(57)【要約】【課題】肝臓を保護することに用いられるラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株の使用方法を提供する。【解決手段】  肝臓を保護することに用いられるラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株の使用方法を開示する。本発明は、また、上記ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を哺乳動物に投与する工程を含む、肝臓を保護する方法を開示する。本発明は、さらに、上記ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を含む、肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物を開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓を保護することに用いられるラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項２】
前記ラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株は、財団法人食品工業発展研究所での受託番号がＢＣＲＣ  ９１０４７２であり、ドイツ微生物細胞培養コレクションでの受託番号がＤＳＭ  ２３７８０である菌株であることを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項３】
アスパラギン酸アミノ基転移酵素、及び、アラニンアミノ基転移酵素のうち少なくとも一つの肝機能を評価する指標酵素を低減することを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項４】
血液、及び、肝臓のうち少なくとも一方のコレステロール量を低減することを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項５】
血液内の脂質を低減することを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項６】
血液内のアルコール濃度を低減することを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項７】
血液内の内毒素量を低減することを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項８】
肝臓内の内毒素量を低減することを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項９】
血液内の炎症性サイトカインＴＮＦ−αを低減することを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項１０】
アルコール、炎症性サイトカインＴＮＦ−α又は内毒素による肝炎を予防することを特徴とする請求項１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項１１】
前記ラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株を哺乳動物に投与する工程を含むことを特徴とするラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物は、ヒトであることを特徴とする請求項１１に記載のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法。
【請求項１３】
濃度が１×１０５ＣＦＵ／ｇ〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇである乾燥粉末状態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株を含み、肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物。
【請求項１４】
薬品、飼料、飲料、栄養補助剤、乳製品、食品、健康食品とする請求項１３に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項１５】
アルコール及び内毒素による肝炎、ならびに、内毒素による病変及び癌のうち少なくとも一方の発生を低減することで、肝臓病を予防又は治療する請求項１３に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項１６】
形が、粉剤、錠剤、造粒、坐薬、マイクロカプセル、アンプル、液剤、スプレー剤又は坐剤である請求項１３に記載のプロバイオティクス組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチラス‐プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）  ＣＭＵ９９５菌株の使用方法に関し、特に、肝臓を保護することに用いられるラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株の使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、ヒトまたは動物の腸管に存在する主要な細菌の１種である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、ヒトまたは動物の体の生理活性に対して有益な効果があるため、よく様々なプロバイオティクス製品に応用される。現在、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを病原体の抑制に応用することに関する、特許が多数ある。例えば、特許文献１に開示されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株は、エンテロトキシンおよび腸管侵入性病原体を抑制することができ、特許文献２に開示されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ菌株は、消化器系にある大腸菌の増殖を抑制することができ、特許文献３に開示されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌株は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染に起因する胃炎、十二指腸潰瘍および胃潰瘍を予防および治療することができる。
