(57)【要約】【課題】新規なアンカータンパク質を提供することを目的とする。【解決手段】Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来の細胞膜関連アンカータンパク質。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来の細胞膜関連アンカータンパク質。
【請求項２】
ＳＰＢＣ２１Ｄ１０．０６ｃ（配列番号１）、ＳＰＢＣ９４７．０４（配列番号２）、ＳＰＢＣ１９Ｃ７．０５（配列番号３）、またはＳＰＢＣ３５９．０４ｃ（配列番号４）である、請求項１に記載の細胞膜関連アンカータンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞膜関連アンカータンパク質を介して、外来タンパク質が細胞表層に固定化された、微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜関連アンカータンパク質およびこれを含む酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞表層工学と呼ばれる技術が注目されている。細胞表層工学とは、真核細胞である酵母や原核細胞である細菌の細胞表層に外来タンパク質を提示（固定）させる技術である。当該細胞表層工学は、例えば、微生物が本来有さない外来タンパク質を導入できるため、より有用性の高い微生物を得ることができる。
【０００３】
このような細胞表層工学を適用する技術としては、いくつかの手法が知られているが、なかでもグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを利用した方法がよく知られている。ＧＰＩアンカーとは、酵母の細胞壁タンパク質であるアグルチニンタンパク質に含有される基であり、ＧＰＩアンカーが細胞表層のグルカンと共有結合を形成することにより、アグルチニンを細胞表層に提示することができる。このＧＰＩアンカーはアグルチニンをコードする遺伝子のＣ末端に存在していることから、分泌シグナルをコードする遺伝子および外来タンパク質をコードする遺伝子をＮ末端に導入したＤＮＡ（融合タンパク質をコードした遺伝子）を合成し、これを微生物に導入することで、外来タンパク質が細胞表層に提示された微生物を得ることができる。なお、前記分泌シグナルとは、細胞内で発現した融合タンパク質を細胞外に分泌する機能を有する。当該分泌シグナルは、通常、融合タンパク質が細胞内から細胞壁を通過して細胞外に移動する際にシグナルペプチダーゼにより分解され、融合タンパク質から除去される。
【０００４】
前記ＧＰＩアンカーを利用した方法として、例えば特許文献１には、分泌シグナル配列、リパーゼの構造遺伝子配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列およびＧＰＩアンカー付着シグナル配列をこの順で有するＤＮＡであって、リパーゼを細胞表層に発現し得るＤＮＡが開示されている。当該特許文献１には、前記ＤＮＡによって発現した融合タンパク質が細胞外に分泌される際に、ＧＰＩアンカーが酵母の細胞表層に固定化されることで、細胞表層にリパーゼが提示された酵母が得られることが記載されている。そして、前記酵母を油脂と反応させることにより、脂肪酸および脂肪酸エステルが製造できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２９００７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のようにＧＰＩアンカーを利用した外来タンパク質の細胞表層への提示技術は有用な方法ではあるものの、使用する外来タンパク質や微生物の種類によっては、細胞表層にアンカータンパク質が固定できない場合があることが判明した。そのため、本技術が適用できる外来タンパク質や微生物等の種類が制限されてしまう。
【０００７】
そこで、本発明は、新規なアンカータンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、Schizosaccharomyces pombe由来の細胞膜関連タンパク質がアンカータンパク質としての機能を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アンカータンパク質として機能する新規なSchizosaccharomyces pombe由来の細胞膜関連タンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一形態に係る外来タンパク質が細胞表層に提示された酵母を示す図である。
【図２】本発明の一形態に係る融合タンパク質をコードする遺伝子を示す図である。
【図３】実施例におけるＢＧＬ活性の定量的評価の結果を示す図である。
【図４】実施例におけるセロビオース資化能の評価の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の一形態によれば、Schizosaccharomyces pombe（以下、「S. Pombe」と略称する）由来の細胞膜関連アンカータンパク質が提供される。
【００１３】
＜アンカータンパク質＞
本形態に係るアンカータンパク質は、細胞内から細胞外に分泌される際に細胞表層に固定される、アンカーとしての機能を有する。
【００１４】
用いられうるアンカータンパク質としては、S. Pombe由来の細胞膜関連タンパク質であれば特に制限されない。具体的には、S. PombeのゲノムＤＮＡから得られるＤＮＡ断片によって発現されたタンパク質が挙げられる。
【００１５】
