(57)【要約】      （修正有）【課題】スネイル−ｐ５３の結合を阻害する候補薬物を選別する段階を含むＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】ｐ５３を固定させたプレートにスネイル及び候補薬物を培養する段階と、ＥＬＩＳＡリーダーでスネイル−ｐ５３の結合を阻害する候補薬物を選別する段階と、を含んでなることを特徴とするＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患治療剤のスクリーニング方法。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５３を固定させたプレートにスネイル及び候補薬物を培養する段階と、
ＥＬＩＳＡリーダーでスネイル−ｐ５３の結合を阻害する候補薬物を選別する段階と、
を含んでなることを特徴とするＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スネイル−ｐ５３間の結合を阻害してｐ５３の発現を誘導することによって、膵膓癌、肺癌、胆管癌及び大膓癌のようなＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患治療に有用に使われるスネイル−ｐ５３間の結合を阻害する化合物及びそれを有効成分として含有する癌疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤及び診断技術の改善によって全体癌患者の５年生存率が５０％増加した。しかし、いくつかの癌疾患、例えば、肺癌と膵膓癌は、相変らず１０％以下の低い生存率を表わしている。したがって、このような患者の生存率を増加させるために、このような疾患の初期診断方法の開発が至急である。また、このような類型の癌は、Ｋ−Ｒａｓでよく変化を示している。特に、発癌性Ｋ−Ｒａｓは、５％以下の生存率を表わす膵膓癌で圧倒的に優勢な傾向を表わしている。
【０００３】
発癌性Ｒａｓは、ｐ５３活性化を通じる老化及び連続した細胞死を誘導すると知られており、発癌性Ｒａｓ媒介腫瘍形成は、ｐ５３欠乏条件下で起こると推定されており、特に、Ｈ−Ｒａｓ誘導肝癌細胞種は、素早く活性化されたｐ５３によって抑制された。
【０００４】
現在使われている肺癌、膵膓癌などの治療剤は、薬物効果の持続時間が短い一方、多様な副作用が誘発されるので、このような疾患を効果的に治療するか、初期診断することができる薬物の開発が至急である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、発癌性Ｋ−Ｒａｓがスネイルの誘導を通じてｐ５３を抑制するということを明らかにし、ｐ５３及びスネイル間の相互作用を遮断することができる化合物を同定し、このような化合物が、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞株でｐ５３発現を誘導することを発見して、本発明を完成した。
【０００６】
これにより、本発明の目的は、スネイル−ｐ５３の結合を阻害する候補薬物を選別する段階を含むＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、スネイル−ｐ５３間の結合を阻害する化合物及びそれを有効成分として含有する癌疾患治療剤を提供することである。
【０００８】
また、本発明者は、ｐ５３の特定領域、例えば、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞での透過性が増加するので、それを担体として用いてＫ−Ｒａｓ突然変異細胞に特異的に薬物を伝達することができるという点を明らかにし、またスネイルの自動抗体の発現有無を測定してＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患、例えば、膵膓癌、肺癌、胆管癌、大膓癌などを初期に診断することができるという点を明らかにすることによって、本発明を完成した。
【０００９】
これにより、本発明のまた他の目的は、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインのエンドサイトーシスを用いてＫ−Ｒａｓ突然変異細胞に特異的に薬物を伝達することができる薬物伝達方法を提供することである。
【００１０】
また、本発明のさらに他の目的は、スネイル自動抗体の発現有無を測定してＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患を診断することができる初期診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を果たすために、本発明は、ｐ５３を固定させたプレートにスネイル及び候補薬物を培養する段階と、ＥＬＩＳＡリーダーでスネイル−ｐ５３の結合を阻害する候補薬物を選別する段階と、を含んでなることを特徴とするＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、下記化学式１で表される化合物、またはその塩を提供する：
【化１】
2014115294.tif 000003
前記化学式１で、
ｍは、０ないし１０の整数、ｎ及びｐは、それぞれ０または１の整数であり、
Ｚは、−ＮＨ（ＣＨ２）ｑＣＨ３、−ＯＨ、４−フェニルピペリジン基、４−フェニル
ピペラジン基、イソブチルアミノ基及びイソブチルオキシ基からなる群から選択され、
ｑは、０ないし９の整数である。
【００１３】
より望ましくは、前記化合物は、２−ノニルアミノ−５、８−ジメトキシ−１、４−ナフトキノン；２−デシルアミノ−５、８−ジメトキシ−１、４−ナフトキノン；３−（５，８−ジメトキシ−１、４−ジオキソ−ナフタレン−２−イルチオ）プロパン酸；１１−（５，８−ジメトキシ−１、４−ジオキソ−ナフタレン−２−イルチオ）ウンデカン酸；イソブチル−１１−（５，８−ジメトキシ−１、４−ジオキソ−１、４−ジヒドロナフタレン−２−イルチオ）−ウンデカノアート；１１−（５，８−ジメトキシ−１、４−ジオキソ−１、４−ジヒドロナフタレン−２−イルチオ）−Ｎ−イソブチルウンデカンアミド；及びイソブチル−１１−（５，８−ジメトキシ−１、４−ジオキソ−１、４−ジヒドロナフタレン−２−イルスルフィニル）ウンデカノアートからなる群から選択された化合物、またはその塩であり得る。
【００１４】
前記化学式１の化合物は、前記Ｋ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患治療剤のスクリーニング方法を利用すれば、スネイル−ｐ５３の結合を阻害する薬物を特異的に選別することができて、膵膓癌、肺癌及び大膓癌のように診断や治療が容易ではないＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患を効果的に治療するか、予防することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によるＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患治療剤のスクリーニング方法を利用すれば、スネイル−ｐ５３間の結合を阻害する薬物を特異的に選別することができて、膵膓癌、肺癌、胆管癌及び大膓癌のように診断や治療が容易ではないＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患を効果的に治療するか、予防することができる。
【００１６】
また、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインを担体として用いてＫ−Ｒａｓ突然変異細胞に特異的に薬物を伝達することができて、Ｋ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患の治療に非常に有用であり、スネイルの自動抗体の発現有無を測定してＫ−Ｒａｓ突然変異によって誘発される癌疾患を初期に診断することができて、診断が困難な膵膓癌などの早期診断が可能であって、癌患者の生存率を延長させるか、治療に効率的に対処することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】スネイル媒介ｐ５３発現抑制に関する分子的機転の考察を示す図である。
【図２】スネイル媒介ｐ５３発現抑制に関する分子的機転の考察を示す図である。
【図３】スネイル媒介ｐ５３発現抑制に関する分子的機転の考察を示す図である。
【図４】発癌性Ｋ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制が化学的阻害剤によって遮断されないものを示す図である。
【図５】スネイルが発癌性Ｋ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制のために重要な媒介体であるものを示す図である。
【図６】スネイルとｐ５３との間の直接的な相互作用を示す図である。
【図７】Ｋ−Ｒａｓ誘導性スネイル安定化において、ＡＴＲ活性の必要条件を示す図である。
【図８】スネイル及びｐ５３間の直接的な結合を示す図である。
【図９】スネイル及びｐ５３間の結合阻害剤の同定に関する図である。
【図１０】スネイル及びｐ５３間の結合遮断がＫ−Ｒａｓ突然変異細胞でｐ５３機能を誘導するものを示す図である。
【図１１】スネイル及びｐ５３間の結合遮断がＫ−Ｒａｓ突然変異細胞でｐ５３機能を誘導するものを示す図である。
【図１２】スネイル媒介ｐ５３発現抑制に関する分子的機転の考察を示す図である。
【図１３】ｐ５３の核から細胞質への移動機転に関する結果である。
【図１４】ｐ５３が小嚢輸送を通じて分泌するものを示す図である。
【図１５】ｐ５３がプロテアーゼ及びエンドサイトーシスによって除去される一方、スネイルは、これらに抵抗性を表わした結果である。
【図１６】Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞でのＨｉｓ−ｐ５３の再吸収を示す図である。
【図１７】癌組織でのｐ５３及びスネイル分泌を示す図である。
【図１８】肺癌血清で抗−スネイルＡｂを分析した図である。
【図１９】発癌性Ｋ−Ｒａｓでｐ５３及びスネイルの分泌態様を模式化した図である。
【図２０】実施例１〜５で合成された化合物のｐ５３及びｐ２１の誘導能を確認するウェスタンブロット結果を示す図である。
【図２１】Ｎｕｔｌｉｎ−３と前記化合物とのうちから５ｏと７ａとを選択してスネイル−ｐ５３結合阻害効果を確認するＧＳＴプルダウン分析結果を示す図である。
【図２２】Ｋ−Ｒａｓ突然変異癌細胞株とＫ−Ｒａｓ野生型癌細胞株とに化合物５ｏ、７ａ及びＮｕｔｌｉｎ−３を処理して表われた細胞死滅率を示す図である。
【図２３】ｐ５３突然変異細胞株に化合物５ｏとＮｕｔｌｉｎ−３とを処理してｐ２１の活性が誘導されるものを表わすウェスタンブロット結果を数値化して示す図である。
【図２４】腹腔注射でＡ５４９細胞を非胸腺マウスに注入後、化合物５ｏ処理によるマウスの生存率を示す図である。
【図２５】腹腔注射後、発生した腫瘍の組職写真を示す図である。
【図２６】Ａ５４９細胞で化合物５ｏ処理による総体的な解剖学的異常所見を観察した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一つの具体的様態として、前記化学式１の化合物は、塩の形態で存在することができる。前記塩は、塩酸または硫酸などのような無機酸、またはｐ−トルエンスルホン酸などのような有機酸の薬剤学的に許容可能な塩であり得る。
【００１９】
前記化学式１の化合物は、下記反応式１ないし５のような方法で製造可能である。
【化２】
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【００２０】
【化３】
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【００２１】
【化４】
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【００２２】
【化５】
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【００２３】
【化６】
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【００２４】
反応式２の工程を具体的に説明すれば、次の通りである。
１，５−ジヒドロキシナフタレン（２）を出発物質として用いて、既に知られた３段階の反応を経て、１，４，５，８−テトラメトキシナフタレン（３）を合成し、再び脱メチル化して合成中間体である５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（４）を合成した。詳しい合成方法は、合成スキームにある参考文献で見られるが、このとき使われた溶媒は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒である水酸化ナトリウム、アセトニトリル、無水メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、クロロホルムなどを使った。初めのメチル化反応は、窒素ガス存在下で水酸化ナトリウムに溶かした１，５−ジヒドロキシナフタレンに硫酸ジメチルを１時間滴加して２時間反応させて得た。後でベンゼンで再結晶して１，５−ジメトキシナフタレンを得た。
【００２５】
１，４，５，８−テトラメトキシナフタレン（３）を合成する時は、無水条件でナトリウムメトキシドとヨウ化銅とをジメチルホルムアミドとメタノールとを入れて３０時間加熱還流して得た。反応に対する温度は、８０℃以上にして還流させ続けた。中間体５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノンを合成する時は、硝酸二アンモニウムセリウムを使ったが、室温で３０分間滴加して３０分間さらに反応させて得た。化合物５ａないし５ｐは、中間体５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（４）をメタノールに溶かして、得ようとするアミンやメルカプタンまたは末端にカルボキシル基やヒドロキシル基が付いたメルカプタンを入れて室温で４時間から一晩撹拌してＴＬＣで反応進行状況を確認し、硫酸と重クロム酸ナトリウム水溶液とでウォークアップさせてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して得た。
