(57)【要約】【課題】細胞を基板の所定の位置に正確に配置することができ、細胞挿入用部材を標的となる細胞に正確にかつ効率良く挿入する。【解決手段】一主面に長さが略同一の複数の柱状体を有するピラーアレイにおける、当該柱状体の端面にＢＡＭ溶液を接触させる工程と、基板の一主面にピラーアレイを柱状体の端面が対向するように位置決めし、当該端面に付着した上記ＢＡＭ溶液を当該基板の一主面に転写する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一主面に長さが略同一の複数の柱状体を有するピラーアレイにおける、当該柱状体の端面に細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を接触させる工程と、
基板の一主面にピラーアレイを柱状体の端面が対向するように位置決めし、当該端面に付着した上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を当該基板の一主面に転写する工程と
を含む細胞アレイ用基板の製造方法。
【請求項２】
上記複数の柱状体の配置は、支持体上に複数の針状物が配置された細胞挿入部材であって、細胞アレイ用基板に細胞を接着してなる細胞アレイに対して近接することで当該針状物を細胞に挿入できる細胞挿入部材における当該複数の針状物の配置に対応することを特徴とする請求項１記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【請求項３】
上記ピラーアレイは、ＩＶ型半導体材料からなる基板の一主面に複数の略円形のレジスト膜をパターニングし、ドライエッチング加工により上記複数の柱状体を形成したものであることを特徴とする請求項１記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【請求項４】
上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液が転写される上記基板の一主面には、予めウシ血清アルブミン膜を成膜することを特徴とする請求項１記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【請求項５】
上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液に含まれる細胞膜修飾剤の濃度により細胞接着力を調整することを特徴とする請求項１記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【請求項６】
上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液は、グリセリンを含有することを特徴とする請求項１記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【請求項７】
一主面に長さが略同一の複数の柱状体を有するピラーアレイにおける、当該柱状体の端面に細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を接触させる工程と、
基板の一主面にピラーアレイを柱状体の端面が対向するように位置決めし、当該端面に付着した上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を当該基板の一主面に転写する工程と、
上記基板の一主面に細胞懸濁液を接触させることで、上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液が転写された領域に細胞を接着する工程と
を含む細胞アレイの製造方法。
【請求項８】
上記細胞を接着する工程では、基板の一主面に細胞懸濁液を接触させた後、基板上に接着しなかった細胞を基板上から除去する処理を行うことを特徴とする請求項７記載の細胞アレイの製造方法。
【請求項９】
上記複数の柱状体の配置は、支持体上に複数の針状物が配置された細胞挿入部材であって、細胞アレイに対して近接することで当該針状物を、基板上に接着した細胞に挿入できる細胞挿入部材における当該複数の針状物の配置に対応することを特徴とする請求項７記載の細胞アレイの製造方法。
【請求項１０】
上記ピラーアレイは、ＩＶ型半導体材料からなる基板の一主面に複数の略円形のレジスト膜をパターニングし、ドライエッチング加工により上記複数の柱状体を形成したものであることを特徴とする請求項７記載の細胞アレイの製造方法。
【請求項１１】
上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液が転写される上記基板の一主面には、予めウシ血清アルブミン膜を成膜することを特徴とする請求項７記載の細胞アレイの製造方法。
【請求項１２】
上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液に含まれる細胞膜修飾剤の濃度により細胞接着力を調整することを特徴とする請求項７記載の細胞アレイの製造方法。
【請求項１３】
上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液は、グリセリンを含有することを特徴とする請求項７記載の細胞アレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の細胞を基板に所望の配置で配列させることができる細胞アレイ用基板の製造方法、当該細胞アレイ用基板を用いて複数の細胞を所望の配置で配列させた細胞アレイの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の分離技術としては、最近利用されている手段として、ＦＡＣＳ（Fluoresence activated cell sorting）がある。この手段は、蛍光標識抗体を用いて、細胞試料中の標的細胞のみを標識するものであり、細胞試料を液流として流しつつレーザー光を照射して、細胞試料中の個々の細胞から発する蛍光を測定して、上記標的細胞を識別し、該標的細胞のみをソーティングするものである。
【０００３】
