(57)【要約】【課題】Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ由来の、タンパク質、ポリペプチドおよびそのフラグメントを提供すること。【解決手段】本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ由来の、タンパク質、ポリペプチドおよびそのフラグメントを提供する。このタンパク質、ポリペプチドおよびフラグメントをコードする核酸、ならびにそれらに相補的な核酸（例えば、アンチセンス核酸）も提供される。本発明は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはフラグメントに結合する抗体を提供する。本発明は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはフラグメントを作製するために有用な発現ベクター、ならびにこのベクターを用いてトランスフェクトした宿主細胞を提供する。本発明は、ワクチン、診断薬、免疫原性組成物などに使用するための、タンパク質、ポリペプチド、フラグメントおよび/または核酸の組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のフラグメント：
【化２】
2014068652.tif 000913
を含むタンパク質であって、
該タンパク質は、
【化４】
2014068652.tif 000914
または
【化５】
2014068652.tif 000915
のアミノ酸配列からなるものではない、タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のフラグメントを認識する、抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の抗体、および／または請求項３に記載の核酸を含む組成物であって、ここで、該組成物は、ワクチン、診断試薬、または免疫原性組成物である、組成物。
【請求項５】
医薬としての使用のための請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
（ｉ）ナイセリア細菌に起因する感染を処置もしくは予防するための医薬、（ｉｉ）ナイセリア細菌の存在もしくはナイセリア細菌に対して惹起される抗体の存在を検出するための診断試薬、ならびに／あるいは（ｉｉｉ）ナイセリア細菌に対して抗体を惹起し得る試薬、の製造における、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の抗体、ならびに／あるいは請求項３に記載の核酸の使用。
【請求項７】
（ｉ）ナイセリア細菌に起因する感染を処置もしくは予防するため、（ｉｉ）ナイセリア細菌の存在もしくはナイセリア細菌に対して惹起される抗体の存在を検出するため、ならびに／あるいは（ｉｉｉ）ナイセリア細菌に対して抗体を惹起するための、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の抗体、ならびに／あるいは請求項３に記載の核酸を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書の内容は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ細菌由来の抗原性ペプチド配列に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、非運動性のグラム陰性双球菌であり、ヒトにおいて病原性がある。
【０００４】
生物の被膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２の血清群が同定されている。Ａ群は、サハラアフリカ周縁での伝染病において最も頻繁に関与している病原体である。血清群Ｂ群および血清群Ｃ群は、米国および大部分の先進国における症例の大部分の原因である。血清群Ｗ１３５およびＹは、米国および先進国における症例の残りの原因である。
【０００５】
現在使用される髄膜炎菌ワクチンは、血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５で構成される４価の多糖類ワクチンである。しかし、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ｂには、問題が残る。この多糖類アプローチは、使用され得ない。なぜならばｍｅｎＢ被膜多糖類は、哺乳動物組織にもまた存在するα（２−８）−連結  Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマーであるからである。ｍｅｎＢワクチンに対する１つのアプローチは、外膜タンパク質（ＯＭＰ）の混合物を使用する。抗原変異性を克服するために、９つまでの異なるポリンを含む多価ワクチンが構築されている［例えば、Ｐｏｏｌｍａｎ  ＪＴ（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｓ．４：１３−２８］。外膜ワクチンで使用されるさらなるタンパク質は、ｏｐａタンパク質およびｏｐｃタンパク質であったが、これらのアプローチは、いずれも抗原変異性を克服し得なかった［例えば、Ａｌａ’ＡｌｄｅｅｎおよびＢｏｒｒｉｅｌｌｏ（１９９６）］。髄膜炎菌トランスフェリン結合タンパク質１および２は、表面に露出しており、相同株および非相同株を殺し得る殺菌性抗体を生成する［ｖａｃｃｉｎｅ  １４（１）：４９−５３］。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）国際特許出願ＷＯ９９／５７２８０またはＷＯ００／２２４３０に開示されるタンパク質のフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１つの抗原決定基を含む、フラグメント。
（項目２）前記フラグメントが、１００アミノ酸以下の長さを有する、項目１に記載のフラグメント。
（項目３）前記フラグメントが、５アミノ酸以上の長さを有する、項目１または２に記載のフラグメント。
（項目４）前記フラグメントが、表Ｉに開示されるアミノ酸配列を有する、項目１〜３のいずれかに記載のフラグメント。
（項目５）項目１〜４のいずれか１項に記載のフラグメントと５０％以上の配列同一性を有するポリペプチド。
（項目６）項目１〜３のいずれか１項に記載のフラグメントの１つ以上を含むタンパク質であって、該タンパク質は、国際特許出願ＷＯ９９／５７２８０またはＷＯ００／２２４３０に開示される完全タンパク質配列の１つではない、タンパク質。
（項目７）項目１〜６のいずれか１項に記載されるフラグメントを認識する、抗体。
（項目８）ペプチド配列を含むタンパク質であって、ここで、該ペプチド配列は、項目７に記載の抗体により認識される、タンパク質。
（項目９）項目１〜３のいずれか１項に記載のフラグメント、項目５に記載のポリペプチド、または項目６もしくは８に記載のタンパク質、をコードする核酸。
（項目１０）項目１〜３のいずれか１項に記載のフラグメント、項目５に記載のポリペプチド、または項目６もしくは８に記載のタンパク質、項目７に記載の抗体、ならびに／あるいは項目９に記載の核酸、を含む組成物であって、ここで、該組成物は、ワクチン、診断試薬、または免疫原性組成物である、組成物。
（項目１１）医薬としての使用のための項目１０の組成物。
（項目１２）（ｉ）ナイセリア細菌に起因する感染を処置もしくは予防するための医薬、（ｉｉ）ナイセリア細菌の存在もしくはナイセリア細菌に対して惹起される抗体の存在を検出するための診断試薬、ならびに／あるいは（ｉｉｉ）ナイセリア細菌に対して抗体を惹起し得る試薬、の製造における、項目１〜３のいずれか１項に記載のフラグメント、項目５に記載のポリペプチド、または項目８に記載のタンパク質、項目７に記載の抗体、ならびに／あるいは項目９に記載の核酸の使用。
（項目１３）患者を処置する方法であって、項目１０に記載の組成物の治療的有効量を、該患者に投与する工程を包含する、方法。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、国際特許出願ＷＯ９９／５７２８０およびＷＯ００／２２４３０（以下「国際出願」）に開示されるタンパク質のフラグメントを提供する。ここで、このフラグメントは、少なくとも１つの抗原決定基を含む。
【０００８】
従って、国際出願に開示される任意の特定のタンパク質配列の長さがｘアミノ酸である場合、本発明は、そのタンパク質のｘ−１以下のアミノ酸のフラグメントを提供する。このフラグメントは、これより短くてもよく（例えば、ｘ−２、ｘ−３、ｘ−４．．．）、そして好ましくは１００アミノ酸以下（例えば、９０アミノ酸、８０アミノ酸など）である。このフラグメントは、３アミノ酸程度の短さであり得るが、好ましくはより長い（例えば、最大で５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、または１００アミノ酸）である。
【０００９】
好ましいフラグメントは、表１に開示される髄膜炎菌性ペプチド配列またはその部分配列を含む。このフラグメントは、表１に示されるフラグメントより長くてもよい。ここで、例えば、表１のフラグメントは、タンパク質のアミノ酸残基ｐから残基ｑまで延び、本発明はまた、残基（ｐ−１）、（ｐ−２）または（ｐ−３）から残基（ｑ＋１）、（ｑ＋２）または（ｑ＋３）までのフラグメントに関する。
【００１０】
本発明はまた、これらのフラグメントに相同な（すなわち、配列同一性を有する）ポリペプチドを提供する。この特定のフラグメントに依存して、配列同一性の程度は、好ましくは５０％よりも大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）。これらの相同なポリペプチドは、このフラグメントの変異体および対立遺伝子改変体を含む。２つの配列の間の同一性は、好ましくはパラメーターｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１を有するａｆｆｉｎｅギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。
【００１１】
本発明はまた、上記で規定されるフラグメントの１つ以上を含むタンパク質を提供する。
【００１２】
本発明は、国際出願で開示された完全長タンパク質配列のいずれか（すなわち、ＷＯ９９／５７２８０の２−３０２０の偶数の配列番号、およびＷＯ００／２２４３０の９６３−１０４５の奇数の配列番号）に限定されるタンパク質をその範囲内に含まないことを条件とする。
【００１３】
本発明のタンパク質は、もちろん、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によっておよび種々の形態で（例えば、天然型、Ｃ末端および／またはＮ末端融合型など）調製され得る。これらは、好ましくは実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、他のナイセリアタンパク質または宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）。短いタンパク質は、好ましくは、化学的ペプチド合成を用いて生成される。
【００１４】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のフラグメントを認識する抗体を提供する。ただし、本発明は、国際出願の完全タンパク質配列のうちのいずれかを認識する抗体をその範囲内に含まない。この抗体は、ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナルであり得、そして任意の適切な手段により産生され得る。
【００１５】
本発明はまた、これらの抗体により認識されるペプチド配列を含むタンパク質を提供する。これらのペプチド配列は、もちろん、国際出願の髄膜炎菌タンパク質のフラグメントを含むが、免疫グロブリンに結合する場合、髄膜炎菌性ペプチドの抗原性構造を模倣するペプチドもまた含む。
【００１６】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のフラグメントおよびタンパク質をコードする核酸を提供する。ただし、本発明は、国際出願の全長タンパク質配列のうちのいずれかをコードする核酸をその範囲内に含まない。この核酸は、１０ヌクレオチドと同じ程度短くあり得るが、好ましくは、より長い（例えば、最大で１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、または１００ヌクレオチド）。
【００１７】
さらに、本発明は、これらの配列と相同な（すなわち、配列同一性を有する）配列を含む核酸を提供する。配列同一性の程度は、好ましくは５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）程度である。さらに、本発明は、これらの配列に、好ましくは「高ストリンジェンシー」な条件下で（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液中６５℃）ハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００１８】
本発明が上記に記載される配列と相補的な配列を含む核酸を提供することもまた、認識されるべきである（例えば、アンチセンス目的またはプローブの目的において）。
【００１９】
本発明に従う核酸は、もちろん、多くの様式（例えば、化学合成により、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物体自体からなど）で調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）をとり得る。さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、そしてまた改変された骨格を含むＤＮＡおよびＲＮＡのようなそれらの類似物、そしてまたペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【００２０】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２１】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体および／または核酸を含む組成物を提供する、これらの組成物は、例えばワクチンとして、または診断用試薬として、または免疫原性組成物として適切であり得る。
【００２２】
本発明はまた、医薬品として（例えばワクチンとしてまたは免疫原性組成物として）または診断用試薬として使用するための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。また、以下の製造における、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用を提供する：（ｉ）ナイセリア細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬品；（ｉｉ）ナイセリア細菌またはナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断用試薬；および／または（ｉｉｉ）ナイセリア細菌に対する抗体を惹起し得る試薬。上記のナイセリア細菌は任意の種または菌株であり得る（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が、好ましくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（特に、菌株Ａまたは菌株Ｂ）である。
【００２３】
本発明はまた、治療的有効量の、本発明に従う核酸、タンパク質、および／または抗体を患者に投与する工程を含む、患者の処置の方法を提供する。
【００２４】
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。例えば：本発明のタンパク質を産生するためのプロセスであって、タンパク質の発現を誘導する条件下において、本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する、プロセスが提供される；
本発明のタンパク質または核酸を産生するためのプロセスであって、ここでそのタンパク質または核酸は、化学的手段を使用して、一部または全体が合成されるプロセスが提供される；
本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプロセスであって、（ａ）本発明に従う核プローブを、ハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させて、二重鎖を形成する工程；および（ｂ）上記の二重鎖を検出する工程を包含する、プロセスが提供される；ならびに
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスであって、（ａ）本発明に従う抗体を、抗体−抗原複合体を形成するために適切な条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程を包含する、プロセスが提供される。
【００２５】
本発明を実行するために用いられ得る標準的な技術および手順（例えば、ワクチン接種目的または診断目的のために、開示された配列を利用するための）の要旨は以下の通りである。この要旨は、本発明に対する限定ではなく、むしろ使用され得るが必要とされるわけではない実施例を与えるものである。
【００２６】
（概要）
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻およびｉｉ巻（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編  １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に１５４および１５５巻；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編  １９８６）。
