(57)【要約】【課題】肺癌患者、特に、EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者の治療の有効性の予測検査方法及び肺癌治療剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】「EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者由来のサンプル中のBIMが非野生型である場合には、上皮成長因子受容体のEGFR-TKI単独投与は治療の有効性が低いが、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤若しくはドセタキセルの併用投与は治療の有効性が高いこと」を見出し、本発明の予測検査方法及びスクリーニング方法を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む肺癌患者の治療の有効性の予測検査方法。
（１）肺癌患者から取得したサンプル中のBIMが野生型であるか非野生型であるかを検査する工程、
（２）非野生型の場合には、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤若しくはドセタキセルの併用投与が有効であると判定する工程。
【請求項２】
前記肺癌患者は、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を有する非小細胞肺癌患者である請求項１に記載の予測検査方法。
【請求項３】
前記非野生型であることは、以下のいずれか１を検出することを含むことである請求項１又は２に記載の予測検査方法。
（１）BIM遺伝子の第2イントロンの部分欠失
（２）BIM-γ
（３）mRNA転写産物のエクソン3対エクソン4比が1以上
【請求項４】
前記上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤は、ゲフィチニブである請求項１〜３のいずれか１に記載の予測検査方法。
【請求項５】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ボリノスタットである請求項１〜４のいずれか１に記載の予測検査方法。
【請求項６】
下記の工程を含む上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤と併用する肺癌治療剤のスクリーニング方法、
（１）肺癌細胞を上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤及び候補物質の存在下で培養する工程、
（２）該細胞のBIM発現上昇の有無を判定する工程。
【請求項７】
前記肺癌細胞は、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を有する非小細胞肺癌細胞である請求項６に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌患者の治療の有効性の予測検査方法及び肺癌治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（肺癌）
日本では、毎年約6万人以上が肺癌で死亡しており、その中で非小細胞肺癌（NSCLC）は、約75％以上であると言われている。このような肺癌患者の治療方法として、一般的に上皮成長因子受容体（EGFR）のチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）の投与がある。
【０００３】
（上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤）
上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤（EGFR-TKI）であるゲフィチニブ及びエルロチニブは、エクソン19欠失やL858R点突然変異等のEGFR活性化突然変異を有するNSCLCに対して顕著な治療効果を示すことが知られている（非特許文献１、２）。
しかし、約20〜30%の患者では、EGFR-TKIに対する内因性耐性が現れる。また、初期にEGFR-TKI投与による効果を示す患者でも、治療期間中にEGFR-TKIへの耐性が発現していることが報告されている（非特許文献３）。
さらに、EGFR-TKIの薬剤性間質性肺炎等の副作用が問題になっている。
以上により、EGFR-TKIに対する感度又は感受性が低い（耐性がある）患者に対して、投与前に効果を予測できる方法、さらにEGFR-TKI耐性の患者に対する最適な治療の選択方法の確立が強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】New Engl J Med 2010;362:2380-8
【非特許文献２】Lancet Oncol 2010;11:121-8
【非特許文献３】Nat Rev Cancer 2010;10:760-74
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記要望に対して、肺癌患者、特に、EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者の治療の有効性の予測検査方法及び肺癌治療剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、「EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者由来のサンプル中のBIMが非野生型である場合には、上皮成長因子受容体のEGFR-TKI単独投与は治療の有効性が低いが、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤若しくはドセタキセルの併用投与は治療の有効性が高いこと」を見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下からなる。