しかし、この手段は、細胞表面の抗原を標的とするものであり、細胞内部に産生するタンパク質等の細胞内物質を指標に細胞を識別分離するものではない。ＦＡＣＳでは、遺伝子組み換えにより蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させる方法により細胞内部のタンパク質を指標にすることも可能であるが、移植治療に用いる等の目的で天然の細胞の分離を目的とする場合には遺伝子組み換え細胞は適用できない。また、ＦＡＣＳでは、個々の細胞の蛍光測定結果とソーティングとを連動させるための極めて精密な制御機構を必要とし、極めて高価なものとならざるを得ないほか、蛍光標識抗体を用いなければならない問題点も有していた。
【０００４】
一方、本発明者は、遺伝子等を先端に固定したナノレベルの針状物を細胞に挿入し、細胞の応答を観察する手法を開発しており（特許文献１参照）、この手法をさらに展開し、針状物を細胞挿入後、標的細胞のみをつり上げ分離する手法も既に提示している。この手法は、細胞内のマーカー物質と選択的に結合する、例えば抗体等の物質を固定化した針状物を、細胞培養基板上の各細胞に挿入して、上記マーカー物質と選択的に結合する物質を介して細胞内のマーカー物質を針状物に結合させた後、該針状物を引き上げて、上記マーカー物質を含有する細胞のみを選択して釣り上げ分離するものである（特許文献２参照）。
【０００５】
この方法は、細胞中のマーカー物質と該マーカー結合物質と選択的に結合する物質との結合に基づく細胞と針状物との結合力を、細胞の基板に対する接着力よりも大きく、かつ、抗体固定化針状物とマーカー物質を発現していない細胞との非特異的な吸着力が、細胞の基板に対する接着力より小さく設定するもので、これにより、マーカー物質を含む特定の細胞のみを識別すると同時に、上記針状物により標的細胞を釣り上げることを可能とするものである。
【０００６】
また、この方法では、一本の針状物を利用することで、基板上に配置した試料細胞を順次釣り上げるか、複数本の針状物を利用することで同時に複数の試料細胞を釣り上げることができる。複数本の針状物としては、例えば、２００ｎｍ程度の直径及び２０μｍ程度の長さの針状物を１００μｍ間隔で１００×１００本配置した例が開示されている。さらに、特許文献２には記載されていないが、釣り上げる細胞にダメージを与えず、かつ挿入効率に優れた部材についても検討されつつあり、特許文献２に開示された針状物に限らず種々の形状の細胞挿入用部材をこの方法に利用することができる。
【０００７】
以上のように、基板上に細胞を接着させてなる細胞アレイは、遺伝子等を先端に固定したナノレベルの針状物を細胞に挿入する使用形態、マーカー結合物質を先端に固定してマーカー物質を含有する細胞を釣り上げる使用形態等に利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３―３２５１６１号公報
【特許文献２】特開２０１１−１８２７６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところが、上述したような細胞アレイの各種使用形態において、針状物等の細胞挿入用部材を標的となる細胞に正確にかつ効率良く挿入するには、基板において細胞を正確に配置することが肝要となる。そこで、本発明は、細胞を基板の所定の位置に正確に配置することができ、細胞挿入用部材を標的となる細胞に正確にかつ効率良く挿入することができる細胞アレイ用基板の製造方法及び細胞アレイの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成するため本発明者らが鋭意検討した結果、複数の柱状体を有するピラーアレイを用いて細胞膜修飾剤溶液を基板の一主面に転写することで、当該溶液が転写された領域に細胞を接着できるようにする手法を開発し、複数の細胞を基板における所定の位置に正確に配置することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
【００１１】
（１）一主面に長さが略同一の複数の柱状体を有するピラーアレイにおける、当該柱状体の端面に細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を接触させる工程と、基板の一主面にピラーアレイを柱状体の端面が対向するように位置決めし、当該端面に付着した上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を当該基板の一主面に転写する工程とを含む細胞アレイ用基板の製造方法。
【００１２】
（２）上記複数の柱状体の配置は、支持体上に複数の針状物が配置された細胞挿入部材であって、細胞アレイ用基板に細胞を接着してなる細胞アレイに対して近接することで当該針状物を細胞に挿入できる細胞挿入部材における当該複数の針状物の配置に対応することを特徴とする（１）記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【００１３】
（３）上記ピラーアレイは、ＩＶ型半導体材料からなる基板の一主面に複数の略円形のレジスト膜をパターニングし、ドライエッチング加工により上記複数の柱状体を形成したものであることを特徴とする（１）記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【００１４】
（４）上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液が転写される上記基板の一主面には、予めウシ血清アルブミン膜を成膜することを特徴とする（１）記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【００１５】
（５）上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液に含まれる細胞膜修飾剤の濃度により細胞接着力を調整することを特徴とする（１）記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【００１６】
（６）上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液は、グリセリンを含有することを特徴とする（１）記載の細胞アレイ用基板の製造方法。
【００１７】
