(57)【要約】【課題】  本発明の課題は光学活性アミン類、カルボン酸類の光学異性体をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分離分析する際、娘イオンが測定対象物によらず、一定の値を示すジアステレオマー生成試薬を開発することにある。【解決手段】  上記課題解決のため、ＭＳ／ＭＳにて娘イオンを生じるＮ−芳香族置換カルバモイル基、ジアステレオマー間の良好な分離のためにピロリジン環の２−位あるいは３−位に不斉中心を有するジアステレオマー生成試薬を開発した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式
【化１】
2014034573.tif 000029
（式中、Ｒ１はカルボキシル基、活性エステル体、カルボニルクロリド、水素原子から選択され、Ｒ１がカルボキシル基、活性エステル体、カルボニルクロリドから選択された場合、Ｒ２は水素原子で、Ｒ１が水素原子の場合、Ｒ２はアミノ基、アルキルアミノ基から選
2014034573.tif 000030
し、Ａｒは下記構造式
【化２】
2014034573.tif 000031
のいずれかから選ばれ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立にアルキル基、アルキルオキシ基、ハロゲン原子、水素原子から選択される）で示される光学活性ピリジルチオウレア誘導体。
【請求項２】
Ａｒがピリジル、Ｒ１がカルボキシル基、活性エステル体、カルボニルクロリドから選択され、Ｒ２が水素である光学活性ピリジルチオウレア誘導体。
【請求項３】
Ａｒがピリジル、Ｒ１が水素、Ｒ２がアミノ基である光学活性ピリジルチオウレア誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は光学活性ピリジルチオウレア誘導体に関するもので、分析化学の属する分野および他の分野において要求されている光学活性化合物の分離分析に供するものである。
【背景技術】
【０００２】  医薬品や生体内分子などの生理活性物質は不斉中心を有するものが多く、これら不斉中心を有する化合物には光学異性体が存在する。光学異性体の間では生理活性が大きく異なる場合や生体内での挙動が異なる場合がある。従って、これらの光学異性体を分離、高感度で再現性よく定量することは重要な分析課題となっている。ことに光学活性アミン類、カルボン酸類は生理活性物質の主要な構成要素となっており、これら光学異性体を効率よく分離分析することが求められている。【０００３】  光学活性アミン類あるいはカルボン酸類の光学異性体を分離分析する方法は、いくつか知られている。例えば、シフト試薬を用いるＮＭＲ法、ジアステレオマーによるＮＭＲ法、旋光分散法、光学活性固定相を用いるＨＰＬＣ法、光学活性移動相を用いるＨＰＬＣ法、ジアステレオマーを生成させてそれをＨＰＬＣで分離分析する方法などがある。中でもジアステレオマーを生成させてそれをＨＰＬＣで分離分析する方法は汎用性が高く、確実な方法として多用されている。【０００４】  例えば、Ｐ．Ｍａｒｆｅｙは下記構造式
【化１】
2014034573.tif 000002
で示されるＮ−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド（以下、Ｍａｒｆｅｙ試薬という）とアミノ酸を反応させ、ジアステレオマーを生成させ、これをＨＰＬＣで分離分析している（非特許文献１）。この時、ジアステレオマー間は良好な分離を示す。【０００５】  木下らは、アミノ基を有する光学活性な化合物に対する蛍光キラル誘導体化法を報告している（特許文献１）。それによれば、アミノ基を有する光学活性な化合物とｏ−フタルアルデヒド、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを反応させ、インドール誘導体のジアステレオマーを生成させている。このジアステレオマーはＨＰＬＣで良好な分離を示す。この反応は第１級アミンに対して選択的で、また、反応に際してラセミ化を起こすことがない。【０００６】  ピヨーンらは下記構造式
【化２】
2014034573.tif 000003
（式中、Ｒはアルキル基、トリフルオロメチル基から選択され、Ｘはハロゲン、アジド基、スクシンイミジル基から選択され、＊は不斉炭素原子でエナンチオマーの一方を示す）で示される光学活性フルオレン誘導体を開発し、アミノ基を有する光学活性な化合物と反応させ、カルバミン酸誘導体のジアステレオマーを生成させている（特許文献２）。そして、このジアステレオマーをＨＰＬＣで分離し、良好な結果を得ている。【０００７】  豊岡らは下記構造式
【化３】
2014034573.tif 000004
（式中、Ｒはニトロ基、ジメチルアミノスルホニル基から選択され、＊は不斉炭素原子でエナンチオマーの一方を示す）で示される光学活性４−ニトロ−７−（３−インチオシアナートピロリジン−１−イル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下、ＮＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳという）、光学活性４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−（３−イソチオシアナートピロリジン−１−イル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下、ＤＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳという）を開発し、それぞれ不斉炭素原子に直結したアミノ基、メルカプト基を有する化合物のＨＰＬＣによる光学純度測定法を報告している（非特許文献２）。ＮＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳ、ＤＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳのいずれも不斉炭素原子に直結したアミノ基、メルカプト基と速やかに反応し、それぞれチオウレア、ジチオカルバメートのジアステレオマーを生成する。これらの一対のジアステレオマーはＨＰＬＣで分離し、長波長の強い蛍光を示す。【０００８】  また、カルボン酸類の光学異性体の分離、分析用として、豊岡らは下記構造式
【化４】
2014034573.tif 000005
（式中、Ｒはニトロ基、ジメチルアミノスルホニル基から選択され、＊は不斉炭素原子でエナンチオマーの一方を示す）で示される光学活性４−ニトロ−７−（３−アミノピロリジン−１−イル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下、ＮＢＤ−ＡＰｙという）、光学活性４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−（３−アミノピロリジン−１−イル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下、ＤＢＤ−ＡＰｙという）を開発、その有用性を報告している（非特許文献３）。それによれば、ＮＢＤ−ＡＰｙ、ＤＢＤ−ＡＰｙのいずれも温和な条件下、カルボキシル基を有する化合物と反応し、ジアステレオマーを生成する。このジアステレオマーはＨＰＬＣ分離条件に安定で、良好な分離を示し、強い蛍光を有する。【０００９】  磯部らは下記構造式
