(57)【要約】      （修正有）【課題】自己集合などによる凝集を抑制し、精度よく微小物質を検出する。【解決手段】試料導入方法は、微小物質を検出する方法であって、前記微小物質を凝集抑制剤とともに捲濁する工程Ａ、前記微小物質を捲濁した溶液を微小細孔近傍に設置する工程Ｂ、前記微小物質が前記微小細孔を通過するときに発生する電気コンダクタンスの変化を検出する工程Ｃを包含する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小物質を検出する方法であって、以下の工程Ａ〜Ｃを具備する試料導入方法：
前記微小物質を凝集抑制剤とともに捲濁する工程Ａ、
前記微小物質を捲濁した溶液を微小細孔近傍に設置する工程Ｂ、
前記微小物質が前記微小細孔を通過するときに発生する電気コンダクタンスの変化を検出する工程Ｃ。
【請求項２】
前記凝集抑制剤がｔｗｅｅｎ２０であることを特徴とする請求項１に記載の試料導入方法。
【請求項３】
前記捲濁液でのｔｗｅｅｎ２０の最終濃度が１ｖｏｌ％となることを特徴とする請求項２に記載の試料導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チリ、ホコリや細菌、ウイルスなどの微小物質を高感度に検出する装置への試料導入方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サブミクロンサイズの微小物質を高感度に検出する方法として小さな間隙を持つ細孔に物質を通過させることによって、電気コンダクタンスの変化で検出する方法（非特許文献１）が考案されている。前記微小物質を前記細孔へ導入するには、電気泳動法や、ブラウン運動による偶然的に導入する方法などが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｌｅｔｔｅｒｓ  （２００９），  ９５：  １２３７０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前記従来の構成では、検出したい微小物質のタイプや捲濁する溶液などの影響によっては自己集合して凝集してしまうものがあり、対象となる試料を１つ１つ区別して計測できないという課題を有していた。また、前記凝集した微小物質が前記細孔の大きさよりも大きい場合には、前記従来技術のように電気泳動法などで試料を導入すると前記細孔が詰まってしまい検出不能となる、という課題を有していた。
【０００５】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、自己集合などによる凝集を抑制し、精度よく前記微小物質を検出可能とする試料導入方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、微小物質を検出する方法であって、以下の工程Ａ〜Ｃを具備する試料導入方法：前記微小物質を凝集抑制剤ともに捲濁する工程Ａ、前記微小物質を捲濁した溶液を微小細孔近傍に設置する工程Ｂ、前記微小物質が前記細孔を通過するときに発生する電気コンダクタンスの変化を検出する工程Ｃに関する。
【０００７】
前記凝集抑制剤は、ｔｗｅｅｎ２０であることが好ましい。
【０００８】
前記捲濁した溶液に含まれる凝集抑制剤の最終濃度は、１ｖｏｌ％であることが好ましい。
【０００９】
本構成によって、検出対象となる微小物質の凝集を抑制し、精度よく検出することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の試料導入方法によれば、検出すべき微小物質を個別に検出するだけでなく、細孔を用いた検出方法の短所であった細孔部分での詰まりを解消することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）は、本発明の実施の形態１における微小物質捲濁液（実施例１）と従来の微小物質捲濁（従来例）との液吸光度分布を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ、実施例１および従来例において微小細孔で測定された電気コンダクタンスの変化を示す図。