(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト幹細胞集団およびこれらに由来する細胞集団に存在する特異的シアリル化構造の制御方法を提供する。【解決手段】細胞のシアリレーションおよび／またはフコシレーションレベルを変更させることによって、幹細胞状態を制御する方法。新規な幹細胞に関し、これらの幹細胞のグリコシレーションを特異的に変更する方法。さらに質量分析計による制御方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された初期ヒト細胞から調製または取得した新規の細胞集団であって、前記細胞集団がインビトロで酵素的に変更されたシアリレーションまたはフコシレーションを含み、
ａ）Ｎｅｕ５Ａｃによるインビトロでの増大したシアリレーション、および／または、
ｂ）インビトロでの低減したシアリレーション、および／または、
ｃ）ＧＤＰ−Ｆｕｃおよび特異的フコシルトランスフェラーゼ酵素の使用による該細胞のインビトロでのフコシレーション、
のいずれかを含む、細胞集団。
【請求項２】
単離された臍帯血細胞、臍帯血由来間葉幹細胞または間葉幹細胞から調製または取得した新規細胞集団において、当該細胞集団は、インビトロでの酵素的に変更されたシアリレーションまたはフコシレーションを含み、
ａ）インビトロでのＮｅｕ５Ａｃの増大したシアリレーションと、選択的に
ｂ）インビトロでのＮｅｕＧｃの低減したシアリレーションと、
を含む、細胞集団。
【請求項３】
前記細胞集団が、増大した量のＮｅｕ５Ａｃα３構造のみを含み、さらに、増大した量のα３−および／またはα４−リンクフコースを含む、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記細胞集団が、定量的なＮｅｕＡｃ構造を含み、ＮｅｕＮＡｃの量は、少なくとも１５％ユニット増大または減少する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項５】
前記細胞集団が、単核細胞集団であり、その９０％が生存可能である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項６】
初期ヒト細胞、好ましくは、臍帯血細胞または間葉幹細胞のシアリレーションまたはフコシレーションを変更する方法において、
ａ）ＮｅｕＧｃシアリレーションレベルの少なくとも１５％の量的減少がなされように、前記細胞表面から、２または複数のリンクタイプ、あるいは、特異的なα３−および／またはα６−リンクシアル酸を含む、シアル酸を選択的に除去するステップと、
ｂ）ＣＭＰ−シアル酸および特異的シアリルトランスフェラーゼ酵素の使用によって細胞をシアリル化するステップと、
ｃ）ＧＤＰ−Ｆｕｃおよび特異的フコシルトランスフェラーゼ酵素の使用によって、細胞をフコシル化するステップと、
を具える、方法。
【請求項７】
前記方法が、
ＣＭＰ−シアル酸およびシアリルトランスフェラーゼ酵素で細胞を培養することにより、特異的α３−および／またはα６−リンクシアル酸を用いてシアリレーションするステップと、選択的に、
ＧＤＰ−Ｆｕｃ酸およびフコシルトランスフェラーゼ酵素で細胞を培養することにより、特異的α３−および／またはα４−リンクフコースを用いて更にフコシレーションするステップと、
を具える、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シアリルＬｅｗｉｓ ｘ が、ｉ）選択的に細胞を脱シアリル化するステップと、ｉｉ）（再）シアリル化するステップと、ｉｉｉ）α３−フコシルトランスフェラーゼによってフコシル化するステップと、によって合成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
臍帯血細胞、および、そのサブ集団、臍帯血から取得したマルチ分化能を有する細胞株を修飾する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
造血細胞のＣＦＵ培養または細胞のインビボターゲティングにおける細胞の生物学的活性の研究に関して、請求項３または４に記載のように、特異的な好適な末端構造タイプを生成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記シアリダーゼおよび／またはシアリルトランスフェラーゼ試薬は、炭化水素材料の存在に関して、制御された試薬である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
リコンビナントヒトシアリルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼである、細胞修飾に関する制御試薬において、好ましくは、制御されたグリコシレーションを行う、末端構造ＮｅｕＡｃα３／α６Ｇａｌまたはシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）酵素を有する二分岐鎖のＮ−グリカンを含む、制御試薬。
【請求項１３】
前記修飾酵素が、反応混合物から酵素を除去するように精製されたアフィニティを有し、および／または、前記酵素は、当該酵素のインヒビタによって前記細胞から放出される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
タグ付きのシアリルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼ細胞修飾酵素。
【請求項１５】
タグ付き修飾酵素が、マトリックスに固定され、細胞から前記マトリックスを分離させることで除去される、細胞修飾方法。
【請求項１６】
前記酵素が、ヒト受容可能酵素であり、この酵素は、ｉ）ヒト酵素の分泌形態に対応し、ｉｉ）制御グリカン構造を含み、および、ｉｉｉ）選択的に、修飾されたグリカン構造である、請求項１２または１３に記載の試薬。
【請求項１７】
酵素のインヒビタまたは基質で細胞を培養するステップを具える、修飾細胞からグリコシルトランスフェラーゼまたはシアリダーゼ修飾酵素を除去する方法。
【請求項１８】
前記インヒビタが、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）インヒビタ、または、シアリルトランスフェラーゼインヒビタ、または、フコシルトランスフェラーゼインヒビタ、好ましくは、ラクトース、であり、選択的に、好ましくは、請求項１１乃至１４に記載される方法において、この方法が、制御されたまたはタグが付されたシアリダーゼ酵素とともに使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の構造の存在についての質量分析において、グリカンの放出、グリカンフラクションの精製、分子質量の測定；選択的に、特異的なシアリダーゼ酵素によるグリカンの一部の修飾、および、修飾されたグリカンの分析；および、前記特異的構造に対するグリカンの分子質量の割当／適合、を具え、好ましくは、シアリレーションレベルおよび選択的に、ＮｅｕＧｃの存在又は不存在が、ｍ／ｚ１９４６、ｍ／ｚ２２３７およびｍ／ｚ２２５３のグリカン名、または、表１および／または表６に挙げられたＮｅｕＧｃ構造に割り当てられた対応するおよび付加的シグナルとして、おおよその正確質量数を用いて、指標グリカンシグナルによって分析され、選択的に、質量数が、代替構造にも対応するとき、ＮｅｕＧｃの存在は、さらに、他のデータ、好ましくは、質量分析計またはらベリ具データによって、確認される、質量分析。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト幹細胞およびヒト幹細胞由来の細胞集団に提示される特別なシアリレーション化構造を開示する。本発明は、特に、細胞のシアリレーションレベルを変化させることで、幹細胞の状態（ｓｔａｔｕｓ）を制御する方法に関する。さらに、本発明は、新規な幹細胞、すなわち特別に変更されたグリコシル化に関する。本発明の制御方法は、好ましくは、質量分析法である。
【背景技術】
【０００２】
Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５、Ｎａｔ．，Ｍｅｄ．，ｐｕｂｌ．ｏｎｌｉｎｅ  ３０．１．２００５、ｄｏｉ  １０．１０３８ｉ）
シアル化グリカンの分析はアメリカ合衆国で行われ、ヒト胚性幹細胞に関して報告しており、このような細胞株にＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を混入（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ）したことが報告されており、ＮｅｕＧｃおよびＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）の双方の量を定量化した。さらに、化学者は、ＮｅｕＧｃを含んでおり、培養細胞株に混入を生じさせる細胞培養材料について検討し、代替の組み替えタンパク質と、特に、ＮｅｕＧｃをもともと含まない熱不活性化ヒト血清と、を使用して、この問題に対処した。
【０００３】
本発明の発明者らは、潜在的なＮｅｕＧｃおよびその他のシアリル−グリカン混入の新規な供給源を発見することができた。さらに、本発明は、初期ヒト細胞からの特定のシアリル−グリカン構造を開示している。さらに、本発明者らは、グリコシル化、特にアルブミン、ゼラチンおよび抗体試薬に関して制御される必要のある、細胞生成プロセスに関与する特定のタンパク質試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）を開示することができた。
【０００４】
Ｖａｒｋｉ、米国パテントドキュメント２００５
上記パテントドキュメントは、食物および他の材料からのモノサッカライドＮｅｕＧｃ分析を開示している。特に食物材料において、ＮｅｕＧｃおよびＮｅｕＡｃの総量中のＮｅｕＧｃ割合を特にクレームしている。さらに、このドキュメントは、患者に提示される抗ＮｅｕＧｃ抗体と、ＮｅｕＧｃのグリセロールテールの酸化に関与する抗体生成物とを開示する。遊離（ｆｒｅｅ）ＮｅｕＧｃを加えることで、血清含有培地において、培養内皮（癌）細胞株にＮｅｕＧｃを組み入れることが研究されている。
【０００５】
ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４に関するＣＤ３４＋造血幹細胞材料の分析
ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４構造は、特定のモノクローナル抗体を使用することで、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋造血細胞に提示されることが、以前から示されている（Ｍａｇｎａｎｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，９６５，４５７号）。その発明は、全てのＣＤ３４＋細胞および臍帯血および骨髄から由来のものをクレームしている。
【０００６】
本発明の発明者らは、ヒト幹細胞および臍帯血細胞集団において、ＮｅｕＡｃα３およびＮｅｕＡｃα６構造の両方の存在、ＮｅｕＧｃα３／６、および、グリカンが細胞に結合するためのグリカンコア構造についての情報など、より大きなシアリル化構造を分析することができた。本発明は、好適な実施例において、少なくとも２またはいくつかのシアリル化末端エピトープ、あるいは、少なくとも１のグリカンの全体構造に関する。好適な実施例において、臍帯血細胞のシアル酸分析は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞ではない、多分化能を有する細胞集団に関する。好ましくは、これらの分析は、Ｎ−結合グリカンのコア構造分析を含んでおり、Ｍａｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許）は、グリカンが細胞に結合するためのコア構造が開示していない。
【０００７】
本発明による脱シアリレーション（ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）および再シアリレーション
特定のシアリルトランスフェラーゼを用いた脱シアリレーションおよび再シアリレーションによるシアリレーションの変化（ｃｈａｎｇｅ）は、インフルエンザウィルスの結合特異性を分析するために、赤血球で報告されている（Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）。
【０００８】
ヒト末梢血のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−フルオレセインおよび骨髄液（ａｓｐｉｒａｔｅ）由来のＣＤ３４＋を用いた部分的な脱シアリレーションおよびα−６−再シアリレーションが報告されており、これらの末梢血細胞は、ＧＭ−ＣＳＦによって放出され、被検体のほとんどが、癌治療を受けている（Ｓｃｈｗａｒｚ−Ａｌｂｉｅｚ，Ｒｅｉｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．２１  ４５１−４５９）。結果中の大きな変化は、治療及びＧＭ−ＣＳＦによるものと考えられる。使用した方法は、使用したシアリルトランスフェラーゼの特異性の限界によって、シアル酸タイプの本当の定量性を明らかにできてなく、また、シアル酸の可能なキャリア構造も示していない。シアル酸の修飾は、使用したシアリルトランスフェラーゼの受容体特異性にさらなる影響を与えるように考えられ、従って、構造をラベルした。本発明は、特に、特定のキャリア構造のα３−シアリレーションに関する。
【０００９】
ブタの異種移植組織からＮｅｕＧｃを除去すること、および、ＮｅｕＡｃおよびシアリルトランスフェラーゼによる再シアリレーションが、示唆されている（ＷＯ０２／０８８３５１）。この研究は、幹細胞に関するものでもなく、ヒト幹細胞に関する方法でもなく、使用された方法は、特定化されいないが、これは、上記細胞の適用には必須である。異種移植のアイデアは、グリコシル化の組織および種の特異性により、本発明には関連性がない。特許出願（ＷＯ２００３／１０５９０８）は、この出願において、所定のＮＫ／リンパ球細胞株に対する可能なシアリダーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ反応を開示しており、さらに、個別に幹細胞についても検討している。これらの結果は、可能性のある反応は、同一タイプの細胞株間で変化し、細胞の性質および酵素の特異性に部分的に起因して、この研究で使用した条件下で予測／予想されないこと示しており、さらに、ＣＭＰ−シアル酸を用いないシアリルトランスフェラーゼの反応条件は、その発明に開示されていない。
【００１０】
ヒト赤血球細胞から末端ＧａｌまたはＧａｌＮＡｃを除去する方法は、ヒト血小板における変化を誘導する低温保存の文脈におけるガラクトシル化とともに、開示されている（Ｚｙｍｅｑｕｅｓｔ；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４）。赤血球を修飾するためのαガラクトシダーゼ／α−ｇａｌＮＡｃｄａｓｅ反応の文脈において、反応後に、リラーゼ（ｒｅｌａｓｅ）酵素に対するインヒビタの使用が示唆されているが、インヒビタの化学的性質は示唆されていない（特許出願、Ｈｅｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ＷＯ０４  Ｋｏｄｅ／Ｋｉｗｉ  ＮＺ）。インヒビタの使用、特に、細胞およびシアリダーゼ反応またはグリコシルトランスフェラーゼ反応の文脈における可溶性受容体模倣性（ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ）競合的インヒビタの使用に関する示唆はなく、上記反応は、機構的に異なっており、例えば、フコシルトランスフェラーゼに対するＧＤＰまたはシアリルトランスフェラーゼに対するＣＭＰなど、特にドナー基質などの基質の一部は、細胞への酵素の結合力を、事実上、上昇させるようにした。さらに、基質に対する有用な濃度範囲は示唆されてなく、発明者らは、酵素から結合したグリコシルトランスフェラーゼを除去する必要性を明らかにしている。また、組み替え赤血球修飾酵素が示唆されているが、化学的にコンジュゲートしたタグも、細胞の文脈における精製用の酵素に関するグリカンコンジュゲートタグも、示唆されてなく、融合セルロース結合ドメインが提案されているものの、生成方法に関する特別な示唆はない。
【００１１】
Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０４（１０）３０９１−９では、シアリレーションレベルおよび骨髄ターゲティングにおいて可能性のある修飾の有用性を変化させず、臍帯血細胞集団のフコシレーションの変化が開示されている。
【００１２】
これらのレポートは、ヒト幹細胞および臍帯血細胞の好適なシアル酸化Ｎ−グリカン構造の特異的発現を開示していない。一般的に、グリコシル化は、細胞タイプ特異的であるが、このことは、本発明によってさらに示唆される。細胞が、特異的なシアリダーゼ酵素または特異的なシアリルトランスフェラーゼに対する特異的な受容体サイトによって除去可能なシアル酸残基を含むかどうかは、前もって、または、当分野の技術に基づいて知ることはできなかった。本発明による特異的なシアリルトランスフェラーゼ、特に、グリコシル化に関して制御された組み替えヒトシアリルトランスフェラーゼは、本発明において開示されたプロセスに適している。さらに、本発明は、本発明による特異的にシアリレーションしたグリカン構造の合成に関し、これは、従来技術には開示されていない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を示すシアリル化Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析的検出。Ａ．ヒト胚性幹細胞株、Ｂ．骨髄由来の間葉幹細胞株、Ｃ．血清弛緩を用いた市販の細胞培養培地、Ｄ．ウシ血清トランスフェリン、Ｅ．ウシ胎児血清（ＦＢＳ）細胞培養培地、および、Ｆ．ウシ胎児血清由来のフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）。
【図２】ＮｅｕＡｃ１ＮｅｕＧｃ１Ｇｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４のアダクトイオン（ａｄｄｕｃｔ  ｉｏｎ）［Ｍ−２Ｈ＋３Ｎａ］＋に対応するｍ／ｚ２３０５．５０で、親イオンのフラグメンテーション質量分析。ＮｅｕＡｃＮａ（ｍ／ｚ  １９９１．９７）、ＮｅｕＧｃＮａ（ｍ／ｚ  １９７５．７６）、または、ＮｅｕＡｃＮａ＋ＮｅｕＧｃＮａ（ｍ／ｚ  １６６２．５６）のロスに対応するフラグメントイオンは、主なフラグメンテーション生成物である。ｘ軸：マス−チャージ比（ｍ／ｚ）；ｙ軸：アービトラリユニット（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ：ａ．ｕ．）；ｍ／ｚ２２０５．０７：未知。
【図３】連続する広範囲のシアリダーゼおよびα２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応の前（明／青コラム）後（暗／赤コラム）における、臍帯血単核細胞シアリル化Ｎ−グリカンプロファイル。ｍ／ｚ値は、表３を参照。
【図４】連続するα２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応の前（明／青コラム）後（暗／赤コラム）における、臍帯血単核細胞シアリル化Ｎ−グリカンプロファイル。ｍ／ｚ値は表３を参照。
【図５】Ａ．臍帯血ＣＤ１３３＋細胞およびＢ．ＣＤ１３３−細胞から単離したシアリル化Ｎ−グリカンのα２，３−シアリダーゼ分析。それぞれのコラムは、テキスト中に記載しているように、ｍ／ｚ２０７６（ＳＡ１）でのモノシアリル化グリカンシグナルと、対応するｍ／ｚ２３６７（ＳＡ２）ジシアリル化グリカンシグナルと、の相対的割合を示しており、ＳＡ１およびＳＡ２の相対的割合は、α２，３−シアリダーゼ処置に際して劇的に変化せず（Ｂ）、ＣＤ１３３＋細胞において、α２，３−シアリダーゼ対ＳＡ２グリカンの割合は、α２，３−シアリダーゼ対ＳＡ１グリカンよりも大幅に小さい（Ａ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
細胞のグリコシレーションを変更（除去、低減または変化）させる方法
【００１５】
有害なグリカン構造の分析及び分解除去
本発明は、細胞から、好ましくは、本発明による所望の細胞集団から、特異的な有害グリカン構造の分解除去に関する。
【００１６】
グリカンまたはその一部の除去は、好ましくは、グリコシダーゼ酵素などの酵素によって生じる。
【００１７】
いくつかの場合、炭水化物構造の除去は、別の有害な構造を暴露することとなる。別の好適な実施例においては、本発明は、所望の使用により最適な、より無害またはより耐性のある構造によって、除去される構造を置換することに関する。
【００１８】
細胞の生物学的使用
本発明によって製造された新規な細胞は、インビボターゲティング実験およびこれを試験するための動物トライアルに有用である。特に、本発明は、例えば、Ｍｉｎ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ａｎｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ２０（３）１６５−７０またはＫａｎｇ  ＷＪ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４７，１２９５−１３０１）に開示されるように、ＰＥＴイメージングなど動物モデルに関する好適な実施例においては、インビボイメージングトライアル用の細胞を使用することに関する。
【００１９】
ＣＦＵ培養におけるアシアロ（ａｓｉａｌｏ）細胞の使用
本発明は、全ての細胞集団が生存可能であることを明らかにした（表７）。本発明は、さらに予期しなかったことには、シアル酸レベルを量的に低下させた細胞が、修飾した臍帯血単核細胞（Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００６）７，３０）に記載されるように実行されたＣＦＵ細胞培養アッセイにおいて、より高いカウントを付与したことを明らかにした。本発明は、特に、血液細胞集団を培養するための、脱シアリレーション造血細胞の使用に関する（表７）。
【００２０】
除去可能な酵素を用いて細胞を修飾する新規な方法
タグ付き酵素
本発明は、グリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼなどのグリコシルなど、グリコシル修飾酵素によって、これらの酵素が、細胞調製液から除去されるとき、細胞を修飾する新規で効率的な方法を提示する。本発明は、特に、細胞からの酵素を除去する、特異的なタグ構造の使用に関する。
【００２１】
炭水化物酵素インヒビタによる酵素放出
触媒部位などの炭水化物結合部位によって、酵素が細胞に結合することが実現する。別の実施例においては、これらの酵素は、細胞を酵素のインヒビタ、好ましくは、酵素の触媒作用炭化水素認識部位に結合するインヒビタとともに培養することによって除去する。好ましいインヒビタには、メチルおよびエチルグリコシドおよびより特異的なインヒビタなど、モノサッカライドおよびモノサッカライドグリコシドを具え、これらは、遷移状態（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ）インヒビタとしての触媒部位に基づいて設計することができる。シアリダーゼに対する好ましいインヒビタは、シアル酸など活性の低い競合インヒビタ、ＮｅｕＡｃαＯＭｅ、ＮｅｕＮＡｃαＯＥｔ、例えば、牛乳から得られるシアリル−ラクトース、または、バクテリア（Ｅ．ｃｏｌｉ、コロミン酸（ｃｏｌｏｍｎｉｃ  ａｃｉｄ））から入手可能なポリシアル酸、修飾された又は低コスト競合基質；ＮｅｕＡｃ２ｅｎなどより活性の高いインヒビタ（２−および３−位に二重結合を有するＮｅｕＮＡｃ）または、例えば、インフルエンザウィルスノイラミニダーゼインヒビタなど限られた数の酵素に特異的により活性の高いインヒビタ：タミフル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ、Ｒｏｃｈｅ）またはＺａｎａｍｉｖｉｒ（ＧＳＫ）を具える。必要な酵素インヒビタの量は、阻害定数によって推定可能である。低（ｌｏｗ）ミリモーラ阻害（または結合定数）の競合的モノサッカライドグリコシドまたはオリゴサッカライドインヒビタは、阻害定数よりも数倍量あるいはより大きな量のオーダが必要とされる。低アフィニティインヒビタの通常の濃度は、約１−５００ｍＭ、より好ましくは、１−２５０ｍＭ、および、より好ましくは、２−１００ｍＭ、または、２−５０ｍＭ、よりさらに好ましくは、２−２０ｍＭである。細胞の安定性および浸透条件を安定に維持するのに、より低い範囲も好ましい。より高いアフィニティインヒビタに対する通常の濃度は、約１ｐＭから約１０ｍＭであり、アフィニティ定数に依存している。低範囲のマイクロモーラインヒビタに対する好ましい濃度は、１０−１０００マイクロモーラの間である。好適な阻害濃度は、文献から入手可能である。