１．下記の工程を含む肺癌患者の治療の有効性の予測検査方法、
（１）肺癌患者から取得したサンプル中のBIMが野生型であるか非野生型であるかを判定する工程、
（２）非野生型の場合には、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤若しくはドセタキセルの併用投与が有効であると判定する工程。
２．前記肺癌患者は、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を有する非小細胞肺癌患者である前項１に記載の予測検査方法。
３．前記非野生型であることは、以下のいずれか１を検出することを含むことである請求項１又は２に記載の予測検査方法。
（１）BIM遺伝子の第2イントロンの部分欠失
（２）BIM-γ
（３）mRNA転写産物のエクソン3対エクソン4比が1以上 
４．前記上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤は、ゲフィチニブである前項１〜３のいずれか１に記載の予測検査方法。
５．前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ボリノスタットである前項１〜４のいずれか１に記載の予測検査方法。
６．下記の工程を含む上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤と併用する肺癌治療剤のスクリーニング方法、
（１）肺癌細胞を上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤及び候補物質の存在下で培養する工程、
（２）該細胞のBIM発現上昇の有無を判定する工程。
７．前記肺癌細胞は、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を有する非小細胞肺癌細胞である前項６に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、肺癌患者、特にEGFR変異NSCLC患者に見られるBIM多型を検出して、最適な治療法を提供することができる。
これにより、EGFR-TKIの治療効果を投与前に予測することが可能になり、EGFR-TKI投与の効果が期待される患者には早期からEGFR-TKIを投与することにより、治療効果が高い。さらに、EGFR-TKI単独投与の治療の有効性が期待できない患者には、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤若しくはドセタキセルの併用投与の選択を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】BIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株はゲフィチニブ誘発性アポトーシスに対して感受性が低いことを示す結果。（Ａ）上のパネルは、BIM欠失部に隣接するプライマーによって生成した4種のEGFR変異型NSCLC細胞株由来のPCR生成物を示す。サイズが4.2 kb及び1.3 kbのPCR生成物は、それぞれ、欠失のないアレイ及び欠失のあるアレイに相当し、その両方の生成物が存在することは欠失多型に対してヘテロ接合性があることを示している。下のパネルは、各細胞株のタンパク質であるBIMEL、BIML及びBIMSの発現レベル示す。（Ｂ）細胞株を、ゲフィチニブ（1 μM）又はDMSOコントロールで48時間処理し、カスパーゼ-3/7の活性をCaspase-Glo3/7アッセイキットで測定した。各バーは平均±SDを示す。（Ｃ）BIM又はコントロールであるsiRNA をPC-9（左）及びHCC827（右）細胞に形質移入し、その後ゲフィチニブ（1 μM）で48時間処理し、カスパーゼ3/7の活性を上記（Ｂ）と同様に測定した。各バーは平均±SDを示す。溶解物を回収し、ウエスタンブロッティングにてタンパク質を分析した。
【図２】NSCLC細胞株における全BIMの発現とBIMイソ型比を示す結果。（Ａ）アクチンに対して標準化したエクソン2A含有BIM転写産物の量。エクソン2Aは翻訳開始部位を含むことから、エクソン2A含有転写産物はBIMイソ型すべてを表すものである。（Ｂ）各細胞株におけるエクソン4含有転写産物（E4）に対するエクソン3含有転写産物（E3）の比率。バーは平均±SDを示す。
【図３】BIM多型を有するEGFR変異細胞株はゲフィチニブ誘発性アポトーシスに感受性が低いことを示すフローサイトメトリー分析の結果。腫瘍細胞（2x105細胞個）を、ゲフィチニブ（1 μM）又はDMSOコントロールで72時間培養した。細胞を、PE-アネキシンV及び7-AADで染色した。アポトーシス細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。
