(57)【要約】【課題】  藻類の細胞中にトリアシルグリセロールを効率的に蓄積させる手段を提供する。【解決手段】  藻類に、リン欠乏応答プロモーターを付加したトリアシルグリセロール合成酵素遺伝子を導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類に、リン欠乏応答プロモーターを付加したトリアシルグリセロール合成酵素遺伝子を導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法。
【請求項２】
リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法。
【請求項３】
トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法。
【請求項４】
トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法。
【請求項５】
藻類が、クラミドモナス属、ナンノクロロプシス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、又はクロレラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法によって作製されたトリアシルグリセロール高生産性藻類。
【請求項７】
請求項６に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類をリン欠乏条件下で培養し、藻類細胞中にトリアシルグリセロールを蓄積させ、蓄積したトリアシルグリセロールを採取することを特徴とするトリアシルグリセロールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアシルグリセロール（以下、「TAG」という）高生産性藻類の作製方法、及びその方法によって作製された藻類、並びに前記藻類を用いたTAGの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii、以下「C. reinhardtii」という場合がある。）などの藻類にTAG合成酵素遺伝子を導入し、それにより細胞中にTAG蓄積させることは従来から行われてきた（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、C. reinhardtiiに、強発現プロモーターであるpsaDを付加したDGAT2遺伝子を導入し、これを窒素又は硫黄欠乏条件下で培養し、TAGを細胞中に蓄積させる方法が記載されている。特許文献１にも、非特許文献１と同様に、psaDを付加したDGAT2遺伝子を導入したC. reinhardtiiが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開WO 2011/156520
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】M. La Russa et al., J. Biotechnol. 2012 Apr 20.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したようにTAG合成酵素遺伝子を藻類に導入することにより、細胞中にTAGを蓄積させる方法は既に知られているが、それらの方法では十分な量のTAGを蓄積させることができなかった。例えば、非特許文献１には、窒素欠乏、硫黄欠乏のいずれの条件においても、DGAT2遺伝子導入株と野生株との間にTAGの蓄積量に統計的に意味のある差異はなかったと記載されている（Fig. 5など）。
【０００７】
本発明は、このような背景の下、藻類の細胞中にTAGを効率的に蓄積させる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、まず、従来の方法において十分な量のTAGが蓄積しないのはプロモーターに原因があるのではないかと考えた。即ち、TAGは栄養欠乏時に蓄積されるが、栄養欠乏時には、psaDのような強発現プロモーターは十分機能していないのではないかと考えた。そこで、強発現プロモーターに代えて、栄養欠乏応答プロモーターを使用するという発想を得た。
【０００９】
また、本発明者は、窒素欠乏条件とリン欠乏条件におけるTAGの蓄積量とTAGの脂肪酸組成を調べた。その結果、１）増殖の盛んな細胞を植え継いだ場合、窒素欠乏条件よりリン欠乏条件の方がTAGの蓄積量が多いこと、２）窒素欠乏条件では、葉緑体の膜脂質由来の脂肪酸を含むTAGが多く、新しく合成された脂肪酸は少ないこと、３）窒素欠乏、リン欠乏のいずれの条件でも細胞の増殖は阻害されるが、リン欠乏条件では、窒素欠乏条件ほど、細胞の増殖は阻害されないことなどがわかった。これらの知見から、TAG高生産性藻類としては、窒素欠乏応答性のものよりも、リン欠乏応答性のものの方が好ましいという発想を得た。
【００１０】
