(57)【要約】【課題】胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価のための指標を得る方法の提供。【解決手段】ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価の指標とする。好ましくは、それに加えて、ＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価の指標とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価のための指標を得る方法であって、
被験者から採取した検体における、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を測定する工程を含み、
ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価の指標とする、
方法。
【請求項２】
被験者から採取した検体における、ＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を測定する工程を含み、
ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方と、ＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方とを、胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価の指標とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検体が、胃粘膜洗浄液、生検、胃液、血液又は糞便である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
検体が、胃粘膜洗浄液である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＢＡＲＨＬ２遺伝子のシトシンメチル化頻度を測定するキットであって、
配列番号１の核酸配列を含み、４０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２の核酸配列を含み、４０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットと、
配列番号３の核酸配列を含み、３０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチドからなるプローブと、を含む、キット。
【請求項６】
プライマーセットが、配列番号４の核酸配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドからなり、
プローブが、配列番号６の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドからなる、
請求項５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価のための指標を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌の診断方法として、生検により体細胞を摘出し、細胞表面の癌特異的な抗原を利用した免疫染色を行い、病理医が確定診断を行っている。
【０００３】
癌のリスク要因として、一塩基多型（ＳＮＰｓ）等の遺伝子異常が知られているが、生活習慣等により後天的に影響がでるエピジェネティック異常によっても癌が発症することが知られてきている。エピジェネティック異常は、ＤＮＡの５’−ＣＧ−３’（ＣｐＧ配列）のシトシン（Ｃ）の５位の炭素のメチル化によるもの、及びヒストンがアセチル化、メチル化及びリン酸化等の修飾を受けることによるクロマチン構造の変化によるものが主としてある。特に、ＤＮＡのメチル化は、ＣｐＧ配列が高密度な遺伝子プロモーター領域において、ＤＮＡの塩基配列を変えることなくシトシン（Ｃ）がメチル化することにより、遺伝子の発現が抑制され、発がんに寄与すると考えられている（非特許文献１−２）。メチル化は、胃炎、ヘリコバクターピロリ菌及び化学物質等により生じることが知られている（非特許文献３−５）。
【０００４】
今までに癌の検査に用いられてきたものとしては、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＰＳＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ抗原、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ及びペプシノゲン等の癌マーカーがある。しかし、癌発生後でないとマーカーが顕著に上昇しないために、進行癌では有用であっても、早期の癌発見には繋がらなかった。従来の癌マーカー以外にも、近年では、ＤＮＡのメチル化を標的とした、癌の診断方法が提案されてきた（特許文献１）。胃癌においては、ＤＮＡメチル化を標的とした、ＭＩＮＴ２５遺伝子及びＳｏｘ１７遺伝子の胃癌マーカーが提案されている（特許文献２−３）。しかしながら、これらの胃癌マーカーを用いた場合、ピロリ菌感染を伴う胃癌患者では有意差が認められるが、ピロリ菌に感染していない胃癌患者では有意差が認められないという問題点がある。近年、若年層を中心に、ピロリ菌非感染者における胃癌発症が増加しているため、ピロリ菌感染の有無によらない、早期胃癌の検出又は胃癌発症リスクの評価の指標が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２８３９４７号公報
【特許文献２】特許第４４２６５４９号公報
【特許文献３】国際公開第２００９／１３６５０１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ，１２８：６８３−６９２，２００７、
【非特許文献２】Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８５（１５）：１２３５−１２４０，１９９３
【非特許文献３】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１２（３）：９８９−９９５，２００６
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１７（１０）：２５５５−２５６４，２００８
