(57)【要約】【課題】特有のオフフレーバー(不快臭気)が低減された食酢を提供することを課題とする。より具体的には、そのような優れた食酢を生産することのできる改変された酢酸菌を提供することを課題とする。【解決手段】アセトイン生成能が抑制されている酢酸菌であって、オーバーフローメタボリズム関連遺伝子群の少なくとも一種が欠損している酢酸菌。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトイン生成能が抑制されている酢酸菌であって、オーバーフローメタボリズム関連遺伝子群の少なくとも一種が欠損している酢酸菌。
【請求項２】
α−アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ａｌｄＣ）、α−アセト乳酸合成酵素（ａｌｓ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）からなる群より選択される少なくとも一種のオーバーフローメタボリズム関連遺伝子が少なくとも欠損している、請求項１に記載の酢酸菌。
【請求項３】
少なくともａｌｄＣが欠損している、請求項１に記載の酢酸菌。
【請求項４】
アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属である、請求項１〜３のいずれかに記載の酢酸菌。
【請求項５】
食酢の製造方法であって、
請求項１〜４のいずれかに記載の酢酸菌を用いた酢酸発酵工程を含有する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により得られうる、食酢。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変された酢酸菌及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌Gluconacetobacter europaeus（Ga. europaeus）は高いエタノール酸化能力および酢酸耐性を有し、食酢の工業生産において世界中で広く利用されている。しかし、当該酢酸菌の代謝工学技術は現時点で報告されてはおらず、近年タイプ株のドラフトゲノム配列が決定されたばかりでもあり、今後の研究の発展が期待される微生物である。
【０００３】
食酢にはバター・チーズ様のオフフレーバー(不快臭気)があることが知られ、食酢に通常含まれるアセトインがその原因であるとされる。
【０００４】
食酢の製造工程は、通常、（１）糖質(米、コーン等の穀類、リンゴ等)からアルコールを生産するアルコール発酵工程、及び（２）工程（１）で得られたアルコールを酢酸へ転換する酢酸発酵工程からなる。工程（１）は酵母が、工程（２）は酢酸菌が担うプロセスである。アルコール発酵は嫌気状態で行われるため、工程（１）において嫌気性細菌である乳酸菌による汚染が生じる可能性がある。乳酸菌による汚染が生じた場合、アルコール原料中に乳酸が蓄積する。このとき、得られたアルコール原料を酢酸発酵へ供試すると、酢酸菌の代謝により乳酸からアセトインが生成する（非特許文献１〜３）。このアセトインの生成及び蓄積を制御することは食酢の品質設計における重要な課題の一つである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．ＤＥ  Ｌｅｙ、「Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｅｔｏｉｎ  ｂｙ  Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ」、Ｊ．ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９５９年、２１、ｐｐ．３５２−３６５
【非特許文献２】柳田藤治、外５名、「酢酸菌とその利用に関する研究」、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ，Ｊａｐａｎ、１９７６年、Ｖｏｌ．７１、Ｎｏ．７、ｐｐ．５７４〜５７９
【非特許文献３】円谷悦造、外１名、「種々の微生物による米酢香気の変化」、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ，Ｊａｐａｎ、１９８６年、Ｖｏｌ．８１、Ｎｏ．１、ｐｐ．４７〜５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、特有のオフフレーバー(不快臭気)が低減された食酢を提供することを課題とする。より具体的には、本発明は、そのような優れた食酢を生産することのできる改変された酢酸菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ね、本発明を完成させた。具体的には、本発明者らは、オーバーフローメタボリズム関連遺伝子群の少なくとも一種が欠損している酢酸菌を利用することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明はかかる知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項１．
アセトイン生成能が抑制されている酢酸菌であって、オーバーフローメタボリズム関連遺伝子群の少なくとも一種が欠損している酢酸菌。
項２．
α−アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ａｌｄＣ）、α−アセト乳酸合成酵素（ａｌｓ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）からなる群より選択される少なくとも一種のオーバーフローメタボリズム関連遺伝子が少なくとも欠損している、項１に記載の酢酸菌。
