(57)【要約】【課題】マイクロチャンバーの底面における細胞の接着力が強く、かつマイクロチャンバーの側面およびマイクロチャンバー外の面における細胞の接着力が弱いマイクロチャンバーチップを容易に製造することができるマイクロチャンバーチップの製造方法を提供すること。【解決手段】その表面における細胞の接着力が強い第１基板と、その表面における細胞の接着力が弱い第２基板とを準備する。第２基板には、１または２以上の貫通孔が形成されている。第１基板および第２基板を積層し、固定して、マイクロチャンバーチップを作製する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を収容するためのマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーチップの製造方法であって、
第１基板と、１または２以上の貫通孔を形成された第２基板とを準備する工程と、
前記第１基板および前記第２基板を積層し、固定する工程と、を有し、
前記第１基板の前記第２基板と対向する面における細胞の接着力は、前記第２基板の前記第１基板と対向しない面および前記貫通孔の内面における細胞の接着力よりも強い、
マイクロチャンバーチップの製造方法。
【請求項２】
前記貫通孔の最大径は、２０〜１５０μｍの範囲内であり、
前記第２基板の厚みは、２０〜１００μｍの範囲内である、
請求項１に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
【請求項３】
前記第１基板の前記第２基板と対向する面における細胞の接着力は、０.０１ｎＮ超であり、
前記第２基板の前記第１基板と対向しない面および前記貫通孔の内面における細胞の接着力は、０.０１ｎＮ以下である、
請求項１または請求項２に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
【請求項４】
前記第１基板の前記第２基板と対向する面における細胞の接着力は、０.１ｎＮ以上であり、
前記第２基板の前記第１基板と対向しない面および前記貫通孔の内面における細胞の接着力は、０.００１ｎＮ以下である、
請求項３に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
【請求項５】
前記第１基板および前記第２基板は、互いに異なる素材からなる樹脂基板である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
【請求項６】
前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、積層される前に、細胞の接着力を調整するための表面処理がなされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
【請求項７】
前記第１基板および前記第２基板は、熱溶着、超音波溶着または接着剤により固定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャンバーチップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、各種幹細胞など（以下「希少細胞」ともいう）は、病態に応じて血液中に極めて稀に存在する。このような希少細胞の検出は、臨床的に有用であることは明らかであるが、極めて難しい。近年、様々な細胞分離手法を応用して希少細胞の検出が試みられており、様々な検出装置が製品化されている。たとえば、血液などの検体中に対象の希少細胞が存在するかどうかを検査する場合に、検体に由来する細胞懸濁液を平面状に展開した後、展開された全細胞を解析することが提案されている。
【０００３】
たとえば、特許文献１には、複数の微細な凹部（試料保持部）を有するマイクロデバイスが開示されている。特許文献１に記載のマイクロデバイスは、熱可塑性樹脂を射出成型することにより製造される。このため、凹部外の表面性状は、凹部内の表面性状と同じである。各凹部に試料を保持させた後、各凹部内の試料に励起光を照射して試料からの蛍光を検出することで、特許文献１に記載のマイクロデバイスを用いて試料を分析することができる。
【０００４】
特許文献１に記載のマイクロデバイスを用いて希少細胞を検出する場合、各凹部に細胞を保持させる方法としては、各凹部に個別に細胞懸濁液を提供することが考えられる。しかしながら、この方法では、各凹部に細胞懸濁液を提供するのに大幅な時間がかかり、効率的に分析を行うことができない。そこで、別の方法としては、マイクロデバイスの凹部が形成されている面上に細胞懸濁液を広く提供することが考えられる。しかしながら、この方法では、凹部外の領域にも細胞が付着してしまうため、一部の細胞についてしか分析を行うことができない。
【０００５】
このような凹部外の領域への細胞の付着を防止する手段としては、凹部外の領域に表面処理を行うことが提案されている。たとえば、特許文献２には、基板の表面に細胞の非特異的な付着を防止するための処理（例えば、エチレンジアミン処理）を行った後、基板に微細な凹部を複数形成して、プレバイオチップを製造することが開示されている。微細な凹部は、収束イオンビームを用いて形成されている。このように凹部外の領域に表面処理を行うことで、凹部外への細胞の付着を低減できると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−２１２０４８号公報
【特許文献２】特開２００５−２１４８８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、特許文献１に記載のマイクロデバイスの一方の面上に細胞懸濁液を広く提供すると、凹部外にも多数の細胞が付着してしまう。このため、特許文献１に記載のマイクロデバイスを用いて希少細胞を検出しようとした場合、検体に含まれる希少細胞が失われてしまう可能性がある。
【０００８】
一方、特許文献２に記載のプレバイオチップでは、凹部外の領域を表面処理している。このため、凹部外に細胞が付着する可能性は、特許文献１に記載のマイクロデバイスよりも低いと考えられる。しかしながら、特許文献２に記載のプレバイオチップでは、表面処理をした後に凹部を形成するため、凹部の形成時に、特に凹部周辺で表面処理の効果が損なわれてしまう可能性がある。したがって、特許文献２に記載のプレバイオチップを用いて希少細胞を検出しようとした場合も、検体に含まれる希少細胞が失われてしまう可能性がある。
