(57)【要約】【課題】ガレクチン−３の免疫アッセイの提供。【解決手段】本発明は、試料中のガレクチン−３を特異的かつ定量的に検出するための方法および組成物に関する。本発明の実施態様は、補足結合部分および標識化結合部分がガレクチン−３のＮ末端上の非重複エピトープを特異的に認識する検出アッセイを包含する。さらなる実施態様は、被験者における心不全の存在および重症度の指標となるガレクチン−３濃度範囲の確立方法、ならびにガレクチン−３濃度に基づいて被験者の臨床結果を予測する方法を対象とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００８年１０月２９日出願の、米国仮特許出願第６１／１０９，３６６号の利益およびこれに対する優先権を主張し、この全体の開示が本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
心不全（ＨＦ）は、アメリカ合衆国における主要な公衆衛生の問題である。およそ５００万人がこの疾患に罹患し、患者数は着実に増加している。ＨＦは、一般的であるが、特に高齢者にとっては深刻かつ複雑な臨床症候群である。ＨＦは、心臓が、身体の要求に見合う十分な血液を拍出することができない状態を指す。不十分な拍出は、肝臓、腹部、下肢および肺における鬱血および他の体液の滞留を生じる。従って、ＨＦは、鬱血性心不全（ＣＨＦ）とも呼ばれているが、全ての患者が体液の滞留を示すわけではないため、用語ＨＦが好ましい。ＨＦは、結果的に患者を徐々に悪化させ、しばしば心血管系死亡率を招く。従って、多くの患者が、診断後１年〜５年以内に死亡する。しかしながら、一部では長期間にわたり安定したままの患者もいる。ＨＦは、心筋梗塞または再灌流傷害によって引き起こされる心虚血とは全く異なる疾患である。
【０００３】
ＨＦの症状には、倦怠、虚弱、頻脈または不整脈、息切れ、持続性の咳または喘鳴、下肢または腹部のむくみ、体液の滞留による急激な体重の増加、食欲不振または吐き気、および胸痛が包含される。現在、ＨＦの重要な診断試験は、構造異常があるかどうか決定するため、包括的断層心エコー図と共にドップラー血流研究である。この試験において、心機能の重要な測定である、心室から拍出された血液画分（駆出率、ＥＦ）を測定することができる。正常な心臓の駆出率は、およそ６０％である。また、下記試験の１以上を使用してもよい：ラジオアイソトープ心室造影、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、全血球計算、尿検査、血清電解質、グリコヘモグロビンおよび血液脂質、腎臓および肝機能試験、甲状腺機能試験、胸部Ｘ線写真、および１２誘導心電図（１２−ｌｅａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍ）。
【０００４】
加えて、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）等のバイオマーカーの血液試験を実施してもよい。ＢＮＰは心筋細胞の伸長に応じて上方制御される。したがって、高レベルのＢＮＰは、ストレス下の心臓の指標であり、心不全の良好な指標となる。しかしながら、炎症等の心不全において役割を果たす他の機序は、ＢＮＰの上昇によって反映されない可能性がある。
【０００５】
ＨＦ発症リスクにある患者の早期特定は、急速な進行を防止し得る可能性がある。従って、実際にそうなる前に、心不全を発症しそうな患者を特定できることが望ましい。加えて、深刻な合併症を発症するか、または早期に死亡するリスクのある心不全に罹患した患者を特定できることが好ましい。
【０００６】
現在の方法は、確実にＨＦを除外することは可能であるが、確実に心不全の存在を証明することはおろか、確立したＨＦの結果（ｏｕｔｃｏｍｅ）を予測することもできない。このため、ＨＦの症状の発現可能性を予測するための、および重症度、疾患のステージを評価し、および／またはすでに確立した心不全の結果を予測するための、の簡便かつ確実な方法が必要とされている。
【０００７】
心不全において役割を果たす他の機序を反映する、さらなる生化学的マーカーを見出すため、心不全に進展した高血圧のラットと、代償性の状態にある（ｒｅｍａｉｎｅｄ  ｃｏｍｐａｎｓａｔｅｄ  ）高血圧のラットを比較し、どの遺伝子が上方制御したのかを測定するためのマイクロアレイ研究が実施された（非特許文献１）。心不全に進展したラットにおいて最も強く上方制御していた遺伝子は、ベータ−ガラクトシド結合レクチンであるガレクチン−３であった。この知見は、Ｓｈａｒｍａらによる研究において確認され、高いガレクチン−３レベルが、高血圧症のラットモデルにおける心不全発症の予兆となることを示した（非特許文献２）この研究は、さらに、心不全および過度のコラーゲン沈着を引き起こす、外部から適用されたガレクチン−３の能力を実証した。最近では、ヒト血漿および血清中のガレクチン−３濃度が、ＨＦの重症度と相関していた（特許文献１および、対応する米国特許出願番号１０／５７５，７４５を参照）。
【０００８】
ガレクチンは、それらのガラクトース特異的結合によって特徴づけられたタンパク質のファミリーを構成する。全てが、炭水化物認識ドメインまたはＣＲＤとして公知のそれらの構成領域における共通アミノ酸配列を共有している。現在、１５の哺乳類ガレクチンが同定されている。一つのサブグループは、ガレクチン１，２，５，７，１０，１３，１４および１５を含有し、それぞれが単一ＣＲＤを含む。二番目のサブグループは、単一種、ガレクチン−３を含有し、ＰＧＡ等の短いアミノ酸配列の繰り返しを含むＮ末端ドメインに連結した一つのＣＲＤを含む。三番目のガレクチンサブグループは、ガレクチン４，６，８，９および１２を含有し、それぞれが、可変長のリンカーによってつながれた二つのＣＲＤを含む。全てのガレクチンは、顕著なアミノ酸配列相同性を有し、多くがヒトの循環器系にみられる。
【０００９】
ガレクチン−３に関するアッセイは存在するが、いずれも日常的な臨床使用には適さない。これまでの好適なアッセイは、検体としてのガレクチン−３の複雑性のため、本技術分野（ｔｈｅ  ａｒｔ）が避けてきた。ガレクチン−３は、他の１４の哺乳類ガレクチンと高度な配列類似性を共有する（特に保存された炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）において）ため、試料中のガレクチン−３を他のガレクチンと明確に判別することは難しい。他のガレクチンのうち、ＨＦとの関連が公知のものはない。特異的、再現性のある検出アッセイの開発を妨げてきたガレクチン−３の他の特性は、様々なタンパク質、炭水化物、核酸および脂質に結合するガレクチン−３の性質である。血液試料等の体液において再現可能にガレクチン−３を定量的に測定するに十分に、産業的に頑健であり、感度がよくかつ特異的なアッセイが開発されれば、ＨＦの診断および管理は改善され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００５／０４０８１７号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｏｅｎら（２００４）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９５（５）：５１５−２２．
【非特許文献２】Ｓｈａｒｍａら、２００４  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０（１９）：３１２１−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
臨床試料中のガレクチン−３の検出方法は、現在、確認され、開発されている。現在、ガレクチン−３のＮ末端の少なくとも２つの個別の非重複エピトープに特異的に結合する２つの結合部分の使用が、ＨＦを伴う被験者の診断および結果の予測に必要な再現性、特異性および感度を提供することが可能な様々な特異的サンドイッチアッセイ形式を産生するために使用可能であるということが発見されている。従って、本発明は、臨床試料中のガレクチン−３レベルを検出するための方法およびキットを提供する。これは、改善された疾患の管理を可能とし、トリアージおよび管理に有用な診断／予後の情報を提供する。
【００１３】
１つの側面において、本発明は、試料中のガレクチン−３濃度を検出するためのキットに関する。キットは、２つの結合部分（例えば、モノクローナル抗体）を包含し、これらの少なくとも１つが検出可能な標識で標識化されている。各二つの結合部分は、下記１１３アミノ酸配列を含むガレクチン−３のＮ末端部分上の間隔をあけたエピトープ（ｓｐａｃｅｄ−ａｐａｒｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ）にそれぞれ結合する：
【００１４】
【化１】
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１つの実施様態において、結合部分は、下記ガレクチン−３アミノ酸配列の内の１つの少なくとも一部によって定義されたエピトープとそれぞれ結合する：
【００１５】
【化２】
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これらが直線状エピトープを説明する一方、Ｎ末端の２次構造および３次構造によって生み出され、配列の間隔をあけた部分からのアミノ酸を含むエピトープを使用してもよい。
【００１６】
他の実施様態において、ガレクチン−３検出に使用される結合部分は、モノクローナル抗体であり、例えば、Ｍ３／３８，９Ｈ３．２および８７Ｂ５である。Ｍ３／３８は、ガレクチン−３のＮ末端上の直線状エピトープ
【００１７】
【化３】
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）を検出する。Ｍ３／３８は、ラットハイブリドーマＭ３／３８．１．２．８ＨＬ．２（そのクローンはＡＴＣＣ（登録商標）番号ＴＩＢ−１６６によりアメリカンタイプカルチャーコレクションにおいて見出され得る）の上清から調製された。９Ｈ３．２は、ガレクチン−３の最もＮ末端における直線状エピトープ
【００１８】
【化４】
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を検出する。９Ｈ３．２は、マウスモノクローナルＩｇＧであり、プロテインＡを使用して親和性精製される。９Ｈ３．２は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，２９０コンコードロード，ビレリカ，マサチューセッツ州０１８２１，アメリカ合衆国）、カタログ番号：ＭＡＢ４０３３から入手可能である。８７Ｂ５は、
【００１９】
【化５】
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の部分を含む非直線状エピトープを検出する。８７Ｂ５は、マウス‐マウスハイブリドーマ（Ｘ６３−Ａｇ８．６５３×ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞）クローン８７Ｂ５から調製され、プロテインＡを使用して親和性精製されたＩｇＧ２ａである。８７Ｂ５は、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＩＢＬ，８２０１セントラルアベニューＮＥ，スイートＰ，ミネアポリス，ミネソタ州５５４３２アメリカ合衆国）から入手可能である。
【００２０】
その他の側面において、本発明は被験者由来の試料中のヒトガレクチン−３レベルを検出するための方法に関する。当該方法は、試料を二重結合部分サンドイッチアッセイに供することを包含する。この方法において、少なくとも一つの結合部分は検出可能な標識で標識化され、各々の結合部分は、上記されているようなガレクチン−３のＮ末端部分上のそれぞれの非重複エピトープに対して特異的である。１つの実施様態において、検出可能な標識は、酵素またはフルオロフォアである。サンドイッチアッセイは、定量的結果または定性的結果（例えば、閾値を超えるガレクチン−３濃度の存在または非存在を示す結果）を提供してもよい。閾値は、例えば５〜１０ｎｇ／ｍｌ、１０〜１５ｎｇ／ｍｌ；１５〜２０ｎｇ／ｍｌ；２０〜２５ｎｇ／ｍｌ；２５〜３０ｎｇ／ｍｌ；３０〜３５ｎｇ／ｍｌ、または３５〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲であってもよい。
【００２１】
当該方法は、アッセイにおいて得られた結果と、ガレクチン−３濃度に対する結果に関連するデータセット（例えば標準曲線）とを比較して、試料中のガレクチン−３濃度を決定する工程、および、その後、推測されるガレクチン−３の濃度を、被験者がＨＦに罹患しているまたはＨＦ発症のリスクがあるというリスクに関係づけ、その被験者のＨＦのステージもしくは重症度を評価する工程という、追加の工程を包含してもよい。もちろん、ＨＦに罹患しているまたは発症のリスクを伴う被験者、または、被験者のＨＦのステージもしくは重症度を評価するため、結果とリスクとを直接的に互いに関係づけてもよい。当該方法は、傾向を得るために長期間繰り返されてもよい。被験者のＨＦを発症するリスクを決定するため、または被験者のＨＦのステージもしくはその重症度を評価するため、付加的な変数（例えば、被験者の身長、体重、年齢、性別、他のバイオマーカーのレベル等であるが、これらに限定されない）を考慮してもよい。
