(57)【要約】【課題】大型設備を必要とせず、コストが低く、かつ効率的にＢＰＡ類を除去することのできる方法、及びその方法のために用いられるＢＰＡ吸着剤を提供すること。【解決手段】（Ａ）超好熱始原菌由来の、ＥＲｐ２９様ポリペプチド、又は（Ｂ）前記ポリペプチド（Ａ）の改変ポリペプチドであり、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチドを含有する、ビスフェノールＡ吸着剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）超好熱始原菌由来の、ＥＲｐ２９様ポリペプチド、又は
（Ｂ）前記ポリペプチド（Ａ）の改変ポリペプチドであり、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド
を含有する、ビスフェノールＡ吸着剤。
【請求項２】
前記超好熱始原菌が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓである、請求項１に記載のビスフェノールＡ吸着剤。
【請求項３】
前記ポリペプチド（Ａ）が、
（１ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ
前記ポリペプチド（Ｂ）が、
（１ｂ）前記ポリペプチド（１ａ）との相同性が８０％以上のポリペプチドであって、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド
である、請求項１に記載のビスフェノールＡ吸着剤。
【請求項４】
前記ポリペプチド（Ａ）が、
（２ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ
前記ポリペプチド（Ｂ）が、
（２ｂ）前記ポリペプチド（２ａ）との相同性が８０％以上のポリペプチドであって、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド
である、請求項１に記載のビスフェノールＡ吸着剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドが固定化された、ビスフェノールＡ吸着用カラム。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを表面に担持する珪藻。
【請求項７】
ビスフェノールＡを吸着する方法であって、
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドにビスフェノールＡを接触させる工程
を含有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビスフェノールＡ吸着剤及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビスフェノールＡ（２，２’−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン；以下、「ＢＰＡ」ということがある。）は、アセトン及びフェノールから合成され、ポリカーボネート樹脂等の原料として利用されている。しかしながら、ＢＰＡは同時に環境ホルモン又は内分泌攪乱物質としても知られている。具体的には、ＢＰＡは生物の生殖機能を乱すホルモン様作用に加えて、脳又は中枢神経系機能への悪影響、並びに発がん性をも有することが近年報告されている。このような環境への悪影響の大きさから、ＢＰＡを効果的に排水又は汚染水等から除去する方法が求められている。
【０００３】
これまでに、ＢＰＡ除去方法として、オゾン処理、活性炭（非特許文献１〜３）、活性汚泥による吸着処理（非特許文献４）、ペルオキシダーゼ（非特許文献５〜７）、ラッカーゼ（非特許文献８）等の酸化・還元酵素、逆浸透法（非特許文献９）、光分解、並びに光酸化等を利用する方法が提案されている。またスベリヒユ属の植物に吸収及び分解させ、これにより環境ホルモンで汚染された水を浄化することを特徴とする水浄化システムも提案されている（特許文献１）。しかしながら、これらはいずれも（１）大型設備を必要とする、（２）コストが高くつく、あるいは（３）効率が悪い等の問題を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２９７３６７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】荒木満美子、外４名、「活性炭の表面化学的性質とビスフェノールA除去能との関連性」、表面科学、2002年、Vol. 23、No. 7、ｐｐ． ４３７−４４２
【非特許文献２】Ｋ． Ｏｉｋａｗａ、外２名、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、２００５年、４１(１)、ｐｐ．１４９−１５２
【非特許文献３】柴山敦、外３名、「水質浄化を考慮したビスフェノールＡおよび１７β−エストラジオールの除去に関する実験的検討」、環境資源工学、２００７年、５４、ｐｐ．１７５−１８１
【非特許文献４】中塩真喜夫、「廃水の活性汚泥処理」、１９８６年４月、恒星社厚生閣
【非特許文献５】Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ、外６名、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、２０１０年、１１８、７２１
【非特許文献６】Ｋ．Ｙａｍａｄａ、外５名、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０年、３１、２４３
