(57)【要約】【課題】農薬用含窒素化合物について低コスト且つ簡便な測定を実現する農薬用含窒素化合物検出剤およびその農薬用含窒素化合物検出剤を用いた農薬の測定方法を提供すること。【解決手段】検体から、溶剤を用いて抽出した抽出液中に、農薬用含窒素化合物が含まれている場合、抽出液に検出剤を混合すれば検出剤と農薬用含窒素化合物との間に水素結合が形成される。その結果、検出剤の電子密度が変化するので、検出剤の吸光度を測定することでこれを検出し、吸光度の変化の度合いから農薬用含窒素化合物を測定する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
他の分子と水素結合を形成することで電子密度が変化する化学構造であって、水素結合に関与するアニオン原子団と、そのアニオン原子団と共役する共役原子団とを有する化合物を備えており、
その化合物の前記アニオン原子団は、農薬用含窒素化合物の有する水素原子との間に水素結合を形成させるものであることを特徴とする農薬用含窒素化合物検出剤。
【請求項２】
前記アニオン原子団は、カルボン酸アニオンまたはリン酸アニオンであることを特徴とする請求項１に記載の農薬用含窒素化合物検出剤。
【請求項３】
前記共役原子団は、ベンゼン環を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の農薬用含窒素化合物検出剤。
【請求項４】
前記アニオン原子団はカルボン酸アニオンであり、
前記共役原子団は、末端のベンゼン環に発色団を含む原子団が結合した構成を有しており、
前記カルボン酸アニオンは、前記共役原子団の末端のベンゼン環において、発色団を含む原子団の結合位置に対してメタ位またはパラ位となるように配置されるものであることを特徴とする請求項３に記載の農薬用含窒素化合物検出剤。
【請求項５】
前記共役原子団は、アゾ基または置換基を有してもよいボロンジピロメテン基を備えることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の農薬用含窒素化合物検出剤。
【請求項６】
４８０ｎｍ〜６４５ｎｍに吸収波長を有することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の農薬用含窒素化合物検出剤。
【請求項７】
前記共役原子団は、電子供与性又は電子吸引性の官能基の少なくとも一方を備えていることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の農薬用含窒素化合物検出剤。
【請求項８】
検体から農薬を有機溶剤中へ移行させるサンプリング工程と、
そのサンプリング工程で使用される有機溶剤に、前記サンプリング工程の前または後において請求項１から７のいずれかに記載の農薬用含窒素化合物検出剤を添加する添加工程と、
その添加工程にて添加された前記農薬用含窒素化合物検出剤と有機溶剤中に含まれる農薬用含窒素化合物との間に水素結合が形成されることで変化する前記農薬用含窒素化合物検出剤の電子密度の変化を検出する検出工程とを備えており、
その検出工程により検出される前記農薬用含窒素化合物検出剤の電子密度変化に基づいて農薬用含窒素化合物を測定する農薬測定方法。
【請求項９】
前記農薬用含窒素化合物は、フェニル尿素化合物、フェニル尿素化合物の誘導体、ヘテロ環式尿素化合物、又はグアニジニウム基を含む化合物であることを特徴とする請求項８に記載の農薬測定方法。
【請求項１０】
前記農薬用含窒素化合物の尿素基中の２つの窒素原子は、それぞれ１つ以上水素原子と結合していることを特徴とする請求項９に記載の農薬測定方法。
【請求項１１】
前記検出工程は、吸光度または蛍光強度を検出することによって前記農薬検出剤の電子密度変化を測定するものであることを特徴とする請求項８から１０のいずれかに記載の農薬測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農薬として用いられる含窒素化合物を検出する農薬用含窒素化合物検出剤および本農薬用含窒素化合物検出剤を用いた農薬の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の食料生産において、農作物の病害虫を防止、または、その成長を促進するため、多くの農薬が開発されている。農薬は、人体に対して影響をあたえることも多いことから残留農薬の検査が行われている。
【０００３】
一般に、農作物や食品の残留農薬検査では、有機溶剤を用いて農作物等から農薬を抽出し、その抽出物を分析機器にて定性分析や定量分析することによって、農薬の有無や濃度測定を行っている。具体的には、農作物や食品中の残留農薬は、酢酸エチル、アセトニトリル等の有機溶媒を用いて抽出され、脱水処理等の前処理を行った後、液体クロマトグラフィー（以下、「ＬＣ」ということがある。）やガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」ということがある。）、ミセル動電クロマトグラフィー（以下、「ＭＥＫＣ」というこがある。）を含むキャピラリー電気泳動法等での分離操作によって分離され、質量分析計（以下、「ＭＳ」ということがある。）を用いて測定される。質量分析に代わる検出方法として、ＵＶ検出法、蛍光検出法が用いられる方法もある（非特許文献１〜５）。
【０００４】
また、このような分析装置を用いる分析方法とは別に、抗原抗体反応を用いたイムノアッセイ法によって農薬検出を行う方法が検討されている（非特許文献６）。更には、有機リン系農薬や、カーバメート系農薬に関しては、呈色反応による検出方法が開発され用いられている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−９７９２６
【特許文献２】特開２００７−６８５３１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cahill, M.G., Caprioli, G.,Stack, M., Vittori, S., James, K. J. : Anal. Bioanal. Chem., 2011,400, 587-594.
【非特許文献２】Crespo-Corral, E.,Santos-Delgado, M.J., Polo-Diez, L.M., Soria, A.C.: J Chromatogr A, 2008,1209, 22-28.
【非特許文献３】Wang, Y., Xiao, L., Cheng, M.: JChromatogr A, 2011, 1218, 9115-9119.
【非特許文献４】Mou, R. X., Chen, M. X., Zhi, J. L.:J Chromatogr B, 2008, 875, 437-443.
【非特許文献５】Moliner-Martinez, Y., Molins-Legua,C., Verdu-Andres, J., Herraez-Hernandez, R., Campins-Falco, P.: J ChromatogrA, 2011, 1218, 6256-6262.
