(57)【要約】【課題】発酵工程における発酵槽の発泡を抑制し、長鎖ジカルボン酸を製造する方法を提供する。【解決手段】長いアルキル鎖長をもち、その両末端にカルボキシル基を有する長鎖ジカルボン酸を発酵法により製造する方法において、基質として炭素数が１０〜２２の脂肪酸エステルおよび炭素源として水溶性アルコールを添加した培地中で微生物を培養することにより、培養液の発泡を抑え、生産速度を低下することなく長鎖ジカルボン酸を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖ジカルボン酸を製造する方法であって、基質として脂肪酸エステルおよび炭素源として水溶性アルコールを添加した培地中で、微生物を培養することを含む、長鎖ジカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
水溶性アルコールがグリセロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物が酵母菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
脂肪酸エステルの混合物が１０から２２個の炭素原子を有する脂肪酸エステルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
脂肪酸エステルが少なくともパルミチン酸エステルおよび／またはパルミトレイン酸エステルを含む、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖ジカルボン酸を発酵法により効率よく生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長いアルキル鎖長をもち、その両末端にカルボキシル基を有する長鎖の飽和ジカルボン酸は、香料、合成高分子の改質材、接着剤などの原料として有用である。従来、飽和カルボン酸は、石油からの蒸留分離によって得られるｎ−パラフィン等のアルカンを原料とし、その両末端を酸化することによって生産されている。ｎ−パラフィン等のアルカンの両末端の酸化には、酵母を用いた発酵法も用いられており、さらにこの発酵法ではｎ−パラフィン以外に脂肪酸や脂肪酸エステルを基質とする場合でもジカルボン酸を生産できることも知られている（例えば特許文献１〜３）。
【０００３】
特許文献に開示された方法としては、基質として飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸、炭素源としてグリセロールを用いて培養することによりタプシン酸を生産する方法（特許文献１）、同様に基質としてドデカン、炭素源としてグリセロールを用いる発酵によりドデカン二酸を生成する方法（特許文献２）、基質としてオレインヒマワリ油（オレイン酸が主成分）、炭素源としてグルコースを用いる発酵によりジカルボン酸を得る方法方法（特許文献３）が開示されている。
【０００４】
開示された方法はいずれも基質として脂肪酸を用いた培養又は発酵を行う方法であるが、培養液中に脂肪酸が大量に存在していると、通常ｐＨ調整のため添加しているアルカリ溶液と反応し、石鹸成分である脂肪酸塩を形成し発泡し、培養液が発酵槽より噴き出すという現象がみられる。その場合、培養液が発酵槽より噴き出さないように、通気量や撹拌速度の調整を行う必要があり、その結果としてジカルボン酸生産効率（生産速度）の低下を引き起こすという問題があった。そのため、発泡を抑制したジカルボン酸の発酵生産方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−５５２５８号公報
【特許文献２】特表２０１２−５１１９０７号公報
【特許文献３】特開２０１２−１０５６８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、発酵法により長鎖ジカルボン酸を製造する方法を提供することを目的とする。詳しくは、発酵工程における発酵槽の発泡を抑制し、ジカルボン酸生産効率の低下を引き起こすことなく長鎖ジカルボン酸を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、基質として脂肪酸エステル類、炭素源として水溶性アルコールを培地に添加して培養を行うことによって、培養液の発泡を抑え、生産速度を低下することなく長鎖ジカルボン酸を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］長鎖ジカルボン酸を製造する方法であって、基質として脂肪酸エステルおよび炭素源として水溶性アルコールを添加した培地中で、微生物を培養することを含む、長鎖ジカルボン酸の製造方法。
［２］水溶性アルコールがグリセロールである、［１］の方法。
［３］微生物が酵母菌である、［１］または［２］の方法。
［４］脂肪酸エステルの混合物が１０から２２個の炭素原子を有する脂肪酸エステルである、［１］から［３］の方法。
［５］脂肪酸エステルが少なくともパルミチン酸エステルおよび／またはパルミトレイン酸エステルを含む、［４］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、発酵液の発泡を抑え、生産速度を低下させることなく長鎖ジカルボン酸を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、発酵法により長鎖ジカルボン酸を製造する方法に関する。
【００１１】
より具体的な態様では、本発明は、基質として脂肪酸エステル、炭素源として水溶性アルコールを添加した培地中で、微生物を培養する工程を含む、長鎖ジカルボン酸を生産する方法に関する。
