(57)【要約】【課題】簡単な構成にもとづき、液体の残留量を効果的に低下させることができる吸引方法及びそれを用いた洗浄方法を提供する。【解決手段】吸引ノズルを下降させながら容器内の液体を吸引する方法であって、吸引ノズルが、液面と接触して液体と雰囲気ガスを吸引しながら、その接触状態を維持する速度で容器底部まで下降することを特徴とする、液体の吸引方法。また、容器中で固相成分と液相成分とを反応させた後、容器から液相を排出し、次いで容器に液体を注入して固相を洗浄した後に、上述の吸引方法により液体を吸引することを特徴とする、固相の洗浄方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸引ノズルを下降させながら容器内の液体を吸引する方法であって、吸引ノズルが、液面と接触して、液体と雰囲気ガスを吸引しながら、その接触状態を維持する速度で容器底部まで下降することを特徴とする、液体の吸引方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、請求項１に記載の吸引方法を複数回行い、その最後の回において、それ以前の回と比較して、吸引ノズルが下降する速度を最も小さくする、液体の吸引方法。
【請求項３】
容器中で固相成分と液相成分とを反応させた後、容器から液相を排出し、次いで容器に液体を注入して固相を洗浄した後に、請求項１に記載の方法により液体を吸引することを特徴とする、固相の洗浄方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、容器に液体を注入して固相を洗浄した後に請求項１に記載の方法によって液体を吸引するという工程を複数回行い、その最後の回において、それ以前の回と比較して、吸引ノズルが下降する速度を最も小さくする、固相の洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体の吸引方法及びそれを用いた固相の洗浄方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
固相状態の反応物と液相状態の反応物とが反応する固液反応すなわち不均一系反応を利用して、試料中の成分分析を行なう免疫測定において、固液反応後の反応液の除去および固相担体の分離・洗浄を行なうＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離またはＢ／Ｆ洗浄は、測定結果の感度、再現性等の基本的性能に重要な役割を担っている。たとえば、上部開口容器に固相試薬と試料を注入して反応させたのち第１のＢ／Ｆ洗浄を行ない、さらに標識試薬をその容器に注入して反応させたのち第２のＢ／Ｆ洗浄を行ない、さらに基質試薬を加えて、試料に起因する信号を測定する酵素免疫測定において、Ｂ／Ｆ洗浄に使用した洗浄液が容器に残留すると、またその残留量が測定ごとに変動すると、洗浄効率の低下、または洗浄後追加する試薬の希釈もしくは阻害を経て、測定値の正確性の低下または測定値のばらつきにつながる。
【０００３】
特許文献１および２には、吸引ノズルで平面状の底面を有する開口容器中の液体を吸引するとき、容器の隅に液体を残さないように、吸引ノズルを底面付近で水平移動させることが記述されている。また、特許文献３は、吸引ノズル部を多孔質かつ反応容器の内部形状に合わせた形にし、固相微粒子の集磁場所に対応するノズル部を引っ込ませて反応容器との隙間を広く取ることにより、微粒子の吸い込みを防止し、残液量を最小限にしようとするものである。さらに、特許文献４には、刷毛状の複数の吸引触手により容器隅部の残液を最小にする技術が開示されている。特許文献５は、水面と平行な容器内部の最大断面積に吸引ノズルの下降速度を乗じた体積変化速度よりも大きな一定の吸引量で液体を吸引する方法を開示している。この方法によれば、吸引ノズル外周面への液体の付着を最小限にすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−８３９３９号公報
【特許文献２】特開２００３−１９０８９９号公報
【特許文献３】特開平８−６２２１５号公報
【特許文献４】特開２００３−４２９１２号公報
