(57)【要約】【課題】疾患処置におけるＭＧＤ−ＣＳＦのための組成物およびその使用方法の提供。【解決手段】開示されるのは、本明細書において「単球、顆粒球および樹状細胞コロニー刺激因子」（ＭＧＤ−ＣＳＦ）として同定された、新規に同定された分泌型分子、ポリペプチド配列、およびそのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドである。また、例えば、ベクターおよび宿主細胞を使用する組み換え技術によって、ポリペプチドを産生するためのい手順も提供される。さらに、本発明の開示された新規な分子を改変して融合タンパク質を調製する手順が開示される。また、例えば、ガン、自己免疫疾患および炎症性疾患、感染性疾患、および再発性の流産を含む種々の疾患の処置のためにポリペプチドおよびその活性なフラグメントを用いるための方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において免疫応答を調節するための組成物であって、
（ａ）配列番号７、９または１０のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ免疫細胞の増殖を刺激する活性を有するポリペプチド、および
（ｂ）配列番号７、９または１０のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、かつ免疫細胞の増殖を刺激する活性を有する、ポリペプチド
から選択されるポリペプチドに特異的な抗体
を含み、該免疫応答の調節が、炎症の抑制および／または自己免疫疾患の抑制である、組成物。
【請求項２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記免疫応答の調節が、関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症、心筋梗塞、脳卒中および劇症肝不全より選択される疾患の処置または予防である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
炎症性疾患の患者に投与するための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
自己免疫疾患の患者に投与するための、請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本出願は、２００４年７月２２日出願の仮出願第６０／５９０，５６５号；２００５年１月２７日出願の同第６０／６４７，６０４号；２００５年３月２４日出願の同第６０／６６４，９３２号；および２００５年７月１４日出願の「Ｎｏｖｅｌ  ＭＧＤ−ＣＳＦ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆ  ＵＳｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された仮出願に対して優先権を主張する。本出願はまた、２００３年１０月３１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０３／３４８１１号；２００４年４月３０日出願のＰＣＴ／ＵＳ０４／１１２７０号；２００４年７月２２日出願の第６０／５９０，５６５号；２００５年１月１１日出願の第６０／６４２，６０４号；２００５年１月２７日出願の第６０／６４７，０１３号；および２００５年１月１８日出願の第６０／６５４，２２９号の出願に関する。これらの出願はそれらの全体が参照によって全て援用されている。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、本明細書において「単球、顆粒球および樹状細胞コロニー刺激因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅ、ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ，ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）」（ＭＧＤ−ＣＳＦ）として同定された、新規な分泌型分子に関する。本発明は、ＭＧＤ−ＣＳＦのポリペプチド、およびポリヌクレオチド配列、ＭＧＤ−ＣＳＦを含む融合分子、ベクター、宿主細胞、組成物およびＭＧＤ−ＣＳＦを含むキット、ならびに免疫関連疾患、感染性疾患およびガンを含む疾患を診断、予防、予後を確認および処置するためにＭＧＤ−ＣＳＦおよび関連の分子を用いる方法に関する。ＭＧＤ−ＣＳＦは以前には機能が未知である遺伝子ＭＣＧ３４６４７のスプライシング改変体である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
生得的な免疫系の細胞、例えば、単球、マクロファージ、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、および多形核好中球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）（ＰＭＮ）は、それらの食作用、細胞溶解性および抗菌性の特性のおかげで、ガンおよび感染性疾患に対する第一選択の防御因子である。単球およびマクロファージは、炎症性メディエータの活性化および分泌を通じて炎症性疾患において重要な役割を果たすと考えられる。例えば、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、顆粒球、単球およびマクロファージの増殖および分化を促進することが公知である。顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、顆粒球および好中球の分化および増殖を促進することが公知である（非特許文献１）。現在、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは両方とも、化学療法、放射線療法および骨髄移植後の血球の回復を促進するためのタンパク質治療剤として用いられている。
【０００４】
ＮＫ細胞は、ガンに対する宿主応答において役割を果たすことが公知である。同系および異種の両方の移植片モデルでは、腫瘍細胞は、ＮＫ−／−マウスでより効率的に増殖し、そしてこれらのモデルでのマウスの生存率は、ＮＫ細胞を保有しているマウスについての生存率よりも有意に低い。さらに、ＩＬ−２またはＩＬ−１５のような可溶性のタンパク質因子でのＮＫ応答の増強は、インビトロおよびインビボの両方において、抗腫瘍抗体の存在においてＮＫ細胞が腫瘍細胞を殺傷する効率を増大することが示されている（非特許文献２）。
【０００５】
さらに、ＮＫ細胞はまた、感染性疾患に対する宿主応答においてある役割を果たすことが公知である。例えば、ＮＫ細胞を欠くマウスは、ウイルスおよび細胞内病原体に対して感受性が増大していることが公知である。同様に、ＮＫ細胞の欠失が天然に生じているヒトも、感染に対して極めて過敏であることが公知である。インビトロでは、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染した細胞のＮＫ媒介性の殺傷は、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２およびインターロイキン１８のようなサイトカインによって増強されることが公知である（非特許文献３）；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００６】
活性化されたＮＫ細胞は、体外受精（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＩＶＦ）の手順を受けている女性の失敗率と相関し得、そして自然流産（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｌｏｓｓ）にさらに関連し得ることも公知である（非特許文献６）。さらに、活性化ＮＫ細胞のレベルの上昇は、女性の不妊の背景的な原因として公知の免疫子宮内膜症を有する多数の患者で見出され得る（非特許文献６）。
【０００７】
抗原を処理する樹状細胞は、新規な抗原およびリコール抗原の両方に対してＴ細胞を感作し得る。樹状細胞は、高レベルの主要組織適合複合体クラスＩおよびＩＩの抗原を発現し、この抗原は他の免疫調節性タンパク質、付着因子およびサイトカインとともに、ガンの免疫療法においてある役割を果たす。樹状細胞ガンワクチンは、患者の樹状細胞を抽出すること、およびインビトロまたはエキソビボで免疫細胞刺激因子を用いて大量の樹状細胞を再生することによって生成されることが報告されている。次いで樹状細胞は、患者のガン細胞由来の抗原に曝され得る。樹状細胞および抗原の組み合わせが、患者に注射されて、樹状細胞は患者のＴ細胞をプログラムする。樹状細胞はガン細胞表面で抗原を破壊し、次いでそれらをキラーＴ細胞に提示する（非特許文献７）。
【０００８】
自系の造血細胞移植から回復しているガン患者は、循環中の樹状細胞のレベルの低下を示す。樹状細胞は造血系前駆体から発達し、そしてそれらの発達の促進は、正常な樹状細胞レベルの再獲得を補助し得る。単離されたヒト樹状細胞の増殖を誘導すること、ならびに造血幹細胞の増殖および分化を誘導することにより樹状細胞を生成する能力によって、樹状細胞ワクチン接種の有効性試験が容易になり、そして有効なワクチン接種実施が容易になる。樹状細胞増殖および／または造血幹細胞増殖および／または樹状細胞への分化を刺激する因子の必要性が当該分野では存在する。造血細胞移植のための調製物において循環中の樹状細胞を増大するために造血細胞から樹状細胞の生成を促進する因子も当該分野では必要である。
【０００９】
破骨細胞は、樹状細胞、マクロファージおよびミクログリアと共通の前駆体を共有する（非特許文献８）。これらの多角性の、粘着性の、骨吸収性の細胞は、骨髄中で分化して、骨再構築およびカルシウムホメオスタシスを調節するように骨の近傍で機能する。破骨細胞の分化および機能は、Ｍ−ＣＳＦおよびオステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（ＲＡＮＫリガンド）を含む分泌因子によって調節されることが報告されている（非特許文献９）。破骨細胞分化および機能の調節においてある役割を果たす因子は、骨粗鬆症および他の骨の疾患を処置するのにおいて治療的であり得る。
【００１０】
ミクログリアの細胞は、中枢神経系の免疫エフェクターとして機能し、それらはまた、神経栄養因子を生じて、グルタミン酸取り込みを調節する。これらの単核の食細胞は、白質および灰白質の両方において中枢神経系の実質を通じて分布される。ミクログリアは、アルツハイマー病を有する患者において増大した数で存在し、ここでミクログリアは一酸化窒素生成ならびにＩＬ−１およびＭＩＰ１αを含む炎症性サイトカインの顕著な増大を示すことが報告されている（非特許文献１０）。ミクログリアの分化および機能を調節する因子は、アルツハイマー病、ならびに脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、脳卒中およびパーキンソン病を含む他の神経疾患を処置するのに治療的であり得る。
【００１１】
遺伝子ＭＧＣ３４６４７は、仮説的なタンパク質ＮＰ−６８９６６９をコードする（非特許文献１１）。この遺伝子およびそのコードされたポリペプチドの機能は以前には未知である。ＭＧＣ３４６４７およびＮＰ＿６８９６６９の配列は、特許文献１のそれぞれ配列番号４９および配列番号１０３に相当する。それらは、それぞれ機能が未知の分泌タンパク質のアミノ酸配列およびそのコード配列に相当する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００２／０４８３３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｏｇａｗａ、Ｂｌｏｏｄ、１９９３年、第８１巻、ｐ．３８４４〜２８５３
【非特許文献２】Ｃａｒｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９４年、第１８０巻、ｐ．１３９５〜１４０３
【非特許文献３】Ｗｕら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００３年、第９０巻、ｐ．１２７
【非特許文献４】Ｂｉｒｏｎら、Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９年、第１７巻ｐ．１８９
【非特許文献５】Ｎａｕｍｅら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４年、第４０巻、ｐ．１２８
【非特許文献６】Ｄｏｓｉｏｕら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、２００５年、第２６巻、ｐ．４４
【非特許文献７】Ｓｏｎｇら、Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄ．Ｊ．４５、２００４年、補遺、ｐ．４８〜５２
【非特許文献８】Ｓｅｒｖｅｔ−Ｄｅｌｐｒａら、ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年、第３巻、ｐ．１５
【非特許文献９】Ｍｉｙａｍｏｔｏら、Ｋｅｉｏ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００３年、第５２巻、ｐ．１〜７
【非特許文献１０】Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、２００２年、第２３巻、ｐ．３４９〜３６２
【非特許文献１１】Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００２年、第９９巻、ｐ．１６，ｐ８９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
（産業上の有用性）
免疫疾患、ガン、感染性疾患および免疫媒介性の再発性流産の現在の治療は、不適切で、不十分でかつしばしば毒性である。これらの状態に対する先天性の免疫応答の有効性を増大する新規な治療化合物および治療剤は、さらに十分な治療を提供し得、そして現在の治療剤よりも良好な治療係数を有し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（表の簡単な説明）
表１は、配列表に列挙される、配列番号１〜２７１に関する情報を示している。第１列は、内部の指定識別番号（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）（ＦＰ  ＩＤ）を示す。第２列は、核酸配列（配列番号１）のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列識別番号（配列番号：（Ｎ１））を示す。第３列は、ポリペプチド配列のアミノ酸配列識別番号（配列番号：（Ｐ１））を示す。第４列は、コード領域および非コード領域を含む、核酸配列全体のヌクレオチド配列識別番号（配列番号：Ｎ０））を示す。第５列は、対応する命名またはＮＣＢＩアクセッション番号（Ｓｏｕｒｃｅ  ＩＤ）を示す。第６列は、配列のタイプ、例えば、機能またはベクターの組成（Ｔｙｐｅ）を示す。
【００１６】
表２は、最大程度の類似性を有する公的に開示された配列であるＮＰ−６８９６６９に対してＭＧＤ−ＣＳＦをアノテーションする。第１行は内部の指定識別番号（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）（ＦＰ  ＩＤ）を示す。第２行は、クローンの識別番号（Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ）を示す。第３行は、ポリペプチドの予測長さをアミノ酸残基の数で示す（Ｐｒｅｄ  Ｐｒｏｔ  Ｌｅｎ）。第４行は、ＮＣＢＩの公的データベースに見出されるトップのヒトのヒットの公的なアクセッション識別番号（Ｔｏｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｉｏｎ  Ｎｏ）を示す。第５行は、第４行において示されるトップのヒトのヒットのアノテーション（Ｔｏｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｔ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を示す。第６行は、アミノ酸残基の数におけるこのトップのヒトのヒットの長さ（Ｔｏｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｔ  Ｌｅｎ）を示す。第７行は、ＦＰ  ＩＤによって示されるクエリー配列とトップのヒトのヒットとの間のアミノ酸残基の数におけるマッチの長さ（Ｍａｔｃｈ  Ｌｅｎ）を示す。第８行は、発現されたＦＰ  ＩＤアミノ酸配列の長さにまたがるＦＰ  ＩＤとトップのヒトのヒットとの間の同一性パーセントをパーセンテージとして示す（Ｑｕｅｒｙ  ＬｅｎにまたがるＴｏｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｔ  ＩＤ％（Ｔｏｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｔ  ％  ＩＤ  ｏｖｅｒ
Ｑｕｅｒｙ  Ｌｅｎ））。第９行は、トップのヒトヒットの長さにまたがるＦＰ  ＩＤとトップのヒトのヒットとの間の同一性パーセント（Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｔ  ＬｅｎにまたがるＩＤ％（％  ＩＤ  ｏｖｅｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｔ  Ｌｅｎ））を示す。
【００１７】
表３は、ＭＧＤ−ＣＳＦおよびＮＣＢＩ  ＮＰ＿６８９６６９のタンパク質配置を示す。第１行は、ポリペプチドの内部の指定ＩＤ番号（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ＩＤ  ｎｕｍｂｅｒ）（ＦＰ  ＩＤ）を示す。第２行は、クローン識別番号またはポリペプチドのＮＣＢＩアクセッション番号（Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ）を示す。第３行は、このポリペプチドの内部クラスター識別番号（ＣＬｕｓｔｅｒ）を示す。第４行は、ＮＰ−６８９６６９が分泌されることを示す（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）。第５行は、予測タンパク質長をアミノ酸残基の数で示す（Ｐｒｅｄ  Ｐｒｏｔ  Ｌｅｎ）。第６行は、ＦＰ  ＩＤが分泌される確率を予測する内部パラメーターを示しており、ここで「１」は、このポリペプチドが分泌される可能性が高く、そして「０」は、分泌の可能性が低い（Ｔｒｅｅｖｏｔｅ）。第７行は、シグナルペプチドの配置の位置（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｏｒｄｓ）を示す。第８行は、アミノ酸数が１である全長ポリペプチドのＮ末端で第一のアミノ酸残基を有する成熟ポリペプチドのタンパク質配置を示す（Ｍａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉ  Ｃｏｏｒｄｓ）。
【００１８】
表４は、表１に示される分泌リーダー配列のアノテーションを示す。第１列は、このポリペプチドの内部の指定ＩＤ番号（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ＩＤ  ｎｕｍｂｅｒ）（ＦＰ  ＩＤ）を示す。第２列は、参照識別番号（Ｓｏｕｒｃｅ  ＩＤ）を示す。第３列は、この配列のＮＣＢＩアノテーションを示す。
【００１９】
表５は、表１に示されるＭＧＤ−ＣＳＦ構築物のアノテーションを提供する。第１列は、クローン識別番号（Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ）を示す。第２列は、ＮＣＢＩアノテーション（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を示す。第３列は、ベクターのリストを示す（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）。第４列は、もしあれば、タグを列挙する（Ｔａｇ）。
【００２０】
表６は、実施例９Ｃにさらに記載されるように、インビトロでの骨髄細胞増殖に対するＭＧＤ−ＣＳＦ構築物の効果を示す。第１列は、クローン識別番号（Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ）を示す。第２列は、このクローンのアミノ酸配列を示す。第３行は、単球増殖を刺激する各々のクローンの活性の力価の半定量的描写（Ｐｏｔｅｎｃｙ）を示す。第４行は、各々の構築物の発現の程度の半定量的な描写（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。
【００２１】
表７は、インビボでの骨髄細胞増殖に対するＭＧＤ−ＣＳＦ構築物の効果を示す。表７Ａは、骨髄細胞増殖に対して３つをコントロールベクターで、３つをヒトＭＧＤ−ＣＳＦ構築物とした、６匹のマウスの群に注射した結果を示している。表７Ｂは、６つをコントロールベクターで、６つをマウスＭＧＤ−ＣＳＦとした、１２匹のマウスの群に注射した結果を示している。表７Ａでも表７Ｂでも両方とも、第１列は、動物の識別番号を挙げており（Ａｎｉｍａｌ  ＩＤ）、第２列は、ベクターをコントロールまたはＭＧＤ−ＣＳＦとして（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）記載し、そして第３列は、末梢血中の単球の数を示す（単球／μｌ）。
【００２２】
表８は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３チッププローブを用いてＧｅｎｅＬｏｇｉｃ
データベースを問い合わせることによって決定したＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子の発現を示す。第１列は、ＭＧＣ３４６４７が過剰発現された疾患を列挙する（Ｄｉｓｅａｓｅ）。第２列は、第１列の疾患に関連する特異的な病理を列挙する（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）。第３列は、ＭＧＣ３４６４７の存在について陽性と試験された疾患種の数を示す（ＭＧＣ３４６４７陽性）。カラム４は、検査された標本の数を挙げている（Ｔｏｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ）。第５列は、陽性であった、検査された標本の割合（％Ｔｏｔａｌ）を挙げている。第６列および第７列は、３つの急性前骨髄球性白血病サンプル（検査した総数の１３％）が、骨髄由来であったことを示す。
【００２３】
（要旨）
ＭＧＤ−ＣＳＦは、単球、顆粒球、樹状細胞およびＮＫ細胞の増殖、生存および／または分化を促進する。従って、ＭＧＤ−ＣＳＦは、腫瘍細胞と戦うＮＫ細胞、単球、マクロファージ、顆粒球および樹状細胞のような免疫細胞の増殖および／または活性化を刺激する能力を通じてガンを処置するためのタンパク質治療剤としての用途を見出す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ガンを処置するために、単独で、または治療用のモノクローナル抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ）と組み合わせて用いられ得る。なぜなら、ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＮＫ細胞、単球または顆粒球によって媒介される抗体依存性の細胞傷害性を促進し得るからである。ＭＧＤ−ＣＳＦはまた、化学療法および骨髄移植に対する補助的な造血系再生を果たすための拮抗的な治療タンパク質として用いられ得る。これはさらに、インビボまたはエキソビボにおいて樹状細胞の数を増やすために用いられ得る。さらに、ＭＧＤ−ＣＳＦは、細菌またはウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））によって生じる疾患のような感染性疾患の処置における抗感染性因子として有用であり得る。
【００２４】
ＭＧＤ−ＣＳＦは、免疫細胞の増殖および／または分化を促進し、従って免疫疾患の処置において用途を見出す。これは、自己免疫疾患の発症および処置においてある役割を果たし得る。ＭＧＤ−ＣＳＦアンタゴニストは、免疫疾患を処置するための治療剤として開発され得る。アンタゴニストとしては、ＭＧＤ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体；可溶性レセプターを含むＭＧＤ−ＣＳＦレセプター；非機能的な変異体；アンチセンスＤＮＡ；およびＲＮＡｉを挙げることができる。
【００２５】
本発明は、配列番号１、２、３および５から選択される第一のヌクレオチド配列を含む第一のポリヌクレオチド；配列番号７、８、９および１１から選択される第一のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；この第一のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；ならびにこれらのいずれかの生物学的に活性なフラグメントを含む単離された核酸分子を提供する。ある実施形態では、この生物学的に活性なポリペプチドフラグメントは、配列番号７、８、９および１１から選択される少なくとも６つの連続するアミノ酸残基を含み、この連続する６つのアミノ酸残基のうち少なくとも２つがそれぞれアミノ酸残基位置８０および８１のロイシン残基およびアルギニン残基である。この単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、ｍＲＮＡ分子、アンチセンス分子およびリボザイムから選択され得る。ある実施形態では、この核酸分子はさらにその相補体を含む。
【００２６】
ある実施形態では、この第一のヌクレオチド配列は配列番号３である。この実施形態はさらに、第二のポリヌクレオチドを含み得る。この第二のポリヌクレオチドは、相同なまたは異種の分泌リーダーをコードする第二のヌクレオチド配列を含み得る。この分泌リーダーは、配列番号１４〜２１１より選択され得る。
【００２７】
本発明はまた、上記の単離された核酸分子に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％同一な核酸分子を提供する。本発明は、配列番号１、２もしくは３に示される配列に対して、または配列番号１、２、３および５に示される配列の相補体に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子であって、この核酸分子が顆粒球、単球および樹状細胞の増殖および分化を刺激し得る、ポリペプチドをコードする、核酸分子を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、配列番号７、８、９および１１から選択される第一のアミノ酸配列と；配列番号１、２、３および５によってコードされる配列と；それらのいずれかの生物学的に活性なフラグメントとを含む単離されたポリペプチドを提供する。この単離されたポリペプチドは、細胞培養物、例えば細菌の細胞培養物、哺乳動物細胞培養物、昆虫細胞培養物、もしくは酵母細胞培養物中に、または細胞培養培地中に存在し得る。この単離されたポリペプチドはまた、植物または非ヒト動物に存在し得る。
【００２９】
ある実施形態では、この生物学的に活性なフラグメントは、配列番号７、８、９および１１から選択される少なくとも６つの連続するアミノ酸残基を含み、この連続する６つのアミノ酸残基のうち少なくとも２つが配列番号５のアミノ酸残基８０および８１のロイシンおよびアルギニンである。
【００３０】
本発明はさらに、配列番号７、８、９および１１から選択される第一のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％相同な単離されたポリペプチド；配列番号１、２、３および５によってコードされる配列；ならびにこれらのいずれかの生物学的に活性なフラグメントを提供する。
【００３１】
本発明は、配列番号７、８、９および１１から選択される第一のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配列番号１、２、３および５によってコードされる配列；ならびにこれらのいずれかの生物学的に活性なフラグメントであって、さらに第二のアミノ酸配列を含み、この第二のアミノ酸配列が相同な分泌性リーダーまたは異種の分泌性リーダーであって、この第一および第二のアミノ酸配列が作動可能に連結されている、フラグメントを提供する。この分泌性リーダー配列は、配列番号１４〜２１１より選択され得る。
【００３２】
本発明はまた、上記の核酸分子およびその発現を調節するプロモーターを含むベクターを提供する。このベクターは、ウイルスベクターであってもまたはプラスミドベクターであってもよい。このプロモーターは、この核酸分子に対して天然に近接していてもよいし、または、この核酸分子に対して天然に近接していなくてもよい。これは、誘導性プロモーターであっても、条件活性化プロモーターであっても、構成的プロモーターであっても、そして／または組織特異的プロモーターであってもよい。
【００３３】
さらに、本発明は、細胞および上記の１つ以上の単離された核酸、ポリペプチドまたはベクターを含む組み換え宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、原核生物細胞であっても、または真核生物細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、昆虫細胞、魚細胞、植物細胞または真菌細胞であってもよい。ある実施形態では、この哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞株または２９３細胞株、例えば、２９３Ｔ細胞または２９３Ｅ細胞である。
【００３４】
本発明はさらに、本発明の単離された核酸またはポリペプチドを注入された非ヒト動物を提供する。この動物は、例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ウサギ、イヌまたはブタであってもよい。
【００３５】
本発明はなおさらに、本発明の単離された核酸分子およびキャリアを含む核酸組成物を提供する。本発明は、本発明の単離されたポリペプチドおよびキャリアを含むポリペプチド組成物を提供する。本発明は、本発明のベクターおよびキャリアを含むベクター組成物を提供する。本発明は、本発明の宿主細胞およびキャリアを含む宿主細胞組成物を提供する。ある実施形態では、このキャリアは薬学的に受容可能なキャリアである。
【００３６】
別の局面では、本発明は、組み換え宿主細胞を生成する方法を提供し、この方法は、本発明の単離された核酸分子を含むベクターを提供する工程と、細胞をこのベクターと接触させて、この核酸分子でトランスフェクトされた組み換え宿主細胞を形成させる工程とを包含する。
【００３７】
本発明は、ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、本発明の単離された核酸分子を提供する工程と、発現系においてこの核酸分子を発現してポリペプチドを生成する工程とを包含する。ある実施形態では、この発現系は細胞発現系、例えば、原核生物発現系または真核生物発現系である。この発現系は、組み換え宿主細胞を形成する、本発明の単離された核酸分子でトランスフェクトされた宿主細胞を包含してもよく、さらに、組み換え宿主細胞を培養してポリペプチドを生成する工程を包含する。ある実施形態では、この発現系は、コムギ胚芽溶解物、ウサギ網状赤血球、リボソームディスプレイおよびＥ．ｃｏｌｉ溶解物由来の無細胞発現系である。
【００３８】
本発明はまた、このような方法によって生成されるポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、上記のような真核生物発現系であって、宿主細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞および細菌細胞から選択される発現系によって生成されるポリペプチドを提供する。
【００３９】
さらに別の局面では、本発明は、本発明の単離された核酸分子と、この核酸分子またはその相補体を検出するためのレポーターと、ビヒクルとを含む組成物を備える診断キットを提供する。本発明は、本発明の単離されたポリペプチドに特異的に結合する抗体およびキャリアを含む診断キットを提供する。本発明はまた、本発明の単離されたポリペプチドおよびキャリアを含む診断キットを提供する。
【００４０】
さらなる局面では、本発明は、患者サンプルにおいて本発明の単離されたポリペプチドに特異的な抗体の存在を検出する方法を提供し、この方法は、本発明の単離されたポリペプチドを含む組成物を提供する工程と、このポリペプチドをこのサンプルと相互作用させる工程と、もし存在するなら、このサンプル中でこのポリペプチドと抗体との間に相互作用が生じたか否かを決定する工程とを包含する。
【００４１】
なお更なる局面においては、本発明は、配列番号７〜１２より選択される少なくとも６つの連続するアミノ酸残基を含む抗原に特異的に結合するか、そして／またはその抗原の活性を邪魔する、単離された抗体を提供する。例えば、これらの連続するアミノ酸残基は、配列番号７のアミノ酸位置８０および８１で保存的アミノ酸残基ｌｅｕ−ａｒｇ、または配列番号１２の保存的アミノ酸残基ｌｅｕ−ｇｌｎ−ａｒｇを含んでもよい。この抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体およびこれらのいずれかの活性なフラグメント、例えば、抗原結合フラグメント、Ｆｃフラグメント、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメントおよびフレームワークフラグメントから選択され得る。
【００４２】
本発明はまた、少なくとも１つの融合パートナーをさらに含む、上記のような単離されたポリペプチドを提供する。一例として、この融合パートナーは、ポリマー、ポリペプチド、スクシニル基、フェチュインＡ、フェチュインＢ、ロイシンジッパードメイン、テトラネクチン三量体形成ドメイン、マンノース結合タンパク質およびＦｃ領域から選択され得る。このポリマーは、例えば、ポリペプチドのアミノ酸のアミノ基を介して結合され得るポリエチレングリコール部分であってもよい。このポリエチレングリコール部分は、分枝したポリマーであっても直鎖のポリマーであってもよい。
【００４３】
本発明はさらに、本発明の単離されたポリペプチドの活性を調節する因子をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、本発明の単離されたポリペプチドが生物学的活性に影響する試験系を提供する工程と；この試験系において本発明の単離されたポリペプチドの活性に対する影響について複数の因子をスクリーニングする工程とを包含する。この修飾因子は例えば、低分子薬物であってもよい。この修飾因子はまた、例えば、抗体であってもよい。
【００４４】
本発明はさらに、免疫細胞を刺激する方法を提供し、この方法は、請求項７〜１２のいずれかから選択される実質的に純粋なポリペプチド、およびその活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程と；１つ以上の免疫細胞とこのポリペプチドとを接触させる工程と；を包含する。このポリペプチドは、配列番号１〜６より選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ得る。適切な免疫細胞としては、顆粒球；単球；リンパ球、例えば、ＮＫ細胞；マクロファージ；末梢血単核球；および樹状細胞が挙げられる。
【００４５】
本発明はなおさらに、免疫細胞の集団を増大させる方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２より選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程と；１つ以上の免疫細胞または免疫細胞前駆体とこのポリペプチドとを接触させる工程と；を包含する。このポリペプチドは、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ得る。適切な免疫細胞集団としては、顆粒球；単球；リンパ球、例えば、ＮＫ細胞；マクロファージ；および末梢血単核球の集団が挙げられる。
【００４６】
本発明はさらに、被験体における免疫応答を刺激する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２より選択されるポリペプチドをコードする実質的に純粋なポリヌクレオチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程と；この組成物をこの被験体に投与する工程とを包含する。このポリペプチドは、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ得る。このポリペプチドは、局所的に投与されても全身的に投与されてもよい。これは、静脈内に、浣腸によって、腹腔内的に、皮下的に、局所的にまたは経皮的に投与され得る。
【００４７】
本発明は、ガン治療を受けている被験体において免疫細胞を増大する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２のうちのいずれかから選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程と；この被験体に対してこの組成物を投与する工程とを包含する。このポリペプチドは、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ得る。適切な免疫細胞集団としては、単球；リンパ球、例えば、ＮＫ細胞；マクロファージ；および末梢血単核球の集団が挙げられる。ガン治療は、化学療法および／または放射線療法であっても、それを含んでもよい。このポリペプチドは骨髄移植後に投与されてもよい。
【００４８】
本発明はまた、被験体におけるガンを処置または予防する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程と；この被験体に対してこの組成物を投与する工程とを包含する。
【００４９】
本発明はさらに、被験体において腫瘍増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程とこの被験体に対してこの組成物を投与する工程とを包含する。この腫瘍とは、ヒト腫瘍細胞、例えば、固体腫瘍細胞または白血病腫瘍細胞を挙げることができる。
【００５０】
本発明はなおさらに、被験体における感染を処置または予防する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程と；この被験体に対してこの組成物を投与する工程とを包含する。このポリペプチドは、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ得る。この方法は、例えば、細菌感染、マイコプラズマ感染、真菌感染、ウイルス感染、細胞内病原体および／または細胞内寄生生物を処置または予防し得る。この方法は、この被験体に対してこの組成物を局所的にまたは全身的に投与することによって、実行され得る。
【００５１】
さらに、本発明は、被験体において免疫応答を調節する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択されるポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントの修飾因子を提供する工程と；この被験体に対してこの修飾因子を投与する工程とを包含する。この修飾因子は、例えば、抗体、可溶性レセプター、および／またはポリペプチドであってもよい。適切な抗体修飾因子としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントが挙げられる。この修飾因子はまた、例えば、アプタマー、ＲＮＡｉ、アンチセンス分子、および／またはリボザイムであってもよい。この方法は、例えば、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を抑制することによって免疫応答を調節し得る。この方法はまた、例えば、関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症、心筋梗塞、脳卒中および／または劇症肝不全を処置または予防することによって免疫応答を調節し得る。
【００５２】
本発明は、妊娠に対する免疫応答を調節する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択されるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントの修飾因子を提供する工程と；この修飾因子をこの被験体に投与する工程とを包含する。この方法は、例えば、免疫応答を調節して再発性の流産を減少させ得る。
【００５３】
本発明は、被験体においてワクチンに対する免疫応答を増強する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含むポリペプチド組成物を提供する工程と；ワクチン組成物を提供する工程と；この被験体に対してこのポリペプチド組成物およびワクチン組成物を投与する工程とを包含する。このポリペプチド組成物は、ワクチン組成物を投与する前に、実質的に同時に、または後に被験体に投与され得る。
【００５４】
本発明はまた、被験体において炎症性疾患を処置または予防する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択されるポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントの修飾因子を提供する工程と；この被験体に対してこの修飾因子を投与する工程とを包含する。この修飾因子は、例えば、アプタマー、ＲＮＡｉ、アンチセンス分子、および／またはリボザイムであってもよい。この修飾因子はまた、例えば、抗体、可溶性レセプター、および／またはポリペプチドであってもよい。適切な抗体修飾因子としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントが挙げられる。
【００５５】
本発明はさらに、被験体における自己免疫疾患を処置または予防する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択されるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントの修飾因子を提供する工程と；この修飾因子をこの被験体に投与する工程とを包含する。この修飾因子は、例えば、アプタマー、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、および／またはリボザイムであってもよい。この修飾因子はまた、例えば、抗体、可溶性レセプターおよび／またはポリペプチドであってもよい。適切な抗体修飾因子としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントが挙げられる。
【００５６】
本発明はなおさらに、被験体におけるＮＫ細胞の数を増大する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択されるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを提供する工程と；このポリペプチドをこの被験体に投与する工程とを包含する。
【００５７】
本発明は、被験体におけるＮＫ細胞集団を調節する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択されるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントの修飾因子を提供する工程と；この修飾因子をこの被験体に投与する工程とを包含する。この修飾因子は、例えば、アプタマー、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、および／またはリボザイムであってもよい。この修飾因子はまた、例えば、抗体、可溶性レセプターおよび／またはポリペプチドであってもよい。適切な抗体修飾因子としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントが挙げられる。ある実施形態では、ＮＫ細胞集団が免疫応答を刺激する。ある実施形態では、ＮＫ細胞集団が流産を抑制する。ある実施形態では、ＮＫ細胞集団が抗癌応答を刺激する。
【００５８】
本発明はまた、造血幹細胞の集団を増大する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程と；この造血幹細胞の集団とこのポリペプチドとを接触を接触させる工程とを包含する。
【００５９】
本発明はさらに、細胞の集団に対して細胞保護作用を提供する方法を提供し、この方法は、配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程と；細胞のこの集団とこのポリペプチドとを接触させる工程とを包含する。
【００６０】
免疫応答を調節または増強する、疾患を処置または予防する、ＮＫ細胞の数を増大する、ＮＫ細胞の集団を調節する、造血幹細胞の集団を増大する、そして細胞保護を提供するための方法は、例えば、上記の組成物を局所的にまたは全身的に投与することによって行われ得る。それらはまた、上記のポリペプチド組成物であって、ポリペプチドが配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを提供することによって行われ得る。それらはさらに、上記のポリペプチド組成物であって、ポリペプチドがさらに少なくとも１つの融合パートナーを含むポリペプチド組成物を提供することによって行われてもよい。例えば、この融合パートナーは、ポリマー、ポリペプチド、スクシニル基、フェチュインＡ、フェチュインＢ、ロイシンジッパードメイン、テトラネクチン三量体化ドメイン、マンノース結合タンパク質およびＦｃ領域から選択されてもよい。このポリマーは、ポリエチレングリコール部分であってもよく、この部分は、例えば、ポリペプチドのアミノ酸のアミノ基を介して結合してもよい。このポリエチレングリコール部分は、分枝したポリマーであっても、または直鎖ポリマーであってもよい。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
単離された核酸分子であって、
（ａ）配列番号１、２、３および５；
（ｂ）配列番号７、８、９および１１から選択される第一のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；
（ｃ）該（ａ）の第一のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；ならびに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の生物学的に活性なフラグメント、
から選択される第一のヌクレオチド配列を含む第一のポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
（項目２）
前記生物学的に活性なポリペプチドフラグメントが、配列番号７、８、９および１１から選択される少なくとも６つの連続するアミノ酸残基を含み、該連続する６つのアミノ酸残基のうち少なくとも２つが、それぞれアミノ酸残基位置８０および８１のロイシン残基およびアルギニン残基である、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
前記核酸分子が、ｃＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、ｍＲＮＡ分子、アンチセンス分子およびリボザイムから選択される、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）
さらにその相補体を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目５）
前記第一のヌクレオチド配列が配列番号３である、項目１に記載の核酸分子。
（項目６）
項目１に記載の核酸分子に対して少なくとも約７０％同一である、核酸分子。
（項目７）
項目１の核酸分子に対して前記分子が少なくとも約８０％同一である、項目６に記載の核酸分子。
（項目８）
前記分子が項目１に記載の核酸分子に対して少なくとも約９０％同一である、項目７に記載の核酸分子。
（項目９）
配列番号１、２または３に記載の配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子であって、該核酸分子が顆粒球、単球および樹状細胞の増殖および分化を刺激し得る、ポリペプチドをコードする、核酸分子。
（項目１０）
配列番号１、２、３および５に示される配列の相補体に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子であって、該核酸分子が顆粒球、単球および樹状細胞の増殖および分化を刺激し得る、ポリペプチドをコードする、核酸分子。
（項目１１）
さらに第二の配列を含む、項目５に記載の核酸分子。
（項目１２）
前記第二のポリヌクレオチド配列が、同種または異種の分泌性リーダーをコードする、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１３）
前記分泌性リーダーが異種である、項目１２に記載の核酸分子。
（項目１４）
前記分泌性リーダーが配列番号１４〜２１１から選択される、項目１２に記載の核酸分子。
（項目１５）
配列番号７、８、９および１１から選択される第一のアミノ酸配列；配列番号１、２、３および５によってコードされる配列から選択される配列；ならびにそれらのいずれかの生物学的に活性なフラグメントを含む、単離されたポリペプチド。
（項目１６）
前記生物学的に活性なフラグメントが、配列番号７、８、９および１１から選択される少なくとも６つの連続するアミノ酸残基を含み、該連続する６つのアミノ酸残基のうち少なくとも２つが配列番号５のアミノ酸残基８０および８１のロイシンおよびアルギニンである、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記ポリペプチドが細胞培養物中に存在する、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ポリペプチドが細胞培養培地に存在する、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記細胞培養物が、細菌細胞培養物、哺乳動物細胞培養物、昆虫細胞培養物および酵母細胞培養物から選択される、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記ポリペプチドが、植物または非ヒト動物に存在する、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記第一のアミノ酸配列が、配列番号９に記載のアミノ酸配列である、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記第一のアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸配列であり、位置１６７のシステイン残基が、セリンまたはアラニン残基によって置換される、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目２３）
項目１５に記載のポリペプチドに対して少なくとも約７０％および／または少なくとも約８０％相同であるポリペプチド。
（項目２４）
前記ポリペプチドが、項目１５に記載のポリペプチドに対して少なくとも約９０％相同である、項目２３に記載のポリペプチド。
（項目２５）
第二のアミノ酸配列をさらに含み、該第二のアミノ酸配列が、相同な分泌性リーダーまたは異種の分泌性リーダーであって、第一および第二のアミノ酸配列が作動可能に連結されている、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記分泌性リーダー配列が異種のリーダー配列である、項目２５に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記異種のリーダー配列が配列番号１４〜２１１より選択される、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２８）
項目１に記載の核酸分子および該核酸分子の発現を調節するプロモーターを含む、ベクター。
（項目２９）
前記ベクターが、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターである、項目２８に記載のベクター。
（項目３０）
前記プロモーターが、前記核酸分子に対して天然に近接しているプロモーターおよび前記核酸分子に対して天然には近接していないプロモーターから選択される、項目２８に記載のベクター。
（項目３１）
前記プロモーターが、誘導性プロモーター、条件的活性化プロモーター、構成的プロモーターおよび組織特異的プロモーターから選択される、項目２８に記載のベクター。
（項目３２）
項目１もしくは項目５に記載の細胞、および核酸、項目１５もしくは項目２５に記載のポリペプチド、および／または項目２８に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
（項目３３）
前記細胞が原核生物細胞である、項目３２に記載の宿主細胞。
（項目３４）
前記細胞が真核生物細胞である、項目３２に記載の宿主細胞。
（項目３５）
前記真核生物細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、昆虫細胞、魚細胞、植物細胞および真菌細胞から選択される、項目３４に記載の宿主細胞。
（項目３６）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目３２に記載の宿主細胞。
（項目３７）
前記哺乳動物細胞が２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株の細胞である、項目３６に記載の宿主細胞。
（項目３８）