【００２２】
他の側面において、本発明は、被験者由来の試料中のガレクチン−３濃度が１５〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲の閾値を超えるかどうかの決定を包含する、被験者における心不全の発症または進行のリスクを検出する方法に関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
試料中のガレクチン−３の濃度を検出するためのキットであって、１つが検出可能な標識で標識化され、各々が、下記アミノ酸配列：
【化１０】
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を含むガレクチン−３のＮ末端部の間隔をあけたエピトープにそれぞれ結合している、第１結合部分および第２結合部分を含むキット。
（項目２）
前記検出可能な標識が酵素またはフルオロフォアである、項目１のキット。
（項目３）
前記結合部分が、それぞれ、下記からなる群より選択されるガレクチン−３アミノ酸配列の部分の少なくとも１種により定義されるエピトープに結合する、項目１または２のキット。
【化１１】
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（項目４）
前記結合部分がモノクローナル抗体である、項目１〜３のいずれかのキット。
（項目５）
前記モノクローナル抗体が、９Ｈ３．２、８７Ｂ５およびＭ３／３８からなる群より選択される、項目４のキット。
（項目６）
前記抗体が、
【化１２】
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を含むエピトープに結合する、項目４または５のキット。
（項目７）
前記モノクローナル抗体がマウス抗体である、項目４〜６のいずれかのキット。
（項目８）
被験者由来の試料中のヒトガレクチン−３のレベルを検出する方法であって：
前記試料を二重結合部分サンドイッチアッセイに供すること、少なくとも１つの前記結合部分が検出可能な標識で標識化されること、前記結合部分の各々が下記アミノ酸配列：
【化１３】
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を含むガレクチン−３のＮ末端部のそれぞれの非重複エピトープに特異的であること、を含む方法。
（項目９）
前記サンドイッチアッセイが、閾値をこえるガレクチン−３濃度の存在または非存在を示す定性的結果を提供する、項目８の方法。
（項目１０）
前記被験者由来の前記試料中の前記閾値ガレクチン−３濃度が１５〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲にある、項目９の方法。
（項目１１）
前記被験者由来の前記試料中の前記閾値ガレクチン−３濃度が２０〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲にある、項目９の方法。
（項目１２）
前記被験者由来の前記試料中の前記閾値ガレクチン−３濃度が２５〜３０ｎｇ／ｍｌの範囲にある、項目９の方法。
（項目１３）
前記被験者由来の前記試料中の前記閾値ガレクチン−３濃度が３０〜３５ｎｇ／ｍｌの範囲にある、項目９の方法。
（項目１４）
前記サンドイッチアッセイが前記ガレクチン−３濃度を示す定量的結果を提供する、項目８の方法。
（項目１５）
前記サンドイッチアッセイの結果と、前記試料中の前記ガレクチン−３の濃度をデータと相関させるデータとを比較して、前記結果を、前記被験者が心不全（ＨＦ）の症状を発現するリスクまたは前記被験者の診断されたＨＦ疾患の重症度と関連付ける追加の工程を含む、項目８〜１４のいずれかの方法。
（項目１６）
さらに、傾向を得るために長期間反復することを含む、項目８〜１５のいずれかの方法。
（項目１７）
被験者における心不全の発症のリスクまたは進行を検出する方法であって、前記被験者由来の試料中のガレクチン−３濃度が少なくとも１５ｎｇ／ｍｌの閾値を上回るかどうかを決定することを含む方法。
（項目１８）
前記閾値が１５〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲にある、項目１７の方法。
（項目１９）
前記閾値が２０〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲にある、項目１７の方法。
（項目２０）
前記閾値が２５〜３０ｎｇ／ｍｌの範囲にある、項目１７の方法。
（項目２１）
前記閾値が３０〜３５ｎｇ／ｍｌの範囲にある、項目１７の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明によって開発されたタイプのダブルモノクローナルサンドイッチアッセイの漫画図である。
【図２】図２は、本発明の特性を説明するのに役立つガレクチン−３濃度とシグナルとを関連づける代表的な仮説の標準曲線である。
【図３】図３は、本発明の特性を説明するのに役立つガレクチン−３濃度とシグナルを関連づける代表的な第２の仮説の標準曲線である。
【図４】図４は、実施例２Ｅに記載される急性非代償性ＨＦ研究における、１７．６ｎｇ／ｍｌの閾値を超える、およびその閾値を下回るベースラインのガレクチン−３レベルを有する被験者に関する代表的な生存確率曲線である。
【図５】図５は、実施例２Ｆに記載される慢性ＨＦ研究Ｉにおける１７．６ｎｇ／ｍｌの閾値を超える、およびその閾値を下回るベースラインのガレクチン−３レベルを有する被験者に関する代表的な生存確率曲線である。
【図６】図６は、実施例２Ｇに記載される慢性ＨＦ研究ＩＩにおける１７．６ｎｇ／ｍｌの閾値を超える、およびその閾値を下回るベースラインのガレクチン−３レベルを有する被験者に関する代表的な生存確率曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本明細書において使用される用語「定量化する（ｑｕａｎｔｉｆｙ）」および「定量化する（ｑｕａｎｔｉｔａｔｅ）」は、試料対標準品試料または別の試料において（例えば、試料中のその濃度、質量、モルまたは容量に関して）、ガレクチン−３の量またはガレクチン−３の相対量を測定するプロセスを指す。
【００２５】
本明細書において使用される用語「心不全」、「ＨＦ」、「鬱血性心不全」、または「ＣＨＦ」は、血液を満たすか、または血液を排出する心室の能力を損なう複雑な臨床症候群を指す。損なわれた左心室（ＬＶ）の心筋機能を伴う大多数のＨＦ患者において、いかなる構造的または機能的な心障害もＨＦを引き起こし得る。ＨＦの徴候は、呼吸困難（息切れ）、疲労および体液鬱滞（ｆｌｕｉｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）を包含する。米国心臓協会（ＡＨＡ）は、ＨＦ発症においての４つの段階を識別した。ステージＡおよびＢにおいて患者は、明確な危険因子を示すが、いまだＨＦを発症していない。ステージＣおよびＤにおいて患者は、現在ＨＦの症候を呈するか、または過去にＨＦの症候を示した。例えば、ステージＡの患者は、損なわれた左心室（ＬＶ）機能を示さない冠動脈疾患、高血圧症また糖尿病等の危険因子を有する患者である。ステージＢの患者は、無症候性であるが、損なわれたＬＶ機能、肥大または幾何学的な心室ひずみ（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ）等の心臓の構造異常またはリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を有する。ステージＣの患者は、心臓の異常を有し、症候性である。ステージＤの患者は、最大の医療処置にもかかわらず症状を呈する難治性ＨＦを有する。彼らは、典型的に、繰り返し入院するか、または専門的な介入なしに病院を出ることができない。
【００２６】
ガレクチン−３
ガレクチン−３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００００１４．７（遺伝子）およびＮＰ＿００２２９７．２（タンパク質））は、それらのガラクトース特異的結合によって特徴づけられる、１５の哺乳類ベータガラクトシド結合レクチンまたは『ガレクチン』のうちの１つである。ガレクチン−３は、文献において、ＬＧＡＬＳ３、ＭＡＣ−２抗原、炭水化物結合蛋白質（ＣＢＰ）−３５、ラミニン結合タンパク質、ガラクトース特異的レクチン３、ｍＬ−３４、Ｌ−２９、ｈＬ−３１、イプシロンＢＰおよびＩｇＥ結合タンパク質として様々に呼ばれてきた。ガレクチン−３は、カルボキシル末端炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）およびアミノ末端タンデムリピートから構成されている（Ｌｉｕ，Ｆ．−Ｔ．（２０００）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｌｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｍ．ＣａｒｏｎおよびＤ．Ｓｅｖｅ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｐ．５１；Ｌｉｕ，Ｆ．−Ｔ．ら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：１０１６）。ガレクチン−３は、通常、マクロファージはもちろん、樹状細胞およびクッパー細胞をも包含する、多くの器官の上皮および様々な炎症細胞に分布する（Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｊ．ら（１９８３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１１：１１２）。
【００２７】
ガレクチン−３は、細胞−細胞接着、細胞マトリクス相互作用、食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、細胞周期、アポトーシス、新脈管形成およびｍＲＮＡスプライシングを包含する、様々な細胞プロセスにおいて役割を果たすことが示されてきた。ガレクチン−３は、細胞内および細胞外の作用の両方を介して機能することが示されてきた（Ｓａｎｏ，Ｈ．ら（２０００）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６５：２１５６−２１６４）。それは、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）の構成成分であり（Ｌａｉｎｇ，Ｊ．Ｇ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：５３２９）、プレｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）スプライシングにおける因子であり（Ｄａｇｈｅｒ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１２１３）、および、細胞周期を制御すること（Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｒ．Ｃ．ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４１４８）およびＢｃｌ−２ファミリーメンバーとの相互作用を介してＴ細胞アポトーシスを妨げること（Ｙａｎｇ，Ｒ．−Ｙ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６７３７）が見出されている。一方、単球／マクロファージ（Ｓａｔｏ，Ｓ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４４２４）および上皮細胞（Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ，Ｒ．Ｇ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１７５０）から分泌されるガレクチン−３は、単球／マクロファージ（Ｌｉｕ，Ｆ．−Ｔ．（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：４８６）、肥満細胞、好中球およびリンパ球（Ｈｓｕ，Ｄ．Ｋ．，Ｓ．Ｒ．ら（１９９６）．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：１６６１）等の様々なタイプの細胞の活性化において細胞外分子として機能することが実証されてきた。ガレクチン−３は、単球およびマクロファージのための新規な化学遊走物質として作用することが示されてきた（Ｓａｎｏ，Ｈ．ら（２０００）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，１６５：２１５６−２１６４）。ガレクチン−３は、癌、炎症および心不全等の疾病および病状に関係している。国際特許公開公報番号ＷＯ２００５／０４０８１７に開示されるように、ガレクチン−３の定量化は、ＨＦの重症度を診断および検出、ならびに結果を予測するためのアッセイにおける使用に特に好適である。
