(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の足場となるスキャホールドなどに利用することができる、任意の形状を有する中空部を備えた三次元構造体を自由に製造することができる方法を提供する。【解決手段】材料を静電インクジェット方式により吐出して、構造体本体部と、該構造体本体部の内部に充填されるように形成された擬製部とを有する構造体を作製した後、該構造体から前記擬製部を除去することにより、中空部１６、２１を有する三次元構造体１７、２２を製造する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造体本体部と、該構造体本体部の内部に充填されるように形成された擬製部とを有する構造体を作製した後、該構造体から前記擬製部を除去することにより、前記擬製部の形状に対応した形状を有する中空部を形成する、中空部を有する三次元構造体の製造方法であって、
前記構造体本体部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより前記構造体本体部を形成する工程、
前記擬製部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、前記構造体本体部の内部に充填されるように前記擬製部を形成する工程、および
前記構造体から前記擬製部を除去する工程
を含むことを特徴とする、中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【請求項２】
前記構造体から前記擬製部を除去する工程が、前記構造体本体部と前記擬製部との融解する温度の差を利用して、前記構造体の温度を制御することにより、前記擬製部を選択的に融解して除去する工程である請求項１に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【請求項３】
前記構造体本体部の形成に用いる材料が、アルギン酸、鉄イオン架橋アルギン酸、コラーゲンおよびフィブリンから選ばれる少なくとも１種、またはアルギン酸、鉄イオン架橋アルギン酸、コラーゲンおよびフィブリンから選ばれる少なくとも１種ならびにゼラチンを含み、
前記擬製部の形成に用いる材料がゼラチンを含む
請求項２に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【請求項４】
前記構造体本体部の形成に用いる材料が、アルギン酸およびコラーゲンを含み、前記擬製部の形成に用いる材料がゼラチンを含む請求項２に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【請求項５】
前記構造体本体部の形成に用いる材料が、アルギン酸、コラーゲン、フィブリンおよびゼラチンから選ばれる少なくとも１種を含み、
前記擬製部の形成に用いる材料が所定の転移温度以上でゲル、温度以下でゾルの機能を有する熱可逆性ハイドロゲルを含む
請求項２に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【請求項６】
前記中空部を有する三次元構造体がスキャホールドである、請求項１〜５のいずれかに記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【請求項７】
人工臓器の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、前記構造体本体部の内部に、前記擬製部の少なくとも一部に接触するように人工臓器を形成する工程を含む請求項１または２に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法によって製造された中空部を有する三次元構造体の中空部に、血管内皮細胞を含む媒体を挿入し、前記中空部の壁面に前記血管内皮細胞を付着させ、前記壁面に沿って前記血管内皮細胞を増殖させる血管組織の製造方法。
【請求項９】
請求項７に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法によって製造された中空部を有する三次元構造体の中空部に、血管内皮細胞を含む媒体を挿入し、前記中空部の壁面に前記血管内皮細胞を付着させ、前記壁面に沿って前記血管内皮細胞を増殖させる臓器組織の製造方法。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法により製造された中空部を有する三次元構造体。
【請求項１１】
請求項８に記載の血管組織の製造方法により製造された血管組織。
【請求項１２】
請求項９に記載の臓器組織の製造方法により製造された臓器組織。
【請求項１３】
構造体本体部と、該構造体本体部の内部に充填されるように形成された構造体擬製部とを有する構造体を作製した後、該構造体から前記構造体擬製部を除去することにより、前記構造体擬製部の形状に対応した形状を有する中空部を形成して中空部を有する三次元構造体の製造する、中空部を有する三次元構造体の製造装置であって、
前記構造体本体部の形成に用いる材料および前記構造体擬製部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、構造体本体部および該構造体本体部の内部に充填されるように構造体擬製部を形成して、前記構造体を形成するパターニング部、および
前記構造体の温度を制御する温度制御部
を有する中空部を有する三次元構造体の製造装置。
【請求項１４】
前記パターニング部が、前記構造体本体部の形成に用いる材料を吐出してパターニングを行う対象である基盤を水平方向および垂直方向に移動させ、さらに水平面に平行な回転方向に回転させることができる位置調整部を備えた請求項１３に記載の中空部を有する三次元構造体の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空部を有する三次元構造体およびその製造方法に関し、詳しくは、インクジェット方式によるパターニングを利用した中空部を有する三次元構造体の製造方法、およびその製造方法により製造された中空部を有する三次元構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療・人工臓器などのバイオテクノロジー研究では、実際の組織に類似した三次元構造の細胞組織を用いて実験することが強く望まれている。また、人工的に三次元構造を有する組織を形成する場合、実際に組織として機能する必要がある。しかしながら、三次元構造を有する組織は自重が細胞間の結合力を上回ることが多く、三次元状に細胞を配置してもその三次元形状を維持することは困難であった。このため、三次元構造を有する組織を人工的に作製するのは容易ではなかった。
