(57)【要約】【課題】検査光を用いて生物試料を観察する場合において、検査光の照射強度が生物試料に悪影響を与えない程度の高さであっても、その検査光によって発生するエバネッセント光の光強度を大幅に増強することができ、生物試料の観察を高い精度でより適切に行うことができる。【解決手段】生物試料である試料２０の観察に用いる観察装置１００であって、光源部１０４と、光源部１０４と試料２０との間に設けられ、光源部１０４が発生する検査光を試料２０へ向けて照射する光学部材１０２とを備え、試料２０は、全反射面上の所定位置である位置３０６に置かれ、光学部材１０２は、検査光を、位置３０６で全反射される方向である第１の方向で照射し、位置３０６で全反射された検査光について、光学部材１０２内において、第１の方向とは異なる方向であり、かつ位置３０６で全反射される方向である第２の方向になるように全反射することにより、検査光を第２の方向で更に位置３０６に照射する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査光に対する生物試料の応答の観察に用いる観察装置であって、
前記検査光を発生する光源部と、
前記検査光の光路における前記光源部と前記生物試料との間に設けられ、前記光源部が発生する前記検査光を前記生物試料へ向けて照射する光学部材と
を備え、
前記生物試料は、入射角が臨界角以上の場合に前記検査光を全反射する全反射面上の所定位置に置かれ、
前記光学部材は、前記検査光を、前記所定位置で全反射される方向である第１の方向で照射し、前記所定位置で全反射された前記検査光について、前記光学部材内において、前記第１の方向とは異なる方向であり、かつ前記所定位置で全反射される方向である第２の方向になるように全反射することにより、前記検査光を前記第２の方向で更に前記所定位置に照射することを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記生物試料は、生物の細胞の試料であることを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記観察装置は、全反射照明蛍光顕微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記検査光は、レーザー光であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の観察装置。
【請求項５】
前記生物試料が置かれる前記全反射面は、前記光学部材における一の面であり、
前記生物試料は、前記一の面における前記所定位置で前記光学部材と接触した状態で、前記光学部材上に置かれることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の観察装置。
【請求項６】
前記光学部材は、前記一の面と平行であり、前記一の面と対向する位置で前記検査光を全反射する対向全反射面を更に有し、
前記生物試料の観察を行う試料観察時において、前記光学部材は、前記対向全反射面で前記検査光を全反射することにより、前記第１の方向及び前記第２の方向の前記検査光を、前記所定位置へ照射することを特徴とする請求項５に記載の観察装置。
【請求項７】
前記光学部材は、前記第２の方向で前記所定位置に照射し、前記所定位置で全反射された前記検査光について、前記光学部材内において、前記第１の方向、及び前記第２の方法のいずれとも異なる方向であり、かつ前記所定位置で全反射される方向である第３の方向になるように全反射することにより、前記検査光を前記第３の方向で更に前記所定位置に照射することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の観察装置。
【請求項８】
検査光に対する生物試料の応答を観察する観察方法であって、
前記検査光を発生し、
前記検査光の光路における前記光源部と前記生物試料との間に設けられた光学部材を用いて、前記検査光を前記生物試料へ向けて照射し、
前記生物試料は、入射角が臨界角以上の場合に前記検査光を全反射する全反射面上の所定位置に置かれ、
前記光学部材は、前記検査光を、前記所定位置で全反射される方向である第１の方向で照射し、前記所定位置で全反射された前記検査光について、前記光学部材内において、前記第１の方向とは異なる方向であり、かつ前記所定位置で全反射される方向である第２の方向になるように全反射することにより、前記検査光を前記第２の方向で更に前記所定位置に照射することを特徴とする観察方法。
【請求項９】
検査光に対する生物試料の応答を観察する観察装置において用いる光学部材であって、
前記検査光の光路において、前記検査光を発生する光源部と前記生物試料との間に設けられ、前記光源部が発生する前記検査光を前記生物試料へ向けて照射し、
前記生物試料は、入射角が臨界角以上の場合に前記検査光を全反射する全反射面上の所定位置に置かれ、
前記光学部材は、前記検査光を、前記所定位置で全反射される方向である第１の方向で照射し、前記所定位置で全反射された前記検査光について、前記光学部材内において、前記第１の方向とは異なる方向であり、かつ前記所定位置で全反射される方向である第２の方向になるように全反射することにより、前記検査光を前記第２の方向で更に前記所定位置に照射することを特徴とする光学部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置、観察方法、及び光学部材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療分野等での研究の発展に伴い、微生物や細胞等の生物試料をより高い精度で観察する方法が望まれている。しかし、生物試料の場合、試料の性質から、診断方法に様々な制限がある。例えば、生物試料の場合、通常、真空中に試料を設置して観察を行うことは困難である。また、強い光や紫外線等を照射すると細胞の組織が破壊されてしまうおそれがあるため、光の照射についても様々な制限がある。