【化５】
2014034573.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、あるいはアラルキル基から選択され、＊は不斉炭素原子でエナンチオマーの一方を示す）で示される光学活性１，３−オキサゾリン−２−チオン誘導体を開発し、カルボキシル基を有するケトプロフェンなどに存在する光学異性体のＨＰＬＣ分離分析法を報告している（特許文献３）。【００１０】  上記方法はＨＰＬＣの検出器としてＵＶ検出器あるいは蛍光検出器を用いる方法である。近年、医薬品開発、生体成分の分析を中心として極めて微量のエナンチオマーの検出、定量が望まれており、これらの方法では到底満足できるものではない。【００１１】  そうした要望に応える手法としてＭＳを検出器とするＨＰＬＣ−ＭＳが利用されつつある。例えば、Ｓ．Ａ．ＦｕｃｈｓらはＭａｒｆｅｙ試薬とセリンを反応させてジアステレオマーを生成させ、このジアステレオマーをＨＰＬＣ−ＭＳで分離分析している（非特許文献４）。その検出限界はＤ−セリンが０．２０μｍｏｌ、Ｌ−セリンが０．１４μｍｏｌと報告されている。【００１２】  Ｄ．Ｊｉｎらは光学活性なＤＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳとチロキシン（以下、Ｔ４という）を反応させてジアステレオマーを生成させ、このジアステレオマーをＨＰＬＣ−ＭＳで分離分析している（非特許文献５）。ＭＳでの検出はネガティブイオンモードを使用し、Ｄ−Ｔ４の検出限界は２８ｎｇ／ｍｌ、Ｌ−Ｔ４の検出限界は４０ｎｇ／ｍｌを得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】公開特許広報，昭６０−３８６５２
【特許文献２】公表特許広報，昭６３−５０１５７
【特許文献３】公開特許広報，平９−１２４６２１
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐ．Ｍａｒｆｅｙ，Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４９，５９１（１９８４）
【非特許文献２】Ｔ．Ｔｏｙｏ’ｏｋａ，Ｙ−Ｍ．Ｌｉｎ，Ａｎａｌｙｓｔ，１２０，３８５（１９９５）
【非特許文献３】Ｔ．Ｔｏｙｏ’ｏｋａ，Ｍ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｔ．Ｔｅｒａｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６２５，３５７（１９９２）
【非特許文献４】Ｓ．Ａ．Ｆｕｃｈｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，１４４３（２００８）
【非特許文献５】Ｄ．Ｊｉｎ，Ａ．Ｐ．Ｋｕｍａｒ，Ｇ−Ｃ．Ｓｏｎｇ，Ｙ−Ｉ．Ｌｅｅ，Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８８，６２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】  しかしながら、Ｓ．Ａ．ＦｕｃｈｓらのＭａｒｆｅｙ試薬を用いる方法はＤ−セリン、Ｌ−セリンの分離は良好であるが、その検出限界はそれぞれ０．２０μｍｏｌ、０．４１μｍｏｌである。高感度検出法とは言い難く、到底満足できるものではない。【００１６】  Ｄ．Ｊｉｎらの方法はナノグラムレベルの高い検出感度でチロキシンの光学異性体を検出、定量することができる優れた方法である。しかしながら、この方法は親イオン［Ｍ−Ｈ］−１１２９を選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）することで高感度検出を達成している。この親イオン［Ｍ−Ｈ］−１１２９はチロキシン誘導体由来のイオンである。そのため、類縁体であるトリヨードサイロニンの同時検出は不可能であり、到底満足できる手法ではない。高感度検出を達成させるには、ＭＳ／ＭＳ分析において娘イオンがジアステレオマー生成試薬由来となるようなジアステレオマー生成試薬が求められている。ジアステレオマー生成試薬由来の娘イオンで選択反応モニタリング（ＳＲＭ）することで類縁体を含めた一群の測定対象物を同時に高感度で検出、定量することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】  そこで、発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明化合物がＨＰＬＣによる光学活性アミン類、カルボン酸類の光学異性体を分離、定量するため優れたジアステレオマー生成試薬であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１８】  すなわち、本発明は下記構造式
【化６】
2014034573.tif 000007
（式中、Ｒ１はカルボキシル基、活性エステル体、カルボニルクロリド、水素原子から選択され、Ｒ１がカルボキシル基、活性エステル体、カルボニルクロリドから選択された場合、Ｒ２は水素原子で、Ｒ１が水素原子の場合、Ｒ２はアミノ基、アルキルアミノ基から選
2014034573.tif 000008
し、Ａｒは下記構造式
【化７】
2014034573.tif 000009
のいずれかから選ばれ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立にアルキル基、アルキルオキシ基、ハロゲン原子、水素原子から選択される）で示される光学活性ピリジルチオウレア誘導体に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】  本発明に係る上記構造式で表される化合物からアミン類の光学異性体の分離、分析するためのジアステレオマー生成試薬の代表例として下記構造（１）を、カルボン酸類の光学異性体の分離、分析するためのジアステレオマー生成試薬の代表例として下記構造（２）を取り上げ、本発明の詳細を明らかにする。
【化８】
2014034573.tif 000010
【００２０】  構造式（１）、（２）で表される光学活性ピリジルチオウレア誘導体は文献未載の新規化合物あり、その製造法としては例えば下記反応式に従って、３−ピリジルイソチオシアネートから容易に合成することができる。
【化９】
2014034573.tif 000011
【００２１】  本発明化合物Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸（１）の合成における第一工程は３−イソチオシアナートピリジンと光学活性なプロリンｔｅｒｔ−ブチルを反応させ、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートを得る工程で、使用しうる溶媒はジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、テトラヒドロフラン、メタノール、酢酸エチル、ヘキサンあるいはそれらの混合溶媒から適宜選択される。反応温度は室温から溶媒の還流温度の間で適宜選択され、反応に要する時間は使用する溶媒、反応温度などにより異なるが、３０分から１２時間の間で適宜選択される。第二工程はエステル結合を加水分解する工程で、例えばトリフルオロ酢酸水溶液などで加水分解し、目的とする本発明化合物光学活性Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸が得られる。