【００２２】
本発明は、インヒビタまたは酵素の基質を用いて細胞を培養するステップを含む、修飾した細胞から修飾酵素を除去することに関する。この方法は、選択的に、付加的な量のインヒビタを含む、ＰＢＳなどの適宜な溶液、リン酸緩衝食塩水またはその他の適宜な溶液で細胞を洗浄するステップと、好ましくは、インヒビタを含まない溶液で最終的に洗浄するステップとを具える。
【００２３】
このインヒビタは、好ましい実施例においては、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）インヒビタであり、選択に、この方法は、好ましくは、請求項２４乃至２９に記載される方法において、制御されたまたはタグ付シアリダーゼ酵素とともに使用される。
【００２４】
組み合わせ方法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）
好適な実施例においては、本発明は、インヒビタの使用と酵素タグとの組み合わせによって、酵素を除去することに関する。
【００２５】
シアリレーションレベルの量的変化
本発明は、本発明によるヒト細胞のシアリレーションレベルを量的に変化させることを可能にしたことを明らかにした。二分岐Ｎグリカンコアのモノシアリル化およびジシアリル化シアル酸のシグナルは、放出型非修飾Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定された。細胞表面のＮグリカンのシアリレーションレベルは、シアリルトランスフェラーゼ酵素による細胞のシアリレーションによって、少なくとも１５％、約２０％、または２５％上昇した。
【００２６】
本発明は、シアリレーションレベルが量的に上昇および低減する細胞集団、特に、好適なヒト細胞の増加および低減するＮ−グリカンシアリレーションレベルに関する。
【００２７】
本発明は、α３−シアル酸細胞が、フコシレーション可能であり、シアリル−Ｌｅｗｉｓ  ｘ  Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ（ｓＬｅｘ）および関連した末端構造を具える、シアリレーションおよびフコシレーションにおいて、増大した細胞を増大させる。ｓＬｅｘ内容は、さらに、細胞を第１の再シアル酸化し、可能性のあるｓＬｅｘエピトープに対するサイトをブロッキングするα６−シアル酸化構造を還元することによって、さらに増加される。上記のシアリル−Ｌｅｗｉｓ  ｘ  細胞は、特に、内在性Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃから低量産生される構造は、細胞に再送（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）することができるとき、インビボターゲティングとして特に有用である。
【００２８】
脱シアリレーション方法
好適な特別なターゲット細胞タイプ
特異的な細胞集団に対する効果的で特異的な脱シアリレーション方法が開発された。本発明は、ヒト臍帯血細胞を修飾する脱シアリレーション方法に関する。臍帯血細胞は、他の細胞とは明らかに異なり、これらの細胞に関してはこれまでは脱シアリレーション方法は開発されていなかった。細胞特異的な差異によって、いずれの量的な脱シアリレーション方法は、１つの細胞集団から別の細胞集団を一般化することができなかった。従って、他の細胞タイプを使用した他の研究によって示されたいずれの結果やデータも、臍帯血に適用することはできない。さらに、本発明は、ヒト幹細胞または臍帯血細胞サブ集団の脱シアリレーション修飾に関する。
【００２９】
本発明は、好適な細胞の表面からの、本発明による好適な構造の脱シアリレーション方法に関する。本発明は、さらに、本発明による好適な分析方法によって、脱シアリレーションの量的検査のための好適な方法に関する。本発明は、さらに、リンク特異的な脱シアリレーション、および、本発明の分析的方法を使用して、好適な炭化水素構造上にリンク特異的なシアリレーションの分析に関する。
【００３０】
本発明は、本発明によるその他のシアリル化構造と干渉しない、本発明による好適な構造のリンク特異的なα３−脱シアリレーションに関する。本発明は、本発明による、α３−およびα６−シアリル化構造を同時に脱シアリレーションすることに関する。
【００３１】
さらに、本発明は、ＮｅｕＡｃおよびＮｅｕＧｃの両方が、細胞表面、好ましくは、本発明の好適な構造から定量的に除去されるときの脱シアリレーションに関する。本発明は、好適な細胞集団、最も好適には臍帯血および幹細胞集団から、および、本発明による好適な構造からＮｅｕＧｃを除去することに関する。本発明は、さらに、ＮｅｕＧｃの除去の検査、好ましくは、定量的な検査およびより好ましくは、質量分析による検査に対する方法に関する。
【００３２】
グリコシルトランスフェラーゼによる好適な細胞の細胞表面の修飾
本発明は、本発明による好適な細胞で、制御された細胞表面グリコシル化修飾を行うことができるを明らかにした。本発明は、細胞表面、好ましくは、血液細胞、より好ましくは、白血球または幹細胞、より好ましくは、本発明による好適な細胞における、Ｎ−リンクグリカンのグリコシルトランスフェラーゼ触媒修飾に特に関する。
【００３３】
本発明は、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼによる細胞修飾に関する。本発明による２つの最も好適なトランスフェラーゼ反応は、α３−シアリレーションおよびα３−フコシレーションなど、修飾反応である。これらの反応を組み合わせるとき、シアリル−Ｌｅｗｉｓ  ｘ（ｓＬｅｘ）など、シアリル化およびフコシル化Ｎ−アセチルラクトサミンである重要な細胞接着構造を生成するために使用できる。
【００３４】
シアリレーション（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）
可能なα６−シアリレーションは、骨髄細胞と、増殖因子投与により骨髄から循環系に放出（ｒｅｌｅａｓｅｄ）された末梢血ＣＤ３４＋細胞と、に含まれ、臍帯血細胞またはその他の幹細胞タイプが研究されていない。さらに、シアリルトランスフェラーゼ酵素の特異性に影響を与えることのある人工的なシアル酸修飾方法を使用した以前の研究、および、酵素反応の実際の結果は、研究者によって解析されなかった反応生成物として周知ではない。これらの反応は、使用されたα６−シアリルトランスフェラーゼの特異性によって限定されたとは考えられず、本発明に関して先行技術として考えられる可能性はない。
【００３５】
本発明の発明者らは、さらに、シアリレーション、好ましい実施例においては、α３−シアリレーションによって、本発明による好ましい細胞の効果的な修飾を明らかにした。
【００３６】
上述した先行技術は、初期ヒト血液、好ましくは臍帯血からの細胞、培養間葉幹細胞、または、培養胚性細胞に対する、本発明による特異的な修飾を示唆していない。本発明は、特に、これらの細胞タイプに対するシアリルトランスフェラーゼ反応に関する。本発明は、天然シアル酸、好ましくは、標的細胞に対するＣＭＰ−シアル酸からのＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＧｃまたはＮｅｕ−Ｏ−Ａｃのシアリルトランスフェラーゼ触媒転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）に関する。
【００３７】
以下の式によるシアリルトランスフェラーゼ触媒反応：
ＣＭＰ−ＳＡ  ＋  標的細胞  →  ＳＡ−標的細胞  ＋  ＣＭＰ
ここで、ＳＡは、シアル酸、好ましくは天然のシアル酸、好ましくは、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＧｃまたはＮｅｕ−Ｏ−Ａｃであり、
この反応は、シアリルトランスフェラーゼ酵素、好ましくは、α３シアリルトランスフェラーゼによって触媒化され、
標的細胞は、培養幹細胞または初期ヒト血液細胞（臍帯血細胞）である。
【００３８】
好ましくは、シアル酸は、細胞表面の少なくとも１つのＮグリカン構造に転移され、好ましくは、本発明による好適なシアリル化構造を形成する。
【００３９】
フコシルトランスフェラーゼ反応
先行技術においては、非特異的な細胞表面構造に対するフコシルトランスフェラーゼ反応が研究されている。先行技術は、ヒト臍帯血細胞集団は、ヒトフコシルトランスフェラーゼＶＩによるα３−フコシル化され、このような修飾した細胞集団は、セレクチンとの相互作用により、骨髄に送られる。
【００４０】
細胞およびセレクチンリガンドの送達
本発明は、細胞表面、好ましくはｓＬｅｘおよび関連する構造において、特に、シアリル化およびフコシル化Ｎ−アセチルラクトサミンを生成するために、フコシルトランスフェラーゼによる臍帯血細胞を効果的に修飾する反応を開示している。本発明は、さらに、細胞のターゲティングに関するセレクチンに関する好適な実施例においては、細胞をターゲティングする細胞表面上での上昇したシアリル化および／またはフコシル化構造の使用に関する。本発明は、グリカンに結合するレクチンなど、レクチンを具える組織をターゲティングする細胞に関し、好ましい標的組織は、造血組織、好ましくは、骨髄（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ  ２００４に示されるように）を具え、レクチン、特にセレクチンを連続的または誘導的に発現する他の組織をターゲティングする。
【００４１】
ターゲット幹細胞
本発明は、培養細胞を含む幹細胞のα３−および／またはα４−フコシレーションおよび／またはシアリレーション修飾に関し、好ましくは、幹細胞は、胚性幹細胞および間葉幹細胞であり、臍帯血または骨髄または造血幹細胞に由来し、好ましくは、臍帯血または骨髄、好ましくはＣＤ３４＋および／またはＣＤ１３３＋細胞に由来する。
【００４２】
ヒト末梢血単核細胞集団のフコシレーション
特定の実施例においては、本発明は、ヒト末梢血からの総単核細胞集団のα３−フコシレーションに関する。好ましくは、修飾は、少なくとも１つのタンパク質結合グリカン、より好ましくは、Ｎ−リンクグリカンに関する。臍帯血に関する先行技術の反応は、上記細胞集団および可能な反応の効果が未知である。本発明は、さらに、組み合わせて上昇したα３−シアリレーションおよびフコシレーション、好ましくは、ヒト末梢血白血球のα３−シアリレーションに関する。末梢血白血球に関する構造は、末梢血白血球をターゲティングする、好ましくは、セレクチンを発現する有害な組織など、発現部位を選択するのに使用可能となる。
【００４３】
組み合わせて上昇したα３−シアリレーションおよびα３−フコシレーションの方法
本発明は、ベースライン細胞集団と比較する場合で、細胞集団が上昇した量のα３−シアリレーションを示すとき、本発明による好適な細胞集団から細胞集団の選択に関する。
【００４４】
発明者らは、一般的に、ヒト臍帯血が高度にα６−シアリル化されており、従って、特に、セレクチンリガンド構造の生成に関する反応において、α３／４−フコシレーション反応に対する優れたターゲットではないことを明らかにした。
【００４５】
選択された培養α３−シアル酸発現細胞集団の使用
本発明者らは、天然の臍帯血細胞の特別なサブ集団が、上昇した量のα３−リンクシアル酸を発現することを明らかにした。α３／４フコシレーションに関する臍帯血由来の好適な選択細胞集団は、ＣＤ１３３＋細胞を含む。
【００４６】
さらに、本発明による培養細胞は、α６リンクシアル酸の代わりのα３−シアル酸を発現する傾向が高いことがわかった。本発明は、好ましくは、培養間葉幹細胞株、より好ましくは、上昇した量のα３−リンクシアル酸を発現する骨髄または臍帯血由来の間葉幹細胞に関する。
【００４７】
α３−シアリル化細胞のフコシレーション
好ましくは、本発明は、細胞、好ましくは、本発明による好適な細胞のα３−シアリレーション後のフコシレーションに関する。本発明は、細胞表面の２つの異なるモノサッカライドタイプを具える、特異的末端エピトープを生成するための２つのグリコシルトランスフェラーゼによる組み合わせた反応を最初に開示している。
【００４８】
脱シアリル化（ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）およびα３−シアリル化細胞のフコシレーション
好ましくは、本発明は、細胞の脱シアリレーションおよびα３−シアリレーション後のフコシレーションに関する。
【００４９】
シアリレーション方法
好適な特別なターゲット細胞タイプ
初期ヒト血液
特異的な細胞集団に関して効果的な特異的シアリレーション方法が開発された。本発明は、特に、ヒト臍帯血細胞およびそのサブ集団、ならびに、多能性幹細胞株についてのシアリレーション方法に関する。臍帯血細胞は、他の細胞タイプとは明らかに異なり、このような細胞集団に関するシアリレーション方法は、開発されていない。細胞特異性の差に起因して、量的シアリレーション方法は、１つの細胞集団から別の細胞集団に一般化できない。さらに、本発明は、ヒト臍帯血細胞サブ集団のシアリレーション修飾に関する。
【００５０】
胚性タイプの細胞および間葉幹細胞
さらに、本発明の方法は、胚性タイプの幹細胞および間葉幹細胞を変更する本発明による方法に関する。好ましい実施例においては、修飾技術は、本発明による培養細胞に関する。
【００５１】
好適なシアリル化構造の生成
本発明は、特に、好適な細胞の表面から本発明による好適な構造を生成するシアリレーション方法に関する。本発明は、特に、好適なＮｅｕＧｃ−およびＮｅｕＡｃ−構造の生成に関する。本発明は、例えば、細胞ラベリングに関するコントロール材料など、細胞表面上のインビボ有害構造の生成に関する。本発明は、好ましくは、好適な特異的末端構造タイプ、α３−およびα６−シアリル化構造、および、細胞の生物学的活性の研究用のＮｅｕＡｃ−およびＮｅｕＧｃ−構造、に関する。
【００５２】
本発明は、さらに、本発明による好適な分析方法によるシアリレーションの量的検査についての好適な方法に関する。さらに、本発明は、本発明の分析方法を用いた好適な炭化水素構造上の、リンク特異的シアリレーションおよびリンク特異的シアリレーションの分析、に関する。
【００５３】
本発明は、さらに、本発明による他のシアリル化構造と干渉せずに、本発明による好適な構造のリンク特異的α３−シアリレーションに関する。本発明は、本発明による他のシアリル化構造と干渉せずに、本発明による好適な構造のリンク特異的なα６−シアリレーションに関する。
【００５４】
さらに、本発明は、本発明によるα３−およびα６−シアリル化構造を同時にシアリル化することに関する。さらに、本発明は、好ましくは、２つのシアリル−トランスフェラーゼを用いた単一反応において、α３−およびα６−シアリル化構造と好適な関連のある生成物に関する。
【００５５】
さらに、本発明は、ＮｅｕＡｃまたはＮｅｕＧｃが、細胞表面、好ましくは、本発明による好適な構造に対して定量的に合成されるときのシアリレーションに関する。さらに、本発明は、ＮｅｕＡｃおよびＮｅｕＧｃの両方が、好ましくは定量的に、細胞表面の受容体部位に転移されるときのシアリレーションに関する。
【００５６】
本発明は、特に、好適な細胞集団、最も好ましくは、臍帯血細胞集団から、および、本発明による好適な構造から、ＮｅｕＧｃを除去すること、および、ＮｅｕＡｃで再シアリレーションに関する。
【００５７】
本発明は、ＮｅｕＧｃの除去の検査、ＮｅｕＡｃを用いた再シアリレーション、好ましくは、定量的検査、および、より好ましくは、好適な構造に関する質量分析によって行われる好適な検査について、本発明による好適な方法に関する。
【００５８】
細胞修飾の制御
さらに、本発明は、シアリダーゼ試薬が炭化水素材料の存在下で制御試薬であるとき、本発明による細胞修飾に関し、好ましくは、本発明による細胞の脱シアリレーションまたはシアリレーションに関する。
【００５９】
修飾酵素に関する細胞精製
本発明による好適なプロセスは、細胞調製から、酵素、好ましくは、本発明によるシアリル修飾酵素、を除去するステップを具える。最も好適には、酵素が、治療使用に関する細胞集団から除去される。酵素タンパク質は、特に、抗原が非哺乳類起源である場合は、通常、抗原である。材料が、ヒト起源ではない場合、そのグリコシレーションは、材料の抗原性を増大させると考えられる。これは、グリコシレーションが、ヒトのグリコシレーションとの大きな差異を有するときであり、グリコシレーションの大きさとしての好適な例は、原核生物のグリコシレーション、植物タイプのグリコシレーション、酵母または真菌のグリコシレーション、Ｇａｌα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する哺乳類／動物のグリコシレーション、ＮｅｕＧｃ構造を有する動物グリコシレーションを含む。リコンビナント酵素のグリコシレーションは、細胞株の生成におけるグリコシレーションに依存しており、これらは、非生理学的グリカン構造を部分的に生成する。好ましくは、これらの酵素は、培養、保存または治療用途を目的とした細胞集団から除去される。細胞表面に関するアフィニティを有する酵素の存在は、炭化水素結合試薬または質量分析、あるいは、本発明のその他の分析によって検出可能なように、細胞を変更することができ、逆方向の（ａｄｖｅｒｓｅ）免疫応答を生じさせることができる。
【００６０】
別の実施例においては、細胞表面構造が、細胞のより近い生理学的温度または培養温度で、保存から回復（ｒｅｃｏｖｅｒ）するとき、細胞集団は、細胞表面構造の変化を維持するために、修飾酵素の存在下で培養または保存される。好適には、次いで、これらの細胞は、使用の前に、微量の修飾酵素から生成される。
【００６１】
さらに、本発明は、細胞調製から修飾試薬を除去する方法に関し、好ましくは、修飾試薬は、脱シアリレーションまたは再シアリレーション試薬である。可溶性酵素が、修飾細胞集団から洗浄可能であることが実現した。好ましくは、洗浄される細胞材料は、マトリックスに固定されるか、遠心分離され、酵素を除去し、より好ましくは、磁気ビーズマトリックスに固定される。
【００６２】
しかしながら、外来性の洗浄は、細胞の少なくとも部分的な破壊および細胞の生存能力の低下を生じさせる。さらに、酵素は、細胞表面とのアフィニティを有する。従って、本発明は、特に酵素のアフィニティ除去方法に関する。好適な方法は、細胞修飾語、酵素に結合するアフィニティマトリックスに修飾細胞を接触させるステップを具える。
【００６３】
本発明の特別な実施例下において、本発明は、細胞集団から除去するべき酵素をターゲティングする方法に関する。タグを付けるステップは、酵素を細胞に接触させる前に行われる。タググループ（ｔａｇｇｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）は、酵素の活性を低減または大幅に低減することなく、酵素表面に好ましくは共有結合するように設計される。本発明は、マトリックスにタグを結合させることによって、細胞から分離可能なタグ付き酵素を除去することに関する。好ましくは、マトリックスは、群：ポリマ、ビーズ、磁気ビーズ、または、固相表面から選択される少なくとも１つのマトリックス材料を具える。
【００６４】
修飾グリカン制御酵素に対する酵素のタグ化
さらに、本発明は、シアル酸を欠損（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）させるべきおよび／または再シアリル化させるべき細胞から、修飾試薬を除去する方法に関する。好適な修飾試薬は、脱シアリレーションまたは再シアリレーション試薬であり、これらの試薬は、試薬が、タグを認識する結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）を具える固相に結合可能なようにタグが付され、例えば、マイクロビーズなどの上での、タグ結合剤の組み合わせは、除去可能である。
【００６５】
好適なタグは、
１）ペプチドＦＬＡＧまたはＨＡ−赤血球凝集ペプチドタグなどの抗原、または
２）Ｈｉｓタグやフルオロアルカンなどの化学タグ、または
３）ビオチン、を具え、および、
本発明は、ペプチドに対する特異的な抗体など、上記のものに対する周知な特異的な結合剤に関し、Ｈｉｓ−ＴＡＧ用のヒスタグ結合カラム、フルオロアルカンの水素結合用フルオロアルカン、ビオチン用のアビジンまたはストレプトアビジンを使用する。
【００６６】
タグがふされる好適な修飾酵素および酵素は、例えば、哺乳類またはバクテリア由来で、タイプＩおよび／またはタイプＩＩ  Ｎ−アセチルラクトサミン、好ましくは、当分野で周知の二分岐鎖および三分岐鎖グリカンに特異的な、α３−、α６−および複数特異的シアリダーゼおよびα３−、α６−シアリルトランスフェラーゼなど、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）を具える。本発明は、基質などの好ましいタグ付酵素に関する。
【００６７】
一実施例においては、本発明は、細胞から除去されるべき酵素にタグをつける方法に関する。
【００６８】
好ましくは、シアリダーゼ酵素またはシアリルトランスフェラーゼは、タグ分子にリンクされ、タグ付き酵素は、リモデルすべき細胞と反応し、酵素は、タグに特異的に結合する分子に結合させることで酵素を固定化させる反応後、除去され、修飾された細胞は、タグに特異的に結合する分子マトリックスで細胞をフィルタリングすることによって、固定化した酵素から除去し、好ましいマトリックスは、細胞精製に使用されるカラムまたは細胞混合物から成分を精製するのに使用される磁気ビーズを具える（プロトコルまたはＤｙｎａｌ  ａｎｄ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のカタログ参照）。
【００６９】
タグ付きステップは、細胞と酵素を接触させる前に行われるのが好ましい。タググループ（ｔａｇｇｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）は、酵素活性を低減または大幅に低減させることなく、酵素表面に好適に共有結合するように設計される。好ましい共有リンクは、Ｐｉｅｒｃｅのカタログから周知なアミノ基、チオール基または酸化グリカン基に生じる。
【００７０】
さらに、本発明は、修飾すべき細胞から分離可能なマトリックスにタグを結合させることによって、タグ付き酵素を除去することに関する。好ましくは、細胞タンパク質は、タグを使用する当分野の周知技術として、水性媒体でタグ−結合剤固定化試薬から、分離される。好ましくは、マトリックスは、ポリマ、ビーズ、磁気ビーズまたは固相面からなる群から選択される少なくとも１つのマトリックス材料を具える。
【００７１】
試薬または細胞をヒトに対して許容可能に修飾した酵素
一実施例においては、本発明は、本発明による細胞修飾についての使用に関し、別の実施例においては、有害なアレルギまたは免疫反応を生じさせずに、ヒトに対して少なくとも所定量が許容される、本発明によるヒト許容酵素、好ましくは、シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼのプロセス用試薬に関する。ヒト許容酵素は、反応混合物から除去するのに必要ではなく、または、洗浄ステップは、除去するための所望レベルに対して、より少なくてすむ。ヒト許容酵素は、好ましい実施例においては、ヒトグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼである。本発明は、シアリルトランスフェラーゼであるヒト許容酵素にも関する。さらに、本発明は、シアリダーゼであるヒト許容酵素に関し、好ましくは、細胞からシアル酸タイプ特異的に除去されるヒトシアリダーゼに関する。
