(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質を選択的に吸着、分離することができるタンパク質用アフィニティ分離剤を提供する。【解決手段】下記式（１）等で表される化合物に由来する構造単位を有する共重合体からなり、平均粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるリガンド粒子と、有機系高分子粒子担体とからなるタンパク質用アフィニティ分離剤。2014161833.tif 000020（上記式（１）において、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ2は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基である。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物及び式（３）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位を主成分として含有する共重合体からなり、平均粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるリガンド粒子と、有機系高分子粒子担体とからなるタンパク質用アフィニティ分離剤。
【化１】
2014161833.tif 000017
【化２】
2014161833.tif 000018
【化３】
2014161833.tif 000019
（上記式（１）において、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ2は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、上記式（２）において、Ｒ3は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ4は炭素数４〜８の分岐していてもよいアルキル基である。上記式（３）において、Ｒ5は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基である。）
【請求項２】
式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物及び式（３）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位が、前記共重合体を構成する全ビニル系化合物の合計重量に対して以下の割合である、請求項１に記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
式（１）で表される化合物に由来する構造単位：５重量％以上９０重量％以下
式（２）で表される化合物に由来する構造単位：５重量％以上９０重量％以下
式（３）で表される化合物に由来する構造単位：３重量％以上５０重量％以下
【請求項３】
前記式（１）で表される化合物がＮ−イソプロピルアクリルアミドであり、前記式（２）で表される化合物がｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミドであり、前記式（３）で表される化合物がアクリル酸である請求項１又は２に記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
【請求項４】
前記有機系高分子粒子担体が、平均粒径１μｍ以上１０００μｍ以下、水銀圧入法による細孔直径１０Å以上１０，０００Å以下の多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
【請求項５】
前記有機系高分子粒子担体が、（メタ）アクリル酸エステル単量体由来の構造単位を有する架橋共重合体からなる多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
【請求項６】
前記有機系高分子粒子担体が、エポキシ基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、イミノ基、イミダゾール基、カルバメート基、シアノ基、チオール基、アルデヒド基からなる群のうちの少なくとも１つの官能基を有する、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的に安定であり、タンパク質を選択的に吸着、分離することができ、また、安価に製造することの可能な分離剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質等の生体高分子の研究・開発において、それらの吸着・分離・精製にはクロマトグラフィーが多く用いられている。特に、これらのタンパク質等と親和力のあるリガンドを担体上に結合した固定床を用いるアフィニティクロマトグラフィーが、標的分子に対する選択性が高く、高い収率で高速かつ高純度な分離・精製等が可能となるため好ましく用いられている。
【０００３】
また、近年、がんやリウマチなどの特効薬として抗体医療が有効であることが示されている。抗体医療は、がん細胞を標的とした場合を例にすれば、そのがん細胞が持っている正常細胞にはない目印を頼りに、そのがん細胞だけを攻撃する抗体に似た薬を使う療法である。ただし、抗体医薬は高価であり、安価で安定な製造方法が求められている。
【０００４】
かかる抗体医薬の精製において有効な方法として、リガンドとしてプロテインＡを使用したアフィニティ分離剤が報告されている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−０１８１３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記特許文献１に記載されているようなアフィニティ分離剤においてリガンドとして用いられているプロテインＡは非常に高価であり、また、不安定な物質であるという問題点があり、抗体医薬等の精製に用いるために問題がある。
【０００７】
