(57)【要約】【課題】微小粒子を複数の蛍光色素で修飾した場合でも、各色素から発せられる蛍光を精度よく検出することができる微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法を提供する。【解決手段】異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部を備える微小粒子分析装置に、光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部を設け、この光源駆動制御部により、各光源に第１の電流を供給すると共に、第１の電流を供給している間に第２の電流を光源毎に時分割で供給することにより、微小粒子に波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する。【選択図】図１
2014115121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子に前記レーザ光を照射する光照射部と、
前記光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部と、を有し、
前記光源駆動制御部は、各光源に第１の電流を供給すると共に、前記第１の電流を供給している間に第２の電流を光源毎に時分割で供給する微小粒子分析装置。
【請求項２】
前記第１の電流は、前記第２の電流よりも大きい請求項１に記載の微小粒子分析装置。
【請求項３】
前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、前記第１の電流の供給を制御する第１電流制御部と、前記第２の電流の供給を制御する第２電流制御部が設けられている請求項１に記載の微小粒子分析装置。
【請求項４】
前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、オートパワーコントロール回路と、駆動回路とが設けられている請求項１に記載の微小粒子分析装置。
【請求項５】
更に、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する光検出部を有し、
該光検出部は、少なくとも、
前記微小粒子から発せられた光を波長分離する分光光学系と、
前記分光光学系により分離された光を検出する複数の光検出器と
を備える請求項１に記載の微小粒子分析装置。
【請求項６】
前記光検出部には、前記光検出器毎に、検出信号の取得を制御する検出回路が設けられている請求項５に記載の微小粒子分析装置。
【請求項７】
前記検出回路は、補正モードと測定モードとを切り替えるスイッチを備える請求項６に記載の微小粒子分析装置。
【請求項８】
前記光源駆動制御部に設けられた複数のオートパワーコントロール回路と、前記光検出部に設けられた複数の検出回路に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路を備える請求項５に記載の微小粒子分析装置。
【請求項９】
複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する光照射工程を有し、
各光源に第１の電流を供給すると共に、前記第１の電流を供給している間に第２の電流を光源毎に時分割で供給することにより、前記微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する微小粒子分析方法。
【請求項１０】
前記第１の電流を、前記第２の電流よりも大きくする請求項９に記載の微小粒子分析方法。
【請求項１１】
前記第１の電流の供給と、前記第２の電流の供給を、個別に独立して制御する請求項９に記載の微小粒子分析方法。
【請求項１２】
前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を波長分離する分光工程と、
複数の光検出器により前記分光工程により分離された光を検出する検出工程と、
を有する請求項９に記載の微小粒子分析方法。
【請求項１３】
前記光源の発光と前記光検出器の検出を同期させる請求項１２に記載の微小粒子分析方法。
【請求項１４】
前記検出工程により検出された蛍光データを、予め検出されたオフセットデータに基づいて補正を行う請求項１２に記載の微小粒子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、微小粒子などの試料を光学的に検出する微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法に関する。より詳しくは、複数の光源を用いた微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子の識別には、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている。このフローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する分析手法である。
【０００３】
また、近年、微小粒子を複数の蛍光色素で修飾し、各色素から発せられる蛍光を分離検出することで、各微小粒子について複数の情報を得るマルチカラー分析も行われている。このマルチカラー分析に対応するため、従来、流路を通流する微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を照射し、微小粒子から発せられる複数波長の蛍光を検出可能にしたフローサイトメーターが提案されている（例えば、特許文献１〜３参照。）。
