(57)【要約】【課題】合成ガス等からクロトニルＣｏＡを生産することができる組換え細胞を提供する。【解決手段】メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、アセトアセチルＣｏＡ チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からクロトニルＣｏＡを生産可能である組換え細胞。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、アセトアセチルＣｏＡ チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、
前記遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からクロトニルＣｏＡを生産可能である組換え細胞。
【請求項２】
メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、少なくともアセトアセチルＣｏＡ チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、
前記遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からブタジエン若しくはその前駆体を生産可能である組換え細胞。
【請求項３】
前記宿主細胞は、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞は、偏性嫌気性微生物である、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属細菌、又はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項６】
前記遺伝子の少なくとも１つは、細菌由来のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７】
前記遺伝子の少なくとも１つは、宿主細胞由来のものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８】
導入された遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化炭素等の特定のＣ１化合物からクロトニルＣｏＡ（Crotonyl−CoA）を生産可能な組換え細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの微生物による生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。これらの技術の多くは、有機物、特に糖やグルセロール、油成分等から微生物によって生産する微生物法である。一方で、植物資源等に由来する現状使用可能な糖質、グリセリンや油成分の量は、石油に由来する数多くの基幹化学品の世界的な生産量を賄うためには到底足らない。このため、糖質や油成分に依存する微生物による基幹化学品の生産量は、将来に渡っても限定的である。また、これらの炭素源を用いる方法は、食との競合も懸念される。
【０００３】
合成ガス（Synthesis gas，Syngas）は、廃棄物や天然ガスから高温・高圧下で金属触媒の作用によって効率よく得られる、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を主成分とする混合ガスである。合成ガスを起点とする化学触媒によるＣ１ケミストリーの分野では、ホルムアルデヒドやメタノール等の化学品を安価かつ大量に生産するプロセスが開発されている。一酸化炭素や二酸化炭素は、廃棄物由来の合成ガスや工場排ガス、または天然ガス由来の合成ガスに含まれており、ほぼ永久的に利用可能であることから、合成ガスを炭素源として有用な有機化合物を効率よく合成し得る微生物の開発が望まれている。
【０００４】
しかしながら、合成ガスを炭素源とした微生物による化学品生産の例は、極めて少ないのが現状である。現在のところ、開発が進んでいるのは、エタノール、２，３−ブタンジオール等の生産のみである。特に、遺伝子組換え体による合成ガス資化性微生物の利用に関する報告は少ない。例えば、特許文献１には、本来は合成ガス資化菌ではない大腸菌に、複数の一酸化炭素代謝酵素遺伝子を導入して合成ガス資化能を付与した組換え体によって、合成ガスからイソプロパノールを生産する技術が開示されている。しかしながら、元々合成ガス資化性を有していない大腸菌内で、一酸化炭素代謝酵素遺伝子群を効率良く機能的に発現させることは難しい。また、大腸菌の一酸化炭素耐性も低い。このため、当該技術によって製造された一酸化炭素代謝を有する組換え大腸菌を用いる系では、イソプロパノールをはじめとする目的物質を高生産させることは期待できない。
【０００５】
一方で、クロトニルＣｏＡやその代謝産物たるクロチルアルコール（Crotyl alcohol）は、合成ゴムのモノマーとして重要なブタジエンの原料となり得る有機化合物であり、特にタイヤ業界において重要な素材である。これらの有用な有機化合物を合成ガスから生産し得る微生物が望まれているものの、未だ報告されていない。例えば、特許文献２には、微生物によるブタジエンの生産を達成するための生合成仮説が示されているが、各生合成経路は仮説の域を出ず、実際にその作業仮説を満たす組換え微生物は製造できていない。
【０００６】
なお、クロトニルＣｏＡやその代謝産物たるクロチルアルコールは、例えば、アセチルＣｏＡを出発物質として生合成可能である。特許文献２に記載されているクロトニルＣｏＡとクロチルアルコールの生合成仮説経路の例を図１に示す。
【０００７】
アセチルＣｏＡから、アセトアセチルＣｏＡ、３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡを介してクロトニルＣｏＡが合成される。アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの変換は（ａ）アセトアセチルＣｏＡ チオラーゼ（Acetoacetyl−CoA thiolase）により触媒され、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡへの変換は（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（3−hydroxybutyryl−CoA dehydrogenase）により触媒され、３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡからクロトニルＣｏＡへの変換は（ｃ）３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼ（3−Hydroxybutyryl−CoA dehydratase）により触媒される。
【０００８】
クロトニルＣｏＡからクロチルアルコールへの変換は主に３つの経路が考えられる。まず、クロトニルＣｏＡからクロトンアルデヒドを介してクロチルアルコールが合成される経路がある。クロトニルＣｏＡからクロトンアルデヒドへの変換は（ｄ）クロトニルＣｏＡ還元酵素（アルデヒド生成型）（Crotonyl−CoA reductase；aldehyde froming) により触媒され、クロトンアルデヒドからクロチルアルコールへの変換は（ｅ）クロトンアルデヒド還元酵素（Crotonaldehyde reductase；alcohol forming）により触媒される。また、別の経路として、クロトニルＣｏＡからクロチルアルコールへ直接変換できる経路もあり、クロトニルＣｏＡからクロチルアルコールへの変換は（ｆ）クロトニルＣｏＡ還元酵素 （アルコール生成型）（Crotonyl−CoA reductase；alcohol forming）が触媒する。さらには、クロトニルＣｏＡからクロトン酸を経て、クロトンアルデヒドを生成し、クロトンアルデヒドからクロチルアルコールへ変換する経路もあり、この経路のうち、クロトニルＣｏＡからクロトン酸への変換は（ｇ）クロトニルＣｏＡハイドロラーゼ（Crotonyl−CoA hydrolase）により触媒され、クロトン酸からクロトンアルデヒドへの変換は（ｈ）クロトン酸還元酵素（Crotonate reductase）が触媒する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１１−５０９６９１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１４０１７１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記現状に鑑み、本発明は、合成ガス等からクロトニルＣｏＡを生産することができる組換え細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る組換え細胞は、下記［１］〜［８］の組換え細胞である。
