(57)【要約】【課題】カシス果実の抽出物が抗ウイルス作用や抗菌作用を示す新たなウイルスやバクテリアを特定し、当該知見に基づいた新たな技術を提供する。【解決手段】カシス果実の抽出物を有効成分として含有するエンベロープを有しないウイルスに対するウイルス不活化剤が提供される。カシス果実の抽出物を有効成分として含有する鳥インフルエンザウイルスに対するウイルス不活化剤が提供される。カシス果実の抽出物を有効成分として含有する緑膿菌又は黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤が提供される。エンベロープを有しないウイルス、鳥インフルエンザウイルス、又は緑膿菌若しくは黄色ブドウ球菌にカシス果実の抽出物を接触させることにより、前記ウイルスを不活化あるいは前記緑膿菌の増殖を抑制する抗ウイルス方法・抗菌方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カシス果実の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンベロープを有しないウイルスに対するウイルス不活化剤。
【請求項２】
前記エンベロープを有しないウイルスは、カリシウイルス、口蹄疫ウイルス、及びアデノウイルスからなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項１に記載のウイルス不活化剤。
【請求項３】
カシス果実の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする鳥インフルエンザウイルスに対するウイルス不活化剤。
【請求項４】
カシス果実の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする緑膿菌又は黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤。
【請求項５】
エンベロープを有しないウイルスにカシス果実の抽出物を接触させることにより、前記ウイルスを不活化することを特徴とするウイルス不活化方法。
【請求項６】
前記エンベロープを有しないウイルスは、カリシウイルス、口蹄疫ウイルス、及びアデノウイルスからなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項５に記載のウイルス不活化方法。
【請求項７】
鳥インフルエンザウイルスにカシス果実の抽出物を接触させることにより、前記鳥インフルエンザウイルスを不活化することを特徴とするウイルス不活化方法。
【請求項８】
緑膿菌又は黄色ブドウ球菌にカシス果実の抽出物を接触させることにより、前記緑膿菌又は黄色ブドウ球菌の増殖を抑制することを特徴とする抗菌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス不活化剤、抗菌剤、ウイルス不活化方法、並びに、抗菌方法に関し、さらに詳細には、カシス果実の抽出物を有効成分として含有するウイルス不活化剤及び抗菌剤、並びに、カシス果実の抽出物を利用したウイルス不活化方法及び抗菌方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、植物等の天然物由来成分が有する生理活性を利用した製品が、種々開発されている。
【０００３】
カシス（黒すぐり、黒房すぐり、ブラックカラント）はスグリ科スグリ属に分類される植物であり、その濃紫色の果実が食用に供されている。そして、カシス果実の抽出物が有する生理活性を利用した種々の技術が知られている。特許文献１には、カシス果実の抽出物を含む栄養補助食品が開示されている。
【０００４】
一方、カシス果実の抽出物が有する抗ウイルス作用（ウイルス不活化作用）や抗菌作用（増殖抑制作用や殺菌作用）について、インビトロとインビボの両面から調べられている。特許文献２には、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、又は単純ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス活性を備えた、黒房すぐり抽出物濃縮液を含む抗ウイルス剤について記載されている。また特許文献２では、前記ウイルスが全てエンベロープを有するウイルスであるところ、黒房すぐり抽出物がエンベロープの脂質または蛋白質と結合することにより、前記ウイルスに対する抗ウイルス活性を示すものと考察している（段落〔００６３〕）。さらに当該抗ウイルス剤は、大腸菌Ｏ１５７、ネズミチフス菌、腸炎サルモネラ菌に対する殺菌作用も有するとされている。
【０００５】
特許文献３には、黒房すぐり抽出物濃縮液に含まれるアントシアニンが抗ウイルス活性を示す成分であることが記載されている。
【０００６】
特許文献４と非特許文献１では、赤血球凝集阻害試験とモデルマウスを用いた試験によって、カシス果実抽出物がヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス作用を有することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１２−５２８１４８号公報