【００２７】
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な省略が、本明細書において使用される。
【００２８】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は参考としてその全体が援用される。
【００２９】
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえを含む。
【００３０】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、またはＸ＋ＹのようなＸに付加したものも含み得る。
【００３１】
用語「抗原決定基」は、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを含む。
【００３２】
用語「異種」とは、天然では共に見られない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結されるときのように、それらは共に機能し得る。別の例は、髄膜炎菌配列がマウス宿主細胞に対して異種であることである。さらなる例は、天然においてみられない配置で単一タンパク質に組み立てられる同じタンパク質または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。
【００３３】
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始または調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において効率的な自律性複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で効率的であるウイルスＴ抗原である。
【００３４】
（発現系）
髄膜炎菌ヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母と共に使用される発現系において発現され得る。
【００３５】
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る速度を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版）。
【００３６】
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主範囲を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、ホルモン応答性細胞においてグルココルチコイドで誘導され得るプロモーターに依存して、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）かのいずれかであり得る。
【００３７】
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合わされるエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、相同性プロモーターまたは異種プロモーターに連結されるとき、転写を１０００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくはｆｌｉｐｐｅｄ方向のいずれかで転写開始部位より上流または下流に、もしくはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離で位置するとき、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらは通常、より広い宿主範囲を有するため、特に有用であり得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７）。
【００３８】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
【００３９】
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から生育培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成されるシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３分割リーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
【００４０】
通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら．（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３’ｅｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を方向づけ、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ
ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００４１】
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライス供与部位および受容部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳動物の複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｍ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数で複製する。哺乳動物レプリコンの別の例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンは維持することが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
【００４２】
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドの哺乳類細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオチドの封入、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が挙げられる。
【００４３】
発現用宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定しない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。
【００４４】
（ｉｉ  バキュロウイルス系）
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベクター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を有する転移ベクター（通常は細菌プラスミド）；転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および生育培地。
【００４５】
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイルスゲノムを組換え可能にする。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓならびにＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書中で以下、「Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
【００４６】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに先立って、プロモーター配列、リーダー配列（所望される場合は）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転移ベクター）に構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；操作可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅用の適切な宿主内で維持され得る。
【００４７】
現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計されている。これらのものとしては、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１）が挙げられる。
【００４８】
そのプラスミドも通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、および原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉにおいての選抜ならびに増殖のための複製起点を含む。
【００４９】
バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）方向の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始点を含む。バキュロウイルス転移ベクターは、またエンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、存在する場合は、通常、構造遺伝子に対し遠位にある。発現は調節され得るか、あるいは構成的であり得る。
【００５０】
ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号１２７８３９および１５５４７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
【００５１】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質、あるいはバキュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）のような、分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、哺乳類細胞の翻訳後修飾（シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化のような）のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞および脊椎動物細胞間で保存されると思われるので、ヒトインターフェロンα（Ｍａｅｄａら，（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，（１９８８），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら，（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用され得る。
【００５２】
組換えポリペプチドあるいは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得、あるいは適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合の外来タンパク質の優れた細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
【００５３】
あるいは、自然に分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指示する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードしている。
【００５４】
タンパク質の前駆体である発現産物をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入物は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｒｅｃｏｎｖｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内にあり得る；挿入物はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に操作された制限酵素部位内にあり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ４；９１。発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合のＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列により５’および３’の両側で隣接され、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置される。
【００５５】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％〜約５％の間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウイルスである。従って、方法には、組換えウイルスの同定が必要となる。その発現系の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的スクリーニングである。天然のウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスを区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層にプラーク形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野性型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）によりスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００５６】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ
ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；およびＦｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。
【００５７】
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、上記ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。
【００５８】
改変した昆虫細胞をさらに、適切な栄養培地で増殖し、その改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度まで増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は、目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補給しながら、培地中に連続的に発現され、そして栄養培地を連続的に循環させる必要がある。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切な場合、必要ならば、その産物をさらに精製し、その結果、これもまた培地中に分泌された、または昆虫細胞の溶解から生じた実質的に全ての昆虫タンパク質を除去し、宿主細片（例えば、タンパク質、脂質および多糖）を少なくとも実質的に含まない産物を提供し得る。
【００５９】
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知のことに基づいて、当業者に容易に確かめられ得る。
【００６０】
（ｉｉｉ．植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および植物全体での遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；および米国特許第５，６０８，１４３号のような特許に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載された。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中においても見出され得る；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ  ５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，Ｇｅｎｅ  １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモン（ジベレリン酸およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素）による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏｌｍ  Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編  １９８４  Ｐｉｔｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁の中に見出され得る。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献は、以下である：Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。
【００６１】
