(57)【要約】【課題】本発明の目的は、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞の分化誘導過程を可視化および解析する優れた方法を提供することにある。【解決手段】本発明に係る浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞の分化誘導過程を可視化する方法は、浮遊細胞への分化能を有する少なくとも１つの細胞を、未分化マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光する発光タンパク質で標識することと、前記細胞を生かした状態で、前記細胞から放射される発光を経時的に撮像して複数の発光画像を取得することと、前記複数の発光画像に基づいて、前記細胞の分化の状態が識別可能となるように、発光量の変化を表現することとを含む。【選択図】図４Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する少なくとも１つの細胞を、未分化マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光する発光タンパク質で標識することと、
前記細胞を生かした状態で、前記細胞から放射される発光を経時的に撮像して複数の発光画像を取得することと、
前記複数の発光画像に基づいて、前記細胞の分化の状態が識別可能となるように、発光量の変化を表現することと
を含む浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞の分化誘導を可視化する方法。
【請求項２】
前記発光量の変化は、細胞ごとに表現される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発光画像と並行して明視野画像を取得し、前記発光を放射する細胞の位置を確認することを更に含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は少なくとも幹細胞、造血幹細胞または前駆細胞を含む請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は少なくとも幹細胞、造血幹細胞または前駆細胞から分化した細胞を含む請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は少なくともＢ細胞を含む請求項４または5に記載の方法。
【請求項７】
前記撮像の際に、前記細胞の移動が抑制される請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか１項に記載の方法により可視化された浮遊細胞への分化誘導に関する情報から、分化の状態と未分化マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子の発現量との関係を判定することを含む、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞への分化誘導過程を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞の分化誘導過程の可視化および解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野では、幹細胞または前駆細胞を使った細胞移植や臓器再生による難病治療が期待されている。このような治療は、心疾患等の臨床応用において先行しているものの、実際に移植した幹細胞または前駆細胞がどのように機能しているか不明な点が多い。安全な移植を行うためには、幹細胞または前駆細胞の分化誘導、すなわち、幹細胞または前駆細胞をある特定の機能を持つ細胞へ分化誘導することのメカニズムを解明すること、および細胞内動態や機能を制御する因子を同定することが必須である。
【０００３】
従来、ｐｒｅＢ細胞など免疫系の前駆細胞の分化誘導プロセスの解析には、フローサイトメーターが用いられている（特許文献１）。この場合、分化マーカーを指標に分化の程度が判断されるが、フローサイトメーターを用いた計測ではエンドポイントのマーカー発現しか行えず、１細胞における連続的な観察を行うことが難しい。
【０００４】
また、顕微鏡を用いて観察しようとしても、ｐｒｅＢ細胞は浮遊性の細胞であるため、培養液中で動いてしまい、接着性の細胞のように長時間同じ細胞を観察することが難しいという問題があった。
【０００５】
