(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内において、細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的かつ高感度に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブを提供する。【解決手段】アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞の検出のためのプローブ用タンパク質であって、Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に、二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが結合した融合タンパク質であり、前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、タンパク質。ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列に含まれる３０〜１２０アミノ酸残基長の配列ｂ）ａ）と８０％以上の同一性を有する配列。標識化された、前記タンパク質を含むプローブ。前記プローブを含む、腫瘍の画像診断剤。【選択図】図１
2014227398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞の検出のためのプローブ用タンパク質であって、
Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に、二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが結合した融合タンパク質であり、
前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、タンパク質。
ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列に含まれる３０〜１２０アミノ酸残基長の配列
ｂ）ａ）と８０％以上の同一性を有する配列
【請求項２】
前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ’）又はｂ’）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、請求項１に記載のタンパク質。
ａ’）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列のＮ末端から３０〜１２０番目のアミノ酸残基までの配列
ｂ’）ａ’）と８０％以上の同一性を有する配列
【請求項３】
前記Ｔｉｍ４タンパク質のＩｇＶドメインは、下記ｃ）又はｄ）のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のタンパク質。
ｃ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のＩｇＶドメインのアミノ酸配列
ｄ）ｃ）において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＰＳ結合能を有するアミノ酸配列
【請求項４】
前記二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク
質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記野生型Ｔｉｍ４タンパク質が、ヒトＴｉｍ４タンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される前記融合タンパク質の分子量が１００ｋＤａ〜２５０ｋＤａである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
標識化された、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質を含むプローブ。
【請求項８】
請求項７に記載のプローブを含む、腫瘍の画像診断剤。
【請求項９】
請求項８に記載の腫瘍の画像診断剤を含む、画像診断用キット。
【請求項１０】
請求項７に記載のプローブを用いて、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス細胞やネクローシス細胞等の死細胞を検出し、該細胞の分子イメージングを可能にするプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における細胞死を検出し分子イメージングを行うことは、癌等の疾患の診断や薬剤の治療効果を判定するのに重要である。腫瘍組織の画像診断にはポジトロン断層法（ＰＥＴ）や単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などが確立されており、種々の分子イメージングプローブが用いられている。
【０００３】
そのような分子イメージングプローブには、フォスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｙｄｉｌｓｅｒｉｎｅ、以下ＰＳとも記す）を認識して結合する分子が含まれる。これは、アポトーシスやネクローシスを呈した細胞が、細胞膜表面上にＰＳを表出することに基づき、腫瘍組織における該細胞を検出するものである（非特許文献１）。具体的には、ＰＳ結合分子であるＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５やＳｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ ＩのＣ２Ａドメインを核種標識したものを、ＳＰＥＣＴ又はＰＥＴ用トレーサーとして用いることが提案されている。
【０００４】
ところで、免疫機能及び細胞の生存に関連するタンパク質のひとつとしてＴｉｍ４（Ｔ細胞免疫グロブリンタンパク質及びムチンドメイン４）が知られている（特許文献１）。Ｔｉｍ４は、保存されたＩｇＶ及びムチンドメインを有する細胞表面分子であり、ＰＳ受容体であることが確認されている（非特許文献４）。
Ｔｉｍ４は、一回膜貫通型のタンパク質で二量化してＰＳへ結合する。三次構造としては金属イオンポケットを有することがわかっているが（非特許文献２、３）、ＰＳへの結合にＣａ２＋を要するＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５とは異なり、Ｃａ２＋非依存的にＰＳへ結合
することも確認されている（非特許文献４、５）。
なお、これまでにＴｉｍ４タンパク質が分子イメージングプローブとして用いられた例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４５７２２７６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Apotosis, (2010) 15, 1072-1082
【非特許文献２】Immunity, (2007) 27(6), 941-951
【非特許文献３】Immunological Reviews, (2010) 235, 172-189
【非特許文献４】Nature (2007) 450, 435-439
【非特許文献５】Immunity (2007) 27, 927-940
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＰＳ結合性プローブとして知られているＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５やＳｙｎａｐｔｏｔａｇ
ｍｉｎ ＩのＣ２Ａドメインは、肝臓又は腎臓へ非特異的に集積することが指摘されてお
り、核種標識したプローブとして適用すると生体への放射能の影響が懸念されるという問題がある。また、これらの分子は、ＰＳへの結合の際に多量（２．５ｍＭ以上）のＣａ２＋を必要とすることから、生体内において定量的な画像解析を行うのには適さない。
