(57)【要約】【課題】雑種ラクツカ・サティバ（Lactuca sativa）種子及び当該種子の作製のための方法を提供すること。また、雑種ラクツカ・サティバ植物、及び雑種ラクツカ・サティバ植物由来の細胞を提供すること。【解決手段】本発明は、雑種ラクツカ・サティバ（Lactuca sativa）種子であって、雄性不稔遺伝子型であるとともに、特徴的な表現型である当該種子に由来する植物を提供する、少なくとも１つの特徴的遺伝子の異種接合体である種子に関する。本発明はまた、雑種ラクツカ・サティバ種子の作製のための方法であって、一定環境中で表現型的に雄性不稔植物及び表現型的に雄性不稔性植物の栽培のステップ、植物の開花の際に一定環境中に導入される双翅目による授粉のステップ、及び雄性不稔植物により作製される種子の収穫のステップ、を含んでなる方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
雑種ラクツカ・サティバ（Lactuca sativa）種子であって、それが
雄性不稔性遺伝子型を有するとともに、
検出可能な表現型を当該種子に由来する植物に提供する、少なくとも１つの特徴的遺伝子の異種接合体であること、
を特徴とする種子。
【請求項２】
前記雄性不稔性遺伝子型が、少なくとも１の核遺伝子を含有し、且つ前記種子が雄性不稔性の原因である１又は複数の遺伝子の異種接合体である、請求項１に記載の種子。
【請求項３】
前記雄性不稔性が一遺伝子的である、請求項２に記載の種子。
【請求項４】
前記雄性不稔性の遺伝子が優性である、請求項３に記載の種子。
【請求項５】
前記雄性不稔性遺伝子型がＭｓ７不稔性遺伝子により提供される、請求項１に記載の種子。
【請求項６】
ゲノムが、650〜700ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ配列を含んでなり、ここでその２本の鎖の各々の５'末端が配列 5' ＴＧＣＧＴＴＣＣＡＣ 3'（配列番号１）で開始することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の種子。
【請求項７】
前記表現型が農業で注目の表現型である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の種子。
【請求項８】
前記表現型が、ウイルス、細菌、虫又は真菌による感染に対して、標準的又は中程度に耐性である遺伝子により提供される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の種子。
【請求項９】
前記表現型が、
以下の真菌：ブレミア・ラクツカエ（Bremia lactucae）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、スクレロティニア・マイナー（Sclerotinia minor）もしくはスクレロトラム（sclerotorum）、ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizictonia solani）、ミクロドチウム・パナットニアナム（Microdochium panattonianum）、ベルチシリウム・ダーリエ（Verticiulium dahliae）、エリシフェ・チコセアラム（Erysiphe chicocearum）又はピチウム・トラケイフィルム（Pithium tracheiphilum）の１種に対して、以下の虫：ナソノビア・リビスニグリ（Nasonovia ribisnigri）、マイザス・ペルシカエ（Myzus persicae）、マクロシファム・エウフォルビア（Macrosiphum euphorbia）、ネマトデス・プラチレクス（Nematodes pratylenchus）又はネコブ線虫（meloidogyne）、ハモグリバエ（leafminers）リリオマイザ・フイドブレンシス（liriomyza huidobrensis）又はペンフィガス・ブサリウス（Pemphigus busarius）の１種に対して、以下の細菌：シュードモナス（pseudomonas）、キサントモナス（xanthomonas）又はリゾモナス（rhizomonas）の１種に対して、又は以下のウイルス：ＬＭＶ、ＴＳＷＶ、「ビッグベイン（Big vein）」、ＴＢＳＶ、ＬＮＳＶ、ＴｕＭＶ、ＣＭＶ又はＢＷＹＶの１種に対する、標準的又は中程度の耐性である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の種子。
【請求項１０】
前記種子が、異種接合状態で、標準的又は中程度の耐性である、第二の特徴的遺伝子を提示する、請求項８又は９に記載の種子。
【請求項１１】
前記標準的又は中程度の耐性遺伝子が、以下の、ブレミア（bremia）耐性遺伝子：Ｄｍ１０、Ｒ１７、Ｄｍ５／Ｄｍ８、Ｒ３６／Ｒ３７(クラスター１)、Ｄｍ１、Ｄｍ２、Ｄｍ３、Ｄｍ６、Ｄｍ１４、Ｄｍｌ５、Ｄｍｌ６、Ｄｍｌ８ (クラスター２)、又はＤｍ４、Ｄｍ７、Ｄｍ１１、Ｒ３８ (クラスター４)；又はＴｕＭＶ耐性のＴｕ遺伝子（クラスター１）；ナソノビア（Nasonovia）耐性のＮｒ遺伝子（クラスター２）；又はＬＭＶ耐性の遺伝子ｍｏｌ１、ｍｏｌ２（クラスター４）から選択される、請求項８又は１０に記載の種子。
【請求項１２】
雑種ラクツカ・サティバ植物であって、それが
雄性不稔性遺伝子型の異種接合体であるとともに、
検出可能な表現型を提供する、少なくとも１つの特徴的遺伝子の異種接合体であること、
を特徴とする植物。
【請求項１３】
前記雄性不稔性遺伝子型が核由来であり、且つ前記植物が雄性不稔性の原因である１又は複数の遺伝子の異種接合体である、請求項１２に記載の植物。
【請求項１４】
前記雄性不稔性が一遺伝子的である、請求項１３に記載の植物。
【請求項１５】
前記雄性不稔性の遺伝子が優性である、請求項１４に記載の植物。
【請求項１６】
前記雄性不稔性遺伝子型が不稔性遺伝子Ｍｓ７により提供される、請求項１２に記載の遺伝子。
【請求項１７】
雑種ラクツカ・サティバ植物由来の細胞であって、それが
雄性不稔性遺伝子型の異種接合体であるとともに、
植物中で検出可能な表現型を提供する、少なくとも１つの特徴的遺伝子の異種接合体であること、
を特徴とする細胞。
【請求項１８】
前記雄性不稔遺伝型が核由来であり、且つ前記植物が雄性不稔性の原因である１又は複数の遺伝子の異種接合体である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記雄性不稔性が一遺伝子的である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記雄性不稔性遺伝子が優性である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記雄性不稔性遺伝子型が不稔性遺伝子Ｍｓ７により提供される、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２２】
少なくとも105個の種子、好ましくは少なくとも106個の種子を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の種子の集団。
【請求項２３】
少なくとも107種子を含んでなる、請求項２２に記載の集団。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の種子を少なくとも40％含んでなる、ラクツカ・サティバ種子の集団。
【請求項２５】
その他の種子が雄性不稔性遺伝子を含まない、請求項２４に記載の集団。
【請求項２６】
雄性稔性植物による雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物の閉鎖環境中での授粉を実施するための、１ｍ2当たり100匹以上、又は１ｍ3当たり25匹以上の濃度での双翅目の虫の使用。
【請求項２７】
前記双翅目が、１ｍ2当たり少なくとも250匹、又は１ｍ3当たり少なくとも75匹の濃度で存在する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
雑種ラクツカ・サティバ植物を得るための、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物が、単一の優性遺伝子により、好ましくはＭｓ７雄性不稔性遺伝子によりもたらされる雄性不稔性を有する、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記雄性稔性植物がまた、ラクツカ・サティバ植物、好ましくは栽培品種である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
雑種ラクツカ・サティバ種子を得るための方法であって、
表現型的に「雌」親として使用される雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物、及び表現型的に「雄」親として使用される雄性稔性ラクツカ・サティバ植物を、互いに近接した状態で、閉鎖環境中で栽培するステップであって、２つの親の一方が、雄性不稔性以外の検出可能な表現型をそれに提供する遺伝子の同種接合体であるという追加的な特徴を有し、他方の親はこの遺伝子を保有しないものであるステップ、
植物の開花の際に、１ｍ2当たり100匹以上又は１ｍ3当たり25匹以上の濃度で、好ましくは１ｍ2当たり少なくとも250匹の又は１ｍ3当たり少なくとも75匹の濃度で、閉鎖環境へ導入する双翅目を用いて授粉するステップ、及び
雄性不稔性植物により作られる種子を収穫するステップ
を含んでなる方法。
【請求項３２】
