(57)【要約】  【課題】嗅覚受容体の応答を指標としてカビ臭抑制剤を探索する方法の提供。  【解決手段】以下の工程を含むカビ臭抑制剤の探索方法：ＯＲ１１Ａ１及びＯＲ２Ｍ３から選択される嗅覚受容体に試験物質及びカビ臭原因物質を添加する工程；当該カビ臭原因物質に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程；当該同定された試験物質を、カビ臭抑制剤として選択する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むカビ臭抑制剤の探索方法：
ＯＲ１１Ａ１及びＯＲ２Ｍ３から選択される嗅覚受容体に試験物質及びカビ臭原因物質を添加する工程；
当該カビ臭原因物質に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；
測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程；
当該同定された試験物質を、カビ臭抑制剤として選択する工程。
【請求項２】
上記カビ臭がジオスミン又は２−メチルイソボルネオールの匂いである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記嗅覚受容体が、天然に嗅覚受容体を発現する細胞上又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答を測定する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答に対して、試験物質を添加された嗅覚受容体の応答が８０％以下に抑制されていれば、当該試験物質をカビ臭抑制剤として選択する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記受容体の応答を測定する工程が、レポータージーンアッセイによって行われる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カビ臭抑制剤を探索する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品、飲料水、空気調和装置（エアコン）のフィルター等、カビが生息することによって生じるカビ臭は、微弱な臭いであってもヒトに対して不快感を与える。
カビ臭は、カビの増殖によって生成する物質の存在によって臭気を感じるものであり、代表的な原因物質として、２−メチルイソボルネオール及びジオスミンが知られている（非特許文献１及び２）。当該物質については水道水のカビ臭の原因ともなるため、我が国の水道法において、０．００００１ｍｇ／L以下と云う基準値が設定されている。
【０００３】
発生するカビ臭に対する対策として、カビ臭の原因となるカビに対する抗菌成分を用いて静菌を行う技術、カビ臭よりも強い匂いの香料によりマスキングする技術等が提案されているが、このような技術は、発生したカビ臭成分を消臭するものではなく、カビ臭を根本的になくすことはできず、即効性もない。また、芳香剤の匂いによる不快感が生じることもある。
【０００４】
ところで、ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は３９６個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約３％にあたる。
一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
【０００５】
従って、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの変調は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭方法と異なり、カビ臭等の悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができ、また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもないことから、好ましい消臭手段である。本発明者は、上記受容体アンタゴニズムを利用することで、ヘキサン酸やスカトールといった悪臭を抑制できることを見出している（特許文献１及び２）。
【０００６】
嗅覚受容体アンタゴニズムのためには、目的のカビ臭原因物質に対応する嗅覚受容体を同定し、且つ当該カビ臭原因物質に対して有効な嗅覚受容体アンタゴニスト作用を示す物質を探索、同定しなければならないが、そのような探索は容易ではない。また、従来、匂いの評価は、専門家による官能試験によって行われてきたが、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−５０４１１号公報
【特許文献２】特開２０１２−２４９６１４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】木村憲司，食の科学 No.288 Page.27-37 (2002)
【非特許文献２】浜田信夫, 増田淳二, 福山丈二，生活衛生 Vol.43 No.4 Page.135-143 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、嗅覚受容体の応答を指標としてカビ臭抑制剤を効率良く探索する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、カビ臭原因物質に応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功し、当該嗅覚受容体の応答を指標とすることにより、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによってカビ臭を抑制する、新たなカビ臭抑制剤の評価・選択が可能となることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の工程を含むカビ臭抑制剤の探索方法に係るものである。
ＯＲ１１Ａ１及びＯＲ２Ｍ３から選択される嗅覚受容体に試験物質及びカビ臭原因物質を添加する工程；
当該カビ臭原因物質に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；
測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程；