【００２２】  本発明化合物３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン（２）の合成における第一工程は３−イソチオシアナートピリジンと光学活性な３−Ｂｏｃアミノピロリジンを反応させ、３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを得る工程で、使用しうる溶媒はジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、テトラヒドロフラン、メタノール、酢酸エチル、ヘキサンあるいはそれらの混合溶媒から適宜選択される。反応温度は室温から溶媒の還流温度の間で適宜選択され、反応に要する時間は使用する溶媒、反応温度などにより異なるが、３０分から１２時間の間で適宜選択される。第二工程はＢｏｃを脱離させる工程で、種々のＢｏｃ基の脱保護条件が利用できる。例えば、トリフルオロ酢酸を用いても定量的にＢｏｃが脱離し、目的とする本発明化合物光学活性３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンが得られる。
【００２３】  本発明化合物である光学活性Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸はアミン類と、光学活性３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンはカルボン酸類とそれぞれ縮合剤の存在下、反応結合する。縮合剤は２，２’ジピリジルジスルフィド−トリフェニルホスフィン、シアノホスホン酸ジエチル、ジフェニルホスホリルアジドなどから適宜選択される。アミン類、カルボン酸類が不斉炭素原子を有し、エナンチオマーの混合物である場合、反応生成物はジアステレオマーを形成する。このジアステレオマーはアキラルな逆相カラムを用いるＨＰＬＣ−ＭＳで良好な分離を示す。検出にはジアステレオマー生成試薬として用いられている本発明化合物由来のｍ／ｚ１３７．０の選択反応モニタリング（ＳＲＭ）により高感度で検出、定量することができる。
【００２４】  本発明化合物の有用性を明らかにするため、カルボン酸類の代表例としてイブプロフェンを、アミン類の代表例として１−ナフチルエチルアミンを取り上げ、エナンチオマーの分離、分析を参考例として示す。
【００２５】  ３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを用いたイブプロフェンの誘導体化の方法は以下の通りである。
１０μＭ（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン１０μｌ（２０．６ｎｇ）に１０ｍＭ  ２，２’ジピリジルジスルフィド（ＤＰＤＳ）、１０ｍＭトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）、１ｍＭ  ３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを其々１０μｌ加え、混和した。その後６０℃、１２０分加熱した。溶媒留去後、移動相に溶解し、希釈後、測定サンプルとした。
また、（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（２−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを用いてイブプロフェンの誘導体化を行うこともできる。その際の誘導体化の方法は以下の通りである。まず、アセトニトリルに溶解した１ｍＭ  （Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（２−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン１０μｌを氷冷下に静置し、そこにトリフルオロ酢酸を４０μｌを滴下し、６０分間反応させた。溶媒を留去後、アンモニア水にて中和し、溶媒を再留去した。その後、残渣を１０μｌのアセトニトリルに再溶解した。これ以降の誘導体化の方法は先述した方法と同様とした。
調製したサンプルをＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにて測定した。（インジェクション量：イブプロフェン誘導体５ｆｍｏｌ）
【００２６】  この時のＨＰＬＣ−ＭＳの条件は次の通りである。
2014034573.tif 000012
ステム
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ，１．７μｍ，２．１ｍｍ×１００ｍｍ
カラム温度：４０℃
溶出液：０．１％ギ酸含有水／０．１％ギ酸含有アセトニトリル＝６０／４０
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２μｌ
質量分析計：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥまたはＸｅｖｏＴＭＴＱ−Ｓ
【００２７】  誘導体化は下記式に従って進行する。
【００２８】
【化１０】
2014034573.tif 000013
【００２９】  分析結果は次の通りである。ＵＰＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ分析におけるイブプロフェン誘導体（ｍ／ｚ４１１．２）のクロマトグラム［表１］とスペクトル［表２］を以下に示す。両ピークとも同様のスペクトルパターンを示し、良好な分離を達成していることがわかる。
【００３０】
【表１】
2014034573.tif 000014
【００３１】
【表２】
2014034573.tif 000015
【００３２】  次にイブプロフェン誘導体のＸｅｖｏＴＭＴＱ−Ｓを用いたプロダクトイオンスキャンによるスペクトルとＳＲＭモード（ｍ／ｚ４１１．２→１３７．０）のクロマトグラムを［表３］［表４］に示す。
プロダクトイオンｍ／ｚ１３７．０は誘導体化試薬由来であり、このプロダクトイオンを用い、ＳＲＭモードでの測定を行った。分離度Ｒｓは３．４と完全分離を達成している。また、検出限界はおよそ０．４ｆｍｏｌであった。
【００３３】
【表３】
2014034573.tif 000016
【００３４】
【表４】
2014034573.tif 000017
【００３５】  Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸を用いた１−ナフチルエチルアミンの誘導体化の方法は以下の通りである。
１０μＭ（Ｒ，Ｓ）−１−ナフチルエチルアミン１０μｌ（１７．７１ｎｇ）に１０ｍＭ  ２，２’ジピリジルジスルフィド（ＤＰＤＳ）、１０ｍＭトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）、１ｍＭ  Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸を其々１０μｌ加え、混和した。その後６０℃、１２０分加熱した。溶媒留去後、移動相に溶解し、希釈後、測定サンプルとした。
