(57)【要約】【課題】ヘモグロビンＦを正確かつ再現性よく、しかもヘモグロビンＡ２等の他のヘモグロビンと同時に定量し得る定量方法を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフィーのクロマトグラムにおいて、ヘモグロビンＦの溶出ピーク開始時間から、一定の条件に従って設定される溶出ピークの溶出終了時間までの面積を求めることにより、前記課題を解決する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン交換カラムを用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＦの定量方法であって、以下の工程からなる方法。
（ａ）ヘモグロビンＦ含有試料をカラムに供し、ヘモグロビンＦを他のヘモグロビンから分離して溶出させ、クロマトグラムを得る工程、
（ｂ）クロマトグラムからヘモグロビンＦの溶出を同定し、その溶出開始時間、ピーク及びピーク溶出時間（ｔ０）を同定する工程、
（ｃ）ヘモグロビンＦピークからクロマトグラムベースラインに向かう垂線上で、当該ピーク高さの１／２となる点（ｈ１／２点）を同定する工程、
（ｄ）クロマトグラムベースラインと平行でｈ１／２点を通過する直線と、ヘモグロビンＦのクロマトグラム背面との交点を求め、該交点の溶出時間とｔ０の差（ｔ）を求める工程、
（ｅ）ヘモグロビンＦのクロマトグラムの面積計算を、ヘモグロビンＦ溶出開始時間からｔ０＋Ｋｔ（Ｋは２以上かつ３以下の整数）の範囲で行う工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビンＦの定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血中の各種ヘモグロビン濃度（全ヘモグロビンに占める特定のヘモグロビンの割合）は、液体クロマトグラフィーを用いて定量することが可能である。ヘモグロビンの一種である胎児性ヘモグロビン（ヘモグロビンＦ）は、α鎖とγ鎖の２種類のグロブリンからなるヘモグロビンで、胎児では９０％存在するが生後２から３ヵ月で急激に低下し、２から４歳までに２％未満に減少する。近年、先天性溶血性貧血の一種である血色素異常症（異常ヘモグロビン症、サラセミア症）を診断する上で、ヘモグロビンＦを正確に定量することが重要になっている。血色素異常症によって成人ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ０）の合成異常が生じるとヘモグロビンＦの存在割合が増加することから、その濃度を定量することによってサラセミア症や異常ヘモグロビン症を診断することが可能になるからである。また血色素異常症の診断には、ヘモグロビンＦと同時に、ヘモグロビンＡ２を定量することも重要である。
【０００３】
ヘモグロビンＦの血中濃度は新生児と成人で大きく異なり、０．５％から９０%という広い濃度範囲の定量が必要となる。一方ヘモグロビンＡ２は健常人で２％から３．５％、サラセミア症患者では４％から７％と微量であり、２％から７％という低濃度範囲の定量が必要となる。
【０００４】
ヘモグロビンＦは０．５％から９０％と広い濃度範囲で血中に存在し得る一方で、サラセミア症の診断に重要なもう一つのヘモグロビンであるＡ２は２％から７％と狭い濃度範囲でしか血中に存在しないため、両者を同時に定量しようとすれば、ヘモグロビンＡ２のような低濃度のヘモグロビンを正確に定量し得る量の試料をカラムに負荷することになる。ところが、ヘモグロビンＦは試料中に０．５％から９０％存在することに加え、ヘモグロビンＡ２といった他のヘモグロビンと比較して陽イオン交換カラム（陽イオン交換体）との相互作用が弱いため、ヘモグロビンＡ２のような微量ヘモグロビンの定量に適切な量の試料を負荷すると過負荷になりやすく、ピーク形状の乱れや溶出時間の変動を起こしてしまう。過負荷の影響を低減するには表面積が大きく試料負荷量の大きいカラムを使用することが考えられるが、各種ヘモグロビンの分離が悪化し、長時間の分離操作を余儀なくされ、一試料当り数分で定量を実施することが要求される臨床診断の要請に反することとなる。
【０００５】