［１］メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、アセトアセチルＣｏＡ チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、前記遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からクロトニルＣｏＡを生産可能である組換え細胞。
［２］メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、少なくともアセトアセチルＣｏＡ チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、前記遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からブタジエン若しくはその前駆体を生産可能である組換え細胞。
［３］前記宿主細胞は、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである、前記［１］又は［２］の組換え細胞。
［４］前記宿主細胞は、偏性嫌気性微生物である、前記［１］又は［２］の組換え細胞。
［５］前記宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属細菌、又はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌である、前記［１］〜［４］のいずれかの組換え細胞。
［６］前記遺伝子の少なくとも１つは、細菌由来のものである、前記［１］〜［５］のいずれかの組換え細胞。
［７］前記遺伝子の少なくとも１つは、宿主細胞由来のものである、前記［１］〜［６］のいずれかの組換え細胞。
［８］導入された遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれている、前記［１］〜［７］のいずれかの組換え細胞。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る組換え細胞により、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、又はメタノールからクロトニルＣｏＡを生産することができる。例えば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスからクロトニルＣｏＡを生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】アセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡ及びクロチルアルコールに至る代謝経路を表す説明図である。
【図２】アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００１５】
本発明に係る組換え細胞は、本来「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を有している宿主細胞に、アセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡに至る生合成経路で作用する酵素群の少なくとも１つをコードする遺伝子が導入されたものである。
【００１６】
メチルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨ３］−ＴＨＦ）、一酸化炭素（ＣＯ）、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、例えば、図２に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）に含まれている。
【００１７】
図２に示すように、アセチルＣｏＡ経路では、二酸化炭素（ＣＯ２）が２つの経路で別々に、一酸化炭素とメチルカチオン源に還元される。そして、これら２つの炭素源を基質としてＣｏＡ（図２ではＨＳＣｏＡと表記）のチオール基がアセチル化され、１分子のアセチルＣｏＡが合成される。アセチルＣｏＡ経路では、アセチルＣｏＡシンターゼ（Acetyl−CoA synthase、ＡＣＳ）、メチルトランスフェラーゼ（Methyltransferase）、一酸化炭素脱水素酵素、ギ酸デヒドロゲナーゼ（Formate dehydrogenase、ＦＤＨ）、等の酵素が作用している。なお、ホルミルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨＯ］−ＴＨＦ）からメチルテトラヒドロ葉酸に至る経路は、メチルブランチ（Methyl branch）と呼ばれる。
一方、メタノール経路は、メタノールをホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）、さらにギ酸（ＨＣＯＯＨ）に変換する経路と、メタノールからメチルテトラヒドロ葉酸を誘導する経路を含んでいる。
すなわち、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路とで共通している。
【００１８】
一酸化炭素脱水素酵素（例えば、ＥＣ．１．２．９９．２／ＥＣ．１．２．７．４）（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、CO dehydrogenase、ＣＯＤＨ）は、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを生成させる反応の触媒作用、及びその逆反応である、二酸化炭素とプロトンから一酸化炭素と水を生成させる反応の触媒作用、を有する。一酸化炭素脱水素酵素は、アセチルＣｏＡ経路（図２）で作用する酵素の１つである。
【００１９】
本発明に係る組換え細胞を製造するために用いられる宿主細胞としては、アセチルＣｏＡ経路を保有し、かつ一酸化炭素耐性並びに合成ガス資化性を保有する微生物が好ましい。当該微生物としては、具体的には、図２に示すアセチルＣｏＡ経路及びメタノール経路を有する微生物が挙げられる。本発明に係る組換え細胞としては、一酸化炭素脱水素酵素を有する細胞を宿主細胞として製造されたものがより好ましい。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する細胞が好ましい。
【００２０】
アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を有する嫌気性微生物は、一酸化炭素脱水素酵素を有している。そこで、本発明に係る組換え細胞の宿主細胞としては、嫌気性微生物が好ましく、偏性嫌気性微生物がより好ましい。
【００２１】
ＣＯＤＨを有する嫌気性微生物として、Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenumn、Clostridium carboxidivorans、Clostridium ragsdalei（Kopke M. et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2011，vol.77(15)，p.5467−5475）、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ）（Pierce EG. Et al.，Environ. Microbiol.，2008，vol.10，p.2550−2573)、Acetobacterium woodii（Dilling S. et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2007，vol.73(11)，p.3630−3636）等のクロストリジウム（Clostridium）属細菌、モレラ（Moorella）属細菌、又はアセトバクテリウム（Acetobacterium）属細菌が代表例として挙げられる。これらの５種の嫌気性微生物は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。特に、クロストリジウム属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明に係る組換え細胞の宿主細胞（宿主微生物）として好適である。