本発明はかかる状況に鑑み、生体内において、細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的かつ高感度に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の結果、ＰＳ結合分子であるＴｉｍ４と二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドとの融合タンパク質が、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を高感度に検出できることを見出した。さらに、Ｔｉｍ４タンパク質中のムチンドメインの大きさを野生型よりも小さいサイズとすることにより、アポトーシスを呈した腫瘍組織への集積の特異性を高めることができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞の検出のためのプローブ用タンパク質であって、
Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に、二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが結合した融合タンパク質であり、
前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、タンパク質（以下、「本発明のタンパク質」とも記す）。
ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列に含まれる３０〜１２０アミノ酸残基長の配列
ｂ）ａ）と８０％以上の同一性を有する配列
［２］前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ’）又はｂ’）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、［１］に記載のタンパク質。
ａ’）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列のＮ末端から３０〜１２０番目のアミノ酸残基までの配列
ｂ’）ａ’）と８０％以上の同一性を有する配列
［３］前記Ｔｉｍ４タンパク質のＩｇＶドメインは、下記ｃ）又はｄ）のアミノ酸配列を有する、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
ｃ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のＩｇＶドメインのアミノ酸配列
ｄ）ｃ）において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＰＳ結合能を有するアミノ酸配列
［４］前記二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タン
パク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質。
［５］前記野生型Ｔｉｍ４タンパク質が、ヒトＴｉｍ４タンパク質である、［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質。
［６］非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される前記融合タンパク質の分子量が１００ｋＤａ〜２５０ｋＤａである、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質。
［７］標識化された、［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質を含むプローブ（以下、「本発明のプローブ」とも記す）。
［８］［７］に記載のプローブを含む、腫瘍の画像診断剤。
［９］［８］に記載の腫瘍の画像診断剤を含む、画像診断用キット。
［１０］［７］に記載のプローブを用いて、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を検出する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、死細胞を高感度に検出することができ、生体内において細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブが提供される。本発明のプローブは、生体内における細胞死を的確に検出し画像化して、
疾患の診断や薬剤の試料効果判定に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】［６４Ｃｕ］ｍＴｉｍ４−Ｆｃまたは［６４Ｃｕ］ｍＴｉｍ４−Δ２３０−Ｆｃ投与４８時間後のマウスのＰＥＴ画像（写真、最大値投影表示）。
【図２】摘出腫瘍切片の免疫染色像（写真）。Ａ〜Ｃ：ＭＭＣ投与個体摘出腫瘍、Ｄ〜Ｅ：生理食塩水投与個体摘出腫瘍、Ａ及びＢ：抗活性化カスパーゼ３抗体による免疫染色像（赤）、Ｂ及びＥ：ＴＵＮＥＬ染色像（緑）、Ｃ及びＦ：抗活性化カスパーゼ３抗体による免疫染色像、ＴＵＮＥＬ染色像、及びＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８による核染色像（青）の合成画像。
【図３】ＰＳに対する各ｈＴｉｍ−Ｆｃの結合性を示すドットブロッティング像（写真）。
【図４】各種リン脂質に対するｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃの結合性を示すドットブロッティング像（写真）。
【図５】ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ又はＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５によるアポトーシス誘導細胞の免疫染色像（写真）。Ａ：ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ及びＰＩによる免疫染色像、Ｂ：Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５及びＰＩによる免疫染色像。それぞれ、左列：ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ又はＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５の染色像、中央列：ＰＩの染色像、右列：蛍光画像と透過光像の合成画像。上下段とも同条件の別視野の画像である。
【図６】［６４Ｃｕ］ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ−Ｋ６０Ｒ，Ｋ１１９Ｒ投与４８時間後のマウスのＰＥＴ画像（写真、最大値投影表示）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のプローブ用タンパク質は、Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に、二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが結合した融合タンパク質である。
【００１２】
野生型Ｔｉｍ４タンパク質は、Ｎ末端側から順にシグナル配列、ＩｇＶドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質領域で構成される。ＩｇＶドメインはＰＳ結合部位であり、ムチンドメインは糖鎖結合部位である。
なお、野生型Ｔｉｍ４タンパク質のアミノ酸配列について、ヒトのものを配列番号２に、マウスのものを配列番号４に記すが、両者はアミノ酸配列において４８％の同一性がある。
【００１３】
