(57)【要約】【課題】  吸着効率の高い抗体精製用カラムを提供し、抗体精製に掛かる時間を大幅に短縮する。【解決手段】  ３次元網目構造のシリカゲルまたはシリカガラスからなる骨格体７と、骨格体７の表面に分散して形成された骨格体の表面から内部まで貫通する細孔９とを有し、窒素吸着法で測定した細孔９の中心直径が４０ｎｍ以上７０ｎｍ以下である多孔質担体５の表面に、プロテインＡを固定してなる吸着体を備えてなる抗体精製用カラムを用い、精製対象の抗体を含む精製前溶液と吸着体との接触時間が４０秒以下の条件で、抗体精製用カラムに精製前溶液を通液させて、精製前溶液内の抗体を吸着体に吸着させ、抗体を精製する。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元網目構造のシリカゲルまたはシリカガラスからなる骨格体と、前記骨格体の表面に分散して形成された前記骨格体の表面から内部まで貫通する細孔とを有し、窒素吸着法で測定した前記細孔の中心直径が４０ｎｍ以上７０ｎｍ以下である多孔質担体の表面に、プロテインＡを固定してなる吸着体を備えてなる抗体精製用カラムを用い、
精製対象の抗体を含む精製前溶液と前記吸着体との接触時間が４０秒以下の条件で、前記抗体精製用カラムに前記精製前溶液を通液させて、前記精製前溶液内の抗体を前記吸着体に吸着させ、前記抗体を精製することを特徴とする抗体精製方法。
【請求項２】
前記接触時間が２秒以上４０秒以下であることを特徴とする請求項１に記載の抗体精製方法。
【請求項３】
溶媒置換、吸着、洗浄、溶出、及び、後洗浄の各工程からなる１回の精製工程に要する時間が、１２０秒以内であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗体精製方法。
【請求項４】
前記後洗浄工程でｐＨ１３を超える強アルカリの溶液を用いずに前記抗体精製用カラムの洗浄を行い、２時間以内に、前記精製工程を１００回以上繰り返すことを特徴とする請求項３に記載の抗体精製方法。
【請求項５】
３次元網目構造のシリカゲルまたはシリカガラスからなる骨格体と、前記骨格体の表面に分散して形成された前記骨格体の表面から内部まで貫通する細孔とを有する多孔質担体の表面に、プロテインＡを固定してなる吸着体を備えてなり、
窒素吸着法で測定した前記細孔の中心直径が４０ｎｍ以上７０ｎｍ以下であることを特徴とする抗体精製用カラム。
【請求項６】
精製対象の抗体を含む精製前溶液と前記吸着体との接触時間が２秒以上４０秒以下の条件で、前記吸着体に前記精製前溶液を通液させて、前記精製前溶液内の抗体を前記吸着体に吸着させた場合における、波長２８０ｎｍの紫外線を用いて得られる吸着破過曲線で１０％破過を超える前記吸着体の単位体積当たりの前記抗体の添加量で規定される動的吸着容量が１０ｍｇ／ｍＬｇｅｌを超える吸着性能を有することを特徴とする請求項５に記載の抗体精製用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＡを固定してなる吸着体を備えてなる抗体精製用カラム、及び、その抗体精製用カラムを用いて行う抗体精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、抗体医薬として広く用いられている他、生化学分野の研究でも広く活用されており、抗体精製を高効率に行われることが望まれている。免疫グロブリン抗体（Ｉｇ）は、２本の同一重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と２本の同一軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）のポリペプチド鎖を有し、重鎖と軽鎖がＹ字型に配置した基本構造を有している。免疫グロブリン抗体は、基本構造が共通しているため、抗体精製に生物学的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーを用いて、粗精製プロセスを行った後に最終精製プロセスを行うことが一般に行われている。
