(57)【要約】【課題】新規なイオン交換媒体、およびそれらの調製および使用についての関連する方法を提供すること。【解決手段】本発明によるイオン交換固定相は、種々の生体分子のクロマトグラフィー分離に適している。本発明によるイオン交換媒体の際立った特徴としては、例えば、５μｍ未満の粒径を有する多孔性基質を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーを介するモノクローナル抗体の改変体を分離する能力が挙げられる。イオン交換固定相の媒体は、加水分解に安定な層を備え、この層が、１００％の水性媒体中における粒子の表面分解を阻害する。別の固有の特徴は、イオン交換基を用いて粒子を官能化するために用いられる低分子量構築ブロックである。【選択図】図１
2014070073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換媒体であって：
直径で約０．５μｍと約１００μｍとの間という平均粒子径を有する粒子状基質と；
前記粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層であって、前記二官能性または多官能性のオルガノシランが（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有する単層と；
【化１】
2014070073.tif 000012
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、Ｑ１およびＱ２の各々は独立して、直鎖または分岐した、非環式または環状の、飽和脂肪族部分から選択され、酸素、窒素またはイオウのヘテロ原子によって置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有しており、かつＺは１つ以上の窒素原子を含んでいるアミノ官能化有機基である。）
二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な前記単層に対して共有結合された、１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層であって、複数のイオン交換部位を示しているイオン交換層と；
を備える、イオン交換媒体。
【請求項２】
前記粒子状基質が、多孔性であり、非多孔性コアおよび多孔性のシェルを含むか、または非多孔性である、請求項１に記載のイオン交換媒体。
【請求項３】
前記粒子状基質が、約６０Å〜約２，０００Åという平均細孔径を有する、請求項１〜２のいずれか１項に記載のイオン交換媒体。
【請求項４】
Ｑ１が−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）ｍ−Ｇ−（ＣＨ２）ｎ−であり、Ｑ２が−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）ｍ−Ｇ’−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｍおよびｎの各々が、約１〜約６の整数であり、ＧおよびＧ’が独立して、−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、Ｚが、
【化２】
2014070073.tif 000013
である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のイオン交換媒体。
（上記式中、Ｌが脂肪族スペーサー基であり、酸素、窒素またはイオウのヘテロ原子で置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有し、Ｒ７が、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキル基であり、Ｒ８が、２つ以上の窒素原子を有するポリアミン基である。）
【請求項５】
Ｌが−（ＣＨ２）ｋ−であり、ｋが約１〜約６の整数であり、Ｒ７がＨであり、Ｒ８が
【化３】
2014070073.tif 000014
である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のイオン交換媒体。
（上記式中、Ｒ９がＨまたはアルキル基であり、ｌが約１〜約１２の整数であり、Ｙが−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０である。ここで、Ｒ１０がＨであり、かつＵが−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊが約１〜約６の整数である。）
【請求項６】
前記二官能性または多官能性のオルガノシランが、（ＩＩ）の構造式を有している、請求項１〜５のいずれか１項に記載のイオン交換媒体。
【化４】
2014070073.tif 000015
（上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々が独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子状基質の表面との間に、および／またはオルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｒ７がＨ、またはＣ１−Ｃ３アルキル基であり、
ｍ、ｎおよびｋの各々が、約１〜約３の整数であり、
ｌが約１〜約１２の整数であり、かつ
Ｙが、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０である。ここで、Ｒ１０がＨであり、かつＵが−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊが約１〜約６の整数である。）
【請求項７】
前記加水分解に安定な単層に共有結合した前記１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層が、前記加水分解に安定な単層に共有結合した１つ以上の陽イオン交換有機化合物または陰イオン交換有機化合物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のイオン交換媒体。
【請求項８】
イオン交換クロマトグラフィーによって生物学的被分析物を精製するための方法であって：
イオン交換媒体で充填されたイオン交換クロマトグラフィーカラムを提供する工程であって、このイオン交換媒体は：
直径で約０．５μｍ〜約１００μｍの平均粒子径を有する粒子状基質と、
前記粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層であって、前記二官能性または多官能性のオルガノシランが（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有する単層と、
【化５】
2014070073.tif 000016
（上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｑ１およびＱ２の各々は独立して、直鎖または分岐した、非環式または環状の、飽和脂肪族部分から選択され、酸素、窒素またはイオウのヘテロ原子によって置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有しており、かつ
Ｚは１つ以上の窒素原子を含んでいるアミノ官能化有機基である。）
二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な前記単層に対して共有結合された、１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層であって、複数のイオン交換部位を示している、イオン交換層とを備える工程と；
精製される生物学的被分析物が由来するサンプル溶液と、前記イオン交換クロマトグラフィー媒体とを接触させて、前記サンプル溶液とイオン交換クロマトグラフィー媒体との間のイオン交換を可能にする工程と；
前記生物学的被分析物を前記イオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させて、生物学的分子を精製する工程と；
を含む、方法。
【請求項９】
