(57)【要約】【課題】本発明は、採取哺乳類組織およびインビボ技術により製造した生存培養組織相当物の優れた凍結保存パッケージデザインを提供することを目的とする。【解決手段】哺乳類組織または培養組織相当物を凍結保護溶液中に浸し、凍結保護溶液および浸した組織を撹拌し、組織内への凍結保護溶液の有効な浸透を達成し、次いでゆっくりした凍結速度で組織を凍結させる。凍結工程において、細胞外氷形成を種晶添加により開始させる。凍結保存組織は、使用前、無期限に保存し得る。培養組織相当物は、皮膚または角膜のような相当ヒト組織のインビトロモデルであり、貯蔵から回収した時、インビボで移植または内移植にまたはインビトロで化合物スクリーニングに使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取哺乳類組織または培養組織相当物（以下、両者を「組織」という）を凍結保存する（cryopreserving）方法であって、
（ａ）組織を凍結保護溶液中に浸漬し、凍結保護溶液および浸漬した組織を撹拌して組織内への凍結保護溶液の有効な浸透を達成し、浣流組織（perfused tissue）を得る;
（ｂ）凍結保護溶液および浣流組織に細胞外氷を種晶添加(seeding)する；
（ｃ）工程（ｂ）からの浣流組織を、ゆっくりした速度で少なくとも約−７０℃またはそれ以下の温度へ凍結保存状態まで冷却することにより、凍結保存組織を調製する；および
（ｄ）凍結保存組織を少なくとも約−７０℃またはそれ以下の温度で貯蔵する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、浸漬を約２０℃の温度で開始し、そして浣流の間に約−１０℃／分の速度で約−６℃の温度へ冷却する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において、−１℃／分の速度で約−８℃の温度へ冷却して凍結させ、そして組織中の凍結保護溶液の物理学的および生物学的平衡化を達成するのに充分な時間、維持する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において、組織中の凍結保護溶液の物理学的および生物学的平衡化を達成するのに充分な時間、温度が一定に維持される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
冷却が約−０.３〜−０.０２℃／分の速度で約−７０℃またはそれ以下の温度へ続けられる、請求項３記載の方法。
【請求項６】
採取哺乳類組織が採取哺乳類皮膚である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
培養組織相当物が培養上皮相当物、培養皮膚相当物および培養角膜相当物からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
凍結保存状態の温度が−１２０℃またはそれ以下から−１９６℃またはそれ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
凍結保護溶液が、ダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)中に１.５〜２.５Ｍグリセロールを含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
更に凍結保存組織の融解を含み、該組織が約１〜２分で融解される、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野：
本発明は、採取組織およびインビトロ技術を使用して製造した培養組織相当物の凍結保存に関する。本発明はまた、凍結保存すべき組織または組織相当物の最大生存率を可能にする、実際的価格で、パッケージデザイン、（設計（品）、以下同じ）の取り扱いが容易である、採取組織および培養組織相当物の凍結保存パッケージデザインにも関する。凍結保存技術の使用により、凍結保存採取組織または凍結保存培養組織を、使用前に、無期限に貯蔵し得る。培養組織は、相当ヒト組織のインビトロモデルであり、貯蔵から回収した時、インビボで移植または内移植またはインビトロで化合物スクリーニングに使用できる。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景の簡単な説明：
インビトロ技術は、インビトロ試験または創傷修復のためのインビボ移植の目的で組織相当物を開発している。このような組織相当物の製造法は、米国特許第４,４８５,０９６号、第４,６０４,３４６号、第４,８３５,１０２号および第５,３７４,５１５号および米国出願番号第０８／１９３,８０９号および第０８／３３７,８３０号に記載されており、これらすべてを本明細書に参考として包含させる。
【０００３】
生存組織の貯蔵寿命は限度があり、従って、その使用可能期間は短く、多くの廃棄をもたらす。このような組織を、使用まで、輸送および貯蔵のために、長時間保存することが必要である。凍結保存法および凍結保存および貯蔵用のパッケージの開発は使用の窓を無限に広げ、運搬を容易にし、在庫の維持を可能にする。熱傷処置センターおよび病院での組織在庫を可能にすることもまた望ましい。他の利点は、サンプルが製造サイクルの種々の段階から、品質管理のために採取でき、それらが凍結状態で維持できる限り、大きいバッチが製造できることである。
【０００４】
現在、細胞性生物学的物質の貯蔵時間は、“凍結発生(cryogenic)”温度まで冷却することにより延長される。システムの温度を下げることによる液体から固体段階への移行は、水分子の規則正しい配列を含む凍結(氷)またはこのような結晶相の規則正しい配列なしのガラス化または無定形化(ガラス形成)として進行する。凍結生物学者に課された挑戦は、細胞を傷つけることなく凍結発生温度にし、再び生物学的状態に戻すことである。
【０００５】
細胞および組織の凍結保存のために二つの基本的試みがある：凍結−融解およびガラス化である。凍結−融解法において、細胞外溶液を凍結(すなわち、結晶形)させるが、細胞内氷形成を最小にする工程を行う。ガラス化方法において、全サンプル中の氷形成を防止する試みがある。前者の試みは、氷が細胞内に形成された場合、融解した時の細胞生存率に有害であることが問題である。しかしながら、細胞は、非毒性レベルの凍結保護剤の存在下で制御された速度で冷却された場合、凍結−融解サイクルで生存する。後者のガラス化の試みは、非常に高濃度の溶解物および／またはポリマーを使用して氷形成を抑制することにより、細胞内および外の氷による可能性のある障害が避けられるように思われる。しかしながら、細胞障害は、ガラス化に必要な毒性レベルのこれらの添加剤に長時間さらすことにより起こり得る。
【０００６】
凍結保護剤は、凍結工程に関与する負荷から生存細胞を保護する。凍結保護剤が細胞を保護する一つの方法は、水が氷になるに連れて、非凍結溶液中で徐々に濃縮される塩を希釈することによる。氷の量は、温度および最初の溶液の組成により決められる；一方、非凍結フラクションの量は、温度のみの関数である。凍結保護剤は、他の幾つかの機能を有する。重要なものは、それらが細胞内氷形成温度を通常低下させることである。他の機能は、それらが膜およびタンパク質を安定化することである。
【０００７】
すべての溶液は、それらが結晶形成のための無作為凝集地点が定まるまで、凍結点以下で超冷却である。凍結−融解法による凍結保存法する場合、細胞外培地での氷形成は低度の超冷却で種晶添加（seeding）することにより、故意に開始させなければならない。氷形成が種晶添加により誘発されない場合、氷は、溶液をその平衡凍結点より遥かに低く充分に冷却することにより、自然に形成される。この工程が、天然では無作為であるため、氷形成は無作為に予期できない温度で起こる；従って、生存率は、同じ凍結プロトコールの反復試験でその都度変化する。更に、高度に超冷却された溶液中で氷が形成される場合の非常に急速な結晶化は、細胞および組織に障害をもたらし得る。更に、細胞外氷形成が超冷却の非常に高い程度で開始した場合、細胞内氷形成の可能性は非常に増加することが示されている。この現象は、凍結−誘発細胞脱水の遅い開始に由来し、それは細胞内水の増加した保持、従って、細胞内での氷形成の高い可能性をもたらす。