【０００３】
免疫グロブリン抗体の精製には、当該抗体の定常部位と親和性のあるプロテインＡを担体にリガンドしてなる吸着体を備えたアフィニティーカラムが使用できる。従来、アフィニティーカラムに用いる担体として、ビーズ状のシリカゲル、アガロースゲル、セルロースゲル等の多数の細孔を有する多孔質担体が用いられている。
【０００４】
また、最近では、下記の特許文献１において、アフィニティーカラムに用いる多孔質担体として、無機モノリスを使用することが提案されている。特許文献１では、無機モノリスは、直径０．１μｍ〜１０μｍのマクロ孔（貫通孔）と骨格体が共連続構造を形成し、骨格体に直径２ｎｍ〜２００ｎｍのメソ孔（細孔）が存在する、シリカを主成分とする無機系多孔質連続体として規定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１４６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在実用化されているビーズ状の多孔質セルロースゲル等を担体として使用した抗体精製用のアフィニティーカラムは、高線速にすると吸着能力が低下する、或いは、高線速で圧密化を起こすという欠点が指摘されており、担体として無機モノリスを使用することで、当該欠点が補われると考えられている（特許文献１参照）。尚、これらのビーズ状の多孔質担体の欠点は、以下のように分析することができる。
【０００７】
第１に、抗体精製用カラム内に通液された精製対象の抗体を含む精製前溶液は、各ビーズ間の隙間を流路として流れるが、抗体のビーズ内部の細孔表面への移動は拡散による移動となり、更に、担体がビーズ状でその直径が細孔径に対して大きいので、抗体はビーズ表面近傍の細孔表面にしか吸着されず、ビーズ表面近傍から深奥部に亘る細孔表面積の全てを有効に利用できない。
【０００８】
第２に、上記第１の問題点を改善するためにビーズ径を小さくすると、各ビーズ状担体間の隙間が狭窄して精製前溶液の流路抵抗が高くなって圧力損失が増加し、精製前溶液の流量を大きくできない。カラム容器内にビーズ状担体を密に充填した場合を仮定すると、各ビーズ状担体間の隙間の狭窄個所を通過する流路径がビーズ径の１５％程度まで狭くなること、また、当該狭窄個所がビーズ状担体によって４方向から囲まれ、一方向から当該狭窄個所に浸入する流路が対向するビーズ状担体によって大きく屈曲すること等が、圧力損失増加の要因と考えられる。
【０００９】
更に、多孔質セルロースゲル等のソフトゲルでは、更に圧力損失が高く、高線速で精製前溶液を通液した場合、圧密化が起こり一定流量以上では精製前溶液が流れなくなる。
【００１０】
従って、担体として無機モノリスを使用することで、高線速下での吸着能力の低下及び圧密化は或る程度改善されることが期待される。
【００１１】
しかしながら、吸着能力の低下は単に高線速であることだけが要因でないことが、本願発明者の鋭意研究により明らかになった。無機モノリスにおいても、高線速にすると吸着能力が低下する点は、程度の差はあれ、従来のビーズ状の担体と同じであり、当該高線速以外の他の要因を考慮した設計を行わなければ、高線速下において高い吸着能力を得られないことが判明した。
【００１２】
特許文献１に開示の無機モノリスの細孔径が２ｎｍ〜２００ｎｍと広範囲に分布しており、細孔径の設定の自由度は極めて大きい。一方、吸着対象の免疫グロブリン抗体の分子は扁平なＹ字型形状をしており、当該Ｙ字型構造の頂点間の距離（以下、「抗体の大きさ」と称す）は約１０〜１２ｎｍである。つまり、無機モノリスの細孔径は、当該抗体の大きさの６分の１から２０倍までの広範囲に分布している。
【００１３】