前記粒子状基質が、多孔性であり、非多孔性コアおよび多孔性のシェルを含むか、または非多孔性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的被分析物が、タンパク質、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび多糖類から選択される、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｑ１が−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）ｍ−Ｇ−（ＣＨ２）ｎ−であり、Ｑ２が−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）ｍ−Ｇ’−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｍおよびｎの各々が、約１〜約６の整数（例えば、１、２、３、４、５、６）であり、ＧおよびＧ’が独立して、−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、Ｚが、
【化６】
2014070073.tif 000017
である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（上記式中、Ｌが脂肪族スペーサー基であり、酸素、窒素またはイオウのヘテロ原子で置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有し、Ｒ７が、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキル基であり、Ｒ８が、２つ以上の窒素原子を有するポリアミン基である。）
【請求項１２】
Ｌが−（ＣＨ２）ｋ−であり、ｋが約１〜約６の整数であり、Ｒ７がＨであり、Ｒ８が
【化７】
2014070073.tif 000018
である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（上記式中、
Ｒ９がＨまたはアルキル基であり、
ｌが約３〜約１２の整数であり、
Ｙが−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０である。ここで、Ｒ１０がＨであり、かつＵが−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊが約１〜約６の整数である。）
【請求項１３】
前記二官能性または多官能性のオルガノシランが、（ＩＩ）の構造式を有している、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【化８】
2014070073.tif 000019
（上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々が独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子状基質の表面との間に、および／または前記オルガノシラン（Ｉ）の分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｒ７がＨ、またはＣ１−Ｃ３アルキル基であり、
ｍ、ｎおよびｋの各々が、約１〜約３の整数であり、
ｌが約３〜約６の整数であり、かつ
Ｙが、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０である。ここで、Ｒ１０がＨであり、かつＵが−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊが約１〜約６の整数である。）
【請求項１４】
前記加水分解に安定な単層に共有結合された１つ以上の前記イオン交換有機化合物のイオン交換層が、前記加水分解に安定な単層に共有結合した１つ以上の陽イオン交換有機化合物または１つ以上の陰イオン交換有機化合物を含む、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
陽イオン交換クロマトグラフィー固定相であって：
直径で約０．５μｍ〜約１００μｍの平均粒子径を有する粒子状基質と；
前記多孔性の粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層であって、前記二官能性または多官能性のオルガノシランが（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有する単層と；
【化９】
2014070073.tif 000020
（上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子状基質の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基であり、
ｍ、ｎおよびｋの各々が、約１〜約３の整数であり、
ｌが約３〜約６の整数であり、かつ
Ｙが、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０である。ここで、Ｒ１０がＨであり、かつＵが−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊが約１〜約６の整数である。）
前記加水分解に安定な単層に共有結合されたカルボン酸、スルホン酸およびホスホン酸から選択される１つ以上の二酸または多酸の陽イオン交換層と；
を備える、陽イオン交換クロマトグラフィー固定相。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、イオン交換媒体に関する。より具体的には、本発明は、加水分解に安定なイオン交換組成物、ならびに、例えば、クロマトグラフィーの固定相としての、それらの調製および使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換クロマトグラフィーは、イオンおよび極性の分子を、それらの荷電に基づいて分離する、頻繁に用いられるクロマトグラフィー技術である。これは、大型のタンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、小型のヌクレオチドおよびアミノ酸を含む、ほぼあらゆる種類の荷電した分子に用いることができる。固定相の表面は、イオン性の官能基を示し、これは、クーロン（ｃｏｌｕｍｂｉｃ）（イオン性）相互作用を通じて反対荷電の被分析物イオンと相互作用する。従って、イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーに分けられる。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、固定相は負に荷電された官能基を示すので、正に荷電された官能基が保持されるが、陰イオン交換クロマトグラフィーでは、固定相の上の正に荷電された官能基によって陰イオンが保持される。
【０００３】
タンパク質は、それらが一般には、負の荷電および正の荷電の両方を有するという点で両性電解質である。例えば、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基は、負の電荷を示すが、アルギニン残基、リジン残基およびヒスチジン残基は、正の電荷を示す。しかし、タンパク質上の正味の電荷は、荷電された残基の組成およびタンパク質が存在する環境のｐＨに依存する場合が多い。
【０００４】
非多孔性のポリマーおよびシリカ粒子は典型的には、表面積が小さく、これが、非多孔性粒子に基づいてイオン交換固定相を生じるために表面重合技術の使用を要する主な要因である。例えば、表面重合化が、多重イオン交換基の長いポリマー鎖（非多孔性粒子の表面に結合される）への組み込みを通じてカラムの能力を改変するために用いられてもよい。
【０００５】
非多孔性基質は、具体的には、非多孔性粒子の表面に位置するイオン交換部位に対する生体分子の無制限のアクセスに起因する、生体分子およびモノクローナル抗体の分離のために用いられてきた。しかし、重合化のような表面グラフティングを介した表面官能化は、温度、酸素の濃度、重合化過程の間の物質移動を含む、多くの要因によって影響される場合があり、これらの要因は、生成物の再現性に対して負の影響の一因となる場合がある。また、市販の非多孔性の材料は、すべての所望の粒子サイズでは利用できず、これによってそれらの用途は、特定の利用可能なカラム方式に限定される。
【０００６】
さらに不利なのは、非多孔性粒子（これは典型的には、粒子表面に結合された長いポリマー鎖とカップリングされる）を充填されたイオン交換カラムで高い背圧が発達するということである。高い背圧は、このような非多孔性粒子で充填されたカラム中で、特にそれらの粒子のサイズが小さい場合に、促進される場合がある。
【０００７】