【０００３】
従来、生体外において生体中の三次元構造を有する組織を構築する方法があった。たとえば、ピエゾ方式またはサーマル方式のインクジェット技術を利用して、細胞を内包するアルギン酸カプセルを二次元または三次元にパターニングして、人工組織を作製する技術がある（非特許文献１）。ピエゾ方式およびサーマル方式のインクジェット技術においては、粘性の高い溶液の吐出を制御できないので、この技術においては細胞をアルギン酸カプセルに内包して用いている。このため、この技術では、細胞同士の接着ならびに相互作用がアルギン酸カプセルによって阻害されてしまうという問題があり、細胞が二次元または三次元状に配列されているものの、組織として機能していなかった。つまり、この技術ではインクジェット技術を用いることにより、ある程度自由に細胞をパターニングすることができるが、実用的なパターニングを行うことはできなかった。
【０００４】
特許文献１には、静電インクジェット方式によるパターニングを利用した細胞組織を作製する方法が開示されている。再生医療・人工臓器などのバイオテクノロジー分野では、精密に二次元または三次元状にパターニングされた細胞組織が必要であり、そのためには、細胞および細胞の足場となるスキャホールドをパターニングする技術が必要である。こうしたスキャホールドとしては細胞外マトリックス物質が望ましいが、足場としての強度を得るためには高粘性であることが必要である。また、細胞を含む媒体は特に粘性が高い。このため、ピエゾ方式およびサーマル方式のインクジェットでは、インクジェットプリンタで用いられるキャピラリーチューブが詰まり、媒体を安定して吐出させることができず、組織として機能しうる三次元構造を有する組織を作製することは不可能であった。特許文献１に開示された静電インクジェット方式を利用した方法によれば、高粘性のスキャホールドや細胞を含む液体をキャピラリーチューブに詰まらせることなく安定して吐出できるので、組織として機能しうる三次元構造を有する細胞組織を作製することができる。
【０００５】
しかし、組織として機能しうる臓器を作製することはできても、その臓器に栄養分を送る血管等の経路がなければ、臓器を生体内と同様の環境下で機能させることはできない。たとえば経路としての血管は生体内をきわめて複雑に伸長している。臓器に栄養分を送る血管を作るには、三次元構造体の内部に、血管を作製し得る中空部を所望の構造に形成する技術が必要である。そのような技術により作製された中空部を有する三次元構造体をたとえばスキャホールドとして使用し、その中空部に血管を人工的に形成すれば、その血管を利用して臓器に栄養分を送ることができ、臓器を生体内と同様の環境下で機能させることができる。
【０００６】
しかし、生体組織を形成できるような中空部を有する三次元構造体を製造することは静電インクジェット方式を用いても従来困難であった。
特許文献２に、三次元構造体の内部に、血管を作製し得る中空部を形成する技術が開示されている。この技術では、網構造の中に、保持シートに造形材料を保持して固定し、その上に次層の保持シートを載置し、その保持シートに次層の造形材料を保持して固定し、この操作を繰り返して積層した後に保持シートの除去を行い、保持シートを除去することにより形成された空洞部に血管などを作製することが可能となる。しかし、この技術では、得られる三次元構造体は積層体となり、血管などの作製に利用される空洞部の形状は積層物の形状により制限され、自由に所望の形状を有する空洞部を得ることはできず、その結果、生体内における形状に近似した形状を有する血管等を作製することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２２２５１号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０３７５２９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Henmi C. et al., AATEX, 14, Special Issue, 689-692, 2008.
【非特許文献２】Kawamoto H. et al., JOURNAL OF IMAGING SCIENCE AND TECHNOLOGY, Volume 49, Number 1, January/February 2005, p.19-27
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、任意の形状を有する中空部を備えた三次元構造体を自由に製造することのできる製造方法を提供することであり、さらにそのような中空部を有する三次元構造体を用いて血管等を含む生体組織を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成する本発明は、具体的には以下のとおりである。
［１］構造体本体部と、該構造体本体部の内部に充填されるように形成された擬製部とを有する構造体を作製した後、該構造体から前記擬製部を除去することにより、前記擬製部の形状に対応した形状を有する中空部を形成する、中空部を有する三次元構造体の製造方法であって、
前記構造体本体部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより前記構造体本体部を形成する工程、
前記擬製部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、前記構造体本体部の内部に充填されるように前記擬製部を形成する工程、および
前記構造体から前記擬製部を除去する工程
を含むことを特徴とする、中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【００１１】
［２］前記構造体から前記擬製部を除去する工程が、前記構造体本体部と前記擬製部との融解する温度の差を利用して、前記構造体の温度を制御することにより、前記擬製部を選択的に融解して除去する工程である前記［１］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【００１２】
［３］前記構造体本体部の形成に用いる材料が、アルギン酸、鉄イオン架橋アルギン酸、コラーゲンおよびフィブリンから選ばれる少なくとも１種、またはアルギン酸、鉄イオン架橋アルギン酸、コラーゲンおよびフィブリンから選ばれる少なくとも１種ならびにゼラチンを含み、
