(57)【要約】【課題】本発明は、安定性が高く活性の高いＬ−トリプトファン脱水素酵素を提供することを目的とする。また、本発明は、当該Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用い、様々な物質を含む生体試料などにおいてもＬ−トリプトファンを簡便に且つ高い精度で測定できる方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該測定方法を実施する際に利用できる測定用キットと酵素センサを提供することも目的とする。【解決手段】本発明に係るＬ−トリプトファン脱水素酵素は、野生型のＬ−トリプトファン脱水素酵素に比べ、特定位置に変異を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の何れかのＬ−トリプトファン脱水素酵素。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンまたはプロリンで、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシン、グルタミン酸、ロイシンまたはリジンで、第２３４番目のアラニンがアスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、スレオニンまたはアラニンで、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素；
（２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第５９、１６８、２３４および２９６番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性が維持されているか或いは高いＬ−トリプトファン脱水素酵素；または
（３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性が維持されているか或いは高いＬ−トリプトファン脱水素酵素（ただし、該Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において上記第５９、１６８、２３４、２９６番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。
【請求項２】
請求項１に記載のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【請求項４】
Ｌ−トリプトファンを測定するための方法であって：
（Ａ）水とＮＡＤ+の存在下、請求項１に記載のＬ−トリプトファン脱水素酵素と検体とを保温する工程；および
（Ｂ）上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のＬ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを測定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
工程（Ｂ）において測定する反応生成物がＮＡＤＨである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
吸光度計を用いてＮＡＤＨを測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（Ｂ）において測定する反応生成物がＬ−トリプトファンの脱アミノ化生成物である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＬ−トリプトファン脱水素酵素とＮＡＤ+を含むことを特徴とするＬ−トリプトファンの測定用キット。
【請求項９】
反応用緩衝液、ＮＡＤＨ検出試薬、およびＬ−トリプトファンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
Ｌ−トリプトファンの測定用酵素センサであって、検出用電極の表面または近傍に請求項１に記載のＬ−トリプトファン脱水素酵素が配置されていることを特徴とする酵素センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規Ｌ−アミノ酸脱水素酵素、並びにこの新規Ｌ−アミノ酸脱水素酵素を用いるＬ−トリプトファンの測定方法、それに用いるキットおよび酵素センサに関する。より詳しくは、本発明は、Ｌ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性の高い変異型Ｌ−アミノ酸脱水素酵素、並びにこの変異型酵素を利用したＬ−トリプトファンの測定方法、Ｌ−トリプトファン測定用キットおよび酵素センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−トリプトファンは、タンパク質構成アミノ酸の一つであり、さまざまな二次代謝産物の生合成原料にもなる。
【０００３】
例えば、トリプトファンは、生体内でセロトニンやメラトニンなどを生成するセロトニン経路や、キヌレニンやニコチン酸アミドなどを生成するキヌレニン経路によって代謝される。よって、血中におけるトリプトファンやその代謝物の変動は、これらの代謝に関連する病態の指標になり得る。また、トリプトファンは主として肝臓で代謝されるため、その血中濃度は肝機能障害の指標の一つにもなり得る。
【０００４】
従来、Ｌ−トリプトファンの定量は、主に自動アミノ酸分析装置やプレカラム誘導体化逆相高速液体クロマトグラフィーによる分離と誘導体化を伴う機器分析的手法で行われていた。また、Ｌ−トリプトファンと直接反応する発色試薬を用いる方法もある。その他、酵素を用いたＬ−トリプトファンの定量方法も知られている。
【０００５】
酵素を用いた方法として、ヒトヨタケ属担子菌（Ｃｏｐｕｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）由来のＬ−トリプトファン用アミノ酸オキシダーゼを用いる方法が報告されている（特許文献１および非特許文献１）。Ｌ−トリプトファンｔＲＮＡ合成酵素を用いた方法も知られている（非特許文献２）。また、トリプトファン２−モノオキシゲナーゼを用いた酵素センサも知られている（非特許文献３）。また、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼを用いた分析方法も知られている（特許文献２）。さらに、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来のＬ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ）を用いる方法が報告されている（特許文献３、非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−６９９７４号公報
【特許文献２】特開２０１２−１９６２０７号公報
【特許文献３】特開２０１２−１８３０１８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 1468-1493 (2000)
【非特許文献２】Anal. Biochem. 154, 618-623 (1986)
【非特許文献３】Biosen.and Bioelect. 12, 363-371 (1997)
【非特許文献４】J. Am. Chem. Soc., 130, 15260-15261 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、Ｌ−トリプトファンは、主にＨＰＬＣを中心とした機器分析的手法により定量が行われてきた。しかし、トリプトファンを含むアミノ酸の定量に用いられる機器は一般的に高価なものが多い。特に生体試料に適用するには高度な分解能が必要となるが、高分解能の測定機器はより一層高価である。
【０００９】
Ｌ−トリプトファンの測定方法としては、Ｌ−トリプトファンと直接作用する染色剤を用いた方法もあるが、生体試料などを測定対象とした場合、生体試料には様々な化合物が含まれており、類似化合物と反応し得るため、正確な測定が難しいという問題がある。
【００１０】
特許文献１および非特許文献１に記載の方法で用いられているヒトヨタケ由来のアミノ酸オキシダーゼは、Ｌ−トリプトファンに対する特異性が低く、Ｌ−フェニルアラニンに対しても７％の相対活性を有している。また、オキシダーゼ活性のほかにジオキシゲナーゼ活性も持つため、定量的に反応が進行しない。よって、かかるアミノ酸オキシダーゼは、生体試料などにおけるＬ−トリプトファンの定量には適さない。
【００１１】
非特許文献２に記載の方法は、放射性同位体元素を使用するものであるため、汎用的に使用することはできない。
【００１２】
非特許文献３に記載の酵素センサに用いられているＬ−トリプトファン２−モノオキシゲナーゼは、Ｌ−トリプトファン以外にＬ−フェニルアラニンにも反応する。そのため、かかるＬ−トリプトファン２−モノオキシゲナーゼを用いた酵素電極では、生体試料などの測定においては十分な精度が得られない。
【００１３】
特許文献２に記載の方法で用いられているＬ−トリプトファンオキシダーゼは安定性が悪く、安定化剤であるグリセロールの添加が必要である。
【００１４】
特許文献３で用いられているＬ−トリプトファン脱水素酵素はノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来のものであり、非特許文献４には、ラン藻由来生物中でｓｃｙｎｅｔｏｍｉｎ合成経路の一部を担っている酵素であると記載されている。かかる酵素はロイシン脱水素酵素ホモログであり、基質として２０種類のアミノ酸全部の測定を行っていないことから、容易にトリプトファン定量用酵素と判断できない。また、特許文献３に記載されているように、このＬ−トリプトファン脱水素酵素は安定性が悪く、４８時間で失活する。そのため、測定用キットや酵素センサに適さない。また、安定化剤としてグリセロールが記載されているが、血漿サンプル測定時に吸光度に影響が生じる問題がある。
【００１５】
そこで本発明は、安定性が高く活性の高いＬ−トリプトファン脱水素酵素を提供することを目的とする。また、本発明は、当該Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用い、様々な物質を含む生体試料などにおいてもＬ−トリプトファンを簡便に且つ高い精度で測定できる方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該測定方法を実施する際に利用できる測定用キットと酵素センサを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した。その結果、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）に由来する上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において、第５９番目のロイシン、第１６８番目のアスパラギン酸、第２３４番目のアラニン、第２９６番目のイソロイシンを所定のアミノ酸に置換することにより得られる変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素が、グリセロールなどの安定化剤を添加しない条件でも安定であり、野生型酵素よりも高い活性を示すことを見出した。本発明は、係る知見により完成されたものである。
【００１７】
本発明に係るＬ−トリプトファン脱水素酵素は、下記（１）〜（３）の何れかのものである。
【００１８】
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンまたはプロリンで、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシン、グルタミン酸、ロイシンまたはリジンで、第２３４番目のアラニンがアスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、スレオニンまたはアラニンで、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素；
