(57)【要約】【課題】免疫学的に活性な組換え結合タンパク質（特に、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的な一本鎖融合タンパク質）、ならびに、自己免疫疾患および他の障害または状況（例えば、移植片拒絶）を処置するための組成物および方法を提供する。【解決手段】本発明は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に結合する融合タンパク質、そのような融合タンパク質を含む組成物および単位投薬形態、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび発現ベクター、固形臓器移植片の拒絶を減少させるためかまたは自己免疫疾患を処置するための方法、ならびにＴ細胞活性化を検出するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＲ複合体に特異的に結合する結合ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、該結合ドメインは、配列番号２４５に示されるアミノ酸配列と、配列番号２４１に示されるアミノ酸配列とを含む、組換え結合タンパク質。
【請求項２】
前記配列番号２４５に示されるアミノ酸配列と、前記配列番号２４１に示されるアミノ酸配列とは、ＧｌｙＳｅｒ、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ（配列番号３３９）、Ｇｌｙ３Ｓｅｒ（配列番号３４０）、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号３４１）、Ｇｌｙ５Ｓｅｒ（配列番号３４２）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４３）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４４）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４５）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４６）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４７）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４８）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号３４９）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３５０）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号３５１）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号３５２）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３５３）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号３５４）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号３５５）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号３５６）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１４５）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号３５７）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号３５８）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＱ（配列番号９８）を含むリンカーによって連結される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記結合ドメインは、配列番号２６３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質は、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドと免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドとを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドが、
（ｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３８位における１つ以上の置換もしくは欠失；
（ｉｉ）２３４〜２３８位における１つ以上の置換もしくは欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２もしくは３３１位における少なくとも１つの置換；または
（ｉｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４〜２３８位における１つ以上の置換もしくは欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２もしくは３３１位における少なくとも１つの置換
を含む、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドが、２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４、２３５および２３７位におけるアミノ酸置換、ならびに２３６位におけるアミノ酸欠失を含む、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項７】
２９７位における前記アミノ酸置換が、ＡｓｎからＡｌａへの置換である、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記結合ドメインが免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドによってＣＨ２基またはＣＨ３基に連結される、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドが、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、少なくとも１つのシステインが変異したヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型マウスＩＧＨＧ２ｃヒンジ、配列番号２１２〜２１８、３００および３７９〜４３４に示されるアミノ酸配列のいずれか一つ、ならびに、配列番号１０のアミノ酸３〜１７からなる群より選択される、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
配列番号７５、１０２〜１０４および３７５〜３７８のいずれか一つに示される免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドを含む、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項１１】
（ｉ）前記免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域ポリペプチドであり、前記免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ３領域ポリペプチドであるか；または
（ｉｉ）前記免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域ポリペプチドであり、前記免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ３領域ポリペプチドである、
請求項４に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質が、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドを含まない、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
配列番号２９０〜２９３のいずれか一つに示される配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質が、サイトカイン放出を誘導しないか、または最小限の検出可能なサイトカイン放出を誘導する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質が、Ｔ細胞を活性化させないか、または最小限に活性化させる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１６】
請求項１に記載のタンパク質、および薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
発現制御配列に作動可能に連結された請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１９】
固形臓器移植レシピエントにおける固形臓器移植片の拒絶を減少させるための組成物であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む、組成物。
【請求項２０】
自己免疫疾患を処置するための組成物であって、請求項１に記載のタンパク質の有効量を含む、組成物。
【請求項２１】
前記自己免疫疾患が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、真性糖尿病、喘息および関節炎からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００８年１０月１０日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０４，６０８、および２００９年１月２９日に出願された米国仮特許出願番号６１／１４８，３４１の米国特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張し、これらの仮出願は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（配列表に関する声明）
本願に関する配列表は、紙の複写物の代わりにテキスト形式で提供され、本明細書中に参考として援用される。その配列表を含むテキストファイルの名称は、９１０１８０＿４１６ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、６２２ＫＢであり、２００９年１０月９日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
（背景）
（技術分野）
本開示は、免疫学的に活性な組換え結合タンパク質、および特に、ＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＣＤ３）に特異的な一本鎖融合タンパク質に関する。本開示は、自己免疫疾患および他の障害または状況（例えば、移植片拒絶）を処置するための組成物および方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
（関連技術の説明）
抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いてヒトＴ細胞上のＴＣＲ複合体を標的とすることが、長い間、臓器の同種移植片拒絶の処置に用いられてきた。ヒトＣＤ３に特異的なマウスモノクローナル抗体、例えば、ＯＫＴ３（非特許文献１）は、そのような処置法の第１世代だった。ＯＫＴ３は、強い免疫抑制効果を有するが、その免疫原性および分裂促進の潜在能力に関連する重篤な副作用が原因でその臨床上の使用が阻まれていた（非特許文献２）。ＯＫＴ３は、それ自体の迅速なクリアランスおよび中和を促進する抗グロブリン応答を誘導した（非特許文献３）。さらに、ＯＫＴ３は、インビトロにおいてＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を誘導し、インビボにおいて大量のサイトカインを放出させた（非特許文献４）。そして、このサイトカイン放出（「サイトカインストーム」とも呼ばれる）は、発熱、悪寒、頭痛、悪心、嘔吐、下痢、呼吸困難、敗血性髄膜炎および低血圧を特徴とする「インフルエンザ様」症候群をもたらした（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ，２００３）。そのような重篤な副作用を理由に、ＯＫＴ３を移植においてより広範に使用すること、ならびにＯＫＴ３の用途を自己免疫などの他の臨床分野に拡張することが限定された（同文献）。
【０００５】
その第１世代の抗ＣＤ３モノクローナル抗体の副作用を減少させるために、マウス抗ＣＤ３モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトＩｇＧ配列に移植するだけでなく、ＦｃＲに結合しない変異をＦｃに導入することによって、第２世代の遺伝的に操作された抗ＣＤ３モノクローナル抗体が開発された（非特許文献５；非特許文献６）。マウスモノクローナル抗体をヒト化することにより、免疫原性が低下し、ｍＡｂ半減期が改善される（同文献）。さらに、ＦｃＲに結合しないｍＡｂは、インビボにおいてサイトカイン放出および急性毒性を誘導する潜在能力が低くなった（非特許文献７）。しかしながら、サイトカイン放出は、低レベルであったとしても、なおも用量を制限させるものであり、非常に低薬物用量（マイクログラム／患者）でも毒性である（非特許文献８）。
【０００６】
抗ＣＤ３／ＴＣＲに向けた治療を改善するためには、いくつかの困難が存在している。例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体によって媒介される免疫抑制の機序は、複雑であり、完全に理解されていない。そのような抗体は、４つの機序：細胞コーティング、細胞枯渇、ＴＣＲの下方調節（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）および細胞シグナル伝達（後半の２つが主要な機序として機能する）を通じて機能すると考えられている（非特許文献９）。さらに、ＣＤ３／ＴＣＲに向けた治療が有効であるためには、サイトカインストームの誘導およびインビボにおけるＴ細胞の活性化が必要であると考えられている（非特許文献１０）。最後に、インビトロにおいて「活性化しない」と報告されている第２世代の抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、インビボでは、なおもサイトカインストームを誘導した。
【０００７】
現在、いくつかの抗ＣＤ３に向けられた抗体が、自己免疫疾患、炎症性疾患および移植患者において使用するために診療所で試験されている。これらの抗体には、ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ビジリズマブ（ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）（Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標），ＰＤＬ）、ＴＲＸ−４（Ｔｏｌｅｒｘ）およびＮＩ−０４０１（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ）が含まれる。しかしながら、これらの抗体の各々で処置された患者は、サイトカイン放出に関連する有害事象（中程度から重篤）、および時折、この患者集団に代表的に観察されるものよりも高いウイルスの再活性化を起こした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７９）２０６：３４７−９
【非特許文献２】Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００３）３：１２３−１３２
【非特許文献３】Ｃｈａｔｅｎｏｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８２）１３７：８３０−８
【非特許文献４】Ｈｉｒｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：７３７−４３，１９８９
【非特許文献５】Ｃｏｌｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９９）６８：５６３
【非特許文献６】Ｃｏｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９：３６１３
【非特許文献７】Ｃｈａｔｅｎｏｕｄら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８９）３２０：１４２０
【非特許文献８】Ｐｌｅｖｙら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００７）１３３：１４１４−１４２２
【非特許文献９】Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００３）１２３−１３２
【非特許文献１０】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）１６５：６２０５−１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
サイトカイン放出に関連する有害事象が、現在のＴ細胞抗体療法および他の生物学的療法に関係することを考慮に入れると、引き続き代替療法が必要である。本発明は、そのようなニーズを満たすものであり、さらに他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（簡単な要旨）
本開示は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に結合する融合タンパク質、そのような融合タンパク質を含む組成物および単位投薬形態、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび発現ベクター、固形臓器移植片の拒絶を減少させるためかまたは自己免疫疾患を処置するための方法、ならびにＴ細胞活性化を検出するための方法を提供する。
【００１１】
１つの態様において、本開示は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって：（ａ）ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメイン、（ｂ）リンカーポリペプチド、（ｃ）必要に応じて、（ｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換；（ｉｉ）２３４〜２３８位における１つ以上のアミノ酸置換または欠失；（ｉｉｉ）２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失；（ｉｖ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３８位における１つ以上の置換または欠失；（ｖ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つの置換または欠失；（ｖｉ）２３４〜２３８位における１つ以上のアミノ酸置換または欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失；または（ｖｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４〜２３８位における１つ以上のアミノ酸置換または欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を含む免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチド、ならびに（ｄ）免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる融合タンパク質を提供し、ここで、この融合タンパク質は、サイトカインストームを誘導しないか、または最小限の検出可能なサイトカイン放出を誘導し、その免疫グロブリンＣＨ２領域内のアミノ酸残基は、ＥＵナンバリングシステムによってナンバリングされる。請求項２〜２０および本明細書中に記載されるさらなる融合タンパク質が、提供される。
【００１２】
別の態様において、本開示は、本明細書中に提供される融合タンパク質および薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００１３】
別の態様において、本開示は、上で述べられた薬学的組成物を含む単位用量形態を提供する。
【００１４】
別の態様において、本開示は、本明細書中に提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
別の態様において、本開示は、発現制御配列に作動可能に連結された本明細書中に提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００１６】
別の態様において、本開示は、固形臓器移植片の拒絶を減少させる方法を提供し、その方法は、固形臓器移植レシピエントに、有効量の本明細書中に提供される融合タンパク質を投与する工程を包含する。
【００１７】
別の態様において、本開示は、自己免疫疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、真性糖尿病、喘息および関節炎）を処置するための方法を提供し、その方法は、その必要のある患者に、有効量の本明細書中に提供される融合タンパク質を投与する工程を包含する。
【００１８】
別の態様において、本開示は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質によって誘導されたサイトカイン放出を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）マイトジェンで刺激（prime）されたＴ細胞を準備する工程、（ｂ）工程（ａ）の刺激されたＴ細胞を、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質（例えば、融合タンパク質および抗体）で処理する工程、および（ｃ）工程（ｂ）において処理された刺激されたＴ細胞からのサイトカインの放出を検出する工程を包含する。
【００１９】
別の態様において、本開示は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質によって誘導されたＴ細胞活性化を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）マイトジェンで刺激されたＴ細胞を準備する工程、（ｂ）工程（ａ）の刺激されたＴ細胞を、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質（例えば、融合タンパク質および抗体）で処理する工程、および（ｃ）工程（ｂ）において処理された刺激されたＴ細胞の活性化を検出する工程を包含する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
アミノ末端からカルボキシ末端に向かって：
（ａ）ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメイン、
（ｂ）リンカーポリペプチド、
（ｃ）必要に応じて、
（ｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４から２３８位における１つ以上の置換または欠失；
（ｉｉ）２３４から２３８位における１つ以上の置換または欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つの置換；または
（ｉｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４から２３８位における１つ以上の置換または欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つの置換
を含む免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチド、および
（ｄ）免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチド
を含む一本鎖融合タンパク質であって、ここで、該融合タンパク質は、サイトカイン放出を誘導しないか、または最小限の検出可能なサイトカイン放出を誘導し、該免疫グロブリンＣＨ２領域内のアミノ酸残基は、ＥＵナンバリングシステムによってナンバリングされる、一本鎖融合タンパク質。
（項目２）
上記結合ドメインが、上記ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
上記ＴＣＲ複合体またはその構成要素が、ＴＣＲα、ＴＣＲβまたはＣＤ３εである、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
上記ｓｃＦｖが、配列番号２５８〜２６４に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含む、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目５）
上記リンカーが、免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドである、項目１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目６）
上記免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドが、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、少なくとも１つのシステインが変異したヒトＩｇＧ１ヒンジ、または野生型マウスＩＧＨＧ２ｃヒンジである、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目７）
上記免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドが、（ａ）配列番号２１２〜２１８、３００および３７９〜４３４または（ｂ）配列番号１０のアミノ酸３〜１７に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目８）
２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４から２３８位における１つ以上の置換または欠失を含む免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドを含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目９）
２３４〜２３８位における１つ以上の置換または欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つの置換を含む免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドを含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
上記免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドが、２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４から２３８位における１つ以上の置換または欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つの置換を含む、項目８に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
２９７位における上記アミノ酸置換が、ＡｓｎからＡｌａへの置換である、項目１〜８および１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
上記免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドが：
（ｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４、２３５、２３６または２３７位における１つのアミノ酸置換；
（ｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３７位の２つにおけるアミノ酸置換；
（ｉｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３７位の３つにおけるアミノ酸置換；
（ｉｖ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４、２３５および２３７位におけるアミノ酸置換、ならびに２３６位におけるアミノ酸欠失；
（ｖ）２３４〜２３７位の３つにおけるアミノ酸置換、ならびに３１８、３２０および３２２位におけるアミノ酸置換；または
（ｖｉ）２３４〜２３７位の３つにおけるアミノ酸置換、２３６位におけるアミノ酸欠失、ならびに３１８、３２０および３２２位におけるアミノ酸置換
を含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
配列番号１０２〜１０４  ７５および３７５〜３７８のいずれか１つに示されているような免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドを含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
上記免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域ポリペプチドであり、上記免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ３領域ポリペプチドである、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
上記免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域ポリペプチドであり、上記免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ３領域ポリペプチドである、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
上記融合タンパク質が、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドを含まない、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
配列番号１１〜１６、７４、１０１および３０７〜３０９のいずれか１つに示されているような配列を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
配列番号８０〜９７、２６５〜２９９、３０４および３０６のいずれか１つ、最初の２２アミノ酸のリーダー配列を有しない配列番号２３４、２３６、２３８、２４０のいずれか１つ、または最初の２０アミノ酸のリーダー配列を有しない配列番号３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５および３２７のいずれか１つに示されているような配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
上記融合タンパク質がさらに、Ｔ細胞を活性化させないか、または最小限に活性化させる、項目１〜１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２０）
上記融合タンパク質がさらに、カルシウム流動の誘導、Ｔ細胞レセプターシグナル伝達経路内の分子のリン酸化の誘導、同種抗原に対するＴ細胞応答の阻止、抗原に対するメモリーＴ細胞応答の阻止および上記ＴＣＲ複合体の下方調節から選択される活性のうちの少なくとも１つを有する、項目１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２１）
項目１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、組成物。
（項目２２）
項目２１に記載の薬学的組成物を含む、単位用量形態。
（項目２３）
項目１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目２４）
発現制御配列に作動可能に連結された項目２３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目２５）
固形臓器移植片の拒絶を減少させる方法であって、固形臓器移植レシピエントに、有効量の、項目１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、項目２１に記載の組成物および項目２２に記載の単位用量形態を投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）
自己免疫疾患を処置するための方法であって、その必要のある患者に、有効量の、項目１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、項目２１に記載の組成物および項目２２に記載の単位用量形態を投与する工程を包含する、方法。
（項目２７）
上記自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記自己免疫疾患が、真性糖尿病、喘息または関節炎である、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質によって誘導されたサイトカイン放出を検出するための方法であって：
（ａ）マイトジェンで刺激されたＴ細胞を準備する工程、
（ｂ）工程（ａ）の刺激されたＴ細胞を、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含む該タンパク質で処理する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）において処理された、該刺激されたＴ細胞からのサイトカインの放出を検出する工程
を包含する、方法。
（項目３１）
ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質によって誘導されたＴ細胞活性化を検出するための方法であって：
（ａ）マイトジェンで刺激されたＴ細胞を準備する工程、
（ｂ）工程（ａ）の刺激されたＴ細胞を、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含む該タンパク質で処理する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）において処理された、該刺激されたＴ細胞の活性化を検出する工程
を包含する、方法。
（項目３２）
ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含む上記タンパク質が、項目１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質である、項目３０または項目３１に記載の方法。
（項目３３）
ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含む上記タンパク質が、抗体である、項目３０または項目３１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＰＨＡで刺激されたヒトＴ細胞を様々な抗体および小モジュール免疫薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＳＭＩＰＴＭ））製品で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「Ｒｘなし」とは、ネガティブコントロールとして使用された、処理無しのことを指す。
【図２】図２は、混合リンパ球反応アッセイにおいて、応答物（responder）細胞を様々な抗体およびＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「ＭＬＲ」とは、いかなる追加の処理も行わなかった混合リンパ球反応のことを指す。「応答物のみ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指す。「ＩｇＧ２ａ」とは、１０μｇ／ｍｌ  ＩｇＧ２ａ  ｍＡｂで処理された応答物細胞のことを指す。
【図３】図３は、混合リンパ球反応アッセイにおいて、応答物細胞を様々な抗体およびＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「ＭＬＲ」とは、いかなる追加の処理も行わなかった混合リンパ球反応のことを指す。「応答物のみ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指す。
【図４】図４は、メモリーＴ細胞をモノクローナル抗体および様々なＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「応答物（ＴＴなし）」とは、破傷風トキソイドの非存在下における反応のことを指す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、（Ａ）単離の直後（０日目）または（ｂ）ＯＫＴ３モノクローナル抗体または様々なＯＫＴ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理した４日後に染色されたヒトＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ３のＦＡＣＳ分析のドットプロットである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、（Ａ）単離の直後（０日目）または（Ｂ）ＯＫＴ３  ＩｇＧ１ＡＡまたはＯＫＴ３  ＨＭ１  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理した４日後に染色されたヒトＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ３のＦＡＣＳ分析のドットプロットである。
【図７】図７は、精製ヒトＴ細胞をモノクローナル抗体、抗体の組み合わせまたは様々なＯＫＴ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、経時的なカルシウム流動指示色素の蛍光の変化を示している。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＣｏｎＡで刺激されたマウスＴ細胞をモノクローナル抗体（２Ｃ１１ｍＡｂおよびＨ５７ｍＡｂ）またはＳＭＩＰ融合タンパク質（２Ｃ１１  Ｎｕｌｌ２およびＨ５７  Ｎｕｌｌ２）で処理した後の、（Ａ）ＩＦＮγまたは（Ｂ）ＩＰ−１０の放出を示している。
【図９】図９は、混合リンパ球反応アッセイにおいて、応答物細胞を様々な抗体またはＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「Ｒのみ」とは、応答物細胞だけが存在する反応のことを指し；「Ｓのみ」とは、刺激物（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）細胞だけが存在する反応のことを指し；「Ｒ：Ｓ」とは、応答物細胞と刺激物細胞の両方が存在する反応のことを指す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、様々な濃度の抗体（Ｈ５７ｍＡｂ）およびＨ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ融合タンパク質を静脈内投与した後の経時的な（Ａ）体重および（Ｂ）臨床スコアの変化を示している。ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａをネガティブコントロールとして使用した。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗ＴＣＲ抗体（Ｈ５７ｍＡｂ）または様々な濃度の抗ＴＣＲ  ＳＭＩＰ融合タンパク質（Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２）を静脈内投与した２時間後、２４時間後、７２時間後の血清中の（Ａ）ＩＬ−６および（Ｂ）ＩＬ−４の濃度を示している。マウスＩｇＧ２ａ抗体およびＰＢＳ（希釈剤）をネガティブコントロールとして使用した。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗ＴＣＲ抗体（Ｈ５７ｍＡｂ）または様々な濃度の抗ＴＣＲ  ＳＭＩＰ融合タンパク質（Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２）を静脈内投与した２時間後、２４時間後、７２時間後の血清中の（Ａ）ＩＬ−６および（Ｂ）ＩＬ−４の濃度を示している。マウスＩｇＧ２ａ抗体およびＰＢＳ（希釈剤）をネガティブコントロールとして使用した。
【図１２】図１２は、様々な濃度の抗ＴＣＲ  ＳＭＩＰ融合タンパク質（Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２）を静脈内投与した後の１日目または３日目のマウス脾臓に見られたＨ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰで覆われたＴ細胞のパーセンテージを示している。ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａをネガティブコントロールとして使用した。
【図１３】図１３は、急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）のモデルにおいてドナー細胞を移入した後の１４日間にわたるレシピエントマウスの開始体重からの変化のパーセンテージを示している。「ナイーブレシピエント」は、ネガティブコントロールとしてドナー細胞移入を受けなかったマウスのことを示す。レシピエントマウスを、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ融合タンパク質、デキサメタゾン（ＤＥＸ）またはコントロール（ＰＢＳまたはＩｇＧ２ａ）で処置した。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、ドナー細胞移入後のそれぞれ１４日目、１４日目または７日目における（Ａ）Ｇ−ＣＳＦ、（Ｂ）ＫＣまたは（Ｃ）ＩＦＮγの血清濃度を示している。
【図１５】図１５は、ドナー細胞移入後の１４日目におけるドナー：宿主リンパ球比を示している。「細胞移入なし」は、ドナー細胞を投与されなかったネガティブコントロールマウスのことを示す。ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａをコントロール処置として使用した。