【０００４】
図１６は特許文献１に記載の従来のフローサイトメーターの構成を模式的に示す図である。図１６に示すように、特許文献１に記載のフローサイトメーター１０１は、主に、フロー系１０２と、光学系１０３と、信号処理装置１０４とで構成されている。そして、蛍光色素で修飾された細胞１０５をフロー系１０２のフローセル内で１列に配列し、光学系１０３により各細胞１０５に波長の異なる複数のレーザ光を照射する。
【０００５】
その際、変調器を内蔵する光源１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃから、互いに異なる波長を有する複数のレーザ光を、所定の周期及び互いに異なる位相で出射する。これら複数のレーザ光は、導光部材１０７により同一の入射光路上に導光され、細胞１０５に集光される。そして、細胞１０５から発せられた散乱光や蛍光は、ハーフミラーやバンドパスフィルターなどにより波長毎に分離された後、各ＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）で検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−４６９４７号公報
【特許文献２】特開２００９−２７０９９０号公報
【特許文献３】特開２０１０−２８６３８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来のフローサイトメーターには、各検出器に目的以外の蛍光色素からの蛍光が漏れ込むことがあるため、精度よく分析を行うためには、蛍光が重なり合った部分を差し引く蛍光補正を行う必要がある。蛍光の漏れ込みの問題は、特許文献２に記載の測定方法のように、励起スペクトラムが重複しない色素を使用することにより解消するが、そうすると、選択できる色素が限定されてしまう。
【０００８】
一方、特許文献１に記載のフローサイトメーターは、複数のレーザ光を所定の周期及び互いに異なる位相で出射しているが、この方法では、各レーザが点灯と消灯を交互に繰り返し行うため、発光遅れ現象や発光後の緩和振動が発生する。例えば、数百ＭＨｚの周波数で発光と消灯を繰り返すと、この発光と消灯の繰り返しにより生じる発光遅れ時間は数ｎｓ程度に達することがあり、必要なタイミングでレーザを発光させることができなくなる。特に、点灯と消灯を高速で切り替える場合には、波形制御が極めて難しくなる。また、レーザ緩和振動現象が生じると、波高値が一定でなくなるため、変動した値を検出する可能性があり、その場合、測定値の精度が低下する。
【０００９】
そこで、本開示は、微小粒子を複数の蛍光色素で修飾した場合でも、各色素から発せられる蛍光を精度よく検出することができる微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示に係る微小粒子分析装置は、異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子に前記レーザ光を照射する光照射部と、前記光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部と、を有し、前記光源駆動制御部は、各光源に第１の電流を供給すると共に、前記第１の電流を供給している間に第２の電流を光源毎に時分割で供給する。
この微小粒子分析装置では、前記第１の電流を、前記第２の電流よりも大きくすることができる。
また、前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、前記第１の電流の供給を制御する第１電流制御部と、前記第２の電流の供給を制御する第２電流制御部が設けられていてもよい。
更に、前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、オートパワーコントロール回路と、駆動回路とが設けられていてもよい。
一方、本開示の微小粒子分析装置は、少なくとも、前記微小粒子から発せられた光を波長分離する分光光学系と、前記分光光学系により分離された光を検出する複数の光検出器とを備え、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する光検出部を有していてもよい。
この光検出部には、前記光検出器毎に、検出信号の取得を制御する検出回路が設けられていてもよい。
その場合、検出回路は、補正モードと測定モードとを切り替えるスイッチを備えていてもよい。
また、前記光源駆動制御部に設けられた複数のオートパワーコントロール回路と、前記光検出部に設けられた複数の検出回路に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路を設けることもできる。
【００１１】
本開示に係る微小粒子分析方法は、複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する光照射工程を有し、各光源に第１の電流を供給すると共に、前記第１の電流を供給している間に第２の電流を光源毎に時分割で供給することにより、前記微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する。