（２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第５９、１６８、２３４および２９６番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性が維持されているか或いは高いＬ−トリプトファン脱水素酵素；または
（３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性が維持されているか或いは高いＬ−トリプトファン脱水素酵素（ただし、該Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において上記第５９、１６８、２３４、２９６番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。
【００１９】
本発明に係る核酸は、上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素をコードすることを特徴とし、本発明に係る形質転換体は、当該核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする。これら核酸と形質転換体は、本発明に係るＬ−トリプトファン脱水素酵素の製造に有用である。
【００２０】
本発明に係るＬ−トリプトファンの測定方法は、
（Ａ）水とＮＡＤ+の存在下、請求項１に記載のＬ−トリプトファン脱水素酵素と検体とを保温する工程；および
（Ｂ）上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のＬ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを測定する工程
を含むことを特徴とする。
【００２１】
上記測定方法において、工程（Ｂ）において測定する反応生成物としてはＮＡＤＨとＬ−トリプトファンの脱アミノ化生成物を挙げることができ、ＮＡＤＨは吸光度計を用いて容易に測定することが可能である。
【００２２】
本発明に係るＬ−トリプトファンの測定用キットは、上記のＬ−トリプトファン脱水素酵素とＮＡＤ+を含むことを特徴とする。さらに、反応用緩衝液、ＮＡＤＨ検出試薬、およびＬ−トリプトファンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つを含むものであってもよい。
【００２３】
本発明に係る酵素センサは、Ｌ−トリプトファンの測定用酵素センサであって、検出用電極の表面または近傍に上記のＬ−トリプトファン脱水素酵素が配置されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る新規の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素は、Ｌ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性が非常に高い。よって、この変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用いることにより、ほかのアミノ酸など多くの夾雑物を含む試料においても、Ｌ−トリプトファンを精度良く、簡便、迅速に測定することが可能となる。特に、血漿、血清、尿のような生体試料に対して本発明は有効であり、吸光度計などでＬ−トリプトファンを定量できるのみならず、電極型酵素センサをも提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列と、本発明の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）のアミノ酸配列についてアライメント解析を行った結果を示す。図１において、ＴｒｐＤＨ  Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅは、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）ＡＴＣＣ２９１３３由来の野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素、ＴｒｐＤＨ  Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎは、本発明の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を示している。
【図２】図２は、本願実施例において精製した野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素と本発明の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、熱安定性を調べた結果を示す。縦軸は比活性である。
【図３】図３は、本願実施例において精製した野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素と本発明の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、熱安定性を調べた結果を示す。縦軸は相対活性である。
【図４】図４は、本願実施例において精製した野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素と本発明の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、酵素の安定化剤を添加していない条件での安定性を調べた結果を示す。縦軸は比活性である。
【図５】図５は、本願実施例において精製した野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素と本発明の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、酵素の安定化剤を添加していない条件での安定性を調べた結果を示す。縦軸は相対活性である。
【図６】図６は、Ｌ−トリプトファンを添加した血漿サンプルについて、酵素の安定化剤であるグリセロールを添加せずに野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用いてＬ−トリプトファンを定量した結果を示す。
【図７】図７は、Ｌ−トリプトファンを添加した血漿サンプルについて、酵素の安定化剤であるグリセロールを添加し、野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用いてＬ−トリプトファンを定量した結果を示す。
【図８】図８は、Ｌ−トリプトファンを添加した血漿サンプルについて、酵素の安定化剤であるグリセロールを添加せずに、本発明に係る変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用いてＬ−トリプトファンを定量した結果を示す。
【図９】図９は、Ｌ−トリプトファンを添加した血漿サンプルについて、酵素の安定化剤であるグリセロールを添加せずに、本発明に係る変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用いてＬ−トリプトファンを定量した結果、得られた検量線を示す。
【図１０】図１０は、本発明に係る変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素の様々なアミノ酸に対する脱水素酵素活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
＜変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素＞
本発明に係るＬ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ）は、上記（１）〜（３）の何れかのものである。
【００２７】
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンまたはプロリンで、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシン、グルタミン酸、ロイシンまたはリジンで、第２３４番目のアラニンがアスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、スレオニンまたはアラニンで、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素；
（２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第５９、１６８、２３４および２９６番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素であり、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ−トリプトファンに対する基質特異性が高い脱水素酵素活性を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素；または
（３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素と比較してＬ−トリプトファンに対する基質特異性が高い脱水素酵素活性を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素（ただし、該Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において上記第５９、１６８、２３４、２９６番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。
【００２８】
上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（１）において、配列番号２に示すアミノ酸配列は、微生物株分与機関Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から分譲されたノストク・パンクチフォルムが生産するＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする遺伝子をクローニングすることにより得られたものである。この点については実施例において詳述する。
【００２９】
上記配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、実施例において確かめられている通り、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素活性を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素である。該タンパク質が有するＬ−トリプトファン脱水素酵素活性は、例えば、水とＮＡＤ+の存在下、ｐＨ１１．５、３７℃において、Ｌ−トリプトファンに作用してＬ−トリプトファンのケト酸（インドールピルビン酸または３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２−オキソプロパン酸）とＮＡＤＨを生成する活性である。本明細書では、以下、Ｌ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性を、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素活性という。なお、この脱水素酵素活性は、以下の実施例に記載の測定試薬と測定方法を用いることにより測定することができる。
【００３０】