第二の親も、他方の親が有しない、雄性不稔性以外の検出可能な表現型をそれに提供する少なくとも１の遺伝子の異種接合体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記導入する双翅目の濃度が、１ｍ2当たり400匹以上、好ましくは１ｍ2当たり50匹以上である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記双翅目を蛹の状態で導入する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記閉鎖環境が虫に対して密閉されている、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記双翅目が、短角類（ブラキセラ、brachycera）、好ましくはシクロラファ・ブラキセラ（cyclorhapha brachycera）である、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記双翅目がクロバエ（Calliphorides）又はイヌバエ（Muscidae）ファミリーに属する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記双翅目が、カリホラ・ボミタリア（Calliphora vomitaria）、カリホラ・エリトロセファラ（Calliphora erythrocephala）又はルシリア・カエサル（Lucilia Caesar）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
閉鎖環境中で、雄性不稔性植物の数が雄性稔性植物の数より多い、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
閉鎖環境中で、雄性不稔性植物の数が少なくとも2000であり、雄性稔性植物の数が少なくとも1000である、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
双翅目の導入を、少なくとも１週間に１度、３〜４週間にわたって繰り返す、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
雌親として使用される植物の雄性不稔性が一遺伝子起源、優性且つ核性であるとともに、雌親として使用される植物が以下の、
優性の核雄性不稔性遺伝子の異種接合体であるラクツカ・サティバ植物と、不稔性遺伝子を保有しない雄性稔性のラクツカ・サティバ植物との間で交配するステップ、
前記交配から得られる種子を栽培するステップ、及び
雄性稔性表現型を有する植物を除去するステップ、
を含んでなる方法により得られる、
請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記雄性稔性表現型を有する植物を除去するステップが、植物の各サンプルにおいて、雄性不稔優性遺伝子に特異的な分子マーカーの不存在を検出することにより実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
雌親として使用される植物の雄性不稔性がＭｓ７遺伝子により提供される、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
雌親として使用される植物のゲノムが、650〜700ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ配列を含んでなり、ここでその２本の鎖の各々の５'末端が配列 5' ＴＧＣＧＴＴＣＣＡＣ 3'（配列番号１）で開始する、請求項３１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも105個の種子、好ましくは106個の種子及びより好ましくは107個の種子を含んでなる、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の方法を使用して得られる種子の集団。
【請求項４７】
ＴＳＷ（1000種子質量、thousand seed weight）が、「雄」親として使用される雄性稔性ラクツカ・サティバ植物の自己受精により得られる植物のＴＳＷより、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％及びより好ましくは少なくとも30％大きい、請求項４６に記載の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雑種ラクツカ・サティバ（Lactuca sativa）種子及び当該種子の作製のための方法に関する。本発明はまた、雑種ラクツカ・サティバ植物、及び雑種ラクツカ・サティバ植物由来の細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
雑種強勢（Heterosis又はhybrid vigour）、恒常性（異なる環境における植物の安定性）、虫、真菌、細菌又はウイルスへの耐性、又は非生物ストレスへの適応、例えば極限温度、すなわち５℃未満又は30℃超の温度への耐性、又は微光レベルへの耐性を有する遺伝子蓄積の可能性は、雑種植物由来の種子を大スケールで作製するための、いくつかの理由を構成する。
【０００３】
特に、ラクツカ・サティバ（栽培品種レタス）において、問題の遺伝子が、同じ遺伝子座（各対立遺伝子の一方）又は非常に近接する遺伝子座に位置するため、同型接合系統における特定の耐性遺伝子を集積することが、不可能又は非常に困難であることが示されている。
【０００４】
雑種Ｆ１栽培レタスを得ること、特に同じ遺伝子座の様々な対立遺伝子、又は非常に近接する遺伝子座によりもたらされる、農業で注目の複数の相互優性（co-dominant）又は優性遺伝子を蓄積する、大スケールの雑種作製をさせることについては、大きな関心を集めるであろう。
【０００５】
ラクツカ（Lactuca）属は100種以上が含まれており、例えばラクツカ・サティバ（レタス、Lactuca sativa）（栽培品種）、ラクツカ・サリグナ（Lactuca saligna）（野生型種）、ラクツカ・セリオラ（Lactuca serriola）（野生型種）及びラクツカ・ビロサ（Lactuca virosa）（野生型種）がある。
【０００６】
ラクツカ・サティバ（レタス）は、種子作製は、98％が自己授粉による、ほとんどが自家生殖の二倍性種（２ｎ＝18）である。雄蕊（雄器官）は集団を形成し、葯の花粉嚢を開く雄蕊管を形成する。雌蕊（雌器官）は子房、花柱、及び二分された柱頭から構成される。開花時は、雄蕊管内部に花柱が伸びて、柱頭が花粉で覆われ、植物が自己受精する。一般的に１つのラクツカ・サティバ植物は、栽培条件次第で、0.5〜6グラム又は最大で10グラムもの種子を作製し、その１グラムには一般的に600〜1000個の種子が含まれる。
【０００７】
雑種植物の大スケールでの作製のための従来技術は、互いに近接する「親」として使用される２つの変種を栽培し、授粉のための虫を使用することからなり、雄性不稔性をもたらす一方の親が、自己授粉による汚染（contamination）を防止する。その後、雄性不稔性親から種子を収穫する。
【０００８】
この技術は、その組（parcel）の均一性を維持しながら、各親において異種接合状態で存在する注目の遺伝子を蓄積でき、そのＦ１世代は収穫段階で（開花前に）100％異種接合体の表現型である。
【０００９】
前記技術を用いて大スケールで栽培雑種レタス（ラクツカ・サティバ）を作製することは非常に困難であることが観察されている。これはラクツカ・サティバの花が、通常の授粉する虫、例えば特定種のハチ（ミツバチ）又はバンブルビー（bumble bee）（Bombus種）がまだ活動しない日中（早朝）の時間帯に、一度だけ、たった数時間、例えば１〜４時間しか開花しないことが原因である。
ラクツカ・サティバはまた、風による授粉はしない。
【００１０】
すなわち、雑種レタスの作製のために使用できる授粉する虫を確認することは、多数の問題に直面する。具体的には：
開花の期間が短く且つ早朝であるために、虫が花を訪れることの確認を困難にする。
開花が１度しかないために、最大数の雄性不稔花の受粉を確実にするためには、選択された授粉する虫が花を毎日訪れる虫でなければならない。
【００１１】
さらに、Ｆ１雑種の作製は、「雄」系及び「雌」系の供給が必要である。「雌」系は、当該植物の手作業で去葯することにより得ることができる。ただし、レタスの場合は、開花が１回で且つ非常に短期間（数時間）なので、この方法はかなりの労力を要するため、流通スケールでの実施は困難である。
【００１２】
「雌」系はまた、葯の不存在、空の葯又は生育不能花粉により、それ自身が発現する不稔性の遺伝子型（又は核型）又は細胞質型を誘導することにより得ることができる。
【００１３】
その作業において、Goubara及びTakasakiは、雑種ラクツカ・サティバレタスの作製のために使用できる、可能性ある授粉する虫を確認する目的で、野外及び閉鎖条件で実験を行った（Appl Entomo Zool 38(4), 571-581, 2003 [1]）。22種の虫が観察され（21種のハチ及び１種の吸蜜（nectar-feeding）ハエ種、シルフィダエ・エリスタリス・テナクス（syrphidae eristalis tenax））、そのうちハチのラジオグロッサム・ビロスラム・トリコプセ（lagioglossum villosulum trichopse）は最も可能性ある授粉する虫であることがわかった。
【００１４】
Goubara及びTakasakiはまた、閉鎖環境中にハチのラジオグロッサム・ビロスラム・トリコプセを存在させて、雄性不稔性遺伝子を有するレタスと雄性稔性レタスとの間で小スケールのハイブリダイゼーション試験を行った。その著者等は、雑種Ｆ１レタスは得られたが収率が非常に低かったことを報告している。
【００１５】
現時点では、授粉する虫を使用する雑種ラクツカ・サティバの作製実験で他に知られるものはない。
今日、Ｆ１雑種レタス変種で、流通スケールで作製されているものはない。
【００１６】
本発明との関連において、以下の用語は以下の意味を有する。
「栽培レタス」は、ラクツカ・サティバ種を意味する。基本的な栽培レタスの５つの栽培品種群（cultigroups）が存在する（図１を参照）：ラクツカ・サティバ変種 アングスタナ（angustana）（アスパラガス(asparagus）レタス）; ラクツカ・サティバ変種 カピタタ(capitata）（バターヘッド(butterhead）レタス）; ラクツカ・サティバ変種 クリスパ（crispa）（バタビア(batavia）又はアイスバーグ（Iceberg）レタス); ラクツカ・サティバ変種 ロンギフォリア(longifolia）（ロマイネ(Romaine）レタス）及びラクツカ・サティバ変種 アセファラ(acephala）（フリシー(frisee）レタス、カッティング（cutting）レタス）。本発明は、これらの様々な型のレタスの各々の使用を包含する。
