(57)【要約】【課題】ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患における新規のバイオマーカーを提供すること。【解決手段】本発明のヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用のポリペプチドは、特定のタンパク質の全長または部分断片を有している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１．〜１７．のいずれか１つのヒトタンパク質の全長または当該ヒトタンパク質に由来する部分である、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）関連疾患検出用ポリペプチド。
１．Eosinophil lysophospholipase；
２．10 kDa heat shock protein, mitochondrial；
３．Bone marrow proteoglycan；
４．Moesin；
５．Myeloid cell nuclear differentiation antigen；
６．Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial；
７．Parathymosin；
８．Triosephosphate isomerase；
９．Heat shock 70 kDa protein 1A/1B；
１０．T-cell differentiation antigen CD6；
１１．Annexin A1；
１２．Annexin A6；
１３．Spectrin alpha chain, brain；
１４．HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-1, 4, 10, 11, 13, 15, 16 beta chain；
１５．Calpain-2 catalytic subunit；
１６．Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta；
１７．Platelet basic protein。
【請求項２】
配列番号１〜１９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含ふくんでおり、上記ヒトタンパク質に由来する部分である、請求項１に記載のヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチド。
【請求項３】
生体から採取した試料に含まれている、請求項１または２に記載のヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドを検出または測定する工程を包含している、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患を検出する方法。
【請求項４】
上記ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）または成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
検出または測定する上記工程の結果に基づいて、上記試料が採取された上記生体が、ＨＡＭ／ＴＳＰの患者、ＡＴＬの患者、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患を発症していないヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型の感染者、またはヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型の非感染者であることを識別する工程をさらに包含している、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
検出または測定する上記工程は、異なる上記ヒトタンパク質に由来する２つ以上の上記ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドを一度に検出または測定する工程である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
検出または測定する上記工程は、上記ヒトタンパク質に由来する部分としての上記ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドを質量分析法によって検出または測定する工程である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記試料は血液由来である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記試料は、ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性の単離されたＴ細胞である、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患の患者に対する処置の効果を評価する方法であって、
処置を施す前に生体から採取した試料Ａ、および処置を施した後に生体から採取した試料Ｂに含まれている、請求項１または２に記載のヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドを検出または測定する第１の工程と、
検出または測定した上記ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドについて、上記試料Ａおよび試料Ｂの間において上記第１の工程における結果を比較する第２の工程とを包含している、方法。
【請求項１１】
成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）を処置するための化合物の候補物質をスクリーニングする方法であって、
Calpain-2遺伝子を発現している細胞を試験物質と接触させる工程と、
接触させる上記工程の後に、Calpain-2遺伝子の発現量の変化またはCalpain-2の活性の変化を評価する工程とを包含している、方法。
【請求項１２】
10 kDa heat shock protein, mitochondrial；Moesin；Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial；Parathymosin Spectrin alpha chain, brain；またはCalpain-2の成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の治療標的としての利用。
【請求項１３】
Annexin A1、またはSignal transducer and activator of transcription 1-alpha/betaのＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）の治療標的としての利用。
【請求項１４】
以下の１．〜１７．のいずれか１つのヒトタンパク質の全長または当該ヒトタンパク質に由来する部分であるポリペプチドと結合する抗体を含んでいる、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）関連疾患検査用試薬またはキット。
１．Eosinophil lysophospholipase；
２．10 kDa heat shock protein, mitochondrial；
３．Bone marrow proteoglycan；
４．Moesin；
５．Myeloid cell nuclear differentiation antigen；
６．Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial；
７．Parathymosin；
８．Triosephosphate isomerase；
９．Heat shock 70 kDa protein 1A/1B；
１０．T-cell differentiation antigen CD6；
１１．Annexin A1；
１２．Annexin A6；
１３．Spectrin alpha chain, brain；
１４．HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-1, 4, 10, 11, 13, 15, 16 beta chain；
１５．Calpain-2 catalytic subunit；
１６．Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta；
１７．Platelet basic protein。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドとその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）は、ＨＴＬＶ−１関連疾患の病因となるヒトレトロウイルスである。ＨＴＬＶ−１関連疾患は、例えば成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）である。ＨＴＬＶ−１の感染者数は、全世界において２〜３０００万人であると報告されており、２〜３０年にわたる無症候の期間を経た後に、全感染者の２〜５％がＡＴＬを０．５〜３％がＨＡＭ／ＴＳＰを発症する。
【０００３】
ＡＴＬは、最も侵襲性および悪性度の高い白血病の一種である。ＡＴＬは、全体の生存期間の中央値が７ヶ月であり、５年間の生存率が２０％と、予後が非常に不良である。近年、ヒト化抗ＣＣＲ４（ＫＷ−０７６１）を用いた第２相の試験においてＡＴＬ治療に大いな改善が認められた。一方、ＨＡＭ/ＴＳＰは脊髄の炎症により四肢の不随、および排尿障害を伴う重篤な脊髄症であり、病態の進行に関する機序に関しては未だに多くが不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Asquith B, Zhang Y, Mosley AJ, et al. In vivo T lymphocyte dynamics in humans and the impact of human T-lymphotropic virus 1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(19):8035-8040. Epub 2007 May 8031.
【非特許文献２】Sakashita A, Hattori T, Miller CW, et al. Mutations of the p53 gene in adult T-cell leukemia. Blood. 1992;79(2):477-480.
【非特許文献３】Beltran B, Quinones P, Morales D, Cotrina E, Castillo JJ. Different prognostic factors for survival in acute and lymphomatous adult T-cell leukemia/lymphoma. Leuk Res. 2011;35(3):334-339.
【非特許文献４】Ishida T, Joh T, Uike N, et al. Defucosylated anti-CCR4 monoclonal antibody (KW-0761) for relapsed adult T-cell leukemia-lymphoma: a multicenter phase II study. J Clin Oncol. 2012;30(8):837-842. Epub 2012 Feb 2016.