本発明の上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（１）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンまたはプロリンで置換され、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシン、グルタミン酸、ロイシンまたはリジンで置換され、第２３４番目のアラニンがアラニンのまま維持されているか或いはアスパラギン酸、リジン、フェニルアラニンまたはスレオニンで置換され、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素である。上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸を上記の特定アミノ酸に置換して得られるタンパク質は、実施例で示される通り、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するトリプトファン脱水素酵素と比較して安定性が高い。
【００３１】
「配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸脱水素酵素と比較して安定性が高い」とは、対象となるタンパク質の安定性が、野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（以下、「野生型酵素」という）と比較して相対的に高いことをいう。具体的には、野生型酵素と比較して、酵素の安定剤であるグリセロールを添加していない条件で安定であることを意味する。
【００３２】
Ｌ−トリプトファン以外のタンパク質構成アミノ酸である、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリンに対し、本発明に係る変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素は活性を示さない。
【００３３】
本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、−Ｓ−Ｓ−結合などの架橋構造などが挙げられる。
【００３４】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素（２）において、「第５９、１６８、２３４および２９６番目のアミノ酸を除く領域」とは、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（１）のアミノ酸配列中、第１〜５８番目、第６０〜１６７番目、第１６９〜２３３番目、２３５〜２９５番目および第２９７番目以降の領域をいう。
【００３５】
また、「１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失等を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素が、上記Ｌ−トリプトファンに対する基質特異性が高い脱水素酵素活性を有する限り特に限定されるものではない。前記「１から数個」の範囲は、上記Ｌ−トリプトファンに対する基質特異性が高いオキシダーゼ活性を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素である割合が高いことから、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、１個程度であることができる。
【００３６】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素（３）において、「上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、該アミノ酸配列の同一性を有するＬ−トリプトファン脱水素酵素が、上記Ｌ−トリプトファンに対する基質特異性が高い脱水素酵素活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の配列同一性は７１％以上であれば特に限定されないが、好ましくは７２％以上、７３％以上、７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、より一層好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上である。本発明において「配列同一性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が同一性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
【００３７】
さらに、本発明において、「ただし、該Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列において上記第５９、１６８、２３４、２９６番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする」における「変異」とは、具体的にはアミノ酸の欠失または置換を意味する。つまり、上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（３）のアミノ酸配列において、配列同一性の判断の基準となる上記（１）のＬ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列における第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が、上記（１）のＬ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列における第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸と同一であることを意味する。
【００３８】
上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（３）のアミノ酸配列において、配列同一性の判断の基準となる上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（１）のアミノ酸配列における第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、上述した配列同一性ないし相同性の解析により調べることができる。具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて、配列番号２に示されるアミノ酸配列または上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（１）のアミノ酸配列に対して解析対象のアミノ酸配列のアライメント解析を行えば、上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸を検索することが可能である。このようなアライメント解析の手法は当業者に広く知られている。
【００３９】
本発明の上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素は、上記（１）から（３）に規定される範囲に属するものである限りその由来は特に限定されるものではない。例えば、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよく、或いは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬ−トリプトファン脱水素酵素の遺伝子ホモログを有する特定の生物種（例えば、細菌）に変異原を与えることにより本発明の変異型酵素を産生し得る変異体を獲得して、該変異体が産生するタンパク質を抽出および精製することによって製造したタンパク質であってもよい。
【００４０】
遺伝子工学技術により本発明の組換えタンパク質を製造する場合には、上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（１）、（２）または（３）をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を作製し、各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を発現させることができる。本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を作製するに当たり、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第５９、１６８、２３４もしくは２９６番目のアミノ酸または該アミノ酸に相応するアミノ酸を上記（１）に記載の所定のアミノ酸に置換するため、或いは上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（２）のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換および／または付加を施すため、或いは上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（３）のアミノ酸配列において配列番号２のアミノ酸配列と所定の同一性を有するタンパク質をコードする核酸を準備するためには、例えば、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換および／または挿入を行うことができる。このようにして作製した本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を適当な発現系に導入することにより、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を製造することができる。
【００４１】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を製造するために利用可能な発現系としては、特に限定させるものではないが、例えば各種生物種（ホスト）において組換えタンパク質の発現を可能とする発現ベクターを利用することができる。利用可能な発現ベクターとしては、細菌や真菌類（例えば、酵母類）などの微生物、植物、昆虫細胞、哺乳類細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることが可能であり、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。或いは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質発現系を用いて、本発明のタンパク質を製造してもよい。
【００４２】
特定の生物種をホストとして用いた発現系で本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を発現させる場合には、上記本発明のタンパク質をコードする核酸をベクターに組み込む工程、当該ベクターによって宿主細胞を形質転換する工程、形質転換させた宿主細胞を培養する工程、培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集する工程を含む、製造方法により調製することができる。
【００４３】
本発明のタンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体は本発明の一態様である。これら核酸、ベクターおよび形質転換体は、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列が決定されれば、当業者であれば常法に従って調製可能である。
