(57)【要約】【課題】抗うつ剤を提供する。【解決手段】ブテア  スペルバ又はその抽出物を有効成分とする抗うつ剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブテア  スペルバ又はその抽出物を有効成分とする抗うつ剤。
【請求項２】
ブテア  スペルバの抽出物がブテア  スペルバの低級アルコール抽出物である請求項１記載の抗うつ剤。
【請求項３】
低級アルコールがエタノールである請求項２記載の抗うつ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗うつ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高ストレス社会が到来した我が国では、精神的に疲弊し、不安やうつ状態を訴えるうつ病患者が急増し、大きな社会問題となっている。うつ病は、患者や患者家族の精神的・経済的負担が大きいだけでなく、甚大な社会経済的損失を与える。うつの発症には、様々な説が提唱されているものの未だ結論は得られていない。
従来、うつの治療薬としては、三環系抗うつ薬、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬等が用いられている。しかし、効果や副作用の点から、長期に渡って継続して服用でき、うつの発症を予防できるような安全で有効性の高い新たな物質の開発が求められている。
【０００３】
一方、マメ科植物ブテア  スペルバ（Ｂｕｔｅａ  ｓｕｐｅｒｂａ）は、古くから特に高齢者の滋養強壮に用いられている安全性の高い植物である。また、ブテア  スペルバは、勃起障害、精力増強に有用であること（非特許文献１）、血小板凝集阻害作用を有すること（特許文献１）等が報告されている。
しかしながら、ブテア  スペルバとうつとの関連については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１３１３９０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ、２００３年９月、第５巻、ｐ．２４３−２４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、抗うつ剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、天然物中にうつに有用な物質を鋭意探索した結果、ブテア  スペルバが優れた抗うつ作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ブテア  スペルバ又はその抽出物を有効成分とする抗うつ剤により上記課題を解決したものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抗うつ剤は、優れた抗うつ作用を有すると共に、副作用が少なく、安全性に優れるため、うつの予防及び治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＯＢＸマウスを用いた尾懸垂試験の結果を示す図である。
【図２】ＣＭＳ負荷マウスを用いた尾懸垂試験の結果を示す図である。
【図３】蔗糖嗜好性試験の結果を示す図である。
【図４】血中コルチコステロン量を示す図である。
【図５】マウス海馬及び大脳皮質における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明で用いられるブテア  スペルバ（Ｂｕｔｅａ  ｓｕｐｅｒｂａ）はマメ科コチョウ亜科に属する熱帯植物の一種である。斯かる植物は、根、茎、花、葉等いずれの任意の部位を使用することができるが、根を用いるのが好ましい。
ブテア  スペルバは、そのまま用いても乾燥させて用いてもよく、更にそれらを処理して用いてもよい。処理としては、例えば、切断、破砕、磨砕、粉砕等が挙げられる。
【００１２】
ブテア  スペルバの抽出物は、ブテア  スペルバをそのままもしくは乾燥させ、又はそれらを処理した後に抽出工程に付すことによって得ることができる。ブテア  スペルバの抽出物としては、市販されているもの、常法により得られる各種溶媒抽出物であってもよい。
ブテア  スペルバの抽出物を得る抽出手段は、特に制限されず、例えば、固液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。
【００１３】
抽出のための溶媒としては、例えば、水、低級アルコール、多価アルコール、ケトン類、エステル類、エーテル類、ポリエーテル類、炭化水素類、芳香族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類、超臨界二酸化炭素、オイル類、これらの混合物等が挙げられる。なかでも、水、低級アルコール、低級アルコール−水混合液が好ましい。
低級アルコールとしては、炭素数１〜５のアルコールが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノールがより好ましく、エタノールが特に好ましい。
【００１４】
抽出のための溶媒として低級アルコール−水混合液を使用する場合には、低級アルコールと水との配合割合（容量比）としては、０．００１〜１００：９９．９９９〜０が好ましく、５〜９５：９５〜５がより好ましい。エタノール水溶液の場合、エタノール濃度が５０〜９５（ｖ／ｖ）％であることが好ましい。
【００１５】
溶媒の使用量としては、ブテア  スペルバ（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬが好ましく、抽出時間としては、３０分間〜２日間が好ましく、１時間〜１２時間がより好ましい。このときの抽出温度は、０℃〜溶媒沸点、より好ましくは２０〜１００℃である。このような抽出が終了してから溶媒を分取し、更に溶媒を加えて抽出する操作を数回繰り返すのが好ましい。
【００１６】
斯くして得られるブテア  スペルバの抽出物は、抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、抽出に用いられる溶媒、例えば水等で希釈して用いることもできる。
