(57)【要約】      （修正有）【課題】パパイヤ輪点ウイルス（ＰＲＳＶ）抵抗性キュウリ植物およびその製造方法を提供する。【解決手段】本ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、第６染色体上に、ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、特定の塩基配列を有する。本ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）抵抗性キュウリ植物とを交雑することによって、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物の品種が得られる。このため、本ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物によれば、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶの感染による収量低下および農薬使用の増加などの経済的ならびに労力的な損失を、大きく軽減できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第６染色体上にＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有することを特徴とするＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列
（Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
【請求項２】
前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５２３で特定されるキュウリ植物またはその後代系統である、請求項１記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
【請求項３】
前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、植物体またはその部分である、請求項１または２記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
【請求項４】
前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が種子である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
【請求項５】
前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、さらに、ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座によって供与されるＺＹＭＶ抵抗性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
【請求項６】
第６染色体上に、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座および前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
【請求項７】
前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座および前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、ヘテロ接合体である、請求項５または６記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
【請求項８】
前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ｂ１）、（Ｂ２）または（Ｂ３）の塩基配列を有する、請求項５から７のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｂ３）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
【請求項９】
前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ｃ１）、（Ｃ２）または（Ｃ３）の塩基配列を有する、請求項５から７のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｃ３）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
【請求項１０】
下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とするＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法。
（ａ）請求項１から４いずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑する工程、
（ｂ）前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物またその後代系統から、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物を選抜する工程
【請求項１１】
前記（ａ）工程に先立って、下記（ｘ）工程を有する、請求項１０記載のＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の製造方法。
（ｘ）請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物を選抜する工程
【請求項１２】
前記（ｘ）工程における前記選抜が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有するＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜である、請求項１１記載の製造方法。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列
（Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
【請求項１３】
前記（ｂ）工程における前記選抜が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有するＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列
（Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
【請求項１４】
前記（ｂ）工程における前記選抜が、前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列と、下記（Ｂ１）、（Ｂ２）もしくは（Ｂ３）の塩基配列または下記（Ｃ１）、（Ｃ２）もしくは（Ｃ３）の塩基配列とを有するＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜である、請求項１３記載の製造方法。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｂ３）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｃ３）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
【請求項１５】
前記（ａ）工程の前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５２３で特定されるキュウリ植物またはその後代系統である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物、ならびに、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリ植物の栽培において、ウイルスによる病害は、世界的に深刻な問題となっている。特に、ポチウイルスの一種であるズッキーニ黄斑モザイクウイルス（zucchini  yellow  mosaic  virus；ＺＹＭＶ）およびパパイヤ輪点ウイルス（papaya  ringspot  virus；ＰＲＳＶ）による被害は、甚大である。
【０００３】
