(57)【要約】【課題】  糸球体硬化抑制又はメサンギウム細胞機能異常抑制のための医薬組成物を提供する。【解決手段】  ラクトフェリンを有効成分とする糸球体硬化抑制又はメサンギウム細胞機能異常抑制のための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン類を有効成分とする糸球体硬化抑制又はメサンギウム細胞機能異常抑制のための医薬組成物。
【請求項２】
慢性腎臓病の予防又は治療に用いられる請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ラクトフェリン類の慢性腎臓病治療用食品、糖尿病性腎症治療用食品、糸球体硬化抑制用食品、又はメサンギウム基質増殖抑制用食品への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸球体硬化抑制又はメサンギウム細胞機能異常抑制のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、血液の老廃物を排泄し、体内の水分とその内容のバランスをとったり、血液の酸とアルカリの調整、造血ホルモンの分泌、血圧調整、カルシウム代謝に係わるビタミンＤの活性化等を行う器官である。腎臓は主にネフロンという小さな機能上の単位の集合体である。このネフロンは、糸球体という毛細血管の球体と、それを包む薄い膜のボーマン嚢、ボーマン嚢から出ている尿細管から成り立っている。
腎機能が低下する原因としては、急性腎不全と慢性腎臓病とがあるが、その予後、治療法が異なるため、治療現場ではこれらは明確に区別されており、これらの鑑別が重要視されている。
急性腎不全は、急激な腎機能の低下により体液の恒常性が維持できなくなる状態である。この原因として、例えば出血や急激な血圧低下、感染症、熱傷に伴う脱水等がみられる。急性腎不全の治療としては、補液、薬剤（主に利尿剤）使用、血液浄化が行われ、予後はほとんどが治療による急速な回復又は自然回復に向かう。
【０００３】
慢性腎臓病（Chronic kidney disease：ＣＫＤ）は、尿検査、画像診断、血液検査、病理等の結果により、腎臓に明らかに障害があるか又は腎臓の濾過機能が６０％未満に低下しているか、の少なくとも何れかの状態が３ヶ月以上の長期間続く場合である。この原因としては、高血圧、加齢、動脈硬化、糖尿病、慢性糸球体腎炎等と多岐に渡る。しかし、慢性腎臓病における腎機能の低下が不可逆的で進行性があるため、急性腎不全とは異なり腎機能の回復が困難である。慢性腎臓病の治療としては、進行性腎障害の進展抑制・合併症の予防のための食事療法及び化学療法等の対症療法が行われている。
【０００４】
この慢性腎臓病は、日本で１３３０万人存在し、日本人の８人に１人がこの慢性腎臓病になっている。さらに、２０００年以降、慢性腎臓病患者の半分が、糖尿病によって腎臓機能に障害が生じる糖尿病性腎症が増えている。慢性腎臓病は、慢性腎不全とも慢性腎疾患とも呼ばれている。
慢性腎臓病は、通常第１期（腎予備力の減衰期）、第２期（腎機能障害期）、第３期（腎不全期）、第４期（尿毒症期）に分類されている。第１期は無症状であるが、その後第２−４期とステージが上がるにつれ、食事制限及び運動制限が厳しくなる。第４期では腎代替療法（透析、移植等）を行わなければ、尿毒症に陥って死亡する疾患である。
【０００５】
慢性腎臓病において、腎機能の低下が不可逆的に進行するため、対症療法として、食事療法及び化学療法が行われている。この食事療法では、尿素窒素やクレアチンの増加を抑えるためタンパク制限；高血圧やむくみにならないように塩分制限を行なっている。そして、タンパク制限によるエネルギー不足を、糖質及び脂質で補うようにしている。糖尿病によって腎臓機能に障害が生じる糖尿病性腎症では、さらに糖質コントロールにも注意を払う必要がある。
このような実情から、慢性腎臓病治療に関する様々な研究開発が進められている。
非特許文献１には、シスプラチンによる急性腎不全誘発ラットにおけるラクトフェリンの腎保護効果が開示されているが、慢性腎臓病に対する効果については示唆されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ラクトフェリン２０１１、日本ラクトフェリン学会第４回学術集会実行委員会編、２０１１年１１月３０日、株式会社日本医学館発行、第１４２−１４７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
慢性腎臓病では、様々な原因因子が関与することで糸球体硬化症が進行し、この糸球体硬化症の進行によって腎機能の濾過機能が低下する。近年増加している糖尿病性腎症では、メサンギウム細胞機能異常が起こり、糸球体硬化症が進行すると言われている。
そこで、本発明は、斯かる実情に鑑み、糸球体硬化抑制又はメサンギウム細胞機能異常抑制のための医薬組成物を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意検討した結果、ラクトフェリン類が、糸球体硬化抑制作用を有すること、及び糸球体硬化に至る前段階であるメサンギウム細胞機能異常抑制作用を有することを見出し、糸球体硬化抑制又はメサンギウム細胞機能異常抑制のための医薬組成物を提供する。
さらに、本開示は、慢性腎臓病の予防又は治療に用いられてもよい。
また、本開示は、ラクトフェリン類の慢性腎臓病治療用食品、糖尿病性腎症治療用食品、糸球体硬化抑制用食品、又はメサンギウム基質増殖抑制用食品への使用を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示は、糸球体硬化抑制又はメサンギウム細胞機能異常抑制のための医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＢＳＡを４g／ｋｇ体重／日投与した群、ウシラクトフェリンを０．８g／ｋｇ体重／日投与した群及び４g／ｋｇ体重／日投与した群における糸球体硬化発生頻度（全節性糸球体硬化、分節性糸球体硬化、非硬化）の割合（％）を示す図である。左図は投与期間２６週であり、右図は投与期間５２週である。
【図２】ＢＳＡを４g／ｋｇ体重／日投与した群、ウシラクトフェリンを０．８g／ｋｇ体重／日投与した群及び４g／ｋｇ体重／日投与した群におけるメサンギウム基質増殖発生頻度（メサンギウム基質増加の各評価（−、＋、２＋、３＋、４＋））の割合（％）を示す図である。左図は投与期間２６週であり、右図は投与期間５２週である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本開示は以下の好ましい実施形態に限定されず、本開示の範囲内で自由に変更することができるものである。
【００１２】
本開示のラクトフェリン類とは、ラクトフェリン、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物から選ばれる１種又は２種以上のものである。
また、本開示のラクトフェリン類には、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、当該ペプチドを含んでなるペプチド、当該ペプチドを含んでなるタンパク質から選ばれる１種又は２種以上のものも含まれる。
【００１３】
上記ラクトフェリンは、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等を乳原料とし、例えばイオン交換クロマトグラフィー等の公知の分離・精製方法を用いることで、前記原料から分離して得られるものを用いることができる。さらに、ラクトフェリン中の金属含有量は特に限定されず、上記ラクトフェリンは、この分離ラクトフェリンを塩酸やクエン酸等により脱鉄したアポ型ラクトフェリン；該アポ型ラクトフェリンを、鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせて得られる飽和度１００％の状態の金属飽和ラクトフェリン；及び１００％未満の各種飽和度で金属が結合している状態の金属部分飽和ラクトフェリンからなる群から選ばれる、いずれか１種又は複数種の混合物を用いることも可能である。
