(57)【要約】【課題】安全かつ効果的にPeriod遺伝子発現を調節できる物質を提供する。【解決手段】ペラルゴニウム属植物の抽出物を有効成分として含有するPeriod遺伝子発現調節剤。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペラルゴニウム属植物の抽出物を有効成分として含有する、Period遺伝子発現調節剤。
【請求項２】
前記ペラルゴニウム属植物が、ペラゴニウム グラベオレンス（Pelargonium graveolens）、ラデュラ ゼラニウム（Pelargonium radula）、ペラルゴニウム ロゼム（Pelargonium roseum）、ペラルゴニウム カピタツム（Pelargonium capitatum）、ペラルゴニウム オドラティシマム（Pelargonium odoratissimum）、およびペラルゴニウム デンティクラタム（Pelargonium denticulatum）から選択される１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１記載のPeriod遺伝子発現調節剤。
【請求項３】
Period遺伝子が、Period1、 Period2または Period3であることを特徴とする請求項１または２記載のPeriod遺伝子発現調節剤。
【請求項４】
請求項１から３いずれか１項記載のPeriod遺伝子発現調節剤を含む概日リズム調整剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時計遺伝子の発現調節剤に関するものであり、より詳しくは、時計遺伝子Periodの発現調節剤、ならびにそれを含む概日リズム調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上の殆ど全ての生物は体内に約２４時間周期で自律振動する「生体時計」を持っている。生体時計は、概日リズムという生物学的な日周変動を引き起こし、生物の睡眠・覚醒サイクルをはじめ、体温、血圧、ホルモン分泌、代謝、さらには、心身の活動、摂食などの、様々な生体現象（活動）の日周変動を支配すると考えられている。近年、概日リズムの乱れが、睡眠障害、皮膚疾患、生活習慣病、さらには欝病等の精神神経疾患など、様々な心身の症状または疾患の発症要因として指摘されている。
【０００３】
生体時計は、時計遺伝子と呼ばれる遺伝子群を含むリズム発生システムにより制御されている。哺乳類の場合、CLOCK, BMAL1, PERIOD, CRYPTOCHROMEの４つのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写の促進/抑制により形成されるフイードバックループが時計分子機構の中核（コア）をなし、これらコアループに関わる時計遺伝子がうまく発現しないと、欝や生活習慣病をはじめ、様々な疾病を引き起こすと考えられている（非特許文献１）。
【０００４】
概日リズムの制御中枢（中枢時計）は視床下部の視交叉上核に存在しているが、末梢組織においても時計遺伝子が発現し、同様のシステムで概日リズムを形成することが明らかになっている。皮膚でも時計遺伝子は発現しており、他の臓器と同様に、脳内の概日リズム中枢と同調して時計遺伝子がリズムを刻むことにより、生体恒常性が維持されている（非特許文献２）。例えば、Bmal1ノックダウン動物では、皮膚の萎縮や体毛再生の抑制が見られ、時計遺伝子が順調に働かないと、皮膚の健康が損なわれる（非特許文献３）。
【０００５】
末梢時計システムにおいて重要な時計遺伝子としてPeriod遺伝子をあげることができるが、Period遺伝子は、転写調節領域としてグルココルチコイド応答領域（GRE）を持ち、副腎皮質ホルモンであるコルチゾールに応答し、転写を開始する。すなわち、生体においては、中枢時計の情報が、副腎皮質ホルモンコルチゾールを介して、末梢時計へと伝達され、末梢における概日リズム発現を調節することができる。従って、コルチゾール分泌が不調になると、中枢時計の情報が、末梢時計に正しく伝達されず、中枢と末梢の時計が同調せず、様々な不調が引き起こされる原因となることから、Period遺伝子に作用し、時計リズムを調節する方法が求められる。
【０００６】
Period遺伝子は、Period1、Period2、Period3が知られているが、時計遺伝子として重要な働きをするばかりでなく、ストレス応答や、肥満とも関連することが報告されている。生体は、急性ストレスに応答して、コルチゾール分泌が上昇し、様々なストレス応答反応を生体に引き起こす。このストレスによるコルチゾール分泌に対しても、Period遺伝子発現量が上昇することから、Period遺伝子のストレス応答への関与が報告されている（非特許文献４）。また、肥満との関連については、Periodノックダウン動物では肥満が観察され（非特許文献５）、またヒトでも肥満者のPeriod遺伝子発現リズムが、健常者と比較し異常となっていることが報告されている（非特許文献６）
【０００７】
上述したように、Period時計遺伝子の発現を調節することにより、それに関連する生体の様々な行動リズムや生理機能の概日リズムを調整することが可能であり、効果的にPeriod時計遺伝子の発現を調節できる新規薬剤の開発が望まれている。
【０００８】