項３．
少なくともａｌｄＣが欠損している、項１に記載の酢酸菌。
項４．
アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属である、項１〜３のいずれかに記載の酢酸菌。
項５．
食酢の製造方法であって、
項１〜４のいずれかに記載の酢酸菌を用いた酢酸発酵工程を含有する、方法。
項６．
項５に記載の方法により得られうる、食酢。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法を利用することにより、特有のオフフレーバー(不快臭気)が低減された食酢を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｇａ．  ｅｕｒｏｐａｅｕｓゲノムにおけるアセトイン生合成に関与する遺伝子群のクラスター構造を示す図面である。
【図２】ドラフトゲノム情報より推測されたＧａ．  ｅｕｒｏｐａｅｕｓにおけるアセトイン生合成経路を示す図面である。
【図３】ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した本発明の方法の一例を示す図面である。
【図４】ゲノム中のｐｙｒＥ遺伝子を欠失させる方法の一例を示す図面である。
【図５】目的遺伝子（ａｌｄＣ）を欠失させる方法の一例を示す図面である。
【図６】実施例の結果を示す図面である。
【図７】実施例の結果を示す図面である。
【図８】試験例の結果を示す図面である。
【図９】試験例の結果を示す図面である。
【図１０】試験例の結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．本発明の酢酸菌
１．１  酢酸菌及びオーバーフローメタボリズム関連遺伝子
本発明の酢酸菌は、アセトイン生成能が抑制されている酢酸菌であって、オーバーフローメタボリズム関連遺伝子群の少なくとも一種が欠損している酢酸菌である。
【００１２】
酢酸菌としては、特に限定されないが、例えば、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属等を用いることができる。中でも、Gluconacetobacter  europaeus及びAcetobacter  pasteurianusが好ましい。
【００１３】
オーバーフローメタボリズムとは、大腸菌、枯草菌及び乳酸菌等においてその存在が知られている代謝経路であり、具体的には、過剰炭素（乳酸及びピルビン酸）をより中性の化合物（アセトイン）へ転換することで環境及び細胞内における酸性化を防ぐと同時に、栄養枯渇時における炭素源としてアセトインを菌体外で貯蔵する働きを持つとされる（Renna, M. C. et al.: J. Bacteriol., 175, 3863 (1993)、Huang, M. et al.: J. Bacteriol., 181, 3837 (1999)）。
【００１４】
本発明者らの独自の検討により、このオーバーフローメタボリズムが酢酸菌においても見られることが初めて見出された。具体的には、タイプ株ドラフトゲノムデータを用いたバイオインフォマティクス解析から、Ga. europaeusにおいても図１に示したアセトイン生合成経路遺伝子クラスター、及びそれらの関与する代謝経路の存在が示唆された。なお、同代謝経路は分岐鎖アミノ酸生合成経路と、一部の中間代謝産物を共有する（図２）。
【００１５】
本発明の酢酸菌は、このオーバーフローメタボリズム関連遺伝子が欠損しているため、アセトイン生成能が抑制されている。本発明の酢酸菌を利用することにより、特有のオフフレーバー(不快臭気)が低減された食酢を提供することができる。
【００１６】
なお、本発明において、「オーバーフローメタボリズム関連遺伝子が欠損している」状態には、アセトイン生成能が抑制されている限りにおいて、当該遺伝子が一部欠損している状態も含まれる。
【００１７】
オーバーフローメタボリズム関連遺伝子としては、特に限定されないが、具体的には、図２に示す代謝経路に関連する酵素のうち、それを欠損することによりアセトイン生成能が抑制されるものをコードする遺伝子等が挙げられる。特に限定されないが、α−アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードするａｌｄＣ遺伝子、α−アセト乳酸合成酵素をコードするａｌｓ遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子等が挙げられる。
【００１８】
オーバーフローメタボリズム関連遺伝子を欠損させる方法は、特に限定されず、従来公知の方法を幅広く採用できる。ただし、得られる形質転換体が「遺伝子組換え体」には分類されず、そのまま食酢の生産に用いることができれば好ましい。そのような形質転換体は、すなわち外来性の遺伝子を含有しないものである。そのような形質転換体を得る方法としては、セルフクローニングによる方法が利用できる。なお、セルフクローニングとは、同一種に属する生物間で核酸を交換することをいう。
【００１９】
セルフクローニングによる方法としては特に限定されないが、具体的には、本発明者らが独自に開発した以下に説明する方法を用いることができる。
【００２０】
１．２  セルフクローニングによる形質転換方法
まず、内在性のピリミジン生合成系遺伝子を選択マーカーとして用いる。内在性の遺伝子を選択マーカーとするため、目的遺伝子を欠損した酢酸菌であって、外来遺伝子が導入されていない酢酸菌を製造することができる。
【００２１】