【０００９】
また、特許文献２に記載のプレバイオチップには、凹部の側面が表面処理されていないため、凹部の側面に細胞が付着してしまうという問題もある。このように凹部の側面に細胞が付着してしまうと、一部の細胞が他の細胞の陰に隠れてしまうため、検体に含まれる希少細胞を検出できない可能性がある。
【００１０】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、マイクロチャンバー（凹部）の底面に対する細胞の接着力が強く、かつマイクロチャンバーの側面およびマイクロチャンバー外の面に対する細胞の接着力が弱いマイクロチャンバーチップを容易に製造することができるマイクロチャンバーチップの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、その表面に対する細胞の接着力が互いに異なる２枚の基板を組み合わせて使用することで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下のマイクロチャンバーチップの製造方法に関する。
【００１３】
［１］細胞を収容するためのマイクロチャンバーを有するマイクロチャンバーチップの製造方法であって、第１基板と、１または２以上の貫通孔を形成された第２基板とを準備する工程と、前記第１基板および前記第２基板を積層し、固定する工程と、を有し、前記第１基板の前記第２基板と対向する面における細胞の接着力は、前記第２基板の前記第１基板と対向しない面および前記貫通孔の内面における細胞の接着力よりも強い、マイクロチャンバーチップの製造方法。
［２］前記貫通孔の最大径は、２０〜１５０μｍの範囲内であり、前記第２薄板の厚みは、２０〜１００μｍの範囲内である、［１］に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
［３］前記第１基板の前記第２基板と対向する面における細胞の接着力は、０.０１ｎＮ超であり、前記第２基板の前記第１基板と対向しない面および前記貫通孔の内面における細胞の接着力は、０.０１ｎＮ以下である、［１］または［２］に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
［４］前記第１基板の前記第２基板と対向する面における細胞の接着力は、０.１ｎＮ以上であり、前記第２基板の前記第１基板と対向しない面および前記貫通孔の内面における細胞の接着力は、０.００１ｎＮ以下である、［３］に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
［５］前記第１基板および前記第２基板は、互いに異なる素材からなる樹脂基板である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
［６］前記第１基板および前記第２基板の少なくとも一方は、積層される前に、細胞の接着力を調整するための表面処理がなされている、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
［７］前記第１基板および前記第２基板は、熱溶着、超音波溶着または接着剤により固定される、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のマイクロチャンバーチップの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、希少細胞の検出に好適なマイクロチャンバーチップを容易に製造することができる。本発明により製造されたマイクロチャンバーチップを用いることで、希少細胞を高精度に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、細胞展開用デバイスの平面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示されるＡ−Ａ線の断面図である。
【図２】図２Ａは、マイクロチャンバーチップの平面図であり、図２Ｂは、枠体の平面図であり、図２Ｃは、天板の平面図である。
【図３】図３Ａは、マイクロチャンバーチップの部分拡大断面図であり、図３Ｂは、細胞展開用デバイスの使用時におけるマイクロチャンバーチップの部分拡大断面図である。
【図４】図４Ａは、第１基板の平面図であり、図４Ｂは、第２基板の平面図である。
【図５】図５Ａ，Ｂは、本実施の形態に係るマイクロチャンバーチップの製造方法を説明するための模式図である。
【図６】図６Ａは、実施例に係る枠体の平面図であり、図６Ｂは、実施例に係る天板の平面図であり、図６Ｃは、両面シールと天板を重ね合わせた状態の平面図である。
【図７】図７Ａは、実施例に係る第１基板の平面図であり、図７Ｂは、実施例に係る第２基板の平面図であり、図７Ｃは、実施例に係る細胞展開用デバイスの側面図であり、図７Ｄは、実施例に係る細胞展開用デバイスの平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。本実施の形態のマイクロチャンバーチップは、例えば細胞展開用デバイスに組み込まれて使用されうる。そこで、以下の説明では、細胞展開用デバイスに組み込まれたマイクロチャンバーチップと、その製造方法について説明する。
【００１７】
［細胞展開用デバイス］
図１は、希少細胞の検出に好適な細胞展開用デバイスの一例を示す図である。図１Ａは、細胞展開用デバイス１００の平面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示されるＡ−Ａ線の断面図である。
【００１８】
図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、細胞展開用デバイス１００は、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０を有する。図２Ａは、マイクロチャンバーチップ１１０の平面図であり、図２Ｂは、枠体１２０の平面図であり、図２Ｃは、天板１３０の平面図である。
【００１９】