【０００３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが動物の体内で効果的に機能するためには、基礎的な生理的／薬理学的活性を備えなければならないほか、２つの重要な特徴を有さなければならない。まず、前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、動物の胃腸管によって分泌される胃酸およびコリンに対する耐性を有することで、消化器系を通過する過程で生き残り、腸管に到達してその機能を生かすことができる。なお、前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、動物宿主の腸管上皮細胞に対し強い付着能力を有することが必要で、胃腸管で病原体と上皮細胞に付着することに競合する。その両方とも兼ね備えることで、効率よく腸管を保護し、毒素を排出し、病原体を抑制する機能を発揮することができる。
【０００４】
本願の発明者に、初期に選出された腸管付着型新規ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、インビボ及びインビトロでの実験を通して、腸管及び尿路の病原体に対して良好な抑制効果を有することに加えて、胃腸管及び尿路上皮細胞への優れた付着能力を有することで、胃腸管および尿路を病原体感染から、効果的かつ長期的に保護できることが実証された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，６０３，９３０号明細書
【特許文献２】米国特許第３，９５３，６０９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４９１，９５６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願のラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、腸管上皮細胞を安定させる機能を有し、上皮細胞が腸内の毒素に破壊されて死亡することを低減することができる。動物生体の試験から、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、アルコールによる腸内毒素が腸管組織を通して血液に入ることを抑制することができるため、アルコール又は毒素による肝炎及び腸炎の発生を抑制できることが発見された。また、臨床ヒト試験から、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株により、肝癌及び肝硬変患者の血液毒素及び血液中アンモニア濃度を効果的に改善できることが発見された。従って、ＣＭＵ９９５菌株は、アルコール及び／又は毒素による関連疾患の予防及び／又は治療に応用されることができる。
【０００７】
本発明の目的は、肝臓を保護することに用いられるラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株の使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、財団法人食品工業発展研究所での受託番号がＢＣＲＣ  ９１０４７２であり、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ；ＤＳＭＺ）での受託番号がＤＳＭ  ２３７８０である。
【０００９】
ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株による肝臓保護の使用方法は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ）及び／又はアラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）のような肝機能を評価する指標酵素を低減することができる。
【００１０】
ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株による肝臓保護の使用方法は、血液内の脂質、コレステロール、内毒素、炎症性サイトカインＴＮＦ−α及び／又はアルコールの含有量の低減することができ、肝臓におけるコレステロール及び／又は内毒素の含有量を直接に低減することもできる。
【００１１】
ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株による肝臓保護の使用方法は、アルコール、サイトカインＴＮＦ−α及び／又は内毒素による肝炎の予防に用いられる。
【００１２】
上記の使用方法によって、肝臓の代謝の負担を低減する一方、肝炎の発生を予防し、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴの肝機能指数を低減し、更に肝臓を保護する効果を達成することができる。
【００１３】
本発明によると、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を哺乳動物に投与する工程を含む。哺乳動物は、ヒトであってもよい。
【００１４】
本発明は、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株の有効濃度の範囲が１×１０5ＣＦＵ／ｇ〜１×１０12ＣＦＵ／ｇである乾燥粉末である、肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物である。
【００１５】