【０００３】
これに対し、近年、様々な機能性蛍光試薬や蛍光性蛋白質（Green Fluorescence Proteinなど）の開発等により、分子・細胞生物学の研究等において、試料に与える影響を抑えつつ生物試料を観察する方法として、全反射照明蛍光顕微鏡による生物試料の観察（全反射照明蛍光観察法）が有用な手法と考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。この方法では、例えば、蛍光性のない生物試料に蛍光物質を導入するか、蛍光性蛋白を発現させることにより、生物試料における分子や構造を光る画像としてとらえる蛍光観察を行う。また、この方法では、試料を載せた全反射面のごく狭い領域のみに光を照射することにより、試料に与える影響を抑えつつ、例えば生物試料に含まれる特定の分子の位置を数十ナノメートルの精度で求めるような、高感度かつ高精度の観察を行うことができる。また、試料に照射する光として可視光を用いることができるため、この点でも、試料に与える影響を抑えることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】インターネットURLhttp://www.nikon-instruments.jp/jpn/tech/2-1-6-1.aspx
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
全反射照明蛍光観察法では、例えば、生物試料をカバーガラス等により保持し、カバーカラスと生物試料との境界位置で全反射が起こる条件でレーザー光（検査光）を照射する。これにより、カバーガラス近傍のごく限定された領域（例えば、カバーガラス表面から１００ｎｍ程度）にのみに発生するエバネッセント波、いわゆるエバネッセント光を発生させ、その限定された領域における励起により生じる蛍光現象を観察する。このような励起方法を用いることにより、全反射が起こる界面近傍でのみ起こる現象の画像化や背景光の少ない高感度な蛍光分子検出が可能となる。
【０００６】
一般に、カバーガラス近傍の領域に発生するエバネッセント光の光強度が高くなるほど、生物試料から発生する蛍光の光強度は高くなる。エバネッセント光の光強度を高くするには、照射するレーザー光のエネルギー強度を高くするのが通常の手法である。しかし、レーザー光のエネルギー強度を高くすると、生物試料の細胞組織を破壊するリスクが高くなるため、生物試料に照射するレーザー光のエネルギー強度をあまり高くすることはできない。また、例えば生物試料の状態（例えば、試料の形状、試料の向き、試料に含まれる物質等）や、実験条件によっては、生物試料へレーザー光を照射する方向により、蛍光を適切に観察できないおそれもある。また、レーザー光を照射する方向によっては、適切に励起光が生じないことも考えられる。
【０００７】
このような問題点に対しては、例えば、複数のレーザー光源を用意し、複数の方向からレーザー光を照射することも考えられる。このようにすることで、１つのレーザー光のエネルギー強度が従来の高さであっても、カバーガラス近傍のごく限定された領域で発生するエバネッセント光の光強度を従来よりも高くすることは可能である。しかし、この場合、装置の構造が複雑になり、装置の製造コストや運用コストが大きく増大すると考えられる。  
【０００８】
また、レーザー光を照射する方向による問題を解決するためには、試料とレーザー光源との位置関係を変更することにより、レーザー光の照射方向を適宜変更することも考えられる。しかし、この場合、試料観察時の手間が大きく増大し、適切に観察を行えないおそれがある。そのため、より適切な構成により、生物試料を観察することが望まれる。そこで、本発明は、上記の課題を解決できる観察装置、観察方法、及び光学部材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願の発明者は、生物試料の近傍に設定する全反射位置に対し、複数の光源を用意することなく、全反射条件を満たす複数の方向（２方向以上）から光を照射する方法について、鋭意研究を行った。そして、所定の光学的特性を有する光学部材を用いることにより、一の光源が発生する光を利用して、所定の全反射位置へ向けて、複数の方向から光を照射することができることを見出した。また、これにより、例えば全反射照明蛍光観察法における検査光の照射を、より適切に行い得ることを見出した。以上の知見に基づいて本願の発明者が想到した本発明は、以下の構成を有する。
【００１０】
（構成１）検査光に対する生物試料の応答の観察に用いる観察装置であって、検査光を発生する光源部と、検査光の光路における光源部と生物試料との間に設けられ、光源部が発生する検査光を生物試料へ向けて照射する光学部材とを備え、生物試料は、入射角が臨界角以上の場合に検査光を全反射する全反射面上の所定位置に置かれ、光学部材は、検査光を、所定位置で全反射される方向である第１の方向で照射し、所定位置で全反射された検査光について、光学部材内において、第１の方向とは異なる方向であり、かつ所定位置で全反射される方向である第２の方向になるように全反射することにより、検査光を第２の方向で更に所定位置に照射する。
【００１１】
このように構成した場合、例えば、全反射面上の所定位置へ向けて、複数の方向の検査光を適切に照射できる。そのため、このように構成すれば、例えば、検査光の方向が観察結果に影響することを適切に防ぐことができる。また、これにより、生物試料の観察を高い精度で適切に行うことができる。
【００１２】
尚、生物試料について、全反射面上の所定位置に置かれるとは、例えば、全反射面と接した状態で、全反射面における所定位置に設置されることである。すなわち、生物試料が置かれる位置は、全反射面に対して重力方向の上方側に限らず、下方側であってもよい。
【００１３】
（構成２）生物試料は、生物の細胞の試料である。この細胞は、例えば微生物中の細胞であってもよい。このように構成すれば、例えば、生物の細胞の試料の観察を、高い精度で適切に行うことができる。