【非特許文献５】Sharron L. Manuel,  Todd D. Schell, Edward Acheampong, et al.  Presentation of human T cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) Tax protein by dendritic cells: the underlying mechanism of HTLV-1-associated neuroinflammatory disease. Journal of Leukocyte Biology vol. 86 no. 5 1205-1216.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、現行のＡＴＬ診断およびＨＡＭ／ＴＳＰ診断における曖昧性である。ＡＴＬ診断は、血中ウイルス量、ＡＴＬ細胞である花弁細胞の有無、血中ＬＤＨ、およびＣａ２+値などに基づいて行われている。しかし、例えば細胞診では異形細胞の正確な判断が困難なこと、さらにはＡＴＬの中で最も悪性度の高い急性型の診断が消極的診断である事から客観性・正確性に乏しい上、予後改善につながる早期診断が非常に困難なのが現状である。またＨＡＭ／ＴＳＰ診断は患者の訴える症状に基づいた重症度指針が用いられており、これも同様に客観性に乏しく、必要な患者に必要な治療が行われているか極めて不明瞭である。これらの観点から、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患に対する医療改善は急務であり、新規の診断用バイオマーカー等の必要性は非常に高い。
【０００６】
以上の点を鑑みて、本発明の目的は、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患における新規のバイオマーカー等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、本願発明は以下のいずれかの内容を包含する。
１）以下の１．〜１７．のいずれか１つのヒトタンパク質の全長または当該ヒトタンパク質に由来する部分である、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）関連疾患検出用ポリペプチド。１．Eosinophil lysophospholipase；２．10 kDa heat shock protein, mitochondrial；３．Bone marrow proteoglycan；４．Moesin；５．Myeloid cell nuclear differentiation antigen；６．Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial；７．Parathymosin；８．Triosephosphate isomerase；９．Heat shock 70 kDa protein 1A/1B；１０．T-cell differentiation antigen CD6；１１．Annexin A1；１２．Annexin A6；１３．Spectrin alpha chain, brain；１４．HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-1, 4, 10, 11, 13, 15, 16 beta chain；１５．Calpain-2 catalytic subunit；１６．Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta；１７．Platelet basic protein。
２）配列番号１〜１９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含み、上記ヒトタンパク質に由来する部分である、１）に記載のヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチド。
３）生体から採取した試料に含まれている、１）または２）に記載のヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドを検出または測定する工程を包含している、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患を検出する方法。
４）上記ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）または成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である、３）に記載の方法。
５）検出または測定する上記工程の結果に基づいて、上記試料が採取された上記生体が、ＨＡＭ／ＴＳＰの患者、ＡＴＬの患者、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患を発症していないヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型の感染者、またはヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型の非感染者であることを識別する工程をさらに包含している、３）または４）に記載の方法。
６）検出または測定する上記工程は、異なる上記ヒトタンパク質に由来する２つ以上の上記ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドを一度に検出または測定する工程である、３）〜５）のいずれかに記載の方法。
７）検出または測定する上記工程は、上記ヒトタンパク質に由来する部分としての上記ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドを質量分析法によって検出または測定する工程である、６）に記載の方法。
８）上記試料は血液由来である、３）〜７）のいずれかに記載の方法。
９）上記試料は、ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性の単離されたＴ細胞である、３）〜８）のいずれかに記載の方法。
１０）ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患の患者に対する処置の効果を評価する方法であって、処置を施す前に生体から採取した試料Ａ、および処置を施した後に生体から採取した試料Ｂに含まれている、１）または２）に記載のヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドを検出または測定する第１の工程と、検出または測定した上記ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチドについて、上記試料Ａおよび試料Ｂの間において上記第１の工程における結果を比較する第２の工程とを包含している、方法。
１１）成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）を処置するための化合物の候補物質をスクリーニングする方法であって、Calpain-2遺伝子を発現している細胞を試験物質と接触させる工程と、接触させる上記工程の後に、Calpain-2遺伝子の発現量の変化またはCalpain-2の活性の変化を評価する工程とを包含している、方法。
１２）10 kDa heat shock protein, mitochondrial；Moesin；Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial；Parathymosin Spectrin alpha chain, brain；またはCalpain-2の成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の治療標的としての利用。
１３）Annexin A1、またはSignal transducer and activator of transcription 1-alpha/betaのＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）の治療標的としての利用。
１４）以下の１．〜１７．のいずれか１つのヒトタンパク質の全長または当該ヒトタンパク質に由来する部分であるポリペプチドと結合する抗体を含んでいる、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）関連疾患検査用試薬またはキット。１．Eosinophil lysophospholipase；２．10 kDa heat shock protein, mitochondrial；３．Bone marrow proteoglycan；４．Moesin；５．Myeloid cell nuclear differentiation antigen；６．Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial；７．Parathymosin；８．Triosephosphate isomerase；９．Heat shock 70 kDa protein 1A/1B；１０．T-cell differentiation antigen CD6；１１．Annexin A1；１２．Annexin A6；１３．Spectrin alpha chain, brain；１４．HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-1, 4, 10, 11, 13, 15, 16 beta chain；１５．Calpain-2 catalytic subunit；１６．Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta；１７．Platelet basic protein。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患における新規のバイオマーカー等を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、ＣＣＲ４陽性細胞のプロテオミクス分析について概略的な手順を示す図である。６人の健常者、５人の無症候性キャリア、および９人のＨＡＭ／ＴＳＰ患者からＰＢＭＣを回収し、続いて、フローサイトメーターを用いてＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、ＣＣＲ４陽性分画の単離を行った。これらを、細胞溶解液によって溶解させ、トリプシン処理し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析に供した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によって得られたデータを、大容量のデータ処理が可能なExpressionistプロテオームサーバーに移行させた後に、標識を用いないラベルフリー定量に基づく統計学的な解析を行った。有望なバイオマーカー・治療標的候補として統計解析によって抽出されたタンパク質の同定を、２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によって確立されたタンパク質同定データベースに対する照会によって実施した。
