(57)【要約】【課題】帯電した高分子を十分に伸長させる方法を提供する。【解決手段】固定用電極と対向電極との間の距離が高分子の全長よりも長い流路内にて、高分子を含んでいる溶液を流動させ、固定用電極と対向電極との間に電圧を印加し、当該電圧を低下させることで高分子の一端を固定用電極に固定した状態で、他端を固定用電極から離脱させ、高分子を伸長させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電荷を有する高分子を流路内で伸長させる、高分子の伸長方法であって、
上記高分子を含んでいる溶液を、上記高分子を固定するための固定用電極および上記固定用電極と対をなす対向電極が備えられている流路内へ導入し、当該溶液を、上記流路内にて流動させる溶液流動工程と、
上記固定用電極に上記高分子が有する電荷とは逆の極性を与えるように、上記固定用電極と上記対向電極との間に電圧を印加して、上記高分子を上記固定用電極上に固定する高分子固定工程と、
上記電圧を低下させることによって、上記高分子の一端が上記固定用電極上に固定された状態で上記高分子の他端を上記固定用電極から離脱させ、上記高分子を、上記溶液の流動方向へ伸長させる高分子伸長工程と、を含み、
上記固定用電極と上記対向電極との間の距離は、上記高分子の全長よりも長いことを特徴とする高分子の伸長方法。
【請求項２】
上記溶液流動工程では、上記溶液を、上記流路内にて上記固定用電極から上記対向電極へ向かって流動させることを特徴とする請求項１に記載の高分子の伸長方法。
【請求項３】
上記溶液流動工程では、上記溶液を、上記流路内にて上記対向電極から上記固定用電極へ向かって流動させることを特徴とする請求項１に記載の高分子の伸長方法。
【請求項４】
上記電圧を低下させる速度が、４５０ｍＶ／ｓ以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の高分子の伸長方法。
【請求項５】
上記固定用電極の、上記溶液の流動方向に平行な方向への幅が、上記高分子の全長よりも短いことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の高分子の伸長方法。
【請求項６】
上記高分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチドまたは糖であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の高分子の伸長方法。
【請求項７】
上記流路の一端には、上記流路内へ導入するための上記溶液を貯留している導入用リザーバが連結されているとともに、上記流路の他端には、上記流路外へ導出された上記溶液を貯留している導出用リザーバが連結されており、
上記溶液流動工程では、上記導入用リザーバと上記導出用リザーバとの間における上記溶液の水頭差によって、上記溶液を、上記流路内にて流動させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の高分子の伸長方法。
【請求項８】
上記流路内を流動する上記溶液の流速が、４５．９μｍ／ｓ以上９１．８μｍ／ｓ以下であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の高分子の伸長方法。
【請求項９】
電荷を有する高分子を伸長させる高分子伸長装置であって、
上記高分子を含んでいる溶液を流動させるための流路と、
上記流路の内部に配置され、かつ、上記高分子を固定するための固定用電極と、
上記流路の内部に配置され、かつ、上記固定用電極と対をなす対向電極と、
上記固定用電極と上記対向電極との間に印加する電圧の値を切り替えるための電圧調節手段と、を備えており、
上記固定用電極と上記対向電極との間の距離が、上記高分子の全長よりも長いことを特徴とする高分子伸長装置。
【請求項１０】
上記流路は、上記溶液を、上記固定用電極から上記対向電極へ向かって流動させるためのものであることを特徴とする請求項９に記載の高分子伸長装置。
【請求項１１】
上記流路は、上記溶液を、上記対向電極から上記固定用電極へ向かって流動させるためのものであることを特徴とする請求項９に記載の高分子伸長装置。
【請求項１２】
上記電圧調節手段は、４５０ｍＶ／ｓ以上の速度で電圧を低下させるものであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の高分子伸長装置。
【請求項１３】
上記固定用電極の、上記溶液の流動方向に平行な方向への幅が、上記高分子の全長よりも短いことを特徴とする請求項９〜１２のいずれか１項に記載の高分子伸長装置。
【請求項１４】
上記流路の一端に連結され、かつ、上記流路内へ導入するための上記溶液を貯留している導入用リザーバと、
上記流路の他端に連結され、かつ、上記流路外へ導出された上記溶液を貯留している導出用リザーバと、を備えており、
上記導入用リザーバおよび上記導出用リザーバは、上記導入用リザーバと上記導出用リザーバとの間における上記溶液の水頭差によって、上記溶液を流動させるものであることを特徴とする請求項９〜１３のいずれか１項に記載の高分子伸長装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子の一端を電極上に固定した状態で、当該高分子を伸長させる、高分子の伸長方法および高分子伸長装置に関する。更に具体的には、高分子の一端を電極上に固定した状態で、流路内を流れる流体の力によって当該高分子を伸長させる、高分子の伸長方法および高分子伸長装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子の分子レベルでの観察は、高分子の構造および挙動の理解を進める上で重要であり、近年、生物学、医学、薬学、農学、工学等の分野において注目を集めている。高分子の分子レベルでの観察が可能になれば、医療、創薬、ナノデバイスの開発等の分野にも応用することが可能になると考えられる。
【０００３】
しかしながら、高分子は複雑な立体構造をとることが多い。例えば、核酸の重合体であるＤＮＡは非常に長い糸状の高分子であるが、溶液中では凝集した状態となって存在している。ＤＮＡ等の鎖状高分子を分子レベルで観察するには、当該高分子を一直線状に伸長させた方が観察しやすい。
【０００４】
本発明者らは、これまで、非一様な電場におけるＤＮＡの流動特性に着目し、高分子を伸長させる方法について実験的考察を行ってきた。具体的には、非特許文献１に示すように、正極と負極とを交互に有するくし歯状電極を配置したマイクロ流路を用いた新たなＤＮＡ伸長方法を提案し、実験においてλＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）の伸長を試みてきた。
【０００５】
非特許文献１に記載の技術では、リン酸基によって負に帯電しているλＤＮＡの一端を、マイクロ流路内に設けられている正極上に固定する。なお、上記正極は、マイクロ流路の底面に設けられている。上述した状態で、λＤＮＡを、マイクロ流路の底面近傍を流れる流体に晒すことによって、λＤＮＡが伸長する。
【０００６】
上記マイクロ流路の底面には、上記正極の下流側に、当該正極と対をなす負極が配置されている。λＤＮＡの他端もリン酸基によって負に帯電しているので、当該他端と負極とが反発する。これによって、λＤＮＡの他端をマイクロ流路内の流れの速い領域（具体的には、マイクロ流路の横断面における中央部）にまで浮上させて、λＤＮＡを伸長させる方法を試みている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】N. Yukimoto et. al.，Proceedings of the International Workshop on Micro- and Nano-Engineering，p.106，2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述のような従来の技術では、帯電した高分子を十分に伸長させることができないという問題があった。
【０００９】
具体的には、非特許文献１に記載の技術では、最も伸長しているλＤＮＡの長さでも、λＤＮＡの全長（１６．５μｍ）の３５％程度でしかなかった。
【００１０】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は帯電した高分子を十分に伸長させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、高分子を十分に伸長させるためには、正極と負極との間の距離の設定が重要であることを見出し、本発明を完成させるに至った。更に具体的には、本発明者らは、正極と負極との間の距離が短すぎると、高分子の他端をマイクロ流路内の流れの速い領域にまで浮上させる効果よりも、高分子が伸長することを妨げる効果（換言すれば、高分子を、伸長方向とは逆の方向へ跳ね返す効果）の方が大きくなり、かえって高分子を十分に伸長させることができないことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