【図４】ボリノスタットによるBIMの上方制御はBIM多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株におけるアポトーシスの誘導を促進することを示す結果。（Ａ）PC-3細胞を、様々な濃度で希釈したボリノスタットで24時間培養した。細胞溶解物を回収し、被験タンパク質をウエスタンブロッティングで分析した。（Ｂ）HCC827細胞（左）及びPC-3細胞（右）を、ゲフィチニブ（1 μM）及び／又はボリノスタット（3 μM）と共に48時間培養した。細胞溶解物を回収し、そして被験タンパク質をウエスタンブロッティングで測定した。（Ｃ）PC-3細胞を、ゲフィチニブ（1 μM）及び／又はボリノスタット（3 μM）で12時間処理した。エクソン2A、3又は4を含む各種転写産物の量を、アクチンに対する標準比として示す（上）。各化合物での処理後のPC-3細胞内でのエクソン4含有転写産物（E4）に対するエクソン3含有転写産物（E3）の比率を示す（下）。コントロールに対するP値は、*P<0.05であった。バーは平均±SDを示す。（Ｄ）アポトーシスをカスパーゼ-3/7活性を指標として測定して分析した。コントロールに対するゲフィチニブ又はボリノスタットのP値は*P<0.05；コントロール及び単剤に対する併用治療のP値は**P<0.05であった。バーは平均±SDを示す。
【図５】ボリノスタットで誘導されたBIMの上方制御はBIM多型を有するHCC2279細胞株でアポトーシスを促進することを示す結果。（Ａ）HCC2279細胞を、様々な濃度のボリノスタットで24時間培養した。細胞溶解物を回収し、被験タンパク質をウエスタンブロッティングで測定した。（Ｂ）PC-9細胞（左）及びHCC2279細胞（右）を、ゲフィチニブ（1 μM）及び／又はボリノスタット（3 μM）と共に48時間培養した。細胞溶解物を回収し、被験タンパク質をウエスタンブロッティングで測定した。（Ｃ）カスパーゼ-3/7活性を測定してアポトーシスを分析した。コントロールに対するゲフィチニブ又はボリノスタットのP値は*P<0.05；コントロール及び単剤に対する併用治療のP値は**P<0.05であった。バーは平均±SDを示す。
【図６】BIMのノックダウンはPC-3細胞でゲフィチニブ及びボリノスタットに誘導されたカスパーゼ-3/7の活性化を抑制することを示す結果。（Ａ）BIM siRNA又はコントロールであるsiRNAをPC-3細胞に形質移入し、その後、ゲフィチニブ（1  μM）及び／又はボリノスタット（3  μM）で48時間処理した。カスパーゼ3/7の活性をCaspase-Glo3/7アッセイキットを使用して測定した。（Ｂ）細胞溶解物中のタンパク質発現レベルをウエスタンブロッティングにより測定した。
【図７】HCC827及びPC-3腫瘍のマウス異種移植モデルでのゲフィチニブ及び／又はボリノスタットの抗腫瘍活性。HCC827（Ａ）又はPC-3（Ｂ）細胞の腫瘍を担持したヌードマウスに、25 mg/kgのゲフィチニブ及び／又は40 mg/kgのボリノスタットを1日1回、21日間投与した。腫瘍体積を、指定の日付において、キャリパー（カリパス）を用いて計測した。1群4〜5匹のマウス各群の平均±SEの腫瘍体積を示す。一元配置分散分析において、コントロールに対するP値は*P<0.05であり、ゲフィチニブに対するP値は**P<0.05であった。
【図８】ボリノスタットとゲフィチニブを併用するとBIM多型を有する異種移植腫瘍においてアポトーシスが促進されることを示す結果。異種移植HCC827及びPC-3腫瘍を、25 mg/kgのゲフィチニブ及び／又は40 mg/kgのボリノスタットを4日間投与したマウスから切除した。（Ａ）TUNEL染色によるアポトーシスの分析。典型的な蛍光像を示している。緑色の蛍光はアポトーシス細胞を示す。バーは長さ50 μMを示す。（Ｂ）アポトーシス細胞数の定量。コントロールに対するゲフィチニブ又はボリノスタットのP値は*P<0.05；コントロール及び単剤に対する併用治療のP値は**P<0.05であった。バーは平均±SDを示す。（Ｃ）腫瘍溶解物中のタンパク質の発現レベルをウエスタンブロッティングで測定した。
【図９】ゲフィチニブとドセタキセルの併用投与によるBIM発現上昇とアポトーシス誘導効果を確認した結果。なお、使用した細胞は、HCC2279です。
【図１０】ヒト末梢血単核細胞（PBMC）及び血清におけるBIM多型の検出を示す結果。（Ａ）BIM欠失部に隣接するプライマーを使用し、5人の健常ボランティアのPBMC由来DNAをPCR増幅した。サイズが4.2 kb及び1.3 kbのPCR生成物は、それぞれ、欠失のないアレイ及び欠失のあるアレイに相当する。（Ｂ）5人の健常ボランティアにおける血清DNAのPCR生成物。362 bp及び284 bpのPCR生成物は、それぞれ、野生型（W）及び欠失多型（D）アレイが存在することを示している。PBMCの結果と血清の結果は一致した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、「肺癌患者から取得したサンプル中のBIMが野生型であるか非野生型であるかを判定し、さらに、非野生型の場合には、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤若しくはドセタキセルの併用投与が有効であると判定することを特徴とする肺癌患者の治療の有効性の予測検査方法」並びに「肺癌細胞をEGFR-TKI及び候補物質の存在下で培養し、該細胞のBIM発現上昇の有無を判定することを特徴とすることを特徴とするEGFR-TKIと併用する肺癌治療剤のスクリーニング方法」である。
【００１１】
（肺癌患者の治療の有効性の予測検査方法）
本発明の肺癌患者の治療の有効性の予測検査方法の工程は、以下の通りである。
（１）肺癌患者から取得したサンプル中のBIMが野生型であるか非野生型であるかを判定する工程
