(57)【要約】      （修正有）【課題】神経変性疾患に関与する種の存在について生物学的試料を迅速且つ高感度に分析できる方法、アッセイ、及び成分を疾患の診断並びに神経変性疾患の治療用候補薬のスクリーニングのために提供する。【解決手段】キットは、表面を有する第一のアーティクル２０と、表面を有する第二のアーティクル２０と、複数の結合種２８とを含み、前記結合種の少なくとも一部は、前記第一のアーティクル２０の表面に対して固定されているか又は固定されるように適応され、前記結合種２８の少なくとも一部は、前記第二のアーティクル２０の表面に対して固定されるか又は固定されるように適応されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を有する第一のアーティクルと；
表面を有する第二のアーティクルと；そして
凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを含むキットであって、前記結合種
の少なくとも一部は、前記第一のアーティクルの表面に固定されるか又は固定さ
れるように適応され、前記結合種の少なくとも一部は、前記第二のアーティクル
の表面に固定されるか又は固定されるように適応されているキット。
【請求項２】
結合種が神経変性疾患の凝集体形成種を結合できる、請求項
１に記載のキット。
【請求項３】
凝集に影響を及ぼす候補薬をさらに含む、請求項１に記載の
キット。
【請求項４】
神経変性疾患を抑制する候補薬をさらに含む、請求項２に記
載のキット。
【請求項５】
結合種がペプチドである、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項６】
結合種がタンパク質である、請求項１又は２に記載のキット
。
【請求項７】
結合種がタンパク質由来の配列である、請求項１又は２に記
載のキット。
【請求項８】
結合種が小分子である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項９】
小分子が、コンゴーレッド又はチオフラビンＴである、請求
項８に記載のキット。
【請求項１０】
結合種が、凝集体形成種又は原線維形成種に対する抗体で
ある、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１１】
結合種が、神経変性疾患に関係する原線維又は凝集体を結
合できる、請求項２に記載のキット。
【請求項１２】
結合種が、神経変性疾患に関係する原線維又は凝集体に組
み込まれることが可能な、請求項２に記載のキット。
【請求項１３】
結合種が、複数の凝集体に結合した複数のアーティクルを
包含するマクロ構造を形成できる、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
結合種が、神経変性疾患に関係する複数の凝集体に結合し
た複数のアーティクルを包含するマクロ構造を形成できる、請求項１１に記載の
キット。
【請求項１５】
結合種が、生体分子の異常凝集が関与する疾患に特徴的な
凝集が可能なタンパク質である、請求項１に記載のキット。
【請求項１６】
結合種が、免疫グロブリン、ヘモグロビン、ｐ５３、フィ
ブリン、インテグリン、クリオグロブリン、ヒトのランゲルハンス島アミロイド
ポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）、及び他のアミロイドタンパク質から選ばれる、請
求項１に記載のキット。
【請求項１７】
結合種が、β−アミロイドタンパク質、アミロイドタンパ
ク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、タウ、シヌクレイン、ＰｒＰCJ
D、ＰｒＰBSE、ＰｒＰscrapie、ハンチンチン、並びにそれらのフラグメント及
び融合物から選ばれる、請求項２に記載のキット。
【請求項１８】
種が、β−アミロイドペプチドのアミノ酸１〜４０、又は
１〜４２を包含する、請求項２に記載のキット。
【請求項１９】
タンパク質、フラグメント又は融合物が、凝集体結合、凝
集体形成耐性である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
アーティクルの少なくとも一つが金であるか又は金被覆さ
れている、請求項１、２、３又は４に記載のキット。
【請求項２１】
自己集合単層が金表面上に形成されている、請求項２０に
記載のキット。
【請求項２２】
自己集合単層が合成分子からなる、請求項２０に記載のキ
ット。
【請求項２３】
自己集合単層が、チオール及びジチオールだけで構成され
、タンパク質の単層への直接組込みを含まない、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
チオール、ジチオール及びシステイン又は硫黄末端ペプチ
ドが、自己集合単層に組み込まれている、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
自己集合単層が親和性リガンドの結合パートナーを提示す
る、請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
表面が金属を配位できる部分を提示する、請求項２４に記
載のキット。
【請求項２７】
表面が、表面に対して固定化された金属を配位しているキ
レートを保持し、結合種がポリアミノ酸標識で誘導体化されている、請求項２４
に記載のキット。
【請求項２８】
自己集合単層が、非修飾生体分子への化学結合を容易にす
るためにカルボキシ末端ヘッド基を提示する、請求項２２に記載のキット。
【請求項２９】
生体分子上の第一級アミンが、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリン
グ化学によってカルボキシル化表面に結合している、請求項２８に記載のキット
。
【請求項３０】
自己集合単層が、ニトリロ三酢酸、２，２’−ビス（サリ
チリデンアミノ）−６，６’−デメチルジフェニル、又は１，８−ビス（ａ−ピ
リジル）−３，６−ジチアオクタンを含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項３１】
自己集合単層が、自己集合単層形成種を含む混合自己集合
単層であり、前記自己集合単層形成種のすべてではないが一部が金属を配位でき
る部分を含む、請求項２２に記載のアーティクル。
【請求項３２】
第一のアーティクルが、液に懸濁可能な、単離可能な粒子
である、請求項１、２、又は２０〜３０に記載のキット。
【請求項３３】
粒子が単離可能な粒子である、請求項３２に記載のキット
。
【請求項３４】
第一のアーティクルがコロイド粒子である、請求項３２に
記載のキット。
【請求項３５】
第一のアーティクルが金コロイド粒子である、請求項３４
に記載のキット。
【請求項３６】
第一のアーティクルがＳＰＲチップである、請求項１又は
２０に記載のキット。
【請求項３７】
第一のアーティクルが粒子であり、キットが、結合種の少
なくとも一部に固定された又は固定されるように適応された追加の粒子をさらに
含む、請求項１、２、３２、又は３５に記載のキット。
【請求項３８】
凝集に影響を及ぼす候補薬をさらに含む、請求項３７に記
載のキット。
【請求項３９】
第一のアーティクル表面に固定された又は固定されるよう
に適応された結合種が表面に固定可能であり、固定が第一のアーティクル上のそ
のパートナーに結合する親和性標識によって容易になる、請求項３７に記載のキ
ット。
【請求項４０】
第一のアーティクル表面に固定された又は固定されるよう
に適応された結合種が、金属結合標識／金属／キレート連結によって表面に固定
可能である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
表面が、表面に対して固定化された金属を配位しているキ
レートを保持し、結合種がポリアミノ酸標識で誘導体化されている、請求項４０
に記載のキット。
【請求項４２】
ポリアミノ酸標識がヒスチジン標識である、請求項４１に
記載のキット。
【請求項４３】
結合種が、第一のアーティクルの表面に化学カップリング
反応を通して固定されている、請求項３７に記載のキット。
【請求項４４】
ＥＤＣ及びＮＨＳが、結合種上の第一級アミンを第一のア
ーティクル表面上のカルボキシレートに連結するのに使用される、請求項４３に
記載のキット。
【請求項４５】
第一のアーティクル表面に固定された又は固定されるよう
に適応された結合種が、相補的核酸配列対を介して表面に固定可能である、請求
項１、２、２１〜２３に記載のキット。
【請求項４６】
結合種が末端システインを持ち、それによって第一のアー
ティクル表面に固定されている、請求項１、又は２に記載のキット。
【請求項４７】
結合種の少なくとも一部に固定された複数の粒子を含み、
前記結合種が、表面に固定されていない補助的な凝集体形成種又は原線維形成種
の不在下で、粒子／粒子曝露時の粒子凝集をある時間枠内遅らせるほど低い表面
濃度で前記粒子表面に対して固定されている結果、補助的な凝集体又は原線維形
成種の不在下での凝集を、補助的な凝集体又は原線維形成種の存在下での凝集と
比較できる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４８】
比較が視覚的に測定される、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
比較パラメータが溶液の色の目に見える変化である、請求
項４８に記載のキット。
【請求項５０】
結合種が、神経変性疾患の凝集体形成種又は原線維形成種
でない、請求項２に記載のキット。
【請求項５１】
結合種が、神経変性疾患の凝集体形成種又は原線維形成種
であるが、他の結合種を神経変性疾患の凝集体形成種又は原線維形成種に変換で
きない、請求項２に記載のキット。
【請求項５２】
結合種が、神経変性疾患の凝集体形成種又は原線維形成種
によって凝集体形成種又は原線維形成種に変換される、請求項２に記載のキット
。
【請求項５３】
凝集体形成種に変換された結合種が、他の結合種を凝集体
形成種又は原線維形成種に変換できる、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
凝集反応を増幅するために、追加として、神経変性疾患の
凝集体形成種又は原線維形成種によって凝集体形成種に変換されることが可能な
種をさらに含む、請求項２に記載のキット。
【請求項５５】
結合種が、金属を配位できる部分にそのＮ−末端で固定さ
れているペプチドである、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項５６】
結合種が、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学、核酸配列、又は親和性標
識相互作用により、少なくとも１個のカルボキシレート基を介して第一のアーテ
ィクル表面に固定されている又は固定されるように適応されている、請求項１、
２、３、４、及び３７に記載のキット。
【請求項５７】
液に懸濁可能な、単離可能な粒子が、どの次元の断面も５
００ｎｍを超えない、請求項３２に記載のアーティクル。
【請求項５８】
液に懸濁可能な、単離可能な粒子が、どの次元の断面も１
００ｎｍを超えない、請求項３２に記載のキット。
【請求項５９】
自己集合単層が、結合種の固定を容易にする部分を提示す
る混合単層であり、シグナリング実体をさらに含む、請求項３５に記載のアーテ
ィクル。
【請求項６０】
コロイド自体がシグナリング実体である、請求項５９に記
載のアーティクル。
【請求項６１】
複数の補助的シグナリング実体を含む、請求項５９に記載
のアーティクル。
【請求項６２】
コロイド粒子に共有結合的に固定された複数の補助的シグ
ナリング実体を含む、請求項５９に記載のアーティクル。
【請求項６３】
シグナリング実体が、チオールに共有結合的に付着し、自
己集合単層に組み込まれている、請求項５９に記載のアーティクル。
【請求項６４】
シグナリング実体が電気活性種である、請求項６３に記載
のアーティクル。
【請求項６５】
シグナリング実体がメタロセンである、請求項６４に記載
のアーティクル。
【請求項６６】
シグナリング実体がフェロセン又はフェロセン誘導体であ
る、請求項６５に記載のアーティクル。
【請求項６７】
粒子が複数の固定電気活性種を保持している、請求項３２
に記載のアーティクル。
【請求項６８】
補助的シグナリング実体が、染料、顔料、電気活性分子、
蛍光部分、アップレギュレーティングリン光体、又は西洋ワサビペルオキシダー
ゼ及びアルカリホスファターゼを含む酵素固定シグナリング部分を含む、請求項
５９に記載のアーティクル。
【請求項６９】
第一のアーティクルが磁気的に懸濁可能な粒子である、請
求項１に記載のキット。
【請求項７０】
粒子が金被覆磁気粒子である、請求項３３に記載のキット
。
【請求項７１】
結合種が、第一のアーティクル表面に特異的に固定されて
いる又は特異的に固定されるように適応されている、請求項１に記載のキット。
【請求項７２】
凝集体形成種を結合でき、親和性標識に固定されている結
合種を含む組成物。
【請求項７３】
結合種が、疾患に関係する凝集体形成種を結合できる、請
求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
結合種が、神経変性疾患に関係する凝集体形成種を結合で
きる、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７５】
結合種がペプチドである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７６】
結合種がタンパク質である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７７】
結合種がタンパク質由来の配列である、請求項７２に記載
の組成物。
【請求項７８】
結合種が小分子である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７９】
結合種が凝集体形成種又は原線維形成種に対する抗体であ
る、請求項７２に記載の組成物。
【請求項８０】
結合種が凝集体を結合できる、請求項７２に記載のキット
。
【請求項８１】
結合種が、疾患に関係する凝集体を結合できる、請求項７
２に記載のキット。
【請求項８２】
結合種が、神経変性疾患に関係する凝集体を結合できる、
請求項７２に記載のキット。
【請求項８３】
結合種が、複数の凝集体に結合した複数のアーティクルを
包含するマクロ構造を形成できる、請求項８０に記載のキット。
【請求項８４】
結合種が、疾患に関係する複数の凝集体に結合した複数の
アーティクルを包含するマクロ構造を形成できる、請求項８０に記載のキット。
【請求項８５】
結合種が、神経変性凝集関連疾患に特徴的な凝集が可能な
タンパク質である、請求項７２に記載のキット。
【請求項８６】
結合種が、凝集関連疾患に特徴的な凝集が可能なタンパク
質である、請求項７２に記載のキット。
【請求項８７】
結合種が、神経変性疾患に特徴的な凝集が可能なタンパク
質である、請求項７２に記載のキット。
【請求項８８】
結合種が、ＡＰＰ、β−アミロイドタンパク質、アミロイ
ドタンパク質、タウ、シヌクレイン、ＰｒＰCJD、ＰｒＰBSE、ＰｒＰscrapie、
ハンチンチン、並びにそれらのフラグメント及び融合物から選ばれる、請求項７
２に記載のキット。
【請求項８９】
タンパク質、フラグメント又は融合物が、凝集体結合性、
凝集体形成耐性である、請求項８８に記載のキット。
【請求項９０】
結合種の少なくとも一部に固定された又は固定されるよう
に適応された粒子をさらに含む、請求項７２に記載の組成物。
【請求項９１】
親和性標識が金属結合標識である、請求項７２に記載の組
成物。
【請求項９２】
前記部分がポリアミノ酸標識である、請求項７２に記載の
組成物。
【請求項９３】
ポリアミノ酸標識がヒスチジン標識である、請求項７２に
記載の組成物。
【請求項９４】
凝集体形成種を含有する試料中で凝集体を形成させ；そし
て、
表面と、凝集体又は凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを有するアーテ
ィクルに前記凝集体を曝露することを含む方法であって、前記結合種は前記アー
ティクル表面に対して固定されている又は固定されるように適応されている方法
。
【請求項９５】
凝集体を、凝集に影響を及ぼす候補薬の存在下で、アーテ
ィクルに曝露することをさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
方法が液媒体中で実施される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
溶液が洗浄剤又は界面活性剤を含有しない、請求項９６に
記載の方法。
【請求項９８】
結合種、アーティクル、又は凝集体形成種を一緒に結合す
るのに毛細管流動力を必要としない、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
表面が液媒体を吸収しない、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
結合種がペプチドである、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
結合種がタンパク質である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０２】
結合種がタンパク質由来の配列である、請求項９４に記
載の方法。
【請求項１０３】
結合種が小分子である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０４】
アーティクルが、液に懸濁可能な、単離可能な粒子であ
る、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０５】
アーティクルがコロイド粒子である、請求項９４に記載
の方法。
【請求項１０６】
アーティクルが金コロイド粒子であり、その表面が結合
種が固定されているＳＡＭである、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０７】
アーティクルが粒子であり、方法が、凝集体を、結合種
の少なくとも一部に対して固定された又は固定されるように適応された追加の粒
子に曝露することを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０８】
結合種が、金属結合標識／金属／キレート連結を介して
アーティクル表面に固定されている又は固定されるように適応されている、請求
項９４に記載の方法。
【請求項１０９】
アッセイが、複数の個々に空間的にアドレス可能な領域
で実施される、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１０】
個々に空間的にアドレス可能な領域が多穴滴板の異なる
ウェルを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１１】
表面を有するアーティクルと；そして
凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを含むキットであって、
前記結合種の少なくとも一部は、前記表面に対して固定されている又は固定さ
れるように適応されており、前記表面は、凝集体形成種の非特異的結合を実質的
に阻害する化学官能性を有しているキット。
【請求項１１２】
化学官能性がトリエチレングリコール末端チオールであ
る、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１３】
表面が、タンパク質遮断ステップの不在下で、非特異的
結合を実質的に阻害する化学官能性を有する、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１４】
凝集体形成種が神経変性疾患に伴う、請求項１１１に記
載のキット。
【請求項１１５】
アーティクルが、液に懸濁可能な、単離可能な粒子であ
る、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１６】
アーティクルがコロイド粒子である、請求項１１１に記
載のキット。
【請求項１１７】
アーティクルが粒子であり、結合種の少なくとも一部に
対して固定された又は固定されるように適応された追加の粒子をさらに含む、請
求項１１１に記載のキット。
【請求項１１８】
結合種が、金属結合標識／金属／キレート連結を介して
表面に固定されている又は固定されるように適応されている、請求項１１５に記
載のキット。
【請求項１１９】
表面が自己集合単層を保持している、請求項１１１に記
載のキット。
【請求項１２０】
自己集合単層が、コロイド／コロイド自己凝集を阻害す
る種を含む、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
自己集合単層が荷電部分を含有する、請求項１２０に記
載のキット。
【請求項１２２】
自己集合単層がカルボキシ末端種を含有する、請求項１
２０に記載のキット。
【請求項１２３】
自己集合単層がポリエチレングリコールチオールを含有
する、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２４】
荷電部分が、ニトリロ三酢酸、２，２’−ビス（サリチ
リデンアミノ）−６，６’−デメチルジフェニル、又は１，８−ビス（ａ−ピリ
ジル）−３，６−ジチアオクタンを含む、請求項１２１に記載のキット。
【請求項１２５】
荷電部分がニトリロ三酢酸を含む、請求項１２４に記載
のキット。
【請求項１２６】
自己集合単層がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１
９に記載のキット。
【請求項１２７】
自己集合単層がＤＮＡ部分を含む、請求項１１９に記載
のキット。
【請求項１２８】
自己集合単層が荷電ペプチドを含む、請求項１１９に記
載のキット。
【請求項１２９】
自己集合単層が合成分子からなる、請求項１１９に記載
のキット。
【請求項１３０】
自己集合単層が、カルボキシ末端チオールを含む溶液か
ら表面上に付着された、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１３１】
溶液が界面活性剤を含有する、請求項１３０に記載のキ
ット。
【請求項１３２】
溶液が、カルボキシレート、カルボン酸塩、又はクエン
酸ナトリウムを含有する、請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３３】
自己集合単層が、コロイド粒子自体の形成中でないとき
に表面上に付着した、請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３４】
自己集合単層が、粒子が液−液界面に存在しない液中で
懸濁状態にある表面上に付着している、請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３５】
自己集合単層が、結合種又は結合種の結合パートナーの
固定を容易にする部分を末端に持つチオールをさらに含む混合自己集合単層であ
る、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１３６】
凝集体又は原線維を、結合種に固定可能な複数のコロイ
ドに曝露することによって前記コロイドを前記原線維又は凝集体に連結させるこ
とを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１３７】
曝露ステップが洗浄剤を含まない溶液中で行われる、請
求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
曝露ステップが吸収性表面の不在下で行われる、請求項
１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
コロイドの添加によって原線維又は凝集体を目視的に検
出可能にすることを含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４０】
目視的に検出可能なパラメータが溶液の色変化である、
請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
目視的に検出可能なパラメータが、目に見えるコロイド
−ペプチド細網の形成である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
コロイド−ペプチド凝集体が光散乱によって検出される
、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４３】
自己集合単層形成分子種及び界面活性剤を含有する媒体
に表面を曝露することによって、自己集合単層を表面に形成することを含む方法
。
【請求項１４４】
自己集合単層形成分子種及びカルボキシレートを含有す
る媒体に表面を曝露することによって、自己集合単層を表面に形成することを含
む方法。
【請求項１４５】
コロイド粒子自体の形成中でないときに自己集合単層を
コロイド粒子表面に形成することを含む方法。
【請求項１４６】
粒子が液−液界面に存在しない液中で懸濁状態にあるコ
ロイド粒子表面上に自己集合単層を形成することを含む方法。
【請求項１４７】
媒体が、自己集合単層形成分子種及び界面活性剤を含有
する溶液又は懸濁液である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４８】
表面に自己集合単層を形成後、自己集合単層から残存す
る界面活性剤をすべて除去することをさらに含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４９】
コロイド粒子を熱サイクルすることをさらに含む、請求
項１４３に記載の方法。
【請求項１５０】
少なくとも２個の結合種を提供し、各々は凝集体形成種
を結合でき、相互に固定されている又は相互に固定されるように適応されている
ことによって凝集体リンカーを規定し；そして、
前記リンカーを、凝集体形成種を含有すると考えられる試料、又は凝集に影響
を及ぼす候補薬を含有する溶液に曝露することを含む方法。
【請求項１５１】
結合種が、疾患に関係する凝集体形成種を結合できる、
請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
結合種が、神経変性疾患の凝集体形成種を結合できる、
請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
結合種が、非神経変性疾患の凝集体形成種を結合できる
、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５４】
凝集体形成種を産生できる生細胞を、凝集に影響を及ぼ
す候補薬に曝露し；そして
前記細胞によって産生された物質の凝集体形成のポテンシャルをモニタするこ
とを含む方法。
【請求項１５５】
細胞が産生した物質の凝集ポテンシャルを、凝集体を、
表面と、凝集体又は凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを有するアーティ
クルに曝露することによってモニタすることを含み、前記結合種は、前記アーテ
ィクル表面に対して固定されている又は固定されるように適応されている、請求
項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
凝集ポテンシャルのモニタリングが、溶液の色変化をモ
ニタすることによって達成される、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
凝集ポテンシャルのモニタリングが、コロイド−ペプチ
ド細網の形成程度をモニタすることによって達成される、請求項１５５に記載の
方法。
【請求項１５８】
細胞が候補薬に曝露されない、請求項１５４に記載の方
法。
【請求項１５９】
モニタリングステップが、細胞試料又は細胞周囲の液を
除去することを含まない、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１６０】
モニタリングステップが細胞の存在下で行われる、請求
項１５４に記載の方法。
【請求項１６１】
モニタリングステップの前に細胞が溶解される、請求項
１５４に記載の方法。
【請求項１６２】
細胞が疾患に関係する凝集体形成種を産生でき、前記細
胞によって産生された物質の、疾患に特徴的な凝集体形成のポテンシャルをモニ
タすることを含む、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１６３】
疾患が神経変性疾患である、請求項１５５に記載の方法
。
【請求項１６４】
疾患が非神経変性疾患である、請求項１５５に記載の方
法。
【請求項１６５】
凝集体形成種を結合できる種と、凝集体形成種を含有す
ると考えられる試料又は凝集に影響を及ぼす候補薬のうちの一つを含有する溶液
を作成し；そして
いかなる成分も前記溶液に移したり、容器から前記溶液を除去したりすること
なく、前記溶液中の凝集を検出することを含む方法。
【請求項１６６】
種が疾患に関係する凝集体形成種を結合でき、方法が疾
患に特徴的な凝集を検出することを含む、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
疾患が神経変性疾患である、請求項１６６に記載の方法
。
【請求項１６８】
疾患が非神経変性疾患である、請求項１６６に記載の方
法。
【請求項１６９】
液にエネルギーを導入することをさらに含む、請求項１
６５に記載の方法。
【請求項１７０】
少なくとも２個の粒子を含み、各々が凝集体形成種に対
して固定されている系。
【請求項１７１】
少なくとも２個の粒子の各々が、凝集体形成種を結合し
ている結合種に固定されている、請求項１７０に記載の系。
【請求項１７２】
少なくとも２個の粒子を含み、各々が疾患に関係する凝
集体形成種に対して固定されている、請求項１７０に記載の系。
【請求項１７３】
凝集体を含み、少なくとも２個の粒子が前記凝集体に対
して固定されている系。
【請求項１７４】
凝集体が疾患に関係する凝集体である、請求項１７３に
記載の系。
【請求項１７５】
第一の表面と、前記表面に対して固定された又は固定さ
れるように適応された、凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを有するアー
ティクルを用意し；そして
前記第一の表面を、凝集体形成種を含有している又は含有すると考えられる試
料に曝露することを含む方法。
【請求項１７６】
結合種が疾患に関係する凝集体形成種を結合できる、請
求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
疾患が神経変性疾患である、請求項１７６に記載の方法
。
【請求項１７８】
疾患が非神経変性疾患である、請求項１７６に記載の方
法。
【請求項１７９】
表面が粒子の表面であり、方法が、
粒子に対して固定された結合種を保持している複数の粒子を用意し；そして
前記粒子を試料に曝露することを含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８０】
試料中に存在する凝集体形成種を示す、粒子の凝集程度
を測定することをさらに含む、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
表面が粒子の表面であり、方法が、
複数の粒子と、前記粒子の表面に固定された又は固定されるように適応された
結合種とを用意し；そして
前記粒子及び結合種を試料に曝露することを含む、請求項１７５に記載の方法
。
【請求項１８２】
結合種及び試料が、異なる生物学的種から得られる、請
求項１７９に記載の方法。
【請求項１８３】
結合種及び試料が、異なる生物学的種に由来する同じタ
ンパク質又はタンパク質フラグメントである、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８４】
粒子の凝集程度を測定することをさらに含む、請求項１
７９に記載の方法。
【請求項１８５】
試料が凝集体形成種を含有し、曝露ステップが、凝集体
形成に影響を及ぼすと考えられる候補薬の存在下で、粒子と結合種を試料に曝露
することを含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
試料が細胞によって産生される、請求項１８５に記載の
方法。
【請求項１８７】
粒子の凝集程度を測定することをさらに含む、請求項１
８６に記載の方法。
【請求項１８８】
まず、試料を産生する細胞を、凝集体形成に影響を及ぼ
すと考えられる候補薬に曝露し、次に、粒子及び結合種を試料に曝露することを
含む、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
細胞を溶解して試料を製造することをさらに含む、請求
項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
候補薬が、疾患を阻害すると考えられる、請求項１８８
に記載の方法。
【請求項１９１】
候補薬が、神経変性疾患を阻害すると考えられる、請求
項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
薬物が、神経変性疾患につながる活性を備えた酵素を阻
害すると考えられる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９３】
薬物が、神経変性疾患につながる細胞プロセスを阻害す
ると考えられる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９４】
