(57)【要約】【課題】ＤＮＡを断片化するために極めて適切な精製されたトランスポザーゼ複合体を調製するための簡易かつ迅速な方法を提供する。【解決手段】細胞溶解物中のオリゴヌクレオチドアダプターとのトランスポザーゼ複合体を形成する工程、次いで、細胞溶解物中で他の物質からこの複合体を精製する工程を包含する。精製は、特定の結合対を用いて達成され、ここでこの対の１つのメンバーは、この複合体のオリゴヌクレオチドアダプターに結合され、この対の他のメンバーは、固体基板に結合される。【効果】この結合された複合体を、ＤＮＡ断片化反応で直ちに用いて、固体基板結合のＤＮＡフラグメントを生成することができ、これを増幅および配列決定のためのテンプレートとしてを含めて、複数の目的に用いることができる。【選択図】図１Ａ
2014068650.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体基板結合のトランスポザーゼ複合体であって、
（ａ）少なくとも１つのトランスポザーゼを含んでいるトランスポザーゼ構成要素と、
（ｂ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドアダプターを含んでいるオリゴヌクレオチドアダプター構成要素であって、各々のアダプターが、前記複合体のトランスポザーゼの認識配列を含む少なくとも１つの二重鎖部分を含み、１つの複合体あたり少なくとも１つの前記アダプターが、それに対して特定の結合対のメンバーを結合した、アダプター構成要素と、
（ｃ）特定の結合対を含んでいるリンカー構成要素であって、前記特定の結合対のメンバーの一方が、アダプターに結合されており、前記特定の結合対のもう一方のメンバーが、固体基板に結合されているリンカー構成要素と、
（ｄ）固体基板とを備え、
前記複合体が、１つのトランスポザーゼを含む場合、これは１つのアダプターによって結合されており、前記複合体が２つ以上のトランスポザーゼを含む場合、少なくとも２つのアダプターが、前記トランスポザーゼに結合される、トランスポザーゼ複合体。
【請求項２】
前記複合体が、
（ｅ）２つのトランスポザーゼを含んでいるトランスポザーゼ構成要素と、
（ｆ）２つのオリゴヌクレオチドアダプターを含んでいるオリゴヌクレオチドアダプター構成要素であって、各々のアダプターが、前記複合体のトランスポザーゼの認識配列を含む少なくとも１つの二重鎖部分を含み、前記アダプターの１つが、それに対して特定の結合対のメンバーを結合しており、１つのアダプターが、１つのトランスポザーゼに結合され、かつ別のアダプターが、他のトランスポザーゼに結合される、オリゴヌクレオチドアダプター構成要素と、
（ｇ）特定の結合対を含んでいるリンカー構成要素であって、前記特定の結合対のメンバーの一方が、アダプターに結合されており、前記特定の結合対のもう一方のメンバーが、固体基板に結合されているリンカー構成要素と、
（ｈ）固体基板とを備える、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記トランスポザーゼ構成要素が、２つ以上の異なるトランスポザーゼを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
組成物であって、
（ａ）トランスポザーゼ複合体であって、
少なくとも１つのトランスポザーゼを含んでいる、トランスポザーゼ構成要素と、
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドアダプターを含んでいるオリゴヌクレオチドアダプター構成要素であって、各々のアダプターが、前記複合体のトランスポザーゼの認識配列を含む少なくとも１つの二重鎖部分を含み、１つの複合体あたり少なくとも１つの前記アダプターが、それに対して特定の結合対のメンバーを結合している、オリゴヌクレオチドアダプター構成要素とを含むトランスポザーゼ複合体と、
（ｂ）細胞溶解物とを含み、
前記複合体が、１つのトランスポザーゼを含んでいる場合、これは１つのアダプターによって結合され、そして前記複合体が２つ以上のトランスポザーゼを含んでいる場合、少なくとも２つのアダプターが前記トランスポザーゼに結合されている、組成物。
【請求項５】
ヌクレアーゼインヒビターをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼインヒビターが、二価陽イオンキレート剤である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記複合体が、
（ｃ）２つのトランスポザーゼ単位を含んでいるトランスポザーゼ構成要素と、
（ｄ）２つのオリゴヌクレオチドアダプターを含んでいる、オリゴヌクレオチドアダプター構成要素であって、各々のアダプターが、前記複合体のトランスポザーゼの認識配列を含む少なくとも１つの二重鎖を含み、前記アダプターの１つが、それを特定の結合対のメンバーに結合しており、１つのアダプターが、１つのトランスポザーゼに結合され、かつ別のアダプターが、他のトランスポザーゼに結合されるオリゴヌクレオチドアダプター構成要素とを含んでいる、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記トランスポザーゼ構成要素が、２つ以上の異なるトランスポザーゼを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
ＤＮＡ断片化活性を有するトランスポザーゼ複合体を産生する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのトランスポザーゼを含む細胞を溶解して、細胞溶解物を作製する工程と、
（ｂ）前記細胞溶解物中に少なくとも１つのトランスポザーゼの認識配列を含む、少なくとも１つの二重鎖部分を有する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドアダプターを添加する工程と、
（ｃ）前記アダプターを前記トランスポザーゼに対して十分な時間結合させ、これによってトランスポザーゼ複合体を作製する工程とを包含する、方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ断片化活性が、十分高く、前記複合体を、インビトロのＤＮＡ断片化に用いることができる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞溶解液に対してヌクレアーゼインヒビターを添加する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼインヒビターが、二価イオンキレート剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランスポザーゼ複合体が、２つ以上のトランスポザーゼおよび２つ以上のアダプターを含み、各々のアダプターが、１つのトランスポザーゼに結合されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランスポザーゼ複合体を固体支持体に対して特異的な結合対反応によって結合する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
未結合の細胞溶解物のある程度またはすべてを除去する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
トランスポザーゼ複合体を精製する方法である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的ＤＮＡを断片化する方法であって、
標的ＤＮＡと、請求項１に記載の固体基板結合の複合体とを、標的ＤＮＡのトランスポザーゼ媒介性切断を可能にする条件下で組み合わせる工程を包含する、標的ＤＮＡを断片化する方法。
【請求項１８】
固体基板結合の断片化ＤＮＡを産生する方法であって、
標的ＤＮＡと請求項１の固体基板結合複合体を前記標的ＤＮＡのトランスポザーゼ媒介性の切断を可能にする条件下で組み合わせ、前記切断が、固体基板結合した断片化ＤＮＡの産生を生じる工程を包含する方法。
【請求項１９】
ハイスループット配列決定のためのＤＮＡを調製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのトランスポザーゼを含む細胞を溶解して細胞溶解物を作製する工程と、
（ｂ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドアダプターを前記細胞溶解物に添加する工程であって、各々のアダプターが、二本鎖である少なくとも１つの部分を含み、かつ少なくとも１つのトランスポザーゼの認識配列を含み、前記アダプターの少なくとも１つが、それを特定の結合対のメンバーに結合させた工程と、
（ｃ）前記アダプターを十分な時間トランスポザーゼに結合させて、トランスポザーゼ複合体を産生する工程と、
（ｄ）前記細胞溶解物およびトランスポザーゼ複合体と、固体基板とを複合させ、前記固体基板がそれを特定の結合対の他のメンバーに対して、前記特定の結合対のメンバーが結合して固体基板結合のトランスポザーゼ複合体を作製することを可能にする条件下で結合させた工程と、
（ｅ）未結合の細胞溶解物を取り除く工程と、
（ｆ）前記結合した複合体と断片化すべき標的ＤＮＡおよび核酸の増幅に必須の試薬とを合わせて反応混合物を形成する工程と、
（ｇ）前記反応混合物を、トランスポザーゼ媒介性ＤＮＡ断片化を可能にする条件下でインキュベートして、固体基板結合のＤＮＡフラグメントを生じる工程と、
（ｈ）前記ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅に供して、増幅されたＤＮＡフラグメントを生成する工程と、
（ｉ）前記反応混合物から前記増幅されたＤＮＡフラグメントを除去する工程とを包含する方法。
【請求項２０】
各々のアダプターがさらに、少なくとも１つの一本鎖部分を含む、請求項１に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関するものである。さらに具体的には、本発明は、粗細胞溶解物中のオリゴヌクレオチドアダプターと複合体化されるか、または特定の結合対連結によって固体支持体に結合されたトランスポザーゼを有する組成物に関し、この複合体を精製するトランスポザーゼ／オリゴヌクレオチド複合体の使用、ならびにインビトロ増幅、核酸の配列決定および目的の配列のためのＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためにＤＮＡ分子を調製するためのこの複合体の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムＤＮＡの断片化は、次世代配列決定（next generation sequencing）すなわちＮＧＳとも呼ばれる、ハイスループット配列決定のためのＤＮＡサンプル調製における重要な工程である。もともと用いられるサンプル調製方法、例えば、ＤＮＡｓｅＩを用いるＤＮＡ断片化は、極めて信頼できないものであり、不十分であるかまたは詳細すぎるＤＮＡ断片化につながる場合が多い。いずれの場合にも、有用なサイズのＤＮＡ断片（約２００〜８００塩基対（ｂｐ））の収率は低い。
【０００３】
マサチューセッツ州、ウォーバンにあるCovaris社製の超音波処理器、例えば、Ｅ２２０およびＥ２２０ｘの装置を用いるＤＮＡ剪断によって、代用が得られる。しかし、このような装置は、極めて高価であって（２０１２年の価格で１００，０００ドルを超える）、全体的なＤＮＡ剪断は、多くの労力を要する多段階の過程である。これは、ＤＮＡ断片化、フラグメント末端修復、第一フラグメント精製、ポリＡテーリング、アダプター連結、第二フラグメント精製、ＰＣＲ増幅および第三フラグメント精製を包含する。複数の工程は、カリフォルニア州、サンディエゴにあるIllunina社製のＮＥＸＴＥＲＡ（商標）ＤＮＡサンプル調製キットのようなオリゴヌクレオチド−トランスポザーゼ複合体を用いて半分にカットできる。キットで提供されるオリゴヌクレオチド−トランスポザーゼ複合体は、単一の反応で制御されたＤＮＡ断片化およびアダプターの結合の両方を達成できて、これには２〜３分間しかかからない。
【０００４】
このような複合体は、改変Ｔｎ５トランスポザーゼの二量体、および一対のＴｎ５結合二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチド（１９ｂｐのトランスポザーゼ結合配列または逆位反復配列（ＩＲ）を含む）から構成される。ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）システムでは、遺伝子操作された、天然ではない１９ｂｐのトランスポザーゼ結合配列が用いられ、これは、天然のＴｎ５ＩＲ配列よりも有効なＤＮＡ断片化をもたらす。この結合配列は、「モザイク」と呼ばれる。
【０００５】
ＤＮＡａｓｅ（その単一分子は、標的ＤＮＡ中で複数の切断を生じ得る）と異なり、トランスポザーゼ複合体は、１つの複合体あたり１つのＤＮＡ切断しか生じないと考えられる。したがって、ＤＮＡｓｅＩと異なり、ＤＮＡ断片化の程度は、反応混合物中での標的ＤＮＡに対するトランスポザーゼ複合体の比を制御することによってトランスポザーゼ断片化の間に容易に制御される。さらに、モザイク配列と組み合わせた特定のヌクレオチドタグは、このトランスポザーゼ媒介性ＤＮＡ断片化プロセスで結合されることができ、このプロセスは、ＰＣＲ中でのＤＮＡ増幅および配列決定チップに対するＤＮＡフラグメントの結合のために有用である。コスト、時間および労力における明確な利点にもかかわらず、トランスポザーゼ方法は、超音波処理と比較して用いられる頻度は低い。なぜなら、この方法では、標的ＤＮＡの完全に無作為な断片化は生じない（バイアス）からである。
【０００６】
今まで、ＮＧＳにおけるＤＮＡ断片化およびタグ付けに適切であることが公知の唯一のトランスポザーゼは、改変Ｔｎ５トランスポザーゼである。その始まりから、Ｔｎ５トランスポザーゼは、いくつかの点で問題があった。まず、天然のトランスポザーゼは、強力なプロモーターから発現されるとき、E. coliにとって毒性であるので、生成することが実際的に不可能であった。しかし、この困難性は、いくつかのＮ末端アミノ酸を欠失することによって克服された（非特許文献１）。
【０００７】
これによって、毒性の問題は解決され、Ｎ末端短縮トランスポザーゼが高収率で産生されたが、このトランスポザーゼが保有する活性は極めて低かった。したがって、いくつかの他の変異を導入して、その活性を増大した（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。しかし、これでは、酵素によるすべての問題を解決はしなかった。
【０００８】
例えば、変異された酵素は高い塩、例えば、０．７ＭのＮａＣｌでのみ安定であり（非特許文献２）、これは、トランスポザーゼ反応に必要なより低い塩条件では、その活性を急速に失い、これは、反応混合物中でわずか２．４分の半減期である。したがって、このトランスポザーゼを用いるＤＮＡ断片化反応は典型的には、５分間行われ、極めて大量の酵素が用いられる。
【０００９】
精製プロセス全体にわたって高い塩濃度が維持されるという事実にもかかわらず、精製された酵素は、大部分は不活性であり、したがって、オリゴヌクレオチドよりも９．４倍過剰の酵素を典型的には用いて、Ｔｎ５トランスポザーゼオリゴヌクレオチド複合体を形成する（非特許文献３）。
