(57)【要約】【課題】高いセルラーゼ生産能を有するセルラーゼ生産菌を提供することを目的とする。【解決手段】cre1遺伝子が機能しない糸状菌変異株であって、糸状菌がアクレモニウム（Acremonium）／タラロマイセス（Talaromyces）（ペニシリウム（Penicillium））属に属する、上記糸状菌変異株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
cre1遺伝子が機能しない糸状菌変異株であって、糸状菌がアクレモニウム（Acremonium）／タラロマイセス（Talaromyces）（ペニシリウム（Penicillium））属に属する、上記糸状菌変異株。
【請求項２】
cre1遺伝子が欠失している、請求項１に記載の糸状菌変異株。
【請求項３】
糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である、請求項１又は２に記載の糸状菌変異株。
【請求項４】
セルロースを含有する原料を含む培地中にて、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糸状菌変異株を培養することを含む、セルラーゼの製造方法。
【請求項５】
培地がさらにグルコースを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の方法により得られた、セルラーゼ。
【請求項７】
請求項４又は５に記載の方法により得られたセルラーゼを用いてセルロースを分解または糖化することを含む、セルロースの分解または糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、cre1遺伝子が機能しないアクレモニウム（Acremonium）／タラロマイセス（Talaromyces）（ペニシリウム（Penicillium））属糸状菌変異株及びそれを用いたセルラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は様々な酵素生産の宿主として工業的に用いられている。近年の遺伝子組み換え技術の進歩により、より効率的に有用物質を生産する菌株の作製が可能となっている。
【０００３】
酵素の高生産株の開発において、特にセルラーゼの高生産株が過去に多数取得されている。セルラーゼを生産する微生物として、糸状菌トリコデルマ・リーセイや糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスなどの糸状菌が工業的に用いられている。さらにこれらの糸状菌はランダムな遺伝子変異の導入により多数のセルラーゼを高生産する変異株が取得されている。
【０００４】
アクレモニウム・セルロリティカスについては、発明者らのグループにより複数のセルラーゼ高生産変異株が取得されており、さらに、全ゲノム情報の解読や遺伝子組み換え系の開発が行われたことにより、より効率的な菌株の改良が可能となった。
しかしながら、当該分野においては依然として、高いセルラーゼ生産能を有するセルラーゼ生産菌が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高いセルラーゼ生産能を有するセルラーゼ生産菌を提供することを目的とする。さらに、本発明は、セルラーゼの製造、ならびにセルロースの分解、および糖化を、より効率的に行うことが可能な新たな手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、アクレモニウム（Acremonium）／タラロマイセス（Talaromyces）（ペニシリウム（Penicillium））属に属する糸状菌において、cre1遺伝子が機能しない糸状菌変異株が、野生型株よりも高いセルラーゼ生産能を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
［１］  cre1遺伝子が機能しない糸状菌変異株であって、糸状菌がアクレモニウム（Acremonium）／タラロマイセス（Talaromyces）（ペニシリウム（Penicillium））属に属する、上記糸状菌変異株。
［２］  cre1遺伝子が欠失している、［１］の糸状菌変異株。
［３］  糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である、［１］又は［２］の糸状菌変異株。
［４］  セルロースを含有する原料を含む培地中にて、［１］〜［３］のいずれかの糸状菌変異株を培養することを含む、セルラーゼの製造方法。
［５］  培地がさらにグルコースを含む、［４］の方法。
［６］  ［４］又は［５］の方法により得られた、セルラーゼ。
［７］  ［４］又は［５］の方法により得られたセルラーゼを用いてセルロースを分解または糖化することを含む、セルロースの分解または糖化方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、高いセルラーゼ生産能を有するセルラーゼ生産菌を提供することができる。さらに、本発明によれば、セルラーゼの製造、ならびにセルロースの分解、および糖化を、より効率的に行うことが可能な新たな手法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、cre1遺伝子欠失株及びY-94株を、セルロースとグルコースの比率（質量比）を5:0、4:1、2.5:2.5、1:4とした培地で培養して得られた培養液中のセルラーゼ活性を示す。
【図２】図２は、セルロース培地又はセルロース＋グルコース培地で培養した際の、cre1遺伝子欠失株及びY-94株のcbhI遺伝子の発現量を解析した結果を示す。レーン1はY-94株をセルロース培地で培養した際の、レーン2はY-94株をセルロース＋グルコース培地で培養した際の、レーン3はcre1遺伝子欠失株をセルロース培地で培養した際の、レーン4はcre1遺伝子欠失株をセルロース＋グルコース培地で培養した際のcbh1の発現をそれぞれ示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（１．cre1遺伝子が機能しないAcremonium／Talaromyces（Penicillium）属糸状菌変異株）