【００１７】
「授粉（受粉）（pollinization）」は、葯からの花粉を、同じ花又は別の花の柱頭に移転することを意味する。この生殖系は花を有する植物の繁殖の好ましい態様である（被子植物及び裸子植物）。花粉の粒を柱頭に到達させ、その後、それを受精させるために、花柱を通って、胚珠に到達する花粉管を形成させる。
【００１８】
「自己授粉」は、自身の持つ花粉を用いる個体又は生物型の授粉を意味し、その結果当該個体は自己授粉したと言われる。
「自家生殖の」なる用語は、２つの配偶子が同じ個体に由来する、植物の自己授粉する能力を意味する。
「他殖性の」は、ある個体の花が他の１又は複数の個体からの花粉で受精する表現型を意味する。
「授粉する虫」は、花の研究において（例えば蜜を研究する場合）、雄蕊を摺ることにより花粉の数粒を収穫し、その後これを別の花に置いてくる虫を意味する。
【００１９】
「遺伝子座」は、染色体上での遺伝子又は対立遺伝子により占められる場所を意味する。
「対立遺伝子」は、所与の染色体位置（遺伝子座）に位置する特定の遺伝子内での変異である。遺伝子の異なる対立遺伝子は、異なる形質の発現をもたらす。
【００２０】
「クラスター」は、同じ染色体上に互いに近接して位置する２以上の遺伝子を意味する。レタスにおいて確認された耐性遺伝子のクラスターは、特にKesseli等により報告されている[12]。
「優性遺伝子」は、１対の２つの染色体に存在するか１つだけに存在するかにかかわらず、表現型を提供する遺伝子を意味する。
「劣性遺伝子」は、それが２つの相同染色体のうちの各々に存在する場合、１の表現型のみを提供する遺伝子を意味する。
「相互優性（co-dominanace）」は、２つの対立遺伝子が決定する表現型的特徴の、一方及び他方を発現する遺伝子特性を意味する。異種接合体において、物質が２つの相互優性の対立遺伝子を有すると、遺伝子型はこれらの遺伝子によりもたらされた情報に従ってその表現型で完全に発現する。
「異種接合体」は、染色体の同じ対の既定の遺伝子座上の２つの異なる対立遺伝子を有する細胞又は個体を意味する。
「同型接合体」は、染色体の同じ対の規定の遺伝子座上の２つの同一の対立遺伝子を有する細胞又は個体を意味する。
「雑種」なる用語は、異なる遺伝子構成の、好ましくは同一種由来の個体間の交配産物を意味する。
【００２１】
「Ｆ１雑種」なる用語は、異なる遺伝子構成の個体間の交配から得られる第一世代を意味する。結果としてＦ１雑種は、少なくとも１の遺伝子の異種接合体である。
「戻し交配」は、雑種とその親の一方との間の交配を意味する。
「栽培品種」は、ある変種を意味する。
「遺伝子型」は、個体からもたらされた遺伝物質であって、その遺伝形質を構成するものの全てを意味する。
「表現型」は、遺伝子型の発現比率と外部環境により決定される現象の両方に対応する、個体の、明らかな形態的又は機能的特徴の組を意味する。
「農業で注目の表現型」なる用語は、例えば２つの同型接合遺伝子型間での交配から得られた表現型であって、農業的観点から注目の特性、例えば様々な病原菌又は虫への耐性の蓄積、雑種強勢（すなわち、雑種形質の平均は、２つの親のものの平均より高い）、恒常性、非生物ストレスに適応する能力、形態学的特徴、例えば色、形、葉の柔軟性又は剛性の性質、栄養組成物又は植物の味質等を伴う表現型を意味する。
「雑種強勢（heterosis又はhybrid vigour)」とは、Ｆ１雑種が、一又は複数の特徴の点で、特に強勢（vigour）に関して、その最良の親よりも顕著に優勢である表現型を意味する。
「恒常性」とは、環境又は複数の環境的特徴まで適応する、植物の能力を意味する。
「不稔性雄」とは、花の雄的要素の不稔性が原因で、自己授粉により繁殖できない植物を意味する。例としては、花粉が非機能的である、又は雄性繁殖器官、例えばタペータム構造的異常がある可能性がある。
「細胞質雄性不稔性」とは、細胞質型の遺伝により、その母から均一に遺伝する不稔性を意味する。
「核（又は遺伝子的）雄性不稔性」とは、劣性遺伝又は優性遺伝のいずれに依存してもよいが、核のＤＮＡによりもたらされる、メンデル遺伝による不稔性を意味する。
「一遺伝子的雄性不稔性」とは、単一の遺伝子によりもたらされる雄性不稔性を意味する。
「多遺伝子的雄性不稔性」とは、複数の遺伝子によりもたらされる雄性不稔性を意味する。
「耐性」とは、病原又は有害生物にとって、類似する環境且つ圧力条件下で、感受性の高い変種と比較して、既定の病原又は有害生物及び／又はそれが引き起こす障害の増殖及び発展を制限する様々な能力を意味する。ただしこれらの変種は、病原又は有害生物の圧力が高い場合、病気のいくつかの症状又はいくつかの障害を発現する可能性がある。
「標準的又は高い耐性」とは、感受性の高い変種と比較して、通常の圧力条件下で既定の病原又は有害生物の増殖又は発展を強力に制限する様々な能力を意味する。ただし、これらの変種は、病原又は有害生物の圧力が高い場合、症状又は障害を発現することもある。
「中程度又は調整的な耐性」とは、既定の病原又は有害生物の増殖及び発展を制限するが、高い／標準的な耐性変種と比較すると、症状又は障害をより発現し得る能力を意味する。中程度の耐性変種は、類似する環境及び／又は病原又は有害生物にとっての圧力条件下で、感受性の高い変種で観察されたものより、重篤性の低い症状又は障害を示す。
「分子マーカー」とは、個体の全ゲノムにおいて確認され得る、及び注目の遺伝子を局在化させるために、又は親生物からのある特定の特徴が遺伝した個体であるかを検証するために使用できる、ＤＮＡの特定の断片を意味する。それはコード配列であってもそうでなくてもよい。遺伝的交配において、注目の遺伝子は、一般的に分子マーカーと連結した状態である。つまり、分子マーカーの検出とは、注目の遺伝子が存在する個体が、その遺伝子の配列を知る必要なく、セレクションできることを意味する。
【００２２】
農学分野において、分子マーカーの使用は、植物が所望の特徴を保持することを、セレクションの際、迅速に試験できることを意味する。特定の場合において、形質に関連するマーカーの存在により、特定の試験又は表現型の観察が不必要になる。具体的には、雄性不稔性遺伝子のための、好ましくは雄性不稔性の優性遺伝子のための、特定の分子マーカーを使用することで、開花前の雄性不稔性植物を早期にセレクションできる。このセレクションは、例えば雄性不稔性の優性遺伝子を使用する場合、雑種種子の作製のための、「雌」（雄性不稔性）と推測される親として使用される植物の集団の一部を形成し得る、雄性稔性植物を除去することができ、その結果、これらの雄性稔性植物の自己受精に結びつく汚染のリスクを低減できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、雄性不稔性遺伝子型を有するとともに、雄性不稔性に関与せず、且つその植物に検出可能な表現型を提供する少なくとも１つの遺伝子との異種接合体であることを特徴とする、雑種ラクツカ・サティバ植物由来の種子、植物及び細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ラクツカ・サティバの系統図。
【図２】試行１で「雄」及び「雌」親として使用されたレタスの性質。
【図３】試行２で「雄」及び「雌」親として使用されたレタスの性質。
【図４】試行１０から得られた50個の雑種植物の遺伝子型決定。ＴａｇＩとの消化処理後の、分子マーカーＳＣＷ０９の増幅プロファイル。ＳＣＷ０９マーカーは、ブレミア・ラクツカエに耐性のあるＤｍ６及びＤｍ８を標識する。Ａ＝Ｄｍ１８＋／Ｄｍ１８＋コントロール、Ｂ＝Ｄｍ１８−／Ｄｍ１８−コントロール、Ｃ＝Ｄｍ６＋コントロール、Ｄ＝ＴａｑＩでの消化処理なし。
【図５】試行１０から得られた50個の雑種植物の遺伝子型決定。ブレミア・ラクツカエに耐性のあるＤｍ３遺伝子を標識する分子マーカーＢ１の増幅プロファイル。Ａ＝Ｄｍ３＋コントロール、Ｂ＝Ｄｍ３−コントロール。
【図６】マーカーＢＡ０５−６７５（矢印）を伴うＯＰＢＡ０５プライマーの電気泳動プロファイル。1.0％アガロースゲル電気泳動、190Ｖで１時間45分。Ｍ：100bpラダー分子量マーカー（Pharmasica Biotech、27.4001.01参照）。
【図７】レタス、ラクツカ・サティバにおけるＭｓ７遺伝子座に関連するＢＡ０５−６７５分子マーカーのマッピング（Kosambi関数を用いて計算した距離）。
【図８】レタス、ラクツカ・サティバにおけるＭｓ７遺伝子座に関連するＢＡ０５−６７５分子マーカーの５'〜３'ヌクレオチド配列（配列番号２）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ラクツカ・サティバ植物由来の、種子、植物又は細胞によりもたらされた雄性不稔性は、核又は細胞質起源であってよい。それが細胞質性である場合、その不稔性は雌親から遺伝する。これは細胞質に存在するミトコンドリアと核遺伝子との間の相互作用に起因することが多い。細胞質雄性不稔性は、雄親のゲノムで稔性を回復する遺伝子の不存在下で、100％雄性不稔性の表現型を有する子孫の出現により特徴付けられる。雄性不稔性は、「雄」親のゲノムにおける稔性回復遺伝子 （restoring gene （Rf））の存在によって、その子孫で回復してもよい。
【００２６】
より具体的には、本発明は雄性不稔性遺伝子型が、少なくとも１の核遺伝子を含み、且つその種子、細胞又は植物が、雄性不稔性の原因であるその１又は複数の遺伝子の異種接合体である場合に関する。
核雄性不稔性は、その核のＤＮＡから遺伝した雄性不稔性の、１又は複数の遺伝子により引き起こされ、この１又は複数の遺伝子は、優性でも劣性でもあり得る。
【００２７】