マイクロチャンバーチップ１１０は、その一方の面に１個または２個以上のマイクロチャンバー１１１を有する（図２Ａ参照）。複数のマイクロチャンバー１１１を有するマイクロチャンバーチップ１１０は、マイクロチャンバーアレイ（ＭＣＡ）とも言われる。ここで、「マイクロチャンバー」とは、１個または２個以上の細胞を収容し、保持するための微細な有底の凹部（マイクロウェル）を意味する。また、「細胞を保持する」とは、マイクロチャンバーに収容された細胞に対して、後述する流路１２１内に液体を流したときにマイクロチャンバー外に出難くすることを意味する。
【００２０】
マイクロチャンバーチップ１１０のマイクロチャンバー１１１が形成されている面は、細胞展開用デバイス１００の流路１２１の底面となる。各マイクロチャンバー１１１は、流路１２１に対して開口している。マイクロチャンバー１１１の配置位置は、特に限定されない。図２Ａに示される例では、複数のマイクロチャンバー１１１は、流路の中央部にマトリックス状に配置されている。マイクロチャンバーチップ１１０の構成については、別途詳細に説明する。
【００２１】
枠体１２０は、マイクロチャンバーチップ１１０と天板１３０との間に配置された、貫通孔を有する薄板である（図２Ｂ参照）。この貫通孔は、検体に由来する細胞懸濁液を流すための流路１２１となる。流路１２１（貫通孔）の形状は、マイクロチャンバー１１１上に細胞懸濁液を流すことが可能であれば、特に限定されず、用途に応じて適宜選択されうる。また、枠体１２０の厚みは、特に限定されず、所望の流路の高さ（深さ）に応じて適宜設定される。たとえば、枠体１２０の厚みは、５０〜５００μｍの範囲内である。流路の高さを５０〜５００μｍの範囲内とすることで、マイクロチャンバーチップ１１０のマイクロチャンバー１１１以外の面に付着した細胞を、流路１２１内を流れる液体の力で容易に剥離させることが可能となる。また、流路１２１内の細胞による目詰まりの発生を防止しつつ、流路１２１内の細胞懸濁液中の細胞がマイクロチャンバー１１１内に沈降するまでの時間を短縮することもできる。
【００２２】
枠体１２０の素材は、特に限定されず、公知のマイクロプレートなどと同じ素材であってもよい。枠体１２０の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。また、枠体１２０は、両面に粘着性を有するシリコンシート（両面シール）などであってもよい。枠体１２０として両面シールを使用することで、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０を容易に固定して、細胞展開用デバイス１００を製造することができる。
【００２３】
枠体１２０の貫通孔の内面は、流路１２１の側面となり、細胞展開用デバイス１００の使用時には細胞懸濁液と接触する。したがって、枠体１２０の貫通孔の内面は、必要に応じて表面処理されていてもよい。表面処理の例には、プラズマ処理、コロナ放電処理、親水性ポリマーやタンパク質、脂質などによるコーティング処理が含まれる。たとえば、枠体１２０の貫通孔の内面は、細胞の非特異的付着を防止するためのブロッキング処理が施されてもよい。ブロッキング剤の例には、カゼイン、スキムミルク、アルブミン（ウシ血清アルブミンを含む）、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマー、リン脂質、エチレンジアミンやアセトニトリルなどの低分子化合物などが含まれる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
天板１３０は、枠体１２０の上に配置された、２つの貫通孔を有する薄板である（図２Ｃ参照）。これらの貫通孔は、それぞれ、流路１２１内に液体（例えば細胞懸濁液や洗浄液、染色液など）を導入するための導入口１３１と、流路１２１内から液体を排出するための排出口１３２となる。通常、導入口１３１は、流路１２１の一端に連通し、排出口１３２は、流路１２１の他端に連通する。導入口１３１および排出口１３２の形状は、特に限定されない。また、天板１３０の厚みも、必要な強度を確保できれば特に限定されない。
【００２５】
天板１３０の素材は、特に限定されないが、蛍光顕微鏡などを用いて外部から流路１２１内を観察する観点からは、光透過性を有する素材であることが好ましい。天板１３０の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。また、枠体１２０と同様に、天板１３０の流路１２１の天面となる面も表面処理（例えばブロッキング処理）されていてもよい。
【００２６】
細胞展開用デバイス１００は、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０をこの順番で積層し、互いに固定することで製造されうる。これらを固定する方法は特に限定されないが、観察やメンテナンスの観点からは、互いに取り外し可能に固定されることが好ましい。固定方法の例には、係合による固定、螺子を用いた固定、粘着剤を用いた固定が含まれる。また、前述のとおり、枠体１２０として両面シールを使用してもよい。
【００２７】
図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、細胞展開用デバイス１００内に形成された流路１２１は、導入口１３１および排出口１３２を介して外部に連通している。導入口１３１から液体（例えば細胞懸濁液）を導入することで、流路１２１内に液体を満たすことができる。このとき、液体は、導入口１３１から排出口１３２に向かって流路１２１内を流れる。細胞懸濁液で流路１２１内を満たした場合、細胞はマイクロチャンバーチップ１１０上に沈降し、マイクロチャンバー１１１の底面に付着する。すなわち、細胞は、マイクロチャンバー１１１内に収容される。この後、洗浄や染色などを行い、外部からマイクロチャンバー１１１内に収容されている細胞を蛍光顕微鏡などを用いて観察することで、各種分析を行うことができる。細胞展開用デバイス１００を用いた希少細胞の検出方法については、マイクロチャンバーチップの説明の後に改めて詳細に説明する。
【００２８】
［マイクロチャンバーチップ］
次に、マイクロチャンバーチップ１１０について、図面を用いて詳細に説明する。図３Ａは、マイクロチャンバーチップ１１０の部分拡大断面図であり、図３Ｂは、細胞展開用デバイス１００の使用時におけるマイクロチャンバーチップ１１０の部分拡大断面図である。
【００２９】
図３Ａに示されるように、マイクロチャンバーチップ１１０は、第１基板１１２と、第１基板１１２の上に配置された第２基板１１３とを有する。図４Ａは、第１基板１１２の平面図であり、図４Ｂは、第２基板１１３の平面図である。
