(57)【要約】【課題】所望のβシート構造を容易に形成できると共に、電荷が精密に制御されたβシート構造を有する自己組織化ペプチドを提供する【解決手段】一方の面にマイナス電荷を有するアミノ酸残基の側鎖を配向させ、他方の面にプラス電荷を有するアミノ酸残基の側鎖を配向させる。例えば、３以上の奇数個配列したアミノ酸残基からなるβストランド構造のペプチドをβシート構造に形成する。そして、前記ペプチド中、前記酸性アミノ酸残基及び前記塩基性アミノ酸残基を夫々少なくとも１つ以上有するようにし、前記塩基性アミノ酸残基が前記酸性アミノ酸残基から数えて偶数番目に配列されているようにする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方の面にマイナス電荷を有するアミノ酸残基の側鎖が配向し、他方の面にプラス電荷を有するアミノ酸残基の側鎖が配向したβシート構造の自己組織化ペプチド。
【請求項２】
３以上の奇数個配列したアミノ酸残基を有する複数のβストランド構造のペプチドから前記βシート構造が形成されており、
前記βストランド構造のペプチドは、酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を夫々少なくとも１つ以上有し、
前記βストランド構造のペプチド中、前記塩基性アミノ酸残基が前記酸性アミノ酸残基から数えて偶数番目のアミノ酸残基として配列された請求項１に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項３】
前記βストランド構造のペプチドには、疎水性アミノ酸残基が含まれる請求項２に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項４】
前記βストランド構造のペプチド中、前記酸性アミノ酸残基の数と前記塩基性アミノ酸残基の数とは同一である請求項３に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項５】
前記βストランド構造のペプチドのＮ末端アミノ酸残基がＦｍｏｃ基で置換されている請求項２〜４のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己組織化ペプチドに関する。より詳しくは、誘電材料、光機能材料、生体組織培養等に応用されるβシート構造を有する自己組織化ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子を利用した電子エネルギー変換デバイスの開発が行われている。たんぱく質の２次構造の一つであるβシート構造は構造上安定であり、電荷を有するβシート構造のペプチドは電子エネルギー変換デバイス等への応用に期待されている。
【０００３】
一般に、ペプチドの集合形態は、側鎖の静電的性質に影響を受けやすく、親水性アミノ酸残基である酸性アミノ酸残基や塩基性アミノ酸残基よりも、疎水性アミノ酸残基を有するペプチドがβシート構造を形成しやすい。このような傾向はあるものの、電子エネルギー変換デバイス等への応用に向けて、酸性アミノ酸残基や塩基性アミノ酸残基が配列され、電荷を有するβシート構造のペプチドの研究及び開発が行われている。
【０００４】
例えば、非特許文献１〜３には、疎水性アミノ酸残基を挟んで相補的な電荷を持つアミノ酸残基が交互に配置され、βシート構造を形成するオリゴペプチドに関する技術が開示されている。
【０００５】
また、特許文献１には、あるドメインの一方の面に酸性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基を配置し、異なるドメインには他方の面に酸性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基を配置したβシート構造を有するペプチドについて開示されている。更に、特許文献２には、親水性アミノ酸残基と隣接するアミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基としたβシート構造を有するペプチドについて開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２１７３７５号公報
【特許文献２】特開２００４−１９０２１２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】"Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, Vol.90, p.3334-3338
【非特許文献２】"Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly" Nat. Biotechnol. 2003, Vol.21, p.1171-1178