【００２２】
クロストリジウム属細菌、モレラ属細菌、及びアセトバクテリウム属細菌以外では、Carboxydocella sporoducens sp. Nov.（Slepova TV. et al.，Inter. J. Sys. Evol. Microbiol.，2006，vol.56，p.797−800）、Rhodopseudomonas gelatinosa（Uffen RL, J. Bacteriol.，1983，vol.155(3)，p.956−965）、Eubacterium limosum（Roh H. et al.，J. Bacteriol.，2011，vol.193(1)，p.307−308）、Butyribacterium methylotrophicum（Lynd, LH. Et al.，J. Bacteriol.，1983，vol.153(3)，p.1415−1423）等の細菌を宿主微生物として用いることができる。
【００２３】
なお、上記で具体的に列挙した細菌の増殖及びＣＯＤＨ活性は全て酸素感受性であるが、酸素非感受性のＣＯＤＨも知られている。例えば、Oligotropha carboxidovorans（Schubel, U. et al.，J. Bacteriol.，1995，p.2197−2203）、Bradyrhizobium japonicum（Lorite MJ. Et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2000，vol.66(5)，p.1871−1876）を始めその他のバクテリア種には、酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（King GM et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2003，vol.69(12)，p.7257−7265）。好気性水素酸化細菌であるラルソトニア（Ralsotonia）属菌にも、酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（NCBI Gene ID：4249199，8019399)。
【００２４】
このように、ＣＯＤＨを有する細菌は広く存在しており、その中から本発明に係る組換え細胞のための宿主微生物を適宜選択することができる。例えば、ＣＯ、ＣＯ／Ｈ２（ＣＯとＨ２を主成分とするガス）、若しくはＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２（ＣＯとＣＯ２とＨ２を主成分とするガス）を唯一の炭素源かつエネルギー源とした選択培地を用い、嫌気、微好気、若しくは好気的条件で、宿主細胞として利用できるＣＯＤＨを有する細菌を分離することができる。
【００２５】
一方、いくつかのクロストリジウム属細菌では、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Butyryl−CoA dehydrogenase）の作用により、クロトニルＣｏＡをブチリルＣｏＡに変換し、次いでアルデヒド／アルコール脱水素酵素（aldehyde/alcohol dehydrogenase）の作用によって１−ブタノールを生成させる経路を保有する（Atsumi S. et al.，Metabolic Engineering，2008，vol.10，p.305−311）。これらのクロストリジウム属細菌のブチリルＣｏＡ脱水素酵素の活性を欠損又は抑制させた細胞を宿主細胞として用いることによって、クロトニルＣｏＡからブタジエン等の１−ブタノール以外の目的物質をより多量に生成し得る組換え細胞を育種することが可能となる。
【００２６】
ブチリルＣｏＡ脱水素酵素は、短鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素(Short−chain specific acyl−CoA dehydrogenase；ＥＣ．１．３．８．１)の一種であり、具体的には、Ｐ５２０４２（Clostridium acetobutylicum-bcd CA）；Ｆ０Ｋ４２２（Clostridium acetobutylicum−bcd CEA）；Ｃ９ＸＮＥ９（Clostridium difficile−bcd2）；Ｑ９ＫＤＴ１（Bacillus halodurans−BH1130）；Ｑ０７４１７（Mus musculus−Acads）等が挙げられる。なお、これらの番号は、UniProt KB/Swiss Protのデータベースの登録番号である。
【００２７】
宿主細胞における上記酵素の活性を欠損又は抑制させる遺伝子改変の手法としては、特に限定されるものではなく、例えば、発現する酵素の分子数を減少させる手法と、発現する酵素自体の活性を減少させる手法の２つが大きく挙げられる。前者の例としては、標的酵素遺伝子の発現量を転写レベル又は翻訳レベルで減少させる手法が挙げられる。具体的には、プロモーター配列やシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変することが挙げられる。後者の例としては、ゲノム上の標的酵素遺伝子に変異を導入することが挙げられる。
【００２８】
酵素活性を欠損又は抑制する方法としては、宿主微生物が本来有している酵素遺伝子を、別の遺伝子に置換する態様が好ましく採用される。例えば、ゲノム上にある既存の酵素遺伝子を、当該酵素遺伝子にフレームシフトを生じさせた配列、当該酵素遺伝子に点変異を生じさせた配列、当該酵素遺伝子の部分断片遺伝子等に置換することにより、酵素活性の欠損や抑制を実現することができる。
【００２９】
遺伝子の置換は、例えば相同組換えにより行うことができる。相同組換えに求められる塩基配列の相同性（配列同一性）は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。なお、相同組換え法による遺伝子操作法は既に多くの細菌等で確立されており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、プラスミドを用いる方法等がある（米国特許第６３０３３８３号明細書、特開平０５−００７４９１号公報等参照）。クロストリジウム属菌におけるプラスミドによる相同組換えの手法は、例えば「Heap JT et al.，J. Microbiol. Methods，2007，vol.70(3)，p.452−64」に記載されている。なお、クロストリジウム属菌への遺伝子導入では、導入遺伝子が制限酵素Ｃａｃ８２４Ｉ等による分解を受けやすく極めて不安定である。そこで、導入遺伝子を一旦、大腸菌（例えば、ＥＲ２２７５株）内において複製することによってメチル化する方法（Mermelstein LD et al., Apply. Environ. Microbiol., 1993, vol.59(4)，p.1077−1081）や、Ｃａｃ８２４Ｉ遺伝子を欠損させたクロストリジウム属菌欠損株を用いる方法（Dong H. et al., PLoS ONE, 2010, vol.5(2)，p.e9038）等を用いることにより、効率よく遺伝子導入及び相同組換えを行うことができる。
【００３０】
宿主微生物に変異誘発剤等による変異処理を行うことによっても、目的の遺伝子改変を行うことができる。例えば、放射線照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の変異剤によって宿主微生物を処理し、標的酵素（ブチリルＣｏＡ脱水素酵素）の活性が欠損、若しくは抑制された変異微生物を選抜することができる。
【００３１】
本発明に係る組換え細胞においては、アセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡに至る生合成経路で作用する酵素群（以下、まとめて「クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素（群）」と呼ぶことがある。）が発現している。図１の（ａ）〜（ｃ）で示される酵素が、クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素に相当する。本発明に係る組換え細胞において発現しているクロトニルＣｏＡ生合成関連酵素としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば特許文献２に開示されたものの中から適宜選択することができる。例えば、以下の酵素が挙げられる。
