(57)【要約】【課題】口腔常在菌に影響を及ぼさない、新たなう蝕予防剤の提供を課題とする。【解決手段】納豆、納豆分離菌、または納豆分離菌培養濾液のいずれか一種以上を有効成分とするバイオフィルムの形成抑制剤により、口腔常在菌に影響を及ぼさない、新たなう蝕予防剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆、納豆分離菌、及び納豆分離菌培養濾液からなる群から選ばれるいずれかひとつ以上を有効成分として含むバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項２】
納豆分離菌培養濾液に含まれる１０ｋＤａ未満の低分子画分を有効成分とする請求項１に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項３】
う蝕原性菌によるバイオフィルムの形成を抑制する請求項１または２に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項４】
う蝕原性菌がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓである請求項３に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルム形成抑制剤に関する。さらに詳しくは、納豆、納豆分離菌または納豆分離菌培養液を有効成分とするバイオフィルム形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕（虫歯）はう蝕原性菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（以下、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓと示す場合がある）やＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ（以下、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓと示す場合がある）が歯の表面に付着・増殖し、う蝕誘発性のバイオフィルムを形成することによって引き起こされる。
近年、高齢者等において誤嚥性肺炎等のう蝕を起因とする疾病が増加しており、う蝕の予防において有用な剤の提供が望まれている。
【０００３】
う蝕予防剤として、従来、う蝕原性菌に対する殺菌剤や抗菌剤等が使用されてきた。しかし、これらの殺菌剤や抗菌剤は、日和見菌感染症等に対し免疫機能を示す、有用な口腔常在菌にも作用してしまうという問題があった。そこで、口腔常在菌に影響を及ぼさない、新たなう蝕予防剤の提供が望まれている。
【０００４】
う蝕原性菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓに特異的に作用するものとして、例えば、特許文献１では、ササゲ、小豆、紫花豆、白花豆、クロインゲンマメ、キントキマメ等の豆類を粉砕し、水、親水性の有機溶媒等で抽出した豆類の抽出物が、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのクオラムセンシング（細菌密度依存的遺伝子発現制御系）を制御する物質として挙げられており、Ｓ．ｍｕｔａｎｓによるバイオフィルム形成を抑制することが開示されている。
特許文献２では、ヒト口腔内及び漬物から単離した乳酸菌の菌株を、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの生育やバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物や口腔内バイオフィルム形成抑制剤等とすることが開示されている。
【０００５】
また、特許文献３では、ナットウキナーゼに、ミュータンス菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）だけでなく、複数の口腔内病原菌種を含むバイオフィルムを除去し、口臭を改善する効果があること、このナットウキナーゼを含むナットウエキスと、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を必須の成分としてなる口腔用組成物は歯石除去効果および口臭改善効果が高いこと等が開示されている。
なお、特許文献４おいても豆類に納豆菌にて発酵させてできた納豆の粘質およびその成分がＳ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス菌）の増殖、酸産生、産生した酸による歯の侵食、歯石形成能等を抑制することが記載されているが、この文献では、これらの具体的な効果は開示されていない。
【０００６】
これらの文献に示されるように、様々な成分がう蝕原性菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓに特異的に作用するものとして開示されているが、より安全かつ効果的にう蝕の予防が可能な剤の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−６７０１８号公報
【特許文献２】特開２００７−１１７０６４号公報