【００２８】
他の哺乳類ガレクチンと異なり、ガレクチン−３は、以下のアミノ酸配列を含む、異型のＮ−末端ドメインを含む：
【００２９】
【化６】
2014199261.tif 000012
検査から認めることができるように、ガレクチン−３のＮ末端配列は、他の哺乳類ガレクチンの配列と非類似であるが、介在するプロリン、グリシン及びチロシンリッチ領域を伴う、ＰＧＡＹＰＧ（Ｘ）１−４（配列番号２）タイプの複数の反復を含む。Ｎ末端ドメインの反復配列の存在は、検出アッセイの開発を複雑にする、ガレクチン−３特異的な異なる潜在的エピトープの数を減少させる。しかしながら、Ｎ末端エピトープは、確実にガレクチン−３と他の哺乳類ガレクチンを区別可能であることが現に発見された。本明細書に開示されるアッセイの使用により、ガレクチン−３の臨床結果を、確実かつ再現可能に、被験者におけるＨＦの存在、重症度および進行のステージと関連させることが可能である。代表的なＮ末端エピトープは、
【００３０】
【化７】
2014199261.tif 000013
を包含するが、これらに限定されない（ここで、文字は、標準アミノ酸コードを表わす）。
他のエピトープは、一次構造上に間隔をあけたアミノ酸を含むＮ末端上に現われるが、三次構造においては共に提示され、これらは、また、本発明のアッセイにおいて使用される結合剤によって処理（ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）され得る。
【００３１】
サンドイッチアッセイによるガレクチン−３の検出
本発明の方法によれば、ガレクチン−３の濃度は、特異的にガレクチン−３のＮ末端部分に結合する一対の結合部分を使用して、体液試料で定量化されてもよい。「結合部分」は、ポリペプチドまたはペプチドと選択的にまたは優先的に結合または相互作用する分子を指す。結合部分の例は、抗体、ガレクチン結合タンパク質（ＧＢＰ）相互作用融合タンパク質、ペプチドアプタマー、アヴィマー（ａｖｉｍｅｒ）、Ｆａｂ、ｓＦｖ、アドネクチンおよびＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）リガンド等のタンパク質；ＤＮＡおよびＲＮＡ（ヌクレオチドアプタマーを包含する）等の核酸、ならびに膜脂質等の脂質を包含するが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の方法および組成物を、ＨＦ診断用に、血清等の臨床試料中のガレクチン−３濃度を検出するために使用することができる。本発明の方法によれば、ガレクチン−３の検出において使用される試験サンプルは、任意の体液または組織試料であってもよく、全血、血清、血漿またはリンパ液、および好ましさは劣るが、尿、胃液、胆汁、唾液、汗、および脊髄液、便または筋肉生検を包含するが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、試料は血液試料である。他の実施態様において、試料は血漿試料である。また、血清試料を使用してもよい。さらに、体液は処理されても（例えば血清）、処理されなくてもよい。被験者から体液を得る方法は、当業者に公知である。
【００３３】
本発明の方法によれば、ガレクチン−３は「サンドイッチ」アッセイを用いて検出および定量化される。この実施態様において、ガレクチン−３のＮ末端上の非重複部位（「エピトープ」）に特異的に結合するモノクローナル抗体等の２つの分子（「結合部分」）が使用される。図１を参照。典型的には、１つの結合部分は、それがガレクチン−３に結合し、捕捉する固体表面上に固定化される。従って、この第１結合部分も、本明細書において捕捉結合部分と呼ばれる。第２結合部分のガレクチン−３複合体への結合が、ガレクチン−３が捕捉されたことを示すように、例えば、フルオロフォア、酵素、または着色粒子で第２結合部分を検出可能に標識する。シグナル強度は、試料中のガレクチン−３濃度に比例する。従って、第２結合部分も、本明細書において、検出結合部分または標識結合部分と呼ばれる。結合部分は、ガレクチン−３のＮ末端の一部に特異的に結合する限り、どのようなタイプの分子であってもよい。好ましい実施態様において、使用される結合部分は、モノクローナル抗ガレクチン−３抗体（すなわち、ガレクチン−３のＮ末端１１３アミノ酸の別々の部分に対して産生された、あるいはその部位に結合するために選択された単クローン）である。
【００３４】
そのようなアッセイ手法は、２−部位イムノメトリックアッセイ法（ｔｗｏ−  ｓｉｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）、すなわち「サンドイッチ」法または（抗体が結合剤である場合）「サンドイッチイムノアッセイ」と呼ばれ得る。当該技術分野において公知であるように、捕捉抗体および検出抗体を、試験試料と同時または順次接触させてもよい。逐次的な方法（時に「前進（ｆｏｒｗａｒｄ）」法と呼ばれる）は、試料と共に捕捉抗体をインキュベーションし、そしてその後の所定時間に標識化検出抗体を添加することによって達成され得る。あるいは標識化検出抗体を、最初に試料とともにインキュベーションし、その後、当該試料を捕捉抗体に曝露してもよい（時に、「逆行」法と呼ばれる）。任意の必要なインキュベーション（複数可）の後（短期間であってもよい）の後、標識を検出し、また、測定してもよい。そのようなアッセイは、様々なハイスループット臨床検査室アナライザーの使用を通し、ケアの目的で（ｗｉｔｈ  ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）または家庭用試験デバイスを包含する、当業者に公知の多数の特定の形式において実行されてもよい。
【００３５】
１つの実施態様において、ベースライン感度レベルを超える生体試料中のガレクチン−３の存在が、側方流動アッセイにおける捕捉ゾーンの上流または捕捉ゾーンでのサンドイッチ相互作用の形成を可能にする、サンドイッチ方式において、側方流動デバイスを使用してもよい。例えば、米国特許番号６，４８５，９８２を参照。本明細書に使用される捕捉ゾーンは、ガレクチン−３の捕捉に好適な抗体分子か、またはビオチン化複合体の捕捉用の固定化アビジン等の捕捉結合部分を含有してもよい。例えば、米国特許番号６，３１９，６７６を参照。また、デバイスは、捕捉ゾーンでの捕捉に好適な発光標識を組込んでもよい（ガレクチン−３濃度は捕捉部位でのシグナル強度に比例する）。好適な標識は、ポリスチレンミクロスフェア上に固定化された蛍光標識を包含する。また、着色粒子を使用してもよい。
【００３６】
本発明の方法において使用され得る他のアッセイ形式は、フロースルーデバイス（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｅｖｉｃｅ）を包含するが、これに限定されない。例えば、米国特許番号４，６３２，９０１を参照。フロースルーアッセイにおいて、１つの結合部分（例えば、抗体）は、膜表面の規定の領域に固定化される。その後、この膜を、デバイスを通して試料容量を送るための貯蔵器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）としてはたらく吸収層（ａｂｓｏｒｂｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）にのせる。固定に続き、膜上の残りのタンパク結合部位を、非特異的な相互作用を最小化するためにブロックする。操作において、試料中の抗体に特異的な任意の検体が固定化された抗体に結合するように、膜に生体試料を添加し、濾過する。第二工程において、サンドイッチを完了するため、捕捉マーカーと反応する標識化二次抗体を添加または放出してもよい。あるいは、二次抗体を試料と混合し、単一工程において添加されてもよい。ガレクチン−３が存在する場合、着色スポットは膜表面上に現れる。
【００３７】
最も一般的な酵素免疫測定法は、「酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）」である。ＥＬＩＳＡは、標識化（例えば、酵素連結）形態の抗体を使用して抗原の濃度を検出および測定する技術である。異なる形態のＥＬＩＳＡが存在し、それは当業者に周知である。当該技術分野において公知のＥＬＩＳＡに関する標準的な技術は、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ”，第２版，Ｒｏｓｅ及びＢｉｇａｚｚｉ編集，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８０；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４；およびＯｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．（１９８４），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：８９５−９０４に記載される。
【００３８】
「サンドイッチＥＬＩＳＡ」において、抗体（例えば、抗ガレクチン−３）は、固相（すなわち、マイクロタイタープレート）に連結され、抗原（例えば、ガレクチン−３）を含有する生体試料に曝露される。その後、固相を、非結合抗原を除去するために洗浄する。その後、標識化抗体（例えば、酵素連結）は、結合抗原に結合し、抗体−抗原−抗体サンドイッチを形成する。抗体に連結され得る酵素の例は、アルカリフォスファターゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼである。酵素結合抗体は基質と反応して、測定することができる着色した反応生成物を生じる。この測定値を使用して、例えば、その測定値をガレクチン−３標準曲線と比較することにより、試料中に存在するガレクチン−３濃度を得ることができる。被験者からの試料中のガレクチン−３濃度は閾値を超えるか、または下回って測定され得る。閾値は、例えば５〜１０ｎｇ／ｍｌ、１０〜１５ｎｇ／ｍｌ；１５〜２０ｎｇ／ｍｌ；２０〜２５ｎｇ／ｍｌ；２５〜３０ｎｇ／ｍｌ；３０〜３５ｎｇ／ｍｌ、または３５〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲であってもよい。
【００３９】
本発明のキットおよび方法による使用に好適な本明細書に記載される免疫測定法のいずれもが、抗体に代えて任意の結合部分も使用することができる。
【００４０】
結合部分
本発明の好ましい実施態様において、抗ガレクチン−３抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は結合部分として使用される。
【００４１】
モノクローナル抗体
本発明の好ましい実施態様において、モノクローナル抗体が使用される。モノクローナル抗体は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを包含する単一のクローンに由来する抗体を指す。モノクローナル抗体は、２つのタンパク質（すなわち、重鎖および軽鎖）を含むか、または２つのタンパク質からなってもよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレー技術の使用、またはこれらの組み合わせを包含する当該技術分野において公知の多様な技術の１つを使用して調製され得る。
【００４２】
抗ガレクチン−３モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ．２５６：４９５によって記載されるような精ハイブリドーマ（ｓｅｍｉｎａｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）法を包含する、任意の公知の方法論を使用して調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することが可能なリンパ球を誘発するために免疫剤で免疫する。あるいは、リンパ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫されてもよい。
【００４３】
免疫剤は、典型的にはガレクチン−３ポリペプチドの少なくとも一部、またはそれらの融合タンパク質を包含する。例えば、任意のガレクチン−３のＮ末端エピトープを含む合成ポリペプチドまたは組換えポリペプチドを、免疫剤として使用してもよい。代表的なＮ末端エピトープは、
