(57)【要約】      （修正有）【課題】オキシダーゼ活性と共にオキシゲナーゼ活性を有しているアミノ酸酸化酵素が特定のアミノ酸に対して特異的に作用するpH領域において、十分なオキシゲナーゼ活性を有する酵素を提供する。【解決手段】Aspergillus属に属する菌に由来の、下記の特徴を有するアミノアミド酸化酵素：（ア）4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドを酸化することができ；（イ）pH6.0において、最大時の少なくとも30％のアミノアミド酸化活性を発揮することができ；（ウ）ホモ二量体を形成することができ、二量体の分子質量が125〜135kDaである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Aspergillus属に属する菌に由来する、下記の特徴を有するアミノアミド酸化酵素：
（ア）4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドを酸化することができ；
（イ）pH6.0において、最大時の少なくとも30％のアミノアミド酸化活性を発揮することができ；
（ウ）ホモ二量体を形成することができ、二量体の分子質量が125〜160kDaである。
【請求項２】
Aspergillus属に属する菌に由来する、下記の特徴を有するアミノアミド酸化酵素：
（ア）4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドを酸化することができ；
（ウ）ホモ二量体を形成することができ、二量体の分子質量が125〜160kDaであり；
（エ）4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドのほか、n-ブチルアミンも酸化することができ、4-アミノブチルアミドを酸化する活性のn-ブチルアミンを酸化する活性に対する割合が、9%以上であるか、および／または4-アミノブチルアミドに対するKm値が、6.0以下である。
【請求項３】
Aspergillus carbonariusに属する菌由来である、請求項1または2に記載のアミノアミド酸化酵素。
【請求項４】
さらに下記のいずれかの特徴を有する、請求項1〜3のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素：
（エ）至適pHが、6.5〜8.0であるか、および／または
（オ）至適温度が、30℃〜50℃である。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか一に記載の酵素を含む、酵素剤。
【請求項６】
オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素、またはアミノ酸オキシゲナーゼの、オキシゲナーゼ反応生成物を酸化するために用いられる、請求項1〜5のいずれか一に記載の酵素の使用方法。
【請求項７】
アミノ酸の定量方法であって、
アミノ酸に、オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素、またはアミノ酸オキシゲナーゼを作用させ、対応するアミドを生成する工程；
生成したアミドに、請求項1〜4のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素を作用させ、反応生成物を生成する工程；および
反応生成物の少なくとも一種を定量する工程
を含み、得られた反応生成物の量に基づいてアミノ酸の量を決定する、アミノ酸の定量方法。
【請求項８】
アミノ酸の定量方法であって、
アミノ酸に、オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素を作用させ、過酸化水素および対応するアミドを生成する工程；
生成したアミドに、請求項1〜4のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成する工程；および
生成した過酸化水素を定量する工程
を含み、得られた過酸化水素の量に基づいてアミノ酸の量を決定する、アミノ酸の定量方法。
【請求項９】
オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素が、Pseudomonas属に属する菌由来のL-アミノ酸オキシダーゼである、請求項7に記載のアミノ酸の定量方法。
【請求項１０】
下記の試薬を含む、アミノ酸の定量用キット：
(K1)請求項1〜4のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素または請求項5に記載の酵素剤。
【請求項１１】
下記をさらに含む、請求項10に記載のキット：
(K2)Pseudomonas属に属する菌由来のL-アミノ酸オキシダーゼ、またはアミノ酸オキシゲナーゼ
【請求項１２】
(K2)としてPseudomonas属に属する菌由来のL-アミノ酸オキシダーゼを含み、下記をさらに含む、請求項11に記載のキット：
(K3)過酸化水素検出用試薬。
【請求項１３】
請求項1〜4のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項13に記載のポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された、形質転換菌。
【請求項１５】
請求項14に記載の形質転換菌を用いることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミド類を酸化する活性を有する、新規な酵素に関する。本発明の酵素は、アミノ酸酸化酵素と併用することにより、アミノ酸の定量のために用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、アミノ酸の定量法として酵素を用いる方法が多数知られている。酵素を用いる方法は、機器分析的手法と比べ安価で簡易的に行うことができるという利点がある。定量用酵素としては、例えば、デヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼが多く用いられる。オキシダーゼを用いる場合、アミノ酸にオキシダーゼを作用させることで生成される過酸化水素をペルオキシダーゼで検出し、定量する方法が挙げられる。この検出および定量には、比色法、蛍光法、電極法のいずれの方法も利用可能である。
【０００３】
本発明者らは、Pseudomonas sp. AIU 813由来のL-アミノ酸オキシダーゼは、中性付近ではL-リジン、L-オルニチン、L-アルギニンを酸化し、pH 6.5より酸性側ではL-リジンのみを酸化することを報告した（特許文献1および非特許文献1）。
【０００４】
一方、アミン酸化酵素（EC1.4.3.4またはEC1.4.3.6）は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミンなどの脂肪族アミン類やベンジルアミン等の芳香族アミン類から、酸化的にアミノ基を遊離してアルデヒド類と過酸化水素を生成する酵素として知られている。当該酵素は、動物、植物および微生物に広く分布しており、例えば、Aspergillus niger AKU 3302 に由来するものが知られている（非特許文献2および3）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2012-200217
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Isobe et al., 2012, J. Biosci. Bioeng., 114, 257-261
【非特許文献２】Hideaki Yamada, Osao, Adachi, Koichi, Ogata. Agric. Biol. Chem., 29, 117-123 (1965).