代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は、植物内で作動させるために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のようなもともとのクローニング宿主から、所望の植物宿主へＤＮＡを移動させるために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主域の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、アグロバクテリウムの形質転換については、アグロバクテリウム媒介移入のためのＴ  ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出できない場合は、好ましくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するために適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見られる。
【００６２】
植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推奨される。これらは、相同組換えのためのトランスポゾン配列など、および植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にするＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。さらなる機能をコードしている他のＤＮＡ配列はまた、当該分野で公知であるように、そのベクターの中に存在し得る。
【００６３】
本発明の核酸分子はまた、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る。２つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットが存在する。組換え発現カセットは、異種タンパク質のコード配列に加え、以下のエレメントを含む；プロモーター領域、植物５’非翻訳配列、構造遺伝子が開始コドンを備えているかどうかに依存して開始コドン、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの５’末端および３’末端の独特な制限酵素認識部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
【００６４】
異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質のための配列であり得る。目的のタンパク質をコードする配列は、適切な場合、そのタンパク質の適切なプロセシングおよびトランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得る任意の配列を欠いている。転写開始領域は、大部分は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子のためのものであるから、トランスロケーションを与えるシグナルペプチドを使用することにより、それはまた、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。この方法で、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ得、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳内へ、アリューロン層あるいは胚盤上皮層を通過する。タンパク質を産生する細胞からタンパク質が分泌される必要がない場合、このことは組換えタンパク質の分離および精製を容易にする。
【００６５】
所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物細胞におけるものであるために、クローン化された遺伝子の任意の部分が、イントロンのように、宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構より、プロセシングで除去される配列を含むかどうかを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、偽イントロンコードとして遺伝的情報の一部を欠失することを防ぐために実施され得る。ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ  ４１：９５−１０５（１９８５）。
【００６６】
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いて植物細胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５）。遺伝子物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に移入され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９６、７２−７４、１９８２）。核酸セグメントの導入の別の方法は、小さいビーズまたは粒子のマトリックスの内部に、あるいはその表面のいずれかに核酸を有する小さな粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０−３３６は、大麦胚乳のパーティクルボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランスジェニック大麦を作製することを示している）。さらに別の導入方法は、他の実体（ミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の融合可能な脂質表面体のいずれか）とのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
【００６７】
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在中でエレクトロポレーションされる。高い場の強度の電気衝撃により、生体膜を可逆的に通過できるようにし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、そして植物カルスを形成する。
【００６８】
プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、その結果、移入された遺伝子を含む完全な植物が再生される。実際に、全ての植物が、サトウキビ、テンサイ、ワタ、果実および他の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞あるいは組織から再生され得ることが公知である。いくつかの適切な植物としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる：Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、ＳｏｒｇｈｕｍおよびＤａｔｕｒａ。
【００６９】
再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織は形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根させ得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特にトウモロコシおよびアルファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は通常、同時に発生する。効率的な再生は、培地、遺伝子型、および培養歴に依存する。これらの３つの変数が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り返し可能である。
【００７０】
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され得るか、あるいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のない半分の種子または他の植物組織は、機械的に破壊されて、細胞間および組織間の任意の分泌されたタンパク質を放出し得る。その混合物は緩衝溶液に懸濁されて、可溶性タンパク質が回収され得る。次いで、従来のタンパク質分離および精製方法は組換えタンパク質を精製するために使用される。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパラメーターは、異種タンパク質の発現および回収を最適化するための慣用的な方法により調整される。
【００７１】
（ｉｖ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流方向（３’方向）の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し得、このドメインは、ＲＮＡ合成が始まる近接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、その配列が存在する場合は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に（５’側で）近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例は、カタボライトアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）であり、それはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を助ける（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。調節される発現は、それゆえ正または負のいずれかであり、従って転写を増強し得るかまたは低下させ得る。
【００７２】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６号およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。ｇ−ラクタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提供する。
【００７３】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとして機能する。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを形成する（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、ある細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくつかの遺伝子の高いレベルでの発現を生じるために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合されたプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ−Ａ−０  ２６７  ８５１）。
【００７４】
機能性のプロモーター配列に加え、効率的なリボソーム結合部位はまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’側との間の塩基対合によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒら編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現が記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００７５】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロでのインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され得る（ＥＰＯ−Ａ−０２１９２３７）。
【００７６】
融合タンパク質は、直接的発現に代わるものを提供する。通常、内在性の細菌タンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端で連結し得、そして細菌において発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素（第Ｘａ因子）用の部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰ−Ａ−０３２４６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断可能部位をコードしてもよいし、あるいはコードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）用の部位を保持するユビキチン領域と共に作製される。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は分離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８）。
【００７７】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る（米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、プロセシング部位が存在する。
【００７８】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯ
Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質に関する遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０２４４０４２）。
【００７９】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例は、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列を含む。
【００８０】
通常、上記の成分（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物となる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）における安定な保持が可能である染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに保持される。このレプリコンは複製系を有し、従って、このことが、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれもが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。
【００８１】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡによって構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０  １２７  ３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【００８２】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含んで、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得、そして細菌が薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）に耐性になるようにする遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
【００８３】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいて組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成される。
【００８４】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ２５９およびＥＰ−Ａ−０  ０６３  ９５３；ＷＯ  ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０
０３６  ７７６、ＥＰ−Ａ−０  １３６  ８２９およびＥＰ−Ａ−０  １３６  ９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許第４，７４５，０５６号）。
【００８５】
外来ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ2または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理
された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ２５９およびＥＰ−Ａ−０６３  ９５３；ＷＯ  ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ＣＯｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；（Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；（Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、（Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。
【００８６】
（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、もし存在するならば、通常、構造遺伝子に対して遠位である。このＵＡＳは、調節される（誘導できる）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるかまたは減少させるかのいずれかであり得る。