前記細胞が２９３細胞である、項目３７に記載の宿主細胞。
（項目３９）
前記２９３細胞が２９３Ｔ細胞または２９３Ｅ細胞である、項目３８に記載の宿主細胞。
（項目４０）
項目１に記載の核酸分子、または項目１５に記載のポリペプチドを注入された非ヒト動物。
（項目４１）
前記動物がげっ歯類、非ヒト霊長類、ウサギ、イヌまたはブタである、項目４０に記載の動物。
（項目４２）
項目１または項目５に記載の核酸分子およびキャリアを含む、核酸組成物。
（項目４３）
項目１５に記載のポリペプチド分子およびキャリアを含む、ポリペプチド組成物。
（項目４４）
項目２８に記載のベクターおよびキャリアを含む、ベクター組成物。
（項目４５）
項目３２に記載の宿主細胞およびキャリアを含む、宿主細胞組成物。
（項目４６）
前記キャリアが薬学的に受容可能なキャリアである、項目４２に記載の組成物。
（項目４７）
前記キャリアが薬学的に受容可能なキャリアである、項目４３に記載の組成物。
（項目４８）
前記キャリアが薬学的に受容可能なキャリアである、項目４４に記載の組成物。
（項目４９）
前記キャリアが薬学的に受容可能なキャリアである、項目４５に記載の組成物。
（項目５０）
組み換え宿主細胞を生成する方法であって：
（ａ）項目１または項目３に記載の核酸分子を含むベクターを提供する工程；および
（ｂ）細胞を該ベクターと接触させて、該核酸分子でトランスフェクトされた組み換え宿主細胞を形成させる工程；
を包含する、方法。
（項目５１）
ポリペプチドを生成する方法であって：
（ａ）項目１または項目３に記載の核酸分子を提供する工程；および
（ｂ）発現系において該核酸分子を発現して、該ポリペプチドを生成する工程
を包含する、方法。
（項目５２）
前記発現系が細胞発現系である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞発現系が原核生物発現系である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記細胞発現系が真核生物発現系である、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
項目５１に記載の方法であって、前記発現系が、組み換え宿主細胞を形成する、項目１に記載の核酸分子でトランスフェクトされた宿主細胞を含み、そして該方法は、該組み換え宿主細胞を培養して前記ポリペプチドを生成する工程をさらに包含する、方法。
（項目５６）
前記発現系がコムギ胚芽溶解物、ウサギ網状赤血球、リボソームディスプレイおよびＥ．ｃｏｌｉ溶解物由来の無細胞発現系である、項目５１に記載の方法。
（項目５７）
項目５１に記載の方法によって生成される、ポリペプチド。
（項目５８）
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞および細菌細胞から選択される、項目５４に記載の方法によって生成される、ポリペプチド。
（項目５９）
項目１に記載の核酸分子、該核酸分子またはその相補体を検出するためのレポーター、およびビヒクルを含む組成物を含む、診断キット。
（項目６０）
項目１５に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびキャリアを含む診断キット。
（項目６１）
項目１５に記載のポリペプチドおよびキャリアを含む診断キット。
（項目６２）
患者サンプル中の項目１５に記載のポリペプチドに特異的な抗体の存在を決定する方法であって：
（ａ）項目１５に記載のポリペプチドを含む組成物を提供する工程；
（ｂ）前記ポリペプチドを前記サンプルと相互作用させる工程；
（ｃ）存在する場合、該サンプル中で該ポリペプチドと該抗体との間に相互作用が生じたか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（項目６３）
配列番号７〜１２より選択される少なくとも６つの連続するアミノ酸残基を含む抗原に特異的に結合するか、そして／またはその抗原の活性を妨害する、単離された抗体。
（項目６４）
前記連続するアミノ酸残基が、配列番号７のアミノ酸位置８０および８１で保存的アミノ酸残基ｌｅｕ−ａｒｇ、または配列番号１２の連続したアミノ酸残基ｌｅｕ−ｇｌｎ−ａｒｇを含む、項目６３に記載の抗体。
（項目６５）
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体およびこれらのいずれかの活性なフラグメントから選択される、項目６３に記載の抗体。
（項目６６）
抗原結合フラグメント、Ｆｃフラグメント、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメントおよびフレームワークフラグメントから選択される、項目６５に記載の活性フラグメント。
（項目６７）
前記ポリペプチドが少なくとも１つの融合パートナーをさらに含む、項目１５に記載のポリペプチド、または項目５１〜５６のいずれかに記載の方法によって生成されるポリペプチド。
（項目６８）
前記融合パートナーが、ポリマー、ポリペプチド、スクシニル基、フェチュインＡ、フェチュインＢ、ロイシンジッパードメイン、テトラネクチン三量体形成ドメイン、マンノース結合タンパク質およびＦｃ領域から選択される、項目６７に記載のポリペプチド。
（項目６９）
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール部分である、項目６８に記載のポリペプチド。
（項目７０）
前記ポリエチレングリコール部分が、前記ポリペプチドのアミノ酸のアミノ基を介して結合される、項目６９に記載のポリペプチド。
（項目７１）
前記ポリエチレングリコール部分が分枝しているか、または直鎖ポリマーである、項目６９に記載のポリペプチド。
（項目７２）
項目１５に記載のポリペプチドの活性を調節する因子をスクリーニングする方法であって：
（ａ）項目１５に記載のポリペプチドが生物学的活性に影響する試験系を提供する工程；および
（ｂ）該試験系において項目１５に記載のポリペプチドの活性に対する影響について複数の因子をスクリーニングする工程；
を包含する、方法。
（項目７３）
前記調節因子が低分子薬物である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記調節因子が抗体である、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
免疫細胞を刺激する方法であって：
（ａ）項目７〜１２のいずれかから選択される実質的に純粋なポリペプチド、およびその活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）１つ以上の免疫細胞と該ポリペプチドとを接触させる工程；
を包含する、方法。
（項目７６）
前記免疫細胞が顆粒球、単球、リンパ球、マクロファージ、末梢血単核球、または樹状細胞である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記リンパ球がＮＫ細胞である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記ポリペプチドが、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、項目７５に記載の方法。
（項目７９）
免疫細胞の集団を増大させる方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２より選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）１つ以上の免疫細胞または免疫細胞前駆体と該ポリペプチドとを接触させる工程；
を包含する、方法。
（項目８０）
前記免疫細胞の集団が、単球の集団、リンパ球の集団、マクロファージの集団、または末梢血単核球の集団である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記リンパ球がＮＫ細胞である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記ポリペプチドが、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、項目７９に記載の方法。
（項目８３）
被験体における免疫応答を刺激する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２より選択されるポリペプチドをコードする実質的に純粋なポリヌクレオチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）該組成物を該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
（項目８４）
前記ポリペプチドが局所的にまたは全身的に投与される、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記ポリペプチドが、静脈内、浣腸によって、腹腔内、皮下、局所的または経皮的に投与される、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記ポリペプチドが、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、項目８３に記載の方法。
（項目８７）
ガン治療を受けている被験体において免疫細胞を増大する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２のいずれかのうちから選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）該被験体に対して該組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目８８）
前記免疫細胞が、単球、リンパ球、マクロファージ、または末梢血単核球細胞である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記リンパ球がＮＫ細胞である、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記ガン治療が、化学療法および放射線療法から選択される、項目８７に記載の方法。
（項目９１）
前記ポリペプチドが骨髄移植後に投与される、項目８７に記載の方法。
（項目９２）
前記ポリペプチドが、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、項目８７に記載の方法。
（項目９３）
被験体におけるガンを処置または予防する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）該被験体に対して該組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目９４）
被験体において腫瘍増殖を阻害する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）該被験体に対して該組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目９５）
前記腫瘍が、ヒト腫瘍細胞を含む、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記ヒト腫瘍細胞が、固体腫瘍細胞または白血病腫瘍細胞である、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
被験体における感染を処置または予防する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）該被験体に対して該組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目９８）
前記感染が、細菌感染、マイコプラズマ感染、真菌感染、ウイルス感染、細胞内病原体および細胞内寄生生物から選択される、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記組成物が前記被験体に対して局所的にまたは全身的に投与される、項目９７に記載の方法。
（項目１００）
前記ポリペプチドが、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、項目９７に記載の方法。
（項目１０１）
被験体において免疫応答を調節する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択されるポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントの調節因子を提供する工程；および
（ｂ）該被験体に対して該調節因子を投与する工程
を包含する、方法。
（項目１０２）
前記調節因子が、抗体、可溶性レセプター、およびポリペプチドから選択される、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記調節因子が抗体である、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記調節因子が、アプタマー、ＲＮＡｉ、アンチセンス分子、およびリボザイムから選択される、項目１０１に記載の方法。
（項目１０５）
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントから選択される、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）
前記免疫応答の調節が炎症の抑制である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０７）
前記免疫応答の調節が自己免疫疾患の抑制である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０８）
前記免疫応答の調節が、関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症、心筋梗塞、脳卒中および劇症肝不全より選択される疾患の処置または予防である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０９）
妊娠に対する免疫応答を調節する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択されるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントの調節因子を提供する工程；および
（ｂ）該調節因子を被験体に投与する工程
を包含する、方法。
（項目１１０）
前記免疫応答の調節が再発性の流産の減少である、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
被験体においてワクチンに対する免疫応答を増強する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含むポリペプチド組成物を提供する工程；
（ｂ）ワクチン組成物を提供する工程；および
（ｃ）該被験体に対して該ポリペプチド組成物および該ワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目１１２）
前記ポリペプチド組成物が、前記ワクチン組成物を投与する前に前記被験体に投与される、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記ポリペプチド組成物が、前記ワクチン組成物を投与した後に前記被験体に投与される、項目１１１に記載の方法。
（項目１１４）
前記ポリペプチド組成物が、前記ワクチン組成物と実質的に同時に前記被験体に投与される、項目１１１に記載の方法。
（項目１１５）
被験体において炎症性疾患を処置または予防する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択されるポリペプチドおよびそれらのいずれかの活性なフラグメントの調節因子を提供する工程；および
（ｂ）該被験体に対して該調節因子を投与する工程
を包含する、方法。
（項目１１６）
前記調節因子が、アプタマー、ＲＮＡｉ、アンチセンス分子、およびリボザイムから選択される、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記調節因子が、抗体、可溶性レセプター、およびポリペプチドから選択される、項目１１５に記載の方法。
（項目１１８）
前記調節因子が抗体である、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントから選択される、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
被験体における自己免疫疾患を処置または予防する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択されるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントの調節因子を提供する工程；および
（ｂ）該調節因子を該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
（項目１２１）
前記調節因子が、抗体、アプタマー、可溶性レセプター、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイムおよびポリペプチドから選択される、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体または抗体の活性フラグメントから選択される、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
被験体におけるＮＫ細胞の数を増大する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択されるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを提供する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドを該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
（項目１２４）
被験体におけるＮＫ細胞集団を調節する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択されるポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを提供する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドを該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
（項目１２５）
前記調節因子が、抗体、アプタマー、可溶性レセプター、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイムおよびポリペプチドから選択される、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｃｄｒフラグメント、ＶＨフラグメント、ＶＣフラグメント、フレームワークフラグメント、単鎖抗体および抗体の活性フラグメントから選択される、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記ＮＫ細胞集団が免疫応答を刺激する、項目１２４に記載の方法。
（項目１２８）
前記ＮＫ細胞集団が流産を抑制する、項目１２４に記載の方法。
（項目１２９）
前記ＮＫ細胞集団が抗癌応答を刺激する、項目１２４に記載の方法。
（項目１３０）
造血幹細胞の集団を増大する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）該造血幹細胞の集団と該ポリペプチドとを接触させる工程
を包含する、方法。
（項目１３１）
細胞の集団に対して細胞保護作用を提供する方法であって：
（ａ）配列番号７〜１２から選択される実質的に純粋なポリペプチド、およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）該細胞の集団と該ポリペプチドとを接触させる工程
を包含する、方法。
（項目１３２）
前記組成物が前記被験体に対して局所的にまたは全身的に投与される、項目１０１、１０９、１１１、１１５、１２３、１２４、１３０または１３１のいずれかに記載の方法。
（項目１３３）
前記ポリペプチドが、配列番号１〜６より選択されるヌクレオチド配列およびそれらのいずれかの活性なフラグメントを含む核酸分子によってコードされる、項目１０１、１０９、１１１、１１５、１２０、１２３、１２４、１３０または１３１のいずれかに記載の方法。
（項目１３４）
前記ポリペプチドが少なくとも１つの融合パートナーをさらに含む、項目１０１、１０９、１１１、１１５、１２０、１２３、１２４、１３０または１３１のいずれかに記載の方法。
（項目１３５）
前記融合パートナーが、ポリマー、ポリペプチド、フェチュインおよび血清アルブミンから選択される、項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
ポリマーおよび／またはスクシニル基をさらに含む、項目１３４に記載の方法。
（項目１３７）
前記ポリマーがポリエチレングリコール部分である、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
前記ポリエチレングリコール部分が、前記ポリペプチドのアミノ酸のアミノ基を介して結合される、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記ポリエチレングリコール部分が分枝したポリマーまたは直鎖ポリマーである、項目１３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、実施例１にさらに記載されるような、ＭＧＤ−ＣＳＦ（ＭＧＤ−ＣＳＦ＿エキソン４）；配列番号８）、ＭＧＣ３４６４７（ＮＰ＿６８９６６９）；配列番号１０）およびＭＧＤ−ＣＳＦ配列番号７）のエキソン４のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸同一性は（＊）によって指定する。
【図２】図２は、実施例２にさらに記載されるような、哺乳動物細胞を一過性にトランスフェクトするために用いた、ｐＴＴ５−Ｇａｔｅｗａｙを生成するために用いたｐＴＴ５骨格ベクターのダイアグラムを示す。図２はまた、ｐＴＴ５−Ｇ（配列番号２７２の残基１１８２〜１２６５および２９８４〜３１２７）、ｐＴＴ５−Ｈ（配列番号２７３の残基１１８２〜１３９２および１５９７〜１６０２）およびｐＴＴ５−Ｉ（配列番号２８４および配列番号２７４の残基２９０５〜３０４８）のベクターの配列に隣接するマルチクローニング部位の核酸配列を示す。
【図３】図３は、実施例２にさらに記載されるような、哺乳動物細胞を安定にトランスフェクトするために用いたｐＴＴ２骨格ベクターのダイアグラムを示す。
【図４】図４は、実施例３および表１にさらに記載されるような、トランスフェクションの３〜６日後のプラスミドベクターでのＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。図４Ａは、２９３−６Ｅ細胞における、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＭＧＤ−ＣＳＦベクター、細胞内（細胞）および分泌された（上清）ＣＬＮ００７３２６６３の発現を示す。図４Ｂは、２９３−６Ｅ細胞における、Ｃ末端Ｈｉｓタグおよびコラーゲンリーダー配列を有するＭＧＤ−ＣＳＦベクター、細胞内（細胞）および分泌された（上清）ＣＬＮ００８１６４２４の発現を示す。図４Ａおよび図４Ｂの両方とも、発現のための正のコントロールとしてＰｏｓｉｔｏｐｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（右パネル）を示す。分子量は、左側パネルに示す。
【図５】図５は、実施例４および表１にさらに記載されるような、トランスフェクションの３〜６日後の、実施例２および表１に記載された構築物でトランスフェクトした細胞の増殖の程度および生存度を示す。図５Ａは、ＣＬＮ００５４２９４５（黒のバー）、ＣＬＮ００７３２６６３（明灰色のバー）、ＣＬＮ００８２１８６７（斜線のバー）、およびＣＬＮ００８１６４２４（格子模様のバー）でトランスフェクトした細胞、ならびに、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするコントロール遺伝子（濃灰色のバー）と比較した細胞増殖の程度を示している。ＣＬＮ００８１６４２４およびコントロールのＳＥＡＰの両方でトランスフェクトした細胞とも、実施例４にさらに記載されるとおり、トランスフェクションの３〜６日後に細胞数が増大した。図５Ｂは、ＣＬＮ００５４２９４５（黒のバー）、ＣＬＮ００７３２６６３（明灰色のバー）、ＣＬＮ００８２１８６７（斜線のバー）、およびＣＬＮ００８１６４２４（格子模様のバー）でトランスフェクトして、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするコントロール遺伝子（濃灰色のバー）でトランスフェクトした細胞と比較した細胞の生存度の割合を示している。ＣＬＮ００８１６４２４およびコントロールのＳＥＡＰ細胞でトランスフェクトした細胞は、生きたままであったが、ＭＧＤ−ＣＳＦ、ＣＬＮ００７３２６６３およびＣＬＮ００８２１８６７でトランスフェクトした細胞は、毒性の増大を示し、これは、培養条件に依存したが、遺伝子特異的ではなく、培養物中での経時的なそれらの生存度の低下によって証明された。
【図６】図６は、ＭＧＤ−ＣＳＦを発現する付着性２９３−Ｔ細胞が、実施例５にさらに記載されるとおり、低血清濃度の培養条件に適合され得ることを示す。図６Ａは、実施例５にさらに記載されるとおり、３％ＦＢＳを有するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中で、そして１％ＦＢＳを有するＨｙＱ−ＣＨＯ培地中で増殖される懸濁物２９３−Ｔ細胞の培養物中でのＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。図６Ｂは、細菌宿主から生成された精製ＭＧＤ−ＣＳＦ標準（パネル４）に比較した、低血清（パネル１）で血清の非存在下（パネル２）の懸濁培養中での、そして接着培養中での（パネル３）、ＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。
【図７】図７は、実施例６にさらに記載されるとおり、バイオリアクター中でのＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。発酵は６日間モニターした。サンプルは、ゲル電気泳動によって試験して、接種の１〜６日後にクマーシーブルー染色で染色した。分子量は左のパネルに示す。ＭＧＤ−ＣＳＦの位置は、矢印で示す。ゲル上のタンパク質の量を定量するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の漸増量を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例７にさらに記載されるとおり、２９３−Ｔ細胞からのＭＧＤ−ＣＳＦの単離を示す。細胞培養上清（Ｓｕｐｔ）をＳｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＳＰ−Ｐｏｏｌ）、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（Ｈｅｐ−Ｐｏｏｌ）、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｑ−Ｐｏｏｌ）に分画した。ＭＦＤ−ＣＳＦはグリコシル化されて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって３９ｋＤａのみかけの分子量を有する。分子量マーカーは、左のパネルに示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例８にさらに詳細に記載されるとおり、還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＦＥ条件下でのＭＧＤ−ＣＳＦの突然変異タンパク質（ムテイン）の電気泳動遊走パターンを示す。左のパネルは、ジスルフィド結合を還元する条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示しており、そして真ん中のパネルは、ジスルフィド結合を還元しない条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。野性型ＭＧＤ−ＣＳＦであって、その天然のシグナルペプチド（ｗｔ  ｎａｔＳＰ）とともに発現された野性型ＭＧＤ−ＣＳＦ、野性型ＭＧＤ−ＣＳＦであって、コラーゲンシグナルペプチド（ｗｔ  ｃｏｌＳＰ）とともに発現された野性型ＭＧＤ−ＣＳＦ、ならびにシステインからセリンへの突然変異タンパク質（ムテイン）Ｃ３５Ｓ、Ｃ１６７Ｓ、Ｃ１７６Ｓ、Ｃ１７８Ｓ、Ｃ１７９Ｓ、Ｃ１９０ＳおよびＣ１９８Ｓの変異を両方のパネルに示す。精製されたＭＧＤ−ＣＳＦを、定量および比較のための標準として右のパネルに示す。Ｃ１７９ＳおよびＣ１９０Ｓは、野性型ＭＧＤ−ＣＳＦよりも低い量で発現され、そしてＣ３５Ｓは、検出可能なレベルでは発現されなかった。
【図９】図９は、実施例９Ａにさらに記載されるように、ＭＧＤ−ＣＳＦがＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導する能力を示す。ＮＫ細胞数は、負の緩衝液コントロール（ひし形）またはＭＧＤ−ＣＳＦでトランスフェクトされた細胞由来の馴化培地（四角）に曝露した後の１ウェルあたりの相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で表した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、マウスＮＫ細胞増殖を刺激した。コントロール緩衝液は、影響なかった。ＮＫ細胞に対するＭＧＤ−ＣＳＦの増殖活性は、特異的であってかつ用量依存性であった。
【図１０】図１０は、実施例９Ａにさらに記載されるように、ＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導する因子についてのスクリーニングアッセイの結果を示す。上のパネルおよび下のパネルは、独立して行った２つの同一の実験を示す。ヒトＮＫ細胞の数は、試験因子に対する曝露後の相対ルシフェラーゼ単位（ｒｌｕ）で表す。ＭＧＤ−ＳＣＦで、またはＭＧＤ−ＣＳＦの供給源であるクラスター１９０６４７由来のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞由来の馴化培地は、ヒトＮＫ細胞の生存および／または増殖を刺激した。正のコントロールであるＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦも、ＮＫ細胞増殖を刺激した。
【図１１】図１１は、図９Ｂにさらに記載されるように、ＭＧＤ−ＣＳＦが造血幹細胞増殖を誘導する能力を示す。幹細胞の数は、血球計算器で細胞をカウントすることによって決定した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、用量依存性の方式で増殖を増大させた。ＭＧＤ−ＣＳＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）は、Ｍ−ＣＳＦよりも大きい程度まで、そしてＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦと同様の程度まで幹細胞増殖を誘導した。
【図１２Ａ】図１２は、実施例９Ｃにさらに記載されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦが骨髄球性細胞増殖を誘導する能力を示す。図１２Ａは、ＭＧＤ−ＣＳＦを含有する馴化培地が骨髄増殖を誘導する能力を、陰性コントロールの空のベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）および無関係の化合物ＣＬＮ３７３２、ＦＰＴ０２６、ＩＬ−１０および非馴化培地と；そして陽性のコントロールＧＭ−ＣＳＦと比較する。単球の数は、試験因子に対する曝露後の１ウェルあたりの相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で表した。
【図１２Ｂ】図１２は、実施例９Ｃにさらに記載されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦが骨髄球性細胞増殖を誘導する能力を示す。図１２Ｂは、精製ＧＭ−ＣＳＦ（星）およびＭＧＤ−ＣＳＦ（四角）でトランスフェクトした細胞由来の馴化培地の両方とも、ヒト単球増殖を刺激したことを示す。コントロールベクター（ひし形）は影響なかった。単球に対するＭＧＤ−ＣＳＦの増殖活性は、特異的であってかつ用量依存性であった。
【図１３】図１３は、分化抗原ＣＤ６７およびＣＤ２４の存在によって測定し、実施例１０Ａにさらに詳細に記載されるような、顆粒球分化の蛍光表示式細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。負のコントロールベクター（Ｖｅｃｔｏｒ  ＣＭ）で馴化した培地、およびＭＧＤ−ＣＳＦベクター（ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭ）で馴化した培地に対する応答における顆粒球へ分化するように誘導された造血幹細胞の数を示す。ＣＤ６７  ＦＩＴＣ（ｘ軸）は、ＣＤ６７に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ６７陽性細胞の数を示す。ＣＤ２４ＰＥ（ｙ軸）は、ＣＤ２４に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ２４陽性細胞の数を示す。線で囲んだ三角の領域（矢印）は、４つのパネルの各々における細胞表面分化抗原ＣＤ６７およびＣＤ２４の両方について陽性の細胞数を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭは、Ｇ−ＣＳＦの非存在下（サイトカインなし）および存在下の両方で顆粒球分化を刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦによるこの刺激は、Ｇ−ＣＳＦの効果と相乗的であった。
【図１４】図１４は、分化抗原ＣＤ１５およびＣＤ２４の存在によって測定し、実施例１０Ａにさらに詳細に記載されるような、顆粒球分化のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＣＤ２４ＰＥ（ｘ軸）は、ＣＤ２４に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ２４陽性細胞の数を示す。ＣＤ１５ＡＰＣ（ｙ軸）は、ＣＤ１５に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ１５陽性細胞の数を示す。各々のグラフの上の右側の枠は、ＣＤ１５およびＣＤ３４分化マーカーの両方を細胞表面上に有するそれらの細胞の割合を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、濃度依存性の様式で顆粒球分化を誘導し、ここで５００ｎｇ／ｍｌの用量では、骨髄造血幹細胞のうち８％の顆粒球への分化が生じた。
【図１５】図１５は、分化抗原ＣＤ１４およびＣＤ３の存在によって測定し、実施例１０Ｂにさらに詳細に記載されるような、単球分化のＦＡＣＳ分析の結果を示す。負のコントロールベクター（Ｖｅｃｔｏｒ  ＣＭ）で馴化した培地、およびＭＧＤ−ＣＳＦベクター（ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭ）で馴化した培地に対する応答において単球へ分化するように誘導された造血幹細胞の数を示す。ＣＤ１４ＦＩＴＣ（ｘ軸）は、ＣＤ１４に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ１４陽性細胞の数を示す。ＣＤ３ＡＰＣ（ｙ軸）は、ＣＤ３に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ３陽性細胞の数を示す。線で囲んだ卵形の領域（矢印）は、４つのパネルの各々における細胞表面分化抗原ＣＤ１４およびＣＤ３の両方について陽性の細胞数を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭは単球分化を刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭは、Ｇ−ＣＳＦの非存在下（サイトカインなし）および存在下の両方で単球分化を刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦが単球分化を誘導する能力は、ＧＭ−ＣＳＦの能力よりも大きかった。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦと相乗的に作用した。
【図１６】図１６は、分化抗原ＣＤ１４およびＣＤ１６の存在によって測定し、実施例１０Ｂにさらに詳細に記載されるような、単球分化のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＣＤ１４ＡＰＣ（ｙ軸）は、ＣＤ１４に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ１４陽性細胞の数を示す。ＣＤ１６ＦＩＴＣ（ｘ軸）は、ＣＤ１６に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ１６陽性細胞の数を示す。各々のグラフの上の右側の枠は、ＣＤ１４およびＣＤ１６分化マーカーの両方を細胞表面上に有するそれらの細胞の割合を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、濃度依存性の様式で単球分化を誘導し、ここで１００ｎｇ／ｍｌの用量では、骨髄造血幹細胞のうち１０％の顆粒球への分化が生じた。
【図１７】図１７は、分化抗原ＣＤ８６およびＣＤ１の存在によって測定し、実施例１０Ｃにさらに詳細に記載されるような、樹状細胞分化のＦＡＣＳ分析の結果を示す。負のコントロールベクター（Ｖｅｃｔｏｒ  ＣＭ）で馴化した培地、およびＭＧＤ−ＣＳＦベクター（ＭＧＤ−ＣＳＦ）で馴化した培地に対する応答における樹状細胞へ分化するように誘導された造血幹細胞の数を示す。ＣＤ１ａＦＩＴＣ（ｘ軸）は、ＣＤ１に特異的な抗体の蛍光強度によるＣＤ１陽性細胞の数を示す。ＣＤ８６ＰＥ（ｙ軸）は、ＣＤ８６に特異的な抗体の蛍光強度によってＣＤ８６陽性細胞の数を示す。線で囲んだ卵形の領域は、細胞表面分化抗原ＣＤ１およびＣＤ８６の両方について陽性の細胞数を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭは、樹状細胞分化を刺激した。負のコントロールでトランスフェクトされた細胞のうち４％が樹状細胞に分化したが、ＭＧＤ−ＣＳＦベクターでトランスフェクトした細胞のうち２２％が樹状細胞に分化した。
【図１８Ａ】図１８は、実施例１１にさらに詳細に記載されるように、ヒト骨髄コロニー形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。図１８Ａは、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果に比較して、ＣＦＵ−Ｇ（左パネル）およびＣＦＵ−Ｍ（右パネル）の形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの用量依存性の刺激効果を示す。
【図１８Ｂ】図１８は、実施例１１にさらに詳細に記載されるように、ヒト骨髄コロニー形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。図１８Ｂは、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果に比較して、ＣＦＵ−ＧＭの形成（左パネル）および総コロニー形成能（Ｔｏｔａｌ  ＣＦＣ）（右パネル）に対するＭＧＤ−ＣＳＦの用量依存性の刺激効果を示す。
【図１８Ｃ】図１８は、実施例１１にさらに詳細に記載されるように、ヒト骨髄コロニー形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。図１８Ｃは、サイトカインＩＬ−３および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下におけるＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果に比較して、ＣＦＵ−Ｇ（上の左パネル）、ＣＦＵ−ＧＭ（上の右パネル）、ＣＦＵ−Ｍ（下の左パネル）の形成および総コロニー形成能（Ｔｏｔａｌ  ＣＦＣ）（下の右パネル）に対するＭＧＤ−ＣＳＦの用量依存性の刺激効果を示す。
【図１９】図１９は、実施例１２にさらに詳細に記載されるように、種々の生物学的活性についてのアッセイにおけるＭＧＤ−ＣＳＦの効果のプロフィールを示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、活性化単球（ＭｏｎＰｒｏ４）の増殖および末梢性ＮＫ細胞（ＮＫＧｌｏ）の増殖を刺激した。
【図２０】図２０は、実施例１３にさらに詳細に記載されるように、サイトカイン分泌の種々のアッセイにおけるＭＧＤ−ＣＳＦの効果のプロフィールを示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｕｍｉｎｅｘ２−ＧＭＣＳＦ）、ＩＬ−２（Ｌｕｍｉｎｅｘ２−ＩＬ２）およびＩＬ−１３（Ｌｕｍｉｎｅｘ２−ＩＬ１３）の分泌を刺激した。
【図２１】図２１は、実施例１４にさらに詳細に記載されるように、ＣＦＵ−Ｍ形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。緩衝液、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦによって誘導されるＣＦＵ−Ｍ形成の例は、上の３つのパネルに示す。２０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦによって誘導されるＣＦＵ−Ｍ形成の用量依存性の効果は、下の３つのパネルに示される。
【図２２】図２２は、実施例１５にさらに詳細に記載されるように、樹状細胞形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。培地、２０ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦおよび５００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦによって誘導される樹状細胞形成の例を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦは、球状の未分化造血幹細胞からの細長い分化した樹状細胞の形成を誘導した。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
（実施形態の説明）
（定義）
本明細書において用いられる用語は、下に示されるように、その通常の意味を有し、そして本明細書の文脈でさらに理解され得る。
【００６３】
「単球、顆粒球および樹状細胞コロニー刺激因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅ、ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ，ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）」（ＭＧＤ−ＣＳＦ）とは、新規な、単離された、分泌された分子であって、それぞれ配列番号１および７に示されるような核酸およびアミノ酸配列を有する分子をいう。仮出願６０／５９０，５６５号および同第６０／５６４，９３２号は、ＭＧＤ−ＣＳＦをＦＰＴ０２５と呼んだ。「本発明の分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、配列番号１〜１３のいずれか、配列番号１〜１３のいずれかと配列番号１４〜２１１のいずれかの分泌性リーダー、および配列番号２１２〜２７１の構築物のいずれかを含むものとして本明細書において用いられる。
【００６４】
「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」および「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」という用語は、ポリマー形態の任意の長さのヌクレオチドを指すものとして本明細書において交換可能に用いられる。それらは、二本鎖および一本鎖の両方の配列を含んでもよく、そして限定はしないが、ウイルス、原核生物および真核生物の供給源由来のｃＤＮＡ；ｍＲＮＡ；ウイルス（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物の供給源由来のゲノムＤＮＡ配列；ＲＮＡｉ；ｃＤＮＡ；アンチセンス分子；リボザイム；および合成のＤＮＡ配列を包含する。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含む配列を包含する。
【００６５】
「組み換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」とは、本明細書において用いる場合、核酸分子を表し、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成および／または合成に由来するポリヌクレオチドであって、その起源もしくは操作のおかげでそれが天然に会合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部とは会合していないポリヌクレオチドを意味する。「組み換え体」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、組み換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。「組み換え体」という用語は、宿主細胞に関して用いられる場合、組み換えポリヌクレオチドが導入されている宿主細胞を意味する。
【００６６】
「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」ヌクレオチド配列核酸分子とは、その塩基対の相補体からなるものである。塩基アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドは、塩基チミジンを有するデオキシリボヌクレオチドに相補的であり、そして塩基チミジンを有するデオキシリボヌクレオチドは、塩基アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドに対して相補的である。塩基シトシンを有するデオキシリボヌクレオチドは、塩基グアニンを有するデオキシリボヌクレオチドに相補的であり、そして塩基グアニンを有するデオキシリボヌクレオチドは、塩基シトシンを有するデオキシリボヌクレオチドに対して相補的である。塩基アデニンを有するリボヌクレオチドは、塩基ウラシルを有するリボヌクレオチドに相補的であり、そして塩基ウラシルを有するリボヌクレオチドは、塩基アデニンを有するリボヌクレオチドに対して相補的である。塩基シトシンを有するリボヌクレオチドは、塩基グアニンを有するリボヌクレオチドに相補的であり、そして塩基グアニンを有するデオキシリボヌクレオチドは、塩基シトシンを有するデオキシリボヌクレオチドに対して相補的である。
【００６７】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）」とは、本明細書において用いる場合、哺乳動物細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合して、それに作動可能に連結された下流（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節性領域である。本発明の目的のためには、プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列は転写開始部位内であってもよく、そして同様にＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）であってもよい。真核生物プロモーターは常にではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。プロモーターとしては、核酸分子に対して自然に近接しているプロモーター、および核酸分子に対して自然には近接していないプロモーターが挙げられる。さらに、「プロモーター」という用語は、誘導性プロモーター、条件的活性プロモーター、例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘプロモーター、構成的プロモーターおよび組織特異的プロモーターを包含する。
【００６８】
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、エレメントの配置であって、そのように表された成分が、その所望の機能を行うように構成される配置をいう。従って、あるポリペプチド配列に作動可能に連結された分泌性リーダー配列は、細胞からのこのポリペプチドの分泌を達成し得る。
【００６９】
「トランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」とは、リポフェクタミンのような任意の補助促進因子の使用の有無において、導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを保有することを意味する。当該分野で公知であるトランスフェクションの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーションおよびリポフェクションが挙げられる。
【００７０】
「核酸分子の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、この核酸分子に含まれる情報の遺伝子産物への変換をいう。遺伝子産物は、ある遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるペプチドもしくはポリペプチドであり得る。遺伝子産物としてはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集のようなプロセスによって改変されるＲＮＡ；ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン結合、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化およびグリコシル化によって改変されるタンパク質が挙げられる。
【００７１】
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、遺伝物質を細胞または生物体に変換させるために用いられ得る因子、代表的にはウイルスまたはプラスミドである。
【００７２】
「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」とは、任意の組み換えベクター（単数または複数）または単離されたポリヌクレオチド（単数または複数）のレシピエントであり得るかまたはレシピエントにとなっている、個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞は、単独の宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然の、偶発的なもしくは意図的な変異および／または変化に起因してもとの親細胞に対して完全に同一である（形態学的にまたは総ＤＮＡ相補体において）必要はない。宿主細胞としては、本発明の組み換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてインビボまたはインビトロでトランスフェクトされるかまたは感染された細胞が挙げられる。本発明の組み換えベクターを含む宿主細胞は、「組み換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」と呼ばれてもよい。
【００７３】
「幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」とは、自己再生する、未分化のままで残る、そして分化する能力を有する未分化の多能性または多分化能の細胞である。幹細胞は、限定はしないが、幹細胞が天然に存在する動物の少なくともその寿命の間、分裂し得る。幹細胞は、最終分化されず、そのことは分化経路の終わりではないことを意味する。幹細胞が分裂する場合、各々の娘細胞は、幹細胞に残ってもよいし、または娘細胞は、最終分化をもたらす経路に乗り出してもよい。幹細胞は、胚性幹細胞、若年性幹細胞、または成体幹細胞であってもよい。「造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」は、前駆細胞から成熟血球を形成する過程である造血の過程に関与する。
【００７４】
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」および「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に用いられ、そして最小の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義内に包含される。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方とも、この定義によって包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを包含する。さらに、本発明の目的のためには、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然の配列に対して、欠失、付加および置換（一般には、事実上保存的）のような改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発などを通じて意図されてもよいし、または、タンパク質を生成する宿主の変異、もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどを通じて偶発的であってもよい。