一方、幹細胞から胚様体を形成させて分化誘導を行なう場合、分化マーカー遺伝子の発現のレポーターとしてＧＦＰを用いて分化状態を調べる従来の方法では、組織体である胚様体において励起光照射による自家蛍光が影響し、定量性のある観察が難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１３５０９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞のへの分化誘導過程を可視化および解析する優れた方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る浮遊細胞への分化誘導過程を可視化する方法は、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞への分化能を有する少なくとも１つの細胞を、未分化マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光する発光タンパク質で標識することと、前記細胞を生かした状態で、前記細胞から放射される発光を経時的に撮像して複数の発光画像を取得することと、前記複数の発光画像に基づいて、前記細胞の分化の状態が識別可能となるように、発光量の変化を表現することとを含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞への分化誘導過程を可視化および解析する優れた方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、種々の条件にて培養されたλ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞の発光強度の変化を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、発光顕微鏡ＬＶ２００を用いて取得した７０Ｚ／３細胞の発光画像および明視野画像である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、発光顕微鏡ＬＶ２００を用いて取得した７０Ｚ／３細胞の発光画像および明視野画像である。
【図３Ａ】図３Ａは、λ５遺伝子の発現量を定量するために選択された細胞選択領域（ＲＯＩ）を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、λ５遺伝子の発現量を定量するために選択された細胞選択領域（ＲＯＩ）を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、４つの選択領域における発光量の経時的な変動を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、４つの選択領域における発光量の経時的な変動を示す図である。
【図５】図５は、免疫細胞を誘導するための培養スケジュールを示す図である。
【図６】図６は、ＯＰ９上で培養したＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の培養１日目の明視野画像を示す図である。
【図７】図７は、ＯＰ９上での培養開始から５日後に取得した、ＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の画像である。
【図８】図８は、ＯＰ９上での培養開始から８日後に取得した、ＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１実施形態は、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞への分化誘導過程を可視化する方法に関する。
【００１２】
第１実施形態に係る方法は、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞への分化能を有する少なくとも１つの細胞を、未分化マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光する発光タンパク質で標識することと、前記細胞を生かした状態で、前記細胞から放射される発光を経時的に撮像して複数の発光画像を取得することと、前記複数の発光画像に基づいて、前記細胞の分化の状態が識別可能となるように、発光量の変化を表現することとを含む。
【００１３】
細胞は、種々の生物に由来する細胞であってよく、例えば、多細胞生物に由来する細胞である。特に、細胞は、ヒトといった哺乳類に由来する細胞である。細胞は、培養細胞であってよい。細胞は、単一の種類であってよく、または複数の種類を含んでよい。
【００１４】
細胞は分化能を有する幹細胞または前駆細胞である。すなわち、細胞は、未分化の状態の細胞である。あるいは、細胞は、ある程度分化しているものの、更に分化し得る状態の細胞である。細胞は、本発明の実施とともに分化が進行してよい。細胞は、本発明の開始の段階において、接着性の細胞であってよく、または浮遊性の細胞であってよい。
【００１５】
細胞は、例えば、少なくとも造血幹細胞または造血幹細胞から分化した細胞を含む。細胞は、例えば、少なくともＢ細胞を含む。
【００１６】
未分化マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子とは、例えば、その遺伝子が発現することおよび／または発現しないことに基づいて細胞の分化の状態を判定することが可能となる遺伝子である。これらの遺伝子は、分化に関連する遺伝子であり、分化の開始前に、分化の進行に伴っておよび／または分化の完了後に、発現が変動する。これらのマーカー遺伝子は、対象とする細胞が本来有する遺伝子であることが好ましい。