更に、本発明者は、リン欠乏応答プロモーターとしては、C. reinhardtiiのSQD2a遺伝子のプロモーターが好適であり、TAG合成酵素遺伝子としては、C. reinhardtiiのDGTT4遺伝子が好適であるという知見も得た。
【００１１】
本発明は、以上の知見及び発想に基づき完成されたものである。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（７）を提供する。
（１）藻類に、リン欠乏応答プロモーターを付加したTAG合成酵素遺伝子を導入することを特徴とするTAG高生産性藻類の作製方法。
（２）リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする（１）に記載のTAG高生産性藻類の作製方法。
（３）TAG合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のTAG高生産性藻類の作製方法。
（４）TAG合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のTAG高生産性藻類の作製方法。
（５）藻類が、クラミドモナス属、ナンノクロロプシス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、又はクロレラ属に属する藻類であることを特徴とする（１）乃至（４）のいずれかに記載のTAG高生産性藻類の作製方法。
（６）（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法によって作製されたTAG高生産性藻類。
（７）（６）に記載のTAG高生産性藻類をリン欠乏条件下で培養し、藻類細胞中にTAGを蓄積させ、蓄積したTAGを採取することを特徴とするTAGの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の高生産性藻類は、例えば、以下のような効果を有する。
（１）従来知られている藻類よりも、多くのTAGを蓄積する。
（２）TAG合成酵素遺伝子はリン欠乏応答プロモーターの制御下にあるので、通常培養時にこの遺伝子は発現しない。このため、TAG蓄積のタイミングをコントロールすることができる。
（３）通常条件に比べて増殖効率は低下するものの、リン欠乏条件下でもある程度の細胞増殖は可能なので、細胞を増殖させながら、TAGを蓄積させることも可能である。
（４）蓄積されるTAG中の脂肪酸は、既に合成されている脂質（葉緑体の脂質など）に由来するものではなく、新たに合成されたものなので、有用な特殊脂肪酸の生産にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】培養液1 L当たりのTAG[mg]量を示す図。
【図２】TAGの脂肪酸組成を示す図。
【図３】半定量PCRによる発現量を比較した図。
【図４】SQD2のN末端領域を比較した図。枠で囲んであるのがC. reinhardtiiのSQD2aであり、矢印が開始メチオニンである。
【図５】DGAT2のN末端領域を比較した図。枠で囲んであるのがC. reinhardtiiのDGTT1であり、矢印が開始メチオニンである。
【図６】TAG生産系強化のためのコンストラクトを示す図。
【図７】半定量PCRによる各遺伝子の発現量を比較した図（１）。
【図８】半定量PCRによる各遺伝子の発現量を比較した図（２）。
【図９】半定量PCRによる各遺伝子の発現量を比較した図（３）。
【図１０】HygR-pDGTT1-DGTT2〜4各変異株の培養液1 L当たりのTAG[mg] 量を示す図。
【図１１】HygR-pSQD2a-DGTT2〜4各変異株の培養液1 L当たりのTAG[mg] 量を示す図。
【図１２】培養液１L当たりのTAG[mg] 量を示す図。
【図１３】細胞当たりのTAG[pg] 量を示す図。
【図１４】TAG脂肪酸組成を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明のTAG高生産性藻類の作製方法は、藻類に、リン欠乏応答プロモーターを付加したTAG合成酵素遺伝子を導入することを特徴とするものである。
【００１７】
リン欠乏応答プロモーターとしては、例えば、SQD2遺伝子のプロモーターを使用することができる。SQD2はスルホキノボシルジアシルグリセロール（SQDG）の合成に関与する酵素であり、この酵素やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されており（例えば、 Yu B, Xu C, Benning C., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr;99(8):5732-7.）、また、この酵素のアミノ酸配列もデータベース上で公表されているので（例えば、C. reinhardtiiのSQD2(SQD2a)のアミノ酸配列はGenBank Accession No. XP_001689662に記載されている。）、当業者はSQD2遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。SQD2遺伝子のプロモーターとしては、C. reinhardtiiのSQD2a遺伝子のプロモーターを使用することができ、その配列は配列番号１に示すとおりである。