本明細書において「cre1遺伝子が機能しない」とは、cre1遺伝子が正常の機能を有さない状態にある。「正常の機能を有さない状態」とは、当該遺伝子中に一又は複数個の塩基の欠失、置換、付加または挿入などを含むために、当該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が、正常なタンパク質の活性と比較して70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満または全く活性を有さない状態を指す。好ましくは、「cre1遺伝子が機能しない」とはcre1遺伝子の一部又は全体が欠失した状態にある。
【００１１】
本発明の糸状菌変異株は、自然突然変異によるものであってもよいし、セルラーゼ生産能を有するAcremonium／Talaromyces（Penicillium）属に属する糸状菌を紫外線照射や変異誘発剤（例えば、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で処理することによって得られたものであっても良い。
【００１２】
あるいは、本発明の糸状菌変異株は、セルラーゼ生産能を有するAcremonium／Talaromyces（Penicillium）属に属する糸状菌を宿主として遺伝子組換え手法によって製造することができる。Acremonium／Talaromyces（Penicillium）属に属する糸状菌としては、Acremonium cellulolyticusであり、本発明においては、Acremonium cellulolyticus Y-94株、及びその変異株を利用することができる。Acremonium cellulolyticus Y-94株の変異株としては、ウラシル要求性変異株（YP4株）を利用することができる。なお、Acremonium cellulolyticus Y-94株は、昭和58年1月12日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所］にFERM BP-5826として寄託されている。
【００１３】
なお、Acremonium cellulolyticusが単離された当初は遺伝子情報が普及しているとは言い難く、形態観察の結果からAcremoniumu属糸状菌と分類され、現在まで使用されている。しかし、その後のリボソーマルDNAの遺伝子配列解析により、Acremonium cellulolyticusはTalaromyces（Penicillium）属に最も近縁であることが明らかとなったため、Talaromyces（Penicillium）属への属名変更の発表が予定されている。
【００１４】
Acremonium／Talaromyces（Penicillium）属菌のcre1遺伝子は公知の手法により得ることができる。すなわち、公知のcre1遺伝子（例えば、Penicillium marneffei由来のcre1遺伝子（GenBankにXM_002152098として登録されている）の配列を基に、Acremonium／Talaromyces（Penicillium）属菌のcDNAライブラリーなどに対してスクリーニングを行い、当該遺伝子を特定することができる。スクリーニングの方法としては、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する当該技術分野において周知の方法を用いて、低い、中程度又は高いストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにより得ることができる。さらに、Acremonium／Talaromyces（Penicillium）属菌由来のORFのデータベースに対してBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））サーチ等を行い、cre1遺伝子に対するホモログを同定することもできる。この場合、検索された配列に基づいて該当する遺伝子全体を増幅するために適当なPCR用のプライマーを作製し、得られたPCR産物を適当なクローニング用のベクターに挿入することによって、目的の遺伝子をクローン化することもできる。同定された遺伝子は適当なクローニング用ベクターにサブクローニングして配列確認を行う。一旦、塩基配列が決定されると、その後は、当該塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、Acremonium／Talaromyces（Penicillium）属菌から抽出したゲノムDNAやcDNAを鋳型としたPCRによって、目的のcre1遺伝子を得ることができる。
【００１５】
本発明において、「cre1遺伝子」としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。
また、本発明における「cre1遺伝子」としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列を有し、かつ、グルコースの存在下においてセルラーゼ遺伝子の発現を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで「複数」とは１〜３０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個を意味する。
【００１６】
