(57)【要約】【課題】検量線を使用することなく、ＡＴＰ濃度を経時的に測定することが可能なＡＴＰの定量方法及びこの方法に用いるキットを提供すること。【解決手段】ＡＴＰをルシフェラーゼの触媒活性の下でルシフェリンと反応させることにより発生する発光強度を測定することにより試料中に含まれるＡＴＰを定量する方法であって、前記ルシフェラーゼとしてＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる少なくとも２つのルシフェラーゼを使用し、各ルシフェラーゼについての発光強度を同じ時系列で少なくとも２つの時点において測定することを含むＡＴＰの定量方法。【選択図】図１
2014161275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰをルシフェラーゼの触媒活性の下でルシフェリンと反応させることにより発生する発光強度を測定することにより試料中に含まれるＡＴＰを定量する方法であって、前記ルシフェラーゼとしてＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる少なくとも２つのルシフェラーゼを使用し、各ルシフェラーゼについての発光強度を同じ時系列で少なくとも２つの時点において測定することを含むＡＴＰの定量方法。
【請求項２】
時系列的に発光強度が測定された少なくとも２つの前記ルシフェラーゼの中から、第一のルシフェラーゼと第二のルシフェラーゼを選択し、第一のルシフェラーゼにおける任意の２つの時点における発光強度の比と、第二のルシフェラーゼにおける、前記２つの時点と同じ２つの時点における発光強度の比とを求めることを含む、請求項１に記載のＡＴＰの定量方法。
【請求項３】
第一のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値と、第二のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値と、第一のルシフェラーゼにおける任意の２つの時点における発光強度の比と、第二のルシフェラーゼにおける、前記２つの時点と同じ２つの時点における発光強度の比を、ミカエリス・メンテン式に代入することにより下式（Ｉ）及び（ＩＩ）を導き、前記２つの時点におけるＡＴＰ濃度が定量される、請求項２に記載のＡＴＰの定量方法。
【数１】
2014161275.tif 000012
式中の各記号は以下に示す意味を表す。
Ｓ１：時点ｔ１におけるＡＴＰ濃度（Ｍ）
Ｓ２：時点ｔ２におけるＡＴＰ濃度（Ｍ）
Ｋｍａ：第一のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値
Ｋｍｂ：第二のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値
Ｘａ：Ｖａ２／Ｖａ１
Ｘｂ：Ｖｂ２／Ｖｂ１
Ｖａ１：時点ｔ１における第一のルシフェラーゼの発光強度
Ｖａ２：時点ｔ２における第一のルシフェラーゼの発光強度
Ｖｂ１：時点ｔ１における第二のルシフェラーゼの発光強度
Ｖｂ２：時点ｔ２における第二のルシフェラーゼの発光強度
【請求項４】
時系列的に発光強度が測定される少なくとも２つの前記ルシフェラーゼにおけるＡＴＰに対するＫｍ値の差が１０μＭ以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＴＰの定量方法。
【請求項５】
時系列的に発光強度が測定される少なくとも２つの前記ルシフェラーゼ中、最も高いＫｍ値を有するルシフェラーゼにおけるＫｍ値が１００μＭ以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＴＰの定量方法。
【請求項６】
時系列的に発光強度が測定される少なくとも２つの前記ルシフェラーゼの中の１つが、マレーシア産のＬｕｃｉｏｌａ属に属するホタルに由来するルシフェラーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＴＰの定量方法。
【請求項７】
マレーシア産のＬｕｃｉｏｌａ属に属するホタルに由来する前記ルシフェラーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＡＴＰの定量方法。
【請求項８】
時系列的に発光強度が測定される少なくとも２つの前記ルシフェラーゼにおける最大発光波長が互いに異なり、これらルシフェラーゼがＡＴＰを含む同じ試料中に導入される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＴＰの定量方法。
【請求項９】
ＡＴＰを含む前記試料が生体由来である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＡＴＰの定量方法。
【請求項１０】