【非特許文献７】柏田  歩、外２名、「酸化還元酵素によるキノン酸化を介したビスフェノールAの除去におけるキトサンの利用」、２０１０年、４３／２、ｐｐ．６１−６８
【非特許文献８】Ｆｕｋｕｄａ、「Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ ｂｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｌａｃｃａｓｅ ＦＲＯＭ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ．」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、２００１年、２８４、ｐｐ．７０４−７０６
【非特許文献９】Ａ． Ｔｏｊｉ、環境技術＝Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００２年、３１(８)、ｐｐ．６３０−６３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、大型設備を必要とせず、コストが低く、かつ効率的にＢＰＡ類を除去することのできる方法、及びその方法のために用いられるＢＰＡ吸着剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ね、本発明を完成させた。具体的には、本発明者らは、ＢＰＡ類がヒトのプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）におけるｂドメイン（ＥＲｐ２９）に結合するという、本発明者自身が見出した知見（Ｓｈｏｋｏ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、外３名、「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２０１２年、１５１（１）、ｐｐ．３５−４５）に基づき、まず、このＥＲｐ２９を利用してＢＰＡ類を吸着することを着想した。なお、ＥＲｐ２９は細胞小胞体に存在し、シャペロンとして働くとされるが、それ自身はｒｅｄｏｘ（酸化還元）活性機能を欠いており、ＰＤＩとはみなされていないタンパク質である。
【０００８】
本発明者らによる上記の新しい試みにより、ヒト由来ＥＲｐ２９が確かにＢＰＡ類吸着能を有することが見出されたが、その一方で、ヒト由来ＥＲｐ２９は水を含有する溶媒中では不安定であり、溶媒中における使用は実質的に困難であることが見出された。
【０００９】
試行錯誤を経て、本発明者らは、超好熱始原菌由来のポリペプチドのうち、一次構造はさほど似ていないにもかかわらず、三次構造の一部がＥＲｐ２９と類似しており、優れたＢＰＡ類の吸着能を示すポリペプチドを新たに発見するに至った。そして本発明者らは、これらのポリペプチドが、水系溶媒中においても安定であり、本発明の目的を達成する上で十分に使用可能であることを見出した。本発明者らは、ＢＰＡ吸着能、及び水系環境下での安定性というこれらの優れた特性が、超好熱始原菌由来であり、かつＢＰＡ類吸着能を有するポリペプチドに共通して見出されるものであることを突き止めた。
【００１０】
本発明はかかる知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項１．
（Ａ）超好熱始原菌由来の、ＥＲｐ２９様ポリペプチド、又は
（Ｂ）前記ポリペプチド（Ａ）の改変ポリペプチドであり、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド
を含有する、ビスフェノールＡ吸着剤。
項２．
前記超好熱始原菌が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓである、項１に記載のビスフェノールＡ吸着剤。
項３．
前記ポリペプチド（Ａ）が、
（１ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ
前記ポリペプチド（Ｂ）が、
（１ｂ）前記ポリペプチド（１ａ）との相同性が８０％以上のポリペプチドであって、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド
である、項１に記載のビスフェノールＡ吸着剤。
項４．
前記ポリペプチド（Ａ）が、
（２ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ
前記ポリペプチド（Ｂ）が、
（２ｂ）前記ポリペプチド（２ａ）との相同性が８０％以上のポリペプチドであって、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド
である、項１に記載のビスフェノールＡ吸着剤。
項５．
項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドが固定化された、ビスフェノールＡ吸着用カラム。
項６．
項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを表面に担持する珪藻。
項７．
ビスフェノールＡを吸着する方法であって、
項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドにビスフェノールＡを接触させる工程
を含有する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のビスフェノールＡ吸着剤を利用することにより、大型設備を必要とせず、コストが低く、かつ効率的にＢＰＡ類を除去することのできる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトＥＲｐ２９とＴＫ１０８５の一次構造の相同性を示す図面である。
