(57)【要約】      （修正有）【課題】メタボリックシンドロームの予防・改善のための肥満予防の重要な遺伝子であるミトコンドリア脱共役タンパク質をコードしているＵＣＰ（脱共役タンパク質：Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーＵＣＰ−２の発現促進作用を示すレスベラトロール誘導体類を有効成分とする新たな代謝促進剤及びＵＣＰ−２発現促進剤の提供。【解決手段】レスベラトロール誘導体、その薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2014070052.tif 000005
で示されるレスベラトロール誘導体、その薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする代謝促進剤。
【請求項２】
式（１）：
【化２】
2014070052.tif 000006
で示されるレスベラトロール誘導体、その薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするＵＣＰ−２発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝促進剤に関する。また、本発明は、ＵＣＰ−２発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の社会生活においては、過剰なストレスや食物摂取、運動不足が蔓延している。これらが原因となるメタボリックシンドロームが大きな社会問題になっている。メタボリックシンドロームとは、内蔵脂肪型肥満に加えて高血糖、高血圧、脂質異常のうち二つ以上を併せ持った状態であり、動脈硬化のリスクが高くなる。
【０００３】
メタボリックシンドロームの原因として、過剰な脂肪・糖質といったエネルギー源の摂取が挙げられる。過剰に摂取されたエネルギー源は体内に脂肪という形で脂肪組織に蓄積される。この脂肪の蓄積がメタボリックシンドロームの原因の一つである。つまり、この脂肪の蓄積を抑制、又は脂肪の消費を亢進させることでメタボリックシンドロームの予防・改善が可能であるとされている。
【０００４】
体内の脂肪の消費を亢進する、つまりエネルギー代謝を亢進させるには、最も確実な方法としては、運動が挙げられる。しかし、不定期な生活を余儀なくされる現代社会においては定期的に運動を行うことが困難であることが多い。このような現状から、エネルギー代謝を亢進させる薬剤等を用いた新しいメタボリックシンドロームの予防・改善方法が求められている。
【０００５】
近年、メタボリックシンドロームに関連する研究が盛んに行われているなかで、肥満予防に重要な遺伝子の存在が明らかとなった。それはミトコンドリア脱共役タンパク質をコードしているＵＣＰ（脱共役タンパク質：Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーである。
【０００６】
ＵＣＰファミリーは脊椎動物体内の様々な部位で発現していることが知られている。たとえば、褐色脂肪組織にはＵＣＰ−１、白色脂肪組織、骨格筋、腎臓、肝臓にはＵＣＰ−２、筋組織にはＵＣＰ−３がそれぞれ発現していることが知られている。
【０００７】
ＵＣＰファミリーはまた、その発現と肥満は深い関わりがあることが知られている。たとえば、１）肥満した動物及びヒトではＵＣＰの発現が低下している、２）肥満し難い脊椎動物ではＵＣＰの発現量が高い、３）ＵＣＰノックダウンマウスでは肥満になる、４）ＵＣＰトランスジェニックマウスでは肥満しない等のことが知られている。
【０００８】
このようにＵＣＰファミリーの発現を亢進させることの有効性からそのＵＣＰ発現を促進する技術が報告されている。たとえば、フコキサンチンを有効成分とするＵＣＰ発現促進剤（特許文献１）、スイレン科もしくはハス科植物種子の極性溶媒抽出エキスを有効成分とする熱産生タンパク質発現促進剤（特許文献２）、カプサイシン及びカプサイシノイド様物質を有効成分とする脂質代謝改善組成物（特許文献３）、ピンクロックローズ抽出物を有効成分とする脱共役蛋白質発現促進剤（特許文献４）等が報告されている。
【０００９】
また、ブドウ果皮に含有されるスチルベン誘導体であるレスベラトロールを有効成分とするＵＣＰ―２発現亢進剤（特許文献５）が報告されている。
【００１０】
中でも、ＵＣＰ−２遺伝子は脂肪燃焼による痩身、抗炎症、外傷による神経系の損傷抑制等に適用され得ると考えられることから（特許文献５の段落［０００７］）、より優れたＵＣＰ−２発現促進作用を示す化合物や素材について更なる開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１０−２７００２１号公報
【特許文献２】特開２００３−１１３１００号公報
【特許文献３】特許第４８０３９７１号公報
【特許文献４】特開２０１１−１６２５２０号公報
【特許文献５】特開２０１０−２４２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、メタボリックシンドロームに関する前記の状況を鑑みて、鋭意検討を行った。その結果、新たに作製したレスベラトロール誘導体類が、レスベラトロールよりも優れたＵＣＰ−２発現促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
したがって、本発明は、レスベラトロールよりも優れたＵＣＰ−２発現促進作用を示すレスベラトロール誘導体類を有効成分とする新たな代謝促進剤及びＵＣＰ−２発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の要旨は、
【００１５】
本発明の要旨は、式（１）：
【００１６】
【化１】
2014070052.tif 000002
【００１７】
で示されるレスベラトロール誘導体、その薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする代謝促進剤、
（２）式（１）：
【００１８】
【化２】
2014070052.tif 000003
【００１９】
で示されるレスベラトロール誘導体、その薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするＵＣＰ−２発現促進剤
に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の代謝促進剤は、レスベラトロールよりも優れたＵＣＰ−２発現促進作用を有していることから、体内の白色脂肪細胞におけるＵＣＰ−２発現促進に伴って生じる熱産生等の代謝を促進して肥満を予防・改善すること、さらには抗炎症、外傷による神経系の損傷抑制なども期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は実施例１で行ったレスベラトロール誘導体（ＵＨＡ４００３）を含む生成物のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。Ｒ４はＵＨＡ４００３に該当する。
【図２】図２は実施例２で行った培養細胞を用いたインビトロでのＵＣＰ−２発現解析の結果であり、ＤＭＳＯ、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｒａｔｒｏｌ）とＵＨＡ４００３で処理したマウス脂肪細胞中のＵＣＰ−２遺伝子発現量を定量した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「代謝促進剤」とは、脂肪細胞のＵＣＰ−２の発現を亢進することができる薬剤をいう。
