(57)【要約】【課題】生体標識用の安定なシアニン色素の提供。【解決手段】下式Ｉの化合物。2014065919.tif 000036（式中、ＺがＯ、Ｓ、またはＮＲ３５；Ｒ３５がＨまたはアルキル；Ｒ１〜Ｒ５が、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋が陽イオン；Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋；Ｒ６およびＲ７が、Ｈ、アルキルであるか、選択的に（ａ）基と結合して環を形成し；ｍおよびｎが０〜５の整数；ＸおよびＹがＯ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０；Ｒ８およびＲ１３が、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８；Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７が、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２；）の化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014065919.tif 000020
（式中、ＺがＯ、Ｓ、またはＮＲ３５であり、Ｒ３５がＨまたはアルキルであり、
Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ、Ｈ、アルキルであるか、選択的に
【化２】
2014065919.tif 000021
と結合して環を形成し、
ｍおよびｎが、それぞれ独立して０〜５の整数であり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０であり、Ｒ１９およびＲ２０が、それぞれ独立して、アルキルであるか、選択的に炭素原子と結合して環を形成し、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜５０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキレンであり、Ｒ２２がアルキルであるか、選択的にＲ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成するか、選択的にＲ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成する）の化合物。
【請求項２】
ＺがＯまたはＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３がＳＯ３−Ｃａｔ＋である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｃａｔ＋がＨ＋である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｃａｔ＋が金属イオンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
Ｃａｔ＋がアルカリ金属イオンである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ６およびＲ７が低級アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ６およびＲ７が
【化３】
2014065919.tif 000022
と結合して環を形成する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ６およびＲ７を含む環がスルホナトと置換されている、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ６およびＲ７を含む環が４〜１０員環である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ６およびＲ７を含む環が５または６員環である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ６およびＲ７を含む環がヘテロ原子を含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
環が少なくとも１つの位置でアルキル基、アミノ基、またはスルホナト基に置換されている、請求項８に記載の化合物。
【請求項１４】
ｍおよびｎが共に０である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
ｍ＋ｎの合計が３未満である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
ＸおよびＹの少なくとも１つがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
ＸおよびＹの少なくとも１つがＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
ＸおよびＹの少なくとも１つがＳｅである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
ＸおよびＹの少なくとも１つがＣＲ１９Ｒ２０である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
ＸおよびＹの両方がＣＲ１９Ｒ２０である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１９およびＲ２０の少なくとも１つが低級アルキルである、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１９およびＲ２０の両方がメチルである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１８が、メルカプト、カルボキシル、アミノ、ハロアルキル、ホスホラミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、およびマレイミジルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ８およびＲ１３のうちの１つが（ＣＨ２）ｒＲ２５であり、Ｒ２５がチオアセチルまたはスルホナトである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ１８がメルカプト、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、またはイソチオシアナトである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
ｒが１〜５の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１８が、アミノ、ホスホラミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、またはマレイミジルである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ１８がイソチオシアナトである、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ８およびＲ１３の両方が（ＣＨ２）ｒＲ１８である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ９〜Ｒ１２がそれぞれＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ９〜Ｒ１２のうちの１つがスルホナトである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ９〜Ｒ１２のうちの１つが、アルキル、ハロ、アミノ、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキルであり、Ｒ２２がアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ１４〜Ｒ４７がそれぞれＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ１４〜Ｒ１７のうちの１つがスルホナトである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ１４〜Ｒ１７のうちの少なくとも１つが、アルキル、ハロ、アミノ、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキルであり、Ｒ２２がアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３７】
式（Ｖ）：
【化４】
2014065919.tif 000023
（式中、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、または（ＣＨ３）２Ｃであり、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜２０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ１１およびＲ１２が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成し、
Ｒ１６およびＲ１７が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成する）
の化合物。
【請求項３８】
Ｃａｔ＋がＨ＋または金属イオンである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
ＸおよびＹのうち少なくとも１つが（ＣＨ３）２Ｃである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４０】
ＸおよびＹのうち少なくとも１つがＯである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４１】