一般に、非多孔性陽イオン交換カラム（非多孔性陽イオン交換体）を用いることにより、定量対象物の分離性能の向上と操作時間の短縮を図ることが出来る（特許文献１）。しかし非多孔陽イオン交換カラムは試料負荷量が制限され、上記のような理由でヘモグロビンＦが過負荷となるとピーク形状の乱れや溶出時間の変動を起こしてしまう。過負荷の影響を低減するためにはヘモグロビンＦの溶出とその後溶出する他のヘモグロビンの溶出の時間差を大きくするような操作条件を設定することになるが、ヘモグロビンＦの溶出ピークが小さい場合はピークの溶出終了時間を見出すのが困難となって、定量の再現性が悪化する。
【０００６】
従来、陽イオン交換カラムを用いてヘモグロビンＦとヘモグロビンＡ２を同時に定量する方法として、特許文献２に記載された方法が知られている。特許文献２は溶離液と溶離条件を工夫することによってヘモグロビンＦとヘモグロビンＡ２を同時に定量する方法であるが、定量されたヘモグロビンＦの最高濃度は約３０％であり、それを超える濃度のヘモグロビンＦを含有する試料に対して有効であるか否かについては不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２９２９４５６号公報
【特許文献２】特許第４４２０５３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、特に非多孔性陽イオン交換カラムを用いて分離性能の向上と操作時間の短縮を図りつつ、ヘモグロビンＦを正確かつ再現性をもって定量し得る定量方法を提供することにある。また本発明の目的は、正確性と再現性をもってヘモグロビンＦを定量しつつ、同時にヘモグロビンＡ２等の他のヘモグロビンを定量し得る定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意検討した結果、多孔性及び非多孔性陽イオン交換カラムにおいて、（１）ヘモグロビンＦピークの溶出終了時間（ピークエンドタイム）は負荷量（試料中の成分濃度）により変化するが、ピーク溶出開始時間（ピークスタートタイム）はほぼ一定であること、及び、（２）ヘモグロビンＦのピーク形状は溶出開始時間（ピークスタートタイム）からピーク頂点までは不規則であるが、ピーク頂点から溶出終了時間（ピークエンドタイム）まではほぼ正規分布に近いことを見出し、これらを利用してヘモグロビンＦの溶出ピークのピーク形状の乱れや溶出時間の変動による影響を排除し、ヘモグロビンＦの溶出ピークが小さい場合のピーク溶出終了時間の検出を可能とする定量方法を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、負荷量の影響を受けない溶出開始時間と、ピーク形状が正規分布に近い時間範囲を利用してヘモグロビンＦを定量する方法であり、以下の工程からなる陽イオン交換カラムを用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＦの定量方法である。
（ａ）ヘモグロビンＦ含有試料をカラムに供し、ヘモグロビンＦを他のヘモグロビンから分離して溶出させ、クロマトグラムを得る工程、
（ｂ）クロマトグラムからヘモグロビンＦの溶出ピークを同定し、その溶出開始時間、ピーク頂点及びピーク頂点の溶出時間（ｔ０）を同定する工程、
（ｃ）ヘモグロビンＦのピーク頂点からクロマトグラムベースラインに向かう垂線上で、当該ピーク頂点高さの１／２となる点（１／２ｈ）を同定する工程、
（ｄ）クロマトグラムベースラインと平行で１／２ｈを通過する直線と、ヘモグロビンＦの溶出ピーク背面との交点を求め、該交点の溶出時間とｔ０の差（ｔ）を求める工程、
（ｅ）ヘモグロビンＦの溶出ピークの面積計算を、ヘモグロビンＦ溶出開始時間からｔ０＋Ｋｔ（Ｋは２以上かつ３以下の整数）の範囲で行う工程。
【００１１】
以下、図１から図３に基づいて本発明を詳細に説明する。図１と図２は、異なる濃度のヘモグロビンＦ含有試料を非多孔性陽イオン交換カラムに供して得たクロマトグラムの一部を示すものである。図１は高濃度のヘモグロビン含有検体、図２は低濃度のヘモグロビン含有検体のクロマトグラムの一部である。高濃度のヘモグロビンＦ含有検体でヘモグロビンＦの溶出ピーク（Ｆ）が後続のヘモグロビン類の溶出ピーク（Ｌ）と重複しない分離条件を採用したものであるが、この条件で低濃度のヘモグロビンＦ含有検体を分析すると、図２に示すようにヘモグロビンＦの溶出ピーク（Ｆ）と後続のヘモグロビン類の溶出ピーク（Ｌ）の間が大きく広がってしまう。このヘモグロビンＦの溶出ピーク（Ｆ）と後続のヘモグロビン類の溶出ピーク（Ｌ）の間の溶出曲線は接戦の傾きの変化が小さい平坦な曲線となるため、接線の傾きを検出する等の通常の方法で溶出終了時間（ＥＰ）を同定しようとすると、クロマトグラムの僅かな変動でＥＰが図中のＢ点からＣ点間で変動するため、再現性が悪化する可能性がある。