【００１２】
本願明細書中において、「基質」とは「長鎖ジカルボン酸の原料」のことをいう。「基質」、すなわち「長鎖ジカルボン酸の原料」の存在下にて、特定の微生物を培養することによって、微生物の働きにより当該「長鎖ジカルボン酸の原料」が酸化され長鎖ジカルボン酸を生じる。
【００１３】
本発明において基質は、特に限定されないが、炭素数が１０〜２２の長鎖の脂肪酸エステルが用いられる。炭素数が１２以上のものが好ましく、１６以上のものがより好ましい。長鎖の脂肪酸エステルは、飽和脂肪酸エステル又は鎖中に不飽和結合を１つ以上有しても良い不飽和脂肪酸エステル等が挙げられる。
【００１４】
飽和脂肪酸エステルとしては、限定されるものではないが、例えば、カプリン酸（炭素数１０;ヤシ油等に含まれる）、ラウリル酸（炭素数１２;ココナッツ油やヤシ油に含まれる）、ミリスチン酸（炭素数１４;ヤシ油やパーム油に多く含まれる）、ペンタデシル酸（炭素数１５）、パルミチン酸（炭素数１６;動物性油脂や植物性油脂に含まれる）、マルガリン酸（炭素数１７）、ステアリン酸（炭素数１８;動物性油脂や植物性油脂に多く含まれる）、ツベルクロステアリン酸（炭素数１９）、アラキジン酸（炭素数２０;ピーナッツ油等に含まれる）、ベヘン酸（炭素数２２:ナタネ油、ピーナッツ油、モリンガ油等に含まれる）等の各種飽和脂肪酸のエステル類が挙げられる。
【００１５】
不飽和脂肪酸エステルとしては、限定されるものではないが、例えば、パルミトレイン酸（炭素数１６、不飽和結合１（以下炭素数と不飽和結合の数をＣ１６：１と表記することもある;タラ肝油、イワシ油、ニシン油等に含まれる）、オレイン酸（炭素数１８、不飽和結合１のｃｉｓ−９−モノ不飽和脂肪酸・オリーブ油等に含まれる)、バクセン酸（炭素数１８、不飽和結合１のｃｉｓ−１１−モノ不飽和脂肪酸;牛脂、羊脂、バター等に含まれる）、リノール酸（炭素数１８（Ｃ１８：２（９，１２））；多くの植物油に含まれる）、αーリルン酸（炭素数１８（Ｃ１８：３（９，１２，１５））；アマニ油等の多くの植物の種油に含まれる）、γーリルン酸（炭素数１８（Ｃ１８：３（６，９，１２））；月見草油等に含まれる）、ピルン酸（炭素数１８（Ｃ１８：３（５，９，１２））；松の実油等に含まれる）、エレオステアリン酸（炭素数１８（Ｃ１８：３（９，１１，１３））；キリ油等に含まれる）、ステアドリン酸（炭素数１８（Ｃ１８：４（６，９，１２，１５））；イワシ油やニシン油等に含まれる）、ガドレイン酸（炭素数２０のｃｉｓ−９−モノ不飽和脂肪酸；タラ肝油や海産動物油に含まれる）、エイコセン酸（炭素数２０のｃｉｓ−１１−モノ不飽和脂肪酸；多くの植物油に含まれる）、エイコサペンタエン酸（炭素数２０（Ｃ２０：５）；海産動物油や魚油等に含まれる）、エルカ酸（炭素数２２のｃｉｓ−１３−モノ不飽和脂肪酸；ナタネ油、カラシ油等に含まれる）、ドコサヘキサエン酸（炭素数２２（Ｃ２２：６）；海産動物油や魚油等に含まれる）等の各種不飽和脂肪酸のエステルが挙げられる。
【００１６】
脂肪酸エステルとしては脂肪酸メチル、脂肪酸エチル、脂肪酸プロピル、脂肪酸ブチル等が挙げられるが、これに限定されない。好ましくは脂肪酸メチルである。
【００１７】
脂肪酸エステルは、上記の飽和脂肪酸エステルや不飽和脂肪酸エステルを単独で用いても良いし、混合物として用いても良い。混合物として用いる場合は、特定の炭素数（１又は２種以上の特定の炭素数）の飽和脂肪酸エステルと不飽和脂肪酸エステルを、混合物中の脂肪酸エステル総合量に対して合計で６０質量％以上、例えば８０質量％以上含むことが好ましい。一例では、飽和脂肪酸エステルと不飽和脂肪酸エステルの混合物は、混合物中の脂肪酸総含量に対し、炭素数１６である不飽和脂肪酸（パルミトレイン酸）エステルと飽和脂肪酸（パルミチン酸）エステルの合計量で８０質量％以上含むことも好ましい。特定の１種の炭素数の不飽和脂肪酸エステルと飽和脂肪酸エステルを高濃度に含む混合物を用いることにより、目的とする飽和ジカルボン酸を高濃度で生産することができる。特定の２種以上の炭素数の不飽和脂肪酸エステルと飽和脂肪酸エステルの混合物を用いれば、目的とするジカルボン酸の混合物を高濃度で生産することができる。不飽和脂肪酸エステルと飽和脂肪酸エステルの混合物は、特定の炭素数の不飽和脂肪酸エステルと飽和脂肪酸エステルのみを含むことも好ましい。このような混合物を用いれば、その原料に用いた炭素数と同一の炭素数のジカルボン酸のみが生産されることになり、取得時の精製度を顕著に高めることができる。
【００１８】
このような不飽和脂肪酸エステルと飽和脂肪酸エステルの混合物の生成に供する天然油脂は、その脂肪酸組成において、特定の（好ましくは１又は２種以上の特定の）炭素数の脂肪酸エステル（不飽和脂肪酸エステルと飽和脂肪酸エステルの合計）が、脂肪酸エステル総合量の６０質量％以上、例えば８０質量％以上含まれているものが好ましい。そのような天然油脂としては、例えばケイ藻油、ダイズ油、アマニ油等があるが、これらに限定されるものではない。本発明では、そのような脂肪酸エステル組成を有する天然油脂を選択して用いることによって、鎖長の均質性がより高い長鎖飽和ジカルボン酸を調製することができる。
【００１９】
本発明の一つの実施形態では、天然油脂から生成される不飽和脂肪酸エステルと飽和脂肪酸エステルの混合物は、飽和脂肪酸エステルとしてパルミチン酸エステル、不飽和脂肪酸エステルとしてパルミトレイン酸エステルを少なくとも含むことが好ましい。より好ましくは、パルミチン酸エステルはパルミチン酸メチル、パルミトレイン酸エステルはパルミトレイン酸メチルである。
