(57)【要約】【課題】セルロース系バイオマスを主原料とした抗生物質の発酵生産系を確立する。【解決手段】放線菌において機能可能な遺伝子発現プロモーター領域、及びその下流に機能可能に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を含む発現カセット、この発現カセット及び発現カセットの下流に機能可能に連結したKSM生産遺伝子群を含むDNA構築物、又はこのDNA構築物を含むプラスミドを用い、セルロース分解性の放線菌にカスガマイシン（KSM）を生産させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌において機能可能な遺伝子発現プロモーター領域、及びその下流に機能可能に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を含む発現カセットを用い、セルロース分解性の放線菌にカスガマイシン（KSM）を生産させる工程を含む、KSMの生産方法。
【請求項２】
プロモーターがPrpsJである、請求項1に記載の生産方法。
【請求項３】
下記（1）〜（4）のいずれか一のポリヌクレオチドを用い、セルロース分解性の放線菌にカスガマイシン（KSM）を生産させる工程を含む、KSMの生産方法：
（1）配列番号:3の1〜1652のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（2）(1)に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に連結されたKSM生産遺伝子群をセルロース分解性の放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド；
（3）(1)に記載のポリヌクレオチドと少なくとも85％以上の配列同一性を有し、かつその下流に連結されたKSM生産遺伝子群をセルロース分解性の放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド；
（4）(1)に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列において１若しくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、及び／又は付加した配列からなり、かつその下流に連結されたKSM生産遺伝子群をセルロース分解性の放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項1若しくは2に定義した発現カセット又は請求項3に定義したポリヌクレオチド、及びその下流に機能可能に連結したKSM生産遺伝子群を含むDNA構築物を用いる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生産方法。
【請求項５】
請求項4のDNA構築物を含む、プラスミドを用いる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生産方法。
【請求項６】
プラスミドが、pKSM109（受領番号 NITE AP-1545）である、請求項5に記載の生産方法。
【請求項７】
請求項5又は6に定義したプラスミドを、セルロース分解性の放線菌に導入して得られる、放線菌組み換え体。
【請求項８】
C42/pKSM109（受領番号 NITE AP-1544）である、請求項7に記載の放線菌組み換え体。
【請求項９】
請求項1若しくは2に定義した発現カセット、請求項3に定義したポリヌクレオチド、請求項4に定義したDNA構築物、又は請求項5若しくは6に定義したプラスミドを有する、微生物株としてのセルロース分解性の放線菌。
【請求項１０】
請求項7若しくは8に記載の放線菌組み換え体又は請求項9に記載の放線菌を、セルロース系バイオマスに作用させる工程を含む、KSMの生産方法。
【請求項１１】
セルロース系バイオマスが米ぬかを含む、請求項10に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Streptomyces属放線菌に抗生物質カスガマイシン（KSM）生産能を付与することが可能なKSM生産プラスミド、及びこれを利用したKSMを発酵生産可能な組換え放線菌の構築及びその活用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
国内に豊富に賦存する森林バイオマスあるいは稲わら、米ぬか等のセルロース系バイオマスの利活用について、現状では、森林バイオマスは建築材料としての利用方法と、建築材料を切り出す際に端材として副生する木材類を用いた集成材あるいは木材燃料としての利用に留まっている。また、稲わらは多くが鋤込みにより水田へ還元され、米ぬか等のバイオマスも廃棄されるなど必ずしも有効に活用されているとは言えない。
【０００３】
近年、喫緊の課題として、国内森林資源を中心としたセルロース系のバイオマスの利活用に関する社会的ニーズが存在する。しかし現在のところ、稲わらや林地残材、端材などの木質バイオマス、あるいは米ぬか等農林業分野で生じる廃棄物にもセルロース系バイオマスが豊富に含まれているが、これらは現在ほとんど有効利用されていない。近年、これらのバイオマスを化学処理や酵素処理により糖化し、得られた糖を利用してバイオエタノールを生産する試みがなされているが、糖化に必要な酵素が高価であるため、低価格であるバイオエタノールの製造は経済的成功を収めているとはいいがたい。従って、バイオエタノール化技術も含め温暖化防止の観点からカーボンニュートラルとされる木質バイオマス、セルロース系バイオマスの有効利用が叫ばれているが、有効な活用方法が確立されている状況とは言えない（特許文献1、特許文献2、特許文献3）。
【０００４】
一般的に、放線菌は、抗菌剤、抗真菌剤、抗寄生虫薬、抗がん剤などを含む、産業上有用な抗生物質を二次代謝産物として生産するグラム陽性細菌である。特に、Streptomyces属放線菌から見出された抗生物質はこれまでに発見された微生物由来抗生物質の約6割を占めるため、Streptomyces属放線菌は創薬の研究、開発において重要な位置を占める。
【０００５】
放線菌ストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）は、イネのいもち病用の農薬として長年にわたって利用されているアミノグリコシド系抗生物質カスガマイシン（KSM）の生産菌であり、M338（工業生産株）とMB273とが知られている。M338のKSM生産遺伝子群は分割して順次クローン化され、全体として約27kbの大きさの遺伝子クラスターを形成していることが明らかにされている（非特許文献1及び2等）。また、MB273からはカスガマイシン生産遺伝子のうち、耐性遺伝子（カスガマイシンアセチル化酵素遺伝子）のみが単離、報告されていた（特許文献4）。
【０００６】