【非特許文献３】Ivo Freboort, Hisanori Tamaki, Hiroko Ishida, Pavel Pec, Lenka Luhova, Hiroko Tsuno, Martin Halata, Yasuhisa Asano, Yasuo Kato, Kazunobu Matsushita, Hirohide Toyama, Hidehiko Kumagai, Osao Adachi, Eur. J. Biochem., 237, 255-265 (1996).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Pseudomonas sp. AIU 813由来のL-アミノ酸オキシダーゼは、本発明者らの検討によると、オキシダーゼ活性と共に、オキシゲナーゼ活性を有していることが判明した。オキシゲナーゼ活性によってL-リジンやL-オルニチンが酸化されるとH2O2が生成されず、H2O2生成量でL-リジンやL-オルニチンを測定すると測定感度が低くなる。そこで、L-アミノ酸オキシダーゼのオキシゲナーゼ活性によってL-リジンから生成される5-アミノペンチルアミドやL-オルニチンから生成される4-アミノブチルアミドを酸化してH2O2を生成する酵素を探索し、L-リジンの測定感度を高める方法への応用を検討した。
【０００８】
本発明者らは、まず4-アミノブチルアミドの構造からAspergillus niger AKU 3302株由来のアミン酸化酵素の4-アミノブチルアミドに対するオキシダーゼ活性を調べた。その結果、この酵素が4-アミノブチルアミドを酸化することが明らかになった。しかし、酸性領域における4-アミノブチルアミドに対する反応性は非常に低く、酸性領域で低濃度のL-リジンを測定するためには不向きであった（実施例および図1）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、酸性領域で生育するカビから4-アミノブチルアミド酸化能の高い酵素を探索し、酸性領域でL-リジンの測定に利用できる酵素を選抜することにした。その結果、Aspergillus carbonariusに属する菌株に由来する酵素が、4-アミノブチルアミドに良く作用し、かつ酸性領域においても高い活性が発揮されることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本願は、以下を提供する：
[1]  Aspergillus属に属する菌に由来する、下記の特徴を有するアミノアミド酸化酵素：
（ア）4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドを酸化することができ；
（イ）pH6.0において、最大時の少なくとも30％のアミノアミド酸化活性を発揮することができ；
（ウ）ホモ二量体を形成することができ、二量体の分子質量が125〜135kDaである。
[2]  Aspergillus属に属する菌に由来する、下記の特徴を有するアミノアミド酸化酵素：
（ア）4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドを酸化することができ；
（ウ）ホモ二量体を形成することができ、二量体の分子質量が125〜160kDaであり；
（エ）4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドのほか、n-ブチルアミンも酸化することができ、4-アミノブチルアミドを酸化する活性のn-ブチルアミンを酸化する活性に対する割合が、9%以上であるか、および／または4-アミノブチルアミドに対するKm値が、6.0以下である。
[3]  Aspergillus carbonariusに属する菌由来である、[1]または[2]に記載のアミノアミド酸化酵素。
[4]  さらに下記のいずれかの特徴を有する、[1]〜[3]のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素：
（エ）至適pHが、6.5〜8.0であるか、および／または
（オ）至適温度が、30℃〜50℃である。
[5]  [1]〜[4]のいずれか一に記載の酵素を含む、酵素剤。
[6]  オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素、またはアミノ酸オキシゲナーゼの、オキシゲナーゼ反応生成物を酸化するために用いられる、[1]〜[5]のいずれか一に記載の酵素の使用方法。
[7]  アミノ酸の定量方法であって、
アミノ酸に、オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素、またはアミノ酸オキシゲナーゼを作用させ、対応するアミドを生成する工程；
生成したアミドに、[1]〜[4]のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素を作用させ、反応生成物を生成する工程；および
反応生成物の少なくとも一種を定量する工程
を含み、得られた反応生成物の量に基づいてアミノ酸の量を決定する、アミノ酸の定量方法。
[8]  アミノ酸の定量方法であって、
アミノ酸に、オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素を作用させ、過酸化水素および対応するアミドを生成する工程；
生成したアミドに、[1]〜[4]のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成する工程；および
生成した過酸化水素を定量する工程
を含み、得られた過酸化水素の量に基づいてアミノ酸の量を決定する、アミノ酸の定量方法。
[9]  オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素が、Pseudomonas属に属する菌由来のL-アミノ酸オキシダーゼである、[7]に記載のアミノ酸の定量方法。
[10]  下記の試薬を含む、アミノ酸の定量用キット：
(K1)[1]〜[4]のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素または[5]に記載の酵素剤。
[11]  下記をさらに含む、[10]に記載のキット：
(K2)Pseudomonas属に属する菌由来のL-アミノ酸オキシダーゼ、またはアミノ酸オキシゲナーゼ
[12](K2)としてPseudomonas属に属する菌由来のL-アミノ酸オキシダーゼを含み、下記をさらに含む、[11]に記載のキット：
(K3)過酸化水素検出用試薬。
[13]  [1]〜[4]のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
[14]  [13]に記載のポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換された、形質転換菌。