【図１６】図１６は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４およびマウスＩＧＨＧ２ｃのＣＨ２領域（それぞれ配列番号６４、６６、６８および７３）間の配列アラインメントを示している。これらのアラインメントは、ＤＮＡＳＴＡＲ５．０３（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムのデフォルトパラメータを使用したＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を用いて行った。ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２のアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔに従うＥＵナンバリングに基づいている（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９９１）を参照のこと）。すなわち、ヒトＩｇＧ１の重鎖可変領域は、１２８アミノ酸長であると考えられるので、ヒトＩｇＧ１の定常領域における最もアミノ末端のアミノ酸残基は、１２９位である。他のＣＨ２領域のアミノ酸の位置は、それらとアラインメントされるヒトＩｇＧ１におけるアミノ酸残基の位置に基づいて示される。２９７位のＡｓｎ残基（Ｎ２９７）は、下線が引かれ、太字で示されている。
【図１７】図１７は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、応答物細胞を抗体またはＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「Ｒ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指し、「Ｓ」とは、刺激物細胞だけが存在した反応のことを指し、「Ｒ＋Ｓ」とは、いかなる追加の処理も行わなかった混合リンパ球反応のことを指し、「ｍｕＩｇＧ２ｂ」とは、１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＧ２ｂで処理された応答物細胞のことを指す。「コントロールＳＭＩＰ」は、Ｔ細胞に結合しないｓｃＦｖ結合ドメインを有するＳＭＩＰ融合タンパク質である。Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａ（配列番号２６５）を用いて、これらの細胞を試験した。
【図１８】図１８は、単離の直後に染色されたヒトＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ３のＦＡＣＳ分析のドットプロットを示している。上の２枚のパネルは、Ｃｒｉｓ−７モノクローナル抗体で処理されたヒトＴ細胞を示しており、下の２枚のパネルは、Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａ（配列番号２６５）による処理を示している。左のパネルは、処理当日（０日目）の細胞の分布を示しており、右のパネルは、処理の２日後（２日目）の細胞の分布を示している。
【図１９】図１９は、ヒトＴ細胞をＢＣ３  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（配列番号８０，ｓｃＦｖとＣＨ２ＣＨ３ドメインとの間にヒンジとしてリンカー８７を有する）で処理したことに起因する経時的なカルシウム流動指示色素の蛍光の変化を、ヒンジリンカー８７を様々な長さの他のヒンジ（特に、配列番号２１２〜２１８に対応する、それぞれリンカー１１５〜１２０および１２２）と交換した同じ融合タンパク質と比較して示している。
【図２０】図２０は、ＭＬＲアッセイにおいて、応答物細胞を抗体またはＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「コントロールＳＭＩＰ」とは、Ｔ細胞に結合しないｓｃＦｖ結合ドメインを有するＳＭＩＰ融合タンパク質のことを指す。「応答物のみ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指す。角括弧内の数字は、ＳＭＩＰ融合タンパク質の配列識別番号である。
【図２１】図２１は、ＭＬＲアッセイにおいて、応答物細胞を、様々なヒンジリンカーを含むＢＣ３  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。
【図２２】図２２は、ＭＬＲアッセイにおいて、応答物細胞をモノクローナル抗体Ｃｒｉｓ７、キメラもしくはヒト化Ｃｒｉｓ７  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはキメラＢＣ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質（配列番号８０）で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「コントロールＳＭＩＰ」とは、Ｔ細胞に結合しないｓｃＦｖ結合ドメインを有するＳＭＩＰ融合タンパク質のことを指し、「応答物のみ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指す。角括弧内の数字は、ＳＭＩＰ融合タンパク質の配列識別番号である。
【図２３】図２３は、ＭＬＲアッセイにおいて、応答物細胞をヒト化Ｃｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７、ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７ＡおよびＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ、ならびにＨＭ１  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはキメラＣｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７ＡおよびＨＭ１  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「親ｍＡｂ」とは、Ｃｒｉｓ７ｍＡｂのことを指し、「コントロールＳＭＩＰ」とは、Ｔ細胞に結合しないｓｃＦｖ結合ドメインを有するＳＭＩＰ融合タンパク質のことを指す。
【図２４】図２４は、ＰＨＡで刺激されたヒトＴ細胞をヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａまたはヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理した後の、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「コントロールＳＭＩＰ」は、Ｔ細胞に結合しないＳＭＩＰ融合タンパク質である。
【図２５Ａ】図２５Ａおよび２５Ｂは、ＰＨＡで刺激されたＴ細胞を様々なヒト化およびキメラＣｒｉｓ７  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ＢＣ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質（配列番号８０）、ならびに様々な抗体（ＢＣ３ｍＡｂ、親Ｃｒｉｓ７ｍＡｂおよびＮｕｖｉｏｎ  ＦＬ）で再刺激した２４時間後（１日目）および７２時間後（３日目）における血清中の（Ａ）ＩＦＮγおよび（Ｂ）ＩＬ−１７の濃度を示している。角括弧内の数字は、ＳＭＩＰ融合タンパク質の配列識別番号である。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび２５Ｂは、ＰＨＡで刺激されたＴ細胞を様々なヒト化およびキメラＣｒｉｓ７  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ＢＣ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質（配列番号８０）、ならびに様々な抗体（ＢＣ３ｍＡｂ、親Ｃｒｉｓ７ｍＡｂおよびＮｕｖｉｏｎ  ＦＬ）で再刺激した２４時間後（１日目）および７２時間後（３日目）における血清中の（Ａ）ＩＦＮγおよび（Ｂ）ＩＬ−１７の濃度を示している。角括弧内の数字は、ＳＭＩＰ融合タンパク質の配列識別番号である。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｄ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｅ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｆ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｇ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｈ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２７】図２７は、ＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ（４１１μｇ）、Ｈ５７ｍＡｂ（５μｇ）、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ融合タンパク質（３００μｇ）、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ  ＳＭＩＰ融合タンパク質（３００μｇ）またはＨ５７  ＨＭ２  ＳＭＩＰ融合タンパク質（３００μｇ）を静脈内投与した後の経時的な体重の変化を示している。
【図２８】図２８は、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した２時間後の末梢血Ｔ細胞の濃度を示している。
【図２９】図２９は、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した７２時間後の末梢Ｔ細胞の濃度を示している。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜３０Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−２の濃度を示している。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜３０Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−２の濃度を示している。
【図３０Ｃ】図３０Ａ〜３０Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−２の濃度を示している。
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−１０の濃度を示している。
【図３１Ｂ】図３１Ａ〜３１Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−１０の濃度を示している。
【図３１Ｃ】図３１Ａ〜３１Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−１０の濃度を示している。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜３２Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３２Ｂ】図３２Ａ〜３２Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３２Ｃ】図３２Ａ〜３２Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜３３Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＴＮＦαの濃度を示している。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜３３Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＴＮＦαの濃度を示している。
【図３３Ｃ】図３３Ａ〜３３Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＴＮＦαの濃度を示している。
【図３４Ａ】図３４Ａ〜３４Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−４の濃度を示している。
【図３４Ｂ】図３４Ａ〜３４Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−４の濃度を示している。
【図３４Ｃ】図３４Ａ〜３４Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−４の濃度を示している。
【図３５Ａ】図３５Ａ〜３５Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＭＣＰ−１の濃度を示している。
【図３５Ｂ】図３５Ａ〜３５Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＭＣＰ−１の濃度を示している。
【図３５Ｃ】図３５Ａ〜３５Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＭＣＰ−１の濃度を示している。
【図３６Ａ】図３６Ａ〜３６Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＫＣの濃度を示している。
【図３６Ｂ】図３６Ａ〜３６Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＫＣの濃度を示している。
【図３６Ｃ】図３６Ａ〜３６Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＫＣの濃度を示している。
【図３７Ａ】図３７Ａ〜３７Ｃは、ＩｇＧ２ａ、Ｈ５７ｍＡｂおよびＨ５７  Ｎｕｌｌ２、ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨＭ２  ＳＭＩＰを静脈内投与した２時間後（Ａ）、２４時間後（Ｂ）および７２時間後（Ｃ）のＩＬ−１７の濃度を示している。
【図３７Ｂ】図３７Ａ〜３７Ｃは、ＩｇＧ２ａ、Ｈ５７ｍＡｂおよびＨ５７  Ｎｕｌｌ２、ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨＭ２  ＳＭＩＰを静脈内投与した２時間後（Ａ）、２４時間後（Ｂ）および７２時間後（Ｃ）のＩＬ−１７の濃度を示している。
【図３７Ｃ】図３７Ａ〜３７Ｃは、ＩｇＧ２ａ、Ｈ５７ｍＡｂおよびＨ５７  Ｎｕｌｌ２、ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨＭ２  ＳＭＩＰを静脈内投与した２時間後（Ａ）、２４時間後（Ｂ）および７２時間後（Ｃ）のＩＬ−１７の濃度を示している。
【図３８Ａ】図３８Ａ〜３８Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３８Ｂ】図３８Ａ〜３８Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３８Ｃ】図３８Ａ〜３８Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３９Ａ】図３９Ａおよび３９Ｂは、Ｈ５７−ＨＭ２およびＨ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌについての時間に対する平均血清濃度のグラフである。結果は、観察されたデータセットおよびＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭソフトウェアによって計算された予測値として表されている。Ｒｓｑ値およびＲｓｑ調整値は、ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ  ｚの推定において使用された時点（６．６および４０．７時間）の数値に対する調整の前および後の、末期排泄相（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）についての適合度統計量である。
【図３９Ｂ】図３９Ａおよび３９Ｂは、Ｈ５７−ＨＭ２およびＨ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌについての時間に対する平均血清濃度のグラフである。結果は、観察されたデータセットおよびＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭソフトウェアによって計算された予測値として表されている。Ｒｓｑ値およびＲｓｑ調整値は、ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ  ｚの推定において使用された時点（６．６および４０．７時間）の数値に対する調整の前および後の、末期排泄相（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）についての適合度統計量である。
【図４０】図４０は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＧ−ＣＳＦの濃度を示している。
【図４１】図４１は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＦＮ−γの濃度を示している。
【図４２】図４２は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−２の濃度を示している。
【図４３】図４３は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−５の濃度を示している。
【図４４】図４４は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−６の濃度を示している。
【図４５】図４５は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−１０の濃度を示している。
【図４６】図４６は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−１７の濃度を示している。
【図４７】図４７は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図４８】図４８は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＫＣの濃度を示している。
【図４９】図４９は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＭＣＰ−１の濃度を示している。
【図５０】図５０は、応答物細胞をＨ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ、Ｈ５７−ＨＭ２、マウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂまたはＨ５７ｍＡｂで処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。
【図５１】図５１は、応答物細胞をＨ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７ｍＡｂで処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージ（（Ｒ＋Ｓ）−無処理＝１００％に正規化されたパーセンテージ）を示している。
【図５２】図５２は、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ、Ｈ５７−ＨＭ２、マウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂまたは２Ｃ１１ｍＡｂの処理によって活性化された、ＣｏｎＡで刺激されたＴ細胞のパーセンテージを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（詳細な説明）
本開示は、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰＴＭ）製品の形態の、または独特のＴ細胞シグナル伝達プロファイルを誘導する、Ｎ末端からＣ末端方向と逆向きの方向でＦｃおよび結合ドメインを有するＳＭＩＰ分子ＳＭＩＰ分子（ＰＩＭＳ）の形態の、ＴＣＲ複合体に対する１つ以上の結合ドメインを含む融合タンパク質を提供する。このシグナル伝達プロファイルは、検出不可能の、または少量の、最小量のもしくはわずかなサイトカイン放出（すなわち、サイトカインストームが無いかまたは最小のサイトカインストーム）、カルシウム流動の誘導、Ｔ細胞を活性化させないままでのＴＣＲシグナル伝達タンパク質のリン酸化、またはそれらの任意の組み合わせを特徴とする。そのようなシグナル伝達プロファイルは、モノクローナル抗体を用いても再現されないことから、ＳＭＩＰまたはＰＩＭＳタンパク質がそれらの標的に結合することによって引き起こされる予想外のシグナル伝達のサイン（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が証明される。現在、ＴＣＲ複合体に対するタンパク質分子は、Ｔ細胞活性化とともに強力なＴ細胞シグナル（例えば、サイトカインストーム）を誘導するか、または架橋の非存在下では細胞に対してほとんど作用を有しないかのいずれかである。
【００２２】
さらに、本開示は、そのような融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびにそのようなタンパク質を組換え的に産生するためのベクターおよび宿主細胞、ならびに様々な治療への応用（疾患または状況（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患および臓器移植片拒絶）の少なくとも１つの症状の処置ならびに回復を含む）において本開示の融合タンパク質を使用するための組成物および方法を提供する。
【００２３】
本開示を詳細に示す前に、本明細書中で使用されるある特定の用語の定義を提供することが、本開示の理解に役立つ場合がある。さらなる定義が、本開示全体にわたって示される。
【００２４】
本開示において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲または整数の範囲は、別段示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値および適切な場合はその分数（例えば、ある整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解される。また、任意の物理的特徴（例えば、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さ）に関して本明細書中で列挙される任意の値の範囲は、別段示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解される。本明細書中で使用されるとき、「約」または「〜から本質的になる」は、別段示されない限り、示された範囲、値または構造の±２０％を意味する。本明細書中で使用されるとき、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同意語として使用される。用語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中で使用されるとき、列挙される構成要素の「１つまたはそれ以上」のことを指すと理解されるべきである。選択的な用語（例えば、「または」）の使用は、その選択的な用語が指示するものの一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。さらに、本明細書中に記載される構造および置換基の様々な組み合わせから得られる個別の化合物または化合物の群は、化合物または化合物の群の各々が個別に示されたかのように、同程度に本願によって開示されると理解されるべきである。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本発明の範囲内である。
【００２５】
本開示の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域内アミノ酸残基は、別段示されない限り、ＥＵナンバリングシステムによってナンバリングされる（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９９１）を参照のこと）。
【００２６】
「小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰＴＭ）タンパク質」とは、そのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって：標的分子に特異的に結合する結合ドメイン、リンカーポリペプチド（例えば、免疫グロブリンヒンジまたはその誘導体）、免疫グロブリンＣＨ２ポリペプチドおよび免疫グロブリンＣＨ３ポリペプチドを含む一本鎖融合タンパク質のことを指す（米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、同２００３／０１１８５９２号および同２００５／０１３６０４９号を参照のこと）。
【００２７】
「ＰＩＭＳタンパク質」は、逆方向のＳＭＩＰ分子であり、ここで、その結合ドメインは、融合タンパク質のカルボキシ末端に配置されている。ＰＩＭＳタンパク質を作製するための構築物および方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／０２３３８６に記載されている。通常、ＰＩＭＳ分子は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に向かって、任意のＣＨ２領域ポリペプチド、ＣＨ３ドメイン、リンカーペプチド（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域）および特異的な結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。
【００２８】
本明細書中で使用されるとき、あるタンパク質は、そのタンパク質のいくつかのドメイン（例えば、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメイン、リンカーポリペプチド、免疫グロブリンＣＨ２領域および免疫グロブリンＣＨ３領域）以外の部分（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端または２つのドメイン間のアミノ酸）が、あわせて、そのタンパク質の長さの多くとも２０％（例えば、多くとも１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、そのタンパク質の活性（例えば、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に対する親和性、サイトカイン放出を誘導しない能力（または最小限の検出可能なサイトカイン放出を誘導する能力）、カルシウム流動またはＴ細胞レセプターシグナル伝達経路内の分子のリン酸化を誘導する能力、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止する能力、抗原に対するメモリーＴ細胞の応答を阻止する能力、および細胞のＴＣＲ複合体の下方調節）に実質的に影響しない（すなわち、その活性を５０％超（例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％超）低下させない）場合、上記いくつかのドメイン「から本質的になる」。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメイン、リンカーポリペプチド、任意の免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドおよび免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドから本質的になる。そのような分子は、さらに、そのタンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または２つの異なるドメイン間（例えば、結合ドメインとリンカーポリペプチドとの間、リンカーポリペプチドと免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドとの間、または免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドと免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドとの間）に接合部アミノ酸を含み得る。
【００２９】
抗体技術の分野の当業者によって理解されている用語の各々は、本明細書中で明確に異なって定義されない限り、当該分野において獲得されている意味が与えられる。抗体は、可変領域、ヒンジ領域および定常ドメインを有すると知られている。免疫グロブリンの構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）において概説されている。例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」とは、それぞれ抗体の軽鎖および重鎖に由来する可変結合領域のことを指す。この可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られる、別個の詳細に明らかにされたサブ領域から構成されている。用語「ＣＬ」とは、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽重鎖に由来する定常領域のことを指す。用語「ＣＨ」とは、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」のことを指し、これは、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）にさらに分離可能である。定常領域ドメインの一部は、抗体由来のＦｃ領域（「フラグメント結晶化可能」領域）を構成し、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞食作用）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）および補体結合）、Ｆｃレセプター（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）への結合、Ｆｃ領域を有しないポリペプチドよりも長いインビボにおける半減期、プロテインＡ結合、およびおそらくさらに胎盤通過（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５（１９８９）を参照のこと）に関与する。
【００３０】
さらに、抗体は、代表的にはＦａｂ領域とＦｃ領域との間に位置するヒンジ配列を有する（しかし、下部のヒンジはＦｃ領域のアミノ末端部分を含み得る）。バックグラウンドとして、免疫グロブリンヒンジは、Ｆａｂ部分が空間内で自由に動くことを可能にする柔軟なスペーサーとして作用する。定常領域とは対照的に、ヒンジは、構造的に多種多様であり、免疫グロブリンクラス間およびさらにサブクラス間で配列と長さの両方が様々である。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は、十分な柔軟性があり、これにより、Ｆａｂフラグメントが、その対称軸のまわりを回転すること、および２つの重鎖間ジスルフィド架橋の１つ目を中央に置く球形内で動くことが可能になる。それに対して、ヒトＩｇＧ２ヒンジは、比較的短く、４つの重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された堅いポリプロリン二重らせんを含むことにより、柔軟性が制限される。ヒトＩｇＧ３ヒンジは、６２アミノ酸（２１個のプロリンおよび１１個のシステインを含む）を含み、柔軟性を欠くポリプロリン二重らせんを形成し、そしてＦａｂフラグメントがＦｃフラグメントと比較的離れていることを理由として大きな柔軟性をもたらす、独特の長いヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）という点で他のサブクラスと異なる。ヒトＩｇＧ４ヒンジは、ＩｇＧ１より短いが、ＩｇＧ２と同じ長さを有し、その柔軟性は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との中間である。
【００３１】
結晶学的研究によれば、ＩｇＧヒンジドメインは、機能的および構造的に３領域：上部、コアまたは中央および下部ヒンジ領域に細分され得る（Ｓｈｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：８７（１９９２））。例示的な上部ヒンジ領域は、ＩｇＧ１に見られるようなEPKSCDKTHT（配列番号３５９）、ＩｇＧ２に見られるようなERKCCVE（配列番号３６０）、ＩｇＧ３に見られるようなELKTPLGDTTHT（配列番号３６１）またはEPKSCDTPPP（配列番号３６２）、およびＩｇＧ４に見られるようなESKYGPP（配列番号３６３）を含む。例示的な中央またはコアヒンジ領域は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２に見られるようなCPPCP（配列番号３６４）、ＩｇＧ３に見られるようなCPRCP（配列番号３６５）、およびＩｇＧ４に見られるようなCPSCP（配列番号３６６）を含む。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体の各々は、１つの上部および中央ヒンジを有するとみられるが、ＩｇＧ３は、４つ（１つは、ELKTPLGDTTHTCPRCP（配列番号３６７）であり、３つは、EPKSCDTPPPCPRCP（配列番号３６８）である）をタンデムに有する。
【００３２】
ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体は、ＩｇＧ様コア領域を有しないとみられ、ＩｇＤは、２つの上部ヒンジ領域をタンデムに有するとみられる（ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNT（配列番号３６９）およびGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP（配列番号３７０）を参照のこと）。ＩｇＡ１およびＩｇＡ２抗体に見られる例示的な野生型上部ヒンジ領域は、それぞれVPSTPPTPSPSTPPTPSPS（配列番号３７１）およびVPPPPP（配列番号３７２）である。
【００３３】
対照的に、ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、代表的なヒンジ領域を有さず、その代わり、ヒンジ様特性を備えたＣＨ２ドメインを有する。ＩｇＥおよびＩｇＭの例示的な野生型ＣＨ２上部ヒンジ様配列は、それぞれ配列番号３７３
【００３４】
【化１】
2014227419.tif 000002
に示されている。
【００３５】
本明細書中で使用されるとき、「ヒンジ領域」または「ヒンジ」とは、（ａ）免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、上部およびコア領域から構成される）もしくはその機能的改変体、（ｂ）レクチンドメイン間領域もしくはその機能的改変体、または（ｃ）分化抗原（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（ＣＤ））分子のストーク（ｓｔａｌｋ）領域もしくはその機能的改変体のことを指す。
【００３６】
免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域または変更された野生型免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域であり得る。
【００３７】
本明細書中で使用されるとき、「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の重鎖に見られる、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に挿入され、それらのドメインを接続する（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの場合）か、またはＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとの間に挿入され、それらのドメインを接続する（ＩｇＥおよびＩｇＭの場合）、天然に存在する上部および中央ヒンジアミノ酸配列のことを指す。
【００３８】
「変更された野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「変更された免疫グロブリンヒンジ領域」とは、（ａ）最大３０％のアミノ酸の変更（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸の置換または欠失）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域、または（ｂ）約５アミノ酸（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸）から、最大約１２０アミノ酸の長さを有し（好ましくは、約１０〜約４０アミノ酸または約１５〜約３０アミノ酸または約１５〜約２０アミノ酸または約２０〜約２５アミノ酸の長さを有し）、最大約３０％のアミノ酸の変更（例えば、最大約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％のアミノ酸の置換または欠失またはそれらの組み合わせ）を有し、かつ配列番号３６４、３６５または３６６に示されているようなＩｇＧコアヒンジ領域を有する、野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部のことを指す。
【００３９】
「可変ドメイン連結配列」は、軽鎖可変領域に重鎖可変領域を接続するアミノ酸配列であり、得られるポリペプチドが同じ軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体の標的分子と同じ標的分子に対して特異的な結合親和性を保持するように、その２つの結合サブドメインの相互作用に適合したスペーサー機能を提供する。ある特定の実施形態において、結合ドメインを免疫グロブリンＣＨ２またはＣＨ３領域ポリペプチドに連結するために有用なヒンジは、可変ドメイン連結配列として使用され得る。
【００４０】
「リンカーポリペプチド」とは、融合タンパク質において結合ドメインを免疫グロブリンＣＨ２またはＣＨ３領域ポリペプチドに連結するアミノ酸配列のことを指す。ある特定の実施形態において、リンカーポリペプチドは、本明細書中で定義されるようなヒンジである。ある特定の実施形態において、軽鎖可変領域に重鎖可変領域を接続するために有用な可変ドメイン連結配列は、リンカーポリペプチドとして使用され得る。
【００４１】
ある特定の実施形態において、融合タンパク質の２つのドメイン間（例えば、結合ドメインとリンカーポリペプチドとの間、リンカーポリペプチドと免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドとの間、および免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドと免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドとの間）に１つまたはいくつかの（例えば、２〜８つの）アミノ酸残基、例えば、融合タンパク質の構築物の設計によって生じるアミノ酸残基（例えば、一本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子の構築中に制限酵素部位を使用することによって生じるアミノ酸残基）が存在し得る。本明細書中に記載されるように、そのようなアミノ酸残基は、「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」と呼ばれ得る。
【００４２】
「誘導体」は、本明細書中で使用されるとき、親化合物と構造的に類似しており、親化合物から（実際にまたは理論的に）誘導可能である、化学的または生物学的に改変されたバージョンの化合物（例えば、タンパク質）のことを指す。
【００４３】
本明細書中で使用されるとき、「アミノ酸」とは、天然のアミノ酸（自然界に存在するアミノ酸）、置換された天然のアミノ酸、非天然アミノ酸、置換された非天然アミノ酸またはそれらの任意の組み合わせのことを指す。天然のアミノ酸に対する名称は、本明細書中では、標準的な１文字または３文字コードとして示される。天然の極性アミノ酸としては、アスパラギン（ＡｓｐまたはＮ）およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；ならびに塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）およびそれらの誘導体）；ならびに酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）およびそれらの誘導体）が挙げられる。天然の疎水性アミノ酸としては、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）およびそれらの誘導体；ならびに他の無極性アミノ酸（例えば、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）およびそれらの誘導体）が挙げられる。中間の極性の天然のアミノ酸としては、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）およびそれらの誘導体が挙げられる。別段特定されない限り、本明細書中に記載される任意のアミノ酸は、Ｄ配置またはＬ配置で存在し得る。
【００４４】
アミノ酸は、物理的特性ならびに２次および３次タンパク質構造に対する寄与に従って分類され得る。「保存的置換」は、当該分野において、１つのアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することと認識されている。例示的な保存的置換は、当該分野で周知である（例えば、１９９７年３月１３日公開のＷＯ９７／０９４３３の１０頁；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹおよびＣｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０），ｐ．８を参照のこと）。ある特定の実施形態において、保存的置換は、ロイシンからセリンへの置換を含む。
【００４５】
