(57)【要約】【課題】抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、歯組織の再生を図る新規かつ独創的な歯組織再生方法を提供する。【解決手段】対象となる歯１００に対して、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に、歯髄幹細胞を含む細胞２２０と、歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質２１０とを有する根管充填材２００を注入する。歯髄幹細胞を含む細胞は、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、若しくは、ＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む。歯髄ＳＰ細胞は、例えば、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性である。深いう蝕で歯髄炎を生じている場合でも、適切に歯髄再生及び歯髄機能の回復が可能である。【選択図】図１Ｆ
2014168714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯髄幹細胞を含む細胞と、前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有して、抜髄後の根管内に充填される根管充填材であって、
前記歯髄幹細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞であり、
前記細胞外基質が、コラーゲン、又は、ゼラチンであり、
かつ、Ｇ-ＣＳＦが前記細胞外基質の少なくとも歯冠側に付着させてあることを特徴とする根管充填材。
【請求項２】
前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質における、前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１記載の根管充填材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、根管充填材に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕が深くて歯髄にまで達している場合、う触の治療として一般に抜髄が行われてきた。しかし歯髄は、修復象牙質形成による外来刺激の遮断というばかりでなく、知覚によりう蝕の進行を抑え、咬合感覚を与え硬いものを噛んで歯が破折することを防止する役割がある。また、歯髄は、代謝により象牙質蛋白質及び水分を維持し、更に象牙質の機械的強度及び性質を保つ。歯髄は、免疫機能による感染防御機構を有することも知られている。
【０００３】
歯内治療では根管形態の複雑性から、ＮｉＴｉ合金製ロータリーファイルが普及してきた。しかし、完璧な抜髄、根管拡大、及び根管充填は不可能に近い。そのため、抜髄は後に根尖性歯周炎を導き、結果として歯を失う可能性も多いに秘めている。
【０００４】
歯の寿命を高めるには歯髄をできるだけ保存する方法を開発する必要がある。そのためには、歯再生の３要素と考えられる１）形態形成因子（ＢＭＰｓ（骨形成因子）等）２）歯髄組織幹細胞、３）微小環境（足場、細胞外基質等）を駆使して、象牙質及び歯髄を再生させる新しいう蝕治療法の技術開発が進められている。
【０００５】
まず、非特許文献１に記載されているように、生体外細胞導入法又は遺伝子導入法として、歯髄幹細胞に生体外でＢＭＰ蛋白質の投与又はＢＭＰ遺伝子を導入し、三次元培養を行って分化した象牙芽細胞を露髄面上に移植し、早期且つ大量の象牙質の再生手法がある。
【０００６】
また、非特許文献２に記載されているように、上述の手法を実際臨床応用するため、免疫拒絶反応を起こさないヒト歯髄幹細胞を大量に創生する技術開発が進められており、幹細胞を多く含むｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞を分取し、その幹細胞の分子生物学的特徴の解析が行われている。
【０００７】
歯髄組織が偶発的露髄又は可逆性歯髄炎程度であれば、上述の象牙質の再生手法は有効であると考えられる。しかし、不可逆性歯髄炎で疼痛がある場合は、抜髄せざるを得ない。
【０００８】
これまで、ヒト歯根未完成歯の自家移植に関しては、移植後高頻度に歯髄の治癒が生じることが知られている。そして、石灰化組織による歯髄腔の閉鎖、歯根の成長及び根尖孔の閉鎖を伴い、歯根破折を防止できる。歯髄は壊死していても感染がなければ残った細胞外基質は血管及び細胞の侵入のためのｓｃａｆｆｏｌｄとして働く可能性がある。
【０００９】
また、移植時、根尖部付近の細胞は生存しており、移植後に歯冠部方向に遊走、増殖する可能性がある。
【００１０】
一方、イヌの歯根未完成歯では、抜髄をした後に移植しても同様に歯髄が再生される。根尖部に病変を伴う歯根未完成歯でも、徹底的な根管洗浄・消毒を行い、３種抗菌剤の貼薬後、セメント・象牙境まで血餅を満たしＭｉｎｅｒａｌ ｔｒｉｏｘｉｄｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅ（ＭＴＡ）及びＣａｖｉｔで窩洞を完全封鎖することにより、歯髄が再生されるとの報告がある。
【００１１】
また、非特許文献３に記載されているように、イヌの健全歯根完成歯においても、抜歯後抜髄し、根尖部を切断した後、移植した場合には、血餅により歯髄再生がみられるといわれている。
【００１２】
しかしながら、根管内歯髄再生の報告は、根未完成歯についての報告が大半である。深いう蝕で歯髄炎を生じている場合又は根尖性歯周炎の歯根完成歯の場合における歯組織再生方法及び歯組織再生のための根管充填材の開発はなされていない。
【００１３】
特許文献１及び特許文献２には、人工物で形成されている根管充填材が記載されている。しかし、これらの根管充填材は、根管充填後に、根管充填材が剥離又は断裂する可能性がある。更に、これらの根管充填材は、数年後には根尖性歯周炎が発生する可能性もある。
【特許文献１】特開２００６−００１９１０号公報
【特許文献２】特開２００２−０２９９１１号公報
【非特許文献１】Ｎａｋａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｒｅｄｄｉ、２００３；Ｎａｋａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ａｋａｍｉｎｅ、２００６（ＰＭＩＤ １２９４９５６８ ｄｏｉ １０．１０３８／ｎｂｔ８６４；ＰＭＩＤ：１６１８６７４８）
【非特許文献２】Ｉｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６（ＰＭＩＤ：１６８７３７６５ ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，２００６−０１６１）
【非特許文献３】Ｌａｕｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，２００１（ＰＭＩＤ：１１２９８３０８ ｄｏｉ：１０．１０６７／ｍｏｄ．２００１．１１３２５９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、歯根完成歯に対して抜髄後の根管内にｓｃａｆｆｏｌｄを充填して歯組織再生を図る新規で独創的で適切な根管充填材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明にかかる根管充填材は、歯髄幹細胞を含む細胞と、前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有して、抜髄後の根管内に充填される根管充填材であって、前記歯髄幹細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞であり、前記細胞外基質が、コラーゲン、又は、ゼラチンであり、かつ、Ｇ-ＣＳＦが前記細胞外基質の少なくとも歯冠側に付着させてあることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る根管充填材は、深いう蝕で歯髄炎を生じている場合又は根尖性歯周炎の歯根完成歯の場合であっても、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後に根管内に充填することにより歯組織再生を図ることができた。本発明に係る根管充填材は、血管及び神経の再生を促進させ、歯髄細胞の増殖による歯髄再生及び歯髄機能の回復を促進させた。