(57)【要約】【課題】無機塩培地で脂質生産量が多い微細藻類や、かかる微細藻類を用いた脂質の製造方法を提供する。【解決手段】ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であり、アシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスを培養し、培養したアシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスから脂質を抽出する。かかる脂質の製造方法により、低コストで微細藻類由来の脂質を製造することが可能である。また、製造された脂質は不飽和脂肪酸を多く含むことから、凝固点が低く、寒冷地で使用することが可能な脂質として有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であり、アシドボラックス（Acidovorax）属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシス（Oogamochlamys zimbabwiensis）を培養し、培養したアシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスから脂質を抽出することを特徴とする脂質の製造方法。
【請求項２】
乾燥菌体あたりの脂質含量が１８重量％以上であるアシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスを培養することを特徴とする請求項１記載の脂質の製造方法。
【請求項３】
アシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスが、アシドボラックス属細菌とバリオボラックス（Variovorax）属細菌、又はアシドボラックス属細菌とカイスティア（Kaistia）属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスであることを特徴とする請求項１又は２記載の脂質の製造方法。
【請求項４】
ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であることを特徴とするアシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシス。
【請求項５】
乾燥菌体あたりの脂質含量が１８重量％以上であることを特徴とする請求項４記載のオーガモクラミス・ジンバブエンシス。
【請求項６】
アシドボラックス属細菌とバリオボラックス属細菌、又はアシドボラックス属細菌とカイスティア属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスであることを特徴とする請求項４又は５記載のオーガモクラミス・ジンバブエンシス。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか記載のオーガモクラミス・ジンバブエンシスを含有する飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であり、アシドボラックス（Acidovorax）属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシス（Oogamochlamys zimbabwiensis）、例えば、アシドボラックス属細菌とバリオボラックス（Variovorax）属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスや、アシドボラックス属細菌とカイスティア（Kaistia）属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシス（以下、これらを総称して「本件微細藻類」という場合がある）や、かかる本件微細藻類を培養し、培養した本件微細藻類から脂質を抽出する脂質の製造方法や、本件微細藻類を含有する飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は光合成を行うことにより微細藻類自身の生命活動に必要な各種有機物を生合成できるという特徴を有している。この微細藻類の特徴を生かして、微細藻類で有機物を生合成し、その有機物を化石燃料の代替にしようとする研究が行われている。その一つとして、微細藻類で生合成した脂質をバイオディーゼルの生産原料に用いるという研究が進められている。
【０００３】
