(57)【要約】【課題】翻訳後修飾ペプチドに対して得られたＭＳ2スペクトルに基づくデータベース検索により、元のペプチドのアミノ酸配列を高い信頼度で推定する。【解決手段】被検試料のＭＳ1スペクトル上で修飾物が脱離したペプチドイオンと修飾を受けたままのペプチドイオンとを見つけ、それぞれをプリカーサとするＭＳ2分析を実行する（S1-S3）。二つのＭＳ2スペクトルを比較することで、ペプチド由来の修飾物が脱離したプロダクトイオンと修飾を受けたプロダクトイオンとの対を見つける（S4）。イオン対毎に一方のイオンを削除するとともに、削除されたイオンの強度を残すイオンの強度に加算する（S5）。こうして作成されたピークリストに対し、S2,S4で検出された修飾条件の下で既存のデータベース検索を実行し、その検索結果である同定結果を表示する(S6-S9）。【選択図】図２
2014115087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳn分析（ここでｎは２以上の整数）を実行可能な質量分析装置を用いて翻訳後修飾を受けたペプチドのアミノ酸配列を同定するためのペプチド構造解析方法であって、
a)被検試料中の目的ペプチドに由来するプリカーサイオンをｎ−１段階に開裂させることにより取得されたＭＳnスペクトルに基づいて、修飾物が付加した状態のプロダクトイオンと該修飾物が脱離したプロダクトイオンとのイオン対を複数検出するイオン対検出ステップと、
b)前記イオン対検出ステップにより検出された複数のイオン対のそれぞれについて、修飾物が付加した状態のプロダクトイオンと修飾物が脱離したプロダクトイオンとのいずれか一方を選択し他方を削除するとともに、削除された方のイオンの強度情報を選択された方のイオンの強度情報に反映させるように強度情報を修正した上で、又は、選択された方のイオンの強度情報をそのまま残して、選択されたプロダクトイオンのピーク情報を集めたピークリストを作成するピークリスト作成ステップと、
c)前記イオン対検出ステップにおけるイオン対検出時に用いられた修飾情報を検索条件の一つとして、又は修飾がないことを検索条件の一つとして、前記ピークリスト作成ステップにより作成されたピークリストをデータベースに登録されているペプチドと照合するデータベース検索を実行するデータベース検索ステップと、
d)前記データベース検索ステップで得られた検索結果に基づいて、目的ペプチドのアミノ酸配列に関する情報を出力する結果提供ステップと、
を有することを特徴とするペプチド構造解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチド構造解析方法であって、
被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトル中に現れる目的ペプチド由来で修飾物が付加されたイオンのピークと修飾物が脱離したイオンのピークとを抽出し、それら二つのピークに対応したイオンをそれぞれプリカーサイオンとして被検試料に対するＭＳn分析を行ってＭＳnスペクトルを取得する分析実行ステップ、をさらに有し、
前記イオン対検出ステップでは、二つのＭＳnスペクトルを比較することによりイオン対を検出することを特徴とするペプチド構造解析方法、
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチド構造解析方法であって、
前記ピークリスト作成ステップでは、選択したイオンの強度に削除されたイオンの強度に強度が小さい方のイオンの強度を加えることを特徴とするペプチド構造解析方法。
【請求項４】
ＭＳn分析（ここでｎは２以上の整数）を実行可能な質量分析装置を用いて翻訳後修飾を受けたペプチドのアミノ酸配列を同定するためのペプチド構造解析装置であって、
a)被検試料中の目的ペプチドに由来するプリカーサイオンをｎ−１段階に開裂させることにより取得されたＭＳnスペクトルに基づいて、修飾物が付加した状態のプロダクトイオンと該修飾物が脱離したプロダクトイオンとのイオン対を複数検出するイオン対検出部と、
b)前記イオン対検出部により検出された複数のイオン対のそれぞれについて、修飾物が付加した状態のプロダクトイオンと修飾物が脱離したプロダクトイオンとのいずれか一方を選択し他方を削除するとともに、削除された方のイオンの強度情報を選択された方のイオンの強度情報に反映させるように強度情報を修正した上で、又は、選択された方のイオンの強度情報をそのまま残して、選択されたプロダクトイオンのピーク情報を集めたピークリストを作成するピークリスト作成部と、
c)前記イオン対検出部におけるイオン対検出時に用いられた修飾情報を検索条件の一つとして、又は修飾がないことを検索条件の一つとして、前記ピークリスト作成部により作成されたピークリストをデータベースに登録されているペプチドと照合するデータベース検索を実行するデータベース検索部と、
d)前記データベース検索部で得られた検索結果に基づいて、目的ペプチドのアミノ酸配列に関する情報を出力する結果提供部と、