【００４４】
【化８】
2014199261.tif 000014
を包含するが、これらに限定されない。融合タンパク質は、キャリアタンパク質（例えばキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，サンディエゴ，カリフォルニア州）、ＢＳＡ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，サンディエゴ，カリフォルニア州）、またはオボアルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ）にポリペプチドを融合させることにより作製され得る。免疫剤は、様々な標準法のうちのいずれかに従うアジュバントを用いて、または用いずに哺乳動物に投与されてもよい。免疫剤は、１度だけ投与されてもよいが、好ましくは標準ブースティングスケジュールに従って１回より多く投与される。
【００４５】
一般に、ヒト起源の細胞が望まれる場合には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、または非ヒト哺乳類源が望まれる場合には、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。その後、リンパ球を、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して不死化された細胞株と融合して、ガレクチン−３のＮ末端部分上のエピトープに対して適切な特異性および親和性を有する種についてスクリーニングされたハイブリドーマ細胞集団を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞株が採用される。ハイブリドーマ細胞を、好ましくは、非融合、不死化細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を含有する好適な培養培地中で培養してもよい。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠乏する場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、（それらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を抑制する）ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを包含する（「ＨＡＴ培地」）である。
【００４６】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性なものである。より好ましい不死化細胞株は、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューションセンター（サンディエゴ、カリフォルニア州）およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナッサス、ヴァージニア）から得ることができるマウスミエローマ細胞株である。また、ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．（１９８４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
【００４７】
その後、例えば、標識化ガレクチン−３Ｎ末端ポリペプチドを用いたスクリーニングによって、ガレクチン−３のＮ末端に対して向けられたモノクローナル抗体の存在について、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地をアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって測定される。そのような技術およびアッセイは、当該技術分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ（１９８０），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０のスキャッチャード解析によって測定され得る。結合特異性を測定する様々な解析プロトコルは、キット、またはサービスとして商業的に入手可能である。
【００４８】
また、モノクローナル抗体は、米国特許番号４，８１６，５６７に記載されたもの等の組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい。適切なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用によって）単離し、配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦分離されれば、組換えの宿主細胞中にモノクローナル抗体の合成を得るため、ＤＮＡは発現ベクター中に置かれ、その後、それらは免疫グロブリンタンパク質を他に（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ）産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞等の宿主細胞中にトランスフェクトされる。また、ＤＮＡは、例えば、相同なマウス配列（米国特許番号４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１）に代えて、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することにより、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全てまたは一部に免疫グロブリンコード配列を共有結合することによって改変されてもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインと置換することができ、またはキメラ二価抗体を作出するために本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換することができる。
【００４９】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は、当該技術分野において周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖架橋を防ぐように、一般にＦｃ領域の任意の箇所で切断される。あるいは、適切なシステイン残基が別のアミノ酸残基と置き換えられるか、または架橋を防ぐように欠失される。
【００５０】
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、一価の抗体を調製するために好適である。そのフラグメント（特にＦａｂフラグメント）を産生するための抗体の消化は、当該技術分野において公知の常用技術を用いて達成され得る。
【００５１】
また、抗体をファージディスプレーライブラリーを使用して産生することもできる（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１）。さらに、ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術は、モノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅら（１９８５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５）。同様に、抗体を、トランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されたマウス）へ免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製することができる。
【００５２】
また、抗体を、上記のような公知の選択および／または変異誘発法を使用して親和性成熟させてもよい。好ましい親和性成熟抗体は、成熟抗体が調製される出発抗体よりも５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０倍または３０倍より大きい親和性を有する。特に好ましい実施態様において、ガレクチン−３を検知するために使用される抗体はモノクローナル抗体（例えば、Ｍ３／３８、９Ｈ３．２および８７Ｂ５）である。Ｍ３／３８は、ガレクチン−３のＮ末端上の直線状エピトープ
【００５３】
【化９−１】
2014199261.tif 000015
を検出する。Ｍ３／３８は、ラットハイブリドーマＭ３／３８．１．２．８ＨＬ．２の上清から調製され、そのクローンはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにおいてＡＴＣＣ（登録商標）番号ＴＩＢ−１６６により見出され得る。９Ｈ３．２は、ガレクチン−３の最もＮ末端の直線状エピトープ
【００５４】
【化９−２】
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を検出する。９Ｈ３．２は、マウスのモノクローナルＩｇＧであり、プロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）を用いて親和性精製される。９Ｈ３．２はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，２９０コンコードロード，ビレリカ，マサチューセッツ州０１８２１，ＵＳＡ）から、カタログ番号：ＭＡＢ４０３３により入手可能である。８７Ｂ５は、
【００５５】
【化９−３】
2014199261.tif 000017
の部分を含む非直線状エピトープを検出する。８７Ｂ５は、マウス−マウスハイブリドーマ（Ｘ６３−Ａｇ８．６５３×ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞）クローン８７Ｂ５から調製され、プロテインＡを用いて親和性精製されたＩｇＧ２ａである。８７Ｂ５は、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＩＢＬ，８２０１  セントラルアベニューＮＥ，スイートＰ，ミネアポリス，ミネソタ州５５４３２  ＵＳＡ）から入手可能である。
【００５６】
現在の好ましい実施態様においては、捕捉結合部分は、抗ガレクチン−３モノクローナル抗体Ｍ３／３８であり、標識化検出結合部分が２次抗ガレクチン−３モノクローナル抗体８７Ｂ５である。これらの抗体に対して与えられた表記（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）は、制限されない。他の実施態様において、捕捉抗体は９Ｈ３．２であり、標識化検出結合部分はＭ３／３８である。また、上記エピトープを認識する他の抗体を使用してもよい。
【００５７】
他の結合部分を、本発明の方法およびキットと共に使用してもよい。結合部分の例は、タンパク質、ペプチドアプタマー、アヴィマー、アドネクチンおよびＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）配位子；ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸（ヌクレオチドアプタマーを包含する）、および膜脂質等の脂質を包含するが、これらに限定されない。
【００５８】
アプタマー
ヌクレオチドアプタマーは、選択される標的への高い親和性で結合する、小さなペプチドまたは小さなヌクレオチド配列である。ヌクレオチドアプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの進化とも呼ばれる、試験管内進化法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる選択プロセスによって産生される。この手法において、標的分子は、大きく、無作為に作出されたオリゴヌクレオチドライブラリーに曝露される。非結合オリゴヌクレオチドを、幾つもの方法（通常、アフィニティークロマトグラフィー）によって混合物から分離する。結合されたままのオリゴヌクレオチドを溶出し、増幅する。その後、標的分子を、新たに合成されたオリゴヌクレオチドに曝露し、非結合配列を分離するために徐々にストリンジェントを高めた条件で選択プロセスを数ラウンド繰り返す。その後、結果として生じるオリゴヌクレオチドを、それらの実体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定するために配列決定する。米国特許出願番号０７／５３６，４２８；米国特許番号５，４７５，０９６；および米国特許番号５，２７０，１６３を参照。
【００５９】