【００１０】
さらに、トランスポザーゼは、タンパク質分解性の分解を受けやすい。この問題に取り組むため、分解しやすい部位を変異した。興味深いことに、これらの変異によって、酵素のインビボ活性の劇的な低下が生じたが、インビトロ活性に対しては影響がほとんどなかった（非特許文献４）。全体的に、Ｔｎ５トランスポザーゼは、産生するのが困難であり、大量に必要とされ、極めて高価である。
【００１１】
しかし、今までのところ、別の技術を提供したものはいない。天然の変異されていないトランスポザーゼは本質的に不活性であると一般には考えられる。なぜなら、高い活性は、環境中での宿主生存には不適であるからである（非特許文献５）。
【００１２】
天然のトランスポザーゼは、有する活性が低いと考えられるので、それらは、ＮＧＳサンプル調製には適切ではない。精製されたＴｎ５トランスポザーゼを活性にするためには長年の変異および生物学的選択がかかるという事実に照らして、適切な活性を有する別のトランスポザーゼを提供するという課題は、解決が難しいと思われる。例えば、真核生物細胞の変更のために超活性のＳＢトランスポザーゼを構築する試みでは、その中のほとんどあらゆる単一アミノ酸が変異され、関連したトランスポザーゼからのアミノ酸の小さいブロックが持ち込まれ、系統的なアラニンスキャンイングおよび選択されたアミノ酸残基の合理的な置換が適用された（非特許文献６）。
【００１３】
しかし、この労力によって、活性のごく軽度の増大を伴う改変体が得られた。このような改変体を組み合わせるためのハイスループットのアプローチだけが、所望の活性を有する改変体を生じた。適切なトランスポザーゼを得ることがさらに困難であることは、天然のトランスポザーゼがインビトロ操作のために十分な活性であるということを仮定してさえ、トランスポザーゼ活性は、従来のタンパク質精製の間に典型的には使用される、天然ではない環境（すなわち、高いまたは低い塩、アルカリ、または酸性のｐＨ、界面活性剤、樹脂への結合、推定される補因子の非存在など）にそれが曝された場合、その精製プロセスの間に失われる場合があるということである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，９６５，４４３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４０６，８９６号Ｂ１明細書
【特許文献３】米国特許第７，６０８，４３４号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Weinreich et al., J. Bacterial, 第176巻 p.5494〜5504, 1994年
【非特許文献２】Steiniger et al., Nucl. Acids Res., 2006年, 第34巻, p.2820-2832
【非特許文献３】NaumannおよびReznikoff, J. Biol. Chem., 2002年, 第277巻, p.17623-17629
【非特許文献４】Twining et al., J. Biol. Chem., 2001年, 第276巻, p.23135-23143
【非特許文献５】Reznikoff WS., Mol. Microbiol., 2003年, 第47巻, p.1199-1206
【非特許文献６】IvicsおよびIzvak., Mobile DNA, 2010年, 第1巻, 第25号, p.1-15
【非特許文献７】Robinson et al., Nature Biotechnology, 2011年, 第29巻, p.24-26
【非特許文献８】YuanおよびWessler, Proc Natl Acad Sci, アメリカ合衆国, 2011年5月10日, 第108巻, 第19号, p.7884-7889
【非特許文献９】Reznikoff et al., Journal of Bacteriology, 2004年, 第186巻, 第24号, p.8240-8247
【非特許文献１０】Vaezeslami et al., Bacteriol., 2007年, 第189巻, 第20号, p.7436-7441
【非特許文献１１】Keefe et al., Protein Expr Purif, 2001年, 第23巻, 第3号, p.440-446
【非特許文献１２】Duffy et al., Anal Biochem., 1998年, 第262巻, 第2号, p.122-128
【非特許文献１３】LamlaおよびErdmann, Protein Expr Purif, 2004年, 第33巻, 第1号, p.39-47
【非特許文献１４】Motomura et al., Protein Expr Purif., 2011年, 第77巻, 第2号, p.173-177
【非特許文献１５】Dorgan et al., Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 1999年, 第194巻, p.69-75
【非特許文献１６】Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
以下に考察されるとおり、本発明者は、精製された、活性なトランスポザーゼを得るために新しいプロセスを考案することによって、当該分野の問題に取り組み、かつ解決した。この解決は、先行技術のスキームで使用されるよりも生理学的な環境である、粗細胞溶解物中でトランスポザーゼとオリゴヌクレオチドとの複合体を最初に形成すること、およびトランスポザーゼ活性の使用をさらに少なくすること、次いでこの複合体を精製することによって従来のトランスポザーゼ精製の必要性を取り除いた。
【００１７】
このアプローチの有利な点は、オリゴヌクレオチドとのトランスポザーゼ複合体が、トランスポザーゼ精製の前に形成されるということである。このアプローチの別の利点は、これによって、他の技術でみられるトランスポザーゼ精製の高価であって、かつ時間のかかるプロセスを回避するということである。さらに、プレートまたはビーズのような固体支持体に対するトランスポザーゼ複合体の結合によって、ＮＧＳのためのハイスループットのプレートまたはビーズ形式のサンプル調製のための技術的解決が得られる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、改良されたトランスポザーゼ媒介性のＤＮＡ断片化システムの必要性が当該分野にあることを認識していた。とりわけ、このようなシステムにおける必要性は、トランスポザーゼおよび他の物質と複合体化されたトランスポザーゼであり、これは、ＤＮＡ断片化のために優れた特性および特徴を有し、これには、現在市販されているＴｎ５由来のトランスポザーゼと比較して、改善された活性だけでなく、標的ＤＮＡの改善された安定性およびよりランダムな断片化も同様に挙げられる。このシステムは、現在市販されているＴｎ５由来のトランスポザーゼと比較して、優れた特性および特徴を有している、トランスポザーゼおよびトランスポザーゼ複合体を含んでいる組成物を備えることができる。さらに、本発明者は、トランスポザーゼおよび他の物質と複合体化されたトランスポザーゼを作製または作製して精製するための本発明の方法が、現在市販されているＴｎ５由来のトランスポザーゼよりも高い活性および優れた安定性を有するトランスポザーゼを提供する必要があることを認識していた。さらに、本発明者は、このような改善されたシステムが、より制御された方式でＤＮＡを断片化するための、ならびに種々の他の分子生物学的プロセス（無細胞ＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）、およびハイスループット配列決定を含むがこれに限らない）における使用のためにＤＮＡ分子を産生するための、改善されたトランスポザーゼおよびトランスポザーゼ複合体の使用を包含できることを認識していた。
【００１９】
第一の態様では、本発明は、実施形態で単離されるかまたは精製される、組み換え野性型および改変されたトランスポザーゼを提供する。このトランスポザーゼは、それらが天然に存在する環境よりも困難な環境で見出されるか、またはそれらが産生された場合、単離されるかまたは精製されるとみなされる。例えば、それらは、環境中にあることも可能で、ここではトランスポザーゼが産生される細胞の他の生体分子のある程度またはすべてが除去される。このトランスポザーゼは、それらが天然に見出される細胞ではない細胞中で産生される場合は、組み換えであり、それらが由来するかまたは起源であるトランスポザーゼ（単数または複数）の天然に存在する配列（単数または複数）とは異なるアミノ酸配列を有する場合は、改変されている。例えば、本発明によるトランスポザーゼは、天然に存在するトランスポザーゼ（野性型）のアミノ酸配列を有することもでき、または１つ以上の天然に存在するアミノ酸が欠失されているかもしくは異なるアミノ酸で置換されている改変トランスポザーゼのアミノ酸配列を有することもでき、または改変されたトランスポザーゼが、野性型配列に加えられたアミノ酸配列を有することもできる。さらに、天然に存在するアミノ酸配列が、配列中の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の付加によって中断できる。いくつかの実施形態では、このトランスポザーゼは、キメラタンパク質であって、すなわち、それらは、２つ以上の異なるトランスポザーゼ由来のアミノ酸配列の混合を含むタンパク質である。
【００２０】
本発明のトランスポザーゼは、トランスポザーゼに加えて少なくとも１つの他の物質を含む組成物中に存在してもよい。特定の実施形態では、この組成物は、２つ以上の異なるトランスポザーゼを含む。他の物質の性質および数は特に限定されない。複数の実施形態では、この組成物は、少なくとも水を含むが、特定の実施形態は、凍結された組成物または乾燥された（例えば、凍結乾燥された）組成物に関する。実施形態では、この組成物は、細胞溶解物中に、またはＤＮＡ断片化反応混合物中にトランスポザーゼを含み、これは、実施形態では、ＥＤＴＡおよび／またはオリゴヌクレオチドを補充される。ＥＤＴＡは、二価陽イオンをキレートし、これによって、それらの活性のために典型的にはＭｇ２＋イオンを必要とし、そうでなければオリゴヌクレオチドを分解する、宿主細胞ヌクレアーゼを阻害する。トランスポザーゼ−オリゴヌクレオチド複合体の形成が二価陽イオンを必要としないという事実によって、複合体の形成または維持の破壊なしに粗細胞溶解物に対してＥＤＴＡまたは他のヌクレアーゼインヒビターを添加することが可能になる。
【００２１】
本発明の別の一般的な態様では、トランスポザーゼは、複合体の一部として見出され得る。本発明によるトランスポザーゼ複合体は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに対して、非共有結合を通じて化学的に結合した本発明の少なくとも１つのトランスポザーゼを含む。複合体中の各々のオリゴヌクレオチドは、二本鎖である少なくとも一部を含み、かつ一本鎖である一部を含むことができる。これらのオリゴヌクレオチドは、時には本明細書において「アダプター」と呼ばれる。各々の複合体のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、特定の結合対の特定の結合対メンバーを含み、これによって、この複合体は、固体基板（当該分野でおよび本明細書では、また固体支持体とも呼ばれる）と結合できる。実施形態では、特定の結合対メンバーとは、ストレプトアビジンおよびビオチンである。
【００２２】
この複合体は、１つ以上のトランスポザーゼ分子および１つ以上のアダプターを含んでもよい。少なくとも２つのトランスポザーゼを含む複合体では、トランスポザーゼのうち少なくとも２つがオリゴヌクレオチドに結合される。複合体が２つのトランスポザーゼを含む実施形態では、この複合体は、シナプス複合体と同様の形態を示すことができる。より高次の複合体、例えば、４つのトランスポザーゼ、８つのトランスポザーゼまたは異なる数の大きさの複合体の混合物もまた可能である。上記で示唆されるとおり、３つ以上のトランスポザーゼを含んでいる複合体では、すべてのトランスポザーゼがオリゴヌクレオチドによって結合される必要はない。そうではなく、トランスポザーゼの２つが結合されることで十分であるが、追加のオリゴヌクレオチドが結合されてもよい。
【００２３】
通常は、２つ以上のトランスポザーゼ分子が複合体中に存在する場合、同じトランスポザーゼが複合体中で使用される。しかし、いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるトランスポザーゼを単一の複合体中で使用することが好ましい。例えば、複合体中の１つ以上のトランスポザーゼ分子を、それらのアミノ酸配列の改変によって部分的にまたは完全に不活性にすることができて、そして活性および部分的にまたは完全に不活性なトランスポザーゼ分子の混合物を用いて、活性なサブユニットの間の距離、および結果としてその複合体によって産生されるＤＮＡフラグメントの平均サイズを調節することができる。
【００２４】
同様に、異なる認識配列を有する異なる複合体、例えば、高いＧＣ配列の認識配列を有するトランスポザーゼおよび低いＧＣ含量を有する配列の認識配列を有する別のトランスポザーゼを含む複合体などを用いることもできる。認識配列において異なるＧＣおよびＡＴ含量を有するトランスポザーゼの混合によって、標的ＤＮＡ配列の断片化パターンを仕立てることが可能になる。
【００２５】
１種類のオリゴヌクレオチドアダプターをフラグメントＤＮＡに用いることもできるが、断片化の後に、断片化されたＤＮＡの増幅および配列決定が続く実施形態では、ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を容易にするため、およびＤＮＡフラグメントを両方向に配列決定するために用いられる異なるＤＮＡ配列決定プライマーの異なる着地点を提供するために、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドアダプターの使用が好ましい。１つ以上のトランスポザーゼ認識配列を用いて、オリゴヌクレオチドを設計してもよい。なぜなら、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＮｉｎｄＩＩＩと異なり、トランスポザーゼは、１つの正確な認識配列に必ずしも限定されないからである。
【００２６】
本発明のトランスポザーゼと同様、本発明のトランスポザーゼ複合体は、組成物中に存在してもよく、この組成物は、トランスポザーゼ複合体に加えて少なくとも１つの他の物質を含む。他の物質の性質および数は、特に限定されない。複数の実施形態では、この組成物は、少なくとも水を含むが、特定の実施形態は、凍結または乾燥された（例えば、凍結乾燥された）組成物に関する。実施形態では、この組成物は、細胞溶解物の中に、またはＤＮＡ断片化反応混合物の中にトランスポザーゼ複合体を含む。
【００２７】
本発明の別の一般的な態様は、連結によって固体支持体に結合されたトランスポザーゼ複合体である。この連結は、固体支持体に対する生化学的分子の結合について当該分野で公知の任意の連結であってもよい。いくつかの実施形態では、この連結は切断可能である。当業者は、複数のこのような連結ならびに対応する除去試薬および技術を承知している。