【００４４】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、以下の実施例に記載の通り、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）から単離したＬ−トリプトファン脱水素酵素遺伝子（配列番号１）をコードする核酸を材料として本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を取得してもよいし、或いは本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素ないし配列番号２に記載のアミノ酸配列と相同性を有する遺伝子を各種細菌から単離し、該遺伝子をコードする核酸を調製して、上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応する塩基配列の置換を行って、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造してもよい。また、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸は、配列番号１に記載の塩基配列もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号１に記載の塩基配列と一定の同一性を有する公知の塩基配列もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と一定の同一性を有する公知のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００４５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、菌分譲機関から分譲されたノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来の野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列であるが、当該Ｌ−トリプトファン脱水素酵素には一定の相同性を示す遺伝子が多数知られている。例えば、かかる細菌由来の相同遺伝子に対応する酵素として、表１に示すものが知られている。
【００４６】
【表１】
2014161258.tif 000002
【００４７】
野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素である変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎのアミノ酸配列、並びに表１に示す既知酵素のアミノ酸配列についてアライメント解析を行った結果を図１に示す。図１において、矢印で示される位置のアミノ酸が上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸である。図１に示される通り、上記野生型酵素と同様に表１に示される既知遺伝子は１６８以外、ロイシン、アラニン、イソロイシンである。本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素のアミノ酸配列は、これら既知遺伝子の配列に基づいて設計してもよいし、その他公知のホモログ遺伝子の配列情報に基づいて設計してもよい。
【００４８】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸は、具体的には、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。また、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造する上で、核酸に部位特異的な変異を導入するために有用である。
【００４９】
例えば、本明細書中の配列表の配列番号１に記載した塩基配列または配列番号２に示すアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）を含む細菌のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料となる核酸を準備することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、常法により作製することができる。
【００５０】
また、ＰＣＲ法により本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料を取得することもできる。例えば、ノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）株を含む細菌のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。増幅されたＤＮＡ断片は、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料として用いることができる。さらに、増幅されたＤＮＡ断片を、次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることにより得られたベクターも本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料として用いることができる。
【００５１】
上述の通り準備した、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を製造するための材料において、上記第５９、１６８、２３４または２９６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）に各種変異導入法を用いて塩基の置換を施し、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸、または該核酸を含むベクターを製造することができる。なお、上記したプローブまたはプライマーの調製、ゲノムライブラリーの構築、ゲノムライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知である。
【００５２】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸は適当なベクター中に挿入した状態で使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記核酸には、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
【００５４】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００５５】
また、上記ベクターにおいて、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸は、必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を含むベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００５６】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を含むベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンもしくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００５７】
さらに、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素をコードする核酸を含むベクターを適当な宿主に導入することによって、本発明の形質転換体を作製することができる。本発明のベクターを導入される宿主細胞は、細胞内で本発明のベクターが複製されるものであれば任意の細胞でもよい。さらに、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を発現する形質転換体を作製する場合には、ベクターの複製に加えて、言うまでもなく本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素の発現が可能となる任意の細胞である。このような宿主細胞の例としては、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００５８】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法やその他の公知方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００５９】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、またはシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００６０】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００６１】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
【００６２】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
【００６３】
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
【００６４】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法やリポフェクション法等を挙げることができる。
【００６５】
上記の形質転換体は、本発明のベクターの複製を可能にする条件下、或いは本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を発現させた場合、形質転換体の培養物（形質転換体および培養培地を含む）から、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離精製法を用いればよい。例えば、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等の樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を精製標品として得ることができる。
【００６６】
＜Ｌ−トリプトファンの定量方法＞
本発明に係るＬ−トリプトファンの測定方法は：
（Ａ）水とＮＡＤ+の存在下、上記本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素と検体とを保温する工程；および
（Ｂ）上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のＬ−トリプトファンに対する脱水素酵素活性により反応液中に生成される反応生成物の少なくとも一つを測定する工程
を含むことを特徴とする。
【００６７】
上記本発明方法には、検体中におけるＬ−トリプトファンの有無を判断するための検出方法と、検体中におけるＬ−トリプトファンの濃度や量を測定する定量方法などが含まれるものとする。以下、本発明方法を実施の順番に従って説明する。
【００６８】
酵素反応工程（工程Ａ）
本発明方法での測定対象となる検体は、Ｌ−トリプトファンを含む可能性のある試料であり、Ｌ−トリプトファンの有無を判断すべきものや、Ｌ−トリプトファンの濃度や量を測定すべきものであれば特に制限されない。例えば、血液、血清、血漿、臓器の一部のホモジェネート、尿などの生体試料を挙げることができる。さらに、例えば、生体試料に本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素を作用させて生じる、いかなる生成物を定量することで生体試料中のＬ−トリプトファンの濃度を測定するのか等により、生体試料は適宜選択することができる。例えば、発色剤や蛍光剤を利用して上記生成物を定量する場合には無色の水溶液であることが好ましく、血清や血漿などが例として挙げられる。
【００６９】
