(57)【要約】【課題】ＰＤ−１抗体を有効成分として含む癌治療剤に関する。【解決手段】ＰＤ−１抗体は癌に対する治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体を有効成分として含み、インビボにおいて癌細胞の増殖を抑制する作用を有する癌治療剤。
【請求項２】
癌が、肺癌、大腸癌、食道癌、卵巣癌、メラノーマまたはリンパ腫である請求項１記載の癌治療剤。
【請求項３】
肺癌が、肺扁平上皮癌または肺腺癌である請求項２記載の癌治療剤。
【請求項４】
さらに、インターフェロン−αまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせることを特徴とする請求項１記載の癌治療剤。
【請求項５】
さらに、化学療法剤と組み合わせることを特徴とする請求項１記載の癌治療剤。
【請求項６】
化学療法剤が、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤および白金錯体誘導体から選択される一または二以上の化学療法剤である請求項５記載の癌治療剤。
【請求項７】
さらに、癌抗原と組み合わせることを特徴とする請求項１記載の癌治療剤。
【請求項８】
癌抗原が、ＭＡＧＥ−１もしくはＭＡＧＥ−３由来のＨＬＡ−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２拘束ペプチド、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチド、ＭＵＣ−１ペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１から選択される一または二以上の癌抗原である請求項７記載の癌治療剤。
【請求項９】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体である請求項１記載の癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害することを特徴とする免疫賦活、癌の治療若しくは感染症の治療のための組成物、およびそれらを用いる治療方法に関する。
【０００２】
さらに詳しく言えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害した結果惹起される免疫賦活を介した癌の治療若しくは感染症の治療ための組成物、それらを用いる治療方法、その組成物に有効成分として含まれる免疫賦活物質、癌治療物質若しくは感染症治療物質のスクリーニング方法、それらスクリーニング方法に使用される細胞株、癌治療物質を選別する評価法、およびその評価に用いられる癌細胞移植哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫療法は、ほとんどの薬物療法において避け難い副作用が軽減され、極めて特異性の高い治療方法として期待されている。特に、癌治療や感染症治療における薬物療法が、患者に対して大きな負担を課す治療方法であるために、患者のＱＯＬ（クオリティ・オブ・ライフ）の回復が重要視されているが、免疫療法は、ヒトがもともと備え持っている免疫反応を外因的な方法によって賦活化させ、薬物投与による負担の一部を肩代わりさせることによって、患者のＱＯＬを回復させる目的のもとに行なうことができる。
【０００４】
免疫の賦活化は、Ｔリンパ球細胞の免疫反応を活性化させる方法で行なうことができる。Ｔ細胞の活性化には、抗原レセプター（ＴＣＲ）を介した刺激だけでなく、共役刺激分子群（例えば、ＣＤ２８）を介した付加的な刺激誘導が必要であるといわれている。一方、最近、共役刺激分子群と相同的な構造を有する分子群、ＣＴＬＡ−４とＰＤ−１が発見され、抗原レセプター（ＴＣＲ）シグナルを抑制するシグナルを発していることが報告されている。Ｔ細胞の活性化の方法として、この共役抑制分子の機能を抑制することも有効な１つの手段であると考えられている。
【０００５】
ＰＤ−１は免疫グロブリンファミリーに属する５５ｋＤのＩ型膜タンパクとしてクローニングされた（The EMBO Journal，1992年，第11巻，第11号，p.3887〜3895、特開平5-336973号公報、特開平7-291996号公報）。ヒトＰＤ−１ｃＤＮＡは、EMBL / GenBank Acc. No. NM_005018に示される塩基配列で構成され、マウスＰＤ−１ｃＤＮＡは、Acc. No. X67914に示される塩基配列で構成され、それら発現は、胸腺細胞においてはＣＤ４−ＣＤ８−からＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞に分化する際に認められる（International Immunology，1996年，第18巻，第5号，p.773〜780、Journal of Experimental Medicine，2000年，第191巻，第5号，p.891〜898）。また、末梢におけるＰＤ−１の発現は、抗原レセプターからの刺激により活性化したＴ細胞、Ｂ細胞（International Immunology，1996年，第18巻，第5号，p.765〜772参照）または活性化マクロファージを含む骨髄細胞に認められることが報告されている。
【０００６】
ＰＤ−１の細胞内領域には、ＩＴＩＭモチーフ（Immunoreceptor Tyrosine - based Inhibitory Motif）があり、免疫反応に対する抑制ドメインと考えられている。さらに、ＰＤ−１欠損マウスが、糸球体腎炎、関節炎といったループス様自己免疫病（Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子背景の場合）（International Immunology，1998年，第10巻，第10号，p.1563〜1572、Immunity，1999年，第11巻，第２号，p.141〜151）や拡張性心筋症様疾患（ＢＡＬＢ／ｃ遺伝子背景の場合）（Science，2001年，第291巻，第5502号，p.319〜332）を発症することから、ＰＤ−１が自己免疫疾患発症、特に、末梢自己免疫寛容の制御因子であることも示唆されている。
【０００７】
ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１（ヒトＰＤ−Ｌ１ｃＤＮＡはEMBL / GenBank Acc. No. AF233516、マウスＰＤ−Ｌ１ｃＤＮＡはNM_021893で示される塩基配列で構成される。）は、活性化した単球や樹状細胞などのいわゆる抗原提示細胞に発現している（Journal of Experimental Medicine，2000年，第19巻，第7号，p.1027〜1034）。これら細胞は、Ｔリンパ球細胞に対して、さまざまな免疫誘導シグナルを誘導する相互作用分子を提示しており、ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１による抑制シグナルを誘導する分子の１つである。ＰＤ−Ｌ１リガンド刺激は、ＰＤ−１を発現しているＴリンパ球細胞の活性化（細胞増殖、各種サイトカイン産生誘導）を抑制することが示されている。さらに、ＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫担当細胞のみでなく、ある種の腫瘍細胞株（単球性白血病由来細胞株、肥満細胞種由来細胞株、肝癌由来細胞株、神経芽細胞種由来細胞株、乳癌由来各種細胞株）でも確認されている（Nature Immunology，2001年，第2巻，第3号，p.261〜267参照）。
【０００８】
ＰＤ−Ｌ２（ヒトＰＤ−Ｌ２ｃＤＮＡはEMBL / GenBank Acc. No. NM_025239、マウスＰＤ−Ｌ２ｃＤＮＡはNM_021896で示される塩基配列で構成される（Nature Immunology，2001年，第2巻，第3号，p.261〜267）。）は、ＰＤ−１の第２番目リガンドとして同定されたが、その発現と機能はＰＤ−Ｌ１とほぼ同じであることが報告されている。
【０００９】
ＰＤ−１に代表される共役抑制分子からの抑制シグナルは、抗原レセプター（ＴＣＲ）および共役刺激分子によるポジティブなシグナルを適性に制御するメカニズムによって、リンパ球発生または成熟過程での免疫寛容や自己抗原に対する異常な免疫反応を制御していると考えられている。また、ある種の腫瘍やウイルスは、直接的もしくは間接的なメカニズムによって、Ｔ細胞の活性化および増殖を遮断し、これら共役抑制分子を自らに対する宿主免疫反応を衰弱させるのに利用していると考えられている（Cell，1992年，第71巻，第7号，p.1093〜1102、Science，1993年，第259巻，第5093号，p.368〜370参照）。さらに、Ｔ細胞の機能障害に起因すると考えられている疾患の一部では、これら共役抑制分子の異常がＴ細胞の機能障害を起していると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平５−３３６９７３号公報
【特許文献２】特開平７−２９１９９６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】The EMBO Journal，1992年，第11巻，第11号，p.3887〜3895
【非特許文献２】International Immunology，1996年，第18巻，第5号，p.773〜780
【非特許文献３】Journal of Experimental Medicine，2000年，第191巻，第5号，p.891〜898
【非特許文献４】International Immunology，1996年，第18巻，第5号，p.765〜772
【非特許文献５】International Immunology，1998年，第10巻，第10号，p.1563〜1572
【非特許文献６】Immunity，1999年，第11巻，第２号，p.141〜151
【非特許文献７】Science，2001年，第291巻，第5502号，p.319〜332
【非特許文献８】Journal of Experimental Medicine，2000年，第19巻，第7号，p.1027〜1034
【非特許文献９】Nature Immunology，2001年，第2巻，第3号，p.261〜267
【非特許文献１０】Cell，1992年，第71巻，第7号，p.1093〜1102
【非特許文献１１】Science，1993年，第259巻，第5093号，p.368〜370
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２による抑制シグナルを阻害して、免疫賦活させる組成物およびこの機構を介した癌治療または感染症治療のための組成物の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、癌治療または感染症治療における新たな標的として、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に注目し、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２による抑制シグナルを阻害する物質が、免疫機能の回復、さらには賦活機構を介して癌の増殖を阻害することを見出した。さらに、感染したウイルスの排除にＰＤ−１シグナル、具体的にはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用が関与していることを見出した。これら事実に基づいて、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２による抑制シグナルを阻害する物質が、癌または感染症に対して治療効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、
１．ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる免疫賦活組成物、
２．ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる癌治療組成物、
３．癌転移を抑制する組成物である前項２記載の癌治療組成物、
４．ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質を含有してなる感染症治療組成物、
５．免疫賦活を介して作用することを特徴とする前項２または３記載の癌治療組成物、
６．免疫賦活を介して作用することを特徴とする前項４記載の感染症治療組成物、
７．ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用阻害物質、ＰＤ−１の細胞内シグナル阻害物質、およびＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２の産生阻害物質から選択される一以上の免疫抑制シグナル阻害物質である前項１乃至６のいずれかに記載の組成物、
８．ＰＤ−１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体、可溶化ＰＤ−１、および可溶化ＰＤ−Ｌ１から選択される一以上のＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用阻害物質である前項７記載の組成物、
９．国際受託番号FERM BP-8392で識別されるハイブリドーマが産生する抗ヒトＰＤ−１抗体、非ヒト抗体をヒト化させた抗ＰＤ−１抗体、および完全ヒト型抗ヒトＰＤ−１抗体から選択されるＰＤ−１抗体である前項８記載の組成物、
１０．遺伝子改変によりＰＤ−１発現が阻害されたリンパ球細胞が、免疫抑制シグナル阻害物質である前項１乃至６のいずれかに記載の組成物、