【００７５】
「リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸残基１で開始して、かつタンパク質切断の際に成熟タンパク質の形成を生じる切断部位へ伸長する、アミノ酸残基の配列を含む。リーダー配列は一般には、疎水性であって、いくつかの正に荷電した残基を有する。リーダー配列は、天然であっても、または合成であっても、それらが結合されるタンパク質と異種であっても、または同種であってもよい。「分泌リーダー（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅａｄｅｒ）」とは、タンパク質が細胞から分泌されることを指示するリーダー配列である。
【００７６】
「融合パートナー（ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ）」とは、治療用もしくは予防用のポリペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端でインフレームに、または治療用もしくは予防用のポリペプチドに対して内部的に融合されたポリペプチドである。
【００７７】
「レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」という用語は、特定のリガンドに結合するポリペプチドをいう。このリガンドは通常、細胞外分子であって、これは、レセプターへの結合の際に、通常、シグナル伝達経路の開始のような細胞応答を開始する。「可溶性レセプター（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、膜貫通ドメインのような膜結合ドメインを欠くレセプターである。「可溶性レセプター」は、膜貫通ドメインがスプライシングされてなくなっている、野性型の膜貫通タンパク質レセプターの天然に存在するスプライシング改変体を含んでもよい。「可溶性レセプター」は、膜貫通タンパク質レセプターの細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの任意のフラグメントを含んでもよい。可溶性レセプターは、標的タンパク質を調節し得る。それらは、例えば、リガンド結合のための野性型レセプターと競合してもよいし、リガンド／レセプター相互作用に関与してもよく、これによって、レセプターの活性もしくは数、および／またはこのレセプターから下流の細胞活性を調節する。この調節は、細胞内応答、例えば、細胞を活性化するシグナル伝達事象、細胞を阻害するシグナル伝達事象、または細胞の成長、増殖、分化および／もしくは死亡を調節する事象を誘発し得、あるいはこのような活性を順次調節する他の因子の産生を誘導しる。
【００７８】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」、「実質的に単離された（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ）」または「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ）」分子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）とは、天然の状態よりも高濃度で存在するように操作されている分子である。例えば、本発明の抗体は、それが天然に関連している、この抗体ではない物質のうち少なくとも１０％または２０％または４０％または５０％または７０％または９０％が除去されている場合に、単離され、精製され、実質的に単離され、または実質的に精製されている。本明細書において用いる場合、「単離された」、「精製された」、「実質的に単離された」または「実質的に精製された」分子とは、組み換え分子を包含する。
【００７９】
「生物学的に活性な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ）」な実体、または「生物学的活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」を有する実体とは、天然に存在する分子の構造的、調節的もしくは生化学的機能、または代謝過程もしくは生理学的過程に関するかもしくは関連する任意の機能を有する実体である。生物学的に活性なポリヌクレオチドフラグメントは、本発明のポリヌクレオチドの活性と同一である必要はないが類似である活性を示すフラグメントである。この生物学的活性は、改善された所望の活性または低下された所望されない活性を含み得る。例えば、ある実体は、別の分子との分子相互作用に関与する場合、例えば、ハイブリダイゼーション、疾患状態を軽減するのに治療的な役割を有する場合、免疫応答を誘導するのにおいて予防的な値を有する場合、ポリヌクレオチド分子について特有であることが決定され得るか、またはポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーとして用いられ得るポリヌクレオチドの生物学的に活性なフラグメントのような分子の存在を決定するのにおいて診断的および／または予防的な価値を有する場合、生物学的活性を示す。生物学的に活性なポリペプチドまたはそれらのフラグメントとしては、生物学的反応に関与し得るものが挙げられ、これには、限定はしないが、抗体の産生のような免疫応答を刺激するためのエピトープもしくは免疫原として機能し得るもの；または免疫応答を調節するのに関与し得るものが挙げられる。
【００８０】
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」という用語は交換可能に用いられて、タンパク質、例えば、免疫系によって、合成的にまたは組み換え的に生成されるタンパク質であって、特定の抗原を認識してそれに結合し得るタンパク質を指す。抗体は通常当該分野で公知である。抗体は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原を認識し得る。この用語は活性なフラグメントを包含し、これには例えば、免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、重鎖の可変領域および／または定常領域、軽鎖の可変領域および／または定常領域、相補性決定領域（ｃｄｒ）、およびフレームワーク領域が挙げられる。この用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製物、ならびにハイブリッド抗体、変更された抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体分子、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（例えば、非共有結合ヘテロ二量体）、二量体および三量体抗体フラグメント構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ヒト化抗体分子およびこのような分子から得られた任意の機能的フラグメントであって、このようなフラグメントは特異的な結合を保持するフラグメントを包含する。
【００８１】
「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」とは、特定の疾患に対する免疫を生じるかまたは人工的に増大する調製物である。これは、特定の疾患に対する免疫を生じる化合物または人工的に増大するために投与される、例えば、殺傷された微生物、生きている弱毒化された生物体、または生きている病原性の生物体から構成され得る。これは、特定の疾患を生じる種類の弱毒化または殺傷された微生物を含む調製物であって、その疾患に対する抗体を生じるように免疫系を刺激するために投与される調製物を包含する。この用語は核酸およびポリペプチドワクチンを包含する。
【００８２】
「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」という用語は、抗体結合の文脈では、特定のエピトープに対する高い結合活性および／または高い親和性の結合をいう。従って、１つのエピトープ（「第一のエピトープ（ｆｉｒｓｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」に対して特異的に結合して、別の（「第二のエピトープ（ｓｅｃｏｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」）には結合しない抗体は、「特異的な抗体（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」である。第一のエピトープに特異的な抗体は、２つのエピトープが相同性または他の類似性を共有する場合、第二のエピトープと交差反応して結合してもよい。「特異的に結合する」という用語は、ポリヌクレオチドの文脈では、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイズをいう。ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡの両方のハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大する条件は、広く公知であり、そして当該分野で公開されている（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（２００１））。
【００８３】
「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「宿主（ｈｏｓｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、本明細書において交換可能に用いられて、ヒトおよび非ヒト動物を含む生きた動物を指す。被験体とは、例えば、抗原刺激、ならびに細胞表面レセプター結合を通じた刺激および阻害性のシグナル伝達に応答し得る免疫細胞を保有する生物体であってもよい。この被験体は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウスであってもよい。「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、疾患に関して完全に正常であるか、または全ての観点において正常である個体を除外しない。
【００８４】
「患者サンプル（ｐａｔｉｅｎｔ  ｓａｍｐｌｅ）」とは、患者由来の任意の生物学的な標本である。この用語は、限定はしないが、生物学的な液体、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙液、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液、精液および他の液体サンプル、ならびに生物学的起源の細胞および組織を包含する。この用語はまた、細胞およびそれに由来する細胞およびその子孫を含み、これには、培養中の細胞、細胞上清および細胞溶解液が挙げられる。これはさらに、器官または組織培養物由来の液体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、糞便サンプルおよび生物学的組織から抽出された液体、ならびに固形組織、組織切片および細胞溶解液から分離された細胞を包含する。この定義は、その調達後任意の方法で、例えば、試薬での処置、可溶化または特定の成分、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドについての富化によって、操作されているサンプルを包含する。またこの用語には、患者サンプルの誘導体および画分も包含される。患者サンプルは、診断、予後または他のモニタリングアッセイにおいて用いられ得る。
【００８５】
「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、病理学的状態であって、例えば、健康な状態または正常な状態とは異なるとして症状または他の同定因子によって同定され得る病理学的状態である。「疾患」という用語は、障害、症候群、状態および傷害を包含する。疾患としては、限定はしないが、増殖性、炎症性、免疫、代謝の、感染性の、そして虚血性の疾患が挙げられる。
【００８６】
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、適切なコントロールと比較した場合、測定された活性における、増大または減少、刺激、阻害、干渉、または妨害の、直接的または間接的ないずれかの生成をいう。ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはある「因子（ａｇｅｎｔ）」の「修飾因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」とは、本明細書において交換可能に用いられて、適切なコントロールと比較した場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの測定された活性に影響する、例えば、増大、減少、刺激、阻害、干渉またはブロックする物質を指す用語である。
【００８７】
「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」とは、本明細書において用いる場合、疾患の素因があり得るが、その疾患とはまだ診断されていない被験体においてその疾患の発現または再発に関して予防を提供することを包含する。処置および予防は、ヒトを含む生物体に対して、または細胞に対して、インビボ、インビトロもしくはエキソビボで投与され得、そしてその細胞が引き続きその被験体に投与され得る。
【００８８】
「処置する（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本明細書において用いる場合、ヒトを含む哺乳動物における疾患のための治療薬の任意の投与または適用を包含し、そして疾患を阻害する工程を包含する。これは、機能の損失、欠失または欠損を抑制または回復または修復を生じること、あるいは不十分なプロセスを刺激することなどによって、疾患の進行を阻止すること、およびこの疾患を救済することを包含する。
【００８９】
「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化剤、処方物助剤、または任意の従来のタイプの賦形剤をいう。「薬学的に受容可能なキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、非毒性の「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」をいう。薬学的に受容可能なキャリアは、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であって、処方物の他の成分と適合性である。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、ビヒクル、アジュバントまたは希釈剤であってもよい。
【００９０】
（ＭＧＤ−ＣＳＦおよび関連の核酸およびポリペプチド）
本発明は、新規な単離された分泌分子であって、「単球、顆粒球および樹状細胞コロニー刺激因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅ、ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ，ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ
ｃｅｌｌ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）」（ＭＧＤ−ＣＳＦ）として本明細書において同定された分泌分子を提供する。本発明は、ＭＧＤ−ＣＳＦを用いる方法、ならびにＭＧＤ−ＣＳＦの改変体および変異体を包含する関連の因子を提供する。ＭＧＤ−ＣＳＦは、下にさらに記載されるように、ＮＰ＿６８９６６９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｌｏｎｅ  ＭＧＣ３４６４７、およびＩｎｃｙｔｅ配列番号２３２、２５５および２５７（ＷＯ  ２００２／０４８３３７）に関連する。
【００９１】
ＭＧＤ−ＣＳＦは、２４１アミノ酸長であり、そしてシグナルペプチドまたは分泌性リーダー配列を含む。ＭＧＤ−ＣＳＦは、クローンファミリーＣＬＮ００２１２３８８における、マザークローンＣＬＮ００５０６５７９由来のサブクローンである。ＭＧＤ−ＣＳＦは、Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅｒのクラスター１９０６４７に属する。分泌されたタンパク質のこのクラスターは、単独の遺伝子に相当する全ての発現された配列を含む。その状況は、分泌された分子として、０．９２というそのＴｒｅｅｖｏｔｅによって確認される。このＴｒｅｅｖｏｔｅは、予測アミノ酸配列が分泌されるか否かを予測する多数の物理的および化学的な属性に基づいて構築されるアルゴリズムの結果である；０．５０より大きいＴｒｅｅｖｏｔｅは、分泌型分子の指標である。
【００９２】
図１に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＣＢＩ）によって命名される、ＮＰ＿６８９６６９のｍＲＮＡ配列によってコードされると予測される仮定のタンパク質に関する（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１６，８９９（２００２））。この仮定的なヒトタンパク質は、２４２アミノ酸を含むことが予測される。ＮＰ＿６８９６６９のコード配列は、ＭＣＧ３４６４７としてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（国立衛生研究所）のＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＧＣ）によって記載されている。ＭＧＣ３４６４７の核酸配列は、ＷＯ  ２００２／０４８３３７に指定される、それぞれ配列番号４９および配列番号１０３に相当しており、ここでは配列番号４９は、配列番号１０３によってコードされる、未知の機能の分泌タンパク質として記載された。ＭＧＣ３４６４７およびＮＰ＿６８９６６９の機能は、従来開示されていなかった。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＭＧＣ３４６４７の新規なスプライシング改変体である。エキソン３とエキソン４との間の接合は、アミノ酸Ｌ８０にＲ８１が続くように示差的にスプライシングされる。
【００９３】
遺伝子ＭＧＣ３４６４７は、７２９ヌクレオチド長の核酸コード配列を有する、２４２アミノ酸のオープンリーディングフレームを有するタンパク質をコードすることが予測される。この前駆タンパク質は、２７，４７９ダルトンと秤量されて、７．７２という等電点を有することが予測される。アミノ酸１〜２０を含むシグナルペプチドの切断後、この成熟タンパク質は、２５，２２９ダルトンと秤量されて、６．７４という等電点を有することが予測される。この成熟タンパク質は、６６９ヌクレオチドの核酸分子によってコードされる、２２２アミノ酸長であると予測される。ＭＧＣ３４６４７は、６つのエキソンを有する。これは、染色体１６ｑ２２．１上のゲノムに、７０４５６６４９の開始位置から７０４７０７６５の停止位置へマッピングする。
【００９４】
ＭＧＣ３４６４７発現は、下にさらに記載されるとおり、脾臓、耳下腺、関節の半月板、胆管、精嚢、延髄、脳下垂体、唾液腺および配列表で観察されている。これらの局在に基づいて、ＭＧＣ３４６４７は、いくつかの特異的な治療用途を有することが予測される。これは、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の拮抗性の抗体の標的であり得る。これは、例えば、化学療法および骨髄移植の間の造血細胞再生のためのタンパク質治療アゴニストとして、感染性疾患を処置するために細胞媒介性免疫を増強するための拮抗性のタンパク質治療剤として、または細胞保護のためのタンパク質治療アンタゴニストとして用いられ得る。
【００９５】
（核酸）
本発明は、表および配列表、例えば、配列番号１、２、３および５に示されるような新規なＭＧＤ−ＣＳＦ配列に相当するポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本発明は、これらの核酸分子について、そして関連の核酸分子、例えば、配列番号４および１３に示される核酸分子についての用途を提供する。これらの用途は、本明細書において記載される。
【００９６】
本発明は、ＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ−６８８６６９をコードする遺伝子に対して作動可能に連結された肝臓発現遺伝子のプロモーターを含み、機能的に活性であるタンパク質を生じるようにインビボで発現され得るＤＮＡ分子を提供する。記載されたＤＮＡ分子は、種々の用途を、例えば、人工的に導入されたＭＧＤ−ＣＳＦもしくはＮＰ＿６８８６６９のインビボ機能、２つ以上の人工的に導入されたＭＧＤ−ＣＳＦもしくはＮＰ＿６８８６６９の相互作用、人工的に導入されたＭＧＤ−ＣＳＦもしくはＮＰ＿６８８６６９融合タンパク質のインビボ動態を研究するため、または人工的に導入されたＭＧＤ−ＣＳＦもしくはＮＰ＿６８８６６９タンパク質のインビボ標的を同定するための基礎的な研究におけるツールとして、そして下にさらに記載されるような治療処置として、種々の用途を有する。
【００９７】
核酸分子の非限定的な実施形態としては、遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。核酸分子としては、ｍＲＮＡのスプライシング改変体が挙げられる。核酸は、天然に存在する、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよいし、または当該分野で公知のような合成アナログであってもよい。このようなアナログは、アッセイ条件下で安定性を実証し、従ってそれらは、プローブとして適切である。核酸分子はまた、改変された核酸分子、例えば、メチル化核酸分子および核酸分子アナログを含んでもよい。プリンおよびピリミジンのアナログは当該分野で公知である。
【００９８】
本発明の核酸は、生物学的サンプルに存在する組織（単数または複数）または細胞タイプ（単数または複数）の示差的な同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。全長ＭＧＤ−ＣＳＦ改変体のフラグメントは、全長遺伝子を単離するため、そして高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためのｃＤＮＡライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。このタイプのプローブは、少なくとも３０塩基を有してもよいし、そして例えば、５０以上の塩基を含んでもよい。このプローブはまた、全長転写物に相当するｃＤＮＡクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む、完全なＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子を含むゲノムクローン（単数または複数）を同定するためのスクリーニング手順において用いられ得る。このようなスクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知の核酸配列を用いることによって、ＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニングして、相補的なライブラリー成分を同定するために用いられ得る。
【００９９】
本発明はさらに、本明細書において上記される配列であって、その配列の間に少なくとも９１％、少なくとも９２％または少なくとも９５％同一性がある場合、その配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は、本明細書において上記されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。ストリンジェントな条件とは一般に、その配列の間で少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみハイブリダイゼーションが生じる条件を包含する。例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、その後の０．１×ＳＳＣ中で約６５℃でのフィルターの洗浄がストリンジェントな条件を構成する。
【０１００】
表および配列表に示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドをコードし得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズして、それに対して同一性を有する、少なくとも２０塩基、少なくとも３０塩基または少なくとも５０塩基を有してもよく、そしてこれは成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持してもしなくてもよい。従って、本発明は、配列表に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびにそのフラグメントであって、少なくとも３０塩基または少なくとも５０塩基を有するフラグメントに、そしてこのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。
【０１０１】
本明細書に提供される情報、例えば、表および配列表に示されるヌクレオチド配列を用い、ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順、例えば、開始物質としてｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングするための手順を用いて得ることができる。
【０１０２】
（改変体および変異体ポリヌクレオチド）
本発明はさらに、ＭＧＤ−ＣＳＦ分子の一部、アナログまたは誘導体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、例えば、Ｇｅｎｅ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）に記載されるように、ある生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの別の形態のうちの１つのような、天然の対立遺伝子改変体のように天然に存在し得る。天然には存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【０１０３】
このような改変体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって生成される改変体が挙げられる。この置換、欠失または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含んでもよい。この改変体は、コード領域、非コード領域またはその両方において変更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生じ得る。これらは、所望のＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質、またはその部分の特性または活性を変更しない、サイレントな置換、付加または欠失の形態をとってもよい。
【０１０４】
ある実施形態では、本発明は、例えば、配列表に示されるような、切断されたシグナルペプチドまたはリーダー配列を有するタンパク質を含む、成熟タンパク質をコードする核酸分子を提供する。他の実施形態は、配列表由来のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一もしくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子、配列表に示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、配列表に示されるポリペプチド、またはこれらのいずれかの生物学的に活性なフラグメントを包含する。
【０１０５】
ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、この参照ヌクレオチド配列の各々１００ヌクレオチドあたり最大５つの点変異まで含んでもよいこと以外は、ヌクレオチド配列が参照配列と同一であるポリヌクレオチドである。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、この参照配列におけるヌクレオチドの最大５％までが、欠失されるかもしくは別のヌクレオチドで置換されてもよく、またはこの参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％までの多数のヌクレオチドがこの参照配列に挿入されてもよい。この参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端の位置で、またはそれらの末端位置の間のいずれかで、参照配列におけるヌクレオチドの間で個々に分散されて、もしくは参照配列内の１つ以上の連続する群において、生じてもよい。
【０１０６】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列表に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のような公知のコンピュータープログラムを用いて都合よく決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列の間の相同性の最適のセグメントを見出す。特定の配列が、本発明による参照配列に対して例えば９５％同一であるか否かを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いる場合、そのパラメーターは、当然ながら、同一性のパーセンテージが、この参照ヌクレオチド配列の全長にわたって算出され、そして、この参照配列中のヌクレオチドの総数の最大５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
【０１０７】
本出願は、核酸分子がＭＧＤ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらず、配列表に示される核酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一である核酸分子に関する。特定の核酸分子が、ＭＧＤ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして用いる方法を公知である。ＭＧＤ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途としては、とりわけ、ＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子またはその対立遺伝子改変体をｃＤＮＡライブラリー中で単離すること；およびＶｅｒｎａら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるような、ＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子の正確な染色体位置を予測するために中期染色体開裂に対するハイブリダイゼーション（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））；および特定の組織においてＭＧＤ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げられる。
【０１０８】
本出願はまた、配列表の核酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一である配列を有する核酸分子であって、ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド活性を有するポリペプチドすなわち、特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合、本発明のＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドの活性に対して同一であるかまたは類似である活性を示すポリペプチドをコードする、核酸分子に関する。例えば、本発明のＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドは、免疫細胞増殖を刺激し、腫瘍増殖を阻害し、そして／または腫瘍細胞を殺傷し得る。
【０１０９】
遺伝子コードの縮重に起因して、当業者は、配列表に示される核酸配列の核酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一である配列を有する多数の核酸分子が、ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の複数の縮重改変体が同じポリペプチドをコードするので、上記の比較アッセイを行わなくても当業者にはこれは明白である。縮重改変体でない相当な数の核酸分子がまた、ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードすることが当業者には認識され、そして当業者は、下にさらに記載されるように、タンパク質機能に影響する可能性が低いか、または有意に影響する可能性がないアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）を十分に承知している。
【０１１０】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含むベクター、組み換えベクターで遺伝子操作される宿主細胞、および組み換え技術によるＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドまたはそのフラグメントの生成に関する。これは、分泌性リーダー配列（例えば、配列表を参照のこと；分泌性リーダーは、コラーゲン分泌リーダーであってもよい）をコードする例えば核酸構築物を含む組み換えベクター、および目的の選択された異種ポリペプチド、および組み換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞を提供する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルスの伝播は、補完している宿主細胞においてのみ生じる。本発明のベクターは、Ｋｏｚａｋ配列（Ｌｏｄｉｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、１９９９）を含んでもよい。本発明のベクターはまた、目的の配列のＡＴＧ開始コドンを含んでもよい。
【０１１１】
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般には、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿のような沈殿で、または荷電された脂質との複合体において導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質転換されてもよい。
【０１１２】
ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター、例えば、２〜３例を挙げれば、λファージＰＬプロモーター；Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター；ＳＶ４０初期および後期プロモーター；ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターに作動可能に連結されてもよい。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、終結および転写領域の部位、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。この構築物によって発現される転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する開始コドンおよび終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）で翻訳開始コドンを含んでもよい。
【０１１３】
本発明は、とりわけ肝臓において機能するプロモーターの制御下で、ヒトを含む動物において目的の遺伝子の発現を提供する。尾静脈注射の流体力学に基づく手順（Ｚｈａｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１７３５（１９９９））は、目的の遺伝子を用いて細胞をトランスフェクトすることが実証されている。本発明はまた、血管内のＤＮＡ投与の量および頻度を制御することによって遺伝子発現のレベルの操作を提供する。本発明はさらに、肝臓において遺伝子を発現するように機能するプロモーターを提供する。
【０１１４】
肝臓において発現されるタンパク質の１つの大きいファミリーは、チトクロムＰ４５０タンパク質ファミリーである。これらのタンパク質は、しばしば、有害な物質をさらに水溶性にさせることによってその物質を処分する身体の機構の一部として、種々の酸化反応を行う一群のヘム−チオレートモノオキシゲナーゼである。チトクロムP４５０タンパク
質の身体の総量のほとんどが、肝臓で、詳細には、肝細胞のミクロソームにおいて見出される。千を超える異なるチトクロムＰ４５０タンパク質が存在する。しかし、わずか４９の遺伝子および１５の偽遺伝子しかヒトでは配列決定されていない。ヒトでは、チトクロムＰ４５０  ３Ａ４は、酸化的代謝における最も重要なチトクロムＰ４５０タンパク質として同定されている。これは身体における最も一般的なチトクロムＰ４５０タンパク質であり、誘導性タンパク質である。
【０１１５】
肝臓において発現される遺伝子のプロモーター配列、例えば、任意のチトクロムＰ４５０タンパク質のプロモーター配列を目的の遺伝子に作動可能に連結させることによって、肝臓およびこのプロモーターが活性である任意の他の部位における遺伝子の発現がもたらされ得る。本発明は、限定はしないが、チトクロムＰ４５０遺伝子、例えばチトクロムＰ４５０  ３Ａ４；ｃ−ｊｕｎ；ｊｕｎ−ｂ；ｃ−ｆｏｓ；ｃ−ｍｙｃ；血清アミロイドＡ；アポリポプロテインＢ編集触媒サブユニット（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ）；肝臓再生因子；例えば、ＬＲＦ−１シグナル伝達因子、および転写活性化因子、例えば、ＳＴＡＴ−３；血清アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）；インスリン様増殖因子結合タンパク質、例えばＩＧＦＢＰ−１；サイクリンＤ１；活性タンパク質−１（ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）；ＣＣＡＡＴエンハンサーコア結合タンパク質；βオルニチンデカルボキシラーゼ；肝臓再生ホスファターゼ−１（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｏｆ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ−１）；早期増殖応答遺伝子−１（ｅａｒｌｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅ−１）；肝細胞増殖因子；ヘモペキシン；インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）例えばＩＧＦ２；肝細胞核ファミリー１；肝細胞核ファミリー４；肝細胞Ａｒｇ−Ｓｅｒ−リッチドメイン含有タンパク質；グルコース６−ホスファターゼ；および急性期タンパク質、例えば、血清アミロイドＡおよび血清アミロイドＰ（ＳＡＡ／ＳＡＰ）を包含する遺伝子を発現するように機能するプロモーターを包含する。
【０１１６】
表１および実施例９に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦに対してチトクロムＰ４５０  ３Ａ４のプロモーター配列を作動可能に連結させて、得られたこの構築物をマウスの尾静脈へ注射することによって、ＭＧＤ−ＣＳＦの発現、およびそれに伴うマウスによる単球産生の増大が誘導される。従って、本発明は、インビボで送達される、本発明の治療用分子を提供する。本発明は、裸のＤＮＡを、薬学的に受容可能なキャリアの有無において、または目的の配列を有するベクターＤＮＡを送達するために用いられ得る。インビボで送達される本発明の分子の機能を評価する方法は、当該分野で公知であり、そしていくつかが本明細書に記載される。
【０１１７】
示されたとおり、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを包含し得る。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養物については、ジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、そしてＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラマイシン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性の遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、限定はしないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞の適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
【０１１８】
選択マーカーは、マーカーを発現する細胞に対して表現型を付与して、その結果この細胞が適切な条件下で同定され得る遺伝子である。一般には、選択マーカーは、必須の細胞機能を阻害する化合物または他の因子の有無において形質転換された細胞が育つ能力に基づいてそれらの形質転換された細胞の選択を可能にする。従って、適切なマーカーとしては、薬物耐性または薬物に対する感受性を付与し、選択マーカーをコードする分子でトランスフェクトされた細胞が、適切な選択培地中で増殖された場合、その細胞に色を与えるかまたは抗原の特徴の変化を付与するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、選択マーカーとしては、細胞毒性マーカーおよび薬物耐性マーカーであって、これによって細胞が１つ以上の細胞毒素または薬物を含む培地上で増殖する能力によって選択されるマーカー；栄養要求性のマーカーであって、チミジンおよびヒポキサンチンのような特定の栄養素または補充物の有無において規定の培地で細胞が増殖する能力についてその細胞が選択されるマーカー；代謝マーカーであって、例えば、細胞が唯一の炭素原として適切な糖を含有する規定の培地で増殖する能力について選択されるマーカー、ならびに発色基質上で着色されたコロニーを形成するか細胞が蛍光を発するように細胞の能力を付与するマーカーが挙げられる。
【０１１９】
なかでも細菌における使用に適切なベクターとしては、Ｑｉａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。とりわけ適切な真核生物ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。他の適切なベクターは、当業者に明白である。
【０１２０】
他の適切なベクターとしては、ｐＴＴベクター骨格を使用するベクターが挙げられる（図２、図３およびＤｕｒｏｃｈｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２００２））。要するに、ｐＴＴベクター骨格は、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ／ＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ）およびｐＳＥＡＰ基本ベクター（単数または複数）を得ることによって調製され得、そしてｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６（配列番号２７７に開示される６×Ｈｉｓタグ）およびｐＣＥＰ４ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手され得る。本明細書において用いる場合、ｐＴＴ５骨格ベクターは、ｐＴＴ５−Ｇａｔｅｗａｙを生成し得、そして哺乳動物細胞においてタンパク質を一時的に発現するために用いられ得る。ｐＴＴ５ベクターは、例えば、ｐＴＴ５−Ａ、ｐＴＴ５−Ｂ、ｐＴＴ５−Ｄ、ｐＴＴ５−Ｅ、ｐＴＴ５−ＨおよびｐＴＴ５−Ｉに誘導体化されてもよい。本明細書において用いる場合、ｐＴＴ２ベクターは、哺乳動物細胞株における適切な発現のための構築物を生成し得る。
【０１２１】
発現ベクターｐＴＴ５は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動されるｃＤＮＡの染色体外複製を可能にする。プラスミドベクターｐＣＤＮＡ−ｐＤＥＳＴ４０は、高レベル発現のためのＣＭＶプロモーターを利用し得るＧａｔｅｗａｙ適合ベクターである。ＳｕｐｅｒＧｌｏ  ＧＦＰ改変体（ｓｇＧＦＰ）は、Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得ることができる。ｐＣＥＰ５ベクターを調製することは、プラスミドｐＣＥＰ４Δを生じるＳａｌＩおよびＸｂａＩ酵素を用いる連続的消化および自己連結によりｐＣＥＰ４のＣＭＶプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを取り除くことによって達成され得る。ｐＡｄＣＭＶ５由来のＧｂｌＩＩフラグメント（Ｍａｓｓｉｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２２８９〜２２９６（１９９８））は、ＢｇｌＩＩ−直線化ｐＣＥＰ４Δに連結されたＣＭＶ５−ポリ（Ａ）発現カセットをコードしており、ｐＣＥＰ５ベクターが得られる。
【０１２２】
ｐＴＴベクターは、ハイグロマイシン（ＢｓｍＩおよびＳａｌＩ切除、それに続く充填および連結）およびＥＢＮＡ１（ＣｌａＩおよびＮｓｉＩ切り出し、それに続く充填および連結）発現カセットを欠失することによって調製され得る。ＣｏｌＥＩ起点（βラクタマーゼＯＲＦの３’末端を含む、ＦｓｐＩ−ＳａｌＩフラグメント）は、ｐＭＢＩ起点（βラクタマーゼＯＲＦの同じ３’末端）を含むｐｃＤＮＡ３．１由来のＦｓｐＩ−ＳａｌＩフラグメントで置換されてもよい。Ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６（配列番号２７７として開示される６×Ｈｉｓタグ）Ｃ末端融合タグは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓにおけるインフレーム連結後、ＳＥＡＰ（ｐＳＥＡＰ−ベーシック由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩフラグメント）に付加され得る。プラスミドは引き続き、ＬＢ培地中で増殖されたＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）中で増殖されてもよく、そしてＭＡＸＩｐｒｅｐカラム（Ｇｉａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて精製されてもよい。定量するためには、プラスミドは引き続き、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中に希釈されて、吸光度が２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで測定され得る。約１．７５〜約２．００の間のＡ２６０／Ａ２８０比を有するプラスミド調製物が適切である。
【０１２３】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって達成され得る。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第三版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓのような多くの標準的な実験室マニュアルにおいて記載されている。
【０１２４】
このポリペプチドは、融合タンパク質のような改変形態で発現されてもよいし、分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的な領域を含んでもよい。例えば、さらなるアミノ酸の領域、特に荷電されたアミノ酸が、精製の間、またはその後の取り扱いおよび保管の間の、宿主細胞における安定性および永続性を改善するために、このポリペプチドのＮ末端に付加されてもよい。また、ペプチド部分が精製を容易にするためにこのポリペプチドに付加されてもよい。このような領域は、このポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。
【０１２５】
（ポリペプチド）
本発明はさらに、表および配列表に示されるヌクレオチド配列、例えば、それぞれ、全長ポリペプチド、エキソン４、成熟ポリペプチドおよびフラグメントＴＲＬＲＡＱ（配列番号１１）（ＭＧＤ−ＣＳＦのエキソン３とエキソン４との間の接合に存在する）に相当する配列番号７、８、９および１１によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドを提供する。本発明は、配列番号１０および１２に示されるように、新規なポリペプチドについて、および関連のポリペプチドについて新規な用途を提供する。
【０１２６】
本発明は、分泌リーダー、シグナルペプチドまたはリーダー配列の結果としてＥＲ、分泌小胞または細胞外間隙を指向し得る分泌タンパク質、そしてシグナル配列を含む必要なしに細胞外間隙に放出されるタンパク質を提供する。分泌されたタンパク質が細胞外間隙に放出される場合、成熟ポリペプチドへの細胞外プロセシングを受けるかもしれない。細胞外間隙への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク質分解性の切断を含む多くの機構によって生じ得る。
【０１２７】
図８Ａに示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドは、周知の方法によって組み換え細胞培養物から取り出されて、単離され得る。このような方法としては、硫酸アンモニウムおよびエタノールの沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が精製のために使用されてもよい。本発明のポリペプチドは、直接単離されてもまたは培養されても、体液、組織および細胞を含む天然の供給源から精製される産物；化学合成手順の産物；ならびに、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む原核生物宿主または真核生物宿主から組み換え技術によって生成される産物を包含する。組み換え生成手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、最初の改変メチオニン残基を、ある場合には、宿主媒介プロセスの結果として含んでもよい。従って、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンは一般に、真核生物細胞における翻訳後に任意のタンパク質から高い効率で除去されることが当該分野では周知である。ほとんどのタンパク質上のＮ末端メチオニンはまた、ほとんどの原核生物で効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では、この原核生物の除去過程は、Ｎ末端メチオニンが共有結合されているアミノ酸の性質に依存して不十分である。
【０１２８】
代表的には、異種ポリペプチドは、改変されてもされなくても、上記のように、または融合タンパク質として発現されてもよく、そしてこれには分泌シグナルを含むだけでなく、分泌リーダー配列も含んでもよい。本発明の分泌リーダー配列は、小胞体（ＥＲ）に対して特定のタンパク質を指向する。このＥＲは、他のタンパク質から膜結合タンパク質を分離する。一旦ＥＲに局在すれば、タンパク質は、分泌小胞を含む小胞；原形質膜；リソソーム；および他のオルガネラへの分布のためにゴルジ装置にさらに指向され得る。
【０１２９】
分泌リーダー配列によってＥＲに標的化されるタンパク質は、分泌されたタンパク質として細胞外間隙へ放出され得る。例えば、分泌タンパク質を含む小胞は、細胞膜と融合されてもよく、そしてその内容物をエキソサイトーシスを介して細胞外間隙へ放出し得る。エキソサイトーシスは、構成的に、または誘引シグナルの受容の際に生じ得る。後者の場合、タンパク質は、エキソサイトーシスが誘引されるまで分泌小胞（または分泌顆粒）に保管され得る。同様に、細胞膜上に存在するタンパク質はまた、膜に対してタンパク質を保持するリンカーのタンパク質分解による切断によって細胞外間隙に分泌され得る。
【０１３０】
さらに、ペプチド部分および／または精製タグが、精製を容易にするためにポリペプチドに添加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。他の理由のうちでもとりわけ、分泌または排出を生じさせるため、安定性を改善するため、そして精製を容易にするためのポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該分野において周知でかつ慣用的な技術である。適切な精製タグとしては、例えば、Ｖ５、ＨＩＳＸ６（配列番号２７７）、ＨＩＳＸ８（配列番号２７８）、アビジンおよびビオチンが挙げられる。
【０１３１】