前記生体が細胞である、請求項９に記載のＡＴＰの定量方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＴＰの定量方法において使用される、ＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる２以上のルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれ含む２以上の核酸を含むキット。
【請求項１２】
少なくとも２つの前記ルシフェラーゼ遺伝子におけるＡＴＰに対するＫｍ値の差が
１０μＭ以上である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記核酸の一つが配列番号２に示される塩基配列を含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光を利用したＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の定量方法、及び、この方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を測定するためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光量を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。
【０００３】
また、ルシフェラーゼの発光反応は、ＡＴＰ量に依存するため、ルシフェラーゼは、ＡＴＰの定量的検出のために利用されている。ＡＴＰは、細胞内でのエネルギー通貨であるとともに、シグナル伝達系のリン酸化反応の基質でもあり、細胞内で非常に重要な役割を担っている。そのため、細胞内のＡＴＰ濃度の測定は細胞機能解析にとって重要である。
【０００４】
従来において細胞内のＡＴＰ量の測定は、例えば、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびルシフェラーゼ等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量するという手順で行われる。すなわち、発光量の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点での発光量は、細胞全体の平均値として測定される。すなわち、個々の細胞の持つ情報は失われ、単一の細胞内のＡＴＰ濃度を知ることはできず、また、時間経過によるＡＴＰ濃度の変化を知ることもできない。
【０００５】
時間経過に沿ってＡＴＰ量を分析するには、生きた細胞からの発光量を経時的に測定する必要がある。このような測定は、通常、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、全細胞集団からの発光量を一定時間ごとに定量し、これをＡＴＰ標準液を用いて作成した検量線に照らして発光量に対するＡＴＰ濃度を定量することにより行われる（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、このような測定方法は、細胞集団全体の観測に止まり、個々の細胞におけるＡＴＰ濃度を経時的に測定することはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｉｅｒｒｅ  Ｍａｅｃｈｌｅｒ，Ｈａｉｙａｎ  Ｗａｎｇ，Ｃｌａｅｓ  Ｂ．Ｗｏｌｌｈｅｉｍ，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ＡＴＰ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ”，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２２，ｐｐ．２８−３３２，１９９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
同一の生きた単一細胞内のＡＴＰ濃度を時系列で定量することができれば、ＡＴＰの新しい役割が解明されることが期待されるため、細胞機能解析にとって極めて重要であるところ、上掲の通り、この要望に応えられる適切なＡＴＰ（ATMになっておりましたので、訂正しました。）の定量技術が確立されていないのが実情である。  
本発明は、検量線を使用することなく、ＡＴＰ濃度を経時的に測定することが可能なＡＴＰの定量方法及びこの方法に用いるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を達成するために、本発明に係るＡＴＰの定量方法は、一態様において、ＡＴＰをルシフェラーゼの触媒活性の下でルシフェリンと反応させることにより発生する発光強度を測定することにより試料中に含まれるＡＴＰを定量する方法であって、上記ルシフェラーゼとしてＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる少なくとも２つのルシフェラーゼを使用し、各ルシフェラーゼについての発光強度を同じ時系列で少なくとも２つの時点において測定することを含む。
【０００９】
