(57)【要約】【課題】  被培養物を培養袋から取り出すことなく、微生物、細胞等の被培養物を培養しつつ、被培養物の培養状態を観察することができる培養袋を提供する。【解決手段】  培養液８を内部に収容でき、プラスチック材料により形成された袋本体１１と、袋本体１１の内部に配設され、袋本体１１の内部に収容される培養液８を撹拌できる撹拌器３０と、培養液８の一部を収容可能であり、かつ、袋本体１１で培養される前記被培養物の培養状態を観察できる観察室２０と、袋本体１１と観察室２０との間を連結する連結部材６０と、を備えることにより、上記課題を解決することができた。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被培養物を含む培養液を内部に収容でき、プラスチック材料により形成された袋本体と、
前記袋本体の内部に配設され、前記袋本体の内部に収容される前記培養液を撹拌できる撹拌器と、
前記培養液の一部を収容可能であり、かつ、前記袋本体で培養される前記被培養物の培養状態を観察できる観察室と、
前記袋本体と前記観察室との間を連結する連結部材と、を備えることを特徴とする培養袋。
【請求項２】
前記連結部材に仕切部材が設けられていることを特徴とする請求項１記載の培養袋。
【請求項３】
前記観察室の表面に格子が形成されていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の培養袋。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や微生物等の被培養物を含む培養液を収容して、被培養物を培養する培養袋に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品産業の大部分を占める新薬市場の主流が、低分子医薬品からバイオ医薬品へ移行している。このバイオ医薬品の生産には、微生物、細胞等の被培養物を大量に培養する培養法が用いられている。
【０００３】
培養法には、従来から培養袋を有する培養システムが用いられてきた。この培養袋には細胞や微生物等の被培養物を含む培養液が収容され、撹拌器によって培養液が撹拌される。このようにして、細胞や微生物等の被培養物の培養が行われるようになっている。
この培養システムにおいて、培養液中の被培養物の増殖状態を把握するために、一定時間ごとに培養袋より少量抜き出して被培養物の濃度を顕微鏡で、血球計算盤等を用いて計数し、時間を横軸にとった増殖曲線を作成して前回の被培養物の濃度から増加した分を経過時間で割った値によって増殖状態を推測することが一般的に行われている。
【０００４】
しかしながら、従来の培養袋は、培養中の培養液を培養袋のポート部よりシリンジ等で少量抜き出す際、培養液に異物混入の恐れがあり、異物混入に十分に注意を払いながら、サンプリングの作業を行わなければならない。
【０００５】
例えば、細胞を培養する際に伴う操作を自動的に行うことのできる細胞培養装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
この培養装置は、観察手段としてＣＣＤカメラを用い、円形のシャーレ構造をした培養器内における細胞の画像情報を基に細胞数を計測することを可能にしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／０５９０９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に示す培養装置のように小型の培養器の場合、直接、ＣＣＤカメラにより培養器内の細胞の培養状態を観察可能であるが、５リットル〜３０００リットルの容量がある培養袋を用いて被培養物を大量に培養する培養システムでは、培養袋内の被培養物を顕微鏡により直接、観察することが困難であるという問題がある。
また、一度観察した細胞は廃液タンクに排出されるため、観察後の細胞を再び培養するシステムとなっていない。
【０００９】
本発明はこのような点を考慮してなされたものであり、被培養物を培養袋から取り出すことなく、密閉された培養袋内で被培養物を培養しつつ、微生物、細胞等の被培養物の培養状態を観察し、観察後の被培養物を再び培養袋内で培養することができる培養袋を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的は以下の本発明によって達成される。即ち、本発明は、被培養物を含む培養液を内部に収容でき、プラスチック材料により形成された袋本体と、前記袋本体の内部に配設され、前記袋本体の内部に収容される前記培養液を撹拌できる撹拌器と、前記培養液の一部を収容可能であり、かつ、前記袋本体で培養される前記被培養物の培養状態を観察できる観察室と、前記袋本体と前記観察室との間を連結する連結部材と、を備えることを特徴とする。