【非特許文献６】Yuan, M., Liu, B., Liu, E.,Sheng, W., Zhang, Y., Crossan, A., Kennedy, I., Wang, S.: Anal Chem, 2011,83, 4767-4774.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した測定技術のうち、ＬＣ、ＧＣ、キャピラリ−電気泳動を用いて分離し、質量分析等で測定する手法は、装置価格やメンテナンス費用が高額であるといった問題点があった。また、かかる分析装置は、一般に大型で設置スペ−スを確保する必要がある上、その取り扱いに高度で専門的な知識が要求されるという問題点があった。また、イムノアッセイ法は、用いられる試薬の製造コストが高額である、酵素が反応し発色するまでに数十分程度の時間がかかる、適正に管理された温度条件下で測定できない場合測定結果の信頼性が低下するという問題点があった。
【０００８】
更に、特許文献１、２に示される技術は、呈色反応によって簡便に農薬を検出できるものであるが、有機リン系農薬や、カ−バメ−ト系農薬を検出するものであり、フェニルウレア系などの含窒素化合物の農薬を対象とすることはできないという問題点があった。
【０００９】
本発明は、以上のような問題点を解決するためになされたものであり、農薬用含窒素化合物について低コスト且つ簡便な測定を実現する農薬用含窒素化合物検出剤およびその農薬用含窒素化合物検出剤を用いた農薬の測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的を達成するために、農薬用含窒素化合物検出剤に係る請求項１に記載の発明は、他の分子と水素結合を形成することで電子密度が変化する化学構造であって、水素結合に関与するアニオン原子団と、そのアニオン原子団と共役する共役原子団とを有する化合物を備えており、その化合物の前記アニオン原子団は、農薬用含窒素化合物の有する水素原子との間に水素結合を形成させるものである。
【００１１】
農薬用含窒素化合物検出剤に係る請求項２に記載の発明は、前記化合物のアニオン原子団が、カルボン酸アニオンまたはリン酸アニオンであることを特徴とするものである。また、請求項３に記載の発明は、前記共役原子団が、ベンゼン環を備えることを特徴とするものである。また、請求項４に記載の発明は、前記アニオン原子団はカルボン酸アニオンであり、前記共役原子団は、末端のベンゼン環に発色団を含む原子団が結合した構成を有しており、前記カルボン酸アニオンは、前記共役原子団の末端のベンゼン環において、発色団を含む原子団の結合位置に対してメタ位またはパラ位となるように配置されるものであることを特徴とするものである。更に、請求項５に記載の発明は、前記共役原子団がアゾ基または置換基を有してもよいボロンジピロメテン基を備えることを特徴とするものである。なお、請求項５記載の発明において請求項４に従属する発明にあっては、アゾ基または置換基を有してもよいボロンジピロメテン基が発色団として備えられていてもよい。また、請求項６に記載の発明は、４８０ｎｍ〜６４５ｎｍに吸収波長を有することを特徴とするものである。更に、請求項７に記載の発明は、前記共役原子団が、電子供与性又は電子吸引性の官能基を少なくとも一方を備えていることを特徴とするものである。
【００１２】
他方、農薬の測定方法に係る請求項８に記載の発明は、検体から農薬を有機溶剤中へ移行させるサンプリング工程と、そのサンプリング工程で使用される有機溶剤に、前記サンプリング工程の前または後において請求項１から７のいずれかに記載の農薬用含窒素化合物検出剤を添加する添加工程と、その添加工程にて添加された前記農薬用含窒素化合物検出剤と有機溶剤中に含まれる農薬用含窒素化合物との間に水素結合が形成されることで変化する前記農薬用含窒素化合物検出剤の電子密度の変化を検出する検出工程とを備えており、その検出工程により検出される前記農薬用含窒素化合物検出剤の電子密度変化に基づいて農薬用含窒素化合物を測定するものである。
【００１３】
請求項９に記載の農薬測定方法に係る発明は、前記農薬用含窒素化合物が、フェニル尿素化合物、フェニル尿素化合物の誘導体、ヘテロ環式尿素化合物、又はグアニジニウム基を含む化合物であることを特徴とするものである。また、請求項１０に記載の農薬測定方法に係る発明は、前記農薬用含窒素化合物の尿素基中の２つの窒素原子が、それぞれ１つ以上水素原子と結合していることを特徴とするものである。さらに、請求項１１に記載の農薬測定方法に係る発明は、前記検出工程が、吸光度または蛍光強度を検出することによって前記農薬検出剤の電子密度変化を測定するものであることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１に記載の農薬用含窒素化合物検出剤に係る発明によれば、検査対象物に農薬用含窒素化合物が含まれている場合、当該検査対象物から採取した農薬成分に当該検出剤を添加することにより、前記化合物のアニオン原子団が農薬用含窒素化合物の水素原子との間で水素結合することとなる。これによって化合物の電子密度が変化することから、当該検出剤の添加前と添加後の電子密度を測定することにより、電子密度の変化の有無を判断することができ、その変化の有無によって農薬用含窒素化合物を簡便に検出することができる。また、本発明によれば、電子密度の変化によって農薬用含窒素化合物を検出することができることから、低コストによる当該農薬用含窒素化合物の検出を実現する検出剤を提供することができる。
【００１５】
また、請求項２に記載の発明によれば、請求項１に記載の発明の効果に加え、農薬用含窒素化合物との間で容易に水素結合させることができ、当該水素結合による電子密度の変化を明確に生じさせることができる。
【００１６】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１又は２に記載の発明の効果に加え、汎用性のある化合物を利用することができ、安価に入手することができる。つまり、本検出剤を汎用性のある化合物を利用して安価に提供することができる。
【００１７】
請求項４に記載の発明によれば、請求項３に記載の発明の効果に加え、本検出剤を形成する化合物の共役原子団の末端のベンゼン環にアニオン原子団を配置することができ、更にその配置はメタ位またはパラ位であるので、農薬用含窒素化合物がアニオン原子団に近接（アニオン原子団と水素結合を形成）する際、検出剤の分子構造に起因する立体障害の影響を抑制できる。故に、農薬用含窒素化合物とアニオン原子団との接触を容易化して安定に水素結合が形成されることを促進でき、結果として、より低濃度側における農薬用含窒素化合物の検出を行うことができる。
【００１８】
請求項５に記載の発明によれば、請求項１から４のいずれかに記載の発明の効果に加え、共役原子団の連鎖長を任意な長さとすることができ、電子密度の変化が最も良好に検出できるように調整することが可能となる。
【００１９】
請求項６に記載の発明によれば、請求項１から５のいずれかに記載の発明の効果に加え、本検出剤は４８０ｎｍ〜６４５ｎｍに吸収波長を有するので、電子密度変化によって、かかる波長範囲での吸光度を変化させることができる。例えば、検査対象とする食品類の多くにはクロロフィルが含有されているが、４８０ｎｍ〜６４５ｎｍは、その吸光度が比較的低い波長範囲である。本検出剤を用いれば、かかる波長範囲において吸光度変化を指標とすることができるので、クロロフィルの存在下でもその影響によって本検出剤の電子密度変化の検出が困難となることを回避でき、目的とする農薬用含窒素化合物を良好に検出することができる。
【００２０】
請求項７に記載の発明によれば、請求項１から６のいずれかに記載の発明の効果に加え、当該検出剤の電子密度の変化を顕著な状態とすることができ、農薬用含窒素化合物との間で水素結合されたか否かを検出し易くなるものである。
【００２１】
他方、農薬測定方法に係る請求項８から１１のいずれかに記載の発明によれば、上記検出剤を用いて、電子密度の変化を検出することによるものであることから、請求項１から７のいずれかに記載の発明と同様の効果を有するとともに、低コストで簡便に農薬用含窒素化合物を測定することのできる農薬の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施形態の農薬用含窒素化合物検出剤を示しており、図１（ａ）は、アゾ基を発色団に備えた第１の実施形態の農薬用含窒素化合物検出剤が水素結合を形成することで検出剤中の電子密度が変化する概要を説明する図であり、図１（ｂ）は、第２の実施形態の農薬用含窒素化合物検出剤の一例を示した図である。
【図２】本発明の１実施形態の農薬測定方法の概要を示す図である。
【図３】各実施例において測定対象物質とした農薬用含窒素化合物の化学構造を示す図である。
【図４】実施例１の検出剤Ａによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物Ｉ）の測定結果を示した図である。