さらにＢＭＰｓ等の形態形成因子又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布すると、歯髄細胞の象牙芽細胞への分化が促進され、象牙質による歯冠部封鎖が行われた。さらに、根尖孔はセメント質添加により閉鎖された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、細胞外基質の模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細胞外基質に歯髄幹細胞を含む細胞を付着させて形成される根管充填材を説明する模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、対象となる歯髄炎の説明図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、抜髄後の根管拡大処置を行ったところを説明する模式図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、根管充填材を注入するところを説明する模式図である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、スポンゼル（ゼラチン）及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
【図１Ｇ】図１Ｇは、抜歯窩に再移植するところを説明する模式図である。
【図１Ｈ】図１Ｈは、歯髄再生及び血管再生を示す模式図である。
【図１Ｉ】図１Ｉは、形態形成因子及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
【図１Ｊ】図１Ｊは、象牙質再生を示す模式図である。
【図１Ｋ】図１Ｋは、細菌が根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる根尖性歯周炎の模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、歯髄幹細胞を含む細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に遊走因子を付着させている根管充填材を説明する模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、根管充填材を注入するところを説明する模式図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、抜歯窩に再移植するところを説明する模式図である。
【図３】図３は、ＳＰ細胞のフローサイトメトリー分析を説明する図である。
【図４】図４は、ＣＤ３１及びＣＤ１４６抗体でラベルしてＳＰ細胞を分画する図である。
【図５Ａ】図５Ａは、０．２％ＢＳＡのコントロールにおいて、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の増殖活性を説明する図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦにおいて、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の増殖活性を説明する図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、５０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦにおいて、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の増殖活性を説明する図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦにおいて、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の増殖活性を説明する図である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＤＦ１において、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の増殖活性を説明する図である。
【図５Ｆ】図５Ｆは、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１において、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の増殖活性を説明する図である。
【図６】図６は、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の遊走能を、ＶＥＧＦ濃度を変化させた場合に示す図である。
【図７】図７は、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の遊走能を、遊走因子を変化させた場合に示す図である。
【図８】図８は、ＨＵＶＥＣ（血管内皮細胞）に対する歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の増殖活性を説明する図である。
【図９】図９は、１００ｎＭ ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅによりアポトーシスを生じさせたＨＵＶＥＣ（血管内皮細胞）を用いたフローサイトメトリーによる壊死細胞及びアポトーシス細胞の割合の測定を説明する図である。
【図１０】図１０は、自家歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞をイヌ生活歯髄切断面上に移植して１４日後を説明する図である。
【図１１】図１１は、自家歯髄ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞をイヌ生活歯髄切断面上に移植して１４日後を説明する図である。
【図１２】図１２は、細胞を含まない、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合である混合コラーゲンをイヌ生活歯髄切断面上に移植して１４日後を説明する図である。
【図１３】図１３は、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植して１４日後を説明する拡大図である。
【図１４】図１４は、ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植して１４日後を説明する拡大図である。
【図１５】図１５は、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞が再生歯髄の底部に見られるところを説明する図である。
【図１６】図１６は、ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞が窩洞全体に分散して存在するところを説明する図である。
【図１７】図１７は、血管内皮細胞をＣＤ１４６抗体で染色したものであり、ＤｉＩラベルされたＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞が新生血管に隣接して存在することを説明する図である。
【図１８】図１８は、歯冠部上部のリン酸セメントに接する部分で象牙芽細胞の分化及び細管象牙質形成が見られるところを説明する図である。
【図１９】図１９は、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ抗体で染色したものであり、再生された歯髄中に、切断された歯根部歯髄の神経から伸びる神経軸索が示されているところを説明する図である。
【図２０】図２０は、残存した歯髄中に、切断され修復された歯根部歯髄の神経が示されているところを説明する図である。
【図２１】図２１は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＳＤＦ１及び自家ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を吸着させて、抜髄後の根管内に注入した１４日後を説明する図であり、根管内のほぼ全部が歯髄組織で再生されている。
【図２２】図２２は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＳＤＦ１を吸着させて、抜髄後の根管内に注入した１４日後を説明する図であり、根管内の根尖側のごく一部のみ歯髄組織で再生されている。
【図２３】図２３は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞のみを吸着させて抜髄後の根管内に注入した１４日後を説明する図であり、ごくわずかしか歯髄組織は再生されていない。