本発明は、このような従来技術の問題点を解決することを目的としてなされたものである。即ち、本発明は、化学的に安定であり、タンパク質を選択的に吸着、分離することができるために抗体医薬等の精製で用いられるアフィニティ精製の分野において有用であり、また、安価に製造することの可能なタンパク質用アフィニティ分離剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、上記課題を鑑みて鋭意研究を行った結果、特定の化学構造を有する共重合体を、担体に担持とからなる分離剤が、優れた性能を有し、また、安価に製造することが可能であることを見出し、本発明に至った。即ち本発明の要旨は以下の［１］〜［６］に存する。
【０００９】
［１］  下記式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物及び式（３）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位を主成分として含有する共重合体からなり、平均粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるリガンド粒子と、有機系高分子粒子担体とからなるタンパク質用アフィニティ分離剤。
【化１】
2014161833.tif 000002
【化２】
2014161833.tif 000003
【化３】
2014161833.tif 000004
（上記式（１）において、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ2は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、上記式（２）において、Ｒ3は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ4は炭素数４〜８の分岐していてもよいアルキル基である。上記式（３）において、Ｒ5は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基である。）
【００１０】
［２］  式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物及び式（３）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位が、前記共重合体を構成する全ビニル系化合物の合計重量に対して以下の割合である、前記[１]に記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
式（１）で表される化合物に由来する構造単位：５重量％以上９０重量％以下
式（２）で表される化合物に由来する構造単位：５重量％以上９０重量％以下
式（３）で表される化合物に由来する構造単位：３重量％以上５０重量％以下
【００１１】
［３］  前記式（１）で表される化合物がＮ−イソプロピルアクリルアミドであり、前記式（２）で表される化合物がｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミドであり、前記式（３）で表される化合物がアクリル酸である前記［１］又は［２］に記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
【００１２】
［４］  前記有機系高分子粒子担体が、平均粒径１μｍ以上１０００μｍ以下、水銀圧入法による細孔直径１０Å以上１０，０００Å以下の多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体である、前記［１］乃至［３］のいずれかに記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
【００１３】
［５］  前記有機系高分子粒子担体が、（メタ）アクリル酸エステル単量体由来の構造単位を有する架橋共重合体からなる多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体である、前記［１］乃至［４］のいずれかに記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
【００１４】
［６］  前記有機系高分子粒子担体が、エポキシ基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、イミノ基、イミダゾール基、カルバメート基、シアノ基、チオール基、アルデヒド基からなる群のうちの少なくとも１つの官能基を有する、前記［１］乃至［５］のいずれかに記載のタンパク質用アフィニティ分離剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、化学的に安定であり、タンパク質を選択的に吸着、分離することができるために抗体医薬等の精製で用いられるアフィニティ精製の分野において有用であり、また、安価に製造することの可能なタンパク質用アフィニティ分離剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施の形態の一例であり、本発明はその要旨を超えない限り、以下の記載内容に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」という表現を用いる場合、その前後の数値又は物性値を含む表現として用いるものとする。
【００１７】
〔タンパク質用アフィニティ分離剤〕
本発明のタンパク質用アフィニティ分離剤は、下記式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物及び式（３）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位を主成分として含有する共重合体からなり、平均粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるリガンド粒子と、有機系高分子粒子担体とからなる。以下、本発明のタンパク質用アフィニティ分離剤を「本発明の分離剤」と略称することがある。
【化４】
2014161833.tif 000005
【化５】
2014161833.tif 000006
【化６】
2014161833.tif 000007
【００１８】