【特許文献５】特開２００８−７６２７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記先行技術文献において、特許文献１、２の技術は吸引ノズルを水平方向に操作する動作制御機構が必要となり、また吸引に余計な時間がかかってしまう。特許文献３、４の技術は吸引ノズルに複雑な形状の構成部材を必要とするため経済的に好ましくない。特許文献５の技術は、吸引ノズルは常に液面より上方にあり、吸引ノズルの外周面は液体に接触しないとある。本発明はこのような事情を鑑みてなされたものであり、簡単な構成にもとづき、液体の残留量を効果的に低下させることのできる迅速な液体の吸引方法及びそれを用いた固相の洗浄方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）吸引ノズルを下降させながら容器内の液体を吸引する方法であって、吸引ノズルが、液面と接触して、液体と雰囲気ガスを吸引しながら、その接触状態を維持する速度で容器底部まで下降することを特徴とする、液体の吸引方法。
（２）上述の（１）に記載の方法において、（１）に記載の吸引方法を複数回行い、その最後の回において、それ以前の回と比較して、吸引ノズルが下降する速度を最も小さくする、液体の吸引方法。
（３）容器中で固相成分と液相成分とを反応させた後、容器から液相を排出し、次いで容器に液体を注入して固相を洗浄した後に、（１）に記載の方法により液体を吸引することを特徴とする、固相の洗浄方法。
（４）上述の（３）に記載の方法において、容器に液体を注入して固相を洗浄した後に（１）に記載の方法によって液体を吸引するという工程を複数回行い、その最後の回において、それ以前の回と比較して、吸引ノズルが下降する速度を最も小さくする、固相の洗浄方法。
【０００７】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【０００８】
本発明では、吸引ノズルを下降させながら容器内の液体を吸引するが、吸引ノズルを液面に接触させた状態を維持したまま、液体と雰囲気ガスを吸引しつつ、ノズルと液面が実質的に同じ速度で下降していくものである。この場合、吸引の初期段階から終期段階にかけて吸引配管内の減圧度は、空気の混入に伴う細かな変動があるものの、ドリフトなくほぼ一定になり、吸引の終期においてもゆるやかに液面部から液体を吸引する。そのため、容器隅部に付着している液体の分子群も、滑らかに液面中央部に移動しノズルに吸引されていくものと推察される。
【０００９】
これに対して、吸引ノズルによって液面より低い位置で液体を吸引すると、液面に接触させた状態で吸引した時と比べて、雰囲気ガスの吸引が起きないため、吸引配管内の減圧度が高まり、吸引速度が増加する。このため、吸引の終期に容器隅部に付着している液体は吸引ノズルまで移動する猶予が与えられず、ノズル付近の液体のみが引きちぎられるように吸引されて吸引工程が終わるので、容器隅部に吸い残しの液滴が残るものと推察される。
【００１０】
また、本発明によれば、吸引ノズルは液面に接触させた状態で液体を吸引し、液面より下に深く浸漬することはないので、ノズル外表面への液体の付着を回避できる点で好ましい。
【００１１】
なお、本発明では、吸引ノズルは液面と接触した状態を維持する速度で下降する。これは換言すれば、ノズル下降速度は、液体の吸引速度との兼ね合いによることとなる。
【００１２】
本発明で使用する吸引ノズルの形状については特に限定はない。その材質についても、使用する液体や容器との接触に際して、腐食、変形、破損等のない安定した材質であれば、特定の材質に限定されることはない。一例として、長期間液体に接触しても変質しにくいステンレス鋼の管体、耐薬品性に優れたプラスチック（例えば、ポリエーテルエーテルケトン）の管体があげられる。吸引ノズル先端には容器底面によってノズルが閉塞しないように図２に示すようなスリットを形成するのが好ましい。スリットの高さによっては、終期段階の液体吸い切りのときに多量の雰囲気ガスが混入して吸引配管内の減圧度が弱まり、液体の吸引が不完全となり液体残りが増加する。そのため吸引ノズルとして、内径１ｍｍ前後のステンレス管を使用したとき、スリットはノズルの円形縁部の直径位置２箇所に設けるのが好適であり、１箇所または３箇所にスリットを設けると液体残りが増加する傾向があった。
【００１３】