【００３２】
酵素（ａ）：アセトアセチルＣｏＡ  チオラーゼ（アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA acyltransferase）とも呼ばれる。）（例えば、ＥＣ．２．３．１．９等）。具体的には、Ｐ７６４６１（E．coli−atoB）；Ｐ４５３５９（Clostridium acetobutylicum−thlA）；Ｐ４５８５５(Bacillus subtilis−mmgA); Q18AR0 (Clostridium difficile−thlA)；Ｑ９Ｉ２Ａ８(Pseudomonas aeruginosa−atoB)等（いずれもUniProtKB/Swiss−Prot No.で表示。）が挙げられる。
【００３３】
酵素（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（例えば、ＥＣ．１．１．１．１５７、ＥＣ．１．１．１．３５等）。具体的には、Ｐ５２０４１（Clostridium acetobutylicum−hbd）；Ｐ４５３６４（Clostridium difficile−hbd）；Ｐ７７３３９（Escherichia coli−fadJ）；Ｏ５３７５３（Mycobacterium tuberculosis−fadB2）等（いずれもUniProtKB/Swiss−Prot No.で表示。）が挙げられる。
【００３４】
酵素（ｃ）：３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼ（クロトナーゼ（Crotonase）とも呼ばれる。）（例えば、ＥＣ．４．２．１．５５等）。具体的には、Ｐ５２０４６（Clostridium acetobutylicum−crt）；Ｐ４５３６１（Clostridium difficile−crt）；Ｂ９Ｊ１２５（Bacillus cereus−crt）等（いずれもUniProtKB/Swiss−Prot No.で表示。）が挙げられる。
【００３５】
本発明に係る組換え細胞においては、（ａ）アセトアセチルＣｏＡ  チオラーゼ、（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素及び（ｃ）３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼのうち少なくとも１種の酵素をコードする構造遺伝子が、人為的に導入されている。宿主細胞に導入される構造遺伝子の数は、得られた組換え細胞が、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からクロチルアルコールを生産可能である限り、１種類のみであってもよい。例えば、宿主細胞が元々前記３種の酵素のうちの２種類を備えている場合には、欠損している残る１種類の酵素をコードする遺伝子のみを導入することによって、本発明に係る組換え細胞を製造することができる。一方で、人為的に導入される構造遺伝子は、２種類以上であってもよく、（ａ）アセトアセチルＣｏＡ  チオラーゼをコードする構造遺伝子、（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素をコードする構造遺伝子、及び（ｃ）３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼをコードする構造遺伝子の全てを宿主細胞に導入してもよい。また、同種の酵素活性を有する酵素の構造遺伝子を２種以上導入してもよい。同種又は異種の酵素を２種類以上導入することにより、各酵素の活性が増強される場合には、クロトニルＣｏＡ、及びその代謝産物（例えば、クロチルアルコール等）の生産性が高まることが期待される。
【００３６】
本発明に係る組換え細胞の製造のために宿主細胞に人為的に導入される構造遺伝子は、宿主細胞が元々有していない酵素をコードする遺伝子のみならず、宿主細胞が元々有している酵素をコードする遺伝子であってもよい。外部から遺伝子を導入させた酵素は一般的に発現効率が高いため、内在性の酵素のみの場合よりもクロトニルＣｏＡの産生効率が高められるためである。また、宿主細胞が保有しているが分子活性が低い場合には、より分子活性の高い酵素（例えば、変異を加えた酵素や、他の生物種由来の酵素）をコードする遺伝子を導入することが好ましい。
【００３７】
本発明に係る組換え細胞としては、宿主細胞が元々保有しているか否かにかかわらず、（ａ）アセトアセチルＣｏＡ  チオラーゼ、（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、及び（ｃ）３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも２つの酵素をコードする構造遺伝子が導入されているものが好ましく、（ａ）アセトアセチルＣｏＡ  チオラーゼをコードする構造遺伝子、（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素をコードする構造遺伝子、及び（ｃ）３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼをコードする構造遺伝子の全てが導入されているものがより好ましい。このような組換え細胞は、３種全てのクロトニルＣｏＡ生合成関連酵素が人為的に発現していることにより、クロトニルＣｏＡの合成効率が非常に高い結果、クロトニルＣｏＡを起点として合成される様々な化合物をも高生産し得るため、非常に有用である。
【００３８】
図１に示すように、クロトニルＣｏＡからクロチルアルコールが合成され得る。図１の酵素（ｄ）〜（ｈ）で示される、クロトニルＣｏＡからクロチルアルコールに至る生合成経路で作用する酵素（群）を、以下、まとめて「クロチルアルコール生合成関連酵素（群）」と呼ぶことがある。例えば、宿主細胞が元々、図１の酵素（ｄ）と酵素（ｅ）を保有している場合、酵素（ｇ）と酵素（ｈ）と酵素（ｅ）を保有している場合、又は酵素（ｆ）を保有している場合には、本発明に係る組換え細胞においては、合成されたクロトニルＣｏＡからクロチルアルコールが合成される。また、宿主細胞がこれらのクロチルアルコール生合成関連酵素を保有していない場合には、必要な酵素をコードする構造遺伝子を人為的に導入することにより、アセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを介してクロチルアルコールを合成する組換え細胞を得ることができる。クロチルアルコール生合成関連酵素をコードする構造遺伝子は、クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素をコードする構造遺伝子と共に宿主細胞に導入されてもよく、クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素をコードする構造遺伝子が導入される前の宿主細胞に導入されてもよく、クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素をコードする構造遺伝子が導入されて得られた組換え細胞に導入されてもよい。
【００３９】
本発明に係る組換え細胞において発現しているクロチルアルコール生合成関連酵素としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば特許文献２に開示されたものの中から適宜選択することができる。例えば、以下の酵素が挙げられる。
【００４０】
酵素（ｄ）：クロトニルＣｏＡ還元酵素（アルデヒド生成型）。本酵素は、アシルＣｏＡ還元酵素に属する酵素であり、クロトニルＣｏＡ還元活性を示すものは、酵素分類では、例えばＥＣ．１．２．１．５０、ＥＣ．１．２．１．ｎ２、ＥＣ．１．２．１．７６等に該当する。具体的には、Ｐ９４１２９（Acinetobacter baylyi-acr1）；Ｐ２３１１３（Photorhabdus luminescens−luxC）；Ｐ０８６３９（Vibrio harveyi−luxC）；Ｑ９７ＧＳ８（Clostridium acetobutylicum−luxC）；Ｐ３８９４７（Clostridium kluyveri−sucD）等（いずれもUniProtKB/Swiss−Prot No.で表示。）が挙げられる。
【００４１】