【図２】フローサイトメトリーによって各臨床群から得られたＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、ＣＣＲ４陽性細胞の代表的な結果を示す図である。抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４−Ｃｙ７、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ、および抗ＣＣＲ４−ＰＥを用いて標識後、ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、ＣＣＲ４陽性の分画を単離した。ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性細胞分画におけるＣＤ２５陽性、ＣＣＲ陽性の平均含有量±ＳＤ（％）を各臨床群に対して算出し、図面上部右側の部分に示した。
【図３】候補となる治療標的の統計学的な抽出結果を示す図である。４群クラスカルウォリス検定（ＮＤ、ＡＣ、ＡＴＬ、およびＨＡＭ／ＴＳＰ）を用いて、検出された重複のない１４，０６４ペプチドから１，１７０の候補を、第１段階のスクリーニングの結果として抽出した（ｐ＜０．０１）。次に、support vector machine - recursive feature elimination（ＳＶＭ−ＲＥＦ）を用いて誤分類率を最小化するペプチド群を抽出するアルゴリズムを実行することによって、第２段階目のスクリーニングの結果として疾患特異的に変動するバイオマーカーの候補を、９１ペプチドに絞り込んだ（Ａ）。ＳＶＭ−ＲＦＥによって上位にランキングされる９１ペプチドを用いたLeave-one-out交差検定（leave-one-out cross validation）の結果、および用いたＳＶＭの出力値のヒートマップ（Ｂ）に示した。２９検体のうち２７検体が正しく分類されたことが分かった。（Ｃ）は、主要成分解析（ＰＣＡ）を用いて９１ペプチドの疾患特異性を視覚的に表している。Ｃｏｍｐ.１〜３は第１〜３主成分を示している。
【図４】同定された１９ペプチドの各臨床群の定量情報を比較した箱髭図である。示した１９パネルは、質量分析によって得られた各１９タンパク質の定量情報に対応している。上記統計解析によって絞り込まれた９１ペプチドから、１９ペプチド由来の１７タンパク質を同定することに成功した。１９ペプチドのうちＧＬＹＭおよびＰＲＧ２に関しては、同一タンパク質由来の独立した領域由来のペプチドがバイオマーカー候補として同定されたため、それぞれにPeptide 1、Peptide 2と示してある。ｙ軸は質量分析によって得られた強度を示している。質量分析において、強度は定量情報と相関している事が知られている。
【図５】Calpain-2活性の誘導がＡＴＬ細胞において細胞死を惹起することを図である。（Ａ）２９検体におけるCalpain-2の発現レベルおよびα2-spectrinの発現レベルの間に相関関係を見出した。Calpain-2およびα2-spectrinは、酵素と基質の関係にあると報告されており、２つのタンパク質の強度の相関はこの報告を裏付けている。細胞増殖を、コントロールベクターまたはΔ１９ＣＡＮ２の形質移入から３６時間後のＳＯ４細胞（Ｂ）およびＫＯＢ細胞（Ｃ）におけるＭＴＴ解析によって測定し、スチューデントのｔ検定によって有意差を確認した（ｐ＜０．０１）。Δ１９ＣＡＮ２の過剰発現は、形質移入から２４時間後のＳＯ−４細胞（Ｄ）およびＫＯＢ細胞（Ｅ）における細胞死を著しく促進した（ｐ＜０．０１）。（Ｆ）α2-spectrinのタンパク質レベルの低下は、Δ１９ＣＡＮ２の形質移入後、２４時間および１２時間においても観察された。抗ｍｙｃタグのウエスタンブロットによって外来性のΔ１９ＣＡＮ２の発現を確認した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔１．ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型関連疾患検出用ポリペプチド〕
本発明に係るヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）関連疾患検出用ポリペプチド（以下、単に本発明に係るポリペプチドと記載する）は、以下の１．〜１７．のいずれか１つのヒトタンパク質の全長または部分（部分断片）である。当該ヒトタンパク質は、１．Eosinophil lysophospholipase；２．10 kDa heat shock protein, mitochondrial；３．Bone marrow proteoglycan；４．Moesin；５．Myeloid cell nuclear differentiation antigen；６．Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial；７．Parathymosin；８．Triosephosphate isomerase；９．Heat shock 70 kDa protein 1A/1B；１０．T-cell differentiation antigen CD6；１１．Annexin A1；１２．Annexin A6；１３．Spectrin alpha chain, brain；１４．HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-1, 4, 10, 11, 13, 15, 16 beta chain；１５．Calpain-2 catalytic subunit；１６．Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta；および１７．Platelet basic proteinである。
【００１１】
なお、本明細書においてポリペプチドとは、上記のヒトタンパク質の全長または当該ヒトタンパク質に由来する部分断片の双方を包含する概念である。また、単にペプチドと称する場合は、ポリペプチドたる部分断片のうち、構成するアミノ酸数が２０〜３０個以下のものを指す。
【００１２】
Ｔ細胞における上記１７ヒトタンパク質の発現様式は、（Ａ）ＨＴＬＶ−１非感染細胞、（Ｂ）無症候性キャリア由来ＨＴＬＶ−１感染細胞、（Ｃ）ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）由来ＨＴＬＶ−１感染細胞、および（Ｄ）成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）由来ＨＴＬＶ−１感染細胞の間で異なっており、この発現様式の変化は各臨床グループの分子生物学的差異を反映したものである。したがって、好ましい一態様では、対象の血液に含まれるＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、ＣＣＲ４陽性Ｔ細胞における、本発明に係るポリペプチドの存在量を測定し、非感染のヒトおよび潜伏感染期にあるヒトの血液に含まれる同種のＴ細胞における当該ポリペプチドの存在量と比較することによって、対象がＨＡＭ／ＴＳＰまたはＡＴＬを発病しているか否かを判定することができる。つまり、本発明に係るポリペプチドは、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患を検出、診断、および／または識別するためのバイオマーカーとして使用可能である。
【００１３】
本発明に係るポリペプチドは、上記ヒトタンパク質の部分断片を含んでいることが好ましい。上記部分断片は、配列番号１〜１９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含んでいる部分断片であり得、配列番号１〜１９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含んでいるペプチドであり得る。
【００１４】