具体的に、ＺＹＭＶおよびパパイヤ輪点ウイルス−スイカ系（papaya  ringspot  virus  type  W；ＰＲＳＶ−Ｗ）は、キュウリ植物に感染すると、急性萎凋症を引き起こす（非特許文献１および２）。このようにウイルスに感染したキュウリ植物は、枯死するため、被害は甚大であり、前記両ウイルスによる被害の経済的損失は、全国のキュウリ植物の産地で、年間約５０億円以上ともいわれている。そして、一般的に、これらの植物ウイルスに対して有効な薬剤は、報告されていないという問題がある。したがって、代替手段として、ウイルスの媒介主であるアブラムシを駆除したり、弱毒化したウイルスを幼苗に接種する必要があるため、その防除に、多大な労力および経費を費やしているのが現状である（特許文献１ならびに非特許文献３および４）。
【０００４】
このような問題から、ウイルス抵抗性を備えるキュウリ植物の系統の探索、および、ウイルス抵抗性遺伝子の解析が進められている。
【０００５】
現在、ＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物の系統としては、例えば、ＴＭＧ−１およびＤｉｎａ−１が知られており、一方、ＰＲＳＶ−Ｗ抵抗性を備えるキュウリ植物の系統としては、ＴＭＧ−１、Ｄｉｎａ−１およびＳｕｒｉｎａｍが知られている。ＴＭＧ−１およびＤｉｎａ−１が備えるＺＹＭＶ抵抗性は、１つの劣性遺伝子によって支配されているという報告がある（非特許文献５）。また、ＴＭＧ−１およびＤｉｎａ−１が有するＺＹＭＶ抵抗性遺伝子は、同じ遺伝子座または非常に近接した遺伝子座に存在するといわれている（非特許文献６）。キュウリ植物のＺＹＭＶ抵抗性遺伝子は、第６染色体の２つのマーカーの間の２．２ｃＭ内に座乗していることが知られている（非特許文献７）。さらに、ＴＭＧ−１が有するＰＲＳＶ抵抗性遺伝子およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子は、互いに近接（２．２ｃＭ）していること、および、前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子から５．２ｃＭの位置に、１つのＡＦＬＰマーカー（Ｅ１５／Ｍ４７−Ｆ−１９７）があることが知られている（非特許文献８）。
【０００６】
中でも、日本においては、ＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物の品種の育成が、鋭意に進められ、栽培に供されている。しかしながら、前記両ウイルスに対して十分な抵抗性を備える品種は、報告されていない。また、前記両ウイルスによる被害は、高温期において特に大きくなるため、地球温暖化の影響によって、被害が大きくなる可能性が高い。このため、前記両ウイルスのうち一方だけでなく、両方のウイルスに対して、十分な抵抗性を備える品種の育成が必要である。
【０００７】
一方、抵抗性を付与する方法として、遺伝子組換え技術を利用することも考えられる。しかしながら、消費者からすると、遺伝子組換えされた食物の安全性に対する不安感は依然として高い。したがって、遺伝子組換え技術を用いずに、前記両ウイルスに対する抵抗性を備える品種が提供されることが、強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−２８３１６４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】愛媛県農業試験場・生産環境室、「愛媛県の夏秋キュウリから検出されるウイルスの種類」、研究成果報告、１９９６年
【非特許文献２】岩崎真人、外２名、「接木キュウリ萎凋株から分離されたパパイヤ輪点ウイルス−ｔｙｐｅ  Ｗ（ＰＲＳＶ−Ｗ）」、日本植物病理学会報、１９９２年、ｐ．６１９
【非特許文献３】You  BJ  et  al.,  “Engineered  Mild  Strains  of  Papaya  ringspot  virus  for  Broader  Cross  Protection  in  Cucurbits”  Phytopathology.  2005  May;95(5):533-40
【非特許文献４】庄司俊彦、「キュウリ急性萎凋症の発生とその防除対策」、植物防疫、２００２年、第５６巻、第５号、ｐ．１９４−１９７
【非特許文献５】Grumet  R  et  al.,  “Characterization  of  sources  of  resistance  to  the  watermelon  strain  of  Papaya  ringspot  virus  in  cucumber:  allelism  and  co-segregation  with  other  potyvirus  resistances”  Theoretical  and  Applied  Genetics.  2000;101(3):463-472
【非特許文献６】Kabelka  E  et  al.,  “Multiple  alleles  for  zucchini  yellow  mosaic  virus  resistance  at  the  zym  locus  in  cucumber”  Theoretical  and  Applied  Genetics.  1997,  95(5):997-1104
【非特許文献７】井村喜之、「キュウリのズッキーニ黄斑モザイクウイルス抵抗性遺伝子のマッピング」、日本植物病理学会報、２０１１年、ｐ．２３９−２４０
【非特許文献８】Park  YH  et  al.,  “A  genetic  map  of  cucumber  composed  of  RAPDs,  RFLPs,  AFLPs,  and  loci  conditioning  resistance  to  papaya  ringspot  and  zucchini  yellow  mosaic  viruses”  Genome.  2000  Dec;43(6):1003-1010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、新たなＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物、ならびに、それを用いたＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、第６染色体上にＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有することを特徴とする。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列
（Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
【００１２】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法は、下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（ａ）前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑する工程、
（ｂ）前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物またその後代系統から、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物を選抜する工程
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物によれば、ＰＲＳＶ抵抗性はもちろんのこと、さらに、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物と交雑することによって、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶの両方に対して優れた抵抗性を示すキュウリ植物を得ることができる。これにより、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶの感染による収量低下および媒介主の駆除等に伴う労力およびコスト軽減が大きく図れ、また、消費者ニーズに適したキュウリ植物の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施例において、ＰＲＳＶの発病度の評価基準を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（１）ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、前述のように、第６染色体上にＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有することを特徴とする。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列
（Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
【００１６】
本発明において、「キュウリ植物」は、Cucumis sativus L.である。
【００１７】
前記キュウリ植物の品種は、特に制限されず、例えば、短形白イボ、四葉、英国温室型、スライス型、ベイトアルファ型等、どのタイプのキュウリでも良いが、短形白イボ型キュウリが好ましい。
【００１８】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、ＰＲＳＶに抵抗性を示す。ＰＲＳＶは、特に制限されず、ＰＲＳＶ−Ｗ（Type  W）、ＰＲＳＶ−Ｐ（Type  P）があげられる。
【００１９】
本発明において、「ＰＲＳＶ抵抗性」は、例えば、「ＰＲＳＶ耐性」ともいう。前記抵抗性は、例えば、ＰＲＳＶの感染による病害の発生および進行に対する阻害能または抑制能を意味し、具体的に、例えば、病害の未発生、発生した病害の進行の停止、および、発生した病害の進行の抑制（阻害ともいう）等のいずれでもよい。病害の未発生、進行の停止および抑制は、例えば、細胞へのＰＲＳＶの感染自体の抑制によるものでもよいし、感染細胞におけるＰＲＳＶの増殖の抑制によるものでもよいし、感染した細胞から他の細胞へのＰＲＳＶの感染（拡散ともいう）の抑制等によるものでもよい。
【００２０】
本発明において、前記ＰＲＳＶ抵抗性は、第６染色体上の前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座によってもたらされる。
【００２１】
ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座とは、ＰＲＳＶ抵抗性を供与する量的形質遺伝子座または遺伝子領域を意味する。前記量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｒａｉｔｓ  Ｌｏｃｉ；ＱＴＬ）は、一般に、量的形質の発現に関与する染色体領域を意味する。ＱＴＬは、染色体上の特定の座を示す分子マーカーを使用して規定できる。前記分子マーカーを使用してＱＴＬを規定する技術は、当該技術分野において周知である。
【００２２】
本発明において、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座は、前述のように、前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有する。本発明において、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座は、前記（Ａ１）、（Ａ２）および（Ａ３）のいずれの塩基配列を有してもよい。
【００２３】
前記（Ａ１）の塩基配列（配列番号１）を、下記表に示す。下記塩基配列において、四角で囲んだ大文字の塩基が、ＰＲＳＶ抵抗性に関与する一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【００２４】
【表１】
2014168429.tif 000002
【００２５】
前記（Ａ２）の塩基配列は、配列番号１の塩基配列における２５番目のＡ（ＳＮＰ）が保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列である。前記（Ａ２）の塩基配列は、前記５カ所の塩基のうち、２５番目の塩基が保存されていることが好ましい。また、前記（Ａ２）の塩基配列は、例えば、２５番目のＡが保存され、且つ、その他の４カ所の塩基のうち少なくとも一つの塩基が保存されていてもよい。前記５カ所の塩基は、例えば、いずれか１カ所、いずれか２カ所、いずれか３カ所、いずれか４カ所が保存されてもよいが、５カ所全てが保存されていることが好ましい。「同一性」は、前記（Ａ２）の塩基配列がＰＲＳＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記同一性は、８５％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上である。前記同一性は、前記（Ａ１）の塩基配列とのアラインメントにより求めることができ、具体的には、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２６】
前記（Ａ３）の塩基配列は、配列番号１の塩基配列における２５番目のＡ（ＳＮＰ）が保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列である。前記（Ａ３）の塩基配列は、前記５カ所の塩基のうち、２５番目の塩基が保存されていることが好ましい。また、前記（Ａ３）の塩基配列は、例えば、２５番目のＡが保存され、且つ、その他の４カ所の塩基のうち少なくとも一つの塩基が保存されていてもよい。前記５カ所の塩基は、例えば、いずれか１カ所、いずれか２カ所、いずれか３カ所、いずれか４カ所が保存されてもよいが、５カ所全てが保存されていることが好ましい。「１もしくは数個」は、前記（Ａ３）の塩基配列がＰＲＳＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記欠失等の塩基の数は、例えば、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜９個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１個、２個または３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００２７】
前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列の検出方法は、特に制限されない。前記方法としては、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅法により目的の領域を増幅し、得られた増幅産物の配列を解析する方法や、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）の解析方法等があげられる。前記ＲＦＬＰは、例えば、以下のように行える。例えば、まず、対象となるキュウリ植物のゲノムＤＮＡに対して、前記塩基配列の増幅を行う。つぎに、得られた増幅産物に対して制限酵素処理を行い、その断片パターンを確認する。ＰＲＳＶ抵抗性とＰＲＳＶ罹病性とでは、前述したＳＮＰに依存して前記断片パターンが異なるため、前記断片パターンによって、前記塩基配列の有無を判断でき、これに基づいて、対象となるキュウリ植物が、ＰＲＳＶ抵抗性か否かを判断できる。前記制限酵素処理に使用する酵素は、特に制限されず、例えば、ＭｓeＩ等があげられる。また、前記断片パターンの確認方法は、特に制限されず、例えば、電気泳動があげられる。
【００２８】
前記ＰＲＳＶ抵抗性の程度は、例えば、前記非特許文献５（Grumet  R  et  al.,  “Characterization  of  sources  of  resistance  to  the  watermelon  strain  of  Papaya  ringspot  virus  in  cucumber:  allelism  and  co-segregation  with  other  potyvirus  resistances”  Theoretical  and  Applied  Genetics.  2000;101(3):463-472）に記載の方法に準じて、発病度により表わすことができる。この方法による前記発病度の算出は、後述する実施例１の記載を援用でき、例えば、発病度１以下を耐病性、発病度３以上を罹病性と設定することができる。
【００２９】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、一例として、受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５２３で寄託されたキュウリ植物またはその後代系統があげられる。寄託の情報を以下に示す。
寄託の種類：国際寄託
寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター
受託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５２３