上記ラクトフェリンは、市販のラクトフェリンを使用してもよい。この市販のラクトフェリンとして、工業的規模で製造されているもの（例えば、森永乳業社製）を使用することが好適である。
【００１４】
また、上記ラクトフェリンは、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産したラクトフェリンを使用することも可能である。好ましくは、ヒト若しくはウシ由来のラクトフェリン又はその対応する遺伝子に基づいて遺伝子工学的に製造されたラクトフェリンである。
【００１５】
本開示に使用するラクトフェリンの好ましい形態としては、ヒト由来のラクトフェリン及びウシ由来のラクトフェリン（配列番号１及び２）が例示され、１種を単独で使用することも、複数種を混合して用いることも可能である。
【００１６】
ここで、本開示に用いられるラクトフェリンの調製（乳等の原料からのラクトフェリンの分離、精製）方法の一例を以下に示すが、これに限定されるものではない。
乳原料を陽イオン交換カラムに通液し、この通過液を回収し、適宜この通過液を繰り返しカラムに通液する。このカラムに脱イオン水を通液し、食塩水を通液し、この陽イオン交換カラムに吸着した塩基性タンパク質の溶出液を得る。この溶出液に硫酸アンモニウム沈殿法にて、これを回収し、適宜洗浄する。回収された沈殿物を脱イオン水にて溶解し、この溶解液を限外ろ過膜にてろ過する。さらに、脱塩処理、凍結乾燥することで、粉末状のラクトフェリンが得られる。
【００１７】
より詳細には、まず、イオン交換体（たとえばＣＭ−セファロースＦＦ（商品名、アマシャムファルマシア社製））をカラムに充填し、塩酸を通液し、水洗してイオン交換体を平衡化する。続いて、４℃に冷却したｐＨ６．９の脱脂乳をカラムに通液し、透過液を回収し、再度同様にカラムに通液する。次いで、脱イオン水をカラムに通液し、食塩水を通液し、イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質の溶出液を得る。この溶出液に飽和度８０％の硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を沈殿させ、遠心分離して沈殿物を回収する。回収した沈殿物を、飽和度８０％の硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、脱イオン水を添加して溶解し、得られた溶液を限外ろ過膜モジュール（例えば、ＳＬＰ００５３（商品名）：旭化成社製）を用いて脱塩し、凍結乾燥して、粉末状ウシラクトフェリンを得る。このようにして、純度が９５質量％以上のウシラクトフェリンが得られる。
【００１８】
本開示に用いられるラクトフェリンにおいては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数の位置での１又は複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が当然存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じている場合がある。
本開示に用いることができるラクトフェリンには、本開示の効果が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも含有される。
【００１９】
本開示のラクトフェリン処理物の好適な物理的及び／又は化学的処理方法としては、例えば、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理が挙げられる。これらを２種以上組み合わせて、本開示のラクトフェリン処理物を得ることも可能である。
【００２０】
また、本開示のラクトフェリンの変性等の処理物の製造方法については、熱変性又はｐＨ変化による変性（「タンパク質ハンドブック」，丸善株式会社  2003年発行）、圧力変性（Mazri Cら，「J. Dairy Sci.」，2012年，95巻，ｐ．549-557）等多くの方法により行うことが可能である。
【００２１】
熱処理の際の加熱処理温度は、好ましくは６０℃以上、より好ましくは８０〜１２５℃、さらに好ましくは９０〜１０５℃であるのが好適である。
一例として、加熱処理ラクトフェリンは、ラクトフェリン水溶液を５〜３０分間熱湯中で煮沸し、遠心分離の沈殿物を回収することで得ることができる。
また、酸・アルカリ処理する際には、ラクトフェリン含有溶液のｐＨを調整して処理すればよい。当該ｐＨ調整による処理の場合は、処理液のｐＨが、好ましくはｐＨ５以下又はｐＨ９以上であり、より好ましくはｐＨ４以下又はｐＨ１０以上である。ｐＨ調整された処理液は、室温にて５分〜１時間、放置又は撹拌することによって、処理物として調製することができる。なお、「室温」とは、４〜４０℃程度である。
【００２２】
本開示のラクトフェリンの加水分解物の製造方法については、酸加水分解処理、アルカリ加水分解処理、酵素加水分解処理等が挙げられ、これらを１種又は２種以上組み合わせて行なってもよい。
なお、本開示の加水分解物（例えば、酸加水分解処理物、アルカリ加水分解処理物及び酵素加水分解処理物等）は、ラクトフェリンを加水分解処理し、未精製のままの状態で使用しても効能を発揮することが可能である。さらに、後述するが、効能を向上させるために、適宜本開示における効能成分又はこの成分を含有する画分を分離精製することも可能である。
【００２３】
本開示の酸・アルカリ加水分解処理にて得られる酸・アルカリ加水分解処理物の製造方法については、弱酸や弱アルカリにて行うことも可能である。酸・アルカリ加水分解処理物として、例えば、ラクトフェリン含有溶液をそのまま又はｐＨ調整した後、加熱処理して得ることも可能である。
酸・アルカリ処理により加水分解物を得る場合のｐＨは、好ましくは酸性領域であり、より具体的には、好ましくはｐＨ１〜４、より好ましくはｐＨ２〜３である。
本開示のタンパク質酵素加水分解処理にて得られるタンパク質分解酵素加水分解処理物の製造方法については、通常知られている方法により行うことが可能である。具体的には、Takayama Yらの方法が知られている（Takayama Y ら, 「B.B.R.C.」， 2002年， 299巻，p．813-817）。
酵素加水分解処理において、好ましくは、トリプシン又は類似の反応特異性を有する酵素による製造である。
一例として、ｐＨ７．５〜８．５程度に調整したラクトフェリン水溶液に、トリプシン酵素を加え、３５〜３９℃で２〜２４時間程度処理することで本開示のタンパク質分解酵素生成物を得ることができる。さらに適宜分離精製処理してもよい。
【００２４】
また、本開示のラクトフェリンの熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理、の処理物の製造方法については、上述の処理物の製造方法及び加水分解物の製造方法を、適宜組み合わせて行うことも可能である。
【００２５】
さらに、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物を、公知の分離精製を行うことで、さらに本開示における効能を有するペプチド又は低分子化されたタンパク質を得ることも可能である。例えば、ポリマー系逆相カラム分画により各溶出画分を得、各溶出画分の糸球体硬化抑制、メサンギウム細胞機能異常抑制を確認することで、より活性の高い溶出画分を得ることが可能である。
このようにして得ることが可能な本開示における効能を有するペプチド又はタンパク質としては、例えば、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるペプチド；配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるタンパク質等が挙げられる。なお、これらペプチド又はタンパク質は、本開示における効能を有する範囲において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したものであってもよい。
【００２６】
腎臓病には、急性腎不全と慢性腎臓病とがあるが、これらは、症状の原因や進行速度が異なるため、治療法も異なっている。また、慢性腎臓病（より具体的には糸球体硬化）の発症・進展機構には様々な原因因子が関与している。しかし、様々な原因因子が関与しているため、どのような原因因子でのアプローチがよいかは依然不明である。しかも、実際には、現在の化学療法では慢性腎臓病を寛解できるまでには至っておらず、対症療法にとどまっているのが実情である。