前記脂肪細胞のＵＣＰ−２発現促進作用は、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。
【００２３】
本発明の代謝促進剤及びＵＣＰ−２発現促進剤（以下、本発明の代謝促進剤と略する）は、式（１）：
【００２４】
【化３】
2014070052.tif 000004
【００２５】
で示されるレスベラトロール誘導体（１）及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする。
【００２６】
前記レスベラトロール誘導体において、炭素−炭素２重結合は、トランス又はシスであってよく、シス体とトランス体との混合物を含む。
【００２７】
前記レスベラトロール誘導体の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２８】
本発明で使用する前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体は、レスベラトロールを原料として、金属塩の存在下で加熱処理して得ることができる。
以下に、前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体の製造方法について具体的に説明する。
【００２９】
前記製造方法では、前駆体として前記レスベラトロールを用いる。レスベラトロールにはトランス体とシス体の構造異性体が存在するが、加熱や紫外線によってトランス体とシス体の変換が一部生じる。したがって、レスベラトロールとしては、トランス体でもシス体でも、あるいはトランス体とシス体の混合物であってもよい。レスベラトロールは、ブドウ果皮やピーナッツ果皮、イタドリ等から抽出・精製した天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のレスベラトロールを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明で用いる前記レスベラトロール誘導体が得られるから、レスベラトロール以外の成分を含む混合物も使用できる。また、レスベラトロールには、塩、エーテル、エステル等の誘導体もあるが、前記製造方法では、これらの誘導体も原料として使用することができる。
ただし、前記レスベラトロール誘導体の回収率の観点からは、レスベラトロール換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記レスベラトロール含有原料としては、ブドウ果皮、ピーナッツ果皮、イタドリ等の原料からの抽出物、該抽出物の凍結乾燥品等を使用してもよい。
【００３０】
本発明では、前記レスベラトロールを適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであると、レスベラトロールの溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させることが好ましい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、レスベラトロールが十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。反応後に得られる組成物を最終的な精製を十分に適用せずに食品、医薬品、医薬部外品等に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。
【００３１】
前記のようにして得られるレスベラトロールを含有する溶液中のレスベラトロールの濃度について特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、レスベラトロールの濃度は各々の溶媒に対しレスベラトロールがそれぞれ飽和する濃度近くが好ましい。
また、レスベラトロールは前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。
【００３２】
次に、前記レスベラトロールを含有する溶液（以下、レスベラトロール含有溶液という）のｐＨを８．０以上に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、レスベラトロール含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整しても良いし、前記溶液の調製時に予め溶媒のｐＨを調整しておいても良い。レスベラトロール含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、効率的に後述の反応が進むので好ましく、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なレスベラトロール誘導体類の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは８．０以上１３．０未満が望ましい。
【００３３】
本発明では、前記レスベラトロール含有溶液中に金属塩を添加する。前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む物質が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記金属塩の含有量としては、前記レスベラトロール誘導体を生成可能な量であればよく、特に限定はない。
【００３４】
次に、前記金属塩を添加したレスベラトロール含有溶液を加熱処理することにより前記金属塩の存在下でレスベラトロールを加熱処理する。この加熱処理により、前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、レスベラトロール含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にレスベラトロール含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にレスベラトロール含有溶液を入れて前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。レスベラトロール誘導体の回収効率の面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分〜１２０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して加熱を行うことが好ましい。
【００３５】
前記加熱処理によるレスベラトロール誘導体の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析によりレスベラトロール誘導体の生成量を確認して判断すればよい。
【００３６】
得られる反応液中には、本発明で用いるレスベラトロール誘導体が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程でレスベラトロール誘導体を製造した場合には、前記レスベラトロール誘導体を含む混合物の状態で食品、医薬品又は医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のレスベラトロールを含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを添加して加熱処理した場合には、得られる反応液を食品、医薬品又は医薬部外品の原料の一つとして使用することが可能である。