本発明者等は、S. kasugaensisによるKSM生産について、遺伝子レベルでの研究を長年行っており、MB273の全KSM生産遺伝子群を丸ごと含むコスミドクローンpKSM1（38kb塩基対、図1）としてクローン化し、その全塩基配列を決定した。この詳細な遺伝子情報は、国立遺伝学研究所のDNAデータベース、DNA Data Bank of Japan（DDBJ）に、accession number AB360380として登録されている（非特許文献3）。KSMの生産には、kasJ、kasNO、kasQP、kasRABCDE1E2FのKSM生合成酵素遺伝子群、kasKLM、kacのKSM自己耐性遺伝子群が必要であり、さらに転写活性化遺伝子kasTが発現して、KSM生合成酵素遺伝子群の発現を活性化する必要があることを明らかにした。
【０００７】
また一方で、ある種の放線菌の中にはセルロースやヘミセルロースなどのセルロース系バイオマスを分解する能力をもつものが見出されており、これらは天然に大量に存在する枯れ木や枯れ草の分解に関与することが知られている（非特許文献4）。しかしながら、産業的に有用な抗生物質生産放線菌のほとんどでセルロース系バイオマスの分解能力は確認されておらず、KSM生産菌S. kasugaensisもまた、セルロース分解能をもたず、セルロース系バイオマスからKSMを生産することはできない。このように、セルロース系バイオマスを発酵原料として放線菌により抗生物質を生産する技術は確立されておらず、少なくとも産業面で利用される段階には至っていない。
【０００８】
放線菌C42は、発明者らが秋田県内外の土壌及び植物試料などから単離した菌株の一つであり、カルボキシメチルセルロース（CMC）アッセイ法により、菌体外にセルラーゼ活性を分泌するセルロース分解菌として選抜された。さらに、C42は微結晶性セルロース（アビセル）、及び稲わらや木粉末などの各種セルロース系バイオマスを分解して生育し、菌糸体を形成できる。また、C42は、その16S rRNA遺伝子の配列に基づき、Streptomyces属放線菌（S. thermocarboxydus）であると同定され、染色体組込み型ベクターpTYM19（非特許文献5）を安定に導入することができることを明らかにした。
【０００９】
さらに放線菌に関しては、強力な遺伝子発現を誘導することができるStreptomyces avermitilis由来の構成的プロモーターPrpsJが報告されており（非特許文献6）、kas遺伝子群のうちkasTの上流に、PrpsJを連結した遺伝子カセットが構築され、Streptomyces lividans等によるKSMの生産が試みられている（非特許文献7及び8）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2010-17084
【特許文献２】特開2008-253153
【特許文献３】特開2006-87350
【特許文献４】特開平5-23187
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】池野聡一ら著、「DNA sequencing and transcriptional analysis of the kasugamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces kasugaensis M338-M1.」、Journal of Antibiotics誌、2006年1月発行、59巻1号 P.18-28
【非特許文献２】小嶋郁夫ら著、「The biosynthesis of kasugamycin, an antibiotic against rice blast disease, with particular references to the involvement of rpoZ, a gene encoding RNA polymerase omega subunit」、International Journal of the Society of Materials Engineering for Resources誌、2006年発行、14巻、P.28〜32
【非特許文献３】佐々木玲ら著、「放線菌Streptomyces kasugaensisにおけるカスガマイシン生合成経路特異的活性化遺伝子kasTに関する研究」、日本農芸化学会2006年度大会講演要旨集、2006年3月5日発行、P.256
【非特許文献４】近藤昭彦ら監修、「バイオマス分解酵素の最前線  −セルラーゼ・ヘミセルラーゼを中心として−」、シーエムシー出版、2012年3月1日発行、P.62-65
【非特許文献５】尾仲宏康ら著、「pTOYAMAcos, pTYM18, and pTYM19, actinomycete-Escherichia coli integrating vectors for heterologous gene expression」、Journal of Antibiotics誌、2003年11月発行、56巻11号 P.950-956
【非特許文献６】池田治生ら著、「Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America誌、2010年1月、107巻6号、P.2646-2651
【非特許文献７】春日 和ら著、「異種放線菌を宿主としたカスガマイシンの恒常的生産」、秋田応用生命科学研究会  第18回講演会要旨集、2011年発行
【非特許文献８】Kasuga, K.ら著、「Heterologous production of kasugamycin, an aminoglycoside antibiotic from Streptomyces kasugaensis, in Streptomyces lividans and Rhodococcus erythropolis L-88 by constitutive expression of the biosynthetic gene cluster」、IUMS 2011 Congress要旨集、2011年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
セルロース系バイオマスはいまだ有効利用されているとは言えず、これまでも木質バイオマスを主原料とした物質の発酵生産はバイオエタノールなど比較的安価な物質に限られている。また一方で、放線菌による抗生物質の発酵生産は、デンプン、タンパク質、脂質などを主原料として行われており、セルロース系バイオマスを主原料とした抗生物質の発酵生産系は確立されていない。
【００１３】
発明者らは、セルロース系バイオマスを分解する能力を有する放線菌株を宿主として、これに抗生物質KSMの生産能力を付与することにより、セルロース系バイオマスからKSMを直接発酵生産させるという着想に至った。この方法によれば、バイオエタノールの発酵生産系のように高価なセルラーゼを用いてセルロース系バイオマスを糖化する過程が不要になるだけではなく、比較的高価な物質を生産することが可能になる。
【００１４】
本発明は、放線菌株にKSM生産能力を付与することができるプラスミドDNAの構築方法、及びそのプラスミドDNAをセルロース系バイオマス分解菌C42に導入することにより、セルロース系バイオマスを発酵原料としてKSMを発酵生産できる新たなKSM生産菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下を提供する。