【００１４】
（構成３）観察装置は、全反射照明蛍光顕微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy）である。このように構成すれば、例えば、全反射面上の所定位置へ向けて複数の方向の検査光を照射することにより、生物試料に含まれる蛍光物質等による励起光を、より適切に発生させることができる。
【００１５】
（構成４）検査光は、レーザー光である。このように構成すれば、検査光の照射方向の制御を高い精度で適切に行うことができる。
【００１６】
（構成５）生物試料が置かれる全反射面は、光学部材における一の面であり、生物試料は、一の面における所定位置で光学部材と接触した状態で、光学部材上に置かれる。
【００１７】
このように構成すれば、例えば、全反射面における所定位置に生物試料を適切に設置できる。また、例えば光学部材とは別の部材における全反射面上に生物試料を置く場合等と異なり、生物試料を設置する所定位置が光学部材に対して固定されているため、全反射面上の所定位置へより高い精度で検査光を照射できる。
【００１８】
（構成６）光学部材は、一の面と平行であり、一の面と対向する位置で検査光を全反射する対向全反射面を更に有し、生物試料の観察を行う試料観察時において、光学部材は、対向全反射面で検査光を全反射することにより、第１の方向及び第２の方向の検査光を、所定位置へ照射する。このように構成すれば、例えば、全反射面における所定位置へ向けて、第１の方向及び第２の方向の検査光を適切に照射できる。
【００１９】
（構成７）光学部材は、第２の方向で所定位置に照射し、所定位置で全反射された検査光について、光学部材内において、第１の方向、及び第２の方法のいずれとも異なる方向であり、かつ所定位置で全反射される方向である第３の方向になるように全反射することにより、検査光を第３の方向で更に所定位置に照射する。
【００２０】
このように構成した場合、例えば、全反射面における所定位置へ向けて、３以上の方向の検査光を照射できる。そのため、このように構成すれば、例えば、検査光の方向が観察結果に影響することをより適切に防ぐことができる。また、これにより、生物試料の観察を高い精度でより適切に行うことができる。
【００２１】
（構成８）検査光に対する生物試料の応答を観察する観察方法であって、検査光を発生し、検査光の光路における光源部と生物試料との間に設けられた光学部材を用いて、検査光を生物試料へ向けて照射し、生物試料は、入射角が臨界角以上の場合に検査光を全反射する全反射面上の所定位置に置かれ、光学部材は、検査光を、所定位置で全反射される方向である第１の方向で照射し、所定位置で全反射された検査光について、光学部材内において、第１の方向とは異なる方向であり、かつ所定位置で全反射される方向である第２の方向になるように全反射することにより、検査光を第２の方向で更に所定位置に照射する。このように構成すれば、例えば、構成１と同様の効果を得ることができる。
【００２２】
（構成９）検査光に対する生物試料の応答を観察する観察装置において用いる光学部材であって、検査光の光路において、検査光を発生する光源部と生物試料との間に設けられ、光源部が発生する検査光を生物試料へ向けて照射し、生物試料は、入射角が臨界角以上の場合に検査光を全反射する全反射面上の所定位置に置かれ、光学部材は、検査光を、所定位置で全反射される方向である第１の方向で照射し、所定位置で全反射された検査光について、光学部材内において、第１の方向とは異なる方向であり、かつ所定位置で全反射される方向である第２の方向になるように全反射することにより、検査光を第２の方向で更に所定位置に照射する。このように構成すれば、例えば、構成１と同様の効果を得ることができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、例えば、検査光を用いて生物試料を観察する場合において、検査光の照射強度が生物試料に悪影響を与えない程度の高さであっても、その検査光によって発生するエバネッセント光の光強度を大幅に増強することができる。検査光の方向が観察結果に影響することを適切に防ぐことができる。また、これらにより、生物試料の観察を高い精度で適切に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態に係る観察装置１００の構成の一例を示す図である。図１（ａ）は、観察装置１００の構成の一例を示す。図１（ｂ）は、光学部材１０２の詳細な構成の一例を示す図である。
【図２】光学部材１０２の構成の他の例を示す図である。図２（ａ）は、面２０２と面２０４とが非平行である場合の光学部材１０２の構成の例を示す図である。図２（ｂ）は、図２（ａ）に示した光学部材１０２の斜視図である。図２（ｃ）は、面２０２と面２０４とが平行である場合の光学部材１０２の構成の他の例を示す図である。図２（ｄ）は、図２（ｃ）に示した光学部材１０２の斜視図である。
【図３】第１〜第４の４方向の検査光を試料設置位置へ照射する場合の光学部材１０２の構成（４方向立体折り返し）の例を示す図である。図３（ａ）は、４方向の検査光を照射する光学部材１０２の構成の一例を示す斜視図である。図３（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、試料設置位置へ検査光を照射している状態を示す光学部材１０２の斜視図、上面図、及び側面図である。
【図４】６方向の検査光を照射する場合（６方向立体折り返し）の例を示す図である。
【図５】８方向の検査光を照射する光学部材１０２の構成（８方向立体折り返し）の一例を示す図である。図５（ａ）は、８方向立体折り返しを行う光学部材１０２の構成の第１の例を示す図である。図５（ｂ）は、８方向立体折り返しを行う光学部材１０２の構成の第２の例を示す図である。