本発明によると、肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物は、薬品、飼料、飲料、栄養補助剤、乳製品、食品、健康食品である。本発明によると、肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物は、形が粉剤、錠剤、造粒、坐薬、マイクロカプセル、アンプル（ａｍｐｏｕｌｅ／ａｍｐｕｌｅ）、液剤、スプレー剤又は坐剤等の剤形であってもよい。また、肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物は、アルコール及び毒素による全身性炎症、肝炎、腸炎又は腎炎等の関連疾患をはじめ、また、例えば、腎炎、腎不全又は大腸癌の発生等の器官病変のような毒素による臓器の病変を低減する予防又は治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法による血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ）の濃度変化を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法による血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）の濃度変化を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法による血清中のトリグリセリド（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の濃度変化を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法による血清中のコレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の濃度変化を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法による血清中の内毒素（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）の濃度変化を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法による肝臓内の内毒素（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）の濃度変化を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法による肝臓内のＴＮＦ−αの濃度変化を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルムＣＭＵ９９５菌株の使用方法による大腸組織中のＴＮＦ−αの濃度変化を示す図である。
【図９Ａ】本発明の一実施形態のプロバイオティクス組成物を服用した肝硬変患者の血液中のＴＮＦ−αの変化を示す図である。
【図９Ｂ】本発明の一実施形態プロバイオティクス組成物を服用した肝硬変患者の血液中のアンモニア濃度の変化を示す図である。
【図９Ｃ】本発明の一実施形態のラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を含むプロバイオティクス組成物を服用した肝硬変患者の血液中の内毒素濃度の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（一実施形態）
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。しかしながら、この実施形態は、様々な発明の概念の応用であってもよく、異なる特定の範囲内に具体的に実行されることができる。特定の実施形態は、説明を目的として示すのみであり、開示された範囲に制限されない。
【００１８】
本実施形態の使用方法で使用する植物性乳酸菌とも呼ばれるラクトバチラス‐プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の菌株は、本願の発明者により初期に選出され、ＣＭＵ９９５菌株と名づけられ、ＢＣＲＣ  ９１０４７２という受託番号で財団法人食品工業発展研究所に寄託されている。以下、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株と呼ぶ。
【００１９】
インビボ及びインビトロでの実験を通して、上記ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株が病原体の活性を抑制する効果を有することに加えて、胃腸管又は尿路上皮細胞への優れた付着能力を有することで、胃腸管と尿路を病原体による感染から、効果的かつ長期的に保護できることが発見された。
【００２０】
ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、胃腸管及び／又は尿路を病原体による感染から、効果的かつ長期的に保護することができ、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を用いることで、アルコールの生体の血液への進入を低減させることができるため、アルコールの代謝又はアルコールの血液への進入を抑制する機能を有する二日酔い治療薬／予防薬や食品又は飲料等の製剤に作製することによって、肝臓を保護することに応用することができる。また、アルコールにより、腸内の病原体及び毒素の増加も引き起こされるが、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株も腸内毒素の発生を抑制する機能を有するため、毒素が血液に入って肝臓及びその他の器官組織に移動することを低減させることができる。従って、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、毒素排出効果及び肝臓保護使用方法を有する。
【００２１】
本発明のラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株及びそのプロバイオティクス組成物は、薬品、健康食品、栄養補助剤、飲料、ヨーグルト、一般食品及び動物の飼料等のさまざまな形の食用品に作製されることができる。なお、前記肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物は、その剤形が粉剤、カプセル、造粒、マイクロカプセル、錠剤、スプレー剤、液剤又は坐剤等の剤形であってもよい。本発明の一実施形態によるラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株含有プロバイオティクス組成物は、疾患を予防又は治療する効果を有し、腸管細胞の保護、腸管及び血液中の毒素量の低減、アルコール吸収の抑制に応用されて、更に、肝臓器官を保護する効果を達成することができる。
【００２２】
下記の具体的な実施例によって、本発明を更に例示して説明する。下記実施例は、説明を目的として提供するのみであり、本発明の範囲を制限しない。
【００２３】
（第１実施例）
（付着能力分析）
（１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株の調製