本発明の一形態において、時系列的に発光強度が測定された少なくとも２つの上記ルシフェラーゼの中から、第一のルシフェラーゼと第二のルシフェラーゼが選択され、第一のルシフェラーゼにおける任意の２つの時点における発光強度の比と、第二のルシフェラーゼにおける、上記２つの時点と同じ２つの時点における発光強度の比とが求められる。
【００１０】
例えば、この第一のルシフェラーゼにおける任意の２つの時点における発光強度の比と、第二のルシフェラーゼにおける、上記２つの時点と同じ２つの時点における発光強度の比と、更に、第一のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値と、第二のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値を、ミカエリス・メンテン式に代入することにより下式（Ｉ）及び（ＩＩ）が導かれ、上記２つの時点におけるＡＴＰ濃度が定量される。
【００１１】
【数１】
2014161275.tif 000003
【００１２】
式中の各記号は以下に示す意味を表す。  
Ｓ１：時点ｔ１におけるＡＴＰ濃度（Ｍ）
Ｓ２：時点ｔ２におけるＡＴＰ濃度（Ｍ）
Ｋｍａ：第一のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値
Ｋｍｂ：第二のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値
Ｘａ：Ｖａ２／Ｖａ１
Ｘｂ：Ｖｂ２／Ｖｂ１
Ｖａ１：時点ｔ１における第一のルシフェラーゼの発光強度
Ｖａ２：時点ｔ２における第一のルシフェラーゼの発光強度
Ｖｂ１：時点ｔ１における第二のルシフェラーゼの発光強度
Ｖｂ２：時点ｔ２における第二のルシフェラーゼの発光強度
【００１３】
本発明の一形態において、時系列的に発光強度が測定される少なくとも２つの上記ルシフェラーゼにおけるＡＴＰに対するＫｍ値の差は、１０μＭ以上であってよい。  
また、本発明の一形態において、時系列的に発光強度が測定される少なくとも２つの上記ルシフェラーゼ中、最も高いＫｍ値を有するルシフェラーゼにおけるＫｍ値が１００μＭ以上であってよい。
【００１４】
また、本発明の一形態において、時系列的に発光強度が測定される少なくとも２つの上記ルシフェラーゼの中の１つが、マレーシア産のＬｕｃｉｏｌａ属に属するホタルに由来するルシフェラーゼであってよい。  
また、本発明の一形態において、マレーシア産のＬｕｃｉｏｌａ属に属するホタルに由来する上記ルシフェラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むものであってよい。
【００１５】
また、本発明の一形態において、時系列的に発光強度が測定される少なくとも２つの上記ルシフェラーゼにおける最大発光波長が互いに異なり、これらルシフェラーゼがＡＴＰを含む同じ試料中に導入され得る。  
また、本発明の一形態において、ＡＴＰを含む上記試料は生体由来であってよく、また、この生体は、例えば細胞であってよい。
【００１６】
本発明は、他の態様において、上掲のＡＴＰ定量方法において使用される、ＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる２以上のルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれ含む２以上の核酸を含むキットに関する。
【００１７】
本発明の一形態において、このキットにおける少なくとも２つの上記ルシフェラーゼ遺伝子におけるＡＴＰに対するＫｍ値の差は、１０μＭ以上であってよい。
また、本発明の一形態において、このキットに含まれる核酸の一つは、配列番号２に示される塩基配列を含むものであってよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、検量線を使用することなく、ＡＴＰ濃度を経時的に測定することが可能なＡＴＰの定量技術が提供されたため、単一の生細胞内のＡＴＰ濃度における経時による変化量を測定することが可能になった。これにより、ＡＴＰの新しい役割が解明されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｋｍ値が互いに異なる２つのルシフェラーゼの触媒反応における、発光強度とＡＴＰ濃度との関係を示す図。
【図２】本発明の一形態において使用されるＳＰ２ルシフェラーゼの各種ｐＨにおける発光スペクトルを示す図。
【図３】本発明の一形態において測定される、Ｋｍ値が互いに異なる２つのルシフェラーゼの発光強度の経時変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。  
ルシフェラーゼは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。ルシフェラーゼは、ＡＴＰに感受性があり、ＡＴＰの濃度変化に応じて発光強度が変化する。本発明に係るＡＴＰの定量方法は、このルシフェラーゼによる発光を利用したものであり、ＡＴＰをルシフェラーゼの触媒活性の下でルシフェリンと反応させることにより発生する発光強度を測定することにより試料中に含まれるＡＴＰを定量する。