【００７２】
好ましい実施例においては、ヒト許容可能酵素は、好ましくは、ヒト血清、尿または乳から得られるヒト材料から精製される。別の好ましい実施例においては、酵素は、天然のヒト酵素に対応する組み替え酵素である。より好ましくは、酵素は、ヒトの天然の酵素に対応し、天然の細胞表面、または、酵素、より好ましくは、血清または尿素またはヒト乳形態の酵素に対応する。さらにより好ましくは、本発明は、分泌形態のヒトシアリルトランスフェラーゼまたはシアリダーゼ、より好ましくは、分泌血清／血液形態のヒト酵素に対応するヒト許容酵素に関する。好ましい実施例においては、ヒト許容酵素、より好ましくは、ヒト組み替え許容酵素は、潜在的なヒトグリカン構造、好ましくは、本発明によるＮｅｕＧｃ構造に関して制御される。組み替えタンパク質は、有害グリコシレーション構造を含んでもよく、発明者らは、上記種類の構造は、組み替えグリコシルトランスフェラーゼ、分泌された（切断した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ））組み替えグリコシルトランスフェラーゼ上にも発現することを明らかにした。
【００７３】
修飾細胞および／または試薬の定量的および定性的質量分析
さらに、本発明は、本発明による修飾細胞および／または試薬の定量的および定性的質量分析に関する。
【００７４】
本発明は、材料を得るためのモノサッカライド組成物を決定するステップを具える、細胞および／または試薬の定性的グリコーム（ｇｌｙｃｏｍｅ）分析に関する。
【００７５】
さらに、本発明は、シグナル、好ましくは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析シグナルに対応する分子量に関して（適正に）定量的であることを証明するための、質量分析シグナルの全てまたは一部の強度を判定するステップを具える、本発明による材料の定量質量分析に関する。
【００７６】
さらに、本発明は、本発明によって開示されるように、試薬または細胞を生成する本発明による製品開発（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）方法など、特に、研究開発方法に関し、定性的および／または定量的グリコーム分析ステップ、より好ましくは、定量的および定性的分析の両方のステップを具える。
【００７７】
本発明による細胞をラベルする方法
さらに、本発明は、初期ヒト細胞上に好適な構造を結合させることに関する方法に関する。この方法は、「結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）」と呼ばれる特異的結合分子の使用に基づいており、結合剤は、細胞集団の表面のマーカー構造に結合する。好適な実施例においては、本発明は、タンパク質結合分子の使用に関し、より好ましくは、抗体、最も好ましくはモノクローナル抗体の使用に関する。
【００７８】
好適な抗体は、構造ＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）０または１および／またはＧａｌＮＡｃβ４［ＮｅｕＧｃα３］Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）０または１を認識する抗体を具え、［ ］は、上記構造中分岐鎖を示し、（ ）０または１は、構造が存在するか、または、存在しないことを示す。好適な実施例においては、本発明は、モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体である抗体に関する。
【００７９】
さらに、本発明は、細胞表面のグリカンマーカー構造を認識するグリカン結合分子に関する。好ましい実施例においては、結合分子は、タンパク質、より好ましくは、酵素、レクチンまたはグリカン結合抗体である。
【００８０】
好適なレクチンは、ＳＡα３Ｇａｌ−構造、好ましくは、Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンに特異的なレクチン、または、ＳＡα６Ｇａｌ−構造、好ましくは、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａアグルチニンであるレクチン、を具える。
【００８１】
好適なレクチンおよび抗体などの結合タンパク質は、本発明により開示されるように、好適にはＮグリカンに発現するときに、非ヒトシアル酸（ＮｅｕＧｃおよびＯ−アセチル化シアル酸）に特異的に結合する試薬をさらに具える。特に好ましい試薬は、非ヒトシアル酸（ＮｅｕＧｃおよびＯ−アセチル化シアル酸）、より好ましくは、Ｏ−アセチル化シアル酸に結合、および、特異的および／または選択的に（細胞培養または他の細胞環境において存在するコンタミから分離することができる）認識するタンパク質（好ましくは、抗体、レクチン、酵素）などの試薬を具える。
【００８２】
さらに、本発明は、本発明による幹細胞材料が胚性幹細胞ではないとき、ＮｅｕＧｃ二対する結合試薬のサーチに関し、幹細胞は、好ましくは、胚性および／または胚性タイプの幹細胞由来の分化した細胞、または、初期ヒト細胞などの成熟幹細胞、または、初期ヒト血液細胞、より好ましくは、血液関連幹細胞、または、臍帯血細胞、あるいは、間葉幹細胞である。
【００８３】
さらに、本発明は、開発方法、特に、本発明によって開示されるように、試薬または細胞を生成する本発明による、製品開発方法など、研究開発方法に関し、
ｉ）本発明によるグリカン構造に対する結合試薬を検査するステップと、
ｉｉ）本発明による非修飾および修飾細胞材料を含む、細胞材料に結合する結合試薬を検査するステップと、
を具える。
【００８４】
さらに、本発明は、本発明による好適な構造を認識できる適宜な特異性を有する周知な試薬から特異的細胞材料−結合試薬に最適な、および／または、最も効率的な、選択方法を検査するステップに関する。検査される最も好適な試薬は、好適には、好適なオリゴサッカライド（好適なジサッカライドまたはトリサッカライドエピトープに関する）またはグリカンシークエンスに潜在的に結合するステップに関係する、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、および、同一または類似の末端モノサッカライド残基構造を認識するレクチンを具える。本発明は、特に、本発明による非ヒトシアル酸を認識する周知の試薬に関する。
【００８５】
好適な実施例においては、本発明は、ヒト自動免疫および／または癌関連抗体、および／または、Ｏ−アセチル化シアル酸を認識することで周知なＣａｎｃｅｒ  ａｎｔｅｎｎａｒｉｕｓ（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）レクチンなどのレクチンを検査することに関する。本発明は、特に、Ｏ−アセチル化シアル酸によるコンタミリスクがあり、間葉幹細胞の文脈において、本発明による細胞を認識するＣａｎｃｅｒ  ａｎｔｅｎｎａｒｉｕｓ（ＥＹ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）レクチンの使用に関する。実施例において開示されるレクチンラベル方法により、ヒト骨髄由来の間葉幹細胞に対する結合に関して試験して、これらの結果は、レクチンが、ヒト間葉幹細胞に提示されるキャリアグリカン上のシアリル構造を認識可能なことを明らかにした。
【００８６】
本発明は、特に、本明細書および２００６年７月に出願したシアル酸コンタミネーションについての本発明者の先の出願に開示される質量分析プロファイリングによって、または、米国で継続中のものに含まれる特異的な結合剤構造によるラベリングによって；あるいは、特異的結合剤によるラベリングによって、本発明によるヒト細胞集団からＯ−アセチル化シアル酸レベルを定量的に判定することに関する。この定量的判定は、好ましくは、総シアル酸のＮｅｕ−ＯＡｃ分子の量の割合を判定する。
【００８７】
好適なグリカン制御試薬およびその調製プロセス
制御すべき好適な試薬は、好適には、生物学的材料と関連して得られる又は生成される試薬の全て、好ましくは、このプロセス中に存在する糖タンパク質、タンパク質混合物、血清およびアルブミン調製物を具える。本発明者らは、非グリコシル化タンパク質として周知なアルブミンが、細胞材料のコンタミネーションに対して十分な糖タンパク質を依然として含んでいる可能性があることを明らかにした。
【００８８】
好適な実施例においては、本発明は、グリカン構造による潜在的なコンタミネーションに対する動物アルブミン、好ましくは、ウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン調製物の制御に関する。他の好適な制御試薬は、制御されたトランスフェリンおよび他の血清タンパク質を具え、より好ましくは、制御された血清タンパク質は、抗体調製物、好ましくは、Ｆｃブロッキング抗体調製物により制御される。
【００８９】
さらに別の実施例においては、本発明は、グリカンの欠損した（ｇｌｙｃａｎ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ）生成物、および／または、リモデリングタンパク質混合物、好ましくは、ヒト又は動物のグリカンリモデリング血清、より好ましくは、血清生成物を生成するのに使用される動物由来の血清、好ましくは、細胞培養血清または抗体に関する。修飾される好適な血清は、ウシ、ウマ、羊、ヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスの血清を具え、より好適には、ウシ、ウマまたは羊の血清であり、さらにより好適にはウシ胎児血清である。
【００９０】
好適な実施例においては、血清のグリコシレーションは、ａ）動物の遺伝子操作、または、ｂ）血清製品に使用される製品動物（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｉｍａｌ）の天然の変異体を採血（ｂｌｅｅｄ）するか、あるいは、選択するステップによって得られる、遺伝的に変更されたグリカン生成物を有する動物に基づいた方法により変更され、好ましくは、遺伝的変更は、血清タンパク質を生成する組織に関する。
【００９１】
移植可能な細胞を併用する目的のための生成物を調製する制御酵素
本発明は、一実施例において、生きている細胞から所望しない炭化水素構造を除去する方法に関する。特に、抗原が、バクテリアおよび／または植物などの非哺乳類由来である場合、酵素タンパク質は、通常、抗原である。材料がヒト由来でない場合、そのグリコシレーションは、材料の抗原性を上昇させると考えられる。このことは、特に、ヒトグリコシレーションとは大きく異なる場合、当てはまり、グリコシレーションに大きな違いのある好ましい実施例は、原核生物グリコシレーション、植物タイプのグリコシレーション、酵母または真菌のグリコシレーション、Ｇａｌα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ−構造を有する哺乳類／動物グリコシレーション、ＮｅｕＧｃ構造を有する動物グリコシレーションを具える。組み替え酵素のグリコシレーションは、製品細胞株のグリコシレーションに依存し、これらは、ほとんどの場合、非生理学的グリカン構造を部分的に生成する。
【００９２】
制御された試薬の好適なクラス
１．グリカンの欠損した（ｇｌｙｃａｎ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ）生物学的材料、好ましくは、糖タンパク質材料
本発明は、生物学材料、好ましくは、有害構造が除去されるか、または、量的に低減される糖タンパク質材料の使用に関する。と糖タンパク質は、バイオアクティブグリカンの主な供給源であり、いくつかの材料において、糖脂質の存在も可能性があり、同様に処理することが可能である。糖脂質の脂質部分が、上記材料と結合する場合、放出されたグリカンまたはその部分は、可溶性であり、分離することが可能である。本発明は、さらに、グリカン欠損方法に関する。好適な実施例においては、本発明は、グリカン構造を放出するステップと、放出されたグリカン構造を除去するステップとを具える方法に関する。
【００９３】
放出されたグリカン構造の好適な除去方法は、フィルトレーション方法を具える。フィルトレーション方法は、放出されたグリカン構造およびグリカン欠損タンパク質の寸法差に基づいている。放出されたグリカンの好適な除去方法は、沈殿（ｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）方法を具え、好適な実施例においては、本発明は、放出されたグリカン構造が可溶である条件下でタンパク質を沈殿させることに関する。
【００９４】
グリカンを欠損させることは、このプロセスに関与する可能性のあるレクチンまたは抗体などの潜在的な有害なタンパク質を不活性化させるステップと組み合わせることが出来る。所定の細胞培養工程における血清などのいくつかの試薬は、熱で不活性化させることができる。このような不活性化は部分的であってもよい。このような部分的な不活性化は、好適な実施例においては、試薬、さらにプロセスに関連する細胞に対して結合する有害なタンパク質を阻害するグリカンを放出することによって行われる。好適な実施例においては、欠損した（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）グリカンおよびグリカンを阻害する結合タンパク質は、同一構造である。好ましくは、放出されたグリカンは、これらが、組み込まれて細胞関連プロセスにおいて更なる問題を生じさせないときに、使用される。放出グリカン方法は、細胞に組み込み可能な条件下で、ＮｅｕＧｃに対しては好ましくない。
【００９５】
末端欠損グリカン
好適な実施例においては、１又は複数の末端構造は、生物学的材料、好ましくは糖タンパク質材料から欠損される。末端構造を欠損させる好ましい方法は、酵素的および化学的方法を具える。好適な酵素的方法は、グリコシダーゼ酵素による加水分解、または、末端構造を除去可能なトランスグリコシル化酵素による加水分解である。末端欠損は、さらに、例えば、グリコシダーゼ酵素による複数の末端モノサッカライドユニットの放出を含む。好適な化学的加水分解は、酸加水分解、好ましくは、タンパク質構造を破壊しないような条件下、または、タンパク質構造が修復または復元可能である弱酸加水分解である。欠損させるべき構造は、好適な実施例においては、シアル酸である。好ましくは、シアル酸は、シアリダーゼ酵素または弱酸加水分解によって放出される。
【００９６】
内部欠損グリカン
さらに、本発明は、化学的および／または酵素的方法により、サブ末端リンクからグリカンを放出することによるグリカン材料の内部欠損に関する。グリカンを化学的に放出する方法は、Ｏリンクグリカンの放出に関するβ脱離（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）などの塩基加水分解方法、Ｏ−グリカンおよびＮ−グリカンを放出するヒドラジン分解方法、Ｓｍｉｔｈ分解およびオゾン分解（好ましくは、糖脂質に対する）などの酸化方法を具える。好適な酵素方法は、糖脂質に対する内在性グリコシルセラミダーゼなど、内在性グリコシダーゼ、Ｎ−グリカン用Ｎ−グリコシダーゼ、および、Ｏ−グリカン用Ｏ−グリコシダーゼの使用を含む。
【００９７】
２．動物以外の供給源からのグリコシル化試薬
好適な実施例においては、本発明は、潜在的に有害な試薬のない動物以外の供給源からの試薬の使用に関する。好適な非動物グリコシル化タンパク質は、酵母および真菌、ならびに、植物由来のタンパク質である。注目すべき点は、これらの材料が、有害なアレルギ活性またはヒトタイプのグリカンの分析で問題を生じさせるグリカンを含むことである。好ましくは、本発明は、非動物構造からのグリコシル化試薬の制御にも関する。好ましい植物由来タンパク質は、植物細胞培養によって生成された組み替えアルブミン、より好ましくは、非グリコシル化ヒト血清アルブミンおよびウシ血清アルブミン、および、植物細胞系によって生成されたコラーゲンなどの組み替えゼラチン材料を具える。本発明は、特に、グリカンまたは本発明による有害なグリカンが試薬で置換され、好ましくは、非動物源からの制御試薬によって置換されるときの、本発明によるプロセスに関する。
【００９８】
３．原核生物からの非グリコシル化試薬
多くのバクテリアの組み替えタンパク質は、グリカン発現をしないことで周知である。本発明は、バクテリアタンパク質のグリコシレーション制御が、所定のタンパク質で生じるので、バクテリアタンパク質のグリコシレーション制御に関する。本発明は、グリカンまたは本発明による有害なグリカンを含む材料が、試薬、好ましくは、原核生物からの制御試薬によって置換されるとき、これらのプロセスに関する。
【００９９】
一実施例においては、本発明は、本発明による移植細胞修飾に関するグリカン制御形態のグリコシダーゼ酵素の使用に関し、本発明によって開示されるように、反応から上記酵素を除去することに関する。
【０１００】
さらに、本発明は、特に、哺乳類細胞株／培養プロセスで生成されるとき、Ｇａｌα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ構造、ＮｅｕＧｃ構造を有する動物グリコシレーションに関して制御されるとき、グリカン制御酵素調製物に関する。好適な酵素は、ヒト由来であり、より好ましくは、組み替え酵素である。最も好ましくは、ヒト血清形態の酵素が選択され、グリコシレーションは、ヒトタイプ非抗原グリコシレーション、好適には、ヒト天然可溶性酵素のグリコシレーションと同様のものであるように制御される。
【０１０１】
酵素反応後の細胞の好適な生存レベル
本発明は、本発明により生成される新規な細胞手段に関し、細胞の生存率は、未処理のコントロールと比べて、９０％を超え、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、最も好ましくは９８％である。生存データは、表７、および、コントロールと近い値若しくは超えている値を示す実施例８に示す。実験コントロール細胞前の細胞調製処理は、最適化しなかった。
【０１０２】
コンジュゲート酵素
本発明は、特異的な酵素の使用、または、幹細胞の修飾に関する文脈に関し、酵素は、タグに共有的に結合（コンジュゲート）される。本発明によるコンジュゲーションは、例えば、ビオチン化によって、細胞表面で１又は複数のマルチアミンに非特異的に行われるか、あるいは、特異的に行われる。
【０１０３】
特異的コンジュゲーション
特異的なコンジュゲーションは、本発明による幹細胞の細胞表面グリカン上で修飾すべき、酵素のリガンドグリカンおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼのドナーヌクレオチド結合部位への、酵素の結合部位の結合を阻害しない、タンパク質領域からのコンジュゲーションを目的とする。
【０１０４】
好適な特異的なコンジュゲーション方法は、酵素タンパク質／ペプチドの表面から、特異的なアミノ酸残基からの化学的なコンジュゲーションを具える。好適な方法において、システインなどの特異的なアミノ酸残基は、コンジュゲーション部位に対してクローン化され、このコンジュゲーションは、システインから生じる。別の好適な方法においては、Ｎ末端システインは、過ヨウ素酸によって酸化され、アミノ−オキシ−メチルヒドロキシルアミンまたはヒドラジン構造など、アルデヒド反応試薬にコンジュゲートし、更に好適な化学物質は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている「Ｃｌｉｃｋ」ケミストリ、および、Ｐｉｅｒｃｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒプローブによって市販化されているアミノ酸特異的カップリング試薬を含む。
【０１０５】
好適な特異的コンジュゲーションは、好ましくは、グリカンが、酵素基質の結合部位に近くないか、または、より長いスペーサが使用されるとき、酵素のＯ−またはＮ−グリカンなど、タンパク質とリンクした炭化水素から生じる。
【０１０６】
グリカンコンジュゲーション酵素タンパク質
好適なグリカンコンジュゲーションは、グリカンの反応性化学選択的ライゲーションＲ１基を介して生じ、化学基は、酵素のタンパク質部分に対する大きな変化や結合破壊的変化なしで、第２の化学選択的ライゲーション基Ｒ２に特異的にコンジュゲートできる。アルデヒドおよび／またはケトンと反応する化学選択的ライゲーション基は、アミノ−オキシ−メチルヒドロキシルアミンまたはヒドラジンとして含まれる。好適なＲ１基は、タンパク質表面で、アルデヒドまたはケトン化学的に合成されたものなど、カルボニルである。他の好適な化学選択的基は、マレイミドおよびチオールを具え、「Ｃｌｉｃｋ」試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって販売されている）は、アジドおよびそれに反応性のある基を具える。
【０１０７】
好適な合成ステップは、
ａ）化学物質を選択的に酸化する炭化水素、好適には、過ヨウ素酸による化学的酸化、または、
ｂ）ガラクトースオキシダーゼなど、非還元末端モノサッカライド酸化酵素による、または、モノサッカライド残基を具える修飾アルデヒドまたはケトン基（２位のＯＨの代わりにＣＨ３ＣＯＣＨ２−を具えるＧａｌ）をグリカンの末端モノサッカライドに転移することによる、酵素的酸化、
を具える。
【０１０８】
酸化酵素または過ヨウ素酸の使用は、当分野においては周知であり、Ｋａｂｉ−Ｆｒｅｎｓｅｎｉｕｓおよびドイツのリサーチ研究所による、ＨＥＳ−ポリサッカライドを組み替えタンパク質にコンジュゲートすることに関する特許出願（ＷＯ２００５ＥＰ０２６３７、ＷＯ２００４ＥＰ０８８２１、ＷＯ２００４ＥＰ０８８２０、ＷＯ２００３ＥＰ０８８２９、ＷＯ２００３ＥＰ０８８５８、ＷＯ２００５０９２３９１、ＷＯ２００５０１４０２４、参照することで全てを含む）に開示されている。
【０１０９】
末端モノサッカライド残基を転移するための好適な方法は、変異体ガラクトシルトランスフェラーゼの使用を含み、本発明者らの一部による特許出願ＵＳ２００５０１４７１８（参照することで全体を含む）、ＱａｓｂａおよびＲａｍａｋｒｉｓｈｍａｎおよびその共同研究者によるＵＳ２００７２５８９８６（参照することで全体を含む）、あるいは、Ｎｅｏｓｅに特許が付与されたグリコペジレーション（ｇｌｙｃｏｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）（ＵＳ２００４１３２６４０、参照することで全体を含む）に開示されている方法の使用によって開示されている。
【０１１０】
特異性の高い化学タグを含むコンジュゲート
好適な実施例においては、酵素は、Ｔと呼ばれるタグに特異的または非特異的にコンジュゲートされ、リガンドＬによって特異的に認識可能であり、タグの例としては、ビオチン結合リガンド（ｓｔｒｅｐｔ）アビジン、または、別のフルオロカルボニルに結合するフルオロカルボニル、または、ペプチド／抗原およびペプチド／抗原に対して特異的な抗体、を含む。
【０１１１】
タグ−コンジュゲート構造
好適なコンジュゲート構造は、式ＣＯＮＪ
Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎＴ−Ｌ−（Ｓ２）ｓ−ＳＯＬ
により、Ｂは酵素であり、ＳＯＬは、固相またはアフィニティマトリックスまたはポリマまたは酵素の除去に有用な他のマトリックスであり、Ｇはグリカン（酵素がコンジュゲートしたグリカンであるとき）であり、Ｒ１およびＲ２は、化学選択的ライゲーション基であり、Ｔはタグ、好ましくはビオチン、Ｌはタグに特異的に結合するリガンド；Ｓ１およびＳ２は、選択的なスペーサ基、好ましくは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ｍ、ｎ、ｐ、ｒおよびｓは、独立して０または１のいずれかの整数である。スペーサ構造ライゲーション基または（ストレプト）アビジンなどのリガンドを固相に化学的に結合させる方法は、当分野において周知である。