【図５】実施例２の検出剤Ｂによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物Ｉ）の測定結果を示した図である。
【図６】実施例３の検出剤Ａによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物ＩＩ）の測定結果を示した図である。
【図７】実施例３の検出剤Ｂによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物ＩＩ）の測定結果を示した図である。
【図８】実施例３の検出剤Ａによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物ＩＩＩ）の測定結果を示した図である。
【図９】実施例３の検出剤Ｂによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物ＩＩＩ）の測定結果を示した図である。
【図１０】実施例３の検出剤Ａによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物ＩＶ）の測定結果を示した図である。
【図１１】実施例３の検出剤Ｂによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物ＩＶ）の測定結果を示した図である。
【図１２】実施例４の検出剤Ｃによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物Ｉ）の測定結果を示した図である。
【図１３】実施例５の検出剤Ｃによる農薬用含窒素化合物（尿素化合物Ｉ）の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面を参照し、本発明について詳細に説明する。本発明の農薬用含窒素化合物検出剤は、農薬として用いられる農薬用含窒素化合物を検出するための検出剤である。
【００２４】
ここで、検出剤とは、測定対象である化合物やイオンを測定（検出）するために用いられる材料であって、測定対象物質と相互作用する化合物を含むものをいう。本実施形態の検出剤が測定対象物質に対して及ぼす相互作用は、水素結合である。即ち、本検出剤は、測定対象物質である農薬用含窒素化合物との間で水素結合を形成するように設計されており、この水素結合が形成された場合の電子密度変化（光学特性変化）を指標として農薬用含窒素化合物検出剤を検出するものとなっている。
【００２５】
本検出剤は、測定対象物質と相互作用する化合物のみで構成されていても良く、化合物以外の添加剤を含んで構成されても良い。添加物としては例えば、剤形を液状とするための溶剤や、粘度調整のための増粘剤、化合物の溶剤中への分散性を向上させる界面活性剤、固形の剤形に成形するための結着剤や、紫外線吸収剤、安定剤などが例示される。
【００２６】
また、検出剤に含まれる化合物は１の種類であっても良く、複数種類であっても良い。尚、説明を簡単にするために、本実施形態の検出剤は、測定対象物質と相互作用する化合物のみで形成されるものとして、以下の説明を行なう。
【００２７】
本検出剤は、他の分子（測定対象物質、即ち農薬用含窒素化合物）と水素結合を形成することで電子密度が変化する化学構造を備えている。ここで、他の分子と水素結合を形成することで電子密度が変化する化学構造とは、他の分子との水素結合により検出剤中の電子が局在化すること、即ち局部的な電子密度の変化を意味しており、必ずしも検出剤全体の電子密度（平均値）が変化することを意味するものではない。
【００２８】
本検出剤は、測定対象物質である農薬用含窒素化合物と水素結合を形成するためのアニオン原子団を備えている。アニオン原子団は、測定対象物質と水素結合を形成する原子団であってアニオン性を有するものであれば特に制限されないが、例えば、カルボン酸アニオン、リン酸アニオンなどが例示でき、これらの群より選択される１種類以上を含むことができる。農薬用含窒素化合物に対する親和性や合成の容易さから、好ましくは、カルボン酸アニオンを選択できる。
【００２９】
このアニオン原子団は、農薬測定（農薬用含窒素化合物の測定）を行う段階でアニオン性であれば良く、本検出剤が溶剤等に混合された使用状態でアニオン性であれば足りる。例えば、カルボン酸アニオンであれば、カルボン酸やカルボン酸塩の構造であっても良い。また、当該アニオン原子団は、農薬用含窒素化合物と水素結合を形成できる程度に電気的に陰性であれば良く、必ずしも完全に電離したアニオンとなっている必要はない。
【００３０】
本検出剤は、上記アニオン原子団と共役する共役原子団を備える。共役原子団とは、化合物中に非局在化電子を持つ結合ｐ軌道系を有する分子構造を意味している。共役原子団では、パイ電子が常に移動しているため、電子は非局在化していると言われている。水素結合によって測定対象物質の農薬用含窒素化合物を結合するためには、アニオン原子団の電気陰性度は高い程良く、アニオン化していることが望ましい。一方、このアニオン化によって検出剤が構造的に不安定となると、副反応や分解反応が生じてしまう。本検出剤は、かかる共役原子団を備えることにより、アニオン化した場合の電子を非局在化でき、エネルギー的に安定として検出剤が分解や副反応を起こすことを抑制できる。
【００３１】
かかる共役原子団としては、その主骨格が、単結合と多重結合とが交互に連続する構造であって上記のアニオン原子団と連結して共役系を形成するものであれば特に制限されないが、例えば、フェニル基や、ナフチル基、アントラセン基などの縮合環化合物構造、ビフェニル基、トリフェニルメチル基などの芳香族多環化合物構造、フェニルアゾ基、ナフチルアゾ基などのアゾ基によってベンゼン環が結合された構造、アゾキシ基、アミド基、カルボニル基などの官能基でベンゼン環が結合された構造、アリル基、１，３−ブタジエニル基、１，３−ペンタジエニル基などの非環式化合物構造が例示できる。また、例示された化学構造中には、一つ以上のヘテロ原子を含んでもよい。具体的には、ヘテロアリール基や、更には、フラン環構造やイミダゾール環など、環上の窒素原子あるいは環のα位に位置するカルボニル基、イミノ基を有する構造体のように、交互の単結合および二重結合以外の構造であっても共役を維持するものが例示される。
【００３２】
上記した共役原子団の構造において、好ましくは、ベンゼン環を備える化学構造であり、より好ましくは、複数のベンゼン環を備える化学構造であり、さらに好ましくは、２つのベンゼン環がアゾ基で連結されたフェニルアゾ基の化学構造を備えるものである。共役原子団を脂肪族化合物のみで構成するよりも、ベンゼン環構造を備えた構成とするほうが、長波長域においてより大きいモル吸光係数を有するためより少量の検出剤消費で済み、複数のベンゼン環を有するとより一層長波長域において大きいモル吸光係数を有するため、より一層検出剤の消費が抑えられる。尚、当該ベンゼン環は、安定な共役状態を実現できる範囲において置換基を備えていても良い。
【００３３】
更に、アゾ基は、エチレン基と比べ、吸収波長を長波長側にシフトさせる作用を備える。従って、共役原子団の一部となるフェニル基やナフチル基などの芳香族化合物をアゾ基で連結させると、検出剤の吸収波長を、更に長波長側に出現させることができる。後述するように、検出剤の電子密度変化は吸光光度分析によって計測できるが、農薬測定時に一般的には検体から農薬を抽出するために有機溶剤が使用される。また、検出剤は溶液中で農薬用含窒素化合物と反応させる。農薬検出時に汎用的に溶剤として用いられるアセトンは、２８０ｎｍの吸収極大から３５０ｎｍまですそ野が広がる吸収特性を有しているため、アセトンを用いる場合には測定波長を３３０ｎｍより長波長とすることが求められる。ここで、フェニル基にエチレン基を導入して３３０ｎｍより長波長側に波長を有する化合物を設計しようとすれば、エチレン構造を二つ導入せねばならず、その合成が煩雑で高度となる。一方、アゾ基であれば、波長シフトが大きいため、構造中に一つ導入するだけで３３０ｎｍより長波長側に吸収帯を備える検出剤を実現できる。つまり、アゾ基の導入は、吸収波長のシフト、即ち、目標とする吸収波長帯を有する化合物の合成を容易とし、更に安定性に優れた化合物を得ることができる。
【００３４】
本検出剤は、共役原子団中に、アゾ基に代えて、下記一般式（１）に示すボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）基を備えていても良い。
【化１】
2014115278.tif 000003
（ただし、Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立して、ヘテロ原子を含んでいてもよい飽和または不飽和の炭化水素基またはフッ素であり、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、単結合と多重結合とが交互に連続して共役系を形成する原子団またはアルキル基若しくはアミノ基であり、（Ａ）は、アニオン原子団側の結合位置である。
【００３５】