分離特徴および有効性の改善をもたらし、同時により広範な適用を可能にする、固定相材料および組成物、ならびに関連のイオン交換クロマトグラフィー法に関して満たされていない要件がまだ存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，４７７，４９２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／００５１８７７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「有機化学」Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９
【非特許文献２】Ｋｉｒｋｌａｎｄ、２０００  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ９６５：２５〜３４
【非特許文献３】「現代液体クロマトグラフィー入門（Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」、Ｌ．Ｒ．ＳｎｙｄｅｒおよびＪ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ、第７章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）
【非特許文献４】「多孔性シリカ（Ｐｏｒｏｕｓ  Ｓｉｌｉｃａ）」、Ｋ．Ｋ．Ｕｎｇｅｒ、第１０８頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ＮＹ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）
【非特許文献５】「シリコーン類の化学および技術（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ）」、Ｗ．Ｎｏｌｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、新規なイオン交換材料および媒体、ならびにそれらの調製および使用に関する関連方法の予期されない発見に一部基づく。本発明によるイオン交換固定相は、種々の生体分子のクロマトグラフィー分離に適している。本発明によるイオン交換媒体の識別特徴としては、例えば、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを介するモノクローナル抗体の改変体をそれらが分離する能力が挙げられる。
【００１１】
本明細書に開示されるイオン交換固定相の固有の特徴は、加水分解に安定な単層を備えていることであり、この単層は、１００％の水性媒体中で表面分解を阻害する。別の固有の特徴は、イオン交換基を用いて粒子を官能化するために用いられる低分子量構築ブロックである。後者のアプローチは、固定相の表面上に高分子量のイオン交換ポリマーをグラフトするという従来の方法とは正反対である。これらの特徴が一緒になって、大幅に改善された、かつ多用途の固定相をもたらす。
【００１２】
一側面では、本発明は一般的に、イオン交換媒体であって：直径で約０．５μｍと約１００μｍとの間という平均粒子径を有する粒子状基質と；前記粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層と；二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な前記単層に対して共有結合された、１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層とを備える、イオン交換媒体に関する。このイオン交換層は、複数のイオン交換部位を示している。
【００１３】
前記二官能性または多官能性のオルガノシランは（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有している。
【００１４】
【化１】
2014070073.tif 000003
【００１５】
上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｑ１およびＱ２の各々は独立して、直鎖または分岐した、非環式または環状の、飽和脂肪族部分から選択され、酸素、窒素またはイオウによって置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有しており、かつ
Ｚは、１つ以上の窒素原子を含んでいるアミノ官能化有機基である。
【００１６】
特定の実施形態では、前記粒子状基質は、多孔性である。特定の実施形態では、前記粒子基質は、非多孔性コアおよび多孔性のシェルを含む。特定の実施形態では、この粒子状基質は、非多孔性である。
【００１７】
別の側面では、本発明は一般に、イオン交換クロマトグラフィーによって生物学的被分析物を精製するための方法に関する。この方法は、以下：イオン交換媒体で充填されたイオン交換クロマトグラフィーカラムを提供する工程と；精製される生物学的被分析物が由来するサンプル溶液と、前記イオン交換クロマトグラフィー媒体とを接触させて、前記サンプル溶液とイオン交換クロマトグラフィー媒体との間のイオン交換を可能にする工程と；前記生物学的被分析物を前記イオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させて、生物学的分子を精製する工程と；を包含する。このイオン交換媒体は、直径で約０．５μｍ〜約１００μｍの平均粒子径を有する粒子状基質と、前記粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層と；二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な前記単層に対して共有結合された、１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層とを備える。このイオン交換層は、複数のイオン交換部位を示している。
【００１８】
前記二官能性または多官能性のオルガノシランは（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有している。
【００１９】
【化２】
2014070073.tif 000004
【００２０】
上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｑ１およびＱ２の各々は独立して、直鎖または分岐した、非環式または環状の、飽和脂肪族部分から選択され、酸素、窒素またはイオウのヘテロ原子によって置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有しており、かつ
Ｚは、１つ以上の窒素原子を含んでいるアミノ官能化有機基である。
【００２１】
前記生物学的被分析物は、任意の適切な生物学的分子または材料、例えば、タンパク質、酵素、抗体、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは多糖類であってもよい。
【００２２】
さらに別の側面では、本発明は、一般的に、陽イオン交換クロマトグラフィー固定相に関し、これは以下：直径で約０．５μｍ〜約１００μｍの平均粒子径を有する粒子状基質と；この多孔性粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層と；この加水分解に安定な単層に共有結合された、カルボン酸、スルホン酸およびホスホン酸から選択される１つ以上の二酸または多酸の陽イオン交換層とを備える。
【００２３】
この二官能性または多官能性のオルガノシランは（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有している。
【００２４】
【化３】
2014070073.tif 000005
【００２５】
上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子状基質の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基であり、
ｍ、ｎおよびｋの各々は、約１〜約３の整数であり、
ｌは約３〜約６の整数であり、かつ  Ｙは、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０である。ここで、Ｒ１０がＨであり、かつＵは−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊは約１〜約６の整数である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の化合物を調製するための実施形態を示す。
