(57)【要約】【課題】計測環境によらず、アナライトの濃度を高精度に定量可能なセンシング方法及びセンシング装置を提供する。【解決手段】所定の定量時点ｔでの蛍光強度Ｆ（ｔ）を取得し、蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化量及び／又は環境温度θに応じて、蛍光強度Ｆ（ｔ）との関係からなる定常的な濃度定量則、及び、蛍光強度Ｆ（ｔ）とその時間微分項Ｆ’（ｔ）との関係からなる少なくとも１つの非定常的な濃度定量則の中から濃度定量則を１つ選択する。【選択図】図４
2014115076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライトと標識化合物との相互作用により蛍光強度が変化する性質を利用して、前記アナライトの濃度を定量・計測するセンシング方法であって、
所定の定量時点での蛍光強度を取得する取得ステップと、
取得された前記蛍光強度の時間変化量及び／又は環境温度に応じて、前記蛍光強度との関係からなる定常的な濃度定量則、及び、前記蛍光強度とその時間微分量との関係からなる少なくとも１つの非定常的な濃度定量則の中から濃度定量則を１つ選択する選択ステップと、
選択された前記濃度定量則に従って前記アナライトの濃度を定量する定量ステップと
を備えることを特徴とするセンシング方法。
【請求項２】
請求項１記載のセンシング方法において、
前記選択ステップでは、前記環境温度が第１閾値を超える場合に前記定常的な濃度定量則を選択し、前記環境温度が前記第１閾値を超えない場合に前記非定常的な濃度定量則を選択することを特徴とするセンシング方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のセンシング方法において、
前記選択ステップでは、前記蛍光強度の時間変化量が第２閾値を超えない場合に前記定常的な濃度定量則を選択し、前記蛍光強度の時間変化量が前記第２閾値を超える場合に前記非定常的な濃度定量則を選択することを特徴とするセンシング方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンシング方法において、
前記選択ステップでは、前記時間微分量の寄与度がそれぞれ異なる複数の非定常的な濃度定量則の中からさらに選択することを特徴とするセンシング方法。
【請求項５】
請求項４記載のセンシング方法において、
前記選択ステップでは、前記環境温度が低下するにつれて前記寄与度を大きくすることを特徴とするセンシング方法。
【請求項６】
請求項４記載のセンシング方法において、
前記選択ステップでは、前記蛍光強度の時間変化量が増加するにつれて前記寄与度を大きくすることを特徴とするセンシング方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンシング方法において、
前記蛍光強度の時間変化量及び／又は前記環境温度に応じて前記蛍光強度のサンプリング間隔を変更する変更ステップをさらに備えることを特徴とするセンシング方法。
【請求項８】
アナライトと標識化合物との相互作用により蛍光強度が変化する性質を利用して、前記アナライトの濃度を定量・計測するセンシング装置であって、
所定の定量時点での蛍光強度を取得する蛍光センサと、
前記蛍光強度との関係からなる定常的な濃度定量則に従って前記アナライトの濃度を定量する定常的定量部と、
前記蛍光強度とその時間微分量との関係からなる少なくとも１つの非定常的な濃度定量則に従って前記アナライトの濃度を定量する非定常的定量部と、
前記蛍光センサにより取得された前記蛍光強度の時間変化量及び／又は環境温度に応じて、前記定常的な濃度定量則及び前記少なくとも１つの非定常的な濃度定量則の中から濃度定量則を１つ選択する定量則選択部と
を有することを特徴とするセンシング装置。
【請求項９】
請求項８記載のセンシング装置において、
前記定量則選択部は、前記環境温度が第１閾値を超える場合に前記定常的な濃度定量則を選択し、前記環境温度が前記第１閾値を超えない場合に前記非定常的な濃度定量則を選択することを特徴とするセンシング装置。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のセンシング装置において、
前記定量則選択部は、前記蛍光強度の時間変化量が第２閾値を超えない場合に前記定常的な濃度定量則を選択し、前記蛍光強度の時間変化量が前記第２閾値を超える場合に前記非定常的な濃度定量則を選択することを特徴とするセンシング装置。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のセンシング装置において、
前記定量則選択部は、前記時間微分量の寄与度がそれぞれ異なる複数の非定常的な濃度定量則の中からさらに選択することを特徴とするセンシング装置。
【請求項１２】
請求項１１記載のセンシング装置において、
前記定量則選択部は、前記環境温度が低下するにつれて前記寄与度を大きくすることを特徴とするセンシング装置。
【請求項１３】
請求項１１記載のセンシング装置において、
前記定量則選択部は、前記蛍光強度の時間変化量が増加するにつれて前記寄与度を大きくすることを特徴とするセンシング装置。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載のセンシング装置において、
前記蛍光強度の時間変化量及び／又は前記環境温度に応じて前記蛍光強度のサンプリング間隔を変更するサンプリング間隔変更部をさらに有することを特徴とするセンシング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アナライトと標識化合物との相互作用により蛍光強度が変化する性質を利用して、前記アナライトの濃度を定量・計測するセンシング方法及びセンシング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近時、アナライトと標識化合物との相互作用により蛍光強度が変化する性質を利用して、前記アナライトの濃度を定量・計測するセンシング装置が開発されている。一適用例として、被検体の体内にセンサ部を埋め込み、グルコース濃度を連続定量する装置が提案されている（特許文献１参照）。この装置を用いて糖尿病患者の血糖値の時系列データを取得・解析することで、血糖値を安定化するための薬剤の投与プロトコール設定や、生活習慣の改善指導を適切に行える。