【００８７】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ−Ａ−０  ２８４  ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ−Ａ−０  ３２９  ２０３）。酵母ＰＨＯ５遺伝子はまた、酸性ホスファターゼをコードし、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１）。
【００８８】
さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域と連結されるＡＤＨ調節配列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）を含む。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなり、ＧＡＰまたはＰｙＫ（ＥＰ−Ａ−０  １６４  ５５６）のような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合されているプロモーターを含む。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する、天然に生じる非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ  １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。
【００８９】
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端にある最初のアミノ酸は常に、ＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである。もし所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切断され得る。
【００９０】
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、バキュロウイルス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現において、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母において発現し得る。２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断可能部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−０  １９６  ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域を伴って作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな融合タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
【００９１】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、通常コードする。
【００９２】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質に関する遺伝子由来であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０  ０１２  ８７３；ＪＰＯ．６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）である。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（ＥＰ−Ａ−０  ０６０  ０５７）。
【００９３】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得る型のα因子フラグメントは、完全長の、プレ−プロα因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；ＥＰ−Ａ−０  ３２４  ２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーは、第１の酵母のプレ配列を有するが、第２の酵母α因子からのプロ領域を有しないで作製される、ハイブリッドα因子リーダーを含む（例えば、ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【００９４】
通常、酵母によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、ｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする転写終結配列である。
【００９５】
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物になる。発現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばしば保持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、レプリコンが、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において保持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
【００９６】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するために適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座が指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして生じ得る。
【００９７】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子であり、それぞれ、酵母細胞にツニカマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）
あるいは、上記の成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターになり得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンのままで保持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーを含む。
【００９８】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ
３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
【００９９】
外来ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処理されたインタクトな酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）。
【０１００】
（抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗体結合部位から構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、抗原のエピトープの特徴に相補的な内部表面形状および電荷分布を有する、３次元結合空間であり、これが、抗体と抗原の結合を可能にする。「抗体」は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変された抗体、単価抗体、Ｆａｂタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。
【０１０１】
本発明のタンパク質に対する抗体は、親和性クロマトグラフィー、免疫アッセイ、および髄膜炎菌のタンパク質の識別／同定に有用である。
【０１０２】
本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、従来の方法によって調製され得る。一般に、タンパク質は、最初に、適切な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タンパク質を生理的食塩水（好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント）に混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的に（一般的に皮下、または筋肉内に）注射することによって、行われる。５０〜２００μｇ／注射の用量が、代表的に十分である。免疫は、一般的に、２〜６週後に生理的食塩水（好ましくはフロイント不完全アジュバントを用いて）中のタンパク質の１回以上の注射でブーストされる。あるいは、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産生し得、これは、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいと考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製の容器へ採血し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、その後４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例えば１，０００ｇ、１０分間）によって回収される。ウサギから、採血１回につき約２０〜５０ｍｌが得られ得る。
【０１０３】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜９６）の標準的方法、またはその改変版を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）が取り出され、そして単一の細胞へ解離される。所望の場合、脾臓細胞は、（非特異的付着細胞の回収後）細胞懸濁液をタンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへ適用することによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、洗い落とされない。得られるＢ細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫する抗原に対して特異的に結合する（かつ関連しない抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。選択されるＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、次にインビトロ（例えば、組織培養瓶または中空線維リアクター中で）、またはインビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養される。
【０１０４】
所望の場合、抗体は（ポリクローナルまたはモノクローナルいずれであっても）、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる：発蛍光団、発色団、放射性原子（特に32Ｐおよび125Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パー
トナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青い色素（分光光度計を用いて定量可能）へ変換するその能力によって、検出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいい、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド結合体を含む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、上記が、種々の標識を別個のクラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべきである。例えば、125Ｉは、放
射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。ＨＲＰは、酵素として、またはＭＡｂについての抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識を組合せ得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とする。従って、ＭＡｂをビオチンで標識して、そして125Ｉで標識したアビジン、またはＨＲ
Ｐで標識した抗ビオチンＭＡｂで、その存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内に等しいと考えられる。
【０１０５】
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択される治療または治療の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定情況のための有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
【０１０７】
本発明の目的のために、有効な用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体において、ＤＮＡ構築物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１０８】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤のような、治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない、任意の薬学的キャリアをいい、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のように、大きく、ゆっくり代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
【０１０９】
薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて利用可能である。
【０１１０】
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
【０１１１】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１１２】
その組成物の直接送達は、一般的に、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュールであり得る。
【０１１３】
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【０１１４】
このようなワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリア自体は、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原体由来の毒素）と結合体化され得る。
【０１１５】
この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントは、（１）アルミニウム塩（「明礬」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、（２）水中油懸濁処方物（他の特定の免疫刺激薬剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うか伴わない）を含むが、それらに限定されず、例えば、以下：（ａ）５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、モデル１１０Ｙ微小流体化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いてμ未満の粒子へと処方されたＭＦ５９TM（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、編、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５の第１０章）；（ｂ）μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉTMアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；および（６）その組成物の効力を強化するための免疫刺激性因子として作用する他の物質を含むが、それらに限定されない。ミョウバンおよびＭＦ５９TMが好ましい。
【０１１６】
上記で言及したように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを含むが、それらに限定されない。
【０１１７】
免疫原性組成物（例えば、免疫化抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクルにおいて存在し得る。
【０１１８】
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
【０１１９】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性または免疫原性のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」とは、その量の個体への投与が、単回用量であれ、一連の（用量の）一部としてであれ、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、そのワクチンの処方物、処置する医師の医療的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲であり、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