さらに、本発明における「cre1遺伝子」としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の同一性を有する配列を有し、かつ、グルコースの存在下においてセルラーゼ遺伝子の発現を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１７】
このような「cre1遺伝子」としては、配列番号１で示される塩基配列の4001〜5248番目の塩基からなるDNAが挙げられる。本発明において、cre1遺伝子が機能しない変異株を作製するに際しては、配列番号１に示される配列情報を利用することができる。
【００１８】
cre1遺伝子が機能しない変異株の作製は、相同組換え手法を利用する公知の手法により行うことができる。例えば、相同組換え法によるダブルクロスオーバー等が挙げられる。簡単に説明すると、宿主のcre1遺伝子を遺伝子導入のために当業者に公知である一般的なベクターにクローニングする。その後、クローン化した当該cre1遺伝子の配列中に外来遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）を挿入することで、外来遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）により分断されたcre1遺伝子を含むDNA構築物を調製する。このDNA構築物を宿主に導入することにより、DNA構築物上の分断されたcre1遺伝子と当該宿主染色体上のcre1遺伝子とが相同組換えを生じ、宿主のcre1遺伝子が機能しないようにすることができる。あるいは、cre1遺伝子に外来遺伝子を挿入して分断するかわりに、cre1遺伝子の塩基配列においてその一部または全体を欠失させたcre1遺伝子を含むDNA構築物を調製し、これを上記宿主に導入することにより、DNA構築物上の一部または全体の欠失を有するcre1遺伝子と当該宿主染色体上のcre1遺伝子とが相同組換えを生じ、宿主のcre1遺伝子が機能しないようにすることもできる。
【００１９】
DNA構築物を宿主に導入する方法としては、リン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００２０】
本発明の糸状菌変異株は、野生型株よりも高いセルラーゼ生産能を有する。また、本発明の糸状菌変異株は、培地中に糖類（例えば、グルコース）が存在する条件下においても、野生型株よりも高いセルラーゼ生産能を有する。
【００２１】
本発明の糸状菌変異株は、固相支持体（例えば、ポリマー、鉱物、金属、ゲル、多糖類など）に対して固定化されていても良い。当該糸状菌の固相支持体への固定化は共有結合または非共有結合を用いることができる。
【００２２】
（２．糸状菌変異株の培養）
培地には、炭素源として、粉末セルロース（アビセルを含む）、古紙類、瀘紙、一般紙類、木材、麦わら、稲わら、ふすま、もみがら、およびバガス、窒素源として、硫安、硝安などの無機アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、およびタンパク質分解物などの有機窒素含有物、ならびに無機塩類として、硫酸マグネシウム、リン酸２水素カリウム、酒石酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化鉄、塩化マンガン等を含むことができる。必要ならば有機微量栄養物を含有する培地を使用してもよい。培地は、寒天やゼラチンを加えて固化した固体培地、低濃度の寒天を加えた半流動培地、培地成分のみを入れた液体培地（ブイヨン、またはブロスともいう）を用いることができるが、液体培地が好ましい。
【００２３】
培地にはさらに、糖類を含めることができる。培地に加える糖類としては、単糖類、二糖類、多糖類などが挙げられる。糖類としては例えば、グルコースを挙げることができ、培地中のセルロースとグルコースの量は、4：1（質量比）で含めることができる。
【００２４】
培養は、25〜35℃にて、48時間〜10日ほど培養を行う。培養温度および培養時間は、遺伝子組換え糸状菌の種類、セルラーゼ生産能に応じて適宜調節することができる。培養に用いることができる発酵槽としては、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などが挙げられる。
【００２５】
（３．セルラーゼの回収）
培養終了後、培養液を回収する。得られた培養液は、さらなる処理に付すことなくそのままセルラーゼの粗酵素液として利用することができる。
【００２６】
また、得られた培養液から、遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し上清液を回収することができる。この上清液は、さらなる処理に付すことなくこのままセルラーゼの粗酵素液として使用することができる。
【００２７】
セルラーゼは、上記上清液より、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を1つまたは複数組み合わせて用いて精製することができる。
【００２８】
精製したセルラーゼは、固定化して用いることもできる。固定化することによって、安定化され、連続反復使用が可能となる点において有効である。セルラーゼの固定化は、担体結合法、架橋法、包括法を用いて行うことができる。担体結合法では、セルラーゼを水不溶性の担体（例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物など）に、物理的吸着、イオン結合および共有結合を用いて結合させることができる。架橋法では、２個またはそれ以上の官能基を持つ試薬を用いて、セルラーゼとセルラーゼを架橋することによって固定化する。架橋試薬としては、Schiff塩基をつくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導体、N,N’-エチレンマレイミド、ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジン、あるいはアルキル化するN,N’-ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどを用いることができる。