(57)【要約】【課題】アフラトキシンの産生を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高く、実用的なアフラトキシン産生阻害剤及びその効率的な製造方法、並びに、前記アフラトキシンの生合成経路の生合成中間体であるノルソロリン酸の産生を特異的かつ効果的に阻害するノルソロリン酸産生阻害剤、前記アフラトキシンの生合成に関与するａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡの発現を抑制するｍＲＮＡ発現抑制剤、及びアフラトキシンの産生を特異的かつ効果的に阻害するアフラトキシン汚染防除方法の提供。【解決手段】ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を含むアフラトキシン産生阻害剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を含むことを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナス  スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｎｏ．２７株を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物からｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を精製する精製工程と、
を少なくとも含むことを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤の製造方法。
【請求項３】
ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を含むことを特徴とするノルソロリン酸産生阻害剤。
【請求項４】
ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を含むことを特徴とするａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡ発現抑制剤。
【請求項５】
請求項１に記載のアフラトキシン産生阻害剤、請求項３に記載のノルソロリン酸産生阻害剤、及び請求項４に記載のａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡ発現抑制剤、の少なくともいずれかを用いることを特徴とするアフラトキシン汚染防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフラトキシン産生阻害剤及びその製造方法、ノルソロリン酸産生阻害剤、ａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡ発現抑制剤、並びに、アフラトキシン汚染防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カビの二次代謝物には、有用な化合物が含まれる一方、マイコトキシンと呼ばれる毒性を示す化合物も多い。現在、マイコトキシンによる農作物の汚染は、世界的に深刻な問題となっており、安全な食糧を安定して得るために、マイコトキシン汚染防除の手段が求められている。
【０００３】
マイコトキシンによる農作物の汚染のうち、最も深刻な問題となっているのが、アフラトキシンによる農作物の汚染である。アフラトキシンは、既知の天然物質中で最も強い発ガン性や急性毒性を有することが知られており、また、通常の調理方法等では分解されない化合物であることから、その健康被害は深刻である。アフラトキシンに汚染された農作物の摂取による死亡の報告は頻繁にあり、またアフラトキシンが原因と推定される肝臓ガンによる死者は、中国だけでも毎年数十万人にのぼっている。
【０００４】
このような健康被害を防止するため、アフラトキシンの農作物汚染の規制値は、１０ｐｐｂ程度と低く設けられている。しかし、これにより、アフラトキシンで汚染された農作物を破棄することによる損害額も高額にのぼっている。例えば、米国でのアフラトキシン汚染による損失は、年間数百億円である。また、アジアにおけるアフラトキシン汚染による損失は更に大きく、年間１，０００億円以上にのぼると推定されている。
【０００５】
アフラトキシンの主な産生菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓであり、熱帯及び亜熱帯の環境下において、農作物の栽培や貯蔵の段階で、トウモロコシやピーナッツ等の農作物に感染してアフラトキシンを産生することが知られている（非特許文献１及び２参照）。熱帯及び亜熱帯以外の気候の地域においても、近年の地球温暖化現象による気候変動により、汚染地域の拡大が懸念されている。
【０００６】
従来から、アフラトキシン汚染防除の取り組みとして、アフラトキシン産生菌のゲノム解析やアフラトキシンの産生に関与する遺伝子の同定等の基礎研究や、感染に抵抗性を有する品種の取得、アフラトキシン非産生菌との競合による汚染の軽減等の実用研究が行われている。しかしながら、アフラトキシン汚染防除の効果的かつ抜本的な方法は、未だ確立されていない。
【０００７】
アフラトキシン汚染防除方法としては、例えば、アフラトキシン産生菌の生育を阻害する抗カビ剤を使用する方法が考えられるが、強力な抗カビ剤は安全性に問題があり、また、該抗カビ剤の耐性菌の蔓延を引き起こす可能性がある。
一方、アフラトキシンは二次代謝物であるため、その産生を阻害しても産生菌の生育には影響を与えないと考えられることから、アフラトキシンの産生のみを特異的に阻害する薬剤を利用することができれば、有効な汚染防除方法になりうると考えられる。
【０００８】
そこで、アフラトキシンの産生を阻害する物質の探索が行なわれた結果、有機リン系の殺虫剤であるｄｉｃｈｌｏｒｖｏｓや、メラニン生合成系酵素を阻害するｔｒｉｃｙｃｌａｚｏｌｅに、アフラトキシンの産生阻害活性が見出された（非特許文献３参照）。しかしながら、これらの化合物はアフラトキシンの産生阻害活性が弱く、また該化合物自体の安全性に問題があることに加え、阻害活性の選択性に問題があることから実用化には至っていない。
【０００９】
このように、耐性菌の蔓延を引き起こすことなく、アフラトキシンの産生のみを特異的に阻害する作用を有する化合物が求められており、探索の結果いくつかの化合物も見出されている（特許文献１及び２参照）。しかし、安全性が高く、かつ実用性の高いアフラトキシン産生阻害剤としては、未だ満足なものが見出されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平９−２４１１６７号公報
【特許文献２】特開平１１−７９９１１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，  “Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ：  Ｒｉｓｋｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ，  Ａｎｉｍａｌ，  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”，  ＣＡＳＴ，  Ａｍｅｓ，  Ｉｏｗａ，  ＵＳＡ，  ２００３
【非特許文献２】宇田川俊一，田端節子，中里光男：“マイコトキシン”，中央法規，２００２
【非特許文献３】Ｌ．Ｌ．  Ｚａｉｋａ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ｂｕｃｈａｎａｎ，  Ｊ．  Ｆｏｏｄ．  Ｐｒｏｔ．，  １９８７，  ５０，  ６９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アフラトキシンの産生を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高く、実用的なアフラトキシン産生阻害剤及びその効率的な製造方法、前記アフラトキシンの生合成経路の生合成中間体であるノルソロリン酸の産生を特異的かつ効果的に阻害するノルソロリン酸産生阻害剤、前記アフラトキシンの生合成に関与するａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡの発現を抑制するｍＲＮＡ発現抑制剤、並びに、アフラトキシンの産生を特異的かつ効果的に阻害するアフラトキシン汚染防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、アミノ酸からなり非常に安全性の高いｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）が、優れたアフラトキシンの産生阻害活性を有すること、更に、前記ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）は、アフラトキシンの生合成の初期段階を阻害することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１４】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を含むことを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤である。
＜２＞  受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナス  スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｎｏ．２７株を培養する培養工程と、  前記培養工程で得られた培養物からｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を精製する精製工程と、を少なくとも含むことを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤の製造方法である。
＜３＞  ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を含むことを特徴とするノルソロリン酸産生阻害剤である。
