(57)【要約】【課題】癌転移過程の全てが再現された癌転移モデル動物の作出方法、当該モデル動物を用いた癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】細胞膜のＥ−カドヘリン陽性の上皮細胞の形態を維持したヒト癌上皮細胞を、ＮＯＧマウスの皮下に移植し、癌を遠融転移させることを特徴とするヒト上皮癌転移モデルマウスの作出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜のＥ−カドヘリン陽性の上皮細胞の形態を維持したヒト癌上皮細胞を、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ）マウスの皮下に移植し、癌を遠融転移させることを特徴とするヒト上皮癌転移モデルマウスの作出方法。
【請求項２】
上皮細胞の形態を維持したヒト癌上皮細胞に加えて癌内線維芽細胞を皮下に移植する請求項１に記載のヒト上皮癌転移モデルマウスの作出方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法により作出されたヒト上皮癌転移モデルマウス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のヒト上皮癌転移モデルマウスに被験物質を投与し、癌の転移の有無を測定することを特徴とする上皮癌転移抑制薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト癌上皮細胞の遠隔転移モデルマウスの作出方法、その方法により作出された癌転移モデルマウス、及び当該モデルマウスの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における大きな問題は、外科手術後の転移による再発であり、癌転移をいかにして抑制するかが癌療法の重要な課題である。癌転移は、基本的に、（１）原発巣での癌細胞の上皮間葉転換(EMT:epithelial to mesenchymal transition)による周囲組織への浸潤能の獲得、（２）原発巣からの癌細胞の離脱、（３）脈管（血管やリンパ管）への浸潤、（４）脈管内での移動、（５）転移臓器の血管内皮への接着、（６）転移臓器への浸潤、（７）転移臓器内での増殖、という過程によって生じる。そして、癌転移の過程には、血管新生、細胞接着、細胞外マトリックス等が関与しているため、これらを阻害する薬剤が、癌転移抑制剤として期待されている（非特許文献１）。
【０００３】
しかし、未だ有効な癌転移抑制剤は開発されていない。これは、癌転移過程のうちの一つを制御しても実用的な癌転移抑制剤にはなり得ないためである。
【０００４】
有効な癌転移抑制剤の開発には、癌転移モデル動物が必要である。しかし、従来の癌転移モデルは、癌転移巣より抽出され株化された培養癌細胞をマウスの皮下、臓器や静脈内に投与して遠隔転移が生じるかどうかを観察したものであり、前記癌転移過程の（１）〜（７）のすべての過程を再現するものではない（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２７１３７６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ファルマシア  Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１０（１９９５），ｐ１１３２−１１３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、癌転移過程の全てが再現された癌転移モデル動物の作出方法及び、当該モデル動物を用いた癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来の多くの癌転移研究は、既に上皮間葉転換を起こし原発巣から離脱し、転移能を獲得した癌細胞株を使用し、マウスに移植された時の癌転移の程度を調べるものであった。本発明者は、原発巣から離脱していない細胞−細胞間の接着を促がす役割をつかさどるＥ−カドヘリン蛋白を発現している癌上皮細胞を使用した。このがん上皮細胞を移植して遠隔転移を生じるモデルを作製すべく種々検討した。細胞膜のＥ−カドヘリン陽性の上皮細胞の形態を維持したヒト乳癌上皮細胞は、高度免疫不全ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ）マウスに皮下移植すれば、上皮間葉転換を起こし周囲組織に浸潤して、血中より、遠隔臓器に到達して転移を形成することを見出した。
