(57)【要約】      （修正有）【課題】イバブラジン及びその薬学的に許容しうる酸とのその付加塩の合成方法の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表されるイバブラジン合成中間体化合物の合成方法。2014168461.tif 000030有機溶媒とｐＨ５〜１０を有する水性溶液との混合物中、溶媒混合物１リットルあたり１〜５００ｇの濃度の対応するラセミ体のニトリルを、コンピテント生物系を有する別の生物において過剰発現したロドコッカス・ロドクラウスのニトリラーゼにより、１／１〜１／１００のＥ／Ｓ比、２５℃〜４０℃の温度で、エナンチオ選択的酵素的加水分解を行う、合成方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的に純粋な式（Ｉ）：
【化１６】
2014168461.tif 000021
で示される化合物の合成方法であって、
式（ＩＶ）：
【化１７】
2014168461.tif 000022
で示される、ラセミ体、すなわち光学的に純粋でない、ニトリルのエナンチオ選択的酵素的加水分解による、
コンピテント生物系を有する別の生物において過剰発現したロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）NCIMB 11216 のニトリラーゼを使用し、
有機溶媒と、ｐＨ５〜１０を有する水性溶液との混合物中、
溶媒混合物１リットルあたり式（ＩＶ）のニトリル１〜５００ｇの濃度で、
１／１〜１／１００のＥ／Ｓ比で、
２５℃〜４０℃の温度での、
合成方法。
【請求項２】
コンピテント生物系を有する生物が、再編成したプラスミドを含む細菌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ニトリラーゼを過剰発現している細菌を、細菌スラリー又は凍結乾燥の形態で直接使用する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ＤＭＦ、アセトン、アセトニトリル、エタノール、イソプロパノール、ＴＨＦ及びＭＴＢＥより選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
下記：
【化１８】
2014168461.tif 000023
で示される二次的反応生成物である、立体配置（Ｒ）のニトリルが、酵素的加水分解法で再利用されるために、塩基の作用よってラセミ化されて、式（ＩＶ）のラセミニトリルを形成する、請求項１〜４のいずれか一項記載の合成方法。
【請求項６】
塩基が、ＤＢＵである、請求項５記載の合成方法。
【請求項７】
ラセミ化工程が、インサイツで実施される、請求項５又は請求項６のいずれかに記載の合成方法。
【請求項８】
式（Ｉ）の酸が、１つ以上の酵素的加水分解サイクル後に単離される、請求項５〜７のいずれか一項記載の合成方法。
【請求項９】
式（ＩＩＩ）：
【化１９】
2014168461.tif 000024
で示される化合物の合成方法であって、
請求項１〜８のいずれか一項に従って、
式（ＩＶ）：
【化２０】
2014168461.tif 000025
で示されるニトリルから出発して、
これを加水分解して、
光学的に純粋な式（Ｉ）：
【化２１】
2014168461.tif 000026
で示される酸を形成し、次にこれを、
光学的に純粋な式（ＸＩ）：
【化２２】
2014168461.tif 000027
で示されるアミドに変換し、
これの還元により、式（ＩＩＩ）で示される化合物を得る、合成方法。
【請求項１０】
式（ＩＩＩ）の化合物を形成するための式（ＸＩ）の化合物の還元は、ＢＨ３、ＮａＢＨ４又はＬｉＡｌＨ４により実施される、請求項９記載の合成方法。
【請求項１１】
式（ＩＩＩ）の化合物を、引き続き、
式（ＸＩＩ）：
【化２３】
2014168461.tif 000028
［式中、Ｘは、ハロゲン原子を表す］で示される化合物とカップリングするか、又は、
式（ＸＩＩＩ）：
【化２４】
2014168461.tif 000029
［式中、
Ｒ２は、ＣＨＯ及びＣＨＲ３Ｒ４より選択される基を表し、
Ｒ３及びＲ４は、各々、直鎖状もしく分岐鎖状（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基を表すか、又はそれらを担持する炭素原子と一緒になって、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソランもしくは１，３−ジオキセパン環を形成する］で示される化合物と、還元剤の存在下、還元的アミノ化反応に供するかのいずれかにより、