上記式（１）において、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ2は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、上記式（２）において、Ｒ3は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ4は炭素数４〜８の分岐していてもよいアルキル基である。上記式（３）において、Ｒ5は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基である。
【００１９】
＜リガンド粒子＞
本発明に用いるリガンド粒子は、式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物及び式（３）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位を主成分として含有する共重合体からなり、平均粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。ここで、主成分とは、リガンド粒子を構成する全ビニル系化合物の合計重量に対し、式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物及び式（３）で表される化合物の合計重量が５０重量％以上であることを意味する。
【００２０】
当該リガンド粒子を構成する共重合体は、式（１）で表される化合物に由来する構造単位により、親水性、疎水性の中間的性質を有するポリマーの基本骨格としての機能を発現し、式（２）で表される化合物に由来す構造単位により、ターゲットとなる分子と吸着するための疎水性相互作用を主に発現し、また、式（３）で表される化合物に由来す構造単位により、ターゲットとなる分子と吸着するための親水性相互作用、静電相互作用を主に発現するため、タンパク質、特に抗体に対して、優れたアフィニティ吸着性を有する。
ここで、「アフィニティ吸着性」とは、疎水性相互作用、親水性相互作用、静電相互作用、分子間力、水素結合、配位結合、などが複合的に関与する機構に基づく吸着性のことである。
【００２１】
前記式（１）において、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、好ましくは水素原子又はメチル基である。Ｒ2は、炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、炭素数３であることが好ましく、特にイソプロピル基であることが好ましい。式（１）で表される化合物としては、例えば、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド等が挙げられ、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミドが好ましく、特にＮ−イソプロピルアクリルアミドであることが好ましい。なお、本発明において、「（メタ）アクリル」という表記は、「アクリル又はメタクリル」を意味するものである。リガンド粒子を構成する共重合体は、式（１）で表される化合物に由来する構造単位を１種のみ又は２種以上を含んでいてもよい。
【００２２】
前記式（２）において、Ｒ3は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、好ましくは水素原子又はメチル基である。Ｒ4は、炭素数４〜８の分岐していてもよいアルキル基であり、炭素数４〜６であることが好ましく、特にＲ4がｔｅｒｔ−ブチル基であることが好ましい。式（２）で表される化合物としては、例えば、ブチル（メタ）アクリルアミド、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、ペンチル（メタ）アクリルアミド、ヘキシル（メタ）アクリルアミド、オクチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられ、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミドが好ましく、特にｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミドであることが好ましい。リガンド粒子を構成する共重合体は、式（２）で表される化合物に由来する構造単位を１種のみ又は２種以上を含んでいてもよい。
【００２３】
前記式（３）において、Ｒ5は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、水素原子又はメチル基であることが好ましく、Ｒ5が水素原子であるアクリル酸であることが好ましい。リガンド粒子を構成する共重合体は、式（３）で表される化合物に由来する構造単位を１種のみ又は２種以上を含んでいてもよい。
【００２４】
リガンド粒子を構成する共重合体の安定性、及びリガンド粒子のタンパク質に対するアフィニティ吸着性の点で、リガンド粒子を構成する共重合体として特に好適なのは、式（１）で表される化合物がＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）であり、式（２）で表される化合物がｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）であり、式（３）で表される化合物がアクリル酸（ＡＡｃ）である、共重合体である。
【００２５】
また、前記共重合体は、本発明の効果を損なわない範囲で、上記式（１）〜（３）で表される化合物以外のビニル系化合物（以下、「他のビニル化合物」と称す場合がある。）に由来する構造単位を含んでいてもよい。
他のビニル化合物としては、後述する架橋剤として機能する多官能ビニル化合物、（有機系高分子粒子担体との）共有結合性の官能基を含むビニル化合物や、定量用マーカーとして機能するビニル化合物等が挙げられる。
【００２６】
共重合体における式（１）〜（３）で表される化合物に由来する構造単位の好適な割合は、
式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物及び式（３）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位が、共重合体を構成する全ビニル系化合物の合計重量に対して、好適には、
式（１）で表される化合物に由来する構造単位：５重量％以上９０重量％以下、
式（２）で表される化合物に由来する構造単位：５重量％以上９０重量％以下、
式（３）で表される化合物に由来する構造単位：３重量％以上５０重量％以下、
