(57)【要約】【課題】被験物質の血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用を評価する方法の提供【解決手段】被験物質を血管内皮細胞に接触させる工程と、血管内皮細胞の血管透過性を亢進する薬剤を血管内皮細胞に接触させる工程と、血管内皮細胞の頂点高さを測定する工程とを備え、血管内皮細胞の頂点高さを被験物質の血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用の指標とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の、血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用を評価する方法であって、
被験物質を血管内皮細胞に接触させる工程と、
血管内皮細胞の血管透過性を亢進する薬剤を血管内皮細胞に接触させる工程と、
血管内皮細胞の頂点高さを測定する工程と、
を備え、
血管内皮細胞の頂点高さを、被験物質の、血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用の指標とする、方法。
【請求項２】
前記指標は、被験物質の存在下の血管内皮細胞の頂点高さが被験物質の非存在下の血管内皮細胞の頂点高さよりも低い場合に、当該被験物質は血管内皮細胞の血管透過性亢進を抑制すると判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管内皮細胞の接着面積を測定する工程をさらに備え、
血管内皮細胞の頂点高さ及び接着面積を、被験物質の、血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用の指標とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記指標は、被験物質の存在下の血管内皮細胞の頂点高さが被験物質の非存在下の血管内皮細胞の頂点高さよりも低く、かつ被験物質の存在下の血管内皮細胞の接着面積が被験物質の非存在下の血管内皮細胞の接着面積よりも大きい場合に、当該被験物質は血管内皮細胞の血管透過性亢進を抑制すると判断する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
血管内皮細胞の血管透過性を亢進する薬剤がヒスタミンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
血管内皮細胞の頂点高さ及び／又は接着面積の測定を定量位相顕微鏡で行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管透過性亢進抑制作用の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型アレルギー反応は、以下の機序で生じる。アレルゲンが体内に侵入し、肥満細胞の細胞表面のＩｇＥとアレルゲンが結合すると、肥満細胞はヒスタミン等の生理活性物質を放出する。これにより、血管拡張及び血管透過性亢進などが起こり、浮腫及び掻痒等の症状が引き起こされる。
【０００３】
血管透過性亢進（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）とは、血管内皮細胞がヒスタミンに応答して、細胞間の間隙が広がり、血管の透過性が上昇する現象である。この現象は、血管内皮細胞の二次元画像を撮影し、細胞間の間隙の拡大を測定することによって評価されてきた（非特許文献１及び２）。抗ヒスタミン剤は、ヒスタミン刺激による血管透過性亢進を抑制する作用を有することから、抗ヒスタミン剤の薬効評価に細胞間の間隙の拡大の抑制を測定する評価系が利用可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Wysolmerskiら, The American Journal of Pathology, 132(1), 28-37 (1988).
【非特許文献２】Killackeyら, The American journal of pathology, 122(1), 50-61 (1986).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、細胞間の間隙の拡大は、ヒスタミン刺激から約３０分経過しなければ観察することができず、迅速な測定を行うことが困難であった。