イバブラジンを生成し、次にこれを薬学的に許容しうる酸との付加塩（無水又は水和物の形態）に変換する、請求項９又は請求項１０のいずれかに記載の合成方法。
【請求項１２】
Ｘが、ヨウ素原子である、請求項１１記載の合成方法。
【請求項１３】
式（ＩＩＩ）の化合物が、その塩酸塩の形態で還元的アミノ化反応において使用されて、イバブラジンを塩酸塩の形態で得る、請求項１１記載の合成方法。
【請求項１４】
式（ＸＩＩＩ）の化合物との還元的アミノ化反応を、パラジウム担持炭素によって触媒される二水素の存在下で実施する、請求項１０又は請求項１３のいずれかに記載の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2014168461.tif 000002
で示される化合物の酵素的合成方法に関し、そしてまた、
式（ＩＩ）：
【化２】
2014168461.tif 000003
で示されるイバブラジン、すなわち、３−｛３−［｛［（７Ｓ）−３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−イル］メチル｝（メチル）アミノ］−プロピル｝−７，８−ジメトキシ−１，３，４，５−テトラヒドロ−２Ｈ−３−ベンゾアゼピン−２−オン、薬学的に許容しうる酸とのその付加塩及びそれらの水和物の合成における、式（Ｉ）の化合物の適用に関する。
【０００２】
イバブラジン、及び薬学的に許容しうる酸とのその付加塩、ならびにより特別にはその塩酸塩は、非常に有益な薬理学的及び治療的特性、特に徐脈特性を有しており、これらの特性により、それらの化合物は、狭心症、心筋梗塞及び関連する律動障害のような心筋虚血の種々の臨床症状の治療又は予防において、ならびに律動障害、特に上室性律動障害が関与する種々の病態において、及び心不全において有用となっている。
【０００３】
イバブラジン及び薬学的に許容しうる酸とのその付加塩、ならびにより特別にはその塩酸塩の調製及び治療的使用は、欧州特許明細書 EP 0 534 859に記載されている。
【０００４】
前記特許明細書は、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2014168461.tif 000004
で示される化合物、すなわち（７Ｓ）−１−（３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−イル）Ｎ−メチルメタンアミンから出発する、イバブラジン塩酸塩の合成について記載している。
【０００５】
式（ＩＩＩ）の化合物は、イバブラジン及びその薬学的に許容しうる塩の合成において重要な中間体である。
【０００６】
従来技術は、式（ＩＩＩ）の化合物を得るための幾つかの方法を開示している。
【０００７】
特許明細書 EP 0 534 859は、式（ＩＩＩ）の化合物の合成であって、
式（ＩＶ）：
【化４】
2014168461.tif 000005
で示されるニトリルの、テトラヒドロフラン中のＢＨ３による還元、
続く、塩酸の付加により、
式（Ｖ）：
【化５】
2014168461.tif 000006
で示されるラセミアミンの塩酸塩を生成し、
これを、クロロギ酸エチルと反応させて、
式（ＶＩ）：
【化６】
2014168461.tif 000007
で示されるカルバマートを生成し、
これのＬｉＡｌＨ４による還元により、式（ＶＩＩ）：
【化７】
2014168461.tif 000008
で示されるラセミメチル化アミンを生成し、
カンファースルホン酸を使用するこれの分割により、式（ＩＩＩ）の化合物を得る、
式（ＩＩＩ）の化合物の合成について記載している。
【０００８】
この方法は、式（ＩＶ）のラセミニトリルから出発して、式（ＩＩＩ）の化合物を２〜３％のわずかな低収率でしか得られない欠点を有している。この非常に低い収率は、式（ＶＩＩ）の第二級アミンの分割工程の低収率（４〜５％）が原因である。
【０００９】
特許明細書 EP 2 166 004は、式（ＩＩＩ）の化合物を得ることを記載しており、キラルクロマトグラフィーを使用して、式（ＩＶ）のラセミニトリルの光学的分割により、
光学的に純粋な式（ＩＸ）：
【化８】
2014168461.tif 000009
で示されるニトリルを生成し、これを、ＮａＢＨ４を用いるか又は加水分解性水素により還元して、式（ＶＩＩＩ）の第一級アミンを生成する。次に、第一級アミンを上記と同じ反応順序（カルバマートへの変換、そして続く還元）を使用してメチル化することができる。それにより、式（ＩＩＩ）の化合物を、式（ＩＶ）のラセミニトリルから出発して５工程にて、分解工程については収率４５．６％で得ることができる。
【００１０】