ＸおよびＹのうち少なくとも１つがＳである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４２】
ＸおよびＹのうち少なくとも１つがＳｅである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｒ１８がメルカプト、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、またはイソチオシアナトである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４４】
ｒが１〜５の整数である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４５】
Ｒ１８が、アミノ、ホスホラミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、またはマレイミジルである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４６】
Ｒ８およびＲ１３が（ＣＨ２）ｒＲ１８である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４７】
式（Ｉ）：
【化５】
2014065919.tif 000024
（式中、ＺがＯ、Ｓ、またはＮＲ３５であり、Ｒ３５がＨまたはアルキルであり、
Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ、Ｈ、アルキルであるか、選択的に
【化６】
2014065919.tif 000025
と結合して環を形成し、
ｍおよびｎが、それぞれ独立して０〜５の整数であり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０であり、Ｒ１９およびＲ２０が、それぞれ独立して、アルキルであるか、選択的に炭素原子と結合して環を形成し、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜５０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキレンであり、Ｒ２２がアルキルであるか、選択的にＲ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成するか、選択的にＲ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成する）
の色素を生体分子と反応させる工程を含む、式（Ｉ）の色素を使用した、生体分子の標識法。
【請求項４８】
生体分子が、少なくとも１つのヒドロキシル、カルボキシル、チオ、またはアミノを有し、式（Ｉ）の色素のＲ８またはＲ１３が生体分子上の１つまたはそれ以上のヒドロキシル部位、カルボキシル部位、チオ部位、またはアミノ部位で生体分子と結合している、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒ８またはＲ１３のうちの１つのみが生体分子に結合している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ８およびＲ１３の両方が生体分子に結合している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
生体分子が天然または合成生体分子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
生体分子が、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、少糖類、多糖類、核酸、デオキシ核酸、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド三リン酸、アシクロターミネーター三リン酸、およびＰＮＡからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４７に記載の方法によって生成された、色素標識生体分子。
【請求項５４】
式（ＸＶ）：
【化７】
2014065919.tif 000026
（式中、ＺがＯ、Ｓ、またはＮＲ３５であり、Ｒ３５がＨまたはアルキルであり、
Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ、Ｈ、アルキルであるか、選択的に
【化８】
2014065919.tif 000027
と結合して環を形成し、
ｍおよびｎが、それぞれ独立して０〜５の整数であり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０であり、Ｒ１９およびＲ２０が、それぞれ独立して、アルキルであるか、選択的に炭素原子と結合して環を形成し、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜５０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキレンであり、Ｒ２２がアルキルであるか、選択的にＲ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成するか、選択的にＲ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成し、
Ｂが生体分子であり、
Ｒ３０が（ＣＨ２）ｒＬであり、ｒが１〜５０の整数であり、Ｌが結合基である）
の色素標識生体分子。
【請求項５５】
Ｒ１８が、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシル、アミノ、ハロアルキル、ホスホラミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、およびマレイミジルからなる群から選択される、請求項５４に記載の色素標識生体分子。
【請求項５６】
Ｂが、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、少糖類、多糖類、核酸、デオキシ核酸、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド三リン酸、アシクロターミネーター三リン酸、およびＰＮＡからなる群から選択される、請求項５４に記載の色素標識生体分子。
【請求項５７】
式（Ｖ）：
【化９】
2014065919.tif 000028
（式中、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、または（ＣＨ３）２Ｃであり、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜２０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ１１およびＲ１２が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成し、
Ｒ１６およびＲ１７が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成する）
の色素を生体分子と反応させる工程を含む、式（Ｖ）の色素を使用した、生体分子の標識法。
【請求項５８】
生体分子が、少なくとも１つのヒドロキシル、カルボキシル、チオ、またはアミノを有し、式（Ｉ）のＲ８またはＲ１３が生体分子上の１つまたはそれ以上のヒドロキシル部位、カルボキシル部位、チオ部位、またはアミノ部位で生体分子と結合している、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
Ｒ８またはＲ１３のうちの１つのみが生体分子に結合している、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
Ｒ８およびＲ１３の両方が生体分子に結合している、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
生体分子が天然または合成生体分子である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
生体分子が、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、少糖類、多糖類、核酸、デオキシ核酸、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド三リン酸、アシクロターミネーター三リン酸、およびＰＮＡからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項５７に記載の方法によって生成された、色素標識生体分子。
【請求項６４】
式（ＸＸ）：
【化１０】
2014065919.tif 000029
（式中、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、または（ＣＨ３）２Ｃであり、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜２０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ１１およびＲ１２がＨ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成し、
Ｒ１６およびＲ１７がＨ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成し、
Ｂが生体分子であり、
Ｒ３０が（ＣＨ２）ｒＬであり、ｒが１〜２０の整数であり、Ｌが結合基である）
の色素標識生体分子。
【請求項６５】
Ｒ１８が、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシル、アミノ、ハロアルキル、ホスホラミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、およびマレイミジルからなる群から選択される、請求項６４に記載の色素標識生体分子。