【０１１２】
複合体構造
複合体構造が、好ましくは、
Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎＴ−Ｌ−（Ｓ２）ｓ−ＳＯＬ
に形成された後、酵素がタグを使用して除去されるとき、
Ｂは酵素であり、ＳＯＬは、固相またはアフィニティマトリックスまたはポリマまたは酵素の除去に有用な他のマトリックスであり、Ｇはグリカン（酵素がコンジュゲートしたグリカンであるとき）であり、Ｒ１およびＲ２は、化学選択的ライゲーション基であり、Ｔはタグ、好ましくはビオチン、Ｌはタグに特異的に結合するリガンド；Ｓ１およびＳ２は、選択的なスペーサ基、好ましくは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ｍ、ｎおよびｓは、独立して０または１のいずれかの整数であり、Ｔ−Ｌ間のリンクは、非共有結合的なアフィニティの高い結合である。スペーサ構造ライゲーション基または（ストレプト）アビジンなどのリガンドを固相に化学的に結合させる方法は、当分野において周知である。
【０１１３】
タグコンジュゲートの使用
タグコンジュゲートの好適な方法は、以下のステップは、
１）タグ付き酵素を細胞とともにインキュベーションし、
２）細胞から酵素を放出させる酵素インヒビタを選択的に加え、
３）放出タグ付き酵素を、タグに特異的なリガンドを具えるマトリックスと接触させ、
４）酵素−マトリックス複合体を細胞から単離する
ことを具える。
【０１１４】
リガンドを具えるマトリックスは、固相またはアフィニティマトリックスまたはポリマ、あるいは、酵素を除去するのに有用な他のマトリックスでもよい。マトリックスは、磁気粒子、カラム、チューブまたは容器の表面、好ましくは、可溶性または不溶性の水混和性ポリマの形態で使用できる。
【０１１５】
さらに別の好適な実施例においては、タグ付き酵素は、非タグ付き酵素ととともに使用され、好ましくは治療用途およびタグ付き酵素の除去を目的として、細胞調製物中で同一または極めて同様な細胞結合特性を有する、非タグ付き酵素のレベルを構築する。
【０１１６】
間葉幹細胞の修飾
好適な実施例においては、本発明は、血液組織、または、臍帯血間葉幹細胞または骨髄間葉幹細胞など間葉幹細胞由来の細胞からなる群から選択される間葉幹細胞の修飾に関する。好適には、間葉幹細胞は、好ましくは、ＳＴＧａｌＩＩＩおよびＦｕｃ−ＴＶＩなどのシアリル−ＬａｃＮＡｃ合成およびフコシレーションに対する好適なトランスフェラーゼによって、組み合わせ方法として、シアリレーションおよび／またはフコシレーションを上昇させるように修飾される。
【０１１７】
好適なフコシルトランスフェラーゼ条件は、３百万細胞あたり約４ｍＵ（特に、Ｆｕｃ−ＴＶＩ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ酵素およびユニット、新鮮な酵素）、または、１００万細胞あたり、０．５−５ｍＵ、より好ましくは、０．７５−３ｍＵ、最も好ましくは１−２ｍＵである。好適な範囲は、酵素の状態（保存中の腐食）、細胞の種類に依存する。好適な反応温度は、約３７℃、好ましくは、３３−４０℃、より好ましくは、３５−３９℃であらう。好適な反応時間は、０．５−６時間、好ましくは、１−６時間、より好ましくは、２−６時間、より更に好ましくは、３−５．５時間、好適な実施例においては、約４時間（３．５−４．５時間）である。酵素量の増加は、必要な反応時間を低減することがわかった。
【０１１８】
好適なシアリルトランスフェラーゼの条件は、１００万細胞あたり、約５０ｍＵ（特に、α２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ酵素およびユニット、新鮮な酵素）、５−２００ｍＵ、より好ましくは、１０−１５０ｍＵ、最も好ましくは、２５−７５ｍＵである。好適な範囲は、酵素の状態（保存中の腐食）、細胞の種類に依存する。好適な反応時間は、０．５−６時間、好ましくは、１−６時間、より好ましくは、２−６時間、より更に好ましくは、３−５．５時間、好適な実施例においては、約４時間（３．５−４．５時間）である。好適な反応温度は、約３７℃、好ましくは、３３−４０℃、より好ましくは、３５−３９℃であらう。酵素量の増加は、必要な反応時間を低減することがわかった。
【０１１９】
本発明は、特に、間葉幹細胞などの幹細胞の修飾に関し、通常、これらの細胞のシアリレーションレベルは低い。シアリレーションの低い細胞は、非シアリル化形態において３０％以上のＮ−グリカンを具える。好適な実施例においては、シアリレーションの低い間葉幹細胞は、間葉幹細胞由来の骨髄である。
【０１２０】
細胞修飾のための好適なグリコシレーションレベル
本発明は、好ましくは、シアリレーション細胞に対するグリコシレーション細胞がＮグリカン上の利用可能なフリーなシアリレーション部位のうちの５０％レベルを超えることを明らかにした。好適な実施例においては、本発明は、１つのシアリルトランスフェラーゼによるシアリレーションレベルが、６０％を超え、より好ましくは７０％を超え、さらにより好ましくは７５％を超え、さらにより好ましくは８０％、もしくは、少なくとも８３％を超え、最も好ましくは８５％を超える。本発明は、さらに、６０％を超え、より好ましくは７０％を超え、さらにより好ましくは７５％を超え、さらにより好ましくは８０％、もしくは、少なくとも８３％を超え、最も好ましくは８５％を超える上昇したシアリレーションを含む新規な間葉幹細胞集団に関する。細胞集団は、好ましくは、ヒト臍帯血または骨髄から得られる。好適な実施例においては、最適化されたシアリレーションは、臍帯血間葉幹細胞で行われる。
【０１２１】
好適なシアリルトランスフェラーゼ
好適なシアリルトランスフェラーゼは、好適には、可溶形態において、哺乳類、より好ましくは、ヒトのα３−およびα６−シアリルトランスフェラーゼを具える。好適な実施例においては、トランスフェラーゼは、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶまたはＳＴ６ＧａｌＩなどのＮアセチルラクトースアミン、あるいは、ＳＴ３ＧａｌＩまたはＳＴ３ＧａｌＩＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶなどのＯ−グリカンコアＩ、をシアリル化する。最も効率的なシアリレーションは、例えばＳＴ３ＧａｌＩＩＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶまたはＳＴ３ＧａｌＩ／ＩＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶなどコアＩシアリル化およびＮアセチルラクトースアミンシアリル化など、少なくとも２つのシアリルトランスフェラーゼの組み合わせで得られる。
【０１２２】
好適なフコシルトランスフェラーゼ
好適なフコシルトランスフェラーゼは、好適には、可溶形態において、哺乳類、より好ましくは、ヒトのα３−およびα６−フコシルトランスフェラーゼを具える。好適な実施例においては、ＦＴＩＩＩ、ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ、ＦＴＶＩＩおよびＦＴＩＸなど、より好ましくは、シアリルα３−Ｎ−アセチルラクトースアミン、好ましくはＦＴＩＩＩ、ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ、ＦＴＶＩＩ、より好ましくは、ＦＴＩＩＩ、ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩおよびＦＴＶＩＩ、より更に好ましくは、ＦＴＶＩおよびＦＴＶＩＩ、最も好ましくは、ＦＴＶＩなど、Ｎ−アセチルラクトースアミンと上記トランスフェラーゼは、反応する。最も効率的なフコシレーションは、少なくとも２つのフコシルトランスフェラーゼとの組み合わせで得られる。
【０１２３】
好適な実施例においては、ガラクトシレーション反応は、ＵＳ２００５０１４７１８（参照することで全体を含む）に開示されているように、好ましくは、哺乳類ＧａｌＴ、より好ましくは天然のヒトＧａｌＴによって、あるいは、ＱａｓｂａおよびＲａｍａｋｒｉｓｎａｎのＭｇ２＋選択的β４−ガラクトシルトランスフェラーゼなど、外在性トランスフェラーゼを使用して、Ｍｇ２＋イオンの存在下で行われる。本発明による特異的Ｔａｇを使用することによって、および／または、本発明による酵素インヒビタを使用することによって、外在性ＧａｌＴおよび／またはシアリルトランスフェラーゼを除去するのに有用であることがわかった。
【０１２４】
修飾用の制御試薬
別の実施例においては、グリカン制御シアリルトランスフェラーゼまたはガラクトシルトランスフェラーゼを使用することは有用である。本発明は、ヒト以外で発現するグリコシルトランスフェラーゼのグリカンの分析に関する。トランスフェラーゼは、非ヒトグリコシレーションを具える場合、非ヒト構造は、特異的なグリコシダーゼによって除去され、または、例えば、過ヨウ素酸塩の酸化および還元によって化学的に修飾される。
【０１２５】
本発明は、特に、制御された酵素基質、好ましくは、式
Ｍａｎα６（Ｍａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｅ
によるグリカンを具える、本発明による反応のためのガラクトシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼの使用に関し、Ｅは、酵素タンパク質であり、Ｎは、Ｎグリコシレーション部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）ａにおけるグリコシドのリンク窒素である。
【０１２６】
非還元末端マンノースは、さらに、（ＮｅｕＮＡｃα３／６）ｍＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２によってさらに修飾されることができ、ｍおよびｎは０または１である。酵素は、ＮｅｕＮＡｃのかわりにＮｅｕＮＧｃを具える場合、これは、好ましくは、除去され、ＮｅｕＮＡｃに変更される。
【０１２７】
別の好適な実施例においては、酵素は、例えば、ＱａｓｂａによるＵＳ２００７２５８９８６（参照することで全体を含む）に開示されるように、好ましくは、バクテリア生成物からの非グリコシル化酵素であり、可能性のある酵素のＯ−グリコシレーション部位は、真核生物系の発現では変異する。
【０１２８】
この構造が特に有益であるのは、Ｍａｎβ４−残基が、植物細胞に存在するＸｙｌβ２−修飾を欠いており、末端ＧｌｃＮＡｃを還元することで、昆虫または植物細胞由来の材料に存在するＦｕｃα３−構造を欠く（例えば、酵素が、昆虫または植物細胞培養によって生成される場合）からである。
【０１２９】
細胞からのグリコシルトランスフェラーゼの放出に関するグリコシルトランスフェラーゼインヒビタ
本発明は、反応後の細胞から効果的にトランスフェラーゼを洗浄するための、グリコシルトランスフェラーゼのインヒビタについてのアクセプタサッカライドまたはドナーヌクレオチドの類似体または誘導体の使用に関する。好適なアクセプタ類似体は、基質部位に結合可能で酵素のアクセプタ結合を阻害する、炭化水素オリゴサッカライド、モノサッカライドおよびコンジュゲートおよびこれらのアナログを具える。好適な炭化水素の濃度は、１−５００ｍＭ、より好ましくは、５−２５０ｍＭおよびさらにより好ましくは、１０−１００ｍＭで細胞が耐えられる濃度であり、より高い濃度も、モノサッカライドに好ましく、この方法は、固相に結合する結合剤を含む。
【０１３０】
シアリルトランスフェラーゼ阻害に対する好適なオリゴサッカライドは、オリゴサッカライドを含む配列を具え、末端コンジュゲートの還元は、付随しているＧａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃを含む。ＧａｌＴインヒビタは、ＧｌｃＮＡｃおよびコンジュゲートおよびＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ６ＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌを含む。
【０１３１】
好適な実施例においては、シアリルトランスフェラーゼは、アクセプタジサッカライド、アフィニティの高いレセプタに対して、より好ましくは５−１５０ｍＭアクセプタ、より好ましくは１０−１００ｍＭ、より更に好ましくは１０−８０ｍＭ、より好ましくは１０−５０ｍＭ、アフィニティの低いレセプタに対して、２０−１００ｍＭ、より好ましくは４０−１００ｍＭ、最も好ましい５０−１００ｍＭである。アクセプタアフィニティは、酵素間で変化し、ラクトースは、α２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）またはＳＴ３ＧａｌＩＩＩについて、中度から弱いアフィニティのアクセプタして考えられており、アフィニティの高いアクセプタは、通常、Ｋｍ値が約１０倍以上低い。好適には、洗浄によって、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、より更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の細胞結合酵素を除去される。
【０１３２】
コンジュゲートの末端構造の好適な還元は、ＡＲであり、Ａは、好ましくは、Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃについてのβ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃについてのαである、アノマー（ａｎｏｍｅｒｉｃ）構造であり、Ｒは、有機残基がサッカライドにグリコシド結合したものであり、好ましくは、メチル、エチルまたはプロピルなどのアルキルであり、シクロヘキシルなどの環状構造あるいは更なる官能基で選択的に修飾された芳香環構造である。好適なモノサッカライドは、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎなど、結合エピトープの末端もしくは２又は３末端モノサッカライド、好ましくは、ＦｕｃαＲ、ＧａｌβＲ、ＧａｌＮＡｃβＲ、ＧａｌＮＡｃαＲ、ＧｌｃＮＡｃβＲ、ＭａｎαＲとしてのアノマーコンジュゲートを具える。例えば、α３−またはα６−シアリルトランスフェラーゼ合成シアリルＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃは、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ又はラクトースによって阻害される。好適なドナー類似体は、ＣＭＰおよびシアリルトランスフェラーゼ誘導体、ならびに、ＵＤＰおよびガラクトシルトランスフェラーゼ誘導体を具え、類似体は、結合しているアクセプタと干渉し、酵素が放出される。
【０１３３】
天然のシアル酸のシアリルトランスフェラーゼ触媒転移
本発明は、ＣＭＰシアル酸から標的細胞への、天然シアル酸、好ましくは、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＧｃまたはＮｅｕ−Ｏ−Ａｃのシアリルトランスフェラーゼ触媒化転移に関する。本発明は、式、
ＣＭＰ−ＳＡ  ＋  標的細胞  →  ＳＡ−標的細胞  ＋  ＣＭＰ
好ましくは、
ＣＭＰ−ＳＡ  ＋  Ｇａｌβ４／３ＧｌｃＮＡｃ−標的細胞  →  ＳＡα３／６Ｇａｌβ４／３ＧｌｃＮＡｃ−標的細胞  ＋  ＣＭＰ
によるシアリルトランスフェラーゼ触媒反応を提供し、ＳＡはシアル酸、好ましくは、天然シアル酸、好ましくは、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＧｃまたはＮｅｕ−Ｏ−Ａｃであり、この反応は、シアリルトランスフェラーゼ酵素、好ましくは、α３−シアリルトランスフェラーゼによる触媒化であり、標的細胞は、培養幹細胞または幹細胞または初期ヒト血液細胞（臍帯血細胞）である。
【０１３４】
Ｌｅｗｉｓ  ａおよびＬｅｗｉｓ  ｘとシアリル化バリアントの好適なフコシルトランスフェラーゼ反応合成は、
ＧＤＰ−Ｆｕｃ  ＋  Ｇａｌβ４／３ＧｌｃＮＡｃ−標的細胞  →  Ｇａｌβ４／３（Ｆｕｃα３／４）ＧｌｃＮＡｃ−標的細胞  ＋  ＧＤＰ
および／または、
ＧＤＰ−Ｆｕｃ  ＋  ＳＡα３Ｇａｌβ４／３ＧｌｃＮＡｃ−標的細胞  →  ＳＡα３Ｇａｌβ４／３（Ｆｕｃα３／４）ＧｌｃＮＡｃ−標的細胞  ＋  ＧＤＰ
である。
【０１３５】
シアリル−Ｌｅｗｉｓ  ｘ、ＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ、および、シアリル−Ｌｅｗｉｓ  ａ、ＳＡα３Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃの合成の両方が、好ましく、細胞が、間葉幹細胞上に共通して主にタイプ２のｌａｃＮＡｃアクセプタを具えるときはｓＬｅｘがより好適である。
【０１３６】
反応は、フコシルトランスフェラーゼ酵素、好ましくは、α３／４−フコシルトランスフェラーゼにより、触媒化される。α４−フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩおよび−ＴＶ）は、Ｌｅｗｉｓ  ａの合成に対して好適である。新規のフコシル化細胞集団は、構造に関する機能的研究において好ましい。
【０１３７】
実験例
実験例１：幹細胞および分化した細胞サンプル、細胞培養培地ならびに生物学的試薬におけるグリカン構造含有Ｎ−グリコリルノイラミン酸の検出
細胞材料生成物の例
臍帯血細胞調製
【０１３８】
単核細胞の調製：最多血を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）−２ｍＭＥＤＴＡで１：４に希釈し、３５ｍｌの希釈臍帯血を注意深く１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）の上に層状にした。チューブを休みなく４００ｇで４０分間遠心分離した。中間層の単核細胞層を回収し、ＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡで２回洗浄した。チューブを３００ｇで１０分間遠心分離した。
【０１３９】
ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞のポジティブセレクション：臍帯血単核細胞ペレットを再懸濁して、終濃度で、１０８総細胞あたり３００μｌのＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）とした。ＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋細胞をポジティブセレクションするために、１０８の単核細胞あたり、１００μｌのＦｃＲブロッキング試薬、１００μｌのＣＤ３４またはＣＤ１３３のＭｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。懸濁液を、６−１２℃で３０分間培養した。細胞をＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡで洗浄し、１０８細胞あたり、５００μｌのＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡに再懸濁した。
【０１４０】
適宜なＭＡＣＳアフィニティカラムタイプ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を総細胞数に従って選択した。＜２×１０８細胞にはＭＳカラム、２×１０８−２×１０９細胞にはＬＳカラムを選択した。カラムを、磁場に配置して、ＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡでリンスした。ラベルを付した細胞懸濁液を、カラムにかけ、カラムを通過した細胞をネガティブ細胞フラクションとして回収した（ＣＤ３４−またはＣＤ１３３−）。ついで、ＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡでカラムを４回洗浄した。カラムを磁場から取り出し、保持されているポジティブ細胞を、プランジャを使用してＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡで取り出した。
【０１４１】
取り出したポジティブ細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、３００μｌのＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡで再懸濁した。２５μｌのＦｃＲブロッキング試薬と２５μＬのＣＤ３４またはＣＤ１３３Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを加えた。懸濁液を６−１２℃で１５分間培養した。細胞をＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡで洗浄し、５００μｌのＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡに再懸濁した。
【０１４２】
ＭＳカラムを磁場に配置し、ＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡでリンスした。ラベル付細胞懸濁液をカラムにかけた。カラムを４回、ＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡで洗浄した。次いで、カラムを磁場から取り出し、保持されているポジティブ細胞（ＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋）を、プランジャを使用してＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％ＢＳＡを用いて取り出した。
【０１４３】
Ｌｉｎ−細胞のネガティブセレクション：系統分化（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞を除くために、ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ中の単核細胞（８×１０７／ｍｌ）を、室温で１５分間、抗ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、グリコフォリンＡ抗体（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を含むＳｔｅｍＳｅｐ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌで１００μｌ／ｍｌ細胞にラベルした。続いて、細胞懸濁液１ｍｌあたり、６０μｌのコロイド状磁鉄粒子を加え、室温で１５分間インキュベーションした。
【０１４４】
ラベル付細胞懸濁液を、ＭＡＣＳ  ＬＤカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）にかけ、カラムを通過したラベルされてない細胞をネガティブフラクション（Ｌｉｎ−）として回収した。ＬＤカラムを１ｍｌのＰＢＳ−０．５％ＢＳＡで２回洗浄し、流出物（ｅｆｆｌｕｅｎｔ）をラベルされてない細胞とともに同一チューブに回収した。次いで、カラムを磁場から取り出し、保持されているポジティブ細胞（Ｌｉｎ＋）をプランジャを使用してＰＢＳ−０．５％ＢＳＡで取り出した。
【０１４５】
臍帯血間葉幹細胞株
臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ）の回収：ヒト臍帯血（ＵＣＢ）ユニットを、母親とのインフォームドコンセント得て分娩後に回収し、ＵＣＢを回収から２４時間以内に処理した。ＵＣＢをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈して、単核細胞（ＭＮＣ）を各ＹＣＢユニットから単離し、その後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）濃度勾配遠心分離（４００ｇ／４０分）を行った。単核細胞フラグメントを勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）から回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１４６】