これら雄性不稔性の遺伝子には、Ryderによる（J Am Soc Hort Sci 96(6), 826-828, 1971 [8]）に記載の、優性核遺伝子Ｍｓ７がある。当該雄性不稔性植物は、異種接合体Ｍｓ７ｍｓ７である。稔性植物は、同種接合体ｍｓ７ｍｓ７である。優性のＭｓ７Ｍｓ７同種接合体の獲得は、不可能とは言わないまでもかなり困難である。さらに、Ryderによればこの雄性不稔性の優性形質は、雑種レタスの作製のためにこの遺伝子を使用することについて問題がある。本発明の方法を使用して獲得されるラクツカ・サティバ種子のサンプルで、ＮＣＩＭＢ（NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, A21 9YA, スコットランド、英国）に２００７年２月１３日に、受託番号NCIMB 41470で寄託されたサンプルを、Ｍｓ７遺伝子の源とした。さらに、本発明者等により開発された分子マーカーRAPD BA05-675 （配列番号２）は、次の交配のために使用されるはずの雄性不稔性植物を確認するための、開花前の初期段階で実施されるべき分子試験を可能にするので、雄性不稔性レタス植物Ｍｓ７のセレクションを補助の点で特に注目される。この図８に示される配列のマーカーの検出は、全てのレタス類型を共に考慮すると、平均で96％の事例において雄性不稔性植物の確認ができる（表１８）。
【００２８】
雄性不稔性のための３つの劣性遺伝子、ｍｓ１、ｍｓ２及びｍｓ３はまた、Lindqvist の（Heriditas 46 :387- 470, 1960 [3]）により、他の３つ、ｍｓ４、ｍｓ５及びｍｓ６は、Ryder (Proc. Am. Soc. Hort . Sci 83 : 585-595, 1963 [6], Proc . Am. Soc. Hort. Sci 91 : 366-368, 1967 [7])により確認されている。ただし、1979年に公表された彼の研究（Leafy Salad Vegetables, p 30 [9]）で、Ryderは、不稔性遺伝子ｍｓ１、ｍｓ２、ｍｓ３、ｍｓ４、ｍｓ５、ｍｓ６及びＭｓ７は全て核性であるため、Ｆ１雑種を作製するために使用できることが全く見込めない。これにもかかわらず、本発明者等は、核起源の雄性不稔体を使用する、雑種の種子、植物及び細胞を獲得することに成功した。
【００２９】
核雄性不稔性は、多遺伝子的であっても一遺伝子的であってもよい。多遺伝子的である場合、例えば上記記載のｍｓ１、ｍｓ２及びｍｓ３遺伝子の集積による、劣性遺伝子の複合体を使用して獲得してもよい。好ましくは、本発明は、雄性不稔性が一遺伝子的である場合に関する。
核雄性不稔性は、優性であっても劣性であってもよい。具体的には、本発明は雄性不稔性が優性の一遺伝子的である場合に関する。より具体的には、本発明は雄性不稔性が、上記記載の優性のＭｓ７遺伝子により提供される場合に関する。
【００３０】
好ましくは、本発明の種子、植物又は細胞のゲノムは、650〜700ヌクレオチドの、例えば655〜695、660〜690、665〜685、670〜680、673〜677ヌクレオチドの、又は674、675又は676ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ配列を含んでなり、ここで、各２つの５'末端は、配列「５' ＴＧＣＧＴＴＣＣＡＣ ３'」（配列番号１）から開始する。好ましい実施態様によれば、本発明の種子、植物又は細胞のゲノムは、図８（配列番号２）に示したヌクレオチド配列を含んでなるか、又は１〜10個の、好ましくは１〜５個の又はより好ましくは１〜３個のヌクレオチドが他のものにより置換、削除又は付加される、この配列に由来する配列を含んでなる。
【００３１】
好ましくは、本発明は、１又は複数の異種接合遺伝子により提供された検出可能な表現型が、農業で注目の表現型、例えば様々な病原又は虫に対する耐性、雑種強勢、恒常性（異なる環境での植物の安定性）、非生物ストレス、例えば極限温度又は微光レベルへの適応、雑種由来の変種のものより高い収率、形態的特長、例えば色、形、大きさ、葉の柔軟性もしくは剛性の性質、栄養組成物又は植物の味質等である場合に関する。
【００３２】
さらに、驚くべきことに本発明者等は、異なるレタス間での様々な交配から得られる本発明の種子由来の植物は、冬期に且つ温暖な地域での栽培で、同じ条件下で栽培した親植物より平均で７〜10日早く成熟に到達し、より早く生育することを観察した。Ｆ１雑種の組の中で（intraparcel）発育の均一性（１組当たりおよそ30植物の株でのもの）は、組系列（親植物）のものより高いことも観察された。言い換えると、同じ組由来の全ての植物と比較して遅延又は向上した発育を示す植物の数は、変種系列由来の組よりも、Ｆ１雑種の組の方がかなり少なかった。結果として、これらのＦ１雑種の特徴は、レタス作製周期を短縮できるだけでなく、収穫を短期間に集中させることができる。
【００３３】
農業で注目の表現型は、ウイルス、細菌、虫又は真菌による感染に対して、より具体的には以下の真菌：ブレミア・ラクツカエ（Bremia lactucae）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、スクレロチニア・マイナー（Sclerotinia minor）もしくはスクレロトラム（sclerotorum）、又はボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、リジクトニア・ソラニ（Rhizictonia solani）、ミクロドシウム・パナットニアナム（Microdochium panattonianum）、ベルチシウリウム・ダリアエ（Verticiulium dahliae）又はエリシフェ・チコセアラム（Erysiphe chicocearum）又はピチウム・トラケイフィラム（Pithium tracheiphilum）の１種に対して、以下の虫：ナソノビア・リビスニグリ（Nasonovia ribisnigri）、マイザス・ペルシカエ（Myzus persicae）、マクロシファム・ユーフォルビア（Macrosiphum euphorbia）、ネマトドス・プラチレンカス（Nematodes pratylenchus）、又はネコブ線虫（meloidogyne）、ハモグリバエ（leafminers）：リリオミザ・フリドブレンシス（Liriomyza huidobrensis）又はペンフィガス・ブサリウス（Pemphigus busarius）の１種に対して、以下の細菌：シュードモナス（pseudomonas）、キサントモナス（xanthomonas）又はリゾモナス（rhizomonas）の１種に対して、又は以下のウイルス：ＬＭＷ（レタスモザイクウイルス）、ＴＳＷＶ（鉢植えトマト立ち枯れ病ウイルス）、「ビッグ・ベイン」（ＬＢＶＶ(レタスビッグベインウイルス）及びＭＩＬＶ（ミラフィオリ（mirafiori）レタスウイルス）からなる）、ＴＢＳＶ（トマト茂み（bushy）発育阻害ウイルス）、ＬＮＳＶ（レタス壊死発育阻害ウイルス）、ＴｕＭＶ（カブモザイクウイルス）、ＣＭＶ（カボチャモザイクウイルス）又はＢＭＹＶ（ビート西洋黄色（beet western yellows）ウイルス）の１種に対する、標準的又は中程度の耐性である１又は複数の遺伝子から提供されてもよい。
【００３４】
農業で注目の表現型は、ウイルス、細菌、虫又は真菌による感染に対して、標準的又は中程度の耐性のある１又は複数の遺伝子から提供され、この表現型を提供する当該又は前記の標準的又は中程度の耐性のある遺伝子は、具体的に、ブレミア Ｄｍ１０、Ｒ１７ｍ、Ｄｍ５、Ｄｍ８、Ｒ３６、Ｒ３７（ラクツカ・サティバのクラスター１上に位置する遺伝子）、Ｄｍ１、Ｄｍ２、Ｄｍ３、Ｄｍ６、Ｄｍ１４、Ｄｍ１５、Ｄｍ１６、Ｄｍ１８、（ラクツカ・サティバのクラスター２上に位置する遺伝子）、Ｄｍ４、Ｄｍ７、Ｄｍ１１、Ｒ３８（ラクツカ・サティバのクラスター４上に位置する遺伝子）への耐性遺伝子；又はクラスター１上に位置するＴｕＭＶに耐性のあるＴｕ遺伝子；クラスター２上に位置するナソノビアに耐性のあるＮｒ遺伝子；又はクラスター４上に位置するＬＭＶに耐性のあるｍｏｌ．１及びｍｏｌ．２遺伝子、から選択してもよい。上記のクラスター１、２及び４は、Michelmore R.W.による（Plant Pathol, 1987, vol. 36, no4 : 499-514 [4], Theor . Appl. Genet., 1993, vol. 85, No 8 : 985-993 [5]）で定義されている。
【００３５】
より具体的には、農業で注目の表現型は、レタスを侵す病気、ブレミア・ラクツカエ、白色を引き起こす真菌、枝内面に落下粉末（powdery down on the inner face of the limb）の１つに対し、標準的又は中程度の耐性のある、１又は複数の遺伝子により提供されてもよい。さらに、ブレミアは、高度に適応でき、植物繁殖者によってその変種に既に導入された耐性を征服できる、新規な品種の出現をもたらす。
【００３６】
より好ましくは、本発明は、ラクツカ・サティバ植物の種子、植物又は細胞が、雄性不稔性に関与せず、且つ検出可能な表現型を提供する、少なくとも２つの遺伝子の異種接合体である。さらにより好ましくは、検出可能な表現型を植物に提供する２以上の遺伝子は、同じクラスターに、例えばラクツカ・サティバのクラスター１、２又は４の耐性遺伝子のクラスター上に位置する。
【００３７】
本発明はまた、雄性不稔性遺伝子型であるとともに、雄性不稔性に関与せず、且つ当該種子由来の植物を検出可能な、少なくとも１つの遺伝子の異種接合体であり、任意に上記の種子の追加の特徴を有する、雑種ラクツカ・サティバ種子集団であって、少なくとも105個の種子、好ましくは少なくとも106、及びより好ましくは少なくとも107個の種子を含んでなるような、種子集団に関する。
【００３８】
種子を２つのラクツカ・サティバ植物の交配により得る場合、このうちの１つ（「雌」親）は１又は複数の優性遺伝子により提供される核雄性不稔性をもたらし、「雌」親として使用される植物は、不稔性遺伝子の異種接合体であることが必要である。実際は、１又は複数の優性の雄性不稔性遺伝子の同種接合体となるものとして、交配により得られる「雌」親として使用される植物由来の当該２つの植物は、自身が雄性不稔性の遺伝子のキャリアとなるはずである。ただし、その場合はこれらの２つの植物間の交配は不可能である。
【００３９】