（７）一主面に長さが略同一の複数の柱状体を有するピラーアレイにおける、当該柱状体の端面に細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を接触させる工程と、基板の一主面にピラーアレイを柱状体の端面が対向するように位置決めし、当該端面に付着した上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を当該基板の一主面に転写する工程と、上記基板の一主面に細胞懸濁液を接触させることで、上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液が転写された領域に細胞を接着する工程とを含む細胞アレイの製造方法。
【００１８】
（８）上記細胞を接着する工程では、基板の一主面に細胞懸濁液を接触させた後、基板上に接着しなかった細胞を基板上から除去する処理を行うことを特徴とする（７）記載の細胞アレイの製造方法。
【００１９】
（９）上記複数の柱状体の配置は、支持体上に複数の針状物が配置された細胞挿入部材であって、細胞アレイに対して近接することで当該針状物を、基板上に接着した細胞に挿入できる細胞挿入部材における当該複数の針状物の配置に対応することを特徴とする（７）記載の細胞アレイの製造方法。
【００２０】
（１０）上記ピラーアレイは、ＩＶ型半導体材料からなる基板の一主面に複数の略円形のレジスト膜をパターニングし、ドライエッチング加工により上記複数の柱状体を形成したものであることを特徴とする（７）記載の細胞アレイの製造方法。
【００２１】
（１１）上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液が転写される上記基板の一主面には、予めウシ血清アルブミン膜を成膜することを特徴とする（７）記載の細胞アレイの製造方法。
【００２２】
（１２）上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液に含まれる細胞膜修飾剤の濃度により細胞接着力を調整することを特徴とする（７）記載の細胞アレイの製造方法。
【００２３】
（１３）上記細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液は、グリセリンを含有することを特徴とする（７）記載の細胞アレイの製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る細胞アレイ用基板の製造方法は、複数の柱状体を有するピラーアレイを利用することで、基板の一主面における所定の位置に細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を転写する。これにより、本発明に係る細胞アレイ用基板の製造方法によれば、基板における所定の位置に細胞を配置することができる細胞アレイ用基板を製造できる。
【００２５】
また、本発明に係る細胞アレイの製造方法は、複数の柱状体を有するピラーアレイを利用することで、基板の一主面における所定の位置に細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を転写する。これにより、本発明に係る細胞アレイの製造方法によれば、基板における所定の位置に細胞を配置した細胞アレイを製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ピラーアレイの概略を示す斜視図である。
【図２】細胞アレイ用基板の製造方法であって、細胞膜修飾剤溶液を基板に滴下する工程を示す斜視図である。
【図３】細胞アレイ用基板の製造方法であって、滴下した細胞膜修飾剤溶液をスピンコートする工程を示す斜視図である。
【図４】細胞アレイ用基板の製造方法であって、細胞膜修飾剤溶液の被膜を基板に形成した工程を示す斜視図である。
【図５】細胞アレイ用基板の製造方法であって、ピラーアレイを細胞膜修飾剤溶液の被膜に対向させた工程を示す斜視図である。
【図６】細胞アレイ用基板の製造方法であって、ピラーアレイを細胞膜修飾剤溶液の被膜に当接させた工程を示す斜視図である。
【図７】細胞アレイ用基板の製造方法であって、細胞膜修飾剤溶液を柱状体の端面に保持した状態のピラーアレイを細胞培養用シャーレに対向させた工程を示す斜視図である。
【図８】細胞アレイ用基板の製造方法であって、細胞膜修飾剤溶液を保持した柱状体の端面を細胞培養用シャーレに当接させた工程を示す斜視図である。
【図９】細胞アレイ用基板の製造方法により製造された細胞アレイ用基板の斜視図である。
【図１０】細胞アレイの製造方法であって、細胞アレイ用基板に細胞懸濁液を滴下する工程を示す斜視図である。
【図１１】細胞アレイの製造方法であって、細胞アレイ用基板に細胞を接着させる工程を示す斜視図である。
【図１２】細胞アレイの製造方法により製造された細胞アレイの斜視図である。
【図１３】マイクロピラーアレイに使用する基板の斜視図である。
【図１４】基板にレジスト膜を成膜した状態を示す斜視図である。
【図１５】レジスト膜に対向するようにフォトマスクを位置決めした状態を示す斜視図である。
【図１６】フォトマスクに対応するパターンをレジスト膜に形成した状態を示す斜視図である。
【図１７】現像することにより基板上に所定形状のレジスト膜を形成した状態を示す斜視図である。
【図１８】ドライエッチングによりマイクロピラーを形成した状態を示す斜視図である。
【図１９】レジスト膜を除去して作製されたマイクロピラーアレイの斜視図である。
【図２０】細胞挿入部材を用いた標的細胞の釣り上げ分離の態様を表す概念図である。
【図２１】BAM濃度を0.5、1及び10mMとした３種類のBAMインク液を使用したときの基板に対する細胞の平均接着力を測定した結果を示す特性図である。
【図２２】マイクロピラーアレイのSEM写真である。上は直径2μm、長さ20μm及びピッチ30μmのマイクロピラーアレイであり、下は直径5μm、長さ20μm及びピッチ30μmのマイクロピラーアレイである。
【図２３】細胞挿入部材を水平から３０°傾けて撮影した走査型電子顕微鏡写真である。上は３００倍、下は１５０００倍の観察像である。スケールバーはそれぞれ１００μｍ、３μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に係る細胞アレイ用基板の製造方法及び細胞アレイの製造方法を、図面を参照して詳細に説明する。
