(57)【要約】【課題】植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離する方法、および植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から植物ステロール脂肪酸エステルとトリテルペンアルコール脂肪酸エステルを別々に製造する方法を提供すること。【解決手段】カラムクロマトグラフィーを用いることにより、植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から、植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離することができる。分離した植物ステロールおよびトリテルペンアルコールをそれぞれ脂肪酸エステル化することにより、植物ステロール脂肪酸エステルとトリテルペンアルコール脂肪酸エステルを別々に製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から、植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離する方法であって、カラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とする分離方法。
【請求項２】
植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物が、植物油の精製過程で生じるソープストックまたは脱臭スカム由来であることを特徴とする請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
カラムクロマトグラフィーの担体にシリカゲルを用いることを特徴とする請求項１または２に記載の分離方法。
【請求項４】
カラムクロマトグラフィーの移動相にヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０〜９５:５混液を用いることを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
【請求項５】
植物ステロール脂肪酸エステルおよび／またはトリテルペンアルコール脂肪酸エステルの製造方法であって、
請求項１〜４のいずれかに記載の分離方法を用いて、植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離した後に、植物ステロールおよびトリテルペンアルコールの少なくとも１種を脂肪酸エステル化することを特徴とする製造方法。
【請求項６】
酵素を触媒とするエステル化反応により脂肪酸エステル化することを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
エステル化反応によって発生する水分を減少させながら反応を進行させることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
酵素がリパーゼであることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
リパーゼが、トリテルペンアルコールと植物ステロールの混合物に対して、両者を非特異的にエステル化する性質を持つことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
リパーゼがＣａｎｄｉｄａ属の微生物に由来することを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
植物ステロールとトリテルペンアルコールと脂肪酸の混合物から、植物ステロールを特異的にエステル化する酵素を用いて植物ステロール脂肪酸エステルを生成させ、植物ステロール脂肪酸エステルを分離することを特徴とする植物ステロール脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１２】
酵素が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属およびＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選択される少なくとも１種の微生物に由来するリパーゼであることを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
植物ステロールとトリテルペンアルコールと脂肪酸の混合物から、植物ステロールを特異的にエステル化する酵素を用いて植物ステロール脂肪酸エステルを生成させ、植物ステロール脂肪酸エステルを分離し、未反応のトリテルペンアルコールを取得することを特徴とするトリテルペンアルコールの分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離方法およびこれらの脂肪酸エステルの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ステロール（ｓｔｅｒｏｌ）はステロイド骨格を有し、その基本骨格Ｃ−３位にヒドロキシル基を、Ｃ−１７位に炭化水素側鎖を有する炭素数２７〜３０の化合物の総称である。この中で植物に含まれるものを特に植物ステロールと呼び、植物体に広く分布している。主要なものとしてβ−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロールなどが知られている。
【０００３】