【００１８】
SQD2遺伝子のプロモーターの塩基配列としては、配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と高い同一性を示す塩基配列であって、プロモーター活性を維持している塩基配列などを例示できる。ここでいう「高い同一性」とは、通常９０％以上の同一性、好ましくは９５以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。なお、本明細書における「同一性」の値は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出することができる。例えば、NCBIの相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００１９】
また、SQD2遺伝子のプロモーターの塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、プロモーター活性を維持している塩基配列であってもよい。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１〜１０個であり、好ましくは、１〜５個であり、より好ましくは１〜３個であり、更に好ましくは１個である。また、「欠失、置換若しくは付加」には、人為的な変異のほか、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantやvariant）も含まれる。
【００２０】
TAG合成酵素遺伝子としては、例えば、DGAT2遺伝子を使用することができる。DGAT2はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの一種であり、この酵素やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されているので（例えば、Jay M. Shockey et al., The Plant Cell, Vol. 18 September 2006, 2294-2313、Miller et al., Plant Physiology, vol.154 2010, 1737-1752）、当業者はDGAT2遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。
【００２１】
DGAT2遺伝子としては、例えば、DGTT4遺伝子を使用することができる。DGTT4は、C. reinhardtiiに含まれるDGAT2ファミリーに属するタンパク質であり、このタンパク質やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されているので（例えば、Boyle et al. The Journal of biological chemistry, 287 (2012), pp. 15811-15825、 Chen JE and Smith AG, J Biotechnol. 2012 Jun 29）、当業者はDGTT4遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。DGTT4のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号２に示すとおりである。本発明におけるDGTT4遺伝子には、C. reinhardtiiのDGTT4遺伝子(Cre03.g205050)だけでなく、他の生物におけるこの遺伝子に相当する遺伝子（ホモログなど）も含まれる。このようなC. reinhardtii以外の生物におけるDGTT4遺伝子の具体例としては、Volvox carteri f. nagariensisのDGAT2 (JGI protein ID77655)遺伝子、Ostreococcus tauriのDGAT2 (JGI protein ID 21937)遺伝子などを挙げることができる。
【００２２】
DGTT4遺伝子の塩基配列としては、配列番号２に示す塩基配列を例示できる。また、DGTT4遺伝子の塩基配列は、配列番号２に示す塩基配列と高い同一性を示す塩基配列であって、活性（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性など）のあるタンパク質をコードしている塩基配列であってもよい。ここでいう「高い同一性」とは、通常９０％以上の同一性、好ましくは９５以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。
【００２３】