臍帯血細胞単離および培養：ＣＤ４５／グリコフォリンＡ（ＧｌｙＡ）ネガティブ細胞セレクションを、免疫ラベル磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して行った。ＭＮＣを、ＣＤ４５とＧｌｙＡ磁気マイクロビーズとの両方とともに３０分間培養し、製造者の説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従って、ＬＤカラムを使用してネガティブに選択した。ＣＤ４５／ＧｌｙＡネガティブエリューションフラクションおよびポジティブフラクションの両方を回収し、培養培地で再懸濁して、カウントした。ＣＤ４５／ＧｌｙＡポジティブ細胞を１×１０６／ｃｍ２の密度でフィブロネクチン（ＦＮ）コーティング６ウェルプレートに播種した。ＣＤ４５／ＧｌｙＡネガティブ細胞を約１×１０４細胞／ウェルでＦＮコーティング９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種した。ほとんどの非接着細胞は、次の日に培地を交換したときに取り除かれた。残りの非接着細胞は、次の週２回の培地交換の間に取り除かれた。
【０１４７】
５６％のＤＭＥＭ低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ、Ｇｉｂｃｏ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、４０％ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１×ペニシリン−ストレプトマイシン（両方ともＧｉｂｃｏから購入）、１×ＩＴＳ液体培地サプリメント（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、１×リノール酸−ＢＳＡ、５×１０−８Ｍデキサメタソン、０．１ｍＭ  Ｌ−アスコビル酸−２−リン酸塩（３つともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）、１０ｎＭ  ＰＤＧＦ（Ｒ＆Ｄシステム、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）および１０ｎＭ  ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる培地で、細胞を初期培養した。後期継代（ｐａｓｓａｇｅ）（７継代後）において、細胞を、ＦＣＳ濃度を１０％に上昇させる以外は、同様の増殖培地で培養した。
【０１４８】
プレートをコロニーについてスクリーニングし、細胞が８０−９０％コンフルーエントのとき、細胞を二次培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）した。一次継代で細胞数が依然として低いときに、細胞を、室温で最小量のトリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％／１ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ）で剥離し、トリプシンをＦＣＳで阻害した。細胞を血清フリー培養培地でフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）し、血清濃度を２％に調整した通常培養培地で懸濁した。これらの細胞を約２０００−３０００／ｃｍ２で播種した。後期継代において、細胞を規定した時間ポイントで規定した領域からトリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、血球計算器でカウントして、２０００−３０００細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。
【０１４９】
骨髄由来幹細胞の単離および培養：骨髄（ＢＭ）−由来ＭＳＣを、Ｌｅｓｋｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）によって開示されているように取得した。簡単に説明すると、整形外科手術中に得た骨髄をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｌｐｈａ−Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）で培養し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＣＳ、１×ペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（すべてＧｉｂｃｏから購入）を加えた。２日間の細胞付着期間後、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋フリーＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、同一培地に２０００−３０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を播種することで二次培養をして、ほぼコンフルーエントになるまで週に２回、培地の半分を除去し、新鮮な培地と交換した。
【０１５０】
間葉幹細胞表現型のフローサイトメトリ分析：ＵＢＣおよびＢＭ由来の間葉幹細胞の両方を、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって表現型を決定した。フルオロセインイソチシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリチリン（ＰＥ）コンジュゲード抗ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ７３およびＨＬＡ−ＡＢＣ抗体（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍから購入）、抗ＣＤ１０５抗体（Ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ）および抗ＣＤ１３３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を、直接ラベルするために使用した。適宜なＦＩＴＣ−およびＰＥ−コンジュゲートアイソタイプコントロール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。非コンジュゲート抗ＣＤ９０抗体およびＨＬＡ−ＤＲ（両方共ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を使用して間接的にラベルした。間接的にラベルするために、ＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を２次抗体として使用した。
【０１５１】
ＵＢＣ由来細胞は、造血マーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ１３３に対してネガティブだった。これらの細胞は、ＣＤ１３（アミノペプチダーゼＮ）、ＣＤ２９（β１−インテグリン）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸レセプタ）、ＣＤ７３（ＳＨ３）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）、ＣＤ１０５（ＳＨ２／エンドグリン）およびＣＤ４９ｅに対してポジティブに染色された。さらに、これらの細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣにポジティブに染色されたが、ＨＬＡ−ＤＲに対してはネガティブだった。ＢＭ−由来細胞は、同様の表現型を有することが示された。それらは、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、および、ＨＬＡ−ＤＲにネガティブであり、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−ＡＢＣにはポジティブだった。
【０１５２】
アジポジェニック分化（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）：ＵＣＢ由来ＭＳＣの脂肪生成ポテンシャルを評価するために、これらの細胞を、３回の複製ウェルで、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に３×１０３／ｃｍ２の密度で播種した。サンプルをグリコーム分析用に調整する前に、ＤＭＥＭ低グルコース、２％ＦＣＳ（両方共Ｇｉｂｃｏから購入）、１０μｇ／ｍｌインスリン、０．１ｍＭインドメタシン、０．１μＭデキサメタソン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）からなる脂肪生成誘導培地でＵＣＢ由来ＭＳＣを５週間培養した。
【０１５３】
オステオジェニック分化（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）：ＢＭ由来ＭＳＣのオステオジェニック分化を誘導するために、２４−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）上に３×１０３／ｃｍ２の密度で、細胞を通常増殖培地に播種した。翌日、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１μＭデキサメタソン、１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩、０．０５ｍＭ  Ｌ−アスコビル酸−２−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を加えたα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）からなるオステオジェニック誘導培地に培地を変更した。ＢＭ由来ＭＳＣを３週間培養し、グリコーム分析用にサンプルを調整する前に、培地を週に２回交換した。
【０１５４】
グリコーム分析のための細胞回収：１ｍｌの細胞培養液をグリコーム分析用に残し、残りの培養液をアスピレータで除去した。細胞培養プレートをＰＢＳバッファｐＨ７．２で洗浄した。ＰＢＳを吸引し、細胞をスクレープして、５ｍｌのＰＢＳで回収した（２回繰り返した）。この時点で、小さな細胞フラクション（１０μｌ）を細胞カウント用に取り出し、サンプルの残りを５分間４００ｇで遠心分離した。上澄みを吸引し、ペレットをＰＢＳでさらに２回洗浄した。これらの細胞を１．５ｍｌのＰＢＳで回収し、５０ｍｌチューブから１．５ｍｌ回収チューブに移し、７分間、５４００ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを吸引し、もう一度洗浄を繰り返した。細胞ペレットを−７０℃で保存し、グリコーム分析に使用した。
【０１５５】
ヒト胚性幹細胞株（ｈＥＳＣ）
未分化のｈＥＳＣ：受精した過度の（ｅｘｃｅｓｓ）ヒト胎児のインビトロ胚盤胞ステージから、ｈＥＳＣ株の生成プロセスは、前述したように開示されている（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。本実験において分析した２つの細胞株は、最初に、マウス胚性繊維芽細胞供給器（ｆｅｅｄｅｒ）で得られて培養され（ＭＥＦ；ＩＣＲ系統の１２−１３ｐｃ胎児）、２つは、ヒト包皮繊維芽細胞供給器細胞で得られて培養された（ＨＦＦ；ＣＲＬ−２４２９  ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｎｓ，ＵＳＡ）。本実験に関して、全ての細胞株を、マイトマイシン−Ｃ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理したＨＦＦ供給器に移し、２ｍＭのＬ−グルタミン／ペニシリンストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０％ＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＩＴＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた血清フリー培地（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭＤ−ＭＥＥＭ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）細胞培養システム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で培養した。
【０１５６】
ステージ２  分化したｈＥＳＣ（胚様態）：胚様態（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ（ＥＢ））の形成を誘導するために、ｈＥＳＣコロニ−をまず１０−１４日間増殖させ、その後、コロニーを小さな部分に分け、非接着性ペトリ皿の上に移し、懸濁液培養する。次の１０日間、ｂＦＧＦのない標準培養培地（上記参照）中で、形成されたＥＢを懸濁液で培養した。
【０１５７】
ステージ３  分化したｈＥＳＣ：さらなる分化に関して、ＩＴＳ、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２混合液（Ｇｉｂｃｏ）からなる培地中で、ゼラチンコーティング（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）接着培地皿の上にＥＢを移した。接着した培養を１０日間培養して、その後、回収した。
【０１５８】
サンプル調製：細胞を機械的に回収し、洗浄し、グリカン分析の前まで凍結保存した。
【０１５９】
実験工程
生物学的試薬：ウシ血清アポトランスフェリンおよびフェチュインをＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）から購入した。
【０１６０】
グリカンの単離：基本的に上述したように（Ｎｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍのＮ−グリコシダーゼＦ分解（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＵＳＡ）によって、Ｎ−リンクグリカンを細胞性糖タンパク質から解離（ｄｅｔａｃｈ）させ、その後、イオン交換分離を含む固相抽出方法によって、放出されたグリカンを分析用に精製し、シアリル化フラクションと非シアリル化フラクションに分けた。
【０１６１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析：基本的に上述したように（Ｓａａｒｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ  ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎまたはＢｕｒｋｅｒウルトラフレックスＴＯＦ／ＴＯＦ装置を用いて行った。相対的モル量の中性グリカン成分（Ｎａｖｅｎ  ＆  Ｈａｒｖｅｙ，１９９６）およびシアリル化グリカン成分（Ｐａｐｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）の両方を、相対的シグナル強度に基づいて割り当てた。質量分析フラグメンテーション分析を、製造者の指示書に従って、ＢｒｕｋｅｒウルトラフレックスＴＯＦ／ＴＯＦ装置を用いて行った。
【０１６２】
シアル酸分析：穏やかなプロピオン酸加水分解によって、シアル酸をサンプルグリココンジュゲートから放出させ、１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）と反応させ、基本的に上述したように（Ｙｌｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって分析した。
【０１６３】
結果
幹細胞サンプルのＮ−グリカン分析：各種幹細胞および分化した細胞、ならびに、培養培地およびこれらのサンプル処理に使用された他の生物学的試薬から、Ｎ−グリカンを単離して、実験工程に記載するように、中性Ｎ−グリカンフラクションとシアリル化Ｎ−グリカンフラクションとにフラクション分けした。シアリル化Ｎ−グリカンフラクションのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析において、いくつかのグリカンシグナルが、Ｎ−グリカン中のＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）の存在を示す上記サンプルから検出された。例としては、図１は、幹細胞サンプルのシアリル化Ｎ−グリカンフラクション（Ａ．およびＢ．）、市販の細胞培養培地（Ｃ．およびＥ．）、および、ウシ血清糖タンパク質（Ｄ．およびＦ．）のマススペクトルを示す。ＮｅｕＧｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４の［Ｍ−Ｈ］−イオンに対応するｍ／ｚ１９４６（上方パネル）のグリカンシグナル、ならびに、ＮｅｕＧｃ１ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４およびＮｅｕＧｃ２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４［Ｍ−Ｈ］−イオンそれぞれのｍ／ｚ２２３７およびｍ／ｚ２２５３（下方パネル）のグリカンシグナルは、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、すなわち、Ｎ−アセチルノイラミン酸よりも大きな質量で１６Ｄａのシアル酸残基の存在を示している。
【０１６４】
Ｎｅｕ５Ｇｃ含有グリカン種に対応するように提案された、指標となるグリカンシグナルおよび他のシグナルは、幹細胞サンプルから得られた質量分析プロファイリング結果と併せて表１に挙げられる。ヒト臍帯血からのＣＤ１３３＋細胞は、この実験例における臍帯血細胞集団を示し、同様のＮｅｕ５Ｇｃグリココンジュゲートを含むことが検出された他の細胞集団は、臍帯血からのＣＤ３４＋およびＬＩＮ−細胞を含んでいた。ヒト骨髄からの間葉幹細胞は、本実験例における間葉幹細胞株を示し、同様のＮｅｕ５Ｇｃグリココンジュゲートを含むことを検出した他の間葉幹細胞株は、臍帯血由来の細胞株を含んでいた。
【０１６５】
細胞培養培地および生物学的試薬から得た質量分析プロファイリング結果は、下記に列挙する。指標となるグリカンシグナルおよび研究された試薬におけるＮｅｕ５Ｇｃ含有グリカン種に対応するように提案された、他のシグナルは、表６に列挙する。これらの結果は、列挙した試薬にＮｅｕ５Ｇｃの存在を示す。
【０１６６】
試薬のグリカンプロファイリング：ＮグリコシダーゼＦによって酵素的にＮ−グリカンを試薬から放出させ、精製して質量分析計で分析した。これらの結果を以下にまとめる。
【０１６７】
１．検出可能量のＮ−グリカンを含んだ以下の試薬：
市販のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）
トランスフェリン、ウシ血清
ウマ血清
マウス抗体を含むモノクローナル抗体
細胞培養培地
【０１６８】
２．Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）またはアセチル基（Ａｃ）を含む試薬
以下のリストは、マススペクトルから検出された質量およびこれに対応する提案されるモノサッカライド組成物（正確に計算された質量値は、表６に示される）。
【０１６９】
Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）またはアセチル基（Ａｃ）を含む一般的な動物Ｎ−グリカン構造の一般的なモノサッカライド組成物
各種動物種が多数の異なるタンパク質を生成していることがわかった。以下の一般的な組成物は、有用な主なシグナルを示し、本発明は、好ましくは、哺乳類、好適にはウマおよび／またはウシからのサンプル由来の血清／血液の文脈において、特に上記シグナルの分析に関する。本発明は、血清トランスフェリンまたは抗体などの、個々に単離されたタンパク質の分析に関連し、好ましくは、個々のタンパク質間（例えば、動物固体、動物の状態、動物種または系統）における変化の分析に関する。本発明は、さらに好ましくは、血液フラクション、より好ましくは血清フラクションなど動物組織フラクションなどの複合体タンパク質混合物の分析に関する。これらのシグナルが、ヒト組織または動物材料のコンタミした細胞材料で観察される一般的なものではないときは、特に有用である。グリカンが、周知の抗原または他のリスクを保有するので、例えば、治療用細胞生成物または試薬などを生成する目的で、これらの治療製品からグリカンの存在を分析するのに有用である。
【０１７０】
さらに、本発明は、特に、本発明による研究開発方法、例えば、製品開発方法などの方法に関し、細胞用関連材料またはこれらの開発に対する定量的および／または定性的グリコーム分析を行うステップと、または、哺乳類シアリル化タンパク質など、動物タンパク質など非ヒトタンパク質材料によって、潜在的な存在またはコンタミネーションを明らかにするために、細胞から定量的および／または定性的グリコーム分析を行うステップと、を具える。細胞培養試薬は、好ましくは、植物、真菌、酵母または昆虫細胞など、あるいは、ヒト類似グリコームを生成する上記細胞の工学化バージョンなど、非哺乳類または無脊椎動物細胞系によって、非ヒトＮ−グリコシレーションを行う各種細胞培養法によって生成可能であり、上記ヒト類似グリコームは、分析する必要のある異なる生物活性を有し、好ましくは、本発明による方法によって分析される。
【０１７１】
好ましくは、血清（ＮｅｕＮＡｃ−ＯＡｃ−グリカンなどのＯ−アセチル化シアル酸など、ＮｅｕＧｃ−グリカンおよび／またはＯ−アセチル構造を具える）である、動物タンパク質Ｎ−グリカンの文脈において分析されるべき、特徴的な主なグリカンシグナル（構造）に対する一般的なモノサッカライド組成物は、以下の式であり：
ＮｅｕＧｃｎ１ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５Ａｃｎ６、
ｎ１は、値が０−５、好ましくは、０−４、より好ましくは、０−３、最も好ましくは、０、１または２の整数であり、
ｎ２は、値が０−５、好ましくは、０−４、より好ましくは、０−３、最も好ましくは、０、１または２の整数であり、
ｎ３は、値が１−８、より好ましくは、１または３−８、より好ましくは、１または３−６、より好ましくは、３−６、最も好ましくは、３、５または６、の整数であり、
ｎ４は、値が２−７、より好ましくは、２−６、さらにより好ましくは、２−５または３−６、最も一般的には３−５、の整数であり、
ｎ５は、値が０−３の整数であり、
ｎ６は、値が０−４の整数であり、好ましい範囲が、０、１または２、および、０、１、２または４を具える。
【０１７２】
上記タンパク質組成物は、シアル酸量が増大した複数の分岐Ｎ−グリカンと、末端Ｎ−アセチルラクトースアミン量が増大しているｎ３およびｎ４と、を具えることができることがわかった。さらに、Ｎ−グリカンが、ポリ−ｎ−アセチルラクトースアミンを具えるとき、観察可能なシグナル中のモノサッカライドユニットの値、および、選択的に、シアル酸の数（ｎ１およびｎ２、ならびに、可能なｎ６のアセチレーション）、分岐差がぞうだいするとき、フコースの数（ｎ５、ｎ５の上昇は、通常、Ｎ−アセチルラクトースアミンの上昇よりも小さい）、Ｎ−アセチルラクトースアミンのフコシレーションが増大するときは、約１−１０の間の数であってもよく、その数だけ増大してもよく、より好ましくは、組成物中のモノサッカライドユニットの数は、１−５の間の数だけ増大してもよく、あるいは、Ｎ−アセチルラクトースアミン中の一般的な穏やかな増大では、増大は、１−３である。