【００１１】
また、上述した培養袋において、前記連結部材に仕切部材が設けられてもよい。
【００１２】
また、上述した培養袋において、前記観察室の表面に格子が形成されていてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、被培養物を培養袋から取り出すことなく、密閉された培養袋内で被培養物を培養しつつ、被培養物の培養状態を観察し、観察後の被培養物を再び培養袋内で培養することができるので、厳密なサンプリングの必要がなく、異物混入を防止でき、リアルタイムで被培養物の培養状態を観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施の形態による培養袋が取り付けられる培養システムの概略構成の一例を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態による培養液を収容した培養袋を示す概略図である。
【図３】本発明の実施の形態による培養液を収容した観察室を示す概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。なお、本明細書に添付する図面においては、図示と理解のしやすさの便宜上、適宜縮尺及び縦横の寸法比等を、実物のそれらから変更し誇張してある。
【００１６】
＜培養システム＞
本実施の形態における培養袋は、細胞、微生物、菌等の被培養物を含む培養液を収容して被培養物を培養するためのものである。培養袋は、例えば、図１に示す培養システムに取り付けて使用することができる。まず、図１に示す培養システム１について説明する。
【００１７】
図１に示す培養システム１は、ベース２と、ベース２上に設けられ、内部に培養袋１０が取り付けられる円筒状のタンク３と、タンク３をベース２上に支持する支持部材４と、を備えている。このうち、タンク３は、例えばステンレス等の金属材料により形成されている。ベース２の下面には、複数の車輪５が取り付けられている。
【００１８】
タンク３の上方には、培養袋１０の撹拌器３０（後述）を駆動する撹拌駆動装置６が設けられている。この撹拌駆動装置６は、支持部材４に取り付けられている。ベース２上には、制御装置７が設けられており、制御装置７によって撹拌駆動装置６が制御されるようになっている。この制御装置７は、培養袋１０への培養液の注入及び排出、培養液への空気の導入等、培養袋１０による培養に必要な処理を制御するためのものである。
【００１９】
＜培養袋＞
次に、図２を用いて、本実施の形態における培養袋１０について説明する。
図２に示すように、培養袋１０は、袋本体１１と、袋本体１１内に回転自在に設けられ、培養液８を撹拌する撹拌器３０とを備えている。このうち、袋本体１１は、一対の胴部フィルム１２と、上面フィルム１４と、下面フィルム１５とを有している。袋本体１１の容量は制限されていないが、例えば５リットル〜３０００リットルの容量とすることができる。
【００２０】
撹拌器３０は、袋本体１１の上下方向に延びる回転シャフト３１と、回転シャフト３１に設けられた撹拌用羽根３２を有している。このうち、回転シャフト３１の上端部及び下端部は、袋本体１１に回転自在に支持されている。すなわち、袋本体１１の上面フィルム１４には、回転シャフト３１の上端部を回転自在に支持する上側軸受部４０が設けられ、袋本体１１の下面フィルム１５には、回転シャフト３１の下端部を回転自在に支持する下側軸受部４１が設けられている。撹拌器３０の回転シャフト３１の上端部には、上述した培養システム１の撹拌駆動装置６から磁気カップリング方式で駆動力が伝達されるようになっている。このようにして、撹拌駆動装置６によって、攪拌器３０の回転シャフト３１および撹拌用羽根３２が回転するようになっている。
図２に示すように、本実施の形態における撹拌器３０は、例えば、回転シャフト３１の先端と中間のいずれか一方または両方に撹拌用羽根３２を撹拌用羽根の固定部材３３により固定して設けることができる。
【００２１】
袋本体１１の上面フィルム１４には、培養液８を注入する培養液注入部５０が設けられている。この培養液注入部５０には、培養システム１の図示しない培養液供給部から、被培養物を含む培養液８が供給されて、培養液８が袋本体１１内に注入されるようになっている。袋本体１１の上面フィルム１４には、培養液注入部５０から袋本体１１に培養液８を注入する際、袋本体１１内の気体を排出する気体排出部５１が設けられている。なお、上述した下側軸受部４１が、袋本体１１から培養液８を排出する機能を有しており、下側軸受部４１から、袋本体１１内の培養液８が排出されるようになっている。
【００２２】