【００２６】
次の段階で、化合物５ｏの２番位置カルボキシル基に４−フェニルピペリジンまたは４−フェニルピペラジン誘導体を付ける時は、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）よりは、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を入れて反応させることによって、化合物６ａと６ｂとを合成することができ、前記反応は、収率も高くて分離過程にウレアがなしにきれいに分離することができる。次の段階で、化合物５ｐを用いてイソブチルアルコールとイソブチルアミンとを付ける時にも、同様にＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使って、得ようとした化合物７ａ、７ｂを容易に得られる。スルホキシド化合物８を合成する時には、化合物７ａを用いてＭＣＰＢＡを使い、ＴＬＣで反応状況を確認しながら合成することができる。最後に、重炭酸ナトリウムで反応を中止させてシリカゲルカラムをかけて精製された化合物７ａが得られる。
【００２７】
しかし、前記反応式２ないし５による方法は、化学式１の化合物の製造方法の一例に該当し、例えば、反応溶媒、塩基、反応物質の使用量のような反応条件が、前記から説明されたことのみで限定されるものではなく、前記反応式２ないし５の方法の以外にも、当業者に知られた公知の多様な合成方法を用いて、前記化学式１の化合物を製造することができる。
【００２８】
また、本発明は、スネイル−ｐ５３間の結合を阻害する化合物を有効成分として含有する癌疾患治療剤を提供する。
【００２９】
前記化合物は、前記化学式１で表される化合物、またはその塩であり、より望ましくは、２−ノニルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン；２−デシルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン；３−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソナフタレン−２−イルチオ）プロパン酸；１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イルチオ）ウンデカン酸；イソブチル−１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロキシナフタレン−２−イルチオ）−ウンデカノアート；１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イルチオ）−Ｎ−イソブチルウンデカンアミド；及びイソブチル−１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イルスルフィニル）ウンデカノアートからなる群から選択された化合物、またはその塩であり得る。
【００３０】
前記癌疾患は、Ｋ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患であり、望ましくは、膵膓癌、肺癌、胆管癌及び大膓癌からなる群から選択された癌疾患であり得る。
【００３１】
本発明による癌疾患治療剤は、薬学組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含みうる。
【００３２】
本発明で使用可能な担体、賦形剤または希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、燐酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物類などが挙げられる。
【００３３】
前記癌疾患治療剤は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤型、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液の形態で剤型化して使われる。
【００３４】
製剤化する場合には、普通使う充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って調剤される。経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、前記化合物は少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤する。
【００３５】
また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。
【００３６】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ−ル、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
【００３７】
前記癌疾患治療剤の使用量は、患者の年齢、性別、体重によって変わりうるが、０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回ないし数回投与することができる。
【００３８】
また、このような癌疾患治療剤の投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、年齢などによって増減される。したがって、前記投与量は、如何なる面でも、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
前記癌疾患治療剤は、モルモット、マウス、家畜、人間などの哺乳動物に多様な経路で投与されることがある。投与のあらゆる方式は予想されるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与されることがある。
【００４０】
また、本発明は、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインのエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を用いて伝達しようとする薬物をＫ−Ｒａｓ突然変異細胞に特異的に伝達することを特徴とするＫ−Ｒａｓ突然変異細胞の特異的薬物伝達方法を提供する。
【００４１】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、人間ｐ５３（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ０４６３７）の９０番目から２８０番目までのアミノ酸配列を含む。
【００４２】
望ましくは、前記薬物伝達方法は、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン及び伝達しようとする薬物を共に細胞に処理する段階と、前記ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインによるエンドサイトーシスによって隣合うＫ−Ｒａｓ突然変異細胞に薬物が伝達される段階と、を含んでなりうる。
【００４３】
また、本発明は、スネイル抗体の発現有無を測定することを特徴とするＫ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患の初期診断方法を提供する。
【００４４】
前記スネイル抗体の発現は、Ｋ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患を有した患者の血清から測定することができ、Ｋ−Ｒａｓ突然変異性癌疾患は、膵膓癌、肺癌、胆管癌及び大膓癌からなる群から選択された癌疾患であり得る。
【００４５】
本発明の理解を助けるために、望ましい実施例を下記に提示する。しかし、このような実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであって、本発明が、下記の実施例に限定されるものではない。
［スネイル媒介ｐ５３抑制に関する分子的機転の考察］
＜実施例１＞
【００４６】
１．マウス線維芽細胞の分離及び無限分裂
６ヶ月齢の雄マウスを犠牲させて肺線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を集めた。肺を分離した後、組職メスを用いて組職を切って溶出した。２０％  ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ培地で３日間培養した後、付着された細胞を培養皿に分周し、ｊｅｔＰＥＩを用いて製造者の指針によって突然変異Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ及びＫ−Ｒａｓで形質感染させた。７２時間後、ＤＭＥＭ含有Ｇ４１８  ４００μｇ／ｍｌを用いて形質感染された細胞を選別した。
２．細胞培養及び試薬準備
【００４７】
本発明で使った細胞株は、ＡＴＣＣから購入し、１０％  ＦＢＳを含有したＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭで維持された。また、使われた抗体は、Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚまたはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ｐ５３−Ｒ、Ｐ−Ｅｒｋ）から購買した。Ｒａｓ発現ベクター及びＳｎａｉｌベクターは、それぞれＤｒ．Ｃｈｉ  ＳＧ及びＨｕｎｇ  Ｍ−Ｃから提供された。ｐ５３  Ｓ４６Ｄ及び４６Ａは、Ｍａｙｏ  ＬＤから提供された。また、本発明で使われた化学物質は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購買し、組替えｐ５３は、Ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎｓから購買した。
【００４８】
また、細胞分画分析は、Ｓｕｂｃｅｌｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて製造者の指針によって行った。培地分析のために、細胞培養された培地を集めてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＥｔＯＨ沈降を用いて濃縮した。
３．免疫染色及びウェスタンブロット
【００４９】
細胞染色のために、先行培養された細胞を洗浄して１００％メタノールで固定し、抗体（第１次抗体；１：２００、４℃で一晩中、第２次抗体；１：１０００、室温で２時間）で培養した。分泌されたｐ５３及びＳｎａｉｌを測定するために、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞を１ｍＬ  ＲＰＭＩ  １６４０培地で２４時間ベクターで形質感染させ、洗浄なしに２％  ＰＦＡ  １ｍＬを加えて固定させた。固定後、細胞をＰＢＳで２回洗浄してブロッキング緩衝液［ＰＢＳ＋抗人間Ａｂ（１：５００）］で培養して、非特異的結合を除去した。ＰＢＳ洗浄後、細胞を抗−ｐ５３  Ａｂ及び抗−Ｓｎａｉｌ  Ａｂと培養して、第２次Ａｂとマッチングした。タンパク質分析のために、ＲＩＰＡ緩衝液でタンパク質を抽出してＳＤＳ−ＰＡＧＥに試料を適用し、一般的なウェスタンブロット（ＷＢ）プロトコルによって行った。
【００５０】
免疫沈降分析は、一般的なプロトコルによって行われた。すなわち、細胞溶出物を４時間Ａｂと先に培養し、タンパク質−Ａ／Ｇ−アガロースで２時間培養した。遠心分離後、３回洗浄した。沈降された複合体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＷＢ分析を行った。
【００５１】
４．形質感染及びｓｉ−ＲＮＡ効果の検討
細胞形質感染のために、製造者のプロトコルによってｊｅｔＰＥＩを利用した。細胞を完全培地で２４時間ＤＮＡ／ｊｅｔＰＥＩ混合物で培養した。生体外遺伝子ノックアウトのために、Ｓｎａｉｌ及びＭＤＭ２に対するｓｉ−ＲＮＡを作った。ｊｅｔＰＥＩを用いてｓｉ−ＲＮＡを形質感染させて２４時間後、その効果を検討した。
５．実験結果
【００５２】
図１Ａに示したように、Ｎ−ＲａｓまたはＨ−Ｒａｓの形質感染がアポトーシスまたは老化を誘導したが、Ｋ−Ｒａｓで形質感染された細胞は、６ヶ月が経過されても引き続き成長して維持された。
【００５３】
また、発癌性Ｋ−Ｒａｓの強制発現が、野生型ｐ５３−含有細胞株でｐ５３発現を抑制し（図２Ａ参照）、Ｋ−Ｒａｓは、Ｎ−ＲａｓまたはＨ−Ｒａｓと異なってｐ５３抑制を引き起こし、これは、ｓｉ−ＭＤＭ２によって遮断されなかった（図２Ｂ参照）。しかし、野生型Ｋ−Ｒａｓは、ｐ５３発現を抑制しなかった（図２Ｃ及び図２Ｄ参照）。
【００５４】
図１Ｂに示したように、このようなｐ５３は、Ｋ−Ｒａｓ濃度依存的に抑制された。ＤＮ−ＲａｓｅによるＲａｓ活性の遮断が、Ｋ−Ｒａｓ突然変異Ａ５４９でｐ５３発現を増加させたが、ＨｅｐＧ２では増加させなかった（図２Ｅ）。
【００５５】
前記結果を総合すれば、内因性発癌性Ｋ−Ｒａｓが、ｐ５３発現を抑制するということを示唆する。しかし、図１Ｃのように、ＤＮ−ＲａｓｅがＤＮＡ損傷−媒介ｐ５３抑制に関して明確であり、相加的な効果を観察することができず、これは、強い遺伝毒性ストレスが発癌性Ｋ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制を克服できるということを示唆する。
【００５６】
図２Ｆ及び図２Ｇに示したように、Ｋ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制が点突然変異ｐ５３で確認されたが、ｐ５３活性型であるｐ５３  Ｓ４６Ｄは、Ｋ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制に抵抗性を表わした。このような結果は、遺伝毒性誘導性ｐ５３活性化がＫ−Ｒａｓ媒介抑制を克服できるという図１Ｃの結果とも一致する。
【００５７】
２２／２３突然変異がＭＤＭ２と関連しないために、Ｋ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制は、ＭＤＭ２と独立した経路で行なわれるということを確認することができ、プロテアソーム−阻害剤がＫ−Ｒａｓ媒介ｐ５３を遮断することができなかったために、ＭＤＭ２またはｐ５３ユビキチンシステムと関係のないということが分った（図１Ａ及び図２Ｈ参照）。