細孔径が大きくなると細孔容積当たりの表面積が小さくなり、吸着効率が低下する。逆に、細孔径が小さくなると細孔内の拡散速度が遅くなるため表面近傍の細孔表面にのみにしか抗体が吸着されず、吸着効率が低下する。従って、抗体の大きさに対して大き過ぎる或いは小さ過ぎる細孔径を用いることで、吸着効率が低下すると考えられ、無機モノリスの細孔径が２ｎｍ〜２００ｎｍと広範囲に分布していれば、吸着効率が低下する細孔径の範囲が含まれることになり、改善の余地がある。
【００１４】
本願発明者の鋭意研究により、吸着効率と細孔径の間に有意な相関があることを見出し、従来の無機モノリスより細孔径の分布をタイトに制御することで、従来と比較して吸着効率を大幅に改善できることを確認した。実際、特許文献１では、吸着効率と細孔径との間の関係は一切考慮されておらず、細孔径の分布を制御して吸着効率の改善を図ることにつき何らの検討も示唆もなされていない。
【００１５】
本発明は、上述の抗体精製用のアフィニティーカラムの問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、吸着効率の高い抗体精製用カラムを提供し、抗体精製に掛かる時間を大幅に短縮することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明は、３次元網目構造のシリカゲルまたはシリカガラスからなる骨格体と、前記骨格体の表面に分散して形成された前記骨格体の表面から内部まで貫通する細孔とを有し、窒素吸着法で測定した前記細孔の中心直径が４０ｎｍ以上７０ｎｍ以下である多孔質担体の表面に、プロテインＡを固定してなる吸着体を備えてなる抗体精製用カラムを用い、精製対象の抗体を含む精製前溶液と前記吸着体との接触時間が４０秒以下の条件で、前記抗体精製用カラムに前記精製前溶液を通液させて、前記精製前溶液内の抗体を前記吸着体に吸着させ、前記抗体を精製することを特徴とする抗体精製方法を提供する。
【００１７】
更に好ましくは、上記特徴の抗体精製方法において、前記接触時間は２秒以上４０秒以下である。
【００１８】
更に好ましくは、上記特徴の抗体精製方法において、溶媒置換、吸着、洗浄、溶出、及び、後洗浄の各工程からなる１回の精製工程に要する時間は、１２０秒以内である。
【００１９】
更に好ましくは、上記特徴の抗体精製方法において、前記後洗浄工程でｐＨ１３を超える強アルカリの溶液を用いずに前記抗体精製用カラムの洗浄を行い、２時間以内に、前記精製工程を１００回以上繰り返す。
【００２０】
上記目的を達成するため、本発明は、３次元網目構造のシリカゲルまたはシリカガラスからなる骨格体と、前記骨格体の表面に分散して形成された前記骨格体の表面から内部まで貫通する細孔とを有する多孔質担体の表面に、プロテインＡを固定してなる吸着体を備えてなり、窒素吸着法で測定した前記細孔の中心直径が４０ｎｍ以上７０ｎｍ以下であることを特徴とする抗体精製用カラムを提供する。
【００２１】
更に好ましくは、上記特徴の抗体精製カラムは、精製対象の抗体を含む精製前溶液と前記吸着体との接触時間が２秒以上４０秒以下の条件で、前記吸着体に前記精製前溶液を通液させて、前記精製前溶液内の抗体を前記吸着体に吸着させた場合における、波長２８０ｎｍの紫外線を用いて得られる吸着破過曲線で１０％破過を超える前記吸着体の単位体積当たりの前記抗体の添加量で規定される動的吸着容量が１０ｍｇ／ｍＬｇｅｌを超える吸着性能を有する。
【００２２】
尚、上記特徴の抗体精製方法及び抗体精製用カラムにおいて、多孔質担体の表面は、骨格体の表面に加え、細孔の内壁面を含む。
【発明の効果】
【００２３】
上記特徴の抗体精製方法または抗体精製用カラムによれば、担体にシリカモノリスを用い、しかも抗体吸着に最適な範囲の中心細孔直径を使用することで、後述するように、高線速下において高い動的吸着容量（ｄＢＣ、動的結合容量とも呼ばれる）が実現でき、吸着工程での所要時間を４０秒以下にして、高効率且つ短時間での抗体精製を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明に係る抗体精製用カラムの第１実施形態における概略の構成を模式的に示す構成図