＜４＞  ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を含むことを特徴とするａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡ発現抑制剤である。
＜５＞  前記＜１＞に記載のアフラトキシン産生阻害剤、前記＜３＞に記載のノルソロリン酸産生阻害剤、及び前記＜４＞に記載のａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡ発現抑制剤、の少なくともいずれかを用いることを特徴とするアフラトキシン汚染防除方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、アフラトキシンの産生を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高く、実用的なアフラトキシン産生阻害剤及びその効率的な製造方法、前記アフラトキシンの生合成経路の生合成中間体であるノルソロリン酸の産生を特異的かつ効果的に阻害するノルソロリン酸産生阻害剤、前記アフラトキシンの生合成に関与するａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡの発現を抑制するｍＲＮＡ発現抑制剤、並びに、アフラトキシンの産生を特異的かつ効果的に阻害するアフラトキシン汚染防除方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓによるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：アフラトキシンの産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｆｌａｖｕｓによるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：アフラトキシンの産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図２Ａ】図２Ａは、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓによるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：アフラトキシンの産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｆｌａｖｕｓによるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：アフラトキシンの産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図３Ａ】図３Ａは、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓによるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：アフラトキシンの産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｆｌａｖｕｓによるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：アフラトキシンの産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図４Ａ】図４Ａは、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓによるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：アフラトキシンの産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｆｌａｖｕｓによるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：アフラトキシンの産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図５】図５は、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓによるノルソロリン酸の産生量及び菌体質量の結果を示す図である。縦軸：ノルソロリン酸の産生量（μｇ／ｍＬ）又は菌体質量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図６Ａ】図６Ａは、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるａｆｌＲ  ｍＲＮＡの発現量の結果を示す図である。縦軸：ａｆｌＲ  ｍＲＮＡの発現量（％）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるｐｋｓＡ  ｍＲＮＡの発現量の結果を示す図である。縦軸：ｐｋｓＡ  ｍＲＮＡの発現量（％）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるｏｍｔＡ  ｍＲＮＡの発現量の結果を示す図である。縦軸：ｏｍｔＡ  ｍＲＮＡの発現量（％）、横軸：ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加濃度（ｍＭ）。
【図７】図７は、アフラトキシンの生合成経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（アフラトキシン産生阻害剤）
本発明のアフラトキシン産生阻害剤は、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。前記アフラトキシン産生阻害剤は、アフラトキシンの産生を阻害するものである。
【００１８】
＜ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）＞
前記ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）は、下記構造式（１）で表される化合物である。
【化１】
2014070038.tif 000002
【００１９】
前記アフラトキシン産生阻害剤中の前記ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記アフラトキシン産生阻害剤は、前記ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）そのものであってもよい。
【００２０】
＜その他の成分＞
前記アフラトキシン産生阻害剤中の前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、任意の農薬成分、農薬補助剤などが挙げられる。
前記アフラトキシン産生阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
＜＜農薬成分＞＞
前記農薬成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下の農薬の有効成分が挙げられる。
前記農薬としては、例えば、殺カビ剤、殺細菌剤、抗ウィルス剤、植物抵抗性誘導剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、昆虫生育調整剤、昆虫誘引剤、除草剤、植物生長調整剤、共力剤、薬害軽減剤、鳥類忌避剤、肥料、土壌改良剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２２】
＜＜農薬補助剤＞＞
前記農薬補助剤は、担体と、界面活性剤と、その他の補助剤とを含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有する。
【００２３】
−担体−
前記担体としては、農園芸用に用いることができるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体担体、固体担体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２４】
前記液体担体としては、例えば、水；イソプロピルアルコール、エチレングリコール等のアルコール類；シクロヘキサノン；メチルエチルケトン等のケトン類；プロピレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテル等のエーテル類；ケロシン、軽油等の脂肪族炭化水素類；キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼン、メチルナフタリン、ソルベントナフサ等の芳香族炭化水素類；Ｎ−メチル−２−ピロリドン等のアミド類；脂肪酸のグリセリンエステル等のエステル類；大豆油、ナタネ油等の植物油などが挙げられる。
【００２５】
前記固体担体としては、例えば、澱粉、活性炭、大豆粉、小麦粉、木粉、魚粉、粉乳等の動植物性粉末；タルク、カオリン、ベントナイト、ゼオライト、珪藻土、ホワイトカーボン、クレー、アルミナ、炭酸カルシウム、塩化カリウム、硫安等の鉱物性粉末などが挙げられる。
【００２６】
−界面活性剤−
前記界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。これらの界面活性剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキレート、ポリオキシエチレンフェニルエーテルポリマー、ポリオキシエチレンアルキレンアリールフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーなどが挙げられる。
【００２８】
前記陰イオン性界面活性剤としては、例えば、リグニンスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホサクシネート、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルサルフェート、アルキルナフタレンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルサルフェートなどが挙げられる。
【００２９】
前記陽イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルアミン塩などが挙げられる。