【００１２】
図３で本発明で利用するパラメータを説明する。クロマトグラムからのヘモグロビンＦの溶出ピークは、前後の溶出ピークの様子や、ヘモグロビンＦのピーク頂点の溶出時間（ｔ０）等から容易に同定することができる。ヘモグロビンＦの溶出ピークの溶出開始点やピーク頂点は、クロマトグラムの接線の傾きを検出する等の方法で検出すれば良く、溶出開始時間（ＳＰ）やピーク頂点の溶出時間（ｔ０）は、溶出開始点及びピーク頂点の検出とともに、容易に決定することができる。またヘモグロビンＦのピーク頂点が同定されれば、その高さ及び１／２ｈ点もまた、容易に決定することができる。
【００１３】
次にクロマトグラムベースラインと平行で１／２ｈを通過する直線と、ヘモグロビンＦの溶出ピーク背面との交点を求める。溶出ピーク背面とは、図２に示した通り、ヘモグロビンＦの溶出ピークにおいて、ピーク頂点の溶出に続く部分（クロマトグラムの右側）をいう。クロマトグラム上で交点から、その溶出時間とｔ０の差（ｔ）もまた、容易に求めることができる。
【００１４】
ヘモグロビンＦの濃度（％）は、その溶出ピーク面積を求め、その値を全ヘモグロビンの溶出ピーク面積の和と比較して計算する。従来の定量法では、クロマトグラムの接線の傾きを検出する等の方法で同定された溶出開始時間（ＳＰ）と溶出終了時間（ＥＰ）の間の溶出ピーク面積を算出するが、本発明では、溶出終了時間（ＥＰ）にかえて、ｔ０＋Ｋｔ（Ｋは２から３の整数）を用いる。
【００１５】
以上の各工程は、コンピューター等で構成される波形処理手段を用いて自動的に行うことが可能である。例えば市販されている自動ヘモグロビン分析装置（東ソー（株）製、グリコヘモグロビン分析装置  ＨＬＣ−７２３（登録商標））と同装置用の試薬キット等を利用することが出来る。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ヘモグロビンＦのピーク溶出開始時間はその負荷量にかかわらずほぼ一定であること、及び、（２）ヘモグロビンＦのピーク形状は溶出開始時間からピーク頂点までは不規則であるが、ピーク頂点から溶出終了時間まではほぼ正規分布に近い、という新たな知見に基づき、クロマトグラムにおいてヘモグロビンＦの溶出終了時間を一定の波形処理に基づいて算出することで、正確かつ再現性の高いヘモグロビンＦの定量を実現するものである。本発明により、０．５％から９０％という、広い濃度範囲で存在するヘモグロビンＦの負荷量にかかわらず、胎児血から成人血まで、ヘモグロビンＡ２等の他のヘモグロビンと同時に定量することが可能となる。
【００１７】
本発明は、特に非多孔性陽イオン交換カラムを用いるヘモグロビン定量に効果的であるが、多孔性の陽イオン交換カラムを用いる場合であっても、ヘモグロビン溶出ピークの背面がブロードで、他のヘモグロビンの溶出ピークと重複してしまう場合など、ヘモグロビン溶出ピークの溶出終了の同定が困難となる場合に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明を説明するための図である。
【図２】本発明を説明するための図である。
【図３】本発明で利用するパラメータを説明するための図である。
【図４】実施例１のクロマトグラム（ヘモグロビンＦ濃度０．６％）を示す図である。
【図５】実施例１のクロマトグラム（ヘモグロビンＦ濃度６８．４％）を示す図である。
【図６】実施例１のヘモグロビンＦ％と溶出開始時間およびピーク頂点時間の関係を示す図である。なお図５では、溶出開始時間をＳＰ、ピーク頂点時間をＰＴと記載している。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。
【００２０】
実施例１
非多孔性陽イオン交換樹脂（東ソー（株）製、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ―ＮＰＲ（登録商標））を直径４．６ｍｍ、長さ３．５ｃｍのＳＵＳ製カラムに充填し、市販の自動ヘモグロビン分析装置（東ソー（株）製、グリコヘモグロビン分析装置  ＨＬＣ―７２３（登録商標））に取り付けて以下の実験を行った。なお、溶離液としては、前記装置用に市販されているもの（Ｇ８  ベータサラセミアエリューションバッファーキット）を使用し、試料注入時は１液を、注入後２．４分経過時点２液に切り替え、試料注入後３．４分から５分にかけて、２液からリニアグラジエントで３液に切り替えた。