【非特許文献３】"Self-assembly of ionic-complementary peptides: a physicochemical viewpoint" Colloids and Surface Sciences A 2005, 261, p.3-24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前述した技術は、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基との配向を制御するものではなく、電荷の制御という点ではまだ十分とは言えなかった。また、これらの技術では、βシート構造を形成するβストランド構造のペプチドのアミノ酸残基数を制御しておらず、所望のβシート構造を容易に製造できる技術とは言えなかった。
【０００９】
そこで、本発明は、容易にβシート構造を形成できると共に、電荷が精密に制御されたβシート構造を有する自己組織化ペプチドを提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、前述した課題を解決するために、βシート構造を構成するβストランド構造のアミノ酸残基の数が特定の数に制御され、一方の面に酸性アミノ酸残基の側鎖が配向し、他方の面に塩基性アミノ酸残基の側鎖が配向するように制御されたβシート構造の自己組織化ペプチドを見出し、本発明に至った。
【００１１】
即ち、本発明では、一方の面にマイナス電荷を有するアミノ酸残基の側鎖が配向し、他方の面にプラス電荷を有するアミノ酸残基の側鎖が配向したβシート構造の自己組織化ペプチドを提供する。
この自己組織化ペプチドは、３以上の奇数個配列したアミノ酸残基からなる複数のβストランド構造のペプチドから前記βシート構造が形成されており、前記βストランド構造のペプチドは酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を夫々少なくとも１つ以上有し、前記ペプチド中、前記塩基性アミノ酸残基が前記酸性アミノ酸残基から数えて偶数番目のアミノ酸残基として配列されていてもよい。
この自己組織化ペプチドでは、前記ペプチドには、疎水性アミノ酸残基が含まれていてもよい。
また、この自己組織化ペプチドでは、前記ペプチド中、前記酸性アミノ酸残基の数と前記塩基性アミノ酸残基の数は同一であってもよい。
更に、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸残基は、Ｆｍｏｃ基等で置換されていてもよい。
【００１２】
なお、本発明において、塩基性アミノ酸残基が、「酸性アミノ酸残基から数えて偶数番目のアミノ酸残基として配列されている」とは、酸性アミノ酸を１番目のアミノ酸として、２番目、４番目、６番目等の偶数番目のアミノ酸残基として配列されていることを指す。
また、「酸性アミノ酸残基」とは、構造中にカルボキシル基を２つ持つアミノ酸残基を指し、具体的には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸残基」とは、構造中にアミノ基を２つ持つアミノ酸残基を指し、具体的には、リシン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。
また、「βストランド構造」とは、ペプチドを構成するアミノ酸残基の鎖が直線状に伸びた構造を指す。
また、「βシート構造」とは、βストランド構造を有するペプチドが水素結合で結合し、束となってシート状に形成された構造を指す。
また、単に「ペプチド」と表現しているものは、βストランド構造のペプチドであって、自己組織化してβシート構造を形成可能なものを指す。
また、「自己組織化ペプチド」とは、βストランド構造のペプチドが自己組織化してβシート構造に形成されたペプチドを指す。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、容易に製造できると共に、電荷が精密に制御されたβシート構造を有する自己組織化ペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態の自己組織化ペプチドを模式的に示した図である。
【図２】平行型βシート構造を模式的に示した図である。
【図３】逆平行型βシート構造を模式的に示した図である。
【図４】偶数個のペプチドによりβシート構造が形成される場合を概念的に示した図である。
【図５】奇数個のペプチドによりβシート構造が形成される場合を概念的に示した図である。
【図６】βシート構造を有する光電変換人工ペプチドを模式的に示した図である。
【図７】試験例１〜３の自己組織化ペプチドのＣＤスペクトルデータを示す図である。
【図８】試験例１の自己組織化ペプチドの発光スペクトルデータを示す図である。
【図９】試験例１の自己組織化ペプチドのＳＥＭ画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
［自己組織化ペプチド］
図１は、本発明の実施形態の自己組織化ペプチドを模式的に示した図である。図１に示すように、本実施形態の自己組織化ペプチドは、βシート構造であって、一方の面はマイナス電荷を有するアミノ酸残基の側鎖が配向してマイナスに帯電している。そして、他方の面はプラス電荷を有するアミノ酸残基の側鎖が配向してプラスに帯電している。
【００１７】