前記両性界面活性剤としては、例えば、第４級アンモニウム塩アルキルベタイン、アミンオキサイドなどが挙げられる。
【００３０】
−その他の補助剤−
前記その他の補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粘結剤、増粘剤、固着剤、防腐防カビ剤、溶剤、農薬活性成分の安定化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、着色剤などが挙げられる。
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００３１】
＜剤型＞
前記アフラトキシン産生阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳剤、懸濁剤、水和剤、水溶剤、液剤、ゾル剤（フロアブル剤）、顆粒水和剤、粉剤、細粒剤、粒剤、錠剤、油剤、噴霧剤、煙霧剤、エアゾール剤、ペースト剤などが挙げられる。これらの中でも、液剤が好ましい。
前記各剤の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法により製造することができる。
【００３２】
＜混用あるいは併用＞
前記アフラトキシン産生阻害剤は、他の殺菌剤（殺カビ剤、殺細菌剤、抗ウィルス剤、植物抵抗性誘導剤など）、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、昆虫生育調整剤、昆虫誘引剤、除草剤、植物生長調整剤、共力剤、薬害軽減剤、鳥類忌避剤、肥料、土壌改良剤等との混用あるいは併用することもできる。
【００３３】
＜製造方法＞
前記アフラトキシン産生阻害剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、後述する本発明のアフラトキシン産生阻害剤の製造方法で製造してもよく、化学合成により製造してもよい。
【００３４】
前記化学合成により製造する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔｈａｊｕｄｅｅｎ，Ｈ．；Ｐａｒｋ，Ｋｙｕｎｇｓｅｏｋ，Ｐ．；Ｍｏｏｎ，Ｓ．Ｓ．；Ｈｏｎｇ，Ｉ．Ｓ．，  “Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｒｅｅｎ  ｓｙｓｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｗａｔｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｔａｌｙｓｔ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．”，  Ｔｅｔｒａｈｅｄ  Ｌｅｔｔ．，  ２０１０，  ５１，  １３０３−１３０５．に記載された方法などが挙げられる。
【００３５】
具体的には、Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３を出発物質として用い、これにＢｏｃ−Ｌ−Ａｌａを反応させ、Ｂｏｃ基（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）とメチルエステル基で保護されたジペプチドを得た後、これらの保護基を脱保護し環化することによりｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を合成することができる。
【００３６】
＜用途＞
前記アフラトキシン産生阻害剤は、優れたアフラトキシンの産生阻害活性を有することから、アフラトキシン汚染防除方法に好適に利用可能である。
【００３７】
（アフラトキシン産生阻害剤の製造方法）
本発明のアフラトキシン産生阻害剤の製造方法は、培養工程と、精製工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００３８】
＜培養工程＞
前記培養工程は、受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナス  スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｎｏ．２７株を培養する工程である。
【００３９】
前記Ｎｏ．２７株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託申請し、平成２４年２月１５日に、受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１４６７として受託された。前記Ｎｏ．２７株は、東京大学農学部弥生キャンパスの土壌より分離されたものであり、毒性がなく安全な細菌である。
【００４０】
なお、他の菌にも見られるように、前記Ｎｏ．２７株は、性状が変化することがあり、前記培養工程で使用する菌としては、例えば、前記Ｎｏ．２７株に由来する突然変異株（自然発生）、形質接合体、遺伝子組換体などであってもよい。また、前記Ｎｏ．２７株は、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、アフラトキシンの産生阻害活性を高めるような処理を施されたものであってもよい。
【００４１】
前記培養は、前記Ｎｏ．２７株を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、前記アフラトキシン産生阻害剤の産生に良好な温度で培養することによって行われる。
【００４２】
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来ステノトロフォモナス  スピーシーズの培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販されているペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、ＮＺ−アミン、カゼイン、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源；トマトペースト、グリセリン、シュークロース、デンプン、グルコース、ガラクトース、マンノース、デキストリン、糖みつ、脂肪等の炭素源；食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム等の無機塩；などが挙げられる。
また、前記培地中の成分として、前記栄養源の他、例えば、微量の金属塩、消泡剤としての動物油、植物油、鉱物油などを添加することもできる。
これらの材料は、前記Ｎｏ．２７株が利用し、アフラトキシン産生阻害剤の産生に役立つものであればよく、公知の培養材料はすべて用いることができる。
【００４３】
アフラトキシン産生阻害剤の産生のための種母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上で培養した前記Ｎｏ．２７株の生育物などが挙げられる。
【００４４】
前記培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件で培養することが好ましい。
【００４５】
前記培養の方法としては、斜面（スラント）培養、平板（プレート）培養などの固体（寒天）培養や、液体培養のいずれであってもよいが、前記アフラトキシン産生阻害剤を大量に産生させる観点から、液体培養が好ましい。前記液体培養としては、振とう培養、静置培養、攪拌培養のいずれであってもよいが、振とう培養が好ましく、回転振とう培養がより好ましい。なお、大量培養を行う場合には、発酵槽等を用いて培養を行ってもよい。
【００４６】
前記培養の温度としては、前記Ｎｏ．２７株の発育が実質的に阻害されずに、アフラトキシン産生阻害剤を産生しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する産生菌に応じて適宜選択することができるが、２０℃〜３７℃が好ましい。
【００４７】
前記培養の期間としては、特に制限はなく、アフラトキシン産生阻害剤の蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜７日間でアフラトキシン産生阻害剤の蓄積が最高となる。
【００４８】
＜精製工程＞
前記精製工程は、前記培養工程で得られた培養物からｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を精製する工程である。
【００４９】
前記培養物としては、前記Ｎｏ．２７株の培養物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養液、培養上清、培養菌体、培養菌体の破砕物などが挙げられる。また、前記培養物の抽出物を用いてもよい。前記培養物の抽出物としては、例えば、該培養物に適当な有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトンなど）を加えて懸濁した後、遠心分離や濾過膜分離等を行い菌体と分離した抽出上清や、該抽出上清に対して、通常用いられる単離精製処理を行ったものなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、培養液、培養上清が好ましい。
【００５０】
前記培養物から、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶媒抽出法、分配あるいは吸着クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィー法などが挙げられる。これらの方法は、組み合わせて行ってもよい。
前記精製工程は、１回であってもよいが、複数回行うことが、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の収率が向上する点で好ましい。
【００５１】
前記精製工程で得られた物質が、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）であることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＳＩ−飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ）、旋光度計で旋光度を測定する方法、プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ−ＮＭＲ）、カーボン核磁気共鳴分光法（１３Ｃ−ＮＭＲ）などにより分析する方法などが挙げられる。