上記一般式（１）において、Ｘ１、Ｘ２がヘテロ原子を含んでいてもよい飽和または不飽和の炭化水素基の場合は、炭素数１〜１２のアルキル基が好ましく、直鎖状のものがより好ましい。また、Ｒ１、Ｒ２が共役系を形成する分子構造である場合、共役原子団の鎖長を変更することができ、より長鎖長とすることにより検出剤の吸収波長を長波長側へシフトさせることができる。Ｒ１、Ｒ２がアルキル基の場合は、低級アルキル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。また、ボロンジピロメテン基は、（Ａ）の位置において、アニオン原子団に直接結合されても良く、共役原子団を形成する分子や原子を更に介してアニオン原子団に結合されても良い。
【００３６】
尚、ボロンジピロメテン基およびアゾ基は、発色団の一例である。発色団は、不飽和結合系に作用して共役系を延長したり、電荷の偏りを偏重させる原子団を意味しており、ボロンジピロメテン基およびアゾ基以外に、例えば、ナフトキノン基、アントラキノン基、シアニン基、インジゴ基、スクアリリウム基などが例示される。
【００３７】
例えば、電子密度変化を吸光度で検出する場合には、予め定めた特定の波長範囲において検出したいという要望がある。アゾ基やボロンジピロメテン基は、共役原子団の連鎖長変更を比較的容易に行うことができるビルディングブロックであるので、多様な構造体、即ちバリエーションのある一連の化合物の生成を容易に実現でき、使用者の所望する吸収特性を有するものを提供し得る。
【００３８】
更に、共役原子団の一方の末端はベンゼン環構造であることが好ましく、アニオン原子団は、このベンゼン環構造に結合する（置換する）よう構成されることが好ましい。また、アニオン原子団は、末端のベンゼン環に連続する共役原子団に対し、末端ベンゼン環においてメタ位またはパラ位になるよう配置されることが望ましく、更にパラ位に配置されることがより望ましい。農薬用含窒素化合物が近接した際における立体障害の影響を低減できるからである。尚、かかる立体障害の影響を抑制可能な構造であれば、アニオン原子団は、共役原子団の末端ベンゼン環において、（末端ベンゼン環に連続する共役原子団に対し）オルト位に配置されていてもよい。
【００３９】
本検出剤の共役原子団は、上記した主骨格構造に、一つ以上の官能基を備えていてもよい。かかる官能基としては、例えば、電子供与性官能基または電子吸引性官能基であり、これらの少なくとも一方を備えていてもよい。
【００４０】
かかる電子供与性官能基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基が例示でき、電子吸引性官能基としては、ニトロ基、シアノ基、フルオロ基、クロロ基、トリフルオロメチル基、スルホニル基が例示できる。好ましくは、共役原子団は、一つの電子供与性官能基を有する化学構造であり、より好ましくは、一つのジメチルアミノ基を有する化学構造である。電子供与性官能基を備えると、電子供与性官能基から電子が押し出され、アニオン原子団に電子が局在化するため、水素結合の強度が向上する。その結果、電子移動の制限も大きくなり、吸光度の変化が大きくなる。
【００４１】
共役原子団構造中の官能基の位置は特に制限されないが、電子吸引性官能基の場合には、アニオン原子団に対して遠方となる位置に配置されていることが望ましく、電子供与性官能基の場合には、アニオン原子団に対して近接する位置に配置されることが望ましい。
【００４２】
また、本検出剤は蛍光物質であってもよい。かかる場合に、上記の電子供与性官能基または電子吸引性官能基の官能基以外に、本検出剤は蛍光分子を備えていても良い。
【００４３】
尚、本検出剤は、かかる共役原子団によって、分子構造の一部分に電子の局在化が起こるものであっても良く、分子構造全体に電子の非局在化が生じるものであっても良い。故に、本検出剤は、アニオン原子団と共役原子団とのみを備えた構造に限定されるものではなく、それ以外の原子団を備えていても良い。好ましくは、上記アニオン原子団に起因する電子を分子構造のなるだけ広い領域に非局在化させるものであり、より好ましくは検出剤の分子構造全体において電子を非局在化させるものである。
【００４４】
かかる検出剤の好適な例としては、例えば、４−カルボキシルアゾベンゼン、４−カルボキシル−４’−ジメチルアミノアゾベンゼン、４−カルボキシル−４’−ジエチルアミノアゾベンゼンのアニオン、４−カルボキシル−４’−ニトロアゾベンゼン例示でき、好ましくは、４−カルボキシル−４’−ジメチルアミノアゾベンゼンを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
更には、4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-8-(carboxyphenyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceneが検出剤の好適な例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本検出剤は、上記したようにアニオン原子団にて測定対象物質である農薬用含窒素化合物の有する水素原子との間に水素結合を形成する。ここで農薬とは、例えば、農業の効率化や農作物の保存に使用される薬剤殺菌剤、殺虫剤、除草剤、殺鼠剤、植物成長調整剤をいう。含窒素化合物とは、例えば、アンモニア、硝酸などの無機化合物、アミノ基を有する化合物、尿素基を有する化合物、グアニジニウム基を有する化合物、ニトロ化合物、窒素原子を有する複素環式化合物などの有機化合物をいう。
【００４７】
また、本検出剤が測定対象とする農薬用含窒素化合物とは、含窒素化合物の中で農薬用途として用いられているもので有り、例えば、１−（２−クロロ−４−ピリジル）−３−フェニル尿素、１−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（４−メチルフェニル）尿素、１−（２−メチルシクロヘキシル）−３−フェニル尿素（ダイムロン）、１−（２−クロロベンジル）−３−（１−メチル−１−フェニルエチル）尿素、３−ｔｒｅｔ−ブチル−１−（４−フェノキシ−２，６−ジイソプロピルフェニル）尿素、３−（３，４−ジクロロフェニル）−１−メトキシ−１−メチル尿素、１−（４−クロロベンジル）−１−シクロペンチル−３−フェニル尿素、３−（３，４−ジクロロフェニル）−１，１−ジメチル尿素、３−（５−ｔｒｅｔ−ブチルイソオキサゾ−ル−３−イル）−１，１−ジメチル尿素、１−（５−ｔｒｅｔ−ブチル−１，３，４−チアジアゾ−ル−２−イル）−１，３−ジメチル尿素、１−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−メチル−３−フェニル尿素、１−（４−クロロフェニル）−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−［３，５−ジクロロ−４−（３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−ピリジニルオキシ）フェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−［４−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−２−フルオロフェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−［３，５−ジクロロ−４−（１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ）フェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−［２，５−ジクロロ−４−（１，１，２，３，３，３−ヘキサフルオロプロポキシ）フェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−（３，５−ジクロロ−２，４−ジフルオロフェニル）−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−（２−シアノ−２−メトキシイミノアセチル）−３−エチル尿素、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−［［（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）カルバモイル］スルファモイル］ニコチンアミド、１−（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）−３−［２−メチル−４−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾ−ル−５−イル）−２Ｈ−ピラゾ−ル−３−イルスルホニル］尿素、１−（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）−３−［［３−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］スルホニル］尿素、Ｎ−（２−クロロイミダゾ［１，２−a］ピリジン−３−イルスルホニル）−Ｎ'−（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）尿素、２−［［［［［（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］メチル］安息香酸、２−［［［［［（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］メチル］安息香酸メチル、シモキサニル（１−（２−シアノ−２−メトキシイミノアセチル）−３−エチル尿素）、3,3'-(o-フェニレン)ビス[1-(メトキシカルボニル)チオ尿素]、 1-(2-クロロチアゾール-5-イル)メチル-3-メチル-2-ニトログアニジン、1-(テトラヒドロフラン-3-イルメチル)-2-ニトロ-3-メチルグアニジン、1,1’-イミニオジ（オクタメチレン）ジグアニジニウム塩や、かかる化合物の誘導体の群か���選択される一つ以上の化合物が例示できるが、これらに限られるものでない。また、農薬用含窒素化合物は、農薬用途のみに用いられる化合物を示すものではなく、当該化合物の１の用途が農薬用途であるものを含む。