本発明に係る高分子の伸長方法は、上記課題を解決するために、電荷を有する高分子を流路内で伸長させる、高分子の伸長方法であって、上記高分子を含んでいる溶液を、上記高分子を固定するための固定用電極および上記固定用電極と対をなす対向電極が備えられている流路内へ導入し、当該溶液を、上記流路内にて流動させる溶液流動工程と、上記固定用電極に上記高分子が有する電荷とは逆の極性を与えるように、上記固定用電極と上記対向電極との間に電圧を印加して、上記高分子を上記固定用電極上に固定する高分子固定工程と、上記電圧を低下させることによって、上記高分子の一端が上記固定用電極上に固定された状態で上記高分子の他端を上記固定用電極から離脱させ、上記高分子を、上記溶液の流動方向へ伸長させる高分子伸長工程と、を含み、上記固定用電極と上記対向電極との間の距離は、上記高分子の全長よりも長いことを特徴としている。
【００１３】
上記構成によれば、上記流路に高分子を含んでいる溶液を流し、固定用電極と対向電極との間に電圧を印加することによって、固定用電極上に高分子を固定することができる。さらに、上記電圧を低下させることによって、高分子の一端を固定用電極から離脱させることができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に伸長させることができる。
【００１４】
また、上記固定用電極と上記対向電極との距離は、上記高分子の全長よりも長いので、上記対向電極の影響によって上記高分子が縮小する方向に力が働くことを防ぐことができる。よって、上記高分子を、より効率よく伸長させることができる。
【００１５】
本発明に係る高分子の伸長方法では、上記溶液流動工程では、上記溶液を、上記流路内にて上記固定用電極から上記対向電極へ向かって流動させることが好ましい。
【００１６】
上記構成によれば、上記高分子を上記固定用電極から上記対向電極へ向かって伸長させることができる。上記固定用電極と上記対向電極との距離は、上記高分子の全長よりも長いので、上記高分子と対向電極との間の反発を防ぐことができる。すなわち、上記対向電極によって上記高分子が縮小する方向に力が働くことを防ぐことができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より効率よく伸長させることができる。
【００１７】
本発明に係る高分子の伸長方法では、上記溶液を、上記流路内にて上記対向電極から上記固定用電極へ向かって流動させることが好ましい。
【００１８】
上記構成によれば、上記高分子を上記固定用電極から下流へ向かって伸長させることができる。上記固定用電極と上記対向電極との距離は、上記高分子の全長よりも長く、さらに上記対向電極が上記固定用電極よりも上流に存在するため、上記対向電極によって上記高分子が縮小する方向に力が働くことを、より確実に防ぐことができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より効率よく伸長させることができる。
【００１９】
本発明に係る高分子の伸長方法では、上記電圧を低下させる速度が、４５０ｍＶ／ｓ以上であることが好ましい。
【００２０】
上記構成によれば、上記高分子の一端を固定用電極に固定した状態で、上記高分子の他端をより効率よく離脱させることができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より伸長させることができる。
【００２１】
本発明に係る高分子の伸長方法では、上記固定用電極の、上記溶液の流動方向に平行な方向への幅が上記高分子の全長よりも短いことが好ましい。
【００２２】
上記構成によれば、上記高分子全体が上記固定用電極に付着してしまうことを防ぐことができ、上記高分子の一端を固定用電極から離脱しやすくすることができる。
【００２３】
本発明に係る高分子の伸長方法では、上記高分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチドまたは糖であることが好ましい。
【００２４】
上記構成によれば、溶液中において複雑な立体構造をとる高分子を伸長させることができる。
【００２５】
本発明に係る高分子の伸長方法では、上記流路の一端には、上記流路内へ導入するための上記溶液を貯留している導入用リザーバが連結されているとともに、上記流路の他端には、上記流路外へ導出された上記溶液を貯留している導出用リザーバが連結されており、上記溶液流動工程では、上記導入用リザーバと上記導出用リザーバとの間における上記溶液の水頭差によって、上記溶液を、上記流路内にて流動させることが好ましい。
【００２６】
上記構成によれば、流路の外部にポンプ等を接続して動力を与える必要がなく、簡易な構成によって上記溶液を流動させることができる。
【００２７】
本発明に係る高分子の伸長方法では、上記流路内を流動する上記溶液の流速が、４５．９μｍ／ｓ以上９１．８μｍ／ｓ以下であることが好ましい。
【００２８】
上記構成によれば、溶液の流れによるせん断応力を利用して高分子の一端を十分に伸長させることができ、かつ、上記せん断応力が大きすぎるために固定用電極から高分子全体が離脱してしまうことを防ぐことができる。
【００２９】
本発明に係る高分子伸長装置は、上記課題を解決するために、電荷を有する高分子を伸長させる高分子伸長装置であって、上記高分子を含んでいる溶液を流動させるための流路と、上記流路の内部に配置され、かつ、上記高分子を固定するための固定用電極と、上記流路の内部に配置され、かつ、上記固定用電極と対をなす対向電極と、上記固定用電極と上記対向電極との間に印加する電圧の値を切り替えるための電圧調節手段と、を備えており、上記固定用電極と上記対向電極との間の距離が、上記高分子の全長よりも長いことを特徴としている。
【００３０】
上記構成によれば、上記流路に高分子を含んでいる溶液を流し、固定用電極と対向電極との間に電圧を印加することによって、固定用電極上に高分子を固定することができる。さらに、電圧調節手段を用いて上記電圧を低下させることによって、高分子の一端を固定用電極から離脱させることができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に伸長させることができる。
【００３１】
また、上記固定用電極と上記対向電極との距離は、上記高分子の全長よりも長いので、上記対向電極の影響によって上記高分子が縮小する方向に力が働くことを防ぐことができる。よって、上記高分子を、より効率よく伸長させることができる。
【００３２】
本発明に係る高分子伸長装置では、上記流路は、上記溶液を、上記固定用電極から上記対向電極へ向かって流動させるためのものであることが好ましい。
【００３３】
上記構成によれば、上記高分子を上記固定用電極から上記対向電極へ向かって伸長させることができる。上記固定用電極と上記対向電極との距離は、上記高分子の全長よりも長いので、上記高分子と対向電極との間の反発を防ぐことができる。すなわち、上記対向電極によって、上記高分子が縮小する方向に力が働くことを防ぐことができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より効率よく伸長させることができる。
【００３４】
本発明に係る高分子伸長装置では、上記流路は、上記溶液を、上記対向電極から上記固定用電極へ向かって流動させるためのものであることが好ましい。
【００３５】
上記構成によれば、上記高分子を上記固定用電極から下流へ向かって伸長させることができる。上記固定用電極と上記対向電極との距離は、上記高分子の全長よりも長く、さらに上記対向電極が上記固定用電極よりも上流に存在するため、上記対向電極が上記高分子に対して及ぼす影響を、より確実に低減することができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に伸長させることができる。
【００３６】
本発明に係る高分子伸長装置では、上記電圧調節手段は、４５０ｍＶ／ｓ以上の速度で電圧を低下させるものであることが好ましい。
【００３７】
上記構成によれば、上記高分子の一端を固定用電極に固定した状態で、上記高分子の他端をより効率よく離脱させることができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より伸長させることができる。