【００２８】
この態様の実施形態では、オリゴヌクレオチドアダプターによって各々結合される（アダプターの１つは、複数の特異的な結合対をその末端に含む）、少なくとも２つのトランスポザーゼを含んでいるトランスポザーゼ複合体は、固体基板に対して、その結合パートナー（その固体基板に対して化学的に結合される）に対する特異的な結合対メンバーの結合によって化学的に結合される。任意の特異的な結合対を用いることができるが、実施形態では、ストレプトアビジンおよびビオチンが用いられる。固体基板に結合されたトランスポザーゼ複合体は、精製され結合された複合体について可能にするだけでなく、細胞溶解物のような、結合されたトランスポザーゼ複合体を含む組成物についても可能にし、ここでは、トランスポザーゼ複合体とは、固体の基板結合およびトランスポザーゼ反応混合物、例えば、ＤＮＡ断片化混合物である。
【００２９】
別の一般的な態様では、本発明は、トランスポザーゼ複合体を作製する方法を提供する。一般には、この方法は、１つ以上のトランスポザーゼを含んでいる細胞溶解物に対して、１つ以上のアダプターオリゴヌクレオチドを添加する工程と、このアダプターをトランスポザーゼに結合させて複合体を形成させる工程とを包含する。望ましい場合、この方法はさらに、トランスポザーゼ複合体をお互いと会合させて、二量体および／またはより高次の複合体を形成する工程を包含する。
【００３０】
好ましい実施形態では、この方法はまた、溶解物中に存在するデオキシリボヌクレアーゼを、例えば、カルシウムイオン、化合物（例えば、キレート剤）、還元剤、２−ニトロ−５−チオシオアノ安息香酸、アルファトキシンＢ２ａ、Ｇ２、Ｇ２ａおよびＭ１、カルボジイミド、コレステロール硫酸、ヨード酢酸、またはタンパク質、例えば、ウシ脾臓阻害タンパク質またはアクチンで阻害する工程を包含する。実施形態では、この方法はまた、細胞中でトランスポザーゼを産生する工程、細胞を溶解する工程、またはその両方を包含する。
【００３１】
さらに、本発明は、トランスポザーゼまたはトランスポザーゼ複合体を精製する方法を提供する。一般には、この方法は、トランスポザーゼを含む細胞を溶解する工程と、アダプターオリゴヌクレオチド（特定の結合対のメンバーを含む）を細胞溶解物に添加する工程と、このアダプターをトランスポザーゼに結合させる工程と、この溶解物を、特異的な結合対メンバーのパートナーを含む固体基板と接触させる工程と、この溶解物および固体基板を、特定の結合対メンバーがお互いに結合する条件に供する工程と、この固体基板から細胞溶解物のある程度またはすべてを除去する工程とを包含する。
【００３２】
好ましい実施形態では、この方法はまた、溶解物中に存在するデオキシリボヌクレアーゼを、例えば、ＤＮａｓｅインヒビター（例えば、キレート剤）で阻害する工程を包含する。この方法はさらに、固体基板結合のトランスポザーゼを洗浄して、それを細胞溶解物質からさらに精製する工程を包含してもよい。実施形態では、この方法はさらに、細胞溶解物と固体基板とを接触させる前に、トランスポザーゼ複合体の形成を包含する。さらにこの方法はまた、トランスポザーゼ複合体の形成の前に、または複合体の形成と同時に、固体基板が添加される実施形態を包含する。さらに、いくつかの実施形態では、この方法は、精製後にトランスポザーゼ複合体を解離させる工程、および／または精製後にアダプターからトランスポザーゼを解離する工程とを包含する。
【００３３】
この精製されたトランスポザーゼ複合体は、当業者によって想定できるように、複数の用途を有する。それらの用途の中でも、本明細書は、さらなる分析手順で用いられるべきＤＮＡの調製のためのトランスポザーゼ複合体の使用を例示する。１つのこのような使用は、ＤＮＡの断片化において、無細胞増幅（例えば、ＰＣＲ）またはハイスループット配列決定のためにトランスポザーゼ複合体を調製することである。したがって、１つの態様では、ＤＮＡを断片化する方法および好ましくはこれをアダプターでタグ付けする方法が提供される。
【００３４】
一般には、この方法は、断片化されるべき標的ＤＮＡを、固体基板に結合されたトランスポザーゼ複合体と組み合わせる工程と、この組み合わせを、トランスポザーゼ複合体によるＤＮＡ切断に適切な条件下で、インキュベートして、固体基板に結合した断片化された標的ＤＮＡを生成する工程とを包含する。次に、この固体基板結合ＤＮＡフラグメントを、複数の分析的反応で用いることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、固体基板に結合されていない反応混合物の構成要素を、例えば、当該分野で公知の任意の適切な洗浄手順によって除去する。いくつかの実施形態では、固体基板結合ＤＮＡフラグメントを、追加の精製または調製なしに、創出して直ちに用いる。例えば、１つに混合したＤＮＡ断片化および増幅混合物を提供することが可能で、ここでは標的ＤＮＡを、固体基板結合したトランスポザーゼ複合体と、ＤＮＡ断片化が固体基板結合のＤＮＡフラグメントを産生することを可能にする条件下で組み合わせて、次に、この混合物を、例えば、ＰＣＲによる、結合したＤＮＡフラグメントの無細胞の増幅を可能にする条件に供する。
【００３６】
本明細書の一部に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本発明の実施形態および特徴を図示し、書面の説明を支持するデータを提供し、そして書面の説明とともに、本発明の特定の原理を説明するように機能する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】トランスポザーゼ複合体を創出し、この複合体を固体基板に結合し、フラグメントＤＮＡに対して固体基板結合の複合体を用い、固体基板結合のＤＮＡフラグメントを産生することができる一連の工程を示す図である。
【図１Ｂ】トランスポザーゼ複合体を創出し、この複合体を固体基板に結合し、フラグメントＤＮＡに対して固体基板結合の複合体を用い、固体基板結合のＤＮＡフラグメントを産生することができる一連の工程を示す図である。
【図１Ｃ】トランスポザーゼ複合体を創出し、この複合体を固体基板に結合し、フラグメントＤＮＡに対して固体基板結合の複合体を用い、固体基板結合のＤＮＡフラグメントを産生することができる一連の工程を示す図である。
【図１Ｄ】トランスポザーゼ複合体を創出し、この複合体を固体基板に結合し、フラグメントＤＮＡに対して固体基板結合の複合体を用い、固体基板結合のＤＮＡフラグメントを産生することができる一連の工程を示す図である。
【図２】インビトロ増幅のための固体基板結合のＤＮＡの使用を示す図である。
【図３】ＤＮＡについて染色されたアガロースゲルの写真を示しており、これは、粗細胞溶解物中で形成され、固体基板に結合され、溶解物から結合型で単離された、トランスポザーゼ特異的オリゴヌクレオチドとのトランスポザーゼ（「Vibhar」）複合体を結合型で（すなわち、精製された固定された複合体）を用いて、標的ＤＮＡ（ファージラムダＤＮＡ）を断片化できて、このフラグメントがＰＣＲ中で特異的に増幅できることを示している。レーンの内容：Vibharトランスポザーゼを発現するE. coli細胞の溶解物（レーン３）またはVibharトランスポザーゼを発現しない陰性のコントロール細胞の溶解物（レーン２、４、５）であって、標的ＤＮＡを加えたもの（レーン３および５）または標的ＤＮＡを加えてないもの（レーン２および４）。比較のために、１ｋｂ＋ＤＮＡラダー（カリフォルニア州、カールスバッドにあるLife Technologies社製）をレーン１に流した。
【図４】本発明によって包含される特定のトランスポザーゼを模式的に記述した図である。ここでトランスポザーゼは、２つ以上のトランスポザーゼのキメラであり、種々の合わせた配列が、灰色の異なる影で示され、左側の注釈は、配列の順序を示している。１．Ａ（Vibhar＋Ant）、Vibrio harveyiトランスポザーゼ（ＹＰ＿００１４４６２８９、配列番号１）であって、ＧＧＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＥＮ（配列番号２）というＣ末端伸長を有する（全長配列は配列番号３として示す）。２．Ｌ（Vibhar＋Lef）、Vibrio harveyiトランスポザーゼであって、ＧＧＧＫＫＫＲＫＲＥＲ（配列番号４）というＣ末端伸長を有する（全長配列は配列番号５として示す）。３．Ｓ（Vibhar＋Sox）、Vibrio harveyiトランスポザーゼであって、ＧＧＧＫＹＲＰＲＲＲＫＱ（配列番号６）というＣ末端伸長を有し（全長配列は配列番号７として示す）。４．５Ｂ−Photobacterium profundum ＳＳ９トランスポザーゼ（ＹＰ＿１３３４３９、配列番号８）。５．５Ｌ  Vibrio harveyiトランスポザーゼであって、そのＣ末端ドメインが、Photobacterium profundum ＳＳ９トランスポザーゼ由来の対応するＣ末端ドメインに代えられている（キメラの全長配列は配列番号９で示される）。６．Ｖ６，Vibrio harveyiトランスポザーゼ（ＹＰ＿００１４４６２８９、配列番号１）。７．Vibrio cholerae Ｖ５１トランスポザーゼ（ＺＰ＿０４９１８２８６．１、配列番号１０）。８．Vibrio cholerae Ｖ５１トランスポザーゼ（ＺＰ＿０４９１８２８６．１）であって、Vibrio細菌ＳＷＡＴ−３トランスポザーゼに順応するようにアミノ酸が変化されたもの（ＺＰ＿０１８１５１４１．１、キメラの全長配列は、配列番号１１として示される）。９．Vibrio harveyiトランスポザーゼであって、そのＣ末端ドメインが、ＩＳ４ファミリーのトランスポザーゼＴｎｐ４［Legionella pneumophila subsup. Pneumophila str. Philadelphia １］由来の対応するＣ末端ドメインで置換されているもの（全長キメラ配列は、配列番号１２で示される）。１０．Vibrio harveyiのトランスポザーゼであって、そのＣ末端ドメインが、Vibrio choleraeのＶ５１トランスポザーゼ由来の対応するＣ末端ドメインで置換されているもの（全長キメラ配列は、配列番号１３で示される）。１１．Vibrio harveyiのトランスポザーゼであって、そのＣ末端ドメインが、Vibrio細菌ＳＷＡＴ−３トランスポザーゼ由来の対応するＣ末端ドメインで置換されているもの（ＺＰ＿０１８１５１４１．１、全長キメラ配列は、配列番号１４で示される）。
【図５】ＰＣＲ増幅のためのアダプターおよびプライマー、ならびにIllumina装置での配列決定のためのオリゴヌクレオチドを示す図である。ＡｇＰ１＝配列番号１５、３ｂｉｏ＝配列番号１６、３ｉ０＝配列番号１７、ＡｇＰ２＝配列番号１８、８ｉｌ＝配列番号１９、８ｉ０＝配列番号２０、ｉｌ＝配列番号２１、ｉ２＝配列番号２２、ｉ３＝配列番号２３、ｉ４＝配列番号２４、ｉ５＝配列番号２５、ｉ６＝配列番号２６、ｉ７＝配列番号２７、ｉ８＝配列番号２８、３ｉＳ＝配列番号２９、８ｉＳ＝配列番号３０、Ｒｐ１＝配列番号３１、Ｒｐ２＝配列番号３２、ＩｎＰ＝配列番号３３。
【図６】ＤＮＡについて染色したアガロースゲルの写真を示し、これは、種々の固体基板結合のトランスポザーゼ複合体（組み換え／キメラトランスポザーゼ複合体を含む）を用いて、標的のラムダＤＮＡを断片化して、固体基板に結合した場合、断片化したＤＮＡを増幅することができることを示している。比較のために、１ｋｂ＋ＤＮＡラダー（カリフォルニア州、カールスバッドにあるLife Technologies社製）を、フラグメントと並行してゲルに流した。ゲルのウェルの上に示されるサンプルコードは、図４に示されるコードに相当する。
【図７】ＤＮＡについて染色したアガロースゲルの写真を示しており、これによって、組み換え／キメラトランスポザーゼ複合体を含んでいる、種々の固体基板のトランスポザーゼ複合体が、標的E. coli ＤＮＡを断片化して、固体基板に結合した場合、断片化したＤＮＡを増幅することができること、およびこの増幅が、なんらかの特定のポリメラーゼにもポリメラーゼ混合物にも依存しないことが示される。ゲルのウェルの上に示されるサンプルコードは、図４に示されるコードに相当する。分子量は、ゲルの右側に示す。Ｍ＝ＰｉｃｏＭａｘｘ（Agilent Technologies, Inc社の商標）を用いて増幅し、Ｕ＝ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＨＦ（Agilent Technologies, Inc社の商標）を用いて増幅。
【図８】配列決定のための提出の前のＤＮＡフラグメントのBioanalyzer Electropherogramを示すグラフである。サンプル番号は、図４に示される数に相当する。
【図９】E. coliゲノム上に配列され、Interactive Genomics Viewerプログラム（非特許文献７）で示された、異なるトランスポザーゼを用いて得たE. coliゲノム（Genbank ＣＰ０００９４６）の配列決定されたＤＮＡフラグメントを示す。サンプル含量が示されており、図４に示される構築物に相当する。
【図１０Ａ】種々のトランスポザーゼを用いて得られたE. coliのゲノム（Genbank ＣＰ０００９４６）の配列決定されたＤＮＡフラグメントのＧＣバイアスプロットを示す図である。プロットのサンプルコードは、図４に示されるコードに相当する。
【図１０Ｂ】種々のトランスポザーゼを用いて得られたE. coliのゲノム（Genbank ＣＰ０００９４６）の配列決定されたＤＮＡフラグメントのＧＣバイアスプロットを示す図である。プロットのサンプルコードは、図４に示されるコードに相当する。
【図１０Ｃ】種々のトランスポザーゼを用いて得られたE. coliのゲノム（Genbank ＣＰ０００９４６）の配列決定されたＤＮＡフラグメントのＧＣバイアスプロットを示す図である。プロットのサンプルコードは、図４に示されるコードに相当する。
【図１０Ｄ】種々のトランスポザーゼを用いて得られたE. coliのゲノム（Genbank ＣＰ０００９４６）の配列決定されたＤＮＡフラグメントのＧＣバイアスプロットを示す図である。プロットのサンプルコードは、図４に示されるコードに相当する。
【図１０Ｅ】種々のトランスポザーゼを用いて得られたE. coliのゲノム（Genbank ＣＰ０００９４６）の配列決定されたＤＮＡフラグメントのＧＣバイアスプロットを示す図である。プロットのサンプルコードは、図４に示されるコードに相当する。
【図１０Ｆ】種々のトランスポザーゼを用いて得られたE. coliのゲノム（Genbank ＣＰ０００９４６）の配列決定されたＤＮＡフラグメントのＧＣバイアスプロットを示す図である。プロットのサンプルコードは、図４に示されるコードに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の種々の実施形態をここで詳細に参照して、このような実施形態を支持するデータは、添付の図面に図示されている。この詳細な説明は、本発明の限定と解釈されるべきではなく、読者に本発明の特定の態様、特徴および実施形態のさらに具体的な詳細を提供する開示として理解されるべきである。
【００３９】