【００２８】
細胞アレイ用基板とは細胞を接着することができる基板を意味し、細胞アレイとは細胞アレイ用基板に細胞を接着した状態の基板を意味する。すなわち、細胞アレイ用基板とは、細胞を未だ接着していない状態であって、細胞を接着した状態の細胞アレイとは異なる。ここで、細胞アレイ用基板に接着する細胞としては、特に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル等の哺乳動物由来の動物細胞を挙げることができる。
【００２９】
本発明に係る細胞アレイ用基板の製造方法は、図１に示すように、一主面に長さが略同一の複数の柱状体１を有するピラーアレイ２を利用する。なお、ピラーアレイ２における複数の柱状体１の配置は、細胞アレイ用基板における細胞接着領域の配置に対応することとなる。例えば、柱状体１の形状を直径略１〜４μｍの円柱とした場合、隣接する柱状体１の間隔を例えば２５〜１５０μｍ、好ましくは２８〜１００μｍ、より好ましくは３０〜５０μｍとなるように配置することができる。すなわち、柱状体１は、１０ｍｍ角の領域に、例えば４千〜１６万本、好ましくは１万〜１２万本、より好ましくは４万〜１１万本、ＸＹ方向に整列するように配置することができる。ただし、ピラーアレイ２を構成する複数の柱状体１の数及び配置について、何ら限定されるものではない。
【００３０】
なお、隣接する柱状体１の間隔を、例えば３０μｍとすることは、細胞アレイ用基板に接着する細胞の間隔が約３０μｍになることを意味する。通常、浮遊状態の体細胞の直径は約１０μｍであり、細胞アレイ用基板に接着する細胞の間隔を約３０μｍとすれば、隣接する細胞同士の接着を確実に防止することができる。
【００３１】
ピラーアレイ２において、複数の柱状体１が一主面から略同一の長さを有するため、これら柱状体１の端面に対してほぼ隙間無く平板を当接することができる。なお、柱状体１の端面は、平面でも良いし、所定の荒さとなるように粗面処理が施されていても良いし、或いは、所定形状の溝が形成されていても良い。また、柱状体１の端面の平面形状、すなわち柱状体１の断面形状は、特に限定されず、円形でも良いし、三角形や矩形等の多角形でもよい。
【００３２】
本発明に係る細胞アレイ用基板の製造方法では、先ず、図１に示したピラーアレイ２における柱状体１の端面に細胞膜修飾剤（Biocompatible Anchor for Membrane）溶液を接触させる。これにより、複数の柱状体１の端面には、それぞれ所定量の細胞膜修飾剤溶液が保持されることとなる。次に、柱状体１の端面に細胞膜修飾剤溶液を保持した状態で、柱状体１の端面に基板の一主面を当接する。これにより、柱状体１の端面に保持した細胞膜修飾剤溶液を当該基板の一主面に転写することができる。このようにして、基板の一主面に、ピラーアレイ２を構成する複数の柱状体１の配置に対応した、細胞膜修飾剤溶液が転写された複数の領域が形成されることとなる。少なくとも以上の工程によって、基板の一主面に細胞膜修飾剤溶液が転写された複数の領域が形成されてなる細胞アレイ用基板を製造することができる。なお、細胞アレイ用基板の基となる基板としては、特に限定されないが、例えば細胞培養等に使用されるシャーレ、その他のガラスからなる基板、樹脂からなる基板を適宜使用することができる。
【００３３】
より詳細な細胞アレイ用基板の製造方法を図２〜９にて説明する。先ず、図２に示すように、細胞膜修飾剤として、スクシミド基を有するSUNBRIGHT OE-020CS（日油株式会社製)、イソプロパノール、グリセリン及び水を含む細胞膜修飾剤溶液を、ガラス基板１０に滴下する。ここで、細胞膜修飾剤溶液としては、特にグリセリンを含有する組成とすることが好ましい。細胞膜修飾剤溶液がグリセリンを含有する場合、後述する処理において細胞膜修飾剤溶液が乾燥することを防止できる。なお、細胞膜修飾剤溶液の乾燥防止には、グリセリンに限定されず、例えば、ヒアルロン酸をはじめとする他の多糖類やベタイン等、保水効果を有する各種化合物を利用することができる。なお、細胞膜修飾剤溶液には、蛍光試薬であるフルオロセインを含有させておくことで、細胞アレイ用基板に転写されたときのパターンをフルオロセインに基づいて確認することができる。
【００３４】
次に、図３に示すように、いわゆるスピンコート法により、細胞膜修飾剤溶液の被膜１１をガラス基板１０上に形成する（図４）。次に、図５に示すように、ピラーアレイ２における柱状体１の端面がガラス基板１０における細胞膜修飾剤溶液の被膜１１が形成された面に対向させる。次に、図６に示すように、ピラーアレイ２及び/又はガラス基板１０を近接する方向に移動させ、柱状体１の端面を細胞膜修飾剤溶液の被膜１１に接触させる。なお、柱状体１の端面がガラス基板１０に当接するまで、ピラーアレイ２及び/又はガラス基板１０を移動させてもよい。以上の工程を経ることによって、複数の柱状体１の全ての端面に細胞膜修飾剤溶液を保持させることができる。
【００３５】
次に、図７に示すように、柱状体１の端面に細胞膜修飾剤溶液を保持した状態で、ピラーアレイ２における柱状体１の端面を細胞アレイ用基板の基となる細胞培養用シャーレ１２に対向させる。なお、この細胞培養用シャーレ１２は、柱状体１の端面が対向する一主面に予め1 mg/mL ウシ血清アルブミンBSA溶液を満たし、BSA被膜を形成している。次に、図８に示すように、ピラーアレイ２及び/又は細胞培養用シャーレ１２を近接する方向に移動させ、柱状体１の端面を細胞培養用シャーレ１２に形成されたBSA被膜に接触させる。なお、柱状体１の端面が細胞培養用シャーレ１２に当接するまで、ピラーアレイ２及び/又は細胞培養用シャーレ１２を移動させてもよい。そして、ピラーアレイ２と細胞培養用シャーレ１２とを離間させることで、柱状体１の端面に保持された細胞膜修飾剤溶液を細胞培養用シャーレ１２の一主面に転写することができる。その後、およそ60分間室温で放置することで、細胞膜修飾剤におけるスクシミド基とBSAとを反応させることができる。
【００３６】
以上により、図９に示すような、細胞培養用シャーレ１２の一主面に細胞膜修飾剤溶液が転写された複数の細胞接着領域１３を有する細胞アレイ用基板を製造することができる。製造された細胞アレイ用基板は、例えば図１０〜１２に示すような工程によって複数の細胞接着領域１３に細胞を接着させることができる。言い換えると、製造された細胞アレイ用基板を用いて図１０〜１２に示す工程に従って細胞アレイを製造することができる。