生体試料などのように検体が様々な成分を含むものであり、その中に正確な測定を損なうものが含まれる場合には、検体からその様な成分を除去するよう前処理することもできる。
【００７０】
例えば、後述するように、Ｌ−トリプトファン由来の酵素反応生成物やＮＡＤＨを測定することにより間接的にＬ−トリプトファンを測定する場合、当該酵素反応生成物やＮＡＤＨと同一または類似の物性を有する化合物が検体に含まれていると、正確な測定ができない場合がある。より具体的には、ＮＡＤＨは３４０ｎｍの波長光をよく吸収することから、ＮＡＤＨの測定には、３４０ｎｍの波長光の吸光度測定がよく用いられる。よって、ＮＡＤＨの吸光度を測定する予定であり且つ検体中に当該波長光を吸収する性質をもつ化合物が含まれている場合には、かかる化合物を事前に除去しておくことが好ましい。この他、発色や蛍光を測定する予定であり且つ用いる酵素や電子伝達体に影響を与える化合物が検体中に含まれている場合には、かかる化合物を事前に除去しておくことが好ましい。
【００７１】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素によるＬ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）の脱水素反応（酸化反応）を以下の反応式に示す。即ち、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素は、下記反応を触媒する。
【００７２】
【化１】
2014161258.tif 000003
【００７３】
本工程では、水とＮＡＤ+の存在下、上記本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素と検体とを保温する。前記反応式に示すように、本発明に係る酵素反応においては、ＮＡＤ+を電子受容体としＬ−トリプトファンのα位の脱アミノ化が進行する。従って本発明における測定方法では、溶媒である水の存在下、試料溶液に含まれるＬ−トリプトファンの他、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素とＮＡＤ+が含まれていれば上記反応は進行する。
【００７４】
本発明方法で用いる水は、超純水、純水、精製水、蒸留水、イオン交換水など、上記酵素反応を阻害しないものであれば特に制限されない。また、検体が水を含むものであれば、その水を利用することができる。水の使用量は、検体の形態や検体中のＬ−トリプトファン濃度などにより適宜調整することができ、また、予備実験により決定してもよい。
【００７５】
本発明により測定可能なＬ−トリプトファン濃度は、使用するＬ−トリプトファン脱水素酵素や、後述する工程（Ｂ）で用いる測定方法などに依存する。例えば後述の実施例に従いノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）菌由来の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用い、３４０ｎｍの吸収によりＮＡＤＨを検出し、エンドポイント法でＬ−トリプトファンを定量する場合、実施例に示す通り本酵素には基質阻害が確認されるため、試料中のＬ−トリプトファン濃度としては、例えば、０ｍＭ以上、１ｍＭ以下が適当である。この範囲より高濃度の検体につき測定する場合には、適量の水を加えて反応溶液中のＬ−トリプトファン濃度をこの範囲に調整することが好ましい。
【００７６】
ＮＡＤ+は、上記反応式のとおり、反応液中、測定すべきＬ−トリプトファンと等モル以上存在すればよい。よって、ＮＡＤ+の使用量も、水と同様に、検体の形態や検体中のＬ−トリプトファン濃度などにより適宜調整することができ、また、予備実験により決定してもよい。例えば、測定すべきＬ−トリプトファンの濃度が０〜１ｍＭと比較的少ない生体試料などを検体とする場合などでは、反応液におけるＮＡＤ+を１ｍＭ以上、５０ｍＭ以下とすることができる。
【００７７】
上記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素は、基質特異性と親和性により、定量用酵素としての利用が制限される。例えば、後述の実施例に示すノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）のＬ−トリプトファン脱水素酵素の場合、トリプトファン以外のタンパク質構成アミノ酸とＤ−トリプトファンに対しては、活性が検出されない。一方、かかる特性により、Ｌ−トリプトファンの測定に適している。本発明に係るＬ−トリプトファン脱水素酵素は、かかる野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素に比べて安定性や活性が高いため、さらにＬ−トリプトファンの測定に適するものである。また、上記野生型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素のＬ−トリプトファンに対するＫｍ値は０．０７５９ｍＭであり、Ｌ−トリプトファン量が比較的少ない（０〜１ｍＭ程度）生体試料などを対象としても使用可能である。このような観点から、反応液における本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素の混合量は、１０ｍＵ／ｍｌ以上、１００ｍＵ／ｍｌ以下程度の範囲とすることが適当である。
【００７８】
さらに、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素およびＮＡＤ+に加えて、好ましくは、反応液のｐＨをＬ−トリプトファン脱水素酵素の至適ｐＨやＮＡＤＨの安定性を考慮したｐＨに調整することができる緩衝液を添加することができる。さらに、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素の安定化剤を添加することもできる。Ｌ−トリプトファン脱水素酵素の安定化剤としては、例えば、グリセロール、スクロース、ソルビトールおよびトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。
【００７９】
反応液のｐＨは、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素に加えてＮＡＤＨの定量に酵素を用いる場合には、使用する酵素とその他の試薬の安定性、可溶性が許す範囲においていずれのｐＨでも可能であるが、好ましくはその酵素の至適ｐＨ付近で反応を行うことが望ましい。特に上述のノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来の変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用いる場合は、塩基性、例えばｐＨ８．５以上、１１．５以下が望ましい。
【００８０】
本工程（Ａ）では、以上で説明した反応液を保温する。反応温度は適宜調整すればよいが、例えば、２０℃以上、５５℃以下とすることができ、５０℃以下がより好ましく、４５℃以下がさらに好ましい。反応時間も適宜調整できるが、例えば、１分間以上、１０時間以下程度とすることができる。
【００８１】
測定工程（工程Ｂ）
本工程（Ｂ）では、上記反応後の反応液中に存在する本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種を測定する。かかる反応生成物としては、上記反応式のとおり、Ｌ−トリプトファンの脱アミノ化生成物である３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２−オキソプロパン酸（インドールピルビン酸）や、ＮＡＤ+の還元化物であるＮＡＤＨを挙げることができる。
【００８２】
本発明においては、測定にはエンドポイント法を用いることができるが、この他に反応の初速度を用いる初速度法を用いることもできる。
【００８３】
本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素によって触媒される反応でＮＡＤ+が変換されて生じるＮＡＤＨは、３４０ｎｍに極大吸収をもつことから、３４０ｎｍの波長光の吸光度測定により容易に測定する事が可能である。ＮＡＤＨの産生量は、化学量論的に反応によって消費されたＬ−トリプトファンと等モル量であることから、Ｌ−トリプトファンの測定に適している。
【００８４】
ＮＡＤＨの検出法としては、３４０ｎｍの吸光度を測定するほか、発色性の電子受容体を用いることもできる。発色性電子受容体としては、２−（４−ｉｎｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）、レサズリン、フェロシアン化合物等を例として挙げることができる。これらの電子伝達体は、還元されることにより蛍光などを発するため、容易に測定することが可能である。またこの際、ＮＡＤＨからの電子伝達を触媒するジアホラーゼを共存させることもできる。
【００８５】
また、ＮＡＤＨの検出法として、ＮＡＤＨを酸化する別の酵素を検出用試薬として用いることができる。かかる酵素としては、ＮＡＤＨオキシダーゼを挙げることができる。この場合、更に発色・蛍光試薬としてペルオキシダーゼを用いる必要がある。ペルオキシダーゼの例としては、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼを用いることができる。更に発色試薬としてペルオキシダーゼの基質を加えなければならない。ペルオキシダーゼの基質としては、２−アミノアンチピリン・フェノールやＡＢＴＳを挙げることができる。
【００８６】
さらに、ＮＡＤＨの検出に電極を使用することもできる。検出には、前述の電子伝達体を単独で使用するか、ジアホラーゼやＮＡＤＨオキシダーゼと組み合わせることもできる。また、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素、ジアホラーゼ，ＮＡＤＨオキシダーゼは、遊離の状態で使用する事もできるが、公知の方法により直接あるいは間接的に電極へ固定化することもできる。
【００８７】
また、Ｌ−トリプトファンの脱アミノ化生成物（インドールピルビン酸）は、例えばＨＰＬＣなどにより測定することができる。その他、Ｌ−トリプトファンの脱アミノ化生成物は、クエン酸鉄アンモニウムなどに含まれる鉄イオンと結合して褐色の色調を帯びる。よって、Ｌ−トリプトファンの脱アミノ化生成物検出薬としてクエン酸鉄アンモニウムを用い、色調の変化を測定することにより、間接的に反応生成物を測定することができる。
【００８８】
＜Ｌ−トリプトファンの測定用キット＞
本発明に係るＬ−トリプトファンの測定用キットは、上記本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素とＮＡＤ+を含むことを特徴とする。
【００８９】
本発明のキットにおいては、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素は、当該酵素の安定化剤との混合物であることが好ましい。かかる混合物は、例えば、酵素１００質量部に対して、１０質量部以上、７０質量部以下の安定化剤を含むことが、酵素を長期間安定に保存できるという観点から好ましい。安定化剤の量は、好ましくは、酵素１００質量部に対して、２０質量部以上、６０質量部以下の範囲である。安定化剤は、例えば、グリセロール、スクロース、ソルビトールおよびトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも１種である。
【００９０】
ＮＡＤ+は、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素による反応に必要な電子伝達体である。Ｌ−トリプトファン脱水素酵素は、ＮＡＤ+に依存する酵素である。このため、Ｌ−トリプトファンの２位の脱アミノ化は、ＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変換と共役して起こる。従って、変換されて生じるＮＡＤＨは、消費されたＬ−トリプトファン量と化学量論的に等量である。