本発明のタンパク質におけるＴｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、野生型のムチンドメインのＣ末端及び／又はＮ末端を欠損させて小型化したポリペプチドに置換されている。置換される領域は、Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質領域の一部又は全部であって少なくとも全長ムチンドメインを含む領域である。融合タンパク質の作製の簡便さの観点から、好ましくはムチンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質領域の全てが置換される。
野生型のムチンドメインのＣ末端及び／又はＮ末端を欠損させて小型化したポリペプチドとは、具体的には、ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列に含まれる３０〜１２０、好ましくは４５〜８０、より好ましくは５０〜６０アミノ酸残基長のアミノ酸配列、又はｂ）ａ）と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。またはｃ）ａ）の配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、本発明の効果を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
野生型のムチンドメインの小型化は、そのＣ末端側を欠損させることが調製の容易さの
観点から好ましい。すなわち、ａ’）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列のＮ末端から３０〜１２０番目、好ましくは４５〜８０番目、より好ましくは５０〜６０番目のアミノ酸残基までの配列に置換されることが好ましい。あるいは、ｂ’）ａ’）と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、またはｃ’）ａ’）の配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されていてもよい。
野生型のムチンドメインの小型化は、そのＮ末端側を欠損させることにより行ってもよく、あるいは、Ｃ末端側の欠損に加えてＮ末端側も欠損させることにより行ってもよい。
【００１４】
融合タンパク質中のＴｉｍ４タンパク質を、ムチンドメインのアミノ酸配列長を短くし、小型化した改変Ｔｉｍ４タンパク質とすることにより、腫瘍等の細胞死を呈した部位・組織を有する個体に標識化タンパク質（プローブ）として投与した場合に、標的とする死細胞を有する部位・組織へ特異的に集積しそれ以外の部位への非特異集積が抑えられる。
なお、ヒトＴｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列を配列番号６に、マウスＴｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列を配列番号８に示す。本発明のプローブを、臨床における画像診断等へ適用する際は、Ｔｉｍ４タンパク質はヒト由来のものを用いることが特に好ましい。
【００１５】
本発明のタンパク質におけるＴｉｍ４タンパク質のＩｇＶドメインは、野生型でも改変型でもよい。ここで、改変型とは、野生型のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＰＳ結合能を有するものをいう。前記ＩｇＶドメインは、ＰＳへの結合性維持の観点から、野生型の配列を有することが好ましい。
Ｔｉｍ４タンパク質のＰＳへの結合には、ＩｇＶドメイン中の内側の領域が主に関与することが知られているが（非特許文献２、３）、ＩｇＶドメインの両端に近い部位はβシート構造を形成してＴｉｍ４タンパク質の三次構造の維持に関与し、ＰＳへの結合性に間接的に寄与していると考えられている。
【００１６】
後述するように本発明のタンパク質を金属キレート剤を用いて標識化する場合は、キレーターがＩｇＶドメインのＰＳ結合作用を妨げる場合があるため、それを避けるようにＩｇＶを改変してもよい。例えば、特定のアミノ酸残基に特異的に結合するキレート剤を用いて本発明のタンパク質を標識化する場合は、ＩｇＶドメイン中の該アミノ酸残基、好ましくはＰＳ結合領域中又は近接部位に存在する該アミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換する改変をすることができる。置換後のアミノ酸としては、特に限定されないが、置換前のアミノ酸と構造、分子量、ファンデルワールス力の大きさ、親水性／疎水性、酸性／アルカリ性、又はその他性質が似ているものを選ぶことが好ましい。
例えば、アミノ基と反応するＮＣＳ（イソシアネート）基やＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）基を有するキレート剤（例えば、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＰＣＴＡ等）はリジン残基を特異的に修飾できるキレート剤であるが、これを用いて本発明のタンパク質を標識化する場合は、ＩｇＶドメイン中のリジン残基、ヒトＴｉｍ４配列では好ましくは５１Ｋ、６０Ｋ、７５Ｋ、７８Ｋ、及び１１９Ｋから選択される１個又は２個以上、より好ましくは５１Ｋ、６０Ｋ及び／又は１１９Ｋ、さらに好ましくは６０Ｋ及び／又は１１９Ｋ、特に好ましくは６０Ｋ及び１１９Ｋを欠失又は他のアミノ酸残基に置換する改変をするのが好ましい。また、マウスＴｉｍ４配列では、好ましくは５６Ｋ、６３Ｋ、８０Ｋ、８３Ｋ、８９Ｋ、１２４Ｋ、及び１２５Ｋから選択される１個又は２個以上、より好ましくは５６Ｋ、６３Ｋ及び／又は１２４Ｋ、さらに好ましくは６３Ｋ及び１２４Ｋを欠失又は他のアミノ酸残基に置換する改変をするのが好ましい。この場合置換後のアミノ酸としては、特に限定されないが、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン等が好ましい。
また、チオール基と反応するマレイミド基を有するキレート剤（例えば、ＤＴＰＡ等）はシステイン基に特異的に修飾できるキレート剤であるが、これを用いて本発明のタンパク質を標識化する場合は、ＩｇＶドメイン中のシステイン残基のうち１個又は２個以上を欠失又は他のアミノ酸残基に置換する改変をしてもよい。
【００１７】
本発明のタンパク質における二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドは、前述した改変Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に結合している。この二量体を形成するタンパク質は、Ｔｉｍ４タンパク質がＰＳへ結合する際に二量化するのを促すために導入される。
二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドとしては、ＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク質
、ロイシンジッパー構造を有するタンパク質又はポリペプチド等が挙げられる。また、任意のタンパク質又はポリペプチドをＴｉｍ４タンパク質に融合させて、２分子の融合タンパク質の該タンパク質又はポリペプチド同士をＳ−Ｓ結合させて融合タンパク質とした場合も、本発明のタンパク質に含まれる。これらのうち、適当な分子量としてプローブの標的部位以外への非特異的集積を抑制する観点、及び後述するプローブ作製におけるタンパク質の精製の容易さの観点から、ヒトＩｇＧ−Ｆｃタンパク質が好ましい。
【００１８】
本発明のタンパク質の分子量は、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、好ましくは１００ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、より好ましくは１３０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、さらに好ましくは１５０ｋＤａ〜１８０ｋＤａである。