【請求項６６】
Ｂが、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、少糖類、多糖類、核酸、デオキシ核酸、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド三リン酸、アシクロターミネーター三リン酸、およびＰＮＡからなる群から選択される、請求項６４に記載の色素標識生体分子。
【請求項６７】
ａ）式（Ｉ）：
【化１１】
2014065919.tif 000030
（式中、ＺがＯ、Ｓ、またはＮＲ３５であり、Ｒ３５がＨまたはアルキルであり、
Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ、Ｈ、アルキルであるか、選択的に
【化１２】
2014065919.tif 000031
と結合して環を形成し、
ｍおよびｎが、それぞれ独立して０〜５の整数であり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０であり、Ｒ１９およびＲ２０が、それぞれ独立して、アルキルであるか、選択的に炭素原子と結合して環を形成し、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜５０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキレンであり、Ｒ２２がアルキルであるか、選択的にＲ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成するか、選択的にＲ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成する）
の色素、および
ｂ）緩衝液を含む、生体分子標識キット。
【請求項６８】
精製キットをさらに含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
精製キットが、遊離の加水分解色素および消光中に形成された結合物から色素標識生体分子を分離する方法を提供する、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
ａ）式（Ｖ）：
【化１３】
2014065919.tif 000032
（式中、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、または（ＣＨ３）２Ｃであり、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜２０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ１１およびＲ１２が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成し、
Ｒ１６およびＲ１７が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成する）
の色素、および
ｂ）緩衝液を含む、生体分子標識キット。
【請求項７１】
精製キットをさらに含む、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
式（Ｉ）：
【化１４】
2014065919.tif 000033
（式中、ＺがＯ、Ｓ、またはＮＲ３５であり、Ｒ３５がＨまたはアルキルであり、
Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ、Ｈ、アルキルであるか、選択的に
【化１５】
2014065919.tif 000034
と結合して環を形成し、
ｍおよびｎが、それぞれ独立して０〜５の整数であり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０であり、Ｒ１９およびＲ２０が、それぞれ独立して、アルキルであるか、選択的に炭素原子と結合して環を形成し、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜５０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキレンであり、Ｒ２２がアルキルであるか、選択的にＲ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成するか、選択的にＲ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成する）の化合物であって、
化合物が生体分子を標識するための蛍光色素であり、色素が、熱安定性、光安定性、および水安定性が増加している、化合物。
【請求項７３】
式（Ｖ）：
【化１６】
2014065919.tif 000035
（式中、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、または（ＣＨ３）２Ｃであり、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜２０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ１１およびＲ１２が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成し、
Ｒ１６およびＲ１７が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成する）の化合物であって、
生体分子を標識するための蛍光色素であり、色素が、熱安定性、光安定性、および水安定性が増加している、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０００年９月１９日に提出された、米国特許仮出願第６０／２３３，５１１号（本明細書に参照として組み入れられる）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
政府援助研究または開発
国立衛生研究所から授与されたＨＧ０１１８２の政府援助を使用して本発明を実施した。
【背景技術】
【０００３】
背景
シアニン色素は、ＤＮＡ配列決定などの種々の用途のための生体分子の標識に広く使用されている。例えば、シアニン色素を使用したＤＮＡ配列の同定法の例として、米国特許第５，５７１，３８８号（特許文献1）（本明細書に参照として組み入れられる）を参照のこと。他にも理由があるが、これらの多くの色素が近赤外線領域（ＮＩＲ）(600〜1000nm)のスペクトルで操作されるので、科学者らは生物学的適用にシアニン色素の使用を好む。これにより、これらのシアニン色素の生体分子の自己蛍光からの干渉に対する感受性が低下する。
【０００４】
シアニン色素の他の利点には、以下が含まれる：１）シアニンは強く吸着して蛍光を発すること、２）多くのシアニン色素は蛍光顕微鏡下で急速に漂白されないこと、３）簡単且つ有効なカップリング試薬であるシアニン色素誘導体を作製することができること、４）多数の構造および合成手順が使用可能であり、且つこの色素クラスは用途が広いこと、および５）シアニン色素は比較的小さく（典型的な分子量は約１，０００ダルトンである）ので、標識生体分子のその結合部位に到達し、その機能を発揮する能力を低下させ得る方法で明確な立体障害を引き起こさないこと。
【０００５】
これらの利点にもかかわらず、多数の既知のシアニン色素は、多数の欠点を有する。いくつかの既知のシアニン色素は、バイオアッセイで一般的に認められる所定の試薬の存在下で安定ではない。このような試薬には、水酸化アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、第一級および第二級アミン、および過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）が含まれる。さらに、いくつかの既知のシアニン色素は、ＤＮＡ配列決定および遺伝子型同定などの生物学的適用に必要な熱安定性および光安定性を欠く。
【０００６】
これらの理由により、特に生体標識用の安定なシアニン色素が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，５７１，３８８号
【発明の概要】
【０００８】
概要
本発明の方法、化合物、色素、および色素標識生体分子は、上記分技術分野の少なくともいくつかの問題を解決する。
【０００９】
本発明の１つの局面では、式（Ｉ）：
【化１７】
2014065919.tif 000002
（式中、ＺがＯ、Ｓ、またはＮＲ３５であり、Ｒ３５がＨまたはアルキルであり、Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｒ６およびＲ７が、それぞれ、Ｈ、アルキルであるか、選択的に
【化１８】
2014065919.tif 000003
と結合して環を形成し、ｍおよびｎが、それぞれ独立して０〜５の整数であり、ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０であり、Ｒ１９およびＲ２０が、それぞれ独立して、アルキルであるか、選択的に炭素原子と結合して環を形成し、Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜５０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキレンであり、Ｒ２２がアルキルであるか、選択的にＲ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成するか、選択的にＲ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成する）の化合物が得られる。
【００１０】
本発明の別の局面では、式（Ｖ）：
【化１９】
2014065919.tif 000004