を備えることを特徴とするペプチド構造解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を用いたタンパク質又はペプチドの構造解析方法及び装置に関し、さらに詳しくは、翻訳後修飾を受けたペプチドを分析して得られるＭＳn（ここでｎは２以上の整数）スペクトルデータを利用して、ペプチドのアミノ酸配列と修飾部位とを同定するペプチドの構造解析方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析の手法は広く用いられており、その技術的な進歩には著しいものがある。プロテオーム解析分野において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置）を始めとする質量分析装置を用いたペプチドの構造解析手法として、データベース検索法がよく知られている。一般に、データベース検索法では、ＭＳn分析を行うことで得られたＭＳnスペクトルに現れるピークの質量電荷比情報を集めたピークリストと、データベースに登録されているタンパク質より算出される質量電荷比とを照合し、その一致度を手がかりとしてペプチドのアミノ酸配列を決定する。また、データベース検索に際して、ペプチドの受けた修飾の種類を検索条件としてユーザが指定することにより、蓋然性の高いペプチドとその修飾部位とを同定する手法も開発されている。
【０００３】
例えば、現在幅広く使用されている解析ソフトウエアである英国マトリックス・サイエンス社製のマスコット（Mascot）には、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ（MS/MS ion Search）と名付けられた検索エンジンが含まれる。このＭＳ／ＭＳイオンサーチでは、非特許文献１に開示されているように、データベース検索条件として、タンパク質の分解に使用した消化酵素の種類（エンザイム：Enzyme）、修飾の種類（モディフィケイション：modification）、質量分析の精度の許容値（MS/MS tol.）などをユーザが入力設定できるようになっている。そして、こうした条件をユーザが適宜に設定した上で検索の実行を指示すると、複数のＭＳ／ＭＳスペクトル（又はＭＳnスペクトル）に対して設定されている検索条件に従ったデータベース検索が行われ、スペクトルデータの一致度（スコア）が高いペプチドがリストアップされる。
【０００４】
図４はＭＳ／ＭＳイオンサーチによる検索結果の一例である。この検索結果例では、スコア：１２２５を獲得したタンパク質「Ｈｓｐ６０」が順位１位でヒットしており、ヒットしたペプチド断片のアミノ酸配列が同定されている。また、図４中左方に矢印で示したクエリ(Query)13という検索操作に対して同定されたペプチド「ＩＰＡＭＴＩＡＫ」において、修飾（酸化）部位が４番目の「Ｍ」であると同定されている。
【０００５】
しかしながら、実際には、タンパク質特有の翻訳後修飾を受けたペプチドについてＭＳ／ＭＳイオンサーチなどによるデータベース検索の手法を適用しても、妥当なスコアでペプチドや修飾部位を同定することはかなり困難であるという問題があった。なお、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法は、マスコット以外の他のアミノ酸配列解析用ソフトウエア、例えばX!Tandemなどにも搭載されているが、これらでも事情は同様である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「マトリックス・サイエンス−マスコット−ＭＳ／ＭＳ・イオン・サーチ（Matrix Science - Mascot - MS/MS Ions Search）」、[online]、英国マトリックス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２４年１０月２２日検索]、インターネット＜URL :  http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質の翻訳後修飾は非常に多様性に富んでおり、翻訳後修飾を受けたペプチドの解析は近年、非常に重要性を増している。本発明はこうした点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、修飾物の脱離のために従来のデータベース検索法では十分な信頼度で以て同定できないような翻訳後修飾を受けたペプチドのＭＳnスペクトルを用いてデータベース検索を行い、妥当なペプチドのアミノ酸配列とその修飾部位の同定を可能とするペプチド構造解析方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一般に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いたＭＳn分析により得られるＭＳnスペクトルには翻訳後修飾を受けたプロダクトイオンとそうした修飾物が脱離したプロダクトイオンとが混在して現れる。修飾物には様々なものがあり、ペプチドから脱離しにくいものや逆に脱離し易いものなど様々である。また、開裂条件やイオン化条件などの分析条件によっても、脱離のし易さがかなり変動する。そのため、翻訳後修飾を受けたペプチドのＭＳnスペクトルはかなり複雑になる。こうしたことから、既存のデータベース検索法では仮に修飾（例えばマスコットにおける「modification」）を仮定したデータベース検索を行ったとしても、修飾物が付加されたイオンと脱離したイオンとを十分に識別できず、或いは、そうした複雑なプロダクトイオン情報を有効に活用することができず、検索の精度が上がりにくいものと考えられる。そこで、本願発明者は、既存のデータベース検索法を適用するに先立って、いわばＭＳnスペクトルデータの前処理を実行し、既存のデータベース検索に適するようにデータを整理するという新規な手法に想到するに至った。
【０００９】
即ち、上記課題を解決するために成された本発明に係るペプチド構造解析方法は、ＭＳn分析（ここでｎは２以上の整数）を実行可能な質量分析装置を用いて翻訳後修飾を受けたペプチドのアミノ酸配列を同定するためのペプチド構造解析方法であって、
