(57)【要約】      （修正有）【課題】セルラーゼによりセルロースを効率的に酵素分解するためのセルロースを含むバイオマスの前処理剤および前処理方法を提供する。【解決手段】セルロースを含むバイオマスを、イオン液体に過酸化物を添加した処理剤混合液中で撹拌し、得られたセルロースを含むバイオマス、イオン液体、過酸化物を含む処理剤混合液に水を加えてセルロースを析出させて、セルロースを再生させる前処理を行うことで、その後の酵素反応におけるセルロースの加水分解（糖化）が促進され、単糖、二糖、オリゴ糖などのセルロース分解物を効率的に得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースを含むバイオマスを、イオン液体と過酸化物とを含む処理剤混合液中で撹拌する混合工程と、得られたセルロースを含むバイオマス、イオン液体、および過酸化物を含む混合液からセルロースを析出させて、セルロースを再生するセルロース再生工程とを有する、前処理方法。
【請求項２】
前記混合工程において、前記バイオマスに、イオン液体を加えた後にさらに過酸化物を加え、または、前記バイオマスに、イオン液体と過酸化物とを含む前記処理剤混合液を加える、請求項１記載の前処理方法。
【請求項３】
前記セルロース再生工程において、混合液に水を加えてセルロースを析出させる、請求項１記載の前処理方法。
【請求項４】
前記バイオマスが、セルロース単体もしくは、リグニンおよび／またはヘミセルロースをさらに含む混合物であることを特徴とする、請求項１記載の前処理方法。
【請求項５】
前記セルロース単体が、天然のセルロースであるＩ型セルロース、および／または天然のセルロースを一度溶解後、溶剤を水洗し、乾燥させて得られるII型セルロース、および／または非結晶性の非晶セルロースであることを特徴とする、請求項４記載の前処理方法。
【請求項６】
前記リグニンおよび／またはヘミセルロースをさらに含む混合物が、木材、稲わら、麦わら、もみ殻、バガス、および／または、その粉末であることを特徴とする、請求項４記載の前処理方法。
【請求項７】
前記イオン液体のカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、および／またはアンモニウムカチオンであることを特徴とする、請求項１記載の前処理方法。
【請求項８】
前記イミダゾリウムカチオンが、１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｉｏｎであることを特徴とする、請求項７記載の前処理方法。
【請求項９】
前記イオン液体のアニオン部位が、塩化物イオン、リン酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、および／またはパーフルオロアルキル基を含むイオンであることを特徴とする、請求項１記載の前処理方法。
【請求項１０】
前記パーフルオロアルキル基がｂｉｓ（ｔｒｉ−ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｉｍｉｄｅ  ｉｏｎであることを特徴とする、請求項９記載の前処理方法。
【請求項１１】
前記イオン液体が、１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅもしくは、１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｂｉｓ（ｔｒｉ−ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｉｍｉｄｅを含むことを特徴とする、請求項１記載の前処理方法。
【請求項１２】
前記過酸化物が、過酸化水素、および／または過酢酸であることを特徴とする、請求項１記載の前処理方法。
【請求項１３】
前記過酸化物の濃度が、前記イオン液体に対して、１重量％から８重量％であることを特徴とする、請求項１記載の前処理方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の前処理方法を経て、再生したセルロースをセルラーゼにより酵素分解するセルロース分解工程を含む、単糖、二糖、および／またはオリゴ糖の製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１３いずれかに記載の前処理方法において、セルロースを含むバイオマスを前処理するために用いる、イオン液体と過酸化物とを含む前処理剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼによりセルロースを効率的に酵素分解するためのセルロース前処理剤および前処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオエタノールは、カーボンニュートラル、石油代替（燃料・基礎化学品）の観点から、地球温暖化対策として期待されている。バイオエタノール生産の現行プロセスは、原料に可食部バイオマス（トウモロコシやさとうきび等）を用いているため、食糧と競合し、バイオエタノール生産に限界がある。一方、非可食部バイオマス（バガスや木粉等）を原料にできれば、耕作面積あたりのバイオエタノール生産量を増やすことができることから、当該バイオマスを原料としたバイオエタノール製造プロセスの開発が望まれている。新しいプロセスを達成するために解決すべき課題の一つとしては、木質系または草本系のバイオマスの主成分であるセルロース、中でも結晶性セルロースの効率的な分解方法の開発が挙げられる。