【０００３】
ところで、グルコース濃度に対応した蛍光信号としては、例えばグルコースと結合して蛍光を発生させる蛍光色素化合物がある（特許文献２参照）。また、例えば、特許文献３に示されるような、グルコースと結合するだけでは蛍光信号変化のないローダミン標識コンカナバリンＡを用いて、フルオロセイン標識デキストランとローダミン標識コンカナバリンＡの複合体が、グルコースによって解離するときに生じる蛍光共鳴エネルギー転移の程度の変化を蛍光信号として、グルコース濃度と相関させることも提案されている。
【０００４】
アナライトの濃度変化がない場合、すなわち平衡状態において、アナライトの濃度［Ａ（ｔ）］と、蛍光強度Ｆ（ｔ）との間には、次の（１）式に示す関係が成り立つ。
【０００５】
【数１】
2014115076.tif 000003
【０００６】
ここで、α1〜α3は反応速度定数等に起因する定量係数である。特に、α2は、標識化合物と第３成分との解離反応速度定数に対応する。（１）式の簡単な変形により、［Ａ（ｔ）］は、次の（２）式で算出される。
【０００７】
【数２】
2014115076.tif 000004
【０００８】
この系では、アナライトの濃度［Ａ（ｔ）］を連続定量する場合、所定の定量時点ｔにおいて蛍光強度Ｆ（ｔ）を取得し（２）式に従って定量すればよい。
【０００９】
しかしながら、アナライト濃度が時々刻々変化する場合、このグルコース（アナライト）濃度に対する蛍光信号の追随性は、アナライトと標識化合物（蛍光色素）の結合解離速度と、標識化合物が存在するセンサ部分への、外部からのアナライトの浸透速度に依存するため、アナライトの濃度変化に対して、蛍光信号の変化は遅れることになる。すなわち、単純に（２）式から得たアナライトの濃度値は、信号を計測した時刻より昔の値ということになり、誤差を生む。
【００１０】
さらにこの遅れは、結合解離速度については化学反応であるため、環境温度による影響を受け、一般に低温ほど遅くなる傾向にあり、誤差が拡大する傾向にある。
【００１１】
このようなアナライトと標識化合物の結合解離に伴う遅れの反応は、前述のローダミン標識コンカナバリンＡとフルオロセイン標識デキストランが結合解離するような反応では、反応する分子がともに大きな分子量のポリマーであるとともに、アナライトと標識化合物が結合する前に、ローダミン標識コンカナバリンＡとフルオロセイン標識デキストランが解離する反応も必要になるため、より遅れ易いことが予想される。
【００１２】
一方で、前述の特許文献２に記載されている蛍光色素では、低分子量のグルコースとの結合解離のみで蛍光信号が変化するため、グルコース濃度の変動に対して比較的追随し易いことが予想される。しかしながら、実際センサを使用する状況でのアナライトの経時変化速度と求められる精度の関係を鑑みて、（２）式を用いて問題ないかどうかが判断されるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６３３０４６４号明細書
【特許文献２】特許第２８８３８２４号公報
【特許文献３】特許第３２９６５５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ところで、本発明者の研究結果によれば、蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化量と、（２）式の分子の値α2Ｆ（ｔ）との相対的大小関係によって、（２）式に従った定量精度が変化することを見出した。例えば、α2Ｆ（ｔ）が相対的に十分に大きい場合は、濃度［Ａ（ｔ）］の定量精度は良好であった。
【００１５】
しかし、α2Ｆ（ｔ）が小さい場合において、蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化が急峻であるときに濃度［Ａ（ｔ）］の定量値に時間遅延が生じる。その結果、（２）式に従った定量精度が低下するという問題があった。この問題は、濃度［Ａ（ｔ）］が低い場合（蛍光強度Ｆ（ｔ）が小さい場合）や、環境温度が低い場合（定量係数α2が小さい場合）に特に顕在化する。特に、血糖値の定量・計測において、血糖値の時系列データの解析に特に必要とされる低体温状態・低血糖状態での定量精度が低下するので好ましくない。
【００１６】
本発明は、上記の課題を解消するためになされたものであり、計測環境によらず、アナライトの濃度を高精度に定量可能なセンシング方法及びセンシング装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明に係るセンシング方法は、アナライトと標識化合物との相互作用により蛍光強度が変化する性質を利用して、前記アナライトの濃度を定量・計測する方法に関する。
【００１８】
所定の定量時点での蛍光強度を取得する取得ステップと、取得された前記蛍光強度の時間変化量及び／又は環境温度に応じて、前記蛍光強度との関係からなる定常的な濃度定量則、及び、前記蛍光強度とその時間微分量との関係からなる少なくとも１つの非定常的な濃度定量則の中から濃度定量則を１つ選択する選択ステップと、選択された前記濃度定量則に従って前記アナライトの濃度を定量する定量ステップとを備えることを特徴とする。
【００１９】
蛍光強度の時間変化量及び／又は環境温度に応じて、定常的な濃度定量則及び少なくとも１つの非定常的な濃度定量則の中から濃度定量則を１つ選択するようにしたので、蛍光強度の時間変化の傾向に適した濃度定量則を適宜選択可能であり、計測環境によらず、アナライトの濃度を高精度に定量できる。
【００２０】
また、前記選択ステップでは、前記環境温度が第１閾値を超える場合に前記定常的な濃度定量則を選択し、前記環境温度が前記第１閾値を超えない場合に前記非定常的な濃度定量則を選択することが好ましい。これにより、蛍光強度の時間変化が急峻であっても濃度の定量値に即時に反映されるので、常に高精度の定量結果が得られる。
【００２１】
さらに、前記選択ステップでは、前記蛍光強度の時間変化量が第２閾値を超えない場合に前記定常的な濃度定量則を選択し、前記蛍光強度の時間変化量が前記第２閾値を超える場合に前記非定常的な濃度定量則を選択することが好ましい。これにより、蛍光強度の時間変化が急峻であっても濃度の定量値に即時に反映されるので、常に高精度の定量結果が得られる。