a)被検試料中の目的ペプチドに由来するプリカーサイオンをｎ−１段階に開裂させることにより取得されたＭＳnスペクトルに基づいて、修飾物が付加した状態のプロダクトイオンと該修飾物が脱離したプロダクトイオンとのイオン対を複数検出するイオン対検出ステップと、
b)前記イオン対検出ステップにより検出された複数のイオン対のそれぞれについて、修飾物が付加した状態のプロダクトイオンと修飾物が脱離したプロダクトイオンとのいずれか一方を選択し他方を削除するとともに、削除された方のイオンの強度情報を選択された方のイオンの強度情報に反映させるように強度情報を修正した上で、又は、選択された方のイオンの強度情報をそのまま残して、選択されたプロダクトイオンのピーク情報を集めたピークリストを作成するピークリスト作成ステップと、
c)前記イオン対検出ステップにおけるイオン対検出時に用いられた修飾情報を検索条件の一つとして、又は修飾がないことを検索条件の一つとして、前記ピークリスト作成ステップにより作成されたピークリストをデータベースに登録されているペプチドと照合するデータベース検索を実行するデータベース検索ステップと、
d)前記データベース検索ステップで得られた検索結果に基づいて、目的ペプチドのアミノ酸配列に関する情報を出力する結果提供ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１０】
また上記課題を解決するために成された本発明に係るペプチド構造解析装置は、上記発明に係るペプチド構造解析方法を具現化するための装置であって、ＭＳn分析（ここでｎは２以上の整数）を実行可能な質量分析装置を用いて翻訳後修飾を受けたペプチドのアミノ酸配列を同定するためのペプチド構造解析装置であって、
a)被検試料中の目的ペプチドに由来するプリカーサイオンをｎ−１段階に開裂させることにより取得されたＭＳnスペクトルに基づいて、修飾物が付加した状態のプロダクトイオンと該修飾物が脱離したプロダクトイオンとのイオン対を複数検出するイオン対検出部と、
b)前記イオン対検出部により検出された複数のイオン対のそれぞれについて、修飾物が付加した状態のプロダクトイオンと修飾物が脱離したプロダクトイオンとのいずれか一方を選択し他方を削除するとともに、削除された方のイオンの強度情報を選択された方のイオンの強度情報に反映させるように強度情報を修正した上で、又は、選択された方のイオンの強度情報をそのまま残して、選択されたプロダクトイオンのピーク情報を集めたピークリストを作成するピークリスト作成部と、
c)前記イオン対検出部におけるイオン対検出時に用いられた修飾情報を検索条件の一つとして、又は修飾がないことを検索条件の一つとして、前記ピークリスト作成部により作成されたピークリストをデータベースに登録されているペプチドと照合するデータベース検索を実行するデータベース検索部と、
d)前記データベース検索部で得られた検索結果に基づいて、目的ペプチドのアミノ酸配列に関する情報を出力する結果提供部と、
を備えることを特徴としている。
【００１１】
本発明に係るペプチド構造解析方法及び装置に使用される質量分析装置では、イオン源として例えばＭＡＬＤＩイオン源やＥＳＩ（エレクトロスプレイイオン化）イオン源を用いることができる。また、該質量分析装置においてイオンを解離させてプロダクトイオンを生成するイオン解離部は、プロダクトイオンに付加されている修飾物があまり脱落しないような解離手法、例えば低エネルギー衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いたものであることが好ましい。何故なら、ＭＳn分析に際してのイオン解離操作において修飾物が脱離したプロダクトイオンしか生成されない、或いは生成されるプロダクトイオンの大部分が修飾物が脱離したプロダクトイオンであるような状況であると、データベース検索を実行したときにペプチドは同定できるものの修飾部位を同定することが困難であるからである。換言すれば、翻訳後修飾を受けたペプチドの修飾部位を同定するには、少なくとも一部のプロダクトイオンで修飾物が残るようにすることが必要である。
【００１２】
構造が未知である翻訳後修飾を受けたペプチドを解析しようとする場合には、その修飾物が既知である場合と、修飾物も未知である場合とが考えられる。前者である場合には、ＭＳnスペクトルに基づくイオン対の検出は比較的容易である。即ち、目的ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとして実施されたＭＳn分析により得られたＭＳnスペクトルには、そのペプチドが様々な態様で開裂して生成したプロダクトイオンによるピークが現れる。元のペプチドが翻訳後修飾を受けたものである場合、通常、その修飾物が付加したままのプロダクトイオンと該修飾物が脱離したプロダクトイオンとが現れるから、イオン対検出ステップではＭＳnスペクトル上で既知修飾物の質量差だけ離れた２本のイオンピークを探索することにより、イオン対を見つけることができる。ペプチドの開裂の態様によって、ｙ系列、ｂ系列といった様々なプロダクトイオンが現れるから、それぞれのプロダクトイオン毎にイオン対を探索する。
【００１３】