【０１７３】
最も好ましい組成物は、一般的な二分岐複合体タイプＮ−グリカンのモノサッカライド組成物と、いくつかの一般的でないより小さなその変異体とを具えることが、明らかになった。
【０１７４】
市販のＢＳＡ
市販の転移性ウシ血清（ＮｅｕＧｃ−グリカンを具える）の文脈において分析されるべきモノサッカライド組成物は、式：
ＮｅｕＧｃｎ１ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５、
によるシグナルを具え、
ｎ１は、１または２であり；
ｎ２は、０はたま１であり；
ｎ３は、３−５の値を有する整数であり；
ｎ４は、３−４の値を有する整数であり、
ｎ５は、０または１の値を有する整数であり、好適な組成物の例を下に列挙する。
【０１７５】
これらの組成物は、ウシ血清タンパク質と極めて類似しているが、グリカンの一部のみが含まれる。動物血清アルブミン、好ましくは、ウシ血清アルブミンから分析される例示的および最も好適なシグナルは、以下の質量シグナルおよび／またはモノサッカライド蘇生異物を具える：
1419   NeuGcHex3HexNAc3
1581   NeuGcHex4HexNAc3
1946   NeuGcHex5HexNAc3
2237   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4
2253   NeuGc2Hex5HexNAc4
2383   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4dHex
2399   NeuGc2Hex5HexNAc4dHex
2528   NeuGcNeuAc2Hex5HexNAc4
2544   NeuGc2NeuAcHex5HexNAc4
【０１７６】
市販の抗体調製
Ｏ−アセチル化ＮｅｕＮＡｃ残基をみつけた。本発明は、好適な実施例において、抗体からのＮ−グリカンを具えるＮｅｕＡｃ−ＯＡｃを分析することに関する。本発明は、特に、以下のモノサッカライド組成物のジシアリル化抗体の分析に関する。これらの組成物は、１、２または４Ｏ−アセチル基を具える二分岐Ｎ−グリカンに対応する。Ｏ−アセチル構造は、抗原であると考えられ、さらに、例えば、治療または診断用途における血清レクチンなど、シアル酸結合レクチンとの干渉など、グリカンの他の生物学的活性に影響を与えることもある。従って、本発明は、抗体などの市販のタンパク質からのグリカンを具えるＮｅｕ−ＯＡｃの分析に関する。
【０１７７】
本発明は、特に、組成物：
ＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４Ａｃｎ
に関し、ｎは１−４、好ましくは、１，２または４の整数であり、以下のように示される：
2263   NeuAc2Hex5HexNAc4Ac (NeuAcHex4HexNAc5dHex2)
2305   NeuAc2Hex5HexNAc4Ac2
2389   NeuAc2Hex5HexNAc4Ac4
【０１７８】
トランスフェリン、ウシ血清
市販のウシ血清転移（ＮｅｕＧｃ−グリカンを具える）の文脈において分析される特徴的なグリカンシグナル（構造）に関するモノサッカライド組成物は、式：
ＮｅｕＧｃｎ１ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５、
によるシグナルを具え、
ｎ１は、１または２であり、
ｎ２は、０、１または２であり、
ｎ３は、３−６の値を有する整数であり；
ｎ４は、３−４の値を有する整数であり、
ｎ５は、０−２の値を有する整数であり、好適な組成物の例を下に列挙する。これらの組成物は、以下に示す市販の血清代替品と極めて類似している。
【０１７９】
動物血清トランスフェリン、好ましくは、ウシ血清トランスフェリンから分析されるべき例示的および最も好適なシグナルは、以下の質量シグナルおよび／またはモノサッカライド組成物を具える：
1419   NeuGcHex3HexNAc3
1581   NeuGcHex4HexNAc3
1784   NeuGcHex4HexNAc4
1946   NeuGcHex5HexNAc3
2092   NeuGcHex5HexNAc4dHex
2237   NeuGcNeuNAcHex5HexNAc4
2253   NeuGc2Hex5HexNAc4
2254   NeuGcHex6HexNAc4dHex
2383   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4dHex
2399   NeuGc2Hex5HexNAc4dHex
2528   NeuGcNeuAc2Hex5HexNAc4
2529   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4dHex2
2544   NeuGc2NeuAcHex5HexNAc4
2545   NeuGcNeuAcHex6HexNAc4dHex
【０１８０】
本発明は、ウシ血清タンパク質、好ましくは、ウシ血清トランスフェリンなど、個々の動物糖タンパク質の定量的組成物において個々の変化があることを明らかにした。判定されるべき好ましい変数は、相対的量のシアリル化グルカンおよび中性グリカン、および／または、モノシアリル化グルカンと、マルチシアリル化グリカン、好ましくは、ジシアリル化グリカンとの関連性；および／または非フコシル化グリカンと、モノおよび／またはマルチフコシル化グリカンと、の比；および／または、モノフコシル化グリカンと、マルチフコシル化グリカンと、の比、である。定量的組成物は、個々のピーク、好ましくは、ピーク強度として測定されたピークの組成物の相対量を意味する。本発明は、特に、動物タンパク質から単離したグリコームの定量的組成物、および、これらの組成物の定量的組成物の決定に関する。
【０１８１】
ウマ血清
ウマ血清タイプ材料の文脈において、特徴的グリカンシグナル（構造）についてのモノサッカライド組成物は、式：
ＮｅｕＧｃｎ１ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５Ａｃｎ６、
によるものであり、
ｎ１は、０、１または２であり、
ｎ２は、０、１または２であり、
ｎ３は、値が３−５、好ましくは３，５または６の整数であり、
ｎ４は、値が３−５の整数であり、
ｎ５は、値が０または１の整数であり、
ｎ６は、０、１または２の整数である。
2092   NeuGcHex5HexNAc4dHex (NeuAcHex6HexNAc4)
2237   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4
2238   NeuGcHex5HexNAc4dHex2 (NeuAcHex6HexNAc4dHex)
2254   NeuGcHex6HexNAc4dHex (NeuAcHex7HexNAc4)
2399   NeuGc2Hex5HexNAc4dHex
【０１８２】
ＮｅｕＧｃｎ１ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５Ａｃｎ６、
ｎ１は、１または２であり、
ｎ２は、０または１であり、
ｎ３は、値が３−５、好ましくは３，５または６の整数であり、
ｎ４は、値が３−５の整数であり、
ｎ５は、値が０または１の整数であり、
ｎ６は、０の整数であり、好適な組成物の例は、上述のものを含む。
1445   NeuAcHex3HexNAc3Ac
1972   NeuAcHex5HexNAc4Ac
2263   NeuAc2Hex5HexNAc4Ac
2305   NeuAc2Hex5HexNAc4Ac2
2321   NeuAcHex5HexNAc5dHexAc
2409   NeuAc2Hex5HexNAc4dHexAc
2451   NeuAc2Hex5HexNAc4dHexAc2
2483   NeuAcHex6HexNAc5dHexAc
2467   NeuAcHex5HexNAc5dHex2Ac
【０１８３】
Ｏ−アセチル化シアル酸（ＮｅｕＡｃ）に対応するように分析される好適なアセチル化配列は、式
（ＮｅｕＧｃｎ１）ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５Ａｃｎ６、
ｎ１は、０、配列は、部分的に全てのＮｅｕＮＡｃを具え；
ｎ２は、０または１であり、
ｎ３は、値が３−５、好ましくは３，５または６の整数であり、
ｎ４は、値が３−５の整数であり、
ｎ５は、値が０、１または２の整数であり、
ｎ６は、０、１または２の整数であり、好適な組成物の例は、上述のものを含む。
【０１８４】
３．分析される細胞培養培地
市販の血清置換細胞培養培地
市販の血清置換細胞培養培地（ＮｅｕＧｃ−グリカンを具える）の文脈において分析されるモノサッカライド組成物は、式：
ＮｅｕＧｃｎ１ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５、
によるシグナルを具える。
ｎ１は、０、１または２であり、好ましくは、１または２であり；
ｎ２は、０または１であり、
ｎ３は、値が３−７、好ましくは、３−６の整数であり、
ｎ４は、値が３−５の整数であり、
ｎ５は、値が０−３の整数である。
1419   NeuGcHex3HexNAc3
1581   NeuGcHex4HexNAc3
1727   NeuGcHex4HexNAc3dHex
1743   NeuGcHex5HexNAc3
1784   NeuGcHex4HexNAc4
1946   NeuGcHex5HexNAc3
2092   NeuGcHex5HexNAc4dHex
2237   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4
2238   NeuGcHex5HexNAc4dHex2
2253   NeuGc2Hex5HexNAc4
2254   NeuGcHex6HexNAc4dHex
2383   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4dHex
2384   NeuGcHex5HexNAc4dHex3
2399   NeuGc2Hex5HexNAc4dHex
2528   NeuGcNeuAc2Hex5HexNAc4
2529   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4dHex2
2544   NeuGc2NeuAcHex5HexNAc4
2545   NeuGcNeuAcHex6HexNAc4dHex
2560   NeuGc3Hex5HexNAc4
2602   NeuGcNeuAcHex6HexNAc5
2603   NeuGcHex6HexNAc5dHex2 (NeuAcHex7HexNAc5dHex)
【０１８５】
ＦＢＳ含有細胞培養培地
ウシ胎児血清の文脈において分析される特徴的なグリカンシグナル（構造）についてのモノサッカライド組成物は、式：
ＮｅｕＧｃｎ１ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５、
によるシグナルを具える。
ｎ１は、０、１または２であり、
ｎ２は、０、１または２であり、
ｎ３は、１、または４−６の整数であり、
ｎ４は、０、１または２の整数であり、
ｎ５は、０または１の整数であり、好適な組成物は、上述のものを含む。
【０１８６】
本発明は、ｍ／ｚ１０３８、ＮｅｕＧｃＨｅｘＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ、および、１３２９、ＮｅｕＧｃＮｅｕＡｃＨｅｘＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘでの通常でないシグナルの存在を分析することに関し、さらに、本発明は、好ましくは、特異的グリコシダーゼ試薬および／またはフラグメンテーション質量分析および／またはＮＭＲ分光測定による、特にＦＢＳなどウシ血清からの上記構造の分析に関する。
1038   NeuGcHexHexNAc2dHex
1329   NeuGcNeuAcHexHexNAc2dHex
1727   NeuGcHex4HexNAc3dHex
1946   NeuGcHex5HexNAc3
2092   NeuGcHex5HexNAc4dHex
2237   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4
2238   NeuGcHex5HexNAc4dHex2
2253   NeuGc2Hex5HexNAc4
2254   NeuGcHex6HexNAc4dHex
2366   NeuGcNeuAc2Hex4HexNAc4
2383   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4dHex
2409   NeuAc2Hex5HexNAc4dHexAc 2528 NeuGcNeuAc2Hex5HexNAc4
2529   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4dHex2
2544   NeuGc2NeuAcHex5HexNAc4
2602   NeuGcNeuAcHex6HexNAc5
2618   NeuGc2Hex6HexNAc5
2674   NeuGcNeuAc2Hex5HexNAc4dHex
2893   NeuGcNeuAc2Hex6HexNAc5
【０１８７】
ウマ血清含有細胞培養培地
細胞培養培地（ＮｅｕＧｃ−グリカンおよび／またはＮｅｕＮＡｃ−ＯＡｃ−グリカンを具える）ウマ血清の文脈において分析される特徴的なグリカンシグナル（構造）についてのモノサッカライド組成物は、式：
（ＮｅｕＧｃｎ１）ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５Ａｃｎ６、
により、
ｎ１は、０、１または２であり、
ｎ２は、０、１または２であり、
ｎ３は、値が３−６、好ましくは３、５または６の整数であり、
ｎ４は、値が３−５の整数であり、
ｎ５は、値が０または１の整数であり、
ｎ６は、整数０、１または２である。
1581   NeuGcHex4HexNAc3
1711   NeuGcHex3HexNAc3dHex2
1727   NeuGcHex4HexNAc3
1873   NeuGcHex4HexNAc3dHex2
1946   NeuGcHex5HexNAc3
2092   NeuGcHex5HexNAc4dHex
2237   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4
2238   NeuGcHex5HexNAc4dHex2
2310   NeuGcNeuAcHex4HexNAc3dHex3
2366   NeuGcNeuAc2Hex4HexNAc4
2383   NeuGcNeuAcHex5HexNAc4dHex
2384   NeuGcHex5HexNAc4dHex3
2399   NeuGc2Hex5HexNAc4dHex
【０１８８】
グリカンを具えるＮｅｕＧｃの好適なサブグループは、
ＮｅｕＧｃｎ１ＮｅｕＮＡｃｎ２Ｈｅｘｎ３ＨｅｘＮＡｃｎ４ｄＨｅｘｎ５Ａｃｎ６、
を具え、
ｎ１は、１または２であり、
ｎ２は、０、１または２であり、
ｎ３は、値が３−５の整数であり、
ｎ４は、値が３または４の整数であり、
ｎ５は、値が０−４の整数であり、
ｎ６は、整数０である。
【０１８９】
ウマ血清含有培地は、既に列挙したウマ血清シグナルに加えて、シグナル２３１０、２３６６、２３８３および２３８４を有し、ｍ／ｚ２２５４でのシグナルを欠いている。これらは、動物タンパク質材料間、特に、ウマ由来材料間の比較における特徴的シグナル／成分分化として考えられる。
1972   NeuAcHex5HexNAc4Ac
2263   NeuAc2Hex5HexNAc4Ac
2305   NeuAc2Hex5HexNAc4Ac2
2321   NeuAcHex5HexNAc5dHexAc
2409   NeuAc2Hex5HexNAc4dHexAc
2483   NeuAcHex6HexNAc5dHexAc
【０１９０】
ウシ血清由来細胞培養培地は、グリカン構造を具えるより多くのＮｅｕＧｃと、上記のウマ血清サンプルと比較して、ｍ／ｚ１４４５、２４５１および２４６７のピークを欠く、より少ないＮｅｕＮＡｃ−ＯＡｃ構造を含むことに留意されたい。これらは、動物タンパク質材料、特に、ウマ由来材料間での比較において、特徴的なシグナル／成分分化として考えられる。
【０１９１】
本発明は、細胞培養に使用する血清タンパク質など、動物由来細胞培養材料の変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）分析に関し、動物タンパク質材料、特に、動物由来細胞培養材料または上記材料に対する適正に関して最もよく検査される材料間における差異に関する分析のためのモノサッカライド組成物および／または特徴的シグナルの使用に関する。本発明は、サンプル材料の供給源であるか、あるいは、サンプルを作成する同一種内の個々の動物に関連した変化、および、動物種間の変化に関する。好適な実施例においては、本発明は、発現したグリカンを分析することによる、タンパク質の供給源（血清などの組織タイプ、個々の動物、動物系統または動物種）の認識に関する。
【０１９２】
好適な実施例においては、本発明は、分析、好ましくは、サンプル材料中のＯ−アセチル化シアル酸の有無またはレベルの分析、および／または、分析、好ましくは、ＮｅｕＧｃシアル酸の有無またはレベルの分析、および／または、各種シグナル／モノサッカライド組成物／構造分化動物タンパク質サンプルの存在の分析に関する。本発明は、特に、Ｏ−アセチル化シアル酸およびＮｅｕＧｃの同時分析、好ましくは、特異的結合タンパク質など、特異的結合分子による、あるいは、より好ましくは、ＮＭＲおよび／または質量分析計、最も好ましくは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計による、Ｏ−アセチル化シアル酸およびＮｅｕＧｃの同時分析に関する。
【０１９３】
フラグメンテーション質量分析：臍帯血ＣＤ１３３＋細胞から単離したシアリル化Ｎ−グリカンのサンプルを、質量分析フラグメンテーション分析にかけた。ｍ／ｚ２２６１［Ｍ＋Ｎａ］＋および２３０５［Ｍ−２Ｈ＋３Ｎａ］＋２つの異なるナトリウム添加物シグナルをフラグメンテーション用に選択した。提案されるフラグメンテーションとともに、ｍ／ｚ２３０５．５０（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ２３０５．７３）での［Ｍ−２Ｈ＋３Ｎａ］＋イオンのフラグメンテーションスペクトルは、図２に示される。イオン［ＮｅｕＡｃＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４−Ｈ＋２Ｎａ］＋（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ１９７６．６６）に対応するｍ／ｚ１９７５．７６、イオン［ＮｅｕＧｃＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４−Ｈ＋２Ｎａ］＋（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ１９９２．６５）に対応するｍ／ｚ１９９１．９７、および、イオン［Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４＋２Ｎａ］＋（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ１６６３．５８）に対応するｍ／ｚ１６６２．５６、でのグリカンシグナルは、もともとのＮ−グリカンイオンにおいて、１つのＮ−グリコリルノイラミン酸ナトリウム塩残基（ＭＮｅｕＧｃ−Ｈ＋Ｎａ＝３２９）、および、１つのＮ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩残基（ＭＮｅｕＡｃ−Ｈ＋Ｎａ＝３１３）の存在を示唆する。ｍ／ｚ２２６１．８６（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ２２６１．７７）での［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンのフラグメンテーションスペクトルは、同様の結果を出し、イオン［ＮｅｕＡｃＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４＋Ｎａ］＋（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ１９５４．６８）に対応するｍ／ｚ１９５４．４５、［ＮｅｕＧｃＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４＋Ｎａ］＋（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ１９７０．６７）に対応するｍ／ｚ１９６９．９３、および、［Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４＋Ｎａ］＋（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ１６６３．５８）に対応するｍ／ｚ１６６４．８２での、得られたフラグメントシグナルは、同様に、もともとのＮ−グリカンイオンにおいて、１つのＮ−グリコリルノイラミン酸残基（ＭＮｅｕＧｃ＝３０７）および１つのＮ−アセチルノイラミン酸残基（ＭＮｅｕＡｃ＝２９１）の存在を示唆する。結論としては、フラグメンテーション分析は、陽イオンモードスペクトルにおいて、ｍ／ｚ２２６１および２３０５でのグリカンシグナルは、ＮｅｕＡｃＮｅｕＧｃＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４の［Ｍ＋Ｎａ］＋および［Ｍ−２Ｈ＋３Ｎａ］＋イオンにそれぞれ対応し、陰イオンモードスペクトルにおいては、ｍ／ｚ２２３７でのグリカンシグナルは、ＮｅｕＡｃＮｅｕＧｃＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４の［Ｍ−Ｈ］−イオンに対応することを示唆する。
【０１９４】
シアル酸分析：上述したように、質量分析プロファイリング分析は、各種細胞サンプルおよび生物学的試薬におけるＮｅｕ５Ｇｃの存在を示唆する。市販のウシトランスフェリンのシアル酸組成物は、実験工程下で開示されるように分析した。この分析は、サンプルが、Ｎｅｕ５ＧｃおよびＮｅｕ５Ａｃをほぼ５０：５０の比で含んでいたことを示した。この結果は、質量分析プロファイリングに部分的に類似しており、このプロファイリングは、検出したグリカンシグナルおよびそれらの相対的シグナル強度からなる提案されたモノサッカライド組成物から計算されるように、シアリル化Ｎ−グリカンが、５３：４７の比でＮｅｕ５ＧｃおよびＮｅｕ５Ａｃを含む同一サンプルから単離されることを示唆している。しかしながら、このＮｅｕ５Ｇｃ：Ｎｅｕ５Ａｃ組成物は、個々の糖タンパク質バッチがそのシアル酸組成物に関して互いに異なる可能性のあることを示唆している、ウシ血清トランスフェリンシアル酸分析結果に関する初期のリポート（例えば、６４：３６、Ｒｏｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）とは大きく異なっていた。
【０１９５】
実験例２．臍帯血単核細胞および白血球集団、ならびに、骨髄間葉幹細胞のシアル酸リンク分析
【０１９６】
実験工程
臍帯血細胞集団からのＮ−グリカンの単離：上述したように、ヒト臍帯血単核細胞を単離し、ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞集団に分けた。上述のように、Ｎ−リンクグリカンを細胞糖タンパク質から分離して、質量分析計により分析した。
【０１９７】