本発明の一実施形態において、前記アンカータンパク質は、SPBC21D10.06c（配列番号１）、SPBC947.04（配列番号２）、SPBC19C7.05（配列番号３）、またはSPBC359.04c（配列番号４）であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明の一実施形態において、前記アンカータンパク質は、細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端（Cell-wall adhesin ligand-binding C-terminal）のモチーフを含むことが好ましい。ここで、「モチーフ」とは、タンパク質が有する所定の機能と対応づけられた、タンパク質中において局所的に非常に良く保存されているアミノ酸配列を意味する。そして、「細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端のモチーフ」とは、細胞内から細胞外に分泌される際に細胞表層に固定するリガンドとして機能する、タンパク質のＣ末端に位置する部位である。よって、S. Pombe由来の細胞膜関連タンパク質が、細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端のモチーフを含むことにより、より高いアンカーとしての機能を発揮しうる。
【００１７】
前記細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端のモチーフとしては、下記のアミノ酸配列（配列番号５、Pfam ID = DIPSY）が挙げられる。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
前記配列番号５で表されるモチーフのうち、大文字で記載しているアミノ酸は、アンカーとしての機能を非常に良く保存するものであると推定される。よって、前記アンカータンパク質は、当該大文字で記載するアミノ酸（Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ｒ、Ｃ、Ｐ、Ｙ、Ｄ、Ｇ、Ｆ、およびＲ）をこの順でモチーフとして含むことがより好ましい（以下、前記大文字で記載されたアミノ酸群を「保存アミノ酸群」とも称する）。なお、小文字で記載されたアミノ酸（以下、「モチーフ構成アミノ酸群」とも称する）については、アンカータンパク質の種類によって、欠失、置換、付加等がなされている場合がある。また、「Ｘ」で記載されたもの（以下、「任意アミノ酸」とも称する）は、アンカータンパク質の種類によってそれぞれ異なる。具体的には、前記任意アミノ酸は、欠失しているか、または少なくとも１つのアミノ酸で構成されうる。
【００２０】
なお、上記好ましいアンカータンパク質のうち、SPBC21D10.06c（配列番号１）、SPBC947.04（配列番号２）、およびSPBC359.04c（配列番号４）については、上記細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端のモチーフ、特に保存アミノ酸群を含む。
【００２１】
上述のアンカータンパク質は、Ｎ末端側に分泌シグナルを有していると推定されるため、外来タンパク質と組み合わせるだけで、外来タンパク質を細胞表層に提示することが可能となりうる。
【００２２】
本発明に係るアンカータンパク質を用いて外来タンパク質が微生物の細胞表層に提示されると、微生物と外来タンパク質との間が比較的近接した構成を有する。このため、例えば、外来タンパク質が酵素である場合には、酵素による反応生成物を効率良く微生物内に取り込むことができる。また、外来タンパク質を微生物の細胞表層に提示することで、外来タンパク質の機能（例えば、酵素活性）を長期間維持することができる。
【００２３】
上述のS. Pombe由来の細胞膜関連タンパク質をアンカータンパク質として使用することにより、外来タンパク質が細胞表層に提示された微生物を得ることができる。
【００２４】
＜外来タンパク質が細胞表層に提示された微生物＞
図１は、本発明の一形態に係る外来タンパク質が細胞表層に提示された酵母を示す図である。外来タンパク質が細胞表層に提示された酵母１は、酵母５の細胞表層に融合タンパク質２を有する。この際、前記融合タンパク質２は、アンカータンパク質３および外来タンパク質４を含み、前記アンカータンパク質３を介して前記外来タンパク質４を酵母５の細胞表層に固定化することができる。
【００２５】
［融合タンパク質］
融合タンパク質は、上述のアンカータンパク質および外来タンパク質を含む。
【００２６】
（外来タンパク質）
外来タンパク質としては、特に制限されず、公知のものが適用されうる。具体例としては、酵素、抗原タンパク質、抗体、レポータータンパク質、受容体タンパク質等が挙げられる。
【００２７】
前記酵素としては、加水分解酵素、酸化還元酵素、異性化酵素、リアーゼ、脱炭酸酵素等が挙げられる。具体的には、グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼが挙げられる。
【００２８】
前記抗原タンパク質としては、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ等のウイルスのコアタンパク質や合成ペプチド等が挙げられる。
【００２９】
前記抗体としては、免疫グロブリン、およびそのＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）2フラグメント等が挙げられる。
【００３０】
前記レポータータンパク質としては、発光性タンパク質、蛍光タンパク質等が挙げられる。具体的には、Green Fluorescein Proteinやその変異体が挙げられる。
【００３１】
前記受容体タンパク質としては、ホルモンの核内受容体やG-Protein Coupled Recepter等が挙げられる。具体的には、エストロゲンレセプターやアンドロゲンレセプター等のヒトの性ホルモンレセプターが挙げられる。
【００３２】
これらのうち、外来タンパク質は、使用する微生物の種類によっても異なるが、微生物が本来有さない外来タンパク質であることが好ましい。例えば、微生物として酵母であるS. Pombeを用いる場合には、前記外来タンパク質として、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β−グルコシダーゼ等が用いられうる。特に、セルロースを炭素源として用いる場合には、これらの酵素を組み合わせることが好ましい。微生物が本来有さない外来タンパク質を適用することにより、微生物は新たな機能を有しうる。
【００３３】