【０００８】
一度細胞外氷を種晶添加し、サンプルが氷相で囲まれた場合、サンプルを凍結保護段階に冷却することが必要である。冷却段階は、凍結−融解プロトコールで最も重要な段階の一つである。氷、即ち純水氷形成のため、部分的凍結細胞外溶液は細胞内区画よりも濃縮される。結果として、細胞は熱力学的平衡を保持するために、水を失うことにより脱水する。全システムが冷却するに従って、より多くの細胞外氷が形成され、溶解物の濃度が増加し、細胞をより脱水させる。その脱水速度を制御できる細胞の３つの特性がある。一つは、膜水透過性である；水透過性が低い程、細胞脱水により長い時間がかかる。他のものは細胞膜水透過性の温度依存性である；すべての細胞は温度が低下するとその水透過性を減少させる。最後は細胞サイズである；より大きい細胞は小さい細胞より脱水に時間がかかる。各細胞タイプが非常に異なる特性を有し得るとすれば、最適凍結保存状態は、異なる細胞タイプにおいて強さの程度を変化できる。
【０００９】
凍結保存中の細胞障害の正確な機構はまだ完全には明瞭になっていないが、冷却速度の関数としての細胞生存率の測定により得られる特徴的生存のサインは、全ての細胞タイプで定性的に同一であるように見え、逆Ｕ字曲線を示す。細胞生存率は、非常に遅いおよび非常に速い冷却速度で低く、中間の冷却速度が最大生存率を与える。最適冷却速度および曲線の幅は異なる細胞タイプで激しく変化し得るが、定性的挙動は普遍的であるように見える。より速い冷却速度は、細胞が脱水するのに充分な時間を与えず、細胞は内部に氷を形成する。速い冷却速度での細胞障害は、細胞内氷形成による。冷却の遅い速度では、細胞障害は高濃度の細胞内塩および細胞外塩および凍結保護溶液にさらすことによるものであるか、または細胞と細胞外氷の機械的相互作用によるものであると考えられる。
【００１０】
細胞を、細胞内氷凝集曲線と交差する前にできるだけ脱水することが必要である。この点で、細胞内に残る実際の全ての水が凝集し、氷を形成する。これが起こる正確な温度を決定することは実際的ではないが、細胞を１Ｍから２Ｍの濃度の凍結保護剤の存在下でゆっくり凍結した場合、−４０℃から−５０℃である。この点で細胞内で氷に変わる水の量は、凍結の場合無害であるが、充分に早く融解しない場合、融解において広がり、細胞を殺し得ることに注意することは重要である。(Ｔhe Ｂiophysics of Ｏrgan Ｃryopreservation, 117-140頁, Ｄavid Ｅ. ＰeggおよびＡrmand Ｍ. Ｋarow, Ｊr.編, NATO ASI Ｓeries Ａ：Ｌife Ｓciences Ｖol. 147 1987 Ｐlenum Ｐress, Ｎew Ｙork 233 Ｓpring Ｓt., Ｎew Ｙork, NY 10013)。
【００１１】
商業的に実行可能な皮膚相当物の開発前は、死体皮膚を移植の目的で使用していた。凍結保存プロトコールは、熱傷センターおよび病院が皮膚バンクを維持できるように開発された。多くの異なるプロトコールが、異なる凍結保護剤、凍結速度、包装形態および貯蔵状態を用いて開発された。ほとんどの研究者が、急速融解プロトコールで同意見であった。プロトコールの成功または失敗は、創傷を埋めるのに使用した移植片または細胞生存率検定で測定した。
【００１２】
Ｂeisangの米国第３,８４２,８３１号は、死体皮膚パッチの凍結保存法を記載している。方法は、死体皮膚の粗く織ったスクリムまたは裏地への接触、並びに、皮膚パッチおよびスクリムを凍結前に巻くことを含む。凍結保護剤は、発明者はグリセリンまたはＤＭＳＯの使用を示しているが、使用しない。凍結プロトコールは、凍結発生温度−７０℃までの急速非制御(固定温度)凍結速度プロトコールを使用する。
【００１３】
Ｍay ＳＲおよびＦＡ ＤeＣlement(Ｓkin Ｂanking Ｍethodology, 17, 33-45(1980))は、デルマトーム(dermatome)死体皮膚を使用して、包装幾何学および冷却および加温速度の評価を行った。結果は、死体皮膚は、巻くよりむしろ平で、凍結の遅い制御速度を用いることを示した。
【００１４】
Ｔuboの米国第５,０４０,６７７号は、上皮細胞シートの個々の片のガス−密閉可能容器を記載している。容器は、上皮細胞シートが、クリップの使用により粘着支持体シートまたは裏地に付着していることを必要とする。
【００１５】
Ｔuboの米国第５,１４５,７７０号は、−１℃／分の冷却速度で、デキストランのような非細胞浸透剤の凍結保護剤を使用する、角化細胞の凍結保存法を記載している。同様に、Ｃhao et al.の欧州特許第０３６４３０６号は、生存、培養上皮細胞のシートの凍結保存法を記載しているが、ＤＭＳＯおよびグリセロールの両方を凍結保護剤として使用し、好ましい凍結プロトコールは−１℃／分である。
【００１６】
Ｃancedda et al.の米国第５,２９８,４１７号は、米国第４,０１６,０３６号、第４,３０４,８６６号および第４,４５６,６８７号に記載のように製造した上皮シートのような一層構築物のために開発した凍結保存プロトコールを記載している。上皮シートを８−１５％グリセロールまたはＤＭＳＯの凍結保護剤とインキュベートし、冷却速度がプロトコールの最後よりも最初が遅く、凍結手順の頂点の前に温度が上昇することにより特徴付けられる、制御速度プロトコールを用いて凍結保存する。
【００１７】
コラーゲンゲル中の皮膚線維芽細胞の凍結保存法は、Ｔeasdale et al., Ｂurns, 19(5)406-410(1993)により発明された。Ｔeasdaleは、最大細胞生存率が、ＤＭＳＯを凍結保護剤として−０.５℃／分の凍結で得られることを測定した。
【００１８】
Ｎanchahal et al., "Ｃultured composite skin grafts:Biological skin equivalents permitting massive expansion", Ｔhe Ｌancet, 2(8565), 191-193(Ｊuly 22, 1989)は、Ｍedium 199中に１５％グリセロールおよび１０％ＦＣＳの凍結保護剤を使用した合成培養組織片の貯蔵技術を記載している。移植片および凍結保護剤を３７℃で２時間インキュベートし、次いで、−１℃／分で−７０℃まで凍結させ、次いで、液体窒素中で保存した。移植片の急速融解後、その生存率を２週間の培養によりおよび無毛マウスへの移植により測定した。最終評価を、入れ墨消去を行っている３名の患者に移植して行った。
【００１９】
Ｊohnstone et al., "Ｃryopreservation of Ｒabbit and Ｃat Ｃorneas at −18 to −24℃", Ｃornea, 11(3):211-220(1992)は、液体窒素または非常に低温の冷凍庫よりむしろ家庭用冷凍庫を使用した、ウサギおよびネコ角膜の凍結保存の単純な方法を記載している。凍結保護剤の浣流を、角膜を５０％ウシ胎児血清および増加したグリセロールおよびグルコース濃度のＭcＣarey−Ｋaufman培地の連続溶液に置くことにより得る。
【００２０】
先行技術を使用して、培養組織相当物を凍結保存することは不可能であり、これは、一部分、それらが相対的に厚く、不均質細胞層のためである。これらの組織のインビボの一つの機能は、浸透性バリアーの形成である。組織機能は、凍結保存プロトコールの開発において考えなければならない。