加水分解性ニトリラーゼ酵素（酵素の国際分類番号：EC 3.5.5.1）を用いることは、式（ＩＶ）のラセミニトリルから出発して式（Ｉ）の光学的に純粋な酸を直接得ることを可能にするために、かつそれによりラセミニトリルから出発して式（ＩＩＩ）のメチル化アミンを得るための工程数を減らすことを可能にするために、有望に見えた。
【００１１】
式（Ｘ）：
【化９】
2014168461.tif 000010
で示されるニトリルは、Almac社によって市販されているNESK-1400スクリーニングキットのニトリラーゼの基質として記載されている。
【００１２】
しかし、これらと同じニトリラーゼを式（ＩＶ）のニトリルに使用すること（比較実施例Ａを参照のこと）は、大部分の場合、結果としてアミドと酸の同時形成（ニトリルヒドラターゼ活性）をもたらし、それらが僅かな選択性を伴う低い活性しか有しないことを示したので、これを、式（ＩＩＩ）の化合物の合成において中間体を得るための合成目的に利用することは困難である。
【００１３】
したがって本発明の課題は、アミドの形成を最小限にしながら、式（ＩＶ）のラセミニトリルから出発して、式（Ｉ）の光学的に純粋な酸のエナンチオ選択的合成を可能にするニトリラーゼを見出すことであった。
【００１４】
次に本出願者は、立体配置Ｓの、式（Ｉ）の酸の優先的形成を伴う様々な全微生物におけるニトリラーゼ活性の証拠を見出した。試験した微生物のうち、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodocrous）だけは、（Ｓ）酸が、アミドの形成なしに、非常に良好なエナンチオ選択性を持って得られることを可能にした（比較実施例Ｂを参照のこと）。この活性は、ニトリラーゼの過剰発現によって向上した。
【００１５】
驚くべきことに、この過剰発現したニトリラーゼを使用する酵素的加水分解は、式（Ｘ）の基質に対してエナンチオ選択的ではない（比較実施例Ｃを参照のこと）。
【００１６】
より具体的には、本発明は、光学的に純粋な式（Ｉ）：
【化１０】
2014168461.tif 000011
で示される化合物の合成方法であって、
式（ＩＶ）：
【化１１】
2014168461.tif 000012
で示される、ラセミ体、すなわち光学的に純粋でない、ニトリルのエナンチオ選択的酵素的加水分解による、
細菌、酵母又は真菌のようなコンピテント生物系を有する別の生物において過剰発現したロドコッカス・ロドクラウス NCIMB 11216 のニトリラーゼを使用し、
有機溶媒と、ｐＨ５〜１０を有する水性溶液との、好ましくはｐＨ５〜１０を有する緩衝液との混合物中、
１〜５００g/Lの、好ましくは溶媒混合物１リットルあたり式（ＩＶ）のニトリル２ｇ〜１００ｇの濃度で、
１／１〜１／１００のＥ／Ｓ比で、
２５℃〜４０℃の温度での、
合成方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）の過剰発現したニトリラーゼを使用するニトリルの酵素的加水分解における、６時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２】ＮＩＴ１１５を使用するニトリルの酵素的加水分解における、５時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【００１８】
本発明の態様に従って、ニトリラーゼは、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、好ましくは E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21(DE3)pLysS、E. coli BL21star(DE3)又はE. coli JM9(DE3)のような再編成したプラスミドを含む細菌中で過剰発現される。
【００１９】
本発明の態様に従って、有機溶媒は、水と完全に又は部分的に混和性である溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド、ＤＭＦ、アセトン、アセトニトリル、アルコール（例えば、エタノール又はイソプロパノール）、又はエーテル（例えば、ＴＨＦ又はＭＴＢＥ）である。
【００２０】
本発明の別の態様に従って、有機溶媒は、例えば、炭化水素（例えば、ヘプタン又はオクタン）のように水と混和性でない。
【００２１】
水性溶液は、好ましくは、ｐＨ約７を有する緩衝液である。
【００２２】
本発明の態様に従って、ニトリラーゼを過剰発現している細菌を、細菌スラリー又は凍結乾燥の形態で、該方法において直接使用する。
【００２３】