【００５８】
また、Ｋ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制に対するＭＡＰＫ信号阻害剤の効果を検討した結果、ＭＡＰＫ経路遮断が、Ｋ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制に関する効果を無くすことができなかった。このような結果からＫ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制は、他の新規経路で行われると判断される。
【００５９】
また、不溶性分画でスネイルによるｐ５３の分布を検討した結果、図１２Ａのように、ｐ５３は、スネイルまたは発癌性Ｋ−Ｒａｓによって減少し、細胞を４つの分画、すなわち、核、細胞質、膜／器官及び不溶性分画に分けて検討した結果、図１２Ｂのように、スネイルによって減少したｐ５３は、いかなる細胞分画でも回復されなかった。
【００６０】
また、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞でスネイルの除去がｓｉ−ＭＤＭ２より圧倒的にｐ５３を誘導した（図１２Ｃ）。そして、図１２Ｄ及び図１２Ｅのように、スネイルによるｐ５３の減少は、ＭＤＭ２−媒介抑制とは異なってプロテアソーム阻害剤によって回復されなかった。
＜実施例２＞
１．ウェスタンブロット及び生体外のキナーゼまたはバインディング分析
【００６１】
Ｓｎａｉｌ及びｐ５３間の直接結合を検討するために、典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル移動方式を通じて組替えｐ５３またはＳｎａｉｌまたはｐ５３形質感染された細胞溶出物でローディングされたメンブレンを準備した。５％非脂肪乾燥油でブロッキングした後、メンブレンをｐ５３またはＳｎａｉｌ形質感染されたｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞溶出物で４℃で４時間培養した。洗浄後、メンブレンをｐ５３  ＡｂまたはＳｎａｉｌ  Ａｂを用いて典型的なＷＢ手続きを進行した。
【００６２】
インビトロ結合のために、再結合ｐ５３及びＧＳＴ−Ｓｎａｉｌを交互に４℃で１時間培養し、ｐ５３  ＡｂまたはＧＳＴ  Ａｂを有したＩＰ及びＧＳＴまたはｐ５３  Ａｂを有したＷＢを行った。Ｓｎａｉｌの変形を調査するために、２９３細胞を形質感染のために使った。フラクションまたはリシス後、溶出物をＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｓｎａｉｌで２５℃で１時間培養し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢ分析を行った。ｐ−ＭＡＰＫ及びｐ−ＡＴＭ／ＡＴＲ基質に対する抗体をｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。
２．実験結果
【００６３】
図３Ａに示したように、スネイル発現に対するＫ−Ｒａｓの効果を検討した結果、スネイルがＫ−Ｒａｓによって誘導されうるということを観察した。また、細胞株でｐ５３発現に対するスネイルの効果を検討した結果、図３Ｂのように、スネイルの過発現がＡ５４９及びＨｅｐＧ２細胞株でｐ５３を抑制することができる一方、スネイルノックダウンがＡ５４９（発癌性Ｋ−Ｒａｓ含有細胞株）でのみｐ５３を誘導するだけで、ＨｅｐＧ２では誘導することができなかった。
【００６４】
また、ｓｉ−スネイルがＤＮＡ損傷薬剤に対して敏感性を増加させ（図４Ｆ）、したがって、スネイルの過発現が細胞増殖を増進させてＤＮＡ損傷誘導性細胞死に抵抗性を表わした（図４Ｇ）。
【００６５】
図３Ｃのように、スネイルは、Ｋ−Ｒａｓと同様にｅｎｄｏ−ｐ５３だけではなく、ｅｘｏ−ｐ５３を抑制し、図３Ｄないし図３Ｆのように、スネイルとｐ５３とを共に形質感染させた時、突然変異ｐ５３と関係なくスネイル及びｐ５３いずれも減少した。しかし、スネイル及びｐ５３のｍＲＮＡは減少しなかった（図３Ｃ及び図３Ｄ）。また、ｐ５３転写物に対するスネイルの効果を検討した結果、スネイルは、ｐ５３  ｍＲＮＡを減少させなかった（図４Ｈ）。
【００６６】
したがって、ｐ５３及びスネイルは、たとえよく知られた転写調節剤であるとしても、これらの減少は、転写調節と無関係であるいうことを示唆する。また、図３Ｇ及び図３Ｈのように、スネイルの除去がＫ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制を遮断することができる。また、図５Ａ及び図５Ｂのように、ｅｘｏ−ｐ５３でも類似した結果を得た。このような結果からＫ−Ｒａｓ媒介ｐ５３抑制は、スネイル誘導を通じて得られるということが分かる。
【００６７】
また、図５Ｃのように、発癌性Ｋ−Ｒａｓは、４時間以内にｐ５３を誘導する一方、ｐ５３は６時間後に減少し、これは、ｐ５３抑制が形質感染の人為的結果ではなく、形質感染されたタンパク質の効果であるということを表わす。
【００６８】
また、図５Ｅのように、Ｋ−Ｒａｓ／スネイル形質感染された細胞でアポトーシス及び細胞周期を検討し、アポトーシス及び細胞周期阻害は、Ｋ−Ｒａｓ／スネイルによって明らかに誘導されなかった。
【００６９】
また、Ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ処理細胞でＫ−Ｒａｓ／スネイルによってｐ５３の減少が観察されて、ｐ５３の減少は細胞周期とは関連しないものと判断される。
【００７０】
また、ＣＨＸ−ｐｕｌｓｅ  ｃｈａｓｅを通じてｐ５３の半減期を対するスネイルの効果を検討し、図５Ｆのように、スネイルは、ｐ５３半減期を短縮させなかった。そして、ｐ５３  Ｓ４６Ｄの発現に対するスネイルの効果を検討し、図６Ａのように、スネイルがＫ−Ｒａｓと異なってｐ５３  Ｓ４６Ｄ発現を抑制した。
【００７１】
また、スネイル発現に対するｐ５３  Ｓ４６Ｄの効果を検討した結果、図６Ｂのように、Ｓ４６Ｄが転写及び翻訳レベルでスネイル発現を抑制した。したがって、ｓｉ−スネイルがｐ５３抑制を回復させることができる野生型ｐ５３とは異なって、図６Ｃのように、Ｓ４６Ｄで形質感染される場合には、ｓｉ−スネイルがｐ５３発現を誘導することができなかった。
【００７２】
このような結果から或るストレス条件下でセリン４６残基で変形によって活性化されたｐ５３は、スネイル転写物の抑制を通じてＫ−Ｒａｓ媒介抑制機転を克服することができる。
【００７３】
また、スネイル誘導がＡＴＲを通じてなされた。
Ｋ−Ｒａｓが、スネイルを如何に誘導するかを検証するために、ＡＫＴの関連を検討した。Ｒａｓは、ＡＫＴを活性化してＧＳＫ−３β媒介スネイル不安定性を抑制できると知られている。
【００７４】
しかし、図７Ａのように、ＡＫＴ−ＫＤは、スネイルまたはＫ−Ｒａｓ誘導ｐ５３抑制を遮断することができなかった。一方、図７Ｂのように、ｓｉ−ＲＮＡを通じるＡＴＲの抑制がｐ５３抑制を遮断した。また、図７Ｃ及び図７Ｄのように、スネイルは、ＡＴＲ処理によって増加するが、ＡＴＭ及びノコダゾール処理によっては増加しなかった。図６Ｄのように、インビトロキナーゼ分析でスネイルは、ＡＴＲによってリン酸化された。ＡＴＲを活性化させるものと知られたＫ−Ｒａｓは、図７Ｅのように、ｐ−スネイルをＡＴＲ−依存性方式と同様に増加させ、図７Ｆのように、スネイルの半減期を延長させた。
＜実施例３＞
１．再組合タンパク質及びＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ分析
【００７５】
３つの人間Ｓｎａｉｌ断片（残基１−９０、９１−１１２及び１１３−２６４）及びｐ５３断片（１−９３及び９３−２９２）をＧＳＴ−融合タンパク質として大膓菌で発現した。各断片をＧＳＨ−アガロースにローディングし、洗浄した後、２０ｍＭ還元グルタチオンを含有した緩衝液を用いて溶出した。溶出分画を陰イオン−交換クロマトグラフィー（ＨｉｔｒａｐＱ）を用いて錠剤した。再組合人間ｐ５３タンパク質（残基９４−２９２）をベクターｐＥＴ２８Ａを用いて大膓菌で発現させた。前記ベクターｐＥＴ２８Ａは、Ｃ末端にヘキサ−ヒスチジンタグを含有した。
【００７６】
Ｎｉ−ＮＴＡ親和力及び大きさ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）を用いてｐ５３タンパク質を錠剤した。ｐ５３及びＳｎａｉｌ間の直接結合を検討するために、アガロース−ビーズ接合ＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｓｎａｉｌを４℃で４５分間ＲＩＰＡで細胞溶出物、またはＨｉｓ−ｐ５３と培養した。ＰＢＳ及びＲＩＰＡで洗浄した後、沈澱されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢを行った。
【００７７】
２．実験結果
スネイルは、核タンパク質であるために、スネイル及びｐ５３を共に形質感染させた時、スネイル及びｐ５３がいずれも消えた（図３Ｄないし図３Ｆ参照）。図８Ａのように、ｅｎｄｏ−ＩＰからこれらタンパク質が互いに関連するということが分かった。図８Ｂ及び図８Ｃのように、Ｆａｒ−ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析及びＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ分析を通じてスネイル及びｐ５３が互いに直接的に相互作用するというが分かった。また、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン及びスネイルの中間領域が、結合ドメインとして役割を行った（図８Ｄないし図８Ｆ、図６Ｅ、図６Ｆ参照）。
＜実施例４＞
１．化学的スクリーニングのためのＥＬＩＳＡシステムの製造
【００７８】
Ｓｎａｉｌ−ｐ５３結合阻害剤を分離するために、ＥＬＩＳＡシステムを製造した。０．５％  ＰＦＡを用いて９６ウェルプレートにＨｉｓ−ｐ５３（９３−２９２）を固定させた。乾燥して洗浄した後、０．１μＭ化学物質を有したＧＳＴ−Ｓｎａｉｌで培養した。１時間培養後、９６ウェルプレートをＴＢＳＴで洗浄して抗−ＧＳＴ−Ａｂ（１：１００００、４５分）及び抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５００００、３０分）で培養した。２回洗浄後、プレートをＴＭＢ溶液及び停止液で培養した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定した。
２．実験結果
【００７９】
図９Ａ及び図９Ｂのように、ｐ５３及びスネイル間の結合抑制をＥＬＩＳＡシステムで検討した。図９Ｃのように、１５０余個の化学物質からスネイル及びｐ５３の結合阻害剤で３つの化学物質を同定した。図１０Ａ及び図１１Ａのように、このような化学物質は、濃度依存的にスネイル及びｐ５３間の結合を抑制した。
【００８０】
ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ分析を通じて、このような化合物処理後、ｐ５３及びその標的の発現を検討し、３つの化学物質がいずれもｐ５３及びスネイルの相互作用発現を抑制し、ｐ５３発現を誘導した（図８Ｂ及び図１１Ｂ）。
【００８１】
また、図１０Ｃのように、このような化学物質処理によってＰＵＭＡ及びｐ２１の誘導を観察することができた。特に、ｐ５３の誘導がＫ−Ｒａｓ突然変異細胞でのみ検出され、野生型Ｋ−Ｒａｓ細胞では検出されなかった（図１０Ｄ）。ケルセチン及びモリンの類似した構造が、本発明のスクリーニングシステムの信頼性を高めた（図１０Ｅ）。
【００８２】
また、スネイル媒介ｐ５３抑制に対する化学物質の効果を検討し、図１０Ｅ及び図１０Ｆのように、スネイルの共形質感染によるｐ５３の減少が、＃３及び＃９による化学物質処理によって遮断された。このような結果からｐ５３−スネイルの相互作用の遮断が、ｐ５３発現を回復することができる。
【００８３】
また、トリパンブルー染色を用いて細胞増殖に対するこれら化学物質の効果を検討した。Ａ５４９で、これら化学物質が細胞増殖を明らかに抑制した一方、ＭＫＮ４５（Ｋ−Ｒａｓ野生型細胞）に対する抗増殖効果を示していない（図１１Ｃ）。
【００８４】
そして、フェルラ酸は、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞で細胞死を誘発した（図１１Ｄ）。また、ケルセチン（＃２）は、スネイル−ｐ５３相互作用抑制剤として確認された。
［ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインのエンドサイトーシスを利用したＫ−Ｒａｓ突然変異細胞の特異的に薬物伝達方法の考察］
＜実施例５＞
【００８５】
１．ｐ５３の核から細胞質への移動機転の検討
ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ分析のために、先ず人間スネイル及びｐ５３再組合タンパク質を知られた方法によって製造した（Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １１：１−１０，２００９）。培地及び前細胞ライセートでｐ５３及びスネイル間の直接的な結合を検討するために、アガロース−ビーズ接合ＧＳＴまたはＧＳＴ−スネイルを細胞ライセートまたは培養培地と４℃で２時間培養した。ＰＢＳ及びＲＩＰＡで洗浄後、沈降されたタンパク質を以前方法と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢに適用した。
２．実験結果
【００８６】
ｐ５３の核から細胞質への移動配列で変異を起こすｐ５３  ＮＥＳに対するスネイルの効果を検討した結果、スネイルは、ｐ５３  ＮＥＳ発現を減少させ（図１３Ａ）、レプトマイシンＢ（ＬＭＢ；核から細胞質への移動遮断剤）は、スネイル媒介−ｐ５３減少を遮断することができなかった（図１３Ｂ及び図１３Ｃ）。スネイルによるｐ５３減少がリアルタイムで確認された（図１３Ｄ）。培養培地でｐ５３の発現を検討した結果、２時間以内に培地でｐ５３の発現を検出することができた（図１３Ｅ）。そして、ｐ５３は、スネイルまたはＫ−Ｒａｓ形質感染細胞で小嚢のような構造でサイトゾルから検出され、最終的に、細胞外の領域から検出された（図１３Ｆ）。一方、スネイルは、ｐ５３と共にサイトゾルの小嚢に存在した（図１７Ａ）。