ピリミジン生合成系遺伝子とは、ピリミジン塩基（チミン、シトシン及びウラシル）の生合成経路に関わる遺伝子群を指す。この経路はすべてのピリミジン塩基の前駆体であるＵＭＰ（ウリジン一リン酸）を合成する６つの酵素反応からなる。６つの酵素（及びそれをコードする遺伝子）とは、すなわち、ＵＭＰ合成経路の上流から順にカルバモイルリン酸合成酵素（ｃａｒＡＢ遺伝子）、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ（ｐｙｒＢ遺伝子）、ジヒドロオロターゼ（ｐｙｒＣ遺伝子）、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒＤ遺伝子）、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｙｒＥ）遺伝子、及びオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｙｒＦ）である。これらの酵素をコードする遺伝子を保持する株はウラシル原栄養性を示すが、これらの酵素をコードする遺伝子を破壊された株はＵＭＰを生合成できなくなり、ウラシル要求性株となる。
【００２２】
これらのうち、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦを破壊された株については、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）によるポジティブセレクションが可能である。５−ＦＯＡは、遺伝子破壊を受けていない株においてはまずオロチン酸（ｏｒｏｔａｔｅ）の代わりにピリミジン経路に取り込まれ、最終的にＲＮＡに取り込まれるために正常なＲＮＡの合成が阻害され、菌体は死滅する。これに対して、ｐｙｒＥ破壊株及びｐｙｒＦ破壊株においては５−ＦＯＡは代謝されず、菌体は生存できる。このことを利用すると、５−ＦＯＡ及び十分量のウラシルを含む培地を用いることにより、ｐｙｒＥ破壊株又はｐｙｒＦ破壊株を選別することができる。このため、選択マーカーとして用いる内在性のピリミジン生合成系遺伝子としては、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦが好ましい。ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦを用いれば、ウラシル原栄養性を指標として、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦがゲノムに存在する株を選択することができる。また、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦを用いれば、５−ＦＯＡ耐性を指標として、ｐｙｒＥ又はｐｙｒＦがゲノムから欠損した株を選択することができる。
【００２３】
目的遺伝子を欠損した酢酸菌の製造方法は、ダブルクロスオーバーを利用した方法であってもよいし、ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した方法であってもよい。
【００２４】
ダブルクロスオーバーを利用した方法としては、特に限定されないが、例えば以下のような工程（１）及び（２）を含む方法等が挙げられる。
（１）当該酢酸菌のゲノムにおける、目的遺伝子の上流領域から下流領域までに相当するＤＮＡにおいて、当該目的遺伝子の少なくとも一部が前記ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡで置換されたＤＮＡを含有する、目的遺伝子破壊作用を備えるＤＮＡを、該ピリミジン生合成系遺伝子を欠損した酢酸菌株に導入する工程；及び
（２）前記工程（１）により得られた酢酸菌から、ウラシル原栄養性を指標として、目的遺伝子を破壊する作用を備える前記ＤＮＡとダブルクロスオーバーを起こした目的遺伝子欠損株を選抜する工程。
【００２５】
前記工程（１）において、目的遺伝子破壊作用を備えるＤＮＡを、ピリミジン生合成系遺伝子を欠損した酢酸菌株に導入することにより、ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡがゲノムに導入される一方で、目的遺伝子をゲノムから欠落させることができる。これは、当該酢酸菌のゲノム中の、目的遺伝子を含む領域が、前記ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡで置き換わるためである。より詳細には、この置換は、目的遺伝子破壊作用を備える前記ＤＮＡがゲノムとダブルクロスオーバーを起こすことによって起こる。このダブルクロスオーバーを起こすためには、目的遺伝子破壊作用を備える前記ＤＮＡが、目的遺伝子の上流領域（以下、「５’−ＵＲ」ということがある。）及び下流領域（以下、「３’−ＤＲ」ということがある。）を、ピリミジン生合成系遺伝子を挟むようにしてそれぞれ含んでいる必要がある。これらの５’−ＵＲ及び３’−ＤＲと同一の配列は、それぞれ目的遺伝子を挟むようにしてゲノム中にも存在している。これらの互いに同一の配列同士でダブルクロスオーバーを起こすことにより、結果的にゲノム中の目的遺伝子がピリミジン生合成系遺伝子で置換される。このダブルクロスオーバーを起こすために、５’−ＵＲ及び３’−ＤＲに求められる長さは適宜設定できるが、通常、２００塩基以上であれば十分である。５’−ＵＲ及び３’−ＤＲの長さは、目的遺伝子の破壊効率の面で、好ましくは３００塩基〜２，０００塩基であり、より好ましくは５００塩基〜１，０００塩基である。
【００２６】
目的遺伝子を破壊する作用を備える前記ＤＮＡは、前述のダブルクロスオーバーを起こすものであればよく、特に限定されない。このＤＮＡは、環状ＤＮＡであってもよいし、直鎖ＤＮＡであってもよい。このＤＮＡの長さは、特に限定されないが、環状ＤＮＡである場合には通常、２ｋｂｐ〜１０ｋｂｐであり、好ましくは４ｋｂｐ〜８ｋｂｐである。また、同様に直鎖ＤＮＡである場合には通常、１ｋｂｐ〜８ｋｂｐであり、好ましくは２ｋｂｐ〜４ｋｂｐである。