【図２】本発明に係る抗体精製用カラムの吸着体の構造を模式的に示す要部断面図
【図３】本発明に係る抗体精製用カラムの吸着体を構成する多孔質担体の構造を模式的に示す要部断面図
【図４】本発明に係る抗体精製用カラムの吸着体を構成する多孔質担体のＳＥＭ写真
【図５】本発明に係る抗体精製用カラムの吸着体を充填した評価用カラムの線速度と動的吸着容量の関係を測定した結果を示す吸着破過曲線図
【図６】図５の吸着破過曲線から得られる線速度と動的吸着容量と接触時間の関係を示す図
【図７】本発明に係る抗体精製用カラムの多孔質担体の中心細孔直径の異なる４種類の評価用カラムの吸着性能を比較評価した結果を示す図
【図８】本発明に係る抗体精製用カラムの第２実施形態における概略の構成を模式的に示す構成図
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係る抗体精製用カラム（以下、適宜「本カラム」という。）、及び、本カラムを用いた抗体精製方法の実施の形態につき、図面に基づいて説明する。
【００２６】
〈第１実施形態〉
第１実施形態の本カラム１０は、一例として、図１に示すように、円盤状または円柱状の吸着体１が円筒容器２に収容されて構成されている。円筒容器２の各端面には、夫々開口部３，４が形成されている。開口部３，４の一方が、後述する精製工程の各工程で通液する溶液の送入口となり、他方が通液後の溶液の排出口となる。
【００２７】
本カラム１０の主要な構成部品である吸着体１は、図２に模式的に示すように、円盤状または円柱状に成形された無機系の多孔質担体５の表面に吸着対象物質である免疫グロブリン抗体の定常部位と特異的に結合するタンパク質６を表面修飾して固定化したものである。本実施形態では、当該タンパク質６としてプロテインＡを使用する。
【００２８】
吸着体１を構成する無機系の多孔質担体５は、図３に模式的に示すように、３次元網目状の一体構造の骨格体７と、骨格体７の間隙に形成された平均孔径が４μｍ以下の範囲内の３次元網目状の貫通孔８を有してなり、更に、骨格体７の表面には、中心細孔直径が４０ｎｍ以上７０ｎｍ以下の範囲の細孔９が分散して形成されている。尚、貫通孔８の孔径は細孔９の孔径より大きく、例えば０．５μｍ以上である。従って、本カラム１０で使用する多孔質担体５は、孔径の異なる２種類の細孔（貫通孔８と細孔９）からなる２重細孔構造となっている。図４に、本カラム１０で使用する多孔質担体５のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真の一例を示す。尚、貫通孔はマクロ孔、細孔はメソ孔とも呼ばれる。
【００２９】
次に、多孔質担体５の表面に抗体結合能を有するタンパク質６としてプロテインＡを固定化した吸着体１を備えた本カラムの作製方法について、後述する吸着性能評価に使用する評価用カラムの作製工程を一例として説明する。
【００３０】
先ず、１０ｍＭ（体積モル濃度）硝酸水溶液１０ｍｌに対してポリエチレングリコール（分子量１０００００）１．２ｇと尿素０．９ｇを溶かし、氷冷下でテトラエトキシシラン５ｍｌを加え、３０分攪拌して均一な溶液を得る。得られた均一溶液を、直径８ｍｍのポリプロピレンチューブに充填し、３０℃でゲル化させる。その後、得られたゲルを密閉容器に入れ、１２０℃で２０時間加熱処理した後、蒸留水ですすぎ乾燥し、６５０℃５時間で焼成してシリカモノリス多孔質担体５（シリカゲルまたはシリカガラスからなる多孔質担体に相当）を得る。尚、本実施形態で使用する多孔質担体５の合成方法は、スピノーダル分解ゾルゲル法を使用するものである。
【００３１】