当該同定された試験物質を、カビ臭抑制剤として選択する工程。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来の消臭剤や芳香剤を用いる消臭方法において生じていた即効性の低さや芳香剤の匂いに基づく不快感等の問題を生じることがなく、カビ臭を特異的に消臭することができるカビ臭抑制剤を、効率よく探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】嗅覚受容体のジオスミンに対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す。
【図１Ｂ】嗅覚受容体の２−メチルイソボルネオールに対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す。
【図２Ａ】種々の濃度のジオスミンに対する嗅覚受容体の応答。エラーバー＝±ＳＥ。●：ＯＲ１１Ａ１、○：ｍｏｃｋ（受容体を発現させていない細胞、受容体を組み込んでいないｐＭＥ１８Ｓベクターを発現）
【図２Ｂ】種々の濃度の２−メチルイソボルネオール対する嗅覚受容体の応答。エラーバー＝±ＳＥ。●：ＯＲ２Ｍ３、○：ｍｏｃｋ（受容体を発現させていない細胞、受容体を組み込んでいないｐＭＥ１８Ｓベクターを発現）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、匂いに関する用語「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段(例えば、封じ込め)、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、等が挙げられる。
【００１５】
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的の匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し結果的に個体に認識される匂いを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを変化させることができる。
【００１６】
本発明のカビ臭抑制剤の探索方法は、ａ）ＯＲ１１Ａ１及びＯＲ２Ｍ３から選択される嗅覚受容体のいずれか１種に試験物質及びカビ臭原因物質を添加する工程、ｂ）当該嗅覚受容体の応答を測定する工程、ｃ）測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程、及び、ｄ）当該同定された試験物質を、カビ臭抑制剤として選択する工程、を含む。
【００１７】
本発明の方法においては、カビ臭に応答する嗅覚受容体に、試験物質及び当該カビ臭原因物質が添加される。
本発明の方法で使用される嗅覚受容体は、ＯＲ１１Ａ１及びＯＲ２Ｍ３から選択される。
ＯＲ１１Ａ１は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、GenBankに GI:２７７５４１６５として登録されている。ＯＲ１１Ａ１は、配列番号１で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。後記実施例に示すように、ＯＲ１１Ａ１はジオスミン（IUPAC名：(4S,4aS,8aR)-4,8a-ジメチル-1,2,3,4,5,6,7,8-オクタヒドロナフタレン-4a-オール）に対して濃度依存的な応答を示す。
また、当該ＯＲ１１Ａ１のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ジオスミンに対する応答性を有するポリペプチドも本発明の方法に使用される嗅覚受容体に包含される。
【００１８】
ＯＲ２Ｍ３は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、GenBankに GI:５２３１７１９９として登録されている。ＯＲ２Ｍ３は、配列番号３で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。後記実施例に示すように、ＯＲ２Ｍ３は２−メチルイソボルネオールに対して濃度依存的に応答を示す。
また、当該ＯＲ２Ｍ３のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、２−メチルイソボルネオールに対する応答性を有するポリペプチドも本発明の方法に使用される嗅覚受容体に包含される。
【００１９】
本発明の方法では、当該嗅覚受容体のうちのいずれかを単独で使用してもよく、又は両者を組み合わせて使用してもよいが、カビ臭をより確実に抑制する物質を評価又は選択する場合は、ＯＲ１１Ａ１及びＯＲ２Ｍ３を組み合わせて使用するのが好ましい。
【００２０】
ＯＲ１１Ａ１はジオスミンによる匂い、ＯＲ２Ｍ３は２−メチルイソボルネオールによる匂いに対して応答を示すので（図１及び２）、これらの受容体の応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより中枢におけるジオスミンの匂い又は２−メチルイソボルネオールの匂いの認識に変化を生じさせ、結果としてそれらの匂いを抑制することができる。斯かるジオスミン及び２−メチルイソボルネオールは、カビ（放線菌）や藍藻によって産生される匂い分子で、カビ臭の代表的な原因物質である（前記非特許文献１及び２）。したがって、ＯＲ１１Ａ１及び／又はＯＲ２Ｍ３の応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングによりカビ臭を抑制することができる。
【００２１】
本発明で使用されるカビ臭原因物質としては、嗅覚受容体としてＯＲ１１Ａ１を用いる場合はジオスミン、嗅覚受容体としてＯＲ２Ｍ３を用いる場合は２−メチルイソボルネオールを使用するのが好ましい。
また、本発明の方法で探索されたカビ臭抑制剤によって抑制されるカビ臭としては、ジオスミンの匂い、２−メチルイソボルネオールの匂い等が挙げられる。
【００２２】
本発明の方法に使用される試験物質は、カビ臭抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
本発明の方法において、試験物質とカビ臭原因物質は同時に添加されても、任意の順序で添加されてもよい。
【００２３】
本発明の方法において、嗅覚受容体は、受容体の機能を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、嗅覚受容体は、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の天然に嗅覚受容体を発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体を担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及び、当該嗅覚受容体を有する人工脂質二重膜、等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体の範囲に含まれる。
