(57)【要約】【課題】菌根菌の胞子形成を促進させる新規の物質を見いだし、それによる菌根菌の純粋培養技術をさらに高める培養方法や農業場面での活用方法を提供する。【解決手段】菌根菌の純粋培養技術を、新たに発見した菌根菌生長促進物質、すなわちアミンまたはアミン誘導体を用いてさらに改善した。従来に比べ、菌根菌が感染し得る宿主の根や根抽出物を用いずに、菌根菌の生長を旺盛にして大量に胞子を増殖できるので、菌根菌の純粋培養技術をさらに安定化できる。アミンは菌根菌感染植物の根で生成されるので、アミンまたはアミン誘導体を農業場面で活用できる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む培養基で菌根菌を培養する
ことを特徴とする菌根菌の培養方法。
【請求項２】
請求項１記載の菌根菌の培養方法において、
前記培養基にぺプチドを加えて菌根菌を培養する
ことを特徴とする菌根菌の培養方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の菌根菌の培養方法において、
前記菌根菌は、アーバスキュラー菌根菌、エリコイド菌根菌、および外生菌根菌のいずれかである
ことを特徴とする菌根菌の培養方法。
【請求項４】
請求項１ないし３いずれかに記載の菌根菌の培養方法において、
前記培養基は、アミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む培地に、無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質を適宜加えた固形培地または液体培地のいずれかである
ことを特徴とする菌根菌の培養方法。
【請求項５】
請求項１ないし４いずれかに記載の菌根菌の培養方法において、
アミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む溶液に菌根菌胞子を浸漬した後に菌根菌を培養する
ことを特徴とする菌根菌の培養方法。
【請求項６】
請求項１ないし５いずれかに記載の菌根菌の培養方法に用いるアミンとして、菌根植物の根で生成したものを用いる
ことを特徴とする菌根菌の活用方法。
【請求項７】
エチレンジアミン、１，２−プロパンジアミン、ジメチルアミン、これらいずれかの誘導体、およびクロラミンＴの少なくともいずれかを含む
ことを特徴とする菌根菌生長調整用物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌根菌の生長、特に胞子形成を著しく促進させる菌根菌生長調整用物質による菌根菌の培養方法に関し、さらに菌根菌の純粋培養等への活用方法、およびその菌根菌生長調整用物質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の菌根菌の培養方法としては、宿主の根を用いた菌糸の培養や胞子生産方法が知られている。また、消毒した宿主の根を用いて、体外的なインビトロ（in vitro）において無菌状態下で菌根菌を培養することも知られている。すなわち、従来は、これら菌根菌の培養方法のように、絶対共生菌である菌根菌の培養においては、宿主の根なくして無菌状態下で純粋に菌根菌を培養し、胞子を得るまで増殖できないと考えられていた。
【０００３】
ところが、近年、フラッシュクロマトグラフィで得たバヒアグラス根の２５質量％のメタノール溶出物を用い、菌根菌の中でも代表的なアーバスキュラー菌根（Arbuscular Mycorrhiza：ＡＭ）菌の純粋培養が成功している（例えば、特許文献１、並びに非特許文献１および２参照）。そして、この培養方法においては、赤色光から遠赤色光までの光の照射によって、菌根菌の菌糸生長が著しく促進することも知られている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、これらの培養方法は、バヒアグラスという宿主から得た根抽出物を用いた培養基においてのものであり、バヒアグラス根の採取時期の判断が極めて重要であるとともに、胞子の生産効率が余り良くなく、実用化が容易ではない（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