上記合成条件では、貫通孔の平均孔径（水銀圧入法による測定）が約１．７μｍ、細孔の中心直径（中心細孔直径、窒素吸着法による測定）が約５０ｎｍのシリカモノリスが得られる。上述のポリエチレングリコールの添加量を調整することで、貫通孔の孔径を制御することができ、ゲル化後の加熱処理温度を調整することで、中心細孔直径を制御することができる。尚、本実施形態においては、中心細孔直径は、窒素吸着法で測定した細孔分布における細孔容積（Ｖ）を細孔直径（Ｄ）の常用対数（ｌｏｇＤ）で微分した値（ｄＶ／ｄ（ｌｏｇＤ））を細孔直径（Ｄ）に対してプロットした曲線の最大のピークを示す細孔直径として定義される。
【００３２】
引き続き、得られたシリカモノリス多孔質担体を直径８ｍｍにくり抜き、硬質ガラス管に装填して外周からガスバーナーで加熱して、シリカモノリス多孔質担体とガラス管を密着させガラスクラッドカラムを得る。得られたガラスクラッドカラムを所定長さ（本実施形態では１０ｍｍ）にダイアモンドカッターで切断して、プロテインＡを固定化する前の評価用カラムが得られる。
【００３３】
引き続き、得られた評価用カラムに、５％γアミノプロピルトリエトキシシランのトルエン溶液を通液して充填し、１００℃２４時間加熱し、反応後に、２−プロパノールを通液して評価用カラムを洗浄し８０℃で乾燥する。その後、１％炭酸スクシンイミジルのアセトニトリル溶液を通液した後、アセトニトリルで洗浄して減圧乾燥し、５ｍｇ／ｍＬのプロテインＡのＨＥＰＥＳ緩衝溶液を通液して、プロテインＡを固定化した評価用カラムを得る。
【００３４】
尚、上述の作製方法で説明した寸法や成型方法等は、評価用カラムの形状及び大きさに合わせた値であり、実用に供する本カラム１の多孔質担体５の形状及び大きさ応じて、適宜変更される。
【００３５】
次に、上記要領で作製した評価用カラムを用いて本カラムの免疫グロブリン抗体（ＩｇＧ）の吸着性能評価を行った評価手順及び評価結果を説明する。
【００３６】
本カラムの吸着性能の評価では、動的吸着容量（ｄＢＣ）の多孔質担体の中心細孔直径に対する依存性と、線速度に対する依存性を調べた。中心細孔直径依存性の評価では、多孔質担体の中心細孔直径が３０ｎｍ、５０ｎｍ、７０ｎｍ、１００ｎｍの４種類のサンプルを準備し、線速度９０ｃｍ／ｈでの動的吸着容量を測定した。線速度依存性の評価では、多孔質担体の中心細孔直径が５０ｎｍのサンプルを準備し、線速度９０ｃｍ／ｈ、３６０ｃｍ／ｈ、７２０ｃｍ／ｈ、１８００ｃｍ／ｈの４通りの線速度での動的吸着容量を測定した。
【００３７】
何れの評価においても、動的吸着容量の測定は以下の要領で実施した。評価用カラムを高速液体クロマトグラフィー装置に接続した。評価用カラムを１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にて平衡化した後、１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧリン酸緩衝生理食塩水溶液（リン酸濃度１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を所定の線速度にて評価用カラムに通液し、紫外可視吸光光度計を用いて評価用カラム出口の溶液を紫外吸収波長２８０ｎｍにてオンラインで測定した。
【００３８】
尚、動的吸着容量の測定では、ゲル単位体積当たりのＩｇＧ添加量（通液したＩｇＧ溶液量×ＩｇＧ濃度÷評価用カラムの担体体積、単位：ｍｇ／ｍＬｇｅｌ）を横軸に、評価用カラム出口の溶液の紫外吸収波長２８０ｎｍでのＩｇＧリン酸緩衝生理食塩水の検出強度比（リン酸緩衝生理食塩水溶液が１ｍｇ／ｍＬで検出される強度を１００％とする）を縦軸にプロットして吸着破過曲線を描き、ゲル体積当たりで添加したＩｇＧが１０％（１０％破過）を超える点を動的吸着容量とした。
【００３９】
