(57)【要約】      （修正有）【課題】より少量のペプチドを検出することが可能な質量分析法を提供する。【解決手段】ペプチドのマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法であって、ターゲットプレート上に、１５〜５０体積％のアセトニトリルを含む水溶液を溶媒とするペプチド溶液と、１５〜５０体積％のアセトニトリルを含む水溶液を溶媒とし且つ０．０５〜１ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含むマトリックス溶液とをそれぞれ滴下し、ペプチド−マトリックス混合溶液の液滴を調製する工程と、ペプチド−マトリックス混合溶液の液滴から溶媒を除去し、残渣として質量分析用試料を調製する工程と、質量分析用試料にレーザーを照射してペプチドを検出する方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドのマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法であって、
ターゲットプレート上に、１５〜５０体積％のアセトニトリルを含む水溶液を溶媒とするペプチド溶液と、１５〜５０体積％のアセトニトリルを含む水溶液を溶媒とし且つ０．０５〜１ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含むマトリックス溶液とをそれぞれ滴下し、ペプチド−マトリックス混合溶液の液滴を調製する工程と、
前記ペプチド−マトリックス混合溶液の液滴から溶媒を除去し、残渣として質量分析用試料を調製する工程と、
前記質量分析用試料にレーザーを照射して前記ペプチドを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析法によるペプチドの分析技術に関する。本発明は、製薬、受託分析、食品、衛生、及び法科学分析等に関連する分野において適用される。
【背景技術】
【０００２】
分析科学における中心的課題は高感度分析である。ＭＡＬＤＩ質量分析は分析科学の一翼を担う重要な技術であるため、ＭＡＬＤＩ質量分析法の高感度化は常に求められている。
ＭＡＬＤＩ質量分析法によるペプチドの高感度分析の目的で、質量分析用試料のサンプリング時におけるマトリックス物質の選択、使用溶液のｐＨの調整、表面が撥水処理されたターゲットプレートの使用（非特許文献１：Hudson Surface Technologyホームページ“μFocus”）、マトリックス補助剤の使用等が試みられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】“μFocus”、[online]、Hudson Surface Technology、[平成２４年６月１１日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.maldiplate.com/catalog/category/sample-plates/%CE%BCfocus＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＭＡＬＤＩ質量分析の高感度化への試みはなされているものの、そのアプローチは断片的であり、マトリックス濃度その他のパラメータについて系統立った研究はなされていない。そのため、系統立った研究に基づいていないサンプリング法が一般的な方法として用いられている。具体的には、ペプチドを被検出物質とし、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとし、且つアセトニトリルを溶媒中に用いる質量分析系におけるシンプルなサンプリング法としてよく行われている方法は、アセトニトリルと０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液とを同体積混合した溶液を溶媒とする１０ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸溶液と、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液を溶媒とするペプチド溶液とを、それぞれステンレスターゲットプレート上に滴下して混合し、溶媒を揮発により除去し、残渣を質量分析用サンプルとして得るものである。このようなサンプリング法を用いたＭＡＬＤＩ質量分析によると、ペプチドの検出限界は１０ｆｍｏｌである。