であり、より好適には
式（１）で表される化合物に由来する構造単位：１０重量％以上８０重量％以下、
式（２）で表される化合物に由来する構造単位：１０重量％以上８０重量％以下、
式（３）で表される化合物に由来する構造単位：５重量％以上４０重量％以下、
であり、特に好適には、
式（１）で表される化合物に由来する構造単位：２０重量％以上６０重量％以下、
式（２）で表される化合物に由来する構造単位：２０重量％以上６０重量％以下、
式（３）で表される化合物に由来する構造単位：１０重量％以上３０重量％以下、
である。
なお、「共重合体を構成する全ビニル系化合物の合計重量」は、共重合体が式（１）〜（３）で表される化合物由来の構造単位以外に、他のビニル化合物由来の構造単位を含む場合は、式（１）〜（３）で表される化合物と他のビニル化合物との合計重量である。即ち、「共重合体を構成する全ビニル系化合物の合計重量」は共重合体を構成する全ビニル系化合物の合計重量を意味する。また、上記の各構造単位の重量割合は原料として用いられる各ビニル系化合物の重量割合に基づいて定められるものとする。
【００２７】
上記共重合体は、特にリガンド粒子としての機能発現のために、粒子状の立体構造を有することが好ましく、その平均粒径は、２０〜５００ｎｍであり、好適には、平均粒径２５〜２００ｎｍである。リガンド粒子はターゲット分子（タンパク質）に対して吸着選択性を有するために立体的構造をとる必要があるが、このような構造をとるためには上記下限値以上の平均粒径であることが好ましい。また、リガンド粒子のターゲット分子（タンパク質）に対する吸着量の観点からは平均粒径が上記上限値以下であることが好ましい。
【００２８】
上記共重合体は、溶液重合法、バルク重合法、懸濁重合法、乳化重合法、沈殿重合法などの従来公知の合成方法によって製造することができる。
特に上記平均粒径が２０〜５００ｎｍ（好適には、平均粒径２５〜２００ｎｍ）の粒子状の共重合体を得るためには、沈殿重合法により製造することが好ましい。
沈殿重合法として、文献Journal of the American Chemical Society, 134, 15765-15772,2012やPolymer Preprints,52,502-503,2011に記載されている方法に準じる方法により製造することが好ましい。
なお、合成された粒子状の共重合体の平均粒径は、動的光散乱法にて測定することができる。
【００２９】
沈殿重合法は、原料モノマーが可溶で、生成する共重合体が溶解し難い溶媒を使用して重合を行う方法である。
本発明に係る粒子状の共重合体は、原料モノマーである上記式（１）で表される化合物、（２）で表される化合物及び（３）で表される化合物を溶媒中に所定の割合で混合し、必要に応じて架橋剤、重合開始剤の共存下、重合反応を進行させると、反応の進行と共に生成する重合体が沈殿してくるので、これをろ過等の手段により分離・回収し、乾燥することで得ることができる。なお、得られた粒子状の共重合体は、ゲルろ過、再沈殿、分液抽出、透析等の一般的に知られている方法で精製を行うことが好ましい。
【００３０】
重合に用いる溶媒は、原料モノマーおよび重合開始剤が室温あるいは加熱により可溶で、生成する共重合体が溶解しないものであれば特に制限はない。
例えば、水、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン等が挙げられる。これらは単独でも２種以上を混合して用いてもよい。
【００３１】
共重合体の原料モノマーである上記式（１）〜（３）で表される化合物の好適な割合は、式（１）で表される化合物：５〜９０重量％（より好適には１０〜８０重量％、特に好適には２０〜６０重量％）、式（２）で表される化合物：５〜９０重量％（好適には１０〜８０重量％、特に好適には２０〜６０重量％）、式（３）で表される化合物：３〜５０重量％（好適には５〜４０重量％、特に好適には１０〜３０重量％）である。
ここの割合（重量％）は、共重合体を構成する全ビニル系化合物の合計重量を１００重量％とした際の値である。
【００３２】
粒子状の共重合体は、機械的強度を高める点で、架橋構造を有していることが好ましい。共重合体に架橋構造を付与する方法としては、原料モノマーを重合する際に、架橋剤を共存させ、原料モノマーと共重合することによって行うことができる。
架橋剤としては、多官能ビニル化合物が挙げられ、例えば、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、ヒドロキシエチルジメタクリレート、ジビニルベンゼン等のビニル基を複数有する二官能性単量体が挙げられる。
【００３３】
架橋剤の割合は、共重合体を構成する全ビニル系化合物の合計重量に対して、好ましくは０．１〜５重量％、より好ましくは、０．５〜２重量％である。
架橋剤の割合が上記下限値以上であると、機械的強度の観点で好ましく、一方、上記上限値以下であると、リガンド粒子としての機能を得る観点から好ましい。
【００３４】
また、リガンド粒子を構成する共重合体は、担体と共有結合性の官能基を含むビニル化合物からなる構造単位を含むことが好ましい。
このようなビニル化合物として、例えば、担体が反応性官能基としてエポキシ基を有する場合には、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド等、アミノ基を有するビニル化合物が挙げられる。
担体が反応性官能基として第４級アミノ基を有する場合には、スルホン酸基、カルボン酸基など、アニオン性を有する基が挙げられる。
【００３５】
反応液中の原料モノマー全体（共重合体を構成するビニル系化合物全体）の濃度は、製造効率、撹拌性や付着防止などの観点から、好ましくは１〜５０質量％である。
【００３６】
沈殿重合法における原料モノマー（架橋剤等の他のビニル化合物含む）や他の成分（重合開始剤等）の溶媒への添加方法、添加順序等に特に制限はなく、全ての原料を初めから一括して混合した後に反応させる方法を用いてもよいし、何れか２成分又は３成分以上を予め配合し、その後に残りの成分を混合した後に反応させる方法を用いてもよい。
【００３７】
重合反応の最適な条件は、重合開始剤、モノマー、溶媒の種類、濃度等によって異なるが、温度は通常、１０〜８０℃、重合時間は通常、１〜２０時間程度である。
また、酸素による重合開始剤の不活性化を抑制するために不活性ガス雰囲気下で反応させることが好ましい。