【００３０】
図４Ｂに示されるように、第２基板１１３には、１個または２個以上の貫通孔１１４が形成されている。図３Ａに示されるように、貫通孔１１４の一方の開口部が第１基板１１２により塞がれることで、有底のマイクロチャンバー１１１が形成される。したがって、第１基板１１２の第２基板１１３と対向する面の一部は、マイクロチャンバー１１１の底面となる。また、第２基板１１３に形成された貫通孔１１４の内面は、マイクロチャンバー１１１の側面となり、第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない面は、細胞展開用デバイス１００の流路１２１の底面となる。
【００３１】
第１基板１１２および第２基板１１３の素材は、特に限定されないが、蛍光顕微鏡などを用いて外部から流路１２１内を観察する観点からは、天板１３０と同様に光透過性を有する素材であることが好ましい。第１基板１１２および第２基板１１３の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。第１基板１１２の厚みは、必要な強度を確保できれば特に限定されない。一方、第２基板１１３の厚みは、所望のマイクロチャンバー１１１の深さに応じて適宜選択される。
【００３２】
第２基板１１３に形成される貫通孔１１４の形状は、特に限定されない。貫通孔１１４の形状の例には、円柱、多角柱、逆円錐台、逆多角錐台が含まれる。また、貫通孔１１４の大きさは、特に限定されず、収容する細胞の種類や１個のマイクロチャンバーに収容する細胞の数などに応じて適宜設定されうる。通常は、貫通孔１１４の大きさは、マイクロチャンバー１１１の底面に１０〜１５個程度の細胞が付着できる大きさであることが好ましい。たとえば、貫通孔１１４の最大径は、２０〜１５０μｍの範囲内であり、貫通孔１１４の深さ（第２基板１１３の厚み）は、２０〜１００μｍの範囲内である。
【００３３】
マイクロチャンバー１１１に収容される細胞の種類は、特に限定されない。マイクロチャンバーに収容される細胞の例には、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞、抗原特異的Ｔ細胞、各種幹細胞などが含まれる。
【００３４】
流路１２１内に提供された細胞懸濁液に含まれるすべての細胞をマイクロチャンバー１１１内に収容し、適切に分析するためには、図３Ｂに示されるように、マイクロチャンバー１１１の底面にのみ細胞１０が付着し、マイクロチャンバー１１１の側面およびマイクロチャンバー１１１外の表面（流路１２１の底面）には細胞１０が付着しないことが好ましい。すなわち、第１基板１１２の第２基板１１３と対向する面（マイクロチャンバー１１１の底面）における細胞１０の接着力は、第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない面（流路１２１の底面）および貫通孔１１４の内面（マイクロチャンバー１１１の側面）における細胞の接着力よりも強いことが好ましい。
【００３５】
本明細書において、「細胞の接着力」とは、平面に付着している複数の細胞に対して、前記平面と略平行方向に力を加えたときに、半数（５０％）の細胞が前記平面から剥離する力の値（単位：Ｎ）を意味する。たとえば、底面（平面）上に複数の細胞が付着している流路に液体を流した場合、細胞に加えられる力Ｆは以下の式（１）で算出される。
Ｆ＝３πμＶｄ    …（１）
ここで、Ｆは細胞に加えられる力（Ｎ）、μは液体の粘性係数（Ｎ／ｍ２・ｓ）、Ｖは液体の流速（ｍ／ｓ）、ｄは細胞の直径（ｍ）である。
【００３６】
本発明において「細胞の接着力」を測定する場合は、室温において、底面（平面）上に１０２個／ｍｍ２の細胞密度で複数の細胞が付着している流路に液体を流して、これらの細胞に対して力Ｆを１分間加える。力Ｆは、上記式（１）により算出される。流路の上流部、中央部、下流部のそれぞれについて、２００μｍ×２００μｍの範囲における細胞の剥離率を測定し、これらの平均値を算出する。得られた平均値が５０％のときの力Ｆを「細胞の接着力」とする。
【００３７】
具体的には、第１基板１１２の第２基板１１３と対向する面における細胞の接着力は、０.０１ｎＮ超であり、かつ第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない面および貫通孔１１４の内面における細胞の接着力は、０.０１ｎＮ以下であることが好ましい。また、第１基板１１２の第２基板１１３と対向する面における細胞の接着力は、０.１ｎＮ以上であり、かつ第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない面および貫通孔１１４の内面に対する細胞の接着力は、０.００１ｎＮ以下であることがより好ましい。このようにすることで、より確実に、マイクロチャンバー１１１の底面にのみ細胞１０を付着させることができる。第１基板１１２の第２基板１１３と対向する面における細胞の接着力と、第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない面および貫通孔１１４の内面に対する細胞の接着力とを変える方法については、この後マイクロチャンバーチップ１１０の製造方法を説明する際に説明する。
【００３８】
［マイクロチャンバーチップの製造方法］
次に、マイクロチャンバーチップ１１０の製造方法について、図５を参照して説明する。図５Ａ，Ｂは、本実施の形態に係るマイクロチャンバーチップの製造方法を説明するための模式図である。これらの図では、図３Ａ，Ｂと同様に、第１基板１１２および第２基板１１３の一部のみを示している。また、第１基板１１２の表面性状と第２基板１１３の表面性状が異なることを示すために、第１基板１１２の表面を白抜きで示し、第２基板１１３の表面を黒く塗りつぶして示す。
【００３９】
本実施の形態に係るマイクロチャンバーチップ１１０の製造方法は、（１）第１基板１１２および第２基板１１３を準備する第１工程と、（２）第１基板１１２および第２基板１１３を積層する第２工程とを含む。以下、各工程について説明する。
【００４０】
（１）第１工程
第１工程では、図５Ａに示されるように、第１基板１１２と、１または２以上の貫通孔１１４を形成された第２基板１１３とを準備する。
【００４１】