このため、現在の慢性腎臓病治療の目的は、不可逆的に進行していく慢性腎不全を、患者のクオリティー・オブ・ライフを著しく損なう末期腎不全（ＥＳＫＤ）へ至ることを阻止する、或いは末期腎不全へ至る時間を遅らせるためにある。慢性腎臓病のステージを上げることを阻止する或いは遅らせることで、ステージが上がるにつれて食事療法の食事制限（例えば、タンパク質制限や、糖尿病性腎症でのタンパク質制限に加えて糖質コントロール等）が厳しくなることを阻止又は遅らせることができる。
末期腎不全になることを遅らせることによって、末期腎不全になると必要とされる、血液透析、腹膜透析或いは腎移植といった腎代替療法を遅らせることができる。
また、慢性腎不全治療を行うことで、心血管疾患の発症を抑制する又は既往の心血管疾患の進展を阻止することもできる。
また、特に慢性腎臓病では、食事療法としてタンパク摂取量制限がなされているが、その一部を置き換えることで、症状等の予防、改善又は治療できることは、患者の負担が少なく有利な点と言える。
【００２７】
後記実施例に示すように、本開示のラクトフェリン類は、糸球体硬化抑制作用、メサンギウム細胞機能異常（例えば、形質変換、基質産生増加等）抑制作用、血管極硝子化抑制作用等を有する。また、本開示のラクトフェリン類により、糸球体硬化抑制、メサンギウム細胞機能異常抑制、血管極硝子化抑制等されることで、慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善又は治療が可能と考えられる。
本開示のラクトフェリン類の使用により、慢性腎臓病の発症抑制又は進展遅延をより期待することができる。そして、糖尿病性腎症の動物モデルにおいて有効であったため、本開示のラクトフェリン類の使用は、糖尿病性腎症の予防、改善又は治療において特に有望であると考えられる。また、本開示のラクトフェリン類の使用は、糖尿病を原疾患とする病理学的なメサンギウム細胞機能異常（例えば形質変換、基質産生増加等）及び糸球体硬化の発症抑制又は進展遅延に特に有望である。
また、ラクトフェリンは母乳や牛乳等に含まれる糖タンパク質であるので、本開示のラクトフェリン類は安全性が高いと言える。
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転；疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延；或いは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延；或いは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００２８】
従って、本開示のラクトフェリン類は、有効成分として本開示の組成物（例えば糸球体硬化抑制用、メサンギウム細胞機能異常抑制用、血管極硝子化抑制用、慢性腎臓病治療用、糖尿病性腎症治療用等の組成物）に含有させることができる。
また、本開示のラクトフェリン類は、本開示の前記組成物に使用することができ、当該組成物を製造するために使用又は応用することができる。
また、本開示のラクトフェリン類は、糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常、血管極硝子化等が関与する疾病、疾患若しくは症状等の予防、改善又は治療のために、また慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善及び／又は治療のために、使用することができ、これら疾病、疾患又は症状等の予防、改善又は治療において使用することができる。
また、本開示のラクトフェリン類は、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常、血管極硝子化等が関与する疾病、疾患や症状等の予防、改善及び／又は治療を図るための方法に使用することができる。
また、本開示のラクトフェリン類を有効成分として含有する上述の各種組成物は、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、上述の糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常等が関与する疾病、疾患や症状等の予防、改善又は治療、また慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善又は治療を図るための方法に使用することができる。
【００２９】
さらに、本開示のラクトフェリン類は、上述の糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常等が関与する様々な疾病、疾患や症状の予防、改善及び／又は治療のための、また上述の慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善及び／又は治療のための組成物、医薬、医薬部外品、飲食品若しくはその原料、又は飼料若しくはその原料に素材として配合することができる。また、本開示のラクトフェリン類は、これら疾病、疾患や症状の予防、改善、治療において使用すること、又はこれら組成物等の製造のために使用又は応用することができる。
【００３０】
上記組成物、医薬、医薬部外品、飲食品、飼料又は飲食品若しくは飼料の原料は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。本開示のラクトフェリン類は、上記組成物、医薬、医薬部外品、飲食品、飼料又は飲食品若しくは飼料の原料に素材として配合することが可能であり、上述の糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常等が関わる様々な状態の予防、改善及び／又は治療のため、また上述の慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の疾病、疾患や症状の予防、改善及び／又は治療のための有効成分として含有させることが可能である。
【００３１】
以下の組成物や製剤等に使用するラクトフェリン類は、上記で製造されたラクトフェリン由来の生成物を含むものである。
【００３２】
上記医薬又は医薬部外品は、本開示のラクトフェリン類を有効成分として含有する。当該医薬又は医薬部外品の投与形態は特に限定されず、任意の投与形態で投与され得る。投与形態は、治療やサプリメントとしての予防等の目的に応じて適宜選択でき、経口投与でも非経口投与でもよい。例えば、経口投与形態として、錠剤、被覆錠剤、散剤、カプセル剤のような固形投与形態；シロップ及び懸濁液のような液体投与形態が挙げられ、非経口投与形態としては、注射、輸液、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、湿布剤等が挙げられる。
【００３３】
ウシラクトフェリンが経口投与により直接炎症部分に到達して治癒させるという報告は見られない。ところが、後記実施例に示すように、本開示のラクトフェリンは経口摂取により、上述の糸球体硬化抑制、メサンギウム細胞機能異常抑制等を奏することが確認された。このことから、本開示のラクトフェリンが何らかの分解を受けてラクトフェリン分解物になった場合でも、この分解物は上述の如き効果を発現していることが考えられる。
一般的にインビトロで効能を発現した物質があった場合でも、インビボのような経口摂取又は投与した場合、体内で効能がなくなる又は低減することが多い。このような場合、注射等で血管又は皮下に直接投与する方法があるが、これは患者の負担が多い。ところが、本開示のラクトフェリン類は経口摂取にて上述の糸球体硬化抑制等の効果を奏することが可能であるので、産業上利用の点でも有利である。
【００３４】
上記医薬又は医薬部外品は、本開示のラクトフェリン類を単独で含有していてもよく、又は製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、流動性促進剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。これらを用いて常法に従って上述した組成物や製剤等を製造することができる。