【図６】１２方向の検査光を照射する光学部材１０２の構成（１２方向立体折り返し）の一例を示す図である。図６（ａ）は、１２方向立体折り返しを行う光学部材１０２の全体の構成の一例を示す斜視図である。図６（ｂ）は、試料観察時の検査光の経路の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る観察装置１００の構成の一例を示す。図１（ａ）は、観察装置１００の構成の一例を示す。観察装置１００は、生物試料である試料２０の検査光に対する応答の観察に用いる装置である。また、本例において、試料２０は、例えば生物の細胞の試料である。この細胞は、例えば微生物中の細胞であってもよい。また、観察装置１００は、全反射照明蛍光顕微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy）である。全反射照明蛍光顕微鏡とは、例えば、全反射面上の所定位置へ検査光を照射することで生じるエバネッセント光を利用して、試料２０に対する蛍光観察を行うための顕微鏡である。また、試料２０に対する蛍光観察とは、例えば、試料２０に蛍光物質を導入するか、蛍光性蛋白を発現させることにより、試料２０における分子や構造を光る画像としてとらえる観察である。また、本例において、観察装置１００は、光学部材１０２、光源部１０４、拡大光学系１０６、及び撮像部１０８を備える。
【００２６】
尚、図中に示すように、本例において、試料２０は、光学部材１０２上の所定位置の上に置かれる。以下の説明においては、この所定位置のことを、試料設置位置という。本例において、この試料設置位置は、試料２０が載る領域中の一点であり、光学部材１０２において試料２０を載せる面において、検査光が照射される位置になる。
【００２７】
光学部材１０２は、試料設置位置へ照射する検査光の向きを設定する透光性の部材である。本例において、光学部材１０２は、特殊形状のプリズムであり、光源部１０４から入射する光の向き（光路）をその内部で変更することにより、矢印４０４及び矢印４０６で示すように、複数の方向の検査光を試料設置位置へ照射する。尚、光学部材１０２の光学特性については、後に更に詳しく説明する。
【００２８】
光源部１０４は、試料設置位置へ照射する光の光源である。光源部１０４は、全反射照明蛍光顕微鏡において用いられる公知の光源と同一又は同様の光源であってよい。本例において、光源部１０４は、レーザー光源であり、発生したレーザー光を、光学部材１０２へ向けて照射する。これにより、光学部材１０２は、光源部１０４が発生する検査光を試料２０へ向けて照射する。
【００２９】
拡大光学系１０６は、試料設置位置に置かれた試料２０の像を拡大する光学系である。本例において、拡大光学系１０６は、顕微鏡であり、対物レンズの焦点を試料２０に合わせて設置される。また、拡大光学系１０６の接眼レンズ側には、撮像部１０８が取り付けられている。撮像部１０８は、例えばＣＣＤ素子等の撮像素子であり、拡大光学系１０６により拡大された試料設置位置近傍の像を撮像する。撮像部１０８は、撮像した画像を、例えばコンピュータ等の画像処理装置へ送ってもよい。
【００３０】
このように構成すれば、例えば、試料設置位置へ向けて、検査光を適切に照射できる。また、これにより、例えば、試料２０の位置にエバネッセント光を生じさせ、試料２０に対する蛍光観察を適切に行うことができる。また、本例においては、更に、１つの光源部１０４から照射された検査光を光学部材１０２の内部で光路を変更させることで、試料設置位置へ向けて複数の方向の検査光を照射する構成を備える。これにより、検査光の照射強度が生物試料に悪影響を与えない程度の高さに抑制しても、複数の検査光が１点に集中する試料設置位置から発生するエバネッセント光の光強度は大幅に増強される。また、検査光の方向が観察結果に影響することを適切に防ぐことができる。これらにより、試料２０に含まれる蛍光物質等による励起光を、より適切に発生させることができる。そのため、本例によれば、例えば、試料２０に対する蛍光観察をより高い精度でより適切に行うことができる。
【００３１】
続いて、光学部材１０２の光学特性について更に詳しく説明する。図１（ｂ）は、光学部材１０２の詳細な構成の一例を示す図であり、試料設置位置へ検査光を照射している状態での検査光の経路と共に、光学部材１０２の側断面図を示す。この側断面図は、光学部材１０２において試料２０が置かれる面である面２０２と垂直、かつ、検査光の光路と平行な平面による光学部材１０２の断面である。
【００３２】
本例において、光学部材１０２は、モノリシックなプリズムであり、例えばガラスで形成されている。また、光学部材１０２の表面は、断面図において示した面２０２〜２１２と、断面図の手前側及び奥側の面とで構成されている。これらの面は、全て平面である。
【００３３】
面２０２は、試料観察時に試料２０が置かれる平面である。また、本例において、面２０２は、入射角が臨界角以上の場合に検査光を全反射する全反射面である。面２０２には、所定の試料設置位置が予め設定されており、その上に試料２０を保持する。これにより、試料観察時において、試料２０は、面２０２における試料設置位置で光学部材１０２と接触した状態で、光学部材１０２上に置かれる。尚、図示した場合においては、位置３０６が、試料設置位置となる。
【００３４】
面２０４は、面２０２と平行、かつ、面２０２と対向する平面である。本例において、面２０４は、対向全反射面の一例であり、面２０２と対向する位置で検査光を全反射する。面２０６は、光源部１０４と対向する位置において面２０２及び面２０４と交差する平面であり、光学部材１０２の外部において光源部１０４が照射する検査光を、光学部材１０２の内部へ導入する。
【００３５】
面２０８は、面２０６と対向し、かつ面２０２及び面２０４と交差する平面である。本例において、面２０８は、面２０２及び面２０４に対して傾斜しており、光学部材１０２内での検査光の経路において面２０２の側から入射する検査光を面２０４へ向けて反射することにより、その後の検査光の方向を規定する。面２１０は、面２０４と対向し、かつ面２０２及び面２０４に対して傾斜する位置に設けられた平面であり、面２０６から入射した検査光を面２０４へ向けて反射する。面２１２は、面２１０と面２０２とをつなぐ平面である。