【図２】本発明の化合物を充填された２．１×１５０ｍｍの弱陽イオン交換カラムを用いるリボヌクレアーゼＡおよびＢの分離を示す。
【図３】本発明の化合物を充填された２．１×１５０ｍｍの弱陽イオン交換カラムを用いて分画されたヒト化ＩｇＧサンプルの質量分析を示す。このサンプルを分画する試みは、市販の非多孔性の弱陽イオン交換固定相を用いた場合には失敗した。
【図４】本発明の化合物を充填された２．１×１５０ｍｍの弱陽イオン交換カラムを用いて分画されたヒト化ＩｇＧサンプルの質量分析を示す。このサンプルを分画する試みは、市販の非多孔性の弱陽イオン交換固定相を用いた場合には失敗した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
化学的用語および官能基の定義は、下にさらに詳細に記載する。有機化学の一般的な原理、ならびに特定の官能部分および反応性は、非特許文献１に記載される。
【００２８】
本明細書に記載されるような化合物は、任意の数の置換基または官能部分で置換されてもよいことが理解される。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「Ｃｘ−Ｃｙ」とは、一般に、ｘ個からｙ個（包括的）の炭素原子を有する基を指す。従って、例えば、Ｃ１−Ｃ６とは、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する基を指し、これには、Ｃ１−Ｃ２、Ｃ１−Ｃ３、Ｃ１−Ｃ４、Ｃ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ３、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ６およびすべての同様の組み合わせを包含する。「Ｃ１−Ｃ２０」などは同様に、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ１２、およびＣ３−Ｃ１２などの１〜２０個（包括的）の炭素原子の種々の組み合わせを包含する。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「脂肪族」という用語は、非芳香族の、飽和または不飽和の、直鎖、分枝鎖、非環式、環状または多環式の炭化水素骨格であって、１つ以上の官能基で必要に応じて置換されている骨格を指す。例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびシクロアルキニル部分が挙げられる。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「アルキル」という用語は、ヒドロカルビル基であって、指定された炭素原子数を有する飽和炭化水素基であり、直鎖、分岐鎖、環状および多環式の基を含む基を指す。「ヒドロカルビル」という用語は、水素および炭素原子のみを含む任意の部分を指す。ヒドロカルビル基としては、飽和基（例えば、アルキル基）、不飽和基（例えば、アルケン類およびアルキン類）、芳香族基（例えば、フェニルおよびナフチル）およびそれらの混合物が挙げられる。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「Ｃｘ−Ｃｙアルキル」という用語は、本質的にｘ個からｙ個の炭素原子からなる飽和の直鎖状または分岐した遊離基を指し、ここでｘは、１〜約１０の整数であり、かつｙは約２〜約２０の整数である。Ｃｘ−Ｃｙアルキル基としては、「Ｃ１−Ｃ２０アルキル」が挙げられ、これは、本質的に１〜２０個の炭素原子および対応する数の水素原子からなる、飽和した、直鎖または分岐した遊離基を指す。Ｃ１−Ｃ２０アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ドデカニルなどが挙げられる。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「Ｃｘ−Ｃｙアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して主要な構造に結合されている、本質的にｘ個からｙ個の炭素原子からなる直鎖状または分岐した鎖のアルキル基を指し、ここでｘは、１〜約１０の整数であり、かつｙは約２〜約２０の整数である。例えば、「Ｃ１−Ｃ２０アルコキシ」とは、酸素原子を介して主要な構造に結合されている、１〜２０個の炭素原子を有しており、従って、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペンチル、イソペントキシ、ネオペントキシ、ヘキソキシ、２−ヘキソキシ、３−ヘキソキシおよび３−メチルペントキシのような一般式アルキル−Ｏ−を有している、直鎖状または分岐した鎖のアルキル基を指す。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。
【００３５】
本明細書において用いる場合、脂肪族基に関して「飽和した」という用語は、その脂肪族基における炭素−炭素間の結合のすべてが炭素−炭素の単結合であることを指す。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「置換された」という用語は、ある基、例えば、ヒドロカルビル基に結合された水素原子が、別の原子で、例えば、Ｃｌまたは原子のグループ、例えばＣＨ３で置換されたことを意味する。アリール基およびヘテロアリール基に関して、「置換された」という用語は、任意のレベルの置換、例えば、一置換、二置換、三置換、四置換または五置換を指す。置換は、独立して選択され、置換は、化学的にかつ立体的にアクセス可能な任意の位置であってよい。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「オルガノシラン」という用語は、塩類の誘導体である有機化合物を指す。この有機化合物は、ケイ素結合に対する少なくとも１つの炭素を含む。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「固定相材料」（または時には「固定相」）という用語は、クロマトグラフィー使用を意図する疎性の（ｌｏｏｓｅ）粒子状材料を指す。一旦、物質が、カラムに充填されて、移動相と接触されれば、これは典型的には、「固定相」と呼ばれ、移動相によってクロマトグラフィーシステムを通じて行われている、被分析物の保持を担うクロマトグラフィーシステムの一部である。
【００３９】
本発明は、種々のクラスの生体分子の分離における使用に適した、新規なイオン交換媒体を提供する。本明細書に開示されるイオン交換固定媒体の固有の特徴としては、（１）加水分解に安定な単層（１００％の水性媒体における表面分解を阻害する）、および（２）イオン交換基で粒子を官能化するために用いられる比較的低分子量の構築ブロックが挙げられる。
【００４０】
本発明は、新規な多用途の固定相を提供する。本明細書に開示されるイオン交換媒体の際立った特徴としては、例えば、５μｍ未満の粒径を有する多孔性基質を用いる陽イオン交換液体クロマトグラフィーを介してモノクローナル抗体の改変体を分離する能力が挙げられる。
【００４１】
イオン交換媒体は、表面重合化なしに合成される。低分子量の、構造的に規定された、加水分解に安定な表面化学によって、ある場合には、カラム能力における劇的な改善が可能になる。例えば、本発明によって調製された小さい直径（例えば、３μｍ、３００Åの細孔）の陽イオン交換多孔性シリカ粒子を充填されたカラムは、高い背圧を生じない。この特徴は、それらを超高圧のクロマトグラフィーで用いること、ならびにモノクローナル抗体および生理活性タンパク質のような生体分子の迅速な分析を可能する。
【００４２】
一側面では、本発明は一般に、以下：直径で約０．５μｍ〜約１００μｍという平均粒子径を有する粒子状基質と；この粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層と；二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層に対して共有結合された、１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層と；を含むイオン交換媒体に関する。このイオン交換層は、複数のイオン交換部位を示している。
【００４３】
この二官能性または多官能性のオルガノシランは、（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有している。
【００４４】
【化４】
2014070073.tif 000006