【００２１】
本発明者は、凍結保存法、および特に、培養組織相当物の凍結保存のための驚くほど有効であり、商業的に実際的なパッケージである、多くの培養組織相当物および哺乳類皮膚に適用可能なパッケージデザインを発明した。
【００２２】
発明の要約
本発明は、プログラム可能冷凍装置を使用した実行可能な温度での、有害な細胞内氷結晶の形成を避け、有害な可能性のある化学物質の有効な濃度を減少させ、凍結保護剤の急速挿入および除去を可能にした、非常に低温での培養組織相当物の優れた凍結保存法を提供する。
【００２３】
本発明はまた培養組織相当物の凍結保存、貯蔵および搬送のために開発された新規パッケージデザインも提供する。新しいデザインは、既存のパッケージデザインを超える多くの利点を提供する。現在、商業的に入手可能な凍結保存培養組織相当物はなく、従って、出荷用のパッケージデザインは入手可能ではない。新規パッケージデザインはより効率的な熱伝導を用いて、凍結チャンバーの外部の温度によるパッケージ内部のより良好な温度追跡を可能にする。改善された熱伝導率は、より制御された；従って、培養組織相当物の均一な冷却および加温速度を可能にし、それにより細胞生存率のバラツキを減少させる。
【００２４】
本発明者らは、組織がその生存率およびヒト組織相当物としての利用能を維持するような、インビトロ技術から製造した培養組織相当物の凍結保存を発明した。本発明は、有効な量の凍結保護剤の浸透を促進する撹拌の使用を含む。本発明法は、採取組織および培養組織相当物の両方の、構造的無傷さおよび細胞性生存率を守る方法での凍結保存法を提供する。
【００２５】
本発明の方法は、以下の工程を含む：
１）採取組織または培養組織相当物を凍結保護溶液中に浸し、凍結保護溶液および浸した組織を撹拌し、組織内への凍結保護溶液の有効な浸透(組織の浣流（perfusion）)を達成する；および
２）凍結保護溶液の組織への浣流の後、凍結保護剤の固体−液体相平衡温度範囲まで冷却する；細胞外氷を種晶添加し、遅い凍結速度で、少なくとも−７０℃またはそれ以下、より好ましくは−１２０℃またはそれ以下、より更に好ましくは−１４０℃および最も好ましくは−１９６℃の温度まで、組織を凍結させることにより、凍結保存状態まで冷却する。
【００２６】
一度凍結させたら、凍結保存組織は約−１２０℃から約−１９６℃の温度である液体窒素の温度で、無期限に貯蔵できる。
【００２７】
凍結保存組織の融解は、約１分から２分で行う高速で、凍結組織を暖めることにより達成される。凍結組織の融解は、直接暖かい培養培地を適用することにより、または、生理学的緩衝液により、または他の急速加温法で行い得る。パッケージデザインは、組織の融解を、パッケージデザインが、重要な融解工程中の無菌状態を維持しながら、急速加温速度および熱均一性制御を確保するため、パッケージを水浴に浸すことによりできる。
【００２８】
移植またはインビトロ試験のためのヒト組織の相当物の使用前に、融解培養組織を濯ぎ、凍結保護溶液を除去する。凍結保護溶液は、例えば、生理学的ｐＨで等張性の緩衝液で濯ぐことにより除去し得る。次いで、培養組織相当物を、使用前にこのような緩衝液中に一時的に貯蔵できるか、または適当な細胞培地で再培養できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは蓋を示す。
【図２】図２はシールの平面図を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは蓋においたシールを示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは担体を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂはトレイを示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、組み立て品の分解図および完成図の側面図を示す。
【図７】図７は、組み立て品の精密図を示す。
【図８】図８は、完成した組み立て品の平面図を示す。
【図９】図９は、非凍結保存培養組織と比較した凍結保存培養組織の生存率のグラフを示す。ＭＴＴにより測定した凍結保存培養組織の生存率を示す。ＬＳＥは更にＬＤＨ検定で測定した。全ての培養組織は、年令適合非凍結保存対象と比較し、対象のパーセントとして示す。
【００３０】
発明の詳細な説明
組織工学は、培養組織細胞を使用し、化学薬品または医薬化合物による傷の応答の試験に使用できる組織相当物を利用する、新しい領域である。培養組織は、移植可能ヒト組織を形成するのにも使用し得る。
【００３１】
組織相当物は、全て本明細書に参考として包含する、米国特許第４,４８５,０９６号；第４,４８５,０９７号；第４,５３９,７１６号；第４,５４６,５００号；第４,６０４,３４６号；第４,８３７,３７９号および第５,３７４,５１５号を含む多くの特許に広範囲に記載されている。組織相当物の一つの成功した適用は、実際のヒト皮膚と類似の形態を有する“生存皮膚相当物”である。生存皮膚相当物(ＬＳＥ)は二層から成る；上部は分化したおよび層状のヒト表皮角化細胞から成り、それがコラーゲンマトリックス内のヒト皮膚線維芽細胞の下層を覆う。Ｐarenteau et al., "Ｅpidermis Ｇenerated Ｉn Ｖitro：Ｐractical Ｃonsiderations and Ａpplications", Ｊ. of Ｃellular Ｂiochemicstry, 45:245-251(1991)；Ｐarenteau et  al., "Ｔhe organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to acheve form and function", Ｃytotechnology, 9:163-171(1992)；およびＢell et al., "Ｔhe Ｌiving Ｓkin Ｅquivalent：Ｉts Ｍanufacture, Ｉts Ｏrganotypic Ｐroperties and Ｉts Ｒesponses to Ｉrritants", Ｔoxic. in Ｖitro, 5:591-596(1991)。移植のためのＬＳＥは、皮膚傷の部分的および完全な厚さに関する適応症：切除手術、熱傷、静脈停滞潰瘍、糖尿病性潰瘍および慢性炎症性潰瘍に関して臨床試験されている。ＬＳＥは、完全な厚さで、二層で、インビトロ工学皮膚組織である。
【００３２】
眼の角膜のインビトロ器官相当物が、本明細書に参考として包含させる米国特許第５,３７４,５１５号に記載のように開発されている。角膜組織相当物は、３つの別の細胞層、層状鱗屑状上皮である外部層；コラーゲン線維および間質細胞の中間層；およびまた角膜内皮とも呼ぶ単層鱗屑状上皮である内部層を有する。インビトロ角膜相当物は、インビトロ毒性検定に使用でき、多くのタイプの生産物および未加工材料のインビボ眼および皮膚刺激の可能性の正確で安価な非動物予測モデルとして働く。
【００３３】
凍結保存の目的は、無期限の生物学的物質の構造的無傷さおよび生存率の保存であり、これらの物質を必要に応じて利用可能および使用できるようにする。限定生存時間の複合組織は、製造物利用能および実用性を広げるために凍結保存が必要である。しかしながら、生物学的物質の凍結保存の歴史は、特定細胞の凍結保存プロトコールの最適化が、他の細胞タイプに使用した場合またはその組織の他の細胞に使用した場合に必ずしも良好な結果とはならないことを示す。完全な厚さの組織相当物の細胞密度、水含量および構造的構成のレベルの差のためのより特定化した方法の発展が必要であった。本発明の凍結保存プロトコールは、驚くべきことに、一層表皮および皮膚層単独、二層組織相当物、三層角膜相当物および採取哺乳類動物皮膚に適用可能である。パッケージデザインの開発は、これらの組織の凍結保存を、製品規模工程で実際的にする。