１１．ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用阻害物質、ＰＤ−１の細胞内シグナル阻害物質、またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２の産生阻害物質が、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、抗体若しくはそれらの誘導体、有機合成化合物、無機化合物、および天然物から選択される一以上の物質である前項７記載の組成物、
１２．ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる免疫賦活方法、
１３．ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる癌治療方法、
１４．癌転移を抑制する前項１３記載の癌治療方法、
１５．ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質を投与することからなる感染症治療方法、
１６．免疫賦活を介して作用することを特徴とする前項１３または１４記載の癌治療方法、
１７．免疫賦活を介して作用することを特徴とする前項１５記載の感染症治療方法、
１８．ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用阻害物質、ＰＤ−１の細胞内シグナル阻害物質、およびＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２の産生阻害物質から選択される一以上の免疫抑制シグナル阻害物質である前項１２乃至１７のいずれかに記載の方法、
１９．ＰＤ−１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体、可溶化ＰＤ−１、および可溶化ＰＤ−Ｌ１から選択される一以上のＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用阻害物質である前項１８記載の方法、２０．国際受託番号FERM BP-8392で識別されるハイブリドーマが産生する抗ヒトＰＤ−１抗体、非ヒト抗体をヒト化させたＰＤ−１抗体、および完全ヒト型抗ヒトＰＤ−１抗体から選択されるＰＤ−１抗体である前項１９記載の方法、
２１．遺伝子改変によりＰＤ−１発現が阻害されたリンパ球細胞が、免疫抑制シグナル阻害物質である前項１２乃至１７のいずれかに記載の方法、
２２．ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用阻害物質、ＰＤ−１の細胞内シグナル阻害物質、またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２の産生阻害物質が、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、抗体若しくはそれらの誘導体、有機合成化合物、無機化合物、および天然物から選択される１つ以上の物質である前項１８記載の方法、
２３．免疫賦活組成物を製造するためのＰＤ−1、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質の使用、
２４．癌治療組成物を製造するためのＰＤ−1、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質の使用、
２５．癌治療組成物が、癌転移抑制組成物である前項２４記載の物質の使用、
２６．感染症治療組成物を製造するためのＰＤ−1、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の免疫抑制シグナル阻害物質の使用、
２７．ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現するように形質転換されたスクリーニング用癌細胞株、
２８．前項２７記載の細胞、リンパ球細胞および被験物質を接触させて、前項２７記載の細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用を評価することを特徴とする免疫賦活物質のスクリーニング方法、
２９．癌細胞である前項２７記載の細胞、リンパ球細胞および被験物質を接触させて、その癌細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用またはその腫瘍細胞の増殖に対する阻害作用を評価することを特徴とする癌治療物質のスクリーニング方法、
３０．病原体を感染させた前項２７記載の細胞またはＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞、リンパ球細胞および被験物質を接触させて、その感染細胞へのリンパ球細胞の免疫反応に対する被験物質の増強作用または病原体増殖に対する阻害作用を評価することを特徴とする感染症治療物質のスクリーニング方法、
３１．前項２７記載の癌細胞株を移植して作出した哺乳動物、
３２．前項３１記載の哺乳動物に被験物質を投与し、被験物質による移植癌細胞の増殖に対する抑制率またはその被移植哺乳動物の生存率を評価することを特徴とする癌治療物質の選別方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】（Ａ）は、Ｈ−２Ｌd特異的２Ｃ  ＣＴＬクローンのＰＤ−１発現と、Ｐ８１５（肥満細胞種由来細胞株）のＰＤ−Ｌ１発現安定形質転換株でのＰＤ−Ｌ１発現を示すフローサイトメトリー、（Ｂ）は、ＰＤ−Ｌ１発現Ｐ８１５細胞株に対する２Ｃ  ＣＴＬ細胞株の細胞傷害活性と抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１Ｆ（ａｂ’）2ＩｇＧ）の細胞傷害活性に対する効果を示す。
【図２】同系マウスにおける移植ＰＤ−Ｌ１発現Ｐ８１５細胞株の腫瘍増殖性と浸潤性を示す。（Ａ）は移植ＰＤ−Ｌ１発現Ｐ８１５腫瘍の腫瘍容積（上）、移植後の生存率（下）であり、（Ｂ）は同系ＤＢＡ／２マウスにおける移植ＰＤ−Ｌ１発現Ｐ８１５腫瘍塊の組織染色像である（ａは腹壁および腹膜への腫瘍細胞の浸潤を示す４０倍像、ｂは同じく４００倍像、ｃは脾臓への転移、ｄは肝臓への転移を示す。）。
【図３】同系マウスにおける移植ＰＤ−Ｌ１発現Ｐ８１５細胞株の腫瘍増殖性に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のin vivo効果を示す。（Ａ）は当該マウスにおける腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のin vivo効果、（Ｂ）は当該マウスにおける移植ＰＤ−Ｌ１発現Ｐ８１５腫瘍の腫瘍容積（上）と生存率（下）に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のin vivo効果を示す（図中、□は対照群（ラットＩｇＧ投与群）、○は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（anti−ＰＤ−Ｌ１Ｆ（ａｂ'）2ＩｇＧ）投与群）。
【図４】ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損同系マウス（ＰＤ−１-/-）でのＰＤ−Ｌ１発現Ｂ１６メラノーマの増殖抑制を示す。
【図５】同系マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）における移植ミエローマ細胞株の腫瘍増殖性に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のin vivo効果とＰＤ−１の関与を示す。（Ａ）は各種ミエローマ細胞株でのＰＤ−Ｌ１発現を示すフローサイトメトリー、（Ｂ）は前記マウスにおける移植Ｊ５５８Ｌ腫瘍の腫瘍容積に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のin vivo効果、（Ｃ）は野生型およびＰＤ−１遺伝子欠損ＰＤ−１-/-の同系マウスにおける移植Ｊ５５８Ｌ腫瘍の腫瘍増殖の比較を示す。
【図６】血管内皮でのＰＤ−Ｌ１発現を示す。（Ａ）はマウス心臓の血管内皮細胞でのＰＤ−Ｌ１，ＰＤ−Ｌ２の発現を示す。（Ｂ）はマウス各組織でのＰＤ−Ｌ１発現の確認を組織染色を示す。（ａ）：眼球、（ｂ）：顎下腺、（ｃ）：心臓、（ｄ）：肺、（ｅ）：肝臓、（ｆ）：腎臓でのＰＤ−Ｌ１の発現を示す。図中、Ｃｈは脈絡膜、ＣＶは中心静脈、Ｇｌは糸球体、Ｒｅは網膜を示す。各矢印は、血管内皮細胞を示す。各染色像は４０倍拡大像である。
【図７】肝臓非実質細胞でのＰＤ−Ｌ１発現を示す。（Ａ）はマウス肝臓でのＩＣＡＭ−１、（Ｂ）はＰＤ−Ｌ１の発現を示す（ＣＶ：中心静脈）。
【図８】クップファー細胞（Kupffer Cell）および肝臓類洞周囲腔内皮細胞（ＬＳＥＣ）での細胞表面分子のフェノタイプを示す。
【図９】ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型マウス（ｗｔ）のＣＤ４陽性Ｔ細胞での細胞表面分子のフェノタイプを示す。
【図１０】ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型マウス（ｗｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞での細胞表面分子のフェノタイプを示す。
【図１１】Ｔ細胞増殖に対するＬＮＰＣのＰＤ−Ｌ１の効果を示す。（Ａ）はＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウスのそれぞれのナイーブＴ細胞刺激時の細胞増殖を示す。（Ｂ）はＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウス由来で既に活性化されたＴ細胞とＬＮＰＣとの共培養における細胞増殖に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を示す。
【図１２】サイトカイン産生に対するＬＮＰＣのＰＤ−Ｌ１の効果を示す。（Ａ）はＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウスのそれぞれのナイーブＴ細胞刺激時のサイトカイン産生を示す。（Ｂ）は、ＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウス由来で既に活性化されたＴ細胞とＬＮＰＣとの共培養におけるサイトカイン産生に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を示す。（Ｃ）はＬＮＰＣとの共培養におけるＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウスからの活性化Ｔ細胞の細胞分裂を示す。
【図１３】ウイルス感染したマウス肝臓におけるＴリンパ球細胞の増殖に対するＰＤ−１の関与を示す。（Ａ）はアデノウイルス感染後０日目、（Ｂ）は同７日目でのＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウスの肝臓および脾臓でのＣＤ１９陽性およびＣＤ３陽性リンパ球細胞の増殖を示す。
【図１４】ウイルス感染したマウス肝臓におけるＴリンパ球細胞の増殖に対するＰＤ−１の関与を示す。（Ａ）はアデノウイルス感染後７日目でのＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウスの肝臓でのＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性リンパ球細胞の増殖を示す。（Ｂ）は、感染後７日目での各種増殖性リンパ球の割合を示す。
【図１５】ウイルス感染に対するＰＤ−１の関与を示す。図中（ａ）〜（ｄ）は、アデノウイルス感染後０日および７日目でのＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウスの肝臓でのそれぞれの細胞増殖を示す組織染色像である。（ｅ）、（ｆ）はアデノウイルス感染後７日目でのＰＤ−１-/-マウスでのＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞増殖を示す。
【図１６】ウイルス感染に対するＰＤ−１の関与を示す。図中（ｇ）〜（ｎ）は、アデノウイルス感染後０日および７日目でのＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウスの肝臓のヘマトキシリン＆エオジン組織染色像である。図中（ｏ）〜（ｒ）は、アデノウイルス感染後０日および７日目でのＰＤ−１-/-マウスおよびｗｔマウスの肝臓のＸ−Ｇａｌ染色像である。
【図１７】細胞傷害活性に対する各物質の増強作用を示す。図中（ａ）抗マウスＰＤ−１抗体の増強作用、（ｂ）抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体の増強作用、（ｃ）マウスＰＤ−１Ｆｃの増強作用（ｄ）ヒトＰＤ−１Ｆｃの増強作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明中のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２は、それぞれマウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ブタ、サルまたはヒトを含む霊長類の哺乳動物を由来とするものを含む。好ましくは、ヒトＰＤ−１、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２である。
【００１７】
