(57)【要約】【課題】新たなコラーゲン収縮用組成物を提供する。【解決手段】コラーゲン収縮用組成物が、有効成分として松樹皮抽出物を含有する。【選択図】図１
2014065684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
松樹皮抽出物を有効成分として含有するコラーゲンゲル収縮用組成物。
【請求項２】
松樹皮抽出物を有効成分として含有する皮膚たるみ改善用組成物。
【請求項３】
松樹皮抽出物を有効成分として含有する皮膚引き締め用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、松樹皮抽出物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
繊維芽細胞は、皮膚において細胞外マトリックスを構成するコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸などの生成に深く関わっている。繊維芽細胞の増殖が活発であると、細胞外マトリックスが十分に機能して皮膚は弾力性や柔軟性のある状態となるが、繊維芽細胞の働きが衰えると皮膚にはシワ、たるみなどの老化症状が現れる。また、繊維芽細胞を活発化することは、創傷治癒にも有用であるとされている。そこで、繊維芽細胞のコラーゲン産生能を増強させる皮膚外用剤が提案されている（特許文献１）
【０００３】
また、繊維芽細胞をコラーゲンゲル中で培養すると、増殖した繊維芽細胞の細胞数が多いほどコラーゲンゲルが収縮する。そして、このコラーゲンゲルの収縮の程度により、繊維芽細胞の活性を評価できることが知られている。そのため、コラーゲンゲルの収縮作用を有する種々のコラーゲンゲル収縮剤あるいは細胞増殖促進剤が提案されている（特許文献２、３）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開2007-094384号パンフレット
【特許文献２】特開平10-72336号公報
【特許文献３】特開2003-176208号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方、皮膚中のコラーゲン量が過度に増えると、創傷治癒時に瘢痕が生じるなどの問題が生じる。
【０００６】
そこで、本発明は、繊維芽細胞のコラーゲンの産生能に影響を与えることなくコラーゲンゲルの収縮能を向上させ、皮膚のたるみを改善し、皮膚を引き締められるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、繊維芽細胞をコラーゲンゲルで培養するにあたり、松樹皮抽出物を添加するとコラーゲン量が増大することなくコラーゲンゲルが収縮することを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、松樹皮抽出物を有効成分として含有するコラーゲンゲル収縮用組成物を提供する。
また、本発明は、松樹皮抽出物を有効成分として含有する皮膚たるみ改善用組成物を提供し、松樹皮組成物抽出物を有効成分として含有する皮膚引き締め用組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のコラーゲンゲル収縮用組成物によれば、コラーゲン量を増大させることなくコラーゲンゲルを収縮させることができるので、例えば、シワやたるみなどの老化症状のある皮膚に対してたるみを改善し、また、皮膚を引き締めて皮膚に弾力性やハリを付与することが可能となる。
【０００９】
また、本発明のコラーゲンゲル収縮用組成物は、天然物由来で機能性食品原料として使用されているものを原料とするため、安全に使用することができ、安定して供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、松樹皮抽出物を添加したコラーゲンゲルの収縮状態を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のコラーゲン収縮用組成物、皮膚たるみ改善用組成物、及び皮膚引き締め用組成物（以下、これらを本発明の組成物ともいう）は、いずれも有効成分として松樹皮抽出物を含有する。
【００１２】
松樹皮抽出物の原料松としては、フランス海岸松（Pinus Martima）、カラマツ、クロマツ、アカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、リュウキュウマツ、ウツクシマツ、ダイオウマツ、シロマツ、カナダのケベック地方のアネダ等が挙げられる。中でも、フランス海岸松の樹皮抽出物が好ましい。