また、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートを用いてナフチルエチルアミンの誘導体化を行うこともできる。その際の誘導体化の方法は以下の通りである。まず、アセトニトリルに溶解したｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレート１０μｌを氷冷下に静置し、そこにトリフルオロ酢酸を４０μｌを滴下し、６０分間反応させた。溶媒を留去後、アンモニア水にて中和し、溶媒を再留去した。その後、残渣を１０μｌのアセトニトリルに再溶解した。これ以降の誘導体化の方法は先述した方法と同様とした。
調製したサンプルをＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにて測定した。（インジェクション量：ナフチルエチルアミン誘導体５ｆｍｏｌ）
【００３６】  この時のＨＰＬＣ−ＭＳの条件は次の通りである。
2014034573.tif 000018
ステム
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ，１．７μｍ，２．１ｍｍ×１００ｍｍ
カラムオーブン：４０℃
溶出液：０．１％ギ酸含有水／０．１％ギ酸含有アセトニトリル＝７２／２８
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２μｌ
質量分析計：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥまたはＸｅｖｏＴＭＴＱ−Ｓ
【００３７】  誘導体化は下記反応式に従って進行する。
【化１１】
2014034573.tif 000019
【００３８】  分析結果は次の通りである。ＵＰＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ分析におけるナフチルエチルアミン誘導体（ｍ／ｚ４０５．２）のクロマトグラムとスペクトルを［表５］［表６］に示す。両ピークとも同様のスペクトルパターンを示し、良好な分離を達成していることがわかる。
【００３９】
【表５】
2014034573.tif 000020
【００４０】
【表６】
2014034573.tif 000021
【００４１】  次にナフチルエチルアミン誘導体のＸｅｖｏＴＭＴＱ−Ｓを用いたプロダクトイオンスキャンによるスペクトルとＳＲＭモード（ｍ／ｚ４０５．２→１３７．０）のクロマトグラムを［表７］［表８］に示す。プロダクトイオンｍ／ｚ１３７．０は誘導体化試薬由来であり、このプロダクトイオンを用い、ＳＲＭモードでの測定を行った。分離度Ｒｓは５．３と完全分離を達成している。また、検出限界はおよそ１．１ｆｍｏｌであった。
【００４２】
【表７】
2014034573.tif 000022
【００４３】
【表８】
2014034573.tif 000023
【００４４】  以上のように本発明化合物はアミン類、カルボン酸類のエナンチオマーの分離分析に用いられる。標識体はＨＰＬＣ−ＭＳの分離条件に安定で、カラムの移動中に分解することはない。標識体であるジアステレオマーのアキラルカラムによる分離度は１．５以上で、良好な分離を示す。また、ＭＳ／ＭＳ分析における娘イオンは下記式に示すように本発明化合物由来の１３７．０で、一群のアミン類、あるいは一群のカルボン酸類を同時に分離分析することが可能である。したがって、本発明化合物はアミン類、カルボン酸類のエナンチオマーのＨＰＬＣ−ＭＳによる分離分析に極めて有用なジアステレオマー生成試薬である。
【００４５】
【化１２】
2014034573.tif 000024
【実施例】
【００４６】  以下に本発明の好ましい実施例を記載するが、これは例示の目的であり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲内で変形が可能なことは当業者には明らかであろう。【００４７】実施例１
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートの合成
３−イソチオシアナートピリジン（１等量）とＤ−プロリンｔｅｒｔ−ブチル（５等量）をジクロロメタンに溶解し、室温６時間攪拌した。その後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝３０／１）にて、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートの白色結晶を得た。【００４８】  得られたｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートの主な物性値は次の通りである。
ｍｐ：１５５〜１５６℃【００４９】
【表９】
2014034573.tif 000025
【００５０】（Ｓ）−Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸の合成
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートを少量のジクロロメタンに溶解し、氷冷下で攪拌した。そこにトリフルオロ酢酸を段階的に加え、さらに激しく６０分間攪拌した。その後、溶媒留去することで、油状の（Ｓ）−Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸を得た。【００５１】
【表１０】
2014034573.tif 000026
【００５２】  ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレート、（Ｓ）−Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸、どちらを用いてもジアステレオマー生成試薬として有益な結果をもたらすことは先述した通りである。【００５３】実施例２
（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンの合成
３−イソチオシアナートピリジン（１等量）と（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノピロリジン（５等量）をジクロロメタンに溶解し、室温６時間攪拌した。その後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝３０／１）にて、（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンの白色結晶を得た。【００５４】  得られた（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンの主な物性値は次の通りである。
ｍｐ：９７〜１００℃【００５５】
【表１１】
2014034573.tif 000027
【００５６】（Ｓ）−３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンの合成