実際のヒト癌組織は、癌細胞以外に癌内線維芽細胞（Carcinoma-associated fibroblasts：ＣＡＦｓ）などの癌間質細胞を多数含んでおり、ＣＡＦｓが癌細胞の増殖や血管新生を促進することが知られている（Orimo A., Gupta  P., Sgroi D., Arenzana-Seisdedos F., Delaunay T., Naeem R., Carey V., Richardson A., and Weinberg RA., Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion, Cell, 121, 335-348, 2005)。癌上皮細胞のみの移植で誘導される癌転移の形成は不十分なため、より生理的に患者癌に近いモデルとして、本発明者はＣＡＦｓと当該癌上皮細胞をマウスに共移植した。ＣＡＦｓが、癌細胞に顕著に上皮間葉転換を誘導することにより、癌の転移効率は飛躍的に向上することを見出した。さらに、この癌転移モデルを用いれば、癌転移抑制薬がスクリーニングできることも見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［４］に係るものである。
［１］細胞膜のＥ−カドヘリン陽性の上皮細胞の形態を維持したヒト癌上皮細胞を、ＮＯＧマウスの皮下に移植し、癌を遠隔転移させることを特徴とするヒト上皮癌転移モデルマウスの作出方法。
［２］上皮細胞の形態を維持したヒト癌上皮細胞に加えて癌内線維芽細胞を皮下に共移植し、癌細胞に上皮間葉転換を誘導して、より顕著に転移を促進する［１］に記載のヒト上皮癌転移モデルマウスの作出方法。
［３］［１］又は［２］に記載の方法により作出されたヒト上皮癌転移モデルマウス。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のヒト上皮癌転移モデルマウスに被験物質を投与し、癌の転移の有無を測定することを特徴とする上皮癌転移抑制薬のスクリーニング方法。
【００１０】
本発明のヒト上皮癌転移モデルマウスは、癌転移過程の初期から転移終了までの全てを再現したモデルマウスであり、このモデルマウスを用いれば有効な癌転移抑制薬のスクリーニングが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１の操作手順を示す図である。
【図２】CAFｓと共移植された原発巣で、がん細胞に上皮間葉転換が誘導され、周辺組織へがん細胞の増殖や浸潤が亢進していることを示す図である。
【図３】皮下に移植した癌細胞が肺に転移したことを示す図である。CAFsが共移植された場合はより顕著な肺転移の形成が観察されている。
【図４】CAFsで高発現しているサイトカインである、SDF-1,uPAやTGF-bを抑制することにより、CAFｓにより誘導されたがん細胞の肺転移形成能が抑制されることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のヒト上皮癌転移モデルマウスの作出においては、上皮細胞の形態を維持した細胞膜のＥ−カドヘリン陽性のヒト癌上皮細胞を用いる点に特徴の一つがある。ここで、ヒト癌上皮細胞は、ヒト上皮細胞由来の癌細胞であり、組織及び体表面を形成する上皮細胞が癌化したものである。従って、上皮細胞癌には、通常の固形癌が含まれ、具体的には、上顎洞癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、食道癌、胃癌、直腸癌、結腸癌、肝臓癌、胆管癌、胆のう癌、すい臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、外陰癌、皮膚癌、甲状腺癌などが挙げられる。このモデルは、乳癌以外の他の上皮がんにも適用があることが推測される。
【００１３】
「上皮細胞の形態を維持した」とは、癌転移の第一段階である、癌細胞が原発巣から離脱していない状態であることをいう。具体的には、細胞膜のＥ−カドヘリン陽性であることにより確認できる。原発巣から離脱した細胞を用いた場合には、癌転移の全過程を再現したことにならない。また、ヒト上皮細胞癌由来の細胞であればよく、ヒト上皮細胞を動物に移植して原発巣を形成させた癌細胞由来でもよく、ヒト原発上皮細胞癌患者由来の癌細胞であってもよい。
【００１４】
また、本発明においては、前記癌上皮細胞に加えて、ＣＡＦｓも移植するのが、転移効率を向上させる点で好ましい。ここでＣＡＦｓは、ヒト乳癌より抽出され、不死化された細胞株である(Kojima, Y. et al. Autocrine TGF-b and SDF-1 signaling drives evolution of mammary stromal fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 20009-20014, 2010)。癌上皮細胞に加えてＣＡＦｓを共移植することにより遠隔転移が促進される理由は、ＣＡＦｓが癌上皮細胞に上皮間葉転換を誘導して癌細胞をより浸潤能の高い、アポトーシス抵抗性な細胞に変化させていることにある。原発巣でＣＡＦｓとの相互作用により教育された癌細胞は、なんらかの機構でその表現型を安定に維持し、積極的に遠隔臓器に播種しかつ播種後も転移を形成する能力を増していると考えられる。