【特許文献２】特開２０００−２１２０９２号公報
【特許文献３】特開２００１−３２８９４１号公報
【特許文献４】特開２００９−２６９８６１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】野口ら「カシスエキスの抗インフルエンザウイルス作用」，信州大学農学部紀要，第４４巻，第１・２号（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、カシス果実の抽出物が種々のウイルスやバクテリアに対する抗ウイルス作用・抗菌作用を有することが知られている。そこで本発明は、カシス果実の抽出物が抗ウイルス作用や抗菌作用を示す新たなウイルスやバクテリアを特定し、当該知見に基づいた新たな技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、カシス果実の抽出物が有する抗ウイルス作用・抗菌作用に関する研究をさらに進めた結果、消毒剤に対する抵抗性が強いとされるエンベロープを有しないウイルスに対しても、カシス果実の抽出物が抗ウイルス作用を示すことを見出した。また、鳥インフルエンザウイルスに対しても、カシス果実の抽出物が抗ウイルス作用を示すことを見出した。さらに、グラム陰性菌である緑膿菌やグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌に対してもカシス果実の抽出物が抗菌作用を示すことを見出した。
【００１１】
上記した知見に基づいて提供される本発明の１つの様相は、カシス果実の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンベロープを有しないウイルスに対するウイルス不活化剤である。
【００１２】
エンベロープを有さないウイルスは消毒剤に対する抵抗性が高く、塩素剤等の強力な消毒剤を用いなければ不活化できない。例えば、エタノールや界面活性剤では不活化できない。しかし本発明のウイルス不活化剤によれば、エンベロープを有さないウイルスを、天然物たるカシス果実の抽出物の作用によって不活化することができる。
【００１３】
好ましくは、前記エンベロープを有しないウイルスは、カリシウイルス、口蹄疫ウイルス、及びアデノウイルスからなる群より選ばれた少なくとも１種である。
【００１４】
本発明の１つの様相は、カシス果実の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする鳥インフルエンザウイルスに対するウイルス不活化剤である。
【００１５】
鳥インフルエンザウイルスは、感染性が強く、鳥類に対する高い死亡率を示す病原体である。本発明のウイルス不活化剤によれば、鳥インフルエンザウイルスを、天然物たるカシス果実の抽出物の作用によって不活化することができる。
【００１６】
本発明の１つの様相は、カシス果実の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする緑膿菌又は黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤である。
【００１７】
本発明の抗菌剤によれば、緑膿菌や黄色ブドウ球菌を、天然物たるカシス果実の抽出物の作用によって抗菌することができる。
ここで「抗菌」には、細菌の可逆的な増殖抑制と不可逆的な増殖抑制（すなわち殺菌）の両方が含まれる。
【００１８】
本発明の１つの様相は、エンベロープを有しないウイルスにカシス果実の抽出物を接触させることにより、前記ウイルスを不活化することを特徴とするウイルス不活化方法である。
【００１９】
本発明のウイルス不活化方法によれば、塩素剤等の強力な消毒剤でなければ不活化できなかったエンベロープを有さないウイルスを、天然物たるカシス果実の抽出物の作用によって不活化することができる。
【００２０】
好ましくは、前記エンベロープを有しないウイルスは、カリシウイルス、口蹄疫ウイルス、及びアデノウイルスからなる群より選ばれた少なくとも１種である。
【００２１】
本発明の１つの様相は、鳥インフルエンザウイルスにカシス果実の抽出物を接触させることにより、前記鳥インフルエンザウイルスを不活化することを特徴とするウイルス不活化方法である。
【００２２】
本発明のウイルス不活化方法によれば、鳥インフルエンザウイルスを、天然物たるカシス果実の抽出物の作用によって不活化することができる。
【００２３】
本発明の１つの様相は、緑膿菌又は黄色ブドウ球菌にカシス果実の抽出物を接触させることにより、前記緑膿菌又は黄色ブドウ球菌の増殖を抑制することを特徴とする抗菌方法である。
【００２４】