脂質を高濃度に蓄積するという特徴はいくつかの属種の微細藻類ですでに報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜７参照）。しかしながら、一般に微細藻類は生育が遅いため、たとえ乾燥菌体あたりの脂質含量が高い株が得られても、単位時間、単位容積あたりの脂質生産量は低い。菌体重量あたりの脂質含量が高いことで知られる微細藻類ボトリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）は乾燥菌体あたり４０％程度もの脂質を含有するが、無機塩にクエン酸を添加した従属栄養培地で培養した場合でも極めて生育が遅く、脂質生産量としては、およそ９ｍｇ／Ｌ／日であり、ボトリオコッカス・ブラウニーを用いた脂質生産は非常に効率の低い手段となる（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
増殖が遅い場合には、高濃度ＣＯ2の添加や、糖若しくは有機酸を炭素源として培地に加えて増殖速度を高めることや、培養槽外から混入した雑菌等による汚染を防ぐために、厳密に雑菌汚染が制御された培養装置で菌体生産をすることが必要となる。実際に、上記ボトリオコッカス・ブラウニーの工業的な培養では、増殖速度及び脂質生産速度を改善するために高濃度ＣＯ2の添加や、糖あるいは有機酸を炭素源として培地に加えた光培養を行う場合が多く、さらに高い雑菌汚染リスクを回避するために閉鎖系バイオリアクターを用いている場合が多い。しかしながら、従属栄養培地に高濃度ＣＯ2を添加して培養した場合でも、ボトリオコッカス・ブラウニーの増殖速度は１６０ｍｇ／Ｌ／日、脂質生産量は２８．８ｍｇ／Ｌ／日までしか改善されていない（例えば、非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−４２７３８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mutanda et al. Bioresource Technol 102, 57-70 (2011)
【非特許文献２】Lee et al. Lett Appl Microbiol 27, 14-18 (1998)
【非特許文献３】Kalacheva et al. Aquatic Ecol 36, 317-330 (2002)
【非特許文献４】Yoo et al. Bioresource Technol Suppl 1:S71-4 (2009)
【非特許文献５】Rodolfi et al. Biotechnol Bioeng 102, 100-12 (2009)
【非特許文献６】Moazami et al. Biomass and Bioenergy 35, 1935-1939 (2011)
【非特許文献７】Suali et al. Renewable and Sustainable Energy 16, 4316-4342 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の微細藻類を用いた脂質の製造方法においては、脂質の生産量を高めるために従属栄養培地でＣＯ2を添加しながら培養する必要や、厳密な雑菌制御を行う必要があった。また、ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であり、アシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスについては報告されていない。本発明の課題は、無機塩培地で培養した場合に脂質生産量が多い微細藻類や、かかる微細藻類を用いた脂質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これまで、微細藻類で脂質を製造する際には、まず脂質含量の高い微細藻類株を探索し、次に有機物やＣＯ2添加等の培養条件を検討して、脂質含量の高い微細藻類株をいかに早く増殖させるかという研究が行われていたが、コスト削減のために有機物やＣＯ2を添加しない培地で培養できることが望ましい。しかし、有機物やＣＯ2を添加しない低コストの無機塩培地で培養する場合には、たとえ温度やｐＨ等の条件を調整しても、培養速度を十分に改善することはできなかった。そこで本発明者は、無機塩培地で増殖可能な株を分離し、その分離した株の中に、増殖速度が速く、脂質生産量が高い株が存在するのではないかと考え、まずは幾つかの淡水池から無機塩培地で増殖可能な株を分離採集し、その分離した株の中で脂質生産量が多い株をスクリーニングした。その結果、上記課題を解決するのに適したオーガモクラミス・ジンバブエンシスを得ることができた。