酵素（ｅ）：クロトンアルデヒド還元酵素（アルコール生成型）。本酵素は、Ｃ２−Ｃ１４（炭素数が２〜１４）程度のアルコールに作用するアルコール脱水素酵素（例えば、ＥＣ．１．１．１．２、ＥＣ．１．１．１．−等）である。具体的には、Ｑ９Ｆ１Ｒ１ (Acinetobacter sp.−Alr−A）；Ｑ４６８５６（Escherichia coli−yqhD）；Ｑ０４９４４（Clostridium acetobutylicum−bdhA）；Ｑ０４９４５（Clostridium acetobutylicum−bdhB）等（いずれもUniProtKB/Swiss−Prot No.で表示。）が挙げられる。
【００４２】
酵素（ｆ）：クロトニルＣｏＡ還元酵素 （アルコール生成型）。本酵素は、クロトニルＣｏＡから直接クロチルアルコールを生成することが可能であり、アシルＣｏＡから相当するアルコールへ変換する酵素群（例えば、ＥＣ．１．１．１．１、ＥＣ．１．２．１．１０等）に属する。具体的には、Ｑ９ＡＮＲ５（Clostridium acetobutylicum−adhE2）；Ｄ８ＧＵ５３（Clostridium ljungdahlii−adhE2）；Ｐ０Ａ９Ｑ７（Escherichia coli−adhE）等（いずれもUniProtKB/Swiss−Prot No.で表示。）が挙げられる。
【００４３】
酵素（ｇ）：クロトニルＣｏＡハイドロラーゼ。本酵素は、アシルＣｏＡを相当するカルボン酸に変換する酵素群（例えば、ＥＣ.３．１.２．４、ＥＣ.３．１.２．１等）に属する。具体的には、Ｑ５ＸＩＥ６（Rattus norvegicus−hibch）；Ｑ６ＮＶＹ１（Homo sapiens−hibcｈ）；Ａ２ＶＤＣ２（Xenopus laevis−hibch）；Ｐ３２３１６（Saccharomyces cerevisiae−ACH1）等（いずれもUniProtKB/Swiss−Prot No.で表示。）が挙げられる。
【００４４】
酵素（ｈ）：クロトン酸還元酵素。本酵素は、アルデヒド脱水酵素の一種の活性、すなわちクロトンアルデヒド脱水素酵素の逆反応によって、クロトン酸からクロトンアルデヒドを生成するものである。本活性は、酵素分類上、例えばＥＣ．１．２．１．２２、ＥＣ．１．２．１．３等に属する。具体的には、Ｑ５８８０６（Methanococcus jannaschii−LDH）；Ｐ２５５５３（Escherichia coli−aldA）；Ｐ１２６９３（Pseudomonas oleovorans−alkH）；Ｑ６ＲＫＢ１（Nocardia iowensis−car）等（いずれもUniProtKB/Swiss−Prot No.で表示。）が挙げられる。
【００４５】
本発明に係る組換え細胞としては、例えば、宿主細胞が元々保有しているか否かにかかわらず、（ａ）アセトアセチルＣｏＡ  チオラーゼ、（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、及び（ｃ）３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする構造遺伝子と、（ｄ）クロトニルＣｏＡ還元酵素（アルデヒド生成型）及び（ｅ）クロトンアルデヒド還元酵素（アルコール生成型）からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする構造遺伝子とが宿主細胞に導入された組換え細胞；（ａ）アセトアセチルＣｏＡ  チオラーゼ、（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、及び（ｃ）３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする構造遺伝子と、（ｆ）クロトニルＣｏＡ還元酵素 （アルコール生成型）をコードする構造遺伝子とが宿主細胞に導入された組換え細胞；（ａ）アセトアセチルＣｏＡ  チオラーゼ、（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、及び（ｃ）３−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡデハイドラターゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする構造遺伝子と、（ｇ）クロトニルＣｏＡハイドロラーゼ、（ｈ）クロトン酸還元酵素、及び（ｅ）クロトンアルデヒド還元酵素（アルコール生成型）からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする構造遺伝子とが宿主細胞に導入された組換え細胞が好ましい。クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素のうちの少なくとも１種をコードする構造遺伝子と、クロチルアルコール生合成関連酵素のうちの少なくとも１種をコードする構造遺伝子との両方が導入されていることにより、アセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを介してクロチルアルコールを合成する生合成経路が亢進され、クロチルアルコール又はその代謝産物を高生産し得るためである。
【００４６】
なお、本発明に係る組換え細胞において、クロチルアルコールを高生産させて細胞内に蓄積又は細胞外へ分泌させることを目的とする場合には、宿主細胞としてクロチルアルコールに対する耐性の高い微生物を用いることが好ましい。中でも、少なくとも４００ｍＭのクロチルアルコールに対する耐性を有する宿主細胞や、少なくとも１％（ｗ／ｖ）濃度のクロチルアルコールに対する耐性を有する宿主細胞を用いることが好ましい。このようなクロチルアルコール耐性を有する宿主細胞は、例えば、適宜の変異処理を宿主細胞に施して目的の特性を有する宿主細胞を選抜することにより得ることができる。
【００４７】
本発明に係る組換え細胞において導入されるこれらの酵素をコードする遺伝子としては、組換え細胞内で正常に転写・翻訳され、発現された酵母が当該組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定されない。例えば、本発明に係る組換え細胞内で発現させるクロトニルＣｏＡ生合成関連酵素やクロチルアルコール生合成関連酵素は、宿主細胞やその他の生物の細胞内において天然に存在する酵素であってもよく、各酵素の改変体であってもよい。当該改変体としては、例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチド等が挙げられる。
【００４８】
宿主細胞が元々保有しているクロトニルＣｏＡ生合成関連酵素又はクロチルアルコール生合成関連酵素を導入する場合には、元々保有していた酵素よりもより基質特異性、分子活性又は安定性が優れた、すなわちＫｃａｔ／Ｋｍ値等がより高い酵素遺伝子を導入することが好ましい。このような酵素遺伝子は、宿主細胞が元々保有する酵素の改変体をコードする遺伝子であってもよく、宿主細胞とは異なる生物種由来の同種の酵素をコードする遺伝子であってもよい。
【００４９】
本発明に係る組換え細胞において導入されるクロトニルＣｏＡ生合成関連酵素又はクロチルアルコール生合成関連酵素の酵素遺伝子としては、細菌由来のものが好ましく、宿主細胞と同種の生物種由来のものがより好ましい。宿主細胞が細菌である場合において、使用されるコドンの構成が宿主細胞のそれに近いため、導入された酵素遺伝子が宿主細胞内で効率よく転写・翻訳され得る。
【００５０】
本発明の組換え細胞においては、クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素をコードする遺伝子やクロチルアルコール生合成関連酵素をコードする遺伝子に加えて、他の遺伝子がさらに導入されていてもよい。導入する他の遺伝子としては、例えば、アセチルＣｏＡ経路やメタノール経路で作用する酵素、例えば、アセチルＣｏＡシンターゼ、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素脱水素酵素、ギ酸デヒドロゲナーゼ等をコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子を導入することにより、組換え細胞内におけるアセチルＣｏＡ合成の増強が期待でき、ひいてはクロトニルＣｏＡ合成の増強が期待できる。
【００５１】
宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能であり、かつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
【００５２】