【００３５】
結合剤として、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が例示される。
崩壊剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が例示される。
界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が例示される。
滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が例示される。
流動性促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が例示される。
【００３６】
本開示の組成物中に含まれる本開示のラクトフェリン類の量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常組成物中に０．０００１〜７５質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％とするのがよい。
【００３７】
本開示の組成物の投与方法と投与量は特に限定されず、各種組成物の形態、投与対象となる方の年齢、性別、その他の条件、摂取する医薬組成物や同様の効果を有するサプリメントとの摂取状況等により決定される。
通常有効成分としての本開示のラクトフェリン類の量は、ヒトへの投与の際の用量換算で、好ましくは０．０３５ｇ以上／ｋｇ体重／日（マウスへの投与量として０．５ｇ以上／ｋｇ体重／日）、より好ましくは０．０３５〜０．７ｇ／ｋｇ体重／日（マウスへの投与量として０．５〜１０ｇ／ｋｇ体重／日）、さらに好ましくは０．０７〜０．５６ｇ／ｋｇ体重／日（マウスへの投与量として１〜８ｇ／ｋｇ体重／日）、特に好ましくは０．０７〜０．４２ｇ／ｋｇ体重／日（マウスへの投与量として１〜６ｇ／ｋｇ体重／日）の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
なお、前記ラクトフェリン類のヒトへの投与の際の用量は、『体表面積に基づく動物からのＨＥＤ（Human Equivalent Dose）交換』（例えば、参考文献１を参照）による換算式から算出することができる。
ＨＥＤ＝［動物への投与量（ｍｇ／ｋｇ体重）］×｛［動物の体重（ｋｇ）］÷［ヒトの体重（ｋｇ）］｝０．３３
ヒトの体重：６０ｋｇ
マウスの体重：２０ｇ
参考文献１：Guidance for Industry, Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, V. STEP 2: HUMAN EQUIVALENT DOSE CALCULATION, July 2005, Pharmacology and Toxicology, p.6-7 / U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER)．
【００３８】
また、摂取又は投与期間は、好ましくは２６週以上、より好ましくは５２週以上である。ラクトフェリン類は安全性が高いので長期間可能であり、また、後記実施例に示すように、長期間摂取又は投与するほど上述の薬理効果を奏することや症状改善等を期待することができる。
【００３９】
また、後記実施例に示すように、マウスに対して、１日に体重１ｋｇあたり２ｇ（２ｇ／ｋｇ体重／日）以上のラクトフェリン類を少なくとも２６週間連日投与することで、上述の糸球体硬化抑制、メサンギウム細胞機能異常抑制、血管極硝子化抑制等が可能である。したがって、ヒトに対して、１日に体重１ｋｇあたり０．１４ｇ（０．１４ｇ／ｋｇ体重／日）以上のラクトフェリン類を少なくとも２６週間連日投与することで、糸球体硬化抑制、メサンギウム細胞機能異常抑制、血管極硝子化抑制等が可能であり、さらに当該投与にて慢性腎臓病の発症抑制或いは進展遅延を期待することができる。
投与量の下限値は、ヒトへの投与の際の用量換算で、好ましくは１日に体重１ｋｇあたり０．２８ｇ（０．２８ｇ／ｋｇ体重／日）以上（マウスへの投与量として４ｇ／ｋｇ体重／日以上）である。また投与量の上限値は、ヒトへの投与の際の用量換算で、好ましくは１日に体重１ｋｇあたり０．７ｇ（０．７ｇ／ｋｇ体重／日）以下（マウスへの投与量として１０ｇ／ｋｇ体重／日以下）、より好ましくは１日に体重１ｋｇあたり０．５６ｇ（０．５６ｇ／ｋｇ体重／日）以下（マウスへの投与量として８ｇ／ｋｇ体重／日以下）、さらに好ましくは１日に体重１ｋｇあたり０．４２ｇ（０．４２ｇ／ｋｇ体重／日）以下（マウスへの投与量として６ｇ／ｋｇ体重／日以下）である。
【００４０】
上記飲食品や飼料は、上述の糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常が関わる様々な状態の予防、改善及び／又は治療のため、また上述の慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の疾病、疾患や症状の予防、改善及び／又は治療等の機能を有し、当該機能を必要に応じて表示した食品若しくは飲料、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品、ペットフード等であり得る。
【００４１】
本開示の有効成分であるラクトフェリン類を、食品又は飲料に対して、食品添加剤として添加して、飲食品組成物（飲食品）の形態で製造することができ、経口または経管的に摂取することが可能である。
このような飲食品組成物（飲食品）の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料、アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；惣菜、パン類；経腸栄養食品、流動食、スポーツ飲料；健康補助食品等の機能性食品等が例示される。
機能性食品の形態としては、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントであることが、有効成分の摂取量を把握し易いという点で好ましい。
【００４２】
本開示の飲食品組成物において、本開示のラクトフェリン類を添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の食品又は飲料中０．０００１〜７５質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％となるように添加すればよい。
【００４３】
本開示の飲食品には、有効成分である前記ラクトフェリン類の他に、例えば、ラクチュロース、マルチトール、及びラクチトール等のアルコール吸収抑制性の糖類、及びそれ以外の糖類、例えばデキストリン、デンプン等；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を含有させることができる。
【００４４】
本開示のための食品添加剤は、各種食品添加剤を製造する際に、ラクトフェリン類を含有させることによって製造することができる。
食品添加剤には、有効成分としての本開示のラクトフェリン類の他に、通常使用される賦形剤等の添加剤を所望により含有させることができる。また、食品添加剤として公知の他の成分を所望により含有させることもできる。食品添加剤の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、タブレット、液体等、食品添加剤の通常の形態をとることができる。
【００４５】
本開示の有効成分であるラクトフェリン類は、ヒトに限られることなく、ほ乳類に対しても、効果を示すものである。したがって、本開示は、ラクトフェリン類を有効成分として含有する飼料、及び飼料添加剤にもあり、特にほ乳動物飼育用の粉乳、及び粉乳添加剤にもある。
【００４６】
本技術は、以下の構成を採用することも可能である。
〔１〕  ラクトフェリン類を有効成分とする糸球体硬化抑制又はメサンギウム細胞機能異常抑制のための医薬組成物。