（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを少量のジクロロメタンに溶解し、氷冷下で攪拌した。そこにトリフルオロ酢酸を段階的に加え、さらに激しく６０分間攪拌した。その後、溶媒留去し、飽和炭酸水素ナトリウム水にて中和した。液−液抽出（水／ジクロロメタン）を行い、ジクロロメタン層を濃縮することで油状の（Ｓ）−３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを得た。【００５７】
【表１２】
2014034573.tif 000028
【００５８】  （Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン、（Ｓ）−３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン、どちらを用いてもジアステレオマー生成試薬として有益な結果をもたらすことは先述した通りである。
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月4日(2012.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は光学活性ピリジルチオウレア誘導体に関するもので、分析化学の属する分野および他の分野において要求されている光学活性化合物の分離分析に供するものである。
【背景技術】
【０００２】  医薬品や生体内分子などの生理活性物質は不斉中心を有するものが多く、これら不斉中心を有する化合物には光学異性体が存在する。光学異性体の間では生理活性が大きく異なる場合や生体内での挙動が異なる場合がある。従って、これらの光学異性体を分離、高感度で再現性よく定量することは重要な分析課題となっている。ことに光学活性アミン類、カルボン酸類は生理活性物質の主要な構成要素となっており、これら光学異性体を効率よく分離分析することが求められている。【０００３】  光学活性アミン類あるいはカルボン酸類の光学異性体を分離分析する方法は、いくつか知られている。例えば、シフト試薬を用いるＮＭＲ法、ジアステレオマーによるＮＭＲ法、旋光分散法、光学活性固定相を用いるＨＰＬＣ法、光学活性移動相を用いるＨＰＬＣ法、ジアステレオマーを生成させてそれをＨＰＬＣで分離分析する方法などがある。中でもジアステレオマーを生成させてそれをＨＰＬＣで分離分析する方法は汎用性が高く、確実な方法として多用されている。【０００４】  例えば、Ｐ．Ｍａｒｆｅｙは下記構造式
【化１】
2014034573.tif 000032
で示されるＮ−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド（以下、Ｍａｒｆｅｙ試薬という）とアミノ酸を反応させ、ジアステレオマーを生成させ、これをＨＰＬＣで分離分析している（非特許文献１）。この時、ジアステレオマー間は良好な分離を示す。【０００５】  木下らは、アミノ基を有する光学活性な化合物に対する蛍光キラル誘導体化法を報告している（特許文献１）。それによれば、アミノ基を有する光学活性な化合物とｏ−フタルアルデヒド、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを反応させ、インドール誘導体のジアステレオマーを生成させている。このジアステレオマーはＨＰＬＣで良好な分離を示す。この反応は第１級アミンに対して選択的で、また、反応に際してラセミ化を起こすことがない。【０００６】  ピヨーンらは下記構造式
【化２】
2014034573.tif 000033
（式中、Ｒはアルキル基、トリフルオロメチル基から選択され、Ｘはハロゲン、アジド基、スクシンイミジル基から選択され、＊は不斉炭素原子でエナンチオマーの一を示す）で示される光学活性フルオレン誘導体を開発し、アミノ基を有する光学活性な化合物と反応させ、カルバミン酸誘導体のジアステレオマーを生成させている（特許文献２）。そして、このジアステレオマーをＨＰＬＣで分離し、良好な結果を得ている。【０００７】  豊岡らは下記構造式
【化３】
2014034573.tif 000034
（式中、Ｒはニトロ基、ジメチルアミノスルホニル基から選択され、＊は不斉炭素原子でエナンチオマーの一方を示す）で示される光学活性４−ニトロ−７−（３−イソチオシアナートピロリジン−１−イル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下、ＮＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳという）、光学活性４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−（３−イソチオシアナートピロリジン−１−イル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下、ＤＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳという）を開発し、それぞれ不斉炭素原子に直結したアミノ基、メルカプト基を有する化合物のＨＰＬＣによる光学純度測定法を報告している（非特許文献２）。ＮＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳ、ＤＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳのいずれも不斉炭素原子に直結したアミノ基、メルカプト基と速やかに反応し、それぞれチオウレア、ジチオカルバメートのジアステレオマーを生成する。これらの一対のジアステレオマーはＨＰＬＣで分離し、長波長の強い蛍光を示す。【０００８】  また、カルボン酸類の光学異性体の分離、分析用として、豊岡らは下記構造式
【化４】
2014034573.tif 000035
（式中、Ｒはニトロ基、ジメチルアミノスルホニル基から選択され、＊は不斉炭素原子でエナンチオマーの一方を示す）で示される光学活性４−ニトロ−７−（３−アミノピロリジン−１−イル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下、ＮＢＤ−ＡＰｙという）、光学活性４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−（３−アミノピロリジン−１−イル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下、ＤＢＤ−ＡＰｙという）を開発、その有用性を報告している（非特許文献３）。それによれば、ＮＢＤ−ＡＰｙ、ＤＢＤ−ＡＰｙのいずれも温和な条件下、カルボキシル基を有する化合物と反応し、ジアステレオマーを生成する。このジアステレオマーはＨＰＬＣ分離条件に安定で、良好な分離を示し、強い蛍光を有する。【０００９】  磯部らは下記構造式
【化５】
2014034573.tif 000036