【００２２】
さらに、前記選択ステップでは、前記時間微分量の寄与度がそれぞれ異なる複数の非定常的な濃度定量則の中からさらに選択することが好ましい。寄与度を段階的に変化させることで、濃度定量則の選択結果の差異に伴う定量値の不連続性を緩和可能であり、定量精度が局所的に低下するリスクを回避できる。
【００２３】
さらに、前記選択ステップでは、前記環境温度が低下するにつれて前記寄与度を大きくすることが好ましい。これにより、実際の系に合致した一層正確な定量結果が得られる。
【００２４】
さらに、前記選択ステップでは、前記蛍光強度の時間変化量が増加するにつれて前記寄与度を大きくすることが好ましい。これにより、実際の系に合致した一層正確な定量結果が得られる。
【００２５】
さらに、前記蛍光強度の時間変化量及び／又は前記環境温度に応じて前記蛍光強度のサンプリング間隔を変更する変更ステップをさらに備えることが好ましい。蛍光強度のサンプリング間隔を適宜変更することで、定量精度の確保と消費電力の低減とを両立できる。
【００２６】
本発明に係るセンシング装置は、アナライトと標識化合物との相互作用により蛍光強度が変化する性質を利用して、前記アナライトの濃度を定量・計測する装置に関する。
【００２７】
所定の定量時点での蛍光強度を取得する蛍光センサと、前記蛍光強度との関係からなる定常的な濃度定量則に従って前記アナライトの濃度を定量する定常的定量部と、前記蛍光強度とその時間微分量との関係からなる少なくとも１つの非定常的な濃度定量則に従って前記アナライトの濃度を定量する非定常的定量部と、前記蛍光センサにより取得された前記蛍光強度の時間変化量及び／又は環境温度に応じて、前記定常的な濃度定量則及び前記少なくとも１つの非定常的な濃度定量則の中から濃度定量則を１つ選択する定量則選択部とを有することを特徴とする。
【００２８】
また、前記定量則選択部は、前記環境温度が第１閾値を超える場合に前記定常的な濃度定量則を選択し、前記環境温度が前記第１閾値を超えない場合に前記非定常的な濃度定量則を選択することが好ましい。
【００２９】
さらに、前記定量則選択部は、前記蛍光強度の時間変化量が第２閾値を超えない場合に前記定常的な濃度定量則を選択し、前記蛍光強度の時間変化量が前記第２閾値を超える場合に前記非定常的な濃度定量則を選択することが好ましい。
【００３０】
さらに、前記定量則選択部は、前記時間微分量の寄与度がそれぞれ異なる複数の非定常的な濃度定量則の中からさらに選択することが好ましい。
【００３１】
さらに、前記定量則選択部は、前記環境温度が低下するにつれて前記寄与度を大きくすることが好ましい。
【００３２】
さらに、前記定量則選択部は、前記蛍光強度の時間変化量が増加するにつれて前記寄与度を大きくすることが好ましい。
【００３３】
さらに、前記蛍光強度の時間変化量及び／又は前記環境温度に応じて前記蛍光強度のサンプリング間隔を変更するサンプリング間隔変更部をさらに有することが好ましい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係るセンシング方法及びセンシング装置によれば、蛍光強度の時間変化量及び／又は環境温度に応じて、定常的な濃度定量則及び少なくとも１つの非定常的な濃度定量則の中から濃度定量則を１つ選択するようにしたので、蛍光強度の時間変化の傾向に適した濃度定量則を適宜選択可能であり、計測環境によらず、アナライトの濃度を高精度に定量できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】第１及び第２実施形態に共通するセンシング装置の概略ブロック図である。
【図２】図１のセンサ部の概略断面構成を表す模式図である。
【図３】図１のセンサ部の概略構造を説明するための分解斜視図である。
【図４】第１実施形態に係る演算部の機能ブロック図である。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、定量係数の例を表すグラフである。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、一定の環境温度下における負荷濃度と定量値との相関関係を表すグラフである。
【図７】第１実施形態に係る演算部を組み込んだセンシング装置の動作説明に供されるフローチャートである。
【図８】第１実施形態に係る微分項係数の決定例を説明するグラフである。
【図９】グルコースの負荷濃度の経時的変化を表すグラフである。
【図１０】第１変形例に係る微分項係数に従った場合での、グルコースの負荷濃度と定量値との相関関係を表すグラフである。
【図１１】図１１Ａは、第１変形例に係る微分項係数の決定例を表すグラフである。図１１Ｂは、図１１Ａに示す第２閾値の決定例を表すグラフである。
【図１２】第１変形例に係る微分項係数に従った場合での、グルコースの負荷濃度と定量値との相関関係を表すグラフである。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂは、第２変形例に係る微分項係数の決定例を表すグラフである。
【図１４】第２実施形態に係る演算部の機能ブロック図である。
【図１５】第２実施形態に係る演算部を組み込んだセンシング装置の動作説明に供されるフローチャートである。
【図１６】図１６Ａ及び図１６Ｂは、サンプリング間隔の決定例を表すグラフである。
【図１７】グルコースの負荷濃度の経時的変化を表すグラフである。
【図１８】３通りのサンプリング間隔変更則に従って定量した場合における、グルコースの定量誤差率の累積ヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明に係るセンシング方法についてこれを実施するセンシング装置との関係において好適な実施形態を挙げ、添付の図面を参照しながら詳細に説明する。
【００３７】
先ず、第１及び第２実施形態に共通するセンシング装置１０の構成について、図１〜図３を参照しながら説明する。
【００３８】
図１に示すように、センシング装置１０は、センサ部１２（蛍光センサ１４及び温度センサ１５を含む。）と、センサ制御回路１６と、演算部１８（８０）と、電源回路２０と、ＲＯＭ２２と、ＲＡＭ２４と、クロック発生器２６と、表示器２８とを基本的に備える。