〔２〕  ラクトフェリン類を１日に体重１ｋｇあたり０．１４ｇ以上を少なくとも２６週間連日投与することを特徴とする前記〔１〕記載の医薬組成物。
〔３〕  慢性腎臓病の予防又は治療に用いられる前記〔１〕又は〔２〕記載の医薬組成物。
【００４７】
〔４〕  慢性腎臓病治療用医薬組成物、糖尿病性腎症治療用医薬組成物、糸球体硬化抑制用医薬組成物、又はメサンギウム基質増殖抑制用医薬組成物の製造のための、ラクトフェリン類の使用。
〔５〕  慢性腎臓病治療用食品、糖尿病性腎症治療用食品、糸球体硬化抑制用食品、又はメサンギウム基質増殖抑制用食品の製造のための、ラクトフェリン類の使用。
〔６〕  ラクトフェリン類の、慢性腎臓病治療用医薬組成物、糖尿病性腎症治療用医薬組成物、糸球体硬化抑制用医薬組成物、若しくはメサンギウム基質増殖抑制用医薬組成物、又は慢性腎臓病治療用食品、糖尿病性腎症治療用食品、糸球体硬化抑制用食品、若しくはメサンギウム基質増殖抑制用食品への使用。
【００４８】
〔７〕  糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常が関与する疾病、疾患や症状、又は慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善又治療のための、ラクトフェリン類。
〔８〕  糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常が関与する疾病、疾患や症状、又は慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善又治療における使用のための、ラクトフェリン類。
〔９〕  糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常が関与する疾病、疾患や症状、又は慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善又治療のための、ラクトフェリン類の使用。
〔１０〕ラクトフェリン類を有効成分として摂取又は投与する、糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常が関与する疾病、疾患や症状、又は慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善又治療方法。
【００４９】
〔１１〕前記〔１〕〜〔１０〕の記載のラクトフェリン類は、ラクトフェリン、ラクトフェリンの熱処理物、ラクトフェリンの酸処理物、ラクトフェリンのアルカリ処理物、ラクトフェリン加水分解物、並びに、熱処理、酸処理、アルカリ処理及び加水分解処理を２種以上組み合わせて処理されたラクトフェリンの処理物から選ばれる１種又は２種以上のものであるのが好適である。
また、好適には、ラクトフェリンを経口摂取又は経口投与に使用することである。
〔１２〕１日に体重１ｋｇあたり０．１４ｇ以上のラクトフェリン類を投与する前記〔１〕〜〔３〕、〔１１〕の何れか１項記載の医薬組成物；前記〔４〕、〔１１〕記載の医薬組成物又は〔５〕、〔１１〕記載の食品の製造のためのラクトフェリン類の使用；前記〔６〕、〔１１〕記載の医薬組成物又は食品へのラクトフェリン類の使用；前記〔７〕、〔１１〕記載の糸球体硬化、メサンギウム細胞機能異常が関与する疾病、疾患や症状、又は慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の予防、改善又治療のためのラクトフェリン類；前記〔８〕、〔１１〕記載の予防、改善又治療における使用のためのラクトフェリン類；前記〔９〕、〔１１〕記載のラクトフェリン類の使用；前記〔１０〕、〔１１〕記載の予防、改善又治療方法。
【実施例】
【００５０】
以下に、具体的な実施例等を説明するが、本発明（本開示）はこれに限定されるものではない。なお、本実施例における投与量の表示は、いずれもマウスへの投与量として示されるものである。
【００５１】
＜実験方法＞
実験にはＮＳＹ（Nagoya Shibata Yasuda）雄マウスを使用した。ＮＳＹマウスはブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を耐糖能障害の指標としてＪｃｌ：ＩＣＲを選択交配し、近交系化した自然発症２型糖尿病モデルマウスである。雄では４８週齢までに、ほぼ全例が糖尿病を発症する。糖尿病性腎症発症の経過がヒトと似ていることでも知られている。
動物は５週齢で日本エスエルシー株式会社より購入し、１週間の検疫馴化期間をおいてから実験に供した。実験（経口投与）期間は２６週間及び５２週間とし、２６週間群及び５２週間群とした。群分けは、体重別層化無作為抽出法により、各群５匹、６群とした。
動物は、温度２４±２℃、湿度５５±５％、１２時間明暗サイクル、換気回数１５回／時間に調整されたＳＰＦ施設内で、プラスチックケージに木製チップ（ホワイトフレーク：日本チャールス・リバー株式会社）を適宜入れ個別に飼育した。飲料水は水道水を用いた。
動物には飼料として検疫馴化中は、粉末飼料（乳原料フリー：ＭＲストック粉末、日本農産化工株式会社）を自由摂取させた。
【００５２】
試験開始後は、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ投与群、０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群及び４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群の各群に、以下のとおりの各群用飼料をそれぞれ自由摂取させた。
マウスへの投与量４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ投与群には４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ投与群用飼料を、マウスへの投与量０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群には０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群用飼料を、及びマウスへの投与量４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群には４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群用飼料を提供した。さらに各群を、実験期間の違いで、２６週間群及び５２週間群とした。
なお、各群間で蛋白摂取量に差が出ないように調整した。カロリーは、日本農産化工株式会社開示の栄養成分表のカロリー欄に基づき、さらに添加したＢＳＡまたはラクトフェリンをタンパク質１ｇ＝４ｋｃａｌとして算出した。なお、使用したラクトフェリンの含有量（９７質量％）をもとに、ラクトフェリン量およびタンパク量を算出した。また、飼料作製時もラクトフェリンの終濃度が０．４％または２％となるように設定した。
【００５３】
（１）  ４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ投与群用粉末飼料：Bovin Serum Albumin (Fraction V, Batch.056K1544)を２％の割合でＭＲストック粉末に均等に混入した粉末飼料。
（２）  ０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群用粉末飼料：森永乳業株式会社製のウシラクトフェリン(lot.251007)を０．４％の割合でＭＲストック粉末に均等に混入した粉末飼料。
（３）  ４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群用粉末飼料：森永乳業株式会社製のウシラクトフェリン(lot.251007)を２％の割合でＭＲストック粉末に均等に混入した粉末飼料。
【００５４】
なお、実験（投与）期間を通して、各群間での総摂餌量、総タンパク摂取量及び総カロリー摂取量に関して有意差はみられなかった。
【００５５】
