(57)【要約】【課題】蛍光イメージングや光音響イメージングの造影剤等として使用するインドシアニングリーン（ＩＣＧ）含有粒子において、ＩＣＧが凝集することなく単量体のままリポソーム内に高濃度で内包させること。【解決手段】インドシアニングリーンと、粒子と、１ｍＭ以上１０Ｍ以下のカオトロピック剤を含む溶液とを混合する工程を有することを特徴とするインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドシアニングリーンと、粒子を、１ｍＭ以上１０Ｍ以下のカオトロピック剤を含む溶液中で混合する工程を有することを特徴とするインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【請求項２】
前記カオトロピック剤を含む溶液は、６．２５ｍＭ以上のカオトロピック剤を有することを特徴とする請求項１に記載のインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【請求項３】
前記カオトロピック剤を含む溶液は、１００ｍＭ以下のカオトロピック剤を有することを特徴とする請求項１または２に記載のインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【請求項４】
インドシアニングリーンと、粒子を、１ｍＭ以上１０Ｍ以下のカオトロピック剤を含む溶液中で混合する工程において、インドシアニングリーンが溶解したカオトロピック剤を含む溶液と、粒子とを混合することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【請求項５】
前記カオトロピック剤が尿素、グアニジン、ヨウ素、あるいはこれらのイオンであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【請求項６】
前記カオトロピック剤が尿素であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【請求項７】
前記粒子がリポソームであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【請求項８】
前記カオトロピック剤を含む溶液のｐＨが７未満であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子の製造方法。
【請求項９】
インドシアニングリーンと粒子とを含むインドシアニングリーン含有粒子であって、
前記インドシアニングリーン含有粒子がさらにカオトロピック剤を有することを特徴とするインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項１０】
前記インドシアニングリーン含有粒子の平均粒径が１０００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項９に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項１１】
前記インドシアニングリーン含有粒子の平均粒径が２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項９または１０に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項１２】
前記粒子がリン脂質を有することを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項１３】
前記粒子がリポソームであることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項１４】
前記インドシアニングリーン含有粒子がさらにコレステロールを有することを特徴とする請求項９乃至１３のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子。
【請求項１５】
請求項９乃至１４のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子からなる光音響イメージング造影剤。
【請求項１６】
請求項９乃至１４のいずれか１項に記載のインドシアニングリーン含有粒子と、前記インドシアニングリーン含有粒子を分散するための分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用の造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドシアニングリーンを含有する粒子、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、非侵襲的に診断ができるイメージング方法として、蛍光イメージング法や光音響イメージング法が注目されている。
【０００３】
蛍光イメージング法は蛍光色素に光を照射し、色素が発する蛍光を検出する方法で、各種イメージングに広く用いられている。光音響イメージング法は、光を照射された測定対象の分子が放出する熱が起こす体積膨張により生じる音響波の強度と音響波の発生位置を検出することで、測定対象の画像を得る方法である。蛍光イメージング法や光音響イメージング法において、測定対象部位からの蛍光の大きさや音響波の強度を大きくするための造影剤として色素を用いることができる。
【０００４】
このような造影剤においては、信号強度（蛍光や音響波の強度）を有効に増幅するために、光を吸収することで蛍光または音響波を発する色素をミセル、ポリマーミセル、リポソーム、その他の等（以下、単に粒子という場合は、特に言及される場合を除き、これらの総称を意味する）に集積することにより、色素密度を上げて、照射エネルギーの吸収効率を上げることが望まれる。
【０００５】
光を吸収することで蛍光または音響波を発することが知られている色素として、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下、ＩＣＧと略すことがある）が知られている。なお、本明細書において、ＩＣＧとはシアニン骨格を有し、下記に示される構造を有する化合物を指す。
【化１】
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ただし、対イオンはＮａ＋でなくともよく、Ｈ＋あるいはＫ＋でもよい。またヨウ化ナトリウムＮａＩを添加してもよい。
【０００６】
しかし、ＩＣＧは低分子であることからサイズが小さく、リンパ節内滞留性が低いため、よりサイズの大きいリンパ節用造影剤が望まれていた。ＩＣＧを含み、よりサイズの大きな粒子として、非特許文献１には、ポリビニルアルコール（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ：ＰＶＡ）を界面活性剤にしてエマルジョン溶媒拡散法によって得たＩＣＧ含有乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ：以下ＰＬＧＡと略すことがある）粒子が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２２００４５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】”Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｈｏｔｏ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  ｔｈｅｒｍａｌ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，７４、２９−３８（２００４）
【非特許文献２】”Ｊ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ”，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２２０，３８５−３９２（１９９７）
【非特許文献３】”Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ”，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２２０，３７３−３８４（１９９７）
【非特許文献４】”Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ  Ｊ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９，３９９−４０９（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、非特許文献１に開示されたＩＣＧを含有する粒子には、リポソーム内に充填できる色素量に限界があり、造影剤粒子のＩＣＧ含有率が低く、標的組織へのＩＣＧ輸送量が減少し、造影感度が不十分になる結果、ＩＣＧ含有粒子を大量に投与する必要が生じることになり、患者に過度の負担を与えることになるという問題があった。