【００９１】
本発明のキットは、さらに反応用緩衝液、ＮＡＤＨ検出試薬、およびＬ−トリプトファンの脱アミノ化生成物検出薬を含んでいてもよい。
【００９２】
反応用緩衝液は、反応液を酵素反応に適したｐＨに維持するために用いられる。後述の実施例に示すノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）由来のＬ−トリプトファン脱水素酵素を含め、ほとんどのＮＡＤ+依存型脱水素酵素は、塩基性水溶液で高い活性を示す。このため使用する緩衝液は、中性より塩基性側のｐＨであることが望まれ、ｐＨ８．５以上、１１．５以下の緩衝液が好ましく、ｐＨ９．０上の緩衝液がより好ましい。
【００９３】
ＮＡＤＨ検出試薬は、ＮＡＤＨの検出を発色もしくは蛍光によって行う場合に必要となる。発色で検出を行う場合、例えばＩＮＴなどＮＡＤＨから直接電子を受け取ることができる発色試薬を用いることができる。また、ジアホラーゼやＮＡＤＨオキシダーゼを用いることにより間接的にＮＡＤＨから発色性物質へ電子を伝達させた発色反応を行うこともできる。ジアホラーゼと併用する発色もしくは蛍光性基質としては、レサズリンを挙げることができる。ＮＡＤＨオキシダーゼをＮＡＤＨ検出試薬として用いる場合、ＮＡＤＨオキシダーゼにより生じる過酸化水素を検出するため、ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼに対する発色基質が必要となる。ＮＡＤＨオキシダーゼと併用する発色試薬の組み合わせとしては、西洋わさびペルオキシダーゼと２−アミノアンチピリン・フェノールの組み合わせを挙げることができる。
【００９４】
＜酵素センサ＞
本発明に係る酵素センサは、Ｌ−トリプトファンの測定用酵素センサであって、検出用電極の表面または近傍に本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素が配置されていることを特徴とする。この酵素センサで用いるＬ−トリプトファン脱水素酵素は、上記の本発明に係るＬ−トリプトファン脱水素酵素と同様である。
【００９５】
本発明の酵素センサは、本発明のＬ−トリプトファン脱水素酵素がその表面または近傍に配置されているものであり、Ｌ−トリプトファンの測定に用いるものである。本発明の酵素センサは、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素によりＬ−トリプトファン依存的に生成するＮＡＤＨを直接または間接的に定量的に検出できるものである。例えば、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素に加え、ジアホラーゼなどのＮＡＤＨを検出用電極で感度良く検出するための酵素を、上記検出用電極と固定化の有無にかかわらず併用することもできる。前記Ｌ−トリプトファン脱水素酵素は、前記酵素の安定化剤と共に検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置されることが好ましい。前記安定化剤は、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも１種であることができる。
【００９６】
加えて、本発明の酵素センサは、上記酵素以外に、電子伝達物質やペルオキシダーゼなど検出に寄与する他のタンパク質を、上記検出用電極と固定化の有無に関わらず併用したものであることもできる。それ以外の構成は、公知の酵素センサで採用されている構成をそのまま、または適宜改変して利用することができる。
【００９７】
本発明の酵素センサは、検体を含有する反応液に少なくとも検出用電極部分を浸漬し、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素によりＬ−トリプトファン依存的に生産されるＮＡＤＨを直接あるいは間接的に電気化学的に検出する。
【００９８】
本発明における酵素センサは、公知の酵素電極の基本的な構成にＬ−トリプトファン脱水素酵素を組み合わせたものであり、直接もしくは間接的にＬ−トリプトファン脱水素酵素および前述のＮＡＤＨ検出用酵素を固定化した酵素電極を用いる電極型酵素センサであることができる。さらに、この酵素電極の検出用電極付近に酵素，ＮＡＤＨと電極の間の電子の授受を容易にする電気化学メディエーターを存在させたものであることもできる。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【０１００】
実施例１：  本発明酵素の調製
（１）  天然型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素の調製
シアノバクテリアであるノストク・パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）ＡＴＣＣ  ２９１３３よりゲノムＤＮＡを調製し、データベース上にある同株のゲノムシーケンス（ＣＰ００１０３７）をもとに設計したプライマー１（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＡＧ−３’）（配列番号１０）およびプライマー２（５’−ＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＡＧＡＣ−３’）（配列番号１１）を用いたＰＣＲによりＬ−トリプトファン脱水素酵素遺伝子（ＮｐＲ１２７５）を増幅した。増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、コンピテントセル（タカラバイオ社製「Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９」）を宿主としてサブクローニングを行った。さらに、サブクローニングされたｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＮｐＲ１２７５よりプライマー２およびプライマー３（５’−ＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧ-３’）（配列番号１２）を用い、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩの切断配列を導入したＰＣＲ産物を作製し、同制限酵素で処理したのち、同様の制限酵素で処理したベクター（メルクケミカルズ社製「ｐＥＴ２１（＋）」）とライゲーションし、コンピテントセル（バイオダイナミクス研究所社製「ＢＬ２１（ＤＥ３）」）に導入した。以下に記載の変異型酵素遺伝子ライブラリー作成のために、プライマー４（５’-ＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＴＧ−３’）（配列番号１３）とプライマー５（５’−ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＴＣ−３’）（配列番号１４）を用いたＰＣＲによりＬ−トリプトファン脱水素酵素遺伝子をＣ末端の６残基のヒスチジンタグと共に増幅した。増幅産物は、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理したのち、同様の制限酵素で処理したｐＵＣ１９  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）とライゲーションし、コンピテントセル（タカラバイオ社製「Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９」）に導入した。このプラスミドは、発現されるタンパク質のＣ末端に６残基のヒスチジンタグが導入されるため、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｎｉ−ＩＭＡＣを用いた精製が可能である。
【０１０１】
上記発現株［ＪＭ１０９／ｐＵＣＮｐＲ１２７５ｈｉｓ］を、アンピシリンを含むＬＢ培地（５００ｍＬ）に植菌後、３７℃で９０分、２５℃で６０分、１５℃で９０分培養したのち、終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを加えて１５℃で２０時間培養した。培養液を６，０００×ｇで５分間遠心分離後、上清を取り除き、残渣に対し５倍量の２０ｍＭリン酸カリウムバッファーを加えて懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液は、直ちにＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｎｉ−ＩＭＡＣを用いて精製し、必要に応じて後述の安定化剤を加え、同様に安定化剤を含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファーで透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的に均一な酵素を得た。かかる野生型酵素をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。さらに、この酵素のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１０２】
（２）  Ｌ−トリプトファン脱水素酵素の変異型酵素遺伝子ライブラリーの調製
上記で構築したＬ−トリプトファン脱水素酵素遺伝子が導入された発現用プラスミドを鋳型として、変異導入のためのＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の組成は、滅菌水２４．５μＬ、１００ｐｇ／μＬプライマー４  ０．５μＬ、１００ｐｇ／μＬプライマー５  ０．５μＬ、５００ｎｇ／ｍＬｐＵＣＮｐＲ１２７５ｈｉｓ  ０．５μＬ、１０ｍＭｄＡＴＰ  １．０μＬ、１０ｍＭｄＧＴＰ  １．０μＬ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ  ５．０μＬ、１０ｍＭ  ｄＣＴＰ  ５．０μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液（−ＭｇＳＯ4）５．０μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4  １．０μＬ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ2  ４．０μＬ、Ｄｒｅａｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１．０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９４℃で３０秒間、（ｉｉ）９４℃で２０秒間、（ｉｉｉ）５８℃で３０秒間、（ｉｖ）７２℃で２分間、（ｖ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）を２９サイクル行った。ＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで制限酵素処理し、同様に制限酵素処理を行ったｐＵＣ１０９にライゲーションした。
【０１０３】
（３）  Ｌ−トリプトファン要求株の調製