本明細書中で使用されるとき、別段提供されない限り、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域内のアミノ酸残基の位置は、ヒトＩｇＧ１の可変領域が、Ｋａｂａｔナンバリングの慣例に従って１２８アミノ酸残基から構成されると仮定して、ナンバリングされる。次いで、ヒトＩｇＧ１重鎖のナンバリングされた定常領域は、他の免疫グロブリン重鎖の定常領域内のアミノ酸残基をナンバリングするための参照として使用される。ヒトＩｇＧ１重鎖以外の免疫グロブリン重鎖の定常領域内の目的のアミノ酸残基の位置は、目的のアミノ酸残基とアラインメントされるヒトＩｇＧ１重鎖内のアミノ酸残基の位置である。ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域と他の免疫グロブリン重鎖の定常領域とのアラインメントは、デフォルトのパラメータを使用したＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を用いるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）などの当該分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して行われ得る。例示的な配列のアラインメントは、図１６に示されている。本明細書中に記載されるナンバリングシステムによれば、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域は、図１６中の他のＣＨ２領域と比べてそのアミノ末端付近にアミノ酸欠失を有するが、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２内の下線の「Ｎ」の位置は、なおも２９７位である。なぜなら、この残基は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２内の２９７位の「Ｎ」とアラインメントするからである。
【００４６】
（ＴＣＲ複合体に対する融合タンパク質）
１つの態様において、本開示は、そのアミノ末端からそのカルボキシ末端に向かって：（ａ）ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメイン、（ｂ）リンカーポリペプチド、（ｃ）必要に応じて免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチド、および（ｄ）免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるＳＭＩＰ融合タンパク質の形態の一本鎖融合タンパク質を提供する。その免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは、存在するとき、（１）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換；（２）２３４〜２３８位における１つ以上のアミノ酸置換または欠失；（３）２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失；（４）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３８位における１つ以上の置換または欠失；（５）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における１つ以上の置換または欠失；（６）２３４〜２３８、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における１つ以上のアミノ酸置換または欠失；または（７）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３８、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を含み得る。
【００４７】
好ましい実施形態において、本開示の一本鎖融合タンパク質は、そのアミノ末端からそのカルボキシ末端に向かって：（ａ）ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメイン、（ｂ）リンカーポリペプチド、（ｃ）免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチド、および（ｄ）免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、ここで、その免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは、（ｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３８位における１つ以上の置換または欠失；（ｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４、２３５および２３７位における置換、ならびに２３６位における欠失；（ｉｉｉ）２３４〜２３８、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失；（ｉｖ）２３４、２３５、２３７、３１８、３２０および３２２位におけるアミノ酸置換、ならびに２３６位における欠失；（ｖ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３８、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位における少なくとも１つの置換または欠失；または（ｖｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４、２３５、２３７、３１８、３２０および３２２位におけるアミノ酸置換、ならびに２３６位における欠失を含む。これらの好ましい実施形態の各々において、置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）に使用されるアミノ酸は、好ましくは、アラニンまたはセリンである。
【００４８】
さらに好ましい実施形態において、本開示の一本鎖融合タンパク質は、そのアミノ末端からそのカルボキシ末端に向かって：（ａ）ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメイン、（ｂ）リンカーポリペプチド、および（ｃ）免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、ここで、その免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドは、ヒトＩｇＭのＣＨ３領域およびヒトＩｇＧ（好ましくは、ＩｇＧ１）のＣＨ３領域を含む。
【００４９】
本融合タンパク質は、単に検出不可能に、わずかに、最小に、もしくは低レベルで、サイトカイン放出（すなわち、サイトカインストーム）を誘導するかまたはＴ細胞を活性化し、さらに、以下の活性：（１）カルシウム流動の誘導、（２）ＴＣＲシグナル伝達経路内の分子のリン酸化の誘導、（３）同種抗原に対するＴ細胞応答の阻止、（４）抗原に対するメモリーＴ細胞応答の阻止、および（５）ＴＣＲ複合体の下方調節のうちの１つ以上が可能であり得る。
【００５０】
好ましい実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号２９３、２９４、２９８または２９９に示されているようなアミノ酸配列を含む。関連する好ましい実施形態において、配列番号２９３、２９４、２９８および２９９のアミノ酸２４７〜２６１におけるヒンジ配列は、配列番号３７９〜４３４に示されているようなヒンジアミノ酸配列で置き換えられる。さらに好ましい実施形態において、配列番号２９３、２９４、２９８および２９９の免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは、ＥＵナンバリングによるところの３１８、３２０および３２２位におけるアミノ酸置換をさらに含む。
【００５１】
関連する態様において、本開示は、そのアミノ末端からそのカルボキシ末端に向かって：（ａ）必要に応じて免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチド、（ｂ）免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチド、（ｃ）リンカーポリペプチド、および（ｄ）ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるＰＩＭＳタンパク質の形態の一本鎖融合タンパク質を提供する。その免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは、存在するとき、本明細書中に提供されるＳＭＩＰ融合タンパク質と同じタイプの変異を含み得る。さらに、ＰＩＭＳタンパク質は、本明細書中に記載されるようにＳＭＩＰ融合タンパク質が有する望ましい生物学的活性のうちの１つ以上を有する。
【００５２】
（結合ドメイン）
本明細書中に記載されるように、本開示の融合タンパク質は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβまたはそれらの任意の組み合わせ）に特異的に結合する結合ドメインを含む。
【００５３】
本開示に記載の「結合ドメイン」または「結合領域」は、例えば、生物学的分子（例えば、ＴＣＲ複合体またはその構成要素）を特異的に認識してそれに結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチドであり得る。結合ドメインは、目的の生物学的分子に対する、任意の天然に存在するか、合成か、半合成か、または組換え的に生成された結合パートナーを含む。例えば、結合ドメインは、抗体の軽鎖可変ドメイン領域および重鎖可変ドメイン領域であり得、または軽鎖可変ドメイン領域および重鎖可変ドメイン領域は、一本鎖においていずれかの向き（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）で共に連結され得る。特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための種々のアッセイが知られており、それらとしては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーまたはＢｉａｃｏｒｅＴＭ分析が挙げられる。
【００５４】
結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍという単位を有する、特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子に結合するかまたはそれと会合する場合、その結合ドメインは、標的分子に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６Ｍ−１、約１０７Ｍ−１、約１０８Ｍ−１、約１０９Ｍ−１、約１０１０Ｍ−１、約１０１１Ｍ−１、約１０１２Ｍ−１または約１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）とは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１またはそれ以上のＫａを有する結合ドメインのことを指す。あるいは、親和性は、Ｍという単位を有する、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍまたはそれ未満）。本開示に記載の結合ドメインポリペプチドおよび融合タンパク質の親和性は、従来の手法を用いて容易に測定され得る（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；および米国特許第５，２８３，１７３号；同第５，４６８，６１４号、または等価物を参照のこと）。
【００５５】
「Ｔ細胞レセプター」（ＴＣＲ）は、一般に、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識にＣＤ３とともに関与する、Ｔ細胞の表面上に見られる分子である。Ｔ細胞レセプターは、ほとんどのＴ細胞において、高度に可変性のαおよびβ鎖がジスルフィドで連結されたヘテロ二量体からなる。他のＴ細胞では、可変γおよびδ鎖から構成される代替のレセプターが、発現される。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質テイルを有する（Ａｂｂａｓ  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  Ｅｄ．），Ｅｄｉｔｏｒ：Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００３；Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ１４８，１４９および１７２，１９９９を参照のこと）。本開示に使用されるようなＴＣＲは、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物を含む様々な動物種に由来し得る。
【００５６】
「抗ＴＣＲ融合タンパク質、ＳＭＩＰまたは抗体」とは、ＴＣＲ分子またはその個別の鎖（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδ鎖）のうちの１つに特異的に結合する融合タンパク質、ＳＭＩＰまたは抗体のことを指す。ある特定の実施形態において、抗ＴＣＲ融合タンパク質、ＳＭＩＰまたは抗体は、ＴＣＲα、ＴＣＲβまたはその両方に特異的に結合する。
【００５７】
「ＣＤ３」は、６本の鎖の多タンパク質複合体として当該分野で知られている（Ａｂｂａｓ  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，２００３；Ｊａｎｅｗａｙら、ｐ１７２および１７８，１９９９を参照のこと）。哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２本のＣＤ３ε鎖、およびＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含む。そのＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。そのＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これは、これらの鎖が正に帯電したＴ細胞レセプター鎖と会合することを可能にする特徴である。そのＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の各々の細胞内テイルは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られる保存されたモチーフを１つ含み、一方、各ＣＤ３ζ鎖は、３つ含む。理論に拘束されるものではないが、これらのＩＴＡＭが、ＴＣＲ複合体（ｃｏｍｐｅｌｘ）のシグナル伝達の能力にとって重要であると考えられる。本開示において使用されるようなＣＤ３は、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物を含む様々な動物種に由来し得る。
【００５８】
「抗ＣＤ３融合タンパク質、ＳＭＩＰまたは抗体」は、本明細書中で使用されるとき、個別のＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖）または２本以上の個別のＣＤ３鎖から形成される複合体（例えば、２本以上のＣＤ３ε鎖の複合体、ＣＤ３γとＣＤ３ε鎖との複合体、ＣＤ３δとＣＤ３ε鎖との複合体）に特異的に結合する融合タンパク質、ＳＭＩＰまたは抗体のことを指す。ある特定の好ましい実施形態において、抗ＣＤ３融合タンパク質、ＳＭＩＰまたは抗体は、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはそれらの任意の組み合わせ、より好ましくは、ＣＤ３εに特異的に結合する。
【００５９】
「ＴＣＲ複合体」は、本明細書中で使用されるとき、ＣＤ３とＴＣＲの会合によって形成される複合体のことを指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２本のＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖から構成され得る。あるいは、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２本のＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲγ鎖およびＴＣＲδ鎖から構成され得る。
【００６０】
「ＴＣＲ複合体の構成要素」は、本明細書中で使用されるとき、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはＣＤ３ζ）または、２本以上のＴＣＲ鎖またはＣＤ３鎖によって形成される複合体（例えば、ＴＣＲαとＴＣＲβとの複合体、ＴＣＲγとＴＣＲδとの複合体、ＣＤ３εとＣＤ３δとの複合体、ＣＤ３γとＣＤ３εとの複合体、またはＴＣＲαと、ＴＣＲβと、ＣＤ３γと、ＣＤ３δと、２本のＣＤ３ε鎖とのサブＴＣＲ複合体）のことを指す。
【００６１】
バックグラウンドとして、ＴＣＲ複合体は、一般に、ＭＨＣ分子に結合した抗原に対するＴ細胞応答の惹起に関与する。ＴＣＲおよびコレセプター（すなわち、ＣＤ４またはＣＤ８）にペプチド：ＭＨＣリガンドが結合することにより、ＴＣＲ複合体、コレセプターおよびＣＤ４５チロシンホスファターゼが寄せ集められると考えられている。これによって、ＣＤ４５が阻害性のリン酸基を除去し、それにより、ＬｃｋおよびＦｙｎタンパク質キナーゼが活性化される。これらのタンパク質キナーゼが活性化されると、ＣＤ３ζ鎖上のＩＴＡＭがリン酸化され、そしてこのことは、この鎖をサイトゾルのチロシンキナーゼＺＡＰ−７０に結合可能にする。続いて、結合したＺＡＰ−７０がリン酸化によって活性化されることにより、３つのシグナル伝達経路が誘発され、それらのうちの２つは、ＰＬＣ−γのリン酸化および活性化によって開始され、次いで、ＰＬＣ−γは、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）リン酸（ＰＩＰ）をジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）に切断する。ＤＡＧによってタンパク質キナーゼＣが活性化されると、転写因子ＮＦκＢが活性化される。ＩＰ３作用の結果として、細胞内の遊離Ｃａ２＋が急激に上昇すると、細胞質のホスファターゼであるカルシニューリンが活性化され、それが転写因子ＮＦＡＴ（活性化されたＴ細胞の核因子）を細胞質から核に移動させる。ＮＦＡＴの完全な転写活性には、転写因子のＡＰ−１ファミリーのメンバー；転写制御因子のＦｏｓおよびＪｕｎファミリーのメンバーの二量体も必要である。活性化されたＺＡＰ−７０によって開始される第３のシグナル伝達経路は、Ｒａｓの活性化およびそれに続くＭＡＰキナーゼカスケードの活性化である。これは、Ｆｏｓの活性化、ゆえにＡＰ−１転写因子の活性化に至る。ＮＦκＢ、ＮＦＡＴおよびＡＰ−１が、共にＴ細胞染色体に対して作用することにより、Ｔ細胞の分化、増殖およびエフェクター作用をもたらす新しい遺伝子転写が開始される。Ｊａｎｅｗａｙら、ｐ１７８，１９９９を参照のこと。
【００６２】
ある特定の実施形態において、本開示の結合ドメインは、個別のＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３ε）または個別のＣＤ３鎖の２本以上の組み合わせ（例えば、ＣＤ３γおよびＣＤ３εから形成された複合体またはＣＤ３δおよびＣＤ３εから形成された複合体）に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、本結合ドメインは、個別のヒトＣＤ３鎖（例えば、ヒトＣＤ３γ鎖、ヒトＣＤ３δ鎖およびヒトＣＤ３ε鎖）または個別のヒトＣＤ３鎖の２本以上の組み合わせ（例えば、ヒトＣＤ３γとヒトＣＤ３εとの複合体またはヒトＣＤ３δとヒトＣＤ３εとの複合体）に特異的に結合する。ある特定の好ましい実施形態において、本結合ドメインは、ヒトＣＤ３ε鎖に特異的に結合する。
【００６３】
ある特定の他の実施形態において、本開示の結合ドメインは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＴＣＲαおよびＴＣＲβから形成されたヘテロ二量体に特異的に結合する。ある特定の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ヒトＴＣＲα、ヒトＴＣＲβ、またはヒトＴＣＲαおよびヒトＴＣＲβから形成されるヘテロ二量体のうちの１つ以上に特異的に結合する。
【００６４】
ある特定の実施形態において、本開示の結合ドメインは、１本以上のＴＣＲ鎖と１本以上のＣＤ３鎖から形成された複合体（例えば、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖、ＴＣＲα鎖もしくはＴＣＲβ鎖またはそれらの任意の組み合わせから形成された複合体）に結合する。他の実施形態において、本開示の結合ドメインは、１本のＣＤ３γ鎖、１本のＣＤ３δ鎖、２本のＣＤ３ε鎖、１本のＴＣＲα鎖および１本のＴＣＲβ鎖から形成された複合体に結合する。さらに好ましい実施形態において、本開示の結合ドメインは、１本以上のヒトＴＣＲ鎖とともに１本以上のヒトＣＤ３鎖から形成された複合体（例えば、ヒトＣＤ３γ鎖、ヒトＣＤ３δ鎖、ヒトＣＤ３ε、ヒトＴＣＲα鎖もしくはヒトＴＣＲβ鎖またはそれらの任意の組み合わせから形成された複合体）に結合する。ある特定の実施形態において、本開示の結合ドメインは、１本のヒトＣＤ３γ鎖、１本のヒトＣＤ３δ鎖、２本のヒトＣＤ３ε鎖、１本のヒトＴＣＲα鎖および１本のヒトＴＣＲβ鎖から形成された複合体に結合する。
【００６５】
本開示の結合ドメインは、本明細書中に記載されるように、または当該分野で公知の種々の方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号；同第６，２９１，１５８号を参照のこと）によって生成され得る。結合ドメインの供給源としては、ヒト、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダまたはラマ；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７５：４１３）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：１１８０４）、魚類（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５４：３９）、げっ歯類、鳥類またはヒツジをはじめとした、様々な種由来の抗体可変ドメイン核酸配列が挙げられる（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして、例えば、ファージライブラリーにおいて、形式設定され得る）。本開示の結合ドメインが由来し得る例示的な抗ＣＤ３抗体としては、Ｃｒｉｓ−７モノクローナル抗体（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．ら（ｅｄｓ．），Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８６））、ＢＣ３モノクローナル抗体（Ａｎａｓｅｔｔｉら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１６９１）、ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：３３７）およびそれらの誘導体（例えば、ＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａ（Ｈｅｒｏｌｄら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１：４０９）、ビジリズマブ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９：２７１２）ならびに１４５−２Ｃ１１モノクローナル抗体（Ｈｉｒｓｃｈら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３７６６））が挙げられる。例示的な抗ＴＣＲ抗体は、Ｈ５７モノクローナル抗体（Ｌａｖａｓａｎｉら（２００７）Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６５：３９−４７）である。
【００６６】
本開示の結合ドメインの代替の供給源としては、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、または代替の非抗体骨格（例えば、フィブリノゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３８８を参照のこと）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照のこと）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４を参照のこと）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開番号２００７／００６５４３１を参照のこと）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｚｅｌｅｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｒｅａｄｙ（２００５）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２：６１７９）、ｍＡｂ２またはＦｃａｂＴＭ（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００７／０９８９３４；ＷＯ２００６／０７２６２０を参照のこと）など）のループ領域における操作された様々なアミノ酸をコードする配列が挙げられる。例えば、本開示の結合ドメインは、ＣＤ３鎖に特異的に結合するＦａｂフラグメントについてＦａｂファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る（Ｈｏｅｔら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４を参照のこと）。
【００６７】
さらに、簡便な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂ  ｍｏｕｓｅ（登録商標）、ＴＣ  ｍｏｕｓｅＴＭ、ＫＭ−ｍｏｕｓｅ（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において免疫原としてＣＤ３鎖を使用したハイブリドーマ開発のための従来のストラテジーを用いることにより、本開示の結合ドメインが開発され得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、結合ドメインは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。好ましい実施形態において、ＶＨおよびＶＬドメインは、ヒトＶＨおよびＶＬドメインまたはヒト化ＶＨおよびＶＬドメインである。例示的なＶＨドメインとしては、それぞれ配列番号２、６、４９および５８に示されているようなＢＣ３  ＶＨ、ＯＫＴ３  ＶＨ、Ｈ５７  ＶＨおよび２Ｃ１１  ＶＨドメインが挙げられる。さらなる例示的なＶＨドメインとしては、配列番号２２０、２４３、２４４および２４５に示されているドメインなどのＣｒｉｓ−７  ＶＨドメインが挙げられる。例示的なＶＬドメインは、それぞれ配列番号４、８、５１および６０に示されているようなＢＣ３  ＶＬ、ＯＫＴ３  ＶＬ、Ｈ５７  ＶＬおよび２Ｃ１１  ＶＬドメインである。さらなる例示的なＶＬドメインとしては、配列番号２２２、２４１および２４２に示されているドメインなどのＣｒｉｓ−７  ＶＬドメインが挙げられる。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγおよびＴＣＲδまたはそれらの組み合わせ）に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、配列番号４、８、５１、６０、２２２、２４１または２４２）もしくは重鎖可変領域（ＶＨ）（例えば、配列番号２、６、４９、５８、２２０、２４３、２４４または２４５）またはその両方のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一である配列を含むか、またはその配列である。
【００６９】
「配列同一性」は、本明細書中で使用されるとき、配列をアラインメントし、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するようにギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、別の参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である、１つの配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージのことを指す。そのパーセンテージ配列同一性の値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって定義されているようなＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウェアを、デフォルトの値に設定されたパラメータで使用して生成され得る。
【００７０】
ある特定の実施形態において、本開示の結合ドメインＶＨ領域は、公知のモノクローナル抗体（例えば、Ｃｒｉｓ−７、ＢＣ３、ＯＫＴ３（それらの誘導体を含む））のＶＨに由来し得るか、または基づき得、公知のモノクローナル抗体のＶＨと比べたとき、１つ以上の挿入、１つ以上の欠失、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）または上で述べた変更の組み合わせを含む。改変されたＶＨ領域を含む結合ドメインが、野生型結合ドメインに類似の親和性でその標的になおも特異的に結合し得るという条件で、その挿入、欠失または置換は、ＶＨ領域のアミノ末端もしくはカルボキシ末端または両端を含むこの領域内の任意の位置に存在してよい。
【００７１】
ある特定の実施形態において、本開示の結合ドメイン内のＶＬ領域は、公知のモノクローナル抗体（例えば、Ｃｒｉｓ−７、ＢＣ３、ＯＫＴ３（それらの誘導体を含む））のＶＬに由来するか、または基づき、公知のモノクローナル抗体のＶＬと比べたとき、１つ以上の挿入、１つ以上の欠失、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）または上で述べた変更の組み合わせを含む。改変されたＶＬ領域を含む結合ドメインが、野生型結合ドメインに類似の親和性でその標的になおも特異的に結合し得るという条件で、その挿入、欠失または置換は、ＶＬ領域のアミノ末端もしくはカルボキシ末端または両端を含むこの領域内の任意の位置に存在してよい。
【００７２】
上記ＶＨおよびＶＬドメインは、いずれかの向き（すなわち、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）で配置され得、可変ドメイン連結配列によって引き離され得る。ある特定の実施形態において、可変ドメイン連結配列は、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４３）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４４）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４５）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４６）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４７）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号３４８）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号３４９）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３５０）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号３５１）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号３５２）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３５３）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号３５４）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号３５５）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号３５６）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１４５）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号３５７）もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号３５８）を含む、ＧｌｙＳｅｒ、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ（配列番号３３９）、Ｇｌｙ３Ｓｅｒ（配列番号３４０）、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号３４１）およびＧｌｙ５Ｓｅｒ（配列番号３４２）のファミリーに属するものを含む。ある特定の実施形態において、可変ドメイン連結配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＱ（配列番号９８）である。好ましい実施形態において、これらの（ＧｌｙｘＳｅｒ）ベースのリンカーは、可変ドメインを連結するために使用され、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）をＦｃテイル（例えば、ＩｇＧ  ＣＨ２ＣＨ３）に連結するために使用されない。ある特定の実施形態において、可変ドメイン連結配列は、約５〜約３５アミノ酸を含み、好ましくは、約１５〜約２５アミノ酸を含む。
【００７３】
本明細書中に記載されるような、特定のドメインまたは領域のアミノ末端またはカルボキシ末端における任意の挿入、欠失または置換は、例えば、１つの可変領域が別の可変領域に連結されるように操作された結果（例えば、ＶＨ領域とＶＬ領域との間またはＶＬ領域とＶＨ領域との間の接合部におけるアミノ酸の変更）または結合ドメインが定常領域に連結されるように操作された結果（例えば、結合ドメインとヒンジリンカーとの間の接合部におけるアミノ酸の変更）であり得る。例えば、１つ以上（例えば、２〜８つ）のアミノ酸が、以下で詳細に記載されるような融合タンパク質接合部の１つ以上において付加され得るか、欠失され得るか、または置換され得る。
【００７４】
本開示の例示的な結合ドメインは、配列番号１８、２０、４８、６２および２５８〜２６４に示されているようなものを含む。ある特定の好ましい実施形態において、本開示の一本鎖融合タンパク質は、配列番号２５８〜２６４のいずれか１つに示されているようなアミノ酸配列を有する結合ドメインを含む。
【００７５】
（リンカーポリペプチド）
本明細書中に記載されるように、本開示の融合タンパク質は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを、免疫グロブリンＣＨ２領域または免疫グロブリンＣＨ３領域に連結するリンカーポリペプチドを含む。リンカーは、融合タンパク質の結合ドメインとその残りとの間にスペースを入れる機能を提供することに加えて、その標的（すなわち、ＴＣＲ複合体またはその構成要素、例えば、ＣＤ３）と相互作用するために融合タンパク質の結合ドメインを正しい向きにするのに適した柔軟性または剛性を提供し得る。さらに、リンカーは、完全長融合タンパク質の発現を補助し得、インビトロと、ヒトなどのその必要のある被験体に投与した後のインビボの両方において精製タンパク質に安定性を提供し得、好ましくは、リンカーは、そのような被験体において免疫原性でないか、または免疫原性が乏しい。
【００７６】
本開示において企図されるリンカーは、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーのドメイン間領域に由来するペプチド、免疫グロブリンドメイン間領域（例えば、抗体ヒンジ領域）またはＣ型レクチンのストーク領域（ＩＩ型膜タンパク質のファミリー）（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００７／１４６９６８に示されている例示的なレクチンストーク領域配列、例えば、その公報の配列番号１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８７、２８９、２９７、３０５、３０７、３０９〜３１１、３１３〜３３１、３４６、３７３〜３７７、３８０または３８１を参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される））および分化抗原（ＣＤ）分子のストーク領域を含む。
【００７７】
本開示の融合タンパク質における使用に適したリンカーは、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＡヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＩｇＥ  ＣＨ２、ＩｇＭ  ＣＨ２またはそれらのフラグメントもしくは改変体から選択される抗体ヒンジ領域を含む。ある特定の好ましい実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４またはそれらのフラグメントもしくは改変体から選択される抗体ヒンジ領域であり得る。いくつかの実施形態において、そのリンカーは、野生型ヒト免疫グロブリンヒンジ領域などの野生型免疫グロブリンヒンジ領域である。例示的なリンカーは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域および野生型マウスＩＧＨＧ２ｃヒンジ領域であり、それらの配列は、それぞれ配列番号６３および７２に示されている。
【００７８】
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基が、融合タンパク質構築物設計の一部として野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ末端またはカルボキシ末端に付加され得る。代表的な改変リンカーは、アミノ末端に追加の接合部アミノ酸残基（例えば、「ＲＴ」（例えば、配列番号１００および５２に示されている）、「ＲＳＳ」（例えば、配列番号３２８および３３１〜３３８に示されている）、「ＴＧ」（例えば、配列番号１７７に示されている）または「Ｔ」（例えば、配列番号３００に示されている））；カルボキシ末端に追加の接合部アミノ酸残基（例えば、「ＳＧ」（例えば、配列番号２１２および２１３に示されている））；または付加と組み合わされる欠失（例えば、カルボキシ末端に付加される「ＳＧ」を伴うΔＰ（例えば、配列番号２１２に示されている））を有し得る。
【００７９】
好ましい実施形態において、リンカーは、変異ＩｇＧ免疫グロブリンヒンジ領域などの変異免疫グロブリンヒンジ領域である。例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は、３つのシステイン残基を含む：ヒンジ領域の最もアミノ末端側のシステインが、第１システインと呼ばれ、一方、最もカルボキシ末端側のシステインが、第３システインと呼ばれる。ある特定の実施形態において、リンカーは、第１システインがセリンで置換されているヒトＩｇＧ１ヒンジ領域などの、２つのシステイン残基しか有しない変異ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。ある特定の他の実施形態において、リンカーは、第１、第２または第３システインなどの１つのシステイン残基しか有しない変異ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域内の第３システインに対してカルボキシ末端の第１プロリンが、例えば、セリンによって置換される。融合タンパク質の結合ドメインとその残りとの間のリンカーポリペプチドとして使用され得る例示的な変異ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は、配列表に列挙されている（例えば、リンカー４７〜４９、５１および５３〜６０（それぞれ配列番号９９、１４６〜１４８および１５０〜１５７））。ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基が、融合タンパク質構築物設計の一部として変異免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ末端またはカルボキシ末端に付加され得る。そのような改変リンカーの例は、配列番号１０、３３５および３００に示されており、ここで、それぞれアミノ酸残基「ＲＴ」、「ＲＳＳ」または「Ｔ」が、変異ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ末端に付加されている。
【００８０】
ある特定の実施形態において、リンカーは、１つまたは１つより多いシステイン残基を有し得るが、鎖間ジスルフィド結合を形成するために単一のシステイン残基（例えば、ＩｇＧ１の第２または第３のシステイン）を有する。他の実施形態において、リンカーは、３つ以上のシステイン残基を有し得るが、鎖間ジスルフィド結合を形成するために２つのシステイン残基を有する。
【００８１】
ある特定の実施形態において、本開示のリンカーポリペプチドは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１ヒンジ領域）に由来し、野生型免疫グロブリンヒンジ領域と比べたとき、改変ヒンジが、その標的と相互作用するために融合タンパク質の結合ドメインを正しい向きにするのに適した柔軟性または剛性を保持するという条件で、１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）の挿入、１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）の欠失、１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）または上で述べた変異の組み合わせを含む。その挿入、欠失または置換は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端または両端を含む野生型免疫グロブリンヒンジ領域内の任意の位置に存在してよい。ある特定の実施形態において、リンカーポリペプチドは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジまたは野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジ）と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはその配列である。