【０００３】
酵素糖化は、温和な反応条件と高い反応選択性の観点から、セルロース系バイオマスの望ましい糖化法の一つとして考えられているが、結晶性セルロースを基質とするセル    ラーゼによる酵素反応は非常に遅く、糖化プロセスの効率化が実用化に向けた大きな課題となっている。糖化プロセスの効率化のための一つの手段として、セルロースの強固で密な結晶構造を緩和して、セルラーゼが作用しやすい構造にすることが有効である。
【０００４】
近年、イオン液体がセルロースを可溶化することが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。イオン液体の強い水素結合能により、セルロース内外の水素結合を緩和もしくは切断するため、イオン液体へ溶解した後に再生したセルロースにはセルラーゼが作用しやすいと考えられている。より穏和な条件で、セルロースを結晶緩和させるためにイオン液体の構造を変換する試みもなされている（特許文献２、３）。しかしながら、イオン液体単独で前処理し再生したセルロースでは十分な酵素反応速度が得られないため、実用化するには克服しなければならない課題が多い。
【０００５】
また、各種化合物を添加したイオン液体中でセルロースの酵素分解が促進されるとする開示が幾つかあるが（特許文献４、５、６、７）、これらの方法はイオン液体と添加剤の混合液中でセルロースを直接分解（糖化）する方法であり、酵素反応前に行うセルロースの前処理方法とは全く異なるものである。また、それらの手法すなわち、イオン液体と添加剤の混合液中で直接セルロースを分解することによるグルコースの収率は、最も良い条件でも６０％程度であるが、イオン液体でセルロースを前処理した後に、酵素反応を行う方法では仕込みのセルロースのほぼ全量がグルコースへと転化することから、イオン液体と添加剤の混合液中で直接セルロースを分解することによるグルコースの収率は悪いと言わざるを得ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５０６４０１号
【特許文献２】特開２００６−１３７６７７号
【特許文献３】特開２０１０−１３２５５８号
【特許文献４】特開２００９−２０１３９４号
【特許文献５】特表２００９−５２９０７５号
【特許文献６】特表２００９−５３１０２４号
【特許文献７】特開２０１０−０８３８５０号
【特許文献８】特開２００９−２０３４５４号
【特許文献９】特開２０１０−２２０４９０号
【特許文献１０】特開２０１１−１４９１２４号
【特許文献１１】特開２０１２−００５３５９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒ．Ｄ．Ｒｏｇｅｒｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，１２４（１８），  ４９７４−４９７５，２００２．
【非特許文献２】Ｒ Ｄ. Ｒｏｇｅｒｓら、ＧｒｅｅｎＣｈｅｍ.,  ５, ４４３−４４７,   ２００３.
【非特許文献３】Ｃ Ａ. Ｓｃｈａｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｂｉｏｅｎｇ., ９５（５）, ９０４−９１０, ２００６.
【非特許文献４】Ｙａｓｕｎｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（１１），１９４４−１９４６，１９９７．
【０００８】
一方、各種化合物を添加したイオン液体でセルロースを前処理し、その後再生したセルロースを用いて酵素反応を行っている例はこれまでに開示も報告もなされていない。したがって、各種化合物を添加したイオン液体でセルロースを前処理した際、その再生したセルロースの酵素分解（糖化）反応が高効率で行われるのであれば、その手法は実用化の面からも有効な手法であり、前処理剤ならびにその前処理方法も極めて有用であると言える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、セルラーゼによりセルロースを効率的に分解するためのセルロース前処理剤および前処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、イオン液体に過酸化物を添加した前処理剤を用いてセルロースを前処理することで、その後の酵素反応におけるセルロースの加水分解（糖化）が促進され、より効率的にセルロース分解物が得られることを見出し、本発明をなすに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである
【００１１】
＜１＞  セルロースを含むバイオマスを、イオン液体と過酸化物とを含む処理剤混合液中で撹拌する混合工程と、得られたセルロースを含むバイオマス、イオン液体、および過酸化物を含む混合液からセルロースを析出させて、セルロースを再生するセルロース再生工程とを有する、前処理方法である。
＜２＞  前記混合工程において、前記バイオマスに、イオン液体を加えた後にさらに過酸化物を加え、または、前記バイオマスに、イオン液体と過酸化物とを含む処理剤混合液を加える、上記＜１＞に記載の前処理方法である。
＜３＞  前記セルロース再生工程において、混合液に水を加えてセルロースを析出させる、上記＜１＞に記載の前処理方法である。
＜４＞  前記バイオマスが、セルロース単体もしくは、リグニンおよび／またはヘミセルロースをさらに含む混合物であることを特徴とする、上記＜１＞に記載の前処理方法である。
＜５＞  前記セルロース単体が、天然のセルロースであるＩ型セルロース、および／または天然のセルロースを一度溶解後、溶剤を水洗し、乾燥させて得られる結晶性のII型セルロース、および／または非結晶性の非晶セルロースであることを特徴とする、上記＜４＞に記載の前処理方法である。
＜６＞  前記リグニンおよび／またはヘミセルロースをさらに含む混合物が、木材、稲わら、麦わら、もみ殻、バガス、および／または、その粉末等であることを特徴とする、上記＜４＞に記載の前処理方法である。
＜７＞  前記イオン液体のカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、および／またはアンモニウムカチオンであることを特徴とする、上記＜１＞に記載の前処理方法である。
＜８＞  前記イミダゾリウムカチオンが、１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｉｏｎ（１−エチル−３−メチルイミダゾリウムイオン）であることを特徴とする、上記＜７＞に記載の前処理方法である。
＜９＞  前記イオン液体のアニオン部位が、塩化物イオン、リン酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、および／またはパーフルオロアルキル基を含むイオンであることを特徴とする、上記＜１＞に記載の前処理方法である。
＜１０＞  前記パーフルオロアルキル基がｂｉｓ（ｔｒｉ−ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｉｍｉｄｅ  ｉｏｎ（ビス（トリフルオロメチル−スルフォニル）イミドイオン）であることを特徴とする、上記＜９＞に記載の前処理方法である。
＜１１＞  前記イオン液体が、１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート）もしくは、１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｂｉｓ（ｔｒｉ−ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｉｍｉｄｅ（１−エチル−３−メチルイミダゾリウム  ビス（トリフルオロメチル−スルフォニル）イミド）を含むことを特徴とする、上記＜１＞に記載の前処理方法である。
＜１２＞  前記過酸化物が、過酸化水素、および／または過酢酸であることを特徴とする、上記＜１＞に記載の前処理方法である。
＜１３＞  前記過酸化物の濃度が、前記イオン液体に対して、１重量％から８重量％であることを特徴とする、上記＜１＞に記載の前処理方法である。
【００１２】
また、本発明は、
＜１４＞  上記＜１＞に記載の前処理方法を経て、再生したセルロースをセルラーゼにより酵素分解するセルロース分解工程を含む、単糖、二糖、および／またはオリゴ糖の製造方法である。
【００１３】
また、本発明は、
＜１５＞  上記＜１＞〜＜１３＞に記載の前処理方法において、セルロースを含むバイオマスを前処理するために用いる、イオン液体と過酸化物とを含む前処理剤である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜セルロース材料＞
本明細書において、セルロースとは、グルコースがβ−１，４−グリコシド結合により重合した重合体をいう。本発明に使用するセルロースの由来は、特に限定されないが、植物由来セルロース、動物由来セルロース、バクテリア由来セルロース、再生セルロース等を用いることができる。本発明に使用するセルロースの形態は、特に限定されないが、糸状、布状、紙状、フィルム状、綿状、粉状、粒状、棒状等、種々の形態のセルロースを用いることができる。セルロースの結晶形は、特に限定されないが、Ｉ型、II型、III型、IV型、非晶のいずれか一つの構造またはそれらの組み合わせからなる構造を有するセルロースを用いることができる。セルロースの分子量（重合度）は、特に限定されないが、後述するイオン液体にセルロースを添加していくと、その溶解液の粘性が増加するため、イオン液体中のセルロース濃度は、セルロース材料の分子量（重合度）により、調節することが好ましい。例えば、イオン液体中のセルロース濃度が１０重量％のセルロース溶解液を得るには、重合度は２００以下のセルロース材料を用いることが好ましく、セルロース濃度が０．５重量％のセルロース溶液を得るには、重合度６５００以下のセルロース材料を用いることが好ましい。