ペプチドアプタマーは、典型的には短い可変ペプチドドメインからなる。ペプチドアプタマーは、両端でタンパク質スキャフォールドへと結合した可変ペプチドループを含む。この二重構造の拘束は、ペプチドアプタマーの結合親和性を抗体のそれに匹敵するレベル（ナノモル範囲）まで著しく増加する。可変ループ長は、典型的には１０〜２０のアミノ酸であり、スキャフォールドは、可溶性且つ小型の任意のタンパク質（バクテリアタンパク質チオレドキシンＡ等）であってもよい。可変ループを、チオレドキシンＡの還元活性部位内（野生型タンパク質における−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループ）に挿入することができ、２つのシステイン側鎖がジスルフィド架橋を形成することができる。ペプチドアプタマーの選択は、酵母ツーハイブリッド系等の異なるシステムを使用して行われ得る。ペプチドアプタマーのさらなる議論については、国際特許公報番号ＷＯ２００７／１１７６５７を参照。
【００６０】
アヴィマー
アヴィマー（結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）マルチマー）は、標的に対する低い親和性の複数の領域を含有する短いペプチド配列である。低親和性の複数の固有領域の存在は、高親和性結合部分の産生のために共に作用する。小さいサイズおよび高ジスルフィド密度は、アヴィマーの低い免疫原性に寄与する。対象のタンパク質に対する高い結合親和性を有するアヴィマーを同定するため、高度に多様なモノマーのプールを合成組換えによって生み出す。このモノマーのプールは、ファージディスプレーまたは他の好ましいスクリーニング法を用いて標的タンパク質に対してスクリーニングされ得る。一旦候補が見つかれば、他のモノマーが添加され、新たな二量体のライブラリーが標的に対してスクリーニングされる。反復の後、その標的タンパク質に対して非常に高い結合親和性を有する三量体が分離される（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら（２００５），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５５６−１５６１を参照）。
【００６１】
アドネクチン
アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンの特定ドメインの天然アミノ酸配列のバックボーン、および無作為化配列を含有する１〜３の標的ループからなる。アドネクチンは、対象の治療標的を特異的に認識する能力に基づいてスクリーニングされ、単離される（例えば、米国特許番号６，８１８，４１８を参照）。
【００６２】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）リガンド
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）リガンドは、「スキャフォールド」ドメインおよび可変ドメインからなる小さなペプチドである。「スキャフォールド」ドメインは、非システインスリーへリックスバンドルドメイン（ブドウ球菌プロテインＡに基づく構造）を含む。可変ドメインは、対象の標的に対してスクリーニングされ得る無作為に作出された配列を含有する。Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）リガンドライブラリーを構築し、ライブラリーを対象のタンパク質への高い結合親和性を有する候補を見つけるためにスクリーニングすることができる。Ｎｙｇｒｅｎ，Ｐ．−Å．（２００８）ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７５，２６６８−２６７６を参照。
【００６３】
天然に存在する結合パートナー
ガレクチン−３のＮ末端に結合する天然に存在するガレクチン−３結合パートナーを、単離または組換えで産生することができ、結合部分として使用できる。ガレクチン−３結合パートナーまたはそのフラグメントを、アッセイの特定の制約（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）に依存して、捕捉結合部分または検出結合部分のいずれかとして使用することができる。ガレクチン−３結合パートナーの例は、ミコール酸およびリポポリサッカリド（Ｂａｒｂｏｎｉら（２００５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７９：６７４９−６７５５）を包含するが、これらに限定されない。加えて、ガレクチン−３の循環は、自己免疫反応を誘発し、結果として正常および病的状態の両方において血清中のガレクチン−３に対する自己抗体の生成を生じる（Ｊｅｎｓｅｎ−Ｊａｒｏｌｉｍら（２００１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（５）：３４８−５６；Ｌｉｍら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９５（１）：１１９−２４；Ｍａｔｈｅｗｓら（１９９５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（６）：３２９−３７）。これらの自己抗体は、ガレクチン−３のＮ末端ドメイン上のエピトープに対する標的となるようである（上記Ｍａｔｈｅｗｓら）。
【００６４】
捕捉
捕捉結合部分の重要な特性は、それが試験混合物の残部からの分離手段を提供するということである。従って、当該技術分野において理解されているように、捕捉結合部分は、すでに固定されるか、不溶性の形態（すなわち、試験溶液の残部から複合体を分離することを可能にする形態）でアッセイに導入され得る。あるいは、固定化は、試料へ捕捉結合部分の可溶性形態の導入後のガレクチン−３を含む免疫複合体の捕捉によって行われてもよい。固定化捕捉結合部分の例は、磁気粒子、ラテックス粒子、マイクロタイタープレートウェル、膜、チップ、ビーズ、キュベット、アレイ、または他の反応容器もしくはホルダー等の固相に共有結合でまたは非共有結合で接着された結合部分である。可溶性捕捉結合部分の例は、リガンド（例えば、ハプテン、ビオチン等）によって化学的に改変された結合部分であり、それはガレクチン−３を包含する複合体の選択的捕捉を可能にするためのホックとして作用する。固相に捕捉結合部分をつなぐ方法は、当該技術分野において周知である。これらの方法は、例えば、二官能性結合剤を採用してもよく、または固相は接触する分子を結合する反応性基（エポキシドまたはイミダゾール等）によって誘導体化されてもよい。異なる標的タンパク質に対する生物特異的捕捉試薬を、同じ場所で混合することができ、またはそれらを異なる物理的配置もしくは処理可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）配置で固相表面に結合させることができる。
【００６５】
標識
本発明の方法によれば、使用される標識は、当該技術分野において従来から公知の任意のものから選択され得る。好ましい標識は、より正確な定量化を可能とするものである。標識の例は、蛍光性部分、酵素、電気化学的活性種、放射性同位体、化学発光分子、ラテックスまたは金粒子、検知可能なリガンド等（例えば、リガンドに対する標識化結合パートナーの２次結合によって検出できる）等を包含するが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、標識は酵素または蛍光性分子である。結合部分に標識を付ける方法は、当該技術分野において周知であり、共有結合および非共有結合を包含する。
【００６６】
１つの実施態様において、結合部分は、蛍光性化合物によって標識化され得る。蛍光標識化結合部分が適切な波長の光に曝露された場合、その存在は、その後、発光した蛍光によって検出され得る。最も一般に用いられている蛍光性標識化合物のなかには、Ｃｙ３およびＣｙ５（シアニン染料ファミリーの水溶性の蛍光染料−「Ｃｙ」染料）、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンがある。
【００６７】
他の実施態様において、酵素に結合部分を連結することによって、検出結合部分を検出可能に標識化する。酵素は、次には、その基質に曝露された場合、例えば分光光度法、蛍光定量法または視覚的方法によって検出され得る化学的部分を産生するように基質と反応する。本発明の結合部分を検出可能に標識化するために使用され得る酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ―Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ―ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを包含するが、これらに限定されない。
【００６８】
また、検出は、放射性標識化結合部分を用いて達成され得る。そして、放射性免疫測定法の使用を通して、結合部分の検出が可能である。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。本発明の目的のために特に有用な同位体は、３Ｈ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、そして好ましくは１２５Ｉである。
【００６９】
また、結合部分は、化学発光化合物にそれをつなぐことにより検出可能に標識化され得る。その後、化学発光結合部分の存在は、一連の化学反応の間に生じる発光の存在を検出することにより測定される。特に有用な化学発光標識化化合物の例は、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００７０】
ガレクチン−３の代替形態
ガレクチン−３は、検出可能な異なる質量によって特徴づけられる複数の異なる形態で試料中に存在する。これらの形態は、翻訳前修飾、翻訳後修飾またはこれらの両方から生じ得る。翻訳前修飾形態は、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、およびＲＮＡエディティングフォームを包含する。翻訳後修飾形態は、とりわけ、タンパク質分解による切断（例えば、親タンパク質のフラグメント）、複合体化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、酸化、メチル化、システイン化、スルホン化、およびアセチル化から生じる形態を包含する。ガレクチン−３の修飾形態は、それらが適切なＮ末端エピトープを保持する限り、本発明の方法によって検出され得る。
【００７１】
診断・予後用途
本発明のガレクチン−３アッセイを、ＨＦ発症リスクを伴う被験者の同定、またはＨＦに罹患した被験者の同定に使用することができる。この方法において、ＨＦ発症のリスクが同定された患者または他の被験者を、本発明のイムノアッセイを用いて経時的に体液から定量化されたガレクチン−３レベルの変化についてモニターしてもよい。特定の実施態様において、ＨＦ発症のリスクが同定された被験者は、経時的に、例えば毎月、年４回、年２回、毎年、２年ごと、または５年ごとに彼または彼女のガレクチン−３レベルをモニターしてもよい。
【００７２】
他の実施態様において、被験者におけるＨＦの存在、ステージもしくは重症度を測定するための診断マーカーとして、または試料中のガレクチン−３の濃度を測定し、この結果と、ガレクチン−３濃度とヒト被験者のＨＦ疾患の重症度またはステージが相関するデータとを比較することにより、彼または彼女の予後を予測するための診断マーカーとして、ガレクチン−３を使用してもよい。本明細書に記載される診断および／または予後の予測方法は、当該技術分野において通常使用される他の診断および／または予後の予測方法（ドップラー解析による心エコー図、ラジオアイソトープ心室造影、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、全血球計算、尿検査、血清電解質、グリコヘモグロビンおよび血液脂質、腎臓および肝臓機能試験、甲状腺機能試験、胸部Ｘ線写真、１２誘導心電図、ＢＮＰ等のバイオマーカーに関する血液試験等）等と組み合わせてもよい。
【００７３】
他の使用