【図２４】図２４は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンのみを注入した１４日後を説明する図であり、ほとんど歯髄組織は再生されていない。
【図２５】図２５は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＳＤＦ１及びＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を注入した１４日後の根尖側の毛細血管の高倍像を説明する図である。
【図２６】図２６は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＳＤＦ１及びＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を注入した１４日後の歯冠側の毛細血管の高倍像を説明する図である。
【図２７】図２７は、ＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎによる血管内皮細胞染色を説明する図である。
【図２８】図２８は、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ免疫染色よる神経軸索を説明する図である。
【図２９】図２９は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＳＤＦ１及びＣＤ１０５＋細胞を注入した１４日後を説明する図であり、根管内のほぼ全部が歯髄組織で再生されている。
【図３０】図３０は、３代目ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞のフローサイトメトリーを説明する図である。
【図３１】図３１は、３代目ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の血管誘導を説明する図である。
【図３２】図３２は、３代目ヒト歯髄ＣＤ１０５＋細胞の血管誘導を説明する図である。
【図３３】図３３は、３代目ヒト歯髄ＣＤ１５０＋細胞の血管誘導を説明する図である。
【図３４】図３４は、３代目ヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞の場合を説明する図であり、血管はほとんど誘導されない。
【図３５】図３５は、ヒト歯髄ＣＤ２４＋細胞の神経誘導を説明する図である。
【図３６】図３６は、３代目ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞移植のレーザードップラー解析を説明する図であり、血流の回復がみられる。
【図３７】図３７は、３代目ヒト歯髄ＣＤ１０５＋細胞移植の場合のレーザードップラー解析を説明する図であり、血流の回復がみられる。
【図３８】図３８は、ＰＢＳ注入コントロールの場合のレーザードップラー解析を説明する図であり、血流の回復がみられない。
【図３９】図３９は、ヒト歯髄ｔｏｔａｌ歯髄細胞移植のレーザードップラー解析を説明する図であり、血流の回復はあまりみられない。
【図４０】図４０は、ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞、ヒト歯髄ＣＤ１０５細胞、ヒト歯髄ｔｏｔａｌ歯髄細胞移植のレーザードップラー測定結果の統計学的解析を説明する図である。
【図４１】図４１は、ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞移植１４日後の、ＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎにて血管内皮細胞を染色した結果を説明する図である。
【図４２】図４２は、ＰＢＳ注入コントロール１４日後の、ＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎにて血管内皮細胞を染色した結果を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明する。
【００１９】
（実施形態１）
本実施形態に係る発明は、根管内の歯組織を再生する歯組織再生方法において、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に、歯髄幹細胞を含む細胞と、歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有する根管充填材を注入することを特徴とする。再生する歯組織は、例えば根管内の血管、神経、歯髄、象牙質等である。本実施形態に係る発明は、抜歯後又は感染根管の根管拡大清掃後、抜髄及び消毒し、根尖部を切断して開口して根管充填材を移植する。本実施形態に係る発明では、無菌化され空洞となった根管内に、人工の充填材又は血餅を移植するのではなく、歯髄組織を模倣した、生体親和性に優れ、為害性及び免疫原性のないｓｃａｆｆｏｌｄに歯髄幹細胞を含有する細胞を付着させて充填する。根管充填材は、根尖部の１／４〜２／５に充填するのが望ましく、より望ましくは根尖部の１／３に充填する。
【００２０】
以下、図１Ａ〜図１Ｋを参照しながら、実施形態１に係る歯組織再生方法を説明する。図１Ａに示すように、細胞外基質２１０を用意する。細胞外基質２１０とは、いわゆる（ｓｃａｆｆｏｌｄ）スキャフォールドであり、細胞を定着させる足場である。細胞外基質２１０の形状は、根管に充填されやすいように、円柱形状又は略円錐形状が望ましい。なお細胞外基質２１０がゲル状の場合は形状は不定形である。
【００２１】
細胞外基質２１０は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（乳酸グリコール酸共重合体）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＤＬＬＡ（ポリ−ＤＬ−乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。なお、プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖（グリコサミノグリカン）が共有結合した複合糖質の一種である。また、細胞外基質２１０は、熱可塑性高分子等の高分子体で作製された数平均直径が１ｎｍ〜１０００ｎｍのナノファイバーからなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。そのような三次元構造体の空隙率は８０％〜９９．９９％とすることが好ましい。
【００２２】
細胞外基質２１０として使用されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合である混合コラーゲンを用いることが好ましい。Ｉ型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、線維性コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、コラーゲン線維とは別の、細網線維と呼ばれる細い網目状の構造を形成し、細胞等の足場を作る。
【００２３】
上述の混合コラーゲンにおける、ＩＩＩ型コラーゲンの割合は３０重量％以上５０重量％以下とすることが好ましい。ＩＩＩ型コラーゲンの割合が５０重量％よりも多くなると、混合コラーゲンが固化できないおそれがあるからである。一方、ＩＩＩ型コラーゲンの割合が３０重量％よりも少なくなると、Ｉ型コラーゲンの割合が多くなり、後述するような血管新生が起こるのではなく、象牙質が再生される可能性があるからである。特に好ましくはＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合割合は１：１である。
【００２４】
図１Ｂに示すように、根管充填材２００は、細胞外基質２１０に歯髄幹細胞を含む細胞２２０を付着させて形成される。歯髄幹細胞を含む細胞２２０は、根管充填材２００の根管の根尖側に、付着される。根管充填材２００の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで６０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に３０μリットル〜４０μリットルの混合コラーゲン（Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合割合は１：１）を吸い込み、次に歯髄幹細胞を含む細胞を混合させた混合コラーゲンを２０μリットル〜３０μリットル吸い込む。ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。根管充填材２００内部に気泡が発生すると、発生した気泡が細胞の遊走を妨げて歯組織再生の促進が損なわれるからである。ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましく、例えばチップの下内径が０．５〜０．７ｍｍのものが使用でき、例えばＱＳＰ社のＨ−０１０−９６ＲＳマイクロキャピラリーチップを使用できる。