識別のための表示：Ｔａｋｉｉ２
受領日：２０１２年１２月２７日
【００３０】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物について、病害抵抗性以外の特徴、例えば、形質的、生態的特徴等は、特に限定されない。具体例として、短形白イボキュウリの場合、例えば、草姿は、比較的に葉が小さく、側枝の発生も多いため、栽培管理がしやすく、また、果実は濃緑色で、その形は円筒形であることが例示できる。
【００３１】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、さらに、ＺＹＭＶ抵抗性を有してもよい。この場合、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、前記両病害に対する抵抗性を有することから、「ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物」と示す場合もある。前記ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物は、前記両病害による被害を防ぐことが可能であり、商品価値が高い。前記ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物は、後述するように、前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物との交雑により得ることができる。なお、この製造方法の詳細は、後述する。
【００３２】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物によれば、前述のように、親として、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物と交雑することにより、ＰＲＳＶ抵抗性とＺＹＭＶ抵抗性とを兼ね備えるＦ１品種のキュウリ植物を得ることができる。このような、親として使用する本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、例えば、前述のような、前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有するキュウリ植物の選択や、ＰＲＳＶを接種し、抵抗性のある個体を選択することにより得ることができる。また、親として使用する前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、中でも、前記受託番号で特定されるキュウリ植物またはその後代系統が好ましい。
【００３３】
本発明において、「ＺＹＭＶ抵抗性」は、例えば、「ＺＹＭＶ耐性」ともいう。前記抵抗性は、例えば、ＺＹＭＶの感染による病害の発生および進行に対する阻害能または抑制能を意味し、具体的に、例えば、病害の未発生、発生した病害の進行の停止、および、発生した病害の進行の抑制（阻害ともいう）等のいずれでもよい。病害の未発生、進行の停止および抑制は、例えば、細胞へのＺＹＭＶの感染自体の抑制によるものでもよいし、感染細胞におけるＺＹＭＶの増殖の抑制によるものでもよいし、感染した細胞から他の細胞へのＺＹＭＶの感染（拡散ともいう）の抑制等によるものでもよい。
【００３４】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、さらに、ＺＹＭＶ抵抗性を有する場合、ＺＹＭＶ抵抗性は、ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座によってもたらされる。本発明において、ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座は、例えば、第６染色体上に座乗することが好ましい。
【００３５】
ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座とは、ＺＹＭＶ抵抗性を供与する量的形質遺伝子座または遺伝子領域を意味する。
【００３６】
前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座は、例えば、下記（Ｂ１）、（Ｂ２）または（Ｂ３）の塩基配列を有する遺伝子座（以下、Ｉ型という）、および、下記（Ｃ１）、（Ｃ２）または（Ｃ３）の塩基配列を有する遺伝子座（以下、II型という）があげられる。本発明のＰＲＳＶ抵抗性植物において、前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子は、特に制限されず、前記Ｉ型および前記II型のいずれであってもよい。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｂ３）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｃ３）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
【００３７】
前記（Ｂ１）の塩基配列（配列番号２）を、下記表に示す。下記塩基配列において、四角で囲んだ大文字の塩基が、ＺＹＭＶ抵抗性に関与するＳＮＰである。
【００３８】
【表２】
2014168429.tif 000003
【００３９】
前記（Ｂ２）の塩基配列は、配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列である。前記２カ所の塩基は、２カ所全てが保存されていることが好ましい。「同一性」は、前記（Ｂ２）の塩基配列がＺＹＭＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記同一性は、８５％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上である。前記同一性は、前記（Ｂ１）の塩基配列とのアラインメントにより求めることができる。
【００４０】
前記（Ｂ３）の塩基配列は、配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列である。前記２カ所の塩基は、２カ所全てが保存されていることが好ましい。「１もしくは数個」は、前記（Ｂ３）の塩基配列がＺＹＭＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記欠失等の塩基の数は、例えば、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜９個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１個、２個または３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００４１】
前記（Ｃ１）の塩基配列（配列番号３）を、下記表に示す。下記塩基配列において、四角で囲んだ大文字の塩基が、ＺＹＭＶ抵抗性に関与するＳＮＰである。
【００４２】
【表３】
2014168429.tif 000004
【００４３】
前記（Ｃ２）の塩基配列は、配列番号２の塩基配列における９３番目のＡ（ＳＮＰ）が保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列である。「同一性」は、前記（Ｃ２）の塩基配列がＺＹＭＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記同一性は、８５％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上である。前記同一性は、前記（Ｃ１）の塩基配列とのアラインメントにより求めることができる。
【００４４】
前記（Ｃ３）の塩基配列は、配列番号２の塩基配列における９３番目のＡ（ＳＮＰ）が保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列である。「１もしくは数個」は、前記（Ｃ３）の塩基配列がＺＹＭＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記欠失等の塩基の数は、例えば、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜９個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１個、２個または３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００４５】