本発明の抗菌方法によれば、緑膿菌や黄色ブドウ球菌を、天然物たるカシス果実の抽出物の作用によって抗菌することができる。ここで「増殖の抑制」には、可逆的な増殖抑制と不可逆的な増殖抑制（すなわち殺菌）の両方が含まれる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、天然物たるカシス果実の抽出物の作用によって、エンベロープを有さないウイルス、鳥インフルエンザウイルス、緑膿菌又は黄色ブドウ球菌を不活化又は抗菌することができる。そのため、本発明は高い安全性と安心感をもって、前記ウイルスとバクテリアを対象とした抗ウイルス・抗菌処理を行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の抗ウイルス剤・抗菌剤はカシス果実の抽出物を有効成分として含有するものであり、エンベロープを有さないウイルス、鳥インフルエンザウイルス、緑膿菌又は黄色ブドウ球菌を対象とするものである。
【００２７】
「カシス果実の抽出物」の種類や調製方法については、例えば、特表２０１２−５２８１４８号公報に記載の抽出物（ブラックカラント抽出物）や調製方法を採用することができる。
【００２８】
「カシス果実」には、丸ごとの果実のほか、果実の部分（果実の構成要素）が含まれる。果実の構成要素としては、果実の皮（果皮）、果肉、種子が挙げられる。
【００２９】
「カシス果実の抽出物」には、「カシス果実の搾りカス」と、「カシス果実の圧搾液」が少なくとも含まれる。さらに、カシス果実の圧搾液の濃縮液も、カシス果実の抽出物に含まれる。さらに、これらの溶媒抽出物、すなわち、カシス果実の搾りカスの溶媒抽出物、カシス果実の圧搾液の溶媒抽出物、当該圧搾液の濃縮液の溶媒抽出物、カシス果皮の溶媒抽出物も、カシス果実の抽出物に含まれる。さらに、これらの乾燥物（例えば、凍結乾燥物）、並びに当該乾燥物を粉砕したもの（例えば粉末状のもの）も、カシス果実の抽出物に含まれる。
【００３０】
カシス果実の抽出物の調製方法については、抽出物の種類や形態によって適宜選択すればよい。
例えば、カシス果実の搾りカスの溶媒抽出物から、粉末状のカシス果実の抽出物を得ることができる。例えば、カシス果実の搾りカスをエタノール等の溶媒で抽出し、溶媒抽出液を得る。この溶媒抽出液を濃縮した後、凍結乾燥することにより、固体形状のカシス果実の抽出物を得ることができる。また、この固形物を粉砕することにより、粉末状のカシス果実の抽出物を得ることができる。
【００３１】
別の例として、カシス果実の圧搾液から、粉末状のカシス果実の抽出物を得ることができる。例えば、丸ごとのカシス果実を圧搾して圧搾物を得る。この圧搾物を遠心分離等によって固液分離し、圧搾液を得る。この圧搾液を濃縮した後、凍結乾燥することにより、固体形状のカシス果実の抽出物を得ることができる。さらに、この固形物を粉砕することにより、粉末状のカシス果実の抽出物を得ることができる。
【００３２】
本発明の抗ウイルス剤・抗菌剤におけるカシス果実の抽出物の含量としては、対象ウイルスやバクテリアに対して効果を示す含量であれば特に限定はなく、カシス果実の抽出物の種類や、使用方法（例えば、使用場所、使用温度、対象物との接触時間など）等によって適宜設定することができる。
例を挙げると、エンベロープを有さないＲＮＡウイルス（カリシウイルス等）を対象とする場合には、カシス果皮のエタノール抽出乾燥物（アントシアニン１０％含有）を１００μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２５０μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬ含有するよう調製することができる。カシス果実の圧搾液濃縮物（６倍濃縮）であれば、１２．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは２５ｍｇ／ｍＬ以上含有するよう調製することができる。
エンベロープを有さないＤＮＡウイルス（アデノウイルス等）を対象とする場合には、カシス果皮のエタノール抽出乾燥物（アントシアニン１０％含有）を６．２５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１２．５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２５ｍｇ／ｍＬ以上含有するよう調製することができる。
【００３３】
また鳥インフルエンザウイルスを対象とする場合には、例えば、カシス果皮のエタノール抽出乾燥物（アントシアニン１０％含有）を５０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは７０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ含有するよう調製することができる。
【００３４】
緑膿菌や黄色ブドウ球菌を対象とする場合には、例えば、カシス果汁を５〜５０％含有するように抗菌剤を調製することができる。そして具体的使用法としては、例えば、カシス果汁を５０％含有する抗菌剤に対象物を１時間以上接触させる、あるいは、カシス果汁を５％以上含有する抗抗菌剤に対象物を６時間以上接触させることにより、緑膿菌を処理することができる。また、カシス果汁を５０％含有する抗菌剤に対象物を２４時間以上接触させることにより、黄色ブドウ球菌を処理することができる。