【００３８】
本発明に係る高分子伸長装置では、上記固定用電極の、上記溶液の流動方向に平行な方向への幅が上記高分子の全長よりも短いことが好ましい。
【００３９】
上記構成によれば、上記高分子全体が上記固定用電極に付着してしまうことを防ぐことができ、上記高分子の一端を固定用電極から離脱しやすくすることができる。
【００４０】
本発明に係る高分子伸長装置では、上記流路の一端に連結され、かつ、上記流路内へ導入するための上記溶液を貯留している導入用リザーバと、上記流路の他端に連結され、かつ、上記流路外へ導出された上記溶液を貯留している導出用リザーバと、を備えており、上記導入用リザーバおよび上記導出用リザーバは、上記導入用リザーバと上記導出用リザーバとの間における上記溶液の水頭差によって、上記溶液を流動させるものであることが好ましい。
【００４１】
上記構成によれば、流路の外部にポンプ等を接続して動力を与える必要がなく、簡易な構成によって上記溶液を流動させることができる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、高分子を含んでいる溶液を流路に流し、固定用電極と対向電極との間に電圧を印加することによって、固定用電極上に高分子を固定し、さらに、上記電圧を低下させることによって、高分子の一端を固定用電極から離脱させる方法である。
【００４３】
そのため、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に伸長させることができるという効果を奏する。
【００４４】
また、上記固定用電極と上記対向電極との距離は、上記高分子の全長よりも長いので、上記対向電極の影響によって上記高分子が縮小する方向に力が働くことを防ぐことができ、より効率よく上記高分子を伸長させることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明に係る高分子を伸長させる方法の原理を示す概略図であり、（ａ）および（ｂ）は電圧を印加した場合の流路内部の図であり、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は断面図である。（ｃ）および（ｄ）は電圧を低下させた場合の流路内部の図であり、（ｃ）は平面図であり、（ｄ）は断面図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る高分子伸長装置の一部を示し、（ａ）は斜視図であり、（ｂ）は（ａ）の点線Ａ−Ａ’における断面図であり、（ｃ）は電極に導線を接続した場合の斜視図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る高分子伸長装置の一部を示し、（ａ）は斜視図であり、（ｂ）は（ａ）の点線Ａ−Ａ’における断面図であり、（ｃ）は電極に導線を接続した場合の斜視図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る高分子伸長装置を示す概略図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る高分子伸長装置を示す概略図である。
【図６】本発明の一実施例に係る第１の基板の製造方法を示す概略図であり、（ａ）〜（ｇ）のそれぞれにおいて上側が平面図であり、下側が平面図中の点線Ａ−Ａ’〜Ｇ−Ｇ’のそれぞれにおける断面図である。
【図７】本発明の一実施例に係る第１の基板上に電極を製造する方法を示す概略図であり、（ａ）〜（ｇ）のそれぞれにおいて上側が平面図であり、下側が平面図中の点線Ａ−Ａ’〜Ｇ−Ｇ’のそれぞれにおける断面図である。
【図８】本発明の一実施例に係る流路の断面図である。
【図９】本発明の実施例１および比較例２における実験結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例１〜３における実験結果を示す図である。
【図１１】本発明の一実施例に係る第３〜５の基板の製造方法を示す概略図であり、（ａ）〜（ｇ）のそれぞれにおいて上側が平面図であり、下側が平面図中の点線Ａ−Ａ’〜Ｇ−Ｇ’のそれぞれにおける断面図である。
【図１２】本発明の一実施例に係る流路の断面図である。
【図１３】本発明の一実施例における印加した電圧と時間との関係を示す図である。
【図１４】本発明の比較例２における実験結果を示す図である。
【図１５】本発明の実施例４における実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。なお、説明の便宜上、同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
【００４７】
〔１．高分子が伸長する原理〕
本発明における高分子が伸長する原理を説明する。図１の（ａ）〜（ｄ）は、流路内部における一対の固定用電極および対向電極の概略図を示している。図１の（ａ）〜（ｄ）のｘ軸、ｙ軸、ｚ軸は、３次元空間における方向を規定している。図１の（ａ）および（ｃ）におけるｙ軸方向は、紙面に垂直な方向を示している。図１の（ｂ）は、図１の（ａ）をｚ軸方向から見た図であり、図１の（ｄ）は、図１の（ｃ）をｚ軸方向から見た図である。図１では、高分子５が負に帯電しており、固定用電極１は正極であり、対向電極２は負極である例を示しているが、本発明はこれに限定されない。また、図１の（ｂ）および（ｄ）における放物線は流速の分布を表しており、後述する水頭差によって溶液を流動させる場合を想定しているが、本発明はこれに限定されない。
【００４８】
まず、負に帯電している高分子５を含んでいる溶液を流路３に導入し、流動させる。ここで、流路３は流路壁４によって囲まれている。また、図１の（ａ）〜（ｄ）において、上記溶液は、ｘ軸の矢印の方向に流動している。よって、図１の（ａ）〜（ｄ）においては、ｘ軸の方向を下流方向とし、ｘ軸の方向と逆の方向を上流方向とする。
【００４９】
そして、流路３の底面に配置された固定用電極１と対向電極２との間に高電圧を印加すると、負に帯電した高分子５が正極である固定用電極１上に拘束される。図１の（ａ）および（ｂ）は高電圧を印加した場合の流路３の概略図を示している。印加した電圧が比較的高い場合、高分子５は伸長することなく、高分子５の全体が固定用電極１上に強く拘束される。
【００５０】
次に、上記溶液を流動させた状態で、印加電圧を高電圧から低電圧へと瞬時に切り替えると、固定用電極１上に拘束されていた高分子５の一端が固定用電極１から離脱し、上記溶液の流れによって下流側へと流される。しかしながら、高分子５のもう一端は固定用電極１上に拘束され続ける。その結果、高分子５の一部分が固定用電極１上に拘束された状態で、高分子５の離脱した部分が下流方向へ流された状態となり、高分子５は伸長する（高分子は常に周囲の流体分子のブラウン運動による衝突力を受けており、高分子の一端が固定され、他端が離脱する現象は確率統計力学的に理解されるべきものである）。図１の（ｃ）および（ｄ）は、印加電圧を低電圧へと切り替えた後の流路３の概略図を示している。
【００５１】
なお、図１では、負に帯電している高分子５が、正極である固定用電極１上に拘束される例を示したが、高分子５が正に帯電している高分子である場合は、負極を固定用電極１として用いればよく、正極を対向電極２として用いればよい。また、図１では、固定用電極１から対向電極２に向かって溶液を流動させる例を示しているが、対向電極２から固定用電極１に向かって溶液を流動させてもよい。
【００５２】
＜高分子＞
本発明において、高分子は、電荷を有する高分子である。本発明において「電荷を有する高分子」とは、少なくとも一部が帯電している高分子である。具体的に、上記高分子は、少なくとも一部が、正または負の何れかに帯電している高分子であってもよい。また、上記高分子は、一部が正に帯電し、別の一部が負に帯電している高分子であってもよい。この場合には、高分子全体として見たときに、高分子が正または負の何れか一方に偏って帯電していればよい。また、元来帯電していない高分子に帯電している分子を接続し、帯電させたものであってもよい。
【００５３】
上記高分子は、溶液に含まれた状態で流路内に導入される。上記構成であれば、容易に溶液を流路内に導入し、かつ、流動させることができる。また上記構成であれば、溶液の流動によって容易に高分子を伸長させることができる。
【００５４】
上記高分子の分子量や主鎖の長さは特に限定されない。上記高分子は、例えば単一の単量体の重合によって形成された重合体でもよく、複数の単量体の共重合によって形成された共重合体であってもよい。
【００５５】