【００２１】
ルシフェラーゼのＡＴＰに対する感受性は、酵素学的パラメーターの１つであるミカエリス定数（Ｋｍ）で表される。ここにいう、ＡＴＰに対するＫｍとは、ルシフェラーゼによって触媒されるＡＴＰとルシフェリンとの反応において、ルシフェリンが十分に存在している場合に、ＡＴＰ濃度と反応速度との関係を示すミカエリス・メンテン式におけるＫｍである。すなわち、以下の式（１）に示されるミカエリス・メンテン式におけるＫｍである。
【００２２】
【数２】
2014161275.tif 000004
【００２３】
この式において、ｖは反応速度または発光強度を意味し、［Ｓ］はＡＴＰ濃度を意味する。また、ＶｍａｘはＡＴＰが十分量存在するときの反応速度を意味する。
【００２４】
図１は、ルシフェラーゼの触媒反応におけるＡＴＰ濃度と発光強度との関係を、ＡＴＰ濃度を横軸とし発光強度を縦軸としてプロットしたものであり、この図には、ＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる２つのルシフェラーゼに関するプロットが示されている。この図から、同じＡＴＰ濃度の変化量に対する発光強度の変化量が、ＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる２つのルシフェラーゼの間で異なっていることがわかる。
【００２５】
本発明に係るＡＴＰの定量方法は、この知見に基づき開発されたものであり、ＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる少なくとも２つのルシフェラーゼを使用し、各ルシフェラーゼについての発光強度を同じ時系列で少なくとも２つの時点において測定することを第一の特徴とするものである。
【００２６】
具体的には、上記方法により時系列的に発光強度が測定された少なくとも２つのルシフェラーゼの中から、第一のルシフェラーゼと第二のルシフェラーゼを選択し、第一のルシフェラーゼにおける任意の２つの時点（ｔ１、ｔ２）における発光強度（Ｖａ１、Ｖａ２）の比（Ｖａ２／Ｖａ１＝Ｘａ）と、第二のルシフェラーゼにおける、前記２つの時点と同じ２つの時点（ｔ１、ｔ２）における発光強度（Ｖｂ１、Ｖｂ２）の比（Ｖｂ２、Ｖｂ１＝Ｘｂ）とを求める。得られたこれら２つの比（Ｘａ、Ｘｂ）と、第一のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値（Ｋｍａ）と、第二のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値（Ｋｍｂ）とを、ミカエリス・メンテン式（上掲の式（１））に代入し、時点ｔ１におけるＡＴＰ濃度（Ｓ１）、及び、時点ｔ２におけるＡＴＰ濃度（Ｓ２）について解くことにより、下記に示す式（Ｉ）及び（ＩＩ）を得る。
【００２７】
【数３】
2014161275.tif 000005
【００２８】
式中の各記号は以下に示す意味を表す。
Ｓ１：時点ｔ１におけるＡＴＰ濃度（Ｍ）
Ｓ２：時点ｔ２におけるＡＴＰ濃度（Ｍ）
Ｋｍａ：第一のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値
Ｋｍｂ：第二のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値
Ｘａ：Ｖａ２／Ｖａ１
Ｘｂ：Ｖｂ２／Ｖｂ１
Ｖａ１：時点ｔ１における第一のルシフェラーゼの発光強度
Ｖａ２：時点ｔ２における第一のルシフェラーゼの発光強度
Ｖｂ１：時点ｔ１における第二のルシフェラーゼの発光強度
Ｖｂ２：時点ｔ２における第二のルシフェラーゼの発光強度
【００２９】
本発明に係るＡＴＰの定量方法によれば、ＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる第一及び第二のルシフェラーゼの各Ｋｍ値と、上記定量方法により時系列的に発光強度が測定された第一のルシフェラーゼにおける任意の２つの時点における発光強度の比と、第二のルシフェラーゼにおける、上記２つの時点と同じ２つの時点における発光強度の比とを求めることにより、ＡＴＰ標準液を用いて作成される検量線を使用することなく、ＡＴＰ濃度を時系列で測定することが可能となる。
【００３０】
本発明に係るＡＴＰの定量方法に使用される少なくとも２つのルシフェラーゼは、精度等の観点から、Ｋｍ値の差が１０μＭ以上であることが好ましく、１００μＭ以上であることがより好ましく、５００μＭ以上であることが更に好ましい。
【００３１】
本発明の一形態において、ＡＴＰの定量方法に使用される少なくとも２つのルシフェラーゼは、ＡＴＰに対するＫｍ値が高いことが好ましい。Ｋｍ値が高いルシフェラーゼは、ＡＴＰ濃度に対する測定のダイナミックレンジが広いため、より高いＡＴＰ濃度における測定が可能となり、生物学または医学の研究において生きた試料中のＡＴＰ量の経時的測定にも応用でき好ましい。特に限定されるものではないが、例えば、Ｋｍ値は１００μＭ以上であることが好ましい。