図５に、線速度が９０ｃｍ／ｈ、３６０ｃｍ／ｈ、７２０ｃｍ／ｈ、１８００ｃｍ／ｈにおける、多孔質担体の中心細孔直径が５０ｎｍの評価用カラムの吸着破過曲線を示す。図５に示す吸着破過曲線の１０％破過から、各線速度に対する動的吸着容量が導出され、各線速度と評価用カラムの長さから、ＩｇＧ溶液の評価用カラムの入口から出口までの接触時間が算出される。図６に、各線速度に対する接触時間と動的吸着容量を纏めて示す。
【００４０】
図６に示すように、線速度が９０ｃｍ／ｈ、３６０ｃｍ／ｈ、７２０ｃｍ／ｈ、１８００ｃｍ／ｈと速くなると、接触時間は４０秒、１０秒、５秒、２秒と短くなり、動的吸着容量は、３８ｍｇ／ｍＬｇｅｌ、３３ｍｇ／ｍＬｇｅｌ、２７ｍｇ／ｍＬｇｅｌ、２０ｍｇ／ｍＬｇｅｌと低下する。線速度と接触時間は反比例の関係にある。ここで、注目すべきは、線速度を上げて接触時間を４０秒から２秒に、２０分の１に短縮しても、動的吸着容量は、３８ｍｇ／ｍＬｇｅｌから２０ｍｇ／ｍＬｇｅｌと約半分に低下したに過ぎない点である。つまり、本カラムは、基本的な吸着性能が高いため、吸着能力の極端な低下を伴わずに、線速度を上げて接触時間を４０秒から更に短縮できることが分かる。
【００４１】
図７に、線速度が９０ｃｍ／ｈにおける、多孔質担体の中心細孔直径が３０ｎｍ、５０ｎｍ、７０ｎｍ、１００ｎｍの４種類の評価用カラムの動的吸着容量を示す。図７より、中心細孔直径が４０ｎｍを下回り３０ｎｍになると、動的吸着容量は中心細孔直径が５０ｎｍの場合の約１３％まで低下し、逆に、中心細孔直径が７０ｎｍを上回り１００ｎｍになると、動的吸着容量は中心細孔直径が５０ｎｍの場合の約２６％まで低下し、中心細孔直径が５０ｎｍ付近、概ね４０ｎｍから７０ｎｍの範囲に最適な中心細孔直径の範囲が存在することが分かる。図７中の横方向の矢印で示す幅は、４種類の評価用カラムの細孔径の分布範囲を示しており、夫々、概ね±１０ｎｍの範囲で分布している。
【００４２】
免疫グロブリン抗体の大きさが約１０〜１２ｎｍであることから、中心細孔直径が３０ｎｍ程度では、抗体は、細孔の骨格体表面付近で固定化されたプロテインＡに結合しても、細孔奥部の表面に固定化されたプロテインＡとは十分に結合できていないものと推察される。図７より、中心細孔直径としては、４０ｎｍ以上であることが好ましいと推察される。また、中心細孔直径が７０ｎｍから１００ｎｍへと増加するに伴い、細孔容積当たりの表面積が小さくなり、動的吸着容量が低下していると考えられる。以上より、多孔質担体の中心細孔直径は、４０ｎｍから７０ｎｍの範囲内、より好ましくは、４５ｎｍから６０ｎｍの範囲内に設定するのが良い。
【００４３】
次に、本カラムを用いた抗体精製方法の処理手順を説明する。本実施形態では、抗体精製方法は、溶媒置換、吸着、洗浄、溶出、後洗浄の５つの工程で構成される。
【００４４】
先ず、溶媒置換工程では、本カラムに１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を通液して平衡化する。
【００４５】
次に、吸着工程では、ＩｇＧリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）、或いは、血清、腹水、細胞上清等の免疫グロブリン抗体を含む溶液を、本カラムに通液して、抗体を吸着体に吸着させる。
【００４６】
次に、洗浄工程では、本カラムに１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を通液して、吸着体内の免疫グロブリン抗体を含んでいた溶液を洗い流す。
【００４７】
次に、溶出工程では、本カラムに１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）または１００ｍＭグリシン＋塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を通液して、吸着体内を酸性にして吸着体に吸着した免疫グロブリン抗体を溶出させる。これにより、吸着体に吸着した免疫グロブリン抗体を回収することができる。