【図２】ヒトＥＲｐ２９とＴＫ１０８５又はＴＫ１２０８の三次構造の類似性を示す図面である。
【図３】ヒトＥＲｐ２９とＴＫ１０８５の三次構造の類似性を示す図面である。
【図４】試験例の結果を示す図面である。
【図５】試験例の結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．ビスフェノールＡ吸着剤
本発明のビスフェノールＡ吸着剤は、
（Ａ）超好熱始原菌由来の、ＥＲｐ２９様ポリペプチド、又は
（Ｂ）前記ポリペプチド（Ａ）の改変ポリペプチドであり、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド
を含有する、ビスフェノールＡ吸着剤である。
【００１４】
１．１  ポリペプチド（Ａ）
本発明のポリペプチド（Ａ）は、超好熱始原菌由来の、ＥＲｐ２９様ポリペプチドである。
【００１５】
超好熱始原菌は、特に限定されず、本発明の効果が得られる限り、幅広く選択できる。超好熱始原菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ等のＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属の菌やＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ等のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の菌などが挙げられる。これらのうち、より多くの遺伝子パラログを有している点などで、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属の菌が好ましい。とりわけ多くの遺伝子パラログを有しているのはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓであり、多様な遺伝子を取得する目的において、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓが特に好ましい。本発明においては、超好熱始原菌由来のポリペプチドを利用する点が効果の面で重要であり、例えば同じ超好熱菌であっても超好熱バクテリアに由来するポリペプチドを利用した場合に比べて、本発明はより優れた効果を奏する。
【００１６】
本発明において、「ＥＲｐ２９様ポリペプチド」とは、ヒトＥＲｐ２９と一次構造がさほど似ていなくてもよいが、少なくとも一部の三次構造に類似性が認められ、実際にＢＰＡ吸着能を有するものを意味する。ＢＰＡ吸着能は、具体的には次のようにして試験する。表面プラズモン共鳴法を利用して試験する。より具体的には、Ｓｈｏｋｏ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、外３名、「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２０１２年、１５１（１）、ｐｐ．３５−４５に記載の通り行う。すなわち、以下の通りである。
【００１７】
ＢＰＡを、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ；あるいはその同等品を用いてもよい。）上に、マニュアルにしたがってアミンカップリング法で固定する。具体的には、以下の通り行う。７０μｌのＮ−ヒドロキシスクシミド（ＮＨＳ）及びｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の混合物を注入することによりＣＭ５センサーチップを活性化させ、表面に反応性エステルを形成させる。続いて、リンカー及びアミノ基を有する、５００μＭのＢＰＡ−アミン誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）（１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解させたもの）１４０μｌをパルスする。ＢＰＡ固定化チップを７０μｌのエタノールアミンでマスクする。分析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ；あるいはその同等品を用いてもよい。）により２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて行う。チップ表面を、５μｌのＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（６Ｍグアニジン含有））を１０μｌ／ｍｉｎでフローセルを通すことにより再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）させる。評価対象化合物（１０，２０，５０μＭ）を、１０μｌ／ｍｉｎで固定化ＢＰＡ上を通液させ、共鳴の変化をｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ（グラフ）として記録する。コントロールチップについても同様に測定を行い、コントロールチップについてのｓｅｎｓｏｒｇｒａｍを、ＢＰＡ固定化チップのｓｅｎｓｏｒｇｒａｍから差し引く。得られたデータを、標準ラングミュア結合等温線の非線形カーブフィッティング、又はＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｌｉｇａｎｄ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎにより、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて行う。
【００１８】