上述の外来タンパク質は単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。また、アンカータンパク質についても単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
【００３４】
［微生物］
本形態に適用されうる微生物としては、特に制限されないが、酵母および微生物が挙げられる。これらのうち、酵母を用いることが好ましい。
【００３５】
前記酵母としては、特に制限されず、公知の酵母が挙げられる。具体的には、Schizosaccharomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Pichia属、Torulaspora属、Zygosaccharomyces属、Candida属の酵母等が挙げられる。具体的には、Schizosaccharomyces pombe（S. Pombe）、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces marxianus、Kluyveromyces thermotolerans、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、Candida sonorensis等が挙げられる。
【００３６】
これら微生物は、遺伝子改変されたものであっても、その他の外来遺伝子が導入されたものであってもよい。例えば、ＴＣＡサイクルの働きを促進する遺伝子の一つであるＨＡＰ４遺伝子を導入したSaccharomyces cerevisiaeに、外来タンパク質であるβ−グルコシダーゼを細胞表層に提示することで、セロビオースを原料として有機酸（リンゴ酸等）を高い濃度で含有する酒類を製造することができる。
【００３７】
上述の酵母のうち、本形態に係るアンカータンパク質の起源であるS. Pombeと同属（Schizosaccharomyces属）の酵母を用いることがより好ましく、S. Pombeを用いることがさらに好ましい。
【００３８】
外来タンパク質が細胞表層に提示された微生物は、種々の用途に用いられうる。例えば、特許文献１のように、酵母の細胞表層にリパーゼを提示することで、脂肪酸エステルの合成に使用されうる。その他、清酒や食品の製造、バイオ材料の合成等に使用されうる。
【００３９】
上記のうち、微生物を用いて酸を合成する場合には、前記微生物は、酸耐性能を有することが好ましい。例えば、酸耐性能を有する酵母としては、特に制限されないが、Schizosaccharomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Pichia属、Ｔorulaspora属、Zygosaccharomyces属、Candida属の酵母等が挙げられる。
【００４０】
有機酸を発酵により合成する場合には、有機酸の合成に伴い培地のｐＨが低下する。その結果、通常の微生物であれば、有機酸による微生物の生育抑制を防止することを目的として、培養過程でアルカリ試薬を添加し、ｐＨを中性付近に調整する必要がある。これにより、合成された酸は塩の状態で得られることとなる。
【００４１】
しかしながら、微生物として酸耐性能を有する微生物を用いると、低ｐＨでも発酵産物の生成が継続する（すなわち、低ｐＨでも微生物の育成は抑制されない）ため、アルカリ試薬を添加が不要となり、酸の形態で合成した酸を得ることができる。その結果、発酵工程以降の工程、例えば、発酵液からの生成物の回収工程に用いる場合に、原材料の削減、工程の簡略化、およびユーティリティーの向上が期待できる。なお、微生物の生育、所望の酸のｐＫａなどを考慮し、必要に応じてｐＨを適切な範囲に調整してもよい。
【００４２】
ｐＨの調整方法としては、アルカリ性物質を発酵中に適時培養液に添加する方法や、緩衝作用を持った培地を使用する方法等が挙げられる。アルカリ性物質を適時培養液に添加する場合、アルカリ試薬として、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化アンモニウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等の一般的なアルカリ試薬を用いることができる。また、緩衝作用を持った培地を使用する場合、前記培地には、予め水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウム等が添加されうる。
【００４３】
＜外来タンパク質が細胞表層に提示された微生物の製造方法＞
前記外来タンパク質が細胞表層に提示された微生物は、通常、融合タンパク質をコードする遺伝子を微生物内に導入し、当該微生物を培養することで製造することができる。より詳細には、前記製造方法は、（１）融合タンパク質をコードする遺伝子を調製する工程と、（２）融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主（微生物）に導入する工程と、（３）宿主を培養して融合タンパク質を発現する工程と、（４）融合タンパク質が宿主の細胞表層に固定化される工程とを含む。
【００４４】
［（１）融合タンパク質をコードする遺伝子を調製する工程］
融合タンパク質をコードする遺伝子は、通常、アンカータンパク質をコードする遺伝子および外来タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００４５】
図２は、本発明の一形態に係る融合タンパク質をコードする遺伝子を示す図である。融合タンパク質をコードする遺伝子６は、アンカータンパク質をコードする遺伝子７および外来タンパク質をコードする遺伝子８を有する。この際、外来タンパク質をコードする遺伝子８は、アンカータンパク質をコードする遺伝子７のＣ末端側で融合される。この点は、上記特許文献１に記載されているＮ末端に分泌シグナルをコードする遺伝子および外来タンパク質をコードする遺伝子を導入するＧＰＩアンカーとは対照的である。
【００４６】
（アンカータンパク質をコードする遺伝子）
アンカータンパク質をコードする遺伝子は、S. PombeのゲノムＤＮＡから、アンカータンパク質としての機能を有するように選択された配列を有する遺伝子でありうる。