候補薬がβ−セクレターゼを阻害すると考えられる、請
求項１９２に記載の方法。
【請求項１９５】
候補薬がγ−セクレターゼを阻害すると考えられる、請
求項１９２に記載の方法。
【請求項１９６】
曝露ステップが、１〜３８ないし１〜４４のアミノ酸配
列を含むβ−アミロイドの存在下で、粒子を試料に曝露することを含む、請求項
１８５に記載の方法。
【請求項１９７】
β−アミロイドペプチドが１〜４０のアミノ酸配列を含
む、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
曝露ステップが、粒子を、神経変性疾患に関係している
と考えられる試料から得られた生物学的検体に曝露することを含む、請求項１８
０に記載の方法。
【請求項１９９】
検体を粒子及び結合種に曝露することを含む、請求項１
９８に記載の方法。
【請求項２００】
試料が血液試料を含む、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０１】
試料がヒト患者から得られる、請求項１９８に記載の方
法。
【請求項２０２】
試料が動物から得られる、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０３】
試料が家畜から得られる、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０４】
試料が家畜飼料から得られる、請求項１９８に記載の方
法。
【請求項２０５】
試料が臓器供与試料である、請求項１９８に記載の方法
。
【請求項２０６】
試料がヒトの消費に適した食物である、請求項１９８に
記載の方法。
【請求項２０７】
試料がヒト又は動物の消費に適した液である、請求項１
９８に記載の方法。
【請求項２０８】
試料が乳である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０９】
試料が水である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１０】
粒子を試料に曝露したときに試料の目に見える変化を観
察することをさらに含む、請求項１８０に記載の方法。
【請求項２１１】
目に見える変化が粒子の凝集を含む、請求項２１０に記
載の方法。
【請求項２１２】
目に見える変化が金コロイド粒子の凝集を含む、請求項
２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
目に見える変化が色の変化を含む、請求項２１０に記載
の方法。
【請求項２１４】
粒子を試料に曝露したときに、粒子／集塊物の有効寸法
の変化を光散乱装置を用いて測定することをさらに含む、請求項１８０に記載の
方法。
【請求項２１５】
試料の画像をデジタル化し、次いでパターン認識を用い
て前記試料が凝集体を含有するかどうかを判定することを含む、請求項１８０に
記載の方法。
【請求項２１６】
結合種が、表面に固定されていない補助的な凝集体形成
種又は原線維形成種の不在下で、粒子／粒子曝露時の粒子凝集をある時間枠内遅
らせるほど低い表面濃度で前記粒子表面に対して固定されている結果、補助的な
凝集体形成種又は原線維形成種の不在下での凝集を、補助的な凝集体形成種又は
原線維形成種の存在下での凝集と比較できる、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１７】
結合種と、試料中に存在する任意の凝集体形成種又は原
線維形成種との相互作用を測定することをさらに含む、請求項１７５に記載の方
法。
【請求項２１８】
結合種及び試料が異なる生物学的種である、請求項１７
５に記載の方法。
【請求項２１９】
粒子に対して固定され、凝集体形成種に結合する結合種
の存在下で、表面を試料に曝露することを含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項２２０】
前記粒子が、補助的なシグナリング実体を保持している
、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
補助的シグナリング実体が、染料、顔料、電気活性分子
、蛍光部分、アップレギュレーティングリン光体、又は西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ及びアルカリホスファターゼを含む酵素固定シグナリング部分を含む、請求
項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
表面が電極の表面であり、粒子が前記表面に対して固定
された電気活性種を保持している、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２３】
粒子が、複数の固定された電気活性種を保持している、
請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
複数の電気活性種がメタロセンを含む、請求項２２３に
記載の方法。
【請求項２２５】
複数の電気活性種がフェロセン又はフェロセン誘導体を
含む、請求項２２３に記載の方法。
【請求項２２６】
アーティクルが磁気ビーズである、請求項１７５に記載
の方法。
【請求項２２７】
アーティクルがＳＰＲチップである、請求項１７５に記
載の方法。
【請求項２２８】
アーティクルが電極である、請求項１７５に記載の方法
。
【請求項２２９】
アーティクルがＥＬＩＳＡプレートである、請求項１７
５に記載の方法。
【請求項２３０】
表面が、複数の個々に空間的にアドレス可能な領域を含
む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項２３１】
個々に空間的にアドレス可能な領域が多穴滴板の異なる
ウェルを含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２３２】
試料を、凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の存在下で、
表面に曝露することを含む、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３３】
候補薬の存在に起因する、凝集体形成種と表面に固定さ
れた結合種との相互作用の低下を観察することをさらに含む、請求項２３２に記
載の方法。
【請求項２３４】
試料が、凝集体形成種を含有する薬物スクリーニング製
剤である、請求項１７５に記載の方法。
【請求項２３５】
表面が粒子の表面であり、方法が、
結合種と、前記結合種に固定可能な粒子と、前記結合種に固定可能な磁気ビー
ズとを液媒体中に懸濁された状態で含む組成物を形成し；そして
前記組成物を試料に曝露することを含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項２３６】
粒子及び／又は磁気ビーズが固定されたキレートを保持
し、結合種の少なくとも一部が、キレートに配位されている金属に固定可能な金
属結合標識を保持している、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
粒子及びビーズの少なくとも一部が結合種に固定されて
いる、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３８】
組成物がさらに、粒子に固定された又は固定可能なレド
ックス活性種を含む、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３９】
組成物を、凝集体形成種及び凝集体の形成に影響を及ぼ
す候補薬を含有する試料に曝露することをさらに含む、請求項２３５に記載の方
法。
【請求項２４０】
レドックス活性剤を保持している粒子に固定された凝集
体形成種又は原線維形成種に固定されている磁気ビーズの少なくとも一部を電極
に引き寄せ、電極に近接するレドックス活性剤の存在を測定することをさらに含
む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４１】
方法を磁気ビーズの不在下で実施し、コロイド−ペプチ
ド細網を電極上に沈殿させることを含む、請求項２４０に記載の方法。
【請求項２４２】
方法を磁気ビーズの不在下で実施し、電極が、信号を出
すコロイド−ペプチド細網を電極に誘引するために、凝集体形成種を結合できる
結合種を提示することを含む、請求項２４０に記載の方法。
【請求項２４３】
電極が非特異的結合阻害物質で被覆されている、請求項
２４０に記載の方法。
【請求項２４４】
非特異的結合阻害物質が自己集合単層を含む、請求項２
４３に記載の方法。
【請求項２４５】
自己集合単層が、ポリエチレングリコール末端自己集合
単層形成種を含む、請求項２４４に記載の方法。
【請求項２４６】
自己集合単層が、電子に対する自己集合単層の透過性を
向上させる種をさらに含む、請求項２４４に記載の方法。
【請求項２４７】
電子に対する透過性を向上させる種が、導電性の自己集
合単層形成種を含む、請求項２４６に記載の方法。
【請求項２４８】
電子に対する透過性を向上させる種が、自己集合単層中
に欠陥部位を生じさせる種を含む、請求項２４６に記載の方法。
【請求項２４９】
凝集体形成種を結合できる結合種と；
前記結合種に対して固定された電子シグナリング実体とを含む組成物。
【請求項２５０】
結合種が、神経変性疾患の凝集体形成種を結合できる、
請求項２４９に記載の組成物。
【請求項２５１】
第一の表面に対して固定された又は固定されるように適
応された結合種を用意し、前記結合種は神経変性疾患の凝集体形成種ではないが
、神経変性疾患の凝集体形成種を結合でき；そして
前記結合種を神経変性疾患の凝集体形成種に変換することを含む方法。
【請求項２５２】
結合種に、他の結合種を神経変性疾患の凝集体形成種に
変換させることをさらに含む、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５３】
結合種を、神経変性疾患の凝集体形成種と相互作用させ
、それによって構造的に神経変性疾患の凝集体形成種に変換し、次いでその種に
他の結合種を変換させることを含む、請求項２５２に記載の方法。
【請求項２５４】
系を、神経変性疾患の凝集体形成種でない、表面に結合
していない補助的結合種に曝露し、前記補助的結合種を神経変性疾患の凝集体形
成種に変換させることを含む、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５５】
結合種が当初アーティクル表面に固定されている、請求
項２５１に記載の方法。
【請求項２５６】
結合種が当初アーティクル表面に固定されていない、請
求項２５１に記載の方法。
【請求項２５７】
神経変性疾患の凝集体形成種を結合でき、アーティクル
表面に固定された又は固定されるように適応された結合種を用意し；
場合により前記結合種を前記アーティクル表面に固定させ；
前記結合種を凝集体形成種に変換せずに、前記結合種に神経変性疾患の凝集体
形成種を結合させ；そして
第二のアーティクル表面に固定された又は固定されるように適応された第二の
結合種に凝集体形成種を結合させる
ことを含む方法。
【請求項２５８】
結合種及び神経変性疾患の凝集体形成種が、生物学的分
類上異なる種に由来する、請求項２５７に記載の方法。
【請求項２５９】
神経変性疾患の凝集体形成種ではないが、神経変性疾患
の凝集体形成種を結合できる結合種を用意し；
前記結合種を神経変性疾患の凝集体形成種と相互作用させることによって神経
変性疾患の凝集体形成種に変換し、神経変性疾患の凝集体形成種の存在に特徴的
な凝集に参加させ；そして
神経変性疾患の凝集体形成種の存在に特徴的な凝集を検出する
ことを含む方法。
【請求項２６０】
アーティクルの表面と；
表面に固定された、凝集体形成種を結合できる結合種と；
表面に固定されたシグナリング実体と
を含むアーティクル。
【請求項２６１】
結合種が神経変性疾患の凝集体形成種を結合できる、請
求項２６０に記載アーティクル。
【請求項２６２】
表面を有するアーティクルと；
自己集合単層を介して表面に固定された又は固定されるように適応された、凝
集体形成種を結合できる複数の結合種と
を含むキット。
【請求項２６３】
少なくとも２個の粒子の各々が、粒子に固定され且つ凝
集体を結合している結合種を介して、凝集体に対して固定されている、請求項１
７３に記載の系。
【請求項２６４】
少なくとも２個の粒子に対して固定された凝集体を含み
、前記粒子の少なくとも１個が第二の凝集体に対して固定されている、請求項２
６３に記載の系。
【請求項２６５】
粒子と凝集体がヒトの肉眼に見える構造を形成する、請
求項２６４に記載の系。
【請求項２６６】
シグナリング実体が多数のシグナリング実体である、請
求項２６０に記載のアーティクル。
【請求項２６７】
原線維又は凝集体を目に見えるようにする、請求項１に
記載の方法。
【請求項２６８】
試料が天然試料である、請求項１７５に記載の方法。
【請求項２６９】
試料が、構造が予め決められた試料である、請求項１７
５に記載の方法。
【請求項２７０】
凝集体関連の状態の危険性がある又はその治療が適応さ
れるヒト又は動物患者に、前記状態を治療するための候補薬を投与し；そして
前記患者から採取した試料を、状態の治療における候補薬の有効性を示すアッ
セイに曝露する
ことを含む方法。
【請求項２７１】
ヒト又は動物が、凝集体関連疾患の危険性がある又はそ
の治療が適応され、方法が、試料を、凝集の阻害における候補薬の有効性を示す
アッセイに曝露することを含む、請求項２７０に記載の方法。
【請求項２７２】
ヒト又は動物が、凝集体関連疾患の危険性がある又はそ
の治療が適応され、方法が、試料を、凝集の増強における候補薬の有効性を示す
アッセイに曝露することを含む、請求項２７０に記載の方法。
【請求項２７３】
ヒト又は動物患者が、神経変性疾患の危険性がある又は
その治療が適応され、方法が、試料を、神経変性疾患の抑制又は治療における候
補薬の有効性を示すアッセイに曝露することを含む、請求項２７０に記載の方法
。
【請求項２７４】
試料を、試料の凝集ポテンシャルを示すアッセイに曝露
することを含む、請求項２７０に記載の方法。
【請求項２７５】
ポリアミノ酸標識を含む、１〜３８ないし１〜４２のβ
−アミロイドペプチドを含む組成物。
【請求項２７６】
第一のコロイド粒子を、第二のコロイド粒子に対して、
第一のコロイド粒子に固定された又は固定されるように適応された第一の化学又
は生物学的種と、第二のコロイド粒子に固定された又は固定されるように適応さ
れた第二の化学又は生物学的種との間の結合相互作用によって固定させ；そして
第一のコロイド粒子の第二のコロイド粒子に対する固定化を測定する
ことを含む方法。
【請求項２７７】
方法を、結合相互作用に影響を及ぼす候補薬の存在下で
実施することを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項２７８】
第一のコロイド粒子を、第二のコロイド粒子に対して、
第一のコロイド粒子に対して固定された又は固定されるように適応された第一の
化学又は生物学的種と、第二のコロイド粒子に対して固定された又は固定される
ように適応された第二の化学又は生物学的種との間の結合相互作用によって固定
させ、ただし前記結合相互作用は、第一の核酸配列の相補核酸配列への結合は関
与していない；そして
第一のコロイド粒子の第二のコロイド粒子に対する固定化を測定する
ことを含む方法。
【請求項２７９】
第一のコロイド粒子を、第二のコロイド粒子に対して、
第一のコロイド粒子に対して固定された又は固定されるように適応された第一の
化学又は生物学的種と、第二のコロイド粒子に対して固定された又は固定される
ように適応された第二の化学又は生物学的種との間の結合相互作用によって固定
させ、前記第一のコロイド粒子は第二に、粒子を介して、少なくとも一つの自己
集合単層を介して連結し；そして
第一のコロイド粒子の第二のコロイド粒子に対する固定化を測定する
ことを含む方法。
【請求項２８０】
第一及び第二の化学又は生物学的種は、それぞれ第一及
び第二のコロイド粒子に対して自己集合単層を介して固定されている、請求項２
７９に記載の方法。
【請求項２８１】
測定ステップが、溶液の色の変化をモニタすることを含
む、請求項２８０に記載の方法。
【請求項２８２】
方法を、結合相互作用に影響を及ぼす薬物候補の存在下
で実施することを含む、請求項２７９に記載の方法。
【請求項２８３】
固定された発光種又は吸光種を保持している第一のコロ
イド粒子を用意し；
固定された発光種又は吸光種の発光又は吸光に影響を及ぼす能力を有する第二
の種を保持している第二のコロイド粒子を、第一のコロイド粒子に接近させ、前
記第二の種に、固定された発光種又は吸光種の発光又は吸光に影響を及ぼさせ、
少なくとも１個のコロイドは自己集合単層で誘導体化されている
ことを含む方法。
【請求項２８４】
前記発光種が蛍光種であり、方法が、第二の種に、固定
された種の蛍光に影響を及ぼさせることを含む、請求項２８３に記載の方法。
【請求項２８５】
第一のコロイド粒子に対して固定された種と、第二のコ
ロイド粒子に対して固定された種との間に結合事象を発生させることによって、
第二のコロイド粒子を第一のコロイド粒子に接近させることを含む、請求項２８
３に記載の方法。
【請求項２８６】
第一のコロイド粒子に固定された第一の種を、第二のコ
ロイド粒子に対して固定された第二の種に対して固定させることによって、第二
のコロイド粒子を第一のコロイド粒子に接近させることを含む、請求項２８３に
記載の方法。
【請求項２８７】
第一及び第二の種を相互に結合させる、請求項２８６に
記載の方法。
【請求項２８８】
第一及び第二の種を相互に特異的に結合させる、請求項
２８７に記載の方法。
【請求項２８９】
第一及び第二の種を共通の物質に結合させることを含む
、請求項２８７に記載の方法。
【請求項２９０】
共通の物質が共通のコロイド粒子である、請求項２８９
に記載の方法。
【請求項２９１】
共通の物質が生物学的材料の表面である、請求項２８９
に記載の方法。
【請求項２９２】
生物学的材料が腫瘍である、請求項２９１に記載の方法
。
【請求項２９３】
生物学的材料が細胞である、請求項２９１に記載の方法
。
【請求項２９４】
生物学的材料がタンパク質複合体である、請求項２９１
に記載の方法。
【請求項２９５】
第一のコロイド粒子に固定された第一の種と、第二のコ
ロイド粒子に固定された第二の種を、それぞれ共通の生物学的標的に特異的に結
合させることによって、第二のコロイド粒子を第一のコロイド粒子に接近させる
ことを含む、請求項２８３に記載の方法。
【請求項２９６】
第二の種に、第一の種の発光を消光させることを含む、
請求項２８３に記載の方法。
【請求項２９７】
第二の種に、第一の種の発光を増強させることを含む、
請求項２８３に記載の方法。
【請求項２９８】
第二の種に、発光種の発光又は吸光の波長をシフトさせ
ることを含む、請求項２８３に記載の方法。
【請求項２９９】
結合相互作用が酵素によって影響される、請求項２７６
又は２７９に記載の方法。
【請求項３００】
前記酵素がカスパーゼである、請求項２９９に記載の方
法。
【請求項３０１】
酵素活性に影響を及ぼす薬物候補の存在下で方法を実施
することを含む、請求項３００に記載の方法。
【請求項３０２】
酵素がカルパインである、請求項２９９に記載の方法。
【請求項３０３】
酵素活性に影響を及ぼす薬物候補の存在下で方法を実施
することを含む、請求項３０２に記載の方法。
【請求項３０４】
酵素に第一及び第二種間の結合相互作用を促進させ、次
いで少なくとも１個のコロイド粒子を、少なくとも１個の第一又は第二の種に固
定させることを含む、請求項２９９に記載の方法。
【請求項３０５】
第一のコロイド粒子と、第二のコロイド粒子と、前記第
一のコロイド粒子に対して固定された又は固定されるように適応された第一の化
学又は生物学的種と、前記第二のコロイド粒子に対して固定された又は固定され
るように適応された第二の化学又は生物学的種とを用意し；
前記第一及び第二の化学又は生物学的種を、第一の化学又は生物学的種と第二
の化学又は生物学的種との連結を促進する能力を有する、又はその能力を有する
と考えられる酵素に曝露し；そして
第一の化学又は生物学的種と第二の化学又は生物学的種との連結における酵素
活性を示す、第一のコロイド粒子の第二のコロイド粒子に対する固定化又は非固
定化を測定する
ことを含む方法。
【請求項３０６】
酵素がカスパーゼである、請求項３０４に記載の方法。
【請求項３０７】
酵素がカルパインである、請求項３０４に記載の方法。
【請求項３０８】
測定ステップが、第一のコロイド粒子の第二のコロイド
粒子に対する固定化を示す色の変化を測定することを含む、請求項２７６又は２
７９に記載の方法。
【請求項３０９】
第一のコロイド粒子の第二のコロイド粒子に対する固定
化を、目に見える細網の測定によって測定することを含む、請求項２７６又は２
７９に記載の方法。
【請求項３１０】
被検体を含有すると考えられる試料を、第一の化学又は
生物学的種に対して固定された又は固定されるように適応された第一のコロイド
粒子及び第二の化学又は生物学的種に対して固定された又は固定されるように適
応された第二のコロイド粒子に曝露し、前記第一及び第二の化学又は生物学的種
はそれぞれ被検体に固定する能力を有しており；そして
試料中に被検体の存在を示す、第一のコロイド粒子の第二のコロイド粒子に対
する固定化を測定する
ことを含む方法。
【請求項３１１】
第一及び第二のコロイド粒子を、前記コロイド粒子を相
互に固定する能力を有する複数の化学又は生物学的種と、少なくとも一つの結合
相互作用を分断することによって第一及び第二のコロイド粒子の相互の固定を阻
止する候補薬とに曝露し；そして
候補薬の結合相互作用の分断における有効性を示す、第一及び第二のコロイド
粒子の相互の固定化を測定する
ことを含む方法。
【請求項３１２】
化学又は生物学的種が、少なくとも一つの自己集合単層
を介してコロイド粒子を相互に固定する能力を有する、請求項３１１に記載の方
法。
【請求項３１３】
第一及び第二のコロイド粒子を、それぞれ第一及び第二
のコロイド粒子に固定された又は固定されるように適応された第一及び第二の種
に曝露することを含み、前記第一及び第二の化学又は生物学的種が、相互に特異
的に結合する能力を有し、候補薬が前記第一及び第二の化学又は生物学的種間の
特異的結合の分断の候補である、請求項３１１に記載の方法。
【請求項３１４】
第一及び第二のコロイド粒子を、それぞれ第一及び第二
のコロイド粒子に対して固定された又は固定されるように適応された第一及び第
二の化学又は生物学的種、及び前記第一及び第二の化学又は生物学的種に結合す
る能力を有する第三の種に曝露することを含み、候補薬が前記第一及び第二の化
学又は生物学的種のうちの一つと前記第三の種との間の結合を分断するためのも
のである、請求項３１１に記載の方法。
【請求項３１５】
第一及び第二の化学又は生物学的種がＲＧＤ−含有モチ
ーフを含み、第三の種がエンドスタチンを含む、請求項３１４に記載の方法。
【請求項３１６】
第一のコロイド粒子と、前記第一のコロイド粒子に対し
て固定された又は固定されるように適応された第一の化学又は生物学的種と、第
二のコロイド粒子と、前記第二のコロイド粒子に対して固定された又は固定され
るように適応された第二の化学又は生物学的種と、第三の粒子と、前記第三のコ
ロイド粒子に対して固定された又は固定されるように適応された第三の化学又は
生物学的種とを用意し、前記第一及び第二の化学又は生物学的種はそれぞれ前記
第三の化学又は生物学的種に連結する能力を有しており；そして
第一及び第二の化学又は生物学的種の各々と第三の化学又は生物学的種との間
の結合を介して、第一のコロイド粒子の第二のコロイド粒子に対する固定化を測
定する
ことを含む方法。
【請求項３１７】
第一、第二、及び第三のコロイド粒子を、第一又は第二
の化学又は生物学的種と第三の化学又は生物学的種との間の結合相互作用を分断
する候補薬の存在下で、互いに曝露することを含む、請求項３１４又は３１６に
記載の方法。
【請求項３１８】
第一及び第二の化学又は生物学的種の各々がビトロネク
チンから誘導され、第三の化学又は生物学的種がアンギオスタチンである、請求
項３１６に記載の方法。
【請求項３１９】
第一及び第二の化学又は生物学的種の各々がビトロネク
チンであり、第三の化学又は生物学的種がアンギオスタチンであり、候補薬がビ
トロネクチン／アンギオスタチン結合を分断するための候補である、請求項３１
７に記載の方法。
【請求項３２０】
凝集体形成種を含有している又は含有していると考えら
れる；又は凝集体形成種の前駆体を含有している又は含有していると考えられる
；又は凝集体形成種を産生できる又は産生できると考えられる；又は凝集体形成
種の前駆体を産生できる又は産生できると考えられる第一の試料を、第一の試料
の凝集プロセスへの関与傾向に影響を及ぼす能力を有していると考えられる第二
の試料に曝露し；そして
第二の試料の、第一の試料の凝集プロセスへの関与傾向に影響を及ぼす能力を
測定する
ことを含む方法。
【請求項３２１】
第一の試料を、第二の試料に、第一の試料の凝集プロセ
スへの関与傾向に影響を及ぼす第二の試料の能力を緩和する候補薬の存在下で、
曝露することを含む、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２２】
測定ステップが、第一の試料の凝集ポテンシャルを測定
することを含む、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２３】
第一の試料が、疾患に関係する凝集体形成種を含有して
いる又は含有していると考えられる、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２４】
疾患が神経変性疾患である、請求項３２３に記載の方法
。
【請求項３２５】
第一の試料が、凝集体形成種であるタンパク質又はペプ
チドを含む、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２６】
第一の試料が、凝集体形成種であるタンパク質又はペプ
チドの前駆体を含む、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２７】
第一の試料が、凝集体形成種であるタンパク質又はペプ
チドを産生する細胞から誘導された種を含む、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２８】
第一の試料が、細胞から分泌された物質を含む、請求項
３２７に記載の方法。
【請求項３２９】
第一の試料が、細胞の溶解産物又はそのフラクションを
含む、請求項３２７に記載の方法。
【請求項３３０】
第二の試料が、凝集体形成種でなく、凝集体形成種の前
駆体でもない、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３３１】
第二の試料が、天然、合成、又はクローン化されたタン
パク質、ペプチド、核酸、又は酵素である、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３３２】
第二の試料が細胞から誘導されている、請求項３３１に
記載の方法。
【請求項３３３】
第二の試料が、細胞から誘導された物質を含む、請求項
３３１に記載の方法。
【請求項３３４】
測定ステップが、コロイド粒子に対して固定された結合
種の、凝集体又は凝集体形成種への結合によるコロイド粒子の凝集を測定するこ
とを含む、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３３５】
それぞれが表面と、前記表面に対して固定された又は固
定されるように適応された、凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを有する
複数の粒子を用意し；
前記粒子と前記結合種を、凝集体形成に影響を及ぼすと考えられる候補薬に曝
露し；
凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の第一の時点における有効性を示す、前記粒
子の第一の観察可能な特徴を測定し；そして
凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の第二の時点における有効性を示す、前記粒
子の第二の観察可能な特徴を測定する
ことを含む方法。
【請求項３３６】
候補薬が凝集体形成を阻害すると考えられ、測定ステッ
プが、凝集体形成を阻害する候補薬の第一及び第二の時点における有効性を示す
、粒子の第一及び第二の観察可能な特徴を測定することを含む、請求項３３５に
記載の方法。
【請求項３３７】
結合種が神経変性疾患の凝集体形成種を結合でき、候補
薬が神経変性疾患の凝集体形成を阻害すると考えられ、測定ステップが、神経変
性疾患の凝集体形成を阻害する候補薬の第一及び第二の時点における有効性を示
す、粒子の第一及び第二の観察可能な特徴を測定することを含む、請求項３３５
に記載の方法。
【請求項３３８】
粒子、結合種、及び候補薬を補助的な凝集体形成種に曝
露することをさらに含む、請求項３３５に記載の方法。
【請求項３３９】
第一及び第二の観察可能な特徴の少なくとも一つが、直
接目で確認可能な変化である、請求項３３５に記載の方法。
【請求項３４０】
第一及び第二の観察可能な特徴の少なくとも一つが、色
の変化である、請求項３３９に記載の方法。
【請求項３４１】
第一及び第二の観察可能な特徴の少なくとも一つが、肉
眼で確認可能である、請求項３３５に記載の方法。
【請求項３４２】
第一及び第二の時点の差が少なくとも１日である、請求
項３３５に記載の方法。
【請求項３４３】
第一及び第二の時点の差が少なくとも１．５日である、
請求項３３５に記載の方法。
【請求項３４４】
第一及び第二の時点の差が少なくとも２日である、請求
項３３５に記載の方法。
【請求項３４５】
第一及び第二の時点の差が２０分を超えない、請求項３
３５に記載の方法。
【請求項３４６】
第一及び第二の時点の差が１０分を超えない、請求項３
３５に記載の方法。
【請求項３４７】
第一及び第二の時点の差が５分を超えない、請求項３３
５に記載の方法。
【請求項３４８】
第一及び第二の時点の差が１分を超えない、請求項３３
５に記載の方法。
【請求項３４９】
第一及び第二の時点の差が３０秒を超えない、請求項３
３５に記載の方法。
【請求項３５０】
第一及び第二の測定ステップ中及び第一及び第二の測定
ステップ間に、アッセイを分断／撹乱することなく、また外部エネルギーをアッ
セイに曝露することなく、第一の観察可能な特徴を測定し、第二の観察可能な特
徴を測定することを含む、請求項３３５に記載の方法。
【請求項３５１】
凝集体形成に影響を及ぼすと考えられる候補薬を、第一
組の条件下で、それぞれが表面と、前記表面に対して固定された又は固定される
ように適応された、凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを有する複数の粒
子に曝露し、前記第一組の条件下で凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の有効性を
示す、前記粒子の観察可能な特徴を測定し；
前記候補薬を、第二組の条件下で、それぞれが表面と、前記表面に対して固定
された又は固定されるように適応された、凝集体形成種を結合できる複数の結合
種とを有する複数の粒子に曝露し；そして
前記第二組の条件下で凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の有効性を示す、前記
粒子の観察可能な特徴を測定する
ことを含む方法。
【請求項３５２】
候補薬が凝集体形成を阻害すると考えられ、測定ステッ
プが、凝集体形成を阻害する候補薬の有効性を示す、粒子の観察可能な特徴を測
定することを含む、請求項３５１に記載の方法。
【請求項３５３】
候補薬が神経変性疾患の凝集体形成を阻害すると考えら
れ、測定ステップが、神経変性疾患の凝集体形成を阻害する候補薬の有効性を示
す、粒子の観察可能な特徴を測定することを含む、請求項３５１に記載の方法。
【請求項３５４】
第一組の条件が第一の時点であり、第二組の条件が第二
の時点である、請求項３５１に記載の方法。
【請求項３５５】
第一組の条件が凝集の第一段階であり、第二組の条件が
凝集の第二段階である、請求項３５１に記載の方法。
【請求項３５６】
複数の粒子及び結合種が溶液中にある、請求項３５１に
記載の方法。
【請求項３５７】
凝集の第一及び第二段階の観察可能な特徴の測定ステッ
プが、溶液の色を測定することを含む、請求項３５６に記載の方法。
【請求項３５８】
凝集の第一及び第二段階の観察可能な特徴の測定ステッ
プが、機器を通して色変化を観察することを含む、請求項３５７に記載の方法。
【請求項３５９】
凝集の第一及び第二段階の観察可能な特徴の測定ステッ
プが、凝集体の相対的寸法を測定することを含む、請求項３５３に記載の方法。
【請求項３６０】
凝集体の相対的寸法が顕微鏡検査によって測定される、
請求項３５９に記載の方法。
【請求項３６１】
凝集の第一及び第二段階の観察可能な特徴の測定ステッ
プが、凝集体の分子量を測定することを含む、請求項３５３に記載の方法。
【請求項３６２】
第一組の条件が第一のペプチド濃度を含み、第二組の条
件が第二のペプチド濃度を含む、請求項３５１に記載の方法。
【請求項３６３】
第一及び第二組の条件のいずれかが、低濃度又は高濃度
のペプチドを含む、請求項３６２に記載の方法。
【請求項３６４】
第一組の条件が第一の種類の結合種を含み、第二組の条
件が第二の種類の結合種を含む、請求項３５１に記載の方法。
【請求項３６５】
凝集体の形成段階を測定し；そして
凝集体又は凝集体形成の段階を疾患の段階と相関させる
ことを含む方法。
【請求項３６６】
疾患が神経変性疾患である、請求項３６５に記載の方法
。
【請求項３６７】
それぞれが表面と、前記表面に対して固定された又は固