[1]放線菌において機能可能な遺伝子発現プロモーター領域、及びその下流に機能可能に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を含む発現カセットを用い、セルロース分解性の放線菌にカスガマイシン（KSM）を生産させる工程を含む、KSMの生産方法。
[2]プロモーターがPrpsJである、[1]に記載の生産方法。
[3]下記（1）〜（4）のいずれか一のポリヌクレオチドを用い、セルロース分解性の放線菌にカスガマイシン（KSM）を生産させる工程を含む、KSMの生産方法：
（1）配列番号:3の1〜1652のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（2）(1)に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に連結されたKSM生産遺伝子群をセルロース分解性の放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド；
（3）(1)に記載のポリヌクレオチドと少なくとも85％以上の配列同一性を有し、かつその下流に連結されたKSM生産遺伝子群をセルロース分解性の放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド；
（4）(1)に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列において１若しくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、及び／又は付加した配列からなり、かつその下流に連結されたKSM生産遺伝子群をセルロース分解性の放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド。
[4][1]若しくは[2]に定義した発現カセット又は[3] に定義したポリヌクレオチド、及びその下流に機能可能に連結したKSM生産遺伝子群を含むDNA構築物を用いる、[1]〜[3]のいずれか一に記載の生産方法。
[5][1]のDNA構築物を含む、プラスミドを用いる、[1]〜[3]のいずれか一に記載の生産方法。
[6]プラスミドが、pKSM109（受領番号 NITE AP-1545）である、[5]に記載の生産方法。
[7][5]又は[6]に定義したプラスミドを、セルロース分解性の放線菌に導入して得られる、放線菌組み換え体。
[8]C42/pKSM109（受領番号 NITE AP-1544）である、[7]に記載の放線菌組み換え体。
[9][1]若しくは[2]に定義した発現カセット、[3]に定義したポリヌクレオチド、[4]に定義したDNA構築物、又は[5]若しくは[6]に定義したプラスミドを有する、微生物株としてのセルロース分解性の放線菌。
[10][7]若しくは[8]に記載の放線菌組み換え体又は[9]に記載の放線菌を、セルロース系バイオマスに作用させる工程を含む、KSMの生産方法。
[11]セルロース系バイオマスが米ぬかを含む、[10]に記載の生産方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明で作製した、セルロース系バイオマス分解放線菌C42にKSM生産プラスミドpKSM109を導入して得られる遺伝子導入株C42／pKSM109は、稲わら、各種木材粉末、米ぬか、廃綿など、各種セルロース系バイオマスを発酵原料としてKSMを生産することが可能であり、これまで有効利用されていなかったこれらのバイオマスの有効利用を可能にする。
【００１７】
本発明で作製したKSM生産プラスミドpKSM109は、種々の放線菌に導入することにより、新たなKSM生産菌の作製を可能とする。従って、生育基質や様式などが異なる特徴をもつ放線菌にpKSM109を導入することにより、新規のKSM生産方法を可能にする放線菌株を作製することができる。
【００１８】
近年、KSM以外の抗生物質についても生産遺伝子群のクローン化が進み、同様の抗生物質生産プラスミドを作製することが可能になっている。そのため、本発明はセルロース系バイオマスを発酵原料とした様々な医薬の発酵生産系を構築する切っ掛けとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】pKSM1の遺伝子地図。pKSM1はS. kasugaensis MB273由来のKSM生合成遺伝子群全体を含む。pKSM1のうち、KSM生産遺伝子群の右側領域（灰色線部分）については省略した。制限部位の略号は、E, EcoRI；B, BglII；P, PstI、S, SphI；H, HindIIIである。
【図２】KSM生産プラスミドpKSM109の構造。pKSM109はStreptomyces属放線菌に導入することにより抗生物質KSMの生産を導くことができる。本プラスミド上にはkasJからkacまでの17のKSM生産関連遺伝子群（白い五角形で遺伝子の大きさと向きを表す）、及びこれら遺伝子群の発現に必要なKSM生合成系特異的転写活性化遺伝子kasTの強制発現ユニットPrpsJ-kasTが存在している。int＊、組み込み酵素遺伝子；lacZ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子；ori、大腸菌複製起点；bla、アンピシリン耐性遺伝子；oriT、接合伝達起点；tsr、チオストレプトン耐性遺伝子；B、BglII部位；Bam、BamHI部位、X、XbaI部位。
【図３】pKSM109の作製。pKSM109の作製過程を示した。図1のpKSM1をHindIII処理することにより、KSM生産遺伝子群を含む2つのHindIII断片、pKSM1-H1、pKSM1-H3を切り出すことができる。操作I：pKSM1-H1をHindIIIで切断して末端を平滑化した後、XbaIリンカーを連結した（pKSM1-H1X）。操作II：pKSM1-H1XをXbaIとHindIIIで処理して、1.3kbのH1-A断片を調製した。操作III：pKSM1-H1をXbaIとPstIで処理して12.4kbのH1-B断片を調製した。操作IV：pKSM1-H3をHindIIIとSphIで処理しpKSM1-H3を構築した。SphI部位の隣にはベクター由来のXbaI部位が存在する。操作V：pKSM1-H3をXbaIとHindIIIで切断し6.0kbのH3-C断片を調製した。操作VI：H1-A、H1-B、H3-C断片を連結してクローン化した（pKSM6）。操作VII：pKU460のPrpsJプロモーターのEcoRI部位を、EcoRI消化、平滑化、BglIIリンカーの連結によりBglII部位に変換した。操作VIII：PrpsJのBglII-NdeI断片と、PCRで増幅したkasTを含むNdeI-XbaI断片とを連結した（pKSM101）。操作IX：pKSM101のPrpsJ-kasTを含む1.8kb  BglII-XbaI断片と、pKSM6のKSM生産遺伝子群を含む19.7kb XbaI-BglII断片とを連結して、これを染色体組込み型ベクターpTYM19に連結してpKSM109を作製した。制限酵素部位は、X, XbaI; P、PstI； S、SphI; H、HindIII； B、BglII； N、NdeIである。