【００４７】
本発明の一実施形態において、前記アンカータンパク質をコードする遺伝子は、ＳＰＢＣ２１Ｄ１０．０６ｃをコードする遺伝子（配列番号６）、ＳＰＢＣ９４７．０４をコードする遺伝子（配列番号７）、ＳＰＢＣ１９Ｃ７．０５をコードする遺伝子（配列番号８）、ＳＰＢＣ３５９．０４ｃをコードする遺伝子（配列番号９）であることが好ましい。
【００４８】
また、本発明の一実施形態において、前記アンカータンパク質をコードする遺伝子は、細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端のモチーフをコードする塩基配列を含むことが好ましい。具体的には、前記アンカータンパク質をコードする遺伝子は、保存アミノ酸群をコードする遺伝子または配列番号５（Pfam ID = DIPSY）をコードする遺伝子を含むことが好ましく、保存アミノ酸群をコードする遺伝子を含むことがより好ましく、ＳＰＢＣ２１Ｄ１０．０６ｃをコードする遺伝子（配列番号６）、ＳＰＢＣ９４７．０４をコードする遺伝子（配列番号７）、ＳＰＢＣ３５９．０４ｃをコードする遺伝子（配列番号９）であることさらにが好ましい。
【００４９】
当該アンカータンパク質をコードする遺伝子は、S. PombeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、所望の配列が得られるように設計されたプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲを行うことにより調製することができる。その他、公知の手法、例えば、ハイブリダイゼーション法等を利用してアンカータンパク質をコードする遺伝子を調製することもできる。
【００５０】
（外来タンパク質をコードする遺伝子）
外来タンパク質をコードする遺伝子は、特に制限されず、上述の外来タンパク質をコードする遺伝子でありうる。この際、前記外来タンパク質の起源は特に制限されない。
【００５１】
例えば、S. Pombeに外来タンパク質としてβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子を用いる場合には、β−グルコシダーゼをコードする遺伝子を、所望の配列が得られるように設計されたプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲを行うことにより調製することができる。この際、適宜遺伝子に欠失、付加、置換等の改変を施してもよい。
【００５２】
（分泌シグナルをコードする遺伝子）
本形態に係るアンカータンパク質は、Ｎ末端に分泌シグナルを有していると推定される。その結果、本形態に係る融合タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、特許文献１に記載の発明のように、必ずしも分泌シグナルをコードする遺伝子を導入する必要はない。
【００５３】
しかしながら、アンカータンパク質、外来タンパク質、宿主等に応じて、分泌シグナルをコードする遺伝子を導入してもよい。
【００５４】
分泌シグナルをコードする遺伝子は、通常、Ｎ末端に存在し、生物間で類似の構造を有する。したがって、本形態に係る融合タンパク質をコードする遺伝子に分泌シグナルをコードする遺伝子を導入する場合には、得られる融合タンパク質をコードする遺伝子は、通常、Ｎ末端−分泌シグナルをコードする遺伝子−アンカータンパク質をコードする遺伝子−外来タンパク質をコードする遺伝子−Ｃ末端の順となりうる。なお、発現された分泌シグナルは、約２０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端付近に疎水性アミノ酸を多く含む構成を有する。
【００５５】
分泌シグナルをコードする遺伝子としては、特に制限されないが、Rhizopus oryzae由来のグルコアミラーゼの分泌シグナル配列をコードする遺伝子、Aspergillus oryzae由来のアラビノフラノシダーゼの分泌シグナル配列をコードする遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナルをコードする遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子の分泌シグナルをコードする遺伝子等が挙げられる。
【００５６】
本形態に係る融合タンパク質をコードする遺伝子は、その他任意の遺伝子が導入されていてもよい。
【００５７】
（融合タンパク質をコードする遺伝子の調製）
融合タンパク質をコードする遺伝子を調製する方法は、特に制限されず、公知の手法が適用されうる。具体例を挙げると、前記アンカータンパク質をコードする遺伝子、前記外来タンパク質をコードする遺伝子、および任意の分泌シグナルをコードする遺伝子をベクターに導入する方法が挙げられる。その他、融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組換えによって宿主の染色体に導入してもよい。
【００５８】
用いられうるベクターとしては、宿主で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、外来遺伝子の導入に利用されるプラスミド、ファージ、コスミド等が挙げられる。
【００５９】
前記プラスミドとしては、特に制限されない。例えば、宿主として酵母を用いる場合には、pDUAL51等のpDUAL、pART、pSM、REP3X、pSLF101、pAUR224、pUC119等が用いられうる。また、宿主として細菌を用いる場合には、pHSG398、pUC18、pBR322、pSC101、pUC19、pUC118、pUC119、pACYC117、pAUR224、pGPD、pBluescript II SK(+)、pETDuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1、pCOLADuet-1、PinPoint Xa-1（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等が用いられうる。
【００６０】