[15]  [14]に記載の形質転換菌を用いることを特徴とする、[1]〜[4]のいずれか一に記載のアミノアミド酸化酵素の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アミノ酸酸化酵素とA. niger AKU 3302由来アミン酸化酵素によるL-リジン測定に対するpHの影響
【図２】DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィー（粗酵素液）
【図３】Phenyl-Toyopearlカラムクロマトグラフィー（F-1分画）
【図４】Phenyl-Toyopearlカラムクロマトグラフィー（F-1以外の活性分画）
【図５】A. carbonarius AIU 205酵素の4-アミノブチルアミド酸化に対するpHの影響。●，F-1；○，F-2；▲，F-3
【図６】精製酵素の電気泳動。A, Native-PAGE; B, SDS-PAGE; C, 標準タンパク質
【図７】A. carbonarius AIU 205 F-1酵素の活性（●）と安定性（○）に対するpHの影響
【図８】A. carbonarius AIU 205 F-1酵素の4-アミノブチルアミド酸化活性に対する温度の影響
【図９】F-1画分酵素溶液の吸収スペクトル
【図１０】A. carbonarius AIU 205 F-1酵素を用いたL-リジンの測定。黒色，L-アミノ酸オキシダーゼ; 灰色, L-アミノ酸オキシダーゼ＋F-1酵素
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、数値範囲を「  〜  」で表すときは、特に記載した場合を除き、両端の値を含む。本発明で「アミノアミド酸化酵素」というときは、特に記載した場合を除き、アミド、特にL-アミノ酸に対応するアミドを、酸化する活性を有する酵素をいう。アミノアミド酸化活性を有する限り、他の活性、例えばアミン酸化活性を有していても、本発明でいうアミノアミド酸化酵素の範疇に含まれる。
【００１３】
[新規酵素]
本発明は、アミノアミド酸化酵素を提供する。本発明のアミノアミド酸化酵素の酵素学的性質を以下に説明する。
【００１４】
(1) 作用
本発明のアミノアミド酸化酵素は、4-アミノブチルアミド（4-アミノブタンアミドということもある。）および／または5-アミノペンチルアミドを酸化することができる。本発明において、ある酵素に関し、「4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドを酸化することができる」というときは、特に記載した場合を除き、4-アミノブチルアミドと5-アミノペンチルアミドとのいずれか一方、または双方を酸化できることを指す。本発明のアミノアミド酸化酵素が触媒する反応は、下記反応式で示すように、4-アミノブチルアミドが酸化的脱アミノ化反応で4-アミドブチルアルデヒドに酸化され、アンモニアと過酸化水素が生成する反応と推定される。また、5-アミノペンチルアミドは酸化的脱アミノ化反応で5-アミドペンチルアルデヒドに酸化され、アンモニアと過酸化水素が生成する反応と推定される。
【００１５】
【数１】
2014168406.tif 000002
【００１６】
(2) 至適反応pH、酸性領域での機能性、安定性
本発明の酵素は、pH5.5〜9.0、さらに特定するとpH6.0〜8.5で、4-アミノブチルアミドを酸化することができる。アミド酸化反応のために至適なpHは、6.5〜8.0、より特定するとpH6.8〜7.8である。Aspergillus carbonarius AIU 205の菌由来のアミノアミド酸化酵素に関しては、本明細書の実施例に示した条件では、最適pHは7.0付近である。
【００１７】
本発明のアミノアミド酸化酵素は、Pseudomonas sp. AIU 813由来のL-アミノ酸オキシダーゼ（前掲特許文献1および非特許文献1参照）およびその変異酵素がL-リジンに特異的に反応するpH領域のいずれかのpHにおいて、より特定するとpH5.5〜6.5の領域のいずれかのpHにおいて、例えばpH6.0において、目的のアミノアミド酸化活性を、最大時の少なくとも30％、好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上発揮することができる。なお、対象酵素のある条件（pH条件、温度条件）におけるアミノアミド酸化活性が最大時の活性の何％に相当するかは、その条件下で4-アミノブチルアミドと対象酵素を反応させ、過酸化水素生成速度等から求めた酵素活性と、至適条件において得られる酵素活性とに基づいて、求めることができる。より具体的には、pH 6.0における活性が最大時の活性の何％に相当するかは、pH 6.0における反応速度を、最適pH（典型的にはpH7.0）である以外は同じ条件で測定した反応速度（最大速度）で除することにより、求めることができる。
【００１８】
また、ある処理を施した後に残存するアミノアミド酸化活性がどの程度であるかは、処理前の酵素活性と、処理後の酵素活性（処理の有無以外は、同じ条件で測定する。）とに基づいて、求めることができる。より具体的には、pH 5.0で40℃、30分加温処理した酵素の残存活性は、処理後酵素について求めた反応速度を、同じ条件で測定した未処理の酵素の反応速度で除することにより、求めることができる。
【００１９】
また、本発明の酵素は、弱酸性から弱アルカリ性領域、より特定するとpH5.5〜9.0、さらに特定するとpH6.0〜8.5で安定である。あるpHにおいて安定であるとは、酵素をそのpHで40℃、30分間加温したときに、アミノアミド酸化活性を、最大時の少なくとも50％、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上維持されていることをいう。
【００２０】
(3) 分子質量
本発明の酵素の分子質量は、TSKgel G3000SWXLを用いたゲルろ過で125〜160kDa、より特定すると約130〜145 kDa、SDS-PAGEでは66〜76kDa、より特定すると約71 kDaと算出される。本発明の酵素は、同一のサブユニットの二量体で存在していると推定される。
【００２１】
(4) 至適反応温度
本発明の酵素は、至適pHにおいては、20〜55℃で、最大時の20％以上の活性を発揮しうる。より特定すると、30〜55℃で、最大時の40％以上の活性を発揮しうる。さらに特定すると、40〜50℃で、最大時の80％以上の活性を発揮しうる。さらに特定すると、43〜47℃で、最大時の90％以上の活性を発揮しうる。
【００２２】
(5) 基質特異性、反応動力学定数