本発明の実施形態を詳細に記載する前に、本明細書に用いられる技術用語は、特定の実施形態を説明する目的に過ぎず、限定であると意図されるものではないことが理解されるべきである。さらに、ある範囲の値が提供される場合、各々の介在する値は、その文脈が明確に他を示すのでない限り、下限の単位の十分の一まで、その範囲の上限と下限との間もまた厳密に言えば開示されることが理解される。
【００４０】
言及した範囲における任意の言及した値または介在する値と、その言及した範囲の任意の他の言及したまたは介在する値との間の各々のより小さい範囲は、本発明内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、その範囲に含まれてもよいし、または除外されてもよく、各々の範囲（そのより小さい範囲内に、いずれかの限界が包含されるか、いずれの限界も包含されないか、または両方の限界が包含される）はまた、本発明内に包含され、言及される範囲の任意の明確に排除される限界に支配される。
【００４１】
言及される範囲が、その限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる範囲のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。明確にするために、あるセットの値またはある範囲の値が開示される場合、その２つの値または値の範囲内におさまる各々の値は、本発明によって包含され、各々の特定の値の特定の言及の省略は、読者の便宜上のものであり、本明細書のサイズを小さくするために行うものであることが理解されるべきである。当業者は、各々の値およびあらゆる値について本明細書に具体的に開示する必要なく、本明細書に開示される範囲によってどの値が包含されるかを直ちに理解する。
【００４２】
別段規定しない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および化学的な用語は、その用語が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書に言及されるすべての刊行物は、参照によって本明細書に援用され、その刊行物が言及するものに関連して、方法および／または材料を開示し記載するものである。本開示は、それが任意の援用された刊行物と矛盾する程度までは支配されている。
【００４３】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「１つの、ある（a、an：不定冠詞）」および「この、その（the：定冠詞）」は、文脈上、明らかに他が示されない限り、複数の言及を包含する。したがって、例えば、「あるトランスポザーゼ」という言及は、複数のこのようなトランスポザーゼを包含し、「このサンプル」という言及は、当業者に公知の１つ以上のサンプルおよびその等価物などに対する言及を包含する。さらに、等価な用語を用いて記載することができる用語の使用は、その等価な用語の使用を包含する。
【００４４】
本発明の第一の態様は、インビトロでＤＮＡ断片化活性を有するトランスポザーゼである。本発明のトランスポザーゼは、インビトロでトランスポザーゼ活性を有している任意のタンパク質であることができる。これは天然に存在するトランスポザーゼであることも、または組み換えトランスポザーゼであることもできる。このトランスポザーゼは、少なくともある程度まで、その天然の環境（すなわち、細胞核または細胞質ゾル）から単離することもでき、精製することもできる。好ましくは、このトランスポザーゼは、組み換え産生され、好ましくは、少なくともある程度まで、組み換え宿主環境（すなわち、細胞核または細胞質ゾル）から単離されるか、または精製される。
【００４５】
最も好ましくは、このトランスポザーゼは、本発明の組成物中への包含の前に、他の細胞成分から９０％以上のレベルまで精製される。好ましくは、このトランスポザーゼは、約９５％以上、例えば、約９８％純粋、約９９％純粋、または９９％純粋を超えるレベルである。純度は、タンパク質ゲルのクマーシーブルー染色、タンパク質ゲルの銀染色、ＨＰＬＣ、質量分析、またはタンパク質サンプル中の不純物を検出するための他の鋭敏な技術などによる、純度を決定するための一般的な技術に基づいて決定される。ＤＮＡ不純物はまた、例えば、ＰＣＲを用いて評価することもできる。
【００４６】
実施形態では、トランスポザーゼは、転位の「カットアンドペースト」機構を有するトランスポザーゼであり（非特許文献８）、Vibrio harveyiを含むがこれに限定されないVibrio種で天然に見出されるものなどの、ＩＳ４ファミリーのトランスポザーゼのメンバーである。実施形態では、このトランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼでも、例えば、野性型Ｔｎ５トランスポザーゼの突然変異生成によるＴｎ５トランスポザーゼ由来のトランスポザーゼでもない。
【００４７】
本発明の実施形態では、Vibrio harveyiトランスポザーゼに関連し、その発見および特徴付けは、２０１２年５月１１日出願の同時係属の米国特許出願第１３／４７０，０８７号に開示されており、その内容全体は、参照によって本明細書に援用される。天然に存在する酵素配列は、仮説のタンパク質ＶＩＢＨＡＲ＿０３１１３［Vibrio harveyi ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１１１６］として、ＮＣＢＩ／GenBankアクセッション番号ＹＰ＿００１４４６２８９のもとで利用可能であり、本明細書において時には「Vibhar」（配列番号１）と呼ばれる。本発明によるトランスポザーゼの他の実施形態は、配列番号３、５および７〜１４を含めて、図４を参照して記載される実施形態である。
【００４８】
天然に存在するVibharトランスポザーゼは本明細書において例示されるが、挿入の切り貼り機構を有する他の天然に存在するトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼとも呼ばれるＩＳ５０トランスポザーゼ）は、本発明の範囲内に包含されることが理解されるべきである。さらに、遺伝子操作されたトランスポザーゼ（例えば、改変されたＴｎ５トランスポザーゼ配列を有するトランスポザーゼ）であって、天然に存在するトランスポザーゼ由来であり、ただし１つ以上のアミノ酸欠失、置換または付加を含むトランスポザーゼも包含される。さらに、キメラトランスポザーゼが、本発明によって包含される。
【００４９】
天然に存在するトランスポザーゼに対して行われる改変は、酵素のトランスポザーゼ活性を廃しないが、この改変は、いくつかの方法では、特異性または活性を変更してもよいことが理解されるべきである。当業者は、トランスポザーゼの配列の整列に基づいてトランスポザーゼの中で保存された残基を参照して、本発明によって包含される種々のトランスポザーゼの機能で重要である残基を認識できる。
【００５０】
好ましくは、遺伝子操作されたトランスポザーゼは、天然に存在するトランスポザーゼ（好ましくは、このトランスポザーゼから遺伝子操作された酵素が誘導される）と少なくとも５０％の配列同一性を共有する。他の好ましい同一性のレベルとしては、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％が挙げられる。ここでも、当業者は、これらの範囲内におさまる同一性パーセントについてのすべての特異的な値は、出願人が本明細書にすべての値を具体的に列挙する必要なしに、本発明によって考慮されることを直ちに認識する。
【００５１】
例えば、残基Ｄ９３、Ｄ１９３およびＥ３２７（GenBankアクセッション番号ＹＰ＿００１４４６２８９．１のアミノ酸配列に基づくアミノ酸のナンバリング）は、活性部位の残基である。当業者は、組み換えタンパク質を作製する目的が、酵素活性を保持することである場合は、これらの残基が維持されなければならないが、非活性酵素が所望される場合、またはこの変更された活性を有する酵素が所望される場合は（例えば、保存的変化、またはこれらの残基の１つ以上で三次元提示を保存した変化を作製することによって）、これらの残基を標的することを直ちに認識する。
【００５２】
さらに、当業者は、以下の残基が、組み換え酵素について活性の変化がほとんどまたはまったく所望されない場合は、変異の部位として回避されるべきであるが、活性の変化が所望される場合は標的されることを認識するであろう：Ｗ９、Ｌ１９、Ｄ２１、Ｒ２３、Ｒ２７、Ｌ２８、Ａ５６、Ｙ５７、Ｒ５８、Ｎ６２、Ｉ７０、Ｔ７８、Ｔ９４、Ｌ１０８、Ｇ１０９、Ｈ１２３、Ｌ１２７、Ｇ１３７、Ｑ１４１、Ｒ１４６、Ｋ１６５、Ｅ１６６、Ｗ１７０、Ｒ１９４、Ｅ１９５、Ｄ１９７、Ｒ２０６、Ｒ２１５、Ｌ２２９、Ｒ２５５、Ｌ２９６、Ｌ３０１、Ｌ３０２、Ｐ３０６、Ａ３１３、Ｙ３２０、Ｒ３２３、Ｗ３２４、Ｈ３３０、Ｋ３３４、Ｇ３３７、Ｅ３４１、Ｒ３５３、Ａ３６２、Ｒ３６４、Ｌ３８６、Ｌ３９４、Ａ４１３、Ｌ４２０、Ｇ４２２、Ｋ４２７、Ｗ４３８、およびＧ４４０。
【００５３】
さらに、当業者は、ＩＳ４ファミリーのトランスポザーゼの酵素活性に関与する、保存された「ＹＥＲＲＷＬＩＥＤＦＨＫＶＷＫＳＥＧ」（配列番号３４）モチーフ（GenBankアクセッション番号ＹＰ＿００１４４６２８９．１の残基３２０〜３３７）の重要性、ＩＳ４ファミリーのトランスポザーゼにおける標的ＤＮＡリン酸塩骨格を有するトランスポザーゼの触媒作用および接触に関与する、保存された「ＤＤＴ」モチーフ（GenBankアクセッション番号ＹＰ＿００１４４６２８９．１の残基８８〜９９）の重要性、および標的および／またはドナーのＤＮＡ結合に関与する、保存された「ＤＲＥＡＤ」（配列番号：３５）モチーフ（GenBankアクセッション番号ＹＰ＿００１４４６２８９．１の残基１９３〜１９７）の重要性を理解するであろう。
【００５４】
さらにまた、当業者は、酵素のヘアピン切断機構に関与する残基Ｗ２９９の重要性を理解するであろう。組み換えトランスポザーゼを作製するのにおける構造−機能の考慮に関して目的である他の残基は、文献中に記載される種々の残基である（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、非特許文献８、非特許文献９）。標的となりうる（または回避できる）さらに他の残基は、Ｔｎ５タンパク質（ＹＰ＿７８８１２９）およびVibharタンパク質（ＹＰ＿００１４４６２８９）の配列の整列から明らかである。
【００５５】
任意の特定のトランスポザーゼに限定されるものではないが、下にさらに詳細に考察されるように、本発明による種々のトランスポザーゼが本明細書に開示される。上記で考察された種々のアミノ酸残基およびモチーフの認識された構造−機能の関係、および下に考察される野性型およびキメラのトランスポザーゼに関連する実験データに基づいて、当業者には、トランスポザーゼの活性の中でいくつかの変化がある場合もあるが、本発明は、選択されたトランスポザーゼの種類に限定されないことが明らかである。
【００５６】
本発明の別の態様は、本発明のトランスポザーゼを含む組成物に関する。本発明のこの態様の組成物は、複数の目的のために創出することが可能であり、かつ本明細書に詳細に考察されるものに限定されない。組成物は、トランスポザーゼを保存するために、標的ＤＮＡを切断または断片化するために、ならびに標的ＤＮＡを切断およびタグ付けするために有用な組成物である。さらに、組成物は、本発明のトランスポザーゼを細胞溶解物中に含む。一般には、本発明のトランスポザーゼを含む組成物は、トランスポザーゼの精製のための組成物、トランスポザーゼの貯蔵のための組成物、およびトランスポザーゼの使用のための組成物である。したがって、任意の種々の公知のトランスポザーゼ反応組成物が、水性貯蔵組成物のように、本発明によって包含される。
【００５７】
当業者は、このような組成物を承知しており、特定の必要性を満たすためにこの組成物の１つ以上の特徴を変更するための条件を調節する（例えば、特定のイオンの濃度を変更することまたはｐＨを変更することによって）ことは十分に当該分野のレベル内である。例えば、トランスポザーゼ反応条件は、非特許文献１０に記載される。典型的には、この反応は、６〜９というｐＨ範囲、好ましくはｐＨ７〜８で、２０〜２００ｍＭの緩衝液、例えば、Tris緩衝液（塩、例えば、ＫＣｌを、約０．１〜０．８Ｍで、および５〜５０％のグリセロールを含む）中でトランスポザーゼにアダプターをロードする段階を包含する。アダプターは、５〜３００ｍＭで提供される。典型的には、トランスポザーゼは、０．２〜２０ｍｇ／ｍｌで提供される。次の段階では、トランスポザーゼ複合体を、約１〜１００ｍＭ、好ましくは約５〜２０ｍＭのＭｎ２＋またはＭｇ２＋のイオンの存在下で標的ＤＮＡと混合する。通常は、標的ＤＮＡは、約０．０００００１〜２００μｇ／ｍｌ、例えば、０．５〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０〜１００μｇ／ｍｌで存在する。同時係属の２０１２年５月１１日出願の米国特許出願第１３／４７０，０８７号に実証されたとおり、Ｍｎ２＋イオンは、Ｍｇ２＋イオンの代わりに用いることができる。
【００５８】
本発明によるトランスポザーゼは、ＤＮＡを断片化するために用いられる場合、好ましくは、少なくとも２つのトランスポザーゼから構成される複合体中に存在する（ここでは各々の複合体の少なくとも２つのトランスポザーゼが、少なくとも部分的に二本鎖であるＤＮＡオリゴヌクレオチドに対して、キレート結合によって結合される）。各々の言及に関しておよび上記で言及されるとおり、このようなオリゴヌクレオチドは本明細書では、ときおり、単に「アダプター」と呼ばれる。極めて好ましい実施形態では、この複合体は、２つのトランスポザーゼ（各々がアダプターによって結合される）を含む。極めて好ましいトランスポザーゼ／アダプター複合体は、例えば、図１にグラフとして示される。
【００５９】
トランスポザーゼ複合体の中で、各々のトランスポザーゼは、同じであることもでき、またはＤＮＡについて同じ認識配列を有することもできる。あるいは、トランスポザーゼが、いくつかのヌクレオチドで異なる配列を認識できる場合、この認識配列は、異なることができる（例えば、２０１２年５月１１日出願の同時係属の米国特許出願第１３／４７０，０８７号を参照のこと）。さらにここでも、この２つは、同一性および／または認識配列で異なることができる。２つのトランスポザーゼが異なる認識配列を有する場合、アダプターは、各々のトランスポザーゼがアダプターに結合できるように、適切に設計される。
【００６０】
アダプターは、アダプターの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）領域で複合体のトランスポザーゼに化学的に結合される。ｄｓＤＮＡ領域は、トランスポザーゼの認識配列を含む。特定の複合体中のアダプターは、特定のトランスポザーゼの単一の認識配列を、必然ではないが、含むことができる。実施形態では、アダプターは、同じトランスポザーゼの２つ以上の認識配列を含むことができる。あるいは、２つの異なるトランスポザーゼが複合体中であり、および各々が異なる認識配列を有する場合、この複合体の１つのアダプターが、トランスポザーゼの１つの認識配列を有し、他のアダプターが他のトランスポザーゼの認識配列を有する。
【００６１】