Ｅ／Ｓ比は、好ましくは、細菌スラリーの場合は１／１〜１／１０、及び凍結乾燥の場合は１／１０〜１／２０である。
【００２４】
本発明の別の態様に従って、ニトリラーゼは、精製した酵素の形態で使用される。
【００２５】
本発明による酵素的加水分解の図解は、下記のようである：
【化１２】
2014168461.tif 000013
【００２６】
有利には、二次的反応生成物である、立体配置（Ｒ）のニトリルは、酵素的加水分解法で再利用されるために、有機塩基（例えば、ＤＢＵ）又はミネラル塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム又は炭酸ナトリウム）の作用よってラセミ化される。
【００２７】
ラセミ化工程がインサイツで実施される場合、本発明による方法は、９８％より多いｅｅ（鏡像体過剰率）を有する、式（Ｉ）のＳ酸を得ることを可能にする動的速度論的分割（ＤＫＲ）方法である。
【００２８】
式（Ｉ）の酸は、好ましくは１つ以上の酵素的加水分解サイクルの後に、反応媒体から単離される。
【００２９】
定義
光学的に純粋な化合物とは、９０％より大きい又は９０％に等しい鏡像体過剰率を有する化合物であると理解される。
【００３０】
光学的に純粋でないニトリルとは、９０％未満の鏡像体過剰率を有するニトリルであると理解される。
【００３１】
ラセミニトリルとは、５５：４５〜４５：５５の比率の２つの鏡像異性体の混合物の形態のニトリルであると理解される。
【００３２】
ラセミ体、すなわち光学的に純粋でない、ニトリルのエナンチオ選択的加水分解とは、混合物の鏡像異性体のうちの１つの優先的加水分解であると理解される。
【００３３】
コンピテント生物系とは、（ａ）目的の組換えタンパク質を生物種が産生することができるように、生物種の遺伝子材料が遺伝子的組換えにより改変された生物種（宿主細胞）を指すと理解される。その目的のために構築された発現ベクター（プラスミド）は、目的の遺伝子をコードするＤＮＡを宿主細胞に移入することができ、それにより機能タンパク質を効率的（過剰）に発現し得る。
【００３４】
本発明の別の態様は、僅か２工程での式（ＩＩＩ）の化合物の合成方法であって、光学的に純粋な式（Ｉ）の酸から出発し、これが、光学的に純粋な式（ＸＩ）：
【化１３】
2014168461.tif 000014
で示されるアミドに変換され、
これの、好ましくはＢＨ３、ＮａＢＨ４又はＬｉＡｌＨ４による還元により、式（ＩＩＩ）の化合物を生成する、合成方法に関する。
【００３５】
式（ＩＩＩ）の化合物を、引き続き、
式（ＸＩＩ）：
【化１４】
2014168461.tif 000015
［式中、Ｘは、ハロゲン原子、好ましくはヨウ素原子を表す］で示される化合物とカップリングするか、又は、
式（ＸＩＩＩ）：
【化１５】
2014168461.tif 000016
［式中、
Ｒ２は、ＣＨＯ及びＣＨＲ３Ｒ４より選択される基を表し、
Ｒ３及びＲ４は、各々、直鎖状もしく分岐鎖状（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基を表すか、又はそれらを担持する炭素原子と一緒になって、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソランもしくは１，３−ジオキセパン環を形成する］で示される化合物と、還元剤の存在下、還元的アミノ化反応に供するかのいずれかにより、
イバブラジンを生成し、次にこれを薬学的に許容しうる酸との付加塩（該塩は、無水又は水和物の形態である）に変換する。
【００３６】
式（ＩＩＩ）の化合物はまた、薬学的に許容しうる酸とのその付加塩、好ましくはその塩酸塩の形態で還元的アミノ化反応において使用し得る。その場合、イバブラジンは、塩酸塩の形態で直接得られる。
【００３７】
薬学的に許容しうる酸には、いかなる限定もするわけではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸及びカンファー酸を挙げることができる。
【００３８】
式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＸＩＩＩ）の化合物との還元的アミノ化反応に使用し得る還元剤には、いかなる限定もするわけではないが、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムもしくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような水素化ドナー化合物、及び特に担体形態又は酸化物形態の、パラジウム、白金、ニッケル、ルテニウム、ロジウム又はその化合物のような触媒の存在下での二水素を挙げることができる。式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＸＩＩＩ）の化合物との還元的アミノ化反応に好ましい還元剤は、パラジウム担持炭素によって触媒される二水素である。