【００１５】
＜バイオマス＞
本発明の前処理方法等においては、セルロースを含むバイオマスを用いる。具体的には、セルロースの抽出が可能である限り特に限定はされないが、バイオマスは、例えば、セルロース単体、もしくは、リグニンおよび／またはヘミセルロースをさらに含む混合物である。セルロース単体としては、例えば、天然のセルロースである上述のＩ型セルロース、天然のセルロースを一度溶解後、溶剤を水洗し、乾燥させて得られるII型セルロース、および非結晶性の非晶セルロースが挙げられ、バイオマスは、これらを複数、含んでいても良い。また、セルロースに加えてヘミセルロースとリグニンを含有する木質系または草本系のバイオマス、例えば、木材、稲わら、麦わら、もみ殻、バガス、および／または、それらの粉末等も使用できる。本発明においては、これらのバイオマスを単独で、あるいは２種類以上組み合わせて、用いることができる。
【００１６】
＜前処理方法＞
本発明の前処理方法は、セルロースを含むバイオマスを、イオン液体と過酸化物とを含む処理剤混合液中で撹拌する混合工程と、得られたセルロースを含むバイオマス、イオン液体、および過酸化物を含む混合液からセルロースを析出させて、セルロースを再生するセルロース再生工程とを有する。以下、これらの工程において使用される成分、および各工程について、説明する。
【００１７】
＜イオン液体＞
本発明に使用するイオン液体は、特に限定されないが、親水性イオン液体、疎水性イオン液体を用いることができる。
【００１８】
＜イオン液体のカチオン部位＞
本発明に使用する親水性イオン液体および疎水性イオン液体を構成するカチオン部位は、特に限定されないが、例えば、好ましいカチオン部位は、ヘテロ環オニウムカチオンおよびアンモニウムカチオンである。中でも好ましいカチオン部位は、イミダゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオンである。最も好ましいカチオン部位は、イミダゾリウムカチオンである。
【００１９】
イミダゾリウムカチオンとしては、例えば、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−プロピル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−ペンチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−ヘプチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−ノネチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−デカチル−３−メチルイミダゾリウムイオン等のジアルキルイミダゾリウムカチオン、１−（１，２または３−ヒドロキシプロピル）−３−メチルイミダゾリウムイオン、１，２，３−トリメチルイミダゾリウムイオン、１，２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウムイオン、１−ブチル−２，３−ジメチルイミダゾリウムイオン等のトリアルキルイミダゾリウムカチオンが挙げられる。
【００２０】
ピリジニウムカチオンとしては、例えば、Ｎ−プロピルピリジニウムイオン、Ｎ−ブチルピリジニウムイオン、１−ブチル−４−メチルピリジニウムイオン、１−ブチル−２，４−ジメチルピリジニウムイオン等が挙げられる。
【００２１】
また、アンモニウムカチオンとしては、例えば、トリメチルプロピルアンモニウムイオン、トリメチルヘキシリルアンモニウムイオン、テトラペンチルアンモニウムイオン、ジエチルトリメチル（２−メトキシエチル）アンモニウムイオン等の脂肪族４級アンモニウムイオン、Ｎ−ブチル−Ｎ−メチルピロリジニウムイオン等の脂環式４級アンモニウムイオン等が挙げられる。
【００２２】
＜イオン液体のアニオン部位＞
本発明に使用する親水性イオン液体および疎水性イオン液体を構成するアニオン部位は、特に限定されないが、例えば、親水性イオン液体を構成する好ましいアニオン部位は、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンといったハロゲンアニオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオンといったカルボン酸アニオン、硫酸イオン、およびリン酸イオンである。中でも好ましいアニオンは、塩化物イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、リン酸イオンであり、最も好ましいアニオン部位は、酢酸イオンである。疎水性イオン液体を構成するアニオン部位はフッ化アルキル基含有アニオンが好ましく、中でもパーフルオロアルキル基を含むアニオン部位が好ましい。