具体的には、本実施形態の自己組織化ペプチドは、例えば、３以上の奇数個配列したアミノ酸残基からなるβストランド構造のペプチドがβシート構造に形成される。そして、このペプチドが酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を夫々少なくとも１つ以上有する。更に、本実施形態の自己組織化ペプチドでは、βストランド構造のペプチド中、塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基から数えて偶数番目に配列される。なお、図１では、９つのアミノ酸がβストランド構造に形成された場合の例を示す。
【００１８】
このβシート構造を形成するβストランド構造のペプチド間は水素結合で結合される。更に、図示しないが、このβシート構造を形成するβストランド構造のペプチド間は架橋形成されていてもよく、例えば、開環メタセシス重合等による形成方法が挙げられる。
【００１９】
［βストランド構造のペプチド］
まず、図１を参照しながら、本実施形態の自己組織化ペプチドにおいて、βストランド構造のペプチド中、塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基から数えて偶数番目のアミノ酸残基として配列されている場合について説明する。
【００２０】
自己組織化ペプチドを構成するβストランド構造のペプチドは、アミノ酸残基の側鎖がβシートに対して上下交互に配列する。そして、本実施形態の自己組織化ペプチドを構成するペプチドでは、塩基性アミノ酸残基（図１中、（２）、（４）、（６）等に示すアミノ酸）は、酸性アミノ酸残基（例えば、図１中、（１）に示すアミノ酸）から数えて偶数番目に配列される。
【００２１】
そのため、本実施形態の自己組織化ペプチドを構成するβストランド構造のペプチドは、シート面に対して上側にマイナスに帯電した酸性アミノ酸残基の側鎖が配向し、下側にプラスに帯電した塩基性アミノ酸残基の側鎖が配向する。従って、本実施形態の自己組織化ペプチドを構成するペプチドでは、上下夫々の面で、マイナス及びプラスの電荷が互いに打ち消し合うことなく、一方の面をマイナスに帯電させ、他方の面をプラスに帯電させることができる。なお、シート面に対して下側にマイナスに帯電した酸性アミノ酸残基の側鎖が配向し、上側にはプラスに帯電した塩基性アミノ酸残基の側鎖が配向してもよい。
【００２２】
続いて、図２〜図５を参照しながら、本実施形態の自己組織化ペプチドにおいて、βストランド構造のペプチドが３以上の奇数個配列したアミノ酸残基からなる場合について説明する。
【００２３】
図２は、平行型βシート構造を模式的に示す図である。図３は、逆平行型βシート構造を模式的に示す図である。また、図４は、βストランド構造を形成するペプチドが偶数個の場合にβシート構造を形成する例を模式的に示す図である。一方、図５は、βストランド構造を形成するペプチドが奇数個の場合にβシート構造を形成する例を模式的に示す図である。
【００２４】
図２に示すように、平行型βシートとは、２つのβストランド構造のペプチド１０、１１が同一方向に並んで結合することで形成されたβシート構造のことを指す。また、図３に示すように、逆平行型βシートとは、２つのβストランド構造のペプチド１２、１３が反対方向に並んで結合することで形成されたβシート構造のことを指す。
【００２５】
図４に示すように、βストランド構造を形成するペプチドが偶数個（例えば、図に示すように８個）であると、図４Ａに示す向きのペプチドと、図４Ｂに示す向きの同一のペプチドとが結合し、逆平行型βシート構造を形成することがある。このとき、マイナス及びプラスの電荷は互いに打消し合うことになる。すなわち、βストランド構造を形成するペプチドからβシート構造を形成する際、電荷の打ち消し合いを生じさせないように、平行型βシート構造にするようにペプチドの配向を制御することが必要となる。
【００２６】
一方、本実施形態の自己組織化ペプチドでは、図５に示すように、βストランド構造を形成するアミノ酸残基の個数が奇数個である（例えば、図５Ａ、Ｂに示すように９個）。この場合、図５Ａに示すペプチドと、図５Ｂに示すペプチドの向きにより、マイナス及びプラスの電荷が互いに打消し合う懸念がなく、βシート構造が形成される。
【００２７】
すなわち、本実施形態の自己組織化ペプチドでは、βストランド構造を形成するアミノ酸残基の個数が奇数個であるため、集合形態が平行型であるか反平行型であるかにかかわらず、βシート構造中でマイナス及びプラスの電荷が互いに打消し合うことがない。従って、βストランド構造のペプチドに対して、特別な制御等を行う必要なく、一方の面をマイナスに帯電させ、他方の面をプラスに帯電させたβシート構造の自己組織化ペプチドを作製することができる。
【００２８】
このように、本実施形態の自己組織化ペプチドは、βストランド構造のペプチド中、塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基から数えて偶数番目に配列されると共に、ペプチドが３以上の奇数個配列したアミノ酸残基からなるペプチドとすることができる。そのため、マイナス及びプラスの電荷が互いに打消し合うことがなく、一方の面がマイナスに帯電し、他方の面がプラスに帯電したβシート構造に形成される。