【００３７】
詳細には、先ず、図１０に示すように、細胞アレイ用基板における細胞接着領域１３が形成された一主面に、細胞懸濁液を接触させる。例えば、細胞アレイ用基板として細胞培養用シャーレ１２を使用する場合、細胞懸濁液を細胞培養用シャーレ１２に満たす。そして、例えば、10分間10 rpmで振とうする。これにより、図１１に示すように、細胞アレイ用基板の細胞接着領域１３に細胞１４を接着させることができる。そして、図１２に示すように、細胞アレイ用基板の細胞接着領域１３に接着しなかった細胞１４を除去することで、細胞接着領域１３の配置に応じて複数の細胞１４が接着して細胞アレイ１５を製造することができる。
【００３８】
以上のように製造された細胞アレイ１５においては、細胞接着領域１３の大きさによって接着する細胞の数を調節することができる。例えば、１個の細胞を接着したい場合には、領域１３の直径を例えば１〜５μｍ、好ましくは１．５〜４μｍ、より好ましくは２〜３μｍとする。
【００３９】
なお、上述した例では、細胞培養用シャーレ１２にBSA被膜を形成しているため、細胞膜修飾剤溶液が転写された細胞接着領域１３以外の領域は、BSA被膜が露出することとなる。BSAは細胞接着を抑制できるため、上述した例では、細胞膜修飾剤溶液が転写された細胞接着領域１３以外に対する細胞の接着を防止することができる。また、上述した例では、例えば24時間のインキュベーションを経たとしても、細胞接着領域１３に接着した細胞が細胞接着領域１３以外の領域に移動することを防止できる。
【００４０】
一方、細胞培養用シャーレ１２の一主面には、BSA被膜に代えて、細胞接着を促す被膜を形成しても良い。細胞接着を促す被膜としては、フィブロネクチン被膜、コラーゲン被膜、ポリリジン被膜等を挙げることができる。このような細胞接着を促す被膜を形成することで、細胞膜修飾剤溶液を転写した細胞接着領域１３と比較して弱い接着力でもって、細胞接着領域１３以外の領域には細胞を一過的に接着させることができる。例えば、細胞接着領域１３に細胞を接着させた後に24時間のインキュベーションを行うことで、細胞接着領域１３以外の領域において、培養細胞が通常の付着状態を形成することができる。
【００４１】
なお、この細胞接着領域１３の形状や大きさについては、上述した細胞アレイ用基板の製造工程から理解できるように、ピラーアレイ２における柱状体１の端面の形状及び大きさ、並びに細胞膜修飾剤溶液の粘度等に依存する。よって、柱状体１の端面の形状及び大きさ、並びに細胞膜修飾剤溶液の粘度等を調節することで、細胞接着領域１３を所望の形状及び大きさとすることができる。
【００４２】
また、細胞アレイ用基板における複数の細胞接着領域１３の配置は、上述した細胞アレイ用基板の製造工程から理解できるように、ピラーアレイ２における複数の柱状体１の配置に対応する。よって、細胞アレイ用基板における複数の細胞接着領域１３、すなわち細胞アレイ用基板に接着した細胞１４の位置は、ピラーアレイ２における複数の柱状体１の配置によって調整することができる。
【００４３】
複数の細胞１４を接着してなる細胞アレイ１５は、特に限定されないが、例えば、特開２０１１−１８２７６１号公報に開示された細胞の分離装置に使用することができる。すなわち、特開２０１１−１８２７６１号公報に開示された細胞の分離装置は、マーカー結合物質を固定化した複数の針状物を備え、基板に接着した複数の細胞に対してそれぞれ針状物を挿入するものである。この分離装置では、マーカー物質を有する細胞に針状物が挿入されると、マーカー物質とマーカー結合物質とが結合するが、細胞の基板に対する接着力が、マーカー物質が結合したときの上記針状物と細胞との結合力に比し小さく設定されている。よって、この分離装置では、細胞に針状物を挿入した後、針状物を引き上げることによって、マーカー物質を有する細胞のみを基板から引きはがし、マーカー物質を有しない細胞から分離することができる。
【００４４】
上述した細胞アレイ１５は、この分離装置に使用することができる。特に、分離装置に備わる複数の針状物の配置に対応する位置に細胞を接着することで、細胞の分離効率を大幅に向上することができる。すなわち、細胞アレイ用基板を作製する際に使用するピラーアレイ２は、分離装置に備わる複数の針状物の配置に一致するように配置された複数の柱状体１を有するものを使用することが好ましい。これにより、細胞アレイは、分離装置に備わる複数の針状物の配置に一致するように細胞１４を接着することができる。例えば、後述する方法によりピラーアレイ２から直径２００ｎｍの針状物を作製する場合、細胞アレイ用基板に接着した細胞と針状物とを非常に正確に位置決めすることができる。例えば、後述する方法によりピラーアレイ２から直径２００ｎｍの針状物を作製する場合、細胞アレイ用基板に接着した細胞の中心と針状物の先端との位置を、細胞の半径であるおよそ５μｍの範囲に収めることができる。
【００４５】
また、上述した細胞アレイ１５は、特開２０１１−１８２７６１号公報に開示された細胞の分離装置に限定されず、細胞に対して挿入する針状物を改良したタイプの分離装置に適用することもできる。一例としては、特徴的な形状の針状物を多数配置したナノニードルアレイを使用する分離装置を挙げることができる。
【００４６】
ここで、ナノニードルアレイのナノニードル（針状物）は支持体と一体加工されたものであり、ナノニードルの配置密度は、培養基板上の細胞の配置状態に応じて種々変更可能ではあるが、各動物細胞に一本のナノニードルを挿入する場合、例えば、支持体１０ｍｍ角に１万〜５万本である。各ナノニードルの長さ（支持体面からの高さ）は、１０〜５０μｍ、直径は、針状物の１／２長さの部分で２００〜３００ｎｍである。このナノニードルの形状は、先太りの野球のバット様の形状をしており、ナノニードルの最大直径は、針状物１／２長さの部分の直径の１０〜３０％大きい形状となっている。
【００４７】
効率的な細胞挿入は、針状物の直径と長さによって決定される。針状物の直径が１００〜４００ｎｍ、長さ１０μｍ以上の場合に、ヒト、マウス、ラット等の様々な動物由来の体細胞に対して、８０％以上の高い挿入効率が得られるが、各ナノニードルの最大直径でも４００ｎｍ以下であり、高い挿入効率が達成できる。なお、挿入効率とは針状物の細胞への接近動作の試行回数に対する針状物の細胞膜貫通の達成割合をいう。