本発明の酵素は、pH 7.0, 30℃では、3-アミノプロピオンアミド、4-アミノブタンアミドを含むアミド類、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミンを含む脂肪族短鎖モノアミン類を基質として酸化しうる。本発明者らの検討によると、長鎖のほうが反応効率が高くなりうる（表4）。またアミン類への反応性から、5-アミノペンチルアミドも基質とすると予想される。本発明者らの検討によると、実施例の項に示した実験条件では、本発明の酵素はジアミン類およびL-リジンやL-オルニチンなどのアミノ酸類には作用しない。
【００２３】
本発明のアミノアミド酸化酵素は、4-アミノブチルアミドおよび／または5-アミノペンチルアミドのほか、n-ブチルアミンも酸化しうるが、本発明の酵素の4-アミノブチルアミドを酸化する活性のn-ブチルアミンを酸化する活性に対する割合（「アミド/アミン」と表すことがある。）は、9%以上である。より特定すると11％以上であり、さらに特定すると17％以上であり、さらに特定すると30％以上である。なお、アミド/アミン（％）を計算する際は、4-アミノブチルアミドを酸化する活性およびn-ブチルアミンを酸化する活性は、同じ方法で求めたものであればよく、例えば、細胞重量当たりの酵素単位（mU/g・cell weight）で表したものであってもよい。
【００２４】
本発明の酵素は、4-アミノブチルアミドに高い親和性を有している。本発明の酵素の4-アミノブチルアミドに対するKm値（mM）は、0.15〜6.0である。より特定すると0.20〜5.2、さらに特定すると0.25〜4.7、さらに特定すると0.27〜0.99である。なお、本発明者らの検討によると、Aspergillus niger AKU 3302 に由来する2種類のアミン酸化酵素の4-アミノブチルアミドに対するKm値は、15.0または6.1であり、A. carbonariusのF-1画分酵素の4-アミノブチルアミドに対するKm値は、このアミン酸化酵素のそれより小さかった（表3参照）。A. carbonariusのF-1画分酵素は低濃度のアミド類に対して、よりよく作用しうることが期待できる。
【００２５】
本発明の酵素の一つであるA. carbonarius AIU 205由来のF-1画分酵素（実施例参照）の4-アミノブチルアミドに対するKm値、Vmax値（μmol/min/mg protein）は、それぞれ0.26および1.63である。
【００２６】
(6) 阻害剤、金属イオン等の影響
本発明の酵素は、1.0 mMの、Hydroxylamine、Hydrazine、Phenylhydrazine、Semicarbazide、o-Phenanthroline、α,α'-Dipyridyl、8-Hydroxyquinoline、EDTA、NaN3、N-Ethylmaleimide、Monoiodoaceticacid、KCN、IsoniazidまたはIproniazidにより、4-アミノブタンアミド酸化活性を阻害されうる。特にSemicarbazide、IsoniazidおよびIproniazidにより阻害が見られたことから、銅含有酵素であることが示唆される。また、本発明の酵素は、1.0 mMの、MgCl2、NiCl2、CoCl2、MnCl2、CuCl2、ZnCl2、FeCl2、FeCl3により、4-アミノブタンアミド酸化活性を阻害されうる。さらに、本発明の酵素は、吸収スペクトル（図9）からフラビン酵素ではないことが示唆される。
【００２７】
本発明はまた、n-ブチルアミンを窒素源とする培地で培養した後、下記の工程により得られ、二量体の分子質量が125〜160kDaである、アミノアミド酸化酵素を提供する：
Aspergillus属に属する菌の菌体を水性溶媒中で破砕して上清画分を得て；
得られた上清画分をpH6.0〜8.0でイオン交換体に供して目的酵素を吸着させ；そして
目的酵素が吸着したイオン交換体を塩濃度勾配に供して目的酵素を溶出させる。
【００２８】
［酵素の製造］
本発明の酵素は、Aspergillus属、好ましくは、Aspergillus carbonariusに属する菌の培養物（菌体、培養上清等）から精製することができる。本発明者らの検討によると、Aspergillus carbonariusの複数の菌株から所定の手順で精製して得られた酵素は、概して4-アミノブチルアミドを酸化する活性のn-ブチルアミンを酸化する活性に対する割合（アミド/アミン）が高く、また4-アミノブチルアミドに対するKm値が低かった。そのため、Aspergillus carbonariusに属するものであれば種々の菌株が、本発明の酵素の製造において有効に用いうるものであると期待できる。Aspergillus carbonariusに属する菌株であって、入手可能なものは、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構（〒292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8、TEL：0438-20-5763、FAX：0438-52-2329）の、IFM 47662、IFM 48055、IFM 48077、IFM 49644、IFM 52169、IFM 55790、IFM 55918、IFM 55999、IFM 57331、IFM 57334、IFM 57345、IFM 57346、IFM 57348、IFM 57618、IFM 57620、IFM 57621、IFM 57622、IFM 57644、IFM 57645、IFM 57651、IF M57653、JCM 12713、JCM 1859、JCM 22225、JCM 22242、NBRC 4030、NBRC 4038、NBRC 4039、NBRC 5864を挙げることができる。本発明の酵素の製造において、特に好ましい菌株の例は、Aspergillus carbonarius AIU 205である。
【００２９】
本発明の酵素は、詳細には、以下の手順で精製することができる。
(1) 菌体を適切な緩衝液（例えば15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0）に懸濁し、細胞を破砕した後、上清画分を、例えば遠心分離により集める。
(2) この上清画分を、あらかじめ適切な緩衝液（例えば、15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0）で平衡化したイオン交換体（より特定すると弱陰イオン交換体、例えばDEAE-Toyopearlカラム）に供して、目的の酵素を吸着させる。必要に応じ、洗浄操作を行って、未吸着タンパク質を除去する。
(3) イオン交換体に吸着した目的の酵素を、直線濃度勾配法で溶出して、目的の酵素を含む活性画分を集める。濃度勾配は、例えば15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0と0.09 M NaCl含有15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0を用いて、調製することができる。