前述のとおり、第１基板１１２の第２基板１１３と対向する面における細胞の接着力は、第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない面および貫通孔１１４の内面における細胞の接着力よりも強い。したがって、少なくとも、第１基板１１２の第２基板１１３と対向する予定の面の表面性状（図５Ａにおいて白色で示す）と、第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない予定の面および貫通孔１１４の内面の表面性状（図５Ａにおいて黒色で示す）とは、互いに異なっている。なお、図５Ａでは、第１基板１１２の両面が同一の表面性状であり、かつ第２基板１１３の両面および貫通孔１１４の内面が同一の表面性状である例を図示している。
【００４２】
第１基板１１２の第２基板１１３と対向する予定の面における細胞の接着力と、第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない予定の面および貫通孔１１４の内面における細胞の接着力とを変える方法としては、第１基板１１２および第２基板１１３としてそれぞれ異なる素材の樹脂基板を使用することが考えられる。たとえば、実施例で示すように、未処理のポリスチレン基板の表面におけるヒト白血病培養細胞（ＣＥＭ）の接着力は１Ｎ以上であるが、未処理のポリメチルメタクリレート基板の表面におけるヒト白血病培養細胞の接着力は０.０１Ｎ以下である。したがって、第１基板１１２として未処理のポリスチレン基板を使用し、第２基板１１３として未処理のポリメチルメタクリレート基板を使用すればよい。
【００４３】
また、第１基板１１２の第２基板１１３と対向する予定の面における細胞の接着力と、第２基板１１３の第１基板１１２と対向しない予定の面および貫通孔１１４の内面における細胞の接着力とを変える別の方法としては、第１基板１１２または貫通孔１１４を形成された第２基板１１３の少なくとも一方に対して、第２の工程で積層する前に、細胞の接着力を調整するための表面処理することも考えられる。表面処理の例には、プラズマ処理、コロナ放電処理、親水性ポリマーやタンパク質、脂質などによるコーティング処理が含まれる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。たとえば、貫通孔１１４を形成された第２基板１１３の表面（少なくとも第１基板１１２と対向しない予定の面および貫通孔１１４の内面）に、細胞の接着力を弱める処理として、プラズマ処理、コロナ放電処理、ＵＶオゾン処理、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のコーティング処理、またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のコーティング処理を施してもよい。また、第１基板１１２の表面（少なくとも第２基板１１３と対向する予定の面）に、細胞の接着力を強める処理として、抗ＥｐＣＡＭ抗体の固定化処理、またはポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）のコーティング処理を施してもよい。
【００４４】
第２基板１１３に貫通孔１１４を形成する方法は、特に限定されない。たとえば、リソグラフィやマイクロニードルなどにより、第２基板１１３に物理的に貫通孔１１４を形成すればよい。また、射出成型により貫通孔１１４を有する第２基板１１３を作製してもよい。また、ポリマーの重合反応により化学合成された多孔質膜を第２基板１１３として利用してもよい。
【００４５】
（２）第２工程
第２工程では、図５Ｂに示されるように、第１基板１１２および第２基板１１３を積層し、固定する。これにより、有底のマイクロチャンバー１１１を有するマイクロチャンバーチップ１１０が作製される。
【００４６】
第１基板１１２と第２基板１１３とを固定する方法は、特に限定されない。たとえば、第２基板１１３は、熱溶着、超音波溶着または接着剤により、第１基板１１２の一方の面上に固定される。
【００４７】
以上の手順により、マイクロチャンバーチップ１１０を製造することができる。本実施の形態に係る製造方法によれば、マイクロチャンバー１１１の底面は、細胞の接着力の強い第１基板１１２の表面（図５Ｂにおいて白色で示す）から構成される。一方、マイクロチャンバー１１１の側面およびマイクロチャンバー１１１外の面（流路１２１の底面）は、細胞の接着力の弱い第２基板１１３の表面（図５Ｂにおいて黒色で示す）から構成される。したがって、マイクロチャンバーチップ１１０の上に細胞懸濁液を提供した場合、図３Ｂに示されるように、ほぼすべての細胞は、マイクロチャンバー１１１内の底面上に付着する。
【００４８】
以上のように、本実施の形態に係るマイクロチャンバーチップの製造方法は、希少細胞の検出に好適な、マイクロチャンバーの底面における細胞の接着力が強く、かつマイクロチャンバーの内側面およびマイクロチャンバー外の面における細胞の接着力が弱いマイクロチャンバーチップを容易に製造することができる。
【００４９】
［希少細胞の検出方法］
最後に、細胞展開用デバイス１００を用いた希少細胞の検出方法について説明する。
【００５０】
たとえば、（Ａ）細胞展開用デバイス１００の流路１２１の底面を濡らす前処理工程と、（Ｂ）細胞懸濁液を流路１２１に導入する導入工程と、（Ｃ）流路１２１内の細胞を移動させて細胞をマイクロチャンバー１１１内に回収する回収工程と、（Ｄ）マイクロチャンバー１１１内に回収された希少細胞を染色し、検出する検出工程と、を順に行うことで、細胞展開用デバイス１００を用いて、細胞懸濁液から希少細胞を回収し、検出することができる。
【００５１】
（Ａ）前処理工程
前処理工程では、細胞展開用デバイス１００の流路１２１内に水よりも表面張力が低い水溶液を導入して、流路１２１内の底面（特に、マイクロチャンバーチップ１１０の表面）を濡らす。水よりも表面張力が低い水溶液を使用することで、マイクロチャンバー１１１外だけでなく、マイクロチャンバー１１１内も濡らすことができる。
【００５２】
流路１２１内に導入する水溶液の種類は、表面張力が水よりも低ければ特に限定されない。そのような水溶液の例には、エタノールやメタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコールの水溶液、ＴＷＥＥＮ ２０（商品名）やＴｒｉｔｏｎ Ｘ（商品名）、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤の０.０１〜１％（ｗ／ｖ）水溶液が含まれる。使用時の温度における水溶液の表面張力は、１０〜６０ｍＮ／ｍの範囲内が好ましく、１０〜３５ｍＮ／ｍの範囲内がより好ましい。