【特許文献３】特開２０１１−１２６８１９号公報
【特許文献４】特開２０１０−１２４７７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
口腔常在菌に影響を及ぼさない、新たなう蝕予防剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、納豆、納豆分離菌、または納豆分離菌培養濾液を作用させることで、う蝕原性菌によるバイオフィルムの形成を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。これにより、安全かつ効果的にう蝕、う蝕を起因とする疾病等の予防、治療が可能となる。
【００１０】
すなわち、本発明は次の（１）〜（４）のバイオフィルム形成抑制剤等に関する。
（１）納豆、納豆分離菌、及び納豆分離菌培養濾液からなる群から選ばれるいずれかひとつ以上を有効成分として含むバイオフィルム形成抑制剤。
（２）納豆分離菌培養濾液に含まれる１０ｋＤａ未満の低分子画分を有効成分とする上記（１）に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
（３）う蝕原性菌によるバイオフィルムの形成を抑制する上記（１）または（２）に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
（４）う蝕原性菌がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓである上記（３）に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ等のう蝕原性菌に特異的に作用するバイオフィルム形成抑制剤を提供することにより、う蝕、う蝕を起因とする疾病等の予防、治療が可能となる。本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、有効成分が食品を由来とするものであるため安全性が高く、安価に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】バイオフィルム形成抑制剤（納豆Ａ〜Ｅ）によるバイオフィルム形成抑制効果を示した図である（試験例１）。
【図２】バイオフィルム形成抑制剤（納豆分離菌ａ〜ｅ）によるバイオフィルム形成抑制効果を示した図である（試験例１）。
【図３】バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅ）によるバイオフィルム形成抑制効果を示した図である（試験例１）。
【図４】バイオフィルム形成抑制剤（低分子画分ｅ）によるバイオフィルム形成抑制効果を示した図である（試験例１）。
【図５】バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅ）によるう蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生育抑制効果を示した図である（試験例２）。
【図６】ナットウキナーゼによるバイオフィルムの形成抑制効果を示した図である（試験例３）。
【図７】ナットウキナーゼによるう蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生育抑制効果を示した図である（試験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の「バイオフィルム形成抑制剤」とは、う蝕原性菌によって形成される、う蝕誘発性のバイオフィルムの形成を抑制する剤のことをいう。
ここで、う蝕原性菌にはＳ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ等が挙げられる。本発明の「バイオフィルム形成抑制剤」は、これらのう蝕原性菌や、う蝕原性菌を含む口腔内の細菌叢によるバイオフィルムの形成を抑制する剤であればよい。
本発明の「バイオフィルム形成抑制剤」は、このバイオフィルムの形成を抑制する剤であれば良いが、バイオフィルムの形成を抑制する効果とともにう蝕原性菌の成育を抑制する効果を有する剤であってもよい。
【００１４】
本発明の「バイオフィルム形成抑制剤」は、納豆、納豆分離菌、納豆分離菌培養濾液から選ばれるいずれかひとつ以上を有効成分とする剤であればよく、これらの有効成分を二つ以上組み合わせて含む剤であってもよい。また、納豆分離菌培養濾液に含まれる１０ｋＤａ未満の低分子画分を有効成分とする剤であってもよい。さらに、これらの有効成分以外に、ヒト等の動物が安全に摂取できるその他の成分、薬学的に許容される担体等を含むものであってもよい。
【００１５】
このような本発明の「バイオフィルム形成抑制剤」は、そのまま食品、薬品等とすることもでき、食品、薬品等の有効成分とすることもできる。また、液状、粉状、ペースト状、液体、固体等、様々な形態で利用することができる。例えば歯磨剤、洗口剤、タブレット、口中清涼剤、チューインガム、飴等に調製することができ、歯磨剤とする場合も練歯磨剤、液状歯磨剤、粉歯磨剤等の様々な形態のものとできる。
【００１６】
以下、実施例、試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