トリテルペンアルコールは米に多く含まれる炭素数３０のステロールの一種であり、植物ステロールに近い構造、性質を持つ。トリテルペンアルコールは、米糠、オリーブ種子、トウモロコシ種子、アロエ等に分布し、主要な化合物としてシクロアルテノール、２４−メチレンシクロアルタノール、シクロアルタノール、シクロブラノールなどが含まれる。これらは米糠の代表的な機能性物質であるγ−オリザノールの部分構造としても知られている。
【０００４】
植物ステロールの主要な生理機能としては、コレステロールの低下作用が知られている。その他にも前立腺肥大による排尿障害の改善、癌細胞の増殖抑制作用、炎症抑制作用などの生理機能が報告されている。一方トリテルペンアルコールの生理機能は植物ステロールの生理機能と似通っているものの、トリテルペンアルコールに固有の生理機能として中性脂肪の低下作用、リパーゼ阻害作用が報告されており、植物ステロールと併用することで、相乗的に脂質の吸収を阻害することが報告されている。
【０００５】
植物ステロールの製造方法としては、植物油の精製過程で生じるソープストックや脱臭スカム等の副産物を原料とし、アセトンやヘキサンなどの溶媒で抽出し、結晶化法により精製する手法が一般的である。ほぼ同様の方法でトリテルペンアルコールも得ることができるが、植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離は困難である。ソープストックや脱臭スカム等の原料から、植物ステロールとトリテルペンアルコールを分離することができれば、それぞれの生理機能を別々に有効利用することが可能になると考えられる。
【０００６】
トリテルペンアルコールの製造方法として工業的に確立された方法はなく、例えばγ−オリザノールを加水分解して得る方法が報告されている（特許文献１〜４）。これらの方法では植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物が高濃度で容易に得られるが、植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離は依然困難である。
【０００７】
ステロールは元来水にも油にも溶け難く、酸化されやすい性質を持つため、脂肪酸とのエステル化を行い、誘導体化することで安定性、汎用性を向上させることができる。またエステル化により、結晶化による分離精製が容易になることも知られている。それゆえ、植物ステロール脂肪酸エステルおよびトリテルペンアルコール脂肪酸エステルは、化粧品、医薬品および食品の重要な原料として用いられており、特に皮膚の保湿作用、老化防止作用、抗炎症作用に優れることから化粧品用途での期待が高まっている（特許文献５）。
【０００８】
植物ステロール脂肪酸エステルは植物ステロールから有機合成により合成されるが、副反応の進行、着色、着臭、触媒除去等の問題点から、現在では酵素合成が検討されている。植物ステロール脂肪酸エステル合成酵素としてはリパーゼ（特許文献６）、コレステロールエステラーゼ（特許文献７、８）を用いた報告がある。リパーゼの起源としてはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属などが報告されている（特許文献６）。コレステロールエステラーゼの起源としてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属他いくつかの微生物由来のコレステロールエステラーゼを用いたステロールエステル製造技術が開示されている（特許文献７、８）。これらの酵素合成法は植物ステロールと遊離脂肪酸を特異的かつ効率的にエステル化反応させるものであるが、これをトリテルペンアルコールに適用した例は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−４１３０４号公報
【特許文献２】特公昭５５−２４４０号公報
【特許文献３】特開２００６−２７３７６４号公報
【特許文献４】特開平０５−３３１１０１号公報
【特許文献５】特開２００６−１７６４２２号公報
【特許文献６】特開２００１−０４０３８８号公報
【特許文献７】特開２００９−５５８１９号公報
【特許文献８】特公平０５−３３７１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離する方法、および植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から植物ステロール脂肪酸エステルとトリテルペンアルコール脂肪酸エステルを別々に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から、植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離する方法であって、カラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とする分離方法。
［２］植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物が、植物油の精製過程で生じるソープストックまたは脱臭スカム由来であることを特徴とする前記［１］に記載の分離方法。
［３］カラムクロマトグラフィーの担体にシリカゲルを用いることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の分離方法。
［４］カラムクロマトグラフィーの移動相にヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０〜９５:５混液を用いることを特徴とする前記［３］に記載の分離方法。