【非特許文献５】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７０（４）：１４３０−４４０，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、早期胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価のための指標を得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を胃癌マーカーとして利用可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価のための指標を得る方法であって、被験者から採取した検体における、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を測定する工程を含み、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価の指標とする方法、を提供する。
【００１０】
上記方法において、被験者から採取した検体における、ＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を測定する工程を含み、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方と、ＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方とを、胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価の指標とすることが好ましい。既に胃癌マーカーとして利用されているＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方を指標に加えることで、より精度の高い診断を行うことが可能である。
【００１１】
上記方法において、検体は、胃粘膜洗浄液、生検、胃液、血液又は糞便を用いることができ、特に、胃粘膜洗浄液であることが好ましい。胃粘膜洗浄液には、胃全体の情報が得られるという利点及び検体中のＤＮＡ鎖の切断が少ないという利点がある。
【００１２】
本発明は、また、ＢＡＲＨＬ２遺伝子のシトシンメチル化頻度を測定するキットであって、配列番号１の核酸配列を含み、４０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２の核酸配列を含み、４０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットと、配列番号３の核酸配列を含み、３０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとを含むキット、を提供する。かかるキットを利用して上記方法を実施することが可能である。
【００１３】
上記キットにおいて、プライマーセットが、配列番号４の核酸配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドからなり、プローブが、配列番号６の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドからなることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る方法によれば、早期胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価が可能となる。さらに、本発明に係る方法によれば、ピロリ菌の感染の有無に関わらず、早期胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＢＡＲＨＬ２遺伝子のＣｐＧアイランドを示す模式図である。バーはＣｐＧが存在する位置を表す。
【図２】ＥＳＤ前後におけるメチル化頻度の変化を示す図である。（ａ）はアレイ上の全遺伝子を表し、（ｂ）はＥＳＤ後にメチル頻度が低下した遺伝子を表す。１〜６の数字は、患者を表す。
【図３】胃癌細胞におけるＢＡＲＨＬ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量及びメチル化頻度を表す図である。
【図４】脱メチル化剤が胃癌細胞のＢＡＲＨＬ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を表す図である。
【図５】胃炎及び胃腺腫の胃粘膜組織断片の染色結果を表す図である。
【図６】胃癌の胃粘膜組織断片の染色結果を表す図である。
【図７】ＥＳＤ前後におけるメチル化頻度の変化を示す図である。（ａ）ＭＩＮＴ２５遺伝子、（ｂ）ＢＡＲＨＬ２遺伝子、（ｃ）ＳＯＸ１７遺伝子。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（遺伝子及びＣｐＧアイランド）
ＢＡＲＨＬ２遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｍａｐ  Ｌｏｃｕｓ：１ｐ２２．２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００１．１０（９１１７７５７９．．９１１８２７９４））は、５２１６塩基対からなり、ＢａｒＨ−ｌｉｋｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ２タンパク質を発現する遺伝子であり、神経系の発生時に発現する神経軸索系の遺伝子である。ＢＡＲＨＬ２遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１３に示す。
【００１７】
ＳＯＸ１７遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｍａｐ  Ｌｏｃｕｓ：８ｑ１１．２３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００８．１０（５５３７０４９５．．５５３７３４５６））は、２９６２塩基対からなり、ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  １７遺伝子である。ＳＯＸ１７遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１４に示す。
【００１８】
ＭＩＮＴ２５（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ２５）遺伝子は、ＣＡＢＩＮ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｍａｐ  Ｌｏｃｕｓ：２２ｐ１１．２３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００００２２．１０（２４４０７７６５．．２４５７４５９６）の遺伝子断片である。ＭＩＮＴ２５遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１５に示す。
