(57)【要約】【課題】反応ロット間での収量及び純度のバラつきが小さく、反応効率が高く、再現性が高い、固相担体上での反応を利用したオリゴヌクレオチドの合成装置及び合成方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明のオリゴヌクレオチド合成装置は、管状のマイクロ流路を備え、該マイクロ流路の内壁面に、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、メトキシ基及びチオール基から選択されるいずれかの官能基を有する固相合成用カラム反応容器を含むことを特徴とする。【選択図】図１
2014047169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
管状のマイクロ流路を備え、該マイクロ流路の内壁面に、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、メトキシ基及びチオール基から選択されるいずれかの官能基を有する固相合成用カラム反応容器を含むオリゴヌクレオチド合成装置。
【請求項２】
マイクロ流路を複数本備え、該複数本のマイクロ流路が一体成形されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド合成装置。
【請求項３】
マイクロ流路の断面形状が、多角形である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド合成装置。
【請求項４】
マイクロ流路の内径が、１〜１００μｍである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド合成装置。
【請求項５】
マイクロ流路の内壁面における官能基の量が、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｃｍ２である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド合成装置。
【請求項６】
ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、メトキシ基及びチオール基から選択されるいずれかの官能基を内壁面に有する管状のマイクロ流路を用い、該マイクロ流路の内壁面における官能基に、リンカーを介してヌクレオシドを結合させる工程と、
結合したヌクレオシドを基点として、ヌクレオチドを順次結合させ伸長させる工程と、
合成したオリゴヌクレオチドを、リンカーを分解することによりマイクロ流路から分離する工程と、
を含むオリゴヌクレオチドの合成方法。
【請求項７】
ヌクレオチドを順次結合させ伸長させる工程が、脱保護剤、アミダイト試薬及び酸化剤をマイクロ流路に順次供給することにより行われる請求項６に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【請求項８】
脱保護剤、アミダイト試薬及び酸化剤の供給が、不活性ガスの圧力を利用して行われる請求項７に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成装置及び合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴデオキシリボヌクレオチドやオリゴリボヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドの固相合成法は、２０年以上前から知られており、自動合成装置も販売されている。オリゴヌクレオチドの固相合成法の多くは、固相担体上にヌクレオシドを結合させ、そのヌクレオシドにヌクレオチドを順次結合させ、伸張したオリゴヌクレオチドを得るという合成スキームに基づいている。
【０００３】
より具体的には、例えば、通常用いられるホスホロアミダイト法の場合、次のようにしてオリゴヌクレオチドが合成される。まず、合成しようとするオリゴヌクレオチドの３’末端に相当するヌクレオシドを、スクシニル基等のリンカーを介して固相担体に担持させる。次いで、このヌクレオシド・リンカーを担持させた固相担体を核酸自動合成装置の反応容器に入れ、溶媒としてアセトニトリルを流し込む。そして、核酸自動合成装置が、合成プログラムに従い、前記ヌクレオシドの５’−ＯＨ基の脱保護反応、５’−ＯＨ基へのヌクレオシドホスホロアミダイトのカップリング反応、未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング反応及び生成したホスファイトの酸化反応からなるサイクルを繰り返し、目的の配列を有するオリゴヌクレオチドが合成される。最終的に合成されたオリゴヌクレオチドは、アンモニア等を用いてリンカーを加水分解させ、固相担体から切り出される。
【０００４】