【００２９】
［アミノ酸残基］
本実施形態の自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基は、βストランド構造のペプチド中、３以上の奇数個であって、塩基性アミノ酸残基が任意の酸性アミノ酸から数えて偶数番目に配列されていることが好ましい。
【００３０】
本実施形態の自己組織化ペプチドを構成する酸性アミノ酸としては、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）が挙げられる。この中でも、合成上の扱いやすさの観点からグルタミン酸が含まれていることが好ましい。
【００３１】
また、本実施形態の自己組織化ペプチドを構成する塩基性アミノ酸としては、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。この中でも、合成上の扱いやすさの観点からリシンが含まれていることが好ましい。
【００３２】
また、本実施形態の自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基には、疎水性アミノ酸残基が含まれていてもよい。自己組織化ペプチドに疎水性アミノ酸残基が含まれていることで、より安定にβシートが形成されやすくなる。
【００３３】
疎水性アミノ酸としては、バリン（Ｖａｌ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。この中でも、βシートの形成しやすさの観点からバリン、イソロイシン、もしくはアラニンが含まれていることが好ましい。
【００３４】
βストランド構造のペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、３個以上であることが好ましく、５個以上であることがより好ましい。また、アミノ酸残基の数は、２０個以下であることが好ましく、１５個以下であることがより好ましい。
【００３５】
アミノ酸残基の数が、３個以上であると、より多くの荷電アミノ酸残基を導入することができ、誘電特性に優れる。また、アミノ酸残基の数が、２０個以下であると、αヘリックス等の異なる２次構造を形成しにくくなり、βシートが安定に形成される。
【００３６】
また、βストランド構造のペプチドを構成する塩基性アミノ酸残基の数と、酸性アミノ酸残基の数とは同一であることが好ましい。これらの数が同一であると、βシートの上面と下面の価数が一致することから、誘電特性のバランスに優れる。
【００３７】
βストランド構造のペプチドを構成する塩基アミノ酸残基及び酸性アミノ酸残基の全アミノ酸残基の数に対する割合は、３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましい。
【００３８】
塩基アミノ酸残基及び酸性アミノ酸残基の全アミノ酸の数に対する割合が、３０％以上であると、より誘電特性に優れる。
【００３９】
また、本実施形態の自己組織化ペプチドを構成するペプチドのＮ末端アミノ酸残基は、Ｆｍｏｃ基等で置換されていてもよい。ペプチドのＮ末端アミノ酸残基がＦｍｏｃ基で置換されていることで、Ｆｍｏｃ基の集合化能により、βストランド構造のペプチドが集合化した際に、βシート構造の自己組織化ペプチドがより安定に形成されやすくなる。
【００４０】
［自己組織化ペプチドの製造方法］
次に、本実施形態の自己組織化ペプチドの製造方法について説明する。本実施形態の自己組織化ペプチドを得るためには、まず、例えば、３以上の奇数個配列したアミノ酸からなるペプチドであって、酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を夫々少なくとも１つ以上有し、塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基から数えて偶数番目に配列されたβストランド構造のペプチドを準備する。次いで、βストランド構造のペプチドを、例えば、メタノール等の極性溶媒に加熱溶解し、室温（約１５〜３０℃）にて３日程度静置し、自己組織的にβシート構造へと集合化させることで、本実施形態の自己組織化ペプチドが得られる。
【００４１】
βストランド構造のペプチドの合成については、特に限定されないが、通常のＦｍｏｃ固相合成法により作製することができる。具体的には、Ｆｍｏｃ基の脱保護、アミノ酸のカップリング、未反応アミン部位のキャッピングを繰り返し行うことにより作製することができる。βストランド構造のペプチドの同定については、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより行うことができる。
【００４２】
次に、合成工程により得られた溶液中のペプチドを溶媒に溶かし、精製することで自己組織化させる。ペプチドをβシート構造へと集合化させるための溶媒としては、特に限定されないが、メタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等が挙げられる。溶媒の使用量は、ペプチドの１０〜１００倍モルであることが好ましく、より好ましくは、２０〜５０倍モルである。
【００４３】