前記ファージとしては、特に制限されないが、λgt10、Charon 4A、EMBL、M13ｍp18、M13mp19等が用いられうる。
【００６１】
前記ベクターは、プロモーター、ターミネーター、および複製起点等を有しうるが、必要に応じて５'−非翻訳領域、３'−非翻訳領域、および栄養要求性相補マーカー、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含んでいてもよい。
【００６２】
前記融合タンパク質をコードする遺伝子は、酵母等において前記遺伝子を確実に発現させる観点から、発現プロモーターの下流に導入することが好ましい。発現プロモーターの下流に前記遺伝子を導入することにより、前記遺伝子が導入された酵母の育成環境が悪化（例えば、培地のｐＨが低下）しても、融合タンパク質が好適に発現しうる。
【００６３】
前記発現プロモーターとしては、特に制限されず、公知のものが挙げられる。例えば、宿主として酵母を用いる場合には、nmt1プロモーター、nmt41プロモーター、nmt81プロモーター、fbp1プロモーター、inv1プロモーター、ctr4プロモーター、CaMV35Sプロモーター、adh1プロモーター、SV40プロモーター、urg1プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ef1a-cプロモーター、tifプロモーター、tif51プロモーター、cam1プロモーター、tub1プロモーター等が挙げられる。また、宿主として、細菌を用いる場合には、T7プロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、λ-PLプロモーター、tacプロモーター等が挙げられる。
【００６４】
遺伝子のベクターへの導入方法としては、特に制限されないが、ベクターを任意の制限酵素で切断し所望の遺伝子をライゲーションにより連結する方法等が挙げられる。
【００６５】
前記所望の遺伝子が導入されたベクターは、一部の塩基配列に欠失、付加、置換等の改変が施されていてもよい。
【００６６】
［（２）融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入する工程］
ベクターの宿主への導入方法は、特に制限されず、公知の方法が適用されうる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００６７】
このようにして、細胞膜関連アンカータンパク質をコードする遺伝子（好ましくは、ＳＰＢＣ２１Ｄ１０．０６ｃ（配列番号１）、ＳＰＢＣ９４７．０４（配列番号２）、ＳＰＢＣ１９Ｃ７．０５（配列番号３）、およびＳＰＢＣ３５９．０４ｃ（配列番号４）からなる群から選択される少なくとも１つを含む細胞膜関連アンカータンパク質をコードする遺伝子、並びに／または細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端のモチーフを含む細胞膜関連アンカータンパク質をコードする遺伝子）、外来タンパク質をコードする遺伝子、および任意の遺伝子（分泌シグナルをコードする遺伝子等）を含むＤＮＡ（融合タンパク質をコードする遺伝子）が導入されてなる宿主を得ることができる。
【００６８】
［（３）宿主を培養して融合タンパク質を発現する工程］
上記で得られた融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなる宿主を培養することにより、前記遺伝子が細胞内で転写および翻訳されて目的とする融合タンパク質が発現する。この際、前記転写によって得られるＲＮＡは、ＲＮＡプロセッシングが行われることがある。前記ＲＮＡプロセッシングとしては、例えば、キャップ形成、ポリアデニル化、スプライシング等が挙げられる。したがって、発現したタンパク質は、融合タンパク質をコードする遺伝子の配列と完全に対応しない場合がありうる。
【００６９】
宿主の培地は、使用する酵母等によって適宜選択されうる。例えば、糖、窒素源、およびその他任意の添加物（無機物、抗生物質、インデューサー等）を添加した培地で培養することができる。
【００７０】
前記糖としては、宿主が資化できるものであれば特に制限されないが、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース；アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース；マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、デンプン、セルロース等の二糖類や多糖類；マンニトール、キシリトール、リビトール等の糖アルコール類；セルロース、リグノセルロース等のバイオマス糖化処理物由来の糖などが挙げられる。これらの糖は、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７１】
前記窒素源としては、宿主が資化できるものであれば特に制限されないが、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム糖のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が用いられうる。これらの窒素源は、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７２】
前記無機物としては、特に限定されないが、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。これらの無機物は、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７３】
前記抗生物質としては、カナマイシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、オーレオバシジンＡ、ストレプトスライシン、ブラストシジン、フレオマイシン等が挙げられる。これらの抗生物質は、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７４】