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、実施例２、比較例１および比較例２の金ナノ粒子の捲濁溶液の粒度分布を測定した結果を示す図。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、実施例３、比較例３および比較例４の金ナノ粒子の捲濁溶液の粒度分布を測定した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（実施の形態１）
以下本発明の実施の形態１について説明する。
【００１３】
＜工程Ａ：捲濁工程＞
実施形態１において、工程Ａでは検出対象となる微小物質が混入した溶液に凝集抑制剤を混入させ、捲濁した溶液を作製する。
【００１４】
対象となる微小物質は、チリやホコリなどのハウスダストや、金ナノ粒子、金属ナノパーティクルなどの無機材料でもよい。また、細菌やウイルス、タンパク質やポリヌクレオチドなどの生物材料でもよい。
【００１５】
捲濁する溶液は、工程Ｃで電気コンダクタンスを測定することから塩化カリウム溶液や塩化ナトリウム溶液などの電解液であることが望ましい。また、電解液の濃度は、測定する細孔の電気コンダクタンスと測定装置の電流検出感度の関係から、好適なものを選択することが望ましい。
【００１６】
凝集抑制剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子化合物を用いてもよいし、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７などの界面活性剤を用いてもよい。
【００１７】
凝集抑制剤を混入させて捲濁する方法としては、ピペッティングなどを用いて溶液を攪拌する方法でもよいし、スターラーなどの攪拌装置を用いる方法でもよい。
【００１８】
＜工程Ｂ：準備工程＞
工程Ｂでは工程Ａで作製された微小物質の捲濁溶液を、微小物質を検出する微小細孔デバイスの近傍に設置する。
【００１９】
微小細孔デバイスとしては、検出対象となる微小物質よりも大きい細孔を有することが望ましく、同程度の大きさをもつ細孔を有することがより好ましい。また、微小細孔デバイスの材料としては、無機材料でも有機材料でもよいか、電気的に絶縁であることが望ましい。あるいは、絶縁物質ではない材料であっても、テフロン（登録商標）などの絶縁物質を表面にコートすることによって絶縁状態になっているデバイスであってもよい。
【００２０】
捲濁溶液をデバイス近傍に設置する方法は、ピペット等で捲濁溶液を少量分注する道具を用いて、微小細孔デバイス近傍に配置する方法がある。また、微小細孔デバイス上に流路などを作製し、流路に注入することによって、捲濁溶液を微小細孔近傍に設置する方法でもよい。
【００２１】
＜工程Ｃ：検出工程＞
工程Ｃでは、工程Ａおよび工程Ｂで準備された捲濁溶液に含まれる微小物質が微小細孔を通過する際に変化する電気コンダクタンス信号を検出する。
【００２２】
微小細孔部の電気コンダクタンスは、微小細孔を持つデバイスと同一平面上にある一対の電極間で測定される微小細孔を横断する方向のコンダクタンスでもよいし、微小細孔デバイスの上部および下部に設置された電極間で測定される微小細孔を通過する方向のコンダクタンスでもよい。
【００２３】
微小物質を微小細孔に通過させる方法としては、ブラウン運動などの自由運動によって通過させる方法でもよいし、電気泳動の原理を用いて、細孔を通過する方向に電界をかけ、強制的に通過させる方法を用いてもよい。
【００２４】
（実施の形態２）
以下本発明の実施の形態２について説明する。実施形態２については、実施形態１と同じ構成となる場合、その詳細な説明を省略する。
【００２５】
＜工程Ａ：捲濁工程＞
実施形態２において、工程Ａでは検出対象となる微小物質が混入した溶液に凝集抑制剤を混入させ、捲濁した溶液を作製する。
【００２６】
実施形態２と実施形態１とのもっとも大きな相違点は、凝集抑制剤としてｔｗｅｅｎ２０を用いる点である。