［５］植物ステロール脂肪酸エステルおよび／またはトリテルペンアルコール脂肪酸エステルの製造方法であって、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の分離方法を用いて、植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離した後に、植物ステロールおよびトリテルペンアルコールの少なくとも１種を脂肪酸エステル化することを特徴とする製造方法。
［６］酵素を触媒とするエステル化反応により脂肪酸エステル化することを特徴とする前記［５］に記載の製造方法。
［７］エステル化反応によって発生する水分を減少させながら反応を進行させることを特徴とする前記［６］に記載の製造方法。
［８］酵素がリパーゼであることを特徴とする前記［６］または［７］に記載の製造方法。
［９］リパーゼが、トリテルペンアルコールと植物ステロールの混合物に対して、両者を非特異的にエステル化する性質を持つことを特徴とする前記［８］に記載の製造方法。
［１０］リパーゼがＣａｎｄｉｄａ属の微生物に由来することを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１１］植物ステロールとトリテルペンアルコールと脂肪酸の混合物から、植物ステロールを特異的にエステル化する酵素を用いて植物ステロール脂肪酸エステルを生成させ、植物ステロール脂肪酸エステルを分離することを特徴とする植物ステロール脂肪酸エステルの製造方法。
［１２］酵素が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属およびＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選択される少なくとも１種の微生物に由来するリパーゼであることを特徴とする前記［１１］に記載の製造方法。
［１３］植物ステロールとトリテルペンアルコールと脂肪酸の混合物から、植物ステロールを特異的にエステル化する酵素を用いて植物ステロール脂肪酸エステルを生成させ、植物ステロール脂肪酸エステルを分離し、未反応のトリテルペンアルコールを取得することを特徴とするトリテルペンアルコールの分離方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離することができ、また、植物ステロール脂肪酸エステルとトリテルペンアルコール脂肪酸エステルを別々に製造することができる。別々に得られた植物ステロールおよびトリテルペンアルコール、またはそれらの脂肪酸エステルを用いれば、それぞれの生理機能を別々に有効利用することできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物から、シリカゲルクロマトグラフィーを用いてＰＳとＴＡとを分離したＲＩクロマトグラムを示す図である。
【図２】ＴＡのエステル化反応における各種リパーゼの添加量とＴＡエステル生成量を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
〔植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離方法〕
本発明の植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離方法は、植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物からカラムクロマトグラフィーを用いて植物ステロールとトリテルペンアルコールとを分離する方法である。
植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物は特に限定されず、植物ステロールとトリテルペンアルコールの両方を含んでいるものであればよい。植物ステロールおよびトリテルペンアルコールの２成分のみからなるものでもよく、これら以外の成分を含んでいるものでもよい。
【００１５】
植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物は、植物油の精製過程で生じるソープストックまたは脱臭スカム由来であることが好ましい。ソープストックはアルカリフーツまたはアルカリ油滓とも称される。脱臭スカムは脱臭留出物とも称される。いずれも、植物油の精製過程で副産物として得られるものであり、植物ステロールおよびトリテルペンアルコールを豊富に含むことが知られている。ソープストックまたは脱臭スカムは、そのままカラムクロマトグラフィーに供してもよいが、これらを原料として、精製操作を経た植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物をカラムクロマトグラフィーに供することが好ましい。精製操作は特に限定されず公知の精製方法を用いることができる。精製操作を経た植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物としては、例えばソープストックから結晶化処理などによって得られる粗γ−オリザノールの加水分解物などが挙げられる。
【００１６】
カラムクロマトグラフィーの種類は特に限定されず、例えば、オープンカラムクロマトグラフィー、フラッシュカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等が挙げられる。カラムクロマトグラフィーに用いられる担体は特に限定されず、例えばシリカゲル、ＯＤＳゲル、疎水性樹脂、イオン交換樹脂等が挙げられる。好ましくはシリカゲルである。カラムの径および長さ、担体量は、供する植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物の種類や不純物の量に応じて適宜最適化することができる。