【００３５】
本発明の抗ウイルス剤・抗菌剤の形態としては特に限定はなく、液体状、固体状、ペースト状、スラリー状などのいずれの形状でもよい。
液体状の場合における溶媒としては水が代表的であるが、他の溶媒、例えばエタノールやイソプロパノール等のアルコールであってもよい。例えば、これらの溶媒にカシス果実の抽出物を溶解あるいは分散させて、本発明の抗ウイルス剤・抗菌剤とすることができる。
【００３６】
本発明の１つの様相では、エンベロープを有さないウイルスを処理対象とする。当該ウイルスは、ＤＮＡウイルスとＲＮＡウイルスのいずれであってもよい。エンベロープを有さないウイルスの例としては、カリシウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ノダウイルス（以上、ＲＮＡウイルス）、アデノウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス（以上、ＤＮＡウイルス）、等が挙げられる。
好ましい実施形態では、カリシウイルス、口蹄疫ウイルス、及びアデノウイルスからなる群より選ばれた少なくとも１種を処理対象とする。
【００３７】
本発明のウイルス不活化剤・抗菌剤の使用方法としては、処理対象物や処理対象場所へ散布や噴霧することが挙げられる。例えば、鳥インフルエンザウイルスの不活化を目的として、鶏舎やその周辺に本発明のウイルス不活化剤を散布することが挙げられる。他の例として、カリシウイルス（エンベロープを有しないウイルス）の不活化を目的として、ペットの飼育場所等に散布することが挙げられる。また、口蹄疫ウイルス（エンベロープを有しないウイルス）の不活化を目的として、家畜舎に散布することが挙げられる。また、アデノウイルス（エンベロープを有しないウイルス）の不活化を目的として、医療施設内や家屋内に散布することが挙げられる。さらに、緑膿菌や黄色ブドウ球菌の殺菌を目的として、医療施設内や家屋内に散布することが挙げられる。
【００３８】
本発明のウイルス不活化剤・抗菌剤の使用方法の他の例として、液体状のウイルス不活化剤・抗菌剤に処理対象物を浸漬することが挙げられる。また、液体状のウイルス不活化剤・抗菌剤を処理対象物に塗布することが挙げられる。
【００３９】
さらに、ウイルス不活化剤・抗菌剤を処理対象物自体に配合することが挙げられる。例えば、食品にウイルス不活化剤・抗菌剤を配合させる（例えば練り込む）ことが挙げられる。本発明のウイルス不活化剤・抗菌剤は、食用に供されているカシス果実の抽出物を有効成分とするものであるから、食品への適用が容易である。
【００４０】
なお、本発明のウイルス不活化剤・抗菌剤と処理対象物等との接触時間については、対象とするウイルスや細菌の種類、処理環境（例えば、温度）等に応じて適宜選択すればよく、特に限定はない。
【００４１】
本発明のウイルス不活化方法・抗菌方法は、カシス果実の抽出物を対象のウイルスやバクテリアに接触させることにより、ウイルスの不活化やバクテリアの増殖抑制を行うものである。例えば、上記した本発明のウイルス不活化剤・抗菌剤をウイルスやバクテリアに接触させることにより、本発明のウイルス不活化方法・抗菌方法を実施することができる。
【実施例】
【００４２】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
以下の実施例で用いたカシス果実の抽出物（カシス抽出物）（ａ）〜（ｆ）（いずれもスジョン・ジャパン社製）の詳細は以下のとおりである。
（ａ）「ドライカシスパウダー」（品番D0002）：
カシス果実そのものを冷凍乾燥にし、それを粉末化した固形物
（ｂ）「カシス濃縮果汁」（品番N10031）：
カシス果実そのものを圧縮しそこから得られたカシス果汁の液体から水分を取り除き６倍濃縮して得られる液状物質
（ｃ）「カシス搾りカス」（品番S0001）：
カシス果実そのものを圧縮し水分を取り除いた果皮と種を乾燥し、それを粉末化した固形物
（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」（品番A10010）：
カシス果皮からエタノール抽出により得られた液状物質を乾燥し粉末化した１０％のアントシアニン量を含む固形物
（ｅ）「アントシアニンパウダー」（品番A0028）：
カシス果皮からエタノール抽出により得られた液状物質を乾燥し粉末化した２９．８％のアントシアニン量を含む固形物
（ｆ）「アントシアニンエクストラクトパウダー」（品番A0057）：
カシス果皮からエタノール抽出により得られた液状物質を乾燥し粉末化した５８．３％のアントシアニン量を含む固形物
【００４４】
すなわち、（ａ）は丸ごとの果実、（ｂ）は果実の圧搾液、（ｃ）は果実の搾りカスに、それぞれ由来する。また（ｄ）〜（ｆ）は、いずれも果皮のエタノール抽出物に由来する。
【００４５】
〔実施例１〕
本実施例では、カシス抽出物のネコカリシウイルスに対する効果を調べた。
【００４６】
１．使用したカシス抽出物試料、ウイルス、細胞
（１）カシス抽出物試料