【０００６】
また、血管内皮細胞によっては、細胞の接着力が強いため、細胞間の間隙の拡大が起きない場合があり、正確な評価を行えない可能性があることを本発明者らは見出した。
【０００７】
本発明の課題は、迅速かつ正確な測定が可能な、血管透過性亢進の抑制作用の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒスタミン刺激後の血管内皮細胞を三次元的に観察したところ、ヒスタミン刺激の直後から血管内皮細胞の形態が変化することを初めて見出した。具体的には、ヒスタミン刺激の直後に、細胞の頂点高さが高くなり、その後しばらく経ってから細胞の接着面積が小さくなっていくという形態変化を血管内皮細胞は示すことが分かった。さらに、血管内皮細胞の接着力が強く、最終的に接着面積に変化が見られない場合であっても、ヒスタミン刺激直後には細胞の頂点高さが高くなることを、本発明者らは見出した。これらの知見に基づき、細胞の頂点高さの変化を利用することで、迅速かつ正確に血管透過性亢進の抑制作用の評価することが可能であると本発明者らは考え、発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、被験物質の血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用を評価する方法であって、被験物質を血管内皮細胞に接触させる工程と、血管内皮細胞の血管透過性を亢進する薬剤を血管内皮細胞に接触させる工程と、血管内皮細胞の頂点高さを測定する工程とを備え、血管内皮細胞の頂点高さを被験物質の血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用の指標とする方法を提供する。
【００１０】
上記指標は、被験物質の存在下の血管内皮細胞の頂点高さが被験物質の非存在下の血管内皮細胞の頂点高さよりも低い場合に、当該被験物質は血管内皮細胞の血管透過性亢進を抑制すると判断する指標とすることができる。
【００１１】
上記方法は、血管内皮細胞の接着面積を測定する工程をさらに備え、血管内皮細胞の頂点高さ及び接着面積を、被験物質の、血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用の指標とすることが好ましい。頂点高さに加えて、接着面積も指標とすることで、より正確な評価を行うことが可能となる。この場合、上記指標は、被験物質の存在下の血管内皮細胞の頂点高さが被験物質の非存在下の血管内皮細胞の頂点高さよりも低く、かつ被験物質の存在下の血管内皮細胞の接着面積が被験物質の非存在下の血管内皮細胞の接着面積よりも大きい場合に、当該被験物質は血管内皮細胞の血管透過性亢進を抑制すると判断する指標とすることができる。
【００１２】
上記方法において、血管内皮細胞の血管透過性を亢進する薬剤はヒスタミンであることが好ましい。本来のリガンドであるヒスタミンを用いることで、実際の生体内に近い反応を観察することが可能となる。
【００１３】
上記方法において、血管内皮細胞の頂点高さ及び／又は接着面積の測定を定量位相顕微鏡で行うことが好ましい。定量位相顕微鏡を用いることで、正確かつ簡便に頂点高さ及び／又は接着面積の測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の血管透過性亢進の抑制作用の評価方法は、迅速かつ正確な測定が可能である。この評価方法を利用することで、抗ヒスタミン剤の薬効評価を行うことが可能である。また、この評価方法を利用することで、抗ヒスタミン剤のスクリーニングを行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒスタミン刺激による血管内皮細胞の形態変化を模式的に表した図である。（ａ）ヒスタミン刺激前の細胞、（ｂ）ヒスタミン刺激直後の細胞、（ｃ）ヒスタミン刺激から約１０分後の細胞、（ｄ）ヒスタミン刺激から約１５分後の細胞。
【図２】前処理なしでヒスタミン刺激した場合の、血管内皮細胞の形態変化を表す図である。（ａ）２７０秒後、（ｂ）４０２秒後、（ｃ）、１００２秒後（ｄ）１１７０秒後。ヒスタミン刺激は３００秒後に行った。