【００２５】
本実施形態に係る歯組織再生方法では、図１Ｃに示すように例えば歯髄炎が発生している対象となる歯１００について、抜歯を行う。そして、図１Ｄに示されるように、対象となる歯１００に対して抜髄を行う。対象となる歯１００とは、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯をいう。抜髄とは、歯牙の内部に存在する歯髄を取り去る行為である。
【００２６】
抜髄後は、対象となる歯１００の根管を拡大することで、根尖部の根管の大きさを所定の太さにすることが望ましい。なぜならば、後述するように、抜髄した根管に根管充填材を充填する際に、根管を拡大しておくほうが根管充填材を充填しやすいからであり、また根尖歯周組織から血管及び神経が進入しやすいからである。
【００２７】
例えば、図１Ｄに示されるように、根尖部の根管の太さｄは、根管の直径において０．７ｍｍ以上１．５ｍｍ以下とすることが望ましい。根管の太さｄが０．７ｍｍよりも小さいと、血管及び神経が根尖歯周組織から進入しにくく、また根管充填材の充填が難しいおそれがあるからであり、一方、根管の太さｄが１．５ｍｍよりも大きいと、対象となる歯１００に対して必要以上の負担を与えて割れやすくなるおそれがあるからである。
【００２８】
対象となる歯１００を抜髄した後は、図１Ｅに示されるように、根管の根尖側にピンセット等により根管充填材２００を注入する。根管充填材２００は、例えば歯髄ＳＰ細胞のように生物学的材質を含有するので、生物学的根管充填材とすることもできる。なお、細胞外基質２１０がゲル状の場合はピンセット等でつまむことができないので、ピペットマン、注射等により注入することになる。
【００２９】
歯髄幹細胞を含む細胞は、歯組織再生の処置を受ける対象動物自身から抽出した自家細胞でもよいし、また、歯組織再生の処置を受ける対象動物以外の動物から抽出した同種細胞でもよい。
【００３０】
歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞である。特に、ヒト乳歯由来の歯髄細胞には、ＣＤ１０５＋が約５０％と多く含まれ、（ヒト永久歯由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞ではＣＤ１０５＋は約２０％）、永久歯ＣＤ１０５＋細胞又はＳＰ細胞とほぼ同様に、乳歯由来の歯髄細胞は試験管内血管誘導、下肢虚血部位での血流回復、血管新生促進効果を示す。また、ＣＤ１５０＋は乳歯歯髄細胞に０．２％含まれ、永久歯ＣＤ３１−ＳＰ細胞の含有量０．１％より多い。さらには、乳歯歯髄細胞は分取せずとも、そのまま抜髄後血管新生及び歯髄再生に使うことも可能である。そして、例えば、下肢虚血部位における血管新生では、ヒト乳歯由来の歯髄細胞は、ヒト永久歯由来の歯髄細胞と比較して、２．２倍の血管新生能を有する。
【００３１】
歯髄幹細胞を含む細胞は、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、及び、ＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。例えばヒト歯髄ＳＰ細胞は、血管新生能等の組織再生能力が高い。具体的には、下肢虚血部位における血管新生では、ヒト歯髄ＳＰ細胞はヒト乳歯歯髄細胞と比較して１．２倍の血管新生能を有する。また、ヒト歯髄ＳＰ細胞はヒト永久歯歯髄細胞と比較して２．６倍の血管新生能を有する。さらに、ＰＢＳコントロールと比較して５．７倍の血管新生能を有する。ここで、根尖とは、対象となる歯１００の歯槽骨に結合される端部（歯根の先端部分）をいう。
【００３２】
また、ＳＰ細胞とは、Ｇｏｏｄｅｌら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１８３，１９９６年）によって発見された未分化細胞であり、フローサイトメトリーでの解析でＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２という蛍光色素を細胞に取り込ませてＵＶで励起すると４０５ｎｍ及び６００ｎｍに蛍光を発する通常の細胞（未分化細胞以外の細胞）からサイトグラム上は異なった位置（“Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｂｌｕｅ弱陽性かつＨｏｅｃｈｓｔ Ｒｅｄ弱陽性”）に出現する細胞集団のことである。
【００３３】
歯髄ＳＰ細胞は、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、又は、ＣＤ１５０陽性の何れかとすることが好ましい。
【００３４】
根管充填材における歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下とすることが好ましい。歯髄幹細胞の含有率が、１×１０３セル／μｌよりも少ないと、根管内の歯組織の再生が不十分なものとなる可能性があるからである。一方、歯髄幹細胞の含有率が、１×１０６セル／μｌよりも多いと、対象の歯に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があるからである。
【００３５】
根管の根尖側に根管充填材を注入した後は、図１Ｆに示されるように、根管充填材２００の上部にゼラチン６１０を注入し、レジン６２０により蓋をする。その後は図１Ｇに示されるように、抜歯をした歯を抜歯窩３００に再移植する。これにより、根管内の歯組織が再生される。再生される歯組織は、図１Ｈに示されるように、例えば根管内の血管４００及び歯髄組織である。その後は、レジン６２０を一度除去して、ＢＭＰｓ等の形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、図１Ｉに示すように、レジン６２０により蓋をする。形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布したことにより、図１Ｊに示されるように象牙質５００も再生される。もっともこれに限定されず神経再生も促進される。なお、上述の実施形態１では、対象となる歯１００は、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯であったが、これに限定されず、対象となる歯１００には神経機能が低下して咬合感覚が弱くなっている歯も含まれる。係る場合は、抜髄後に、根管充填材を注入することにより、歯髄を再生させることで咬合感覚を向上させることができる。また、図１Ｋに示すように、対象となる歯１００には、細菌感染が根尖歯周組織まで波及している歯（細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる歯）も含まれる。このような歯は根尖性歯周炎１１０を伴うことが多い。感染根管の根管拡大清掃後に根管充填材２００を注入する。ここで感染根管とは、細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質に及んでいる場合の根管をいい、根管拡大清掃後とは、感染根管における細菌を除去した後をいう。
【００３６】
（実施形態２）
以下、図２Ａ〜図２Ｃを参照しながら、実施形態２に係る歯組織再生方法を説明する。実施形態２に係る根管充填材２００の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで６０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に遊走因子を混合させた混合コラーゲン（Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合割合は１：１）を３０μリットル〜４０μリットルを吸い込み、次に歯髄幹細胞を含む細胞を混合させた混合コラーゲンを２０μリットル〜３０μリットル吸い込む。実施形態２においても、ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。また、ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましい。このようにして、図２Ａに示す根管充填材２００が製造される。このように、根管充填材２００は、歯髄幹細胞を含む細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側（例えば根管の上部１／２〜２／３）に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子２３０を付着させている。歯髄幹細胞を含む細胞２２０を根管の根尖側に付着させ、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる理由は、歯髄幹細胞を含む細胞２２０を根管の歯冠側にまで付着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであり、また、根管の根尖側に付着している歯髄幹細胞を含む細胞が根管の歯冠側に付着している遊走因子に引っぱられて歯組織再生が促進されやすいからである。なお、図２Ａに示すように、根管充填材２００の根管の歯冠側に細胞外基質２１０を残しておくことも可能である。