【０１２０】
免疫学的組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内または経皮（ｔｒａｎｓｕｄｅｒｍａｌｌｙ）／経皮（ｔｒａｎｓｕｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）のいずれかへの注射による）に投与される（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、坐剤、ならびに経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。
【０１２１】
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンが使用され得る（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８；本明細書の以下を参照のこと）。
【０１２２】
（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
【０１２３】
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはアルファウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１４８−１５３を参照のこと。
【０１２４】
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、そして本発明者らは、任意のレトロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であることを意図する。これには、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性レトロウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）多向性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｏｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
【０１２５】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起源はトリ白血症ウイルスに由来し得る。
【０１２６】
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそれらを導入することによって形質導入適合性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによって宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みについて構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６号を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
【０１２７】
上記に記載のレトロウイルスベクターを伴う使用について適切なパッケージング細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３号およびＷＯ９２／０５２６６号を参照のこと）、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株、すなわち「ＶＣＬ」とも称される）を作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を除去する。
【０１２８】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスは、トリ白血症ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）を含む。このようなレトロウイルスは、寄託機関または収集機関（例えば、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄのアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」））から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【０１２９】
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターは、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１．ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、同第４，９８０，２８９号、同第４，７７７，１２７号、同第５，５９１，６２４号に記載されるものを含む。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１；６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １もまた参照のこと。
【０１３０】
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターは、上記に参照される文書およびＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるものを含む。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載されるような殺傷したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要なおよび好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡＶ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドおよび１８までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌクレオチドから１８までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイティブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失またはネイティブでないヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイティブなＤ配列は、各ＡＡＶ逆方向末端反復において（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）２０の連続するヌクレオチドの配列であって、これは、ＨＰ形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティブなＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２４：２５７−２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）である。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ＩＴＲベクターである。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒ  米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａ  米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅ  米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎ
ＷＯ９４／２８８１５７に開示されるものである。本発明において使用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性に発現を指向する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，９４１号、および同第５，２５２，４７９号に開示される。
【０１３１】
本発明の遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要なおよび好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるもの）である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクターは、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ＬａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１−１９に記載されるＨＳＶ  Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｅｄ）に記載されるＨＳＶ  ７１３４、２ＲＨ  １０５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ  ＶＲ−２６０として寄託されたものを含む。
【０１３２】
意図されるのはまた、本発明において使用され得るアルファウイルス遺伝子治療ベクターである。好ましいアルファウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）および米国特許第５，０９１，３０９号、同第５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるもの。より詳細には、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、および米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるそれらのアルファウイルスベクターが使用可能である。このようなアルファウイルスは、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭａｒｙｌａｎｄのＡＴＣＣのような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性が減少したアルファウイルスベクターを使用する（米国特許出願番号０８／６７９６４０号を参照のこと）。
【０１３３】
ＤＮＡベクター系（例えば、真核細胞層状発現系）もまた、本発明の核酸の発現について有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核細胞層状発現系はアルファウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
【０１３４】
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターは、ポリオウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（１９８９）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  １：１１５に記載されるもの；リノウイルス、例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｌ４０１に記載されるもの；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ
ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ  ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同第４，７６９，３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるもの））；ＳＶ４０ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：１５３３に記載されるもの）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ．８７：３８０２−３８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５９：１１０（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ  Ｍｅｄ  ３０９：１３ならびにＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるもの）；アウラウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）；ベバルウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）；カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）；チクングンヤウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）；フォートモーガン（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）；ムカンボウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）；ヌヅムウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）；ピクスナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）；トリニティウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）；ユナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）；ワタロアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）；オニオニオンウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）；西部ウマ脳炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７４０）およびＨａｍｒｅ（��９６６）Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １２１：１９０に記載のものを含む。
【０１３５】
本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウイルスに連結したかまたは連結してないポリカチオン性縮合ＤＮＡ単独（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核酸電荷中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：１５８１−１５８５に記載される。
【０１３６】
粒子媒介遺伝子送達が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド（ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２に記載されるような）、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０：２５３−２６３に記載されるようなインスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ３：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された合成遺伝子伝達分子（例えば、重合ＤＮＡ結合カチオン（ポリリジン、プロタミンおよびアルブミンのような））とともにインキュベートされ得る。
【０１３７】
裸のＤＮＡもまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生体分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にすることによってさらに改良され得る。
【０１３８】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、重合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン）のような合成遺伝子伝達分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイルス送達は、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法は、例えば、手動の遺伝子伝達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）を含む。
【０１３９】
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １４９：１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：７８５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７６：４２０に記載されるものである。
【０１４０】
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量（この用語は上記に定義されるとおりである）の遺伝子治療ビヒクルを含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０１４１】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタンパク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