例えば、ヒト皮膚線維芽細胞を用いた評価系で、アルニカエキス、コウホネエキス等の生薬およびジュニパーオイル、セダーオイル等の精油がPeriod時計遺伝子の発現を促進することが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１２２０４１号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Akhilesh B. Reddy, John S. O’Neill, Healthy clocks, healthy body, healthy mind. Trends Cell Biol. 2010 January; 20(1): 36-44
【非特許文献２】Miki Tanioka, Molecular Clocks in Mouse Skin. Journal of Investigative Dermatology (2009), 129, 1225-1231
【非特許文献３】Roman V. Kondratov, Early aging and age-related pathologies in mice deficient in BMAL1, the core component of the circadian clock. GENES & DEVELOPMENT (2006) 20: 1868-1873
【非特許文献４】Takuro Yamamoto., Acute physical stress elevates mouse Period1 mRNA expression on mouse peripheral tissues via a glucocoticoid-responsive element. The Journal of Biological Chemistry (2005), 280 (51), 42036-42043
【非特許文献５】Biliana Marcheva, et al, Clock genes and metabolic disease. J Appl Physiol. (2009), 107, 1638-1646
【非特許文献６】Kazunobu Tahira, et al, Obesity alters the expression profile of clock genes in peripheral blood mononuclear cells. Arch. Med. Sci. (2011), 7(6), 933-940
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記のような事情に鑑み、Period遺伝子の発現を調節できる新規物質を提供することを目的とするものである。Period遺伝子の発現を調節することにより、Period遺伝子が関連する概日リズム不調や、ストレス応答、肥満などの様々な不調を改善し、生体恒常性を維持することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、ペラルゴニウム属植物の抽出物が、Period遺伝子の発現を調節し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明のPeriod遺伝子発現調節剤は、ペラルゴニウム属植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。ペラルゴニウム属植物の抽出物が時計遺伝子の発現を調節できることは今まで全く知られていなかった。
【００１４】
本発明において、遺伝子発現調節とは、遺伝子の発現を促進させることに加え、遺伝子の発現リズム（位相または周期）を調節することを含む。
【００１５】
本発明において好ましく使用されるペラルゴニウム属植物として、限定はされないが、ペラゴニウム グラベオレンス（Pelargonium graveolens）、ラデュラ ゼラニウム（Pelargonium radula）、ペラルゴニウム ロゼム（Pelargonium roseum）、ペラルゴニウム カピタツム（Pelargonium capitatum）、ペラルゴニウム オドラティシマム（Pelargonium odoratissimum）、およびペラルゴニウム デンティクラタム（Pelargonium denticulatum）等が挙げられる。
【００１６】
また、Period遺伝子として、Period1、Period2およびPeriod3が挙げられる。
【００１７】
本発明の概日リズム調整剤は、上記のPeriod遺伝子発現調節剤を含む。Period時計遺伝子の発現を調節することにより、それに関連する生体の様々な行動リズムや生理機能の概日リズムを調整することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のPeriod遺伝子発現調節剤は、Period遺伝子の発現を調節し、恒常性維持を促進して、概日リズムの不調に起因する様々な心身の症状または疾患を改善することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、コルチゾールによる刺激後のPeriod１およびBmal１遺伝子の発現リズムを示すグラフ
【図２】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、ペラルゴニウム属植物の抽出物によるPeriod1遺伝子の発現に対する効果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のPeriod遺伝子発現調節剤は、ペラルゴニウム属植物の抽出物を有効成分とする。