【００１０】
ＩＣＧを含有する粒子の造影剤においては、生体内での粒子のＩＣＧ含有率が優れていることが必要であるが一般的なリポソーム作製方法においてはリポソーム内に充填できる色素量に限界があった。具体的には水和分散法においては有機溶媒に溶解し溶媒除去したリン脂質フィルムをＩＣＧ水溶液と共に超音波撹拌することによりＩＣＧ水溶液を内包するリポソームを形成できる。かかる方法において例えば粒径７０ｎｍ前後のリポソームの体積、乾燥重量より求めたリポソーム個数から計算される内水相体積は全体の０．５ｖｏｌ％前後しかない。
飽和濃度に近いＩＣＧ水溶液を使って水和分散し限外ろ過や遠心などで濃縮したとしても造影剤全体のＩＣＧモル吸光係数εは１０８オーダーである。
別のリポソーム作製方法であるバンガム法においてはリン脂質クロロホルム溶液にＩＣＧメタノール溶液を混和溶解した後、溶媒除去したＩＣＧを含むリン脂質フィルムをバッファ水溶液と共に超音波撹拌することによりＩＣＧをリン脂質内に含むリポソームを形成できる。かかる方法において上記同様の粒径７０ｎｍ前後のリポソームの体積、乾燥重量より求めたリポソーム個数から計算されるリポソーム脂質膜の体積は全体の１ｖｏｌ％前後しかない。
この場合でも造影剤全体のＩＣＧモル吸光係数εは１０８オーダーである。
よってＩＣＧ含有率が高いＩＣＧ含有粒子が求められていた。
【００１１】
そこで本発明は、外水相から内水相へとＩＣＧを輸送しＩＣＧ内水相濃度を高めることが可能なｐＨ勾配法に基づく粒子の作製方法を提供する。
ｐＨ勾配法を含む従来のリポソーム作製法においては高濃度ＩＣＧ水溶液（非特許文献２によれば１．５ｍＭ以上）をリン脂質の相転移温度である６０℃以上（非特許文献２では６５℃を基準に２０℃、４５℃、８０℃、９０℃）に加熱した状態にするとＪ会合体の形成（以下、Ｊ会合体化、と略すことがある）が始まり、会合体の核形成が更なるＪ会合体化促進することが知られている。
しかしｐＨ勾配法において外水相におけるＩＣＧの濃度が高いほど内包率が高くなる傾向にあり、ｐＨ勾配法より高内包率化を目標とするため非特許文献２に記載の１．５ｍＭ以上とすることが一般的に行われ内包化の加熱処理時にＪ会合体を形成することが避けられなかった。ＩＣＧがＪ会合体を形成すると、粒子におけるＩＣＧの内包率を高くすることが難しい。
なぜなら、ｐＨ勾配法はトランスメンブレン勾配とも呼ばれ、外水相に含まれる非イオン性溶質がリン脂質膜を越えて内水相に移動するもので、移動時に分子容積が小さい方が移動量は多くなる。そして、
非特許文献３にあるように、ＩＣＧのＪ会合体は分子数２００００乃至５００００の集合体であることが知られており、リン脂質メンブレンをトランスするには巨大すぎるためである。
【００１２】
本発明はＩＣＧを単量体のまま粒子に大量に内包させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ＩＣＧと、粒子を、１ｍＭ以上１０Ｍ以下のカオトロピック剤を含む溶液中で混合する工程を有することを特徴とするインドシアニングリーン含有粒子（ＩＣＧ含有粒子）の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る粒子は、ＩＣＧをＪ会合体化せず粒子内に安定に保持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態における粒子の例である。
【図２】本発明の一実施形態における別の粒子の例である。
【図３】ＩＣＧ水溶液ならびにＩＣＧのＪ会合体の吸収スペクトルである。
【図４】実施例１における本発明の１．５ｍＭ  インドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）および尿素を含む水溶液を６０℃３０分加熱した前後のスペクトルシフトを各１００ｍＭ以下の尿素濃度で測定した結果一覧であって、左端のマスはＩＣＧを含まない１００ｍＭ尿素水溶液のみの吸収スペクトルで、各マスの横軸は波長で左端が５００ｎｍ、右端が９５０ｎｍであり、縦軸は吸光度でスケールは任意である。  ２段になっているマスの上段は加熱前で下段は加熱後の吸収スペクトルを示す。左端のマスはＩＣＧを含まないブランクであって、左端から２マス目は１．５ｍＭＩＣＧに各１００ｍＭ以下の尿素濃度（一覧表の上部に尿素濃度を記載）添加物を加えた溶液の吸収スペクトルで、上段と下段は加熱前後を表わす。
【図５】実施例１における本発明の１．５ｍＭ  インドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）および尿素を含む水溶液を６０℃３０分加熱した前後のスペクトルシフトを各１００ｍＭ以下のクエン酸濃度で測定した結果一覧であって、左端のマスはＩＣＧを含まない１００ｍＭクエン酸水溶液のみの吸収スペクトルで、各マスの横軸は波長で左端が５００ｎｍ、右端が９５０ｎｍであり、縦軸は吸光度でスケールは任意である。２段になっているマスの上段は加熱前で下段は加熱後の吸収スペクトルを示す。  左端のマスはＩＣＧを含まないブランクであって、左端から２マス目は１．５ｍＭＩＣＧに各１００ｍＭ以下のクエン酸濃度（一覧表の上部にクエン酸濃度を記載）添加物を加えた溶液の吸収スペクトルで、上段と下段は加熱前後を表わす。
【図６】１．５ｍＭ  以下のインドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）を含む水溶液を６０℃３０分加熱した前後のスペクトルシフトを測定した結果一覧であって、左端のマスはＩＣＧを含まない水のみの吸収スペクトルで、各マスの横軸は波長で左端が５００ｎｍ、右端が９５０ｎｍであり、縦軸は吸光度でスケールは任意である。  ２段になっているマスの上段は加熱前で下段は加熱後の吸収スペクトルを示す。  左端のマスはＩＣＧを含まないブランクであって、左端から２マス目は１．５ｍＭＩＣＧ水溶液の吸収スペクトルで（一覧表の上部にＩＣＧ濃度を記載）、上段と下段は加熱前後を表わす。
【図７】本発明の実施例２において尿素添加ｐＨ勾配法で得たＩＣＧ含有粒子の吸収スペクトルである。７８０ｎｍ付近に吸収ピークが認められる。
【図８】本発明の比較例１において尿素を添加しない従来のｐＨ勾配法で得たＩＣＧ含有粒子の吸収スペクトルである。８９５ｎｍ付近に吸収ピークが認められる。
【図９】本発明の比較例２においてｐＨ勾配を施さないで得たＩＣＧ含有粒子の吸収スペクトルである。７８０ｎｍ付近に吸収ピークが認められる。
【図１０】本発明の実施例２で得たリポソームであって、ｐＨ勾配でＩＣＧ内包前ならびに内包・精製後において粒径を比較したデータである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態に限られない。
【００１７】
本発明の第一の実施形態は、ＩＣＧと、粒子を、１ｍＭ以上１０Ｍ以下のカオトロピック剤を含む溶液中で混合する工程を有することを特徴とするＩＣＧ含有粒子の製造方法である。
【００１８】
また、本実施形態に係るＩＣＧ含有粒子の製造方法は、カオトロピック剤を含む溶液が６．２５ｍＭ以上のカオトロピック剤を有することが好ましく、１００ｍＭ以下のカオトロピック剤を有することがさらに好ましい。
【００１９】
また、ＩＣＧと、粒子を、１ｍＭ以上１０Ｍ以下のカオトロピック剤を含む溶液中で混合する工程においては、ＩＣＧが溶解したカオトロピック剤を含む溶液と、粒子とを混合することが好ましい。本実施形態は、例えば、ＩＣＧを外水相からリポソーム内水相に内包させるｐＨ勾配法において、外水相に例えば尿素などのカオトロピック剤を添加することで、ＩＣＧのＪ会合体化を抑制し、ＩＣＧの内包率の高い粒子を製造することができる。
【００２０】
カオトロピック剤とは、水分子間の相互作用を減少させ、それによる構造を不安定化させる物質のことである。カオトロピック剤の好ましい例として、尿素、グアニジン、ヨウ素、あるいはこれらのイオンを挙げることができ、カオトロピック剤の好ましい濃度として１ｍＭ以上１０Ｍ以下であり、尿素であれば、特に好ましい濃度として、１０ｍＭ以上１Ｍ以下を挙げることができる。
【００２１】
１ｍＭ以上１０Ｍ以下のカオトロピック剤を含む溶液は、好ましくは、ｐＨが７未満であり、さらに好ましくは５未満を挙げることができる。なお、溶液には特に限定はなく、水、水系溶媒、緩衝液、粒子分散媒などを指し、例としては、表２中の、Ａ溶液、Ｂ溶液、あるいは、尿素１００ｍＭを含むｐＨ３．０の溶液、を挙げることができる。
【００２２】
また、本発明において、粒子は特に限定されないが、好ましい例としてリポソームを挙げることができる。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態の一は、インドシアニングリーンと粒子とを含むインドシアニングリーン含有粒子であって、前記インドシアニングリーン含有粒子がさらにカオトロピック剤を有することを特徴とするインドシアニングリーン含有粒子である。