ｄｓＤＮＡ認識配列領域に加えて、典型的には、アダプターは、増幅または他のポリメラーゼ反応のためのプライマー結合について設計される、少なくとも１つの他の領域を含む。このプライマー結合領域は、二本鎖であることも、または一本鎖であることも可能で、任意の適切なプライマー結合配列を含むように設計できる。当業者には、プライマー結合配列および対応するプライマーを設計することは慣用的な課題であり、プライマー結合および伸長における使用のために適切な配列を考案することは実施者に任せられる。
【００６２】
アダプターはさらに、１つ以上のｄｓＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）配列（本明細書では「タグ」とも呼ばれる）を含んでもよい。タグを含んで、生成されたＤＮＡフラグメントの配列決定チップ、例えば、Illuminaチップ（当該分野で公知のような）への結合を可能にして、Index配列のような、標的ＤＮＡライブラリーの供給源の特定を可能にすることができる。次世代の生成配列決定へ適合する目的のために、アダプター末端の約半分は、１種類のタグでタグ付され、別の半分は、異なるタグでタグ付けされることが好ましく、この結果、標的ＤＮＡのトランスポザーゼ媒介性の断片化の後、１種類のタグが標的ＤＮＡフラグメントの一端に結合して、別の種類が反対の末端に結合して、両方の方向でＤＮＡフラグメントの読み取りが可能になる。
【００６３】
本発明者は、さらなる分析のためのフラグメントの調製のための改善されたＤＮＡ断片化（すなわち、断片化の改善された無作為化）の結果が、２つの異なるトランスポザーゼ認識配列を組み合わせることによって達成され得るということ、すなわち、特定の組成物中のある程度（例えば、約５０％）のアダプターが、トランスポザーゼの第一の認知器配列を含み、残りのアダプターが、第二の異なる認識配列を含むということを認識していた。この認識配列は、トランスポザーゼの天然に存在する配列であることもでき、またはアダプターの追加もしくは別の機能を提供する遺伝子操作された配列であることもできる。
【００６４】
実施形態では、この認識配列は、断片化されるべき標的ＤＮＡの各々の末端について異なる。いくつかの実施形態では、この２つの配列は、同一であるかまたは実質的に同一であり、お互いと少なくとも９０％（すなわち、９０％〜１００％）の配列同一性を有する。いくつかの他の実施形態では、２つの配列は、異なり、お互いと９０％未満（すなわち、８９％以下、最小は約３０％）の同一性を有する。しかし、両方の認識配列とも、ほぼ同じ程度まで、それらと組み合わせて用いられるトランスポザーゼによって認識可能であることが好ましい。この目的を達成するために、トランスポザーゼ断片化の有効性は、いくつかの認識配列について別々に評価すること可能であり、実質的に同じ有効性を有する認識配列が、一緒に用いるために選択される。
【００６５】
実施形態では、この認識配列は、天然のおよび改変されたV. harveyi配列の両方、すなわち、以下の配列を含む。５’−ｃｔｇｔｃｔｃｔｔｇａｔｃａｃａａｇｔ−３’（配列番号：３６であり、天然のＩＲＬ配列である）、およびその補体５’−ａｃｔｔｇｔｇａｔｃａａｇａｇａｃａｇ−３’（配列番号：３７）、改変ＩＲＬ配列５’−ｃｔｇｔｃｔｃｔｔｇａｔｃａｃａｔｃｔ−３’（配列番号３８）、およびその相補体５’−ａｇａｔｇｔｇａｔｃａａｇａｇａｃａｇ−３’（配列番号：３９）。天然のV. harveyiのＩＲＲ認識配列もまた用いることができる、５’−ａｃｔｔｇｔｇａｔｃａａｇａｇａｃａｇ−３’（配列番号：４０）、およびその相補体５’−ｃｔｇｔｃｔｃｔｔｇａｔｃａｃａａｇｔ−３’（配列番号：４１）。さらに、単一の種類の天然または改変された認識配列を用いることも可能であり、または同時に２つ以上の種類の天然または改変された認識配列、例えば、V. harveyiの配列を任意の組み合わせで用いることもできる。当業者は、任意のトランスポザーゼを用いること、およびその認識配列を容易に識別することが可能である。なぜなら認識配列は、トランスポザーゼ遺伝子に隣接するＩＲＲおよびＩＲＬリピートとして存在することが公知であるからである。
【００６６】
当業者は、任意のヌクレオチド配列が、オリゴヌクレオチド合成の間、または他の方法によって、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いて認識配列に容易に結合できることを認識する。このような配列は、ＤＮＡフラグメントを増幅するために、配列決定プライマーおよびＰＣＲプライマーの着地点を提供可能であり、またIlluminaチップのようなＤＮＡ配列決定チップに対してＤＮＡフラグメントを結合する目的も果たすことができる。
【００６７】
追加のヌクレオチド配列は好ましくは、一本鎖またはほとんど一本鎖であり、そうでなければ、トランスポザーゼは阻害されてもよい。なぜならこれは過剰なｄｓＤＮＡを基質として認識するからである。かなり小さい程度までであるが、一本鎖伸長の結合はまた、トランスポザーゼ活性を低減可能であり、したがって、結合のサイズを最小限に維持することが好ましい。この目的を達成するために、２つの異なる認識配列の使用が好ましい。その方法では、プライマーの着地点は、２つの間で異なる認識配列の一部へ伸長することができる（例えば、２０１２年５月１１日出願の同時係属の米国特許出願第１３／４７０，０８７号を参照のこと）。このデザインによって、両方のアダプターに同じトランスポザーゼ認識配列を用いる、ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）システムで４つのプライマーと比べてＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のために２つのプライマーだけを使用することが可能になる。４つではなく、２つのプライマーを用いることは、より簡易でかつより効率的であるという点でこのプライマーシステムの利点である。
【００６８】
本発明のトランスポザーゼ複合体の固有の特徴は、複合体の少なくとも１つのアダプターにおける特定の結合対のメンバーの包含である。このメンバーは、アダプターの核酸に共有結合され、特定の結合対の他のメンバーに対する複合体の特異的な結合を可能にする。実施形態では、この特定の結合対の他のメンバーは、固体基板に結合される。この方法では、トランスポザーゼ複合体は、固体基板に特異的に結合できて、これによって固体基板結合のトランスポザーゼ切断生成物（例えば、増幅／特徴付けのためのＤＮＡフラグメント）を生成するための複合体の精製および複合体の使用が容易になる。
【００６９】
図５に示されるとおり、アダプターの１つの鎖の５’末端を介する、結合対メンバー、例えば、ビオチンの結合が好ましい。しかし、結合対メンバー（単数または複数）はまた、図５に示される「ＤＮＡインサート」位置とは離れた３’末端または３’および５’末端の両方に対して結合できる。「ＤＮＡインサート」位置での結合対メンバーの結合は、好ましくはない。なぜなら、これは、トランスポザーゼ複合体の活性を阻害すると予想されるからである。
【００７０】
固体支持体に対する複合体の結合はまた、固体支持体に対する結合を可能にするタグを担持する複合体のトランスポザーゼ部分を介して達成できる。例えば、ビオチンタグは、Ｃ末端またはＮ末端のストレプトアビジン結合ペプチドを介して組み換えトランスポザーゼに結合可能であり（非特許文献１１、非特許文献１２）、この複合体は、ストレプトアビジンコーティングされたビーズまたはプレートに結合できる。当業者によって用いられ得る複数のこのようなタグがある。任意の適切な特異的な結合対は、本発明によって用いることが可能で、ここでは、この対の少なくとも１つのメンバーが、固体支持体上に固定され、当業者は、複数の考慮に基づいて適切な対を自由に選択する。
【００７１】
結合対の非排他的な列挙としては以下が挙げられる：アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチン、ナノタグおよびストレプトアビジン（例えば、非特許文献１３を参照のこと）、抗体（その抗原結合部分）およびこれが特異的に結合する抗原／エピトープ、例えば、ＦＬＡＧタグのＭｙｃ、酵素−基質対、例えば、グルタチオントランスフェラーゼおよび還元グルタチオン、ポリ−ヒスチジンおよびニッケル系の樹脂、アプタマーおよびそれらの特異的な標的分子、およびＳｉタグおよびシリカ粒子（例えば、非特許文献１４を参照のこと）。
【００７２】
本発明はさらに、トランスポザーゼ複合体を含む組成物を包含する。この組成物は、存在する物質の数および種類に特に限定されない。一般には、液体組成物は、水およびトランスポザーゼ複合体を含む。典型的には、１つ以上の他の物質、例えば、塩、イオン、緩衝性の化合物、金属、または１つ以上の生体分子が存在する。一般には、複数の物質を本発明のこの態様の組成物中に含むことができる。種々の追加的な成分の同一性、数および量は典型的には、組成物についての適用、または最適活性のための特定のトランスポザーゼ複合体の特定の要件によって決定される。
【００７３】
実施形態では、本発明のこの態様の組成物は、１つ以上のトランスポザーゼ複合体を細胞の細胞溶解物中に含み、ここでトランスポザーゼが産生される（そしてここにアダプターが細胞溶解の前後に添加された）。関連の実施形態では、トランスポザーゼ複合体は、細胞溶解物中に存在するが、特定の結合対連結方法で固体基板に結合されている形態で見出される。固体基板に対する複合体の結合によって、細胞溶解物中に存在する他の物質からの複合体の容易な精製が可能になる。したがって、本発明による種々の組成物は、他の細胞溶解物質からの種々の精製段階において、固体基板結合の複合体を包含する。精製のプロセスの間、固体基板結合の複合体は、洗浄溶液成分（当該分野で公知）を含む組成物中に見出すことができる。
【００７４】
精製されたトランスポザーゼ複合体組成物はまた、その複合体が溶液中で遊離であろうと、固体基板に結合されていようと、ＤＮＡ切断／断片化反応のような、酵素反応組成物中に含まれることができる。本発明のこの態様による組成物中に存在できる非物質としては以下が挙げられる。トランスポザーゼ複合体により切断されるべき標的ＤＮＡ、標的ＤＮＡフラグメントの重合化のためのオリゴヌクレオチドプライマー、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素、多糖類、脂質膜、ナノ粒子、ビーズ、例としては磁気ビーズ、トランスフェクション試薬、および界面活性剤。
【００７５】
本明細書において用いる場合、「固体基板」および「固体支持体」という用語は、当該分野におけるそれらの意味に従って用いられる。したがって、それらは、精製および／または酵素反応の条件下で核酸を結合し保持するために適切であると当該分野で公知の任意の材料である。当業者は、本明細書で示されるべき網羅的な列挙を必要とすることなく、固体基板として用いるための適切な材料を十分承知している。
【００７６】
本発明において有用な固体基板の非限定的な例としては以下が挙げられる。ナイロン、イットリウムケイ酸塩（ＹＳｉ）およびポリビニルトルエン（ＰＶＴ）ビーズ、例としては、磁気ビーズ（例えば、非特許文献１５）、ナイロン、ニトロセルロース、またはＰＶＤＧ膜、およびプラスチック表面、例えば、ポリスチレンまたはポリプロピレンを含むもの、後者は、核酸のＰＣＲ増幅のためのプレートまたはウェル上で見出される、例えば、ストレプトアビジンコーティングのＳＴＲＥＰ Thermo-Fast ＰＣＲプレート（イギリス、サリー州にあるAbgene社）。固体支持体は、化学的に修飾、例えば、アミノ化（一級または二級アミン）またはカルボキシル化されて、特定の結合対の結合を容易にすることができる。
【００７７】
固体支持体結合のトランスポザーゼ複合体を用いることの１つの利点は、１つのアダプターが、固体支持体に結合されるという事実に由来する。したがって、トランスポザーゼ複合体が標的ＤＮＡを切断する場合、標的ＤＮＡは、アダプターを介して固体支持体上に捕獲される。反応の結果としての標的による酵素の置き換えは、反応成分から容易に精製できるＤＮＡフラグメントを産生するための洗練された方法である。これはまた、ＤＮＡフラグメントの多段階精製の必要性なしに種々の反応に供することができるＤＮＡフラグメントを産生するための洗練された方法でもある。なぜなら、それらは、単純な洗浄によって容易に精製できるからである。
【００７８】
別の一般的な態様では、本発明は、トランスポザーゼ複合体を作製する方法を提供する。一般には、この方法は、１つ以上のトランスポザーゼを含む細胞を溶解する工程と、トランスポザーゼ（単数または複数）の認識配列（単数または複数）を含むアダプターオリゴヌクレオチドを添加する工程と、このアダプターが、トランスポザーゼに結合して複合体を形成する工程とを包含する。「可能にする」工程は、言及される作用が生じる条件を提供する工程を包含する。このような条件は、約０℃〜ほぼ室温まで（すなわち、２１℃〜２５℃）で数時間（例えば、５〜１４時間）の細胞溶解物のインキュベーションを含むがこれに限定されない、任意の適切な条件であり得る。より高温およびより短いインキュベーション時間を用いてもよいが、粗溶解物中のトランスポザーゼ活性の損失の可能性に起因してそれほど好ましくない。
【００７９】
この方法はさらに、トランスポザーゼ、アダプターまたはその両方を産生する工程を包含できる。この方法が、トランスポザーゼを産生することを包含する場合、この方法は、細胞を溶解する前に、宿主細胞中でトランスポザーゼを発現させる工程を包含する。トランスポザーゼは、それが天然に見出される細胞中で発現でき、またはその天然の宿主細胞ではない宿主細胞中で組み換え的に発現することもできる。タンパク質の組み換え産生のための複数の宿主細胞、例えば、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳動物の細胞は当該分野で公知であり、実施者は任意の適切な宿主細胞を自由に選択する。実施形態では、E. coli細胞を、トランスポザーゼの組み換え産生のための宿主細胞として用いる。
【００８０】
実施形態では、トランスポザーゼ複合体を作製する方法は、アダプターを産生する工程を包含する。このアダプターは、産生されているトランスポザーゼ（単数または複数）に特異的に結合するように設計される。したがって、各々のアダプターに存在しなければならない認識配列は、アダプターを合成する前に既知である。天然の認識配列は、逆方向反復を構成する場合が多く、これは、トランスポザーゼのオープンリーディングフレームの５０〜２００ヌクレオチド上流でおよびすぐ下流で見出すことが可能であり、当業者にはゲノム配列中で特定できる。アダプターは、化学合成を含めて、任意の適切な技術を用いて作製することができる。アダプターは、二本鎖である部分を少なくとも一部含む。したがって、使用前に、２つの相補性部分を、ハイブリダイゼーションが二本鎖部分を生じる条件下でお互いに暴露することが好ましい。
【００８１】
上記で考察されるとおり、精製を容易にするため、および固体基板結合のＤＮＡフラグメントの産生を可能にするため、各々のトランスポザーゼ複合体の１つのアダプターは、特定の結合対のメンバーを含む。この特定の結合対のメンバーは、図５に示されるように、好ましくはその５’末端でアダプターに共有結合される。連結は、核酸に対して物質を化学的に連結するのに公知の任意の適切な技術によるものであることができる。唯一の制限は、特定の結合対メンバーが、トランスポザーゼに対するアダプターの結合を妨害すべきではなく、固体基板に結合する場合、トランスポザーゼの活性を廃するべきでもなく、ＰＣＲでの固体基板結合のＤＮＡフラグメントの増幅を邪魔するべきでもないということである。この目的を達成するために、リンカーを、特異的な結合対メンバーと、認識配列との間に設けてもよく、例えば、アダプター３ｂｉｏ中のＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４２）ＤＮＡ配列（図５）は、この目的を果たす。