【００４８】
また、ナノニードルは培養基板上の各細胞に対して、１本ずつ配置してもよいが、さらに、一つの細胞に対し２本あるいは３本ずつ、各細胞の配置間隔と対応させて配置してもよい。特に、３本配置する場合は、培養基板表面に対し、三角形、好ましくは正三角形になるように配置するのが好ましい。
【００４９】
このようなナノニードルの配置によれば、細胞解析用のプローブとして同一細胞内での異なる複数箇所でのデータを同時測定でき、また、細胞挿入操作時の横ずれを防止するという機能も発揮できる。さらに、標的細胞をつり上げて分離する際、ナノニードルの細胞保持力の増大にも寄与する。
【００５０】
このようなナノニードルアレイは、以下のａ）〜ｄ）の工程を含む製造方法により得られる。
【００５１】
ａ）フォトレジストのコーティング工程
先ず、図１３に示すように、IV型半導体材料からなる基板２０を準備する。次に、図１４に示すように、基板２０の一主面をフォトレジストでコーティングしてレジスト膜２１を形成する。このフォトレジスト（感光性樹脂）としては、ポジ型、ネガ型のいずれも使用でき、IV型半導体基板２０としては、Ｓｉ、ＳｉＣ、Ｇｅ等の無機材料からなるものが挙げられる。
【００５２】
ｂ）マスクパターンの現像工程
次に、図１５に示すように、上記フォトレジストによりコーティングされた基板２０上にマスクパターンが印画されたフォトマスク２２を配置し、光照射する。フォトマスク２２は、合成石英ガラス等の透明材料上に、直径１〜４μｍの独立した円形の繰り返しパターン２３を有し、該パターン２３中の各円形部分の位置は、用いる培養基板上の細胞の位置と対応するものとすればよく、決まったものではないが、各円形部分の間隔は、通常、５０〜１００μｍに設定すればよい。
【００５３】
フォトマスク２２としては、例えば、クロム、酸化クロム、エマルジョン等を含有するものを用いることができる。ポジ型のフォトレジストを用いる場合、マスク剤は、フォトマスクの各円形部分に塗布し、ネガ型のフォトレジストを用いる場合は、各円形部分を残して、他の領域にマスク剤を塗布する。
【００５４】
光照射手段としては、マスクアライナ、ステッパなど等を用いることができる。フォトマスク２２を介してレジスト膜２１に光照射することによって、図１６に示すように、パターン２３に対応した領域２４のみが硬化する。その後、現像剤を用いてレジスト膜２１を現像処理すると、図１７に示すように、硬化した領域２４のみが基板２０上に残存することとなる。ここで現像剤としては、ポジ型フォトレジストを使用する場合は、ＴＭＡＨ（テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド）等のアルカリ溶液が用いられ、ネガ型フォトレジストを使用する場合は、有機溶剤が用いられる。このような現像剤により、ポジ型のレジスト膜２１の場合は、マスクされた円形部分が残り他の領域は除去され、ネガ型のレジスト膜２１に場合は、マスクされた領域は除去され、マスクされなかった円形部分が残る。いずれの場合であっても、シリコン基板２０上に残存したフォトレジストによる独立した円形の繰り返しパターン（領域２４）が描画される。
【００５５】
ｃ）ドライエッチング工程
この繰り返しパターン（領域２４）が描画された基板２０は、ドライエッチングにより、図１８に示すように、フォトレジストにより描画された円形部分に対応する部分以外の領域を掘り下る。ドライエッチングは、例えば、誘導結合プラズマエッチング装置を用いて、該装置に上記パターンが描画された基板を収納し、該装置にエッチングガスと保護ガスを交互に繰り返し導入（例えば６０〜１２０サイクル）してエッチングすることにより行う。エッチングガスとしては、例えば、ＳＦ６、ＩＦ５、ＣＨＦ３、ＣＦ４等のエッチングガスが用いられ、エッチング側壁を保護するための上記保護ガスとしては、Ｃ４Ｈ８が用いられる。他に使用できるドライエッチング装置としては誘導結合プラズマ（Inductively Coupled Plasma，ＩＣＰ）ドライエッチング装置等がある。
【００５６】
次に、得られたマイクロアピラーから、アッシャーによりレジスト膜２１を除去する。これにより、図１９に示すように、直径２〜３μｍの複数のピラー２５を有するマイクロピラーアレイ２６を作製することができる。なお、ここで作製したマイクロピラーアレイ２６は、上述した細胞アレイ用基板を製造する際のピラーアレイ２として使用することが好ましい。すなわち、上述したピラーアレイ２における複数の柱状体１が、図１９に示したマイクロピラーアレイ２６におけるピラー２５に相当する。
【００５７】
ｄ）ウエットエッチング工程
上記のようにレジスト膜２１を除去した後、１１００℃以上、１０〜２０時間の湿潤条件で熱酸化して、酸化層を作製した後、フッ酸系のウエットエッチング剤を用いてウエットエッチングを行い、上述した特徴的な構造を有するナノニードルアレイを製造することができる。ここで、フッ酸系ウエットエッチング剤としては、例えば、フッ酸あるいはフッ酸とフッ化アンモニウムを混合した緩衝フッ酸等を用いることができる。ナノニードルの上記独特の先太り形状は、このようなウエットエッチング処理を付加したことにより初めて得られたものである。
【００５８】
以上のように作製されたナノニードルアレイは、各ナノニードルに、例えば、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質等を固定化し、各細胞中の遺伝子の発現状態を検出、測定するために用いることができる。上記遺伝子等をナノニードルアレイの各ナノニードルに固定し、各ナノニードルが細胞アレイに接着している各細胞の位置に合致するようにナノニードルアレイを位置あわせし、下降させることにより、各ナノニードルを同時に個々の細胞に挿入することができる。
【００５９】
特に、ナノニードルアレイを作製する途中段階のマイクロピラーアレイ２６を、上述したピラーアレイ２として使用することで、ナノニードルアレイに最適な細胞アレイ用基板及び細胞アレイを作製することができる。また、ナノニードルアレイに最適な細胞アレイ用基板及び細胞アレイを作製するには、当該ナノニードルアレイを作製する際に使用したフォトマスク２２を利用してピラーアレイ２を別途作製し、このピラーアレイ２を利用して細胞アレイ用基板及び細胞アレイを作製してもよい。