【００１７】
未分化マーカー遺伝子は、例えば、細胞が未分化であるときに特異的に発現する遺伝子であり、その具体例は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２等である。分化マーカー遺伝子は、例えば、細胞が分化する過程において特異的に発現する遺伝子であり、その具体例は、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍａｓｈ１といった神経分化マーカー遺伝子、およびＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５といった心筋分化マーカー遺伝子である。細胞がＢ細胞である場合、マーカー遺伝子の例は、λ５遺伝子およびＣＤ４０遺伝子である。細胞がＴ細胞である場合、マーカー遺伝子の例は、ＣＤ７である。細胞が樹状細胞である場合、マーカー遺伝子の例は、ＣＤ３４およびＣＤ４０である。細胞が単球である場合、マーカー遺伝子の例は、ＣＤ１４、ＣＤ４５およびＣＤ４０である。
【００１８】
未分化マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子は、例えば、その発現に依存して発光タンパク質の発現が促進されるように設計されている。例えば、細胞の有する核酸において、これらのマーカー遺伝子のための転写因子結合領域の下流に、発光タンパク質の遺伝子が配置されており、本来マーカー遺伝子の発現を制御するための転写因子が、この転写因子結合領域に結合することで、発光タンパク質の遺伝子の発現が促進される。
【００１９】
発光タンパク質とは、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光タンパク質の例はルシフェラーゼである。ルシフェラーゼは、ＡＴＰが存在する場合に、基質であるルシフェリンの酸化反応を触媒する。その反応の際、ルシフェリンが発光する。
【００２０】
ルシフェラーゼは、ホタルやバクテリアといった種々の生物に由来するものであってよい。ルシフェラーゼは、例えば、緑色の発光を生じさせるＥｌｕｃルシフェラーゼ、赤色の発光を生じさせるＣＲＢルシフェラーゼ、青色の発光を生じさせるウミシイタケルシフェラーゼといった市販されるものであってよい。ルシフェラーゼ遺伝子を予め含有する市販のベクターの例は、Ｅｌｕｃ  ｖｅｃｔｏｒ（東洋紡）、ＣＲＢ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＲｅｎｉｌｌａ  ｖｅｃｔｏｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）である。
【００２１】
細胞を発光タンパク質で標識することとは、例えば、上述したように、マーカー遺伝子の転写因子結合領域と、その下流に位置する発光タンパク質の遺伝子とを含む核酸を細胞に導入することである。マーカー遺伝子の転写因子結合領域と発光タンパク質とのセットを複数使用してよく、この場合、これらの複数のセットは互いに異なる複数であってよい。
【００２２】
細胞を標識した後、細胞を生かした状態で、発光画像が取得される。細胞を生かした状態とは、例えば、細胞を固定していない状態である。好ましくは、細胞は、分化し得る状態にされるか、または未分化の状態に戻り得る状態にされる。具体的には、細胞は、ＬＰＳ、ＦＬｔ等が添加された培地において培養される。あるいは、細胞は、分化が阻害される条件下で培養され、例えば、分化の阻害剤が添加された培地において培養される。
【００２３】
発光は経時的に撮像され、複数の画像が取得される。本発明では、発光を撮像することにより得られた画像を発光画像と称する。発光画像は、発光する細胞に由来する発光シグナルが検出された領域と、発光しない細胞および細胞が存在しない部分に由来する発光シグナルが検出されない領域とを含む。このため、細胞毎またはコロニー毎の発光を推定することができる。
【００２４】
撮像は、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光のみを主に透過させるフィルターと、光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す処理手段とを含む装置を用いて行うことができる。発光画像を取得するための装置の例は発光イメージングシステムであり、この具体例は、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）である。
【００２５】
撮像は経時的に行われる。すなわち、撮像は、任意の間隔で連続的に行われる。例えば、撮像は、５分から１時間の間隔で行われる。また、１回の撮像の時間は任意に設定される。１回の撮像時間は、十分な発光シグナルを検出できるように調整することができる。
【００２６】