【００１７】
移動相は特に限定されず、用いる担体および供する植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物の種類に応じて適宜最適化することができる。担体がシリカゲルの場合には、シリカゲルクロマトグラフィーに一般に使用される移動相を用いることができる。例えば、ヘキサン／酢酸エチル混合液、クロロホルム／メタノール混合液、トルエンなどが挙げられる。好ましくはヘキサン／酢酸エチル混合液であり、混合比率はヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０〜９５:５が好ましく、より好ましくはヘキサン：酢酸エチル＝８０：２０〜９５:５であり、さらに好ましくはヘキサン：酢酸エチル＝８５：１５〜９５:５である。担体がＯＤＳゲルの場合には、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類の混合物、アルコールと水の混合物などを移動相として用いることができる。
その他のカラムクロマトグラフィーの条件は特に限定されず、公知のカラムクロマトグラフィーの条件を、適宜選択して組み合わせることにより適切な条件を設定することができる。
【００１８】
検出器は植物ステロールおよびトリテルペンアルコールを検出できるものであれば特に限定されない。具体的には、示差屈折率（ＲＩ）検出器、紫外／可視光（ＵＶ／ＶＩＳ）検出器、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）などが挙げられる。中でも、示差屈折率（ＲＩ）検出器を用いることが好ましい。
植物ステロールおよびトリテルペンアルコールは、それぞれのピーク検出時の画分を分取することにより分離して取得することができる。
【００１９】
〔脂肪酸エステルの製造方法〕
本発明は、植物ステロール脂肪酸エステルおよび／またはトリテルペンアルコール脂肪酸エステルの製造方法（以下、「本発明の製造方法」と記す。）を提供する。
本発明の製造方法は、上記本発明の植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離方法により分離した植物ステロールおよびトリテルペンアルコールを別々に脂肪酸エステル化する方法である。本発明の製造方法には、分離した植物ステロールおよびトリテルペンアルコールのいずれか１種のみを脂肪酸エステル化する方法も含まれる。植物ステロールまたはトリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステル化の方法は特に限定されず、例えば、酸またはアルカリ等の化学触媒を使用する化学合成法、酵素を触媒として用いる酵素合成法等の公知の合成法を用いることができる。好ましくは酵素を触媒として用いる酵素合成法である。
【００２０】
脂肪酸は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれでもよく、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が挙げられる。直鎖脂肪酸および分岐脂肪酸のいずれを用いてもよいが、好ましくは直鎖脂肪酸である。脂肪酸は、動物由来および植物由来のいずれでもよいが、好ましくは植物由来である。植物ステロールまたはトリテルペンアルコールと脂肪酸との比率は特に限定されないが、モル比が植物ステロールまたはトリテルペンアルコール：脂肪酸＝１：０．５〜１０が好ましい。
【００２１】
酵素は、植物ステロールまたはトリテルペンアルコールと脂肪酸とのエステル化反応を触媒できる酵素であれば特に限定されない。このような酵素として、例えば、リパーゼ、コレステロールエステラーゼなどが知られており、本発明の製造方法において好適に用いることができる。これらの酵素の起源としては、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属等の微生物が挙げられるが、これらに限定されない。なかでも本発明の製造方法で使用する酵素としては、トリテルペンアルコールのエステル化効率が優れている点で、Ｃａｎｄｉｄａ属の微生物に由来するリパーゼを用いることが好ましい。Ｃａｎｄｉｄａ属のなかでも、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼがより好ましく、ＳＩＧＭＡ社製のＣａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼ（Ｔｙｐｅ ＶＩＩ、製品番号Ｌ１７５４−１００Ｇ）またはこれと同等の活性を有するリパーゼがさらに好ましい。なお、ＳＩＧＭＡ社製のＣａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼはＴｙｐｅ ＶＩＩであり、３種類のアイソザイムを含むことが報告されている（Ｒ．Ｃ．ＣＨＡＮＧ， ｅｔ ａｌ., Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ ｌｉｐａｓｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．１９，９３−９７（１９９４））。
【００２２】