生体内に投与したプローブ分子は、一般に、分子量が大きいものでは肝臓へ、分子量が小さいものは腎臓へ、非特異的に集積する傾向が見られる。そのため、本発明における融合タンパク質は、標的とする死細胞を有する部位・組織へ特異的に集積させ、それ以外の部位への非特異集積を抑える観点から上記の大きさとすることが好ましい。
【００１９】
本発明のタンパク質は、周知の遺伝子操作法を含む任意の方法で作製することができ、特に限定されない。
例えば、野生型のＴｉｍ４をコードするＤＮＡに対して、所望のアミノ酸長の改変型ムチンドメインが残るように該ＤＮＡ中のムチンドメインのＣ末端及び／又はＮ末端側をコードする領域を欠損させて、改変型Ｔｉｍ４をコードするＤＮＡ断片を取得し、周知の方法で二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ断片と連結して、融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を作製する。得られた融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに導入して、該ベクターで大腸菌を形質転換して周知の方法で融合タンパク質を発現、回収し、クロマトグラフィー等により適宜精製を行えばよい。
また、野生型の配列に欠失、置換、挿入、及び／又は付加等の変異も、周知の手法により導入することができる。
【００２０】
本発明のタンパク質は、標識化することによりプローブとなり、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を検出するために適用できる。アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を有する腫瘍部位・組織の簡便な検出のため、標識化は検出可能な態様であれば特にその種類は限定されない。標識化は周知の方法で適宜行うことができ、例えば、ＦＩＴＣなどを用いる蛍光標識法、ペルオキシダーゼなどを用いる酵素標識法、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ等の画像診断に通常用いられる核種を用いるＲＩ標識法、ビオチン標識法などが挙げられる。
【００２１】
ＰＥＴやＳＰＥＣＴ等汎用されている画像診断法への適用の観点から、本発明のプローブはＲＩ標識化されていることが特に好ましい。ＰＥＴ核種としては、例えば、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、６８Ｇａ、１２４Ｉ、１８Ｆ等が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＰＥＣＴ核種としては、例えば、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ等が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの放射性金属元素で本発明のタンパク質を標識するには、本発明のタンパク質に放射性金属配位子を有する金属キレート剤を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。すなわち、本発明のタンパク質はキレーターを介して放射性金属元素で標識化されるのが好ましい。その際、キレーターの結合により本発明のタンパク質の活性（ＰＳ結合性、ＰＳ特異性）が損なわれることを避けるため、前述のように本発明のタンパク質の配列を適宜改変してもよい。
【００２２】
このような錯体形成に用いられる金属キレート剤の例としては、例えば、
（１）８−ヒドロキシキノリン、８−アセトキシキノリン、８−ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ−アセチルオキシン、Ｏ−ベンゾイルオキシン、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；
（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２−メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；
（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；
（４）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
【００２３】
本発明のタンパク質は、細胞膜に種々存在するリン脂質のうち、ＰＳに特異的に結合することができる。なお、その結合能は、既知のＰＳ結合タンパク質であるＡｎｎｅｘｉｎ
Ａ５と同等である。また、一般に標識体では標識前よりも標的分子への結合能の低下が
みられるが、本発明のタンパク質はＲＩ等で標識化したプローブの態様としてもＰＳへの結合性が低下せず維持される。
上記性質に基づき、本発明のプローブは、細胞膜表面にＰＳを表出させている細胞のＰＳに結合し、それにより該細胞を検出することができる。一般に、生細胞ではＰＳは細胞膜の内側に存在しているが、死細胞においては細胞膜表面にＰＳを表出させるため、本発明のプローブは死細胞を特異的に検出することができる。具体的には、アポトーシス細胞及びネクローシス細胞を検出することができ、アポトーシス誘導等で死につつある段階にある細胞も既に細胞死を起こした細胞も検出することができる。
【００２４】
また、本発明のタンパク質は、改変型Ｔｉｍ４タンパク質を融合タンパク質としたことにより、生体に投与した場合に腎臓への非特異的集積を生じず、アポトーシス細胞及び／
又はネクローシス細胞を有する部位・組織へ特異的に集積する。
さらに、本発明のタンパク質は、Ｃａ２＋濃度に依存せずにＰＳへ結合するため、本発明のプローブを生体に投与した場合でも定量的な解析を可能にする。
【００２５】
したがって、本発明のタンパク質は、プローブの態様とすることで死細胞を高感度に検出することができ、生体内において細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブとなり得る。特に、ＲＩ等で適宜標識化することにより、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ等の画像診断におけるトレーサーとして用いることができる。したがって、本発明のプローブは、腫瘍の画像診断剤に含めることができ、また該画像診断剤を画像診断用キットの態様とすることもできる。
本発明のプローブを、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ等の画像診断におけるトレーサーとして用いた場合の利用態様としては、癌等の疾患診断、薬剤の治療効果判定へ適用を挙げることができる。対象となる癌や腫瘍組織の種類は特に限定されない。
【００２６】
本発明のプローブを用いてアポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞、あるいはこれらを含む腫瘍組織を検出する方法を行う場合は、一般的な手法に準じて行う。
インビトロにおいては、例えば、試料細胞に対して本発明のプローブを添加し、適当な時間反応させた後に、標識に応じた手法での検出を行えばよい。
生体においては、本発明のプローブを対象個体の静脈へ注射（局所又は全身）や輸液等の手段にて投与し、適当時間経過後、例えば投与後１〜２４時間経過後にＳＰＥＣＴ又はＰＥＴにて放射線を測定し、診断や判定に供する。診断、検査の方法、手技は、通常の癌の診断や検査、又は通常の画像診断の方法、手技と基本的に変わらない。
【００２７】
本発明のプローブを個体に投与する場合の適用量としては、特に限定されるものではないが、ヒトに対しては１０〜１００μｇ／個体が好ましく、１５〜７４μｇ／個体がより好ましい。または、ＲＩ標識化したプローブの場合においては、５０〜２５０ＭＢｑ／個体、好ましくは４０〜２００ＭＢｑ／個体、より好ましくは３７〜１８５ＭＢｑ／個体となるように投与する。