【００２７】
直鎖ＤＮＡである場合、より詳細には、一例として、被破壊遺伝子（目的遺伝子）の上流０．５ｋ〜１ｋの領域、ｐｙｒＥ遺伝子（１．５ｋ）及び被破壊遺伝子の下流０．５〜１．０ｋの領域（すなわち、全長２．５ｋ〜３．５ｋ）のもの等を用いることができるが、特にこれに限定されず、発明の効果が得られる範囲内で幅広く選択できる。
【００２８】
ＤＮＡの酢酸菌への導入方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。特に限定されないが、例えばエレクトロポレーション法、大腸菌との接合伝達法（特開2012-125164号公報）及び塩化カルシウム法（Okumura, H. et al.: Agric. Biol. Chem., 49, 1011 (1985)）等により導入することができる。この中でも、特にエレクトロポレーション法が作業の簡便性の面で好ましい。
【００２９】
上記において、ピリミジン生合成系遺伝子を欠損した酢酸菌株は、特に限定されないが、例えば次のような工程を含む方法によって得ることができる。
（ｉ）酢酸菌のゲノムにおける、当該ピリミジン生合成系遺伝子の上流領域から下流領域までに相当するＤＮＡにおいて、該ピリミジン生合成系遺伝子の少なくとも一部が欠損したＤＮＡを含有する、該ピリミジン生合成系遺伝子破壊作用を備えるＤＮＡを、酢酸菌に導入する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた酢酸菌から、５−ＦＯＡ耐性、及びウラシル要求性を指標として、該ピリミジン生合成系遺伝子破壊作用を備える前記ＤＮＡとダブルクロスオーバーを起こした該ピリミジン生合成系遺伝子欠損株を選抜する工程。
【００３０】
上述の方法において、ダブルクロスオーバーによる遺伝子置換のメカニズムは、前記工程（１）及び（２）のメカニズムと同様である。
【００３１】
ピリミジン生合成系遺伝子破壊作用を備えるＤＮＡが、ピリミジン生合成系遺伝子の上流領域及び下流領域をそれぞれどの程度の長さ有していればよいかについても、前記工程（１）及び（２）においてした説明と同様である。
【００３２】
前記工程（２）において、ウラシル原栄養性を指標とする選抜は、目的遺伝子を破壊する作用を備える前記ＤＮＡとダブルクロスオーバーを起こした目的遺伝子欠損株を選抜する目的で行うものであり、かかる目的が達成される限りにおいて、その詳細な条件については適宜設定することができる。
【００３３】
例えば、極めて低頻度で生じる形質転換体（ウラシル原栄養性株）を、ウラシルを含まない最少培地で集積することにより、目的遺伝子破壊株を選抜することができる。この場合の条件としては、特に限定されないが、最少培地の組成として以下が例示できる。
【００３４】
グルコース ３０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム・一水和物 １０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム ０．１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、塩化カリウム ０．１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム・二水和物 ０．１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．２５ｇ／Ｌ、塩化鉄(ＩＩＩ) ０．００５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．０５ｇ／Ｌ、モリブデン(ＩＶ)酸二ナトリウム・二水和物 ０．０００５ｇ／Ｌ、ホウ酸 ０．０００５ｇ／Ｌ、硫酸銅・五水和物 ０．００２５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・五水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、塩化コバルト(ＩＩ) ０．０００５ｇ／Ｌ、(＋)−パントテン酸カルシウム ０．００２ｇ／Ｌ、エタノール及び酢酸 ５ｍｌ／Ｌ
【００３５】
目的遺伝子を欠損した酢酸菌の製造方法のうち、ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した方法としては、特に限定されないが、例えば以下のような工程（１）及び（２）を含む方法等が挙げられる。
（１）当該酢酸菌のゲノムにおける、目的遺伝子の上流領域から下流領域までに相当するＤＮＡにおいて、当該目的遺伝子の少なくとも一部が欠損したＤＮＡ；並びに前記ピリミジン生合成系遺伝子をそれぞれ含有する環状ＤＮＡを、該ピリミジン生合成系遺伝子を欠損する株に導入する工程； 
（２）前記工程（１）により得られた酢酸菌から、ウラシル原栄養性を指標として、前記環状ＤＮＡがｐｏｐ−ｉｎ置換によりゲノムに取り込まれた株を選抜する工程；及び
（３）前記工程（２）により選抜された酢酸菌株から、５−ＦＯＡ耐性、及びウラシル要求性を指標として、ｐｏｐ−ｏｕｔ置換により少なくとも一部の目的遺伝子及び該ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡがゲノムから脱落した目的遺伝子欠損株を選抜する工程。
【００３６】
ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した方法の一例を、図３に示す。
【００３７】