この微小粒子分析方法では、前記第１の電流を、前記第２の電流よりも大きくしてもよい。
また、前記第１の電流の供給と、前記第２の電流の供給を、個別に独立して制御することもできる。
更に、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を波長分離する分光工程と、複数の光検出器により前記分光工程により分離された光を検出する検出工程と、を有していてもよい。
その場合、前記光源の発光と前記光検出器の検出を同期させることができる。
また、検出工程により検出された蛍光データを、予め検出されたオフセットデータに基づいて補正を行ってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本開示によれば、緩和振動や発光遅れを防止しつつ、検出光の相互干渉を抑制することができるため、各色素から発せられる蛍光を精度よく検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本開示の第１の実施形態の微小粒子分析装置の構成を示すブロック図である。
【図２】図１に示す微小粒子分析装置１の全体回路図である。
【図３】図１に示すＡＰＣ回路部の構成を示すブロック図である。
【図４】図１に示す駆動回路部の構成を示すブロック図である。
【図５】図４に示す駆動回路部の回路図である。
【図６】図１に示す検出回路部の構成を示すブロック図である。
【図７】各光源の発光パターンを示す図である。
【図８】タイミング信号のパターンを示す図である。
【図９】検出信号とサンプルホールドのタイムチャートである。
【図１０】Ａは本開示の実施形態の微小粒子分析方法により得た蛍光スペクトルであり、Ｂは従来の方法で得た蛍光スペクトルである。
【図１１】Ａは本開示の第１の実施形態の微小粒子分析装置におけるレーザ発光波形を示す図であり、Ｂは従来の装置におけるレーザの発光波形を示す図である。
【図１２】本開示の第１の実施形態の変形例の微小粒子分析装置の構成を示すブロック図である。
【図１３】本開示の第２の実施形態の微小粒子分析装置における検出回路部の構成を示すブロック図である。
【図１４】Ａは通常測定時の光源の発光パターンを示す図であり、Ｂはそのときの蛍光スペクトルである。
【図１５】Ａは補正値取得時の光源の発光状態を示す図であり、Ｂはそのときの蛍光スペクトルである。
【図１６】特許文献１に記載の従来のフローサイトメーターの構成を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本開示を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本開示は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
（レーザ光を時分割照射する微小粒子分析装置の例）
２．第１の実施の形態の変形例
（蛍光用の対物レンズユニットを備える微小粒子分析装置の例）
３．第２の実施の形態
（補正機能を備える微小粒子分析装置の例）
【００１５】
＜１．第１の実施の形態＞
［全体構成］
先ず、本開示の第１の実施形態の微小粒子分析装置について説明する。図１は本実施形態の微小粒子分析装置の構成を示すブロック図であり、図２はその全体回路図である。図１に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置１には、サンプル流内を１列になって通流する微小粒子１０に、レーザ光を照射する光照射部２と、光照射部２の各光源の発光を制御する光源駆動制御部３とが設けられている。
【００１６】
この微小粒子分析装置１は、レーザ光が照射された微小粒子１０から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部４を備えており、また、必要に応じて散乱光を検出する散乱光検出部５など蛍光以外の光を検出するその他の光検出部が設けられていてもよい。
【００１７】
［光照射部２］
光照射部２には、例えば、励起光となるレーザ光を発生する光源ユニット２１と、光源ユニット２１で発生したレーザ光を微小粒子１０に向けて集光する対物レンズユニット２３とが設けられている。光源ユニット２１には、それぞれ異なる波長のレーザ光を発生する複数の光源が設けられており、各光源から出射されたレーザ光は、ミラーやレンズなどを用いて集光され、光ファイバ２２により対物レンズユニット２３に導光される。
【００１８】
［光源駆動制御部３］
光源駆動制御部３は、光源ユニット２１に設けられた各光源の発光を制御するものであり、例えば、光源毎に、オートパワーコントロール（ＡＰＣ）回路部ＡＰＣ１〜ＡＰＣ４と駆動回路部Ｄ１〜Ｄ４とが設けられている。
【００１９】
図３はＡＰＣ回路部の構成を示すブロック図である。図３に示すように、各ＡＰＣ回路部ＡＰＣ１〜ＡＰＣ４には、ピーク信号及び振幅信号それぞれについて、検波回路、差動増幅回路、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路及びローパスフィルター（ＬＰＦ）回路が設けられている。また、各ＡＰＣ回路部ＡＰＣ１〜ＡＰＣ４は、ピーク電流及びボトム電流を独立して制御可能な構成となっている。
【００２０】