【００２０】
ケイ藻油は、ケイ藻（ケイソウ；珪藻綱に属する微細藻類）から抽出される、微細藻類由来の油脂である。最近、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属ケイ藻において、パルミチン酸（Ｃ１６：０）及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）を非常に高い比率で含む天然油脂を生産する株が報告された（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：  ０８，  Ｓｅｐｔ  ｅｍｂｅｒ  ２００９；  Ｖｏｌ．１６１，  Ｎｏｓ．１−８，  ｐ．  ４８３−４９０）。  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．の報告によれば、そのナピクラ・エスピー（Ｎａｖｉｃｕｌａｓｐ．）  ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株から産生された脂肪酸について、脂肪酸総含量のおよそ４４．９％がパルミチン酸（Ｃ１６：０）、およそ５２．７％がパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）であり、その合計はおよそ９７．６％であった。このケイ藻油を天然油脂として使用する場合、そこから得られる不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸のエステの混合物は、不飽和脂肪酸としてパルミトレイン酸エステル、飽和脂肪酸としてパルミチン酸エステルを多量に含む。したがってこのようなケイ藻油は、本発明における天然油脂として好適に使用することができ、本発明に係る方法により、Ｃ１６ジカルボン酸（タプシン酸）を効率よく生産するのに用いることができる。ケイ藻由来の脂肪酸のように炭素数１６の合計量が９７．６％も含む単一な基質を用いると、炭素数が単一なジカルボン酸を生産することができる。発酵終了時に発酵液に含まれる炭素数の異なるジカルボン酸量が少ないため、その後の精製工程を容易に行うことができる。さらに、高純度飽和ジカルボン酸と高純度不飽和ジカルボン酸の分離も容易であるため、高純度で炭素数の均一な飽和ジカルボン酸または不飽和ジカルボン酸をそれぞれ得ることができる。このようにして得られる高純度で炭素数が単一なジカルボン酸は、異なる炭素数のジカルボン酸混合物よりも優れた特性を示す。例えば、パルミチン酸エステルより得られる炭素数１６の飽和ジカルボン酸（タプシン酸）はナイロンの原料として用いることができ、高純度タプシン酸を用いて合成されたナイロンは耐溶剤溶解性や柔軟性が向上したものとなる。したがって、純度の高いパルミチン酸エステルやパルミトレイン酸エステルは基質として好適に用いられる。
【００２１】
天然油脂からの不飽和脂肪酸エステルと飽和脂肪酸エステルの混合物の生成は、典型的には、エステル交換反応に基づいて常法により実施することができる。エステル交換は、以下に限定するものではないが、例えば天然油脂を原料とするバイオディーゼル燃料の製法（バイオディーゼルのすべて、坂志朗編、アイピーシー、２００６年）などを利用して、低級アルコールと油脂を反応させることにより実施すればよい。具体的には、例えば、天然油脂に、メタノールやエタノール等の低級アルコールを添加して、酸触媒や塩基触媒等の触媒（苛性ソーダ、アルカリ金属含有酸化マグネシウム触媒、硫酸一酸化カルシウム触媒等）の存在下で、加熱するか又は加熱せずに反応させることにより、触媒作用によるエステル交換反応を引き起こし、不飽和脂肪酸エステル及び飽和脂肪酸エステルを含む脂肪酸エステルとグリセロールとを生成させることができる。
【００２２】
本発明に係る方法の好ましい一実施形態は、天然油脂を加水分解又はエステル交換等によって、飽和脂肪酸エステル及び不飽和脂肪酸エステルとともに生じたグリセロールを、分離することなく、それら脂肪酸エステルと共に、後の微生物による培養工程のために用いる培地に添加する形態である。その場合、グリセロールは、ジカルボン酸合成のための酸化反応を担う微生物のエネルギー源（炭素源）として消費され得るからである。
【００２３】
本発明の方法では、天然油脂から生成される飽和脂肪酸エステルと不飽和脂肪酸エステルの混合物を還元処理することにより、混合物中の不飽和脂肪酸エステルを飽和脂肪酸エステルに変換(転換)することができる。又は発酵により生産された飽和ジカルボン酸エステルと不飽和ジカルボン酸エステルの混合物を還元処理することにより、混合物中の不飽和ジカルボン酸エステルを飽和ジカルボン酸エステルに変換（転換）することができる。還元処理は培養前の基質の調整時に行っても良いし、生成物であるジカルボン酸を得た後に行っても良い。
【００２４】
還元処理は、通常の還元反応に基づいて常法により実施することができる。還元処理は、例えば、水素添加により行うことができる。水素添加は、食用油脂加工分野で植物油脂から硬化油を合成する際などに一般的に使用される技術であり、一般に「水添」とも呼ばれる。水素添加反応は、脂肪酸の炭素−炭素二重結合を水素化する反応である。一般的な水添は、反応温度１００〜２５０℃、水素雰囲気下及び触媒存在下で、常圧文は高圧下で、液状油脂を撹持して行われる。水素圧力は、常圧〜２０ｋｇ／ｃｍ２程度（好ましい一つの例では１〜５ｋｇ／ｃｍ２）が使用される。触媒としては、一般的にはニッケル、コバルト、銅、銅−クロム、白金、パラジウムを含有する化合物が用いられ、還元ニッケル、ギ酸ニッケル、ラネーニッケル、ホウ化ニッケル等のニッケル触媒が好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。なお還元処理は、グリセロール(グリセリン)の存在下で行ってもよい。