【００５２】
（ノルソロリン酸産生阻害剤）
本発明のノルソロリン酸産生阻害剤は、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。前記ノルソロリン酸産生阻害剤は、アフラトキシンの生合成中間体であるノルソロリン酸の産生を抑制するものである。
【００５３】
＜ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）＞
前記ノルソリン酸産生阻害剤中の前記ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ノルソロリン酸産生阻害剤は、前記ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）そのものであってもよい。
【００５４】
＜その他の成分＞
前記ノルソロリン酸産生阻害剤中の前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、前記アフラトキシン産生阻害剤中のその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記ノルソロリン酸産生阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５５】
＜剤型＞
前記ノルソロリン酸産生阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳剤、懸濁剤、水和剤、水溶剤、液剤、ゾル剤（フロアブル剤）、顆粒水和剤、粉剤、細粒剤、粒剤、錠剤、油剤、噴霧剤、煙霧剤、エアゾール剤、ペースト剤などが挙げられる。これらの中でも、液剤が好ましい。
前記各剤の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法により製造することができる。
【００５６】
＜混用あるいは併用＞
前記ノルソロリン酸産生阻害剤は、他の殺菌剤（殺カビ剤、殺細菌剤、抗ウィルス剤、植物抵抗性誘導剤など）、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、昆虫生育調整剤、昆虫誘引剤、除草剤、植物生長調整剤、共力剤、薬害軽減剤、鳥類忌避剤、肥料、土壌改良剤等との混用あるいは併用することもできる。
【００５７】
＜製造方法＞
前記ノルソロリン酸産生阻害剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、化学合成により製造してもよいし、本発明の前記アフラトキシン産生阻害剤の製造方法でも好適に製造できる。
【００５８】
＜用途＞
前記ノルソロリン酸産生阻害剤は、図７に示すように、アフラトキシンの生合成経路において上流に位置する生合成中間体である。したがって、優れたノルソロリン酸の産生阻害活性を有する前記ノルソロリン酸産生阻害剤は、アフラトキシン汚染防除方法に好適に利用可能である。
【００５９】
（ｍＲＮＡ発現抑制剤）
本発明のａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡ発現抑制剤（以下、「ｍＲＮＡ発現抑制剤」と略記することがある）は、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。前記ｍＲＮＡ発現抑制剤は、アフラトキシン生合成酵素をコードする遺伝子であるｐｋｓＡ及びｏｍｔＡ、並びに、前記ｐｋｓＡ及び前記ｏｍｔＡの転写を制御する制御タンパク質ＡｆｌＲをコードする遺伝子であるａｆｌＲの少なくともいずれかのｍＲＮＡの発現を抑制するものである。
【００６０】
図７に示すように、アフラトキシンの生合成は、複雑であり、２０以上の生合成酵素が触媒するステップにより生合成される。アフラトキシン生産菌において、前記生合成酵素をコードする遺伝子群は、約７０ｋｂの遺伝子クラスター内に存在する。そのクラスターには、生合成酵素遺伝子以外に、制御タンパク質をコードするａｆｌＲ遺伝子も含まれている。ＡｆｌＲは、クラスターに含まれる生合成酵素遺伝子のプロモーター部位に結合し、それらの遺伝子の発現を開始させる。即ち、ＡｆｌＲの発現がアフラトキシン生合成の鍵となる。ＡｆｌＲの発現レベルが抑制されると、アフラトキシン生産は阻害される。ｐｋｓＡ及びｏｍｔＡは、アフラトキシン生合成経路の初期及び後期の生合成酵素をコードする遺伝子であり、ＡｆｌＲによって発現が制御されている。
したがって、これらの遺伝子発現を抑制することで、アフラトキシンの産生を好適に抑制できる。
【００６１】
＜ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）＞
前記ｍＲＮＡ発現抑制剤中の前記ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ｍＲＮＡ発現抑制剤は、前記ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）そのものであってもよい。
【００６２】
＜その他の成分＞
前記ｍＲＮＡ発現抑制剤中の前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、前記アフラトキシン産生阻害剤中のその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記ｍＲＮＡ発現抑制剤中の、前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６３】
＜剤型＞
前記ｍＲＮＡ発現抑制剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳剤、懸濁剤、水和剤、水溶剤、液剤、ゾル剤（フロアブル剤）、顆粒水和剤、粉剤、細粒剤、粒剤、錠剤、油剤、噴霧剤、煙霧剤、エアゾール剤、ペースト剤などが挙げられる。これらの中でも、液剤が好ましい。
前記各剤の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法により製造することができる。
【００６４】
＜混用あるいは併用＞
前記ｍＲＮＡ発現抑制剤は、他の殺菌剤（殺カビ剤、殺細菌剤、抗ウィルス剤、植物抵抗性誘導剤など）、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、昆虫生育調整剤、昆虫誘引剤、除草剤、植物生長調整剤、共力剤、薬害軽減剤、鳥類忌避剤、肥料、土壌改良剤等との混用あるいは併用することもできる。
【００６５】
＜製造方法＞
前記ｍＲＮＡ発現抑制剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、化学合成により製造してもよいし、本発明の前記アフラトキシン産生阻害剤の製造方法でも好適に製造できる。
【００６６】
＜用途＞
前記ｍＲＮＡ発現抑制剤は、上述のとおり、アフラトキシンの生合成に関与するａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡの発現に対して優れた抑制活性を有することから、アフラトキシン汚染防除方法に好適に利用可能である。
【００６７】
（アフラトキシン汚染防除方法）
本発明のアフラトキシン汚染防除方法は、本発明の前記アフラトキシン産生阻害剤、本発明の前記ノルソロリン酸産生阻害剤、及び本発明の前記ｍＲＮＡ発現抑制剤の少なくともいずれかを用いる方法である。
前記アフラトキシン汚染防除方法は、アフラトキシン産生菌によるアフラトキシンの産生を阻害する方法であり、前記アフラトキシン産生菌が付着及び／又は感染した対象物、若しくは、前記アフラトキシン産生菌の付着及び／又は感染の発生を防止したい対象物に対し、前記アフラトキシン産生阻害剤、前記ノルソロリン酸産生阻害剤、及び前記ｍＲＮＡ発現抑制剤の少なくともいずれかを施用する方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６８】
前記対象物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物体、農作物などが挙げられる。
前記農作物としては、例えば、トウモロコシ、コメ、ソバ、ハトムギ等の穀類；ピーナッツ、ピスタチオナッツ、ブラジルナッツ等のナッツ類；ナツメグ、唐辛子、パプリカ等の香辛料；コーヒー豆等の豆類；ゴマ類；綿実；などが挙げられる。
【００６９】
前記アフラトキシン産生阻害剤、前記ノルソロリン酸産生阻害剤、及び前記ｍＲＮＡ発現抑制剤の少なくともいずれかを施用する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アフラトキシン産生阻害剤、前記ノルソロリン酸産生阻害剤、及び前記ｍＲＮＡ発現抑制剤の少なくともいずれかをそのまま、又は水等で希釈した状態で、散布（例えば、噴霧、ミスティング、アトマイジング、散粉、散粒、水面施用、箱施用等）する方法、土壌施用（例えば、混入、潅注等）する方法、表面施用（例えば、塗布、粉衣、被覆等）する方法、浸漬する方法などが挙げられる。
【００７０】
前記アフラトキシン産生阻害剤、前記ノルソロリン酸産生阻害剤、及び前記ｍＲＮＡ発現抑制剤の少なくともいずれかの施用量としては、特に制限はなく、製剤の形態、対象病害や作物の種類、病害による被害の程度、施用場所、施用方法、施用時期、混用あるいは併用する薬剤や肥料等の種類や使用量、気象などの種々の条件に応じて、適宜選択することができる。
【００７１】
前記アフラトキシン産生阻害剤の施用濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができるが、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の濃度が、０．６ｍＭ以上となるように施用することが好ましく、１．０ｍＭ以上となるように施用することがより好ましい。前記施用濃度が、０．６ｍＭ未満であると、アフラトキシンの産生を十分に阻害できないことがある。
【００７２】