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、あるいはアラルキル基から選択され、＊は不斉炭素原子でエナンチオマーの一方を示す）で示される光学活性１，３−オキサゾリン−２−チオン誘導体を開発し、カルボキシル基を有するケトプロフェンなどに存在する光学異性体のＨＰＬＣ分離分析法を報告している（特許文献３）。【００１０】  上記方法はＨＰＬＣの検出器としてＵＶ検出器あるいは蛍光検出器を用いる方法である。近年、医薬品開発、生体成分の分析を中心として極めて微量のエナンチオマーの検出、定量が望まれており、これらの方法では到底満足できるものではない。【００１１】  そうした要望に応える手法としてＭＳを検出器とするＨＰＬＣ−ＭＳが利用されつつある。例えば、Ｓ．Ａ．ＦｕｃｈｓらはＭａｒｆｅｙ試薬とセリンを反応させてジアステレオマーを生成させ、このジアステレオマーをＨＰＬＣ−ＭＳで分離分析している（非特許文献４）。その検出限界はＤ−セリンが０．２０μｍｏｌ、Ｌ−セリンが０．１４μｍｏｌと報告されている。【００１２】  Ｄ．Ｊｉｎらは光学活性なＤＢＤ−Ｐｙ−ＮＣＳとチロキシン（以下、Ｔ４という）を反応させてジアステレオマーを生成させ、このジアステレオマーをＨＰＬＣ−ＭＳで分離分析している（非特許文献５）。ＭＳでの検出はネガティブイオンモードを使用し、Ｄ−Ｔ４の検出限界は２８ｎｇ／ｍｌ、Ｌ−Ｔ４の検出限界は４０ｎｇ／ｍｌを得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】公開特許広報，昭６０−３８６５２
【特許文献２】公表特許広報，昭６３−５０１５７
【特許文献３】公開特許広報，平９−１２４６２１
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐ．Ｍａｒｆｅｙ，Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４９，５９１（１９８４）
【非特許文献２】Ｔ．Ｔｏｙｏ’ｏｋａ，Ｙ−Ｍ．Ｌｉｎ，Ａｎａｌｙｓｔ，１２０，３８５（１９９５）
【非特許文献３】Ｔ．Ｔｏｙｏ’ｏｋａ，Ｍ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｔ．Ｔｅｒａｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６２５，３５７（１９９２）
【非特許文献４】Ｓ．Ａ．Ｆｕｃｈｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，１４４３（２００８）
【非特許文献５】Ｄ．Ｊｉｎ，Ａ．Ｐ．Ｋｕｍａｒ，Ｇ−Ｃ．Ｓｏｎｇ，Ｙ−Ｉ．Ｌｅｅ，Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８８，６２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】  しかしながら、Ｓ．Ａ．ＦｕｃｈｓらのＭａｒｆｅｙ試薬を用いる方法はＤ−セリン、Ｌ−セリンの分離は良好であるが、その検出限界はそれぞれ０．２０μｍｏｌ、０．４１μｍｏｌである。高感度検出法とは言い難く、到底満足できるものではない。【００１６】  Ｄ．Ｊｉｎらの方法はナノグラムレベルの高い検出感度でチロキシンの光学異性体を検出、定量することができる優れた方法である。しかしながら、この方法は親イオン［Ｍ−Ｈ］−１１２９を選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）することで高感度検出を達成している。この親イオン［Ｍ−Ｈ］−１１２９はチロキシン誘導体由来のイオンである。そのため、類縁体であるトリヨードサイロニンの同時検出は不可能であり、到底満足できる手法ではない。高感度検出を達成させるには、ＭＳ／ＭＳ分析において娘イオンがジアステレオマー生成試薬由来となるようなジアステレオマー生成試薬が求められている。ジアステレオマー生成試薬由来の娘イオンで選択反応モニタリング（ＳＲＭ）することで類縁体を含めた一群の測定対象物を同時に高感度で検出、定量することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】  そこで、発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明化合物がＨＰＬＣによる光学活性アミン類、カルボン酸類の光学異性体を分離、定量するため優れたジアステレオマー生成試薬であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１８】  すなわち、本発明は下記構造式
【化６】
2014034573.tif 000037
（式中、Ｒ１はカルボキシル基、活性エステル体、カルボニルクロリド、水素原子から選択され、Ｒ１がカルボキシル基、活性エステル体、カルボニルクロリドから選択された場合、Ｒ２は水素原子で、Ｒ１が水素原子の場合、Ｒ２はアミノ基、アルキルアミノ基から選
2014034573.tif 000038
し、Ａｒは下記構造式
【化７】
2014034573.tif 000039
のいずれかから選ばれ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立にアルキル基、アルキルオキシ基、ハロゲン原子、水素原子から選択される）で示される光学活性ピリジルチオウレア誘導体に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】  本発明に係る上記構造式で表される化合物からアミン類の光学異性体の分離、分析するためのジアステレオマー生成試薬の代表例として下記構造（１）を、カルボン酸類の光学異性体の分離、分析するためのジアステレオマー生成試薬の代表例として下記構造（２）を取り上げ、本発明の詳細を明らかにする。
【化８】
2014034573.tif 000040
【００２０】  構造式（１）、（２）で表される光学活性ピリジルチオウレア誘導体は文献未載の新規化合物あり、その製造法としては例えば下記反応式に従って、３−ピリジルイソチオシアネートから容易に合成することができる。
【化９】
2014034573.tif 000041
【００２１】  本発明化合物Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸（１）の合成における第一工程は３−イソチオシアナートピリジンと光学活性なプロリンｔｅｒｔ−ブチルを反応させ、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートを得る工程で、使用しうる溶媒はジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、テトラヒドロフラン、メタノール、酢酸エチル、ヘキサンあるいはそれらの混合溶媒から適宜選択される。反応温度は室温から溶媒の還流温度の間で適宜選択され、反応に要する時間は使用する溶媒、反応温度などにより異なるが、３０分から１２時間の間で適宜選択される。第二工程はエステル結合を加水分解する工程で、例えばトリフルオロ酢酸水溶液などで加水分解し、目的とする本発明化合物光学活性Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸が得られる。