このようなオリゴヌクレオチドの合成に用いられる固相担体としては、ポリスチレン系樹脂ビーズやガラス系多孔質ビーズ等の粒子担体等が知られている。特に、従来の固相担体としては、ＣＰＧ（Controlled Pore Glass）やシリカゲルのような無機粒子が広く用いられている。その理由は、例えば、ペプチド固相合成に用いられる低架橋性ポリスチレン等の樹脂ビーズをオリゴヌクレオチド合成の固相担体として用いる場合、合成サイクルの過程で頻繁に行われる固相担体中への合成試薬や溶媒の出入りに伴って樹脂ビーズが膨潤し、その結果、試薬類の送液に時間を要し、オリゴヌクレオチドを高純度で合成することができないためと考えられる。一方、オリゴヌクレオチド合成に使用される酸やアルカリに対する化学的安定性を向上させるために、高度に架橋された非膨潤性の多孔質ポリスチレン粒子もオリゴヌクレオチド合成用の固相担体として使用されている（特許文献１及び２参照）。
【０００５】
しかし、粒子状の固相担体を利用したオリゴヌクレオチドの合成は、反応ロット間での収量及び純度のバラつきが大きく、反応効率が低く、再現性が低いという問題点が指摘されている。上述したＣＰＧや非膨潤性多孔質ポリスチレン粒子をオリゴヌクレオチド合成用の固相担体に用いる場合、固相担体当たりの合成量を高くするために基点となるヌクレオシド・リンカーの担持量を多くすると、生成するオリゴヌクレオチドの純度が著しく低下するという問題がある。
【０００６】
また、ＤＮＡを合成する場合と比較して、ＲＮＡを合成する場合は、２’−ＯＨ基に保護基が結合したホスホロアミダイトを用いて合成する必要があるため、アミダイトのカップリング効率が低下し、その結果、得られるＲＮＡの純度が低下するという問題がある。可能な限り純度を低下させずにＲＮＡを合成するためには、合成の基点となる固相担体上でのヌクレオシド・リンカーの結合量を少なくする必要があるが、結合量を少なくすることにより固相担体当たりの合成量が低下するという問題を新たに招来する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平３−６８５９３号公報
【特許文献２】特開２０１０−６８８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記従来の状況に鑑み、本発明は、反応ロット間での収量及び純度のバラつきが小さく、反応効率が高く、再現性が高い、固相担体上での反応を利用したオリゴヌクレオチドの合成装置及び合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、従来の無機ビーズや樹脂ビーズ等の粒子担体を充填した固相合成用カラム反応容器では、試薬や溶媒を繰り返し送液することで担体が膨潤したり、担体上で合成されたオリゴヌクレオチドが伸長することによって、試薬や溶媒が通る流路の空間が狭まり、これによって圧力損失を生じ、試薬や溶媒の送液に時間を要することとなり、さらに、流通が不均一になることで固相担体上でのオリゴヌクレオチドの合成が意図した配列順序で行えなくなることが、収率低下の要因であることを明らかにした。そして、微小な内径を有する管状のマイクロ流路の内壁面で合成反応を行わせることにより、試薬類や溶媒が流通する空間が確保され、反応効率が高くなることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド合成装置は、管状のマイクロ流路を備え、該マイクロ流路の内壁面に、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、メトキシ基及びチオール基から選択されるいずれかの官能基を有する固相合成用カラム反応容器を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、試薬や溶媒が流通する空間が狭まることなく、また、圧力損失を生じて試薬類や溶媒の送液に時間を要することなく、固相合成用カラム反応容器への試薬類の均一な供給が可能となる。これにより、固相担体上でのオリゴヌクレオチドの合成を意図した配列順序で行うことができ、収率や合成純度の低下を回避し得る。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る合成装置における固相合成用カラム反応容器の一実施形態を示す図である。
【図２】本発明に係る合成装置における固相合成用カラム反応容器の一実施形態を示す図である。
【図３】本発明に係る合成装置における固相合成用カラム反応容器の一実施形態を示す図である。
【図４】本発明に係る合成装置における固相合成用カラム反応容器の一実施形態を示す図である。
【図５】本発明に係るオリゴヌクレオチド合成装置の一実施形態を示す図である。
【図６】本発明に係るオリゴヌクレオチド合成装置の一実施形態を示す図である。