（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」（品番A10010）
（ｂ）「カシス濃縮果汁」（品番N10031）
【００４７】
（２）ウイルス
ネコカリシウイルスＦ９株を用いた。このウイルスをネコ腎臓株化細胞であるＣＲＦＫ細胞に接種し、３７℃で４８時間培養し、十分に細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められたことを確認した上で、凍結融解を３回行った。その後、培養上清を遠心し、その上清をウイルス液とした。得られたウイルス液について５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ50）を算出後、試験に用いた。
【００４８】
（３）細胞
ＣＲＦＫ細胞を用いた。
【００４９】
２．試験方法
各カシス抽出物サンプルについて、濃度が０．２ｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて懸濁した。２時間静置後、２０００ｒｐｍで１分間遠心処理を行った。遠心上清を５００μＬ採取し、１．５ｍＬ容チューブに移した。
一方、ウイルス液を、約１０7.0ＴＣＩＤ50／ｍＬとなるようにＰＢＳにて調整した。
１．５ｍＬ容チューブ内のサンプル（遠心上清）に等量のウイルス液を加えて撹拌し、氷上で１０分間反応させた（以下、「反応液」と称する。）。反応液の一部をＰＢＳにて１０倍階段希釈し、９６穴プレートで培養するＣＲＦＫ細胞に、１穴あたり２５μＬずつ４穴に接種した。３７℃で１時間吸着させた後、反応液を除去し、１％牛胎児血清含ＤＭＥＭ培地を１穴あたり１００μＬずつ分注した。３７℃で２〜３日間培養した後、ＣＰＥの有無により、感染性ウイルスの有無を判定した。（試験１−１）
【００５０】
さらに、同様の試験を、カシス抽出物サンプルの濃度をより低濃度にして行った（計３回）。ただし、反応液の１０倍階段希釈は１００倍までとした。（試験１−２）
【００５１】
３．試験１−１の結果
濃度０．２ｇ／ｍＬのサンプルを用いた結果を表１に示す。表１中、「＋」は試験に用いた１０7.0ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルスが検出限界以下になったことを示し、「−」は感染性ウイルスが検出されたことを示し、「ＮＤ」は、細胞が傷害されたためウイルスを検出できなかったことを示す。
【００５２】
（１）「カシスアントシアニンパウダー１０％」による抗ウイルス効果
原液および１０倍希釈した反応液を接種した細胞は、細胞傷害性が認められ細胞が死滅したため、ウイルス感染によるＣＰＥを観察できず、ウイルスの不活化は判定できなかった。しかし、１００倍希釈した反応液では細胞傷害性は認められず、ウイルスの不活化が認められた（表１）。また「カシスアントシアニンパウダー１０％」は、ネコカリシウイルスの感染価を約１０の７乗分の１以下に減少させた。
【００５３】
（２）「カシス濃縮果汁」による抗ウイルス効果
原液の反応液を接種した細胞は、細胞傷害性が認められたため、ウイルス感染によるＣＰＥを観察できず、ウイルスの不活化は判定できなかった。しかし、１０倍および１００倍希釈反応液では細胞傷害性は認められず、ウイルスの不活化が認められた（表１）。また「カシス濃縮果汁」は、ネコカリシウイルスの感染価を約１０の３乗分の１以下に減少させた。
【００５４】
【表１】
2014227409.tif 000002
【００５５】
４．試験１−２の結果
濃度０．２ｇ／ｍＬにおける試験により、「カシスアントシアニンパウダー１０％」と「カシス濃縮果汁」について抗ネコカリシウイルス効果が認められたことから、より低濃度の試験サンプルによる抗ウイルス効果を調べた。反応液原液を用いた試験結果を表２に、１０倍希釈反応液を用いた試験結果を表３に、それぞれ示す。表２，３中、「＋」は試験に用いた１０7.0ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルスが検出限界以下になったことを示し、「−」は感染性ウイルスが検出されたことを示す。空欄は試験を行わなかったことを示す。「ＮＤ」は細胞が傷害されたためウイルスを検出できなかったことを示す。
【００５６】
（１）「カシスアントシアニンパウダー１０％」による抗ウイルス効果
原液を用いた試験では、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ以上でウイルスの不活化が認められた（表２）。１０倍希釈反応液を用いた試験では、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ以上でウイルスの不活化が認められた（表３）。１０倍希釈反応液を用いた試験から、ウイルスを検出限界以下にする「カシスアントシアニンパウダー１０％」の最低濃度は、２５０μｇ／ｍＬと算出された。
【００５７】
（２）「カシス濃縮果汁」による抗ウイルス効果