酵素の添加量、反応温度、反応時間等の条件は、用いる酵素に応じて適宜設定することができる。例えばＣａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼを用いる場合、通常、植物ステロールまたはトリテルペンアルコール１ｇ当たり１０〜５０００単位（ただし、単位は、オリーブ油の加水分解において１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸生じる酵素量である。）の酵素を添加し、２０℃〜５０℃で３０分〜４８時間反応させればよい。
【００２３】
酵素を触媒とするエステル化反応において、エステル化反応によって発生する水分を減少させながら反応を進行させることが好ましい。これにより、反応系におけるエステル合成とエステル分解が平衡に達してエステル化の効率が低下することを防止することができる。エステル化反応によって発生する水分を減少させながら反応を進行させる方法は特に限定されず、反応の途中で反応液を静置して分離した水を除去して反応を続ける方法、反応の途中で遠心分離を行い分離した水を除去して反応を続ける方法、脱水剤を添加する方法、減圧条件下で脱水しながら反応を進行させる方法、これらの２つ以上を組み合わせる方法などが挙げられる。好ましくは、減圧条件下で脱水しながら反応を進行させる方法である。減圧条件としては、例えば０．１ｋＰａ〜１０ｋＰａが好ましい。エステル化反応の開始時から水分を減少させながら反応を進行させてもよく、エステル化反応の途中から水分を減少させながら反応を進行させてもよい。エステル化反応の途中から行う場合には、エステル化反応が平衡に達した後に開始することが好ましい。
【００２４】
反応液からの植物ステロール脂肪酸エステルまたはトリテルペンアルコール脂肪酸エステルの分離方法は特に限定されない。例えば、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、分子蒸留、短行程蒸留、溶剤分別、液液抽出などが挙げられる。好ましくはカラムクロマトグラフィーである。
【００２５】
〔選択的植物ステロール脂肪酸エステルの製造方法およびトリテルペンアルコールの分離方法〕
本発明の選択的植物ステロール脂肪酸エステルの製造方法は、植物ステロールとトリテルペンアルコールと脂肪酸の混合物から、植物ステロールを特異的にエステル化する酵素を用いて植物ステロール脂肪酸エステルを生成させ、植物ステロール脂肪酸エステルを分離することを特徴とする。植物ステロールとトリテルペンアルコールと脂肪酸の混合物は、植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物に脂肪酸を添加することにより調製することができる。植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物は、上記「植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離方法」に用いられる植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物を好適に用いることができる。植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物と脂肪酸との比率は特に限定されないが、モル比が植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物：脂肪酸＝１：１〜５が好ましい。
【００２６】
植物ステロールを特異的にエステル化する酵素は、植物ステロールとトリテルペンアルコールと脂肪酸の混合物に作用させた場合に、以下の式
（ＰＳ選択率）＝（ＰＳエステル量）／［（ＰＳエステル量）＋（ＴＡエステル量）］
で求められるＰＳ選択率（植物ステロール選択率）が０．８０以上であることが好ましく、０．９０以上であることがより好ましく、０．９５以上であることがさらに好ましく、０．９８以上であることがさらに好ましい。
このような酵素として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の微生物に由来するリパーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の微生物に由来するリパーゼまたはＣａｎｄｉｄａ属の微生物に由来するリパーゼを好適に用いることができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉが好ましく、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の微生物としては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉが好ましく、Ｃａｎｄｉｄａ属の微生物としてはＣａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａが好ましい。Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼのなかでも名糖産業社製のリパーゼＯＦまたはこれと同等の活性を有するリパーゼがより好ましい。なお、名糖産業社製のリパーゼＯＦは、１種類のアイソザイムのみを含むことが報告されている（Ｒ．Ｃ．ＣＨＡＮＧ，ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ ｌｉｐａｓｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．１９，９３−９７（１９９４））。
【００２７】