【図７】本発明に係るオリゴヌクレオチド合成装置の一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明に係る固相合成用カラム反応容器を用いたオリゴヌクレオチド合成装置について図面を参照して、詳細に説明する。
【００１４】
図１に示すように、本発明における固相合成用カラム反応容器１は、入口と出口が連通した微小な内径を有する管状のマイクロ流路２を備える。固相合成用カラム反応容器１の材質としては、流通させる溶媒や反応試薬に対して耐性を有し、好ましくは、その溶媒等により膨潤しないものであれば特に限定されることなく適用可能である。特に、有機溶剤や強アルカリに対して耐性を有し、形状加工性に優れるものが好ましい。具体的には、ポリスチレンの他、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート等）等が用いられる。なお、ポリカーボネート等の、強アルカリ類に対し耐性が低い材質は好ましくない。
【００１５】
図１の固相合成用カラム反応容器１は、通常の射出成形によって形成することができる。なお、図１では円筒形状の固相合成用カラム反応容器の例を示しているが、オリゴヌクレオチドの固相合成の反応はマイクロ流路２の内壁面を反応場として行うため、固相合成用カラム反応容器の外形は、接続する配管との接続性やハンドリング性の観点から適した形状であればどのような形状であっても良く、円筒形状の他、四角柱等の多角柱状であっても良い。また、マイクロ流路２の断面形状についても、射出成形が困難でなければ特に限定されるものではなく、円形の他、四角形、六角形等の多角形であっても良い。マイクロ流路２には、オリゴヌクレオチド合成のための反応試薬や洗浄液等を送液するが、試薬の利用効率の面からは、マイクロ流路の断面積に対する流路内周の比率が大きくなるように形成されることが望ましい。すなわち、マイクロ流路の内径は１ｍｍ以下、望ましくは１〜１００μｍである。マイクロ流路の内径がこれより大きい場合には試薬の利用効率が低下し、逆に小さい場合には試薬等の送液の際の圧力損失が大きくなる場合がある。
【００１６】
また、図１は固相合成用カラム反応容器を単一のマイクロ流路から構成した場合であるが、別の実施形態として、複数本のマイクロ流路を備え、それら複数本のマイクロ流路をまとめて一体に成形することによって、一度に合成できるオリゴヌクレオチドの量を増加させることが可能である。この場合、それぞれのマイクロ流路は、入口から出口まで互いに途中で交差することがないように成形することが好ましい。途中で流路が交差すると、それ以降の流路内の圧損の差異によって、一方の流路に偏った流れを生じることがあり、合成オリゴヌクレオチドの収率を低下させることになる。
【００１７】
オリゴヌクレオチドの固相合成は、マイクロ流路の内壁面に存在するヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、メトキシ基（−ＯＣＨ３）、チオール基（−ＳＨ）等の官能基に結合させるリンカーを介して行うので、固相合成用カラム反応容器の容積当たりに占めるマイクロ流路内壁面の総面積をできるだけ大きくすることがオリゴヌクレオチドの合成量を多くするためには効率的である。具体的には、マイクロ流路と直交する固相合成用カラム反応容器の断面積当たりのマイクロ流路内周の総計が大きくなるように、すなわち、単位面積当たりのマイクロ流路の数を多くすることが好ましい。
【００１８】
この観点から、複数本のマイクロ流路を一体成形する場合には、各マイクロ流路の断面形状は多角形であることが好ましい。特に、内燃機関やボイラーの排ガスを浄化する触媒用担体として用いられるハニカム構造体のように、隔壁により仕切られた軸方向に貫通する多数の流通孔を有する構造体を形成して固相合成用カラム反応容器とすることが好ましい。図２は、断面形状が四角形である複数本のマイクロ流路２から構成される固相合成用カラム反応容器１を示し、また図３は、射出成形によって一体成形したハニカム構造の固相合成用カラム反応容器１を示す。このような一体成形された複数本のマイクロ流路を構成する樹脂としては、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート等）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。特に、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート等）、ポリスチレン及びポリエチレンテレフタレートが好ましい。
【００１９】