工程（１）で使用する環状ＤＮＡは、当該酢酸菌のゲノムにおける、目的遺伝子の上流領域（５’−ＵＲ）から下流領域（３’−ＤＲ）までに相当するＤＮＡにおいて、当該目的遺伝子の少なくとも一部が欠損したＤＮＡを含有する。当該環状ＤＮＡは、さらに、ピリミジン生合成系遺伝子を含有する。
【００３８】
続く工程（２）において、ウラシル原栄養性を指標として選抜することにより、ゲノムの５’−ＵＲ又は３’−ＤＲの部分（図３では５’−ＵＲの部分）においてｐｏｐ−ｉｎ置換によりこの環状ＤＮＡの全長がゲノムに取り込まれた株を選抜することができる。
【００３９】
さらに、工程（３）において、５−ＦＯＡ耐性、及びウラシル要求性を指標として選抜することにより、ｐｏｐ−ｏｕｔ置換により少なくとも一部の目的遺伝子及び該ピリミジン生合成系遺伝子を含有するＤＮＡがゲノムから脱落した目的遺伝子欠損株を選抜することができる。
【００４０】
５’−ＵＲ及び３’−ＤＲについての説明は、ダブルクロスオーバーに用いる配列についての説明と同様である。
【００４１】
遺伝子の導入方法、ウラシル原栄養性を指標とする選抜方法、並びに５−ＦＯＡ耐性及びウラシル要求性を指標とする選抜方法についての説明も、ダブルクロスオーバーを利用する方法についての説明と同様である。
【００４２】
ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔを利用した方法の利点としては、最終的に得られる遺伝子破壊株を用いて、さらに別の目的遺伝子を標的として工程（１）〜（３）を繰り返すことにより、別々の遺伝子を順次欠損させていくことができるという点が挙げられる。
【００４３】
２．本発明の食酢の製造方法
本発明の食酢の製造方法は、上記の酢酸菌を用いた酢酸発酵工程を含むことを特徴とする。
【００４４】
本発明の食酢の製造方法は、上記のようにオーバーフローメタボリズム関連遺伝子が欠損している酢酸菌を利用するため、アセトイン生成能が抑制され、特有のオフフレーバー(不快臭気)が低減された食酢を提供することができるという点で優れている。
【００４５】
特に限定されないが、本発明の食酢とは具体的には醸造酢であり、具体的には、その原料の違いにより、穀物酢、果実酢及びそれ以外の醸造酢に大きく分けられる。穀物酢としては、米の使用量が４０ｇ／ｌ以上である米酢；米（糠を完全に取っていないもの）の使用量が１８０ｇ／ｌ以上のものであり、褐色又は黒褐色をしたものである米黒酢（さらに小麦及び／又は大麦を含んでもよい）；大麦のみを使用し、その使用量が１８０ｇ／ｌ以上であり、褐色又は黒褐色をしたものである大麦黒酢；それ以外の穀物酢が挙げられる。果実酢とは、果実の搾汁の使用量が３００ｇ／ｌ以上のものであり、具体的には、りんご酢、ぶどう酢、その他の果実酢等が挙げられる。使用する原材料の種類および使用量が「食酢品質表示基準」に合致しないものの、酢酸菌を用いて発酵生産した酢酸を含む調味料も広義の食酢に含む。
【００４６】
これらの酢のうち、米黒酢においては従来からアセトインの混入が避けられず、アセトインの混入を避けることは特に困難であった。本発明の食酢としては、従来アセトインの混入を避けることが特に困難な状況にあったにもかかわらず、それが達成されているという点で、米黒酢が特に好ましい。
【００４７】
上記の酢酸菌を用いた酢酸発酵工程以外の部分については、従来公知の工程を適宜用いることができる。本発明の食酢の製造方法は、特に限定されないが、具体的には例えば、
（１）糖質からアルコールを生産するアルコール発酵工程（この工程は発酵アルコールで代替することで省くこともできる）、及び
（２）工程（１）で得られたアルコールを上記の酢酸菌を用いて酢酸へ転換する酢酸発酵工程
からなる。
【００４８】
工程（１）において、糖質としては、特に限定されないが、例えば米、コーン等の穀類、リンゴ等を用いることができる。
【００４９】
工程（１）において、アルコール発酵は、特に限定されないが、具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
【００５０】
（ｉ）デンプン質原料(米・雑穀類)
米を原料とした際の代表的な製法を例示する（参考文献：「酢の機能と科学」(酢酸菌研究会編, 朝倉書店, 2012)）。洗米の後、水に浸漬し吸水させる。この浸漬は、米粒中のデンプンに麹菌が繁殖し易い状態(α化)にするための「蒸し」(次工程)に必要な水分を吸水させるために行う。吸水率は25〜30%が望ましい(100kgの米が吸水して125kgになった時、吸水率25%という)。続いて、得られた浸漬米を連続蒸米機等の蒸米機を用いて15分〜60分蒸し、デンプン質のα化およびタンパク質の変性を行う。次に、麹菌による糖化を行うが、種麹としては清酒用のAspergillus oryzaeが用いられる。この麹菌は増殖速度が速く、十分な量のα-アミラーゼ(液化アミラーゼ)、グルコアミラーゼ(糖化アミラーゼ)、および酸性プロテアーゼを有するため糖化力が強く、多くの糖を生成する。また、この工程において多くのアミノ酸を蓄積せしめることが出来れば、呈味のある食酢が産生される。製麹の手法として、麹蓋法、箱麹法、床麹法、機械製麹法などが用いられている。ここでは、機械製麹法について概略する。種麹を散布(種切り)した蒸米を25℃に冷やし、これを上部培養槽に20〜22cmの厚さに堆積する。14時間後に切り返しを行い、二酸化炭素を放散して酸素を供給する。21時間目に再度切り返しを行いながら原料を下部培養槽へ移動させる。以降は35時間目まで静置し、この間に麹菌の繁殖が旺盛となり、温度も上昇する。断続通風を続け、原料温度を39℃→41℃→39℃といった具合に維持する。44時間目で出麹となる。
【００５１】