また、DGTT4遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性など）のあるタンパク質をコードするものであってもよい。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１〜１０個であり、好ましくは、１〜５個であり、より好ましくは１〜３個であり、更に好ましくは１個である。また、「欠失、置換若しくは付加」には、人為的な変異のほか、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantやvariant）も含まれる。
【００２４】
TAG合成酵素遺伝子等の導入対象とする藻類は特に限定されず、例えば、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属、シュードコリシスチス（Pseudochoricystis）属、フェオダクチラム（Phaeodactylum）属、オステレオコックス（Ostreococcus）属、シアニディオシゾン（Cyanidioschyzon）属、クレブソルミディウム（Klebsormidium）属、クロロキブス（Chlorokybus）属、スピロギラ（Spirogyra）属、カラ（Chara）属、コレオケーテ（Coleochaete）属、又はクロレラ（Chlorella）属に属する藻類などを用いることができる。クラミドモナス属の藻類としては、クラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）などを例示でき、ナンノクロロプシス属の藻類としては、ナンノクロロプシス・オクラタ (Nannochloropsis oculata)、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・ ガディタナ(Nannochloropsis gaditana)などを例示でき、シュードコリシスチス属の藻類としては、シュードコリシスチス・エリプソイディア（Pseudochoricystis ellipsoidea）などを例示でき、フェオダクチラム（Phaeodactylum）属の藻類としてはフェオダクチラム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）を例示でき、オステレオコックス属の藻類としてはオステレオコックス・タウリ（Ostreococcus tauri）を例示でき、シアニディオシゾン属の藻類としてはシアニディオシゾン・メロラ（Cyanidioschyzon merolae）を例示でき、クレブソルミディウム属の藻類としてはクレブソルミディウム・フラチダム（Klebsormidium flaccidum）を例示でき、カラ属の藻類としては、カラ・フラギリス（Chara fragilis）を例示でき、コレオケーテ属の藻類としては、コレオケーテ・スクタータ（Coleochaete scutata）を例示でき、クロレラ属の藻類としては、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）などを例示できる。
【００２５】
TAG合成酵素遺伝子にリン欠乏応答プロモーターを付加する操作やこれを藻類に導入する操作などは常法に従って行うことができる。
【００２６】
上述した方法によって作製されたTAG高生産性藻類の培養は、TAG蓄積時にリン欠乏条件下で培養すること以外、通常の藻類の培養と同様に行うことができる。例えば、藻類として、C. reinhardtiiを培養する場合、培地としては、TAP培地などを用いることができ、培養温度は2325℃程度とすることができ、培養時の光強度は1040μE/m2/secとすることができる。
【００２７】
TAG高生産性藻類にTAGを蓄積させる場合は、リン欠乏条件下で培養する。リン欠乏条件下での培養は、増殖時に用いていた培地からリン成分（例えば、K2HPO4、KH2PO4など）を除くか、あるいは33μM以下にした培地を用いることにより行えばよい。通常、813日程度の培養で細胞中に十分な量のTAGが蓄積される。
【００２８】
TAGを蓄積した細胞からTAGの採取は常法に従って行うことができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実験材料〕
C. reinhardtii の野生株２種（C9株 CC-408 mt-、及びCW15株 CC-400 cw15 mt+）を使用した。両株ともChlamydomonas Center (http://chlamycollection.org/)から入手することができる。
【００３０】
実験に使用した遺伝子の遺伝子名とprotein ID(JGI Chlamydomonas reinhardtii 4.0)は、以下の通りである。
【００３１】
【表１】
2014068638.tif 000002
【００３２】
〔実験操作〕
（１）培養条件