【００８７】
Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞でｐ５３の分泌を検討するために、培養培地及び細胞ライセートでスネイル−ＧＳＴを利用したＧＳＴ−Ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ分析を行った。スネイル関連ｐ５３が、あらゆる細胞ライセートから検出されても、Ｋ−Ｒａｓ突然変異膵膓癌細胞株でのみ培地ｐ５３を観察することができた（図１３Ｇ）。また、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞の培養培地でスネイル−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎなしに培地ｐ５３を観察することができた（図１３Ｈ）。
【００８８】
ｐ５３は、小嚢のような輸送を通じて減少するために、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ；Ｎｏｃ）による細胞骨格ネットワークを妨害してｐ５３の発現を検討した結果、Ｎｏｃ処理は、スネイルまたはＫ−Ｒａｓ媒介ｐ５３減少を遮断することができた（図１４Ａ）。Ｎｏｃ−処理細胞でｐ５３のサイトゾル小嚢性染色にもかかわらず、細胞形象は対照群と区別されるように変化された（図１４Ｂ）。Ｎｏｃは、ｐ５３減少を遮断することができた（図１４Ｃ）。Ｎｏｃ−処理によって培地ｐ５３が消えた一方、ｐ５３は小嚢として細胞質で蓄積された（図１４Ｄ及び図１４Ｅ）。Ａｐｈ／Ｎｏｃは、ｐ５３の減少を遮断することができ、これは、ＬＭＢによって得られることができなかった（図１４Ｆ及び図１４Ｇ）。
＜実施例６＞
１．細胞外ｐ５３及びスネイルの態様検討
【００８９】
１）組職分析
正常及び腫瘍が一対を成す胆管癌及び肝組職を順天郷医薬センターから得た。組職をｄｅｅｐ  ｆｒｅｅｚｅｒで素早く凍結し、該凍結された組職を切って０．５ｍｇの組職を０．２５ｍＬ血清フリー培地で３７℃で３０分間培養して組職液を遊離した。培養後、培養培地を集めて０．５ｍＬ  １００％  ＥｔＯＨで沈降させた。該沈降された物質をＲＩＰＡを用いて溶解させ、以前方法と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢ分析を行った。また、同じ方法で同一培養培地を得てｐ５３  Ａｂを検出した。
【００９０】
２）ｐ５３  ＥＬＩＳＡ分析
ｐ５３の調査のために、製造者の指針（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ）によってＥＬＩＳＡを行った。すなわち、０．２ｍＬ組職培養培地を各ウェルに加えて検出Ａｂと培養した。洗浄緩衝液で洗浄した後、０．２ｍＬ基質ゾル及び０．０５ｍＬ停止液を加えた。
【００９１】
３）血液試料でスネイルＡｂ検出
人間血液試料を順天郷大学（膵膓癌及び胆石患者）から得て、釜山大学の医薬センター（肺癌）から得た。正常血液試料を志願者または癌ではない患者から集めた。血清は遠心分離して集め、使用前まで−７０℃で保管された。３μｌの血清をＧＳＴ−タンパク質と事前承認後、アガロース−接合ＧＳＴ−スネイル−Ｎと培養した。沈降されたＧＳＴ−スネイル−Ａｂ複合体は、ＲＩＰＡ及びＳＤＳ試料緩衝液で溶解し、以前方法と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用した。ＰＶＤＦ膜に移した後、タンパク質を抗−人間Ａｂ及び抗−ＧＳＴ  Ａｂと培養した。
２．実験結果
【００９２】
先ず、Ａ５４９及びＭＫＮ４５細胞に組替えｐ５３を処理し、これらの位置を調査した。培地から回収された対照群タンパク質（Ｈｉｓ−ｌａｍｉｎ  Ａ）と比較して、Ｈｉｓ−ｐ５３は、Ａ５４９の前細胞ライセートで発現された（図１５Ａ）。そして、Ｈｉｓ−ｐ５３は、ＭＫＮ４５細胞及びその培養培地で完全に除去された（図１５Ａ）。
【００９３】
より具体的な検討のために、本発明では、新鮮な培地、Ａ５４９−培養培地、ＰＣ３及びＨＣＴ１１６を用いて組替えｐ５３を培養した。培地で回収されたＨｉｓ−ｌａｍｉｎＡと比較して、ｐ５３−Ｈｉｓは、ＨＣＴ１１６の前細胞ライセートから検出された。そして、ｐ５３はＰＣ３だけではなく、Ａ５４９培養培地で回収されなかった。このような結果からｐ５３は、培養された細胞から分泌されるプロテアーゼによって消化され、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞によって再吸収されるということが分かる。
【００９４】
また、プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ）及びエンドサイトーシス阻害剤（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ；ＢＦＡ）をＡ５４９及びＣａｐａｎ−１に処理した。細胞内ｐ５３発現に対する未反応にもかかわらず、これら化合物は、培地ｐ５３の発現を増加させた（図１５Ｂ）。ＢＦＡは、Ａ５４９前細胞ライセートで組替えｐ５３の局在を遮断した（図１５Ｃ）。
【００９５】
分泌されたスネイルの態様を確認するために、再組合スネイルで処理してｐ５３の目的地を比較した。ｐ５３中間領域は、Ａ５４９のＷＣＬから回収され、これは、ＢＦＡによって抑制された。しかし、ＭＫＮ４５に処理された組替えｐ５３は、培地及びＷＣＬで消えた。このような結果から分泌されたｐ５３は、セリンプロテアーゼだけではなく、ＭＭＰのような他種のプロテアーゼによって消化されると判断された。一方、スネイルは、培地から回収され、プロテアーゼ阻害剤なしに再組合スネイルを回収した。このような結果からスネイルは、プロテアーゼ媒介消化だけではなく、エンドサイトーシスに抵抗性があると判断された。
【００９６】
ｐ５３−エンドサイトーシスに対するＫ−Ｒａｓの効果を検討した結果、組替えｐ５３は、Ｋ−Ｒａｓ形質感染細胞によって選択的に除去された。ｐ５３中間領域が、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞によって選択的に再び入ることができるならば、このような特徴は、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞に対する化合物の伝達のために非常に有用である。
【００９７】
それを確認するために、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｅ；Ｒｅｄ  ｄｙｅ、５０ｕｇ／ｍＬ）及びＨｉｓ−ｐ５３（２ｕｇ／ｍＬ）をＡ５４９及びＭＫＮ４５に処理した結果、ＰＩのみ処理した場合には、二つの細胞株で細胞として蓄積されなかったが、ＰＩ及びｐ５３を共に処理すれば、Ａ５４９の細胞内にＰＩの蓄積を観察することができた（図１５Ｅ、図１６Ａないし図１６Ｂ）。しかし、ＭＫＮ４５では、このような観察ができなかった。このような結果からｐ５３は、Ｋ−Ｒａｓ特異的薬物伝達システムとして有用であると判断された。
【００９８】
スネイル媒介分泌されたｐ５３によってｐ５３の自動Ａｂが生成されるか否かを検討するために、組職液でのｐ５３及びスネイルの発現態様を調査した結果、胆管癌では、ｐ５３及びスネイルが検出されたが、肝癌細胞種及び非癌組職液では検出されなかった（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。図１７Ｃのように、ＥＬＩＳＡを用いて組職液でのｐ５３の存在を確認した結果、抗−ｐ５３  Ａｂ及び抗−スネイルＡｂは胆管癌では検出されたが、肝癌細胞種では検出されなかった（図１７Ｄ及び図１７Ｅ）。また、膵膓癌または胆管癌患者の血清でｐ５３及びスネイルに対する自動Ａｂを調査した結果、抗−ｐ５３  Ａｂは、癌と関連性を示していない。このような結果からｐ５３自動Ａｂは、癌の状態と関連しないものと判断され、分泌されたｐ５３は、迅速にプロテアーゼ及びエンドサイトーシスによって除去された（図１５Ａ）。
【００９９】
【表１】
2014115294.tif 000009
【０１００】
一方、スネイルは、プロテアーゼ及びエンドサイトーシスに対する抵抗性を表わした（図１５Ｄ）。したがって、血清でスネイル自動Ａｂを測定した。スネイルＡｂの発現は、膵膓癌患者の血清及び胆石患者の血清から検出された（図１５Ｆ）。一方、スネイルＡｂは、正常健康人では検出されなかった（図１５Ｇ）。また、肺癌患者の血清でも、スネイルＡｂが観察された（図１８）。したがって、スネイルＡｂの存在が癌診断マーカーとして非常に有用であると判断された。
【０１０１】
【表２】
2014115294.tif 000010
【０１０２】
［スネイル−ｐ５３間の結合阻害剤の同定］
＜実施例１＞
１−１．２−メチルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ａ）の合成
【０１０３】
１口１００ｍｌのラウンドフラスコに、１，４−ナフトキノン（１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）０．６１７ｍＭをメタノール３０ｍｌに溶解させた後、ナトリウムチオメトキシド（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）１．５４ｍＭを入れて一晩中撹拌させた。反応混液に飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍｌを入れてクロロホルム５０ｍｌで３回抽出した後、有機層を無水芒硝で脱水させた後、濾過した。該濾過した濾液を減圧濃縮して得た残渣をメタノールで再結晶して黄色結晶の表題化合物を得た。
【０１０４】
収率：１４．０％、融点：１８５−１８６℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１２−８．０７（ｍ、２Ｈ）、７．７８−７．７０（ｍ、２Ｈ）、６．５８（ｓ、１Ｈ）、２．４０（ｓ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２０５．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−２．２−エチルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｂ）の合成
【０１０５】
前記実施例１−１の合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、エチルメルカプタン（Ｅｔｈｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶の表題化合物を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１０６】
収率：４０．７％、融点：１３５−１３６℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１２−８．０８（ｍ、２Ｈ）、７．７８−７．６９（ｍ、２Ｈ）、６．６２（ｓ、１Ｈ）、２．８７（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．４４（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２１９．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−３．２−プロピルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｐｒｏｐｙｌｔｈｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｃ）の合成
【０１０７】
前記実施例１−１の合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、プロピルメルカプタン（Ｐｒｏｐｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶の表題化合物を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１０８】
収率：３３．９％、融点：１１８−１１９℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１２−８．０７（ｍ、２Ｈ）、７．７７−７．６８（ｍ、２Ｈ）、６．６１（ｓ、１Ｈ）、２．８２（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．８６−１．７７（ｍ、２Ｈ）、１．１１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２３３．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−４．２−ブチルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｂｕｔｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｄ）の合成
【０１０９】
前記実施例１−１の合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、ブチルメルカプタン（Ｂｕｔｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶２−ブチルチオ−１，４−ナフトキノン（１ｄ）を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１１０】