麹および蒸米を原料として、清酒醸造用のSaccharomyces属酵母を用いたアルコール発酵が行われる。仕込み工程は、日本酒の製造に準じた工程（アルコール発酵）を経るが、飲用ではなく米酢の原料として使用することから、酒もろみと称する。発酵の完了した酒もろみに米酢を添加し、酒類として飲用することができない処置（不可飲処置）とする。続いて、加圧ろ過し、米酢の直接の原料となる変性もろみを調製する。変性もろみに、さらに米酢と水を加えて、酢酸濃度2%程度、アルコール濃度3.5%程度になるように調整し、酢酸発酵に移行する。
【００５２】
（ｉｉ）果実原料
りんご酢の原料にはりんご搾汁が使用される。予め糖濃度8〜10％程度に調整したりんご搾汁に、清酒醸造用のSaccharomyces属酵母を接種する。活発なアルコール発酵は数日で終了し、りんご酒が完成する。主発酵が完了する少し前に、糖分を残留させた状態で発酵を終了させる。発酵液に糖分を残留させることによって、酢酸菌の栄養素とするとともに食酢に良好な風味を付与することに役立つ。発酵を完了したりんご酒に、りんご酢を添加することによって不可飲処置をとる。さらにりんご酢と水を加えて、酢酸濃度2%程度、アルコール濃度3.5%程度になるように調整し、酢酸発酵に移行する。
【００５３】
工程（２）は、特に限定されないが、具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
【００５４】
（ｉ）静置発酵法
本手法は古来より行われてきた食酢製造法であり、酢酸菌が発酵液の表面で増殖して菌膜を形成し、気液面で酸素を得ながら酢酸発酵を行うため、表面発酵法とも呼ばれる。本手法ではAcetobacter属酢酸菌が用いられるが、その中でもA. pasteurianusが代表的な食酢生産菌であり、同酢酸菌はエタノール酸化能、および菌膜形成能に優れた酢酸菌である。
【００５５】
発酵槽には、木製の角槽に樹脂板を内張りした桶等が用いられる。仕込み法は、基本的には江戸時代に開発された手法を踏襲している。米酢と酒もろみと水で調製された仕込み液に酢酸菌を移植する。移植する酢酸菌は、仕込み後約1週間経過して活発な発酵が行なわれている発酵槽から比較的薄い酢酸菌の被膜（菌膜）を掬い取り、仕込み液の表面に浮かせるようにして接種する。植菌後5〜7日程度で液面全体に薄い菌膜の形成が認められ、液温も上昇（35℃〜38℃）する。発酵が進むにつれて、仕込み液のアルコール濃度は徐々に低下し、代わって酢酸濃度が上昇し、20〜30日程度で発酵は完了する。
【００５６】
（ｉｉ）通気発酵法
現在では、食酢醸造法として通気発酵法が採用されることが多くなっている。深部発酵法、或いは全面発酵法とも呼ばれる。通気発酵法においては、主にGluconacetobacter属が酢酸発酵を担う。中でも、Ga. europaeusはアルコール酸化能、アルコール耐性、および酢酸耐性に優れ、世界中で広く用いられている。
【００５７】
酢酸発酵は好気的な発酵であるため、気液接触面積を大きくすることで発酵効率を上昇させることが出来る。通気発酵に用いる発酵槽は、撹拌機によって発酵槽内の発酵液を機械的に撹拌すると同時に、槽の底部より気泡による通気を行い、撹拌翼によってさらに気泡を細分化し、発酵槽内の酸素を仕込み液に有効に溶解し、溶存酸素量を高める原理に基づいた装置である。
【００５８】
発酵装置としては、ドイツ・フリングス社製のアセテーターが用いられる場合が多い。同装置は内部に冷却管を有するステンレス製の発酵缶体の底部に高速攪拌機を備え、キャビテーション効果(撹拌翼を高速回転させた時に生じる翼背面の負圧)により外部の空気を吸い込み、微細気泡の形で自給式通気を行う。星型ローター外周部に接する様にステーターが設置されており、ローターが弾き飛ばした微細気泡がステーターを通って勢い良く飛び出し、缶体外周部まで気泡が届く。発酵液全体に細かい気泡を分散させる構造になっている（「酢の機能と科学」(酢酸菌研究会編, 朝倉書店, 2012)）。生産性に優れていることから、醸造酢を大量に生産することが可能である。
【００５９】
３．本発明の食酢
本発明の食酢は、上記の方法により得られうる、食酢である。
【００６０】
本発明の食酢は、上記のようにオーバーフローメタボリズム関連遺伝子が欠損している酢酸菌を利用して生産されるため、アセトイン生成能が抑制され、特有のオフフレーバー(不快臭気)が低減されているという点で優れている。
【００６１】
特に、本発明の食酢が、本発明の酢酸菌であって、外来性の遺伝子を含有しない酢酸菌を利用して得られうるものである場合は、「遺伝子組換え体」を利用せずに製造されたものとなるため、特に好ましい。
【実施例】
【００６２】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００６３】
１．実施例：ａｌｄＣ欠損株の作出
１．１  遺伝子操作
一般的な遺伝子操作は、既報(Green and Sambrook)に準拠した。DNA断片のクローニングには大腸菌DH5α株を用い、50 μg/ml アンピシリンを添加したLB培地で培養することで形質転換体を選抜した。プラスミドDNAの抽出には、Plasmid Midi Kit (キアゲン社)を用いた。以下に記す遺伝子破壊ベクター構築の際に用いたプライマーは、Ga. europaeus LMG18890T株(Andres-Barrao, C. et al )のドラフトゲノムデータを基に設計した。DNAポリメラーゼは、KOD plus (東洋紡)、またはPfu-X (グライナー社)を用いた。制限酵素およびその他核酸修飾酵素は、タカラバイオ社およびニッポンジーン社より購入した。サザンブロット解析には、DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (ロシュ社)を用いた。DNAシーケンシングは、BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, ver. 3.1および3130ジェネティックアナライザー(共にアプライド・バイオシステムズ社)を用いた。