一方、修飾物が未知（ただし、多くの場合、多数の想定される修飾物のうちの一つであることは既知）である場合には、ＭＳnスペクトルから直接的にイオン対を検出することは難しい。そこで本発明に係るペプチド構造解析方法の一態様として、被検試料をＭＳn-1分析して得られたＭＳn-1スペクトルにおいて、目的ペプチド由来であって修飾物が付加されたイオンのピークと修飾物が脱離したイオンのピークとを抽出し、それらピークに対応したイオンをそれぞれプリカーサイオンとして被検試料に対するＭＳn分析を行ってＭＳnスペクトルを取得する分析実行ステップ、をさらに有し、上記イオン対検出ステップでは、二つのＭＳnスペクトルを比較することにより上記イオン対を検出するようにすることが好ましい。ここでは典型的にはｎは２、つまりＭＳ1スペクトル上で目的ペプチド由来の修飾物付加イオンピークと修飾物脱離イオンピークとを抽出し、それら二つのイオンをそれぞれプリカーサイオンとしたＭＳ2スペクトルを取得して、それらを比較することでイオン対を検出するとよい。
【００１４】
ＭＡＬＤＩイオン源を用いたＭＡＬＤＩ質量分析では、イオン化の過程などにおいてリン酸基や硫酸基などの修飾物が比較的容易に脱離する。そのため、例えばリン酸化糖鎖ペプチドをＭＡＬＤＩ質量分析して得られたＭＳ1スペクトルでは、リン酸化糖鎖ペプチドによるイオンのピークとリン酸基が脱離したニュートラルロスによる糖鎖ペプチドのピークとが現れる。ＭＳ1スペクトルは比較的単純であり、様々な修飾物の質量に相当する二つのピークが存在するか否かを調べることは比較的簡単である。そこで、こうして見つけたイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ2分析を行えばよい。これにより、修飾物が未知であってもイオン対の検出が容易になるとともに、その検出誤りを少なくして最終的なペプチドの同定精度を上げることができる。
【００１５】
イオン対検出ステップに引き続くピークリスト作成ステップでは、検出されたイオン対毎に、修飾物の付加されたもの又は脱離したもののいずれか一方を選択し他方を削除する。例えば、イオン対の一方の選択方法としては、例えば、全てのイオン対について質量電荷比が大きい方の（修飾物が付加した）イオンの強度の総和と質量電荷比が小さい方の（修飾物が脱離した）イオンの強度の総和とを比較し、いずれか値が大きい方のイオンを各イオン対で選択する方法が考えられる。また、全てのイオン対ではなく、強度が大きい順に所定個数のイオン対で同様の処理を行うことも考えられる。また、これに限らず様々な選択方法を採り得る。
【００１６】
また、その際に、例えば削除されるイオンの強度が選択されたイオンの強度に比べて格段に低ければ、選択されたイオンの強度情報をそのまま利用するようにしてもよいが、例えば両イオンの強度がほぼ同程度であるような場合には、削除されるプロダクトイオンの強度も考慮するべく、例えば削除されるプロダクトイオンの強度を対となる選択されたプロダクトイオンの強度に加算するようにする。これにより、例えば対となるプロダクトイオンの強度がほぼ同等である場合には、残されるプロダクトイオンのピーク強度は約２倍になる。また、この強度を２で除す、つまり対をなす両イオンの強度の平均を用いてもよいし、或いは、対をなす両イオンのうちの強度の大きい方を採用する（選択されたイオンは強度が小さい方であることもあり得る）ようにしてもよい。
こうしてイオン対毎にイオンの選択と必要に応じて強度の修正を行ったならば、その質量電荷比情報と強度情報とからなるピークリストを作成する。
【００１７】
データベース検索ステップでは、上記のようにして作成されたピークリストについて、設定された検索条件に則ったデータベース検索を実施し、データベースに登録されているペプチドとの照合を行う。ピークリスト作成ステップにおいて各イオン対について質量電荷比が大きい方のプロダクトイオンを選択した場合には、それらプロダクトイオンは修飾を受けているものであるから、イオン対検出時に用いられた修飾情報を検索条件の一つとして設定すればよい。一方、ピークリスト作成ステップにおいて各イオン対について質量電荷比が小さい方のプロダクトイオンを選択した場合には、それらプロダクトイオンは修飾物が脱離したものであるから、修飾がないことを検索条件の一つとするか、又は修飾を特に設定せずに検索を実行すればよい。ただし、後者の場合には、ペプチドは同定できるものの修飾部位を同定することはできない。
【００１８】
そしてデータベース検索によって、ピークリスト中の質量電荷比と既知のペプチド断片との一致度が高いものをリストアップし、これを目的ペプチドのアミノ酸配列に関する情報として表示画面上に出力する。また、データベース検索によってペプチドのアミノ酸配列とともに修飾部位が求まる場合には、これも表示画面上に出力する。
なお、データベース検索の手法自体は既存のものを利用することができ、例えば、上述した英国マトリックス・サイエンス社が提供するMascotに含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチ法やX! Tandemにおける同様の機能を利用することができるが、これに限るものではない。
【００１９】