包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中にセルラーゼを取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によってセルラーゼを皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、合成高分子物質のポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂などの高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる（福井三郎、千畑一郎、鈴木周一、「酵素工学」東京化学同人発行、1981年）。
【００２９】
なお、「セルラーゼ」とは、セルロースを、グルコース、セロビオースおよびセロオリゴ糖に加水分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称であり、エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼなどが挙げられるが、セルロースの分解活性を有していれば、本発明のセルラーゼに含まれる。
【００３０】
（４．セルラーゼ活性の測定）
セルラーゼ活性は、上記上清液または精製したセルラーゼに、濾紙、カルボキシメチルセルロース（CMC）、微結晶セルロース（Avicel）、サリシンおよびセロビオースなどの基質を加えて、一定時間酵素反応を行わせた後に、生じた還元糖をSomogy-Nelson法およびDNS法などにより発色させ所定の波長で比色定量して測定することができる。
【００３１】
Somogy-Nelson法においては、一定時間反応させた上記反応溶液にSomogy銅試薬（和光純薬）を加えて反応を停止する。その後およそ２０分間煮沸し、煮沸終了後急速に水道水にて冷却する。冷却後、Nelson試薬を注入して還元銅沈殿を溶解し発色させ、およそ３０分静置した後蒸留水を加え、吸光度を測定する。
【００３２】
DNS法を用いる場合は、一定時間酵素反応を行わせたのち、煮沸などによって酵素反応を停止する。この反応液にジニトロサリチル酸を加えて、5分間煮沸し、冷却後吸光度を測定する（柏木豊「発酵糸状菌の酵素」、微生物遺伝資源利用マニュアル（１６）、独立行政法人農業生物資源研究所発行、2004年2月29日発行）。
【００３３】
（５．セルロースの分解又は糖化）
「セルロースの分解又は糖化」とは、セルロースを分解し、オリゴ糖類、二糖類、単糖類およびそれらの混合物にすることをいう。すなわち、「セルロースの分解又は糖化」とは、セルラーゼによって、多糖類のグリコシド結合を加水分解することをいう。
【００３４】
セルロースの分解又は糖化は、公知の方法を用いることができる。例えば、セルロース含有物質を水性媒体中に懸濁し、上記セルラーゼを含む培養液または上清液または精製したセルラーゼを加え、撹拌または振とうしながら加温して、セルロース含有物質を分解または糖化することができる。セルロース含有物質としては、上記培地に含める「炭素源」として挙げられたものを利用することができる。ただし、セルラーゼによってセルロースを分解又は糖化できるようにするために、必要に応じてセルロース含有物質は公知の手法により前処理されたものを使用する。セルロースの分解又は糖化において、反応液のｐＨおよび温度は、セルラーゼが失活しない範囲内であればよく、一般的に、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲でよい。
セルロースの分解又は糖化の工程は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の実施例においては、セルラーゼ生産菌としてアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）Y-94株（FERM BP-5826）（以下、「Y-94株」と記載）、およびY-94株由来のウラシル要求性変異株（以下、「YP4株」と記載）を用いた。
【００３６】
（実施例１：ゲノムDNAの抽出）
アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムDNAは以下の手法により抽出・単離した。
Y-94株をPD (ポテトデキストロース)培地で一晩培養し、得られた培養液を遠心分離によって集菌した。次に、菌体の2倍量から3倍量のTE （2% SDS含有）緩衝液で菌体を懸濁し、50℃で1時間保温し、5 M酢酸カリウム溶液を全量の10分の1量加えて、氷上で1時間冷却した後、遠心して上清を回収した。得られた上清に対し、フェノール・クロロホルム処理を2回行い、100％エタノールを2.5倍量加えて、マイナス20℃で1時間以上冷却した後、遠心処理により核酸を沈殿させた。得られた沈殿を70％エタノールで2回洗い、適当量のTE緩衝液に懸濁した後、RNaseAを加え、37℃で1時間保温した。
【００３７】
（実施例２：cre1遺伝子欠失用プラスミドの作製）
アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムデータベースより、公知の糸状菌のcre1遺伝子（Penicillium marneffei ATCC 18224、 XM_002152098）の配列情報に基づいて、IMC（in silico molecular cloning、in silico biology inc.,）を用いてアクレモニウム・セルロリティカスのcre1遺伝子を検索した。
【００３８】