【００４５】
上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、またはオルガノシランと前記粒子の表面との間に、および／またはオルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｑ１およびＱ２の各々は独立して、直鎖または分岐した、非環式または環状の、飽和脂肪族部分から選択され、酸素、窒素またはイオウのヘテロ原子によって置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有しており、かつ
Ｚは、１つ以上の窒素原子を含んでいるアミノ官能化有機基である。
【００４６】
特定の実施形態では、この粒子状基質は、多孔性である。特定の実施形態では、この粒子状基質は、非多孔性コアおよび多孔性のシェルを含む。特定の実施形態では、この粒子状基質は、非多孔性である。
【００４７】
多孔性の粒子状基質に関して、この粒子は好ましくは、約６０Å〜約２，０００Åの平均細孔径を有する（例えば、約６０Å〜約１，５００Å、約６０Å〜約１，０００Å、約６０Å〜約５００Å、約６０Å〜約４００Å、約６０Å〜約３００Å、約１００Å〜約２，０００Å、約１００Å〜約１，５００Å、約１００Å〜約１，０００Å、約１００Å〜約５００Å、約１００Å〜約４００Å、約１００Å〜約３００Å、約３００Å〜約２，０００Å、約３００Å〜約１，５００Å、約３００Å〜約１，０００Å、約３００Å〜約５００Å）。この細孔サイズの分布は（１標準偏差）は、任意の適切な数、例えば、細孔サイズ中央値の４０％以下（例えば、３０％以下、２０％以下、１０％以下）であってもよい。
【００４８】
特定の好ましい実施形態では、この粒子は、約５ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの表面積を有する（例えば、約５ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇ、約５ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇ、約５ｍ２／ｇ〜約５０ｍ２／ｇ、約１０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇ、約１０ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇ、約１０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇ）。
【００４９】
この粒子が非多孔性のコアを有する場合、このコアは、粒子全体の容積の約１０％〜約９０％、より好ましくは粒子全体の容積の約５０％〜約８０％（例えば、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約９０％、約６０％〜約８０％、約７０％〜約９０％）の範囲の容積を有することができる。
【００５０】
この粒子が非多孔性のコアを有する場合、このコアは、粒子全体の重量の約１０％〜約９０％、より好ましくは粒子全体の重量の約５０％〜約８０％（例えば、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約９０％、約６０％〜約８０％、約７０％〜約９０％）の範囲の重量を有することができる。
【００５１】
この粒子サイズの分布（１標準偏差）は、所望のユーティリティ次第で、狭くてもよいし、広くてもよいし、中央値の粒子サイズの約４０％以下、好ましくは中央値の粒子サイズの約３０％以下、さらに好ましくは中央値の粒子サイズの約２０％以下、そしてそれよりさらに好ましくは中央値の粒子サイズの約１０％以下であることができる。
【００５２】
特定の好ましい実施形態では、前記の二官能性または多官能性のオルガノシランは１分子あたり、２つ以上の共有結合を介して粒子状基質の表面に共有結合される（例えば、１分子あたり平均して２つの共有結合を介して、１分子あたり平均で２つを超える共有結合を介して）。
【００５３】
特定の実施形態では、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）ｍＧ−（ＣＨ２）ｎ−であり、Ｑ２は−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）ｍ−Ｇ’−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｍおよびｎの各々は、約１〜約６の整数（例えば、１、２、３、４、５、６）であり、ＧおよびＧ’は独立して、−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、Ｚは、
【００５４】
【化５】
2014070073.tif 000007
【００５５】
である。
【００５６】
上記式中、Ｌは脂肪族スペーサー基であり、酸素、窒素またはイオウのヘテロ原子で置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有し、Ｒ７は、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキル基であり、Ｒ８は、２つ以上の窒素原子を有するポリアミン基である。
【００５７】
Ｌは、例えば、−（ＣＨ２）ｋ−であってもよく、ｋは約１〜約６の整数（例えば、１、２、３、４、５、６）であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８は
【００５８】
【化６】
2014070073.tif 000008
【００５９】
である。
【００６０】
上記式中、Ｒ９はＨまたはアルキル基であり、ｌは約１〜約１２の整数であり、かつＹは−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０であり、ここでＲ１０がＨであり、かつＵは−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊは約１〜約６の整数（例えば、１、２、３、４、５、６）である。
【００６１】
特定の好ましい実施形態では、前記二官能性または多官能性のオルガノシランは、（ＩＩ）の構造式を有している。
【００６２】
【化７】
2014070073.tif 000009
【００６３】
上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、またはオルガノシランと前記粒子状基質の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合である。Ｒ７はＨ、またはＣ１−Ｃ３アルキル基（例えば、１、２、３）である。ｍ、ｎおよびｋの各々は、約１〜約３の整数（例えば、１、２、３）である。ｌは、約１〜約１２の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）である。Ｙは、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０である。ここで、Ｒ１０がＨであり、かつＵは−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊは約１〜約６の整数（例えば、１、２、３、４、５、６）である。
【００６４】
二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層は、粒子状基質の表面に共有結合される。ここで、「単層」という用語は、この粒子状基質の表面に対して垂直な寸法で、単一分子（ポリマー分子の対語として）を有する層を指す。二機能性または多機能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層は、単一の分子層の架橋されていない網目状構造であってもよいし、または架橋された網目状構造（粒子状基質の表面に延びている）であってもよい。
【００６５】
陽イオン交換の用途では、加水分解に安定な単層に共有結合した１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層は、加水分解に安定な単層に共有結合した１つ以上の陽イオン交換有機化合物を有する。陰イオン交換の用途では、加水分解に安定な単層に共有結合された１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層は、加水分解に安定な単層に共有結合された１つ以上の陰イオン交換有機化合物を有する。
【００６６】