【図３】レボセチリジンによる前処理後にヒスタミン刺激した場合の、血管内皮細胞の形態変化を表す図である。（ａ）２７０秒後、（ｂ）４０２秒後、（ｃ）、１００２秒後（ｄ）１１７０秒後。ヒスタミン刺激は３００秒後に行った。
【図４】前処理なしでヒスタミン刺激した場合の、単一の血管内皮細胞の形態変化を表す図である。ヒスタミン刺激は３００秒後に行った。
【図５】レボセチリジンによる前処理後にヒスタミン刺激した場合の、単一の血管内皮細胞の形態変化を表す図である。ヒスタミン刺激は３００秒後に行った。
【図６】ヒスタミン刺激による血管内皮細胞の頂点高さ及び接着面積の変化を表す図である。（ａ）前処理なし、（ｂ）レボセチリジンによる前処理あり。ヒスタミン刺激は３００秒後に行った。
【図７】前処理なしでヒスタミン刺激した場合の、血管内皮細胞の頂点高さ及び接着面積の変化を表す図である。（ａ）接着力が弱く剥がれ易い細胞、（ｂ）接着力が強く剥がれ難い細胞。ヒスタミン刺激は３００秒後に行った。
【図８】デキストロセチリジンによる前処理後にヒスタミン刺激した場合の、血管内皮細胞の形態変化を表す図である。（ａ）２７０秒後、（ｂ）１１７０秒後。ヒスタミン刺激は３００秒後に行った。
【図９】ラセミ体のセチリジンによる前処理後にヒスタミン刺激した場合の、血管内皮細胞の形態変化を表す図である。（ａ）２７０秒後、（ｂ）１１７０秒後。ヒスタミン刺激は３００秒後に行った。
【図１０】ヒスタミン刺激による、血管内皮細胞の頂点高さの変化を表す図である。縦軸は、ヒスタミン刺激時の頂点高さで標準化した頂点高さの変化を表す。横軸は、ヒスタミン刺激時を０秒としたときの経過時間（秒）を表す。（ａ）前処理なし、（ｂ）レボセチリジンによる前処理あり、（ｃ）デキストロセチリジンによる前処理あり、（ｄ）ラセミ体のセチリジンによる前処理あり。
【図１１】ヒスタミン刺激による、血管内皮細胞の頂点高さの変化（平均値）を表す図である。縦軸は、ヒスタミン刺激時の頂点高さで標準化した頂点高さの変化を表す。横軸は、ヒスタミン刺激時を０秒としたときの経過時間（秒）を表す。
【図１２】ヒスタミン刺激時の血管内皮細胞の頂点高さで標準化した、ヒスタミン刺激から８分後の血管内皮細胞の頂点高さのボックスプロットを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（ヒスタミン刺激による、血管内皮細胞の形態変化）
ヒスタミン刺激による血管内皮細胞の形態変化を図１に沿って説明する。図１（ａ）はヒスタミン刺激前の血管内皮細胞を表す。図１（ｂ）はヒスタミン刺激直後の血管内皮細胞を表す。ヒスタミン刺激によって、まずは細胞の頂点高さが高くなる。細胞の接着面積は、ヒスタミン刺激直後は変化しない。図１（ｃ）はヒスタミン刺激から約１０分後の血管内皮細胞を表す。細胞の頂点高さは維持される。細胞の接着面積が小さくなり始める。図１（ｄ）はヒスタミン刺激から約１５分後の血管内皮細胞を表す。細胞の頂点高さがさらに高くなり、細胞の接着面積が小さくなり、この状態が維持される。
【００１７】
一方、抗ヒスタミン剤等の血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用を有する物質で前処理を行った後、血管内皮細胞をヒスタミン刺激すると、細胞の形態変化はおきず、図１（ａ）の状態が維持される。
【００１８】
この形態変化の差異に基づいて、血管透過性亢進の抑制作用の評価を行う。
【００１９】
（被験物質の血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用を評価する方法）
抑制作用を評価する被験物質は、どのような物質を用いてもよい。好ましくは、Ｈ１受容体拮抗作用を有することが期待される物質を被験物質として用いる。
【００２０】
血管内皮細胞は、マウス、ラット、ウシ及びヒト等の哺乳類由来の血管内皮細胞を用いることができる。ヒトに投与した場合の抗ヒスタミン剤の薬効の評価を適切に行うことが可能であることから、ヒト由来の血管内皮細胞を用いることが好ましい。ヒト由来の血管内皮細胞は、皮膚微小血管内皮細胞、臍帯静脈血管内皮細胞及び大静脈血管内皮細胞等を利用することができる。血管内皮細胞は、成人由来でも新生児由来でも構わない。血管内皮細胞は、公知の方法により動物から採取し単離することができる。また、細胞バンクから入手することも可能である。血管内皮細胞の培養方法は当業者にとって周知であり、例えば、市販の血管内皮細胞用培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ―で、培養することが可能である。