発光画像の取得と並行して、明視野画像を取得することができる。明視野画像とは、例えば、幹細胞に対して照射された照明光が幹細胞を反射および／または透過して生じる光を撮像することにより得られる画像である。すなわち、明視野画像は、発光に基づくことなく、幹細胞の位置および形態等を観察することができる画像である。明視野画像は、位相差画像やＤＩＣ観察画像を含む。明視野画像は、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで取得することができ、あるいは、発光画像の取得からは独立して、任意のタイミングで明視野画像を取得することができる。
【００２７】
撮像の際に、細胞の移動を抑制することができる。細胞自体をポリリジン等によりプレート底面に接着してもよいが、細胞の周囲に存在する液体培地の流動を抑制することにより、細胞の移動を抑制することもできる。
【００２８】
例えば、細胞を含む培地を、培養用容器の底面とメンブレン等とで挟むことで培地の流動を抑制することができる。この場合、底面とメンブレンとの距離はできる限り小さくされる。この距離は、例えば、細胞の大きさよりも大きく、細胞が２層で存在できる距離よりも小さい。このような細胞の移動の抑制は、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＭｉｌｌｃｅｌを用いて行うことができる。
【００２９】
培地の流動を抑制することにより細胞の移動を抑制する別の手段は、細胞の移動を抑制するような構造が底面に形成された培養用容器である。このような容器の底面には、例えば複数の微小な空洞が形成されており、１つまたは少数の細胞のみがその空洞に収まる。このような細胞の移動の抑制は、Ｚｅｌ社製のＣｙｔｏｃａｐｔｕｒｅを用いて行うことができる。
【００３０】
複数の発光画像の取得に続き、それらの画像に基づいて、細胞の分化の状態が識別可能となるように、発光量の変化が表現される。すなわち、複数の発光画像から発光量の変化が読み取られ、分化状態を識別できる表現形式に変換される。例えば、発光量の変化が、視覚的に確認できるように表現される。例えば、測定した時点の発現量をその測定時間とともに記録し、表としてまとめられる。あるいは、測定した時点の発光量を、経過時間−発現量の平面上にプロットすることで、発光量の変動がグラフとして表現される。
【００３１】
複数の発光画像から発光量の変化が読み取られる際、その変化を細胞毎に読み取ることができる。例えば、１つの発光画像において読み取るべき細胞を選択した後、その他の発光画像からも同じ細胞を選択して、発光量の変化を読み取ることができる。そのような選択は、例えば、コンピューター上で実行されるプログラムを用いて行うことができる。この場合、１つの発光画像において、細胞を含む領域を四角で囲んで、またはフリーハンドで囲んで関心領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＲＯＩ）を指定し、その他の画像においてもこの関心領域が追跡される。指定した領域について、例えばコンピューター上のプログラムを用いて発光量が数値化され、記録される。
【００３２】
本発明の第２実施形態は、浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞への分化誘導を解析する方法に関する。
【００３３】
第２実施形態に係る方法は、第１実施形態に係る方法により可視化された浮遊細胞または浮遊細胞への分化能を有する細胞への分化過程に関する情報から、分化の状態と未分化マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子の発現量との関係を判定することを含む。
【００３４】
第２実施形態に係る方法では、例えば、第１実施形態に係る方法により得られた情報に基づいて、分化の状態とマーカー遺伝子の発現量との関係式を得る。さらに、そのような関係式から、ある発現量を示すときの分化の状態を特定することもできる。
【００３５】
本発明によれば、例えば以下のような効果を得ることができる。
【００３６】
第１実施形態に係る方法によれば、免疫細胞が分化する際の遺伝子発現の過程を観察することができる。このとき、観察は発光イメージングを用いて行うことで、高い定量性を実現することができる。この方法によれば、Ｂ細胞のような浮遊性の細胞を長時間観察することが可能となり、また、幹細胞から免疫細胞に分化にする過程を観察することが可能となる。
【００３７】
第１実施形態に係る方法において、細胞毎に観察を行うことにより、細胞群内における状態のバラツキに左右されることなく、細胞毎の状態を可視化することができる。
【００３８】