バイオフィルム形成抑制剤の調製
１．納豆
市販の５種類（３社）の納豆Ａ〜Ｅをそれぞれ滅菌蒸留水に１０ｗ／ｖ％となるように加え、ブレンダー（Ｗａｒｉｎｇ社  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｂｌｅｎｄｏｒ（Ｍｏｄｅｌ  ３１ＢＬ９２））にて１０分間撹拌し、それぞれバイオフィルム形成抑制剤とした。
【００１８】
２．納豆分離菌
上記１．にて調製したバイオフィルム形成抑制剤（５種類）を滅菌蒸留水で適宜段階希釈し、ＢＨＩ寒天培地（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ培地，ＢＤ社）へ塗布した。３７℃、好気条件で２日間培養した後、生育したコロニーを釣菌し、ＢＨＩ液体培地（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ培地，ＢＤ社）へ懸濁し、同条件で２日間培養した。その後、同様にＢＨＩ寒天培地へ塗布し、培養し、生育したコロニーを釣菌し、ＢＨＩ液体培地で培養するという工程を２回繰り返して純化し、ＢＨＩ液体培地に含まれた状態の各納豆分離菌（生菌）を、由来とする納豆の種類（納豆Ａ〜Ｅ）に合わせて納豆分離菌ａ〜ｅとし、それぞれバイオフィルム形成抑制剤とした。
【００１９】
３．培養濾液
上記２．にて調製した納豆分離菌ａ〜ｅを、ＢＨＩ液体培地（ＢＲＡＩＮ  ＨＥＡＲＴ  ＩＮＦＵＳＩＯＮ培地，ＢＤ社）へ懸濁し、さらに３７℃、５％ＣＯ2で１晩培養した後、遠心分離（６，０００ＲＰＭ，１５ＭＩＮ）し、上清部分を滅菌フィルター（ポアサイズ０．２ＭＭ）処理して菌体を完全に除去した。これを由来とする納豆の種類（納豆Ａ〜Ｅ）に合わせ培養濾液ａ〜ｅとし、それぞれバイオフィルム形成抑制剤とした。
【００２０】
４．低分子画分
上記３．にて調製した培養濾液ａ〜ｅ各１２ｍｌを、それぞれ限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ−１５  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  １０，０００ＮＭＷＬ，ミリポア社）に供し、遠心分離を行った。限外濾過後の１０ｋＤａ未満の各画分を滅菌水にて１２ｍｌにメスアップしたものをそれぞれ低分子画分ａ〜ｅとし、バイオフィルム形成抑制剤とした。
なお、限外濾過後の１０ｋＤａ以上の各画分も滅菌水にて１２ｍｌにメスアップし、下記試験例における試料とした。
【００２１】
［試験例１］
バイオフィルム形成抑制剤の効果の検討
上記実施例と同様に調製した各バイオフィルム形成抑制剤（納豆Ａ〜Ｅ、納豆分離菌ａ〜ｅ、培濾濾液ａ〜ｅ、低分子画分ａ〜ｅ）とう蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）との共培養試験により、バイオフィルム形成抑制剤の効果を検討した。
【００２２】
１．納豆、納豆分離菌との共培養試験
上記実施例と同様に調製した各バイオフィルム形成抑制剤（納豆Ａ〜Ｅまたは納豆分離菌ａ〜ｅのいずれか一種）とう蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）との共培養試験により、う蝕原性菌によるバイオフィルムの形成の有無を検討した。
実施例の１．、実施例の２．と同様の方法によって調製した各バイオフィルム形成抑制剤（納豆Ａ〜Ｅまたは納豆分離菌ａ〜ｅのいずれか一種）を使用した。また、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養液としてＢＨＩ液体培地、３７℃、好気条件にて１晩培養した後の定常期細胞を含む、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養液を使用した。
う蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）は、ＢＨＩ液体培地（ＢＲＡＩＮ  ＨＥＡＲＴ  ＩＮＦＵＳＩＯＮ培地，ＢＤ社）にて５％ＣＯ2、３７℃で１晩培養した後の定常期細胞を含む、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ培養液を使用した。
共培養のための培地には、２倍量のＴｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ培地（ＢＤ社）にｇｌｕｃｏｓｅを０．５％添加したものを使用した。
共培養のための培地１６０μＬ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ培養液２０μＬと、バイオフィルム形成抑制剤（納豆Ａ〜Ｅまたは納豆分離菌ａ〜ｅのいずれか一種）２０μＬを混合し、９６ウェルプレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で２０時間共培養した。
なお、バイオフィルム形成抑制剤の代わりにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養液、または滅菌蒸留水を使用したものをＣｏｎｔｒｏｌとした。