配列番号１によって示されるアミノ酸配列は、Eosinophil lysophospholipaseをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号２によって示されるアミノ酸配列は、10 kDa heat shock protein, mitochondrialをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号３および１８によって示されるアミノ酸配列のそれぞれは、Bone marrow proteoglycanをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号４によって示されるアミノ酸配列は、Moesinをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号５によって示されるアミノ酸配列は、Myeloid cell nuclear differentiation antigenをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号６および１４によって示されるアミノ酸配列のそれぞれは、Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrialをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号７によって示されるアミノ酸配列は、Parathymosinをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号８によって示されるアミノ酸配列は、Triosephosphate isomeraseをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号９によって示されるアミノ酸配列は、Heat shock 70 kDa protein 1A/1Bをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号１０によって示されるアミノ酸配列は、T-cell differentiation antigen CD6をトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号１１によって示されるアミノ酸配列は、Annexin A1をトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号１２によって示されるアミノ酸配列は、Annexin A6をトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号１３によって示されるアミノ酸配列は、Spectrin alpha chain, brainをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号１５によって示されるアミノ酸配列は、HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-1, 4, 10, 11, 13, 15, 16 beta chainをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号１６によって示されるアミノ酸配列は、Calpain-2 catalytic subunitをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号１７によって示されるアミノ酸配列は、Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/betaをトリプシン処理した断片化ペプチドである。配列番号１９によって示されるアミノ酸配列は、Platelet basic proteinをトリプシン処理した断片化ペプチドである。
【００１５】
上述した本発明に係るペプチドのアミノ酸配列の一例（配列番号１〜１９に相当するアミノ酸配列）を表１にまとめた。
【００１６】
【表１】
2014047143.tif 000002
【００１７】
なお、ＨＴＬＶ−１感染による患者の病状に応じて発現様式が変化する点から、下記の表２〜４に示す９１の化合物を、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患を検出するためのバイオマーカーとして使用可能である。表２〜４に示す９１の化合物は、それぞれ“Ｍａｓｓ”の欄に示されている分子量を有しているＴ細胞に存在するバイオマーカーである。表２〜４における“ｍ／ｚ”、“ＲＴ”、“Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＮＤ）”、“Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＡＣ）”、“Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＡＴＬ）”、および“Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＨＡＭ）”は、後述する実施例に記載の測定法にしたがって同定された値である。なお、表２〜４に示す９１の化合物は、そのイオン化における電荷および分子量から、ペプチドまたは修飾ペプチドと推定される。
【００１８】
【表２】
2014047143.tif 000003
【００１９】
【表３】
2014047143.tif 000004
【００２０】
【表４】
2014047143.tif 000005
【００２１】
つまり、表２〜４に示される分子量を有している、対象の血液のＴ細胞における化合物を検出または測定することによって、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患を検出可能である。
【００２２】
なお、表２〜４に示されている化合物のうちの、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿01585、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿01719、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿02511、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿02550、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿03363、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿08409、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿09121、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿09391、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿10679、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿11083、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿11318、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿11808、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿12714、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿12918、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿13427、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿13495、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿13535、Ｃｌｕｓｔｅｒ＿13650、およびＣｌｕｓｔｅｒ＿13999は、データベース検索によってそのアミノ酸配列が同定されているペプチドであり、表１のペプチドの何れかに分類されている。
【００２３】
〔２．ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の検出方法〕
本発明に係るＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患を検出する方法は、生体（検出対象）から採取した試料に含まれている１７の上記ヒトタンパク質またはその部分断片からなる群から選択される１つ以上のＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドを検出または測定する工程を包含している。つまり、本発明に係る上記方法は、他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置によって特に限定されない。
【００２４】
本明細書において、上記検出または測定する工程は、生体試料およびこれを精製して得られる試料に含まれているＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの量（例えば含有量または濃度）を測定する工程を意味する。
【００２５】
本発明に係る上記方法の一例において、上記工程において上記検出対象について得られた結果を、ＨＴＬＶ−Ｉに非感染の対象およびＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患を生じていないＨＴＬＶ−Ｉ感染の対象（これらの２種類の対象を“比較対象”と記載する）から得られた試料に含まれているＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの存在量または濃度と比較することによって、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の発病の有無を判定し得る。詳細には、上記検出対象に由来する試料に含まれているＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの量を、比較対象に由来する試料に含まれているＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの量と比較して、これらの量の間に有意な相違が認められた場合に、当該検出対象がＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患を発病していると判定可能である。
【００２６】