【００３２】
また、本発明の一形態において、ＡＴＰの定量方法に使用される少なくとも２つのルシフェラーゼ中、最も高いＫｍ値を有するルシフェラーゼにおけるＡＴＰに対するＫｍ値は、例えば、１００μＭ以上であることが好ましく、５００μＭ以上であることがより好ましく、１０００μＭ以上であることが更に好ましい。
【００３３】
また、本発明の一形態において、ＡＴＰの定量方法に使用されるルシフェラーゼとして、マレーシア産のＬｕｃｉｏｌａ属に属するホタルに由来するルシフェラーゼを含むことが好ましい。このルシフェラーゼは、特にＫｍ値が高い。例えば、後述するＳＰ２ルシフェラーゼにおいては１２６０μＭ付近のＫｍ値を有し、特に有利な効果を奏する。すなわち、このマレーシア産のＬｕｃｉｏｌａ属に属するホタルに由来するルシフェラーゼは、ＡＴＰ濃度に対する測定のダイナミックレンジが広いため、より高いＡＴＰ濃度における測定が可能となり、また、ＡＴＰ濃度の変化に対する発光量の変化の割合が高い。例えば、後述するＳＰ２ルシフェラーゼにあっては、ＡＴＰ量が１．３ｍＭから２．５ｍＭに増大した場合、１５．７％の発光強度変化を起こすと考えられる。このようなルシフェラーゼを使用することで、測定の際に検出すべきシグナルとバックグラウンドとを明瞭に区別できることは言うまでもなく、本発明の定量方法において使用される他のルシフェラーゼとのＫｍ値の差を大きくすることができるため、細胞内ＡＴＰが高濃度域で推移した場合であっても、経時的な試料内ＡＴＰ量の変化を精度よく継続して測定することができる。
【００３４】
このマレーシア産のＬｕｃｉｏｌａ属に属するホタルに由来するルシフェラーゼの一例として、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼを挙げることができる。当該ルシフェラーゼは、主としてマレーシアに生息するホタルであって、現時点においてＬｕｃｉｏｌａ属に属することは判明しているものの正式な学名が決定されていないホタルから得られたものである。本発明において、当該ホタルをＬｕｃｉｏｌａ  ｓｐ２と称し、このホタルから取得されたルシフェラーゼをＳＰ２ルシフェラーゼと称する。図２に示された発光スペクトルによれば、ＳＰ２ルシフェラーゼのｐＨ８における最大発光波長は５７２ｎｍ付近であることがわかる。配列番号１は以下の通りである。
【００３５】
【表Ａ】
2014161275.tif 000006
【００３６】
本発明に係るＡＴＰの定量方法において、ＡＴＰ濃度を定量する試料は、ルシフェラーゼ・ルシフェリン反応が生じ得るあらゆる試料であってよい。例えば、試料は、細胞または溶液とすることができる。細胞とは、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞または動物細胞であってよい。動物細胞は、哺乳細胞であってよく、例えばマウス、サルまたはヒトの細胞であってよい。また、試料は、細胞の集合した組織であってもよい。試料として使用する溶液は、生体由来の溶液であってよく、または非生体由来の溶液であってよい。生体由来の溶液は、たとえば細胞破砕液または組織破砕液であってよい。
【００３７】
本発明において使用される、ＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる２以上のルシフェラーゼは、１つの試料に導入されてもよいし、２以上に分けられた試料にそれぞれ別々に導入されてもよい。１つの試料に２以上のルシフェラーゼが導入される場合、各ルシフェラーゼは最大発光波長が互いに異なることが必要である。
【００３８】
ルシフェラーゼを試料に導入する工程は既知の手法によって行うことができる。  
試料が細胞である場合、当該手法の１つは、細胞外で精製したルシフェラーゼを細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によってルシフェラーゼを細胞内に直接注入することができる。または、ルシフェラーゼを含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによってルシフェラーゼを細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まずルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内でルシフェラーゼを発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターからルシフェラーゼを発現させることができる。試料として細胞を使用する場合、細胞は生きた状態でも固定した状態でもよい。例えば、細胞の機能の一部または全部が維持された生きた状態の細胞を使用することで、同一細胞内のＡＴＰ濃度の経時に伴う変化を測定したり、外部からの刺激に応じた同一細胞内のＡＴＰ濃度の変化を経時的に測定したりすることができる。