【００２１】
ペラルゴニウム属植物は、フウロソウ科ペラルゴニウム属に属する植物であり、例えば、ペラゴニウム グラベオレンス（Pelargonium graveolens）、ラデュラ ゼラニウム（Pelargonium radula）、ペラルゴニウム ロゼム（Pelargonium roseum）、ペラルゴニウム カピタツム（Pelargonium capitatum）、ペラルゴニウム オドラティシマム（Pelargonium odoratissimum）、およびペラルゴニウムデンティクラタム（Pelargonium denticulatum）等が挙げられる。
【００２２】
本発明で使用されるペラルゴニウム属植物の抽出物は、ペラルゴニウム属植物の葉、茎または花、あるいはそれらを含む全草より、水蒸気蒸留または溶剤抽出により抽出して作成することができる。抽出に用いる溶剤としては、限定はされないが、例えば、水、アルコール、アセトン、酢酸エチル、石油エーテル等から選ばれる1種あるいは２種以上を使用することができ、好ましくは、石油エーテルが使用される。
【００２３】
例えば、ペラルゴニウム属植物の全草を約一日放置後、水蒸気蒸留することによりオイルが得られる。
【００２４】
本発明のPeriod遺伝子発現調節剤は、ペラルゴニウム属に属する１種の植物の抽出物を用いても、あるいは２種以上の植物の抽出物を混合して用いてもよい。
【００２５】
また、本発明の概日リズム調整剤は、Period遺伝子発現調節剤としての上記のペラルゴニウム属植物の抽出物の１種または２種以上を含む。
【００２６】
本発明のPeriod遺伝子発現調節剤は、本発明の効果を損なわない限り、上記の必須成分に加えて任意の他の成分を含んでいてよい。また、単独で用いてもよいが、他のPeriod遺伝子の発現調節作用を有する薬剤等と組み合わせて使用してもよい。
【００２７】
本発明のPeriod遺伝子発現調節剤は、Period遺伝子が脳内ばかりでなく様々な末梢臓器でも発現していることより、投与方法については、特に限定しない。例えば、Period遺伝子の発現を促進するペラルゴニウム属植物の抽出物を配合した組成物を皮膚に適用した場合には、皮膚のPeriod遺伝子発現を調節して恒常性維持を促進し、健やかな肌状態を維持することが可能である。
【００２８】
本発明のPeriod遺伝子発現調節剤は、様々な対象物に含めることができ、その対象物の種類に応じて、上記の必須成分の他に、任意の構成要素をさらに含めることができる。
【００２９】
例えば、皮膚外用剤に配合する場合、その剤形（例えば、液剤、粉末剤、顆粒剤、エアゾール剤、固形剤、ジェル剤、パッチ剤、坐剤等）や、製品形態（例えば化粧料、医薬品、医薬部外品等）に応じて、通常そのような皮膚外用剤に含まれる任意の成分を、本発明のPeriod遺伝子発現調節剤と共に含んでいてよい。皮膚外用剤は、皮膚（頭皮、頭髪、爪も含む）に対して適用する組成物全般を包括する概念であり、例えば、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、毛髪化粧料、皮膚もしくは毛髪洗浄料等の化粧料や、軟膏剤、パッチ剤、坐剤、歯磨等の種々の医薬品ないし医薬部外品等を含む。その剤形も特に限定されず、例えば、水溶液系、可溶化系、乳化系、油液系、ゲル系、ペースト系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層など、任意の剤型を含む。皮膚外用剤が化粧料である場合、例えば、香水、オードトワレ、オーデコロン、クリーム、乳液類、化粧水、ファンデーション類、粉白粉、口紅、石鹸、シャンプー・リンス類、ボディーシャンプー、ボディーリンス、ボディーパウダー類、浴剤類等が挙げられる。
【００３０】
また、例えば、散剤、顆粒、錠剤、カプセル剤等様々な形態のサプリメント（栄養補助食品）、菓子、飲料等の任意の食品、医薬等に、本発明のPeriod発現調節剤を含めてもよい。
【００３１】
対象物中における本発明のPeriod遺伝子発現調節剤の配合量は、対象物の種類等によって適宜選択することができ、本願発明の効果を発揮できる限り限定されないが、皮膚外用剤に配合する場合、有効成分であるペラルゴニウム属植物の抽出物の配合量は通常、皮膚外用剤全質量に対して０．０１〜１０００ｐｐｍであり、より好ましくは、０．１〜１００ｐｐｍである。
【００３２】
尚、本発明の使用態様を例示したが、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を達成できる限り、任意の態様で用いることができる。また、本発明のPeriod遺伝子発現調節剤の他に、具体的な態様に応じて、他の任意の薬剤等を本発明の効果を損なわない限り、配合することができる。
【００３３】
本発明のPeriod遺伝子発現調節剤やそれを配合した対象物の具体的な適用は、Period遺伝子発現の調節に関連するものであれば特に限定されないが、例えば、皮膚に適用した場合には、肌の保湿や柔軟性向上、しわの予防または改善、肌荒れなどの皮膚諸症状の予防、改善または治療等に適用できる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。尚、培養細胞として、皮膚線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、色素細胞、脂肪細胞、神経細胞など各種細胞を用いることができるが、本実施例ではヒト皮膚線維芽細胞を用いて評価を行なった。また、ヒトでは、Period遺伝子としてPeriod1、Period2およびPeriod3の３種類の存在が知られているが、本実施例では代表としてPeriod1の発現を測定した。
