(57)【要約】      （修正有）【課題】低コスト、かつヘパリンカラムクロマトグラフィーによる精製効率がよく，さらに安定で保存中に分解されないウシFGF4およびブタFGFを提供する。【解決手段】ウシまたはブタのゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、ウシまたはブタＦＧＦ(Fibroblast Growth Factor)４遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅し、これらを連結してウシまたはブタFGF4のコード領域を含むＤＮＡを調製し、これを宿主で発現させてウシまたはブタFGF4タンパク質を得る、ウシまたはブタFGF4タンパク質の製造方法、および、特定のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列において、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、線維芽細胞増殖促進活性を有する、安定型FGF4タンパク質。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシまたはブタのゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、ウシまたはブタFGF4 (Fibroblast Growth Factor 4)遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅し、これらを連結してウシまたはブタFGF4のコード領域を含むＤＮＡを調製し、これを発現させてウシまたはブタFGF4タンパク質を得る、ウシまたはブタFGF4タンパク質の製造方法。
【請求項２】
ウシまたはブタFGF4タンパク質が、成熟型からさらにN末端側領域を欠失させた安定型ウシまたはブタFGF4タンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
安定型ウシまたはブタFGF4タンパク質が下記のいずれかで示される、請求項２に記載の方法。
ａ）配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
ｂ）配列番号７もしくは配列番号９において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞増殖促進活性を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号１５と１６のプライマー対、配列番号１７と１８のプライマー対、および配列番号１９と２０のプライマー対を用い、ウシFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
配列番号２２と２６のプライマー対、配列番号２５と２８のプライマー対、および配列番号２７と２４のプライマー対を用い、ブタFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
ウシまたはブタFGF4タンパク質が、成熟型ウシまたはブタFGF4タンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
成熟型ウシまたはブタFGF4タンパク質が下記のいずれかで示される、請求項６に記載の方法。
ｃ）配列番号３もしくは配列番号５の３２〜２０６のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
ｄ）配列番号３もしくは配列番号５の３２〜２０６において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞増殖促進活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号１４と１６のプライマー対、配列番号１７と１８のプライマー対、および配列番号１９と２０のプライマー対を用い、ウシFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅する、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
配列番号２１と２６のプライマー対、配列番号２５と２８のプライマー対、および配列番号２７と２４のプライマー対を用い、ブタFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅する、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いてウシまたはブタFGF4タンパク質を精製する工程を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
下記のいずれかで示される、安定型FGF4タンパク質。
ａ）配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
ｂ）配列番号７もしくは配列番号９において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞増殖促進活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
請求項１１に記載の安定型FGF4タンパク質を含む、細胞増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖促進タンパク質である線維芽細胞増殖因子4（FGF4）タンパク質の製造方法，および安定型FGF4タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