１０倍希釈反応液を用いた試験では、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ以上でウイルスの不活化が認められた（表３）。原液を用いた試験では、細胞障害性が認められたためウイルスの不活化を検出できなかった（表２）。１０倍希釈反応液を用いた試験から、ウイルスを検出限界以下にする「カシス濃縮果汁」の最低濃度は、２５ｍｇ／ｍＬと算出された。
【００５８】
【表２】
2014227409.tif 000003
【００５９】
【表３】
2014227409.tif 000004
【００６０】
〔実施例２〕
本実施例では、カシス抽出物のアデノウイルスに対する効果を調べた。
【００６１】
（１）カシス抽出物試料
（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」（品番A10010）
（ｂ）「カシス濃縮果汁」（品番N10031）
【００６２】
（２）ウイルス
ヒトアデノウイルス３型Ｇ．Ｂ．株（ＡＴＣＣ）を用いた。このウイルスをヒト子宮頚癌由来株化細胞であるＨｅＬａ細胞に接種し、３７℃で３〜５日間培養し、十分に細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められたことを確認した上で、凍結融解を３回行った。その後、培養上清を遠心し、その上清をウイルス液とした。得られたウイルス液について５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ50）を算出後、試験に用いた。
【００６３】
（３）細胞
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ−２９３細胞を用いた。
【００６４】
２．試験方法
各カシス抽出物サンプルについて、濃度が０．２ｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて懸濁した。２時間静置後、２０００ｒｐｍで１分間遠心処理を行った。遠心上清を５００μＬ採取し、１．５ｍＬ容チューブに移した。
一方、ウイルス液を、約８×１０6.0ＴＣＩＤ50／ｍＬとなるようにＰＢＳにて調整した。
１．５ｍＬ容チューブ内のサンプル（遠心上清）に等量のウイルス液を加えて撹拌し、氷上で１０分間反応させた（以下、「反応液」と称する。）。９６穴プレートにあらかじめＭＥＭ培地を１穴あたり２５μＬずつ入れ、１０％牛胎児血清含ＭＥＭで懸濁したＨＥＫ−２９３細胞液を１穴あたり５０μＬずつ入れた。さらに、反応液の一部をＰＢＳにて１０倍階段希釈し、１穴あたり２５μＬずつ４穴に接種した。３７℃で１１〜１３日間培養した後、ＣＰＥの有無により、感染性ウイルスの有無を判定した。（試験２−１）
【００６５】
さらに、同様の試験を、カシス抽出物サンプルの濃度をより低濃度にして行った（計３回）。ただし、反応液の１０倍階段希釈は１００倍までとした。（試験２−２）
【００６６】
３．試験２−１の結果
濃度０．２／ｍＬのサンプルを用いた結果を表４に示す。表４中、「＋」は試験に用いた１０7.0ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルスが検出限界以下になったことを示し、「−」は感染性ウイルスが検出されたことを示し、「ＮＤ」は、細胞が傷害されたためウイルスを検出できなかったことを示す。
【００６７】
（１）「カシスアントシアニンパウダー１０％」による抗ウイルス効果
原液および１０倍希釈した反応液を接種した細胞は、細胞傷害性が認められ細胞が死滅したため、ウイルス感染によるＣＰＥを観察できず、ウイルスの不活化は判定できなかった。しかし、１００倍希釈した反応液では細胞傷害性は認められず、ウイルスの不活化が認められた（表４）。また「カシスアントシアニンパウダー１０％」は、ヒトアデノウイルスの感染価を約１０の４乗分の１以下に減少させた。
【００６８】
（２）「カシス濃縮果汁」による抗ウイルス効果
原液の反応液を接種した細胞は、細胞傷害性が認められたため、ウイルス感染によるＣＰＥを観察できず、ウイルスの不活化は判定できなかった。また１０倍および１００倍希釈反応液において、ウイルスの不活化は認められなかった（表４）。
【００６９】
【表４】
2014227409.tif 000005
【００７０】
４．試験２−２の結果
（１）「カシスアントシアニンパウダー１０％」による抗ウイルス効果
濃度０．２ｇ／ｍＬにおける試験により、「カシスアントシアニンパウダー１０％」について抗ヒトアデノウイルス効果が認められた（表４）ことから、より低濃度の試験サンプルによる抗ウイルス効果を調べた。反応液原液、１０倍希釈反応液、及び１００倍希釈反応液について試験を行った結果、１００倍希釈反応液を用いた場合に抗ウイルス効果が認められた。１００倍希釈反応液を用いた場合の試験結果を表５に示す。表５中、「＋」は試験に用いた８×１０6.0ＴＣＩＤ50／ｍＬのヒトアデノウイルスによる細胞変性効果が５０％以下になったことを示す。「−」は試験に用いた８×１０6.0ＴＣＩＤ50／ｍＬのヒトアデノウイルスによる細胞変性効果が５０％以上になったことを示す。「ＮＤ」は細胞が傷害されたためウイルスを検出できなかったことを示す。