【図４】C42／pKSM109による各種バイオマスからのKSM生産（1）。発酵原料となる各物質やセルロース系バイオマスを0.5％濃度（w／v）で含む低栄養液体培地MYでC42／pKSM109を培養し、KSMの発酵生産を行った。KSM感受性細菌Pseudomonas fluorescensを用いたバイオアッセイ法により、生産されたKSMの力価を定量した。
【図５】C42／pKSM109による各種木粉からのKSM生産。発酵原料となる各木粉を1％濃度（w／v）で含むMY液体培地でC42／pKSM109を培養してKSMの発酵生産を行った。KSM感受性細菌Pseudomonas fluorescensを用いたバイオアッセイ法により、生産されたKSMの力価を定量した。
【図６】C42／pKSM109による各種バイオマスからのKSM生産（2）。各発酵原料を1％、2％、4％で（w／v）で含むMY液体培地でC42／pKSM109を培養してKSM発酵生産を行い、18日目のKSM生産量をバイオアッセイ法により定量した。
【図７】C42／pKSM109による米ぬかからのKSM生産。発酵原料として米ぬかを2％、4％、8％濃度（w／v）でMY培地に添加し、C42／pKSM109を培養してKSMの発酵生産を行った。5日ごとに培養液をサンプリングし、培養上清に含まれるKSM量をHPLC分析により定量した。
【図８】pKSM109のヌクレオチド配列。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、セルロース系バイオマス分解放線菌C42と、放線菌において抗生物質KSMの生産能を導くことのできるプラスミドpKSM109（KSM生産プラスミド）とを組み合わせることにより、各種セルロース系バイオマスを主発酵原料としてKSMを生産することができる遺伝子組換え株を作製し、さらにその遺伝子導入株を利用してセルロース系バイオマスを原料としてKSMを発酵生産する技術に関するものである。
【００２１】
本発明で「カスガマイシン（KSM）」というときは、特に記載した場合を除き、通常の意味で用いており、下記の構造を有する化合物を指す。
【００２２】
【化１】
2014168425.tif 000002
【００２３】
本発明で数値範囲を「m〜n」で表すときは、特に記載した場合を除き、両端の値m及びnを含む。
【００２４】
本発明は、放線菌にカスガマイシン（KSM）を生産させるための発現カセットを提供する。本発明の発現カセットは、放線菌において機能可能な遺伝子発現プロモーター領域、及びその下流に機能可能に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を含む。
【００２５】
本発明の発現カセットに用いることのできるプロモーター領域は、下流に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を強制的に発現することができるものである。例えば、Streptomyces avermitilis由来の構成的プロモーターPrpsJ、多コピーベクターのPermE、および多種の細菌で機能可能なネオマイシン耐性遺伝子のプロモーターPneo等がある。
【００２６】
本発明の発現カセットに用いることのできるプロモーター領域の好ましい例は、PrpsJ及びその変異体である。PrpsJは放線菌において強力な遺伝子発現を誘導することができる遺伝子発現プロモーターである（非特許文献6）。そのためpKSM109を放線菌に導入すると、放線菌細胞内でKasTタンパク質が強制的に過剰発現し、これがKSM生産遺伝子群の発現を導くことにより、KSMの大量生産が可能になる。PrpsJは放線菌Streptomyces avermitilis MA4680に由来し、配列表の配列番号:3の1〜564(GATCT...CATATG)のヌクレオチド配列を有する。このプロモーターはリボソームS10タンパク質遺伝子rpsJ（必須遺伝子）のプロモーターであり、ほとんどのStreptomyces属放線菌が非常に高い同一性を有する配列をもつと推察される。本発明には、このようなPrpsJの変異体を用いてもよい。
【００２７】
PrpsJの変異体は、下記（1）〜（3）のいずれか一のポリヌクレオチドであってもよい：
（1）配列番号:3の1〜564のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド；
（2）配列番号:3の1〜564のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも85％以上の配列同一性を有し、かつその下流に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド；
（3）配列番号:3の1〜564のヌクレオチド配列において１若しくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、及び／又は付加した配列からなり、かつその下流に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド。
【００２８】
本発明の発現カセットは、上述のプロモーター領域の下流に機能可能に連結された転写活性化因子KasTをコードする遺伝子を含む。転写活性化因子KasTは、配列表の配列番号:3の565〜1652のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質である。
【００２９】
放線菌におけるKasTの機能に関し、本発明者らは、放線菌の標準的な遺伝子発現用宿主であるStreptomyces lividans TK21を用い、次の事項を確認している。
1）KSM生合成遺伝子群のkasJからkac（図1参照）のみをTK21に導入したところ、KSM生産は観察されなかった（非検出）。
2）kasTからkacまでをTK21に導入したところ、KSM生産は観察されなかった（非検出）。
3）1）の菌に、多コピーベクターのPermE（強力な構成的発現プロモーター）の下流にkasTを連結して導入したところ、KSM生産が観察された。
4）KSM生合成遺伝子群のkasJからkacを用い、kasJ上流にPrpsJ-kasTを連結してTK21に導入すると、KSM生産が観察された。
【００３０】
これらの結果から、もともとのKSM生産菌(Streptomyces kasugaensis)以外の異種放線菌では、KSM遺伝子群を発現させてKSMを生産させるためには、KasTを有効量で発現させることが好ましいと考えられ、本発明のカセットは、その機能を有するものである。
【００３１】
本発明の発現カセットのより具体的な例は、下記（1）〜（4）のいずれか一のポリヌクレオチドである。
（1）配列番号:3の1〜1652のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（2）(1)に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に連結されたKSMを放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド；