【００６０】
遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質等の固定化は、例えば、物理的吸着、固定化アビジンを利用したアビジンビオチン結合の利用等が挙げられるが、例えば素材がシリコン系の場合は、ナノニードル表面を酸化処理した後、各種シラン化剤を用いて官能基を形成させ、この官能基を利用して共有結合で固定化することができる。
【００６１】
各細胞における遺伝子の発現状態の検出は、ナノニードルアレイを引き上げた後、基板上の個々の細胞について別途行ってもよいが、遺伝子の発現状態の検出、測定においては、例えば、モレキュラービーコンのような機能性プローブを針状物表面に修飾しておけば、針状物が細胞に挿入された状態で細胞内の遺伝子発現を生きたまま測定し、経時的に同時多数の細胞の解析を行うことができる。
【００６２】
上記モレキュラービーコンは、両端に蛍光物質とクエンチャーとを有するステム・ループ構造を有するＤＮＡで、ループ部分に解析する遺伝子とハイブリダイズ可能な配列を有するものである。
【００６３】
固定化する遺伝子としては、例えば、ガンの増殖抑制遺伝子であり、試験薬剤の存在下、細胞の挿入試験を行い、固定化されたマーカー遺伝子が発現すれば、上記薬剤は効果を有すると評価できる。また、分化に関与する各遺伝子をナノニードルに固定化し、試験薬剤の存在下、分化に関与する各遺伝子の発現状態の変化を測定することができる。同様に例えば分化遺伝子の発現に関与する物質を固定化した場合には、該物質により分化遺伝子の発現状態がどの様に変化するかも検出・測定できる。
【００６４】
モレキュラービーコン等の修飾では、例えばビオチン化されたモレキュラービーコンを用いる。針状物表面を、シランカップリング反応を用いた化学修飾によりビオチン化し、ストレプトアビジンを介した結合によって、ビオチン化モレキュラービーコンを固定化する。モレキュラービーコン修飾針状物が細胞に挿入された際、細胞内に該モレキュラービーコンの標的であるmRNAが発現している場合、モレキュラービーコンとのハイブリダイズにより針状物表面における蛍光が上昇する。この蛍光を、共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮影、解析することによって、細胞内のmRNAを検出・測定することが可能である。
【００６５】
一方、上述したナノニードルアレイは、特に多数の細胞の中から、標的細胞を選択的に分離するための、細胞分離用部材として有用である。
【００６６】
これらを用いる細胞分離の概要は図２０に示される。ナノニードルアレイを細胞分離用部材として使用する場合、各ナノニードルには、細胞内のマーカー物質と選択的に結合する物質、例えば抗体等を固定化する。固定化法については上記したとおりである。ついで、ナノニードルアレイを、各ナノニードルが細胞アレイ上の各細胞に対応するように位置決めした後、ナノニードルアレイを下降させ、各ナノニードルと基板上の各細胞に挿入して、上記マーカー物質と上記選択的に結合する物質を介して細胞内のマーカー物質をナノニードルに結合させた後、該ナノニードルアレイを引き上げて、上記マーカー物質を含有する細胞のみを選択して釣り上げ分離する。これらの多数の細胞へのナノニードルの挿入、標的細胞のつり上げは、ナノニードルアレイの一度の下降、上昇でなされる。
【００６７】
マーカー物質とマーカー結合物質の結合を介した、ナノニードルと細胞の結合力は、マーカー結合物質の固定化量の増大、あるいは固定化剤の選択、あるいは細胞挿入後のナノニードルの細胞内滞留時間の調整等により、５ｎＮ以上に調節可能である。さらに、上記した各細胞に対しナノニードルを複数配置した場合には、つり上げ時の細胞に対する保持力を増大することができる。
【００６８】
一般に、細胞と基板との接着力は、通常２０〜４０ｎＮであり、また、上記針状物とマーカー物質を発現していない細胞との非特異的吸着力は、通常２００ｐＮ程度であるので、細胞と細胞培養基板との接着力は、下限は２００ｐＮを超え、好ましくは５００ｐＮ以上であり、上限は少なくとも５ｎＮ未満、好ましくは３ｎＮ以下、さらに好ましくは２ｎＮ以下にする。この接着力の調節は、トリプシン等の蛋白分解酵素、あるいは、ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase）阻害剤、ブチリルオキサゾリジノン化合物、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、フィブロネクチン結合阻害剤等がなどの接着タンパク質発現阻害剤等による細胞の処理によってなすことができる。また、キレート剤を含有する、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及びＢＡＭ（Biocompatible Anchor for Membrane）−ＢＳＡ複合体の混合物からなる被膜形成剤で培養基板をコーティングする手法を採用することもできる。この被膜形成剤においては、ＢＳＡとＢＳＡ−ＢＡＭ複合体との混合比率を変えることにより、細胞と基板とを所望の接着力に調節することができる。
【００６９】
このナノニードルの形状は、先太りの野球のバット様の形状をしており、ナノニードルの最大直径は、針状物１／２長さの部分の直径の１０〜３０％大きい形状となっている。このような形状を有するナノニードルは、先細りの通常の針状物に比べて、細胞釣り上げ時の細胞の抜け落ちしにくい形状であり、マーカー固定化量も増大できるので、釣り上げ時の細胞脱落を有効に抑制できる。また、動物細胞の大きさは通常１０〜３０μｍであり、上記先端側の直径増大程度では、細胞に対するダメージ増大はほとんどない。
【００７０】