【００２１】
血管内皮細胞をディッシュに播種し、十分に接着するまで培養する。培養期間は好ましくは２４時間である。
【００２２】
次に、被験物質を培地に添加して、被験物質を血管内皮細胞に接触させる（以下、前処理ともいう）。接触時間は、通常、３０分〜６０分である。被験物質は適切な溶媒に溶かした溶液として添加することが好ましい。溶媒は好ましくは培地である。被験物質が培地に溶解し難い場合は、被験物質を溶解する溶媒に溶解した後に培地で希釈してもよい。なお、この際、被験物質を含まない溶媒のみを培地に添加したサンプルをネガティブコントロールとしてもよい。
【００２３】
次に、血管内皮細胞の血管透過性を亢進する薬剤を培地に添加して、血管内皮細胞に接触させる（以下、薬剤刺激ともいう）。血管内皮細胞の血管透過性を亢進する薬剤は、Ｈ１受容体作動薬であればよく、ヒスタミン、２−メチルヒスタミン及び２−（２−ピリジル）エチルアミン等が挙げられる。Ｈ１受容体本来のリガンドであることから、ヒスタミンを用いることが好ましい。
【００２４】
薬剤刺激後、血管内皮細胞の頂点高さを測定する。三次元イメージング装置を用いることで、頂点高さを測定することができる。三次元イメージング装置として、定量位相顕微鏡、低コヒーレンス干渉顕微鏡、デジタルホログラフィ顕微鏡、トモグラフィック位相顕微鏡及び走査型プローブ顕微鏡等が挙げられ、定量位相顕微鏡が好ましい。
【００２５】
定量位相型顕微鏡は、例えば特許第４０９０２４４号公報及び特開第２０１０−４８６１９号公報に開示される。定量位相型顕微鏡を用いることにより、位相シフト干渉法を用いて光場の位相を定量的に測定することができる。定量位相顕微鏡を用いることにより、細胞の三次元的な形態を１ミクロン以下の分解能で得ることができ、それにより細胞の頂点高さ及び接着面積を正確に測定することが可能である。
【００２６】
定量位相顕微鏡は位相シフト法を用いることにより、測定対象物を透過した光の受ける位相変化を分布的に求めることができる。光学的な厚さ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）＝ＯＴとは、測定対象物を透過した光の受ける位相変化をφとしたときに、（１）式で与えられる指標である。ここでλは光の波長を表す。
ＯＴ＝λ×φ／２π  （１）
【００２７】
光学的な厚さは、測定対象物の屈折率をｎ１、測定対象物の周囲の媒質の屈折率をｎ０、測定対象物の高さをｈとしたときに、（２）式で記述される。したがって、光学的な厚さを測定することにより、測定対象物の高さに比例する値を近似的に求めることができる。
ＯＴ＝ｈ×（ｎ１−ｎ０）  （２）
【００２８】
細胞の頂点とは、単一の細胞における高さが最も高い点をいう。高さとは、培養容器に接着している細胞の底面から、培養容器に接着していない細胞表面までの距離をいう。細胞の頂点高さは、実高さであっても光学的厚さであってもよい。
【００２９】
細胞の頂点高さの測定は、薬剤刺激後の任意の時点で行ってよい。被験物質の前処理なしで薬剤刺激した場合、細胞の頂点高さは刺激直後に上昇し約１０分後まではほぼ同じ高さを維持し、約１５分後にはさらに上昇する。しかしながら、接着力の強い血管内皮細胞の場合には、約１５分後の細胞の頂点高さのさらなる上昇が認められない場合もある。また、測定効率を上げるためには、短時間で測定を行うことが好ましい。したがって、細胞の頂点高さの測定は、薬剤刺激開始から１０分後以内に行うことが好ましい。また、細胞の頂点高さの変動ができるだけ少ない時間帯で細胞の頂点高さを測定する方が、より正確な測定を行える。したがって、細胞の頂点高さの測定は、薬剤刺激開始から３分後〜９分後の間に行うことが好ましい。
【００３０】
測定した細胞の頂点高さに基づいて、被験物質の血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用を評価する。単一の細胞の頂点高さに基づく指標であってもよく、複数の細胞の頂点高さの平均値に基づく指標であってもよい。より具体的には、被験物質の存在下の血管内皮細胞の頂点高さが被験物質の非存在下の血管内皮細胞の頂点高さよりも低い場合に、当該被験物質は血管内皮細胞の血管透過性亢進を抑制すると判断することができる。