前記ノルソロリン酸産生阻害剤の施用濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができるが、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の濃度が、１．５ｍＭ以上となるように施用することが好ましく、２ｍＭ以上となるように施用することがより好ましい。前記施用濃度が、１．５ｍＭ未満であると、ノルソロリン酸の産生を十分に阻害できないことがある。
【００７３】
前記ｍＲＮＡ発現抑制剤の施用濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができるが、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の濃度が、３ｍＭ以上となるように施用することが好ましく、６ｍＭ以上となるように施用することがより好ましい。前記施用濃度が、３ｍＭ未満であると、アフラトキシンの産生を十分に阻害できないことがある。
【実施例】
【００７４】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７５】
（合成例１）
＜ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の合成＞
ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）は、Ｔｈａｊｕｄｅｅｎらの方法（Ｔｈａｊｕｄｅｅｎ，Ｈ．；Ｐａｒｋ，Ｋｙｕｎｇｓｅｏｋ，Ｐ．；Ｍｏｏｎ，Ｓ．Ｓ．；Ｈｏｎｇ，Ｉ．Ｓ．，  “Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｒｅｅｎ  ｓｙｓｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｗａｔｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｔａｌｙｓｔ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．”，  Ｔｅｔｒａｈｅｄ  Ｌｅｔｔ．，  ２０１０，  ５１，  １３０３−１３０５．）に従い調製した。具体的には、以下のとおりである。
【００７６】
Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３（０．５ｇ、３ｍｍｏｌ、渡辺化学工業株式会社製）を３ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ｄｒｙ  ＤＭＦ、関東化学株式会社製）に溶かした溶液に、Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｌａ（０．５７ｇ、３ｍｍｏｌ、渡辺化学工業株式会社製）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（１．３７ｇ、３．６ｍｍｏｌ、渡辺化学工業株式会社製）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．３８ｇ、６．０ｍｍｏｌ、関東化学株式会社製）を加えて反応させた。この反応混合物を２５℃で２０時間撹拌し、得られた反応溶液に１００ｍＬの酢酸エチル（関東化学株式会社製）を加えた後、５質量％炭酸水素ナトリウム水溶液（６０ｍＬ、関東化学株式会社製）及び５質量％塩化ナトリウム水溶液（６０ｍＬ、関東化学株式会社製）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。酢酸エチル溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を、溶出溶媒として、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルとの混合溶媒（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１〔体積比〕）を用いたシリカゲルクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００、２３ｇ、和光純薬工業株式会社製）により精製し、Ｂｏｃ基とメチルエステル基で保護されたジペプチド（０．６５ｇ）を得た。得られたジペプチドのうち０．５ｇを３５ｍＬの水に溶かし、１２１℃で４時間オートクレーブした。水を減圧下留去して得られた残渣を、溶出液にジクロロメタンとメタノールとの混合溶媒（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１〔体積比〕）を用いたシリカゲルクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００、１０ｇ、和光純薬工業株式会社製）により精製し、１９０ｍｇの下記構造式（１）で表されるｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を得た。
【化２】
2014070038.tif 000003
【００７７】
得られたｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）について、物理化学的性質を分析した結果は、以下のとおりであった。
（１）ＥＳＩ−飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ  １６９（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
（２）比旋光度は、［α］２８Ｄ＝−１３６（ｃ＝０．２３、エタノール）であった。
（３）プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ−ＮＭＲ）により、５００ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＨ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：４．３８（１Ｈ，ｍ），４．３３（１Ｈ，ｍ），３．５１−３．６１（２Ｈ，ｍ），２．３１−２．３９（１Ｈ，ｍ），１．９５−２．１２（３Ｈ，ｍ），１．４３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
（４）カーボン核磁気共鳴分光法（１３Ｃ−ＮＭＲ）により、１２５ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＣ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７２．２，１６８．３，５８．９，５０．６，４５．２，２７．３，２１．７，１４．４．
【００７８】
（比較合成例１）
＜ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）の合成＞
合成例１において、Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３をＤ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３（渡辺化学工業株式会社製）に変え、Ｂｏｃ−Ｌ−ＡｌａをＢｏｃ−Ｄ−Ａｌａ（渡辺化学工業株式会社製）に変えたこと以外は、合成例１と同様の方法で、２２０ｍｇの下記構造式（２）で表されるｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）を得た。
【化３】
2014070038.tif 000004
【００７９】
得られたｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）について、物理化学的性質を分析した結果は、以下のとおりであった。
（１）ＥＳＩ−飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ  １６９（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
（２）比旋光度は、［α］２８Ｄ＝＋１３７（ｃ＝０．２３５、エタノール）であった。
（３）プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ−ＮＭＲ）により、５００ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＨ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：４．３８（１Ｈ，ｍ），４．３３（１Ｈ，ｍ），３．５１−３．６１（２Ｈ，ｍ），２．３１−２．３９（１Ｈ，ｍ），１．９４−２．１２（３Ｈ，ｍ），１．４３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
（４）カーボン核磁気共鳴分光法（１３Ｃ−ＮＭＲ）により、１２５ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＣ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７２．２，１６８．３，５８．９，５０．６，４５．２，２７．３，２１．７，１４．４．
【００８０】
（比較合成例２）
＜ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の合成＞
合成例１において、Ｂｏｃ−Ｌ−ＡｌａをＢｏｃ−Ｄ−Ａｌａ（渡辺化学工業株式会社製）に変えたこと以外は、合成例１と同様の方法で、２５０ｍｇの下記構造式（３）で表されるｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を得た。
【化４】
2014070038.tif 000005
【００８１】
得られたｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）について、物理化学的性質を分析した結果は、以下のとおりであった。
（１）ＥＳＩ−飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ  １６９（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
（２）比旋光度は、［α］２８Ｄ＝−１３７．６（ｃ＝０．１７５、エタノール）であった。