（２）非野生型の場合には、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤若しくはドセタキセルの併用投与が有効であると判定する工程
【００１２】
（肺癌患者）
本発明の予測検査方法では、肺癌患者は、好ましくはEGFR変異肺癌患者であり、より好ましくはEGFR変異NSCLC患者であり、最も好ましくは進行性のEGFR変異NSCLC患者である。
加えて、本発明の予測検査方法は、BIM欠失多型は、比較的東アジア人に多いので、黄色人種、好ましくは東アジア人種、より好ましくは日本人の肺癌患者に有効である。
【００１３】
（サンプル）
本発明のサンプルは、下記実施例４の結果を示すように、特に限定されないが、例えば血液（末梢単核球）、血清、肺癌細胞、リンパ液、精液、尿、唾液（含：口内粘膜細胞）、その他の体液、及び生体組織（肺癌組織）等が挙げられ、特に、末梢単核球、血清等が採取等の取り扱いが容易で、侵襲性が低いという点で最も好ましい。被検者からサンプルを取得する方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。
【００１４】
（サンプルの処理方法）
上記肺癌患者から取得したサンプルは、免疫染色法、RT-PCR法等の自体公知の方法でBIMの多型を検出できる。
また、取得したサンプルは、予め処理することができる。サンプルからのDNA又はmRNAの抽出方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。例えばDNAを抽出する場合は、塩析、PCI（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出）法、市販のDNA抽出キット等を用いる方法、その他公知の方法によることができる。例えば、mRNAを抽出する場合は、PCI法において溶液を酸性にして水層から抽出する方法、オリゴdTカラム等を利用する方法、市販のRNA抽出キットを用いる方法、その他の公知の方法によることができる。
【００１５】
サンプルから得られたDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドの量が少ない場合には、必要に応じて、公知の方法によってこれらを増幅することができる。ポリヌクレオチドの増幅方法は、特に限定されず自体公知の方法を採用することができ、増幅の対象がDNAの場合は、例えばPCR法やLAMP法を利用することができ、増幅の標的となる対象がmRNAの場合には、RT-PCR法やRT-LAMP法等を利用することができる。
【００１６】
上記サンプルから得られたDNA又はmRNAから、BIMを含む領域を増幅することができる。増幅されたヌクレオチド断片は、測定可能なサイズのものであればよい。
上記BIMを含む領域を増幅するためのプライマーは、BIMを含む領域のポリヌクレオチドのアンチセンス鎖及びセンス鎖の3'末端と、それぞれ特異的にハイブリダイズする、フォワード（センス）プライマーとリバース（アンチセンス）プライマーが含まれる。これらのプライマーは、BIMを含む領域の塩基配列に合わせて、適宜デザインすることができる。
【００１７】
（BIM多型の決定方法）
本発明の予測検査方法は、サンプルから得られたDNA又はmRNA等のポリヌクレオチド、又は上記増幅により得られたポリヌクレオチド断片により、BIMの多型を決定する工程を含む。BIMの多型を決定する方法は、自体公知の方法を用いることができ、例えば、シークエンサー等を用いて直接塩基配列を決定するdirect sequence法（ジデオキシ法）の他、RELP（制限酵素断片長多型性）を利用するPCR-RELP法、TaqMan法、DigiTag2法、シングルヌクレオチドプライマー伸長法、SnaPshot法（ABI）、ASP-PCR法、PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）法、PCR-SSP（sequence specific primer）法、PCR-SSCP（single-stranded conformational polymorphism analysis）法、電気泳動等による核酸の長さの確認、及びDNAチップ等の遺伝子多型検査用器具等を用いる方法等が挙げられる。
【００１８】
（BIM）
BCL2L11とも称されるBIMは、プロアポトーシスタンパク質であり、Bcl-2ファミリーのメンバーである。アポトーシス誘導に不可欠なBH3ドメインを有する遺伝子産物（BIMEL、BIML及びBIMS等）は、抗アポトーシスタンパク質（Bcl-2、Bcl-XL及びMcl-1等）に拮抗し、プロアポトーシスタンパク質（BAX及びBAK等）を活性化し、アポトーシスを誘導する。BAX及びBAKを活性化すると、細胞質内にシトクロームＣが放出され、カスパーゼのカスケードが活性化される。
BIM欠失多型は、比較的東アジア人に多く（12.9%）、0.5%がこの欠失に対してホモ接合性である。BIM欠失多型は、イントロン2内で2903 bp断片の欠失を含み、これによってエクソン4よりもエクソン3が優先的にスプライスされ、BH3ドメインを欠失したBIMイソ型が生成される（参照：Nat Med 2012;18:521-8）。
また、BIMELは、E1、E2A、E2B、E2C、E4（BH3ドメインを含む）及びE5を含む転写産物であり、BIMLは、E1、E2A、E2C、E4及びE5を含む転写産物であり、BIMSは、E1、E2A、E4及びE5を含む転写産物であり、BIM-γは、E1、E2A、E2C及びE3を含む転写産物である。
【００１９】
（BIMが野生型であるか非野生型であるかの判定）