【００４８】
次に、後洗浄工程では、本カラムに１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を通液して、溶出工程で用いた吸着体内の酸性溶液を洗い流し、吸着体内を中性に平衡化させる。
【００４９】
本実施形態では、以下の要領で、上記の溶媒置換、吸着、洗浄、溶出、後洗浄の５つの工程からなる１回の精製工程を、１２０秒以内に実施することができる。本実施形態では、吸着体の体積を基準として、各工程で通液する溶液の容量を、溶媒置換工程で２倍、吸着工程で３倍、洗浄工程で２倍、溶出工程で４倍、後洗浄工程で１倍を想定している。尚、各工程で通液する溶液の容量比は、上記比率に限定されるものではない。
【００５０】
上述の評価用カラムと同じ、直径８ｍｍ、長さ１０ｍｍの円柱形のシリカモノリス多孔質担体にプロテインＡを固定した吸着体の使用を想定し、１回の精製工程を通しての各溶液を流量０．６４８ｍＬ／ｍｉｎ（線速度３６０ｃｍ／ｈに相当）で通液した場合、溶媒置換工程で２００μＬを１７．５秒、吸着工程で３００μＬを２６．３秒、洗浄工程で２００μＬを１７．５秒、溶出工程で４００μＬを３５．１秒、後洗浄工程で１００μＬを８．８秒、夫々通液することになり、１回の精製工程が約１０５秒で完了する。
【００５１】
尚、吸着工程で通液する免疫グロブリン抗体を含む溶液中の抗体濃度を１０ｍｇ／ｍＬとした場合に、吸着体の単位体積当たり３０ｍｇ／ｍＬｇｅｌの吸着量が得られる。
【００５２】
上記想定では、線速度３６０ｃｍ／ｈを想定したが、図５及び図６に示す評価結果より、線速度は３６０ｃｍ／ｈより更に速くできるので、１回の精製工程に要する時間を１０５秒より更に短縮できる。例えば、１回の精製工程に要する時間を７２秒まで短縮すると、上記精製工程を２時間で１００回繰り返すことができる。１回の精製工程に要する時間が１２０秒でも、上記精製工程を２時間で６０回繰り返すことができる。
【００５３】
ここで注目すべきは、１回の精製工程に要する時間が１〜２分程度と短いため、１回の精製工程毎に、後洗浄工程で強アルカリ溶液（ｐＨ１３以上）を用いて、強吸着物質の洗浄及び滅菌を行う必要が無い点である。従来のアフィニティーカラムでは、強アルカリ処理により吸着性能が低下することが知られており、強アルカリ処理による滅菌が必要なければ、吸着性能の低下を伴わずに、上述の精製工程を連続的に繰り返すことができる。
【００５４】
精製工程を連続的に繰り返すことで、高効率に抗体精製が実施できるとともに、本カラムに使用するプロテインＡは高価であるので、精製工程を１００回以上繰り返すことで、コストパフォーマンスの向上も図れる。
【００５５】
一方、現在実用に供されている従来のビーズ状のアガロースゲルを用いたアフィニティーカラムでは、抗体精製に要する総処理時間はしばしば２時間を超える。その間、当然ながら滅菌処理は行われていない。つまり、本カラムを用いて精製工程を連続的に繰り返す場合でも総処理時間が２時間以内であれば、従来と同様に滅菌処理の必要がなく、後洗浄工程で強アルカリ溶液（ｐＨ１３以上）を用いなくてもよい。
【００５６】
〈第２実施形態〉
本カラムの第２実施形態について説明する。図８に示すように、第２実施形態の本カラム２０は、円筒状の吸着体１１が円筒容器１２に収容されて構成されている。円筒容器１２の各端面には、夫々開口部１３，１４が形成され、開口部１３，１４の一方が、上述の精製工程の各工程で通液する溶液の送入口となり、他方が通液後の溶液の排出口となる。
【００５７】
図８に示すように、吸着体１１の筒状外側面１１ａが円筒容器１２の内壁面から離間して、その間に溶液の通流路１５が形成されている。図８中の左右の通流路１５は環状になっており連通している。また、吸着体１１の筒状内側の空間も、溶液の通流路１６となる。開口部１３は、通流路１６に連通し、開口部１４は通流路１５に連通している。開口部１３が送入口、開口部１４が排出口となる場合、溶液は、開口部１３、通流路１６、吸着体１１、通流路１５、開口部１４の順番に流れる。