【００１９】
ＣｐＧアイランドとは、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の割合であるＧＣ含量が５０％以上であり、ＣｐＧ（ＣＧの配列）の割合がＧＣ含量から期待される量の６０％以上となる領域である。このＣｐＧアイランドのメチル化は、シトシンのピリミジン環の５位の炭素原子へのメチル基の付加反応である。このメチル化が起こることにより、遺伝子の発現が抑制されることになる。メチル化の頻度が高くなると、必要な遺伝子発現が得られなくなり、癌が発生する原因の一つとなることが知られている。
【００２０】
（胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価のための指標を得る方法）
本発明の一実施形態において、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価の指標とする。そのため、被験者から採取した検体における、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を測定する。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方と、ＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方とを、胃癌の検出又は胃癌発症のリスク評価の指標とする。そのため、被験者から採取した検体における、ＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を測定し、被験者から採取した検体における、ＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方の発現量及びシトシンメチル化頻度の少なくとも一方を測定する。
【００２２】
被験者は、ＳｔａｇｅＩ〜ＩＶの全ての胃癌患者に加えて、ＳｔａｇｅＩとは診断されない、悪性又は良性の判断がつかない腺腫等の患者も含む。さらに、健常者を被験者として、胃癌発症リスクを評価することが可能である。特に、早期胃癌検出としては、ＳｔａｇｅＩが好ましい。
【００２３】
検体とは、胃粘膜洗浄液、生検及び胃液等の胃由来の検体に限定されず、口腔拭い液、血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、腹水、尿及び糞便等も含む。検体は、取り扱いのし易さの観点等から、胃粘膜洗浄液、生検、胃液、血液又は糞便であることが好ましい。中でも、胃全体からの情報が含まれる点及び検体中のＤＮＡ鎖の切断が少ない点から、検体として胃粘膜洗浄液がより好ましい。
【００２４】
得られた検体から細胞成分を単離する方法として、胃粘膜洗浄液、胃液等の液体内混入成分の場合には遠心分離単離を行い、生検等の組織片の場合にはそのまま用いる。単離した細胞は必要に応じてＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を抽出する。いずれも当業者にとって周知の方法で行うことができ、市販されている各種キットを利用することができる。ＤＮＡの抽出方法としては、例えば、フェノール・クロロホルム抽出法が利用できる。ＲＮＡの抽出方法としては、例えば、ＡＧＰＣ法が利用できる。タンパク質の抽出方法としては、例えば、ＲＩＰＡバッファー等を用いた方法が利用できる。
【００２５】
遺伝子の発現量とは、転写産物すなわちｍＲＮＡの量でもよく、翻訳産物すなわちタンパク質の量でもよい。得られたＲＮＡは逆転写酵素によりｃＤＮＡの合成し、遺伝子発現量測定に用いる。遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチン等のハウスキーピング遺伝子の量で補正してもよい。ｍＲＮＡの定量方法として、例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を利用することができる。得られたタンパク質は、ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチン等のハウスキーピング遺伝子の蛋白量で補正してもよい。タンパク質の定量方法として、例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用することができる。
【００２６】
遺伝子のシトシンメチル化頻度を測定する方法としては、制限酵素を用いたサザンブロットによる方法、制限酵素を用いたＰＣＲによる方法、バイサルファイト反応とシークエンス解析による方法、バイサルファイトＰＣＲを用いたＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｍａｐｐｉｎｎｇによる方法及びリアルタイムＰＣＲを用いた方法等が挙げられる。シークエンス解析法は、リアルタイムＰＣＲやパイロシークエンス法等が用いられる。
【００２７】
ＢＡＲＨＬ２遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子及びＭＩＮＴ２５遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化頻度を測定する場合の代表的な例として、重亜硫酸塩（バイサルファイト）処理した後に、パイロシークエンス法で塩基配列を測定する方法を説明する。
【００２８】
検体から抽出したＤＮＡを、重亜硫酸ナトリウムを用いたバイサルファイト処理を行い、その後脱スルホン酸処理を行う。それにより、非メチル化Ｃはウラシル（Ｕ）に変換されるが、メチル化Ｃは変換されずにＣのままである。そのため、ＤＮＡ中の同じ場所でのＵとＣの割合を調べることで、メチル化頻度が測定できる。ＣｐＧアイランド内の任意の位置のＣｐＧのメチル化頻度を測定して構わないが、遺伝子転写開始点の上流もしくは下流２Ｋｂの範囲にあるＣｐＧのメチル化頻度を測定することが好ましい。このままのＤＮＡをシークエンス解析することもできる。
【００２９】
通常、特定部位のみを増幅できるプライマーを用いて、ＰＣＲ等で特定部位を増幅することでシークエンス解析が容易になる。ＤＮＡの増幅方法としては、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＣＲ法（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｎ）及びＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等を使用することができる。広く用いられていることから、ＰＣＲ法が好ましい。
【００３０】