すなわち、１００倍希釈反応液を用いた試験では、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ以上でウイルスの不活化が認められた。このことから、ウイルスを検出限界以下にする「カシスアントシアニンパウダー１０％」の最低濃度は、２５ｍｇ／ｍＬと算出された。
【００７１】
【表５】
2014227409.tif 000006
【００７２】
〔実施例３〕
本実施例では、カシス抽出物の緑膿菌及び黄色ブドウ球菌に対する効果を調べた。
【００７３】
１．使用したカシス抽出物試料、菌株
（１）カシス抽出物
（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」（品番A10010）
（ｂ）「カシス濃縮果汁」（品番N10031）
【００７４】
（２）菌株
緑膿菌としてPseudomonas aeruginosa ATCC 27853株を用いた。黄色ブドウ球菌としてStaphylococcus aureus ATCC29213株を用いた。凍結保存された菌株をＬＢ寒天平板培地またはMueller-Hinton寒天培地に接種し、３７℃で一晩培養した。ＰＢＳ２ｍＬに菌体を0.5 McFarland（およそ１０8ＣＦＵ／ｍＬ）相当に懸濁した。懸濁液をＰＢＳで１００倍希釈し、試験に供した。
【００７５】
２．試験方法
「カシスアントシアニンパウダー１０％」を、濃度が２００ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳにて懸濁した。２時間静置後、２０００ｒｐｍで１分間遠心処理を行った。遠心上清を３００μＬ採取し、１．５ｍＬ容チューブに移した。「カシス濃縮果汁」は、原液もしくは２〜１０倍希釈したものを３００μＬ採取し、１．５ｍＬ容チューブに移した。陰性コントロールとして、ＰＢＳのみを３００μＬを１．５ｍＬ容チューブに移した。
１．５ｍＬ容チューブ内のサンプルに等量の菌液（菌懸濁液の１００倍希釈液）を加えて撹拌し、氷上で１０分間、１時間、６時間、又は２４時間反応させた（以下、「反応液」と称する。）。反応液を１０倍希釈し、希釈した反応液を１００μＬずつ、２枚のMueller-Hinton培地に接種した。接種菌数を確認するため、供試菌液を１０、１０2、１０3、及び１０4希釈し、希釈した菌液を１０μＬずつMueller-Hinton培地に接種した。３７℃で一晩培養した後、菌の発育の有無を確認し、コロニー数を計測した。
【００７６】
３．結果
表６に、「アントシアニンパウダー１０％」の緑膿菌に対する効果を調べた実験結果を示す。表７に、「アントシアニンパウダー１０％」の黄色ブドウ球菌に対する効果を調べた実験結果を示す。表８に、「カシス濃縮果汁」の緑膿菌に対する効果を調べた実験結果を示す。表９に、「カシス濃縮果汁」の黄色ブドウ球菌に対する効果を調べた実験結果を示す。表６〜９中、「＋」の数はコロニー数の多寡を表す。ＮＤは試験を行わなかったことを表す。接種菌数はMueller-Hinton寒天培地に塗布した際の菌数である。
【００７７】
（１）「アントシアニンパウダー１０％」による抗菌効果
表６に示すように、緑膿菌については、濃度２００ｍｇ／ｍＬ（反応時の濃度；１００ｍｇ／ｍＬ）の試験サンプルと６時間反応させた際、コロニー数が１／１００〜１／１０００以下に減少し、２４時間では菌の発育が認められなかった。濃度１００ｍｇ／ｍＬ（反応時の濃度；５０ｍｇ／ｍＬ）では、６時間後にコロニー数の減少が認められ、２４時間後には菌の発育を阻止した。濃度５０ｍｇ／ｍＬ（反応時の濃度２５ｍｇ／ｍＬ）では、２４時間後にコロニー数の減少を認めた。
【００７８】
表７に示すように、黄色ブドウ球菌については、濃度２００ｍｇ／ｍＬ（反応時の濃度；１００ｍｇ／ｍＬ）の試験サンプルと２４時間反応させた際、コロニー数の減少が認められ、４回の試験のうち、２回はコロニー数が１／１００以下に減少した。濃度１００ｍｇ／ｍＬ（反応時の濃度；５０ｍｇ／ｍＬ）では、コロニー数がやや減少し、その他の濃度では、いずれの反応時間においても著明な菌数の減少は認められなかった。
【００７９】
（２）「カシス濃縮果汁」による抗菌効果
表８に示すように、緑膿菌については、試験サンプルの原液（反応時の濃度；５０％）では、１０分間の反応でコロニー数が減少し、１時間後にはコロニー数が１／１００以下となり、４回の試験のうち３回は、菌が発育しなかった。２倍希釈液（反応時の濃度；２５％）では、１０分後からコロニー数の減少が認められ、４倍希釈液（反応時の濃度；１２．５％）では、１時間後にコロニー数の減少が認められた。６時間後には試験したすべての濃度において、菌の発育を阻止した。
【００８０】
表９に示すように、黄色ブドウ球菌については、試験サンプルの原液（反応時の濃度５０％）に６時間反応させた際、コロニー数の減少が認められ、２４時間後にはコロニー数は１／１００〜１／１０００以下となった。２４時間反応させた際、２倍希釈液ではコロニー数が１／１００以下に減少し、４倍希釈液では１／１０〜１／１００以下に減少した。１０倍希釈液においてもコロニー数の減少を認めた。