【００６４】
１．２  エレクトロコンピテントセルの作成
食酢発酵液より単離したGa. europaeus 凍結菌体100μlを、1.6 % (wt/v) エタノールおよび1.0 % (v/v) セルラーゼ(Sigma-Ardrich社)を含む5 ml YPD(グルコース 30 g/l, 酵母エキス, 5 g/l, ポリペプトン 2 g/l)またはYPDU(YPDに60μg/ml ウラシルを添加したもの)に接種し、30℃、往復振とう150 rpmで16時間培養した(前培養)。前培養液を、OD660が0.03となる様、1.6% エタノールおよび1.0 % セルラーゼを含む30 ml YPDまたはYPDUに接種し、対数期中期(OD660=0.4)まで培養した。菌体を回収し、滅菌超純水および10 % (v/v) グリセロールで十分に洗浄した後、培養液の1/100量の10 % グリセロールに細胞を懸濁し、エレクトロコンピテントセルとした。
【００６５】
１．３  遺伝子破壊ベクターの構築
KGMA0119株(野生株)のゲノムDNAを抽出した後、これを鋳型として、pyrE ORFの上流および下流1.0 kbの領域を、それぞれEU-F (5’-GGAATTCGATCGCCATCCACGACGAAT-3’（配列番号１）; 下線, EcoRI認識サイト)-E5’-R(5’-TTCAGCGCCAGTGCTTCTTCGGAGCCTGTTGAAAGTCCAG-3’ （配列番号２）; 下線, pyrE ORF 下流領域5’末端との相同領域)およびE3’-F(5’-CTGGACTTTCAACAGGCTCCGAAGAAGCACTGGCGCTGAA-3’ （配列番号３）; 下線, pyrE ORF 上流領域3’端との相同領域)-ED-R(5’-CGGGATCCAGCCCGGAAAACATTCAGCA-3’ （配列番号４）; 下線, BamHI認識サイト)のプライマーペアを用いてPCR増幅した。得られた両DNA断片を鋳型とし、EU-FおよびED-RによるPCR増幅を行い、pyrE ORFを欠失させたDNA断片を作製した。同DNA断片を制限酵素で消化し、pUC19の該当位置にクローニングしたものをpyrE破壊ベクター(pUC19-ΔpyrE)とした。同様に、aldC ORF、その上流1.0 kb、および下流1.0 kbを含む2.9 kbの領域を、aldC-F(5’-AGAATTCGATCACGCTCGAAACCCTGT-3’ （配列番号５）（配列番号１）; 下線, EcoRI認識サイト)およびaldC-R(5’-AAATCGATCGATATCCCCCACCAGTTCA-3’ （配列番号６）; ClaI認識サイト)のプライマーを用いてPCR増幅し、得られたDNA断片を制限酵素処理した後、pBR322の該当位置にクローニングした。得られたプラスミドDNAを鋳型とし、aldC-i1(5’-ATTCACGAAGCCATTCGCGTGGCTG-3’ （配列番号７）)およびaldC-i2(5’-GATTGCCCGAGAATGGTGAAGCAGG-3’ （配列番号８）)のプライマーを用いてinverse PCRを行い、aldC ORFを欠失させた直鎖状DNA断片を作製した。同時に、pyrE ORFおよびその推定プロモーター領域を含む1.5 kbのDNA断片を、5’端をリン酸化したEP-F2(5’-CTGCCATATCCCGTGTTCGT-3’ （配列番号９）)およびE-R4(5’-TCGCCATAGGGAAAGACTGC-3’ （配列番号１０）)によりPCR増幅し、この断片と前述のaldC OFR欠失断片を連結することでaldC破壊ベクター(pBR322-ΔaldC::pyrE)を作製した。
【００６６】
１．４  遺伝子破壊株の単離
１．４．１
pUC19-ΔpyrEおよびKGMA0119株エレクトロコンピテントセルを氷冷した0.1cmキュベット中で混和した後、遺伝子導入装置ECM630(BTX社)により25kv/cm, 200Ω, 25μFの電気パルスを与え、エレクトロポレーションによる同株の形質転換を行った。その後、直ちに氷冷した1 ml YPD液体培地を加え、30℃で16時間振とう培養した。培養液を0.2 % (wt/v) 5-FOAおよび60 μg/ml ウラシルを含む最少寒天培地(組成前述)へ塗布し、30℃で2~3日間培養し、5-FOA耐性およびウラシル要求性を示す株を選抜した。同表現型を示す株の遺伝子型をPCR、DNAシーケンシング、およびサザンブロット解析により解析し、pyrE遺伝子欠失の認められた株の一つをKGMA0704株(ΔpyrE)として、以降の遺伝子破壊実験を行った（図４）。
【００６７】
上記に示す方法で、aldC破壊ベクターであるpBR322-ΔaldC::pyrE をKGMA0704株へ、エレクトロポレーションにより導入した。電気パルスを与えた後、直ちに氷冷した1 ml YPD液体培地を加え、30℃で3時間振とう培養した。菌体を回収し、生理食塩水(0.85 % (wt/v) NaCl)で洗浄したのち、5 ml ウラシル非添加最少培地へ接種して、更に30℃で96〜120時間培養することで、ウラシル原栄養性株を集積培養した。続いて、培養液を適宜希釈し、ウラシル非添加最少寒天培地へ塗布して30℃で2〜3日間培養した。得られたウラシル原栄養性株の遺伝子型をPCR、DNAシーケンシングおよびサザンブロット解析により解析し、aldC遺伝子座においてpyrEとの置換が認められた株の一つをKGMA4004株(ΔpyrE, ΔaldC::pyrE)とし（図５）、アセトイン生産性試験へ供試した。