本動物実験は、動物の愛護及び管理に関する法律（昭和48年10月1日法律第105号、一部改正平成17年6月22日）、実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準（平成18年4月28日、環境省告示第88号）、動物の殺処分法に関する指針（平成19年11月12日、環境省告示第105号）、厚生労働省における動物実験等の実施に関する基本指針（平成18年6月1日）、動物実験の適正な実施に向けたガイドライン（日本学術会議、2006年6月1日）等を遵守して行った。
【００５６】
実験期間中は一般状態観察を毎日行い、動物の健康状態を観察した。途中、飼育継続困難と判断された１例（０．８ｇ／ｋｇ体重／日、２６週、ＬＦ群中の１例）は安楽死処置とした。安楽死処置はセボフルラン深麻酔を施した後、通常解剖時と同様に採血・採材、各検査を実施、参考データとした。
【００５７】
今回の実験では以下について観察・測定を行い、参考データとした。
（１）  一般状態を毎日観察した。
（２）  体重と２４時間摂餌量を１回／週に測定した。
（３）  血圧と通常血糖値を１回／４週に測定した。
（４）  新鮮尿を１回／４週に採取、尿中アルブミン（ＡＬＢ）と尿中クレアチニン（ＣＲＥ）を測定し、ＡＬＢ／ＣＲＥ比を算出した。
（５）  解剖時尿検査（ＡＬＢ、ＣＲＥ、ＡＬＢ／ＣＲＥ比算出）
（６）  解剖時血液学的検査（白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積、平均血色素量、平均血色素濃度、血小板数）
（７）  解剖時血液生化学的検査（尿素窒素、ＡＬＢ、グロブリン、総蛋白、ＣＲＥ）
（８）  解剖時臓器重量測定（肝臓、腎臓、脾臓、心臓）
【００５８】
臓器重量測定が終了した各臓器ならびに病変部は、固定液（サクラユフィックス）に浸漬し固定した。この際、腎臓は左腎臓下部に２ｍｍのカミソリ痕を入れることにより、左右を識別した。
固定済み臓器のうち、左右腎臓とも中心部を５ｍｍの横断片に切り出し、エタノールによる脱水、キシレンによる置換、パラフィン浸漬を施した。
パラフィン浸漬済みの腎臓はパラフィンブロックを作製し、パラフィンブロック用ミクロトーム（リトラトーム、大和光機工業株式会社）で、０．５μｍの厚さに薄切した。薄切した切片はシランコート済みスライドガラス（マツナミ）にとり、湯伸ばしをして貼付した。
【００５９】
薄切した腎臓は以下の手順に従ってＰＡＳ染色を行った。なおＰＡＳ染色は腎臓病理診断に汎用されている手法である。
（１）  キシレンにより脱パラフィン  ３分×３回
（２）  エタノールによる置換（１００％エタノール：３分×３回、７０％エタノール：３分×１回）
（３）  蒸留水水洗  ２分
（４）  ０．５％過よう素酸液浸漬  ８分
（５）  水洗（５分）、蒸留水を通す
（６）  シッフ液浸漬  １５分
（７）  蒸留水水洗  １分
（８）  マイヤーのヘマトキシリン染色（核染色）  ２分
（９）  流水水洗（色だし）  ２０分
（１０）エタノールによる脱水（３分×７回）
（１１）キシレンによる透徹（３分×７回）
（１２）マリノールによる封入
【００６０】
染色した腎臓は以下の評価基準に従い、顕微鏡下（OLYMPUS BX53）で全視野観察・精査した。
（１）  糸球体硬化
全節性：糸球体面積の５０％以上に結節形成がみられる。
分節性：糸球体面積の５０％未満に結節形成がみられる。
非結節：糸球体に結節形成は認められない。
（２）  メサンギウム基質増加（メサンギウム細胞の核に対して）
−：ＰＡＳ赤色好染がみられない。
＋：ＰＡＳ赤色好染が核のまわりだけにある。
２＋：ＰＡＳ赤色好染が核のまわり以外にみられる。
３＋：ＰＡＳ赤色好染が大きく広がりがある。
４＋：ＰＡＳ赤色好染が広く厚い、又は硝子様変化の少なくとも何れかがみられる。
（３）  細胞浸潤
−：糸球体に浸潤細胞がみられない。
＋：ひとつの糸球体に浸潤細胞が３以下存在。
２＋：ひとつの糸球体に浸潤細胞が６以下存在。
３＋：ひとつの糸球体に浸潤細胞が７以上存在。
（４）  血管極硝子化の有無
観察可能な糸球体血管極（観察時に糸球体血管極が視野に現れているもの）のうち、硝子様変化がみられた血管極をもつ糸球体の数。
（５）  血管炎の有無
観察できた腎臓内動脈静脈のうち、炎症がみられた血管の数。
（６）  糸球体密度
腎臓観察面の０．１ｃｍ２面積あたりの糸球体個数。
【００６１】
統計処理
（１）  血管極硝子化発現数、血管炎発現数：χ２検定
（２）  糸球体硬化発現頻度、メサンギウム基質増殖発生頻度、細胞浸潤発生頻度、糸球体密度、体重、摂餌量、血圧、血糖値、尿中ＡＬＢ／ＣＲＥ比、左右腎重量、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値、平均赤血球容積、平均血色素量、平均血色素濃度、血小板数、尿素窒素量、血中アルブミン濃度、血中グロブリン濃度、血中総蛋白濃度、血中クレアチニン濃度：Dunnettの多重比較検定
【００６２】
「糸球体硬化」は、糖尿病性腎症の特徴的・基本的変化として観察されている。メサンギウム基質増殖とメサンギウム領域拡大により毛細管腔が狭窄、結果起きる病変である。「糸球体硬化」の判断として、硬化の面積により全節性、分節性に分類され、通常は変化しない。
【００６３】
「メサンギウム細胞機能異常」として、形質変換、基質産生増加等が挙げられる。なお、「メサンギウム基質増殖（メサンギウム基質産生増加ともいう）」は、糖尿病性腎症の基本的変化として観察され、糸球体はメサンギウム基質とメサンギウム細胞によって毛細管が固定されている。高血糖の状態が続くとメサンギウム細胞に大量のブドウ糖が流れ込むが、量が多く流れるために処理しきれず、ブドウ糖とタンパク質が結合した糖タンパク質をメサンギウム細胞が過剰に作り出すようになる。これによってメサンギウム基質が肥大し、周囲にある糸球体の毛細血管を圧迫する。「メサンギウム基質増殖」は、基質増加の程度或いは硝子様変化の有無により分類される。通常はメサンギウム細胞の周囲に薄く見える程度である。
【００６４】
「細胞浸潤」は、糸球体血管腔内へ炎症性細胞が入り込むことであり、炎症の早期によく見られる。「細胞浸潤」は、炎症が進むにつれ管腔への浸潤は多くなる。通常はほぼ見られない。
【００６５】
「血管極硝子様変化」について、糸球体へ流入する輸入細動脈と流出する輸出細動脈が一点に集まる部分を血管極と呼ぶ。腎小体（尿生成の出発点である袋状組織、糸球体とこれを包む膜で形成）に入る直前の輸入細動脈側に極沈（糸球体膀細胞）が、輸出細動脈にメサンギウム細胞（糸球体外血管間膜）が密に集合している。レニン分泌細胞は輸入細動脈周辺に存在しており、これらの細胞やメサンギウム基質増殖による血管圧迫により腎機能障害並びに合併症が起こる。「血管極硝子様変化」は通常見られない。
【００６６】
「血管炎」は、腎臓の中の細・小血管（細動脈、毛細血管、細動脈等）や中動脈等の炎症をいう。壊死性糸球体腎炎の頻度が高い。血管及び血管周辺に細胞浸潤や血管変性が見られる。「血管炎」は、通常は見られない。
【００６７】
＜腎臓組織の精査＞
糸球体硬化（％）の実験結果を表１及び図１に示す。
【００６８】
【表１】
2014227375.tif 000002
【００６９】
（１）糸球体硬化（２６週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の全節性糸球体硬化発現頻度、及び０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の分節性糸球体硬化発現頻度が、それぞれ４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群に比べて統計学的に有意に減少した（ｐ＜０．０５）。また非硬化糸球体発現頻度は両ＬＦ群で４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群に比べて統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０５）。０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の全節性糸球体硬化発現頻度、及び４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の分節性糸球体硬化発現頻度は、それぞれ４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して減少したが、統計学的有意差は認められなかった。