【０１４２】
この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内の注射によって、または組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与および肺投与、坐剤、および経皮または経皮適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。
【０１４３】
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例は、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞を含む。
【０１４４】
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。
【０１４５】
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
【０１４６】
（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの環境スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）。
【０１４７】
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
【０１４８】
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥデキストランである。また、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）。
【０１４９】
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。
【０１５０】
脂質カプセル化は、一般的に核酸に安定に結合し得るか、または核酸を捕捉もしくは維持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。
【０１５１】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６０７７−６０８１）；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１５２】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒ前出もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームは、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含む。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０１５３】
同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが含まれる。これらの物質はまた、適切な比率のＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１５４】
このリポソームは、多重膜のベシクル（ＭＬＶ）、小さな単一膜ベシクル（ＳＵＶ）、または大きな単一膜のベシクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ  １７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：１６６を参照のこと。
【０１５５】
（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例は、キロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬを含む。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。
【０１５６】
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって命名されている。
【０１５７】
１つのリポタンパク質は、１を超えるアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するキロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥからなり、そして時間が経てばこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。
【０１５８】
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：２４６５；Ｕｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６５：２３２に記載されている。
【０１５９】
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造を補助するために選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
【０１６０】
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＷＯ９８／０６４３７に見い出され得る。
【０１６１】
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを有する組成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
【０１６２】
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれもを有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。
【０１６３】
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例は、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）を含む。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸濃縮薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。
【０１６４】
有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）を含む。
【０１６５】
ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から外挿されて、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。
【０１６６】
有用な合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンを含む。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTMは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。
【０１６７】
（免疫診断アッセイ）
本発明の髄膜炎菌抗原は、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得る（または、逆に抗髄膜炎菌抗体は抗原レベルを検出するために使用され得る）。充分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイは、侵襲性の診断方法と置き換えるために開発され得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む）内の髄膜炎菌タンパク質に対する抗体が検出され得る。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象であり、そして種々のこれらは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイは公知である；これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）である。
【０１６８】
免疫診断に適切でありそして適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中に、アッセイの実行に必要とされる残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）ならびに適切なセットのアッセイの説明書と共に本発明の組成物を含む適切な物質を詰めることによって構築される。
【０１６９】
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いの会合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離している。次いで、２つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影響を与える因子は以下を含む：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁。
【０１７０】
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
【０１７１】
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブおよび検出される配列の間の相同性である。研究されるフラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物については０．１〜１μｇ、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピー遺伝子については１０-9〜１０-8ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露時間、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い比活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０8ｃｐｍ／μｇ
のプローブを用いてハイブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０8ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸
デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間曝露時間を生じる。
【０１７２】
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して直面する変化には、長さ、ハイブリダイズする配列の全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ10Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６（％ホルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、およびｎは塩基対内のハイブリッドの長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４からわずかに改変した）。
【０１７３】
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。
【０１７４】
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性では３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いて、適切にホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び曝露され得る。曝露のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。
【０１７５】
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ、またはブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を決定し得る。プローブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
【０１７６】
核酸プローブは、本発明の髄膜炎菌ヌクレオチド配列（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がアミノ酸配列をコードするが、ネイティブな髄膜炎菌配列は、細胞に存在する実際の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡは、コード配列を表し、従ってプローブはコード配列に相補的であるべきであり、一本鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤＮＡプローブは非コード配列に相補的であるべきである。
【０１７７】
プローブ配列は髄膜炎菌配列（またはその相補物）に同一である必要はない。核酸プローブが標的ヌクレオチドと、検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列および長さの変動は、アッセイの感度の増加をもたらし得る。また、核酸プローブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらなる髄膜炎菌配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識としての一助となり得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの５’末端に付着され得、ここでそのプローブ配列の残りは髄膜炎菌配列に相補的である。あるいは、プローブ配列が、それとハイブリダイズし、そしてそれによって、検出され得る二重鎖を形成するために髄膜炎菌配列との十分な相補性を有する場合、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散され得る。
【０１７８】
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存して、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５、そしてより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含むが、これよりも短くもあり得る。短いプライマーは、一般的には、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。
【０１７９】
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５））、またはＵｒｄｅａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７４６１）に従って、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、産生され得る。
【０１８０】
プローブの化学的性質は、優先度に従って選択され得る。特定の適用については、ＤＮＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのような骨格の改変）が組み込まれ得、インビボの半減期を増大させ、ＲＮＡ親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性などを増大させるためなどに使用され得（例えば、ＡｇｒａｗａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ  １４：３７６−３８７）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（例えば、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ  １５  ２２４−２２９；Ｂｕｃｈａｒｄｔら（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：３８４−３８６）。
【０１８１】
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別の周知の手段である。そのアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０）；米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、増殖標的（またはその相補物）の配列にハイブリダイズしない、二重鎖の安定性を補助するための、または、例えば、首尾よい制限部位を組み込むための配列を含む。代表的には、このような配列は、所望の髄膜炎菌配列に隣接する。
【０１８２】
熱安定性のポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プライマーから標的核酸のコピーを作製する。標的核酸の閾値量がポリメラーゼによって産生された後、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。サザンブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、髄膜炎菌配列（またはその相補物）にハイブリダイズする。
【０１８３】