（3）(1)に記載のポリヌクレオチドと少なくとも85％以上の配列同一性を有し、かつその下流に連結されたKSMを放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド；
（4）(1)に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列において１若しくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、及び／又は付加した配列からなり、かつその下流に連結されたKSMを放線菌で発現させる機能を有する、ポリヌクレオチド。
【００３２】
なお、本発明でポリヌクレオチドに関し、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」というときは、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、ハイブリダイゼーションの条件は、Molecular Cloning． A Laboratory Manual． 2nd ed．（Sambrook et al．，Cold Spring Harbor Laboratory Press）及びHybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138，267−284（1984））の記載に従い、取得しようとするポリヌクレオチドに合わせて適宜選定することができる。例えば85％以上の同一性を有するDNAを取得する場合、2倍濃度のSSC溶液及び50％ホルムアミドの存在下、45℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、60℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また90％以上の同一性を有するDNAを取得する場合、2倍濃度のSSC溶液及び50％ホルムアミドの存在下、50℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1倍濃度のSSC溶液）を用い、65℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。
【００３３】
また、本発明でポリヌクレオチドに関し、「1若しくは複数のポリヌクレオチドが置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度である。このような変異型ポリヌクレオチドを調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
【００３４】
本発明でヌクレオチド配列（「塩基配列」ということもある。）に関し「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×100で算出できる。また、このような解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
【００３５】
本明細書において、ヌクレオチド配列に関し、同一性が高いというときは、特に記載した場合を除き、少なくとも70％、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97．5％以上さらに好ましくは99％以上の配列の同一性を指す。
【００３６】
本発明の発現カセットの特に好ましい態様の一つは、配列番号:3の1〜1652のヌクレオチド配列からなるもの（図8参照）であるが、ここでは、kasT部分（配列番号:3の566〜1652）においてはkasT本来の開始コドン（GTG）が削除されており、PrpsJプロモーターに連結する際にNdeIサイトに含まれるATG(配列番号:3の563〜565)が開始コドンになるように構築されている。
【００３７】
本発明はまた、上述の発現カセット、及びその下流に機能可能に連結したKSM生産遺伝子群を含む、DNA構築物を提供する。
【００３８】
本発明で「KSM生産遺伝子群」というときは、特に記載した場合を除き、放線菌においてKSMを生産させるために必要な複数の遺伝子からなるクラスターを指し、典型的には、図1に示したkasJからkacまでの17遺伝子群を含む領域である。
【００３９】
本発明のDNA構築物は、上述の発現カセットの下流に、KSM生産遺伝子群を機能可能に連結することにより構築できるが、図3に示したように操作し、プラスミドに挿入されたものとして構築してもよい。
【００４０】
プラスミドは、選択のためのマーカーや、挿入配列を宿主染色体に組み込むための配列等を含んでいてもよい。DNA構築物を挿入するプラスミドとしては、大腸菌−放線菌型細菌のシャトルベクターを好適に用いることができ、この例として、染色体組込み型ベクターpTYM19（非特許文献5）、pTYM18、pTOYAMAcos等を挙げることができる。
【００４１】
本発明により提供されるDNA構築物の好ましい例の一つは、配列表の配列番号:3のヌクレオチド配列からなるものである。なお配列番号:3のヌクレオチド配列において、1653〜1658部分（TCTAGA）は、kasTとkasJ-kac断片の連結に用いた部分である。
【００４２】
本発明のDNA構築物がpTYM19に挿入されたKSM生産プラスミドpKSM109は、2013年2月20日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8、TEL：0438-20-5580、FAX：0438-20-5581）に寄託された（受領番号 NITE AP-1545）。
【００４３】
本発明はまた、本発明のプラスミドを放線菌に導入して得られる、放線菌組み換え体を提供する。宿主とすることのできる放線菌の例は、Streptomyces属、Kitasatospora属、又はStreptacidiphilus属に属するものであり、より特定された例は、Streptomyces thermocarboxydus、Streptomyces lividans、Streptomyces avermitilis、Streptomyces griseus、Streptomyces kanamyceticus、Streptomyces peucetius、Streptomyces galilaeus、Streptomyces parvulus、又はStreptomyces antibioticusのいずれかに属する菌株である。本発明者らは、S. lividans TK21、TK24、及びJT46、S. avermitilis SUKA1、S. thermocarboxydus C42、及びC44、ならびにStreptomyces属放線菌N700、K12及びMai3に、pKSM109を導入し、プラスミドが放線菌染色体に安定に導入されることを確認した。そのうち、KSM生産が認められた株は、 S. lividans TK21、TK24、及びJT46、S. avermitilis SUKA1、S. thermocarboxydus C42及びC44、ならびにStreptomyces属放線菌K12であった。S. lividansに比べて他の菌は形質転換効率が低く、DNAの制限系が強いことが推察された。