また、本発明の方法およびキットは、ガレクチン−３濃度の増加または濃度の減少によって特徴づけられる他の状態の検出における使用に好適である。このガレクチン−３の発現は、炎症（Ｆｌｏｔｔｅら（１９８３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１１：１１２．）、細胞増殖（Ａｇｒｗａｌら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７２３６）および細胞分化（Ｎａｎｇｉａ−Ｍａｋｋｅｒら（１９９３）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：１）の間、ならびにウイルスタンパク質によるトランスアクチベーションを通して（Ｈｓｕ，Ｄ．ら（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：１６６１）上方制御される。また、その発現は、腫瘍性の形質転換によって影響される。例えば、ガレクチン−３の上方制御は、特定のタイプのリンパ腫（Ｈｓｕ，Ｄ．ら（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：１６６１）および甲状腺癌（Ｆｅｒｎａｄｅｚ，Ｐ．Ｌ．ら（１９９７）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８１：８０）において見出される一方、ガレクチン−３は、結腸癌（Ｌｏｔｚ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３４６６）、乳癌（Ｃａｓｔｒｏｎｏｖｏ，Ｖ．，Ｆ．Ａ．ら（１９９６）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７９：４３．）、卵巣癌（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｅｌｅ，Ｆ．Ａ．ら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ：１０９６）および子宮癌（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｅｌｅ，Ｆ．Ａ．ら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２７：１１８５）等の他のタイプの悪性疾患において下方制御される。ガレクチン−３の発現は、原発性脳腫瘍のグレードおよび悪性度と強い相関がある（Ｂｒｅｓａｌｉｅｒ，Ｒ．ら（１９９７）．Ｃａｎｃｅｒ  ８０：７７６）。
【００７４】
ガレクチン−３は、糖尿病および高血圧症における自己免疫障害および血管合併症を包含する、多くの他の疾患、状態および障害において役割を果たす。ガレクチン−３は、炎症性疾患によって影響を受けた組織において検出されている。例えば、ガレクチン−３は、炎症性眼疾病（Ｈｒｄｌｉｃｋｏｖａ−Ｃｅｌａら（２００１），Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，８５：１３３６−４０）を伴う患者の涙の中に検出された。また、増加したガレクチン−３レベルは、ヒト粥状動脈硬化病変においても記録されている（Ｏｈｓｈｉｍａら（２００３），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，４８：２７８８−９５；Ｎａｃｈｔｉｇａｌら（１９９８），Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１５２：１１９９−２０８）。
【００７５】
キット
また、本発明は、ＨＦのリスクの増加の検出、ＨＦの存在の診断、ＨＦの重症度の決定、ＨＦを伴う被験者の予後の予測に有用なガレクチン−３の定量化のためのキットを提供する。キットは、体液中のガレクチン−３のレベルを定量化するための、１以上の結合部分を含んでいてもよい。例えば、キットは、ガレクチン−３のＮ末端上のエピトープを特異的に認識する捕捉結合部分および検出結合部分を含むことができる。捕捉結合部分および検出結合部分は、ガレクチン−３に対して免疫特異的な抗体を含んでもよい。１つの実施態様において、キットは２つの抗ガレクチン−３モノクローナル抗体（例えばＭ３／３８、９Ｈ３．２または８７Ｂ５）を含む。キットに存在する捕捉結合部分は、固体表面（例えば、プラスチックもしくはガラス容器、またはスライドであるが、これらに限定されない）へあらかじめ結合させてもよい。キットは、試料と結合部分とを混合するための容器をさらに含んでもよい。そのような容器は、検出結合部分によって産生されるシグナルを検出することが可能な検出器具による使用に好適であるり得る。キットは、同一の疾患を示す２次マーカーのレベルを測定するための１以上の試薬（例えば、異なる抗体）をさらに含んでもよい。
【００７６】
本発明のキットは、さらに下記の１以上を含んでもよい：（１）ガレクチン−３レベル測定用キットの使用のための指示書；（２）キットに存在する任意の抗体の標識化結合パートナー；（３）その上に任意のそのような抗体を固定化する固相（試験紙（ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｔｒｉｐ）等）；ならびに（４）診断的使用、予後的使用、または治療的使用、またはそれらの任意の組み合わせに関して規制の承認を示すラベルまたは挿入物。抗体に対する標識化結合パートナーが提供されない場合、抗体そのものを検出可能なマーカー（例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、または放射性部分）で標識化することができる。
【実施例】
【００７７】
本発明を、さらに以下の実施例によって説明する。実施例は説明の目的でのみ提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲および内容を限定するものとして解釈されない。
【００７８】
実施例１：
ヒトガレクチン−３の定量的検出のための酵素結合免疫吸着測定法
ヒトガレクチン−３ＥＬＩＳＡは、ＥＤＴＡ血漿中のヒトガレクチン−３の定量的検出のための酵素結合免疫吸着測定法である。試料中に存在するヒトガレクチン−３、または抗体に結合した標準品（ｓｔａｎｄａｒｄ）をマイクロウェルに吸着させた。インキュベーションの後、非結合物質を洗浄工程の間に除去した。抗ヒトガレクチン−３抗体に結合したＨＲＰが添加され、コーティング抗体によって捕捉されたガレクチン−３に結合した。インキュベーションの後、非結合ＨＲＰ結合体を洗浄工程の間に除去し、そしてＨＲＰと反応性の基質溶液をウェルに添加した。着色生成物は、試料中または標準品中に存在するヒトガレクチン−３の量に比例して形成された。反応を酸の添加によって停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準曲線は７つのヒトガレクチン−３標準品希釈物から調製され、そしてヒトガレクチン−３試料の濃度を決定した。血漿を、血液試料の凝固および分離後、凝結塊または細胞からできるだけ早く除去した。目に見える沈殿を含有する試料を、アッセイにおける使用に先立って澄明化した。著しく溶血した標本または脂血標本は使用されなかった。試料を等分し、生物活性ヒトガレクチン−３の損失を回避するため−２０℃で凍結保存した。アッセイに先立って、凍結試料を室温まで徐々にもどし、穏やかに混合した。
【００７９】
アッセイにおける使用のため以下の試薬を調製した。５０ｍｌの洗浄バッファー濃縮物（２０×、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を、清潔な１０００ｍｌのメスシリンダーへ混合することにより洗浄バッファー（１×）を調製した。最終容量は脱イオン水により１０００ｍｌにし、この溶液を穏やかに混合した。最終溶液のｐＨを７．４に調整した。洗浄バッファー（１×）を清潔な洗瓶に移した。
【００８０】
清潔な１００ｍｌのメスシリンダーへ５ｍｌのアッセイバッファー濃縮物（２０×、１％Ｔｗｅｅｎ２０および１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を添加することにより、アッセイバッファーを調製した。最終容量を脱イオン水で１００ｍｌし、この溶液を穏やかに混合した。
【００８１】
清潔なプラスチックチューブ中のアッセイバッファー（１×）において、濃縮ＨＲＰ結合体溶液を１：１００の比率で希釈した。ヒトガレクチン−３標準品を蒸留水の添加によって６０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、混合物を完全かつ均質な可溶化を確保するために穏やかに回転した。希釈物の作製に先立ち、再構成された標準品を１０分間放置した。
【００８２】
外部標準品希釈物を作製するため、７本のチューブを、各々の標準ポイントに対して１つ、表記した（Ｓｌ、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７）。連続希釈物を、１：２の比率で以下のように調製した：２２５μｌの試料希釈剤を各チューブへピペットで移した。２２５μｌの再構成された標準品（濃度＝６０ｎｇ／ｍｌ）を、最初のチューブへピペットで移し、Ｓｌと表記し、そして混合した（標準品１の濃度＝３０ｎｇ／ｍｌ）。２２５μｌのこの希釈物を第２のチューブへピペットで移し、Ｓ２と表記して、完全に混合してから次の移動を行った。この連続希釈を、さらに５回繰り返して標準曲線のポイントを作成した。試料希釈剤はブランクとしての役割を果たした。
【００８３】
凍結乾燥されたヒトガレクチン−３を、蒸留水中で下記容量まで再構成した：高コントロール（１８０μｌ、５６〜８４ｎｇ／ｍｌ）、中コントロール（２００μｌ、３２〜４８ｎｇ／ｍｌ）および低コントロール（１３０μｌ、３．４〜５．８ｎｇ／ｍｌ）。バイアルを、内容物の定量的可溶化を確保するために回転させた。再構成されたコントロールを１０分間放置した。
【００８４】
各試料、標準品、ブランクおよび任意選択のコントロール試料は、２つ組でアッセイされるべきである。マイクロウェルストリップ（ｓｔｒｉｐ）を、１ウェルあたりおよそ４００μｌの洗浄バッファーで２度洗浄し、洗浄の間にマイクロウェル内容物を充分に吸引した。吸引の前に約１０〜１５秒間、ウェル中に洗浄バッファーを放置した。
【００８５】
最後の洗浄工程の後、ウェルを空にし、マイクロウェルストリップを余分な洗浄バッファーを除去するために吸収紙に軽く打ちつけた。マイクロウェルストリップは乾燥されなかった。
【００８６】
１００μｌの標準品（Ｓｌ〜Ｓ７）を、表１に従って標準品ウェル中にピペットで移した。
【００８７】
【表１】
2014199261.tif 000018
１００μｌの試料希釈剤を、２つ組のブランクウェルに添加した。８０μｌの試料希釈剤を、試料ウェルに添加した。２０μｌの各試料を、２つ組の試料ウェルに添加した。ウェルを粘着フィルムで覆い、２００ｒｐｍに設定されたマイクロプレート振盪機上で１時間室温（１８〜２５℃）でインキュベートした。粘着フィルムを除去し、ウェルを空にした。マイクロウェルストリップを、上記のように３回洗浄した。
【００８８】
次に、１００μｌの希釈されたＨＲＰ結合体を、ブランクウェルを含む全てのウェルに添加した。ウェルを、粘着フィルムで覆い、２００ｒｐｍに設定されたマイクロプレート振盪機上で１時間室温（１８〜２５℃）でインキュベートした。粘着フィルムを除去し、ウェルを空にした。マイクロウェルストリップを、上記のように３回洗浄した。
【００８９】
その後、１００μｌのＴＭＢ基質溶液（テトラメチル−ベンジジン）を各ウェルに添加した。マイクロウェルストリップを、３０分間室温（１８°〜２５℃）でインキュベートし、強い光への直接的な曝露を回避した。
【００９０】
各ウェルへ１００μｌの停止溶液（１Ｍリン酸）を素早くピペッティングすることによって、酵素反応を停止した。各マイクロウェルの吸光度を、一次波長として４５０ｎｍを使用して分光光度計（場合により、参照波長として６２０ｎｍ；６１０ｎｍ〜６５０ｎｍは容認できる）上で読んだ。プレートリーダーを、ブランクウェルの使用により製造業者の指示書に従ってブランクとした（ｂｌａｎｋｅｄ）。試料および標準品の両方の吸光度を測定した。２つ組の標準品および試料の各セットについて平均吸光度を計算した。
【００９１】
標準曲線を、横軸上のヒトガレクチン−３濃度に対する縦軸上の各標準品濃度に関する平均吸光度をプロットすることにより作成した。最適適合曲線を、グラフのポイントを通って引いた。図２を参照。
【００９２】
循環ヒトガレクチン−３の濃度を、縦軸上の平均吸光度を見つけて標準曲線まで水平線を延長することにより、各試料について決定してもよい。交差点で、垂線を横軸まで延長し、対応するヒトガレクチン−３濃度を読んだ。
【００９３】
試料を１：５（試料２０μｌ＋試料希釈剤８０μｌ）に希釈したため、標準曲線から読まれた濃度に希釈係数（×５）を掛けた。代表的な標準曲線を図２に示す。
【００９４】
【表２】
2014199261.tif 000019
性能特性
感度
希釈培地（平均プラス３標準偏差）のものより顕著有意に高い吸光度に帰着する検体濃度として規定されるヒトガレクチン−３の検出限界（ＬｏＤ）は、０．０９ｎｇ／ｍｌ（１２の独立したアッセイの平均値）と決定された。
【００９５】
再現性
イントラアッセイ再現性（アッセイ内の再現性）を、４つの独立した試験において評価した。各アッセイを、異なる濃度のヒトガレクチン−３を含有する８つの血漿試料について６つの複製物を用いて行った。２つの標準曲線を各プレート上で実行した。下記データは、各試料の平均ヒトガレクチン−３濃度および変動係数を示す（表３を参照）。計算された全体的なイントラアッセイ変動係数は４．２％であった。