胃腸管細胞への付着能力分析を行うことに用いられるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓには、本発明のラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ（ＬＧＧ、ラクトバチルスラムノサス、ＡＴＣＣ  ５３１０３）、ラクトバチラス‐プランタルム  ２９９ｖ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｓｈｉｒｏｔａが含まれる。すべての被験ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓをＭＲＳ培養液（Ｄｉｆｃｏ）で２回活性化した後、それらをＭＲＳ培養液（５ｍＬ）に接種し、培養した。２４時間後に、１ｍＬのブロスを採取し、６０００回／分間で１０分間遠心させ、ｐＨ７．２のリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＰＢＳ）で２回すすいで、吸光度６００ｎｍで濃度を１ｘ１０９コロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ；ＣＦＵ）／ｍＬに調整し、後続の付着試験を行った。
【００２４】
（２）胃腸管細胞株の培養
この試験で使用された胃腸管細胞株は、Ｃａｃｏ−２＆ＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞株（ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）及びＡＧＳ胃癌細胞株（ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）であり、何れも台湾生物資源保存研究中心（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）から購入したものである。Ｃａｃｏ−２＆ＨＴ−２９細胞の培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）であった。ＡＧＳ細胞の培地は、Ｆ−１２培地であった。上記培地の何れにも１０体積％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）細胞を添加して、活性化させ安定させてから、後続の実験が行われた。
【００２５】
（３）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの付着性分析
実験Ｂで調製された細胞を９６穴細胞培養プレートに分け入れ、各穴に１×１０4個の細胞を加え、培地を毎日、２００μＬの新しい培地に交換する。細胞インキュベーターで４８時間培養した後、２０μＬの実験Ａで調製された異なるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを細胞に加え、付着を１時間行った後に、リン酸塩緩衝溶液を用いて３回すすぎ、付着しなかったＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを除去し、１０％のホルマリン液で細胞とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓとを安定化させた。３０分後に、細胞を３回、リン酸塩緩衝溶液ですすぎ、最後に１００μＬのクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）で５分間染色してから、７５％のアルコールで洗浄して細胞上の染色剤を落す。位相差顕微鏡を用いて、様々なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの胃腸管上皮細胞への付着性を観察し、ランダム化された異なる顕微鏡の視野の下で、約５０個の細胞への総Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ付着量を観察および計算し、最後、各細胞の平均付着菌数を計算した。
【００２６】
（４）付着能力分析の実験結果
結果は、下記表１に示す通りである。表１の結果から分かるように、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、他の菌株と比較して、より優れた胃腸管上皮細胞への付着能力を有する。
【表１】
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【００２７】
（第２実施例）
（動物実験）
（１）実験の群分け
本試験のアルコール性肝炎モデルは、Ｓｅｇａｗａなどの（２００８）の研究報告を参考したものである。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを任意に６つの群に分けて、各群に８匹にした。開始体重が２３±１ｇであった。実験は、下記のように群分けされた。
【００２８】
群Ａ：正常制御群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）：マウスには、アルコール添加無しの流動食（Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ食餌）を任意に摂食させ、また、毎日０．２ｍＬの殺菌された生理食塩水をチューブによって給餌した。
【００２９】
群Ｂ：陰性対照群（アルコール性肝障害群、Ａｌｃｏｈｏｌ）：マウスには、アルコール含有流動食（Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ食餌）を任意に摂食させ、また、毎日０．２ｍＬの殺菌された生理食塩水をチューブによって給餌した。
【００３０】
群Ｃ：ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５実験群（ＣＭＵ９９５）：マウスには、アルコール含有流動食（Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ食餌）を任意に摂食させ、また、毎日０．２ｍＬの濃度２×１０10ＣＦＵ／ｍＬのラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株をチューブによって給餌した。
【００３１】