得られた配列情報（配列番号１）に基づいて、cre1遺伝子の上流領域および下流領域を増幅するためのプライマーを設計し、実施例１で得たゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行った。当該PCRに用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
【００３９】
（上流領域）（配列番号１で示される塩基配列の2191〜4580番目の塩基からなる）
forward primer  5’-GGGTCGACTGACGGAAACGAGAATGCCG-3’（配列番号３）
Reverse primer  5’-GGGAATTCGCGAGGTGTAGTTGGTGTAA-3’（配列番号４）
（下流領域）（配列番号１で示される塩基配列の4601〜6960番目の塩基からなる）
forward primer  5’-CCTCTAGACCTTATTCACGCAACAGCGA-3’（配列番号５）
Reverse primer  5’-CCGCGGCCGCGTCTGGCCGAACACGTGATT-3’（配列番号６）
とした。
【００４０】
PCRによって得られた上流領域および下流領域を、公知のプラスミドpbs-pyrF（Fujii T. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. Vol 76, pp245-249, 2012）のSalI-EcoRIサイト及びXbaI-NotIサイトにそれぞれ導入し、cre1遺伝子欠失用プラスミドとした。
【００４１】
（実施例３：cre1遺伝子欠失株の作製）
PD培地を用いて一晩培養したYP4株を遠心分離によって回収し、0.8M NaClを用いて洗浄した。
得られた菌体に対し、10mM KH2PO4、0.8M NaClに懸濁した0.2% Yatalase（タカラバイオ株式会社）を加え、30℃下で1時間穏やかに振盪した。顕微鏡下で菌体がプロトプラスト化していることを確認し、これを遠心分離により回収した後に、0.8M NaClを用いて菌体を洗浄した。得られた菌体を溶液A（1.2M Sorbitol、10mM Tris-HCl (pH 7.5)）へ懸濁し、プロトプラスト溶液とした。
【００４２】
プロトプラスト溶液0.2mlに、あらかじめNotIで処理したcre1遺伝子欠失用プラスミド（約10μg）および50μlのPEG溶液（40% PEG 4000、10 mM Tris-HCl、10 mM CaCl2 : pH7.5）を加え、氷上に30分静置後、1mlのPEG溶液を加え、十分に混合して室温下で30分間静置した。次に、得られた溶液を0.2mlずつ、1M スクロースを加えたMM寒天培地に塗布し、5〜7日後生育してきたコロニーを選択した。
得られたコロニーの全DNAを回収し、サザン解析により転写因子遺伝子が欠失した株を選抜した。
【００４３】
（実施例４：セルラーゼ活性の評価）
実施例３で得られたcre1遺伝子欠失株及びY-94株を、セルロースとグルコースの比率（質量比）を5:0、4:1、2.5:2.5、1:4とした培地でそれぞれ48時間培養し、その培養液を遠心分離によって分離し、セルラーゼ活性を測定して酵素の生産を確認した。
【００４４】
酵素活性は、基質として、ろ紙（Whatman No.1）を用い、50℃で60分間、酵素液を混合してインキュベートすることにより、遊離されたグルコースをDNS法を用いて比色定量することにより算出した。
【００４５】
各培養条件下における酵素活性を図１に示す。
図１に示すように、cre1遺伝子欠失株はY-94株と比べて、高いセルラーゼ生産能を有し、cre1遺伝子欠失株の培養液は、Y-94株の培養液と比較して高いセルラーゼ活性を示すことが明らかとなった。また、培地中にグルコースが存在する条件下で培養した場合であっても、cre1遺伝子欠失株の培養液は、Y-94株の培養液と比較して高いセルラーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【００４６】
（実施例５：遺伝子発現解析）
実施例３で得られたcre1遺伝子欠失株及びY-94株を、セルロースとグルコースの比率（質量比）を5:0（セルロース培地）および1:4（セルロース＋グルコース培地）とした培地でそれぞれ24時間培養し、培養後の菌体を遠心分離によって回収した。得られた菌体から全RNAを回収し、oligo-dT プライマー（Toyobo）を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型としたPCRにより、セロビオハイドロラーゼI（cbhI）遺伝子の発現を解析した。
【００４７】
cbhIの発現解析の結果を図２に示す。
図２に示すように、Y-94株は培地中にグルコースが存在する場合、cbhIの発現量が顕著に低下した。一方、cre1遺伝子欠失株は培地中にグルコースが存在する場合においても、cbhIの発現量が顕著に低下することはなかった。
【００４８】
以上より、cre1遺伝子欠失株は、野生型株と比較して顕著に高いセルラーゼ生産能を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のcre1遺伝子が機能しない糸状菌変異株によれば、野生型と比べて、効率良くセルラーゼを生産することが可能である。また、本発明のcre1遺伝子が機能しない糸状菌変異株によれば、培地中にグルコースが存在する条件下においても、効率良くセルラーゼを生産することが可能である。したがって、本発明のcre1遺伝子が機能しない糸状菌変異株を利用することによって、セルラーゼ生産の低コスト化、及びリグノセルロース系バイオマス糖化における単糖の収量増加が期待できる。
【図１】
2014168424.tif 000002
【図２】
2014168424.tif 000003
【配列表】
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