結果として、一方（その「雌」親は）は１又は複数の優性遺伝子から提供される核雄性不稔性のキャリアである、２つの型のラクツカ・サティバ植物の間の交配から得られる本発明の種子集団は、減数分裂中の染色体の分離現象が原因で、１又は複数の雄性不稔性の優性の遺伝子を保有するラクツカ・サティバ種子、及び当該１又は複数の遺伝子を保有しない種子からなる。一般的に「雌」親によりもたらされる雄性不稔性が一遺伝子的且つ優性である場合、不稔性雄性種子の割合は少なくとも40％である。
【００４０】
本発明は、発明者等による以下の観察により生まれた。すなわち双翅目はラクツカ・サティバの花に定常的に授粉する虫ではないが、さらにその蜜を餌とすることは知られておらず、これらの虫、具体的な種としては、カリホラ・ボミタリア（Calliphora vomitaria）、カリホラ・エリトロセファラ（Calliphora erythrocephala）、及びルシリア・カエサル（Lucilia Caesar）は、閉鎖環境に過剰数を導入すると、ラクツカ・サティバの花粉授粉者としてふるまうという観察である。
【００４１】
さらに本発明は、具体的には雑種ラクツカ・サティバ植物を得る観点で、閉鎖環境で雄性稔性植物により雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物の授粉を行うための、双翅目の使用に関する。好ましくは、使用される雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物は、単一の優性遺伝子により、好ましくは上記の雄性不稔性Ｍｓ７によりもたらされる雄性不稔性を有する。使用される稔性雄性植物は、好ましくはラクツカ・サティバ植物であり、より好ましくは栽培品種である。
【００４２】
本発明の閉鎖環境は、具体的には温室、ケージ又はトンネルであってもよく、好ましくは30ｍ2以上の、より好ましくは300ｍ2以上の、例えば30〜1500ｍ2又は50〜1000ｍ2の表面積である。閉鎖環境の高さは、通常、2ｍ〜4ｍの範囲であり、好ましくは2.5ｍ〜3.5ｍ、例えば3ｍである。具体的には、換気、散水、温度制御及び光レベル制御のための手段があってもよい。好ましくは、当該閉鎖環境は、虫に対して密閉するように封じられる囲いである。
【００４３】
使用される双翅目は、好ましくは１ｍ2当たり少なくとも100匹、好ましくは１ｍ2当たり少なくとも250匹、例えば１ｍ2当たり100〜1000匹の濃度で存在させるべきである。この濃度はまた、１ｍ3当たりの双翅目の数として決定してもよく、好ましくは、１ｍ3当たり少なくとも25匹、より好ましくは１ｍ3当たり少なくとも50匹、さらに好ましくは１ｍ3当たり少なくとも75匹、例えば１ｍ3当たり25〜500匹、１ｍ3当たり75〜250匹でもよい。
【００４４】
本発明はまた、雑種ラクツカ・サティバ種子を獲得するための方法であって、
表現型的に「雌」親として使用される雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物、及び表現型的に「雄」親として使用される雄性稔性ラクツカ・サティバ植物を、互いに近接した状態で、閉鎖環境中で栽培するステップであって、２つの親の一方が、雄性不稔性以外の検出可能な表現型をそれに提供する遺伝子の同種接合体であるという追加的な特徴を有し、他方の親はこの遺伝子を保有しないものであるステップ、
植物の開花の際に、１ｍ2当たり100匹以上の濃度で、好ましくは１ｍ2当たり少なくとも250匹の濃度で、閉鎖環境へ導入する双翅目を用いて授粉するステップ、及び
雄性不稔性植物により作られる種子を収穫するステップ、
を含んでなる方法に関する。
【００４５】
好ましくは、第二の親はまた、他方の親からはもたらされない、雄性不稔性以外の検出可能な表現型をそれに提供する少なくとも１つの遺伝子の異種接合体である。好ましくは、当該閉鎖環境は、虫に対して密閉するように封じられる囲いである。
【００４６】
最良の結果は双翅目が過剰の場合に観察され、さらにその濃度は、好ましくは１ｍ2当たり400匹以上、より好ましくは１ｍ2当たり500匹以上である。
【００４７】
双翅目は卵期、幼虫期、蛹期又は成虫期に導入してよい。好ましくは、これらを蛹の状態で導入する。
使用する双翅目は好ましくは短角類（brachycera）であり、例えばシクロラファ・ブラキセラ（cyclorhapha brachycera）、より好ましくはイエバエ科（Muscidae）又はクロバエ科（Calliphoride）由来の短角類、例えばカリホラ・ボミタリア（Calliphora vomitaria）、カリホラ・エリトロセファラ（Calliphora erythrocephala）又はルシリア・カエサル（Lucilia Caesar）である。
【００４８】
双翅目の導入が、少なくとも１週間に１回、好ましくは１週間に２回、少なくとも３〜４週にわたって繰り返されると、通常より良好な収率が得られる。
同様に、閉鎖環境中での雄性不稔性植物の数が、雄性稔性植物の数より大きくなると、通常より良好な収率が得られる。閉鎖環境中の雄性不稔性植物の数は、例えば少なくとも200、及び雄性稔性植物の数は、例えば少なくとも1000である。
【００４９】
本発明の方法の実施において、２つの親の開花が同時に起こることが必要である。これはこの形質のためのセレクションにより、又は適切な栽培技術を使用することにより達成できる。
【００５０】
好ましくは、雌親として使用する植物の雄性不稔性は、一遺伝子的、優性及び核性であり、より好ましくは遺伝子Ｍｓ７により提供される。
好ましくは、雌親として使用する植物のゲノムは、650〜700ヌクレオチドの、例えば655〜695、660〜690、665〜685、670〜680、673〜677ヌクレオチドの、又は674、675又は676ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ配列を含んでなり、ここで、各２つの５'末端は、配列「５' ＴＧＣＧＴＴＣＣＡＣ ３'」（配列番号１）から開始する。好ましい実施態様に従うと、「雌」親として使用する植物のゲノムは、図８に示すヌクレオチド配列（配列番号２）を含んでなるか、又は１〜10個の、好ましくは１〜５個又はより好ましくは１〜３個のヌクレオチドが他のものにより置換、削除又は付加される前記配列に由来する配列を含んでなる。
【００５１】
上記の説明の通り、減数分裂中の染色体の分離現象が原因で、従来の交配技術では、雄性不稔性の優性遺伝子を保有し、「雌」植物として使用される植物の同種接合体集団を得ることはできない。結果として、雄性不稔性の優性遺伝子を使用する場合、雌親として使用される植物は、
核雄性不稔性の優性遺伝子の異種接合体であるラクツカ・サティバ植物と、不稔性遺伝子を保有しない雄性稔性のラクツカ・サティバ植物との間で交配するステップ、
当該交配から得られる種子を栽培するステップ、及び
雄性稔性表現型を有する植物を除去するステップ、
を含んでなる方法により得ることができる。
【００５２】
この雄性稔性表現型を有する植物を除去するステップは、例えば、雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物を、雄性稔性ラクツカ・サティバ植物から識別可能とする可視的な特徴に基づき、手作業で行ってもよい。例としては、Ｍｓ７遺伝子に関連する不稔性の場合、雄性不稔性植物の花頭は、雄性稔性植物のそれより長時間開いており、その雄性不稔性植物は花粉を持たないという事実を有効に用いることにより、分類を行ってもよい。
【００５３】
代替の実施態様に従えば、雄性稔性表現型の植物を除去するステップは、各植物のサンプルにおける雄性不稔性の優性遺伝子に特異的な分子マーカーの不存在を検出することにより行う。例えばそれは、約675塩基対（例えば650〜700、655〜695、660〜690、665〜685、670〜680、673〜677、674、675又は676塩基対）の長さの、２本鎖の各々の５'末端は、配列「５' ＴＧＣＧＴＴＣＣＡＣ ３'」（配列番号１）で開始する、ＲＡＰＤ（多形ＤＮＡのランダム増幅（random amplification of polymorphic））マーカーであって、例えば発明者等により開発されたマーカーＢＡ０５−６７５（配列番号２）又はＳＣＡＲ（配列特徴付け増幅領域（sequence characterized amplified region））マーカー、ＣＡＰＳ（開裂増幅多形配列（cleaved amplified polymorphic sequence））マーカー、又はこのＲＡＰＤマーカーを用いて開発したＳＴＳ（配列タグ化部位（sequence tagged site））として一般的に設計された任意の他のマーカーがある。
【００５４】
好ましい実施態様によれば、雄性不稔性の優性遺伝子の特異的分子マーカーの存在又は不存在の検出は、雌親として使用される植物の開花前に、好ましくは植物の生育の初期段階に、例えば１〜５葉期に、又はより好ましくは１〜２葉期に行う。
【００５５】
さらに好ましくは、使用される分子マーカーは、少なくとも70％、75％、80％、85％、95％、98％又は99％、又は100％もの感受性のある雄性不稔性植物を検出でき、その感受性は、分子マーカーを有する雄性不稔性植物（真陽性）の数と、真陽性の数と分子マーカーを有さない雄性不稔性植物（偽陰性）の数の総和との間の比率として定義される（表１７を参照）。
【００５６】
一般的に、本発明の方法を用いて得られた種子のＴＳＷ（1000種子質量（thousand seed weight））は、「雄」親として使用される雄性稔性ラクツカ・サティバ植物の自己受精により得られた種子のＴＳＷより、少なくとも10％、又は少なくとも20％又は少なくとも30％大きい。
【００５７】
本発明はまた、上記記載の方法を用いて得ることができる種子集団で、少なくとも105個の種子、好ましくは106個の種子、及びより好ましくは107個の種子含んでなる集団に関する。
【実施例】
【００５８】
実施例１：雑種レタス種子の獲得