前記インデューサーとしては、特に制限されないが、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、アラビノース、ラクトース等が挙げられる。これらのインデューサーは、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７５】
前記培地としては、特に制限されないが、宿主として酵母を用いる場合には、ＹＰＤ培地、ＹＥＳ培地、ＥＭＭ培地等が挙げられる。また、宿主として細菌を用いる場合には、ＬＢ培地等が挙げられる。
【００７６】
前記用いられうる栄養素、添加物、培地等は、使用する宿主や導入される外来遺伝子等に応じて適宜異なる。この際、細胞表層に提示する外来タンパク質によっても、用いられうる栄養素等が異なる。例えば、天然のS. Pombeは、本来β−グルコシダーゼを有さないため、通常であれば、セロビオース（β−グルコシダーゼにより分解されてグルコースが生成する）を直接の栄養素とすることができない。そのため、S. Pombeの栄養素としてセロビオースを使用する場合には、予めグルコースに分解するか、培地中にβ−グルコシダーゼを分泌する微生物を混合させる必要がある。しかしながら、細胞表層にβ−グルコシダーゼを提示したS. Pombeを用いる場合には、セロビオースを直接の栄養素とすることができる。その結果、別途グルコースを生成させる工程や、培地中への微生物の添加が不要となり、工程に簡略化や効率的な目的物の製造を行うことができる。また、前記β−グルコシダーゼは細胞壁表面に固定されていることから、酵素活性を長期間維持することができる。また、セロビオースを分解して得られるグルコースは宿主近傍に存在していることから、前記グルコースのS. Pombe内への取り込みが容易となりうる。
【００７７】
宿主の培養条件は、特に制限されず、使用する宿主や所望の生成物に応じて適宜選択されうる。
【００７８】
培養温度としては、特に制限されないが、宿主として酵母を用いる場合には、２０℃〜４５℃であることが好ましく、２５〜４２℃であることがより好ましい。
【００７９】
培養時間としては、特に制限されないが、２４〜１９２時間であることが好ましく、２４〜１２０時間であることがより好ましい。
【００８０】
培地のｐＨとしては、特に制限されず、宿主等に応じて適宜設定されうる。
【００８１】
［（４）融合タンパク質が酵母の細胞表層に固定化される工程］
上記（３）で発現した融合タンパク質は、分泌シグナルにより細胞質内を移動し、細胞内から細胞外に分泌される。この際、アンカータンパク質が足場となり、分泌された融合タンパク質は、細胞表層に固定化される。
【００８２】
一実施形態について、上記過程をより詳細に説明すると、はじめにリボソームで合成された融合タンパク質は、粗面小胞体に取り込まれる。次いで、粗面小胞体中の融合タンパク質はゴルジ体に輸送される。この際、前記融合タンパク質は糖鎖修飾が行われる場合がある。そして、ゴルジ体から融合タンパク質を含む分泌顆粒が放出され、当該分泌顆粒は、細胞質内を移動して細胞膜へと接近する。そして、例えば、エキソサイトーシスによって融合タンパク質が細胞外に分泌される。この際、前記融合タンパク質は、アンカータンパク質を有しているため細胞外へは放出されず、細胞表層に固定化されうる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。
【００８４】
［実施例１］
(SPBC21D10.06cをコードするＤＮＡ（配列番号６）の調製)
S.pombe FY7132（ナショナルバイオリソースプロジェクト（酵母）より分譲）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーSPBC21D10.06c_F（配列番号１０）およびSPBC21D10.06c_R（配列番号１１）、並びにＤＮＡポリメラーゼKOD FX（TOYOBO社製）を用いてＰＣＲを行い、SPBC21D10.06cをコードするＤＮＡ（配列番号６）を得た。
【００８５】
（融合タンパク質をコードする遺伝子の調製）
外来タンパク質としてβ-グルコシダーゼ（ＢＧＬ）を用い、融合タンパク質をコードする遺伝子を調製した。
【００８６】
（１）pDUAL51-BGLの構築
はじめに、ＢＧＬをコードする遺伝子をベクターpDUAL51-FFH51（理研バイオリソースセンターより分譲）に導入し、pDUAL51-BGLを構築した。
【００８７】
Aspergillus aculeatusのゲノムＤＮＡ（配列番号１８）をテンプレートとして、プライマーNheI_SalI_F（配列番号１９）およびBGL_delSalI_R（配列番号２０）またはプライマーBGL_delSall_F（配列番号２１）およびBGL_NcoI_R（配列番号２２）、並びにＤＮＡポリメラーゼKOD FX（TOYOBO社製）を用いてＰＣＲを行い、２つのＢＧＬ遺伝子断片を取得した。
【００８８】
当該２つのＢＧＬ遺伝子断片をテンプレートとして、プライマーNheI_SalI_F（配列番号１９）およびBGL_NcoI_R（配列番号２２）、並びにＤＮＡポリメラーゼKOD FX（TOYOBO社製）を用いてＰＣＲを行い、１つのＢＧＬ遺伝子断片を取得した。
【００８９】
このようにして得たＢＧＬ遺伝子断片は、Aspergillus aculeatusのゲノムＤＮＡ（配列番号１８）からSalIサイトが除去されている（配列番号２３および２４を参照）。
【００９０】
上記で得たＢＧＬ遺伝子断片を、pDUAL-FFH51（理研バイオリソースセンターより分譲）のtif51プロモーターの下流にクローニングした。より詳細には、制限酵素であるNheIおよびNcoIによって前記ＢＧＬ遺伝子断片およびpDUAL-FFH51のＤＮＡを切断し、ライゲーションを行うことによって、pDUAL51-BGLを構築した。
【００９１】
（２）pDUAL51-SPBC21D10.06c-BGLの構築
次に、上記（１）で構築したpDUAL51-BGLにSPBC21D10.06cをコードする遺伝子を導入した。
【００９２】