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製が可能又は染色体（ゲノム）中への組み込みが可能であり、かつ挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、及び転写終結配列からなる一連の構成（発現カセット）を宿主細胞内で構築することが好ましい。導入した構造遺伝子が安定的に組換え細胞内で保持されるため、本発明に係る組換え細胞においては、クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素をコードする遺伝子等が、ゲノムに組み込まれるように人為的に導入されたものであることが好ましい。
【００５３】
宿主細胞がクロストリジウム属細菌（モレラ属細菌のような近縁種を含む。）の場合には、例えば、クロストリジウム属細菌と大腸菌とのシャトルベクターｐＩＭＰ１（Mermelstein LD et al.，Biotechnology，1992，vol.10，p.190−195）を用いることができる。当該シャトルベクターは、ｐＵＣ９（ＡＴＣＣ番号：３７２５２）とBacillus subtilisから分離されたｐＩＭ１３（Projan SJ et al.，J. Bacteriol.，1987，vol.169(11)，p.5131−5139）との融合ベクターであり、クロストリジウム属細菌内でも安定的に保持される。
【００５４】
クロストリジウム属細菌への遺伝子導入には、通常、エレクトロポレーション法が使用されるが、遺伝子導入直後の導入された外来プラスミドは制限酵素Ｃａｃ８２４Ｉ等による分解を受けやすく極めて不安定である。そのため、Bacillus subtilis ファージΦ3T1由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子が保持されたｐＡＮ１（Mermelstein LD et al.，Apply. Environ. Microbiol.，1993，vol.59(4)，p.1077−1081）を保有する大腸菌、例えばＥＲ２２７５株等でｐＩＭＰ１に由来するベクターを一旦増幅し、メチル化処理を行ってから、これを大腸菌から回収しエレクトロポレーションによる形質転換に使用することが好ましい。なお、最近では、Ｃａｃ８２４Ｉ遺伝子が欠損したClostridium acetobuthylicumが開発されており、このようなＣａｃ８２４Ｉ遺伝子が欠損したクロストリジウム属細菌を宿主細胞とすることにより、メチル化処理されていないベクターも安定的に使用可能である（Dong H. et al.，PLoS ONE，2010，vol.5(2)，p.e9038）。
【００５５】
クロストリジウム属細菌における異種遺伝子発現のプロモーターとしては、例えばｔｈｌ（thiolase）プロモーター（Perret S et al.，J. Bacteriol.，2004，vol.186(1)，p.253−257)、Ｄｈａ（glycerol dehydratase）プロモーター（Raynaud C. et al.，PNAS，2003，vol.100(9)，p.5010−5015）、ｐｔｂ（phosphotransbutyrylase）プロモーター（Desai RP et al.，Appl. Environ. Microbiol.，1999，vol.65(3)，p.936−945）、ａｄｃ（acetoacetate decarboxylase）プロモーター（Lee J et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2012，vol.78(5)，p.1416−1423）等が挙げられる。ただし、本発明に係る組換え細胞の製造においては、これらに限定されることなく、宿主細胞等に見出される様々な代謝系のオペロンに使用されているプロモーター領域の配列が使用可能である。
【００５６】
また、ベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主細胞に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよく、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよく、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の遺伝子を導入する例としては、クロトニルＣｏＡ生合成関連酵素をコードする遺伝子やクロチルアルコール生合成関連酵素をコードする遺伝子と共に、アセチルＣｏＡ経路やメタノール経路で作用する酵素をコードする遺伝子を導入してもよい。
【００５７】
本発明に係る組換え細胞の製造においては、使用できる既知のベクターをそのまま用いてもよく、プロモーター、ターミネーター等の転写制御、複製領域等に関わる領域を、目的に応じて改変したものを用いてもよい。改変方法としては、プロモーター等の領域を、各宿主細胞又はその近縁種が保有する天然の他の遺伝子配列に変更してもよく、人工の遺伝子配列に変更してもよい。
【００５８】
以上の遺伝子導入による改変に加え、突然変異、ゲノムシャッフリング等の変異手法をも組み合わせることにより、宿主細胞における導入遺伝子の発現効率、クロトニルＣｏＡやその代謝産物（例えば、クロチルアルコール等）に対する耐性等を向上させることにより、クロトニルＣｏＡ又はその代謝産物の生産性をさらに向上させることが可能となる。
【００５９】
なお、クロチルアルコールは、ブタジエン合成の起点となり得る。そこで、本発明に係る組換え細胞の製造に、クロチルアルコールからブタジエンを生合成するために必要な酵素を保有している微生物を宿主細胞として用いることにより、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から、クロトニルＣｏＡ及びクロチルアルコールを経由してブタジエンを生産し得る組換え細胞が得られる。また、本発明に係る組換え細胞に、さらに、クロチルアルコールからブタジエンを生合成するために必要な酵素をコードする構造遺伝子を導入することによっても、ブタジエンを生産し得る組換え細胞が得られる。
【００６０】
本発明に係る組換え細胞について、クロトニルＣｏＡ等の生産を目的とせず、専ら細胞を増やす目的で培養する場合には、一酸化炭素や二酸化炭素を炭素源として用いる必要はない。例えば糖類やグリセリンといった他の炭素源を用いて、組換え細胞を培養すればよい。
【００６１】
本発明に係る組換え細胞を培養する方法としては、特に限定されるものではなく、宿主細胞の種類等に応じて適宜行うことができる。組換え細胞がクロストリジウム属細菌（偏性嫌気性）の場合には、例えば、生育に必要な無機塩類、及び合成ガスからなる栄養条件で培養する。好ましくは０．２〜０．３Ｍｐａ（絶対圧）程度の加圧状態で培養する。また、組換え細胞が好気性や通性嫌気性の場合には、例えば、液体培地を用いた通気・撹拌培養を行うことができる。また、偏性嫌気性細菌、好気性細菌、通性嫌気性細菌のいずれであっても、初期増殖及び到達細胞密度を良好にするために、ビタミン、酵母エキス、コーンスティープリカー、バクトトリプトン等の蛋白質加水分解物等の有機物を少量加えてもよい。
【００６２】
本発明に係る組換え細胞は、少なくともアセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを合成する生合成経路を保有し、かつ一酸化炭素耐性並びに合成ガス資化性を保有する細胞である。このため、本発明に係る組換え細胞は、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からクロトニルＣｏＡを合成することが可能である。また、クロトニルＣｏＡは反応活性が高いため、当該組換え細胞内で合成されたクロトニルＣｏＡは代謝されてクロチルアルコール等に変換される。つまり、本発明に係る組換え細胞は、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から、クロチルアルコール等のクロトニルＣｏＡの代謝産物を合成することも可能である。
【００６３】
すなわち、本発明に係る組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養することにより、クロトニルＣｏＡやその代謝産物（クロチルアルコール等）を製造することができる。
【００６４】