図４には、本発明における固相合成用カラム反応容器の別の実施形態を示す。図４の固相合成用カラム反応容器１は、一方の面に流路用溝が形成された樹脂基板３を順次積層し、その積層体の片側を蓋部材５で閉じることにより構成される。樹脂基板３に形成された流路用溝の内側が、マイクロ流路２として機能する。流路用溝が形成された樹脂基板３を製造する方法としては、例えば射出成形で製造する方法、平板状の樹脂基板に流路用溝を切削加工する方法等が挙げられる。図４では、流路用溝の断面形状を四角形としているが、特に制限はなく、三角形等の多角形、半円形、楕円形等の形状とすることができる。しかし、製作上の観点からは三角形、四角形、あるいは半円形とすることが好ましい。前述したように、マイクロ流路の内径は１ｍｍ以下、特に１〜１００μｍ程度とすることが好ましい。流路内径が、これより大きい場合には試薬の利用効率が低下し、小さい場合には送液の際の圧力損失が大きくなるので好ましくない場合がある。なお、マイクロ流路の断面形状が円形以外の場合、「マイクロ流路の内径」とは、種々の方向における流路の内径のうち最も長いものを指す。
【００２０】
樹脂基板３を構成する樹脂としては、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート等）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。特に、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート等）、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート等が好ましく用いられる。流路用溝を形成した樹脂基板３の隔壁の厚さについても特に制限はないが、隔壁の厚さが薄過ぎると構造体の強度が不足し、厚過ぎると固相合成用カラム反応容器の容積当たりのオリゴヌクレオチド合成量が低下するので好ましくない。隔壁の厚さとしては、５０μｍ〜２ｍｍとすることが望ましい。樹脂基板３に別の樹脂基板３を積層させる際の接合処理には、加熱によって圧着する熱圧着接合や超音波接合の他に、接着剤４を用いても良い。このような接着剤としては、例えばアクリル系接着剤、エポキシ系接着剤、ウレタン系接着剤、ポリエステル系接着剤等を挙げることができる。
【００２１】
成形されたマイクロ流路の内壁面は、ヌクレオシドシリルエーテル等の、シリコン置換基の一つを介した共有結合の実現に必要な官能基を含有するように誘導体化される。この目的に使用可能な官能基としては、図１に示すように、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、メトキシ基及びチオール基が挙げられる。ヒドロキシ基は、誘導体化ヌクレオシドのクロロシラン官能基と反応することができる。また、アミノ基は、誘導体化ヌクレオシドのシリコン置換基におけるカルボキシル基又はエポキシ基と反応することができる。これらの内壁面における官能基と誘導体化ヌクレオシドとの関係については本技術分野の通常の当業者であれば容易に理解するであろう。
【００２２】
マイクロ流路の内壁面の修飾方法としては、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシ基を導入する方法としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、ヒドロキシルエチルアクリレート、ヒドキシルエチルメタクリレート等のポリマーをグラフト重合する方法が挙げられる。末端基に所望の官能基を導入したデンドリマー（樹状高分子）を、流路基材の表面に結合させても良い。この際に、デンドリマーと流路基材との結合を強固にするために、シランカップリング剤を介して結合させる方法を挙げることができる。また、プラズマ処理、コロナ放電処理、エキシマレーザー処理、フレーム処理等の表面処理によって含酸素官能基を導入する方法も可能であるが、本発明はこれらの処理方法によって、特に限定されるものではない。
【００２３】
マイクロ流路の内壁面におけるヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、メトキシ基又はチオール基等の官能基の量は、特に限定するものではないが、内壁面の単位面積当たり０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｃｍ２とすることが好ましい。１ｍｍｏｌ／ｃｍ２より高密度であると、隣接する官能基間の距離が不十分であるために、逐次合成反応によって隣り合って伸長するオリゴヌクレオチド鎖が互いに立体的に障害となって、意図した配列のオリゴヌクレオチドが得られず、結果として製品としてのオリゴヌクレオチドの純度が低下する恐れがある。
【００２４】
上述のように、マイクロ流路の内径は、１〜１００μｍとすることが好ましい。内径が１μｍより小さくなると、逐次合成反応によって伸長したオリゴヌクレオチド鎖や、高濃度に溶解された反応試薬類が結晶化して析出した場合に、流路に目詰まりを生じて合成反応の収率低下を招く恐れがある。また、内径が１００μｍを超えると、マイクロ流路の内壁面を基点として伸長するオリゴヌクレオチドの合成反応に対し、過剰な試薬を流通させることになるため、試薬コストの過剰な増加を招くことにもなる。