【００３６】
ここで、本例での試料観察時において、光学部材１０２は、大気中に置かれる。また、光学部材１０２の各面は、光学部材１０２の内部で以下のように検査光を反射するよう、光学設計されている。このような光学部材１０２を用いることにより、試料観察時における検査光の経路は、以下の通りになる。
【００３７】
先ず、光源部１０４は、矢印４０２に示すように、光学部材１０２の外部において面２０２と平行な方向へ進む検査光を発生する。そして、面２０６は、その検査光を、位置３０２から光学部材１０２の内部に導入する。また、光学部材１０２の内部に導入された検査光は、面２１０へ到達する。
【００３８】
そして、面２１０は、面２０６から導入された検査光を面２０４へ向けて反射する。また、面２０４は、面２１０から到達する検査光を、位置３０４において、面２０２における試料設置位置である位置３０６へ向けて、矢印４０４により示す第１の方向へ反射する。この第１の方向は、位置３０６で検査光が全反射される方向である。すなわち、試料観察時において、光学部材１０２は、面２０４で検査光を全反射することにより、先ず、第１の方向の検査光を、位置３０６へ照射する。
【００３９】
また、位置３０６で全反射された検査光は、面２０４の位置３０８へ向かう。そして、位置３０８でも全反射され、再度、面２０２の位置３１０へ向かう。また、検査光は、位置３１０でも全反射される。そして、本例において、位置３１０で全反射された検査光は、面２０４へ到達する前に、面２０２の位置３１２へ到達する。また、面２０８は、位置３１２において検査光を反射する。そして、位置３１２で反射された検査光は、面２０４の位置３１４へ到達する。
【００４０】
また、面２０４は、面２０８から到達する検査光を、位置３１４において、位置３０６へ向けて、矢印４０６により示す第２の方向へ反射する。この第２の方向は、第１の方向とは異なる方向であり、かつ位置３０６で全反射される方向である。すなわち、試料観察時において、光学部材１０２は、第１の方向で照射されて位置３０６で全反射された検査光について、その後に面２０４で全反射することにより、第２の方向の検査光を更に位置３０６へ照射する。
【００４１】
また、本例において、第２の方向の検査光は、位置３０６で再度全反射され、面２０４の位置３１６へ向かう。また、位置３１６でも全反射され、面２０６の所定の位置から光学部材１０２の外部へ出射する。
【００４２】
このように、本例において、光学部材１０２は、位置３０４で全反射された検査光、及び位置３１４で全反射された検査光が、共に位置３０６へ向かうように光学設計されている。そのため、本例において、試料設置位置である位置３０６は、異なる方向から照射された複数の検査光が重なる光集中点となる。この光集中点は、例えば全反射照明蛍光顕微鏡の観察精度に応じた精度で複数方向の検査光が集中する点であってよい。
【００４３】
本例によれば、例えば、面２０２上の試料設置位置へ向けて、複数の方向の検査光を適切に照射できる。このため、検査光の照射強度が生物試料に悪影響を与えない程度の高さに抑制しても、複数の検査光が１点に集中する試料設置位置から発生するエバネッセント光の光強度は大幅に増強される。また、検査光の方向が観察結果に影響することを適切に防ぐことができる。これらにより、生物試料の観察を高い精度で適切に行うことができる。
【００４４】
尚、光学部材１０２のより具体的な形状については、例えば以下のようにすることができる。例えば、図１（ｂ）に示した断面形状における各辺の長さについて、Ｌ１、Ｌ２＝２５〜３５ｍｍ程度（但し、Ｌ２＞Ｌ１）とすることができる。また、Ｌ３＝５〜８ｍｍ程度、Ｌ４＝０．５〜２ｍｍ程度、Ｌ５＝２０〜２５ｍｍ程度とすることができる。また、Ｄ１＝４〜８ｍｍ程度とすることができる。また、各頂点の角度について、ａ、ｂ＝９１〜９５°程度、ｃ＝５０〜８０程度、ｄ＝７０〜１２０°程度、ｅ＝９０〜１３０°程度、ｆ＝７０〜９０°程度とすることができる。また、光学部材１０２の幅（断面図の奥側の面と手前側の面との距離）は、検査光のビーム径及び生物試料の直径よりも大きければよく、例えば、５〜２０ｍｍ程度とすることができる。
【００４５】
ここで、単に検査光の方向を設定するという観点で考えた場合、本例のようにモノリシックな光学部材１０２を用いるのではなく、例えば複数のプリズムを用いる構成や、プリズムと鏡とを組み合わせた構成等の、複数の光学部材を用いる構成を採用することも考えられる。しかし、その場合、複数の光学部材間の精密な位置合わせ等が必要になるため、試料観察時の工数が増加することとなる。また、光学部材間の位置のずれにより、試料観察の精度が低下するおそれもある。そのため、実用上、本例のように、モノリシックな単独の光学部材１０２を用いることが好ましい。
【００４６】
また、光学部材１０２の内部で検査光を反射する各面について、検査光を反射可能とする簡単な方法としては、その反射面の表面を鏡面状態とし、かつその表面を露出状態とし、反射面で検査光を全反射させる方法がある。この方法を適用する場合、反射面に接する光学部材１０２の外側の媒体（空気等）の屈折率と、光学部材１０２を構成する物質の屈折率との間の差を大きくすることが望まれる。この屈折率差が大きくなるほど、反射面で検査光を全反射させることが可能な検査光の反射面に対する入射角度の限界値である臨界角が小さくなるためである。
【００４７】