定されるように適応された、凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを有する
複数の粒子を用意し；
前記粒子を、凝集体形成に影響を及ぼすと考えられる候補薬の存在下で、凝集
体形成種を含有する試料に曝露し；そして
曝露ステップの少なくとも５時間後に、凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の有
効性を示す、前記粒子の凝集程度を測定する
ことを含む方法。
【請求項３６８】
それぞれが表面と、前記表面に固定された又は固定され
るように適応された、神経変性疾患の凝集体形成種を結合できる複数の結合種と
を有する複数の粒子を用意し；
前記粒子を、神経変性疾患の凝集体形成を阻害すると考えられる候補薬の存在
下で、神経変性疾患の凝集体形成種を含有する試料に曝露し；そして
曝露ステップの少なくとも５時間後に、凝集体形成を阻害する候補薬の有効性
を示す、前記粒子の凝集程度を測定する
ことを含む、請求項３６７に記載の方法。
【請求項３６９】
凝集程度を、曝露ステップ後１０時間してから測定する
ことを含む、請求項３６７に記載の方法。
【請求項３７０】
凝集程度を、曝露ステップ後１５時間してから測定する
ことを含む、請求項３６７に記載の方法。
【請求項３７１】
凝集程度、曝露ステップ後２０時間してから測定するこ
とを含む、請求項３６７に記載の方法。
【請求項３７２】
それぞれが表面と、前記表面に固定された又は固定され
るように適応された、凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを有する複数の
粒子を用意し；
前記粒子を、神経変性疾患の凝集体形成に影響を及ぼすと考えられる候補薬の
存在下で、凝集体形成種を含有する試料に曝露し；そして
曝露ステップ後１分以内に、凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の有効性を示す
、前記粒子の凝集程度を測定する
ことを含む方法。
【請求項３７３】
それぞれが表面と、前記表面に固定された又は固定され
るように適応された、神経変性疾患の凝集体形成種を結合できる複数の結合種と
を有する複数の粒子を用意し；
前記粒子を、神経変性疾患の凝集体形成を阻害すると考えられる候補薬の存在
下で、神経変性疾患の凝集体形成種を含有する試料に曝露し；
曝露ステップ後１分以内に、凝集体形成を阻害する候補薬の有効性を示す、前
記粒子の凝集程度を測定する
ことを含む、請求項３７２に記載の方法。
【請求項３７４】
凝集程度を、曝露ステップ後３０秒以内に測定すること
を含む、請求項３７２に記載の方法。
【請求項３７５】
凝集程度を、曝露ステップ後１０秒以内に測定すること
を含む、請求項３７２に記載の方法。
【請求項３７６】
疾患過程の第一段階を示す症状を呈する第一の患者に、
疾患治療のために第一の薬物を投与し（前記第一の薬物は、凝集体形成に影響を
及ぼすポテンシャルを示すアッセイに曝露すると、凝集体形成への影響に関して
第一の特徴を示す）；そして
疾患過程の第二段階を示す症状を呈する第二の患者に、疾患治療のために第二
の薬物を投与する（前記第二の薬物は、前記アッセイに曝露すると、凝集体形成
への影響に関して第二の特徴を示す）
ことを含む方法。
【請求項３７７】
神経変性疾患過程の第一段階を示す症状を呈する第一の
患者に、疾患治療のために第一の薬物を投与し（前記第一の薬物は、凝集体形成
の阻害を示すアッセイに曝露すると、凝集体形成の阻害に関して第一の特徴を示
す）；そして
神経変性疾患過程の第二段階を示す症状を呈する第二の患者に、疾患治療のた
めに第二の薬物を投与する（前記第二の薬物は、前記アッセイに曝露すると、凝
集体形成の阻害に関して第二の特徴を示す）
ことを含む、請求項３７６に記載の方法。
【請求項３７８】
アッセイが、それぞれ表面と、前記表面に固定された又
は固定されるように適応された、神経変性疾患の凝集体形成種を結合できる複数
の結合種とを有する複数の粒子、及び神経変性疾患の凝集体形成種を含有する試
料を含む、請求項３７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、生体分子の相互作用、特に神経変性疾患などの病的状態に関係する
ペプチド凝集及び非病的凝集の迅速且つ高感度の検出及び分析のための方法、ア
ッセイ、及び成分に関する。このような方法及びアッセイは、臨床検査に使用で
きるだけでなく、高処理量の薬物スクリーニングによる薬物の発見も容易にする
。
【０００２】
発明の背景
タンパク質やペプチドなどの生体分子の異常凝集及び有毒凝集を特徴とする様
々な疾患があり、時にタンパク質凝縮症、もつれ形成症、原線維形成症、プラー
ク形成症などと呼ばれている。従って、このような異常凝集事象を阻害する物質
が確認できれば有益と思われる。ところが、天然の凝集プロセスの阻害によって
生じる毒性が病気を起こすこともある。このような場合は、正常の凝集機能を回
復させる分子が識別できれば有益であろう。
【０００３】
本発明の主眼でもある、タンパク質の異常凝集に伴う重要な疾患は神経変性疾
患である。本発明に係る神経変性疾患は、家族性英国型痴呆（ＡＢＲＩ）、パー
キンソン病（α−シヌクレイン）、アルツハイマー病（Ａβペプチド）、フィン
ランド型家族性アミロイドーシス（ゲルソイン）、ハンチントン病（ハンチンチ
ン）、ＡＤ、前頭側頭性痴呆（タウ）、老人性全身性アミロイドーシス（トラン
スチレチン）、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＴＴＲ）、及び伝達性海
綿状脳症（ＰｒＰ）などであるが、これらに限定されない（括弧内は凝集に関与
する関係タンパク質）。多くの神経変性疾患は、今日では、神経ペプチドの異常
凝集の結果、脳内に発生する凝集体形成に伴うプラークが関係及び／又は原因で
あることが示されている。アルツハイマー病、パーキンソン病、ゲルストマン−
シュトラウスラー−シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、ハンチントン舞
踏病、クールー病、及び家族性アミロイドポリニューロパチー、並びにクロイツ
フェルト・ヤコブ病、スクレイピー、及びウシ海綿状脳症（ＢＳＥ、狂牛病）の
ような伝達性海綿状脳症などの神経変性疾患は、脳内に形成される規則的に配列
されたタンパク質凝集体を特徴とする。これらの凝集体を作るタンパク質には配
列の相同性も、保存モチーフさえもないが、凝集体自体はある形態学的な特徴を
有している。これについては、ＬａｎｓｂｕｒｙのＰｒｏｃ．ＮａｔＬ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３３４２（１９９９）参照。これらの疾患では、病
原状態に関係するペプチドが、通常は可溶性であるのに、天然ペプチドの突然変
異や変性ペプチドとの物理的会合により三次元構造が変化し、規則的に配列され
た不溶性の重合状態に変換される。これが、神経変性疾患の脳内にみられるタン
パク質の異常沈積の特徴である。この、規則的に配列された重合状態又は凝集体
は、内因性もしくは外因性の物質又はペプチドの播種によって起こることもある
。
【０００４】
例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）では、これらの凝集体はβ−アミロイドタ
ンパク質からできているが、立体配座上の変化を受け、可溶性モノマーから不溶
性のβ−板状オリゴマーに変換されている。これらの原線維の脳内濃度は疾患の
進行と相関している。特徴的原線維の成長のしかたは、極度に非線形であるとい
う特性がある。このことは、患者が数年間は無症状であるように見えた後、突然
急激な変性が進んで痴呆状態に陥ることの説明となる。インビトロでの原線維形
成はペプチド濃度に依存している。β−アミロイド（Ａβ）タンパク質から誘導
された短鎖の合成ペプチドから、アルツハイマー病に特徴的な原線維形成を模し
た原線維をインビトロで形成させることができる。Ａβ１〜４２（長い疎水性Ｃ
−末端を有する）のほうがＡβ１〜４０よりも速い速度で原線維を形成すること
が示されている。Ｊ．Ｊａｒｒｅｔｔ  Ｊ  ら、“β−アミロイドタンパク質の
カルボキシ末端はアミロイド形成の種として重要である：アルツハイマー病の発
生機序との関係(The carboxy terminus of the B-amyloid protein is critical
for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis
of Alzheimer's disease)”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：４６９３−４
６９７（１９９３）参照。Ａβ１〜４０もそれ自体で原線維又は凝集体を形成で
きるが、Ａβ１〜４０を含有する溶液は、低溶性の１〜４２ペプチドと“混合”
するか、又は予め形成されたペプチド原線維を“播種”すると、原線維形成が促
進される。Ａβ１〜４０は神経突起斑の主要タンパク質であるが、これらの研究
によれば、原線維形成速度は１〜４２の１〜４０に対する比率に依存するようで
ある。早期発症ＡＤのすべての形態で１〜４２ペプチドの発現レベルが高いこと
は、これらの所見と一致する。
【０００５】
Ａβの二大変異体、１〜４２及び１〜４０を用いて、インビトロでの原線維形
成を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で調べると、原線維形成の前に現れる準安定中間
体が確認され、プロトフィブリルと名付けられた。Ｊ．Ｈａｒｐｅｒら、“原子
間力顕微鏡検査による準安定Ａβプロトフィブリルの観察(Observation of meta
stable AB protofibrils by atomic force microscopy)”，Ｃｈｅｍ．ａｎｄ  
Ｂｉｏｌ  ４：１１９−１２５（１９９７）参照。このような原線維前駆体の存
在は、ＡＤの素因のあるヒトの脳に観察されるびまん性のアミロイド沈着の説明
となろう。有毒中間体であるプロトフィブリルの存在は、Ａβ原線維がＡＤの病
原物質であることに賛成意見と反対意見の両方が論じられた、インビトロ及びイ
ンビボにおけるいくつかの観察された不一致を説明すると思われる。神経変性疾
患の原線維又は原線維形成種を検査したり、神経変性疾患の治療に適した薬物の
スクリーニングをするための現存のアッセイは、コンゴーレッド及びチオフラビ
ンＴアッセイであるが（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学
における方法），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９，Ｖｏｌ．３０９，
２７４−２８７ページ；３０４−３０５ページ）、通常、小凝集体やプロトフィ
ブリルの検出はできない。具体的には、約１００μＭ未満の濃度の凝集体又は原
線維形成種は検出できない。これは、初期の疾患の検出や、初期の疾患に使用す
るのに適した薬物のスクリーニングには不適切である。
【０００６】
疾患の発症前の段階（小原線維又は小凝集体しか存在しない時期）に作用する
候補薬があれば、プラーク／原線維形成の抑制及び有症疾患の予防により有効で
あろう。これを実現するためには、小さな原線維凝集体を効率よく検出する必要
がある。しかしながら、このような凝集体は小さすぎてまずどの検出法でも検出
できない。ＡＦＭを使えば検出できるが、この技術は臨床診断や薬物スクリーニ
ングのプロトコルに不向きである。従って、現時点では、小さな原線維種に対し
て作用する薬物をスクリーニングすることはできない。そのうえ、原線維形成を
任意の段階で抑制する薬物のスクリーニング法は非常に限られている。
【０００７】
凝集体及び原線維形成速度は、神経ペプチド変異体又は転化プリオンペプチド
のような変換された又は誤って折り畳まれたペプチド濃度の極度に非線形的な関
数である（これらのペプチドは凝集体形成種又は原線維形成種である）。異常種
の濃度が臨界濃度に達すると、反応速度が迅速に進行しすぎて薬物療法が及ばな
くなる。従って、薬物がプラーク形成の阻害に有効であるためには、対症療法的
というより予防療法的なものにして、早期の段階で作用させる必要がある。当該
技術の現状は、小さな凝集体又は原線維を、並行薬物スクリーニング法や非侵襲
的診断に適合するような様式で検出することはできない。このことは、１）疾患
の初期状態を治療する薬物を容易に確認できない；２）発症前の患者を識別でき
ない；そして、３）現存する、又は将来的に確認されることになる潜在的候補薬
の有効性を正確に評価できない、ことを意味する。
【０００８】
コンゴーレッド及びチオフラビンＴなどを用いる現行技術の別の欠点は、アッ
セイの過程で機械的介入を必要とすることである。すなわち、アッセイの過程で
液を一つの容器から別の容器に移し替えることなどが必要になるので、原線維形
成を促進する非再現的アッセイを妨害する。そのうえ、コンゴーレッド及びチオ
フラビン成分の添加は反応を停止させ、凝集プロセスを停止させてしまうので、
溶液中での単一のアッセイで、いくつかの時点を取って観察することができない
。
【０００９】
神経変性疾患の診断で厄介な問題は、疾患に特徴的な凝集体又は原線維を形成
できる種が非常に低濃度で存在することがあり、それでも検出できれば、疾患の
発症を意味する濃度で存在しているという事実である。
【００１０】
神経変性疾患の進行に関する情報はあるが、神経変性疾患を検出するための簡
便且つ安価で信頼できるアッセイを含む、診断及び薬物スクリーニング用の特異
的技術、神経変性疾患の治療のための候補薬のスクリーニング技術、並びに関連
成分に対する需要がある。
【００１１】
異常タンパク質凝集が関与する非神経変性疾患も多数ある。これに属する疾患
は、記述したものだけに制限されないが、以下の通りである。多発性骨髄腫では
、抗体のＬ鎖が凝集して毒性を生じる。ワルデンストレームマクログロブリン血
症は、抗体のＨ鎖の凝集を特徴とする疾患である。クリオグロブリンと呼ばれる
種類のタンパク質は、低温で沈殿し、患部の血管の遮断を起こす。播種性血管内
凝固（ＤＩＣ）は、重症の全身感染又は自己免疫疾患患者の罹病及び死亡の主た
る原因である。これはおそらく、疾患によってフィブリンが枯渇し、血液凝固が
阻害されるためであろう。グランツマン血小板無力症は出血障害で、インテグリ
ンαIIbβ3の欠乏による血小板の凝集異常を特徴とする1。フィブロネクチンの
凝集異常は、ヒトの遺伝性フィブロネクチン沈着糸球体疾患の特徴である2。鎌
状赤血球貧血は、４量体を形成せずに凝集してしまう変異ヘモグロビンによって
発生する3。卒中の有毒因子として異常タンパク質凝集の関与も考えられている
。
【００１２】
特に重要なのは、II型糖尿病に関与する異常タンパク質凝集である。ヒトのラ
ンゲルハンス島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）は、II型真性糖尿病患者
の膵臓のランゲルハンス島にみられるプラークの主成分である4。アミノ酸２０
〜２９がこの凝集の原因であることが示されている。ｈＩＡＰＰの凝集は時間の
関数として非線形的に進行し、反応に予め形成された凝集体を“播種”すること
によって促進されうる。これはアルツハイマー病に特徴的なβ−アミロイド凝集
の場合と同様である。しかしながら、アルツハイマー病とは違ってｈＩＡＰＰの
凝集はペプチド濃度に無関係である。これを説明するために、凝集していないペ
プチドミセルモデルが提唱されている。本発明の方法を使用すれば、この凝集を
阻害する薬物をスクリーニングすることができる。例えば、アミノ酸２０〜２９
を含有するｈＩＡＰＰフラグメントをコロイドに付着させ、候補薬を含有する溶
液に加える。凝集を阻害した薬物を含有した溶液は、凝集が色の変化で特徴づけ
られている間、ピンク色のままである。
【００１３】
一方で、正常の凝集又は多量体化プロセスの喪失を特徴とする多くの病的状態
もある。この活性を回復するための治療薬をスクリーニングする方法も有用であ
ろう。血液凝固は、前駆体タンパク質のフィブリノゲンの産物であるタンパク質
のフィブリンの凝集によって達成される。さらに、単量体では機能せず、機能す
るためには２量体又は４量体として存在しなければならないタンパク質もある。
多くのタンパク質では、その生物学的機能は、それらの多量体化状態に決定的に
依存している。本明細書中に記載の凝集アッセイは、多量体化（一種の凝集）を
分断又は促進するいずれの分子のスクリーニングにも容易に適応できる。
【００１４】
例えば、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、細胞周期の停止及びアポトーシスの活
性化を通じて細胞増殖を抑制するが、全ヒトがんの約５０％で変異を起こしてい
る。ｐ５３の複雑な機能の多くの側面は、それがどのような多量体化状態を取っ
ているかで決まる。いくつかの研究から、発がんのためにはｐ５３が４量体を形
成する必要があることが分かっている6。そのＤＮＡ結合7及び転写活性に４量体
化が必要なのである。ｐ５３の４量体化ドメインには核内から核外への輸送シグ
ナル（ＮＥＳ）も含まれている8。ｐ５３の弱化には、核からのその搬出が必要
と考えられている。４量体から２量体及び単量体へ変換されるとＮＥＳが露出す
る。増殖抑制因子であるｃ−Ａｂｌは、ｐ５３が４量体である場合にのみ、その
Ｃ−末端に結合し、これがＤＮＡ結合を促進する9。ｐ５３の４量体化を刺激す
る、並びにそれを分断する分子の確認は治療上の価値があると考えられる。
発明の要旨
本発明は、神経変性疾患、異常凝集を特徴とする他の疾患、凝集を特徴とする
非疾患性プロセスに関わる一連の組成物、アーティクル、キット及び方法、並び
に生体分子相互作用の一般的検出法を提供する。疾患の診断、並びに異常タンパ
ク質凝集を特徴とする神経変性疾患及び非神経変性疾患の治療のための候補薬の
スクリーニングのための技術及び成分を提供する。また、凝集が望ましい場合に
凝集を促進するための候補組成物をスクリーニングする技術及び成分も提供する
。当該技術は、簡便且つ極めて高感度で、容易に入手できる成分を利用するもの
である。本発明の技術及び成分は、既存の技術や、神経変性疾患及び他の疾患を
治療するための薬物のスクリーニングで、これまで検出が困難又は不可能な、例
えば１〜２００ｎｍの長さの、通常非常に小さい凝集体形成種又は原線維形成種
を非常に高感度に検出することができる。
【００１５】
本発明の重要な一態様は、神経変性疾患以外の疾患及び非疾患性プロセスに関
わる組成物、アーティクル、キット及び方法も包含するので、本明細書に記載の
すべての開示内容は、非神経変性疾患及び非疾患性プロセスにも適用されると理
解されるべきである。
【００１６】
そこで、本発明は、これらの疾患の早期に特徴的な凝集体又はプロトフィブリ
ルを検出及びモニタする能力の提供を意図している。本発明は、また、推定候補
薬による治療に反応する凝集体形成速度を調べる能力を提供することも意図して
いる。
【００１７】
本発明は、神経変性疾患及び他のタンパク質凝集疾患並びに非疾患性プロセス
の表現型に関与するペプチド配列のスクリーニングに使用できる凝集体及び原線
維の検出法を提供する。一技術において、選択したペプチド配列を合成し、粒子
に固定するか又は固定されるように適応し、そして本発明のアッセイにかける。
これらのアッセイで、ペプチド配列が凝集プロセスに参加している可能性を示す
粒子の凝集が起こっているか、又は本明細書中に記載のような粒子の関与する他
の結合であるかを調べることができる。別の技術では、ランダムなペプチド配列
を遺伝子工学的にファージに組み込み、これを粒子に結合させて、本発明のアッ
セイに参加させることができる。本発明の方法は、原線維及びペプチド凝集体を
検出するためのものであるので、これらの疾患の診断に使用することができる。
なぜならば、これらの凝集体は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中を循環していることが示
されており、また容易に試料採取できる他の体液中にも循環していると考えられ
ているからである。
【００１８】
一実施の形態において、本発明は、伝達性海綿状脳症を含む神経変性疾患のよ
うな凝集体プロセスの特徴である凝集体、原線維、及びプロトフィブリル（又は
凝集体形成種）の存在について、生物学的試料を迅速且つ高感度に分析できる検
出系を意図している。一態様において、本発明は、疾患性もしくは非疾患性の凝
集体プロセスの検出又は薬物スクリーニングに使用できる一連のキットを提供す
る。一実施の形態において、キットは、表面を有する第一のアーティクルと、表
面を有する第二のアーティクルと、複数の結合種とを含み、前記結合種の少なく
とも一部は、前記第一のアーティクルの表面に対して固定されているか又は固定
されるように適応され、前記結合種の少なくとも一部は、前記第二のアーティク
ルの表面に対して固定されるか又は固定されるように適応されている。結合種は
凝集体形成種を結合することができる。以下の詳細な説明で明らかになるように
、本実施の形態では様々な組合せのアーティクルを使用することができる。各ア
ーティクルは、液に懸濁可能な、単離可能なアーティクルでありうるが、それぞ
れがコロイド粒子であったり、一方がコロイド粒子で、他方が磁気ビーズなどで
あったり、一方のアーティクルが電極、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）チップ、
又は他の肉眼で見えるアーティクルなどの大きなアーティクルの表面で、他方の
アーティクルが前述のような液に懸濁可能な粒子であったりする。
【００１９】
本発明の別のキットは、表面を有するアーティクル（様々なアーティクルを意
図している）と、複数の結合種とを含み、前記結合種の少なくとも一部は前記表
面に対して固定されているか又は固定されるように適応されている。表面は、本
明細書中に記載のような任意の表面であってよく、凝集体形成種又は原線維又は
凝集体の表面への結合を示すことができるシグナリング実体(signaling entity)
を組み合わせて含むこともできる。一実施の形態において、表面は、表面に対し
て固定されていない又は固定されるように適応されていない結合種、又は凝集体
形成種もしくは原線維形成種の非特異的結合を実質的に阻害する化学官能性を有
する。本実施の形態は、特に高感度な検出技術を可能にする。
【００２０】
本発明の多くのキット、アッセイなどの記述中、多くの種が別の種又は成分に
対して固定できることが記載されている。一つの種又は成分が他の種又は成分に
対して固定できる場合、他の実施の形態においてもこれらの種又は成分は相互に
固定できると理解されるべきである。
【００２１】
本発明の別のキットは、表面を有するアーティクルと、前記表面に対して固定
されているか又は固定されるように適応されている複数の結合種を含む。本実施
の形態においては、該アーティクルは具体的にはＳＰＲ成分ではない。本実施の
形態により、非常に高感度の非ＳＰＲ分析、例えば疾患試料又は薬物活性の電子
分析が可能になる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本発明の様々なキット及び方法と組み合わせて
使用できる一連の成分、系、及びアーティクルを提供する。本発明の一つのアー
ティクルは、結合種を固定する表面を含む。シグナリングエレメントも該アーテ
ィクルの表面に固定される。本発明の組成物は、結合種と、結合種に対して固定
されたシグナリング実体とを含む。本発明の別の組成物は、金属に配位できる部
分に固定された結合種を含む。
【００２３】
本発明の一つの系は、神経変性疾患の原線維又は凝集体に対して固定された少
なくとも２個の粒子を含む。本発明の別の系は、任意の供給源の原線維又は凝集
体に対して固定された少なくとも２個の粒子を含む。本発明の別の系は、凝集体
形成種に対して固定された少なくとも２個の粒子を含む。これらの系は、典型的
には、疾患状態又は前疾患状態の検出、あるいは候補薬物のスクリーニング混合
物のために設計されたアッセイの結果である。
【００２４】
別の態様において、本発明は一連の方法を提供する。一つの方法は、表面を有
するアーティクルと、前記表面に対して固定された又は固定されるように適応さ
れた、凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを提供することを含む。該表面
は、凝集体形成種を含有している、又は含有していると考えられる試料に曝露さ
れる。場合により、該表面は、試料中に存在する疾患の凝集体形成種と表面に対
して固定された又は固定されるように適応された結合種との結合を信号で知らせ
るように構築及び配置されたシグナリング実体にも曝露される。
【００２５】
別の方法は、アーティクルの表面に対して固定された又は固定されるように適
応された結合種を提供すること、そして前記結合種を、神経変性疾患の凝集体形
成種でない状態から、凝集体形成種である状態に変換することを含む。当該方法
は、以下の詳細な説明で明らかになるように、非常に高感度のアッセイで重要な
役割を果たす。
【００２６】
別の実施の形態において、本発明の方法は、結合種を神経変性疾患の凝集体形
成種と相互作用させることにより、神経変性疾患の凝集体形成種に変換すること
を含む。変換された種は、以後、神経変性疾患の凝集体形成種又は原線維形成種
の存在に特徴的な凝集に参加する。次にこの凝集を検出する。当該方法も、疾患
状態又は前疾患状態のスクリーニングの感度を著しく向上させる。
【００２７】
別の実施の形態において、本発明の提供する方法は、当該目的に限定するつも
りはないが、薬物スクリーニングに使用することができ、その分野に顕著な進歩
をもたらす。当該方法は、アーティクルの表面に対して固定された又は固定され
るように適応された結合種を提供し、場合により（当初固定されていない場合）
、結合種を表面に対して固定させ、そして該結合種を凝集体形成種と結合させる
ことを含む。この結合は、結合種を表面に固定させる前後に生じ、結合種は、結
合中に凝集体形成種に変換されてもされなくてもよい。第二のアーティクルの表
面に対して固定された又は固定されるように適応された第二の結合種を、凝集体
形成種に結合させる。第二の結合種の凝集体形成種への結合は、本方法による他
のステップとの関係で適切な任意の時点で生じうる。
【００２８】
本発明の別の方法は、表面を有するアーティクルと、前記表面に対して固定さ
れた又は固定されるように適応された複数の結合種とを含む。アーティクルの表
面は、神経変性疾患の凝集体形成種又は原線維形成種を含有していると考えられ
る別の供給源由来の試料に曝露される。本方法は、様々な個々の技術に利用でき
る。例えば、明らかにされるように、試料中の疾患状態の検出などである。
【００２９】
本発明の別の方法は、凝集体形成種を含有する試料中にまず凝集体を形成させ
ることを含む。凝集体は、アーティクルの表面に対して固定された又は固定され
るように適応された複数の結合種を含むアーティクルに曝露される。該結合種は
、凝集体又は凝集体形成種を結合することができる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、候補薬の、疾患抑制に対する有効性を判定する
技術も提供する。該技術は、疾患の凝集体形成種を産生できる細胞を候補薬に曝
露し、細胞から産生された物質、例えば細胞から分泌された物質の凝集ポテンシ
ャルを判定することを含む。細胞は、該種を天然に産生できるものであるか、又
は該種を産生できるようにトランスフェクトされたものであるか、又は公知技術
によって該種を産生できるように誘導可能である。細胞は、例えばアミロイド前
駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来のＡβ原線維形成種のプラスミドを細胞にトラン
スフェクトすることによって、凝集体形成種を産生するように適応できる。細胞
の産生した物質の、疾患に特徴的な凝集に対するポテンシャルは、細胞を候補薬
に曝露した後、細胞環境を本発明の任意のアッセイ、例えば凝集体形成種の存在
を示すコロイド凝集を呈するように設計されたアッセイに曝露することによって
モニタできる。凝集体形成種を産生する、又は産生する能力を有する細胞は、凝
集体形成種分泌能を有する必要はない。その代わり、凝集体形成種を細胞内に産
生する又は保持する細胞は、コロイド添加の前に溶解することができる。本発明
の本態様は、神経変性疾患を含む凝集の関与する任意の疾患プロセスに適用可能
である。
【００３１】
本発明の別の態様は、表面に自己集合単層を形成させる一連の方法、及びＳＡ
Ｍで被覆された表面を有するアーティクルである。一組の好適な実施の形態では
、完全に合成分子で形成されたＳＡＭが表面又は表面領域を完全に被覆する。例
えばコロイド粒子の表面を完全に被覆する。本文脈における“完全に被覆する”
とは、ＳＡＭによる完全な直接被覆を妨害するタンパク質、抗体、又は他の種に
直接接触する表面の部分又は領域がないことを意味する。すなわち、該表面又は
領域は、全体的に、完全に非天然分子（すなわち合成分子）からなるＳＡＭを含
む。ＳＡＭは、表面に密集したＳＡＭを形成するＳＡＭ形成種、これらの種と組
み合わせた、ＳＡＭ全体の電子伝達を促進できる分子ワイヤ又は他の種（ＳＡＭ
に参加可能な欠陥促進種を含む）、ＳＡＭに参加可能な他の種、及びこれらの任
意の組合せから完全に形成できる。好ましくは、ＳＡＭに参加するすべての種は
、表面に結合する、場合により共有結合する官能性を含む。好適な実施の形態に
おいて、自己集合単層は金コロイド上に形成される。自己集合単層は、コロイド
上に形成されるにせよ別の表面上に形成されるにせよ、（金が表面の場合）チオ
ール種の混合物で構成できる。前記チオール種は、非特異的吸着に抵抗性のある
トリエチレングリコール末端チオール、及び末端に親和性標識の結合パートナー
を持つチオール、例えば末端に金属を配位できるニトリロ三酢酸のようなキレー
ト（これは、ニッケル原子と錯体化するとヒスチジン標識された結合種を捕捉す
る）を持つチオールを含む。好適な実施の形態において、結合種は、容易に自己
凝集できるβ−アミロイドペプチドである。本発明は、コロイド表面に提示され
たヒスチジン標識ペプチドの濃度を厳密に制御する方法を提供する。各コロイド
粒子上のペプチド密度に対するこのような厳密な制御がなければ、互いに固定さ
れたペプチドは相互に容易に凝集し、試料中に存在する凝集体形成種がなくても
、コロイド−コロイド凝集を触媒する微小−疎水性−ドメインを形成するであろ
う。これは、既存のコロイド降着アッセイに優る本発明の利点である。
【００３２】
本発明で記述している方法によって、タンパク質遮断ステップがなくても、例
えばＢＳＡで遮断しなくても、非特異的吸着に抵抗性のある自己集合単層がコロ
イド上に製造される。また、本明細書中に記載の方法によって、生物学的関連液
中で安定で、結合反応を妨害する洗浄剤（安定性のため；コロイドを懸濁状態に
維持する）を必要としない誘導体化コロイドも製造される。これにより、高感度
の結合アッセイを溶液中で実施することが可能になる。これにより、既存のコロ
イド膠着アッセイでよく行われる吸着性表面に結合パートナーを付着させる必要
がなくなる。以下に解説の通り、洗浄剤はコロイド上にＳＡＭを形成させるのに
都合よく使用できる。この場合、洗浄剤は、ＳＡＭ形成後に除去できる、及び好
ましくは除去され、コロイドの結合相互作用中もしくは他の使用中、コロイド上
、ＳＡＭ中、または何処にももはや存在しない。
【００３３】
これらの方法は、本発明の他の態様と組み合わせて使用できる単層被覆アーテ
ィクルの形成に使用できる。一つの方法は、表面に自己集合単層を形成すること
を含む。すなわち、該表面を自己集合単層形成分子種及び界面活性剤を含有する
媒体に曝露する。別の方法では、表面を、自己集合単層形成分子種及びカルボキ
シレートを含有する媒体に曝露する。さらに別の方法では、界面活性剤とカルボ
キシレートを媒体中に一緒に含めることもできる。本発明の本態様に従って自己
集合単層を種の上に付着させるのに使用できる界面活性剤は、本質的に任意の各
種界面活性剤を含む。自己集合単層の形成を補助するのに使用するカルボキシレ
ートは、好ましくはクエン酸ナトリウムを含むカルボン酸塩を含む。
【００３４】
自己集合単層形成のための別の方法は、コロイド粒子の表面上に自己集合単層
を形成することを含む。この形成は、コロイド粒子自体の形成中には発生しない
。例えば、単層は、予め完全に形成されたコロイド粒子上に形成できる。別の方
法において、自己集合単層は、液に懸濁しているコロイド粒子の表面に形成され
る。この場合、粒子はいかなる液−液界面にも存在しない。
【００３５】
本発明の各種態様のさらに具体的な例において、凝集体（プラーク及び原線維
を含む）に組み込み又は結合可能なペプチド又は他の結合種は、シグナリング部
分で修飾した後、疾患関連のペプチドもしくはタンパク質凝集体／原線維、又は
凝集体形成を誘発できる因子を含有しうる生物学的試料と混合する。本文脈中で
“結合する”という場合、任意の疎水性、非特異的、又は特異的（例えば抗体の
場合）相互作用を含み得る。“組み込む”とは、好ましくは、天然の凝集体又は
原線維形成プロセスを妨げたり、歪めたりすることなく、凝集体又は原線維の一
部になることを意味する。凝集体に組み込み可能で、感知表面に差別的に引き寄
せられ得る誘引部分（例えば、磁気ビーズ又はデンドリマーのような磁気もしく
は電磁気粒子）で修飾された他の種も同じ試料に混合される。適切なインキュベ
ーション期間を経て、試料溶液を、誘引可能なペプチドを検出装置に差別的に引
き寄せる条件に曝露する。シグナリング部分及び誘引可能部分を予め存在してい
る凝集体に組み込むことは、高感度且つ効率的な凝集体の標識法を提供する。次
いでそれらを検出領域に集中させる。
【００３６】
シグナリング種及び誘引種に付着した結合種の配列は、それらが既存の凝集体
に容易に組み込まれ得るように、ただし予め存在する凝集体がない場合は容易に