これを蒸留水１５０μＬで２回洗浄し、サフラニン５０μＬで１０分染色した。その後、蒸留水１５０μＬでさらに２回洗浄し、７０％ＥｔＯＨで色素抽出を行った後、プレートリーダーで吸光度（４９２ｎｍ）を測定し、吸光度値によりバイオフィルム量を評価した。
【００２３】
図１にバイオフィルム形成抑制剤（納豆Ａ〜Ｅ）と共培養した場合の、バイオフィルムの形成抑制効果を示した。また、図２にバイオフィルム形成抑制剤（納豆分離菌ａ〜ｅ）と共培養した場合の、バイオフィルムの形成抑制効果を示した。
その結果、図１、図２に示されるように、いずれのバイオフィルム形成抑制剤（納豆Ａ〜Ｅ、納豆分離菌ａ〜ｅ）も、う蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）によるバイオフィルムの形成を有意に抑制することが確認できた。
【００２４】
２．培養濾液、低分子画分との共培養試験
上記実施例と同様に調製した各バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅまたは低分子画分ａ〜ｅのいずれか一種）とう蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）との共培養試験により、う蝕原性菌によるバイオフィルムの形成の有無を検討した。
実施例の３．、実施例の４．と同様の方法によって調製した各バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅまたは低分子画分ａ〜ｅのいずれか一種）を使用した。また、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養液としてＢＨＩ液体培地、３７℃、好気条件にて１晩培養した後の定常期細胞を含む、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養液を使用した。
う蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）は、ＢＨＩ液体培地（ＢＲＡＩＮ  ＨＥＡＲＴ  ＩＮＦＵＳＩＯＮ培地，ＢＤ社）にて５％ＣＯ2、３７℃で１晩培養した後の定常期細胞を含む、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ培養液を使用した。
共培養のための培地には、２倍量のＴｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ培地（ＢＤ社）にｇｌｕｃｏｓｅを０．５％添加したものを使用した。
共培養のための培地８０μＬ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ培養液２０μＬと、バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅまたは低分子画分ａ〜ｅのいずれか一種）１００μＬを混合し、９６ウェルプレートに分注した後、３７℃、５％ＣＯ2の条件で２０時間共培養した。
なお、バイオフィルム形成抑制剤の代わりにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養液、これを実施例の４．と同様の方法で限外濾過した１０ｋＤａ未満の画分、１０ｋＤａ以上の画分、または滅菌蒸留水を使用したものをＣｏｎｔｒｏｌとした。
これを蒸留水１５０μＬで２回洗浄し、サフラニン５０μＬで１０分染色した。その後、蒸留水１５０μＬでさらに２回洗浄し、７０％ＥｔＯＨで色素抽出を行った後、プレートリーダーで吸光度（４９２ｎｍ）を測定し、吸光度値によりバイオフィルム量を評価した。
【００２５】
図３にバイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅ）と共培養した場合の、バイオフィルムの形成抑制効果を示した。なお、比較として、培養濾液ａ〜ｅを９５度、１５分で加熱したものを上記２．と同様に共培養した場合の結果（図３、Ｈｅａｔ）も示した。
その結果、図３に示されるように、いずれのバイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅ）も、う蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）によるバイオフィルムの形成を有意に抑制することが確認できた。一方、培養濾液ａ〜ｅを９５度、１５分で加熱したものも、加熱しないバイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅ）と比べてバイオフィルムの形成抑制効果は低下するものの、コントロールと比べてバイオフィルムの形成抑制効果を示すことが確認できた。
【００２６】
図４にバイオフィルム形成抑制剤（低分子画分ａ〜ｅ）のうち、バイオフィルム形成抑制剤（低分子画分ｅ）と共培養した場合のバイオフィルムの形成抑制効果を示した。なお、比較としてバイオフィルム形成抑制剤である培養濾液ｅ、培養濾液ｅから分画した１０ｋＤａ以上の高分子画分を上記２．と同様に共培養した場合の結果も示した。