【００５３】
前処理工程を終えた後は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などで流路１２１内を満たしておくことが好ましい。
【００５４】
（Ｂ）導入工程
導入工程では、細胞懸濁液を導入口１３１から流路１２１内に導入して、流路１２１内を細胞懸濁液で満たす。流路１２１内がリン酸緩衝液で満たされている場合は、導入口１３１から細胞懸濁液を導入するのと同時に、排出口１３２からリン酸緩衝液が排出される。
【００５５】
流路１２１内における細胞懸濁液の流速が所定の範囲で一定となるように、細胞懸濁液を導入することが好ましい。このようにすることで、細胞懸濁液に含まれる細胞を流路１２１内において略均一に分布させることができる。流路１２１内における細胞懸濁液の流速は、流路１２１の形状に応じて適宜設定される。流速が遅すぎる場合、導入口１３１近傍に細胞が留まってしまい、流路１２１の長手方向における細胞の分布が不均一になるおそれがある。一方、流速が速すぎる場合、流路１２１の短手方向における細胞の分布が不均一になるおそれがある。
【００５６】
細胞懸濁液を導入した後は、一定時間（例えば１〜１５分間）静置して、細胞懸濁液に含まれる細胞を沈降させることが好ましい。このとき、一部の細胞はマイクロチャンバー１１１内に沈降するが、残部の細胞はマイクロチャンバー１１１外に沈降する。マイクロチャンバー１１１の底面における細胞の接着力は強いため、マイクロチャンバー１１１内に沈降した細胞は、マイクロチャンバー１１１の底面に強固に付着する。一方、マイクロチャンバー１１１外における細胞の接着力は弱いため、マイクロチャンバー１１１外に沈降した細胞は、マイクロチャンバー１１１外の流路１２１の底面に弱く付着する。
【００５７】
（Ｃ）回収工程
回収工程では、マイクロチャンバー１１１外の細胞を移動させて、細胞をマイクロチャンバー１１１内に回収する。具体的には、間欠送液を行うことで、マイクロチャンバー１１１外の細胞に間欠的に移動力を付与する。
【００５８】
間欠送液は、マイクロチャンバー１１１外の細胞を送液方向に移動させるためのワンショット送液工程と、移動した細胞を沈降させるための静置工程とを含む。送液を行う装置が、所定の送液圧を所定の時間、流路１２１内に発生させて、マイクロチャンバー１１１外の細胞を送液方向に移動させる送液をすると、「ワンショット送液」となる。一方、この装置が、送液圧を発生させないと「静置」となる。ワンショット送液工程の開始から静置工程の終了までを１サイクルとすると、マイクロチャンバー１１１外の細胞は、例えば１サイクルで送液方向に５０μｍ程度移動する。マイクロチャンバー１１１外の細胞がマイクロチャンバー１１１の直上に移動した場合は、その細胞はマイクロチャンバー１１１内に沈降し、回収される。マイクロチャンバー１１１外の細胞をマイクロチャンバー１１１内に回収する観点からは、間欠送液のサイクル数は、２回以上が好ましく、１０回以上がより好ましい。
【００５９】
ワンショット送液における送液量は、流路１２１の大きさなどに応じて適宜設定される。たとえば、ワンショット送液における送液量は、流路１２１内の細胞懸濁液の体積の１／１００〜１／２程度が好ましい。また、流路１２１内の流速が１ｍｍ／秒以下となるように、単位時間あたりの送液量を調整することが好ましい。静置時間は、特に限定されないが、例えば１〜３０秒間である。
【００６０】
なお、間欠送液では、導入口１３１からだけでなく、排出口１３２から送液を行ってもよい。たとえば、導入口１３１から間欠送液を１サイクルまたは２サイクル以上を行った後、排出口１３２から間欠送液を１サイクルまたは２サイクル以上を行ってもよい。導入口１３１および排出口１３２から交互に間欠送液を行うことで、細胞の回収率を向上させることができる。
【００６１】
（Ｄ）検出工程
検出工程では、マイクロチャンバー１１１内に回収された細胞を染色し、希少細胞を検出する。
【００６２】
細胞の染色は、所定の染色液（例えば、蛍光色素で標識された抗体の溶液）を流路１２１内に導入することで行われる。この後、洗浄液（例えばリン酸緩衝液）を導入口１３１から流路１２１内に導入し、排出口１３２から排出させるという工程を少なくとも１回は行うことで、細胞や流路１２１内を洗浄する。染色液の種類は、検出対象の細胞の種類に応じて適宜選択される。
【００６３】
たとえば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、血液由来の細胞集団において、核染色が陽性であり、かつＣＤ４５が陰性である細胞として検出される。また、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、サイトケラチン（ＣＫ）が陽性でもある。したがって、例えばニュートラルレッド（核染色）および蛍光標識された抗ＣＤ４５抗体を含む溶液、またはこれらに加えて蛍光標識された抗サイトケラチン抗体をさらに含む溶液を使用することで、循環腫瘍細胞を検出することができる。
【００６４】
また、循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）は、血液由来の細胞集団において、ＣＤ３１やＣＤ５１／６１などの内皮細胞マーカーが陽性である細胞として検出される。したがって、例えば蛍光標識された抗ＣＤ３１抗体や抗ＣＤ５１／６１抗体を含む溶液を使用することで、循環血管内皮細胞を検出することができる。また、検出された細胞が腫瘍細胞であるかどうかは、内皮細胞が腫瘍化したときに発現するＣＤ１４６が陽性かどうかを確認すればよい。この場合は、蛍光標識された抗ＣＤ１４６抗体も使用される。
【００６５】
循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）は、血液由来の細胞集団において、ＡＬＤＨ活性が高い細胞として検出される。したがって、例えばＡＬＤＨ活性測定試薬（蛍光法を利用）を使用することで、循環血管内皮前駆細胞を検出することができる。
【００６６】