α２，３−シアリダーゼ分解：既に基本的に開示されているように（Ｓａａｒｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、シアリル化Ｎ−グリカンを、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅα２，３−シアリダーゼ（Ｇｌｙｋｏ，ＵＫ）で処理した。シアル酸リンク特異性を、並行制御反応において、合成オリゴサッカライドで制御し、これらの反応条件において、酵素がα２，３−リンクであって、α２，６−リンクではない、シアル酸を加水分解したことがわかった。この酵素反応後、グリカンを生成し、シアリル化フラクションおよび非シアリル化フラクションに分け、上述したように質量分析計で分析した。
【０１９８】
レクチン染色：ＦＩＴＣラベルＭａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＭＡＡ）をＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ（ＵＳＡ）から購入し、ＦＩＴＣラベルＳａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＮＡ）をＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＫ）から購入した。骨髄由来間葉幹細胞株を上述のように培養した。培養後、細胞をＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１４０ｍＭ  Ｎａｃｌ）で５回リンス、室温で１０分間、ｐＨ７．２の４％ＰＢＳ緩衝リン酸ナトリウムで固定し、非特異的結合部位を室温で３０分間、３％ＨＳＡ−ＰＢＳ（ＦＲＣ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｆｉｎｌａｎｄ）または３％ＢＳＡ−ＰＢＳ（＞９９％の純粋ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）でブロックした。製造者の指示書に従い、レクチン培養前に、細胞をＰＢＳ、ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ、１０ｍＭ  Ｃａｃｌ２）または（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で２回洗浄した。ＦＩＴＣラベルレクチンを１％ＨＳＡまたは１％ＢＳＡに希釈して、室温、暗所で６０分間細胞を培養した。さらに、細胞を１０分間、ＰＢＳ／ＴＢＳ／ＨＥＰＥＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ染料（Ｖｅｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）に封入した。レクチン染色を、ＦＩＴＣおよびＤＡＰＩフィルタを用いてＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ２プラス−経口顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。画像をＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｃ−カメラ、および、倍率４００ＸのＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅ３．１／４．０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で撮像した。
【０１９９】
結果
【０２００】
臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞Ｎ−グリカンの質量分析：シアリル化Ｎ−グリカンを臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞フラクションから単離し、以下の実験工程で開示されるように、個々のＮ−グリカンシグナルの相対的定量化を可能とするＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計によって分析した。
【０２０１】
臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞Ｎ−グリカンは、異なるα２，３−シアリル化である：実験工程下で開示されるように、臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞のシアリル化Ｎ−グリカンをα２，３−シアリダーゼで処理し、その後、得られたグリカンをシアリル化フラクションおよび非シアリル化フラクションに分ける。α２，３−シアリダーゼ耐性および感受性シアリル化Ｎ−グリカンの両方が観察された。すなわち、シアリダーゼ処置後、シアリル化グリカンは、シアリル化Ｎ−グリカンフラクションで観察され、脱シアリル化（ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）グリカンは、中性Ｎ−グリカンフラクションで観察された。これらの結果は、臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞は、異なるように、α２，３−シアリル化されていることを示している。例えば、α２，３−シアリダーゼ処置後、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１の［Ｍ−Ｈ］−イオンに対応する、ｍ／ｚ２０７６でのモノシアリル化（ＳＡ１）グリカンシグナルと、ＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１の［Ｍ−Ｈ］−に対応する、ｍ／ｚ２３６７でのジシアリル化（ＳＡ２）グリカンシグナルと、の相対比率は、α２，３−シアリダーゼ耐性モノシアリル化Ｎ−グリカンと比較するとき（図４）、α２，３−シアリダーゼ耐性ジアリル化Ｎ−グリカンは、ＣＤ１３３＋細胞中よりもＣＤ１３３−細胞中の方が、相対的により多いことを示している。これにより、特に、α２，６−シアリレーションを含む他のシアル酸リンクとの関連するＮ−グリカンα２，３−シアリレーションが、臍帯血中のＣＤ１３３−細胞よりもＣＤ１３３＋細胞でより多くあることが結論づけられる。
【０２０２】
臍帯血細胞ＣＤ１３３−細胞において、α２，３−シアリダーゼ処置に耐性のあるいくつかのシアリル化Ｎ−グリカンが観察された。すなわち、もともとのシアリル化グリカンの脱シアリル化形態に対応する可能性のある天然のグリカンは、観察されなかった。表２に開示されているこれらの結果は、臍帯血ＣＤ１３３＋細胞とＣＤ１３３−細胞と間の個々のＮ−グリカン構造の異なるα２，３−シアリレーションを明らかにした。これらの結果は、他のシアル酸リンクに関連したＮ−グリカンα２，３−シアリレーションが、臍帯血ＣＤ１３３−細胞よりもＣＤ１３３＋細胞の方が多いことを示唆している。
【０２０３】
間葉幹細胞のレクチン結合分析：実験工程で開示されるように、骨髄由来間葉間細胞を、その表面上のα２，３−リンクシアル酸特異的レクチン（ＭＡＡ）、および、α２，６−リンクシアル酸特異的レクチン（ＳＮＡ）のリガンドの存在について分析した。ＭＡＡが強力にこれらの細胞に結合する一方で、ＳＮＡの結合は弱いことがわかり、このことは、細胞培養条件において、上記細胞が、その表面グリココンジュゲート上で、α２，６−リンクシアル酸よりもα２，３−リンクシアル酸を明らかにより多く有していたことを示唆する。
【０２０４】
実験例３．細胞表面グリカン構造の酵素修飾
実験工程
酵素修飾：シアリルトランスフェラーゼ反応：ヒト臍帯血単核細胞（３×１０６細胞）を６０ｍＵのα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（ラット、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのリコンビナント、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５０ｍＭの３−モルフォリノプロパンスルホン酸ナトリウム（ＭＯＰＳ）緩衝液ｐＨ７．４の１．６μｍｏｌ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、総量１００μｌとなる１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、最大１２時間、修飾した。フコシルトランスフェラーゼ反応：ヒト臍帯血単核細胞（３×１０６細胞）を４ｍＵ  α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ヒト、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａリコンビナント、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．２中の１μｍｏｌ  ＧＤＰ−Ｆｕｃ、総量１００μｌとなる１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、最大３時間修飾した。広域シアリダーゼ反応：ヒト臍帯血単核細胞（３×１０６細胞）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５の５ｍＵシアリダーゼ（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｇｌｙｋｏ、ＵＫ）、総量１００μｌとなる１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、最大１２時間、修飾した。α２，３−特異的シアリダーゼ反応：細胞を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中のα２，３−シアリダーゼ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉリコンビナント）、総量１００μｌとなる１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて修飾した。連続酵素修飾：連続する反応間において、細胞を遠心分離でペレット化して、上澄み液を捨てて、その後、適宜な緩衝液および基質溶液中の次の修飾酵素を、上述のように、細胞に加えた。洗浄工程：修飾後、細胞をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。
【０２０５】
グリカン分析：細胞を洗浄後、全ての細胞性糖タンパク質を、Ｎ−グリコシダーゼ分解にかけ、シアリル化および中性Ｎ−グリカンを単離し、上述したように、質量分析計で分析した。Ｏ−グリカン分析に関して、基本的に既に開示されているように（Ｎｙｍａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、糖タンパク質をアルカリβ脱離（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）の還元にかけ、その後、シアリル化および中性グリカンアルジトールフラクションを単離し、上述したように、質量分析計によって分析した。
【０２０６】
グリコシルトランスフェラーゼ／グリコシルトランスフェラーゼによってリモデリングされたグリカン
本発明は、以下のステップを含むプロセスによって生成される特異的グリカン制御試薬に更に関し、上記プロセスは、
１）本発明によって開示されるように、選択的に、グリカン構造を部分的に欠損させるステップ。部分的に欠損したグリカン構造は、グループ２のグリカン欠損試薬または原核生物からのグリコシル化タンパク質に関して記載した非動物構造でもよい。
２）許容されるグリカン、または、非有害グリカンを試薬のグリカンに転移させるステップ。上記プロセスは、所定の治療用タンパク質に関する糖タンパク質リモデリングとして周知であり、本発明者らは、細胞培養プロセスにおいて特異的試薬についてのプロセスをリモデリングする必要があることを明らかにした。
を具える。さらに、本発明者らは、転移反応を潜在的に阻害するいくつかの因子を含む血清全体について、グリカン欠損および／または大部分の糖タンパク質混合物のリモデリングを示すことができた。
【０２０７】
結果
シアリダーゼ分解：例えば、Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ３、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ０−２、およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ０−１モノサッカライド生物である、天然のＮ−グリカン構造に対応する相対量の増加によって示されるように（表５）、生きている臍帯血単核細胞の広域シアリダーゼ触媒化脱シアリレーションに際し、シアリル化Ｎ−グリカン構造、ならびに、Ｏ−グリカン構造を脱シアリル化した（データ示さず）。一般的に、シアル酸残基のより少ないグリカン構造へのグリコシレーションプロファイルのシフトは、広域シアリダーゼ処理に際し、シアリル化Ｎ−グリカン分析で観察された。上記反応に際した細胞のグリカンプロファイルのシフトは、反応結果を特徴付ける有効な手段として役立つ。結果として、得られた修飾細胞は、上記反応後、その細胞表面に、より少ないシアル酸残基と、より多い末端ガラクトース残基と、を含んでいた。
【０２０８】
α２，３−特異的シアリダーゼ分解：同様に、生きている単核細胞のα２，３−特異的シアリダーゼ触媒化脱シアリレーションに際し、対応する天然のＮ−グリカン構造の相対量の増加によって示されるように、（データ示さず）シアリル化Ｎ−グリカン構造を脱シアリル化した。一般的に、シアル酸残基の少ないグリカン構造へのグリコシレーションプロファイルのシフトは、α２，３−特異的シアリダーゼ処置に際し、シアリル化Ｎ−グリカン分析で観察される。上記反応の際、細胞のグリカンプロファイルシフトは、反応結果を特徴付ける有効な手段として機能する。結果として、得られた修飾細胞は、反応後、それらの表面で、α２，３−リンクシアル酸残基が少なく、末端ガラクトース残基がより多かった。
【０２０９】
シアリルトランスフェラーゼ反応：生きている臍帯血単核細胞のα２，３−シアリルトランスフェラーゼ触媒シアリレーションに際し、中性Ｎ−グリカン構造（表５のＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ０−３およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ０−２モノサッカライド組成物）の相対量の減少、および、対応するシアリル化構造（例えば、表４のＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１グリカン）の増大、によって示唆されるように、多数の中性Ｎ−グリカン構造（表５）およびシアリル化Ｎ−グリカン構造（表４）、ならびに、Ｏ−グリカン構造をシアリル化した。一般的に、シアル酸残基の多いグリカン構造へのグリコシレーションプロファイルのシフトは、Ｎ−グリカンおよびＯ−グリカン分析の双方で観察された。結果として、得られた細胞は、上記反応後、それらの表面で、α２，３−リンクシアル酸残基がより多く、末端ガラクトース残基がより少ない。
【０２１０】
フコシルトランスフェラーゼ反応：生きている臍帯血単核細胞のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ触媒フコシレーションに際し、非フコシル化グリカン構造の相対量の減少（提案されたモノサッカライド組成物においてｄＨｅｘがない）、および、対応するフコシル化構造における増加（提案されたモノサッカライド組成物中のｎｄＨｅｘ＞０）、によって示されるように、多数の中性（表５）およびシアリル化Ｎ−グリカン構造、ならびに、Ｏ−グリカン構造（下記参照）をフコシル化した。例えば、フコシル化前に、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２アルジトール［Ｍ＋Ｎａ］＋ｉｏｎに対応する、ｍ／ｚ７７３、および、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１アルジトールの［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに対応するｍ／ｚ９１９、でのＯ−グリカンアルジトールシグナルは、それぞれに関する相対比率が、約９：１であったことが観察された（データ示さず）。フコシレーション後、相対比率は、約３：１となり、このことは、中性Ｏ−グリカンに重要なフコシレーションが生じていたことを示唆している。いくつかのフコシル化Ｎ−グリカン構造は、例えば、提案する構造Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ２を有する中性Ｎ−グリカン（表５）など、もともとの細胞において観察されていなかった上記反応後も観察され、このことは、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応において、生きている細胞の細胞表面が、タンパク質リンクＮ−グリカンならびにＯ−グリカンにおける、特に、末端Ｌｅｗｉｓ ｘ エピトープなど、増大した量のまたは過剰構造タイプのフコシル化グリカンで修飾可能であることを示している。
【０２１１】
シアリルトランスフェラーゼ反応に続くシアリダーゼ分解：臍帯血単核細胞を、広域シアリダーゼ反応にかけ、その後、実験工程で記載されるように、α２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを同一反応に加えた。細胞のＮ−グリカンプロファイルについての上記反応シークエンスの結果を、図３に示す。シアリル化Ｎ−グリカンプロファイルをさらに、反応ステップ間で分析し、その結果は、シアル酸は、まず、シアリル化Ｎ−グリカンから取り除かれ（例えば、中性Ｎ−グリカン量が増大したことによって示唆される）、ついで、α２，３−リンクシアル酸残基によって置換される（例えば、新たに形成された中性Ｎ−グリカンの消失により示唆される）ことを明らかに示していた。結果として、得られた修飾細胞は、上記反応後、より多くのα２，３−リンクシアル酸残基を含んでいた。
【０２１２】
フコシルトランスフェラーゼ反応に続くシアリルトランスフェラーゼ反応：臍帯血単核細胞を、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応に欠け、その後、実験工程で記載されるように、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびＧＤＰ−フコースを同一反応に加えた。細胞のシアリル化Ｎ−グリカンプロファイルについての反応シークエンスの効果は、表４に示される。これらの結果は、グリカンシグナルの大部分（詳細は表３）は、相対強度において、変化したことを示し、このことは、細胞中に存在するシアリル化Ｎ−グリカンの大部分が、酵素の基質であったことを示している。また、明らかに、酵素反応のステップを組み合わせることで、反応ステップ単独のものとは異なる結果となった。
【０２１３】
上述したα１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応とは異なり、フコシレーション前のシアリレーションは、臍帯血単核細胞表面に存在する中性フコシルトランスフェラーゼアクセプタグリカン構造をシアリル化し、その結果、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応単独後にはあった、中性フコシル化Ｎ−グリカン構造の形成が検出されなかった。
【０２１４】
グリコシルトランスフェラーゼ由来グリカン構造：グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼ酵素が、修飾反応において細胞を汚染する可能性があることをみつけた。例えば、細胞を、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で産生されたリコンビナントフコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼ酵素で培養するとき、Ｎ−グリコシダーゼ、および、細胞性および細胞関連糖タンパク質の質量分析は、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１グリカン組成物の［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに対応する、ｍ／ｚ１０７９での豊富な中性Ｎ−グリカンシグナル（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ１０７９．３８）を検出した。通常、リコンビナントグリコシルトランスフェラーゼ処理した細胞において、このグリカンシグナルは、より豊富であるか、または、少なくとも細胞自体のグリカンシグナルと同等であり、このことは、昆虫由来グリココンジュゲートは、昆虫細胞において産生されるリコンビナントグリカン修飾酵素と関連した非常に強力な汚染源（ｐｏｔｅｎｔ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔ）であることを示唆している。さらに、このようなグリカン汚染は、細胞を洗浄した後でも残っていて、このことは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素に対応するまたは関連する昆虫タイプのグリココンジュゲートが、細胞に対するアフィニティを有するか、洗浄に対する耐性を有する傾向があることを示している。もともとのグリカンシグナルを確認するために、市販のリコンビナントフコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ酵素調製物のグリカン内容物を分析し、ｍ／ｚ１０７９グリカンシグナルは、これらの酵素と関連した主なＮ−グリカンシグナルだったことを発見した。対応するＮ−グリカン構造、例えば、Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃα３／６）ＧｌｃＮＡｃ（β−Ｎ−Ａｓｎ）は、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で産生される糖タンパク質として既に開示されている（Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｋｒｅｔｚｃｈｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋｕｂｅｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。文献に開示されているように、リコンビナント酵素または精製酵素で処理された細胞を潜在的に汚染するこれらのグリカン構造、ならびに、他のグリカン構造は、ヒトにおいて潜在的な免疫原となり、および／または、修飾細胞の使用に有害となる。結果として、グリカン修飾酵素は、抗原性グリカンエピトープ、非ヒトグリカン構造、および／または、潜在的に、望ましくない生物学的効果を有する他のグリカン構造を含まないように、特に、医療用など、ヒト細胞の修飾に関して、注意深く選択されなければならない。
【０２１５】
実験例４
グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ修飾細胞の安定性および培養特性の分析
ノイラミニダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼ（シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ）修飾細胞の安定性および培養特性を、Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００６）７，３０）に開示されるように、ＣＦＵ細胞培養アッセイおよび生存アッセイで分析した。本発明は、シアル酸レベルが量的に低減した修飾臍帯血単核細胞が、ＣＦＵ細胞培養アッセイにおいて、より多くのコロニーカウントを与えたことを明らかにした。本発明は、具体的には、血液細胞集団、特に、造血細胞の培養などの培養についての脱シアリル化造血細胞の使用に関する（表７）。