これに対し、本発明者らは、ＡＭ菌の生長に関与する物質の単離・同定によって、宿主の根や根抽出物を全く用いない人工の培養基内でも、ＡＭ菌母胞子から新胞子を生産でき、数世代も継代培養できる純粋培養技術を確立した（例えば、特許文献３、並びに非特許文献４および５参照）。この純粋培養用培地には、ＡＭ菌菌糸を生長促進させて、誘引する作用を持ち、胞子形成をも促進させるトリプトファンダイマー（Trp-Trp）、ロイシルプロリン（Leu-Pro）などのペプチドが含まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−１９１６８５号公報
【特許文献２】特許第４６９１３０７号公報
【特許文献３】特許第４９７９５５１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】石井孝昭、外４名、園芸学会、１９９５年、第６４巻、別冊１、ｐ．１９０−１９１
【非特許文献２】石井孝昭、外４名、ＩＣＯＭ４（The Fourth International Conference on Mycorrhizae）、（カナダ）、２００３年、ｐ．６９６
【非特許文献３】デクレエーク（Declerck S.）、外２名、イン ビトロ カルチャー オブ マイコライザス（In Vitro Culture of Mycorrhizae）、（ドイツ）、２００５年、ｐ．１−３８８
【非特許文献４】石井孝昭および堀井幸江、園芸学研究、２００７年、第６巻、別冊２、ｐ．１３６
【非特許文献５】堀井幸江および石井孝昭、園芸学研究、２００７年、第６巻、別冊２、ｐ．１３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一方、ＡＭ菌の純粋培養技術の実用化を図るためには、ＡＭ菌の生長に関与する物質のさらなる探索が必要である。その探索の過程で、菌根菌の胞子形成を著しく促進する新規の物質、すなわちアミンおよびアミン誘導体を発見し、菌根菌を純粋培養技術で安定的に生産できる技術を作り上げたと言える。
【０００８】
ここで、菌根菌は、植物の根に共生し、宿主の植物から光合成産物を得る見返りとして、植物の養水分を促進させ、生長を旺盛にさせるとともに、病害虫や環境ストレスに対する抵抗性を植物に付与する働きを有している。このため、菌根菌の利用としては、（１）低投入で持続可能な作物生産、（２）環境に優しく、安心・安全な食料生産、（３）乾燥地・半乾燥地における環境緑化、等に着目されている。
【０００９】
以上のように、菌根菌は絶対共生微生物であることから、この菌根菌の純粋培養が容易ではないと考えられていたという問題を有している。
【００１０】
本発明は、このような点に鑑みなされたもので、新規の菌根菌生長調整用物質を見出し、菌根菌の純粋培養が容易にできる菌根菌の培養方法に加え、新規の菌根菌生長調整用物質を用いた菌根菌の活用方法、および菌根菌生長調整用物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１記載の菌根菌の培養方法は、アミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む培養基で菌根菌を培養するものである。
【００１２】
請求項２記載の菌根菌の培養方法は、請求項１記載の菌根菌の培養方法において、前記培養基にぺプチドを加えて菌根菌を培養するものである。
【００１３】
請求項３記載の菌根菌の培養方法は、請求項１または２記載の菌根菌の培養方法において、前記菌根菌は、アーバスキュラー菌根菌、エリコイド菌根菌、および外生菌根菌のいずれかであるものである。
【００１４】
請求項４記載の菌根菌の培養方法は、請求項１ないし３いずれかに記載の菌根菌の培養方法において、前記培養基は、アミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む培地に、無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質を適宜加えた固形培地または液体培地のいずれかであるものである。
【００１５】