【００３８】
＜有機系高分子粒子担体＞
上記本発明に係るリガンド粒子を有機系高分子粒子担体に担持することにより、本発明の分離剤を調整することができるが、その有機系高分子粒子担体に関しては、ポリマー系、セルロース系、アガロース系等の有機系粒子担体のいずれも使用することができるが、特にポリマー系の有機系粒子担体が好ましい。リガンド粒子を担持するための内部表面積をもつ観点から、有機系粒子担体は、多孔性を有する多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体であることが特に好ましい。
【００３９】
このような有機系高分子粒子担体の平均粒径は、１μｍ以上であり、５μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上であることがより好ましい。一方、１０００μｍ以下であり、７００μｍ以下であることが好ましく、５００μｍ以下であることがより好ましい。有機系高分子粒子担体の平均粒径が、上記下限値以上であると本発明の分離剤をカラムに充填して通液したときの圧力損失による通液速度低下を抑え、生産性を良好なものとする観点から好ましく、一方、カラムに通液した際のタンパク質の吸着量や分離性能が向上する傾向にある。
【００４０】
有機系高分子粒子担体の平均粒径は、既知の方法で測定することができる。例えば、光学顕微鏡にて、１００個以上の粒子径を測定し、その分布から体積メジアン径を算出することで平均粒径が得られる。
【００４１】
有機系高分子粒子担体が多孔性を有する場合、その細孔直径は水銀圧入法により測定され、リガンド粒子を担持するための表面積を得る観点から、好ましくは１０Å以上であり、より好ましくは２０Å以上であり、更に好ましくは５０Å以上である。一方、有機系高分子粒子担体そのものの物理的強度を得る観点から、好ましくは１０，０００Å以下であり、より好ましくは５，０００Å以下であり、更に好ましくは２，０００Å以下である。
【００４２】
なお、水銀圧入法は、圧力をかけて水銀を開孔部に侵入させ、圧力値と対応する侵入水銀体積とを用いて、円柱状と仮定した細孔の径をＷａｓｈｂｕｒｎの式から算出する方法であり、セラミックス成形体について規定されたＪＩＳ Ｒ１６５５を準用することができる。
【００４３】
上記担体の中でも、上記リガンド粒子を構成する共重体を十分に担持でき、かつ、化学的安定性に優れる点で、特開２０１２−１８１３５号公報に記載されている多孔性架橋ポリマー粒子からなる有機系高分子粒子担体や、それにスペーサーを導入した有機系高分子粒子担体が好適である。
以下、本発明の分離剤における有機系高分子粒子担体として好適な多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体について説明する。
【００４４】
本発明の分離剤において担体として好適に用いられる多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体は、架橋構造を有し、かつ、上記リガンド粒子を構成する共重合体を担持するのに適した細孔を有する粒子状の担体である。
【００４５】
（１）多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体の製造方法
粒子状の多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体を得るための方法は、従来公知の懸濁重合や乳化重合が挙げられる。例えば、特公昭５８−０５８０２６号公報に開示されているような方法を用い、スチレン系単量体、（メタ）アクリル系単量体等の重合性単量体と、必要に応じて反応性官能基付与性を有する重合性単量体とを、懸濁重合や乳化重合させることによって行うことができる。
特に平均粒径１μｍ以上１０００μｍ以下の多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体を形成できる点で、例えば特開平１−５４００４号公報に記載されているような、懸濁重合法により製造することが好ましい。
【００４６】
多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体は、分離時の水媒体との親和性が高く、選択率向上に有効な（メタ）アクリル系単量体、特に（メタ）アクリル酸エステル単量体由来の構造単位を有することが好ましい。特に、（メタ）アクリル酸エステル単量体由来の構造単位を重合体の全構造単位の５０重量％以上であることが好ましい。
なお、本発明において「（メタ）アクリル」という表記は、上述の通り、「アクリル又はメタクリル」を意味するものである。
【００４７】
また、上記のスチレン系単量体としては、スチレン、エチルスチレン、メチルスチレン、ヒドロキシスチレン、クロロスチレン等の単量体が挙げられる。
（メタ）アクリル系単量体としては、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル単量体、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリロニトリルのようなニトリル類、グリシジル（メタ）アクリレート、４，５−エポキシブチル（メタ）アクリレート、９，１０−エポキシステアリル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有量体などが例示できる。
【００４８】
なお、多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体の平均粒径は、懸濁重合の操作条件、例えば、上記の各種原料モノマーの種類・量の選択、乳化剤及び／又は保護コロイド剤の種類・量の選択、及び撹拌の強度（撹拌回転数等）、その他を調節すること等により、適宜制御することができる。
【００４９】
多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体の細孔の径や細孔の総容積は、用いる重合性単量体の種類・量や、重合時の水と単量体との量比、あるいは重合に際して重合に不活性な有機溶媒を反応系中に所定量共存させ、その種類や量を制御することによって調整することができる。更に、重合開始剤の種類・量によっても調整が可能である。
【００５０】