【００２５】
本発明のマイクロ流路を利用するオリゴヌクレオチド合成は、当業者に公知の方法により行うことができる。具体的には、図５に示すような従来と同様の構成を有する合成装置を用いることができる。従来の無機ビーズや樹脂ビーズを充填した固相合成用カラム反応容器に代替して、マイクロ流路を備えた固相合成用カラム反応容器１を用いる。そして、従来と同様に送液ポンプ２０〜２３を用い、モノマー試薬１０〜１３や溶媒を順次、繰り返し送液することによって、マイクロ流路の内壁面に所望のオリゴヌクレオチドを伸長、合成することができる。
【００２６】
オリゴヌクレオチドの合成は、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト法等の従来と同様の合成反応により行われる。特に、固相ホスホロアミダイト法は、オリゴヌクレオチドの合成能力が高く、高純度のオリゴヌクレオチドが得られるという理由から好ましく採用される。この方法は、以下の４工程を含む。
【００２７】
（１）ジクロロ酢酸等の脱保護剤により、マイクロ流路の内壁面における官能基に結合したヌクレオシドスクシニルリンカーの５’−ＯＨの保護基であるＤＭＴ（ジメトキシトリチル基）を外す脱トリチル化工程、
（２）テトラゾール等により活性化したヌクレオシドホスホロアミダイト（アミダイト試薬）を前記の脱保護した５’−ＯＨとの求核置換反応により結合させるカップリング工程、
（３）アミダイト試薬が結合しなかった５’−ＯＨを無水酢酸等によりアセチル化して保護するキャッピング工程、及び
（４）ヨウ素等の酸化剤により、アミダイト試薬に由来する亜リン酸結合を酸化して、リン酸トリエステルの形にする酸化工程。
【００２８】
固相合成用カラム反応容器を、オリゴヌクレオチド合成反応の工程がプログラムされた自動合成装置に連結することにより、オリゴヌクレオチドの製造を自動化することができる。例えば、装置のコントローラ又はコンピュータからの指示にしたがって、本発明におけるマイクロ流路が充填された反応容器に、上記（１）〜（４）を１サイクルとして、あらかじめ決められた順序で試薬を分配する試薬分配システムにより、それぞれの工程が進められる。このサイクルを目的物の生成に必要な回数だけ繰り返した後、合成されたオリゴヌクレオチドが結合したマイクロ流路を反応容器から取り出し、バイアルに回収する。そこに濃アンモニア等を加え、例えば５５℃で８時間放置する。これにより、スクシニルリンカーが分解・切断され、マイクロ流路から目的のオリゴヌクレオチドが分離される。シアノエチル基を外してリン酸ジエステルの形に変換し、さらに塩基部分であるアミノ基の保護基を外し、その後、フィルターを用いてオリゴヌクレオチドを単離することで、目的のオリゴヌクレオチドが得られる。
【００２９】
図５で用いた送液ポンプ２０〜２３に代えて、図６に示すように、不活性ガス、例えばアルゴン（Ａｒ）ガスを用いた送液系を構成することができる。個々の送液段階でのオリゴヌクレオチド合成反応の効率をさらに向上させて試薬の利用効率の向上を図るために、固相合成用カラム反応容器１の前後にバッファータンク（Tank）を設けて、バルブの開閉動作を切り替えることによって、未反応の試薬を再度、固相合成用カラム反応容器１に戻して反応させることができる。図７では、バッファータンクを設けることによる装置の大型化を回避するために、固相合成用カラム反応容器１内に試薬を循環する送液ポンプを設けた合成装置を示す。
【００３０】
従来のビーズ充填カラムでは、オリゴヌクレオチドの伸長に伴って試薬類や溶媒が流通する空間が狭まり、これによって圧力損失を生じて試薬類や溶媒の送液に時間を要し、さらに、流通が不均一になることで固相担体上でのオリゴヌクレオチドの合成が意図した配列順序で生成できなくなるリスクが大きかった。これに対し、本発明による合成装置では、例えば、隔壁により仕切られた軸方向に貫通する多数のマイクロ流路を有する反応容器を用いることによって、上記の問題点を解消することができるので、反応効率を向上させることができる。
【００３１】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００３２】
１    固相合成用カラム反応容器
２    マイクロ流路
３    樹脂基板
４    接着剤
５    蓋部材
【図１】
2014047169.tif 000003
【図２】
2014047169.tif 000004
【図３】
2014047169.tif 000005
【図４】
2014047169.tif 000006
【図５】
2014047169.tif 000007
【図６】
2014047169.tif 000008
【図７】
2014047169.tif 000009