群Ｄ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ実験群（ＬＧＧ）：マウスには、アルコール含有流動食（Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ食餌）を任意に摂食させ、また、毎日０．２ｍＬの濃度２×１０10ＣＦＵ／ｍＬのＬＧＧプロバイオティクスをチューブによって給餌した。
【００３２】
群Ｅ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｓｈｉｒｏｔａ実験群（ＬＣ）：マウスは、アルコール含有流動食（Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ食餌）を任意に摂食させ、また、毎日０．２ｍＬの濃度２×１０10ＣＦＵ／ｍＬのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｓｈｉｒｏｔａプロバイオティクスをチューブによって給餌した。
【００３３】
（２）ブロスの調製
各菌株の実験菌粉は、菌数濃度が１×１０11ＣＦＵ／ｇとなる凍結乾燥粉末であり、４℃の冷蔵庫に置かれた。毎日、マウスに給餌する前に新しく調製され、菌粉を１ｇに精確に量って無菌遠心管に入れ、殺菌された生理食塩水と十分に混合させて、濃度２×１０10ＣＦＵ／ｍＬのブロスに調合した。
【００３４】
（３）プロバイオティクスの給餌と肝炎の誘導
実験の初期に、各群のマウスには、何れも流動食（Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ食餌）を自由に摂食させ、一週間で環境に適応させた後、実験を始めた。まず、各群のマウスに、毎日０．２ｍＬの異なる実験試料をチューブによって給餌しはじめた。群Ａ、群Ｂに生理食塩水を給餌したが、群Ｃ、群Ｄ、群Ｅに新しく調製されたプロバイオティクスブロスを給餌した。マウスが犠牲になるまで、毎日１回給餌し続けた。肝炎の誘導は、プロバイオティクスが投与された３日目から行われた。群Ａを除いて、その他の群Ｂ、群Ｃ、群Ｄ、群Ｅの何れのマウス飼料にもアルコールを添加した。アルコールの開始濃度が１．２５％であり、２日ずつ飼料に１．２５％投与量のアルコール濃度を増加させ、最後、最高アルコール濃度５％まで増加させて、このアルコール濃度で６週間給餌し続けた。肝炎の誘導期は、合計７週間であった。
【００３５】
（４）マウスの犠牲と検体の収集
本試験は、肝炎を誘導するためにマウスにアルコールを給餌し初めた日を、実験期の０日目と定義した。マウスは、７週間目終了した後（４９日目）で犠牲になった。マウスが環境に適応し及び肝炎の誘導の実験期間に、実験期の０日目及び２８日目に、ホホによる採血法によって、それぞれのマウスの適切な量の血液を収集し、犠牲になる前に宵越し断食させた。犠牲になった場合に、断頭法によって各マウスの全血を収集して、注意深く解剖してからマウスの肝臓及び大腸段を取り出し、−８０℃の冷凍庫に入れて、急速に冷凍した。
【００３６】
（５）血液、肝臓及び腸管の分析
それぞれ適宜な重量の冷凍された肝臓又は大腸段を取り出してから、乳鉢に入れ、液体の窒素を入れて検体を研磨した後、検体の粉末を収集し遠心管に、計量してから一定の量のヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ  ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＥＰＥＳ）緩衝溶液を加え、均一に混合してから、後続の分析作業に備える。血液については、低速で遠心させてから、血清を取り出して、後続の分析作業に備える。分析としては、全自動血液アナライザ（Ｃｏｂａｓ  Ｍｉｒａ  ｐｌｕｓ，Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）又は酵素免疫アナライザによって、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）、トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）、ＴＮＦ−αの濃度測定の項目を含む各種の生化学検出を行った。
【００３７】
（６）統計分析
実験データは、ＳＡＳ統計分析ソフトウェア（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖ．  ８．０２  Ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標），２００１）を用いて、分散分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅ；ＡＮＯＶＡ）を行って各群間の相違性を分析した。有意差の判定基準は、ｐ＜０．０５であった。実験結果は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １０．０ソフトウェアによって作図された。
【００３８】
（７）動物試験の結果
血清中のＡＳＴの実験中の濃度変化を示す図１、及び血清中のＡＬＴの実験中の濃度変化を示す図２を参照する。図から見れば、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を給餌したマウスの血液で検出された肝機能評価の指標酵素ＡＳＴ及びＡＬＴが、アルコールを給餌して肝炎を誘導したその他のマウスのより、明らかに低かった。これは、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株が良好な肝臓保護効果を有し、アルコールの肝臓への損傷を低減させることができることを示す。
【００３９】
血清中のトリグリセリド（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の実験中の濃度変化を示す図３、及び血清中のコレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の実験中の濃度変化を示す図４を参照する。図から見れば、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を給餌したマウスの血液で検出されたトリグリセリド及びコレステロールが、アルコールを給餌して肝炎を誘導したその他のマウスのより、明らかに低かった。これは、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株がアルコールによる高脂血症を低減させることができることを示す。
【００４０】