収率：３３．９％、融点：９７−９８℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１２−８．０７（ｍ、２Ｈ）、７．７７−７．６８（ｍ、２Ｈ）、６．６１（ｓ、１Ｈ）、２．８４（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．８０−１．７２（ｍ、２Ｈ）、１．５７−１．４８（ｍ、２Ｈ）、０．９８（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２４７．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−５．２−ペンチルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｐｅｎｔｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｅ）の合成
【０１１１】
前記合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、ペンチルメルカプタン（ｐｅｎｔｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶の表題化合物を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１１２】
収率：１５．３％、融点：１１１−１１２℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１１−８．０６（ｍ、２Ｈ）、７．７７−７．６８（ｍ、２Ｈ）、６．６０（ｓ、１Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．１７−１．７４（ｍ、２Ｈ）、１．５１−１．３３（ｍ、４Ｈ）、０．９３（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２６１．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−６．２−ヘキシルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｈｅｘｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｅ）の合成
【０１１３】
前記実施例１−１の合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、ヘキシルメルカプタン（ｈｅｘｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶の表題化合物を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１１４】
収率：１５．０％、融点：１０１−１０２℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１３−８．０８（ｍ、２Ｈ）、７．７７−７．６９（ｍ、２Ｈ）、６．６１（ｓ、１Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．８１−１．７３（ｍ、２Ｈ）、１．５６−１．４６（ｍ、２Ｈ）、１．３５−１．３１（ｍ、４Ｈ）、０．９１（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２７５．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−７．２−ヘプチルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｈｅｐｔｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｇ）の合成
【０１１５】
前記実施例１−１の合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、ヘブチルメルカプタン（ｈｅｐｔｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶の表題化合物を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１１６】
収率：４６．４％、融点：１１４−１１５℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１２−８．０７（ｍ、２Ｈ）、７．７７−７．６８（ｍ、２Ｈ）、６．６１（ｓ、１Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝１４．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．７７（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．５２−１．４５（ｍ、２Ｈ）、１．３５−１．２９（ｍ、６Ｈ）、０．９０（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２８９．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−８．２−オクチルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｏｃｔｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｈ）の合成
【０１１７】
前記実施例１−１の合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、オクチルメルカプタン（ｏｃｔｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶の表題化合物を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１１８】
収率：７６．８％、融点：１１４−１１５℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１２−８．１０（ｍ、２Ｈ）、７．７８−７．７０（ｍ、２Ｈ）、６．６１（ｓ、１Ｈ）、２．８４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．７７（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．４９−１．４７（ｍ、２Ｈ）、１．３５−１．２９（ｍ、８Ｈ）、０．８９（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ３０４．５（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−９．２−ノニルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｎｏｎｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｉ）の合成
【０１１９】
前記実施例１−１の合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、ノニルメルカプタン（ｎｏｎｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶の表題化合物を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１２０】
収率：８７．４％、融点：１０５−１０６℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１２−８．０７（ｍ、２Ｈ）、７．７７−７．６８（ｍ、２Ｈ）、６．６１（ｓ、１Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．７７（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．５１−１．４５（ｍ、２Ｈ）、１．３３−１．２９（ｍ、１０Ｈ）、０．８９（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ３１７．５（Ｍ＋Ｈ）＋。
１−１０．２−デシルチオ−１，４−ナフトキノン（２−Ｄｅｃｙｌｔｈｉｏ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、１ｊ）の合成
【０１２１】
前記実施例１−１の合成方法と同じ方法で製造するが、単にナトリウムチオメトキシドの代りに、デシルメルカプタン（Ｄｅｃｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ）を使って黄色結晶の表題化合物を得た。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１２２】
収率：８７．４％、融点：１０１−１０２℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ８．１２−８．０８（ｍ、２Ｈ）、７．７７−７．６８（ｍ、２Ｈ）、６．６１（ｓ、１Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．７７（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．５０−１．４２（ｍ、２Ｈ）、１．３３−１．２９（ｍ、１２Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ３３１．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
＜実施例２＞
２−１．２−メチルアミノ−５，８−ジメトキシ−１．４−ナフトキノン（２−Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−５，８−  ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４  −ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ａ）の合成
【０１２３】
１口１００ｍｌのラウンドフラスコに、前から製造された５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、４）を０．４５ｍＭをメタノール３０ｍｌに溶解させた後、メチルアミン（Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）０．６８７ｍｍｏｌを入れて室温で３時間撹拌させた。反応混液に重クロム酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｍ  ｄｉｃｈｒｏｍａｔｅ）０．６４ｍＭと硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）０．１８ｍＭとを水に溶解させてゆっくり滴加した後、室温で３分間撹拌した。反応混液に飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍｌを入れてクロロホルム５０ｍｌで３回抽出した後、有機層を合わせて無水芒硝で脱水させた後、濾過した。該濾過した濾液を減圧濃縮して得た残渣をシリカゲルカラム分離を通じてさび色の表題化合物を得た。表題化合物の収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１２４】
収率：５６．７％、融点：２０３−２０４℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．６ＭＨｚ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝９．２ＭＨｚ、１Ｈ）、５．７５（ＢＲ、１Ｈ）、５．６０（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、２．８７（ｄ、Ｊ＝５．２ＭＨｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２４８（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−２．２−エチルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｂ）の合成
【０１２５】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、エチルアミン（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｂ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１２６】
収率：２３．６％、融点：１７２−１７３℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．６３（ＢＲ、１Ｈ）、５．６１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．０９（ｑ、２Ｈ）、１．２９（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２６２．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−３．２−プロピルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｃ）の合成
【０１２７】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、プロピルアミン（ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｃ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１２８】
収率：４６．５％、融点：１７５−１７６℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．７２（ＢＲ、１Ｈ）、５．６１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．０９（ｑ、２Ｈ）、１．６８（Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、０．９９（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２７６（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−４．２−ブチルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｄ）の合成