【００２４】
好ましい態様においては、嗅細胞等の天然に嗅覚受容体を発現する細胞、又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
【００２５】
好適には、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進するために、ＲＴＰ１Ｓを受容体と共に、好ましくはＲＴＰ１ＳとＲＴＰ２を受容体と共に遺伝子導入する。上記組換え細胞の作製に使用できるＲＴＰ１Ｓとしては、例えば、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されている。ヒトＲＴＰ１Ｓは、配列番号５で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ヒトＲＴＰ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２５８５４７１２０として登録されている。ヒトＲＴＰ２は、配列番号９で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
また、ヒトＲＴＰ１Ｓの代わりに、ヒトＲＴＰ１Ｓのアミノ酸配列（配列番号６）に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＲＴＰ１Ｓと同様に、嗅覚受容体の膜における発現を促進するポリペプチドを使用してもよい。例えば、本明細書の実施例で使用されているＲＴＰ１Ｓ変異体は、配列番号７で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、配列番号６で示されるアミノ酸配列と７８．９％の配列同一性を有し、且つ嗅覚受容体の膜における発現を促進する機能を有し、上記組換え細胞の作製に使用することができる蛋白質である。あるいは、マウスＲＴＰ１Ｓ（Saito H., Chi Q., Zhuang H., Matsunami H., Mainland J.D. Sci Signal., 2009, 2:ra9）もまた、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８９％の配列同一性を有し、且つ嗅覚受容体の膜における発現を促進する機能を有し、上記組換え細胞の作製に使用することができる蛋白質である。
【００２６】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００２７】
本発明の方法によれば、試験物質及びカビ臭原因物質の添加に続いて、当該カビ臭原因物質に対する嗅覚受容体の応答が測定される。測定は嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、カルシウムイメージング法等によって行えばよい。例えば、嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Mombaerts P. Nat Neurosci. 5. 263-278）。従って、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が挙げられる。
【００２８】
次いで、測定された嗅覚受容体の応答に基づいて、当該受容体の応答に対する試験物質の抑制効果を評価し、当該応答を抑制する試験物質を同定する。抑制効果の評価は、例えば、異なる濃度の試験物質を添加した場合に測定されたカビ臭原因物質に対する受容体の応答を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の試験物質添加群とより低濃度の試験物質添加群との間；試験物質添加群と非添加群との間；又は試験物質添加前後で、カビ臭原因物質に対する受容体の応答を比較する。試験物質添加により、又はより高濃度の試験物質の添加により嗅覚受容体の応答が抑制される場合、当該試験物質を、当該嗅覚受容体の応答を抑制する物質として同定することができる。
【００２９】
例えば、試験物質添加群における受容体応答が対照群と比較して８０％以下、好ましくは５０％以下に抑制されていれば、当該試験物質を、カビ臭抑制剤として選択することができる。嗅覚受容体として、ＯＲ１１Ａ１及びＯＲ２Ｍ３を共に用いた場合、用いた受容体のいずれか１つの応答が抑制されていればよいが、両受容体の応答が共に抑制されているのが好ましい。
【００３０】
上記の手順で同定された試験物質は、上記手順で使用されたカビ臭に対する嗅覚受容体の応答を抑制することによって、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより中枢における当該カビ臭の認識に変化を生じさせ、結果として当該カビ臭を個体が認識できないようにすることができる物質である。従って、上記手順で同定された試験物質は、上記手順で使用されたカビ臭に対するカビ臭抑制剤として選択される。
【００３１】
本発明の方法によって選択されたカビ臭抑制剤は、カビ臭に対する嗅覚受容体の応答抑制に基づく嗅覚マスキングによって、当該カビ臭を抑制するために使用することができ、また、当該カビ臭を抑制するための化合物又は組成物の製造のために使用することができる。当該カビ臭抑制用化合物又は組成物は、当該カビ臭抑制剤に加えて、他の消臭効果を有する成分、又は消臭剤や防臭剤に使用される任意の成分、例えば、香料、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、植物抽出物、漢方成分、高級アルコール類、低級アルコール類、エステル類、長鎖脂肪酸、界面活性剤（非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤等）、ステロール類、多価アルコール類、保湿剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、皮膜剤、殺菌剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保留剤、冷感剤、温感剤、刺激剤、金属イオン封鎖剤、糖分、アミノ酸類、有機アミン類、合成樹脂エマルジョン、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、酸化防止助剤、油分、粉体、カプセル類、キレート剤、無機塩、有機塩色素、増粘剤、殺菌剤、防腐剤、防カビ剤、着色剤、消泡剤、増量剤、変調剤、有機酸、ポリマー、ポリマー分散剤、酵素、酵素安定剤等を、その目的に応じて適宜含有していてもよい。