【００３９】
試料が溶液である場合、その手法の１つは、当該溶液とルシフェラーゼと含む溶液とを混合することである。対象とする溶液として細胞破砕液または組織破砕液を使用する場合は、それらの溶液にルシフェラーゼを添加してもよい。
【００４０】
ルシフェラーゼの発光を検出する工程は既知の手法によって行うことができる。例えば、ルシフェラーゼを含む試料にルシフェリンおよびＭｇ２＋イオン等を適宜与えて、ルシフェラーゼによる発光反応を生じさせ、発生した発光を検出装置により検出することができる。ここにいう検出装置とは、特定の波長の発光または特定の波長域の発光を検出できる装置である。例えば、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ社）を使用することができる。検出装置によって、特定の波長（例えば、発光スペクトルにおいてピークを示す波長）の発光を検出し、または特定の波長域（例えば、発光スペクトルにおいてシグナルが検出できる全域）の発光を検出する。試料が溶液である場合、当該溶液に対して、ルシフェラーゼと、ルシフェリンおよびＭｇ２＋イオン等を含む溶液とを同時に添加してもよい。また、試験対象となる溶液とルシフェリンおよびＭｇ２＋イオン等を含む溶液とを予め混合しておき、そこへルシフェラーゼを添加することで発光反応を開始させてもよい。
【００４１】
本発明は、他の態様において、上述した本発明に係るＡＴＰの定量方法において使用される試薬キットに関する。この試薬キットは、ＡＴＰに対するＫｍ値が互いに異なる２以上のルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれ含む２以上の核酸を含むものであり、一例において、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸を含む。配列番号２は以下の通りである。
【００４２】
【表Ｂ】
2014161275.tif 000007
【００４３】
本発明に係るＡＴＰの定量方法は、検量線を使用することなく、ＡＴＰ濃度を経時的に測定することが可能であるため、ルミノメーター又は発光イメージングを用いた単一生細胞内のＡＴＰ濃度の測定に応用することができる。例えば、発光色とＡＴＰに対するＫｍ値の異なる２種類のルシフェラーゼを使用し、フィルターによる分光を行うことで、生細胞内のＡＴＰ濃度の経時による変化を連続的に検出することができる。
【実施例】
【００４４】
＜例１：ＡＴＰに対するＫｍ値の決定＞
本発明に係るＡＴＰの定量方法において必要なルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値の決定方法について、本発明において好適に使用し得る２つのルシフェラーゼの組み合わせ（ＳＰ２ルシフェラーゼ、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ）を用いて説明する。
【００４５】
［発光タンパク質の精製］
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌにＰ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼおよびＳＰ２ルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを添加し、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分インキュベートした。その後、大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌと０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、５０％グリセリン溶液とした。保存は−２０℃で行った。
【００４６】
［速度論的解析］
・Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰの濃度の決定
Ｄ−ルシフェリン溶液中のＤ−ルシフェリン濃度およびＡＴＰ溶液中のＡＴＰ濃度を以下の通りに決定した。  
ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて、Ｄ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。  
Ｄ−ルシフェリン：λｍａｘ  ３２８ｎｍ、ε１８２００、ｐＨ５．０
ＡＴＰ：λｍａｘ  ２５９ｎｍ、ε１５４００、ｐＨ７．０。
【００４７】
測定はそれぞれ１０回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したＤ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液を用いて、以下のＫｍ値算出を行った。
【００４８】
・ＡＴＰに対するＫｍ値の測定