また、マウスに対する投与量としては、５００〜７００μｇ／ｋｇが好ましく、ＲＩ標識化したプローブの場合は１０〜２５ＭＢｑ／個体が好ましい。
【実施例】
【００２８】
＜実施例１：野生型又は改変型ｍＴｉｍ４−Ｆｃの作製＞
以下の手順で、野生型又は改変型のマウスＴｉｍ４とヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク質
との融合タンパク質を作製した。
野生型マウスＴｉｍ４とヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク質との融合タンパク質（ｍＴｉ
ｍ４−Ｆｃ）の配列情報をコードしたプラスミドｐＴｉｍ４−Ｆｃ（長田重一教授提供、作製方法は非特許文献４を参照されたい）で、大腸菌（ＪＭ１０９、タカラバイオ）を形質転換し、プラスミドベクターを増幅した。該プラスミドベクターをＦＡＳＴＰＬＡＳＭＩＤ ＭＩＮＩ ＫＩＴ−２５０ ＰＲＥＰＳ（ＶＰｒｉｍｅ）を用いて精製し、得られた
ｐＴｉｍ４−Ｆｃを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）を用いてＰＣＲを行った。配列番号１１及び１２のプライマーを用いて、ｍＴｉｍ４−ΔＭ２３０−Ｆｃ（ｍＴｉｍ４部分において、野生型ｍＴｉｍ４のムチンドメインのＣ末端側を欠損させて、ムチンドメインのＮ末端から９６番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を残した改変型）をコードするＤＮＡ断片を調製した。また、配列番号１１及び１３のプライマーを用いて、ｍＴｉｍ４−ΔＭ１８４−Ｆｃ（ｍＴｉｍ４部分において、野生型ｍＴｉｍ４のムチンドメインのＣ末端側を欠損させて、ムチンドメインのＮ末端から５０番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を残した改変型）をコードするＤＮＡ断片を調製した。これらのＰＣＲ産物及びｐＴｉｍ４−Ｆｃをそれぞれ制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶ（ともにタカラバイオ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって目的
のバンドを切り出し、精製した。精製後のＰＣＲ産物とｐＴｉｍ４−Ｆｃをライゲーションし、大腸菌に形質転換した。アンピシリン添加ＬＢプレート（０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン、１．５％ アガロース、４０カプセル／Ｌ、Ｃｉｒｃｌｅ ｇｒｏｗ、Ｑ−ＢＩＯ
ｇｅｎｅ）に形質転換した大腸菌を播種し、３７℃、１６時間インキュベートした。形
成されたコロニーを鋳型として配列番号１４及び１５のプライマーとＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＭＡＸ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）を用いてコロニーＰＣＲを行い、形質転換体を確認後、ＤＮＡ配列解析を行った。ｍＴｉｍ４−Ｆｃ、ｍＴｉｍ４−ΔＭ２３０−Ｆｃ、及びｍＴｉｍ４−ΔＭ１８４−ＦｃをコードするＤＮＡをそれぞれ含む目的のプラスミドベクターを用いて、以下に示す方法にて各融合タンパク質の発現を行った。なお、作製した各発現タンパク質のＤＮＡ配列とアミノ酸配列及びムチンドメインのアミノ酸残基数を表１に示す。
【００２９】
【表１】
2014227398.tif 000003
【００３０】
融合タンパク質をコードするプラスミドベクターで形質転換した大腸菌を0.1 mg/mL アンピシリン、２００ｍＬ ＬＢ培地で３７℃、１６時間振とう培養し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて増幅したベクターを精製した。精製ベクターをリン酸カルシウム法で２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、２４時間後に培地をＤＭＥＭ培地に交換した。培地交換から４８時間後に培地を回収し、１０００×ｇで５分間遠心分離を行い、上清を回収した。回収した培地５０ｍＬあたりＰｒｏｔｅｉｎ Ａ アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２５μＬ加え、４℃
で一晩ローテートした。翌日ビーズを回収し、ＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０)で５回洗浄し、１００μＬの１００ｍＭグリシンバッファー、ｐＨ３．０でビーズを懸濁し、室温に5分間静置後、遠心分離によ
って上清を回収した。回収した上清をアミコンウルトラ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、３０ｋＤａ ｃｕｔ）を用いてＰＢＳに置換・濃縮し、使用まで−２０℃にて保存した。この結果
、培養上清２００ｍＬから１００〜１５０μｇの各融合タンパク質を得ることができた。
【００３１】
＜試験例１：ＰＥＴイメージング＞
以下の手順で、前述のようにして得た融合タンパク質（ｍＴｉｍ４−Ｆｃ、ｍＴｉｍ４−ΔＭ２３０−Ｆｃ、及びｍＴｉｍ４−ΔＭ１８４−Ｆｃ）をそれぞれＲＩ標識化した。
各融合タンパク質の保存液をＰＢＳ（D-PBS、和光純薬）に置換した。１０ｍＭ ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡ（ＮＯＴＡ、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）水溶液を０．１Ｎ Ｎａ
ＯＨでｐＨ７．９〜８．４に調整したものを、各融合タンパク質に対し１０００当量となるように加え、４℃にて一晩静置した。その後、ＰＢＳで平衡化した脱塩カラム（ＰＤ−１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉ.）でＮＯＴＡに結合した融合タンパク質と未反応のＮＯＴＡとを分離した。ＮＯＴＡ結合融合タンパク質分画をアミコンウルトラにて濃縮し、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）に置換し、ＮＯＴＡ結合融合タンパク質１μgあたり
６ＭＢｑの［６４Ｃｕ］ＣｕＣｌ２水溶液を加え、４０℃、３０分間保温し、６４Ｃｕの
キレート反応を行った。反応後、アミコンウルトラにて３００μＬの１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ６．５）で未反応の６４Ｃｕを３回洗い出し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
２０−ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に置換し、タンパク質濃度を測定した。その結果、９０％以上の精製度で、比放射能はおよそ６００〜８００ＭＢｑ/ｎｍｏｌのＲＩ標識体をそれぞ
れ得た（表２）。
【００３２】
【表２】
2014227398.tif 000004
【００３３】
ＰＥＴイメージング実験に際し、以下のようにモデル動物を作製した。
５〜６週齢の雄のBalb/c-Ajcl-nu/nuマウス（日本クレア）を用意し、２群（ＭＭＣ投
与群及びＶｅｈｉｃｌｅ群、各群３匹）に分けた。ＭＭＣ投与群にはＰＥＴ実験の２〜３週間前に、Ｖｅｈｉｃｌｅ群には１０日〜２週間前に、それぞれＡ４３１細胞を左大腿部に接種し、ＲＩ標識体投与の前日に腫瘍サイズが５０〜１２０ｃｍ３となった個体をＰＥＴ実験に使用した。ＲＩ標識体投与の１日、３日、５日前に、ＭＭＣ投与群にはＭＭＣ（マイトマイシンＣ）を５ｍｇ／６．２５ｍＬ／ｋｇとなるよう調整して尾静脈投与し、Ｖｅｈｉｃｌｅ群には６．２５ｍＬ／ｋｇの生理食塩水を尾静脈投与した。