前記擬製部の形成に用いる材料がゼラチンを含む
前記［２］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【００１３】
［４］前記構造体本体部の形成に用いる材料が、アルギン酸およびコラーゲンを含み、前記擬製部の形成に用いる材料がゼラチンを含む前記［２］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【００１４】
［５］前記構造体本体部の形成に用いる材料が、アルギン酸、コラーゲン、フィブリンおよびゼラチンから選ばれる少なくとも１種を含み、
前記擬製部の形成に用いる材料が所定の転移温度以上でゲル、温度以下でゾルの機能を有する熱可逆性ハイドロゲルである
前記［２］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【００１５】
［６］前記中空部を有する三次元構造体がスキャホールドである、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
［７］人工臓器の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、前記構造体本体部の内部に、前記擬製部の少なくとも一部に接触するように人工臓器を形成する工程を含む前記［１］または［２］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法。
【００１６】
［８］前記［１］または［２］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法によって製造された中空部を有する三次元構造体の中空部に、血管内皮細胞を含む媒体を挿入し、前記中空部の壁面に前記血管内皮細胞を付着させ、前記壁面に沿って前記血管内皮細胞を増殖させる血管組織の製造方法。
【００１７】
［９］前記［７］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法によって製造された中空部を有する三次元構造体の中空部に、血管内皮細胞を含む媒体を挿入し、前記中空部の壁面に前記血管内皮細胞を付着させ、前記壁面に沿って前記血管内皮細胞を増殖させる臓器組織の製造方法。
【００１８】
［１０］前記［６］または［７］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造方法により製造された中空部を有する三次元構造体。
［１１］前記［８］に記載の血管組織の製造方法により製造された血管組織。
［１２］前記［９］に記載の臓器組織の製造方法により製造された臓器組織。
【００１９】
［１３］構造体本体部と、該構造体本体部の内部に充填されるように形成された構造体擬製部とを有する構造体を作製した後、該構造体から前記構造体擬製部を除去することにより、前記構造体擬製部の形状に対応した形状を有する中空部を形成して中空部を有する三次元構造体の製造する、中空部を有する三次元構造体の製造装置であって、
前記構造体本体部の形成に用いる材料および前記構造体擬製部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、構造体本体部および該構造体本体部の内部に充填されるように構造体擬製部を形成して、前記構造体を形成するパターニング部、および
前記構造体の温度を制御する温度制御部
を有する中空部を有する三次元構造体の製造装置。
【００２０】
［１４］前記パターニング部が、前記構造体本体部の形成に用いる材料を吐出してパターニングを行う対象である基盤を水平方向および垂直方向に移動させ、さらに水平面に平行な回転方向に回転させることができる位置調整部を備えた前記［１３］に記載の中空部を有する三次元構造体の製造装置。
【発明の効果】
【００２１】
静電インクジェット方式によれば、高粘度の媒体であっても高精度で自由な形状にパターニングをすることができる。このため、静電インクジェット方式により、構造体本体部の内部に擬製部を所望の形状にパターニングし、作製された構造体から擬製部を除去することにより、任意の形状を有する中空部を備えた三次元構造体を自由に製造することができる。この中空部を有する三次元構造体は、細胞の足場となるスキャホールドなどに利用することもできる。
【００２２】
さらに、この中空部を有する三次元構造体の中空部に細胞を送り込み、中空部において細胞を増殖させれば、中空部の形状に対応した形状を有する生体組織、たとえば血管を作製することができる。さらに、このように作製した血管の他に臓器を人工的に作製し、この臓器に前記血管を接続もしくは介在すれば、血管を介して臓器に栄養分を供給することができるようになり、生体内と同様に環境下で機能し得る人工臓器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法に使用されるパターン生成装置１１の概略構成を示す図である。
【図２】図２は、本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法に使用されるパターン生成装置１２の概略構成を示す図である。
【図３】図３（Ａ）は、実施例１において得られた構造体の概略図である。図３（Ｂ）は、実施例２において得られた構造体の概略図である。
【図４】図４（Ａ）は、実施例１において得られた中空部を有する三次元構造体の写真である。図４（Ｂ）は、実施例２において得られた中空部を有する三次元構造体の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
［中空部を有する三次元構造体の製造方法］
本発明に係る中空部を有する三次元構造体の製造方法は、
構造体本体部と、該構造体本体部の内部に充填されるように形成された擬製部とを有する構造体を作製した後、該構造体から前記擬製部を除去することにより、前記擬製部の形状に対応した形状を有する中空部を形成する、中空部を有する三次元構造体の製造方法であって、
前記構造体本体部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより前記構造体本体部を形成する工程、
前記擬製部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、前記構造体本体部の内部に充填されるように前記擬製部を形成する工程、および
前記構造体から前記擬製部を除去する工程