【００３９】
蛍光センサ１４は、アナライトＡと標識化合物との相互作用による蛍光Ｆの強度に応じた信号（以下、蛍光信号という。）を取得する。蛍光Ｆは、アナライトＡと標識化合物との結合又は解離に起因する光でもよいし、アナライトＡと異なる第３成分と標識化合物との結合又は解離に起因する光であってもよい。いずれの蛍光Ｆであっても、蛍光信号に基づいてアナライトＡの濃度を定量可能である。温度センサ１５は、蛍光センサ１４近傍での環境温度θに応じた信号（以下、温度信号という。）を取得する。
【００４０】
センサ制御回路１６は、蛍光センサ１４及び温度センサ１５を駆動し、蛍光信号及び温度信号を取得可能に制御する。演算部１８は、ＣＰＵ、ＭＰＵ等で構成されており、ＲＯＭ２２に記録されたプログラムを読み出し、後述する各種信号処理を実行する。電源回路２０は、演算部１８を含むセンシング装置１０内の各構成要素に電力を供給する。ＲＡＭ２４は、蛍光センサ１４を介して入力された蛍光信号、温度センサ１５を介して入力された温度信号の他、本発明に係るセンシング方法を実施するために必要な各種データを読出し又は書込み可能である。クロック発生器２６は、所定周期でクロック信号を発生し、演算部１８側に供給する。これにより、演算部１８は、蛍光信号及び温度信号の取得タイミングの制御が可能である。表示器２８は、演算部１８により定量されたアナライトＡの濃度に関する各種情報を可視化して表示する。表示器２８は、モノクロ又はカラー表示可能な表示モジュールであり、液晶パネル、有機ＥＬ（Electro-Luminescence）、無機ＥＬパネル等で構成されてもよい。
【００４１】
次いで、センサ部１２の構造について、図２及び図３を参照しながら詳細に説明する。
【００４２】
図２に示すように、センサ部１２は、概略矩形状の筐体３０を備える。筐体３０内部は中空であり、蛍光センサ１４と、母材３２と、６本の金属線３４、３５、３６とを収容可能である。筐体３０及び母材３２は、例えばポリイミド、パリレン（ポリパラキシリレン）、又は環状ポリオレフィンなどの樹脂でそれぞれ形成されている。また、外部光を遮光するため、材料中にカーボンブラックなどの光遮断性材料を含有させてもよい。また、筐体３０の一面（進入面３８）は、ハイドロゲルとカーボンブラック等とからなり、アナライトＡを通過させるとともに、外部光を遮断する特性を有する。
【００４３】
蛍光センサ１４は、下方から上方の順に、シリコン等からなる基体４０と、フォトダイオード（Photo Diode：以下「ＰＤ」ともいう。）素子４２と、図示しない第１保護膜と、フィルタ４４と、発光ダイオード（Light Emitting Diode：以下「ＬＥＤ」ともいう。）素子４６と、エポキシ樹脂等からなる第２保護膜４８と、インジケータ層５０とから構成されている。
【００４４】
基体４０の表面には、ＰＤ素子４２が形成されている。ＰＤ素子４２は、蛍光Ｆを電気信号に変換する光電変換素子である。ＰＤ素子４２に代替して、フォトコンダクタ（光導電体）、またはフォトトランジスタ（Photo Transistor、PT）などの各種光電変換素子を用いてもよい。なお、ＰＤ素子４２と金属線３４とは、ボンディングワイヤ５２、又は貫通配線等の手段により、電気的に結線されている。
【００４５】
フィルタ４４は、ＬＥＤ素子４６が発光する励起光Ｅの波長帯域は遮断し、且つ、前記波長帯域よりも長波長側の蛍光Ｆを通過する吸収型光学フィルタである。光学フィルタとして、多結晶シリコン等のシリコン膜、炭化シリコン膜、またはガリウムリン膜等を用いてもよい。
【００４６】
ＬＥＤ素子４６は、励起光Ｅを発光する発光素子である。ＬＥＤ素子４６に代替して、有機ＥＬ（Electro-Luminescence）素子、無機ＥＬ素子、またはレーザーダイオード素子など多様な種類の発光素子を用いてもよい。ここでは、蛍光Ｆの検出量（ＰＤ素子４２での受光量）を増加させるため、蛍光Ｆの光透過率が高い発光素子を選択することが好ましい。
【００４７】
インジケータ層５０は、進入面３８から進入したアナライトＡ（例えば、グルコース）の濃度に応じた蛍光Ｆを発光する。インジケータ層５０は、標識化合物としての蛍光色素が含まれたベース材料から構成されている。標識化合物（例えば、フルオロセイン標識デキストラン）と第３成分（例えば、ローダミン−標識コンカナバリンＡ）との解離により蛍光Ｆを発光させる場合、インジケータ層５０のベース材料に標識化合物と併せて第３成分を含めてもよい。あるいは、第３成分を混入するための別異の機構を設けてもよい。
【００４８】
図３に示すように、筐体３０の内部には、蛍光センサ１４近傍での温度信号を取得可能な温度センサ１５（図１参照）も配設されている。温度センサ１５として、蛍光温度計などの光学型、サーミスタ型、金属薄膜抵抗型、またはＰＮ接合の順方向電流の温度特性を基礎におく半導体型等を用いてもよい。なお、半導体型センサの場合、ＰＤ素子４２と同様に、基体４０上に形成可能である。
【００４９】
金属線３４、３５、３６は、アルミニウム又は銅等の導電体で形成され、筐体３０内の電気配線としての役割に加えて、剛性増加の機能を有する。センサ部１２は、金属線３４〜３６を介してセンサ制御回路１６（図１参照）と電気的に接続されている。図３に示すように、金属線３４は、２本の金属線３４ａ、３４ｂで構成されている。金属線３５は、２本の金属線３５ａ、３５ｂで構成されている。金属線３６は、２本の金属線３６ａ、３６ｂで構成されている。例えば、金属線３４（又は金属線３５）と金属線３６との間に図示しない絶縁層を設けることで、両者を電気的に絶縁してもよい。
【００５０】
これにより、金属線３４を介して、センサ制御回路１６は、ＰＤ素子４２からの蛍光信号を取得可能である。また、金属線３５を介して、センサ制御回路１６は、ＬＥＤ素子４６に駆動電力を供給可能である。さらに、金属線３６を介して、センサ制御回路１６は、温度センサ１５からの温度信号を取得可能である。
【００５１】
次に、センサ部１２の動作について説明する。例えば、センサ部１２が針状である場合、被検体に針先端部を穿刺・保持させることで、前記被検体の体内のアナライトＡの濃度を連続して測定可能である。その際、一部のアナライトＡは、進入面３８から筐体３０の内部に進入して、インジケータ層５０周辺に滞在している。