本発明中のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２による免疫抑制シグナルは、少なくともＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用、ＰＤ−１の細胞内シグナルから構成される。さらに、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２分子自身の産生もこれに含まれる。
【００１８】
本発明中のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２による免疫抑制シグナルは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用またはＰＤ−１の細胞内シグナルの直接的あるいは間接的な阻害によって阻害される。これらの阻害活性を有する物質として、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２にそれぞれ選択的に結合する物質が挙げられる。好ましくは、例えば、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、抗体若しくはそれら誘導体、有機合成化合物、無機化合物、または天然物が挙げられる。特に、特異性に優れた物質として、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に対する抗体が挙げられる。
【００１９】
また、当該免疫抑制シグナルは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２分子自身の産生の阻害によっても阻害される。
【００２０】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に対する抗体は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２による免疫抑制シグナルを阻害するものであれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体またはヤギ由来抗体のいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、完全型若しくは短縮型（例えば、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'、ＦａｂまたはＦｖ断片）抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。
【００２１】
そのような抗体は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の細胞外領域の部分タンパク質を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。細胞外領域の部分タンパク質は、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。
【００２２】
ポリクローナル抗体は、公知の方法によって製造することができる。例えば、抗原タンパク質あるいはそれとキャリアー蛋白質との混合物で、適当な動物に免疫を行ない、その免疫動物から抗原タンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。用いられる動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモットが一般的に挙げられる。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを抗原タンパク質と共に投与することができる。投与は、通常約２週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうのが一般的である。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水などから採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、例えば、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤を用いた精製法、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法などの免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００２３】
抗体製剤としては、モノクローナル抗体あるいはその修飾体がより好ましい。
モノクローナル抗体産生細胞の作製は、抗原で免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、継代培養可能なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することにより行なうことができる。抗原タンパク質の投与は、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と共に行なう。投与には、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与するのが一般的である。また、“ＤＮＡ免疫”と呼ばれる方法によっても、動物を免疫することができる。この方法は、免疫動物の後足前脛骨筋にカルジオトキシン（Cardiotoxin）を処置し、さらに抗原タンパク質を発現するベクターを導入した後、組織修復の過程でベクターが筋細胞に取りこまれ、タンパク質を発現する現象を利用した方法である（Nature Immunology，2001年，第2巻，第3号，p.261〜267）。
【００２４】
免疫される動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギまたはモルモットが可能であるが、好ましくはマウスまたはラットが用いられる。融合操作は、コーラー（Kohler）とミルシュタイン（Milstein）の方法（Nature，1975年，第256巻，第5517号，p.495〜497）で実施することができ、融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが用いられる。骨髄腫細胞としては、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ１、ＳＰ２／０、ＡＰ１などの骨髄腫細胞が挙げられるが、通常Ｐ３Ｕ１がよく利用される。モノクローナル抗体産生細胞の選別は、例えば、抗原タンパク質を直接あるいは担体と共に吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加することによるＥＬＩＳＡ法などにより検出して行なうことができる。さらに、ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、ＥＬＩＳＡ法によって測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は、上記のポリクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。具体的には、国際受託番号FERM BP-8392で識別されるハイブリドーマが産生する抗ヒトＰＤ−１抗体あるいは国際受託番号FERM BP-8396で識別されるハイブリドーマが産生する抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００２５】
国際受託番号FERM BP-8392で識別されるハイブリドーマは、2002年12月19日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号305-8566）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-19162で寄託され、2003年6月5日付で国際寄託に移管されている。また、国際受託番号FERM BP-8396で識別されるハイブリドーマは、2002年6月25日付で同センターに受託番号FERM P-18908で寄託され、2003年6月11日付で国際寄託に移管されている。
【００２６】
抗体断片とは、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'、ＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、プロテアーゼ酵素により処理し、場合により還元して得ることができる。
【００２７】
Ｆ（ａｂ'）2抗体フラグメントは、精製されたモノクローナル抗体をペプシンで完全に消化し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、プロテインＡあるいはプロテインＧカラムなどのアフィニティークロマトグラフィーのいずれかの方法により精製することができる。ペプシンの消化時間は、Ｉｇサブタイプにより異なるため、適当に調製することが必要である。Ｆａｂ'抗体フラグメントは、調製したＦ（ａｂ'）2を２−メルカプトエチルアミンで部分還元することによって作製することができる。また、Ｆａｂ抗体フラグメントは、システイン存在下で消化酵素パパインで直接消化し、精製して作製することができる。
【００２８】
また、モノクローナル抗体は、抗体のアミノ酸配列を決定したり、ハイブリドーマから単離できる抗体をコードするＤＮＡ配列を利用して、遺伝子組換え技術により改変し、改変抗体やハイブリッド抗体を産生させることも可能である。例えば、通常の完全型抗体ではなく単鎖抗体として作製することもできる。ｓｃＦｖ抗体（Single Chain Fv）は、ジョストらの方法（Journal of Biological Chemistry，1994年，第269巻，第42号，p.26267〜26273）により行なうことができる。重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれコードするＤＮＡ断片を中性アミノ酸（グリシンあるいはセリン）をコードするスペーサーで連結し、この融合ＤＮＡを含む発現ベクターを適当な宿主細胞で発現させることによって、本来の抗体の特性と親和性を保持する単鎖の抗体を作製することができる。
【００２９】
非ヒト抗体をヒトの治療に用いる場合、その抗体の抗原性を減少させることが不可欠である。患者の抗体に対する免疫反応は、有効な治療期間を短縮させる場合が多く、抗体をヒト化あるいは完全ヒト型化させ、抗体の抗原性を減らす工程が必要である。ヒトへの投与が可能となるよう改変されたヒト化抗体とは、同抗体をヒトに投与したときに薬理学的に許容し得る程度に、抗原性が減少あるいは血中動態が改善するよう改変された抗体である。
【００３０】
本発明の明細書中のヒトＰＤ−１抗体またはヒトＰＤ−Ｌ１抗体は、これをヒト化あるいは完全ヒト型化した抗体をも含む。
【００３１】
ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物に免疫して作製された非ヒト抗体の一部をヒト抗体の一部に置換することによって作製できる。具体的には、ヒト抗体の定常領域をコードする遺伝子とのキメラを構築することによって作製できることが知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，1987年，第84巻，p.3439〜3443、Journal of Immunology，1987年，第139巻，第1号，p.3521）。ヒトの定常領域のＤＮＡ配列は文献に記載されており、その定常領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。続いて、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をヒトの定常領域の配列に融合させる。ヒトの定常領域のアイソタイプは所望のエフェクター機能または抗体依存細胞性細胞毒性における活性によって選択できる。好ましいアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。また、ヒト軽鎖定常領域、κ鎖またはλ鎖のいずれも用いることができる。このヒト化キメラ抗体は通常の方法によって発現させることができる。
【００３２】
完全ヒト型抗体は、ヒト免疫グロブリンの定常領域遺伝子を導入されたマウス（ゼノマウス（Chemical Biology，2000年，第7巻，第8号，p.R185-6）、ヒューマブマウス（infection and immunity，2002年，第70巻，第2号，p.612-9）、ＴＣマウス（Biotechnology and Genetics Enginnering Revew，2002年，第19巻，p.73〜82）、ＫＭマウス（Cloning Stem Cells，2002年，第4巻，第1号，p.91-102））を利用して作製することができ、さらにそれらマウスから単離した抗体産生リンパ球をハイブリドーマにして、目的の抗体を量産させることができる。また、ファージ・ディスプレー法（FEBS Letter，1998年，第441巻，p.20-24）によっても作製することができる。この方法は、環状一本鎖ＤＮＡにヒト抗体遺伝子を組み込んだファージを利用して、ファージを構成する外殻タンパク質と融合した形で、ヒト型抗体をファージの表面に発現されることができる。