【００２３】
＜アニオンとカチオンの組み合わせについて＞
イオン液体は、カチオンとアニオンの組み合わせであり、上述したカチオン部位やアニオン部位を含む従来公知のカチオンおよびアニオンを適宜組み合わせて用いることができる。イオン液体は、商業的に入手できるものの他に、公知の方法で合成したものも用いることができる。合成方法は特に限定されず、カチオンをいったん塩とし、その後、得ようとするイオン液体のアニオンと反応させる、もしくはいったん水酸化物とした上で、アニオンを含む酸で中和してもよい。
【００２４】
＜イオン液体の使用について＞
本発明に使用する上記イオン液体は、単独でも２種類以上組み合わせて用いてもよい。また本発明に使用するイオン液体の融点は、１００℃以下であることが好ましく、８０℃以下が好ましい。さらに好ましくは４０℃以下であり、最も好ましくは２０℃以下である。これは、より低い温度下でセルロース前処理を行うことができ、前処理工程で使用するエネルギーを低減し、かつ加熱による糖の過分解を防ぐことができるためである。
【００２５】
＜セルロース濃度＞
本発明に使用するセルロースの濃度は、特に限定されないが、イオン液体にセルロースを添加していくと現実的にはイオン液体の粘性が増加するため、イオン液体中のセル      ロース濃度はセルロース材料の分子量（重合度）により調節することが好ましい。例えばセルロース材料としてセオラスＰＨ−１０２（重合度ＤＰ＝２００）を用い、イオン液体として１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート）を用いた場合には、９０℃に加熱したイオン液体に対してセルロース濃度を１０重量％以下にすることが好ましく、イオン液体の粘性の増加により撹拌等の操作が困難となる場合にはさらに希釈することが好ましい。
【００２６】
＜過酸化物＞
本発明に使用する過酸化物は、特に限定されないが、過酸化水素、過酢酸、有機過酸化物、モノ過硫酸、過酸化塩素等が挙げられる。中でも好ましい過酸化物は過酸化水素、過酢酸であり、特に好ましい過酸化物は過酢酸である。また、本発明において、過酸化物は単独でも２種類以上組み合わせて用いてもよい。さらに、過酸化物以外にも、二酸化塩素等が使用できる。
【００２７】
＜過酸化物添加濃度＞
セルロースを溶解したイオン液体中の過酸化物添加濃度は、イオン液体に対して１重量％から８重量％であることが好ましい。より好ましくは１重量％から５重量％であり、最も好ましくは２重量％から５重量％である。イオン液体に対して過酸化物添加濃度が１重量％以下では、過酸化物添加による酵素反応の促進効果がみられない。また、８重量％以上ではイオン液体への水の混入量が増加することや、過酸化物によるイオン液体の分解の影響があり、過酸化物添加による酵素反応の促進効果が逆に低下する可能性がある。
【００２８】
＜前処理剤＞
本発明の前処理剤は、少なくとも、上述のイオン液体および過酸化物を含む（処理剤混合液）。このような前処理剤を用いてセルロース含有バイオマスに前処理を施すことにより、その後の再生工程で得られる再生セルロースの加水分解（糖化）を促進することができる。
【００２９】
＜混合工程＞
混合工程においては、上述のイオン液体と過酸化物とを含む混合液に、セルロースを含むバイオマスを加え、撹拌する。このとき、セルロースを含むバイオマスにイオン液体のみを加えて撹拌した後に過酸化物を加えること、あるいは、イオン液体と過酸化物とを混合、撹拌して処理剤混合液を形成した後に、バイオマスを加えることが好ましい。特に、バイオマスにイオン液体のみを加えて撹拌した後、さらに過酸化物を加え、撹拌することが好ましい。これは、水分を含む過酸化物、例えば過酸化水素などを単独でバイオマスに加えると、系内の水分によりセルロースの溶解性が低下してしまう可能性があるのに対し、上述の方法によれば、セルロースの溶解性を良好に保つことができるためである。ただし、セルロースの溶解性の問題が生じない限り、バイオマスと過酸化物とを始めに混合させ、その後、イオン液体をさらに加えても良い。
【００３０】
＜セルロース再生工程＞
セルロース再生工程においては、イオン液体−過酸化物−セルロース溶解液（混合液）からセルロースを析出、再生させる。このセルロース再生工程では、混合液にセルロースの貧溶媒、例えば、水、プロトン性極性溶媒であるメタノール、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、非プロトン性溶媒であるジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、非極性溶媒であるジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン等を加える。好ましくは、混合液に貧溶媒として水を加える。このようにセルロースを再生する際に使用する水等の温度は、溶解液温度と同程度に加熱されていることが好ましい。セルロース再生時に投入する水の温度と溶解液温度の間の温度差が２０℃以下、より好ましくは１０℃以下であれば、溶解液と水の混合時にゲルが形成されにくい。一方、温度差が３０℃以上であれば再生時にセルロースゲルを形成してしまい、その後の酵素反応において酵素が作用しにくくなり反応速度が遅くなる可能性がある。