図１にＢＡＲＨＬ２遺伝子を例に挙げて、具体的に説明する。フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して遺伝子を増幅し、プローブを使用して増幅産物の検出が可能である。
【００３１】
ＢＡＲＨＬ２遺伝子のシトシンメチル化の頻度を測定するためのプライマーセットとして、（ｉ）フォワードプライマーとして配列番号１の核酸配列を含み、４０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）リバースプライマーとして配列番号２の核酸配列を含み、４０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。かかるオリゴヌクレオチドの長さは、３５塩基以下であることが好ましく、３０塩基以下であることがより好ましく、２５塩基以下であることがさらに好ましい。フォワードプライマーの具体例として、配列番号４の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。リバースプライマーの具体例として、配列番号５の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
上記プライマーセットにより増幅された増幅産物を検出するためのプローブとして、配列番号３の核酸配列を含み、３０塩基以下の長さを有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。かかるオリゴヌクレオチドの長さは、２５塩基以下であることが好ましく、２０塩基以下であることがより好ましい。プローブの具体例として、配列番号６の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３３】
ＳＯＸ１７遺伝子のシトシンメチル化の頻度を測定するためのプライマーセットとして、配列番号７の核酸配列からなるオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー）及び配列番号８の核酸配列からなるオリゴヌクレオチド（リバースプライマー）の組み合わせが挙げられ、プローブとして、配列番号９の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３４】
ＭＩＮＴ２５遺伝子のシトシンメチル化の頻度を測定するためのプライマーセットとして、配列番号１０の核酸配列からなるオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー）及び配列番号１１の核酸配列からなるオリゴヌクレオチド（リバースプライマー）の組み合わせが挙げられ、プローブとして、配列番号１２の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００３６】
（実施例１）
オリンパス製内視鏡装置（ＥＶＩＳ  ＬＵＣＥＲＡシリーズ）を用いて、早期胃癌の罹患者に対して内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ：ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）及び内視鏡的粘膜剥離術（ＥＳＤ：ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を施し、早期胃癌を内視鏡的に治療した。治療の前後において、患者の胃粘膜洗浄液を回収して試料とした。
【００３７】
内視鏡観察前に、粘液溶解除去剤（プロナーゼ（登録商標）ＭＳ  ２万単位、重曹１ｇ及びガスコン（登録商標）ドロップ４ｍＬ（ジメチコン８０ｍｇ含有）に対し、常水１００ｍＬ以上）を投与した。内視鏡観察により、粘液溶解除去剤に溶けた粘液を内視鏡により吸引除去した。その後、生理食塩水（大塚製薬）により、胃粘膜を洗浄することで得られる胃粘膜洗浄液（国際公開第２００７／１３２８４４号に記載）を内視鏡ボトル（フォルテグロウメディカル（株）製、医療機器届出番号０９Ｂ１Ｘ００００４０００１３８）により採取した。この胃粘膜洗浄液を５０ｍＬ遠沈管に取り分け、遠心機により１５００Ｇ、１０分間遠心し、上清を除去後、胃粘膜洗浄液に含まれる胃粘膜細胞を得た。
【００３８】
この細胞を４．５ｍＬのＳＤＳ・ＥＤＴＡ・Ｔｒｉｓ溶液中に再懸濁した。これに、１０％ＳＤＳを０．５ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬのプロテナーゼＫ（タカラバイオ株式会社、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．９０３３）を５０ｍＬ加え、５５℃で１時間インキュベートした。フェノール（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  Ｂｕｆｆｅｒ−Ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５ｍＬ加え、転倒混和後、２７００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心分離し、上清を新しいチューブへ移した。この操作をさらに１〜２回繰り返し、溶媒を同量のクロロホルム（和光純薬工業株式会社）に変えてさらに１〜２回繰り返した。グリコーゲン５ｍＬ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｔ＃９５１０）及び１００％エタノール９ｍＬを加え、転倒混和後、４℃にて１２時間インキュベートした。その後、検体を２７００ｒｐｍで、４℃で１５分遠心分離して上清を捨て、ペレットを７０％エタノール１０ｍＬに懸濁後、２７００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心分離し、上清を捨て、精製水２００ｍＬに溶解し、ＤＮＡ分析試料を得た。
【００３９】
テストセット６症例を用い、同様に処理したＤＮＡ分析試料について、ＭＣＡＭ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＣｐＧ  Ｉｓｌａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）法により、早期胃がん診断に有効な候補遺伝子を選出した。その後、検証セット６４症例を用いて、候補遺伝子メチル化異常をＥＳＤ前後で比較した。
【００４０】