（式中、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、または（ＣＨ３）２Ｃであり、Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜２０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、Ｒ１１およびＲ１２が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成し、Ｒ１６およびＲ１７が、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成する）の化合物が得られる。
【００１１】
本発明の別の局面では、式（Ｉ）の色素を使用した生体分子の標識法は、式（Ｉ）の色素を生体分子と反応させる工程を含む。得られた色素標識生体分子は、本発明のさらに別の局面である。
【００１２】
本発明の別の局面では、式（Ｖ）の色素を使用した生体分子の標識法は、式（Ｖ）の色素を生体分子と反応させる工程を含む。得られた色素標識生体分子は、本発明のさらに別の局面である。
【００１３】
本発明のさらに別の局面では、生体分子標識用キットは、式（Ｉ）の色素および緩衝液を含む。同様に、本発明の別の局面では、生体分子標識用キットは、式（Ｖ）の色素および緩衝液を含む。
【００１４】
本発明は、上記および他の特徴を提供し、本発明の利点は、以下の実施例と併せて以下の現在好ましい態様の詳細な説明からさらに明らかとなる。詳細な説明および実施例は、本発明の例示のみを意図し、本発明の範囲を限定せず、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって定義される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
定義
「アルキル」は、置換および非置換直鎖アルキル基、置換および非置換分岐アルキル基、および置換および非置換シクロアルキル基を含む飽和脂肪族基である。「アルキル」という用語には、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルキルオキシアルキルエーテル種が含まれる。好ましい態様では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に５０個またはそれ以下、より好ましくは３０個またはそれ以下、最も好ましくは１０個またはそれ以下の炭素原子を有する。好ましいシクロアルキルは、その環構造中に３〜１０個の炭素原子、より好ましくは３〜６個の炭素原子を有する。「低級アルキル」は、その骨格中に１〜１０個の炭素原子、より好ましくは１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。アルキル環状基は、環あたり３個と１２個との間の原子、好ましくは骨格中に１個と９個の間の原子を含む、単環式または多環式の基であり得る。アルキル骨格上の好ましい置換基には、置換または非置換アルキルラジカル、ハロ、カルボキシル、アミノ、およびスルファナト基が含まれる。
【００１６】
「アルケニル」および「アルキニル」は、長さが類似しており、且つ上記のアルキルラジカルに置換可能であるが、それぞれ少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む、不飽和脂肪族置換基である。
【００１７】
「アミノ」は、ＲおよびＲ’が同一でも異なっていてもよく、いずれかがＨまたはアルキルである、−ＮＲＲ’基である。好ましくは、ＲおよびＲ’の少なくとも１つがＨである。選択的に、さらなる置換基を添加して、第四級アンモニウムイオンを作製することができる。
【００１８】
本明細書中で使用される、「芳香環」には、酸素、硫黄、セレン、および窒素からなる群から選択される０〜４つのヘテロ原子を含み得る５〜１２員環の芳香族単環式または融合多環式部分が含まれる。アリール基の例には、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ナフタレン、ベンザチアゾリン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンズインドール、キノリンなどが含まれる。アリール基を、１つまたはそれ以上の位置で、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロアルキル、シアノ、スルホナト、アミノスルホニル、アリール、スルホニル、アミノカルボニル、カルボニル、アシルアミノ、アルキルスルホニル、アミノ、および置換または非置換置換基と置換することができる。
【００１９】
「生体分子」は、生物系で使用される天然または合成分子である。好ましい生体分子には、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、少糖類、多糖類、核酸、デオキシ核酸、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド三リン酸、アシクロターミネーター三リン酸、およびＰＮＡが含まれる。
【００２０】
「シアニン色素」は、一般に、不飽和架橋によって結合した２つの置換または非置換窒素含有複素環を有する化合物をいう。
【００２１】
「結合基」は、生体分子の相補的官能基（好ましくは、カルボキシ、ヒドロキシ、チオール、またはアミノ官能基）と反応することができ、このような反応により生体分子に色素が連結する「結合」が形成される部分である。ハウグランド（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ）、「蛍光プローブおよび研究試薬ハンドブック（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）」、モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、１９９２を参照のこと。この開示では、Ｒ１８は連結反応が起こる前の結合基であり、Ｒ３０は色素と生体分子との間に得られた連結を示す。好ましい結合基には、ホスホラミダイト基、ＮＨＳエステル、カルボン酸、チオシアナート、およびイソチオシアナートが含まれる。
【００２２】
「スルホナト」は、選択的に陽イオンに結合したＳＯ３−である。
【００２３】
「スルホ−フェノキシ色素」は、シアニン色素の不飽和架橋が、好ましくはベンゼン環の第４位でスルホナト基に置換されたベンゼン環へのエーテル結合に置換されたシアニン色素である。
【００２４】
全ての他の頭文字および略語は、有機化学分野に関連する雑誌で公開された対応する意味を有する。
【００２５】
好ましいシアニン色素
好ましいシアニン色素は、式（Ｉ）：
【化２０】
2014065919.tif 000005
の化合物である。
【００２６】
好ましくは、Ｚは、少なくとも１つの電子対を有するヘテロ原子である。特に好ましい態様では、ＺはＯ、Ｓ、またはＮＲ３５であり、Ｒ３５はＨまたはアルキルである。Ｒ３５がアルキルである場合、Ｒ３５は低級アルキルであることが好ましい。好ましくは、Ｚは、Ｚに結合したベンゼン環とＺに結合した式
【化２１】
2014065919.tif 000006
のポリエン鎖との間の直接的結合中に１つの原子のみが存在するような構造である。ベンゼン環とポリエン鎖との間の結合上の側鎖に接近可能である。側鎖を有するこれらの態様では、低級アルキル側鎖が好ましい。
【００２７】
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋は陽イオンであり、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋である。Ｒ３がＳＯ３−Ｃａｔ＋であることが好ましい。Ｃａｔ＋はＨ＋またはＮａ＋などのアルカリ金属イオンことが特に好ましい。
【００２８】
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、Ｈ、アルキルであるか、選択的に
【化２２】
2014065919.tif 000007
と結合して環を形成する。Ｒ６およびＲ７が原子と結合して環を形成することが好ましい。環は４〜１０個の原子、より好ましくは５〜６個の原子を有することが好ましい。１つの好ましい態様では、Ｒ６およびＲ７を含む環は好ましくはスルホナトラジカルで置換されることが好ましい。
【００２９】
整数ｍおよびｎは、それぞれ独立して０〜５の整数である。好ましくは、ｍとｎとの合計は２である。より好ましくは、ｍとｎとの合計は１である。最も好ましくは、ｍとｎとの合計は０である。ｍとｎとの合計が増加するにつれて、色素の波長は高くなる。一般に、ポリエン鎖中の各二重結合の付加により、約４０〜１２０ｎｍの波長が増加し得る。トリメチンからペンタメチンまたはペンタメチンからヘプタメチンによる吸収の変化について、典型的には、約１００ｎｍの深色団のシフト（赤方偏移）が存在する。例えば、ｍとｎが共に０である場合、好ましい色素の波長は、約７７０ｎｍである。ｍとｎが共に１である場合、好ましいし色素の波長は約９５０ｎｍである。最も好ましい色素は、ＮＩＲスペクトル（６００〜１０００ｎｍ）で操作する。
【００３０】
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０であり、Ｒ１９およびＲ２０は、それぞれ独立して、アルキルであるか、選択的に炭素原子と結合して環を形成する。ＸおよびＹはＯ、Ｓ、およびＳｅなどのヘテロ原子であることが好ましい。ＸまたはＹがＣＲ１９Ｒ２０である場合、Ｒ１９およびＲ２０は共に低級アルキル、より好ましくはＲ１９およびＲ２０は共にメチルであることが好ましい。
【００３１】