【００３９】
本明細書に下記の実施例は本発明を例証する。
【００４０】
略語
ＴＦＡ              トリフルオロ酢酸
ＴＬＣ              薄層クロマトグラフィー
ＤＢＵ              ジアザビシクロウンデセン
ＤＫＲ              動的速度論的分割
ＤＭＦ              ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ            ジメチルスルホキシド
ＯＤ                光学密度
Ｅ                  エナンチオ選択的係数
ｅｅ                鏡像体過剰率
ｅｑ                モル当量
ＨＰＬＣ            高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＴＧ            イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド
ＬＢ                ＬＢ（溶原）培地
ＭｅＯＨ            メタノール
ＭＴＢＥ            メチルtert−ブチルエーテル
ｏｐ                光学純度又はエナンチオマー純度
Ｅ／Ｓ比            酵素／基質の比（g/g）
ＮＭＲ              核磁気共鳴（分光分析）
ＭＳ                質量分析
ＴＨＦ              テトラヒドロフラン
ＴＭＳ              テトラメチルシラン
【００４１】
実施例１：  （７Ｓ）−３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボン酸
ニトリラーゼの過剰発現：
ロドコッカス・ロドクラウス NCIMB 11216のニトリラーゼタンパク質は、タンパク質及びゲノムのデータベースに記載されている。目的遺伝子の配列は、EMBL-BankのＥＮＡ（European Nucleotide Archive／欧州ヌクレオチドアーカイブ）中の識別子ＳＶＡ（Sequence Version Archive／配列版アーカイブ）「ＥＦ４６７３６７」に列記されている。この配列は、UniProtKB/TrEMBL データベース中の参照「Ａ４ＬＡ８５」に対応している。発現ベクター pET28a-Nit1で形質転換された生産菌株 E. coli BL21(DE3)を使用した。ニトリラーゼ過剰発現プロトコルは、Applied Biochemistry and Biotechnology 2010, Vol 160(2), pp 393-400に記載されている。それにより形質転換された細胞は、細菌スラリーの形態で直接使用されるか、又は使用前に凍結乾燥されるかのいずれかである。
【００４２】
過剰発現したニトリラーゼを使用する酵素的加水分解
上記プロトコルに従って形質転換された細胞を、５．６×１０９細胞／mLの濃度で撹拌した（ＯＤ＝１（６００nm）での培養液１mLは、１．１０９細菌及び細菌スラリー約１０mg又は凍結乾燥１．５mgに相当する）。リン酸緩衝液ＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（１／１５M、ｐＨ７）２５０mLの溶液に、E. coliの凍結乾燥１ｇ及び２％ＤＭＳＯ（５mL）中の３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリル５００mg（ｃ＝２g/L、１０mM）を加えた。反応混合物を、２２０rpmで回転撹拌しながら、３０℃で６時間保持した。
【００４３】
測定すべき酸及びニトリルの鏡像体過剰率を許す条件下、反応をキラル相ＨＰＬＣによりモニタリングした：
Chiralpak IBカラム
９０％ｎ−ヘキサン １０％２−ＰｒＯＨ＋０．１％ＴＦＡ
１mL／分、３０℃、２８８nm
【００４４】
【表１】
2014168461.tif 000017
【００４５】
６時間後のキラル相ＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。
【００４６】