【００８１】
【表６】
2014227409.tif 000007
【００８２】
【表７】
2014227409.tif 000008
【００８３】
【表８】
2014227409.tif 000009
【００８４】
【表９】
2014227409.tif 000010
【００８５】
〔実施例４〕
本実施例では、カシス抽出物の鳥インフルエンザウイルスに対する効果を調べた。
【００８６】
１．使用したカシス抽出物試料、ウイルス、細胞
（１）カシス抽出物試料
（ａ）「ドライカシスパウダー」（品番D0002）
（ｂ）「カシス濃縮果汁」（品番N10031）
（ｃ）「カシス搾りカス」（品番S0001）
（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」（品番A10010）
（ｅ）「アントシアニンパウダー」（品番A0028）
（ｆ）「アントシアニンエクストラクトパウダー」（品番A0057）
【００８７】
（２）ウイルス
鳥インフルエンザウイルスA/whistling swan/Shimane/499/83 (H5N3) 株を用いた。これは、１９８３年に大槻らが、島根県に飛来したコハクチョウの糞便から分離した低病原性鳥インフルエンザウイルスである（Research in Veterinary Science, 1987, 43, pp. 177-179、及びActa. Virol., 28:534, 1987)。本ウイルス株についてはヒナで継代することにより、強毒化させることに成功している。このウイルスを１０日齢の発育鶏卵の尿膜腔内に接種し３５℃で４８時間培養した後、尿液を採取し、ウイルス液とした。本試験に供したウイルスは、５０％鶏卵感染価（ＥＩＤ50）を算出後、試験に用いた。
【００８８】
（３）使用鶏卵
１０日齢のＳＰＦ発育鶏卵を用いた。栃木県那須市の青木種鶏場から有精卵を導入し、京都産業大学鳥インフルエンザ研究センターにおいて孵卵させ、１０日齢に達した時点で試験に供した。
【００８９】
２．試験方法
各カシス抽出物サンプルについて、濃度が０．２ｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳにて懸濁した。２時間静置後、２０００ｒｐｍで１分間遠心処理を行った。遠心上清を５００μＬ採取し、１．５ｍＬ容チューブに移した。
一方、ウイルス液を、約１０7.0ＥＩＤ50／０．２ｍＬとなるようにＰＢＳにて調整した。
１．５ｍＬ容チューブ内のサンプル（遠心上清）に等量のウイルス液を加えて撹拌し、氷上で１０分間反応させた（以下、「反応液」と称する。）。反応液を０．２ｍＬずつ、３個の１０日齢発育鶏卵の尿膜腔内に接種した。３５℃で４８時間培養した後、発育鶏卵の尿液を採取し、０．５％鶏赤血球浮遊液と反応させ、赤血球の凝集によりウイルス増殖の有無を判定した。残存ウイルス感染価はReed and Muench の方法によりＥＩＤ50を算出した。（試験４−１）
【００９０】
さらに、一部の試料について、同様の試験を、カシス抽出物サンプルの濃度をより低濃度にして行った（計３回）。（試験４−２）
【００９１】
３．試験４−１の結果
（ａ）「ドライカシスパウダー」、（ｂ）「カシス濃縮果汁」、及び（ｃ）「カシス搾りカス」を用いた場合には、感染性ウイルスが検出された。一方、（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」、（ｅ）「アントシアニンパウダー」、（ｆ）「アントシアニンエクストラクトパウダー」を用いた場合には、１０7.0ＥＩＤ50／０．２ｍＬのウイルスが検出限界以下となった。このように、（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」、（ｅ）「アントシアニンパウダー」、（ｆ）「アントシアニンエクストラクトパウダー」について、抗ウイルス効果が認められた。
【００９２】
４．試験４−２の結果
抗ウイルス効果が認められた（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」、（ｅ）「アントシアニンパウダー」、（ｆ）「アントシアニンエクストラクトパウダー」について、より低濃度における抗ウイルス効果を調べた。結果を表１０に示す。表１０中、「＋」は試験に用いた１０7.0ＥＩＤ50／０．２ｍＬのウイルスが検出限界以下になったことを示し、「−」は感染性ウイルスが検出されたことを示す。空欄は試験を行わなかったことを示す。
すなわち、（ｄ）「カシスアントシアニンパウダー１０％」の場合には、５０ｍｇ／ｍＬ以上でウイルスが検出限界以下となった。また（ｅ）「アントシアニンパウダー」の場合には、２５ｍｇ／ｍＬ以上でウイルスが検出限界以下となった。また（ｆ）「アントシアニンエクストラクトパウダー」の場合には、５０ｍｇ／ｍＬ以上でウイルスが検出限界以下となった。
【００９３】
【表１０】
2014227409.tif 000011