上記高分子には例えば生体高分子が挙げられる。生体高分子の例としては、核酸、タンパク質、ペプチドおよび糖等が挙げられる。核酸としては特に限定されず、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。例えば、高分子がＤＮＡであれば、ＤＮＡが有するリン酸基が負の電荷を帯びているため、正極上に拘束される。また、例えば元来帯電していないタンパク質に対し、解離性アミノ酸を連結することによって帯電させたものであってもよい。
【００５６】
〔２．高分子伸長装置〕
本発明の一実施形態に係る高分子伸長装置について、図２〜５を参照しながら、以下に説明する。図２の（ａ）〜（ｃ）は、本実施形態に係る高分子伸長装置の一部の概略構成を示す図である。図２の（ａ）は本実施形態に係る高分子伸長装置の一部の斜視図であり、図２の（ｂ）は図２の（ａ）の点線Ａ−Ａ’における断面図である。図２の（ａ）および（ｂ）に示すように、本実施形態では、第１の基板６および第２の基板７を貼り合せることによって流路３が形成されている。流路３の内部には固定用電極１および対向電極２が配置されている。図２の（ｃ）は本実施形態に係る高分子伸長装置の固定用電極１および対向電極２に導線１１を接続した場合の斜視図である。
【００５７】
＜流路＞
本発明に係る高分子伸長装置は、電荷を有する高分子を含んでいる溶液を流動させるための流路３を備えている。
【００５８】
流路３の形状は特に限定されるものではなく、例えば、流路３において、溶液を流動させる方向に垂直な断面が矩形であっても、円形であってもよいが、流路３の底面が平面である形状の方が、固定用電極１および対向電極２を配置しやすいので好ましい。
【００５９】
流路３の大きさは特に限定されるものではないが、例えば流路３において、溶液を流動させる方向に垂直な断面が矩形である場合、溶液を流動させる方向の長さを５０μｍ以上２８ｍｍ以下とし、流路の高さを５μｍ以上５０μｍ以下とし、流路の幅を５０μｍ以上１００μｍ以下とすることができる。
【００６０】
本実施形態では第１の基板６および第２の基板７を貼り合せることによって流路３が形成されているが、流路３の形成方法は特に限定されるものではなく、例えば、２つ以上の基板を貼り合せることで形成されてもよいし、１つの基板中を掘削することで形成してもよい。２つ以上の基板を貼り合せる場合は、表面が平らな基板と溝が形成されている基板とを貼り合せて溝部分を流路３としてもよいし、溝が形成されている基板同士を貼り合せることで溝部分を流路３としてもよい。また、２つ以上の基板を貼り合せた後に掘削して流路３を形成してもよい。
【００６１】
図３の（ａ）〜（ｃ）は、３つ以上の基板を貼り合せて流路３を形成した場合の高分子伸長装置の一部の概略構成を示す図である。図３の（ａ）は高分子伸長装置の一部の斜視図であり、図３の（ｂ）は図３の（ａ）の点線Ａ−Ａ’における断面図である。図３の（ａ）および（ｂ）に示すように、本実施形態では、第３の基板１２、第４の基板１３および第５の基板１４、ならびに第２の基板７を貼り合せることによって流路３が形成されている。図３の（ｃ）は本実施形態に係る高分子伸長装置の固定用電極１および対向電極２に導線１１を接続した場合の斜視図である。
【００６２】
上記基板の材料は特に限定されるものではなく、例えばガラス、樹脂等を用いることができる。例えば、顕微鏡によって流路内部を観察する場合には、基板の少なくとも一部にカバーガラスおよび／またはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の透明な材料を用いればよい。例えば、図２の第２の基板７としてカバーガラスを用いれば、底面から流路３の内部を観察することができる。また、例えば図３の第３の基板１２としてカバーガラスを用いれば、上面から流路３の内部を観察することができる。
【００６３】
流路３は、上記高分子を含んでいる溶液を導入するための導入口９を備えていてもよい。導入口９の形状および大きさは特に限定されるものではないが、例えば導入口９を円形とすることができる。
【００６４】
さらに、流路３は、流路３から上記溶液を導出するための導出口１０を備えていてもよい。上記構成によれば、毛細管現象によって流路３内で上記溶液を流動させることもできる。また、導入口９または導出口１０にポンプを接続して外部から力を加えて上記溶液を流動させてもよい。導出口１０の形状および大きさも導入口９と同様に、特に限定されるものではない。
【００６５】
＜電極＞
流路３の内部には高分子を固定するための固定用電極１および固定用電極と対をなす対向電極２が備えられている。本明細書では、固定用電極１および対向電極２を合わせて電極８と称する場合もある。図２および３では、対向電極２は固定用電極１よりも下流側に配置されている。すなわち、上記高分子を含んでいる溶液は固定用電極１から対向電極２に向かう方向に流動する。ただし、本発明では、固定用電極１と対向電極２の距離が十分離れていれば、上記高分子を含んでいる溶液を対向電極２から固定用電極１に向かう方向に流動させても良い。また、対向電極２は流路の上面や側面に設置しても、固定用電極１との距離が十分離れていれば、高分子の伸長効果を損なうことはほとんどない。
【００６６】
図２の（ｃ）および図３の（ｃ）に示すように、固定用電極１および対向電極２には導線１１が接続されている。上記構成によれば、導線を介して電源を接続することができ、上記固定用電極と上記対向電極との間に電圧を印加することができる。
【００６７】
上記固定用電極および上記対向電極は、少なくとも１対備えられていればよい。上記固定用電極および上記対向電極はそれぞれ複数備えられていてもよい。例えば、図２および図３に示すように、固定用電極１および対向電極２をくし歯状電極として配置すれば、流路内において固定用電極１および対向電極２を交互に配置することができる。上記構成によれば、高分子を固定用電極１上に固定する機会を増やすことができる。
【００６８】
固定用電極上に上記高分子を固定するには、上記固定用電極に上記高分子が有する電荷とは逆の極性を与えるように、上記固定用電極と上記対向電極との間に電圧を印加すればよい。すなわち、上記固定用電極に負に帯電した高分子を固定する場合は、固定用電極を正極とすればよく、上記固定用電極に正に帯電した高分子を固定する場合は、固定用電極を負極とすればよい。
【００６９】
本発明に係る高分子伸長装置では、上記固定用電極と上記対向電極との間の距離が、上記高分子の全長よりも長いことを特徴としている。本発明は、上述の〔高分子が伸長する原理〕に示したように、上記固定用電極上に高分子の一端を固定し、高分子の他端を固定用電極から離脱した状態で、溶液の流れによって高分子を伸長させることを特徴としている。上記固定用電極と上記対向電極との間の距離が、上記高分子の全長よりも短い場合、上記高分子と上記対向電極とが反発し合い、上記高分子が収縮する方向へ力が働いてしまう。例えば、正極である固定用電極上に、負に帯電した高分子を固定する場合、負極である対向電極と負に帯電した高分子とが反発し合う。上記固定用電極と上記対向電極との間の距離が、上記高分子の全長よりも長ければ、上記反発を防ぐことができ、上記高分子を伸長させることができる。
【００７０】
上述のように、本発明に係る高分子伸長装置では、流路の内部において、固定用電極および対向電極のどちらが上流に配置されていてもよい。例えば上記高分子を含んでいる溶液を固定用電極１から対向電極２に向かう方向に流動させる場合、上記高分子を固定用電極１から対向電極２へ向かって伸長させることができる。固定用電極１と対向電極２との距離は、上記高分子の全長よりも長いので、上記高分子と対向電極２との間の反発を防ぐことができる。すなわち、対向電極２によって上記高分子が収縮する方向に力が働くことを防ぐことができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より効率よく伸長させることができる。
【００７１】
また、例えば上記高分子を含んでいる溶液を対向電極２から固定用電極１に向かう方向に流動させる場合、上記高分子を固定用電極１から下流へ向かって伸長させることができる。固定用電極１と対向電極２との距離は、上記高分子の全長よりも長く、さらに対向電極２が固定用電極１よりも上流に存在するため、対向電極１によって上記高分子が縮小する方向に力が働くことを、より確実に防ぐことができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より効率よく伸長させることができる。
【００７２】
本願出願時において、各種高分子の長さは周知である。例えば、高分子が核酸である場合、１塩基あたりの長さは、０．３４ｎｍと近似することができる。それ故に、伸長させようとする核酸を構成する塩基の数を設定すれば高分子の長さを決定することができ、当該決定された長さに基づいて、上記固定用電極と上記対向電極との間の距離を適宜設定することができる。