本発明において、容器とは、上部が開口したまたは開口しうる、液体を収容できるものであり、例えばウェル、カップ、セル、試験管、反応槽などと呼ばれる器具等をあげることができる。容器は、単一の収容部をもつものでも、二個、三個と側壁同士が隣接して一体成形された多連容器、マイクロタイタープレート状の容器であってもよい。
【００１４】
本発明では、上述の吸引方法による吸引を行った後、容器に液体を添加し、再度上述の吸引方法による吸引を行ってもよい。このように、本発明の吸引方法を複数回繰り返して行う場合、その最後の回の吸引は、それ以前の回と比較して、吸引ノズルが下降する速度を最も小さくすることが好ましい。これは即ち、液体の吸引速度を最も小さくすることを意味するものである。これにより、最後の回以外の吸引ノズルの下降速度は、最後の回より大きく設定して吸引時間を短縮するとともに、最後の回においては、吸引ノズルの下降速度をそれ以前の回と比較して最も小さくする、即ち、液体の吸引速度を最も小さくすることにより、残液量を効果的に減少させることが可能になる。
【００１５】
本発明の吸引方法は、容器中で固相成分と液相成分とを反応させた後、容器から液相を排出し、次いで容器に液体を注入して固相を洗浄した後に、液体を吸引するときにも利用できる。
【００１６】
固相成分とは、特に限定されるものではないが、例えば試料中の成分分析を行う免疫測定では、固相担体に抗体、抗原等の特異的親和性を有する試薬成分が物理的／化学的に結合した固相結合体、または前記固相結合体に試料液中の分析成分および／または標識試薬中の標識成分が直接もしくは間接的に結合した反応複合体をあげることができる。また液相成分としては、例えば前記固相結合体または前記反応複合体に結合する、試料液中の分析成分または標識試薬中の標識成分等をあげることができる。
【００１７】
本発明では、上述の洗浄方法において、液体を注入して固相を洗浄した後に上述の（１）の吸引方法によって液体を吸引するという工程を複数回繰り返して行ってもよい。その場合、その最後の回において、それ以前の回と比較して、吸引ノズルが下降する速度を最も小さくすることが好ましい。これは即ち、液体の吸引速度を最も小さくすることを意味するものである。これにより、最後の回以外の吸引ノズルの下降速度は、最後の回より大きく設定して吸引時間を短縮するとともに、最後の回においては、吸引ノズルの下降速度をそれ以前の回と比較して最も小さくする、即ち、液体の吸引速度を最も小さくすることにより、残液量を効果的に減少させることが可能になる。
【００１８】
このように、本発明の洗浄方法は、試料中の成分分析を行う場合のＢ／Ｆ分離又はＢ／Ｆ洗浄として用いることができる。
【００１９】
以下に本発明を、試料中の成分分析を行う免疫測定に用いた場合を例にして説明する。
【００２０】
固相成分を構成する固相担体については、反応容器に収容できるものであり、材質、大きさ、形のいずれに関しても特段の制限はないが、Ｂ／Ｆ分離のために磁力、重力等の外力により反応容器内の底面隅部または側壁に局在させることに適したものが好ましい。また、反応容器の内壁自体を固相担体として使用することもできる。たとえば容積が０．５ｍＬから１ｍＬ程度のカップ状容器に対して、粒径０．０１μｍ程度の微粒子から粒径１ｍｍ程度のビーズに至る大きさの固相担体が使用できる。なかでも、固相成分と液相成分との反応効率を上げ、Ｂ／Ｆ分離の際、容器外部からの磁力により容器側壁部に集めるのに適した０．１〜１０μｍの磁性微粒子を用いるのが好ましい。
【００２１】
洗浄液としては、特に限定されるものではないが、前記固相結合体、前記反応複合体、またはさらに標識成分が結合した前記反応複合体が解離することなく、未反応の試料および標識試薬を効果的に洗浄できるような電解質濃度、ｐＨ、界面活性剤の種類や濃度等を選択すればよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、液体を吸引した時に、その残液量を効果的に減少させることが可能になる。また、吸引ノズルは液面より下に深く浸漬することはないので、ノズル外表面への液体の付着を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＢＦ洗浄装置および反応容器を示す図である。