第１実施形態に係る方法において、明視野画像を取得して、発光を放射する細胞の位置を確認することで、発光画像だけからは判断できない細胞の状態を確認することができる。例えば、観察する領域に、細胞が存在しているのか、存在していないのか、さらには、観察している細胞が生きているのか、死んでいるのか等を確認することができる。また、細胞が分裂している段階か否かを確認することができる。浮遊細胞は動きやすいため、分裂の影響で細胞が移動する可能性がある。また、細胞が分裂して２つに分かれることで、１つの細胞が含む発光タンパク質の量が一時的に減少したり、細胞分裂が縦方向に生じることで、焦点の合っている位置から細胞がずれ、発光シグナルが低下したりすることがある。このような細胞の状態は発光画像だけで判断することは難しいため、明視野画像に基づいて分裂の状態を確認することは重要である。このように明視野画像を取得することで、発光画像の有効性が補強される。
【００３９】
第１実施形態に係る方法において、少なくとも造血幹細胞または造血幹細胞から分化した細胞を観察の対象とすることにより、再生医療等への応用において重要な分化に関する情報を得ることができる。
【００４０】
第１実施形態に係る方法において、少なくともＢ細胞を含む細胞を観察の対象とすることにより、急性リンパ性白血病の研究において重要な分化に関する情報を得ることができる。
【００４１】
第１実施形態に係る方法において、細胞の移動を抑制することにより、精度の高い可視化を行うことができる。本発明は、浮遊細胞を対象とするため、細胞が移動し易い。例えば、１度の撮像の際に細胞の移動が生じると、正しい細胞の形状を捉えることはできず、また、正しい発光量を測定することも困難となる。さらに、撮像と撮像との間に細胞の移動が生じると、形状の変化や発光量の変動を追跡することが困難となる。細胞の移動を抑制することで、これらの問題を回避することができる。特に、細胞を培養容器の壁面等に直接接着させることなく、細胞の周囲の培地の流動を抑制することにより細胞の移動を抑制することで、細胞に対する接着の影響を回避することができる。
【００４２】
第２実施形態に係る方法により、細胞の分化の状態を正確に判定することができる。それにより、幹細胞の再生医療への応用や急性リンパ性白血球の研究を促進することができる。
【実施例】
【００４３】
［実施例１：７０Ｚ／３細胞におけるλ５遺伝子のレポーターアッセイ］
造血幹細胞は、ｐｒｏＢ細胞、大型ｐｒｅＢ細胞、小型ｐｒｅＢ細胞および未熟Ｂ細胞の状態を順に経て、Ｂ細胞に分化する。この分化の過程において、λ５遺伝子はｐｒｅＢ細胞期に特異的に発現し、リポ多糖（ＬＰＳ）などの薬剤刺激により分化が進むと発現が低下するといわれている（Li, J. et al., The Journal of Biological Chemistry 2001 vol.276, No.21, p18579-18590）。このλ５遺伝子の遺伝子発現を指標にして、ｐｒｅＢ細胞の分化誘導の可視化が可能であるかを検討した。
【００４４】
［実施例１−１：ルミノメーターを用いたλ５−ＧＬ４遺伝子安定発現７０Ｚ／３細胞の長期観察および解析］
（１）λ５遺伝子のエンハンサー／プロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸が導入された７０Ｚ／３細胞の作成
λ５遺伝子のためのエンハンサー／プロモーター領域のクローニングを、非特許文献「Sigvardsson, M. et al., Immunity 1997 Vol. 7, p25-36」を参考に行い、このエンハンサー／プロモーター配列を取得した。このとき、マウスゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。また、プライマーは、以下の２つを使用した。  
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号１）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＣＣＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧ（配列番号２）。
【００４５】
取得したλ５遺伝子のためのエンハンサー／プロモーター配列をネオマイシン耐性のｐＧＬ４−ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込み、「λ５遺伝子発現特異的発光ベクターｐλ５−ＧＬ４」を作成した。
【００４６】
ベクターを導入するｐｒｅＢ細胞（７０Ｚ／３細胞株）の培養には、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、１０％ＦＢＳ、１％２−メルカプトエタノール入り）を用いた。
【００４７】
エレクトロポレーション法を用いて、７０Ｚ／３細胞にｐλ５−ＧＬ４遺伝子発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を一晩ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した後、抗生物質Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度５００μｇ／ｍｌとなるよう加えたＲＰＭＩ１６４０に培地にて選択的な培養を行うことで、安定発現細胞株を取得した。以下、この細胞をλ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞と呼ぶ。