（３）プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ−ＮＭＲ）により、５００ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＨ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：４．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７  ａｎｄ  １０Ｈｚ），４．１０（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．５４−３．６９（２Ｈ，ｍ），２．３９（１Ｈ，ｍ），１．９１−２．１４（３Ｈ，ｍ），１．４８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
（４）カーボン核磁気共鳴分光法（１３Ｃ−ＮＭＲ）により、１２５ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＣ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７０．９，１６８．４，５７．６，５２．４，４５．３，２７．８，２１．１，１８．１．
【００８２】
（比較合成例３）
＜ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）の合成＞
合成例１において、Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３をＤ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３（渡辺化学工業株式会社製）に変えたこと以外は、合成例１と同様の方法で、２４０ｍｇの下記構造式（４）で表されるｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）を得た。
【化５】
2014070038.tif 000006
【００８３】
得られたｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）について、物理化学的性質を分析した結果は、以下のとおりであった。
（１）ＥＳＩ−飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ  １６９（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
（２）比旋光度は、［α］２８Ｄ＝＋１４８（ｃ＝０．３３５、エタノール）であった。
（３）プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ−ＮＭＲ）により、５００ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＨ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：４．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７  ａｎｄ  １０Ｈｚ），４．１０（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．５４−３．６９（２Ｈ，ｍ），２．３９（１Ｈ，ｍ），１．９１−２．１４（３Ｈ，ｍ），１．４８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
（４）カーボン核磁気共鳴分光法（１３Ｃ−ＮＭＲ）により、１２５ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＣ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７０．９，１６８．４，５７．６，５２．４，４５．３，２７．８，２１．１，１８．１．
【００８４】
（製造例１）
＜培養工程＞
ベネット寒天培地（１質量％グルコース、０．２質量％ポリペプトン（日本製薬株式会社製）、０．１質量％肉エキス（極東製薬工業株式会社製）、０．１質量％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ製）、２％質量寒天（ナカライテスク株式会社製）、残部水；ｐＨ７．２）でステノトロフォモナス  スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｎｏ．２７株（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１４６７）を２６．５℃で１週間培養後、このＮｏ．２７株を三角フラスコ（５００ｍＬ容量）に入ったベネット液体培地（１質量％グルコース、０．２質量％ポリペプトン（日本製薬株式会社製）、０．１質量％肉エキス（極東製薬工業株式会社製）、０．１質量％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ製）、残部  水；ｐＨ７．２）１００ｍＬに植菌し、２６．５℃で２日間静置培養することにより前培養を行った。
この前培養液５ｍＬを三角フラスコ（５００ｍＬ容量）に入ったベネット液体培地１００ｍＬに植菌し、２６．５℃で５日間静置培養することにより培養液を得た。
【００８５】
＜精製工程＞
前記培養工程で得られた培養液２Ｌから、遠心分離（５，０００×ｇ，３０分間）により菌体を除去して得た培養上清を、溶媒に水を用いてパックした活性炭カラム（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｈａｒｃｏａｌ、１００ｇ、和光純薬工業株式会社製）に通した。次いで、３００ｍＬの水で洗浄後、５００ｍＬの１０体積％エタノール、５００ｍＬの２５体積％エタノール、５００ｍＬの５０体積％エタノール、及び５００ｍＬの１００体積％エタノールの順で、段階溶出を行った。得られた２５体積％エタノールの溶出画分を濃縮後、凍結乾燥し、１６０ｍｇの残渣を得た。得られた残渣を下記測定条件にて、３回の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行い、活性物質を精製した。
［ＲＰ−ＨＰＬＣ測定条件：１回目］
・カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（長さ２５０ｍｍ、直径１０ｍｍ、資生堂株式会社製）：
・溶出液：Ａ  ０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液／Ｂ  １００体積％アセトニトリル
・溶出条件：Ａ：Ｂ＝９０：１０からＡ：Ｂ＝１０：９０で３０分間の直線グラジエント溶出
・流速：３ｍＬ／分間
・検出；ＵＶ２２０ｎｍ
・活性画分収量：５２ｍｇ
［ＲＰ−ＨＰＬＣ測定条件：２回目］
・カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（長さ２５０ｍｍ、直径４．６ｍｍ、資生堂株式会社製）
・溶出液：Ａ  １０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．９）／Ｂ  １００体積％アセトニトリル
・溶出条件：Ａ：Ｂ＝１００：０からＡ：Ｂ＝７０：３０で２５分間の直線グラジエント溶出
・流速：０．８ｍＬ／分間
・検出：ＵＶ２２０ｎｍ
・活性画分収量：２８ｍｇ
［ＲＰ−ＨＰＬＣ測定条件：３回目］
・カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（長さ２５０ｍｍ、直径４．６ｍｍ、資生堂株式会社製）
・溶出：グラジエント溶出（１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、０体積％〜２０体積％アセトニトリル水溶液、ｐＨ８．９）
・溶出液：Ａ  １０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．９）／Ｂ  １００体積％アセトニトリル
・溶出条件：Ａ：Ｂ＝１００：０からＡ：Ｂ＝８０：２０で２０分間の直線グラジエント溶出
・流速：０．８ｍＬ／分間
・検出：ＵＶ２２０ｎｍ
・活性物質保持時間：１３．８分間
・活性物質収量：２．８ｍｇ
【００８６】
得られた活性物質は、前記ＲＰ−ＨＰＬＣでの保持時間及び以下の物理化学的性質の標品との比較によりｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）と同定した。
【００８７】
（１）ＥＳＩ−飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ  １６９（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
（２）比旋光度は、［α］２８Ｄ＝−１４０（ｃ＝０．１９、エタノール）であった。
（３）プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ−ＮＭＲ）により、５００ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で２５℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルは、以下のとおりであった。
δＨ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：４．３８（１Ｈ，ｍ），４．３３（１Ｈ，ｍ），３．５０−３．６１（２Ｈ，ｍ），２．３１−２．３９（１Ｈ，ｍ），１．９４−２．１２（３Ｈ，ｍ），１．４３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）．
【００８８】
（試験例１：アフラトキシンの産生阻害活性の評価）
＜胞子懸濁液１の調製＞
アフラトキシンＢ１及びＧ１の産生菌として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＮＲＲＬ  ２９９９（ＵＳＤＡ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＵＳＡより入手）をポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地；Ｄｉｆｃｏ製）の斜面培地上で、２７℃で１４日間培養後、その菌叢より胞子を白金耳で掻きとり、２．５×１０３ＣＦＵ／μＬになるようＴｗｅｅｎ２０を０．１質量％含む蒸留水に懸濁して胞子懸濁液を調製した。