【００４４】
宿主として特に好ましい例の一つは、セルロース分解性である放線菌である。本発明で放線菌に関し「セルロース分解性」というときは、特に記載した場合を除き、カルボキシメチルセルロース(CMC)を分解するセルラーゼ活性の検定(CMC アッセイ)により、セルラーゼ分泌が認められる放線菌をいう。
【００４５】
CMC アッセイ（Teather RM and Wood PJ. (1982) Use of Congo red polysaccharide interactions complex formation between Congo red and polysaccharide in detection and assay of polysaccharide hydrolases. Methods Enzymol. 160:59-74）は、具体的には下記の手順によることができる。
1）1.5%普通寒天(Wako)、0.5% CMC Na塩(low viscosity, Sigma) 60mLを溶解し、角形シャーレ1号(10x13.5cm)に流し込んで固める(CMC plate)。
2）市販ストロー（6mm径）でCMCプレートに穴(ウェル)をあける。
3）ウェルに被試験菌の培養液上清60〜80μLをいれ、37℃にて一晩静置する。
（培養液上清中のセルラーゼがplate中に拡散しつつCMCを分解する）
4）0.1%コンゴーレッド溶液を流し込み、室温で15分放置しCMCを染色する。
5）1M NaClを流し込み、常温で10分間脱染色を行う。数回行う。
【００４６】
セルロース分解性である放線菌は、種々の者が知られている。また、本発明者らは、セルロース分解性の放線菌株として、Streptomyces thermocarboxydus C42、及びStreptomyces argenteolus M178を同定している。Streptomyces thermocarboxydus C42は、日本国内の土壌から単離された。
【００４７】
本発明に宿主として用いることのできるセルロース分解性の放線菌の好ましい例は、下記のものである：
（i）Streptomyces thermocarboxydus C42、
（ii）Streptomyces thermocarboxydus C42又はC42/pKSM109と同一の菌学的性質を有する、Streptomyces thermocarboxydus に属するC42の変異体、又は
（iii）Streptomycesに属する菌であって、配列番号:4のヌクレオチド配列（C42の16S rRNA遺伝子の部分配列）と少なくとも95%、好ましくは97.5％、より好ましくは98％、さらに好ましくは99%、さらに好ましくは99.5％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる部分を含む16S rRNA遺伝子を有する、放線菌。
【００４８】
ここでStreptomyces thermocarboxydus C42又はC42/pKSM109と同一の菌学的性質とは、下記(a)及び（b）を満たすことをいう：
（a）菌糸状に生育する、及び
（b）CMCを資化する。
【００４９】
上述の、本発明に宿主として用いることのできるセルロース分解性の放線菌（i）〜（iii）はいずれも、通常のGPY培地を用いて培養することができる。
【００５０】
Streptomyces thermocarboxydus C42にpKSM109を導入して得られた放線菌組換え体C42/pKSM109は、2013年2月20日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8、TEL：0438-20-5580、FAX：0438-20-5581）に寄託された（受領番号 NITE AP-1544）。
【００５１】
本発明はまた、上述の放線菌組換え体の子孫も提供する。放線菌組換え体の子孫は、導入された配列が機能的に維持され、所望の性質を発揮できる限り、本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明は、本発明の発現カセット、本発明のDNA構築物、本発明のプラスミドを有する、微生物株としての放線菌を提供する。
【００５２】
本発明の放線菌組み換え体又は上述の微生物株としての放線菌は、KSMを生産しうる。KSM生産の有無及び程度は、KSM感受性菌Pseudomonas fluorescens IFO15334を被検菌として用いたバイオアッセイ法により評価できる。また場合により、本発明の放線菌組み換え体又は上述の微生物株としての放線菌は、セルロースを分解する能力を有し、セルロースを含むバイオマスを資化して、KSMを生産しうる。
【００５３】
したがって、本発明はさらに、KSMの生産方法を提供する。本発明のKSM生産方法は、本発明の放線菌組み換え体又は上述の微生物株としての放線菌を、セルロース系バイオマスに作用させる工程を含む。本発明に用いることのできるセルロース系バイオマスの例は、木材、廃材木、もみ殻・稲わら、麦わら、バガス、スイッチグラス、パルプ廃液、木綿（廃木綿）、紙類を含む。セルロース系バイオマスはまた、広葉樹又は針葉樹に由来するものであってもよく、より具体的には、アカシア、マカンバ、ミズナラ、シナノキ、ヒバ、スギ、アカマツ由来であってよい。本発明者らは、C42／pKSM109が、各種広葉樹（アカシア、マカンバ、ミズナラ、シナノキ）や針葉樹の辺材（スギ、アカマツ）を原料としてKSMを生産できることを確認している。また、C42／pKSM109は、微結晶セルロース、稲わら粉、米ぬか、スギ辺材、ミズナラ粉については、高KSM生産性を示すことを確認している。特に、米ぬかは繊維質としてのセルロース系バイオマス以外にデンプンやタンパク質、脂質などの栄養分に富むため、KSM生産のための原料として用いるのに適しているということができる。
【００５４】
KSM生産は、菌体を、適切な濃度でセルロース系バイオマスを懸濁した培養液で培養することにより、実施することができる。培養条件（温度、時間等）は、当業者であれば、適宜設定できる。またセルロース系バイオマスの濃度も適宜とすることができ、例えば、1％（w／v）以上とすることができ、2％以上としてもよい。本発明者らの検討によると、米ぬか8％条件では1,000μg／mL以上の高KSM生産に至ったため、米ぬかがC42／pKSM109によるKSM生産に適した発酵原料であることが示された。
本発明を、以下、実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００５５】
〔MB273由来のKSM生産遺伝子群を含むpKSM109の作製〕
【００５６】
以下、MB273由来のKSM生産遺伝子群を用いてKSM生産プラスミドpKSM109を作成する方法について詳細に述べる。pKSM109の作製は、