【０１２９】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、ブチルアミン（ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｄ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１３０】
収率：４６．２％、融点：１０４−１０５℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０（ＢＲ、１Ｈ）、５．６１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１１（ｑ、２Ｈ）、１．６４（ｐ、２Ｈ）、１．４６−１．３８（ｍ、２Ｈ）、０．９５（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ２９０（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−５．２−ペンチルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｏ−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｅ）の合成
【０１３１】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、ペンチルアミン（ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｅ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１３２】
収率：５５．９％、融点：１０２−１０３℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．２ＭＨｚ、１Ｈ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０（ＢＲ、１Ｈ）、５．６１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１１（ｑ、２Ｈ）、１．２９（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ３０３．６（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−６．２−ヘキシルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｆ）の合成
【０１３３】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、ヘキシルアミン（Ｈｅｘｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｆ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１３４】
収率：４７．３％、融点：８３−８４℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９（ＢＲ、１Ｈ）、５．６１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１１（ｑ、２Ｈ）、１．６６−１．５８（ｍ、４Ｈ）、１．３２−１．３０（ｍ、４Ｈ）、０．８９（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ３１８（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−７．２−ヘブチルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｈｅｐｔｙｌａｍｉｎｏ−５，８−  ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｇ）の合成
【０１３５】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、ヘブチルアミン（Ｈｅｐｔｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｇ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１３６】
収率：４１．８％、融点：７４−７５℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３３（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９（ＢＲ、１Ｈ）、５．６０（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１１（ｑ、２Ｈ）、１．６６−１．６１（ｍ、２Ｈ）、１．３５−１．２９（ｍ、８Ｈ）、０．８９（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ３３２（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−８．２−オクチルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｏｃｔｙｌａｍｉｎｏ−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｈ）の合成
【０１３７】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、オクチルアミン（ｏｃｔｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｈ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１３８】
収率：４５．１％、融点：８１−８２℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９（ｂｒ、１Ｈ）、５．６１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１１（ｑ、２Ｈ）、１．６８−１．６１（ｍ、２Ｈ）、１．４１−１．２０（ｍ、１０Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ３４６（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−９．２−ノニルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｎｏｎｙｌａｍｉｎｏ−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｉ）の合成
【０１３９】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、ノニルアミン（ｎｏｎｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｉ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１４０】
収率：４４．０％、融点：８５−８６℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９（ｂｒ、１Ｈ）、５．６１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１１（ｍ、２Ｈ）、１．６６−１．６１（ｍ、２Ｈ）、１．４１−１．２０（ｍ、１２Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ３６０（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−１０．２−デシルアミノ−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（２−Ｄｅｃｙｌａｍｉｎｏ−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｊ）の合成
【０１４１】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、デシルアミン（ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｊ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１４２】
収率：１７．６％、融点：８６−８７℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３３（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９（ｂｒ、１Ｈ）、５．６０（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１１（ｑ、２Ｈ）、１．６６−１．６１（ｍ、２Ｈ）、１．４０−１．２０（ｍ、１４Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ３７４（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−１１．２−（２−ヒドロキシエチルチオ）−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン［２−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｋ］の合成
【０１４３】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｋ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１４４】
収率：５９．５％、融点：１１７−１１８℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２８（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．６１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、６Ｈ）、３．９３（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．０５（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、ｍ／ｚ  ３１６．９（Ｍ＋Ｎａ）＋。
２−１２．２−（３−ヒドロキシプロピルチオ）−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン［２−（３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ）−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｌ］の合成
【０１４５】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、３−メルカプト−１−プロパノール（３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｌ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１４６】
収率：６９．９％、融点：１２５−１２６℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３３（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．５１（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、６Ｈ）、３．８１（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．９１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．９９（ｍ、２Ｈ）、ｍ／ｚ  ３３１．１（Ｍ＋Ｎａ）＋。
２−１３．２−（４−ヒドロキシブチルチオ）−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン［２−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｌｔｈｉｏ）−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｍ］の合成
【０１４７】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、４−メルカプトブタノール（４−ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔａｎｏｌ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｍ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１４８】
収率：６４．０％、融点：１２２−１２３℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３３（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２９（ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．４６（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９５（ｓ、３Ｈ）、３．７１（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．８７−１．８１（ｍ、２Ｈ）、１．７８−１．５０（ｍ、２Ｈ）、ｍ／ｚ  ３４５．１（Ｍ＋Ｎａ）＋。