一方、図４は駆動回路部の構成を示すブロック図であり、図５は回路図である。図４に示すように、各駆動回路部Ｄ１〜Ｄ４には、電圧電流変換回路と、電流スイッチと、レーザ駆動回路とが設けられている。そして、図５に示すように、レーザ駆動回路の電流スイッチは、エミッタ結合回路の片方のトランジスタをカスコード接続し、このコレクタに、トランジスタＱ４のコレクタを接続した構成となっている。
【００２１】
なお、図１にはＡＰＣ回路部及び駆動回路部を４個ずつ設けた場合の構成を示しているが、本開示はこれに限定されるものではなく、ＡＰＣ回路部及び駆動回路部の数は、光源の数に応じて適宜変更することができる。
【００２２】
［光検出部］
蛍光検出部４は、微小粒子１０から発せられた蛍光を波長分離する分光ユニット４１と、分光ユニット４１により分離された蛍光を検出する複数の光検出器（図示せず）などを備えている。この蛍光検出部４の分光ユニット４１は、波長フィルタやミラーなどを備えており、検出対象の波長のみが光検出器に入射する構成となっている。
【００２３】
一方、散乱光検出部５は、微小粒子１０から発せられた散乱光を集光する集光レンズユニット５１と、集光された散乱光を検出する光検出器（図示せず）などを備えている。この散乱光検出部５の集光レンズユニット５１は、例えば集光レンズやミラーなどで構成されており、微小粒子１０からの散乱光を光検出器に向けて集光する。
【００２４】
ここで、蛍光検出部４及び散乱光検出部５に設ける光検出器は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）やＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）などを使用することができる。
【００２５】
更に、蛍光検出部４及び散乱光検出部５には、光検出器毎に検出信号の取得を制御する検出回路部Ｓ１〜Ｓ６が設けられている。図６は検出回路部の構成を示すブロック図である。図６に示すように、各検出回路部Ｓ１〜Ｓ６には、電流電圧変換アンプと、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路と、ローパスフィルタ回路と、アナログ−デジタル変換回路（ＡＤＣ）がこの順に配置されている。
【００２６】
また、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路には、検出する蛍光（励起光を出射するレーザ）を選択する切り替えスイッチ（ＭＰＸ）が接続されており、アナログ−デジタル変換回路（ＡＤＣ）には、サンプルクロックが入力される。そして、本実施形態の微小粒子分析装置１では、ユーザが、検出対象の蛍光体と、使用する検出回路部Ｓ１〜Ｓ６のチャネルとの組合せを自由に変更できるように、光源選択信号は、情報処理装置などによって制御可能となっている。
【００２７】
［タイミング発生回路６］
本実施形態の微小粒子分析装置１には、光源駆動制御部３に設けられたＡＰＣ回路部ＡＰＣ１〜ＡＰＣ４と、光検出部４に設けられた検出回路部Ｓ１〜Ｓ６に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路が設けられていてもよい。
【００２８】
タイミングが必要な信号は、光源のＯＮ／ＯＦＦと、検出回路部Ｓ１〜Ｓ６のサンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路を制御する信号の２種類である。そこで、タイミング発生回路６では、各光源を順次間欠的に点灯させるためのタイミング信号と、検出信号を取得させるためのタイミング信号とを生成する。
【００２９】
［動作］
次に、微小粒子分析装置１の動作、即ち、本実施形態の微小粒子分析装置１を使用して微小粒子１０を分析する方法について説明する。本実施形態の微小粒子分析方法では、複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する。その際、各光源に第１の電流を供給すると共に、前記第１の電流を供給している間に第２の電流を光源毎に時分割で供給することにより、微小粒子１０に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する。
【００３０】
ここで、本実施形態の微小粒子分析方法において測定される「微小粒子１０」には、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、又はラテックス粒子、ゲル粒子及び工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれる。
【００３１】
そして、生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれる。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。この生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
【００３２】