【００３１】
＜イオン液体および過酸化物除去工程＞
イオン液体で可溶化したセルロースをセルラーゼで糖化する試みもなされているが、イオン液体中ではセルラーゼが不活性化されるという報告がなされている（非特許文献２）。また、イオン液体でセルロースを可溶化する前処理を施した後、可溶化後のセルロースを水等の親水性溶媒で洗浄してイオン液体を取り除き、その後、水に投入することによりセルラーゼで分解できることが報告されている（非特許文献３）。そのため、酵素反応前のセルロース材料から、イオン液体を少なくとも１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、より好ましくは１重量％未満まで除去することが好ましい。
【００３２】
また、過酸化物は酸であるため、酵素反応液のｐＨを酸性側にシフトさせて酵素反応の最適ｐＨから大きく離れてしまい酵素活性を低下させる。そのため、酵素反応前のセルロース材料のｐＨが少なくとも４以上、好ましくはｐＨが５以上であって、ｐＨ８以下、好ましくは６以下となるまで過酸化物を除去することが望まれる。さらに、酵素反応前のセルロース材料は、完全に脱水された状態ではなく、ウエットな状態、例えば、セルロース材料中の液体の濃度が１０重量％以下、より好ましくは３重量％以下であることが望まれる。イオン液体−過酸化物−セルロース溶解液に、水を加えて得られたスラリーから、固体成分（セルロースおよび水に不溶な生成物）と液体成分（イオン液体、水、過酸化物）を分離する方法としては、一般的な固液分離方法である遠心沈降や濾過（重力濾過、真空濾過、加圧濾過、遠心濾過、圧搾濾過）、透析が挙げられる。その他、イオン交換樹脂を用いて分離することもできる（特許文献４）。前記した固液分離方法は組み合わせて用いることもでき、例えば紙の製造で通常に使用している脱水方法が挙げられるが、長網、円網、傾斜ワイヤーなどで液体成分を除いた後、ロールプレスで分離することもできる（特許文献１０）。
【００３３】
＜糖の製造方法およびセルロース分解工程＞
本発明は、単糖、二糖、および／またはオリゴ糖の製造方法を含む。この本発明における糖の製造方法は、上述の前処理方法を経て、再生させたセルロースを、セルラーゼにより酵素分解させるセルロース分解工程を含む。この方法によれば、前処理の各工程により再生セルロースの加水分解（糖化）が促進されるため、従来法よりも効率的に、セルロース分解物を製造することが可能である。
【００３４】
＜セルラーゼ＞
セルラーゼは、セルロースをグルコースにまで加水分解するのに作用する各種の酵素の総称である。本発明に使用されるセルラーゼは、特に限定されないが、β−１，４−エンドグルカナーゼ、グルカン１，４−β−グルコシダーゼ、セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ、β−グルコシダーゼが挙げられる。また、セルラーゼは天然由来であっても人工的に改変されたものであってもよい。天然由来のものとしては、特に限定されないが、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のセルラーゼなどを用いることが好ましい。本発明においては、上記したセルラーゼを１種類または２種類以上を組み合わせて用いることもできる。また、由来の異なるセルラーゼを組み合わせて用いることもできる。
【００３５】
＜緩衝液＞
酵素反応に用いる緩衝液は、特に限定されないが、用いるセルラーゼの至適ｐＨを含む酵素活性に適したｐＨ域と一致する範囲に緩衝能を有するものを用いることが好ましい。一般的なセルラーゼの好適ｐＨは４から６程度であるため、例えばクエン酸緩衝液（クエン酸およびクエン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸および酢酸ナトリウム）、クエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸およびリン酸二水素ナトリウム）等を用い、緩衝液の濃度やｐＨを適宜調整して、セルラーゼ作用環境のｐＨを４以上８以下、好ましくはｐＨ５以上６以下となるように設定することが好ましい。
【００３６】
＜酵素反応時の温度＞
酵素反応時の温度は、特に限定されないが、用いるセルラーゼの至適温度に合わせて選択することが好ましい。一般的なセルラーゼの好適な温度は３５℃から６０℃程度である。
【００３７】
＜セルロース分解生成物の定量方法＞