【００３３】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に結合するポリペプチドまたはその誘導体は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２のそれぞれの部分タンパク質であって、免疫抑制シグナルを誘導しないものが挙げられる。ＰＤ−１の免疫抑制シグナルの誘導には、ＰＤ−１が抗原レセプターの近傍に存在することが不可欠であり、そのためには抗原提示細胞、腫瘍あるいは癌細胞に存在するＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２との相互作用による拘束が必要である。したがって、細胞外ドメインのみであってＰＤ−１と相互作用する部分を有する可溶化ＰＤ−Ｌ１または可溶化ＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１の免疫抑制シグナルを阻害することができる。逆に、同様の構造を有し、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に結合できる可溶化ＰＤ−１も、免疫抑制シグナルを阻害することができる。これら可溶化タンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に結合するのに必要十分な細胞外領域を含むものであればよく、公知のタンパク質発現法および精製法によって調製することができる。
【００３４】
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用阻害物質がタンパク質またはポリペプチドであり、それらの相互作用に必須の領域が、連続するポリペプチドのみによって構成されている場合、そのようなポリペプチド断片は、互いの拮抗物質になり得る。さらに、このポリペプチド断片を化学的に修飾されたあるいはポリペプチド断片の立体構造をもとにコンピュータによって設計された分子群から、より強力な活性を有する拮抗物質を同定することが可能となる。また、相互作用領域のタンパク質立体構造解析データをもとにコンピュータによって設計された分子群の中から、最適の拮抗分子をより効率的に選択することもできる。
【００３５】
また、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用を阻害する物質を直接スクリーニングすることができる。そのような物質は、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、非ペプチド性化合物、有機合成化合物、または天然物（例えば、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物）のライブラリーから同定することが可能である。
【００３６】
ＰＤ−１細胞内ドメインの抑制シグナルは、ＰＤ−１細胞内ドメインであるＩＴＩＭに結合した脱リン酸化酵素（例えば、ＳＨＰ−１、２（Sathish JG，Journal of Immunology），2001年，第166巻，第3号，p.1763-70）が、抗原受容体複合体の細胞内複合体に接触することによって生じることから、総じて抗原受容体複合体とＰＤ−１の接触の阻害によって阻害される。抑制シグナルを阻害する物質として、ＩＴＩＭのチロシン残基のリン酸化を阻害する物質、ＩＴＩＭへの脱リン酸化酵素の結合を阻害する物質、その脱リン酸化酵素の活性を直接阻害する物質などが挙げられる。抗原受容体複合体としては、Ｔ細胞受容体複合体、Ｂ細胞受容体複合体が挙げられる。
【００３７】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の産生は、特定のポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオシド、有機合成化合物、無機化合物、または天然物などによって阻害できる。特に、好適なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオシドとして、リボザイムと呼ばれるアンチセンスヌクレオチド誘導体が挙げられる。これは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１または、ＰＤ−Ｌ２のｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチド誘導体を、対象の発現細胞に導入することによって、発現するｍＲＮＡが破壊される機構を利用したものである。さらに、ベクターは、患者から採取したリンパ球前駆細胞に対して、ＰＤ−１の発現を阻害するような遺伝子操作に使用でき、その操作された細胞は、増殖、分化、そして、活性化させて、再び患者に投与する細胞医療に利用することができる。特に、癌に対する免疫療法においては、リンパ球前駆細胞の成熟化および活性化の際に、標的細胞の特異抗原を添加することによって、標的細胞に特異的で、よりクローナルなリンパ球細胞を調製することができる。
【００３８】
本発明のスクリーニング法は、細胞機能を測定する方法で行なうことができる。同方法で使用されるＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現するように形質転換したスクリーニング用癌細胞株とは、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現するように構築された発現ベクターを公知の方法によって細胞に導入し、一過性あるいは安定的に形質転換された癌細胞株を含む。使用される癌細胞株としては、サルＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記する。）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記する。）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。特に、動物細胞を形質転換する場合には、例えば、「細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール」（秀潤社、1995年、第263）や「Virology」（1973年、第52巻、第456号）に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３９】
また、自然にＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞を用いることもできる。そのような細胞として、白血球細胞、好ましくは単球、マクロファージ若しくは抗原提示細胞、上皮系細胞、腫瘍細胞、癌細胞またはそれらの細胞株などである。腫瘍細胞または癌細胞として使用できる細胞として、例えば、Ｐ３８Ｄ１細胞、Ｐ８１５細胞、ＮＢ４１Ａ３細胞、ＭＤＡ−２３１細胞、ＳＫＢＲ−３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｊ５５８Ｌ細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ＰＡＩ細胞、Ｘ６３細胞またはＳＰ２／０細胞を用いることができる。
【００４０】
ＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２を自然に発現する細胞または強制的に発現させた細胞であって、病原体を感染させた細胞を用いることもできる。感染させる病原体としては、ヒト肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ａ型肝炎）またはＥ型肝炎）、ヒトレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１、ＨＩＶ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２）、単純ヘルペスウイルス１型若しくは２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６を含むヒトヘルペスウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、おたふくウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を発症するウイルス、エボラウイルス、西ナイルウイルス、またはそれらを人為的に改変されたウイルスが挙げられる。その他の病原体として、例えば、病原性原生動物（例えば、トリパノソーマ、マラリアおよびトキソプラズマ）、細菌（例えば、マイコバクテリウム、サルモネラおよびリステリア）、または真菌（例えば、カンジダ）が挙げられる。
【００４１】
本発明のスクリーニング法で使用されるリンパ球細胞としては、Ｔ細胞またはＢ細胞であり、好ましくは、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞（ＣＴＬ）である。また、本発明のスクリーニング法におけるリンパ球細胞の免疫反応は、細胞傷害反応（例えば、腫瘍免疫反応）、混合リンパ球反応、サイトカイン、抗体、補体若しくはその他細胞表面抗原の産生、または細胞増殖が挙げられる。
【００４２】
本発明の免疫賦活または癌治療組成物の有効成分のスクリーニング法は、具体的には、細胞傷害性Ｔリンパ球の対象細胞に対する細胞傷害活性を測定し、その活性に対する被験物質の効果を定量することによって行なうことができる。この方法は、ＰＤ−１を自然に発現する細胞傷害性Ｔリンパ球細胞（ＣＴＬ）あるいは細胞株（例えば、２Ｃ細胞）および同系マウス由来であってＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を自然に発現するもしくは強制的に発現させた細胞の混合培養に対して、被験物質を添加することによる細胞傷害活性の回復あるいは増強を定量するものである。本法の特徴は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現していない細胞に対する細胞傷害活性に比べ、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現している細胞に対する細胞傷害活性が低く、被験物質による細胞傷害活性の回復（上昇幅）をより明確に測定できるところにある。被験物質による細胞傷害性の回復は、本発明の特徴とするＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２による細胞傷害性の抑制の阻害に相当するものとして評価することができる。さらに、被験物質による細胞毒性を任意に測定することがより望ましい。これに使用される細胞としては、自然にＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する腫瘍細胞株または癌細胞株（Nature Immunology，2001年，第2巻，第3号，p.261〜267）、例えば、Ｐ３８Ｄ１細胞、Ｐ８１５細胞、ＮＢ４１Ａ３細胞、ＭＤＡ−２３１細胞、ＳＫＢＲ−３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｊ５５８Ｌ細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ＰＡＩ細胞、Ｘ６３細胞、またはＳＰ２／０細胞を用いることができるが、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を安定的にあるいは一過的に発現するように形質転換させた腫瘍細胞株または癌細胞株も使用することができる。
【００４３】
一方、使用できる細胞傷害性リンパ球は、ＰＤ−１を発現しているものであって、対象とする細胞に対して同系の動物由来の細胞であることが好ましい。
【００４４】
本発明の感染症治療組成物の有効成分のスクリーニングは、ＰＤ−１を自然に発現する細胞傷害性Ｔリンパ球細胞（ＣＴＬ）あるいは細胞株（例えば、２Ｃ細胞）、病原菌またはウイルスを感染させた同系由来のＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を自然に発現するもしくは強制的に発現させた細胞の混合培養に対して、被験物質を添加することによるその感染細胞へのリンパ球細胞の免疫反応の増強作用または病原菌若しくはウイルスの増殖活性に対する阻害作用を定量するものである。
【００４５】
さらに、同様の原理を利用した評価法では、上記のＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現するように形質転換させたスクリーニング用癌細胞株または自然にＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞を、同系哺乳動物に移植して作出した哺乳動物を使用することができる。作出する工程としては、細胞を移植する工程、評価対象が適切となるまで同哺乳動物を飼育する工程が不可欠である。この評価法は、移植細胞の増殖、各種サイトカイン若しくは細胞表面抗原の産生量、特に、細胞が癌細胞の場合は、同細胞の増殖、浸潤若しくは転移の組織学的解析または被移植哺乳動物の生存率を評価することを特徴とする。細胞増殖は、腹水癌または血液癌の場合はその単位容量当りの癌細胞数、固形癌の場合はその大きさまたは摘出後の重量によって評価することができる。本法における被験物質による癌治療効果は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２による細胞傷害性抑制の阻害に由来する効果に相当するものとして評価することができる。移植する癌細胞株は、インビトロでのスクリーニング法で使用できる癌細胞のいずれも使用できるが、移植哺乳動物と同系由来のもので、増殖性が良いものがより好ましい。哺乳動物としては、ヒトを除く霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ブタ、サルが挙げられる。
【００４６】