着床直前の胚である胚盤胞は，将来，胎仔を形成する内部細胞塊と，将来，胎盤を形成する栄養外胚葉から構成されている。また栄養外胚葉は，内部細胞塊に接している極栄養外胚葉と，それ以外の壁栄養外胚葉に分けられる。哺乳動物のモデル生物であるマウスと遺伝子ノックアウト技術を用いることにより，線維芽細胞増殖因子4（Fibroblast Growth Factor 4；FGF4）は内部細胞塊から分泌され，極栄養外胚葉の増殖を刺激することにより胎盤形成を促進して妊娠の成立を導く，重要な細胞増殖因子であることが証明されている(非特許文献１)。すなわち，FGF4は哺乳動物の繁殖において必要不可欠な細胞増殖因子である。
【０００３】
ヒト（GenBank ID 2249），マウス（GenBank ID 14175），ウシ（GenBank ID 618474），ブタ（GenBank ID 100518595）のFGF4遺伝子はタンパク質コーディングエキソン1，2，3から構成され，タンパク質コーディングエキソン1と2の間，およびタンパク質コーディングエキソン2と3の間に，タンパク質がコードされていないDNA領域であるイントロンを含む。生体内では，FGF4遺伝子はRNAポリメラーゼにより転写され，イントロンが除去され，メッセンジャーRNAが完成し，リボゾームによりFGF4タンパク質へと翻訳される。ヒト，ウシおよびブタFGF4は206アミノ酸残基，マウスFGF4は202アミノ酸残基から構成される(図1)。また，ヒトFGF4はA7-P22（以下，アルファベットはアミノ酸一文字標記，肩数字はタンパク質N末端側からのアミノ酸番号を示す）に分泌シグナルペプチドが同定されている（非特許文献２）。動物細胞内の小胞体膜を通過する際に分泌シグナルペプチドは切断され，成熟型FGF4へとプロセッシングされる。また，FGF受容体への結合部位およびヘパリン結合部位がC末端側に存在する。なお，ヒト成熟型FGF4はP32-L206から構成されていることが明らかにされている(非特許文献２)。ヒト成熟型FGF4のアミノ酸配列との比較から推定されたマウス（P31-L202），ウシ（P32-L206）およびブタ（P32-L206）の成熟型FGF4は，アミノ酸レベルで高い相同性を示す（84-95％）。ヒトFGF4の類似タンパク質であるヒトFGF2のドメイン構造から推定すると(非特許文献３)，ヒト，マウス，ウシ，ブタ成熟型FGF4のアミノ酸配列中に含まれるFGF受容体への結合部位に相当する配列（6アミノ酸残基，図1）は，それぞれ1-4アミノ酸の相違が認められる。このことは，FGF4とFGF4受容体との結合には動物種に依存した特異性が現れることを示している。
【０００４】
動物体内におけるFGF4の生産は発生初期のごく一時期に限られ，しかも生産量はきわめて微量である。そこで遺伝子工学技術を用いてFGF4が製造され，細胞増殖促進活性(非特許文献４)や骨形成の促進活性(非特許文献５)などに例示される，生物学や医学に有効な生物活性に関する知見が得られた。
【０００５】
FGF4を遺伝子工学的に製造する行程は，FGF4タンパク質をコードするDNA（以下，FGF4タンパク質コードDNA）の製造，FGF4タンパク質コードDNAを組み込んだ発現ベクターの製造，該ベクターを組み込んだ宿主細胞の製造，FGF4の精製，から構成される。ヒト，マウス，ウシ，ブタのFGF4のアミノ酸一次構造は明らかにされているので，FGF4タンパク質コードDNAは公知の化学合成法により製造することができる。しかし，特殊な合成試薬を必要とするのでコストが高価であり産業上好ましくない。一方，ヒト(非特許文献４)およびマウス(非特許文献５)のFGF4の場合，常套手段にもとづいてFGF4遺伝子が発現している癌細胞よりメッセンジャーRNAを抽出し，メッセンジャーRNAを鋳型にしてDNAに逆転写し，DNA
ライブラリーを製造し，FGF4タンパク質をコードするDNAを同定することにより製造することができる。該製造方法は特殊な試薬を使わないのでコストは安価であり，産業上有利である。
【０００６】
ウシFGF4遺伝子の塩基配列が1995年に報告された(非特許文献６)。その後，ウシおよびブタでは全ゲノム解析プロジェクトが進行中であり，ウシでは2009年，ブタでは2011年にその途中経過の一部のみがようやく公開された。その結果，ヒトとマウスのFGF4遺伝子と同様に，ウシ(非特許文献７，８)とブタ（GenBank accession no. NW_003534199）のFGF4遺伝子もタンパク質コーディングエキソン1，2，3から構成されることが判明した。しかし，FGF4遺伝子が発現していることが既知であるウシおよびブタの初期胚を大量に採取することは高コストであること，また，ウシおよびブタの癌細胞など、FGF4のメッセンジャーRNAが発現している細胞の入手が困難であることにより，安価にウシおよびブタのFGF4タンパク質コードDNAを入手することは困難である。
【０００７】