陽イオン交換有機化合物とは、陽イオン交換基、例えば、二酸または多酸（遊離、活性または保護）を有する任意の適切な化合物であってもよい。二酸または多酸の例としては、カルボン酸、スルホン酸およびホスホン酸が挙げられる。
【００６７】
陰イオン交換有機化合物は、陰イオン交換基、例えば、二塩基または多塩基（遊離、活性または保護）を有する任意の適切な化合物であってもよい。二塩基または多塩基の例としては、一級アミン、二級アミン、三級アミンおよび四級アミンが挙げられる。
【００６８】
粒子状基質は、任意の適切な材料から調製されてもよい。例えば、粒子状基質は、シリカベースの固体材料（例えば、シリカゲルから調製）であってもよい。この粒子状基質はまた、アルミナ（酸化アルミニウム）、チタニア（酸化チタン）、ジルコニア（二酸化ジルコニウム）またはハイブリッドの有機／無機材料から調製されてもよい。
【００６９】
この粒子状基質は、例えば、直径で約１μｍ〜約５０μｍ（例えば、直径で約１μｍ〜約２０μｍ、直径で約１μｍ〜約１０μｍ、直径で約１μｍ〜約５μｍ、直径で約３μｍ〜約２０μｍ、直径で約３μｍ〜約１５μｍ、直径で約３μｍ〜約１０μｍ、直径で約５μｍ〜約２０μｍ、直径で約５μｍ〜約１０μｍ）の平均サイズを有する、設計された用途に適した任意の粒子サイズを有してもよい。
【００７０】
特定の実施形態では、オルガノシランの分子量は好ましくは、１０，０００未満（例えば、約９，０００未満、約８，０００未満、約７，０００未満、約６，０００未満、約５，０００未満、約４，０００未満、約３，０００未満、約２，０００未満）である。
【００７１】
別の側面では、本発明は一般に、イオン交換クロマトグラフィーによって生物学的被分析物を精製するための方法に関する。この方法は、以下：イオン交換媒体で充填されたイオン交換クロマトグラフィーカラムを提供する工程と；精製される生物学的被分析物が由来するサンプル溶液と、前記イオン交換クロマトグラフィー媒体とを接触させて、前記サンプル溶液とイオン交換クロマトグラフィー媒体との間のイオン交換を可能にする工程と；前記生物学的被分析物を前記イオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させて、生物学的分子を精製する工程と；を包含する。このイオン交換媒体は、直径で約０．５μｍ〜約１００μｍの平均粒子径を有する粒子状基質と、前記粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層と、二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な前記単層に対して共有結合された、１つ以上のイオン交換有機化合物のイオン交換層とを備える。このイオン交換層は、複数のイオン交換部位を示している。
【００７２】
前記二官能性または多官能性のオルガノシランは（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有している。
【００７３】
【化８】
2014070073.tif 000010
【００７４】
上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｑ１およびＱ２の各々は独立して、直鎖または分岐した、非環式または環状の、飽和脂肪族部分から選択され、酸素、窒素またはイオウのヘテロ原子によって置換される１つ以上の炭素原子を必要に応じて有しており、かつ
Ｚは、１つ以上の窒素原子を含んでいるアミノ官能化有機基である。
【００７５】
前記生物学的被分析物は、任意の適切な生物学的分子または材料、例えば、タンパク質、酵素、抗体、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは多糖類であってもよい。
【００７６】
イオン交換クロマトグラフィー媒体は、適切なイオン交換基を組み込むことによって、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体または陰イオン交換クロマトグラフィー媒体として設計されてもよい。
【００７７】
このイオン交換方法を行って、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の純度を有する、実質的に精製された生物学的被分析物を得てもよい。
【００７８】
さらに別の側面では、本発明は一般に、陽イオン交換クロマトグラフィー固定相に関し、これは以下：直径で約０．５μｍ〜約１００μｍの平均粒子径を有する粒子状基質と；この多孔性粒子状基質の表面に共有結合された二官能性または多官能性のオルガノシランを含む加水分解に安定な単層と；加水分解に安定な単層に共有結合されたカルボン酸、スルホン酸およびホスホン酸から選択される１つ以上の二酸または多酸の陽イオン交換層とを備える。
【００７９】
この二官能性または多官能性のオルガノシランは（Ｉ）の構造式を有し、かつ約２０，０００未満の分子量を有している。
【００８０】
【化９】
2014070073.tif 000011
【００８１】
上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、または前記オルガノシランと前記粒子状基質の表面との間に、および／または前記オルガノシランの分子の間に形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合であり、
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基であり、
ｍ、ｎおよびｋの各々は、約１〜約３の整数であり、
ｌは約３〜約６の整数であり、かつ
Ｙは、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０または−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−Ｕ−（ＣＨ２）ｊ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ１０であり、ここで、Ｒ１０がＨであり、かつＵは−ＮＨ−、酸素またはイオウのヘテロ原子であり、かつｊは約１〜約６の整数である。
【００８２】
本発明のイオン交換媒体を調製するための方法は典型的には、２つ（またはそれ以上）の表面官能化工程を包含する。第一の工程は、粒子状基質（シリカのような無機の酸化物）の表面と多官能性シランとの間のケイ素−酸素結合の形成を介して、加水分解に安定な層を構築する工程を包含する。多官能性シランを、無機酸化物の表面官能化の間に種々のシランと混合して、加水分解に安定な層へ追加の官能性を導入してその特性を修飾できる。
【００８３】
第二の工程は、加水分解に安定な層のアミノ基と、二官能性または多官能性の化合物（１または複数）の活性型のカルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸との間の反応を介する共有結合を形成するために、加水分解に安定な層の遊離のアミノ基と、活性型のカルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸を有する二官能性または多官能性の化合物（１または複数）（例えば、無水物、エステル類、アシルハライド類、スルホニル類、またはホスホリルハライド類）との間の反応を包含する。この反応の間に、加水分解に安定な層の遊離のアミノ基は、無機酸化物の表面上に遊離型、保護型または活性型のいずれかで陽イオン交換部位を導入するための結合ポイントとして機能することができる。
【００８４】
二官能性または多官能性の化合物（１または複数）のカルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸基の一部のみが、加水分解に安定な層においてアミン基との反応の間に消費される場合、残りの酸基は、加水分解または他の化学的／物理的過程の結果として、陽イオン交換部位に変換されることができる。二官能性または多官能性の化合物は、１分子あたり１〜約２０，０００個の陽イオン交換基を遊離型、活性型または保護型で含むことができる。二官能性または多官能性の化合物の各々の分子はまた、陽イオン交換基の残りの遊離型、保護型または活性型とは異なる１つ以上の反応性の官能基を有してもよい。
【００８５】
例えば、二官能性または多官能性の化合物は、ハロゲン化アルキル／塩化アシルまたはイソシアネート／エステル官能基の組み合わせを有してもよい。二官能性または多官能性の化合物の分子としては、活性化されたカルボン酸基（例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸；塩化アシル類、エステル類、ジカルボン酸およびポリカルボン酸のＮＨＳエステル類、ならびにそれらの誘導体または組み合わせ）が挙げられる。