【００３１】
別の実施形態において、血管内皮細胞の頂点高さの測定に加えて、血管内皮細胞の接着面積の測定を行う。血管内皮細胞の接着面積に基づく評価は、従来の評価方法である細胞間隙の拡大に基づく評価に相当するものであり、血管内皮細胞の頂点高さ単独の場合と比較してより正確な評価が可能となる。血管内皮細胞の接着面積とは、培養容器に接着している細胞の底面の面積をいう。３次元イメージング装置を用いることで、細胞の頂点高さとともに接着面積も測定することができる。細胞の接着面積の測定は、薬剤刺激後の任意の時点で行ってよい。被験物質の前処理なしで薬剤刺激した場合、細胞の接着面積は刺激から約１０分後に小さくなり始め、約１５分後には一定となる。したがって、細胞の接着面積の測定は、薬剤刺激開始から１５分後以降に行うことが好ましい。また、細胞の接着面積の変動ができるだけ少ない時間帯で細胞の接着面積を測定する方が、より正確な測定を行える。また、測定効率を上げるためには、短時間で測定を行うことが好ましい。したがって、細胞の接着面積の測定は、薬剤刺激開始から１５分後〜２０分後の間に行うことが好ましい。
【００３２】
測定した細胞の頂点高さ及び接着面積に基づいて、被験物質の血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用を評価する。単一の細胞の頂点高さ及び接着面積に基づく指標であってもよく、複数の細胞の頂点高さの平均値及び接着面積の平均値に基づく指標であってもよい。より具体的には、被験物質の存在下の血管内皮細胞の頂点高さが被験物質の非存在下の血管内皮細胞の頂点高さよりも低く、かつ被験物質の存在下の血管内皮細胞の接着面積が被験物質の非存在下の血管内皮細胞の接着面積よりも大きい場合に、当該被験物質は血管内皮細胞の血管透過性亢進を抑制すると判断することができる。
【００３３】
（被験物質の血管内皮細胞の血管透過性の亢進作用を評価する方法）
他の実施形態において、被験物質の血管内皮細胞の血管透過性の亢進作用を評価する方法であって、被験物質を血管内皮細胞に接触させる工程と、血管内皮細胞の頂点高さを測定する工程とを備え、血管内皮細胞の頂点高さを被験物質の血管内皮細胞の血管透過性の亢進作用の指標とする方法を提供する。この評価方法を利用することで、Ｈ１受容体作動薬のスクリーニングを行うことが可能である。
【００３４】
上記指標は、被験物質の存在下の血管内皮細胞の頂点高さが被験物質の非存在下の血管内皮細胞の頂点高さよりも高い場合に、当該被験物質は血管内皮細胞の血管透過性を亢進すると判断する指標とすることができる。
【００３５】
上記方法は、血管内皮細胞の接着面積を測定する工程をさらに備え、血管内皮細胞の頂点高さ及び接着面積を、被験物質の、血管内皮細胞の血管透過性の亢進作用の指標とすることが好ましい。この場合、上記指標は、被験物質の存在下の血管内皮細胞の頂点高さが被験物質の非存在下の血管内皮細胞の頂点高さよりも高く、かつ被験物質の存在下の血管内皮細胞の接着面積が被験物質の非存在下の血管内皮細胞の接着面積よりも小さい場合に、当該被験物質は血管内皮細胞の血管透過性を亢進すると判断する指標とすることができる。
【００３６】
上記方法において、血管内皮細胞の頂点高さ及び／又は接着面積の測定を定量位相顕微鏡で行うことが好ましい。
【００３７】
亢進作用を評価する被験物質は、どのような物質を用いてもよい。好ましくは、Ｈ１受容体アゴニスト作用を有することが期待される物質を被験物質として用いる。
【００３８】
使用する血管内皮細胞及びその培養方法は上述の通りである。
【００３９】
被験物質を培地に添加して、被験物質を血管内皮細胞に接触させる。この工程は、上述の薬剤刺激に相当する工程となる。
【００４０】
薬剤刺激後の血管内皮細胞の頂点高さ及び接着面積の測定は上述の通りである。
【実施例】
【００４１】
材料及び方法
【００４２】
（１）血管内皮細胞
ヒト新生児皮膚由来微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）を用いた。継代後、測定直前までの培養液は、ＥＢＭ−２培地５００ｍＬ（Ｌｏｎｚａ社ＣＣ−３１５６）に微小血管内皮細胞添加因子セット−２  ＥＧＭ−２  ＭＶ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（Ｌｏｎｚａ社ＣＣ−４１４７）を添加したものを用いた。継代後２４時間、３７℃、５％ＣＯ２環境でインキュベートし、前処理の直前に培養液を、ＥＢＭ−２培地に置換した。継代時の培養ディッシュは、無処理のプラスチックディッシュを用いた。