【００９６】
【表３】
2014199261.tif 000020
インターアッセイ再現性（１つの実験室内のアッセイ間再現性）を、４つの独立した実験において評価した。各アッセイを、異なる濃度のヒトガレクチン−３を含有する８つの血漿試料について６つの複製物を用いて行った。２つの標準曲線を各プレート上で実行した。下記データは、各試料の２４の測定で計算された、平均ヒトガレクチン−３濃度および変動係数を示す。計算された全体的なインターアッセイ変動係数は４．０％であった。
【００９７】
【表４】
2014199261.tif 000021
添加回収率
添加回収率は、３つの個別の血漿試料へ３レベルのヒトガレクチン−３を添加する（ｓｐｉｋｉｎｇ）ことにより評価された。回収率は各々２つの複製物を用いた４つの独立した実験において決定された。これらの実験において、ブランクとして、添加していない（ｕｎｓｐｉｋｅｄ）血漿試料を使用した。全体的な平均回収率は１０１％であった（表５を参照）。
【００９８】
【表５】
2014199261.tif 000022
希釈並行性
異なるレベルのヒトガレクチン−３を有する４つの血漿試料を、連続する２倍希釈で解析した。回収率は、各々４つの複製物を用いた４つの独立した実験において測定された。全体的な平均回収率は８８．６％であった（表６を参照）。
【００９９】
【表６】
2014199261.tif 000023
試料安定性
凍結解凍安定性
血漿試料のアリコートを、−２０℃で保存し、３回解凍し、そしてヒトガレクチン−３レベルを測定した。検出されたヒトガレクチン−３の免疫反応性に、凍結および解凍による有意な損失はなかった。
【０１００】
貯蔵安定性
血漿試料のアリコートを−２０℃、２〜８℃、室温（ＲＴ）、および３７℃で保存し、２４時間後にヒトガレクチン−３のレベルを測定した。上記条件下での保存中に検出されたヒトガレクチン−３の免疫反応性の有意な損失はなかった。
【０１０１】
実施例２Ａ：ガレクチン−３を検出するためのキット
表７は、ガレクチン−３検出用の代表的なキットの構成部品を示す。
【０１０２】
【表７】
2014199261.tif 000024
１つの抗ガレクチン−３抗体、Ｍ３／３８は、マイクロタイタープレートのウェル表面上にコーティングされて、試料中のガレクチン−３分子を結合するための捕捉抗体としての役割をはたす一方、他の抗ガレクチン−３抗体（ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ガレクチン−３抗体（８７Ｂ５））が溶液中に提供されて、捕捉抗体に結合するガレクチン−３分子を検出するための検出抗体として機能する。Ｍ３／３８および８７Ｂ５を本実施例において使用したが、これらの特異的抗体の使用は本発明のキットおよび方法で必要ではない。
【０１０３】
ガレクチン−３コントロール（Ｃ１およびＣ２）は、組換えのヒトガレクチン−３で添加された（ｓｐｉｋｅｄ）タンパク質マトリクスから構成された。
【０１０４】
実施例２Ｂ：組換えガレクチン−３コントロールの検出
実施例２Ａのキットを、ガレクチン−３レベルを定量化するための、マイクロタイタープレートに基づくＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用した。ガレクチン−３に対する２つのモノクローナル抗体が、キットに包含された。このアッセイにおいて、下記段落で非常に詳しく記載されるように、標準品および品質管理物質をウェルへ導入し、６０分間インキュベートした。このインキュベーションの間、標準品に存在するガレクチン−３はウェル表面にコーティングされた捕捉抗体に結合された。後の洗浄工程は、非結合ガレクチン−３を含む試料で、導入された全ての非結合物質を除去した。その後、検出抗体をウェルへ導入し、６０分間インキュベートした。この時間の間、抗体―抗原―抗体複合体が形成された。あらゆる非結合の検出抗体を除去する洗浄工程の後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質が添加され、ＨＲＰの存在下で青色を生じた。発色は、硫酸の添加によって２０分後に停止され、４５０ｎｍの吸光度で読まれる黄色に変色した。標本の試験結果を検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）から読んだ。吸光度は、標本中のガレクチン−３レベルに比例した。  
【０１０５】
使用に先立ち、全てのアッセイ構成成分を３０分間室温にした。プレートを含有するパウチを開いた後、万が一プレートフレームから意図せずにに離されたときのため、各ストリップの一番上の表面を、パーマネントインクで番号付けした。脱イオン水を使用し、１０×洗浄濃縮物（ＷＣ）の１：１０希釈物を調製した。希釈されたバッファーを、２〜８℃で保存した。
【０１０６】
７つのガレクチン−３標準品のセットを、標準品（Ｓ１、組換えヒトガレクチン−３、１バイアルあたり１２ｎｇ）の連続希釈によって調製した。キャリブレーションの範囲は０．１５６ｎｇ／ｍＬ〜１０．０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１０７】
使用前に、ガレクチン−３標準品（Ｓ１）の１個のバイアルを、３００μＬの脱イオン水により再構成し、続いて、９００μＬのアッセイ希釈剤を添加した。周期的なボルテックスおよび穏やかな回転を伴う、バイアルの室温での１５〜２０分の静置によって、再構成水がバイアル内部の全表面積を濡らすことを確実にした。標準品の完全溶解を、使用に先立って得た。
【０１０８】
ガレクチン−３コントロール（Ｃ１およびＣ２）の各々の１個のバイアルを、２５０μＬの脱イオン水で再構成した。周期的なボルテックスおよび穏やかな回転を伴う、バイアルの室温での１５〜２０分の静置によって、再構成水がバイアル内部の全表面積を濡らすことを確実にした。Ｃ１およびＣ２の完全溶解を、使用に先立って得た。
【０１０９】
各再構成されたコントロール（Ｃ１およびＣ２）を、使い捨てのホウ珪酸ガラスもしくはポリプロピレン、または他のタンパク質結合が低いプラスチック試験管もしくはバイアル中でアッセイ希釈剤（ＡＤ）を使用して１０倍（１：１０）に希釈した。各希釈物を、ボルテックスまたは回転により混合した。再構成されたコントロールの最小２５μＬを希釈に使用した。希釈を、外部で（すなわち、ウェル中希釈ではない）かつ使用直前に行った。
【０１１０】
標準品を使用直前に希釈した。６本の使い捨てチューブを、２〜７番までの番号を表記した。２５０μＬのアッセイ希釈剤（ＡＤ）を、各標識化チューブへピペットで入れた。次に、２５０μＬのガレクチン−３標準品（Ｓ１）を、チューブ２にピペットで入れ、穏やかに混合した。その後、２５０μＬをチューブ２からチューブ３に移し、穏やかにボルテックスした。次に、２５０μＬをチューブ３から４へ移し、チューブ７までこのプロセスを継続した。
【０１１１】
マイクロタイタープレートウェルを、コントロール、希釈された標準品およびブランクの各々として指定した。全ての試料を、２つ組で（すなわち、ブランク、希釈された標準品およびコントロール）試験した。
【０１１２】
１００μｌの各試料を、希釈容器から直接、ガレクチン−３捕捉抗体で覆われたマイクロタイタープレートの２つ組のウェルへ移した。ウェルを清潔なプレートシールで覆い、振盪せずに２０〜２５℃で１時間インキュベートした。
【０１１３】
プレートをインキュベートしている間、標識化抗体を、下記表８に示される希釈スキームに従って、アッセイ希釈剤で１：３０に希釈した。
【０１１４】
【表８】
2014199261.tif 000025
次に、プレートシールを除去し、１サイクルあたり１５秒の浸漬時間を伴って４洗浄サイクルを実行するようにプログラムされた機械的ウォッシャーを使用し、１ウェルあたり４００μＬの希釈された洗浄バッファーでウェルを洗浄した。４回目の洗浄の後、ウェルを吸収性のペーパータオル上にそれらを軽く打ちつけることにより空にした。
【０１１５】
次に、１００μＬの希釈された検出溶液を、各ウェルにピペットで入れた。ウェルを清潔なプレートシールで覆い、振盪せずに２０〜２５℃で１時間インキュベートした。プレートシールを除去し、１サイクルあたり１５秒の浸漬時間を伴って４洗浄サイクルを実行するようにプログラムされた機械的ウォッシャーを使用し、１ウェルあたり４００μＬの希釈された洗浄バッファーでウェルを洗浄した。４回目の洗浄の後、ウェルを吸収性のペーパータオル上にそれらを軽く打ちつけることにより空にした。
【０１１６】
１００μＬのＴＭＢ基質（ＴＳ）を、各ウェルにピペットで入れ、そしてこのプレートを暗闇で２０〜２５℃で２０分間インキュベートした。
【０１１７】
５０μＬの停止溶液（ＳＴ）を、各ウェルにピペッティングした。各ウェルの内容物を、清潔なピペットチップを使用して内容物を上下に引いて混合するか、または穏やかにプレートの側面を軽くたたくことにより混合した。ウェルの内容物は青から黄色になった。いかなる泡も、各ウェルの液体表面から除去し、いかなる汚れまたは液体もウェル外部から除去した。
【０１１８】
各ウェルの吸光度を、停止液添加の３０分以内に４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーにおいて測定した。
【０１１９】
アッセイ工程を終えた後、各標準品およびコントロールの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで読んだ。アッセイ用の標準曲線を、下記手法を使用して決定した。ブランクの平均吸光度を、標準品およびコントロールを含む全てのデータから引いた。吸光度（Ａｂｓ４５０）値の平均、標準偏差および変動係数（ＣＶ）を、２つ組の標準品およびコントロールの各セットについて計算した。コントロールのいずれかが、２０％を超える２つ組のＣＶを有する場合、全プレートを棄却し、全ての標本を、新しい試薬を使用して再分析した。平均の最小二乗最適化を伴う第三次多項式曲線あてはめについての適切な曲線あてはめ手段は、各標準品希釈物から使用された。最終ガレクチン−３濃度を得るため、測定された濃度に１０（標本およびコントロールの希釈係数）を掛けた。コントロール値は許容域内にあると確認された。ブランク値は、最低の検量用試料（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）よりも低いと確認された。ブランク値が、最低の検量用試料値を超えた場合（例えば、ブランクが引かれる場合、低い検量用試料値はマイナスである）、アッセイを繰り返した。
【０１２０】
代表的な検量線を図３に示し、各希釈された標準品の吸光度に対する代表値を表９に示す。
【０１２１】
【表９】
2014199261.tif 000026
実施例２Ｃ：臨床試料中の組換えガレクチン−３の検出
実施例２Ｂにおいて概説された方法を、以下に概説される追加の工程を組込み、臨床試料の添加により行った。
【０１２２】
標準品およびコントロールを再構成する間、各試験標本を使い捨てのホウ珪酸ガラスもしくはポリプロピレン、または他のタンパク質結合が低いプラスチックチューブもしくはバイアル中のアッセイ希釈剤（ＡＤ）を用いて１０倍（１：１０）に希釈した。各希釈物を、攪拌または回転によって、希釈に使用されている血清または血漿の最低２５μＬと混合した。希釈を、外部で（すなわち、ウェル中希釈ではない）かつ使用直前に行った。
【０１２３】
アッセイ工程を終えた後、各標本の吸光度をマイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで読んだ。吸光度は標本中のガレクチン−３濃度に比例した。標本およびコントロール中のガレクチン−３濃度は、既知の濃度のガレクチン−３を有する標準品のそれと比較される、標本の吸光度との関係に基づいた。
【０１２４】
アッセイ用の標準曲線を、下記手法を使用して各個別のプレートについて割り当てた。ブランクの平均吸光度を、標準品、コントロールおよび試験標本を包含する全てのデータから引いた。吸光度（Ａｂｓ４５０）値の平均、標準偏差および変動係数（ＣＶ）を、２つ組の標準品、コントロールおよび試験標本の各セットについて計算した。２０％を超える２つ組のＣＶを有する標本を再解析した。コントロールのいずれかが、２０％を超える２つ組のＣＶを有する場合、全プレートを棄却し、全ての標本を、新しい試薬を使用して再分析した。平均の最小二乗最適化を伴う第三次多項式曲線あてはめについての適切な曲線あてはめ手段は、各標準品希釈物から使用された。未知の標本およびコントロールの濃度は、第三次多項方程式に基づいて計算された。最終ガレクチン−３濃度を得るため、測定された濃度に１０（標本およびコントロールの希釈係数）を掛けた。コントロール値は許容範囲内にあると確認された。アッセイコントロールから承諾しがたい結果が得られた場合、アッセイを繰り返した。ブランク値は、最低の検量用試料よりも低いと確認された。ブランク値が、最低の検量用試料値を超えた場合（例えば、ブランクが引かれる場合、低い検量用試料値はマイナスである）、アッセイを繰り返した。