ヒトおよびマウスのFGF4タンパク質コードDNAは，常套手段である組換えDNA技術を用い，市販されている動物細胞用発現ベクター（pRc/CMV，インビトロージェン社，など），市販されている昆虫細胞用発現ベクター（pFastBac1，インビトロージェン社，など），市販されている大腸菌用発現ベクター（pET，ノバゲン社，など）等に組み込まれ，FGF4タンパク質コードDNAを組み込んだ発現ベクターが製造される(非特許文献４，６)。これらのFGF4発現ベクターを，いずれも常套手段(非特許文献９)であるリン酸カルシウム法，リポフェクション法，もしくは電気穿孔法等により遺伝子導入し，該ベクターを組み込んだ昆虫細胞(非特許文献１０)や動物細胞(非特許文献１１)が製造された。しかし，昆虫細胞や動物細胞を宿主として用いた製造方法はFGF4の生産コストが高価であり，産業上不利である。そこで，生産コストが安価であるという点において産業上有利である遺伝子組換え大腸菌を製造するために，常套手段であるコンピテントセル法もしくは電気穿孔法により該ベクターを遺伝子導入して遺伝子組換え大腸菌を製造し，これによりヒトFGF4(非特許文献５)およびマウスFGF4(非特許文献６)を製造する技術が開発されている。ただし大腸菌を使ってFGF4を製造する場合，FGF4遺伝子に含まれているイントロンを含んでいないFGF4タンパク質コードDNAを発現ベクターに組み込むことが必要である。また，FGF類似タンパク質群が共通して示す特徴であるヘパリン結合性を利用して，ヘパリンカラムクロマトグラフィーによりFGF4を精製する技術が開発されている(非特許文献１２、６)。
【０００８】
ヒト成熟型FGF4を遺伝子工学的にサル由来培養細胞により製造した場合，分解により低分子化するため産業上不利である(非特許文献１３)。一方，ヒトFGF4のアミノ酸配列を遺伝子工学的に短縮化し，短縮化ヒトFGF4を大腸菌により製造後，細胞増殖促進活性を測定して比較することにより，細胞増殖促進活性を担うアミノ酸配列領域を探索する研究が行われている。その結果，N末端側短縮化ヒトFGF4（A73-L206）は十分な細胞増殖促進活性を示すがN末端側短縮化ヒトFGF4（L96-L206）は活性を示さないことが判明している(非特許文献５)。加えて，N末端側短縮化ヒトFGF4（A73-L206）は，ヘパリンカラムクロマトグラフィーによる精製効率が向上することが示された(非特許文献５)。また，N末端側短縮化ヒトFGF4（L67-L206）の生物活性の増加，およびヘパリンカラムクロマトグラフィーによる精製効率の向上に関して報告されている(非特許文献１３)。
しかしながら、N末端側を短縮することによるFGF4タンパク質の安定性への影響については調べられていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Niswander & Martin 1992, Rappolee et al. 1994, Feldman et al. 1995
【非特許文献２】妹尾昌治ら FGF-4. In 成長因子.1993
【非特許文献３】西川克三 & 吉竹佳乃 FGFファミリー. In 細胞増殖因子.1995
【非特許文献４】Cell 50 729-737. 1987
【非特許文献５】Bone 25 431-437. 1999
【非特許文献６】J Reprod Dev 57 650-654. 2011
【非特許文献７】Gene 162 333-334.1995
【非特許文献８】Genome Biol 10 R42.2009
【非特許文献９】Aminal Science Journal 83 260-262. 2012
【非特許文献１０】Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001
【非特許文献１１】Oncogene 3 383-389. 1988
【非特許文献１２】Mol Cell Biol 8 2933-2941. 1988
【非特許文献１３】Bellosta et al. J Cell Biol 121 705-713.1993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ウシおよびブタの効率的な繁殖は畜産業界，遺伝子組換えウシおよびブタによる医薬品製造業界，遺伝子組換えブタによる移植用代替臓器の製造業界，に例示される動物関連産業においてきわめて重要である。また，ウシ腎由来MDBK細胞に例示されるウシ培養細胞はウシ伝染性鼻気管炎・ウシパラインフルエンザウィルス・ウシRSウィルス等に対するワクチン製造宿主として産業的に用いられており，製造宿主として培養しているウシ培養細胞の増殖を促進することは製造期間の短縮や製造コスト削減に資するので産業上重要である。ウシFGF4およびブタFGF4は，ウシ胚およびブタ胚に含まれる極栄養外胚葉の細胞増殖を促進することを介して胎盤形成を導くことにより効率的な繁殖をもたらす作用，および，ウシおよびブタ培養細胞の効率的な増殖を導く作用を有しており産業上重要であるが，入手は困難である。
さらに，ウシやブタの成熟型FGF4は細胞増殖促進活性を有するものの、保存中に分解されたりするなど、タンパク質分子として安定性が十分ではない。
【００１１】
そこで，本発明は、低コストで細胞増殖促進活性を保持するウシFGF4およびブタFGF4の製造方法を提供すること，および細胞増殖促進活性を保持し，かつ，ヘパリンカラムクロマトグラフィーによる精製効率がよく，さらに安定で保存中に分解されにくいウシFGF4およびブタFGF4を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決すべく鋭意研究した結果，本発明者は、安価であるウシ血液細胞からゲノムDNAを採取し，FGF4構造遺伝子を含むDNA領域をPCR法により増幅し，該DNAを鋳型にしてFGF4のタンパク質コーディングエキソン1，2，3をPCR法により増幅し，これらをコーディングエキソン1，2，3の順で連結することによりウシ成熟型FGF4タンパク質コードDNAを得ることに成功した。また，該DNAを遺伝子工学的に改変することにより，ブタ成熟型FGF4タンパク質コードDNAを得ることに成功した。
そして、これらFGF4タンパク質コードDNAを大腸菌用発現ベクターに組み込み，該ベクターを大腸菌に組み込み，大腸菌細胞抽出液を調製後，ヘパリンカラムクロマトグラフィーにより混在物から抽出することにより，細胞増殖促進活性を有するウシFGF4およびブタFGF4を製造できることを見出した。