前述のようにして調製した各６４Ｃｕ標識体を０．２〜０．２５ｍｇ／ｋｇ（１５〜２５ＭＢｑ／ｂｏｄｙ）となるように尾静脈投与し、投与後４８時間に１時間のダイナミック撮像を行った（MicroPET Focus 220、Siemens）。得られた画像を図１に示す。
すべての撮像終了後にマウスを解剖し、各組織の放射能をγ-カウンターにて測定した
（表３）。
これらの結果、［６４Ｃｕ］Ｔｉｍ４―Ｆｃを投与したＭＭＣ投与動物と生食投与動物間での差は見られなかったが、［６４Ｃｕ］ｍＴｉｍ４−ΔＭ２３０−Ｆｃ、及び［６４Ｃｕ］ｍＴｉｍ４−ΔＭ１８４−ＦｃではＭＭＣ投与動物において腫瘍への集積が認められた。
【００３４】
【表３】
2014227398.tif 000005
【００３５】
＜試験例２：標的組織におけるアポトーシスの判定＞
前述のＰＥＴ実験終了後、マウスから腫瘍を摘出し凍結切片を作製した。作製した凍結切片は冷却メタノール固定した後、使用まで−２０℃で保存し、解剖から３〜５日間の間に実験に使用した。
凍結切片をＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ、Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ（Ｄａｋｏ）でブロッ
キングし、ＤｅａｄＥｎｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いてＴＵＮＥＬ染色後、１０００倍希釈した一次抗体（Ｃｌｅａｖｅｄ
Ｃａｓｐａｓｅ−３（Ａｓｐ１７５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＣＳＴ）を室温で２時間反応
させ、さらに二次抗体（Ｃｙ３標識抗ウサギＩｇＧ抗体）を室温で２時間反応させた。また、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５６（Ｄｏｊｉｎｄｏ）をもちいて核染色も行った。反応後、試料を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
結果を図２に示す。ＭＭＣ投与個体から採取した腫瘍の凍結切片では、全体に活性化カスパーゼ３抗体とＴＵＮＥＬの陽性細胞が観察された。一方、生理食塩水投与個体のものはいずれも陰性であった。このことから、ＭＭＣ投与個体の腫瘍ではアポトーシスが生じていることを確認した。
【００３６】
＜実施例２：野生型又は改変型ｈＴｉｍ４−Ｆｃの作製＞
以下の手順で、ヒトＴｉｍ４（野生型、ムチンドメインの長さを様々に変えた改変型）とヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク質との融合タンパク質を作製した。
ｈＴｉｍ４配列をコードしたベクター（ｐＣＭＶ６−ＸＬ５ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １ ａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔｉｏｎ−ｒｅａｄｙ ＤＮＡ、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を鋳型として、５’末端にＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを含むプライマー（配列番号２２）及び３’末端にＢｇｌＩＩ制限サイトを含むプライマー（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物とヒトＩｇＧ−Ｆｃ領域をコードしたｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１ｅ３―Ｆｃ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）をそれぞれＥｃｏＲＶ及びＢｇｌＩＩで消化したものをライゲーションし、大腸菌（ＪＭ１０９、タカラバイオ）に形質転換させ、コロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドを抽出しＤＮＡ配列解析を行い、ｈＴｉｍ４配列の挿入されたコロニーを大量培養しベクターを得た。得られたベクターを配列番号２０及び２
１に示すプライマーを用いて増幅し、タンパク質発現用ベクター（ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。挿入ベクターを大腸菌（Ｔ
ＯＰ１０、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換し、ＤＮＡ配列解析で挿入
方向を確認し、得られたベクターをｐｈＴｉｍ４−Ｆｃとした。表４に示す各プライマーと、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ）
を使用して、野生型のムチンドメインのＣ末端及び／又はＮ末端を削除した様々な長さのムチンドメインを持つ融合タンパク質をコードするベクターを作製した。具体的には、ｐｈＴｉｍ４−Ｆｃを鋳型として、ｐｈＴｉｍ４−２４０−Ｆｃ及びｐｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃを、得られたｐｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃを鋳型として、ｐｈＴｉｍ４−１８４−Ｆｃ、ｐｈＴｉｍ４−１８１−Ｆｃ、ｐｈＴｉｍ４−１７８−Ｆｃ、ｐｈＴｉｍ４−１７５−Ｆｃ、ｐｈＴｉｍ４−１６２−Ｆｃ、ｐｈＴｉｍ４−１４９−Ｆｃ、ｐｈＴｉｍ４−１３５−Ｆｃ、ｐｈＴｉｍ４−１３０−Ｆｃ及びｐｈＴｉｍ４−Δ１３１−１８７−Ｆｃを、ｐｈＴｉｍ４−２４０−Ｆｃを鋳型として、ｐｈＴｉｍ４−Δ１３１−２４０−Ｆｃを、ｐｈＴｉｍ４−Δ１３１−１８７−Ｆｃを鋳型として、ｐｈＴｉｍ４−Δ１３１−１８７Δ２４１−３１０−Ｆｃを作製した。作製した各発現タンパク質のＤＮＡ配列とアミノ酸配列及びムチンドメインのアミノ酸残基数を表５に示す。
得られたベクター３７．５μｇを１×１０６個／ｍＬに調整したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ 
２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３０ ｍＬにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ 
ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクションし、３７℃、８％ ＣＯ２の条件下で４日間振とう培養し、培養３日目に１０ｍＬ
の培地を追加した。回収した培養上清４０ｍＬに対しＰｒｏｔｅｉｎ Ａアガロースビー
ズ（Ｐｉｅｒｃｅ）２５０μＬを加え、発現タンパク質を回収した。回収した発現タンパク質をゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ＰＢＳ ｐＨ６．８に置換し４℃で使用まで保存した。精製タン
パク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、非還元状態における分子量を算出した（表６）。
【００３７】
【表４】
2014227398.tif 000006
【００３８】
【表５】
2014227398.tif 000007
【００３９】
【表６】
2014227398.tif 000008
【００４０】
＜試験例３：野生型又は改変型ｈＴｉｍ４−ＦｃのＰＳに対する結合能の評価１＞
以下の手順でドットブロッティングを行い、前述のように作製した各融合タンパク質（ｈＴｉｍ４−Ｆｃ）のＰＳに対する結合能を検討した。
１０ｍｍ角のＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に０．１５μｇのＰＳをスポ