【００５２】
先ず、センサ制御回路１６は、蛍光センサ１４の金属線３５を介して、ＬＥＤ素子４６に駆動電力信号を供給することで、励起光Ｅは発光される。そして、ＬＥＤ素子４６からの励起光Ｅは、インジケータ層５０に入射される。そして、インジケータ層５０は、アナライトＡと標識化合物との相互作用により、あるいは第３成分を加えた相互作用により、アナライトＡの濃度に応じた強度の蛍光Ｆを発する。
【００５３】
インジケータ層５０からの蛍光Ｆは、ＬＥＤ素子４６、フィルタ４４等を透過された後、ＰＤ素子４２により光電変換され、蛍光信号として金属線３４を伝送され、センサ制御回路１６側に供給される。あわせて、温度センサ１５からの温度信号は、金属線３６を伝送され、センサ制御回路１６側に供給される。
【００５４】
このようにして、蛍光センサ１４は蛍光信号を取得するとともに、温度センサ１５は温度信号を取得する。なお、図２及び図３に示すセンサ部１２は、酸素センサ、グルコースセンサ、ｐＨセンサ、免疫センサ、又は微生物センサ等、多様な用途に適用可能である。また、センサ部１２の構成は、本構成に限られることなく種々の構成を採り得ることはいうまでもない。
【００５５】
［第１実施形態］
続いて、第１実施形態に係る演算部１８の構成及び動作について、図４〜図１０を参照しながら説明する。なお、本明細書では、アナライトＡとしてグルコースを用いた定量結果を中心に説明する。
【００５６】
図４に示すように、第１実施形態の演算部１８は、定常的定量式（定常的な濃度定量則）に従ってアナライトＡの濃度［Ａ（ｔ）］を定量する定常的定量部６０と、非定常的定量式（非定常的な濃度定量則）に従って濃度［Ａ（ｔ）］を定量する非定常的定量部６２と、指標算出部６４と、微分項係数決定部６６と、前記定常的定量式及び少なくとも１つの前記非定常的定量式の中から濃度定量式を１つ選択する定量則選択部６８とを備える。
【００５７】
本明細書において、「定常的な濃度定量則」とは、蛍光強度Ｆ（ｔ）との関係からなる濃度［Ａ（ｔ）］の定量則を意味する。また、定常的定量式は、定常的な濃度定量則の一形態であって、蛍光強度Ｆ（ｔ）との関係式｛具体的には（２）式に示す関係式｝である。
【００５８】
一方、「非定常的な濃度定量則」とは、蛍光強度Ｆ（ｔ）その時間微分量｛例えば、１次の時間微分項Ｆ’（ｔ）。２次以上であってもよい。｝との関係からなる濃度［Ａ（ｔ）］の定量則を意味する。定常状態下の反応速度の関係式である（１）式を拡張すると、次のような、時刻ｔに関する１次微分方程式として記述される。
【００５９】
【数３】
2014115076.tif 000005
【００６０】
ここで、α1、α2、及びα3は、アナライトＡの濃度［Ａ（ｔ）］を定量するための定量係数である。また、γは、時間微分項Ｆ’（ｔ）の寄与度を表す係数（以下、微分項係数という。）であり、例えば、０又は正の実数の値を採り得る。以下、この明細書及び図面において、１次の時間微分項Ｆ’（ｔ）を、（３）式の左辺に示すγの被乗算項のように表記する場合がある。この（３）式の関係から、濃度［Ａ（ｔ）］は、次のように算出される。
【００６１】
【数４】
2014115076.tif 000006
【００６２】
この（４）式は、濃度［Ａ（ｔ）］と、蛍光強度Ｆ（ｔ）及び時間微分項Ｆ’（ｔ）との関係式を表している。（４）式は、γが非０である場合、非定常的な濃度定量則の一形態である「非定常的定量式」に相当する。一方、γが０である場合、（４）式の右辺は（２）式の右辺に一致する（定常的定量式）。なお、濃度［Ａ（ｔ）］が蛍光強度Ｆ（ｔ）の厳密解として表現できない場合は、公知の非線形最適化手法、最急降下法、ニュートン法、準ニュートン法、シンプレックス法等を用いて算出してもよい。定常的な濃度定量則についても同様である。
【００６３】
図５Ａ及び図５Ｂは、定量係数α1〜α3の決定例を表すグラフである。グラフの横軸は、環境温度θ（単位：℃）である。グラフの縦軸は、定量係数α1（図５Ａのグラフ上の実線で示す。単位：Ｍ-1ｓ-1）、定量係数α2（図５Ａのグラフ上の破線で示す。単位：ｓ-1）及びα3（単位：Ｍ-1ｓ-1）である。なお、単位［Ｍ］は、体積モル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）を意味する。このように、環境温度θにそれぞれ適した定量係数α1〜α3を予め決定しておく。
【００６４】
図６Ａ及び図６Ｂは、一定の環境温度（θ）下におけるグルコースの負荷濃度と定量値との相関関係を表すグラフである。グラフの横軸は負荷濃度（単位：Ｍ）であり、グラフの縦軸は定量値（単位：Ｍ）である。
【００６５】
本図において、各プロットの位置が等値直線（Ｙ＝Ｘ）上に存在する場合、最も理想的な定量特性である。相関関係の良し悪しを容易に把握可能にするため、理想値（Ｙ＝Ｘ）に対する許容誤差を２０％以内と定めた場合での、上限値（Ｙ＝１．２Ｘ）及び下限値（Ｙ＝０．８Ｘ）を破線で示している。なお、後述する図１１及び図１３についても同様である。
【００６６】
図６Ａは、環境温度θ＝４２℃でのグラフである。本図に示すように、定常的定量式（γ＝０）及び非定常的定量式（γ＝１）に従って定量した場合のいずれについても、許容誤差の範囲内にほぼ収まっている。さらに両者を比較すると、定常的定量式（γ＝０）の方が、定量精度に若干優れている。これは、時間微分項Ｆ’（ｔ）の演算の際に、蛍光強度Ｆ（ｔ）の差分誤差が生じ易いためであると推定される。
【００６７】
図６Ｂは、環境温度θ＝２５℃でのグラフである。本図に示すように、非定常的定量式（γ＝１）に従った場合では許容誤差（２０％）の範囲内にほぼ収まる一方、定常的定量式（γ＝０）に従った場合では許容誤差の範囲を大きく超えることがある。これは、環境温度θが低い場合、標識化合物と第３成分との結合解離反応が遅くなり、定量誤差が生じ易くなるためであると推定される。
【００６８】
図４に戻って、定量則選択部６８は、定常的定量式（γ＝０）及び非定常的定量式（γ≠０）の中から濃度定量則を１つ選択する。なお、濃度定量式の選択に関わる構成要素、すなわち、指標算出部６４及び微分項係数決定部６６の動作説明については後述する。
【００６９】