【００３７】
そして、実施形態１において図１Ｄに示したように、対象となる歯１００に対して抜髄及び抜髄後の根管拡大処置を行う。その後は、図２Ｂに示すように、根管の根尖側に根管充填材２００を注入する。
【００３８】
細胞遊走因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の遊走に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。また、細胞増殖因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。そして、神経栄養因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の生存に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。
【００３９】
細胞遊走因子は、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭＣＳＦのうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。特に、ＭＭＰ３は、細胞遊走能が高く好適に使用することができる。
【００４０】
細胞増殖因子は、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦの少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
【００４１】
神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ及びＮＧＦのうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
【００４２】
遊走因子を付着させた細胞外基質における、遊走因子の含有率は、０．１ｎｇ／μｌ以上５００ｎｇ／μｌ以下とすることが好ましい。遊走因子の含有率が０．１ｎｇ／μｌよりも少ないと、遊走の程度が少なくなる可能性がありうるからである。一方、遊走因子の含有率が５００ｎｇ／μｌよりも多いと、対象となる歯１００に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があり得るからである。
【００４３】
実施形態１と同様に、細胞外基質は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。
【００４４】
コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合である混合コラーゲンであることが好ましい。さらに、混合コラーゲンにおけるＩＩＩ型コラーゲンの割合は３０重量％以上５０重量％以下とすることが好ましい。
【００４５】
その後は、実施形態１における図１Ｆと同様にゼラチン６１０を注入してレジン６２０にて蓋をして、図２Ｃに示すように、抜歯をした歯を抜歯窩３００に再移植する。その後は、図１Ｈに示したように根管内の血管４００及び歯髄組織が再生するが、実施形態１よりも再生率が向上している。そして、図１Ｉに示したようにＢＭＰｓ等の形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、図１Ｊに示したように象牙質再生を行うが、実施形態１よりも再生率が向上している。なお、上述の実施形態２においても、対象となる歯１００に対して感染根管の根管拡大清掃後に根管充填材２００を注入することもできる。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
〈細胞分取と特徴化〉
ブタ歯胚を摘出後、３７℃で１時間半、コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄細胞を分離した後、２％血清を含むＤＭＥＭ中に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞を分散させ、５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２でラベルした。ついで、ＣＤ３１及びＣＤ１４６の抗体を用いて４℃で３０分ラベル後、フローサイトメトリーを行った。図３に、ＳＰ細胞のフローサイトメトリーの分析結果を示す。ブタ歯髄由来のＳＰ細胞は全体の０．２％を占めた。
図４に示されるように、歯髄由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−，ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−及びＣＤ３１＋；ＣＤ１４６＋ ＳＰ細胞の３分画を得た。ＣＤ３１及びＣＤ１４６抗体でラベルしてＳＰ細胞をさらに分画すると、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞，ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞，ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６＋ＳＰ細胞は、それぞれ、５０％、４８％、２％を占めた。ＥＧＦ及びＩＧＦ−Ｉが添加された１０％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ２培地中で培養した。
【００４７】
表１に示すように、フローサイトメトリーにて、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はＣＤ３４＋、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１＋が７０〜９０％ぐらいをしめており、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４は０％であった。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲでは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ４５ｍＲＮＡは発現しておらず、造血系の幹細胞とは異なることが明らかとなった。
【００４８】
【表１】
2014168714.tif 000003
【００４９】
また、表２に示すように、骨髄由来のａｎｇｉｏｂｌａｓｔに発現するＣＤ１３３ｍＲＮＡは歯髄由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞には全くみられなかった。
【００５０】
【表２】
2014168714.tif 000004
【００５１】
マイクロアレイならびにＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲにて、歯髄由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞と歯髄由来ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞とをＲＮＡ発現について比較すると、表３に示すように、前血管誘導因子（ＶＥＧＦ−Ａ）、サイトカイン（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ１／ＣＣＬ２、ＭＤＣＦ Ｉ）、細胞外基質分解酵素（ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、Ａｒｇｉｎａｓｅ Ｉ）、その他（ＧＰ３８Ｋ、ＣＲＳＰ）等が高発現していた。
【００５２】
【表３】
2014168714.tif 000005
【００５３】
〈多分化能〉
Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で血管誘導を行うとＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は２４時間後には網目状の管腔構造を呈した。ＣＤ３１＋ＳＰ細胞は明らかな管腔構造を形成しなかった。さらに１０日後にＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はＭａｔｒｉｇｅｌ内部に血管様構造を形成し、血管様構造物周囲の細胞はＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１４６及びｏｃｃｌｕｄｉｎ ｍＲＮＡの内皮細胞の分化マーカーを発現していた。またＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ存在下で培養すると１０日目にはＣＤ３１、ｖＷＦ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの内皮細胞の分化マーカーを発現するようになった。さらにＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、内皮細胞の機能的な性質であるヒスタミンによるｖＷＦの放出やａｃ−ＬＤＬの取り込み能を示した。また、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、多分化能を有し、試験管内で軟骨、脂肪、神経、象牙芽細胞に分化誘導された。
【００５４】
〈遊走能、増殖能〉
試験管内で、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は他の２画分と比較してｂＦＧＦ及びＥＧＦ刺激により高い増殖能を示した。また、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は他の２画分と比較してＶＥＧＦ及びＳＤＦ１により誘導され２倍高い遊走能を示した。
【００５５】
図５Ａは０．２％ＢＳＡのコントロールであり、図５Ｂは５０ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦであり、図５Ｃは５０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦであり、図５Ｄは５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦであり、図５Ｅは５０ｎｇ／ｍｌ ＳＤＦ１であり、図５Ｆは５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１である。Ｔｅｔｒａ−ｃｏｌｏｒ ｏｎｅ（登録商標）を添加して、０、１２、２４、３６、４８、７２時間後、細胞数を４５０ｎｍで測定した。ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は他の画分と比較して、７２時間ではｂＦＧＦあるいはＥＧＦで高い増殖活性があった。データは４サンプルの平均値プラスマイナスＳＤで示す（＊Ｐ＜０．０１）。実験は３回繰り返し、典型例を示した。
【００５６】
図６に示すように、２４ｗｅｌｌの培地にＶＥＧＦ−Ａ、０、５、１０、１００ｎｇ／ｍｌを添加し、５×１０４個の細胞をＰＥＴ−ｍｅｍｂｒａｎｅインサートに播種し、膜を通過した細胞を２４時間後にカウントした。ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は遊走能が高く、濃度依存性に遊走能が増加した。４サンプルの平均値プラスマイナスＳＤで示す（＊Ｐ＜０．０１）。実験は３回繰り返し、典型例を示した。
【００５７】
図７に示すように、ＶＥＧＦ−Ａ、ＳＤＦ１及びＧＣＳＦ添加による遊走能の変化を観察した。ＳＤＦ１及びＶＥＧＦ−ＡはＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の遊走を促進させることが判明した。データは４サンプルの平均値プラスマイナスＳＤで示す（＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１）。実験は３回繰り返し、典型例を示した。
【００５８】
このように、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対して、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の上清画分を試験管内で４８時間作用させるとＭＭＰ３あるいはＶＥＧＦを５０ｎｇ／ｍｌで作用させた場合とほぼ同様の増殖活性がみられた。また、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の上清画分は血管内皮細胞に対してＭＭＰ３あるいはＧＭ−ＣＳＦに相当するぐらいのアポトーシス抑制効果がみられた。
【００５９】
図８は、ＨＵＶＥＣに対する歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の増殖活性を示すものである。２、１２、２４、３６、４８時間後における、ＭＭＰ３、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞上清との比較が示される。３６及び４８時間ではＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞上清では他のサイトカインと同様に増殖活性があり、ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の上清に比べて有意に高い活性が見られた（＃Ｐ＜０．０１） ＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ｃｏｎｔｒｏｌ。
【００６０】
図９は、１００ｎＭ ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅによりアポトーシスを生じさせたＨＵＶＥＣを用いたフローサイトメトリーによる壊死細胞及びアポトーシス細胞の割合の測定したものである。歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清は、ＭＭＰ３、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦと同様に高い抗アポトーシス効果を有することが理解され、ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞上清と比較して有意に高い抗アポトーシス効果を有することがわかった（＃Ｐ＜０．０１）。これらの結果より、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は血管新生を促進するのに適した細胞であることが明らかとなった。
【００６１】
〈マウス下肢虚血モデルでの血管新生〉
ＳＣＩＤ（Ｓｅｖｅｆｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＩｍｍｕｎｏＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）マウスの下肢虚血モデルを作製し、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を下肢虚血部位に移植すると、１週間後には血流が回復し、ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞移植群と比較して、新生血管形成が約１３倍に促進された。
【００６２】
〈イヌ生活歯髄切断モデルでの血管新生、神経再生、歯髄再生〉
イヌ歯髄組織よりＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞をブタと同様に分取すると、ＳＰ細胞の約１０％を占めていた。この歯髄由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞１×１０６個をＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを添加して三次元培養を行った。２４時間後にイヌの生活歯髄切断面上に自家移植し、上部はスポンゼル及び燐酸セメントで充填し、さらに化学重合レジンで封鎖した。コントロールとしてＣＤ３１＋ＳＰ細胞あるいはＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンのみを用いた。１４日後、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞移植群では生活歯髄切断面上に歯髄が再生され、新生血管が連続して、図１０及び図１３に示すように、再生歯髄中にみられた。図１０及び図１３は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン中に１日三次元培養して自家移植後１４日目のもので、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植したものである。染色はＨ−Ｅ染色を使用した。図中において矢印は歯髄切断面を示す。図１０及び図１３に示すように、歯髄切断面上の窩洞内は再生歯髄組織に満たされており、リン酸セメントを充填した部位近くまで毛細血管が伸張していることが理解される。