【００３５】
培養ヒト皮膚線維芽細胞における時計遺伝子発現リズムの検討
培養ヒト皮膚線維芽細胞の系で時計遺伝子の発現パターンを確認するため、コルチゾールを刺激薬剤として用いて、Period1およびBmal1の発現量を経時的に測定した。培養細胞では通常、個々の細胞がばらばらのタイミングでリズムを刻んでいるが、コルチゾールやフォルスコリンのようなシグナル刺激因子で刺激することにより、時計遺伝子発現リズムを同調させて概日リズムを誘導することができる。
【００３６】
培養ヒト皮膚線維芽細胞は、正常成人皮膚由来線維芽細胞を購入し（Cell Application, Inc）、実験に用いた。10%FBS、20mM HEPES、 Glutamax、抗菌剤を添加したDMEM培地に播種し、37℃、5%CO2にて培養した。培養６日目に、50ng/mlのコルチゾールを含む培地に交換し、交換直後を0時間とし、経時的に細胞をサンプリングした。採取した細胞から、市販のRNA抽出キットを使用してRNAを抽出し、市販のPCRプライマー（Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社）を用い、RT-PCR法により、Period1およびBmal1遺伝子の発現量を測定した。同様に、ハウスキーピング遺伝子であるRPLP0の発現量を定量して内部標準として用い、RPLP0の発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。
【００３７】
結果を図１に示す。Period1とBmal1は、逆位相で概日リズムを刻んで発現しており、Period1は、添加２時間後に高く、１６時間後に低い、発現パターンを示していた。そこで以下の実験では、刺激の２時間後および１６時間後の遺伝子発現量を指標として、試験物質のPeriod1遺伝子の発現に対する効果について評価した。
【００３８】
ペラルゴニウム属植物の抽出物による時計遺伝子発現調節効果の評価
上記と同様の方法により、正常成人皮膚由来線維芽細胞（Cell Application, Inc）を播種し、培養６日目に、各濃度のペラルゴニウム属植物の抽出物（ゼラニウム油、香栄興業社製）を培地中25ppmまたは50ppm含む試験用培地に交換し、交換直後を０時間とし、２時間後および１６時間後に細胞をサンプリングした。採取した細胞から、市販のRNA抽出キットを使用してRNAを抽出し、市販のPCRプライマー（Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社）を用い、RT-PCR法によりPeriod１遺伝子の発現量を測定した。また、同様に、ハウスキーピング遺伝子であるRPLP0の発現量を定量して内部標準として用い、RPLP0の発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。得られた値について、Dunnettの多重比較検定を行い、コントロール（試験物質の添加なし）と比較して片側５％の危険率で有意差があるものを効果有りと判定した。
【００３９】
図２に結果を示す。25ppmおよび50ppmのいずれの濃度においても、ペラルゴニウム属植物の抽出物は、刺激２時間後のPeriod1遺伝子の発現を有意に高めた。
【００４０】
上記の結果から、ペラルゴニウム属植物の抽出物が、Period遺伝子の発現を促進し得ることが示された。
【００４１】
(配合例)
以下、本発明のPeriod発現調節剤の配合例を示すが、本発明の実施は以下に限定されるものではない。配合量は全て製品全量に対する質量％で表す。
【００４２】
マッサージ用ジェル
（１）エリスリトール                                          ２．０
（２）カフェイン                                              ５．０
（３）オウバク抽出物                                          ３．０
（４）グリセリン                                            ５０．０
（５）カルボキシビニルポリマー                                ０．４
（６）ポリエチレングリコール４００                          ３０．０
（７）エデト３ナトリウム                                      ０．１
（８）ポリオキシエチレン（１０）メチルポリシロキサン共重合体  ２．０
（９）スクワラン                                              １．０
（１０）水酸化カリウム                                        ０．１５
（１１）ペラルゴニウム属植物の抽出物                          １．０
【００４３】
マッサージクリーム
（１）固形パラフィン                                      ５．０