２−１４．２−（６−ヒドロキシヘキシルチオ）−５，８−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン［２−（６−Ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘｙｌｔｈｉｏ）−５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、５ｎ］の合成
【０１４９】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、６−メルカプトヘキサノール（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘａｎｏｌ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｎ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１５０】
収率：３８．２％、融点：８７−８８℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３３（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．４５（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、６Ｈ）、３．６６（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．７６（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．７８−１．１２（ｍ、２Ｈ）、１．６１−１．２５（ｍ、６Ｈ）、ｍ／ｚ  ３７２．９（Ｍ＋Ｎａ）＋。
２−１５．３−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソナフタレン−２−イルチオ）プロパン酸［３−（５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｄｉｏｘｏ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−２−ｙｌｔｈｉｏ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、５ｏ］の合成
【０１５１】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、３−メルカプトプロピオン酸（３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｏ）を製造した。その収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１５２】
収率：８０．６％、融点：２０８−２０９℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３５（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．２８（ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．５１（ｓ、１Ｈ）、３．９７（ｓ、３Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．０７（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．８１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、ｍ／ｚ  ３４８．４（Ｍ＋Ｎａ）＋。
２−１６．１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−ナフタレン−２−イルチオ）ウンデカン酸［１１−（５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｄｉｏｘｏ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−２−ｙｌｔｈｉｏ）ｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、５ｐ］の合成
【０１５３】
前記実施例２−１のラウンドフラスコにメチルアミンの代りに、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を使用する点を除いては、実施例２−１の反応と同じ工程を行って表題化合物（５ｐ）を製造した。
【０１５４】
収率：７７．９％、融点：１４６−１４７℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３３（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．４６（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９５（ｓ、３Ｈ）、３．３４（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．７５（ｔ、Ｊ＝２．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．４１−２．３２（ｍ、５Ｈ）、２．０６−２．００（ｍ、２Ｈ）、１．７６−１．５６（ｍ、５Ｈ）、１．４８−１．３９（ｍ、２Ｈ）、０．９７−０．８８（ｍ、２Ｈ）、ｍ／ｚ  ４３５（Ｍ＋Ｈ）＋。
＜実施例３＞
３−１．５，８−ジメトキシ−２−［３−オキソ−３−（４−フェニルピペリジン−４−イル）プロピルチオ］−１，４−ナフトキノン［５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−２−（３−ｏｘｏ−３−（４−ｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）ｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，４−ｄｉｏｎｅ、６ａ］の合成
【０１５５】
１口１００ｍｌのラウンドフラスコに、前から製造された３−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イルチオ）プロパン酸、０．１６３ｍＭをクロロホルム４０ｍｌに溶解させた後、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）０．２６ｍＭと４−フェニルピペリジン（４−ｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）０．２６ｍＭとを入れて一晩撹拌させた。反応混液に１Ｎ塩酸溶液を入れた後、室温で３分間撹拌した。再び飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍｌを入れてクロロホルム５０ｍｌで３回抽出した後、有機層を合わせて無水芒硝で脱水させた後、濾過した。該濾過した濾液を減圧濃縮して得た残渣をシリカゲルカラム分離を通じてさび色の表題化合物（６ａ）を得た。表題化合物の収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１５６】
収率：７３．５％、融点：９４−９５℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３４−７．２８（ｍ、５Ｈ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、６．２６（ｓ、１Ｈ）、３．９５（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１４（ｔ、４Ｈ）、２．７９−２．７４（ｑ、４Ｈ）、２．６７（ｔ、Ｊ＝１２Ｈｚ、１Ｈ）、１．８９（ｔ、Ｊ＝１２．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．６５（ｔ、Ｊ＝１２．４Ｈｚ、２Ｈ）、ｍ／ｚ  ４６６．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
＜実施例４＞
４−１．イソブチル−１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イルチオ）−ウンデカノアート［Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１１−（５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｄｉｏｘｏ−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−２−ｙｌｔｈｉｏ）ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ、７ａ］の合成
【０１５７】
１口１００ｍｌのラウンドフラスコに、前から製造された１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イルチオ）ウンデカン酸（５ｐ）１．１５ｍＭをクロロホルム６０ｍｌに溶解させた後、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）１．３８ｍＭとイソブチルアルコール（ｉｓｏｂｕｔｙｌａｌｃｏｈｏｌ）１．３８ｍＭとを入れて一晩撹拌させた。反応混液に１Ｎ塩酸溶液を入れた後、室温で３分間撹拌した。再び飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍｌを入れてクロロホルム５０ｍｌで３回抽出した後、有機層を合わせて無水芒硝で脱水させた後、濾過した。該濾過した濾液を減圧濃縮して得た残渣をシリカゲルカラム分離を通じてさび色の表題化合物（７ａ）を得た。表題化合物の収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１５８】
収率：５２．４％、融点：５８−５９℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３２（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２６（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．４４（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９５（ｓ、３Ｈ）、３．８５（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．７５（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．３１（ｔ、７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．９６−１．８９（ｍ、１Ｈ）、１．７２−１．６８（ｍ、４Ｈ）、１．２９−１．２５（ｍ、１２Ｈ）、０．９４（ｓ、３Ｈ）、０．９２（ｓ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ４９１（Ｍ＋Ｈ）＋。
４−２．１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イルチオ）−Ｎ−イソブチルウンデカンアミド［１１−（５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，４−ｄｉｏｘｏ−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−２−ｙｌｔｈｉｏ）−Ｎ−ｉｓｏｂｕｔｙｌ  ｕｎｄｅｃａｎａｍｉｄｅ、７ｂ］の合成
【０１５９】
前記実施例４−１のラウンドフラスコにイソブチルアルコールの代りに、イソブチルアミンを使用する点を除いては、実施例４−１の反応と同じ工程を行って下記物性値を有する表題化合物（７ｂ）を得た。収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１６０】
収率：７７．９％、融点：７４−７５℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．３３（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４４（ｓ、１Ｈ）、５．５５（ｓ、１Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）、３．９５（ｓ、３Ｈ）、３．１０（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．７５（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．１７（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．７８−１．７（ｍ、２Ｈ）、１．６３（ｍ、２Ｈ）、１．４５（ｍ、１Ｈ）、０．９２（ｓ、３Ｈ）、０．９０（ｓ、３Ｈ）、ｍ／ｚ  ４９０．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
＜実施例５＞
５−１．イソブチル１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イルスルフィニル）ウンデカノアート［ｉｓｏｂｕｔｙｌ１１−（５，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｌ−１，４−ｄｉｏｘｏ−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−２−ｙｌ  ｓｕｌｆｉｎｙｌ）ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ、８］の合成
【０１６１】