なお、比較対象におけるＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの量としては、あらかじめ測定されている基準の量、および多数の測定結果に基づいて設定されている上記ポリペプチドの量の許容範囲が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る方法において、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）または成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）であり得る。上述のように、（Ａ）〜（Ｄ）の状態に応じて、ヒトのＴ細胞は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの発現様式を異にしている。つまり、本発明に係る方法の一例によれば、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の病状について、試料を４臨床グループに分類可能である。したがって、本発明に係る方法の一例では、１回の検出によって、検出対象がＨＡＭ／ＴＳＰおよびＡＴＬに罹患しているか否かを判定可能である。
【００２８】
本発明に係る方法において、２以上のＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの量を、測定または検出し、かつ比較することが好ましい。上述のように、本発明に係る方法の一例では、対象のＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の病状について４つの臨床グループに分類する。それぞれのＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの量は個人差と疾患特異的変動の両方を含んでいるが、判定の基準にするパラメータを増やし、診断アルゴリズムを好適化することによって、疾患特異的変動を強調することが可能であり、この結果、検出、診断および／または識別結果の信頼性を向上させ得る。Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび免疫沈降法等の、抗体を用いてヒトタンパク質またはその部分断片（ただしペプチドを除く）を検出等をする場合は、１７のＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用タンパク質（表１に示す１７種）全てを用いることが好ましい。質量分析法の原理に基づいて、ペプチドを用いた検出等をする場合は、９１ペプチド（表２〜４に示す９１種）全てを用いることが最も好ましい。
【００２９】
検出または測定する上記工程としては、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの存在量を定量的もしくは半定量的に決定し得る手法、またはＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの有無を決定し得る手法を利用する工程が挙げられるが、これらに限定されない。上記手法は、例えば、免疫学的手法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび免疫沈降法）、および質量分析法などであり得る。
【００３０】
本発明に係る検出または測定する上記工程は、上記ポリペプチドを質量分析法によって検出または測定する工程であることが好ましい。質量分析装置を用いた定量法は、特異的な抗体を作製することなく、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用のペプチドを簡便に検出または測定し得る。また、質量分析装置を用いた質量分析法は、感度および精度に優れているため、より正確な分類が可能である。さらに、多成分同時分析が可能なマルチチャネル型の質量分析装置を用いることにより、２以上のＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用のペプチドを一度に検出または測定可能である。上述のように、多数（例えば、９１）のペプチドを同時に検出または測定する場合に、このような質量分析装置を用いることが非常に好ましい。また、より精度よく検出をおこなうためには、タンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いることが好ましい。したがって、本発明に係る方法に用いられる質量分析装置としては、定量が可能な種々の公知の質量分析装置（例えば、四重極型および飛行時間型の質量分析装置など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明に係る試料は、生体（ヒト）から採取された試料である。当該試料は、血液、髄液、またはこれらのいずれか一方に由来する試料であり得、血液から分離されたＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性の単離されたＴ細胞であることが特に好ましい。当該Ｔ細胞は、健常者にも存在する分画である一方、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞が最も濃縮される分画であり、ＨＡＭ／ＴＳＰまたはＡＴＬの発症によってその存在率が増加する。このようなＴ細胞を試料としてタンパク質の発現レベルを比較することによって疾患の進行に従って起こる変化を追跡することが可能であり、疾患の進行とは関係ない個人差などのノイズが低下し、得られた結果（疾患分類）の信頼性が向上する。
【００３２】
本発明に係る試料は、上述のような単離されたＴ細胞を、タンパク質分解酵素を用いて処理した試料であり得る。後述の実施例において使用されている通り、タンパク質分解酵素としてはトリプシンが一般的であるが、本発明に係る方法において適用可能な範囲において、当業者にとっての公知の種々のタンパク質分解酵素が本発明に係る方法に使用され得る。
【００３３】
以上のように、本発明に係る方法によれば、これまで適切な診断手法が確立されていなかったＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患を、高い精度において決定可能である。
【００３４】
〔３．ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の患者に対する処置の効果の評価方法〕
本発明に係るＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の患者に対する処置の効果の評価方法は、処置を施す前に生体から採取した試料Ａ、および処置を施した後に生体から採取した試料Ｂに含まれている、上述の項目１．に記載のポリペプチドを検出または測定する第１の工程と、検出または測定した上記ポリペプチドについて、上記試料Ａおよび試料Ｂの間において上記第１の工程における結果を比較する第２の工程とを包含している。つまり、本発明に係る評価方法は、具体的な他工程の、ならびに使用する器具および装置によって限定されない。
【００３５】
本発明の評価方法の一例において、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の患者から採取された生体試料における少なくとも１つのＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患用ポリペプチドの量をＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の処置の開始前にあらかじめ測定しておき、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の処置の開始後の任意の時点において、当該患者の当該ポリペプチドの量を測定し、両者を比較することによって、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患に対する処置の効果を評価し得る。
【００３６】
評価の基準は、例えば、あらかじめ測定された上記ポリペプチド量が、後に測定された量より大きいか否かである。上記ポリペプチド量が疾患の進行に伴い増加する傾向がある場合では、この基準にしたがって、“真（前者が後者より高い）”である場合、実施した処置は有効であると評価され、特に前者が後者より有意に高い場合、実施した処置は十分に有効であると評価される。上記ポリペプチド量が疾患の進行に伴い減少する傾向がある場合では、この基準にしたがって、“真（前者が後者より低い）”である場合、実施した処置は有効であると評価され、特に前者が後者より有意に低い場合、実施した処置は十分に有効であると評価される。
【００３７】
後の測定は、任意の１以上の時点に実施され得る。よって、評価は、数回の測定の平均値を後の測定結果として、あらかじめ測定した結果と比較することによってなされる。また、評価は、処置の開始から短期間（例えば１週間〜１ヵ月間）、中期間（例えば１〜６ヶ月間）または長期間（例えば６ヶ月〜１または２年間）を隔ててか、または継続して実施され得る。
【００３８】
なお、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの検出または測定に用いられる生体試料の調製および精製、ならびにＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患検出用ポリペプチドの検出方法または測定方法は、上述の項目２．記載にしたがう。
【００３９】
〔４.成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の治療薬候補物質のスクリーニング方法〕
本発明に係るＡＴＬの治療薬候補物質のスクリーニング方法の一例は、Calpain-2（Calpain-2）遺伝子を発現している細胞と試験物質とを接触させる接触工程と、上記接触工程の後に行われCalpain-2遺伝子の発現量の変化またはCalpain-2の活性の変化を評価する評価工程と、を含む方法である。
【００４０】