請求項５記載の菌根菌の培養方法は、請求項１ないし４いずれかに記載の菌根菌の培養方法において、アミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む溶液に菌根菌胞子を浸漬した後に菌根菌を培養するものである。
【００１６】
請求項６記載の菌根菌の活用方法は、請求項１ないし５いずれかに記載の菌根菌の培養方法に用いるアミンとして、菌根植物の根で生成したものを用いるものである。
【００１７】
請求項７記載の菌根菌生長調整用物質は、エチレンジアミン、１，２−プロパンジアミン、ジメチルアミン、これらいずれかの誘導体、およびクロラミンＴの少なくともいずれかを含むものである。
【発明の効果】
【００１８】
請求項１記載の菌根菌の培養方法によれば、菌根菌生長促進物質であるアミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む培養基で菌根菌を培養することにより、純粋に菌根菌の胞子を生産できるから、菌根菌の純粋培養をさらに容易にできる。
【００１９】
請求項２記載の菌根菌の培養方法によれば、請求項１記載の菌根菌の培養方法において、例えばトリプトファンダイマーおよびロイシルプロリン等のぺプチドを加えた培養基で菌根菌を培養することにより、菌根菌の菌糸生長を回復でき、菌根菌の胞子を生産できるから、菌根菌の純粋培養をより効率良くできる。
【００２０】
請求項３記載の菌根菌の培養方法によれば、請求項１または２記載の菌根菌の培養方法の効果に加え、アーバスキュラー菌根菌、エリコイド菌根菌および外生菌根菌のいずれの菌根菌であっても、これら菌根菌の胞子を効率良く増殖することができる。
【００２１】
請求項４記載の菌根菌の培養方法によれば、請求項１ないし３いずれかに記載の菌根菌の培養方法において、アミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む培地に、無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質を適宜加えた固形培地または液体培地のいずれかの培地基とすることにより、菌根菌の胞子形成率を向上できる。
【００２２】
請求項５記載の菌根菌の培養方法によれば、請請求項１ないし４いずれか記載の菌根菌の培養方法において、培養前の胞子をアミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む溶液に浸漬させることにより、胞子形成を誘発させやすくできるから、菌根菌の胞子形成率をより向上できる。
【００２３】
請求項６記載の菌根菌の活用方法によれば、菌根植物の根では菌根菌の成長をつかさどるアミンが生成されるので、それらのアミンおよびアミン誘導体を農業場面で活用することができる。
【００２４】
請求項７記載の菌根菌生長調整用物質によれば、エチレンジアミン、１，２−プロパンジアミン、ジメチルアミン、これらいずれかの誘導体、およびクロラミンＴの少なくともいずれかを含むため、この菌根菌生長調整用物質にて菌根菌を培養することにより、純粋に菌根菌の胞子を生産でき、菌根菌の純粋培養をさらに容易にできる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る実施例１においてアミン類が純粋培養下での菌根菌の菌糸生長に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】上記実施例１においてアミン類が純粋培養下での菌根菌の胞子形成に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】本発明に係る実施例２においてエチレンジアミン（ＥＤＡ）が純粋培養下での菌根菌の胞子形成に及ぼす影響を示す顕微鏡写真である。
【図４】上記実施例２においてＥＤＡとペプチドとの併用処理が純粋培養下での菌根菌の胞子形成に及ぼす影響を示す顕微鏡写真で、（ａ）は１．５質量％ゲルライト固体培地（純粋培養２か月後）、（ｂ）は液体培地（純粋培養３か月後）である。
【図５】本発明に係る実施例３において菌根菌（Glomus clarum）胞子へのクロラミンＴ処理と胞子形成とを示す顕微鏡写真である。
【図６】本発明に係る実施例４においてバヒアグラス根からのアミンの抽出方法を示すフローチャートである。