【００２７】
＜工程Ｂ：準備工程＞
工程Ｂでは工程Ａで作製された微小物質の捲濁溶液を、微小物質を検出する微小細孔デバイスの近傍に設置する。
【００２８】
＜工程Ｃ：  検出工程＞
工程Ｃでは、工程Ａおよび工程Ｂで準備された捲濁溶液に含まれる微小物質が微小細孔を通過する際に変化する電気コンダクタンス信号を検出する。
【００２９】
（実施の形態３）
以下本発明の実施の形態３について説明する。実施形態３については、実施形態１または実施形態２と同じ構成となる場合、その詳細な説明を省略する。
【００３０】
＜工程Ａ：捲濁工程＞
実施形態３において、工程Ａでは検出対象となる微小物質が混入した溶液に凝集抑制剤を混入させ、捲濁した溶液を作製する。
【００３１】
実施形態３と実施形態２とのもっとも大きな相違点は、凝集抑制剤として用いるｔｗｅｅｎ２０の最終濃度が１ｖｏｌ％となるように混入することである。
【００３２】
＜工程Ｂ：準備工程＞
工程Ｂでは工程Ａで作製された微小物質の捲濁溶液を、微小物質を検出する微小細孔デバイスの近傍に設置する。
【００３３】
＜工程Ｃ：  検出工程＞
工程Ｃでは、工程Ａおよび工程Ｂで準備された捲濁溶液に含まれる微小物質が微小細孔を通過する際に変化する電気コンダクタンス信号を検出する。
【００３４】
［実施例］
次に実施例をあげて前記実施の形態をさらに詳しく説明する。
【００３５】
（実施例１）
微小物質として直径２０ｎｍの金ナノ粒子を対象に実験を行った。
【００３６】
＜工程Ａ＞
微小物質である金ナノ粒子を１００ｍＭの塩化カリウム溶液に捲濁し、そこに凝集抑制剤としてｔｗｅｅｎ２０を最終濃度が０．００２５ｖｏｌ％となるように混入した溶液を作製した。また、従来例として比較を行うために、凝集抑制剤を混入しない溶液も作成した。
【００３７】
図１（ａ）は凝集抑制剤を混入した溶液（実施例１）と混入していない溶液（従来例）の吸光度を測定したグラフである。吸光度はＶ６７０（ＪＡＳＣＯ社製）を用いて測定を行った。凝集抑制剤を混入することによって、従来例で見られていたような幅の広い吸光のピークが、実施例１では５００ｎｍ近傍にピークを持つより幅の狭い吸光ピークに変化している。このことから、凝集等により発生していた様々なサイズのコロイドが分解されて、均一の大きさの粒子が捲濁していることがわかる。
【００３８】
＜工程Ｂ＞
ナノサイズの細孔（約４０ｎｍ）を持つナノポアデバイスを用意し、ナノポア近傍に溶液が注入されるように流路を取り付けた。その流路を用いて、工程Ａで作製した溶液（実施例１あるいは従来例）を注入し、ナノポア近傍に金ナノ粒子の捲濁溶液を設置した。
【００３９】
＜工程Ｃ＞
工程Ｂで金ナノ粒子を捲濁した溶液をナノポア近傍に設置し、金ナノ粒子がナノポアを通過する際に得られる電気コンダクタンスの変化を測定した。ナノポアデバイスの上部と下部に銀塩化銀電極を設置し、その１対の電極の間に一定電圧（２５ｍＶ）を印加して、ナノポアを通過する電流を測定した。
【００４０】
図１（ｂ）は凝集抑制剤を混入しない従来例での電流波形を表示したもので、電流値がマイナス側に振れれば電流が多く流れ、プラス側に振れれば電流が少なく流れることを示している。ここでは、金ナノ粒子１つがナノポアを通過することによって見られる一過性の電流変化が見られず、徐々にプラス側にシフトしていることがわかる。つまり、ナノポア部分の抵抗値が大きくなり、電流が流れにくくなっていることをしめす。図１（ａ）で計測したとおり、捲濁液中で金ナノ粒子が凝集することにより、ナノポア部分で目詰まりを起こし、抵抗値が高くなっていると予想される。
【００４１】
図１（ｃ）は凝集抑制剤であるｔｗｅｅｎ２０を混入させた実施例１での電流波形を表示したものである。金ナノ粒子がナノポアを通過している状態を示す一過性の電流変化が見られた。
【００４２】
以上より、実施例１の方法によれば、測定対象である金ナノ粒子の凝集を抑制し、高感度に金ナノ粒子を個別に検出することが可能となる。
【００４３】
（実施例２）