前記（Ｂ１）、（Ｂ２）もしくは（Ｂ３）のＩ型の塩基配列、または前記（Ｃ１）、（Ｃ２）もしくは（Ｃ３）のII型の塩基配列の検出は、特に制限されず、前述したＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の塩基配列の検出方法と同様にして行える。具体例として、前記ＲＦＬＰは、例えば、以下のように行える。例えば、まず、対象となるキュウリ植物のゲノムＤＮＡに対して、前記I型または前記II型の塩基配列の増幅を行う。つぎに、得られた増幅産物に対して制限酵素処理を行い、その断片パターンを確認する。ＺＹＭＶ抵抗性とＺＹＭＶ罹病性とでは、前述したＳＮＰに依存して前記断片パターンが異なるため、前記断片パターンによって、前記Ｉ型または前記II型の塩基配列の有無を判断でき、これに基づいて、対象となるキュウリ植物が、ＺＹＭＶ抵抗性か否かを判断できる。また、前記Ｉ型の塩基配列と、前記II型の塩基配列との間においても、断片パターンが異なるため、Ｉ型とII型についても分類できる。前記制限酵素処理に使用する酵素は、特に制限されず、例えば、ＭｎｌＩがあげられる。また、前記断片パターンの確認方法は、特に制限されず、前述のように、例えば、電気泳動があげられる。
【００４６】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物において、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座とＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座とは、ヘテロ接合体であることが好ましい。
【００４７】
前記ＺＹＭＶ抵抗性の程度は、例えば、前記非特許文献５（Grumet  R  et  al.,  “Characterization  of  sources  of  resistance  to  the  watermelon  strain  of  Papaya  ringspot  virus  in  cucumber:  allelism  and  co-segregation  with  other  potyvirus  resistances”  Theoretical  and  Applied  Genetics.  2000;101(3):463-472）に記載の方法に準じて、発病度により表わすことができる。この方法による前記発病度の算出は、後述する実施例２の記載を援用でき、例えば、発病度１以下を耐病性、発病度３以上を罹病性と設定することができる。
【００４８】
前記ＺＹＭＶ抵抗性の程度は、例えば、この他にも、品種登録時の植物抵抗性評価審査基準（http://www.hinsyu.maff.go.jp/info/sinsakijun/botanical_taxon.html#C  p35）等により、評価することもできる。
【００４９】
本発明において、「植物体」は、植物全体を示す植物個体および前記植物個体の部分のいずれの意味であってもよい。前記植物個体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられ、いずれでもよい。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記植物体の部分は、例えば、一種類の器官、組織および／または細胞でもよいし、二種類以上の器官、組織および／または細胞でもよい。
【００５０】
（２）ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の製造方法
つぎに、本発明のＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物（ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物）の製造方法について説明する。なお、以下の方法は、例示であって、本発明は、これらの方法に制限されない。本発明において、製造方法は、例えば、育成方法ということもできる。
【００５１】
本発明のＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の製造方法は、前述のように、下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（ａ）前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑する工程、
（ｂ）前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物またその後代系統から、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物を選抜する工程
【００５２】
本発明の製造方法は、前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物を親として使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【００５３】
前記（ａ）工程において、第一の親として使用するＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物であればよい。前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、例えば、前述のような受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５２３で寄託されたキュウリ植物またはその後代系統が好ましい。また、前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、例えば、前記（ａ）工程に先立って、例えば、被検キュウリ植物（候補キュウリ植物ともいう）から、下記（ｘ）工程により選抜して準備してもよい。
（ｘ）前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物を選抜する工程
【００５４】
前記（ｘ）工程における前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜は、例えば、下記（ｘ１）工程および（ｘ２）工程により行うことができる。
（ｘ１）被検キュウリ植物の染色体上における、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する検出工程
（ｘ２）前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の存在により、前記被検キュウリ植物を、ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物として選抜する選抜工程
【００５５】
前記（ｘ）工程における前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜は、例えば、前述のような前記ＰＲＳＶ遺伝子座の塩基配列の有無によって行える。すなわち、前記（ｘ１）工程において、例えば、前記塩基配列の有無によって前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する。これによって、前記（ｘ２）工程において、前記被検キュウリ植物から、前記塩基配列を有するものを、前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物として選抜できる。
【００５６】
前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する染色体は、第６染色体である。
【００５７】
また、前記（ａ）工程において、他方の親として使用するキュウリ植物は、ＺＹＭＶ抵抗性を有していればよく、特に制限されない。交雑に使用する前記ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物は、例えば、ＺＹＭＶ抵抗性の公知キュウリ植物を使用してもよいし、自然発病の有無または病原体の接種により選抜したＺＹＭＶ抵抗性のキュウリ植物を使用してもよく、選抜方法は、何ら制限されない。具体例としては、例えば、第６染色体上に、前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有するＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物を使用できる。前記ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の選抜方法は、特に制限されず、例えば、前記Ｉ型の塩基配列または前記II型の塩基配列の有無によって選抜できる。