上記のように作成されたピークリストは、少なくとも基幹断片構造が同じであるプロダクトイオンについて、修飾物が付加したイオンピークと同修飾物が脱離したイオンピークとが混在することはなく、プロダクトイオンピークの質量電荷比情報は整理されたものとなる。一方、残されたピークの強度には削除されたピークの強度情報も反映されるため、ニュートラルロスによりピーク強度が下がる影響も軽減される。このように整理されたピークリストに基づいてデータベース検索が実行されるため、従来のデータベース検索法を利用しても、高い信頼度を以て目的ペプチドのアミノ酸配列と修飾部位とを同定することが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るペプチド構造解析方法及び装置によれば、例えばＭＳ／ＭＳイオンサーチなどの従来のデータベース検索を利用しながら、従来は困難であった、翻訳後修飾されたペプチドのアミノ酸配列の同定を高い信頼性を以て行うことができるようになる。また、イオンの解離操作によって修飾物の全て又は大部分が脱離してしまうような特殊な状況を除けば、従来のデータベース検索を利用しながら、ペプチドの中の修飾部位も高い信頼性を以て同定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係るペプチド構造解析方法を実施するペプチド構造解析システムの一実施例の全体構成図。
【図２】本実施例のペプチド構造解析システムにおいて実施される翻訳後修飾解析の処理手順を示すフローチャート。
【図３】図２に示した翻訳後修飾解析を説明するための模式図。
【図４】通常のＭＳ／ＭＳイオンサーチの検索結果の一例を示す図。
【図５】修飾を受けたヒトトランスフェリンの構造（ａ）と該トランスフェリン由来のＨｅｘＮＡｃ付加ペプチドイオンをプリカーサとするＭＳ2スペクトル及びプロダクトイオンの帰属結果を示す図（ｂ）。
【図６】図５（ｂ）に示したＭＳ2スペクトルから生成したピークリストに対し通常のデータベース検索を行った結果の一例を示す図。
【図７】図５（ｂ）に示したＭＳ2スペクトルから生成したピークリストに対し本発明による特徴的なデータ処理を含むデータベース検索を行った結果の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明に係るペプチド構造解析方法を実施するペプチド構造解析システムの一実施例について、添付の図面を参照して説明する。
図１は本実施例のペプチド構造解析システムの全体構成図、図２は本システムにおけるペプチド構造解析（翻訳修飾解析）の処理手順を示すフローチャート、図３は図２に示した翻訳後修飾解析を説明するための模式図である。
【００２３】
図１に示すように、本実施例のペプチド構造解析システムは大別して、質量分析部１と、コンピュータを中心に構成される制御・処理部２と、から成る。質量分析部１はマトリクス支援レーザ脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ）であり、被検試料中の分子や原子をイオン化するＭＡＬＤＩ法によるイオン化部１０と、発生したイオンを一時的に捕捉し、質量電荷比に応じたイオンの選別と衝突誘起解離（ＣＩＤ）によるイオンの解離操作とを実行可能な３次元四重極型のイオントラップ１１と、そのイオントラップ１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離して検出する飛行時間型質量分析器（ＴＯＦＭＳ）１２と、を備える。飛行時間型質量分析器１２は、リフレクトロン電極により発生する電場によりイオンを折返し飛行させる飛行空間１３と、該飛行空間１３を飛行する間に質量電荷比に応じて時間的に分離されたイオンを順次検出するイオン検出器１４と、を含む。
【００２４】
ここではイオン化部１０はＭＡＬＤＩイオン源であるが、イオン化法はこれに限るものではなく、例えばＥＳＩなどを用いてもよい。また、質量分析器には飛行時間型質量分析器１２以外の、例えば四重極マスフィルタなどを用いてもよい。さらに、イオントラップ１１の代わりにコリジョンセルを用いてもよい。但し、後述の例のように、インソース分解（ＩＳＤ＝In-Source Decoy）やポストソース分解（ＰＳＤ＝Post-Source Decoy）などにより修飾物が脱離することを利用してＭＳ1スペクトル上で目的とするペプチド由来のプリカーサイオンを決定する場合には、ＩＳＤやＰＳＤが起こり易いイオン化法や質量分析器を採用する必要がある。その目的のためには、ＭＡＬＤＩ（又はそれ以外のレーザ照射を利用したイオン化法）とリフレクトロン型ＴＯＦとの組合せが好適である。
【００２５】
制御・処理部２は、質量分析部１の各部を制御する分析制御部２０、イオン検出器１４から得られる検出信号に基づいてＭＳ1スペクトル及びＭＳ2スペクトルを作成するスペクトル作成部２１、ＭＳ1スペクトルやＭＳ2スペクトルを解析して例えば特定のピークを抽出して該ピークに関連したピークリストを作成する等のデータ処理を実行するスペクトル解析部２２、ペプチドのアミノ酸配列及び修飾部位を推定するための同定用情報が予め登録された同定用データベース（ＤＢ）２４、その同定用データベース２４を用いてピークリストに一致する可能性の高いペプチドの検索を行うデータベース（ＤＢ）検索部２３、などを機能ブロックとして含む。
【００２６】
制御・処理部２の実体はパーソナルコンピュータ（又はさらに高機能なワークステーションなど）であって、該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアが動作することにより、前述の各種機能が達成される。入力部２８はユーザが検索条件を入力設定したりスペクトル解析のために必要な各種操作を行ったりするためのものであり、具体的には、パーソナルコンピュータに接続されるキーボードや、マウス等のポインティングデバイスである。また、表示部２９は検索条件入力設定画面を表示したり同定結果を表示したりするためのものである。
【００２７】