凝集しないように選ぶことができる。ペプチドは、標識されたデンドリマー又は
ポリマーへの直接化学結合による付着によって、シグナリング部分に連結できる
。あるいは、ペプチドは、結合種とシグナリング基の両方を同時に提示するコロ
イドなどの粒子様物質との会合によってシグナリング部分に連結してもよい。さ
らに、凝集体形成に参加可能なバージョンの種を、溶液中に遊離状態で加え（標
識又は非標識）、凝集プロセスを加速させる、従って増幅剤として作用させるこ
ともできる。
【００３７】
結合種は、例えばペプチドを磁気ポリマーに付着させるような直接的な化学付
着によって誘引部分に連結できる。誘引部分は電磁場又は静置磁石によって検出
領域に誘引可能である。さらに、結合種は、例えばタンパク質Ａ−被覆磁気ビー
ズ（抗体に結合するタンパク質Ａの部分を含む表面官能性を提示する）、又は荷
電粒子との会合によって誘引部分に間接的に連結することもできる。誘引部分は
感知領域又は表面に差別的に引き寄せ可能である。結合種は、直接的な化学結合
又は粒子様物質との会合によっても誘引部分に連結可能である。誘引部分は、親
和性標識（例えばヒスチジン標識）に連結されたペプチドのような生物学的認識
単位によって誘引可能である。次に、これがニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）のような
表面結合キレートによって配位された金属に結合する。キレートは表面の自己集
合単層（ＳＡＭ）の一部として表面に固定できる。結合種又は他の任意の種は、
Ｂｉｏｍｅｔｒａから市販されているストレプト(Strept)標識を使用して表面に
連結させることもできる。ストレプト標識は、チオールなどの自己集合単層形成
種に付着させてある。自己集合単層の一部を形成しているストレプトアビジン(S
treptavidin)標識は、ビオチン修飾結合種のようなビオチン修飾部分に容易に固
定される。結合種は、以下でさらに十分に説明するように、他の方法によっても
表面に連結できる。
【００３８】
本発明の別の態様は、ヒト又は動物患者における神経変性疾患又は他のタンパ
ク質凝集疾患などの凝集が関与する状態、又は凝集の増強が望ましい状態の治療
のための候補薬の有効性を判定することに関する。一つの方法は、凝集関連疾患
の危険性がある、又は疾患の治療が適応される（例えば疾患の症状がある、又は
疾患を示す生理学的特徴の検査が陽性である）ヒト又は動物患者に疾患治療のた
めの候補薬を投与することを含む。次に、患者から試料を採取し、神経変性疾患
又は他の凝集状態の抑制又は治療における候補薬の有効性を示すアッセイにかけ
る。具体的には、該試料を、試料の凝集ポテンシャルを示すアッセイに曝露すれ
ばよい。試料の凝集ポテンシャルを示す好適なアッセイは、本要旨中及び以下の
詳細な説明中に記載のアッセイを含む。例えば、患者から採取した試料を、第一
の表面を有するアーティクルと、表面に固定されるか又は固定されるように適応
された、凝集体形成種を結合できる複数の結合種とを含む構成に曝露できる。結
合種と、患者から採取した試料中に存在する凝集体形成種、又は原線維もしくは
凝集体との相互作用を測定する。あるいは、ヒト又は動物に候補薬を投与し、患
者から試料を採取し、凝集の増強が望ましい場合、凝集を増強する候補薬の有効
性を示すアッセイに曝露することもできる。
【００３９】
本発明の別の態様は、神経変性疾患又は他のタンパク質凝集疾患に付随する新
規なポリアミノ酸標識種、例えばヒスチジン標識種に関する。一実施の形態にお
いて、本発明は、ポリアミノ酸標識β−アミロイドペプチド１〜３８、１〜３９
、１〜４０、１〜４１、又は１〜４２を提供する。このうちペプチド１〜４０及
び１〜２４が好適である。
【００４０】
本発明の別の態様は、第一の試料を第二の試料に曝露し、凝集プロセスに関与
する第一の試料の傾向に影響を及ぼす第二の試料の能力を測定する方法に関する
。第一の試料は、凝集体形成種又は凝集体形成種の前駆体を含有しているか含有
していると考えられている、又は凝集体形成種を産生できるか産生可能と考えら
れている。あるいは、第一の試料は、凝集体形成種の前駆体を産生できる又は産
生可能と考えられている。第二の試料は、第一の試料の凝集プロセスへの関与傾
向に影響を及ぼす能力を有していると考えられている。凝集体形成種の前駆体は
、切断されるか翻訳後修飾されて凝集体形成種を形成する親タンパク質であり得
るか、又は凝集体形成種もしくは親タンパク質をコードする核酸である。凝集体
形成種又はその前駆体は、細胞由来であり得る（例えば細胞からの分泌物質、細
胞溶解産物、又はそのフラクション）。第二の試料は、凝集体形成種でなく、凝
集体形成種の前駆体でもない。第二の試料は、任意のタンパク質、ペプチド、核
酸、酵素であり、これらはいずれも、場合により細胞から誘導された、天然又は
合成又はクローン化物である。第二の試料は、細胞から誘導された他の任意の物
質であってもよい。第二の試料は、場合により細胞から誘導された小分子であっ
てもよい。
【００４１】
本発明の別の態様は、コロイド粒子、好ましくは金コロイド粒子上の自己集合
単層に関する。この場合、該自己集合単層は、ビオチンに連結される何らかの種
を含む。好ましくは、曝露される末端にいくつか（例えば３個）のエチレングリ
コール単位を含む長鎖アルキル（例えばＣ１１）を含む混合自己集合単層を金コ
ロイド粒子上に形成する。この曝露末端がビオチンに共有結合する。混合自己集
合単層は、この種と、不活性種又は非特異的結合阻害種、例えばＣＯＯＨ−末端
チオール、ＰＥＧ−末端チオールなどを含みうる。本発明の本態様による混合自
己集合単層は、約０．０１〜約５０％のビオチン、更に好ましくは約０．０５〜
約２０％、さらに好ましくは約０．１〜約５％のビオチン含有ＳＡＭ形成種を含
みうる。このような混合ＳＡＭを持つコロイドは、以下に記載のＳＡＭ被覆コロ
イドと同じように製造できる。ビオチンを提示するＳＡＭ形成種は、日常的有機
合成技術を用いて形成できる。
【００４２】
結合相互作用が関与する好適な実施の形態では、結合の測定または形成は、液
媒体中の表面（例えば懸濁状態の粒子）に対して固定されている種の関与の下、
吸収表面に対して液を移動させるような毛管液作用又は他の液／表面誘引相互作
用(このような作用は生理的試料を使用する様々な公知アッセイ及び／又は他の
コロイド膠着アッセイではよく見かける)のない状態で行われる。すなわち、好
ましくは、静止した液中で、又は動いたとしても表面吸収による移動や流れの中
で結合を生じさせる、又は結合を測定する。
【００４３】
本発明の他の利点、新規特徴、及び目的は、添付の図面と合わせて考慮すると
き、以下の本発明の詳細な説明から明らかになるであろう。図面は概略図であり
、正確な縮尺率で描かれたものではない。図中、様々な図に示されているそれぞ
れ同一又はほぼ同一の成分は一つの数字で表してある。平明化のために、すべて
の図に全成分が標識されているわけでも、本発明を当業者に理解してもらう上で
図面が不要な箇所では本発明の各実施の形態の全成分が表示されているわけでも
ない。
【００４４】
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／０１９９７、出願日２０００年１月２５
日、発明者Ｂａｍｄａｄら、発明の名称“神経変性疾患における異常タンパク質
凝集の迅速且つ高感度の検出(Rapid and Sensitive Detection of Aberrant Pro
tein Aggregation in Neurodegenerative Diseases)”（公開番号及び公開日Ｗ
Ｏ００／４３７９１、２０００年７月２７日）；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ
００／０１５０４、出願日２０００年１月２１日、発明者Ｂａｍｄａｄら、発明
の名称“コロイド固定種と非コロイド構造上の種との相互作用(Interaction of 
Colloid-Immobilized Species with Species on Non-Colloidal Structures)”
（公開番号及び公開日ＷＯ００／３４７８３、２０００年７月２７日）；同一出
願人による係属中の米国特許出願第０９／６０２，７７８号、出願日２０００年
６月２３日、発明者Ｂａｍｄａｄら、発明の名称“コロイド固定種と非コロイド
構造上の種との相互作用(Interaction of Colloid-Immobilized Species with S
pecies on Non-Colloidal Structures)”；及び同一出願人による係属中の米国
特許出願第０９／６３１，８１８号、出願日２０００年８月３日、発明者Ｂａｍ
ｄａｄら、発明の名称“タンパク質凝集の迅速且つ高感度の検出(Rapid and Sen
sitive Detection of Protein Aggregation)”は、いずれも本願に引用して援用
する。
定義
本明細書中で使用している“小分子”は、５キロドルトン未満、より典型的に
は１キロドルトン未満の分子を意味する。本明細書中で使用している“小分子”
からタンパク質は除外される。
【００４５】
“凝集体”という用語は、相同分子の複合体（例えば原線維）、並びに分子混
合物（例えば、凝集体形成を促進する結合パートナー、ペプチド、タンパク質、
核酸又はこれらの複合体などの相互作用分子、特異的相互作用によって特徴づけ
られる複合体を含む）のことである。“凝集体”は、神経変性疾患及び他の疾患
のような疾患状態、並びに非疾患状態に付随しうる。神経変性疾患に付随する凝
集体は、典型的には、神経変性疾患に特徴的な、そして神経変性疾患に付随する
、すなわちその原因となるもつれ又はプラークなどのタンパク質分子の凝集を含
む。神経変性疾患の凝集体は、典型的には相同分子の複合体であるが、混合物を
含むこともある。非神経変性疾患の凝集体は、神経変性疾患の凝集体に類似した
凝集体が関与するII型糖尿病、鎌状赤血球貧血に伴う凝集体、並びにＬ鎖又はＨ
鎖ＩｇＧ凝集が関与する骨髄腫のような他の非神経変性疾患の凝集体を含む。疾
患に関係しない凝集体は、例えば血液凝固に伴う凝集体（フィブリノゲン、プラ
スミノゲン凝集体、及び関連因子）、Ｐ５３凝集体のような腫瘍抑制物質として
作用する凝集体などを含む。当業者であれば、凝集体が、神経変性疾患、非神経
変性疾患、及び非疾患性の生理的プロセスに関係することは理解するであろう。
これらの各プロセスに関係する凝集体は、当業者には相互に区別可能である。本
明細書中で使用している“凝集体”は、原線維を包含する。すべての原線維は凝
集体であるが、必ずしもすべての凝集体が原線維というわけではない。本発明の
凝集体は、典型的には、（コロイド相互作用のために）眼で、顕微鏡下で、光散
乱によって、又は色変化によって視覚化可能である。
【００４６】
“凝集体”は、本明細書中に記載の疾患及び非疾患プロセスに関与する分子又
はフラグメントの集合のことであるが、原線維は、ある種の疾患プロセスに関与
する凝集体の一種であることは理解されるべきである。本明細書中で“原線維”
が記述されている場合、それらは凝集体であると理解されるべきである。
【００４７】
“凝集体を見えるようにする”という句は、見えない凝集体を目に見えるよう
にする、顕微鏡下で見えるようにする、又は吸光度によって見えるようにする技
術のことを言う。特異的な吸収特性を有する金コロイドのような粒子、発色実体
を持つ粒子などを凝集体に付着させる又はそのような粒子で凝集体を装飾するな
ど、さまざまな方法が考えられるが、それらに限定されない。
【００４８】
本明細書中で使用している“候補薬”という用語は、ヒト、動物、又は植物に
使用される任意の医薬物質のことである。この定義に包含されるのは、化合物類
似体、天然、合成及び組換え医薬品、ホルモン、抗菌物質、神経伝達物質などで
ある。これは、神経変性疾患、又は異常凝集を特徴とする他の疾患の治療又はそ
れらの予防のために、薬物としての使用について評価されることになる任意の物
質又は前駆体（天然、合成、又は組換えを問わず）を含む。評価は、典型的には
、本発明のスクリーニングアッセイのようなアッセイにおける活性を通して実施
される。
【００４９】
本発明には様々な種類の粒子が使用できる。例えば、“液に懸濁可能な粒子”
は、本発明の目的のためにそれが使用される液（典型的には水溶液）中で、自力
で懸濁状態を維持できる粒子、又は磁場、電磁場の印加や、撹拌、振盪、振動、
音波処理、遠心分離、渦流などのかき混ぜの適用によって溶液中に維持されうる
粒子を意味する。“磁気的に懸濁可能な”粒子は、磁場の印加によって液中で懸
濁状態を維持できる粒子である。電磁気的に懸濁可能な粒子は、電磁場の印加に
よって液中で懸濁状態を維持できる粒子である（例えば電荷を持つ粒子、又は電
荷を持つように修飾される粒子）。“自己懸濁可能な粒子”は、それが使用され
る液（典型的には水溶液）中で少なくとも１時間、例えば磁場の補助なしに懸濁
状態を保てるほど十分に小さいサイズ及び／又は質量の粒子である。その他の自
己懸濁可能粒子は、本発明に従って、補助なしで５時間、１日間、１週間、又は
さらには１ヶ月間も懸濁状態を保つであろう。
【００５０】
本明細書中で使用している“凝集体形成種を結合できる結合種”は、タンパク
質、ペプチド、いずれかの配列、抗体、コンゴーレッド、チオフラビン−Ｔ、又
はすでに述べたような結合が可能な任意の種のような任意の種を含む。ある場合
には、この結合は抗体又はＰ５３の場合のように部位特異的なこともある。別の
場合には非特異的なこともある。タンパク質又はペプチドの場合、結合は、典型
的には非特異的疎水的相互作用を含む。神経変性疾患の場合、典型的にはβ−シ
ート／β−シート相互作用が関与する。結合種も、天然の疾患凝集体形成種と相
同のペプチド、フラグメント、又は全タンパク質を含みうる。
【００５１】
“タンパク質”及び“ペプチド”は、当該技術分野では周知の用語であるが、
各々が含むアミノ酸の数に関して当該技術分野では正確に定義されていない。本
明細書中で使用しているこれらの用語には、当該技術分野における通常の意味が
付与される。一般的に、ペプチドは長さ約１００個未満のアミノ酸配列であるが
、３００個までの配列を含みうる。タンパク質は、一般的に少なくとも１００個
のアミノ酸分子とされている。
【００５２】
本明細書中で使用している“金属結合標識”は、キレートに配位されている金
属に固定されうる分子群のことを言う。適切なそのような分子群は、典型的には
約２〜約１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。これに含まれるの
はヒスチジン及びシステインであるが（“ポリアミノ酸標識”）、これらに限定
されない。そのような結合標識は、ヒスチジンを含む場合、“ポリヒスチジント
ラクト(tract)”又は“ヒスチジン標識”又は“ＨＩＳ−標識”と呼ぶことがで
き、ペプチド又はタンパク質又は核酸のアミノ末端もしくはカルボキシ末端のい
ずれか、又は任意の曝露領域に存在しうる。本発明での使用には、６〜１０個の
残基のポリヒスチジントラクトが好適である。ポリヒスチジントラクトは、機能
的に、問題のタンパク質に付加されたいくつかの連続したヒスチジン残基という
定義もされる。これにより、得られたタンパク質の金属キレートカラムでの親和
精製や、別の分子（例えば、ＨＩＳ−標識に反応する抗体）との相互作用を通じ
てタンパク質末端の識別が可能になる。
【００５３】
“親和性標識”という用語には、当該技術分野における通常の意味が付与され
る。親和性標識は、例えば、金属結合標識、ＧＳＴ（ＧＳＴ／グルタチオン結合
クリップにおける）、及びストレプトアビジン（ビオチン／ストレプトアビジン
結合における）などである。本明細書中の様々な箇所で、特異的な親和性標識が
結合相互作用との関係で記述されている。本発明は、親和性標識を使用するすべ
ての実施の形態において、本明細書中に記載のいずれかの親和性標識の選択をそ
れぞれ必要とする個々の実施の形態の連続を含むことを理解すべきである。
【００５４】
本明細書中で使用している“金属に配位しているキレート”又はキレートによ
って配位されている金属とは、キレート剤によって配位された金属のことである
が、キレート剤は金属上のすべての利用可能な配位部位を満たさず、金属結合標
識による結合が利用できる配位部位をいくつか残している。
【００５５】
“シグナリング実体(signaling entity)”は、特定の試料中で、又は特定の位
置でその存在を示すことができる実体のことである。本発明のシグナリング実体
は、ヒトの肉眼で識別可能なもの、孤立状態では見えないかもしれないが、十分
な量であればヒトの肉眼で検出可能であり得るもの（例えばコロイド粒子）、視
覚的（肉眼又は電子顕微鏡などを含む顕微鏡を用いて）又は分光学的に容易に検
出できるようなレベル又は波長内で電磁放射線を吸収又は放出するもの、適当な
活性エネルギーに曝露されると特徴的な酸化／還元パターンを示すレドックス活
性分子のように電子的又は電気化学的に検出できるもの（“電子シグナリング実
体”）などであり得る。例えば、染料、顔料、レドックス活性分子のような電気
活性分子、蛍光部分（本明細書における定義により、リン光部分も含む）、アッ
プレギュレーティングリン光体、化学発光実体、電気化学発光実体、又は西洋ワ
サビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼなど酵素に連結したシグナリ
ング実体などである。“シグナリング実体の前駆体”は、それ自体はシグナリン
グ能力を持たないが、別の種との化学的、電気化学的、電気的、磁気的、又は物
理的相互作用により、シグナリング実体となる実体である。一例として、別の分
子との化学相互作用があった場合にのみ、特定の検出可能な波長内で放射線を出
す能力を有する発色団が挙げられる。シグナリング実体の前駆体は、本明細書中
で使用している“シグナリング実体”とは識別可能であるが、その定義内に含め
る。
【００５６】
別の種又はアーティクル表面に対する種との関連で本明細書中で使用している
“固定されている又は固定されるように適応されている”とは、該種が、共有結
合、特定の生物学的結合（例えばビオチン／ストレプトアビジン）、キレート／
金属結合のような配位結合、などを介して化学的又は生化学的に連結されている
ことを意味する。例えば、本文脈で“固定されている”というときには、複数の
化学的連結、複数の化学／生物学的連結などが含まれる。例えば、ポリスチレン
ビーズ上で合成されたペプチドのような結合種、ビーズに共有結合しているタン
パク質Ａのようなタンパク質に結合している抗体に特異的生物学的に結合してい
る結合種、表面に共有結合的に固定されている結合パートナーに特異的生物学的
に結合しているＧＳＴ又はファージのような分子の一部を形成している（遺伝子
工学によって）結合種（例えばＧＳＴの場合のグルタチオン）などであるが、こ
れらに限定されない。別の例として、チオールは金と共有結合するので、チオー
ルに共有結合している部分は、金表面に固定されるように適応されている。同様
に、金属結合標識をもつ種も、表面に共有結合した分子（チオール／金結合など
）を保持する表面に固定されるように適応されている。この分子は金属に配位し
ているキレートも表す。また、表面が特定のヌクレオチド配列を有し、種が相補
的ヌクレオチド配列を含んでいれば、その種は表面に固定されるように適応され
ている。
【００５７】
“共有結合的に固定されている”とは、一つ以上の共有結合を介して固定され
ていることにほかならない。例えば、金表面に固定されているカルボキシレート
提示アルキルチオールにＥＤＣ／ＮＨＳ化学を介して共有結合している種は、該
表面に共有結合的に固定されている。
【００５８】
“特異的に固定されている”又は“特異的に固定されるように適応されている
”とは、種が、“固定されている又は固定されるように適応されている”という
定義に関して前述したように、別の検体又は表面に化学的又は生化学的に連結さ
れていることを意味するが、すべての非特異的結合は除外される。
【００５９】
本明細書中で使用している“非特異的結合”は、生化学の分野における通常の
意味を与えられる。
本明細書中で使用している“コロイド”は、ナノ粒子、すなわち無機、ポリマ
ー及び金属粒子などの非常に小さい自己懸濁可能な粒子を意味する。典型的には
、コロイド粒子は、どの次元の断面も２５０ｎｍ未満、さらに典型的にはどの次
元の断面も１００ｎｍ未満、好ましくは１０〜３０ｎｍで、金属、非金属、結晶
質又は非晶質であり得る。本明細書中で使用しているように、この用語は生化学
の分野で普通に使用されている定義を含み、典型的には金のコロイド粒子を意味
する。
【００６０】
本明細書中で使用している“金属に配位できる部分”とは、金属原子上の少な
くとも二つの配位部位を占めることができる、金属結合標識又はキレートのよう
な任意の分子を意味する。
【００６１】
本明細書中で使用している、別の成分“に対して固定された”成分は、例えば
、該別の成分も固定されている第三の成分に固定されることによって、又はそう
でなければ他の成分と移行的に会合することによって、他の成分に固定されてい
るか、又は他の成分に間接的に固定されている、のいずれかである。例えば、シ
グナリング実体が、結合種に固定されている、結合種が固定されているコロイド
粒子に固定されている、結合種が固定されているデンドリマー又はポリマーに固
定されている、などであれば、シグナリング実体は結合種に対して固定されてい
ることになる。第一のコロイド粒子表面に固定されている種が実体に付着してお
り、第二のコロイド粒子表面上の種が同じ物質に付着していれば、コロイド粒子
は別のコロイド粒子に対して固定されている。このとき、実体は、単一の実体、
複数種の複合実体、細胞、別の粒子などであってよい。
【００６２】
本明細書中で使用している“凝集体形成種”は、前述の定義のような凝集体の
関与する疾患又は非疾患プロセスに付随する生物学的種のことで、疾患又は非疾
患プロセスに付随する他の分子（類似分子を含む）に結合して該プロセスに特徴
的な原線維又は凝集体を形成するに足る結合能力を有する。神経変性疾患のよう
な一部の疾患プロセスでは、このような凝集体形成種は、典型的には、配列相同
の健常な対応物に比べて分子の立体配座における変化を特徴とするので、類似分
子にいっそう結合しやすくなる。神経変性疾患、II型糖尿病、骨髄腫のような場
合、このような凝集体形成種は、結合種を、凝集体を形成しない立体配座から凝
集体を形成する配座に変換する能力を有する。神経変性疾患の凝集体形成種から
形成されたプロトフィブリルは、神経変性疾患に関連する凝集体の前駆体又はそ
の初期形態であると報告されている。プロトフィブリルは、本明細書中で使用し
ている凝集体形成種の定義に含まれる。“凝集体”の用語と同様、当業者であれ
ば、“凝集体形成種”の用語の意味は、神経変性疾患の凝集体形成種、非神経性
疾患の凝集体形成種、及び非疾患性の凝集体形成種に適用されることは理解され
よう。
【００６３】
“異なる生物学的種”とは、マウスとハムスター、マウスとヤギなどのような
異なる動物を意味する。
“試料”という用語は、任意の細胞、組織、又は生物源由来の液（“生物学的
試料”）、又は本発明に従って有益に評価されうる生物学的又は非生物学的なそ
の他の任意の媒体のことである。例えば、ヒト患者から採取した生物学的試料、
動物から採取した試料、ヒトが消費するように設計された食品から採取した試料
、家畜飼料などの動物消費用に設計された食品などの試料、乳、臓器提供試料、
血液供給用の血液試料、水道から採取した試料などであるが、これらに限定され
ない。試料の一例は、薬物の効力を測定するために候補薬を投与されたヒト又は
動物から採取した試料である。
【００６４】
特定の成分を“含有していると考えられる試料”とは、試料に関して成分の内
容が未知の試料のことである。例えば、神経変性疾患又は非神経変性疾患のよう
な疾患を有していると考えられるが、その疾患を有していることがわかっていな
いヒトから採取した液試料は、神経変性疾患の凝集体形成種を含有していると考
えられる試料を規定する。この文脈における“試料”は、ヒト又は他の動物から
採取した生理的試料のような天然試料、食品、家畜飼料などから採取した試料、
並びに“構造を予め決められた試料”を含む。本明細書中では、“構造を予め決
められた試料”とは、試料の化学的又は生物学的配列又は構造が予め決められて
おり、その構造が神経変性疾患のような特定のプロセスと関連しているかどうか
を試験するために設計されたアッセイに使用される試料を意味する。例えば、“
構造を予め決められた試料”は、ペプチド配列、ファージ表示ライブラリーのラ
ンダムペプチド配列などである。ヒト又は他の動物から採取した典型的な試料は
、細胞、血液、尿、眼液、唾液、脳脊髄液、又は扁桃、リンパ節、穿刺生検など
から得られた液又は他の試料などである。
【００６５】
本明細書中で使用している“金属結合標識”は、キレートに配位されている金
属に固定されうる分子群のことを言う。適切なそのような分子群は、典型的には
約２〜約１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。これに含まれるの
はヒスチジン及びシステインであるが（“ポリアミノ酸標識”）、これらに限定
されない。そのような結合標識は、ヒスチジンを含む場合、“ポリヒスチジント
ラクト”又は“ヒスチジン標識”又は“ＨＩＳ−標識”と呼ぶことができ、ペプ
チド又はタンパク質又は核酸のアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれか、
又は任意の曝露領域に存在しうる。本発明での使用には、６〜１０個の残基のポ
リヒスチジントラクトが好適である。ポリヒスチジントラクトは、機能的には、
問題のタンパク質に付加されたいくつかの連続したヒスチジン残基とも定義され
る。これにより、得られたタンパク質の金属キレートカラムでの親和精製や、別
の分子（例えば、ＨＩＳ−標識に反応する抗体）との相互作用を通じてタンパク
質末端の識別が可能になる。
【００６６】
“親和性標識”は、当該技術分野における通常の意味を付与される。親和性標
識は、定義により金属結合標識を含む。
本明細書中で使用している“金属結合標識／金属／キレート連結”は、第一及
び第二の種間の連結を定義する。この場合、第一の種は金属結合標識に対して固
定され、第二の種はキレートに対して固定され、キレートは金属に配位し、金属
には結合標識も配位している。Ｂａｍｄａｄらの米国特許第５，６２０，８５０
号（本発明に引用して援用する）に、連結の例が記載されている。
【００６７】
“生物学的結合”という用語は、相互親和性又は結合能を示す対応分子対間の
相互作用のことである。典型的には特異的又は非特異的な結合又は相互作用であ
り、生化学的、生理学的、及び／又は薬学的相互作用を含む。生物学的結合は、
タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモンなどを含む分子対間に生
じる種類の相互作用を規定する。具体的な例は、抗体／抗原、抗体／ハプテン、
酵素／基質、酵素／インヒビター、酵素／補因子、結合タンパク質／基質、担体
タンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェク
ター、核酸の相補鎖、タンパク質／核酸リプレッサー／誘導物質、リガンド／細
胞表面受容体、ウィルス／リガンドなどである。
【００６８】
“結合パートナー”という用語は、特定の分子と結合することができる分子の
ことである。生物学的結合パートナーがその例である。例えば、タンパク質Ａは
生体分子ＩｇＧの結合パートナーである。逆もまた然りである。
【００６９】
“測定する”という用語は、例えば、分光法、楕円偏光法、圧電測定、イムノ
アッセイ、電気化学測定などによる種の定量又は定性分析のことである。“測定
する”とは、種間の相互作用の検出又は定量も意味する。例えば２つの種間の結
合の検出である。
【００７０】
“自己集合単層”（ＳＡＭ）という用語は、表面に自然に化学吸着する比較的
整列した分子集合のことである。この場合、分子は互いにほぼ平行に、表面に対
してはおよそ垂直に配列している。各分子は、表面に付着する官能基と、単層中
で隣接する分子と相互作用する部分とを含み、比較的整列したアレイを形成する
。Ｌａｉｂｉｎｉｓ，Ｐ．Ｅ．；Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｊ．；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｍ
．Ｓ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．によるＳｃｉｅｎｃｅ  ２４５，８４
５（１９８９），Ｂａｉｎ，Ｃ．；Ｅｖａｌｌ，Ｊ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，
Ｇ．Ｍ．によるＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，７１５５−７１６４（１
９８９），Ｂａｉｎ，Ｃ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．によるＪ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，７１６４−７１７５（１９８９），米国特許第５，
６２０，８５０号参照。これらの参考文献はいずれも本願に引用して援用する。
本発明のある種の実施の形態は、コロイド粒子表面のような表面に形成した自己
集合単層（ＳＡＭ）、及びＳＡＭで被覆した表面を有するコロイド粒子のような
アーティクルを利用している。一組の好適な実施の形態では、完全に合成分子で
形成されたＳＡＭが、表面又は表面領域を完全に覆っている。例えば、コロイド
粒子表面を完全に覆っている。本文脈における“合成分子”は、天然のものでは
なく、ヒトの指揮下又はヒトが創作もしくは指揮した制御下で合成されたものを
意味する。本文脈における“完全に被覆する”とは、ＳＡＭによる完全な直接被
覆を妨害するタンパク質、抗体、又は他の種に直接接触する表面の部分又は領域
がないことを意味する。すなわち、好適な実施の形態において、該表面又は領域
は、全体的に、完全に非天然分子（すなわち合成分子）からなるＳＡＭを含む。
ＳＡＭは、表面に密集したＳＡＭを形成するＳＡＭ形成種から、又はこれらの種
に組み合わせた、ＳＡＭ全体の電子伝達を促進できる分子ワイヤ又は他の種（Ｓ
ＡＭに参加可能な欠陥促進種を含む）、あるいはＳＡＭに参加可能な他の種、及
びこれらの任意の組合せから、完全に形成できる。好ましくは、ＳＡＭに参加す
るすべての種は、表面に結合する（場合により共有結合する）チオールのような
官能性を含む。チオールは金表面に共有結合する。本発明による表面の自己集合
単層は、本質的に任意の化学又は生物学的官能性を提示（曝露）できる種の混合
物（例えば、金が表面の場合、チオール種）で構成されることができる。例えば
、非特異的吸着に抵抗性のあるトリエチレングリコール末端種（例えばトリエチ
レングリコール末端チオール）、及び末端に親和性標識の結合パートナーを持つ
他の種（例えばチオール）、例えば末端に、金属に配位できるニトリロ三酢酸の
ようなキレート（これは、ニッケル原子と錯体化するとヒスチジン標識結合種の
ような金属結合標識種を捕捉する）を持つ種を含む。本発明は、コロイド表面又
は他の任意の表面に提示される本質的に任意の化学又は生物学的種の濃度を厳密
に制御する方法を提供する。多くの実施の形態において、自己集合単層は金コロ
イド粒子上に形成される。
【００７１】
“自己集合混合単層”という用語は、異種の自己集合単層のことを言う。すな
わち、少なくとも２個の異なる分子の比較的整列された集合から成る自己集合単
層のことである。
【００７２】
本明細書中で使用している“分子ワイヤ”は、ＳＡＭ被覆電極に接触する液の
、電極と電気的に伝達し合う能力を増強するワイヤを意味する。これに含まれる
のは、導電性分子、又はＳＡＭに欠陥を生じさせて電極との伝達を可能にする分
子（これについては前述したが、以下で更に詳しく例示する）などである。追加
の分子ワイヤの非制限的リストは、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトベ
ンゾチアゾール、ジチオトレイトール、１，２−ベンゼンジチオール、１，２−
ベンゼンジメタンチオール、ベンゼン−エタンチオール、及び２−メルカプトエ
チルエーテルなどである。単層の導電性は、電極面の導電性を増大させる分子を
加えることによっても向上させられる。導電性ＳＡＭは、１）硫黄を末端に持つ
ポリ（エチニルフェニル）鎖；２）ベンゼン環を末端に持つアルキルチオール；
３）ＤＮＡ塩基を末端に持つアルキルチオール；４）硫黄を末端に持つ、単層に
ゆるく詰まる任意の種；５）末端にエチレングリコール単位又はメチル基のいず
れかを持ち、非特異的吸着を阻害するアルキルチオールスペーサーを前記すべて
に加えるか除去したもの、で構成されうるが、これらに限定されない。チオール
を取り上げるのは、金に対する親和性があるため、ＳＡＭを容易に形成するから
である。米国特許第５，６２０，８２０号及び他の参考文献から当該技術分野で
知られているようにチオールを他の分子で置き換えることもできる。分子ワイヤ
は、典型的には、そのかさ高さ又は他の立体配座のために、そうでなければ比較
的密集したＳＡＭに欠陥を生じさせ、曝露される液に対して、ＳＡＭが表面を密
封するのを妨げている。分子ワイヤは、密集した自己集合構造の崩壊を招くこと
によって、表面が曝露される液に、表面との電気的伝達を可能にする欠陥を規定
する。このような状況において、液は、表面と接触するか、又はトンネル現象な
どによる電子伝達が起こりうるほど十分表面に接近することによって表面と電気
的伝達をする。
【００７３】
本発明の一つの構成が概略的に示されている図１を参照する。図１に示されて
いるのはアーティクル２０である。具体的には、その表面にＳＡＭ２２を含む電
極である。ＳＡＭ２２は、ＳＡＭ２２が比較的導電性であることが望ましい実施