【００４８】
（２）λ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞の分化誘導
Ｄ−ルシフェリン（Ｗａｋｏ社製、終濃度１ｍＭ）を加え、２４時間培養、発光を安定させた安定発現細胞を３つに分け、それぞれ、終濃度１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ（分化誘導あり）、終濃度５０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ（分化誘導あり）およびＬＰＳを含まないＰＢＳ（分化誘導なし）に添加した。
【００４９】
（３）λ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞の観察および解析
ルミノメーター（クロノス（ＡＴＴＯ株式会社））を用いて、３通りの条件において培養したλ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞の発光強度を、それぞれ２４時間連続で測定した。測定間隔は３分とした。
【００５０】
図１には、互いに異なる条件にて培養されたλ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞の発光強度の変化を示す。分化誘導なし（ＬＰＳ−）のλ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞の発光強度は、観察１２時間後もほとんど変化していないのに対し、分化誘導あり（ＬＰＳ＋）で培養した２種のλ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞では、ＬＰＳ添加後から明らかに発光強度が下がっていることがわかり、λ５遺伝子の発現が下がっている様子が確認できた。
【００５１】
なお、実施例１−１では、薬剤耐性遺伝子を導入して薬剤選択を行った安定発現株細胞を使用したものの、一過性発現細胞株を使用することもできる。
【００５２】
［実施例１−２：ＬＶ２００を用いたλ５−ＧＬ４遺伝子安定発現７０Ｚ／３細胞の長期観察および解析］
発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を用いて、実施例１−１で作製したλ５−ＧＬ４遺伝子安定発現７０Ｚ／３細胞を細胞毎に発光観察を行った。
【００５３】
（１）発光顕微鏡ＬＶ２００を用いた観察と解析
Ｄ−ルシフェリン（Ｗａｋｏ社製、終濃度１ｍＭ）を加え、２４時間培養、発光を安定させた安定発現細胞を２つに分け、それぞれ、終濃度１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ（分化誘導あり）およびＬＰＳを含まないＰＢＳ（分化誘導なし）に添加した。
【００５４】
分化誘導を行った細胞および分化誘導を行わなかった細胞を、それぞれ疎水性のポリマー層がコートされた微小空洞が配された３５ｍｍ径ディッシュであるＣｙｔｏｃａｐｔｕｒｅ（ＺＥＬ社）に加え、４０倍の対物レンズを取り付けた発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を使って観察した。
【００５５】
７０Ｚ／３細胞は浮遊細胞であり、従来の３５ｍｍディッシュでの観察を行なった場合には、観察中に細胞が容易に動き、観察視野外に移動し観察不能となる。Ｃｙｔｏｃａｐｔｕｒｅのような仕切りのある容器を用いることで浮遊細胞を保持しながら観察を行うことが可能となった。
【００５６】
ＣＣＤカメラ  ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）をｂｉｎｎｉｎｇ１×１の条件で使用し、λ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞を露光時間１分、撮影間隔２分で撮影することにより、λ５遺伝子発現量の経時変化を観察した。
【００５７】
タイムラプス観察後、撮像した観察画像を保存し、画像解析システム“ＴＩＭＥＬＡＰＳ  ＩＭＡＧＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ”（オリンパス株式会社製）を用いてその観察画像から数値データを解析すると共に、解析した数値データのグラフ化を行った。
【００５８】
図２Ａおよび２Ｂに、発光顕微鏡ＬＶ２００を用いて取得した７０Ｚ／３細胞の発光画像および明視野画像を示す。図２Ａは分化誘導を行わなかった細胞の画像であり、図２Ｂは分化誘導を行った細胞の画像である。
【００５９】
また、λ５遺伝子の発現量を定量するため、λ５−ＧＬ４発現７０Ｚ／３細胞を複数選択し、発光量の数値化を行った。図３ＡおよびＢには、λ５遺伝子の発現量を定量するために選択された選択領域（ＲＯＩ）が示される。選択領域は８カ所とし、それぞれＲＯＩ１〜８とした。なお、図３Ａは分化誘導を行わなかった細胞の画像であり、図３Ｂは分化誘導を行った細胞の画像である。