なお、上述したように、ナノニードルを使用することで細胞を釣り上げることも可能であるが、特に、細胞アレイ用基板に接着した細胞に対して物質を輸送・導入する際に使用することもできる。すなわち、物質（例えばDNA、タンパク質など機能性分子）を各ナノニードルの先端に付着させておき、細胞アレイ用基板に接着した複数の細胞に対してナノニードルを挿入することで、複数の細胞に対して当該物質を同時に輸送・導入することも可能である。この場合、細胞アレイ用基板に接着した細胞は、挿入したニードルを抜く際に基板から釣り上がらないように接着していることが好ましい。すなわち、この場合には、細胞アレイ用基板と細胞との接着力を、細胞を釣り上げる場合と比較してより強くするように設定することが好ましい。言い換えると、細胞アレイ用基板に対して細胞を接着する際には、使用形態に合わせて任意の接着力に制御することが望ましい。
【００７１】
なお、上記で説明したように、細胞アレイ用基板に対して正確な配置で細胞を接着すること、望ましくは適切な接着力で細胞を接着することにより、針状物を利用した細胞操作のみならず、イメージングサイトメトリー等、他の細胞解析、細胞操作のための細胞アレイとしても利用が可能となる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７３】
本実施例では、先ず、細胞培養用シャーレに1 mg/mL BSA溶液を満たし、BSA被膜を作製した。細胞膜修飾（BAM）にはスクシミド基を有するSUNBRIGHT OE-020CS（日油株式会社製)を用いた。イソプロパノール、グリセリン、水、DMSO（ジメチルスルホキシド）の混合溶液を溶媒としてコンタクトプリントのためのBAMインク液を調製した。また本実施例ではBAMインク液には、パターンの確認のために蛍光試薬フルオロセインを含有させた。すなわち、本実施例では表１の組成となるようにBAMインク液を調製した。すなわち、本実施例では、BAM濃度を0.5、1及び10mMとした３種類のBAMインク液を調製した。
【００７４】
【表１】
2014168450.tif 000003
【００７５】
次に、調製したBAMインク液をガラス基板上でスピンコートし、インク液薄膜を作製した。このBAMインク液薄膜にマイクロピラーアレイを接触させ、マイクロピラーの先端部にのみインク液を塗布した。このマイクロピラーアレイを、BSA被膜を形成した細胞培養用シャーレに接触させることにより、BAMインク液を転写した。BAMのスクシミド基とBSAの反応のため、転写後60分間室温放置した。その後、細胞の懸濁液をシャーレに満たし、10分間10 rpmで振とうし、細胞がドットパターン上に配列した細胞アレイを形成させた。配列しなかった余剰の浮遊細胞は取りのぞいた。本実施例では、細胞としてマウス繊維芽細胞NIH3T3を使用した。
【００７６】
３種類のBAMインク液（BAM濃度：0.5、1、10mM）について、アレイ化した細胞の接着力を測定した。具体的には、鉤型に加工したAFM探針（NanoWorld社製）を用いて、基板から細胞を強制的に剥離した際のフォースカーブの最大値を接着力として測定した。測定にはJPK社製NanoWizardIIを使用した。測定結果を図２１に示した。BAM濃度が0.5、1及び10mMの３種類のBAMインク液の、平均接着力はそれぞれ、11 nN、36 nNおよび200 nNとなった。
【００７７】
また、本実施例で使用したマイクロピラーアレイは以下のように作製した。先ず、直径４インチ、厚さ０．４ ｍｍのシリコンウエハに対して、フォトレジスト凝着助触媒としてＨＭＤＳをスピンコートした後に、ポジ型フォトレジストであるＴＳＭＲ−Ｖ９０をスピンコートした。直径２μｍの円形のマスクパターン（クロム）がガラス基板上に３０μｍ間隔に配列されたフォトマスクを用いて、マスクアライナにより光照射、2.38% NMD-3による現像処理でレジストにパターンを作製した。
【００７８】
その後、誘導結合プラズマ（Inductively Coupled Plasma，ＩＣＰ）ドライエッチング装置ＭＵＣ−２１（ＳＴＳ）を用いたドライエッチング加工により、フォトレジストが除去された部分を掘り下げることによって、直径２〜３ミクロンのピラーが配列された基板（マイクロピラーアレイ）を作製した（例えば、図２２の上写真）。エッチングにおける導入ガスの条件は、エッチングＳＦ６ (４５０ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｃ／ｍｉｎ) ３秒、保護Ｃ４Ｆ８(１３５ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｃ／ｍｉｎ) ２秒を６０〜１２０サイクル繰り返した。
【００７９】
なお、このように作製したマイクロピラーアレイから以下のようにナノニードルアレイを作製することができる。すなわち、フォトレジストをアッシャーで除去した後に、マイクロピラーアレイを１１００℃、２０時間の湿潤条件で熱酸化し、酸化層を作製し、その後に、２０％緩衝フッ酸によるウエットエッチングを行い、酸化層を除去した。これによって。直径３００ｎｍ以下、長さ１０ μｍ以上のナノニードルが１０ ｍｍ角に１万本以上配列されたナノニードルアレイを得た（図２３）。作製されたナノニードルアレイは培養細胞に対して接近動作を行った際に効率よく挿入されることが確認されている。
【符号の説明】
【００８０】
１…柱状体、２…ピラーアレイ、１０…ガラス基板、１１…被膜、１２…細胞培養用シャーレ、１３…細胞接着領域、１４…細胞、１５…細胞アレイ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014168450.tif 000010
【図８】
2014168450.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2014168450.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2014168450.tif 000018
【図１６】
2014168450.tif 000019
【図１７】
2014168450.tif 000020
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2014168450.tif 000024
【図２２】
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【図２３】
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