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される、従来的なブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡからポリメラーゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体にブロットされる。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いですべてのハイブリダイズしていないプローブを洗浄して除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。代表的には、そのプローブは、放射活性部分で標識される。
【０１８４】
（本発明を実施するための形態−好ましいフラグメント）
本発明は、特に、国際出願に開示されるタンパク質配列を、全長タンパク質内の予想抗原性ペプチドフラグメントに対するコンピューター分析に供した。この分析には以下の３つのアルゴリズムを用いた。
●ＡＭＰＨＩ：このプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために用いられてきた［Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ補遺．１１：９］そして、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．のＰｒｏｔｅａｎパッケージにおいて利用可能である（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）。
●ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ  ＩＮＤＥＸ（抗原性指標）：ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ（１９８８）によって開示された「抗原性指標：抗原決定基を予測するための新規なアルゴリズム（Ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ
ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）」ＣＡＢＩＯＳ，４：１８１：１８６．
●ＨＹＤＲＯＰＨＩＬＩＣＩＴＹ（親水性）：ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（１９８１）により開示された「アミノ酸配列からのタンパク質抗原決定基の予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」ＰＮＡＳ，７８：３８２４〜３８２８。
【０１８５】
３つのアルゴリズムがしばしば同じフラグメントを特定する。このような複数で特定されるフラグメントが特に好ましい。このアルゴリズムは、しばしば重複するフラグメントを特定する（例えば、抗原「０１３」について、ＡＭＰＨＩはアミノ酸（ａａ）４２〜４６を特定し、そして抗原性指標は、アミノ酸３９〜４５を特定する）。本発明は、明白に、これらの重複するフラグメントの組合せから得られるフラグメントを含む（例えば、「０１３」の場合、残基３９〜残基４６のフラグメント）。単一のアミノ酸により分離されるフラグメントがまた、しばしば特定される（例えば、「０１８−２」について、抗原性指標は、アミノ酸１９〜２３および２４〜４１を特定する）。本発明はまた、このような「隣接する」フラグメントの２つの端にまたがるフラグメントを含む（例えば、「０８１−２」について、１９〜４１）。実施例では、国際出願において開示されるタンパク質の好ましい抗原性フラグメントを提供する。
【実施例】
【０１８６】
（実施例１）好ましい抗原タンパク質フラグメント
以下の表１におけるアミノ酸配列は、特定のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（国際出願において命名されたものと一致する）に対して割り当てられた番号（数字）を示す、タイトルによって同定される。このタイトルは、以下の形式のタイトルである：［プレフィックス（ｐｒｅｆｉｘ）なし、ｇまたはａ］［＃］、ここで、「プレフィックスなし」は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の配列を意味し、「ａ」は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  血清型Ａ由来の配列を意味し、そして「ｇ」は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列を意味する；ならびに「＃」は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に割り当てられた番号（数字）を意味する。例えば、「１２７」は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂアミノ酸配列（ＯＲＦ番号１２７）をいう。これらのタイトルへの添字「−１」または「−２」の存在は、特定のＯＲＦについて見出されたさらなる配列を示す。従って、例えば、「ａ１２−２」は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ａアミノ酸配列（ＯＲＦ番号１２）（これは、本来命名されたＯＲＦ１２およびＯＲＦ１２−１に加えてＯＲＦ１２について見出される別の配列である）をいう。各アミノ酸配列は、開始アミノ酸位置番号が先行して存在し、続いて末端アミノ酸位置番号が存在する。
【０１８７】
（表１）
ＡＭＰＨＩ  Ｒｅｇｉｏｎｓ（ＡＭＰＨＩ領域）、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｉｎｄｅｘ（抗原性指標）、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎｓ（親水性領域）
【０１８８】
【表１】
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【０１８９】
【表２】
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【０１９０】
【表３】
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【０１９１】
【表４】
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【０１９２】
【表５】
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【０１９３】
【表６】
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【０１９４】
【表７】
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【０１９５】
【表８】
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【０１９６】
【表９】
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【０１９７】
【表１０】
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【０１９８】
【表１１】
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【０１９９】
【表１２】
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【０２００】
【表１３】
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【０２０１】
【表１４】
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【０２０２】
【表１５】
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【０２０３】
【表１６】
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【０２０４】
【表１７】
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【０２０５】
【表１８】
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【０２０６】
【表１９】
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【０２０７】
【表２０】
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【０２０８】
【表２１】
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【０２０９】
【表２２】
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【０２１０】
【表２３】
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【０２１１】
【表２４】
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【０２１２】
【表２５】
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【０２１３】
【表２６】
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【０２１４】
【表２７】
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【０２１５】
【表２８】
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【０２１６】
【表２９】
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【０２１７】
【表３０】
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【０２１８】
【表３１】
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【０２１９】
【表３２】
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【０２２０】
【表３３】
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【０２２１】
【表３４】
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【０２２２】
【表３５】
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【０２２３】
【表３６】
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【０２２４】
【表３７】
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【０２２５】
【表３８】
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【０２２６】
【表３９】
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【０２２７】
【表４０】
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【０２２８】
【表４１】
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【０２２９】
【表４２】
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【０２３０】
【表４３】
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【０２３１】
【表４４】
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【０２３２】
【表４５】
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【表４６】
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【０２３４】
【表４７】
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【０２３５】
【表４８】
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【０２３６】
【表４９】
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【０２３７】
【表５０】
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【０２３８】
【表５１】
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【０２３９】
【表５２】
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【０２４０】
【表５３】
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【０２４１】
【表５４】
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【０２４２】
【表５５】
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【表５６】
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【０２４４】
【表５７】
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【０２４５】
【表５８】
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【０２４６】
【表５９】
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【０２４７】
【表６０】
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【０２４８】
【表６１】
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【０２４９】
【表６２】
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【０２５０】
【表６３】
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【０２５１】
【表６４】
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【０２５２】
【表６５】
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【０２５３】
【表６６】
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【０２５４】
【表６７】
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【０２５５】
【表６８】
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【０２５６】
【表６９】
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【０２５７】
【表７０】
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【０２５８】
【表７１】
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【０２５９】
【表７２】
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【０２６０】
【表７３】
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【０２６１】
【表７４】
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【表７５】
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【０２６３】
【表７６】
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【０２６４】
【表７７】
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【表７８】
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【０２６６】
【表７９】
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【０２６７】
【表８０】
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【０２６８】
【表８１】
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【０２６９】
【表８２】
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【０２７０】
【表８３】
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【０２７１】
【表８４】
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【０２７２】