本発明の予測検査方法では、BIMが野生型であるか非野生型であるかを判定する基準として、BIM多型を検出する。下記のBIM多型を検出することができれば、非野生型と判定する。さらに、本実施例では、下記のBIM多型がEGFR-TKI抵抗性を有することを確認している。
加えて、下記実施例２の結果により、BH3ドメインを含んでいるBIM多型では、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤若しくはドセタキセルの併用投与が、特に有効であることを確認している。
（１）BIM遺伝子の第2イントロンの部分欠失
（２）BIM-γ
（３）mRNA転写産物のエクソン3対エクソン4比が1以上
【００２０】
（EGFR-TKI）
EGFR-TKIは、EGFRのチロシンキナーゼの活性を阻害する抗癌剤である。EGFR-TKIは、特に制限されないが、例えば、ゲフィチニブ、エロチニブ等が例示される。
ゲフィチニブは、他の治療法で効果がなかった進行性NSCLCの治療に使用されている分子標的抗癌剤でありアストラゼネカ社により商品名「イレッサ」として市販されている。
【００２１】
（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）
ヒストン脱アセチル化酵素は、クロマチンリモデリングを調節し、様々な遺伝子の後成的調節に極めて重要な酵素である。
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるボリノスタットは、商品名「ゾリンザ」として市販されており、皮膚T細胞性リンパ腫の患者を治療するために、米国食品医薬品局（FDA）に認可されている。
【００２２】
（ドセタキセル）
ドセタキセルは、タキサン系の抗癌剤であり、細胞の分裂に必要な微小管の働きを阻害し、がん細胞の分裂を防ぐ作用があり、商品名「タキソテール」あるいは「ワンタキソテール」として市販されている。
【００２３】
（有効な抗癌剤の判定方法）
肺癌患者から得られたサンプルのBIMが非野生型の場合には、実施例２の結果よりEGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の併用投与が有効である、又は、実施例３の結果よりEGFR-TKI及びドセタキセルの併用投与が有効であると判定する。
なお、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の好ましい組み合わせは、ゲフィチニブ及びボリノスタットである。
さらに、肺癌患者から得られたサンプルのBIMが野生型の場合には、実施例２の結果より、EGFR-TKI単独投与でも有効であると判定し、治療期間中において、必要に応じて、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の併用投与、又は、EGFR-TKI及びドセタキセルの併用投与の選択を行う。
【００２４】
（肺癌治療剤のスクリーニング方法）
本発明のEGFR-TKIと併用する肺癌治療剤のスクリーニング方法は、以下の通りである。
（１）肺癌細胞をEGFR-TKI及び候補物質の存在下で培養する工程
（２）該細胞中のBIM発現上昇の有無を判定する工程
【００２５】
（候補物質）
候補物質は、特に限定されないが、例えば、低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。また、被験物質は、天然物質でも合成物であってもよい。
【００２６】
（BIM発現上昇の判定）
本発明におけるBIM発現上昇の判定は、好ましくは、候補物質存在下のBIM発現量が、候補物質非存在下のBIM発現量と比較して、上昇していることを確認できればよく、特に限定されるものではない。
例えば、BIM mRNA及び／又はBIM多型  mRNAの量を測定する方法、BIM発現タンパク質の量を測定する方法等が挙げられる。
mRNAを測定するには、例えば、RT-PCR、競合的RT-PCR、リアルタイムRT-PCR、RNase保護分析法、ノ−ザンブロットティング及びDNAチップからなる群から選択されるいずれか一つを使用することができる。
発現タンパク質の発現量を測定するには、該タンパク質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて検出する方法等が挙げられる。
【００２７】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。さらに、すべての動物実験は、金沢大学学際科学実験センター及び実験動物研究施設（承認番号AP-081088）のガイドラインにしたがった。
【実施例１】
【００２８】
（材料及び方法）
実施例で使用した材料及び方法は、以下の通りである。
【００２９】
（細胞株と試薬）
EGFR変異のあるNSCLC細胞株PC-9、HCC827及びHCC2279を、それぞれ、Immuno-Biological Laboratories Co.,ltd.（日本国、群馬県、藤岡市）、ATCC（バージニア州、Manassas）及びDr. John Minna（テキサス大学南西医療センター、テキサス州、Dallas）から入手した。
NSCLCである日本人女性患者から樹立したPC-3細胞（EGFRエクソン19欠失あり）をヒューマンサイエンス研究資源バンク（JCRB0077: http://cellbank.nibio.go.jp/~cellbank/en/search_res_det.cgi?DB_NUM=1&ID=252）（日本国、大阪府）から購入した。なお、該細胞は、前立腺癌細胞株PC-3（ATCC CRL1435）とは異なる。