６時間反応させた後、高酸性ｐＨ（ｐＨ２）を得るために、反応混合物を１M ＨＣｌで酸性化し、次にジクロロメタン（２×１００mL）で抽出した。有機相を取り除いた。トルエン（２×１００mL）を使用する第２の抽出により、水相中に残っているすべての生成物を回収することが可能になった。有機相を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、次に無水硫酸マグネシウムを使用して乾燥させた。溶媒の蒸発の後、粗生成物を得たが、これをシリカカラムフラッシュクロマトグラフィーにより、以下の条件下、精製した：
カラムタイプ：８０ｇ ＳｉＯＨ Macherey-Nagel
材料及び方法：Reveleris（登録商標）
溶離剤：均一濃度（シクロヘキサン＋１％酢酸／酢酸エチル＋１％酢酸７５／２５）
検出：ＵＶ ２８８nm
流速：６０mL/分
結果：
ニトリル（Ｒ）：収率（収量）３６％（１７９mg）、ｅｅ（Ｒ）：９６％
酸（Ｓ）：収率（収量）３９％（２４６mg）、ｅｅ（Ｓ）：９６％
【００４７】
実施例２：  （Ｒ）ニトリルのラセミ化による３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリル
（Ｒ）−（３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−イル）ニトリル１００mg（０．５３mmol）、イソプロパノール５mL及びＤＢＵ １２１mg（１．５当量）を、冷却器及び磁気攪拌機を備えたフラスコに移した。６５℃で２時間加熱し、次に周囲温度に戻るにまかせた。濾過して、標記化合物を得た。
【００４８】
実施例３：  （７Ｓ）−３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチルビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボキサミド
実施例１で得た（７Ｓ）−３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボン酸（３００mg）をＴＨＦ（３mL）に周囲温度で懸濁し、次にトリエチルアミン（２００μL）を加えた。クロロギ酸エチル（１５０μL）を、混合物にゆっくりと加えた。反応混合物が沈殿した（混合物（Ｉ））。別のフラスコで、ＴＨＦ中の２M 溶液としてメチルアミン（２．２５mL）を水（１mL）及びトリエチルアミン（３００μL）と一緒に撹拌した。撹拌を２０分間維持し、次に得られた混合物を混合物（Ｉ）に加え、周囲温度で一晩撹拌した。次に反応混合物を蒸発させ、分取ＨＰＬＣにより精製した。（７Ｓ）−３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチルビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボキサミドを収率６０％で得た。
1H NMR (DMSO-d6, ppm / TMS) = 2.61 (m; 3H); 3.16 (m; 2H); 3.71 (s; 6H); 4.05 (m; 1H); 6.78 (s; 1H); 6.81 (s; 1H); 7.78 (br s; 1H).
【００４９】
実施例４：  （７Ｓ）−３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−イル］Ｎ−メチルメタンアミン
実施例３で得た（７Ｓ）−３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチルビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボキサミド（４５０mg）をテトラヒドロフラン（２０mL）に懸濁し、次にテトラヒドロフラン中の２M ＬｉＡｌＨ４溶液１．６mLを、反応混合物に周囲温度でゆっくり加えた。著しい気体の発生が観察され、反応混合物が清澄になった。反応混合物を還流温度で３０分間加熱した。周囲温度に戻った後、加水分解し、次に酢酸エチルで抽出した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、次に蒸発させた。得られた残留物を、分取ＨＰＬＣ（溶離剤：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸、９８／２／０．２〜２０／８０／０．２）により３０分間かけて精製して、標記生成物を収率４６％で得た。
1H NMR (DMSO-d6, ppm / TMS) = 2.60 (m; 3H); 2.85 (m; 1H); 3.15 (m; 1H); 3.25 (dd; 1H); 3.30 (m; 1H); 3.62 (m; 1H); 3.70 (s; 6H); 6.82 (s; 1H); 6.89 (s; 1H); 8.48 (br s; 1H)