【００１５】
上皮細胞の移植量は、マウスあたり１×１０4〜１×１０6細胞数、より好ましくは１×１０5細胞数程度でよい。またＣＡＦｓの移植量は、マウスあたり３×１０4〜３×１０6細胞数、より好ましくは３×１０5細胞数程度でよい。
【００１６】
癌上皮細胞を移植するマウスは、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ）マウスである。ＮＯＧマウスは、ＷＯ２００２／０４３４７７に記載のマウスであり、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配したマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配して得られたマウスであり、異種細胞の生着に適している。しかし、このマウスを用いて原発巣よりＥ−カドヘリン陽性癌上皮細胞の遠隔臓器への転移を確認した例は未だ報告されていない。
【００１７】
移植は、皮下に行うのが好ましい。静脈内ではなく、皮下に移植して転移させることが重要である。皮下に移植して、遠隔転移させることにより、原発巣からの癌細胞の離脱、脈管へ浸潤、脈管内での移動、転移臓器の血管内皮への接着、遠隔臓器への転移、転移臓器内での増殖の全ての過程が再現できるのである。
【００１８】
移植後、１．５〜２ヶ月後には、移植部位以外の部位への癌転移が確認できる。遠隔転移の確認は、癌細胞の染色などの免疫組織学的な手法や遠隔臓器より転移癌細胞の抽出等により行うことができる。ここで、遠隔転移の確認は、例えば用いた癌細胞が乳癌であれば乳腺部以外の部位などのように原発癌とは相違する部位で行うのが好ましい。
【００１９】
このようにして得られる本発明のヒト上皮癌転移モデルを用いれば、上皮癌転移抑制薬のスクリーニングができる。被験物質を、癌細胞の移植の前、同時又は後に投与しておき、被験物質非投与群と転移の有無、転移量などを対比すればよい。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２１】
実施例１
１）１×１０5ヒト乳癌上皮細胞を３×１０5ＣＡＦｓと共にＮＯＧマウスの皮下に共移植した。また同数のヒト乳癌上皮細胞は、繊維芽細胞の非存在下でＮＯＧマウスの皮下に移植した（図１）。移植後２５日目頃、各グループの原発巣の容積が約１.２５−１．５cm3程度に達した時に全身麻酔下でマウスより原発癌を切除した。切除後１．５−２ヶ月後に肺への転移を調査した。
２）CAFsの存在下で増殖した原発巣内の癌細胞は、CAFsの非存在下で増殖した癌細胞と比較して、より周辺組織への浸潤傾向を示し、癌浸潤や転移に必須な現象である上皮間葉転換の表現型を呈した（上皮細胞マーカーのＥ−カドヘリン（E-cad）の低下や間質細胞のマーカーのVimentin（Vim）の増加の観察）(図２)。
３）移植後２ヶ月後に遠隔臓器（肺、肝臓など）を採取して転移の程度を評価した。ヒト乳癌上皮細胞はds-tomatoの蛍光色素を恒常的に発現するように細工されており、この細胞の各臓器での存在は、蛍光顕微鏡下で容易に確認されることができる。肺転移後に増殖しコロニーを形成した癌細胞が矢印で示されている（図３)。CAFsと移植されたds-tomato陽性の癌細胞は、他のグループと比較して、より顕著な転移を示した（図３）。
４）次にこのヒト上皮癌転移モデルに被験物質を投与し、癌の転移の抑制効果をスクリーニング方法確立のためのパイロット実験を行った。CAFsで高発現している複数のサイトカイン、SDF-1(stromal cell-derived factor 1)、TGF-βあるいはuPA(urokinase, plasminogen activator)がCAFsで誘導される癌細胞の浸潤能に重要であることがin vitroの実験により示唆されている。続いてこれらの遺伝子の発現が、CAFs依存性に誘導される乳癌の肺転移に必要であるかどうか動物モデルを使用して調査した。SDF-1,TGF-βあるいはuPAの発現はlentivirusを使用した遺伝子knock down法により有意にCAFsで抑制された。これらの変異CAFｓとds-tomatoでラベルされた乳癌細胞をＮＯＧマウスの皮下に共移植後、２ヶ月後に肺に検出されるds-tomatoの蛍光強度がCell Profiler cell image analysis softwareを使用して各グループ間で比較した。結果として、対照のCAFｓ（ヒトの細胞で発現していないGFP遺伝子が抑制されている）に比較して、CAFｓにおけるSDF-1,TGF-βあるいはuPAの発現が抑制された場合は、肺転移が顕著に抑制された(図４)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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