【００２４】
本実施形態では、粒子の波長８９５ｎｍ（Ｊ会合体に由来）の光の吸光度と７８０ｎｍ（単量体に由来）の光の吸光度との比率Ｏ．Ｄ．（８９５ｎｍ）／Ｏ．Ｄ．（７８０ｎｍ）が１．０以下であることが好ましいが特に限定されず、粒子内でのＪ会合体と単量体との存在比は特に限定されない。
同様に、粒子の、波長７００ｎｍ（Ｈ会合体に由来）の光の吸光度と７８０ｎｍ（単量体に由来）の光の吸光度との比率Ｏ．Ｄ．（７００ｎｍ）／Ｏ．Ｄ．（７８０ｎｍ）が１．０以下であることが好ましいが特に限定されず、粒子内でのＨ会合体と単量体との存在比は特に限定されない。
【００２５】
本実施形態における粒子は、さらに、リン脂質を含むことができ、さらに好ましくは、本実施形態における粒子のリン脂質は二重膜を形成しており、リン脂質が粒子に占める割合は好ましくは３０重量％以上である。また、リン脂質の例として、リン酸ジエステル結合を有する脂質を挙げることができる。本実施形態の粒子は、さらに、コレステロールを有することができ、粒子の好ましい例として、リポソームを挙げることができる。
粒子の粒径に限定はないが、好ましい例として、平均粒径１０００ｎｍ以下、さらに好ましくは２００ｎｍ以下を挙げることができる。粒子系は、例えば、光散乱法で測定することができる。
またさらには、本実施形態の粒子は、表面にＰＥＧ鎖を有することができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態の一は、上記ＩＣＧ含有粒子を含む光音響イメージング造影剤である。本実施形態の光音響イメージング造影剤は好ましくは、前記ＩＣＧ含有粒子と、ＩＣＧ含有粒子を分散するための分散媒を有する。この場合、上記カオトロピック剤を含む分散媒を有することができる。
【００２７】
（Ｊ会合体）
ＩＣＧは特定の条件下においてＪ会合体（Ｊ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成することが知られている（非特許文献２、３及び４）。Ｊ会合体は、数μｍの平均粒径を有する多量体であり、単量体に比べて、吸収極大波長が長波長側に大きくシフトし、その吸収帯が鋭くなることが知られている。
ＩＣＧのＪ会合体とは、ＩＣＧの多量体構造物である会合体のうち、単量体に比べて吸収波長がずれて、８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大をもつものと定義する。なお、本明細書において粒子にＩＣＧが含まれるという場合、粒子にＩＣＧのＪ会合体やＨ会合体が含まれることを阻害しない。
Ｊ会合体およびＨ会合体は造影の妨害とはならないが、会合することによってＩＣＧ単量体に由来する７８０ｎｍの吸収が減ずるため、会合体の形成を抑制することが感度の点で好ましい。
ＩＣＧのＪ会合体を用いると一般的な蛍光イメージング装置や光音響イメージング装置における計測の境界波長域であるため光源出力が下がり、感度が低下する。
本発明では、会合状態を抑制し、単量体を高濃度に内包させることによりリンパ節等の測定対象部位へのＩＣＧの集積を高めることが可能になる。
【００２８】
（粒子）
本願明細書では、粒子は特に限定されず、ＩＣＧの含有の有無に関わらず全ての粒子を指し、ＩＣＧを含む粒子を指して、特に「インドシアニングリーン含有粒子」「ＩＣＧ含有粒子」などと言う場合がある。粒子は、形状は問わず、ミセル、ポリマーミセル、リポソーム、その他の粒子全てを含む。
本発明の粒子は、ＩＣＧ以外に正帯電部位を有する脂質等の添加物を含んでいてもよいし、添加物を含まない粒子でもよい。粒子は特に限定されず、ミセル、ポリマーミセル、リポソーム等でもよい。また、この粒子表面には界面活性剤が存在していてもよい。
このような粒子の例として、図１に示すようなＩＣＧ  １と添加物としてのリン脂質２からなる粒子や、図２に示すようなＩＣＧ  １を含むリポソーム３の表面に界面活性剤４を含む粒子等が挙げられる。
【００２９】
（平均粒径）
本実施形態に係る粒子の平均粒径は、光散乱法で測定される流体力学的平均粒子径を意味する。以下単に粒径ということがある。本実施形態に係る粒子の粒径の範囲は特に限定されない。ただし、造影剤、特にリンパ節用の造影剤として用いる場合、流体力学的平均粒子径を１０００ｎｍ以下とすることで、リンパ管や組織内部への取り込みやすさ（組織浸透性）とリンパ節や組織への滞留性を高めることが可能となる。
粒径が１０００ｎｍ以下の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、腫瘍血管の透過性亢進と腫瘍内滞留）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの粒子を集積させることができる。集積した粒子を、蛍光や光音響といった各種画像形成モダリティを用いて検出することによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、粒径が１０００ｎｍを超えると、リンパ管等の組織内への効率的な取り込みが期待できない。そのため、粒径は１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下とすることが好ましい。粒径は２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。粒子の粒径が２００ｎｍ以下であると、粒子が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
粒径は電子顕微鏡観察や動的光散乱法に基づく粒径測定法により測定することができる。動的光散乱法に基づいて粒径を測定する場合、動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，  ＤＬＳ）法によって流体力学的直径を測定する。
後述する細孔フィルターによってろ過したり、後述するｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ法を用いたり、リポソーム等の粒子に含ませたりすることで、このような好ましいサイズの粒子を作成することができる。
【００３０】
（カオトロピック剤）
カオトロピック剤の例として、尿素、グアニジン、ヨウ素、あるいはこれらのイオンを挙げられ、この中で特に好ましい例として尿素を挙げることができる。粒子に含まれる添加物は製造工程のｐＨ勾配法による内包化処理時に用いるため残留することが考えられるが、尿素はビタミン静脈注射（商品名：ビタルファ注射液、コンベルビー注など）の添加剤（注射液１０ｍｌ中５０ｍｇ添加）として実績があり、また、尿素のＭＳＤＳ（製品安全データシート）によれば静脈注射のＬＤ５０はラットやマウスで５０００ｍｇ／ｋｇ前後であり、本発明の好ましい濃度範囲上限の１Ｍを添加したとしても尿素分子量と静脈注射の液量から毒性は認められない。
よって、本発明において尿素は製造後に排除する必要はなく、残留もしくは外水相に添加することで経時的な安定性、すなわちＩＣＧ吸収波長シフトを抑制する効果を持続させることができる。
【００３１】
（正帯電部位を有する脂質）
本発明に係る粒子は、正帯電部位を有する脂質等を含むことができる。ＩＣＧは親水性部位であるスルホン酸基を有する親水性色素であるが、正帯電部位を有する脂質を添加すると、添加物の有する正帯電部位がＩＣＧの親水性部位に会合し、ＩＣＧの疎水性を上げることができ、ＩＣＧをクロロホルム、ジクロロメタンなどの有機溶媒に可溶化することができると考えられる。
【００３２】
正帯電部位を有する脂質とは、脂質のうちその構造の一部に、陽イオンの部分構造を有する脂質のことを言う。このような脂質の例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリン等のグリセロ脂質、スフィンゴミエリン、スフィンゴリン脂質及びスフィンゴシン等のスフィンゴ脂質、ノイラミン酸等のアミノ糖部分を有するスフィンゴ糖脂質等の糖脂質、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレン−Ｎ−ヒドロキシエチルアミン及び３−（［Ｎ−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール等の合成コレステロール類、ラウリルアミン、ステアリルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（略称ＤＯＴＭＡ）及び２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（略称ＤＯＳＰＡ）等の合成脂質、並びにエーテル型リン脂質及びカチオニック脂質等を挙げることができる。
【００３３】
また、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンの例としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン及びジアシルホスファチジルセリンなどが挙げられる。