【００５８】
本カラム２０の吸着体１１は、外形は円筒状に加工されているが、平均孔径の異なる２種類の細孔（貫通孔と細孔）からなる２重細孔構造を有する一体構造の多孔質担体の表面に、プロテインＡを固定化したもので、第１実施形態の吸着体１と同じである。また、多孔質担体の貫通孔の平均孔径と細孔の中心直径も、第１実施形態の多孔質担体５の場合と同じである。従って、吸着体及び多孔質担体の作製方法及びそれらの吸着性能は、第１実施形態と同じであるので、重複する説明は省略する。
【００５９】
第２実施形態では、円筒状の吸着体１１の筒状外側面１１ａと筒状内側面１１ｂの一方から他方へと各溶液が通液されるため、筒状外側面１１ａと筒状内側面１１ｂ間の距離が吸着体１１の厚みとなる。第１実施形態では、円盤状または円柱状の吸着体１の上面と下面の一方から他方へと各溶液が通液されるため、吸着体１の上面と下面間の距離が吸着体１の厚みとなる。
【００６０】
次に、本カラムの別実施形態について説明する。
【００６１】
〈１〉上記各実施形態では、吸着体１，１１の厚みについては、具体的な数値を明示しなかったが、吸着体１，１１の厚みは、第１実施形態において説明した評価用カラムと同様に１０ｍｍに設定することで、吸着工程において、線速度９０ｃｍ／ｈ以上で通液することで、接触時間４０秒以内の短時間での処理が可能となる。図５及び図６に示す評価結果より、線速度は９０ｃｍ／ｈより更に速くできるので、吸着体１，１１の厚みを、線速度に比例して厚くしても、接触時間４０秒以内の短時間での処理が可能となる。
【００６２】
〈２〉上記第１実施形態では、吸着体１及び円筒容器２の断面形状として円形及び円環形を想定したが、該断面形状は円形及び円環形に限定されるものではなく、多角形状でも構わない。また、上記第２実施形態では、吸着体１１及び円筒容器１２の断面形状として円環形を想定したが、該断面形状は円環形に限定されるものではなく、多角形状でも構わない。
【００６３】
〈３〉上記各実施形態では、多孔質担体の貫通孔の平均孔径（水銀圧入法による測定）は、４μｍ以下を想定し、第１実施形態で説明した評価用カラムでは、１．７μｍの場合について、説明したが、本カラムの吸着性能は、貫通孔の平均孔径が４μｍ以下の範囲では、平均孔径に大きく依存しないことが確認されている。尚、貫通孔の平均孔径が４μｍを超えて大きくなると、細孔表面積も減少するので、吸着性能も低下してくる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明に係る抗体精製方法及び抗体精製用カラムは、免疫グロブリン抗体の精製に利用可能である。
【符号の説明】
【００６５】
１：          吸着体
２：          円筒容器
３，４：      開口部（送入口，排出口）
５：          多孔質担体
６：          プロテインＡ
７：          骨格体
８：          貫通孔
９：          細孔
１０：        本発明に係る抗体精製用カラム
１１：        吸着体
１１ａ：      吸着体の筒状外側面
１１ｂ：      吸着体の筒状内側面
１２：        円筒容器
１３，１４：  開口部（送入口，排出口）
１５：        通流路（吸着体の外側）
１６：        通流路（吸着体の内側）
２０：        本発明に係る抗体精製用カラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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