本発明の目的は、サンプリング条件を改良し、より少量のペプチドを検出することが可能な質量分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ターゲットプレートへの滴下前においてマトリックス溶液中だけでなくペプチド溶液中にもアセトニトリルを含ませ、且つマトリックス物質及びアセトニトリルの使用量を少なくすることによって、上記本発明の目的が達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、以下の発明を含む。
ペプチドのマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法であって、
ターゲットプレート上に、１５〜５０体積％のアセトニトリルを含む水溶液を溶媒とするペプチド溶液と、１５〜５０体積％のアセトニトリルを含む水溶液を溶媒とし且つ０．０５〜１ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含むマトリックス溶液とをそれぞれ滴下し、ペプチド−マトリックス混合溶液の液滴を調製する工程と、
前記ペプチド−マトリックス混合溶液の液滴から溶媒を除去し、残渣として質量分析用試料を調製する工程と、
前記質量分析用試料にレーザーを照射して前記ペプチドを検出する方法。
【０００７】
本明細書においては、ペプチド溶液中のＭｅＣＮ濃度をＸ（単位：体積％）、マトリックス溶液中のＭｅＣＮ濃度をＹ（単位：体積％）、マトリックス溶液中のマトリックスの濃度をｎ（単位：ｍｇ／ｍＬ）とし、質量分析用試料調製におけるそれぞれの使用量をまとめて「Ｘ−Ｙ（ｎ）」の形式で表示する場合がある。すなわち、本発明においては、Ｘ−Ｙ（ｎ）におけるＸが１５〜５０、Ｙが１５〜５０、且つｎが０．０５〜１．０となるようにそれぞれの成分を用いて質量分析用試料を調製する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、より少量のペプチドを検出することが可能な質量分析法が可能になる。具体的には、従来法（すなわち、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸にマトリックスを、溶媒にアセトニトリルを含む水溶液を用いたサンプリング法を用いた質量分析法）と比較して１００〜１０００倍の高感度化（すなわち、検出限界が１／１０００〜１／１００）を達成した。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｘ−Ｙ（ｎ）組成のＸの値（マトリックス溶液中ＭｅＣＮ濃度）を変化させた場合のペプチド検出のＳＮ比を表す（実験例１）。
【図２】Ｘ−Ｙ（ｎ）組成のｎの値（マトリックス濃度）を変化させた場合のペプチド１ｆｍｏｌ検出のＳＮ比を表す（実験例２）。
【図３】Ｘ−Ｙ（ｎ）組成のｎの値（マトリックス濃度）を変化させた場合のペプチド１００ａｍｏｌ検出のＳＮ比を表す（実験例２）。
【図４】様々なＸ−Ｙ（ｎ）組成で調製されたマトリックス−ペプチド混合溶液又はその残渣の像である（実験例３）。
【図５】Ｘ−Ｙ（ｎ）組成が２０−２０（０．１）である本発明の方法によってさまざまな量のペプチドを検出した際のマススペクトル（Ａ）〜（Ｅ）及びＸ−Ｙ（ｎ）組成が０−５０（１０）である従来法によってさまざまな量のペプチドを検出した際のマススペクトル（ａ）〜（ｅ）である（実験例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明における質量分析対象はペプチドである。ペプチドは、単離及び／又は精製されたものであってもよいし、他の物質と共存した状態のものであってもよい。また、ペプチドは、タンパク質の消化によって得られたペプチド断片であってよく、この場合、ペプチド断片は、消化物中に存在する状態で本発明に供されてよい。
ペプチドの分子量は特に限定されないが、例えば５００〜１００００、好ましくは１０００〜３０００でありうる。
ペプチドの物性も特に限定されない。このため、ペプチドには親水性ペプチド及び疎水性ペプチドのいずれも含まれ、さらに、酸性ペプチド、中性ペプチド及び塩基性ペプチドのいずれも含まれる。
【００１１】
本発明においては、別々に調製されたペプチド溶液とマトリックス溶液とが用意される。