【００１７】
ブテア  スペルバの抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶媒を用いる沈殿法、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００１８】
ブテア  スペルバ又はその抽出物は、後述する実施例に示すように、うつモデルである嗅球摘出（ＯＢＸ）マウス及び慢性的軽度ストレス（ＣＭＳ）負荷マウスにおいて、尾懸垂試験における無動時間を有意に短縮した。また、ストレス応答の指標である蔗糖嗜好性と血中コルチコステロンレベルを有意に改善した。更に、うつ病態発症関連因子の一つとして知られている脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の遺伝子発現量の低下を有意に抑制した。従って、本発明は、ブテア  スペルバ又はその抽出物を有効成分とする抗うつ剤を提供する。
本明細書で云ううつとは、うつ病、例えば大うつ病、双極性うつ病、うつ状態等が挙げられる。
【００１９】
本発明の抗うつ剤は、うつを予防、治療及び／又は改善するための医薬品、食品又は飼料等の他の組成物の製造のために使用することができる。
これら医薬品、食品及び他の組成物は、本発明の効果を奏する限り、必要に応じて、薬学的に許容される担体、添加剤、他の有効成分、薬理成分等を含有していてもよい。
【００２０】
上記医薬品、食品及び他の組成物における抗うつ剤の含有量は、ブテア  スペルバの乾燥物換算として、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは１０質量％以上であり、他方、好ましくは１００質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、更に好ましくは５０質量％以下である。
【００２１】
医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与又は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与が挙げられる。
このような種々の剤型の医薬品を調製するには、薬学的に許容される担体、例えば賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２２】
また、食品又は他の組成物の形態は、固形、半固形又は液状であり得る。食品としては、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品又は他の組成物を調製するには、他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２３】
本発明の抗うつ剤の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、ブテア  スペルバの乾燥物換算として、１日あたり０．１〜２０ｍｇ／ｋｇとすることが好ましく、１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇとするのがより好ましい。
【実施例】
【００２４】
1.ブテア  スペルバ抽出物（ＳＯ）の調製
ブテア  スペルバの根の乾燥粉砕物５２ｇを９５（ｖ／ｖ）％エタノール２００ｍＬで水浴中７５℃、２時間加熱し、抽出ろ過した。この過程を３回繰り返し、全抽出液を併せて減圧濃縮した。濃縮液は  ４０℃で３日間、真空乾燥し、抽出物として４．６３ｇを回収した（１ｇ乾燥根粉末は０．０８９ｇ抽出物に相当）。
ブテア  スペルバの（成人）での一日摂取量はブテア  スペルバ乾燥物で１０ｍｇ／ｋｇ／日とみなし、その１０倍から３０倍容量である１００ｍｇ／ｋｇ／日及び３００ｍｇ／ｋｇ／日に相当する抽出物を実験期間中にモデル動物に経口投与した。
【００２５】
２．嗅球摘出（ＯＢＸ）マウスの作製
９週齢ｄｄＹ系雄性マウスを用いた。ペントバルビタール麻酔下で頭蓋を切開して、嗅球を吸引除去した。尚、切開部位には局所麻酔薬リドカインを塗布した。嗅球摘出を行わず、同様の手術を行ったマウスを偽手術群とした。施術３日後より、ブテア  スペルバ抽出物、或いはイミプラミン（ＩＭＰ、１０ｍｇ／ｋｇ／日；腹腔内投与）の投与を開始し、投与は１日１回、実験期間中継続した。
手術２週間後より次の行動実験を開始した。
【００２６】
３．慢性的軽度ストレス（ＣＭＳ）負荷マウス
６週齢ｄｄＹ系雄性マウスを用い、異なる種類の軽度ストレス刺激（ＣＭＳ）を表１に示す順序で実験期間中（６週間）負荷した。ストレスを負荷せずに通常の飼育ケージで飼育したマウスを非ストレス群とした。第１週に各動物群の蔗糖摂取量を測定後、上記と同様にブテア  スペルバ抽出物、或いはイミプラミンの投与（１日１回）を開始し、実験期間中継続した。
【００２７】
【表１】
2014227380.tif 000002
【００２８】
４．尾懸垂試験
（１）ＯＢＸマウスを用いてマウスのうつ様行動を測定した。マウス尾部を観察箱内の床より５０ｃｍの位置に懸垂し、逃避不可能なストレスを８分間負荷した。無動を０．０５  ｃｍ2／ｓｅｃ以下の動きと定義し、測定開始２分後より６分間無動時間をＳＭＡＲＴ  ｓｙｓｔｅｍで解析した。
試験には、偽手術群、ＯＢＸ−水投与群、ブテア  スペルバ抽出物（１００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群（ＳＯ（１００）と表記）、ブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群（ＳＯ（３００）と表記、以下同じ）、ＩＭＰ投与群（ＩＭＰ（１０）と表記、以下同じ）の５群を用意し、各群１０匹とした。なお、偽手術群、ＯＢＸ−水投与群にはブテア  スペルバ抽出物の代わりに水を投与した。
統計処理は、偽手術群とＯＢＸ−水投与群との比較をｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより、ＯＢＸ−水投与群と薬物投与群との比較を一元配置分散分析の後、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｔｅｓｔで行った。危険率Ｐが０．０５未満の場合を有意と判定した。結果を図１に示す。