様々なＡＴＰ濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ＡＴＰに対する各ルシフェラーゼのＫｍ値を決定した。
【００４９】
ＡＴＰを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の１２種類のＡＴＰ溶液を作製した。これらの溶液は、ＡＴＰの終濃度がそれぞれ５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０、６４０、８００、１２８０、１６００および１９２０μＭとなるようにＡＴＰを含む。これらのＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、１ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）の標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時にフォトンカウント測定を行った。測定は室温で行い、各ＡＴＰ濃度について３回ずつ実施した。得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ＡＴＰ濃度Ｓに対してプロットした。得られた曲線を図１に示す。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。
【００５０】
上記のようにして決定されたＡＴＰに対するＫｍ値を表１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
＜例２：ＡＴＰ濃度の経時変化の測定＞
上記のようにして測定したＫｍ値を使用して、ＨｅＬａ細胞のアポトーシスに伴うＡＴＰ量変化を経時的に算出した。
【００５３】
［ＨｅＬａ細胞のアポトーシスに伴うＡＴＰ量変化の計測］
コドンを哺乳細胞用に最適化したＰ．ｐｙｒａｌｉｓおよびＳＰ２ルシフェラーゼ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Invitorogen）のマルチクローニングサイトにBamHI, EcoRIサイトで挿入したプラスミドを作成した。各プラスミドを３５ｍｍプラスチックディッシュに播種したＨｅＬａ細胞にリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地から１０％ＦＢＳを含むCO2  Independent  Medium(Invitrogen)に交換した。測定直前にD-luciferinを最終濃度１ｍＭで添加した。さらにＨｅＬａ細胞にアポトーシスを誘導することが知られている薬剤スタウロスポリンを最終濃度４μＭで添加し、培養細胞用ルミノメーターＫｒｏｎｏｓ（ATTO）を用いて発光強度を経時的に測定した。アポトーシスが誘導されたＨｅＬａ細胞の発光量の経時変化を図３に示す。
【００５４】
０時間経過時点ｔ１および０．６時間経過時点ｔ２におけるＰ.ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼとＳＰ２ルシフェラーゼのフォトンカウント値はそれぞれ以下のようになる。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
以上の実験結果より、数式(I)および(II)中の各記号は以下のように決定される。
【数４】
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【００５７】
Ｋｍａ：P.pyralisルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値 ７１．３μM
Ｋｍｂ：SP2ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍ値  １２６０μM
Ｘａ：Ｖａ２／Ｖａ１  22516996/18411538
Ｘｂ：Ｖｂ２／Ｖｂ１  3982267/2491629
Ｖａ１：時点ｔ１におけるP. pyralisルシフェラーゼの発光強度 18411538
Ｖａ２：時点ｔ２におけるP. pyralisルシフェラーゼの発光強度 22516996
Ｖｂ１：時点ｔ１におけるSP2ルシフェラーゼの発光強度 2491629
Ｖｂ２：時点ｔ２におけるSP2ルシフェラーゼの発光強度 3982267
【００５８】
これらの数値を数式(I)および数式(II)に代入すると、０時間経過時点ｔ１および０．６時間経過時点ｔ２におけるHeLa細胞内のＡＴＰ濃度Ｓ１およびＳ２は以下のように算出される。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
こように、本法を用いることで、検量線を使用すること無く、生きたサンプルのＡＴＰ量の変化を経時的に計測することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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