セルロースの分解生成物量は、セルロースの分解によって生じる還元糖の量や、セルロース分解生成物量そのものを測定することにより評価することができる。還元糖の定量法として、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法やＰａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法が広く一般的に知られており、これらの方法を用いてセルロースから分解生成した還元糖を定量することでセルロースの分解率（糖化率）を評価することができる。また、セルロース分解生成物量そのものを測定する方法としては、水溶性糖をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で定量する方法（特許文献１１）や、糖を誘導体化した後にＨＰＬＣにて定量する方法（非特許文献４）があり、これらの方法を用いてもセルロースの分解率（糖化率）を評価することができる。一方で、血液中や尿中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）法により定量する方法が一般的に知られている。この方法を用いて血液中や尿中のグルコース濃度を測定するグルコース測定キット（例えば、和光純薬（株）社製グルコースＣII−テストワコー）が市販されている。この測定キットを用いる方法は、簡易的ではあるが、セルロースの分解によって生じるグルコース量を定量できる。このため、この方法を用いることでもセルロースの分解率（糖化率）を評価することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
リグニンを含まないセルロースであるセオラスＰＨ−１０２（旭化成ケミカルズ（株）社製）２０ｍｇをイオン液体１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（以下、［ＥＭＩｍ］［ＯＡｃ］と略記。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１．０ｇに加え、加熱撹拌（９０℃、６００ｒｐｍ）して溶解させてセルロース溶解液を作製した。当該セルロース溶解液に４０重量％過酢酸（以下、ＰＡＡと略記。三菱ガス化学（株）社製）１００μＬを加え、９０℃、６００ｒｐｍにて１時間加熱撹拌した。得られた反応液に、９０℃に加熱した水を加えて、セルロースを再生させた後、４０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、上澄み（水、イオン液体、水溶性糖および過酸の混合物）と沈殿物（再生セルロースとその分解物のうち水に難溶な物質）に分離した。得られた沈殿物に１０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を１０ｍＬ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ由来のセルラーゼＡ「アマノ３」（以下、アマノと略記。アマノエンザイム（株）社製）１０ｍｇを加えて、セルラーゼ濃度が１ｍｇ／ｍＬ（３０ｕｎｉｔ／ｍＬ）になるように調製した。４０℃下でインキュベートし、セルラーゼ添加直後、添加１時間後のスラリーをサンプリングし、１００℃下、２０分間ブロックヒーターにて加熱して酵素を失活させた。得られたサンプル液中の還元糖濃度をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法（以下、ソモギ法と略記）により定量し、糖化率を式（１）に従い算出した。糖化率は４０％だった。
【数１】
2014068611.tif 000002
【実施例２】
【００４０】
４０重量％ＰＡＡの代わりに、３５重量％過酸化水素（以下、ＨＰと略記。三菱ガス化学（株）社製）を１００μＬ加えた以外は、実施例１と同様の操作を行った。糖化率は３６％だった。
【比較例１】
【００４１】
４０重量％ＰＡＡを加えなかった以外は、実施例１と同様の操作を行った。糖化率は１０％だった。
【００４２】
イオン液体［ＥＭＩｍ］［ＯＡｃ］に過酸化物を添加した前処理剤を用いてリグニンを含まないセルロース（セオラスＰＨ−１０２）を前処理すると（実施例１、２）、過酸化物を添加しない前処理剤で前処理した場合（比較例１）と比較して糖化率が上がることを確認した。以上の結果より、セルラーゼによりセルロースを効果的に酵素分解するためのセルロースの前処理剤として、イオン液体に過酸化物を添加した前処理剤（処理剤混合液）の有用性が示唆された。
【実施例３】
【００４３】
リグニンを含むセルロースであるベイマツ粉末５０ｍｇ（セルロース含有率５０重量％）を、イオン液体［ＥＭＩｍ］［ＯＡｃ］１．０ｇに加え、加熱撹拌（８０℃、６００ｒｐｍ）して溶解させてセルロース溶解液を作製した。当該セルロース溶解液に４０重量％ＰＡＡ１００μＬを加え、８０℃、６００ｒｐｍにて１時間加熱撹拌した。得られた反応液を室温まで冷却後、水を加えてセルロースを再生させた後、４０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、上澄みと沈殿に分離した。得られた沈殿に１０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を１０ｍＬ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＡＴＣＣ ２６９２１由来のセルラーゼＣ８５４６（以下、シグマと略記。