このような反射面が全反射によって検査光を反射させる構成とする場合においては、光学部材１０２は、検査光の透過率が高く、屈折率がある程度の高さがあり、透過率や屈折率の均一性が高いという条件を満たすのであれば、いずれの材料も適用可能である。合成石英ガラスは、検査光に対する透過率が非常に高く、屈折率も比較的高く、屈折率の均一性も高めることができ、更にこれらの条件を満たしつつ、コストも比較的低いため、好ましい。また、例えばサファイア、キュービック・ジルコニア、ダイヤモンド等の、より屈折率の高い材料で透光性材料を形成することもできる。この場合、検査光が全反射する臨界角がより小さくなるため、例えば、光学部材１０２の設計の自由度をより高めることができる。
【００４８】
また、上記の方法以外に反射面で検査光を反射可能とする方法としては、例えば試料２０を設置する面２０２以外の面（例えば、面２０４、面２０８、及び面２１０の少なくともいずれか）について、その反射面の表面を鏡面状態とし、かつその表面に誘電体膜等の反射膜をコーティングする方法がある。この場合、全反射させる場合に比べると反射面での検査光の反射率は多少下がる。しかし、反射面で検査光を反射させることが可能な臨界角を考慮する必要が実質的になくなり、光学部材１０２の光学設計の自由度は大幅に高まるという利点がある。反射面の表面にコーティングする反射膜は、検査光の波長において高い反射率で反射可能な構成であれば、特に制限はされない。反射面に検査光に対する反射率をより高めるという観点では、低屈折率材料（低誘電体）の層と高屈折率材料（高誘電体）の層が交互に積層した構造の多層反射膜を反射膜の表面にコーティングすることが好ましい。
【００４９】
このような反射面の表面に反射膜を設けることによって検査光を反射させる構成とする場合においては、光学部材１０２は、検査光の透過率が高く、透過率の均一性が高いという条件を満たすのであれば、いずれの材料も適用可能である。この構成の場合、光学部材１０２を構成する材料として、前記に列挙した合成石英ガラス等の材料のほか、ソーダライムガラスやアルミのシリケートガラス等のガラス材料や、検査光に対する透過率が高い樹脂材料も適用可能となる。
【００５０】
また、本例において、生物試料である試料２０は、例えば、水に含まれた状態で光学部材１０２上に設置されてもよい。この場合、試料設置位置において検査光が全反射する界面は、光学部材１０２の材料と、試料２０を含む水との界面となる。そのため、光学部材１０２の光学設計は、水等との界面で全反射が起こる条件を考慮して行うことが好ましい。
【００５１】
また、本例においては、上記のように、光学部材１０２の上に直接試料２０を設置している。しかし、本発明の変形例においては、例えば、全反射面となる面を有する別の部材を更に用い、その部材の全反射面上に試料２０を設置してもよい。このような別の部材としては、例えばスライドガラスやカバーガラス等を用いることが考えられる。
【００５２】
この場合、スライドガラス等と、光学部材１０２とは、例えば、水（純水）よりも屈折率が高い液体によりその間を液浸とすることにより、光学的に接続される。また、光学部材１０２は、液浸部分及びスライドガラス等における検査光の経路を考慮して、光学設計がされる。より具体的には、例えば、図１（ｂ）に示した光学部材１０２の構成において、試料設置位置である位置３０６を含む一部をスライドガラス等に置き換え、光学部材１０２の他の部分との間を液浸とすること等が考えられる。このように構成した場合も、全反射面上の試料設置位置へ向けて、複数の方向の検査光を適切に照射できる。また、これにより、例えば、検査光の方向が観察結果に影響することを適切に防ぎ、生物試料の観察を高い精度で適切に行うことができる。
【００５３】
続いて、光学部材１０２の構成の更なる他の例について説明する。図２は、光学部材１０２の構成の他の例を示す。尚、図２以降の図面において、図１と同じ符号を付した構成は、以下に説明する点を除き、図１の構成と同一又は同様の特徴を有してよい。
【００５４】
図２（ａ）は、面２０２と面２０４とが非平行である場合の光学部材１０２の構成の例を示す図であり、試料観察時の検査光の経路と共に、光学部材１０２の側断面図を示す。図２（ｂ）は、図２（ａ）に示した光学部材１０２の斜視図である。
【００５５】
図から分かるように、面２０２と面２０４とが非平行である場合も、各面の傾きや、面間の距離等を適宜調整することにより、光学部材１０２の全反射面における所定の位置３０６を、光集中点にできる。そのため、この位置３０６を試料設置位置とすることで、図１を用いて説明をした光学部材１０２の場合と同様に、全反射面上の試料設置位置へ向けて、複数の方向の検査光を適切に照射できる。このため、検査光の照射強度が生物試料に悪影響を与えない程度の高さに抑制しても、複数の検査光が１点に集中する試料設置位置から発生するエバネッセント光の光強度は大幅に増強される。また、これにより、例えば、検査光の方向が観察結果に影響することを適切に防ぎ、生物試料の観察を高い精度で適切に行うことができる。
【００５６】
また、例えば面２０２と面２０４とが平行である場合においても、図１を用いて説明をした光学部材１０２と異なる構成の光学部材１０２を用いることもできる。図２（ｃ）は、面２０２と面２０４とが平行である場合の光学部材１０２の構成の他の例を示す図であり、試料観察時の検査光の経路と共に、光学部材１０２の側断面図を示す。図２（ｄ）は、図２（ｃ）に示した光学部材１０２の斜視図である。図から分かるように、この場合も、各面の傾きや、面間の距離等を適宜調整することにより、光学部材１０２の全反射面における所定の位置３０６を、光集中点にできる。そのため、この位置３０６を試料設置位置とすることで、全反射面上の試料設置位置へ向けて、複数の方向の検査光を適切に照射できる。
【００５７】
尚、各面の傾きや、面間の距離等を適宜調整すれば、上記以外の構成でも、光学部材１０２の全反射面における所定の位置を光集中点にできる。また、面２０２、面２０４以外の面上に光集中点を設定することも考えられる。これらの場合も、光集中点となる位置を試料設置位置とすることで、全反射面上の試料設置位置へ向けて、複数の方向の検査光を適切に照射できる。
【００５８】