「雌」親として以下に記載の種々の試行で使用される雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物は、Ｍｓ７不稔性遺伝子を保有した。当該植物は、ＩＮＲＡ、ＵＳＤＡ等の種々の研究組織から入手できるＭｓ７遺伝子（X Girelle 94-9538-1）を保有する温室バターヘッドレタスの第５代戻し交配（ＢＣ５）由来であった。
【００５９】
Ｍｓ７遺伝子は優性であるため、Ｍｓ７遺伝子を保有する２つの植物間の交配は不可能である。結果として、雄性不稔性表現型を有する植物は、Ｍｓ７遺伝子の異種接合体である必要があり、Ｍｓ７／ｍｓ７（不稔性）とｍｓ７／ｍｓ７（稔性）植物との間で交配することによってのみ、得ることができる。
【００６０】
結果として、雄性稔性植物を除去するための精製ステップが必要となる。この後者のステップは、Ｍｓ７／ｍｓ７植物が花粉を持たず、且つＭｓ７／ｍｓ７植物の花頭はｍｓ７／ｍｓ７植物のそれよりも長期間開いたままであるため、可能となった。
【００６１】
試行１
第一の試行の環境としては、
Ｎａｃｒｅ／Ｃａｍｂｒｉａ Ｄｍ１８／Ｒ３８栽培品種（クラスター２からのＤｍ１８耐性遺伝子及びクラスター４からのＲ３８耐性遺伝子）由来のバターヘッドレタスとの、Ｍｓ７バターヘッドレタスの第３代戻し交配（ＢＣ３）由来の450個の温室バターヘッドレタスラクツカ・サティバ植物は、ブレミア・ラクツカエ品種２４（Ｂl24）に感受性の高い組み合わせであり、これが「雌」親として使用され（その約半分は不稔性雄）；及び
ＢＲＡ Ｄｍ１８／Ｒ３７温室バターヘッド栽培品種（クラスター２からのＤｍ１８耐性遺伝子及びクラスター１からのＲ３７）由来の100個のラクツカ・サティバ植物は、Ｂ124に対して耐性のある組み合わせであり、「雄」親として使用された。
この２つの遺伝的父はまさに同時に開花し、これは受精を可能な限り均一にできることを意味する。
【００６２】
植物を36ｍ2の虫を密閉して封じる囲いの中に（湿度及び温度制御を備えるダッチ型温室で、11ｍ×3.30ｍ）、以下の通りに（図２を参照）配置した。
「雄」親として使用される植物を、密封囲いの端に沿って２列に配置し、植物は20cmずつ間隔をあけ、及び
「雌」親として使用される植物を、「雄」植物の２列の間であって、そこから50ｃｍの距離の点に、７列で配列し、植物は15cmずつ、且つ列は25cmずつ間隔をあけた。
【００６３】
播種は13週目に、植え付けは16週目に行った。
Ｍｓ７遺伝子の優性性質のための、雄性稔性表現型を持つ雌親として使用される植物の精製（除去）のためのステップが必要であった。本ステップは、Ｍｓ７／ｍｓ７植物が花粉を持たず、Ｍｓ７／ｍｓ７（雄性不稔性）植物の花頭が、ｍｓ７／ｍｓ７植物（雄性稔性）のものより長期間開いた状態であるという事実を利用して、主に26週と27週の間で行った。
雌親として使用される450植物のうち、217は雄性不稔性であり、効率的に使用された。
【００６４】
２種類の双翅目クロバエ科の虫を授粉する虫として使用した。
「ウジ虫（maggots）」として知られる（キンバエ（bluebottle）又はニクバエ（blowflie）としても知られる）、カリホラ・ボミタリア及びカリホラ・エリトロセファラハエは、15〜20℃で取り扱い、及び
「ピンキーズ（pinkies）」として知られるラクツカ・カエサーハエ（キンバエ（greenbottle）としても知られる）は、20〜25℃で取り扱った。
授粉する虫は、28週〜31週の間に隔週で、ハエが１ｍ2当たり300匹となる濃度で添加した。
自己授粉制御として使用される、雄性不稔性植物（「雌」親）及び雄性稔性植物（「雄」親）も、33週で収穫した。植物を乾燥させ、脱穀し、その後種子の洗浄を完了させるとともに残存した軽量ごみを除去するため、パルスエアのカラムを通し、重さと幅を調整した。
【００６５】
試行１で得られた2500種子のサンプルを、２００７年２月１３日にＮＣＩＭＢ（NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, A21 9YA,スコットランド、英国）に、受託番号ＮＣＩＭＢ 41470で寄託した。
【００６６】
試行２
同様に第二の試行を、336ｍ2の虫を密閉して封じる囲いの中で（長さ：56ｍ、幅：6ｍ、高さ：3ｍ）、より大きなスケールで実施した。
【００６７】
第二の試行の環境としては、
Ｎａｃｒｅ／Ｃａｍｂｒｉａ Ｄｍ１８／Ｒ３８栽培品種との、Ｍｓ７バターヘッドレタスの第４代戻し交配（ＢＣ４）由来の30000個の温室バターヘッドレタスラクツカ・サティバ植物、ブレミア（Ｂl24に感受性の高い組み合わせ）を、「雌」親として使用し（その約半分は雄性不稔性である）；及び
Ｂ124に対して耐性のある、ＢＲＡ Ｄｍ１８／Ｒ３７温室バターヘッド栽培品種由来の1500個の対応する（parallel）植物を、「雄」親として使用した。
【００６８】
植物を以下の通りに密封囲い中に配列した（図３を参照）。
「雄」親として使用される植物は４列に配置し、密封囲いの各端に沿って（80cmのところに）１列、中央に２列を（20cmの間隔をあけて）配置し、配置において植物はねじれており、15cmの間隔をあけ；及び
「雌」親として使用される植物を、稔性雄親の列の間にそこから65と70cmの距離の点に８列で配置し、植物は15cmずつ、列は25cmずつ間隔をあけた。
播種は12週目に、植え付けは16週目に行った。
【００６９】
試行１と同様の方法で、雄性稔性表現型を持つ雌親として使用される植物の精製（除去）のためのステップが必要であった。本ステップは、Ｍｓ７／ｍｓ７植物が花粉を持たず、Ｍｓ７／ｍｓ７（雄性不稔性）植物の花頭が、ｍｓ７／ｍｓ７植物（雄性稔性）のものより長期間開いた状態であるという事実を利用して、主に26週と27週の間で行った。
雌親として使用される3000植物のうち、1250は雄性不稔性であり、効率的に使用された。
16のｍｓ７／ｍｓ７植物（雄性稔性）を保存したが、精製の間に、自己受精コントロールとして使用されるための、虫を通過させないようなネットで構成された、密封して封じられた囲いの中で自己受精した。
【００７０】
使用した授粉する虫は試行１で使用したものと同じである。
授粉する虫は、25週〜29週の間に毎週、ハエが１ｍ2当たり1100匹となる濃度で添加した。
【００７１】
同時に、精製のステップで保存した、10の稔性植物（雄親）及び16の稔性ｍｓ７／ｍｓ７植物を、自己受精コントロールとして作用するための、虫を通過させないようなネットで構成された、密封して封じられた囲いの中で自己受精した。
【００７２】
雄性不稔性植物（「雌」親）、並びに自己授粉制御として使用した精製ステップで保存した10の雄性稔性植物（雄親）及び16の稔性ｍｓ７／ｍｓ７植物を、33週で収穫した。
植物を乾燥させ、脱穀し、その後種子の洗浄を完了させるとともに残存した軽量ごみを除去するため、パルスエアのカラムを通し、重さと幅を調整した。
【００７３】
得られた種子のサンプルを播種し、得られた植物のＢ124に対する耐性を、公式のＧＥＶＥＳプロトコル（Groupe d’Etude et de controle des Varietes et des Semences [Varieties and Seeds Study and Monitoring Group]）に従って試験した。当該植物がＢ124に耐性であることが明らかになった。
【００７４】
試行１及び２の結果
試行１及び２の結果を以下の表に示す。
表１：試行１及び２で収穫された種子の質量の比較
【表１】
2014168478.tif 000002
【００７５】
表２：試行１及び２で作成した、雑種種子及び自己受精コントロールに由来する種子の計測の比較
【表２】
2014168478.tif 000003
【００７６】
表３：試行１及び２で作成した、雑種種子及び自己受精コントロールに由来する種子のＴＳＷ（1000種子質量）の比較
【表３】
2014168478.tif 000004
【００７７】
考察
第一の試行では、217の雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物（雌親）から730グラムの種子、すなわち１植物当たり3.36グラムの収率で得られ、自己受精コントロールの15.30％の比率に相当した（雄親）。
第二の試行では、1170の雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物（雌親）から7.730kgの種子、すなわち植物あたり6.60グラムの収率で得られ、自己受精コントロールの２つ（「雄」親とｍｓ／ｍｓ雄性稔性「雌」親、精製の間保存され、虫密閉の下で受精した）の平均の50％の比率に相当した。
【００７８】
第二の試行では、Ｆ１雑種を計測する有用種子の量が、自己受精したコントロールの10％以上であった。
２つの試行では、Ｆ１雑種のＴＳＷ（1000種子質量）が、自己受精コントロールの30％以上であった。
第二の試行で得られた種子由来の植物は、Ｂ124に耐性であった。
【００７９】
試行３〜８
異なる種類のバターヘッド及びバタビアのレタスを用い、（Ｍｓ７遺伝子を保有するラクツカ・サティバ植物と稔性ラクツカ・サティバ植物との間の戻し交配に由来する50％の雄性不稔性である）「雌」親として使用される８つのラクツカ・サティバ植物と、「雄」親として使用される４つの雄性稔性ラクツカ・サティバ植物を各々含有する、換気された温室に置いた、虫試験用の3.3ｍ×1.1ｍケージ中で、６つの同様の試行を同時に開始した。
播種を22週目に、植え付けを27週目に行い、31週目の開花の兆候で雄性稔性「雌」植物から雄性不稔性を分類し、ハエを32、33及び34週の３週間にわたり１週間当たりのある量、すなわちハエ約100匹／ｍ2を添加し、37週目に収穫を行った。
【００８０】
試行３〜８の結果
ケージ１： CHARLIN(68/12624)* CHARLIN (バターヘッド)
１種の雌性植物：9.20 g
１種の雄性植物：28.30 g
ケージ２：CHARLIN(BC/77)* CHARLIN （バターヘッド)
１種の雌性植物：5.45 g
１種の雄性植物：19.40 g
ケージ３：BRA 68/12588 (温室リンゴレタス)* BRA 68/12588 
６種の雌性植物：
植物１：7.00 g
植物２：2.00 g
植物３：5.20 g
植物４：3.40 g
植物５：9.60 g
植物６：8.40 g
平均：5.9 g/植物