【００５０】
実施例５：  （７Ｓ）−３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−イル］Ｎ−メチルメタンアミン塩酸塩
テトラヒドロフラン中のＢＨ３の１モル溶液２０mLを、テトラヒドロフラン４５mL中の実施例３で得た（７Ｓ）−３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチルビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボキサミド２．２ｇ（１０mmol）の混合物に、周囲温度で加えた。１時間の撹拌の後、テトラヒドロフラン中のＢＨ３の溶液１０mLを加えた。周囲温度で一晩撹拌した後、エタノール２０mLを滴下し、気体の発生がなくなるまで（約１時間）、混合物を撹拌した。次にエタノール中の塩酸溶液２０mLを滴下した。４時間の撹拌の後、得られた沈殿物（標記生成物１．２ｇ）を濾別した。濾液を濃縮し、酢酸エチル／エタノールの８０／２０の混合物中でそれを固体にすることにより、さらなる０．６５ｇの標記生成物を得た。２つの沈殿物を合わせて、標記生成物１．８５ｇを得た（収率：７７％）。
【００５１】
実施例６：  イバブラジン塩酸塩
３−［２−（１，３−ジオキソラン−２−イル）エチル］−７，８−ジメトキシ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−３−ベンゾアゼピン−２−オン５．５kg、エタノール２７．５リットル、及びパラジウム担持炭素５５０ｇを、オートクレーブに入れた。窒素で、次に水素でパージし、５５℃に加熱し、次に理論上の水素の量が吸収されてしまうまで、５５℃で５barの圧力下、水素化した。次に周囲温度に戻し、オートクレーブを減圧した。次に（７Ｓ）−３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−イル］Ｎ−メチルメタンアミン塩酸塩４kg、エタノール１１リットル、水５．５リットル及びパラジウム担持炭素１kgを加えた。窒素で、次に水素でパージし、８５℃に加熱し、次に理論上の水素の量が吸収されてしまうまで、８５℃で３０barの圧力下、水素化した。次に周囲温度に戻し、オートクレーブをパージし、次に反応混合物を濾過した；溶媒を留出させ、次にトルエン／１−メチル−２−ピロリジノンの混合物からの結晶化により、イバブラジン塩酸塩を単離した。それによりイバブラジン塩酸塩を、収率８５％及び９９％を越える化学純度で得た。
【００５２】
比較実施例Ａ：  ３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリルの酵素的加水分解のための市販ニトリラーゼのスクリーニング
凍結乾燥の形態の、試験中のニトリラーゼ（１５mg）を、管に量り入れ、次に０．１MＫＨ２ＰＯ４緩衝液４mL（ｐＨ＝７）、及びＤＭＳＯ １００μLに溶解した３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリル（２０mg）を加えた。インキュベーター（２８℃、２２０rpm）に置いた。変換割合を、２４時間後及び７２時間後にＨＰＬＣにより測定した。ニトリラーゼNIT 101、NIT 102、NIT 103、NIT 104、NIT 105、NIT 106、NIT 108、NIT 109、NIT 111、NIT 112及びNIT 113 (Almac)は、２４時間後、ニトリルを加水分解しなかった（酸の形成又はアミドの形成なし）。
【００５３】
ニトリラーゼNIT 107、NIT 110、NIT 114及びNIT 115 (Almac)で得られた結果を以下の表に順に並べた：
【００５４】
【表２】
2014168461.tif 000018
【００５５】
分析条件：
Phenomenex LUNA HST 50*3カラム  C18(2)  2.5μm
８分間に亘り０％〜１００％Ｂ  ０．８mL/分  ４０℃
Ａ（１０００ 水＋２５ ＡＣＮ＋１ ＴＦＡ）
Ｂ（１０００ ＡＣＮ＋２５ 水＋１ ＴＦＡ）
【００５６】
次にニトリラーゼ NIT 115を別の試験で用いて、ニトリルの加水分解がエナンチオ選択的であるか測定した。
【００５７】
ニトリラーゼ NIT 115（１２mg； Almac）を緩衝液６mL［２mg/mL］中で使用した。３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリルを加えて、その最終濃度４mg/mLに達した。エナンチオ選択性を、以下の分析条件を使用してＨＰＬＣにより測定した：
Chiralpak IC 250*4.6カラム