【００１３】
更に，成熟型FGF4タンパク質コードDNAを遺伝子工学的に改変し，成熟型FGF4タンパク質分子のN末端側タンパク質領域をさらに欠損させることにより，細胞増殖促進活性を保持し，かつ，ヘパリンカラムクロマトグラフィーによる精製効率が高く，かつ，保存中に分解されにくい安定型（以下、N末端側短縮型と呼ぶこともある）のウシFGF4およびブタFGF4を製造できることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）ウシまたはブタのゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、ウシまたはブタFGF4 (Fibroblast Growth Factor 4)遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅し、これらを連結してウシまたはブタFGF4のコード領域を含むＤＮＡを調製し、これを発現させてウシまたはブタFGF4タンパク質を得る、ウシまたはブタFGF4タンパク質の製造方法。
（２）ウシまたはブタFGF4タンパク質が、成熟型からさらにN末端側領域を欠失させた安定型ウシまたはブタFGF4タンパク質である、（１）に記載の製造方法。
（３）安定型ウシまたはブタFGF4タンパク質が下記のいずれかで示される、（２）に記載の方法。
ａ）配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
ｂ）配列番号７もしくは配列番号９において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞増殖促進活性を有するタンパク質。
（４）配列番号１５と１６のプライマー対、配列番号１７と１８のプライマー対、および配列番号１９と２０のプライマー対を用い、ウシFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅する、（３）に記載の製造方法。
（５）配列番号２２と２６のプライマー対、配列番号２５と２８のプライマー対、および配列番号２７と２４のプライマー対を用い、ブタFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅する、（３）に記載の製造方法。
（６）ウシまたはブタFGF4タンパク質が、成熟型ウシまたはブタFGF4タンパク質である、（１）に記載の製造方法。
（７）成熟型ウシまたはブタFGF4タンパク質が下記のいずれかで示される、（６）に記載の方法。
ｃ）配列番号３もしくは配列番号５の３２〜２０６のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
ｄ）配列番号３もしくは配列番号５の３２〜２０６において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞増殖促進活性を有するタンパク質。
（８）配列番号１４と１６のプライマー対、配列番号１７と１８のプライマー対、および配列番号１９と２０のプライマー対を用い、ウシFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅する、（７）に記載の製造方法。
（９）配列番号２１と２６のプライマー対、配列番号２５と２８のプライマー対、および配列番号２７と２４のプライマー対を用い、ブタFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅する、（７）に記載の製造方法。
（１０）ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いてウシまたはブタFGF4タンパク質を精製する工程を含む、（１）〜（９）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）下記のいずれかで示される、安定型FGF4タンパク質。
ａ）配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
ｂ）配列番号７もしくは配列番号９において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞増殖促進活性を有するタンパク質。
（１２）（１１）に記載の安定型FGF4タンパク質を含む、細胞増殖促進剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ウシやブタのFGF4タンパク質を効率よく安価で製造することができる。また、本発明の安定型FGF4は、細胞増殖促進活性を保持し，かつ，ヘパリンカラムクロマトグラフィーによる精製効率が高く，かつ，保存中に分解されにくいという優れた特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒト， マウス， ウシ， ブタFGF4のアミノ酸配列の比較
【図２】ウシゲノムDNAからのFGF4タンパク質コードDNAの製造
【図３】ウシFGF4構造遺伝子と変異を導入したプライマーを用いたブタFGF4タンパク質コードDNAの製造
【図４】PCRにより増幅したウシ成熟型FGF4およびN末端側短縮ウシFGF4タンパク質コードDNAの電気泳動像（写真）
【図５】PCRにより増幅したブタ成熟型FGF4およびN末端側短縮ブタFGF4タンパク質コードDNAの電気泳動像（写真）
【図６】SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるウシ，ブタ成熟型およびN末端側短縮FGF4の発現誘導（写真）