上記において、ＢＰＡに対する解離定数（Ｋｄ）を指標として、ビスフェノールＡ吸着能を有するか否かを判定する。なお、左記において、解離定数（Ｋｄ）は具体的には以下のようにして測定する。
【００１９】
表面プラズモン共鳴法による解析により測定する。ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、又はその同等品）を用い、すべての解析はＨＢＳ―ＥＰ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．４)， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ３ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．００５％(ｖ／ｖ) Ｔｗｅｅｎ２０）中で２５℃にて行う。はじめにＮ―ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｍｉｄｅ（ＮＨＳ）とＥＤＣを２０μＬ／ｍｉｎの流速で７分間流し、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上のカルボキシル基を活性エステルにする。ここへ、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０)に溶解したリガンド（ＢＰＡ)を流し、適当なＲｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ（ＲＵ）に達するまで流し、その後１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを流し、未反応の活性エステルを不活性化する。チップの再生は再生バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ， ６Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を１０μＬ／ｍｉｎにて５μＬ流すことによって行う。アナライトとして、１０μＭのＰＤＩを流速１０μＬ／ＭＩＮで流し、ギランドとの相互作用によるＲＵの変化を検出する。それぞれのセンサーグラムは、リガンドを固定していないＦｌｏｗ ｃｅｌｌにＰＤＩを流した時のセンサーグラムを差し引いた値をデータとする。また、検出されたＲＵ値から、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解離定数Ｋｄを算出する。
【００２０】
超好熱始原菌由来のＥＲｐ２９様ポリペプチドは、超好熱始原菌由来であることに起因して、水系溶媒中においても安定であるという特性を有する。
【００２１】
本発明のポリペプチド（Ａ）の具体例としては、特に限定されないが、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、以下ＴＫ１０８５という。このペプチドの３５番目〜１４９番目のアミノ酸配列からなる領域が、ＥＲｐ２９と相同な部分である。図１に示すように、一次構造ではヒトＥＲｐ２９との相同性は比較的低いと認められるが、図２及び図３に示すように、三次構造ではこの部分において類似性が認められる。また、実際にＴＫ１０８５は高いＢＰＡ吸着能を示すことが表面プラズモン共鳴法による試験法で確認されている。
【００２２】
さらに、ＴＫ１０８５は、超好熱始原菌由来であることに起因して、水系溶媒中においても安定であるという特性を有する。
【００２３】
本発明のポリペプチド（Ａ）の別の具体例としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。なお、この、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを以下、ＴＫ１２０８という。本ペプチドの５１番目〜１４０番目のアミノ酸からなる領域が、ＥＲｐ２９と相同な部分である。ＴＫ１２０８は、図１に示すように、一次構造ではヒトＥＲｐ２９との相同性は比較的低いと認められるが、図２に示すように、三次構造ではこの部分において類似性が認められる。
【００２４】
さらに、ＴＫ１２０８は、超好熱始原菌由来であることに起因して、水系溶媒中においても安定であるという特性を有する。
【００２５】
その他のポリペプチド（Ａ）は、ＴＫ１０８５及びＴＫ１２０８が見出されるに至ったのと同じ過程を経ることにより、さらに得ることができる。具体的には、超好熱始原菌由来のポリペプチドの中から、ＥＲｐ２９との間における三次構造の類似性、及びＢＰＡ吸着能を手がかりに、常法に従って適宜選び取ってくることができる。
【００２６】
１．２  ポリペプチド（Ｂ）
本発明のポリペプチド（Ｂ）は、前記ポリペプチド（Ａ）の改変ポリペプチドであり、かつＢＰＡ吸着能を有するポリペプチドである。
【００２７】
ＢＰＡ吸着能を有するか否かは、前記したのと同様に、表面プラズモン共鳴法を利用して判定する。
【００２８】
特に限定されないが、ポリペプチド（Ｂ）としては、前記ポリペプチド（Ａ）との相同性が８０％以上のポリペプチドであって、かつＢＰＡ吸着能を有するポリペプチドが挙げられる。左記において、相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００２９】
ポリペプチドの相同性は、ＦＡＳＴＡプログラムを使用した測定（Ｃｌｕｓｔａｌ，  Ｖ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５，  ３０７−３１８（１９９４））によって解析できる。相同性解析の最も好ましくかつ簡便な方法としては、コンピューターにより読取り可能な媒体(例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブ及びＤＶＤなど)に配列を記憶させ、ついでその記憶された配列を使用して、よく知られた検索手段に従い既知の配列データベースを検索する方法等が挙げられる。既知の配列データベースの具体例としては、例えば以下のものが挙げられる。
ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）(ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／)；
Ｇｅｎｅｂａｎｋ(ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／)；及び
Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ＥＭＢＬ）  (ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／)。
【００３０】
相同性解析としては、利用可能な多数の検索アルゴリズムを採用できる。特に限定されないが、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムと称されるプログラム等が挙げられる。このプログラムには５つのＢＬＡＳＴ手段がある。そのうちの３つ(ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸ)は、ヌクレオチド配列の照会のために設計されたものである。残りの２つは、蛋白質配列の照会用に設計されたものである(Ｃｏｕｌｓｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １２：７６−８０（１９９４）； Ｂｉｒｒｅｎ，  ｅｔ ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ， １：５４３−５５９（１９９７）)。
【００３１】
さらに追加的なプログラム、例えば配列アライメントプログラム、より遠縁の配列を同定するためのプログラム等を、同定された配列の分析のために利用できる。
【００３２】
ポリペプチド（Ｂ）としてより好ましい例としては、前記ポリペプチド（Ａ）との同一性が８０％以上のポリペプチドであって、かつＢＰＡ吸着能を有するポリペプチドが挙げられる。左記において、同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００３３】
ポリペプチド（Ｂ）としては、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（以下、「改変等」ということがある。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも挙げることができる。
【００３４】
ポリペプチド（Ａ）において、改変等を加えることによってＢＰＡ吸着能が消失してしまうアミノ酸は、特に限定されないが、例えば、その改変等により三次構造が変化するか否かをシミュレーションにより確認すること等により特定することができる。ポリペプチド（Ｂ）は、そのようなアミノ酸への改変等を避けながら他のアミノ酸への改変等を加えることによって得ることができる。
【００３５】
特に限定されないが、一般に、置換により生じるアミノ酸の変化が保存的であれば、ＢＰＡ吸着能が消失しないと考えられる。保存的なアミノ酸置換の例を表１に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
一方、ポリペプチドの特性に変化を与えると一般的に考えられるアミノ酸残基の置換としては、以下のものが含まれる。
（１）疎水性残基の親水性残基への置換：例えばＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ又はＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換。
（２）Ｃｙｓ及びＰｒｏ以外のアミノ酸のＣｙｓ又はＰｒｏへの置換。
（３）電気的陽性側鎖を有するアミノ酸、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓの、電気的陰性アミノ酸、例えば、Ｇｌｕ又はＡｓｐへの置換。
（４）非常に大きな側鎖を有するアミノ酸、例えばＰｈｅの、Ｇｌｙのような側鎖を有さないアミノ酸への置換。
【００３８】
また、一般にＣｙｓの置換は、ジスルフィド結合に影響を与える。
【００３９】
前述の通り、ＴＫ１０８５の３５番目〜１４９番目のアミノ酸配列からなる領域が、ＥＲｐ２９と相同な部分である。したがって、ＴＫ１０８５の改変体であるポリペプチド（Ｂ）は、ＴＫ１０８５の３５番目〜１４９番目のアミノ酸配列を、ＢＰＡ吸着能を維持しうる程度にまで保存しつつ、その他の領域に改変を加えることによって得ることができる。同様に、ＴＫ１２０８の改変体であるポリペプチド（Ｂ）は、ＴＫ１２０８の５１番目〜１４０番目のアミノ酸配列を、ＢＰＡ吸着能を維持しうる程度にまで保存しつつ、その他の領域に改変を加えることによって得ることができる。
【００４０】
したがって、ポリペプチド（Ｂ）としては、以下のものが挙げられる。
【００４１】
（ｉ−ａ）ＴＫ１０８５の３５番目〜１４９番目のアミノ酸配列からなる領域を含有し、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド。
【００４２】
（ｉ−ｂ）前記ポリペプチド（ｉ−ａ）の改変ポリペプチドであり、かつＢＰＡ吸着能を有するポリペプチド。
【００４３】
（ｉｉ−ａ）ＴＫ１２０８の５１番目〜１４０番目のアミノ酸配列からなる領域を含有し、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチド。