【図７】上記実施例４において菌根菌感染植物における根内のアミンのクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
次に、本発明の菌根菌の培養方法の一実施形態について説明する。
【００２７】
まず、本発明に係る菌糸菌の培養方法は、菌根菌が感染し得る宿主の根や根抽出物を全く用いない人工の培養基を用い、この培養基に活性炭素繊維を添加したり、光環境条件を調整したりすることによって、菌根菌の菌糸および胞子を純粋に増殖できる菌根菌の純粋培養技術である。なお、この菌根菌としては、この種の菌根菌を代表とするアーバスキュラー菌根（ＡＭ菌）（ＶＡ菌根菌）、エリコイド菌根菌および外生菌根菌のいずれかが用いられる。ただし、これらＡＭ菌、エリコイド菌根菌および外生菌根菌以外の菌根菌であっても用いることができる。
【００２８】
また、この菌根菌の純粋培養技術には、新たに発見した菌根菌生長調整用物質としての菌根菌生長促進物質であるアミンとともに、これまでに見出されていた菌根菌生長促進物質であるペプチドや、菌根菌の栄養素、例えば無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質等を適宜添加した固形培地または液体培地のような人工の培養基を用いる。また、菌根菌生長促進物質としては、エチレンジアミン、１、２−プロパンジアミンおよびジメチルアミン等のアミンや、クロラミンＴ等のアミン誘導体が用いられ、これらアミンおよびアミン誘導体の少なくともいずれかを含む菌根菌生長調整用物質が、菌根菌の培養基として用いられる。
【００２９】
ここで、エチレンジアミンおよび１、２−プロパンジアミン等のアミンは、菌根菌の胞子形成を促進させる作用を有するとともに、菌根菌が感染した根で生成される物質である。また、クロラミンＴは、消毒剤などに用いられる物質であるが、菌根菌の胞子形成を誘発させる作用を有しているので、アミンおよびペプチドを加えた培養基で菌根菌を培養する前の胞子表面に生息する雑菌の消毒に効果的であるとともに、胞子形成を刺激させる有効な胞子処理剤である。
【実施例１】
【００３０】
まず、実施例１として、本発明のアミンを用いた菌根菌の純粋培養技術による新しいＡＭ菌胞子生産について説明する。
【００３１】
石井および堀井（石井孝昭・堀井幸江、園芸学研究、２００７年、第６巻別冊２、ｐ．１３６）が開発した表１に示す基本培養液を含むゲルライト（１．５質量％）固形培地をオートクレーブした後、孔径０．２μｍの滅菌フィルタでろ過した図１に示すアミン類を１０μＭ、３０μＭおよび１００μＭの濃度になるように加え、直径５ｃｍのシャーレに入れた。
【表１】
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【００３２】
その後、この培地に表面殺菌を施したグロムス・クララム（Glomus clarum）ＩＫ９７胞子を置床し、２６℃の赤色発光ダイオード（ＬＥＤ）による光照射下(１０μｍｏｌ／ｍ２・ｓｅｃ)で培養した。殺菌方法は、胞子を消毒剤（chloramine T：７０００ｐｐｍ、streptomycin：５６ｐｐｍ、chloramphenicol：２１ｐｐｍ、およびTween ８０：数滴）に投入し、超音波洗浄機で数秒間処理した後、１２分間静置して殺菌した。さらに、培養２か月後、菌糸生長および新しく形成された胞子数を調査した。なお、菌糸長は、スタイラスペン付のタブレット（WACOM Tablet UD−0608II）と自作のプログラムソフトウェア（石井孝昭、日本農業教育学会誌 １９９３年、第２４巻、ｐ．２５−３６）を用いて計測した。
【００３３】
この結果、図１に示すように、供試したアミン類は、菌根菌の菌糸生長促進効果を示さず、むしろ生長を抑制するものが多かった。しかしながら、それらの中で、第一アミンおよび第二アミンに含まれるアミン類は、胞子形成を誘発させる作用を有していた。特に、図２に示すように、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、１，２−プロパンジアミン（ＰＤＡ）およびジメチルアミンの効果は著しく大きいものであった。なお、これら図１および図２中の垂線は、標準誤差（ｎ＝８）を表している。