炭素原として用いるこれらのＣ１化合物については、１種のみを用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素原として用いることが好ましく、唯一の炭素原であることがより好ましい。また、エネルギー源として水素（Ｈ２）を同時に提供することが好ましい。
【００６５】
本発明に係る組換え細胞にクロトニルＣｏＡ等を生産させる場合に炭素源として用いられるＣ１化合物としては、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスが好ましく、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、又は二酸化炭素と水素とを主成分とするガスがより好ましい。この場合、ガスに含まれている水素はエネルギー源として使用される。
【００６６】
Ｃ１化合物がガスである場合、本発明に係る組換え細胞にＣ１化合物を提供することにより、当該Ｃ１化合物からクロトニルＣｏＡ等を生産させることができる。なお、「組換え細胞にガスを提供する」とは、炭素源等としてガスを組換え細胞に与える、あるいは、組換え細胞にガスを接触させる、という意味である。
【００６７】
本発明に係る組換え細胞は、ギ酸及び／又はメタノールからもクロチルアルコールを生産することもできる。すなわち、本発明に係る組換え細胞を、炭素源としてギ酸やメタノールを単独で又は一酸化炭素や二酸化炭素と共に用いて培養したり、ギ酸やメタノールを組換え細胞に接触させることにより、ギ酸やメタノールからもクロチルアルコールを生産することができる。
【００６８】
また、二酸化炭素に代えて、重炭酸塩を用いてもよい。クロストリジウム属細菌及びその近縁種は、炭酸脱水素酵素（Carbonic anhydrase, ＣＡ）(ＥＣ．４．２．１．１：Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２ ⇔ ＨＣＯ３−＋Ｈ＋）を有することが知られており（Braus-Stromeyer SA et al.，J. Bacteriol.，1997，vol.179(22)，p.7197−7200)、ＣＯ２源として、ＨＣＯ３−源となるＮａＨＣＯ３等の重炭酸塩を用いることができる。
【００６９】
ここで、宿主細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路（図２）を有している場合において、組換え細胞に提供され得る一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールの組み合わせについて説明する。
【００７０】
アセチルＣｏＡ経路によるアセチルＣｏＡ合成では、メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（Corrinoid iron−sulfur protein、ＣｏＦｅＳ−Ｐ)、アセチルＣｏＡシンターゼ、及びＣＯＤＨの作用による、ＣｏＡ、メチルテトラヒドロ葉酸及びＣＯからのアセチルＣｏＡの合成過程が必須である（Ragsdale SW et al.，B.B.R.C.，2008，vol.1784(12)，p.1873−1898）。
【００７１】
一方、Butyribacterium methylotrophicumの培養において、炭素源としてＣＯやＣＯ２以外にギ酸やメタノールを添加することは、ＣＯ代謝すなわち、アセチルＣｏＡ経路のメチルブランチにおけるテトラヒドロ葉酸（tetrahydrofolate、ＴＨＦ）含量、及び、ＣＯ代謝で必要とされるＣＯＤＨ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びヒドロゲナーゼ（hydrogenase）の活性を増大させることが知られている（Kerby R. et al.，J. Bacteriol.，1987，vol.169(12)，p.5605−5609）。Eubacterium limosum等においても、嫌気条件下で二酸化炭素及びメタノールを炭素源とした場合でも、高い増殖を得ることが示されている（Genthner BRS. et al.，Appl. Environ. Microbiol.，1987，vol.53(3)，p.471−476）。
【００７２】
これらのメタノールの合成ガス資化性微生物へ影響、及びMoorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticum）及びClostridium ljungdahlii等のゲノム解析（Pierce E. et al.，Environ. Microbiol.，2008，vol.10(10)，p.2550−2573；Durre P. et al., PNAS 2010，vol.107(29)，p.13087−13092）の結果から、これらの微生物種では、図２に示されるようなメタノール経路がアセチルＣｏＡ経路にメチル基のドナーとして関与することが説明できる。
【００７３】
また実際に、いくつかのクロストリジウム属菌ではギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）(ＥＣ．１．２．１．２／ＥＣ．１．２．１．４３：Formate＋ＮＡＤ（Ｐ）＋ ⇔ ＣＯ２＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の正方向の活性（FormateからのＣＯ２形成）が確認されている（Liu CL et al.，J. Bacteriol.，1984，vol.159(1)，p.375−380；Keamy JJ et al.，J. Bacteriol.，1972，vol.109(1)，p.152−161）。このことから、これらの株ではＣＯ２やＣＯが欠乏状態にある場合、部分的にメタノール（ＣＨ３ＯＨ）やギ酸（ＨＣＯＯＨ）からＣＯ２の生成方向の反応が働くことができる（図２）。このことは、前述したＣＨ３ＯＨを加えることによる、ギ酸ヒドロゲナーゼ（formatede hydrogenase）活性、及びＣＯＤＨの活性増大の現象 (Kerby R et al.，J. Bateriol.，1987，vol.169(12)，p.5605−5609)からも説明できる。すなわち、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）又はメタノール（ＣＨ３ＯＨ）を唯一の炭素源としても増殖可能である。
【００７４】
宿主細胞が、元々、ギ酸デヒドロゲナーゼの正方向の活性を有しない株であっても、変異導入、外来遺伝子導入、若しくはゲノムシャッフリングのような遺伝子改変によって、正方向の活性を付与させればよい。
【００７５】
以上のことから、宿主細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を有している場合には、以下のガスや液体を用いて、クロトニルＣｏＡ及びその代謝産物（例えば、クロチルアルコール）を生産することができる。
・ＣＯ
・ＣＯ２
・ＣＯ／Ｈ２
・ＣＯ２／Ｈ２
・ＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２
・ＣＯ／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ２／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＨ３ＯＨ
・ＣＯ２／ＣＨ３ＯＨ
・ＣＯ／Ｈ２／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ２／Ｈ２／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／Ｈ２／ＣＨ３ＯＨ
・ＣＯ２／Ｈ２／ＣＨ３ＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２／ＣＨ３ＯＨ
・ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２
・ＨＣＯＯＨ／Ｈ２
・ＣＨ３ＯＨ
・ＨＣＯＯＨ
【００７６】
本発明に係る組換え細胞は、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、前記のＣ１化合物を炭素源として、クロトニルＣｏＡ、又はその代謝産物たるクロチルアルコールを生産することができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、クロトニルＣｏＡ、若しくはクロチルアルコールを連続的に生産させることができる。
【００７７】