【００３４】
本明細書で使用する限り、“培養組織相当物”は、哺乳類組織の組織相当物を意味し、組織相当物はインビトロ技術で製造され、皮膚相当物または上皮シートの何れかである一層皮膚相当物；二層皮膚相当物、特にＬＳＥ；および三層角膜相当物および皮膚相当物を含む。培養組織相当物の形態は、インビボ哺乳類器官、特にヒト器官のものと類似である。説明のために、ＬＳＥの形態は、ヒト皮膚と多くの類似性を有する。代謝的および有糸分裂的に活性なヒト皮膚線維芽細胞(ＨＤＦ)は、構築物の皮膚層に見られ、格子にコラーゲンおよび他のマトリックス成分を分泌することが示されている。基底層から成る表皮は、ヒト皮膚と同じ有糸分裂速度で分裂することが示されている。基底の上の表皮は、角質層で覆われたケラトヒアリンおよび薄層顆粒を含む良く定義された棘および顆粒層と共にインビボ皮膚と同じ層を示す。免疫組織化学は、正常ヒト皮膚の皮膚−表皮接合部に通常見られるような、細胞外マトリックス成分、例えば、ラミニン、IV型コラーゲンおよびカラニン(ＧＢ３)の存在を証明する。
【００３５】
生存皮膚相当物(ＬＳＥ)のように、器官代表的方法により得た培養組織相当物は、その上に相当物を形成する枠組みとしての担体として利用する。培養組織相当物を、構築物に直接接触することなく、製造、輸送および最終目的使用中の構築物の操作を可能にする、担体上に組み立てる。担体上に培養組織相当物を製造する方法は、米国特許第５,３７４,５１５号、米国特許出願第０８／１９３,８０９号および第０８／３３７,３８０号に記載されている。
【００３６】
担体は、本質的に管状支持体の一端に付着している平らな浸透可能膜を含む。管状支持体の他端は、外側に伸びているフランジを含み、それは、次いで、組織培養皿中および本発明のパッケージデザイン中のウェルの上部端を吊すことが出来るリムを有する。膜支持集合は、特異的な大きさのウェルを少なくとも一つ有する培養皿で使用するための大きさであり、支持体に関した適当な隙間を提供し、ウェルの上端と連合する。膜支持集合は、異なる大きさの培養皿および凍結保存および貯蔵パッケージで使用するように、異なる大きさで製造され得る。これらの担体の例は、米国特許第５,４６６,６０２号に記載のようなTRANSWELL(登録商標)(Ｃostar)である。パッケージデザインの修飾は、当業者が、培養容器中の支持および連合の異なる手段を用いる類似の担体を製造するために行い得る。類似の担体が、米国特許第５,３５８,８７１号および第５,３６６,８９３号に記載され、または米国特許第４,８７１,６７４号に記載のものである。
【００３７】
本発明の好ましいパッケージデザインは、担体枠組みを含み、予め決定された詳細に対して制御し得るように、組織相当物の回りの環境を限定する。本発明は、好ましくは医薬グレードの品質で、広範囲の温度に耐えることができる材料を使用する。これらの材料を、共に密封手段で密封できるトレイおよび蓋を形成するように成形する。新規パッケージは、組織相当物をその上に形成する担体支持体を含むようにデザインされる。
【００３８】
新規パッケージデザインは、トレイ、蓋およびその間の緊密シールを含む。トレイおよび蓋は、付着組織相当物を含む存在する担体と適合するようにデザインする。付着組織相当物を伴う担体をトレイ中に置き、凍結保護溶液を添加する。次いで、蓋をトレイの上に置き、互いに密封して、パッケージの内部よび外部環境間に緊密な密封を形成する。
【００３９】
パッケージデザインは、凍結保護剤の組織相当物およびトレイおよび蓋の両方への接触を維持しながら、担体下および組織相当物表面上の凍結保護剤の等しい分散を可能にする。パッケージのデザインは、制御冷却および凍結速度が、凍結保存すべき培養組織の上および下に類似幾何学で配置した等量の凍結保護剤で維持できるという概念に基づいている。この配置は、培養組織相当物の上および下表面からパッケージの外部壁の均質距離を提供する(ただし、パッケージはまた均質の厚さを有する)。この均質性は、冷却において組織相当物から凍結チャンバーへの；および融解において外部環境から組織相当物への均質熱交換を提供する。
【００４０】
トレイは、側壁およびフランジと隣接する底表面を含む。フランジは、トレイの蓋への密封のための平らな表面を提供する。トレイの側壁は、側壁から内部に伸び、必須の一つの連続したまたは複数の不連続支持体を有する。培養組織相当物を含む担体の上部端は、トレイ中に置いた場合、トレイの側壁により提供される支持体上に吊り下げる。空間は、吊り下げられる担体と、トレイの底表面との間として定義され、該組成相当物のサイズほどの面積であり、約１．０ｍｍの厚さである。
【００４１】
蓋は、側壁およびフランジに続く平らな底表面を含む。蓋フランジの直径は、トレイフランジの直径より僅かに小さい。蓋フランジは、担体を含むトレイ上に置いた場合、担体に寄り掛かり、トレイフランジおよび蓋フランジの両方の上表面は同じ平面にまたはほぼ同じ平面に方向づけられて接触している。第２の空間は、蓋と、培養組織相当物の表面とで定義され、また該組織相当物のサイズほどの面積であり、約１．０ｍｍの厚さである。
【００４２】
デザインは、トレイおよびその中に入れた組織相当物を含む担体の底の合計約１mmおよび蓋と蓋およびトレイの両方に接触した組織相当物の上および下の凍結保護剤を伴う組織相当物間の約１mmを可能にする。蓋が培地を含むトレイ中に置かれる場合、蓋はパッケージ内の空気を、担体の管状支持体を含む末端領域まで排気する。
【００４３】
蓋は、トレイおよび蓋フランジの上部表面に作られた曝露した平面に沿ってトレイを密封する。密封は、加熱、接着剤または当分野で既知の他の手段により行い得る。蓋およびトレイの間の密封は、凍結保護剤の漏出を防止し、ユニットの内部の無菌性を維持する。好ましくは加熱密封可能蓋素材の環状シートがトレイおよび蓋フランジの両方を加熱密封する。蓋素材は、好ましくは、組織相当物に近付くために蓋をトレイから剥がして取って、密封を解くためのつまみを有する。他の態様において、トレイフランジとほぼ同じ直径のフランジを有する蓋を、その中に担体を含むトレイ中に置き、蓋フランジの底表面が密接にトレイフランジの上表面と接触するようにする。次いで、フランジを密封可能手段により互いに密封する。
【００４４】
図１Ａおよび１Ｂは、蓋１０；蓋フランジ１１；蓋側壁１２；および底表面１３を示す。蓋フランジ１１、蓋側壁１２および底表面１３は連続表面を形成する。  図２環状シール２０および取っ手２１を示す。
【００４５】
図３Ａおよび３Ｂは、シール２０；蓋１０；蓋フランジ１１を示す。シール２０を、蓋１０の蓋フランジ１１の上に使用前に置き、密封工程中にシールを直線にするのを容易にする。
【００４６】
図４Ａおよび４Ｂは担体３０；担体リム３１；浸透可能膜３２；および管状支持体３３を示す。浸透可能膜３２は、管状支持体３３により結合した、その中に入れられた培養組織相当物を含む。担体３０は、凍結保存工程中の組織相当物への接触および除去なしの組織相当物の移動を可能にする。
【００４７】
図５Ａおよび５Ｂはトレイ４０；トレイ底表面４１；トレイ側壁４２；トレイフランジ４３；および担体支持体４４を含む。トレイ底表面４１、トレイ側壁４２、トレイフランジ４３および担体支持体４４は連続表面を形成する。担体支持体４４はトレイ内の担体と接触し、支持する。
【００４８】
図６Ａおよび６Ｂはシール２０；蓋１０；担体３０；およびトレイ４０を示す。その中に組織相当物を含む担体３０をトレイ４０内に入れ、トレイ内に吊す。シール２０を伴う蓋１０を担体３０上に置き、担体上に吊す。
【００４９】