（２）ミツロウ                                          １０．０
（３）ワセリン                                          １５．０
（４）流動パラフィン                                    ４１．０
（５）１．３−ブチレングリコール                          ４．０
（６）モノステアリン酸グリセリン                          ２．０
（７）ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル      ２．０
（８）ホウ砂                                              ０．２
（９）カフェイン                                          ２．０
（１０）防腐剤                                            適量
（１１）酸化防止剤                                        適量
（１２）ペラルゴニウム属植物の抽出物                      １．０
（１３）精製水                                            残余    
【００４４】
顆粒
（１）スクラロース                                            ０．１
（２）ペラルゴニウム属植物の抽出物                            ０．１
（３）香味料                                                  ５．０
（４）賦形剤（セオラス）                                    １０．０
（５）マルチトール                                            残余
【００４５】
錠剤（チュアブルタイプ）
（１）イノシトール                                          １１．０
（２）マルチトール                                          ２１．０
（３）スクロース                                              ０．５
（４）鮭白子抽出物（ＤＮＡ  Ｎａ）                            ０．１
（５）酵母抽出物                                              ０．１
（６）ペラルゴニウム属植物の抽出物                            ０．１
（７）香味料                                                  ５．０
（８）賦形剤                                                  残余
【００４６】
タブレット
（１）潤沢剤（ショ糖脂肪酸エステル等）                        １．０
（２）アラビアガム水溶液（５％）                              ２．０
（３）酸味料                                                  １．０
（４）着色料                                                  適量
（５）ペラルゴニウム属植物の抽出物                            ０．１
（６）糖質（粉糖またはソルビトール等）                        残余
【００４７】
キャンディー
（１）砂糖                                                  ５０．０
（２）水飴                                                  ４７．９５
（３）有機酸                                                  ２．０
（４）ペラルゴニウム属植物の抽出物                            ０．０５
【００４８】
ガム
（１）砂糖                                                  ４３．０
（２）ガムベース                                            ３０．９５
（３）グルコース                                            １０．０
（４）水飴                                                  １６．０
（５）ペラルゴニウム属植物の抽出物                            ０．０５
【００４９】
これら配合例の製品は、それぞれの製品形態の典型的な使用態様における使用テストにより、Period遺伝子の発現を促進して、生体の概日リズムを調整することができる。
【図１】
2014065682.tif 000003
【図２】
2014065682.tif 000004