また、図１及び図２においては、試料観察時の検査光の照射について、第１の方向及び第２の方向の２つの方向の検査光を照射する場合について説明した。しかし、試料観察時においては、３以上の方向の検査光を照射してもよい。このようにすれば、例えば、複数の検査光が１点に集中する試料設置位置から発生するエバネッセント光の光強度をより増強させることができる。また、検査光の方向が観察結果に影響することをより適切に防ぐことができる。これらにより、生物試料の観察を高い精度でより適切に行うことができる。そこで、以下、３以上の方向の検査光を照射する場合の例について説明する。
【００５９】
３方向以上の多方向の検査光を試料設置位置へ照射する場合、光学部材１０２は、例えば、第２の方向で試料設置位置に照射し、試料設置位置で全反射された検査光について、光学部材１０２内において、第１の方向、及び第２の方法のいずれとも異なる方向であり、かつ試料設置位置で全反射される方向である第３の方向になるように全反射することにより、検査光を第３の方向で更に試料設置位置に照射する。また、より具体的に、この場合、光学部材１０２は、例えば、第１方向設定部と、第１〜第ｍ（ｍは２以上の整数）の検査光反射部を備える。第１方向設定部は、第１の方向の検査光の方向を規定するための構成である。また、第１〜第ｍの検査光反射部は、第２〜第ｍ＋１の方向の検査光の方向を規定するための構成である。
【００６０】
尚、第１の方向の検査光の方向を規定するとは、例えば、光学部材１０２内で検査光が最初に試料設置位置へ向かう場合の検査光の向きが第１の方向になるように、予め設定された方向へ検査光を反射することである。また、第２〜第ｍ＋１の方向の検査光の方向を規定するとは、例えば、光学部材１０２内で検査光が第２〜第ｍ＋１回目に試料設置位置へ向かう場合の検査光の向きが第２〜第ｍ＋１の方向になるように、予め設定された方向へ検査光を反射することである。
【００６１】
そして、この構成により、試料観察時において、光学部材１０２は、先ず、外部から導入した検査光を第１方向設定部で反射することにより、第１の方向の検査光の方向を規定する。また、光学部材１０２は、第ｋ（ｋは、１以上、ｍ以下の整数）の方向で照射し、試料設置位置で全反射された検査光について、第ｋの検査光反射部で検査光を反射することにより、第ｋ＋１の方向の検査光の方向を規定する。この第ｋ＋１の方向は、試料設置位置で全反射される方向であり、かつ第１から第ｋのいずれの方向とも異なる方向である。
【００６２】
このように構成すれば、例えば、複数（第１〜第ｍ＋１）の検査光が１点に集中する試料設置位置から発生するエバネッセント光の光強度をより増強させることができる。また、試料設置位置へ、より多くの方向の検査光を適切に照射できる。また、これにより、検査光の方向が観察結果に影響することをより適切に防ぐことができる。
【００６３】
続いて、３方向以上の多方向の検査光を試料設置位置へ照射する光学部材１０２の具体的な構成の例を示す。図３は、第１〜第４の４方向の検査光を試料設置位置へ照射する場合の光学部材１０２の構成（４方向立体折り返し）の例を示す。図３（ａ）は、４方向の検査光を照射する光学部材１０２の構成の一例を示す斜視図である。図３（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、試料設置位置へ検査光を照射している状態を示す光学部材１０２の斜視図、上面図、及び側面図である。この上面図は、試料設置位置側から光学部材１０２を見た図である。
【００６４】
本例において、光学部材１０２は、第１方向設定部１２０と、３つの検査光反射部１２２（第１〜第３の検査光反射部１２２）を備える。第１方向設定部１２０は、検査光導入面である面２０６、及び面２１０からなる部分である。試料観察時において、第１方向設定部１２０は、光学部材１０２の内部へ面２０６から導入される検査光を面２１０で反射することにより、検査光を面２０４へ向ける。また、面２０４は、この検査光を反射することにより、第１の方向の検査光を、面２０２において試料設置位置となる位置３０６へ照射する。これにより、第１方向設定部１２０は、第１の方向の検査光の方向を規定する。
【００６５】
３つの検査光反射部１２２のそれぞれは、試料設置位置へ照射する検査光の方向を設定する部分である。本例において、それぞれの検査光反射部１２２は、試料設置位置で全反射された後の検査光について、複数回の反射をすることにより、それぞれの検査光反射部１２２毎に予め設定されている方向へ検査光の方向を変える。
【００６６】
より具体的には、例えば、図３（ｃ）、（ｄ）に示したように、それぞれの検査光反射部１２２は、面２０４へ向けて、それぞれ異なる方向で検査光を反射する。また、それぞれの検査光反射部１２２が検査光を反射する方向は、その後に面２０４で反射され、位置３０６へ向かう方向に設定されている。これにより、第１〜第３の検査光反射部１２２は、第２〜第４の方向の検査光の方向を規定する。
【００６７】
以上のようにして、試料観察時において、光学部材１０２は、試料設置位置へ、それぞれ異なる第１〜第４の方向の検査光を照射する。本例によれば、例えば、試料設置位置へより多くの方向の検査光を適切に照射できる。
【００６８】
図４〜図６は、更に多くの方向の検査光を試料設置位置へ照射する場合の例を示す。図４は、６方向の検査光を照射する場合（６方向立体折り返し）の例を示す。
【００６９】
図４は、６方向立体折り返しを行う光学部材１０２の構成の一例を示す斜視図である。この構成において、光学部材１０２は、第１方向設定部１２０と、第１〜第５の検査光反射部１２２を備える。また、試料観察時において、光学部材１０２は、第１方向設定部１２０、及び第１〜第５の検査光反射部１２２等により、第１〜第６の方向の検査光を試料設置位置へ照射する。そのため、このような光学部材１０２を用いることにより、より高い精度でより適切に生物試料を観察できる。
【００７０】