本発明は、タンパク質を安定化して精製するために有用である免疫グロブリン由来の異種領域を含む融合タンパク質を提供する。他のうちでもとりわけ、分泌または排出を生じさせるため、安定性を改善するため、そして精製を容易にするためのポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該分野において周知でかつ慣用的な技術である。例えば、欧州特許第０  ４６４  ５３３号（カナダでの対応は２０４５８６９号）は、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を別のヒトタンパク質またはその一部と一緒に含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断における使用に有利であり、従って、例えば、改良された薬物動態的な特性を生じる（欧州特許０  ２３２  ２６２号）。他方では、いくつかの用途については、融合タンパク質は記載された有利な方式で発現され、検出され、そして精製された後、Ｆｃ部分を欠失し得ることが所望される。これは、Ｆｃタンパク質が治療および／または診断における用途を妨害するものであることが証明される場合、例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として用いられるべきである場合に特にあてはまる。例えば、薬物開発においては、ヒトのタンパク質、例えばｈＩＬ−５は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイ−スループットのスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇ．８：５２〜５８（１９９５）およびＪｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：９４５９〜９４７１（１９９５）を参照のこと。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは、単離型で提供されてもよいし、そして上記のように実質的に精製されてもよい。本明細書に記載されるＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドの組み換え生成バージョンはまた、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ，６７：３１〜４０（１９８８）に記載の１工程法に従って、実質的に単離されてもよい。本発明のポリペプチドはさらに、当該分野で周知の方法を用いて生成された本発明の抗ＭＧＤ−ＣＳＦ抗体を用いて、天然または組み換えの供給源から単離されてもよい。
【０１３３】
本明細書に記載のポリペプチドは、当該分野で習慣的であるように、分子の折り畳みを補助するか、または分子の二量体化もしくは三量体化を補助するイオンまたは因子の存在下で精製または単離され得る。例えば、生理学的な折り畳みまたは重合化を促進するためには補因子が添加され得る。
【０１３４】
本発明のさらなるポリペプチドは、上記のポリペプチドに対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドはまた、配列表の核酸配列によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一であるポリペプチドを含む。
【０１３５】
２つのポリペプチドの同一性％は、類似性決定のためのデフォールト設定を用いるＢｅｓｔｆｉｔプログラムを用いて２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定された類似性スコアによって測定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列の間の類似性の最適セグメントを見出す。
【０１３６】
ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペプチドのアミノ酸配列が、この参照ポリペプチドの各々１００個のアミノ酸あたり最大５つまでのアミノ酸改変を含んでもよいこと以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列がこの参照配列に対して同一であるポリペプチドである。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、この参照配列におけるアミノ酸残基のうち最大５％までが欠失されるか、もしくは別のアミノ酸と置換されてもよく、または多数のアミノ酸、参照配列における総アミノ酸残基の最大５％までがこの参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じても、またはそれらの末端位置の間のいずれで生じても、この参照配列の残基の間で個々に、またはこの参照配列内で１つ以上の連続する群で分散されてもよい。
【０１３７】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列表に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、またはポリペプチド配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムのような公知のコンピュータープログラムを用いて都合よく決定され得る。特定の配列が、本発明による参照配列に対して例えば９５％同一であるか否かを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アラインメントプログラムを用いる場合、そのパラメーターは、当然ながら、同一性のパーセンテージが、この参照アミノ酸配列の全長にわたって算出され、そして、参照配列中のアミノ酸残基の総数の最大５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
【０１３８】
（改変体および変異体ポリペプチド）
タンパク質操作は、本発明のＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドの特徴を改善または変更するために使用され得る。当業者に公知の組み換えＤＮＡ技術は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む、新規な変異タンパク質または「突然変異タンパク質（ムテイン）」を生成するために用いられ得る。このような改変ポリペプチドは、所望の特性、例えば、活性の増強または安定性の増大を示し得る。さらに、それらは、少なくとも特定の精製および保管条件下で、対応する天然のポリペプチドよりも高い収率で精製されて、良好な可溶性を示し得る。
【０１３９】
（Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体）
例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは成熟型の分泌タンパク質を含む多くのタンパク質について、当該分野では、１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な損失なしにＮ末端またはＣ末端から欠失され得ることが公知である。例えば、Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４〜２９８８（１９９３）は、３、８または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基が欠失されていてさえ、ヘパリン結合活性を有する改変されたＫＧＦタンパク質を報告した。
【０１４０】
しかし、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このタンパク質の１つ以上の生物学的な機能の改変または損失を生じる場合でさえ、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、短縮されたタンパク質がこのタンパク質の完全なまたは成熟型を認識する抗体を誘導するか、および／またはその抗体に結合する能力は、一般に、この完全または成熟タンパク質の残基の過半数未満がＮ末端から除去される場合には保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記載される慣用的な方法によって、決定され得、そしてそうでなければ当該分野で公知である。従って、本発明はさらに、配列表に示されるように、ＭＧＤ−ＣＳＦ分子のアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失されているポリペプチドを提供する。
【０１４１】
同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失突然変異タンパク質（ムテイン）の多くの例が公知である。例えば、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基が欠失された場合、１０倍程度、活性を増大する。例えば、Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９〜２１６（１９８８）を参照のこと。
【０１４２】
しかし、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失がこのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、短縮されたタンパク質がこのタンパク質の完全なまたは成熟型を認識する抗体を誘導するか、および／またはその抗体に結合する能力は、一般に、この完全または成熟タンパク質の残基の過半数未満がＣ末端から除去される場合には保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記載される慣用的な方法によって、決定され得、そしてそうでなければ当該分野で公知である。
【０１４３】
（システインからセリンへの突然変異タンパク質（ムテイン））
ＭＧＤ−ＣＳＦ配列は、アミノ酸位置３５、１６７、１７６、１７８、１７９、１９０および１９８に位置する７つのシステイン残基を含む。ある実施形態では、本発明は、システインに対して変異されたセリンを有する変異体ＭＧＣ３４６４７分子を提供する。これらの変異体は、表１および配列表に示され、配列番号２５８〜２７１と命名される。配列番号１４に記載されるコラーゲンシグナルペプチドを用いて、発現されたポリペプチドの分泌を改善した。表１および図８Ｂに示され、そして実施例１８にさらに詳細に例証されるように、３５、１６７、１７６、１７８、１７９、１９０および１９８位置のシステインは、各々がセリンに置換された。これらの構築物は、当該分野で公知のような任意の適切なベクターに、例えば、ｐＴＴ５−Ｇベクターにクローニングされてもよい。
【０１４４】
これらの突然変異タンパク質（ムテイン）を分析する事によって、ＭＧＤ−ＣＳＦのジスルフィド結合パターンが理解され、そして改善された特性、例えば、哺乳動物細胞からの改善された発現および分泌、精製されたタンパク質の凝集の減少、ならびにＥ．ｃｏｌｉ中で発現された場合、活性な組み換えＭＧＤ−ＣＳＦを生成する能力を有するタンパク質が同定され得る。
【０１４５】
（他の変異体）
上記で考察されたタンパク質の末端欠失形態に加えて、ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能の有意な効果なしに変更され得ることも当業者によって理解される。配列においてこのような相違が意図される場合、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存在することを覚えておくべきである。
【０１４６】
従って、本発明はさらに、実質的なＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド活性を示すか、または下に考察されるタンパク質部分のようなＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質の領域を含むＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドの改変体を包含する。このような変異体は、活性にほとんど影響を有さないような、当該分野で公知の一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、反転、リピートおよびタイプ置換を包含する。例えば、表現型としてサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に提供され、この著者は、変化に対するアミノ酸配列の許容性を研究する２つの主なアプローチが存在することを示している。この第一の方法は、進化の過程に依存しており、ここでは変異は、自然の選択によって許容されるかまたは拒絶される。第二のアプローチは、クローニングされた遺伝子および選択の特定の位置でアミノ酸変化を誘導するように、または機能を維持する配列をスクリーニングして同定するように遺伝子操作を用いる。
【０１４７】
これらの研究によって、タンパク質は驚くべき事に、アミノ酸置換に耐性であることが報告される。著者らはさらに、どのアミノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容される可能性が高いかを示す。例えば、ほとんどの埋もれているアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されない。他のこのような表現型としてサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅら、前出およびそこに引用される参考文献に記載される。代表的には、保存的置換として示されるのは１つのアミノ酸の別のアミノ酸での置換、とりわけ、脂肪族アミノ酸Ａｌａ，Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間の置き換えである。
【０１４８】
従って、配列表のポリペプチドまたは配列表の核酸配列によってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基で置換されるもの；このような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい、もの（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの；（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリぺプチドの半減期を増大する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）との融合されるもの；あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、上記の形態のポリペプチド、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド、リーダー配列もしくは分泌配列、上記の形態のポリペプチドを精製するために使用される配列、または前駆タンパク質配列と融合されるものであってもよい。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１４９】
従って、本発明のＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドは、天然の変異体またはヒトの操作のいずれかに由来する、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでもよい。示されるとおり、これらの変化は、タンパク質の折り畳みにも活性にも有意に影響しない、保存的アミノ酸置換のような、軽度の変化であり得る。保存的なアミノ酸置換としては、芳香族の置換Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ；疎水性置換Ｌｅｕ、ＩｓｏおよびＶａｌ；極性の置換ＧｌｕおよびＡｓｐ；塩基性の置換ＡＲｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓ；酸性の置換ＡｓｐおよびＧｌｕ；そして小アミノ酸の置換Ａｌａ、Ｓｅｒ，Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙが挙げられる。
【０１５０】
ＭＧＤ−ＳＣＦポリペプチドの機能に必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方法、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャンニング変異誘発によって同定され得る。例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１〜１０８５（１９８９）を参照のこと。後者の手順は、単一アラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、レセプター結合のような生物学的活性について、またはインビトロもしくはインビボの増殖活性について試験される。
【０１５１】
特別な目的なのは、凝集の低下のような、極めて所望される改善された特徴を有するタンパク質を生成し得る、荷電されたアミノ酸の他の荷電されたまたは中性のアミノ酸での置換である。凝集は、活性を減少させ得るだけでなく、薬学的な処方物を調製する場合にも問題であり得る。なぜなら、例えば、凝集体は、免疫原性であり得るからである、Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７〜３７７（１９９３））。
【０１５２】
アミノ酸置換は、細胞表面レセプターに対するリガンドの結合の選択性を変化し得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、２つの公知のタイプのＴＮＦレセプターのうちの１つだけに対するＴＮＦ−αの選択的な結合を生じる変異を記載する。リガンド−レセプター結合に重要である部位はまた、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識のような構造の分析によって決定され得る、例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：８９９〜９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：３０６〜３１２（１９９２）。
【０１５３】
（エピトープ保有部分）
下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドを用いて、これも下に記載されるように、ＭＧＤ−ＳＣＦタンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて、またはＭＧＤ−ＳＣＦタンパク質機能を増強または阻害し得るアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストとして有用であるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を上昇させ得る。これらのポリペプチドはまた、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニストでもある、ＭＧＤ−ＳＣＦタンパク質結合を捕獲するための酵母ツーハイブリッドシステムにおいて用いられ得る。酵母ツーハイブリッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３４０：２４５〜２４６（１９８９）に記載される。
【０１５４】
別の局面では、本発明は、本発明のポリペプチドの１つ以上のエピトープ保有部分を含むポリペプチドを提供する。本発明は、ＭＧＤ−ＣＳＦに特異的なポリクローナル抗体を提供し、そして最低でも２つの抗原性エピトープを有するＭＧＤ−ＳＣＦを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性のエピトープである。免疫原性エピトープとは、タンパク質全体が免疫原として提供される場合に抗体応答を惹起するタンパク質の部分である。他方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は抗原性エピトープである。タンパク質の免疫原性エピトープの数は一般に、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：３９９８〜４００２（１９８３）を参照のこと。
【０１５５】
抗原性エピトープを保有するポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含むポリペプチド）の選択に関しては、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、この部分的に模倣されたタンパク質と相互作用する抗血清を慣用的に惹起し得ることが当業者に周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：６６０〜６６６（１９８３）を参照のこと。タンパク質反応性血清を惹起し得るペプチドはタンパク質の一次配列において頻繁に提示されており、単純な化学的規則のセットによって特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質のイムノドミナントな領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノまたはカルボキシル末端にも限定されない。従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７〜７７８（１９８４）を参照のこと。本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の方法によって生成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５１３１〜５１３５（１９８５）および米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）を参照のこと。
【０１５６】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドを用いて、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導し得る。例えば、Ｂｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７〜２３５４（１９８５）を参照のこと。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチドであって、抗体応答を惹起するタンパク質の一部であるものは、タンパク質全体が免疫原である場合、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、目的の抗体の特定の抗原結合部位（パラトープ）に相補的であるエピトープ（ミモトープ）の位相幾何学的等価物であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的方法を記載する米国特許第５，１９４，３９２号（１９９０）を参照のこと。さらに一般的には、米国特許第４，４３３，０９２号（１９８９）は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、米国特許第５，４８０，９７１号（１９９６）は、直線状のＣ１−Ｃ７−アルキル過アルキル化オリゴペプチド、ならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、そして、例えば、目的のアクセプター分子に結合する、過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを用いるための方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法によって慣用的に作成され得る。
【０１５７】
（融合分子）
当業者が理解するとおり、本発明のＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド、およびその上記のエピトープ保有フラグメントは、異種ポリペプチドと組合されてキメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は、精製を容易にして、インビボでの半減期の増大を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質において報告されている、例えば、欧州特許０  ３９４  ８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）。ＩｇＧ部分に起因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜３９６４（１９９５）によって記載されるように、モノマーＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも他の分子に結合および中和するのに効率的であり得る。異種ポリペプチドの誘導体化のための適切な化学部分としては、本明細書に記載され、そして米国特許第６，６８６，１７９号および米国特許出願第６０／５８９，７８８号および６０／６５４，２２９号にさらに記載されるような、例えば、ポリマー、例えば水溶性ポリマー、免疫グロブリンの定常ドメイン、ヒト血清アルブミンの全てまたは一部；フェチュインＡ；フェチュインＢ；ロイシンジッパードメイン；テトラネクチン三量体化ドメイン；マンノース結合タンパク質（マンノース結合レクチンとしても公知）、例えば、マンノース結合タンパク質１；およびＦｃ領域が挙げられる。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。
【０１５８】
例えば、改変されていないインターフェロンαの短い血漿半減期のせいで、ウイルスおよび増殖性障害を処置するために、長期間にわたって頻繁な投与が必要になる。ＨＳＡを融合されたインターフェロンαは、より長い半減期を有し、そして未改変のインターフェロンαよりも必要な投与頻度は少ない；この半減期は１８倍長く、そしてクリアランス速度は、約１４０倍遅い（Ｏｓｂｏｒｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０３：５４０〜５４８，２００２）。ＨＳＡと融合されたインターフェロンβはまた、有益な薬物動態学的特性を有する；その半減期は、未改変のインターフェロンβでの８時間と比較して、３６〜４０時間であることが報告された（Ｓｕｎｇら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２３：２５〜３６，２００３）。ＨＳＡ−インターロイキン−２融合タンパク質は、未改変のインターロイキン−２に比較して長い半減期および有益な生体分布の両方を有することが報告されている。この融合タンパク質は、未改変のインターロイキン２よりも大きい程度までリンパ球が存在する組織を標的することが観察されており、このことはこの融合タンパク質がより大きい有効性を発揮することを示唆している（Ｙａｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：４０４〜４１０，２００４）。
【０１５９】
ヒト免疫グロブリンＧサブクラス１のＦｃレセプターはまた、治療分子の融合タンパク質として用いられている。これは、２つの可溶性ｐ７４腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター分子に対して組み換え的に結合されている。この融合タンパク質は、単量体の可溶性レセプターよりも長い循環半減期を有すること、および関節リウマチを有する患者の関節におけるＴＮＦα誘発性炎症促進活性を阻害することが報告されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：７５〜８７，１９９９）。この融合タンパク質は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎を処置するために臨床的に用いられている（ＮａｎｄａおよびＢａｔｈｏｎ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５：１１７５〜１１８６，２００４）。
【０１６０】
ポリマー、例えば、水溶性ポリマーは、本発明において、ポリペプチドとして有用であり、このポリペプチドには各々のポリマーが結合されて、例えば、代表的には生理学的な環境で見出されるような水溶性の環境では、沈殿しない。本発明において使用されるポリマーは、治療産物または組成物の調製について薬学的に受容可能である。当業者は、このポリマー／タンパク質結合体が治療的に用いられるか、そしてそうである場合、所望の投与量、循環時間およびタンパク質分解に対する耐性のような考慮に基づいて所望のポリマーを選択し得る。
【０１６１】
適切な、臨床的に受容可能な、水溶性ポリマーとしては、限定はしないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトールまたはポリオキシエチル化グルコース、結腸酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ）または他の炭水化物ポリマー、Ｆｉｃｏｌｌ、またはデキストランおよびその混合物が挙げられる。
【０１６２】
本明細書において用いる場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールのような他のタンパク質を誘導するために用いられている任意の形態をほうがんすることを意味する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して製造に利点を有し得る。
【０１６３】
詳細には、本発明の改変された異種ポリペプチドは、このポリペプチドに対してポリアミノ酸または分岐点アミノ酸を結合することによって調製され得る。例えば、ポリアミノ酸は、ポリペプチドの循環半減期を増大するように機能するキャリアタンパク質であり得る（融合分子を介して達成された利点に加えて）。本発明の治療目的に関して、このようなポリアミノ酸は理想的には、中和抗原性応答を有するかまたは生じず、他の有害な応答も生じないものでなければならない。このようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、そのさらなる抗体または部分、例えば、Ｆｃ領域、フェチュインＡ、フェチュインＢ、ロイシンジッパー核因子赤血球誘導因子−２（ＮＦＥ２）、神経網膜ロイシンジッパー、テトラネクチン、または他のポリアミノ酸、例えば、リジンから選択され得る。本明細書において記載されるように、ポリアミノ酸の付着の位置は、Ｎ末端もしくはＣ末端、または間の他の位置であってもよく、そしてまた選択された分子に対して化学的なリンカー部分によって接続されてもよい。
【０１６４】
本明細書において用いられるポリマー、例えば水溶性ポリマーは、任意の分子量のポリマーであってもよいし、そして分枝してもしなくてもよい。このポリマーは各々代表的には、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有する（用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、ポリマーの調製物においては、ある程度の分子が、述べられた分子量より多いか、ある程度少ないことを示す）。各々のポリマーの平均分子量は、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであっても、または約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａであってもよい。一般には、分子量が高いか、またはより分枝しているほど、ポリマー：タンパク質の比は高い。所望の治療プロフィール；例えば、徐放性の期間；もしあれば、生物学的活性に対する影響；取り扱いの容易さ；抗原性の程度または欠失；および本発明の改変された分子に対するポリマーの他の公知の効果；に依存して、他のサイズも用いられてもよい。
【０１６５】
本発明において使用されるポリマーは代表的には、ポリペプチドの機能的なドメインまたは抗原性のドメインに対する影響を考慮して異種のポリペプチドに対して結合される。一般には、化学的誘導体は、活性化ポリマー分子とタンパク質を反応させるために用いられる任意の適切な条件下で行われ得る。活性部分に対してポリマーを連結するために用いられ得る活性化基としては、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジジリン（ａｚｉｄｉｒｉｎｅ）、オキシランおよび５−ピリジルが挙げられる。
【０１６６】
本発明のポリマーは代表的には、アミノ酸のアルファ（α）もしくはイプシロン（ε）アミノ基、または反応性のチオール基で異種ポリペプチドに結合されるが、ポリマー基は、適切な反応条件下でポリマー基に結合するように十分に反応性であるタンパク質の任意の反応性基に結合されてもよいことも意図される。従って、ポリマーは、遊離のアミノまたはカルボキシル基のような反応性基を介して異種ポリペプチドに共有結合されてもよい。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基は、ロイシン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含んでもよい。遊離のカルボキシル基を有する残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基を挙げることができる。反応性チオールを有する残基としては、システイン残基が挙げられる。
【０１６７】
水溶性ポリマーのようなポリマーと結合体化された融合分子を調製するための方法は、各々一般に、（ａ）異種ポリペプチドとポリマーとをこのポリペプチドが１つ以上のポリマーと結合するようになる条件下で反応させる工程と、（ｂ）この反応産物を獲得する工程とを包含する。各々の結合のための反応条件は、当該分野で公知の任意の条件、またはその後に開発された条件から選択されてもよいが、改変されるべきタンパク質を不活性化する温度、溶媒およびｐＨレベルのような反応条件に対する曝露を回避または制限するように選択されなければならない。一般には、反応のための最適の反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて場合によって決定される。例えば、ポリマー：ポリペプチドの結合体の比が大きいほど、結合体化された産物の割合は大きくなる。最適の比（反応の有効性に関して、過剰な未反応のポリペプチドもポリマーも存在しないという点で）は、所望の程度の誘導体化（例えば、モノ−、ジ−  トリ−など）、選択されたポリマーの分子量、このポリマーが分枝されるか未分枝であるか、および用いられる反応条件のような要因によって決定され得る。ポリペプチドに対するポリマー（例えば、ＰＥＧ）の比は一般に、１：１〜１００：１におよぶ。１つ以上の精製された結合体は、とりわけ透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動を含む、標準的な精製技術によって各々の混合物から調製されてもよい。
【０１６８】
Ｎ末端の化学的に改変されたタンパク質が特に所望され得る。分子量、分岐など、反応混合物中のタンパク質（ポリペプチドまたはペプチド）分子に対するポリマーの割合、行われるべき反応のタイプ、および選択されたＮ末端の化学的に改変されたタンパク質を得る方法によってポリマーは選択され得る。Ｎ末端の化学的に改変されたタンパク質調製物を得る方法（必要に応じて他のモノ誘導体化（ｍｏｎｏｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）部分からこの部分を分離する）は、化学的に改変されたタンパク質分子の集団からのＮ末端で化学的に改変されたタンパク質物質の精製によるものであってもよい。
【０１６９】
選択性のＮ末端化学改変は、特定のタンパク質における誘導体化について利用可能な異なるタイプの一次アミノ基（リジン対Ｎ末端）の異なる反応性を引き出す還元性のアルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーによるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択性の誘導体化が達成される。例えば、このタンパク質のリジン残基のεアミノ基とＮ末端残基のαアミノ基との間のｐＫａの相違を利用することができるｐＨで反応を行うことによってタンパク質のＮ末端に対してポリマーを選択的に結合してもよい。このような選択的な誘導体化によって、タンパク質に対するポリマーの結合が制御される：ポリマーとの結合体化は、タンパク質のＮ末端で優先的に生じ、リジン側鎖アミノ基のような他の反応性基の有意な改変は生じない。還元性アルキル化を用い、このポリマーは、上記のタイプであってもよく、タンパク質に対するカップリングのために単一の反応性アルデヒドを有するべきである。単独の反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドも用いられ得る。
【０１７０】
１実施形態では、本発明は、化学的に誘導体化されたポリペプチドがモノ−またはポリ（例えば、２−４）ＰＥＧ部分を含むことを意図する。ペグ化は、当該分野で公知の任意のペグ化反応によって行われてもよい。ペグ化したタンパク質産物を調製するための方法は、一般に、ポリペプチドとポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とをこのタンパク質が１つ以上のＰＥＧ基に結合するようになる条件下で反応させる工程と；（ｂ）この反応産物を得る工程とを包含する。一般には、この反応の最適の反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて場合によって決定される。
【０１７１】
当業者に利用可能な多数のＰＥＧ結合方法が存在する。例えば、欧州特許０  ４０１  ３８４号；Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜１０３５（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４〜１０（１９９２）；欧州特許０  １５４  ３１６；欧州特許０  ４０１  ３８４；ＷＯ  ９２／１６２２１；ＷＯ９５／３４３２６；ならびにペグ化に関する本明細書に引用される他の刊行物を参照のこと。
【０１７２】
本明細書に記載のようなペグ化の工程は、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化またはアルキル化を介して行われてもよい。従って、本発明によるタンパク質産物は、ＰＥＧ基（単数または複数）がアシル基またはアルキル基を介して結合されるペグ化タンパク質を含む。このような産物は、モノペグ化（ｍｏｎｏ−ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）されてもまたはポリペグ化（ｐｏｌｙ−ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）されてもよい（例えば、２−６または２−５ＰＥＧ基を含むもの）。このＰＥＧ基は一般に、アミノ酸のαアミノ基またはεアミノ基でタンパク質に結合されるが、ＰＥＧ基は、適切な反応条件下でＰＥＧ基に結合されるのに十分に反応性であるタンパク質に対して結合された任意のアミノ基に結合され得ることも想定される。
【０１７３】
アシル化によるペグ化は一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性なエステル誘導体と本発明のポリペプチドとを反応させる工程を包含する。アシル化反応のためには、選択されたポリマー（単数または複数）は代表的には、単独の反応性エステル基を有する。任意の公知のまたは引き続いて開発された反応性ＰＥＧ分子が、ペグ化反応を行うために用いられてもよい。適切な活性化ＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）に対してエステル化されたＰＥＧである。本明細書において用いる場合、アシル化は、限定はしないが、治療タンパク質とポリマーとの間の以下のタイプの結合を包含するものとする：ＰＥＧ：アミド、カルバメート、ウレタンなど、例えば、Ｃｈａｍｏｗ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：１３３〜１４０（１９９４）。反応条件は、ペグ化物において公知の任意の条件、またはその後に開発された条件から選択されてもよいが、改変されるべきポリペプチドを不活性化する温度、溶媒およびｐＨのような条件は回避しなければならない。
【０１７４】
アシル化によるペグ化は一般に、ポリ−ペグ化タンパク質を生じる。接続する結合はアミドであってもよい。得られた産物は、実質的に一、二−または三−ペグ化されたものだけであり得る（例えば＞９５％）。しかし、高い程度のペグ化を有するいくつかの種は、用いられる特定の反応条件に依存した量で形成され得る。所望の場合、さらに精製されたペグ化種は、とりわけ透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動を含む、標準的な精製技術によって混合物（特に未反応の種）から調製されてもよい。
【０１７５】
アルキル化によるペグ化は、一般に、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とポリペプチドとを反応させる工程を包含する。還元性のアルキル化反応のためには、選択されたポリマー（単数または複数）は、単独の反応性アルデヒド基を有するべきである。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノ−Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ−もしくはアリールオキシ誘導体であり、例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと。
【０１７６】
さらに、本発明の異種ポリペプチドおよび本明細書に記載のそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わされて、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの特定の融合分子は、精製を容易にし、そしてインビボにおける半減期の増大を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質中で示されている。例えば、欧州特許０  ３９４  ８２７号；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）。ＩｇＧ部分に起因するジスルフィド連結二量体構造を有する融合分子はまた、例えば、単量体のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント単独よりも、他の分子に結合して中和するのに効果的であり得る；例えば、Ｆｏｕｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｇｈｅｍ．，２７０：３９５８〜３９６４（１９９５）を参照のこと。
【０１７７】
別の記載された実施形態では、ヒト血清アルブミン融合分子はまた、本明細書に記載のように、そして米国特許第６，６８６，１７９号にさらに記載されるとおり調製され得る。
【０１７８】
さらに、本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドのようなマーカー配列に融合されてもよい。マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、その多くが市販されている、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）に提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであってもよい。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：８２１〜８２４（１９８９）に記載されるとおり、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである赤血球凝集ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））。これらの上記の融合物のいずれかが、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて操作され得る。
【０１７９】
（分泌性リーダー配列）
本明細書において、そして米国特許６０／６４７，０１３号実証されるように、いくつかの分泌タンパク質が大量に発現および分泌されるためには、別の異なる分泌タンパク質由来の分泌性リーダー配列が所望される。異種の分泌性リーダー配列を使用することは、分泌されたポリペプチドの得られた成熟アミノ酸配列は、分泌過程の間にＥＲにおいて分泌リーダー配列が除去される場合変更されないという点で有利である。さらに、異種分泌リーダーの付加は、いくつかのタンパク質を発現および分泌するために必要である。
【０１８０】
従って、タンパク質を分泌してＭＧＤ−ＣＳＦを発現するために普遍的に用いられ得る潜在的な強固な分泌リーダー配列（単数または複数）を同定するためには、出願人らは、多数の異なる分泌タンパク質をクローニングして発現し、アデノウイルス５で形質転換されているヒト胚性腎細胞株２９３の細胞の上清中でそれらの発現および分泌のレベルを測定している（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））。いくつかの高い発現因子および高レベルの分泌タンパク質が観察された。
【０１８１】
１実施形態では、分泌されたタンパク質コラーゲンＩＸ型αＩ鎖長型に属する分泌リーダー配列を選択して、異種分泌リーダー配列として用いられた場合、発現および分泌を促進する能力をさらに試験した。本明細書に記載されるとおり、分泌されたタンパク質であるコラーゲンＩＸ型αＩ鎖長型のアミノ酸配列は、ＭＫＴＣＷＫＩＰＶＦＦＦＶＣＳＦＬＥＰＷＡＳＡ（配列番号１４）であると予想される。本明細書にさらに記載されるように、この特定の分泌リーダーを含むベクターが構築され、いくつかのタンパク質は、全長コード配列から分泌リーダーを除去して、配列番号１４を含むベクターにそれらをクローニングすることによってクローニングされ、それによって異種分泌性リーダー配列を有する分泌タンパク質が得られた。いくつかの他の選択されたタンパク質の高い発現および分泌も観察された。
【０１８２】
本明細書に記載される、同定された分泌性リーダー配列としては、例えば、インターロイキン−９前駆体、Ｔ細胞増殖因子Ｐ４０、Ｐ４０サイトカイン、トリアシルグリセロールリパーゼ、膵臓前駆体、ソマトリベリン前駆体、バソプレッシン−ニューロフィシン２−コペプチン前駆体、β−エノエンドルフィン−ジノルフィン前駆体、補体Ｃ２前駆体、小誘導性サイトカインＡ１４前駆体、エラスターゼ２Ａ前駆体、血漿セリンプロテアーゼインヒビター前駆体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子前駆体、インターロイキン２前駆体、インターロイキン３前駆体、α−フェトプロテイン前駆体、α−２−ＨＳ−糖タンパク質前駆体、血清アルブミン前駆体、インター−α−トリプシンインヒビター軽鎖、血清アミロイドＰ成分前駆体、アポリポプロテインＡ−ＩＩ前駆体、アポリポプロテインＤ前駆体、コリパーゼ前駆体、カルボキシペプチダーゼＡ１前駆体、α−ｓ１カゼイン前駆体、βカゼイン前駆体、シスタチンＳＡ前駆体、ホリトロピンβ鎖前駆体、グルカゴン前駆体、補体因子Ｈ前駆体、ヒスチジン−リッチ糖タンパク質前駆体、インターロイキン−５前駆体、α−ラクトアルブミン前駆体、Ｖｏｎ  Ｅｂｎｅｒの腺タンパク質前駆体、マトリックスＧｌａ−タンパク質前駆体、α−１−酸糖タンパク質２前駆体、ホスホリパーゼＡ２前駆体、樹状細胞ケモカイン１、スタセリン（ｓｔａｔｈｅｒｉｎ）前駆体、トランスサイレチン前駆体、アポリポプロテインＡ−１前駆体、アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ前駆体、アポリポプロテインＥ前駆体、補体成分Ｃ８γ鎖前駆体、セロトランスフェリン（ｓｅｒｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）前駆体、β−２−ミクログロブリン前駆体、好中球デフェンシン１前駆体、トリアシルグリセロールリパーゼガストリック前駆体、ハプトグロビン前駆体、好中球デフェンシン３前駆体、腫瘍原性１前駆体の神経芽細胞腫サプレッサー、小誘導性サイトカインＡ１３前駆体、ＣＤ５抗原様前駆体、リン脂質移動タンパク質前駆体、ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−４−前駆体、エラスターゼ２Ｂ前駆体、α−１−酸糖タンパク質１前駆体、β−２−糖タンパク質１前駆体、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン前駆体、Ｃ反応性タンパク質前駆体、インターフェロンγ前駆体、κカゼイン前駆体、血漿レチノール結合タンパク質前駆体、インターロイキン−１３前駆体、および表または配列表に示される任意の分泌タンパク質が挙げられる。
【０１８３】
本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクターおよび方法は、例えば、分泌ポリペプチド、細胞外タンパク質、膜貫通タンパク質および可溶性レセプターのようなレセプターを含む、種々のポリペプチドの発現に有用である。このようなポリペプチドの例としては、限定はしないが、サイトカインおよび増殖因子、例えば、インターロイキン１−１８、インターフェロン、リンホカイン、ホルモン、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）、リンホトキシン−β、Ｆａｓリガンド、ｆｌｔ−３リガンド、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベータについてのリガンド（ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ）（ＲＡＮＫＬ）、可溶性レセプター、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＣＤ４０リガンド、Ｏｘ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド（およびＴＮＦファミリーの他のメンバー）、胸腺間質由来リンホポイエチン、刺激因子、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、阻害因子、肥満細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、表皮増殖因子、成長ホルモン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン−Ｍ、造血因子、例えば、エリスロポイエチンおよびトロンボポイエチン、ならびにこれらのいずれかのスプライシング改変体が挙げられる。
【０１８４】
本発明によって発現され得るいくつかのタンパク質の説明は、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第ＩＩ巻（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ、編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ，１９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）およびＴｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．Ｗ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．１９９１）に見出され得る。
【０１８５】
任意の上述のタンパク質のレセプターはまた、例えば、両方の形態の腫瘍壊死因子レセプター（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、インターロイキン−１レセプター（タイプ１および２）、インターロイキン−４レセプター、インターロイキン−１５レセプター、インターロイキン−１７レセプター、インターロイキン−１８レセプター、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子レセプター、顆粒球コロニー刺激因子レセプター、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子のレセプター、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベータ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ）（ＲＡＮＫ）、ＴＲＡＩＬのレセプター、および死亡ドメインを含むレセプター、例えば、Ｆａｓまたはアポトーシス誘導性レセプター（ＡＩＲ）を含む、本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクターおよび方法を用いて発現され得る。
【０１８６】
本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクターおよび方法を用いて発現され得る他のタンパク質としては、例えば、分化抗原のクラスター（ＣＤタンパク質と呼ばれる）、例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ
ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉら編；Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ，１９９６）に記載されるもの、またはその後のワークショップで開示されたＣＤ分子が挙げられる。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０；およびそのリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドおよびＣＤ４０リガンド）が挙げられる。これらのいくつかは、４１ＢＢおよびＯＸ４０も含む、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであって；このリガンドはしばしば、ＴＮＦファミリーのメンバーである（４−１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドと同じく）；従って、ＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーはまた、本発明を用いて発現され得る。
【０１８７】
酵素的に活性であるタンパク質はまた、本明細書に記載された分泌リーダー配列、ベクターおよび方法を使用して発現されてもよく、そして例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー、種々のキナーゼ（ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベータ、ならびにアンキリンリピートおよびＩＫＲ１および２を含む死亡関連キナーゼを含む）、ＴＮＦα変換酵素、および種々の他の酵素を包含する。酵素的に活性なタンパク質のリガンドはまた、本発明を適用することによって発現され得る。
【０１８８】
本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクターおよび方法はまた、例えば、免疫グロブリン分子またはその部分、およびキメラ抗体（ヒト定常領域を有する抗体は、マウス抗原結合領域に結合する）またはそのフラグメントを含む他のタイプの組み換えタンパク質の発現について有用である。ＤＮＡコード免疫グロブリン分子を操作して、組み換えタンパク質、例えば、単鎖抗体、親和性の増大した抗体、または他の抗体に基づくポリペプチドをコードし得るＤＮＡを生じ得る多くの技術が公知である（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４〜９３８，１９８９；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７，１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１〜７３４，１９８７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６，１９８８；およびＣｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４〜３９７，１９８９を参照のこと）。
【０１８９】
（翻訳と同時および翻訳後の改変）
本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化による、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または抗体分子もしくは他の細胞リガンドに対する連結によって、翻訳中または翻訳後に示差的に改変されるポリペプチドを包含する。任意の多数の化学的改変は、限定はしないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼによる特定の化学的な切断；ＮＡＢＨ４、アセチル化；ホルミル化；酸化；還元；および／またはツニカマイシンの存在下の代謝合成を含む公知の技術によって行われてもよい。
【０１９０】
本発明によって包含されるさらなる翻訳後改変としては、例えば、Ｎ連結またはＯ連結された炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端を保有する）、アミノ酸骨格に対する化学部分の結合、Ｎ連結またはＯ連結された炭水化物鎖の化学的改変、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。ポリペプチドはまた、検出可能な標識、例えば、タンパク質の検出および単離を可能にする酵素、蛍光、同位体またはアフィニティー標識で改変されてもよい。
【０１９１】
また、本発明のポリペプチドの化学的に改変された誘導体であって、このポリペプチドの可溶性、安定性および循環時間の増大、または免疫原性の低下のようなさらなる利点を提供し得る誘導体も本発明によって提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体の化学的部分は、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどから選択され得る。このポリペプチドは、分子内の無作為な位置で、または分子内の所定の位置で改変されてもよく、そして１、２、３またはそれ以上の結合された化学部分を含んでもよい。
【０１９２】
ポリマーは任意の分子量であってもよく、そして分枝されても未分枝であってもよい。ポリエチレングリコールについては、適切な分子量は、取り扱いおよび製造における容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間である（この用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、ポリエチレングリコールの調製においては、ある程度の分子が言及された分子量よりも大きく、ある程度は小さいことを意味する）。所望の治療プロフィール（例えば、所望の徐放性の期間、もしあれば生物学的な活性に対する影響、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠失、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知影響）次第で、他のサイズが用いられてもよい。
【０１９３】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、このタンパク質の機能的なドメインまたは抗原性のドメインに対する影響を考慮してタンパク質に結合されなければならない。欧州特許０  ４０１  ３８４（Ｇ−ＣＳＦに対するＰＥＧの結合）のような、当業者に利用可能な多数の結合技術が存在する；またＭａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いるＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告している）も参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基のような反応性の基を介してアミノ酸残基を介して共有結合されてもよい。反応性基とは、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としてはリジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を挙げることができる；遊離のカルボキシル基を有する残基としては、アスパラギン酸残基  グルタミン算残基およびＣ末端アミノ酸残基を挙げることができる。スルフヒドリル基はまた、ポリエチレングリコール分子を結合するために反応性基として用いられ得る。治療目的に適切なのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。
【０１９４】
当業者は、Ｎ末端で化学的に修飾されたタンパク質を特に所望し得る。本発明の組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いて、当業者は、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分枝などによって）反応混合物中のタンパク質（ポリペプチド）分子に対するポリエチレングリコールの割合、行われるべきペグ化反応のタイプ、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質を得る方法を選択し得る。Ｎ末端でペグ化された調製物を得る（すなわち、必要に応じて他のモノペグ化（ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ）部分からこの部分を分離する）方法は、ペグ化タンパク質分子の集団からのＮ末端ペグ化物質の精製によるものであってもよい。Ｎ末端改変で化学的に改変された選択的なタンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なるタイプの一次アミノ基（リジン対Ｎ末端）の異なる反応性を引き出す還元性のアルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーとのＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１９５】
（染色体アッセイ）
染色体マッピングに関する特定の実施形態では、本明細書に開示のｃＤＮＡを用いて、ＭＧＤ−ＣＳＦのゲノム核酸をクローニングする。これは、一般に市販される種々の周知の技術およびライブラリーを用いて達成され得る。次いでゲノムＤＮＡを、この目的について周知の技術を用いるインサイチュの染色体マッピングで用いる。従って、本発明の核酸分子はまた、染色体同定のために有用である。この配列は、特異的に標的されて、個々のヒト染色体上の特定の位置とハイブリダイズし得る。さらに、染色体上の特定の部位を同定する必要性が現在ある。実際の配列データ（反復多型）に基く、染色体位置をマーキングするために現在利用できる染色体マーキング試薬は少ない。本発明による染色体に対するＤＮＡのマッピングは、それらの配列と疾患に関連する遺伝子とを関連づけるのにおいて重要な第一の工程である。
【０１９６】
要するに、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマーを調製することによって染色体にマッピングされ得る。３’非翻訳領域のコンピューター分析を、これによって増幅プロセスが複雑になるゲノムＤＮＡにおける２つ以上のエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択するために用いる。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いる。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【０１９７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に対して特定のＤＮＡを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用いて、亜局在性を特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは大きいゲノムクローンのプールで類似の方式で達成し得る。染色体をマッピングするために同様に用いられ得る他のマッピングストラテジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート染色体でのプレスクリーニング（ｐｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ  ｃｈｒｍｏｓｏｍｅｓ）および染色体特異的なｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる事前選択が挙げられる。
【０１９８】
中期染色体開裂に対するｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、１工程で正確な染色体位置を得ることができる。この技術は、約５０〜６０塩基程度の短さのｃＤＮＡで用いられ得る。この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ；Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０１９９】
正確な染色体位置に対して一旦配列がマッピングされれば、染色体上の配列の物理的な位置は、遺伝子マップデータと相関され得る。（このようなデータは、例えば、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで利用可能なＶ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎで見出される）。次いで、同じ染色体領域にマッピングされている遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の共同相続）を通じて同定される。
【０２００】
次に、相違は、罹患個体および非罹患個体のｃＤＮＡまたはゲノム配列において決定され得る。変異が罹患した個体の数例または全てで観察されるが、任意の正常な個体では観察されないならば、この変異はこの疾患の原因因子であると考えられる。物理的なマッピングおよび遺伝子マッピングの技術の現在の分解能では、疾患に関連する染色体領域に正確に局在する１つのｃＤＮＡが、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子のうちの１つであり得る（１メガベースのマッピング分解能および２０ｋｂあたり１遺伝子を仮定する）。
【０２０１】
ＭＧＤ−ＣＳＦをコードする遺伝子は、染色体１６ｑ２２．１に位置する。連鎖分析の研究によって、１６ｑ２２上の遺伝子は、家族性骨髄性白血病の原因に関与することが示唆される（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６１：８７３〜８８１（１９９７））。１１例の関係のある減数分裂伝達常染色体優性の急性骨髄性白血病および脊髄形成異常を含む家族でのこの研究においては、周知の白血病転移ブレークポイント領域である２１ｑ２２．１−ｑ２２．２および９ｐ２２−ｐ２１に対する連鎖は排除した。Ｈｏｒｗｉｔｚらは、マイクロサテライトマーカーＤ１６Ｓ５２２を用いて、これらの疾患と、組み換えフラクションθ＝０．０で２．８２という最大２−ポイントロッドスコアとを関連付け、これによって１６ｑ２２に対する連鎖の証拠を得た。ハプロタイプ分析によって、共通して、罹患した全ての家族のメンバーによって遺伝され、そしてＤ１６Ｓ４５１からＤ１６Ｓ２８９に伸長された、１６ｑ２２の２３．５−ｃＭ領域が示された。ノンパラメトリック連鎖分析によって、連鎖の条件付確率について０．０００９８というＰ値が得られた。突然変異解析は、多くの増殖応答性遺伝子および増殖促進遺伝子に存在する、ＡＴリッチミニサテライトリピートＦＲＡ１６Ｂ染色体不安定部の伸長およびＥ２Ｆ−４転写因子におけるＣＡＧ三ヌクレオチドリピートを排除した。予測に関連する動的突然変異を検出し得る、「反復伸長検出（ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」法はより一般的に、この家族における白血病の原因として、大きいＣＡＧリピートを排除した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、染色体１６ｑ２２．１に位置する。従って、これは潜在的に、急性骨髄性白血病および脊髄形成異常においてある役割を果たし得、そしてこれらの疾患を処置するために用いられ得る。
【０２０２】
（治療組成物および処方物）
本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、非経口投与のための薬学的組成物を含むために適切な薬学的なキャリアと組み合わせて使用され得る。このような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、限定はしないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストラン、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。この処方物は投与の様式に適合しなければならない。
【０２０３】
ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド組成物は、個々の被験体の臨床的な条件、ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与の計画、および医師に公知の他の要因を考慮して、適正な医療行為（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に一致した方式で処方されて投与される。従って、本明細書の目的のためのＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドの有効量は、このような考慮によって決定される。
【０２０４】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の成分の１つ以上で充填された１つ以上の容器を含む薬学的なパックまたはキットを提供する。このような容器（単数または複数）に付随するのは、薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府の機関によって規定された形態の注意書きであり得、この注意書きは、ヒトの投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療化合物と組み合わせて使用され得る。
【０２０５】
薬学的組成物は、従来の方式で、例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内の経路によって投与され得る。この薬学的組成物は、特定の適応の処置および／または予防のために有効である量で投与される。一般には、それらの薬学的組成物は、体重１ｋｇあたり少なくとも約１０μｇの量で投与され、ほとんどの場合、それらは、１日あたり体重１ｋｇあたり約８ミリグラムという過剰でない量で投与される。
【０２０６】
本発明のポリペプチド、ならびにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニスト化合物はまた、インビボにおけるこのようなポリペプチドの発現、すなわち遺伝子治療によって本発明に従って使用され得る。従って、例えば、細胞は、エキソビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作されてもよい；次いで、この操作された細胞は患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用による当該分野で公知の手順によって、細胞は操作され得る。
【０２０７】
同様に、細胞は、例えば、当該分野で公知の手順によって、インビボでポリペプチドを発現するためにインビボで操作されてもよい。当該分野で公知のとおり、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生する細胞は、インビボで細胞を操作する、そしてインビボでポリペプチドを発現する目的のために患者に投与されてもよい。類似の方法による本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明白であるはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、適切な送達ビヒクルとの組み合わせ後にインビボで細胞を操作するために用いられ得る、レトロウイルス粒子以外の、例えば、アデノウイルスであってもよい。
【０２０８】
本明細書において上記で言及されるレトロウイルスプラスミドベクターが由来するレトロウイルスとしては、限定はしないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウイルス、サル白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス（ＨＩＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺腫瘍ウイルスが挙げられる。
【０２０９】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下である。本発明のベクターは１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターとしては、限定はしないが、レトロウイルス長末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第７巻第９号，９８０〜９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他の相同なまたは異種のプロモーター、例えば、限定はしないが、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩおよびβアクチンプロモーターを含む真核生物細胞プロモーターのような細胞プロモーターが挙げられる。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、限定はしないが、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター；チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられる。
【０２１０】
適切なプロモーターとしては、限定はしないが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター、例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡ１プロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書において上記される改変レトロウイルスＬＴＲを含む）；βアクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、このポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよい。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明白になる。
【０２１１】
レトロウイルスプラスミドベクターを使用し、パッケージング細胞株を形質導入して、プロデューサー細胞株を形成してもよい。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、限定はしないが、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５〜１４（１９９０）に記載されるようにＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＣＲＥ、ＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＮＡ細胞株が挙げられる。このベクターは、当該分野で公知の任意の方法を通じてパッケージング細胞を形質導入し得る。このような方法としては、限定はしないが、エレクトロポレーション、リポソームの使用およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられる。別の１方法では、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル化されてもよいし、または脂質に結合されて、次いで宿主に投与されてもよい。
【０２１２】
プロデューサー細胞株は、このポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのいずれかで真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、限定はしないが、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨髄芽球、ケラチノサイト、内皮細胞および気管支上皮細胞が挙げられる。
【０２１３】
ある実施形態では、ＭＧＤ−ＣＳＦ組成物は、その広範な種々が当該分野で公知である薬学的に受容可能な賦形剤とともに処方物中に提供される（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ，第２０版（２００３）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４）；Ｋｉｂｂｅら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００））。薬学的に受容可能な賦形剤、例えば、ビヒクル、アジュバント、キャリアまたは希釈剤は、公的に入手可能である。さらに薬学的に受容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、毒性調節剤、安定化剤、保湿剤などは公的に入手可能である。
【０２１４】
薬学的な剤形では、本発明の組成物は、それらの薬学的に受容可能な塩の形態で投与されてもよく、またはそれらはまた、単独または適切な関連で、そして他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて用いられてもよい。本発明の組成物は、潜在的な投与の方式に従って処方される。因子の投与は、経口、口腔内、経鼻、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、心室内、頭蓋内、気管内およびクモ膜下腔内の投与などを含む種々の経路で、そうでなければ移植または吸入によって達成されてもよい。従って、本発明の組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、浣腸、注射、吸入、およびエアロゾルのような固体、半固体、液体または気体の形態で調製物に処方されてもよい。以下の方法および賦形剤は単に例示であって、決して限定ではない。
【０２１５】
経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、顆粒、カプセル、徐放性処方物、経口リンスまたは粉末を形成し得る。経口調製物のためには、因子、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、単独で、または適切な添加物と、例えば、従来の添加物、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンと；結合剤、例えば、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンと；崩壊薬、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムと；潤滑剤、例えば、滑石またはステアリン酸マグネシウムと；そして必要に応じて、希釈剤、緩衝化剤、保湿剤、防腐剤および香味料と組み合わされて用いられてもよい。
【０２１６】
適切な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストラン、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望の場合、このビヒクルは、わずかな量の補助物質、例えば、保湿剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化剤を含んでもよい。このような剤形を調製する現実的な方法は、公知であるか、または当業者（Ｇｅｎｎａｒｏ、前出）に明白である。投与されるべき組成物または処方物は、処置されている被験体における所望の状態を達成するために適切な十分な量の因子を含む。
【０２１７】
この因子、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、水性または非水性の溶媒、例えば植物油または他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、より高級の脂肪酸またはプロピレングリコールのエステル中でそれらを溶解、懸濁ままたは乳化することによって；そして所望の場合、従来の添加物、例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および防腐剤とともに、注射のための調製物中に処方され得る。経口または非経口送達のための他の処方物はまた、当該分野における習慣どおりに用いられ得る。
【０２１８】
抗体、因子、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、吸入を介して投与されるべきエアロゾル処方物中で利用されてもよい。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような加圧された受容可能な噴霧剤中に処方され得る。さらに、因子、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド組成物は、当該分野の習慣どおり、経鼻的または吸入による投与のための粉末形態に変換されてもよい。
【０２１９】
さらに、この因子は、乳化基剤または水溶性基剤のような種々の基剤と混合することによって坐剤に作成され得る。本発明の組成物は、坐剤を介して直腸投与されてもよい。この坐剤は、室温では凝固したままであるが体温では融ける、ココアバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールのようなビヒクルを含んでもよい。
【０２２０】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他の修飾因子はまた、他の経路、例えば、ウイルス感染、マイクロインジェクションまたは小胞融合によって組織または宿主細胞に導入されてもよい。例えば、発現ベクターは、上記のように細胞に核酸組成物を導入するために用いられ得る。さらに、ジエット注入を、筋肉内投与のために用いてもよい（Ｆｕｒｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３６５〜３６８（１９９２））。ＤＮＡは、金粒子上にコーティングされてもよく、そして文献（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２〜１５４（１９９２））に記載されるように、金微粒子（ｇｏｌｄ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）がＤＮＡでコーディングされており、次いで皮膚細胞に発射される、微粒子銃デバイスまたは「遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）」によって皮内に送達されてもよい。
【０２２１】
経口または直腸投与のための単位剤形、例えば、シロップ、エリキシルおよび懸濁剤が提供され得、ここで各々の投与単位、例えば、茶さじ一杯、テーブルスプーン一杯、錠剤または坐剤は、１つ以上の因子を含む組成物の所定の量を含む。同様に、注射または静脈投与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または別の薬学的に受容可能なキャリア中の溶液として組成物に因子（単数または複数）を含んでもよい。
【０２２２】
（因子およびアンタゴニストの同定）
本発明は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび他の因子を含む修飾因子であって、それらの標的の活性を増大または減少させる修飾因子を提供する。本発明の修飾因子は、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得、そしてポリペプチドまたはポリヌクレオチドの結合または活性を妨げ得る。このような修飾因子、または因子としては、例えば、アゴニストであってもアンタゴニストであっても、ポリペプチド改変体；アゴニストであってもアンタゴニストであっても、抗体；通常アンタゴニストである、可溶性レセプター；アゴニストであってもアンタゴニストであっても、低分子薬物；通常アンタゴニストである、ＲＮＡｉ；通常アンタゴニストである、アンチセンス分子；および通常アンタゴニストであるリボザイムが挙げられる。ある実施形態では、因子は、本発明のポリペプチドであり、この本発明のポリペプチドはそれ自体が個体に投与される。ある実施形態では、因子は、本発明の「標的（ｔａｒｇｅｔ）」ポリペプチドに特異的な抗体である。ある実施形態では、因子は、経口的に利用可能な薬物として有用であり得る化合物、例えば、低分子である。このような調節としては、調節に直接影響する他の分子の補充を包含する。例えば、細胞表面上のレセプターである本発明のポリペプチドの活性を調節する抗体は、このレセプターに結合して補体を固定し得、補体カスケードを活性化して、細胞の溶解を生じる。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの生物学的活性を調節する因子は、適切なコントロールと比較した場合、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍以上、活性または結合を増大または減少する。
【０２２３】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生物学的活性を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明のポリペプチドの生物学的活性の例は、本明細書において詳細に、例えば、実施例および図面に記載される。
【０２２４】
本発明はさらに、上記のような、本発明のポリペプチドのレセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物が、化合物の存在下で本発明の標識されたポリペプチドとともにインキュベートされる方法を提供する。次いで、化合物がこの相互作用を増強またはブロックする能力が測定される。あるいは、スクリーニングされるべき化合物およびＭＧＤ−ＣＳＦレセプターの相互作用後の公知の第二のメッセンジャー系の応答を測定して、この化合物がレセプターに結合して第二のメッセンジャー応答を惹起する能力を測定し、この化合物が潜在的なアゴニストであるかアンタゴニストであるかを決定する。このような第二のメッセンジャー系としては、限定はしないが、ｃＡＭＰ、グアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルおよびホスホイノシチド加水分解によって媒介される系が挙げられる。
【０２２５】
アンタゴニスト化合物の例としては、抗体、またはある場合には、オリゴヌクレオチドが挙げられ、これは、本発明のポリペプチドのレセプターに結合するが、第二のメッセンジャー応答を惹起しないか、またはＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド自体に結合する。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、レセプターに結合するが、第二のメッセンジャー応答を惹起せず、従って、ポリペプチドの作用を効率的にブロックするポリペプチドの変異型であってもよい。
【０２２６】
ＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子および遺伝子産物に対して拮抗性の別の化合物は、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を用いて、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通じて遺伝子発現は制御してもよい；両方の方法とも、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分を用いて、約１０〜約４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計してもよい。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子のある領域、例えば、三重らせんに対して相補的であるように設計され；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと；これによって本発明のポリペプチドの転写および産生を妨げる。このアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズして、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８８）に記載されるように、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されてポリペプチド産生を阻害するように、細胞に送達されてもよい。
【０２２７】
潜在的なアンタゴニスト化合物としてはまた、レセプターの結合部位に結合してこれを専有し、それによってこのレセプターをそのポリペプチドに接近不能にさせ、その結果正常な生物学的活性が妨げられるような低分子が挙げられる。低分子の例としては、限定はしないが、低分子ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられる。アンタゴニスト化合物を使用して、実施例および図面にさらに詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドの効果を阻害し得る。アンタゴニストは、下にさらに詳細に記載されるように、免疫関連疾患を、診断し、予後を決定し、予防し、そして処置するために使用されてもよい。
【０２２８】
本発明はまた、細胞上のＭＧＤ−ＣＳＦ分子の作用を増強またはブロックする因子、例えば抗体を同定するための方法を提供する。例えば、これらの因子は、レセプターのようなＭＧＤ−ＣＳＦ結合分子の相互作用を増強またはブロックし得る。目的の因子としては、アゴニストおよびアンタゴニストの両方が挙げられる。本発明は、ＭＧＤ−ＣＳＦの天然の生物学的機能を増大し、ＭＧＤ−ＣＳＦと同様の様式で機能するアゴニストを提供する。本発明はまた、ＭＧＤ−ＣＳＦの機能を減少または排除するアンタゴニストを提供する。
【０２２９】
ＭＧＤ−ＣＳＦアゴニストおよびアンタゴニストを同定する１方法は、細胞下分画後の生化学的アッセイを包含する。例えば、細胞区分、例えば、膜または細胞質調製物は、ＭＧＤ−ＣＳＦ分子によって調節されるシグナル伝達または調節経路の分子のようなＭＧＤ−ＣＳＦ分子に結合する分子を発現する細胞から調製され得る。細胞下の分画方法は、細胞生物学の分野で公知であり、そして別個のおよび規定の成分、例えば、オルガネラまたはオルガネラ膜を有する粗画分を生成するために仕立てられてもよい。この調製物は、ＭＧＤ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい、候補分子の有無において標識されたＭＧＤ−ＣＳＦ分子とともにインキュベートされる。候補分子が結合分子またはＭＧＤ−ＣＳＦ分子と相互作用する能力は、標識されたリガンドの結合の減少に反映される。根拠も無く結合する、すなわち、ＭＧＤ−ＣＳＦ分子の効果を誘導することなく結合する分子はほとんどアンタゴニストであると考えられる。十分に結合してＭＧＤ−ＣＳＦ分子と同じか密接に関連する効果を発揮する分子は潜在的に、アゴニストであることが証明され得る。
【０２３０】
潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストの効果は、例えば、候補分子と細胞または適切な細胞調製物との相互作用後の第二のメッセンジャー系の１つ以上の成分の活性を決定すること、およびこの効果とＭＧＤ−ＣＳＦ分子の効果と、またはＭＧＤ−ＣＳＦと同じ効果を発揮する分子の効果とを比較することによって測定され得る。これに関して有用であり得る第二のメッセンジャー系としては、限定はしないが、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、イオンチャネルおよびホスホイノシチド加水分解第二メッセンジャー系が挙げられる。
【０２３１】
ＭＧＤ−ＣＳＦアンタゴニストの同定のためのアッセイの別の例は、ＭＧＤ−ＣＳＦ分子および潜在的なアンタゴニストの混合物と、膜結合したＭＧＤ−ＣＳＦレセプター分子とを合わせる競合アッセイである。競合阻害アッセイのための適切な条件下では、このアッセイはまた、組み換えＭＧＤ−ＣＳＦレセプター分子を用いて行われてもよい。ＭＧＤ−ＣＳＦ分子は、レセプター分子に結合されたＭＧＤ−ＣＳＦ分子の数が潜在的なアンタゴニストの有効性を評価するために正確に決定され得るように、放射能などによって標識されてもよい。
【０２３２】
潜在的なアンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、それによってその活性を阻害または無効にさせる低有機分子、ポリペプチドおよび抗体が挙げられる。潜在的なアンタゴニストはまた、ＭＧＤ−ＣＳＦ誘導性活性を誘導することなく、これによって結合からＭＧＤ−ＣＳＦ分子を排除することによってＭＧＤ−ＣＳＦ分子の作用を防止する、レセプター分子のような結合分子上の同じ部位に結合する密接に関連するタンパク質または抗体のような低有機分子、ポリペプチドであってもよい。本発明のアンタゴニストとしては、配列表に示される核酸およびアミノ酸の配列を有するＭＧＤ−ＣＳＦ分子のフラグメントが挙げられる。
【０２３３】
他の潜在的なアンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アンチセンス技術は、例えば、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通じて、または三重らせん形成を通じて遺伝子発現を制御するために用いられ得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ（１９８８）に考察される。三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４１：４５６（１９８８）；ならびにＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）に考察される。この方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、約１０〜約４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられ得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であり、それによってＭＧＤ−ＣＳＦ分子の転写および引き続く生成を妨げるように設計される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズして、ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、インビボで発現されてＭＧＤ−ＣＳＦ分子の生成を阻害し得る。
【０２３４】
（診断）
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列における変異の存在に関する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部として本発明の遺伝子および遺伝子産物の使用に関する。本発明の遺伝子における変異を担持する個体は、種々の技術によってＤＮＡ標識で検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などから得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接用いられてもよく、または、分析の前に、例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４：１６３〜１６６（１９８６）によって記載されるうように、ＰＣＲを用いることによって酵素的に増幅されてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも、同じ目的のために用いられてもよい。一例として、本発明のポリペプチドをコードする核酸に対して相補的なＰＣＲプライマーを用いて、変異体を同定および分析してもよい。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較して増幅生成物のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、放射性標識されたＲＮＡ、あるいは放射性標識されたアンチセンスＤＮＡ配列に対して増幅されたＤＮＡをハイブリダイズすることによって同定され得る。完全にマッチした配列は、ＲＮａｓｅＡ消化によって、または融解温度の相違によってミスマッチの二重鎖から識別され得る。
【０２３５】
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝子試験は、変性剤の有無でゲル泳動中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化を検出することによって達成され得る。小さい配列欠失および挿入は、高い解像度のゲル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４２（１９８５）に記載のように、その特定の融点または部分的な融点に従って種々の位置で、種々のＤＮＡフラグメントの移動度が遅れる変性ホルムアミド勾配ゲルで識別され得る。
【０２３６】
特定の位置での配列変化はまた、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：４３９７〜４４０１（１９８５）に示されるように、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護または化学的な切断方法のような、ヌクレアーゼ保護アッセイによって明らかにされ得る。従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用、例えば、制限フラグメント長多形性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）（ＲＦＬＰ）およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。さらに便利なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、インサイチュの分析によって検出されてもよい。
【０２３７】
本発明はまた、種々の組織におけるＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質の変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。正常なコントロール組織サンプルと比較したこれらのタンパク質の過剰発現は、異常な細胞増殖、例えば腫瘍の存在を検出し得る。宿主由来のサンプル中のタンパク質レベルを検出するために用いられるアッセイは、当業者に周知であり、そしてこれには、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、「サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）」アッセイ、および当該分野で公知のＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルについての他のアッセイが挙げられる。発現は、生物学的サンプル中において、ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質のレベル、またはＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを質的にまたは定量的に測定または評価することによってアッセイされ得る。アッセイは、直接的に、例えば、絶対的なタンパク質レベルもしくはｍＲＮＡレベルを検出または評価することによって、または第二の生物学的サンプルに対してＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質もしくはｍＲＮＡを比較することによって、相対的に行なわれ得る。これらのアッセイを行うことにおいては、第一の生物学的サンプル中のＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質またはｍＲＮＡレベルは、測定されるかまたは評価されるか、そして標準的なＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質のレベルまたはｍＲＮＡのレベルに対して比較される；適切な標準物としては、目的の障害を有さない個体から得られた第二の生物学的サンプルが挙げられる。標準物は、ＭＧＤ−ＣＳＦ発現に関連する障害を有さない個体の集団におけるＭＧＤ−ＣＳＦのレベルを平均することによって得てもよい。当該分野で理解されるとおり、標準的なＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質のレベルまたはｍＲＮＡのレベルが一旦明らかになれば、比較のための標準物として繰り返し用いられ得る。
【０２３８】
例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１（２）、第６章（１９９１）によって記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイは、本発明のポリペプチド抗原に対する特異性で調製された抗体を利用する。さらに、レポーター抗体は、モノクローナル抗体に対して調製される。レポーター抗体に対して、放射性タグ、蛍光タグまたは酵素タグ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのような検出試薬が結合される。サンプルを宿主から取り出して、サンプル中のタンパク質に結合する固体支持体、例えば、ポリスチレンのディッシュ上でインキュベートする。次いで、このディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位を、非特異的なタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンとともにインキュベートすることによってカバーする。次に、特定の抗体、例えば、モノクローナル抗体を、ディッシュ中でインキュベートして、この間に抗体は、ポリスチレンディッシュに結合した本発明の任意のポリペプチドに結合する。全ての未結合のモノクローナル抗体を緩衝液で洗い流す。レポーター抗体、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたレポーター抗体を、このディッシュに入れて、目的のタンパク質に結合した任意の抗体に対するレポーター抗体の結合を生じる；次いで、未結合のレポーター抗体を取り出す。次いで、基質、例えば、ペルオキシダーゼをこのディッシュに加えて、シグナルを生じた色、例えば、所定の期間で発色した色の量によって、標準に対して比較した場合、所定の容積の患者サンプルに存在する本発明のポリペプチドの量の測定を行う。
【０２３９】
本発明のポリペプチドに特異的な抗体が固体支持体に結合されており、そして標識されたＭＧＤ−ＣＳＦが宿主由来のサンプルとともに、この固体支持体を通過される競合アッセイを使用してもよい。標識は、例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーによって検出および定量され得、そしてその測定は、サンプル中に存在する目的のポリペプチドの量に相関し得る。「サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）」アッセイが、ＥＬＩＳＡアッセイと同様に使用されてもよく、ここで本発明のポリペプチドは、固体支持体を通過されて、固体支持体に対して結合された抗体モジュールに結合する。次いで、第二の抗体が目的のポリペプチドに結合される。標識されて第二の抗体に特異的である第三の抗体が次に、固体支持体を通過して、第二の抗体に結合される。抗体結合の量は、定量され得る；その量は、目的のポリペプチドの量と相関する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。
【０２４０】
本発明の生物学的サンプルは、ＭＧＤ−ＣＳＦのタンパク質またはｍＲＮＡを含む被験体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られた任意の生物学的サンプルを包含し得る。示されたとおり、生物学的サンプルとしては、遊離のＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質を含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および脊髄液）、完全なまたは成熟ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドまたはＭＧＤ−ＣＳＦレセプターを発現することが見出された卵巣または腎臓系の組織および他の組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含むものである場合、組織生検が供給源を提供し得る。
【０２４１】
総細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６〜１５９（１９８７）に記載される単一工程グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法のような任意の適切な技術を用いて生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは任意の適切な方法を用いてアッセイされ得る。これらの方法としては、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。
【０２４２】
総細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６〜１５９（１９８７）に記載される単一工程グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法のような任意の適切な技術を用いて生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは任意の適切な方法を用いてアッセイされ得る。これらの方法としては、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ＰＣＲ、ＰＣＲと組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。
【０２４３】