本発明者らは、癌細胞移植動物モデルへの投与によって、癌の増殖を顕著に抑制し個体の延命効果を発揮する物質として、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１の機能を阻害するそれぞれの特異的抗体（抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）を発明した。これら抗体は、ＰＤ−１を発現しているＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球細胞）へのＰＤ−Ｌ１リガンドの提示によって相対的に低下する細胞傷害活性を回復あるいは増強させる作用を示した（実施例１，図１参照）。これは、ＣＴＬによる癌細胞に対する細胞傷害活性が、これら抗体の投与によって増強しうることを示唆するものである。さらに、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与は、ＰＤ−Ｌ１を人為的に発現させた肥満細胞腫由来細胞株を移入した同系マウスを用いた癌細胞移植動物モデル（蛋白質・核酸・酵素、1981年、26巻、3号、p.208〜224）において、癌細胞の増殖、浸潤および転移を抑制し、個体の延命効果を示した（図２、図３参照）。さらに、この抗体によるＰＤ−Ｌ１機能の阻害による効果と同様の効果が、ＰＤ−１の機能あるいは産生を阻害することによって得られることが示唆された。これは、ＰＤ−１欠損マウスを用いた癌移入モデルでは、移入癌細胞の増殖が全く認められなかったからであり、ＰＤ−１の機能阻害あるいは産生阻害も有効な癌治療方法になることを示すものである（実施例５，図５参照）。
【００４７】
実際に、癌細胞移植動物モデルにおいて、抗ＰＤ−１抗体の投与が移入癌細胞の肝臓への転移を有意に抑制することが証明されていた（実施例１３参照）。
【００４８】
さらに、発明者らは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害する物質が、感染症治療に有用であることを示した（実施例１１，図１５，図１６参照）。
【００４９】
本発明者らが実験的に示したこれら結果は、ＰＤ−１抗体またはＰＤ−Ｌ１抗体のみが既述の効果を呈することを示すものではなく、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２からの免疫抑制シグナルを阻害し得るいずれの物質もほぼ同様の効果を呈することを証明するものである。そのような効果を有する物質として、例えば、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、可溶化ＰＤ−１、可溶化ＰＤ−Ｌ１、可溶化ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１拮抗物質、ＰＤ−Ｌ１拮抗物質、ＰＤ−Ｌ２拮抗物質、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用を阻害する物質、ＰＤ−１産生阻害物質、ＰＤ−Ｌ１産生阻害物質、ＰＤ−Ｌ２産生阻害物質、またはＰＤ−１による細胞内抑制シグナル阻害物質が挙げられる。
【００５０】
本発明の癌治療組成物の投与によって、その効果が期待される癌または腫瘍として、例えば、癌腫、扁平上皮癌（例えば、子宮頚管、瞼、結膜、膣肺、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉頭、食道）、腺癌（例えば、前立腺、小腸、子宮内膜、子宮頚管、大腸、肺、膵、食道、直腸、子宮、胃、乳房、卵巣）が挙げられる。さらに、肉腫（例えば、筋原性肉腫）、白血病、神経腫、メラノーマ、リンパ腫も含まれる。
【００５１】
これら癌または腫瘍のうち、特にＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を顕著に発現しているものに対してその効果が顕著である。ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の発現を、外科的に切除した癌または腫瘍塊あるいは体外に採取した病変部をサンプルとする検査により同定でき、本発明の組成物の投与は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を顕著に発現している腫瘍または癌を有する患者に対する外科的処置後の治療として、効率的で有効な方法となる。ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の発現の同定は、例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体若しくはＰＤ−Ｌ２抗体を用いた免疫化学的方法、ＲＴ−ＰＣＲ法またはＤＮＡアレイ法によって検査することができる。
【００５２】
癌に対する化学療法および放射線療法は、リンパ球の増殖を激しく減少させるという副作用が不可避である。本発明の組成物の投与は、減少したリンパ球細胞を刺激、増殖させる効果を示すと共に、通常の化学療法に付随する激烈な副作用を最小限に抑制することができる。また、放射線療法についても同様である。また、本発明の組成物との併用によって、化学療法剤の用量または照射放射線量を通常使用される用量あるいは照射量から大幅に減少させることができる。
【００５３】
本発明の癌治療組成物は、既存の化学療法剤と併用あるいは合剤化することができる。そのような化学療法剤として、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、その他免疫療法剤またはその他の抗癌剤が挙げられる。さらに、患者のＱＯＬ回復のための癌治療補助剤である白血球（好中球）減少症治療薬、血小板減少症治療薬、制吐剤、癌性疼痛治療薬と併用あるいは合剤化ができる。
【００５４】
本発明の癌治療組成物は、その他の免疫賦活物質と併用あるいは合剤化することができる。そのような免疫賦活物質としては、例えば、各種サイトカインや腫瘍抗原などが挙げられる。免疫反応を刺激するサイトカインとしては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロン−α、β、γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１２などが挙げられる。また、Ｂ７リガンド誘導体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体も免疫反応を高めることができる。
【００５５】
癌抗原の投与も、癌細胞に対するＴリンパ球細胞の特異的免疫反応を高めることができ、本発明の癌治療組成物との併用によって、付加的あるいは相乗的な増強を与えることができる。癌抗原は、遺伝子が明らかなものについては精製タンパク質として、また不明なものについては、癌細胞自体の溶解物として調製することができる。
【００５６】
そのような癌抗原として、例えば、悪性黒色腫のＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３由来のＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２拘束ペプチドやＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００が挙げられる。また、乳癌や卵巣癌のＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドや腺癌のＭＵＣ−１ペプチド、さらに、転移性癌のＮＹ−ＥＳＯ−１も挙げることができる。
【００５７】
ウイルスは、感染宿主の免疫防御から逃れるための１つの方法として、Ｔリンパ球細胞の共役抑制因子を利用していると考えられている（Journal Experimental Medicine，2000年，第191巻，第11号，p.1987〜1997）。ウイルス感染は、このようなウイルスのエスケープ機能に一部起因しており、本発明の組成物の投与によってＴリンパ球細胞のウイルスに対する免疫反応を高めることができると考えられる。
【００５８】
本発明の感染症治療組成物の投与は、例えば、ヒト肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ａ型肝炎またはＥ型肝炎）、ヒトレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１、ＨＩＶ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスまたはヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２）の感染治療に有効である。また、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６を含むヒトヘルペスウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、おたふくウイルス、インフルエンザウイルスまたは風邪ウイルスとして挙げられるアデノウイルス、エンテロウイルス若しくはライノウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を発症するウイルス、エボラウイルス、または西ナイルウイルスの感染治療にも有効であると考えられる。
【００５９】
その他の病原体として、例えば、病原性原生動物（例えば、トリパノソーマ、マラリアおよびトキソプラズマ）、細菌（例えば、マイコバクテリウム、サルモネラおよびリステリア）または真菌（例えば、カンジダ）による感染に対しても有効であると考えられる。
【００６０】
本発明の感染症治療組成物は、既存の抗ＨＩＶ剤、抗ウイルス剤、抗生物質製剤、抗菌剤、内臓真菌症治療薬と併用あるいは合剤化することができる。
【００６１】
抗ＨＩＶ剤として、例えば、逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴ，ｄｄＩ，３ＴＣ，ｄ４Ｔ）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、メシル酸サキナビル、リトナビル、メシル酸ネルフィナビル、アンプレナビル、メシル酸デラビルジン、サキナビル、ロピナビル／リトナビル）、またはＣＣＲ５受容体拮抗剤が挙げられる。抗ウイルス剤としては、例えば、抗ヘルペスウイルス剤、抗インフルエンザウイルス剤、インターフェロン−αおよびβ、または各種免疫グロブリンが挙げられる。
【００６２】
本発明の感染症治療組成物は、ウイルスもしくは病原体のワクチンと併用あるいは共に製剤化することができる。そのようなワクチンとしては、例えば、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、日本脳炎ワクチン、ＢＣＧワクチン、３種混合ワクチン、おたふくワクチン、水痘ワクチン、インフルエンザワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、またはコレラワクチンが挙げられる。
【００６３】
本発明の組成物は、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。
【００６４】
投与量は、本発明に用いる薬物により異なると同時に、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、経口投与の場合は、通常、成人一人あたり、１回につき、１μｇから１００ｍｇの範囲で、１日１回から数回投与される。非経口投与の場合は、成人一人あたり、１回につき、0.1ｎｇから１０ｍｇの範囲で、１日１回から数回投与され、その非経口投与形態は、好ましくは、静脈内投与であり、１日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。
【００６５】
もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。
【００６６】
本発明の組成物と他の薬剤の併用剤を投与する際には、経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤および、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤、吸入剤、経鼻剤等として用いられる。
【００６７】
経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。また錠剤には舌下錠、口腔内貼付錠、口腔内速崩壊錠などが含まれる。
【００６８】
このような内服用固形剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質はそのままか、または賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
【００６９】