【００２１】
ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）濃度０．７％の試料において得られたクロマトグラムを図２に、ヘモグロビンＦ濃度６８％の試料において得られたクロマトグラムを図３にそれぞれ示す。ヘモグロビンＦ濃度が０．７％の場合、ヘモグロビンＦの溶出ピークと後続する不安定型糖化ヘモグロビン（Ｌ―Ａ１）との溶出時間差は大きく離れている。しかしヘモグロビンＦ濃度が６８％の試料では、その溶出ピークがブロードで、不安定型糖化ヘモグロビンの溶出ピークに重複しかけていることが分かる。
【００２２】
このクロマトグラムについて、本発明に従う波形処理を行った。波形処理は、前記装置を制御するコンピューターにてＫ＝３として行った。定量結果は、それぞれ０．７％及び６８％であった。本発明の定量方法により０．７％程度から６８％程度までのヘモグロビンを正確に定量できることが分かる。
【００２３】
実施例２
実施例１の装置を使用して濃度の異なるヘモグロビンＦ試薬を混合して調製した試料を測定し、得られたクロマトグラムからヘモグロビンＦ濃度とピーク溶出開始時間（ＰＳ）及びピーク頂点溶出時間（ＰＴ）の関係を調査した。結果を図４に示す。ヘモグロビンＦ濃度が高くなるに従いＰＴが著しく遅くなる一方で、ＰＳはヘモグロビンＦ濃度に関係なく、ほぼ安定していることが分かる。
【００２４】
実施例３
実施例１の装置を使用して、濃度の異なるヘモグロビンＦ試薬を混合して調製した試料を測定し、得られたクロマトグラムについて、本発明に従う波形処理を行った。波形処理は、前記装置を制御するコンピューターにてＫ＝３として行った。理論的に測定されるべきグリコヘモグロビン濃度と実際に定量された値の比（回収率）を表１に示す。本発明により、ヘモグロビンＦの濃度が0.7から６８％までの範囲で良好な回収率が得られ、広い濃度範囲で正確な定量が可能であることが分かる。
【００２５】
【表１】
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実施例４
実施例１の装置を使用して、濃度の異なるヘモグロビンＦ試薬を混合して調製した極低濃度試料（ヘモグロビンＦ濃度  ０．４％）、中濃度試料（ヘモグロビンＦ濃度  ４．６％）及び高濃度試料（ヘモグロビンＦ濃度  ７４．０％）をそれぞれ５回測定し、得られたクロマトグラムについて、本発明に従う波形処理を行った。波形処理は、前記装置を制御するコンピューターにてＫ＝３として行った。定量結果を表２に示す。本発明により、ヘモグロビンＦの濃度が大きく異なる３種類の試料それぞれについて、５回の測定を再現良く実施できることが分かる。
【００２６】
【表２】
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実施例５
実施例４における波形処理を、Ｋ＝２として行った。定量結果を表３に示す。実施例４と比較するとヘモグロビンＦのピーク面積を算出する終点（溶出終了時間）が早くなる分、定量結果は若干低値となるが、Ｋ＝２の場合でもほぼ正確かつ再現性良くヘモグロビンＦを定量可能であることが分かる。
【００２７】
【表３】
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比較例１
実施例４で得たクロマトグラムについて、ヘモグロビンＦのピーク溶出終了点をピーク接線の傾きから検出し、ヘモグロビンＦ溶出開始時間から溶出終了時間の範囲で溶出ピークの面積を計算して定量を行った。結果を表４に示す。このような、従来の方法では、ヘモグロビンＦの定量ができないというわけではないが、５回の定量結果がわずかながら変動している。このことから、本発明では、従来方法と比較して特に再現性の面で有効であることが分かる。
【００２８】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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