袋本体１１の胴部フィルム１２には、培養液８の培養状態を観察するための観察室２０がチューブ等の連結部材６０を介して連結されている。連結部材６０を介して袋本体１１と観察室２０を連結することにより、袋本体１１内の培養液８を観察室２０に循環させる流路を設けることができる。本実施形態の観察室２０は、連結部材６０と結合させて形成されてもよく、あるいは、観察室２０と連結部材６０とを一体に形成されてもよい。この観察室２０は、袋本体１１の液面より下部に配置されており、袋本体１１内の培養液８が連結部材６０を通り、観察室２０に誘導することができる。
本実施形態の観察室２０は、袋本体１１の液面より下部に配置されていれば、図２に示すように、袋本体１１の胴部フィルムの上下方向に平行に配置してよく、図示しないが、垂直方向に配置してもよい。
連結部材６０には、ポンプ６２を接続して、培養液８を連続的に送液させてもよい。
観察室２０の近傍には、観察室２０内の培養液８を観察できるように位相差顕微鏡等の観察装置７０が設置されている。連続観察の場合、ＣＣＤカメラ等の電子撮像装置７２付き顕微鏡をこの観察室２０の近傍に設置してもよい。観察画像をＣＣＤカメラで撮像することにより、簡単に観察画像を記録することができるため、培養状態の連続モニターが実現できる。なお、必要に応じて、観察室２０の近傍には、被培養物を観察するときに光源７１を設置してもよい。
【００２３】
袋本体１１内に、気体導入部５３を設け、気体導入部５３から袋本体１１の上面フィルム１４を貫通して気体供給チューブ５４を延設してもよい。この気体導入部５３は、袋本体１１内に収容された培養液８に空気等の気体を導入するためのものである。この気体供給チューブ５４は、上述の培養システム１の気体供給部（図示せず）から気体導入部５３に空気を供給するためのものである。
【００２４】
袋本体１１には、温度センサ、ｐＨセンサおよび溶存酸素センサ等のセンサ５２が取り付けられてもよい。このうち温度センサは、培養中の培養液８の温度を計測し、ｐＨセンサは、培養中の培養液８のｐＨを計測するためのものである。溶存センサは、培養中の培養液８の溶存酸素量を計測するためのものである。
【００２５】
なお、上述した培養液注入部５０、各センサ５２等の配置は、図２に示すような配置に限られることはなく、下部フィルム１５に配置することもでき、任意である。
【００２６】
図２に示すように、袋本体１１は、一対の胴部フィルム１２と、各胴部フィルム１２の上縁部にヒートシールにより接合された上面フィルム１４と、各胴部フィルム１２の下縁部に接合された下面フィルム１５とを有している。このうち、一対の胴部フィルム１２は、それらの両側縁部において互いにヒートシールにより接合されている。袋本体１１は、全体として、円筒状に形成されており、培養システム１のタンク３の形状に適合させて、培養液の収容効率を向上させている。
【００２７】
＜観察室＞
次に、図２を用いて、本実施の形態における観察室２０の詳細について説明する。
【００２８】
本実施形態の観察室２０の容量は、被培養物を含む培養液８を収容できる限り、特に限定されないが、１０μｌ以上、１０ｍｌ以下が好ましく、１０μｌ以上、１００μｌ以下がより好ましい。
本実施形態の観察室２０の形状としては、円柱状、角柱状であってもよい。
観察室２０の高さ（Ｈ）は、観察室２０の幅の１倍以上、１０倍以下が好ましい。
本実施形態の観察室２０の高さ（Ｈ）は、被培養物を含む培養液８を収容できる容量を提供する限り、特に限定されないが、０．５ｃｍ以上、１０ｃｍ以下が好ましく、１ｃｍ以上、５ｃｍ以下がより好ましい。
本実施形態の観察室２０の幅（Ｗ）は、被培養物を含む培養液８を収容できる容量を提供する限り、特に限定されないが、観察室２０の高さ（Ｈ）とともに観察室２０の容量を決定する。本実施形態の観察室２０の幅（Ｗ）は、０．５ｃｍ以上、１０ｃｍ以下が好ましく、１ｃｍ以上、５ｃｍ以下がより好ましい。
ここで、観察室２０の幅（Ｗ）および高さ（Ｈ）は、観察室２０の対向する内面間の間隔を意味し、観察室２０の厚みを含まない。
本実施形態の観察室２０の厚さ（Ｔ）は、被培養物がある面の反対側からの顕微鏡観察が可能である限り、特に限定されないが、０．１ｍｍ以上、１０ｍｍ以下が好ましく、０．１ｍｍ以上、１ｍｍ以下がより好ましい。
【００２９】
連結部材６０には、更に、ストップコック等の流路を停止する仕切部材６１が備えられてもよい。仕切部材６１により、連結部材６０内の培養液の流れを止めて被培養物が安定したところを観察装置７０で観察することができる。
なお、仕切部材６１には、三方コックを用いることにより、更に連結部材６０を分岐させて、廃棄用タンク（図示せず）に接続することができる。
【００３０】