の形態では、“分子ワイヤ”２４を含む。典型的には、混合ＳＡＭは、場合によ
りポリエチレングリコールのような非特異的結合阻害物質を末端に持つアルキル
チオールのような比較的非導電種を分子ワイヤと混合して形成される。表面及び
自己集合単層分子を表面に結合させるための官能基の選択は当該技術分野で周知
である。米国特許第５，５１２，１３１号及び５，６２０，８５０号、並びに国
際特許公開番号ＷＯ９６／２９６２９を参照。前記特許は、上記内容の解説及び
他の解説のために本願に引用して援用する。
【００７４】
粒子２６、具体的には磁気ビーズが、該ビーズに対して固定されている又は固
定されるように適応されている複数の結合種とともに提供されている。該結合種
は、神経変性疾患又は非神経変性疾患に伴うものを含む凝集体形成種、又は他の
凝集体形成種を結合できる。複数の結合種２８もシグナリング実体３０に固定さ
れて又は固定可能な状態で提供されている。シグナリング実体３０は、図示され
た実施の形態では、デンドリマー３２を含み、各デンドリマーは複数の個々のシ
グナリング実体３４を保持している。複数の標的分子３６、すなわち神経変性疾
患又は非神経変性疾患の凝集体形成種又は他の原線維形成種が、例えば該分子の
含有が考えられる生理的試料に含まれて導入される。結合種２８が、凝集体形成
種又は原線維形成種３６に結合すると、結合種の付着したビーズ２６、結合種の
付着したシグナリング実体３０、及びそれぞれに対して固定された凝集体又は原
線維形成種３６を含む連結が規定される。この構成は、電極２０の表面に、電極
下の磁石３８によって引き寄せることができる。シグナリング実体３４が電子又
は電気活性（レドックス活性）シグナリング実体の場合、電極２０付近への接近
は検出でき、試料中に凝集体又は原線維形成種３６の存在を示す。
【００７５】
具体的には、本実施の形態では、電子シグナリング実体３４は、メタロセン、
特にフェロセン（すなわちフェロセン誘導体）のようなレドックス活性分子であ
り得る。シグナリング実体３４としてフェロセンの電極２０付近への接近は、交
流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）のようなサイクリックボルタンメトリー技術によ
って、又は電荷計数を使用する装置によって測定できる。
【００７６】
結合種２８は、初めからシグナリング実体３０及び／又はビーズ２６に固定さ
れている必要はないが、結合種２８が、既に固定されていなくても、シグナリン
グ実体３０及び／又はビーズ２６に固定されるように適応されている場合、種３
６の含有が考えられる試料、結合種２８、シグナリング実体３０、及びビーズ２
６を含む混合物が提供できる。この構成では、種２８は、シグナリング実体３０
又はビーズ２６に固定されている分子の化学又は生物学的結合パートナーを含む
ことによって、シグナリング実体３０及び／又はビーズ２６に固定されるように
適応できている。ビーズ２６は、ポリマービーズの場合、共有結合的に付着させ
た様々な連結分子を含むことができる。同様に実体３０もこのように修飾できる
。ビーズ２６も、その上にＳＡＭの形成を容易にする物質の表面層、例えば金で
被覆することができ、連結分子を持つＳＡＭ形成分子（金表面の場合のチオール
のような）をその上に形成できる。ビーズ２６上の連結分子又はシグナリング実
体３０と、結合種２８との間の連結は、金属結合標識／金属／キレート連結、相
補核酸配列、ビオチン／ストレプトアビジンなどのような親和性標識を含むこと
ができる。金属結合標識／金属／キレート連結を使用する構成の場合、キレート
はビーズ２６上のＳＡＭの一部を形成でき、シグナリング実体３０には共有結合
的に付着できる。キレートは金属に配位するが、金属上の利用可能な配位部位を
少なくとも二つは残している。結合種３６の中にポリアミノ酸標識のような金属
結合標識を組み込めるので、種３６には、その金属結合標識が金属に配位するこ
とによってビーズ又はシグナリング実体に固定される能力が備わる。適切なキレ
ートの例は、ニトリロ三酢酸、２，２’−ビス（サリチリデンアミノ）−６，６
’−デメチルジフェニル、または１，８−ビス（ａ−ピリジル）−３，６−ジチ
アオクタンなどである。代替の固定化技術では、結合種３６が末端にシステイン
を持つことができ、それによってビーズ２６の金表面に固定される。
【００７７】
様々な結合種３６が選択できる。該結合種は、ペプチド、タンパク質、タンパ
ク質由来の配列、コンゴーレッドもしくはチオフラビンＴのような小分子、凝集
体形成種から誘導された配列と相同の配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヌクレオシド誘導
体、又は凝集体形成種もしくは原線維形成種３６の抗体などであり得る。
【００７８】
様々な表面が、キットもしくは系の成分を形成し、本発明の方法に参加するこ
とができる。ビーズ、コロイド、電極、ＥＬＩＳＡプレート、他の多穴滴板など
の表面が使用できる。
【００７９】
本発明の多くの技術においては、アッセイに導入されたいかなる結合種も凝集
体形成に参加させないようにするのが望ましい。そのような場合、凝集体とは結
合するが、凝集体形成抵抗性の結合種を使用すればよい。凝集体形成抵抗性の種
は、当業者であれば、結合はするが凝集体は形成しない抗体、タンパク質又はペ
プチドのフラグメントのような種の中から容易に選ぶことができる。
【００８０】
アーティクルの表面は、それが電極、粒子、ビーズ、コロイドなど何であれ、
凝集体形成種の非特異的結合を実質的に阻害する化学官能性を有するのが好まし
い。これは、一実施の形態では、アッセイに望ましい官能性を提示するＳＡＭを
表面に形成することによって達成できる。そのＳＡＭは、他の非特異的結合阻害
物質を含む混合ＳＡＭである。ＮＳＢ(non-specific-binding)阻害物質は、ポリ
エチレングリコール末端を持つＳＡＭ形成種などである。
【００８１】
好ましくは、コロイドを被覆しているＳＡＭは、コロイド／コロイド自己凝集
を抑制する。これは、ＮＳＢに抵抗する種の他に、荷電された十分な量のＳＡＭ
形成種を配合することによって達成できる。荷電部分及び／又はカルボキシ末端
種は、ＳＡＭの約１０％以上の量、又は好ましくはＳＡＭの少なくとも約３０％
もしくは少なくとも約４５％の量存在すべきである。これらの種は、例えば６０
％、８０％、９０％、又はさらには９５％といった高率で存在してもよい。
【００８２】
今度は図２を参照する。これは、図１に示したようなアッセイとしての使用に
適した別の構成を、変更を加えて示してある。図２に構成においては、シグナリ
ング実体３０が種２８に固定されるか固定されるように適応されているのではな
く、種２８とシグナリング実体３４のそれぞれをコロイド粒子４０に固定するか
固定されるように適応することによって、種２８を個々のシグナリング実体３４
に対して固定するか固定されるように適応している。種２８とシグナリング実体
３４は、当該技術分野で公知の又は本明細書中に記載の様々な任意の化学又は生
物学的技術によって、コロイド粒子４０に固定されるように適応できる。金コロ
イド粒子４０を使用する場合、コロイド粒子４０の表面に結合するチオールにシ
グナリング実体３４と結合種２８を付着させるのが、特に好都合である。ＳＡＭ
は、シグナリング実体３４及び結合種２８を含むコロイド４０の表面を覆うよう
に形成できる。図２の構成では、ビーズ２６及びコロイド４０のそれぞれに固定
されている結合種２８を凝集体又は原線維形成種３６に結合させ、次いで磁石３
８を活性化することによってビーズ２６を電極２０の近傍に引き寄せる。すると
、シグナリング実体３４はビーズ２６に対して固定されているので、シグナリン
グ実体３４も電極２０付近に引き寄せられることになる。電極２０付近のシグナ
リング実体３４の電子的又は電気化学的検出は、ＡＣＶなどを使用して行う日常
的な技術である。
【００８３】
図１及び２に示したアッセイは様々な目的に使用できる。凝集体形成種３６が
試料中に存在するかどうかを測定するために使用する場合、ビーズ２６、シグナ
リング実体３０（図１）又はコロイド粒子４０（図２）を含むキットと、ビーズ
２６、物質３０、又はコロイド粒子４０に固定される化又は固定されるように適
応されている結合種２８を用意し、試料と溶液中で混合する。凝集体形成種３６
が試料中に存在すれば、混合及び磁石３８の活性化後、シグナリング実体３４が
電極２０付近に接近することによって、それが示される。凝集体形成種３６が存
在しなければ、シグナリング実体３４は磁石を活性化しても電極に引き寄せられ
ないはずである。
【００８４】
薬物スクリーニングに使用する別の技術では、凝集体形成種３６は、神経変性
疾患、非神経変性疾患、もしくは他のタンパク質凝集疾患の治療用、又は凝集が
望ましい状態の治療用の候補薬に加えて、試料中に既知量が用意される。このよ
うな構成では、異なる候補薬は、結合種２８の結合、ひいては凝集体形成種３６
を介するシグナリング実体３０又はコロイド粒子４０とビーズ２６との結合に異
なる影響を及ぼす。この結合を阻害する候補薬は、神経変性疾患もしくは他のタ
ンパク質凝集疾患の治療用、又は凝集が望ましい状態の治療用の候補薬である。
アッセイは、信号（シグナリング実体３４の電極２０への接近）が、試料中の凝
集体形成種３６の濃度だけでなく、試料中で生じる凝集又は原線維形成の程度に
も比例する又はそうでなければ関連する、というようにして確立できる。そのよ
うな構成の薬物スクリーニングアッセイでは、信号は、特定の候補薬が、試料中
に存在する凝集体又は原線維形成種３６の特定の疾患に特徴的な凝集を防止する
程度に比例する又は関連する、又は信号は、特定の候補薬が、凝集の増強が望ま
しい生理的状態に対しては凝集を増強する程度に比例する又は関連する。
【００８５】
薬物スクリーニングアッセイでは、特定の溶液中の凝集体形成種３６の濃度及
び／又は候補薬の濃度との関連で、シグナリング実体３４に対するビーズ２６の
固定の間の関係を定量的に測定するのが望ましいことが多い。そのような構成で
は、結合種２８が、凝集体形成種３６に、結合種２８が凝集体形成種に転化する
ことなく結合し、結合事象と信号との間に１：１の相関関係を維持するのが望ま
しい。これを達成するには、結合種２８と凝集体形成種３６を異なる生物学的種
、例えばそれぞれハムスターとマウスから選択する、又は同一種から誘導した、
標的と１：１の結合をする配列から選択すればよい。
【００８６】
別の構成では、溶液中での結合事象と信号又は種との間の相関を１：１に維持
するより、アッセイの感度を最大限にすることのほうが望ましい。そのような構
成では、結合種２８を、単に神経変性凝集体形成種３６を結合するが、それ自体
は凝集体形成種でない種から、他の結合種を凝集体又は原線維形成種に変換する
能力を有する凝集体形成種に変換することが望ましい。そのような構成では、図
１及び２を参照すると、極々少量の凝集体形成種３６が試料中に存在しさえすれ
ば（例えば、わずか１００，０００個の分子でも検出しなければならない。なぜ
ならば感染性プリオン分子は、ごく初期の神経変性疾患患者の試料に特徴的なそ
の程度の数でも疾患を起こすのに十分である）、“増幅”種２９を溶液中に提供
して、試料と混合できる。このような構成では、たとえごく少量の凝集体形成種
３６しか試料中に存在し得なくても、増幅種２９がそれにより凝集体又は原線維
形成種に変換されることによって、凝集体又は原線維形成種がアッセイを用いて
検出するに足る濃度で存在できる。凝集体形成種３６が初めから試料中に存在し
ない場合、増幅種２９は未変換のままなので、信号は殆どないし全く検出されな
い。増幅種２９は、試料中に存在する凝集体形成種３６の濃度を検出可能なレベ
ルにまで増幅できるだけでなく、神経変性疾患に特徴的な種３６の塊状凝集を容
易にできる。すなわち、単一のマクロ構造の中で数千の凝集体形成種に結合した
数百又は数千のビーズ、コロイド、及び／又はシグナリング実体を含むマクロ構
造を形成できる。これらの構造は電子的又は電気化学的に容易に検出可能であり
、目に見えることも多い。
【００８７】
増幅種２９は、結合種２８に関して前掲したすべての種の中から選ぶことがで
きるが、特定のアッセイでは必ずしも結合種２８と同じでなくてもよい。例えば
、特定のアッセイで結合種２８は結合種であり得るが、凝集体形成種に変換され
る能力はない。一方、増幅種２９は変換可能で、凝集体形成種を規定できる。後
者の状況（結合種２８は凝集体形成種に変換できないが、増幅種２９は変換可能
）は、陽性の結果がない場合（試料中に凝集体形成種３６がない場合）は粒子／
粒子凝集の防止に有用であるが、種３６が試料中に存在する場合はその増幅が生
じてアッセイを高感度にする。
【００８８】
当初は不十分な凝集体形成種３６しか含まない試料の塊状凝集を起こすために
、増幅種２９を使用して塊状凝集（種３６が望ましい状態で検出されるレベルに
）を生じさせることに関連して、図１及び２に示したような電子シグナリング実
体及び磁気ビーズは必ずしも使用しなくてもよい。このような構成では、コロイ
ド粒子４０、コロイド粒子４０に固定されている又は固定されるように適応され
ている結合種２８、及び増幅結合種２８を含むキットが提供できる。このような
キットは、凝集体又は原線維形成種３６の含有が考えられる、又は含有している
ことが分かっている（薬物スクリーニングの場合）試料と混合できる。たとえご
く少量でも、種３６は増幅結合種２９を凝集体又は原線維形成種に変換できるの
で、容易に検出可能な塊状凝集及びマクロ構造の形成が起きる。容易に検出可能
とは、色の変化などでヒトの肉眼で見える、又は顕微鏡下で見える、光散乱、吸
光度などで検出可能ということである。この構成では、コロイド粒子４０は、何
らかの補助的なシグナリング実体を必ずしも保持する必要はない。
【００８９】
図１及び２を参照しながら前述した構成において、結合種２８の選択と、ビー
ズ２６及びコロイド粒子４０（コロイド粒子が使用される場合）の表面における
濃度は、以下のことを考慮して提供されるのが望ましい。すなわち、補助的な、
表面に固定されない凝集体形成種３６が存在しない場合は、粒子／粒子曝露時の
粒子凝集をある時間枠内遅らせて、（１）補助的凝集体形成種が存在しない場合
の凝集と、（２）補助的凝集体又は原線維形成種が存在する場合の凝集を比較で
きるようにする。つまり、試料中に当初凝集体又は原線維形成種３６が存在しな
ければ、コロイド粒子の凝集は発生してもごく緩慢であるか限られた程度である
が、当初から種３６が存在すれば、凝集はより迅速に、及び／又はかなり大きな
程度で発生しうる。そのようなアッセイでは、対照は試料を含まないので、試料
の速度及び／又は凝集レベルは対照のそれと比較できる。
【００９０】
直前のパラグラフで神経変性疾患を取り上げて記述した本発明の方法及びアッ
セイを、特定の神経変性疾患に伴う特定の凝集体だけに限定するつもりはない。
実際、本発明はそのような疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、
クロイツフェルト・ヤコブ病など）の宿主に付随する原線維の検出を考えている
。
【００９１】
本発明は、疾患の検出又はそのような疾患を治療する薬物の有効性の測定のた
めの様々なアッセイ及びアッセイのための成分を提供する。これらのアッセイに
必要とされうるのは、試料又は薬物スクリーニングアッセイと感知電極との相互
作用を電子的又は電気化学的に検出すること、又は、これらだけに限定されない
が、目視点検、密度スキャニング、光透過、吸光度、色変化及び／又は光散乱な
どの様々な技術によって検出可能な凝集である。凝集に関しては、凝集体形成種
を結合できる、又は予め存在する凝集体又は原線維に組み込まれ得る結合種が、
コロイド（例えば金コロイド）又は他の粒子（例えば蛍光ビーズ）に付着してい
る。これらの粒子は、場合により遊離の結合種（コロイドに付着していないが、
コロイドが懸濁している液中に懸濁している又は溶解している種）とともに、凝
集体を含有する溶液（例えば患者試料）と混合される。粒子（例えばコロイド）
が原線維に組み込まれると、原線維が光学的に検出可能になる。コロイドに固定
されたペプチドが相互に作用し合うのを防止するために、荷電部分のような反発
基（ＣＯＯＨ、ＤＮＡ、荷電ペプチド）をコロイド表面に固定することができる
。こうすることで固定されたペプチドは互い同士ではなく原線維と相互作用する
ようになり、診断アッセイにおける偽陽性の発生が削減される。
【００９２】
グリコール単位のようなフレキシブル基をニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）部分とチ
オール部分との間に化学的に挿入することもできる。より大きな自由度の導入に
より、反応のエントロピーコストが増加することによって相互作用速度が低下す
る。
【００９３】
本発明を検出法によって制限するつもりはない。検出を容易にするために、本
発明は様々な技術を考えている。例えば、染料のようなシグナリング実体は、凝
集体を組み込み可能なペプチドの一端に固定できる。信号修飾ペプチドが原線維
に組み込まれると、その表面に染料が集中して“目に見える”ようになる。別の
実施の形態では、蛍光部分及び消光部分を別のペプチド末端に付着させる。溶液
中で濃度が低いときには相互に頻繁に作用し合うことはないが、原線維上に共に
集まると、消光反応が起きて、溶液中の蛍光に変化が生じる。こうした変化は、
標準のＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて分析できる。さらに別の実施の形態
では、原線維又はプラークに組み込み可能な二つの別のペプチドの末端に二つの
化合物を付着させる。化合物は、一つの化合物が第二の化合物を修飾してそれを
活性化又は検出可能にするように設計される。化学修飾は、修飾しなければ化合
物は蛍光発光しないが、修飾後は蛍光を発光するというようにする。統計的には
、二つの化合物が原線維又はプラーク上に共に集まると、反応は何桁も頻繁に起
こるようになる。別の実施の形態では、電子又は電気化学的相互作用が検出技術
としての役割を果たす。例えば、電極表面付近にレドックス活性分子の存在が検
出できるということは、レドックス活性分子に対して固定された種と、電極に対
して固定された種、又は電極に引き寄せられる磁気ビーズのような誘引可能な粒
子に対して固定された種が結合したことを示す。別の検出技術では、試料の画像
をデジタル化し、次いでパターン認識ソフトウェアを用いて試料に凝集体が含ま
れているか否かを判定する。例えば、図８に示した試料をＣＣＤカメラを用いて
デジタル化し、パターン認識を用いて、色、凝集体のサイズ、凝集体の空間分布
、凝集の相対量などを測定できる。これにより診断スクリーニング及び薬物スク
リーニングの両方の自動化が可能になる。多数の薬物スクリーニングを実施する
際、様々な試料に個々に空間的にアドレスをつけられると特に便利である。本発
明の技術は、多穴滴板の異なるウェル（図８参照）のような、個々に空間的にア
ドレス可能な領域、及び／又は複数の電極を用いて実施できる。複数の電極は、
多穴滴板の個々のウェルなどに配置できる。
【００９４】
多数の薬物スクリーニングを実施する際、様々な試料に個々に空間的にアドレ
スをつけられると特に便利である。本発明の技術は、多穴滴板の異なるウェル（
図８参照）のような、個々に空間的にアドレス可能な領域、及び／又は複数の電
極を用いて実施できる。複数の電極は、多穴滴板の個々のウェルなどに配置でき
る。
【００９５】
どの実施の形態を使用するにかかわらず、本発明のアッセイは、凝集形成を阻
害する化合物の薬物ライブラリーのスクリーニングに容易に適応できる。薬物ス
クリーニングアッセイの場合、結合種をコロイド（又は他の粒子）に付着させ、
凝集体形成種又は原線維形成種及び候補薬を含有する溶液とインキュベートする
。ペプチドの原線維への組込みを促進するために溶液を撹拌してもしなくてもよ
い。結合種が、凝集体もしくは原線維、又はその後凝集体もしくは原線維を形成
する凝集体形成種もしくは原線維形成種に組み込まれると、付着したコロイドを
互いに接近させるので、コロイド溶液の色が変化する（例えばピンク色の懸濁液
から透明溶液中に暗青色の沈殿）。この推移ははっきりと目に見える。吸光光度
分析では、コロイドが凝集すると５６９ｎｍにあるピークが減衰する。
【００９６】
一実施の形態において、本発明の方法はペプチド（神経変性疾患又は他のタン
パク質凝集疾患又は他の非疾患プロセスに特徴的な凝集体を形成できる）を使用
する。このペプチドをシグナリング及び／又は誘引部分で修飾し、疾患状態を示
す転化又は凝集ペプチドを含有している可能性のある生物由来試料（又はそのよ
うな試料をインビトロで模倣したもの）とインキュベートする。ペプチドのプラ
ーク、凝集体、又は原線維の存在は、標識ペプチドの組込みによって検出される
。本アッセイは、以下に示すように多様な方法で、原線維種又は凝集種の迅速且
つ効率よい検出を可能にする系で実施できる。
【００９７】
例えば、一つの要素は、原線維又はプラーク形成に参加するペプチドを保持す
る磁気粒子であり得る。第二の要素は、凝集体形成に参加するペプチドと、シグ
ナリング実体として働くフェロセン誘導体のようなレドックス活性化合物の両方
を提示する異種ＳＡＭで誘導体化されたコロイドの形態であり得る。原線維又は
プラーク形成に参加するペプチドは、ビーズ及びコロイドに付着したペプチドの
ような他のペプチドの誤った折り畳み及び自然凝集を触媒できる。これらのペプ
チドの原線維種又は転化種の存在は、磁気ビーズ上のペプチドとシグナリングコ
ロイド上のペプチドの、それらの原線維又は凝集体への同時組込みによる会合を
検出することにより、試料中に検出できる。
【００９８】
この凝集を生じさせるインキュベーション期間の後、電磁場を印加すると、磁
気粒子とシグナリングコロイドを含有している複合体を誘引できる。この系では
、磁気粒子が、生物学的認識粒子を多量の試料全体に混合し、次いで検出のため
に標識された標的を電極に迅速に誘引するという方法を提供する。電極に振動電
位を印加すると、レドックス活性金属に特徴的な酸化電位時の電流ピークが、電
極における凝集体の存在、つまり凝集ペプチドの存在を示す。さらに、遊離の非
転化ペプチドを測定溶液に加えて、凝集速度及び／又は凝集した物質の量を増加
させることができる。すなわち凝集増幅物質として機能させる。凝集体形成は、
インキュベーション及び測定条件を変化させることによっても促進できる。例え
ば、周波数パルス、並びに温度及び電場及び磁場の変化などを利用する。磁気粒
子は感知電極に引き寄せることができる。あるいは、種が電極又は別の位置に誘
引されるのが望まれる本実施の形態及び他の実施の形態では、重力を利用するこ
ともできる。例えば、本発明のアッセイでは、液に自己懸濁不能であるが重力に
よって沈降する成分が使用できる。又は、他のアッセイでは、液に懸濁可能な成
分が凝集して液に懸濁不能な物質、すなわち懸濁状態を離れて沈降する物質を形
成することになろう。
【００９９】
複合体は、交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）を含む様々な技術を用いて検出で
きる。この検出法は、高次調和解析のような追加の分析技術の使用で補足できる
。これらの複合体は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）のような光学手段によって
も検出可能である。後者の技術を使用すると、粒子／粒子複合体の検出表面への
誘引によって光学的性質に大きな移動が生じる。
【０１００】
これらの疾患関連ペプチドの凝集状態は、可能性ある病原ペプチド（結合種又
は凝集体もしくは原線維形成種）を、リンカーのいずれかの末端に付着させて検
出することもできる。すなわち、重合シード（種）又は凝集体（凝集体又は原線
維形成種は、場合により結合種を凝集体又は原線維形成種に変換できる）を導入
すると、鎖が凝集体を形成し、その検出可能な性質は、もとの非凝集状態から変
化して、眼で確認可能、光散乱検出で光散乱可能、フロー検出系における粘度の
変化、シグナリング実体が凝集体の一部を形成する成分に連結されている場合は
電子検出などによる検出が可能となる。あるいは、通常の形態の病原ペプチドを
、官能基化ヒドロゲル又はゲル様物質の整列した“正孔”に付着させることもで
きる。シード（種）又はタンパク質凝集体の導入で、提供された可溶性ペプチド
が、変化した光学的性質を持つポリマー又は凝集体に変換されるので、これらの
凝集体は光学的に検出できることになる。
【０１０１】
あるいは、磁気粒子を金で被覆し、ＳＡＭで誘導体化することもできる。ＳＡ
Ｍは、ペプチド−チオールの直接付着によって、又はＳＡＭに組み込まれたＤＮ
Ａ−チオールへのＤＮＡ−ペプチドの結合、もしくはＳＡＭに組み込まれたＮＴ
Ａ−チオールへのヒスチジン標識ペプチドの結合のように間接的に、のいずれか
で所望のペプチドを提示する。本明細書中に記載のコロイドは金属原子のクラス
ターであり得、好適な金属は金である。金のクラスターはわずか２０個の金原子
で製造できるので、コロイドは、直径がわずか数ナノメートルしかない最も小さ
い粒子の一つとなろう。このように小さい粒子は、これらの比較的小さい原線維
形成ペプチド及び金属含有化合物を原線維及びプラークに組み込み、それらを懸
濁状態に維持する場合に顕著な利点がある。
【０１０２】
ペプチドと、粒子又はコロイド又は該ペプチドを該粒子又はコロイドに連結す
る認識基との間に挿入されたリンカーがあってもよい。リンカーの存在により、
例えば結合種と原線維又は凝集体形成種との間の相互作用が立体障害によって妨
害されずにすむ。このリンカー又はスペーサーは、グリコール又はアミノ酸を含
む様々な物質から作成できる。スペーサーの長さは、電気活性信号検出物質の酸
化電位のシフトを促進するために、凝集体の接近による増大した疎水性環境を作
り出すことによって変化させることができる。
【０１０３】
磁気粒子は、寸法の大きい第二のコロイドで置き換えることも可能である。こ
れらの大きなコロイドは電極表面に電磁気的に誘引可能である。しかしながら、
これらが信号を発するのは、シグナリング部分を提示するサテライトコロイドで
装飾された場合だけである。あるいは、いずれかのコロイドを、電磁力が印加さ
れた場合にその運動性を変化させる荷電部分で装飾することもできる。すべての
コロイドは同じような大きさであることもでき、その場合は電磁力を使用すれば
凝集コロイドを個々の粒子から分離できる。別の変形では、第一の粒子が重い粒
子又はコロイドで、インキュベーション時に機械的に混合でき、次いで測定を行
う際、沈降によって電極表面に蓄積させることができる。
【０１０４】
これらの技術は一粒子系でも使用できる。例えば、磁気ビーズは病原ペプチド
と遷移金属錯体を提示できる。溶液中の病原ペプチドがビーズ上のペプチドと相
互作用をして凝集体を形成すると、遷移金属の局所環境が変化して酸化電位が高
くなる。病原凝集体又は原線維の存在は、系を電気化学的に分析すると遷移金属
の酸化電位のシフトとして、又は低電位に第二の酸化ピークの出現として検出さ
れる。代替の一粒子系は、正常ペプチドを呈する磁気粒子と、遷移金属錯体を含
む溶液中の増幅ペプチドを含む。これらの遷移金属は、導電性又は非導電性のデ
ンドリマー又はポリマーに連結できる。検査試料中の病原ペプチドが凝集体形成
を促進すると、金属含有化合物は磁気ビーズに付着したペプチドと絡み合い、結
果として電気活性及び磁気複合体を生じ、これが誘引されて電子的又は電気化学
的に検出できる。
【０１０５】
このアッセイ系はビーズを使用しなくても構築できる。金属含有化合物を有す
るペプチド又はペプチドチオール及び遷移金属錯体チオールを、電極上のＳＡＭ
に固定又は組み込むことができる。増幅ペプチドは測定溶液に加えても加えなく
てもよい。検査試料に病原ペプチド又は感染ペプチドが含まれていると、それら
は表面に固定されたペプチドに付着する。すると、これが金属錯体の局所環境を
変化させるので、それらの酸化電位も変化する。測定溶液中の増幅ペプチドは、
デンドリマー又はポリマーに連結できる金属錯体を保持していてもよい。検査試
料中に病原ペプチドが含まれていると、凝集した種が金属化ペプチドと表面に固
定されたペプチドとを架橋する作用をする。この相互作用でシグナリング部分が
電極表面付近に置かれるので、電子信号が電極に伝達される。同様に、電極上に
形成されたＳＡＭに、直接的なチオール付着、又はＨｉｓ−標識ペプチドを予め
形成されたＮＴＡ−ＳＡＭに結合させる、のいずれかによって組み込まれたペプ
チドを、病原ペプチドと、ペプチド及びフェロセンのようなシグナリング部分の
両方を提示するコロイドも含有する試料溶液に導入できる。ここでも、それらが
原線維／凝集体に統合されると、シグナリング部分（この場合コロイド）が電極
に接近し、信号が伝達される。逆に、ＮＴＡ基で誘導体化されたペプチドを、６
個のヒスチジンのストレッチを含有するペプチドと相互作用させることによって
表面に付着させることもできる。増幅ペプチドは測定溶液に加えても加えなくて
もよい。
【０１０６】
これらの技術は、このような神経変性疾患又は他のタンパク質凝集疾患又は他
の非疾患プロセスを治療するための可能性ある候補薬のスクリーニングにも適応
できる。具体的には、前述したすべての変形（の形態）において、候補薬を溶液
に加え、凝集体形成を阻害又は増強する候補薬の能力を時間及び濃度の関数とし
て測定する（これは用量に反映されることになる）。信号の喪失又は電流ピーク
の位置の移動といった様々なパラメータは陽性の効果、すなわち治療上有用な効
果を示しうる。さらに、候補薬を、レドックス活性化合物、例えば金属含有化合
物を保持するビーズに付着させることもできる。これは、ＮＴＡ−チオールを持
つ又は持たないＳＡＭで被覆されたコロイドであり得るが、これはペプチドを付
着させたコロイドに付着した金属含有化合物とは異なる電位で酸化される。する
と、異なる酸化ピークが予想される。シグナリング金属含有化合物はペプチドが
付着したコロイドから除去することもできるので、薬物含有コロイド由来の単一
の電流ピークが測定できる。また、候補薬をマクロアレイに加え、アレイ全体を
上下にひっくり返して分析のためにＳＡＭ修飾電極の蓋に載せる多重薬物スクリ
ーニング装置も設計できる。
【０１０７】
この競合阻害アッセイは、信号検出化合物が候補薬を含有するコロイド上にあ
る系でも実施できる。この系では、金属含有信号検出化合物を持たない磁気ビー
ズがペプチドを保持している。溶液中の遊離ペプチドがこれらの磁気ビーズに結
合したペプチドと相互作用できる。次に、推定上の候補薬を、金属含有信号検出
化合物を有するコロイド上に配置する。コロイド上の金属含有信号検出化合物は
、凝集プロセスを妨害し、磁気ビーズ上のペプチドと直接相互作用をすれば信号
を出す。候補薬が凝集体と相互作用をしても信号を得ることができる。後者の情
報は有用であるが、薬物の作用部位を判定するのに、続けてマルチステップアッ
セイが必要となるようである。
【０１０８】
候補薬は、予め形成された原線維、電子シグナリングコロイドに付着したペプ
チド、及び磁気ビーズに付着したペプチドを含有する溶液に加える。インキュベ
ーション期間後、磁気ビーズは感知電極に引き寄せられるので、ＡＣＶによって
分析する。信号の喪失は、候補薬が原線維形成を阻害したことを示す。
【０１０９】
準安定なプロトフィブリルを選択的に形成し、均一にするためにサイズ排除ク
ロマトグラフィーで精製し、その後薬物スクリーニングの標的原線維として使用
することができる。同様に、パーキンソン病に特徴的な原線維に組み込まれるタ
ンパク質のα−シヌクレインをＨｉｓ標識し、電子シグナリングコロイド及び磁
気粒子に付着させることができる。これらの粒子を、溶液中又はパーキンソン病
患者の試料由来のシヌクレイン原線維とインキュベートすると、感知電極に磁気
的に引き寄せられるので電子分析を行う。
【０１１０】
溶液を電磁場又は機械的撹拌で脈動させると組込みプロセスが加速される。
先に述べたように、本発明のアッセイを電子的又は電気化学的相互作用に限定
するつもりもない。特定の実施の形態において、当該方法は感知表面を使用しな
い。むしろ、当該方法は凝集を含み、その凝集は、これらだけに限定されないが
、目視点検、密度スキャニング、光透過、吸光度、色変化及び／又は光散乱など
の様々な技術によって検出可能である。予め存在している原線維に組込み可能な
ペプチドは、コロイド（例えば金コロイド）又は他の粒子（例えば蛍光ビーズ）
に付着している。これらのペプチド提示粒子は、遊離ペプチドと共に、原線維（
例えば患者試料）を含有する溶液と混合される。粒子（例えばコロイド）が原線
維に組み込まれると、原線維は光学的に検出可能になる。
【０１１１】
この実施の形態をアッセイにどうフォーマットするかに関する特定の詳細に本
発明を限定するつもりはないが、便宜的な手法は９６穴ＥＬＩＳＡプレートのフ
ォーマットである。反応に関し、次の試薬をリン酸塩緩衝液（１０ｍＭのリン酸
塩、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ）中のＥＬＩＳＡプレートに加えること
ができ、以下の濃度が便宜上使用される。すなわち、Ｎ−末端に（Ｈｉｓ）6標
識を持つ５８．２μＭ又は１４μＭのいずれかの濃度の合成Ａβ（１−４０）ペ
プチド、ＮＴＡ／Ｎｉ++を提示する金コロイド３０μＬ（製法は以下に記載）；
及び０．６μＭのＡβ−アミロイド原線維の“シード（種）”である。次にＥＬ
ＩＳＡプレートは、撹拌せずに所望の時間（例えば３０分〜２時間）３７℃でイ
ンキュベートできる。１時間の時点で、５８．２μＭの（Ｈｉｓ）6−Ａβペプ
チドを含有するウェル中に暗赤色の大凝集体構造が明らかに見える。所望の時間
（例えば１〜４．５時間）の後、プレートを短く撹拌し、次いで目視点検を行う
。凝集体構造は、（Ｈｉｓ）6−Ａβペプチド及びＡβ原線維“シード”を含有
するすべてのウェルに明らかに見ることができる。これらの凝集体、原線維様構
造は、速度は遅いが、５０％までのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する溶液中に