【００８６】
陽イオン交換基はまた、加水分解に安定な層のアミノ基と、活性型のカルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸以外の官能基を担持する二官能性または多官能性の化合物とを反応させることによって、無機酸化物の表面上に導入できる。活性型のカルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸以外の官能基は、アミンとの共有結合を形成できる。このような基の例としては、エポキシド類、アルキルハライド類および活性化された二重結合が挙げられる。加水分解に安定な層のアミノ基との反応の間に消費されない、二官能性または多官能性の化合物のエポキシド類、アルキルハライド類および活性化された二重結合はさらに、陽イオン交換基へと直接または間接的に変換されてもよい。
【００８７】
直接変換の例としては、表面のエポキシド類とチオカルボン酸のエステル類との反応、それに続くエステル基の加水分解が挙げられる。間接的な変換の例としては、表面エポキシド類とポリエチレンイミンとの反応、それに続く加水分解に安定な層のアミノ基と二官能性または多官能性の化合物との間の反応が挙げられる。
【００８８】
任意の工程とは、二官能性または多官能性の化合物の残りの活性化されたカルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸の基の共有結合的修飾であり、これは、上述した反応によって無機酸化物の表面上に導入される。共有結合的修飾は、二官能性または多官能性の化合物（１または複数）の残りの活性化されたカルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸基と、例えば、約２００〜約５０，０００、好ましくは約２００〜約２，０００の分子量のオリゴマーまたはポリマーとの相互作用の結果であり、アミノ基を遊離型でまたは部分的に保護された型で有する。
【００８９】
これらの反応は、最終生成物に対して繰り返し、無作為に、または規則的に影響するように、例えば、表面上に導入された陽イオン交換部位または陰イオン交換部位の数を増加させるように設計されてもよい。
【００９０】
本明細書に開示される組成物および方法は、親水性の高い被分析物のクロマトグラフィー分離のための多重官能性を担持する、制御された、加水分解に安定な表面構造を構築する際に大きな可塑性を提供する。本発明は、陽イオン交換、陰イオン交換、水素結合、金属キレート化を含む、種々の保持方式および種々の分離技術に適用することができる。結果として、陽イオン交換、陰イオン交換、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）および固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）用のカスタマイズされた固定相は、適切な官能性表面基を用いて、本明細書の技術に基づいて設計できる。
【００９１】
例えば、加水分解に安定な層のアミノ基とクロロアセトアミド（２−クロロアセトアミド）との反応によって、一級アミド基で官能化されたＨＩＬＩＣ固定相を創出できる。加水分解に安定な層のアミノ基とポリエポキシ化合物との反応と、それに続くその加水分解によって、架橋された水酸化表面がもたらされる。リガンドの金属キレート化は、例えば、表面ポリエポキシドとイミノ二酢酸の誘導体（ＨＮ（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）２またはＩＤＡ）との相互作用を用いて同様に導入できる。
【００９２】
上で考察されるとおり、粒子状基質は、コア中で、および／またはシェル中で多孔性であってもよく、コア中で、および／またはシェル中で、非多孔性であってもよい。
【００９３】
非多孔性コアを有する多孔性シェルを有する粒子状基質を調製するための一般的な方法は、Ｂｅｒｇｎａの特許文献１に、および非特許文献２に記載されており、その各々が、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる。さらに、特許文献２は、固体コアおよび外側多孔性シェルを有する、表面が多孔性の粒子を調製するための方法を提供する。
【００９４】
シラン類とシリカ系支持体材料との反応の一般的考察は、非特許文献３に示されており、これは、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる。個々のシラン類と多孔性シリカとの反応の考察は、非特許文献４に見ることができ、これは、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる。個々のシラン類と種々の支持体材料との反応の詳細は、非特許文献５に見られ、これは、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
【００９５】
一般には、本発明による組成物は、クロマトグラフィーによって広範な種類の化学種を分離する方法に使用されてもよい。クロマトグラフィーでの使用のため、本発明による組成物は、粒子の形状で、クロマトグラフィーカラム中に充填されてもよい。クロマトグラフィーカラムは、特定のカラムが用いられる用途に基づく種々の寸法で製造される。本発明の実施形態による組成物を充填されたクロマトグラフィーカラムは、適切な担体相を含むリザーバーに対して、およびポンプ、例えば、メカニカルポンプまたはシリンジポンプ（クロマトグラフィーカラムを通じて担体相をポンピングできるもの）に対して、およびインジェクター（クロマトグラフィーカラム中に１つ以上の化学種を導入できるもの）に対して操作可能に接続されてもよい。本発明による組成物を含むクロマトグラフィーカラムはさらに、検出器、例えば、紫外分光光度計（クロマトグラフィーカラムから溶出する分離された化学種を検出しかつ必要に応じて分析できるもの）に対して操作可能に接続されてもよい。本発明による組成物を含むクロマトグラフィーカラムは、さらに、分離された種を別々に取り扱えるように、分離された種を複数の別の容器中に含む、担持相を収集できるフラクションコレクターに対して操作可能に接続されてもよい。
【００９６】
本発明による組成物は、粒子の形状で、クロマトグラフィープレート、例えば、薄層クロマトグラフィープレートまたは分取薄層クロマトグラフィープレート上に交互に沈着されてもよい。クロマトグラフィープレートは、材料の層、例えば、ガラスまたはポリマーフィルムを備え、その上にクロマトグラフィーの固定相の組成物が沈着される。本発明による組成物を含んでいるクロマトグラフィープレートは、適切な移動相のリザーバーに対して、およびクロマトグラフィープレート上へ化学種を導入できるインジェクターに対して操作可能に接続されてもよい。
【００９７】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、フラッシュクロマトグラフィー、固相抽出および他の形態のクロマトグラフィー分離を含むクロマトグラフィー分離のための本発明による組成物を用いるための装置および技術を、当業者は理解し、使用するであろう。
【００９８】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲において、不定冠詞の単数形「ａ、ａｎ」および定冠詞の単数形「ｔｈｅ」は、文脈上、明確に他を示すのでない限り、複数のものへの言及も包含する。
【００９９】
他に定義しない限り、本明細書に用いられるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様かまたは等価な任意の方法および材料はまた、本開示の実施または試験でも用いることができ、好ましい方法および材料はここに記載される。本明細書に引用される方法は、開示される特定の順序に加えて、理論上可能である任意の順序で行われてもよい。
【実施例】
【０１００】
加水分解に安定なシリカ粒子（例えば、３μｍ、３００Åの細孔サイズ）を調製し、モノクローナル抗体を含む生体分子の分離のための陽イオン交換固定相として用いた。粒子の表面は、低分子量の、カラム製造の高再現性を可能にする、構造的に規定されたリガンドで官能化される。「中間の」細孔サイズ（約３００〜５００Å）のシリカ粒子を用いることの利点は、イオン交換カラムを充填するための（ａ）表面積、（ｂ）表面イオン交換基のアクセス性、および（ｃ）多孔性基質の小さな（例えば、５μｍ未満）粒子の使用の組み合わせである。
【０１０１】