ットし、２４穴プレート中で５００μＬのブロッキングバッファー（５％スキムミルク−ＰＢＳ−Ｔ）を用いて室温で１時間インキュベートし、ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーに各融合タンパク質を終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるように加え、４℃で一晩インキュベートした。コントロールはブロッキングバッファーのみとした。その後、ＰＶＤＦ膜を２ｍＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、５００μＬのブロッキングバッファーで１００００倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）溶液中で室温にて２時間インキュベートした。その後、２ｍＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＥＣＬ ｐ
ｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で化学発光させ、ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆ
ｉｌｍ）で検出した。
図３に示す結果のとおり、ｈＴｉｍ４−２４０−Ｆｃ、ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ、ｈＴｉｍ４−１８４−Ｆｃ、ｈＴｉｍ４−１８1-Fc、ｈＴｉｍ４−１７８−Ｆｃ、ｈＴｉｍ４−１７５−Ｆｃ及びｈＴｉｍ４−１６２−ＦｃでＰＳへの結合が確認された。
【００４１】
＜試験例４：野生型又は改変型ｈＴｉｍ４−ＦｃのＰＳに対する結合能の評価２＞
以下の手順でＥＬＩＳＡを行い、前述のように作製した各融合タンパク質（ｈＴｉｍ４−Ｆｃ）のＰＳに対する結合能を検討した。
１００μＬのＰＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ）または溶媒（メタノール）を９６穴プレートに入れ、乾固させた。２００μＬの０．５％カゼイン‐ＰＢＳで、室温２時間または４℃で一晩ブロッキングを行い、サンプルの１０倍希釈系列を作製し、一次反応を行った。二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体を用いて、ＴＭＢによる発色による吸光度
をマイクロプレートリーダーで測定した。測定結果から計算ソフトＰｒｉｓｍ ｖｅｒ.５．０４を用いて最大結合量（Ｂｍａｘ）および５０％効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。結果を表７に示す。
【００４２】
【表７】
2014227398.tif 000009
【００４３】
＜試験例５：改変型ｈＴｉｍ４−ＦｃのＰＳに対する結合特異性の評価＞
以下の手順でドットブロッティングを行い、本発明の融合タンパク質の種々のリン脂質に対する結合性を検討した。
ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１００ｐｍｏｌ／μＬの３−ｓｎ−Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＥ）、Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＣ）、Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＰＩ）、及び３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）を各１μＬスポットし、２ｍＬのブロッキングバッファー（５％スキムミルク−ＰＢＳ）を用いて室温で１時間インキュベートし、ブロッキングを行った。各ウェルにブロッキングバッファーにｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃを終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるように加え、室温で２時間インキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜を５ｍＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄したのち、２ｍＬのブロッキングバッファーで１００００倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）溶液中で室温にて２時間反応させた。反応後、５ｍＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で化学発光させ、ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）で検出した。
図４に示す結果のとおり、ｈＴｉｍ４−１８７−ＦｃはＰＳにのみ結合することを確認した。
【００４４】
＜試験例６：アポトーシス誘導細胞の検出＞
以下の手順で免疫染色を行い、アポトーシスを誘導した細胞に対するｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ又はＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５の結合性を検討した。
１×１０６個／ｍＬのＪｕｒｋａｔ細胞に終濃度１００μＭのＥｔｏｐｏｓｉｄを加え、５％ ＣＯ２、３７℃で６時間培養し、アポトーシスの誘導を行った。細胞を回収し冷
却ＰＢＳで洗浄後、２％ＦＢＳ−ＰＢＳに１×１０７個／ｍＬとなるよう懸濁した。ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃによる免疫染色は、前記細胞液に終濃度がそれぞれ０．５μｇ／ｍＬ ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ、２．５ｎｇ／ｍＬ ＣＦ４８８標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、２０μＬ／ｍＬ Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）溶液（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を加え、室温で５分間インキュベートした。その後冷却ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５による染色は、前記細胞液に対し
てＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて行い、同様に蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図５に示す。既存のプローブであるＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５同様に、ｈＴｉｍ４−
１８７−Ｆｃはアポトーシス誘導細胞に対して結合性を示し、また生細胞に対しては結合しないことが確認された。なお、ＰＩ陽性は死細胞を示すところ、Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５
と同様に、ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃはアポトーシス誘導され死につつある段階にある細胞と死細胞とを検出できることも確認された。
【００４５】
＜実施例３：アミノ酸置換型ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃの作製＞
以下の手順で、改変型ヒトＴｉｍ４（ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ）のＩｇＶドメインの６０番目と１１９番目のリジンをアルギニン、ヒスチジン、メチオニン、またはグルタミンに置換した置換型融合タンパク質をコードするベクターを作製した。ベクターの作製には、PrimeSTAR(R) Mutagenesis Basal Kit (Takarabio) を使用し、ｐｈＴｉｍ４−１８