【００４４】
（ｉｉ−ｂ）前記ポリペプチド（ｉｉ−ａ）の改変ポリペプチドであり、かつＢＰＡ吸着能を有するポリペプチド。
【００４５】
上記において、ポリペプチド（ｉ−ｂ）としては、３５番目〜１４９番目のアミノ酸配列からなる領域（ＥＲｐ２９と相同な部分）と相同性が８０％以上の領域を含有し、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチドが挙げられる。左記において、相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。この場合、ポリペプチド（ｉ−ｂ）としては、３５番目〜１４９番目のアミノ酸配列からなる領域と同一性が８０％以上の領域を含有し、かつＢＰＡ吸着能を有するポリペプチドであれば好ましい。左記において、同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。相同性については、ポリペプチド（Ｂ）についての一般的な説明と同じ内容が該当する。
【００４６】
上記において、ポリペプチド（ｉｉ−ｂ）としては、５１番目〜１４０番目のアミノ酸配列からなる領域（ＥＲｐ２９と相同な部分）と相同性が８０％以上の領域を含有し、かつビスフェノールＡ吸着能を有するポリペプチドが挙げられる。左記において、相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。この場合、ポリペプチド（ｉｉ−ｂ）としては、５１番目〜１４０番目のアミノ酸配列からなる領域と同一性が８０％以上の領域を含有し、かつＢＰＡ吸着能を有するポリペプチドであれば好ましい。左記において、同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。相同性については、ポリペプチド（Ｂ）についての一般的な説明と同じ内容が該当する。
【００４７】
１．３  ビスフェノールＡ吸着剤
本発明のＢＰＡ吸着剤は、ＢＰＡ（下記式（１））、及びその誘導体（本明細書においてこれらを総称して「ＢＰＡ類」ということがある。）、を吸着させる目的で使用される。
【００４８】
【化１】
2014168755.tif 000003
【００４９】
本発明のＢＰＡ吸着剤は、水系溶媒中においても安定であるという特性を有するポリペプチド（Ａ）及び（Ｂ）を含有するものであるため、ＢＰＡ類に対する高い結合性を有するだけでなく、水系溶媒中でも使用できるという優れた特性を有し、さらに加えて長期使用に耐えうる安定性をも備えている。
【００５０】
ＢＰＡ誘導体としては、特に限定されないが、下記式（２）に示すビスフェノールＢ（ＢＰＢ）、下記式（３）に示すジメチルブチリデンジフェノール（ＤＭＢＤＰ）、下記式（４）に示す１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン（ＢＨＣＨ）、下記式（５）に示すメチルベンジリデンビスフェノール（ＭＢＢＰ）及び下記式（６）に示すエチルヘキシリデンジフェノール（ＥＨＤＰ）等を挙げることができる。
【００５１】
【化２】
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【００５２】
【化３】
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【００５３】
【化４】
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【００５４】
【化５】
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【００５５】
【化６】
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【００５６】
これら具体例は全て公知のビスフェノールＡ誘導体である。これら公知の誘導体は全て市販されており、ＢＰＢ、ＢＨＣＨ、ＭＢＢＰ及びＥＨＤＰは東京化成工業株式会社から、ＤＭＢＤＰは和光純薬工業株式会社からそれぞれ入手できる。また、製造方法が知られているものについてはその方法にしたがって製造することができる。例えば、ＤＭＢＤＰについてはＢｅｉｌｓｔｅｉｎ  ６(３)５５２３に製造方法が記載されており、これにしたがって製造できる。
【００５７】
本発明のＢＰＡ吸着剤は、必要に応じて、ポリペプチド（Ａ）及び（Ｂ）に加えて添加剤をさらに含有していてもよい。そのような添加剤としては、特に限定されないが、例えば、珪藻土、ゼオライト、パーライト及び活性白土等の無機多孔質体、並びに活性炭及びイオン交換樹脂等の有機多孔質体等が挙げられる。
【００５８】
本発明のＢＰＡ吸着剤で処理されるものは、ＢＰＡ類の除染の必要があるものであればよく特に限定されない。本発明のＢＰＡ吸着剤は、耐熱性があるため高温環境でも変性せず機能する。また、本発明のＢＰＡ吸着剤は、変性速度が遅いため有機系の溶媒中でも、変性しにくい。処理されるものは、溶液であってもよいし、あるいはスラリー等を含む懸濁液等であってもよい。処理されるものは、ＢＰＡ類の他にも、例えばエタノール等の溶剤を含んでいてもよい。具体的には、特に限定されないが、工業製品を製造する際に発生する廃液をはじめとする種々の廃液、並びに河川及び海水等の環境中の液体、土壌等から得られる液体等のほか、ＢＰＡ類を製造する際に発生する廃液等であってもよい。
【００５９】
２．ビスフェノールＡ吸着用カラム
本発明のビスフェノールＡ吸着用カラムは、上記のポリペプチド（Ａ）及びポリペプチド（Ｂ）からなる群より選択される少なくとも一種のポリペプチドが固定化された、ビスフェノールＡ吸着用カラムである。
【００６０】