【００４８】
尚、1,1’-イミニオジ（オクタメチレン）ジグアニジニウム塩は、カチオン化したグアニジニウム基に対イオンが結合して塩を形成しているものであり、対イオンは、特に限定されるものではないが、該対イオンとして、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸アニオンなどが例示される。
【００４９】
次に、本発明の好ましい実施の形態について添付図面を参照して説明する。なお、本発明は本実施形態に示す例に限られないことはいうまでもない。図１は、本発明の実施形態の農薬用含窒素化合物検出剤を示した図である。図１（ａ）は、アゾ基を発色団に備えた第１の実施形態の農薬用含窒素化合物検出剤が水素結合を形成することで検出剤中の電子密度が変化する概要を説明する図である。
【００５０】
この図１（ａ）を参照し、本発明の一実施形態の検出剤を用いて、農薬用含窒素化合物を検出する作用機構について説明する。一般に、水素結合では、水素と、電気陰性度の大きな原子又は原子団が静電的な引力による相互作用を形成している。このため本検出剤と測定対象物質とに水素結合が形成されると、静電的引力の相互作用により電子移動が制限され、電子が局在化し、検出剤中の電子密度が変化する。
【００５１】
図１（ａ）に示した検出剤は、分子構造の末端にアニオン原子団としてのカルボン酸（カルボン酸アニオン（ＣＯＯ−））を備えている４−カルボキシルアゾベンゼンである。カルボキシル基は共役原子団であるフェニルアゾ基に連結されており、カルボン酸アニオンの電子は、フェニルアゾ基の作用によって分子内で非局在化している。ここに、農薬用含窒素化合物（図１（ａ）においてはホルクロルフェニュロン）が共存すると、検出剤のカルボキシル基と、農薬用含窒素化合物の尿素基の水素原子とに水素結合が形成される。これにより、水素結合が形成されていない場合に比べて、検出剤の分子構造内においてカルボキシル基からの電子移動が阻害され、電子が局在化されることとなる。つまり、電子密度が変化する。この検出剤の電子状態の変化を検出すれば、水素結合が形成されたか否か、即ち、対象測定物質である農薬用含窒素化合物の存在を検出することができるのである。
【００５２】
図１（ｂ）は、第２の実施形態の農薬用含窒素化合物検出剤の一例であり、上述の一般式（１）に示すボロンジピロメテン基を有する農薬用含窒素化合物検出剤を示した図である。図１（ｂ）に示した検出剤は、上記一般式（１）において、Ｘ１、Ｘ２がフッ素であり、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれメチル基であり、（Ａ）の位置においてベンゼン環に結合している。また、かかるベンゼン環の（Ａ）の位置に対してパラ位にカルボキシ基が結合した構造を有している。
【００５３】
かかる図１（ｂ）に示した検出剤は、極大吸収波長は４９６ｎｍ付近となる。また、４８０ｎｍ近傍までは、比較的高い吸光度を有している（図１２参照）。尚、この図１（ｂ）に示した検出剤において、ボロンジピロメテン基のＲ１、Ｒ２を、メチル基に代えて下記一般式（２）の分子構造とすれば極大吸収波長は６４５ｎｍ付近となる。即ち、Ｒ１、Ｒ２の構造（分子鎖長）を変更することで吸収波長を調整できる。
【００５４】
例えば、野菜等の食物の多くにはクロロフィルが含まれており、農薬検出時の前処理において検体にクロロフィルが混入することが想定される。このクロロフィルは４００ｎｍ付近と６７０ｎｍ付近にピークを有する吸収スペクトルを備えている。しかし、上記したボロンジピロメテン基を有する本検出剤を用いれば、クロロフィルの吸収が比較的微弱である４８０ｎｍ〜６４５ｎｍの範囲において検出を行うことができるため、クロロフィルの存在下であっても、良好な検出感度で農薬用含窒素化合物の測定を行うことができる。
【化２】
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【００５５】
次に、上記の検出剤を用いた本発明の農薬の測定方法の一実施形態について、図２を参照して説明する。本実施形態では、検出剤を用いた農薬用含窒素化合物の測定方法（以下、「本方法」という。）について説明する。本方法は、本検出剤と、農薬用含窒素化合物とを水素結合させ、本検出剤中の電子密度の変化を、吸収スペクトルで検出することで、農薬用含窒素化合物を測定するものである。
【００５６】
具体的には、例えば、図２に記載の手順で測定できる。まず、検査対象物質の農産物や土壌（これが請求項記載の検体に該当する）を採取し（Ｓ１）、この検体に含まれる農薬成分を、有機溶剤を用いて抽出する（Ｓ２）（このＳ２の工程が請求項記載のサンプリング工程に該当する）。有機溶剤としてはアセトニトリルを使用し、当該溶剤中に検体を混入して攪拌することにより、農薬成分を溶剤中に移動させるのである。
【００５７】
このＳ２の工程において用いられる溶媒は、農薬用含窒素化合物の種類により異なり、上記したアセトニトリル以外に、例えば、アセトン、又は酢酸エチルを用いることができる。また、農薬を溶剤中に移行させる手法は、溶剤による検体の洗浄、ふき取りによって行っても良い。尚、請求項記載の「検体から農薬を有機溶剤中へ移行させるサンプリング工程」とは、検体から農薬の抽出や採取を行うための工程を意味するものである。つまり実際に検体に農薬が含まれているか否かによって何ら限定されるものではない。
【００５８】
他方、検出剤はカルボン酸化合物（アニオン原子団にカルボン酸アニオンを備えるもの）を用い、当該検出剤を溶剤に投入して検出剤溶液を調整する（Ｓ３）。
【００５９】
Ｓ３の工程において本検出剤を溶解させる溶媒は、検出剤の種類により異なるが、例えば、アセトニトリル、アセトン、又は酢酸エチルを用いることができる。
【００６０】
その後、調整した検出剤溶液に、アルカリ性化合物又はアルカリ性溶液を加える（Ｓ４）。これにより、検出剤のアニオン原子団のアニオン化が促進され、検出剤は溶液中でカルボン酸アニオンとなる。
【００６１】
Ｓ４の工程において本検出剤溶液に加えるアルカリ化合物は、有機溶剤中で本検出剤のアニオン化を促進するものであれば特に限定されないが、ｐＫａ値が７以上の物質が好適であり、ｐＫａ値が８以上の物質であれば更に好適である。かかる物質としては、モノアルキルアミン系物質や、ジアルキルアミン系物質、トリアルキルアミン系物質、４級アンモニウム塩類が例示でき、特に好適には４級アンモニウムヒドロキシル塩が用いられる。かかる４級アンモニウムヒドロキシル塩としては、例えば、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド、テトラプロピルアンモニウムヒドロキシド、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドが例示でき、特に好ましくは、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドが用いられる。
【００６２】
ここで検出剤とアルカリ化合物との比率は、検出剤およびアルカリ化合物の夫々の電荷数×モル数の値が、等しい値となることが好ましい。例えば、検出剤が１価のカルボン酸類であり、アルカリ性化合物も１価のものである場合、両者は当モルで混合することが好ましい。
【００６３】
尚、図示を省略しているが、Ｓ４の工程の後、Ｓ５の工程の前に、該検出剤溶液の吸収スペクトルを吸光光度計にて測定し、検体抽出液混合前の基準の吸収スペクトル（吸光度）を取得する基準値測定工程を備えている。測定される検出剤溶液の吸収スペクトルは、溶液中の検出剤の吸収スペクトルである。検出剤の吸収スペクトルは、その電子密度と相関しているので、検出剤の吸収スペクトル変化を検出することによって電子密度変化を検出することができるのである。