Na2EDTA ・ 2H2O 5 g, ZnSO4 ・ 7H2O 2.2 g, H3BO3 1.14 g, MnCl2 ・ 4H2O 506 mg, FeSO4 ・ 7H2O 499 mg, CoCl2 ・ 6H2O 161 mg, CuSO4・ 5H2O 157 mg, ( NH4 )6Mo7O24 ・ 4H2O 110 mg, KOH 1.6gをイオン交換水 1Lへ溶解し、 Hutner’s trace elementsとして4℃に保存しておいた。
【００３３】
NH4Cl 400 mg , CaCl2 ・ 2H2O 51 mg,  MgSO4 ・ 7H2O 100 mg, K2HPO4 119 mg, KH2PO4 60.3 mg, Hutner’s trace elements 10 mL, 酢酸 1 mL, Tris ( hydroxymethyl ) aminomethane 2.42 gをイオン交換水 998 mLへ溶解し、オートクレーブ滅菌してから液体TAP培地として使用した。プレート培地として使用する場合はINA Agar 12 gをオートクレーブ前に添加した。
【００３４】
TAP培地を通常培養の培地として使用し、2030 μE/m2/sec, 23℃で旋回培養した。リン欠乏培地ではTAP培地から K2HPO4, KH2PO4をのぞき、窒素欠乏培地では NH4Clをのぞいた。
（２）脂質抽出
培養液100〜450 mLを800×g, 5分間遠心して、培養細胞を沈殿させ、イオン交換水1 mLに懸濁した後、-80℃ に保存した。
【００３５】
凍結細胞を解凍し、クロロホルム 1 mL, メタノール 2 mLを添加し、10分おきに懸濁しながら１時間室温に置いた。800 g, 5分間スイングローターで遠心し、上清 4 mLを回収した。沈殿に1%(W/V)KCl 0.8 mL, クロロホルム 1 mL, メタノール 2 mLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上清 3.8 mLを先ほどの上清とあわせて回収した。上清 7.8 mLにクロロホルム 2 mL, 1%(W/V)KCl 1.2 mLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、下層の脂質抽出液を回収した。脂質抽出液を乾燥させ、60 mg/mLになるようにクロロホルム：メタノール＝2:1に溶解した後、-20℃ に保存した。
（３）脂質分析
脂質抽出液 50 μLを薄層シリカプレートにスポットし、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝160:40:4の展開液で45分間展開した。0.001%プリムリンを用いて、UV照射下でTAGを確認した。TAGがのっている部分のシリカを削り取り、1mM ペンタデカン酸 100 μL, 5% 塩酸/メタノールを500 μLを添加し、懸濁した後、85℃, 1時間静置した。ヘキサン  500 μLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上層のメチルエステル化した脂肪酸を回収した。下層に再びヘキサン500 μLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上層を回収した。メチルエステル化した脂肪酸を乾燥させた後、ヘキサン60 μLに溶解し、ガスクロマトグラフィサンプルとした。ガスクロマトグラフィはSHIMADZU GC-2014にHR-SS-10 (0.25 φ x 0.25 m) (SHINWA CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.)を取り付けて行った。
（４）RNA抽出
凍結細胞に３倍量以上のRNA抽出液と３倍量以上の酸性フェノールを加え、凍ったまま超音波破砕（超音波15秒、氷冷３０秒）を４回行った。20000×g,５分間, 4℃で遠心し、上清400〜500 μLを回収した。上清に酸性フェノール 300 μL, クロロホルム 300 μLを添加し、懸濁した後、140k rpm,５分間, 4℃で遠心し、上清400〜500 μLを回収し、この操作を５回繰り返した。上清の1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、1倍量のイソプロパノールを添加し、懸濁した後、20000×g,５分間, 4℃で遠心した。沈殿物に70% エタノール  1 mL加え、20000×g,５分間, 4℃で遠心し、この操作を２回繰り返した後、沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿を滅菌イオン交換水 400 μLに溶解した後、1 μg/μL以上の濃度の核酸であることを確認した。核酸 40 μLに10×DNase I Buffer 5 μL, DNase I 0.5 μL, 滅菌イオン交換水 4.5 μLを加え、37℃, 30分間静置した。酸性フェノール 50 μL, クロロホルム 50 μLを添加し、懸濁した後、20000×g,10分間, 4℃で遠心し、上清 35 μLを回収した。上清の1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、1倍量のイソプロパノールを添加し、懸濁した後、20000×g,10分間, 4℃で遠心した。沈殿物に70% エタノール  150 μL加え、20000×g,10分間, 4℃で遠心し、この操作を２回繰り返した後、沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿を滅菌イオン交換水 50 μLに溶解した後、1 μg/μL以上の濃度のRNAであることを確認した。