また、更に多くの方向の検査光を試料設置位置へ照射することも考えられる。図５は、８方向の検査光を照射する光学部材１０２の構成（８方向立体折り返し）の一例を示す。図５（ａ）は、８方向立体折り返しを行う光学部材１０２の構成の第１の例を示す図であり、光学部材１０２の斜視図、試料観察時の検査光の経路、及び検査光反射部１２２のより詳細な構成の一例を示す。
【００７１】
図５（ａ）に示す構成において、光学部材１０２は、第１方向設定部１２０と、第１〜第７の検査光反射部１２２を備える。また、試料観察時において、第１方向設定部１２０、及び第１〜第７の検査光反射部１２２等により、第１〜第８の方向の検査光を試料設置位置へ照射する。そのため、このような光学部材１０２を用いることにより、より高い精度でより適切に生物試料を観察できる。
【００７２】
また、図５（ａ）に示す構成の場合、図中右側に示すように、第１〜第７の検査光反射部１２２のそれぞれは、２つの反射面４２２と、この２つの反射面４２２をつなぐ面４２４とで構成されている。そして、試料観察時において、それぞれの検査光反射部１２２は、この２つの反射面４２２で検査光を反射することにより、その後の検査光の方向を規定する。
【００７３】
このように構成すれば、例えば、より多くの反射面で検査光反射部１２２を構成する場合と比べ、光学部材１０２の加工が容易になる。また、これにより、例えば、高い精度の光学部材１０２をより適切に作成できる。
【００７４】
図５（ｂ）は、８方向立体折り返しを行う光学部材１０２の構成の第２の例を示す図であり、光学部材１０２の斜視図、試料観察時の検査光の経路、及び検査光反射部１２２のより詳細な構成の一例を示す。図５（ｂ）に示す光学部材１０２は、図５（ａ）に示す光学部材１０２と、検査光反射部１２２以外は同じ構成を有する。そのため、この場合も、より高い精度でより適切に生物試料を観察できる。
【００７５】
また、図５（ｂ）に示す構成の場合、図中右側に示すように、第１〜第７の検査光反射部１２２のそれぞれは、３つの反射面４２２で構成されている。そして、試料観察時において、それぞれの検査光反射部１２２は、この３つの反射面４２２で検査光を全反射することにより、その後の検査光の方向を規定する。
【００７６】
このように構成した場合、例えば２以下の反射面４２２により検査光の方向を変える場合と比べ、各反射面４２２への検査光の入射角度を大きくできる。また、その結果、反射面４２２で検査光が反射する条件を設定しやすくなる。これにより、例えば、全反射の臨界角度がより大きな材料、すなわち、屈折率がより小さい材料で光学部材１０２を形成することが可能になる。
【００７７】
尚、検査光反射部１２２について、２回の反射で検査光の向きを変える構成や、３回の反射で検査光の向きを変える構成とすることは、当然、８方向立体折り返しを行う場合以外の光学部材１０２における検査光反射部１２２にも適用できる。また、例えば図５（ａ）に示すように、検査光反射部１２２において２回の反射で検査光の向きを変える場合、３回の反射で検査光の向きを変える場合と比べ、反射面４２２への検査光の入射角度が小さくなる。そのため、この場合、全反射の臨界角度がより小さな材料、すなわち、屈折率がより大きい材料で光学部材１０２を形成することが好ましい。この場合、例えば、サファイア等によって光学部材１０２で形成することが好ましい。
【００７８】
また、３回の反射で検査光の向きを変える場合であっても、ガラス等よりもより屈折率の高い材料で光学部材１０２を形成することにより、例えば、光学部材１０２の光学設計の自由度を高めることができる。特に、４方向以上の検査光を試料設置位置に照射する場合には、屈折率の高い材料で光学部材１０２を形成することが好ましい。
【００７９】
図６は、１２方向の検査光を照射する光学部材１０２の構成（１２方向立体折り返し）の一例を示す。図６（ａ）は、１２方向立体折り返しを行う光学部材１０２の全体の構成の一例を示す斜視図である。図６（ｂ）は、試料観察時の検査光の経路の一例を示す図である。
【００８０】
図６に示す場合において、光学部材１０２は、第１方向設定部１２０と、第１〜第１１の検査光反射部１２２を備え、これらのそれぞれにおいて試料設置位置へ向けて検査光を反射することにより、その後の検査光の方向を規定する。また、これにより、光学部材１０２は、それぞれ異なる第１〜第１２の方向の検査光を試料設置位置へ照射する。このように構成すれば、例えば、試料設置位置へより多くの方向の検査光を適切に照射できる。また、これにより、より高い精度でより適切に生物試料を観察できる。
【００８１】
以上、本発明に関して実施形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施形態に記載の範囲には限定されない。上記実施形態に、多様な変更又は改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更又は改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、例えば、生物試料の観察装置に好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００８３】
２０・・・試料、１００・・・観察装置、１０２・・・光学部材、１０４・・・光源部、１０６・・・拡大光学系、１０８・・・撮像部、１２０・・・第１方向設定部、１２２・・・検査光反射部、２０２・・・面、２０４・・・面、２０６・・・面、２０８・・・面、２１０・・・面、２１２・・・面、３０２・・・位置、３０４・・・位置、３０６・・・位置、３０８・・・位置、３１０・・・位置、３１２・・・位置、３１４・・・位置、３１６・・・位置、４０２・・・矢印、４０４・・・矢印、４０６・・・矢印、４２２・・・反射面、４２４・・・面
【図１】
2014115592.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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