続いて、第１実施形態に係る演算部１８を組み込んだセンシング装置１０の動作について、図７のフローチャートと、主に図１、図４のブロック図とを参照しながら説明する。
【００７０】
ステップＳ１において、演算部１８は、アナライトＡの定量指示があったか否かを判別する。具体的には、演算部１８は、クロック発生器２６から入力されたクロック信号のパルス数をカウントし、カウント上限値（時間に換算すると、サンプリング間隔Ｔｓに相当する。）に到達した場合、定量指示があったと判別する。一方、前記カウント上限値に到達していない場合、到達するまでステップＳ１に留まる。ここで、定量時点をｔとする。
【００７１】
ステップＳ２において、センサ制御回路１６は、蛍光センサ１４を介して、アナライトＡと標識化合物との相互作用による蛍光Ｆ（図３参照）を検出する。そして、センサ制御回路１６は、蛍光Ｆの強度に応じた蛍光信号を取得し、演算部１８側に供給する。演算部１８は、この蛍光信号を蛍光強度Ｆ（ｔ）に変換した上で（或いはそのままの値で）、ＲＡＭ２４に一時的に記憶させる。
【００７２】
ステップＳ３において、センサ制御回路１６は、温度センサ１５を介して、環境温度θに応じた温度信号を取得した後、演算部１８側に供給する。演算部１８は、この温度信号を環境温度θに変換した上で（或いはそのままの値で）、ＲＡＭ２４に一時的に記憶させる。
【００７３】
ステップＳ４において、定量則選択部６８は、定常的定量式（γ＝０）及び非定常的定量式（γ＝１）から濃度定量則を１つ選択する。濃度定量式の選択方法について、以下詳細に説明する。
【００７４】
指標算出部６４は、ＲＡＭ２４から読み出した環境温度θを用いて、微分項係数γを決定するための指標β1を算出する。例えば、指標β1は、環境温度θを用いて、次の（５）式で表される。
【００７５】
【数５】
2014115076.tif 000007
【００７６】
すなわち、指標β1は、環境温度θそのものである。その後、微分項係数決定部６６は、指標算出部６４から取得した指標β1を用いて、微分項係数γを決定する。
【００７７】
図８は、第１実施形態に係る微分項係数γの決定例を説明するグラフである。本グラフでは、微分項係数γは、第１閾値β1*を境界とする、２値を取る階段関数で表される。すなわち、β1≦β1*の場合はγ＝１（非定常的定量式）であり、β1＞β1*の場合はγ＝０（定常的定量式）である。
【００７８】
そして、定量則選択部６８は、微分項係数決定部６６から取得した微分項係数γに応じて、定常的定量部６０（γ＝０）及び非定常的定量部６２（γ＝１）のうちいずれか一方を選択する。図６Ａ及び図６Ｂの定量精度の傾向、並びに図８のグラフ特性から諒解されるように、定量則選択部６８は、環境温度θの変化に応じて定量精度がより高い方の濃度定量式を選択する。
【００７９】
ステップＳ５において、定常的定量部６０（又は非定常的定量部６２）は、アナライトＡの濃度［Ａ（ｔ）］を定量する。具体的には、定常的定量部６０（又は非定常的定量部６２）は、ＲＡＭ２４から読み出した定量係数α1〜α3（図５Ａ及び図５Ｂ参照）、蛍光強度Ｆ（ｔ）及び時間微分項Ｆ’（ｔ）を用いて、（２）式｛又は（４）式｝の濃度定量則に従い濃度［Ａ（ｔ）］を定量する。なお、時間微分項Ｆ’（ｔ）は、センサ制御回路１６内に構成されるフィルタ回路から取得してもよいし、ＲＡＭ２４に記憶された蛍光強度Ｆ（ｔ）の過去データから算出して取得してもよい。
【００８０】
ステップＳ６において、演算部１８は、定量時点ｔで取得した蛍光強度Ｆ（ｔ）及び時間微分項Ｆ’（ｔ）をＲＡＭ２４に記憶させ、データを更新させる。
【００８１】
ステップＳ７において、演算部１８は、ステップＳ５で定量された濃度［Ａ（ｔ）］に関する各種情報を表示器２８に表示させる。
【００８２】
ステップＳ８において、演算部１８は、この一連の定量動作の終了指示があったか否かを判別する。終了指示がなかったと判別された場合、ステップＳ１に戻り、以下ステップＳ１〜Ｓ７を繰り返す。一方、終了指示があった場合、センシング装置１０は、アナライトＡの定量動作を終了する。
【００８３】
このように、各定量時点ｔにおけるアナライトＡの濃度［Ａ（ｔ）］が、時系列データとして得られる。続いて、本発明に係るセンシング方法を用いた場合の定量精度について説明する。
【００８４】
図９は、グルコースの負荷濃度の経時的変化を表すグラフである。グラフの横軸は時間（単位：ｍｉｎ）であり、グラフの縦軸はグルコースの負荷濃度（単位：Ｍ）である。この濃度の変化は、被検体の食後における体内のグルコース濃度の経時変化を模擬している。
【００８５】
図１０は、各環境温度（θ）下におけるグルコースの負荷濃度と定量値との相関関係を表すグラフである。本図は、図９に示す濃度変化において、サンプリング間隔Ｔｓ＝３０（ｓ）で連続定量した場合の負荷濃度及び定量値をそれぞれプロットしている。そして、環境温度θ＝４２℃、３６℃、２５℃の３通りについて併せてプロットしている。本図に示すように、３通りの環境温度θにおいて、理想値（Ｙ＝Ｘ）に対して許容範囲内（２０％以内の誤差）にほぼ収まっている。本方法を用いることで、環境温度θが２５〜４２℃の範囲で変化する場合であっても、定常的定量式及び非定常的定量式のいずれか一方を適用した場合（図６Ａ及び図６Ｂ参照）と比較して、高い定量精度が得られる。
【００８６】
以上のように、所定の定量時点ｔで蛍光強度Ｆ（ｔ）を取得する蛍光センサ１４と、蛍光強度Ｆ（ｔ）との関係からなる定常的な濃度定量則に従ってアナライトＡの濃度［Ａ（ｔ）］を定量する定常的定量部６０と、蛍光強度Ｆ（ｔ）と時間微分項Ｆ’（ｔ）との関係からなる非定常的な濃度定量則に従ってアナライトＡの濃度［Ａ（ｔ）］を定量する非定常的定量部６２と、蛍光センサ１４により取得された蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化量及び／又は環境温度θに応じて、前記定常的な濃度定量則及び前記非定常的な濃度定量則の中から濃度定量則を１つ選択する定量則選択部６８とを設けたので、蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化の傾向に適した濃度定量則を適宜選択可能であり、計測環境によらず、アナライトＡの濃度［Ａ（ｔ）］を高精度に定量できる。
【００８７】