【００８２】
代替のヒンジ配列またはリンカー配列は、ＩｇＶ様ドメインまたはＩｇＣ様ドメインを接続する細胞表面レセプターの一部から作製され得る。細胞表面レセプターが複数のＩｇＶ様ドメインをタンデムに含むときのＩｇＶ様ドメイン間の領域、および細胞表面レセプターが複数のタンデムＩｇＣ様領域を含むときのＩｇＣ様ドメイン間の領域もまた、接続領域またはリンカーペプチドとして使用され得る。ＩｇＶ様ドメインとＩｇＣ様ドメインとの間またはＩｇＣ様ドメイン間もしくはＩｇＶ様ドメイン間のドメイン間領域の代表的なヒンジ配列またはリンカー配列は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６およびＣＤ２４４に見られる。さらなる代替のヒンジは、非免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ７２およびＣＤ１６１）由来のＩＩ型レセプターのジスルフィド含有領域から作製され得る。
【００８３】
ある特定の実施形態において、ヒンジ配列またはリンカー配列は、２〜１５０個のアミノ酸、５〜６０個のアミノ酸、２〜４０個のアミノ酸を有し、好ましくは、８〜２０個を有し、より好ましくは、１２〜１５個のアミノ酸を有し、主に柔軟性であり得るが、より剛性の特徴も提供し得、または、βシート構造は最小で主にαヘリックス構造を含み得る。好ましくは、ヒンジ配列およびリンカー配列は、血漿中および血清中で安定であり、タンパク分解性切断に対して抵抗性である。ある特定の実施形態において、ＩｇＧ１上部ヒンジ領域内の第１リジンが変異することにより、タンパク分解性切断が最小になり、好ましくは、そのリジンがメチオニン、トレオニン、アラニンまたはグリシンで置換されるか、または欠失される（例えば、アミノ末端に接合部アミノ酸（好ましくは、ＲＴ）を含み得る配列番号３７９〜４３４を参照のこと）。いくつかの実施形態において、配列は、分子のカルボキシ末端を安定化させる１つのジスルフィド結合または複数のジスルフィド結合を形成する能力を付与するコア構造ＣＰＰＣ（配列番号３３０）などの、天然に存在するモチーフまたは付加されたモチーフを含み得る。他の実施形態において、配列は、１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。ヒンジの長さを変更することの予想外の特徴は、本開示の一本鎖融合タンパク質によって引き起こされるカルシウム流動のレベルの調節が可能になることである（実施例５を参照のこと）。カルシウム流動を調節するための例示的なヒンジは、配列番号２１２〜２１８を含む。さらに、ヒンジの長さおよび／または配列は、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止する際の融合タンパク質の活性にも影響し得る（実施例１０を参照のこと）。本開示の融合タンパク質において接続領域として有用なリンカーは、配列番号３７９〜４３４に示されている。
【００８４】
（免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチド）
本明細書中に記載されるように、本開示の融合タンパク質は、２９７位のアスパラギンにアミノ酸置換（例えば、アスパラギンからアラニンへの置換）を含む免疫グロブリンＣＨ２領域を含み得る。そのようなアミノ酸置換によって、この部位におけるグリコシル化が減少するかまたは除去され、ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合ができなくなる。
【００８５】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、２３４〜２３８位に少なくとも１つの置換または欠失を含む免疫グロブリンＣＨ２領域を含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４、２３５、２３６、２３７または２３８位、２３４および２３５位、２３４および２３６位、２３４および２３７位、２３４および２３８位、２３４〜２３６位、２３４、２３５および２３７位、２３４、２３６および２３８位、２３４、２３５、２３７および２３８位、２３６〜２３８位、または、２３４〜２３８位における２、３、４または５つのアミノ酸の他の任意の組み合わせの置換を含み得る。さらに、またはあるいは、変異ＣＨ２領域は、２３４〜２３８位、好ましくは、２３６位または２３７位の１つにおいて１つ以上（例えば、２、３、４または５つ）のアミノ酸欠失を含み得、同時に、他の位置が置換される。上で述べた変異は、本融合タンパク質の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃレセプター結合能を低下させるか、または喪失させる。ある特定の好ましい実施形態において、２３４〜２３８位の１つ以上におけるアミノ酸残基は、１つ以上のアラニン残基で置き換えられている。さらに好ましい実施形態において、２３４〜２３８位におけるアミノ酸残基のうちのただ１つが、欠失されており、２３４〜２３８位における残りのアミノ酸の１つ以上が、別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換され得る。
【００８６】
ある特定の他の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２および３３１位に１つ以上のアミノ酸置換を含む免疫グロブリンＣＨ２領域を含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２または３３１位、３１８および３２０位、３１８および３２２位、３１８、３２０および３２２位、または、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２および３３１位における２、３、４、５または６つのアミノ酸の他の任意の組み合わせの置換を含み得る。上で述べた変異は、本融合タンパク質の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を低下させるか、または喪失させる。
【００８７】
ある特定の他の実施形態において、本開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域は、２９７位におけるアミノ酸置換に加えて、２３４〜２３８位に１つ以上（例えば、２、３、４または５つ）の追加の置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４および２９７位、２３４、２３５および２９７位、２３４、２３６および２９７位、２３４〜２３６および２９７位、２３４、２３５、２３７および２９７位、２３４、２３６、２３８および２９７位、２３４、２３５、２３７、２３８および２９７位、２３６〜２３８および２９７位、または２９７位に加えて２３４〜２３８位における２、３、４もしくは５つのアミノ酸の任意の組み合わせの置換を含み得る。さらに、またはあるいは、変異ＣＨ２領域は、２３６位または２３７位などの２３４〜２３８位に１つ以上（例えば、２、３、４または５つ）のアミノ酸欠失を含み得る。その追加の変異は、本融合タンパク質の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃレセプター結合能を低下させるか、または喪失させる。ある特定の実施形態において、２３４〜２３８位の１つ以上におけるアミノ酸残基は、１つ以上のアラニン残基で置き換えられている。さらなる実施形態において、２３４〜２３８位におけるアミノ酸残基のうちのただ１つが、欠失しており、２３４〜２３８位における残りのアミノ酸の１つ以上が、別のアミノ酸（例えば、好ましくは、アラニンまたはセリン）で置換され得る。
【００８８】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域は、２３４〜２３８位における１つ以上（例えば、２、３、４または５つ）のアミノ酸置換に加えて、補体結合に関与する１つ以上の位置（例えば、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２またはＰ３３１位）に１つ以上（例えば、２、３、４、５または６つ）の追加のアミノ酸置換（例えば、アラニンによる置換）を含み得る。好ましい変異免疫グロブリンＣＨ２領域としては、２３４、２３５、２３７（存在する場合）、３１８、３２０および３２２位にアラニン置換を有する、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびマウスＩｇＧ２ａのＣＨ２領域が挙げられる。例示的な変異免疫グロブリンＣＨ２領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２にアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃ  ＣＨ２領域である（配列番号５０）。
【００８９】
なおもさらなる実施形態において、本開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域は、２９７位におけるアミノ酸置換、および２３４〜２３８位における追加の欠失または置換に加えて、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２および３３１位に１つ以上（例えば、２、３、４、５または６つ）の追加の置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、（１）２９７位における置換、（２）２３４〜２３８位における１つ以上の置換もしくは欠失またはそれらの組み合わせ、および、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２およびＰ３３１位における１つ以上（例えば、２、３、４、５または６つ）のアミノ酸置換（例えば、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２位における１、２、３つの置換）を含み得る。好ましくは、上で述べた位置におけるアミノ酸は、アラニンまたはセリンによって置換される。
【００９０】
ある特定の実施形態において、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは：（ｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４、２３５、２３６または２３７位における１つのアミノ酸置換；（ｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３７位の２つにおけるアミノ酸置換；（ｉｉｉ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、および２３４〜２３７位の３つにおけるアミノ酸置換；（ｉｖ）２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、２３４、２３５および２３７位におけるアミノ酸置換、ならびに２３６位におけるアミノ酸欠失；（ｖ）２３４〜２３７位の３つにおけるアミノ酸置換、ならびに３１８、３２０および３２２位におけるアミノ酸置換；または（ｖｉ）２３４〜２３７位の３つにおけるアミノ酸置換、２３６位におけるアミノ酸欠失、ならびに３１８、３２０および３２２位におけるアミノ酸置換を含む。
【００９１】
本開示の融合タンパク質中の２９７位のアスパラギンにアミノ酸置換を有する例示的な変異免疫グロブリンＣＨ２領域は：Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７にアラニン置換、ならびにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２領域（配列番号１０３）、Ｖ２３４、Ｇ２３６およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域（配列番号１０４）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７にアラニン置換、ならびにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（配列番号７５）、Ｆ２３４およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（配列番号３７５）、Ｌ２３５およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（配列番号３７６）、Ｇ２３６およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（配列番号３７７）、ならびに、Ｇ２３７およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（配列番号３７８）を含む。
【００９２】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域は、上に記載されたアミノ酸置換に加えて、上で述べた位置以外の１つ以上の位置に１つ以上の追加のアミノ酸置換を含み得る。そのようなアミノ酸置換は、保存的または非保存的なアミノ酸置換であり得る。例えば、ある特定の実施形態において、Ｐ２３３は、変異ＩｇＧ２  ＣＨ２領域ではＥ２３３に変更され得る（例えば、配列番号１０４を参照のこと）。さらに、またはあるいは、ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域は、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失またはその両方を含み得る。その挿入、欠失または置換は、免疫グロブリンＣＨ２領域内の任意の位置（例えば、リンカーを介してＣＨ２領域を別の領域（例えば、可変領域）と連結することによって生じる野生型免疫グロブリンＣＨ２領域のＮ末端またはＣ末端）に存在し得る。
【００９３】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域は、野生型免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはその配列である。
【００９４】
本開示の融合タンパク質中の変異免疫グロブリンＣＨ２領域は、様々な種（ヒト、マウス、ラットおよび他の哺乳動物を含む）由来の様々な免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＤ）のＣＨ２領域に由来し得る。ある特定の好ましい実施形態において、本開示の融合タンパク質中の変異免疫グロブリンＣＨ２領域は、配列が配列番号６４、６６、６８および７３に示されている、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域に由来し得る。
【００９５】
Ｆｃレセプター（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＦｃεＲ１、ＦｃＲｎ）または補体成分Ｃ１ｑとのＦｃ相互作用を変化させ得る変異をＦｃドメインの内側または外側に作製するための方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｐｒｅｓｔａ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２３７を参照のこと）。
【００９６】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、いかなる免疫グロブリンＣＨ２領域も含まない。
【００９７】
（免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチド）
本明細書中に記載されるように、本開示の融合タンパク質は、１つ以上の免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、いかなるＣＨ２領域も含まない。そのような実施形態において、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインは、リンカー（例えば、ヒンジ）ポリペプチドを介して免疫グロブリンＣＨ３領域に直接連結される。ＣＨ２領域が存在しないある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、ただ１つのＣＨ３領域を含み得る。代替の実施形態は、２つのＣＨ３領域を含み、ＣＨ２領域を含まない、本開示の融合タンパク質を含む。
【００９８】
融合タンパク質が変異免疫グロブリンＣＨ２領域と免疫グロブリンＣＨ３領域の両方を含む実施形態において、そのＣＨ２およびＣＨ３領域は、同じかまたは異なる免疫グロブリン、抗体アイソタイプまたは対立遺伝子改変体に由来し得る。好ましくは、そのＣＨ２領域は、ＣＨ３領域のアミノ末端に直接連結される。ＣＨ３領域のアミノ末端に直接連結されるＣＨ２領域を含む例示的な配列は、配列番号１１〜１４および１０１に示されている。あるいは、そのＣＨ２領域は、１つ以上のアミノ酸またはリンカーを介してそのＣＨ３領域に連結され得る（例えば、配列表に示されているようなリンカーを参照のこと）。
【００９９】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、２つの免疫グロブリンＣＨ３領域を含み得る。これらのＣＨ３領域は、同じ免疫グロブリンアイソタイプ由来の野生型ＣＨ３領域もしくは変異ＣＨ３領域であり得、または異なる免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。例えば、ある特定の他の実施形態において、融合タンパク質は、ヒトＩｇＭのＣＨ３領域およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む。ヒトＩｇＭのＣＨ３領域とヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域とが共に連結されている例示的な配列としては、配列番号１５および７４が挙げられる。ある特定の他の実施形態において、融合タンパク質は、マウスＣＨ３μ領域およびマウスＣＨ３γ領域を含む。マウスＣＨ３μ領域とマウスＣＨ３γ領域とが共に連結されている例示的な配列としては、配列番号３０８および３０９が挙げられる。
【０１００】
本融合タンパク質が２つの免疫グロブリンＣＨ３領域を含む実施形態において、他方のＣＨ３領域に対してアミノ末端に位置するＣＨ３領域は、「第１ＣＨ３領域」と呼ばれる。その他方のＣＨ３領域は、「第２ＣＨ３領域」と呼ばれる。そのような実施形態において、それら２つの免疫グロブリンＣＨ３領域は、互いに直接融合され得る。換言すれば、第１ＣＨ３領域のＣ末端は、第２ＣＨ３領域のアミノ末端に、それらの間にいかなる介在アミノ酸残基もなしに（すなわち、リンカーの非存在下で）直接連結される。あるいは、それら２つのＣＨ３領域は、１つ以上（例えば、２〜８つ）のアミノ酸またはリンカー（例えば、配列表に示されているようなリンカーを参照のこと）を介して連結され得る。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質中の免疫グロブリンＣＨ３領域は、１つ以上（例えば、２〜８つ）の追加のアミノ酸置換を含み得る。そのようなアミノ酸置換は、保存的であってもよいし、非保存的であってもよい。さらに、またはあるいは、ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質中のＣＨ３領域は、様々な位置に１つ以上（例えば、２〜８つ）のアミノ酸の挿入、欠失またはその両方を含み得る。その挿入、欠失または置換は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方を含む、免疫グロブリンＣＨ３領域内の任意の位置に存在してよい。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質中の免疫グロブリンＣＨ３領域は、野生型免疫グロブリンＣＨ３領域（例えば、野生型ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ３領域）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはその配列である。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドは、様々な種（すなわち、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物）由来の様々な免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥまたはＩｇＭ）のいずれか１つの野生型ＣＨ３領域を含む野生型免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドである。例えば、その免疫グロブリンＣＨ３領域は、野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３領域（例えば、配列番号６５）、野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ３領域（例えば、配列番号６７）、野生型ヒトＩｇＧ４  ＣＨ３領域（例えば、配列番号６９）、野生型ヒトＩｇＭ  ＣＨ３領域（例えば、配列番号７１）、マウスＣＨ３μ領域（例えば、配列番号３２９）または野生型マウスＩＧＨＧ２ｃ  ＣＨ３領域（例えば、配列番号５４）であり得る。さらなる実施形態において、免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドは、変異免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドである。その免疫グロブリンＣＨ３領域内の変異は、補体結合に関与する、Ｈ４３３またはＮ４３４などの１つ以上の位置に存在し得る。
【０１０４】
（追加の配列および改変）
本明細書中に記載されるように、本開示の一本鎖融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって：（ａ）ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ε）に特異的に結合する結合ドメイン、（ｂ）リンカーポリペプチド、（ｃ）必要に応じて免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチド、および（ｄ）免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドを含み得る。さらに、本開示の融合タンパク質は、１つ以上の追加領域、例えば、融合タンパク質を発現するための、そのアミノ末端におけるリーダー配列、追加のＦｃサブ領域（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＥの野生型または変異ＣＨ４領域）、または識別目的もしくは精製目的のための、そのカルボキシ末端におけるテイル配列を含み得る。例示的なテイル配列としては、検出用または精製用のエピトープタグ（例えば、６−ヒスチジン領域またはＦＬＡＧエピトープ）が挙げられ得る。
【０１０５】
例えば、本融合タンパク質は、特定の発現系の使用に起因する追加のアミノ酸残基を有し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合生成物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターを使用することにより、その所望のポリペプチドからＧＳＴ成分を切断した後、−１位に追加のグリシン残基を有する所望のポリペプチドがもたらされる。通常、配列のカルボキシ末端および／またはアミノ末端のアミノ酸配列にヒスチジンタグが組み込まれているものを含む、他のベクター系における発現から生じる改変体もまた、企図される。融合タンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端に存在し得る例示的な追加配列は、配列番号７０に示されているように、３コピーのＦＬＡＧエピトープ、１コピーのＡＶＩタグおよび６つのヒスチジンを含む。
【０１０６】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、そのＮ末端にリーダーペプチドを含む。そのリードペプチドは、発現された融合タンパク質の分泌を促進する。任意の従来のリーダーペプチド（シグナル配列）を用いることにより、新生の発現ポリペプチドまたは融合タンパク質を分泌経路に向かわせ、そして、そのリーダーペプチドと融合タンパク質との間の接合部または接合部付近でリーダーペプチドが成熟融合タンパク質から切断されると予想される。特定のリーダーペプチドは、当該分野において公知の考慮事項に基づいて選択される（例えば、分子的操作を容易にするため、制限エンドヌクレアーゼ切断部位をリーダーペプチドのコード配列の最初または最後に容易に含めることを可能にする核酸分子にコードされた配列を用いること）。ただし、そのリーダーペプチドが、そのポリペプチドまたは融合タンパク質の成熟中に切断されない場合に、そのような導入された配列は、新生の発現タンパク質からのリーダーペプチドの任意の所望のプロセシングを容認しがたく干渉しないか、または、ポリペプチドまたは融合タンパク質の任意の所望の機能を容認しがたく干渉しないアミノ酸を規定する。本開示の例示的なリーダーペプチドは、天然のリーダー配列またはその他のもの（例えば、Ｈ３Ｎ−MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG−ＣＯ２Ｈ（配列番号９））を含む。
【０１０７】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、グリコシル化され、ここで、グリコシル化のパターンは、種々の因子に依存し、その因子としては、そのタンパク質が発現される宿主細胞（組換え宿主細胞内で調製される場合）および培養条件が挙げられる。
【０１０８】
さらなる実施形態において、本開示の融合タンパク質の免疫グロブリンＣＨ２またはＣＨ３領域は、免疫グロブリン参照配列のＣＨ２またはＣＨ３領域と比べて、変更されたグリコシル化パターンを有し得る。例えば、任意の種々の遺伝子操作を用いることにより、グリコシル化部位を形成する１つ以上の特定のアミノ酸残基が変更され得る（Ｃｏら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１３６１；Ｊａｃｑｕｅｍｏｎら（２００６）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４：１０４７；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：７９３４；Ｗａｒｎｏｃｋら（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：８３１を参照のこと）。あるいは、本開示の融合タンパク質を産生する宿主細胞が、変更されたグリコシル化パターンをもたらすように操作され得る。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書中に記載される融合タンパク質の誘導体も提供する。誘導体には、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外の改変を有する融合タンパク質が含まれる。好ましくは、その改変は、本質的に共有結合性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分および無機部分との化学結合が挙げられる。本開示の誘導体は、特定の融合タンパク質の循環半減期を延長するように調製され得、またはその融合タンパク質が所望の細胞、組織または臓器を標的とする能力を改善するように設計され得る。
【０１１０】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質のインビボ半減期は、大分子の半減期を延長するための当該分野で公知の方法を用いて延長され得る。例えば、本開示は、１つ以上の水溶性ポリマー付着物（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール）を含むように共有結合的に改変されたかまたは誘導体化された融合タンパク質を包含する（例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；同第４，１７９，３３７号を参照のこと）。当該分野で公知のなおも他の有用なポリマーとしては、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースおよび他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにこれらのポリマーの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化されたタンパク質が、特に好ましい。水溶性ポリマーは、特定の位置、例えば、本開示に記載の融合タンパク質のアミノ末端に結合され得るか、またはそのポリペプチドの１つ以上の側鎖にランダムに付着され得る。治療能力を改善するためのＰＥＧの使用は、米国特許第６，１３３，４２６号に記載されている。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本開示に記載の融合タンパク質は、アミノ末端に配置された免疫グロブリンヒンジ領域をさらに含むＰＩＭＳ分子である。そのアミノ末端のヒンジ領域は、免疫グロブリンＣＨ３領域と結合ドメインとの間に見られるリンカーと同じであってもよいし、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、アミノ末端に配置されたリンカーが、天然に存在するモチーフまたは付加されたモチーフ（例えば、ＣＰＰＣ、配列番号３３０）を含むことにより、二量体化または多量体化された分子のアミノ末端を安定化する少なくとも１つのジスルフィド結合の形成が促進される。
【０１１２】
（融合タンパク質を作製するためおよび精製するための方法）
本開示の融合タンパク質は、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。例えば、ＳＭＩＰ融合タンパク質を作製するための方法は、米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号および同第２００５／０１３６０４９号に記載されており、ＰＩＭＳタンパク質を作製するための方法は、例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００９／０２３３８６に記載されている。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書中に記載されるような精製された融合タンパク質を提供する。用語「精製された」は、本明細書中で使用されるとき、その融合タンパク質がその天然で入手可能な状態に比べて任意の程度に精製されている、他の成分から単離可能な組成物のことを指す。ゆえに、「精製されたタンパク質」とは、それが天然に存在する環境から単離された、そのようなタンパク質のことも指す。ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書中に記載されるような実質的に精製された融合タンパク質を提供する。「実質的に精製された」とは、タンパク質がその組成物の主成分を形成している（例えば、その組成物においてそのタンパク質が少なくとも約５０重量％、例えば、少なくとも約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約９５重量％、約９９重量％を構成する）タンパク質の組成物のことを指す。
【０１１４】
タンパク質精製法は、当業者に周知である。これらの手法は、１つのレベルにおいて、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分の粗分画を含む。クロマトグラフィおよび電気泳動の手法を用いることによって部分的または完全な精製（または均一までの精製）が達成されるさらなる精製が望まれることが多い。純粋な融合タンパク質の調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィ、排除クロマトグラフィ；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；および等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィおよびＨＰＬＣである。
【０１１５】
精製の程度を定量化するための様々な方法は、本開示に鑑みて当業者に公知である。これらとしては、例えば、活性画分の比結合活性を測定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分中のタンパク質の量を評価することが挙げられる。タンパク質画分の純度を評価するための好ましい方法は、その画分の結合活性を計算し、それを最初の抽出物の結合活性と比較し、そして、「精製倍数」によって本明細書中で評価される精製の程度を計算することである。結合活性の量を表すために使用される実際の単位は、当然のことながら、精製を追跡するのに選択される特定のアッセイ手法、および発現されたタンパク質が検出可能な結合活性を示すか否かに依存する。
【０１１６】
（例示的な融合タンパク質）
本開示の例示的な一本鎖融合タンパク質としては、それぞれ配列番号８０〜８５、８８〜９３、９６および９７に示されているような、ＢＣ３  ＩｇＧ１  Ｎ２９７、ＢＣ３  ＩｇＧ１ＡＡ、ＢＣ３  ＩｇＧ２ＡＡ、ＢＣ３  ＩｇＧ４ＡＡ、ＢＣ３  ＨＭ１、ＢＣ３  ΔＣＨ２、ＯＫＴ３  ＩｇＧ１ＡＡ、ＯＫＴ３  ＩｇＧ２ＡＡ、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４ＡＡ、ＯＫＴ３  ＨＭ１、ＯＫＴ３  ΔＣＨ２、Ｈ５７  ｎｕｌｌ２および２Ｃ１１  ｎｕｌｌ２が挙げられる。本開示の例示的な好ましい一本鎖融合タンパク質としては、それぞれ配列番号２６５〜２９９に示されているような、キメラＣｒｉｓ−７  ＩｇＧ１ＡＡ、キメラＣｒｉｓ−７  ＩｇＧ２ＡＡ、キメラＣｒｉｓ−７  ＩｇＧ４ＡＡ、キメラＣｒｉｓ−７  ＨＭ１、ヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ１ＡＡ、ヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ２ＡＡ、ヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ４ＡＡおよびヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＨＭ１が挙げられる。追加の例示的な一本鎖融合タンパク質としては、それぞれ配列番号８６、８７、９４および９５に示されているような、カルボキシ末端のタグを有しない、ＢＣ３  ＨＭ１、ＢＣ３  ΔＣＨ２、ＯＫＴ３  ＨＭ１およびＯＫＴ３  ΔＣＨ２が挙げられる。さらなる例示的な融合タンパク質としては、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４７、５６、７６〜７９、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５および２５７に示されているような、アミノ末端にリーダー配列を有する、上で述べた融合タンパク質が挙げられる。アミノ末端にリーダー配列を有する追加の例示的な融合タンパク質としては、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ（配列番号３０４）およびＨ５７  ＨＭ２（配列番号３０６）が挙げられる。さらなる例示的な融合タンパク質は、配列番号３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５および３２７に示されているような、様々なリンカー配列を有するＢＣ３  ＩｇＧ１  Ｎ２９７である。これらの例示的な一本鎖融合タンパク質のうちのいくつかは、下記の実施例の項に詳細に記載される。
【０１１７】
（機能的特徴）
本明細書中に記載されるように、本開示の一本鎖融合タンパク質は、以下の特性または機能的特徴：（１）Ｔ細胞を活性化させないこと、（２）サイトカイン放出を誘導しないかまたは最小のサイトカイン放出を誘導すること、（３）ＴＣＲシグナル伝達経路内の分子のリン酸化を誘導すること、（４）対応するモノクローナル抗体よりもカルシウム流動を増加させること、（５）同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止すること、（６）抗原に対するメモリーＴ細胞の応答を阻止すること、および（７）ＴＣＲ複合体を下方調節することのうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７つ）またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。
【０１１８】
ある特定の好ましい実施形態において、本開示の一本鎖融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化させないか、またはＴ細胞を最小に活性化させる。融合タンパク質が、Ｔ細胞（例えば、ＰＨＡまたはＣｏｎＡで刺激されたＴ細胞）を処理するために使用されるとき、本開示の実施例に提供される少なくとも１つのインビトロまたはインビボアッセイにおいて無処理細胞と比べて活性化されたＴ細胞のパーセンテージを統計学的に有意に増加させない場合に、その融合タンパク質は、「Ｔ細胞を活性化させないか、または最小にもしくはわずかに活性化させる」。好ましくは、Ｔ細胞の活性化は、実施例１に記載される、刺激されたＴ細胞の活性化のインビトロアッセイにおいて測定される。
【０１１９】
さらに好ましい実施形態において、本開示の融合タンパク質は、サイトカインストームを誘導しないか、または臨床的に関連性のあるサイトカイン放出を誘導しない。融合タンパク質が、Ｔ細胞を処理するために使用されるとき、当該分野で公知であるかまたは本開示の実施例に提供される少なくとも１つのインビトロもしくはインビボアッセイにおいて処理されないときと比べて、処理された細胞から放出される、ＩＦＮγを含む少なくとも１つのサイトカイン；好ましくは、ＩＦＮγおよびＴＮＦαまたはＩＬ−６およびＴＮＦαを含む少なくとも２つのサイトカイン；好ましくは、ＩＬ−６、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを含む３つのサイトカイン；好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを含む４つのサイトカイン；および好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを含む少なくとも５つのサイトカインの量を統計学的に有意に増加させない場合に、その融合タンパク質は、「サイトカインストームを誘導しない」（「検出不可能な、わずかなまたは最小のサイトカイン放出を誘導する」または「サイトカイン放出を誘導しないかまたは最小限の検出可能なサイトカイン放出を誘導する」とも言及される）。好ましくは、そのサイトカインストームは、実施例１に記載される刺激されたＴ細胞のアッセイによって、インビトロにおけるサイトカイン放出において測定される。臨床的には、サイトカイン放出症候群は、ある特定のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγならびにＩＬ−２、ＩＬ−６およびＴＮＦα）の最大の放出を伴う、発熱、悪寒、発疹、悪心ならびに時折、呼吸困難および頻拍を特徴とする。インビトロアッセイまたはインビボにおいて放出について試験され得るサイトカインとしては、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ１、ＩＦＮγおよびＴＮＦαが挙げられ；より好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮγおよびＴＮＦαが挙げられる。
【０１２０】
さらに好ましい実施形態において、本開示の融合タンパク質は、Ｔ細胞などの細胞においてカルシウム流動の増加を引き起こす。融合タンパク質が、Ｔ細胞を処理するために使用されるとき、当該分野で公知であるかまたは本明細書中に提供されるインビトロアッセイにおいて、対応する抗体（すなわち、本開示の一本鎖融合タンパク質と同じ結合ドメインを有する抗体）で処理された細胞と比べて、処理された細胞のカルシウム流動の統計学的に有意な急増を（好ましくは、処理の３００秒以内、より好ましくは、２００秒以内、最も好ましくは、１００秒以内に）引き起こす場合、その融合タンパク質は、「カルシウムの増加」を引き起こす。好ましくは、本開示の一本鎖融合タンパク質によって引き起こされるカルシウム流動は、実施例５に記載されるインビトロカルシウム流動アッセイにおいて、対応する抗体によって引き起こされる流動と比較され、処理の少なくとも最初の１００〜３００秒以内に観察されるかまたは測定される。
【０１２１】
さらなる実施形態において、本開示の一本鎖融合タンパク質は、ＴＣＲシグナル伝達経路内の分子のリン酸化を誘導する。「ＴＣＲシグナル伝達経路」とは、ペプチド：ＭＨＣリガンドのＴＣＲおよびそのコレセプター（ＣＤ４またはＣＤ８）への結合を介して惹起されるシグナル伝達経路のことを指す。「ＴＣＲシグナル伝達経路内の分子」とは、ＴＣＲシグナル伝達経路に直接関与する分子（例えば、そのリン酸化状態（例えば、その分子がリン酸化されているか否か）、別の分子に対する結合親和性、または酵素活性が、ペプチド：ＭＨＣリガンドのＴＣＲおよびそのコレセプターへの結合からのシグナルに応答して変化される分子）のことを指す。ＴＣＲシグナル伝達経路内の例示的な分子としては、ＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＣＤ３ζ鎖）、ＺＡＰ−７０、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ホスホリパーゼｃ−γ、タンパク質キナーゼＣ、転写因子ＮＦκＢ、ホスファターゼ（ｐｈａｓｐｈａｔａｓｅ）カルシニューリン、転写因子ＮＦＡＴ、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）、Ｒａｓ、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１／２）およびＦｏｓが挙げられる。
【０１２２】
本開示の一本鎖融合タンパク質が、Ｔ細胞を処理するために使用されるとき、本開示の実施例に記載されるようなインビトロもしくはインビボアッセイまたは当該分野で公知のレセプターシグナル伝達アッセイにおいて、ＴＣＲシグナル伝達経路内の分子（例えば、ＣＤ３ζ鎖、ＺＡＰ−７０およびＥＲＫ１／２）のリン酸化を統計学的に有意に増加させる場合、本開示の一本鎖融合タンパク質は、「ＴＣＲシグナル伝達経路内の分子のリン酸化を誘導する」。当該分野で公知のほとんどのレセプターシグナル伝達アッセイからの結果は、ウエスタンブロットまたは蛍光顕微鏡観察などの免疫組織化学的方法を用いて決定される。
【０１２３】