舌下錠は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質に賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカ、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（デンプン、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、膨潤剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カーボポール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、キサンタンガム、グアーガム等）、膨潤補助剤（グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、グリシン、グルタミン酸、アルギニン等）安定剤、溶解補助剤（ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸、アスパラギン酸等）、香味料（オレンジ、ストロベリー、ミント、レモン、バニラ等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を加えることもできる。口腔内貼付錠は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質に賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカ、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（デンプン、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、付着剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カーボポール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、キサンタンガム、グアーガム等）、付着補助剤（グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、グリシン、グルタミン酸、アルギニン等）安定剤、溶解補助剤（ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸、アスパラギン酸等）、香味料（オレンジ、ストロベリー、ミント、レモン、バニラ等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を加えることもできる。
【００７０】
口腔内速崩壊錠は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質をそのまま、あるいは原末もしくは造粒原末粒子に適当なコーティング剤（エチルセルロース、ヒドキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アクリル酸メタクリル酸コポリマー等）、可塑剤（ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル等）を用いて被覆を施した活性物質に賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカ、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（デンプン、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、分散補助剤（グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、グリシン、グルタミン酸、アルギニン等）安定剤、溶解補助剤（ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸、アスパラギン酸等）、香味料（オレンジ、ストロベリー、ミント、レモン、バニラ等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を加えることもできる。
【００７１】
経口投与のための内服用液剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノールまたはそれらの混液等）に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
【００７２】
非経口投与のための外用剤の剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、エアゾル剤、点眼剤、および点鼻剤等が含まれる。これらはひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、公知の方法または通常使用されている処方により製造される。
【００７３】
軟膏剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に研和、または溶融させて調製される。軟膏基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸または高級脂肪酸エステル（アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、オレイン酸エステル等）、ロウ類（ミツロウ、鯨ロウ、セレシン等）、界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル等）、高級アルコール（セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等）、シリコン油（ジメチルポリシロキサン等）、炭化水素類（親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン等）、グリコール類（エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マクロゴール等）、植物油（ヒマシ油、オリーブ油、ごま油、テレピン油等）、動物油（ミンク油、卵黄油、スクワラン、スクワレン等）、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保湿剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
【００７４】
ゲル剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させて調製される。ゲル基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、低級アルコール（エタノール、イソプロピルアルコール等）、ゲル化剤（カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース等）、中和剤（トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン等）、界面活性剤（モノステアリン酸ポリエチレングリコール等）、ガム類、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
【００７５】
クリーム剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融または乳化させて調製される。クリーム基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸エステル、低級アルコール、炭化水素類、多価アルコール（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）、高級アルコール（２−ヘキシルデカノール、セタノール等）、乳化剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、脂肪酸エステル類等）、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
【００７６】
湿布剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させ、練合物とし支持体上に展延塗布して製造される。湿布基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、増粘剤（ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース等）、湿潤剤（尿素、グリセリン、プロピレングリコール等）、充填剤（カオリン、酸化亜鉛、タルク、カルシウム、マグネシウム等）、水、溶解補助剤、粘着付与剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
【００７７】
貼付剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させ、支持体上に展延塗布して製造される。貼付剤用基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高分子基剤、油脂、高級脂肪酸、粘着付与剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
【００７８】
リニメント剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物を水、アルコール（エタノール、ポリエチレングリコール等）、高級脂肪酸、グリセリン、セッケン、乳化剤、懸濁化剤等から選ばれるもの単独または２種以上に溶解、懸濁または乳化させて調製される。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
【００７９】
噴霧剤、吸入剤、およびスプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。
【００８０】
非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等およびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって製造される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
【００８１】
非経口投与のための吸入剤としては、エアロゾル剤、吸入用粉末剤又は吸入用液剤が含まれ、当該吸入用液剤は用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁させて使用する形態であってもよい。
【００８２】
これらの吸入剤は公知の方法に準じて製造される。
【００８３】
例えば、吸入用液剤の場合には、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、パラベン等）、着色剤、緩衝化剤（リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、等張化剤（塩化ナトリウム、濃グリセリン等）、増粘剤（カリボキシビニルポリマー等）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。
【００８４】
吸入用粉末剤の場合には、滑沢剤（ステアリン酸およびその塩等）、結合剤（デンプン、デキストリン等）、賦形剤（乳糖、セルロース等）、着色剤、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、パラベン等）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。
【００８５】
吸入用液剤を投与する際には通常噴霧器（アトマイザー、ネブライザー）が使用され、吸入用粉末剤を投与する際には通常粉末薬剤用吸入投与器が使用される。
【００８６】
非経口投与のためその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される直腸内投与のための坐剤および腟内投与のためのペッサリー等が含まれる。
【００８７】
スプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば、米国特許第2,868,691号明細書および米国特許第3,095,355号明細書に詳しく記載されている。
【実施例】
【００８８】
以下に実施例を挙げて本発明を、より具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００８９】
実施例１
マウスＰＤ−Ｌ１発現ベクターの作製は、マウスPD-L1cDNA（Journal of Experimental Medicine，2000年，第19巻，第7号，p.1027〜1034）を制限酵素EcoRIで消化して、発現ベクターpApuroXS（The EMBO Journal，1994年，第13巻，第6号，p.1341〜1349）に挿入し、連結させることによって行った。作製した発現ベクターpApuroXS-PD-L1のＰ８１５細胞への導入は、エレクトロポーレーション法（３６０Ｖ、５００μＦ）で行った。Ｐ８１５細胞の培養は、ＦＣＳ（１０％）、２−メルカプトエタノール（１０-5Ｍ）、各種抗生物質含RPMI-1640培地で培養できるが、さらに、抗生物質ピューロマイシン（Puromycin；３μｇ／ｍｌ）を含んだ培地の培養に対して耐性の同細胞株を継代培養することによって、マウスＰＤ−Ｌ１を安定的に発現する形質転換Ｐ８１５細胞株を取得した。ＰＤ−Ｌ１の発現は、フローサイトメトリー解析にて確認した。図１（Ａ）にＨ−２Ｌd特異的2C CTLクローンのＰＤ−１発現（ｉ）と、Ｐ８１５（肥満細胞種由来細胞株）のＰＤ−Ｌ１発現安定形質転換株でのＰＤ−Ｌ１発現（ii）を示すフローサイトメトリーを示す。
同様の方法で、ＰＤ−Ｌ１を安定的に発現する形質転換Ｂ１６細胞株（Ｂ１６／ＰＤ−Ｌ１）を取得した（図１（Ａ）（iii）〜（ｖ）参照）。ここでは発現ベクターとして同様の方法で作製したpEFBOSneo-PD-L1（Nucleic Acid Research，1990年，第18巻，第17号，p.5322）を用い、細胞株の選択培養にはＧ４１８（0.5ｍｇ／ｍｌ）を使用した。