ペプチド溶液の溶媒は、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸を含む水溶液である。アセトニトリルの濃度は、１５〜５０体積％である。この範囲の下限値は、１６、１７、１８、１９又は２０体積％であってもよい。上記範囲の上限値は、４５、４０、３０、２５又は２０体積％であってもよい。上記範囲を下回ると、調製時におけるペプチドのロスが起きやすくなったり、ＳＮ比が小さくなったりする傾向にある。上記範囲を上回ると、ＳＮ比の低下傾向は上記範囲を下回るほど大きくはないものの、ターゲットプレート上に滴下された場合において、液滴とターゲットプレートの接触面積が大きくなる傾向がある。
トリフルオロ酢酸の濃度は特に限定されず、例えば０．０５〜２体積％、好ましくは０．０５〜１体積％である。
【００１２】
マトリックス溶液の溶媒も、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸を含む水溶液である。アセトニトリルの濃度は、１５〜５０体積％である。この範囲の下限値は、１６、１７、１８、１９又は２０体積％であってもよい。上記範囲の上限値は、４５、４０、３０、２５又は２０体積％であってもよい。上記範囲を下回ると、ＳＮ比が小さくなる傾向にある。上記範囲を上回ると、ＳＮ比の低下傾向は上記範囲を下回るほど大きくはないものの、ターゲットプレート上に滴下された際の液滴とターゲットプレートの接触面積が大きくなる傾向がある。
トリフルオロ酢酸の濃度は特に限定されず、例えば０．０５〜２体積％、好ましくは０．０５〜１体積％である。
マトリックスには、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いる。
マトリックスは、ターゲットプレート上でマトリックス溶液がペプチド溶液と混合されてペプチド−マトリックス混合溶液となった場合においても当該混合溶液を調製する環境下で混合液から析出しない濃度で用いられる。具体的には、マトリックスの濃度は、０．０５〜１．０ｍｇ／ｍＬである。この範囲の下限値は、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９又は０．１ｍｇ／ｍＬであってもよい。上記範囲の上限値は、０．４５、０．４０、０．３５、０．３０、０．２５又は０．２０ｍｇ／ｍＬであってもよい。上記範囲を下回ると、ＳＮ比が小さくなる傾向にある。上記範囲を上回ると、ターゲットプレート上のペプチド−マトリックス混合液滴から溶媒が除去される際に、質量分析用試料となる残渣が小さくまとまらず広がった状態で得やすくなり、感度が悪くなる傾向にある。
【００１３】
マトリックス溶液とペプチド溶液とにおける溶媒は同じ組成の物を用いることができる。あるいは、それぞれにおける溶媒中のアセトニトリル及び／又はトリフルオロ酢酸の濃度差が、例えば２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内、さらに好ましくは３％以内（体積基準）であってもよい。
【００１４】
ペプチド溶液とマトリックス溶液とを、質量分析用ターゲットプレート上の同じ位置、具体的には同じウェル内に滴下することで、ターゲットプレート上でペプチド−マトリックス混合溶液の液滴を調製する。ペプチド溶液とマトリックス溶液とを滴下する順番は任意であるため、マトリックス溶液の滴下が先であってもよいし、ペプチド溶液の滴下が先であってもよい。
【００１５】
ペプチド溶液とマトリックス溶液とは、同じ体積を滴下することができる。あるいは両溶液の体積の差が例えば２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内、さらに好ましくは３％以内（体積基準）であってもよい。
ペプチド−マトリックス混合溶液の液滴１個の体積は、例えば、１０ｎＬ〜２μＬ、好ましくは２０ｎＬ〜１μＬである。
【００１６】
ペプチド−マトリックス混合溶液の液滴から溶媒が除去されることによって、残渣として質量分析用試料が調製される。溶媒の除去は、当該液滴を調製した環境下で放置することにより自然に溶媒を揮発させればよいが、積極的に減圧又は加温をすることも許容する。
【００１７】