一方、工業用粒子としては、例えば有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成されたものが挙げられる。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどを使用することができる。また、無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用することができる。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用することができる。なお、これら微小粒子の形状は、一般には球形であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【００３３】
本実施形態の微小粒子測定装置１においては、タイミング発生回路６によって各光源の発光タイミングを制御する。そして、流路を通流する微小粒子１０が、レーザ光照射領域に入ると、光の拡散及び蛍光体によるレーザ光の波長変換を起こす。蛍光体は、特定の波長の光が照射されると蛍光体特有の波長スペクトルを持った光を放つ。
【００３４】
このとき、検出回路部Ｓ１〜Ｓ６は、特定の光源が発光しているときにのみ検出信号を取得し、検出対象外の光源が発光している際には、それまでに取得した信号レベルを維持する。この信号は、ローパスフィルタ（ＬＰＦ）回路を介すことによって、サンプリング周波数成分が除去され、その後アナログ−デジタル変換回路により、デジタルデータ化される。
【００３５】
以下、本実施形態の微小粒子分析装置１に設けられた各回路の動作について説明する。図７は各光源の発光パターンを示す図であり、図８はタイミング信号のパターンを示す図である。また、図９は検出信号とサンプルホールドのタイムチャートである。
【００３６】
光源駆動制御部３の各ＡＰＣ回路部ＡＰＣ１〜ＡＰＣ４には、レーザ光出力モニタ信号として、光検出器において光電変換された電気信号（微小電流）が入力される。そして、このレーザ光出力モニタ信号は、電流電圧変換アンプ（Ｉ／Ｖ）を介して、２つの検波回路に入力される。
【００３７】
ピーク値用検波回路では、レーザ光出力モニタ信号のピーク値を検出し、差動増幅回路において、設定したピークの値と比較してその差を取り、非常に大きなゲインで増幅する（誤差信号増幅）。差動増幅回路では、設定値と光検出した信号（レーザ光出力モニタ信号）との比較信号を増幅することで、レーザの発光パワーの制御を行う。具体的には、設定値に対して帰還されたレーザ光出力モニタ信号の方が大きい場合は光出力を小さく、一方帰還された光検出信号レーザ光出力モニタ信号のほう方が小さい場合は光出力を大きくするよう制御する。
【００３８】
そして、この増幅された信号を一度サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路で正確なピーク値を取り込み、ホールドする。その後、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路の出力を、ｇｍアンプ（駆動回路部のトランジスタＱ４）に入力して、ピーク電流を得る。
【００３９】
一方、振幅用検波回路では、レーザ光出力モニタ信号の振幅値を検出し、差動増幅回路において、検出したボトムの電圧値はピークの設定値とボトムの設定値の差分と比較してその差を取ることによって、パルスの振幅値の誤差信号とする。そして、この振幅値の誤差信号は、ピーク値と同様に、非常に大きなゲインで増幅される（誤差信号増幅）。この増幅された信号を一度サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路で正確な振幅値を取り込み、ホールドする。その後、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路の出力を、ｇｍアンプ（駆動回路部のトランジスタＱ３）に入力して、振幅電流を得る。
【００４０】
各光源に供給されるパルス電流は、ピーク値とボトム値で規定する。ピーク電流（第１の電流）は定電流源により制御し、ボトム電流（第２の電流）はトランジスタＱ３を介して供給され、その値は、前述した定電流源により供給される直流電流と、トランジスタＱ３の電流との差として制御する。これにより、レーザ特有の緩和振動や発光遅れを抑えることができる。また、本実施形態の微小粒子分析方法では、ピーク電流とボトム電流とを、独立制御しているため、温度ドリフトを抑えることもできる。
【００４１】
なお、ピーク電流及びボトム電流の値は、特に限定されるものではないが、光源の発光遅延と緩和振動の抑制の観点から、連続して供給される第１の電流は、光源（レーザ）が発振する閾値電流以上とすることが好ましい。この場合、時分割で供給される第２の電流は、連続して供給される第１の電流よりも小さい値とする。
【００４２】
また、トランジスタＱ１とトランジスタＱ２をスイッチングすることにより、トランジスタＱ３で生成した直流電流をパルス形状とする。駆動回路部Ｄ１〜Ｄ４では、トランジスタＱ３と出力端子との間にエミッタ結合回路が結合されているため、トランジスタＱ３で決定した電流値（前述した直流電流と同じ値）を、トランジスタＱ１とトランジスタＱ２に交互に流すことにより、パルス状の電流を得ることができる。
【００４３】
トランジスタＱ１，Ｑ２のスイッチング動作は、それぞれのトランジスタの各ベース端子間に電位差を持たせることで実現することができる。例えば、トランジスタＱ１，Ｑ２は、ＨＦアンプを介して、パルス信号源（タイミングジェネレータ）によりスイッチング制御することができる。そして、各光源の発光タイミングの制御は、このタイミングジェネレータにより行う。
【００４４】