全長マウスPD-L1cDNAの３'末端側に６個のヒスチジンがタンデムに並んだペプチドタグ（His-Tag）を連結させたタンパク質をコードするｃＤＮＡを制限酵素EcoRIおよびNotIで消化して、発現ベクターpVL1393（商品名：Clontechより購入）に挿入させた。続いて、この発現ベクターをＳＦ９昆虫細胞（Invitrogenより購入）に導入して、封入体を回収した。この封入体ウイルスをHiFive昆虫細胞（Invitrogenより購入）に２日間、２７℃下で培養することによって感染させた。溶解緩衝液（Tris-ＨＣｌ（５０ｍＭ，ｐＨ７，含１％TritonX-100）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、各種プロテアーゼ阻害剤）で溶解させた細胞溶解液を、Ｎｉ−セファロースカラムクロマトグラフィーで処理することによって、抗原となる精製ＰＤ−Ｌ１タンパク質を取得した。
透析した同ＰＤ−Ｌ１タンパク質を完全フロイントアジュバンドと共に８週令メスWhisterラット（SLC Japanより購入）に免疫して、数日後、末梢リンパ節から回収した２×１０8細胞を、PEG1500（Amershamより購入）を用いて同数のＳＰ２／０細胞と細胞融合させた。さらに、RPMI1640培地（ＨＡＴ（Sigmaより購入）、Origen（１０％，Igenより購入）、ＦＣＳ（１０％）、２−メルカプトエタノール（１０-5Ｍ）、各種抗生物質）で培養することによって選択し、産生抗体の存在をフローサイトメトリー解析にて確認した。これによって樹立されたハイブリドーマ（国際受託番号：FERM BP-8396で認識されるハイブリドーマ）をBalb/C nu/nuマウスに移入して、後に腹水からの回収液をプロテインＧセファロースカラムクロマトグラフィーで精製することによって、ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体（１−１１１）を取得した。フローサイトメトリー等で使用される抗体は、Sulfo-NHS-LC-biotin（商品名：Pierceより購入）を用いてビオチン化したものを用いた。
また、同様の方法に従い、抗ヒトＰＤ−１抗体（国際受託番号：FERM BP-8392で認識されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体）を作製した。
細胞傷害性アッセイは、51Ｃｒ（クロム）遊離アッセイによって行った。
２Ｃ細胞（Journal of Immunology，1996年，第157巻，第2号，p.670〜678）は、２ＣトランスジェニックＢ６マウス由来の（Ｈ−２Ｌ）dアロ反応性の細胞傷害性Ｔ細胞である。図１（Ｂ）に、２Ｃ細胞（Ｅ：エフェクター）を51Ｃｒラベル化したＰ８１５細胞（Ｔ：ターゲット）と共に（○）または３つのＰＤ−Ｌ１発現Ｐ８１５細胞株（Ｐ８１５／ＰＤ−Ｌ１）（□、◇、△）と共にあるいはさらに１０ｍｇ／ｍｌラットanti-PD-L1F(ab')2IgG存在下（▲）を、さまざまなＥ／Ｔ比で混合して、４時間で遊離される51Ｃｒを測定した結果を示す。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体（anti-PD-L1F(ab')2）は、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞の低下した細胞傷害活性を回復させた。これらの結果から、ＰＤ−Ｌ１の機能を阻害することによるＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１シグナルの阻害は、癌細胞に対する細胞傷害活性を増強させることができると考えられる。
【００９０】
実施例２
１×１０6細胞のＰ８１５細胞（ｎ＝６）またはＰ８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞（ｎ＝６）を同系ＤＢＡ／２マウスの皮下にそれぞれ移入し、腫瘍増殖とマウスの生存率を評価した。その結果を図２（Ａ）に示す。図中、○はＰ８１５細胞株移植群、□、△はＰＤ−Ｌ１発現Ｐ８１５細胞株移植群である。さらにＰ８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞を移入した群の組織学的解析を行った。移入２０日後のマウスの腹壁ならびに腹膜腔の組織切片を、１０％ホルムアルデヒドで固定、パラフィンで砲架して、ヘマトキシリン、エオジンで染色して得られた染色像を図２（Ｂ）に示す。図中、ａは腹壁および腹膜への腫瘍細胞の浸潤を示す４０倍像、ｂは同じく４００倍像であり、ｃは脾臓への転移、ｄは肝臓への転移を示す。
Ｐ８１５細胞を移植した群では、Ｐ８１５細胞の増殖は抑えられており、６〜７週目では３０％が生存したのに対して、ＰＤ−Ｌ１を発現するＰ８１５細胞（Ｐ８１５／ＰＤ−Ｌ１）を移植した群では、癌細胞の増殖は著しく、２〜４週目までに全例が死亡した（図２（Ａ））。Ｐ８１５／ＰＤ−Ｌ１は、腹膜腔、さらに、腹腔へ浸潤しており、また、肝および脾臓への転移が認められた（図２（Ｂ）ａ〜ｄ参照）。
【００９１】
実施例３
Ｐ８１５細胞を移入し免疫したマウスから細胞傷害性Ｔ細胞ＣＴＬを調整し、２×１０6個数のＣＴＬ細胞と、５×１０6個数のＰ８１５細胞またはＰ８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞のみ、あるいはanti-PD-L1F(ab')2IgG（１０ｍｇ／ｍｌ）存在下でＰ８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞をそれぞれ混合培養し、２４時間後の培養上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡキット（Bioscienceから購入）で測定した。その結果を図３（Ａ）に示す。
また、図３（Ｂ）に、３×１０6個数のＰ８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞を皮下移入した同系ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝１０）に、ラットＩｇＧ（□）あるいはanti-PD-L1F(ab')2IgG（0.1ｍｇ／一匹）（○）を、細胞移入後１、３、５、７日後にそれぞれ腹腔内投与し、腫瘍増殖とマウスの生存率を評価した結果を示す。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｐ８１５／ＰＤ−Ｌ１により抑制された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞からのＩＦＮ−γ産生を回復させた（図３（Ａ））。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与は、癌細胞増殖を抑制し、明確な生存効果を示した（図３（Ｂ））。この結果は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与が癌治療に有効であることを示している。
【００９２】
実施例４
１×１０6個数のＢ１６メラノーマ（ｎ＝６）またはＢ１６／ＰＤ−Ｌ１細胞（ｎ＝６）をＢ６マウスにはそれぞれ皮下移入し、同数のＢ１６／ＰＤ−Ｌ１細胞をＰＤ−１トランスジェニックＢ６マウス（ｎ＝５）およびＰＤ−１遺伝子ホモ欠損Ｂ６マウス（ＰＤ−１-/-（ｎ＝４））（Science，2001年，291巻，5502号，p.319〜332）に移入し、以後２５日までそれぞれの腫瘍増殖を測定した。その結果を図４に示す。
【００９３】
実施例５
2.5×１０8個数のＪ５５８Ｌミエローマ細胞を皮下移入した同系Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝９）に、ラットＩｇＧあるいはanti-PD-L1F(ab')2IgG（0.1ｍｇ／一匹）を細胞移入後３、５、７日後にそれぞれ腹腔内投与し、腫瘍増殖を評価した（図５（Ｂ））。また、同様にＪ５５８Ｌミエローマ細胞を皮下移入したＰＤ−１ホモ欠損マウスとＢａｌｂ／Ｃ（ｎ＝４）での腫瘍増殖を比較した（図５（Ｃ））。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与は、ＰＤ−Ｌ１を発現しているＪ５５８癌細胞（図５（Ａ）に各種ミエローマ細胞株でのＰＤ−Ｌ１発現を示すフローサイトメトリーを示す。）の増殖を抑制した（図５（Ｂ））。また、Ｊ５５８細胞を移植したＰＤ−１欠損マウスでは移植癌細胞の増殖は完全に阻害された（図５（Ｃ））。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−１の阻害が癌治療に有効であることを示している。
【００９４】
実施例６
血管内皮細胞（以下、ＥＣｓと略す。）をマレリーバーグの方法（Journal Immunology Methods，2000年，第244巻，第1-2号，p.205〜215）により、マウス心臓から取得した。具体的には、心臓組織をコラゲナーゼで消化した後、マウスＩｇとともに前培養、さらに、ＦＩＴＣ修飾した抗ＣＤ３１抗体、同修飾抗ＣＤ１０５抗体、同修飾抗isolectinB4抗体、および、抗ＦＩＴＣビーズを添加して培養した。この血管内皮細胞をMagnetic-activated cell-sorting separation columns（商品名：Miltenyi Biotecより購入）を用いて、ポジティブ選択によって精製した。
取得した血管内皮細胞でのＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２の発現を、フローサイトメトリーで確認した。同細胞の標識には、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（抗体名：１−１１１）、抗ＰＤ−Ｌ２抗体（抗体名：＃１２２）および蛍光標識した２次抗体を用いて行った（図６（Ａ））。解析はCellQuestソフトウェア（Dickinsonより購入）を使用したFacscalibur（機器名：Becton Dickinsonより購入）で、１万回イベントで解析した。ＰＤ−Ｌ１あるいはＰＤ−Ｌ２の発現は、開口曲線で示され、コントロールＩｇは充填曲線で示される。
マウス各組織でのＰＤ−Ｌ１発現の確認を組織染色によって行った。各組織サンプリング１時間前に１００μｇビオチン標識化抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１−１１１）を溶解した１００μｌＰＢＳをマウスに静脈投与した。続いて、５μｍ凍結切片を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定して、Streptavidin-FITCで染色した。さらに、各切片をPhalloidinで対比染色した（図６（Ｂ）、（ａ）眼球、（ｂ）顎下腺、（ｃ）心臓、（ｄ）肺、（ｅ）肝臓、（ｆ）腎臓でのＰＤ−Ｌ１の発現を示す。図中、Ｃｈは脈絡膜、ＣＶは中心静脈、Ｇｌは糸球体、Ｒｅは網膜を示す。各矢印は、血管内皮細胞を示す。各染色像は４０倍拡大像である。）。ＰＤ−Ｌ１は、心臓、肺、腎臓、胃、小腸、顎下腺、眼球、肝臓の血管内皮で認められた。肝臓での発現は、肝臓洞様毛細血管に局在していた。
【００９５】
実施例７
肝臓非実質細胞（以下、ＬＮＰＣｓと略記する。）でのＰＤ−Ｌ１発現を組織染色（図７（Ａ））ならびにフローサイトメトリー（図７（Ｂ））で確認した。組織染色は、３％ＰＦＡで固定した５μｍ肝臓凍結切片をラット血清で前処理し、ビオチン標識化抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１−１１１）あるいはビオチン標識化抗ＩＣＡＭ−１抗体（商品名：BD Pharmingenより購入）にて１時間、室温下で抗体反応を行ない、ビオチン抗体をtyramide signal amplification（ＴＳＡ）fluorescence system（機器名：PerkinElmer Life Sciencesより購入）にて視覚化した（図７（Ａ）：ＩＣＡＭ−１の発現、同図（Ｂ）：ＰＤ−Ｌ１の発現、ＣＶ：中心静脈を示す。各染色像は４０倍拡大像である。）。
ＬＮＰＣｓは、pronaseE法（Experimental Cell Research，1976年，第99巻，p.444〜449）によってマウス肝臓より単離した。具体的には、ＬＮＰＣｓは、肝臓をpronaseE溶液（Merck）にて還流、培養し、密度勾配遠心法にて分離した。その細胞懸濁液中のクップファー細胞（Kupffer Cells）（ＣＤ５４+、ＣＤ１１ｂhigh）の相対的分布は２０〜２５％であり、肝臓類洞周囲腔内皮細胞（以下、ＬＳＥＣｓと略記する。）（ＣＤ５４+、ＣＤ１１ｂhigh）は、７５〜８０％である。
クップファー細胞とＬＳＥＣｓを、ＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ１１ｂ抗体およびＩＣＡＭ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−１、Ｂ７−２に対するそれぞれのビオチン化モノクローナル抗体、それに続くＰＥ標識化Streptavidinにて、それぞれ二重染色した。クップファー細胞とＬＳＥＣｓは、それぞれＣＤ１１ｂhighとＣＤ１１ｂlow細胞としてゲートされる（図８）。
ＰＤ−Ｌ１は、クップファー細胞では、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２を共発現しているが、ＬＳＥＣｓではその発現は弱いものであった（図８）。
【００９６】
実施例８
ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｗｔ）の脾臓ならびにリンパ組織から、T-cell enrichment column（商品名：Genzymeより購入）を用いたネガティブ選別によって、ナイーブＴ細胞（精製度９０％以上）を精製した。同細胞を１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３モノクローナル抗体（２Ｃ１１）とともに４８時間培養して活性化させた。