図７はシール２０；蓋フランジ１１；蓋１０；担体３０；担体リム３１；担体支持体４４；およびトレイ４０を含む。その中に組織相当物を含む担体３０をトレイ４０内に入れ、担体リム３１の底表面を担体支持体４４の上表面に接触させることによりトレイ内に吊す。シール２０を有する蓋１０を担体３０上に置き、蓋フランジ１１の底表面を担体リム３１の上表面に接触させることにより、担体上に吊す。蓋フランジ１１およびトレイフランジ４３の両方の上表面はシール２０のための平らな表面を形成する。
【００５０】
図８は組み立ての鳥瞰図である。
【００５１】
トレイおよび蓋を形成し得る材料は、ポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ)またはポリエチレンテレフタレートグリコール(ＰＥＴＧ)のような、硬性または半軟性熱可塑性樹脂であり、加熱した時、真空または注入造形により造形される。パッケージトレイおよび蓋は、好ましくは、使用前に、滅菌の分野で既知の方法で滅菌する。トレイおよび蓋を形成するのに使用される材料が、使用できる滅菌法を決める。ＰＴＦＥまたはＰＥＴＧを滅菌するために、２.５から３.０メガラドのガンマ放射線が好ましい。当業者に既知の滅菌の電気的および化学的法をまた代わりに使用し得る。
【００５２】
培養組織相当物は、試薬により収縮された水和コラーゲン格子、好ましくは線維芽細胞の皮膚相当物を含む。一つの態様において、表皮細胞の層状層を皮膚相当物の表面で培養する。他の態様において、角膜細胞により縮合された水和縮合コラーゲン格子を、格子の表面で培養した角膜上皮細胞の層状層を有する角膜内皮細胞の層上に置く。あるいは、表皮細胞単独を培養し、層誘発し、表皮シートを形成し得る。培養組織相当物は、担体の上の多孔性膜上または担体規底表面の多孔性膜に粘着したコラーゲンゲル上のいずれかに形成される。加えて、培養表皮シート、培養皮膚相当物、培養角膜相当物または採取哺乳類皮膚を含むがこれらに限定されない他の培養組織相当物が本発明の方法に従い凍結保存され得る。
【００５３】
本発明を、組織相当物および図説のような好ましいパッケージデザインを使用して記載する。当業者は、記載の方法に修飾ができ、本発明の範囲内であることを理解する。
【００５４】
組織相当物を凍結保護溶液で浣流する方法は、組織相当物およびその付着担体を、サンプルを浸し、組織相当物の上および下に等量の凍結保護溶液を有するのに充分な量の凍結保護剤に浸す。組織相当物および担体を含む１００mmペトリ皿に、ＤＭＥＭ中の２Ｍグリセロール２５mＬを、サンプルに完全に浸透するのに充分な時間、好ましくは１時間から２時間の間であるが、最も好ましくは約１時間入れる。凍結保護溶液中での長時間は、組織の細胞生存率の減少をもたらすが、短すぎる時間は組織内への凍結保護剤の浸透が確実ではない。単層構築物は、典型的には、少ない細胞層を有し、少ないバリアー機能を有するため、必要な浣流の時間が短い。この時間中、サンプルと凍結保護溶液を攪拌して、典型的にはペトリ皿を、１０％ＣＯ２ガスチャンバー中で７０rpmでオービタルプラットフォーム(orbital platform)振盪器(Bello orbital shaker)で撹拌して、凍結保護溶液の浸透を、促進する。組織相当物を製造した培養環境と同じ１０％ＣＯ２環境は、培地の脱気を防止し、したがって凍結保護剤の塩基性培地成分のｐＨを維持する。撹拌は、凍結保護剤の組織相当物へのより早いおよびより完全な浣流をさせ、凍結組織相当物間の結果の再現性が良好である。オービタル振盪器を他の空間平面の動きで撹拌を行う装置と変えることができる。加えて、機械的浣流促進の他の方法は、構築物を凍結保護剤と、プラットフォーム上の容器中で振盪させるか、構築物と凍結保護剤の遠心およびポンプを使用した構築物の回りの凍結保護剤の浣流を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
担体および付着組織相当物をトレイ中に置き、全量約１６.０mlの凍結保護溶液を添加する。パッケージデザインは、凍結保護剤の均質分散を可能にする：担体の下に約８.０mlおよび組織相当物の表面に約８.０ml。次いで、蓋をトレイの上に置き、二つの部分を、好ましくは、蓋素材に、加熱密封する。
【００５６】
次いで、包装組織相当物を、ほぼ室温、好ましくは２０.０℃の最初の温度に設定されたプログラム可能冷凍庫(ＣryomedまたはＰlaner)に入れる。包装組織相当物を含む冷凍チャンバーを、通常、ＤＥＭＥ中の２.０Ｍグリセロールについて、約−５.３℃から−６.０℃の間である、凍結保護剤の固体−液体相平衡温度範囲まで−１０.０℃／分で下げる。固体−液体相平衡温度は、凍結保護剤中に氷を種晶添加するのに必要な温度である。チャンバー温度を、包装組織相当物の内部温度とチャンバー温度の平衡化の目的で、しばらく保つ。種晶温度を得るために使用する冷却速度は重要ではない。約４０分の保持時間が熱平衡化に充分であるが、時間は、チャンバーの大きさ、チャンバー内の空気循環および凍結するパッケージの数に依存して変化する。少なくとも３０分が典型的に必要であり、１時間まで、平衡化を確実するために行い得る。保持時間の後、種晶添加による細胞外氷形成を開始させる。
【００５７】
氷種晶添加は、細胞外凍結保護剤中の氷形成の開始の方法と定義される。氷種晶添加の一つの好ましい方法は、組織を含むトレイの側面を、液体窒素冷却(−１９６℃)鉄棒のような冷却針と接触させることによる。パッケージに対する棒の接触面は、パッケージ内の凍結保存冷凍培地のレベルより下でなければならない。他の好ましい方法は、パッケージの外へのフレオンまたはＣＯ２のような膨張ガスの直接排気である。氷形成は、チャンバーの温度を、氷結晶形成に充分な範囲内で低下および上昇させる、チャンバースパイク波形により開始させる。当分野で既知の氷種晶添加の他の方法に変え得る。
【００５８】
全ての組織相当物に氷結晶を種晶添加した後、ユニットを更に１時間、熱平衡化および凍結保護剤への氷種晶添加結晶の増殖のために保持する。次いで、冷却を、好ましくは約−０.０２℃から約−０.３℃；より好ましくは−０.０５から約−０.１℃／分；および最も好ましくは約−０.０７℃／分の速度で、好ましくは、少なくとも−７０℃またはそれ以下；より好ましくは−１２０℃；更により好ましくは−１４０℃；または最も好ましくは−１９６℃まで再開する。最終凍結温度は、水のガラス遷移温度、−１２０℃に近付くため、最終貯蔵場所への移動中に有害な温度変動はありそうにない。
【００５９】
凍結保存組織相当物をプログラム可能冷凍室から移し、約−１２０℃から−１５０℃の蒸気相液体窒素貯蔵タンク(Ｄewer)または−１９６℃の液体窒素中に使用まで貯蔵する。
【００６０】
融解のために、凍結保存培養組織相当物を蒸気相液体窒素貯蔵から除き、ドライアイスに移して、約−７５℃に暖める。一度−７５℃で平衡化したら、次いで、培養組織相当物を、３７℃；またはより好ましくは４℃；または最も好ましくは室温に設定した環境、好ましくは、水浴に移す。一度、凍結保護培地が液相に変わるのが見えたら、培養組織相当物パッケージ単位を、好ましくは、生物学的安全キャビネット、または他の無菌領域に移し、エタノールで滅菌する。皿の蓋を、蓋材料をユニットの底から剥がすか切断して除く。次いで、過剰の凍結保護剤を注ぎ出しながら、培養組織相当物を含む担体をペトリ皿に移す。次いで、培養組織相当物に残っている凍結保護剤を濯ぐために、濯ぎ液、好ましくはＤＭＥＭ２５mlを室温で、培養組織相当物を含むペトリ皿に約３０分添加する。他の充分な濯ぎ液、細胞培養培地またはリン酸緩衝食塩水のような好ましくは生物学的強度溶液が、当業者により決定され得る。濯ぎ液を、２回目、更に３０分交換する。濯ぎ時間は組織の複雑さに依存して変化し得る。
【００６１】
次いで、培養組織相当物ユニットをその元の培養皿に戻し、培養維持培地で３７℃／１０％ＣＯ２で再培養する。あるいは、相当物を患者に適用するか、または、米国特許第４,８３５,１０２号に記載のように、物質との接触の応答を試験する。
【００６２】