【００２９】
（２）ＣＭＳ負荷マウスを用いて、上記（１）と同様にマウスのうつ様行動を測定した。試験には、非ストレス−水／生理食塩水投与群、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群、ブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群、ＩＭＰ投与群の６群を用意し、各群１２匹とした。なお、実験期間中、非ストレス−水／生理食塩水投与群、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群にはブテア  スペルバ抽出物の代わりに水又は生理食塩水を同量投与した。
統計処理は、非ストレス群とＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群との比較をｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群と薬物投与群との比較を一元配置分散分析の後、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｔｅｓｔで行った。危険率Ｐが０．０５未満の場合を有意と判定した。結果を図２に示す。
【００３０】
図１より、偽手術群と比べＯＢＸ−水投与群では無動時間が有意に延長し、うつ様行動が発現することが明らかとなった。ブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群、ＩＭＰ投与群では、いずれもＯＢＸ−水投与群と比べて有意に無動時間が短縮した。
また、図２より、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群では非ストレス群と比較して無動時間が有意に延長した。一方、ブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群、ＩＭＰ投与群の無動時間は有意に短縮し、非ストレス群のレベルまで回復した。
【００３１】
５．蔗糖嗜好性試験
ＣＭＳ負荷マウスを用いて、毎週１８時間絶水絶食処置（表１参照）直後、蔗糖嗜好試験を行った。試験では各飼育ケージに、水道水と１０％蔗糖水を含む２種類のボトルを設置した。試験開始３０分後、ボトルの位置を入れ替え、更に３０分間設置した。
蔗糖嗜好性（％）は、（１０％蔗糖水摂取量  ／  １０％蔗糖水摂取量  ＋  水道水摂取量）×１００  により算出した。
試験には、非ストレス−水／生理食塩水投与群、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群、ブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群、ＩＭＰ投与群の６群を用意し、各群１２匹とした。なお、実験期間中、非ストレス−水／生理食塩水投与群、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群にはブテア  スペルバ抽出物の代わりに水又は生理食塩水を同量投与した。
統計処理は二元配置反復測定分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅ  ＡＮＯＶＡ）で行い、危険率Ｐが０．０５未満の場合を有意と判定した。結果を図３に示す。
【００３２】
一般にうつ病態の動物では蔗糖嗜好性が低下することが知られている。図３より、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群ではストレス負荷開始４週以降に有意な嗜好性の低下が認められた。一方、ブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群及びＩＭＰ投与群では嗜好性低下は有意に抑制された。
【００３３】
６．血中コルチコステロン量の測定
ＣＭＳ負荷（６週間）後、断頭し、頚部より速やかに採血してヘパリン処理したチューブに入れ、５分間遠心分離（４℃、３，０００ｒ／ｍｉｎ）後、上清をとり血清とした。血中コルチコステロン濃度の測定はＡｓｓａｙＭａｘ  Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （Ａｓｓａｙｐｒｏ）を用いて行った。コルチコステロン抗体でコーティングされた９６穴マイクロプレートに２５  μＬの血清を入れ、室温で２時間インキュベート後、２００  μｌ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄した。液を取り除き、５０  μｌ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  を入れ、３０分間インキュベートした。さらに２００  μｌ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄した後、５０μｌ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  を入れて２０分間インキュベートした後、５０  μｌ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  を加えた。分光光度計  （Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｃｌａｓｓｉｃ；  ＴＥＣＡＮ  ＪＡＰＡＮ  Ｋａｗａｓａｋｉ）  を用いて４５０  ｎｍにおける吸光度を測定した。
試験には、非ストレス群、ＣＭＳ負荷−水投与群、ブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群、ＩＭＰ投与群の４群を用意し、各群３匹の血清サンプルを解析した。なお、実験期間中、非ストレス群、ＣＭＳ負荷−水投与群にはブテア  スペルバ抽出物の代わりに水を同量投与した。