細胞の検出方法は、使用した染色方法に応じて適宜選択される。たとえば、希少細胞を色素により染色した場合は、希少細胞は光学顕微鏡などを用いて検出される。また、希少細胞を蛍光標識した場合は、希少細胞は蛍光顕微鏡などを用いて検出される。この後、マイクロピペットなどを用いて、対象の希少細胞を取り出してもよい。
【００６７】
以上の工程により、細胞展開用デバイス１００を用いて、細胞懸濁液から希少細胞を回収し、検出することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【００６９】
１．各種基板に対する細胞接着力の評価
（１）基板の準備
評価対象の基板として、以下の１１種類の基板を準備した。各基板の厚みは、１.５ｍｍである。
（ａ）未処理のポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）基板
（ｂ）未処理のポリプロピレン（ＰＰ）基板
（ｃ）ＵＶオゾン処理をしたポリスチレン（ＰＳ）基板
（ｄ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）処理をしたポリスチレン基板
（ｅ）プラズマ処理をしたポリスチレン基板
（ｆ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）でコーティングしたポリスチレン基板
（ｇ）未処理のポリスチレン基板
（ｈ）未処理のポリカーボネート（ＰＣ）基板
（ｉ）未処理のガラス基板
（ｊ）抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体でコーティングしたポリスチレン基板
（ｋ）ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）でコーティングしたポリスチレン基板
【００７０】
（ｃ）ＵＶオゾン処理をしたポリスチレン基板は、厚み１.５ｍｍのポリスチレン基板にＵＶオゾンクリーナーを用いて紫外線を３００秒間照射することで作製した。
【００７１】
（ｄ）ウシ血清アルブミン処理をしたポリスチレン基板は、厚み１.５ｍｍのポリスチレン基板をウシ血清アルブミン溶液（濃度１％）に１５分間浸漬した後、その表面を乾燥させることで作製した。
【００７２】
（ｅ）プラズマ処理をしたポリスチレン基板は、厚み１.５ｍｍのポリスチレン基板の表面をプラズマ表面処理装置を用いて３０秒間プラズマ処理することで作製した。
【００７３】
（ｆ）ポリビニルアルコールでコーティングしたポリスチレン基板は、厚み１.５ｍｍのポリスチレン基板の表面に光硬化性ポリビニルアルコール（BIOSURFINE-AWP-MRH；東洋合成工業株式会社）溶液（濃度１％）をスピンコート法で塗布した後、紫外線を照射して硬化させることで作製した。
【００７４】
（ｊ）抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体でコーティングしたポリスチレン基板は、厚み１.５ｍｍのポリスチレン基板を抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体溶液（濃度１μｇ／ｍＬ）に１５分間浸漬した後、その表面を乾燥させることで作製した。
【００７５】
（ｋ）ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたポリスチレン基板は、厚み１.５ｍｍのポリスチレン基板の表面にポリ−Ｌ−リシン溶液（濃度０.１ｍｇ／ｍＬ）を塗布し、５分間静置した後、吸引濾過により溶液を除去し、その表面を２時間乾燥させることで作製した。
【００７６】
（２）評価用デバイスの作製
評価対象の基板の一方の面上に、厚み１００μｍの両面シール（枠体）および厚み１.５ｍｍのポリメチルメタクリレート基板（天板）を順に貼り付けることで、評価用デバイスを作製した。
【００７７】
図６Ａは、枠体（両面シール）１２０の平面図であり、図６Ｂは、天板（ポリメチルメタクリレート基板）１３０の平面図であり、図６Ｃは、枠体１２０と天板１３０を重ね合わせた状態の平面図である。図６Ａに示されるように、枠体１２０には、流路１２１となる六角形状の貫通孔が形成されている。流路１２１の長さは４５ｍｍであり、流路１２１の幅は１５ｍｍである。また、図６Ｂに示されるように、天板１３０には、流路１２１の両端に対応する位置に直径１ｍｍの貫通孔がそれぞれ形成されている。図６Ｃに示されるように、これらの貫通孔は、それぞれ流路に対する導入口１３１および排出口１３２となる。
【００７８】
（３）各基板の評価
評価用デバイスの導入口および排出口に、それぞれチューブコネクタを介して送液チューブを接続した。一端が導入口に接続された送液チューブの他端を、１００μＬ中に１×１０５個のヒト白血病培養細胞（ＣＥＭ）を含む細胞懸濁液中に配置した。また、一端が排出口に接続された送液チューブの他端をシリンジポンプに接続した。この状態で、シリンジポンプを用いて１ｍＬ／分の速度で１００μＬの細胞懸濁液を吸引して、流路内を細胞懸濁液で満たした。５分間静置した後、光学顕微鏡を用いて、流路の上流部、中央部、下流部のそれぞれについて２００μｍ×２００μｍの領域に存在する細胞数を計測した。各領域における細胞密度は、いずれも１０２個／ｍｍ２であった。
【００７９】
次いで、一端が導入口に接続された送液チューブの他端を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に移動させた。この状態で、シリンジポンプを用いて０.０１，０.１，１，１０ｍＬ／分の速度でリン酸緩衝液を１分間吸引して、流路内の細胞に力を加えつつ流路内を洗浄した。このときに各細胞に加わる力Ｆは、前述の式（１）より、０.００１ｎＮ（０.０１ｍＬ／分），０.０１ｎＮ（０.１ｍＬ／分），０.１ｎＮ（１ｍＬ／分）または１ｎＮ（１０ｍＬ／分）となる。その後、光学顕微鏡を用いて流路内の同一領域（２００μｍ×２００μｍ）に存在する細胞数を計測して、リン酸緩衝液の送液前後の細胞数の変化から細胞の剥離率（３か所の平均値）を算出した。今回の実験では、細胞の剥離率が５０％未満の場合は「○」と評価し、細胞の剥離率が５０％以上の場合は「×」と評価した。各基板の評価結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
2014219261.tif 000003
【００８１】