【００７３】
本発明に係る高分子伸長装置では、上記固定用電極の、上記溶液の流動方向に平行な方向への幅が上記高分子の全長よりも短いことが好ましい。上記構成によれば、上記高分子全体が上記固定用電極に付着してしまうことを防ぐことができ、上記高分子の一端を固定用電極から離脱しやすくすることができる。
【００７４】
＜電圧調節手段＞
本発明に係る高分子伸長装置は、上記固定用電極と上記対向電極との間に印加する電圧の値を切り替えるための電圧調節手段を備えている。上記構成によれば、上述の〔高分子が伸長する原理〕に示したように、上記固定用電極上に上記高分子を固定した後、電圧を低下させることによって、上記高分子の一端を上記固定用電極上に固定した状態で、上記高分子の他端を上記固定用電極上から離脱させることができる。
【００７５】
＜その他の構成＞
本発明に係る高分子伸長装置は、上述の構成以外にその他の構成を含んでいてもよい。例として、上述の構成およびその他の構成を含んだ高分子伸長装置の概略図を図４および図５に示す。
【００７６】
図４に示す高分子伸長装置では、導入口９および導入用リザーバ１５、ならびに、導出口１０および導出用リザーバ１６は、それぞれシリコンチューブ１７ａおよび１７ｂを介して流路３へ接続されている。導入用リザーバ１５は上記流路内へ導入するための上記溶液を貯留しているものである。導出用リザーバ１６は上記流路外へ導出された上記溶液を貯留しているものである。図４に示す高分子伸長装置では、導入用リザーバ１５、シリコンチューブ１７ａ、流路３、シリコンチューブ１７ｂ、および導出用リザーバ１６に上記溶液が満たされている。導入用リザーバ１５および導出用リザーバ１６はそれぞれ手動ステージ１８ａおよび１８ｂに取り付けられており、手動ステージを流路の高さ方向（図４における紙面上下方向、すなわち、図１の（ｂ）および（ｄ）におけるｙ軸方向）に動かし、導入用リザーバ１５が導出用リザーバ１６よりも高い位置となるように調節して水頭差Δｈを生じさせ、流路３内の溶液を流動させることができる。
【００７７】
また、図４に示す高分子伸長装置では、電極８が導線を介して電源１９に接続されており、これにより電極間に電圧を印加することができ、また電圧を調節することができる。すなわち、電源１９は上記電圧調節手段に該当する。図４に示す高分子伸長装置では、対物レンズ２０およびミラー２１を介して、倒立顕微鏡に接続されたＣＣＤカメラ２２によって、流路の画像を取得し、当該画像をＰＣ２３に取り込んで画像処理を行う。
【００７８】
図５に示す高分子伸長装置では、導入口９にはシリコンチューブ１７ａを介して導入用リザーバ１５が接続されているが、導出口１０にはシリコンチューブ１７ｂを介してシリンジポンプ２４が接続されている。上記構成によれば、導出口１０に接続したシリンジポンプ２４を矢印の方向へ引くことによって、流路３内の溶液を流動させることができる。
【００７９】
図４および図５に示した構成の組み合わせは一例であり、これらに限定されるものではない。
【００８０】
〔３．高分子の伸長方法〕
本発明に係る高分子の伸長方法を以下に説明する。本発明に係る高分子の伸長方法は例えば上述した本発明に係る高分子伸長装置を用いて実現することができる。よって、〔高分子伸長装置〕において既に説明した構成については、詳細な説明は省略する。
【００８１】
＜溶液流動工程＞
本発明に係る高分子の伸長方法は、上記高分子を含んでいる溶液を、上記高分子を固定するための固定用電極および上記固定用電極と対をなす対向電極が備えられている流路内へ導入し、当該溶液を、上記流路内にて流動させる溶液流動工程を含んでいる。
【００８２】
上記構成によれば、後述する高分子伸長工程において、溶液の流動により高分子を溶液の流れの方向に伸長させることができる。また、上記高分子が核酸である場合、溶液中において凝集しやすい核酸を伸長させることができる。なお、上述のように、上記溶液を固定用電極から対向電極に向かう方向に流動させてもよいし、対向電極から固定用電極に向かう方向に流動させてもよい。
【００８３】
上記溶液を流動させる方法は、特に限定されないが、例えば、上述のように導入用リザーバおよび導出用リザーバを設けて水頭差を利用する方法、シリンジポンプを用いる方法が挙げられる。また、電気泳動を利用する方法、電気浸透流を利用する方法を用いてもよい。
【００８４】
上記溶液の流速としては、高分子を伸長させることができれば特に限定されないが、４５．９μｍ／ｓ以上３００μｍ／ｓ以下が好ましく、４５．９μｍ／ｓ以上２００μｍ／ｓ以下がより好ましく、４５．９μｍ／ｓ以上９１．８μｍ／ｓ以下がさらに好ましい。特に好ましい上記溶液の流速は、６８．８μｍ／ｓ以上９１．８μｍ／ｓ以下である。上記構成によれば、溶液の流れによるせん断応力を利用して高分子の一端を十分に伸長させることができ、かつ、上記せん断応力が大きすぎるために固定用電極から高分子全体が離脱してしまうことを防ぐことができる。上記流速は、例えば上述のように導入用リザーバおよび導出用リザーバを設けて水頭差を利用することによって好適に実現できる。
【００８５】
＜高分子固定工程＞
本発明に係る高分子の伸長方法は、上記固定用電極に上記高分子が有する電荷とは逆の極性を与えるように、上記固定用電極と上記対向電極との間に電圧を印加して、上記高分子を上記固定用電極上に固定する高分子固定工程を含んでいる。
【００８６】
上記構成によれば、帯電した高分子を当該高分子とは逆の極性を有する固定用電極上に固定することができる。
【００８７】
本発明において、「固定」とは帯電した高分子の少なくとも一部が電極上へ電気的に誘引されて接触している状態を意味する。本明細書では、電極上へ高分子が「拘束」されていると表現する場合もあるが、同様の意味である。
【００８８】
印加する電圧は、高分子を固定することができる電圧であれば特に限定はされないが、本工程の後に電圧を低下させる工程が存在するため、比較的高い電圧であることが好ましい。印加する電圧は７００ｍＶ以上であることが好ましく、１０００ｍＶ以上であることがより好ましい。上記構成によれば、帯電した高分子を固定用電極上に十分に固定することができる。
【００８９】
＜高分子伸長工程＞
本発明に係る高分子の伸長方法は、上記電圧を低下させ、上記高分子の一端が上記固定用電極上に固定された状態で、上記高分子の他端を上記固定用電極から離脱させ、上記高分子を、上記溶液の流動方向へ伸長させる高分子伸長工程を含んでいる。
【００９０】
上記構成によれば、上記電圧を低下させることによって、上記高分子の一端が上記固定用電極上に固定された状態で、上記高分子の他端を伸長させることができる。
【００９１】
本発明に係る高分子の伸長方法では、上記電圧を低下させる速度は速ければ速いほど好ましい。例えば、上記速度は４５０ｍＶ／ｓ以上であることが好ましく、９００ｍＶ／ｓ以上であることがより好ましい。上記構成によれば、上記高分子の一端を固定用電極に固定した状態で、上記高分子の他端をより効率よく離脱させることができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より伸長させることができる。上記電圧を低下させる速度は、例えば上述の電圧調節手段を利用することによって好適に実現できる。
【００９２】
ここで、上記固定用電極と上記対向電極との間の距離は、上記高分子の全長よりも長いことを特徴としている。よって〔高分子伸長装置〕にて述べたように、上記高分子と上記対向電極との反発を防ぐことができる。上述のように、上記高分子を含んでいる溶液を固定用電極１から対向電極２に向かう方向に流動させる場合、対向電極２によって上記高分子が収縮する方向に力が働くことを防ぐことができる。また、上記高分子を含んでいる溶液を対向電極２から固定用電極１に向かう方向に流動させる場合、固定用電極１と対向電極２との距離が上記高分子の全長よりも長く、さらに対向電極２が固定用電極１よりも上流に存在するため、対向電極１によって上記高分子が縮小する方向に力が働くことを、より確実に防ぐことができる。その結果、高分子を、溶液の流動によって流れの方向に、より効率よく伸長させることができる。
【００９３】
また、上述したように上記固定用電極の、上記溶液の流動方向に平行な方向への幅が上記高分子の全長よりも短いことが好ましい。上記構成によれば、上記高分子全体が上記固定用電極に付着してしまうことを防ぐことができ、上記高分子の一端を固定用電極から離脱しやすくすることができる。
【実施例】
【００９４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９５】
〔実施例１〜３および比較例１〕
＜ＤＮＡ溶液の調製＞