【００６３】
さらに、図１５及び図１７に示されるように、移植細胞は新生血管周囲に遊走、定着していた。図１５では、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は再生歯髄の底部に見られることが理解される。また、図１７は、血管内皮細胞をＣＤ１４６で染色したものであり、ＤｉＩラベルされたＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は再生歯髄組織の新生血管周囲に存在することが理解される。なお、図１７において矢印はＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の位置を示し、記号ｖは、新生血管を示す。図中において点線は新生組織境界部を示す。
【００６４】
一方、図１１、図１４、図１６は、ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植したものである。図１１、図１４及び図１６に示されるように、ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞移植群では移植細胞の定着は見られたが、新生血管形成がみられず、細胞の遊走もみられなかった。図１１及び図１４では、窩洞内に移植組織の定着は見られるが、毛細血管はほとんど見られないことが示される。図１６では、ＣＤ３１＋；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は窩洞全体に分散して存在することが示されている。矢印は歯髄切断面である。白線は象牙質壁を示す。点線は新生組織境界部を示す。
【００６５】
次に、図１２は、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンのみを移植した標本である。図１２に示されるように、生活歯髄切断面上に全く組織はみられなかった。
【００６６】
図１８に示すように、２８日後では、歯冠部上部のリン酸セメントに接する部分で、象牙芽細胞の分化及び細管象牙質形成がみられた。図１８において、矢印は分化した象牙芽細胞の突起を示す。
【００６７】
図１９に示されるように、切断された歯根部歯髄の神経から伸びる神経軸索がみられた。図２０に示されるように、残存した歯根部歯髄中に存在する、切断され修復された神経が示された。なお、図１９及び図２０はｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ免疫染色したものである。
【００６８】
（実施例２）
実施例２では、ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及び細胞遊走因子ＳＤＦ１を用いたイヌ抜髄後の歯髄再生を示す。イヌ歯髄組織よりＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞をブタと同様に分取した。また、ＣＤ１０５＋細胞を分取した。イヌ上顎前歯を抜去後、歯髄を除去して、培地中で＃８０まで拡大し、根尖部の根管の太さを０．８ｍｍ以上にした。抜去後３０分以内に１×１０６個のＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞をＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲン１０μｌに混合し、根管の根尖側１／３に注入した。さらに、根管の歯冠部２／３にＳＤＦ１（２００ｎｇ）を添加したＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを２０μｌ充填した。３０分以内にイヌの抜歯窩３００に再移植し、上部は燐酸セメントならびに化学重合レジンで封鎖した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。
【００６９】
図２１、図２５、図２６、図２７、図２８は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＳＤＦ１（２００ｎｇ）及びＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を注入したものである。ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びＳＤＦ１両方を根管充填材として用いた場合、図２１に示されるように、１４日後に根管内すべてが新生歯髄組織で満たされていた。図２１はＨ−Ｅ染色したものである。その新生歯髄組織には、図２５に示されるように根尖側、及び、図２６に示されるように歯冠側とも新生毛細血管がみられ、図２８に示されるように再生された神経が見られた。図２５及び図２６において、記号ｖは毛細血管を示す。図２７はＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎによる血管内皮細胞染色を示すものである。図２８はｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ免疫染色したものである。
【００７０】
一方、ＳＤＦ１あるいはＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞のどちらか一方では、根管内は根尖部１／５〜１／４しか新生歯髄組織はみられなかった。図２２は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＳＤＦ１（２００ｎｇ）を注入したものである。図２３は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を注入したものである。さらに、図２４に示す場合のように、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンのみでは、ほとんど新生歯髄組織はみられなかった。
【００７１】
ＣＤ１０５＋細胞及びＳＤＦ１両方を根管充填材として用いた場合、図２９に示されるように、１４日後に根管内が新生歯髄組織で満たされていた。
【００７２】
（実施例３）
実施例３では、主に、ヒト永久歯歯髄ＣＤ３１陰性ＣＤ１４６陰性ＳＰ細胞及びヒト永久歯歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を用いた血管新生を示す。
ヒト歯髄を摘出後、３７℃で１時間コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄細胞を分離後、２％血清を含むＤＭＥＭ中に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞を分散させ、５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２でラベルしてさらにＣＤ３１抗体を用いてフローサイトメトリーを行い、歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を分取した。一方、歯髄細胞を分離後、ＣＤ１０５抗体を用いてフローサイトメトリーを行い、歯髄ＣＤ１０５＋細胞を分取した。これらの細胞をＥＧＦ及びＩＧＦ−Ｉが添加された１０％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ２培地中で培養するとブタ歯髄由来のものと同等（約１０％）の頻度で細胞はｄｉｓｈに付着し増幅した。この３代目のＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及び歯髄ＣＤ１０５＋細胞をさらに細胞表面マーカーを用いてフローサイトメトリーを行い細胞の特徴を調べたところ、幹細胞のマーカーＣＤ４４はどちらもほぼ陽性であり、ＣＤ９０はそれぞれほぼ陽性及び３０％陽性であった。図３０に、ヒトＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞のフローサイトメトリーを示す。表４は、ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞とヒト歯髄ＣＤ１０５＋ＳＰ細胞、ヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞、ヒトｔｏｔａｌ乳歯細胞及びブタ歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の比較を示すものである。血管内皮細胞あるいは血管平滑筋細胞のマーカーＣＤ１４６はヒトＣＤ３１−ＳＰ細胞は陰性、ヒトＣＤ１０５＋細胞はほぼ陰性であった。骨髄由来のａｎｇｉｏｂｌａｓｔ及び末梢血中の血管内皮前駆細胞で陽性といわれるＣＤ１３３は陰性であり、ブタ歯髄由来のＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞と同様であったが、ＣＤ１３４はブタと異なり陰性であった。