【００１３】
フランス海岸松は、南仏の大西洋沿岸の一部に生育している海洋性松をいう。このフランス海岸松の樹皮は、フラボノイド類であるプロアントシアニジン（proanthocyanidin）を主要成分として含有する他に、有機酸ならびにその他の生理活性成分等を含有している。この主要成分であるプロアントシアニジンには、活性酸素を除去する強い抗酸化作用があることが知られている。
【００１４】
松樹皮抽出物は、松の樹皮を水または有機溶媒で抽出して得られる。水を用いる場合には温水、または熱水が用いられる。抽出に用いる有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ブタン、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサン、プロピレングリコール、含水エタノール、含水プロピレングリコール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロエテン等の食品あるいは薬剤の製造に許容される有機溶媒が好ましく用いられる。これらの水、有機溶媒は単独で用いてもよいし、組合わせて用いてもよい。特に、熱水、含水エタノール、含水プロピレングリコール等が好ましく用いられる。
【００１５】
松樹皮抽出物を得るための松樹皮からの抽出方法は特に制限はないが、例えば、加温抽出法、超臨界流体抽出法等が用いられる。
【００１６】
超臨界流体抽出法とは、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて抽出を行う方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）等が用いられるが、二酸化炭素が好ましく用いられる。
【００１７】
超臨界流体抽出法では、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程と、目的成分と超臨界流体を分離する分離工程とを行う。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。
【００１８】
また、エントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、抽出流体に、例えば、エタノール、プロパノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類を2〜20W／V％程度添加し、この流体を用いて超臨界流体抽出を行うことによって、目的とする抽出物の抽出溶媒に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、あるいは分離の選択性を増強させる方法であり、効率的な松樹皮抽出物を得る方法である。
【００１９】
超臨界流体抽出法は、比較的低い温度で操作できるため、高温で変質・分解する物質にも適用できるという利点、抽出流体が残留しないという利点、溶媒の循環利用が可能であるため、脱溶媒工程等が省略でき、工程がシンプルになるという利点がある。
【００２０】
また、松樹皮抽出物を得るための松樹皮からの抽出方法は、上述の抽出法以外に、液体二酸化炭素回分法、液体二酸化炭素還流法、超臨界二酸化炭素還流法等の方法によって行ってもよい。
【００２１】
松樹皮抽出物を得るための松樹皮からの抽出方法は、複数の抽出方法を組み合わせてもよい。複数の抽出方法を組み合わせることにより、種々の組成の松樹皮抽出物を得ることが可能となる。
【００２２】
松樹皮からの抽出物は、限外濾過、あるいは吸着性担体（ダイヤイオンHP−20、Sephadex−LH20、キチン等）を用いたカラム法またはバッチ法などにより、精製を行うことが安全性の面から好ましい。また、必要に応じて、減圧濃縮、凍結乾燥などの方法により濃縮または乾燥して、液状、ペースト状、または粉末（抽出物粉末）としてもよい。
【００２３】
本発明に用いられる松樹皮抽出物は、主な成分の一つとして、プロアントシアニジンを含有する。プロアントシアニジンは、フラバン−３−オールおよび／またはフラバン−３，４−ジオールを構成単位とする重合度が２以上の縮重合体からなる化合物群をいう。プロアントシアニジンは、植物が作り出す強力な抗酸化物質であり、植物の葉、樹皮、果実の皮および種に集中的に含まれている。なお、このプロアントシアニジンは、ヒトの体内では生成することができない物質である。