【実施例２】
【００３４】
次いで、胞子形成促進効果が大きなアミン、すなわちＥＤＡと、これまでに発見したペプチド（Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＬｕｅ−Ｐｒｏ、各１０ｐｐｍ）との併用処理が菌糸生長および胞子形成に及ぼす影響について、ゲルライト固形培地上で検討した。また、この研究成果を基に、最適な濃度下での液体培養の調査も行った。殺菌方法および培養方法については、上記実施例１と同様とした。
【００３５】
この結果、純粋培養下における菌根菌（Glomus clarum）の菌糸生長および胞子形成に及ぼすＥＤＡおよびＰＤＡの効果をまとめた表２に示すように、基本培養液のみの区においては菌糸生長が旺盛であったが、胞子形成は全くみられなかった。しかしながら、ペプチド（Ｔｒｐ−Ｔｒｐ，１０ｐｐｍ  ＋  Ｌｕｅ−Ｐｒｏ，１０ｐｐｍ）添加区においては、既報（石井孝昭・堀井幸江、園芸学研究、２００７年、６巻別冊２、ｐ１３６）と同様に、菌糸生長が良好で胞子形成も観察された。一方、ＥＤＡ添加区では、１００μＭおよび２５０μＭのいずれにおいても菌糸生長が阻害され、特に２５０μＭ区では顕著であった。
【表２】
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【００３６】
ところが、図３に示すように、いずれのＥＤＡ添加区においても母胞子１個から新しい胞子が数個形成された。ＥＤＡとペプチドとの併用添加区では、ＥＤＡによる菌糸生長阻害効果が軽減され、胞子形成が促進される傾向が確認できた。なお、図３において、ＭＳは母胞子を示し、ＥＤＡの濃度が１００μＭとされている。
【００３７】
特に、図４（ａ）に示すように、ＥＤＡ２５０μＭ＋ペプチド添加区では、菌糸生長および胞子形成ともに良好であった。さらに、ＥＤＡとペプチドとの併用処理における胞子形成促進効果を液体培養下で検討したところ、図４（ｂ）に示すように、培養３か月後の解体時には１個の母胞子から多数の新胞子が形成されていた。なお、図４（ａ）において、ＭＳは母胞子を示し、Ｓは新胞子を示している。
【実施例３】
【００３８】
以上のように、胞子形成にアミンが関与することが明らかであることから、アミン誘導体であり消毒剤でもあるクロラミンＴを用いて、胞子表面の消毒とともに、胞子形成に及ぼす影響について調査した。方法としては、７０００ｐｐｍ、８０００ｐｐｍおよび１４０００ｐｐｍのクロラミンＴ溶液に３０分間浸漬し胞子を消毒した後、素寒天培地に置床した。その後、２６℃の赤色発光ダイオードによる光照射下(１０μｍｏｌ／ｍ２・ｓｅｃ)で培養した。この成果を踏まえて、クロラミンＴ８０００ｐｐｍ溶液内に、胞子を１時間、４時間および８時間浸漬させた後、素寒天培地に置床し培養を行った。培養条件は上記実施例１と同様とした。
【００３９】
この結果、菌根菌（Glomus clarum）胞子へのクロラミンＴ処理の効果をまとめた表３に示すように、一般に消毒に用いられている濃度、７０００ｐｐｍでは胞子形成はみられなかったものの、８０００ｐｐｍでは母胞子１個から新しい胞子が６個程度形成された。しかしながら、１４０００ｐｐｍになると胞子形成は阻害される傾向が確認できた。さらに、菌根菌胞子をクロラミンＴ８０００ｐｐｍ溶液内に１時間、４時間および８時間浸漬させたところ、いずれの区でも胞子形成が確認できたが、特に、４時間浸漬区では、図５に示すように、多数の新しい胞子が観察された。なお、図５中のＭＳは母胞子を示している。
【表３】
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【実施例４】
【００４０】
無加温のガラスハウス内で育成させたＡＭ菌感染および非感染のバヒアグラス根内からアミン類を抽出して分析した。具体的に、このアミン類の抽出および分析方法は、図６に示すように、根内のアミン類を４ｍＭメタンスルホン酸で抽出し、ろ過した後、Shodex IC-YS-50カラムを装備した電気伝導度検出器付き高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析した。このＨＰＬＣの分析条件は、次のとおりである。
【００４１】