を含むことを特徴とする。
【００２５】
ここで、擬製部とは、中空を形成するために前もって中空部となるべき部位に形成された構造部位を示す。
中空部を有する三次元構造体は、その形状には特に制限はなく、中空部の形状も特に制限はない。中空部は、閉じた空間、すなわち開口部を有しない空間であってもよいし、開いた空間、すなわち開口部を有する空間であってもよい。中空部が開いた空間である場合、開口部の数は１つであっても、２つ以上であってもよい。
【００２６】
前記構造体は、構造体本体部と擬製部とを有する。擬製部は構造体本体部の内部に充填されるように形成されている。充填されるように形成されているとは、擬製部が構造体本体部との間に実質的に隙間を生じないように形成されていることを意味する。前記構造体から擬製部が除去されることにより、擬製部が存在していた箇所が中空部となり、中空部を有する三次元構造体が得られる。擬製部は構造体本体部の内部に充填されるように形成されているので、前記中空部は擬製部の形状に対応した形状になる。構造体本体部が自重等によって変形しない強度を有する場合には、前記中空部は実質的に擬製部と同じ形状になる。構造体本体部が自重等によって変形しない強度を有しない場合には、前記中空部はたとえば擬製部の形状を歪めた形状になる。いずれにしても、前記中空部の形状は、擬製部の形状に対応した形状、擬製部の形状に基づく形状、あるいは擬製部の形状に依存した形状になる。
【００２７】
前記構造体は、擬製部が除去されることにより中空部を有する三次元構造体となるので、前記構造体は中空部を有する三次元構造体に対する前駆体あるいは仮の構造体であるといえる。
【００２８】
構造体本体部は、中空部を有する三次元構造体の主要構造部をなす部分であり、前記構造体が構造体本体部および擬製部のみからなる場合には、構造体本体部が中空部を有する三次元構造体となる。
【００２９】
擬製部は、前記構造体においては存在するが、前記構造体製造後に除去されるので、中空部を有する三次元構造体においては存在しない。擬製部は、構造体本体部の内部に完全に収容された状態、つまり擬製部の表面がまったく前記構造体の表面に露出していない状態で形成されていてもよいし、構造体本体部の内部に完全に収容されていない状態、つまり擬製部の表面の一部が前記構造体の表面に露出している状態で形成されていてもよい。擬製部が除去されることにより形成される中空部は、擬製部が構造体本体部の内部に完全に収容された状態で形成されていた場合には閉じた空間となり、構造体本体部の内部に完全に収容されていない状態で形成されていた場合には開いた空間となる。たとえば、擬製部の表面の１箇所が前記構造体の表面に露出している場合には、中空部は開口部を１つ有する開いた空間となり、擬製部の表面の相互に接触しない２箇所以上が前記構造体の表面に露出している場合には、中空部は開口部を２つ以上有する開いた空間となる。
【００３０】
本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法は、
前記構造体本体部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより前記構造体本体部を形成する工程（以下、構造体本体部形成工程ともいう）、
前記擬製部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、前記構造体本体部の内部に充填されるように前記擬製部を形成する工程（以下、擬製部形成工程ともいう）、および
前記構造体から前記擬製部を除去する工程（以下、擬製部除去工程ともいう）
を含む。
【００３１】
構造体本体部形成工程および擬製部形成工程は、それぞれ構造体本体部の形成に用いる材料および擬製部の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行う工程である。
【００３２】
静電インクジェット方式は、粘度の高い材料であっても高精度に吐出し、パターニングすることができる。このため、静電インクジェット方式によれば、粘度の高いスキャホールドの形成に用いる材料や細胞を含む材料を高精度に任意のパターンにパターニングすることができ、所望の三次元構造を有するスキャホールドや細胞組織を自由に作製することができる。
【００３３】
構造体本体部形成工程および擬製部形成工程は、基本的には特許文献１に記載された手法に則して行うことができる。
構造体本体部形成工程および擬製部形成工程は、通常同時に行われ、構造体本体部をパターニングしながら、その内部に擬製部をパターニングして、前記構造体を作製する。
【００３４】
構造体本体部の形成に用いる材料は、前記構造体から擬製部を除去した後に中空部が得られる程度の強度を有する三次元構造体を形成できる限り、製造される三次元構造体の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
中空部を有する三次元構造体がスキャホールドである場合には、構造体本体部を形成する成分として、生体組織において細胞外マトリックスを構成する成分を用いることができる。細胞外マトリックスとは、生体組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物をいい、細胞接着活性を有し、細胞が三次元構造を形成するときの構造支持体として働く。また、細胞外マトリックスは、細胞の形、細胞移動、細胞増殖、細胞内代謝、細胞分化等を調節する作用も有する。細胞外マトリックスを構成する物質として、アルギン酸、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖蛋白質等が挙げられ、糖蛋白質として、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等が挙げられる。したがって、スキャホールドを形成する成分として、上記の成分およびコラーゲンの変性物であるゼラチンを用いることができる。また、カドヘリン、セクレチンやＮＣＡＭ、ＩＣＡＭ等の免疫グロブリンスーパーファミリーに属する物質も細胞膜を結合する作用を有するので、スキャホールドとして用いることができる。さらにスキャホールドとしては、フィブリノーゲンおよびフィブリンも用いることができる。フィブリノーゲンは、出血に伴ってトロンビンによる切断反応をへてフィブリンとなり、ポリマー化する。ポリマー化の際に、他の血漿蛋白質や血液細胞を巻き込んでフィブリン塊を形成し傷口を接着し、止血効果を表す。血液から精製したフィブリノーゲンとトロンビンは混合して止血剤（フィブリン糊）として使用されている。フィブリノーゲンとトロンビンは、組織を接着する機能や一定の強度を持つことから、細胞の足場としての機能を果たすことができることが知られており、一過性に作られる疑似マトリックスと呼ばれることがある。スキャホールドを形成する成分としては、上記成分の１種類を用いてもよいし、２種類以上を混合して用いてもよい。これらの成分は生体から抽出したものでも、細胞を用いて産生したものでも、人工的に合成したものでもよい。