血清中の内毒素（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）の実験中の濃度変化を示す図５、及び肝臓中の内毒素の実験中の濃度変化を示す図６を参照する。図から見れば、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を給餌したマウスの血液及び肝臓から検出された内毒素の何れも、アルコールを給餌して肝炎を誘導したその他のマウスのより、明らかに低かった。これは、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株がアルコールによる毒素の体内への進入を低減させることができることを示す。
【００４１】
肝臓における炎症性サイトカインＴＮＦ−αの実験中の濃度変化を示す図７、及び大腸における炎症性サイトカインＴＮＦ−αの実験中の濃度変化を示す図８を参照する。図から見れば、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を給餌したマウスの肝臓及び腸内から検出された炎症性サイトカインＴＮＦ−αが、アルコールを給餌して肝炎を誘導したその他のマウスのより、明らかに低かった。これは、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株が肝臓及び腸管の炎症の発生を低減させることができることを示す。
【００４２】
（第３実施例）
（臨床試験）
試験では、肝硬変患者のデータを収集する予定であり、試験を完成した被験者が合計２６人であった。研究に参加した被験者に対して、試験する前及びラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５プロバイオティクス組成物を服用した４週間後に、それぞれの患者の血液及び糞を収集して、検証分析を行った。
【００４３】
（１）試験の主な該当と排除条件：
Ａ．該当条件：
１．肝硬変患者で、年齢が３０〜７０歳である。
Ｂ．排除条件：
１．その他の主な門脈圧亢進症の合併症、例えば、肝腎症候群又は細菌性腹膜炎患者。
２．その他の神経系疾患患者及び急性代謝疾患、例えば、脳卒中、心不全又は呼吸不全又は急性腎不全又は敗血症患者。
３．深刻な肝性昏睡（心理状態レベル３ー４）患者。
４．癌、腎臓及び心肺機能不全を含む深刻な全身性疾患を同時に合併した患者。
５．現在、プロバイオティクス含有関連組成物又は製品を服用している患者。
６．妊娠及び授乳している女性患者。
【００４４】
（２）プロバイオティクス組成物：
臨床試験で投与されたプロバイオティクス組成物は、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株及びその他の賦形剤からなる。単位あたりの前記プロバイオティクス組成物は、３ｇの粉末であり、内蔵の総プロバイオティクス菌数が３×１０10ＣＦＵであり、即ち菌粉の菌数濃度が１×１０10ＣＦＵ／ｇであった。
【００４５】
（３）検証分析
実験では、合計２６例の肝硬変患者のデータを収集する予定であり、被験者が同意書に署名した後、患者に４週間分のプロバイオティクス組成物を与え、毎日食後に１単位服用させた。プロバイオティクス組成物を服用する前、及びこれを服用した４週間後に、検証するために患者の血液を採集した。治療前後にプロバイオティクスの患者に対する改善情況を評価するために、分析項目は、血液中の炎症性サイトカインＴＮＦ−α、血液中の内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）及び血液中のアンモニア（ｂｌｏｏｄ  ａｍｍｏｎｉａ）濃度を含んだ。実験の分析操作ステップは、何れも中国医薬大学薬学部微生物実験室の微生物基準分析ステップに基づいて行われた。血液の分析は、従来の商業的な一連のステップに基づいて、検出を行った。その基準品を検量線とした。最後、得られたデータについては、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１０．０で作図及び統計分析を行った。
【００４６】
（４）臨床試験の結果
ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を含むプロバイオティクス組成物を服用した肝硬変患者の血液中の炎症性サイトカインＴＮＦ−αの変化を示す図９A、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を含むプロバイオティクス組成物を服用した肝硬変患者の血液中のアンモニア濃度の変化を示す図９B、及びラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を含むプロバイオティクス組成物を服用した肝硬変患者の血液中の内毒素量の変化を示す図９Cを参照する。図から見れば、肝硬変患者は、毎日ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株含有プロバイオティクス組成物を服用し、４週間後、血液中の炎症性サイトカインＴＮＦ−α、血液中のアンモニア濃度及び内毒素の何れも著しく低減した（異なるａ、ｂの英語の小文字は、治療前後に有意差があることを示し、即ちＰ＜０．０５）。従って、肝硬変患者の血液が前記プロバイオティクス組成物を服用した後、確実に改善されたことを証明した。
【００４７】
上記本発明の実施形態から分かるように、本発明の応用には、下記のメリットを有する。
【００４８】
１．このラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、胃酸及び胆汁塩に対する良好な耐受力を有し、動物宿主の腸管上皮細胞に対する強い付着能力を有するため、常に胃腸管消化器系に存在し、更に腸管中の病原体と競合して付着し、病原体を排出する効果を達成することができる。前記ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、尿路上皮細胞に強く付着することもできるため、尿路中の病原体と競合して付着し、尿路を保護する効果を達成することもできる。更には、腸管細胞、動物及びヒトの実験を通して、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株が腸管細胞に対して安定化効果を有し、内因性毒素又は外因性毒素の細胞への損傷を低減させることができることが実証された。また、動物及びヒトの臨床実験によって、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株はアルコール及び／又は毒素が腸管を通してヒト又は動物の体内に進入することを抑制して、腸管、肝臓及びその他の器官を保護する効果を達成することができることが実証された。