生産されたクロトニルＣｏＡ等は、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、上述したクロストリジウム属細菌又はモレラ属細菌を宿主細胞とした組換え細胞を用い、細胞外に放出されたクロトニルＣｏＡ又はクロチルアルコールを回収し、単離精製することにより、純化されたクロトニルＣｏＡ又はクロチルアルコールを取得することができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００７９】
［実施例１］クロトニルＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築。
（Clostridium acetobutylicum由来アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ遺伝子のクローニング）
C．acetobutylicum ＡＴＣＣ８２４株のゲノムを鋳型とし、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲによって、配列番号３で表される塩基配列からなるアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ｔｈｌＡ）遺伝子を増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７−Ｂｌｕｅ  Ｔベクター（タカラバイオ社）へクローニングし、ｐＴ７−ｔｈｌＡを構築した。
【００８０】
（Clostridium acetobutylicum  ＡＴＣＣ８２４株由来３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素遺伝子のクローニング）
C．acetobutylicum  ＡＴＣＣ８２４株のゲノムを鋳型とし、配列番号４及び５で表される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲによって、配列番号６で表される塩基配列からなる３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（ｈｓｄ）遺伝子を増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７−Ｂｌｕｅ  Ｔベクターへクローニングし、ｐＴ７−ｈｓｄを構築した。
【００８１】
（Clostridium acetobutylicum由来３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデハイドラターゼ遺伝子のクローニング）
C．acetobutylicum ＡＴＣＣ８２４株のゲノムを鋳型とし、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲによって、配列番号９で表される塩基配列からなる３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデハイドラターゼ（ｃｒｔ）遺伝子を増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７−Ｂｌｕｅ  Ｔベクターへクローニングし、ｐＴ７−ｃｒｔを構築した。
【００８２】
（Ｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ生成遺伝子の発現ベクターの構築）
Clostridium/E．coliシャトルベクターｐＩＭＰ１（Mermelstein LD et al.，Biotechnology，1992，vol.10，p.190−195）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡを導入し、クローニングサイトを改良し、ｐＩＭ１Ａを構築した。さらにｐＩＭ１ＡのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に、配列番号１２及び配列番号１３で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡを導入し、ｐＩＭ１Ｂを構築した。実施例１で作製したｐＴ７−ｔｈｌＡをＢａｍＨＩで切断することにより、ｔｈｌＡ遺伝子を回収し、これをｐＩＭ１ＢのＢａｍＨＩ部位へ導入することで、ｐＩＭＢ−ｔを構築した。さらに、実施例１で作製したｐＴ７−ｈｓｄをＢａｍＨＩで切断することにより、ｈｓｄ遺伝子を回収し、これをｐＩＭＢ−ｔのＢａｍＨＩ部位へ導入することで、ｐＩＭＢ−ｔｈを構築した。最後に、実施例１で作製したｐＴ７−ｃｒｔをＢａｍＨＩで切断することにより、ｃｒｔ遺伝子を回収し、これをｐＩＭＢ−ｔｈのＢａｍＨＩ部位へ導入することで、ｐＩＭＢ−ｔｈｃを構築した。本発現ベクターは、ｐＳＯＳ９５（Mingardon F et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2005，vol.71(3)，p.1215−1222）由来のプロモーター及びターミネーター領域をｔｈｌＡ、ｈｓｄ、及びｃｒｔ遺伝子クラスターの前後に有する。
【００８３】
［実施例２］合成ガス資化性菌へのクロトニルＣｏＡ生合成遺伝子の導入。
実施例１で作製したｐＩＭＢ−ｔｈｃで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓファージφ３ＴＩ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするｐＡＮ１（Mermelstein  LD et al.，Appl. Environ. Microbiol.，1993，vol.59(4)，p.1077−1081）が導入されたE.coli ER2275（ＮＥＢ社）を形質転換することで、ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化を行った。形質転換されたE．coli ER2275からメチル化されたｐＩＭＢ−ｔｈｃを回収した。「BIOTECHNOLOGY，1992，vol.10，p.190−195」に記載の方法に従い、エレクトロポレーションによって、メチル化されたｐＩＭＢ−ｔｈｃでClostridium ljungdahlii（ＡＴＣＣ番号：５５３８３）を形質転換し、組換え体ＣＬ−ｐＭｔｈｃを取得した。上記と同様の操作をｐＩＭＰ１でClostridium ljungdahlii（ＡＴＣＣ番号：５５３８３）を形質転換し、コントロール組換え体ＣＬ−ｐＭを取得した。
【００８４】
［実施例３］組換え合成ガス資化性菌におけるクロトニルＣｏＡの過剰生成。
実施例２で取得したClostridium ljungdahliiの組換え体ＣＬ−ｐＭｔｈｃ及びＣＬ−ｐＭを、３７℃、嫌気条件下で培養した。培地として、１５０μｇ／ｍＬエリスロマイシンを含有するＡＴＣＣ  ｍｅｄｉｕｍ  １７５４  ＰＥＴＣ培地（ただし、フルクトース及び酵母エキスを非含有）を用いた。１００ｍＬ容の密閉可能なガラス容器に１０ｍＬの培地を仕込み、酸素非含有ガスを２．５気圧（絶対圧）のガス圧で充填し、アルミキャップで密封した後、ＯＤ６００が０．６に達するまで振とう培養した。酸素非含有ガスとして、（ａ）ＣＯ／Ｈ２＝５０／５０％、（ｂ）ＣＯ／ＣＯ２／Ｈ２＝３３／３３／３４％、（ｃ）ＣＯ２／Ｈ２＝５０／５０％（いずれも体積比）の３種の混合ガスを用いた。
【００８５】
培養終了後の、菌体内のクロトニルＣｏＡの濃度を「Boynton Z.L. et al.，Appl. Environ. Microbiol.，1994，vol.60(1)，p.39−44」に記載の方法に従って測定した。すなわち、組換え体ＣＬ−ｐＭｔｈｃ及びＣＬ−ｐＭの細胞抽出液から過塩素酸処理で蛋白除去を行い中和した後、遠心分離によって上清を回収した。上清をフィルター処理した後、その一部を逆相カラムを用いるＨＰＬＣに供し、クロトニルＣｏＡを検出した。その結果、組換え体ＣＬ−ｐＭでは、いずれの混合ガスを用いた場合でも、クロトニルＣｏＡは検出されなかったが、組換え体ＣＬ−ｐＭｔｈｃでは、いずれの混合ガスを用いた場合でも有意のクロトニルＣｏＡが検出された。
以上より、クロトニルＣｏＡ合成酵素遺伝子が導入されたClostridium ljungdahliiの組換え体を培養することで、合成ガスからクロトニルＣｏＡを過剰生成できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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