一個の残渣（すなわち質量分析用試料）に含まれるペプチドの量は、例えば、１ａｍｏｌ以上でありうる。この範囲の下限値は、５ａｍｏｌ又は１０ａｍｏｌであってもよい。上記範囲の上限値は、例えば１μｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、又は１００ａｍｏｌであってよい。
【００１８】
質量分析用ターゲットプレートとしては特に限定されず、一般的に入手可能な、ウェルが形成された金属製（例えばステンレス製）のプレートが用いられてよい。
分析対象−マトリックス混合液の液滴から溶媒を除去して質量分析試料としての残渣を得る過程で、液滴とターゲットプレートとの接触面積に比べて、残渣とターゲットプレートとの接触面積が小さくなると、感度が向上することが知られている（HST μFocus Technology, version 2010-08-24, Hudson Surface Technology）。質量分析用ターゲットプレートの中には、このようにターゲットプレート上の接触面積を縮小させることを促進するための表面処理（例えば撥水処理）がされているものもある。本発明においては、ターゲットプレート表面にそのような処理がされているか否かを問わない。本発明は、そのような処理が行われていないターゲットプレートを使用する場合における従来法に比べた感度向上効果が特に優れている。
【００１９】
質量分析においては、残渣にレーザーを照射してペプチドを検出する。本発明において用いられる質量分析装置は、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）イオン源と組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等が挙げられる。
【００２０】
なお、本発明においては、感度向上のために用いられていた手段、例えばマトリックス添加剤の併用、上述の表面処理されたターゲットプレートの使用及び／又はその他の手段を採用しなくても、十分な感度をもってペプチドを検出することができる。しかしながら、本発明は、このような感度向上のために用いられていた手段の採用を格別除外するものではない。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
以下において、ＣＨＣＡはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、ＭｅＣＮはアセトニトリル、及びＴＦＡはトリフルオロ酢酸である。
質量分析試料のサンプリングは、on-target mix法、つまり、別々に調製されたペプチド溶液とマトリックス溶液とをそれぞれＭＡＬＤＩターゲットプレート（島津製作所製AXIMAシリーズ用SUS304ターゲットプレート）の同じウェル内に滴下することによって、ターゲットプレート上でペプチド溶液とマトリックス溶液とを混合する方法（on-target mix法）を用いて行った。
ペプチド溶液−マトリックス混合溶液の液滴は、溶媒を揮発させて残渣を得て（dried-droplet法）、残渣にレーザーを照射して質量分析を行った。
質量分析測定は、AXIMA Performance（島津製作所製）を用い、リフレクトロン、ポジティブモードで行った。
【００２２】
［実験例１：溶媒組成の複数のバリエーションによる方法］
分析対象のペプチドをAdrenocorticotropic hormone fragment 18-39 (ＡＣＴＨ（１８−３９）: m/z 2464.20, monoisotopic)とした質量分析を行った。
Ｘ−Ｙ（ｎ）系において、Ｘ＝０且つＹ＝１０，２０，３０，４０，又は５０である場合と、Ｘ＝Ｙ＝１０，２０，３０，４０，又は５０である場合と（いずれの場合においてもｎ＝０．１）について、on-target mix法及びdried-droplet法により質量分析を行った。
【００２３】
より具体的には、例えばサンプリング系Ｘ−Ｙ（ｎ）が０−５０（０．１）となるようにサンプリングを行う場合、０．１％ＴＦＡ水溶液を溶媒としたペプチド溶液、及びＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液とを１：１の体積比で混合した溶液を溶媒とし、ＣＨＣＡが０．１ｍｇ／ｍＬ溶解したＣＨＣＡ溶液を調製し、それぞれの溶液を、ピペットを用いて０．５μＬずつ、ターゲットプレート上の同じウェル内に分注することによって混合し、溶媒を揮発させて残渣を得て、残渣を質量分析用試料として得た。