大腸菌（タカラバイオ社製「Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９」）よりゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてｔｒｐＢ遺伝子の前後配列をＰＣＲにより増幅した。ｔｒｐＢ遺伝子前部１０００ｂｐの増幅のために、プライマー６（５’−ＧＣＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＡＧＴＡ−３’）（配列番号１５）とプライマー７（５’−ＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡＡＴＡＴＧＣ−３’）（配列番号１６）を用い、ｔｒｐＢ遺伝子前部１,０００ｂｐの増幅のために、プライマー８（５’−ＧＴＴＴＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＡＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＣＴＣＴＧ−３’）（配列番号１７）とプライマー９（５’−ＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＧＣＧＧＧＡ−３’）（配列番号１８）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、滅菌水３０μＬ、１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー６（もしくは８）１μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー７（もしくは９）１μＬ、鋳型ＤＮＡ２μＬおよびＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  １μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９５℃で２分間、（ｉｉ）９５℃で２０秒間、（ｉｉｉ）５５℃で３０秒間、（ｉｖ）６５℃で４分間、（ｖ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）６５℃で５分間とした。同様にプライマー１０（５’−ＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡ  −３’）（配列番号１９）とプライマー１１（５’−ＴＡＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡ−３’）（配列番号２０）を用いて、カナマイシン遺伝子を増幅した。得られた上記３つのＰＣＲ産物各々１０μＬと滅菌水７μＬ、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー６  １μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー９  １μＬおよびＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  １μＬの組成で、上記と同様のＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いて、以下のトリプトファン要求株を作製した。
【０１０４】
大腸菌（タカラバイオ社製「Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９」）にエレクトロポレーション法を用いて、上記遺伝子断片を導入し、形質転換した。エレクトロポレーション法の手順は以下の通りである。大腸菌ＪＭ１０９  ４０μＬに対し、上記遺伝子断片１μＬを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（１ｍｍ）に分注した。その後、１,２００Ｖ、１２９Ωの条件でエレクトロポレーションを行った後、ＬＢ液体培地を１ｍｌ添加し、３７℃で１時間保温した。カナマイシン入りのプレートに塗布し、３７℃で、１６時間培養を行った。
【０１０５】
得られたコロニーをカナマイシン入りＭ９寒天培地に植菌した。同様のコロニーをカナマイシン・トリプトファン入りＭ９寒天培地に植菌し、各々３７℃で、１２時間振盪培養した。トリプトファンの入ったプレートのみに生えたコロニーをトリプトファン要求株として、以下の操作に用いた。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシーケンサー３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＤＮＡシーケンサーにより、ｔｒｐＢの欠落を確認した。
【０１０６】
（４）  形質転換
上記（２）で得られたプラスミドを、上記（３）で得られた大腸菌トリプトファン要求株にヒートショック法により導入し、形質転換した。ヒートショック法の手順は以下の通りである。大腸菌ΔｔｒｐＢ５０μＬに対し、プラスミド５μＬを混合し、６０分間、氷上静置した。その後、４２℃で９０秒間のヒートショックを行った後、ＬＢ液体培地を１ｍＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。アンピシリン・カナマイシン・インドールピルビン酸入りのＭ９液体培地に植菌し、３７℃で１４時間培養した。
【０１０７】
上記培養系において、生育の早い変異型酵素発現株（トリプトファン要求株）は、インドールピルビン酸からトリプトファンの供給能力が高いと考えられる。即ち、トリプトファンの前駆体であるインドールピルビン酸からトリプトファンへの活性が高いトリプトファン脱水素酵素変異型酵素を有する菌株の培養速度が速いと考えられる。
【０１０８】
同様の培地を用いて３回継代培養を行った後に、アンピシリン・カナマイシン入りＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１６時間培養した。
【０１０９】
得られたコロニーをランダムに選び、ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡ配列を解読した結果、多くのコロニーのトリプトファン脱水素酵素遺伝子において、第５９番目のロイシンがフェニルアラニンに、第１６８番目のアスパラギン酸がグリシンに、第２３４番目のアラニンがアスパラギン酸に、第２９６番目のイソロイシンがアスパラギンに置換されていた。得れれた塩基配列を配列番号３に、得られたアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１１０】
試験例１：  酵素活性測定
上記実施例１で得られた変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎについて温度の影響を調べるために、ｐＨ１０．５において、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素活性を測定した。具体的には、先ず、各々の酵素を各温度で３０分間保温した。別途、以下の組成のＬ−トリプトファン脱水素酵素活性測定用試薬を調製した。
【０１１１】
【表２】
2014161258.tif 000004
【０１１２】
上記測定用試薬にＬ−トリプトファン脱水素酵素を最終濃度が０．１Ｕになるように添加し、反応液の全量（１ｍＬ）を１ｃｍ石英セルに加え、生成したＮＡＤＨを３４０ｎｍの吸光度変化により測定した。得られた吸光度変化により、下記計算式に基づきＬ−トリプトファン脱水素酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を与える酵素量を１Ｕとした。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づきＬ−トリプトファン脱水素酵素の活性を算出した。
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×Ｖｔ×希釈倍率｝／（６．２２×１．０×Ｖｓ）
Ｖｔ（ｍＬ）：  全量
６．２２：  ＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ2／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：  セルの光路長（ｃｍ）
Ｖｓ（ｍＬ）：  酵素サンプル液量
【０１１３】
野生型酵素と変異型酵素のそれぞれについて、温度による影響を図２と図３に示す。図２は縦軸に活性を、図３は縦軸を２５℃の各々の活性を１００％とした時の相対活性を示す。
【０１１４】
図２に示される通り、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎは野生型酵素と比較して、活性が１０倍上昇した。また、図３に示される通り、野生型酵素では４０℃付近以上で活性の著しい減少が見られたが、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎでは、５０℃付近まで熱処理後も５０％以上の活性の維持が見られた。
【０１１５】
試験例２：  酵素活性の安定性試験
変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎについて安定性を調べるために、４℃でグリセロールを添加していない条件で保持し、経時的に活性を測定した。野生型酵素と変異型酵素のそれぞれについて、経時的に活性を測定した結果を、図４と図５に示す。
【０１１６】
図４に示される通り、変異型酵素は比活性が１０倍上昇していることが明らかである。図５は図４の縦軸の０時間目を１００％とした相対活性を示している。野生型酵素は、２４時間後にはグリセロールの無い条件では、２０％以下に減少していることが明らかである。しかし、野生型酵素は、２４時間後も９０％以上の活性を維持していた。
【０１１７】
試験例３：  酵素活性測定
温度を３７℃に固定し、上記試験例１と同様の条件で、野生型酵素と変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎの脱水素酵素活性を測定した。結果を表３に示す。
【０１１８】
【表３】
2014161258.tif 000005
【０１１９】
野生型酵素と変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎの活性を比較した結果、表３に示すように、約１０倍の活性の上昇が見られた。
【０１２０】
実施例２：  本発明酵素の調製
上記に得られた変異型酵素の各変異箇所の効果を調査するために、野生型酵素に各々一点変異を導入した。上記で構築した野生型酵素遺伝子が導入された発現用プラスミドを鋳型として、変異導入のためのＰＣＲを行った。変異型酵素Ｌ５９Ｆ調製のためのＰＣＲ反応には、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、滅菌水（ＭｉｌｌｉＱ）１６．５μＬ、１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬ、１００ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ  １．０μＬ、１００ｎｇ／μＬプライマー１２（５’−ｇｃｔｔｔａａａａｇａｔｇｃａｔｔｔｃｇｔｃｔｃａｇｔｃｇｇｇ−３’）（配列番号２１）１．２５μＬ、１００ｎｇ／μＬプライマー１３（５’−ｃｃｃｇａｃｔｇａｇａｃｇａａａｔｇｃａｔｃｔｔｔｔａａａｇｃ−３’）（配列番号２２）１．２５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １．０μＬ、Ｑｕｉｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  １．５μＬ、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  １．０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９５℃で２分間、（ｉｉ）９５℃で２０秒間、（ｉｉｉ）６０℃で１０秒間、（ｉｖ）６８℃で４分間、（ｖ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）を１７回繰り返した後、（ｖｉ）６８℃で５分間とした。ＰＣＲ産物に、２．０μＬの制限酵素（ＤｐｎＩ）を加え３７℃で５分間放置した（サンプル１）。同様にして、変異型酵素Ｄ１６８Ｇ調製のためのＰＣＲ反応には、１００ｎｇ／μＬプライマー１４（５’−ＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣ−３’）（配列番号２３）１．２５μＬと、１００ｎｇ／μＬプライマー１５（５’−ＧＣＡＡＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴ−３’）（配列番号２４）１．２５μＬを用いて、上記の処理を行った（サンプル２）。変異型酵素Ａ２３４Ｄ調製のためのＰＣＲ反応には、１００ｎｇ／μＬプライマー１６（５’−ＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴ−３’）（配列番号２５）１．２５μＬと、１００ｎｇ／μＬプライマー１７（５’−ＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＡ−３’）（配列番号２６）１．２５μＬを用いて、上記の処理を行った（サンプル３）。変異型酵素Ｉ２９６Ｎ調製のためのＰＣＲ反応には、１００ｎｇ／μＬプライマー１８（５’−ＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＡＣＧＡＡＧ−３’）（配列番号２７）１．２５μＬと、１００ｎｇ／μＬプライマー１９（５’−ＣＴＴＣＧＴＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＣ−３’）（配列番号２８）１．２５μＬを用いて、上記の処理を行った（サンプル４）。