【図７】ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるウシ成熟型FGF4の分取
【図８】ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるN末端短縮ウシFGF4の分取
【図９】ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるブタ成熟型FGF4の分取
【図１０】ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるN末端短縮ブタFGF4の分取
【図１１】ウシ成熟型FGF4またはN末端側短縮ウシFGF4によるウシ線維芽細胞の細胞増殖促進効果
【図１２】ブタ成熟型FGF4またはN末端側短縮ブタFGF4によるブタ線維芽細胞の細胞増殖促進効果
【図１３】ウシ成熟型FGF4またはN末端側短縮ウシFGF4によるMDBK細胞の細胞増殖促進効果
【図１４】繰り返しの凍結融解操作が及ぼすウシ成熟型FGF4およびN末端側短縮ウシFGF4の分解に対する影響（写真）
【図１５】繰り返しの凍結融解操作が及ぼすブタ成熟型FGF4およびN末端側短縮ブタFGF4の分解に対する影響（写真）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
まず、FGF4の構造について説明する。
図１には、ヒトFGF4（配列番号１１）、マウスFGF4（配列番号１３）、ウシFGF4（配列番号３）およびブタのFGF4（配列番号５）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
ウシおよびブタのFGF4は全長が１〜２０６であり、３２〜２０６が成熟型であり、５５〜２０６が安定型である。
ここで、安定型とは、成熟型からN末端領域がさらに削除され、それにより、細胞増殖促進活性は維持しつつ、安定性が増加したFGF4タンパク質のことをいう。
安定性が増加したとは、例えば、凍結融解処理を複数回繰り返した時に成熟型と比較して分解度が少ないことをいう。
細胞増殖促進活性は例えば、線維芽細胞を培養する際の培地にFGF4を加え、加えない際と比較して細胞増殖率が高くなることで、細胞増殖促進活性を有すると判断することができる。細胞増殖は公知の試薬を用いて測定することができる。
【００１８】
配列番号７にウシ安定型FGF4のアミノ酸配列を示した。
配列番号９にブタ安定型FGF4のアミノ酸配列を示した。
なお、一般的に、タンパク質を構成するいくつかのアミノ酸において置換、欠失、挿入若しくは付加が生じてもタンパク質の活性に影響を与えない場合が多いことから、本発明の安定型FGF4は、配列番号７または９において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性を有する安定型タンパク質であってもよい。ただし、成熟型とは区別されるため、N末端側に付加される場合は、FGF4の３２〜５４に由来する配列以外の配列であることが好ましい。例えば、N末端側またはC末端側に、タンパク質を標識したり精製したりするためのタグ配列が付加される。具体的には、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、FLAGタグなどが例示される。
【００１９】
上記「１もしくは数個のアミノ酸」とは、安定型FGF4の特性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸残基の数を示す。例えば具体的には、１〜２０の整数、好ましくは１〜１０の整数、より好ましくは１〜５の整数を示す。
また、本発明の安定型FGF4は、細胞増殖促進活性を有する限り、配列番号７または９の全体に対して90％以上、好ましくは96％以上、より好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる安定型タンパク質であってもよい。
【００２０】
安定型FGF4のコード領域を含む遺伝子としては、配列番号６および配列番号８の塩基配列を有する遺伝子があげられる。
ただし、細胞増殖促進活性を有する安定型タンパク質をコードするものである限り、配列番号６または８の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
【００２１】
一方、全長FGF4のコード領域を含む遺伝子としては、配列番号２および配列番号４の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。全長FGF4のコード領域を含む遺伝子は、細胞増殖促進活性を有するタンパク質をコードするものである限り、配列番号２または４の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
また、成熟型FGF4のコード領域を含む遺伝子としては、配列番号２および配列番号４の塩基番号９４〜６１８の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。成熟FGF4のコード領域を含む遺伝子は、細胞増殖促進活性を有するタンパク質をコードするものである限り、配列番号２または４の塩基番号９４〜６１８の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
【００２２】
なお，ウシまたはブタ成熟型FGF4および安定型ウシまたはブタFGF4をコードするDNAは，常套手段により化学的に全合成すること（非特許文献１０），FGF4 mRNAを発現するウシ細胞を入手し，常套手段によりmRNAを抽出し，常套手段を用いた逆転写反応によりcDNAを合成すること（非特許文献１０），により入手することができる。