1）KSM生産遺伝子群（kasJからkacまでの17遺伝子部分）を含み、両末端がXbaI制限部位としたDNA断片の単離（pKSM6の作製）、
2）kasT遺伝子強制発現カセットPrpsJ-kasT（pKSM101）の作製、
3）1）、2）の連結によるpKSM109の作製、
の3段階で行った（図3）。また、遺伝子操作上の扱いやすさを考慮して、pKSM109の作製には、分割してクローン化されていたM338由来のKSM生産遺伝子群ではなく、pKSM1として丸ごと無傷でクローン化されていたMB273由来の遺伝子群を用いた。その結果、図2に示した遺伝子地図、制限酵素部位を特徴とするpKSM109の作製に成功した。
【００５７】
1）のpKSM6は、kasJからkacまでの17のKSM生産遺伝子群を含み、両末端がXbaI制限部位となったDNA断片をクローン化したプラスミドである。pKSM1（図1）には4カ所のHindIII制限部位（KSM生産遺伝子群のうちkasTの下流、kasBの内部、及びKSM生産遺伝子群の挿入位置に隣接する2部位）が存在しており、HindIIIで切断すると、13.7kbのDNA断片（kasJからkasBの途中まで）、及び16.1kbのDNA断片（kasB途中からkac下流側まで）を切り出すことができた。これら2断片をそれぞれ大腸菌での遺伝子操作ベクターpUC18のHindIII部位に連結し、pKSM-H1及びpKSM-H3をそれぞれ作製した。
【００５８】
pKSM-H1の13.7kbのDNA断片ではkasA遺伝子内部に一カ所のPstI制限部位が存在する。pKSM-H1のクローン化DNA断片をHindIIIで切断し、末端のT4 DNAポリメラーゼによる平滑化後に、平滑化末端へのXbaIリンカーの連結を行い、両末端をXbaIに変換した断片としてクローン化し、pKSM-H1Xを作製した（操作I）。このプラスミドをXbaIとPstIとで切断し、kasJからkasAの途中までを含む12.4kb XbaI-PstI断片H1-Aを調製した（操作II）。また、pKSM-H1をHindIII及びPstIとで切断し、1.3kbのHindIII-PstI断片H1-Bを調製した（操作III）。
【００５９】
pKSM-H3ではkasI遺伝子内部にBglII制限部位、SphI制限部位が並んで存在している。pKSM-H3の6.0kb HindIII-SphI領域を当該酵素で切断し、pUC18のHindIII-SphI間に連結してpKSM-H3Cを作製した。さらに、このプラスミドをHindIII部位及びベクターのクローニング部位に含まれるXbaI制限部位で切断し、kasBからkasIまでを含む6.0kb DNA断片、H3-Cを調製した（操作IV）。
【００６０】
放線菌染色体組込み型ベクターpTYM18（非特許文献5）のHindIII制限部位を、HindIII切断、平滑化、再連結により欠失させたpTYM181を作製した。pTYM181のXbaI制限部位に、H1-A、H1-B、H3-Cの3断片を順番に連結し、kasJからkacまでの遺伝子群を含む、19.7kb XbaI断片を含むプラスミドpKSM6を作製した（操作V）。
【００６１】
2）のkasT遺伝子強制発現カセットPrpsJ-kasTは、以下のように構築した。放線菌染色体組込み型ベクターpKU460（非特許文献6）にはPrpsJを含む0.6kb EcoRI-NdeI断片が含まれている（図3）。EcoRIでの制限処理、T4 DNAポリメラーゼによる末端の平滑化、平滑化末端へのBglIIリンカーの連結を順次行うことにより、EcoRI制限部位をBglII制限部位に置換し（操作VI）、PrpsJを含む0.6kb BglII-NdeI断片を得た。
【００６２】
kasT遺伝子はプライマーNde-kasTf（GATCCATATGGCGGAAACAGTTCGGGCCGA）（配列番号:1）及びXba-kasTr（GCTATCTAGAGGCCTGGGATCTCGTACTAC）（配列番号:2）を用いてPCR増幅し、1.2kb NdeI-XbaI断片としてクローン化した。
【００６３】
汎用的な大腸菌用クローニングベクターpUC19のBamHI制限部位を、BamHI消化、末端の平滑化、BglIIリンカーの付加により、BglII制限部位に置換し、pUC19Bglを作製した。このpUC19BglのBglII-XbaI間に、PrpsJを含む0.6kb BglII-NdeI断片と、kasTを含む1.2kb NdeI-XbaI断片とを同時に連結することにより、1.8kb PrpsJ-kasTカセットを含むプラスミドpKSM101を作製した（操作VII）。
【００６４】
3）のpKSM109は、以下のようにして作製した。1）のpKSM6からKSM生産遺伝子群を含む19.7kb XbaI-BglII断片と、2）のpKSM101から1.8kb PrpsJ-kasTカセットを含むBglII-XbaI断片とを、それぞれ切り出して、これらをpUC19のマルチクローニング部位にBglII制限部位を導入しておいたpUC19XBのBglII部位に連結し、21.5kb PrpsJ-kasT-kas遺伝子群を含むpKSM103を作製した。
【００６５】
pKSM103から21.5kb PrpsJ-kasT-KSM生産遺伝子群を含むBglII断片を切り出して、放線菌染色体組込み型ベクターpTYM19のBamHI部位に連結することにより、本発明を構成するKSM生産プラスミドpKSM109を構築した（操作VIII）。
【実施例２】
【００６６】
〔C42／pKSM109の作製法〕
【００６７】
pKSM109の放線菌宿主への導入は、1）Streptomyces放線菌のプロトプラストの作製法、及びポリエチレングリコール（PEG）法によるプロトプラストの形質転換（非特許文献2、及びKieserら著、「Practical Streptomyces Genetics」、John Innes Centre（UK）、2000年発行、P.231-235）、大腸菌宿主からプラスミドの接合伝達（非特許文献6）により行い、pKSM109の選抜マーカーであるチオストレプトンの耐性株として単離した。
【００６８】
以上の手法により、放線菌の遺伝子発現用宿主として用いられるS.lividans TK21、北里大学で開発した抗生物質生産用宿主S.avermitilis SUKA1、及び我々の研究室で単離したセルロース分解放線菌S.thermocarboxydus C42、同種のC44、Streptomyces属放線菌N700、同K12、同Mai3にpKSM109を導入することに成功した。得られたpKSM109導入株では、プラスミドは放線菌染色体に安定に導入された。
【００６９】
得られたpKSM109導入株について、KSM生産試験を行った。S.kasugaensisのKSM生産試験に用いるKPM培地2mlと直径9mmのガラス玉を入れて滅菌した18mm径短試験管に、遺伝子導入株を植菌し、30°Cにて、130strokes／minの往復震盪培養を5日から7日間行った。
【００７０】
KPMの組成は、マルトース一水和物15g／l、酵母エキス（DIFCO）4g／L、Phytone-peptone（BBL）15g／L、MgSO4・7H2O  0.5g／L、KH2PO4  1g／L、NaCl  3g／L、pH6.5である。