【００３７】
また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応液を濃縮してレスベラトロール誘導体の濃度を高める、あるいは前記反応液を精製しレスベラトロール誘導体の純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出してレスベラトロール誘導体を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。
【００３８】
また、前記反応液から式（１）で表されるレスベラトロール誘導体を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。
【００３９】
前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状のレスベラトロール誘導体を得ることができる。
【００４０】
また、得られたレスベラトロール誘導体は、必要に応じて、当該分野で公知の方法により、レスベラトロール誘導体の塩としてもよい。
【００４１】
前記のレスベラトロール誘導体は、レスベラトロールよりも優れたＵＣＰ−２発現促進作用を有することから、本発明は、前記レスベラトロール誘導体を有効成分として含有する代謝促進剤を提供することができる。
【００４２】
上記の代謝促進剤は、いずれも食経験のあるレスベラトロールを前駆体として生成されるものであるため、脂肪燃焼による痩身や肥満予防や改善、抗炎症、外傷のよる神経系の損傷抑制等を目的とした食品、医薬品又は医薬部外品に使用することが可能である。
【００４３】
前記食品としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯性に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。なお、食品には、機能性食品、健康食品、健康志向食品等も含まれる。
【００４４】
また、前記食品には、ヒトが食べる食品だけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。
【００４５】
前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施してもよいし、胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、前記の製剤を公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、前記液剤を注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
【００４６】
医薬部外品としては、口腔に用いられる医薬部外品、例えば、歯磨き剤、マウスウォッシュ、マウスリンス、ドリンク剤等が挙げられる。
【００４７】
本発明の代謝促進剤を用いて食品、医薬品又は医薬部外品を調製する場合、本発明の効果が損なわれない範囲内で食品、医薬品又は医薬部外品に通常用いられる成分を適宜任意に配合することができる。
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせることができる。
医薬品や医薬部外品の場合には、主剤、基材、界面活性剤、起泡剤、湿潤剤、増粘剤、透明剤、着香料、着色料、安定剤、防腐剤、殺菌剤等に組み合わせ、常法に基づいて、液状、軟膏状あるいはスプレー噴射可能な最終形態等にすることができる。
【００４８】
また、本発明の代謝促進剤を食品に添加する場合には、該食品中に、有効成分である前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体換算で０．００１〜２０重量％添加することが好ましい。
【００４９】
本発明の代謝促進剤を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり有効成分である前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体換算で約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００５０】
本発明の代謝促進剤を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、有効成分である前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体換算で０．００１〜３０重量％添加するのが好ましい。
【実施例】
【００５１】
次に本発明を実施例に基いて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。なお、実施例において「％」、「部」は、特に説明がない限り、それぞれ「重量％」、「重量部」を示す。
【００５２】
（実施例１：ＵＨＡ４００３の生成及び単離・精製）
トランス−レスベラトロール（東京化成）７００ｍｇをエタノール１４ｍＬに溶解し、２．５％ＮａＨＣＯ3水溶液を１４ｍＬ加えて、金属塩を添加したレスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）、「ＳＡＮＹＯ  ＬＡＢＯ  ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、以下同じ）にて１３０℃、２０分間加熱した。次いで、１回目のオートクレーブ処理にて得られた反応溶液に、エタノール１４ｍＬと５．０％ＮａＨＣＯ3水溶液を１４ｍＬ加え、再度、オートクレーブにて１３０℃、２０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。その結果を図１に示す。
【００５３】
前記のＨＰＬＣ分析は以下の条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５、野村化学株式会社」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）），  Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００５４】
図１に示すように、反応後溶液のクロマトグラムでは、複数のピークが確認され、原料であるレスベラトロールのピークとは相違しているＲ１〜Ｒ５のピークのうち、Ｒ４のピークに含まれる化合物をＵＨＡ４００３と命名した。
【００５５】
Ｒ４のピークに含まれるＵＨＡ４００３を分取ＨＰＬＣにより精製し、常法により乾燥したところ、褐色粉末状の物質であった。
【００５６】
なお、ＵＨＡ４００３の分子量を高分解能ＦＡＢ−ＭＳ（高速原子衝撃質量分析）にて測定したところ、４３９．４８０３であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ28Ｈ23Ｏ5（Ｍ＋Ｈ）+ ：４３９．４７９２
分子式Ｃ28Ｈ22Ｏ5
【００５７】
次に、前記ＵＨＡ４００３を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ４００３が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。
【００５８】
（実施例２  ＵＣＰ−２遺伝子発現量の定量）
ＵＨＡ４００３によるＵＣＰ−２遺伝子の発現量を評価するために、白色脂肪組織として３Ｔ３―Ｌ１細胞（マウス由来脂肪前駆細胞）を用いて評価を行った。