上記方法によって活性化したナイーブＴ細胞を、ＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ４抗体あるいはＡＰＣ標識化抗ＣＤ８抗体ならびにＰＥ標識化抗ＣＤ２５抗体、ＰＥ標識化抗ＣＤ４４抗体、ＰＥ標識化抗ＣＤ６９抗体、ＰＥ標識化抗ＣＴＬＡ−４抗体、ビオチン標識化抗Ｂ７−１（ＣＤ８０）抗体、ビオチン標識化抗Ｂ７−２（ＣＤ８６）抗体、抗ＰＤ−１抗体（抗体名：Ｊ４３、国際受託番号FERM BP-8118で認識されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１−１１１）で二重染色して、フローサイトメトリーにてそれぞれの分子の発現を解析した（図９、図１０）。
なお、国際受託番号FERM BP-8118で識別されるハイブリドーマは、2001年5月30日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号305-8566）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-18356で寄託され、2002年7月16日付で国際寄託に移管されている。
【００９７】
実施例９
ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型マウス（ｗｔ）のナイーブＴ細胞の活性化は、上記実施例８に記載の方法で行った。活性化後の同細胞の増殖をＢｒｄＵ取りこみ法によって測定した（図１１（Ａ））。ＢｒｄＵを４８時間の最後の６時間に添加して細胞を標識し、これをProliferation ELISA kit（商品名：Rocheより購入）を用いる測定によって細胞増殖を決定した。また、この時のＩＦＮ−γ産生量をELISA Kit（商品名：Genzymeより購入）にて測定した（図１２（Ａ））。
ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型マウス（ｗｔ）由来のＴ細胞を上記実施例８で記載の方法であらかじめ活性化させた。続いて、既に活性化しているＴ細胞に対して、野生型マウスからのマイトマイシンＣ処理ＬＮＰＣｓの存在あるいは非存在下で、さらに、３０μｇ／ｍｌ抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１−１１１）（コントロールとしたラットＩｇＧ）、２０μｇ／ｍｌCTLA4-Ig（Genzyme）（コントロールとしたヒトＩｇＧ）の存在あるいは非存在下でそれぞれ６０時間培養して、最後の１２時間の同細胞の増殖をＢｒｄＵ取りこみ法によって測定した（図１１（Ｂ））。また、４８時間時点でのＩＦＮ−γ産生量も測定した（図１２（Ｂ））。
ナイーブＴ細胞の活性化時におけるＩＦＮ−γ産生量は、ＰＤ−１-/-と野生型マウスの違いによる有意な差異は認められなかった。一方、既に活性化されたＴ細胞においては、野生型マウス由来のＴ細胞のＩＦＮ−γ産生量は、ＰＤ−１-/-由来のものに比べ有意に低かった（図１２）。このことから、既に活性化しているＴ細胞に対するＰＤ−１の抑制作用の効果は、ナイーブＴ細胞の活性化に対する効果よりも高いことが示唆された。
野生型マウス由来の活性化したＴ細胞は、ＬＮＰＣｓとの共培養では、Ｔ細胞の細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生量に有意な変化は認められないが、ＰＤ−１-/-由来の活性化したＴ細胞は、ＬＮＰＣｓとの共培養によって、その細胞増殖に有意な増加が認められた（図１１（Ｂ）、図１２（Ｂ））。また、野生型マウス由来の活性化したＴ細胞とＬＮＰＣｓとの共培養への抗ＰＤ−Ｌ１抗体の添加によって、Ｔ細胞の細胞増殖の増加が認められた（図１１（Ｂ））。これらの結果は、ＬＮＰＣｓのＰＤ−１あるいはＰＤ−Ｌ１が、活性化Ｔ細胞の抑制に関与しており、ＰＤ−１の欠如あるいはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１間の相互作用の阻害が、Ｔ細胞を活性化することを示すものである。
ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型マウス（ｗｔ）の活性化Ｔ細胞を、５μＭ CFSE（5-(6)-carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl diester）（商品名：Molecular probesより購入）で標識して、ＬＮＰＣｓとともに４８時間共培養した。この時の細胞分裂を、ＦＡＣＳを用いたＣＦＳＥ活性測定によって決定した（図１２（Ｃ））。
活性化Ｔ細胞の細胞増殖抑制は、細胞分裂の停止に起因しており、ＰＤ−１シグナルがＴ細胞の細胞分裂を抑制することが示唆された（図１２（Ｃ））。
【００９８】
実施例１０
ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型マウス（ｗｔ）（３匹／群）に109-1010PFU（plaque-forming units）Ad-lacZを静脈内投与して、マウスをアデノウイルスに感染させた。ここで使用したAd-lacZは、Ｅ１およびＥ３領域に欠損を有し、さらに、ｌａｃＺ遺伝子を持った５型アデノウイルスであり、２９３細胞で増殖させた後、塩化セシウム密度勾配遠心分離（Nucleic Acid Research，1995年，第234巻，第19号，p.3816〜3821）の記載によって精製したものである。
感染後０日日あるいは７日目に、同マウスに対して屠殺１時間前に0.5ｍｇ ＢｒｄＵ（商品名：Sigmaより購入）を静脈内投与して、採取した脾臓細胞および肝臓内リンパ球を抗ＢｒｄＵ抗体および抗ＣＤ１９抗体あるいは抗ＣＤ３抗体で二重標識した（図１３）。
さらに、感染後７日目の同細胞に対しては、抗ＢｒｄＵ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体で二重標識した（図１４（Ｂ）、それぞれの棒グラフはＢｒｄＵ陽性細胞の割合を示す。）。
アデノウイルス感染したＰＤ−１-/-マウスの肝臓では、同様に感染した野生型マウスの肝臓に比較して、増殖性（ＢｒｄＵ陽性）の各リンパ球（ＣＤ１９陽性、ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性）の割合が増加していた。一方、このような現象が脾臓では認められなかったことから、ＰＤ−１は、炎症を起した組織でのＴ細胞の増殖を阻害することが示唆された（図１４（Ｂ））。
【００９９】
実施例１１
ＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型マウス（ｗｔ）（３匹／群）に109-1010PFU Ad-lacZを静脈内投与して、マウスをアデノウイルスに感染させ、さらに、感染後０日目あるいは７日目の屠殺１時間前に0.5ｍｇ ＢｒｄＵ（商品名：Sigmaより購入）を静脈内投与して、採取した肝臓切片を抗ＢｒｄＵ抗体で標識した（図１５（ａ）〜（ｄ））、２０倍拡大像）。感染後７日目のＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）の肝臓切片に対しては、抗ＢｒｄＵ抗体および抗ＣＤ４抗体あるいは抗ＣＤ８抗体で二重標識した（図１５（ｅ）、（ｆ）、４０倍拡大像）。
感染後３０日目の野生型マウスの肝臓では、洞様毛細血管および非実質領域への中程度の局所的な細胞浸潤が認められたが、ＰＤ−１-/-マウスでは、肝炎を示す症状は認められなかった（図１６（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）、（ｎ））。
感染後７日目あるいは３０日目のＰＤ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＰＤ−１-/-）あるいは野生型マウス（ｗｔ）の肝臓切片に対して、ヘマトキシリン＆エオジン染色（図１６（ｇ）〜（ｊ），２０倍拡大像、（ｋ）〜（ｎ），４０倍拡大像）およびＸ−Ｇａｌ染色を行った（図１６（ｏ）〜（ｒ），４０倍拡大像）。
感染後７日目および３０日目の野生型マウスの肝臓では、Ｘ−Ｇａｌ染色像が示すアデノウイルスの感染が認められたが、ＰＤ−１-/-マウスでは、その感染は、３０日目にはほぼ排除されていた（図１６（ｏ）、（ｐ）および（ｑ）、（ｒ））。これらの結果から、ＰＤ−１シグナルが、ウイルス感染による炎症組織におけるエフェクターＴ細胞の細胞増殖を誘導することによるウイルスの排除に関与することが示された。
【０１００】
実施例１２
マウスＰＤ−Ｌ１を強制発現させたＰ−８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞は、５μｇ／ｍＬ puromycin（Sigmaより購入）を含む通常培地（以下、選択培地と略す。）を用いて、培養フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ2／９５％airの条件で５０％〜９０％コンフルエントになるまで培養した。マウスcytotoxic T lymphocyte 2C細胞は、ＭＭＣ（Mitomycin C）処理したＰ−８１５細胞およびＣｏｎＡ刺激ラット脾細胞培養上清とともに通常培地中で数日継代培養した。回収したＰ−８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞にDELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents（PerkinElmerより購入）のBATDA Reagentを３μＬ加え、１５分間培養した。さらに、ＰＢＳで洗浄した。２Ｃ細胞は、Ｐ−８１５細胞を加えて継代した５〜８日目の細胞を用いた。
被検物質である抗マウスＰＤ−１抗体（図１７中、anti-mPD-1Ab（Ｊ４３））、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体（同図中、anti-mPD-L1Ab（１−１１１））、マウスＰＤ−１Ｆｃ（同図中、ｍＰＤ−１Ｆｃ）、ヒトＰＤ−１Ｆｃ（同図中、ｈＰＤ−１Ｆｃ）、マウスＩｇＧ２ａκ（同図中、ControlIg）またはＰＢＳを９６well plateに２０μＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）ずつ分注し、Ｐ−８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞または通常培地を５０μＬずつ加えた。さらに２Ｃ細胞、通常培地または１％TritonX100を含む通常培地を５０μＬずつ加えた。通常培地を添加したウェルの上清５０μＬをバックグラウンド用として回収し、その他の上清を回収するまで、３７℃で保存した。残りの細胞は４時間培養した。続いて、同９６well plateを遠心し、上清を回収した。回収した上清にCytotoxicity Reagents（PerkinElmerより購入）のDELFIA Europium Solutionを２００μＬ添加して１５分間振とうした。振とう後、ARVOsxマルチラベルカウンター（WALLAC）にて時間分解蛍光測定を行った。なお、１％TritonX100を含む通常培地を添加したウェルの上清を高コントロール、通常培地を添加したウェルの上清を低コントロールとした。
評価群の組成は、被検物質、Ｐ−８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞及び２Ｃ細胞、高コントロール群の組成は、ＰＢＳ、Ｐ−８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞および１％TritonX100を含む通常培地、低コントロール群の組成は、ＰＢＳ、Ｐ−８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞および通常培地、２Ｃ細胞コントロール群の組成は、ＰＢＳ、通常培地および２Ｃ細胞、バックグラウンド群の組成は、ＰＢＳ、Ｐ−８１５／ＰＤ−Ｌ１細胞及び通常培地である。ＣＴＬ活性（％）は、以下の式にて算出した。すべての値は、バックグランドで得た平均値を引いたものを使用した。
【数１】
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抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびＰＤ−１Ｆｃは、ＣＴＬ活性を有意に増強した（図１７（ａ）〜（ｄ）、図中、Ｅ：Tratioは、２Ｃ細胞とＰＤ−Ｌ１／Ｐ８１５細胞の混合比を示す。）。
【０１０１】
実施例１３
Ｂ１６メラノーマ細胞を脾臓に移入したＣ５７ＢＬ／６マウスに、抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体を２日おきに腹腔内に投与して、移入後１８日目の肝臓重量を測定することによって、癌転移に対する抗ＰＤ−１抗体の抑制効果を評価した。
コントロールＩｇＧのみを投与したコントロール群に比べ、抗ＰＤ−１抗体投与群では、肝臓重量増加が有意に抑制された（肝臓重量／癌細胞非移入群：1.3ｇ、コントロール群：6.8ｇから抗ＰＤ−１抗体投与群：3.5ｇへ減少）。この重量増加の抑制は、Ｂ１６メラノーマ細胞の転移を抑制することを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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