かかるオーガモクラミス・ジンバブエンシスはアシドボラックス属細菌と共生しており、有機物やＣＯ2を添加しない無機塩培地で培養しても、増殖速度が速いために培養液１Ｌによる１日あたりの脂質生産量が多いことを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は［１］ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であり、アシドボラックス（Acidovorax）属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシス（Oogamochlamys zimbabwiensis）を培養し、培養したアシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスから脂質を抽出することを特徴とする脂質の製造方法や、［２］乾燥菌体あたりの脂質含量が１８重量％以上であるアシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスを培養することを特徴とする上記［１］記載の脂質の製造方法や、［３］アシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスが、アシドボラックス属細菌とバリオボラックス（Variovorax）属細菌、又はアシドボラックス属細菌とカイスティア（Kaistia）属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の脂質の製造方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、［４］ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であることを特徴とするアシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスや、［５］乾燥菌体あたりの脂質含量が１８重量％以上であることを特徴とする上記［４］記載のオーガモクラミス・ジンバブエンシスや、［６］アシドボラックス属細菌とバリオボラックス属細菌、又はアシドボラックス属細菌とカイスティア属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスであることを特徴とする上記［４］又は［５］記載のオーガモクラミス・ジンバブエンシスや、［７］上記［４］〜［６］のいずれか記載のオーガモクラミス・ジンバブエンシスを含有する飼料に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本件微細藻類は増殖速度が速いことから、培養する際に培地へのＣＯ2の添加や炭素源としての糖や有機酸の供給を行わなくても脂質生産量が多く、かかる本件微細藻類を用いることにより低コストで微細藻類由来の脂質を製造することが可能である。また、本件微細藻類によって製造された脂質は不飽和脂肪酸を多く含むことから、凝固点が低く、寒冷地で使用することが可能な脂質として有用である。さらに、本発明によって製造された脂質は、魚類において必須脂肪酸である不飽和脂肪酸を多く含むことから、養殖魚等の飼料に添加することで、養殖魚等の肉質の向上が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＩＫＥ３２株の顕微鏡写真において、微細藻類に細菌が共生していることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のアシドボラックス属細菌が共生しているオーガモクラミス・ジンバブエンシスとしては、ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であり、アシドボラックス属細菌が共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシス、すなわち、オーガモクラミス・ジンバブエンシスにアシドボラックス属細菌が共生した共生体であれば特に制限されず、また、本発明の脂質の製造方法としては、本件微細藻類を培養し、培養した本件微細藻類から脂質を抽出する脂質の製造方法であれば特に制限されず、かかる本発明の脂質の製造方法により微細藻類由来の脂質を低コストで製造することが可能となる。
【００１４】
本発明において、無機塩培地としては、有機物を実質的に含まず、硝酸、アンモニア等の窒素源、リン酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩等の無機塩主体の培地を例示することができ、ＭＧ−Ｐ培地、ＭＧ培地、ＭＢＭ培地、ＤＭ培地等の無機塩培地を好適に例示することができ、ＭＧ−Ｐ培地を特に好適に例示することができる。かかる無機塩培地は、必要に応じてｐＨ調整剤によりｐＨを調整することができる。ＭＧ−Ｐ培地、ＭＧ培地、ＭＢＭ培地、ＤＭ培地の組成を表１に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
本発明において、脂質とは、水に不溶性で、クロロホルム等の有機溶媒に溶け、脂肪酸を含み、生体内で代謝される物質をいい、脂肪酸とグリセリンからのみ構成される油脂も含まれる。
【００１７】