【００８２】
本発明の別の態様では、固体基板結合のトランスポザーゼ複合体を作製する方法が提供される。この方法は、少なくとも１つのトランスポザーゼおよび少なくとも１つのアダプターオリゴヌクレオチドを含んでいるトランスポザーゼ複合体を形成する工程であって、ここでこのアダプターは、特異的な結合対のメンバーを含む工程と、この複合体と固体基板とを組み合わせる工程であって、ここに、特異的な結合対のメンバーが結合して固体基板結合のトランスポザーゼ複合体が形成される条件下で、特異的な結合対の他のメンバーが結合される工程とを包含する。
【００８３】
複合体が２つ以上のアダプターを含む実施形態では、アダプターの１つだけが、特異的な結合対のメンバーを含むことが好ましい場合がある。全体として、例えば、複合体が二量体である場合、特定の結合対メンバーを有するアダプターは、結合対メンバーのすべてが１種類のアダプターに提供されるか否かにかかわらず、または各々の種類のアダプターの分子の半分が特異的な結合対メンバーを有する場合、約５０％のアダプタープールを構成することが重要である。各々の複合体における特定の結合対メンバーの数は、タグ付けされた（例えば、ビオチン化された）結合対とタグ付けされてないアダプターとの間の比に基づいて調節され得る。この比を最適化するために、異なる比、例えば、１：３、１：２、１：１、３：１、２：１を用いて、所望のＤＮＡ断片化を達成すべきである。
【００８４】
例えば、ある複合体が、主に二量体である場合、最適であるには約１：１の比が予想できるだろうが、タグ付けされたアダプターの一分子がタグ付けされていないアダプターの３分子と組み合わせて用いられる場合、１：３の比が好ましい場合がある。なぜならタグ付されたアダプターの１分子で、固体支持体に対して複合体の結合を提供するのに十分であるからである。必然ではないが、リンカーの長さおよび可塑性次第で、固体支持体に対する複合体の２ポイント以上の結合は、個々のトランスポザーゼサブユニットの移動度、およびそれらの高次構造の変化（ＤＮＡ断片化を容易にすると考えられる）を制限する場合がある。
【００８５】
この方法は、任意の適切な条件下で行うことができる。トランスポザーゼおよび／またはオリゴヌクレオチドアダプターは、粗細胞溶解物とのインキュベーションの間に分解されること、複合体が溶解物中に存在するゲノムＤＮＡと形成されること、または宿主細胞ゲノムＤＮＡ、タンパク質もしくは他の細胞物質のような不純物は、複合体形成のプロセスを阻害することが予想できるが、驚くべきことに、本発明によるトランスポザーゼ複合体は、可溶性細胞物質からトランスポザーゼを事前精製する必要なしに、細胞溶解物中で作製され得る。本明細書に記載される方法によって、複合体の急速な産生、およびそれらの複合体の固体支持体上での捕獲が、面倒な精製プロトコールの必要なしに可能になる。
【００８６】
本発明の別の態様では、トランスポザーゼ複合体を精製する方法が提供される。一般には、この方法は、特定の結合対のメンバーを含んでいるアダプターを含むトランスポザーゼ複合体を形成する工程と、この複合体と固体基板とを組み合わせて、ここに、特定の結合対のメンバーが結合する条件下で、特定の結合対の他のメンバーを結合させる工程と、細胞溶解物の細胞物質の少なくともいくつかから固体基板結合の複合体を分離する工程とを包含する。除去は、当該分野で用いられる任意の適切な技術によることができる。例えば、固体基板がビーズである場合、遠心分離を用いて、細胞物質から固体基板結合の複合体を分離することができ、または磁気分離を磁気ビーズとともに用いることができる。あるいは、固体基板が、ＰＣＲプレートのウェルのようなプラスチック表面である場合、吸引によるこのウェルからの未結合物質の除去を用いることができる。
【００８７】
上記されるとおり、複合体が２つ以上のトランスポザーゼおよび２つ以上のアダプターを含む実施形態では、１複合体あたり１つだけのアダプターが、特定の結合対メンバーを含むことが好ましい。各々の複合体における特定の結合対のメンバーの数は、各々のトランスポザーゼについての認識配列に基づいて調節できる。
【００８８】
細胞物質の少なくともいくつかの除去を上回るさらなる精製は、適切な洗浄溶液を用いて結合複合体を洗浄することによって達成できる。例えば、適切な洗浄溶液は以下を含んでもよい。２５ｍＭ Bicine（ｐＨ７．９３）、０．５ＭのＫＣｌ、２５％グリセロール、５ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのジチオスレイトール、０．４％のIgepal ＣＡ−６３０。この洗浄溶液は、トランスポザーゼ次第で変化し得るが、一般的なガイドラインは、内部洗浄で、細胞溶解に用いられるのと同じまたは同様の溶液を用いることが、この複合体に供するｐＨ、緩衝液および塩濃度の変化をできるだけ小さくするために推奨される。さらに、最終洗浄工程で用いられる溶液は、サンプルのより良好な均一性を達成するために、ＤＮＡ断片化反応で用いられる溶液と同様であるべきである。
【００８９】
固体基板結合のトランスポザーゼ複合体を得る能力によって、今まで達成できない利点が得られる。例えば、上記のとおり、このような結合された複合体は、トランスポザーゼ複合体の内部精製なしに形成できる。したがって、それらは、細胞溶解物または他の複合体混合物中で形成できる。第一の精製工程（単数または複数）の必要性のない複合体の結合によって、活性トランスポザーゼの急速精製が可能になる。この特徴の利点は、本発明が他の技術と区別される一方法である。
【００９０】
より具体的には、トランスポザーゼは、細胞溶解物のような複雑な混合物中では、適切なＤＮＡ認識配列に結合されるので、トランスポザーゼは、精製プロセスの間、それらの活性のほとんどを保持すると期待される。実際、トランスポザーゼは、精製プロセスを通じて高レベルの活性を保持することがわかっており、したがって、複合体は、アダプターに結合していないトランスポザーゼよりもかなり安定であると思われる。この特徴によって、野性型または野性型に近い活性を有する野性型のトランスポザーゼの精製が可能になり、これは、野性型酵素として活性が少ないかまたは全くなしで精製されるか、または活性な精製された酵素を得るためには変異されなければならないという、Ｔｎ５トランスポザーゼでの以前の研究とは全く対照的である。
【００９１】
精製された固体基板結合のトランスポザーゼ複合体はまた、直ちに利用され、これは、先行技術を上回る利点である。以前の技術とは異なり、本発明は、アダプターをロードされ、ＤＮＡ断片化に適している固体基板結合のトランスポザーゼ複合体を提供する。あるいは、好適度が劣る実施形態では、精製の間にトランスポザーゼを安定化するように機能するアダプターを、固体基板結合のトランスポザーゼ複合体から除去可能であり、これは、トランスポザーゼからアダプターを遊離するだけでなく、固体基板からトランスポザーゼを遊離もする。したがって、精製された可溶性のトランスポザーゼが達成できる。
【００９２】
実施形態では、固体基板結合のトランスポザーゼ複合体を、標的ＤＮＡの断片化に用いる。一般には、標的ＤＮＡを断片化する方法は、標的ＤＮＡと固体基板結合のトランスポザーゼ複合体とを、このトランスポザーゼが標的ＤＮＡを切断できる条件下で接触させ、これによって標的ＤＮＡを断片化する工程を包含する。このプロセスの間、トランスポザーゼ複合体は、アダプターの１つを介して固体基板に結合されるので、断片化されたＤＮＡは、トランスポザーゼ複合体を置き換え、したがって、固体基板に結合される標的ＤＮＡフラグメントを生じる（図１を参照のこと）。この結合された標的ＤＮＡフラグメントは、目的の配列の増幅、配列決定、および検出を含むがこれに限定されない複数の目的に用いることができる。
【００９３】
１つの特に好ましい実施形態では、標的ＤＮＡを断片化するプロセスは、断片化したＤＮＡを増幅する方法に関連できる（図２を参照のこと）。これらの実施形態では、固体基板結合トランスポザーゼ複合体を、標的ＤＮＡと、ＰＣＲなどによるＤＮＡ増幅に適切な条件下で組み合わせる。反応混合物を、標的ＤＮＡ断片化に適切な条件（例えば、２０℃〜５５℃で５〜３０分）下でインキュベートし、次いで、ＤＮＡ断片化緩衝液を、ＰＣＲ緩衝液に交換して、そのフラグメントを、ＰＣＲによる増幅のような、増幅に適切な条件に供する。
【００９４】
本発明の別の態様は、キットに関する。一般には、本発明によるキットは、ＤＮＡを断片化するために有用な、ならびに／またはＤＮＡを断片化および配列決定するために有用なトランスポザーゼまたはトランスポザーゼ複合体を精製するのに有用である上記の本発明の態様のうちの少なくとも１つの１つ以上の構成要素を備える。
【００９５】
このキットの構成要素は、１つ以上の固体材料中で提供されるか、またはその固体材料と結合されることができる。例えば、１つ以上の構成要素は、プラスチック材料から製造できる容器中で提供でき、微小遠心管または配列決定プレート（例えば、１プレートあたり８４ウェルまたは９６ウェル）の形状に形成できる。あるいは、１つ以上の構成要素を、固体支持体に結合された物質として提供できる。例えば、トランスポザーゼ複合体は、ナイロンストリップに対して、またはプラスチックの８４ウェルプレートのウェル壁に対して特定の結合対を介して結合された複合体として提供できる。当業者は、キットの構成要素を含むように用いることができる複数の他の等価な格納物および形態を承知している。したがって、網羅的な列挙は、本明細書では不必要である。
【００９６】
一実施形態では、本発明によるキットは、本発明の１つ以上の精製されたトランスポザーゼを含む。このトランスポザーゼは、液体溶液（例えば、水溶液またはアルコール溶液）として、１つ以上の容器中で提供できる。あるいは、トランスポザーゼは、乾燥組成物として１つ以上の容器中で提供できる。実施形態では、２つ以上の異なる精製されたトランスポザーゼが、単一の容器中でまたは２つ以上の容器中で提供される。２つ以上の容器が提供される場合、各々の容器は、単一のトランスポザーゼを含むこともでき、または容器のうち１つ、いくつかもしくはすべてがトランスポザーゼの１つ、いくつかもしくはすべての混合物を含むこともできる。
【００９７】
本発明のキットの別の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドアダプターが、１つ以上の容器中で提供される。このアダプターは、液体溶液（例えば、水溶液またはアルコール溶液）として、１つ以上の容器中で提供できる。あるいは、アダプターは、乾燥組成物として１つ以上の容器中で提供できる。実施形態では、２つ以上の異なるアダプターが、単一の容器中でまたは２つ以上の容器中で提供される。２つ以上の容器が提供される場合、各々の容器は、単一のアダプターを含むこともでき、または容器のうち１つ、いくつかもしくはすべてがアダプターの１つ、いくつかもしくはすべての混合物を含むこともできる。
【００９８】
本発明のキットの別の実施形態では、このキットは、１つ以上の精製されたトランスポザーゼおよび１つ以上のアダプターを含む。好ましくは、少なくとも１つのアダプターは、少なくとも１つのトランスポザーゼの認識配列を含む。より好ましくは、キットの少なくとも１つのトランスポザーゼの認識配列を有する少なくとも１つのアダプターが提供される。この実施形態では、特定のトランスポザーゼが、複数の関連の配列を認識する場合があるので、キット中でトランスポザーゼおよびアダプターの一対一の適合は必要ないことに留意すること。他の実施形態と同様に、キットのこの実施形態では、トランスポザーゼおよびアダプターは、異なる容器中で単一で提供することができ、またはトランスポザーゼおよびアダプターの任意の混合物は、複数の容器中で提供されることができる。
【００９９】
本発明のキットのさらに別の実施形態では、このキットは、１つ以上のトランスポザーゼ複合体を含む。他の実施形態と同様に、この複合体は、液体組成物中で、または乾燥材料として提供できる。さらに、複数の異なる複合体が、キット中で提供できる。上記のように、複合体は、異なる容器中でもしくは容器上で単一で提供でき、または複合体の任意の混合物が、複数の容器中でもしくは容器上で提供できる。
【０１００】
本発明の実施形態では、キットは、ビーズまたはナノ粒子のような固体支持体に結合された１つ以上のトランスポザーゼ複合体を備える。この実施形態では、この固体支持体は、複合体の容器であるとみなされる。この複合体は、特定の結合対のような、リンカーによって固体支持体に結合される。１つの実施形態では、この複合体は、ＰＣＲプレートのウェルの表面に結合される。この実施形態では、各々のウェルは、単一の種類の複合体を含むことが可能であり、またこれは、２つ以上の異なる複合体を含むことができる。
【０１０１】
このキットの別の実施形態では、この複合体は、ナイロンストリップのような、ナイロン膜の表面に結合される。この実施形態では、この複合体は、任意の所望の順序および幾何形状で、ならびに任意の組み合わせで、膜に分布できる。例えば、膜は、一連のラインまたはドット中で膜上に配置された単一の複合体を有することができる。あるいは、異なる複合体の一連のラインまたはドットが提供される（例えば、複合体１は、ドット１上に配置され、複合体２は、ドット２上に配置されるなど）。さらにここで、２つ以上の複合体の混合物を、ドット、ラインなどの上に配置することができる。
【０１０２】
上記のとおり、特定の実施形態では、ＧＣ対ＡＴのバイアスを減らすために、異なる認識配列を有している２つ以上の異なるトランスポザーゼ複合体を提供し、これによって、ゲノムＤＮＡの断片化の優れた制御を得ることが好ましい。トランスポザーゼ複合体の混合物を備えているキットの状況では、キットを作製する前に、１つ以上の混合物を、混合物中で複合体の比を変化することによって特定の標的ＤＮＡについてバイアスを最小化するために最適化できる。
【０１０３】
当業者は、トランスポザーゼ−アダプター複合体の異なる混合物を創出する方法、固体支持体上にそれらを固定する方法、およびそれらを標的ＤＮＡ断片化に適用する方法を容易に認識できる。当業者にはまた、フラグメントを増幅して配列決定し、配列決定データを分析し、バイアスが最小の混合物組み合わせ（比）を選択して、その組み合わせに基づいてキットを産生する方法も公知である。異なるＤＮＡ標的について異なる比が推奨できることが注記されるべきであり、異なる種類の標的について異なるキットが製造できる。例えば、当業者は、ＡＴバイアスを有するより複数のトランスポザーゼを、ＡＴリッチ標的に用いるべきであることを認識できる。
【０１０４】
２つの異なるトランスポザーゼが存在するキットの特定の実施形態では、このキットは好ましくは、４つの異なるオリゴヌクレオチドアダプターを含む。アダプターの２つは、トランスポザーゼ「１」の認識配列（単数または複数）を含むが、そのうち１つだけが、特定の結合対メンバーを含む。他の２つのアダプターが、トランスポザーゼ「２」の認識配列（単数または複数）を含むが、そのうちの１つだけが特定の結合対メンバーを含む。アダプターの組み合わせの使用を通じて、トランスポザーゼ複合体が形成できて、特定の結合対メンバーを介して固体基板に結合できる。