PC-3及び他の３種の細胞株は、それぞれ、10%ウシ胎仔血清（FBS）及び抗生物質を添加したD-MEM及び10%ウシ胎仔血清及び抗生物質を添加したRPMI1640培地で保持した。
すべての細胞を３か月まで継代維持し、その後、凍結させた初期継代ストックから再生させた。
細胞を、MycoAlert Mycoplasma Detectionキット（Lonza社、メーン州、Rockland）を使用して、定期的にマイコプラズマスクリーニングをした。ボリノスタット及びゲフィチニブは、それぞれ、Selleck Chemicals（テキサス州、Houston）及びAstraZeneca（英国、London）から入手した。
【００３０】
（BIMの遺伝子型及び発現解析）
DNeasy Blood & Tissueキット（Qiagen社、ドイツ、Hilden）を使用し、メーカーのプロトコールにしたがってゲノムDNAを細胞から抽出した。RNeasy PLUS Miniキット（Qiagen社）を使用し、全RNAを細胞から抽出した。PCR法によって、試料中のBIM欠失多型及びBIMイソ型の発現レベルを検出した（参照文献：Nat Med 2012;18:521-8）。
【００３１】
（細胞アポトーシス）
細胞（3x103）を96ウェルの白色壁プレートの各ウェルに播種し、一晩培養し、被験化合物又はビヒクル（DMSO）で48時間処理した。
メーカーの説明書に従い、細胞アポトーシスを、Caspase-Glo 3/7アッセイキット（Promega社、ウィスコンシン州、Madison）で測定し、カスパーゼ-3/7活性を、PE-Annexin V Apoptosis Detection Kit（BD Biosciences社、カリフォルニア州、San Jose）で評価した。
メーカーのプロトコールに従い、腫瘍異種移植片中のアポトーシス細胞を、DeadEndTM Fluorometric TUNELシステム（Promega社、ウィスコンシン州、Madison）で末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ニック末端標識（TUNEL）染色によって検出した。
【００３２】
（RNA干渉）
本発明者らが著者である文献「Cancer Res 2008;68:9479-87」の記載に従い、BIMに対してのDiplexed Stealth RNAi（Invitrogen、カリフォルニア州、Carlsbad）、及びStealth RNAi-negative control low GC Duplex #3（Invitrogen）を使用して、RNA干渉（RNAi）分析を行った。
使用したsiRNA標的配列は、以下の通りである。
BIM #1
5'-CAUGAGUUGUGACAAAUCAACACAA-3'（配列番号１）
5'-UUGUGUUGAUUUGUCACAACUCAUG-3  （配列番号２）
BIM #2
5'-UGAGUGUGACCGAGAAGGUAGACAA-3'（配列番号３）
5'-UUGUCUACCUUCUCGGUCACACUCA-3'（配列番号４）
【００３３】
（ウエスタンブロット分析）
ホスホEGFR（Tyr1068）、Akt及びホスホAkt（Ser473）、切断PARP、切断カスパーゼ-3、ヒストンH3、アセチル化ヒストンH3（Lys27）、BIM（Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州、Beverly）、ホスホErk1/2（Thr202/Tyr204）、Erk1/2及びEGFR（R&D Systems、ミネソタ州、Minneapolis）に対する抗体でウエスタンブロッティングを行った。
次に、ブロットを、マウス又はウサギIgGに特異的なHRP共役二次抗体と共に培養し、化学発光の増強（Pierce Biotechnology）によってシグナルを検出した。
【００３４】
（皮下異種移植モデル）
5〜6週齢の雄BALB/cAJcl-nu/nuマウスをCLEA Japan Inc.（日本国、東京）から購入し、培養腫瘍細胞（5x106細胞個／0.1 mL／1匹）を該マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍体積が100〜200 mm3に達したところで、マウスを無作為に選択し、１日１回ゲフィチニブ及び／又はボリノスタットを投与した。各腫瘍を二次元で測定し、腫瘍体積は「腫瘍体積（mm3）＝1/2 x長さ（mm）x 幅（mm）2」によって算出した。
【００３５】
（統計的分析）
集団間の差異は、一元配置分散分析によって分析した。すべての統計的分析は、GraphPad Prism Ver. 4.01（GraphPad Software, Inc., CA、SanDiego）を使用して行い、P<0.05で、統計的に有意とみなした。
【実施例２】
【００３６】
本実施例では、EGFR-TKIの投与がBIM非野生型（BIM欠失多型）を有するEGFR変異NSCLC細胞株に対して有効であるかどうかを確認した。さらに、EGFR-TKI及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の併用投与がBIM非野生型（BIM欠失多型）を有するEGFR変異NSCLC細胞株に対して有効であるかどうかも確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３７】
（BIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株はゲフィチニブ誘導型アポトーシスに対して感受性が低いかどうかの確認）