３０％無水エタノール＋０．１％ＴＦＡ＋７０％ヘプタン＋０．１％ＴＦＡ
１mL／分  ３０℃  ２８８nm
注記：  これらの条件下、酸の鏡像異性体を分離したが、ニトリルの鏡像異性体は分離しなかった。
【００５８】
５時間反応させた後に得たクロマトグラムを、図２に示す。
【００５９】
結果：エナンチオ選択性は観察されなかった。
【００６０】
比較実施例Ｂ：  ３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリルの酵素的加水分解のための、細菌及び真菌の菌株のニトリラーゼのスクリーニング
多数の細菌性誘発剤（プロピオニトリル、ベンゾニトリル、４−ブロモベンゾニトリル）を用いる研究では、プロピオニトリルが、３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリルとのニトリラーゼ活性の最良の誘発を提供することを示した。細菌の菌株を、プロピオニトリル７２mMで７２時間誘発し、細胞を０．１M リン酸緩衝液ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４５０mL（ｐＨ＝７．３）（濃縮２回、濃度：１mLにつき細胞１０mg）に取り、３，４−ジメトキシビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリルを２％ＤＭＳＯ中の１０mMの濃度（v/v最終）で加えた。真菌の菌株をバレロニトリルで誘発した。
【００６１】
すべての反応混合物を、２２０rpmにて、細菌の場合３０℃で、及び真菌の場合２７℃で撹拌し、以下に記載の方法に従って逆相ＨＰＬＣにより及びキラル相ＨＰＬＣにより、９６時間モニターした：
逆相分析
Phenomenex LUNA HST 50*3カラム  C18(2)  2.5μm
８分間に亘り０％Ｂ〜１００％Ｂ  ０．８mL／分  ４０℃
Ａ（１０００ 水＋２５ ＡＣＮ＋１ ＴＦＡ）
Ｂ（１０００ ＡＣＮ＋２５ 水＋１ ＴＦＡ）
キラル−相分析
Chiralpak IC 250*4.6カラム
３０％無水エタノール＋０．１％ＴＦＡ＋７０％ヘプタン＋０．１％ＴＦＡ
１mL/分  ３０℃  ２８８nm
【００６２】
得られた結果を以下の表に順に並べた：
【００６３】
【表３】
2014168461.tif 000019
【００６４】
比較実施例Ｃ：  ロドコッカス・ロドクラウス NCIMB1216の過剰発現したニトリラーゼを使用する、ビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリルの酵素的加水分解
ＬＢ＋寒天＋カナマイシン上に置き、静置インキュベーション（３７℃、２４時間）（組換えE. coliのニトリラーゼの株11216）。
ＬＢ ５mL＋カナマイシン（５０mg/L）中で前培養、インキュベーション（３７℃、１８０rpm、一晩）。
培養：ＬＢ ５０mL及び前培養５００μLを、隔壁なし（non-baffled）の２５０mL容量のエルレンマイヤー（Erlenmeyer）フラスコに移し、ＯＤが０．６に等しくなるまで（すなわち、約４時間）インキュベーション（２８℃、１６０rpm）。
ＩＰＴＧ（０．５mM）での誘導、インキュベーション（１７℃、１６０rpm、一晩（１７時間））。
活性試験：培養物を４℃で、６０００rpm、２０分間遠心分離し、０．１M リン酸緩衝液１０mL（ｐＨ７）中のスラリーを再懸濁した。ビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエン−７−カルボニトリル（１０mM）＋２％エタノールを加えた。２２０rpm、３０℃でインキュベートした。
注記：  遠心分離するとき、培養物が５０mLを越えている場合、５０mLを取り除き、そして培養物のスラリー５０mLを用いて活性試験を実施すること。
【００６５】
キラルクロマトグラフィーによる加水分解モニタリング：４５分間及び２時間の時点で。
カラム：Phenomenex（登録商標）LUNA HST 50*3  C18(2)  2.5μm
溶離剤：Ａ＋Ｂ（８分間に亘り０〜１００％Ｂ）
Ａ：１０００ 水＋２５ ＡＣＮ＋１ ＴＦＡ
Ｂ：１０００ ＡＣＮ＋ ２５水＋１ ＴＦＡ
０．８mL/分  ４０℃  ＵＶ ２１０nm
【００６６】
結果：
【表４】
2014168461.tif 000020
【００６７】
キラルクロマトグラフィーによるモニタリングは、反応がエナンチオ選択的ではないことを示す。
【図１】
2014168461.tif 000031
【図２】
2014168461.tif 000032
【外国語明細書】
2014168461000001.pdf