生物学的サンプルにおいてＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質レベルをアッセイすることは、抗体ベースの技術を用いて行われ得る。例えば、組織中のＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法、例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１：９７６〜９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０５：３０８７〜０９６（１９８７）を用いて研究され得る。ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法としては、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識が当該分野で公知であり、そして酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ、放射性同位体および蛍光標識、例えば、フルオレセインおよびローダミン、ならびにビオチンが挙げられる。
【０２４４】
個体から得られた生物学的サンプルにおいてＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質のレベルをアッセイすることに加えて、ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質はまた、画像化によってインビボで検出されてもよい。ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質のインビボ画像化のための抗体標識またはマーカーとしては、Ｘ線撮影、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影のためには、適切な標識としては、検出可能な放射線を照射するが、被験体に対しては露骨に有害ではない放射性同位体、例えば、バリウムまたはセシウムが挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲに適切なマーカーとしては、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー、例えば、重水素が挙げられ、これは、関連のハイブリドーマの栄養素の標識によって抗体に取り込まれ得る。
【０２４５】
放射性同位体、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質などの適切な検出可能な画像化部分で標識されているＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質特異的な抗体または抗体フラグメントは、例えば、免疫系の障害について試験されるべき被験体に、非経口的に、皮下でまたは腹腔内で導入される。当該分野では、用いられる被験体および画像化システムのサイズが、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが理解される。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質を含む細胞の位置で蓄積する。インビボの腫瘍画像化は、Ｂｕｒｃｈｉｅｌら編、第１３章、Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０２４６】
（ＭＧＤ−ＣＳＦの分子、アゴニストおよびアンタゴニストの治療的な使用）
本発明の分子ならびにそのフラグメントおよび改変体は、ＭＧＤ−ＣＳＦの不完全なまたは不十分な量によって、直接または間接的に媒介される任意の障害についての診断、予後予測、予防、処置および処置の開発において用いられ得る。ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、このような障害に罹患している患者に投与され得る。遺伝子治療アプローチは、このような障害を処置するために適用され得る。本発明の配列の本明細書における開示によって、欠損性のＭＧＤ−ＣＳＦ関連遺伝子の検出、および正常または修正後の遺伝子でのそれらの置換が可能になる。欠陥遺伝子は、インビトロの診断アッセイにおいて、そして欠損を保有することが疑われる患者由来の遺伝子の配列と本発明の配列との比較によって検出され得る。
【０２４７】
本発明の分子、例えば、組み換えＭＧＤ−ＣＳＦは、種々の細胞タイプの増殖に対して複数の影響を有し得、そして種々の条件下での同じ細胞タイプの増殖および分化に対して複数の影響を有し得る。ＭＧＤ−ＣＳＦが増殖および／または分化を阻害する条件下では、組み換えＭＧＤ−ＣＳＦまたは関連の分子は、異常な増殖および／または分化によって特徴付けられる疾患を処置するために用いられ得る。ＭＧＤ−ＣＳＦが増殖および／または分化を促進する条件下では、ＭＧＤ−ＣＳＦまたは関連の分子に対して阻害性である因子を用いて、異常な増殖および／または分化によって特徴付けられる疾患を処置し得る。適切なインヒビターが本明細書において記載されており、そしてこれには、阻害性抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよび可溶性レセプターを挙げることができる。
【０２４８】
（疾患適用）
本発明の分子は、ガン、免疫疾患、例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患、虚血性疾患、感染性疾患、骨疾患および神経疾患を処置するために有用である。本発明の分子は、腫瘍細胞またはガン細胞の増殖を阻害するために、そしてガンを処置するために有用である。従って、本発明の分子は、動物のガンの処置のための種々の設定において用いられ得る。本発明の分子で処置され得る他の特定のライプのガンとしては、限定はしないが、以下に開示されるガンが挙げられる。
【０２４９】
ＭＧＤ−ＣＳＦは、骨髄での造血細胞の保持、増殖および生存においてある役割を果たし得る。従って、化学療法または放射線療法を受けているガン患者における造血細胞（例えば、好中球）欠損の処置においてＭＧＤ−ＣＳＦは有用であり得る。
【０２５０】
本発明の分子は、リンパ節腫脹を生じるリンパ増殖性疾患を処置するために使用され得る。本発明の分子は、Ｔ細胞のクローン欠失を刺激することによってアポトーシスを媒介し得、従って末梢寛容を刺激する自己免疫疾患および細胞毒性Ｔ細胞媒介性アポトーシスを処置するために使用され得る。本発明の分子はまた、アレルギーの、そして全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グレーブス病、免疫増殖性リンパ節腫脹（ＩＰＬ）、血管免疫増殖性リンパ節腫脹（ＡＩＬ）、免疫芽球性リンパ節腫脹（ＩＢＬ）、関節リウマチ、糖尿病、および多発性硬化症を含む自己免疫障害の生物学を解明するのにおける研究ツールとして、そして移植片対宿主病を処置するために使用され得る。
【０２５１】
本発明の分子は、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患を生じる細胞を殺傷するかもしくはその複製を阻害するために、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患を処置するために有用である。従って、それらは、動物における自己免疫疾患または炎症性疾患の処置のための種々の設定において用いられ得る。
【０２５２】
本発明の分子はまた、限定はしないが、自己免疫障害、免疫不全障害および移植片対宿主病、および再発性流産を含む疾患を処置、予防、診断および／または予後予測を決定するために有用であり得る。さらに、本発明の分子は、一時的な免疫不全を有する個体の中で免疫応答性をブーストするための因子として使用され得る。本発明の分子を投与することによって寛解または処置され得る一時的な免疫不全を生じる状態としては、限定はしないが、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ、感染性単核球症または麻疹）のような感染性疾患からの回復、栄養失調に関連する状態、ストレスからの回復またはそれに関連する状態、輸血からの回復、および手術からの回復が挙げられる。
【０２５３】
本発明の分子はまた、以下の疾患、障害またはそれに関連する状態のうちの１つ以上を診断、その予後を確認、処置、または予防するために用いられ得る：原発性免疫不全、免疫媒介性血小板減少症、川崎症候群、骨髄移植（例えば、成人または小児での最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ球白血病、ＨＩＶ感染（例えば、成人または小児のＨＩＶ感染）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、および輸血後紫斑病。
【０２５４】
さらに、本発明の分子は、以下の疾患、障害またはそれに関連する状態のうちの１つ以上を診断、その予後を確認、処置、または予防するために用いられ得る：ギラン・バレー症候群、貧血（例えば、パルボウイルスＢ１９に関連する貧血、感染のリスクが高い（例えば、再発性の感染）安定な多発性骨髄腫を有する患者）、自己免疫性溶血性貧血（例えば、温式自己免疫溶血性貧血）、血小板減少症（例えば、新生児血小板減少症）、および免疫媒介性好中球減少症）、移植（例えば、ＣＭＶ陽性器官のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−陰性レシピエント）、低γグロブリン血症（例えば、感染または罹患のリスク要因を有する低γグロブリン血症新生児）、てんかん（例えば、難治性てんかん）、全身性脈管性症候群、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症の代償不全）、皮膚筋炎および多発性筋炎。
【０２５５】
本発明の分子によって、処置、予防、診断され得るか、そして／またはその予後予測が確認され得るさらなる自己免疫障害およびそれらの障害に関連する状態としては、限定はしないが、自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブド膜炎眼炎、多腺性内分泌障害、紫斑病（例えば、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病）、ライター病、スティフマン症候群、自己免疫肺炎症、ギラン・バレー症候群、インスリン依存性糖尿病および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられる。
【０２５６】
本発明の分子によって、処置、予防、診断され得るか、そして／またはその予後予測が確認され得るさらなる自己免疫障害としては、限定はしないが、自己免疫甲状腺炎；橋本甲状腺炎ならびに例えば、細胞媒介性および体液性甲状腺細胞毒性により特徴付けられる甲状腺炎を含む甲状腺機能低下症；ＳＬＥ（例えば、循環および局所的に生成される免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）；グッドパスチャー症候群（例えば、抗基底膜抗体によってしばしば特徴付けられる）；天疱瘡（例えば、表皮棘融解性抗体によってしばしば特徴付けられる）；レセプター自己免疫、例えば、グレーブス病（例えば、甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する抗体によってしばしば特徴付けられる；例えば、アセチルコリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる重症筋無力症）など；インスリン耐性（例えば、インスリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる）；自己免疫溶血性貧血（例えば、抗体感受性の赤血球の食作用によってしばしば特徴付けられる）；および自己免疫血小板減少性紫斑病（例えば、抗体感受性血小板の食作用によってしばしば特徴付けられる）が挙げられる。
【０２５７】
本発明の分子によって、処置、予防、診断され得るか、そして／またはその予後予測が確認され得るさらなる自己免疫障害としては、限定はしないが、関節リウマチ（例えば、関節での免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）；抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（例えば、核小体および他の核の抗体によってしばしば特徴付けられる）；混合結合組織病（例えば、抽出可能な核抗原、例えば、リボ核タンパク質に対する抗体によってしばしば特徴付けられる）；多発性筋炎／皮膚筋炎（例えば、非ヒストン抗核抗体によってしばしば特徴付けられる）；悪性貧血（例えば、抗壁細胞、抗ミクロソーム、および抗内因子の抗体によってしばしば特徴付けられる）；特発性アジソン病（例えば、体液性および細胞媒介性の副腎細胞毒性によってしばしば特徴付けられる）；不妊（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付けられる）；糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）；原発性糸球体腎炎による、ＩｇＡ腎症による；水疱性類天疱瘡（例えば、ＩｇＧによっておよび基底膜での補体によってしばしば特徴付けられる）；シェーグレン症候群（例えば、複数の組織抗体および／または特異的な非ヒストン抗核抗体（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）；糖尿病（例えば、細胞媒介性および体液性の島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）；および喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動薬耐性を含む、アドレナリン作動薬耐性（例えば、βアドレナリン作動薬レセプター抗体によってしばしば特徴付けられる）が挙げられる。
【０２５８】
そのアンタゴニストで、処置、予防、その予後予測が確認され、そして／またはその診断され得るなおさらなる自己免疫障害としては、限定はしないが、以下の障害が挙げられる：慢性の活動性の肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けられる）；原発性胆汁性肝硬変（例えば、抗ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けられる）；他の内分泌腺不全（例えば、ある場合には特定の組織抗体によって特徴付けられる）；白斑（例えば、抗メラニン形成細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）；脈管炎（例えば、免疫グロブリンおよび血管壁における補体および／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）；心筋梗塞後の状態（例えば、抗ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けられる）；開心術症候群（例えば、抗ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けられる）；蕁麻疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）；アトピー性皮膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）；喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）；炎症性筋障害；および他の炎症、肉芽腫、変性および萎縮性の障害。
【０２５９】
ある実施形態では、本発明の分子、例えば、抗ＭＧＤ−ＣＳＦ抗体は、ＳＬＥおよび／または関連の疾患、障害もしくは状態を処置または予防するために用いられる。本発明の分子で処置または予防され得るループス関連の疾患、障害および状態としては、限定はしないが、血液疾患、例えば、溶血性貧血、白血病、リンパ球減少症および血小板減少症；免疫学的障害、例えば、抗ＤＮＡ抗体および抗Ｓｍ抗体、発疹、感光性、口腔潰瘍、関節炎、発熱、疲労、体重減少、漿膜炎、例えば、胸膜炎（ｐｌｅｕｒｉｔｕｓ）（胸膜炎（ｐｌｅｕｒｉｓｙ））；腎臓障害、例えば、腎炎；神経学的障害、例えば、てんかん発作、末梢神経障害およびＣＮＳ関連障害；胃腸障害；レイノー現象；および心外膜炎が挙げられる。
【０２６０】
本発明の分子はまた、腫瘍細胞増殖のような新生物形成を阻害するために使用され得る。ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドは、特定の細胞に対するアポトーシスおよび細胞毒性を通じた腫瘍破壊を担い得る。本発明の分子によって、処置、予防、診断されるか、そして／またはその予後予測が確認され得る、細胞生存率の増大またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、限定はしないが、ガン（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫およびホルモン依存性の腫瘍であって、限定はしないが、結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、グリア芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、巨骨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌を含む腫瘍）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫糖尿病、胆汁性肝硬変、ベーチエット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎、自己免疫胃炎、自己免疫血小板減少性紫斑病および関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、移植片対宿主病（急性および／または慢性）、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶が挙げられる。ある実施形態では、本発明は、ガン、詳細には上記で、または以下の段落で列挙されるガンの増殖、進行および／または転移を阻害するために用いられる。
【０２６１】
本発明によって、処置、予防、診断されるか、そして／またはその予後予測が確認され得る、細胞生存率の増大に関連するさらなる疾患または状態としては、限定はしないが、悪性腫瘍および関連の障害、例えば白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病であって、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）、骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病および固形腫瘍であって、限定はしないが、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫を含む腫瘍の進行および／または転移が挙げられる。
【０２６２】
本発明の分子によって、処置、予防、診断されるか、そして／またはその予後予測が確認され得る、アポトーシスの増大に関連する疾患としては、限定はしないが、ＡＩＤＳ（例えば、ＨＩＶ誘発性神経障害およびＨＩＶ脳炎）、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）、自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫糖尿病、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎、自己免疫胃炎、血小板減少性紫斑病、および関節リウマチ、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、移植片対宿主病（急性および／または慢性）、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害または疾患（例えば、肝炎関連肝臓傷害、肝硬変、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）、毒物誘発性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、潰瘍性大腸炎、悪液質および食欲不振が挙げられる。
【０２６３】
本発明の別の実施形態は、ＨＩＶ感染した患者におけるＴ細胞のＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６６９媒介性の死亡を減じるためのＭＧＤ−ＣＳＦポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはアンタゴニストの使用に関する。ＡＩＤＳの発達におけるＴ細胞アポトーシスの役割は、多数の研究の主題である（例えば、Ｍｅｙａａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２１７〜２１９（１９９２）；Ｇｒｏｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：３３１（１９９２）；ならびにＯｙａｉｚｕら、Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｏｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＨＩＶ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＡｎｄｒｉｅｕおよびＬｕ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１０１〜１１４頁（１９９５）を参照のこと）。
【０２６４】
Ｔ細胞のアポトーシスは多数の機構を通じて生じるようである。Ｆａｓ媒介性アポトーシスは、ＨＩＶの個体におけるＴ細胞の損失に関与している（Ｋａｔｓｉｋｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２０２９〜２０３６（１９９５）。活性化されたヒトＴ細胞は、活性化誘導細胞死（ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）（ＡＩＣＤ）と名付けられた過程である、ＣＤ３／Ｔ細胞レセプター複合体を通じた誘導の際に、プログラムされた細胞死（アポトーシス）を受けるように誘導される。ＨＩＶ感染した無症候性個体から単離されたＣＤ４Ｔ細胞のＡＩＣＤが報告されている（Ｇｒｏｕｘら、前出）。従って、ＡＣＩＤは、ＨＩＶ感染個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の減少およびＡＩＤＳへの進行にある役割を果たし得る。従って、本発明は、ＨＩＶ患者においてＭＧＤ−ＣＳＦ媒介性のＴ細胞死を阻害する方法を提供し、この方法は、この患者に対して本発明の分子を投与する工程を包含する。ある実施形態では、この患者はＭＧＤ−ＣＳＦポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはアンタゴニストでの処置が開始するとき無症候性である。必要に応じて、処置の前に、末梢血Ｔ細胞をＨＩＶ患者から抽出して、当該分野で公知の手順によってＭＧＤ−ＣＳＦ媒介性細胞に対する感受性について試験してもよい。１実施形態では、患者の血液または血漿を本発明の分子、例えば、抗ＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６６９抗体とエキソビボで接触させる。この抗体または他のアンタゴニストは、当該分野で公知の手順によって適切なクロマトグラフィーマトリックスに結合され得る。患者の血液または血漿を、このマトリックスに結合されたアンタゴニストを含むクロマトグラフィーカラムを通じて流し、その後に患者に戻す。固定されたアンタゴニストが、ＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６９９に結合し、従ってこれらは患者の血液から除去される。
【０２６５】
さらなる実施形態では、本発明の分子は、Ｔ細胞アポトーシスの他のインヒビターと組み合わせて投与される。例えば、上記のように、Ｆａｓ媒介性アポトーシスはまた、ＨＩＶ陽性の個体におけるＴ細胞の減少に関与している（Ｋａｔｓｉｋｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２０２９〜２０３６（１９９５））。従って、Ｆａｓリガンド媒介性およびＭＧＤ−ＣＳＦ媒介性のＴ細胞死の両方に感受性の患者は、ＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６９９とそれらのレセプターとの相互作用をブロックする因子、およびＦａｓリガンド／Ｆａｓ相互作用をブロックする因子の両方で処置され得る。Ｆａｓに対するＦａｓリガンドの結合をブロックするための適切な因子としては、限定はしないが、可溶性Ｆａｓポリペプチド；可溶性Ｆａｓポリペプチドの多量体型（例えば、ｓＦａｓ／Ｆｃの二量体）；アポトーシスを生じる生物学的シグナルを誘導することなくＦａｓに対して結合する抗Ｆａｓ抗体；Ｆａｓに対するＦａｓリガンドの結合をブロックする抗Ｆａｓリガンド抗体；ならびにＦａｓに結合するが、アポトーシスを生じる生物学的シグナルを誘導しないＦａｓリガンドの突然変異タンパク質（ムテイン）が挙げられる。モノクローナル抗体は、本発明に従って使用され得る。抗Ｆａｓモノクローナル抗体のブロックを含む、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓ相互作用をブロックするために適切な因子の例は、ＷＯ９５／１０５４０に記載される。
【０２６６】
別の例では、レセプターに対するＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６９９の結合をブロックする因子は、本発明の分子とともに投与される。このような因子としては、限定はしないが、可溶性ＭＧＤ−ＣＳＦレセプターポリペプチド、可溶性レセプターポリペプチドの多量体型、およびアポトーシスを生じる生物学的シグナルを誘導することなくＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６９９レセプターに結合するＭＧＤ−ＣＳＦレセプター抗体、１つ以上のレセプターに対するＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６９９の結合をブロックする抗体、ならびにレセプターに結合するが、アポトーシスを生じる生物学的シグナルを誘導しない突然変異タンパク質（ムテイン）が挙げられる。
【０２６７】
本発明の分子はまた、赤血球新生を含む造血を調節するように使用され得る。造血は、多能性幹細胞のプールで開始する多段階の細胞増殖および分化の過程である。これらの細胞は、種々の刺激に応答して増殖して造血前駆体に分化し得る。本発明の分子は、造血細胞、例えば、赤血球産生細胞の発達を刺激または阻害するために用いられ得る。
【０２６８】
ある実施形態では、本発明の分子は、骨疾患を処置または予防するために用いられる。本発明の分子は、造血幹細胞の破骨前駆細胞への分化を促進する。従って、本発明の分子は、破骨細胞の分化および機能における欠陥によって特徴付けられる疾患のような骨疾患、例えば骨粗鬆症を処置するために用いられ得る。ＭＧＤ−ＣＳＦおよび関連の分子は、これらの疾患を処置するために、治療剤、例えば、タンパク質治療剤として、または遺伝子療法において用いられ得る。
【０２６９】
ある実施形態では、本発明の分子を用いて、神経疾患を処置または予防する。本発明の分子は、造血幹細胞のミクログリアの前駆細胞への分化を促進する。従って、本発明の分子は、ミクログリアの分化および機能における欠陥によって特徴付けられる神経疾患のような疾患、例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄障害、進行性多巣性白質脳症、脳卒中、およびパーキンソン病を処置するために用いられ得る。ＭＧＤ−ＣＳＦおよび関連の分子は、これらの疾患を処置するための治療剤、例えば、タンパク質治療剤として、または遺伝子治療において用いられ得る。
【０２７０】
ある実施形態では、本発明の分子は、肢虚血のような末梢動脈疾患を含む心血管障害を処置または予防するために用いられる。心血管障害としては、心血管異常、例えば、動脈−動脈瘻、動静脈フィステル、脳動静脈奇形、先天性心臓欠陥、肺閉鎖症およびシミター症候群が挙げられる。先天性の心欠陥としては、大動脈縮窄、三房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖｅｓｓｅｌ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ）、十字交差心臓（ｃｒｉｓｓｃｒｏｓｓ  ｈｅａｒｔ）、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ  ｄｕｃｔｕｓ  ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー三徴症、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ）、例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、および心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｅａｒｔ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ）が挙げられる。
【０２７１】
本発明の分子で処置され得る心血管障害としてはまた、心疾患、例えば、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉｇｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｈｅａｒｔ  ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、心嚢内気腫、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられる。
【０２７２】
本発明の分子を用いて処置され得る不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、ＱＴ延長症候群（ｌｏｎｇ  ＱＴ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ  ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻脈、および心室性細動が挙げられる。本発明の分子で処置され得る頻脈としては、発作性頻脈、上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性回帰性頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｏｄａｌ  ｒｅｅｎｔｒｙ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性回帰性頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ  ｎｏｄａｌ  ｒｅｅｎｔｒｙ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａｒ  ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０２７３】
本発明の分子で処置され得る心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、および心筋炎が挙げられる。本発明の分子で処置され得る心筋性虚血としては、冠動脈疾患、例えば、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ）が挙げられる。
【０２７４】
本発明の分子で処置され得る心臓血管疾患としてはまた、血管疾患、例えば、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、レイノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全が挙げられる。動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が挙げられる。
【０２７５】
本発明の分子で処置され得る動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０２７６】
本発明の分子で処置され得る脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイド血管障害、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化、脳動静脈先天異常、脳動脈疾患、脳の塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、脳内出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、脳梗塞、脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、脳室周囲白質軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨脳底（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０２７７】
本発明の分子で処置され得る塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０２７８】
本発明の分子で処置され得る虚血としては、脳虚血、虚血性大腸炎、コンパートメント症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前区画症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられる。本発明の分子で処置され得る脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ  ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０２７９】
本発明によってさらに、本発明の分子の投与による新血管新生に関連する疾患の処置が得られる。本発明の分子で処置され得る悪性および転移性の状態としては、限定はしないが、悪性腫瘍、固形腫瘍および本明細書に記載され、そうでなければ当該分野で公知のガンが挙げられる（このような障害の概説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第４版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９７）を参照のこと）。
【０２８０】
さらに、本発明の分子で処置され得る新血管新生に関連する眼科障害としては、限定はしないが、血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患が挙げられる。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
【０２８１】
さらに、本発明の分子で処置され得る障害としては、限定はしないが、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管癒着が挙げられる。
【０２８２】
本発明の分子そのアンタゴニストは、限定はしないが、ガン（例えば、免疫細胞関連のガン、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異または改変を伴う癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺の非小細胞癌腫、および肺の小細胞癌腫、胃癌など）を含む広範な種々の疾患および／または状態の診断および処置または予防において有用である。それらはまた、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ節腫脹）、微生物障害（例えば、ウイルス、細菌など）、感染、例えば、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペスウイルス感染（限定はしないがＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含む）、アデノウイルス感染、ポックスウイルス感染、ヒト乳頭腫ウイルス感染、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶななど）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染、侵襲性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉなど）および寄生生物感染の診断および処置または予防において有用である。それらはさらに、腎炎、骨疾患（例えば、骨粗鬆症）、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心血管障害（例えば、新血管新生、新血管新生低下）、および循環低下（例えば、虚血性疾患、例えば、心筋梗塞、発作など、ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性執権（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など、移植片拒絶（急性および慢性）、移植片対宿主病、骨脊髄形成異常から生じる疾患（例えば、再生不良性貧血）、リウマチの関節組織破壊、肝疾患（例えば、急性および慢性の肝炎、肝障害、胆道疾患、および肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、ＳＬＥ、免疫複合体性糸球体腎炎、自己免疫糖尿病、自己免疫血小板減少性紫斑病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ、喘息、乾癬、糸球体腎炎、敗血性ショックおよび潰瘍性大腸炎の診断および処置または予防において有用である。
【０２８３】
本発明の分子は、血管形成および創傷治癒（例えば、創傷、火傷および骨折）を促進するのに有用である。それらはまた、特定の抗原および／または抗ウイルス免疫応答に対する免疫応答性を増強するアジュバントとして有用である。
【０２８４】
さらに詳細には、本発明の分子は、免疫応答を調節するのに有用である。例えば、それらは、外科手術、外傷、放射線療法、化学療法および移植の準備またはそれからの回復に有用であり得、また高齢者および免疫無防備状態の個体において免疫応答および／または回復プロセスをブーストするために用いられ得る。それらは、例えば、自己免疫障害の処置または予防における免疫抑制剤として有用である。特定の実施形態では、本発明の分子は、本明細書において上記されるか、そうでなければ当該分野で公知であるような、慢性の炎症、アレルギーまたは自己免疫状態を処置または予防するために用いられる。
【０２８５】
本発明の分子の使用としては限定はしないが、成人呼吸窮迫症候群、アナフィラキシー、アレルギー性喘息、アレルゲン鼻炎、薬物アレルギー（例えば、ペニシリンまたはセファロスポリンに対する）、原発性中枢神経リンパ腫（ＰＣＮＳＬ）、グリア芽細胞腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、リンパ節腫脹、関節リウマチ、変形性関節症、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ホジキン病および非ホジキン病リンパ腫、眼病、ブドウ膜網膜炎、１型糖尿病の自己免疫段階、重症筋無力症、自己免疫肝臓障害、自己免疫炎症性腸疾患およびクローン病の処置または予防が挙げられる。ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質と免疫治療剤、例えばＩＬ−２またはＩＬ−１２との組み合わせは、樹立された癌を処置するのにおいて有用な相乗効果または相加効果を生じ得る。
【０２８６】
さらに、本発明の分子は、本明細書に記載のような治療分子だけでなく、さらに、ガンのような腫瘍関連の疾患の生物学を解明するのにおける検索ツールとしても使用され得る。従って、本発明の分子は、腫瘍細胞もしくはガン細胞の操作を阻害するために、または動物においてガンを処置するために有用である。従って、本発明の分子は、動物のガン、例えば、肉腫、腺腫、腺癌、癌腫、乳頭腫、リンパ腫などの処置のために種々の設定において用いられ得る。本発明の分子で処置され得る他の特定のタイプのガンとしては、限定はしないが、前立腺癌、乳癌（例えば、乳管内および炎症性を含む）、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、胚性癌腫、子宮癌および精巣癌が挙げられる。
【０２８７】
（抗体およびワクチン）
（抗体）
ＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６６９に特異的な抗体は、本発明における使用のために適切であり、そしてインタクトなＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起され得る。このタンパク質またはフラグメントは、アルブミンのようなキャリアタンパク質の有無とともに、ウサギまたはマウスのような動物に与えられてもよい。一般には、ポリペプチドフラグメントは、それらが少なくとも約２５アミノ酸長である場合、キャリアなしに満足な免疫応答を生じるのに十分に免疫原性である。
【０２８８】
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製物、ならびにハイブリッド抗体、変更された抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む調製物、ならびにハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９（１９９１））；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２、およびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有ヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２６５９〜１６６２（１９７２）を参照のこと）；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１〜４０９６）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９〜５８８３（１９８０）を参照のこと）；二量体および三量体の抗体フラグメント構築物；ミニボディ（ｍｉｎｏｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｐａｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１５７９〜１５８４（１９９２）；Ｃｕｍｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０〜１２６（１９９２）を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）を参照のこと）；異種結合体化抗体および二価特異的な抗体（例えば、米国特許第６，０１０，９０２号および米国特許出願第２００２／０１５５６０４号を参照のこと）；ならびにこのような分子から得られた任意の機能的フラグメントであって、このようなフラグメントが特異的な結合を保持しているフラグメントが挙げられる。
【０２８９】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知である。モノクローナル抗体は一般には、相同な抗体集団を有する抗体である。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されず、それが作成される方式によって限定されることもないものとする。この用語は、免疫グロブリン丸ごとを包含する。ポリクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギのような適切な動物を、抗原をコードする遺伝子で形質転換された幹細胞のような目的の抗原で免疫することによって生成される。免疫原性を増強するために、抗原は、免疫の前にキャリアと結合されてもよい。適切なキャリアは代表的には、大型のゆっくり代謝される高分子、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）および不活性なウイルス粒子である。このようなキャリアは当業者に周知である。さらに、この抗原は、ジフテリア、破傷風、コレラなど由来の毒素のような細菌の毒素に対して、その免疫原性を増強するために結合体化されてもよい。
【０２９０】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、キメラ抗体の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：８５１〜８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２；６０４〜６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２〜４５４（１９８５））を用いてもよい。異なる部分が異なる動物種に由来する抗体であるキメラ抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体、例えば、ヒト化抗体、ならびにｃｄｒおよびフレームワーク領域に関する挿入／欠失を有する抗体が、本発明における使用に適切である。
【０２９１】
本発明はまた、ヒト化抗体、すなわち、ほとんどヒト免疫グロブリン配列である抗体を包含する。本発明のヒト化抗体は一般には、ヒト配列の部分を組み込むように改変されている非ヒト免疫グロブリンをいう。ヒト化抗体とは、ヒト免疫グロブリン配列全体を含むヒト抗体を包含し得る。
【０２９２】
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、ＭＧＤ−ＣＳＦもしくはＮＰ−６８９６６９タンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与されてもよい。ＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６６９タンパク質の調製は、天然の汚染が実質的にないように調製および精製され、そしてその調製物は特定の結合活性を有するポリクローナル抗血清を生じるために動物に導入され得る。
【０２９３】
本発明の抗体はそれらのそれぞれの抗原（単数または複数）に特異的に結合する；それらは、特定のポリペプチドに対する、または正確に言えば、抗原のエピトープに対する、高い結合活性および／または高い親和性を示し得る。本発明の抗体は、１つのエピトープに結合しても、または２つ以上のエピトープに結合してもよい。それらは、１つ以上の分子上の異なるエピトープに対して異なる親和性および／または結合活性を示し得る。抗体が別のエピトープに対してよりも１つのエピトープに強力に結合する場合、結合条件の調節によって結果として、ある場合には、この特定のエピトープに対してほとんど排他的に結合し、同じポリペプチド上の任意の他のエピトープには結合せず、そしてこのエピトープを含まないポリペプチドにも結合し得ない。
【０２９４】
本発明はまた、モノクローナル抗体およびそのＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６６９タンパク質結合フラグメントを提供する。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、（１９８１）５６３〜６８１頁を用いて調製され得る。一般には、このような手順は、ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質抗原、またはＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質発現細胞を用いて動物（例えば、マウス）を免疫する工程を包含する。適切な細胞は、抗ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質抗体に結合する能力によって認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地中で；例えば、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で不活化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅの改変イーグル培地中で培養されてもよい。このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切な骨髄腫細胞株と融合する。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って使用され得る；例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２０）。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いで例えば、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５〜２３２（１９８１））によって記載されるように限界希釈によってクローニングする。
【０２９５】
あるいは、ＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６６９タンパク質抗原に結合し得る抗体は、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて２工程手順で生成され得る。このような方法は、抗体がそれ自体抗原であり、従って、第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法によれば、特定の抗体を用いて、マウスのような動物を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を産生し、そして、このハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、抗体が特異的な抗体に結合する能力が抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定する。このような抗体は、ＭＧＤ−ＣＳＦまたはＮＰ＿６８９６６９タンパク質に特異的な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなる特異的な抗体の形成を誘導するために用いられ得る。
【０２９６】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２および他のフラグメントは、本明細書に開示の方法に従って用いられ得ることが理解される。このようなフラグメントは代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するため）のような酵素を用いて、タンパク質切断によって生成される。あるいは、ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術の適用を通じてまたは合成化学を通じて生成され得る。ヒト化キメラモノクローナル抗体は、ヒトにおける抗ＭＧＤ−ＣＳＦのインビボでの使用に適切である。このようなヒト化抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を用いて産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である。概説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ  １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ  １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ  ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ  ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０２９７】
（ワクチン）
本発明は、被験体に投与され得るワクチンを提供することによって、予防的な処置または治療的な処置が必要であるかまたは所望される被験体のこのような処置のための方法を提供する。本発明は、配列番号７〜１２由来の実質的に精製されたポリペプチドまたは活性なフラグメントを提供することによって被験体に対する免疫応答を惹起する；ワクチン組成物を提供する、そしてこのポリペプチドおよびワクチン組成物を被験体に投与するための方法も提供する。このワクチンは、ガン、増殖性、炎症性、免疫、代謝性、細菌性またはウイルスの障害を処置するために有用な、本発明の１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは修飾因子、例えば、抗体ワクチン組成物、ポリペプチドワクチン組成物またはポリヌクレオチドワクチン組成物を含んでもよい。
【０２９８】
例えば、ワクチンは、ガンワクチンであってもよく、そしてポリペプチドは、同時にガン抗原であってもよい。ワクチンは、抗炎症性ワクチンであってもよく、このポリペプチドは同時に、炎症関連抗原であってもよい。ワクチンは、ウイルスワクチンであってもよく、そしてポリペプチドは、同時にウイルス抗原であってもよい。ある実施形態では、このワクチンはポリペプチドフラグメントを含み、このフラグメントは、本発明のポリペプチドの少なくとも１つの細胞外フラグメント、および／または本発明のポリペプチドの少なくとも１つの細胞外フラグメントからシグナルペプチドのないものを、例えば、ガンのような増殖性障害の処置のために含む。特定の実施形態では、このワクチンは、例えば、ガンのような増殖性障害の処置のために投与される、１つ以上のこのようなフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。さらにこのワクチンはアジュバント有りで投与されても無しで投与されてもよい。このワクチンは、表および配列表に示されるポリペプチドとともに投与されてもよい；これは、ポリペプチドを投与する前に、実質的に同時に、または後に投与されてもよい。