制限酵素であるNheIおよびSalIによってSPBC21D10.06cをコードする遺伝子およびpDUAL51-BGLのＤＮＡを切断し、ライゲーションを行うことによって、pDUAL51-SPBC21D10.06c-BGLを構築した。得られた融合タンパク質をコードする遺伝子は、SPBC21D10.06cをコードする遺伝子のＣ末端にBGLをコードする遺伝子が連結されている。なお、前記SPBC21D10.06cのＮ末端は、分泌シグナルを有すると推測されることから、分泌シグナルをコードする遺伝子は導入しなかった。
【００９３】
（融合タンパク質をコードする遺伝子の形質転換）
S. pombe FY7132をＹＥＳ液体培地（Yeast extract＝５ｇ／Ｌ、グルコース＝３０ｇ／Ｌ、ヒスチジン＝０．２２５ｇ／Ｌ、アデニン＝０．２２５ｇ／Ｌ、ウラシル＝０．２２５ｇ／Ｌを添加）（ForMedium社製）に植菌し、３０℃で１×１０7細胞／ｍＬとなるまで振盪培養を行った。得られた培養液を３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行い、菌体ペレットを得た。前記菌体ペレットに０．１Ｍの酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）溶液を１０ｍＬ添加し、菌体ペレットを懸濁させた。３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離をを行い、得られた菌体ペレットを０．１ＭのＬｉＡｃ溶液３００μＬで懸濁して菌体懸濁液を得た。
【００９４】
プラスミドpDUAL-FFH51およびpDUAL51-SPBC21D10.06c-BGLを制限酵素NotI（New England Biolabs社製）で切断してなる遺伝子溶液および５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液２９０μＬを、前記菌体懸濁液１００μＬに添加し、３０℃で１時間インキュベートを行った後、３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行った。得られた菌体ペレットに５００μＬの滅菌水を添加して、菌体ペレットを懸濁させ、３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行い、３００μＬの滅菌水を添加することで、菌体ペレットを懸濁させた。
【００９５】
得られた菌体ペレットを、ロイシン無添加ＥＭＭ寒天培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製ＥＭＭ培地（粉末）に、グルコース＝３０ｇ／Ｌ、寒天＝２０ｇ／Ｌ、ヒスチジン＝０．２２５ｇ／Ｌ、アデニン＝０．２２５ｇ／Ｌ、ウラシル＝０．２２５ｇ／Ｌを添加）に塗布して３０℃で１２０時間インキュベートを行い、生育したコロニーを培養して、SPBC21D10.06c-BGLが導入された酵母１を得た。
【００９６】
なお、前記酵母１のゲノムを抽出し、前記ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲを行ったところ、SPBC21D10.06c-BGL発現カセットが導入されていることを確認した。したがって、前記融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されたS. Pombeを培養することにより、SPBC21D10.06c-BGLを含む融合タンパク質が発現することが理解される。
【００９７】
S. pombe OB1（島根大学川向教授より分譲）をS. pombe FY7132の代わりに用いて上記と同様の方法で形質転換を行い、SPBC21D10.06c-BGLが導入された酵母２を得た。
【００９８】
［実施例２］
SPBC947.04_F（配列番号１２）およびSPBC947.04_R（配列番号１３）をプライマーとして用いて、SPBC947.04をコードするＤＮＡ（配列番号７）を得たことを除いては、実施例１と同様の方法で、融合タンパク質をコードする遺伝子であるpDUAL51-SPBC947.04-BGLを導入した酵母３（S. pombe FY7132）および酵母４（S. pombe OB1）を得た。
【００９９】
［実施例３］
SPBC19C7.05_F（配列番号１４）およびSPBC19C7.05_R（配列番号１５）をプライマーとして用いて、SPBC19C7.05をコードするＤＮＡ（配列番号８）を得たことを除いては、実施例１と同様の方法で、融合タンパク質をコードする遺伝子であるSPBC19C7.05-BGLを導入した酵母５（S. pombe FY7132）および酵母６（S. pombe OB1）を得た。
【０１００】
［実施例４］
SPBC359.04c_F（配列番号１６）およびSPBC359.04c_R（配列番号１７）をプライマーとして用いて、SPBC359.04cをコードするＤＮＡ（配列番号９）を得たことを除いては、実施例１と同様の方法で、融合タンパク質をコードする遺伝子であるSPBC359.04c-BGLを導入した酵母７（S. pombe FY7132）および酵母８（S. pombe OB1）を得た。
【０１０１】
［性能評価］
実施例で得た酵母を用いて性能評価を行った。
【０１０２】
（ＢＧＬ活性の定性的評価）
実施例１〜４で得た酵母１〜８をそれぞれ、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド（ＭＵＧ）（ナカライテスク株式会社製）を添加したＥＭＭ寒天培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）にて３０℃で終夜培養した。得られた菌体を、０．０３４重量％の４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシドを含有する軟寒天（ナカライテスク株式会社製）を添加した５０ｍMの酢酸緩衝液（ｐＨ５）の軟寒天培地（寒天：０．７５％）上に画線し、さらに３０℃で１６時間インキュベートした。ＦＡＳ−ＩＩＩ（東洋紡績株式会社製）で４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシドの分解によって生成される４−メチルウンベリフェロンに起因する蛍光を観察した。その結果、酵母１〜８はいずれも明瞭な蛍光を発していた。