【００２５】
本発明は、前記の基質、すなわち脂肪酸エステルを添加した培地中で微生物を培養することで長鎖ジカルボン酸を生成することができる。本発明において利用可能な微生物としては、アルカン又は飽和若しくは不飽和脂肪酸、又は飽和若しくは不飽和脂肪酸エステルを用いる培養において、生成物としてα，ω−ジカルボン酸を分泌することが可能なものであれば特に限定されないが、好ましくは酵母菌である。このような酵母菌としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母菌が挙げられ、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クロアカエ（Ｃ．ｃｌｏａｃａｅ）、カンジダ・グイレルモンジイ（Ｃ．ｇｕｒｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・インターメジア（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・マルトサ（Ｃ．  ｍａｌｔｏｓａ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ゼイレノイデス（Ｃ．ｚｅｙｅｎｏｉｄｅｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等を利用することができるが、これらに限定はされない。また、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）については、β−酸化経路が部分的に遮断されている変異株を利用することが好ましい。このような変異株は自然環境より単離された菌株であっても良いし、遺伝子工学的手法により人為的に作製された菌株であっても良い。このような菌株として、カンジダ・トロピカリスＨ４１、カンジダ・トロピカリスＨ４１Ｂ、カンジダ・トロピカリスＨ５１、カンジダ・トロピカリスＨ４５、カンジダ・トロピカリスＨ４３、カンジダ・トロピカリスＨ５３、カンジダ・トロピカリスＨ５３４、カンジダ・トロピカリスＨ５３４Ｂ、カンジダ・トロピカリスＨ４３５、カンジダ・トロピカリスＡＴＣＣ２０９６２及び、カンジダ・トロピカリスＨＤＣ１００等が挙げられる（これらに限定されない）。好ましい微生物としては、カンジダ・トロピカリスＡＴＣＣ２０９６２又はカンジダ・トロピカリスＨＤＣ１００である。
【００２６】
本発明において基質である脂肪酸エステルは、直接培地に添加してもよいし、適当な溶媒で希釈してから添加してもよい。培地中の微生物が基質である脂肪酸エステルの脂肪酸部位の末端メチル基の炭素原子を酸化反応により酸化してカルボン酸に変換するため、好適に用いることのできる溶媒としては、脂肪酸エステルをよく溶解するが、これらの酸化反応に悪影響を与えず、かつ酸化反応の基質とならないものが好ましい。例えば還元処理及びグリセロール分離処理で、得られる飽和脂肪酸がパルミチン酸メチルの場合、そのような溶媒としては、シクロヘキサン、デカリンなどの環状の炭化水素、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルベンタデカン）、２，２，４，４，６，８，８ーへプロタメチルノナン、ラノリン、フィタン、スクワランなどのイソアルカン類、イソステアリルアルコールなどのイソアルキルアルコール類、イソステアリルカルボン酸などのイソアルキルカルボン酸類などを例示できる。培地への上記の還元処理及びグリセロール分離処理後の飽和脂肪酸／脂肪酸エステルの添加は、任意の手法で行えばよく、例えば一括添加、逐次添加、連続添加などが挙げられる。酸化反応の基質となる還元処理及びグリセロール分離処理後の飽和脂肪酸／脂肪酸エステルの培地中の濃度は、生産効率が最大になるように調整されることが好ましく、例えば０．１〜２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｖ／ｖ）程度の濃度となるように培地に添加すればよい。
【００２７】
本発明は炭素源として水溶性アルコールを用いることにより達成される。炭素源としては、メタノール、エタノール、グリセロール、マンニトールを挙げることができ、これに限定されない。好ましくはグリセロールである。従来用いられる糖類（グルコース、ラクトースなど）を用いると培養液の発泡が起き発酵槽から培養液が噴き出てしまうおそれがあるので、その発泡を抑えるために発酵速度を低下し、ジカルボン酸の生産速度を落とすことになる。
【００２８】
培地には、上記適当な窒素源及び無機塩、ならびに必要に応じその他有機成分を含める。無機塩としては、リン酸、硫酸及び塩酸の、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、ニッケル及び亜鉛塩が挙げられるが、これらに限定はされない。その他有機成分としては、酵母エキス、肉エキス、Ｄ−ビオチンなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２９】