も形成できる。ＦＢＳの濃度を倍数希釈し、一定濃度の原線維シード及び（Ｈｉ
ｓ）6−Ａβペプチドとインキュベートすると、目に見える原線維形成速度はＦ
ＢＳ濃度が減少するにつれて増加する。これは、本アッセイがＡβ原線維に特異
的で、胎仔血清中に存在する原線維種を認識していないことを示す。原線維又は
（Ｈｉｓ）6−Ａβペプチドのどちらか一方だけを含有するウェルは目に見える
凝集体を形成しない。陰性対照として、無関係のＨｉｓ標識ペプチドをコロイド
及びシードとなる原線維と共にインキュベートできる。このような対照溶液には
目に見える原線維凝集体は形成されない。
【０１１２】
前述の方法を用いると、コロイドとＡβペプチドは含有していたがシードとな
る原線維は含有していなかった溶液から、わずか１０ピコモルという原線維シー
ド濃度を目で識別できる。
【０１１３】
本明細書中に記載の比色技術はアッセイプロセスを中断しない。単一の液混合
物を調製し、いかなる移動も他の撹拌も必要とせずに、該混合物の凝集体形成又
は非形成について観察し、判定できる。あるいは、特定のアッセイを撹拌又は他
の形態のエネルギーに曝露してもよい。例えば、ある場合には、エネルギーを特
定の系に導入することが凝集体形成に影響を及ぼしたかどうかを判定したいこと
もある。エネルギーは、撹拌、振盪、振動、音波処理、渦流、又は他の機械的撹
拌のようなかき混ぜの形態で、赤外線、紫外線、又は可視光線のような電磁放射
線への曝露、無線周波エネルギー、マイクロ波放射線、又は任意のスペクトル部
分にある本質的に任意の電磁放射線への曝露、熱への曝露によって導入できる。
時に、系をエネルギーに曝露することで凝集速度に影響が出るが、これは、エネ
ルギーが神経変性及び他の異常凝集疾患プロセスに影響を及ぼしている可能性を
示していると言えよう。
【０１１４】
比色技術は、凝集体を形成する生物学的プロセスに関して、薬物又は候補薬を
時間の関数として又は凝集体形成の関数として活性と相関させるという本発明の
別の態様を容易にする。本発明の一実施の形態は、粒子と、表面に固定された又
は固定されるように適応された、凝集体形成種を結合できる結合種の提供に関す
る。粒子と結合種は、原線維形成に影響を持つと考えられる候補薬に曝露される
。第一の時点において、凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の有効性を示す、粒子
の第一の観察可能な特徴を測定する。次に、第二の時点において、凝集体形成に
影響を及ぼす候補薬の有効性を示す、粒子の第二の観察可能な特徴を測定する。
アッセイは、粒子が相互に異なる程度に結合するように、又はそうでなければ共
通の表面に結合することによって互いに関して固定されるように構築できる。候
補薬は、原線維形成を阻害すると考えられるものであり、判定ステップは、第一
及び第二の時点における、凝集体形成を阻害する候補薬の有効性を示す、粒子の
第一及び第二の観察可能な特徴を測定することを含む。あるいは、薬物は凝集体
形成を増強するとも考えられるので、その増強能力を第一及び第二の時点で判定
できる。このアッセイは補助的な凝集体形成種に曝露することも含みうる。
【０１１５】
観察可能な特徴とは、直接目で確認可能な変化を含む（例えば、コロイド凝集
による色の変化、又は本明細書中に記載の蛍光消光のような他の直接目視確認可
能な変化など）。この技術は、色の変化を分光学的に測定するなど、自動化する
こともできる。
【０１１６】
一組の実施の形態では、第一及び第二の時点の差が比較的大きい。具体的には
、少なくとも１日又は少なくとも１．５日、さらには少なくとも２日異なる。こ
の組の実施の形態は、疾患のような生理的プロセスに付随する後期の凝集体に特
に有効な薬物の確認に有用であり得る。別の組の実施の形態では、第一及び第二
の時点の時間差が２０分を超えない、又は１０分未満、又は５分もしくは１分未
満、又はさらには３０秒未満である。この組の実施の形態は、ごく早期の凝集体
プロセスに特に有効な薬物の確認に使用できる。
【０１１７】
本発明の本技術の一つの利点は、“ワンポット”アッセイで実施できるという
ことである。すなわち、第一及び第二の測定ステップ中及びステップ間に、アッ
セイを中断したり撹乱することなく、又はアッセイに外部エネルギーを曝露する
ことなく、第一及び第二の観察可能な特徴を測定できるということである。これ
を心に留めると、観察可能な変化の分光学的測定は、好ましくは視覚分光法を用
いて実施される。本アッセイは、目視可能な範囲での変化（ピンクから青）を求
めており、また可視分光法は系に大きなエネルギーを加える必要がないため、都
合がよい。可視分光法を使う場合でも、アッセイを分光エネルギーに長時間曝す
のではなく、異なる時点で短いスペクトルを取るのが好ましい。
【０１１８】
粒子の結合状態を示す観察可能な粒子の特徴、及びそれによる候補薬の有効性
は、分光学的方法であれば、少なくとも二つの波長で測定できる。例えば、青と
ピンクはそれぞれ青の減少とピンクの増加をモニタすることによってモニタでき
る。
【０１１９】
観察可能な特徴には、細網の形成、すなわち目に見える凝集体形成の観察所見
も含まれうる。
別の実施の形態では、複数の粒子が試料に曝露され、粒子の凝集程度が曝露ス
テップの少なくとも５時間後に測定される。これは曝露ステップの少なくとも１
０時間後、少なくとも１５時間後、又は少なくとも２０時間後に実施することも
できる。実施の形態の一ステップでは、これらの時間より前には凝集の測定はな
されない。
【０１２０】
別の組の実施の形態では、粒子が試料に曝露され、凝集の測定は曝露ステップ
の１分以内、又は３０秒以内、又は１０秒以内に行われる。
前述のように、本発明の本態様は、異なる病期にある患者の治療に特に有用な
薬物の判定を含むことができる。これに派生して、本発明の一つの方法は、凝集
体関連プロセスの第一期を示す症状を呈する第一の患者に該プロセス治療のため
の第一の薬物を投与することを含み、前記第一の薬物は、原線維形成に影響を及
ぼす可能性を示すアッセイに曝露すると、原線維形成に影響を及ぼす第一の特徴
を示す。プロセスの第二期を示す症状を呈する第二の患者には第二の薬物を投与
し、前記第二の薬物は、アッセイに曝露すると、原線維形成に影響を及ぼす第二
の特徴を示す。凝集体関連プロセスは、神経変性疾患、非神経変性疾患、又は非
疾患プロセスを含みうる。さらに、ｐＨ、塩及び／又は緩衝液濃度などの変化を
利用して凝集体形成速度を変えることもできる。これは、以下に記載するが、凝
集体の大きさ又は形成の進行とある種の薬物の有効性との相関に関する本発明の
有用な技術になりうる。
【０１２１】
本発明は、様々な目的のために、凝集体形成種を産生できる細胞の使用にも関
する。一つの技術では、細胞を、神経変性疾患のような凝集関連の生理的プロセ
スを阻害する候補薬に曝露し、細胞が産生した物質の、神経変性疾患に特徴的な
凝集体の形成に対する可能性をモニタできる。これは、該疾患を阻害する候補薬
の有効性の判定に有用であり得る。他の技術も実施できる。細胞が産生した凝集
体形成種を単に単離し、それらの種を試験するのではなく、細胞自体を使用する
ことで、リアルタイムでの実験の実施及び薬効のモニタが可能となる。この方法
は、技術が簡便、安価、及び迅速であることを含め、いくつかの利点がある。一
つの技術は、細胞からの神経変性疾患の凝集体又は原線維形成種の産生、例えば
分泌を、時間の関数としてモニタすることを含む。時間は、例えば、５秒、３０
秒、及び１日までの任意の分数を含む短い時間間隔、並びに１週間までの任意の
日数を含む長い期間、さらに２週間、３週間などといった長期間である。細胞に
よるこれらの種の産生を時間の関数としてモニタすることは、物質は時間をかけ
て絶えず産生されるので、薬物活性の特徴、すなわち新しく産生された物質に応
答して絶えず作用する薬物の能力の測定が可能となる。時間の関数としての薬効
も調査できる。これは、異なる時点、例えば前述の時点で細胞が産生する異なる
物質に応答して作用する薬物の有効性の測定を可能にする。また、時間の関数と
しての薬物の（熱的）安定性、並びに、細胞が分泌した物質の濃度の上昇に対し
て作用する薬物の能力なども測定できる。
【０１２２】
本発明の方法は、凝集体形成種の分泌能力のある細胞だけに限定する必要はな
い。その代わり、凝集体形成種を細胞内に産生又は保持する細胞は、溶解してか
らコロイドを添加すればよい。本発明の本態様は、神経変性疾患について記載さ
れているが、非神経変性疾患及び他の非疾患性プロセスにも適用される。細胞は
、何らかの凝集体形成種又は凝集体形成種の前駆体を産生又は保持する能力を有
することもある。
【０１２３】
さらに、アッセイは、細胞の物質産生に関して異なる時点における情報を取り
出すために異なる方法で構築することもできる。例えば、コロイドとコロイドに
固定された又は固定可能な結合種を含む予め混合されたアッセイの存在下で、細
胞に凝集体形成種を産生させることもできるし、コロイド及び／又は結合種をプ
ロセスの任意の時点で添加することもできる。
【０１２４】
当該技術は、凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の有効性の測定も可能にする。
この場合、形成に関する特異的機序は分かっていなくてもよい。候補薬は、細胞
による種の産生に影響を与える、又は凝集体形成種が産生された後の凝集体形成
に影響を与える、又はプロセスの任意の段階に影響を与えることによって、凝集
体形成に及ぼす影響が有効と判定できる。プロセスの段階とは、転写、翻訳、翻
訳後修飾、及び分泌を含みうる。
【０１２５】
当該技術は、凝集体形成に長時間にわたる影響を及ぼす候補薬の有効性を、介
入することなくモニタ、例えば視覚化することも可能にする。記載したアッセイ
では、ピペットによる分注、撹拌、又は溶液の移動など、いかなるアッセイ成分
の移動も必要ない。これにより、自然の生物学的環境をより有効にシミュレート
することが可能になるので、自然環境で有効な薬物を一層効果的に確認すること
ができる。本発明の本態様において、本明細書中に記載のすべての測定／視覚化
技術が使用できる。例えば、コロイド／コロイド凝集を肉眼で見る、分光測光、
光散乱、及び本明細書中に記載の他の技術などである。好適な技術は、細胞含有
媒体を目視点検して、コロイドの存在下で媒体が凝集体又は原線維形成がないこ
とを示すピンク色のままであるか、凝集体形成種の存在を示すコロイド凝集を示
す青色に変化するか、又は対応する中間的状態を示すピンクと青の間のスペクト
ル上の任意の色を示すか、を測定する。
【０１２６】
当該技術は、凝集体又は原線維形成の局在化を視覚検出又は他の検出法で検出
することも含む。典型的には、高濃度の凝集体又は原線維形成種が存在する細胞
周囲の濃縮領域における検出である。凝集体又は原線維形成種の局在化は、ペプ
チド又はコロイド細網の増加領域として、又は凝集体又は原線維形成種が細網領
域に引き寄せられるためにペプチド／コロイド細網の増加領域に隣接して溶液が
透明になる領域として視認することができる。個々の細胞又は細胞クラスターの
周囲の凝集を観察する能力は、特定の薬物の有効性をより正確に評価することを
可能にする。具体的には、有効性の定量化がより簡単にモニタできる。例えば、
細網のパターンが簡単に認識でき、特定の細胞と関連している場合には、関与す
る細胞数を知らなくてもアッセイを実施することができる。
【０１２７】
当該技術は、細胞に対する候補薬の毒性の測定も可能にする。
本発明はまた、コロイド−コロイド相互作用が関与する一連のアッセイ及びキ
ットも提供する。本発明のアッセイでは、第一及び第二のコロイド粒子は、互い
に対して固定されるか、又は互いに対して固定されないようにしてある。アッセ
イは、結合相互作用を示すことができ、また、結合相互作用を容易にする酵素、
切断する酵素、結合相互作用を阻害する薬物、又は望ましくはその有無が測定さ
れる本質的に任意の他の結合相互作用を含むことができる。本発明の本態様は、
互いに対して固定される第一及び第二のコロイド粒子に関して記載しているが、
一般的には多くのコロイド粒子が特定のアッセイに関与し、粒子間の結合又は共
通表面への結合を特徴とするコロイド粒子の凝集が生じているかどうかを測定す
るために観察される。凝集が発生しない場合、コロイド粒子が懸濁している溶液
はピンク色のままである。凝集が発生すると、溶液は青又は紫色になり、多くの
場合目に見える細網（目に見える凝集）が生じる。細網はヒトの眼又は顕微鏡を
使って目視的に測定できる。
【０１２８】
本発明の本態様の一つの利点は、色の変化又は未変化を分光学的に測定できる
ことである。例えば、第一及び第二の種間の結合を阻害する候補薬の能力を測定
するための特別なアッセイを構築できる。第一及び第二の種を相対的に固定する
（例えばコロイド粒子への直接固定）、粒子を別の容器に提供する（例えば多穴
滴板の別のウェル）、そして異なる候補薬に曝露する。ウェルは、コロイド凝集
による色の変化を示す、特定の波長における吸収の変化を分光学的に測定できる
。従って、本発明の一つの重要な態様は、結合相互作用の有無を示すコロイド粒
子の凝集を計器を使って自動的に測定することを含む。本発明の本アッセイ及び
他のアッセイでは、初めに種をコロイド粒子に対して不動化（例えば固定）し、
次いで結合を阻害又は促進しうる候補薬、酵素、又は他の種に曝露し、それから
候補薬又は酵素に曝露する。あるいは、第一又は第二の化学もしくは生物学的種
を最初に候補薬、酵素などに曝露し、それから第一及び第二の化学もしくは生物
学的種が固定又は不動化される能力を有するコロイド粒子に曝露してもよい。本
発明のアッセイの実施ステップ順にかかわらず、コロイド−コロイド凝集は、結
合相互作用又はその妨害を示し、自動化できる。
【０１２９】
所望であれば、様々なシグナリング実体をコロイド粒子に対して固定できる。
コロイド上に提示されるシグナリング実体は蛍光分子であり得る。グリーン蛍光
タンパク質を含む、蛍光複合抗体及び他の蛍光融合タンパク質は、生物医学的研
究及び検査に広く使用されている。これらの蛍光タンパク質及び分子は、金コロ
イドに容易に付着できる。この金コロイドは、親和性標識、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学
、又は本発明によってＮＴＡ−ＳＡＭ被覆コロイド上に提示されるＨｉｓ標識タ
ンパク質Ａ又はＧへの結合、のいずれかにより推定上の結合パートナーも提供し
ている。蛍光部分のようなシグナリング実体は、ビオチン末端リガンドを介して
コロイド上に共に固定できる。又はキレート／金属／金属結合標識による連結を
介して固定することもできる。蛍光部分は、それを抗体に付着させ、抗体と結合
するＨｉｓ−タンパク質Ｇとのキレート／金属／金属結合標識を用いて固定させ
ることもできる。次に、該部分は直接検出できる。あるいは、第一のリガンドを
持つ一組のコロイドが蛍光部分を持ち、第二の組のコロイドが推定上の結合パー
トナーと消光部分を提供するように誘導体化される。リガンド−受容体対が相互
作用すると、蛍光信号に測定可能な消光が生じる。候補薬は、この相互作用を分
断するその能力について試験できる。
【０１３０】
そのような研究では、第一及び第二の化学又は生物学的種は、それぞれ第一及
び第二のコロイド粒子に対して固定でき、他の化学又は生物学的種は他のコロイ
ド粒子に対して固定できる。ある場合は、第一及び第二の化学又は生物学的種は
同一である。すなわち、複数のコロイド粒子が同じ固定された実体を持つことに
なる。別の場合は実体は異なる。化学又は生物学的種は、例えば粒子に固定され
ているＳＡＭ形成種に共有結合的に付着することによってコロイド粒子に直接固
定できる。又は、例えば別のコロイド粒子を介してコロイド粒子に固定されるこ
とによってコロイド粒子に対して固定できる。例えば、化学種が別のコロイド粒
子に固定され、その（別の）コロイド粒子がコロイド粒子に固定されていれば、
化学種はコロイド粒子に固定されている。一組の実施の形態において、コロイド
凝集は、結合相互作用によってコロイド粒子に対して固定されている又は固定さ
れるように適応されている化学又は生物学的種を用いて研究される。このときの
結合相互作用は、核酸配列の相補核酸配列に対する結合は含まれない
コロイド／コロイド凝集を含む様々な研究が本発明に従って実施できる。一組
のアッセイは、コロイド粒子に対して固定された吸光又は発光種の第二の種によ
る影響を利用している。すなわち、第二のコロイド粒子に対して固定された第二
の種を、結合、切断、又は本発明に従って研究されるのが望ましい他の相互作用
によって、第一のコロイド粒子に接近させたり遠ざけたりすることによる影響で
ある。例えば、蛍光分子を第一のコロイド粒子に対して固定し、該蛍光分子の蛍
光を消光する、すなわち蛍光分子の発光を実行する能力を有する化学種を第二の
コロイド粒子上に提供できる。次に、第一及び第二のコロイド粒子に対して固定
されている第一及び第二の種が互いに結合すると、第一及び第二のコロイド粒子
を相互に接近させるので、蛍光分子の消光が起こる。第一及び第二の種が第一及
び第二のコロイド粒子に対して固定され、それぞれが共通の被検体に結合できる
と、被検体の存在が蛍光の消光を起こし、被検体がなければ消光は回避される。
【０１３１】
候補薬は、一つの種との結合をめぐる被検体との競合について、又は被検体上
の一つの部位との結合について試験される。この場合、被検体は既知種として提
供される。候補薬の存在が第一及び第二のコロイド粒子の相互間の固定を阻害す
ると、消光が阻害される。代替の実施の形態は、第二のコロイド粒子上の第二の
分子による、第一の分子の発光の増強又は発光もしくは吸光波長の移動を含む。
【０１３２】
このコロイド／コロイド凝集技術は、薬物又は問題とするタンパク質の結合パ
ートナーを確認するのに使用できる。これは、薬物又はタンパク質を一組のコロ
イドに、そして可能性ある結合パートナーを他の組のコロイドに付着させ、二組
のコロイド間の結合相互作用をアッセイで検定することによって達成できる。薬
物又はタンパク質の生物学的標的が一旦確認されたなら、コロイドに付着させた
結合パートナーの存在下で候補薬をアッセイに加えて同族リガンドに対する薬物
又はタンパク質の結合を分断することにより、第一組のコロイド上の薬物又はタ
ンパク質の合成模倣品を確認することができる。この技術は、診断又は薬物スク
リーニングの目的で、希少疾患用薬や特徴付けされていないタンパク質の生物学
的標的を確認するのに非常に有用である。この技術を利用すれば、現在使用され
ている高価な又は製造が困難な薬物の合成代替品又は“模倣品”の確認が可能で
ある。
【０１３３】
一実施の形態において、脈管形成阻害薬を一組のコロイドに付着させ（親和性
標識連結、化学カップリング、又は非特異的吸着を介して）、その生物学的標的
を別の組のコロイドに付着させる。エンドスタチンのような、二つ以上のリガン
ド結合部位を有する脈管形成阻害薬の特異的ケースの場合、リガンドを一組のコ
ロイドに付着させ、脈管形成阻害薬は溶液に添加するのがよい。候補薬を加え、
結合相互作用を分断するその能力についてアッセイで検定する。次に、相互作用
を阻害するいずれかの薬物を第三組のコロイドに付着させ、脈管形成阻害薬及び
脈管形成阻害薬の生物学的標的に対する結合についてアッセイで検定する。脈管
形成阻害薬の生物学的標的に結合し、脈管形成阻害薬がその標的に結合するのを
阻害する薬物は、脈管形成阻害薬の“模倣品”とみなすことができ、代替薬とし
て使用できる。このアッセイは、実質的にすべての薬物の模倣品のスクリーニン
グに使用できる。脈管形成阻害薬は高価で製造も困難であるので、その合成代替
品の薬物スクリーニングは特に興味深い。当該アッセイは、エンドスタチン−ビ
トロネクチン又はエンドスタチン−ＲＧＤ−ペプチド相互作用の分断を通じてエ
ンドスタチンの、アンギオスタチン−ＡＴＰ−シンターゼ又はアンギオスタチン
−ビトロネクチン相互作用の分断を通じてアンギオスタチンの、又はＴＮＰ−４
７０−メチオニン−アミノペプチダーゼ相互作用の分断を通じてＴＮＰ−４７０
の合成代替品を確認するのに使用できる。他のコロイド／コロイドアッセイの場
合と同様、色の変化、蛍光の消光、又は他の発光分子の増強又は抑制などが結果
の指標となりうる。ＲＧＤ／エンドスタチンの相互作用に関する試験は以下の実
施例１８に記載する。
【０１３４】
このコロイド／コロイド凝集技術は、脈管形成阻害薬又は脈管形成経路に関与
するリガンドの発見にも使用できる。一つのアッセイにおいて、推定脈管形成阻
害薬又は関与するタンパク質を第一のコロイド粒子に対して不動化（例えば固定
）することができる。第二のコロイド粒子は、脈管形成及び／又は転移に関与す
る分子、例えば基底膜タンパク質、インテグリン、又は接着分子に対して固定化
することができる。もし、特定の脈管形成阻害薬が、第二組のコロイドに固定さ
れている基底膜タンパク質、インテグリン、又は接着分子に結合すると、二組の
コロイドは互いに対して固定され、その結合相互作用が本発明の方法、例えば色
の変化、沈殿などによって検出可能になる。本方法で脈管形成阻害薬が確認され
ると、結合を分断する候補薬がスクリーニングできる。該薬物が相互作用を分断
すると、コロイド粒子は互いに対して固定されなくなるか又は固定の程度が低く
なる。本アッセイは、既知の脈管形成阻害薬と共に使用して、脈管形成阻害薬の
生物学的標的を確認又は立証することもできる。次に、候補薬をアッセイに添加
して、同じ生物学的標的に作用する他の薬物を確認することができる。
【０１３５】
そのようなアッセイで、コロイド粒子を互いに対して固定できる別の実施の形
態は、コロイドをそれぞれ共通表面に対して固定することを含む。共通表面は、
第一のコロイド粒子上の種の結合パートナーを提示する別のコロイド粒子の表面
であってよい。共通表面は、ニトロセルロース膜のような膜などのアーティクル
の表面、チップ表面、ＳＡＭで誘導体化されたアーティクルの表面などであって
もよい。好適な実施の形態では、コロイド粒子が結合できる表面は、結合が起こ
った場合に（共通表面上の種とコロイド粒子上の種との間で）、コロイド粒子が
、検出（凝集に特徴的な色の変化、蛍光の消光、又は本明細書中に記載の他の性
質によって）ができるほど十分近くに接近するように、十分高密度の結合部位を
含む。
【０１３６】
別の実施の形態では、ＨＩＶ関連Ｐ２４タンパク質を認識する抗体をコロイド
粒子に対して固定又はさもなければ不動化し、Ｐ２４の含有が考えられる試料に
曝露する。Ｐ２４が存在すれば、コロイド粒子は接近し、本明細書中に記載のよ
うに検出される。本発明は、Ｐ２４／抗体の相互作用を分断する候補薬のスクリ
ーニングも提供する。
【０１３７】
タンパク質が機能するには酵素によって翻訳後修飾されなければならない多く
の疾患状態があり、本発明はそのようなプロセスを研究できる技術及び成分を提
供する。以下に、疾患状態を促進する酵素修飾の例を挙げる。このような例では
、酵素活性を阻害することが望ましく、そうすることによって疾患が抑制される
。しかしながら、治療上酵素活性を促進したい場合もある。カスパーゼは、“プ
ログラムされた細胞死”という意味の用語であるアポトーシスの促進に関与して
いる酵素である。従って、カスパーゼ活性、ひいてはプログラムされた細胞死を
増大する薬物又は生体分子を確認するのは有益なことである。これらの治療薬剤
をがん細胞に当てると、腫瘍細胞の特異的破壊が可能になる。
【０１３８】
本発明の方法を用いて活性を検定できる酵素は、１）基質を切断する酵素；及
び２）基質に断片を付加する酵素の二つに大まかに分類される。
第一の分類に入る酵素活性、すなわち切断の例は、アミロイド前駆体タンパク
質（ＡＰＰ）のプロセシングである。ＡＰＰの分解産物は、アルツハイマー病に
伴う凝集体及びプラークを形成するので、プレシネリン並びにβ−及びγ−セク
レターゼのようなＡＰＰを修飾する酵素は、治療の重要な標的である。切断によ
り、一般的に１〜４０又は１〜４２のアミノ酸からなるペプチドが生成するが、
１〜４２ペプチドのほうがずっと凝集及び疾患を起こしやすい。
【０１３９】
他の場合には、酵素の切断活性を増大させるのが有益である。そのような例で
は、ある基質の切断を直接的又は間接的に促進する薬物又は生体分子をスクリー
ニングするのが有益である。例えば、カスパーゼは、アポトーシスすなわちプロ
グラム細胞死の引き金を引くシグナリングカスケードに重要な役割を果たすタン
パク分解酵素である。従って、このクラスの酵素の活性を促進又は始動させる因
子（薬剤）を確認するのは有益である。次に薬物を腫瘍細胞に当てると、健常細
胞には最小限の損傷しか与えずに腫瘍細胞を特異的に破壊する。
【０１４０】
カスパーゼ３は、配列ＤＸＸＤ／Ｘを切断する。カスパーゼ３は、プロテイン
キナーゼＣ（ＰＫＣ）を、転写制御ドメインとキナーゼドメインの間で切断する
ことが示されている。このことは、触媒ドメインがチェックされずに機能するの
を可能にしてしまう。この活性がアポトーシス（プログラム細胞死）の引き金を
引く。ＰＫＣのキナーゼドメインの突然変異体は、このタイプの（ｐ５３依存性
）アポトーシスを誘発しなかった。本発明の一実施の形態で、カスパーゼ３の切
断部位を含有するペプチドをコロイド粒子に固定する。例えば、ペプチドは、ペ
プチドのいずれかの末端に親和性標識を有するように合成または発現できる。金
コロイドは、該親和性標識の結合パートナーを提供するように誘導体化する。こ
の組成物に、基質を切断する酵素を純粋な状態又は混合物の一部として、候補薬
の存在下又は不在下で加える。そして、切断に及ぼす候補薬の影響を、コロイド
／コロイド相互作用に関して本明細書中に記載した技術を用いて測定する。切断
をシミュレートする、すなわちアポトーシスをシミュレートする薬物は、同じく
本明細書中に記載の技術を用いてスクリーニングし確認できる。
【０１４１】
基質を切断し、アポトーシスを誘発しうる酵素の別の例を記述する。サイクリ
ン依存性キナーゼ５１０（ｃｄｋ５）とｐ３５１１からなる複合体は、ニューロ
ンのある重要な細胞プロセスに必要とされている。しかしながら、酵素カルパイ
ンによるｐ３５のｐ２５への切断は、新しいタンパク質複合体ｐ２５／ｃｄｋ５
１２を作り出す。この新規の複合体は不適切に局在化し、構成的に活性である。
この複合体はタウを過剰リン酸化し、これが細胞骨格を分断しニューロンのアポ
トーシスを誘発する。ｐ３５のｐ２５への切断は、β−アミロイドペプチド１〜
４２の添加によって増強できることも示唆されている。
【０１４２】
ｐ３５の切断を阻害できる薬物は治療薬として有用であろうことは明らかであ
る。この理由から、カルパイン又は他の修飾因子によるｐ３５の切断を阻害する
因子（薬剤）を確認するのは有益であろう。以下は、ｐ３５のタンパク質分解を
阻害する薬物の高処理量のスクリーニングを容易にするために本発明をどのよう
に利用できるかを示す予言的な例である。
【０１４３】
酵素カルパインの基質であるｐ３５を、別のコロイドへの直接又は間接的な固
定が促進されるように適応する（必要であれば）。コロイドもこの固定を促進す
るように誘導体化されている。例えば、組換えｐ３５タンパク質を、ＮＴＡ−Ｎ
ｉ（Ｈｉｓ標識を結合する）を持つ第一の金コロイドに付着させるために、一方
の末端にヒスチジン標識を持つように発現させる。そして、グルタチオンを持つ
第二のコロイドに付着させるために、他方の末端はグルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）に組換え的に融合させる。あるいは、ｐ３５は、ｐ３５の
部分に対する抗体を提供するように誘導体化されている第二のコロイドに自然に
付着させるようにもできる。
【０１４４】
当初、修飾ｐ３５はコロイドと混合させない。むしろ、ｐ３５の一部を別々に
、カルパインとカルパインによるｐ３５の切断を阻害する能力を有すると考えら
れる候補薬のパネルとインキュベートする。適切なインキュベーション時間の後
、基質ｐ３５の二つの別の部位に同時に結合するように誘導体化された二つの金
コロイド集団を加える。金コロイドを溶液に加えたときに、懸濁液中に遊離した
コロイドの特徴的なピンク色のままであれば、基質が切断されて、２個以上のコ
ロイドを連結してコロイド−ペプチド細網にするように作用できなかったと結論
づけることができる。しかしながら、溶液がピンク色から青色に変化した場合、
ｐ３５は切断されず、２個以上のコロイドが同時に連結した、すなわち候補薬が
効果的にカルパイン切断を阻害したと推測できる。
【０１４５】
あるいは、色の変化をモニタするのではなく、顕微鏡下でこのアッセイを観察
し、ペプチドコロイド細網が形成されているかどうかを判断してもよい。ｐ３５
の切断を阻害した薬物は、ペプチドの連続性を維持し、二つの認識部位を相互に
、そして２個の別のコロイドに接続させたままにしておくようである。
【０１４６】
本発明の別の態様では、β−アミロイドペプチド（１〜４０又は１〜４２、可
溶性又は予め形成された凝集体の状態のいずれか）を、ｐ３５基質、純カルパイ
ン、カルパインを含有する溶解産物、又は切断活性を含有する溶解産物、及び切
断を阻害すると考えられる候補薬と共にアッセイに加える。
【０１４７】
本発明を特定の酵素又は完全なｐ３５の使用に制限するつもりはない。切断部
位を含有するｐ３５の任意の部分も、アッセイの基質としての使用に適切であろ
う。さらに、基質の２個のコロイドへの直接的又は間接的同時付着を促進する任
意の官能性で基質を修飾してもよい。基質は、親和性標識、親和性配列、ビオチ
ンなどで修飾できる。必ずしも必要というわけではないが、基質は、ペプチド上
の二つの部位が同じコロイド上の二つの部位に結合するのを防止するために、二
つの異なる親和性標識で修飾するのが好ましい。あるいは、基質を修飾せずに、
抗体認識を介して２個のコロイドに付着させることもできる。カルパインは、純
粋な形態、又は細胞溶解産物中にあるような他の酵素及びβ−アミロイドペプチ
ドを含むタンパク質と混合した形態のいずれかで、アッセイに添加できる。
【０１４８】
当該アッセイは、９６穴滴板フォーマットで実施し及び／又は自動分光光度計
で分析することにより容易に多重化できる。
本発明の技術に従って研究できる酵素の別の例はマトリックスメタロプロテイ
ンである。マトリックスメタロプロテインは、がん細胞表面に発現され、がんの
進行及び転移に関与する膜タンパク質の切断に関わっている。本発明の一つの技
術で、マトリックスメタロプロテインによって切断できる基質（そのような基質
は当該技術分野で公知である）を修飾し、２個のコロイド粒子に対して固定化す
る。この構成を、タンパク質の切断活性を阻害する候補薬の存在下で、マトリッ
クスメタロプロテインに曝露すると、候補薬の有効性が分かる。候補薬が効果的
にマトリックスメタロプロテインの活性を阻害すると、構成は青色になり（凝集
コロイド）、候補薬がマトリックスメタロプロテイン活性を効果的に阻害しなけ
れば、構成はピンク色になる（分散コロイド）。
【０１４９】
第二の分類に入る酵素活性、すなわち付加の例は、がん関連タンパク質Ｒａｓ
の修飾である。ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼは、Ｒａｓに脂質様
基を加える酵素である。この修飾により、Ｒａｓは膜に埋め込まれ、機能を発揮
するようになる。この特定の場合にはＲａｓは腫瘍原性を持つ。ＦＰＴと同様に
基質は、親和性標識又は結合因子を基質の別の部分にそれぞれ付加し、二つの標
識を持つ基質は、酵素がその機能を発揮した場合にのみ生じるようにする。タン
パク質Ｒａｓの特別な場合では、（Ｈｉｓ）6のような親和性標識をＮ−末端に
組換え的に用意して、一つのコロイドが後にタンパク質に付着するのを容易にで
きる。酵素が付加する脂質様基はファルネシルピロリン酸で、これは、オチンの
ような親和性標識をＲａｓへの付着部位からは離れた部位に付着させて、実験室
で容易に合成される。親和性標識されたＲａｓと親和性標識された付加基を酵素
及び候補薬と混合する。反応が進行するための適切な時間をおいた後、各親和性
リガンドに対する結合パートナーを持つコロイドを試験溶液に加える。ここでも
、ピンク色から青色への変化の阻害は、候補薬が酵素活性を阻害したことを示す
。
【０１５０】
本発明の一態様は、コロイドに対して固定された種間の結合相互作用を示す、
コロイド／コロイド相互作用の測定を含む。本発明に従って、コロイド上にＳＡ
Ｍを形成する能力は、そうした研究のためにコロイドに種を連結させる一つの技
術である。コロイドは、相互に結合する能力についての研究が望まれている種、
例えばリガンドと受容体のような生物学的に関係のある結合パートナーに連結で
きる。又は、共通の実体に結合する能力を有しうる、あるいは別のコロイド粒子
に対して固定された種にそれぞれ連結できる連結種を持つことができる。これは
薬物の研究にも利用できる。研究用の種を、本明細書中に記載の任意の技術、例
えば金属結合標識／金属／キレート連結によってコロイドに連結できる。例えば
、ヒスチジン標識のような金属結合標識をリガンドに付着させ、標識された推定
上の結合パートナーをＮＴＡ／Ｎｉ（II）提示コロイドと共にインキュベートで
きる。二つの成分が結合パートナーであれば、目に見える細網（ヒトの眼、顕微
鏡などで見える凝集）が生じる。あるいは、推定上の結合パートナーが、コロイ
ド上に提示されたグルタチオンに結合するＧＳＴ融合タンパク質であってもよい
。結合種又は本発明のアッセイに参加している他の種を表面に付着させるのに有
用な他のリンカーは親和性標識などである。親和性標識は、生物学、生化学など
で広く使用されている周知種である。
【０１５１】
一実施の形態で、組成物及び方法を利用して、標的タンパク質、並びにそれと
他のタンパク質、核酸及び小分子との相互作用を検出することができる。本発明
をタンパク質が関与する相互作用の研究だけに限定するという意味ではない。本
明細書中に記載の方法は、互いに作用し合う任意の二つの種の検出にも適用でき
る。本発明の別の箇所に記載したように、金コロイド粒子は、均一溶液中に分散
している場合はピンク色に見えるという固有の光学的性質を有している。しかし