【００７１】
培養液を遠心分離にかけて培養上清を採り、これについて、KSM感受性菌Pseudomonas fluorescens IFO15334を被検菌として用いたバイオアッセイ法によりKSMの有無を調べた。この実験により、実施例2に示した放線菌株のpKSM109遺伝子導入株がそれぞれKSMを生産できたため、pKSM109が放線菌宿主でKSM生産を導くことができることが示された。すなわち、pKSM109は、これに含まれるkasJからkacまでの17遺伝子、及びkasTの強制発現カセットが、S.kasugaensis以外の放線菌宿主においてもKSM生産を導くことが可能であることが示された。
【実施例３】
【００７２】
〔C42／pKSM109による各種バイオマスからのKSM生産（1）〕
【００７３】
C42にpKSM109を導入した株（C42／pKSM109）を、種々の炭素源を主要生育基質として培養し、その培養液においてKSMが生産されるか検討した。50mLのMY液体培地を100mL三角フラスコに入れ、これに主要炭素源として、0.5％濃度（w／v）の微結晶性セルロース、稲わら粉末、スギ材木粉、グルコース、グリセロールをそれぞれ添加し、菌体をほぐすためのステンレスばね（太さ1mm、外径10mm、長さ25mm、ピッチ1.5mm）1個とともに滅菌した。ここで用いた稲わら粉末は稲わらをコーヒーミルで粉砕したものであり、スギ材木粉はスギ材木の端材を振動式ミルで粉末化したものである。
【００７４】
MY液体培地の組成は、KH2PO4  2g／L、Na2HPO4・12H2O  8g／L、酵母エキス（DIFCO）0.5g／L、MgSO4・7H2O  1g／L、（NH4）2SO4  2.5g／L、NaCl  0.5g／L、TE溶液0.2mL／Lである。また、TE溶液は、銅や亜鉛などの微量元素を含む無機塩溶液であり、その組成は、ZnCl2  40mg／L、FeCl3・6H2O  200mg／L、CuCl2・2H2O  10mg／L、MnCl2・4H2O  10mg／L、（NH4）6Mo7O24・4H2O  10mg／L、Na2B4O7・10H2O  10mg／Lである。
【００７５】
上述の培地にC42／pKSM109を植菌し、30℃にて250rpmの回転震盪培養を行い、KSM生産を経時的に調べた。KSMの定量はバイオアッセイ法により行った。
【００７６】
その結果、C42／pKSM109がセルロース結晶や稲わら粉末、スギ材木粉を主要炭素源としてKSMを生産できることが明らかに示された（図4）。なお、KSM生産株であるS.kasugaensisは同様の稲わら粉末添加培地、スギ材木粉添加培地で培養してもKSMを生産しなかった。従って、従来は稲わらや材木などの木質バイオマス及びセルロースをKSM生産用の発酵原料として用いることはできなかったが、木質バイオマス分解菌のpKSM109導入株により、これらを発酵原料としてKSMを生産できることが示された。
【００７７】
C42／pKSM109によるKSMの生産量は、セルロースを炭素源とした場合に300μg／mLであった。S.kasugaensisをKSM生産用のKPM培地で同様に培養した場合、同程度のKSM生産が観察されるため、セルロースを培養基質としてC42／pKSM109を培養することにより、通常のKSM生産条件でのS.kasugaensisと同程度のKSM生産性を実現できることが示された。
【実施例４】
【００７８】
〔C42／pKSM109による各種木粉からのKSM生産〕
【００７９】
各種木粉を1％（w／v）で添加して発酵原料とした場合のC42／pKSM109によるKSMの生産について示す。ここでは広葉樹の木粉としてアカシア、マカンバ、ミズナラ、シナノキを、針葉樹の木粉としてヒバ心材、スギ心材、スギ辺材、アカマツ辺材を用いた。KSMの生産量を経時的に追跡した。KSMの発酵生産と定量は実施例3と同様にして行った。
【００８０】
その結果、C42／pKSM109は各種広葉樹（アカシア、マカンバ、ミズナラ、シナノキ）や針葉樹の辺材（スギ、アカマツ）を原料としてKSMを生産できることが示された。特にスギ辺材からは384 μg／mLという最も高いKSM生産量が得られた（図5）。
【実施例５】
【００８１】
〔C42／pKSM109による各種バイオマスからのKSM生産（2）〕
【００８２】
濃度を変えて各種セルロース系バイオマスを添加して発酵原料とした場合のC42／pKSM109によるKSMの生産について示す。ここでは、微結晶セルロース、廃綿粉、稲わら粉、米ぬか、各種木粉を1、2、4％の濃度でそれぞれ添加し、KSM生産試験を18日間行い、培養液に蓄積されたKSM生産量を定量した。
【００８３】
この結果、微結晶セルロース、稲わら粉、米ぬか、スギ辺材、ミズナラ粉で800μg／mL以上の高KSM生産性を示したため、C42／pKSM109は各種セルロース系バイオマスを主要原料としてKSMを高生産できることが示された（図6）。特に、米ぬかは繊維質としてのセルロース系バイオマス以外にデンプンやタンパク質、脂質などの栄養分に富むため、1,190μg／mLという著しく高いKSM生産性を示した。
【実施例６】
【００８４】
〔C42／pKSM109による米ぬかからのKSM生産〕
【００８５】
濃度を変えて米ぬかを添加して発酵原料とした場合のC42／pKSM109によるKSMの生産について示す。米ぬかはセルロース系バイオマス以外にも、炭水化物、タンパク質、脂質、各種ビタミン類、そしてKSMの原料であるイノシトールの誘導体（フィチン酸）などを豊富に含んでおり、KSM生産のための発酵原料として有望である。米ぬかを2、4、8％（w／v）の3濃度で添加してKSM生産試験を行い、米ぬか濃度とKSM生産量との関連を調べた。
【００８６】
その結果、米ぬか8％条件では1,000μg／mL以上の高KSM生産に至ったため、米ぬかがC42／pKSM109によるKSM生産に適した発酵原料であることが示された（図7）。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明で得られたC42／pKSM109は、現在産業廃棄物などとして有効利用されていない各種セルロース系バイオマスを発酵原料として、付加価値の高いKSMの発酵生産に利用できる可能性をもつ。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号:1  PCRプライマー
配列番号:2  PCRプライマー
配列番号:3  DNA構築物（pKSM109）のヌクレオチド配列
配列番号:4  C42の16S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列
【図１】
2014168425.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014168425.tif 000009
【図８】
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【配列表】
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