【図２】吸引管先端形状を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１に、本発明を実施するのに好適な、吸引ノズル１および吐出ノズル２が、少なくとも昇降可能な駆動手段（不図示）に接続された支持部５に一体化した構成の洗浄装置および反応容器６を示す。吸引ノズル１は、基端部側が廃液手段（不図示）を介して真空ポンプ（不図示）に接続された吸引管３に接続されている。吐出ノズル２は、前記洗浄水の供給元からシリンジポンプ等の制御可能な送液手段に吐出配管４を介して接続されている。前記昇降可能な駆動手段は、好ましくはステッピングモータによりプログラム制御され、吸引工程においては容器中の液体を可能な限り吸引するため、吸引ノズル先端を容器底面に接触するまで下降させる。このため、吸引ノズル１の先端が容器６内の底面に衝突したときの緩衝手段を備えていることが望ましい。
【００２５】
表１に、磁性微粒子を固相とする２ステップイムノアッセイを自動装置で実施する場合のＢ／Ｆ洗浄方法の一例を示す。表中、第１Ｂ／Ｆ洗浄とは、反応容器に固相試薬と試料を注入して反応させたのちに未反応の試料を分離・洗浄するために行なう洗浄工程のことである。第２Ｂ／Ｆ洗浄とは、第１Ｂ／Ｆ洗浄の済んだ固相成分に標識試薬を加えて反応させたのち未反応の標識試薬を分離・洗浄するために行なう洗浄工程のことである。表１の例では第２Ｂ／Ｆ分離として、標識試薬−固相成分複合体（Ｂｏｕｎｄ）と、未反応の標識試薬（Ｆｒｅｅ）との分離洗浄を３回に分けて行なう。３回に分けて行なうのは、検出感度に直接影響する標識試薬の洗浄を徹底させるために、磁性微粒子の完全分散（集磁状態を解除後、洗浄液を吐出することで磁性微粒子を反応容器中の液体全体にわたり分散させた状態）を行なった後の集磁操作に長い時間を確保する必要がある一方、シーケンス制御する自動装置のサイクルタイムを過度に増加させないためである。
【００２６】
第１Ｂ／Ｆ洗浄においては、吸引ノズルを９０ｍｍ／ｓの速度で下降させつつ、０．４秒かけて固相試薬と試料とによる反応液を吸引し吸引配管を通じて廃棄する。ここで、吸引ノズルの下降速度９０ｍｍ／ｓとは、この吸引ノズルを同形容器中の洗浄液に浸漬して液体を吸引したときに液位が下降する速度約１００ｍｍ／ｓより小さい速度であり、吸引ノズルが液面と接触して、液体と雰囲気ガスを吸引しながら、その接触状態を維持する速度で容器底部まで下降することを意味する。なお、この例で使用した容器は、底面径φ約５ｍｍ、高さ約２０ｍｍのポリプロピレン製平底円筒状容器である。
【００２７】
この吸引工程以降、反応容器の外側面に磁石を近接させて磁性微粒子を容器内側面に集磁させておく。ただし、第２Ｂ／Ｆ洗浄２回目の洗浄液吐出時には上記の完全分散を行なうため、磁石を容器から遠ざけ集磁状態を解除する。
【００２８】
上記のように第１Ｂ／Ｆ洗浄において反応液を吸引した後、吸引ノズルを上昇させる。このとき、吸引ノズルは、後工程で洗浄液が最大の４００μＬ吐出された後の液面より高い位置まで上昇させるのが好ましい。つぎにこの位置において、吐出ノズルから洗浄液を２５０μＬ吐出する。所定時間（数秒）後、上記反応液の吸引と同様に、吸引ノズルを速度９０ｍｍ／ｓで下降させつつ、０．４秒かけて残留反応液と洗浄液の混合液を吸引し吸引配管を通じて廃棄する。つぎに吸引ノズルを上昇させ、吐出ノズルから洗浄液を４００μＬ吐出する。ついで、第１Ｂ／Ｆ洗浄の最後の吸引工程として、吸引ノズルを速度４５ｍｍ／ｓで下降させつつ、０．５秒かけて洗浄液体を吸引する。
【００２９】
第２Ｂ／Ｆ洗浄においても、吸引ノズル・吐出ノズルの動作自体は基本的に第１Ｂ／Ｆ洗浄と同様である。第２Ｂ／Ｆ洗浄１回目においては、第１Ｂ／Ｆ洗浄の反応液吸引と同様に、未反応の反応試薬（標識試薬）を、９０ｍｍ／ｓの速度で下降させる吸引ノズルにより０．４秒かけて吸引し吸引配管を通じて廃棄する。つぎに吸引ノズル・吐出ノズルを上昇させ、吐出ノズルから洗浄液を１００μＬ吐出する。吐出量が１００μＬと、２５０μＬより少なくしたのは、標識試薬の容器への吸着による汚染を最小限にとどめるためである。洗浄液１００μＬの吐出後は、０．４秒かけて残留反応試薬と洗浄液の混合液を吸引し廃棄する。さらに洗浄液４００μＬを吐出し、０．５秒かけて吸引する工程を２回繰り返した後、洗浄液を４００μＬ吐出したところで第２洗浄１回目を終了する。
【００３０】