【００３４】
また、正帯電部位を有する脂質は、さらにリン酸ジエステル結合を有することができ、例えば、１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ）、１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＰＰＥ）、１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＭＰＥ）、１，２−Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＬＰＥ）、１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ）、１，２−Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＬｏＰＥ）、１，２−Ｄｉｅｒｕｃｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＥＰＥ）、１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（ＤＳＰＳ）、１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（ＤＰＰＳ）、１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（ＤＭＰＳ）、１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（ＤＯＰＳ）、１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＳＰＣ）、１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＰＰＣ）、１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＭＰＣ）、１，２−Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＬＰＣ）、１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＯＰＣ）、１，２−Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＬｏＰＣ）などが挙げられる。
【００３５】
本実施形態における正帯電部位を有する脂質として、さらに、１，２−ｄｉ−ｏ−ａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１，２−ｄｉａｃｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｒｏｐａｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｏ，ｏ’−ｄｉｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−（α−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏａｃｅｔｙｌ）ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、水素添加大豆ホスファチジルコリン（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  Ｓｏｙ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＨＳＰＣと略すことがある）等を使用することができる。
【００３６】
本発明に係る正帯電部位を有する脂質として、特にこのましくは、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリンを挙げられる。
【００３７】
（リポソーム）
本発明の粒子はリポソームの形状をとることができる。本明細書においてリポソームとは、脂質、糖脂質、リン脂質、ステロール、ならびにそれらの組み合わせにより構成される単層リポソーム及び多重層リポソームを意味する。脂質は異なる脂質の混合物から構成されていてもよく、また脂質の誘導体、たとえばポリエチレングリコール結合リン脂質なども使用することができる。リポソームの調製方法は、従来公知の方法を利用でき、適宜選択して望ましい物性のリポソームを得ることができる。脂質の種類や量などは、リポソームの用途に応じて適宜選択することができる。例えば、脂質量や比率、脂質の荷電を考慮することで、リポソームの粒径や表面電位を制御することができる。
【００３８】
リポソームに含まれる中性リン脂質の例としては、大豆あるいは卵黄レシチン、リゾレシチン、またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体である。その他にも、半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリンも挙げられる。また、合成されたホスファチジン酸（ＰＡ）などのアルキルあるいはアルケニル誘導体も使用でき、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）などが挙げられる。
【００３９】
リポソームに含まれる糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリドなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などが挙げられる。
【００４０】
粒子をリポソームとする場合、リポソーム膜構成分子として、上記の他にも必要に応じ他の分子を加えることもでき、例として、膜安定化剤として作用するコレステロール類、エチレングリコールなどのグリコール類、デキストランなどの糖類、電荷制御のために添加されるリン酸ジアルキルエステル類、ステアリルアミンなどの脂肪族アミンが例示される。
【００４１】
（粒子へのＩＣＧの含有）
本発明において粒子がＩＣＧを含有するというとき、たとえば、粒子がリポソームであって、リポソームにＩＣＧが内包される場合を挙げられる。ＩＣＧは水溶性物質であり、典型的にはリポソームの内水相に内包される。しかし、ＩＣＧはリン脂質との親和性を有していることやＩＣＧ同士の多量体化を起こしやすいことから、リポソーム膜表面や脂質二重膜内の局在も起こりえる。本明細書中では、では上記３通りの場合、すなわち、「リポソーム内水相への内包」、「リポソームの膜内への局在」ならびに「リポソーム表面への局在」をあわせてリポソームへの含有とする。
【００４２】
（界面活性剤）
本実施形態の粒子の作製には、界面活性剤を使用することができる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤又はリン脂質等を使用することができる。これらの界面活性剤は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。上記本実施形態における界面活性剤に使用する非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ８５等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ７６、Ｂｒｉｊ９８、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｉｇｅｐｏｌ  ＣＯ５３０、Ｉｇｅｐｏｌ  ＣＯ６３０、Ｉｇｅｐｏｌ  ＣＯ７２０並びにＩｇｅｐｏｌ  ＣＯ７３０等を挙げることができる。
【００４３】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するアニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等を挙げることができる。
【００４４】
また、本発明における界面活性剤に使用するカチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等を挙げることができる。
【００４５】
また、本発明における界面活性剤に使用する高分子界面活性剤としては、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール及びゼラチン等を挙げることができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールの市販品としては、プルロニックＦ６８（シグマアルドリッチジャパン社製）、プルロニックＦ１２７（シグマアルドリッチジャパン社製）などが挙げられる。
【００４６】