ＤＮＡ溶液の調製方法について説明する。実施例１〜３および比較例１では、高分子としてλＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）、緩衝液としてＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ  １００ｍＭ／Ｂｏｒｉｃ  Ａｃｉｄ  ９０ｍＭ／ＥＤＴＡ  １ｍＭ（ｐＨ８．４））を用いた。また、核酸蛍光染色剤としてＹＯＹＯ−１（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９１／５０９）を用いた。加えて，観察中における蛍光の退色を防ぐために、２−メルカプトエタノールを用いた。実施例１〜３および比較例１で使用したＤＮＡおよび核酸蛍光染色剤の性質について表１および表２にそれぞれ示す。また、ＤＮＡ溶液の製作条件について表３に示す。初めに、−２０℃で冷凍保存しているλＤＮＡおよび核酸蛍光染色剤を常温で１時間放置し、解凍した。解凍後、λＤＮＡ、核酸蛍光染色剤およびＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒを表６に示す割合で混合し、約２時間程度放置することでλＤＮＡと核酸蛍光染色剤とをＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ中で結合させた。その後、蛍光退色防止剤である２−メルカプトエタノールを加え、ＤＮＡ溶液を調製した。
【００９６】
【表１】
2014068612.tif 000003
【００９７】
【表２】
2014068612.tif 000004
【００９８】
【表３】
2014068612.tif 000005
【００９９】
なお、表３中の「染色剤の結合比」は、λＤＮＡに対して染色剤が結合する割合を示しており、本実施例においてはλＤＮＡの５塩基毎に１個のＹＯＹＯ−１分子が結合することを意味している。すなわち、４８，５０２ｂｐのλＤＮＡには平均して約９７００個のＹＯＹＯ−１分子が結合している。
【０１００】
＜高分子伸長装置の作製＞
実施例１〜３および比較例１に用いた流路および電極の作製方法について以下に説明する。実施例１〜３および比較例１では、図２の（ａ）〜（ｃ）に示される流路３と同一の流路を用いた。すなわち、第１の基板６と第２の基板７とを貼り合せることで流路３を形成した。実施例１〜３および比較例１では第１の基板６としてカバーガラスを用い、第２の基板７としてＰＤＭＳを用いて作製した。また、固定用電極１および対向電極２としては金を用いた。
【０１０１】
まず、ＰＤＭＳ製の第２の基板の作製方法を説明する。第２の基板の流路部分（溝）は、フォトリソグラフィによる鋳型の作製と、ＰＤＭＳによる型取りによって作製した。流路の作製手順を図６に示す。また、表４に詳細な作製条件を示す。
【０１０２】
【表４】
2014068612.tif 000006
【０１０３】
まず、シリコン基板２５ａを用意した（図６の（ａ））。次に、スピンコータ（１Ｈ−Ｄ７、ＭＩＫＡＳＡ  ＣＯ．ＬＴＤ）を用いて、シリコン基板２５ａ上にフォトレジスト（ＳＵ−８  ３００５、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を５μｍの厚さで塗布した。
【０１０４】
その後、フォトレジストが塗布されたシリコン基板２５ａを、ホットプレート（ＰＣ−４００Ｄ、ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて９５℃で３分間加熱してソフトベークを行い、レジスト薄膜２６ａを形成した（図６の（ｂ））。急冷するとＳＵ−８が剥離する虞があるので、上記加熱後は低発塵性ワイパ（ＢＥＭＣＯＴ、旭化成せんい株式会社）上でシリコン基板２５ａを自然冷却した。
【０１０５】
次に、レジスト薄膜２６ａを有するシリコン基板２５ａに、流路形状のフォトリソグラフィを行った。レジスト薄膜２６ａに接するようにフォトマスク２７ａを設置し、紫外線露光機（ＢＡＨ２５０、株式会社ウシオ電機）を用いて、１２５ｍＪ／ｓｑｃｍの露光を行った（図６の（ｃ））。
【０１０６】
上記露光後、ホットプレートを用いてシリコン基板２５ａを６５℃で１分間、および９５℃で２分間加熱してポストベークを行った。その後、シリコン基板２５ａを現像溶液（ＳＵ−８  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に５分間浸し、パターン部分以外の余分なフォトレジストを除去した。さらにシリコン基板２５ａを２−プロパノール（株式会社和光純薬工業）によって洗浄した後、ブロワを用いて乾燥させ、流路部分の鋳型を作製した（図６の（ｄ））。
【０１０７】
そして、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  Ｂａｓｅ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）とＳｉｌｉｃｏｎ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  Ｃｕｒｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）とを体積比１０：１の割合で混合し、液状のＰＤＭＳを調製した。
【０１０８】
上記鋳型上に液状のＰＤＭＳを流し込んだ後、真空引きにより脱泡し、ホットプレートを用いて７０℃で５時間加熱してＰＤＭＳを硬化させた（図６の（ｅ））。硬化したＰＤＭＳ２８ａを切り取り（図６の（ｆ））、直径１ｍｍの生検トレパン（ＢＰ−０５Ｆ、株式会社カイインダストリーズ）を用いて、流路となる溝の両端に導入口９および導出口１０となる穴を開けた（図６の（ｇ））。
【０１０９】
次に金電極の作製方法を説明する。金電極はフォトリソグラフィおよびスパッタリングによって作製した。図７に作製手順を示し、表５に詳細な作製条件を示す。
【０１１０】
【表５】
2014068612.tif 000007
【０１１１】
第１の基板６としてカバーガラス２９ａ（ＮＥＯカバーガラス、株式会社松浪硝子工業）を用意した（図７の（ａ））。スピンコータを用いて、カバーガラス２９ａ上にネガ型フォトレジスト（ＺＰＮ１１５０、Ｚｅｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を４μｍの厚さで塗布した。その後、フォトレジストが塗布されたカバーガラス２９ａを、ホットプレートを用いて９０℃で９０秒間加熱してソフトベークを行い、レジスト薄膜３０を形成した（図７の（ｂ））。
【０１１２】
上記レジスト薄膜３０を有するカバーグラス２９ａに、電極形状のフォトリソグラフィを行った。カバーグラス２９ａ上に、レジスト薄膜３０と接するようにフォトマスク２７ｂを設置し、紫外線露光機を用いて、３０ｍＪ／ｓｑｃｍの露光を行った（図７の（ｃ））。
【０１１３】
上記露光後、ホットプレートを用いてカバーガラス２９ａを１１０℃で６０秒間加熱してポストベークを行った。その後、カバーグラス２９ａを現像溶液（ＺＴＭＡ１００、Ｚｅｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に約２分間浸し、パターン部分の余分なフォトレジストを除去した（図７の（ｄ））。
【０１１４】
その後、カバーガラス２９ａ上に、スパッタリング装置を用いて厚さ約５ｎｍのチタン（Ｔｉ）薄膜３１を形成した（図７の（ｅ））。チタン薄膜３１を形成する理由は、カバーガラス上に金電極を直接形成しようとすると密着性が悪いためである。上記チタン薄膜３１上に、スパッタリング装置を用いて厚さ約３５ｎｍの金（Ａｕ）薄膜３２を形成した（図７の（ｆ））。ここで、スパッタリング中の膜厚の計測には水晶発振式成膜コントローラ（ＣＲＴＭ−６０００Ｇ、株式会社アルバック）を用いた。そして、カバーガラス２９ａをアセトン溶液（株式会社和光純薬工業）に約１分間浸し、カバーガラス２９ａ上に残っているレジストを除去した（図７の（ｇ））。
【０１１５】
最後に、固定用電極１および対向電極２が設置されたカバーガラス２９ａとＰＤＭＳ２８ａとの接着方法について説明する。接着にはＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｅｔｃｈｉｎｇ）装置（ＲＩＥ−１０ＮＲ、サムコ株式会社）による酸素プラズマ接着方法を用いた。表６に詳細な作製条件を示す。ＰＤＭＳ２８ａの溝が形成されている側およびカバーガラス２９ａの電極が設置されている側の表面に対して、酸素プラズマによって表面活性化を行った。その後、活性化された表面が互いに接するように、ＰＤＭＳ２８ａとカバーガラス２９ａとを接着させた。以上の工程によって、図２の（ａ）〜（ｃ）に示したものと同様の流路を形成した。すなわち、図２の第１の基板６にカバーガラス２９ａが対応し、第２の基板７にＰＤＭＳ２８ａが対応する。そして、図２の（ｃ）に示すように、固定用電極１および対向電極２と導線１１とを銀ペーストを用いて接続した。