上記脂質生産量（ｍｇ／Ｌ／日）は、増殖速度（ｍｇ／Ｌ／日）に乾燥菌体あたりの脂質含量（乾燥重量％）を乗じることによって算出することができる。増殖速度（ｍｇ／Ｌ／日）は、培養液１Ｌにより１日あたりで増殖する本件微細藻類の乾燥菌体の重量であり、培養期間全体における増殖した本件微細藻類の乾燥菌体の重量を培養液量ならびに培養日数で割ることにより算出することができる。
【００１８】
上記乾燥菌体は、本件微細藻類を無機塩培地で培養後、６０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離し、上澄みを除去したものを−５０℃で凍結乾燥して得られた菌体をいう。
【００１９】
上記乾燥菌体あたりの脂質含量（乾燥重量％）は、本件微細藻類の乾燥菌体をBigh&Dyerの方法(Bligh EJ, Dyer WJA, Rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37, 911-917 (1959))に従ってメタノール／クロロホルム／水の混合溶媒中に懸濁し、抽出、遠心分離後に回収したクロロホルム層を窒素吹付により蒸発乾固して得られた脂質の重量を乾燥菌体の重量で割ることにより算出することができる。
【００２０】
本発明において、共生とは微細藻類と細菌が相互関係を持ちながら同所的に生活する状態をいう。
【００２１】
本発明の脂質の製造方法に用いる本件微細藻類や、本発明の本件微細藻類としては、ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５０ｍｇ／Ｌ／日以上であり、天然から分離したアシドボラックス属細菌が共生しているオーガモクラミス・ジンバブエンシス、好ましくはアシドボラックス属細菌とバリオボラックス属細菌とが共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシスや、アシドボラックス属細菌とカイスティア属細菌とが共生したオーガモクラミス・ジンバブエンシス、又は、それらの人為的な変異株であれば特に制限されないが、乾燥菌体あたりの脂質含量が１８重量％以上、好ましくは１９％以上、より好ましくは２８％以上の本件微細藻類や、ｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下において無機塩培地で培養した場合の脂質生産量が５２ｍｇ／Ｌ／日、好ましくは６４ｍｇ／Ｌ／日以上の本件微細藻類を好適に例示することができる。
【００２２】
本発明の脂質の製造方法における、本件微細藻類の培養方法としては、微細藻類を培養する公知の方法が適用できる。使用する培地としては、上記無機塩培地を好適に例示することができ、上記無機塩培地に必要に応じて糖類やビタミン等の有機物、ｐＨ調整剤、抗生物質等を添加することができる。培地のｐＨ条件としては、６．５〜７．０、好ましくは６．８、温度条件としては、２２〜２８℃、好ましくは２４〜２６℃、より好ましくは２５℃、光照射条件としては、培地表面の照度として１５００〜１００００ｌｕｘ、好ましくは４０００〜８０００ｌｕｘ、より好ましくは６０００ｌｕｘ、培養時間としては７〜３０日、好ましくは１０〜２０日を好適に例示することができ、振とう培養、静置培養、撹拌培養、通気培養、又はこれらの組み合わせでもよい。通気培養を行う場合には、空気や、ＣＯ2を添加した空気を用いることが好ましく、この場合のＣＯ2の濃度は０．０５〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１．０〜３．０％（ｖ／ｖ）を例示することができる。
【００２３】
培養した本件微細藻類から脂質を抽出する方法としては、遠心分離法や濾過分離法等により本発明の微細藻類を培地から回収した後、Bigh&Dyerの方法、具体的には、メタノール／クロロホルム／水の混合溶媒中に懸濁し、抽出、遠心分離後に回収したクロロホルム層を窒素吹付により蒸発乾固する方法を例示することができる。なお、メタノール／クロロホルム／水の混合溶媒を本件微細藻類に加える前に、本件微細藻類の細胞壁を物理的に破壊することもできる。
【００２４】
本件微細藻類は、脂質を製造するためのキットや、高脂質生産微生物製剤として使用されてもよく、その場合には、担体の他、本件微細藻類を用いて脂質を製造する方法等を記載した文書を添付することができる。
【００２５】
また、本件微細藻類を含有する飼料としては、本件微細藻類を含有していれば特に制限されず、本件微細藻類と共に、一般的な飼料に使用されている粗蛋白質、粗灰分、カルシウム、リン等を、給餌する家畜や養殖魚介類の生育状態等に応じて配合することを好適に例示することができる。かかる飼料に含まれる本件微細藻類は、必要に応じて細胞壁を物理的に破壊することができる。
【実施例１】
【００２６】
［無機塩培地で生育する株の分離］
（無機塩培地による培養）