【００４３】
（２）薬剤
血管内皮細胞の血管透過性を亢進する薬剤としてヒスタミンを用いた。また、ラセミ体のセチリジン、レボセチリジン（ｌ−セチリジン）及びデキストロセチリジン（ｄ−セチリジン）をヒスタミンの前処理の試薬として用いた。ラセミ体のセチリジン及びレボセチリジンは抗ヒスタミン作用すなわち血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用があることが知られているが、デキストロセチリジンは抗ヒスタミン作用がわずかしかないことが知られている。また、レボセチリジンのＨ１受容体の結合能は、デキストロセチリジンと比べて約３３倍であることが知られている。
【００４４】
（３）前処理
最終濃度が２μＭとなるようにラセミ体のセチリジンを培地に添加し、３０分間、３７℃にてＣＯ２インキュベータ内に静置した。レボセチリジン及びデキストロセチリジンの場合は、最終濃度を１μＭとする以外は、ラセミ体のセチリジンと同様に前処理した。
【００４５】
（４）ヒスタミン刺激
細胞を下記の装置にセットし、顕微鏡観察を開始した。観察開始から３００秒後に最終濃度が１００μＭとなるようにヒスタミンを添加し、血管内皮細胞の血管透過性亢進を惹起した。
【００４６】
（５）血管内皮細胞の頂点高さ及び接着面積を測定する装置
反射型定量位相顕微鏡を、ガラス底面反射による透過モードで用いて、サンプルをタイムラプス撮像した。干渉画像１枚の露光時間＝２５ミリ秒。位相ステップの時間間隔＝１００ミリ秒。位相シフト法＝５点法の往復（１０点）。撮像サイクル間の待ち時間＝２秒。タイムラプスの時間間隔＝３秒。観察時間は開始から終了までで２０分〜３０分。対物レンズは水没型の２０倍とした（Ｎｉｋｏｎ，ＣＦＩ  Ｆｌｕｏｒ  ２０ｘＷ，ＮＡ＝０．５）。
【００４７】
（実施例１）
レボセチリジンの前処理の有無により、ヒスタミン刺激後の血管内皮細胞の様子を定量位相顕微鏡で観察した。図２は前処理なしの場合の細胞の様子を表したものであり、図３はレボセチリジンで前処理した場合の細胞の様子を表したものである。図２及び３において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）はそれぞれ観察開始から２７０秒後、４０２秒後、１００２秒後及び１１７０秒後の細胞の様子を表している。ヒスタミン刺激は観察開始から３００秒後に行っている。
【００４８】
図２（ｂ）から明らかなように、ヒスタミン刺激の直後から、細胞の頂点高さが高くなり始める様子が観察された。また、図２（ｃ）及び（ｄ）から明らかなように、ヒスタミン刺激から約１０分後には、細胞の頂点高さがさらに高くなり、また、細胞の接着面積が小さくなり始める様子が観察された。
【００４９】
一方、図３から明らかなように、抗ヒスタミン薬であるレボセチリジンによる前処理を行った場合は、ヒスタミン刺激を行っても細胞の頂点高さも接着面積も変化が認められなかった。
【００５０】
単一細胞における細胞の形態変化を図４及び５に示す。図４はレボセチリジンの前処理なしの場合の細胞の形態変化を表したものであり、図５はレボセチリジンで前処理した場合の細胞の形態変化を表したものである。図４から明らかなように、ヒスタミン刺激により、まず細胞の頂点高さが高くなり、その後、細胞の接着面積が小さくなる様子が確認された。一方、図５から明らかなように、レボセチリジンによる前処理を行った場合は、ヒスタミン刺激を行っても細胞の形態変化はほとんど認められなかった。
【００５１】
（実施例２）
実施例１と同様に、レボセチリジンの前処理の有無により、ヒスタミン刺激後の血管内皮細胞の様子を定量位相顕微鏡で観察し、細胞の頂点高さ及び接着面積を測定した。結果を図６（ａ）及び（ｂ）に示す。図６（ａ）から明らかなように、前処理なしの場合は、ヒスタミン刺激の直後に細胞の頂点高さが高くなり、約１０分後にさらに高くなることが確認された。また、前処理なしの場合は、ヒスタミン刺激から約１０分後に細胞の接着面積が小さくなることが確認された。一方、図６（ｂ）から明らかなように、レボセチリジンによる前処理を行った場合は、ヒスタミン刺激を行っても細胞の頂点高さ及び接着面積ともにほとんど変化しなかった。