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１０ｍｇを加えて、セルラーゼ濃度が１ｍｇ／ｍＬ（４ｕｎｉｔ／ｍＬ）になるように調製した。４０℃下でインキュベートし、セルラーゼ添加直後、添加１時間後（酵素反応時間として１時間）のスラリーをサンプリングし、１００℃下、２０分間ブロックヒーターにて加熱して酵素を失活させた。得られたサンプル液中のグルコース濃度をグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）法により定量し（グルコースＣII−テストワコー（和光純薬（株）社製）を用いた）、糖化率を式（２）に従い算出した。糖化率は１５％だった。
【数２】
2014068611.tif 000003
【実施例４】
【００４４】
イオン液体［ＥＭＩｍ］［ＯＡｃ］の代わりに、１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍｂｉｓ（ｔｒｉ−ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｉｍｉｄｅ（以下、［ＥＭＩｍ］［Ｔｆ２Ｎ］と略記。和光純薬（株）社製）を用い、酵素反応時間（糖化時間）を２４時間にしたこと以外は、実施例３と同様の操作を行った。糖化率は１２％だった。
【比較例２】
【００４５】
４０重量％ＰＡＡを加えなかった以外は、実施例３と同様の操作を行った。糖化率は７％だった。
【比較例３】
【００４６】
４０重量％ＰＡＡを加えなかったこと、酵素反応時間（糖化時間）を２４時間にしたこと以外は、実施例４と同様の操作を行った。糖化率は８％だった。
【００４７】
［ＥＭＩｍ］［ＯＡｃ］に過酸化物を添加した前処理剤を用いてリグニンを含むセルロースであるベイマツ粉末を前処理すると（実施例３）、過酸化物を添加しない前処理剤で前処理した場合（比較例２）と比較して、糖化率が上がることを確認した。また                    ［ＥＭＩｍ］［Ｔｆ２Ｎ］に過酸化物を添加した前処理剤を用いて前処理すると（実施例４）、過酸化物を添加しない前処理剤で前処理した場合（比較例３）と比較して、糖化率が上がることを確認した。以上の結果より、セルラーゼによりセルロースを効率的に酵素分解するためのセルロースの前処理剤として、種々のイオン液体に過酸化物を添加した前処理剤の有用性が示唆されたのと同時に、本前処理方法がリグニンを含むセルロースにも有効であることが示唆された。
【実施例５】
【００４８】
セルロースとして再生レーヨン２０ｍｇをイオン液体［ＥＭＩｍ］［ＯＡｃ］１．０ｇに加え、加熱撹拌（９０℃、６００ｒｐｍ）して溶解させてセルロース溶解液を作製した。当該セルロース溶解液に４０重量％ＰＡＡ２５μＬを加え、９０℃、６００ｒｐｍにて  １時間加熱撹拌した。得られた反応液に９０℃に加熱した水を加えて、セルロースを再生させた後、４０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、上澄みと沈殿に分離した。得られた沈殿に１０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を１０ｍＬ、セルラーゼ（アマノ）１０ｍｇを加えて、セルラーゼ濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように調製した。４０℃下でインキュベートし、セルラーゼ添加直後、添加２４時間後のスラリーをサンプリングし、１００℃下、２０分間ブロックヒーターにて加熱して酵素を失活させた。得られたサンプル液中の還元糖濃度をソモギ法により定量し、糖化率を式（３）に従い算出した。糖化率は５２％だった。
【数３】
2014068611.tif 000004
【実施例６】
【００４９】
４０重量％ＰＡＡの代わりに、３５重量％ＨＰ５０μＬを加えた以外は、実施例５と同様の操作を行った。糖化率は３９％だった。
【実施例７】
【００５０】
４０重量％ＰＡＡ１００μＬを加えた以外は、実施例５と同様の操作を行った。糖化率は６２％だった。
【実施例８】
【００５１】
４０重量％ＰＡＡの代わりに、３５重量％ＨＰ１５０μＬを加えた以外は、実施例５と同様の操作を行った。糖化率は４１％だった。
【実施例９】
【００５２】
４０重量％ＰＡＡ１７０μＬを加えた以外は、実施例５と同様の操作を行った。糖化率は２５％だった。
【比較例４】
【００５３】
４０重量％ＰＡＡを加えなかった以外は、実施例５と同様の操作を行った。糖化率は２０％だった。
【００５４】
再生レーヨンを用いたとき、［ＥＭＩｍ］［ＯＡｃ］に過酸化物を添加した前処理剤を用いてセルロースを前処理すると（実施例５、６、７、８、９）、過酸化物を添加しない前処理剤で前処理した場合（比較例４）と比較して、糖化率が上がることを確認した。以上の結果より、セルラーゼによりセルロースを効果的に酵素分解するためのセルロースの前処理剤として、イオン液体に過酸化物を添加した前処理剤の有用性が示唆された。