観察室の周壁２１における観察する側の表面には、印刷や凹凸形状により格子が形成されていてもよい。観察室２０に格子が形成されることにより、観察室内の被培養物を観察装置７０によって観察し、血球計算盤等のように、一定の面積あたりの被培養物の数の計測をすることができる。なお、格子によって囲まれた四角形の面積は、既知の面積を示し、０．２５ｃｍ2以上１０ｃｍ2以下が好ましい。
【００３１】
観察室２０には、室内の温度を例えば、３０℃〜３７℃に保温するためのヒーター（図示せず）を設けてもよい。これにより、観察室２０の温度が、袋本体１１内の培養温度に近い温度に維持され、観察時の温度を安定化させることができる。
【００３２】
＜袋本体の材料＞
次に、袋本体１１の胴部フィルム１２、上面フィルム１４及び下面フィルム１５の材料について説明する。
【００３３】
各フィルム１２、１４、１５に用いる材料としては、可撓性を有するとともに耐ガンマ線滅菌性を有するプラスチック材料であれば特に限定されることはない。例えば、各フィルム１２、１４、１５には、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、エチレンビニルアルコール、ポリエチレン等を用いることができる。
【００３４】
袋本体１１の各フィルム１２、１４、１５の厚さは、１００μｍ〜３５０μｍであることが好適である。
【００３５】
＜観察室の材質＞
観察室２０の周壁２１の材質は、被培養物を観察する面の観察装置７０で観察が可能である限り、特に限定されないが、好ましくはポリオレフィン、ポリスチレン、アクリル、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の透明なプラスチックまたはガラス等の無機材料である。
観察室２０の周壁２１の材質は、中でも、ポリオレフィン、アクリルは、被培養物の付着を防ぐ材質であるので好ましい。なお、必要に応じて、観察室２０の全部または一部に、被培養物の付着を防ぐためにコーティングされていてもよい。
観察装置７０が位相差顕微鏡の場合、複屈折の少ない材料であることが必要であり、観察室２０の周壁２１の材質は、例えば、ガラス、ポリメチルメタクリレート、シクロオレフィンポリマー、ポリメチルペンテン、脂環式アクリレートポリマー、ポリスチレンとポリカーボネートのブロック共重合ポリマー等が挙げられる。
【００３６】
＜撹拌器の材質＞
また、撹拌器３０は、プラスチック材料により形成されていることが好適である。このことにより、袋本体１１内に配置された撹拌器３０により、袋本体１１を破れ難くすることができる。さらに、上側軸受部４０、下側軸受部４１等、袋本体１１にヒートシールされる部材は、ヒートシール性を向上させるために、少なくともヒートシールされる部分がプラスチック材料により形成されていることが好適である。
【００３７】
＜培養袋の製造方法＞
次に、このような構成からなる本実施の形態における培養袋１０の製造方法について説明する。
【００３８】
まず、２枚の胴部フィルム１２と、上面フィルム１４、下面フィルム１５を準備する。
続いて、２枚の胴部フィルム１２と、上面フィルム１４及び下面フィルム１５がヒートシールにより接合される。
２枚の胴部フィルム１２と、上面フィルム１４及び下面フィルム１５が接合された後、上面フィルム１４に孔を設け、上側軸受部４０が挿入されてヒートシールにより接合されるとともに、下面フィルム１５に孔を設け、下側軸受部４１が挿入されてヒートシールにより接合される。
【００３９】
その後、一対の胴部フィルム１２の間に、気体供給チューブが連結された気体導入部（図示せず）が配置され、ヒートシールにより一方の側縁部にて、ヒートシールにより接合される。
【００４０】
次に、袋本体１１に撹拌器３０が取り付けられる。すなわち、撹拌器３０の撹拌用羽根３２が取り付けられた回転シャフト３１の上端部が、上側軸受部４０に取り付けられ、下端部が、下側軸受部４１に取り付けられる。
袋本体１１に撹拌器３０が取り付けられた後、一対の胴部フィルム１２同士が、他方の側縁部にて、ヒートシールにより接合される。
【００４１】
次に、胴部フィルム１２に孔を設け、観察室２０、及び連結部材６０が挿入されてヒートシール等により接合される。
【００４２】
続いて、胴部フィルム１２に孔を設け、温度センサ、ｐＨセンサ、溶存酸素センサ等のセンサ５２及びサンプリングチューブ５３が挿入されてヒートシールにより接合される。また、上面フィルム１４に孔を設け、培養液注入部５０及び気体排出部５１が挿入されてヒートシールにより接合される。このようにして、培養袋１０が製造される。
【００４３】
＜培養袋の使用＞
上述のようにして製造された培養袋１０は、以下のようにして使用することができる。
【００４４】