さらなる実施形態において、本開示の一本鎖融合タンパク質は、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止し得る。「同種抗原」は、ある種において代替（対立遺伝子）の形態で存在する抗原であり、ゆえに、ある形態が、その同種抗原を有しないその種の別のメンバーに移入されると免疫応答を誘導する。例示的な同種抗原は、例えば、血液細胞上（すなわち、血液型抗原）または組織移植片（すなわち、同種移植片）上に見られ得る。
【０１２４】
本開示の一本鎖融合タンパク質が、Ｔ細胞を処理するために使用されるとき、インビトロまたはインビボアッセイ（例えば、本開示の実施例に提供される、ヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイおよび急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）モデル）において、同種抗原に応答して活性化されたＴ細胞のパーセンテージを統計学的に有意に減少させる場合、本開示の一本鎖融合タンパク質は、「同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止する」。当該分野で公知の他のアッセイ（例えば、結合アッセイ、および遅延型過敏反応を検出するマウスにおける足蹠腫脹アッセイのような皮膚試験）もまた、同種抗原に対する反応性を測定するために使用され得る。
【０１２５】
さらなる実施形態において、本開示の融合タンパク質は、抗原に対するメモリーＴ細胞の応答を阻止する。一本鎖融合タンパク質が、メモリーＴ細胞を処理するために使用されるとき、インビトロまたはインビボアッセイ（例えば、本開示の実施例に提供される、破傷風トキソイドを用いてメモリーＴ細胞の活性化を分析するアッセイ）において、特定の抗原（例えば、破傷風トキソイド）に応答して活性化されたＴ細胞のパーセンテージを統計学的に有意に減少させる場合、その一本鎖融合タンパク質は、「抗原に対するメモリーＴ細胞の応答を阻止する」。動物免疫モデルもまた、抗原提示アッセイによって、インビボとエキソビボの両方において二次的な抗原特異的Ｔ細胞応答を検出するために使用され得る。上に記載された遅延型過敏アッセイに加えて、５１Ｃｒ放出アッセイなどの細胞傷害アッセイが、Ｔ細胞活性を検出するために利用され得る（Ｌａｖｉｅら（２０００）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２（４）：４７９−４８６）。
【０１２６】
さらなる実施形態において、本開示の融合タンパク質は、Ｔ細胞の表面からのＴＣＲ複合体を下方調節する。一本鎖融合タンパク質が、Ｔ細胞を処理するために使用されるとき、インビトロまたはインビボアッセイにおいて、Ｔ細胞集団の表面上のＴＣＲ複合体の数を統計学的に有意に減少させる場合、その一本鎖融合タンパク質は、「ＴＣＲ複合体を下方調節する」。有用なインビトロまたはインビボアッセイとしては、本開示の実施例において提供される、Ｔ細胞表面からのＴＣＲおよびＣＤ３の下方調節を評価するためのアッセイが挙げられる。そのようなアッセイは、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡観察などの当該分野で公知の手法によって測定して、刺激の前後に細胞表面に発現されるＴＣＲまたはＣＤ３の量を比較する。
【０１２７】
（Ｔ細胞活性化またはサイトカイン放出を検出するための方法）
関連する態様において、本開示は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質によって誘導されるＴ細胞活性化を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）マイトジェンで刺激されたＴ細胞を準備する工程、（ｂ）工程（ａ）の刺激されたＴ細胞を、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質で処理する工程、および（ｃ）工程（ｂ）において処理された刺激されたＴ細胞の活性化を検出する工程を包含する。
【０１２８】
用語「マイトジェン」は、本明細書中で使用されるとき、様々な特異性またはクローン起源のリンパ球において有糸分裂を誘導する化学物質のことを指す。Ｔ細胞を刺激するために使用され得る例示的なマイトジェンとしては、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）および酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）が挙げられる。
【０１２９】
本明細書中に提供されるＴ細胞活性化を検出するための方法のある特定の実施形態において、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質は、本明細書中に提供される融合タンパク質である。ある特定の他の実施形態において、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質は、モノクローナル抗体である。
【０１３０】
Ｔ細胞活性化は、当該分野で公知の活性化マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ６９）の発現を測定することによって検出され得る。活性化されたＴ細胞は、ＣＦＳＥ標識アッセイおよびチミジン取り込みアッセイ（Ａｄａｍｓ（１９６９）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．５６：５５）などの細胞増殖アッセイによっても検出され得る。
【０１３１】
関連する態様において、本開示は、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質によって誘導されるサイトカイン放出を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）マイトジェンで刺激されたＴ細胞を準備する工程、（ｂ）工程（ａ）の刺激されたＴ細胞を、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質で処理する工程、および（ｃ）工程（ｂ）において処理された刺激されたＴ細胞からのサイトカインの放出を検出する工程を包含する。
【０１３２】
本明細書中に提供されるサイトカイン放出を検出するための方法のある特定の実施形態において、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質は、本明細書中に提供される融合タンパク質である。ある特定の他の実施形態において、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含むタンパク質は、モノクローナル抗体である。
【０１３３】
（ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞）
本開示は、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（単離されているかまたは精製されているかまたは純粋なポリヌクレオチド）、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングベクターおよび発現ベクターを含む）、および本開示に記載のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が企図される。例示的なポリヌクレオチドとしては、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４６、５５、３０３、３０６、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４および３２６が挙げられる。
【０１３５】
本発明は、本開示のポリヌクレオチドを含むベクター、特に、組換え発現構築物にも関する。１つの実施形態において、本開示は、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、融合タンパク質の転写、翻訳およびプロセシングを引き起こし得るかまたは促進し得る他のポリヌクレオチド配列とともに含むベクターを企図する。
【０１３６】
原核生物および真核生物の宿主とともに使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、（１９８９）に記載されている。例示的なクローニング／発現ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ファスミド、コスミド、ウイルス、人工染色体、またはその中に含められるポリヌクレオチドの増幅、移入および／もしくは発現に適した当該分野で公知の任意の核酸ビヒクルに基づき得る、クローニングベクター、シャトルベクターおよび発現構築物が挙げられる。
【０１３７】
本明細書中で使用されるとき、「ベクター」は、それに連結された別の核酸を運搬することができる核酸分子のことを意味する。例示的なベクターとしては、プラスミド、酵母人工染色体およびウイルスゲノムが挙げられる。ある特定のベクターは、宿主細胞内で自律的に複製し得、一方、他のベクターは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と本明細書中で呼ばれ、それは、発現制御配列に作動可能に連結された核酸配列を含み、ゆえにそれらの配列の発現を指示することができる。
【０１３８】
ある特定の実施形態において、発現構築物は、プラスミドベクターに由来する。例証となる構築物としては、アンピシリン耐性遺伝子をコードする核酸配列、ポリアデニル化シグナルおよびＴ７プロモーター部位を有する改変ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；ＣＨＥＦ１プロモーターを有するｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ  ＩＣＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＣＭＶプロモーターを有するｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。他の適当な哺乳動物発現ベクターが、周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと；また、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪのカタログも参照のこと）。適切な選択薬剤（例えば、メトトレキサート）の適用後の遺伝子増幅に起因する、融合タンパク質の高い産生レベルを促進するために、適当な調節管理下においてジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のコード配列を含む有用な構築物が、調製され得る。
【０１３９】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点および選択マーカー、ならびに上に記載されたような下流の構造配列の転写を指示する、高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターを含む。本開示に記載のポリヌクレオチドと作動可能に連結されたベクターは、クローニング構築物または発現構築物をもたらす。例示的なクローニング／発現構築物は、本開示のポリヌクレオチドに作動可能に連結された、少なくとも１つの発現制御因子、例えば、プロモーターを含む。追加の発現制御因子（例えば、エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネーターおよびリボソーム結合部位）もまた、本開示に記載のベクターおよびクローニング／発現構築物において企図される。本開示に記載のポリヌクレオチドの異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列とともに、適切な相において組み立てられる。したがって、例えば、本明細書中に提供されるような融合タンパク質をコードする核酸は、宿主細胞内でそのようなタンパク質を発現するための組換え発現構築物として種々の発現ベクター構築物のいずれか１つに含められ得る。
【０１４０】
適切なＤＮＡ配列は、例えば、種々の手順によってベクターに挿入され得る。通常、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挿入される。クローニング、ＤＮＡの単離、増幅および精製、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応、ならびに様々な分離手法に対する標準的な手法が企図される。いくつかの標準的な手法が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９３  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｇｌｏｖｅｒ（Ｅｄ．）（１９８５  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．），（１９８５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；およびその他に記載されている。
【０１４１】
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指示する少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、構成的プロモーターまたは制御性プロモーター）に作動可能に連結される。そのような発現制御配列の代表的な例としては、上に記載されたような真核細胞またはそれらのウイルスのプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを含む他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択され得る。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲならびにマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当該分野における通常のスキルレベルの範囲内に十分入り、本開示に記載のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターまたは制御性プロモーターを含むある特定の特に好ましい組換え発現構築物の調製が、本明細書中に記載される。
【０１４２】
本開示のポリヌクレオチドの改変体もまた、企図される。改変体ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるような規定される配列のポリヌクレオチドの１つと少なくとも９０％、好ましくは、９５％、９９％または９９．９％同一であるか、または約６５〜６８℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムもしくは約４２℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、規定される配列のポリヌクレオチドのうちの１つにハイブリダイズする。そのポリヌクレオチド改変体は、本明細書中に記載される機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコードする能力を保持する。
【０１４３】
用語「ストリンジェント」は、当該分野においてストリンジェントと通常理解されている条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に対するストリンジェントな条件の例は、約６５〜６８℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは約４２℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９を参照のこと）。
【０１４４】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、ホルムアミドまたは別の変性剤のより高い濃度）もまた使用され得る；しかしながら、ハイブリダイゼーションの速度が影響され得る。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、あまりストリンジェントではない条件（例えば、より低い温度、より高いイオン強度、ホルムアミドまたは別の変性剤のより低い濃度）が、使用され得る。ハイブリダイゼーション（ｈｙｄｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）および洗浄に対する例示的なあまりストリンジェントではない条件は、約４２℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書中に記載される機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコードする能力を保持する。
【０１４６】
本開示のさらなる態様は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物のいずれかで形質転換されたかもしくはトランスフェクトされた宿主細胞、またはそうでなければ本開示のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物のいずれかを含む宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現構築物は、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入を含む当該分野で公知の任意の方法を用いて、適当な細胞に導入される。宿主細胞には、例えば、エキソビボ遺伝子治療をはじめとした、エキソビボ細胞治療を受けている被験体の細胞が含まれる。本開示のある態様として企図される真核生物宿主細胞としては、それが本開示に記載のポリヌクレオチド、ベクターまたはタンパク質を内部に有するとき、被験体自身の細胞（例えば、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（発現される多価結合分子のグリコシル化パターンを改変することができる改変ＣＨＯ細胞が挙げられる。米国特許出願公開番号２００３／０１１５６１４を参照のこと）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、ならびに本開示に記載のタンパク質またはペプチドを発現する際および必要に応じて単離する際に有用であると当該分野で公知の他の任意の真核細胞が挙げられる。大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ、または本開示に記載のタンパク質もしくはペプチドを発現するため、および必要に応じて単離するために適していると当該分野で公知の任意の原核細胞を含む原核細胞もまた企図される。原核細胞からタンパク質またはペプチドを単離する際、特に、封入体からタンパク質を抽出するために当該分野で公知の手法が使用され得ると企図される。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内である。本開示の融合タンパク質をグリコシル化する宿主細胞が、企図される。
【０１４７】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、組換え発現ベクターを含む細胞のことを指す。そのような用語は、特定の対象細胞のことだけでなく、そのような細胞の子孫のことも指すと意図されると理解されるべきである。変異または環境の影響に起因して、ある特定の改変が後の世代に生じ得るので、そのような子孫は、実際は親細胞と同一でない場合があるが、本明細書中で使用されるとき、なおも用語「宿主細胞」の範囲内に含められる。
【０１４８】
組換え宿主細胞は、プロモーターを活性化させるため、形質転換体を選択するため、または特定の遺伝子を増幅するために適切なように改変された従来の栄養培地中で培養され得る。発現のために選択される特定の宿主細胞に対する培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、当業者に容易に明らかになる。様々な哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために使用され得る。哺乳動物の発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５に記載されているサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、ならびに適合するベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよび必要に応じてエンハンサー、ならびに例えば、多価結合タンパク質発現構築物の調製に関して本明細書中に記載されるような任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’−フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０のスプライシングに由来するＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために使用され得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）をはじめとした、当業者によく知られた種々の方法によって行われ得る。
【０１４９】
１つの実施形態において、宿主細胞は、本開示に記載のタンパク質またはポリペプチドの発現を指示する組換えウイルス構築物によって形質導入される。その形質導入された宿主細胞は、ウイルスの出芽中にウイルス粒子によって組み込まれる宿主細胞膜の一部に由来する、発現されたタンパク質またはポリペプチドを含むウイルス粒子を産生する。
【０１５０】
（組成物および使用方法）
ＴＣＲ複合体またはその構成要素に対する融合タンパク質に加えて、本開示は、その融合タンパク質を含む薬学的組成物および単位用量形態、ならびにその融合タンパク質、薬学的組成物および単位用量形態を使用するための方法も提供する。
【０１５１】
ＴＣＲシグナル伝達に関連する疾患状態または状況に罹患しているヒトまたは非ヒト哺乳動物を処置するために、１回以上の投与の経過後にその疾患状態または状況の症状を回復させるのに有効な量で、融合タンパク質がその被験体に投与される。本開示のタンパク質は、ポリペプチドであるので、下記でより十分に検討されるような安定剤または他の薬学的に許容可能な賦形剤を必要に応じて含む薬学的に許容可能な希釈剤に懸濁され得るか、または溶解され得、それは、注射または注入による静脈内投与に使用され得る。
【０１５２】
薬学的に有効な量または用量は、ある疾患状態または状況を予防するため、それの発生を阻害するため、またはそれらを処置するために（症状をある程度軽減するため、好ましくは、すべての症状を軽減するために）必要な量または用量である。好ましい実施形態において、薬学的に有効な量の本開示の一本鎖融合タンパク質が、Ｔ細胞媒介性疾患を処置するために使用される。薬学的に有効な用量は、疾患のタイプ、使用される組成物、投与経路、処置される被験体のタイプ、処置について考慮される特定の被験体の身体的特性、併用される医薬および医学分野の当業者が認識する他の因子に左右される。例えば、本開示の融合タンパク質の力価に応じて、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量（毎日、毎週、毎月または任意の適切な間隔で１回用量として投与され得る量）の活性成分が、投与され得る。
【０１５３】
上に記載され、実施例で例証されるように、本明細書中に提供されるＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＣＤ３）に対する融合タンパク質は、Ｔ細胞の分裂促進性（mitogenicity）を誘導せずにＴＣＲシグナル伝達経路に独自に関与する。以前の研究から、末梢Ｔ細胞の機能および分化が、ＴＣＲ関連シグナル伝達カスケードの操作によって駆動され得ることが証明されている。例えば、Ｔ細胞アネルギーと適応性の制御性Ｔ細胞との両方が、強力な非活性化シグナルによって誘導され得る。さらに、ある特定のサブセットのＴ細胞は、強力なＴＣＲシグナルの送達の際に、より細胞死を起こしやすいことがある。したがって、本明細書中に提供される融合タンパク質は、Ｔ細胞の機能および運命を調節するために使用され得、それにより、Ｔ細胞が重要な寄与物である自己免疫疾患または炎症性疾患を含むＴ細胞媒介性疾患の治療的な処置がもたらされ得る。さらに、本開示の融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化させず、そして／またはサイトカイン放出を誘導しないので、本融合タンパク質は、サイトカイン放出症候群および急性毒性などの副作用を有しないかまたはその副作用が少ないということについて、ＴＣＲ複合体に対する他の分子（例えば、抗ＣＤ３抗体）よりも有益である。
【０１５４】
本融合タンパク質ならびにその組成物および単位用量形態によって処置され得る例示的な自己免疫障害または炎症性障害（ＡＩＩＤ）としては、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、真性糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）、皮膚筋炎、多発性筋炎、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性肝炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、神経精神ループス、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、喘息、乾癬性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られる）、自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、血管炎、セリアック病（ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性閉塞性肺疾患、子宮内膜症、化膿性汗腺炎、間質性膀胱炎、限局性強皮症、強皮症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、白斑および自己免疫性内耳疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
ある特定の実施形態において、本明細書中に提供される融合タンパク質ならびに組成物および単位用量形態は、サイトカイン放出に関連する副作用を有しないかまたは副作用が最小であるかもしくは少ない免疫抑制剤として使用され得る。例えば、本明細書中に提供される一本鎖融合タンパク質ならびに組成物および単位用量形態は、急性拒絶、臓器移植後臓器機能障害（delayedgraft function）および固形臓器移植（例えば、腎臓、肝臓、肺、心臓移植）の移植片損失の誘導と、その予防（すなわち、そのリスクの低下）の両方または減少において使用され得る。さらに、ある特定の実施形態において、本開示の一本鎖融合タンパク質は、Ｔ細胞活性化を誘導せずに、免疫抑制性かつＴ細胞分裂促進的であると知られているＴＣＲ複合体に対する他の分子よりも有効な免疫抑制剤であり得る。さらなる実施形態において、本明細書中に提供される融合タンパク質ならびに組成物および単位用量形態は、他のＴ細胞媒介性疾患（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）ならびに自己免疫性障害および炎症性障害（ＡＩＩＤ））を処置するために使用され得る。
【０１５６】
別の態様において、融合タンパク質の組成物が、本開示において提供される。本開示の薬学的組成物は、通常、本明細書中に提供される融合タンパク質を、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む。そのようなキャリアは、使用される投薬量および濃度においてレシピエントにとって無毒性である。治療上使用するための薬学的に許容可能なキャリアは、薬学分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．）１９８５）に記載されている。例えば、生理学的ｐＨの滅菌された食塩水およびリン酸緩衝食塩水が、使用され得る。保存剤、安定剤、色素などが、その薬学的組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸またはｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが、保存剤として加えられ得る。同文献の１４４９。さらに、酸化防止剤および懸濁化剤が使用され得る。同文献。本発明の化合物は、遊離塩基または塩の形態で使用され得、その両方の形態が、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１５７】
薬学的組成物は、緩衝液などの希釈剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、デキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤も含み得る。中性緩衝食塩水または非特異的な血清アルブミンと混合された食塩水が、例示的な希釈剤である。好ましくは、本生成物は、適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として使用する凍結乾燥物として処方される。
【０１５８】
第２の薬剤と組み合わされる本開示の融合タンパク質組成物の投与もまた企図される。第２の薬剤は、特定の疾患状態または障害（例えば、移植、炎症および自己免疫におけるもの）に対する標準的な処置として当該分野において認められている薬剤であり得る。企図される例示的な第２の薬剤としては、ステロイド、ＮＳＡＩＤｓ、ｍＴＯＲインヒビター（例えば、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス、デフォロリムス（ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）、エベロリムス、ゾタロリムス、クルクミン、ファルネシルチオサリチル酸）、カルシニューリンインヒビター（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、抗代謝産物（例えば、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル）、ポリクローナル抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン）、モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ、バシリキシマブ）もしくは他の活性な薬剤および補助的な薬剤またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１５９】
「薬学的に許容可能な塩」とは、薬学的に許容可能であり、親化合物の所望の薬理学的活性を有する、本開示の融合タンパク質、ＳＭＩＰまたは抗体の塩のことを指す。そのような塩としては、以下：（１）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）；または有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、ラウリル硫酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３級ブチル酢酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸など）で形成された酸付加塩；または（２）親化合物に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオンによって置き換えられるとき；または有機塩基（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミンなど）と配位結合するときに形成される塩が挙げられる。
【０１６０】
例証となる特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、例えば、ボーラス注射または注入によって静脈内に投与される。投与経路としては、静脈内に加えて、経口、局所的、非経口（例えば、舌下または頬側）、舌下、直腸、膣および鼻腔内が挙げられる。非経口という用語は、本明細書中で使用されるとき、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、空洞内、鞘内、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、尿道内の注射または注入手法を含む。本薬学的組成物は、その組成物が患者に投与された際にそれに含まれる活性成分を生物が利用できるように処方される。患者に投与される組成物は、１つ以上の投薬単位の形態を取り得、ここで、例えば、錠剤が、１つの投薬単位であってもよいし、エアロゾル形態の本開示の１つ以上の化合物が入った容器が、複数の投薬単位を保持してもよい。
【０１６１】
経口投与の場合、賦形剤および／または結合剤（例えば、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストラン、シクロデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースおよびエチルセルロース）が、存在し得る。甘味剤、保存剤、色素／着色料、矯味矯臭向上剤またはそれらの任意の組み合わせが、必要に応じて存在し得る。コーティングシェルもまた、必要に応じて使用され得る。
【０１６２】
注射による投与が意図された組成物において、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、等張剤またはそれらの任意の組み合わせの１つ以上が、必要に応じて含められ得る。
【０１６３】
核酸ベースの処方物または本開示に記載の発現産物を含む処方物の場合、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重が、例えば、皮内、皮下、筋肉内もしくは静脈内の経路または所与の一連の状況下で適する当該分野で公知の任意の経路によって、投与される。好ましい投薬量は、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、約５μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇが特に好ましい。投与の回数および頻度が宿主の応答に依存することは、当業者に明らかである。
【０１６４】
本開示の薬学的組成物は、患者への投与を可能にする任意の形態（例えば、固体、液体または気体（エアロゾル）の形態など）で存在し得る。本組成物は、液体、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、溶液、エマルジョンまたは懸濁物の形態で存在し得る。その液体は、２つの例として、経口投与用または注射による送達用であり得る。
【０１６５】
液体の薬学的組成物は、本明細書中で使用されるとき、溶液、懸濁物または他の類似の形態に関わらず、以下の成分：滅菌された希釈剤、例えば、注射用水、食塩水溶液、好ましくは、生理食塩水、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム、固定油、例えば、溶媒または懸濁媒体として働き得る合成モノまたはジグリセリド（ｄｉｇｙｌｃｅｒｉｄｅｓ）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）、および張度調整用の薬剤（例えば、ナトリウム、塩化物またはデキストロース）のうちの１つ以上を含み得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器または複数回用量バイアルに封入され得る。生理食塩水が、好ましい添加物である。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは、滅菌されたものである。
【０１６６】
上記調製物中に他の成分（例えば、アルミニウム塩、油中水エマルジョン、生分解性オイルビヒクル、水中油エマルジョン、生分解性マイクロカプセルおよびリポソームを含む送達ビヒクル）を含めることも望ましい場合がある。そのようなビヒクルにおいて使用するためのアジュバントの例としては、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−インターフェロンおよびＩＬ−１５が挙げられる。
【０１６７】
当業者に公知の任意の適当なキャリアが、本開示の薬学的組成物中で使用され得るが、キャリアのタイプは、投与様式および徐放が望まれるか否かに応じて変化する。非経口投与の場合、そのキャリアは、水、食塩水、アルコール、脂肪、ろう、緩衝剤またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。経口投与の場合、上記のキャリアまたは固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの任意の組み合わせ）のいずれかが使用され得る。
【０１６８】
本開示は、本開示の薬学的組成物を含む投薬単位を企図する。そのような投薬単位としては、例えば、１回用量または複数回用量のバイアルまたは注射器（２区画（一方は、凍結乾燥された形態の本開示の薬学的組成物を含み、他方は、再構成用の希釈剤を含む）のバイアルまたは注射器を含む）が挙げられる。複数回用量の投薬単位は、例えば、静脈内注入デバイスに接続するためのバッグまたはチューブでもあり得る。
【０１６９】
本開示は、単位用量または複数回用量の本開示の薬学的組成物、容器（例えば、バイアル）、およびその組成物を上に記載された障害などの障害に罹患している患者に投与するための一連の指示書を含むキットも企図する。
【実施例】
【０１７０】
（実施例）
（モノクローナル抗体および例示的な一本鎖融合タンパク質）
例示的なモノクローナル抗体（それ由来の結合ドメインおよびその改変体が例示的な一本鎖融合タンパク質を作製するために使用された）および一本鎖融合タンパク質が、簡潔に本明細書中に記載される。
【０１７１】
Ｃｒｉｓ−７（Ｃｒｉｓ−７ｍＡｂまたはＣｒｉｓ−７  ＦＬとも呼ばれる）は、マウス抗ヒトＣＤ３εＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．ら（ｅｄｓ．），Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８６））。Ｃｒｉｓ−７ｍＡｂは、ヒト、ヒヒ、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）およびアカゲザルのＴ細胞に結合することが示された（データ示さず）。本明細書中に記載されるＣｒｉｓ−７一本鎖融合タンパク質の各々もまた、この異種間の反応性を有すると示された（データ示さず）。
【０１７２】
キメラおよびヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（配列番号２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５）は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって：キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、２９７位にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む。
【０１７３】
キメラおよびヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ１−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ（配列番号２６６、２７１、２７６、２８１、２８６、２９１、２９６）は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって：キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７位に４つのアラニン置換ならびにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域（すなわち、ＬＬＧＧ（２３４−２３７）ＡＡＡ）、ならびにヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む。
【０１７４】
キメラおよびヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ（配列番号２６７、２７２、２７７、２８２、２８７、２９２、２９７）は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって：キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｖ２３４、Ｇ２３６およびＮ２９７位に３つのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２のＣＨ２領域、ならびにヒトＩｇＧ２のＣＨ３領域を含む。
【０１７５】
キメラおよびヒト化Ｃｒｉｓ７  ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ（配列番号２６８、２７３、２７８、２８３、２８８、２９３、２９８）は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって：キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７位に４つのアラニン置換ならびにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ４のＣＨ２領域（すなわち、ＦＬＧＧ（２３４−２３７）ＡＡＡ）、ならびにヒトＩｇＧ４のＣＨ３領域を含む。
【０１７６】
キメラおよびヒト化Ｃｒｉｓ−７  ＨＭ１（配列番号２６９、２７４、２７９、２８４、２８９、２９４、２９９）は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって：キメラまたはヒト化Ｃｒｉｓ−７重鎖可変領域、タンデムに連結された少なくとも３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、Ｃｒｉｓ−７軽鎖可変領域、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＭ由来のＣＨ３領域およびヒトＩｇＧ１由来のＣＨ３領域、ならびに３コピーのＦＬＡＧエピトープ、１コピーのＡＶＩタグおよび６つのヒスチジンを含むテイル配列を含む。
【０１７７】
ＢＣ３（ＢＣ３ｍＡｂまたはＢＣ３  ＦＬとも呼ばれる）は、分裂促進的でない（non-mitogenic）マウス抗ヒトＣＤ３εＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂである（Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１６９１−１７００，１９９０）。
【０１７８】