また、本発明における界面活性剤に使用するリン脂質としては、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基又はマレイミド基のいずれかの官能基を有するホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。また、界面活性剤に使用するリン脂質はＰＥＧ鎖を含むものであってもよい。
【００４７】
腫瘍へのパッシブターゲティングの原理として提唱されているＥＰＲ効果を生じさせるためには、高い血中滞留性を有することが造影剤には求められる。ポリエチレングリコールは血中タンパク質との相互作用を抑制することで肝臓などの細網内皮系細胞に貪食され難くなり、粒子の血中滞留性を向上させることができるため、本発明の粒子へのポリエチレングリコールの導入は非常に有益である。
【００４８】
ポリエチレングリコールの分子量や粒子への導入率を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。その分子量が５００から２０００００のポリエチレングリコールの使用が好ましく、特に２０００から１０００００が好適である、また粒子へのポリエチレングリコール導入率は、該粒子を構成する脂質に対して０．００１〜５０モル％、好ましくは０．０１〜３０モル％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。
【００４９】
粒子へのポリエチレングリコール導入方法は、公知の技術を利用することができる。好ましい例としては、粒子を被覆するリン脂質類の中に、予めポリエチレングリコール結合リン脂質などを含めて粒子を作製する方法である。ポリエチレングリコール結合リン脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミンのポリエチレングリコール誘導体、たとえばジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）などがある。
【００５０】
官能基が水酸基、メトキシ基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基でありＰＥＧ鎖を含むような界面活性剤に使用するリン脂質としては、例えば、化学式２で示される１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨ）、化学式３で示されるＰｏｌｙ（ｏｘｙ−１，２−ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌ），α−［７−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｏｘｉｄｏ−１３−ｏｘｏ−１０−［（１−ｏｘｏｏｃｔａｄｅｃｙｌ）ｏｘｙ］−６，８，１２−ｔｒｉｏｘａ−３−ａｚａ−７−ｐｈｏｓｐｈａｔｒｉａｃｏｎｔ−１−ｙｌ］−ω−ｍｅｔｈｏｘｙ−  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）、化学式４で示されるＮ−（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２）、化学式５示される３−（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｇｌｕｔａｒｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、化学式６で示されるＮ−（３−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）等のリン脂質を挙げることができる。なお、化学式２乃至６において、ｎは５以上５００以下の整数である。
【化２】
2014227338.tif 000004
【化３】
2014227338.tif 000005
【化４】
2014227338.tif 000006
【化５】
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【化６】
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【００５１】
なお、本発明において用いる界面活性剤は１種類であってもよいし、２種類又はそれ以上の種類の界面活性剤を同時に用いてもよい。
【００５２】
（捕捉分子）
本発明の一実施形態おいて、上記の粒子の一部に、捕捉分子を固定化することにより、標的部位を特異的に標識することができる。
捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。
捕捉分子が化学結合された粒子を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。例えば、捕捉分子として腫瘍に特異的に結合する物質を採用すれば、腫瘍の特異的検出が可能となる。また捕捉分子として、特定の疾病部位の周辺に多く存在するタンパク質や酵素などの生体物質に特異的に結合する物質を用いれば、その疾病を特異的に検出することが可能である。なお、本実施形態に係る粒子によれば、捕捉分子を持たない場合でも、ＥＰＲ効果によって腫瘍を検出することは可能である。
【００５３】
（捕捉分子の固定化）
本発明の粒子には捕捉分子を固定化してもよい。固定化する方法は、含有粒子に捕捉分子を化学結合させることができる限り、いかなる公知の方法をも使用することができる。例えば、前記した界面活性剤が有する官能基と捕捉分子の官能基とを反応させて化学結合する方法等を使用することができる。
例えば、界面活性剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、アミノ基を有する捕捉分子と反応させて、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基は、グリシン、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
また、界面活性剤がマレイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、チオール基を有する捕捉分子と反応させて、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のマレイミド基は、Ｌ−システイン、メルカプトエタノール、又は末端にチオール基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
また、界面活性剤がアミノ基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、グルタルアルデヒドを用いて捕捉分子のアミノ基と反応させ、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等を反応させて未反応のアミノ基の活性をブロックすることが好ましい。あるいは、界面活性剤のアミノ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド基やマレイミド基に置換して、捕捉分子を固定化しても良い。
【００５４】
（粒子の製造方法）
本実施形態に係るＩＣＧ含有粒子の製造方法の一例は、ＩＣＧを含まない粒子（空リポソーム）を調製するステップと、ＩＣＧを内包させたＩＣＧ含有粒子を調製するステップとを含む。
【００５５】
（ＩＣＧを含まない空リポソーム粒子を調製するステップ）
以下に、本実施形態に係る粒子の製造方法の非限定的な例を挙げる。
【００５６】
（空リポソーム粒子の製造例）
【００５７】
（リポソームの調製方法）
リポソームは、公知のリポソーム製造方法により調製することができる。公知の技術としては、Ｂａｎｇｈａｍらの方法、その変法、超音波処理法、エタノール注入法、コール酸（界面活性剤）法、凍結融解法、逆相蒸発法、ならびに市販のキットを用いた方法などが挙げられ、これら公知の方法により調製されるリポソームを本発明に供することができる。すなわち、リポソーム調製時あるいは後にＩＣＧを内包化させることができる。
【００５８】
リポソームの製造方法の好ましい例は、Ｂａｎｇｈａｍらにより報告されたリポソーム作製方法に従うものである。すなわち、リン脂質などのリポソームの原料を有機溶媒に溶解、混合して、有機溶媒を減圧下で除去して脂質を乾固させ、これを水系媒体で分散させ、超音波照射により均一化させることでリポソームを形成させるものである。その後、リポソーム溶液を加温あるいは超音波処理することもできる。
【００５９】
以下、ＩＣＧを内包するリポソームの製造例を挙げる。リン脂質などのリポソームの原料を有機溶媒に溶解、混合し、有機溶媒を減圧下で除去して溶質を乾固させる。これを中性緩衝液で分散させ、超音波照射により均一化させることでリポソームを形成させることにより、リポソーム内部に中性緩衝液を含むリポソームを調製する。その後、リポソーム外側の緩衝液を酸性緩衝液に置換することにより、リポソーム内側が中性、外側が酸性のｐＨ勾配を持ったリポソーム分散液を調製する。得られたリポソーム分散液に酸性緩衝液に溶解したＩＣＧ溶液を添加し、原料リン脂質の転移温度以上で３０分間加温撹拌することによりＪ会合体化したＩＣＧがリポソームに内包されてしまう。