なお、１ウェル内の１個の残渣あたりのペプチドＡＣＴＨ（１８−３９）の量は１ｆｍｏｌであった。
【００２４】
残渣にレーザーを照射して質量分析測定を行い、ＳＮ比を調べた。その結果を図１に示す。図中、縦軸は感度の指標としてのＳＮ比を表し、横軸はＹ値を表す。図に示されるように、サンプリング時におけるペプチド溶液及びマトリックス溶液の両方の溶媒にＭｅＣＮが含まれ且つＸ＝Ｙ＝２０，３０，４０，及び５０である態様において、そうでない態様の場合に比べ１００〜２００倍のＳＮ比向上効果が確認された。
【００２５】
［実験例２：ＣＨＣＡ濃度の複数のバリエーションによる方法］
Ｘ−Ｙ（ｎ）系におけるＸ＝Ｙ＝５０，２０，又は１０である３種の態様において、それぞれ、ｎ値（ＣＨＣＡ濃度）を飽和濃度から段階的に希釈した。１ウェルあたりのペプチド（ＡＣＴＨ（１８−３９））量が１ｆｍｏｌとなるようにサンプリングを行った場合の質量分析によるＳＮ比の調査結果を図２に示す。同様に、１ウェルあたりのペプチド量が１００ａｍｏｌとなるようにサンプリングを行った場合の結果を図３に示す。なお、図２及び図３においては、参考データとして、Ｘ−Ｙ（ｎ）が０−５０（１０）である態様についての結果も併せて示す。
【００２６】
［実験例３：Ｘ−Ｙ（ｎ）組成がスポット面積に与える影響］
Ｘ−Ｙ（ｎ）が０−５０（１０）である場合（I）を基準として、２０−２０（１）である場合（II）、２０−２０（０．１）である場合（III）、５０−５０（０．１）である場合（IV）、及び０−４０（０．１）である場合（V）を比較した。（I）〜（V）それぞれの場合について、滴下直後のペプチド−マトリックス混合液の液滴の光学顕微鏡像（ａ）、液滴乾燥後の残渣の光学顕微鏡像（ｂ）、残渣に対するＭＳ測定により得られたペプチド（ＡＣＴＨ）信号のイメージング像（ｃ）、及び（ｃ）のヒートマップ（ｄ）を図４に示す。
【００２７】
一般的傾向として、乾燥前のペプチド−マトリックス混合液の液滴のスポット面積（すなわち液滴がターゲットプレートに接している面積）が同程度であれば、乾燥後の残渣のスポット面積（すなわち残渣がターゲットプレートに接している面積）が、乾燥前のペプチド−マトリックス混合液の液滴のスポット面積に比べて相対的に小さいほど、感度向上に有利である。図４の液滴乾燥後の残渣の光学顕微鏡像（ｂ）を（I）〜（V）の場合で比較すると、Ｘ−Ｙ（ｎ）のｎ値（ＣＨＣＡ濃度）が小さい方が、小さいスポット面積の残渣を得ることができた。例えば、Ｘ−Ｙ（ｎ）組成のＸ値及びＹ値が同一の場合、すなわち（II）と（III）とにおける（ｂ）の像を比べると、Ｘ−Ｙ（ｎ）のｎ値（ＣＨＣＡ濃度）がより小さい（III）の場合は、当該値がより大きい（II）の場合に比べ、残渣のスポット面積が約１／４であった。残渣のスポット面積の大きさは、（ｃ）及び（ｄ）の像におけるペプチド信号の検出面積にも対応した。（但し、（II）の場合に関しては、（ｃ）の像よりも（ｄ）の像の方がスポット面積の把握がしやすかった。）
【００２８】
さらに、残渣のスポット面積が液滴のものより同程度縮小した場合であっても感度の差が生じることが、（ｄ）の像によって明確に示された。具体的には、（III）の場合と（V）の場合とでは、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の像は大差ないが、（ｄ）の像のみが、ペプチドの信号強度の差を明確に示していた。
【００２９】
また、（ａ）の像を（I）の場合と（IV）の場合とで比較すると、ＭｅＣＮ濃度が高い方が、液滴のスポット面積が大きくなることが分かった。液滴のスポット面積が大きいこと、ウェルから混合液があふれる虞があることから好ましくない。このような操作性の観点から、使用するＭｅＣＮの濃度は低い方が好ましいことが分かった。
以上より、本実験例においては、（III）の場合、すなわちＸ−Ｙ（ｎ）が２０−２０（０．１）である場合が最適であると結論付けられた。
【００３０】
［実験例４：本発明の方法と従来法とのペプチド検出感度比較］