【００５９】
試料にはレスベラトロール、本発明品であるＵＨＡ４００３の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）に１０ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。
【００６０】
培養は、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）及び１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を用いた。
【００６１】
試験に使用する脂肪細胞は定法に従って調製した。つまり、細胞培養用６ウェルディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）に３Ｔ３―Ｌ１細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬで２ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間培養し、１００％コンフルエントしたものを毎日培地交換しながらさらに４８時間培養した。その後、培地を、脂肪細胞分化試薬（商品名：ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ、タカラバイオ（株）製）に付属の、インスリン、デキサメタゾン及びイソブチルメチルキサンチンをそれぞれ１％、０．５％及び０．１％添加した分化用ＤＭＥＭ培地２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間分化・培養した。分化させた脂肪細胞の培地を、インスリン１％を含むＤＭＥＭ培地（維持培地）に交換し、７日間培養した脂肪細胞を試験に使用した。
【００６２】
試験は以下のように行った。７日間培養した脂肪細胞に各試料を１０μＬ（終濃度５０μＭ）添加し、２日間培養した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。
【００６３】
培養終了後、細胞よりＲＮＡ抽出キット（商品名：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  II、タカラバイオ（株）製）を用いて全量ＲＮＡを抽出・精製した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用逆転写試薬（商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、タカラバイオ（株）製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。
【００６４】
つまり５×（Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）４μＬ及び全量ＲＮＡ  １μｇを混合し、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｄＨ2Ｏで全量を２０μＬにした。ＰＣＲ用サーマルサイクラー（商品名：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して１サイクルが「３７℃×１５分→８５℃×５秒」であるプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用希釈試薬（商品名：ＥＡＳＹ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ、タカラバイオ（株）製）にて１０倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。
【００６５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、ＥＣＯ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ―ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ」（商品名、イルミナ（株）製）を使用した。プライマーには、ＵＣＰ−２フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１１２９８８−Ｆ）及びＵＣＰ−２リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１１２９８８−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８-Ｒ）（前記４種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
【００６６】
反応にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬（商品名：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  ｔａｑ  II（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）、タカラバイオ（株）製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に、２×（ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  ｔａｑ  II（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ））５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、逆転写反応液２μＬ及び（ｄＨ2Ｏ）２．８４μＬ（総量１０μＬ）を混合して『９５℃×３０秒→「９５℃×１５秒→６０℃×１分」×４０サイクル→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒』のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。
【００６７】
得られた各細胞中のβ−アクチンとＵＣＰ−２のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＵＣＰ−２遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図２に示した。
【００６８】
図２の結果より、ＵＨＡ４００３において、レスベラトロールと比較して約９倍以上も高いＵＣＰ−２発現促進作用が確認されたことから、ＵＨＡ４００３は、脂肪細胞の代謝を亢進する作用があることが示された。このことから、式（１）で示される、レスベラトロール誘導体であるＵＨＡ４００３を有効成分として含む本発明の薬剤は、代謝促進剤やＵＣＰ−２発現促進剤として好適なものであることがわかる。
また、本発明の薬剤は、ＵＣＰ−２発現作用に基づく代謝促進作用、例えば、体の各部において熱産生を促進することによる抗肥満作用及び熱産生を促進して体への脂肪の蓄積を抑制することによるメタボリックシンドロームの予防及び治療作用を有することに加えて、抗炎症作用、外傷による神経系の損傷抑制作用を有していると考えられる。
【図１】
2014070052.tif 000007
【図２】
2014070052.tif 000008