【００７０】
（２）糸球体硬化（５２週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の全節性糸球体硬化の発現頻度が、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に減少した（ｐ＜０．０５）ほか、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の非硬化糸球体の発現頻度が、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群に比べて統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０５）。また、０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の全節性糸球体硬化発現頻度は、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して減少した。４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群、及び０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の両ＬＦ群の分節性硬化発現頻度、及び０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の非硬化糸球体の発現頻度は、それぞれ４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して増加する傾向にあったが、統計学的有意差は認められなかった。
【００７１】
メサンギウム基質増殖の実験結果を表２及び図２に示す。
【００７２】
【表２】
2014227375.tif 000003
【００７３】
（３）メサンギウム基質増殖（２６週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の４＋を示す糸球体の発生頻度、及び０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の３＋を示す糸球体の発生頻度が、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群に比べて統計学的に有意に減少し（ｐ＜０．０５）、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の＋及び２＋を示す糸球体の発現頻度が、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に増加した。４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して、０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の４＋を示す糸球体の発現頻度は増加傾向、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の３＋を示す糸球体の発現頻度は減少傾向、０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の２＋を示す糸球体の発現頻度は増加傾向を示したが、統計学的有意差は認められなかった。
【００７４】
（４）メサンギウム基質増殖（５２週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の４＋を示す糸球体の発現頻度が、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に減少した（ｐ＜０．０１）。また、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の＋及び２＋を示す糸球体の発現頻度は、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０１）。０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群では４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群との差異はみられなかった。
【００７５】
細胞浸潤の実験結果を表３に示す。
【００７６】
【表３】
2014227375.tif 000004
【００７７】
（５）細胞浸潤（２６週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の２＋及び３＋を示す糸球体の発現頻度が、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に減少した（ｐ＜０．０５）ほか、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の細胞浸潤がみられない糸球体の発現頻度は、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に増加した（ｐ＜０．０１）。０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の２＋及び３＋を示す糸球体の発現頻度は、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して減少傾向にあったが、統計学的有意差は認められなかった。
【００７８】
（６）細胞浸潤（５２週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群で細胞浸潤がみられない糸球体の発現頻度が高い傾向を示したほか、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の＋〜３＋を示す糸球体の発現頻度は低い傾向を示したが、統計学的有意差は認められなかった。
【００７９】
血管極硝子化の実験結果を表４に示す。
【００８０】
【表４】
2014227375.tif 000005
【００８１】
（７）血管極硝子化の有無（２６週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群、及び０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の両ＬＦ群で、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して減少した（０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ：ｐ＜０．０５，  ４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ：ｐ＜０．０１）。
【００８２】
（８）血管極硝子化の有無（５２週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群、及び０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の両ＬＦ群で、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に減少した（０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ：ｐ＜０．０５，  ４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ：ｐ＜０．０１）。
【００８３】
血管炎の実験結果を表５に示す。
【００８４】
【表５】
2014227375.tif 000006
【００８５】
（９）血管炎の有無（２６週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群で４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に減少した（ｐ＜０．０１）。０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群でも減少傾向が観察されたが、統計学的有意差は認められなかった。