Ｒ８およびＲ１３は、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒは１〜５０の整数であり、Ｒ２５は、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８は、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基である。好ましい態様では、Ｒ８およびＲ１３の一方が（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、他方が（ＣＨ２）ｒＲ２５である。言い換えれば、Ｒ８およびＲ１３の一方が生体分子と反応して生体分子と結合し、他方が反応しないことが好ましい。Ｒ１８基が共有結合して生体分子を標識することができなければならない。特に好ましいＲ１８基には、メルカプト、カルボキシル、アミノ、ハロアルキル、ホスホラミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、およびマレイミジルが含まれる。特に好ましいＲ２５基にはヒロドキシ、チオアセチル、およびスルホナトが含まれる。
【００３２】
Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１は結合またはアルキレンであり、Ｒ２２はアルキルであるか、選択的にＲ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成するか、選択的にＲ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成する。１つの好ましい態様では、Ｒ１１およびＲ１６の一方または両方がスルホナトである。別の好ましい態様では、Ｒ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成し、環が少なくとも１つの位置でスルホナト基に置換されている。別の好ましい態様では、Ｒ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成し、環が少なくとも１つの位置でスルホナト基、ハロ基、アルキル置換基、またはアミノ置換基に置換されている。
【００３３】
別の好ましいシアニン色素は、式（Ｖ）：
【化２３】
2014065919.tif 000008
の化合物である。
【００３４】
Ｃａｔ＋は陽イオンである。好ましくは、Ｃａｔ＋はＨ＋または金属イオンである。より好ましくは、Ｃａｔ＋はアルカリ金属イオン、最も好ましくはＮａ＋である。ＸおよびＹは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、または（ＣＨ３）２Ｃである。
【００３５】
Ｒ８およびＲ１３は、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒは１〜５０の整数であり、Ｒ２５は、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８は、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基である。好ましい態様では、Ｒ８およびＲ１３の一方が（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、他方が（ＣＨ２）ｒＲ２５である。言い換えれば、Ｒ８およびＲ１３の一方が生体分子と反応して生体分子と結合し、他方が反応しないことが好ましい。Ｒ１８基が共有結合して生体分子を標識することができなければならない。特に好ましいＲ１８基には、メルカプト、カルボキシル、アミノ、ハロアルキル、ホスホラミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、およびマレイミジルが含まれる。特に好ましいＲ２５基には、ヒドロキシル、チオアセチル、およびスルホナトが含まれる。
【００３６】
Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成する。好ましい態様では、Ｒ１１はスルホナトである。別の好ましい態様では、Ｒ１１およびＲ１２は原子と結合して芳香環を形成し、環は少なくとも１つの位置でスルホナト基に置換される。
【００３７】
Ｒ１６およびＲ１７は、Ｈ、スルホナトのいずれかであるか、原子と結合して芳香環を形成する。好ましい態様では、Ｒ１６はスルホナトである。別の好ましい態様では、Ｒ１６およびＲ１７は原子と結合して芳香環を形成し、環は少なくとも１つの位置でスルホナト基に置換される。
【００３８】
好ましいシアニン色素を、東芝（Ｔｏｓｈｉｂａ）、フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、ブルースカイリサーチ（Ｂｌｕｅ  Ｓｋｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、およびＮＥＣなどの企業から購入可能な市販の装置によって有効に励起させることができる。
【００３９】
好ましいシアニン色素は、十分な水溶性を有し、一旦可溶性生体分子に結合すると生体分子はその溶解性を保持する。好ましい色素はまた、良好な有機溶媒溶解性を有し、所望の生体分子標識への合成アプローチにおいて多大な汎用性を示す。
【００４０】
好ましいシアニン色素は、水酸化アンモニウムおよびＤＴＴの存在下で化学的安定性が増加する。好ましいシアニン色素は、フェノキシシアニン色素よりも光安定性および熱安定性が改良されている。
【００４１】
好ましいシアニン色素の調製
好ましいシアニン色素を、当技術分野で既知の方法を使用して調製する。一般に、シアニン色素を、ハーマー（Ｈａｍｅｒ，Ｆ．Ｍ．）、「シアニン色素および関連化合物（Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」、ワイスバーガー（Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ａ）編、ウィリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｎ．Ｙ．、１９６４に開示の手順に従って調製する。さらに、米国特許第４，３３７，０６３号、同第４，４０４，２８９号、および同第４，４０５，７１１号（本明細書に参照として組み入れられる）には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基を有するシアニン色素の合成が記載されている。米国特許第４，９８１，９７７号（本明細書に参照として組み入れられる）には、カルボン酸基を有するシアニン色素の合成が記載されている。米国特許第５，２６８，４８６号（本明細書に参照として組み入れられる）には、アリールスルホナートシアニン色素の作製法が開示されている。米国特許第６，０２７，７０９号（本明細書に参照として組み入れられる）には、ホスホラミダイト基を有するシアニン色素の作製法が開示されている。米国特許第６，０４８，９８２号（本明細書に参照として組み入れられる）には、イソチオシアナート、イソシアナート、ホスホラミダイト、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノまたはジハロゲン置換ピリジン、モノハロゲン置換ジアジンまたはジハロゲン置換ジアジン、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、ヒドロキシスクシニミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、グリオキサル、およびアルデヒドからなる群から選択される反応基を有するシアニン色素の作製法が開示されている。
【００４２】
１つの一般的な合成経路は、当技術分野で既知の手順（そのいくつかを本明細書の実施例に詳述する）による置換または非置換インドールスルホナート第四級塩の調製を含む。特に好ましいインドール第四級塩には、中でも本明細書中に例示されているインドールスルホナート第四級塩、およびベンズインドールアルコール第四級塩が含まれる。
【００４３】
その後、合成塩の対を、当技術分野で既知の技術および反応条件（そのいくつかを本明細書の実施例に詳述する）を使用して、Ｎ［（３−（アニリノメチレン）−２−クロロ−１−シクロヘキセン−１−イル）メチレン］アニリン一塩酸などの市販の（ＡＬＤＲＩＣＨ）シッフ塩基と反応させる。次いで、生成物をヒドロベンゼンスルホン酸と反応させて、本発明に係る色素を得る。色素を、例えば、当技術分野で既知の技術および反応条件を使用した色素の市販のホスホラミダイト（２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトなど）との反応（そのいくつかを本明細書の実施例に詳述する）によってさらに修飾して本発明に係る他の色素を得ることができる。
【００４４】
生体分子の標識
本発明のシアニン色素を、上記で定義された生体分子に結合させることができる。結合基により、シアニン色素を、例えば、ホスホラミダイトの化学的性質の利用により生体分子に結合させることができ、最終的には色素と生体分子との間にリン酸結合を形成する。このような標識法の例として、多数の好ましい結合基、結合法、および容易に標識することができる生体分子を開示する米国特許第６，０２７，７０９号を参照のこと。一般に、ＤＮＡ合成機でのＤＮＡ分子を標識するためのシアニン色素のホスホラミダイトを調製することが好ましい。標準的なホスホラミダイトの化学的性質による保護された支持体結合オリゴヌクレオチドの５’末端に色素を結合させることが好ましい。２００ｎｍｏｌｅスケールでの合成により、５０〜６０ｎｍｏｌｅの色素標識オリゴヌクレオチドの典型的な粗生成物が生成される。
【００４５】
種々の型の生体分子への色素の多数の結合法は当技術分野で既知である。オリゴヌクレオチド標識法の総説については、ハウグランド（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ）、「生体ポリマーの励起状態（Ｅｘｃｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）」、ステイナー（Ｓｔｅｉｎｅｒ）編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９８３、「蛍光プローブ設計および合成：技術ガイド（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ）」、ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９６、およびハーマン（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６を参照のこと。