リガンド粒子の担持量（固定化量）は、好適には１０〜５０ｍｇ/ｍＬ（樹脂）であり、より好適には、２０〜４０ｍｇ/ｍＬ（樹脂）である。
リガンド粒子の担持量は、後掲の実施例により示すＤＮＳメタクリレート等の定量用マーカーとして機能するビニル化合物をリガンド粒子である共重合体に重合させておき、有機系高分子粒子担体に対するリガンド粒子の吸着前後の溶液の蛍光スペクトルを測定し、それぞれの極大波長の蛍光強度の差から有機系高分子粒子担体に固定化したリガンド粒子量を求めることができる。
【００５１】
リガンド粒子の有機系高分子粒子担体への担持方法として、リガンド粒子を有機系高分子粒子担体に物理吸着させてもよいが、より強固に固定するためにはイオン交換反応によりリガンド粒子を担持する方法や、リガンド粒子を構成する共重合体が有する反応性官能基と、有機系高分子粒子担体が有する反応性官能基とを化学反応により共有結合を介して結合させる方法が好適である。
【００５２】
イオン交換反応によりリガンド粒子を有機系高分子粒子担体に担持する方法としては、例えば、リガンド粒子を構成する共重合体と溶液とを、トリメチルアンモニウム基、ジメチルエタノールアンモニウム基等の第４級アンモニウム基等、種々のイオン交換基を導入した有機系高分子粒子担体上に供給し、リガンド粒子を構成する共重合体と溶液とを接触させてイオン交換を行う方法が挙げられる。
【００５３】
一方、化学反応により共有結合を介してリガンド粒子を有機系高分子粒子担体に担持（固定化）する方法は、リガンド粒子を構成する共重合体に反応性官能基を有する構造単位を導入しておき、有機系高分子粒子担体にリガンド粒子を構成する共重合体が有する反応性官能基と結合できる反応性官能基を導入することにより、リガンド粒子と有機系高分子粒子担体とを化学結合により固定化する方法である。
【００５４】
リガンド粒子に導入する反応性官能基を有する構造単位としては、有機系高分子粒子担体側の反応性官能基の種類に応じて選択すればよい。
好適な一例としては、リガンド粒子を構成する共重合体にアミノ基を有する構造単位を導入し、有機系高分子粒子担体にアミノ基と共有結合可能な官能基を導入する方法が挙げられる。
アミノ基と共有結合可能な官能基として、エポキシ基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、イミノ基、イミダゾール基、カルバメート基、シアノ基、チオール基、アルデヒド基からなる群のうちの少なくとも１つの官能基が挙げられる。この中でも、エポキシ基、カルボキシル基が好ましく、これらの中でも反応性の点から、エポキシ基が好ましい。
【００５５】
有機系高分子粒子担体にアミノ基と共有結合可能な官能基を導入するために好適に使用されるエポキシ基を有する重合性単量体としては、グリシジル（メタ）アクリレートなどのエポキシ基含有単量体、アリルグリシジルエーテル、ビニルグリシジルエーテル、４−エポキシ−１−ブテンなどが挙げられる。
【００５６】
以下、本発明の分離剤における、好適な有機系高分子粒子担体である多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体に共有結合を介して、リガンド粒子を担持する方法についてより詳細に説明する。
【００５７】
リガンド粒子である共重合体を、多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体に共有結合で固定化する方法としては、多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体に反応性官能基付与性を有する重合性単量体を共重合等の形で取り込ませておいた上で、この反応性官能基と、リガンド粒子に導入した官能基とを直接反応させる方法や、或いは多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体の構成成分を有する官能基及び前記リガンド粒子に導入した官能基とそれぞれ反応可能な官能基を分子内にそれぞれ１個以上有する低分子又は高分子化合物（以下このような化合物をまとめて「スペーサー」と記す）を介して結合させる方法が挙げられる。
【００５８】
アミノ基を導入したリガンド粒子を固定化する場合、前者の方法としては、多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体にエポキシ基、カルボキシル基などのアミノ基と共有結合を形成する官能基を含有させておき、これとリガンド粒子を構成する共重合体を直接反応させて固定化する方法が例示できる。
また、後者の方法としては、スペーサーとしてアミノ酸（アミンカルボン酸）類を用い、そのアミノ基部位と多孔性架橋有機系ポリマー担体に含有されるエポキシ基とを反応させた上で、他の末端のカルボキシル基によってリガンド粒子を構成する共重合体のアミノ基と反応させる方法や、スペーサーとしてジアミンやジオールと（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエーテル等のジグリシジル化合物を逐次的に用いて、多孔性架橋有機系ポリマー担体のエポキシ基とジアミン又はジオールの一方の末端を結合させ、他の末端にジグリシジル化合物の一方のエポキシ基を結合させて、残る末端のエポキシ基をリガンド粒子である共重合体と結合させる方法などが挙げられる。
【００５９】
なお、上記方法でスペーサーの一部の成分として用いられるジアミンとしては、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等の脂肪族ジアミン類が挙げられ、ジオールとしては、プロピレングリコール、ブタンジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール等の脂肪族ジオールやポリエチレングリコール類が挙げられる。
スペーサーとしてはリガンド粒子との反応性や固定化時の多孔性架橋有機系ポリマー担体との立体障害の関係を考慮すると、直鎖状の構造を有していても分岐状の構造を有していてもよいが、直鎖状の構造を有していることが好ましい。直鎖状の構造のスペーサーを用いると、立体障害が小さくなり、リガンド粒子と抗体とのアフィニティ結合が形成されやすくなるためか、吸着量が向上する傾向にある。
【００６０】