上記接触工程は、培地中で、試験物質の存在下、上記細胞を培養しながら行うことができる。ここで、細胞としては、Calpain-2遺伝子を内生的に（endogenous）発現する細胞を用いてもよいが、Calpain-2遺伝子が恒常的に発現するように形質転換された細胞がより好ましい。また、上記試験物質の種類は特に限定されないが、低分子化合物であることが好ましい。
【００４１】
上記評価工程は、上記試験物質が非存在な場合を基準にして、Calpain-2遺伝子の発現量が変化したかどうか、またはCalpain-2のプロテアーゼ活性が変化したかどうかを評価する。ここで、Calpain-2遺伝子の発現量は、タンパク質（Calpain-2）などを直接的に定量して把握してもよく、これらタンパク質などをコードする遺伝子の発現量を検出して把握してもよい。また、Calpain-2のプロテアーゼ活性は、例えば、その基質であるalpha-II spectrinの細胞内での存在量の増減を指標にして把握することができる。
【００４２】
上記評価工程において、Calpain-2遺伝子の発現量を増加させる、またはCalpain-2の活性を増強する試験物質は、ＡＴＬの治療薬の候補物質として選択される。
【００４３】
〔５.ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）を処置する方法および治療薬〕
本発明はまた、ＡＴＬを処置する方法、およびＡＴＬの治療薬を提供する。ＡＴＬ患者から採取したＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞では、非感染細胞と比較して、Calpain-2遺伝子の発現量が有意に低下している。ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞においてCalpain-2遺伝子の発現量を回復させるか、またはCalpain-2のプロテアーゼ活性を増強させれば、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を細胞死に誘導し得る（後述の実施例を参照）。つまり、本発明に係るＡＴＬを処置する方法は、Calpain-2遺伝子の発現量を増加させる薬剤、またはCalpain-2の活性を増強させる薬剤（“ＡＴＬ治療薬”と総称する）の治療有効量を、ＡＴＬの患者に投与する工程を包含している方法である。
【００４４】
本発明において処置は、経過の観察のみを行う場合と比較して、ＡＴＬを発病したヒトにおけるＨＴＬＶ−Ｉの活動を抑制することを意味し、好ましくはＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を死滅させること、ならびにＨＴＬＶ−Ｉの感染能または増殖能を破壊することを意味する。処置の一局面は、ＡＴＬに関連する少なくとも１つの症状を軽減または緩和すること、例えば、リンパ節の腫れ、肝臓もしくは脾臓の腫れ、全身倦怠感、麻痺、意識障害、便秘および各種感染症の軽減または緩和をすることを包含している。
【００４５】
ＡＴＬ治療薬の投与方法は全身投与または局所投与であり得る。全身投与の例としては、経口投与もしくは非経口投与（例えば、静脈内もしくは動脈内への血管内投与、および腸内投与など）が挙げられる。局所投与の例としては、経皮投与および舌下投与などが挙げられる。ＡＴＬ治療薬の投与量（治療有効量）は、投与対象となるヒトの年齢、性別、症状、投与経路、および投与回数などに応じて適宜設定し得る。また、必要に応じて、ＡＴＬ治療薬を用いたインビボアッセイをあらかじめ行い、過度の実験を要することなく上記投与量を決定し得る。
【００４６】
ＡＴＬ治療薬は、治療有効成分以外の構成成分を含んでいる薬学的組成物であり得る。当該薬学的組成物を構成する治療有効成分以外の構成成分は、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、着色剤、香味料、甘味料、抗酸化剤、および粘度調整剤などである。
【００４７】
上記担体の例としては、水、各種塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィン、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。担体の種類は、薬学的組成物の剤型および薬学的組成物の投与方法などに応じて、適宜選択され得る。薬学的組成物の剤型の例としては、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、および注射剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
また、ＡＴＬ治療薬は遺伝子治療剤であり得る。詳細な例としては、Calpain-2をコードしている核酸を治療有効成分として含んでいる遺伝子治療剤が挙げられる。遺伝子治療剤は、上記治療有効成分である核酸を、注射によってヒトに直接的に投与する形態であり得る。また、遺伝子治療剤は、上記治療有効成分である核酸を発現可能に組み込んでいるベクターを、注射によってヒトに直接的に投与する形態であり得る。上記ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど、遺伝子治療に適用可能なベクターが挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、上記遺伝子治療剤はリポソーム製剤であり得る。
【００４９】
〔６.ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）およびＨＡＭ／ＴＳＰ（ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症）の治療標的〕
実施例にも示されるように、10 kDa heat shock protein, mitochondrial；Moesin；Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial；Parathymosin Spectrin alpha chain, brain；またはCalpain-2は、ＡＴＬの治療標的として利用することができる。これらのヒトタンパク質は、ＡＴＬの患者において特異的な動態を示している。
【００５０】
また、Annexin A1、またはSignal transducer and activator of transcription 1-alpha/betaは、ＨＡＭ／ＴＳＰの治療標的として利用することができる。これらのヒトタンパク質は、ＨＡＭ／ＴＳＰの患者において特異的な動態を示している。
【００５１】
以上のように、本発明によれば、ＡＴＬ治療、およびＨＡＭ／ＴＳＰ治療に対する新たな治療標的を提供することができる。現状では、ＡＴＬ治療においてヒト化抗ＣＣＲ４を用いた新規治療法においても依然半数近い患者が非反応性であり、有効な治療法が存在しないうえ、抗ＣＣＲ４による副作用の問題も依然存在する。またＨＡＭ／ＴＳＰに対する根治治療は未だに存在せず、抗炎症を目的とした対処療法に限られている。
【００５２】
以下に示す実施例を用いて、本発明の実施の形態のさらなる詳細を説明する。以下の実施例は、本発明を理解するための例示に過ぎず、本発明の範囲を限定していない。また、実施例には、当業者によって理解される種々の変更がなされ得、本発明は、種々の変更がなされた各実施例をその範囲に包含している。
【実施例】
【００５３】
以下に、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の治療標的の探索を行った例を説明する。当該探索は図１に概略を示す手順にしたがっている。
【００５４】
図１に示すように、４つの群（詳細は後述）のヒトからＰＢＭＣを採取し、ＰＢＭＣからＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性のＴ細胞を単離し、単離した細胞をトリプシン処理する。トリプシン処理したサンプルを、タンパク質の定量化および同定の２通りの処理に使用する。タンパク質およびそれらに由来するペプチドの定量解析（左側に分岐）では、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、非標識の定量および統計的解析を順に実施する。タンパク質の同定（右側の分岐）では、ＳＣＸ分離、２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、および同定ペプチドのデータベースの作成を順に実施する。以上に説明した手順の詳細を以下に説明する。
【００５５】
〔１．材料および方法〕
（末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および細胞株）
聖マリアンナ医科大学において、６人の健常者、５人の無症候性キャリア、および９人のＨＡＭ／ＴＳＰ患者からＰＢＭＣを収集した。今村病院分院において９人のＡＴＬ患者からＰＢＭＣを収集した。本研究におけるこれらのヒト試料の使用は、個々の機関の倫理委員会（理研の横浜研究所の倫理委員会、聖マリアンナ医科大学の倫理委員会、今村分院病院の施設内審査委員会）によって承認された。
【００５６】
ＳＯ−４およびＫＯＢ細胞は、山野嘉久博士のご好意により提供いただいた。両方の細胞株を、１０％のウシ胎児血清（Cell Culture Bioscience、東京、日本）、１００ｋＵ／ＬのＩＬ２（Cell Science and Technology Institute, Inc.、東京、日本）、１×抗生物質−抗真菌水溶液（Sigma-Aldrich、ミズーリ、米国）を補ったＲＰＭＩ１６４０において培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％のウシ胎児血清（Cell Culture Bioscience、東京、日本）、１×抗生物質−抗真菌水溶液（Sigma-Aldrich、ミズーリ、米国）を補ったＲＰＭＩ１６４０において培養した。すべての細胞を、５％ＣＯ２、３７℃において培養した。ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性のＴ細胞のＰＢＭＣからの単離を、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ebioscience、サンディエゴ、米国）、抗ＣＣＲ４−ＰＥ（Becton Dickinson、カルフォルニア、米国）、抗ＣＤ４−Ｃｙ７（ebioscience）、および抗ＣＤ２５−ＡＰＣ（ebioscience）を用いた細胞選別機JSAN（Bay bioscience、兵庫、日本）によって実施した。