山口大学農場演習林池を含む幾つかの淡水池から表層の池水を採集し、各々の池水を０．２μｍ孔径メンブレンフィルター（ミリポア社製）でろ過して微細藻類を含むろ過残渣を得た。一方、上記池水のろ過液に無機栄養培地（ＫＮＯ3  終濃度５００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  終濃度５０ｍｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  終濃度５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  終濃度７０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）を添加して分離用培養液とし、採取したろ過残渣を各試料の池水で調製した上記分離用培養液で懸濁並びに段階希釈（１０-1−１０-4倍）した。次に、各々の希釈サンプルを９６ウェルマイクロプレートに１５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、カルチャーパル（登録商標）ＣＯ2（三菱ガス化学社製）を置いたカルチャーパル専用容器（旭硝子社製）に９６ウェルマイクロプレートを設置し、光インキュベータ内で１２日、２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘ、ＣＯ2濃度１．６〜３．２％の条件下で静置培養した。続けて、微細藻類の増殖が視認されたマイクロプレートの増殖菌液５０μＬ／ｗｅｌｌを前述の新鮮分離用培養液１００μＬを加えたマイクロプレートに接種し、継代培養を行ったところ、４２３ｗｅｌｌで増殖が認められた。この４２３ｗｅｌｌの分離株をNile Red（シグマアルドリッチ社製）でJian Qinの方法（Jian Qin, Bio -Hydrocarbons from Algae. Impacts of temperature, light and salinity on algae growth. (2005))に従って染色した上でBiozero Bz-8000蛍光顕微鏡(キーエンス社製)で観察し、特に強く黄色に発色した４株（ＦＲＩＫＡ１１、ＮＯ４Ｃ３、ＩＫＥ３１およびＩＫＥ３２株と命名）を脂質蓄積株として分離した。さらに当該株の増殖菌液３０μＬを寒天培地（前述の分離用培養液に寒天（和光純薬工業社製）を終濃度１５ｇ／Ｌとなるように添加し、固化したもの）に接種し、１０日間、２５℃、培地表面の照度約６０００ｌｕｘの条件下で静置培養した。出現したコロニーを滅菌済み爪楊枝で分離し、新鮮培地に画線接種することで菌株の純粋分離を行った。なお、ＦＲＩＫＡ１１、ＮＯ４Ｃ３、ＩＫＥ３１及びＩＫＥ３２株は国立大学法人山口大学農学部生物機能科学科に保管されており、一定条件下で分譲可能である。
【実施例２】
【００２７】
［増殖速度の測定］
（増殖速度の測定方法）
分離した４株（ＦＲＩＫＡ１１、ＮＯ４Ｃ３、ＩＫＥ３１、ＩＫＥ３２）をｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下においてＭＧ−Ｐ培地１．５Ｌで１４日振とう培養し、増殖した各株の乾燥菌体の重量を求め、培養期間全体における増殖した各株の乾燥菌体の重量を培養液量ならびに培養日数で割ることにより、増殖速度（ｍｇ／Ｌ／日）算出した。乾燥菌体の重量は、培養後の培養液を６０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離し、上澄みを除去したものを−５０℃下で凍結乾燥して得られた菌体の重量を測定することで求めた。
【００２８】
（結果）
上記４株の増殖速度（ｍｇ／Ｌ／日）は、ＦＲＩＫＡ１１株は１８、ＮＯ４Ｃ３株は１７であるのに対し、ＩＫＥ３１株は１８５、ＩＫＥ３２株は３３６という非常に速い増殖速度であることが明らかとなった。
【実施例３】
【００２９】
［乾燥菌体あたりの脂質含量の測定］
（測定方法）
分離した４株（ＦＲＩＫＡ１１、ＮＯ４Ｃ３、ＩＫＥ３１、ＩＫＥ３２）をｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下においてＭＧ−Ｐ培地１．５Ｌで１４日振とう培養後に増殖した各株の乾燥菌体の重量を求めた。乾燥菌体の重量の測定方法は実施例２と同様である。乾燥菌体あたりの脂質含量（乾燥重量％）は、Bigh&Dyerの方法を用いて脂質の重量を求めることで算出した。具体的には乾燥菌体に６００μＬのメタノール／クロロホルム混合溶媒（２／１）を加えて撹拌後、１６０μＬの水を加えて撹拌し、室温静置１０分し、２００μＬのクロロホルムを加えて撹拌し、２００μＬの水を加えて撹拌後に、１５０００ｒｐｍ、５分で遠心分離し、上層(メタノール／水)を除去して下層のクロロホルム層をガラスチューブに移し、窒素吹付によりクロロホルムを除去して得られた脂質の重量を求めて、求めた脂質の重量を乾燥菌体の重量で割ることにより算出した。