好適な具体的方法を例示すると、上記反応性官能基を有するリガンド粒子を構成する粒子状の共重合体を水溶液として上記エポキシ基等の反応性官能基を有する多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体上に供給し、反応を行わせる方法が挙げられる。
この場合、固定化反応の温度は常温（２０℃）〜３０℃程度が好ましい。温度が高過ぎるとリガンド粒子等が不活性化するおそれがあり、一方温度が低過ぎると反応に長時間を要することがある。
【００６１】
上記のように固定化反応を行った後、多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体側に残存する反応性官能基は、後処理により不活性化しておくことが好ましい。
このような後処理としては、例えば反応性官能基としてエポキシ基を例に取れば、エタノールアミン等のアミン類の水溶液と反応させて不活性化する方法が例示できる。
【００６２】
リガンド粒子固定化反応後の分離剤、または固定化反応に加えて後処理を加えた分離剤は、未反応物を除去するために水で洗浄するのが好ましい。
【００６３】
得られた分離剤は、そのまま使用する場合を除いて一時的に保管される。保管時の媒体
としては、濃度１〜５０重量％のエタノール水溶液を用いるのが好ましい。
多孔性架橋有機系ポリマー粒子担体を用いた上記分離剤を該保管媒体中で保管した時に、該分離剤の膨潤度が適切になり、かつ該分離剤に対する保管媒体への親和性が良好である。
【００６４】
＜用途＞
本発明の分離剤は、リガンド粒子を構成する共重合体が、タンパク質、特に抗体にアフィニティ吸着性を有するため、タンパク質、特に抗体を標的分子としたアフィニティ分離剤として、これらの分離に好適に使用することができる。
特に好ましい標的分子としては、免疫グロブリン又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質、若しくはその化学変性物が挙げられ、これらの中でも免疫グロブリンがモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であるものが好ましい。
【００６５】
標的分子の分離処理においては、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含むように行うことが好ましい。このような分離処理に際しては、少なくとも１つの容器を備え、本発明の分離剤を充填した液体クロマトグラフィー用カラムを用いることが好ましい。
（ａ）標的分子を含む溶液を上記の分離剤に接触させて、標的分子を分離剤に吸着させる工程。
（ｂ）前記標的分子を吸着した分離剤から該標的分子を溶離する工程。
【００６６】
このような方法により、上記のような各種タンパク質を選択性良く分離することが可能
である。また、このような分離処理に際しては、上記の分離剤を含み、少なくとも１つの容器を備えた液体クロマトグラフィー用カラムが好ましく用いられる。
【００６７】
本発明の分離剤の抗体吸着量は、好適には１ｍｇ/ｍＬ（樹脂）以上である。なお、ｍＬ（樹脂）は、湿潤樹脂の体積を示す。
【００６８】
抗体吸着量の測定方法は、分離剤を水湿潤状態として１体積部をチューブに秤取し、これに５０体積部のマウスポリクローナルＩｇＧ水溶液（和光純薬（株）製試薬を濃度２．５ｍｇ／ｍＬに希釈したもの）を加えて室温で５時間攪拌しＩｇＧを吸着させる。吸着前後の上澄み液の吸光度を測定し、別途作成した検量線より抗体吸着量を決定する。
なお、マウスポリクローナル抗体吸着量が小さいと、目的とするヒト抗体の吸着量も低下するものと考えられている。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例における各種の製造条件や評価結果の値は、本発明の実施態様における上限又は下限の好ましい値としての意味をもつものであり、好ましい範囲は前記した上限又は下限の値と、下記実施例の値又は実施例同士の値との組み合わせで規定される範囲であってもよい。
【００７０】
〔実施例１〜６〕
１）ＤＮＳメタクリレートの合成
リガンド粒子を構成する共重合体の定量用マーカーとしてのＤＮＳメタクリレートは以下の方法で合成した。
まず、無水テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと称する。）７５ｍｌにダンシルクロライド０．９４ｇを溶解し、氷浴中の無水ＴＨＦ１５０ｍｌに溶解したエチレンジアミン２．３２ｍｌにゆっくり添加した。反応はアルミで遮光し０℃で３時間反応させた。その後１ｍｏｌ％のＫＯＨ１０ｍｌを加え溶液を塩基性にした。ＴＨＦをエバポレータで飛ばし、水相を塩化メチレンで分液した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、塩化メチレンをエバポレータで飛ばした。ベンゼンで再結晶し、ろ過して黄緑色の固形物を得た。
【００７１】
無水ＴＨＦ３３ｍｌに、この固形物０．３３３ｇを溶解し、メタクリロイルクロライド０．１１２ｍｌとトリエチルアミン０．１６ｍｌを加え、１６時間室温で攪拌した。その後、メタクリロイルクロライド０．０５６ｍｌとトリエチルアミン０．０８ｍｌを加え、３時間攪拌した。塩をろ過で取り除きＴＨＦで洗浄し、ＴＨＦをエバポレータで飛ばした。これを展開溶媒（酢酸エチル／ヘキサン）でカラム精製し、淡緑色の固形物（ＤＮＳメタクリレート）を得た。
【００７２】
２）リガンド粒子の合成
リガンド粒子を構成する共重合体は、種々の原料となるビニル化合物（共重合性モノマー）を、Journal of the American Chemical Society, 134, 15765-15772,2012に記載の沈殿重合法に従い合成した。
リガンド粒子の原料モノマーとして、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）、ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）、アクリル酸（ＡＡｃ）、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド（Ｂｉｓ）、反応性官能基を有するビニル化合物としてＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド（Ａｍ）、定量用マーカーとしてＤＮＳメタクリレートに関しては、１）のものを用いた。それぞれの化学構造は、下記に示す通りである。