【００５８】
前記ＺＹＭＶ抵抗性の公知キュウリ植物としては、例えば、Ｖロード、Ｖアーチおよびスライス（タキイ種苗）、きゅう太郎およびスカイグリーン(久留米原種育成会)、大望Ｉおよび大望II（ときわ種苗）、豊栄Ｖ１０、豊美１号および豊美２号（埼玉原種育成会）、ＴＭＧ−１、Ｄｉｎａ−１等があげられる。
【００５９】
前記（ａ）工程において、前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と前記ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物との交雑方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
【００６０】
前記（ｂ）工程において、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を選抜する対象は、例えば、前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物でもよいし、さらに、そのキュウリ植物から得られた後代系統でもよい。具体的に、前記対象は、例えば、前記（ｂ）工程の交雑によって得られたＦ１のキュウリ植物でもよいし、その後代系統でもよい。前記後代系統は、例えば、前記（ｂ）工程の交雑によって得られたＦ１のキュウリ植物の自殖後代または戻し交雑後代でもよいし、前記Ｆ１のキュウリ植物と別のキュウリ植物とを交雑することによって得られたキュウリ植物であってもよい。
【００６１】
前記（ｂ）工程において、ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の選抜は、例えば、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を、直接的または間接的に確認することにより行うことができる。
【００６２】
前記（ｂ）工程において、前記直接的な確認は、得られた前記Ｆ１のキュウリ植物またはその後代系統について、例えば、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を、前述のような発病度（抵抗性スコア）によって評価することで行える。具体的には、例えば、前記Ｆ１のキュウリ植物またはその後代系統に対して、例えば、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶを、それぞれ接種して、各病害に対する抵抗性を、前記発病度（抵抗性スコア）によって評価することで確認できる。この場合、例えば、１以下のＰＲＳＶによる発病度（ＰＲＳＶ抵抗性スコア）を示し、且つ、１以下のＺＹＭＶによる発病度（ＺＹＭＶ抵抗性スコア）を示す前記Ｆ１のキュウリ植物またはその後代系統を、ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物として選抜できる。
【００６３】
また、前記（ｂ）工程において、前記間接的な確認による選抜は、例えば、下記（ｂ１）および（ｂ２）工程によって行うことができる。
（ｂ１）前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物またはその後代系統について、染色体上における、ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する検出工程
（ｂ２）前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の存在により、前記（ａ）工程により得られたキュウリ植物またはその後代系統を、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物として選抜する選抜工程
【００６４】
前記（ｂ）工程におけるＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選別は、例えば、前記（ｘ）工程において説明した方法と同様であり、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無の検出によって行うことができる。前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する染色体は、第６染色体が好ましい。
【００６５】
本発明の製造方法は、前記（ｂ）工程において選抜されたＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物を、さらに育成することが好ましい。
【００６６】
このように、前記ＰＲＳＶ抵抗性および前記ＺＹＭＶ抵抗性の両方が確認された前記キュウリ植物またはその後代系統を、ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物として選抜できる。
【００６７】
前記ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性のキュウリ植物は、例えば、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座と前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座とを、ヘテロ接合体で有することが好ましい。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
【００６９】
［実施例１］
新規なＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物について、ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の解析を行った。
【００７０】
ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５２３で寄託されたキュウリ植物を使用した。以下、このＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物を寄託系統という。
【００７１】
前記寄託系統のキュウリ植物と、ＰＲＳＶ罹病性系統のキュウリ植物「北進（タキイ種苗）」とを交雑することによって、１０４個体のＦ２分離集団（自殖後代）を得た。そして、Ｆ２分離集団の前記１０４個体に対して、以下に示すように、ＰＲＳＶの接種試験を行った。
【００７２】
ＰＲＳＶの接種試験は、前記非特許文献５に記載の方法に準じて行った。まず、接種源として、宮崎県内の圃場で採取したＰＲＳＶ感染キュウリの若い葉に、１０倍量（体積）の氷冷した０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した後、これを磨砕し、ガーゼでろ過して得られたろ液を用いた。そして、直径９ｃｍのポット苗に、市販の育苗用培土（タキイ育苗培土、タキイ種苗）をつめ、前記Ｆ２の種子を播種し、地温を２８℃に保って発芽させた。子葉が完全に展開した状態の苗を、ＰＲＳＶ接種に供試した。前記子葉に、カーボランダムを軽くふりかけた後、前記接種源を、綿棒で塗布することにより接種した。接種後、前記苗を、最高気温３５℃、最低気温２５℃、日長１３時間の条件で温室内にて管理し、接種から１４日後に、発病度の調査を行った。
【００７３】
発病度は、前記非特許文献５に記載の方法に準じ、抵抗性を以下のように判定した。図１に、各発病度に該当する葉の写真を示す。
発病度０
抵抗性：無病徴
発病度１
抵抗性：下位葉に軽微な葉脈透過が見られる、
発病度２
中程度抵抗性：若い葉と生長点付近は無病徴であるが、下位葉に、明瞭な縮葉、モザイク症状および葉脈透化が見られる
発病度３
罹病性：植物体全体に、縮葉および葉脈透化が見られる
発病度４
罹病性：植物体全体に、激しい縮葉および葉脈透化が見られる
【００７４】
前記Ｆ２分離集団において、ＰＲＳＶ接種の結果、ＰＲＳＶ抵抗性を示す発病度１以下の個体は２５個体、罹病性を示す発病度３以上の個体は７９個体であった。中程度抵抗性を示す個体はなかった。すなわち、ＰＲＳＶ抵抗性の個体数とＰＲＳＶ罹病性の個体数との比は、約１：３であった。ＰＲＳＶ罹病性の個体を、ＰＲＳＶ罹病性系統とした。
【００７５】
つぎに、前記ＰＲＳＶ罹病性系統の個体から、Ｆ３分離集団（自殖後代）を得た。そして、ＰＲＳＶ罹病性系統の１系統あたり前記Ｆ３分離集団の１０個体に対して、前述と同様に、ＰＲＳＶの接種試験を行った。その結果、前記Ｆ３分離集団の各系統の１０個体は、全てＰＲＳＶ罹病性であるか、または、ＰＲＳＶ抵抗性（発病度１以下）の個体とＰＲＳＶ罹病性（発病度３以上）の個体との比が、約１：３であった。なお、前記ＰＲＳＶ抵抗性系統の個体から得た、Ｆ３分離集団（自殖後代）は、全てＰＲＳＶ抵抗性（発病度１以下）であった。以上の結果により、ＰＲＳＶ抵抗性形質は、単因子劣性で遺伝することが判明した。