【０２１６】
実験例５
リンク特異的な脱シアリレーション
臍帯血からの造血幹細胞フラクションは、実験例３において示されるように、α３リンク特異的シアリダーゼで処理される。リンク特異的シアリダーゼによる脱シアリレーションにおける違いは、図５に示されるように、モノシアリル化およびジシアリル化グリカンのシグナルと比較することによって観察可能である。
【０２１７】
実験例６
グリカン制御酵素
昆虫細胞で産生される市販のシアリルまたはフコシルトランスフェラーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＣＡ）酵素のグリコシレーション酵素は、グリカンを放出すること、グリカンを精製すること、および、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（本発明者らによって２００５年７月１１日に出願された国際公開公報）によって制御される。αマンノシダーゼ、βマンノシダーゼ、α３またはα３／α６−フコシダーゼおよびヘキソサミニダーゼなど、（タチナタマメ（Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ）ヘキソサミニダーゼ）昆虫グリカンについて開示されているように、潜在的な昆虫タイプのアレルギー性グリカンが観察され、エキソグリコシダーゼ酵素によって放出された本発明者らによって２００５年７月１１日に出願された国際公開公報）。
【０２１８】
グリコシルトランスフェラーゼ由来グリカン構造：グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼ酵素が、修飾反応における細胞を汚染する可能性があることを発見した。例えば、細胞が、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａで産生されるリコンビナントフコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ酵素で培養されるとき、Ｎ−グリコシダーゼ、および、細胞性および／または細胞関連糖タンパク質の質量分析は、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１グリカン組成物の［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに対応する、ｍ／ｚ１０７９での豊富な中性Ｎ−グリカンシグナルを検出した（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ１０７９．３８）。通常、リコンビナントグリコシルトランスフェラーゼ処理細胞において、このようなグリカンシグナルは、より豊富であり、または、細胞自体のグリカンシグナルと少なくとも同等であり、このことは、昆虫由来グリココンジュゲートが、昆虫細胞で産生されるリコンビナントグリカン修飾酵素と関連した強力な汚染源であることを示している。さらに、このようなグリカン汚染は、細胞を洗浄した後でも残っており、このことは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素に対応する、または、関連した昆虫タイプのグリココンジュゲートは、細胞に対するアフィニティを有するか、あるいは、細胞から洗い落とされることに耐性があることを示している。もともとのグリカンシグナルを確認するために、市販のリコンビナントフコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ酵素調製物のグリカン内容物を分析し、ｍ／ｚ１０７９グリカンシグナルは、上記酵素に関連した主なＮ−グリカンシグナルだったことがわかった。対応するＮ−グリカン構造、例えば、Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃα３／６）ＧｌｃＮＡｃ（β−Ｎ−Ａｓｎ）は、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で産生される糖タンパク質として既に開示されている（Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｋｒｅｔｚｃｈｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋｕｂｅｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。文献に開示されているように、これらのグリカン構造、および、リコンビナント酵素または精製酵素、特に、昆虫由来の生成物で処理された待望を潜在的に汚染する他のグリカン構造は、ヒトにおける潜在的な免疫原となり、および／または、修飾細胞の使用に有害となる。結果として、グリカン修飾酵素は、免疫原性グリカンエピトープ、非ヒトグリカン構造、および／または、望まない生物学的効果を潜在的に有する他のグリカン構造を含まないように、特に治療用途など、ヒト細胞の修飾に関して注意深く選択されなければならなく、あるいは、好適な実施例においては、グリカン構造は、取り除かれるか、あるいは、有害でないグリカンに分解される。
【０２１９】
実験例７
タグ付き酵素の使用
ノイラミニダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼ酵素は、Ｐｉｅｒｃｅのカタログに記載されるようにビオチン化される。ビオチン化されたノイラミニダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼ酵素は、単核血液細胞で培養され、本発明において開示されるように、細胞性グリコシレーションをリモデルする。ノイラミン酸および／またはシアリルトランスフェラーゼアクセプタ（Ｎ−アセチルラクトースアミンまたはラクトース）が選択的に存在する中で、この酵素は、（ストレプト）アビジン磁気ビーズ（例えば、ＭｉｌｔｅｎｙｉまたはＤｙｎａｌ）で除去される。
【０２２０】
実験例８．ＢＭ−ＭＳＣ細胞の修飾
材料および方法
細胞
骨髄（ＢＭ）由来間葉間細胞（ＭＳＣ）を、Ｌｅｓｋｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）によって開示されるように、取得した。初期培養構築後、ＢＭ−ＭＳＣ（＜継代１０）を、１０％ＦＣＳ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１０ｍｌ／ｌペニシリン／ストレプトマイシン、および、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを加えた最小限基本α培地（αＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）において、湿潤な５％二酸化炭素雰囲気、３７℃で培養した。
【０２２１】
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ酵素修飾
細胞溶媒を、剥離（ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）前に、さらに分析するために回収した。酵素修飾について、７０−８０％コンフルーエントなＢＭ−ＭＳＣを、３０分間、３７℃で、ＰＢＳ＋２ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ（Ｖｅｒｓｅｎｅ）で剥離させた。剥離した細胞を、Ｂｕｒｋｅｒチャンバで培養し、コントロール（０−）細胞を、冷たいＣａ２＋フリーＰＢＳで４回洗浄し、質量分析のために、−７０℃で細胞ペレットとして凍結した。全ての遠心分離ステップを、５分間、３００ｘｇで行った。１×１０６ＢＭ−ＭＳＣを、αＭＥＭおよび０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ＞＝９９％純度）からなる３００μｌの反応緩衝液に懸濁した。これらの酵素反応を、湿潤な５％二酸化炭素雰囲気、３７℃、２時間または４時間で、２４ウェル細胞培養プレートで行った。これらの反応は、培養中に３０分ごとに細胞を懸濁することによって、細胞培養皿への接着を制御した。制御反応は、２または４時間の間、反応緩衝液においてのみ、細胞を用いて同時におこなった。以下の酵素条件、１）５０ｍＵリコンビナントα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および１ｍｇのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ（ドナー）、２）１０ｍＵ（１／５）リコンビナントα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼおよび１ｍｇのＮｅｕ５Ａｃ、３）５０ｍＵリコンビナントα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼおよび０．２ｍｇの（１／５）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、および、４）５０ｍＵ不活性（５分間沸騰させ、氷に直接移した）リコンビナントα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼおよび１ｍｇのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃで、試験した。反応液に７５ｍＭラクトースを添加した過剰な（２ｍｌ）冷たいＣａ２＋フリーＰＢＳまたはＣａ２＋フリーＰＢＳを加えることによって、酵素反応を停止させた。細胞生存能力を、Ｔｒｙｐａｎブルー染色およびＢｕｒｋｅｒチャンバにおける顕微鏡分析によって判定した。これらの細胞を３００ ｘ ｇ、５分間遠心分離し、さらに３回洗浄を繰り返した。最後の洗浄後、これらの細胞を２つにわけ、半分の細胞を遠心分離によってペレット化して、さらに質量分析計でグリカン分析をするために−７０℃で凍結し、もう半分の細胞を続いてフローサイトメトリ−分析に使用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、基本的に（Ｈｅｍｍｏｒａｎｔａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）に開示されるように、Ｎ−グリコシダーゼＦ遊離Ｎ−グリカンについて行った。
【０２２２】
表面Ｎ−グリカン分析
いくつかのサンプルを、製造者に開示されているように、３０分間、４℃で、スルホスクシニミジル  ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプロピオネート（スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ）でラベルした。ラベリングは、５００μｌクエンチング溶液を加えることによって停止させ、過剰のトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で２回洗浄した。これらの細胞を、細胞ペレットとして−７０℃で凍結した。
【０２２３】
フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）
ＢＭ−ＭＳＣを、酵素反応後、フローサイトメトリ分析（ＦＡＣＳＡｒｉａ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって表現型化（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｄ）させた。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−シアニン（Ｃｙ）７とコンジュゲート化した、ＣＤ９０に対する抗ヒト抗体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ１０６、ＣＤ７３およびＨＬＡ−ＤＲに対する抗ヒト抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡから購入）を使用し、１％ＢＳＡを加えたＣａ２＋フリーＰＢＳで、反応につき１×１０５細胞を使用して、直接ラベルした。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析を行った。
【０２２４】
結果
細胞の生存能力は、試験した異なる条件間においては、違いはなく、このことは、細胞の生存能力は、酵素修飾反応によって影響を受けなかったことを示唆している。さらに、免疫性表現型（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、酵素修飾中に変化せず、これらの細胞は、一定して、ＣＤ９０およびＣＤ７３に強力にポジティブであり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４およびＣＤ１９に対してネガティブ（もしくは、弱いポジティブ）であった。酵素修飾は、使用したＢＭ−ＭＳＣのＨＬＡ−ＤＲ発現を変化させなかった。これらの結果は、下記の表８に示す。
【０２２５】
シアリルトランスフェラーゼを用いた細胞性グリカン修飾
この反応においては、細胞表面末端Ｎ−アセチルラクトースアミンユニットを、以下のＮ−グリカン構造分析によって示されるように、シアリル化した。反応効率および末端ＬＮ修飾レベルは、前述の実験に記載されるように、中性Ｎ−グリカンフラクションのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析プロファイリングによって追跡した。３つのグリカンシグナルを、反応レベルの指標として、すなわち、ｍ／ｚ１６２２（報告された１つの末端ＬＮユニットとともに、ハイブリッドタイプＮ−グリカンＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ３  Ｎａ−添加物シグナルに対応する）、ｍ／ｚ１６６３（報告された２つの末端ＬＮユニットとともに、複合体タイプＮ−グリカンＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４のＮａ−添加物シグナルに対応する）、および、ｍ／ｚ２０２８（報告された３つの末端ＬＮユニットとともに、複合体タイプＮ−グリカンＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５のＮａ−添加物シグナルに対応する）で、使用した。これらの３つの指標シグナルは、全体のシアリレーションレベル変化に対する良い指標であった。以下の表においては、反応レベルは、式：
１００％−１００％＊（Ｉ１６２２＋Ｉ１６６３＋Ｉ２０２８）ａ／（Ｉ１６２２＋Ｉ１６６３＋Ｉ２０２８）ｂ
で計算され、Ｉｘは、グリカンシグナル×（総グリカンプロファイルの％）の相対比率であり、ａは、酵素反応後のシグナルを示し、Ｂは、コントロール反応を示す。分子からのシアル酸の消失は、シアリレーションレベルの上昇を示し、これは、反応中、中性グリカンプロファイルから消失した末端ＬＮユニットとＮ−グリカンシグナルの比率（％）に対応する。
【０２２６】
ｍ／ｚ１２５７（コントロール、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ２高マンノースタイプＮ−グリカンのＮａ添加物に対応する）でのグリカンシグナルは、全ての条件において、５．７−６．８％の間にあり、修飾は特異的だったことを示している。
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【０２２７】
これらの結果は、
１）もともとの細胞（０％、参照）およびバッファコントロール（３％）の両方と比べるとき、熱不活性化酵素（５％反応レベル）との反応における無視できるほど低い反応レベルによって示唆されるように、外因性酵素が効率的な反応には必要である；しかしながら、低い反応は、ドナー基質ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（５％）を加えた不活性化酵素反応でみられた、
２）最も効率の高い反応レベルは、最適化反応条件において、ｃ．８０％（７９％）だった。
３）２時間の反応時間（７２％）は、４時間の反応時間（７９％）とほぼ同じ効率だったが、しかしながら、より長い反応時間は、より高い反応レベルを生成した、
４）より少ない量の酵素（１：５酵素）またはドナー基質（１：５ドナー）は、より低い反応効率となり（５９％および６４％、それぞれ）、最適化反応条件は、細胞表面ＬＮユニットを効率的に取り除くのに重要である;しかしながら、酵素量は、１：５ドナー濃度より高いドナー量よりも、反応効率に関してより重要だった、
ことを示した。
【０２２８】
細胞培養および反応媒体が同一方法で分析されるときで、ＬＮ基含有糖タンパク質組成物が、上記媒体に加えられるとき、酵素修飾の効率的な基質だったことをさらに発見し、従って、反応溶液に加えられる場合、細胞表面修飾と競合する。
【０２２９】
本発明による反応レベル（ＭＳＣを用いたα２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応）は、表５（α２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応、実験例３参照）におけるデータ、および、表４における個々のグリカンの対応する実質的により小さなユニット変化％、に関する同一の式によって計算される反応レベル（４５％）よりも十分に高い。
【０２３０】
昆虫由来酵素による汚染とその除去
Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１のナトリウム添加物イオンに対応するｍ／ｚ１０７９は、ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｉｄｉｃ昆虫Ｎ−グリカン／低−マンノースタイプヒトＮ−グリカンである。以下は、異なる反応／洗浄条件におけるｍ／ｚ１０７９グリカンシグナルの相対量の質量分析計測定値からの結果である。
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【０２３１】
これらの結果は、
１）ｍ／ｚ１０７９グリカンシグナルの低いベルは、外因性低マンノースＮ−グリカンによる、酵素を添加する前、細胞において存在していた（「緩衝液コントロール」条件において０．７５％相対量）、
２）全酵素量を用いた全て餌の半の条件は、昆虫由来グリカンでの汚染があった（「４時間の反応」、「不活性化酵素」、「１：５ドナー」条件におけるｃ．１．５％相対量）
３）加えた酵素の量が少ないと、汚染も少なかった（「１：５酵素」条件における１．１％相対量）
４）洗浄用緩衝液に含まれる７５ｍＭラクトースは、昆虫由来グリカン汚染を効率よく洗浄した（「洗浄ｏｐｔＡ」条件における０．８４％相対量）、および、
５）不完全な反応は、酵素汚染を上昇させる場合がある（「１：５ドナー」および「４時間反応」条件において、それぞれ、１．４７％対１．４５％）、
を示した。
【０２３２】
実験例９
タグ付きグリココンジュゲート酵素の生成
哺乳類グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ウシＧａｌＴ１）は、α−シアリダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼで処理した。発明者らの一部による特許出願、ＵＳ２００５０１４７１８に開示されるように（参照することで全体を組み込む）またはＱａｓａｂａおよびＲａｍａｋｒｉｓｈｍａｎおよびその共同研究者らによるＵＳ２００７２５８９８６（参照することで全体を組み込む）、または、Ｎｅｏｓｅのグリコペグリレーション特許に開示された方法を用いる（ＵＳ２００４１３２６４０、参照することで全体を組み込む）ことによって、変異体ガラクトシルトランスフェラーゼによって、ケトン修飾Ｇａｌを、ケトン修飾Ｇａｌ−ＵＤＰから、末端モノサッカライドＧｌｃＮＡｃ残基に転移させた。ケトンは、過剰なアミノ−オキシ−ビオチン（またはヒドラジド−ビオチン）で反応させた。
表１．幹細胞およびこれらの幹細胞から分化した細胞におけるＮ−グリコシルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）含有シアリル化Ｎ−グリカンの検出
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表２．臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞から、単離されたシアリル化Ｎ−グリカンについてのα２，３−シアリダーゼ処理のα２，３−シアリダーゼ処理の効果の違い。中性Ｎ−グリカンコラムは、列挙したシアリル化Ｎ−グリカンに対応する中性Ｎ−グリカンは、ＣＤ１３３＋細胞Ｎ−グリカンの分析に存在するが、ＣＤ１３３−細胞Ｎ−グリカンにはない。括弧の外に提案されたグリカン組成物は、ＣＤ１３３＋細胞シアリル化Ｎ−グリカンのα２，３−シアリダーゼ分解後、中性Ｎ−グリカンフラクションにおいて可視化できる。
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表３．臍帯血単核細胞シアリル化Ｎ−グリカンシグナル。ｍ／ｚ値は、［Ｍ−Ｈ］−イオンのモノ同位体質量を意味する。
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表４．ヒト臍帯血単核細胞のシークエンシャル酵素修飾ステップにおける、モノサッカライド組成物、ＮｅｕＡｃ１−２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ０−３、シアリル化Ｎ−グリカンの質量分析結果。カラムは、修飾反応前（ＭＮＣ）、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応後（α２，３ＳＡＴ）、および、シークエンシャルα２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応（α２，３ＳＡＴ＋α１，３ＦｕｃＴ）、の相対的グリカンシグナル強度を示す。各カラムにおけるグリカンシグナル強度の合計は、明りょう化のために１００％に対してノーマライズした。
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表５．ヒト臍帯血単核細胞の酵素修飾ステップにおける選択した中性Ｎ−グリカンの質量分析結果。カラムは、修飾反応前（ＭＮＣ）、広域シアリダーゼ反応後（ＳＡ’ｓｅ）、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応後（α２，３ＳＡＴ）、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応後（α１，３ＦｕｃＴ）、および、シークエンシャルα２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応後（α２，３ＳＡＴ＋α１，３ＦｕｃＴ）の相対グリカンシグナル強度（総グリカンシグナルの％）を示す。
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表６．ＮｅｕＧｃ含有またはＯ−アセチル化シアル酸含有グリカンおよびそれらの計算された同位体質量の提案されたモノサッカライド組成物。
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表７．ＭＮＣの生存および分化についてのフコシレーション、シアリレーションおよびノイラミニダーゼ効果
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表８．α２，３−シアリルトランスフェラーゼ酵素修飾語のＢＭ−ＭＳＣの生存および免疫表現型
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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