（５）cDNAの調製
RNA 1 μgに10 mM dNTP 0.5 μL, 100 mM oligo dT18 0.25 μL, RNase free water 3.65 μLを添加し、65℃, 5分間処理した後、氷上に静置した。さらに5xcDNA Synthesis Buffer 2 μL, 0.1 M DTT 0.5 μL, RNase OUT 0.5μL, Thermo Script RT 0.5 μL, RNase free water 0.5 μLを添加し、50℃, ４０分間, 60℃, ２０分間, 85℃, ５分間 処理した。得られたcDNAは-20℃ に保管した。
（６）半定量PCR法
LA PCR x10 buffer 1.5 μL, 2.5 mM dNTP 1.2 μL, MgCl2 1.05 μL, LA Taq 0.075 μL, 5 M ベタイン 1.5 μL, DMSO 0.45 μL, 10 μM primer_F 1.5 μL, 10 μM primer_R 1.5 μL, cDNA 0.2 μL, 滅菌イオン交換水 6.1 μLを懸濁し、PCR反応に用いた。PCR反応条件は以下の2stepで行った。
step1：94℃ ３分間
step2：94℃ ３０秒間, 54℃ ３０秒間, 72℃ １分間を１８３４サイクル
プライマーは以下のものを使用した。
DGAT1_F   TGGTGGAATGCGGCTACGGT（配列番号４）
DGAT1_R   TCTGTTGAGCTTCTTGCGCA（配列番号５）
DGTT1_F   CTATAAGCCAAGCATGGGTG（配列番号６）
DGTT1_R   GCGCCTCTGTGGCAAATGCC（配列番号７）
DGTT2_F   TGGCTATGTTGACGCTCTTC（配列番号８）
DGTT2_R   TCTCTGCGATGCCTCCCACG（配列番号９）
DGTT3_F   AGACGGAAGCAGATGGCAGG（配列番号１０）
DGTT3_R   GACAAAGATGTAGCGCTTGT（配列番号１１）
DGTT4_F   TTCAAGGAGTGCTGTATGAG（配列番号１２）
DGTT4_R   GTCAGCTGCAGCGGCGTGAA（配列番号１３）
DGTT5_F   AGCCCGCACGGCGCCTTCCC（配列番号１４）
DGTT5_R   TGACGTGTACATCTCCGCAATGC（配列番号１５）
UGP3_F   CATGAACGTGGTGCAGGAG（配列番号１６）
UGP3_R   GGTTGGAGACCAGGAAGGTG（配列番号１７）
SQD2a_F   GGTGCAGGTGTGGAAGAAGG（配列番号１８）
SQD2a_R   CGTGATGATGTCGGGGATG（配列番号１９）
（７）プロモーター配列の獲得
C9株のゲノムを鋳型にPCR反応を行い、プロモーター領域pSQD2a, pDGTT1を得た。得られた約１kbの配列をpMD20-T vector(TAKARA)またはpZErO-2（Invitrogen）へ導入した。
【００３６】
2x GC Buffer II 5 μL, 2.5 mM dNTP 1.6 μL, C9株のゲノム 1 μL, LA Taq 0.05 μL, 10 μM primer_F 1 μL, 10 μM primer_R 1 μL, 滅菌イオン交換水 1.35 μLを懸濁し、PCR反応に用いた。
【００３７】
PCR反応条件は以下の3stepで行った。
step1 94℃ ２分間
step2 94℃ ４５秒間, 55℃ ３０秒間, 71℃ １分３０秒間を４０サイクル
step3 71℃ ５分間
【００３８】
プライマーは以下のものを使用した。
DGTT1_F2   AGCAGCCACACGTAGTTGTC（配列番号２０）
DGTT1_R2   CACGAGCTCTAGTTGGTTCA（配列番号２１）
SQD2a_F2   CGGGATAGTTGTAGCTGTAG（配列番号２２）
SQD2a_R2   CGAAGAGTTGAGGTGTGTGTTC（配列番号２３）
（８）DGTT2〜4遺伝子の配列の獲得
リン欠乏時のcDNAを鋳型にPCR反応を行い、 DGTT2〜4遺伝子の全長を得た。得られた約１kbの配列をpMD20-T vector(TAKARA)またはpZErO-2（Invitrogen）へ導入した。PCR反応液の組成は半定量PCR法と同様のものとした。