これにより、各光源がパルス発光し、微小粒子１０には、波長が異なる複数のレーザ光が時分割で照射される。その際、図７に示すように、各光源は、非常に低い出力（バイアスパワー：例えば１〜２ｍＷ）で常時点灯しており、バイアスパワーよりも十分に大きい出力（ピークパワー：例えば１０ｍＷ以上）でパルス発光する。このとき、ピークパワーの値は、バイアスパワーの２倍以上であればよく、好ましくは１０倍以上、更に好ましくは５０〜１００倍である。これにより、蛍光検出時のクロストークを低減することができる。
【００４５】
微小粒子１０から発せられた散乱光や蛍光は、ＣＣＤやＰＭＴなどの光検出器により検出され、電流信号として出力される。この電流信号は、電流電圧変換（Ｉ／Ｖ）アンプにより電圧信号に変換され、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路に入力される。このサンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路において、検出対象の蛍光を励起する光源が点灯している間に信号レベルを取得し、それ以外の光源が点灯している間はレベルを保持する。これにより、図９に示す蛍光信号が得られる。
【００４６】
そして、本実施形態の微小粒子の検出方法では、タイミング発生回路６において、タイミング信号を生成することで、光源の発光と光検出器の検出とを同期させる。タイミング発生回路６は、光源駆動制御部３に、各光源を順次間欠的に点灯させるタイミング信号を出力する（図８参照）。また、蛍光検出部４には、特定の光源が点灯している間のみ検出信号を通過させ、それ以外は信号レベルを保持し、かつ光源が点灯してから検出回路部の各光検出器に光が到達するまでの間の伝播遅延時間を考慮したタイミング信号を出力する（図８参照）。
【００４７】
図１０Ａは本実施形態の微小粒子分析方法により得た蛍光スペクトルであり、図１０Ｂは従来の方法で得た蛍光スペクトルである。検出回路部Ｓ２で対象とする蛍光について、図１０Ｂに示す従来法により得た蛍光スペクトルでは、破線で囲んだ部分の光は不要である。しかし、同軸光学系で全光源を同時発光させる従来の方法では、光学フィルタを使用しても、この部分の光を除去することができなかった。
【００４８】
これに対して、図１０Ａに示す本実施形態の方法で得た蛍光スペクトルでは、検出回路部Ｓ３で検出する波長帯域と検出回路部Ｓ５で検出する波長帯域の光を除去することが可能となる。その結果、本実施形態の微小粒子分析装置１では、検出回路部Ｓ２で対象とする蛍光を精度良く検出することが可能となる。
【００４９】
本実施形態の微小粒子分析装置１では、微小粒子に波長が異なる複数のレーザ光を、時分割で照射しているため、検出光の相互干渉を抑制することができる。また、時分割照射を行うと、全体として照射光量が低減されるため、微小粒子やプラスチック製マイクロ流路に与えるダメージを軽減することもできる。
【００５０】
更に、本実施形態の微小粒子分析装置１では、第１の電流を供給している間にパルス発光用の第２の電流を供給するため、各光源は、前述した特許文献１に記載の装置のように完全に消灯することはなく、常に発振状態になっている。図１１Ａは本実施形態の微小粒子分析装置におけるレーザ発光波形を示す図であり、図１１Ｂは従来の装置におけるレーザの発光波形を示す図である。
【００５１】
図１１Ｂに示すように、従来の装置で時分割照射を行う場合、光源が消灯と点灯を繰り返すため、レーザの発光波形はパルス幅が保存されず、波形もひずんでしまう。このため、流路を通流する微小粒子の分析には不向きであった。これに対して、本実施形態の微小粒子分析装置１では、光源は消灯せず、発振状態にあるため、電流波形のパルス幅がそのまま発光波形のパルス幅となる。これにより、緩和振動や発光遅れに起因する種々の問題を解決することが可能であり、流路内を通流する微小粒子を、高精度に分析することができる。
【００５２】
＜２．第１の実施の形態の変形例＞
［微小粒子分析装置の全体構成］
次に、本開示の第１の実施形態の変形例に係る微小粒子分析装置について説明する。図１２は本変形例の微小粒子分析装置の構成を示すブロック図である。なお、図１２においては、図１に示す微小粒子分析装置１の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
【００５３】
図１に示す微小粒子分析装置１では、光照射部２に設けられた対物レンズユニット２３により、微小粒子１０からの蛍光を集光しているが、本変形例の微小粒子分析装置１１では、図１２に示すように、蛍光検出部１４に別途対物レンズユニット４２を設けている。そして、対物レンズユニット４２で集光された蛍光は、光ファイバなどを介して分光ユニット４１に導光される。
【００５４】
このような構成にすることにより、細胞の複雑さを検出する横方向拡散光（Side Scatter）成分を検出することが可能となる。横方向散乱光は、後方散乱光よりも検出される光量が大きいため、より高品質な拡散成分の信号を検出することができる。なお、本変形例の微小粒子分析装置１１における上記以外の構成及び効果は、前述した第１の実施形態と同様である。
【００５５】
＜３．第２の実施の形態＞