ながら、コロイドが互いに接近するのを余儀なくされると、溶液はスペクトルの
青色の端の方に変化する。タンパク質は、本明細書中に記載の様々な方法で金コ
ロイドに付着させることができる。アッセイは直接的な相互作用の検出に限定す
る必要はない。コロイドに付着したリガンドは、そのリガンドが共通の標的（こ
れは単一の標的分子であるというよりは生体分子の複合体であろう）を認識する
と、コロイドを互いに近くに引き寄せることができる。
【０１５２】
タンパク質−コロイド細網は、コロイドに付着したリガンド及びそれらの結合
パートナーを含有する溶液中ではっきりと目に見える。タンパク質又は他の分子
は、コロイドに様々な方法で付着できる。例えば、親和性標識を問題のタンパク
質又は分子に付着させ、親和性標識の結合パートナーをコロイドに付着させるな
どであるが、これに限定されない。末端に硫黄を持つペプチドは金コロイドに直
接付着させることができる、又はコロイド上に形成された自己集合単層に組み込
むことができる。好適な実施の形態において、コロイドは、自己集合単層（ＳＡ
Ｍ）で誘導体化され、該ＳＡＭは、問題とする組換えタンパク質に遺伝子的に融
合できる便利な親和性標識の結合パートナーを提供している。例えば、タンパク
質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような標識を含有す
る融合タンパク質として発現させることができる。ＧＳＴの結合パートナーであ
るグルタチオンは、容易にチオールに付着させることができ、また金コロイド表
面上の自己集合単層に組み込むことができる。あるいは、非修飾タンパク質を、
露出したカルボキシレートを持つコロイドにＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学に
より、共有結合的に付着させてもよい。
【０１５３】
本発明は、候補薬を、相互に直接的又は間接的に結合している分子を提示する
コロイドと混合し、ピンクから青への色の変化の減退、又は目に見える細網形成
の程度の減少を検出することも予期している。逆に、本発明の方法は、２個の分
子の相互結合を直接又は間接的に容易にする分子を確認するのにも使用できる。
【０１５４】
本発明のこれら及び他の実施の形態の機能並びに利点は、以下の実施例でさら
に十分に理解されよう。以下の実施例は、本発明の利益を示すのを目的としたも
のであり、本発明の全範囲を例示したものではない。
実施例
以下の実施例は、本発明のある実施の形態を説明するためのものであって、本
発明の範囲を制限すると解釈されるものではない。
以下の実験内容の開示の中で、次の略語が適用される。ｅｑ（当量）；μ（ミク
ロン）；Ｍ（モル）；μＭ（マイクロモル）；ｍＭ（ミリモル）；Ｎ（規定）；
ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ
（ナノモル）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラ
ム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃ
ｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎ
ｍ（ナノメートル）；ｎＭ（ナノモル）；℃（摂氏温度）；ＰＢＳ（リン酸緩衝
化生理食塩水）；Ｕ（単位）；ｄ（日）。
【０１５５】
これらの実施例は、あらゆる種類の凝集体形成について、それが神経変性疾患
、非神経変性疾患、又は凝集が関与する非疾患性プロセスに関するかどうかを調
べるのに適用可能な技術について記述する。当業者は、本明細書中に記載の利益
を用いて、以下の実施例を容易に変更することが可能で、それらを凝集が関与す
る任意の数の神経変性疾患又は非神経変性疾患、及び非疾患性の凝集プロセスに
適用することができる。
【０１５６】
実施例１：原線維の分光光度測定による検出
本実施例では、１４μＭのＨｉｓ−Ａβ（１〜４０）ペプチド及び３０μＬの
ＮＴＡ−チオールコロイドを含有する１００μＬの分液を、１μＭのＡβ原線維
シード（種）、５０ｐＭのＡβ原線維シード又は原線維なしのいずれかとインキ
ュベートした。混合物を３７℃で０．５時間インキュベートし、次いでキュベッ
トに移し、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｕ−２０００  分光光度計に入れた。各分液につき
、５６９ｎｍでの吸光度を記録し、次いでキュベットを取り出し、硬表面に対し
て鋭く叩きつけて、ペプチドが原線維に組み込まれるのを促し、１０分間放置し
てから５６９ｎｍで再度スキャンした。原線維シードを含有していた溶液では５
６９ｎｍの吸収に鋭い低下（原線維が溶液から析出したため）が観察されたが、
ペプチドしか含有しなかった溶液は安定を保っていた（図３）。グラフのバーの
高さは、２回目の測定に対する１回目の測定の比率である。１）１μＭのＡβ原
線維シード（斜線のバー）及び原線維なし（塗りつぶしたバー）；２）５０ｐＭ
のＡβ原線維シード（斜線のバー）及び原線維なし（塗りつぶしたバー）。分析
プロセスは、多穴滴板フォーマットとも適合する吸光光度計を用いて自動化でき
る。
【０１５７】
実施例２：コロイドの製造
本実施例では、１．５ｍｌの市販の金コロイド（Ａｍｅｒｓｈａｍ製Ａｕｒｏ
Ｄｙｅ）をマイクロフュージに入れ、高の状態で１０分間遠心分離してペレッ
ト化した。このペレットを１００μＬの貯蔵緩衝液（クエン酸ナトリウム及びト
ゥイーン−２０）に再懸濁させた。４０μＭのニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）−チオ
ール、１００μＭのフェロセン−チオール、及び５００μＭのカルボキシ末端チ
オールを含有する１００μＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を加えた（
フェロセンのシグナリング実体は任意）。チオール溶液中での３時間のインキュ
ベーション後、コロイドをペレット化し上清は廃棄した。次に、４００μＭのＤ
ＭＦ中トリエチレングリコール末端チオール１００μＬの中で、５５℃で２分間
、３７℃で２分間、５５℃で１分間、３７℃で２分間、次いで室温で１０分間熱
サイクルした。熱サイクルの結果、最低エネルギー配座にないすべての種は除去
されるので、安定な、密集した自己集合単層が得られる。熱サイクルは、広範な
自己集合単層形成種のいずれについても実施できる。次に、コロイドをペレット
化し、１００μＬの１００ｍＭ  ＮａＣｌリン酸塩緩衝液を加えた。次に、コロ
イドを、コロイド貯蔵緩衝液中１８０μＭの ＮｉＳＯ4で１：１に希釈した。
【０１５８】
実施例３：ＳＡＭコード化電極の形成
以下に記載のいくつかの実施の形態において、実施例は、ＳＡＭ形成、コラー
ゲン被覆、細胞成長、コロイド形成、及び交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）に関
する。ＳＡＭ形成に関しては、ガラス製の顕微鏡スライドをＴｉの層、次にＡｕ
の層でスパッタリングした。各電極は、１０％のメチル末端チオール（ＨＳ−（
ＣＨ2）15ＣＨ3）、４０％のトリエチレングリコール末端チオール、ＨＳ（ＣＨ
2）11（ＣＨ2ＣＨ2）3ＯＨ、（式）及び５０％のポリ（エチニルフェニル）チオ
ール（Ｃ16Ｈ10Ｓ）を含有するＤＭＦ溶液３００μＬを用い、室温で０．５時間
インキュベートした。次に、２ｍｌの４００μＭのトリエチレングリコール末端
チオールをチップを含有しているシンチレーションバイアルに入れ、バイアルを
水浴中で以下のように熱サイクルした。すなわち、５５℃で２分間；３７℃で２
分間；５５℃で１分間；３７℃で２分間；次いで室温で１０分間の熱サイクルで
ある。次に電極をＥｔＯＨに浸漬し、次いで無菌ＰＢＳで濯いだ。
【０１５９】
実施例４：凝集体の極めて高感度の検出を示すアッセイ
神経変性疾患及び異常タンパク質凝集を特徴とする他の疾患、並びに他の非疾
患性プロセスに特徴的な予め形成された凝集体を、時間の関数として色の変化及
び目に見える原線維形成をモニタすることによって高感度に検出できる。
【０１６０】
金コロイドを、ヒスチジン標識タンパク質捕捉のため、実施例２に記載のよう
に、ニトリロ三酢酸／ニッケル自己集合単層（ＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭ）で誘導体
化した。コロイドは低密度のＮＴＡ−Ｎｉ（総チオール濃度１０００：Ｍ中４０
μＭのＮＴＡ）で被覆し、共通のコロイド粒子に固定化された最隣接ペプチドの
凝集を防止した。３０μＬの誘導体化コロイド分液を９６穴滴板のウェルに入れ
た。ヒスチジン標識β−アミロイドペプチド（アミノ酸１〜４０）をｐＨ７．４
のリン酸塩緩衝液中に溶解し、それをコロイド溶液に、１００μＬ中の最終濃度
が１４μＭになるように加えた。合成非ヒスチジン標識μ−アミロイドペプチド
から製造した予備形成原線維を倍数希釈し、原線維の最終濃度が３３０ナノモル
〜５０ピコモルの範囲で変化するように溶液に加えた。各アッセイ（各ウェル）
に対して、原線維を添加しない陰性対照アッセイを実施した（図４）。溶液を３
７℃で１時間インキュベートし、溶液を撹拌しないように気をつけた。原線維を
含有している溶液の色は、金コロイドの特徴的なピンク色から濃い紫／灰色に変
化した。ヒスチジン標識μ−アミロイド（１〜４０）は含有しているが予備形成
原線維を含有していない溶液は、原線維を添加した溶液よりも遅い速度で、薄い
紫色に変化した。予備形成原線維を含有しているウェルの中心部には暗色の塊が
肉眼で明らかに見えた（図５）。解剖顕微鏡で４０倍の倍率を用いて観察したと
ころ、大きな紫色の細網が見えた。これらの凝集体はプレートの底に沈降してい
るのではなく、液媒体中に明らかに懸濁していた。陰性対照のウェルには、粒状
の沈殿物が見られたが、大きな凝集体はなかった。目視検査で、予備形成原線維
を含有しているウェルとそうでないウェルの区別が、添加原線維濃度５０ピコモ
ルまで可能であった（図６）。結果は、４０倍の倒立顕微鏡に取り付けたＮｉｋ
ｏｎカメラ（ＡＳＡ８００フィルム）で写真に撮って記録した。
【０１６１】
実施例５：コロイドを用いた視覚化
ペプチド及び原線維濃度が高くなると、コロイドで装飾された大きな原線維構
造が目に見える。
【０１６２】
４０μＭのＮＴＡ−Ｎｉ  ＳＡＭを持つコロイドを実施例２に記載のようにし
て製造した。３０μＬのコロイド分液を９６穴滴板のウェルに加えた。ヒスチジ
ン標識β−アミロイドペプチド（１〜４０）を、最終体積１００μＬ中の最終濃
度２０μＭを達成するように加えた。ヒスチジン標識β−アミロイドペプチドは
、最終体積１００μＬ中の最終濃度が２０μＭになるように加えた。予め形成し
たβ−アミロイド原線維を最終濃度が１μＭになるように加えた。試料を３７℃
で２０分間インキュベートし、凝集を促進するために鋭く３回叩いた。３７℃で
１時間のインキュベーションを続けた後、大きなコロイド−原線維構造が肉眼で
はっきりと見えた（図７Ａ）。コロイドが原線維構造上に凝集すると、周囲の溶
液は透明になった（ピンク色なし）。陰性対照として、コロイドに固定した結合
種の代わりに無関係のタンパク質を固定した。結果を図７Ｂに示す。
【０１６３】
実施例６：薬物スクリーニング
ヒスチジン標識β−アミロイド（１〜４０）ペプチドが凝集体を形成する条件
を決定した。Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＲＢＩ薬物ライブラリーから選んだ
候補薬を各アッセイ溶液に別々に加え、どの候補薬がアルツハイマー病に特徴的
な原線維形成を阻害するかを判定した。結果を視覚化するための方法として、Ｎ
ＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭを持つコロイド（前述）を加えた。
【０１６４】
９６穴滴板の各ウェルに、３０μＬのＮＴＡ−ＳＡＭ保持コロイド、１０．７
μＭのヒスチジン標識β−アミロイド（１〜４０）ペプチド６５μＬ（最終濃度
６．６μＭ）、５μＬの候補薬（各薬物の最終濃度が１００〜２００μＭになる
ように）を加えた。溶液を入れたプレートを３７℃で数時間インキュベートした
。この間、プレートを視覚検査し、写真を撮って進行を定期的に記録した。
【０１６５】
結果：
色の変化（ピンクから青）で、どの薬物が原線維形成を阻害したか予測された
。約２時間のインキュベーション時点で、溶液の色を、薬物を加えていない陽性
対照、及び薬物は加えたがヒスチジン標識ペプチドがβ−アミロイドではなくＧ
ＳＴの陰性対照を含有するウェルと比較することにより、どのウェルが原線維形
成を阻害した薬物を含有していたか肉眼ではっきり見てとれた。
【０１６６】
ウェル中の原線維上に凝集したコロイドからも、原線維形成を阻害した薬物を
含有するウェルの識別が可能である。目に見える凝集体がウェル中にないのが分
かるからである。４０倍に拡大すると、異なるウェル中の薬物の作用を区別する
能力が向上した。
【０１６７】
図８は、３７℃で７２時間インキュベーションした後の小分子ライブラリー、
ラック１の写真の写真複写である。プレートの一番右側のウェル（カラム１２）
は、β−アミロイドペプチドの代わりにＨｉｓ標識ＧＳＴを入れた陰性対照のウ
ェルで、ピンク色のままであった。その左隣のカラム、カラム番号１１は、Ｈｉ
ｓ標識β−アミロイドは含有するが候補薬は含有しない陽性対照であった。ウェ
ルＧ９は明るいピンク色のままで、そのウェル内の化合物が原線維形成を阻害し
たことを示していた。Ａ４、Ｂ５、Ｃ５、Ｄ５、Ｆ５、Ｆ９、Ｇ５、及びＨ１０
のウェルはいずれも容易に目視確認できる凝集体形成を示していることに注意す
る。
【０１６８】
生理的条件下で時間の関数として色及び凝集体形成をモニタするのは、薬効及
び薬物安定性の指標となる。
実施例７：増幅のため溶液中に遊離したペプチドの使用
ＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭ提示コロイドを実施例２に記載のようにして製造した。
総チオール濃度１０００μＭ中４０μＭのＮＴＡ−チオールを使用した。ヒスチ
ジン標識β−アミロイド（１〜４０）ペプチドを、最終体積１００μＬ中の最終
濃度が５８．２μＭを達成するように加えた。陰性対照として、無関係のヒスチ
ジン標識ペプチドＧＳＴをβ−アミロイドペプチドの代わりにコロイド溶液に加
えた。溶液を３７℃でインキュベートした。ヒスチジン標識β−アミロイドペプ
チドを含有する溶液には１５分以内に大きな凝集体がはっきりと見られた。対照
溶液には何の構造物も見られなかった。β−アミロイドペプチドを含有する溶液
は灰色／紫色に変化したが、陰性対照溶液はピンク色のままであった。この結果
は、溶液中に遊離しているβ−アミロイドペプチドは凝集し、凝集プロセスを増
幅又は促進するように作用したという考えと一致する。
【０１６９】
実施例８：電子的検出
β−アミロイド原線維を電子的に検出する我々の方策は、まず、ヒスチジン標
識β−アミロイドペプチド（１〜４０）を、β−アミロイド１〜４２ペプチドか
ら製造した予備形成原線維に組み込むことであった。ＮＴＡと電子シグナリング
のためのフェロセン誘導体を持つコロイドを加え、少なくとも一部のＨｉｓ標識
β−アミロイドペプチドがコロイド粒子に付着するようにした。我々の目的は、
次にコロイド装飾原線維に結合する結合リガンドを持つ磁気ビーズを加え、それ
らを磁気的に動作電極に誘引することであった。
【０１７０】
ＮＴＡ−ＳＡＭ保持コロイドを実施例２に記載のようにして製造した（ただし
、標準のフェロセン−チオールの代わりに１００μＭのオクタメチルフェロセン
−チオールを使用した）。３０μＬのコロイドを各アッセイ溶液に加えた。ペプ
チド添加（これは予備形成原線維がない場合にペプチドの原線維形成を促進する
）後に溶液をピペットで取る必要をなくして交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）分
析を容易にするために、アッセイ溶液を、静置磁石上にある実施例３に記載のよ
うに自己集合単層で誘導体化された金被覆ガラススライド上に固定した１ｍｌ容
量のシリコンガスケットに混合した。ヒスチジン標識β−アミロイドペプチド（
アミノ酸１〜４０）を、１００μＬ体積中の最終濃度１４μＭになるように加え
た。β−アミロイドペプチド（１〜４２）から製造した予備形成原線維を、最終
濃度１５μＭを達成するように加えた。陰性対照溶液は、（１）コロイド、ヒス
チジン標識ＧＳＴ＋原線維、ただしＨｉｓ標識β−アミロイドペプチド（１〜４
０）なし；（２）コロイド、Ｈｉｓ標識β−アミロイドペプチド（１〜４０）、
ただし原線維なし；（３）陽性の結果をもたらすと思われる全成分、ただしＨｉ
ｓ標識ペプチドが原線維に組み込まれる前の時点０で測定、であった。溶液を３
７℃で２０分間インキュベートした。タンパク質Ａ（抗体のＦｃ部分を結合する
）で誘導体化された市販の磁気ビーズ（Ｂａｎｇ  Ｌａｂｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｚ
ｙｍｅ製）を、結合能の１／１０のまで抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔ．よ
り購入）と予め結合させた。この抗体はβ−アミロイドペプチド１〜４２は認識
するが１〜４０は認識しない。抗体提示磁気ビーズ２０μＬをＡＣＶ分析（１０
Ｈｚ．；２５ｍＶの過電位；Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極、Ｐｔ補助電極つき；動作
電極として作用するＳＡＭ被覆金チップ）の直前に各溶液に注入した。
【０１７１】
結果：
ヒスチジン標識β−アミロイドペプチド（１〜４０）、ＮＴＡ−Ｎｉ及びフェ
ロセン保持コロイド、並びに予備形成原線維を含有し、３７℃で２０分間インキ
ュベートした溶液は、コロイド粒子に付着させたフェロセン誘導体（オクタメチ
ルフェロセン）の特徴的な酸化電位（２２０ｍＶ）で２．０μＡの電流ピークを
生じた。図９のトレースＡ参照。
【０１７２】
ヒスチジン標識ペプチドが凝集体に組み込まれる前、直ちに測定した同一の溶
液は、２２０ｍＶで約０．１７μＡのわずかなピークを生じた。図９のトレース
Ｂ参照。
【０１７３】
全成分を含有するが予備形成凝集体を含まない別の陰性対照溶液は、０．０２
２μＡのわずかなピークを生じた（図９、トレースＣ）。
予備形成原線維は含有するがヒスチジン標識β−アミロイドペプチドの代わり
にヒスチジン標識ＧＳＴタンパク質をコロイドに付着させた第三の陰性対照溶液
は電流ピークを生じなかった（図９、トレースＤ）。
【０１７４】
実施例９：光散乱分析
溶液中の粒子の平均粒径を測定する市販の光散乱装置を用いて、ＮＴＡ−Ｎｉ
−ＳＡＭ被覆コロイドとヒスチジン標識β−アミロイド（１〜４０）ペプチドを
含有する溶液を、予備形成凝集体の存在下又は不在下で分析した。コロイドは実
施例２に記載のように製造し、ヒスチジン標識β−アミロイドは、最終体積１０
０μＬ中の最終濃度が１０．２μＭになるように加えた。予備形成凝集体は、最
終濃度が２μＭになるように加えた。平均粒径のベースラインの測定は試薬だけ
で行い、β−アミロイド原線維がなければどの成分も凝集しないことを確認した
。
【０１７５】
ベースラインの測定：
１．４０μＭのＮＴＡ−ＳＡＭ誘導体化コロイドのみ；直径＝１４．８７ｎｍ
２．ヒスチジン標識Ａβ１〜４０ペプチド提示コロイド；直径＝１４．９６ｎｍ
３．１μＭのβ−アミロイドペプチド（１〜４２）予備形成原線維と混合したコ
ロイド（表面にＨｉｓ標識Ａβ１〜４０を固定していない）；直径＝１５．９３
ｎｍ；ｔ＝０
実験：
１．１μＭのβ−アミロイドペプチド（１〜４２）予備形成原線維と混合した、
ヒスチジン標識Ａβ１〜４０ペプチド提示コロイド、ｔ＝０での測定で１５．５
ｎｍ。
２．１μＭのβ−アミロイドペプチド（１〜４２）予備形成原線維と混合した、
ヒスチジン標識Ａβ１〜４０ペプチド提示コロイド、高輝度ランプ下、ｔ＝１．
５時間での測定：直径＝１０，０００ｎｍ超、図１０参照。
【０１７６】
陰性対照：
３．ヒスチジン標識Ａβ１〜４０ペプチド提示コロイド；予備形成原線維の代わ
りに緩衝液を添加；ｔ＝０で測定；直径＝１４．９６ｎｍ。
４．ヒスチジン標識Ａβ１〜４０ペプチド提示コロイド；予備形成原線維の代わ
りに緩衝液を添加；ｔ＝１．５で測定；直径＝５７９．７ｎｍ、図１１参照。
【０１７７】
これらの結果から、得られたマクロ構造の直径を測定することによって検体中
の凝集体の量が定量できることが分かる。９６穴滴板フォーマット中の溶液の平
均粒径を同時に測定する光散乱装置が市販されている。これまで、ペプチドモノ
マーとβ−アミロイド凝集体との区別に光散乱を使用する試みは、両方の種の直
径が非常に小さく検出下限にあること（β−アミロイド原線維はおよそ数百ｎｍ
）、及びモノマーと凝集体の差も小さいことから、限られた成功しか収めていな
かった。しかしながら、本発明者らは、リガンド保持コロイドが、小さくて検出
の困難な原線維を一緒に連結し、まとめ合わせて容易に検出可能なマクロ構造に
する作用を行うことを示した。
【０１７８】
実施例１０：特異性
誘導体化されたコロイドによって提示されるβ−アミロイドペプチドが、正常
の診断試料中に存在すると思われる原線維種に非特異的に組み込まれるかどうか
を見るために、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で視覚的アッセイを実施した。（ＦＢＳ
は、他の原線維種を含め、無関係なタンパク質をＣＳＦより１００倍多く含有す
る。）１μＭのＡβ１〜４２原線維を、様々なＦＢＳ濃度の溶液中、ヒスチジン
標識Ａβ１〜４０を提示した４０μＭのＮＴＡ−ＳＡＭコロイド３０μＬに加え
た。誘導体化コロイドの原線維上への凝集はＦＢＳ濃度が高くなっても増加せず
、本アッセイは他のタンパク質又は原線維種による誤った人為的結果に傾かない
ことが分かった。コロイド上に固定化されたＨｉｓ標識Ａβ１〜４０を含有する
が予備形成Ａβ原線維を含有しない陰性対照溶液はピンク色のままで、４０倍又
は１００倍に拡大しても構造体は観察されなかった。
【０１７９】
実施例１１：目に見える原線維構造の程度を使用してＣＳＦ試料中のアルツハ
イマー病を診断する
ＣＳＦ試料を用いた盲検試験で（実験者には一つがＡＤ患者の試料であるのか
、両方ともそうなのか、両方ともそうでないのか知らされていない）、実施例２
に記載のように製造した４０μＭのＮＴＡ−ＳＡＭ保持コロイドの分液３０μＬ
を９６穴滴板のウェルに加えた。Ｈｉｓ標識Ａβ（１〜４０）ペプチドを最終濃
度３．７５μＭを達成するように加えた。２人のアルツハイマー病患者から採取
したＣＳＦ分液をコロイド／ペプチド溶液に加えた。加えたＣＳＦの量は、最終
のＣＳＦ濃度が１２．５％又は２５％のいずれかになるように変えた。試験した
各ＣＳＦ試料について、条件を以下のように変化させた。すなわち、（１）試料
溶液に予備形成Ａβ原線維（１μＭ；１〜４２）を添加又は“播種”した；（２
）溶液に予備形成Ａβ原線維（０．１μＭ；１〜４２）を播種した；（３）溶液
に何も播種しなかった；そして（４）陰性対照として、プローブのＨｉｓ標識Ａ
βをコロイドに固定しなかった。３７℃で３時間後、Ｈｉｓ標識Ａβを含まない
陰性対照と予備形成原線維を全く含まない一患者からの一試料（＃１０１）以外
のすべての試験溶液に原線維のマクロ構造が見えた。原線維構造の程度はＣＳＦ
濃度の上昇につれて増大した。同様に、構造形成もシード（種）の濃度が増加す
ると増大した。他のＣＳＦ含有溶液はピンク色から紫色に変わったが、４０倍に
拡大しても原線維凝集体の形成は見られなかった。対照溶液（コロイド上にＨｉ
ｓ−Ａβの固定なし）はピンク色のままで、構造形成の何らの徴候も見られなか
った。一晩のインキュベーション（合計１０時間）後、原線維は、患者＃１０９
のＣＳＦを含有する溶液にもはっきりと認められたが、その広がりは第一の患者
のものよりもかなり小さかった。患者１と同様、構造形成の程度は、ＣＳＦ濃度
の上昇及びβ−アミロイドのシード濃度の上昇と共に増大した。試料の検査記録
から、ＣＳＦ試料は両方ともアルツハイマー患者からのもので、第一の患者（１
０１）の疾患の進行は、診断後の経過時間及び痴呆診査の検査法であるＢｌｅｓ
ｓｅｄ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｓｃａｌｅスコアに基づき、第二の患者のおよそ２
倍であることが確認された。患者１０１のＢｌｅｓｓｅｄ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  
Ｓｃａｌｅスコアは２１で、患者１０９のスコアは１２であった。患者１０１の
β−アミロイド濃度は８ｍｇ／ｍｌ、＃１０９は４．６ｍｇ／ｍｌと測定された
。
【０１８０】
実施例１２：ＣＪＤの検出と診断
この仮説実施例で、ＮＴＡ−Ｎｉ提示コロイドを、Ｈｉｓ標識ＰｒＰタンパク
質を可溶性の状態（非変換形）で含有する溶液に、少なくとも一部のＨｉｓ標識
ペプチドがコロイドに付着するように加える。
【０１８１】
診断：色の変化：正常プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、又はアミノ酸１０９〜
１４１もしくは１１３〜１４１のようなフラグメントを、ＳＡＭ被覆コロイドへ
の結合が容易になるように誘導体化する。例えば、正常のシリアンハムスターＰ
ｒＰを、６−ヒスチジン標識のような親和性標識を持つように発現させる。ヒス
チジン標識ＰｒＰはＮＴＡ−ＳＡＭ誘導体化コロイドにＮＴＡ−Ｎｉ結合を介し
て付着する。伝染性ＰｒＰを含有する試料を加える。試料を３７℃でインキュベ
ートして正常ＰｒＰのプロテアーゼ耐性形への変換を促進する。正常ＰｒＰの耐
性形への変換はタンパク質凝集を起こすので、コロイドは接近を余儀なくされて
、色がピンクから青に変化する。試料には正常の非結合ＰｒＰ、又はそのフラグ
メントを添加して、タンパク質濃度で促進される凝集プロセスを増幅することも
できる。試料はまた、凝集プロセスを促進するために機械的撹拌、光又は音のエ
ネルギーに曝露してもよい。
【０１８２】
薬物スクリーニング：候補薬を、ＰｒＰ結合コロイド及び伝染性ＰｒＰ試料に
加え、結合させる。次に試料を３７℃でインキュベートしてＰｒＰの変換と凝集
を促進する。ペプチドのＰｒＰへの結合又はＰｒＰの耐性形への変換を阻害する
薬物を含有する試料は赤いままであるが、無効薬物を含有する試料は色が赤から
青へ変化する。
【０１８３】
あるいは、候補薬、ＰｒＰ結合コロイド、及び伝染性の試料組成物を、インキ
ュベーション後電子的又は電気化学的に分析する。ペプチドのＰｒＰへの結合又
はＰｒＰの耐性形への変換を阻害する薬物を含有する試料は電子信号を発しない
又は弱い信号を発するが、無効薬物を含有する試料は、電極上にコロイド凝集体
が沈殿するために電子信号を発する。
【０１８４】
伝染性物質を含有していない薬物スクリーニングアッセイも考案できる。シリ
アンハムスターのＰｒＰ配列のアミノ酸９０〜１４５からなるペプチドは、正常
ＰｒＰのプロテアーゼ耐性形への変換を促進することが従来示されているが、そ
れをＰｒＰ結合コロイドに加える。試料を３７℃でインキュベートし、正常Ｐｒ
Ｐの耐性形への変換を促進する。正常ＰｒＰの耐性形への変換はタンパク質凝集
を起こすので、コロイドは接近を余儀なくされて、色がピンクから青に変化する
。あるいは、組成物を電子的又は電気化学的に分析することもできる。
【０１８５】
本発明自体は、どのＰｒＰ配列がコロイドに付着したプローブ分子としての使
用に最適であるか、またどの配列が凝集促進剤として機能するかを判定するのに
も使用できる。候補プローブ配列ペプチドをコロイドに付着させ、単独で試験し
てそれらの固有の凝集ポテンシャルを測定する。これは低いはずである（色変化
なし）。次に伝染性又は変換ＰｒＰと共に試験して、ＰｒＰの変換形に結合する
候補プローブ配列ペプチドの能力を査定する（色変化あり）。凝集促進剤の候補
のペプチド配列をコロイドに別に付着させ、それらの凝集能及び溶液の色変化を
起こす能力について、単独で及び変換ＰｒＰと共に試験する。
【０１８６】
【化１】
2014013242.tif 000003
Ｃｈａｂｒｙ  Ｊ，Ｃａｕｇｈｅｙ  Ｂ，Ｃｈｅｓｅｂｒｏ  Ｂ，Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ  １９９８年５月２２日；２７３（２１）：１３２０３−７；シリア
ンハムスターのＰｒＰの残基９０〜１４５(Residues 90-145 of Syrian Hamster
PrP)，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７０，５７４−５８６．
実施例１３：電子的検出
この仮説的実施例では、試料中のプリオン疾患の存在も電子的に検出できる。
ＮＴＡ−Ｎｉ及びオクタメチルフェロセン提示コロイドを、Ｈｉｓ標識ＰｒＰタ
ンパク質を可溶性の状態（非変換形）で含有する溶液に、少なくとも一部のＨｉ
ｓ標識ペプチドがコロイドに付着するように加える。ＰｒＰ又はそれに対する抗
体のいずれかを提示する磁気粒子もアッセイに加える。伝染性ＰｒＰを含有する
と考えられる試料を加える。伝染性ＰｒＰは、コロイド上及び溶液中に遊離して
いる正常ＰｒＰの両方ともを変換し、それらも他のタンパク質の変換に携わるよ
うになるので、塊状凝集が起こる。磁気粒子及びコロイド粒子の両方を同じ凝集
体に組み込む塊状凝集が起こる。次に、この凝集体は、ＳＡＭ被覆されうる電極
に磁気的に引き寄せられるので、ＡＣＶで分析する。
【０１８７】
診断：電子的：伝染性物質も電子的に検出できる。正常ＰｒＰは、前述のよう
にＳＡＭ被覆コロイドに結合されている。前記コロイドは、フェロセンのような
レドックス活性金属などのシグナリング部分も保持している。次に、試料を３７
℃でインキュベートしてＰｒＰの変換と凝集を促進させる。ＰｒＰの耐性形への
変換は不溶性凝集体の形成を起こすので、これが電極表面上に沈殿して電子信号
を出す。電極は、標準の電気化学分析装置及び交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）
のような技術を用いて分析する。
【０１８８】
実施例１４：ＥＬＩＳＡ
この予言的実施例では、分子又は細胞生物学の専門家に馴染み深い技術を使用
する。エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学にお
ける現在のプロトコル），Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１．２
，１９９６，著作権Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．１９９
４−１９９８）。通常、ＥＬＩＳＡを実施する場合、第一の種をプラスチック基
板に直接又は間接的に付着させる。第二の種を加え、プレートを洗浄する。第二
の種の存在を、シグナリング能力も有する“二次”抗体をそれに結合させること
によって検出する。二次抗体は、通常、典型的には西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）のような酵素、又は加えられた
基質上で反応を実施でき、色の変化を生じる（分光光度計で検出）蛍光タグ、又
は蛍光光度計で検出できる蛍光標識タグに結合されている（例えば、“インビボ
における、感染神経線維及び感覚ニューロンに受動移入された、単純ヘルペスウ
ィルスの糖タンパク質Ｄに対するヒト組換えモノクロナール抗体の局在(Localiz
ation of a passively tranferred human recombinant monoclonal antibody to
herpes simplex virus glycoprotein D to infected nerve fibers and sensor
y neurons in vivo)”，Ｓａｎｎａ  ＰＰ，Ｄｅｅｒｉｎｃｋ  ＴＪ，及びＥｌ
ｌｉｓｍａｎ  ＭＨ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １
０月  Ｖｏｌ  ７３（１０  ８８１７−２３）参照）。多くの場合、便宜上、す
べての抗体を酵素に結合する必要はないので、特異認識抗体としてマウス抗体を
使用し、次いで酵素の結合させたウサギ抗マウス抗体を加える。
【０１８９】
本明細書中に記載の技術を用いてＥＬＩＳＡの感度を大幅に上げることができ
るので、天然リガンド（タンパク質又はペプチド）又は候補薬をプローブ分子と
して使用し、固定された標的種の存在を検出できる。固定された種の存在は、複
数の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）又はアルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）も提示するコロイドに付着させたリガンドをそれに結合させることによって
検出される。酵素は、様々な手段によってコロイドに都合よく連結できる。例え
ば、酵素に直接付着させたヒスチジン標識、又はコロイドに付着させたヤギ抗体
にマウス抗ヤギ酵素結合抗体をヒスチジン標識タンパク質Ｇを介して結合させる
などの手段である（Ａｋｅｒｓｔｏｍ，Ｂ．，Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｅ．，Ｂｊｏｒ
ｃｋ，Ｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，１９８７年１０月５日  Ｖｏｌ．２６２（２８）１３３８８−９１ページ、及
びＦａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｐ．，Ｎａｇｌｅ，
Ｊ．，Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｄ．（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１６７，８７０−８８０）。コロイド上で複数の酵素と