もしくは，後述するように、ウシまたはブタの血液細胞などからゲノムDNAを調製し，FGF4タンパク質コーディングエキソン１，２，３それぞれをPCR増幅したのちに連結することにより，ウシまたはブタFGF4タンパク質コードDNAを入手することもできる。
【００２３】
本発明の安定型FGF4は細胞増殖促進剤として使用することができる。
細胞は好ましくは線維芽細胞であり、より好ましくはウシまたはブタの線維芽細胞である。
細胞増殖促進剤として使用する場合、培地中に０．００１〜１ｎＭの濃度で加えることが好ましい。
【００２４】
次に、本発明の製造方法について説明する。
本発明のFGF4の製造方法においては、ウシまたはブタのゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、ウシまたはブタFGF4遺伝子のエキソン１，２および３をそれぞれ増幅し、これらを連結してウシまたはブタFGF4のコード領域を含むＤＮＡを調製し、これを宿主で発現させてウシまたはブタFGF4タンパク質を得る。
【００２５】
まず、ウシの場合について説明する。
配列番号１にウシFGF4のエキソン１（塩基番号１〜３４０）、２（塩基番号９１７〜１０２０），３（塩基番号１７６３〜１９３９）を含む配列を示す。そして、エキソン１のうち、塩基番号９４〜３４０が成熟型のN末端側に該当する。一方、エキソン１のうち、塩基番号１６３〜３４０が安定型のN末端側に該当する。
よって、成熟型FGF4を製造する場合には、エキソン１（塩基番号９４〜３４０）、エキソ
ン２（塩基番号９１７〜１０２０）、エキソン３（塩基番号１７６３〜１９３９）のそれぞれを増幅するようにプライマーを３対用意する。
一方、安定型FGF4を製造する場合には、エキソン１（塩基番号１６３〜３４０）、エキソン２（塩基番号９１７〜１０２０）、エキソン３（塩基番号１７６３〜１９３９）のそれぞれを増幅するようにプライマーを３対用意する。
プライマーとしては、表１に記載のａ，ｂ（エキソン１）、ｃ、ｄ（エキソン２）、ｅ，ｆ（エキソン３）の３対が例示される。ただし、プライマーは各エキソンを増幅できる限りにおいて特に配列はこれらに限定されない。PCRは一反応系で行ってもよいが、３反応系で行うことが好ましい。鋳型はゲノムDNAを直接用いてもよいが、エキソン１，２，３を含むゲノムDNA領域を一旦増幅し、それを鋳型にしてもよい。
次に、増幅された３つの断片を連結させる。これもPCRや制限酵素などを用いて通常の方法により行うことができる。
【００２６】
これを適当な発現ベクターに組み込み、宿主で発現させる。
宿主としては、大腸菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、無細胞翻訳系などがあげられる。
この中では大腸菌が操作が簡便であるため好ましい。
発現ベクターとしては、特に制限されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとしては、pETシリーズ（ノバゲン）が挙げられ、後述の実施例ではpET28a（+）が使用された。ただし、大腸菌用発現ベクターは多くの種類が公知であり、入手できるいずれの種類でも構わない。発現ベクターは誘導可能なプロモーターやタグ配列を有するものが好ましい。
【００２７】
発現させたFGF4タンパク質は精製操作を行うことが好ましい。精製としては、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを行うことが好ましい。FGF4タンパク質にタグをつけて発現させた場合は、それに基づいて精製することも可能である。例えば、Hisタグをつけた場合は金属キレートカラムが使用でき、GSTタグをつけた場合はグルタチオンカラムが使用できる。
【００２８】
ブタFGF4のゲノム遺伝子としては、GenBank accession no. NW_003534199に記載の配列が挙げられる。この配列においてエキソン１，２，３は、それぞれ、44564..44903,45517..45620,46149..46325である。ブタFGF4のコード領域を含む遺伝子もウシFGF4の場合と同様に、エキソン１，２および３をそれぞれ増幅し、これらを連結してブタFGF4のコード領域を含むＤＮＡを調製し、これを宿主で発現させてブタFGF4タンパク質を得ることができる。
プライマーとしては、下記のようなものが使用できるが、あくまでも例示であり、これらには限定されない。
エキソン1は，表２のプライマーａ  成熟型（NdeI/pFGF4 (94-123) F：配列番号２１）または安定型（NdeI(163-182)配列番号２２）と表３のプライマー2（配列番号２６）の組み合わせ。
エキソン2は，表３のプライマー1（配列番号２５）とプライマー4（配列番号２８）の組み合わせ。
エキソン3は，表３のプライマー3（配列番号２７）と表２のプライマーｃ（配列番号２４）の組み合わせ。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例には限定されない。
【００３０】
１.ウシ成熟型FGF4および安定型（N末端側短縮）ウシFGF4をコードするDNAの製造
黒毛和種牛の血液（5 ml）を遠心分離し（3000 rpm，15分間），白血球層を得て，NucleoSpin Tissue Kit（Macherey-Nagel社）を用いてゲノムDNAを調製した。
まず，タンパク質コーディングエキソン１，２，３を含むゲノムDNAについて，プライマー対（CACCCACGGACGCACGGCCCGAGGGCGGGG（配列番号２９）とGGGGGTTGCTTTTGTTCTTCCA（配列番号３０））を用いてPCR増幅した。