また、定量則選択部６８は、環境温度θが第１閾値β1*を超える場合に定常的な濃度定量則を選択し、環境温度θが第１閾値β1*を超えない場合に非定常的な濃度定量則を選択するようにしたので、蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化が急峻であっても濃度［Ａ（ｔ）］の定量値に即時に反映され、常に高精度の定量結果が得られる。
【００８８】
続いて、第１実施形態の変形例（第１〜第３変形例）について、図１１Ａ〜図１３Ｂを参照しながら説明する。
【００８９】
［第１実施形態：第１変形例］
本変形例では、微分項係数γを決定する指標（β2）が、第１実施形態の指標β1と異なる。指標算出部６４は、ＲＡＭ２４から読み出した蛍光強度Ｆ（ｔ）及び時間微分項Ｆ’（ｔ）を用いて、微分項係数γを決定するための指標β2を算出する。例えば、指標β2は、以下の（６）式で表される。
【００９０】
【数６】
2014115076.tif 000008
【００９１】
すなわち、指標β2は、蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化率に相当する。その後、微分項係数決定部６６は、指標算出部６４から取得した指標β2を用いて、微分項係数γを決定する。なお、指標β2は、上記した時間変化率に限られず、時間変化量に相当する指標であればよく、例えば、時間微分項の絶対値｜Ｆ’（ｔ）｜としてもよい。
【００９２】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、第１実施形態の第１変形例に係る微分項係数γの決定例を説明するグラフである。
【００９３】
図１１Ａに示すように、微分項係数γは、第２閾値β2*を境界とする、２値を取る階段関数で表される。すなわち、β2≦β2*（θ）の場合はγ＝０（定常的定量式）であり、β2＞β2*（θ）の場合はγ＝１（非定常的定量式）である。閾値β2*（θ）が一定である場合、蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化率が小さいほど、あるいは、結合解離反応の速度が速いほど、微分項係数γとして０が選択され易くなる。
【００９４】
一方、図１１Ｂに示すように、閾値β2*（θ）は、環境温度θに依存して決定される。本グラフに示すように、環境温度θが増加するにつれて、閾値β2*（θ）は非線形的に増加する。すなわち、環境温度θが増加するにつれて、微分項係数γとして０が選択され易くなる。
【００９５】
図１２は、第１変形例に係る微分項係数γに従った場合での、グルコースの負荷濃度と定量値との相関関係を表すグラフである。本変形例のように、指標β2を用いても、第１実施形態（図１０参照）と略同等の相関特性が得られる。
【００９６】
このように、定量則選択部６８は、指標β2｛蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化量｝が第２閾値β2*を超えない場合に定常的な濃度定量則を選択し、指標β2が第２閾値β2*を超える場合に非定常的な濃度定量則を選択しても、第１実施形態と同様の作用効果が得られる。また、微分項係数決定部６６は、指標β1及び指標β2を用いて、微分項係数γを決定してもよいことはいうまでもない。
【００９７】
［第１実施形態：第２変形例］
本変形例では、微分項係数γを決定する関数形が、第１実施形態（図８参照）と異なる。微分項係数決定部６６は、指標算出部６４から取得した指標β1（β2）を用いて、微分項係数γを決定する。
【００９８】
図１３Ａは、第１実施形態の第２変形例に係る微分項係数γの決定例を表すグラフである。本グラフでは、微分項係数γは、３値を取る階段関数で表される。すなわち、β1＜（β1*−Δ）の場合はγ＝１（非定常的定量式）であり、（β1*−Δ）≦β1≦（β1*＋Δ）の場合はγ＝０．５（非定常的定量式）であり、β1＞（β1*＋Δ）の場合はγ＝０（定常的定量式）である。このように、定量則選択部６８は、１つの定常的定量式及び複数の非定常的定量式の中から濃度定量式を１つ選択してもよい。
【００９９】
図１３Ｂは、第２変形例に係る微分項係数γの別の決定例を表すグラフである。本グラフでは、微分項係数γは、次の（７）式で表される連続関数（いわゆるシグモイド型関数）で表される。
【０１００】
【数７】
2014115076.tif 000009
【０１０１】
ここで、Ｋは、β1＝β1*の座標における曲線の勾配に相当する係数である。Ｋの値が十分大きい（無限大に近い）場合は、図８に示す階段関数の形状と一致する。このように、定量則選択部６８は、連続関数等で表記される多数の非定常定量式の中から、パラメータを介して濃度定量式を１つ選択できるようにしてもよい。（７）式において、指標β1が十分大きい場合、微分項係数γが微小量であるので、定常的定量式（γ＝０）と略同等の定量結果を得る。
【０１０２】
このように、微分項係数γ｛時間微分項Ｆ’（ｔ）の寄与度｝を段階的に変化させることで、特に第１閾値β1*近傍において、濃度定量則の選択結果の差異に伴う定量値の不連続性を緩和可能であり、定量精度が局所的に低下するリスクを回避できる。
【０１０３】
また、指標β2（図１１Ａ参照）に関しても、図１３Ａ（又は図１３Ｂ）に例示する関数形で決定してもよい。この場合、定量則選択部６８は、環境温度θが低下するにつれて微分項係数γを大きくし、及び／又は、環境温度θが上昇するにつれて微分項係数γを小さくしても、第１実施形態と同様の作用効果が得られる。
【０１０４】
［第１実施形態：第３変形例］
本変形例では、微分項係数γを決定する方法が、第１実施形態（図８参照）と異なる。微分項係数決定部６６は、指標算出部６４から取得した指標β1（β2）を用いて確率を算出した上で、前記確率に従って微分項係数γを決定する。例えば、次の（８）式のように確率を算出してもよい。
【０１０５】
【数８】
2014115076.tif 000010
【０１０６】
微分項係数決定部６６は、擬似乱数の発生アルゴリズムを用いて乱数値を発生させた上で、該乱数値に基づいて微分項係数γの値を確率的に決定してもよい。（８）式に示す確率に従って選択することで、期待値としては、図１３Ｂのグラフ特性と等価になる。
【０１０７】
［第２実施形態］