以下の実施例は、本発明の実施をより明瞭にするために提供し、本発明の範囲をいかなる意味でも限定して妨害するものではない。当業者は、種々の修飾が本明細書に記載の方法でできるが、本発明の精神および範囲から外れないことを認識する。
【実施例】
【００６３】
実施例
実施例１から３
実施例１から３は、本発明の凍結保存および融解技術を、好ましいパッケージデザインと共に示す。
【００６４】
実施例１：生存皮膚相当物(ＬＳＥ)の凍結保存とパッケージデザイン
生存皮膚相当構築物(ＬＳＥ)は、米国出願第０８／１９３,８０９号に従って製造した。ＬＳＥおよび付着した７５mm担体挿入物(TRANSWELL(登録商標), Ｃostar, Ｃambridge)を、空輸後９から１０日目で、１００mmペトリ皿(Ｃostar)に入れた。ＬＳＥ構築物を、構築物およびトランスウェル(transwell)を凍結保護培地、１００mmペトリ皿中のＤＭＥＭ中の２Ｍグルセロール２５mＬに１時間浸すことにより凍結保護剤を浣流した。浣流中、構築物を１時間、オービタル振盪器(Ｂellco)で、７０rpmで１０％ＣＯ２ガスチャンバー内で撹拌した。撹拌は、より完全な浣流および凍結保存法の良好な再現性を可能にする。ＬＳＥを浣流した後、ＬＳＥ、担体挿入物および細胞外凍結培地(２ＭグリセロールおよびＤＭＥＭ)を含むペトリ皿を凍結保存パッケージ中に入れ、加熱密封した。凍結保存パッケージは、本明細書と同日に出願した、同時継続出願米国特許出願第・・・号に記載されている。
【００６５】
プログラム可能冷凍庫(Ｐlanar)のチャンバーに、ここに記載した本発明品を供給した。冷凍庫は、開始温度２０℃に設定した。配管ラインは、一秒間隔でフレオンを排気し、ライン内の空気を除いた。包装ＬＳＥユニットをそれぞれ８つのＬＳＥユニットを収納するラックにしっかりと置いた。設立されたピンにより誘導されたラックを、スプレーレールの隣に置いた。冷凍庫のチャンバードアを閉じ、チャンバーを外部環境から密封した。
【００６６】
ＬＳＥユニットを−１０℃／分で−６℃まで冷却し、チャンバー温度を−６℃に４０分維持し、凍結保護剤および浣流構築物をチャンバー温度と平衡化させた。４０分保持後、細胞外氷を、直接フレオンを、パッケージの側面の極めて近くに１秒間直接排気することにより開始させた。パッケージの表面から揮発するため、フレオンはフレオンの接触領域の、細胞外氷形成に充分な温度までの低下をもたらした。
【００６７】
全てのＬＳＥユニットが氷結晶で種晶添加された後、ユニットを１時間、−６℃で平衡化した。次いで、チャンバー温度を−０.０７℃／分で最終温度−２０℃まで冷却した。次いで、チャンバーを、−０.５℃／分で、最終温度−７０℃まで冷却した。一度、ＬＳＥユニットが凍結保存されたら、それらを、−１２０℃から−１５０℃の蒸気層貯蔵タンク(Ｄewar)に移した。
【００６８】
実施例２：凍結保存ＬＳＥの融解
凍結保存ＬＳＥを、蒸気層液体窒素貯蔵から取り出し、ドライアイスに移し、−７５℃まで暖めた。一度−７５℃で平衡化したら、次いで、培養組織相当物を好ましくは３７℃；より好ましくは４℃；または最も好ましくは室温に調節した水浴に移す。全ての凍結保護培地が液層に変わったのを一度見ることができたら、培養組織相当物パッケージユニットを好ましくは生物学的安全キャビネットまたは他の無菌領域に移し、エタノールで滅菌する。皿の蓋をユニットの底から蓋素材をはぎ取るかまたは切り取って除く。次いで、培養組織相当物を含む担体を、過剰の凍結保護剤を注ぎ出しながらペトリ皿に移す。残った凍結保護剤を培養組織相当物から濯ぐために、次いで、濯ぎ液(室温)、好ましくはＤＭＥＭ  ２５mＬを、培養組織相当物を含むペトリ皿に約３０分添加する。他の細胞培養培地またはリン酸緩衝食塩水のような他の充分な生理学的濯ぎ液が、当業者により決められ得る。濯ぎ液を、２回目、更に３０分交換する。
【００６９】
融解凍結保存および対照サンプルを組織学的方法で処理し、光顕微鏡で形態学的組成および生存率を評価し、ほとんど１００％の生存率を示し、ほとんど対照と区別がつかなかった。
【００７０】
実施例３：加温速度および熱均質性に関する凍結保存パッケージデザインの評価
本発明の凍結保存パッケージを、均質熱移動について評価した。培養組織相当物無しの担体膜に、５つの熱電対を乗せ、一つは中央および４つは担体の末端壁から等しく１.０mm離した。熱電対は、蓋とトレイフランジの間からパッケージを出て温度記録器(Ａzonix Ｓcanner Ｐlus)に導かれた。パッケージを凍結保護剤１７mＬで満たし、パッケージを加熱密封した。パッケージを−７０℃に平衡化し、次いで、２０℃に設定した水浴に移した。温度記録器は、各熱電対の温度を加温中、１から２秒毎に記録した。パッケージは最初７００℃／分の速度で暖められ、それが凍結保護溶液の融点に近付くに連れて、遅くなった。熱均質性は、最も早い加温速度で平均熱電対温度の２℃から６℃の間であり、溶液の融点に到達するに連れ、８℃に近付いた。
【００７１】
実施例４から１２は、異なる組織での本発明の凍結保存法を示す。
実施例４：表皮シートの凍結保存
表皮シートを、空輸後１２日目の成熟ＬＳＥから製造した。表皮シートの除去は、表皮基層を表皮層から鉗子で剥がし、皮膚層を廃棄することにより行った。各シートを３つの同じ切片に切った。各シートの一つのを対照として固定した。各シート由来の残った二つの切片を１００mm培養皿(Ｃostar)中の７５mmポリカーボネートトランスウェル膜(Ｃostar)の上に置いた。各切片をＤＥＭＥ  ２５mＬおよび２モル  グリセロールで１時間浣流した。構築物を含む皿をオービタル振盪器(Ｂellco)に７０rpmで１時間、１０％ＣＯ２ガスチャンバーに入れた。表皮シートが浣流した後、表皮シート、トランスウェルおよび細胞外凍結培地(２ＭグリセロールおよびＤＥＭＥ)を含むペトリ皿をを袋内に入れ、５秒間真空および３.９秒間シール時間のプログラムで、真空密封(Ａudiovox)した。
【００７２】
包装表皮シートを、開始温度２０℃で、プログラム可能冷凍庫(Ｐlaner)に入れた。表皮シートを−１０.０℃／分で−６.０℃まで冷却した。温度を−６.０℃に２０分保ち、チャンバー温度と平衡化した。２０分保持後、細胞外氷を、袋の外に、凍結培地のレベルより下で、液体窒素冷却針と接触させることにより開始させた。全ての表皮シートが氷結晶を種晶添加された後、温度を皿に５分間−６.０℃に保った。次いで、チャンバーを、−１.０℃/分で−８.０℃まで冷却した。次いで、温度を３０分間−８.０℃に保ち、サンプルの氷分散を均質にさせた。次いで、チャンバーを−０.１℃／分で最終温度−７０.０℃まで冷却した。
【００７３】
凍結保存表皮シートを冷凍庫から除去し、袋をペトリ皿から切り取り、蓋を除いた。融解のために、暖かい(３７℃)ＤＭＥＭ  ４０mＬを各皿に無菌的に注いだ。４５秒後、液体を皿から除き、皿に４０mＬのアリコートを各皿に２分添加した。全ての氷が溶けた後、表皮シートをＤＭＥＭ  ２５mＬで３０分濯いだ。培地を、２回目、更に３０分交換した。次いで、表皮シートを、分析前に、培養維持培地中で、３７℃／１０％ＣＯ２で２４時間培養した。インキュベーション時間は、凍結細胞に通常見られる遅延が、定常状態を再確立するのを可能にする。また、インキュベーション時間は、凍結細胞に通常見られる遅延が、定常状態を再確立するのを可能にする。
【００７４】
各表皮シートの二つの残った切片の内、それぞれ由来の一方は、組織学的によりし、それぞれ由来の他方はＭＴＴ検定プロトコールに従って検定した。非凍結保存表皮シートおよび実施例４の凍結保存表皮シートの間の光顕微鏡での比較は、表皮の３つの基本性質を示した：表皮の基底層、表皮の基底の上の層および表皮の角質層が本発明により全て保存された。全ての層は無傷であり、凍結保存表皮シートの全ての形態学は、非凍結保存表皮シートのものと同一であった。
【００７５】
実施例５：皮膚相当物の凍結保存