【０２９９】
ワクチン治療は、腫瘍抗原の免疫原として本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは因子の使用を包含する（Ｍａｃｈｉｅｌｓら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９：４９４〜５０２，２００２）。例えば、本発明のペプチドに基づくワクチンは、未改変の本発明のポリペプチド、そのフラグメント、ならびにＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ制限ペプチド（Ｋｎｕｔｓｏｎｒａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．０７：４７７〜４８４，２００１）を包含し、これは例えば、普遍的な、非特異的なＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープを有する開示された配列を含む。腫瘍抗原を含むペプチドに基づくワクチンは直接、単独で、または他の分子と組み合わせて与えられてもよい。このワクチンはまた、トランスジェニック植物中でこの抗原を生成し、これがその後に経口摂取され得ることによって経口的に送達されてもよい（米国特許第６，３９５，９６４号）。
【０３００】
ある実施形態では、抗体自体が抗イディオタイプワクチンにおける抗原として用いられ得る。すなわち、腫瘍抗原に対する抗体を投与することで、Ｂ細胞を刺激して、その抗体に対する抗体を作成し、これが次に腫瘍細胞を認識する。
【０３０１】
核酸ベースのワクチンは、抗原をコードするポリヌクレオチド構築物として腫瘍抗原を送達し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡのような遺伝物質を含むワクチンは、直接、単独で、または他の分子と組み合わせて投与されてもよい。本発明の分子を発現するワクチンの投与は、例えばプラスミドＤＮＡとして、所望されない腫瘍増殖を制御することを補助する、治療的な免疫原の持続的な発現および放出を経時的にもたらす。
【０３０２】
ある実施形態では、核酸ベースのワクチンは、本発明の抗体をコードする。このような実施形態では、このワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）は、転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）由来の転写後調節作用ＲＮＡエレメント（ＷＰＲＥ）を含んでもよい。これらの転写後調節エレメントは、抗体、または抗体および同時刺激分子を含む融合タンパク質を標的するために、腫瘍の微小環境に対して用いられ得る（Ｐｅｒｔｌら、Ｂｌｏｏｄ，１０１：６４９〜６５４，２００３）。
【０３０３】
体液性の応答を誘導することにより抗腫瘍免疫応答を刺激することに加えて、本発明のワクチンはまた、腫瘍細胞を直接認識して殺傷するＴ細胞刺激を誘導する細胞応答を誘導し得る。例えば、腫瘍抗原をコードする本発明のヌクレオチドベースのワクチンは、免疫系のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球のアームを活性化するために用いられ得る。
【０３０４】
ある実施形態では、このワクチンはＴ細胞を直接活性化し、他方では抗原提示細胞がＴ細胞を活性化することを支持する。キラーＴ細胞は、部分的には、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞との相互作用によってプライムされる。ある実施形態では、本発明の核酸分子を含むプラスミドは、抗原提示細胞に入り、これが次に、コードされた腫瘍抗原を提示し、これがキラーＴ細胞活性化に寄与する。ここでも、腫瘍抗原は、プラスミドＤＮＡ構築物として、単独で、または他の分子とともに送達され得る。
【０３０５】
ＭＧＤ−ＣＳＦおよびＮＰ＿６８９６６９は、ヒト骨髄ＣＤ３４＋幹細胞または末梢血単球のいずれかからのインビトロにおける樹状細胞分化を促進し得るので、本発明の分子は、エキソビボで樹状細胞を増殖させるために用いられ得る。次いで、増殖された細胞集団は、例えば、樹状細胞ワクチンとして患者に戻されてもよい。さらに、本発明の分子は、患者においてインビボで自己の造血幹細胞および／または単球からの樹状細胞分化を促進し得、これが患者の抗原提示能力を増強して、ガンのような特定の疾患と戦う能力に寄与する。
【０３０６】
さらなる実施形態では、ＲＮＡがワクチン生成に用いられ得る。例えば、樹状細胞は、腫瘍抗原をコードするＲＮＡでトランスフェクトされてもよい（Ｈｅｉｓｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：４０９〜４１７，２００２；ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＮａｉｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１０６５〜１０６９，２０００）。このアプローチは、十分な量の腫瘍物質を得るという限界を克服し、そうでなければ臨床試験から排除される患者へと治療を拡大する。例えば、腫瘍から単離される本発明のＲＮＡ分子は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅され得る。ある実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は直接、腫瘍から単離されて、介入するクローニング工程なしに樹状細胞にトランスフェクトされる。
【０３０７】
ある実施形態では、本発明の分子は、ペプチド抗原がその天然の状態よりも高度に抗原性であるように変更される。これらの実施形態は、エピトープ配列の改変を介して腫瘍抗原の免疫原性を増強することによって、ほとんどの腫瘍抗原のインビボにおける劣った免疫原性を克服する当該分野での必要性に取り組む（ＹｕおよびＲｅｓｔｉｆｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：２８９〜２９４，２００２）。
【０３０８】
ガンワクチンの別の認識された問題とは、既存の中和抗体の存在である。本発明のいくつかの実施形態は、哺乳動物でない天然の宿主由来のウイルスベクター、例えば、鶏痘ウイルスを用いることによってこの問題を克服する。既存の中和抗体をやはり迂回する別の実施形態としては、遺伝子操作されたインフルエンザウイルス、およびタンパク質に関係しないＤＮＡを含む裸のプラスミドＤＮＡワクチンの使用を包含する（ＹｕおよびＲｅｓｔｉｆｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：２８９〜２９４，２００２）。
【０３０９】
本発明の全ての免疫原性の方法は、単独で、または他の慣習的なもしくは非慣習的な治療と組み合わせて用いられ得る。例えば、免疫原性分子は、種々の抗増殖効果を有する他の分子と、または免疫応答刺激を補助するさらなる物質、すなわちアジュバントもしくはサイトカインと組み合わされてもよい。
【０３１０】
例えば、ある実施形態では、核酸ワクチンは、腫瘍抗原に加えて、アルファウイルスレプリカーゼ酵素をコードする。ワクチン療法に対するこのアプローチは、腫瘍細胞のアポトーシス性死亡の誘導をともなう治療抗原産生と首尾よく組み合わされる（ＹｕおよびＲｅｓｔｉｆｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：２８９〜２９４，２００２）。
【０３１１】
ある実施形態では、本発明の分子は、細胞増殖の制御に関与し、そして本発明の因子は、所望されない細胞増殖を阻害する。このような因子は、限定はしないが、ガン、乾癬および強皮症を含む異常な細胞増殖を含む障害を処置するために有用である。本発明の特定の因子および／または治療レジメンが望ましくない細胞増殖を減少させるのにおいて、例えばガンを処置する状況において、有効であるか否かは、標準的な方法を用いて決定され得る。例えば、生物学的サンプル（例えば、血液、生検サンプルなど）におけるガン細胞の数は、決定され得る。腫瘍量は、標準的な放射線学的方法または生化学的方法を用いて決定され得る。
【０３１２】
本発明の分子は、ガン、新生物および腫瘍随伴性の障害を含む、過剰増殖性の障害の免疫療法において用途を見出す。すなわち、本発明の分子は、そのうち１７７０以上が現在までに同定されている腫瘍抗原に対応し得る（ＹｕおよびＲｅｓｔｉｆｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：２８９〜２９４，２００２）。免疫療法アプローチは、受動免疫療法およびワクチン療法を含み、そして遺伝的および抗原特異的なガン免疫療法の両方を達成し得る。
【０３１３】
受動免疫アプローチは、特定の腫瘍関連抗原に対する本発明の抗体を含む。このような抗体は、正常な細胞を廃することなく、複数の部位で全身性の腫瘍を根絶し得る。ある実施形態では、抗体は、上記のように放射性成分と組み合わされ、これによって、例えば、抗体が腫瘍を特異的に標識する能力と、腫瘍ＤＮＡに対する放射性同位体の致死性の付加とを組み合わせる。
【０３１４】
有用な抗体は、別個のエピトープまたはネスト化されたエピトープの組み合わせ、すなわち、１０マーのエピトープ、ならびに全ての潜在的な８マーおよび９マー、または重複するエピトープを組み込む関連のペプチド多量体を含む（Ｄｕｔｏｉｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１８１３〜１８２２，２００２）。従って単独の抗体が１つ以上のエピトープと相互作用し得る。さらに、抗体は、単独で用いられてもよいし、または全てが単独のエピトープもしくは複数のエピトープのいずれかを認識する種々の抗体と組み合わせて用いられてもよい。
【０３１５】
中和抗体は、ガンおよび増殖障害の治療を提供し得る。本発明のタンパク質またはペプチドを特異的に認識する中和抗体は、タンパク質またはペプチドに対して、例えば、体液中または細胞外間隙で結合し得、それによってこのタンパク質またはペプチドの生物学的な活性を調節する。例えば、癌細胞の増殖を刺激するのにおいてある役割を果たすタンパク質またはペプチドに特異的な中和抗体は、癌細胞の増殖を調節するのに有用であり得る。同様に、癌細胞の分化においてある役割を果たすタンパク質またはペプチドに特異的な中和抗体は、癌細胞の分化を調節するのに有用であり得る。
【０３１６】
（ＭＧＤ−ＣＳＦ「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）」および相同組み換え）
内因性の遺伝子発現は、標的相同組み換えを用いて、目的の遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって減少され得る。例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１７：２３０〜２３４（１９８５）；Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ，５１：５０３〜５１２（１９８７）；およびＴｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，５：３１３〜３２１（１９８９）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列に対して相同なＤＮＡ（遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に隣接する本発明の変異体、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関係のないＤＮＡ配列）は、インビボで本発明のポリペプチドを発現するように細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび／または負の選択マーカーの有無とともに用いられてもよい。別の実施形態では、当該分野で公知の技術を用いて、目的の遺伝子を含むが発現しない、細胞におけるノックアウトを生成する。標的された相同組み換えを介する、ＤＮＡ構築物の挿入によって、標的遺伝子の不活性化が生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変を用いて、不活性な標的遺伝子を有する動物子孫を生成し得る、研究および農業の分野に特に適切である。例えば、Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３〜５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９８９）、前出）。しかし、このアプローチは、組み換えＤＮＡ構築物が当業者に明確である適切なウイルスベクターを用いてインビボで必要な部位に直接投与されるか標的されるという条件で、ヒトにおける使用のために慣用的に適合され得る。
【０３１７】
本発明のさらなる実施形態では、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている、あるいは、ノックアウトのように本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝子操作されている細胞を、インビボで患者に投与する。このような細胞は、ヒトおよび非ヒト動物を含む患者、またはＭＨＣ適合性ドナーから得られてもよく、そしてこれには限定はしないが、線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを挙げることができる。この細胞は、組み換えＤＮＡ技術を用いてインビトロで遺伝子操作されて、細胞へ本発明のポリペプチドのコード配列を導入するか、あるいは、限定はしないが、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームなどの使用を含む、例えば、形質導入（ウイルスベクター、および／または細胞ゲノムへ導入遺伝子を組み込むベクターを用いる）またはトランスフェクション手順によって、本発明のポリペプチドに関連するコード配列および／または内因性の調節性配列（制御配列）を破壊する。本発明のポリペプチドのコード配列は、本発明のポリペプチドの発現および分泌を達成するために、強力な構成的または誘導性のプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下におかれてもよい。本発明のポリペプチドを発現および分泌する操作された細胞は、患者に全身的に、例えば、循環にまたは腹腔内に導入され得る。あるいは、細胞は、マトリックスに組み込まれ得、そして身体に移植され得てもよく、例えば、遺伝子操作された線維芽細胞は、皮膚移植片の一部として移植され得る；遺伝子操作された内皮細胞は、リンパまたは血管移植片の一部として移植され得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；およびＭｕｌｌｉｇａｎ＆Ｗｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと）。
【０３１８】
投与されるべき細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらは、導入された細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨げる周知の技術を用いて投与され得る。例えば、細胞は、即時の細胞外環境との成分の交換を可能にするが導入される細胞が宿主免疫系によって認識されることを可能にしないカプセル化型で導入されてもよい。
【０３１９】
（トランスジェニック非ヒト動物）
本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック非ヒト動物において発現され得る。限定はしないが、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジーを含む任意の種の動物を用いて、トランスジェニック動物を生成してもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載されるか、そうでなければ当該分野で公知の技術を、遺伝子治療プロトコールの一部として用いて、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現する。
【０３２０】
当該分野で公知の任意の技術は、動物に導入遺伝子（配列表に示されるポリヌクレオチドにおいて具象化される）を導入してトランスジェニック動物の創始株を生成するために用いられ得る。このような技術としては、限定はしないが、前核性マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１〜６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３〜１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０〜８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：６１４８〜６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５６：３１３〜３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３〜１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いる本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）；胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞への幹細胞の戻し移入；および精子媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５７：７１７〜７２３（１９８９）；などが挙げられる。このような技術の概説については、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１〜２２９（１９８９）を参照のこと。また、米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｓａｍｅ）米国特許第４，７３６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ａｎｉｍａｌｓ）および米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｚｙｇｏｔｅｓ）も参照のこと。当該分野で公知の任意の技術、例えば、静止状態に誘導された、培養された胚、胎児または成体細胞からの核除去卵母細胞への核移入が、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを生成するために用いられ得る（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４〜６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０〜８１３（１９９７））。
【０３２１】
本発明は、その全細胞に導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物、ならびに導入遺伝子を、その全細胞ではないがある程度に担持する動物、例えば、モザイク動物またはキメラ動物を提供する。この導入遺伝子は、コンカテマーにおけるように、単独の導入遺伝子として、または複数のコピーとして組み込まれ得る、例えば、ヘッド・ツー・ヘッド（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）タンデムまたはヘッド・ツー・テール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）タンデム。この導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示に従って、特定の細胞タイプに選択的に導入されて活性化され得る（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：６２３２〜６２３６（１９９２））。このような細胞タイプ特異的な活性化に必要な調節性配列（制御配列）は、目的の特定の細胞タイプに依存し、そして当業者に明白である。内因性遺伝子の染色体部位へポリヌクレオチド導入遺伝子が組み込まれることが所望され得、次いで、遺伝子標的が適切である。要するに、このような技術が利用される場合、内因性遺伝子に相同性であるいくつかのヌクレオチド配列を含むベクターは、染色体配列との相同組み換えを介する内因性遺伝子のヌクレオチド配列への組み込み、およびその機能の目的のために設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞タイプへ選択的に導入され得、これによって、例えば、Ｇｕらの教示に従って、その細胞タイプにおいてのみ内因性遺伝子を不活性化する（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３〜１０６（１９９４））。このような細胞特異的な不活性化に必要な調節性配列（制御配列）は、目的の特定の細胞タイプに依存して、当業者に明白である。
【０３２２】
一旦トランスジェニック動物が生成されれば、組み換え遺伝子の発現は、標準的な技術を用いてアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって達成して、動物組織を分析して導入遺伝子の組み込みが行われたことを確認し得てもよい。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルはまた、限定はしないが、その動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技術を用いて評価されてもよい。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的にまたは免疫組織化学的に評価され得る。
【０３２３】
一旦、創始動物を生成すれば、それらは、特定の動物のコロニーを生じるために、繁殖、同系交配、異系交配または異種交配されてもよい。このような繁殖戦略の例としては、限定はしないが、別の系統を樹立するための２つ以上の組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各々の導入遺伝子の相加的な発現の効果のおかげで、高レベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニック動物を生成するための別の系統の同系交配；発現を増大し、かつＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性を省くため、所定の組み込み部位についてホモ接合性の動物を生成するためのホモ接合性のトランスジェニック動物の異種交配；複合のヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別のホモ接合性株の異種交配；ならびに目的の実験モデルに適切である別個の背景にこの導入遺伝子を置くための繁殖が挙げられる。
【０３２４】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）」動物は、限定はしないが、本発明の分子の異常な発現に関連する状態および／または障害を研究する本発明の分子の生物学的機能を作り込むのにおいて、そしてこのような状態および／または障害を改善させるのに有効な化合物についてスクリーニングするのにおいて、有用な動物モデル系を含む用途を有する。
【０３２５】
（キット）
本発明は、上記の方法で用いられ得るキットを提供する。１実施形態では、キットは、本発明の抗体、例えば、精製された抗体を１つ以上の容器中に含む。ある実施形態では、本発明のキットは、このキットに含まれる抗体を特異的に免疫反応性であるエピトープを含む実質的に単離されたポリペプチドを含む。本発明のキットはまた、目的のポリペプチドと反応しないコントロールの抗体を含んでもよい。
【０３２６】
ある実施形態では、本発明のキットは、目的のポリペプチドに対する抗体の結合を検出するための手段を含む。例えば、この抗体は、検出可能な基質、例えば、蛍光化合物、酵素基質、反応性化合物もしくは発光化合物に結合体化されてもよいし、または第一の抗体を認識する第二の抗体が、検出可能な基質に結合体化されてもよい。
【０３２７】
ある実施形態では、このキットは、ＭＧＤ−ＣＳＦ関連分子に対して特異的な抗体を含む血清をスクリーニングするのにおける使用のための診断キットである。このようなキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、このようなキットは、この抗体の抗原への結合を検出するための手段を備える。この抗体は、フローサイトメトリーによって検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化合物に結合体化されてもよい。ある実施形態では、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポリペプチド抗原を備えてもよい。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に結合されてもよい。
【０３２８】
さらなる実施形態では、上記のキットの検出手段は、このポリペプチド抗原が結合される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非結合レポーター標識抗ヒト抗体を備えてもよい。この実施形態においては、ポリペプチド抗原に対する抗体の結合はこのレポーター標識抗体の結合によって検出され得る。
【０３２９】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血清をスクリーニングする際の使用のための診断用キットを包含する。この診断用キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である実質的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗体との結合を検出する手段を備える。ある実施形態においては、この抗体は、固体支持体に結合される。ある実施形態においては、この抗体は、モノクロナール抗体である。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクロナール抗体を含んでもよい。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競合抗原を含んでもよい。
【０３３０】
ある診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法によって得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応させられる。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、この試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上で結合した抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合されない標識抗体を除去し、そしてこの試薬と会合したレポーターの量を決定する。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または比色基質の存在下で、この固相をインキュベートすることにより検出される酵素である。
【０３３１】
この固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料、例えば、高分子ビーズ、ディップ・スティック、９６ウェルプレートおよび／または濾過材料に付着させるための公知の技術により調製され得る。これらの付着方法としては、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な基、例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基への、代表的には、遊離アミン基を介する、タンパク質の共有結合、が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に用いられてもよい。
【０３３２】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の詳細な説明に一部は示され、そして一部は詳細な説明から明白であるか、または本発明の実施によって学習され得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に示される要素および組み合わせの手段によって実現されそして達成される。さらに、詳細な説明の本文に記載される利点は、特許請求の範囲に含まれなくても、特許請求される本発明にそれ自体限定されるものではない。
【０３３３】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、請求される本発明の代表であって、代表でしかなく、制限ではないことが理解されるべきである。さらに、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然ながら変化し得ることが理解されなければならない。さらに、特定の実施形態を記載するために用いられる技術用語は、限定されると解釈されるべきではない。なぜなら、本発明の範囲は、その特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。特許請求の範囲は、特許権消滅状態における実施形態を包含しない。
【０３３４】
値の範囲に関しては、本発明は、文脈が明確に他を示すのでない限り、この範囲の上限と下限との間にある各々の値から下限の単位の少なくとも１０倍までを包含する。さらに、本発明は、任意の他の言及される介在する値を包含する。さらに、本発明はまた、言及される範囲から特に排除されるのでない限り、この範囲の上限および下限のいずれかまたは両方を除く範囲を包含する。
【０３３５】
他に規定されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語の意味は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるものである。当業者はまた、本明細書に記載される方法および材料と同様または等価である任意の方法および材料がまた、本発明を実施または試験するために用いられ得ることを認識する。さらに、本明細書に言及される全ての刊行物は、その全体が参照によって援用される。
【０３３６】
本明細書において、そして添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形である「１つの（ａ）」、「または（ｏｒ）」および「この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の対象を包含するということに注意しなければならない。従って、例えば、「１つの本発明のポリペプチド（ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という言及は、複数のこのようなポリペプチドを含み、そして「この因子（ｔｈｅ  ａｇｅｎｔ）」という言及は、当業者に公知の１つ以上の因子およびその等価物などの言及を包含する。
【０３３７】
さらに、本明細書および特許請求の範囲において用いられる、成分、反応条件、純度％、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さなどの量を表す全ての数は、他に示さない限り、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語によって修飾される。従って、本明細書および特許請求の範囲で示される数的なパラメーターは、本発明の所望の特性に依存して変化し得る近似値である。最低限、特許請求の範囲に対する等価物の原理の適用を限定するつもりではないが、各々の数的なパラメーターは、通常の四捨五入技術を適用して、報告された有意な桁数の数に照らして少なくとも解釈されるべきである。それにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、できるだけ正確に報告される。しかし、任意の数値は、その実験的な測定の標準偏差から特定の誤差を本質的に含む。
【０３３８】
本明細書は、本明細書に引用される参考文献に照らしてほとんど完全に理解される。これらの参考文献の各々は、その全体がこの参照によって本明細書に援用される。
【実施例】
【０３３９】
本実施例は、本発明の例示であることを意図するものであって、従って、いかなる方法でも本発明を限定すると解釈されるべきではなく、また上記で考察される本発明の局面および実施形態の詳細を記載し提供する。本実施例は、以下の実験が行なわれる全ての実験であるとか唯一の実験であるとかを示すものではない。用いられる数（例えば、量、温度など）に関しては正確性を保障する労力を払っているが、ある程度の実験の誤差および偏差が見込まれるべきである。他に特定しない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均の分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧かまたは大気圧付近である。
【０３４０】
（実施例１：ＭＧＤ−ＣＳＦとＭＣＧ３４６４７のアミノ酸配列アラインメント）
ＭＧＤ−ＣＳＦおよびＮＰ＿６８９６６９は、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３７，ｃｐｕ＝０．００ｓｅｃ．，スコア＝７２、Ｎｓｅｑ＝３、ｌｅｎ＝２４２のプログラムのクラスタル（ｃｌｕｓｔａｌ）形式を用いてそれらのアミノ酸を整列することによって比較した。図１に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦのアミノ酸配列は、ＮＰ＿６８９６６９（ＭＣＧ３４６４７）のアミノ酸配列とは異なる。後者の配列は、アミノ酸８１の位置にグルタミン（Ｑ）残基を有する。ＭＣＧ３４６４７のＮＣＢＩ配列におけるアミノ酸８１におよびそのいずれかの側に隣接する、５つの隣接するアミノ酸残基は、ＮＶＴＲＬＱＲＡＱＶＳ（配列番号２７９）である。ＭＣＧ３４６４７のこの公開された配列と対照的に、ＭＧＤ−ＣＳＦは、アミノ酸配列ＮＶＴＲＬＲＡＱＶＳ（配列番号２８０）を含む。これらの配列の間の相違は、エキソン３とエキソン４との間のＭＣＧ３４６４７遺伝子の選択的スプライシングから生じる。エキソン３〜４の境界のゲノム配列は、コドンａａｃ  ｇｔｃ  ａｃｃ  ａｇｇ  ｃｔｇ  ｇｔｇ（配列番号２８１）およびｃａｇ  ｃａｇ  ａｇｇ  ｇｃｃ  ｃａｇ  ｇｔｇ  ａｇｃ（配列番号２８２）であり、ここでｇｔｇコドン（斜体で示す）は、エキソン３の末端での５’スプライスドナーに相当し、そして２つのｃａｇコドン（斜体で示す）は、エキソン４の開始での２つの選択的スプライスアクセプター部位に相当する。従って、公開されたＭＣＧ３４６４７配列は、第一のｃａｇスプライスアクセプター部位の使用から生じる転写物に相当するが、ＭＧＤ−ＣＳＦ配列は、第二のｃａｇスプライスアクセプター部位の使用から生じる転写物に相当する。
【０３４１】
ＭＣＧ３４６４７グルタミン８１残基は、第一のｃａｇスプライスアクセプター部位が用いられる場合にスプライスアウトされない第二のｃａｇコドンによってコードされる。対照的に、スプライスアクセプター部位としての第二のｃａｇの使用では、得られたＲＮＡ転写物の第一のｃａｇ配列のスプライシングアウトを生じ、これが次にＭＧＤ−ＣＳＦスプライス改変体における対応するグルタミンの欠失を生じる。従って、ＭＧＤ−ＣＳＦは、スプライシング改変体であって、ＭＣＧ３４６４７とは別個であるＲＮＡおよびタンパク質の種に相当する。
【０３４２】
（実施例２：ＭＧＤ−ＣＳＦ発現のためのプラスミドベクター）
ＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子を、標準的なクローニング手順を用いて、図２および図３に示されるように改変されたｐＴＴ−５およびｐＴＴ−２哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子はまた、標準的なクローニング手順を用いて、ｐＩＢ／Ｖ５Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ昆虫細胞発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）にクローニングした。得られた構築物は、表１および表５に記載される。それらとしては、ベクターｐＴＴ５においてタグ化されていないヒトＭＧＤ−ＣＳＦ（ＭＧＤ−ＣＳＦ）、ベクターｐＴＴ２においてタグ化されていないヒトＭＧＤ−ＣＳＦ（ＣＬＮ００８３９３９５）、ベクターｐＴＴ５においてＣ末端Ｖ５Ｈ８タグを有するヒトＭＧＤ−ＣＳＦ（ＣＬＮ００７３２６６３）、Ｖ５Ｈ８でタグ化されたヒトＭＧＤ−ＣＳＦ（ＣＬＮ００７３２６６３）、ベクターｐＴＴ２においてＣ末端Ｖ５Ｈ８タグを有するヒトＭＧＤ−ＣＳＦ（ＣＬＮ００８４０３５１）、ベクターｐＩＢ／Ｖ５Ｈｉｓ−ＤＥＳＴにおいてＣ末端Ｖ５Ｈ８を有するヒトＭＧＤ−ＣＳＦ（ＣＬＮ００７５８５９３）、およびベクターｐＴＴ５−Ｇにおいてコラーゲン分泌リーダーおよびＣ末端Ｓｔｒｅｐｔａｇを有するヒトＭＧＤ−ＣＳＦ（ＣＬＮ００８１６４２４）が挙げられる。
【０３４３】
ＭＧＤ−ＣＳＦの発現および分泌をモニターするため、そしてその精製を補助するために、構築物ＣＬＮ００８２１８６７を、タンパク質とＣ末端切断タグとの間で操作されたＴｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識部位で生成した。ＴＥＶプロテアーゼの７つのアミノ酸認識部位は、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号１８３）であり、切断はＧｌｎとＧｌｙとの間で生じる。構築物ＣＬＮ００８２１８６７を、ＭＧＤ−ＣＳＦ（１〜２４１ａａ）＿ＴＥＶ＿Ｖ５＿ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ＿Ｈ８と命名して、ベクターｐＴＴ５−Ｉ中でＣタグ化した。
【０３４４】
ＭＧＤ−ＣＳＦの分泌を改善するために、最初の２０アミノ酸によってコードされるその分泌シグナルペプチドを、コラーゲンのシグナルペプチドをコードする２３アミノ酸によって置き換えた（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質アクセッション番号ＮＰ＿００１８４２）。この構築物ＣＬＮ００８４８１４９を、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（２１〜２４１ａａ）と命名して、ベクターｐＴＴ５−Ｇ中で非タグ化する。別のこのような構築物も、タンパク質とＣ末端切断タグとの間で操作されたＴＥＶプロテアーゼ認識部位を有する。ＣＬＮ００８１６４２４を、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（２１〜２４１ａａ）＿ＴＥＶ＿Ｖ５＿ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ＿Ｈ８と命名して、ベクターｐＴＴ５−Ｇ中でＣタグ化する。第三のこのような構築物をＮ末端タグとタンパク質のとの間で操作されたＴＥＶ部位で生成した。ＣＬＮ００８１６４２５を、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿Ｈ８＿ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ＿Ｖ５＿ＴＥＶ＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（２１〜２４１ａａ）と命名して、ベクターｐＴＴ５−Ｈ中でＮタグ化する。
【０３４５】
アミノ酸が成熟タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または両方の末端から欠失された欠失構築物を生成した。これらの欠失構築物のＭＧＤ−ＣＳＦシグナルペプチドを、コラーゲンシグナルペプチドで置き換えた。ＣＬＮ００８４８１６０は、２５のＮ末端アミノ酸が欠失しており；これを、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（２６〜２４１ａａ）と名付けて、ベクターｐＴＴ５−Ｇ中で非タグ化する。ＣＬＮ００８４８１７３は、３０のＮ末端アミノ酸を欠失しており；これを、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（３１〜２４１ａａ）と名付けて、ベクターｐＴＴ５−Ｇ中で非タグ化する。ＣＬＮ００８４８２０９は、５個のＣ末端アミノ酸および２０個のＮ末端アミノ酸（シグナルペプチド）が欠失しており；これを、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（２１〜２３６ａａ）と名付けて、ベクターｐＴＴ５中で非タグ化する。ＣＬＮ００８４８１９７は、１０個のＣ末端アミノ酸および２０個のＮ末端アミノ酸（シグナルペプチド）が欠失しており；これを、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（２３〜２３１ａａ）と名付けて、ベクターｐＴＴ５中で非タグ化する。ＣＬＮ００８４８１８５は、２８個のＣ末端アミノ酸および２０個のＮ末端アミノ酸（シグナルペプチド）が欠失しており；これを、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（２１〜２１３ａａ）と名付けて、ベクターｐＴＴ５中で非タグ化する。ＣＬＮ００８４８２２０は、２５個のＮ末端アミノ酸および１０個のＣ末端アミノ酸が欠失しており；これを、ＭＧＤ−ＣＳＦコラーゲンＳＰ（１〜２３ａａ）＿ＭＧＤ−ＣＳＦ（２６〜２３１ａａ）と名付けて、ベクターｐＴＴ５中で非タグ化する。
【０３４６】
ＭＧＤ−ＣＳＦの２つのマウスオルソログを同定して、標準的な手順によって、非タグ化ｐＴＴ５（ＣＬＮ００８４０２５７およびＣＬＮ００８４７９４８）に、そしてこのクローンとタグとの間のＴＥＶ部位でタグ化されたｐＴＴ５−Ｉ（ＣＬＮ００８４０２５３およびＣＬＮ００８４２７１２）にクローニングした。これらのオルソログを用いて、マウスの組織および細胞においてＭＧＤ−ＣＳＦの生物学的活性に関する動物研究を行なってもよい。
【０３４７】
構築物ＣＬＮ００８４０２５７およびＣＬＮ００８４０２３５によって示されるマウスのオルソログは、ＲＩＫＥＮ全長富化ライブラリー由来のＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ成体雄性小腸ｃＤＮＡクローン２０１０００４Ａ０３に由来した；理論的タンパク質１２８４２０４３；遺伝子座ＡＫ００８０８２。構築物ＣＬＮ００８４０２５７は、ファントムクローン２０１０００４Ａ０３のヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当し、そしてベクターｐＴＴ５にクローニングされたヒトＭＧＤ−ＣＳＦのマウスオルソログである。構築物ＣＬＮ００８４０２５３は、ファントムクローン２０１０００４Ａ０３のヌクレオチド配列のＯＲＦに相当し、そしてベクターｐＴＴ５−Ｉにクローニングされた。
【０３４８】
構築物ＣＬＮ００８４７９４８およびＣＬＮ００８４２７１２によって呈示されるマウスオルソログは、遺伝子座ＢＣ０１６２５４で、ＲＩＫＥＮ全長富化ライブラリー由来のＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｃＤＮＡクローン２０１０００４Ａ０３、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：２８８９１  ＩＭＡＧＥ：４９１２０９７）、完全ｃｄｓ１８９２１４３６に由来した。構築物ＣＬＮ００８４７９４８（１８９２１４３６）は、ベクターｐＴＴ５にクローニングされたヒトＭＧＤ−ＣＳＦのＯＲＦヌクレオチド配列に相当する。この構築物ＣＬＮ００８４２７１２（１８９２１４３６）は、ベクターｐＴＴ５にクローニングされたヒトＭＧＤ−ＣＳＦのＯＲＦヌクレオチド配列に相当する。
【０３４９】
（実施例３：哺乳動物細胞における一過性の発現）
ＭＧＤ−ＣＳＦポリペプチドをコードする相補的なＤＮＡを、発現ベクターｐＴＴ５およびｐＣＤＮＡ−ｐＤＥＳＴ４０にクローニングして、タグ化タンパク質および非タグ化タンパク質の両方として発現した。タンパク質のレベルは、定量的なウエスタンブロット分析により、タグ、例えばＶ５Ｈｉｓタグのレベルを測定することによって定量した。発現ベクターは、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中に含まれるトランスフェクション剤Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｌｔｌｅｙ  ＮＪ）を用いて、接着性２９３細胞中にトランスフェクトして、５％ＣＯ２中において３７℃で４０時間インキュベートし、その後に細胞をＰＢＳで洗浄して、完全ＤＭＥＭ中でさらに４８時間インキュベートした。細胞上清を回収して、遠心分離によって細胞破砕物を除去して、抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロットアッセイによって生物学的活性（非タグ化ｃＤＮＡ）およびタンパク質発現（Ｖ５タグ化ｃＤＮＡ）について試験した。
【０３５０】
発現研究はまた、懸濁培養物中でタグ化ＭＧＤ−ＣＳＦ構築物を一過性に発現している２９３−６Ｅ細胞で行った。細胞は、トランスフェクションの１８〜２４時間前に、２５ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）中で１ｍｌあたり６×１０５個の細胞の密度まで希釈した。トランスフェクション複合体は、１．２５ｍｌのＰＢＳに２５μｇのＤＮＡを添加すること、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に溶解した５０μｌの直鎖の２５ｋＤのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＰＡ）を添加すること、この溶液を混合すること、およびこの混合物を室温で１時間インキュベートしてその後にこれをトランスフェクトされるべき細胞に添加することによって調製した。細胞およびそれらの上清は、トランスフェクションの３〜６日後に回収して、タンパク質発現は、ウエスタンブロット分析によって評価した。
【０３５１】
細胞懸濁液（１ｍｌ）をペレットにし次いで４部のＸＴサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）と混合した。９９℃で３分間の変性後、サンプルをＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）にロードするか、または−２０℃で保管した。細胞ペレットを、１００μｌの溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；および１錠剤完全プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
ＩＮ））中での再懸濁によって溶解した。溶解した細胞を１４，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレットにして、得られた透明な溶解物のタンパク質および細胞懸濁液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ニトロセルロース膜に転写した。ウエスタンブロットは、Ｖ５エピトープに特異的なＨＲＰ結合体化モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を用いて、またはポリクローナルのウサギ抗ＭＧＤ−ＣＳＦ抗体（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）を用いて膜をプローブすることによって行った。結合されたウサギ抗ＭＧＤ−ＣＳＦ抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化されたポリクローナルヤギ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）で検出した。化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）中で膜をインキュベートすること、およびこれを感光性のフィルムに曝すことによって免疫複合体を可視化した。
【０３５２】
図４Ａおよび４Ｂに示されるように、２９３−６Ｅ細胞は、トランスフェクションの３〜６日後にタグ化ＭＦＤ−ＣＳＦを発現した。図４Ａは、２９３−６Ｅ細胞中への一過性にトランスフェクトされたＶ５Ｈ８（ＣＬＮ００７３２６６３）でタグ化されたＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す。この左のパネルは、細胞内ＭＧＤ−ＣＳＦを示す。発現はトランスフェクション後３日でほぼ顕著であった。真ん中のパネルは、上清中へ分泌されたＭＧＤ−ＣＳＦを示す。発現はトランスフェクションの６日後に最も顕著であった。右のパネルは、定量的な陽性コントロール（Ｐｏｓｉｔｏｐｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を示す。
【０３５３】
図４Ｂは、コラーゲン分泌配列を有しＶ５Ｈ８でタグ化されたＭＧＤ−ＣＳＦの発現を示す（ＣＬＮ００８１６４２４）。左パネルは、細胞内ＭＧＤ−ＣＳＦを示す。発現は、３日で観察されて、トランスフェクション後６日にわたって継続して増大した。真ん中のパネルは、上清中へ分泌されたＭＧＤ−ＣＳＦを示す；その発現はまた３日から６日に増大した。右のパネルは、定量的な陽性コントロール（Ｐｏｓｉｔｏｐｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を示す。
【０３５４】
図４Ａおよび図４Ｂの両方において、細胞および上清のタンパク質ロードは、左および真ん中のパネルのゲルロードが匹敵する細胞数を反映するように適合された。従って、真ん中のパネルに示されるＭＧＤ−ＣＳＦの量は、細胞の分泌効率を反映する。上清中で検出された標的化タンパク質は、約４０ｋＤの分子量を有したが、細胞内タンパク質は、おそらく不完全なグリコシル化に起因して約３７ｋＤの分子量を有した。分泌されたタンパク質の収率は、構築物の設計次第で異なった。ＣＬＮ００７３２６６３は、細胞内で低収率で発現された。３７ｋＤ型であって４０ｋＤ型ではないが、おそらく、細胞溶解に起因して、やはり低収率（約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）で、トランスフェクション６日後に細胞培養上清中で検出された。外因性の分泌シグナルおよび伸長された切断性Ｃ末端タグで内因性のシグナルペプチドを置換することで、発現および分泌は少なくとも１倍に増大した（ＣＬＮ００８１６４２４）。さらに、より高分子量のタンパク質バンドのみが、ＣＬＮ００８１６４２４でトランスフェクトされた細胞培養物の上清中で検出可能であり、このことは、このタンパク質が分泌されたものであって、溶解した細胞には由来しなかったことを示した。
【０３５５】
（実施例４：トランスフェクトされた細胞の増殖および生存度）
図５Ａおよび表１に示されるように、ＣＬＮ００８１６４２４で一過性にトランスフェクトされた２９３−６Ｅ細胞は、トランスフェクション後３〜６日にわたって増殖し続けた。懸濁培養物中の細胞の密度は、ＣＬＮ００５４２９４５（黒）、ＣＬＮ００７３２６６３（薄灰色）、ＣＬＮ００８２１８６７（斜線）、およびＣＬＮ００８１６４２４（格子）でのトランスフェクションの後３〜６日血球計算板を用いて、トリパンブルーを排除した細胞をカウントすることによってモニターし、そして分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするコントロールの遺伝子（濃灰色）と比較した。コントロールのＳＥＡＰ細胞およびＣＬＮ００８１６４２４（コラーゲンリーダーを有するＭＧＤ−ＣＳＦ）でトランスフェクトされた細胞の両方が、３〜６日にわたって数が増えた。ＣＬＮ００５４２９４５（非タグＭＧＤ−ＣＳＦ）、ＣＬＮ００７３２６６３（Ｖ５Ｈ８タグ化ＭＧＤ−ＣＳＦ）、またはＣＬＮ００８２１８６７（ストレプタグ化ＭＧＤ−ＣＳＦ）でトランスフェクトされた細胞は増殖しなかった。
【０３５６】
図５Ｂに示されるとおり、ＣＬＮ００８１６４２４（コラーゲンリーダーを有するＭＧＤ−ＣＳＦ）で一過性にトランスフェクトされた細胞は生存したままであった。それらは、培養物中で６日間８０％を超える生存度を維持した。懸濁培養物中の細胞の生存度は、ＣＬＮ００５４２９４５（黒）、ＣＬＮ００７３２６６３（薄灰色）、ＣＬＮ００８２１８６７（斜線）、およびＣＬＮ００８１６４２４（格子）でのトランスフェクションの後３〜６日にわたって血球計算板を用いて、トリパンブルー排除によってモニターし、そして分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするコントロールの遺伝子（濃灰色）と比較した。ＭＧＤ−ＣＳＦ、ＣＬＮ００７３２６６３およびＣＬＮ００８２１８６７を発現する細胞は、培養物中での経時的な細胞生存率の減少によって証明される、細胞毒性の増大を示した。この毒性は、宿主２９３細胞におけるＭＧＤ−ＣＳＦのｃＤＮＡには特異的でないが、特定の培養条件下でのみ観察される。
【０３５７】
（実施例５：哺乳動物細胞での安定なトランスフェクション）