次に，タンパク質コーディングエキソン１，２，３それぞれを表1に示すプライマー（ａとｂ、ｃとｄ、ｅとｆ）を用いてPCR増幅した。
得られたＰＣＲ産物の混合物を鋳型として，表1と図2に示すプライマー（ａとｆ）を用いてPCR増幅し，成熟型または安定型（N末端側短縮）ウシFGF4タンパク質コードDNAを得た（図4  ウシFGF4タンパク質コードDNAのアガロースゲル電気泳動像）。該DNAを鋳型として，制限酵素切断部位(フォワード側にNdeI，リバース側にEcoRI)を付加したプライマー（表1）を用い，ウシ成熟型FGF4タンパク質コードDNAおよびN末端側短縮ウシFGF4（L55-L206）タンパク質コードDNAをPCR増幅した。
【００３１】
【表１】
2014033631.tif 000003
【００３２】
２.ブタ成熟型FGF4およびN末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）をコードするDNAの製造
ウシ成熟型FGF4タンパク質コードDNAを鋳型として用い，ブタFGF4に対応する塩基置換を導入したプライマー（表２）を用いてPCR増幅することにより，ブタ成熟型またはN末端側短縮型FGF4タンパク質コードDNAを製造した（図3）。
【００３３】
【表２】
2014033631.tif 000004
【００３４】
具体的には、ウシ成熟型FGF4タンパク質コードDNAを鋳型として，制限酵素切断部位(フォワード側にNdeI，リバース側にEcoRI)を付加したプライマー（表2，図4）を用い,ブタ成熟型FGF4タンパク質コードDNAおよびN末端側短縮ブタFGF4(L55-L206)タンパク質コードDNAをPCR増幅した（図5）。ａ，ｂを用いたＰＣＲを行い、その産物を鋳型にしてプライマーａ，ｃを用いたＰＣＲを行った。
【００３５】
なお、ブタFGF4コード遺伝子はゲノムＤＮＡを鋳型にして表２と表３のプライマーを用いて、ウシFGF4と同様にして得ることもできる。その場合，プライマー対（GGCCACTGAAAGAGAGGTGGAGAAGG（配列番号３１）とCAATAACTTTGCCCGATGATGAATGTCAAG（配列番号３２））を用いてタンパク質コーディングエキソン１，２，３を含むゲノムDNAをPCR増幅後，このPCR産物を鋳型にすることにより，なお確実に得ることができる。
【００３６】
【表３】
2014033631.tif 000005
エキソン1は，表２のプライマーａ  成熟型（NdeI/pFGF4 (94-123) F：配列番号２１）または安定型（NdeI(163-182)配列番号２２）と表３のプライマー2（配列番号２６）の組み合わせ。
エキソン2は，表３のプライマー1（配列番号２５）とプライマー4（配列番号２８）の組み合わせ。
エキソン3は，表３のプライマー3（配列番号２７）と表２のプライマーｃ（配列番号２４）の組み合わせ。
【００３７】
次に、上記で得られた成熟型ウシまたはブタFGF4タンパク質コードDNAおよびN末端側短縮ウシまたはブタFGF4（L55-L206）タンパク質コードDNA，および大腸菌用発現ベクターpET28a（+）（ノバゲン社）をDNA切断制限酵素（NdeIおよびEcoRI）で処理後，低融点アガロースゲル電気泳動により分離し，フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行うことにより精製した。その後，成熟型ウシまたはブタFGF4タンパク質コードDNAおよびN末端側短縮ウシまたはブタFGF4（L55-L206）タンパク質コードDNAを別個にpET28a（+）ベクターのHisタグ下流に組込み，成熟型ウシまたはブタFGF4発現ベクターおよびN末端側短縮ウシウシまたはブタFGF4（L55-L206）発現ベクターを製造した。
【００３８】
３.大腸菌におけるウシ成熟型FGF4，N末端側短縮ウシFGF4（L55-L206），ブタ成熟型FGF4，N末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）の発現誘導
製造したウシ成熟型FGF4発現ベクター，N末端側短縮ウシFGF4（L55-L206）発現ベクター，ブタ成熟型FGF4発現ベクター，N末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）発現ベクターを大腸菌株Rosetta（DE3）pLysSに組み込んだ。大腸菌を2×YT培地（10 ml）により一晩培養（37℃）した。新たな2×YT培地（500 ml）に菌液（0.1倍容量）を加え，で3時間培養（37℃）した。その後，イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド（IPTG，終濃度1 mM）を加えて，3.5時間培養（37℃）し，タンパク質発現を誘導した。菌体を回収し，可溶性画分と不溶性画分に遠心分離した。一部の可溶性画分と不溶性画分について，SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後，クマシーブリリアントブルー染色法より，所望するタンパク質の発現について検出した（図6  SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるウシ成熟型FGF
4，N末端側短縮ウシFGF4（L55-L206），ブタ成熟型FGF4，N末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）の発現誘導の検出）。
【００３９】