【００７６】
［実施例２］
公知のＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物について、ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の解析を行った。
【００７７】
まず、既知のＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物である、Ｆ１品種「シャキット（タキイ種苗）」、およびＦ１品種「Ｖロード（タキイ種苗）」の自殖後代(Ｆ２分離集団)５０個体を、それぞれ、以下に記載する接種方法に供した。
【００７８】
ＺＹＭＶの接種試験は、前記非特許文献５に記載の方法に準じて行った。まず、接種源として、滋賀県内の圃場で採取したＺＹＭＶ感染キュウリの若い葉に、１０倍量（体積）の氷冷した０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した後、これを磨砕し、ガーゼでろ過して得られたろ液を用いた。そして、直径９ｃｍのポット苗に、市販の育苗用培土（タキイ育苗培土、タキイ種苗）をつめ、前記Ｆ２の種子を播種し、地温を２８℃に保って発芽させた。子葉が完全に展開した状態の苗を、ＺＹＭＶ接種に供試した。前記子葉にカーボランダムを軽くふりかけた後、前記接種源を、綿棒で塗布することにより接種した。接種後、前記苗を、最高気温３５℃、最低気温２５℃、日長１３時間の条件で温室内にて管理し、接種から７日後に、発病度の調査を行った。
【００７９】
そして、前記接種試験により、ＺＹＭＶ抵抗性を示す発病度０の個体の中から、シャキット自殖後代の個体とＶロード自殖後代個体とを、それぞれ１個体ずつ得た。以下、シャキット自殖後代の個体を、「Ｉ型抵抗性個体」、Ｖロード自殖後代の個体を、「II型抵抗性個体」とした。
【００８０】
つぎに、ＺＹＭＶ罹病性系統のキュウリ植物「北進（タキイ種苗）」と、前記Ｉ型抵抗性個体またはII型抵抗性個体とを、それぞれ交雑することによって、１００個体のＦ２分離集団（自殖後代）を、２集団（以下、それぞれ、Ｉ型集団、II型集団という）、すなわち合計２００個体を得た。そして、前記Ｆ２分離集団の前記２００個体に対して、再度、ＺＹＭＶの接種試験を行った。
【００８１】
その前記Ｆ２分離集団のうち前記I型集団において、ＺＹＭＶ接種の結果、ＺＹＭＶ抵抗性（発病度０）の個体は２３個体、罹病性（発病度４）の個体は７７個体であった。一方、前記II型集団において、ＺＹＭＶ接種の結果、ＺＹＭＶ抵抗性（発病度０）の個体は２７個体、罹病性（発病度４）の個体は７３個体であった。すなわち、ＺＹＭＶ抵抗性の個体数とＺＹＭＶ罹病性の個体数との比は、Ｉ型集団およびII型集団のいずれにおいても、約１：３であった。ＺＹＭＶ罹病性の個体を、ＺＹＭＶ罹病性系統とした。
【００８２】
つぎに、前記ＺＹＭＶ罹病性系統の個体から、Ｆ３分離集団（自殖後代）を得た。そして、前記ＺＹＭＶ罹病性系統の１系統あたり前記Ｆ３分離集団の１０個体に対して、前述と同様に、ＺＹＭＶの接種試験を行った。その結果、Ｆ３分離集団の各系統の１０個体は、全てＺＹＭＶ罹病性であるか、または、ＺＹＭＶ抵抗性（発病度１以下）の個体とＺＹＭＶ罹病性（発病度３以上）の個体との比が、約１：３であった。なお、前記ＺＹＭＶ抵抗性系統の個体から得た、Ｆ３分離集団（自殖後代）は、全てＺＹＭＶ抵抗性（発病度１以下）であった。以上の結果により、ＺＹＭＶ抵抗性形質は、Ｉ型抵抗性およびＩＩ型抵抗性ともに、単因子劣性で遺伝することが判明した。
【００８３】
［実施例３］
ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の特定を行った。
【００８４】
（１）ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座
前記実施例１で得られた前記Ｆ２分離集団のＰＲＳＶ抵抗性系統のキュウリ植物５個体、および実施例２で得られた前記Ｆ２分離集団のＰＲＳＶ抵抗性系統のキュウリ植物５個体について、第６染色体上の２つのＳＳＲ（単純反復配列）マーカーの周辺領域約２００ｋｂｐについて、シーケンスを行った。その結果、前記ＰＲＳＶ抵抗性系統のキュウリ植物は、配列番号１で示す領域の２５番目（Ａ）、８０番目（Ｔ）、１１８番目（Ｔ）、１３０番目（Ｃ）および３１７番目（Ｇ）に、特異的なＳＮＰが検出された。
【００８５】
そこで、実施例１で得られた前記Ｆ２分離集団の１０４個体について、ＰＣＲを行い、得られた増幅産物のシーケンスを解析した。前記ＰＣＲには、配列番号５の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるリバースプライマーを使用し、ＰＣＲプログラムは、９４℃：１分、９４℃：３０秒、５８℃：３０秒、７２℃：１分、７２℃：５分、３０サイクルに設定した。
フォワードプライマー（配列番号５）
AGCAATTTCAAGGAGCAAGC
リバースプライマー（配列番号６）
CTCTCCAATCCAGCAACAT
【００８６】
前記プライマーセットは、配列番号１、配列番号２および配列番号３の全長に対応する下記配列番号４の塩基配列を増幅できる。なお、下記配列において、四角で囲んだ部位は、検出目的のＳＮＰの位置を示す。
【００８７】
【表４】
2014168429.tif 000005
【００８８】
そして、前記Ｆ２分離集団について、前記配列番号４の塩基配列における２５番目、８０番目、１１８番目、１３０番目および３１７番目のＳＮＰとＰＲＳＶ抵抗性形質との適合性を確認した。その結果、ＰＲＳＶ抵抗性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、２５番目はＡ、８０番目はＴ、１１８番目はＴ、１３０番目はＣ、３１７番目はＧのＳＮＰであり、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有することが確認された。つまり、前記配列番号１の塩基配列で表わされる前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有していた。そして、前記ＰＲＳＶ抵抗性を示す個体は、このＳＮＰを示すＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、ホモ接合体であることがわかった。これに対して、ＰＲＳＶ罹病性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、２５番目はＧ、８０番目はＣ、１１８番目はＣ、１３０番目はＧ、３１７番目はＡであり、前記配列番号１の塩基配列で表わされるＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座ではなく、罹病性遺伝子座を有することが確認された。そして、前記ＰＲＳＶ罹病性を示す個体は、前記ＰＲＳＶ罹病性遺伝子座が、ホモ接合体またはヘテロ接合体であることがわかった。これらの結果から、前記配列番号１の塩基配列における５カ所のＳＮＰにより、ＰＲＳＶ抵抗性系統のキュウリ植物を選抜できることがわかった。
【００８９】
（２）ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座
前記実施例２で得られた前記Ｆ２分離集団である、Ｉ型集団の１００個体、およびII型集団の１００個体について、前記（１）と同様にして、ＰＣＲを行い、得られた増幅産物のシーケンスを解析した。
【００９０】