【００４９】
２．予防応用については、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を、例えば、飼料、飲料、栄養補助剤、又は保健食品に添加して、食用者の胃腸管上皮細胞に付着させることで胃腸管を保護し、内毒素、アルコール、マイコトキシン又は細菌が体内に進入することを抑制して、肝臓保護、毒素の血液への進入の低減、解酒、毒素排出、炎症の抑制、器官病変の低減、抗がん等の効果が見られた。
【００５０】
３．治療応用の点については、病原体による毒素、アルコール又はその他の有毒物質がヒト又は動物体の体内に侵入して、血液異常又は疾患症状となる場合、例えば、内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）、血液中のアンモニア等の毒物が高すぎる場合、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を含む薬物又は食品を服用すれば、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を摂取することで、血液中の毒素を低減させる効果を達成することができる。例としては、肝癌又は肝炎患者は、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株の関連製剤を服用して、高すぎる血液中のアンモニア濃度、肝炎又は腸炎の症状を低減させることができる。従って、全般的には、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、毒素又はアルコールによる胃腸管及び肝臓等の関連疾患を予防又は治療することを達成することができる。
【００５１】
４．ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、腸管細胞を安定させることで胃腸管中の毒素が血液に移動することを抑制することに加えて、細菌又は毒素の腸管での蓄積を抑制することができ、これらの２つの毒素排出機構の共働作用によって、摂取者を保護することができる。「毒素排出」用語の「毒」とは、例えば、腸管内毒素、血液毒素、腸内病原体、アルコール、有毒薬物、有害化学物質及び可塑剤等のような有害物質、マイコトキシン、発癌物質等であり、これらの毒素は、血液に進入して動物又はヒトの全身に移動し、肝臓又はその他の器官の病変及び損害を引き起こすことがある。また、本菌株及びその組成物は、血液又は腸管中の有毒物質、病原体又はアルコールを体内から排出することを加速させる効果にも寄与する。
【００５２】
５．本発明の菌株は、毒素の血液への進入の抑制、及び毒素排出という２つの特徴を有するため、様々な医療及び保健製品に広く運用されることができる。従って、本発明は、また、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株を含む、肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物を提供する。上記ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株の特徴に基づいて、前記プロバイオティクス組成物は、様々な毒物の吸収への抑制、アルコール吸収への抑制又は病原体の抑制に使用できる。
【００５３】
６．ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、胃腸管における様々な有害物質を抑制することに用いることができる。例としては、細菌発生毒素、カビ発生毒素、ウィルス発生毒素、アルコール、飲食における毒素、農薬、薬物、食品添加物、有害化学物質、可塑剤及び前記組み合わせからなる群から選択された有害物質を抑制することができ、特に、アルコール及び微生物による毒素への抑制に使用することができる。
【００５４】
７．本発明の肝臓を保護することに用いられるプロバイオティクス組成物は、薬品、飼料、飲料、栄養補助剤、食品、保健食品、乳製品又は坐剤の何れの形式であってもよい。ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株は、食品に添加されてもよい。例えば、この菌株を含む乳製品等を作製する。
【００５５】
８．また、必要に応じて、本発明のプロバイオティクス組成物に如何なる適宜な添加物を添加してもよく、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株による付着効果、及び／又は毒素の血液への進入の抑制、及び／又は毒素排出を加速させる効果を更に強化する。また、その他の営養成分や薬物成分を添加して、組成物の運用柔軟性と調合度を向上させることもできる。例としては、本発明のプロバイオティクス組成物には、また一種又は多種のマルチビタミンを含有させ、又は、その他のプロバイオティクス又はその他の漢方薬成分等の物質を添加して、毒素の排出作用又は肝臓の代謝を強化することができる。添加される前記活性成分がラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株の効率への悪影響がない限り、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株と混合して、相乗効果を発揮することができる。
【００５６】
９．本発明のラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株及びその組成物は、腸管細胞の保護、腸管及び血液中の毒素の低減、アルコール吸収の抑制、肝臓及び全身のその他の器官等の保護効果など、多種の応用形式がある。例えば、ラクトバチラス‐プランタルム  ＣＭＵ９９５菌株及びその組成物は、医学組成物、健康食品、栄養補助剤、飲料、ヨーグルト、一般食品及び動物飼料等に作製されて、疾患を予防又は治療することができる。
【００５７】
本発明の実施形態は、上記のように開示されたが、それは本発明を限定するものではなく、当業者なら誰でも、本発明の精神と範囲から逸脱しない範囲内で、多種の変更や修飾を加えることができるため、本発明の保護範囲は、後の請求の範囲に規定されたものに準ずる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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