自動装置の次のサイクル（サイクル時間６５秒）において、第２Ｂ／Ｆ洗浄２回目を行なう。第２Ｂ／Ｆ洗浄１回目の最後に吐出した４００μＬの洗浄液を０．５秒かけて吸引した後、集磁状態を解除して洗浄液を１５０μＬ吐出し、磁性微粒子成分を洗浄する。集磁操作を開始して所定時間（約３０秒）経過後、洗浄液１５０μＬを０．４秒かけて吸引し、再び集磁状態を解除して洗浄液を１５０μＬ吐出したところで第２洗浄２回目を終了する。
【００３１】
さらに自動装置の次のサイクルにおいて、第２Ｂ／Ｆ洗浄３回目を行なう。第２Ｂ／Ｆ洗浄２回目の最後に吐出した１５０μＬの洗浄液を０．４秒かけて吸引した後、洗浄液を４００μＬ吐出し、０．５秒かけて再び吸引したところで第２Ｂ／Ｆ洗浄を終了する。この装置では第２Ｂ／Ｆ洗浄の最後の吸引のとき、吸引ノズルの下降速度を９０ｍｍ／ｓまたはその半分の速度４５ｍｍ／ｓで下降させることができるが、下記実施例１，２により下降速度を４５ｍｍ／ｓとするのが好適であることが示される。
【実施例】
【００３２】
［実施例１］
図１に示したＢ／Ｆ洗浄装置を用い、表１に示した条件で、Ｂ／Ｆ洗浄の吸引・吐出動作を行ない、洗浄液の残留量を秤量した。ここでは洗浄液の残留量を比較するため、磁性微粒子の入っていない空容器を使用し、試料、標識試薬のいずれも加えずに洗浄液の吸引・吐出動作を行なった。なお、吸引ノズル１には内径０．９２ｍｍのステンレス管を使用し、吸引配管３は内径１．５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン管を使用した。洗浄液には塩化ナトリウムおよび界面活性剤を含むトリス緩衝液（ｐＨ８）を使用した。
【００３３】
表２に結果を示す。最後に実行する吸引工程における吸引ノズルの下降速度を９０ｍｍ／ｓとすると、洗浄液の残留量の１０回の平均値が０．００３３ｇであるのに対して、下降速度を４５ｍｍ／ｓとすると０．０００５ｇと、１／６以下に減少した。
【００３４】
上記の実験においては、図２に示す吸引ノズル１先端の長方形のスリット部の幅を０．３０ｍｍとし、スリットの高さは０．５５ｍｍとした。このスリット高さを１．０ｍｍとし、最後に実行する吸引工程における吸引ノズルの下降速度を４５ｍｍ／ｓとしたときの、洗浄液の残留量（１０回測定の平均値）を測定したところ０．００１２ｇとなり、スリット高さ０．５５ｍｍの条件に比べて２倍以上の残留量を示した。表３に結果を示す。
【００３５】
［実施例２］
実施例１と同様の装置、条件においてＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の酵素免疫測定を実施した。すなわち、図１に示したＢ／Ｆ洗浄装置を用い、表１に示した条件でＢ／Ｆ洗浄の吸引・吐出動作を行ない、酵素免疫測定を実施して測定値の再現性を比較した。試料は、ＴＳＨの標準品を希釈して約１０μＩＵ／ｍＬの濃度に調製した。測定は概略常法に従い、粒径約２．５μｍの磁性微粒子に抗ＴＳＨモノクローナル抗体を固定した固相試薬と試料とを反応させた後、第１Ｂ／Ｆ洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨモノクローナル抗体を反応させた後、第２Ｂ／Ｆ洗浄し、ジオキセタン系発光基質を作用させて化学発光強度を測定した。
【００３６】
その結果、最後に実行する吸引工程における吸引ノズルの下降速度を９０ｍｍ／ｓとすると、１０回の測定値に基づく変動係数（ＣＶ）が２．６５％であるのに対して、下降速度を４５ｍｍ／ｓとするとＣＶ１．４６％まで減少した。
【００３７】
以上のことから、本発明の方法によれば、洗浄液の残液量を効果的に減少させることが可能になり、特に最後の回の吸引ノズルの下降速度（４５ｍｍ／ｓ）を、それ以前の回の吸引ノズルの下降速度（９０ｍｍ／ｓ）より小さく設定することにより、最後の吸引工程における洗浄液の残液量をより一層効果的に減少させることが可能になり、かつそのことが酵素免疫測定の再現性を高めるということがわかった。
【００３８】
【表１】
2014070915.tif 000003
【００３９】
【表２】
2014070915.tif 000004
【００４０】
【表３】
2014070915.tif 000005
【符号の説明】
【００４１】
１：吸引ノズル
２：吐出ノズル
３：吸引配管
４：吐出配管
５：支持部
６：反応容器
７：吸引ノズル先端スリット部
【図１】
2014070915.tif 000006
【図２】
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