【００３６】
これらの成分を、たとえば生理食塩水、培地、緩衝液に溶解もしくは混合することにより、前記構造体本体部の形成に用いる材料を得ることができる。前記構造体本体部の形成に用いる材料における前記成分の濃度は、前記構造体から擬製部を除去した後に中空部を維持できる程度の強度が維持されれば特に制限はなく、成分ごとに適宜決定することができ、たとえば０．１〜１０ｍｇ/ｍｌの濃度で用いることができる。
【００３７】
擬製部の形成に用いる材料は、構造体本体部の内部にパターニングでき、擬製部除去工程において前記構造体から除去することが可能な擬製部を形成できる限り、特に制限されない。擬製部の形成に用いる材料としては、たとえばゼラチンゲル、所定の転移温度以上でゲル、温度以下でゾルの機能を有する熱可逆性ハイドロゲル等を挙げることができる。ゼラチンゲルに含まれるゼラチンの濃度は、通常０．０５〜０．１５ｍｇ/ｍｌ、好ましくは０．０７〜０．１３ｍｇ/ｍｌである。
【００３８】
擬製部除去工程を、後述する、前記構造体本体部と前記擬製部との融解する温度の差を利用して、擬製部を選択的に融解し除去する方法により行う場合には、そのような操作が可能な構造体本体部および擬製部を作製することができる、構造体本体部の形成に用いる材料および擬製部の形成に用いる材料の組み合わせが採用される。たとえば、擬製部の融点が構造体本体部の融点より低くなるような構造体本体部および擬製部を作製することができる、構造体本体部の形成に用いる材料および擬製部の形成に用いる材料の組み合わせが採用される。
【００３９】
このような材料の組み合わせとしては、構造体本体部の形成に用いる材料として、アルギン酸、鉄イオン架橋アルギン酸、コラーゲンおよびフィブリンから選ばれる少なくとも１種、またはアルギン酸、鉄イオン架橋アルギン酸、コラーゲンおよびフィブリンから選ばれる少なくとも１種ならびにゼラチンを含む材料、擬製部の形成に用いる材料として、ゼラチンを含む材料を挙げることができ、さらに好ましくは、構造体本体部の形成に用いる材料として、アルギン酸およびコラーゲンを含む材料、擬製部の形成に用いる材料としてゼラチンを含む材料を挙げることができる。
【００４０】
構造体本体部の形成に用いる材料に含まれるアルギン酸は、三次元構造体がスキャホールドとして機能するのに必要な強度を三次元構造体に付与するために有効な成分であり、コラーゲンは、スキャホールドとして機能する三次元構造体に細胞を付着させるのに有効な成分である。構造体本体部の形成に用いる材料がアルギン酸およびコラーゲンを含む場合、アルギン酸とコラーゲンとの質量比は通常３：０．１〜３：１、好ましくは３：０．５〜３：０．７である。構造体本体部の形成に用いる材料におけるアルギン酸およびコラーゲンの合計の濃度は、通常０．１〜０．７ｍｇ/ｍｌ、好ましくは０．３〜０．５ｍｇ/ｍｌである。
【００４１】
上記組み合わせにおいて、擬製部を形成するゼラチンゲルの融点は通常３０℃前後であり、構造体本体部の融点はこれより高いので、前記構造体をゼラチンゲルの融点以上で、構造体本体部の融点より低い温度に制御することにより、ゼラチンゲルを融解し、前記構造体から擬製部のみを選択的に除去することができる。通常は、構造体本体部の融点を５０〜７０℃になるように調整し、前記構造体の温度を３０〜４０℃に制御することにより、ゼラチンゲルを融解し、擬製部を前記構造体から除去する。
【００４２】
他の材料の組み合わせとしては、構造体本体部の形成に用いる材料として、アルギン酸、コラーゲン、フィブリンおよびゼラチンから選ばれる少なくとも１種を含む材料、擬製部の形成に用いる材料として所定の転移温度以上でゲル、温度以下でゾルの機能を有する熱可逆性ハイドロゲルを挙げることができる。
【００４３】
所定の転移温度以上でゲル、温度以下でゾルの機能を有する熱可逆性ハイドロゲルとしては、たとえばメビオールジェル（商品名、メビオール株式会社製）を挙げることができる。
【００４４】
メビオールジェルは、高温側でゲル、低温側でゾルとなる温度転移性を有する熱可逆性ハイドロゲルである。その転移温度は、成分を調整することで制御することが可能であるので、対象組織の作製温度条件との兼ね合いで転移温度を適宜決定することができる。たとえば、メビオールジェルがゾル化する転移温度を４℃〜０℃に設定し、擬製部を含めた構造体の作製時の温度を３７℃〜４５℃とする。このとき、構造体本体部および擬製部ともゲル状である。その後、構造体の温度を前記転移温度以下に制御すると、擬製部を構成するメビオールジェルがゾル化し、擬製部が構造体から選択的に除去される。
【００４５】
本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法は、構造体本体部形成工程および擬製部形成工程に加えて、人工臓器の形成に用いる材料を静電インクジェット方式により吐出して、三次元的にパターニングを行うことにより、構造体本体部の内部に、擬製部の少なくとも一部に接触するように人工臓器を形成する工程（以下、人工臓器形成工程ともいう）を含むことができる。このように構造体本体部の内部に人工臓器を形成し、三次元構造体の中空部に血管を作製することにより、この血管を通じて人工臓器に栄養分を供給することができる臓器組織を製造することができる。
【００４６】
人工臓器の形成に用いる材料に含まれる細胞は限定されず、作製しようとする組織に応じて適宜選択することができる。例えば、外胚葉、中胚葉又は内胚葉に由来する分化細胞や幹細胞を用いることができる。さらに具体的には例えば、表皮細胞、平滑筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、骨格筋芽細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、神経細胞、色素細胞、脂肪細胞等を用いることができる。また、幹細胞としては表皮幹細胞、毛嚢幹細胞、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞（ES細胞）、iPS細胞(induced pluripotent stem cell)等の幹細胞を用いることができる。