その結果、図４に示されるように、バイオフィルム形成抑制剤（低分子画分ｅ）は、バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ｅ）と同様にう蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）によるバイオフィルムの形成を有意に抑制することが確認できた。一方、培養濾液ｅから分画した１０ｋＤａ以上の高分子画分は、バイオフィルムの形成抑制効果を有しないことが確認できた。
なお、他のバイオフィルム形成抑制剤（低分子画分ａ〜ｄ）もバイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ｅ）と同様にう蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）によるバイオフィルムの形成を有意に抑制することが確認できた。一方、培養濾液ａ〜ｄから分画した１０ｋＤａ以上の高分子画分はいずれもバイオフィルムの形成抑制効果を有しないことが確認できた。
【００２７】
［試験例２］
バイオフィルム形成抑制剤によるう蝕原性菌生育抑制効果の検討
上記実施例と同様に調製した各バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅ）とう蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）との共培養試験により、う蝕原性菌の成育抑制効果を検討した。
実施例の３．と同様の方法によって調製した各バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ〜ｅ）を使用した。う蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）は、ＢＨＩ液体培地（ＢＲＡＩＮ  ＨＥＡＲＴ  ＩＮＦＵＳＩＯＮ培地，ＢＤ社）にて５％ＣＯ2、３７℃で１晩培養した後の定常期細胞を含む、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ培養液を使用した。共培養のための生育測定用培地には、２倍量のＴｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ培地（ＢＤ社）にｇｌｕｃｏｓｅを０．５％添加したものを使用した。
生育測定用培地８０μｌ、バイオフィルム抑制剤１００μｌ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ培養液２０μｌを混合し、９６ウェルプレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で１６時間培養した。培養後６００ｎｍでの吸光度値を測定することで生育量を評価した。バイオフィルム形成抑制剤の代わりに滅菌蒸留水を使用したものをＣｏｎｔｒｏｌとした。
【００２８】
図５に示されるように、バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ｃ）は、う蝕原性菌によるバイオフィルムの形成抑制に作用するのみならず、う蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生育抑制にも作用することが確認できた。
一方、バイオフィルム形成抑制剤（培養濾液ａ、ｂ、ｄ、ｅ）は、う蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の生育は抑制しないことから、う蝕原性菌の成育には作用せず、う蝕原性菌によるバイオフィルムの形成に特異的に作用する剤であることが確認できた。
【００２９】
［試験例３］
ナットウキナーゼによるう蝕原性菌に対する作用の検討
試験例１、試験例２と同様の方法により、ナットウキナーゼにおける、う蝕原生菌に対するバイオフィルム形成抑制効果、またはう蝕原生菌の生育抑制効果の有無を検討した。ナットウキナーゼはＷａｋｏ純薬工業のものを使用した。
【００３０】
図６にナットウキナーゼによるバイオフィルムの形成抑制効果を示した。
その結果、図６に示されるように、終濃度が２ｍｇ／ｍｌ、または２００μｇ／ｍｌとなるようにナットウキナーゼを添加した場合には、う蝕原性菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）によるバイオフィルムの形成を有意に抑制したが、２０μｇ／ｍｌ等の低濃度では、バイオフィルムの形成を抑制できないことが確認できた。
また、図７にナットウキナーゼによるう蝕原性菌の成育抑制効果の検討を示したが、いずれの濃度においても、う蝕原性菌の成育は抑制しないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のＳ．ｍｕｔａｎｓ等のう蝕原性菌に特異的に作用するバイオフィルム形成抑制剤を提供することにより、う蝕、う蝕を起因とする疾病等の予防、治療が可能となる。本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、有効成分が食品由来とするものであるため安全性が高く、安価に提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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