原料となるビニル化合物（原料モノマー）として、ＮＩＰＡｍ、ＴＢＡｍ、ＡＡｃ、Ｂｉｓ、Ａｍ及びＤＮＳメタクリレートを下記表−１の割合で、溶液中の原料モノマー総濃度が６．５ｍＭになるように、４００ｍｌの水に溶解した。その際、ＴＢＡｍは、４ｍｌのエタノール、ＤＮＳメタクリレートは５ｍｌのアセトンに溶解してから溶液に投入した。また、４０ｍｇのドデシル硫酸ナトリウムを添加した。溶液をナスフラスコに入れ、セプタムで密栓し攪拌しながら１２０分窒素バブリングで脱気した。次いで、溶液を室温で１７時間攪拌した。反応終了後、透析膜に溶液を入れ、水で４日間透析を行い、共重合体溶液（リガンド粒子溶液）を得た。
【００７３】
【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【００７４】
表−１に各リガンド粒子のモノマーの割合、及び得られた各リガンド粒子の平均粒径を示す。なお、表−１において、リガンド粒子（粒子状の共重合体）の平均粒径は、動的光散乱法（マルバーン社製  ゼータサイザーナノ）にて測定した。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
３）有機系高分子粒子担体の合成
化学結合にてリガンド粒子と結合させるための有機系高分子粒子担体として、共有結合でリガンド粒子と結合させるための有機系高分子粒子担体Ｓ１と、イオン交換法にてリガンド粒子と結合させるための有機系高分子粒子担体Ｓ２の二種類を使用した。
【００７７】
共有結合でリガンド粒子と結合させるための有機系高分子粒子担体Ｓ１は、以下の方法で合成した。
【００７８】
まず、水１００重量部にポリビニルアルコール０．５重量部を溶解した水中に、グリシジルメタクリレート８０重量部、エチレングリコールジメタクリレート２０重量部，２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）１重量部、及びジクロルプロパン１００重量部の混合物を加え、撹拌して懸濁状態とした。このとき、撹拌速度を調整して液滴の平均直径が約１００μｍになるようにした。この懸濁液を７０℃に昇温し、６時間反応させた。冷却後、得られた架橋構造を有する多孔性粒子を水洗後、メタノール洗浄し、乾燥して架橋共重合体の多孔性粒子を得た。
【００７９】
次いで、この多孔性粒子を水湿潤状態とし、その１００重量部をフラスコに採取した。ここにエタノール／水（５０／５０）溶媒を２００重量部添加し、更に１，４−ブタンジオール１００重量部を加えて混合後、触媒として硫酸（９８％）を２重量部添加して、温度４０℃で５時間反応させ、１，４−ブタンジオールが多孔性粒子のエポキシ基と反応した付加物を得た。
【００８０】
次いで、１，４−ブタンジオール付加粒子（水湿潤状態）１００重量部あたり、エチレングリコールジグリシジルエーテル５０重量部を加え、アルカリ触媒を添加して１，４−ブタンジオールの水酸基末端への付加反応を行い、末端基としてエポキシ基を持つスペーサーを有する多孔性架橋ポリマー担体を調製した。この粒子状の多孔性架橋ポリマー担体のエポキシ基含有量は１．５μモル／ｇ（樹脂）であった。
【００８１】
また、イオン交換法にてリガンド粒子と結合させるための有機系高分子粒子担体Ｓ２として、三菱化学社製ＭＣＩ（登録商標）ｇｅｌ  ＣＱＡ３５Ｐを使用した。
【００８２】
有機系高分子粒子担体Ｓ１，Ｓ２の平均粒径及び細孔直径は以下の方法で評価した。
有機系高分子粒子担体の平均粒径は、光学顕微鏡を用いて顕微鏡写真を撮影し、一視野あたり１００個の粒子の径を測定した平均値である。また、有機系高分子粒子担体の細孔直径（Å）は島津製作所製水銀ポロシメーターで測定した細孔容積、細孔直径をそれぞれ縦軸、横軸とした細孔の分布を示すヒストグラムにより、細孔容積の合計が最も多い部分の細孔直径を平均細孔直径とした。
表−２にそれぞれの有機系高分子粒子担体の物性をまとめて示す。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
４）リガンド粒子の有機系高分子粒子担体への担持（分離剤の製造）
上記３）の有機系高分子粒子担体（Ｓ１，Ｓ２）を水湿潤状態で１重量部採取し、これに２）のリガンド粒子水溶液を５〜５０重量部添加し、室温で３時間以上反応させ有機系高分子粒子担体にリガンド粒子を担持した。リガンド粒子を担持した有機系高分子粒子担体を水で十分洗浄し、タンパク質用アフィニティ分離剤（Ｒ１〜Ｒ６）を得た。
【００８５】
５）リガンド粒子担持量の評価
ＤＮＳを導入したリガンド粒子を使用した分離剤に関しては、吸着前後の溶液の蛍光スペクトルを測定し、それぞれの極大波長の蛍光強度の差から、リガンド粒子の担持量を評価した。また、ＤＮＳを導入していないリガンド粒子に関しては、担持後の分離剤のＳＥＭ観察を実施し、リガンド粒子が担持されていることを確認した。
【００８６】
６）ＩｇＧ吸着量評価
タンパク質用アフィニティ分離剤（Ｒ１〜Ｒ６）を水湿潤状態で１体積部をチューブに採取した。これに５０体積部のマウスポリクローナルＩｇＧ水溶液（濃度２．５ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で５時間攪拌した。ＩｇＧ吸着前後の上澄み液の吸光度を測定することにより、ＩｇＧ吸着量を定量した。
【００８７】
７）ＩｇＧ溶離率評価
６）でＩｇＧが吸着したタンパク質用アフィニティ分離剤にｐＨ２．３のグリシン・塩酸緩衝液と３時間接触させ、溶離したＩｇＧを上澄み液の吸光度を測定することにより、ＩｇＧ溶離量を評価し、溶離率を求めた。
【００８８】
以上の結果を表−３にまとめる。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
〔結果の評価〕
表−３に示されるように実施例１〜６のタンパク質用アフィニティ分離剤はいずれもＩｇＧを良好に吸着することが示された。また、表−３の実施例３〜６の結果より、タンパク質用アフィニティはＩｇＧを吸着後、ＩｇＧを良好に溶離する性能も示された。これらの結果より、本発明のタンパク質用アフィニティ分離剤が有効であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の分離剤は、タンパク質、特に抗体に対する高い選択率で分離・吸着性能を示し、かつ、強度と耐久性に優れるため、特に医薬・診断分野における実用上の価値は高い。