そして、前記Ｆ２分離集団について、前記配列番号４の塩基配列における９３番目および３０７番目のＳＮＰとＺＹＭＶ抵抗性形質との適合性を確認した。その結果、Ｉ型集団におけるＺＹＭＶ抵抗性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、９３番目はＡ、３０７番目はＡのＳＮＰであり、前記Ｉ型のＺＹＭＶＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有することが確認された。つまり、前記配列番号２の塩基配列で表わされる前記Ｉ型のＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有していた。そして、前記Ｉ型のＺＹＭＶ抵抗性を示す個体は、このＳＮＰを示すＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、ホモ接合体であることがわかった。また、II型集団におけるＺＹＭＶ抵抗性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、９３番目はＡのＳＮＰであり、前記II型のＺＹＭＶＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有することが確認された。つまり、前記配列番号３の塩基配列で表わされる前記II型のＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有していた。そして、前記II型のＺＹＭＶ抵抗性を示す個体は、このＳＮＰを示すＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、ホモ接合体であることがわかった。これに対して、ＺＹＭＶ罹病性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、９３番目はＧ、３０７番目はＧであり、前記配列番号２または３の塩基配列で表わされるＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座ではなく、罹病性遺伝子座を有することが確認された。そして、前記ＺＹＭＶ罹病性を示す個体は、前記ＺＹＭＶ罹病性遺伝子座が、ホモ接合体またはヘテロ接合体であることがわかった。これらの結果から、前記配列番号２の塩基配列における２カ所のＳＮＰまたは前記配列番号３の塩基配列における１カ所のＳＮＰにより、ＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物を選抜できることがわかった。
【００９１】
［実施例４］
ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物を作成した。
【００９２】
前記実施例１に示す前記寄託系統のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５２３）と、食味および草姿等の農業形質の優れるキュウリ植物「夏すずみ（タキイ種苗）」とを交雑して、Ｆ１（雑種第一代）を得た。そして、前記Ｆ１を自殖させることによって、４００個体のＦ２（自殖後代）を得た。前記Ｆ２について、前記実施例３と同様にして、シーケンスを解析し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有する個体を選択した。そして、これらを、ＰＲＳＶ抵抗性を備えた個体として圃場に定植し、目視にて農業形質の優れる個体を選抜した。そして、この手順を４回繰り返して、ＰＲＳＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる個体を得た。これを、系統Ａのキュウリ植物という。
【００９３】
他方、前記実施例２で得られた前記Ｉ型個体（Ｉ型ＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物）と、食味および草姿等の農業形質の優れるキュウリ植物「夏ばやし（タキイ種苗）」とを交雑して、Ｆ１（雑種第一代）を得た。そして、前記Ｆ１を自殖させることによって、３９８個体のＦ２（自殖後代）を得た。前記Ｆ２について、前記実施例３と同様にして、シーケンスを解析し、前記ＺＹＭＶ抵抗性を有する個体を選択した。そして、これらを、ＺＹＭＶ抵抗性を備えた個体として圃場に定植し、目視にて、農業形質の優れる個体を選抜した。そして、この手順を４回繰り返して、ＺＹＭＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる個体を得た。これを、系統Ｂのキュウリ植物という。
【００９４】
そして、ＰＲＳＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる前記系統Ａのキュウリ植物を、第一の親とし、Ｉ型ＺＹＭＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる前記系統Ｂの植物を、第二の親とし、これらを交雑して、１２個体のＦ１（雑種第一代）である系統ＡＢを得た。前記Ｆ１である前記系統ＡＢの１２個体に対して、前記実施例１および２と同様に、ＰＲＳＶの接種試験およびＺＹＭＶの接種試験を行った。また、対比のために、前記I型個体、前記II型個体、既報のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物である「Ｓｕｒｉｎａｍ（North  Carolina  State  University  Cucumber  Gene  Stock  Collection;  NCG-086)、既報のＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物である「ＴＭＧ１（North  Carolina  State  University  Cucumber  Gene  Stock  Collection;  NCG-085）」、および、両ウイルスに罹病性のキュウリ植物「北進（タキイ種苗）」、それぞれ５個体に対しても、同様に接種試験を行った。
【００９５】
前記接種試験の結果を下記表５に示す。Ｆ１である前記系統ＡＢの１２個体は、全て、完全なＰＲＳＶ抵抗性（発病度０）およびＺＹＭＶ抵抗性（発病度０）であり、また、生育開始から生育後期まで、その抵抗性が維持できることが確認できた。すなわち、ＰＲＳＶ遺伝子座およびＺＹＭＶ遺伝子座は、ともに劣性で遺伝するにもかかわらず、これらの遺伝子座をヘテロ接合体で有する前記１２個体が、完全なＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えることが判明した。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
つぎに、前記Ｉ型ＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物に代えて、前記実施例２で得られた、II型ＺＹＭＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる前記系統Ｃを使用する以外は、同様の実験を行った。
【００９８】
前記接種試験の結果を前記表５にあわせて示す。Ｆ１である前記系統ＡＣの８個体も、ＰＲＳＶ抵抗性（発病度１）およびＺＹＭＶ抵抗性（発病度０）が確認できた。すなわち、前記Ｉ型個体と同様に、ＰＲＳＶ遺伝子座およびＺＹＭＶII型遺伝子座をヘテロ接合体で有する前記８個体が、育種利用に十分なＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えることが判明した。
【００９９】
さらに、比較のため、ＰＲＳＶ抵抗性である前記系統Ａに代えて、既報のＰＲＳＶ抵抗性系統「Ｓｕｒｉｎａｍ」を使用する以外は、同様の実験を行った。その結果を前記表５にあわせて示す。「Ｓｕｒｉｎａｍ」とＩ型ＺＹＭＶ抵抗性キュウリとのＦ１、および、「Ｓｕｒｉｎａｍ」とII型ＺＹＭＶ抵抗性キュウリとのＦ１は、ＰＲＳＶに対しては中程度抵抗性以上（発病度１、２）を示したものの、ＺＹＭＶに対しては罹病性（発病度３）を示した。この結果より、ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座（Ｉ型、ＩＩ型）をヘテロで有するにも関わらず、両ウイルス抵抗性となるのは、前記配列番号１の塩基配列をＰＲＳＶ抵抗遺伝子座として有するキュウリ植物（例えば、寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１５２３由来のキュウリ植物）であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
以上のように、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑することによって、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリの品種が得られる。このため、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物によれば、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶの感染による収量低下および農薬使用の増加などの経済的ならびに労力的な損失を、大きく軽減できる。
【図１】
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【配列表】
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