ＩＣＧを酸性緩衝液であるｐＨ３のクエン酸バッファ中で６０℃加熱するとＪ会合体化することが原因である。
ｐＨ勾配を利用した薬剤のリポソームへの内包方法は、塩基性薬剤のリポソーム内への内包に有効である。しかしＩＣＧは酸性薬剤であるため、本願発明者らはこれとは逆のｐＨ勾配をもつリポソームの調製を試みた。この条件でＩＣＧを内包させたところ、内包されたＩＣＧがほとんどＪ会合体化することがわかった。
【００６０】
Ｊ会合体化は反応速度論で説明することができ、反応速度には濃度と反応温度および触媒がパラメータとなる。
すなわち、ＩＣＧのＪ会合体化はＩＣＧ濃度と加熱温度およびリン脂質やクエン酸や水素イオンなどが正触媒として機能すると思われる。なお、本発明の尿素はＪ会合体化を抑制するため負触媒として機能すると考えることもできる。
【００６１】
（ＩＣＧを内包させたリポソーム粒子を調製するステップ）
本願発明者らは、上記、公知のｐＨ勾配法をさらに改良することにより、ＩＣＧを単量体としてリポソーム内へ高濃度に内包させることに成功した。
【００６２】
すなわち、ＩＣＧの調製方法は、ＩＣＧの酸性緩衝液（ＩＣＧ濃度＝１．５ｍＭ）に１００ｍＭ濃度となるよう尿素を添加することで加熱してもＪ会合体化しにくいＩＣＧの水溶液を調製することができる。得られたＩＣＧの水溶液を外水相として、上記の公知のＩＣＧを含まない空リポソーム粒子を調製するステップで得た空リポソーム調製後に内包化させることで、本発明の粒子を得られる。
内包化処理は上記したリポソーム外側の緩衝液を本発明の尿素を含む酸性緩衝液に置換してリポソーム内側が中性、外側が酸性のｐＨ勾配を持ったリポソーム分散液に、上記ＩＣＧ水溶液を添加し６０℃で３０分以上加熱撹拌する。
上述したように、本発明において、尿素はＪ会合体化を抑制するため負触媒として機能すると考えることができる。
なお、尿素は触媒として機能するため、尿素濃度に比例することはなく、図４の実験結果からわかるように一定濃度以上を添加していれば効果は同じであると思われる。図４の実験結果から本発明において１ｍＭ以上、特に１０ｍＭ以上の尿素濃度であることが好ましい。
【００６３】
このようにしてＩＣＧが内包されたリポソームを遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過などにより精製することで本発明のリポソームが調製される。本発明のＩＣＧを内包するリポソームの調製において重要なポイントは、ＩＣＧを内包させるためのＩＣＧの高濃度環境かつ加温によるリポソーム相転移のふたつである。
溶液中のＩＣＧの濃度は少なくとも０．１ｍＭ以上、好ましくは１．０ｍＭ以上であり、加温は少なくとも２０℃、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは６５℃以上である。しかし、９０℃では色素の分解が促進されることから、好ましい加温温度範囲は、３７℃から６５℃である。
【００６４】
（造影剤）
本実施形態に係る粒子はＩＣＧを含んでおり、近赤外光を吸収して蛍光又は音響波を発することができるため、蛍光イメージング用又は光音響イメージング用の造影剤として用いることができる。また、ＩＣＧは緑色であるため、目視で検出するための造影剤としても使用できる。
【００６５】
ここで、本明細書において「造影剤」とは、主に、検体内にあって観察したい組織や分子とその周囲の組織や分子とのコントラスト差を生じさせ、当該観察したい組織や分子の形態情報あるいは位置情報の検出感度を向上させることができる物質と定義する。ここで「蛍光イメージング」や「光音響イメージング」とは、上記の組織や分子を蛍光検出装置あるいは光音響信号検出機装置などによって、イメージングすることを意味する。
【００６６】
本実施形態に係る造影剤は、本実施形態に係る粒子及び前記粒子が分散された分散媒を有する。分散媒は、本実施形態に係る粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。また、造影剤は、食塩やグルコースなどの薬理上許容できる添加物を有していても良い。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００６７】
（蛍光イメージング法）
本実施形態に係る造影剤は、蛍光イメージング法に用いることもできる。本実施形態に係る造影剤を用いた蛍光イメージング法は、本実施形態に係る造影剤を検体もしくは前記検体から得られる試料に投与する工程と、前記検体もしくは前記検体から得られる試料に光を照射する工程と、前記検体内もしくは前記検体から得られる試料内に存在する前記粒子由来物質の蛍光を測定する工程と、を少なくとも有することを特徴とする。
【００６８】
本実施形態に係る造影剤を用いた蛍光イメージング法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、前記検体とは、実験動物やペット等、その他、特に限定されることなく、あらゆる生物を指し、前記検体中もしくは検体より得られた試料としては、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。前記粒子の投与あるいは添加後、前記検体等に対し近赤外波長域の光を照射する。
【００６９】
イメージングは、市販の蛍光イメージング装置ＩＶＩＳ  （ＩＶＩＳ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍなど）を用い、ＩＣＧフィルターを使って行うことができる。
上述したように、光イメージング装置はこの波長範囲を使うよう設計されているものが多く、ＩＶＩＳもＩＣＧ単量体の吸収波長７８０ｎｍには対応している（フィルタセット４のＥｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｐａｓｓｂａｎｄ７０５−７８０ｎｍ）。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
また、ＩＶＩＳ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍのスペックシートによればＱｕａｎｔｕｍ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  は  ＞８５％  ａｔ  ５００  ７００  ｎｍ，  ＞３０％  ａｔ  ４００  ９００  ｎｍとあるように、Ｊ会合体の吸収波長では装置の感度が低下することが知られている。
【００７２】
本実施形態に係る光音響イメージング法において、照射される光の波長は使用するレーザー光源により選択することが可能である。本実施形態に係る蛍光イメージング法においては、効率良く音響信号を取得するために、生体内における光の吸収、拡散の影響が少ない「生体の窓」と呼ばれる６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの、近赤外光領域の波長の光を照射することが好ましい。
【００７３】
本実施形態に係る造影剤からの蛍光を蛍光検出器で検出し、電気信号に変換することができる。この蛍光検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の内の吸収体の位置や大きさを計算することができる。例えば、造影剤が基準とする閾値以上で検出されれば、その検体に前記粒子由来物質が存在すると推定され、又は、前記検体より得られた試料に前記粒子由来の物質が存在すると推定することができる。
【００７４】
本実施形態に係る造影剤を検体に投与した場合、リンパ節、特にがん原発巣からリンパ管に流入したがん細胞が最初に到達するセンチネルリンパ節を好適に検出することできる。この場合、腫瘍内あるいは腫瘍周辺にリンパ節用造影剤を注射し、注射後の適切な時間に造影剤の検出を行う。
【００７５】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る造影剤は、光音響イメージング法に用いることができる。なお、本明細書において、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。本実施形態に係る造影剤を用いた光音響イメージング法は、本実施形態に係る造影剤を検体もしくは前記検体から得られる試料に投与する工程と、前記検体もしくは前記検体から得られる試料にパルス光を照射する工程と、前記検体内もしくは前記検体から得られる試料内に存在する前記粒子由来物質の光音響信号を測定する工程と、を少なくとも有することを特徴とする。
【００７６】