【００４６】
緩衝液の有機溶媒溶液中、室温の塩基ｐＨ条件下で抗体標識を行うことが好ましい。標識抗体を、セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）Ｇ−５０カラムなどの装置を使用したゲル浸透クロマトグラフィーによって精製して非結合色素を除去することもまた好ましい。
【００４７】
生体分子の標識法の好ましい態様では、任意の好ましいシアニン色素のＲ８またはＲ１３基のＲ１８基は、生体分子上のチオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、またはアミノ基と反応して、色素と生体分子との間に連結（Ｒ３０）を形成する。典型的には、この反応はｐＨ８〜９基の水性緩衝液とＤＭＦなどの有機溶媒との混合物中で行う。１つの好ましい態様では、米国特許第６，０２７，７０９号で開示されるホスホラミダイトの化学的性質を使用した固相合成が好ましい。
【００４８】
本発明にしたがってキットを使用して生体分子を標識することができる。キットの好ましい態様では、このキットは、式（Ｉ）または（Ｖ）の色素および緩衝液を含む。好ましくは、このキットは、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）などのカップリング緩衝液を含む。好ましくは、この緩衝液は適切に蛍光バックグラウンドが低い。
【００４９】
選択的に、このキットは精製サブキットを含むことができる。１つの好ましい色素を用いた生体分子の標識後、この標識生体分子を、任意の反応副産物および正常な加水分解に起因する任意の遊離加水分解生成物から分離することができる。１３個またはそれ以下のアミノ酸を含む生体分子については、調製用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により不純物を除去することができる。パンベラ（ＰＡＮＶＥＲＡ）は、色素標識ペプチドまたはタンパク質を精製するように特に設計されたＴＬＣペプチド精製キットを提供している。
【００５０】
巨大ペプチドまたはタンパク質などのより大きな生体分子については、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−１５またはＧ−２５樹脂により望ましくない誘導体を除去することができる。ＰＡＮＶＥＲＡは、遊離色素から色素標識ペプチドおよびタンパク質を分離するように設計されたタンパク質ゲル濾過キットを提供している。脱塩後に残存する色素標識生体分子を、さらに精製を行うことなくうまく使用することができる場合がある。いくつかの場合、ＨＰＬＣまたは従来のクロマトグラフィーを使用して異なる染色生成物の活性を解明および評価することが必要であり得る。
【００５１】
一旦標識されると、１つの好ましい色素標識生体分子は、式（ＸＶ）：
【化２４】
2014065919.tif 000009
である。
【００５２】
全ての置換基は、上記で定義されている。Ｂは、生体分子であり、Ｒ３０は（ＣＨ２）ｒＬであり、ｒは１〜５０の整数であり、Ｌは結合基である。好ましくは、Ｂは、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、少糖類、多糖類、核酸、デオキシ核酸、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド三リン酸、アシクロターミネーター三リン酸、およびＰＮＡである。ＤＮＡ配列決定における使用のための好ましい標識ターミネーターのリストについては、米国特許第５，３３２，６６６号（本明細書に参照として組み入れられる）を参照のこと。
【００５３】
好ましくは、ｒは１〜５の範囲である。好ましくは、Ｌはホスホラミジチルまたは他の結合基（そのいくつかは米国特許第６，０２７，７０９号に例示されている）である。１つの好ましい態様では、Ｌは二リン酸エステルアミダイトである。
【００５４】
別の好ましい色素標識生体分子は、式（ＸＸ）：
【化２５】
2014065919.tif 000010
である。
【００５５】
全ての置換基は、上記で定義されている。Ｂは、生体分子であり、Ｒ３０は（ＣＨ２）ｒＬであり、ｒは１〜５０の整数であり、Ｌは結合基である。好ましくは、ｒは１〜５の範囲である。１つの好ましい態様では、結合が形成された場合、Ｌはリン酸ジエステルである。類似の好ましい態様の例は、米国特許第６，０２７，７０９号に開示されている。
【００５６】
ＤＮＡ配列決定
本発明の色素標識生体分子を、ＤＮＡ配列決定などの生物学的用途に使用することができる。オリゴヌクレオチドなどの標識生体分子を、例えばＤＮＡ配列決定のサンガー法におけるプライマー、遺伝子型同定用のテールプライマー、またはハイブリダイズ用プローブとして使用することができる。ＤＮＡ配列決定のための一定の既知の技術および反応条件を、本明細書の実施例に詳述する。
【００５７】
既知のＤＮＡ配列決定法には、マキサム（Ｍａｘａｍ）ら、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．）、６５、４９９、１９８０に記載のマキサム-ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）の化学分解法およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ７４、５４６３、１９７７に記載のサンガーのジデオキシチェーンターミネーション法が含まれる。各方法では、ゲル電気泳動によって分析される３２Ｐで標識されたＤＮＡ断片が作製される。放射性標識したリンは一般にこれらの方法ではもはや使用されておらず、色素が使用されている。
【００５８】
ＤＮＡ配列決定は、総説にもまとめられている。例えば、ミッデンドルフ（Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｆ，Ｌ．Ｒ．）、ハンフェリー（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｐ．Ｇ．）、ナラヤナン（Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｎ．）およびローマー（Ｒｏｅｍｅｒ，Ｒ．Ｃ．）、「配列決定技術（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、レーム（Ｒｅｈｍ，Ｈ．−Ｊ）およびリード（Ｒｅｅｄ，Ｇ．）編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ−（章−投稿済）；バレル（Ｂ．Ｂａｒｒｅｌｌ）、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ、５、４０、１９９１；およびトレイナー（Ｇ．Ｌ．Ｔｒａｉｎｏｒ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６２、４１８、１９９０、およびその参考文献を参照のこと。最も広く使用されているＤＮＡ配列決定化学は、いくつかの異なる配列決定ストラテジーを採用した上述のサンガーの酵素によるチェーンターミネーション法である。配列決定反応を、好熱性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、９４３６、１９８８）または特異的に修飾したＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（「ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ」）（Ｓ．Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、４７６７、１９８７）などの異なるＤＮＡポリメラーゼを使用するか、ポリマー支持体の使用と組み合わせた中で行う。例えば、スタール（Ｓ．Ｓｔａｈｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６、３０２５、１９８８；ウーレン（Ｍ．Ｕｈｌｅｎ）、国際公開公報第８９／０９２８２号；コカッザ（Ｃｏｃｕｚｚａ）ら、国際公開公報第９１／１１５３３号；およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、国際公開公報第９２／０３５７５号（本明細書に参照として組み入れられる）を参照のこと。
【実施例】
【００５９】
以下の節は、特定の化合物の実験データ同様、本発明によって作製された種々化合物の好ましい合成法を示す。この節はまた、本発明によって作製された化合物を使用する実施例を提供する。実施例は、例示を意図しており、制限を意図しない。
【００６０】
実施例１：シアニン色素中間体の合成
【化２６】
2014065919.tif 000011
工程Ａ：インドールスルホナート第四級塩の合成
１６０ｇ（１０００ｍｍｏｌ）の１，１，２−トリメチル−１Ｈ−インドール（ＡＬＤＲＩＣＨ）と３４０．４ｇ（２５６ｍｌ、２５００ｍｍｏｌ）のブタンスルトン混合溶液を、窒素下で４００ｍｌのジクロロベンゼンを含む１ＬのＲＢフラスコにて１２５℃に加熱した。１６時間後、反応を停止させ、室温に冷却した。反応混合物を結晶化した固体を濾過し、その後、エーテル（１５０ｍｌ）で洗浄した。このようにして得られた固体を、最小体積のメタノール（３００ｍｌ）に溶解し、アセトン（１６００ｍｌ）の添加によって沈殿させた。固体を濾過し、アセトン（１５０ｍｌ×２）で洗浄した。これを真空乾燥させて、２６１．３ｇ（８８．５％）の第四級塩を得た。これは、次の工程での使用に十分に純粋であった。
【００６１】
工程Ｂ：ベンズインドールアルコール第四級塩の合成
米国特許第６，０２７，７０９号の手順にしたがって、第四級塩を調製した。この場合、９２．０ｇの１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンズインドール（ＡＣＲＯＳ）を使用し、１１３．０ｇ（収率６０％）の純粋なベンズインドールアルコール第四級塩を得た。