本発明の培養は、基質である脂肪酸エステルと炭素源の水溶性アルコールを添加した培地に、上記のような微生物を接種して培養を行えばよい。酸化反応に必要な酸素を供給するため、この培養は好気的に行う必要がある。このため、培養には通気撹拌培養槽を好適に使用することができる。培養条件は、用いる微生物に応じて決定すればよいが、例えば、ｐＨは弱酸性〜中性（好ましくはｐＨ７）、温度は３０℃前後、好ましくは２０〜３５℃である。反応時間は添加した基質が全てジカルボン酸へ変換されるのに十分な時間継続されるように設定すればよいが、通常は１〜１０日程度でよい。
【００３０】
この培養においては、酸化反応の進行に応じて培地のｐＨが低下するため、ＮａＯＨやＫＯＨ、アンモニア（水）などのアルカリ試薬を添加して培地のｐＨを上記範囲に保つことが好ましい。また基質の長鎖脂肪酸エステルは水溶性が乏しいことから、脂肪酸エステル（基質層）と微生物が懸濁されている水層との接触を増加させるために撹枠を行うことが好ましい。さらに、好気的培養に必要な酸素の供給のため、反応系内に酸素又は空気などの酸素を含有する気体を通気し、撹枠により気泡を微分散させることも好ましい。本発明においては不所望の発泡が抑制されるため、培地への気泡の微分散を好適に行うことができる。反応系を加圧することにより液中の飽和溶存酸素濃度を上げる方法も、反応をより効率的に行うために実施することができる。
【００３１】
本発明によれば、培地での培養を完了した後の培養液（発酵液）中では、長鎖ジカルボン酸が生産されている。脂肪酸エステルを基質として、水溶性アルコールを炭素源にした培地で微生物を培養すると、驚くべきことに長鎖のジカルボン酸エステルではなく、主に長鎖ジカルボン酸が生成する。したがって、本発明においては、長鎖ジカルボン酸エステルを加水分解することなく長鎖ジカルボン酸を得ることができる。
【００３２】
発酵液からの長鎖ジカルボン酸の析出及び取得は、長鎖ジカルボン酸の精製について、一般的に用いられる手法を適宜組み合わせて用いることによって行うことができる。すなわち、発酵液に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ性溶液を加えて、ｐＨ１０〜１３、好ましくはｐＨ１１〜１２に調整して、長鎖ジカルボン酸を溶解させる。続いて、発酵液を濾過又は遠心分離し水相を取得する。さらに、得られた水相に硫酸、塩酸、リン酸、及び臭素酸等の無機酸を加えてｐＨ４．０以下、好ましくは３．０以下とし、発酵液中に遊離する長鎖ジカルボン酸を析出させる（酸析）。酸析の際のｐＨが低いほど長鎖ジカルボン酸の回収率が向上する。酸析処理した発酵液を濾過又は遠心分離することにより、粗精製長鎖ジカルボン酸を得ることができる。長鎖ジカルボン酸を析出する方法としては、酸析に限定されない。粗精製長鎖ジカルボン酸は純水やアルコール等で洗浄し、脱水乾固することができる。
【００３３】
粗精製長鎖ジカルボン酸は、ガスクロマトグラフィーによって分析した場合に、主成分の長鎖ジカルボン酸（好ましくはタプシン酸）の純度が少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上又はそれ以上であれば良い。
【００３４】
粗精製長鎖ジカルボン酸の精製は、発酵液中に長鎖ジカルボン酸が存在する状態で行なうことができ、長鎖ジカルボン酸を発酵液から分離した後に行なうこともできる。好適には、分離した後に行うのが良い。例えば、得られたジカルボン酸は溶解することのできる水に難溶な溶媒を添加し、ジカルボン酸を抽出分離して精製することもできる。抽出されたジカルボン酸は、さらに蒸留などにより単離することができる。
【００３５】
本発明においては、得られた長鎖ジカルボン酸をさらに芳香族炭化水素や複素環式化合物などの有機溶剤で処理することにより、長鎖ジカルボン酸に含まれるアルデヒド類を除去することができる。
（芳香族炭化水素を用いたアルデヒド類の除去）
利用可能な芳香族炭化水素としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくはトルエンである。
【００３６】
脱水乾固した粗精製長鎖ジカルボン酸の質量に対して、長鎖ジカルボン酸の純分量の少なくも５倍量（重量）以上、１０倍量（重量）以上、１５倍量（重量）以上又はそれ以上の芳香族炭化水素を加え、粗精製長鎖ジカルボン酸の少なくとも９０質量％を溶解する。好ましくは９３質量％以上、より好ましくは９５質量％以上、さらに好ましくは９９質量％以上を溶解するのが良い。芳香族炭化水素の場合、８０℃以上から１２０℃以下の温度、好ましくは８５℃以上から１１０℃以下の温度、より好ましくは８５℃以上から１００℃以下の温度に加温して、粗精製長鎖ジカルボン酸を溶解させる。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる長鎖ジカルボン酸、アルデヒド類、濁り成分や着色成分の一部または全部が芳香族炭化水素中に溶解する。粗精製ジカルボン酸の溶解が９０質量％未満であると、アルデヒド類等の不純物の除去が不十分となり本発明の効果が得られない。ベンゼン等の沸点の低い有機溶剤を用いる場合は、還流冷却器等を備えて蒸発した溶剤を冷却し容器に戻すのが良い。８０℃未満では未溶解の長鎖ジカルボン酸が液中に存在するためアルデヒド類を十分に除去することができなくなり、純度の低下や着色の原因となる。なお、タプシン酸のトルエンへの溶解度は８０℃で５．０質量％であり、８５℃で１１．３質量％、９０℃で２３．０質量％である。
【００３７】
さらに、長鎖ジカルボン酸を芳香族炭化水素及び／又は複素環式化合物に溶解して得られた溶液に酸化剤を添加して、アルデヒド類を酸化する工程を含む形態を好適に用いることができる。酸化剤として、次亜塩素酸ないしその塩、亜塩素酸ないしその塩、塩素酸ないしその塩、過炭酸ナトリウム、過酸化水素水等を挙げることができ、好ましくは過酸化水素である。