本実施形態に係る造影剤を用いた光音響イメージング法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、前記検体とは、実験動物やペット等、その他、特に限定されることなく、あらゆる生物を指し、前記検体中もしくは検体より得られた試料としては、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。前記粒子の投与あるいは添加後、前記検体等に対し近赤外波長域のレーザーパルス光を照射する。
【００７７】
本実施形態に係る光音響イメージング法において、照射される光の波長は使用するレーザー光源により選択することが可能である。本実施形態に係る光音響イメージング法においては、効率良く音響信号を取得するために、生体内における光の吸収、拡散の影響が少ない「生体の窓」と呼ばれる６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの近赤外光領域の波長の光、特に７００ｎｍ乃至９００ｎｍの波長の光を照射することが好ましい。
【００７８】
本実施形態に係る造影剤からの光音響信号（音響波）を、音響波検出器、例えば圧電トランスデューサで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の内の吸収体の位置や大きさ、あるいはモル吸光係数などの光学特性値分布を計算することができる。例えば、造影剤が基準とする閾値以上で検出されれば、その検体に前記粒子由来物質が存在すると推定され、又は、前記検体より得られた試料に前記粒子由来の物質が存在すると推定することができる。
【００７９】
本実施形態に係る造影剤を検体に投与した場合、リンパ節、特にがん原発巣からリンパ管に流入したがん細胞が最初に到達するセンチネルリンパ節を好適に検出することできる。この場合、腫瘍内あるいは腫瘍周辺にリンパ節用造影剤を注射し、注射後の適切な時間に造影剤の検出を行う。
【００８０】
本発明では、色素の漏出を抑制することで、色素の集積による消光を起こさせ、照射されたパルス光のエネルギーが蛍光発光に用いられることを防ぎ、より多くの熱エネルギーに変換することができる。そのため、より効率的に音響信号を取得することが可能となる。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例でＩＣＧを含む粒子を作製する際に用いる具体的な試薬や反応条件を挙げているが、これらの試薬や反応条件は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００８２】
（実施例１）
ＩＣＧのＪ会合体の形成例ならびにＪ会合体の抑制効果例を以下に記す。
１．５ｍＭのインドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）および、１００ｍＭ以下の各種濃度の尿素を含む水溶液を６０℃で３０分加熱した前後のスペクトルシフトを、各１００ｍＭ以下の尿素濃度で測定した結果一覧を図４に示した。また、１．５ｍＭのインドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）およびクエン酸を含み、かつ、尿素を含まない水溶液を６０℃３０分加熱した前後のスペクトルシフトを各１０ｍＭ以下のクエン酸濃度で測定した結果一覧を図５に、それぞれ示す。
【００８３】
図４および図５は添加物濃度系列による波長シフトの結果を示した図である。図４、図５の左端のマスはＩＣＧを含まない、添加物のみの吸収スペクトルで、各マスの横軸は波長で左端が５００ｎｍ、右端が９５０ｎｍであり、縦軸は吸光度でスケールは任意である。ここでいう添加物は、尿素のことである。
２段になっているマスの上段は加熱前で下段は加熱後の吸収スペクトルを示す。
左端のマスはＩＣＧを含まないブランクであって、左端から２マス目は１．５ｍＭのＩＣＧに１００ｍＭ添加物を加えた溶液の吸収スペクトルで、上段と下段は加熱前後を表わす。左端から３マス目は２マス目の半分の濃度の添加物を加えた溶液で、以下同様にＩＣＧは１．５ｍＭのまま添加物濃度のみを半分ずつ減じた溶液の加熱前後のスペクトルを示す。
ＩＣＧのＪ会合体は８９５ｎｍの吸収ピークを示す為、この有無でＪ会合体化の抑制効果を確認することができる。
【００８４】
図４のαで示される濃度範囲では、尿素の濃度が低いため、ＩＣＧのＪ会合体化が抑制されない。また、図５のβで示される範囲は、尿素を添加しないため、ＩＣＧのＪ会合体化が抑制されない。
【００８５】
また、非特許文献２でＩＣＧがＪ会合体化する条件を再現するために、６０℃で３０分加熱した前後のスペクトルシフトをＩＣＧ水溶液１．５ｍＭ以下のＩＣＧ濃度で測定した結果を図６に示す。
図６は左端のマスはＩＣＧを含まない水だけの吸収スペクトル、左端から２マス目は１．５ｍＭ  ＩＣＧ水溶液で上段と下段は加熱前後を表わし、３マス目は２マス目の半分の濃度のＩＣＧ水溶液、以下同様にＩＣＧ濃度を半分ずつ減じた溶液の加熱前後のスペクトルを示す。
各マスの横軸は波長で左端が５００ｎｍ、右端が９５０ｎｍであり、縦軸は吸光度でスケールは任意である。
【００８６】
図４で示すように、１．５ｍＭ  ＩＣＧ水溶液に１００ｍＭ尿素を添加すると加熱前後で吸収ピーク波長が変化せずＪ会合体化を抑制し、尿素濃度６．２５ｍＭ前後までＪ会合体の形成を抑制している効果がある。
同時にＩＣＧのＨ会合体は７００ｎｍ波長付近に吸収を持つことが知られているが、尿素添加するとＨ会合体の形成も抑制されている。
なお、尿素が希薄になるとＩＣＧは加熱後にＪ会合体を形成し８９５ｎｍ付近に吸収ピークを持つため、Ｊ会合体化の抑制が有効な尿素濃度範囲がわかった。
【００８７】
一方、図５においてクエン酸中ではクエン酸濃度によらず加熱後にＪ会合体を形成している。また、クエン酸濃度が１２．５ｍＭより高いときには凝集沈殿も生じているため溶液スペクトルのベースラインが低くなっている。
【００８８】
また図６では水溶媒においてＩＣＧ濃度を１．５ｍＭ以下としているが、非特許文献２などで実験している１．５ｍＭより低いＩＣＧ濃度範囲でもＪ会合体を形成し得る。
本実施例から、尿素を濃度６．２５ｍＭ以上入れるとＩＣＧはＪ会合体化を抑制されることがわかった。
Ｊ会合体化の抑制のメカニズムは不詳であるが、尿素が水クラスターをばらばらにするため、ＩＣＧに水和水が結合しやすくなると思われる。その結果、ＩＣＧ同士が凝集するのを抑制し、加熱しても単量体のまま存在するために吸収波長シフトが起こらないと推測される。
本発明のカオトロピック剤濃度は１ｍＭ以上１０Ｍ以下、特に好ましくは尿素が１０ｍＭ以上１Ｍ以下であることを特徴とする。
濃度の下限は図４ならびに図５に示した尿素添加による凝集抑制効果の現われる範囲である。
【００８９】
一方、濃度の上限範囲について以下で説明する。
尿素の水への溶解度は１０７．９ｇ／１００ｍｌ（２０°Ｃ）、半数致死量ＬＤ５０は８５００ｍｇ／ｋｇ（ｏｒａｌ，ｒａｔ）であることが知られている。
静脈注射液量１０ｍｌ（肝・循環機能検査用薬ジアグノグリーンと同じ液量）に尿素は１０．７９ｇ溶解し、１リットル当たり１０７９ｇで尿素の分子量６０．０６であるから、１７．９Ｍまで溶解する。
また、体重５０ｋｇで換算すると半数致死量ＬＤ５０＝８．５ｇ／ｋｇ×５０ｋｇ＝４２５ｇとなるが、注射液１０ｍｌには上記したように１０．７９ｇまでしか溶解しない。
また、本発明の尿素濃度の上限値１０Ｍを添加した１０ｍｌ注射液内には
６００．６ｇ×１０／１０００＝６．００６ｇの尿素が存在し、
体重５０ｋｇの半数致死量ＬＤ５０に対して６．００６ｇ／４２５ｇ＝１．４１×１０−２であるため半数致死量ＬＤ５０の約１／１００の無作用量、あるいはそれ以下の濃度で十分な凝集抑制効果を得られた。
【００９０】
（実施例２）
（様々な系におけるＩＣＧ含有粒子の調製と比較）
表２に示した内水相、外水相の組み合わせにより、実施例３、比較例１，２のＩＣＧ含有粒子を調製した。なお、内水相とは、粒子の内側に含まれる相を指し、外水相とは、粒子の外側の相を指す。
実施例３は、外水相と内水相でｐＨ勾配があり、なおかつ、外水相が尿素を含む例、比較例１は、ｐＨ勾配はあるものの外水相が尿素を含まない例、比較例２は、ｐＨ勾配がなく、かつ外水相が尿素を含まない例を示す。
いずれにおいても、空リポソームの調製方法は以下のとおりである。すなわち、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−８０８０、日本油脂製）、コレステロール（和光純薬製）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、日本油脂製）をそれぞれ重量比で３：１：１に秤量した。３種の脂質の合計量１０２ｍｇあたりメタノール・クロロホルム（１：１）溶液２ｍｌに溶解し、３７℃で１時間撹拌した後、溶媒留去し、さらに室温で一晩、真空乾燥した。得られた脂質乾固物（３種の脂質の合計量１０２ｍｇにつき）に表２に示した内水相の溶液を１０ｍｌをそれぞれ添加し、３７℃で１時間撹拌した。そして６０℃で３０分間、バス型超音波装置（３周波超音波洗浄器  ＶＳ−１００ＩＩＩ、アズワン製）により超音波処理（２８ｋＨｚ６０秒→４５ｋＨｚ６０秒→１００ｋＨｚ３秒のサイクルで照射）した後、ポアーサイズ０．２２μｍ膜を通過させた。通過した空リポソーム分散液の外水相を限外ろ過（撹拌式セル、限外ろ過膜３００ＫＤａ、ミリポア製）により表２に示した内水相の溶液である、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ，  ＮａＣｌ  １５０ｍＭ，  ｐＨ  ７．３にそれぞれ置換した後、濃縮し、ＤＳＰＣとコレステロールの合計脂質濃度を４０ｍｇ／ｍＬに調整した。ＤＳＰＣとコレステロールの定量は市販定量キット（リン脂質Ｃテストワコー、コレステロールＥ−テストワコー、和光純薬製）で行った。