ＭＧＤ−ＣＳＦは、トランスフェクトされた接着性２９３−Ｔ細胞によって安定に発現された。安定なトランスフェクションをＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から購入された２９３−Ｔ細胞で行って、完全ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＶＡ）；１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ培地）中で培養した。トランスフェクションの前日、１．２５×１０５個の細胞をＴ−１７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ  ＭＡ）中に播種して、５％ＣＯ２を用いて３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、１１４μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ  ＮＪ）と１．９ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＶＡ）とを混合することによってトランスフェクトして、室温で５分間インキュベートした。プラスミドＤＮＡ（１９μｇの全長ＭＧＤ−ＣＳＦをｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３中に）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）をＦｕｇｅｎｅ／培地混合物に添加して、室温で１５分間インキュベートした。脂質／ＤＮＡ混合物をＴ−１７５フラスコに移して、細胞とともに１６時間インキュベートした。翌日、細胞を０．２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）で剥離して、３つのＴ−１７５フラスコに増殖させた。約１６時間後、この細胞を培養容器に結合させて、選択試薬ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を１０μｇ／ｍｌという最終濃度に添加した。選択培地を１週に１回交換して、細胞生存率を４〜６週間モニターした。発現は、上記のポリクローナルウサギ抗ＭＧＤ−ＣＳＦ抗体を用いてウエスタンブロット分析によって確証した。
【０３５８】
ＭＧＤ−ＣＳＦを安定に発現する接着性２９３−Ｔ細胞は、低血清または血清なしの培地中での懸濁培養に適合された。細胞を１０６／ｍｌの濃度でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）中で、またはＨｙｑ  ＰＦ  ＣＨＯ  ＬＳ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）中で、それぞれ再懸濁して、５％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）を補充した。懸濁細胞培養を、２５０ｍｌの振盪フラスコ中で５０ｍｌの容積で維持して、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。この培地を１週に２回交換して、細胞を約１０６／ｍｌ以下の密度で維持した。細胞生存率は、トリパンブルー排除によって測定した。生存度が８０％を超える場合、血清濃度を、３％、２％、１％、次には血清なしと漸減させた。トランスフェクトされた細胞は、血清の減少した条件、または無血清の条件に適合した。非タグ化ＭＧＤ−ＣＳＦを一過性に発現する２９３−Ｔ細胞の細胞生存率およびタンパク質収率は、１％ＦＢＳを有するＨｙＱ−ＣＨＯ培地中での培養中の４日後には、３％ＦＢＳを有するＦｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ培地中で培養した２９３−Ｅ細胞での一過性の発現の６日後に観察された生存度および収率よりもかなり高かった。
【０３５９】
３％ＦＢＳを有するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中で維持した接着性２９３−Ｔ細胞は、比較的緩徐に増殖した；それらの生存度は３継代後に６７％であった。相対的に、１％ＦＢＳを有するＨｙＱ  ＰＦ  ＣＨＯ  ＬＳ培地中で維持した細胞は、さらに迅速に増殖し；それらの生存度は４継代後に８５％を超えていた。図６Ａに示されるとおり、ＨｙＱ  ＰＦ  ＣＨＯ  ＬＳ培地および１％ＦＢＳ中の培養物のタンパク質収率（右パネル）は、定量的なウエスタンブロットによって決定されるとおり、３％のＦＢＳを補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中で培養した細胞からの収率（左パネル）に比較して１０倍より多く増大された。
【０３６０】
図６Ｂに示されるように、ウエスタンブロット分析によって示される場合、低血清培地または血清なしの培地の懸濁培養物中で増殖するように適合された安定にトランスフェクトされたＭＧＤ−ＣＳＦ  ２９３−Ｔ細胞から、高いタンパク質収率が得られた。低血清で懸濁培養物中で増殖するように適合された安定にトランスフェクトされたＭＧＤ−ＣＳＦ  ２９３−Ｔ細胞は、８倍より分泌した（１．３μｇ  ｍｌ）（パネル１）。血清なしの培地中で増殖された細胞は、４日間にわたって上記されたとおり、接着して増殖する安定にトランスフェクトされたＭＧＤ−ＣＳＦ  ２９３−Ｔ細胞（約１６０ｎｇ／ｍｌ）（パネル３）よりも、６日内に培養上清中へ４倍を超える（６５０ｎｇ／ｍｌ）（パネル２）ＭＧＤ−ＣＳＦを分泌した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現し、次いで精製されて定量的な標準物として機能した（パネル４）。
【０３６１】
（実施例６：バイオリアクター発酵）
図７に示されるとおり、バイオリアクター発酵は、１０リットルのバイオリアクター中で６〜７日の発酵の経過の間、約１０μｇ／ｍｌまでＭＧＤ−ＣＳＦの生産性を改善した。低血清中で増殖するように適合された細胞を、１％ＦＢＳを補充された１０リットルのＨｙＱ  ＰＦ  ＣＨＯ  ＬＳ培地中へ約５×１０５／ｍｌの濃度で接種した。発酵は６日間モニターして、サンプルを上記のようにゲル電気泳動のために調製した。図７の左パネルは、１レーンあたり２２．５μｌのサンプルをロードされ、接種後１〜６日でクマーシーブルー染色されたゲルにおけるＭＧＤ−ＣＳＦの存在を示す。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、右パネルに定量的コントロールとして示される。矢印は、ＭＧＤ−ＣＳＦの位置を示す。
【０３６２】
（実施例７：タンパク質単離）
ＭＧＤ−ＣＳＦは、上記のように、そして図８に示されるように、タンパク質を安定に発現する懸濁培養物中で増殖した２９３Ｔ細胞から単離した。培養上清は、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（ＨＣｌを含む）に調節し、次いで１０ｋＤの分子量カットオフを有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ）を用いて５倍に濃縮した。その濃縮物を、緩衝液Ａ（１０ｍＭの酢酸ｐＨ５．０、１１０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して透析して、緩衝液Ａで平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）陽イオン交換カラムで分画した。そのタンパク質は、１．５Ｍ  ＮａＣｌへ直線勾配で溶出させて、ＭＧＤ−ＣＳＦを含有する画分を緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  １，３ジアミノプロパンｐＨ８．９、３０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して透析した。
【０３６３】
この透析されたＳＰ−Ｐｏｏｌを、緩衝液Ｂで平衡化したヘパリン  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムに加えて、１．５Ｍ
ＮａＣｌへ直線勾配で溶出させて、ＭＧＤ−ＣＳＦを含有する画分を緩衝液Ｃ（１０ｍＭ  ビス−トリプロパンｐＨ７．４、３０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して透析した。この透析されたＨｅｐ−Ｐｏｏｌを、緩衝液Ｃ中で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）陰イオン交換カラムで分画して、１．５Ｍ  ＮａＣｌへ直線勾配で溶出させて、ＭＧＤ−ＣＳＦを含有する画分をプールして、このＱ−Ｐｏｏｌを液体窒素中で急速凍結して、−８０℃で保管した。この精製手順は、９５％を超える純度でこの発現されたタンパク質の１２％の収率を回収した。
【０３６４】
（実施例８：システインからセリンの変異分析）
ＭＧＤ−ＣＳＦ配列は、アミノ酸位置３５、１６７、１７６、１７８、１７９、１９０および１９８に位置する７つのシステイン残基を含む。非還元条件下での変性および未変性のゲル電気泳動の結果の比較に基づけば、ＭＧＤ−ＣＳＦは、ジスルフィド連結オリゴマーを形成しない。従って、天然のタンパク質中のシステイン残基の少なくとも１つは不対であると予想される。不対のシステイン残基によって、不適切なタンパク質折り畳みおよび共有的な凝集体の形成がもたらされ得る。
【０３６５】
ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質の７つの突然変異タンパク質（ムテイン）のセットが構築され、発現され、特徴付けられ、ここでシステインの各々がそのジスルフィド結合パターンを理解するためにセリンに変異された。このジスルフィド結合パターンの分析によって、１つ以上の遊離のシステイン残基の排除が、改善された特性、例えば、哺乳動物細胞からの改善された発現および分泌、精製されたタンパク質の凝集の減少、ならびに／またはＥ．ｃｏｌｉで発現された場合活性な組み換えＭＧＤ−ＣＳＦを生成する能力を有するＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質を生じるか否かが決定され得る。
【０３６６】
各々の突然変異タンパク質（ムテイン）をコードするＤＮＡは、コラーゲンシグナルペプチドを含む構築物、および成熟ＭＧＤ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列（ＣＬＮ００８４８１４９）から生成した。タンパク質は、上記のように、２９３−Ｔ細胞で発現された。上清を回収して、還元および非還元のゲル電気泳動に、続いてヒトＭＧＤ−ＣＳＦにおける真ん中のペプチドエピトープに対して惹起されたポリクローナル抗体でのウエスタンブロッティングに供した。
【０３６７】
図８Ｂに示されるとおり、還元ゲルのウエスタンブロットを分析して、野性型ヒトＭＧＤ−ＣＳＦ（天然またはコラーゲンシグナルペプチドを有する）および各々のＣｙｓからＳｅｒへの突然変異タンパク質（ムテイン）の相対的な発現レベルを決定した。野性型ヒトＭＧＤ−ＣＳＦの分泌タンパク質収率は、天然のシグナルペプチドよりもコラーゲンシグナルペプチドで高いことが観察された。全ての突然変異タンパク質（ムテイン）が、コラーゲンシグナルペプチドを有する野性型ヒトＭＧＤ−ＣＳＦに比較した場合、分泌されたタンパク質の収量の少なくともわずかな減少を有することが観察された。Ｃ１７９ＳおよびＣ１９０Ｓの収率は、有意に減少され、そしてＣ３５Ｓの発現は検出不能であった。これらの結果に基づいて、Ｃ３５、Ｃ１７９およびＣ１９０は、天然のＭＧＤ−ＣＳＦにおけるジスルフィド結合に関与すると考えられる。
【０３６８】
図８Ｂにさらに示されるとおり、非還元ゲルのウエスタンブロットを、タンパク質標準と比較したＭＧＤ−ＣＳＦ種の相対的な移動によって決定された、みかけの分子量の変化について分析した。ジスルフィド結合が破壊されるとき、タンパク質のみかけのサイズは代表的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの変性条件下で増大し、そしてこの増大の大きさは代表的には、このタンパク質の一次配列における２つのシステイン残基の間の距離と相関している。ジスルフィド結合の破壊は、高分子量凝集種の形成を生じ得る。Ｃ１６７Ｓは野性型ＭＧＤ−ＣＳＦと同じ移動時間を有することが観察されるが、他の突然変異タンパク質（ムテイン）の全てが移動の挙動が変化している。これによって、Ｃ１６７は、天然のＭＧＤ−ＣＳＦにおける唯一の不対システインである可能性が高いことが示される。Ｃ１７９ＳおよびＣ１９０Ｓの両方とも最初により高い分子量の種を形成する。これらの突然変異タンパク質（ムテイン）は、タンパク質の収率および移動において同じ変化を有し、このことは、それらが天然のＭＧＤ−ＣＳＦにおいてお互いと対であることを示唆する。Ｃ１７６ＳおよびＣ１７８Ｓは、移動において同じわずかな減少を示し、このことは、それらが、天然のＭＧＤ−ＣＳＦにおいてお互いと対であり得ることを示唆する。結局、Ｃ１９８Ｓは、移動においてより大きい変化を有し、このことは、そのパートナーが、タンパク質配列においてかなり離れて位置するＣ３５であり得ることを示唆する。Ｃ１６７が天然のＭＧＤ−ＣＳＦにおける唯一の不対システインであると考えられるという事実によって、これはセリンまたはアラニンに変異され得、ここで発現されたタンパク質の収率の改善および回収されたタンパク質産物の異質性の減少が生じる。
【０３６９】
（実施例９：ＭＧＤ−ＣＳＦは、造血細胞増殖を促進する）
（Ａ．ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＮＫ細胞増殖を促進する）
マウスＮＫ細胞は、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）の指示に従ってＮＫ細胞単離キットを用いてＣ５７ＢＬ６の１０週齢の雌性マウスの脾臓から精製した。約３０，０００個の精製されたＮＫ細胞を、精製されたＭＧＤ−ＣＳＦと０．０１〜１０μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。ＮＫ細胞数はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７１）を用いて決定した。図９に示されるとおり、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中でのインキュベーションの４日後、ＭＧＤ−ＣＳＦは特異的に、ＮＫ細胞数の増殖および／または生存を用量依存性の様式で増大した。
【０３７０】
ヒトＮＫ細胞は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手した被膜形成細胞において富化された血液から単離して精製した。血液は、ＰＢＳで約１：５に希釈して、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、各々が２５ｍｌの希釈血液を含む複数の５０ｍｌの円錐管に添加した（１２．５ｍｌ／チューブ）。このＦｉｃｏｌｌ／血液混合物を、４５０×ｇで３０分間遠心分離した。末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）層を除去し、カルシウムおよびマグネシウムなしでＤＰＢＳ  １×（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃｏ．ＶＡ）で洗浄して、１０００ＲＰＭで１０分間ペレットにした。ＰＢＭＣは、１３５０  ＲＰＭで１０分間の遠心分離によってＰＢＳ中で３回洗浄して、０．５％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ
Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を含む４０ｍｌのＰＢＳ（ＰＢＳＦＥ）中に再懸濁した。
【０３７１】
ＮＫ細胞は、製造業者によって推奨されるように、ヒトＮＫ細胞  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）を含むＰＢＭＣから濃縮した。この濃縮工程は、ａｕｔｏＭＡＣＳＴＭＳｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）の「枯渇（ｄｅｐｌｅｔｅ）」プログラムを利用した；濃縮ＮＫ細胞に相当する陰性の画分は、出力ポート「ｎｅｇ１」から収集した。これらの細胞は、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離した。この細胞ペレットを１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中に再懸濁して、１×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。この細胞を、９６ウェルの丸底プレート中で、１ウェルあたり１０％のウシ胎仔血清を含む５０μｌのＤＭＥＭに５×１０４個の細胞濃度で、７％ＣＯ２の雰囲気中で３７℃で４日間、下に記載のコントロールおよび試験因子とともにインキュベートした。
【０３７２】
この方式で調製したヒトＮＫ細胞の増殖に対するコントロールおよび試験因子の効果は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｒｅＧｌｏ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ．２８８（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）に記載されるように、ルシフェラーゼ活性を測定することによるＡＴＰの定量に基づいて、培養物中の生存細胞の数を測定することによってスクリーニングアッセイにおいて確認した。定量的な結果は、Ｌｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）で、室温で１ウェルあたり０．６秒で読み取った。このウェルのＡＴＰ含量は、プレート後４日間測定した。
【０３７３】
図１０に示されるように、ＭＧＤ−ＣＳＦでトランスフェクトされた細胞、およびＭＧＤ−ＣＳＦクローンの供給源であるクラスター１９０６４７由来のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞由来の馴化培地は、ＮＫ細胞生成を刺激した。インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）およびＧＭ−ＣＳＦを、インターフェロン陽性のコントロールとして用いた。組み換えインターロイキン１５を含む外部の陽性コントロール、および培養培地を含む外部陰性コントロールは、図１０の右および左に示す。このスクリーニングアッセイによって、ＮＫ細胞の生成を刺激するかおよび／または数を安定化する因子としてＭＧＤ−ＣＳＦは同定された。この結果は、スクリーニングアッセイの４つの独立した繰り返しでみられた。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＮＫ細胞からのサイトカインの産生を一貫して誘導はしない。これは単球細胞の数を増大するかまたは安定化するが、単球細胞からのサイトカインの産生を誘導しなかった。ＭＧＤ−ＣＳＦは、活性化されたＴ細胞またはＢ細胞の数に影響しなかった。
【０３７４】
（Ｂ．ＭＧＤ−ＣＳＦは造血幹細胞増殖を促進する）
ＭＧＤ−ＣＳＦはまた、培養物中で骨髄ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ細胞）（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ）の増殖を刺激した。図１１に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦは、用量依存性の様式で増殖を増大した。ＨＳＣ細胞は、５％熱不活化ウシ胎仔血清（ＡＴＣＣ）および１０ｎｇ／ｍｌ組み換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）を補充された１ｍｌ／ウェルのＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）を含有する１２ウェルの組織培養ディッシュ中で１ウェルあたり２．４×１０４個の細胞密度で間質なしの条件下で、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１〜２週間、培養物中で増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌのＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）で剥がして、再度ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ／０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）中で再懸濁して、血球計算器でカウントした。精製されたＭＧＤ−ＣＳＦは、用量依存性の様式でその増殖を２０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌに増大した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、幹細胞増殖をＭ−ＣＳＦより大きい程度まで、そしてＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦと同様の程度まで誘導した。
【０３７５】
（Ｃ．ＭＧＤ−ＣＳＦは、インビトロにおいて骨髄球性の細胞増殖を促進する）
ヒト初代単球を、前に記載された方法（ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ  Ｏｓｗａｌｄｏ  Ｃｒｕｚ  ９５：２２１〜２２３，２０００）とは改変されたプロトコールを用いてＰＢＭＣから精製した。血液からヒトＰＢＭＣを単離するために、バフィー・コートを６倍容積のＰＢＳ中で希釈し、次いで５０ｍｌのチューブ中で２０ｍｌのＦｉｃｏｌｌに積層した。このチューブを２，０００ｒｐｍで２２℃で２０分間、遠心分離ブレーキの使用なしに遠心分離した。ＰＭＢＣ細胞を界面から収集して、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、次いでＲＰＭＩ  ５％  ＦＢＳ中で再懸濁して、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ細胞ストレイナーを通して濾過した。ＰＢＭＣから初代の未結合単球を精製するために、６ｍｌのＰＢＭＣ懸濁液（７０〜１２０×１０６個の細胞を含む）を、１０ｍｌの高浸透圧性Ｐｅｒｃｏｌｌ上に注意深くかつ緩徐に積層した。この細胞を遠心分離ブレーキの使用なしに５８０×ｇの速度で１５分間、遠心分離した。境界面の細胞を収集して、５０ｍｌのＲＰＭＩ  ５％  ＦＢＳを用いて洗浄した。この精製された単球細胞ペレットを５０ｍｌのＲＰＭＩ５％ＦＢＳに再懸濁した。
【０３７６】
単球アッセイは、約３０，０００個の精製された単球を上記のように精製されたＭＧＤ−ＣＳＦとともにインキュベートすることによって行った。５％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ中でのインキュベーションの４日後、単球増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７１）を用いて決定した。
【０３７７】
ＭＧＤ−ＣＳＦトランスフェクト２９３−Ｔ細胞由来の馴化培地（ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭ）は、単球増殖を促進した。スクリーニングアッセイは、マウスＩｇＧ２ａによって活性化された単球に対して９６ウェルプレート形式で二重のプレートで行った。表６は、各々のクローンが単球増殖および各々の構築物の発現の程度を刺激するという活性の力価の半定量的な記述を示す。ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭは、ＧＭ−ＣＳＦとほぼ同じ程度まで単球増殖を刺激した。結果は、培地から少なくとも２標準偏差の場合、有意であるとみなした。観察されたＥＤ５０は３〜５ｎｇ／ｍｌであった。変異ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質もこのアッセイで試験した。変異クローンＣＬＮ００８４８１８５は、野性型タンパク質に匹敵する活性（力価）を実証し、そして他の変異クローンは、野性型タンパク質よりもわずかに低い活性を有し、そのことは、いくつかの変異タンパク質が治療タンパク質として用いられ得ることを示唆する。
【０３７８】
図１２Ａに示されるとおり、単球増殖に対するＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭの刺激性効果は、１０，０００倍の範囲にわたって用量依存性であった。試験したＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭの最低用量０．０１μｌは、単球増殖に有意な影響を有さなかった。０．１μｌへのＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭの用量の１０倍の増大によって、コントロールに比較して有意なレベルへの細胞増殖が誘導された。１μｌのＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭおよび１０μｌのＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭへの用量のさらなる増大は、単球増殖を用量依存性の様式でさらに増大した。空のベクターでも陰性のコントロールＣＬＮ００３７３２またはＦＰＴ０２６でも用量依存性は観察されなかった。刺激陽性のコントロールであるＧＭ−ＣＳＦの１０ｎｇ／ｍｌの単独用量の効果が示され、同様に陰性のコントロールＩＬ−１０の効果および非馴化培地の効果が示される。
【０３７９】
図１２Ｂに示されるとおり、精製されたＧＭ−ＣＳＦおよびＭＧＤ−ＣＳＦでトランスフェクトされた細胞由来の馴化培地は両方とも、ヒト単球増殖を刺激した。従って、ＭＧＤ−ＣＳＦは、骨髄性細胞および顆粒球の分化および増殖におけるその役割に加えて、単球増殖のアゴニストとして機能する。これは、ガン患者における化学療法または放射線療法および骨髄移植後の造血細胞の回復を強化するための造血因子として用いられ得る。
【０３８０】
（Ｄ．ＭＧＤ−ＣＳＦは、インビボにおいて造血細胞増殖を促進する）
インビボにおけるＭＧＤ−ＣＳＦの役割を理解するため、Ｃ５７ＢＬ６マウスに、Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：９０１６〜９０２２，２００３によって記載される方法を用いて、ＭＧＤ−ＣＳＦプラスミドＤＮＡを注射した。ヒトチトクロムＰ４５０
３Ａ４プロモーターを、ＭＧＤ−ＣＳＦのヌクレオチド配列を有する核酸分子に対して作動可能に連結して、マウスの尾静脈に注射してマウスの肝臓をＭＧＤ−ＣＳＦでトランスフェクトした。ヒト３Ａ４プロモーターを用いて、マウス肝臓におけるＭＧＤ−ＣＳＦの発現を駆動した。完全血球算定（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｕｎｔ）（ＣＢＣ）および異なる分析は、Ｓｅｒｏｎｏ  Ｂａｋｅｒ  ９０００血液学分析計を用い各々の２つの独立した実験においてコントロール群および実験群で行なった。
【０３８１】
第一の実験におけるコントロール群（表７Ａ、動物１〜３）は、実験マウスに年齢適合した３匹の注射していないマウスからなった。第一の実験における実験群（表７Ａ、動物４−６）は、尾静脈を介して裸のＭＧＤ−ＣＳＦ  ＤＮＡを注射された３匹のマウスからなった。血液サンプルは注射の１４日後収集した。表７Ａに示されるとおり、注射されたマウスは、コントロールに比較して上昇した単球カウントを有した。コントロール動物１、２および３は、それぞれ血液１μｌあたり９４、８４および５２個の単球を有した。実験動物４および６は、それぞれ血液１μｌあたり２１６および２６８個の単球を有した。動物３では意味のある単球カウントは得られなかった。
【０３８２】
第二の実験におけるコントロール群（表７Ｂ、動物１〜６）は、実験マウスに年齢適合し、ＬａｃＺ構築物を尾静脈を介して注射した６匹のマウスからなった。第二の実験における実験群（表７Ｂ、動物７〜１２）は、尾静脈を介して裸のＭＧＤ−ＣＳＦ  ＤＮＡを注射された６匹のマウスからなった。血液サンプルは注射の２１日後収集した。表７Ｂに示されるとおり、注射されたマウスは、コントロールに比較して上昇した単球カウントを有した。検出可能な単球レベルを有したコントロール動物はいなかった。６匹の実験動物のうち４匹は、１μｌあたり５０〜７８個の単球におよぶ検出可能な単球レベルを有した。これらの結果によって、ＭＧＤ−ＣＳＦは、インビボで骨髄細胞数を増大したことが実証される。
【０３８３】
（実施例１０：造血性分化に対するＭＧＤ−ＣＳＦの影響のＦＡＣＳ分析）
インビトロの顆粒球、単球および樹状細胞発達アッセイによってさらに、造血におけるＭＧＤ−ＣＳＦの機能が明らかになる。ヒト骨髄ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ細胞）（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ）を上記のように培養した。
【０３８４】
分化は、顆粒球細胞表面上の種々のマーカーを検出するために蛍光標識した抗体を用いる蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析によって確認した（Ｋａｖａｔｈａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：５２４〜５２８（１９８３））。ＭＧＤ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦの有無のいずれかでの１週の培養後、ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞をＰＢＳで１回洗浄して、０．５ｍｌのＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＧＡｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）で剥がし、１ｍｌ  ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）で洗浄して、０．２ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）中に再懸濁して、ＦＡＣＳ染色のための９６ウェルのプレート中にアリコートした（１ウェルあたり５０μｌ）。細胞を、蛍光結合体化抗体を用いて１５分間４℃でインキュベートした。１５０μｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２回の洗浄後、細胞を、製造業者（Ｂａｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ  ＮＪ）の指示に従ってＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで分析した。１０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦまたは３０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ由来）が、公知の増殖因子の効果の陽性コントロールとして機能した。顆粒球、単球または樹状細胞系列の特定の表面マーカーに特異的な蛍光標識化抗体をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入して、顆粒球、単球および樹状細胞の系列へのＨＳＣ細胞の分化に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を確認するために用いた。
【０３８５】
（Ａ．顆粒球分化）
図１３に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦは、未分化の細胞から異なるマーカーＣＤ６７＋およびＣＤ２４＋を保有する分化した顆粒球への顆粒球の分化を刺激した。陰性コントロールとして、空のベクターの存在下およびサイトカインの非存在下における顆粒球分化のベースラインのレベルは、１．２％であることが測定された。陽性のコントロールであるＧ−ＣＳＦは、顆粒球の５５％を分化するように刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭは、顆粒球の４１％を分化するように刺激した（矢印）。ＭＧＤ−ＣＳＦの効果は、Ｇ−ＣＳＦの効果と相乗的であって、両方の存在下では、顆粒球の６４％が分化するように刺激された。
【０３８６】
ＣＤ２４およびＣＤ１５抗体を用いて、顆粒球分化をモニターした。ＣＤ２４抗体は、Ｂ細胞および顆粒球の表面上で発現された３５〜４５ｋＤａの２鎖糖タンパク質と反応した。ＣＤ１５抗体は、Ｘ−ｈａｐｔｅｎとしても公知の２２０ｋＤａの炭水化物構造である、３−フコシル−Ｎ−アセチルラクトサミン（３−ＦＡＬ）と反応した。３−ＦＡＬは、好中球および好酸球を含む試験された顆粒球のうち９５％で、そして単球では種々の程度まで発現されたが、リンパ球または好塩基球では発現されなかった。ＣＤ１５は、食作用、殺菌活性および走化性を媒介する役割を果たす。ＣＤ２４およびＣＤ１５の両方が陽性の細胞は、ＢＭ  ＣＤ３４＋造血前駆細胞から分化した顆粒球に相当する。
【０３８７】
図１４に示されるように、２０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦは、ＣＤ１５＋／ＣＤ２４＋顆粒球へ３％分化を誘導し、５００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦは、ＣＤ１５＋／ＣＤ２４＋顆粒球へ８％分化を誘導した。陽性のコントロールＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの両方とも、骨髄ＣＤ３４＋細胞のうち１２％をＣＤ１５／ＣＤ２４陽性の顆粒球へと分化するように誘導した。
【０３８８】
（Ｂ．単球分化）
図１５に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦは、未分化の細胞からＣＤ１４＋マーカーを保有する分化した単球への単球の分化を刺激した。陰性コントロールとして、空のベクターの存在下およびサイトカインの非存在下における単球分化のベースラインのレベルは、２４％であることが測定された。ＧＭ−ＣＳＦは、単球の２０％を分化するように刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、単球の４５％を分化するように刺激した（矢印）。ＧＭ−ＣＳＦ単独では、これらの細胞に影響は有さなかったが、ＭＧＤ−ＣＳＦと組み合わせた場合、その効果は相乗的であった；両方の存在下では、単球の５５％が分化するように刺激された。
【０３８９】
図１６に示されるように、ＣＤ１４およびＣＤ１６抗体を用いて、単球分化をモニターした。ＣＤ１４抗体は、単球の上で高レベルで発現された５３〜５５ｋＤのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−固定単鎖糖タンパク質と反応した。さらにＣＤ１４抗体は、ある程度のマクロファージと反応した。ＣＤ１６抗体は、５０〜６５ｋＤａの膜貫通型のＩｇＧ  Ｆｃレセプター（ＦｃｇＲＩＩＩ）と反応した。ＣＤ１６抗原は、単球、マクロファージ、顆粒球およびＮＫ細胞上で発現された。単球は、そのＣＤ１６発現に応じて２つのサブセットに分割され得る；常在性の単球はＣＤ＋ＣＤ１６−であって、炎症性の単球はＣＤ１４ｌｏｗＣＤ１６＋である。２０ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−またはＣＦ１４ｌｏｗＣＤ１６＋単球のいずれかへ、分化を３０％を、１００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦは分化を３０％、そして５００ｎｇ／ｍｌは分化を５３％誘導した。陽性コントロールＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦは、それぞれＣＤ１４分化を４１％、３８％および５１％促進した。
【０３９０】
（Ｃ．樹状細胞分化）
図１７に示されるように、ＭＧＤ−ＣＳＦは、未分化の細胞からＣＤ８６およびＣＤ１マーカーを保有する分化した樹状細胞への樹状細胞の分化を刺激した。陰性コントロールとして、空のベクターの存在下における樹状細胞分化のベースラインのレベルは、４％であることが測定された。ＭＧＤ−ＣＳＦは、未分化細胞の２２％を樹状細胞に分化するように刺激した。
【０３９１】
（実施例１１：ＭＧＤ−ＣＳＦは、骨髄コロニー形成を促進する）
ヒト骨髄由来骨髄球（ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＭおよびＣＦＵ−ＧＭ）前駆体増殖に対するＭＧＤ−ＣＳＦの刺激性の効果を評価するために、コロニー形成アッセイを行った。骨髄前駆体の刺激のための陽性コントロールは、Ｇ−ＣＳＦの０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌならびにＧＭ−ＣＳＦの０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび３ｎｇ／ｍｌの添加であった。ＭＧＤ−ＣＳＦタンパク質は、各々の試験濃度のメチルセルロースベースの培地中に２０、１００および５００ｎｇ／ｍｌという最終濃度に希釈された。各々の３つの複製培養物が３×１０４個の細胞を含むように細胞を添加した。複製培養物は、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベートし、次いで、カウントして、写真に撮り、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＭまたはＣＦＵ−ＧＭとしての形態に基づいて分類し、そしてＦＡＣＳ分析を行った。統計学的分析を行って、コロニーの数、サイズおよび形態の変化を評価した。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−ＧＭの形成、および総コロニー形成を促進した。さらに、下記にさらに記載されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦによって促進されるのとは異なる大きいＣＦＵ―Ｍコロニーを促進した。これらの結果によって、ＭＧＤ−ＣＳＦは初期の造血前駆体形成を増強したことが示唆される。
【０３９２】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、外因性のサイトカインの非存在下でのヒト骨髄コロニー形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。図１８Ａに示されるとおり、精製されたＭＧＤ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦに比較して顆粒球コロニー形成（ＣＦＵ−Ｇ）にほとんど影響を有さなかった。ＭＧＤ−ＣＳＦは、用量依存性の様式で単球コロニー形成（ＣＦＵ−Ｍ）を刺激した。図１８Ｂに示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦは、顆粒球−単球コロニー形成ＣＦＵ−ＧＭを用量依存性の様式で刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦはまた、総コロニー形成能（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）（ＣＦＣ）を用量依存性の様式で刺激した。図１８Ｃは、サイトカインＩＬ−３および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下におけるヒト骨髄コロニー形成に対するＭＧＤ−ＣＳＦの効果を示す。それらの条件下で、精製したＭＧＤ−ＣＳＦは、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍおよび総ＣＦＣを用量依存性の様式で刺激した。ＭＧＤ−ＣＳＦの存在下における骨髄前駆体の分布は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのものとは異なった。
【０３９３】
（実施例１２：ＭＧＤ−ＣＳＦの生物学的活性のプロフィール）
図１９に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦを、非活性化Ｂ細胞増殖（ＢＰｒｏ４）、脂肪細胞によるグルコース取り込みを刺激する能力（Ｇｕ２Ｇｙ３Ｔ３）、不活性化単球増殖（ＭｏｎＰｒｏ４）、ＮＫ細胞増殖および／または生存（ＮＫＧｌｏ）、Ｔ細胞増殖（ＴＰｒｏ４）、活性化初代Ｂ細胞増殖（ａＢＰｒｏ４）、活性化初代単球増殖（ａＭｏｎＰｒｏ３）、および活性化初代Ｔ細胞増殖（ａＴＰｒｏ４）を測定するアッセイにおいて、その生物学的効果について、試験した。結果は、中央値から少なくとも２標準偏差の場合、有意であるとみなした。ＭＧＤ−ＣＳＦは、活性化された単球の増殖を刺激することも、活性化または不活性化されたＢ細胞またはＴ細胞の増殖を刺激することも無く、ＮＫ細胞および不活性化単球の増殖を特異的に刺激した。
【０３９４】
（実施例１３：ＭＧＤ−ＣＳＦ誘導性サイトカイン分泌のプロフィール）
図２０に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦを、ＮＫ細胞からの
サイトカイン分泌に対するその生物学的効果について試験した。実施例１１に記載されるとおりにアッセイを行った。製造業者の指示に従って、Ｌｉｎｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）のＬｕｍｉｎｅｘサイトカインアッセイキットを用いてサイトカイン分泌のタイプおよび量を決定するために、実験の終わりに馴化培地を取り出した。結果は、中央値から少なくとも２標準偏差の場合、有意であるとみなした。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３の分泌を刺激した。
【０３９５】
（実施例１４：ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＨＳＣ細胞からのＣＦＵ−Ｍ分化を刺激した）
ＭＧＤ−ＣＳＦは、ヒト骨髄細胞から形成された骨髄コロニーのサイズおよび数を用量依存性の様式で増大した。図２１の上の左のパネルは、サイトカインの非存在下（緩衝液）で培養した骨髄細胞において観察されたＣＦＵ−Ｍコロニーの代表的な写真を示す。コロニー形成の証拠は弱いかまたは存在しない。上の真ん中のパネルは、ＧＭ−ＣＳＦによって誘導されたＣＦＵ−Ｍコロニーの代表的な写真を示す；コロニー形成は明らかであった。上の右側のパネルは、Ｇ−ＣＳＦがＣＦＵ−Ｍ形成を刺激しないことを示す代表的な写真を示す。図１６の下の３つのパネルは、ＭＧＤ−ＣＳＦによって誘導されるＣＦＵ−Ｍの代表的な写真を示す。数およびサイズの両方とも２０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦで用量依存性の様式で増大した。細胞は、４０×のレンズを用いてＡｘｉｏｖｅｒｔ２５顕微鏡およびＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ（両方ともＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査して写真を撮った。細胞は、Ｚｅｉｓｓ
ＫＳ３００  ３．０デジタル画像化システムで可視化した。
【０３９６】
ＭＧＤ−ＣＳＦによって誘導されたコロニーのサイズは、ＧＭ−ＣＳＦによって誘導されたコロニーのサイズより大きかった。ＭＧＤ−ＣＳＦによって誘導されたコロニーの約１０％が極めて大きく、１００〜２０００ミクロンの範囲であった。ＭＧＤ−ＣＳＦは、サイトカインＳＣＦおよびＩＬ−３の存在下および非存在下の両方においてこれらの大きいコロニーを誘導した。これらのデータによって、ＭＧＤ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦよりも早期の前駆体を含む、初期の骨髄前駆体の形成を促進したことが示される。それらによってまた、ＭＧＤ−ＣＳＦが、Ｍ１もしくはＭ２マクロファージ系列のいずれかまたは両方の分化を促進することが示唆される。
【０３９７】
（実施例１５：ＭＧＤ−ＣＳＦは、樹状細胞へＨＳＣ分化を刺激した）
ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ）を、２４ウェル細胞培養プレート上で無血清Ｘ−ビボ２０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ）中にプレートして、ベクターコントロールの馴化培地（ＣＭ）またはＭＧＤ−ＣＳＦ  ＣＭで処理した。その細胞を、４０×のレンズを用いてＡｘｉｏｖｅｒｔ２５顕微鏡およびＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ（両方ともＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査して写真に撮った。細胞は、Ｚｅｉｓｓ
ＫＳ３００  ３．０デジタル画像化システムで可視化した。
【０３９８】
図２２に示されるとおり、ＭＧＤ−ＣＳＦ濃度の増大につれてＭＧＤ−ＣＳＦ処理した培養物中で細長い細胞の数の増大が観察された。抗ＣＤ１ａ抗体を用いて、樹状細胞への分化を確認した。ＭＧＤ−ＣＳＦを用いた２週間の培養物の処置によって、ヒト骨髄ＣＤ３４＋のうち２０％のＣＤ１陽性樹状細胞への分化が誘導された。ＭＧＤ−ＣＳＦは、用量依存性の様式でヒト骨髄細胞から樹状細胞の分化を誘導した（図２２）。４つのパネル全部における示された細胞は、４０×のレンズを用いてＡｘｉｏｖｅｒｔ２５顕微鏡およびＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ（両方ともＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査して写真に撮った。細胞は、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ３００  ３．０デジタル画像化システムで可視化した。
【０３９９】
図２２の上の左のパネルは、サイトカインの非存在下（培地）で培養した骨髄細胞の代表的な写真を示す。細胞は代表的には小さく丸くなっている。上の右側のパネルは、２０ｍｇ／ｍｌのＭＧＤ−ＣＳＦに応答して、樹状細胞にさらに緊密に似るように細長くかつ平板化している骨髄細胞の代表的な写真を示す。下の左側のパネルは、１００ｎｇ／ｍｌという高用量のＭＧＤ−ＣＳＦでは、ＨＳＣ細胞の形態にさらに顕著な効果を有することを実証する代表的な写真を示す。この細胞はより大きくかつ細長い。下の右側のパネルは、５００ｎｇ／ｍｌという濃度のＭＧＤ−ＣＳＦでは、樹状細胞の形態的な外観を有する大きく、平坦で、細長い細胞が生じることを示す。
【０４００】
（実施例１６：ＭＧＤ−ＣＳＦ遺伝子発現）
種々のレベルの遺伝子発現を、プローブ２３７０４６＿ｘ＿ａｔを用いＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイプラットフォーム、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍａ  Ｕ１３３およびＵ１３３Ｐｌｕｓ＿２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃの独自の腫瘍学データベースを問い合わせることによって、個々のヒトガン組織標本において比較した。これはまた、プローブＰＲＢ１０７３８６およびＰＲＢ１０７３８６＿ａｔ．を用いＦｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，によって設計されたマイクロアレイチップを問い合わせることによって比較した。これらのプローブを用いて、過剰増殖性の血液学的異常を有する患者の組織におけるＭＧＤ−ＣＳＦの発現を確認した。この分析によって、異なる組織タイプと異なる組織段階との間の異なる遺伝子発現パターンを同定した。表８、第３列は、ＭＧＣ３４６４７の存在について陽性（ＭＧＣ３４６４７陽性）と試験された疾患標本の数を挙げる。表８の第４列は、検査された標本の数（Ｔｏｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ）を挙げる。ＭＧＤ−ＣＳＦは、ほとんどの骨髄異形成症候群の患者で発現された。ＭＧＤ−ＣＳＦを発現する患者の割合は、観察された病理で変化し、そして過剰な芽細胞または環状の鉄芽細胞を有する難治性貧血を有する患者で最高であった。急性Ｂ細胞リンパ球芽性白血病を有する患者の半分がＭＧＤ−ＣＳＦを発現した。急性骨髄性白血病を有する患者のあるサブセットがＭＧＤ−ＣＳＦを発現した。この割合は、疾患の病理学的な症状次第で１４〜２５％の間で変化した。ＭＧＤ−ＣＳＦは一般に、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、または急性前骨髄球性白血病を有する患者では発現されなかった。
【０４０１】
（配列表）
本出願は、配列表送付シートおよび紙の形式の配列表を添付する。
【０４０２】
【表１】
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【０４０３】
【表２】
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【０４０４】
【表３】
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【０４０５】
【表４】
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【０４０６】
【表５】
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【０４０７】
【表６】
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【０４０８】
【表７】
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【０４０９】
【表８】
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【０４１０】
【表９】
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【０４１１】
【表１０】
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【表１１】
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【０４１３】
【表１２】
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【０４１４】
【表１３】
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【０４１５】
【表１４】
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【０４１６】
【表１５】
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【０４１７】
【表１６】
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【０４１８】
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【０４２１】
【表２０】
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【０４２２】
【表２１】
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【０４２３】
【表２２】
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【化１】
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【化５】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１１９】
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【化１２１】
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【化１２３】
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【化１２４】
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【化１２７】
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【化１３０】
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【化１３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
2014034577.tif 000164
【図１０】
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【図１１】
2014034577.tif 000166
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
2014034577.tif 000172
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１４】
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【図１６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2014034577000001.pdf