【００３０】
（結果）
分離した４株の乾燥菌体あたりの脂質含量（乾燥重量％）は、ＦＲＩＫＡ１１株は１６、ＮＯ４Ｃ３株は２３、ＩＫＥ３１株は２８、ＩＫＥ３２株は１９であった。
【実施例４】
【００３１】
［脂質生産量］
分離した４株（ＦＲＩＫＡ１１、ＮＯ４Ｃ３、ＩＫＥ３１、ＩＫＥ３２）において、上記で求めた増殖速度（ｍｇ／Ｌ／日）に乾燥菌体あたりの脂質含量（乾燥重量％）を乗じることで、培養液１Ｌで培養した場合の１日あたりの脂質生産量（ｍｇ／Ｌ／日）を求めた。その結果、ＦＲＩＫＡ１１株は２．９、ＮＯ４Ｃ３株は３．９であるのに対し、ＩＫＥ３１株は５２、ＩＫＥ３２株は６４であった。これまで報告されている中で、４０％の脂質含量を有する微細藻類ボトリオコッカス・ブラウニーを無機塩にクエン酸を添加した従属栄養培地で培養した場合でも脂質生産量（ｍｇ／Ｌ／日）は９であり（Lee et al. Lett Appl Microbiol 27, 14-18 (1998)）、微細藻類ボトリオコッカス・ブラウニーを従属栄養培地でＣＯ2を導入して培養した場合でも脂質生産量（ｍｇ／Ｌ／日）は２８．８（Kalacheva et al. Aquatic Ecol 36, 317-330 (2002)）であり、ＩＫＥ３１株とＩＫＥ３２株は培養液１Ｌで培養した場合の１日あたりの脂質生産量が非常に多い微細藻類であることが明らかとなった。
【実施例５】
【００３２】
［分離した株の同定］
分離した４株（ＦＲＩＫＡ１１、ＮＯ４Ｃ３、ＩＫＥ３１、ＩＫＥ３２）をｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下においてＭＧ−Ｐ培地１０ｍＬで１４日間振とう培養し、その培地１ｍＬを６０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離し、細胞ペレットをｔｒｉｓＥＤＴＡ緩衝液（１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００）２００μＬ（ｐＨ８．０）に懸濁し、３分間沸騰後、氷冷した。引き続き、それぞれの懸濁液をクロロホルム／イソアミル（２４／１）混合溶媒２００μＬと混合し、１４５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して、水相から粗ＤＮＡを得た。このＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として用い、微細藻類の同定に際して常用される１８ＳｒＤＮＡのＤＮＡをＰＣＲ法にて増幅した。具体的には、配列番号１のフォワードプライマーＮＳ１及び配列番号２のリバースプライマーＮＳ２を利用して、９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分で３０サイクルの条件でＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ法にて増幅した上記ＤＮＡ配列に基づき、里見の方法（Satomi et al. Int.J.Syst.Bacteriol. 47, 832-836 (1997)）を用いて１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定した。ＦＲＩＫＡ１１から検出された１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、ＮＯ４Ｃ３検出された１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号４に、ＩＫＥ３１検出された１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号５〜７に、ＩＫＥ３２から検出された１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号８〜１０に示す。上記方法で得られた１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用い（Altschul et.al. J.Mol.Biol. 215, 403-410 (1990)）、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪからから得た既知の微生物の１８ＳｒＤＮＡ塩基配列と比較して、既知の微生物とのＤＮＡ相同性の一致の程度を調べた。その結果、ＦＲＩＫＡ１１から検出された配列番号３に示す１８ＳｒＤＮＡの塩基配列は、アンキストロデスムス・グラシリスの１８ＳｒＤＮＡの塩基配列と９９％同一であり、ＮＯ４Ｃ３から検出された配列番号４に示す１８ＳｒＤＮＡの塩基配列は、カラシウム・サッカタムの１８ＳｒＤＮＡの塩基配列と９９％同一であった。