【００６４】
Ｓ２、Ｓ４の工程に続いて、Ｓ２の工程において得た検体抽出液の上澄みに、Ｓ４の工程で作製した検出剤溶液を加え混合する（これが請求項記載の添加工程に該当する）（Ｓ５）。尚、このＳ５の工程で調整された本検出剤と農薬用含窒素化合物との混合溶液を、以下、「混合溶液」ということがある。
【００６５】
そして、添加工程（Ｓ５）を経た後の混合溶液について吸光光度計で吸光度を測定する（Ｓ６）（このＳ６の工程が請求項記載の検出工程に該当する）。そして、Ｓ６の工程で得た吸収スペクトルと基準値測定工程で得た吸収スペクトルとを比較することにより、その変化の有無（即ち、混合溶液中の検出剤の電子密度変化の有無）によって農薬用含窒素化合物が検体に含まれているか否かを判定するのである。また、吸収スペクトルの変化の程度に応じて、検体に含まれる農薬用含窒素化合物の量を測定するのである。
【００６６】
本実施形態の検出工程（Ｓ６）においては、上記したように吸収スペクトルを測定することにより検出剤の電子密度変化を検出する。本方法によれば、ＬＣやＧＣ等での分離操作を不要とでき、検体をサンプリングした後、その抽出溶液を用いて直ちに測定を行うことができる。また、吸光光度計は、分光分析装置の中では比較的簡単に取り扱うことのできる装置であるため、化学分析に不慣れなオペレータであっても、本方法によって信頼性のある測定結果を導出することができる。
【００６７】
吸光光度計を用いた場合の測定条件は、測定対象の農薬用含窒素化合物や検出剤の種類や濃度により異なるが、１０℃から４０℃の温度、常圧下において行うことができる。混合溶液作成後から数時間は吸光度を安定して測定できる。
【００６８】
また、農薬用含窒素化合物の濃度に応じて吸光度も変化することから、その変化の程度を検出することにより当該農薬用含窒素化合物の濃度を測定することも可能である。なお、上記のように、農薬用含窒素化合物の添加の前後について吸光度を測定する場合のほかに、極大吸収波長における、混合溶液中の農薬用含窒素化合物濃度と吸光度との関係をプロットした検量線をあらかじめ作成し、同一の測定条件下で、測定対象の混合溶液を測定し比較することで、農薬用含窒素化合物濃度を測定できる。
【００６９】
尚、本実施形態においては、検出工程（Ｓ６）において吸光光度計を用いて吸収スペクトル（吸光度）を測定することにより、検出剤が農薬用含窒素化合物と水素結合することによって変化する検出剤の電子密度を測定したが、かかる検出剤の電子密度変化を検出できる手法であれば、吸収スペクトルの測定に限られるものではない。
【００７０】
例えば、検出剤を蛍光分子を備えたものとして設計し、該検出剤と農薬用含窒素化合物との間に水素結合が形成されることに起因して蛍光波長や蛍光強度に変化が生じる場合には、かかる蛍光を検出することによって農薬用含窒素化合物を検出してもよい。
【００７１】
本検出剤、農薬用含窒素化合物、Ｓ２の工程で作製された検体抽出液、Ｓ４の工程で調整された検出剤溶液、Ｓ５の工程で調整された混合溶液には、水素結合を生じる化合物が少量含まれていても良い。例えば、水の場合、混合溶液に対して２．０体積％以下含まれていてもよく、好ましくは、１．０体積％以下含んでもよく、より好ましくは、０．１体積％以下含んでもよい。検出剤が含まれる溶液に水が存在すると農薬用含窒素化合物との水素結合を阻害し、検出感度を低下させることが懸念されるが、本方法では、各工程で混入する程度の水分量であれば、測定結果に顕著な影響を与えないため、上記各工程は特別な脱水操作を要しない。
【００７２】
本方法において測定対象の農薬用含窒素化合物としては、１−（２−クロロ−４−ピリジル）−３−フェニル尿素、１−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（４−メチルフェニル）尿素、１−（２−メチルシクロヘキシル）−３−フェニル尿素（ダイムロン）、１−（２−クロロベンジル）−３−（１−メチル−１−フェニルエチル）尿素、３−ｔｒｅｔ−ブチル−１−（４−フェノキシ−２，６−ジイソプロピルフェニル）尿素、３−（３，４−ジクロロフェニル）−１−メトキシ−１−メチル尿素、１−（４−クロロベンジル）−１−シクロペンチル−３−フェニル尿素、３−（３，４−ジクロロフェニル）−１，１−ジメチル尿素、３−（５−ｔｒｅｔ−ブチルイソオキサゾ−ル−３−イル）−１，１−ジメチル尿素、１−（５−ｔｒｅｔ−ブチル−１，３，４−チアジアゾ−ル−２−イル）−１，３−ジメチル尿素、１−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−メチル−３−フェニル尿素、１−（４−クロロフェニル）−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−［３，５−ジクロロ−４−（３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−ピリジニルオキシ）フェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−［４−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−２−フルオロフェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−［３，５−ジクロロ−４−（１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ）フェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−［２，５−ジクロロ−４−（１，１，２，３，３，３−ヘキサフルオロプロポキシ）フェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−（３，５−ジクロロ−２，４−ジフルオロフェニル）−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素、１−（２−シアノ−２−メトキシイミノアセチル）−３−エチル尿、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−［［（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）カルバモイル］スルファモイル］ニコチンアミド、１−（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）−３−［２−メチル−４−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾ−ル−５−イル）−２Ｈ−ピラゾ−ル−３−イルスルホニル］尿素、１−（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）−３−［［３−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］スルホニル］尿素、Ｎ−（２−クロロイミダゾ［１，２−a］ピリジン−３−イルスルホニル）−Ｎ'−（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）尿素、２−［［［［［（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］メチル］安息香酸、２−［［［［［（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］メチル］安息香酸メチル、シモキサニル（１−（２−シアノ−２−メトキシイミノアセチル）−３−エチル尿素）、3,3'-(o-フェニレン)ビス[1-(メトキシカルボニル)チオ尿素]、1-(2-クロロチアゾール-5-イル)メチル-3-メチル-2-ニトログアニジン、1-(テトラヒドロフラン-3-イルメチル)-2-ニトロ-3-メチルグアニジン、1,1’-イミニオジ（オクタメチレン）ジグアニジニウム塩や、これらの誘導体を挙げることができる。特に、フェニル尿素化合物、又はフェニル尿素化合物の誘導体、又��ヘテロ環式尿素化合物、グアニジニウム基を有する化合物を好適に検出または測定することができ、さらには、尿素基中の２つの窒素原子は、それぞれ１つ以上水素原子と結合している化合物であれば一層好適に検出または測定することができる。
【００７３】
尚、1,1’-イミニオジ（オクタメチレン）ジグアニジニウム塩は、カチオン化したグアニジニウム基に対イオンが結合して塩を形成しているものであり、対イオンは、特に限定されるものではないが、該対イオンとして、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸アニオンなどが例示される。
【００７４】
フェニル尿素化合物とは、尿素分子中の２つの窒素原子に、それぞれ２ずつ結合した水素原子のうち、１つ以上がフェニル基に置換された化合物をいう。
【００７５】