次に、本開示の第２の実施形態に係る微小粒子分析装置について説明する。前述したように、各光源をパルス発光させる際に、そのピークパワーをバイアスパワーよりも十分に大きくすれば、時分割照射を行っても、検出される蛍光のクロストークを低減することができる。しかしながら、ピークパワーを十分に大きくすることができない場合は、検出される蛍光にクロストークが発生することがあり、また、パルス発光時以外にも、光源が低出力で発光していることによりオフセットが発生することもある。
【００５６】
そこで、本実施形態の微小粒子分析装置では、光検出部において補正を行い、クロストークやオフセットの影響を抑制する。例えば、特定の光源ＬＤｉがピークパワーで発光しているとき、他の光源は低出力のバイアスパワーで発光している。オフセットは、検出対象の蛍光を励起する光源以外の光源も発光していることによって発生する。従って、光源ＬＤｉ以外の光源をバイアスパワーで点灯させたときの蛍光信号を取得することで、オフセットを補正することができる。
【００５７】
［検出回路部］
図１３は本実施形態の微小粒子分析装置における検出回路部の構成を示すブロック図である。図１３に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置の回路検出部は、電流電圧変換アンプに、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路とアナログスイッチが接続されている。そして、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路も、アナログスイッチに接続されており、アナログスイッチはローパスフィルタ回路を介して、アナログ−デジタル変換回路に接続されている。
【００５８】
また、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路には、検出する蛍光（励起光を出射するレーザ）を選択する切り替えスイッチ（ＭＰＸ１）が接続されている。一方、アナログスイッチには、有効にするレーザを選択する切り替えスイッチ（ＭＰＸ２）と、補正モード（Compensation Mode）入力端子が接続されている。そして、これら２種類の切り替えスイッチ（ＭＰＸ１，ＭＰＸ２）のいずれを動作させるかは、測定と補正とで切り替えられるようになっている。
【００５９】
具体的には、通常測定モードのときは、アナログスイッチはサンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路側を選択し、サンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路の出力をローパスフィルター（ＬＰＦ）回路に伝達する。一方、補正モードのときは、アナログスイッチは、電流電圧変換アンプ（Ｉ／Ｖ）側を選択し、電流電圧変換アンプ（Ｉ／Ｖ）の出力をローパスフィルター（ＬＰＦ）回路に伝達する。
【００６０】
［動作］
図１４は通常測定時の光源の発光パターン及び蛍光スペクトルであり、図１５は補正値取得時の光源の発光状態及び蛍光スペクトルである。図１４Ａに示す発光パターンで通常測定を行った場合、検出される蛍光スペクトルは、図１４Ｂに示すようになる。そして、例えば光源ＬＤ２により励起される蛍光を、光検出器ＰＤ２で検出する場合、光検出器ＰＤ２で検出される合成信号レベル（Ｉtotal-PD2）は、下記数式１により表される。
【００６１】
【数１】
2014115121.tif 000003
【００６２】
なお、上記数式１におけるＩ2-peakは光源ＬＤ２から発せられるレーザ光により励起された蛍光であり、Ｉx-biasは光源ＬＤｘから発せられるレーザ光に起因する光である。また、ｅ１〜ｅ４は各蛍光の光検出器ＰＤ２における通過波長帯域内の蛍光変換効率（波長平均値）である。
【００６３】
ここで、光源ＬＤ２以外の光源に由来する光がオフセット成分である（図１４Ｂ参照）。そこで、補正を行う際には、図１５Ａに示すように、光源ＬＤ２のみを消灯し、それ以外の光源を点灯させた状態で、光検出器ＰＤ２で検出を行う。これにより、オフセット成分を示す図１５Ｂに示すスペクトラムが得られる。なお、補正時に検出される合成信号レベル（Ｉtotal-PD2）は、下記数式２により表される。
【００６４】
【数２】
2014115121.tif 000004
【００６５】
そして、下記数式３に示すように、上記数式１と数式２との差を求めることにより、オフセット成分を除いた必要な信号のみを取り出すことができる。
【００６６】
【数３】
2014115121.tif 000005
【００６７】
ここで、検出回路部は、補正モード（Compensation Mode）が「Ｌ」のときは、通常測定を行い、「Ｈ」のときに前述したオフセット補正を行う。オフセット補正時には、アナログスイッチは電流電圧変換アンプに直結される。そして、この状態でアナログ−デジタル変換回路にデータ（オフセットデータ値）を取り込み、記憶する。この動作を、他の光源についても順次実行する。一方、通常測定時は、アナログスイッチをサンプルホールド（Ｓ／Ｈ）回路に直結し、前述したオフセットデータ値を用いて演算処理し、得られたデータを補正する。下記表１に各光源の動作を示す。なお、補正モード（Compensation Mode）が「Ｈ」のときに各光源（ＬＤ）は点灯する。
【００６８】
【表１】
2014115121.tif 000006
【００６９】