次に、本実施例のペプチド構造解析システムにおいて翻訳後修飾を受けたペプチドを同定するための特徴的なデータ処理方法の一例について、図２及び図３により説明する。ここでは、リン酸基など比較的脱離し易い修飾物が付加された翻訳後修飾ペプチドを想定している。リン酸化修飾ペプチドなどはプロトン付加イオンとしてはかなり不安定であり、ＭＳ1スペクトル上では質量分析部１におけるイオン化及び質量分離の過程で修飾物が脱離した特定の質量電荷比にニュートラルロスによるイオンピークが観測され易い。この例では、それを利用してＭＳ2スペクトルにおけるイオン対の検出を容易に行っている。
【００２８】
分析者は目的とするタンパク質を適宜の酵素（例えばトリプシン酵素）により消化し、翻訳後修飾ペプチドを含む被検試料を調製する。分析制御部２０の制御の下に、質量分析部１により上記被検試料に対するＭＳ1分析が実行されると、スペクトル作成部２１ではＭＳ1スペクトルが作成される（ステップＳ１）。上述したように、リン酸基等の修飾物はＩＳＤ、ＰＳＤにより比較的脱離し易いため、該修飾物が脱離した目的ペプチド由来のイオンピークと該修飾物が脱離していない（修飾を受けた状態のままの）目的ペプチド由来のイオンピークとがＭＳ1スペクトル上に現れる。そこでスペクトル解析部２２は、作成されたＭＳ1スペクトルにおいて目的ペプチドについての上記二つのイオンピークを見つけ、この二つのピークに対応するイオンをそれぞれプリカーサイオンとして選定する（ステップＳ２）。
【００２９】
翻訳後修飾ペプチドにおける修飾物には様々なものが知られているが、各修飾物の脱離により生じる質量電荷比差Δは既知である。そこで、図３（ａ）に示すように、ＭＳ1スペクトル上で、様々な修飾物に対応した質量電荷比差Δを持つ２本のピークＰ1、Ｐ2を所定の許容誤差の範囲で探索し、該当する質量電荷比差Δを持つピークＰ1、Ｐ2を抽出してプリカーサイオンを決定すればよい。もちろん、他の知見や情報に基づいて探索すべき飾物の種類を限定することができれば、それだけ２本のピークＰ1、Ｐ2の探索は容易になる。なお、既知の修飾物の中に該当する質量電荷比差Δを示すような物質がない場合には、全く未知の修飾物であるか、或いは、修飾物が脱離していない等の状況が考えられるから、同定不可と判断する等、適宜の対応をとる必要がある。
【００３０】
二つのプリカーサイオンが見出されたならば、次に、分析制御部２０の制御の下に、質量分析部１は、同じ被検試料に対し、ステップＳ２で選択された質量電荷比が相違する２種のプリカーサイオンの質量電荷比を設定したＭＳ2分析をそれぞれ実行する（ステップＳ３）。
即ち、イオン化部１０において被検試料から生成された各種イオンは一旦イオントラップ１１に捕捉され、イオントラップ１１において、指定された質量電荷比を持つイオンのみが選別された後にＣＩＤによる１回の解離操作がなされる。それによってプリカーサイオンが開裂して生成された各種プロダクトイオンがイオントラップ１１から一斉に出射されて、飛行時間型質量分析器１２により質量分析される。この質量分析に応じて得られた検出信号に基づいて、スペクトル作成部２１ではＭＳ2スペクトルが作成される。即ち、プリカーサイオンが相違する二つのＭＳ2スペクトルが作成される。
【００３１】
続いてスペクトル解析部２２は  上記二つのＭＳ2スペクトルを比較することにより、ステップＳ２で見出された修飾物が脱離したニュートラルロスを探索し、修飾物が脱離したプロダクトイオンと修飾物が付加したままであるプロダクトイオンとのイオン対を抽出する（ステップＳ４）。或る一つのイオン対を構成する二つのプロダクトイオンの相違は修飾物の有無だけであり、修飾物以外の断片の基幹構造は同じである。
【００３２】
具体的には、図３（ｂ）に示すように、修飾物が脱離したペプチドイオン（ピークＰ2に対応）をプリカーサイオンとしたＭＳ2スペクトル上に現れるプロダクトイオンピークは全て修飾物が脱離したものである。これに対し、修飾を受けているペプチドイオン（ピークＰ1に対応）をプリカーサイオンとしたＭＳ2スペクトル上に現れるプロダクトイオンピークには修飾物が脱離したものと修飾物が付加したものとが混在する。そこで、その二つのＭＳ2スペクトルに共通に現れるピークの位置を基準とし、修飾を受けているペプチドイオンをプリカーサイオンとしたＭＳ2スペクトルにのみ現れるピークについて質量電荷比差Δを持つニュートラルロスを探索することにより、図３（ｃ）に示すように、比較的容易にイオン対を見つけることができる。ペプチドの開裂の態様は様々であり、通常、目的ペプチドからは断片の基幹構造が相違する多くのプロダクトイオンが生成されるから、数多くのイオン対が見出される。もちろん、偶然に質量電荷比差が一致するノイズピークをイオン対として誤って検出する場合や、基幹構造が同一でない二つのイオンをイオン対として誤って検出する場合もあり得る。
【００３３】
続いてスペクトル解析部２２は、抽出されたイオン対のそれぞれについて、イオンピークＰ1をプリカーサイオンとしたＭＳ2スペクトル上に現れる二つのイオンピークのうちの一方を選択し、他方を削除する処理を実施する（ステップＳ５）。つまり、イオン対毎に一つのイオンピークのみを残すようにピークを整理する。イオン対毎のイオンの選択及び削除の基準としては、例えば両イオンピークの信号強度を比較し、信号強度の大きい方のイオンピークを選択し、他方を削除するという方法が考えられる。また、信号強度とは無関係に、質量電荷比が大きい方（つまり修飾物が付加されている方）又は逆に質量電荷比が小さい方を選択し、他方を削除するという方法も考えられる。いずれの方法が後述の処理によりペプチドを同定する際に有利であるのか、つまり同定精度が高くなるのかは、目的ペプチドの種類や分析条件（例えば解離操作の際の解離エネルギーなど）に依存する。