【００２２】  本発明化合物３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン（２）の合成における第一工程は３−イソチオシアナートピリジンと光学活性な３−Ｂｏｃアミノピロリジンを反応させ、３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを得る工程で、使用しうる溶媒はジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、テトラヒドロフラン、メタノール、酢酸エチル、ヘキサンあるいはそれらの混合溶媒から適宜選択される。反応温度は室温から溶媒の還流温度の間で適宜選択され、反応に要する時間は使用する溶媒、反応温度などにより異なるが、３０分から１２時間の間で適宜選択される。第二工程はＢｏｃを脱離させる工程で、種々のＢｏｃ基の脱保護条件が利用できる。例えば、トリフルオロ酢酸を用いても定量的にＢｏｃが脱離し、目的とする本発明化合物光学活性３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンが得られる。
【００２３】  本発明化合物である光学活性Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸はアミン類と、光学活性３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンはカルボン酸類とそれぞれ縮合剤の存在下、反応結合する。縮合剤は２，２’ジピリジルジスルフィド−トリフェニルホスフィン、シアノホスホン酸ジエチル、ジフェニルホスホリルアジドなどから適宜選択される。アミン類、カルボン酸類が不斉炭素原子を有し、エナンチオマーの混合物である場合、反応生成物はジアステレオマーを形成する。このジアステレオマーはアキラルな逆相カラムを用いるＨＰＬＣ−ＭＳで良好な分離を示す。検出にはジアステレオマー生成試薬として用いられている本発明化合物由来のｍ／ｚ１３７．０の選択反応モニタリング（ＳＲＭ）により高感度で検出、定量することができる。
【００２４】  本発明化合物の有用性を明らかにするため、カルボン酸類の代表例としてイブプロフェンを、アミン類の代表例として１−ナフチルエチルアミンを取り上げ、エナンチオマーの分離、分析を参考例として示す。
【００２５】  ３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを用いたイブプロフェンの誘導体化の方法は以下の通りである。
１０μＭ（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン１０μｌ（２０．６ｎｇ）に１０ｍＭ  ２，２’ジピリジルジスルフィド（ＤＰＤＳ）、１０ｍＭトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）、１ｍＭ  ３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを其々１０μｌ加え、混和した。その後６０℃、１２０分加熱した。溶媒留去後、移動相に溶解し、希釈後、測定サンプルとした。
また、（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを用いてイブプロフェンの誘導体化を行うこともできる。その際の誘導体化の方法は以下の通りである。まず、アセトニトリルに溶解した１ｍＭ（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン１０μｌを氷冷下に静置し、そこにトリフルオロ酢酸を４０μｌを滴下し、６０分間反応させた。溶媒を留去後、アンモニア水にて中和し、溶媒を再留去した。その後、残渣を１０μｌのアセトニトリルに再溶解した。これ以降の誘導体化の方法は先述した方法と同様とした。
調製したサンプルをＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにて測定した。（インジェクション量：イブプロフェン誘導体５ｆｍｏｌ）
【００２６】  この時のＨＰＬＣ−ＭＳの条件は次の通りである。
2014034573.tif 000042
ステム
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ，１．７μｍ，２．１ｍｍ×１００ｍｍ
カラム温度：４０℃
溶出液：０．１％ギ酸含有水／０．１％ギ酸含有アセトニトリル＝６０／４０
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２μｌ
質量分析計：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥまたはＸｅｖｏＴＭＴＱ−Ｓ
【００２７】  誘導体化は下記式に従って進行する。
【００２８】
【化１０】
2014034573.tif 000043
【００２９】  分析結果は次の通りである。ＵＰＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ分析におけるイブプロフェン誘導体（ｍ／ｚ４１１．２）のクロマトグラム［表１］とスペクトル［表２］を以下に示す。両ピークとも同様のスペクトルパターンを示し、良好な分離を達成していることがわかる。
【００３０】
【表１】
2014034573.tif 000044
【００３１】
【表２】
2014034573.tif 000045
【００３２】  次にイブプロフェン誘導体のＸｅｖｏＴＭＴＱ−Ｓを用いたプロダクトイオンスキャンによるスペクトルとＳＲＭモード（ｍ／ｚ４１１．２→１３７．０）のクロマトグラムを［表３］［表４］に示す。プロダクトイオンｍ／ｚ１３７．０は誘導体化試薬由来であり、このプロダクトイオンを用い、ＳＲＭモードでの測定を行った。分離度Ｒｓは３．４と完全分離を達成している。また、検出限界はおよそ０．４ｆｍｏｌであった。
【００３３】
【表３】
2014034573.tif 000046
【００３４】
【表４】
2014034573.tif 000047
2014034573.tif 000048
【００３５】  Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸を用いた１−ナフチルエチルアミンの誘導体化の方法は以下の通りである。
１０μＭ（Ｒ，Ｓ）−１−ナフチルエチルアミン１０μｌ（１７．７１ｎｇ）に１０ｍＭ  ２，２’ジピリジルジスルフィド（ＤＰＤＳ）、１０ｍＭ  トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）、１ｍＭ  Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸を其々１０μｌ加え、混和した。その後６０℃、１２０分加熱した。溶媒留去後、移動相に溶解し、希釈後、測定サンプルとした。
また、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートを用いてナフチルエチルアミンの誘導体化を行うこともできる。その際の誘導体化の方法は以下の通りである。まず、アセトニトリルに溶解したｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレート１０μｌを氷冷下に静置し、そこにトリフルオロ酢酸を４０μｌを滴下し、６０分間反応させた。溶媒を留去後、アンモニア水にて中和し、溶媒を再留去した。その後、残渣を１０μｌのアセトニトリルに再溶解した。これ以降の誘導体化の方法は先述した方法と同様とした。
調製したサンプルをＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにて測定した。（インジェクション量：ナフチルエチルアミン誘導体５ｆｍｏｌ）