１種の雄性植物：34.40 g
ケージ４： BRA 68/12588 * BRA 68/12588 
４種の雌性植物：
植物１：11.95 g
植物２：7.15 g
植物３：15.90 g
植物４：11.90 g
平均：11.25 g/植物
１種の雄性植物：29.00 g
ケージ５：BVA 68/12553 (温室バタビアレタス)* BVA 68/12553 
５種の雌性植物: 
植物１：.50 g
植物２：1.30 g
植物３：2.20 g
植物４：1.70 g
植物５：4.20 g
平均：3.30 g/植物
１種の雄性植物：3.60 g
ケージ６：BVA 68/12553 * BVA 68/12553
３種の雌性植物：
植物１：4.60 g
植物２：3.20 g
植物３：3.70 g
平均：3.80 g/植物
１種の雄性植物：23.40 g
【００８１】
考察
「雌」親の産物の平均は、3.3g〜11.2g／植物であり、バタビア類型物（BVA 68/12553）は、約8.5g／植物のバターヘッド類型物（Charlin, BRA 68/12588）と比較して、かなり低い収率（約3.5g／植物）であり、当該類型物はその最終収率に寄与すると考えられる。
【００８２】
試行９
新規な作製試行を、開放地面上の換気された温室内に置いた、直径0.40ｍの測定用の虫小さな試験用ケージ中で行った。
播種を22週目で、再植え付けを25週目で行い、30週目の開花の兆候で雄性稔性植物から「雌」植物を分類し、31週目で植え付けし、ハエを32、33及び34週の３週間にわたり１週間当たりのある量、すなわちハエ約100匹／ｍ2を添加し、35週目に収穫を行った。
【００８３】
結果
得られた結果を以下の表４及び５にまとめた。
表４：「雄」及び「雌」親、Ｃｈａｒｌｉｎ (温室バターヘッド)による種子の作製
【表４】
2014168478.tif 000005
【００８４】
表５：「雄」及び「雌」親、ＢＶＡ 68/12553 (バタビア)による種子の作製
【表５】
2014168478.tif 000006
【００８５】
考察
バタビアレタス（ＢＶＡ 68/12553）で得られた産物の平均は、自己受精コントロールの1.7g/植物に対して約1 g/植物であり、且つ温室バターヘッドレタス（Ｃｈａｒｌｉｎ）で得られた産物の平均は、約1 g/植物であり自己受精コントロールとほぼ同じであった点で、結果は満足のいくものであった。
【００８６】
試行１０：雑種の組み合わせによるＤｍ３／Ｄｍ１８蓄積
２つの優性遺伝子、Ｄｍ３及びＤｍ１８であって、クラスター２に属し同じ遺伝子座に位置する品種24（Ｂ124）及び品種23（Ｂ123）の、ブレミア・ラクツカエ耐性用遺伝子を蓄積するＦ１雑種レタスは、上記記載の試行で記載された方法を用いて得た。
【００８７】
「雌」親として使用される植物（06/30443: MS7/21NACRExDEVONIAxCAMBRIA）は、Ｄｍ１８及びＲ３８耐性遺伝子のキャリアである。「雄」親として使用される植物は、Ｄｍ３耐性遺伝子を保有する温室バターヘッドレタスである（BC: 06/30443 * Rex 又は BC:06/30443 * Melina）。
以下の５つの交配を行った。
06/30443/01 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-01) Dml8/R38 * Rex Dm3、
06/30443/10 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-10) Dml8/R38 * Rex Dm3、
06/30443/02 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-02) Dml8/R38 * Melina Dm3、
06/30443/03 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-03) Dml8/R38 * Melina Dm3、
06/30443/04 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-04) Dml8/R38 * Melina Dm3。
【００８８】
当該５つの交配由来の種子は播種され、葉ディスク上でのインキュベーション試験及び分子標識をＦ１植物で行うとともに、「雄」（Rex/Melina）及び「雌」親で行った。
【００８９】
Ｉ  葉ディスク上でのインキュベーション試験
装置：
植物原料は、１植物当たり及び１品種当たり５ディスクの数で、１起源当たり10植物及び２つのブレミア・ラクツカエ品種で（Ｄｍ１８／Ｒ３８蓄積を攻撃し、且つＤｍ３がそれに対する耐性を与えるＢ124、及びＤｍ３／Ｒ３８蓄積を攻撃し、且つＤｍ１８がそれに対する耐性を与えるＢ123）、1.5cm直径の葉ディスクからなる。すなわち、総数で80の植物を２つの品種で試験した。
【００９０】
技術：
葉ディスクに、ブレミアＢ123及びＢ124を独立に伴ったスポロシストを噴霧することにより植菌を行った。
【００９１】
１／葉ディスクの除去：
１植物当たり５つの葉ディスクを除去し、２重の厚みの湿ったブロット紙の上に配列させた。各皿には、６列の試験するディスク及び１列の感受性の高いコントロールを入れた。
２／植菌：
６皿の葉ディスクを植菌するために必要な植菌材料の量は11mlであった。100 mlの脱塩水に４滴のTween 80を使用することにより、Tween 80溶液を調製した。植菌材料の容積のための抽出溶液の量は、100mlの植菌材料当たり5 mlのTweenストック溶液であった。植菌材料は、5％のTween 80ストック溶液を補充した水道水中で、スポロシストを分離することにより作製した。スポロシストを、108胞子/ml近傍のスポロシスト濃度を得るため、１植物/mlの植菌材料量で除去した。250mlビーカーに、ガーゼを通して溶液を通過させて濾過を行った。
３／噴霧：
植菌は、葉ディスクを採取した日に行った。植菌材料溶液の容積を測定し、その後配置した皿に植菌した。植菌材料を、各ディスクの表面全体に、微細な液滴で均一に噴霧した。この皿を密封し、15℃で、日光14時間、夜間10時間の単位で７日間インキュベートした。
【００９２】
結果
植菌の結果を、以下の表６〜１３に示す（Ｓ＝感受性、Ｒ＝耐性）。種々の交配から得られる雑種は２つの品種Ｂ123及びＢ124に耐性であり、クラスター２由来の２つの遺伝子Ｄｍ１８及びＤｍ３の存在を示すものである。
【００９３】
表６：「雌」30443 (Dm18/R38)植物： MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA：Ｂ123耐性及びＢ124感受性。
【表６】
2014168478.tif 000007
表７：「雄」Melina (Dm3) 植物：Ｂ123感受性及びＢ124耐性（10植物での試験）
【表７】
2014168478.tif 000008
表８： 06/30443/02 * Melina (Dml8/R38*Dm3) 交配＝MS7/2IxNACRExDEVONIAxCAMBRIA-02*MELINA
【表８】
2014168478.tif 000009
表９： 06/30443/03 * Melina (Dml8/R38*Dm3) 交配＝MS7/2IxNACRExDEVONIAxCAMBRIA-03*MELINA
【表９】
2014168478.tif 000010
表１０： 06/30443/04 * Melina (Dml8/R38*Dm3) 交配＝MS7/2IxNACRExDEVONIAxCAMBRIA-03*MELINA
【表１０】
2014168478.tif 000011
表１１：「雄」Rex (Dm3) 植物：Ｂ123感受性及びＢ124耐性（10植物での試験）
【表１１】
2014168478.tif 000012
表１２：06/30443/01 * Rex (Dml8/R38*Dm3) 交配＝MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-01*REX
【表１２】
2014168478.tif 000013
表１３： 06/30443/10 * Rex (Dml8/R38*Dm3) 交配＝MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-10*REX
【表１３】
2014168478.tif 000014
【００９４】
II  分子標識
２つの分子マーカーを用いることで、ラクツカ・サティバにおいて、優性であり且つ２つのブレミア・ラクツカエ種に耐性である、２つの密接に関連した遺伝子（同じ遺伝子座に位置する）の蓄積を証明することができる。
【００９５】
方法：
１／植物原料：
植物原料は、１植物当たり１ディスクで、1.5cm直径の葉ディスクからなる。遺伝子型当たり5〜10植物（すなわち総数で50植物）由来のＤＮＡを、ＣＴＡＢ／クロロホルム抽出により得て、その後5ng/μlの濃度で、ＴＥ 0.1×溶液中で懸濁として溶解させた。
【００９６】
２／遺伝子型決定：
Maisonneuve等による[10]及びKuang等による[11]で報告された、ＳＣＷ０９及びＢ１マーカーを前記50植物の遺伝子型決定のために使用した（表１４）。ＰＣＲ条件は表１５に記載する。
ＳＣＷ０９及びＢ１のＰＣＲサイクルはそれぞれ以下の通りである：
94℃/30秒−94℃/1分、60℃/1分、72℃/2分；40サイクル−72℃/5分−4℃；
94℃/30秒−94℃/1分、63℃/1分、72℃/2分；40サイクル−72℃/5分−8℃。
ＳＣＷ０９マーカーは、移行ステップの前にＴａｑＩ酵素での酵素的消化を受けた（バッファ１×、ＢＳＡ１×及びＴａｑＩ １Ｕ）。電気泳動を、2％（ＳＣＷ０９）又は1.5％（Ｂ１）のアガロースゲルを用い、ＴＢＥ１×バッファ中で、１時間（Ｂ１）又は１時間30分（ＳＣＷ０９）、定電圧220Ｖで泳動した。電気泳動プロファイルは、ＵＶランプ下、エチジウムブロミド（ＥＴＢ）での染色により明らかになった。
【００９７】
表１４：ＳＣＷ０９及びＢ１マーカーの特徴
【表１４】
2014168478.tif 000015