(4) 所望により、得られた活性画分はさらに、塩濃度を調製（例えば、硫安を0.75 M まで添加）した後、あらかじめ適切な緩衝液（例えば、0.75 M硫安含有10 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0）で平衡化した吸着体（タンパク質、それらのアイソフォームの分離および凝集物の除去のために使用される、中間精製工程および最終精製工程のために使用されるもの、例えば疎水性を有している吸着体、より具体的な例は、Phenyl-Toyopearlカラム）に供して、目的のタンパク質を吸着させる。必要に応じ、洗浄操作を行って、未吸着タンパク質を除去する。
(5) 交換体に吸着した目的の酵素を、直線濃度勾配法溶出して、目的の酵素を含む活性画分を集める。濃度勾配は、例えば0.75 M硫安含有10 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0と10 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0を用いて調製することができる。
(6) 所望により、得られた活性画分をさらに、必要に応じ濃縮した後、あらかじめ適切な緩衝液（例えば、50 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0）で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーカラム（例えば、分子量1,000〜700,000のタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー用のメタクリレート系充てん剤を充てんしたもの、より具体的な例は、Toyopearl HW-55カラム）に供して、目的外のタンパク質を除去する。
【００３０】
本発明の酵素の製造方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドを用いた形質転換体により、産生させることもできる。特定の宿主を用いる場合に適した形質転換の方法は、当業者にはよく知られている。
【００３１】
[酵素の利用]
本発明の酵素は、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、酸化防止剤、希釈剤等の酵素以外の成分を加えて、酵素剤（酵素およびそれ以外の成分を含む組成物）とすることができる。
【００３２】
本発明の酵素はまた、アミノ酸酸化酵素のオキシゲナーゼ活性による反応生成物、またはアミノ酸オキシゲナーゼの反応生成物を酸化するために用いることができる。そのため、以下の工程を含む、アミノ酸の定量方法において利用することができる。
(1) アミノ酸に、オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素、またはアミノ酸オキシゲナーゼを作用させ、対応するアミドを生成する工程；
(2) 生成したアミドに、本発明のアミノアミド酸化酵素を作用させ、反応生成物を生成する工程；および
(3) 反応生成物の少なくとも一種を定量する工程
この方法においては、得られた反応生成物の少なくとも一種に基づいてアミノ酸の量を決定することができる。
【００３３】
オキシゲナーゼ活性を有する酸化酵素を用いる態様は、以下の工程を含む、アミノ酸の定量方法とすることもできる。
(1) アミノ酸に、オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素を作用させ、過酸化水素および対応するアミドを生成する工程；
(2) 生成したアミドに、本発明のアミノアミド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成する工程；および
(3) 生成した過酸化水素を定量する工程。
この方法においては、得られた過酸化水素の量に基づいてアミノ酸の量を決定することができる。
【００３４】
同時に使用されるオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸酸化酵素の例は、前掲特許文献1に開示された酵素（以下、「特許文献1のアミノ酸酸化酵素」ということがある。）である。具体的には、Pseudomonas sp. AIU 813由来のL-アミノ酸オキシダーゼ（前掲特許文献1および非特許文献1参照）およびその変異酵素であり、下記の(1)〜(3)のいずれかのアミノ酸配列からなるものである。
(1) 特許文献1の配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列；
(2) 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1または複数個（例えば、1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜7個、さらに好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列；または
(3) 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有し、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
但し、前記L-アミノ酸オキシダーゼ活性は、酸素および水の存在下、pH 7.0-8.5においてL-リジン、L-オルニチンおよびL-アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成し、かつpH 5.5-6.5においてはL-リジンに対しては上記作用を示すが、L-オルニチンおよびL-アルギニンに対しては上記作用を示さないことを意味する。
【００３５】
この酵素のL-リジンに対する反応は、下記のように表すことができる。
【００３６】
【数２】
2014168406.tif 000003
【００３７】
なお、配列表には、配列番号1としてPseudomonas sp. AIU 813由来のL-アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列を、また配列番号2として、そのヌクレオチド配列を記載した。また、アミノ酸配列に関して同一性とは、特に記載した場合を除き、アミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）、Altschul et al．，J．Mol．Biol．215（1990）403−410に記載されるNBLASTおよびXBLASTにより算出することができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。典型的には、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したアミノ酸の個数の百分率を計算してもよく、この場合は、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×100で算出できる。また当業者は、前掲特許文献1または非特許文献1に基づいて、上記の酵素を製造および使用することができる。