また、自己組織化させる際に、Ｎ末端もしくはＣ末端にノルボルネン等を導入し、開環メタセシス重合によりペプチド間を架橋することができる。
【００４４】
また、溶媒に溶かしたペプチドを精製するための溶剤も、特に限定されないが、エーテル、ヘキサン、アセトン及びジクロロメタン等が挙げられる。溶剤の使用量は、ペプチドの１００〜１００００倍モルであることが好ましく、より好ましくは、５００〜２０００倍モルである。これにより、βシート構造を有する自己組織化ペプチドの析出物を得ることができる。
【００４５】
次に、この析出物をアセトニトリル、ＴＨＦ、クロロホルム及びジクロロメタン等の溶媒に溶かして、０〜３時間静置して、βシート構造を有する自己組織化ペプチドの分散溶液を得ることができる。
【００４６】
ペプチドの自己組織化における溶液の温度は、特に限定されるものではないが、製造効率の観点から０〜４０℃であることが好ましい。
【００４７】
以上、詳述したように、本実施形態の自己組織化ペプチドは、一方の面に酸性アミノ酸残基の側鎖が位置し、他方の面に塩基性アミノ酸残基の側鎖が位置するβシート構造を有する。そのため、マイナス及びプラスの電荷が互いに打ち消し合うことなく、シートの上下面方向に双極子モーメントが誘起されることにより非線形光学効果が得られる。また、外部電場による分極反転により、強誘電特性を発現させることができる。更に、この分極反転を利用し、βシート構造の薄膜上に培養した細胞シートを容易に剥離することができる。
【００４８】
図６は、βシート構造を有する光電変換人工ペプチドを模式的に示す図である。図６に示すように、アミノ酸残基に特定の官能基を修飾することにより、βシート構造を有する自己組織化ペプチドを光電変換人工ペプチドとして応用することもできる。
【００４９】
このように、本実施形態の自己組織化ペプチドは、２次高調波発生素子、レーザー波長変換素子、強誘電素子、蓄電素子、圧電素子、強誘電メモリー、細胞シート剥離基板、細胞成長抑止剤等に応用することができる
【実施例】
【００５０】
［試験例１］
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げて、本発明の効果について具体的に説明する。本実施例においては、ペンタペプチドをデザインした。具体的には、１番目にグルタミン酸（Ｅ）、２番目及び３番目にバリン（Ｖ）、４番目にリシン（Ｋ）、５番目にバリン（Ｖ）が配置されたペンタペプチドＥＶＶＫＶ（配列番号１）をＦｍｏｃ固相合成法により合成した。すなわち、Ｆｍｏｃ基で置換されたＥＶＶＫＶを得た（Ｆｍｏｃ−ＥＶＶＫＶ−ＮＨ２）。次いで、このようにして得られたペンタペプチド５０ｍｇをアセトニトリル２ｍｌに溶かした後、室温（約２０℃）で３日程度静置し、分子の凝集・集合化を促した。
【００５１】
これにより得られた、Ｎ末端にＦｍｏｃ基が置換されたペンタペプチドにおいて、平行βシート構造の形成を確認した。βシートの構造の形成は、図７に示すＣＤスペクトル、図８に示す発光スペクトル及び図９に示すＳＥＭ画像により確認した。
【００５２】
ＣＤスペクトルについては、上記の方法により集合化したペンタペプチドを室温条件下、アセトニトリルに分散させて測定した。図７に示すＣＤスペクトルの結果により、集合化したポリペプチドはβシート構造になったと考えられる。
【００５３】
発光スペクトルについては、上記の方法により集合化したペンタペプチドを室温条件下、アセトニトリルに分散させて測定した。図８に示す発光スペクトルにより、４５６ｎｍでの燐光強度が得られていることから、Ｆｍｏｃ基の集合化が実現されていることが示唆され、これが駆動力となりβシートが形成されていると考えられる。
【００５４】
ＳＥＭ画像は、上記の方法により集合化したペンタペプチドのメタノール分散液を室温条件下、シリコン基板上に滴下し、１０ｎｍの金薄膜をコートして得た。図９に示すＳＥＭ写真により、ペプチドがファイバーを形成し、βシート（アミロイド）構造を形成していると考えられる。
【００５５】
［試験例２］
試験例１に対し、Ｆｍｏｃ−ＥＶＶＫＶ−ＮＨ２を用いてペンタペプチドの凝集・集合化を促した代わりに、ペンタペプチドＥＶＶＫＶの末端がアセチル基で置換されたＡｃ−ＥＶＶＫＶ−ＮＨ２を用いてペンタペプチドの凝集・集合化を促した点以外は、試験例１と同様にして実験を行った。図７に示すＣＤスペクトルにより、集合化したポリペプチドは、一部はβシート構造化し、一部はランダムコイル状になったと考えられる。
【００５６】
［試験例３］
試験例１に対し、Ｆｍｏｃ−ＥＶＶＫＶ−ＮＨ２を用いてペンタペプチドの凝集・集合化を促した代わりに、ペンタペプチドＥＶＶＫＶの末端が置換されていないＨ−ＥＶＶＫＶ−ＮＨ２を用いてペンタペプチドの凝集・集合化を促した点以外は、試験例１と同様にして実験を行った。図７に示すＣＤスペクトルにより、集合化したポリペプチドの大部分はランダムコイル状になったと考えられる。
【符号の説明】
【００５７】
１０、１１、１２、１３：ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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