統計処理は、非ストレス群とＣＭＳ負荷−水投与群との比較をｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより、ＣＭＳ負荷−水投与群と薬物投与群との比較を一元配置分散分析の後、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｔｅｓｔで行った。危険率Ｐが０．０５未満の場合を有意と判定した。結果を図４に示す。
【００３４】
図４より、ＣＭＳ負荷−水投与群では非ストレス群と比べ、血中コルチコステロンレベルが有意に上昇していることが明らかとなった。一方、この上昇はブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与及びイミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）投与により有意に抑制された。
【００３５】
７．脳由来神経栄養因子遺伝子発現量の測定
ＣＭＳ負荷（６週間）後、マウスをｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  ｓｏｄｉｕｍ（６０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）麻酔で断頭し、脳より大脳皮質及び海馬を摘出した。組織は速やかに液体窒素で凍結し、以降の操作を行うまで−８０℃で保存した。Ｓｅｐａｚｏｌ  （Ｎａｃｄａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ）を用いて各組織よりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出方法は添付のプロトコルに従って行った。ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＶｕｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  を用いて測定した。逆転写反応はＯｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）及びＭ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用いて行い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンプレートとし、下記のＢＤＮＦ遺伝子及びβ−ａｃｒｉｎプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ法にてＢＤＦＮ遺伝子発現量を定量した。尚、ＰＣＲにはＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，  ＵＳＡ）  とＳｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００３６】
ＢＤＮＦ  ｍＲＮＡ  （ＭＡＯ２４７５６）
５’−ＣＴＧＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号１）
５’−ＣＴＧＡＴＧＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ）（配列番号２）
【００３７】
β−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ（ＮＭ ０３０３８７）
５’−ＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号３）
５’−ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ）       （配列番号４）
【００３８】
試験には、非ストレス−水／生理食塩水投与群、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群、ブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群、ＩＭＰ投与群の６群を用意し、各群５匹又は６匹とした。
統計処理は、非ストレス群とＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群との比較をｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群と薬物投与群との比較を一元配置分散分析の後、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｔｅｓｔで行った。危険率Ｐが０．０５未満の場合を有意と判定した。結果を図５に示す。
【００３９】
図５に示すとおり、ＣＭＳ負荷−水／生理食塩水投与群では非ストレス群と比べ、海馬組織及び大脳皮質におけるＢＤＮＦ遺伝子発現量の有意な低下が認められた。海馬における発現量低下はブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与群及びＩＭＰ投与群で有意に抑制された（図５のＡ）。大脳皮質におけるＢＤＮＦ遺伝子発現量の低下もブテア  スペルバ抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）投与によって抑制される傾向がみられた。
これらの結果から、ブテア  スペルバは海馬ＢＤＮＦ転写を促進すると考えられた。
【００４０】
以上より、ブテア  スペルバの反復摂取又は投与によって、うつの発症の予防や改善を図れる可能性が確認された。
【図１】
2014227380.tif 000003
【図２】
2014227380.tif 000004
【図３】
2014227380.tif 000005
【図４】
2014227380.tif 000006
【図５】
2014227380.tif 000007
【配列表】
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