【００３８】
上述のアミノ酸酸化酵素はpH 6.5よりも酸性側ではL-リジンのみ酸化し、L-オルニチンとL-アルギニンを酸化しないことが明らかになっている一方で、副反応としてアミノ酸をオキシゲナーゼ反応により対応するアミドに変換する。一方、本願発明のアミノアミド酸化酵素は、そのような酸性領域でも有効にアミドを酸化することができるので、本発明のアミノ酸の定量方法は、特許文献1のアミノ酸酸化酵素を用いることにより、酸性pHにおいてL-リジンを選択的かつ有効に定量することができる系として実施できる。これらの2つの酵素を組み合わせた本発明のL-リジンの定量方法は、特許文献1のアミノ酸酸化酵素のみを用いる定量方法に比較して、少なくとも約2倍の感度を有する（換言すれば、特許文献１のアミノ酸酸化酵素のみを用いる定量方法の測定限界値の、約1/2の量であっても定量しうる。）ことが期待できる。すなわち、本発明のアミノ酸定量方法は、選択的かつ高感度な定量方法として実施できる。
【００３９】
他方、同時に使用されるアミノ酸オキシゲナーゼの例は、L-リジンモノオキシゲナーゼ（Journal of Biological Chemistry,1974, vol. 249, p.2587-2592, M.I.S.Flashner and V.Massey: Journal of Biological Chemistry,1972, vol.247, p.3434-3438, S.Yamamoto, T.Nakazawa and O.Hayaishi）である。
【００４０】
L-リジンの定量方法として実施される場合、本発明のアミノアミド酸化酵素の濃度は、5 mU/ml（4-アミノブタンアミド1μmolを1分間で消費する活性を1 Uとする。）以上とすることが適当である。上限は、実用的には、例えば2 U/ml・反応液以下とすることができる。特許文献１のアミノ酸酸化酵素の濃度は、10 mU/ml（L-リジン1μmolを1分間で消費する活性を1 Uとする。）以上とすることが適当であり、上限は、実用的には、例えば2 U/ml・反応液以下とすることができる。基質となるL-リジンの濃度は、水や緩衝液を混合することにより適宜調製できる。例えば、0.001〜0.5 mMであれば、十分に本願発明の方法により、定量することができると考えられる。
【００４１】
L-リジンの定量は、反応液を酸素の存在下に、所望により加温して、所定時間放置することにより実施できる。特許文献1のアミノ酸酸化酵素は、L-リジン酸化反応においては、L-リジン脱アミノ化生成物である2-オキソ-6-アミノヘキサン酸と共に、アンモニア（NH3）と過酸化水素（H2O2）を生成する。またオキシゲナーゼ反応生産物として、5-アミノペンチルアミドと、CO2とH2Oとを生成すると考えられる。生じた5-アミノペンチルアミドは、本発明のアミノアミド酸化酵素により、対応するアルデヒドと共に、アンモニアと過酸化水素を生成すると考えられる。反応のための時間は、例えば、1分〜2時間の範囲とすることができる。しかし、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。
【００４２】
系全体で生じた過酸化水素量を測定し、その値に基づいてL-リジンの定量が可能である。過酸化水素量は、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法等の公知の方法により、定量できる。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼとして、同様の目的のために使用される種々の酵素、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼを使用することができる。さらに使用するペルオキシダーゼの基質となり得る発色剤または蛍光剤を使用することができ、具体的には西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合には4-アミノアンチピリン：フェノールや 4-アミノアンチピリン：N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリンナトリウム塩 (表中ではTOOSと略す)等を使用することができる。発色剤や蛍光剤は、使用されるペルオキシダーゼの種類によって適宜選択することができる。
【００４３】
過酸化水素は、過酸化水素電極を用いた電流検出型センサーを用いて測定することもできる。過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサーを挙げることができる。
【００４４】
本発明はまた、下記の試薬を含む、アミノ酸の定量用キットを提供する：
(K1)本発明のアミノアミド酸化酵素または本発明のアミノアミド酸化酵素を含む酵素剤。
【００４５】
本発明のキットはまた、さらに以下の試薬を含んでいてもよい。
(K2)特許文献1のアミノ酸酸化酵素（例えば、Pseudomonas属に属する菌由来のL-アミノ酸オキシダーゼ）
(K3)過酸化水素検出用試薬。
本発明のキットは、さらに、(K4)反応用緩衝液を含んでいてもよい。
【００４６】
(K3)過酸化水素検出用試薬は、過酸化水素の検出を、例えば、発色もしくは蛍光によって行う場合に用いる。過酸化水素検出用試薬としては、例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組合せであることができる。具体的には、西洋わさびペルオキシダーゼと4-アミノアンチピリン：フェノールや 4-アミノアンチピリン：N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリンナトリウム塩 (TOOS)の組み合わせを挙げることができる。
【００４７】
(K4)反応用緩衝液は、反応液中を定量反応に適したpHに維持するために用いられる。精度良くL-リジンを定量するには、pH5.5-6.5の範囲の緩衝液であることが望ましい。
【００４８】
本発明はまた、酵素センサーを提供する。本発明の酵素センサーは、詳細には、以下のようなものである：本発明のアミノアミド酸化酵素を検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置したアミノ酸の検出または定量用酵素センサーであって、前記検出用電極が過酸化水素検出用電極である。
【００４９】
前記検出用電極は過酸化水素検出用電極である。過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極であることができる。酵素式過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサーを挙げることができる。隔膜式過酸化水素電極は、隔膜により過酸化水素と反応する電極が隔離されたタイプの電極である。