本発明のビスフェノールＡ吸着用カラムを利用することにより、ＢＰＡ類を吸着することができる。特に限定されないが、例えば、ＢＰＡ類で汚染された水等を、本発明のビスフェノールＡ吸着用カラムに通液させることにより、カラムにＢＰＡ類を吸着させ、除染水を得ることができる。
【００６１】
本発明のビスフェノールＡ吸着用カラムは、水系溶媒中においても安定であるという特性を有するポリペプチド（Ａ）及び（Ｂ）を利用するものであるため、ＢＰＡ類に対する高い結合性を有するだけでなく、水系溶媒に対しても使用できるという優れた特性を有し、さらに加えて長期使用に耐えうる安定性をも備えている。
【００６２】
固定化の手段は、本発明の効果が得られればよく、特に限定されない。例えば、イミダゾールカップリングなど各種カップリング法を用いて共有結合的に固定するほかヒスチジンタグ等のタグを付加し、Ｎｉなど金属キレートで固定するなどが挙げられる。
【００６３】
カラムの材質は、本発明の効果が得られればよく、特に限定されない。例えばシリカビーズ、アミノシラン化ガラス、セルロース樹脂など糖系樹脂等が挙げられる。
【００６４】
固定化するポリペプチド（Ａ）及び（Ｂ）の量は、本発明の効果が得られればよく、特に限定されない。例えば、膨潤した１ｍｌカラムに対して１〜１０ｍｇのポリペプチドを固定化することができる。
【００６５】
本発明のビスフェノールＡ吸着用カラムで処理されるものは、ＢＰＡ類の除染の必要があるものであればよく特に限定されない。処理されるものは、溶液であってもよいし、あるいはスラリー等を含む懸濁液等であってもよい。処理されるものは、ＢＰＡ類の他にも、例えばエタノール等の溶剤を含んでいてもよい。具体的には、特に限定されないが、工業製品を製造する際に発生する廃液をはじめとする種々の廃液、並びに河川及び海水等の環境中の液体、土壌等から得られる液体等のほか、ＢＰＡ類を製造する際に発生する廃液等であってもよい。
【００６６】
３．ビスフェノールＡ吸着能を有する珪藻
本発明の珪藻は、上記のポリペプチド（Ａ）及びポリペプチド（Ｂ）からなる群より選択される少なくとも一種のポリペプチドを表面に担持する珪藻である。
【００６７】
本発明の珪藻を利用することにより、ＢＰＡ類を吸着することができる。特に限定されないが、例えば、本発明の珪藻から珪藻土を得て、これを例えば珪藻土系塗り壁として利用することが挙げられる。この珪藻土系塗り壁は、空気中のＢＰＡ類を吸着することができる。また、本発明の珪藻をそのまま前記ＢＰＡ吸着剤として使用することもできる。
【００６８】
本発明の珪藻は、先述のポリペプチド（Ａ）及び（Ｂ）を利用するものであるため、ＢＰＡ類に対する高い結合性を有するだけでなく、長期使用に耐えうる安定性をも備えている。
【００６９】
珪藻の種類は、本発明の効果が得られればよく、特に限定されない。例えば、Ｐｈａｅｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ等が挙げられる。
【００７０】
珪藻表面において前記ポリペプチドを発現させる手段は、特に限定されないが、遺伝子工学を利用した方法が挙げられる。具体的には、これらのポリペプチドを発現するように珪藻を遺伝子操作することが挙げられる。例えば、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡを珪藻において発現可能なプロモーター配列の下流に配置させた遺伝子発現カセットを珪藻内に導入することができる。珪藻において発現可能なプロモーター配列としては、特に限定されないが、強力な活性を有するＮＲｐプロモーター等が挙げられる。この場合において、遺伝子発現カセットは好ましくは安定的にゲノムに取り込まれている。遺伝子導入方法としては、パーティクルガン（遺伝子銃）等が挙げられる。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００７２】
１．実施例１：タンパク質の発現〜精製
１．１  発現プラスミドの構築
TK1085とTK1208の領域をPCRによって増幅した。KOD Plus DNA ポリメラーゼ（TOYOBO）を用いたPCRは以下の条件で行った。反応液はKOD Plus バッファー（TOYOBO）、2 mM dNTPs、25mM MgSO4、100mM プライマー、80ng/μL  鋳型DNA、1U/μL KOD Plus DNA Polymeraseにて行った。反応サイクルは、98℃  5min、（98℃ 15sec, 52℃ 30sec, 68℃ X min）x30にて行った。PCRにおける伸長反応時間Xは1kbp/minにて行った。プライマーについてはTK1085では5’ - GGAATTCTCACTCGAGGGCAGCGAGGA-3’ （配列番号５）と5’ - AAAAAAACATATGGGACTCATTAGCGATGC-3’ （配列番号６）を用いた。TK1208では5’ -AAAAA GCTAGCGTGAAAAAAACTGGAATACT-3’（配列番号７）と 5’ - GGAATTC TCAACCCGTTGAGTTAGACT-3’ （配列番号８）を用いた。鋳型DNAとしては、Thermococcus kodakarensisのゲノムDNAを用いた。増幅した断片をEcoRIとNdeIにより切断し、同じ酵素で処理したプラスミドpET28aに挿入し、発現用プラスミドpET-TK1085及びpET-TK1208を得た。これら構築されたプラスミドに変異がないことをDNA塩基配列を決定することによって確認した。塩基配列はABI PRISM BigDye Terminator version 1.1 cycle Sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems) を用いてジデオキシ法により伸長反応を行ったのち、ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems) により分離・解析した。