【００５２】
（実施例３）
前処理なしでヒスタミン刺激を行った時に、血管内皮細胞によって異なる挙動を示すことが観察された。前処理なしでヒスタミン刺激を行い、血管内皮細胞の様子を定量位相顕微鏡で観察し、異なる血管内皮細胞について、細胞の頂点高さ及び接着面積を測定した。結果を図７（ａ）及び（ｂ）に示す。図７（ａ）は図６（ａ）と同一である。図７（ｂ）では、ヒスタミン刺激直後に細胞の頂点高さが高くなったが、その後は頂点高さも接着面積もほとんど変化しなかった。これは、細胞によって接着力すなわち剥がれ難さが異なることを意味していると推察され、接着力が弱く剥がれ易い細胞は図７（ａ）のような挙動を示し、接着力が強く剥がれ難い細胞は図７（ｂ）のような挙動を示すものと解釈できる。
【００５３】
評価に用いる細胞が、接着力が強く剥がれ難い細胞である場合は、細胞の接着面積の変化を測定するという従来の方法では適切な評価が行えないことを意味する。一方、細胞の頂点高さの変化を測定するという本願発明の方法では、そのような細胞を用いた場合でも適切な評価が可能であることが、図７に示した結果から理解できる。
【００５４】
（実施例４）
レボセチリジンに代えて、デキストロセチリジン又はラセミ体のセチリジンで前処理し、ヒスタミン刺激後の血管内皮細胞の様子を定量位相顕微鏡で観察し、細胞の頂点高さ及び接着面積を測定した。デキストロセチリジンで前処理した場合の細胞の様子を図８（ａ）及び（ｂ）に示し、ラセミ体のセチリジンで前処理した場合の細胞の様子を図９（ａ）及び（ｂ）に示す。図８及び９において、（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ観察開始から２７０秒後及び１１７０秒後の細胞の様子を表している。ヒスタミン刺激は観察開始から３００秒後に行っている。
【００５５】
図８（ｂ）から明らかなように、デキストロセチリジンで前処理した場合は、ヒスタミン刺激により、細胞の頂点高さが高くなり、また、細胞の接着面積が小さくなる様子が観察された。この観察結果は、デキストロセチリジンに抗ヒスタミン作用がほとんどないことと一致するものである。
【００５６】
図９（ｂ）から明らかなように、ラセミ体のセチリジンで前処理した場合は、ヒスタミン刺激を行っても、細胞の頂点高さも接着面積もほとんど変化しなかった。この結果は、ラセミ体のセチリジンが抗ヒスタミン作用を有することと一致するものである。
【００５７】
（実施例５）
細胞の頂点高さの変化を複数の細胞（Ｎ＝２５〜３７）について測定し、細胞の頂点高さをヒスタミン刺激時の細胞の頂点高さで標準化した結果を図１０にまとめた。図１０（ａ）は前処理なし、（ｂ）はレボセチリジンによる前処理、（ｃ）はデキストロセチリジンによる前処理、（ｄ）はラセミ体のセチリジンによる前処理を行った時の細胞の頂点高さの変化を示すものである。図１０の横軸は、ヒスタミン刺激時を０秒とした場合の経過時間（秒）を表している。図１０（ａ）及び（ｃ）では、ヒスタミン刺激後に細胞の頂点高さが高くなっているが、図１０（ｂ）及び（ｄ）では、ヒスタミン刺激後に細胞の頂点高さの上昇が図１０（ａ）及び（ｃ）よりも少ない。
【００５８】
各処理群での細胞の頂点高さの変化の平均化したものを図１１に示す。図１１から明らかなように、デキストロセチリジンで前処理した場合の細胞の頂点高さは、前処理なしの場合と同様に上昇したのに対して、レボセチリジン又はラセミ体のセチリジンで前処理した場合の細胞の頂点高さはほとんど上昇しなかった。
【００５９】
ヒスタミン刺激から８分後の細胞の頂点高さをヒスタミン刺激時の細胞の頂点高さを基準に標準化したものを図１２のボックスプロットにまとめた。また、各処理群間でのｔ検定の結果を表１にまとめた。図１２及び表１に示す結果から明らかなように、レボセチリジン又はラセミ体のセチリジンで前処理した場合は、前処理なし又はデキストロセチリジンで前処理した場合と比較して有意に細胞の頂点高さが低く、抗ヒスタミン作用（血管内皮細胞の血管透過性亢進の抑制作用）と細胞の頂点高さには相関があることが確認できた。
【００６０】
【表１】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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