【００６２】
工程Ｃ：ＩＲＤ  ８００−クロロ色素の合成
ベンズインドールアルコール第四級塩（３９ｇ、１００ｍｍｏｌ）、インドールスルホナート第四級塩（２０．５ｇ、１００ｍｍｏｌ）を含むエタノール混合溶液（４００ｍｌ）を、窒素下で１０〜１５分間撹拌して均一な溶液を得た。この溶液にシッフ塩基（３５．９ｇ、１００ｍｏｌ；ＡＬＤＲＩＣＨ）を添加し、１００ｍｌのエタノールを添加した。暗赤色溶液を、６０℃に加熱した。この温度で、酢酸ナトリウム（２１．３２ｇ；１３０ｍｍｏｌ）を添加し、１２．８０ｇの酢酸カリウム（１３０ｍｍｏｌ）を添加した。温度を上昇させて激しく還流し（１１０〜１１５℃）、この還流を３５〜４０分維持した。反応を停止させ、室温に冷却した。油性生成物が形成された場合、反応混合物を氷浴（１Ｌ）に注ぎ、底に沈殿させた。水をデカントし、水洗浄物が透明になるまでこの手順を繰り返した。油性生成物を、エーテル（１５０ｍｌ×３）および酢酸エチル（１５０ｍｌ×３）で粉砕した。部分的に固化した生成物をメタノール（３５０ｍｌ）中に溶解し、その後ロータリーエバポレーターによる蒸発によってメタノールを除去した。固体色素を、真空乾燥させた。これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０、３５〜７５ｍｍ、溶媒勾配：１０％メタノールのアセトニトリル溶液から３０％メタノールのアセトニトリル溶液）によってさらに精製して純粋なクロロ色素（２９．０ｇ、収率４０％）を得た。
【００６３】
実施例２：シアニン色素の合成
【化２７】
2014065919.tif 000012
スルホ−フェノキシ色素の合成：
４０ｍｌの無水ＤＭＦに２．９５ｇ（１２．７０ｍｍｏｌ）の４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸を溶解した。１．０８ｇ（６０％、２６．８ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウムの添加後、混合物を室温の窒素下で１０分間撹拌した。２５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解したＩＲＤ−８００−クロロ色素（７．４１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、さらに４５〜５０分間撹拌した。この期間の最後に７８８ｎｍの吸収極大は１３ｎｍの浅色シフトを示し（８０１ｎｍでのクロロ色素吸収）、従って、スルホフェノキシ色素が形成された。反応混合物にドライアイスを添加し、真空下でＤＭＦを除去した。粗色素を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０、溶媒勾配：１０％メタノールのアセトニトリル溶液から３０％メタノールのアセトニトリル溶液）によって精製して４ｇの純粋な色素（収率４５％）を得た。
【００６４】
実施例３：スルホ−フェノキシホスホラミダイトシアニン色素の合成
【化２８】
2014065919.tif 000013
スルホ−フェノキシ色素の合成：
２０ｍｌの無水塩化メチレンに１．４ｇ（１．５９ｍｍｏｌ）の上記スルホ−フェニル色素を溶解し、溶液を窒素下で撹拌しながら氷アセトン浴で冷却した。０℃での０．６ｇ（１．０１ｍｌ、３．１８ｍｍｏｌ）の２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトおよび０．０４５ｇ（１．３ｍｌ、０．６４ｍｍｏｌ）の１−Ｈテトラゾール溶液（０．５Ｍ）の添加後、溶液を室温で２〜２．５時間撹拌した。１％トリエチルアミンを含む塩化メチレンを反応混合物に添加し、次いで、反応混合物を５％重炭酸ナトリウム（５０ｍｌ×２）および水（５０ｍｌ×２）での洗浄に供した。硫酸ナトリウム無水物での乾燥後、溶液を濾過し、濾過物を５ｍｌに濃縮した。濃縮溶液を、窒素下で撹拌しながら０℃のヘキサン（５０ｍｌ）に添加した。ヘキサンのデカンテーション後に得られた粘性残渣を、エーテル（５０ｍｌ）で粉砕し、固体粉末を得た。これを真空乾燥させて、スルホ−フェノキシホスホラミダイト（１．０ｇ、収率５８％）の緑色粉末を得た。
【００６５】
実施例４：中間体シアニン色素の合成
【化２９】
2014065919.tif 000014
工程Ａ：５−フルオロインドールの合成：
フルオロフェニルヒドラジンヒドロクロリド（５．０ｇ、３０．７５ｍｍｏｌ、ＡＬＤＲＩＣＨ）、３−メチル−２−ブタノン（３．７ｇ、４３ｍｍｏｌ、ＡＬＤＲＩＣＨ）、および酢酸（３０ｍｌ）を、窒素下で３０分間撹拌し、透明な溶液を得た。次いで、混合物を、１３０℃で還流する。２５５ｎｍでの紫外可視極吸収極大の出現および２８２ｎｍピークの消失により、インドールの形成が確認された。４０分後、反応を停止させ、混合物を砕いた氷に注いだ（１００ｇ）。残渣を酢酸エチル（１００ｍｌ×２）に抽出し、水（１００ｍｌ×２）で洗浄し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、酢酸エチルを除去し、残渣を乾燥させて、４．１５ｇのインドール（収率７６％）を得た。
【００６６】
工程Ｂ：５−フルオロインドールカルボキシレート塩の合成：
５−フルオロインドール（３．０ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）、６−ブロモヘキサン酸（５．３８ｇ、２７．６ｍｍｏｌ、ＡＬＤＲＩＣＨ）のブチロニトリル混合物（９０ｍｌ）を、１４０〜１４５℃の窒素下で還流した。３５〜４０時間後、第四級化が完了した。反応混合物を室温に冷却し、エーテルで粉砕し、最終的に真空乾燥させて、固体（６．０ｇ、収率９５％）を得た。
【００６７】
工程Ｃ：ベンズインドールスルホナート第四級塩の合成：
概説の手順にしたがって、この塩を実施例１の工程Ａに記載のインドールスルホナート第四級塩の合成で調製した。
【００６８】
工程Ｄ：クロロ色素の合成：
工程Ｃの生成物を実施例１の工程Ｃに概説の手順を使用して、クロロ色素に変換した。この場合、０．４ｇ（１ｍｍｏｌ）の５−フルオロインドールカルボキシレート塩および０．３５ｇ（１ｍｍｏｌ）のベンズインドールスルホナトを使用して、０．２７ｇ（収率３５％）のクロロ色素を得た。
【００６９】
実施例５：シアニン色素の合成
【化３０】
2014065919.tif 000015
非対称スルホ−フェニル色素の合成：
実施例４のクロロ色素を、実施例２に概説の手順を使用してスルホ−フェニル色素に変換した。０．７ｇ（０．９１ｍｍｏｌ）のクロロ色素を使用して、０．４ｇ（収率４８％）の純粋なスルホ−フェニル色素を得た。
【００７０】
実施例６：ＮＨＳエステルシアニン色素の合成
【化３１】
2014065919.tif 000016
エステル色素の合成：
５−フルオロインドールおよび中心にスルホ−フェニル基を含むカルボキシアルキル色素（０．２７ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３．０ｍｌ）および無水ピリジン（０．３ｍｌ）の混合物に溶解した。ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ、ＡＬＤＲＩＣＨ、０．１１５ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を、６０℃の窒素下で２時間撹拌した。エーテル（１５ｍｌ）での混合物の希釈後、上清をデカントし、生成物を無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に再溶解した。撹拌しながらエーテル（１５ｍｌ）を滴下して、固体沈殿を得た。これを濾過し、真空乾燥させて、０．２５ｇの反応性色素を得た（収率８４％）。活性エステルの形成を、ＨＰＬＣで確認した。
【００７１】
実施例７：シアニン色素の合成
【化３２】
2014065919.tif 000017
工程Ａ：１−（４−スルホナトブチル）−２，３，３−トリメチルインドリニンの合成：
１，２，３−トリメチルインドーレニン（１５．９ｇ、１００ｍｍｏｌ）および１，４−ブタンスルトン（２７．２ｇ、２００ｍｍｏｌ）の混合物を、２５０ｍｌの１，２−ジクロロベンゼン中で１４０℃まで１６時間加熱した。溶媒のデカントによって分離された得られた粘着性残渣を、最小量のメタノールに溶解し、アセトンで沈殿した。桃色沈殿を濾過し、真空乾燥させた。収率：８５％。
【００７２】
工程Ｂ：１−（６−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドーレニン第四級塩：
１，２，３−トリメチルインドーレニン（８ｇ、５０ｍｍｏｌ）および６−ブロモヘキサン酸（１９ｇ、１００ｍｍｏｌ）の混合物を、２５０ｍｌのブチロニトリル中で３６時間加熱還流した。ロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）による溶媒除去後に得られた粘着性残渣を、最小量のクロロホルム中に溶解し、エーテルで沈殿した。沈殿物をエーテルで粉砕し、遊離の以下の乾燥粉末を得た。収率：７０％。
【００７３】
工程Ｃ：クロロ色素の合成：
Ｎ−［（３−アニリノエチレン）−２−クロロ−１−シクロヘキセン−１−イル］−メチレン］アニリン一塩酸（１．３０ｇ、５ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１．１ｇ、１３ｍｍｏｌ）と５ｍｍｏｌの工程Ａおよび工程Ｂ由来の各第四級塩の混合物を、３０ｍｌの無水エタノール中で１時間還流した。ロトバップによってエタノールを除去するために、反応混合物を冷却した。残渣をＣ１８逆相シリカゲルカラムでクロマトグラフ分析を行って（メタノール−水、３：２）、３０％の所望のクロロ色素を得た。
【００７４】
工程Ｄ：スルホ−フェノキシ色素の合成：