【００４７】
作製される組織を移植に用いる場合、移植拒絶反応を避けるために、移植を受ける個体の自己の細胞又は主要組織適合性抗原の型が一致若しくは類似している個体由来の細胞を用いるのが好ましい。
【００４８】
これらの細胞は、作製しようとする組織に応じて選択する。複数の種類の細胞からなる組織を作製しようとする場合、複数の異なる細胞を用いればよい。細胞は、生体組織から単離して培養したものを用いてもよいし、前記の幹細胞から分化・増殖させたものを用いてもよい。静電インクジェット方式を用いたパターン生成装置で吐出するときの細胞密度は特に限定されず、例えば１０4〜１０8個/ｍｌの密度で用いればよい。細胞は、例えば、MEM培地、αMEM培地、DME培地、BME培地、IMEM培地、RPMI培地、ES培地等の通常細胞培養に用いられる培地や生理食塩水、緩衝液等に懸濁または混合して用いることができる。
【００４９】
さらに、細胞組織の作製に、細胞増殖因子やサイトカインを用いてもよい。細胞増殖因子とは、細胞の増殖を促進または制御する物質をいい、サイトカインとは、細胞から産生され同種の又は異種の細胞に作用する生理活性物質をいう。細胞増殖因子としては、例えば、血小板由来増殖因子（PDGF）、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、インシュリン等が挙げられる。また、サイトカインとしては、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子などの造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類等が挙げられる。細胞増殖因子は、用いる細胞に対応したものを用いればよい。また、その他の生理活性物質としては、例えば、アスコルビン酸、ビオチン、パントテン酸カルシウム、ビタミンＤ等のビタミン類、トランスフェリン、血清アルブミン等の蛋白質、脂質、リノール酸、コレステロール、ピルビン酸、レチノイン酸、抗生物質等を用いてもよい。
【００５０】
擬製部除去工程において前記構造体から擬製部を除去する方法には、擬製部の形状に対応した形状を有する中空部を形成することができるように擬製部を除去できれば特に制限はなく、擬製部および構造体本体部の種類等に応じて適宜決定することができる。そのような方法としては、たとえば、擬製部を融解して除去する方法、擬製部を機械的操作により除去する方法、擬製部を化学的に除去する方法等を挙げることができる。擬製部を融解して除去する方法としては、前記構造体を恒温槽で加熱して擬製部を融解させる方法、擬製部に蒸気、赤外線、レーザーなどを照射して融解させる方法などを挙げることができる。擬製部を機械的操作により除去する方法としては、前記構造体を振動装置やマイクロ波により震動させ、その振動により擬製部を除去する方法、細い針などを擬製部に挿入し、擬製部を吸引する方法などを挙げることができる。擬製部を化学的に除去する方法としては、擬製部に酵素等の分解触媒を供給して、擬製部を分解して流出させる方法やｐＨによる溶解性の違いのある媒体を利用するなどを挙げることができる。
【００５１】
これらの方法のうち、簡便に擬製部の形状に対応した形状を有する中空部が得られる点で、擬製部を融解して除去する方法が好適である。具体的には、構造体本体部と擬製部との融解する温度の差を利用して、前記構造体の温度を制御することにより、擬製部を選択的に融解して除去することができる。たとえば、擬製部の融点が構造体本体部の融点より低くなるように構造体本体部および擬製部を作製し、前記構造体の温度を、擬製部の融点以上で、構造体本体部の融点より低い温度に制御することにより、擬製部のみを選択的に融解し、除去することができる。前記構造体の温度の制御は、前記構造体を恒温槽に入れるなどして行うことができる。この方法における具体的な構造体本体部および擬製部の組み合わせは前述のとおりである。
【００５２】
［中空部を有する三次元構造体］
以上のとおり、本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法によれば、任意の形状を有する擬製部を形成することにより、その形状に対応した所望の形状の中空部を有する三次元構造体を製造することができる。使用目的に応じて中空部の形状を適宜決定することにより、目的に適合した、中空部を有する三次元構造体を得ることができる。中空部の形状には制限はなく、任意である。中空部の内径にも特に制限はない。静電インクジェットのノズルと吐出媒体のサイズ、粘性に依存し、実施例では、１００μｍ〜十数ｍｍの内径を有する中空部を形成することができる。同様に、中空部を有する三次元構造体の大きさにも特に制限はなく、目的とする用途に応じて材料等を選択することにより、任意の大きさとすることができる。
【００５３】
中空部を有する三次元構造体は、細胞の足場となるスキャホールドなど、様々な用途に使用することができる。たとえば、中空部を有する三次元構造体をスキャホールドとして使用する場合には、中空部の形状を、作製する生体組織の形状に応じた形状にすることができる。その中空部にその生体組織の細胞を含む媒体を挿入し、その中空部を形成する三次元構造体の表面に細胞を付着させ、その表面に沿って細胞を増殖させることにより、中空部の形状に応じた生体組織を得ることができる。
【００５４】
たとえば、生体組織として血管を作製する場合には、分岐を有していてもよい線状の形状を有する擬製部を形成し、その形状に対応した分岐を有していてもよい線状の形状を有する中空部を有する三次元構造体を製造する。その中空部に血管内皮細胞を含む媒体を挿入し、中空部を形成する三次元構造体の表面、すなわち中空部の壁面に前記血管内皮細胞を付着させ、前記壁面に沿って前記血管内皮細胞を増殖させることにより人工血管を形成し、血管組織を製造することができる。
【００５５】
本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法が人工臓器形成工程を含み、構造体本体部の内部に人工臓器を形成する場合には、擬製部の少なくとも一部に接触するように人工臓器を形成し、前記の方法に従って、擬製部に人工血管を作製することにより、人工血管が人工臓器に接続した臓器組織が得られる。このような臓器組織は、血管を介して臓器に栄養分を供給できるので、より生体内の環境に近似した条件下で人工臓器を機能させることができる。また、血管を介して栄養分以外の物質、たとえば細胞などを人工臓器に供給することもできるので、この臓器組織は様々な生理機能に関する研究等に活用することができる。たとえば、血管を介してがん細胞を供給すれば、生体組織のがん化のメカニズムなどの研究が発展するものと期待される。