一方、ＩＫＥ３１からは３種類の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が検出され、配列番号５に示す１８ＳｒＤＮＡの塩基配列（ＩＫＥ３１−１）はオーガモクラミス・ジンバブエンシスの１８ＳｒＤＮＡの塩基配列と９９％同一であり、配列番号６に示す１８ＳｒＤＮＡの塩基配列（ＩＫＥ３１−２）はアシドボラックス属細菌の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列と１００％同一であり、配列番号７に示す１８ＳｒＤＮＡの塩基配列（ＩＫＥ３１−３）はバリオボラックス属細菌の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列と９９％同一であった。また、ＩＫＥ３２からは３種類の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が検出され、配列番号８に示す１８ＳｒＤＮＡの塩基配列（ＩＫＥ３２−１）はオーガモクラミス・ジンバブエンシスの１８ＳｒＤＮＡの塩基配列と９９％同一であり、配列番号９に示す１８ＳｒＤＮＡの塩基配列（ＩＫＥ３２−２）はアシドボラックス属細菌の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列と１００％同一であり、配列番号１０に示す１８ＳｒＤＮＡの塩基配列（ＩＫＥ３２−３）はカイスティア属細菌の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列と９９％同一であった。また、図１に示すＩＫＥ３２の顕微鏡写真から明らかなように、微細藻類の周りに細菌様コロニーが観察された。上記結果から、ＩＫＥ３１はオーガモクラミス・ジンバブエンシスにアシドボラックス属細菌とバリオボラックス属細菌が共生している株、ＩＫＥ３２はオーガモクラミス・ジンバブエンシスにアシドボラックス属細菌とカイスティア属細菌が共生している株であることが明らかとなった。
【００３３】
（実施例２〜５のまとめ）
上述した４株の増殖速度、脂質含量、脂質生産量、微細藻類の同定結果をまとめて表２に示す。なお、表中、ボトリオコッカス・ブラウニー（１）は、無機塩にクエン酸を添加した従属栄養培養培地でボトリオコッカス・ブラウニーを培養した場合、ボトリオコッカス・ブラウニー（２）は、無機塩にクエン酸を添加した従属栄養培地に高濃度ＣＯ2を添加してボトリオコッカス・ブラウニーを培養した場合である。
【００３４】
【表２】
2014168413.tif 000004
【実施例６】
【００３５】
［脂質の脂肪酸組成］
（脂肪酸組成の測定方法）
まず、分離した４株（ＦＲＩＫＡ１１、ＮＯ４Ｃ３、ＩＫＥ３１、ＩＫＥ３２）をｐＨ６．８、温度２５℃、培地表面の照度６０００ｌｕｘの条件下においてＭＧ−Ｐ培地１．５Ｌで１４日振とう培養後に６０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離することで培養物を回収し、回収した培養物にメタノール／クロロホルム／水の混合溶媒を加えて撹拌後、上層を除去し、窒素吹付によりクロロホルムを除去して脂質を得た。その後、得られた脂質を脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク社製）及びメチル化脂肪酸精製キット（ナカライテスク社製）により同社の推奨プロトコルに従って脂肪酸メチルエステルに変換及び精製し、ガスクロマトグラフ質量分析計することで脂肪酸組成を定量した。ＧＣＭＳの昇温プログラムは以下のとおりである。
50 for 3.4 min, 50-330℃ at 10℃min-1, and 330℃ for 10 min. 
column:Rxi-5ms capillary column (30 m×0.25 mm i.d.:Ｒｅｓｔｅｋ社製)
carrier gas, helium (18 mL min-1);
【００３６】
（測定結果）
結果を表３に示す。ＩＫＥ３１株、ＩＫＥ３２株のいずれも不飽和脂肪酸の含量が高く、全脂肪酸のうち５０％以上が不飽和脂肪酸であった。最も豊富な不飽和脂肪酸は動物の必須脂肪酸として知られるリノレン酸であった。
【００３７】
【表３】
2014168413.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本件微細藻類を用いた脂質の製造方法は、低コストで微細藻類由来の脂質を製造することが可能であり、脂質生産の分野において産業上の有用性は高い。
【図１】
2014168413.tif 000006
【配列表】
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