【００６０】
図４ＡおよびＢには、選択した４つの選択領域における発光量の経時的変化を示す図である。図４Ａは、分化誘導を行っていない細胞の変化を示し、図４Ｂは、分化誘導を行った細胞の変化を示している。また、それぞれの図において、４つの選択領域の発光量の平均（ａｖｅｒａｇｅ）を示している。
【００６１】
図４Ａより、分化誘導を行わなかった細胞では時間経過による発光量の変化はほとんど見られないことがわかる。これに対し、図４Ｂより、分化誘導を行った細胞は時間の経過に従って明らかに発光量が減少している。ＬＰＳによる分化誘導によるλ５遺伝子発現の減少は、ルミノメーターの結果とも一致しているが、本検討では発光観察によりλ５遺伝子発現を画像で検出することにより、単一の細胞レベルでの遺伝子発現の変化を初めて明らかにすることができた。細胞毎の観察では、概ねλ５遺伝子発現の減少が観察されているが、発現量の経時プロファイルは異なっており、個々の細胞の応答性の違いが存在することが示唆された。
【００６２】
なお、実施例１−２では、薬剤耐性遺伝子を導入して薬剤選択を行った安定発現株細胞を使用したものの、一過性発現細胞株を使用してもよい。
【００６３】
［実施例２：マウスＥＳ細胞における免疫細胞分化誘導過程の可視化］
造血幹細胞や造血前駆細胞を作製するための方法の１つとして、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の分化誘導が検討されている。本検討では、ストローマ細胞ＯＰ９上でＥＳ細胞を培養することで、造血細胞への分化誘導を行った。その際に、Ｂ細胞、樹状細胞および単球のマーカーとして知られるＣＤ４０遺伝子の発現を観察した。その結果、造血細胞への分化の過程で、ＣＤ４０遺伝子の発現が上昇している様子が観察された。詳細を以下に示す。
【００６４】
（１）免疫細胞の分化マーカーであるＣＤ４０遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸を導入したマウスＥＳ細胞の作成
ＣＤ４０遺伝子のためのプロモーター領域のクローニングを「Tone et al., JBC, vol.277 p8890-8897, 2002, Lam et al., JBC, vol.282 p27587-27597, 2007」を参考に行い、このプロモーター配列を取得した。このとき、マウスゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。また、プライマーとして、以下のものを使用した。  
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：  ＧＧＴＡＣＣＣＴＴＴＧＡＣＣＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＧ（配列番号３）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡ（配列番号４）。
【００６５】
取得したＣＤ４０遺伝子のプロモーター配列をネオマイシン耐性ｐＧＬ４−ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込み、「ＣＤ４０遺伝子発現特異的発光ベクターｐＣＤ４０−ＧＬ４」を作製した。
【００６６】
マウスＥＳ細胞を培養するために、フィーダー細胞を準備した。具体的には、３５ｍｍ径のプラスティックディッシュを０．１％ゼラチンでコーティングし、ＰＢＳにて３回洗浄した。ゼラチンコートを行ったディッシュに、マイトマイシンＣ処理で分裂を停止したＭＥＦ細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏ−ｂｌａｓｔ、マウス胎児線維芽細胞）を撒き、一晩培養を行った。培地には、ＤＭＥＭ（フェノールレッド、１０％ＦＣＳ入り）を用いた。翌日、マウスＥＳ細胞（ＢＲＣ６株、理研ＢＲＣ）を３５ｍｍディッシュ内のフィーダー細胞上に撒いた。
【００６７】
一晩培養後、ｐＣＤ４０−ＧＬ４遺伝子発現ベクターをマウスＥＳ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクトされたＥＳ細胞を、培地として１５％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ））、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）入りＤＭＥＭを用いて一晩培養した。遺伝子のトランスフェクションはＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬株）によるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ法を用いた。翌日、培地を、ＨＥＰＥＳ入りＤＭＥＭ（１５％ＦＢＳ、フェノールレッド抜き）に置き換えた。Ｇ４１８添加を行うことで遺伝子導入が行われた細胞のみを薬剤選択し、安定発現株細胞を作製した。本検討で作成したｐＣＤ４０−ＧＬ４導入安定発現マウスＥＳ細胞株をＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞と呼ぶ。