【００５６】
なお、本発明において血管組織とは、スキャホールドとその内部に形成された人工血管とを含む構造体をも意味する。本発明において臓器組織とは、スキャホールドと、スキャホールドの内部に形成された人工臓器と、スキャホールドの内部に形成された人工血管を含む構造体をも意味する。また、血管は臓器には含まれず、臓器は血管によって必要成分の供給を受ける生体組織を意味する。
【００５７】
［パターン生成装置および中空部を有する三次元構造体の製造装置ならびにその操作方法］
以下、本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法に使用されるパターン生成装置および中空部を有する三次元構造体の製造装置ならびにその操作方法を具体的に説明する。
【００５８】
図１は、本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法に使用されるパターン生成装置の一具体例であるパターン生成装置１１の概略構成を示す図である。パターン生成装置１１は、スキャホールドとして使用される中空部を有する三次元構造体の前駆体である前記構造体の製造装置として構成されている。
【００５９】
パターン生成装置１１は、静電インクジェット方式を用いて構造体本体部および擬製部のパターンニングをすることが可能である。パターン生成装置１１は、構造体本体部の形成に用いる材料を収容し、下端面にするキャピラリーチューブ（ノズル）を備えた容器であるシリンジ２と、擬製部の形成に用いる材料を収容し、下端面にするキャピラリーチューブ（ノズル）を備えた容器であるシリンジ３と、人工臓器の形成に用いる材料を収容し、下端面にするキャピラリーチューブ（ノズル）を備えた容器であるシリンジ４と、各シリンジもしくは、各シリンジ内の媒体に独立に高電圧を印加する３個の高電圧電源１と、パターンを形成する対象である基板を保持するディッシュ６と、ディッシュ６を移動させる位置調整部１０と、各キャピラリーチューブとディッシュ６と間に設けられた、各キャピラリーチューブからの吐出液が通過する穴（孔）を有する平板電極５と備えている。位置調整部１０は、ディッシュ６を水平方向における相互に直行する方向および垂直方向に移動させることができるリニアステージ７と、ディッシュ６を水平面に平行な回転方向に回転させることができる回転ステージ８とを有する。
【００６０】
シリンジ２に収容される構造体本体部の形成に用いる材料としては、たとえばアルギン酸ナトリウムを含む材料、シリンジ３に収容される擬製部の形成に用いる材料としては、たとえばゼラチンを含む材料、シリンジ４に収容される人工臓器の形成に用いる材料としては、たとえばその臓器の細胞を含む材料を挙げることができる。人工臓器の形成に用いる材料は、さらにコラーゲンなどを含んでいてもよい。
【００６１】
平板電極５はアースされているので、各高電圧電源１から印加される高電圧によって、シリンジ２〜４と平板電極５との間に電界が形成される。この電界に基づき、各キャピラリーチューブからシリンジ２〜４に収容されている各材料が吐出され、パターニングが行われる。印加電圧は、通常０．５ｋＶ〜５ｋＶの範囲である。印加電圧の強度を制御することにより、キャピラリーチューブとディッシュ６との間に形成される電界強度が制御される。電界強度を制御することによって、キャピラリーチューブからの吐出量が調整される。吐出される各材料は、電圧印加により帯電しているので、ノズルの少なくとも先端部の吐出面は絶縁されていることが望ましい。このため、各キャピラリーチューブはガラス製であることが望ましい。
【００６２】
パターン生成装置１１においては、シリンジ２〜４と平板電極５との間に電圧が印加されるので、電界はキャピラリーチューブと平板電極５との間にのみ形成される。このため、ディッシュ６上における電界の影響を除去することができる。つまり、三次元状に高く細胞を積み上げた場合でも、キャピラリーチューブ先端周りの電界が変化しないので、吐出形態が変化しにくい。よって、基板上に各材料を均一に積み上げることができるようになり、所望パターンの形成が容易になるという効果がある。
【００６３】
ステージドライバ（図示せず）が制御部（図示せず）の制御に従って、移動信号を位置調整部１０のリニアステージ７および回転ステージ８に与えて、ディッシュ６の位置を制御する。すなわち、まず構造体本体部の形成に用いる材料を吐出し、基板上に付着させて希望の形にパターニングし、さらに擬製部の形成に用いる材料および人工臓器の形成に用いる材料を吐出し、構造体本体部の内部に擬製部および人工臓器が形成されるようにパターニングする。そして一層パターニングした後に、ディッシュ６の位置を一層分上げる。これらの作業を繰り返し行うことで、三次元状にパターニングを行う。パターン生成装置１１においては、位置調整部１０のリニアステージ７に加えて回転ステージ８も備えているので、回転方向にもパターニングが可能であり、構造体本体部、擬製部および人工臓器をより多様な形状、精密な形状に形成することができる。このため、中空部を所望の形状に的確に形成することができる。
【００６４】
人工臓器の形成に用いる材料を吐出するとき、この材料に数μＡの電流が流れるが、この電流は細胞の外側を流れるため、細胞に致死的な障害を与えない。したがって、高電圧を印加するにもかかわらず、細胞が死滅することなく、細胞が生存した状態で、三次元構造を有する細胞組織を作製することができる。
【００６５】
本発明の中空部を有する三次元構造体の製造方法に使用されるパターン生成装置は、構造体本体部の形成に用いる材料および擬製部の形成に用いる材料を別々に吐出することができれば、静電インクジェット方式により吐出される材料の数には特に制限はない。たとえば、人工臓器を形成する必要がない場合、または製造される中空部を有する三次元構造体がスキャホールドでない場合には、パターン生成装置１１からシリンジ４およびシリンジ４に電圧を加える高電圧電源１を取り除いた構成とすることができる。また、吐出する材料を増やしたい場合には、シリンジおよびそのシリンジに電圧を加える高電圧電源１の数を適宜増やせばよい。
【００６６】