ヘテロ環式尿素化合物とは、尿素分子中の２つの窒素原子に、それぞれ２ずつ結合した水素原子のうち、１つ以上がヘテロ環に置換された化合物をいう。
【実施例】
【００７６】
以下に、実施例を挙げてより詳細に説明する。なお、本発明がこれらの実施例に限定されるものではないことは、いうまでもない。
【００７７】
＜農薬用含窒素化合物＞
以下の実施例において検出または測定すべき農薬用含窒素化合物を図３に示す。図３において示している農薬用含窒素化合物は、ホルクロルフェニュロン（１−（２−クロロ−４−ピリジル）−３−フェニル尿素）、メチルダイムロン（１−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−メチル−３−フェニル尿素）、ヘキサフルムロン（１−［３，５−ジクロロ−４−（１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ）フェニル］−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）尿素）およびフラザスルフロン（１−（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）−３−［［３−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］スルホニル］尿素）であり、その化学構造は図示のとおりである。
【００７８】
[実施例１]
＜検出剤溶液の作製＞
１００ｍｌのメスフラスコ中に、４−カルボキシルアゾベンゼン（東京化成、型番製品コードＰ０１４３、1級、純度９８％以上）（以下「検出剤Ａ」ということがある。）１１．３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を電子天秤（島津製作所、ＡＸ−２００）で計量した。さらに、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドのメタノール溶液（東京化成、型番製品コードＴ１９４８T、濃度３７％）０．０４３ｍｌ（０．０５ｍｍｏｌ）と、純水(ミリポア社、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステムにて水道水より製造)１ｍｌをマイクロピペットで上記メスフラスコに加えた。さらに、パスツールピペットでアセトニトリル（ナカライテスク、製品コード００４３３−９５、スペクトル用、純度９９．８％）を総量１００ｍｌとなるように加え、メスフラスコ栓をして振り混ぜ５００μＭの検出剤Ａ溶液を作成した。
【００７９】
＜試料調製＞
実施例１では、上記農薬用含窒素化合物の中からホルクロルフェニュロンを選択し、前記検出剤Ａとの結合による電子密度の変化を吸光光度計により測定した。そこで、予め１００ｍｌのメスフラスコ中に、ホルクロルフェニュロン（東京化成、型番製品コードＣ０９２６、1級、純度９８％以上）（以下、「尿素化合物Ｉ」ということがある。）２４．８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を電子天秤（島津製作所、ＡＸ−２００）で計量し、さらにアセトニトリルをパスツールピペットで総量１００ｍｌになるよう加え、メスフラスコ栓をして振り混ぜ１００μＭの尿素化合物Ｉ溶液を作製した。
【００８０】
検出剤Ａ溶液４００μｌと、尿素化合物Ｉ溶液とを１０ｍｌメスフラスコ中に加え、さらにアセトニトリルをパスツールピペットで加えて総量１０ｍｌとし、メスフラスコに栓をして振り混ぜ、混合溶液を作製した（以下「混合溶液（Ａ−Ｉ）」ということがある。）。なお、混合溶液（Ａ−Ｉ）は、尿素化合物Ｉが予め定めた任意の濃度となるように尿素化合物Ｉ溶液の適正量を検出剤Ａ溶液４００μｌに加え、尿素化合物Ｉの濃度の異なる複数のサンプルを準備した。
【００８１】
＜吸光度測定＞
吸光光度計（日本分光、型番Ｖ−５５０）で、混合溶液（Ａ−Ｉ）の吸光度を測定（測定条件：温度２５℃、混合溶液作製後１０分から２時間）した。結果を図４に示す。なお、図４（ａ）は、尿素化合物Ｉの濃度を０μＭから１００．０μＭの範囲で増加したときの吸収スペクトルであり、縦軸は吸光度（図４（ａ）において「Absorbance」と表示）、横軸は波長（図４（ａ）において「Wavelength」と表示）となっている。図４（ｂ）は、図４（ａ）に示した吸収スペクトルの最も吸光度変化の大きい波長（327nm）について、吸光度と尿素化合物Ｉの濃度との関係を示した図であり、縦軸は吸光度（図４（b）において「Absorbance」と表示）、横軸は濃度(μＭ)であり、測定された吸光度が白抜きの丸印（○）にてプロットされている。尚、実施例１では、混合溶液における尿素化合物Ｉの濃度は、0μＭ、5μＭ、10μＭ、20μＭ、30μＭ、40μＭ、50μＭ、70μＭ、100μＭとした。
【００８２】
この図４（ａ）および図４（ｂ）に示されているように、本検出剤溶液のみの吸光度と、混合溶液の吸光度は、明らかに異なる状態となっている。これは、検出剤Ａの電子密度が変化していることによるものである。従って、本検出剤溶液のみにおける吸光度と、混合溶液の吸光度とを比較することにより、農薬用含窒素化合物の存否を確認することができる。
【００８３】
具体的には、尿素化合物Ｉを添加することにより、検出剤Ａの吸光度は変化し、図４（ａ）に示すように、添加する尿素化合物Ｉの濃度が増加すると特徴的なピークが実線矢印の方向に変化する。特に、本実施例では、尿素化合物Ｉの濃度が高濃度になると３２７ｎｍの吸光度が顕著に上昇すると共にそのスペクトルの頂点が低波長側にシフトしている。従って、吸光度の変化を測定することにより、検出剤Ａと尿素化合物Ｉとが結合し、電子密度が変化していることを認識することができる。
【００８４】
[実施例２]
実施例２は、実施例１で使用した検出剤Ａに代えて、４−カルボキシル−４’−ジメチルアミノアゾベンゼン（東京化成、製品コードＭ０４２３、一級、純度９７％以上）（以下、「検出剤Ｂ」ということがある。）を用い、実施例１と同様の手法により検出剤溶液の作製を行った。実施例１と同様の手法によって検出剤溶液と尿素化合物Ｉ溶液とを混合した混合溶液を作製し吸光度を測定した。測定結果を図５に示す。図５（ａ）は、実施例２の混合溶液の吸収スペクトルであり、縦軸は吸光度（図５（ａ）において「Absorbance」と表示）、横軸は波長（図５（ａ）において「Wavelength」と表示）となっている。図５（ｂ）は、図５（ａ）に示した吸収スペクトルの最も吸光度変化の大きい波長（420nm）について、吸光度と尿素化合物Ｉの濃度との関係を示した図であり、縦軸は吸光度（図５（ｂ）において「Absorbance」と表示）、横軸は濃度(μＭ)であり、測定された吸光度が白抜きの丸印（○）にてプロットされている。尚、実施例２においても混合溶液は尿素化合物Ｉの濃度の異なるものを複数準備したが、尿素化合物Ｉの濃度の種類は実施例１とは異なる。
【００８５】
図５に示す結果を図４と比較すると、吸光度の変化の度合は大きくなっている。また、図５（ｂ）において明らかなように、４２０ｎｍの吸収帯の吸光度が０から１５０μＭの濃度範囲において約０．３近傍から０．６付近まで直線的に変化している（図５（ｂ）中の実線参照）。このため、尿素化合物Ｉの濃度について、吸光度を用いて検量線を作成することができる。検出剤Ｂでは、電子供与性基であるジメチルアミノ基から電子が押し出され、カルボキシル基のアニオンに電子が局在化し、アニオン部分の電子密度が高くなる。その結果、農薬用含窒素化合物との水素結合が強くなり、ジメチルアミノ基が無い検出剤Ａに比べてより一層カルボキシル基からの電子移動が制限されると推定される。その結果、検出剤Ｂ中の電子密度の変化が、農薬用含窒素化合物との水素結合形成前後で大きくなり、吸光度の変化も大きくなっていると考えられる。このように検出剤中に電子供与性基を有することは、農薬用含窒素化合物の測定には有利であるといえる。
【００８６】
[実施例３]
実施例３では、前記検出剤Ａまたは検出剤Ｂを使用し、農薬用含窒素化合物にメチルダイムロン（以下、「尿素化合物ＩＩ」ということがある。）、ヘキサフルムロン（以下、「尿素化合物ＩＩＩ」ということがある。）、フラザスルフロン（以下、「尿素化合物ＩＶ」ということがある。）の三種類を用いて検出を行った。
【００８７】
検出剤Ａによる尿素化合物ＩＩの測定結果を図６に、検出剤Ｂによる尿素化合物ＩＩの測定結果を図７に示す。また、検出剤Ａによる尿素化合物ＩＩＩの測定結果を図８に、検出剤Ｂによる尿素化合物ＩＩＩの測定結果を図９に示す。さらに、検出剤Ａによる尿素化合物ＩＶの測定結果を図１０に、検出剤Ｂによる尿素化合物ＩＶの測定結果を図１１に示す。なお、いずれの混合溶液についても、測定すべき尿素化合物の濃度を変化させつつ測定しているが、その変化の程度は異なる条件としており、濃度以外の条件は同一である。
【００８８】