【００８９】
＜胞子懸濁液２の調製＞
アフラトキシンＢ１の産生菌としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ  ＩＭＦ４７７９８（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓより入手）をポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地；Ｄｉｆｃｏ製）の斜面培地上で、２７℃で１４日間培養後、その菌叢より胞子を白金耳で掻きとり、２．５×１０３ＣＦＵ／μＬになるようＴｗｅｅｎ  ２０を０．１質量％含む蒸留水に懸濁して胞子懸濁液を調製した。
【００９０】
＜アフラトキシンの産生阻害活性の評価＞
合成例１及び比較合成例１〜３で得られた、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）、又はｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）を、それぞれ終濃度が、０ｍＭ（コントロール）、０．３７５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１．５ｍＭ、３ｍＭ、又は６ｍＭとなるように、２４ウェルのマイクロプレートの各ウェル（ｎ＝６）に入れた。各ウェルの液体量が合計１ｍＬとなるようにポテトデキストロース液体培地（Ｄｉｆｃｏ製）を加えた。
それぞれのウェルに、前記胞子懸濁液１（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＮＲＲＬ  ２９９９）又は前記胞子懸濁液２（Ａ．ｆｌａｖｕｓ  ＩＭＦ  ４７７９８）を１０μＬ／ウェルずつ植菌し、２７℃で３日間静置培養した。
【００９１】
３日間培養後、それぞれのウェルの培養液をミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）で濾過し、菌体と濾液（培養上清）とに分離した。
前記菌体は、５ｍＬの蒸留水で洗浄後１．５ｍＬのマイクロチューブに移し、１００℃で３時間乾燥させた。乾燥後、菌体入マイクロチューブの質量を測定し、空のマイクロチューブの質量を差し引いた質量を菌体質量とした。
前記濾液は、該濾液１ｍＬをクロロホルム０．２ｍＬで抽出し、風乾によりクロロホルムを留去後、０．１ｍＬの９０体積％アセトニトリル水溶液に溶解した。この溶液を０．２５μｍの無菌フィルターに通した後、下記測定条件にて、高速液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によりアフラトキシンの質量を定量した。
［ＬＣ／ＭＳの測定条件］
−ＨＰＬＣ−
・装置：２６９５  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
・カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ−ｐａｋ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ  ＵＧ１２０（長さ１５０ｍｍ、直径２．０ｍｍ、資生堂株式会社製）
・溶出液：Ａ  １０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／Ｂ  アセトニトリル
・溶出条件：Ａ：Ｂ＝９０：１０からＡ：Ｂ＝０：１００で１０分間の直線グラジエント溶出
・流量：０．２ｍＬ／分間
・保持時間：アフラトキシンＢ１（１１．４５分間）
アフラトキシンＧ１（１１．７９分間）
−ＭＳ−
・装置：ｍｉｃｒｏ  ｍａｓｓ  ＺＱ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
・イオン化：ＥＳＩ、ポジティブモード
・ソース温度：１２０℃
・脱溶媒温度：３５０℃
・コーン電圧：３０Ｖ
・脱溶媒ガス量：６００Ｌ／時間
・コーンガス量：５０Ｌ／時間
・キャピラリー電圧：２，８００Ｖ
・検出：アフラトキシンＢ１  ｍ／ｚ３１３（Ｍ＋Ｈ）＋
アフラトキシンＧ１  ｍ／ｚ３２９（Ｍ＋Ｈ）＋
【００９２】
ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を図１Ａ及び図１Ｂに、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加培地におけるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を図２Ａ及び図２Ｂに、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地におけるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を図３Ａ及び図３Ｂに、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）添加培地におけるアフラトキシンの産生量及び菌体質量の結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
なお、図１Ａ〜図４Ｂにおいて、各濃度は６ウェル（ｎ＝６）で行い、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定により、コントロール（化合物非添加）に対して、ｐ＜０．０５のものを「＊」で示した。
【００９３】
図１Ａに示すようにｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓのアフラトキシンＢ１及びＧ１の生産を、濃度依存的に阻害した。Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓのアフラトキシンＢ１に対するＩＣ５０値は、０．７５ｍＭであり、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓのアフラトキシンＧ１に対するＩＣ５０値は、０．６８ｍＭであり、いずれも強く阻害していた。なお、このとき、カビの生育に対する影響は認められなかった。
また、図１Ｂに示すように、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）は、Ａ．ｆｌａｖｕｓのアフラトキシンＢ１の生産も、濃度依存的に阻害した。Ａ．ｆｌａｖｕｓのアフラトキシンＢ１に対するＩＣ５０値は、０．６８ｍＭであり、強く阻害していた。なお、このとき、カビの生育に対する影響は認められなかった。
一方、図２Ａ〜図４Ｂに示すように、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）、ｃｙｃｌｏ（Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）、及びｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｐｒｏ）については、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓのアフラトキシンＢ１及びＧ１の産生、及びＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓのアフラトキシンＢ１の生産に対して、阻害活性を示さなかった。
したがって、アフラトキシンの産生阻害活性は、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）に特異的なものであることがわかった。
【００９４】
（試験例２：ノルソロリン酸の産生阻害活性の評価）
【００９５】
＜胞子懸濁液３の調製＞
アフラトキシン生合成経路の初期に含まれる生合成中間体であるノルソロリン酸の産生菌として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ２４６９０（ＵＳＤＡ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＵＳＡより入手）をポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地；Ｄｉｆｃｏ製）の斜面培地上で、２７℃で１４日間培養後、その菌叢より胞子を白金耳で掻きとり、２．５×１０３ＣＦＵ／μＬになるようＴｗｅｅｎ２０を０．１質量％含む蒸留水に懸濁して胞子懸濁液を調製した。
【００９６】
＜ノルソロリン酸の産生阻害活性の評価＞
合成例１で得られたｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を、終濃度が、０ｍＭ（コントロール）、０．７５ｍＭ、１．５ｍＭ、３ｍＭ、１２ｍＭ、又は２４ｍＭとなるように、２４ウェルのマイクロプレートの各ウェル（ｎ＝６）に入れた。各ウェルの液体量は、１ｍＬとなるようにポテトデキストロース液体培地（Ｄｉｆｃｏ製）を加えた。
それぞれのウェルに、前記胞子懸濁液３（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ２４６９０）を１０μＬ／ウェル植菌し、２７℃で５日間静置培養した。
【００９７】
５日間培養後、それぞれのウェルの培養液をミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）で濾過し、菌体と濾液（培養上清）とに分離した。
前記菌体は、５ｍＬの蒸留水で洗浄後１．５ｍＬのマイクロチューブに移し、１００℃で３時間乾燥させた。乾燥後、菌体入マイクロチューブの質量を測定し、空のマイクロチューブの質量を差し引いた質量を菌体質量とした。
前記菌体は、クロロホルム１ｍＬで抽出し、クロロホルムを濃縮後、残渣を０．１ｍＬの１００体積％メタノールに溶解した。この溶液を０．２５μｍの無菌フィルターに通した後、下記測定条件にて、高速液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によりノルソロリン酸の質量を定量した。
［ＨＰＬＣの測定条件］
・装置：ＰＵ２０８０ポンプ高圧グラジエント  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（日本分光株式会社製）
・カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ−ｐａｋ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（長さ２５０ｍｍ、直径４．６ｍｍ、資生堂株式会社製）
・溶出液：Ａ  水／Ｂ  ０．１体積％トリフルオロ酢酸含有１００体積％メタノール
・溶出条件：Ａ：Ｂ＝３０：７０からＡ：Ｂ＝０：１００で１５分間の直線グラジエント溶出の後、Ｂ＝１００で１０分間溶出。
・流量：０．８ｍＬ／分間
・検出：ＵＶ３１５ｎｍ
・ノルソロリン酸保持時間：２１分間
【００９８】
結果を図５に示す。ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ２４６９０のノルソロリン酸の生産を、濃度依存的に阻害した。Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ２４６９０のノルソロリン酸に対するＩＣ５０値は、１．８ｍＭであった。なお、このとき、カビの生育に対する影響は認められなかった。
なお、図５において、各濃度は６ウェル（ｎ＝６）で行い、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定により、コントロール〔ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）非添加〕に対して、ｐ＜０．０５のものを「＊」で示した。
【００９９】
（試験例３：ａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの転写に対する影響）
アフラトキシン生合成酵素をコードする遺伝子であるｐｋｓＡ及びｏｍｔＡ、並びに、前記ｐｋｓＡ及び前記ｏｍｔＡの制御タンパク質ＡｆｌＲをコードする遺伝子であるａｆｌＲの転写に対するｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）の影響について検討した。
【０１００】
合成例１で得られたｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を０ｍＭ（コントロール）、０．７５ｍＭ、１．５ｍＭ、３ｍＭ、又は６ｍＭとなるように、２４ウェルのマイクロプレートの各ウェル（ｎ＝６）に入れた。各ウェルの液体量は、１ｍＬとなるようにポテトデキストロース液体培地（Ｄｉｆｃｏ製）を加えた。
それぞれのウェルに、試験例１で調製した胞子懸濁液１（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＮＲＲＬ  ２９９９）を１０μＬ／ウェル植菌し、２７℃で３日間静置培養した。
【０１０１】
３日間培養後、それぞれのウェルの培養液をミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）で濾過し、菌体と濾液（培養上清）とに分離した。
前記菌体は、液体窒素中で破砕し、破砕物からｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて抽出した。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）とｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ  ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて次のように調製した。
【０１０２】
１μｇの抽出ＲＮＡ、５０ｎｇのｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ  ｐｒｉｍｅｒｓ、及び１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を５００ｍＭ塩化カリウムを含む２００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．４）溶液に溶かし、その１１μＬを６５℃で５分間反応させ、氷上で１分間冷却した。ここへ１μＬの１０×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を加えた後、２μＬの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４μＬの２５ｍＭ塩化マグネシウム、及び０．５μＬのＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を反応溶液に添加し、２５℃で１０分間、次いで５０℃で５０分間、次いで８５℃で５分間反応させた。１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡから調製したｃＤＮＡをｔｅｍｐｌａｔｅとして用いた。Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、各フラクション２５μＬで、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７３００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて行った。２段階のＰＣＲ条件は、最初に９５℃で１０分間反応を行った後，９５℃で１５秒間と６０℃で１分間の反応を４０サイクル行った。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてデザインした。
［プライマー］
ａｆｌＲ−１：５’−ＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号：１）
ａｆｌＲ−２：５’−ＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＡＴＣＧ−３’（配列番号：２）
ｐｋｓＡ−１：５’−ＴＧＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴ−３’（配列番号：３）
ｐｋｓＡ−２：５’−ＧＴＡＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＡＧ−３’（配列番号：４）
ｏｍｔＡ−１：５’−ＧＧＣＣＡＴＡＴＣＣＧＣＧＡＧＣＴＴ−３’（配列番号：５）
ｏｍｔＡ−２：５’−ＣＧＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＣＡＡＴ−３’（配列番号：６）
β−ａｃｔｉｎ−１：５’−ＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧ−３’（配列番号：７）
β−ａｃｔｉｎ−２：５’−ＴＴＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＡ−３’（配列番号：８）
【０１０３】
ａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、又はｏｍｔＡのｍＲＮＡ量は、β−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ量でノーマライズした。コントロール培地（０ｍＭ  ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）でのｍＲＮＡレベルの平均値に対する、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）添加培地でのｍＲＮＡレベルの平均値を「％」で定義した。結果を図６に示す。
【０１０４】
図６に示すように、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）は、ａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡのｍＲＮＡの転写を濃度依存的に抑制した。
これらの結果と、試験例２におけるノルソロリン酸の生産阻害活性の結果から、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）は、ａｆｌＲ  ｍＲＮＡの発現に至るまでのどこかのステップに作用し、ａｆｌＲのｍＲＮＡの発現を抑制していることが示唆された。
なお、図６において、各濃度は６ウェル（ｎ＝６）で行い、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定により、コントロール〔ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）非添加〕に対して、ｐ＜０．０５のものを「＊」で示した。
【受託番号】
【０１０５】
ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１４６７
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明のｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ）を含むアフラトキシン産生阻害剤、ノルソロリン酸産生阻害剤、及びａｆｌＲ、ｐｋｓＡ、及びｏｍｔＡの少なくともいずれかのｍＲＮＡ発現抑制剤は、優れたアフラトキシンの産生阻害活性を有することから、アフラトキシン汚染防除方法に好適に利用可能である。
【図１Ａ】
2014070038.tif 000007
【図１Ｂ】
2014070038.tif 000008
【図２Ａ】
2014070038.tif 000009
【図２Ｂ】
2014070038.tif 000010
【図３Ａ】
2014070038.tif 000011
【図３Ｂ】
2014070038.tif 000012
【図４Ａ】
2014070038.tif 000013
【図４Ｂ】
2014070038.tif 000014
【図５】
2014070038.tif 000015
【図６Ａ】
2014070038.tif 000016
【図６Ｂ】
2014070038.tif 000017
【図６Ｃ】
2014070038.tif 000018
【図７】
2014070038.tif 000019
【配列表】
2014070038000001.app