【００３２】
上記カビ臭抑制用化合物又は組成物に含有され得る消臭効果を有する他の成分としては、化学的又は物理的な消臭効果を有する公知の消臭剤が何れも使用できるが、例えば、植物の葉、葉柄、実、茎、根、樹皮等の各部位から抽出された消臭有効成分（例えば、緑茶抽出物）；乳酸、グルコン酸、コハク酸、グルタン酸、アジピン酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸等の有機酸、各種アミノ酸およびこれらの塩、グリオキサール、酸化剤、フラボノイド類、カテキン類、ポリフェノール類；活性炭、ゼオライトなどの多孔性物質；シクロデキストリン類などの包接剤；光触媒；各種マスキング剤、等が挙げられる。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞以下の工程を含むカビ臭抑制剤の探索方法：
ＯＲ１１Ａ１及びＯＲ２Ｍ３から選択される嗅覚受容体に試験物質及びカビ臭原因物質を添加する工程；
当該カビ臭原因物質に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；
測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程；
当該同定された試験物質を、カビ臭抑制剤として選択する工程。
＜２＞上記カビ臭がジオスミン又は２−メチルイソボルネオールの匂いである、＜１＞の方法。
＜３＞嗅覚受容体としてＯＲ１１Ａ１を選択する場合にはカビ臭原因物質がジオスミンであり、嗅覚受容体としてＯＲ２Ｍ３を選択する場合にはカビ臭原因物質が２−メチルイソボルネオールである＜１＞の方法。
＜４＞前記嗅覚受容体が、天然に嗅覚受容体を発現する細胞上又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である、＜１＞〜＜３＞の方法。
＜５＞試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答を測定する工程をさらに含む、＜１＞〜＜４＞の方法。
＜６＞前記試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答に対して、試験物質を添加された嗅覚受容体の応答が８０％以下に抑制されていれば、当該試験物質をカビ臭抑制剤として選択する、＜５＞の方法。
＜７＞前記受容体の応答を測定する工程が、レポータージーンアッセイによって行われる、＜１＞〜＜６＞の方法。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００３５】
実施例１  カビ臭に応答する嗅覚受容体の同定
１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ  ｆｅｍａｌｅ（G1521: Promega）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Invitrogen）にマニュアルに従って組込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作成したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
【００３６】
２）ｐＭＥ１８Ｓ−ＲＴＰ１Ｓ、ｐＭＥ１８Ｓ−ＲＴＰ２ベクターの作製
ＲＴＰ１Ｓ変異体（配列番号８）をコードするＲＴＰ１Ｓ変異体遺伝子（配列番号７）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組込んだ。同様に、ヒトＲＴＰ２（配列番号１０）をコードするヒトＲＴＰ２遺伝子（配列番号９）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組込んだ。
【００３７】
３）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体３７４種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００  μｌずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
【００３８】
【表１】
2014235098.tif 000002
【００３９】
４）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記３）で作製した培養物から、培地を取り除き、ＣＤ２９３培地（Invitrogen）で調製したジオスミン（和光純薬工業株式会社）もしくは２−メチルイソボルネオール（和光純薬工業株式会社）を含む溶液を７５μｌ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTM  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  （Promega）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。ジオスミンもしくは２−メチルイソボルネオールでの刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
【００４０】
５）結果
３７４種類の嗅覚受容体についてジオスミン（３００μＭ）に対する応答を測定した結果、嗅覚受容体ＯＲ１１Ａ１のみが、ジオスミンに対し応答を示した（図１Ａ）。ＯＲ１１Ａ１のジオスミン応答は、濃度依存的であった（図２Ａ）。このことから、ＯＲ１１Ａ１がジオスミンに対し応答を示すことが明らかとなった。ＯＲ１１Ａ１は、これまでジオスミンに応答することが見出されていない、新規のジオスミン受容体である。
同様に、３７４種類の嗅覚受容体について２−メチルイソボルネオール（１ｍＭ）に対する応答を測定した結果、嗅覚受容体ＯＲ２Ｍ３のみが、２−メチルイソボルネオールに対し応答を示した（図１Ｂ）。ＯＲ２Ｍ３の２−メチルイソボルネオール応答は、濃度依存的であった（図２Ｂ）。このことから、ＯＲ２Ｍ３が２−メチルイソボルネオールに対し応答を示すことが明らかとなった。ＯＲ２Ｍ３は、これまで２−メチルイソボルネオールに応答することが見出されていない、新規の２−メチルイソボルネオール受容体である。
【図１Ａ】
2014235098.tif 000003
【図１Ｂ】
2014235098.tif 000004
【図２Ａ】
2014235098.tif 000005
【図２Ｂ】
2014235098.tif 000006
【配列表】
2014235098000001.app