表１５：ＳＣＷ０９及びＢ１マーカーのＰＣＲ条件
【表１５】
2014168478.tif 000016
【００９８】
結果
結果を表１６並びに図４及び５に示す。ＲＥＸ及びＭＥＬＩＮＡの遺伝子型は、Ｄｍ１８−／Ｄｍ１８−且つＤｍ３＋プロファイルであった。06/30443遺伝子型はＤｍ１８＋／Ｄｍ１８＋且つＤｍ３−プロファイルであった。親（ＲＥＸ又はＭＥＬＩＮＡ）の一方又は他方との交配の組は、Ｄｍ１８＋／Ｄｍ１８−及びＤｍ３＋プロファイル、すなわちＤｍ１８及びＤｍ３に耐性であった。
【００９９】
表１６：ＳＣＷ０９及びＢ１マーカーでの遺伝子型決定の結果（Ｓ＝感受性、Ｒ＝耐性）。
【表１６】
2014168478.tif 000017
【表１７】
2014168478.tif 000018
【０１００】
実施例２：Ｍｓ７遺伝子用分子マーカーの同定
以下に記載のラクツカ・サティバ（レタス）中の雄性不稔性Ｍｓ７に関連する分子マーカーを得るための方法を、指示する目的で提供する。
１−レタス（ラクツカ・サティバ）中で核雄性不稔性Ｍｓ７と関連するマーカーの開発用の群の構成
Ｍｓ７雄性不稔性であるレタス用の異なる類型の２つの群を、戻し交配で作製した。結果として得られた、200植物の反復第４代群（ＢＣ４）の２つを雄性不稔性表現型に対応する「生花粉の不存在」形質で表現型検査を行った。２つの表現型グループを、雄性稔性（Ｆ）又は雄性不稔性（Ｓ）として１：１の比率で同定した。
この比率は、Ｍｓ７遺伝子座で異種接合体の親により提供される、雄性不稔性の優性一遺伝子的性質を裏付けるものであった。
【０１０１】
２−レタス植物由来のＤＮＡの抽出
ＤＮＡは、修正ＣＴＡＢプロトコル（Tomas等, 1989 [20]; Doyle 等, 1990 [15]; Edwards 等, 1991 [16]）を用い、新鮮な幼葉を使用して抽出した。
1.5ml管を用いて得た新鮮な葉ディスクを、500μlの抽出バッファ（Tris−ＨＣｌ 0.1M、NaCl 0.7 M、EDTA 10 mM、CTAB 1%、βメルカプトエタノール １%）中に置いた。この置いた原料を65℃で１時間インキュベートし、インキュベーション中に２〜３回反転させて混合した。
その後、200μlの24：１のクロロホルム：イソアミル溶液を添加し、反転させて混合した。6000rpmで10分間、20℃で遠心分離後に、400μlの上澄みを回収し、400μlのイソプロパノールと混合した。
−20℃で１時間後、混合物を6000rpmで10分間、4℃で遠心分離した。管の中身を出した。管底に付着したＤＮＡ残基は12時間空気中で乾燥させた。
このＤＮＡを、200μlのＴＥ 0.1×溶液（tris−HCl 1 mM、EDTA 0.1 mM）中で懸濁として溶解させた。終濃度を、１％アガロースゲル上で、Lambda DNA-HindIII消化アッセイにより測定した。
【０１０２】
３−ＢＳＡ（bulk segregant analysis）法を用いる、ラクツカ・サティバにおけるＭｓ７雄性不稔性に関連するＲＡＰＤマーカーの研究
雄性不稔性に関連する分子マーカーＭｓ７を同定する目的で、Operon Technologies Inc.（Huntsville, AL 35805、米国）製のＲＡＰＤ（登録商標）10merキット及びBuIk Segregant Analysis法（Michelmore 等, 1991 [17] 及び Paran 等, 1991 [18]）を使用した。
上記記載の２つのBC4群の表現型検査から開始するため、10植物の混合物の２つのサンプルを、２つのグループ「雄性不稔性」及び「雄性稔性」用として作製した。OPA-01〜OPBH-20の1200個のプライマー（Operon Biotechnologies Inc. (Huntsville, AL 35805、米国)）を、William 等, 1990 [22] 及び Welsh 等, 1990 [21]により報告されたＲＡＰＤ技術を用いて、１群当たり４サンプルを試験した。「雄性不稔性」サンプルに特異的なバンドを表し且つ読みやすい電気泳動プロファイルを有するプライマーを選択した。
【０１０３】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ１×バッファ、3 mM MgCl2、200μMのdNTP、400nMのプライマー、１単位のAmpliTaq (Perkin-Elmer cetus)ＤＮＡポリメラーゼで組成した、総反応量25μlで実施した。複数サイクルからなるＰＣＲ反応を以下に記載した。94℃30秒間で１ステップ、94℃１分、その後35℃１分で最終的に72℃にして２分、及び最後の伸長ステップを72℃5分間を45サイクルで実施し、その後反応物を４℃で保存した。
増幅産物を、２％アガロースゲルで、以下の電気泳動条件下で分離した：移動バッファＴＢＥ １×（tris−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ）、190Ｖで2時間15分。
【０１０４】
残存するＲＡＰＤプライマーを確認する（validate）ために、２つのＢＣ４群由来の200植物を、以下の配列：５' TGCGTTCCAC ３'（配列番号１）（これは675bpのマーカー、BA05-675（配列番号２）と対応する）を有し、Ｍｓ７を同時分離する、OPBA05プライマーで個別に試験した。このマーカーから得られた電気泳動プロファイルを図６に示す。
【０１０５】
このマーカーを12の群からの約25植物で、種々の類型のレタス（バタビア、バターヘッド、アイスバーグ（iceberg）、ロメイン（romaine）、オークリーフ（oakleaf）及びロロロッサ（lollo rossa））で確認した。試験条件は、抽出、増幅及び電気泳動のステップで既に記載したものと同じであった。
ＲＡＰＤ BA05-675マーカーの感受性及び特異性の計算からは、類型によって異なる値が得られ、それぞれ平均値は96％及び94％であった（表１７及び１８を参照）。
【０１０６】
表１７：保有する分子マーカーの感受性及び特異性の予測される値の、計算の詳細。
【表１８】
2014168478.tif 000019
表１８：レタスの類型と、Ｍｓ７と関連する分子マーカーBA05-675への感受性（Ｓ*）及び特異性（Ｆ**）の平均値の結果。
【表１９】
2014168478.tif 000020
【０１０７】
４−ラクツカ・サティバ種におけるＭｓ７雄性不稔性に関連するBA05-675の遺伝子マッピング
上記のｍｓ７のために解体されたＢＣ４の群由来の200植物を基に、Ｍｓ７に関連するBA05-675マーカーの遺伝子マッピング（William 等, 1993 [23]）を、JoinMap（登録商標）4 (Stam 等, 1996 [19]) 及び CarteBlanche (Keygene N P, P O Box 216, 6700 A E Wageningen, The Netherlands)を用いて実施した。優性のBA05-675マーカーについて、メンデル型１：１比率のゼロ仮定を、Ｘ2統計的検定で確認した（検定はp > 0.05で有意性がない）（表１９を参照）。3.0以上の可能性ある比率（又はＬＯＤスコア）での結合試験により、Ｍｓ７の1.8 cMマーカーをマップできた（図６）。
【０１０８】
表１９：ＭＳ７に関連する分子分離（segregation）マーカーBA05-675の比率及び比率１：１でのメンデル型分離のゼロ仮説を用いる１ddlでのＸ2検定の結果（Ｆ：稔性優性植物の数、Ｓ：不稔性雄性植物の数）。
【表２０】
2014168478.tif 000021
【０１０９】
５−ラクツカ・サティバレタスにおける雄性不稔性に関連するＲＡＰＤ BA05-675分子マーカーのクローニング及び配列決定
アガロースゲル電気泳動プロファイルから、675bpのＤＮＡ断片を単離し、ＴＥバッファ（10 mM tris-HCl、1 mM EDTA）中で懸濁物として溶解させ、その後上記のＰＣＲ条件下で再増幅させた。この再増幅した単離断片を、市販のPCR（登録商標）4-TOPO（登録商標）キット（Invitrogen, Carlsbad, California 92008, 米国）を用いてクローン化した。クローニングの確認後、ＤＮＡ抽出（Midiprep system）は、Promegaカラム精製キット（(Madison, WI, 米国）を用いて行った。
75 ng/μlに濃縮した精製クローンを、Cogenics (38944 Meylan, フランス)により配列決定した。すなわち、図８に記載のBA05-675マーカーの配列が得られた（配列番号２）。
【０１１０】
６−結果
本発明者等が実施した研究により、ＲＡＰＤマーカー、BA05-675（配列番号２）の特徴づけが可能となった。その配列は、図８に示され、Ｍｓ７から1.8cMの距離で（図７）、且つレタスの類型について個別にそれぞれ平均96％及び94％の感受性及び特異性を有する（表１８）。２つのＢＣ４群由来の個別の植物でのこのマーカーの評価から、不稔性の雄性植物を同定するための平均予測値（Altman 1994a [13]）が97％近傍であるという推定ができる。
【０１１１】
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23. Williams J. K. G., Reiter R. S., Young R.M., Scolnik P.A., 1993. Genetic mapping of mutations using phenotypic pools and mapped RAPD markers. Nucleic Acids Res., 21(11): 2697- 2702.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月19日(2014.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
雑種ラクツカ・サティバ（Lactuca sativa）種子であって、
雄性不稔性遺伝子型を有するとともに、
検出可能な表現型を当該種子に由来する植物に提供する、少なくとも１つの特徴的遺伝子の異種接合体である、種子。
【外国語明細書】
2014168478000001.pdf