酵素の添加量、反応温度、反応時間等の条件は、用いる酵素に応じて適宜設定することができる。通常、植物ステロールとトリテルペンアルコールの混合物１ｇ当たり１０〜３０００単位（ただし、単位はオリーブ油の加水分解において１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸生じる酵素量である。）の酵素を添加し、１０℃〜４０℃で３０分〜４８時間反応させればよい。
【００２８】
生成した植物ステロール脂肪酸エステルを反応液から分離することにより、未反応のトリテルペンアルコールを取得することができる。すなわち、本発明は、植物ステロール植物ステロールとトリテルペンアルコールと脂肪酸の混合物からトリテルペンアルコールを分離する方法を提供する。生成した植物ステロール脂肪酸エステルを反応液から分離する方法としては、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、分子蒸留、短行程蒸留、溶剤分別、液液抽出などが挙げられる。好ましくは、カラムクロマトグラフィーである。植物ステロール脂肪酸エステルを分離した反応液中には、未反応のトリテルペンアルコールおよび脂肪酸が残っている。この反応液を用いて、トリテルペンアルコール脂肪酸エステルを合成することができる。このとき用いる酵素は、トリテルペンアルコールのエステル化効率が優れている酵素を用いることが好ましい。このような酵素としては、Ｃａｎｄｉｄａ属の微生物に由来するリパーゼが好ましく、なかでも、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼがより好ましい。ＳＩＧＭＡ社製のＣａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼ（Ｔｙｐｅ ＶＩＩ、製品番号Ｌ１７５４−１００Ｇ）またはこれと同等の活性を有するリパーゼがさらに好ましい。
【００２９】
植物ステロール脂肪酸エステルを分離した反応液からトリテルペンアルコールを分離することも可能である。植物ステロール脂肪酸エステルを分離した反応液からトリテルペンアルコールを分離する方法としては、植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離方法と同様にカラムクロマトグラフィーを用いる方法が挙げられる。分離したトリテルペンアルコールはそのまま使用してもよく、脂肪酸と反応させてトリテルペンアルコール脂肪酸エステルとして使用してもよい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
〔実施例１：植物ステロールとトリテルペンアルコールの分離〕
植物ステロール（以下「ＰＳ」と記す）とトリテルペンアルコール（以下「ＴＡ」と記す）の混合物から、シリカゲルクロマトグラフィーを用いてＰＳとＴＡとの分離を試みた。
γ−オリザノールの加水分解によって得られたＰＳ／ＴＡ混合物８．０ｇをアセトン４０ｍＬに溶解し、ワコーゲルＣ−２００（商品名、和光純薬）に吸着させた。ロータリーエバポレータでアセトンを除去し、ヘキサン／酢酸エチル＝９／１（ｖ／ｖ）に懸濁してガラスカラム（１５×１５０ｍｍ）に充填した。カラムをＵＬＴＲＡ ＰＡＣＫ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｌｕｍｎ（シリカゲル、３７×３００ｍｍ、山善）に接続し、ヘキサン／酢酸エチル＝９／１（ｖ／ｖ）を１４ｍＬ／ｍｉｎで通液して、ＲＩ検出器を用いてピーク検出時の画分を三角フラスコに分取した。
【００３２】
得られたＲＩクロマトグラムを図１に示した。図１から明らかなように、ＰＳとＴＡを分離することができた。各画分をＴＬＣ分析した後、同一物質のみを含む画分を合一し、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を除去することで、ＰＳおよびＴＡを得た。ＰＳの収量は３．０ｇで純度６６％であり、ＴＡの収量は４．５ｇで純度９７％であった。なお、ＴＬＣ分析にはＴＬＣ用シリカゲルアルミシート（メルク、東京）を使用し、展開溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝７／３（ｖ／ｖ）を用い、５０％硫酸エタノール溶液の噴霧後にホットプレートで加熱して発色した。
【００３３】
〔実施例２：リパーゼによるエステル化反応および反応液からのエステルの分離〕
実施例１で得られたＰＳまたはＴＡとオレイン酸を、それぞれ１：２．５のモル比となるように混合し、同重量の酵素（リパーゼ）溶液（Candida rugosa、SIGMA (Type VII、製品番号L-1754-100G)；5000 U/mL）を加えて３０℃で攪拌した。反応が平衡に達した後（反応率７５％）、ダイヤフラム型真空ポンプＤＩＶＡＣ ０．６Ｌ（東京理化器械）を用いて２．１ｋＰａで減圧しながら反応し、減圧せずに常圧下で反応したものと比較したところ、常圧下で反応したものは反応率に変化がなかったが、減圧下で反応したものは反応率が８９％に改善した。この結果から、リパーゼによるエステル化反応の効率を向上させるためには、減圧下で脱水しながら反応することが好ましいことがわかった。
【００３４】