凝集抑制剤について、実施例１で用いたｔｗｅｅｎ２０以外のものについても検討を行った。微小物質は直径２０ｎｍの金ナノ粒子を用い、それを１０ｍＭ塩化カリウム溶液に捲濁する。
【００４４】
凝集抑制剤は、比較例１として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を最終濃度が１ｖｏｌ％となるように混入した。また、比較例２として、Ｐｌｕｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を最終濃度が１ｖｏｌ％となるように混入した。また、実施例２として、ｔｗｅｅｎ２０を最終濃度が１ｖｏｌ％となるように混入した。
【００４５】
図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、上記実施例２、比較例１、比較例２で作製した金ナノ粒子の捲濁溶液の粒度分布を測定した結果である。溶液の粒度分布はＥＬＳＺ−１０００ＺＳ（大塚電子社製）を用いて測定した。実施例２の捲濁液の粒度分布はおおよそ２０ｎｍのところにピークが見られ、それ以外のピークは見当たらなかった。それに対し、比較例１の捲濁液の粒度分布は約３０ｎｍのところにピークが見られ、実施例２よりも凝集していると認められる。比較例２の捲濁液の粒度分布も約３０ｎｍのところにピークが見られ、かつ、１００００ｎｍ付近にもピークがあることから、こちらも実施例２よりも金ナノ粒子が凝集していると認められた。
【００４６】
以上より、実施例２の方法によれば、電解液中であっても金ナノ粒子をより分散させた状態に保つことが可能である。よって、この実施例２の捲濁溶液を用いれば、ナノポアを用いた測定が高精度に実施することが可能となる。
【００４７】
（実施例３）
凝集抑制剤ｔｗｅｅｎ２０の最終濃度について検討を行った。微小物質は直径２０ｎｍの金ナノ粒子を用い、それを１００ｍＭ塩化カリウム溶液に捲濁する。
【００４８】
凝集抑制剤の最終濃度は、比較例３として、ｔｗｅｅｎ２０を最終濃度が０．５ｖｏｌ％となるように混入した。また、比較例４として、ｔｗｅｅｎ２０を最終濃度が２ｖｏｌ％となるように混入した。また、実施例３として、ｔｗｅｅｎ２０を最終濃度が１ｖｏｌ％となるように混入した。
【００４９】
図３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、上記実施例３、比較例３、比較例４で作製した金ナノ粒子の捲濁溶液の粒度分布を測定した結果である。溶液の粒度分布はＥＬＳＺ−１０００ＺＳ（大塚電子社製）を用いて測定した。実施例３の捲濁液の粒度分布はおおよそ２０ｎｍのところにピークが見られ、ピークでの占有率はおおよそ２０％以上であった。それに対し、比較例３の捲濁液の粒度分布は約２０ｎｍのところにピークがあるものの、ピークでの占有率は１５％以下であった。また、比較例４の捲濁液の粒度分布も約２０ｎｍのところにピークが見られるものの、ピークでの占有率は１５％以下であった。さらに、比較例４の場合は、局所ピークが金ナノ粒子の大きさである２０ｎｍ付近だけでなく、１０ｎｍ以下にも見られたことから凝集抑制剤ｔｗｅｅｎ２０自身が凝集して１０ｎｍ近い大きさのコロイドを形成していると考えられる。
【００５０】
以上より、実施例３の方法によれば、電解液中であっても金ナノ粒子をより分散させた状態に保つことが可能で、かつ凝集抑制剤自身の凝集まで至らないことが明白である。よって、この実施例３で明らかにした最終濃度となる捲濁溶液を用いれば、ナノポアを用いた測定を高精度に実施することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明にかかる微小物質の検出方法は、高精度に微小物質を検出する能力を有し、ホコリ、チリなどを測定する環境センサー等として有用である。またウイルス、細菌、タンパク質などを測定するバイオセンサー等の用途にも応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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