【０１０５】
上記されるとおり、本発明のキットは、トランスポザーゼおよび複合体の精製のためにまたは、本発明の方法の実施のために有用な複数の物質を備えることができる。このような物質としては、限定するものではないが以下が挙げられる。宿主細胞の溶解のための試薬（緩衝液を含む）、二価陽イオンキレート剤、またはヌクレアーゼを阻害する他の剤、トランスポザーゼ複合体および反応の他の構成要素が適切に機能していることを保証するのに使用するためのコントロールのＤＮＡ、ＤＮＡ断片化試薬（緩衝液を含む）、ＰＣＲ反応試薬（緩衝液を含む）および洗浄溶液。
【０１０６】
本発明のキットは、任意の温度で提供できる。例えば、液体中にトランスポザーゼ、アダプターまたは複合体を含有するキットの貯蔵のためには、それらが０℃より下で、好ましくは−２０℃以下で、そうでなければ凍結状態で提供および維持されることが好ましい。
【０１０７】
上記のとおり、キットの構成要素は、容器中にまたは固体基板上に提供される。この容器および固体基板は、ボール紙、プラスチック、金属またはそれらの組み合わせでできた箱のような、適切なパッケージ中で、パッケージングされた組み合わせで提供される。バイオテキノロジー試薬のために適切なパッケージング材料は、当該分野で公知でありかつ広範に用いられており、したがって、本明細書で特定する必要はない。
【実施例】
【０１０８】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、以下の実施例は、本発明の純粋な例示を意図するものであって、決して本発明を限定すると解釈されるべきではない。さらに、この実施例で開示される工程段階のすべてが本発明の全態様を実施するために実行される必要があるわけではないこと、上記で考察されるようないくつかの追加の工程が実施できることが理解されるべきである。
【０１０９】
例えば、実施者が、精製されたトランスポザーゼ複合体を得ることを望む場合、標的ＤＮＡの増幅および増幅された複合体の配列決定に関して下に考察される工程段階は行われる必要はないが、固体支持体からの複合体の遊離の工程が代わりに実施できる。当業者は、下に記載されるプロセスを改変して、上記の開示および当業者によって保持される知識に基づいて、本発明の種々の態様に到達できることを認識する。
【０１１０】
〈固体支持体に結合されたトランスポザーゼを用いる標的ＤＮＡを配列決定するためのサンプル調製〉
以下のプロトコールおよび材料を、標的ＤＮＡの断片化、ならびに断片化されたＤＮＡの配列決定および分析に用いた。当業者は、特定の製造業者の特定のキット、生成物および試薬を考察したが、同様のキット、生成物および試薬が、具体的に考察されたものと交換できることを認識する。さらに、他のオリゴヌクレオチドアダプターであって、異なるトランスポザーゼ、増幅プライマー、配列決定プライマーおよび／またはタグに特異性を有するオリゴヌクレオチドアダプターを、具体的に考察したものに代えることもできる。
【０１１１】
〈オリゴヌクレオチドの溶解およびアダプターの調製〉
図５に示されるすべてのオリゴヌクレオチドを、１０ｍＭのBicine−ＮＨ４ｐＨ７．９３、２０ｍＭのＫＣｌの中で１００ｎＭの濃度に溶解する（各々のｎＭのオリゴヌクレオチドについてこの緩衝液の１０μｌを添加する）。部分的に二重鎖のアダプターを作製するために、等容積のオリゴヌクレオチド３ｂｉｏと３ｉ０とを混合して、アダプター３ｂｉｏを調製する。また、等容積のオリゴヌクレオチド８ｉｌおよび８ｉ０も別のバイアル中で混合して、アダプター８ｉ０を調製する。両方のバイアルを、７２℃から２２℃まで徐々に下がる温度で３時間インキュベートする。
【０１１２】
〈培養〉
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した５ｍＬのＬＢ培地に、目的のトランスポザーゼを発現している組み換えE. coliの新鮮なコロニーを播種して、シェーカーで一晩、３７℃で、１５０ＲＰＭでインキュベートする。トランスポザーゼを発現するE. coliの一晩培養物の５ｍｌを同じ培地を用いて室温で１：１０希釈する。３７℃で７０分間インキュベートして、１００μｌの０．１ＭのＩＰＴＧを添加して、３２℃で５時間インキュベーションを続ける。トランスポザーゼが大部分溶解性である場合、例えば、Vibharトランスポザーゼ、高いインキュベーション温度および短いインキュベーション時間、例えば３７℃で３時間を用いることができる。トランスポザーゼが部分的にしか可溶性でなく、大部分不溶性である場合、より長いインキュベーション時間およびより低い温度、例えば、室温での一晩のインキュベーションが推奨される。トランスポザーゼを産生するために用いられる発現プラスミドは、アンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼも発現するので、この実施例ではアンピシリンを用いる。選択マーカーが異なる場合、当業者は他の抗生物質を用いることができる。プラスミド、組み換えE. coli株を構築する方法、選択方法、培地を調製し、E. coli培養物を増殖させるための方法は、当業者に公知であって、詳細には、文献、例えば、非特許文献１６（参照によって本明細書に援用される）に記載される。
【０１１３】
〈細胞の収集〉
誘導の５時間後、誘導した細胞培養物を、ＡｌｅｇｒａＸ−１５Ｒ遠心分離機（カリフォルニア州、ブレアにあるBeckman Coulter社製）中で１５分間４，５００ＲＰＭでの遠心分離によって収集し、各々のペレットを５０ｍｌの２５ｍＭのBicine−１００ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、再度遠心分離して、洗浄緩衝液の残りを管の底に収集し、緩衝液を徹底的に除去して、ペレットを５０ｍｌの細胞から４５０μｌの緩衝液Ｌ×２（５０ｍＭ Bicine−ＮＨ４ｐＨ７．９３、０．５ＭのＫＣｌ、０．４％のIgepal ＣＡ−６３０、１ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのジチオスレイトール、３９％グリセロール）中に懸濁する。この段階で、再懸濁された細胞を、−８０℃で凍結して、将来の使用のために保管できる。
【０１１４】
〈細胞溶解物を得る工程、およびトランスポザーゼ−アダプター複合体の作製〉
氷上での軽度の超音波処理によって細胞を破壊し、例えば、パワー１．９５、負荷サイクル３０、４０パルスでBranson Sonifierモデル２５０（コネチカット州、ダンベリーにあるBranson Ultrasonics Corporation社製）を用いて２回超音波処理する。４℃で４０分間１４，０００ＲＰＭで、微小遠心管で遠心分離する。上清（清澄化した溶解物）を収集する。４００μｌの清澄化溶解物と、１００μｌのグリセロールとを混合する。なぜなら、Vibharおよび同様のトランスポザーゼのアダプターによる最適ローディングのためには約５０％濃度のグリセロールが好ましいからである。清澄化溶解物を氷上で１：５の冷緩衝液Ｌ×１（２５ｍＭのBicine−ＮＨ４（ｐＨ７．９３）、０．２５ＭのＫＣｌ、０．２％のlegepal ＣＡ−６３０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトール、５０％グリセロール）を用いて希釈する。次に、希釈された溶解物とアダプターとを混合し、例えば、２５μｌのアダプター３ｂｉｏと２５μｌのアダプター８ｉｌとを混合して、５０μｌの希釈溶解物を添加する。室温で２時間インキュベートして、ＳＡｖビーズを添加して、４℃で一晩、ローテーター上でインキュベートする。この結果、トランスポザーゼ−アダプター複合体をビーズに結合させる。
【０１１５】
添加の前に、ビーズを以下のとおり調製する。１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で３７．５μｌのＳＡｖビーズ（ＬｏａｄＳｔａｒｓ２．７ストレプトアビジン、Agilent Technologies）を磁気的に沈殿させ、ビーズを、１００μｌの緩衝液Ｌ×０．５（水で１：１希釈した緩衝液Ｌ×１）を用いてビーズを洗浄する。溶解物との一晩のインキュベーション後、ビーズを結合されたトランスポザーゼ−アダプター複合体とともに、１．５ｍｌの氷冷の２５ｍＭのBicine−ＮＨ４ｐＨ７．３、０．１％のIgepal ＣＡ−６３０、２０％グリセロール、１２５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＤＴＴを用いて３回洗浄する。５０μｌの同じ緩衝液中にビーズを再懸濁する。
【０１１６】
〈ビーズ上に固定されたトランスポザーゼ−アダプター複合体を用いる標的ＤＮＡの断片化〉
５μｌの標的ＤＮＡ（水の中に４０μｇ／ｍｌ）、５μｌの５×トランスポザーゼ緩衝液（１２５ｍＭのBicine−ＮＨ４（ｐＨ７．５５）、１００ｍＭのＭｎＣｌ２、１２５ｍＭのグルタミン酸カリウム）、２μｌの水および３μｌのストレプトアビジンビーズと、結合されたトランスポザーゼ複合体とを組み合わせる。任意の標的ＤＮＡ、例えば、ヒト、動物、植物、細菌またはウイルスのＤＮＡをほぼ同じ濃度で用いることができる。この実施例では、E. coli  ＤＮＡ（ＡＴＣＣカタログ番号＃８７３９Ｄ−５、Genbank ＣＰ０００９４６）（これを、ローテーター４℃で、一晩、水中で４０μｇ／ｍｌの濃度まで再懸濁した）、またはファージラムダＤＮＡ（ウィスコンシン州、マディソンにあるPromega Corporation社製）を用いた。陰性コントロールは、ＤＮＡの代わりに水を用いて設定して、粗細胞溶解物からの宿主細胞ＤＮＡによる汚染の可能性を排除することが提案される。トランスポザーゼ反応はローテーター上で行い、懸濁物中にビーズを保持し、そしてビーズ上の固定されたトランスポザーゼ複合体への標的ＤＮＡの接近性を保証する。１０１３ＳＨＥＬ  ＬＡＢハイブリダイゼーションオーブン（オレゴン州、コーネリアスにあるSheldon manufacturing, Inc.社製）または必要な温度を提供する任意の他のローテーターをこの目的のために用いることができる。反応混合物を、４５℃で１．５時間、１０ＲＰＭで回転させる。次に、ローテーターから反応物を含むバイアルを取り出し、このビーズを、４０μｌの１×ＰｆｕＵｌｔｒａ緩衝液（これは、１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＨＦ反応緩衝液（カリフォルニア州、サンタクララにあるAgilent Technologies社製）を、水を用いて１：１０希釈することによって調製する）を用いて磁気的に１回洗浄する。この緩衝液を完全に取り除き、ビーズを４０μｌの１×ＰｆｕＵｌｔｒａ緩衝液中に再懸濁する。これらのビーズは、図５に示されるようにアダプターに隣接される、図１Ｄに示されるような標的ＤＮＡフラグメントを含む。
【０１１７】
〈ＰＣＲ増幅および配列決定〉
１０μｌのビーズと結合された標的ＤＮＡフラグメント、４μｌの１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＨＦ反応緩衝液、５μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μｌの３ｉＳプライマー、０．５μｌの８ｉＳプライマー、２８．３μｌの水および１．７μｌのＰｆｕＵｌｔｒａ（カリフォルニア州、サンタクララにあるAgilent Technologies社製）とを組み合わせることによってＰＣＲ反応混合物を調製する。他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらのビーズも用いることができる。例えば、ＰｉｃｏＭａｘｘ（カリフォルニア州、サンタクララにあるAgilent Technologies社の商標）。この場合、ＰｉｃｏＭａｘｘ（商標）緩衝液およびＰｉｃｏＭａｘｘ（商標）ポリメラーゼは、同じ量で用いられるが、他の成分およびＰＣＲ反応条件は、同じままである。
【０１１８】
ＰＣＲ増幅器に混合物を置く直前にこの混合物を撹拌して、ビーズを再懸濁し、以下のプログラムを用いてＤＮＡフラグメントを増幅する。ホットスタート４５℃で２．５分、ホットスタート９５℃で３分、続いて９サイクルの９３℃で４０秒間の変性、５９℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の伸長、最後のサイクルは、続けて、７２℃で１０分間の単回の伸長。８８００のThermal Cycler（カリフォルニア州、サンタクララにあるAgilent Technologies社製）または反応パラメーターを提供する任意の他の装置を増幅のために用いることができる。
【０１１９】
増幅されたＤＮＡフラグメントは、図２上に示されるように溶液中である。したがって、ビーズが廃棄されて、上清が引き続く操作に用いられる。この時点で、ＤＮＡフラグメントのサイズ範囲およびそれらの収率は、Agaroseゲル電気泳動を用いて（図６および図７）、またはBioanalyzer High Sensitivity DNA Chips（カリフォルニア州、サンタクララにあるAgilent Technologies社製）を用いて分析できる。
【０１２０】
プライマーおよびプライマー二量体から、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（商標）ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰ磁気ビーズ（カリフォルニア州、ブレアにあるBeckman Coulter社製）を用いて増幅されたフラグメントを精製する。この目的を達成するために、５０μｌのＰＣＲ上清と、６０μｌのビーズ懸濁物とを合わせて、ボルテックスによって混合して、室温で５分間インキュベートする。ビーズを磁気的に沈殿させて、それらを磁気ラック（例えば、カリフォルニア州、カールスバッドにあるLife Technologies社製のＤＹＮＡＬ（商標）、磁気分離ラック）上で、２００μｌの７０％エタノールを用いて、ペレットを乱すことなく２回洗浄する。室温で１５分間風乾して、ＤＮＡフラグメントを、ビーズを５０μｌの水に再懸濁すること、およびその懸濁物を室温で２分間インキュベートすることによって溶出する。ビーズを磁気的に沈殿させて、上清を収集する。
【０１２１】
ＤＮＡフラグメント精製のためには当業者に公知の複数の適切な方法、例えば、ゲル精製、Ｓｔｒａｔａ（商標）ＰＣＲ精製キット（カリフォルニア州、サンタクララにあるAgilent Technologies社製）、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（カリフォルニア州、バレンシアにあるQiagen社製）がある。上記のように、ただし、異なる対のプライマー（すなわち、ＡｇＰ２プライマーと、または任意のｉｌ−ｉ８インデックスのプライマーと組み合わせた、ＡｇＰ１プライマー）を用いて、２回目のＰＣＲ増幅を行う（図５）。
【０１２２】