ＢＣ３−ＨＭ１（「ＢＣ３  ＨＭ１」とも呼ばれる）（配列番号８４）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＢＣ３重鎖可変領域、タンデムに連結された少なくとも３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＢＣ３軽鎖可変領域、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＭ由来のＣＨ３領域およびヒトＩｇＧ１由来のＣＨ３領域、ならびに３コピーのＦＬＡＧエピトープ、１コピーのＡＶＩタグおよび６つのヒスチジンを含むテイル配列を含む。
【０１７９】
ＢＣ３−ΔＣＨ２（「ＢＣ３  ΔＣＨ２」とも呼ばれる）（配列番号８５）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＢＣ３重鎖可変領域、タンデムに連結された少なくとも３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＢＣ３軽鎖可変領域、野生型ＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域ならびに３コピーのＦＬＡＧエピトープ、１コピーのＡＶＩタグおよび６つのヒスチジンを含むテイル配列を含む。
【０１８０】
ＢＣ３−Ｇ１  Ｎ２９７Ａ（「ＢＣ３  Ｎ２９７Ａ」とも呼ばれる）（配列番号８０）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＢＣ３重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＢＣ３軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、２９７位のアスパラギンにおいてアラニン置換を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む。
【０１８１】
ＢＣ３−Ｇ１  ＡＡ  Ｎ２９７Ａ（「ＢＣ３  ＩｇＧ１ＡＡ」とも呼ばれる）（配列番号８１）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＢＣ３重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＢＣ３軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｌ２３４、Ｌ２３５、２３７およびＮ２９７位に４つのアラニン置換ならびにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域（すなわち、ＬＬＧＧ（２３４−２３７）ＡＡＡ）、ならびにヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む。
【０１８２】
ＢＣ３−Ｇ２  ＡＡ  Ｎ２９７Ａ（「ＢＣ３  ＩｇＧ２ＡＡ」とも呼ばれる）（配列番号８２）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＢＣ３重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＢＣ３軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｖ２３４、Ｇ２３６およびＮ２９７位に３つのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２のＣＨ２領域、ならびにヒトＩｇＧ２のＣＨ３領域を含む。
【０１８３】
ＢＣ３−Ｇ４  ＡＡ  Ｎ２９７Ａ（「ＢＣ３  ＩｇＧ４ＡＡ」とも呼ばれる）（配列番号８３）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＢＣ３重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＢＣ３軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７位に４つのアラニン置換ならびにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ４のＣＨ２領域（すなわち、ＦＬＧＧ（２３４−２３７）ＡＡＡ）、ならびにヒトＩｇＧ４のＣＨ３領域を含む。
【０１８４】
ＯＫＴ３（ＯＫＴ３ｍＡｂまたはＯＫＴ３  ＦＬとも呼ばれる）は、分裂促進的なマウス抗ヒトＣＤ３εＩｇＧ２ａ  ｍＡｂである（Ｏｒｔｈｏ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｃｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：３３７，１９８５）。
【０１８５】
ＯＫＴ３−ＨＭ１（「ＯＫＴ３  ＨＭ１」とも呼ばれる）（配列番号９２）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＯＫＴ３重鎖可変領域、タンデムに連結された少なくとも３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＯＫＴ３軽鎖可変領域、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＭ由来のＣＨ３領域およびヒトＩｇＧ１由来のＣＨ３領域、ならびに３コピーのＦＬＡＧエピトープ、１コピーのＡＶＩタグおよび６つのヒスチジンを含むテイル配列を含む。
【０１８６】
ＯＫＴ３−ΔＣＨ２（「ＯＫＴ  ΔＣＨ２」とも呼ばれる）（配列番号９３）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＯＫＴ３重鎖可変領域、タンデムに連結された少なくとも３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＯＫＴ３軽鎖可変領域、野生型ＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域、ならびに３コピーのＦＬＡＧエピトープ、１コピーのＡＶＩタグおよび６つのヒスチジンを含む追加のテイル配列を含む。
【０１８７】
ＯＫＴ３−Ｇ１  Ｎ２９７Ａ（「ＯＫＴ  Ｎ２９７Ａ」とも呼ばれる）（配列番号８８）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＯＫＴ３重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＯＫＴ３軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、２９７位にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む。
【０１８８】
ＯＫＴ３−Ｇ１  ＡＡ  Ｎ２９７Ａ（「ＯＫＴ３  ＩｇＧ１ＡＡ」とも呼ばれる）（配列番号８９）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ヒト２Ｈ７リーダー配列に由来するリーダー配列、ＯＫＴ３重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＯＫＴ３軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７位に４つのアラニン置換ならびにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域（すなわち、ＬＬＧＧ（２３４−２３７）ＡＡＡ）、ならびにヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む。
【０１８９】
ＯＫＴ３−Ｇ２  ＡＡ  Ｎ２９７Ａ（「ＯＫＴ３  ＩｇＧ２ＡＡ」とも呼ばれる）（配列番号９０）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＯＫＴ３重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＯＫＴ３軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｖ２３４、Ｇ２３６およびＮ２９７位に３つのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２のＣＨ２領域、ならびにヒトＩｇＧ２のＣＨ３領域を含む。
【０１９０】
ＯＫＴ３−Ｇ４  ＡＡ  Ｎ２９７Ａ（「ＯＫＴ３  ＩｇＧ４ＡＡ」とも呼ばれる）（配列番号９１）は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：ＯＫＴ３重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、ＯＫＴ３軽鎖可変領域、変異ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＳＣＣ−Ｐ）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７位に４つのアラニン置換ならびにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ４のＣＨ２領域（すなわち、ＦＬＧＧ（２３４−２３７）ＡＡＡ）、ならびにヒトＩｇＧ４のＣＨ３領域を含む。
【０１９１】
ＯＫＴ３  ＩｇＧ４−Ｎ２９７Ａ（すなわち、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＷＴ−Ｎ２９７ＡまたはＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＦＬＧＧ−Ｎ２９７Ａとしても知られる、Ｎ２９７Ａ置換だけを有するヒトＩｇＧ４のＣＨ２領域；配列番号２３２（この配列は、成熟融合タンパク質の一部ではない２２アミノ酸のリーダー配列を含む））もまた、作製され、試験された。また、Ｎ２９７Ａ置換とともに、４つの位置（Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６およびＧ２３７）の各々における単一のアラニン置換変異が作製された（すなわち、それぞれ配列番号２３４、２３６、２３８および２４０に対応する、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＡＬＧＧ−Ｎ２９７Ａ、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＦＡＧＧ−Ｎ２９７Ａ、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＦＬＡＧ−Ｎ２９７ＡおよびＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＦＬＧＡ−Ｎ２９７Ａ（これらは、成熟融合タンパク質の一部ではない２２アミノ酸のリーダー配列も含む））。
【０１９２】
ＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａ（ＯＫＴ３  ＡＡ−ＦＬまたはＯＫＴ３  ＦＬとも呼ばれる）は、２３４および２３５位にアラニン置換を含む、ヒト化Ｆｃ変異抗ＣＤ３ｍＡｂである（Ｈｅｒｏｌｄら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１（３）：４０９−１８）。
【０１９３】
ビジリズマブ（「Ｎｕｖｉｏｎ  ＦＬ」とも呼ばれる）は、ＴＣＲのＣＤ３ε鎖に対するヒト化Ｆｃ変異抗ＣＤ３ｍＡｂである。ビジリズマブは、ヒトＩｇＧ２アイソタイプであり、２３４および２３７位に変異を含む（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ９９：２７１２−９，２００２）。
【０１９４】
Ｈ５７−４５７ｍＡｂは、ハムスター抗ＴＣＲモノクローナル抗体である。Ｈ５７−４５７ｍＡｂは、分裂促進的であり、ＯＫＴ３モノクローナル抗体と同じように機能する（Ｌａｖａｓａｎｉら（２００７）Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６５：３９）。Ｈ５７−４５７ｍＡｂのＶＨおよびＶＬ領域の配列は、配列番号４９および５１に示されている。
【０１９５】
Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ（配列番号３０４）は、Ｈ５７結合ドメインを有し、Ｎ２９７Ａ置換に加えて、ＡＤＣＣ活性の喪失を引き起こす変異をＣＨ２に有する、マウスＩｇＧ２ａ一本鎖融合タンパク質である。Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌは、そのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって：Ｈ５７重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、Ｈ５７軽鎖可変領域、野生型マウスＩＧＨＧ２ｃヒンジ領域、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７位に４つのアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃのＣＨ２領域、ならびにマウスＩＧＨＧ２ｃのＣＨ３領域を含む。
【０１９６】
Ｈ５７  ＨＭ２（配列番号３０６）は、そのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって：Ｈ５７重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、Ｈ５７軽鎖可変領域、野生型マウスＩＧＨＧ２ｃヒンジ領域、マウスＣＨ３μ領域およびマウスＣＨ３γ領域を含むマウス一本鎖融合タンパク質である。
【０１９７】
Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２（配列番号９６）は、Ｈ５７結合ドメインを有し、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の喪失を引き起こす変異をＣＨ２に有する、マウスＩｇＧ２ａ一本鎖融合タンパク質である。Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：Ｈ５７重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、Ｈ５７軽鎖可変領域、野生型マウスＩＧＨＧ２ｃヒンジ領域、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２位に６つのアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃのＣＨ２領域、ならびにマウスＩＧＨＧ２ｃのＣＨ３領域を含む。
【０１９８】
１４５−２Ｃ１１ｍＡｂ（２Ｃ１１ｍＡｂとも呼ばれる）は、マウスＴＣＲ複合体のＣＤ３ε鎖に対するハムスターモノクローナル抗体である（Ｈｉｒｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３７６６，１９８８）。また、１４５−２Ｃ１１ｍＡｂは、分裂促進的であり、ＯＫＴ３モノクローナル抗体と同じように機能する。１４５−２Ｃ１１ｍＡｂのＶＨおよびＶＬ領域の配列は、配列番号５８および６０に示されている。
【０１９９】
２Ｃ１１  Ｎｕｌｌ２（配列番号５６）は、２Ｃ１１結合ドメインを有し、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の喪失を引き起こす変異をＣＨ２に有する、マウスＩｇＧ２ａ一本鎖融合タンパク質である。２Ｃ１１  Ｎｕｌｌ２は、そのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって：２Ｃ１１重鎖可変領域、タンデムに連結された３つの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒを含むリンカー、２Ｃ１１軽鎖可変領域、野生型マウスＩＧＨＧ２ｃヒンジ領域、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２位に６つのアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃのＣＨ２領域、ならびにマウスＩＧＨＧ２ｃのＣＨ３領域を含む。
【０２００】
（実施例１）
（融合タンパク質は、刺激されたＴ細胞を活性化しないか、または刺激されたＴ細胞もしくはアクセサリー細胞によるサイトカイン放出を誘導しない）
（ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離）
新鮮なヒト全血を、ヘパリンを含む３０ｍＬ注射器内に入手し（注射器１本あたり最大２５ｍＬの血液）、室温に最大２時間置いた後、処理した。その血液を、５０ｍＬコニカルチューブにおいて、等容積の室温のＲＰＭＩ−１６４０（補充物を含まない）で希釈した。希釈された血液を２〜３回静かに逆位にして混合した。２５ｍＬピペットを用いて、２０〜２５ｍＬの希釈された血液を、５０ｍＬコニカルチューブに入った１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）の上に慎重に層として重ねた。そのチューブを室温において３０分間、４００ｇで遠心分離した。密度勾配の中間面から細胞を収集し、５０ｍＬコニカルチューブ内で併せた（チューブ１本あたり３０ｍＬを超えない細胞懸濁物）。その細胞懸濁物が入ったチューブを、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＰＭＩ−１６４０）で満たした。そのチューブを室温において５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を吸引した。細胞を２０ｍＬのＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＰＭＩに再懸濁し、室温において５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を吸引することによって、２回洗浄した。洗浄した細胞を血球計算板によって計数し、使用したアッセイプロトコルに従って再懸濁した。
【０２０１】
（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）によるヒトＰＢＭＣの標識）
マウス脾細胞の密度を滅菌ＰＢＳ中において１×１０６／ｍＬに調整した。その細胞を、チューブ１本あたり２５ｍＬ（２５×１０６細胞）を超えないように５０ｍＬコニカルチューブに分配した。その細胞を、使用するために条件を最適化した後のＣＥＬＬＴＲＡＣＥＴＭ  ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＣＦＳＥで標識した。１８μＬの高品質ＤＭＳＯ（キットのＣｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｂ）を、５０μｇの凍結乾燥ＣＦＳＥ（キットのＣｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａ）が入ったバイアルに加えることによって、組織培養グレードのＤＭＳＯ中のＣＦＳＥの５ｍＭ溶液を使用直前に調製した。そのＣＦＳＥ溶液を、５０ｎＭ  ＣＦＳＥという最終濃度となるようにＰＢＭＣ細胞懸濁物に加え、次いで、その細胞懸濁物を５％ＣＯ２中、３７℃において１５分間インキュベートした。そのチューブをＲＰＭＩ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）で満たすことによって、細胞標識反応をクエンチした（quench）。その細胞を室温において７分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を各チューブから吸引し、細胞をＲＰＭＩ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅに再懸濁した。細胞を計数し、アッセイにおいて使用するための所望の密度になるようにＲＰＭＩ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で調整した。
【０２０２】
（ＰＨＡで刺激されたＴ細胞を用いた分裂促進性およびサイトカイン放出の分析）
ヒトＰＢＭＣを２×１０６細胞／ｍＬの濃度でコンプリートＲＰＭＩ培地（１０％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）に懸濁し、３７℃において３日間、２．５μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）で刺激した。インキュベート後、細胞をコンプリートＲＰＭＩで２回洗浄し、新しいフラスコにおいて約２×１０６細胞／ｍＬの濃度で、刺激なしで再度プレーティングした。次いで、細胞をさらに４日間３７℃に置くことにより、２回目の刺激への曝露前にＴ細胞を静置させた。この４日間の静置期間の終わりに、細胞を集め、ＰＢＳで洗浄し、前に記載したようにＣＦＳＥで標識した。標識した後、細胞を、コンプリート（ヒト血清）ＲＰＭＩ（１０％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）中に２×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。この時点で、新たにＰＢＭＣを同じドナーから単離し、再刺激のためのアクセサリー細胞として使用した。アクセサリー細胞を調製するために、ＥａｓｙＳｅｐ技術（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ♯１８０５１）を用いて、Ｔ細胞をＰＢＭＣ集団から磁気的に分離した。製造者のプロトコルに従って、磁性ナノ粒子を、デキストランおよびＣＤ３に対する抗体のカクテルとともに、新たに単離されたＰＢＭＣとインキュベートした。次いで、その細胞とビーズとの混合物を、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ磁石を含む１本目のチューブ中で５分間放置し、次いで、その細胞懸濁物を２本目の５ｍＬのＦＡＣＳチューブに注ぎ込んだ。ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）は、１本目のチューブに保持されるが、アクセサリー細胞は、２本目のチューブに移動した。ネガティブ選択されたアクセサリー細胞をマイトマイシンＣ（ＭＭＣ、以下に記載されるようなもの）で処理することにより、増殖を阻害した。ＣＦＳＥで標識されたＰＨＡ芽細胞とＭＭＣで処理されたアクセサリー細胞の両方を、コンプリート（ヒトＡＢ血清）ＲＰＭＩに２×１０６細胞／ｍＬで懸濁した。各細胞集団を、記載の処理物とともに４８ウェル組織培養プレートに加えた（０．５ｍＬ／ウェル）。細胞を３７℃においてさらに４日間インキュベートし、刺激の２４時間後に５０μＬの上清を集めた。再刺激後の４日目に、細胞および残りの上清を集めた。集めた細胞を、ＣＤ５（３４０６９７，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５（５５７７４１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および７ＡＡＤ（５５９９２５，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光タグ化抗体で染色し、フローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）に通した。ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリーソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて、データを分析した。ゲーティングストラテジーは、以下のとおりだった：前方散乱（ＦＳＣ）：側方散乱（ＳＳＣ）リンパ球ゲート内に入った細胞を７ＡＡＤ発現について分析した。次いで、７ＡＡＤネガティブゲートに入った細胞をＣＤ５発現について分析し、次いで、ＣＤ５＋ゲート内の細胞をＣＦＳＥ希釈およびＣＤ２５上方調節（ｕｐｒｅｇｕａｔｉｏｎ）について分析した。ＣＤ５＋、ＣＦＳＥ低かつＣＤ２５高である細胞を活性化されたＴ細胞とみなした。上清サンプルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のカスタム１１−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘベース検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ｓｅｒｉｅｓ）を製造者のプロトコル（ｐｒｏｃｏｔｏｌ）に従って使用してサイトカインおよびケモカインの存在について分析した。このキットによって検出された１１種の分析物は：ＩＬ−β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＭＣＰ１、ＩＦＮγおよびＴＮＦαだった。
【０２０３】
図１は、ＯＫＴ３  ＩｇＧ２ＡＡ、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４ＡＡおよびＯＫＴ３  ＨＭ１融合タンパク質が、公知の抗体ビジリズマブおよびＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａと比べて、ＰＨＡで刺激されたＴ細胞を活性化させなかったことを示している。ＢＣ３結合ドメインを含む分子を用いたときに同様のデータが生成された。
【０２０４】
表１は、ＯＫＴ３  ＩｇＧ２ＡＡ、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４ＡＡおよびＯＫＴ３  ＨＭ１融合タンパク質が、公知の抗体ビジリズマブおよびＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａとは対照的に、刺激されたＴ細胞またはアクセサリー細胞によるサイトカイン放出を誘導しなかったことを示している。
【０２０５】
【表１】
2014227419.tif 000003
（実施例２）
（融合タンパク質は、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止する）
（ヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ））
２人のドナーからヒトＰＢＭＣを前に記載したように単離し、別々に維持した。以前の研究に基づいて、１人のドナー由来のＰＢＭＣを刺激物集団に選出し、第２のドナーのＰＢＭＣを応答物集団として使用した。両方のドナー由来の細胞を前に記載したようにＣＦＳＥで標識した。刺激物として使用するドナー由来のＰＢＭＣを、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で処理することにより、細胞分裂を防いだ。ＭＭＣ（Ｓｉｇｍａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でコンプリート（ＨＳ）ＲＰＭＩ培地（１０％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁した。ＰＢＭＣを約１×１０６／ｍＬの濃度で再懸濁し、ＭＭＣを２５μｇ／ｍＬの最終濃度になるように加えた。次いで、その細胞とＭＭＣとの混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞をコンプリート（ＨＳ）ＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。調製された刺激物細胞および応答物細胞を、コンプリート（ヒトＡＢ血清）ＲＰＭＩ（１０％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）に約２×１０６／ｍＬの濃度で懸濁し、４８ウェルプレートの１ウェルあたり０．２５ｍＬの各細胞集団を加えた。すべての処理物を細胞と同時にプレートに加え（図２、３および１７に示される濃度で；与えられる濃度は、抗体に対する濃度であり、相当するモル濃度が、図１７に示されるような融合タンパク質に対して使用されたことに注意されたい）、次いで、サンプルをこの実験の時間にわたって３７℃でインキュベートした。準備した７〜８日後に実験したものを集めた。集めた細胞をＣＤ５（３４０６９７，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５（５５５４３３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および７ＡＡＤ（５５９９２５，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光タグ化抗体で染色し、フローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）にかけた。ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリーソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータを分析した。ゲーティングストラテジーは、以下のとおりだった：ＦＳＣ：ＳＳＣリンパ球ゲート内に入った細胞を７ＡＡＤ発現について分析した。次いで、ネガティブ７ＡＡＤゲートに入った細胞をＣＤ５＋発現について分析し、次いで、ＣＤ５＋だった細胞をＣＦＳＥ希釈およびＣＤ２５上方調節について分析した。ＣＤ５＋、ＣＦＳＥ低かつＣＤ２５高である細胞を活性化されたＴ細胞とみなした。
【０２０６】
図２は、ＢＣ３  ＩｇＧ２ＡＡおよびＢＣ３  ＩｇＧ４ＡＡ融合タンパク質が、公知のＢＣ３  ｍＡＢよりも良好に、ＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａ抗体とは対照的に、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止したことを示している。ＯＫＴ３結合ドメインを発現している分子を用いたとき、同様のデータが生成された。
【０２０７】
図３は、ＢＣ３  ＨＭ１およびＢＣ３  ΔＣＨ２融合タンパク質もまた、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止したことを示している。ＯＫＴ３結合ドメインを発現している分子を用いたとき、同様のデータが生成された。
【０２０８】
図１７は、部分的に精製されたＣｒｉｓ−７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（５０％が目的のピークである）が、同種抗原に対するＴ細胞応答を効率的に阻止したことを示している。
【０２０９】
（実施例３）
（融合タンパク質は、リコール抗原に対するメモリーＴ細胞の応答を阻止する）
破傷風トキソイドに対する反応性についての以前のスクリーニングで陽性とスコア付けされたドナーからヒトＰＢＭＣを単離した。前に記載したようにＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、次いで、コンプリート（ヒトＡＢ血清）ＲＰＭＩ（１０％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）に２×１０６／ｍＬの濃度で再懸濁した。０．５ｍＬのＣＦＳＥ標識細胞および１μｇ／ｍＬの破傷風トキソイド（ＥＭＤ）を、実験処理物とともに４８ウェルプレートに加えた。その細胞を実験の時間にわたって５％ＣＯ２、３７℃においてインキュベートした。準備した８日後に実験したものを集めた。集めた細胞をＣＤ５（３４０６９７，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ２５（５５５４３３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光タグ化抗体で染色し、フローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）にかけた。ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリーソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータを分析した。ゲーティングストラテジーは、以下のとおりだった：ＦＳＣ：ＳＳＣリンパ球ゲート内に入った細胞をＣＤ５発現について分析し、続いてＣＤ５＋ゲート内に入った細胞をＣＦＳＥ希釈およびＣＤ２５上方調節について分析した。ＣＤ５＋、ＣＦＳＥ低かつＣＤ２５高である細胞を活性化されたＴ細胞とみなした。
【０２１０】
図４は、ＢＣ３  ＩｇＧ２ＡＡ、ＢＣ３  ＩｇＧ４ＡＡおよびＢＣ３  ＨＭ１融合タンパク質が、リコール抗原である破傷風トキソイドに対するメモリーＴ細胞の応答を阻止し得ることを示している。ＯＫＴ３結合ドメインを含む融合タンパク質を用いたとき、同様のデータが生成された。
【０２１１】
（実施例４）
（融合タンパク質は細胞表面ＴＣＲおよびＣＤ３の下方調節を誘導する）
実施例１に記載されているようにヒトＰＢＭＣ単離し、約２×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。そのＰＢＭＣの一部を即時の細胞表面染色のために取っておき、残りのＰＢＭＣを様々な抗ＣＤ３試薬とともに４日間インキュベートした後、分析した。即時染色されるＰＢＭＣを氷上で３０分間冷却した後、４℃において１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上清を除去した。細胞を１×１０６／ｍＬの濃度で氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ｄＰＢＳ，２．５％ＦＢＳ）に懸濁した。分析される各試薬に対して１ｍＬの細胞を５ｍＬのＦＡＣＳチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に移した。さらに１ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液をその１ｍＬの細胞アリコートに加え、その細胞を４℃において５分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。チューブを反転させ、約０．１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液が細胞ペレットとともにチューブに残るように上清をデカントし、次いで、そのチューブを氷上に置いた。単離の直後にサンプルを分析するために、染色抗体のマスターストック（９０μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液、５μＬの抗ＣＤ５抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および５μＬの抗ＴＣＲ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を調製した。１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬまたは０．１μｇ／ｍＬの、ＣＤ３に対する融合タンパク質またはモノクローナル抗体とともに（与えられる濃度は、抗体に対する濃度であり、相当するモル濃度が、融合タンパク質に対して使用されたことに注意されたい）、マスターストック（１００μＬ）を各ＦＡＣＳチューブに加えた。次いで、そのサンプルを暗黒下の氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート時間の後、サンプルを２ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＣＤ３に対する試薬に特異的なＰＥ標識２次抗体を１：４００の最終希釈で加えた。次いで、そのサンプルを暗黒下の氷上で３０分間インキュベートし、次いで、２ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。染色レベルをＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）において測定した。
【０２１２】
４日間処理され、次いで細胞表面を染色されるＰＢＭＣを、４８ウェルプレートに１ウェルあたり０．５ｍＬアリコートでプレーティングした（細胞濃度は、コンプリート（ヒトＡＢ血清）ＲＰＭＩ培地中、約２×１０６細胞／ｍＬだった）。ＣＤ３に対する試薬をその細胞に１、０．５および０．１μｇ／ｍＬで加え（与えられる濃度は、抗体に対する濃度であり、相当するモル濃度が、融合タンパク質に対して使用されたことに注意されたい）、その細胞を３７℃において２〜４日間インキュベートした。インキュベートした後、細胞を集め、上に記載したように染色した。
【０２１３】
結果（図５Ａ、５Ｂ、６Ａおよび６Ｂ）は、ＯＫＴ３結合ドメインを含む融合タンパク質が、Ｔ細胞の表面からのＴＣＲとＣＤ３の両方の下方調節を誘導し、ＯＫＴ３モノクローナル抗体は、ＴＣＲだけを下方調節し、ＣＤ３を下方調節しなかったことを示している。同様の結果が、ＢＣ３結合ドメインを含む融合タンパク質を用いたとき観察された。
【０２１４】
図１８は、Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質が、Ｔ細胞表面からのＴＣＲとＣＤ３の両方の下方調節を誘導し、Ｃｒｉｓ−７モノクローナル抗体は、ＴＣＲだけを下方調節することを示している。同様の結果が、Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ、Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７ＡおよびＣｒｉｓ−７  ＨＭ１を用いたときに得られる。
【０２１５】
（実施例５）
（融合タンパク質は、Ｔ細胞において堅調なカルシウム流動を誘導する）
前に記載したようにヒトＰＢＭＣを単離した。ＭｉｌｔｅｎｙｉのＭＡＣＳ技術を用いて、非Ｔ細胞をＴ細胞から磁気的に分離した。接触しなかったＴ細胞を、Ｔｈｅ  Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて単離した。製造者のプロトコルに従って、Ｔ細胞以外のＰＢＭＣのすべての細胞サブセットに対する抗体のパネルでコーティングされた超磁性ビーズを、新しく単離されたＰＢＭＣともにインキュベートした。次いで、その細胞とビーズとの混合物を、強力な永久磁石であるＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に置かれたときに磁場を形成するマトリックスが入ったカラムに適用した。Ｔ細胞は、そのカラムを通過するが、他のすべての細胞は、そのカラムに保持される。Ｔ細胞の純度は、概して８７〜９３％だった。精製されたＴ細胞を、約２×１０６細胞／ｍＬの濃度でコンプリートＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン）に懸濁し、適切なサイズのフラスコ内において３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、１００μｌの細胞（２００，０００細胞）を９６ウェルの黒色ポリ−Ｄリジンプレートのウェルに移し、３７℃で３時間インキュベートした。このインキュベーション時間中に、カルシウム流動の指示色素を製造者の指示書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＦＬＩＰＲ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ４アッセイ）に従って調製した。さらに、実験処理物をＵ底プレート内で調製した。細胞処理物を、７５μＬの容積の処理プレート内で５×濃度で調製した。すべての処理物（融合タンパク質および架橋剤）を３連で試験した。そのプレートの読み取りの１時間前に、１００μＬの指示色素をその細胞に加えた。指示色素を加えた後、さらに４５分間、そのプレートをインキュベーターに戻した。次いで、プレートを室温において５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離し、次いで、さらに１５分間、インキュベーターに戻した。このインキュベーション時間の終わりに、処理プレートおよび細胞プレートを、流体移送が一体化した卓上プレートリーダーであるＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にロードした。Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎは、その細胞プレートに５０μＬの処理物をロボット制御で加え、次いで、７５０秒間にわたって７秒ごとにカルシウム指示色素から得られた蛍光を記録した。次いで、捕捉されたデータを分析のためにＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）にエクスポートした。
【０２１６】
結果（図７）は、同じ結合ドメインを有する抗体とは対照的に、本開示の一本鎖融合タンパク質は、架橋剤の非存在下で（すなわち、２つ以上のＳＭＩＰ分子に結合する分子、例えば、抗ＩｇＧ抗体）、Ｔ細胞において堅調なカルシウム流動を誘導することを示している。同様の結果が、ＢＣ３結合ドメインを発現している分子の形式を用いたとき、ならびに刺激されたＴ細胞を使用したときに得られた。
【０２１７】
図１９は、ＢＣ３結合ドメインを有する一本鎖融合タンパク質によって引き起こされるカルシウム流動のレベルに対する、様々なヒンジの作用を示している。この場合、融合タンパク質およびコントロールを、２０秒後に加え、架橋剤を６００秒後に加えた。最も短いヒンジ（リンカー１２２，ＩｇＡ２ヒンジ由来）を有する融合タンパク質が、最大のカルシウム流動を引き起こし、より長いヒンジ（リンカー１１５および１１６，それぞれＩｇＥ  ＣＨ２およびＵＢＡ由来）を有する融合タンパク質が、より低レベルのカルシウム流動を誘導した。しかし、すべての場合において、ＢＣ３結合ドメインを有する一本鎖融合タンパク質は、抗体よりも大きいカルシウム流動の増加を引き起こした。ゆえに、そのヒンジを調整することにより、必要に応じてカルシウム流動が調節され得る。
【０２１８】
（実施例６）
（抗マウスＴＣＲ／ＣＤ３分子のインビトロにおける評価）
（マウス脾細胞の単離）
無菌条件下において、脾臓を切除し、大きな脂肪および組織の断片を除去した。組織培養フード内において、脾臓を５ｍＬの滅菌１×ＰＢＳが入った小皿に置き、次いで、片面すりガラスの２枚のスライドガラスの間ですりつぶした。このプロセス中、スライドガラスは、そのペトリ皿の上で、細胞および流体がその皿に戻るような角度で保持された。この工程は、脾被膜（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｃａｐｓｕｌｅ）が赤色でなくなったときに完了した。ペトリ皿内の細胞懸濁物を１５ｍＬコニカルチューブに移し、ボルテックスすることにより、細胞の凝集塊を分散させた。次いで、そのチューブをさらなる１２ｍＬの滅菌１×ＰＢＳで満たし、直立に置き、内容物を５分間沈ませた。第１のチューブにおいて沈んだ残屑を乱さないようにして、上清を第２の１５ｍＬコニカルチューブに移した。次いで、その細胞を室温において５分間、１５００ｒｐｍで集めた。上清を除去し、細胞ペレットを４ｍＬのＡＣＫ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，カタログＮｏ．１１８−１５６−１０１）に懸濁し、室温において５分間インキュベートした。次いで、そのコニカルチューブをＲＰＭＩ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）で満たした。その細胞懸濁物をセルストレーナーで濾過し、別の１５ｍＬコニカルチューブに移した。細胞をコンプリートＲＰＭＩで３回洗浄し、次いで、血球計算板を用いて計数した。