尚、図６（ａ）、図７（ａ）、図８（ａ）、図９（ａ）、図１０（ａ）、図１１（ａ）は、それぞれ対応する混合溶液の吸収スペクトルであり、縦軸は吸光度（図６〜図１１（ａ）のそれぞれにおいて「Absorbance」と表示）、横軸は波長（図６〜図１１（ａ）のそれぞれにおいて「Wavelength」と表示）となっている。また、前述の各図のそれぞれにおいて、尿素化合物の濃度増加に伴う特徴的なスペクトルピークの変化方向は実線矢印にて示されている。また、図６（ｂ）、図７（ｂ）、図８（ｂ）、図９（ｂ）、図１０（ｂ）、図１１（ｂ）は、それぞれ対応する吸収スペクトルの測定結果の最も吸光度変化の大きい波長（各図の縦軸にカッコ書きにて表示した波長）について、吸光度と添加した尿素化合物の濃度との関係を示した図であり、縦軸は吸光度（図６〜図１１（ｂ）のそれぞれにおいて「Absorbance」と表示）、横軸は濃度(μＭ)であり、測定された吸光度が白抜きの丸印（○）にてプロットされている。
【００８９】
上記の測定結果から明らかなとおり、いずれの検出剤についても尿素化合物が混合される前と後では、程度の差はあるものの吸光度は変化しており、その検出または測定が可能であることがわかる。また、検出剤Ａまたは検出剤Ｂにフラザスルフロン（尿素化合物ＩＶ）を混合した場合には、最も吸光度の高い値を示す波長がシフトしている。具体的には、図１０（ａ）では短波長側にシフトし、図１１（ａ）では長波長側にシフトしている。そこで、このような吸光度の極大値を示す波長を検出することによっても尿素化合物ＩＶの検出または測定を可能にするものである。
【００９０】
なお、図６、図７では、尿素化合物ＩＩの濃度０から４００μＭにおける濃度変化に対する吸光度の変化がおよそ０．１である。尿素基は２つの窒素分子を持ち、それぞれ２つの水素原子と結合しているが、尿素化合物ＩＩ分子中の尿素基の２つの水素原子中、一方の水素原子がメチル基に置換されているため、検出剤と尿素化合物ＩＩとの間での水素結合を阻害する方向に作用しやすいと考えられる。本測定方法は、尿素基中の２つの窒素原子がそれぞれ水素原子と結合している化合物のほうが、より有利であるといえる。
【００９１】
[実施例４] 
実施例４は、実施例１で使用した検出剤Ａに代えて、上記第２の実施形態において図１（ｂ）に示したボロンジピロメテン基を有する検出剤（以下、「検出剤Ｃ」ということがある。）を用いた。
【００９２】
＜検出剤Ｃの合成＞
検出剤Ｃは、三級アミン存在下でジピロメテン前駆体と三フッ化ホウ素エーテル錯体との反応によって調製される。具体的には、一般的な製法である下記反応式に従い、2,4ジメチルピロール（東京化成、型番製品コードD２８４８、純度９８％以上）0.46mlとp-ホルミル安息香酸（和光純薬、型番製品コード038-01322、特級、純度９８-１０２％）0.30gとを、1,4-ジオキサン（和光純薬、型番製品コード042-03766、特級、純度９９．５％以上）20mlに溶かし、この溶液にトリフルオロ酢酸（TFA）（和光純薬、型番製品コード204-02743、特級、純度９８％以上）を0.5ml加え窒素雰囲気下、室温で２４時間反応させ、縮合によりジピロメタンを生成させた。その後、酸化剤である2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン（DDQ）（東京化成、型番製品コードD１０７０、純度９７％以上）0.775gを加え90分室温で反応後三フッ化ホウ素エーテル錯体（東京化成、型番製品コードB0527、東京化成１級、純度９８％以上）3ml、トリエチルアミン（和光純薬、型番製品コード202-02646、特級、純度９９％以上）3mlをゆっくり加えた後、室温で24時間反応を行った。その後少量の水を加えて反応を停止し、酢酸エチル（和光純薬、型番製品コード056-00367、和光1級、純度９９％以上）100mlを加えてから、水道水で2回酢酸エチルを洗浄後無水硫酸ナトリウム（和光純薬、型番製品コード199-03344、特級、純度９９％以上）で乾燥させた。乾燥後シリカゲル（和光純薬、商品名 ワコーゲルC-300、型番製品コード230-00087）を固定相にカラムクロマトグラフィー（展開溶媒はヘキサン（和光純薬、型番製品コード080-00427、和光1級、純度９５％以上）：酢酸エチル＝1:1（体積比））にて精製を行い収率25％で目的化合物を得た。得られた目的化合物はNMR（ブルカー・バイオスピン株式会社製、AVANCE III 400）によって構造解析を行った。
【化３】
2014115278.tif 000005
【００９３】
尚、NMR測定は、得られた目的化合物1ｍｇを重水素化ジメチルスルホキシド（メルク社製、重水素化率99.8％以上）に溶解し、室温で行った。これにより表1に示す結果を得られ、得られた目的化合物が、検出剤Cであることを確認した。
【表１】
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【００９４】
＜検出剤溶液の作製＞
実施例１と同様に、１００ｍｌのメスフラスコ中に、得られた検出剤Ｃを18.4ｍｇ加え、さらに、上記のテトラブチルアンモニウムヒドロキシドのメタノール溶液０．０４３ｍｌ（０．０５ｍｍｏｌ）をマイクロピペットで加えた後、パスツールピペットでアセトニトリルを総量１００ｍｌとなるように加え、メスフラスコ栓をして振り混ぜ５００μＭの検出剤Ｃ溶液を作成した。
＜試料調製＞
実施例１と同様の手法によって検出剤Ｃ溶液と尿素化合物Ｉ溶液とを混合した混合溶液を作製した。混合溶液は、尿素化合物Ｉが予め定めた任意の濃度となるように尿素化合物Ｉ溶液の適正量を検出剤Ｃ溶液４００μｌに加え、尿素化合物Ｉの濃度の異なる複数のサンプルを準備した。尚、尿素化合物Ｉの濃度は、０〜３００μＭの範囲で複数の濃度（０μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ，２０μＭ，５０μＭ，７０μＭ，８０μＭ，１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ）とした。
＜吸光度測定＞
実施例１と同様に吸光度を測定した。測定結果を図１２に示す。図１２（ａ）は、実施例４の混合溶液の吸収スペクトルであり、縦軸は吸光度（図１２（ａ）において「Absorbance」と表示）、横軸は波長（図１２（ａ）において「Wavelength」と表示）、となっている。図１２（ｂ）は、図１２（ａ）に示した吸収スペクトルの最も吸光度変化の大きい波長（５０７ｎｍ）について、吸光度と尿素化合物Ｉの濃度との関係を示した図であり、縦軸は吸光度（図１２（ｂ）において「Absorbance」と表示）、横軸は濃度（μＭ）であり、測定された吸光度が白抜きの丸印（○）にてプロットされている。
【００９５】
図１２において明らかなように、５０７ｎｍの吸光度が０から２００μＭの濃度範囲において約０．２３近傍から０．２８まで増加する傾向を示しており、尿素化合物Ｉについて、検出剤Ｃを用いれば、吸光度変化を測定することによって尿素化合物Ｉ、即ち、農薬用含窒素化合物を検出できることが示された。
【００９６】
[実施例５]
実施例４と同様の手法によって検出剤Ｃ溶液と尿素化合物Ｉ溶液とを混合した混合溶液を複数作製したが、検出剤Ｃの濃度は０．５μＭ、尿素化合物Ｉ溶液の濃度は、０〜１μＭの範囲で複数の濃度（０μＭ、０．０２μＭ、０．０８μＭ、０．１μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．２５μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ）とした。
【００９７】
＜蛍光測定＞
分光蛍光光度計（日本分光株式会社製、ＦＰ７７０）で、混合溶液の蛍光特性を測定（測定条件：温度２５℃、混合溶液作製後１０分から２時間、励起光４９６ｎｍ）した。結果を図１３に示す。なお、図１３（ａ）は、尿素化合物Ｉの濃度を０μＭから１．０μＭの範囲で増加したときの蛍光スペクトルであり、縦軸は蛍光強度（図１３（ａ）において「Fluorescence Intensity」と表示）、横軸は波長（図１３（ａ）において「Wavelength」と表示）、となっている。図１３（ｂ）は、図１３（ａ）に示した蛍光スペクトルの最も蛍光強度変化の大きい５０７ｎｍでの測定結果について、蛍光強度と尿素化合物Ｉの濃度との関係を示した図であり、縦軸は蛍光強度（図１３（ｂ）において「Fluorescence Intensity」と表示）、横軸は濃度（μＭ）として、測定された蛍光強度が白抜きの丸印（○）にてプロットされている。更には、図１３（ｃ）として、尿素化合物Ｉの濃度０μＭから０．３μＭの蛍光測定結果は、グラフ中に拡大して示している。図１３（ｃ）のグラフも縦軸は蛍光強度であり、横軸は濃度（μＭ）である。
【００９８】
図１３からも解るように、本検出剤を用いた手法が、蛍光強度の変化によっても実現できることが示された。また、その場合において、０．０２μＭといった微量の農薬用含窒素化合物を感度良く検出できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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