【００３９】
PCR反応条件は以下の3stepで行った。
step1 94℃ ３分間
step2 94℃ ３０秒間, 54℃ ３０秒間, 72℃ １分間を４１サイクル
step3 72℃ ３分間
プライマーは以下のものを使用した。
DGTT2_F2   ATGGCGATTGATAAAGCACC（配列番号２４）
DGTT2_R2   TCAGCTGATGACCAGCGGTC（配列番号２５）
DGTT3_F2   ATGGCAGGTGGAAAGTCAAACG（配列番号２６）
DGTT3_R2   CTACTCGATGGACAGCGGGC（配列番号２７）
DGTT4_F2   ATGCCGCTCGCAAAGCTGCG（配列番号２８）
DGTT4_R2   CTACATTATGACCAGCTCCTC（配列番号２９）
（９）C. reinhardtii形質転換法
TAP培地で1〜3×106 cells/mlになるまで培養したCW15株 50mLに 10%(v/v) Tween 20を50 μL添加して撹拌した。4℃, 800×g, 5分間スイングローターで遠心し、細胞を沈殿させた。上清をのぞいた後、終濃度1×108 cells/mlになるように、氷冷した40mM Sucrose/TAPに懸濁した。濃縮細胞 50 μLに0.1 mg/ml コンストラクトDNA 2 μL, キャリアssDNA（Salmon Sperm）1 μLを添加した。細胞懸濁液をエレクトロポレーション用キュベット（1 mm幅）に入れ、2000V/cm, 時定数 5 msecで１回電圧をかけた。40mM Sucrose/TAP 1 mLをキュベットへ添加し、細胞を懸濁した後、1.5 mLチューブへ移した。10〜20 μE/m2/sec, 23℃で静置した。24時間後、800× g, 5分間遠心し、細胞を沈殿させた。上清をのぞいた後、20%(w/v) コーンスターチ/40mM Sucrose/TAP 0.5 mLを添加し、10 μg/μL ハイグロマイシンを添加したTAPプレートに蒔いた。20〜30 μE/m2/sec, 23℃で静置し、生えて来たコロニーを形質転換株として新しいハイグロマイシン入りTAPプレートへ植えついだ。
【００４０】
〔実験結果〕
（１）TAG/膜脂質合成系の制御検討 
モデル藻類C. reinhardtiiでの脂質蓄積に関する知見として、窒素欠乏条件下で脂質が蓄積すること、脂質の中では貯蔵脂質であるTAGが蓄積すること、飽和脂肪酸の割合が増えることが報告されている（BMC Biotechnol. 2011; 11: 7.）。
【００４１】
一方で本発明者らがこれまで高等植物で着目してきたリン欠乏条件下での脂質蓄積については詳細な知見は無い。そこで、窒素欠乏とリン欠乏条件下でのTAG蓄積量の比較を行った。
（２）栄養欠乏条件下でのTAG蓄積量の比較
増殖が停止しているstationary phase、増殖が盛んなlogarithmic phase、窒素欠乏条件、リン欠乏条件の比較を行った。
【００４２】
logarithmic phase で窒素欠乏条件へ植え継いだ場合、油脂であるTAGの蓄積量が少なく、TAGを得るためには改良が必要であることがわかった。リン欠乏条件へ植え継いだ場合、増殖が窒素欠乏条件下ほど阻害されないこと、C16:4, C18:3などの多価不飽和脂肪酸の割合が減り、相対的に新規合成脂肪酸の割合は増えること、TAG蓄積量が多いことから、TAGの脂肪酸組成を膜脂質に含まれる脂肪酸から大きく改変するのに向いていることを見つけた（図１、図２）。
（３）脂質合成鍵遺伝子の探索
Diacylglycerol acyltransferase (DGAT)はTAG生合成の最終ステップを触媒する酵素である。DGATは動物、植物に広く存在する酵素であり、DGAT1, DGAT2の２種類が報告されている。
【００４３】
C. reinhardtiiでのDGATについて、公開データベース(JGI  Chlamydomonas reinhardtii v4.0)を探索した結果、DGAT1が１種類、DGAT2が５種類（DGTT1-5）存在することがわかった。これらのうちDGTT1についてはN欠乏条件下でmRNA量の変化がみられること、DGTT2およびDGTT3については窒素欠乏条件下でmRNA量の変化が少ないことが報告されている（Plant physiol. 2010, Vol.154, 1737-1752）。
【００４４】
C. reinhardtiiのC9株を１×１０５cells/mLになるようにTAP培地250mLへ植え継ぎ、 logarithmic phase(５〜６×１０６cells/mL)で細胞を遠心回収し、リン欠乏培地または窒素欠乏培地で洗浄した後、１×１０５cells/mLになるようにリン欠乏培地または窒素欠乏培地250mLへ植え継いだ。新規脂肪酸由来のTAGが蓄積され始める条件である植え継ぎ後５日目に培養液 １ mLから細胞を遠心機で回収し、-80℃に保管した後、RNAを抽出した。RNAから逆転写反応によりcDNAを得た。cDNAを鋳型にPCRで半定量的に各遺伝子発現を調べた。PCRの結果、DGAT1、DGTT1-4が発現していることが確認できた。DGTT5については発現が確認できなかった（図３）。