PCRによって、EGFR変異NSCLC細胞株のBIM欠失多型を検出した。PC-9及びHCC827は、PCR生成物のサイズが4.2kbである野生型アレルを有していた。HCC2279細胞は、PCR生成物のサイズが4.2kb（野生型）及び1.3 kb（2.9 kb欠失多型）のサイズのBIM欠失多型であるヘテロ接合性であった。EGFR変異を有する7つの他の細胞株（参照：下記表１）において、PC-3はBIM欠失多型であるヘテロ接合性であった（図１Ａ）。
ウエスタンブロット分析は、「プロアポトーシスBIMタンパク質の発現はPC-9及びHCC827細胞内よりもPC-3及びHCC2279細胞内で顕著に低いこと」を明らかにした。
BIMイソ型転写産物の分析は、「BIM多型を有する細胞は、エクソン4含有転写産物よりもエクソン3含有転写産物を多く発現すること」を明らかにした（図２）。
EGFR-TKIであるゲフィチニブ単独投与（治療）は、PC-9及びHCC827細胞のカスパーゼ-3/7及びアポトーシスが顕著に活性化した。しかし、ゲフィチニブ単独投与（治療）は、PC-3及びHCC2279細胞のカスパーゼ-3/7及びアポトーシスを活性化しなかった（図１Ｂ、図３）。
さらに、ゲフィチニブは、BIM siRNAで処置したPC-9及びHCC827細胞内のカスパーゼ-3/7を増加させなかった（図１Ｃ）。この非増加は、「BIMがEGFR-TKIで処置したEGFR変異NSCLC細胞内のアポトーシス誘導において極めて重要な役割を担っていること」を示すものであった。
以上により、BIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞は、アポトーシス誘導から明らかなように、野生型BIMを有する細胞と比較して、EGFR-TKIであるゲフィチニブ感受性が極めて低いことを確認した。
すなわち、EGFR-TKIの投与がBIM非野生型（BIM欠失多型）を有するEGFR変異NSCLC患者に対して有効でないことを確認した。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるボリノスタットはゲフィチニブと併用するとBIMを上方制御し、アポトーシスを効率的に誘導するかどうかの確認）
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるボリノスタットが、BIM多型を有するEGFR変異NSCLC細胞にゲフィチニブ感受性を高めることができるかどうかを確認した。
ボリノスタットは、PC-3及びHCC2279細胞のタンパク質、アセチル化ヒストンH3及びBH3ドメインを有するBIMの発現を用量依存的に促進した（図４Ａ、図５Ａ）。さらに、ボリノスタットをゲフィチニブに併用投与すると、BIM多型を有するEGFR変異NSCLC細胞でアポトーシスが誘導されるかどうかを確認した（図４Ｂ、Ｄ）。野生型BIMのみを含むHCC827及びPC-9細胞において、ゲフィチニブはEGFR、Erk及びAktのリン酸化等の下流シグナル伝達を阻害し、さらに、切断PARP及び切断カスパーゼ-3の発現から明らかなように、アポトーシスを誘導した。ボリノスタットとゲフィチニブの併用添加は、さらに、BIM発現及びカスパーゼ3/7活性を増強した。しかし、BIM多型を含むPC-3及びHCC2279細胞では、ゲフィチニブを単独で投与すると、EGFR、Erk及びAktのリン酸化が阻害されたにも関わらず、アポトーシス誘導は極めて低度であった。PC-3及びHCC2279細胞において、ボリノスタット及びゲフィチニブを併用投与すると、BIM並びに切断PARP及び切断カスパーゼ-3の発現が著しく増加した（図４Ｂ、図５Ｂ）。該併用投与は、それぞれの単独投与と比較して、カスパーゼ-3/7の活性も増強させた（図４Ｄ、図５Ｃ）。
ゲフィチニブ及びボリノスタット併用投与（治療）によって誘導されたカスパーゼ-3/7の活性化は、BIMのノックダウンによって不活化された（図６）。
以上の結果より、BIMはゲフィチニブ及びボリノスタットに誘導されたカスパーゼ-3/7の活性化を媒介するということが示された。ボリノスタット単独ではBIM mRNAが誘導され、それはゲフィチニブの追加で促進されるということがBIM転写産物の分析から明らかになった。さらに、ボリノスタットを投与すると、転写産物を含むエクソン3よりもエクソン4が優先的に誘導された（図４Ｃ）。さらに、ボリノスタットはゲフィチニブと併用するとヒストン脱アセチル化酵素が阻害され、BH3ドメインを有するBIMタンパク質の発現が増加し、それによって、BIM多型を有するEGFR変異NSCLC細胞がアポトーシスに対して感受性を示すようになると考えられる。
すなわち、EGFR変異NSCLC患者がBIM非野生型（BIM欠失多型）を有するかどうかを確認することによって、ゲフィチニブ単独投与が有効な治療となるかどうかを予測することができる。
【００４０】
（EGFR-TKIとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の併用投与はBIM多型を有するEGFR変異NSCLC細胞によって生成した腫瘍を退縮させることができるかどうかの確認）
ボリノスタット及びゲフィチニブのin vivoでの有効性を確認した。ゲフィチニブ単独では、HCC827細胞に誘発された異種移植腫瘍がほぼ完全に退縮した（図７Ａ）。BIM多型を有するPC-3細胞によって生成した腫瘍の拡大が、ゲフィチニブ単独療法によって防ぐことができた。しかし、ゲフィチニブ単独療法は、腫瘍を完全に退縮できなかった。したがって、PC-3細胞は、in vivoでゲフィチニブに感受性が低いままであることを確認した。