表１に示される結果から、（ａ）〜（ｆ）の基板の表面における細胞の接着力は、０.０１ｎＮ以下であり、（ｄ），（ｆ）の基板の表面における細胞の接着力は、０.００１ｎＮ以下であることがわかる。また、（ｇ）〜（ｋ）の基板の表面における細胞の接着力は、１ｎＮ超であることがわかる。本実施例では、マイクロチャンバーチップの第１基板（細胞を接着させる）としては、（ｇ）未処理のポリスチレン基板を使用し、第２基板（細胞を接着させない）としては、（ａ）未処理のポリメチルメタクリレート基板または（ｄ）ＢＳＡコートをしたポリスチレン基板を使用することとした。
【００８２】
２．マイクロチャンバーチップの作製と評価
（１）実施例に係るマイクロチャンバーチップおよび細胞展開用デバイスの作製
未処理のポリスチレン基板（厚み１.５ｍｍ；第１基板）と、直径１００μｍの貫通孔を複数形成された未処理のポリメチルメタクリレート基板またはＢＳＡコートをしたポリスチレン基板（厚み５０μｍ；第２基板）とを積層し、レーザー溶着法で貼り合せて、実施例に係るマイクロチャンバーチップを作製した。図７Ａは、第１基板（ポリスチレン基板）１１２の平面図であり、図７Ｂは、複数の貫通孔１１４を形成された第２基板（未処理のポリメチルメタクリレート基板またはＢＳＡコートをしたポリスチレン基板）１１３の平面図である。なお、図７Ｂにおいて貫通孔１１４は模式的に表されており、貫通孔の大きさおよび数は正確ではない。
【００８３】
このマイクロチャンバーチップ１１０の第２基板１１３の上に、前述の枠体１２０（図６Ａ参照）および天板１３０（図６Ｂ参照）をさらに貼り付けることで、実施例に係る細胞展開用デバイスを作製した。図７Ｃは、実施例に係る細胞展開用デバイスの側面図であり、図７Ｄは、実施例に係る細胞展開用デバイスの平面図である。図７Ｄに示されるように、第２基板１１３に形成された複数の貫通孔１１４は、すべて流路内に位置する。また、前述の評価用デバイスと同様に、天板１３０に形成された２つの貫通孔は、それぞれ流路に対する導入口１３１および排出口１３２となる。なお、図７Ｃにおいて各構成部材の厚みは模式的に表されており、これらの厚みは正確ではない。
【００８４】
（２）比較例に係るマイクロチャンバーチップおよび細胞展開用デバイスの作製
未処理のポリスチレン基板（厚み１.５ｍｍ）の一方の面に、直径１００μｍ、深さ５０μｍの凹部を複数形成して、比較例に係るマイクロチャンバーチップを作製した。凹部の位置および形状は、前述の第２基板に形成されている貫通孔と同じである（図７Ｂ参照）。
【００８５】
このマイクロチャンバーチップの凹部が形成されている面上に、前述の枠体（図６Ａ参照）および天板（図６Ｂ参照）をさらに貼り付けることで、比較例に係る細胞展開用デバイスを作製した。比較例に係る細胞展開用デバイスについては、この後説明する評価実験の直前に、ブロッキング溶液（３％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液）を高流速（１５ｍＬ／分）で送液して、流路内面をブロッキング処理した。
【００８６】
（３）各細胞展開用デバイスの評価
細胞展開用デバイスの導入口および排出口に、それぞれチューブコネクタを介して送液チューブを接続した。一端が導入口に接続された送液チューブの他端を、３０％エタノール水溶液中に配置した。また、一端が排出口に接続された送液チューブの他端をシリンジポンプに接続した。この状態で、シリンジポンプを用いて１５ｍＬ／分の速度でエタノール水溶液を吸引して、流路内全面（マイクロチャンバーの底面および側面を含む）を濡らした。次いで、一端が導入口に接続された送液チューブの他端を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に移動させた。この状態で、シリンジポンプを用いて１５ｍＬ／分の速度でリン酸緩衝液を吸引して、流路内を洗浄した。
【００８７】
次いで、一端が導入口に接続された送液チューブの他端を、１００μＬ中に１×１０５個のヒト白血病培養細胞（ＣＥＭ）を含む細胞懸濁液中に移動させた。この状態で、シリンジポンプを用いて１ｍＬ／分の速度で１００μＬの細胞懸濁液を吸引して、流路内を細胞懸濁液で満たした後、シリンジポンプを用いて１ｍＬ／分の速度で０.１μＬの細胞懸濁液を吸引することを２０回繰り返して（１回の吸引後に１０秒間停止）、マイクロチャンバー内に細胞を回収した。
【００８８】
細胞を回収した後、光学顕微鏡を用いてマイクロチャンバー外に存在する細胞の数を計測した。その結果、実施例に係る細胞展開用デバイスでは、マイクロチャンバー外に存在する細胞の割合が流路内に導入した細胞の１％以下であった。特に、第２基板としてＢＳＡコートをしたポリスチレン基板を使用した細胞展開用デバイスでは、マイクロチャンバー外に細胞は存在していなかった。これに対し、比較例に係る細胞展開用デバイスでは、マイクロチャンバー外に存在する細胞の割合が流路内に導入した細胞の２０％であった。また、光学顕微鏡を用いてマイクロチャンバー内に存在する細胞の数も計測した。その結果、実施例に係る細胞展開用デバイスでは、１つのマイクロチャンバーにつき平均８０個の細胞が存在しており、かつマイクロチャンバーあたりの細胞数のばらつきが小さかった（ＣＶ＝１０％）。これに対し、比較例に係る細胞展開用デバイスでは、一部のマイクロチャンバーにしか細胞が存在しておらず、かつ１つのマイクロチャンバーにつき多くても４０個程度の細胞しか存在していなかった。
【００８９】
以上の結果から、本発明に係る製造方法で製造されたマイクロチャンバーチップは、細胞を効率的に回収できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により製造されたマイクロチャンバーチップは、例えば疾患の検査などに有用である。
【符号の説明】
【００９１】
１００  細胞展開用デバイス
１１０  マイクロチャンバーチップ
１１１  マイクロチャンバー
１１２  第１基板
１１３  第２基板
１１４  貫通孔
１２０  枠体
１２１  流路
１３０  天板
１３１  導入口
１３２  排出口
【図１】
2014219261.tif 000004
【図２】
2014219261.tif 000005
【図３】
2014219261.tif 000006
【図４】
2014219261.tif 000007
【図５】
2014219261.tif 000008
【図６】
2014219261.tif 000009
【図７】
2014219261.tif 000010