【００５７】
（質量分析解析のための試料調製）
ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性のＴ細胞を、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、変性バッファー（５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、８Ｍの尿素）に溶解させた。超音波処理の後に、５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Sigma-Aldrich）存在下、３７℃における３０分間の還元、および２５ｍＭのヨードアセトアミド（Sigma-Aldrich）存在下、室温における４５分間のアルキル化処理を実施した。続いて、タンパク質：酵素が２５：１の割合になるように、Trypsin GOLD（Promega、ウィスコンシン、米国）を加え、溶解物を３７℃において１２時間消化した。回収されたペプチド試料を、Vacuum Spin Drier (TAITEC Co., Ltd.、埼玉、日本）を用いて乾燥させ、質量分析に供した。
【００５８】
（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
消化されたペプチドを、０．１％蟻酸存在下で９５分の間に２％→３５％、１５分の間に３５％→９５％になるようにアセトニトリルの濃度勾配を２段階に設定し、０．１×２００ｍｍのＣ１８カラムにおいて、２００ｎＬ／分の流速において分離した。溶出ペプチドを、Analyst QSソフトウェア２．０（AB Sciex）のsmart information-dependent acquisition（SIDA）モードにおいてQSTAR Elite質量分析計（AB Sciex、カルフォルニア、米国）を用いて解析した。QSTAR Eliteにおける詳細なパラメータは、以下に示す通りである：ＤＰ＝６０、ＦＰ＝２６５、ＤＰ２＝１５、ＡＤ＝５、ＩＲＤ＝６、ＩＲＷ＝５、カーテンガス＝２０、およびイオン噴霧電圧＝２０００Ｖ。
【００５９】
（２Ｄ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性のＴ細胞のトリプシン消化物を、２５％のアセトニトリルを含んでいる１０ｍＭの蟻酸アンモニウムに溶解させ、０．２×２５０ｍＭのモノリス型の強カチオンイオン交換カラム（GL Science、東京、日本）によって分画した。ペプチドの溶出にはProminence HPLC装置（島津製作所株式会社、京都、日本）を用いた。より詳細には、Prominence HPLC装置の制御ソフトウェアであるLCsolution（島津製作所株式会社、京都、日本）上において蟻酸アンモニウム濃度勾配パターンを曲線値＝３に設定し、蟻酸アンモニウム濃度勾配を１０ｍＭ→１Ｍに変化させながらProminence HPLC装置（島津製作所株式会社、京都、日本）を用いて７０分にわたって溶出した。溶出物を、保持時間に基づいて２０画分に分画採取し、Ultimate 3000 nano-HPLC装置を組み合わせたLTQ-Orbitrap-Velos質量分析計（Thermo Scientific、ブレーメン、ドイツ）によって各分画ごとに解析した。分画されたペプチド試料を、上述のQSTAR-Eliteを用いたスクリーニング段階に使用したUltimate 3000 nano-HPLCの濃度勾配条件（０．１％蟻酸存在下で９５分の間に２％→３５％、１５分の間に３５％→９５％になるように、２段階に設定されたアセトニトリルの濃度勾配）をそのまま用いて分離した。その上で、ＭＳ解像度＝６０，０００を有しているFourier-transitionモードにおけるフルスキャン（ＭＳスキャン）、および通常の解像度を有しているイオントラップモードにおけるデータインディペンデントスキャン（ＭＳ／ＭＳスキャン）を行い、フルスキャン実行時に最も強く検出された２０のプレカーサイオンについての同時のＭＳ／ＭＳスキャンを取得するプログラムを用いてLTQ-Orbitrap-Velosによって解析を実行した。重要な他のパラメータは、以下の通りである：キャピラリー温度＝２５０、電源電圧＝２ｋＶ、ＭＳスキャン範囲＝ｍ／ｚ  ４００〜１６００、上位２０の強度の前駆体についての取得データ依存的ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ、３０秒間の動的排除の有効化。タンパク質同定のために、すべてのＭＳ／ＭＳスペクトルを、ProteomeDiscoverer 1.3ソフトウェア（ThermoScientific）上のSEQUESTアルゴリズムを用いて、SwissProtデータベース  バージョン  ２０１２＿０６（２０，２３２のヒトタンパク質配列）において、以下のパラメータを用いて検索した：MS tolerance = 3 ppm、MS/MS tolerance = 0.8 Da、maximum missed cleavages = 2、Enzyme = Trypsin、Taxonomy = Homo sapiens、Fixed modification = arbamidomethylation (cysteine)、Variable modification = oxidation (methionine)。ProteomeDiscoverにおけるPercolator FDR評価アルゴリズムによって、１％未満の過誤率（ＦＤＲ）を満たすタンパク質を、同定されたタンパク質と定義した。
【００６０】
（ラベルフリー定量解析）
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によって得られたデータを、Expressionist RefinerMSモジュールに転送し、以下のデータ処理および関連する定量解析に用いた。２９の臨床試料由来のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析のデータを、まず２次元（２Ｄ）平面（電荷−質量の割合（ｍ／ｚ）に対する保持時間（ＲＴ））上に展開した。クロマトグラム・グリッド機能を用いて、２９試料由来のクロマトグラムに対して、ｍ／ｚおよびＲＴから構成される共通の格子をすべての２Ｄ平面において適用した。これらを、以下のパラメータを用いて行った：スキャン数＝１０、多項式次数＝３、ＲＴスムージング＝０。２Ｄ平面からバックグラウンドのノイズを除くために、Chromatogram Chemical Noise Subtractionを実行した。ＲＴウィンドウ＝５０スキャン、変異値減算＝５０％の、ＲＴスムージング＝３スキャン。その後に、インテンシティ・スレッシュホールド機能を用いて、スパイクノイズのような単発的に生じる低強度のノイズを除くために、１０未満の強度を有しているデータ点をすべて０に落とした。なお、１０を超える強度のピークに関しては一切手を付けない。２９の２Ｄ平面間のＲＴの微小なずれを、クロマトグラム・リテンションタイム・アラインメント機能によって調節した。これらは以下のパラメータを用いて行った：ＲＴ変換ウィンドウ＝０．２分、ＲＴ検索間隔＝５分、ｍ／ｚウィンドウ＝０．１Ｄａ、ギャップペナルティー＝１。ピークを、Chromatogram Summed Peak Detection機能によって２段階に検出した。１段階目を、以下のパラメータを用いて行った：合計ウィンドウ＝５スキャン、重複＝５０、最小ピークサイズ＝４スキャン、最大結合距離＝１０点、ピークＲＴ分裂＝正確、強度分析＝最大、ギャップ／ピーク比率＝１％、改善閾値＝５、整合性閾値＝０．８、シグナル／ノイズ閾値＝１。また、２段階目のChromatogram Isotopic Peak Clusteringを用いて同位体群に分類した。第１のパラメータは：最小電荷＝１、最大電荷＝１０、最大不明ピーク＝０、最初の許容されたギャップの位置＝３、ＲＴウィンドウ＝０．１分、ｍ／ｚ耐性＝０．０５Ｄａ、同位体形状耐性＝１０、最小集団サイズ分配＝１．２。第２のパラメータは；最小電荷＝１、最大電荷＝１、最大不明ピーク＝０、最初の許容されたギャップの位置＝３、ＲＴウィンドウ＝０．１分、ｍ／ｚ耐性＝０．０５Ｄａ、最小集団サイズ分配＝０．６であった。
【００６１】
（発現ベクターおよびｓｉＲＮＡ）
Δ１９ＣＡＮ２コンストラクトについて、ＣＡＰＮ２挿入配列を、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ  ＣＡＰＮ２由来のプライマー（５’−ＣＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＣＣＡＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＴ−３’および５’−ＣＡＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＡＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＣ−３’）を用いて、ＰＣＲによって増幅し、ｐＥＦＢＯＳ−Ｍｙｃにクローン化した。クローン化に使用したＣＡＰＮ２配列は、ＭＧＣ配列（登録番号ＢＣ０２１３０３）と同一であることを確認した。ＣＡＰＮ２の強制発現にあたって、ＣＡＰＮ２挿入配列を含んでいる５μｇのベクターＤＮＡを１×１０６個の細胞に形質移入した。ＳＰＴＡＮ１に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＳＰＴＡＮ１；アルファ−ＩＩスペクトリンの遺伝子名）およびｓｉＲＮＡのネガティブコントロールとして、Sigma-Aldrichから市販されているものを使用した。５００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡのオリゴヌクレオチドを１×１０６個の細胞に形質移入した。ベクターおよびｓｉＲＮＡを、Amaxa Nucleoportator transfection Kit V（Lonza,Cologne、ドイツ）によってＳＯ−４細胞、ＫＯＢ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞に形質移入した。