【０２１９】
（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）によるマウス脾細胞の標識）
マウス脾細胞の密度を滅菌ＰＢＳ中で１×１０６／ｍＬに調整した。その細胞を、チューブ１本あたり２５ｍＬ（２５×１０６細胞）を超えないように５０ｍＬコニカルチューブに分配した。その細胞を、ヒトＰＢＭＣおよびマウス脾細胞とともに使用するための条件を最適化した後のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製のＣＥＬＬＴＲＡＣＥＴＭ  ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログＮｏ．Ｃ３４５５４）を用いてＣＦＳＥで標識した。組織培養グレードのＤＭＳＯ中のＣＦＳＥの５ｍＭ溶液を、１８μＬの高品質のＤＭＳＯ（キットのＣｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｂ）を５０μｇの凍結乾燥ＣＦＳＥ（キットのＣｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａ）が入ったバイアルに加えることによって、使用直前に調製した。ＣＦＳＥは、感光性であるので、この試薬が光から保護されるようにこの試薬の調製中およびその後の細胞標識手順中に注意を払った。ＣＦＳＥ溶液を５０ｎＭ  ＣＦＳＥの最終濃度でＰＢＭＣ細胞懸濁物に加えた。ガス交換を可能にするために、そのチューブのキャップを、細胞懸濁物を含むチューブの上で緩く締め、そのチューブを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに１５分間置いた。血清が標識反応をクエンチするので、そのチューブをＲＰＭＩ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）で満たすことによって、細胞標識反応をクエンチした。その細胞を室温において７分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を各チューブから吸引し、細胞をＲＰＭＩ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅに再懸濁した。その細胞を計数し（投入量の最大２５％の損失が通常）、アッセイで使用するための所望の密度になるようにＲＰＭＩ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で調整した。
【０２２０】
（ＣｏｎＡ芽細胞）
脾細胞を、前に記載したようにＢＡＬＢ／ｃマウスから単離し、２×１０６細胞／ｍＬの濃度でコンプリートＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよび１％ＢＭＥ）に懸濁し、１μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）で３日間刺激した。３日後、細胞をコンプリートＲＰＭＩで２回洗浄し、刺激なしで４日間、新しいフラスコに再プレーティングした。この４日間の静止期間の終わりに、細胞を集め、前に記載したようにＣＦＳＥで標識した。
【０２２１】
この時点において、ＢＡＬＢ／ｃマウスから第２の脾臓を採取し、脾細胞を単離した。これらの新しく単離した脾細胞を、本実験の再刺激の段階においてアクセサリー細胞として使用した。アクセサリー細胞集団を調製するために、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＭＡＣＳ技術を用いてその新鮮な脾細胞からＴ細胞（ＣＤ５＋細胞）を磁気的に分離した。抗ＣＤ５抗体でコーティングされた超磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログＮｏ．１３０−０４９−３０１）を、製造者のプロトコルに従ってその新しく単離された脾細胞とともにインキュベートした。次いで、その細胞とビーズとの混合物を、強力な永久磁石であるＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログＮｏ．１３０−０４２−３０１）に置かれたときに磁場を形成するマトリックスが入ったカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログＮｏ．１３０−０４２−４０１）に適用した。ＣＤ５＋細胞（Ｔ細胞）がそのカラムに保持され、結合しなかったアクセサリー細胞は、貫流した。そのネガティブ選択されたアクセサリー細胞をマイトマイシンＣで処理することにより（前に記載したように）、増殖を阻害した。
【０２２２】
ＣＦＳＥ標識ＣｏｎＡ芽細胞とＭＭＣ処理アクセサリー細胞の両方を２×１０６／ｍＬでコンプリート培地に再懸濁した。０．５ｍＬの各細胞集団を、記載の処理物とともに４８ウェル組織培養プレートに加えた。刺激の２４時間後に５０μＬの上清を集め、細胞および残りの上清を再刺激後の４日目に集めた。細胞をＣＤ５（４５−００５１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣＤ２５（２５−０２５１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する蛍光タグ化抗体で染色し、フローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）にかけ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。ゲーティングストラテジーは、以下のとおりだった：ＦＳＣ：ＳＳＣリンパ球ゲート内に入った細胞をＣＤ５発現について分析し、続いてＣＤ５＋ゲート内に入った細胞をＣＦＳＥ希釈およびＣＤ２５上方調節について分析した。ＣＤ５＋、ＣＦＳＥ低かつＣＤ２５高である細胞を活性化されたＴ細胞とみなした。２２種の分析物用のＬｉｎｃｏ−ｐｌｅｘ，Ｌｕｍｉｎｅｘベース検出キット（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、以下の改変を加えて：分析物ビーズ、検出抗体およびストレプトアビジン−ＰＥストック溶液をアッセイにおいて使用する前に１：２希釈して、製造者のプロトコルに従って使用して、サイトカインおよびケモカインの存在について上清サンプルを分析した。そのキットによって検出された２２種の分析物は：ＭＩＰ−１ａ、ＧＭＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＫＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−１ａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＰ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７だった。
【０２２３】
Ｈ５７−４５７と１４５−２Ｃ１１の両方のモノクローナル抗体は、ＣｏｎＡで刺激されたＴ細胞のサイトカイン放出を誘導したが、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２または２Ｃ１１  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰは、サイトカイン放出を誘導しなかった。ＣｏｎＡで刺激されたＴ細胞の処理後の、例示的なサイトカインであるＩＦＮγおよびＩＰ−１０の放出の結果は、図８Ａおよび８Ｂに示されている。さらに、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２（図９中の「Ｈ５７  Ｍｕ  Ｎｕｌｌ」と同じ）と２Ｃ１１  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ（図９中の「２Ｃ１１  Ｍｕ  ｎｕｌｌ  ＳＭＩＰ」と同じ）の両方が、抗原に対するＴ細胞応答を阻止したが、Ｈ５７−４５７および１４５−２Ｃ１１モノクローナル抗体は、阻止しなかった（図９を参照のこと）。他のサイトカインの放出を測定したときも、同様の結果が得られた。
【０２２４】
（実施例７）
（例示的な抗ＴＣＲ  ＳＭＩＰのインビボ研究）
１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ）を６つの群に分け、外側尾静脈を介して、７．３μｇ、３７μｇ、７５ｖｇまたは１８５μｇのＨ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ、５μｇ（最大耐用量）のＨ５７ｍＡｂ、２５０μｇのＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（最大ＳＭＩＰ用量に相当するモル濃度）または２００μＬのＰＢＳを注射した。すべての注射容積は、２００μＬであり、注射したすべての材料は、０．５ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンレベルを有した。ランダムに選択された１群あたり３匹のマウスを２４時間後に屠殺し、残りの１群あたり３匹のマウスを注射の３日後の本実験の終わりに屠殺した。体重減少および臨床スコア上昇の形態において、薬物関連毒性の臨床症状についてマウスをモニターした。臨床スコアを評価する科学者は、各群に投与された処置物について知らされていなかった。スコアは、以下のキーに基づいて割り当てられた：０＝正常；１＝軽度の立毛；２＝中程度の立毛および／または眼球の炎症もしくは刺激作用；３＝猫背の姿勢／けん怠；４＝瀕死。注射の２時間後および屠殺時点において、すべてのマウスから採血した。屠殺時点において、脾臓および鼡径部リンパ節を採取した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のカスタム１４−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘベース検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ｓｅｒｉｅｓ）を、以下の改変を加えて：分析物ビーズ、検出抗体およびストレプトアビジン−ＰＥストック溶液をアッセイにおいて使用する前に１：２希釈して、製造者のプロトコルに従って使用して、サイトカインおよびケモカインの存在について血清サンプルを分析した。さらに、血清サンプルを希釈せずに用いた（推奨される１：２希釈と比較）。このキットによって検出された１４種の分析物は：Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ１、ＩＦＮγおよびＴＮＦαだった。脾臓およびリンパ節におけるＳＭＩＰでコーティングされたＴ細胞のパーセンテージを測定するために、これらの２つの臓器由来の細胞懸濁物を、ＣＤ５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログＮｏ．４５−００５１）およびマウスＩｇＧ２ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログＮｏ．５５３３９０）に対する抗体で染色した。
【０２２５】
図１０Ａは、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰの静脈内投与によって、体重が減少しなかったことを示している。さらに、図１０Ｂは、そのような処置が臨床スコアを上昇させなかったことも示している。これらの結果から、このＮｕｌｌ２  ＳＭＩＰが、所望の安全性プロファイルを有することが証明される。
【０２２６】
図１１は、親抗体とは対照的に、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰの静脈内投与が、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスではサイトカインストームを誘導しなかったことを示している。上記の１４種の分析物パネルからの２つの代表的なサイトカインであるＩＬ−６およびＩＬ−４が示されている。
【０２２７】
図１２は、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰでコーティングされたＴ細胞が、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰの静脈内投与後に脾臓において検出されたことを示している。
【０２２８】
（実施例８）
（融合タンパク質は、インビボにおいて急性移植片対宿主病を阻害する）
代用分子が急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）マウスモデルにおいて有効であるか否かを判定するために、マウスを例示的な融合タンパク質で処置し、次いで、体重減少、ドナー：宿主リンパ球比、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生についてモニターした。
【０２２９】
雌性Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ２  Ｆ１マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）において、ドナー雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）由来の脾細胞を移入することによってａＧＶＨＤを誘導した。ドナーマウスから脾臓を集め、１０％ＦＢＳを含む冷ＲＰＭＩに浸漬した。集めた脾臓を、滅菌されたすりガラスのスライドガラスを用いて解離させた。前に記載したように、上清を集め、遠心分離し、細胞を洗浄した。次いで、洗浄した脾細胞を、６５×１０６／２００μｌの濃度で滅菌ＰＢＳに再懸濁した。注射の直前に、脾細胞混合物を１００μｍセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に通すことにより、残屑および細胞の大きな凝集塊を除去した。２００μｌのドナー脾細胞の細胞懸濁物を、Ｆ１レシピエントマウスの外側尾静脈に静脈内（ＩＶ）注射した。外側尾静脈を介したＩＶ注射を行うために、マウスを熱ランプに短時間曝露し、プラスチックのマウス拘束器（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）内に拘束した。２７．５ゲージ針を用いて注射を行った。レシピエントマウスは、ドナー細胞移入後１４日目までに明白な疾患を有し、この時点で実験を終了し、評価した。疾患の進行は、移入された動物の脾臓内で宿主細胞が、ドナー細胞に媒介される攻撃に起因して減少するのと同時に生じる、体重減少およびドナー細胞の増大と関連した。ＩＦＮγなどの血清バイオマーカーもまた、疾患の進行と相関していた。
【０２３０】
有効性研究のために、ドナー細胞を、本研究の０日目（Ｄ０）に上に記載したようにＦ１レシピエントに移入した。上記ＳＭＩＰ、ＩｇＧ２ａコントロールおよびＰＢＳによる処置を、Ｄ０、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７、Ｄ９およびＤ１１に行い、実験したものをＤ１４に集めた。ドナー細胞の移入の前に後方眼窩洞を介して投与したＤ０注射を除いて、すべての処置注射をＩＶに施した。注射１回あたり１００μｌの容積中の１００μｇのＨ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰもしくはＩｇＧ２ａ、または１００μｌのＰＢＳを投与する。インビボ研究において使用したすべてのタンパク質が、０．５ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを有した。免疫抑制剤のデキサメタゾン（ＤＥＸ；Ｓｉｇｍａ）で処置されたマウスは、腹腔内注射（ＩＰ）を介して１０ｍｇ／ｋｇ／日を投与された。
【０２３１】
本実験中、マウスの体重が減少し始めるまで１日おきにマウスを秤量し、減少し始めた時点から毎日秤量した。レシピエントマウスで減少した開始体重に対するパーセンテージが、図１３に示されている。Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰの投与は、ＰＢＳまたはＩｇＧ２ａによるコントロール処置を受けたマウスとは対照的に、ａＧＶＨＤ病の進行に関連する体重減少を妨げた。
【０２３２】
血清バイオマーカー分析のために７日目にマウスから採血した。屠殺する１４日目に、脾臓および血液サンプルを各動物から集めた。各脾臓の重量および全細胞数を測定した。血清サンプルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のカスタム１４−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘベース検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ｓｅｒｉｅｓ）を製造者のプロトコルに従って使用してサイトカインおよびケモカインの存在について分析した。このキットによって検出された１４種の分析物は：Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ１、ＩＦＮγおよびＴＮＦαだった。Ｇ−ＣＳＦ（図１４Ａ）、ＫＣ（図１４Ｂ）およびＩＦＮγ（図１４Ｃ）を含むサイトカインおよびケモカインの産生は、ＳＭＩＰで処置されたマウスにおいて阻害された。これらの結果は、ＳＭＩＰの投与が、ａＧＶＨＤに関連するサイトカインおよびケモカインの産生、特に、ＩＦＮγの産生（代表的には、ａＧＶＨＤに罹患したマウスの７日目に大きく増加している）を阻害したことを示した。１４日目に、脾細胞を前に記載したように単離し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた分析のために、Ｈ−２ｂ（ドナー細胞）およびＨ２−ｄ（Ｈ２ｂ＋，Ｈ２−ｄ＋細胞は、宿主起源だった）に対する抗体で染色した。Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２融合タンパク質を投与されたマウスは、ＤＥＸを投与されたマウスおよびドナー細胞を投与されなかったネガティブコントロールマウスと類似のドナーリンパ球：宿主リンパ球比を有した（図１５）。これらの結果は、本開示の融合タンパク質が、ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａでのコントロール処置を受けたマウスに見られたａＧＶＨＤに関連する宿主リンパ球の減少と同時に生じるドナーリンパ球の増大を阻害することを示している。
【０２３３】
これらのインビボ研究は、本開示の融合タンパク質が、ａＧＶＨＤの進行を阻害すること（ドナーリンパ球が増大しないことによって証明される）、炎症性サイトカインおよびケモカインの産生ならびに体重減少を阻害することを示している。同様の有効性は、慢性ＧＶＨＤマウスモデルを用いたときの予備段階の結果においても見られている。
【０２３４】
ａＧＶＨＤの実験モデルは、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ、Ｈ５７  ｎｕｌｌ２および２Ｃ１１  ｎｕｌｌ２を評価するためにも企図されている。バイオマーカー研究においていくつかのサイトカインが初期に放出されたが、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨ５７  ｎｕｌｌ２は、調べられたパラメータにおける同様の結果によって効果的であると見出された。２Ｃ１１  ｎｕｌｌ２融合タンパク質もまた効果的であり、ａＧＶＨＤモデルにおいてドナー細胞の増大を妨げることが見出された。
【０２３５】
（実施例９）
（Ｎ２９７ＡおよびＩＧＧ４  ＣＨ２領域内に追加の単一アラニン置換を有する融合タンパク質は、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止する）
以下の融合タンパク質：
【０２３６】
【化２】
2014227419.tif 000004
を用いて、実施例２に記載したように、ヒトＭＬＲアッセイを行った。
【０２３７】
図２０は、（ａ）Ｎ２９７における唯一のアラニン置換、または（ｂ）Ｎ２９７におけるアラニン置換と、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６またはＦ２３７位における追加のアラニン置換との両方を含むＯＫＴ３  ＩｇＧ４融合タンパク質が、公知のＯＫＴ３ｍＡｂおよびＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａ抗体よりも良好に同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止したことを示している。
【０２３８】
（実施例１０）
（ＭＬＲ反応は、ヒンジ領域の選択に影響され得る）
ＢＣ３  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（配列番号８０）に由来し、かつ様々な長さおよび配列のヒンジ：ＵＢＡ由来のリンカー１２５（配列番号３２９）、ＩｇＥ  ＣＨ２由来のリンカー１２６（配列番号３３０）、ＩｇＤヒンジ由来のリンカー１２７（配列番号３３１）、ＩｇＡ２ヒンジ由来のリンカー１２８（配列番号３３２）およびＩｇＧ１ヒンジ由来のリンカー１２９（配列番号３３３）を含む融合タンパク質を用いて、実施例２に記載したようにヒトＭＬＲアッセイを行った。上で述べたリンカーを含むＢＣ３  ＩｇＧ２−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３２５、３２３、３１９、３１５および３１１に示されている。これらのＢＣ３  ＩｇＧ２−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３２４、３２２、３１８、３１４および３１０に示されている。
【０２３９】
図２１は、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止する際のＢＣ３  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質の能力に対する様々なヒンジの作用を示している。より短いヒンジを有する融合タンパク質が、Ｔ細胞応答を阻止する際により有効であったとみられる。しかしながら、すべての場合において、ＢＣ３結合ドメインを有する一本鎖融合タンパク質が、ＨｕＩｇ１  ＢＣ３（ＢＣ３ｍＡｂの可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域を含む抗体分子）よりも、同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止する際に有効だった。
【０２４０】
（実施例１１）
（ヒト化Ｃｒｉｓ７融合タンパク質のインビトロ分析）
様々なヒト化Ｃｒｉｓ７融合タンパク質：ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（配列番号２９０）、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（配列番号２９５）、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ（配列番号２９２）、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ（配列番号２９７）、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ（配列番号２９３）、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ（配列番号２９８）、キメラＣｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（配列番号２６５）、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＨＭ１（配列番号２９４）、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＨＭ１（配列番号２９９）およびキメラＣｒｉｓ７  ＨＭ１（配列番号２６９）を用いて実施例２に記載したようにヒトＭＬＲアッセイを行った。
【０２４１】
図２２は、ヒト化Ｃｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ、ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７ＡおよびＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質ならびにキメラＣｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質が、公知のＣｒｉｓ７ｍＡｂよりも良好に同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止したことを示している。
【０２４２】
図２３は、ヒト化Ｃｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ、ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７ＡおよびＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質ならびにキメラＣｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質が、公知のＣｒｉｓ７ｍＡｂよりも良好に同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止したことも示している。さらに、ヒト化およびキメラＣｒｉｓ７  ＨＭ１融合タンパク質もまた、Ｃｒｉｓ７ｍＡｂよりも良好に同種抗原に対するＴ細胞応答を阻止した。
【０２４３】
ＰＨＡで刺激され、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａおよびヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質によって再度刺激されたＴ細胞の分裂促進性およびサイトカイン放出を、実施例１に記載した方法を用いて分析した。以下のサイトカインを試験した：ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、ＩＬ−２およびＩＬ４。
【０２４４】
図２４は、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａおよびヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質が、ＰＨＡで刺激された（ＰＨＡ−ｐｒｉｍｅｒ）Ｔ細胞を活性化しなかったことを示している。ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａおよびヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質を用いたとき、同様のデータが生成された。
【０２４５】
サイトカイン放出の結果は、（１）ヒト化Ｃｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ、ヒト化Ｃｒｉｓ７−ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ、ヒト化Ｃｒｉｓ７−ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７ＡおよびキメラＣｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質が、Ｔ細胞に結合しないコントロールＳＭＩＰタンパク質と異ならなかったこと、（２）親Ｃｒｉｓ７ｍＡｂが、ＩＬ−１７を除いて、ヒト化Ｃｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ、ヒト化Ｃｒｉｓ７−ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａおよびヒト化Ｃｒｉｓ７−ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質に似ていたこと（親Ｃｒｉｓ７ｍＡｂは、ヒト化Ｃｒｉｓ７融合タンパク質よりも多くＩＬ−１７放出を誘導した）、（３）Ｎｕｖｉｏｎ  ＦＬは、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、ＴＮＦαおよびＩＬ−６を産生するように細胞を活性化したこと、および（４）試験されたすべての分子（Ｔ細胞に結合しないコントロールＳＭＩＰを含む）が、ＰＨＡ再刺激と同程度のレベルでＭＣＰ−１の分泌を引き起こしたことを示している。ＩＦＮγおよびＩＬ−１７放出の結果は、それぞれ図２５Ａおよび２５Ｂに示されている。
【０２４６】
インビトロでのカニクイザルＰＢＭＣにおける初期の分裂促進性アッセイにおけるサイトカインレベルを、以下のとおり測定した：１×ＰＢＳ中９０％のＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＣＭＦ）を使用し、１５ｍｌコニカルチューブ内で密度勾配を調製したことを除いて、実施例１に記載したように、カニクイザルから非ヒト霊長類ＰＢＭＣを単離した。細胞を、４×１０６細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩコンプリート培地（１０％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁し、記載の処理物とともに、９６ウェル平底プレートに１００μｌ／ウェルで等分した。細胞を３７℃でインキュベートした。各ウェルから上清を１日目、２日目および３日目にサンプリングし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のカスタム９−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘベース検出キットを製造者のプロトコルに従って使用して非ヒト霊長類サイトカインの存在について分析した。そのキットによって検出された９つの分析物は：ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＭＣＰ１、ＩＦＮγおよびＴＮＦαだった。
【０２４７】
結果（図２６Ａ〜Ｈ）は、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａおよびヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質が、Ｃｒｉｓ７ｍＡｂよりも少ないＩＦＮγ、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の放出を誘導するのに対し、ＩＬ−１ＢおよびＩＬ−２のレベルは、ヒト化Ｃｒｉｓ７  ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ融合タンパク質での処理後とＣｒｉｓ７ｍＡｂでの処理後で似ていたことを示している。
【０２４８】
（実施例１２）
（Ｈ５７結合ドメインを含む例示的な融合タンパク質のバイオマーカー研究）
１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ２  Ｆ１マウスの体重を対応させ、１群あたり８匹の動物で５群に分けた。ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ（配列番号９６）、Ｈ５７  １／２Ｎｕｌｌ  ＳＭＩＰ（配列番号３０４）、Ｈ５７  ＨＭ２  ＳＭＩＰ（配列番号３０６）または５μｇのＨ５７ｍＡｂを、後方眼窩洞を介して動物にＩＶ注射した（３００μｇのＨ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰに相当するモル濃度の２００μＬ）。各群から４匹のマウスを２４時間後に安楽死させ、残りの１群あたり４匹のマウスは、注射の３日後の実験の終わりに安楽死させた。前に記載したように薬物関連毒性の臨床症状についてマウスをモニターした。すべてのマウスから、注射の２時間後およびそのマウスの最期の時点において採血した。前に記載したようにＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製のカスタム１４−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘベース検出キットを用いて、血清サンプルをサイトカインおよびケモカインの存在について分析した。血清分析のための血液採取に加えて、白血球の末梢血染色のために、血液のアリコートを全血用マイクロテイナー（microtainer）チューブ（ＥＤＴＡ含有）に集めた。簡潔には、５μＬの全血を９６ウェルＵ底プレートのウェルに加えた。５μＬのラット抗１０μｇ／ｍｌマウスＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加え、プレートを室温において１５分間、プレート振盪機上において中速でインキュベートした。ＣＤ５（ＰＥ−Ｃｙ５）、ＣＤ１９（ＦＩＴＣ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣＤ４５（ＰＥ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する１０μＬの抗体カクテル（または適切な単一染色コントロール）を、１：４０００の最終希釈となるように加えた。プレートを、中速のプレート振盪機上に光から保護して置いて、室温でさらに２０分間インキュベートした。１８０μＬの１×ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ緩衝液を加え、ウェルを十分に混合し、室温において３０分間静置させた。次いで、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓａｍｐｌｅｒ（ＨＴＳ）において５０μＬの各サンプルを分析した。ゲーティングストラテジーは、以下のとおりだった：ＦＳＣ：ＳＳＣリンパ球ゲート内に入った細胞をＣＤ４５発現について分析し、続いて、ＣＤ４５＋ゲートに入った細胞をＣＤ５およびＣＤ１９発現について分析した。各細胞型の１ｍｌあたりの細胞を、集めた５０μＬのサンプルおよび４０という希釈係数に基づいて逆算した。
【０２４９】
図２７は、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨＭ２  ＳＭＩＰタンパク質の静脈内投与は、体重喪失を引き起こさなかったが、Ｈ５７ｍＡｂの静脈内投与は、体重喪失を引き起こしたことを示している。すべてのマウスが、０日目〜３日目において苦痛の明らかな徴候はなく、正常であるとみられた。
【０２５０】
図２８は、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  Ｎｕｌｌ、Ｈ５７  ＨＭ２またはＨ５７ｍＡｂの静脈内投与が、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールと比べて、循環ＣＤ５＋Ｔ細胞（細胞／ｍｌ）の一過性の減少をもたらすことを示している。循環ＣＤ５＋Ｔ細胞のレベル（細胞／ｍｌ）は、注射の７２時間後に群間で有意に異ならなかった（図２９）。
【０２５１】
図３０Ａ〜３８Ｃは、（１）Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２およびＨ５７  ＨＭ２が、ＩｇＧ２ａと比べてサイトカイン産生を増加させなかったこと、および（２）Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ処置が、注射の２時間後にＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＰ−１０、ＴＮＦαおよびＩＬ−１７のレベルを上昇させたが、ＩＬ−５以外のすべてのレベルが、注射後２４時間までに正常レベルに戻ったことを示している。
【０２５２】
（実施例１３）
（Ｈ５７結合ドメインを含む例示的な融合タンパク質の薬物動態学的研究）
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２００μｇのＨ５７  Ｎｕｌｌ２（配列番号９６）、Ｈ５７−ＨＭ２（配列番号３０６）またはＨ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ  ＳＭＩＰタンパク質（配列番号３０４）を含む２００μＬのＰＢＳを時間０において静脈内（ＩＶ）注射した。各時点について、１群あたり３匹のマウスに注射した：Ｈ５７−ＨＭ２  ＳＭＩＰタンパク質については、１５分後、２時間後、６時間後、８時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、７２時間後、１６８時間後および３３６時間後に血清サンプルを得て、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２およびＨ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌについては、さらに９６時間後および５０４時間後にも採取したが、８時間後および３０時間後のサンプリングは省略した。注射後の記載の時点において、麻酔されたマウスから腕神経叢または心臓の穿刺によって放血させ、以下に記載されるように血清を集めた。
【０２５３】
捕捉試薬としてヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体、および結合したＢＣ３  ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７ＡまたはＢＣ３−ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰを検出するためのそれぞれヒトＩｇＧ４またはＩｇＧ２に対する抗体のＨＲＰ結合体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ＢＣ３  ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７ＡおよびＢＣ３  ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７Ａの血清濃度を測定した。ＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７ＡおよびＢＣ３−ＨＭ１についての血清濃度を、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株を用いるＦＡＣＳベースの結合アッセイにおいて測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７ＡまたはＢＣ３  ＨＭ１を注射されたマウス由来の血清サンプルとともに９６ウェル平底プレート内でインキュベートした。１つの希釈において各血清サンプルを３連で試験した。サンプルに対して使用した希釈は、異なる時点について様々であったが、ＯＫＴ３  ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａについては１：２０から１：１５，０００、およびＢＣ３−ＨＭ１については１：２０から１：１０００の範囲だった（ＯＫＴ３  ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７ＡまたはＢＣ３−ＨＭ１を注射されたマウス由来のプールされたサンプルを予備アッセイにおいて試験していたので、各サンプルに対する適切な希釈が判明していた）。希釈された血清サンプルまたは標準物質（下記を参照のこと）の存在下において、細胞を１時間インキュベートし、洗浄した後、検出試薬を加えた。Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＯＫＴ３  Ｉｇ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａの結合は、ＰＥ結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγフラグメント特異的抗体を使用して検出されたのに対し、Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＢＣ３−ＨＭ１の結合は、ＰＥ結合体化抗Ｈｉｓ抗体を使用して検出された。Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７−ＨＭ２およびＨ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌについての血清濃度を、マウスＴ細胞株であるＥＬ４細胞を使用するＦＡＣＳベースの結合アッセイにおいて測定した。ＥＬ４細胞を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２でブロッキングし、次いで、Ｈ５７−ｎｕｌｌ２を注射されたマウス由来の血清サンプルとともに９６ウェル平底プレート中でインキュベートした。１つの希釈において各血清サンプルを３連で試験した。サンプルに対して使用した希釈は、異なる時点について様々であったが、１：５００から１：１０，０００の範囲だった（Ｈ５７−ｎｕｌｌ２を注射されたマウス由来のプールされたサンプルを予備アッセイにおいて試験していたので、各サンプルに対する適切な希釈が判明していた）。ＦＡＣＳ緩衝液に加えられたＨ５７  Ｎｕｌｌ２の様々な既知濃度からなる標準曲線を３連で作成した。発展的研究により、１：５０より高い希釈の血清は標準曲線に対して影響しなかったこと、およびさらに高い希釈（最低１：５００）の血清がＰＫサンプルについて必要だったことが示されたので、血清を標準曲線に加えなかった。
【０２５４】
ＥＬ４細胞を、希釈された血清サンプルまたは標準物質の存在下において１時間インキュベートし、洗浄した後、検出試薬を加えた。ＥＬ４細胞に対するＨ５７  Ｎｕｌｌ２およびＨ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌの結合を、ＰＥ結合体化ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて検出したのに対し、ＥＬ４細胞に対するＨ５７−ＨＭ２の結合を、ＰＥ結合体化抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。これらのサンプルは、フローサイトメトリーによって分析された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアにインポートすることにより、血清濃度を計算し、標準曲線の精度および正確度を判定した。
【０２５５】