【００３６】  この時のＨＰＬＣ−ＭＳの条件は次の通りである。
2014034573.tif 000049
ステム
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ，１．７μｍ，２．１ｍｍ×１００ｍｍ
カラムオーブン：４０℃
溶出液：０．１％ギ酸含有水／０．１％ギ酸含有アセトニトリル＝７２／２８
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２μｌ
質量分析計：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥまたはＸｅｖｏＴＭＴＱ−Ｓ
【００３７】  誘導体化は下記反応式に従って進行する。
【化１１】
2014034573.tif 000050
【００３８】  分析結果は次の通りである。ＵＰＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ分析におけるナフチルエチルアミン誘導体（ｍ／ｚ４０５．２）のクロマトグラムとスペクトルを［表５］［表６］に示す。両ピークとも同様のスペクトルパターンを示し、良好な分離を達成していることがわかる。
【００３９】
【表５】
2014034573.tif 000051
【００４０】
【表６】
2014034573.tif 000052
【００４１】  次にナフチルエチルアミン誘導体のＸｅｖｏＴＭＴＱ−Ｓを用いたプロダクトイオンスキャンによるスペクトルとＳＲＭモード（ｍ／ｚ４０５．２→１３７．０）のクロマトグラムを［表７］［表８］に示す。プロダクトイオンｍ／ｚ１３７．０は誘導体化試薬由来であり、このプロダクトイオンを用い、ＳＲＭモードでの測定を行った。分離度Ｒｓは５．３と完全分離を達成している。また、検出限界はおよそ１．１ｆｍｏｌであった。
【００４２】
【表７】
2014034573.tif 000053
【００４３】
【表８】
2014034573.tif 000054
2014034573.tif 000055
【００４４】  以上のように本発明化合物はアミン類、カルボン酸類のエナンチオマーの分離分析に用いられる。標識体はＨＰＬＣ−ＭＳの分離条件に安定で、カラムの移動中に分解することはない。標識体であるジアステレオマーのアキラルカラムによる分離度は１．５以上で、良好な分離を示す。また、ＭＳ／ＭＳ分析における娘イオンは下記式に示すように本発明化合物由来の１３７．０で、一群のアミン類、あるいは一群のカルボン酸類を同時に分離分析することが可能である。したがって、本発明化合物はアミン類、カルボン酸類のエナンチオマーのＨＰＬＣ−ＭＳによる分離分析に極めて有用なジアステレオマー生成試薬である。
【００４５】
【化１２】
2014034573.tif 000056
【実施例】
【００４６】  以下に本発明の好ましい実施例を記載するが、これは例示の目的であり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲内で変形が可能なことは当業者には明らかであろう。【００４７】実施例１
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートの合成
３−イソチオシアナートピリジン（１等量）とＤ−プロリンｔｅｒｔ−ブチル（５等量）をジクロロメタンに溶解し、室温６時間攪拌した。その後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝３０／１）にて、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートの白色結晶を得た。【００４８】  得られたｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートの主な物性値は次の通りである。
ｍｐ：１５５〜１５６℃【００４９】
【表９】
2014034573.tif 000057
【００５０】（Ｒ）−Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸の合成
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレートを少量のジクロロメタンに溶解し、氷冷下で攪拌した。そこにトリフルオロ酢酸を段階的に加え、さらに激しく６０分間攪拌した。その後、溶媒留去することで、油状の（Ｒ）−Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸を得た。【００５１】
【表１０】
2014034573.tif 000058
【００５２】  ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボキシレート、（Ｒ）−Ｎ−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン−２−カルボン酸、どちらを用いてもジアステレオマー生成試薬として有益な結果をもたらすことは先述した通りである。【００５３】実施例２
（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンの合成
３−イソチオシアナートピリジン（１等量）と（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノピロリジン（５等量）をジクロロメタンに溶解し、室温６時間攪拌した。その後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝３０／１）にて、（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンの白色結晶を得た。【００５４】  得られた（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンの主な物性値は次の通りである。
ｍｐ：９７〜１００℃【００５５】
【表１１】
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【００５６】（Ｓ）−３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンの合成
（Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを少量のジクロロメタンに溶解し、氷冷下で攪拌した。そこにトリフルオロ酢酸を段階的に加え、さらに激しく６０分間攪拌した。その後、溶媒留去し、飽和炭酸水素ナトリウム水にて中和した。液−液抽出（水／ジクロロメタン）を行い、ジクロロメタン層を濃縮することで油状の（Ｓ）−３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジンを得た。【００５７】
【表１２】
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【００５８】  （Ｓ）−３−Ｂｏｃアミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン、（Ｓ）−３−アミノ−１−（３−ピリジルチオカルバモイル）ピロリジン、どちらを用いてもジアステレオマー生成試薬として有益な結果をもたらすことは先述した通りである。