【００６２】
（細胞周期解析および細胞増殖解析）
細胞周期解析のために、１〜２×１０５個の細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄した後に、１００ｎｇ／ｍＬのRNase（Sigma-Aldrich）を含んでいる０．１％のriton-X溶液（Sigma-Aldrich）に懸濁した。１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムの添加に続いて、細胞周期をFACScalibur（Becton Dickinson、カルフォルニア、米国）を用いたフローサイトメトリーによって計測した。データ解析を、FlowJoソフトウェア（Tree Star, Inc.、オレゴン、米国）を用いて行った。細胞懸濁液は、凝集によって複数の細胞由来の核が一つに固まっている場合が多く、これらは本来の2N、4Nではなく、誤って4N、6N、8Nと認識されてしまう可能性を有している。この可能性を排除するために、細胞周期の解析前に、ＦＬ２−Ｗ／ＦＬ２−Ａで展開したプロット上における適切なゲーティングによって、凝集していない集団のみを抽出した。Cell Counting Kit-8（同人化学研究所、熊本、日本）を用いて、製造業者の推奨プロトコルに従って、細胞代謝活性を測定することによって、細胞増殖を評価した。
【００６３】
（ウェスタンブロッティング）
細胞を溶解バッファー［１％のＮＰ−４０、２ｍＭの  ＥＧＴＡ、２ｍＭの  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭの  ＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロールであって、プロテアーゼ阻害剤カクテル（protease inhibitor cocktail）Complete（Roche、インディアナ、米国）を含有する]に溶解させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜に転写した。４％Block Ace（雪印乳業株式会社、東京、日本）によるブロッキングに続いて、膜を抗myc抗体（9E10、Sigma-Aldrich）または抗アルファ−ＩＩスペクトリン抗体（abcam、ケンブリッジ、英国）とともに一晩振盪した。次に、膜をそれぞれＨＲＰ結合させた抗マウスＩｇＧ（GE Healthcare, NJ, USA）、または抗ウサギＩｇＧ（GE Healthcare）とともに６０分振盪し、Western Lightning kit（Perkin Elmer, MA）を用いて可視化および現像を行った。
【００６４】
〔２．結果〕
（ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性のＴ細胞の定量的プロテオーム分析）
スクリーニングの概略的な全体図は、図１に示されている。ＨＴＬＶ−１に感染したＴ細胞に発現している治療に有効な標的を同定するために、６人の非感染健常者、５人の無症候性キャリア、９人のＨＡＭ／ＴＳＰ患者、および９人のＡＴＬ患者由来のＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性集団のＰＢＭＣを、フローサイトメトリーによって単離した（図２）。４つの臨床群のＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性のＴ細胞におけるＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性細胞の平均化した割合は、それぞれ６．４８±２．４６％の、１３．１７±１３．０６％の、２０．５５±１０．７３％の、および５５．８３±２２．４０％のであった。これは、ウイルスを保有している細胞による占有率が、病態の進行にともなって大きく変化したことを示唆している。この事実は、定量的な標的の精密な発見にとって、病原性細胞の濃縮の重要性を強く支持していた。
【００６５】
フローサイトメーターを用いて２９検体から単離したＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性およびＣＣＲ４陽性細胞を、トリプシン消化し、それぞれＬＳ／ＭＳ／ＭＳ解析に供した。Expressionist上での解析の結果、６８，４５４個のピークが検出された。さらに、これらについて同一のイオン由来の同位体をまとめるクラスタリング作業を行った結果、３７，１４３個の同一のイオン由来の同位体集団、すなわち同位体クラスターを検出した。トリプシンペプチドはエレクトロスプレーイオン化質量分析において２価以上の多価イオンとして検出されるため、１価のイオンはバイオマーカーおよび治療標的の探索に供する対象ではない。この観点から、非ペプチドに対応する１価の２３，０７９クラスターを除去し、１４，０６４クラスターを、ペプチド由来クラスター（以下、ペプチドと記載）として以下の統計解析に供した。
【００６６】
（統計学的手法を用いたＡＴＬに対する治療標的の探索）
ＡＴＬ群において特異的に変動しているタンパク質群の効率的なスクリーニングを行うために、２段階に分けた統計学的な抽出手法を実施した。第１段階として、４臨床群のうちの２群間において、有意差があるペプチドを抽出するために、４群クラスカルウォリス検定を行った（ｐ＜０．０１）。この結果として１，１７０ペプチドが抽出された。
【００６７】
第２段階のスクリーニングとして、Expressionist AnalystモジュールにおいてSupport Vector Machine-Recursive Feature Elimination (SVM-RFE)アルゴリズムを用いた、治療標的の探索を行った。具体的には、当該探索は、全１４，０６４ペプチドから１つずつペプチドを除いてゆき、それらを使いてＳＶＭによる予測モデルを作成して、leave-one-out交差検定による誤検出率に基づいて、疾患の識別に最も不要なペプチドを除いていく手法である。この過程を繰り返し行うことによって、最も誤検出率の低いペプチドの組合せを選定することが可能である。この過程の結果として、９１のペプチドの組合せが、leave-one-out交差検定において、最も低い誤分類率（７．７８％）を示した（図３Ａおよび図３Ｂ）。これらの９１ペプチドの定量情報に基づく主成分分析（ＰＣＡ）を行って、主要な３成分を抜き出し、３Ｄプロットを作成した（図３Ｃ）。この解析によって、４群が分かれていることは視覚的に明らかに認識可能であり、９１ペプチドは、実際に検体が属する臨床群に分類する分類力が極めて高いことが分かる。このことは、選別した９１ペプチドが疾患特異的に変動している因子であることを裏付けており、有力な治療標的を含んでいると言える。
【００６８】
２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて構築した６，２７９タンパク質由来のペプチドによって構成されている同定データベースに基づき（方法の項目を参照のこと）、表１に列挙されているように、９１の候補ペプチドのうち１７タンパク質由来の１９ペプチドの同定に成功した。また、１９ペプチドに対する質量分析から得られた定量情報は、箱髭図として図４に示されている。
【００６９】
（Calpain-2の活性の回復によって誘導されるＡＴＬ細胞の細胞死）
ＡＴＬの治療標的として同定されたペプチド群のうち、Calpain-2およびα2-spectrinは、細胞死に関連する多くの報告がなされている酵素と基質の関係にある。２７検体の質量分析から得られた定量情報の相関を評価したところ、２つのペプチドは負の相関を示した（Ｒ２＝０．３９５、図５Ａ）。これらの細胞死に関連する酵素と基質の関係がＡＴＬにおいて重要であり、治療標的になり得るかを検討するために、まず、２つのＡＴＬ細胞株であるＳＯ−４およびＫＯＢにおいて、活性型Calpain-2（Δ１９ＣＡＮ２）を過剰発現させた。ＭＴＴ解析の結果、形質移入の３６時間後に、細胞増殖の著しい阻害（図５Ｂおよび図５Ｃ）が検出され、ｓｕｂ−Ｇ１期に移行している細胞の増加が観察された（図５Ｄおよび図５Ｅ）。この増殖阻害活性はＪｕｒｋａｔ細胞では観察されなかった（図示せず）。また、活性型Calpain-2の過剰発現は、タンパク質レベルでα2-spectrinの発現低下を誘導した（図５Ｆ）。一方で、siSPTAN1を用いたα2-spectrinの発現低下はATL細胞における細胞増殖に影響を与えなかった（図示せず）。以上のことから、ＡＴＬ細胞においてCalpain-2活性は、ＡＴＬの発症または進行に重要な役割を果たしている有望な治療標的であることが裏付けられた。
【００７０】
本発明は、上述した各実施形態および実施例に限定されず、特許請求の範囲に示されている範囲において種々の変更が可能である。よって、本発明の技術的範囲には、異なる実施形態および実施例のそれぞれに開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる種々の形態が含まれる。また、本明細書に挙げられている参考文献に記載の内容は全て、参照によって本明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の診断が可能である。よって、本発明は、診断医療分野および保健医学分野に広く利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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