【００２４】
松樹皮抽出物に含有するプロアントシアニジンとしては、特に、重合度が低い縮重合体が多く含まれるプロアントシアニジンが好ましい。重合度の低い縮重合体としては、重合度が2〜30の縮重合体（2〜30量体）が好ましく、重合度が2〜10の縮重合体（2〜10量体）がより好ましく、重合度が2〜4の縮重合体（2〜4量体）がさらに好ましい。重合度が2〜4の縮重合体（2〜4量体）のプロアントシアニジンは、特に体内に吸収されやすい。本明細書では、重合度が2〜4の重合体を、オリゴメリック・プロアントシアニジン（oligomeric proanthocyanidin、以下「OPC」と称する）という。
【００２５】
本発明に用いられる松樹皮抽出物は、OPCを10質量％以上、好ましくは15質量％以上、より好ましくは20質量％以上の割合で含有する抽出物であることが望ましい。
【００２６】
OPCを20質量％以上含有する松樹皮抽出物を得るためのより具体的な抽出方法としては、例えば、フランス海岸松の樹皮を用いる以下の方法が好ましい。ただしこの方法に限定されるものではない。
【００２７】
フランス海岸松の樹皮1kgを、塩化ナトリウムの飽和溶液3Lに入れ、100℃にて30分間抽出し、抽出液を得る（抽出工程）。その後、抽出液を濾過し、得られる不溶物を塩化ナトリウムの飽和溶液500mLで洗浄し、洗浄液を得る（洗浄工程）。この抽出液と洗浄液を合わせて、松樹皮の粗抽出液を得る。
【００２８】
次いで、この粗抽出液に酢酸エチル250mLを添加して分液し、酢酸エチル層を回収する工程を5回行う。回収した酢酸エチル溶液を合わせて、無水硫酸ナトリウム200gに直接添加して脱水する。その後、この酢酸エチル溶液を濾過し、濾液を元の５分の１の量になるまで減圧濃縮する。濃縮された酢酸エチル溶液を2Lのクロロホルムに注ぎ、撹拌して得られる沈殿物を濾過により回収する。この沈殿物を酢酸エチル100mLに溶解した後、再度1Lのクロロホルムに添加して沈殿させる操作を２回繰り返す洗浄工程を行う。この方法により、例えば、OPCを20質量％以上含有する松樹皮抽出物を得ることができる。
【００２９】
松樹皮抽出物としては、市販されているものを使用することができ、例えば、東洋新薬社製「フラバンジェノール」（登録商標）を使用することができる。
【００３０】
本発明の組成物において有効成分となる松樹皮抽出物は、食品素材又は化粧品原料として使用されているものであるため、本発明の組成物の投与形態は、経口投与、又は経皮投与等の非経口投与とすることができる。
【００３１】
経口投与とする場合、本発明の組成物は、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えばハードカプセル、ソフトカプセルなどのカプセル剤、錠剤、顆粒剤、丸剤、散剤、液剤、粉末剤、ゼリー状剤、飴状剤、ペースト状剤等の形態にして投与することができる。
【００３２】
また、松樹皮やその粉砕加工物をティーバッグ状に分包し、お湯に成分を浸出させてから飲むようにしてもよい。また、その服用形態としては、水、お湯、牛乳などに溶いて飲むようにしたり、飲食品等に添加して摂取したりしてもよい。
【００３３】
本発明の組成物には、栄養成分を配合することもできる。栄養成分としては、例えば、アスコルビン酸、トコフェロール、リボフラビン、β-カロテン、葉酸、ビオチンなどのビタミン類；カルシウム、マグネシウム、セレン、鉄などのミネラル類；タウリン、ニンニクなどに含まれる含硫化合物；ヘスペリジン、ケルセチンなどのフラバノイド類やフラボノイド類；難消化性デキストリン、アルギン酸、キチン、キトサン、グアーガムなどの食物繊維；大豆蛋白、コラーゲンなどのタンパク質；ペプチド；アミノ酸；乳脂肪、ラード、牛脂、魚油などの動物性油脂；大豆油、菜種油などの植物性油脂；オレンジ、レモン、グレープフルーツ、いちごなどの果実およびその果汁；ローヤルゼリー、プロポリス、はちみつ、還元麦芽糖、乳糖、糖アルコール、液糖、調味料などが挙げられる。
【００３４】
一方、本発明の組成物を非経口投与とする場合、本発明の組成物は、軟膏剤、クリーム剤、ジェル、ローション、乳液、パック、湿布剤、浴用剤、点眼剤、点鼻剤等の形態にして投与することができる。
【００３５】
また、本発明の組成物は、皮膚用化粧品、シャンプー、リンス、コンディショナー等の毛髪用化粧品等に配合することができ、その場合、化粧品に通常使用される基材や添加剤と共に使用することができる。更に、本発明の組成物の有する機能をより増強したり、補填したりする目的で、様々な助剤を添加することも可能である。例えば、基剤としては、グリセロール、エタノール、パラベン、またはブチレングリコールなどが挙げられる。