【０１２５】
アッセイの測定範囲
臨床標本を用いたガレクチン−３アッセイの測定範囲は、１．３２〜９６．６ｎｇ／ｍＬであることが実証された。アッセイは、およそ０．１〜１０．０ｎｇ／ｍＬの範囲に及ぶ７つの標準品により較正された。測定が検量用試料によって括弧で括られた（ｂｒａｃｋｅｔｅｄ）範囲内に生じるように、アッセイに先立ち、各試験試料（すなわち、コントロールまたは被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）標本）を、１：１０にあらかじめ希釈した。アッセイの線形性は、臨床検査室標準研究所評価プロトコル６（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ６）（ＣＬＳＩ−ＥＰ６）の推奨に従って確立された。血清および血漿標本を調製し、ガレクチン−３濃度の臨床的に意味のある測定範囲に及ぶように希釈した。アッセイは、９６．６ｎｇ／ｍＬまで直線的であることが実証された。測定範囲の下端は、定量限界（ＬｏＱ）によって定義され、それは１．３２ｎｇ／ｍＬと決定された。
【０１２６】
性能特性
精度
ガレクチン−３アッセイの精度を、ＣＬＳＩ  ＥＰ５−Ａ２ガイドラインに従った評価で評価した。ガレクチン−３濃度の範囲に及ぶ３つの血漿プールを、２０日間に亘って１日当たり２実行（ｒｕｎ）で２つ組で分析した。実行内の、実行から実行の（ｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ）、日から日の（ｄａｙ−ｔｏ−ｄａｙ）、および総精度の推定値を計算し、許容できると決定した。結果を表１０に要約する。
【０１２７】
【表１０】
2014199261.tif 000027
また、精度は、ＣＬＳＩ  ＥＰ５−Ａ２ガイドラインに従い、ＣＬＩＡ認証の３つの臨床検査室で評価された。合計変動係数（ＣＶ）は、３つのＣＬＩＡが認証された臨床検査室サイトにわたって５．６０％〜１６．８９％の範囲であり、すべてのサイトで許容される結果を提供した。
【０１２８】
解析感度
ガレクチン−３アッセイの解析感度は、ＣＬＳＩ  ＥＰ１７−Ａガイドラインの推奨に従って確立された。
ブランク限界（ＬｏＢ）：  ＬｏＢ＝０．８６ｎｇ／ｍＬ
検出限界（ＬｏＤ）：ＬｏＤ＝１．１３ｎｇ／ｍＬ
定量限界（ＬｏＱ）：ＬｏＱ＝１．３２ｎｇ／ｍＬ
解析特異性
ガレクチン−３アッセイは、以下の化合物の存在下で試験された場合、いかなる顕著な交差反応性も示さなかった：ガレクチン−１、ガレクチン−２、ガレクチン−４、ガレクチン−７、ガレクチン−８、ガレクチン−９、ガレクチン−１２、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩ（全て、５００ｎｇ／ｍＬの濃度において）。上記潜在的な交差反応物の交差反応性の平均％は０．３％またはそれ未満である。
【０１２９】
直線性
測定範囲に亘る直線性を、ＣＬＳＩ−ＥＰ６の推奨に従って評価した。試料を、血清および血漿標本へガレクチン−３を添加することにより調製し、その後ガレクチン−３アッセイによって解析した。結果は、アッセイが１．２４〜９６．６ｎｇ／ｍＬまで直線であることを示す。測定範囲の下端は定量限界（ＬｏＱ）によって定義され、それは個別の研究において１．３２ｎｇ／ｍＬであると決定された。
【０１３０】
要約すると、ガレクチン−３アッセイの測定範囲は１．３２ｎｇ／ｍｌ〜９６．６ｎｇ／ｍＬである。
【０１３１】
干渉物質
ガレクチン−３アッセイを、ＣＬＳＩ  ＥＰ７−Ａの推奨に従って、内因性および外因性の両方の潜在的な干渉物質の影響について評価した。結合したビリルビン（５ｍｇ／ｄＬまで）、非結合ビリルビン（１５ｍｇ／ｄＬまで）、アルブミン（ＢＳＡ、１２ｇ／ｄＬまで）、トリグリセリド（３０００ｍｇ／ｄＬまで）、コレステロール（２５０ｍｇ／ｄＬまで）およびクレアチニン（５ｍｇ／ｄＬまで）は、アッセイにおいていかなる干渉も示さない。精製ヘモグロビン（５００ｍｇ／ｄＬまで）は、ガレクチン−３アッセイにおいて干渉を示さなかった；しかしながら、包装された血球溶解物は干渉を示す。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）およびリウマチ因子（ＲＦ）は、ガレクチン−３アッセイとの顕著な正の干渉を生じる。
【０１３２】
ガレクチン−３アッセイは、３４の一般的な薬学的物質（ＨＦ薬物（表１１を参照）を包含する）の存在下で試験された場合、著しい影響を受けなかった；
【０１３３】
【表１１】
2014199261.tif 000028
高用量フック効果
５００ｎｇ／ｍＬまでのガレクチン−３レベルにおける高用量フック効果はない。
【０１３４】
添加回収率
６人の被験者の適合された血清およびＥＤＴＡ血漿試料と共に、アッセイ希釈剤に、５つの異なる添加レベル（１５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬおよび９０ｎｇ／ｍＬ）で、ヒトガレクチン−３を添加した研究において、血清中の平均パーセント回収率は総平均パーセント回収率８１．７％を伴って７９．７％〜８４．６％に及び、ＥＤＴＡ血漿中の平均パーセント回収率は総平均パーセント回収率７８．１％を伴って７１．４％〜８１．４％に及んだ。この研究は、アッセイ希釈剤マトリクスと比較して、血清／血漿マトリクス中の添加された量のガレクチン−３の回収率における差異を実証した。この効果は、恐らく同様の添加回収実験において観察されるが、それは臨床の測定に影響を及ぼさない。
【０１３５】
実施例２Ｄ：既知の心疾患のない被験者からの臨床試料中のガレクチン−３の検出
前向き観察研究において、ガレクチン−３レベルは、１，０９２のバンクに預けられた、既知の心臓病はないが、そのほかでは年齢および性別分布がＨＦ患者集団に似ている被験者からの血漿試料の解析によって測定された。標本は、６０〜８０歳の間の女性（ｎ＝５７２）、および５５〜８０歳の間の男性（ｎ＝５２０）からであった。この参照集団は、次のような異なる民族的背景の個人を含んだ：黒人（ｎ＝３０５、２７．９％）、白人（ｎ＝６８６、６２．８％）、ヒスパニック（ｎ＝４２、３．８％）、アジアまたは太平洋の島民（ｎ＝３０、２．７％）、および明示されなかった（ｎ＝２９、２．７％）。血漿試料は、研究参加者からＥＤＴＡを含有するチューブへ採取された。血液を処理し、その後血漿を−２０℃またはそれより低温で凍結した。
【０１３６】
全ての被験者は、実施例２Ｃに記載されるガレクチン−３アッセイを使用により、検出できるガレクチン−３レベルを有した。ガレクチン−３参照範囲値（表１２を参照）の分布を使用するノンパラメトリック法は、正常値の上限（ＵＬＮ）に基づくガレクチン−３に対する１７．６ｎｇ／ｍＬの単一閾値を確立した。ＵＬＮは、性別または年齢非依存的に、ガレクチン−３値の分布の第９０百分位数として定義される。
【０１３７】
【表１２】
2014199261.tif 000029
実施例２Ｅ：急性非代償性ＨＦを伴う被験者からの臨床試料中のガレクチン−３の検出
急性非代償性ＨＦと診断された被験者における実施例２Ｃ記載のガレクチン−３アッセイの実用性を評価するため、ガレクチン−３レベルを、１８１のバンクに預けられた急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）研究からのＥＤＴＡ血漿試料について測定した。ＡＤＨＦ研究は、救急科（４）において呼吸困難を現わした被験者を登録した、アメリカ合衆国において行なわれた前向き観察研究であった。急性非代償性ＨＦと診断された１８１人の被験者に関するベースライン試料において、血漿ガレクチン−３濃度を測定した。被験者を４年間フォローアップした。参照範囲集団（実施例２Ｄに記載）から得られたガレクチン−３閾値１７．６ｎｇ／ｍＬを用いて、上昇したベースラインガレクチン−３を伴う被験者（ｎ＝６８）のカテゴリーを定義した。患者は、最も低い四分位に比べ最も高い四分位のガレクチン−３レベルで、およそ３倍高い死の危険があった。コックス回帰生存率分析およびカプラン−マイヤー分析は、上昇したベースラインガレクチン−３は、年齢、性別、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラス、左室駆出率、喫煙状態および糖尿病状態に関する調整の後であっても、死亡リスクの重要な予測因子であることを実証した（図４を参照）。
【０１３８】
【表１３】
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実施例２Ｆ：慢性心不全被験者からの臨床試料中のガレクチン−３の検出（慢性ＨＦ研究Ｉ）
慢性ＨＦ研究Ｉは、静脈内薬物投与の必要性を包含する、入院が必要であると考えられる典型的な徴候および症候の組み合わせに基づいて診断されるＮＹＨＡクラスＩＩ〜ＩＶを含んだ。被験者は退院の際に登録されたが、その時点で彼らは標準薬物治療により安定していなければならなかった。ガレクチン−３濃度を、５９２人の被験者の利用可能なベースライン試料についてガレクチンアッセイ使用することにより測定した。参照範囲集団（実施例２Ｄに記載）から得られたガレクチン−３閾値１７．６ｎｇ／ｍＬを用いて、上昇したベースラインガレクチン−３を伴う被験者（ｎ＝３６３）のカテゴリーを定義した。退院後のいかなる時でも、最も低い四分位に比べ最も高い四分位のガレクチン−３レベル患者について、死の危険はおよそ３倍高かった。コックス回帰生存率分析およびカプラン−マイヤー分析は、上昇したベースラインガレクチン−３は、年齢、性別、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラス、左室駆出率、喫煙状態および糖尿病状態に関する調整の後であっても、死亡リスクの重要な予測因子であることを実証した（図５を参照）。
【０１３９】
【表１４】
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実施例２Ｇ：慢性心不全被験者からの臨床試料中のガレクチン−３の検出（慢性ＨＦ研究ＩＩ）
慢性ＨＦ研究ＩＩは、慢性のＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶ  ＨＦを有する患者を登録した。ＨＦの診断は、縮小された左室収縮機能もしくは左室駆出率（ＬＶＥＦ）、または保持された左室収縮機能を伴う拡張機能障害の心エコーまたはラジオアイソトープ心室造影所見と共に、典型的なＨＦの臨床徴候および症候によって確立された。患者は、登録時、標準薬物治療により安定していた。
【０１４０】
ガレクチン−３濃度を、２３２人の被験者についてのベースライン試料に対して、ガレクチンアッセイを用いて測定した。参照範囲集団（実施例２Ｄに記載）から得られたガレクチン−３閾値１７．６ｎｇ／ｍＬを用いて、上昇したベースラインガレクチン−３を伴う被験者（ｎ＝１１８）のカテゴリーを定義した。最も低い四分位に比べ最も高い四分位のガレクチン−３レベルの患者について、３〜６年のフォローアップ期間に亘り、死の危険はおよそ２倍高いことを示した。コックス回帰生存率分析およびカプラン−マイヤー分析は、上昇したベースラインガレクチン−３は、年齢、性別、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラス、左室駆出率、喫煙状態および糖尿病状態に関する調整の後であっても、死亡リスクの重要な予測因子であることを実証した（図６を参照）。
【０１４１】
【表１５】
2014199261.tif 000032
参照による編入
本明細書中に引用された特許文書および科学的論文の各々の全開示は、全ての目的のため、参照によって組込まれる。
【０１４２】
等価物
本発明は、その精神またはその本質的特徴から外れることなく、他の具体的形態で実施されてもよい。従って、上述の実施態様は、本明細書に記載された本発明を制限するのではなく、むしろ全ての点で例示であると考えるべきである。本発明の範囲は、従って、上述の記載によるよりも、むしろ添付の特許請求の範囲によって示され、そして本特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内に含まれる全ての変形は、それに包含されるものと意図される。
【数１】
2014199261.tif 000033
【数２】
2014199261.tif 000034
【図１】
2014199261.tif 000035
【図２】
2014199261.tif 000036
【図３】
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【図４】
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【図５】
2014199261.tif 000039
【図６】
2014199261.tif 000040
【配列表】
2014199261000001.app
【外国語明細書】
2014199261000001.pdf