【０１１６】
【表６】
2014068612.tif 000008
【０１１７】
完成した流路３の構造を図８に示す。完成した流路は、流路の幅（図８のｚ軸方向の長さ）が５０μｍ、高さ（図８のｙ軸方向の長さ）が５μｍ、長さ（図８のｘ軸方向の長さ）が２８ｍｍである。電極は正極と負極とが交互に配置されており、それぞれの電極の幅（図８のｘ軸方向の長さ）が１０μｍ、電極間の距離（一対の正極と負極と間の距離）が１００μｍ、電極の膜厚さが４０ｎｍである。なお、比較例１では、電極の幅を６μｍ、電極間の距離を８μｍとしたものを用いた。また、正極および負極は５本ずつあり、計５対である。さらに、第２の基板７に設けられた導入口９および導出口１０の直径は１ｍｍである。
【０１１８】
次に、上記流路を含む高分子伸長装置について述べる。実施例１〜３および比較例１では上述の図４に示したような装置によって高分子が伸長する様子を観察した。手動ステージ１８ａおよび１８ｂを図８におけるｙ軸方向（流路の高さ方向）に動かし、導入用リザーバ１５が導出用リザーバ１６よりも高い位置となるように調節して水頭差を生じさせ、流路内の溶液を固定用電極から対向電極へ向かって流動させた。そして電源１９によって電圧を印加および調節した。実施例１〜３および比較例１では、倒立顕微鏡に接続されたＣＣＤカメラ２２によって、流路の画像を取得し、当該画像をＰＣ２３に取り込んで画像処理を行った。
【０１１９】
＜予備実験＞
まず、印加電圧の大きさとλＤＮＡの流動との関連性を調べるために行った予備実験について説明する。導入用リザーバ１５と導出用リザーバ１６との間における水頭差２０ｍｍ、主流速９１．８μｍ/ｓでＤＮＡ溶液を流動させた状態において、１０００ｍＶの電圧を印加し、溶液中のλＤＮＡを正極上に拘束させた。なお、主流速とは、溶液の平均流速を示す。その後、電圧を約３０ｍＶ／ｓｅｃの割合で１００ｍＶまで徐々に低下させ、拘束されているＤＮＡが完全に離脱する電圧を調べた。
【０１２０】
以下に予備実験の結果を説明する。印加電圧を１０００ｍＶとした場合、λＤＮＡが溶液の流動により受ける力（せん断応力）に比べて、電場により受ける力の方が十分大きいため、流動しているλＤＮＡが正極上に拘束され、離脱することなく拘束され続けた。また、この場合、λＤＮＡは全体が電極上に強く拘束された状態であった。印加電圧を小さくしていくと、λＤＮＡの一部が電極から離脱し、下流側へと流れていく現象が観察された。印加電圧が２００ｍＶ程度の際に、λＤＮＡが電極から完全に離脱する現象が確認できた。
【０１２１】
＜実施例１＞
実施例１について説明する。導入用リザーバ１５と導出用リザーバ１６との間における水頭差を２０ｍｍとして平均流速９１．８μｍ／ｓでＤＮＡ溶液を流動させ、電極に１０００ｍＶの電圧を印加した。この状態で３０秒間ＤＮＡ溶液を流動させ続け、正極上にλＤＮＡを拘束させた。次に、電圧１０００ｍＶを保持した状態で、水頭差を調節して溶液の流動を静止させた。その後、水頭差を２０ｍｍに戻して平均流速９１．８μｍ／ｓで溶液を流動させ、印加電圧を１０００ｍＶから２５０ｍＶに切り替え、λＤＮＡの流動を観察した。観察中は２５０ｍＶの電圧を印加し続けていた。観察には、１００倍油侵対物レンズを用い、可視化動画はＣＣＤカメラによって取得した。画素数、空間解像度および撮影速度はそれぞれ１９２０×１０８０、０．１６６μｍ／ｐｉｘｅｌおよび２０ｆｐｓである。
【０１２２】
以下に実施例１の結果を説明する。図９の（ａ）および（ｂ）は、実施例１において観察されたλＤＮＡの写真である。ここで、最も伸長しているλＤＮＡの長さは１１．７μｍであり、これはλＤＮＡの全長の約７１．０％に相当する。
【０１２３】
＜比較例１＞
比較例１について説明する。比較例１は電極の幅を６μｍとし、電極間の距離を８μｍとした。また、８００ｍＶの電圧を印加してλＤＮＡを正極上に固定した後、電圧を１６０ｍＶに切り替えたこと以外は、実施例１と同一の条件で実験を行った。
【０１２４】
以下に比較例１の結果を説明する。図９の（ｃ）は、比較例１において観察されたλＤＮＡの写真である。電極間距離を８μｍとした場合、最も伸長しているλＤＮＡの長さは５．９０μｍであり、これはλＤＮＡの全長の約３５．８％に相当する。
【０１２５】
＜実施例１と比較例１との比較＞
図９の（ｂ）および（ｃ）を比較すると、電極間距離を８μｍから１００μｍに広げることによって、λＤＮＡの伸長具合が大きくなっていることが確認できた。これは、電極間距離とλＤＮＡの伸長具合との間に関係があることを示している。実施例１の装置では、比較例１の装置に比べ、λＤＮＡを約２倍程度伸長させることが可能となった。
【０１２６】
＜実施例２＞
実施例２について説明する。導入用リザーバ１５と導出用リザーバ１６との間における水頭差を１０ｍｍとして平均流速４５．９μｍ／ｓでＤＮＡ溶液を流動させたこと以外は、実施例１と同一の条件で実験を行った。実施例２における固定用電極近傍の観察画像を図１０の（ａ）に示す。
【０１２７】
＜実施例３＞
実施例３について説明する。導入用リザーバ１５と導出用リザーバ１６との間における水頭差を１５ｍｍとして平均流速６８．８μｍ／ｓでＤＮＡ溶液を流動させたこと以外は、実施例１と同一の条件で実験を行った。実施例３における固定用電極近傍の観察画像を図１０の（ｂ）に示す。
【０１２８】
＜実施例１〜３の間の比較＞
実施例１〜３の間の比較を行い、流動速度の違いによる影響について考察する。図１０の（ｃ）は、実施例１における固定用電極近傍の観察画像である。図１０の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を比較すると、溶液の流速が速いほどλＤＮＡの伸長具合が大きくなっていることが確認できる。これは、流動速度を調整することによって、λＤＮＡの伸長具合を調整できることを示している。
【０１２９】
〔比較例２および実施例４〕
＜ＤＮＡ溶液の調製＞
比較例２および実施例４では、上述の実施例１〜３および比較例１と同一のＤＮＡ溶液を用いた。
【０１３０】
＜高分子伸長装置の作製＞
比較例２および実施例４に用いた流路３、ならびに固定用電極１および対向電極２の作製方法について以下に説明する。比較例２および実施例４では、図３の（ａ）〜（ｃ）に示される流路と同一の流路を用いた。すなわち、流路３は第２の基板７、第３の基板１２、第４の基板１３および第５の基板１４によって形成されている。比較例２および実施例４では第２の基板７および第３の基板１２としてカバーガラスを用い、第４の基板１３および第５の基板１４としてＰＤＭＳを用いて作製した。また、固定用電極１および対向電極２としては金を用いた。
【０１３１】
まず、カバーグラス製の第３の基板、ならびに、ＰＤＭＳ製の第４の基板および第５の基板の作製方法を説明する。第３の基板、第４の基板および第５の基板から構成される流路部分は、フォトリソグラフィによる鋳型および型取りによって作製した。流路の作製手順を図１１に示す。なお、フォトリソグラフィにおける各処理条件、およびＰＤＭＳの作製条件は、実施例１〜３および比較例１の表４と同一である。
【０１３２】
まず、シリコン基板２５ｂを用意した（図１１の（ａ））。次に、スピンコータ（１Ｈ−Ｄ７、ＭＩＫＡＳＡ  ＣＯ．ＬＴＤ）を用いて、シリコン基板２５ａ上にフォトレジスト（ＳＵ−８  ３００５、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を５μｍの厚さで塗布した。その後、フォトレジストが塗布されたシリコン基板２５ｂを、ホットプレート（ＰＣ−４００Ｄ、ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて９５℃で３分間加熱してソフトベークを行い、レジスト薄膜２６ｂを形成した（図１１の（ｂ））。急冷するとＳＵ−８が剥離する虞があるので、上記加熱後は低発塵性ワイパ（ＢＥＭＣＯＴ、旭化成せんい株式会社）上でシリコン基板２５ｂを自然冷却した。
【０１３３】
次に、レジスト薄膜２６ｂを有するシリコン基板２５ｂに、流路形状のフォトリソグラフィを行った。レジスト薄膜２６ｂに接するようにフォトマスク２７ｂを設置し、紫外線露光機（ＢＡＨ２５０、株式会社ウシオ電機）を用いて、１２５ｍＪ／ｓｑｃｍの露光を行った（図１１の（ｃ））。
【０１３４】
上記露光後、ホットプレートを用いてシリコン基板２５ｂを６５℃で１分間、および９５℃で２分間加熱してポストベークを行った。その後、シリコン基板２５ｂを現像溶液（ＳＵ−８  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に５分間浸し、パターン部分以外の余分なフォトレジストを除去した。さらにシリコン基板２５ｂを２−プロパノール（株式会社和光純薬工業）によって洗浄した後、ブロワを用いて乾燥させ、流路部分の鋳型を作製した（図１１の（ｄ））。