【００３８】
続いて、得られた溶液を５℃以上から５０℃以下、好ましくは１０℃以上から４５℃以下、更に好ましくは２０℃以上から４０℃以下に冷却して、長鎖ジカルボン酸を晶析させる。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる、ほとんど又は全てのアルデヒド類は芳香族炭化水素中に溶解したままである。温度が５℃以下であるとアルデヒド類も析出し長鎖ジカルボン酸に不純物として混入し、温度が５０℃以上であると長鎖ジカルボン酸の回収率が低下する。なお、タプシン酸のトルエンへの溶解度は４０℃で０．３質量％である。得られた晶析成分を濾過又は遠心分離して回収し、乾燥させることによって、アルデヒド類がほとんど又は全て除去された長鎖ジカルボン酸を得ることができる。
【００３９】
あるいは、得られた溶液を芳香族炭化水素の沸点以上に加熱し、芳香族炭化水素を蒸発させ溶液を濃縮することによって、長鎖ジカルボン酸を晶析させることもできる。濃縮することにより析出する晶析成分を分離して回収するか、濃縮後さらに前記温度まで冷却することにより析出する晶析成分を濾過又は遠心分離して回収しても良い。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる、ほとんど又は全てのアルデヒド類は芳香族炭化水素中に溶解したままである。得られた晶析成分を濾過又は遠心分離して回収し、乾燥させることによって、アルデヒド類が除去された長鎖ジカルボン酸を得ることができる。
【００４０】
あるいは、得られた溶液に長鎖ジカルボン酸に対する貧溶媒を加えて、長鎖ジカルボン酸を晶析させることもできる。利用可能な貧溶媒としては、長鎖ジカルボン酸の溶解度が低い溶媒であれば良く、例えばｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン、ｎ−ドデカン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカン、ｎ−ペンタデカン、ｎ−ヘキサデカン、ｎ−ヘプタデカン、ｎ−オクタデカン、ｎ−ノナデカン等が挙げられるが、これに限定はされない。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる、ほとんど又は全てのアルデヒド類は溶媒中に溶解したままである。得られた晶析成分を濾過又は遠心分離して回収し、乾燥させることによって、アルデヒド類が除去された長鎖ジカルボン酸を得ることができる。
【００４１】
得られた長鎖ジカルボン酸は、ガスクロマトグラフィーによって分析した場合に、主成分の長鎖ジカルボン酸（好ましくはタプシン酸）の純度が少なくとも９５％以上、９７％以上、９９％以上又はそれ以上であり得る。長鎖ジカルボン酸に含まれるアルデヒド類の含有量は６００ｐｐｍ以下、好ましくは５００ｐｐｍ、より好ましくは４００ｐｐｍ以下である。アルデヒド類が少ない程、ポリマー材料に用いる際に、得られるポリマーの高分子化が可能となる。
（複素環式化合物を用いたアルデヒド類の除去）
利用可能な複素環式化合物としては、１，３‐プロピレンオキシド、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ヘキサメチレンオキシド等の溶剤が挙げられるが、これに限定はされない。好ましくはテトラヒドロフランである。
【００４２】
脱水乾固した粗精製長鎖ジカルボン酸に対して、長鎖ジカルボン酸の純分量の少なくも５倍量（重量）以上、１０倍量（重量）以上、１５倍量（重量）以上又はそれ以上の複素環式化合物を加え、粗精製長鎖ジカルボン酸の少なくとも９０質量％を溶解する。好ましくは９３質量％以上、より好ましくは９５質量％以上、さらに好ましくは９９質量％以上を溶解するのが良い。複素環式化合物の場合、２０℃以上、好ましくは３０℃以上にて、粗精製長鎖ジカルボン酸を溶解させる。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる長鎖ジカルボン酸、アルデヒド類、濁り成分や着色成分の一部または全部が複素環式化合物に溶解する。粗精製ジカルボン酸の溶解が９０質量％未満であると、アルデヒド類等の不純物の除去が不十分となり本発明の効果が得られない。
【００４３】
続いて、得られた溶液に長鎖ジカルボン酸に対する貧溶媒を加えて、長鎖ジカルボン酸を晶析させる。利用可能な貧溶媒としては、長鎖ジカルボン酸の溶解度が低い溶媒であれば良く、例えば純水が挙げられるが、これに限定はされない。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる、ほとんど又は全てのアルデヒド類は溶媒中に溶解したままである。得られた晶析成分を濾過又は遠心分離して回収し、乾燥させることによって、アルデヒド類が除去された長鎖ジカルボン酸を得ることができる。
【００４４】
あるいは、得られた溶液を５℃以上、５０℃以下の温度に冷却する。複素環式化合物を用いる場合、好ましくは２０℃以下、より好ましくは５〜１０℃に冷却して、長鎖ジカルボン酸を晶析させる。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる、ほとんど又は全てのアルデヒド類は溶媒中に溶解したままである。得られた晶析成分を濾過又は遠心分離して回収し、乾燥させることによって、アルデヒド類が除去された長鎖ジカルボン酸を得ることができる。
【００４５】
得られた長鎖ジカルボン酸は、ガスクロマトグラフィーによって分析した場合に、主成分の長鎖ジカルボン酸（好ましくはタプシン酸）の純度が少なくとも９５％以上、９７％以上、９９％以上又はそれ以上であり得る。