【表２】
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ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ，  ＮａＣｌ  １５０ｍＭ，  ｐＨ  ７．３は、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピぺラジニル］−エタンスルホン酸、インビトロジェン製）を濃度１０ｍＭに１０ｍＭ水酸化ナトリウムを添加してｐＨ７．３にｐＨ調製した緩衝液である。
クエン酸  １０ｍＭ，  ｐＨ３．０は、クエン酸一水和物（ナカライテスク製）とクエン酸三ナトリウム二水和物（ナカライテスク製）を溶解しｐＨ３．０に調製した緩衝液である。クエン酸  １０ｍＭ，  尿素  １００ｍＭ，ｐＨ３．０は、尿素（和光純薬製）を前記クエン酸緩衝液１リットルに６ｇ添加し濃度１００ｍＭに調製したものである。
【００９１】
（実施例３）
（外水相と内水相でｐＨ勾配があり、なおかつ、外水相が尿素を含む系で調製されたＩＣＧ含有粒子）
（実施例３−１）
（ＩＣＧ含有粒子の調製）
インドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）を実施例３の外水相の溶液である、クエン酸  １０ｍＭ，  尿素  １００ｍＭ，ｐＨ３．０に溶解し、ＩＣＧ濃度、６ｍｇ／ｍｌとなるＩＣＧ溶液を作製した。上記、実施例２で調製された空リポソームにＩＣＧ溶液を添加し、以下の条件でＩＣＧ内包処理したリポソームを調製した。すなわち、ＩＣＧ溶液及び上記で調製された空リポソームの分散液を６０℃の恒温槽中に１５分置いて、それぞれ、６０℃に加温した。２．５ｍＬの空リポソーム分散液に、２．５ｍＬのＩＣＧ溶液を添加し、６０℃で３０分撹拌した）。その後、外水相の溶液１５ｍｌ添加し、回収したリポソーム分散液にさらに、さらに外水相の溶液を注入しながら限外ろ過（限外ろ過膜３００ＫＤａ）処理し、遊離のＩＣＧを除去し精製した。精製後、液量をおよそ４ｍｌに濃縮し回収した。
ＩＣＧ含有粒子はさらに精製を進めるため及び小粒径成分を回収するため、遠心分離機を用いて２８８０００Ｇの加速度で２０分間の遠心分離を行い、沈殿した大粒径リポソームならびに不純物を除去して上清のみを回収した。
【００９２】
（実施例３−２）
（吸収スペクトル測定）
実施例３−１で得られたＩＣＧ内包化処理リポソームを実施例３の外水相の溶液で希釈し、波長５００〜９５０ｎｍ間の吸光度を測定し、最大吸収波長及びＡｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比を求め、粒子中のＪ会合体の形成を確認した。
本実施例のＩＣＧ含有粒子、すなわち、ｐＨ勾配を施し、外水相にクエン酸緩衝液と尿素を用いて調製したリポソームは、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比が０．２以下と低く、また最大吸収波長も８９５ｎｍ前後を示さず、ほとんど粒子内のＩＣＧはＪ会合体を形成していないことが分かった（図７）。
さらに、内水相にデキストラン４０や塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加してもよい。
【００９３】
（実施例３−３）
（粒径測定）
実施例３−１で得られたＩＣＧ含有粒子の粒径をＤＬＳ（ゼータサイザーナノ、マルバーン社製）で測定した。
本発明におけるｐＨ勾配法を適用する空リポソーム１と内包・精製後のリポソームの粒径を図１０に示した。本発明のＩＣＧ含有粒子は１００ｎｍ前後の粒径として調製できることが分かった。
なお、ＩＣＧ含有粒子は小粒径成分を回収するため、遠心精製により大粒径化したリポソームや不純物を除去したため、平均粒径および粒径分布が空リポソームより若干小さくなっている。
【００９４】
（比較例１）外水相と内水相でｐＨ勾配があるが外水相が尿素を含まない系で調製されたＩＣＧ含有粒子
（比較例１−１）
（ＩＣＧ含有粒子の調製）
外水相として、表２で示される比較例１用のものを用いたほかは、実施例３−１と同様の処理により、ＩＣＧ含有粒子を調製した。
【００９５】
（吸収スペクトル測定）
得られたＩＣＧ含有粒子の７８０ｎｍと８９５ｎｍの吸光度を測定した。表５にＡｂｓ８９５とＡｂｓ７８０、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０を示した。
本比較例において、ｐＨ勾配を施した、外水相に尿素を含まずクエン酸緩衝液のみを用いて調製したリポソームは図８で示したように、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比が２以上と高く、また８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大を示したことにより、Ｊ会合体ＩＣＧを内包したリポソームが調製されたことがわかった。
【００９６】
（比較例２）
（外水相と内水相でｐＨ勾配がなく、かつ、外水相が尿素を含まない系で調製されたＩＣＧ含有粒子）
（比較例２−１）
（ＩＣＧ含有粒子の調製）
外水相として、表２で示される比較例２用のものを用いたほかは、実施例３−１と同様の処理により、ＩＣＧ含有粒子を調製した。
【００９７】
（吸収スペクトル測定）
本比較例で調製された粒子は、図７で示した本発明と同様、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比が０．２以下と低く、また最大吸収波長も８９５ｎｍ前後を示さず、ほとんどリポソーム内のＩＣＧはＪ会合体を形成していないことが分かった（図９）。
表３はｐＨ勾配を施した場合とｐＨ勾配を施さない場合とのＩＣＧ含有粒子の物性値を比較したものである。
ｐＨ勾配を施さない場合、ＩＣＧ内包率が低い粒子であることは表３におけるｐＨ勾配なしのＩＣＧ回収率および含有率で示したとおりであり、ＩＣＧ含有率を高めるためにはｐＨ勾配を施す必要があることは明らかである。
表３の例ではｐＨ勾配ありはｐＨ勾配なしに比較して５．７〜６．０倍の濃縮効果が得られている。
【表３】
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【００９８】
（実施例３）
（光音響信号の測定）
実施例２で得たＩＣＧ含有粒子の光音響信号の強度を測定した。比較例としてＩＣＧ水溶液も同様に測定した。光音響信号の計測は、パルスレーザー光をサンプルに照射し、サンプルから光音響信号を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザ（Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７８０ｎｍあるいは８９５ｎｍ、エネルギー密度は１２ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は２０ナノ秒、パルス繰返しは１０Ｈｚの条件とした。超音波トランスデューサとしては、型式Ｖ３０３（Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ社製）を用いた。中心帯域は１ＭＨｚ、エレメントサイズはφ０．５、測定距離は２５ｍｍ（Ｎｏｎ−ｆｏｃｕｓ）、アンプは＋３０ｄＢ（超音波プリアンプ  Ｍｏｄｅｌ  ５６８２  オリンパス社製）の条件である。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。溶媒は水を用いた。計測器は、ＤＰＯ４１０４（テクトロニクス社製）を用いて、トリガー：光音響光をフォトダイオードで検出、Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：１２８回（１２８パルス）平均の条件で測定を行った。
波長は７８０ｎｍにおける光音響信号測定の結果、本実施例１のＩＣＧ含有粒子はＩＣＧ水溶液に比較して、１．７倍の光音響信号を発生することが分かった。
【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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