すなわち、図１に示す培養システム１のタンク３内に、培養袋１０が取り付けられ、培養システム１の制御装置７によって、以下の手順で、細胞、微生物、菌等の被培養物の培養が行われる。
【００４５】
まず、培養システム１の培養液供給部（図示せず）から、培養袋１０の培養液注入部５０を介して培養袋１０の袋本体１１内に被培養物を含む培養液８が注入される。この際、気体排出部５１から、袋本体１１内の気体が排出される。このことにより、袋本体１１内にスムーズに培養液８を注入することができる。
【００４６】
続いて、培養システム１の撹拌駆動装置６が駆動される。図２に示す回転シャフト３１は、袋本体の上下方向に延ばされた状態である。
そして、撹拌駆動装置６の駆動力が、磁気カップリング方式により撹拌器３０の回転シャフト３１に伝達され、撹拌用羽根３２が回転する。このことにより、培養液８が培養袋１０内を回転するように流れて撹拌され、培養が行われる。
【００４７】
培養を行っている間、培養システム１の気体供給部（図示せず）から気体供給チューブ５４を通って気体導入部５３に空気が供給され、気体導入部から、撹拌されている培養液８に空気が導入される。このことにより、培養液８中の被培養物に、均一に酸素を供給することができ、培養効率を向上させることができる。
【００４８】
また、培養を行っている間、温度センサ、ｐＨセンサおよび溶存酸素センサ等のセンサ５２により、培養中の培養液８の温度、ｐＨ、溶存酸素量が計測される。
【００４９】
また、培養を行っている間、連結部材６０の仕切部材６１を開放してからポンプ６２を作動させ、袋本体１１の培養液８を連結部材６０内の流路に流入させる。培養液８を流入後、ポンプ６２を停止させ、仕切部材６１で流れを止めて観察室２０内の培養液中の被培養物が安定したところで、顕微鏡等の観察装置７０により被培養物の培養状態の観察を行う。観察室２０内に形成された格子で、被培養物の長さ、面積、一定の面積あたりの被培養物の数が計測される。観察終了後、再び仕切部材６１を開放して、ポンプ６２を作動させ、観察後の培養液が、観察室２０から流出し、袋本体１１内に戻される。培養が終了するまで、一定時間毎に観察室２０内の被培養物を計測する操作が繰り返される。
【００５０】
培養が終了すると、撹拌駆動装置６が停止され、撹拌器３０の回転が止まる。その後、袋本体１１から下側軸受部４１を介して培養液８が排出される。
【００５１】
培養液８が排出された後、培養システム１のタンク３から、培養袋１０が取り外されて廃棄される。
次の培養を行う際には、新たな培養袋１０がタンク３に取り付けられる。
培養袋１０が使用後、廃棄されることにより、培養袋１０内の洗浄、滅菌、定期バリデーションといった工程等を不要とすることができる。
【００５２】
以上、本発明の実施の形態について詳細に説明してきたが、本発明による培養袋１０は、上記実施の形態に何ら限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【００５３】
また、上述した本実施の形態においては、袋本体１１が、一対の胴部フィルム１２、上面フィルム１４と、下面フィルム１５とを有している例について説明した。しかしながら、このことに限られることはなく、袋本体１１は、観察室２０、撹拌器３０等の部材を有する培養袋１０を作製可能であれば、任意の構造とすることができる。
【００５４】
また、上述した本実施の形態においては、撹拌器３０の回転シャフト３１の下端部が、袋本体１１の下面フィルム１５に回転自在に支持されている例について説明した。しかしながら、このことに限られることはなく、回転シャフト３１の下端部は、下面フィルム１５に支持されないように構成してもよい。この場合、培養袋１０において、ヒートシール箇所数を低減することができる。
【符号の説明】
【００５５】
１      培養システム
２      ベース
３      タンク
４      支持部材
５      車輪
６      撹拌駆動装置
７      制御装置
８      培養液
１０    培養袋
１１    袋本体
１２    胴部フィルム
１４    上面フィルム
１５    下面フィルム
２０    観察室
２１    周壁
３０    撹拌器
３１    回転シャフト
３２    撹拌用羽根
３３    撹拌用羽根の固定部材
４０    上側軸受部
４１    下側軸受部
５０    培養液注入部
５１    気体排出部
５２    センサ
５３    気体導入部
５４    気体供給チューブ
６０    連結部材
６１    仕切部材
６２    ポンプ
７０    観察装置
７１    光源
７２    電子撮像装置
【図１】
2014161266.tif 000003
【図２】
2014161266.tif 000004
【図３】
2014161266.tif 000005