【００６８】
なお、実施例２では、薬剤耐性遺伝子を導入して薬剤選択を行った安定発現株細胞を使用したが、一過性発現細胞株を使用してもよい。
【００６９】
（２）ＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の免疫細胞への分化誘導法
ストローマ細胞ＯＰ９上でＥＳ細胞を培養することで、免疫細胞への分化誘導が可能であることが報告されている（Cho et al., PNAS vol.96, p9797-9802, 1999、Kim et al., PNAS vol.100, p1203-1208, 2003）。
【００７０】
ＯＰ９は理研バイオリソースセンターから購入した細胞株を利用した。ＯＰ９をαＭＥＭ培地にて培養し、３５ｍｍディッシュに播種した。コンフルエント状態に増殖したところで、ＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞培養をＯＰ９細胞の上で開始した。培養開始５日目にＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞とＯＰ９細胞を継代し、新たにＯＰ９を播種した３５ｍｍ径ディッシュに播種した。この際に、αＭＥＭ培地にｈｕｍａｎ  Ｆｌｔ−３  Ｌｉｇａｎｄ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を５ｎｇ／ｍｌとなるように加えて培養を行なった。さらに培養８日目に２度目の細胞継代を行った。その際には、ｈｕｍａｎ  Ｆｌｔ−３  Ｌｉｇａｎｄ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を５ｎｇ／ｍｌに添加し、細胞培養を行なった。図５に、免疫細胞を誘導するための培養スケジュールを示す。
【００７１】
（２）ＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の観察および解析
発光観察のためＤ−ルシフェリン（プロメガ社製：最終濃度１００μＭ）を加え、発光
顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を使ってマウスＥＳ細胞を観察した。発光観察条件として、ＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞を３０分間撮影することにより、ＣＤ４０遺伝子の発現量を観察した。対物レンズは×２０、ｂｉｎｎｉｎｇは１×１、ＣＣＤカメラはＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）とした。明視野画像および発光画像取得は、画像解析システム“ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ”（浜松ホトニクス株式会社製）を用いて行った。
【００７２】
図６に、ＯＰ９上で培養したＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の培養１日目の明視野画像を示す。
【００７３】
図７は、ＯＰ９上での培養開始から５日後に取得した、ＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の画像である。図７の左は発光画像を示し、右は明視野画像と発光画像とを重ね合わせた画像を示す。図７から、培養開始から５日後の段階において、ＣＤ４０遺伝子を発現する細胞が出現していることがわかる。
【００７４】
図８は、ＯＰ９上での培養開始から８日後に取得した、ＣＤ４０−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の画像である。図８（ａ）の左は発光画像を示し、右は明視野画像と発光画像とを重ね合わせた画像を示す。図８（ａ）では、図７と比較して、ＣＤ４０発現が上昇した細胞が多くみられた。図８（ｂ）は、図８（ａ）において破線にて囲った部分を拡大して示した図である。
【００７５】
図８から、これまでのコロニー状の細胞集合体ではなく、個細胞が出現し、形態的にも分化誘導が行われていることがわかった。しかしながら、ＣＤ４０遺伝子の発現状態は均一ではなく、発現がみられない細胞もあった。発光イメージングにより個々の細胞におけるＣＤ４０遺伝子の発現レベルを検出することができた。ＣＤ４０はＢ細胞だけではなく、樹状細胞や単球にも発現する遺伝子でありＢ細胞特異的な分化誘導が行われているか確認が必要であるが、ＯＰ９細胞培養時の免疫細胞への分化誘導過程を発光イメージングにより可視化することができた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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