陽イオン交換基で官能化された、加水分解に安定なシリカ粒子（例えば、３μｍ、３００Åの細孔サイズ）は、生体分子のクロマトグラフィー分離に必要な条件下で１００％の水性媒体中で操作されてもよい。例えば、短い（２．１×１００ｍｍ）のカラム中に充填された陽イオン交換媒体では、市販の弱陽イオン交換非多孔性ポリマー粒子を充填された長い（２．１×２５０ｍｍ）のカラムと比較した場合、ヒト化ＩｇＧの優れたピーク分離度を示した。
＜実施例１＞
弱陽イオン交換シリカゲルの合成
（ａ）１５ｇの３００Ａ、３μｍのシリカ粒子を、５０ｍＬの乾燥１，４−ジオキサンおよび１０ｇのＮ，Ｎ’−Ｂｉｓ［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、９５％（Ｇｅｌｅｓｔ社製）と混合した。反応混合物を、２５℃で１５分間超音波処理し、次いで、メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、窒素下で２４時間還流した。シリカ粒子は、ガラスフィルターを用いてろ過し、高温の１，４−ジオキサンおよびメタノールで洗浄し、風乾させた。
【０１０２】
（ｂ）パート（ａ）から得られた表面官能化シリカ粒子を、２５０ｍＬの丸底フラスコ中に入れて、５０ｍＬの乾燥アセトニトリルと混合した。この混合物に、８ｇの塩化ジグリコリルを、１０ｍＬの乾燥アセトニトリル中に添加した。反応混合物を、１５分間超音波処理し、２５℃で一晩静置させた。表面官能化シリカゲルを、ガラスフィルターを用いてろ過して、無水アセトニトリルを用いて洗浄し、その洗浄工程の間の全時点で、少量の乾燥アセトニトリルで覆ってシリカ表面を保持した。得られたシリカ粒子を、２５０ｍＬの丸底フラスコに移して、５０ｍＬの乾燥メタノールおよび５ｍＬの無水トリエチレンアミンと化合させた。反応混合物を、２５℃で一晩静置させた。シリカ粒子をろ過して、風乾させた。
【０１０３】
（ｃ）パート（ｂ）から得られた表面官能化シリカ粒子を、６０ｍＬの乾燥アセトニトリルおよび１０ｇのペンタエチレンヘキサミンと化合させた。この反応混合物を２５℃で１５分間超音波処理し、次いでメカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、窒素下で２４時間還流させた。シリカ粒子を、ガラスフィルターを用いてろ過して、高温の無水アセトニトリルおよびメタノールを用いて洗浄して、風乾させた。
【０１０４】
（ｄ）パート（ｃ）から得られた表面官能化シリカ粒子を、２５０ｍＬの丸底フラスコ中に入れて、５０ｍＬの乾燥アセトニトリル、１２ｇの無水コハク酸および８ｍＬの無水トリエチルアミンと混合した。得られた懸濁物を、１５分間超音波処理し、２５℃で一晩静置させた。シリカ粒子を、ガラスフィルターを用いてろ過して、高温のアセトニトリル、５％のトリエチルアミン水溶液、水、５％のギ酸水溶液、水、およびアセトンを用いて段階的に洗浄した。生成された陽イオン交換シリカの１４ｇのバッチを、真空オーブン中で、５０℃で乾燥させた。
＜実施例２＞
弱陽イオン交換シリカゲルの合成
実施例１のパート（ａ）〜（ｃ）を繰り返した。パート（ｃ）から得られた表面官能化シリカ粒子を、２５０ｍＬの丸底フラスコ中に入れて、５０ｍＬの乾燥アセトニトリルと混合した。１０ｇの塩化ジグリコリルおよび５ｍＬのトリエチルアミンを、５℃でこの懸濁物に添加した。得られた懸濁物を、１５分間超音波処理し、２５℃で一晩静置させた。シリカ粒子を、ガラスフィルターを用いてろ過して、高温のアセトニトリル、５％のトリエチルアミン水溶液、水、５％のギ酸水溶液、水、およびアセトンを用いて段階的に洗浄した。生成された陽イオン交換シリカの１４．５ｇのバッチを、真空オーブン中で、５０℃で乾燥させた。
＜実施例３＞
実施例１のパート（ａ）および（ｂ）を繰り返した。
【０１０５】
パート（ｂ）から得られた表面官能化シリカ粒子を、２５０ｍＬの丸底フラスコ中に入れて、２０ｍＬの乾燥ＤＭＦおよび２０ｍＬの乾燥アセトニトリルと混合した。５ｇのＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア、１２８表面アミノ基）、２０重量％のメタノール溶液を、得られた懸濁物に添加した。反応混合物を、２５℃で１５分間超音波処理し、次いで、メカニカルスターラーを備えた２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、窒素下で２４時間還流させた。シリカ粒子を、ガラスフィルターを用いてろ過して、高温のメタノールを用いて洗浄して、風乾させた。得られた表面官能化シリカ粒子を、２５０ｍＬの丸底フラスコ中に入れて、５０ｍＬの乾燥アセトニトリル、１２ｇの無水コハク酸および８ｍＬの無水トリエチルアミンと混合した。得られた懸濁物を、１５分間超音波処理し、２５℃で一晩静置させた。シリカ粒子を、ガラスフィルターを用いてろ過して、高温のアセトニトリル、５％のトリエチルアミン水溶液、水、５％のギ酸水溶液、水、およびアセトンを用いて段階的に洗浄した。生成された陽イオン交換シリカの１４．３ｇのバッチを、真空オーブン中で、５０℃で乾燥させた。
参照による組み込み
特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文献に対する参照および引用が、本開示中でなされた。そのような文献のすべてが、ここで、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書において参照によって組み込まれるとされているものであっても、本明細書に明確に示される既存の定義、言明または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその一部は、その組み込まれる材料と本開示の材料との間で矛盾が生じない限りにおいて組み込まれる。矛盾が生じた場合には、かかる矛盾は、好ましい開示として本開示を支持して解決されるべきである。
等価物
本明細書に開示されている代表的な実施例は、本発明の例示の補助を意図しているものであって、本発明の範囲を限定するよう意図されているものでもなく、限定するものであると解釈されるべきでもない。実際、本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書に示され記載される実施形態に加えて、本明細書に引用される科学文献および特許文献による実施例ならびにそれに対する引用文献を含めて、本明細書の内容全体から当業者に明らかになるであろう。以下の実施例は、本発明の実施に対して、その種々の実施形態および等価物において適合できる重要な追加の情報、例証および手引きを含む。
【図１】
2014070073.tif 000021
【図２】
2014070073.tif 000022
【図３】
2014070073.tif 000023
【図４】
2014070073.tif 000024
【外国語明細書】
2014070073.tif 000025
2014070073.tif 000026
2014070073.tif 000027
2014070073.tif 000028
2014070073.tif 000029
2014070073.tif 000030
2014070073.tif 000031
2014070073.tif 000032
2014070073.tif 000033
2014070073.tif 000034
2014070073.tif 000035
2014070073.tif 000036
2014070073.tif 000037
2014070073.tif 000038
2014070073.tif 000039
2014070073.tif 000040
2014070073.tif 000041
2014070073.tif 000042
2014070073.tif 000043
2014070073.tif 000044
2014070073.tif 000045
2014070073.tif 000046
2014070073.tif 000047
2014070073.tif 000048
2014070073.tif 000049
2014070073.tif 000050
2014070073.tif 000051
2014070073.tif 000052
2014070073.tif 000053
2014070073.tif 000054
【図１】
2014070073.tif 000055
【図２】
2014070073.tif 000056
【図３】
2014070073.tif 000057
【図４】
2014070073.tif 000058