【００５０】
本発明のセンサーにおいて酵素類は、検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置されることが好ましく、検出用電極の表面に配置される場合には、検出用電極の表面に固定化されても固定化されなくてもよい。検出用電極の表面に固定化されることで、本発明のセンサーを繰り返し利用できる利点はある。
【００５１】
本発明の酵素は、食品および医療等の分野における、分析および診断での活用が期待される。以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
【実施例】
【００５２】
[アミンオキシダーゼの精製方法]
(1) 粗酵素液の調製
Aspergillus carbonarius AIU 205洗浄菌体17.5 g（培養液4 L分の菌体）を15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0に懸濁し、ガラスビーズを加えて細胞破砕機を用いて2,200 rpmで8分間破砕した後、10,000×gで遠心分離して上清画分を集めた。この上清画分（570 ml）を粗酵素液としてDEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィーに用いた。他の菌株を用いた場合もこれに準じた。
【００５３】
(2) DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィー
粗素液を15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0で平衡化したDEAE-Toyopearlカラム（60 ml：φ2.4 cm×13.5 cm）に供した後、カラムを15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0で洗浄して未吸着タンパク質を除いた。次に、15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0（300 ml）と0.09 M NaCl含有15 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0（300 ml）を用いた直線濃度勾配法で目的の酵素を溶出し、活性画分を集めた。
【００５４】
(3) Phenyl-Toyopearlカラムクロマトグラフィー
DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィーの活性画分に硫安を0.75 M まで添加し、0.75 M硫安含有10 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0で平衡化したPhenyl-Toyopearlカラム（40 ml：φ1.2 cm×35.0 cm）に供した後、カラムを0.75 M硫安含有10 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0で洗浄して未吸着タンパク質を除去した。次に、0.75 M硫安含有10 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0（200 ml）と10 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0（200 ml）を用いた直線濃度勾配法で目的の酵素を溶出し、活性画分を集めた。
【００５５】
(4) Toyopearl HW-55カラムクロマトグラフィー
Phenyl-Toyopearlカラムクロマトグラフィーの活性画分を1 mlまで濃縮し、50 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 7.0で平衡化したToyopearl HW-55カラム（64 ml：φ1.2 cm×56.5 cm）に供して、目的外のタンパク質を除去した。
【００５６】
[4-アミノブチルアミド酸化活性測定法]
アミノアミド酸化活性は、30℃で4-アミノブチルアミドの酸化によって生成される過酸化水素の生成速度を555 nmの吸光度で測定して求めた（表1：反応液組成）。
【００５７】
【表１】
2014168406.tif 000004
【００５８】
[結果]
1．4-アミノブチルアミドを酸化する酵素の探索
まず4-アミノブチルアミドの構造からAspergillus niger AKU 3302株由来  アミン酸化酵素の4-アミノブチルアミドに対するオキシダーゼ活性を調べた。その結果、本酵素が4-アミノブチルアミドを酸化することが明らかになった。しかし、酸性領域における本アミン酸化酵素の4-アミノブチルアミドに対する反応性は非常に低く、酸性領域で低濃度のL-リジンを測定するためには不向きであった（図1）。
【００５９】
そこで、酸性領域で生育するカビから4-アミノブチルアミド酸化能の高い酵素を探索し、酸性領域でL-リジンの測定に利用できる酵素を選抜することにした。その結果、n-ブチルアミンを単一窒素源とする培地で培養した表1の菌株からn-ブチルアミンと4-アミノブチルアミドを酸化する活性が認められ、n-ブチルアミン含有培地で生育した微生物から4-アミノブチルアミド酸化酵素を得られることが明らかになった。また、n-ブチルアミン酸化活性に対する4-アミノブチルアミド酸化活性は、菌株間で異なり、Aspergillus carbonarius AIU 205などが4-アミノブチルアミドに良く作用する酵素を産生することが明らかになった（表2）。
【００６０】
次に、A. carbonarius AIU 205とA. carbonarius AIU 208の4-アミノブチルアミド酸化活性を持つ酵素を部分精製した。その結果、A. carbonarius AIU 205が産生する酵素は、DEAE-Toyopearlを用いたカラムクロマトグラフィーでは酵素活性は3つのピークに分離された（図2）。この中から最初に溶出された画分をF-1として集めて、Phenyl-Toyopearlを用いたカラムクロマトグラフィーに供した。F-1画分は、酵素活性として1つのピークを示した。またタンパク質と活性のピークは一致した（図3）。このピークを含む画分をF-1画分とした。また、後半２つの活性画分をPhenyl-Toyopearlに供した結果、２つの活性は完全に分離することができた。この活性画分をそれぞれF-2画分，F-3画分とした（図4）。
【００６１】