【００８６】
（１０）血管炎の有無（５２週）：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群で４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に減少した（ｐ＜０．０１）。０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群でも減少傾向が観察されたが、統計学的有意差は認められなかった。
【００８７】
糸球体密度の実験結果を表６に示す。
【００８８】
【表６】
2014227375.tif 000007
【００８９】
（１１）糸球体密度：
４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群、及び０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の各群とも、２６週に比較して５２週で低い傾向がみられたが、群間に差異はみられなかった。
【００９０】
＜その他観察（参考データ）＞
（１２）体重
２６週間及び５２週間とも試験期間を通じて、４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群、及び０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の各群間で、体重の差は認められなかった。なお、各群間で摂餌量推移の差も認められなかった。
【００９１】
（１３）尿素窒素
２６週試験解剖時の４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の尿素窒素が４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して統計学的に有意に低下した（ｐ＜０．０５）。
【００９２】
（１４）その他
上記以外の観察項目として、左右の腎重量、ヘマトクリット値、血清クレアチニン濃度、血圧、血糖値、尿中ＡＬＢ／ＣＲＥ比、左右腎重量、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン値、平均赤血球容積、平均血色素量、平均血色素濃度、血小板数、血中アルブミン濃度、血中グロブリン濃度、血中総蛋白濃度について観察したが、ＢＳＡ群、及びＬＦ群の各群間における有意な変動は確認されなかった。
【００９３】
体重及び尿素窒素濃度等の実験結果を表７に示す。
【００９４】
【表７】
2014227375.tif 000008
【００９５】
１）ウシラクトフェリンが０．８ｇ／ｋｇ体重／日の相当量となる混餌飼料を、ＮＳＹマウスに２６週間群及び５２週間群に与え、糖尿病性腎症に伴う糸球体病変の精査を行った。また、ウシラクトフェリンが４ｇ／ｋｇ体重／日の相当量となる混餌飼料を、ＮＳＹマウスに２６週間群及び５２週間群与え、糖尿病性腎症に伴う糸球体病変の精査を行った。
【００９６】
２）糖尿病性腎症の病理学的エンドポイントである糸球体硬化は、ＬＦ群で４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群に比べて、用量依存的及び経時的に軽症化する傾向がみられ、特に４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群では統計学的有意差も観察された。故に、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ摂取は、明らかに糖尿病性腎症による糸球体硬化の進展抑制又は発症遅延の誘導効果を持つものと考えられる。顕性腎症の特徴である結節性変化が抑制されることは、腎保護の観点からも有用な結果と言える。
【００９７】
３）糸球体硬化に至る前段階であるメサンギウム基質増加は、いずれの群においても経時的に重症化する傾向がみられた。しかし、重度の判定である４＋が２６週では用量依存的に低値を示し、５２週では４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群と比較して、０．８ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群では著しい差はみられなかったものの、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群では４＋がみられた糸球体の発現率は４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡ群の約３０％を示し、統計学的有意差もみられた。
２６週から５２週へのすべての群でみられた重症化は、糸球体の不可逆的・進行的病態変化を示しているが、５２週で著しく４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ投与群で重症化が抑制されたことは、メサンギウム細胞機能異常抑制を表しており、ひいては糸球体硬化症の進展抑制・発症遅延につながるものと考えられる。
【００９８】
４）細胞浸潤は、２６週間試験で２＋或いは３＋を示す糸球体の発現率が、ＬＦの用量依存的に軽減する傾向にあり、特に４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦでは統計学的有意差が認められた。５２週では４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群でやや軽度な傾向を示したが統計学的有意差はみられなかった。
細胞浸潤は、比較的初期の腎炎でみられる所見であり、また糖尿病性腎症では単球、マクロファージの炎症細胞浸潤によりみられるため、２６週では顕著に病態進行が抑制されている証拠である。また、５２週の４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ群の所見は、２６週の４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡの傾向と比較しても軽度であることから、糸球体又は細動脈の炎症が抑制されていることが考えられる。
【００９９】
５）血管極硝子様変化は、経時的及び用量依存的に発現が抑制される傾向がみられた。この血管極硝子様変化は輸入細動脈の血管病変に由来するもので、糖尿病性腎症の特徴的な病変の一つであり、抑制傾向は糖尿病性腎症の進展抑制を示すものと考えられる。
【０１００】
６）血管炎は、経時的及び用量依存的に発現抑制がみられた。血管炎は、糖尿病性腎症に特徴的な病変ではないが、慢性化すると、慢性炎症細胞の浸潤により血管壁又は周辺細胞の繊維化を招き、最終的に腎硬化に進展する。ラクトフェリンは、これら腎硬化事態を抑制する可能性も持つことが考えられる。
【０１０１】
７）糸球体密度には、経時的な変化及び用量依存的な変化はみられなかった。
【０１０２】
８）腎臓の病理学的精査では、コントロールとした４ｇ／ｋｇ体重／日のＢＳＡで多くの病理所見が得られたが、血圧、尿、血液検査データからは、腎症発見に至る特異な所見を得ることができなかった。これらのことから、顕性腎炎発見の段階では、すでに腎病理学的には病態が進んでいるため、病態進展抑制には早い段階からの予防措置が必要なことが改めて確認された。
【０１０３】
９）前記８）に対して、４ｇ／ｋｇ体重／日のＬＦ摂取は、総合的に腎病理学的観点から糖尿病性腎症の病態進行抑制効果が示唆された。特に、糸球体硬化症又はメサンギウム基質増殖といった、糖尿病性腎症のエンドポイント及びエンドポイントに近い病態進展に対する抑制効果を顕著に示した。
【０１０４】
１０）以上の結果から、１日に体重１ｋｇあたり２ｇ以上のＬＦ摂取は、好適に糖尿病性腎症の特徴である糸球体硬化の発症抑制・進展遅延効果を有する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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