【０１０３】
上記性能評価において、融合タンパク質をコードする遺伝子の宿主である酵母S. Pombeは、本来β−グルコシダーゼを有していない。また、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシドは、β−グルコシダーゼによって分解される。
【０１０４】
よって、上記活性評価の結果から、酵母１〜８はＢＧＬ活性を有することが理解できる。
【０１０５】
（ＢＧＬ活性の定量的評価）
実施例１〜４で得た酵母１〜８をそれぞれ、ＥＭＭ液体培地ＥＭＭ寒天培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）で２４時間培養し、培養液を遠心分離して、菌体および培養上清を回収した。この際、得られた菌体については、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。
【０１０６】
菌体および培養上清をそれぞれ、終濃度で２ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ナカライテスク株式会社製）を添加した５０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）の反応液に添加した。３７℃で１分間反応させた後、４００ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０７】
上記性能評価において、融合タンパク質をコードする遺伝子の宿主である酵母S. Pombeは、本来β−グルコシダーゼを有していない。また、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドは、β−グルコシダーゼによって加水分解され、ｐ−ニトロフェノールが生成する。
【０１０８】
よって、４００ｎｍで吸光度によりｐ−ニトロフェノールを定量することにより、ＢＧＬの活性値が算出できる。この際、ＢＧＬの活性値１Ｕは、３７℃、ｐＨ５．０において、１分間で１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールが生じる酵素量と定義する。得られた結果を図３に示す。
【０１０９】
図３の結果からも明らかなように、S. pombe FY7132を宿主として用いた場合（酵母１、３、５、７）、菌体では、SPBC359.04c（配列番号４）をアンカータンパク質として用いたとき（酵母７）にＢＧＬ活性が最も高く、８５Ｕ／細胞×１０5であった。次いで、SPBC21D10.06c（配列番号１）（酵母１）およびSPBC947.04（配列番号２）（酵母３）の順にＢＧＬ活性が高く、それぞれの活性値は８．５Ｕ／細胞×１０5、および８．０Ｕ／細胞×１０5であった。
【０１１０】
一方、S. pombe OB1を宿主として用いた場合（酵母２、４、６、８）、菌体では、SPBC359.04c（配列番号４）（酵母８）、SPBC947.04（配列番号２）（酵母４）、およびSPBC21D10.06c（配列番号１）（酵母２）の順にＢＧＬ活性が高く、それぞれ１０７Ｕ／細胞×１０5、４５Ｕ／細胞×１０5、３８Ｕ／細胞×１０5であった。
【０１１１】
S. pombe FY7132およびS. pombe OB1のいずれの宿主を用いた場合にも、細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端モチーフ（保存アミノ酸群）を有するSPBC21D10.06c（配列番号１）、SPBC947.04（配列番号２）、およびSPBC359.04c（配列番号４）の方が、細胞壁接着リガンド結合Ｃ末端モチーフを有していないSPBC19C7.05（配列番号３）に比べて、ＢＧＬ活性が高かった。
【０１１２】
また、いずれの酵母についても、培養上清の活性値は１０Ｕ／ｍＬ以下であり、菌体よりも活性が低かった。このことから、β−グルコシダーゼは、酵母の細胞表層に提示されており、細胞外に分泌されていないことが分かる。なお、別途調製したS. pombe FY7132およびS. pombe OB1にpDUAL-FFH51(空ベクター)を導入した菌株についてはＢＧＬ活性が認められないことを確認した。
【０１１３】
（セロビオース資化能の評価）
酵母１〜８を、グルコースの代わりに２％セロビオースを添加したＥＭＭ培地（「EMM w/o Dextrose, Powder」（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）＝１２．３５ｇ／Ｌ、セロビオース＝２０ｇ／Ｌ）で培養した。この際、温度は３０℃に設定し、培養初期の菌数は１×１０6とした。培養結果を図４に示す。
【０１１４】
図４の結果からも明らかなように、いずれの菌株についても細胞数の増加が観測された。なお、別途調製したS. pombe FY7132およびS. pombe OB1にpDUAL-FFH51(空ベクター)を導入した菌株については細胞数の増加が観測されないことを確認した。
【０１１５】
上記結果から、SPBC21D10.06c、SPBC947.04、SPBC19C7.05、またはSPBC359.04cをコードする遺伝子と、ＢＧＬをコードする遺伝子とを含む、融合タンパク質をコードする遺伝子をS. Pombe FY7132、S. pombe OB1に導入することにより、前記酵母にセロビオース資化能を付与できたことが分かる。
【符号の説明】
【０１１６】
１  外来タンパク質が細胞表層に提示された酵母、
２  融合タンパク質、
３  アンカータンパク質、
４  外来タンパク質、
５  酵母、
６  融合タンパク質をコードする遺伝子、
７  アンカータンパク質をコードする遺伝子、
８  外来タンパク質をコードする遺伝子。
【図１】
2014070045.tif 000004
【図２】
2014070045.tif 000005
【図３】
2014070045.tif 000006
【図４】
2014070045.tif 000007
【配列表】
2014070045000001.app