【００４６】
複素環式化合物又は芳香族炭化水素を用いたアルデヒド類の除去方法は、それぞれ単独で用いても良いし、組み合わせて用いることも可能である。
【００４７】
本発明においては、得られた長鎖ジカルボン酸を芳香族炭化水素及び水を用いて処理することにより、長鎖ジカルボン酸に含まれる濁り成分や着色成分を抽出・除去することができる。
【００４８】
利用可能な芳香族炭化水素としては、ベンゼン、トルエン、キシレンやメシチレン等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくはトルエンである。
【００４９】
脱水乾固した粗精製長鎖ジカルボン酸に対して、長鎖ジカルボン酸の純分量の少なくも５倍量（重量）以上、２５倍量（重量）以下、好ましくは５倍量（重量）以上、１０倍量（重量）以下の芳香族炭化水素を加える。脱水乾固した粗精製長鎖ジカルボン酸を精製する場合は、長鎖ジカルボン酸の純分量の少なくも２．５倍量（重量）以上、１０倍量（重量）以下の水を加えるのが良く、好ましくは２．５倍量（重量）以上、５倍量（重量）以下である。溶液を添加した後に昇温して８０℃以上から１２０℃以下の温度、好ましくは８５℃以上から１１０℃以下の温度、より好ましくは８５℃以上から１００℃以下の温度に加温して、粗精製長鎖ジカルボン酸を溶解させる。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる長鎖ジカルボン酸及び濁り成分や着色成分の一部が芳香族炭化水素又は水中に溶解する。なお、タプシン酸のトルエンへの溶解度は８０℃で５．０質量％であり、８５℃で１１．３質量％、９０℃で２３．０質量％である。
【００５０】
続いて、８０℃以上から１２０℃以下の温度、好ましくは８５℃以上から１１０℃以下の温度、より好ましくは８５℃以上から１００℃以下の温度の間に維持しながら、静置して重力によって芳香族炭化水素相と水相に分離せしめたのち、該水相を除去して、得られた溶液を５℃以上から５０℃以下、好ましくは１０℃以上から４５℃以下、更に好ましくは２０℃以上から４０℃以下に冷却して、長鎖ジカルボン酸を晶析させる。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる、ほとんど又は全ての濁り成分や着色成分は芳香族炭化水素又は分離した水の中に溶解したままである。なお、タプシン酸のトルエンへの溶解度は４０℃で０．３質量％である。得られた晶析成分を濾過又は遠心分離して回収し、乾燥させることによって、濁り成分や着色成分がほとんど又は全て除去された長鎖ジカルボン酸を白色粉末の形態で得ることができる。
【００５１】
あるいは、８０℃以上から１２０℃以下の温度、好ましくは８５℃以上から１１０℃以下の温度、より好ましくは８５℃以上から１００℃以下の温度の間に維持しながら、静置して重力によって芳香族炭化水素相と水相に分離せしめたのち、該水相を除去して、得られた溶液に長鎖ジカルボン酸に対する貧溶媒を加えて、長鎖ジカルボン酸を晶析させることもできる。利用可能な貧溶媒としては、長鎖ジカルボン酸の溶解度が低い溶媒であれば良く、例えばｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン、ｎ−ドデカン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカン、ｎ−ペンタデカン、ｎ−ヘキサデカン、ｎ−ヘプタデカン、ｎ−オクタデカン、ｎ−ノナデカン等が挙げられるが、これに限定はされない。この際、粗精製長鎖ジカルボン酸中に含まれる、ほとんど又は全ての濁り成分や着色成分は芳香族炭化水素又は分離した水中に溶解したままである。得られた晶析成分を濾過又は遠心分離して回収し、乾燥させることによって、濁り成分や着色成分が除去された長鎖ジカルボン酸を白色粉末の形態で得ることができる。
【００５２】
得られた長鎖ジカルボン酸は、ガスクロマトグラフィーによって分析した場合に、主成分の長鎖ジカルボン酸（好ましくはタプシン酸）の純度が少なくとも９５％以上、９７％以上、９９％以上又はそれ以上であり得る。
【００５３】
得られた長鎖ジカルボン酸は、融解した際に無色透明の融解液であり、濁ったり、着色したりすることがない。本発明の方法により得られた長鎖ジカルボン酸は、融解した際のハーゼン単位色数が１００以下となる長鎖ジカルボン酸である。好ましくは、ハーゼン単位色数が８０以下であり、より好ましくは７０以下又は６０以下であり、さらに好ましくは５０以下、４０以下又は３０以下である。ハーゼン単位色数が２６０を超えると明らかに着色が感じられる。尚、「ハーゼン単位色数」はＪＩＳ  Ｋ００７１−１に準じて測定することができる。
【００５４】
本発明で得られた長鎖ジカルボン酸は、高分子化合物（ポリマー）を構成する単量体成分（モノマー）として利用することができる。長鎖ジカルボン酸の高分子化合物への重合は、長鎖ジカルボン酸を用いたポリマー製造において一般的に用いられる手法（例えば、溶液重合、界面重合などが挙げられるが、これらに限定されない）により行うことができる。ポリマー製造に際しては、本発明の方法により得られた長鎖ジカルボン酸に加えて、他の化合物も単量体成分（モノマー）として併用することができる。
【００５５】
本発明の方法により得られた長鎖ジカルボン酸は、例えば、ジオール類との反応により高分子量で実用可能なポリエステルを得ることができる。当該ポリエステルは、濁りや着色が少なく又は無く、食品をはじめとする様々な包装フィルムや容器など、多岐にわたる分野において好適に利用することができる。