【００３４】
またここでは、イオン対毎に一方のイオンを単に削除するのではなく、図３（ｄ）に示すように、その削除されるイオンピークの信号強度を、残されるイオンピークの信号強度に加算するように強度を修正する。ただし、それ以外に、残されるイオンピークの信号強度として、イオン対の二つのイオンピークの強度の平均を用いる、元の信号強度をそのまま用いる、二つのイオンピークの強度の大きい方の値を採用する、といった方法も考えられる。
【００３５】
また、例えばノイズピークが比較的多いような状況下では偽のイオン対が多く存在するため、検出された全てのイオン対についてイオンの選択及び削除を実行するのは徒に処理時間を延ばすのみならず、同定精度の低下にも繋がる。そこで、例えばイオン対に含まれる一方のイオンの信号強度が大きい順など、所定の基準に従ってイオン対検出対象のイオンピークの数を例えば１０、２０などと絞り込む。具体的には例えば、予め残すと決めておいた方のイオンピークの信号強度がマススペクトル中の全ピークの強度順位上位Ｎ点（このＮが例えば１０、２０など）に収まっているもののみをイオン対として検出する。そうして、その絞り込んだイオンピークを一方に持つイオン対についてのみ、上述したような一方のイオンの選択及び他方のイオンの削除と必要に応じた強度の修正とを実施することが望ましい。
【００３６】
以上のようにしてイオン対毎に一方が、即ち、修飾が脱離したプロダクトイオン又は修飾を受けているプロダクトイオンのいずれかが選択され、且つ必要に応じて強度の修正がなされたならば、選択されたプロダクトイオンの質量電荷比と信号強度とを情報としたピークリストを新たに作成する。
【００３７】
次に、データベース検索部２３は、ステップＳ５で作成されたピークリストとステップＳ２、Ｓ４でピーク検出に利用されたニュートラルロスに対応した修飾条件とに基づき、後述する同定のためのデータベース検索の検索条件を設定する（ステップＳ６）。例えば、ピークリストが修飾物が付加したプロダクトイオンについての情報を含む場合（つまりは、全てのプロダクトイオンが修飾物が脱離したイオンというわけではない場合）であって、ニュートラルロスの質量電荷比差Δが８０Daであればリン酸修飾であることが分かるから、これが検索条件として設定すべき修飾条件である。ピークリストが修飾物が脱離したプロダクトイオンのみの情報を含む場合には、検索条件として修飾条件を設定する必要はないから、修飾なしとすればよい。なお、ここでは、データベース検索として上述したMascotのＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いることを前提としているが、データベース検索法はこれに限るものではなく、周知の他の方法を用いてもよい。
【００３８】
データベース検索部２３はステップＳ６において設定された検索条件に従って、ピークリスト中のイオンピークの情報と、同定用データベース２４に登録されているペプチドのアミノ酸配列のピークパターンとの照合によるデータベース検索を実行する（ステップＳ７）。その検索では、既知のペプチド断片とのピークパターンの一致度を示す指標（スコア）が計算されるから、そのスコアが高く、且つ、指定した修飾を受けている又は受けていないものを、候補として例えばスコア順にリストアップする（ステップＳ８）。そして、そのリストを表示部２９の画面に表示して分析者に提示する（ステップＳ９）。
【００３９】
上述したように、本実施例のペプチド構造解析システムにおける解析処理では、データベース検索に供されるピークリストにおいて、少なくとも同一種の、つまりは断片の基幹構造が同一であるプロダクトイオンについては修飾物が脱離したものと修飾を受けたままのものとが混在していない。したがって、データベース検索の際にペプチド同定スコアが従来よりも高くなる。また、修飾条件を設定してデータベース検索を実行した場合には、従来よりも高い信頼性で以て修飾部位を同定することができる。
【００４０】
例示したリン酸化修飾ペプチドだけでなく、ＩＳＤやＰＳＤで脱離し易い修飾物が付加されたペプチドの場合には、図２、図３に沿った上記説明と同様の手順で解析を行うことができる。ただし、こうした翻訳後修飾ペプチドでは、ＭＳ2分析を実行する際に修飾物の殆どが脱離してしまってＭＳ2スペクトル上でイオン対を見つけるのが難しくなる場合がある。また、実質的に修飾物が脱離したイオンのみを含むイオン対しか検出されないと、ペプチドの同定には支障ないものの、修飾物が付加する位置（修飾部位）の同定は行えなくなる。これを避けるには、修飾物が付加したプロダクトイオンが生成されるように、イオントラップ１１におけるＣＩＤ時のエネルギーを低くする等の分析上の制御を行うとよい。
【００４１】
一方、目的ペプチドにおける翻訳後修飾が既知である場合、つまり修飾物が既知であって、その質量も既知である場合には、図２に示したフローチャート中のステップＳ１〜Ｓ４の処理を行う代わりに、被検試料に対して取得したＭＳ1スペクトル上で目的ペプチド由来の修飾物が付加したイオンを見つけ、該イオンをプリカーサイオンとするＭＳ2分析を実行し、取得したＭＳ2スペクトル上で既知の質量のニュートラルロスを探索することでイオン対を見つけるようにするとよい。即ち、二つのＭＳ2スペクトルを比較してイオン対を見出すという作業を簡略化することができる。
【００４２】
また、上記実施例では、ＭＳ2スペクトルに基づいて作成したピークリストをデータベース検索に供していたが、さらに解離操作の段数を増やしたｎが３以上であるＭＳnスペクトルに基づいて作成したピークリストをデータベース検索に供するようにしてもよい。