４.ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるウシ成熟型FGF4，N末端側短縮ウシFGF4（L55-L206），ブタ成熟型FGF4，N末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）の精製
発現誘導後の菌液を50 ml遠心チューブに50 mlずつ分注後，6000 rpm，5分間，4℃で遠心し，菌体（100 ml培養菌液分/50 ml遠心チューブ）を得た。プロテアーゼインヒビター（(p-アミジノフェニル)メタンスルホニルフルオリド塩酸塩，0.01 ｇ）およびTENG Buffer（2 ml）を加え，よく懸濁した。-80℃での凍結および室温による融解を3回行った後，超音波細胞破砕装置により破砕し，遠心し（15000 rpm，3分間，4℃），上清を得た。公知の方法(Hosoi et al. 2011)により，上清をヘパリンカラム（HiTrap Heparin HP，1 ml，アマシャムバイオサイエンス社）を用いたクロマトグラフィーにより分画した。緩衝液に添加した食塩濃度を段階的に高くすることにより，所望のタンパク質を得た（図7  ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるウシ成熟型FGF4の分取，図8  ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるN末端側短縮ウシFGF4（L55-L206）の分取，図9  ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるブタ成熟型FGF4の分取，図10  ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるN末端側短縮ブタFGF4（L55-L206））。
ウシおよびブタ成熟型FGF4に比較して，N末端側短縮FGF4のピーク面積（斜線部）はウシで2.8倍，ブタで1.3倍であったことより，精製効率が高いことが示された。
【００４０】
５.ウシ成熟型FGF4，N末端側短縮ウシFGF4（L55-L206），ブタ成熟型FGF4，N末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）による細胞増殖促進活性の検出
ウシ線維芽細胞は常套手段(Wang et al. 2011)により採取した。ウシ線維芽細胞およびブタ胎仔線維芽細胞株PEF SV40細胞(Fukuda et al. 2012)を96穴ディッシュに播種（ウシ線維芽細胞は4×103個/well，PEF SV40細胞は3×103個/well）し，10％ ウシ胎仔血清含有培養液で一晩培養し，更に0.4％ 仔ウシ血清含有培養液で一晩培養した（37℃，5％ CO2）。また，ウシ腎由来MDBK細胞（理化学研究所細胞銀行より入手）を96穴ディッシュに播種（500個/well）し，10％ ウシ胎仔血清含有培養液で一晩培養し，更に血清非添加培養液で一晩培養した（37℃，5％ CO2）。
その後，0.001，0.01，0.1，1，もしくは10 nMのウシ成熟型FGF4，N末端側短縮ウシFGF4（L55-L206），ブタ成熟型FGF4，もしくはN末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）を添加培養液により培養した（3日間，37℃，5％ CO2）。引き続き，WST-1試薬を終濃度10％になるよう添加し，更に保温した（3時間，37℃，5％ CO2）。A450を測定して細胞増殖促進活性を比較した（図11  ウシ成熟型FGF4およびN末端側短縮ウシFGF4（L55-L206）によるウシ線維芽細胞の細胞増殖促進効果，図12  ブタ成熟型FGF4およびN末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）によるブタ線維芽細胞の細胞増殖促進効果，図13  ウシ成熟型FGF4およびN末端側短縮ウシFGF4（L55-L206）によるウシMDBK細胞の細胞増殖促進効果）。
【００４１】
６.繰り返しの凍結融解における成熟型FGF4とN末端側短縮FGF4の安定性の比較
ウシ成熟型FGF4，N末端側短縮ウシFGF4（L55-L206），ブタ成熟型FGF4，N末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）に対して，-80℃凍結操作と室温融解操作を20回繰り返した。その後，タンパク質分解の程度を比較するために，SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。ウシ成熟型FGF4およびブタ成熟型FGF4では，精製直後から分解により生じた低分子バンドが認められたが，凍結融解処理を繰り返したN末端側短縮ウシFGF4（L55-L206）とN末端側短縮ブタFGF4（L55-L206）いずれにも認められなかった（図14，図15）。
なお、発明者は，N末端側短縮マウスFGF4（L51-L202）も同様の安定性を有することを確認している。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
FGF4によって産業上有用なタンパク質やワクチンを生産するウシまたはブタ細胞の細胞増
殖を促進するにより，生産効率の向上を導くことができる。家畜人工授精の際に精子と共にFGF4を子宮内に注入すると，ウシおよびブタ受精卵の着床促進と流産が防止されるので，ウシ及びブタの妊娠を効率的に導くことが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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