本研究に使用した皮膚相当物は、ＬＳＥの非表皮化成分であった。皮膚相当物を剥いだ後８日目に凍結させた。１００mmペトリ皿(Ｃostar)中に置いた７５mmトランスウェル(Ｃostar)に付着した皮膚相当物をＤＭＥＭ  ２５mＬおよび２モルグリセロールで１時間浸すことにより、皮膚相当物を凍結保護剤で浣流した。ペトリ皿をオービタル振盪器(Ｂellco)上に、７０rpmで１時間、１０％ＣＯ２ガスチャンバー内で置いた。皮膚相当物を浣流後、ペトリ皿、皮膚相当物、トランスウェルおよび細胞外凍結培地をプログラム可能冷凍庫(Ｐlaner)中に、開始温度２０.０℃で入れた。次いで、チャンバーを−１０.０℃／分で−６.０℃まで冷却した。その温度を２０分維持し、チャンバー温度と平衡化した。２０分維持後、細胞外氷を、皿の外側に、凍結培地のレベルより下で、液体窒素冷却針に接触させることにより開始させた。全ての皮膚相当物を氷結晶で種晶添加した後、温度を更に５分間、−６.０℃に維持した。次いで、チャンバーを−１.０℃／分で−８.０℃まで冷却した。チャンバー温度を再び−８.０℃に３０分保ち、サンプル中の氷の均一分散をさせた。次いで、皮膚相当物ユニットを−０.１℃／分で最終温度−７０.０℃まで冷却させた。
【００７６】
次いで、凍結保存皮膚相当物を冷凍庫から出し、皿の蓋を除いた。融解のために、暖めた(３７℃)ＤＭＥＭ  ４０mＬを各ペトリ皿に無菌的に注いだ。４５秒後、全ての液体を皿から回収し、更に４０mＬのアリコートを２分間皿に加えた。全ての氷が融解した後、皮膚相当物をＤＭＥＭ  ２５mＬで３０分濯いだ。培地を２回目、更に３０分間、交換した。トランスウェルにまだ付着している皮膚相当物を、次いで、培養皿に戻し、培養維持培地中で３７℃／１０％ＣＯ２で２４時間、分析前にインキュベートした。インキュベーション時間は、凍結細胞で通常見られる遅れについて、定常状態が再確立するのを可能にする。サンプルを、ＭＴＴ検定プロトコールを使用して検定した。
【００７７】
実施例６：角膜相当物の凍結保存
２４mm培養トランスウェル(Ｃostar)に付着した、湿潤空輸後９日の角膜相当物を、６ウェルクラスター皿(Ｃostar)に入れた。角膜相当物を凍結保護剤で浣流する方法は、各角膜相当物およびトランスウェルを細胞外凍結培地(ＤＭＥＭ中２Ｍグリセロール)４mＬで、６ウェルクラスター皿中、１時間浸すことによるものであった。角膜構築物含有６ウェルクラスター皿を１時間、オービタル振盪器で、７０rpmで、１０％ＣＯ２ガスチャンバー内で振盪した。角膜相当物を浣流した後、角膜相当物、トランスウェルおよび細胞外凍結培地含有ペトリ皿をプログラム可能冷凍庫(Ｐlaner)中に、開始温度２０.０℃で入れた。次いで、チャンバーを−１０.０℃／分で−６.０℃まで冷却した。その温度を２０分維持し、チャンバー温度と平衡化した。２０分維持後、細胞外氷を、皿の外側に、凍結培地のレベルより下で、液体窒素冷却針に接触させることにより開始させた。全ての皮膚相当物を氷結晶で種晶添加した後、温度を更に５分間、−６.０℃に維持し、その後チャンバーを−１.０℃／分で−８.０℃まで冷却した。温度を再び−８.０℃に３０分保ち、サンプル中の氷の均一分散をさせた。角膜相当物ユニットを−０.１℃／分で最終温度−７０.０℃まで冷却させた。
【００７８】
凍結保存角膜相当物を冷凍庫から出した。皿の蓋を除いた。融解のために、暖めた(３７℃)ＤＭＥＭ  ６mＬを各ペトリ皿に無菌的に注いだ。４５秒後、全ての液体を皿から回収し、更に６mＬのアリコートを２分間皿に加えた。滅菌鉗子を使用して、皮膚相当物および付着トランスウェルを新しいクラスター皿に移した。濯ぐために、ＤＭＥＭ  ４mＬを各ウェルに３０分加えた。培地を２回目、更に３０分間、交換した。次いで、角膜ユニットを同じクラスター皿に戻し、角膜維持培地中で３７℃／１０％ＣＯ２で２４時間、分析前にインキュベートした。インキュベーション時間は、凍結細胞で通常見られる遅れについて、定常状態が再確立するのを可能にする。サンプルを、ＭＴＴ検定プロトコールを使用して検定した。
【００７９】
実施例７：採取マウス皮膚の凍結保存
野生型マウス、B6CB6YF1種を、ネンブタール過投与により安楽死させた。皮膚を無菌的に採取した。過剰な血管、脂肪および結合組織を皮膚から除いた。マウス皮膚を長方形１cm×２cm切片に調整した。次いで、マウス皮膚切片を１００mmペトリ皿(Ｃostar)中の７５mmトランスウェル(Ｃostar)に入れた。マウス皮膚を、１００mmペトリ皿中のＤＭＥＭ中の２Ｍグリセロール２５mＬ中に浸すことにより浣流した。浣流中、それぞれマウス皮膚およびトランスウェルを含むペトリ皿を１時間、オービタル振盪器で、７０rpmで、１０％ＣＯ２ガスチャンバー内で振盪した。非凍結保存マウス皮膚である対照を、皮膚移植前に、栄養培地中に４℃で、凍結保存および融解工程中(２日)維持した。
【００８０】
マウス皮膚を浣流した後、マウス皮膚、トランスウェルおよび細胞外凍結培地含有ペトリ皿をＰlanerプログラム可能冷凍庫中に、開始温度２０.０℃で入れた。マウス皮膚を−１０.０℃／分で−６.０℃まで冷却し、−６.０℃で２０分維持し、チャンバー温度と平衡化した。２０分維持後、細胞外氷を、皿の外側に、液体窒素冷却針に接触させることにより開始させた。接触部位は凍結培地のレベルより下でなければならない。全ての皮膚相当物を氷結晶で種晶添加した後、温度を更に５分間、−６.０℃に維持し、その後チャンバーを−１.０℃／分で−８.０℃まで冷却した。温度を再び−８.０℃に３０分保ち、サンプル中の氷の均一分散をさせた。次いで、ユニットを−０.１℃／分で最終温度−７０.０℃まで冷却させた。
【００８１】
凍結保存マウス皮膚を冷凍庫から出し、皿の蓋を除いた。融解のために、暖めた(３７℃)ＤＭＥＭ  ４０mＬをペトリ皿に無菌的に注いだ。４５秒後、全ての液体を皿から回収し、更に４０mＬのアリコートを２分間皿に加えた。全ての氷が融解した後、マウス皮膚をＤＭＥＭ  ２５mＬで３０分間濯いだ。培地を２回目、更に３０分間、交換した。
【００８２】
融解した凍結保存および対照サンプルを組織学的に処理するかまたはマウスに移植した。凍結保存マウス皮膚と比較した非凍結保存マウス皮膚の光顕微鏡は、マウス皮膚の４つの基本的性質、線維芽細胞を有する皮膚、表皮の基底層、表皮の基底の上の層および表皮の角質層が、本方法で保存されていることを示した。全ての層は無傷であり、凍結保存マウス皮膚の全ての形態は、非凍結保存マウス皮膚のものと同一であった。
【００８３】
実施例８：ATS SKIN2(商標)の凍結保存
SKIN2(商標)、モデルZK 1300(Ａdvanced Ｔissue Ｓcience)を到着してから輸送挿入物による包装から出し、培養皿(Ｃostar)に入れた。トランスウェル挿入物をSKIN2(商標)上に置き、皮膚構築物を浸した。SKIN2(商標)をＤＭＥＭ中の２Ｍグリセロールに、培養皿中で１時間浸すことにより、凍結保護剤で浣流した。浣流間、構築物およびトランスウェルを含む培養皿を、１時間、オービタル振盪器で、７０rpmで、１０％ＣＯ２ガスチャンバー内で振盪した。
【００８４】
SKIN2(商標)を浣流した後、ユニットをプログラム可能冷凍庫中(Ｐlanar)に、開始温度２０.０℃で入れた。SKIN2(商標)ユニットを−１０.０℃／分で−６.０℃まで冷却し、−６.０℃で２０分維持し、チャンバー温度と平衡化した。２０分維持後、細胞外氷を、皿の外側に、凍結培地のレベルより下で、液体窒素冷却針に接触させることにより開始させた。全てのSKIN2(商標)ユニットを氷結晶で種晶添加した後、温度を更に５分間、−６.０℃に維持した。次いで、チャンバーを−１.０℃／分で−８.０℃まで冷却した。SKIN2(商標)ユニットを−８.０℃に３０分保ち、サンプル中の氷の均一分散をさせた。次いで、SKIN2(商標)ユニットを−０.１℃／分で最終温度−７０.０℃まで冷却させた。