４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸の二ナトリウム塩溶液を以下のように調製した。窒素下で０℃に冷却した６０％水素化ナトリウム（１２０ｍｇ、３ｍｍｏｌの１００％ＮａＨ）の１０ｍｌ無水ＤＭＦ懸濁液に、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸二水和物（２ｍｍｏｌ、ＡＬＤＲＩＣＨ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）を添加した。１０分後、反応成分を、２０分間室温まで加温した。次いで、成分を室温で激しく撹拌しながら３０ｍｌのＤＭＦ中で１ｍｍｏｌのクロロ色素を含むフラスコに移した。反応を紫外可視吸収スペクトルによってモニターし、７８２ｎｍから７６９ｎｍの浅色シフトを示した。３０分後、ドライアイスを使用して反応を停止させた。ＤＭＦを、ロトバップで蒸発させた。エーテルでの沈殿により乾燥粉末として粗生成物が得られ、これを４０％メタノール水溶液を使用するゲルカラムによる逆相Ｃ１８シリカによってさらに精製した。収率７５％。純粋な生成物を、プロトンＮＭＲによって特徴付けた。
【００７５】
工程Ｅ：スルホ−フェノキシ色素のＮＨＳエステルの合成：
２．６ｍｇのスルホ−フェノキシ色素（０．００３１ｍｍｏｌ）を、１．５ｍｌ微量遠心分離チューブ中の２５０μｌの無水ＤＭＦに溶解し、これに４．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシニミド（０．０３９ｍｍｏｌ、ＡＬＤＲＩＣＨ）および１０ｍｇのＤＣＣ（０．０５ｍｍｏｌ、ＡＬＤＲＩＣＨ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、反応の進行をＨＰＬＣでモニターした。過剰な試薬をエーテルによる沈殿によって除去し、粗色素−ＮＨＳＥを沈殿の遠心分離によって回収し、ＨＰＬＣ  ＲＰＣ１８プレップカラム（ＩＮＴＥＲＴＳＩＬ、ＯＤＳ  ３．５μ、２５０×４．６ｍｍ）によってさらに精製した。緩衝液ＡＢ  ９０〜１０％から緩衝液１０％Ｂ（Ａ＝４％アセトニトリルの０．１Ｍ  ＴＥＥＡｃおよびＢ＝８０％アセトニトリルの０．１Ｍ  ＴＥＥＡｃ溶液）の溶媒勾配で溶出した。画分をまとめてプールし、溶媒を吸引乾燥によって除去して２ｍｇの純粋なエステルを得た。ＮＨＳエステルの存在をＨＰＬＣで確認した。
【００７６】
実施例８：ＮＨＳエステルシアニン色素の合成
【化３３】
2014065919.tif 000018
ＮＨＳエステル色素の合成：
実施例７のカルボキシルアルキル色素（２．６ｍｇ、０．００３１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２５０μｌ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＡＬＤＲＩＣＨ、４．５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、ＡＬＤＲＩＣＨ、１０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。反応をＨＰＬＣでモニターし、ＮＨＳエステルをＲＰカラム（ＩＮＥＲＴＳＩＬ、ＯＤＳ  ３．５μ、２５０×４．６ｍｍ）への通過および１０％ｂ（ａ＝０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムに溶解した４％アセトニトリル；ｂ＝０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムに溶解した８０％アセトニトリル）〜１００％ａの範囲の溶媒勾配での溶出で精製した。真空下で溶媒を除去して２ｍｇの純粋なＮＨＳエステルを得た。反応性ＮＨＳエステル基の存在を、ＨＰＬＣで確認した。
【００７７】
実施例９：色素標識アシクロ−ＵＴＰの合成
【化３４】
2014065919.tif 000019
実施例８の色素を、アシクロターミネーターＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰにうまく結合した。エヌイーエヌライフサイエンスプロダクツ（ＮＥＮ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ）、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡからこれらの非標識ターミネーターを入手した。色素標識ターミネーターを、ＨＰＬＣで９５％を超える純度に精製した。これらの濃度を、水性リン酸緩衝液中で得られた紫外可視吸収スペクトルで同定した。ＤＮＡ配列決定に標識類似体を使用し、高品質配列ラダーを色素が取り込まれた類似体を使用して得た。色素標識−アシクロ−ＵＴＰを、上記のように示す。
【００７８】
実施例１０：ＤＮＡの標識
実施例２のスルホ−フェノキシ色素のホスホラミダイトを使用して、ＤＮＡ合成機で調製したＤＮＡ分子を標識した。色素を、ホスホラミダイト脱保護化学によって保護した支持体結合オリゴヌクレオチドの５’に結合させた。２００ｎｍｏｌスケールでの合成では、フェノキシ色素標識オリゴヌクレオチドの典型的な粗収率は、６５〜９５ｎｍｏｌである。１００〜１２５ｎｍｏｌのスルホ−フェノキシ色素標識オリゴヌクレオチドが得られる。
【００７９】
実施例１１：ＮＨ４ＯＨおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）中でのスルホ−フェノキシ色素の安定性
実施例２のスルホ−フェノキシ色素およびフェノキシ色素対照物（それぞれ２００ｎｍｏｌ）を、４００μｌの濃縮水酸化アンモニウムで処理し、室温で１時間インキュベートした。４００μｌの濃縮水酸化アンモニウムの別のロットを添加し、さらに０．５時間撹拌した。これらは、色素標識プライマーの脱保護で使用した条件である。ＴＬＣによって１５分間隔で反応を追跡した。フェノキシ色素の場合、１５分後に青色夾雑物の形成が認められた。時間経過とともにこの夾雑物の強度は増加した。１．５時間後、色素のほとんど半分が分解され、青色色素が得られた。青色スポットを単離し、吸収および発光測定した。青色夾雑物の吸収極大は６５５ｎｍであり、発光極大は７４７ｎｍであった。同一の条件下で、ＴＬＣまたは吸収によってスポットすることができるスルホ−フェノキシ色素はいかなる青色スポットも形成しなかった。
【００８０】
ＤＴＴの効果を研究するために、２００ｎｍｏｌの色素を４００μｌのＤＴＴのアセトニトリルで処理し、室温で撹拌した。一晩（１６時間）の撹拌後、ＴＬＣにより新規のスポットの形成を示した。これらを単離して、吸収に供した。３つのスポットは各々、７８６ｎｍ、７３８ｎｍ、および３９２ｎｍで吸収した。７３７ｎｍでの吸収は、７８７ｎｍで吸収するフェノキシ色素の分解による新規の色素の形成を示す。７〜８時間後のみに識別可能な不純物のスポットを得た。同一の条件下で、スルホ−フェノキシ色素は、７３８ｎｍで吸収するいかなるスポットも得られない。
【００８１】
両色素（フェノキシおよびスルホ−フェノキシ）は、吸収極大および減衰係数などの性質の大きな変化は認められなかった。しかし、スルホ−フェノキシ色素は８２８ｎｍで発光し、７８８ｎｍの吸収極大からより良好に分離された。したがって、フェノキシ色素よりもスルホ−フェノキシ色素を用いてより高いストークシフト（４０ｎｍ）が得られ、ストークシフト値が２５ｎｍに対応する。このデータより、スルホ−フェノキシ色素が対応物フェノキシ色素より高い安定性が示される。
【００８２】
範囲
本実施例を含む上記の詳細な説明が、制限よりもむしろ例示に関することが意図され、すべての等価物を含む特許請求の範囲が本発明の範囲を定義することを意図すると理解すべきである。
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月14日(2014.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014065919.tif 000037
（式中、ＺがＯ、Ｓ、またはＮＲ３５であり、Ｒ３５がＨまたはアルキルであり、
Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、カルボキシル、アミノ、またはＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、Ｃａｔ＋が陽イオンであり、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも１つがＳＯ３−Ｃａｔ＋であり、
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ、Ｈ、アルキルであるか、選択的に
【化２】
2014065919.tif 000038
と結合して環を形成し、
ｍおよびｎが、それぞれ独立して０〜５の整数であり、
ＸおよびＹが、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣＲ１９Ｒ２０であり、Ｒ１９およびＲ２０が、それぞれ独立して、アルキルであるか、選択的に炭素原子と結合して環を形成し、
Ｒ８およびＲ１３が、それぞれ独立して、アルキル、（ＣＨ２）ｒＲ２５または（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、Ｒ８およびＲ１３のうちの少なくとも１つが（ＣＨ２）ｒＲ１８であり、ｒが１〜５０の整数であり、Ｒ２５が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と直接反応しない官能基であり、Ｒ１８が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはチオール基と反応することができる官能基であり、
Ｒ９〜Ｒ１２およびＲ１４〜Ｒ１７が、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ハロ、アミノ、スルホナト、Ｒ２１ＣＯＯＨ、Ｒ２１ＯＲ２２、Ｒ２１ＳＲ２２、またはＲ２１ＣＯＯＲ２２であり、Ｒ２１が結合またはアルキレンであり、Ｒ２２がアルキルであるか、選択的にＲ１１およびＲ１２が原子と結合して芳香環を形成するか、選択的にＲ１６およびＲ１７が原子と結合して芳香環を形成する）の化合物。