ボリノスタット単独療法は、腫瘍増殖阻害は低度であった。しかし、ボリノスタットとゲフィチニブとの併用療法による腫瘍増殖阻害は顕著なものであった（図７Ｂ）。なお、これらの薬剤で処理したマウスは、体重減少等の肉眼による有害事象は全く見られなかった（データ無し）。
ボリノスタット及びゲフィチニブがin vivoで作用するメカニズムを解明するため、腫瘍細胞アポトーシスをTUNEL染色で評価した。ゲフィチニブ投与（治療）はHCC827腫瘍内のアポトーシス細胞数を増加させたが、PC-3腫瘍に対して効果はほとんどなかったという結果であった（図８Ａ、Ｂ）。該結果により、BIM多型を有するEGFR変異NSCLC細胞はin vivoでもin vitroでもゲフィチニブ誘発性アポトーシスに不応答性であることが示された。ボリノスタット単独投与ではアポトーシスに効果はほとんどなかったが、一方で、ボリノスタットとゲフィチニブとの併用投与ではPC-3腫瘍のアポトーシスが顕著に誘導された（図８Ａ、Ｂ）。ウエスタンブロット分析は、「ゲフィチニブはHCC827でのカスパーゼ-3の切断を誘導したが、PC-3腫瘍では誘導できないこと」が示された。PC-3腫瘍に関し、ゲフィチニブ又はボリノスタット単独療法ではカスパーゼ-3切断に対しての効果はほとんどなく、これらの併用療法でBIM発現が促進され、カスパーゼ-3が切断された（図８Ｃ）。
以上の結果から、ボリノスタットとゲフィチニブとの併用療法は、BIMタンパク質発現を促進し、さらに腫瘍細胞アポトーシスを誘導し、その結果として、BIM多型を有するEGFR変異NSCLC細胞によって生成した腫瘍が退縮することを確認した。
すなわち、EGFR-TKIとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の併用投与はBIM多型を有するEGFR変異NSCLC患者の有効な治療になることを確認した。
【実施例３】
【００４１】
（EGFR-TKIとドセタキセルの併用投与はBIMを上方制御し、アポトーシスを効率的に誘導するかどうかの確認）
上記実施例２と同様に、ゲフィチニブとドセタキセルの併用投与によるBIM発現上昇とアポトーシス誘導効果を確認した。図９の結果から明らかなように、EGFR-TKIとしてのゲフィチニブとドセタキセルを併用した治療が、BH3ドメインを有するBIMタンパク質の発現を修復し、アポトーシスを誘導し、ゲフィチニブ耐性を解消することができた。
すなわち、EGFR-TKIとドセタキセルの併用投与はBIM多型を有するEGFR変異NSCLC患者の有効な治療になることを確認した。
【実施例４】
【００４２】
（BIM非野生型の検出）
BIM非野生型であるBIM多型は、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織及び末梢血を使用して検出可能であるかどうかを確認した。
【００４３】
BIM欠失部に隣接するプライマーを使用し、5人の健常ボランティアのPBMC由来DNAをPCR増幅した。増幅して得られたBIMサイズが4.2 kb及び1.3 kbのPCR生成物は、それぞれ、欠失のないアレイ及び欠失のあるアレイに相当した（図１０Ａ）。
また、5人の健常ボランティアにおける血清DNAのPCR生成物である362 bp及び284 bpは、それぞれ、野生型（W）及び欠失多型（D）に相当した。
加えて、PBMCの結果と血清の結果は一致したことを確認した。
以上により、本実施例では、利便性があり簡単に利用できるPCRスクリーニング法を適用し、血清中のDNAでBIM多型を容易に検出できることを確認した（図１０Ａ、Ｂ）。さらに、BIM多型は生殖細胞系列の変質であることから、どの時点の血清でも検出が可能である。
【００４４】
（総論）
実施例２では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてのボリノスタットとEGFR-TKIとしてのゲフィチニブとを併用した治療が、BH3ドメインを有するBIMタンパク質（主にBIMEL）の発現を修復し、アポトーシスを誘導し、in vitro及びin vivoでゲフィチニブ耐性を解消することができた。
さらに、実施例２では、BIMはゲフィチニブ誘発性アポトーシスのみならずボリノスタットとの併用でも中心的役割を担っていることを確認した。さらに、ボリノスタットとゲフィチニブとの併用は、BIM発現を促進し、PC-3及びHCC2279細胞のアポトーシスを顕著に誘導した。BIM発現の増強によって、BIM多型を有するEGFR変異NSCLC細胞内でボリノスタットがゲフィチニブ誘発性アポトーシスを促進すると考えられる。
ボリノスタットは、進行性皮膚原発T細胞リンパ腫患者の治療用として米国FDAから承認が得られている。したがって、ゲフィチニブとボリノスタットとの併用は容易に臨床応用可能になると思われる。
実施例３では、ドセタキセルとEGFR-TKIとしてのゲフィチニブとを併用した治療が、BIMタンパク質の発現を修復し、アポトーシスを誘導し、ゲフィチニブ耐性を解消することができた。
以上により、すべての実施例の結果として、EGFR変異NSCLC患者のBIM多型を検出することにより、最適な治療法を選択することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
肺癌患者、特にEGFR変異NSCLC患者のBIM多型を検出して、最適な治療法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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