【００４３】
次に、上述した特徴的な翻訳後修飾ペプチド構造解析を行った実測例について説明する。
図５（ｂ）は、図５（ａ）に示した構造を有する、糖鎖断片であるＨｅｘＮＡｃ１個による修飾を受けたヒトトランスフェリン由来のペプチドイオンをプリカーサイオンとするＭＳ2スペクトル及びプロダクトイオンの帰属結果である。ＨｅｘＮＡｃ付加ペプチドの解離によってｙ／ｂ系列イオンが生じているが、それに加えてＨｅｘＮＡｃの脱離により生じたプロダクトイオン列（図５（ｂ）中にｙx-■及びｂx-■で示した複数のイオン）もｙ／ｂ系列イオンと同等のイオン強度で生じている。このＭＳ2スペクトルに対しピークピッキングを実行して作成したピークリストに対し、MascotのＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いてデータベース検索した結果を図６に示す。即ち、図６は従来手法によるデータベース検索結果である。
【００４４】
この結果によれば、正しいペプチド［ＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＮＫ］（下線を引いたアスパラギン残基（Ｎ）がＨｅｘＮＡｃによる修飾を受けている）が１位候補としてヒットしているものの、その信頼度は相同性が認められる程度にとどまり、十分に高い信頼度で同定するには至っていない。これは、ＭＳ／ＭＳイオンサーチでは、ＨｅｘＮＡｃの脱離によって生じたプロダクトイオン列がペプチド同定性能の低下を引き起こすためであると考えられる。
【００４５】
そこで上述したような手順で以て既知修飾物の脱離を探索し、翻訳後修飾を受けたままのプロダクトイオンと修飾物が脱離したプロダクトイオンとのイオン対を検出した。そして、検出したイオン対毎に、一方のプロダクトイオンを削除し、且つ、残した方のプロダクトイオンの信号強度に削除した方のプロダクトイオンの信号強度を加えることで強度を修正し、新たなピークリストを作成した。このピークリストを用いてデータベース検索を行うことで、ペプチド同定スコアを高められることを確認した。
【００４６】
具体的には、図５（ｂ）に示したＭＳ2スペクトルに対しピークピッキングを行って作成されたピークリストの中で、ピーク強度順位上位２０位までのイオンピークを対象として、既知である修飾物ＨｅｘＮＡｃの分子量に相当する２０３Daの間隔を以て対をなすイオン対を、０．２Daの質量許容誤差の範囲で探索した。そして、検出された各イオン対についてそれぞれ、質量電荷比が小さい方のプロダクトイオンを削除する一方、質量電荷比が大きい方のプロダクトイオンを残し、その削除したイオンの信号強度を残したイオンの信号強度に加算することで信号強度を増加させ、新たなピークリストを作成した。
【００４７】
このような、新たなピークリスト及びプリカーサイオンの質量電荷比を求める前処理を実施した後に、該ピークリストに対して従来通りのMascotのＭＳ／ＭＳイオンサーチによるデータベース検索を行い、図７に示すような検索結果が得られた。なお、検索条件には既知修飾物ＨｅｘＮＡｃを指定した。
【００４８】
図７によれば、正しいペプチド［ＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＮＫ］が１位候補としてヒットしている点は図６の結果と同じであるが、その信頼度（スコア）は図６の結果に比べて格段に上がっている。即ち、本発明による方法では従来法に比べて、十分に高い信頼度で以て正解のペプチド及び糖鎖修飾部位が同定されているといえる。
【００４９】
なお、上記の実測例では、検出されたイオン対のうち質量電荷比が小さい方のイオンを削除したが、質量電荷比が大きい方のイオンを除去した場合であっても、従来法に比べて同定の信頼度を向上させることができることが確認できた。この場合には、元のプリカーサイオンの質量電荷比から上記修飾物の分子量を差し引き、これを新たにプリカーサイオンの質量電荷比とした。また、残した質量電荷比が小さい方のイオンは修飾物が脱離したものである筈であるので、検索条件として図６の結果を求める際にバリアブル・モディフィケーションとして指定したＨｅｘＮＡｃの修飾条件設定は行わなかった。
また、検出されたイオン対のうち残す方のイオンの信号強度については、削除した方のイオンの信号強度を残す方に加算する以外に、元のイオンの信号強度をそのまま用いる、イオン対の平均信号強度を用いる、イオン対のうちの信号強度の大きい方の強度を採用する、などといった別の強度処理を実行した場合でも、従来法に比べて同定の信頼度を向上させることができることが確認できた。
【００５０】
また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００５１】
１…質量分析部
１０…イオン化部
１１…イオントラップ
１２…飛行時間型質量分析器
１３…飛行空間
１４…イオン検出器
２…制御・処理部
２０…分析制御部
２１…スペクトル作成部
２２…スペクトル解析部
２３…データベース検索部
２４…同定用データベース
２８…入力部
２９…表示部
【図１】
2014115087.tif 000003
【図２】
2014115087.tif 000004
【図３】
2014115087.tif 000005
【図４】
2014115087.tif 000006
【図５】
2014115087.tif 000007
【図６】
2014115087.tif 000008
【図７】
2014115087.tif 000009