【０１３５】
そして、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  Ｂａｓｅ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）とＳｉｌｉｃｏｎ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  Ｃｕｒｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）とを体積比１０：１の割合で混合し、液状のＰＤＭＳを調製した。上記鋳型上にカバーガラス２９ｂを設置し、液状のＰＤＭＳを流し込んだ後、真空引きにより脱泡し、ホットプレートを用いて７０℃で５時間加熱してＰＤＭＳを硬化させた（図１１の（ｅ））。カバーガラス２９ｂ、並びに硬化したＰＤＭＳ２８ｂおよび２８ｃを切り取り（図１１の（ｆ））、直径１ｍｍの生検トレパン（ＢＰ−０５Ｆ、株式会社カイインダストリーズ）を用いて、溝の両端に導入口９および導出口１０となる穴を開けた（図１１の（ｇ））。
【０１３６】
金電極は、実施例１〜３および比較例１と同様に、フォトリソグラフィおよびスパッタリングによって作製した。
【０１３７】
最後に、実施例１〜３および比較例１と同様に酸素プラズマ接着方法を用いて、図３の（ａ）〜（ｃ）に示したものと同様の流路を形成した。すなわち、図３の第２の基板７にカバーガラス２９ａが対応し、第３の基板１２にカバーガラス２９ｂが対応し、第４の基板１３にＰＤＭＳ２８ｂが対応し、第５の基板１４にＰＤＭＳ２８ｃが対応する。そして、図３の（ｃ）に示すように、固定用電極１および対向電極２と導線１１とを銀ペーストを用いて接続した。
【０１３８】
完成した流路３の構造を図１２に示す。完成した流路は、流路の幅（図１２のｚ軸方向の長さ）が１００μｍ、高さ（図１２のｙ軸方向の長さ）が５μｍ、長さ（図１２のｘ軸方向の長さ）が２８ｍｍである。電極は正極と負極とが交互に配置されており、それぞれの電極の幅（図１２のｘ軸方向の長さ）が１０μｍ、電極間の距離（一対の正極と負極と間の距離）が１００μｍ、電極の膜厚さが４０ｎｍである。また、正極および負極は５本ずつあり、計５対である。さらに、第４の基板１３に設けられた導入口９および第５の基板１４に設けられた導出口１０の直径は１ｍｍである。
【０１３９】
次に、上記流路を含む高分子伸長装置について述べる。比較例２および実施例４では上述の図５に示したような装置によって高分子が伸長する様子を観察した。図５に示すように、導出口１０に接続したシリンジ２４を矢印の方向へ引くことによって、流路内のＤＮＡ溶液を固定用電極から対向電極へ向かって流動させた。電源１９によって電圧を印加および調節した。比較例２および実施例４では、正立顕微鏡に接続されたＣＣＤカメラ２２によって、流路の画像を取得し、当該画像をＰＣ２３に取り込んで画像処理を行った。
【０１４０】
＜比較例２＞
以下に比較例２について説明する。λＤＮＡを含んだ溶液が流路内を流動している状態において、１０００ｍＶの電圧を約３０秒間印加し、溶液中のλＤＮＡを正極上に拘束させた。その後、電圧を約３０ｍＶ／ｓｅｃの割合で１００ｍＶまで徐々に低下させ、正極表面上におけるλＤＮＡを観察した。比較例２における印加した電圧と時間との関係を図１３（ａ）に示す。観察には、１００倍油侵対物レンズを用い、可視化動画はＣＣＤカメラによって取得した。画素数、空間解像度および撮影速度はそれぞれ５１２×５１２、０．１６６μｍ／ｐｉｘｅｌおよび３４．７ｆｐｓである。
【０１４１】
比較例２の結果を、以下に説明する。印加電圧を１０００ｍＶとした場合、流路内を流動しているλＤＮＡが正極へと拘束されていく様子が観察された。しかし、正極表面に拘束される瞬間にλＤＮＡが観察されなくなった。図１４の（ａ）に１０００ｍＶを印加している状態における正極表面上の観察画像を示す。この図からも、正極表面上に拘束されているλＤＮＡが観察できていないことがわかる。これは、金電極によるクエンチ現象によるものであると考えられる。クエンチ現象とは、金や銀などの一部の金属が光を吸収する現象であり、金属表面から約１０ｎｍ以下の距離に置かれた分子からの蛍光は金属に吸収されてしまうことが報告されている（Ｋ．Ａ．Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１６（２０１１））。この状態から、印加電圧を徐々に低下させていくと、印加電圧が約７００ｍＶ程度の時に正極表面上のλＤＮＡが観察され始めた。図１４の（ｂ）に、印加電圧が７００ｍＶの状態における正極表面上の観察画像を示す。図１４の（ａ）および（ｂ）から、印加電圧が７００ｍＶ以上の場合、λＤＮＡは電極上に強く拘束され、λＤＮＡの全体が金電極表面から約１０ｎｍの範囲に存在していることがわかる。さらに電圧を低下させていくと、蛍光強度が大きくなり、印加電圧約６００ｍＶ程度の時に、λＤＮＡの形状が判断できる程になった。図１４（ｃ）は，印加電圧が５５０ｍＶの状態における、金電極表面上の観察画像を示している。
【０１４２】
図１４の（ａ）〜（ｃ）に示されているように、比較例２では、λＤＮＡの明確な伸長現象は確認できなかった。これは、電圧を徐々に低下させた場合、電圧降下に伴って、λＤＮＡが常に平衡状態を保つように形状を変形させているためであると考えられる。すなわち、λＤＮＡは伸長した状態よりも凝集した糸まり状の状態の方が安定な状態であるため、電圧降下に合わせてある程度凝集した状態を保ちながら形状を変形させていると考えられる。
【０１４３】
＜実施例４＞
以下に実施例４について説明する。λＤＮＡを正極上に拘束させた後、印加電圧を１０００ｍＶから２５０ｍＶに切り替えてλＤＮＡの流動を観察したこと以外は、比較例２と同一の条件で実験を行った。実施例４における印加した電圧と時間との関係を図１３（ｂ）に示す。
【０１４４】
実施例４の結果を、以下に説明する。図１５の（ａ）および（ｂ）は、印加電圧がそれぞれ１０００ｍＶおよび２５０ｍＶの場合において観察される正極近傍の観察画像である。図１５の（ａ）では、比較例２と同様に、電極上に拘束されているλＤＮＡの存在はクエンチ現象により観察できない。また、図１５の（ｂ）では、比較例２と異なり、伸長しているλＤＮＡが観察でき、１０μｍ程度の伸長を示しているλＤＮＡが存在する。
【０１４５】
なお、電極表面上を観察することによって、λＤＮＡは電極の端だけでなく、電極表面全体に拘束されていることが確認できた。このことより、電極幅をより細くすれば、より効果的に高分子の伸長現象を観察することが可能になると考えられる。つまり、高分子の電極に拘束される部分が少なるため、高分子はより伸長するようになると考えられる。
【０１４６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明は、凝集した鎖状高分子を伸長させることができるため、生物学、医学、薬学、農学、工学等の分野において高分子の分子レベルでの観察に利用することができる。
【符号の説明】
【０１４８】
１  ・・・固定用電極
２  ・・・対向電極
３  ・・・流路
４  ・・・流路壁
５  ・・・高分子
６  ・・・第１の基板
７  ・・・第２の基板
８  ・・・電極
９  ・・・導入口
１０  ・・・導出口
１１  ・・・導線
１２  ・・・第３の基板
１３  ・・・第４の基板
１４  ・・・第５の基板
１５  ・・・導入用リザーバ
１６  ・・・導出用リザーバ
１７ａ，１７ｂ  ・・・チューブ
１８ａ，１８ｂ  ・・・手動ステージ
１９  ・・・電圧調節手段
２０  ・・・対物レンズ
２１  ・・・ミラー
２２  ・・・ＣＣＤカメラ
２３  ・・・ＰＣ
２４  ・・・シリンジ
２５ａ，２５ｂ  ・・・シリコン基板
２６ａ，２６ｂ  ・・・レジスト薄膜
２７ａ，２７ｂ，２７ｃ  ・・・フォトマスク
２８ａ，２８ｂ，２８ｃ  ・・・ＰＤＭＳ
２９ａ，２９ｂ  ・・・カバーガラス
３０  ・・・レジスト薄膜
３１  ・・・チタン薄膜
３２  ・・・金薄膜
【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
2014068612.tif 000021
【図１４】
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【図１５】
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