本実施形態の微小粒子分析装置は、オフセット機能を備えているため、蛍光の検出精度を更に向上させることができる。なお、本実施形態の微小粒子分析装置における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第１の実施形態及びその変形例と同様である。
【００７０】
また、本開示は、以下のような構成をとることもできる。
（１）
異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子に前記レーザ光を照射する光照射部と、
前記光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部と、を有し、
前記光源駆動制御部は、各光源に第１の電流を供給すると共に、前記第１の電流を供給している間に第２の電流を光源毎に時分割で供給する微小粒子分析装置。
（２）
前記第１の電流は、前記第２の電流よりも大きい（１）に記載の微小粒子分析装置。
（３）
前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、前記第１の電流の供給を制御する第１電流制御部と、前記第２の電流の供給を制御する第２電流制御部が設けられている（１）又は（２）に記載の微小粒子分析装置。
（４）
前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、オートパワーコントロール回路と、駆動回路とが設けられている（１）〜（３）のいずれかに記載の微小粒子分析装置。
（５）
更に、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する光検出部を有し、
該光検出部は、少なくとも、
前記微小粒子から発せられた光を波長分離する分光光学系と、
前記分光光学系により分離された光を検出する複数の光検出器と
を備える（１）〜（４）のいずれかに記載の微小粒子分析装置。
（６）
前記光検出部には、前記光検出器毎に、検出信号の取得を制御する検出回路が設けられている（５）に記載の微小粒子分析装置。
（７）
前記検出回路は、補正モードと測定モードとを切り替えるスイッチを備える（６）に記載の微小粒子分析装置。
（８）
前記光源駆動制御部に設けられた複数のオートパワーコントロール回路と、前記光検出部に設けられた複数の検出回路に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路を備える（６）又は（７）に記載の微小粒子分析装置。
（９）
複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する光照射工程を有し、
各光源に第１の電流を供給すると共に、前記第１の電流を供給している間に第２の電流を光源毎に時分割で供給することにより、前記微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する微小粒子分析方法。
（１０）
前記第１の電流を、前記第２の電流よりも大きくする（９）に記載の微小粒子分析方法。
（１１）
前記第１の電流の供給と、前記第２の電流の供給を、個別に独立して制御する（９）又は（１０）に記載の微小粒子分析方法。
（１２）
前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を波長分離する分光工程と、
複数の光検出器により前記分光工程により分離された光を検出する検出工程と、
を有する（９）〜（１１）のいずれかに記載の微小粒子分析方法。
（１３）
前記光源の発光と前記光検出器の検出を同期させる（１２）に記載の微小粒子分析方法。
（１４）
前記検出工程により検出された蛍光データを、予め検出されたオフセットデータに基づいて補正を行う（１２）又は（１３）に記載の微小粒子分析方法。
【符号の説明】
【００７１】
１、１１  微小粒子分析装置
２  光照射部
３  光源駆動制御部
４、１４  蛍光光検出部
５  散乱光検出部
６  タイミング発生回路部
１０  微小粒子
２１  光源ユニット
２２  光ファイバ
２３、４２  対物レンズユニット
４１  分光ユニット
５１  集光レンズユニット
１０１  フローサイトメーター
１０２  フロー系
１０３  光学系
１０４  信号処理装置
１０５  細胞
１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃ  光源
１０７  導光部材
【図１】
2014115121.tif 000007
【図２】
2014115121.tif 000008
【図３】
2014115121.tif 000009
【図４】
2014115121.tif 000010
【図５】
2014115121.tif 000011
【図６】
2014115121.tif 000012
【図７】
2014115121.tif 000013
【図８】
2014115121.tif 000014
【図９】
2014115121.tif 000015
【図１０】
2014115121.tif 000016
【図１１】
2014115121.tif 000017
【図１２】
2014115121.tif 000018
【図１３】
2014115121.tif 000019
【図１４】
2014115121.tif 000020
【図１５】
2014115121.tif 000021
【図１６】
2014115121.tif 000022