また、部分精製した各酵素について、4-アミノブチルアミドに対するKm値を求めた。その結果、A. carbonarius AIU 205が4-アミノブチルアミドに高い親和性を持つ酵素を産生することが明らかになった（表3）。また、これらの酵素の4-アミノブチルアミド酸化に対するpHの影響を調べた結果、A. carbonarius AIU 205のF-1画分酵素が酸性側で比較的高い活性を示し（図5）、本画分酵素がL-リジン測定の感度向上に利用できる可能性が示唆された。
【００６２】
【表２】
2014168406.tif 000005
【００６３】
【表３】
2014168406.tif 000006
【００６４】
2．A. carbonariusが産生するF-1画分酵素の精製と諸性質
A. carbonarius AIU 205のF-1画分酵素が4-アミノブチルアミドに高い親和性を持ち、酸性領域で比較的高い活性を示したので、本酵素を精製して酵素化学的性質と反応動力学的性質を明らかにし、L-リジン測定の感度向上への応用について検討した。
【００６５】
1）培養と精製
A. carbonarius AIU 205を0.2％(v/v)ブチルアミンを単一窒素源とする培地で2日間培養し、菌体破砕して調製した粗酵素液からDEAE-Toyopearl，Phenyl-Toyopearl，Toyopearl HW 55のカラムクロマトグラフィーで目的酵素を精製した。精製酵素は、Native-PAGEおよびSDS-PAGEによる分析で単一のタンパク質バンドを示した（図6）。
【００６６】
2）精製酵素の分子質量
本酵素の分子質量は、TSKgel G3000SWXLを用いたゲルろ過で約130 kDa、SDS-PAGEで約71 kDaと算出され、本酵素は、同一のサブユニットの二量体で存在していると推定された。
【００６７】
3）酵素活性と安定性に及ぼすpHの影響
0.1 M リン酸緩衝液, pH 5.0〜8.5を用いて30℃で4-アミノブチルアミドと精製酵素を反応させ、過酸化水素生成速度から酵素活性を求めた。その結果、本酵素は、pH 7.0付近で最大活性を示し、pH 6.0でも最大速度の約65%の活性を示した（図5，図7）。また、本酵素をpH 5.0〜8.5の範囲で40℃, 30分間加温してpH安定性を調べた結果、本酵素はpH 6.0〜8.5で80%以上の活性が残存し、弱酸性から弱アルカリ領域で安定であった（図7）。
【００６８】
4）最適反応温度
pH 7.0で反応温度を20℃〜55℃の範囲で変化させて、4-アミノブチルアミド酸化活性に対する温度の影響を調べた。その結果、本酵素は45℃付近で最大活性を示し、55℃では急激に活性が低下した（図8）。
【００６９】
5）基質特異性と反応動力学定数
pH 7.0, 30℃でアミドおよびアミンに対する酸化活性を調べた。その結果、本酵素は、4-アミノブタンアミドだけでなく、3-アミノプロピオンアミドも酸化した。また、脂肪族短鎖モノアミン類も酸化したが、ジアミン類およびL-リジンやL-オルニチンなどのアミノ酸類には作用しなかった（表4）。
【００７０】
【表４】
2014168406.tif 000007
【００７１】
また4-アミノブタンアミドおよびn-ブチルアミンに対する反応動力学定数を求めた結果、本酵素は4-アミノブタンアミドよりもn-ブチルアミンに対するKm値のほうが小さく、n-ブチルアミンに対して高い親和性を持つことが明らかになった（表4）。しかし、本酵素の4-アミノブタンアミドに対するKm値はA. niger AKU 3302由来アミン酸化酵素の値よりも30倍以上小さく（表3参照）、また炭素数が長くなるとKm値が小さくなることより、本酵素は、5-アミノペンチルアミドに高い親和性を示すことが推定され、本酵素は低濃度のアミド類に対して良く作用すると推定された。
【００７２】
6）阻害剤の影響
反応液に1.0 mMになるように各種阻害剤を添加し、4-アミノブタンアミド酸化活性を測定した。Semicarbazide、IsoniazideおよびIproniazidにより阻害が見られたことから、銅含有酵素であることが示唆された。
【００７３】
【表５】
2014168406.tif 000008
【００７４】
7）金属の影響
反応液に1.0 mMになるように各種金属を添加し、4-アミノブタンアミド酸化活性を測定した。
【００７５】
【表６】
2014168406.tif 000009
【００７６】
8）精製酵素溶液のスペクトル
50 mMリン酸緩衝液,pH 7.0中の精製酵素液の吸収スペクトルを図９に示した。一般に、フラビン酵素は350〜380nm付近と450〜480nm付近に極大吸収を持つことが知られているが、本酵素溶液はこの付近に極大吸収を示さなかった。よって、本酵素はフラビン酵素ではないことが示唆された。
【００７７】
9）L-リジンの測定への応用
Pseudomonas sp. AIU 813由来L-アミノ酸オキシダーゼはpH 6.5よりも酸性側ではL-リジンのみ酸化し、L-オルニチンとL-アルギニンを酸化しないことが明らかになっている（前掲非特許文献1）。そこで、L-アミノ酸オキシダーゼとA. carbonarius AIU 205 F-1酵素を組み合わせて表7に示す方法でL-リジンの測定について検討した。その結果、A. carbonarius AIU 205 F-1酵素を加えることにより吸光度変化量が約2倍増大し、本酵素がL-リジン測定の高感度化に有効であることが明らかになった（図10）。
【００７８】
【表７】
2014168406.tif 000010
【００７９】
[結論]
本研究でL-アミノ酸オキシダーゼのオキシゲナーゼ活性によってL-リジンから生成される5-アミノペンチルアミドやL-オルニチンから生成される4-アミノブチルアミドを酸化してH2O2を生成する酵素を見出し、本酵素がL-リジン測定の感度を高めるために応用できることを明らかにした。また、カビ由来の銅含有アミン酸化酵素が、5-アミノペンチルアミドや4-アミノブチルアミドなどを酸化することを明らかにした。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号1: Pseudomonas sp. AIU 813由来L-アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号2: Pseudomonas sp. AIU 813由来L-アミノ酸オキシダーゼをコードするヌクレオチド配列
【図１】
2014168406.tif 000011
【図２】
2014168406.tif 000012
【図３】
2014168406.tif 000013
【図４】
2014168406.tif 000014
【図５】
2014168406.tif 000015
【図６】
2014168406.tif 000016
【図７】
2014168406.tif 000017
【図８】
2014168406.tif 000018
【図９】
2014168406.tif 000019
【図１０】
2014168406.tif 000020
【配列表】
2014168406000001.app