【表８５】
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【０２７３】
【表８６】
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【０２７４】
【表８７】
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【０２７５】
【表８８】
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【０２７６】
【表８９】
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【０２７７】
【表９０】
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【０２７８】
【表９１】
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【０２７９】
【表９２】
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【０２８０】
【表９３】
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【０２８１】
【表９４】
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【０２８２】
【表９５】
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【０２８３】
【表９６】
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【０２８４】
【表９７】
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【０２８５】
【表９８】
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【０２８６】
【表９９】
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【０２８７】
【表１００】
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【０２８８】
【表１０１】
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【０２８９】
【表１０２】
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【０２９０】
【表１０３】
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【０２９１】
【表１０４】
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【０２９２】
【表１０５】
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【０２９３】
【表１０６】
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【０２９４】
【表１０７】
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【０２９５】
【表１０８】
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【０２９６】
【表１０９】
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【０２９７】
【表１１０】
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【０２９８】
【表１１１】
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【０２９９】
【表１１２】
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【０３００】
【表１１３】
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【０３０１】
【表１１４】
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【０３０２】
【表１１５】
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【０３０３】
【表１１６】
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【０３０４】
【表１１７】
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【０３０５】
【表１１８】
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【０３０６】
【表１１９】
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【０３０７】
【表１２０】
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【０３０８】
【表１２１】
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【０３０９】
【表１２２】
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【０３１０】
【表１２３】
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【０３１１】
【表１２４】
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【０３１２】
【表１２５】
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【０３１３】
【表１２６】
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【０３１４】
【表１２７】
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【０３１５】
【表１２８】
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【０３１６】
【表１２９】
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【０３１７】
【表１３０】
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【０３１８】
【表１３１】
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【０３１９】
【表１３２】
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【０３２０】
【表１３３】
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【０３２１】
【表１３４】
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【０３２２】
【表１３５】
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【０３２３】
【表１３６】
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【表１３７】
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【表１３８】
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【０３２６】
【表１３９】
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【表１４０】
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【０３２８】
【表１４１】
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【０３２９】
【表１４２】
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【０３３０】
【表１４３】
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【０３３１】
【表１４４】
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【表１４５】
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【表１４６】
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【表１４７】
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【表１４８】
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【表１４９】
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【０３３７】
【表１５０】
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【表１５１】
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【表１５２】
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【０３４０】
【表１５３】
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【０３４１】
【表１５４】
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【０３４２】
【表１５５】
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【０３４３】
【表１５６】
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【表１５７】
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【０３４５】
【表１５８】
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【０３４６】
【表１５９】
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【０３４７】
【表１６０】
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【０３４８】
【表１６１】
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【０３４９】
【表１６２】
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【０３５０】
【表１６３】
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【０３５１】
【表１６４】
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【表１６５】
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【表１６６】
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【表１６９】
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【０３５８】
【表１７１】
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【表１７２】
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【０３６０】
【表１７３】
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【０３６１】
【表１７４】
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【０３６２】
【表１７５】
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【０３６３】
【表１７６】
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【表１７７】
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【０３６５】
【表１７８】
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【表１７９】
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【表１８０】
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【０３６８】
【表１８１】
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【０３６９】
【表１８２】
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【表１８３】
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【０３７１】
【表１８４】
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【０３７２】
【表１８５】
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【０３７３】
【表１８６】
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【０３７４】
【表１８７】
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【０３７５】
【表１８８】
2014068652.tif 000189
【０３７６】
【表１８９】
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【０３７７】
【表１９０】
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【０３７８】
【表１９１】
2014068652.tif 000192
【０３７９】
【表１９２】
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【０３８０】
【表１９３】
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【０３８１】
【表１９４】
2014068652.tif 000195
【０３８２】
【表１９５】
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【０３８３】
【表１９６】
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【０３８４】
【表１９７】
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【０３８５】
【表１９８】
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【０３８６】
【表１９９】
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【０３８７】
【表２００】
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【０３８８】
【表２０１】
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【０３８９】
【表２０２】
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【０３９０】
【表２０３】
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【０３９１】
【表２０４】
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【０３９２】
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【１０３８】
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【表９０９】
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【１０９７】
【表９１０】
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【１０９８】
【表９１１】
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【１０９９】
本発明は、例示のみの目的で上に記載され、そして改変は、本発明の範囲内および精神内にとどまる中でなされ得ることが理解される。
【配列表】
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