上記のようにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（商標）ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰ磁気ビーズ上でＰＣＲフラグメントを精製し、例えば、Bioanalyzer（図８）および配列を任意のIlluminaプラットフォーム装置（カリフォルニア州、サンディエゴにあるIllumina社製）を用い、Ｒｐ１およびＲｐ２プライマーを用いて、そしてインデックスされたプライマーが用いられる場合は、またインデックスリード（Ｉｎｐ）プライマーも用いて、ＤＮＡフラグメントのサイズ範囲およびそれらの濃度を分析し、ＤＮＡフラグメントが未使用のプライマーから精製されることを確認する（図５）。
【０１２３】
図９に示されるとおり、標的ゲノムを、ＮＧＳのためのサンプル調製のこの方法を用いて配列決定する。この方法はまた、それらのサンプル調製についての異なる特性および適切性に関して、異なるトランスポザーゼを選択するために有用である。例えば、図１０に示されるとおり、天然のPhotobacterium profundumトランスポザーゼ（サンプル４）およびVibhar/Photobacterium profundumハイブリッドトランスポザーゼ（サンプル５）は、他の試験されたトランスポザーゼよりも少ないＧＣバイアスを示し、ＡＴリッチの標的ゲノムでのサンプル調製にさらに適切である。
【０１２４】
図３から分かるとおり、固体基板結合のVibhar酵素は、外部ラムダＤＮＡ標的に対して優れた活性を示した。重要なことに、外部ＤＮＡ標的（ファージラムダＤＮＡ）が添加されない場合、トランスポザーゼが細胞溶解物中に存在する場合でさえ（レーン２）、ＰＣＲフラグメントは、得られない。これによって、ＰＣＲフラグメントは、溶解物中に存在したが、固体支持体上のトランスポザーゼ複合体の精製のプロセスにおいては除去されたE. coliのＤＮＡ由来ではなく、ＳＡｖビーズに結合された精製されたトランスポザーゼ／アダプター複合体に添加されたラムダＤＮＡ由来であったことが示される。フラグメントのサイズは、実質的に１００ｂｐ〜１０００ｂｐであった。このデータによってまた、ＰＣＲフラグメントは、Vibharトランスポザーゼを含まないE. coli細胞溶解物中では、ラムダＤＮＡあり（レーン５）でも、ラムダＤＮＡなし（レーン４）でも生成されなかったので、固体基板結合のVibharが、いくつかの他の酵素と違い、ＤＮＡ断片化を担うことが示される。
【０１２５】
したがって、図３によって、本発明によるトランスポザーゼ複合体を精製するためのプロセスは、精製された固体基板結合の複合体を提供するだけでなく、これらの複合体は、標的ＤＮＡおよびＰＣＲ増幅の断片化に十分適していることを示すデータが得られる。したがって、この複合体は、活性であり、比較的短いプロセスで精製することができる。
【０１２６】
図３によって、現在利用可能な技術を上回って本発明が提供する種々の利点が示される。中でも利点はとりわけ以下１）から４）である。
【０１２７】
１）現時点で当該分野に公知の技術と比較して、精製の間にトランスポザーゼ活性の損失の減少または排除があるようである。細胞の溶解後の第一工程としてトランスポザーゼ／アダプター複合体を形成することは、精製の間の酵素活性の損失を低減または最小化して、伝統的な方法を用いて得られるように、約９０％不活性よりも、大きい活性の調製を生じるようである。
【０１２８】
２）トランスポザーゼ折り畳み、安定性および活性に影響する場合がある、親和性タグを有するトランスポザーゼを提供する必要はない。天然にはない条件を必要とするクロマトグラフィー工程を用いる必要もない。本発明では、親和性タグ（すなわち、特定の結合対のメンバー、例えば、ビオチン）を、トランスポザーゼではなく、オリゴヌクレオチドアダプターに結合させ、オリゴヌクレオチド−トランスポザーゼ複合体の精製は、特定の結合対メンバーの相互作用（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）を介して、天然の条件（すなわち、細胞環境）下で達成される。ビオチン−ストレプトアビジン対の利点は、相互作用が極めて強力であり、固体支持体に対する信頼できる結合が容易に達成されることは注目されるべきである。しかし、同じ理由によって、ビオチン−ストレプトアビジン対は、タンパク質のアフィニティー精製に問題である場合が多い。なぜなら、タンパク質は、支持体から溶出することが困難であるからである。この問題は、ここで、上手く解決される。なぜなら、固体支持体に結合されたテンプレートは、溶出される必要はないからであり、これによってＰＣＲ増幅が可能になり、結合したテンプレートではなく、ＰＣＲ反応生成物が溶液中に放出されるからである。
【０１２９】
３）配列決定のような、引き続く分析のためのＤＮＡサンプル調製の劇的な簡略化がある。他の方法は、配列決定のために断片化されたＤＮＡを調製するために多段階のプロセス（最大２２工程まで）を必要とする。対照的に、本発明は、増幅の準備がされている、固体基板結合のＤＮＡフラグメントを生成する迅速かつ単純な方法を提供する。言い換えれば、断片化および増幅は、単一の反応容器中でおよび単一セットの試薬中で連関できる。例えば、トランスポザーゼ−アダプター複合体を含むＰＣＲプレートに、結合したオリゴヌクレオチドアダプターに特異的なＰＣＲプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびほぼ中性のｐＨを有する緩衝液を含むマスター混合物を充填する。マグネシウムまたはマンガンイオンがまた、ＤＮＡ断片化反応を開始するために含まれる。典型的には、約２０℃〜６０℃で、例えば、３７℃〜５５℃で行われる断片化の後、反応混合物は単に、ＰＣＲ増幅試行に供することができる。このような方法では、両方の反応を、同じ容器中で、同じ試薬の存在下で行うことができる。実際、ＰＣＲ機で行う場合、増幅の前に最初のインキュベーション工程をプログラミングすることは簡単な問題である。
【０１３０】
４）特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡフラグメントのタグ付けであって、それらの増幅を可能にするためのタグ化、配列決定チップへの結合、およびサンプルの起源を追跡するための任意のバーコードを付すことはまた、第一の工程で達成できる。これは、ＤＮＡフラグメントの生成後のタグ付けを必要として、したがって、さらに追加の工程を必要とするため現在利用可能な方法とは対照的である。
【０１３１】
Vibharトランスポザーゼが、産生できて、固体基板に結合したままでＤＮＡを断片化するために用いることができることを示しているが、追加的なトランスポザーゼを得るか、または作製し、試験して、本発明の堅実性を確認した。この目的を達成するために、GenBankを検索して、Ｔｎ５およびVibharに対してアミノ酸同一性を有する配列を、特にこれらの２つのトランスポザーゼの構造および／または機能に関与することが公知の領域で特定した。図４を参照して記載されたものを含めて、いくつかのトランスポザーゼを特定した。各々のトランスポザーゼについての認識配列を特定して、配列番号２５〜３４として示す。
【０１３２】
これらのトランスポザーゼをコードする野性型配列は、E. coli中で組み換え発現され、トランスポザーゼ−アダプター複合体は、細胞溶解物中で形成され、複合体は、固体基板に結合し、結合した複合体を、上記のプロトコールに従って細胞物質から精製した。あるいは、キメラトランスポザーゼを、２つ以上のトランスポザーゼ由来の配列を用いて作製した。次いで、キメラトランスポザーゼを、組み換え産生された野性型配列と同じ方式で処理した。試験したトランスポザーゼを図４にグラフで示す。各々のアミノ酸配列を、図４の凡例に示す。
【０１３３】
次いで、基板結合のトランスポザーゼ複合体を、それらが標的ＤＮＡを断片化する能力について試験した。具体的には、図６から分かるとおり、キメラ構築物を含む複数のトランスポザーゼ複合体を生成して、活性型で精製した。この図は、本発明の幅広く堅調な性質、および複数の異なるトランスポザーゼに対する広範な適用性を示している。
【０１３４】
上記で示される例は、本発明が、複数のトランスポザーゼを用いてＤＮＡ増幅に適切なＤＮＡフラグメントを作製するために用いることができることを示す。ＤＮＡフラグメントの質は、十分に高く、そのフラグメントを増幅するために用いられるポリメラーゼの種類は、重要ではないことを確認するために、図４に示すトランスポザーゼを発現して、固体基板結合型で精製した。標的ＤＮＡを、固体基板結合の酵素を用いて断片化して、断片化されたＤＮＡを、２つの異なるＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、その増幅生成物を、アガロースゲル電気泳動に供した。
【０１３５】
図７から分かるとおり、試験したすべてのトランスポザーゼによって産生されるＤＮＡフラグメントは、ＰｉｃｏＭａｘｘ（商標）ポリメラーゼおよびＰｆｕ−Ｕｌｔｒａポリメラーゼの両方がフラグメントを増幅できるのに十分な高品質のものであった。用いられるトランスポザーゼおよびポリメラーゼのうち増幅生成物の量にわずかな変化がある場合があるが、このデータによって、ＤＮＡフラグメントの調製のための本発明の広範な適用性が支持される。
【０１３６】
種々の改変および変動を、本発明の範囲からも趣旨からも逸脱することなく本発明の実施においてなすことができることは当業者には明らかである。本発明の他の実施形態は、  本発明の明細書および実施を考慮することによって当業者には明らかになる。
本出願は、その開示全体が参照によって本明細書に援用される、２０１２年１０月１日出願の米国特許出願第６１／７０８，３３２号の優先権請求する。
【図１Ａ】
2014068650.tif 000003
【図１Ｂ】
2014068650.tif 000004
【図１Ｃ】
2014068650.tif 000005
【図１Ｄ】
2014068650.tif 000006
【図２】
2014068650.tif 000007
【図３】
2014068650.tif 000008
【図４】
2014068650.tif 000009
【図５】
2014068650.tif 000010
【図６】
2014068650.tif 000011
【図７】
2014068650.tif 000012
【図８】
2014068650.tif 000013
【図９】
2014068650.tif 000014
【図１０Ａ】
2014068650.tif 000015
【図１０Ｂ】
2014068650.tif 000016
【図１０Ｃ】
2014068650.tif 000017
【図１０Ｄ】
2014068650.tif 000018
【図１０Ｅ】
2014068650.tif 000019
【図１０Ｆ】
2014068650.tif 000020
【配列表】
2014068650000001.app
【外国語明細書】
2014068650.tif 000021
2014068650.tif 000022
2014068650.tif 000023
2014068650.tif 000024
2014068650.tif 000025
2014068650.tif 000026
2014068650.tif 000027
2014068650.tif 000028
2014068650.tif 000029
2014068650.tif 000030
2014068650.tif 000031
2014068650.tif 000032
2014068650.tif 000033
2014068650.tif 000034
2014068650.tif 000035
2014068650.tif 000036
2014068650.tif 000037
2014068650.tif 000038
2014068650.tif 000039
2014068650.tif 000040
2014068650.tif 000041
2014068650.tif 000042
2014068650.tif 000043
2014068650.tif 000044
2014068650.tif 000045
2014068650.tif 000046
2014068650.tif 000047
2014068650.tif 000048
2014068650.tif 000049
2014068650.tif 000050
2014068650.tif 000051
2014068650.tif 000052
2014068650.tif 000053
2014068650.tif 000054
2014068650.tif 000055
2014068650.tif 000056
2014068650.tif 000057
2014068650.tif 000058
2014068650.tif 000059
2014068650.tif 000060
2014068650.tif 000061
2014068650.tif 000062
2014068650.tif 000063
2014068650.tif 000064
2014068650.tif 000065
2014068650.tif 000066
2014068650.tif 000067
2014068650.tif 000068
2014068650.tif 000069
2014068650.tif 000070
2014068650.tif 000071
2014068650.tif 000072
2014068650.tif 000073
2014068650.tif 000074
2014068650.tif 000075
2014068650.tif 000076
2014068650.tif 000077
2014068650.tif 000078
2014068650.tif 000079
2014068650.tif 000080
2014068650.tif 000081
2014068650.tif 000082
2014068650.tif 000083
2014068650.tif 000084
2014068650.tif 000085
2014068650.tif 000086
2014068650.tif 000087
2014068650.tif 000088
2014068650.tif 000089
2014068650.tif 000090
2014068650.tif 000091
2014068650.tif 000092
【図１Ａ】
2014068650.tif 000093
【図１Ｂ】
2014068650.tif 000094
【図１Ｃ】
2014068650.tif 000095
【図１Ｄ】
2014068650.tif 000096
【図２】
2014068650.tif 000097
【図３】
2014068650.tif 000098
【図４】
2014068650.tif 000099
【図５】
2014068650.tif 000100
【図６】
2014068650.tif 000101
【図７】
2014068650.tif 000102
【図８】
2014068650.tif 000103
【図９】
2014068650.tif 000104
【図１０Ａ】
2014068650.tif 000105
【図１０Ｂ】
2014068650.tif 000106
【図１０Ｃ】
2014068650.tif 000107
【図１０Ｄ】
2014068650.tif 000108
【図１０Ｅ】
2014068650.tif 000109
【図１０Ｆ】
2014068650.tif 000110