【００７３】
【表４】
2014168714.tif 000006
【００７４】
ついで、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に１×１０４個／９６ｗｅｌｌ播種し血管誘導を行うと、図３１に示すように、ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は播種２０時間後には網目状の管腔構造を形成した。また、同様にヒト歯髄ＣＤ１０５＋細胞でも実験を行った結果、図３２に示すようにヒト歯髄ＣＤ１０５＋細胞でも管腔構造を形成した。また、同様にヒト歯髄ＣＤ１５０＋細胞でも実験を行った結果、図３３に示すようにヒト歯髄ＣＤ１５０＋細胞でも管腔構造を形成した。
【００７５】
同様に分取していない３代目のヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞でも実験を行った結果、図３４に示すように、分取していない３代目のヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞では明らかな管腔構造を形成しなかった。
【００７６】
一方、ヒト歯髄ＣＤ２４＋細胞で実験を行った結果、図３５に示すように、ヒト歯髄ＣＤ２４＋細胞は試験管内で容易に神経に分化した。
【００７７】
図３６は、下肢虚血部位に３代目ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植したものである。図３７は、下肢虚血部位に３代目ヒト歯髄ＣＤ１０５＋細胞を移植したものである。図３８は、下肢虚血部位にＰＢＳコントロールを注入したものである。図３９は、下肢虚血部位に３代目のヒト歯髄ｔｏｔａｌ歯髄細胞を移植したものである。図３６、図３７、図３８、図３９はレーザードップラー解析の結果であり、図４０はレーザードップラー解析の統計学的有意差を示すものである。図３６、図３７、図３８に示すように、下肢虚血部位にヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞若しくはヒト歯髄ＣＤ１０５＋細胞を移植すると、ＰＢＳを注入したコントロールと比べ、劇的な血流回復がみられた。図３９に示すように、３代目のヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞ではやや血流回復がみられた。
【００７８】
下肢虚血部位の連続凍結切片を作製し、ＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎにて血管内皮細胞を染色し、新生血管密度を測定した。図４１は、ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞移植の場合のＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎにて血管内皮細胞を染色した結果である。図４２は、ＰＢＳ注入コントロールの場合のＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎにて血管内皮細胞を染色した結果である。図４１及び図４２に示すように、ヒト歯髄ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞では、ＰＢＳ注入コントロールに比べて大幅に血管新生を促進していることが明らかとなった。
【００７９】
以上の結果より、ヒト歯髄由来のＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びＣＤ１０５＋細胞は、イヌ及びブタと同様に、血管再生及び歯髄再生に有効である。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
抜髄後の根管内に根管充填材を充填して歯組織再生を図ることができるので、深いう蝕で歯髄炎を生じている場合でも、適切に歯髄再生及び歯髄機能の回復させる用途に適用できる。
【符号の説明】
【００８１】
１００：治療対象となる歯
１１０：根尖性歯周炎
２００：根管充填材
２１０：細胞外基質
２２０：歯髄幹細胞を含む細胞
２３０：遊走因子
３００：抜歯窩
４００：血管
５００：象牙質
６１０：スポンゼル（ゼラチン）
６２０：レジン
６３０：形態形成因子
【図１Ａ】
2014168714.tif 000007
【図１Ｂ】
2014168714.tif 000008
【図２Ａ】
2014168714.tif 000009
【図１Ｃ】
2014168714.tif 000010
【図１Ｄ】
2014168714.tif 000011
【図１Ｅ】
2014168714.tif 000012
【図１Ｆ】
2014168714.tif 000013
【図１Ｇ】
2014168714.tif 000014
【図１Ｈ】
2014168714.tif 000015
【図１Ｉ】
2014168714.tif 000016
【図１Ｊ】
2014168714.tif 000017
【図１Ｋ】
2014168714.tif 000018
【図２Ｂ】
2014168714.tif 000019
【図２Ｃ】
2014168714.tif 000020
【図３】
2014168714.tif 000021
【図４】
2014168714.tif 000022
【図５Ａ】
2014168714.tif 000023
【図５Ｂ】
2014168714.tif 000024
【図５Ｃ】
2014168714.tif 000025
【図５Ｄ】
2014168714.tif 000026
【図５Ｅ】
2014168714.tif 000027
【図５Ｆ】
2014168714.tif 000028
【図６】
2014168714.tif 000029
【図７】
2014168714.tif 000030
【図８】
2014168714.tif 000031
【図９】
2014168714.tif 000032
【図１０】
2014168714.tif 000033
【図１１】
2014168714.tif 000034
【図１２】
2014168714.tif 000035
【図１３】
2014168714.tif 000036
【図１４】
2014168714.tif 000037
【図１５】
2014168714.tif 000038
【図１６】
2014168714.tif 000039
【図１７】
2014168714.tif 000040
【図１８】
2014168714.tif 000041
【図１９】
2014168714.tif 000042
【図２０】
2014168714.tif 000043
【図２１】
2014168714.tif 000044
【図２２】
2014168714.tif 000045
【図２３】
2014168714.tif 000046
【図２４】
2014168714.tif 000047
【図２５】
2014168714.tif 000048
【図２６】
2014168714.tif 000049
【図２７】
2014168714.tif 000050
【図２８】
2014168714.tif 000051
【図２９】
2014168714.tif 000052
【図３０】
2014168714.tif 000053
【図３１】
2014168714.tif 000054
【図３２】
2014168714.tif 000055
【図３３】
2014168714.tif 000056
【図３４】
2014168714.tif 000057
【図３５】
2014168714.tif 000058
【図３６】
2014168714.tif 000059
【図３７】
2014168714.tif 000060
【図３８】
2014168714.tif 000061
【図３９】
2014168714.tif 000062
【図４０】
2014168714.tif 000063
【図４１】
2014168714.tif 000064
【図４２】
2014168714.tif 000065