【００６８】
１．４．２
pyrEを選抜マーカーとした遺伝子破壊系構築にあたり、タイプ株のドラフトゲノムデータを用い、Ga. europaeusのピリミジン生合成経路を推測した。その結果、同酢酸菌は他微生物と同様の代謝経路を有していることが示唆された。そこで、上記に示した手法により、KGMA0119株(野生株)を供試し、5-FOA耐性およびウラシル要求性を指標として、pyrE欠失株の作出を試みた。その結果、複数の候補株が得られたが、その内の一つをKGMA0704株として、以降の解析へ供試した。まず、KGMA0704株をウラシル添加、または非添加最少培地で培養したところ、ウラシルの存在下のみで増殖がみられ（図６）、この結果から同株のウラシル要求性が確認された。また、同株の遺伝子型を、EP-F3(5’-ATCCCCACCAGCATGTTCAC-3’ （配列番号１１）)およびE-R4（図４）をプライマーとして用いたPCR(鋳型, ゲノムDNA)、およびpyrEプローブ（図４）を用いたサザンブロット解析により同定した。その結果、どちらの解析においても、KGMA0704株では野生株よりも低分子のシグナルが検出されたことから（図７）、KGMA0704株ゲノム中におけるpyrE遺伝子の欠失が示された。更にこの事実は、得られたPCR産物のシーケンシングからも確認された。これらの結果から、KGMA0704株において欠失したpyrE遺伝子はGa. europaeusにおいてピリミジン生合成に関与し、同遺伝子を選抜マーカーとして用いた遺伝子破壊系の構築が可能であることが示唆された。これ踏まえ、KGMA0704株(ΔpyrE)を、以降の遺伝子破壊実験へ供試した。
【００６９】
１．４．３  一般に、α-アセト乳酸デカルボキシラーゼはアセトイン生合成系遺伝子群の一つであり、微生物における同生合成系は、過剰量の乳酸、或いはピルビン酸を、中性の化合物であるアセトインへ転換することで環境の酸性化を抑制すると同時に、炭素枯渇時に利用する炭素源として貯蔵するという働きを持つ(Huang, M. et al)。酢酸菌においても、乳酸を含む培地で培養するとアセトインが蓄積することが古くから知られている(Ley, J. De)。一方で、食酢、ビール、或いは清酒等においてアセトインは不快臭の一つとして広く知られており、その蓄積量をコントロールすることは製品設計における重要課題の一つである。更に、タイプ株のドラフトゲノムデータから、Ga. europaeusもaldCを含むアセトイン生合成系遺伝子群を保持することが示唆されている。これらを踏まえ、アセトイン非生産菌作出を目的として、Ga. europaeusにおける推定aldC遺伝子をpyrE遺伝子で置換することで、同遺伝子の破壊を試みた。すなわち、KGMA0704株へaldC破壊ベクターを導入し、ウラシル原栄養性を指標とした選抜を行った。これにより複数の候補株が得られたが、その内の一つをKGMA4004株とし、同株の遺伝子型を前述同様の手法により同定した。なお、PCRにはaldC-F2(5’-CCTGAACCTTCATTTCAATGGTGCG-3’ （配列番号１２）)およびaldC-R2(5’-GTCCATGCTCTGGTGCGTAAGCTTC-3’ （配列番号１３）)をプライマーとして用い（図５）、ゲノムDNAを鋳型とした。また、サザンブロット解析にはaldCプローブ（図５）を用いた。その結果、どちらの解析においても、KGMA4004株では野生株よりも高分子のシグナルが検出され（図７）、aldC遺伝子座における、pyrEによる置換が示された。同様の結果は、DNAシーケンシングからも確認された。これらを踏まえ、KGMA4004株をaldC欠損株(ΔpyrE, ΔaldC::pyrE)として、後述のアセトイン生産性試験へ供試した。
【００７０】
２．試験例：得られたａｌｄＣ欠損株（KGMA4004株）の評価（アセトイン生産性試験）
２．１
KGMA0119株およびKGMA4004株凍結菌体100μlを、0.4 % (wt/v) エタノールおよび0.5 % (wt/v) 酢酸を含む5 ml YPD液体培地へ接種し、30℃、往復振とう150 rpmで16時間培養した(前培養)。前培養液を、OD660=0.03となる様、0.4% エタノール、0.5 % 酢酸、および0.3 % (wt/v) L-乳酸ナトリウムを含む30 ml YPDまたは最少培地へ接種し、前培養と同条件で振とう培養した。培養液上清を経時的に回収し、上清中の揮発性成分をガスクロマトグラフィー(GC-14A, 島津)により定量した。カラムは、信和化工パックドカラム(PEG20M 10%, SHINCARBON A 60/80, 2.1m × 3.2mm)を用い、昇温プログラムは80℃ 3分, 10℃/分 12分, 200℃ 5分で解析を行った。
【００７１】
２．２
上記により得られたKGMA4004株を、L-乳酸ナトリウムを含む富栄養培地(YPD)または最少培地で培養し、そのアセトイン生産性を解析した。その結果、どちらの培地においてもKGMA4004株のアセトイン蓄積量は、野生株と比較して著しく減少していた（図８〜図１０）。これらの結果から、Ga. europaeusにおいてpyrEを選抜マーカーとした遺伝子破壊が可能であることが実証された。また同時に、KGMA4004株において欠失したaldC遺伝子はアセトイン生合成に関与しており、同遺伝子の破壊でアセトイン非生産菌を作出できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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