血清サンプルを、前に記載したようなＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製のカスタム１４−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘベース検出キットを用いてサイトカインおよびケモカインの存在について分析した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＴＭ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌソフトウェア（ｖ５．０．１）を使用し、ＩＶボーラス投与および低頻度のサンプリングに対してコンパイル済みモデル２０１を適用した非コンパートメント分析によって、各タンパク質に対する薬物動態学的性質のパラメータを推定した。ＰＫ結果を図４０に提供し、計算された半減期を下記の表２に提供し、サイトカインの結果を図４０〜４９に提供する。
【０２５６】
【表２】
2014227419.tif 000005
このＰＫ研究の結果は、ＣＨ２ＣＨ３テイルを含むＳＭＩＰタンパク質が、ＣＨ３だけのテイルを含むものよりもかなり長い半減期を有することを示している。
【０２５７】
図３９〜４８は、Ｈ５７−ＨＭ２  ＳＭＩＰタンパク質が、測定されたすべての時点において、ほとんどのサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６またはＩＬ−１７）のレベルを概して上昇させなかったことを示している。これは、この分子のより短い半減期に一部起因しているかもしれない。さらに、観察されたサイトカインのいくつかのレベル上昇が、概して周期的であり、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ  ＳＭＩＰ融合タンパク質で見られたレベルよりも常に低かった。
【０２５８】
（実施例１４）
（Ｈ５７結合ドメインを含む例示的な融合タンパク質のインビトロ研究）
ＭＬＲアッセイおよびＣｏｎＡ芽細胞再刺激アッセイを、実施例６における方法に従って行った。
【０２５９】
結果は、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨ５７−ＨＭ２融合タンパク質（それぞれ配列番号９６、３０４および３０６）は、抗原に対する初期のＴ細胞応答を阻止したが、Ｈ５７ｍＡｂは阻止しなかったことを示している（図５０および５１）。さらに、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨ５７−ＨＭ２融合タンパク質ならびにＩｇＧ２ａは、ＣｏｎＡで刺激されたＴ細胞の活性化を誘導せず、Ｈ５７ｍＡｂは、ＣｏｎＡで刺激されたＴ細胞の活性化をわずかに誘導し、２Ｃ１１ｍＡｂは、ＣｏｎＡで刺激されたＴ細胞の活性化を誘導した（図５２）。Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２およびＨ５７−ＨＭ２融合タンパク質は、ＣｏｎＡ芽細胞再刺激アッセイにおいてサイトカイン放出を誘導せず、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ融合タンパク質は、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２およびＨ５７−ＨＭ２融合タンパク質と比べて、試験されたいくつかのサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０およびＴＮＦ−α）のレベルを上昇させた（データ示さず）。
【０２６０】
上に記載した様々な実施形態は、組み合わされることにより、さらなる実施形態を提供し得る。本明細書中で参照されたおよび／またはＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔに列挙された、米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献のすべての全体が、本明細書中で参考として援用される。
【０２６１】
上で詳述された記載に鑑みて、これらおよび他の変更がそれらの実施形態に対して行われ得る。概して、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきでなく、権利付与されるそのような特許請求の範囲の等価物の全範囲とともに、起こりうるすべての実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2014227419.tif 000006
【図２】
2014227419.tif 000007
【図３】
2014227419.tif 000008
【図４】
2014227419.tif 000009
【図５】
2014227419.tif 000010
【図６】
2014227419.tif 000011
【図７】
2014227419.tif 000012
【図８】
2014227419.tif 000013
【図９】
2014227419.tif 000014
【図１０】
2014227419.tif 000015
【図１１Ａ】
2014227419.tif 000016
【図１１Ｂ】
2014227419.tif 000017
【図１２】
2014227419.tif 000018
【図１３】
2014227419.tif 000019
【図１４】
2014227419.tif 000020
【図１５】
2014227419.tif 000021
【図１６】
2014227419.tif 000022
【図１７】
2014227419.tif 000023
【図１８】
2014227419.tif 000024
【図１９】
2014227419.tif 000025
【図２０】
2014227419.tif 000026
【図２１】
2014227419.tif 000027
【図２２】
2014227419.tif 000028
【図２３】
2014227419.tif 000029
【図２４】
2014227419.tif 000030
【図２５Ａ】
2014227419.tif 000031
【図２５Ｂ】
2014227419.tif 000032
【図２６Ａ】
2014227419.tif 000033
【図２６Ｂ】
2014227419.tif 000034
【図２６Ｃ】
2014227419.tif 000035
【図２６Ｄ】
2014227419.tif 000036
【図２６Ｅ】
2014227419.tif 000037
【図２６Ｆ】
2014227419.tif 000038
【図２６Ｇ】
2014227419.tif 000039
【図２６Ｈ】
2014227419.tif 000040
【図２７】
2014227419.tif 000041
【図２８】
2014227419.tif 000042
【図２９】
2014227419.tif 000043
【図３０Ａ】
2014227419.tif 000044
【図３０Ｂ】
2014227419.tif 000045
【図３０Ｃ】
2014227419.tif 000046
【図３１Ａ】
2014227419.tif 000047
【図３１Ｂ】
2014227419.tif 000048
【図３１Ｃ】
2014227419.tif 000049
【図３２Ａ】
2014227419.tif 000050
【図３２Ｂ】
2014227419.tif 000051
【図３２Ｃ】
2014227419.tif 000052
【図３３Ａ】
2014227419.tif 000053
【図３３Ｂ】
2014227419.tif 000054
【図３３Ｃ】
2014227419.tif 000055
【図３４Ａ】
2014227419.tif 000056
【図３４Ｂ】
2014227419.tif 000057
【図３４Ｃ】
2014227419.tif 000058
【図３５Ａ】
2014227419.tif 000059
【図３５Ｂ】
2014227419.tif 000060
【図３５Ｃ】
2014227419.tif 000061
【図３６Ａ】
2014227419.tif 000062
【図３６Ｂ】
2014227419.tif 000063
【図３６Ｃ】
2014227419.tif 000064
【図３７Ａ】
2014227419.tif 000065
【図３７Ｂ】
2014227419.tif 000066
【図３７Ｃ】
2014227419.tif 000067
【図３８Ａ】
2014227419.tif 000068
【図３８Ｂ】
2014227419.tif 000069
【図３８Ｃ】
2014227419.tif 000070
【図３９Ａ】
2014227419.tif 000071
【図３９Ｂ】
2014227419.tif 000072
【図４０】
2014227419.tif 000073
【図４１】
2014227419.tif 000074
【図４２】
2014227419.tif 000075
【図４３】
2014227419.tif 000076
【図４４】
2014227419.tif 000077
【図４５】
2014227419.tif 000078
【図４６】
2014227419.tif 000079
【図４７】
2014227419.tif 000080
【図４８】
2014227419.tif 000081
【図４９】
2014227419.tif 000082
【図５０】
2014227419.tif 000083
【図５１】
2014227419.tif 000084
【図５２】
2014227419.tif 000085
【配列表】
2014227419000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月4日(2014.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１】図１は、ＰＨＡで刺激されたヒトＴ細胞を様々な抗体および小モジュール免疫薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＳＭＩＰＴＭ））製品で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「Ｒｘなし」とは、ネガティブコントロールとして使用された、処理無しのことを指す。
【図２】図２は、混合リンパ球反応アッセイにおいて、応答物（responder）細胞を様々な抗体およびＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「ＭＬＲ」とは、いかなる追加の処理も行わなかった混合リンパ球反応のことを指す。「応答物のみ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指す。「ＩｇＧ２ａ」とは、１０μｇ／ｍｌ  ＩｇＧ２ａ  ｍＡｂで処理された応答物細胞のことを指す。
【図３】図３は、混合リンパ球反応アッセイにおいて、応答物細胞を様々な抗体およびＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「ＭＬＲ」とは、いかなる追加の処理も行わなかった混合リンパ球反応のことを指す。「応答物のみ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指す。
【図４】図４は、メモリーＴ細胞をモノクローナル抗体および様々なＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「応答物（ＴＴなし）」とは、破傷風トキソイドの非存在下における反応のことを指す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、（Ａ）単離の直後（０日目）または（ｂ）ＯＫＴ３モノクローナル抗体または様々なＯＫＴ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理した４日後に染色されたヒトＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ３のＦＡＣＳ分析のドットプロットである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、（Ａ）単離の直後（０日目）または（Ｂ）ＯＫＴ３  ＩｇＧ１ＡＡまたはＯＫＴ３  ＨＭ１  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理した４日後に染色されたヒトＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ３のＦＡＣＳ分析のドットプロットである。
【図７】図７は、精製ヒトＴ細胞をモノクローナル抗体、抗体の組み合わせまたは様々なＯＫＴ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、経時的なカルシウム流動指示色素の蛍光の変化を示している。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＣｏｎＡで刺激されたマウスＴ細胞をモノクローナル抗体（２Ｃ１１ｍＡｂおよびＨ５７ｍＡｂ）またはＳＭＩＰ融合タンパク質（２Ｃ１１  Ｎｕｌｌ２およびＨ５７  Ｎｕｌｌ２）で処理した後の、（Ａ）ＩＦＮγまたは（Ｂ）ＩＰ−１０の放出を示している。
【図９】図９は、混合リンパ球反応アッセイにおいて、応答物細胞を様々な抗体またはＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「Ｒのみ」とは、応答物細胞だけが存在する反応のことを指し；「Ｓのみ」とは、刺激物（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）細胞だけが存在する反応のことを指し；「Ｒ：Ｓ」とは、応答物細胞と刺激物細胞の両方が存在する反応のことを指す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、様々な濃度の抗体（Ｈ５７ｍＡｂ）およびＨ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ融合タンパク質を静脈内投与した後の経時的な（Ａ）体重および（Ｂ）臨床スコアの変化を示している。ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａをネガティブコントロールとして使用した。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗ＴＣＲ抗体（Ｈ５７ｍＡｂ）または様々な濃度の抗ＴＣＲ  ＳＭＩＰ融合タンパク質（Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２）を静脈内投与した２時間後、２４時間後、７２時間後の血清中の（Ａ）ＩＬ−６および（Ｂ）ＩＬ−４の濃度を示している。マウスＩｇＧ２ａ抗体およびＰＢＳ（希釈剤）をネガティブコントロールとして使用した。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗ＴＣＲ抗体（Ｈ５７ｍＡｂ）または様々な濃度の抗ＴＣＲ  ＳＭＩＰ融合タンパク質（Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２）を静脈内投与した２時間後、２４時間後、７２時間後の血清中の（Ａ）ＩＬ−６および（Ｂ）ＩＬ−４の濃度を示している。マウスＩｇＧ２ａ抗体およびＰＢＳ（希釈剤）をネガティブコントロールとして使用した。
【図１２】図１２は、様々な濃度の抗ＴＣＲ  ＳＭＩＰ融合タンパク質（Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２）を静脈内投与した後の１日目または３日目のマウス脾臓に見られたＨ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰで覆われたＴ細胞のパーセンテージを示している。ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａをネガティブコントロールとして使用した。
【図１３】図１３は、急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）のモデルにおいてドナー細胞を移入した後の１４日間にわたるレシピエントマウスの開始体重からの変化のパーセンテージを示している。「ナイーブレシピエント」は、ネガティブコントロールとしてドナー細胞移入を受けなかったマウスのことを示す。レシピエントマウスを、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ融合タンパク質、デキサメタゾン（ＤＥＸ）またはコントロール（ＰＢＳまたはＩｇＧ２ａ）で処置した。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、ドナー細胞移入後のそれぞれ１４日目、１４日目または７日目における（Ａ）Ｇ−ＣＳＦ、（Ｂ）ＫＣまたは（Ｃ）ＩＦＮγの血清濃度を示している。
【図１５】図１５は、ドナー細胞移入後の１４日目におけるドナー：宿主リンパ球比を示している。「細胞移入なし」は、ドナー細胞を投与されなかったネガティブコントロールマウスのことを示す。ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａをコントロール処置として使用した。
【図１６】図１６は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４およびマウスＩＧＨＧ２ｃのＣＨ２領域（それぞれ配列番号６４、６６、６８および７３）間の配列アラインメントを示している。これらのアラインメントは、ＤＮＡＳＴＡＲ５．０３（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムのデフォルトパラメータを使用したＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を用いて行った。ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２のアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔに従うＥＵナンバリングに基づいている（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９９１）を参照のこと）。すなわち、ヒトＩｇＧ１の重鎖可変領域は、１２８アミノ酸長であると考えられるので、ヒトＩｇＧ１の定常領域における最もアミノ末端のアミノ酸残基は、１２９位である。他のＣＨ２領域のアミノ酸の位置は、それらとアラインメントされるヒトＩｇＧ１におけるアミノ酸残基の位置に基づいて示される。２９７位のＡｓｎ残基（Ｎ２９７）は、下線が引かれ、太字で示されている。
【図１７】図１７は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、応答物細胞を抗体またはＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「Ｒ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指し、「Ｓ」とは、刺激物細胞だけが存在した反応のことを指し、「Ｒ＋Ｓ」とは、いかなる追加の処理も行わなかった混合リンパ球反応のことを指し、「ｍｕＩｇＧ２ｂ」とは、１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＧ２ｂで処理された応答物細胞のことを指す。「コントロールＳＭＩＰ」は、Ｔ細胞に結合しないｓｃＦｖ結合ドメインを有するＳＭＩＰ融合タンパク質である。Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａ（配列番号２６５）を用いて、これらの細胞を試験した。
【図１８】図１８は、単離の直後に染色されたヒトＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ３のＦＡＣＳ分析のドットプロットを示している。上の２枚のパネルは、Ｃｒｉｓ−７モノクローナル抗体で処理されたヒトＴ細胞を示しており、下の２枚のパネルは、Ｃｒｉｓ−７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａ（配列番号２６５）による処理を示している。左のパネルは、処理当日（０日目）の細胞の分布を示しており、右のパネルは、処理の２日後（２日目）の細胞の分布を示している。
【図１９】図１９は、ヒトＴ細胞をＢＣ３  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（配列番号８０，ｓｃＦｖとＣＨ２ＣＨ３ドメインとの間にヒンジとしてリンカー８７を有する）で処理したことに起因する経時的なカルシウム流動指示色素の蛍光の変化を、ヒンジリンカー８７を様々な長さの他のヒンジ（特に、配列番号２１２〜２１８に対応する、それぞれリンカー１１５〜１２０および１２２）と交換した同じ融合タンパク質と比較して示している。
【図２０】図２０は、ＭＬＲアッセイにおいて、応答物細胞を抗体またはＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「コントロールＳＭＩＰ」とは、Ｔ細胞に結合しないｓｃＦｖ結合ドメインを有するＳＭＩＰ融合タンパク質のことを指す。「応答物のみ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指す。角括弧内の数字は、ＳＭＩＰ融合タンパク質の配列識別番号である。
【図２１】図２１は、ＭＬＲアッセイにおいて、応答物細胞を、様々なヒンジリンカーを含むＢＣ３  ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。
【図２２】図２２は、ＭＬＲアッセイにおいて、応答物細胞をモノクローナル抗体Ｃｒｉｓ７、キメラもしくはヒト化Ｃｒｉｓ７  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはキメラＢＣ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質（配列番号８０）で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「コントロールＳＭＩＰ」とは、Ｔ細胞に結合しないｓｃＦｖ結合ドメインを有するＳＭＩＰ融合タンパク質のことを指し、「応答物のみ」とは、応答物細胞だけが存在した反応のことを指す。角括弧内の数字は、ＳＭＩＰ融合タンパク質の配列識別番号である。
【図２３】図２３は、ＭＬＲアッセイにおいて、応答物細胞をヒト化Ｃｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７、ＩｇＧ２−ＡＡ−Ｎ２９７ＡおよびＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ、ならびにＨＭ１  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはキメラＣｒｉｓ７  ＩｇＧ１−Ｎ２９７ＡおよびＨＭ１  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「親ｍＡｂ」とは、Ｃｒｉｓ７ｍＡｂのことを指し、「コントロールＳＭＩＰ」とは、Ｔ細胞に結合しないｓｃＦｖ結合ドメインを有するＳＭＩＰ融合タンパク質のことを指す。
【図２４】図２４は、ＰＨＡで刺激されたヒトＴ細胞をヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａまたはヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質で処理した後の、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。「コントロールＳＭＩＰ」は、Ｔ細胞に結合しないＳＭＩＰ融合タンパク質である。
【図２５Ａ】図２５Ａおよび２５Ｂは、ＰＨＡで刺激されたＴ細胞を様々なヒト化およびキメラＣｒｉｓ７  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ＢＣ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質（配列番号８０）、ならびに様々な抗体（ＢＣ３ｍＡｂ、親Ｃｒｉｓ７ｍＡｂおよびＮｕｖｉｏｎ  ＦＬ）で再刺激した２４時間後（１日目）および７２時間後（３日目）における血清中の（Ａ）ＩＦＮγおよび（Ｂ）ＩＬ−１７の濃度を示している。角括弧内の数字は、ＳＭＩＰ融合タンパク質の配列識別番号である。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび２５Ｂは、ＰＨＡで刺激されたＴ細胞を様々なヒト化およびキメラＣｒｉｓ７  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ＢＣ３  ＳＭＩＰ融合タンパク質（配列番号８０）、ならびに様々な抗体（ＢＣ３ｍＡｂ、親Ｃｒｉｓ７ｍＡｂおよびＮｕｖｉｏｎ  ＦＬ）で再刺激した２４時間後（１日目）および７２時間後（３日目）における血清中の（Ａ）ＩＦＮγおよび（Ｂ）ＩＬ−１７の濃度を示している。角括弧内の数字は、ＳＭＩＰ融合タンパク質の配列識別番号である。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｄ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｅ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｆ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｇ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２６Ｈ】図２６Ａ〜２６Ｈは、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ１）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質、ヒト化Ｃｒｉｓ７（ＶＨ３−ＶＬ２）ＩｇＧ４−ＡＡ−Ｎ２９７Ａ  ＳＭＩＰ融合タンパク質またはＣｒｉｓ７ｍＡｂで２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）または７２時間（ｄ３）処理された初期のＰＢＭＣにおける、（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＬ−１Ｂ、（Ｄ）ＩＬ−１７、（Ｅ）ＩＬ−４、（Ｆ）ＴＮＦ−α、（Ｇ）ＩＬ−６および（Ｈ）ＩＬ−２のレベルを示している。
【図２７】図２７は、ＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ（４１１μｇ）、Ｈ５７ｍＡｂ（５μｇ）、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２  ＳＭＩＰ融合タンパク質（３００μｇ）、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ  ＳＭＩＰ融合タンパク質（３００μｇ）またはＨ５７  ＨＭ２  ＳＭＩＰ融合タンパク質（３００μｇ）を静脈内投与した後の経時的な体重の変化を示している。
【図２８】図２８は、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した２時間後の末梢血Ｔ細胞の濃度を示している。
【図２９】図２９は、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した７２時間後の末梢Ｔ細胞の濃度を示している。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜３０Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−２の濃度を示している。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜３０Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−２の濃度を示している。
【図３０Ｃ】図３０Ａ〜３０Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−２の濃度を示している。
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−１０の濃度を示している。
【図３１Ｂ】図３１Ａ〜３１Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−１０の濃度を示している。
【図３１Ｃ】図３１Ａ〜３１Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−１０の濃度を示している。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜３２Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３２Ｂ】図３２Ａ〜３２Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３２Ｃ】図３２Ａ〜３２Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜３３Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＴＮＦαの濃度を示している。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜３３Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＴＮＦαの濃度を示している。
【図３３Ｃ】図３３Ａ〜３３Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＴＮＦαの濃度を示している。
【図３４Ａ】図３４Ａ〜３４Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−４の濃度を示している。
【図３４Ｂ】図３４Ａ〜３４Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−４の濃度を示している。
【図３４Ｃ】図３４Ａ〜３４Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−４の濃度を示している。
【図３５Ａ】図３５Ａ〜３５Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＭＣＰ−１の濃度を示している。
【図３５Ｂ】図３５Ａ〜３５Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＭＣＰ−１の濃度を示している。
【図３５Ｃ】図３５Ａ〜３５Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＭＣＰ−１の濃度を示している。
【図３６Ａ】図３６Ａ〜３６Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＫＣの濃度を示している。
【図３６Ｂ】図３６Ａ〜３６Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＫＣの濃度を示している。
【図３６Ｃ】図３６Ａ〜３６Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＫＣの濃度を示している。
【図３７Ａ】図３７Ａ〜３７Ｃは、ＩｇＧ２ａ、Ｈ５７ｍＡｂおよびＨ５７  Ｎｕｌｌ２、ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨＭ２  ＳＭＩＰを静脈内投与した２時間後（Ａ）、２４時間後（Ｂ）および７２時間後（Ｃ）のＩＬ−１７の濃度を示している。
【図３７Ｂ】図３７Ａ〜３７Ｃは、ＩｇＧ２ａ、Ｈ５７ｍＡｂおよびＨ５７  Ｎｕｌｌ２、ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨＭ２  ＳＭＩＰを静脈内投与した２時間後（Ａ）、２４時間後（Ｂ）および７２時間後（Ｃ）のＩＬ−１７の濃度を示している。
【図３７Ｃ】図３７Ａ〜３７Ｃは、ＩｇＧ２ａ、Ｈ５７ｍＡｂおよびＨ５７  Ｎｕｌｌ２、ｈａｌｆ  ｎｕｌｌおよびＨＭ２  ＳＭＩＰを静脈内投与した２時間後（Ａ）、２４時間後（Ｂ）および７２時間後（Ｃ）のＩＬ−１７の濃度を示している。
【図３８Ａ】図３８Ａ〜３８Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−５の濃度を示している。
【図３８Ｂ】図３８Ａ〜３８Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−５の濃度を示している。
【図３８Ｃ】図３８Ａ〜３８Ｃは、図２７で投薬されたようにＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂ、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌまたはＨ５７  ＨＭ２を静脈内投与した（Ａ）２時間後、（Ｂ）２４時間後および（Ｃ）７２時間後の血清中のＩＬ−５の濃度を示している。
【図３９Ａ】図３９Ａおよび３９Ｂは、Ｈ５７−ＨＭ２およびＨ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌについての時間に対する平均血清濃度のグラフである。結果は、観察されたデータセットおよびＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭソフトウェアによって計算された予測値として表されている。Ｒｓｑ値およびＲｓｑ調整値は、ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ  ｚの推定において使用された時点（６．６および４０．７時間）の数値に対する調整の前および後の、末期排泄相（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）についての適合度統計量である。
【図３９Ｂ】図３９Ａおよび３９Ｂは、Ｈ５７−ＨＭ２およびＨ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌについての時間に対する平均血清濃度のグラフである。結果は、観察されたデータセットおよびＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭソフトウェアによって計算された予測値として表されている。Ｒｓｑ値およびＲｓｑ調整値は、ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ  ｚの推定において使用された時点（６．６および４０．７時間）の数値に対する調整の前および後の、末期排泄相（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）についての適合度統計量である。
【図４０】図４０は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＧ−ＣＳＦの濃度を示している。
【図４１】図４１は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＦＮ−γの濃度を示している。
【図４２】図４２は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−２の濃度を示している。
【図４３】図４３は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−５の濃度を示している。
【図４４】図４４は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−６の濃度を示している。
【図４５】図４５は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−１０の濃度を示している。
【図４６】図４６は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＬ−１７の濃度を示している。
【図４７】図４７は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＩＰ−１０の濃度を示している。
【図４８】図４８は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＫＣの濃度を示している。
【図４９】図４９は、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７  Ｎｕｌｌ２（各２００μｇ）を静脈内投与した１５分後、２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後の血清中のＭＣＰ−１の濃度を示している。
【図５０】図５０は、応答物細胞をＨ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ、Ｈ５７−ＨＭ２、マウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂまたはＨ５７ｍＡｂで処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージを示している。
【図５１】図５１は、応答物細胞をＨ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ、Ｈ５７−ＨＭ２またはＨ５７ｍＡｂで処理したことに起因する、活性化されたＴ細胞のパーセンテージ（（Ｒ＋Ｓ）−無処理＝１００％に正規化されたパーセンテージ）を示している。
【図５２】図５２は、Ｈ５７  Ｎｕｌｌ２、Ｈ５７  ｈａｌｆ  ｎｕｌｌ、Ｈ５７−ＨＭ２、マウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、Ｈ５７ｍＡｂまたは２Ｃ１１ｍＡｂの処理によって活性化された、ＣｏｎＡで刺激されたＴ細胞のパーセンテージを示している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2014227419.tif 000086
【図２】
2014227419.tif 000087
【図３】
2014227419.tif 000088
【図４】
2014227419.tif 000089
【図５】
2014227419.tif 000090
【図６】
2014227419.tif 000091
【図７】
2014227419.tif 000092
【図８】
2014227419.tif 000093
【図９】
2014227419.tif 000094
【図１０】
2014227419.tif 000095
【図１１Ａ】
2014227419.tif 000096
【図１１Ｂ】
2014227419.tif 000097
【図１２】
2014227419.tif 000098
【図１３】
2014227419.tif 000099
【図１４】
2014227419.tif 000100
【図１５】
2014227419.tif 000101
【図１６】
2014227419.tif 000102
【図１７】
2014227419.tif 000103
【図１８】
2014227419.tif 000104
【図１９】
2014227419.tif 000105
【図２０】
2014227419.tif 000106
【図２１】
2014227419.tif 000107
【図２２】
2014227419.tif 000108
【図２３】
2014227419.tif 000109
【図２４】
2014227419.tif 000110
【図２５Ａ】
2014227419.tif 000111
【図２５Ｂ】
2014227419.tif 000112
【図２６Ａ】
2014227419.tif 000113
【図２６Ｂ】
2014227419.tif 000114
【図２６Ｃ】
2014227419.tif 000115
【図２６Ｄ】
2014227419.tif 000116
【図２６Ｅ】
2014227419.tif 000117
【図２６Ｆ】
2014227419.tif 000118
【図２６Ｇ】
2014227419.tif 000119
【図２６Ｈ】
2014227419.tif 000120
【図２７】
2014227419.tif 000121
【図２８】
2014227419.tif 000122
【図２９】
2014227419.tif 000123
【図３０Ａ】
2014227419.tif 000124
【図３０Ｂ】
2014227419.tif 000125
【図３０Ｃ】
2014227419.tif 000126
【図３１Ａ】
2014227419.tif 000127
【図３１Ｂ】
2014227419.tif 000128
【図３１Ｃ】
2014227419.tif 000129
【図３２Ａ】
2014227419.tif 000130
【図３２Ｂ】
2014227419.tif 000131
【図３２Ｃ】
2014227419.tif 000132
【図３３Ａ】
2014227419.tif 000133
【図３３Ｂ】
2014227419.tif 000134
【図３３Ｃ】
2014227419.tif 000135
【図３４Ａ】
2014227419.tif 000136
【図３４Ｂ】
2014227419.tif 000137
【図３４Ｃ】
2014227419.tif 000138
【図３５Ａ】
2014227419.tif 000139
【図３５Ｂ】
2014227419.tif 000140
【図３５Ｃ】
2014227419.tif 000141
【図３８Ａ】
2014227419.tif 000142
【図３８Ｂ】
2014227419.tif 000143
【図３８Ｃ】
2014227419.tif 000144
【図３９Ａ】
2014227419.tif 000145
【図３９Ｂ】
2014227419.tif 000146
【図４０】
2014227419.tif 000147
【図４１】
2014227419.tif 000148
【図４２】
2014227419.tif 000149
【図４３】
2014227419.tif 000150
【図４４】
2014227419.tif 000151
【図４５】
2014227419.tif 000152
【図４６】
2014227419.tif 000153
【図４７】
2014227419.tif 000154
【図４８】
2014227419.tif 000155
【図４９】
2014227419.tif 000156
【図５０】
2014227419.tif 000157
【図５１】
2014227419.tif 000158
【図５２】
2014227419.tif 000159
【図３６Ａ】
2014227419.tif 000160
【図３６Ｂ】
2014227419.tif 000161
【図３６Ｃ】
2014227419.tif 000162
【図３７Ａ】
2014227419.tif 000163
【図３７Ｂ】
2014227419.tif 000164
【図３７Ｃ】
2014227419.tif 000165
【外国語明細書】
2014227419000001.pdf