【００７３】
１．２  タンパク質の精製
pET-TK1085及びpET-TK1208を用いて大腸菌BL21 CodonPlus (DE3)株を形質転換した。形質転換体を1LのLB培地にて培養し、OD660=0.4にてIPTGを終濃度1mMとなるよう添加し、OD660=1.0にて菌体を回収した。培養菌体（1L分）を-80℃にて凍結保存した。再び融解させた後バッファーA（50mMリン酸バッファー (pH7.4) , 300mM NaCl）に懸濁し、超音波破砕した（Out put4, duty cycle 30, 5 min破砕後、1 min静置を3サイクル）。遠心（8,000 rpm, 10 min, 4℃）後、上清を回収した。上清を80℃にて30分熱処理し、遠心（8,000 rpm, 10 min, 4℃）後、上清を回収した。上清にバッファーAで平衡化した5 mLのNi-NTA Agarose (QIAGEN)を加えて30分間振盪しタンパク質を吸着させた。アガロースをカラムに流しこみ、バッファーAを15mL流し、固定し、再びバッファーＡで洗浄した。その後バッファーB（50mM リン酸バッファー (pH7.4) , 300mM NaCl, 100mM Imidazole）を15mL流し、タンパク質の溶出を行った。得られたタンパク質はバッファーAを用いて透析し、精製純度はSDS-PAGEにより確認した。
【００７４】
大腸菌を宿主とする高発現システムを利用し、TK1085は高効率に発現され、その多くは可溶性画分に回収された。これ以降の検討はTK1085を用いて行った。TK1085は耐熱性を有しているため、細胞破砕後に熱処理（80℃、30分）を行うことで、大腸菌由来のタンパク質の多くを除去することができた。また本タンパク質はN末端にHisタグを有しており、Ni アガロースカラムを利用して高純度に精製された。
【００７５】
２．実施例２：ＢＰＡ結合性の検討
表面プラズモン共鳴法による解析には、BIAcore 2000システム（GE Healthcare, Milwaukee, Wisconsin）を用い、すべての解析はHBS-EP buffer（10mM HEPES(pH7.4), 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005%(v/v) Tween20）中で25℃にて行った。はじめにN-hydroxysuccinmide（NHS）とEDCを20μL/minの流速で7分間流し、CM5センサーチップ（GE Healthcare）の上のカルボキシル基を活性エステルにした。ここへ、10mM酢酸(pH5.0)に溶解したリガンド(BPA)を流し、適当なResonance unit (RU)に達するまで流し、その後1M ethanolamineを流し、未反応の活性エステルを不活性化した。チップの再生は再生バッファー（100mM Tris-HCl, 6M Guanidine）を10μL/minにて5μL流すことによって行った。アナライトとして、10μMのPDIを流速10μL/MINで流し、ギランドとの相互作用によるRUの変化を検出した。それぞれのセンサーグラムは、リガンドを固定していないFlow cellにPDIを流した時のセンサーグラムを差し引いた値をデータとした。また、検出されたRU値から、BIAevaluation softwareを用いて解離定数KDを算出した。
【００７６】
TK1085のBPAの結合性をKD値で評価したところ、0.73μMであり、これはヒトのPDIを同じ条件で評価した数値（1.78μM）よりも低い値であった。このことからTK1085はヒトのPDIよりもBPAに対し、高い親和性を持つと考察される。
【００７７】
３．試験例：安定性試験
超好熱菌由来、及びヒト由来のPDIとしてそれぞれTK1085とhPDIを精製し、以降の実験に供した。TK1085の精製は上述の方法で、hPDIの精製は橋本ら（2012年関西学院大学博士論文）が報告する方法に従った。構造安定性を調べるために、円二色性分散計J-820 CD （JASCO）を用いて円偏光二色性によるスペクトル変化測定を行った。測定には光路長2mm及び10mmの石英キュベットを用いた。測定は、遠紫外部（波長範囲：200〜260nm）にて、サンプルタンパク質濃度は9.26mMで行った。構造の安定性を評価するためにそれぞれのタンパク質に2, 4, 6Mの尿素を加えて40℃で3時間静置した後、スペクトルを測定した。また熱安定性を評価するために、それぞれのタンパク質をバッファーA中で1℃/minの速度で昇温させ、222nmの分子楕円率を測定した。温度変化は20℃〜90℃とした。
【００７８】
PDIをBPA除去に用いる場合、地球上の温度環境で安定に機能する必要がある。hPDIとTK1085を40℃の温度環境で3時間処理し、処理後の構造安定性を円偏向二色性（CDスペクトル）で検討したところ、hPDIはこの条件下で変性が起きていることが示された。さらに変性剤である尿素を添加したところ、2M尿素存在下で変性は顕著になった。一方、TK1085は6M尿素存在下でも構造を維持しており、変性は認められなかった。さらに高温への昇温変化を与えても構造に変性はみられなかった（図４及び図５）。TK1085の耐熱性は極めて高い。これは変性速度が遅いことに起因しており、高温環境以外の化学的変性環境においても安定であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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