ＭＣＡＭ法は、メチル化シトシン感受性制限酵素による処理を行うことにより選択的にメチル化ＤＮＡ断片を遺伝子網羅的にサンプルＤＮＡから採取することが可能となる。その増幅したＤＮＡにマイクロアレイ技術を応用することにより、網羅的なメチル化を可能にしたものである（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ｏｃｔ；１７（１０）：１５２９−３６．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｓｅｐ  ４、ＣＳＨ  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２００８  Ｍａｒ  １；２００８：ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４９７４．  ｄｏｉ：  １０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４９７４．）。
【００４１】
その結果を図２に示す。図２は、ＥＳＤ前のメチル化の頻度をＥＳＤ後のメチル化の頻度で割った値を示している。赤色はＥＳＤ手術前にメチル化の頻度が高いことを示し、ＥＳＤ手術による胃癌切除後にメチル化の頻度が低下している遺伝子である。（ａ）はアレイ上の全遺伝子の結果を示し、（ｂ）はＥＳＤ後にメチル化の頻度が低下した遺伝子を選びだした結果を示している。ＢＡＲＨＬ２、ＳＯＸ１７、ＰＴＰＲＮ２、ＳＬＣ２Ａ９、ＰＡＣＡＰ、ＩＦＮＧＲ２、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＬＲＰＣ４、ＳＯＸ９、ｈａｓ−ｍｉｒ−３６５−１及びｈａｓ−ｎｉｒ−１９３ｂの部分で高い値を示していることから、ＥＳＤ手術により胃癌を除去することで、これらの遺伝子のメチル化の頻度が低下したことを示している。これらの遺伝子の中でも、ＢＡＲＨＬ２遺伝子は、ピロリ菌感染者及びピロリ菌非感染者の区別無く、メチル化の頻度が低下することが分かった。
【００４２】
（実施例２）
サンプルＤＮＡに対してバイサルファイト処理を行った後、ＢＡＲＨＬ２遺伝子プロモーター領域に存在するＣｐＧ配列の部分をターゲットしたビオチン化プライマーによりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いた電気泳動にて確認した後、パイロシークエンサーを用いてメチル化頻度解析を行った。様々な種類の胃癌細胞におけるＢＡＲＨＬ２遺伝子のメチル化頻度の測定を行い、またＢＡＲＨＬ２遺伝子のｍＲＮＡを用いて逆転写酵素によるｃＤＮＡを合成した後、ＲＮＡ量を測定し、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量で規格化した。胃癌細胞として、ＭＫＮ１、ＭＫＮ７、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＮＵＧＣ３及びＫａｔｏＩＩＩを用いた。結果を図３に示す。メチル化頻度が高い細胞（ＭＫＮ７及びＭＫＮ４５）では、ＢＡＲＨＬ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量が低いことが分かった。
【００４３】
メチル化頻度が高い細胞を、ＣＯ２インキュベーター内で培養し、ＤＮＡ脱メチル化剤である５−Ａｚａ−ｄＣ（５−ａｚａ―２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ；１ｍＭ又は５ｍＭ）を２４時間後、４８時間後及び７２時間後に添加し、９６時間後に細胞を回収しＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを合成した後、添加の有無によるＢＡＲＨＬ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量を調べた。結果を図４に示す。脱メチル化剤の添加により、ＢＡＲＨＬ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量が増加することが分かった。このことから、メチル化によってＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現が抑制されていることが分かった。
【００４４】
（実施例３）
胃炎、胃腺腫及び胃癌の胃粘膜組織断片を用いて、核染色及びＢＡＲＨＬ２抗体染色を行い比較した。ＤＡＰＩ染色（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ（ベーリンガーマンハイム  Ｃａｔ．  Ｎｏ．２３６−２７６）（青）、ＢＡＲＨＬ２抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  Ａｎｔｉ−ＢＡＲＨＬ２  ＡＶ３１９８１）染色（緑）、両者を重ね合わせた像（Ｍｅｒｇｅ）を図５及び図６示す。図５は胃炎及び胃腺腫の結果を、図６は胃癌の結果を示す。なお、図６では、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ）の結果もあわせて示した。図５から明らかなように、胃炎及び胃腺腫の胃粘膜組織断片では、ＢＡＲＨＬ２タンパク質が存在している。しかしながら、図６から明らかなように、胃癌の胃粘膜組織断片では、ＢＡＲＨＬ２タンパク質が少ないことが分かる。このことから、胃癌細胞では、ＢＡＲＨＬ２のメチル化の頻度が高くなり、それによってＢＡＲＨＬ２遺伝子の発現（転写及び翻訳）が抑制されていることが分かった。
【００４５】
（実施例４）
早期胃癌患者について、ＥＳＤ治療の前後における各遺伝子のメチル化頻度を測定した。ＤＮＡ分析試料をバイサルファイト処理し、ＭＩＮＴ２５遺伝子、ＢＲＡＨＬ２遺伝子又はＳＯＸ１７遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマーを用いＰＣＲ（ビオチン化）を行い、増幅ビオチン化断片をメチル化解析に用いた。パイロシークエンス法により、ＣＧ配列の部分に特異的な解析プログラムを組み、メチル化の頻度を測定した（キアゲン社、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ２４）。結果を図７に示す。（ａ）はＭＩＮＴ遺伝子、（ｂ）はＢＡＲＨＬ２遺伝子、（ｃ）はＳＯＸ１７遺伝子の結果を示す。すべての遺伝子について、胃癌切除後であるＥＳＤ手術後のメチル化の頻度が顕著に低下した。このことから、ＢＡＲＨＬ２遺伝子のメチル化の頻度を測定することで、胃癌のリスク検査が可能となると考えられる。さらに、ＢＡＲＨＬ２遺伝子のメチル化の頻度に加えて、ＳＯＸ１７遺伝子及び遺伝子ＭＩＮＴ２５遺伝子の少なくとも一方のメチル化の頻度を考慮することで、より精度の高い早期胃癌の検出及び胃癌発症のリスク評価に繋がると考えられる。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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