【００４５】
C. reinhardtiiではDGAT1,DGAT2が発現していることが確認できたので、DGAT1またはDGAT2の上流に栄養欠乏条件になったときのみ強発現を誘導するプロモーターをつけ、小胞体膜で働くDGATを増やし、小胞体でのTAG蓄積を促進する方法を開発することにした。
（４）制御プロモーター探索
脂質合成鍵遺伝子の探索の時と同様にcDNAを作製し、各遺伝子発現量を比較した（図３）。比較した遺伝子はTAG生合成に関わる因子であるDGAT1およびDGAT2、本発明者らが以前に発見したSQDG生合成に関わる因子であるUGP3(Okazaki et al Plant Cell 2009)およびSQD2である。
【００４６】
図３よりSQD2a,UGP3,DGTT1は栄養欠乏条件で発現上昇が確認された。このうち、SQD2aはリン欠乏条件で特異的に発現上昇が見られ、DGTT1は窒素欠乏、リン欠乏の両方の条件で発現上昇が見られた。DGAT1, DGTT2-4では顕著な発現上昇は確認されなかった。そこでSQD2aとDGTT1のプロモーター領域を制御プロモーターの候補とした。
（５）候補プロモーター（pSQD2a、pDGTT1）による鍵遺伝子制御
SQD2a、DGTT1は公開データベースでは開始コドンが決定できなかったので、cDNAをDNAシークエンスし、開始コドンを決定した。
【００４７】
開始コドンを決定したので、そこから約１kb上流までをプロモーター領域pSQD2a、pDGTT1とした。
【００４８】
C. reinhardtiiのゲノムを鋳型として、プロモーター領域pSQD2a, pDGTT1をPCRにより増幅した。またC. reinhardtiiのリン欠乏時のcDNAからDGTT2〜4遺伝子の配列を得た。pSQD2a, pDGTT1をDGTT2〜4遺伝子上流に接続し、pSQD2a-DGTT2〜4, pDGTT1-DGTT2〜4とした。変異株選抜用にハイグロマイシン遺伝子耐性遺伝子（HygR）を上流に接続し、HygR-pSQD2a-DGTT2〜4, HygR-pDGTT1-DGTT2〜4を得た（図６）。
（６）プロモーター（pSQD2a、pDGTT1）とDGAT遺伝子によるTAG増産
これらのコンストラクトをC. reinhardtiiへ形質転換し、ハイグロマイシンで選抜後、各変異株を２０３０株得た。変異株をリン欠乏条件におき半定量PCRにより各遺伝子の発現上昇が確認された株をさらに選抜した(図７、図８、図９)。
【００４９】
各変異株から３株（図７、図８、図９で枠で囲んだ株）について、TAP培地, リン欠乏培地 各250 mLで培養し、TAG蓄積量を調べた(図１０、図１１)。
【００５０】
図１０、図１１より、HygR-pSQD2a-DGTT4#18,#19においてのみリン欠乏条件下でコントロール株よりも多くのTAG蓄積がみられた。#15はコントロール株と同程度のTAG蓄積しかみられなかったので、図７９で#18,#19と同等の遺伝子発現がみられていた#21を候補株として、再度TAG蓄積を確認した（図１２、図１３）。
【００５１】
図１２、図１３よりリン欠乏条件下でHygR-pSQD2a-DGTT4株はコントロール株に比べて２〜３倍のTAGが蓄積していることを発見した。これはこれまでに報告のある藻類での強発現プロモーターを付加した油脂合成遺伝子導入による手法の４５倍の蓄積であった。本手法は、植物よりもバイオマスの大きい、藻類におけるバイオディーゼル生産や有用脂質生産を実現するために、極めて有用性の高い手法である。
【００５２】
さらに、リン欠乏条件下でHygR-pSQD2a-DGTT4株とコントロール株のTAGの脂肪酸組成は図１４に示したように、図２と同様にC16:4, C18:3などの多価不飽和脂肪酸の割合が減り、相対的に新規合成脂肪酸の割合は増えていた。このことからTAGの脂肪酸組成を膜脂質に含まれる脂肪酸から大きく改変するのに向いていると考えられる。
【００５３】
今回の発明で使用したリン欠乏応答プロモーターpSQD2は通常培養時には発現を誘導しないので、油脂蓄積のタイミングをコントロールすることができる。リン欠乏条件下で細胞増殖させながら、油脂蓄積を行わせることができるので、新規脂肪酸合成に適している。これは有用な特殊脂肪酸を蓄積させるにも有効な方法である。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、TAG生産に関連する各種産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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