図２は、パターン生成装置１１に、さらに吐出材料を収容するシリンジ９およびシリンジ９に電圧を加える高電圧電源１を付加して構成されるパターン生成装置１２の概略構成を示す図である。パターン生成装置１２においては、３つの穴（孔）を有する平板電極５の替わりに４つの穴（孔）を有する平板電極５’を有する。パターン生成装置１２においては、たとえば、シリンジ２に、構造体本体部の形成に用いる材料としてたとえばアルギン酸ナトリウムを含む材料を、シリンジ３に、擬製部の形成に用いる材料としてたとえばゼラチンを含む材料を、シリンジ４に、人工臓器の形成に用いる材料としてたとえばその臓器の細胞を含む材料を、シリンジ９に、構造体本体部の形成に用いる材料としてたとえばコラーゲンを含む材料を収容させることができる。パターン生成装置１２の操作方法は、パターン生成装置１１の操作方法と同様である。
【００６７】
擬製部除去工程を、前述した、構造体本体部と擬製部との融解する温度の差を利用して、前記構造体の温度を制御することにより、擬製部を選択的に融解除去する方法により行う場合には、パターン生成装置が、上記パターニングにより得られた前記構造体の温度を制御することができる温度制御部を備えていることが好ましい。パターン生成装置が前記温度制御部を備えていると、たとえば前記構造体の温度を擬製部の融点以上で、構造体本体部の融点より低い温度に制御することにより、擬製部を選択的に融解除去することができる。
【００６８】
パターン生成装置が温度制御部を備えることにより、１つの装置によって中空部を有する三次元構造体を製造することができる。すなわち、温度制御部を備えたパターニング装置は、中空部を有する三次元構造体の製造装置である。具体的には、パターン生成装置１１やパターン生成装置１２に温度制御部を付加して形成される装置が、中空部を有する三次元構造体の製造装置である。温度制御部としては恒温槽などを挙げることができる。たとえば、パターン生成装置１１やパターン生成装置１２のディッシュ６に恒温機能を持たせることによって、ディッシュ６を温度制御部とすることができる。ディッシュ６を温度制御部である恒温槽内に保持してもよい。また、温度制御部を備えた装置であると、パターニングにより得られた前記構造体が細胞組織を含む場合、細胞は通常４０℃以上になると死滅するので、前記構造体の温度を制御することにより細胞の死滅等を防止することができる点においても好ましい。
【００６９】
なお、個々のキャピラリーチューブ（ノズル）側に個々に電極５を備えたシリンジ（一体化されていてもよい）でもよく、シリンジ構成は１本の構成でもよい。シリンジは、交換可能なものでもよく、別途シリンジへ媒体を供給できる媒体供給源（容器）がポンプなどによりシリンジに接続されていてもよい。
【実施例】
【００７０】
［実施例１］
パターン生成装置１１からシリンジ４およびシリンジ４に電圧を加える高電圧電源１を取り除き、平板電極５を、シリンジ２および３からの吐出液を通過させる２つの穴（孔）を有する平板電極に変更した構成を有する装置（以下、パターン生成装置１３という。図示せず。）を用いて中空部を有する三次元構造体を製造した。各シリンジに設けられたキャピラリーチューブ（ノズル）の先端と平板電極の上面との距離を２ｍｍ、平板電極の下面とディッシュ６内に置かれた基板の上面との距離を２ｍｍとした。
【００７１】
構造体本体部の形成に用いる材料としてアルギン酸を１質量％、および視覚での確認を容易にするための赤色色素（食用赤色１０６号、ダイワ化学社製）を０．０１質量％含有する水溶液を用い、これをシリンジ２に収容した。擬製部の形成に用いる材料としてゼラチンを１０質量％含有する水溶液を用い、これをシリンジ３に収容した。
【００７２】
シリンジ２に高電圧電源１から２．４ｋＶの電圧を加え、シリンジ２に装着されたキャピラリーチューブからシリンジ２内の材料を基板上に吐出した。さらに、シリンジ３に高電圧電源１から２．４ｋＶの電圧を加え、シリンジ３に装着されたキャピラリーチューブからシリンジ３内の材料を、基板上に形成されたアルギン酸ゲルの内部に吐出した。ステージドライバが制御部の制御に従って、移動信号を位置調整部１０のリニアステージ７および回転ステージ８に与えて、ディッシュ６の位置を制御しながらパターニングを行った。
【００７３】
上記パターニングにより、図３（Ａ）の概略図に示す、構造体本体部１３と擬製部１４とから形成される直方体状の構造体１５を作製した。構造体本体部１３は、縦１０ｍｍ、横１２ｍｍ、高さ１０ｍｍの直方体状のアルギン酸ゲルからなる。擬製部１４は、構造体１５の対向する２面にそれぞれ端面を有する内径約１．５ｍｍの直線状のゼラチンゲルからなる。この構造体１５を、内部温度を４０℃に調整した恒温槽に入れ、６０分間保持することにより擬製部１４を融解し、構造体１５から除去した。その結果、図４（Ａ）に示す、内径約１．５ｍｍの直線状の中空部１６を有する三次元構造体１７が得られた。図４（Ａ）は、中空部１６の開口部が設けられた面と直角をなす方向から撮影した三次元構造体１７の写真である。
【００７４】
［実施例２］
パターニングの形状を変更した以外は実施例１と同様にパターニングを行うことにより、図３（Ｂ）の概略図に示す、構造体本体部１８と擬製部１９とから形成される直方体状の構造体２０を作製した。構造体本体部１８は、縦５ｍｍ、横７ｍｍ、高さ０．７ｍｍの直方体状のアルギン酸ゲルからなる。擬製部１９は、構造体１５の対向する２面および他の１面にそれぞれ端面を有する内径約１ｍｍの略十字状のゼラチンゲルからなる。この構造体２０を、内部温度を４０℃に調整した恒温槽に入れ、６０分間保持することにより擬製部１９を融解し、構造体２０から除去した。赤色色素（食用赤色１０６号、ダイワ化学社製）を０．０１質量％含有する水溶液を空洞部に注入し、中空部の視覚的な確認を容易にした。その結果、図４（Ｂ）に示す、内径約１ｍｍの略十字状の中空部２１を有する三次元構造体２２が得られた。図４（Ｂ）は、三次元構造体２２の斜め上方から撮影した三次元構造体２２の写真である。
【符号の説明】
【００７５】
１    高電圧電源
２    シリンジ
３    シリンジ
４    シリンジ
５、５’    平板電極
６    ディッシュ
７    リニアステージ
８    回転ステージ
９    シリンジ
１０    位置調整部
１１    パターン生成装置
１２    パターン生成装置
１３、１８    構造体本体部
１４、１９    擬製部
１５、２０    構造体
１６、２１    中空部
１７、２２    中空部を有する三次元構造体
【図１】
2014151524.tif 000003
【図２】
2014151524.tif 000004
【図３】
2014151524.tif 000005
【図４】
2014151524.tif 000006