【００８５】
凍結保存SKIN2(商標)を冷凍庫から出し、皿の蓋を除き、暖めた(３７℃)ＤＭＥＭを各ペトリ皿に無菌的に注いだ。４５秒後、全ての液体を皿から回収し、更にＤＭＥＭを、各皿に２分間に加えた。一度融解したら、SKIN2(商標)ユニットおよび付着トランスフェルを、滅菌鉗子を使用して新しい培養皿に移した。SKIN2(商標)から凍結保護剤を濯ぐために、ＤＭＥＭを、SKIN2(商標)を含む各皿に３０分、添加した。培地を、２回目、更に３０分間、交換した。次いで、SKIN2(商標)ユニットを同じタイプの培養皿に戻し、分析前に、培養維持培地中で３７℃／１０％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。また、インキュベーション時間は、凍結細胞に通常見られる遅延が、定常状態を再確立するのを可能にする。
【００８６】
凍結保存および対照構築物を、生産物で囲まれている、SKIN2(商標)モデルZK1300のためのＭＴＴ検定プロトコールに従って、また組織学的評価により検定した。凍結保存SKIN2(商標)のものと比較した非凍結保存SKIN2(商標)の光顕微鏡は、マウス皮膚の４つの基本的性質、線維芽細胞を有するコラーゲン格子、表皮の基底層、表皮の基底の上の層および表皮の角質層が、本方法で保存されていることを示した。全ての層は無傷であり、凍結保存SKIN2(商標)の全ての形態は、非凍結保存SKIN2(商標)のものと同一であった。
【００８７】
実施例９：代謝性ミトコンドリア活性検定(ＭＴＴ)
凍結および非凍結(対照)ＬＳＥ、表皮シート、皮膚相当物および角膜相当物をＭＴＴ検定を使用して試験した。[SKIN2(商標)構築物は、輸送挿入物に囲まれて、“ＭＴＴ Ａssay Ｐrotocol for use with Ｍodel ZK1300”に従って検定した。]構築物の細胞生存率は、ＭＴＴ検定、細胞成育および生存率の測定のために開発された比色ＭＴＴ変換検定を使用して測定した。本検定は、詳細は、Ｇay et al., "Ｔhe Ｌiving Ｓkin Ｅquivalent as a Ｍodel Ｉn Ｖitro for Ｒanking the Ｔoxic Ｐotential of Ｄermal Ｉrritants", Ｔoxic. in Ｖitro, 6:303-315(1992)に記載されている。可溶性テトラゾリウム塩の青色フォルマザン沈殿への代謝的沈殿は、無傷ミトコンドリア機能の生存細胞の存在に依存する。本検定は、培養ヒト角化細胞を含む種々の細胞タイプの細胞毒性定量に使用されている。
【００８８】
ＬＳＥ、上皮シートおよび皮膚相当物を含む培養皿に、培養培地４０mＬを添加し、角膜相当物を含むウェルに、０.３３mg／mＬ  ＭＴＴ(Ｓigma Ｃhemical Ｃo., Ｓt. Ｌouis, ＭＯ)含有培養培地１.５mＬを添加した。組織相当物をＭＴＴ検定培地中で３〜４時間インキュベートした。変換時間の最後に、組織相当物を８mm直径皮膚生検穿孔機を使用して生検した。次いで、穿孔生検を２〜３時間、室温で０.０４Ｎ  ＨＣｌで酸性化したイソプロパノール０.３mＬで抽出した。抽出時間の最後に、各抽出物０.２mＬを９６ウェルプレートのウェルに移した。吸光度を、イソプロパノール抽出培地をブランクとして、５７０nmでプレート読み取り器で読んだ。融解凍結保存サンプルから得たＭＴＴ値を対応する対照サンプルと比較し、対照のパーセントとして表した(図９)。
【００８９】
実施例１０：ラクトースデヒドロゲナーゼ検定(ＬＤＨ)
ＬＤＨは生存細胞に典型的に見られる酵素である。細胞の傷害が酵素の遊離をおよび本検定で検出される酵素の対応する減少をもたらす。
ＬＳＥの融解凍結保存および対照サンプルを８mm直径生検穿孔器で穿孔した。３つのサンプルを各ＬＳＥユニットから取った。穿孔サンプルを、０.１Ｍトリエタノールアミン緩衝液１mＬ含有１５mm管に入れ(氷上)、電気組織ホモジナイザーで１分間均質化した。次いで、サンプルを１０００ｇで４.０℃で遠心した。次いで、上清を検定した。ＬＤＨカクテル試薬を以下のものを互いに混合することにより製造した：リン酸緩衝液３.００mＬ(０.１mol／ｌ：ｐＨ７.０)、ピルビン酸Ｎａ塩０.１mＬ(２.５mg／mＬ)およびＮＡＤＨ  Ｎａ塩０.０５mＬ(１０mg／mＬ)。サンプル上清１００μＬを試薬９００μＬに添加し、２分間反応させた。２分間にわたる吸光度の変化を記録した。凍結保存ＬＳＥユニット当たりの３つのサンプルの平均を、非凍結対照と比較した。サンプル値は対応する対照値と比較し、対照のパーセントとして表した(図９)。
【００９０】
実施例１１：凍結保存ＬＳＥと非凍結保存ＬＳＥの生物相同性
凍結保存および非凍結保存ＬＳＥの生物相同性を証明するために、無胸腺マウスへの移植研究を行った。
実施例１に概説の方法に従った凍結保存ＬＳＥユニットを移植１日前に融解し、２４時間維持培地中で回復させた。
４つの実験を行い、その中で全６６匹のB6CB6YF/J-nu種(Ｊackson Ｈarbor Ｌabs)の無胸腺マウスに凍結保存ＬＳＥ(ｎ＝４３)または非凍結保存(対照)ＬＳＥ(ｎ＝２３)を移植した。動物をネンブタールで麻酔した。２×２cmの完全な厚さの皮膚部分を、各マウスの背中から、パニキュラス・カルノーサス(panicculus carnosus)に害を与えずに切り取った。対照または凍結保存のＬＳＥ移植片を傷の上に置き、合うように切り落とした。すべての移植片を一層のワセリンに浸したガーゼ(ベンダー)で浸し、２つの粘着性包帯(ベンダー)で覆った。浸したものを移植７日後に除去した。
【００９１】
移植後１４日目にすべての動物を安楽死させ、写真を撮った。次いで、移植部位を組織学的分析および評価のために切除した。全体の写真および顕微鏡は、対照ＬＳＥまたは融解、凍結保存ＬＳＥの移植片統合に差がないことを示した。対照または凍結保存移植片の間で傷収縮の速度に明白な差は見られなかった。
【００９２】
実施例１２：凍結保存および対照マウス皮膚の同遺伝子型(syngenaic)皮膚移植
凍結保存および非凍結保存マウス皮膚の生物相同性を証明するために、同遺伝子型皮膚移植を行った。
野生型マウス、B6CB6YF1種をネンブタール過投与により安楽死させた。皮膚を無菌的に採取した。過剰な血管、脂肪および結合組織を、皮膚移植編の製造において真皮から取り除いた。マウス皮膚を実施例７に記載の方法に従って凍結保存および融解し、対照、非凍結保存マウス皮膚を、皮膚移植前に、栄養培地中で４℃で凍結保存および融解工程中、２日間維持した。
【００９３】
同種の６匹のマウスが皮膚移植を受け、その中で２匹が対照、非凍結保存マウス皮膚および４匹が融解、凍結保存マウス皮膚であった。マウスをネンブタールで麻酔した。２×２cmの完全な厚さの皮膚部位を各マウスの背中から、パニキュラス・カルノーサス(panicculus carnosus)に害を与えずに切り取った。対照または凍結保存のマウス皮膚移植片を傷の上に置き、合うように切り落とした。すべての移植片を一層のワセリンに浸したガーゼで浸し、２つの粘着性包帯で覆った。浸したものを移植７日後に除去した。
【００９４】
移植後３０日目にすべての動物を安楽死させ、写真を撮った。次いで、移植部位を組織学的分析および評価のために切除した。全体の写真および顕微鏡は、対照ＬＳＥまたは融解、凍結保存ＬＳＥの移植片統合に差がないことを示した。対照または凍結保存移植片の間で傷収縮の速度に明白な差は見られなかった。
【００９５】
前述の本発明は、理解を明確にさせるために図説および実施例により詳述しているが、当業者には、ある変化および修飾を添付の請求の範囲内でし得ることが明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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