続いて、第２実施形態に係る演算部８０の構成及び動作について、図１４〜図１８を参照しながら説明する。なお、第２実施形態における第１実施形態と同一である構成要素には、同一の参照符号を付して詳細な説明を省略する。
【０１０８】
図１４は、第２実施形態に係る演算部８０の機能ブロック図である。
【０１０９】
演算部８０は、第１実施形態（図４参照）と同様の機能を有する定常的定量部６０と、アナライトＡの濃度［Ａ（ｔ）］を定量するサンプリング間隔Ｔｓを変更するサンプリング間隔変更部８２とを備える。サンプリング間隔変更部８２は、第１実施形態（図４参照）と同様の機能を有する指標算出部６４と、指標算出部６４により算出された指標β1（β2）からサンプリング間隔Ｔｓを決定する間隔決定部８４とを備える。
【０１１０】
この演算部８０を組み込んだセンシング装置１０の動作説明について、図１５のフローチャートを参照しながら説明する。なお、第１実施形態（図７参照）と同様の動作に関し、その説明を割愛する。
【０１１１】
ステップＳ１１〜Ｓ１６に関し、第１実施形態（図７参照）のステップＳ１〜３、Ｓ５〜Ｓ７と同様の動作であるから、その説明を省略する。なお、ステップＳ１４において、定常的定量部６０は、定常的定量式（γ＝０）に従って濃度［Ａ（ｔ）］を定量する。
【０１１２】
ステップＳ１７において、サンプリング間隔変更部８２は、サンプリング間隔Ｔｓの変更の要否を判断する。判断に先立ち、指標算出部６４は、ＲＡＭ２４から読み出した環境温度θ、蛍光強度Ｆ（ｔ）及び時間微分項Ｆ’（ｔ）を用いて、指標β1（又はβ2）を算出する。ここで、指標β1、β2は、第１実施形態及びその変形例と同一の又は異なる指標を用いてもよい。
【０１１３】
その後、間隔決定部８４は、指標算出部６４から取得した指標β1、β2から、サンプリング間隔Ｔｓを決定する。
【０１１４】
図１６Ａは、第２実施形態に係るサンプリング間隔Ｔｓの決定例を表すグラフである。本図から諒解されるように、サンプリング間隔Ｔｓは、指標β1に応じて決定される。具体的には、β1＜β1*の場合はＴｓ＝Ｔ1であり、β1≧β1*の場合はＴｓ＝Ｔ2（＞Ｔ1）である。
【０１１５】
図１６Ｂは、第２実施形態に係るサンプリング間隔Ｔｓの別の決定例を表すグラフである。本図から諒解されるように、サンプリング間隔Ｔｓは、指標β2に応じて決定される。具体的には、β2＜β2*の場合はＴｓ＝Ｔ2であり、β2≧β2*の場合はＴｓ＝Ｔ1（＜Ｔ2）である。
【０１１６】
図１７は、グルコース濃度の経時的変化を表すグラフである。本図に示すように、負荷濃度の変動幅は、図９と比べて若干大きい。
【０１１７】
図１８は、３通りのサンプリング間隔変更則に従って定量した場合における、グルコースの定量誤差率の累積ヒストグラムである。ヒストグラムの横軸は定量値の誤差率（単位：％）であり、縦軸は累積頻度（単位：％）である。
【０１１８】
第１変更則（１２０ｓｅｃ固定）では、サンプリング間隔Ｔｓを、常にＴｓ＝１２０ｓとした。第２変更則（β1による切替）では、図１６Ａの決定例に従ってサンプリング間隔Ｔｓを変更した。第３変更則（β2による切替）では、図１６Ｂの決定例に従ってサンプリング間隔Ｔｓを変更した。各閾値は、第１閾値β1*＝４０（℃）、第２閾値β2*＝０．００５とした。また、図１６Ａ及び図１６Ｂにおいて、Ｔ1＝６０ｓ、Ｔ2＝１２０ｓとした。
【０１１９】
図１８に示すように、誤差率が５％以下の頻度は、（第２変更則）＞（第３変更則）＞（第１変更則）の順番で高くなっている。そして、誤差率が２０％以下の頻度は、第２、第３変更則では１００％で全て２０％以下の誤差に収まっている。このように、統計学的に、第２変更則、第３変更則、及び第１変更則の順に定量誤差が少ないといえる。
【０１２０】
このように、サンプリング間隔変更部８２は、蛍光強度Ｆ（ｔ）の時間変化量及び／又は環境温度θに応じて蛍光強度Ｆ（ｔ）のサンプリング間隔Ｔｓを適宜変更することで、定量精度の確保と消費電力の低減とを両立できる。また、サンプリング間隔Ｔｓを必要に応じて長く設定することで、励起光Ｅの照射回数を削減でき、蛍光センサ１４の劣化を防止する効果もある。
【０１２１】
なお、この発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、この発明の主旨を逸脱しない範囲で自由に変更できることは勿論である。例えば、第１実施形態、その変形例及び第２実施形態の各構成を適宜組み合わせてもよい。
【符号の説明】
【０１２２】
１０…センシング装置                      １２…センサ部
１４…蛍光センサ                          １５…温度センサ
１８、８０…演算部                        ６０…定常的定量部
６２…非定常的定量部                      ６４…指標算出部
６６…微分項係数決定部                    ６８…定量則選択部
８２…サンプリング間隔変更部              ８４…間隔決定部
【図１】
2014115076.tif 000011
【図２】
2014115076.tif 000012
【図３】
2014115076.tif 000013
【図４】
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【図５】
2014115076.tif 000015
【図６】
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【図７】
2014115076.tif 000017
【図８】
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【図９】
2014115076.tif 000019
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2014115076.tif 000022
【図１３】
2014115076.tif 000023
【図１４】
2014115076.tif 000024
【図１５】
2014115076.tif 000025
【図１６】
2014115076.tif 000026
【図１７】
2014115076.tif 000027
【図１８】
2014115076.tif 000028