Ｘ−Ｙ（ｎ）組成が２０−２０（０．１）である本発明の方法と、０−５０（１０）である従来法とについて、ペプチドＡＣＴＨ（１８−３９）の検出限界を調べた。なお、用いたペプチド溶液及びＣＨＣＡ溶液のターゲットプレートへの搭載量はいずれも０．５μＬであった。得られたマススペクトルを図５に示す。図５中、（Ａ）〜（Ｅ）はＸ−Ｙ（ｎ）組成が２０−２０（０．１）である本発明の方法によるものであり、（ａ）〜（ｅ）はＸ−Ｙ（ｎ）組成が０−５０（１０）である従来法によるものである。検出判定基準をＳＮ比２とすると、（ａ）〜（ｅ）及び（Ａ）〜（Ｅ）の比較から明らかな通り、従来法による検出限界は１０ｆｍｏｌ／ウェルであったことに対し、本発明の方法では１０ａｍｏｌ／ウェルでも検出可能であった。これは、従来法に比べて本発明の方法が１０００倍の高感度化を達成したことを示す。
【００３１】
［実験例５：ペプチドの複数のバリエーションによる方法］
実験例４と同様に、Ｘ−Ｙ（ｎ）組成が２０−２０（０．１）である本発明の方法と、０−５０（１０）である従来法とについて、ＡＣＴＨ（１８−３９）以外のペプチドについても検出限界を調べた。
【００３２】
本実験例で検討されたペプチドは以下の通りである。
ＡＣＴＨ（１８−３９）：adrenocorticotropic hormone fragment (18-39); RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF（配列番号１）; m/z 2464.20 (monoisotopic)
ＡＣＴＨ（１−１７）：adrenocorticotropic hormone fragment (1-17); SYSMEHFRWGKPVGKKR（配列番号２）; m/z 2092.08 (monoisotopic)
ＧｌｕＦｉｂ：[Glu1]-Fibrinopeptide; EGVNDNEEGFFSAR（配列番号３）; m/z 1569.67 (monoisotopic)
Ｐ14Ｒ：PPPPPPPPPPPPPPR（配列番号４）; m/z 1532.86 (monoisotopic)
Ａｎｇ  Ｉ：Angiotensin I; DRVYIHPFHL（配列番号５）; m/z 1295.68 (monoisotopic)
【００３３】
それぞれのペプチドの検出限界を、それぞれのペプチドの物性パラメータ（BB Index (Bull and Breese Index)、HPLC Index及びPI (等電点)）と、従来法に比べた本発明の感度向上の倍率（Enhancement rate）とともに、表１にまとめた。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
表１の結果から、本発明の方法は従来法に比較して、１００〜１０００倍の高感度でペプチドを検出できることが分かった。
【００３６】
［実験例６：タンパク質消化物への適用例］
Ｘ−Ｙ（ｎ）組成が２０−２０（０．１）である本発明の方法と、０−５０（１０）である従来法とについて、タンパク質消化物の検出感度を調べた。
タンパク質消化物としては市販の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）消化物を用い、ZipTipC18等による脱塩処理その他の処理等を行うことなく、そのまま、段階希釈を行って質量分析を行い、マススペクトルを得た。なお、１ウェルあたりのタンパク質消化物の量が、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、１００ａｍｏｌ、及び１０ａｍｏｌ（ＢＳＡ量換算）の場合について検討を行った。
検出感度の指標としては、データベースサーチエンジン(Mascot search)の値及びmanual pickupにより算出したペプチドカバー率（coverage）の値を用いた。得られた結果を表２に示す。表２においては、上記値に加えて、Mascot searchでのscoreも併記した。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
いずれの消化物量の場合においても、Ｘ−Ｙ（ｎ）組成が２０−２０（０．１）である本発明の方法と、０−５０（１０）である従来法との検出感度の差が、ペプチドカバー率及びスコアの大きな差として表れた。それだけでなく、消化物量が少なくなるにつれ、本発明の方法と従来法とによるペプチドカバー率及びスコアの差は広がっていた。これらのことは、本発明の方法による大幅な感度向上効果を反映していると評価できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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