７−Ｆｃを鋳型として、表８に示すプライマーを用いて、所定のアミノ酸の置換を行った。
得られたベクターを１×１０６個／ｍＬに調整したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞
（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３０ ｍＬにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクションし、３
７℃、８％ ＣＯ２の条件下で４日間振とう培養し、培養３日目に１０ｍＬの培地を追加
した。回収した培養上清４０ｍＬに対しＰｒｏｔｅｉｎ Ａアガロースビーズ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）２５０μＬを加え、発現タンパク質を回収した。回収した発現タンパク質をゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ＰＢＳ ｐＨ６．８に置換し４℃で使用まで保存した。
精製後の各変異型融合タンパク質について、以下の手順でキレーターを付加した。ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ、和光純薬）に置換し、１０ｍＭ ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−ｅｓｔｅｒ （ＤＯＴＡ, Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）水溶液を１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０〜７．５に調整
し、各変異型融合タンパク質に対し１０００当量となるように加え、４℃にて一晩静置した。その後、ＰＢＳで平衡化した脱塩カラム（ＰＤ−１０, Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉ.）でＤＯＴＡ−ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃと未反応のＤＯＴＡを分離した。
【００４６】
【表８】
2014227398.tif 000010
【００４７】
＜試験例７：アミノ酸置換型ｈＴｉｍ４−１８７−ＦｃのＰＳに対する結合能の評価＞
以下の手順でＥＬＩＳＡを行い、前述のように作製したアミノ酸置換型ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃの、キレーター付加前後でのＰＳに対する結合能を検討した。
１００μＬのＰＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ）または溶媒（メタノール）を９６穴プレートに入れ、乾固させた。２００μＬの０．５％カゼイン−ＰＢＳで室温２時間または４℃で一晩ブロッキングを行い、サンプルの１０倍希釈系列を作製し、一次反応を行った。二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体を用いて、ＴＭＢによる発色による吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。測定結果から計算ソフトＰｒｉｓｍ ｖｅｒ.５．０４を用いて最大結合量（Ｂｍａｘ）および５０％効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。アッセイ間のばらつきを補正するため、すべてのアッセイにおいてキレーター未付加ｈＴｉｍ４−１８４−Ｆｃをコントロールとして、算出されたＢｍａｘ及びＥＣ５０の補正を行った。補正に用いたｈＴｉｍ４−１８４−ＦｃのＢｍａｘ及びＥＣ５０の平均値±標準偏差はそれぞれ０．５１±０．１３及び３４．８７±２３．９１であった。
表９に示す結果のとおり、例えば６０番目と１１９番目のリジンをアルギニンに置換したものと、６０番目のリジンをアルギニンにかつ１１９番目のリジンをメチオニンに置換したものは、キレーター付加後であってもＰＳ結合能を特に有することが確認された。
【００４８】
【表９】
2014227398.tif 000011
【００４９】
＜試験例８：ＰＥＴイメージング＞
以下の手順で、前述のように作製したアミノ酸置換型ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ（ｈＴｉｍ４−１８７―Ｆｃ−Ｋ６０Ｒ,Ｋ１１９Ｒ）をＲＩ標識化した。
ｈＴｉｍ４−１８７―Ｆｃ−Ｋ６０Ｒ,Ｋ１１９ＲをＰＢＳ（ｐＨ７．５）に置換し、
１０ｍＭ ＮＯＴＡ 水溶液（１Ｎ ＨＣｌでｐＨ ８．３〜８．５に調整）をｈＴｉｍ４−１８７―Ｆｃ−Ｋ６０Ｒ,Ｋ１１９Ｒに対しモル比で５０倍となるように加え、０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ ８．３〜８．５に調整し４℃にて一晩静置した。その後、ＰＢＳで平衡
化した脱塩カラムでＮＯＴＡ−ｈＴｉｍ４−１８７―Ｆｃ−Ｋ６０Ｒ,Ｋ１１９Ｒと未反
応のＮＯＴＡを分離した。ＮＯＴＡ−ｈＴｉｍ４−１８７―Ｆｃ−Ｋ６０Ｒ,Ｋ１１９Ｒ
分画をアミコンウルトラにて濃縮し、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）に置換し、ＮＯＴＡ−ｈＴｉｍ４−１８７―Ｆｃ−Ｋ６０Ｒ,Ｋ１１９Ｒ  １μｇあたり３ＭＢｑ
の［６４Ｃｕ］ＣｕＣｌ２水溶液を加え、４０℃、３０分間保温し、６４Ｃｕのキレート反応を行った。反応後、アミコンウルトラにて３００マイクロＬの１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ６．５）で未反応の６４Ｃｕの洗い出しを３回行い、ＰＢＳ−Ｔに置換し、タンパク質濃度の測定を行った。その結果、精製度９０％以上、比放射能は約５５０ＭＢｑ／ｎｍｏｌの標識体を得た（表１０）。
【００５０】
【表１０】
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【００５１】
試験例１同様に作製したモデル動物（ＭＭＣ投与群及びＶｅｈｉｃｌｅ群）を使用した。６４Ｃｕ標識タンパク質を０．２〜０．３ｍｇ／ｋｇ（１５〜２５ＭＢｑ／ｂｏｄｙ）となるように尾静脈投与し、投与後４８時間に１時間のダイナミック撮像を行った。すべての撮像終了後にマウスを解剖し、摘出した各臓器・組織の放射能をγ-カウンターにて
測定し、％ＩＤ／ｇ±標準偏差を算出した（ｎ＝２）。この結果、腫瘍におけるＲＩの集積はＭＭＣ投与動物において生食投与動物の１．５倍認められた（表１１、図６）。
【００５２】
【表１１】
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【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、死細胞を高感度に検出することができ、生体内において細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブが提供される。したがって、生体内における細胞死を的確に検出し画像化して、疾患の診断や薬剤の試料効果判定に供することができるため、産業上非常に有用である。
【００５４】
本発明は前述の通り好ましい態様で開示されるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱しない限りにおいて改変や刷新が行われてもよいことを知っている。したがって、本発明の範囲は後述のクレームによって定義されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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