１口１００ｍｌのラウンドフラスコに、前から製造されたイソブチル１１−（５，８−ジメトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロキシナフタレン−２−イルチオ）−ウンデカノアート０．１６３ｍＭ（７ａ）をジクロロメタン３０ｍｌに溶解させた後、３−クロロ過安息香酸（３−ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｙｂｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）０．１９６ｍＭを入れて２時間撹拌させた。反応混液に重炭酸ナトリウム溶液を入れた後、室温で３分間撹拌した。再び飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍｌを入れてクロロホルム５０ｍｌで３回抽出した後、有機層を合わせて無水芒硝で脱水させた後、濾過した。該濾過した濾液を減圧濃縮して得た残渣をシリカゲルカラム分離を通じて赤色の表題化合物（８）を得た。表題化合物の収率及び物性は、下記の通りであった。
【０１６２】
収率：４５．８％、融点：９２−９３℃、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ７．４１（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３６（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３１（ｓ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、３．９８（ｓ、３Ｈ）、３．８５（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．２８−３．２１（ｍ、１Ｈ）、２．９６−１．８９（ｍ、２Ｈ）、１．６９−１．５９（ｍ、４Ｈ）、１．４１−１．２３（ｍ、１２Ｈ）、０．９３（ｄ、Ｊ＝６．８ＭＨｚ、６Ｈ）、ｍ／ｚ  ５０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１６３】
前記方法で合成した化合物群を用いてスネイル−ｐ５３の結合抑制効果を次の実験を通じて確認した。
＜実験例１＞ｐ５３活性回復及びターゲット遺伝子誘導確認
【０１６４】
前記実施例１〜５で合成された化合物が、スネイル−ｐ５３結合阻害効果があるか、細胞レベルで効果的であるか否かを立証するために、前記化合物をＫ−Ｒａｓ突然変異型癌細胞株ＨＣＴ１１６に処理し、ウェスタンブロットを用いて、この結果を確認した。
【０１６５】
Ｋ−Ｒａｓは、スネイルの活性を抑制してｐ５３を誘導する作用をする遺伝子であって、前記細胞株ＨＣＴ１１６は、Ｋ−Ｒａｓの突然変異によってスネイルが常に発現してｐ５３と結合した後、ｐ５３が正常に作動しないようにする役割を果たす。前記Ｋ−Ｒａｓ突然変異型癌細胞株ＨＣＴ１１６にスネイル−ｐ５３結合を抑制する化合物を処理すれば、ｐ５３が正常作用することによって、発現量が増加してｐ５３のターゲット遺伝子が誘導される。
【０１６６】
優先的に、ｐ５３とターゲット遺伝子であるｐ２１との発現を確認するために、ウェスタンブロットを行った。本発明で使ったあらゆる細胞株は、ＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳを含有したＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭで維持された。ＲＩＰＡ緩衝液でタンパク質を抽出し、典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル移動方式を通じて細胞溶出物でローディングされたメンブレンを準備した。５％非脂肪乾燥油でブロッキングした後、各遺伝子に該当する抗体を用いて典型的なウェスタンブロット手続きを進行した。本発明で使われた抗体は、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＳａｎｔａＣｒｕｚから購買した。ｐ５３の活性は、ｐ５３のターゲット遺伝子であるｐ２１の発現量を通じて確認することができた。図１は、実施例１〜５で合成した化合物の一部を用いてＫ−Ｒａｓ突然変異型癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞でウェスタンブロットを行った結果を表わす図及びそれを数値化して表わしたグラフであり、表３は、この数値を表わした図表である。
【０１６７】
【表３】
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【０１６８】
前記化合物をＫ−Ｒａｓ突然変異型ＨＣＴ１１６癌細胞株に処理した時、対照群（ＤＭＳＯ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、前記化合物を１０μＭ濃度で処理した所でｐ５３を２〜５倍程度で、ｐ２１は、２〜８倍程度で発現量が大きく増加する化合物があるということを確認することができた（図２０及び表３参考）。前記化合物が、ｐ５３とｐ５３とのターゲット遺伝子であるｐ２１の発現量を増幅させたことは、スネイルが常に活性化されている状態のＫ−Ｒａｓ突然変異細胞株であるＨＣＴ１１６細胞でスネイルの役割が、前記化合物を通じて抑制されてスネイル−ｐ５３の結合阻害状態が維持されるということを表わす。
＜実験例２＞スネイル−ｐ５３結合阻害効果の確認
【０１６９】
次いで、ｐ５３とｐ２１とを同時に誘導しながら発現量が多かった前記化合物のうちから二つの化合物５ｏまたは７ａを選択して、Ｋ−Ｒａｓ、スネイル及びｐ５３の関係を確認するために使う。スネイル−ｐ５３の結合が阻害されるということを立証するために、前記二つの化合物５ｏ及び７ａを用いてＧＳＴプルダウン分析（ＧＳＴ  ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙ）を行って確認した。
【０１７０】
ＧＳＴプルダウン分析は、二つのタンパク質の結合程度を確認することができる方法でＧＳＴが融合されたスネイルタンパク質とｐ５３再組合タンパク質とを製造して、前記化合物５ｏあるいは７ａを共に処理してＧＳＴ−スネイルタンパク質とｐ５３タンパク質との結合程度を確認した。前記化合物の比較群としては、Ｎｕｔｌｉｎ−３を使った。Ｎｕｔｌｉｎ−３は、ｐ５３の陰性調節因子であるＭＤＭ２とｐ５３との結合を遮断する物質で多くの腫瘍細胞で過発現されるタンパク質として知られている。ＭＤＭ２が過発現されれば、ｐ５３のタンパク分解が誘導されてｐ５３のターゲット遺伝子を通じて起こるアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）などの反応を抑制し、細胞の抗増殖効果などを誘導する。代表的なｐ５３の調節因子であるが、Ｋ−Ｒａｓ突然変異性疾患や突然変異ｐ５３を有した疾患には作用しない。
【０１７１】
ＧＳＴプルダウン分析のために、３つの人間スネイル断片（残基１−９０、９１−１１２及び１１３−２６４）及びｐ５３断片（１−９３及び９３−２９２）をＧＳＴ−融合タンパク質として大膓菌で発現し、各断片をＧＳＨ−アガロースにローディングし、洗浄した後、２０ｍＭ還元グルタチオンを含有した緩衝液を用いて溶出した。溶出分画を陰イオン−交換クロマトグラフィー（ＨｉｔｒａｐＱ）を用いて錠剤した。再組合人間ｐ５３タンパク質（残基９４−２９２）をベクターｐＥＴ２８Ａを用いて大膓菌で発現させた。前記ベクターｐＥＴ２８Ａは、Ｃ末端にヘキサ−ヒスチジンタグを含有した。Ｎｉ−ＮＴＡ親和力及び大きさ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）を用いてヒスチジンが付いたｐ５３タンパク質を錠剤した。ｐ５３及びスネイル間の直接結合を検討するために、アガロース−ビーズ接合ＧＳＴまたはＧＳＴ−スネイルを４℃で４５分間ＰＢＳでＨｉｓ−ｐ５３９（ヒスチジン−ｐ５３）と培養した。ＰＢＳで洗浄した後、沈澱されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。
【０１７２】
図２１に示したように、ＧＳＴプルダウン分析結果を確認して見れば、対照群（ｃ）の場合、ＧＳＴ−スネイルとｐ５３とが多量に結合されていることを確認することができる。Ｎｕｔｌｉｎ−３もＭＤＭ２を調節してｐ５３活性を誘導する物質であるために、スネイル−ｐ５３の結合を阻害できず、対照群と類似している結合程度を表わしている。一方、前記二つの化合物５ｏと７ａとを使った分画では、ＧＳＴ−スネイルタンパク質にｐ５３が結合される程度が確実に減ることを確認することができ、前記化合物が、スネイル−ｐ５３の結合を抑制したということを立証することができた。
＜実験例３＞Ｋ−Ｒａｓ依存的なｐ５３誘導能の確認
【０１７３】
次いで、前記化合物が、正常細胞には作用せず、Ｋ−Ｒａｓ突然変異癌細胞にのみ選択的に作用して死滅させる能力があるか否かを確認するために、細胞生存率を通じて前記二つの化合物５ｏと７ａとに対する細胞毒性及び死滅効果をトリパンブルー溶液を用いて細胞数を測定して確認した。前記化合物のｐ５３誘導能が、Ｋ−Ｒａｓと関係があるかを検討するために、Ｋ−Ｒａｓ突然変異癌細胞株であるＡ５４９とＨＣＴ１１６、Ｋ−Ｒａｓ野生型癌細胞株であるＭＫＮ４５とを利用した。
【０１７４】
表４は、それぞれの細胞株に対する死滅率を数値化して表わした図表であり、図２２は、死滅率に対する数値を表わしたグラフである。
【０１７５】
【表４】
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【０１７６】
細胞死滅率を通じて表われた結果は、前記化合物５ｏが、Ｋ−Ｒａｓ突然変異癌細胞株であるＡ５４９とＨＣＴ１１６とから１０μＭ程度でそれぞれ５１％と５７％程度の死滅率を示し、７ａも同一濃度１０μＭでほぼ３４％と４４％程度の死滅率を示した（表４及び図２２参照）。一方、Ｋ−Ｒａｓ野生型癌細胞株であるＭＫＮ４５では、同一濃度１０μＭで前記化合物５ｏは、１５％程度の死滅率を、前記化合物７ａは、ほとんど１％の死滅率を示してＫ−Ｒａｓ突然変異型癌細胞株と確実に異なる結果を表わした。これにより、前記化合物が、Ｋ−Ｒａｓが正常に作用しない癌細胞株でのみ選択的に作用して高い死滅率を表わすことを確認することができた。これは、前記化合物が、Ｋ−Ｒａｓが損傷されている癌細胞にのみ選択的に作用することができ、Ｋ−Ｒａｓが損傷されて癌にかかった患者に有用であるということを暗示する。一方、Ｎｕｔｌｉｎ−３は、Ｋ−Ｒａｓ突然変異癌細胞株であるＡ５４９とＨＣＴ１１６細胞株で同一濃度１０μＭでそれぞれ１９％と３２％死滅率を表わし、Ｋ−Ｒａｓ野生型細胞株であるＭＫＮ４５では、同一濃度１０μＭで細胞死滅率が３８％程度でさらに高くなるなどの一括的ではない類型を表わすことを確認することができた。このように、Ｎｕｔｌｉｎ−３は、Ｋ−Ｒａｓが正常に作用をするか、突然変異状態であるものに関わらずに或る有意な反応を表わさず、Ｋ−Ｒａｓに選択的な反応を表わさないということを確認することができた。これで、前記化合物５ｏと７ａとがＮｕｔｌｉｎ−３と異なってＫ−Ｒａｓに選択的作用効果に優れるということを立証した。
＜実験例４＞ｐ５３のターゲット遺伝子の活性誘導
【０１７７】
次いで、突然変異ｐ５３がある時の前記化合物５ｏの効果を確認した。
前記化合物５ｏを突然変異ｐ５３類型であるＭＴ／ＷＴ−ｐ５３遺伝子を有するＭＤＡ−ＭＢ  ４６８という人間乳房癌細胞株に処理してウェスタンブロットを実施した。図２３は、ＭＤＡ−ＭＢに５ｏを処理して実施したウェスタンブロットの結果を表わすグラフであり、表５は、このグラフ値を数値で表わした図表である。
【０１７８】
【表５】
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【０１７９】
前記化合物５ｏとＮｕｔｌｉｎ−３とをｐ５３突然変異型癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ  ４６８に処理した時、５ｏが処理された所でのみ多量のｐ２１が発現されることを確認することができた。（図２３及び表５参照）。この結果からＮｕｔｌｉｎ−３は、突然変異ｐ５３がある時、ターゲット遺伝子であるｐ２１に何らの影響を及ぼすことができない一方、前記化合物５ｏは、ｐ２１の活性を誘導してＮｕｔｌｉｎ−３と差別的な影響力があるということを表わす。
＜実験例５＞生体内異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）の考察
【０１８０】
１．実験方法
非胸腺マウスをＤａｅｈａｎ  Ｂｉｏｌｉｎｋ  Ｃｏ．Ｌｔｄから購入し、温度及び光の調節条件（２０−２３℃、１２時間光／１２時間暗周期）下で生育させ、滅菌食餌と水とを自在に供給した。２週後、非胸腺マウス（ｎ＝２１）に腹腔注射を通じてＡ５４９細胞を１Ｘ１０７細胞で接種した。２週後、各グループを３つのサブグループに分けてＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの５ｏを一週間に一回ずつ１０週間腹腔内に投与し、生存率を観察した。動物試験は、釜山大学校動物保護委員会の承認及び指針によって行われた。
【０１８１】
２．実験結果
図２４のように、１０ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの５ｏの処理によって腫瘍による死亡率が遮断された一方、ＰＢＳ処理群では、１０週後に生存率が５０％以下になり、図２５に示したように、５ｏ処理群での腫瘍は、ほとんど死滅する形状が観察された。また、図２６のように、体重減少や化合物注射による総体的な解剖学的異常所見を観察することができなかった。下記表６は、腫瘍の発生位置及び形態学的特徴を要約したものである。
【０１８２】
【表６】
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【０１８３】
［配列目録フリーテキスト］
配列番号１は、人間ｐ５３細胞性腫瘍抗原のアミノ酸配列を表わしたものである。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明は、スネイル−ｐ５３間の結合を阻害する化合物及びそれを有効成分として含有する癌疾患治療剤関連の分野に適用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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