常圧での反応で得られた反応液から未反応のオレイン酸を１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液を用いて除去した。次に、試料をシリカゲルカラムＵＬＴＲＡ Ｐａｃｋ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｌｕｍｎ（300 mm×37 mm i.d.）に負荷し、移動相にヘキサン／酢酸エチル＝９／１（ｖ／ｖ）を用いて溶出させることで未反応のＰＳおよびＴＡを除去した。得られたエステル画分をＨＰＬＣ分取カラム（COSMOSIL Cholester；250×10 mm i.d.、ナカライテスク）でさらに分離・精製した。移動相にはメタノール：イソプロピルアルコール＝１：１（ｖ／ｖ）を用い、流量は５ｍＬ／ｍｉｎとした。保持時間７０〜１２０ｍｉｎまで２．５ｍｉｎ毎に分取し、各画分をＴＬＣにて分析した。そして、同一物質のみを含む画分を合一した。ＴＬＣ分析は実施例１と同様に行った。
常圧下で反応した場合、２７ｇの反応液からＰＳエステル６．１ｇ、ＴＡエステル３．０ｇが得られた。
【００３５】
〔実施例３：ＴＡのエステル化反応に適した酵素の検討〕
ＴＡとオレイン酸を１：２．５のモル比となるように混合し、リパーゼ添加量を５０〜２０００Ｕの範囲で５〜７段階に設定し、実施例２と同様に、反応が平衡に達した後２．１ｋＰａで減圧しながら反応した。リパーゼとして、リパーゼ（Candida rugosa、SIGMA、Type VII、製品番号L1754-100G）、リパーゼＴＬ（Pseudomonas stutzeri、名糖産業）、リパーゼＳＬ（Pseudomonas cepacia、名糖産業）、およびリパーゼＡ「アマノ」６（Aspergillus niger、天野エンザイム）の４種類を用いた。反応液中のＴＡエステルの生成量は、実施例２と同様の方法で測定した。
【００３６】
結果を図２に示した。リパーゼ（Candida rugosa、SIGMA、Type VII、製品番号L1754-100G）を用いた場合、酵素量の増加とともにＴＡエステルの生成量の生成量が増加した。一方、他の３種のリパーゼを用いた場合には、酵素量の増加とともに反応液の流動性が低下して反応効率が低下することが明らかとなり、結果として十分にエステル化反応を進行させることができなかった。この結果から、ＴＡのエステル化に用いるリパーゼとして、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼが適していることが明らかとなった。
【００３７】
〔実施例４：ＰＳの選択的エステル化反応に適した酵素の検討〕
１０ｍＬ容バイアル瓶にＰＳ／ＴＡ混合物０．７５ｇおよびオレイン酸１．２５ｇ（モル比１：５）を加えた後、以下の各酵素水溶液を２ｍＬ添加した。３０℃で２４時間反応し、反応液をＨＰＬＣで分析した。酵素には、リパーゼＳＬ（Pseudomonas cepacia、名糖産業）、リパーゼＴＬ（Pseudomonas stutzeri、名糖産業）、リパーゼＧ「アマノ」５０（Penicillium camembertii、アマノエンザイム）、リパーゼ（Candida rugosa、SIGMA、Type VII、製品番号L-1754-100G）およびリパーゼＯＦ（Candida rugosa、名糖産業）の５種類を使用した。酵素量は、リパーゼＳＬおよびリパーゼ（Candida rugosa、SIGMA、Type VII、製品番号L-1754-100G）が２０Ｕ、５０Ｕ、１００Ｕ、２００Ｕ、５００Ｕ、１０００Ｕおよび２０００Ｕの７段階、リパーゼＴＬが５０Ｕ、１００Ｕ、２００Ｕ、５００Ｕ、１０００Ｕおよび２０００Ｕの６段階、リパーゼＧ「アマノ」５０およびリパーゼＯＦが１００Ｕ、２００Ｕ、５００Ｕ、１０００Ｕおよび２０００Ｕの５段階とした。
【００３８】
表１に用いた各酵素のＰＳ選択率を示した。ＰＳ選択率は以下の式で求めた。
（ＰＳ選択率）＝（ＰＳエステル量）／［（ＰＳエステル量）＋（ＴＡエステル量）］
表１から明らかなように、リパーゼＧ「アマノ」５０とリパーゼＯＦは、１００Ｕ〜２０００Ｕのいずれの酵素量においてもＰＳ選択率が１であった。リパーゼＳＬは酵素量２０００ＵまでＰＳ選択率が１に近く、高いＰＳ選択性を示した。リパーゼＴＬもリパーゼＳＬにはやや劣るものの高いＰＳ選択性を示した。一方、リパーゼ（Candida rugosa、Type VII、製品番号、L-1754-100G）は酵素量の増加に伴いＰＳ選択率が低下した。この結果から、ＰＳエステルの選択的合成には、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ由来のリパーゼ（リパーゼＧ「アマノ」５０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼ（リパーゼＳＬ）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来のリパーゼ（リパーゼＴＬ）およびＣａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼ（リパーゼＯＦ）が適していることが示された。一方、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼの場合、メーカーや成分によってはＰＳの選択率合成に適さないものがあることが判明した。
【００３９】
したがって、ＰＳ選択性の高い酵素を用いれば、ＰＳ／ＴＡ混合物からＰＳエステルを選択的に酵素合成し、ＰＳエステルを結晶化等により分離し、未反応のＴＡを蒸留等により取得することが可能となる。さらに、取得したＴＡをリパーゼによりエステル化し、ＰＳエステルが混在していないＴＡエステルの製造が可能となる。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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