【実施例】
【００５６】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。本発明において記載の「％」、「ｐｐｍ」は「質量％」、「質量ｐｐｍ」である。
【００５７】
［実施例１］
パルミチン酸メチル４６％とパルミトレイン酸５３％の混合物８００ｇを、３リットルのステンレス製オートクレーブに取り、水添触媒（パラジウムカーボン触媒）を１．２ｇ添加し、水素を２ｋｇ／ｃｍ２Ｇの圧力で０．０５リットル／分で流入させて反応させた。この水素添加反応は温度２１０℃にて５００ｒｐｍで５時間撹拌することにより行った。次に触媒をろ過により分離した後、活性炭処理した。得られた溶液を分析した所、パルミチン酸メチルの純度は９９％であった。
【００５８】
［実施例２］
Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２０９６２をＹＰＧ培地（酵母エキス  ２％、ペプトン  １％、グリセロール  ２％）５０ｍｌ／坂口フラスコに接種し、３０℃で振とう培養を２４時間行った。種培養液を以下の表１に示した培地１０００ｍｌに２％接種し、２Ｌジャーファーメンターを用いての通気撹拌培養を行った。基質には実施例１で得られたパルミチン酸メチルを用いた。温度は３０℃、通気速度１ｖｖｍ、撹拌速度７２５ｒｐｍの条件で培養を開始した。培養中は培養液に１０Ｎ水酸化カリウム水溶液を添加することにより、ｐＨ７．０に維持した。基質であるパルミチン酸メチルは培養開始時に添加後、培養中は枯渇しない状態を保つように追加を行った。培養期間中の炭素源にはグリセロールを使用し、培養中は枯渇しない状態を保つように追加を行った。培養２４０時間目の培養液中のタプシン酸の蓄積濃度は６１．０ｇ／Ｌであった。培養液中の生成物の分析は培養液とメチル化試薬（東京化成工業  Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  １０％  ｉｎ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を混合後、ガスクロマトグラフィーによって分析した。
シードの調整からジカルボン酸生産までグリセロールを炭素源として培養を行った結果、培養期間中に発泡は見られず、通気速度は培養を通して１ｖｖｍで行った。
得られた発酵液に１０Ｎ  水酸化カリウム水溶液を添加しｐＨを１１．０に調整後、遠心分離を行って菌体を除去した。次に菌体を除去した発酵液に硫酸を加えてｐＨを２．０とし、タプシン酸を酸析した。酸析処理した発酵液を濾過し、粗製のジカルボン酸を取得した。粗製品１６．６ｇにトルエンを８３．０ｇ（５．０倍量）、純水を４１．１ｇ（２．５倍量）加え、撹拌しながら８５〜９０℃に加熱を行った。タプシン酸が溶解したことを確認後、撹拌を止め８５〜９０℃の状態で静置した。２相に分離後、水相を抜き出した。トルエン相を４０℃まで冷却しタプシン酸を析出させ、濾過を行った。上記の再晶析を更に４回繰り返した後、乾燥させてタプシン酸製品を取得した。
取得したタプシン酸を１３０℃に加熱し融解させた所、溶液は無色であり、ハーゼン単位色数は３０であった。
【００５９】
【表１】
2014168440.tif 000002
【００６０】
［比較例１］
Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２０９６２をＹＰＤ培地（酵母エキス  ２％、ペプトン  １％、グルコース  ２％）５０ｍｌ／坂口フラスコに接種し、３０℃で振とう培養を２４時間行った。種培養液を以下の表２に示した培地１０００ｍｌに２％接種し、２Ｌジャーファーメンターを用いての通気撹拌培養を行った。温度は３０℃、通気速度１ｖｖｍ、撹拌速度７２５ｒｐｍの条件で培養を開始した。培養中は培養液に１０Ｎ水酸化カリウム水溶液を添加することにより、ｐＨ７．０に維持した。基質であるパルミチン酸メチルは培養開始時に添加後、培養中は枯渇しない状態を保つように追加を行った。培養期間中の炭素源にはグリセロールを使用し、培養中は枯渇しない状態を保つように追加を行った。培養２４０時間目の培養液中のタプシン酸の蓄積濃度は３５．４ｇ／Ｌであった。培養液中の生成物の分析は培養液とメチル化試薬（東京化成工業  Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  １０％  ｉｎ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を混合後、ガスクロマトグラフィーによって分析した。
シードの調整及びジカルボン酸生産開始時の炭素源をグルコースとして培養を行った結果、培養開始時より発泡が見られた。培養４８時間以降は激しく発泡したため、通気速度を１ｖｖｍから０．５ｖｖｍに変更せざるを得なかった。
【００６１】
【表２】
2014168440.tif 000003
【００６２】
［実施例３］
撹拌装置、窒素導入管、加熱装置、温度計、助剤添加口を備えた容量１００ｍｌの反応容器に実施例２で得られたタプシン酸を８５ｇ、１，４−ブタンジオールを３０ｇ、酸化ゲルマニウムをあらかじめ１重量％溶解させた９０％乳酸水溶液３ｇを仕込んだ。容器内容物を撹拌下、窒素ガスを導入し、窒素ガス雰囲気下１６０℃昇温し、さらにこの温度から１時間で２２０℃まで昇温し、２２０℃で１時間保持した。その後３０分で２３０℃まで昇温すると同時に、１時間３０分かけて反応系内の圧力を真空ポンプで０．５ｍｍＨｇまで減圧し、０．５ｍｍＨｇ減圧下において４時間重合を行った。その結果、得られたポリマーは着色が少なかった。