【００３６】
上述の添加剤としては、賦形剤（シリコン系ポリマー）、香料、色素、保存剤（パラベンなど）、増粘剤（シリコン系ポリマー、アクリル系ポリマー、カルボキシビニル系ポリマーなど）、キレート剤（EDTAなど）、甘味料（スクラロースなど）、清涼剤（メントールなど）、防腐防黴剤（フェノキシエタノールなど）等が挙げられる。
【００３７】
上述の助剤としては、例えば、他の薬効成分や他の油剤（リノール酸、リノレン酸、パルミチン酸、DHA、EPAなどの不飽和脂肪酸およびその誘導体や、亜麻仁油、ヤシ油、ホホバ油、オリーブ油、スクワラン、スクワレン、馬油、コメヌカ油、ヒマシ油などの動植物より抽出された油およびその誘導体など）、保湿剤（コラーゲンまたはその分解物、カロットエキスなどの含まれるコラーゲン類似ペプチド、大豆ペプチド、アミノ酸、ヒアルロン酸などのムコ多糖類、コンドロイチンなどのアミノ酸、トレハロースなどの糖類、海藻類、アルギン酸、グルコマンナン、ペクチンなどの水溶性食物繊維、リン脂質など）、界面活性剤（レシチン、脂肪酸エステル、アミノ酸誘導体など）、紫外線吸収剤（酸化亜鉛、酸化チタンなど）、吸収促進剤等が挙げられる。
【００３８】
本発明の組成物の投与量は、経口投与では経口投与物中の松樹皮抽出物の濃度を、松樹皮抽出物の乾燥質量換算で好ましくは0.00001質量％〜20質量％、より好ましくは0.001質量％〜10質量％とする。また、経皮投与の場合、経皮投与物中の松樹皮抽出物濃度を、松樹皮抽出物の乾燥質量換算で好ましくは0.00001質量％〜20質量％、より好ましくは0.001質量％〜10質量％とする。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。
実施例１
（１）ヒト皮膚由来正常線維芽細胞（HFSKF-II）のコラーゲンゲル培養
細胞培養培地（AteloCell Atelocollagen DMEM、高研製）に、細胞培養用血清（FBS）を10質量%となるように添加し、2mLずつ分注したものを用いて、ヒト皮膚由来正常線維芽細胞（HFSKF-II）の浮遊液 1.0×105mLを作成し、これを0.4mL/wellで24穴プレートへ播種した。播種後すぐにインキュベーターへ移し、37℃、5%CO2で1hr静置した。静置後、ゲル化したコラーゲンの周囲を、縁取りするように剥がした。インキュベーターでさらに一晩 37℃、5%CO2で培養した。
【００４０】
松樹皮抽出物（東洋新薬社製、フラバンジェノール（登録商標））を無血清DMEMで希釈した溶液（0.5μg/ｍL）をサンプル溶液とし、このサンプル溶液0.2ｍLと、20％FBS含有DMEMを0.2mLを、培養したコラーゲンゲルに添加し、最終培養試料とした。これにより、最終培養試料における松樹皮抽出物の濃度は、サンプル溶液の1/4となる。なお、コントロールとして、松樹皮抽出物溶液を添加しないものも同様に作成した。
【００４１】
（２）評価
最終培養試料とコントロールをインキュベーターで 37℃、5%CO2で５日間培養し、ゲルの収縮状態を観察した。この５日間培養後のゲルの写真を図１に示す。
また、５日間培養後の細胞の賦活度合いの計測のため、別の24wellプレートに予め無血清DMEMを0.4mL/well添加しておき、これに上述の５日間培養したゲルを移し、無血清DMEMで15倍希釈したWST-8（同仁化学社）を0.4mL添加し、450nmの吸光度を測定した。
【００４２】
さらに、５日培養後の試料のWST-8溶液をアスピレーターで除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）0.4mL/wellで2回洗浄し、ゲルを24wellプレート上で一晩おいて乾燥し、乾燥したゲルに精製水1mLを添加し、予め重量測定しておいたエッペンチューブへ移した。エッペンチューブで、ゲルを室温で乾燥させ、重量を測定した。
【００４３】
WST-8の吸光度の測定結果、及びゲルの乾燥重量の測定結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2014065684.tif 000003
【００４５】
これらの結果から、図１から、松樹皮抽出物はコラーゲンゲルの重量を増大させることなく、繊維芽細胞を活性化させ、コラーゲンゲルを収縮させることが確認できた。
【図１】
2014065684.tif 000004