共に固定されているリガンドを二次抗体の代わりに標的種に結合させることによ
り、結合事象に対するシグナリング分子の割合は甚だしく増加する。コロイド上
の１個の抗体又はリガンドがＥＬＩＳＡプレート上に提示された抗原に結合する
ことは、間接的に数千又は数百万の酵素の結合をもたらす。あるいは、既知種を
意図的に９６穴滴板に結合させてもよい。そうすると、それぞれ別の候補薬をシ
グナリング酵素と共に提示しているコロイドを使って精査することができる。現
在のところ、各候補薬を酵素に結合させられない既存のＥＬＩＳＡ技術でこれを
行うのは不可能である。あるいは、固定された標的に対する天然リガンドを、シ
グナリング酵素と共にコロイド上に提示し、プレートの各ウェルに候補薬を加え
て、相互作用を分断することもできる。未結合コロイド、従ってそれらの信号は
洗浄工程で喪失する。抗体又はリガンド提示コロイドの標的は、ＥＬＩＳＡプレ
ートに直接又は間接的に（別の抗体又はリガンドを介して）結合した細胞又はタ
ンパク質であり得る。この変形ＥＬＩＳＡ法の利点は、感度だけでなく効率もで
ある。数百のシグナリング酵素がコロイドを介して１個の抗原に結合したままで
あるので、基質の加水分解がより迅速に起こり、適切な読みに必要な時間も少な
くてすむ。
【０１９０】
本実施例では、ＥＬＩＳＡプレート上で、試料中の凝集体形成又は原線維形成
種、プロトフィブリル種、又は凝集体種の存在をいかにして検出するか、又は異
常タンパク質凝集に伴う疾患を阻害する薬物のスクリーニングをいかにして行う
かについて述べる。凝集体又は原線維形成種を結合する結合種、あるいは原線維
もしくは凝集体形成種、プロトフィブリル又は凝集体に対する抗体（具体的には
Ａβ１〜４２に対する抗体）をＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定する。診断ア
ッセイでは、次に該抗体を、凝集体形成又は原線維形成種を含有していると考え
られる試料に曝露し、そして該試料と共に、金属結合標識（ヒスチジン標識）を
持つ結合種、場合により前述した増幅種、及び金属に配位したキレート（ＮＴＡ
）を持つコロイド粒子、並びに粒子にそれぞれ固定された非電子シグナリング実
体も混合する。非電子シグナリング実体は、蛍光標識、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼなどであろう。
【０１９１】
本アッセイを用いて薬物をスクリーニングしたい場合、凝集プロセスを阻害す
る候補薬の存在下で同一の手順を実施する。
実施例１５：生化学的進行の各期で凝集体形成に影響を及ぼす候補薬の細胞ベ
ースのスクリーニングアッセイ
本実施例では、神経変性疾患及び非神経変性疾患を含む凝集関連疾患に関与す
る細胞プロセス、及び非疾患プロセスに影響を及ぼす候補薬の活性をいかにして
試験するかについて述べる。β−アミロイドの産生、切断を含むプロセシング、
及び分泌に直接的又は間接的に影響を及ぼす薬物の活性についてそのスクリーニ
ングを可能にする全細胞アッセイが設計されている（Ｗｏｌｆｅ，ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ，１９９９年４月８日；３９８（６７２７）：５１３−７；Ｈａａｓｓ，Ｎ
ａｔ．Ｍｅｄ．１９９９年１２月；１（１２）：１２９１−６；ＬａＢｌａｎｃ
，ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．，１９９２年４月，３１（４）：６３５
−４５）。
【０１９２】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ：β−アミロイドのタンパク質前駆体）
はヒト胚性腎細胞に安定的にトランスフェクトされた（Ｓｅｌｋｏｅ，“アルツ
ハイマー病におけるβ−アミロイド前駆体タンパク質及びプレセニリンの細胞生
物学(The Cell Biology of Beta-Amyloid Precursor Protein and Presenilin i
n Alzheimer's Disease.)”，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
，８：１１，４４７−４５３，１９９８年１１月；Ｋｎｏｐｓ，ら、“液胞型Ａ
ＴＰアーゼの選択的阻害剤であるバフィロマイシンＡ１によるＡ−β放出のタン
パク質型特異的阻害(Protein-type Specific-Inhibition of A-Beta Release By
Bafilomycin A1, A Selective Inhibitor of Vacuolar ATP ases)”，Ｊｏｕｒ
ｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０：６，２４
１９−２４２２，１９９５年２月１０日）。細胞（体積１００ｕｌ、集密度４０
％）を９６穴滴板に分配し、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地）中で３７
℃で２１時間、ＣＯ2インキュベータ内で成長させた。ＮＴＡ−ＳＡＭ（チオー
ル溶液中４％ＮＴＡ）で誘導体化されたコロイド（３０ｕｌ）をヒスチジン標識
β−アミロイドペプチド（１〜４０）と混合し、次いで微量定量プレートの各ウ
ェルに加えた。各ウェルのβ−アミロイドの最終濃度は１７ｕＭであった。対照
ウェルは、１）β−アミロイドペプチドの代わりにヒスチジン標識ＧＳＴ；又は
２）成長培地中に細胞が存在しない以外は上記すべて；又は３）ＡＰＰがトラン
スフェクトされていない細胞のいずれかを含有していた。
【０１９３】
２１時間の時点でコロイド及びペプチドを加えたところ、ＡＰＰプラスミドを
発現している細胞、コロイド及びＨｉｓ標識β−アミロイドを含有している溶液
だけが特徴的なピンク色から紫色に変わった。対照ウェル中の溶液はピンク色の
ままであった。
【０１９４】
前述のように処理された細胞の別のバッチを、コロイド及びβ−アミロイドの
添加後さらに１８時間成長させた。これらの細胞はＡＰＰ産物（β−アミロイド
１〜４０及び１〜４２）を出し続けていた。４０倍に拡大して観察すると、蓄積
したコロイド−ペプチド凝集体の光輪が各細胞の周囲に見えた。コロイド及びＨ
ｉｓ標識ペプチドとインキュベートした細胞は、コロイドの局部的蓄積は見られ
なかった。β−アミロイド及びコロイドとインキュベートした対照細胞（ＡＰＰ
のトランスフェクションなし）も、コロイド凝集の徴候は見られなかった。コロ
イド、β−アミロイド及び細胞成長培地を含有する対照溶液にも、コロイド凝集
の徴候は見られなかった。
【０１９５】
本実施例は、神経変性疾患を抑制するための候補薬を、神経変性疾患の原線維
又は凝集体形成種を分泌するように適応された細胞に曝露し、そして候補薬が細
胞から分泌される物質の凝集ポテンシャルに及ぼす影響を測定することを含む、
本発明の別の態様も提供している。本実施例は、候補薬が細胞に及ぼす影響を測
定することによって、薬物の毒性を測定する技術も提供している。
【０１９６】
実施例１６：腫瘍抑制に特徴的な凝集の測定（ｐ５３）
この仮説的実施例では、ｐ５３の多量体化を分断又は増強する分子のスクリー
ニング法を記載する。ある場合には野生型のタンパク質がスクリーニングの標的
になり、別の場合には特定の突然変異体を標的にすることで、野生型の機能を救
うことができる。ｐ５３（野生型又は突然変異体）の多量体化ドメインが、金コ
ロイドへの付着を容易にする親和性リガンドを持つフレキシブルなリンカーで修
飾されるように発現させる。ある場合には、４量体化ドメインを核外への輸送シ
グナルなしに発現させることができる。リンカーの修飾は、タンパク質フラグメ
ントのＮ−末端（多量体化ドメインからは離れている）か、又はＣ−末端のいず
れかに付着させることができる。一部の組成物は、コロイドの存在が多量体化を
立体的に妨害しないように、異種の集団を含有できる。また、非結合タンパク質
を組成物に加えて、付着コロイドによる立体障害を回避することもできる。
【０１９７】
タンパク質フラグメントを金コロイドを含有する溶液に加える。金コロイドは
、少なくとも一部のタンパク質の付着を容易にするために改変されている。タン
パク質フラグメントが多量体化すると、溶液はその固有のピンク色から紫／青色
に変わる。候補薬又は生体分子を一部の溶液に加える。ここでも、ピンクから青
への色変化は多量体化を示す。色の変化は連続的にモニタできる。例えば、タン
パク質フラグメントを溶液に加え、多量体化が起こり、溶液がピンク色から青色
に変わる。次に候補薬又は生体分子を加え、青色がピンク色に戻る変化が検出さ
れたら、候補分子が多量体化を分断したことを示すことになろう。
【０１９８】
がんで発生するｐ５３の突然変異の多くは、タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン
が関与している。本発明は、突然変異体に結合する能力についてＤＮＡ配列をス
クリーニングしたり、また、その天然のコグネイトＤＮＡ配列への結合を回復さ
せる分子を確認するのにも使用できる。この計画では、ＤＮＡ（好ましくはｄｓ
であるが一本鎖であってもよい）をコロイドに付着させる（ビオチン−ＳＡ−Ｓ
ＡＭを介して、又は市販のストレプトアビジン被覆コロイドに）。ＤＮＡ結合ド
メイン及び４量体化ドメインの両方を含有するｐ５３タンパク質又はそのフラグ
メント（野生型、突然変異体、又は両方）を溶液に加える。ｐ５３の多量体は、
コロイドに固定されたＤＮＡ鎖にも結合するが、コロイドの凝集を誘発し、色を
ピンクから青へと変化させる。候補薬並びに生体分子も、ＤＮＡ結合を促進する
それらの能力を試験するために組成物に加えることができる。別の実施の形態で
は、タンパク質を、それぞれ異なるＤＮＡ配列を保持しているコロイドの別のバ
ッチに加える。タンパク質は多量体化するので、ピンクから青への溶液の色変化
は、特定のバッチのコロイドに提示されたＤＮＡ配列に結合したタンパク質複合
体を示す。
【０１９９】
あるいは、ＤＮＡ結合に影響を及ぼす突然変異を有するｐ５３の多量体を、候
補薬と共に、ＤＮＡ配列（好ましくはコグネイト配列）提示コロイドを含有する
溶液に加えてもよい。このスクリーニングで、ＤＮＡ結合特異性を変える分子が
確認される。
【０２００】
実施例１７：ビオチン／ストレプトアビジンを介するコロイド／コロイド連結
の測定
一組の金コロイドを、ビオチン−チオール（ＳＡＭ形成種はＣ１１、３エチレ
ングリコール単位、それにビオチンを含む）並びにＣ１６カルボキシ末端チオー
ル（混合ＳＡＭ）を組み込んだ自己集合単層で誘導体化した。ビオチンに対して
４個の結合部位を持つストレプトアビジン、又はランダムタンパク質（ＧＳＴ）
をコロイド溶液に加えた。ストレプトアビジンとその結合パートナーのビオチン
を含有する溶液は直ちに青色に変化したが、対照溶液は変化しなかった。
【０２０１】
実施例１８：ＮＴＡ提示コロイド上のタンパク質／タンパク質認識を介するコ
ロイド／コロイド連結の測定
ニトリロ三酢酸、ＮＴＡ（ヒスチジン標識タンパク質捕捉のため）を提示して
いる自己集合単層で誘導体化されたコロイド６００μＬを、５００μＭのヒスチ
ジン標識ＲＧＤモチーフ含有ペプチド６０μＬと混合した。第二組のＮＴＡ−Ｎ
ｉ提示コロイド６００μＬを、陰性対照として無関係なタンパク質ＧＳＴの５０
０ｕＭ溶液６０ｕｌと混合した。コロイドを遠心沈殿させてリン酸塩緩衝液に再
懸濁させ、残った非結合タンパク質又はペプチドを除去した。脈管形成に関与し
、ＲＧＤペプチドのようなビトロネクチンの領域に結合すると考えられる二つの
タンパク質、エンドスタチン及びアンギオスタチンを、透析によってリン酸塩緩
衝生理食塩水中に用意し、次にＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの貯蔵濃度を１：１０に希
釈した。
【０２０２】
４００ｕｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｕｌのＲＧＤ結合コロイ
ド又はＧＳＴ結合コロイドのいずれか、及び１００ｕｌのエンドスタチン又はア
ンギオスタチンのいずれか、５０ｕｌのエンドスタチン又はアンギオスタチン／
５０ｕｌのリン酸塩緩衝液、又は１００ｕｌのリン酸塩緩衝液（陰性対照として
）を結晶化皿の各ウェルに加えた。色の変化を室温で時間をかけてモニタした。
約１５分後、ＲＧＤペプチド結合コロイド及びエンドスタチンを含有するウェル
で赤から青への色変化が見られた。色の変化は、５０ｕｌエンドスタチン／５０
ｕｌリン酸塩緩衝液を含有するウェルより、１００ｕｌのエンドスタチンを含有
するウェルで顕著であった。エンドスタチンとＧＳＴ結合コロイド、又はアンギ
オスタチンとＲＧＤ又はＧＳＴ結合コロイドを含有するウェルでは色の変化は起
こらなかった。図１３に結果を示す。Ａ列はコロイドとアンギオスタチンを含ん
でいた。Ｂ列はコロイドとエンドスタチンを含んでいた。（Ｃ列とＤ列は空）。
縦の列１〜３は、コロイドに固定されたＲＧＤペプチドを有する。４〜６列は、
コロイドに固定された無関係のタンパク質ＧＳＴを有する。縦の１列と４列は１
００ｍｌの関係薬（エンドスタチン又はアンギオスタチン）を含有する。結果は
、エンドスタチンがＲＧＤモチーフ含有ペプチドに結合し、またエンドスタチン
は２個以上のＲＧＤペプチドに結合できることを示す。従ってコロイドを連結す
るので、赤から青への色の変化が起きる。結果はゲル電気泳動でも立証された。
ＲＧＤペプチド及びヒスチジン標識ＧＳＴは、飽和濃度で少量のＮＴＡ−Ｎｉア
ガロース樹脂に結合した。エンドスタチンを樹脂とインキュベートし、樹脂上の
タンパク質に結合させた。次にヒスチジン標識タンパク質をイミダゾールで溶離
し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果は、エンドスタチンは樹脂に固定
されたＲＧＤペプチドに結合し、タンパク質と共に樹脂から溶出していたが、樹
脂に固定されたＧＳＴには結合していなかったことを明らかに示していた。
【０２０３】
本アッセイは、エンドスタチンに特徴的なＲＧＤ結合を模倣する、又はエンド
スタチン上のＲＧＤ結合ドメインに結合する候補薬のスクリーニングにも容易に
適応できるであろう。候補薬をエンドスタチンの存在下でＲＧＤコロイドに加え
、赤から青への色の変化を阻害する薬物を探せばよい。
【０２０４】
実施例１９：薬物特性分析のため時間の関数としての薬物活性のモニタリング
凝集体形成のどの段階で特定の薬物が有効であるか、どのくらいの長さ薬物が
有効であるか、そして薬物が凝集体形成を保存できるかどうかを調べるために、
薬物の特性分析実験を実施し、９６穴滴板分光光度計を用い、長時間にわたり多
くの時点を取って調べた。
【０２０５】
９６穴滴板の各ウェルに、５５ｕｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）、３０ｕ
ｌのＮＴＡ−ＳＡＭ誘導体化コロイド、１０ｕｌの５０ｕｍ  Ｈｉｓ−ＡＢ、及
び５ｕｌの候補薬又はＤＭＳＯ（対照ウェル用）を加えた。陰性対照ウェルは、
Ｈｉｓ−ＡＢの代わりに１０ｕｌの５０ｕｍ  無関係ヒスチジン標識ペプチド、
及び候補薬の代わりにＤＭＳＯを含有していた。陽性対照ウェルは、Ｈｉｓ−Ａ
Ｂは含有していたが、候補薬の代わりにＤＭＳＯを含有していた。５３０ｎｍに
おける吸光度を５分おきに２時間、ｓｏｆｔ−ｍａｘ  Ｐｒｏ  ９６穴分光光度
計（分子装置）で読み、同一の９６穴滴板は作業台で観察し、写真撮影した。
【０２０６】
陰性対照ウェルは赤いままで、陽性対照ウェルは１時間以内に青に変わった。
候補薬を含有しているウェルは、候補薬の有効性に応じて色が長時間にわたり様
々に変化した。５３０ｎｍにおける吸光度を、各ウェルについて時間に対してプ
ロットした。青変したウェルは、薬物が入っていないか薬物活性がないことを示
すが、５３０ｎｍにおける吸光度が長時間にわたり著しい低下を見せた。凝集を
阻害した薬物を含有するウェルは、薬物が有効な凝集体サイズの範囲では５３０
ｎｍで一定の吸光度を示し、薬物が有効であることを示した。このようにして薬
物の有効性を測定した。図１２に、凝集を阻害した二つの薬物（１及び２）の薬
物特性を、陽性対照（３）及び陰性対照（４）と共にプロットして示す。この二
つの薬物は、異なる大きさの凝集体に異なる時間作用することが分かる。
【０２０７】
本実験の結果は、本発明の別の態様の効力も示している。すなわち、凝集が関
与する生理的プロセスを、該プロセスの特定の段階で、又は特定の凝集体サイズ
の条件下で、又はその両方で治療するのに適切な薬物を決定することを含む。図
１２を参照すると、曲線１で示される薬物は、凝集体形成の早期の段階で、及び
／又は小さい凝集体に関してより有効であり、曲線２で示される薬物は、凝集体
形成の後期の段階で、及び／又は大きい凝集体に関してより有効であることが分
かる。様々な候補薬に対してこのような実験を実施すると、患者の生理的プロセ
スの段階及び／又は凝集体サイズに基づく治療のプロトコルに関する情報を得る
ことができる。
【０２０８】
実施例２０：色の変化と凝集体形成の程度との相関
本実施例は、本発明のコロイド／コロイド凝集アッセイが、凝集体形成を比色
的に、そして目に見える細網の形成を通じて測定するのにも使用できることを示
す。
【０２０９】
コロイド粒子、コロイド粒子に固定されるように適応された、神経変性凝集体
形成種を結合できる結合種、及びＡβペプチドを含む混合物を多穴滴板のウェル
に形成した。対照はランダムペプチドを含んでいた。図１４を参照すると、第一
のプレート６０は、それぞれＡβペプチドとランダムペプチドを含有する列６２
と６４を含む。縦の列６６〜７４は、それぞれ２．５μＭ、５μＭ、１０、２０
、及び５０μＭのＡβペプチド又はランダムペプチドを含有していた。Ａβペプ
チドはヒスチジン標識され、コロイドはニッケルに配位したキレートを提示して
いるＳＡＭを持っていた。列６４は、無関係のヒスチジン標識ペプチドを含有し
ていた。各ウェルは１μＭの予備形成凝集体を含んでいた。
【０２１０】
見て分かるように、結合種、コロイド粒子、及び予備形成凝集体を含有する列
６２は、ピンク色から青色に変わり、特に高濃度で細網の形成がはっきりと見え
る。Ａβの濃度と細網形成との間に著明な相関関係が観察される。
【０２１１】
プレート８０を参照する。列８２のウェルは、１０μＭのＡβペプチド（ヒス
チジン標識）、及びコロイド上ＮＴＡチオール含有ＳＡＭを含む。列８４は、同
じ濃度の、ヒスチジン標識をした無関係のペプチドを含んでいた。この場合も、
すべてのウェルは１μＭの予備形成凝集体を含んでいた。列８６〜９８のウェル
に成分を異なる時間に導入し、プレートを１回観察するだけで凝集体形成が時間
の関数として示されるようにした。列８６は調製したて、列８８は観察の０．５
時間前に調製、列９０〜９８は、観察の１、２、４、６、及び１８時間前に調製
した。プレート８１は、プレート８０と同一のプレートの１８時間後の観察であ
る。見て分かるように、ピンクから青への色の変化、及び容易に目に見える細網
の形成が時間の関数として起こっている。
【０２１２】
当業者であれば、本明細書中に掲載したすべてのパラメータは例示的な意味合
いのもので、実際のパラメータは、本発明の方法及び装置が使用される特定の用
途によって異なることは理解されよう。従って、前述の実施の形態は例のために
提供したものであり、添付のクレーム及びそれと等価の範囲内で、本発明は具体
的に記載した以外の方法でも実施できることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】デンドリマー又はポリマーを介してフェロセンのような金属含有化合物に付着した、原線維又はプラーク形成に参加できるペプチドを示す。これらの誘導体化されたペプチドは、類似のペプチドを提示する磁気粒子と、神経変性疾患に関与する凝集体への同時組込みを通じて会合する。磁石を介してＳＡＭ被覆電極に誘引後、凝集体の存在を、組み込まれたフェロセンのような電気活性シグナリング部分の存在をサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）又は交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）のような技術を用いて検出することによって測定する。
【図２】コロイド粒子に付着した、凝集体形成に参加できるペプチド及びフェロセン誘導体のような金属複合体を示す。これらのペプチドは、類似のペプチドを持つ磁気粒子と、溶液中のこれらのプリオン型（又は原線維形成）ペプチドの異常型の凝集体に両方が組み込まれると会合する。磁石を介してＳＡＭ被覆電極に誘引後、凝集体の存在を電子的に検出する。
【図３】分光光度法による原線維形成の検出を示す棒グラフである。
【図４】本発明の一アッセイにおける陰性対照の写真の写真複写である。
【図５】本発明のアッセイで形成された、肉眼にも容易に識別可能な凝集体の４０倍に拡大した写真の写真複写である。
【図６】５０ピコモルのＡβ原線維から本発明のアッセイで形成された、顕微鏡下で見える小凝集体の写真の写真複写である（図４〜６は、いずれも倍率４０倍）。
【図７】図７Ａは本発明の別のアッセイに従って形成された、肉眼にも容易に識別可能な大コロイド凝集の４０倍に拡大した写真の写真複写である。図７Ｂは図７Ａのアッセイの陰性対照の写真の写真複写である。
【図８】本発明の薬物スクリーニングアッセイの結果を示すＥＬＩＳＡプレートの写真のカラーコピーである。
【図９】本発明の別のアッセイにおける原線維の電子的検出を示す四つのＡＣＶのオーバーレイである。
【図１０】本発明の光散乱原線維アッセイの結果を示す図である。
【図１１】図１０の光散乱実験の陰性対照を示す図である。
【図１２】神経変性疾患アッセイにおける時間の関数としての薬物活性を、薬物活性を凝集体サイズと相関させて示したグラフである。
【図１３】結合相互作用を示すコロイド凝集アッセイを、色で対照と比較した結果を示す図である。
【図１４】神経変性疾患アッセイにおけるＡβ濃度の増加、又は一定濃度のアッセイにおける時間経過によって生じるピンクから青への色の変化を示す（コロイド凝集を示す）図である。
【符号の説明】
【０２１４】
２０  アーティクル、２２  ＳＡＭ、２４  分子ワイヤ、  ２６  粒子（ビー
ズ）、２８  結合種、３０  シグナリング実体、３２  デンドリマー、３４  シ
グナリング実体、３６  標的分子（凝集体又は原線維形成種）、３８  磁石、４
０  コロイド粒子。
【図１】
2014013242.tif 000004
【図２】
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【図３】
2014013242.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014013242.tif 000010
【図８】
2014013242.tif 000011
【図９】
2014013242.tif 000012
【図１０】
2014013242.tif 000013
【図１１】
2014013242.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2014013242.tif 000017
【配列表】
2014013242000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月2日(2013.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非神経変性疾患もしくは非疾患性の凝集体または非神経変性疾患もしくは非疾患性の凝集体形成種を含有するか含有すると考えられる試料、非特異的吸着を阻害するよう表面を完全に被覆する自己集合単層を備えたコロイド粒子、該コロイド粒子に特異的に固定されているか固定可能であり該凝集体または該凝集体形成種と結合可能な複数の結合種、を用意すること；
試料を結合種に曝露し、試料中に存在する凝集体または凝集体形成種のいずれかと結合種とを相互作用させること；
凝集体または凝集体形成種の凝集の程度を、まだ固定されていない場合、コロイド粒子を結合種に特異的に固定することによって測定し、コロイド粒子の凝集の程度を測定すること；
を含む方法。
【請求項２】
コロイド粒子が、金コロイド粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コロイド粒子が、補助的シグナリング実体を保持している、請求項２または３に記載の方法。
【請求項４】
コロイド粒子が、凝集体または凝集体形成種の非特異的結合を阻害する化学官能性を有している、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料を結合種およびコロイド粒子に曝露すること；コロイド粒子を結合種に固定させること；コロイド粒子の凝集の程度を測定すること；を含み、結合種がコロイド粒子に固定されるように適応されている、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
結合種が、共有結合、特異的生物学的結合またはキレート／金属結合によって、コロイド粒子に固定されているか固定可能である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
コロイド粒子の凝集の程度を、目視、顕微鏡、光散乱、吸光度または色変化による視覚化によって測定する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
コロイド粒子の凝集の程度を、試料に曝露した際のコロイド溶液の色変化によって測定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
結合種が、ペプチド、タンパク質またはそれらのフラグメントである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
結合種と凝集体形成種が相同的であり、好ましくは、結合種と凝集体形成種が、異なる生物学的種に由来する同じタンパク質またはタンパク質フラグメントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料が、非神経変性疾患または非疾患性の凝集体形成種を含有するか含有すると考えられる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
凝集形成に影響を及ぼすと考えられる候補薬の存在下で、試料を結合種に曝露することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
結合種それ自体は凝集体形成種ではないが、前記相互作用により結合種が非神経変性疾患または非疾患性の凝集体形成種に変換され、結合種が、変性疾患または非疾患性の凝集体形成種の存在に特徴的な凝集に参加する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
第２の結合種をアーティクル表面に固定するか固定するように適応させ、凝集体形成種を結合させることをさらに含み、前記相互作用が、結合種を凝集体形成種に変換せずに結合させる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
試料が、非神経変性疾患または非疾患性の凝集体を含有するか含有すると考えられる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
凝集形成に影響を及ぼすと考えられる候補薬の存在下で、試料を結合種に曝露することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非特異的吸着を阻害するよう表面を完全に被覆する自己集合単層を備えたコロイド粒子と；このコロイド粒子の表面に特異的に固定されているか固定可能な複数の結合種と；を含むキットであって、
結合種が、非神経変性疾患もしくは非疾患性の凝集体または非神経変性疾患もしくは非疾患性の凝集体形成種に結合可能である、上記キット。
【請求項１８】
コロイド粒子が、金コロイド粒子である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
コロイド粒子が、１０〜３０ｎｍの直径である、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
結合種が、共有結合によってコロイド粒子に固定されているか固定可能である、請求項１７〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
結合種がそれぞれ親和性標識を備え、各コロイド粒子上の親和性標識の結合パートナーによって結合種がコロイド粒子に固定されているか固定可能である、請求項１７〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
結合種が、金属結合標識／金属／キレート連結によってコロイド粒子に固定されているか固定可能である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
結合種がヒスチジン標識化されており、コロイド粒子がニトリロ三酢酸・Ｎｉ基を備えている、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
親和性標識がストレプトアビジンであり、その結合パートナーがビオチンである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
結合種が抗体であり、コロイド粒子がプロテインＡまたはプロテインＧを備えている、請求項１７〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
結合種がＧＳＴ融合タンパク質であり、コロイド粒子がグルタチオンを備えている、請求項１７〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
コロイド粒子が、凝集体または凝集体形成種の非特異的結合を阻害する化学官能性を有している、請求項１７〜２６のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
化学官能性が、トリエチレングリコール末端化された種である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
コロイド粒子が補助的シグナリング実体を保持している、請求項１７〜２８のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
結合種が、凝集体形成種と相同的なペプチド、タンパク質またはそのフラグメントであり、好ましくは、結合種と凝集体形成種が、異なる生物学的種に由来する同じタンパク質またはタンパク質フラグメントである、請求項１７〜２９のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
結合種が、凝集体または凝集体形成種と相互作用すると凝集体形成種に変換可能である、請求項１７〜２８のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
凝集体または凝集体形成種と相互作用すると凝集体形成種に変換可能な増幅用結合種を含む、請求項１７〜２８のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
自己集合単層が非特異的吸着を阻害するようコロイド表面を完全に被覆し、そしてここでタンパク質遮断ステップが実施されない、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
自己集合単層に被覆されたコロイドが洗浄剤を含有しない溶液中で安定である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
自己集合単層に被覆されたコロイドが、チオール溶液中に混合されたグリコール末端チオールを用いることを含む方法によって製造され、それによって非特異的結合を阻害する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
自己集合単層に被覆されたコロイドが、コロイドを自己集合種およびカルボン酸塩および／または界面活性剤に曝露することを含む方法によって製造される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
コロイド表面を完全に被覆する自己集合単層が、チオール種をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解することおよび前記チオール種をコロイドに添加することを含む方法によって製造される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
自己集合単層が非特異的吸着を阻害するようコロイド表面を完全に被覆し、そしてここでタンパク質遮断ステップが実施されない、請求項１７〜３２のいずれかに記載のキット。
【請求項３９】
自己集合単層に被覆されたコロイドが洗浄剤を含有しない溶液中で安定である、請求項１７〜３２のいずれかに記載のキット。
【請求項４０】
自己集合単層に被覆されたコロイドが、チオール溶液中に混合されたグリコール末端チオールを用いることを含む方法によって製造され、それによって非特異的結合を阻害する、請求項１７〜３２のいずれかに記載のキット。
【請求項４１】
自己集合単層に被覆されたコロイドが、コロイドを自己集合種およびカルボン酸塩および／または界面活性剤に曝露することを含む方法によって製造される、請求項１７〜３２のいずれかに記載のキット。
【請求項４２】
コロイド表面を完全に被覆する自己集合単層が、チオール種をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解することおよび前記チオール種をコロイドに添加することを含む方法によって製造される、請求項１７〜３２のいずれかに記載のキット。