【０１２１】
サンプル１、サンプル２、サンプル３、およびサンプル４を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、野生型酵素と同様に培養、精製した変異型酵素を用いて、Ｌ−トリプトファン脱水素酵素活性の比較をした。その結果を表４に示す。
【０１２２】
【表４】
2014161258.tif 000006
【０１２３】
表４に示されるように、野生型酵素と比較した際に、変異型酵素Ｌ５９Ｆは熱安定性が上昇していることが確認された。さらに、変異型酵素Ｄ１６８Ｇと変異型酵素Ｉ２９６Ｎは、２４時間後の残存活性が高いことから、グリセロールの無い条件での安定性の上昇が確認された。さらに、変異型酵素Ａ２３４Ｄは、比活性が上昇していることが確認された。また、これらの残基における他のアミノ酸の影響を調べるために、以下の処理を行った。
【０１２４】
変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎに対して、各々の変異箇所に他の１９種類のアミノ酸変異を導入し、変異型酵素の活性の向上を調べた。変異型酵素遺伝子が導入された発現用プラスミドを鋳型として、変異導入のためのＰＣＲを行った。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、鋳型ＤＮＡとして変異型酵素遺伝子を用いて、上記同様の手法を用いて行った。５９番目のロイシンの変異導入には、プライマー２０（５’−ＧＣＴＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＮＮＳＣＧＴＣＴＣＡＧＴＣＧＧＧＧＣ−３’）（配列番号２９）とプライマー２１（５’−ＧＣＣＣＣＧＡＣＴＧＡＧＡＣＧＳＮＮＴＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＡＡＧＣ−３’）（配列番号３０）を用いて、上記の処理を行った（サンプル５）。１６８番目のアスパラギン酸の変異導入には、プライマー２２（５’−ＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＴＮＮＳＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＡ−３’）（配列番号３１）とプライマー２３（５’−ＴＧＣＡＡＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＳＮＮＡＡＧＴＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧ−３’）（配列番号３２）を用いて、上記の処理を行った（サンプル６）。２３４番目のアラニンの変異導入には、プライマー２４（５’−ＡＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＮＮＳＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣＴＴ−３’）（配列番号３３）とプライマー２５（５’−ＡＡＧＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＳＮＮＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴ−３’）（配列番号３４）を用いて、上記の処理を行った（サンプル７）。２９６番目の変異導入には、プライマー２６（５’−ＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＧＮＮＳＧＧＴＴＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡ−３’）（配列番号３５）とプライマー２７（５’−ＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＴＡＡＣＣＳＮＮＣＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＣ−３’）（配列番号３６）を用いて、上記の処理を行った（サンプル８）。
【０１２５】
サンプル５、サンプル６、サンプル７、およびサンプル８を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢアンピシリンプレートに植菌した。９６穴ディープウェルに１００μＬ／ｍＬのアンピシリン入りのＬＢ液体培地を３００μＬずつ分注し、コロニーピッカーを用いて、得られたコロニーを各ウェルの培地に植菌した。植菌後、振盪機を用いて、３００ｒｐｍ、３７℃で１２時間培養後、ＩＰＴＧ７．５ｍＭを２０μＬ添加し、再度１６℃で１２時間の振盪培養を行った。培養後、２，５００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離することにより集菌を行った。各々の菌体を、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）２００μＬに懸濁し、９６穴丸底プレートに移し替え、８連超音波破砕機により菌体破砕（ｏｕｔｐｕｔ３，３０秒間）を行った。同様の条件で遠心分離後、得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液５０μＬの脱水素酵素活性を、上記試験例１と同様にして、Ｌ−トリプトファンを基質として活性を測定した。２４時間後の残存活性が高いものをＬＢ液体培地で培養し、プラスミドを調製し、各々の変異箇所のアミノ酸を確認した。また、培養、精製した変異型酵素を用いて、精製後と一週間後の脱水素酵素活性の比較をした。その結果を表５に示す。
【０１２６】
【表５】
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【０１２７】
表４に示されるように、５９番目のロイシンがプロリンに変異されても、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎと同様に、残存活性が高いことが確認された。さらに、１６８番目のアスパラギン酸において、リジン、ロイシンおよびグルタミン酸に変異されても、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎと同様に、残存活性が高いことが確認された。さらに、２３４番目のアラニンにおいて、フェニルアラニン、スレオニンおよびリジンに変異されても、変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎと同様に、残存活性が高いことが確認された。
【０１２８】
試験例４：  酵素活性測定
上記変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎについて、様々な濃度のＬ−トリプトファンの水溶液を用いて、脱水素酵素活性の測定を行った。調製した水溶液に、最終濃度０、２５、５０、７５、１００、１２５または１５０μＭとなるようにＬ−トリプトファンを添加し、Ｌ−トリプトファン水溶液とした。測定試薬の組成と測定方法は、上記試験例１の通りであり、反応条件はグリセロールの存在下または不存在下、ｐＨ７．０で３７℃とした。グリセロール不存在下での野生型酵素の結果を図６に、２０％グリセロール存在下での野生型酵素の結果を図７に、グリセロール不存在下での変異型酵素の結果を図８に示す。
【０１２９】
図６に示されるように、野生型酵素（グリセロール無し）を用いた際には、熱に対する安定性が低いこともあり、各時間のエンドポイントを用いた検量線にばらつきが生じた。また、二日後同様に測定した際には、活性が失われ、測定できない結果となった。さらに、図７に示されるように、野生型酵素（２０％グリセロール）を用いた際には、グリセロールの影響で、ベースラインの上昇が見られた。図８に示されるように、上記変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎを用いた際には、各時間のエンドポイントを用いた検量線にばらつきが生じず、グリセロールを添加していないため、ベースラインの上昇なども見られなかった。
【０１３０】
試験例５：  生体サンプルを用いた酵素活性測定
上記変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎについて、Ｌ−トリプトファンを添加したヒト血漿サンプルを用いて脱水素酵素活性の測定を行った。調製したヒト血漿に、最終濃度０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０μＭとなるようにＬ−トリプトファンを添加し血漿サンプルとした。測定試薬の組成及び測定方法は、上記（１）及び（２）に示す通りであり、反応条件はｐＨ７．０、３０℃とした。結果を図９に示す。
【０１３１】
変異型酵素Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎにおいては、図９に示される通り、Ｌ−トリプトファン対して脱水素酵素活性が検出され、直線的な検量線を描くことが可能であった。
【０１３２】
上記試験例により、本発明による変異型酵素を用いれば、臨床サンプルのＬ−トリプトファンを正確に検出又は定量できることが示された。
【０１３３】
試験例６：  基質特異性試験
上記実施例２において精製した本発明に係る変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）について、試験例１の活性測定法に基づき、Ｌ−トリプトファンを含む１８種の天然アミノ酸とＤ−トリプトファンに対するトリプトファン脱水素酵素活性の測定を行った。結果を図１０に示す。
【０１３４】
図１０のとおり、本発明に係る変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素（Ｌ５９Ｆ／Ｄ１６８Ｇ／Ａ２３４Ｄ／Ｉ２９６Ｎ）は、Ｌ−トリプトファン以外のアミノ酸に対して脱水素酵素活性を全く示さず、Ｌ−トリプトファンにのみ特異的に活性を示すことが明らかとなった。従って、本発明に係る変異型Ｌ−トリプトファン脱水素酵素を用いれば、血液など他のアミノ酸を含む試料においても、Ｌ−トリプトファンを精度良く、簡便、迅速に測定することが可能となる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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