カラム： Shodex IC-YS-50、４．６ｍｍＩＤ  ×  １２５ｍｍ
溶離液：４ｍＭメタンスルホン酸
流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：Hitachi L3720 Electric Conductivity Detector
ポンプ：Hitachi Pump L-2130
【００４２】
この結果、非菌根のバヒアグラス根ではアミン類は検出されなかった。しかしながら、グロムス・ファシキュラータム（G. fasciculatum）、グロムス・クララム（G. clarum）およびギガスポラ・マルガリータ（Gi. margarita）のＡＭ菌が感染した根では、図７に示すように、ジエタノールアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ＰＤＡ、ＥＤＡ等のアミン類が検出された。なお、図７において、１はＮａ、２はＮＨ４、３はジエタノールアミン、４はＫ、５はジメチルアミン、６はトリエチルアミン、７はＭｇ、８はＣａ、９はＰＤＡ、１０はＥＤＡを示している。特に、ＥＤＡは、いずれの菌根菌感染根でも検出されたが、ＰＤＡは、グロムス・クララム感染根でのみ分析された。また、菌根菌が感染したバヒアグラスにおける根内のＥＤＡおよびＰＤＡの濃度をまとめた表４に示すように、それらの含量は、胞子形成促進に効果のある濃度で検出された。
【表４】
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【００４３】
以上の結果、胞子形成に効果のあるペプチド以外に、アミン、特に第一アミンおよび第二アミンが菌根菌の胞子形成を著しく促進させる重要な働きを持っていることや、これらの物質は菌根菌が感染した植物において生産されることが見出された。特に、菌根植物において生産されたアミンの中で、ＥＤＡ、ＰＤＡなどはキレート物質であるため、菌根菌の感染によって生成されたＥＤＡ、ＰＤＡなどのアミンが菌根植物の養分吸収に密接に関与していることは非常に興味深く、これらのアミンを土壌などに施用して植物における菌根形成や養分吸収の促進に効果を得ることができるものと考えられる。
【００４４】
ＡＭ菌の純粋培養において、ＥＤＡのようなアミンとペプチドとの併用添加は、それぞれの単独添加よりも胞子形成を高めた。この傾向は液体培養下でも確認でき、この純粋培養技術を用いて、菌根菌の胞子を純粋に安定的に大量生産できるという重要な意味を有している。また実用化に向け、ＥＤＡとペプチドとを同時に添加して実験を行ったところ、ＥＤＡ等のアミンは、菌糸生長をわずかに阻害する傾向が認められたので、ＥＤＡは、菌糸生長が旺盛になったときに添加することが良いと思われる。すなわち、本発明に係る培養方法は、菌根菌が感染し得る宿主の根や根抽出物を用いずに、菌根菌の生長を旺盛にして大量に胞子を増殖できるので、さらに菌根菌の純粋培養技術を安定化できる。また、アミンは菌根菌感染植物の根で生成されるので、アミンあるいはその誘導体を農業場面で活用できる。
【００４５】
一方、ＡＭ菌の増殖方法としては、遺伝子組み換えの毛状根を宿主とした技術がある（Becard, G. & Fortin, J. A. 1988年. New Phytol. 108: 211−218; St-Arnaud, M. C., Hamel, C., Vimard, B., Caron, M. & Fortin, J. A. 1996年. Mycol. Res. 100: 328-332）。この技術を用いることにより、インビトロでの安全なＡＭ菌の生産が可能であるように思われる。しかしながら、ＡＭ菌は宿主から細胞核を奪うので、毛状根を用いた培養では、変異遺伝子によるＡＭ菌への影響やその変異遺伝子の自然環境への流出や拡大が懸念される。それゆえ、ＡＭ菌の増殖および保存を安心かつ安全に行うためには、本発明を用いてさらなる改良が加えられた菌根菌の純粋培養技術を用い、世界のＡＭ菌の増殖や保存を進めていかなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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