(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトアルブミンの精製にアセトンを用いて濃縮，ウイルスの不活化を行うが、アセトン処理は費用がかかり、火災または爆発の危険をもたらす大量のアセトンを用いるので、代替的なウイルス不活化方法および濃縮方法を提供する。【解決手段】溶液のタンパク質濃度を約5%未満へと調整するステップと、溶液のpHを約pH5以下へと調整するステップと、カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを添加するステップと、溶液の温度を約20℃を超えて上げるステップと、溶液をインキュベートするステップとを含むアルブミンを含む溶液からウイルスを不活化したアルブミンを調製する方法。ウイルスが脂質エンベロープウイルスである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンを含む溶液からアルブミンを調製する方法であって、
溶液のタンパク質濃度を約5%未満へと調整するステップと、
溶液のpHを約pH5以下へと調整するステップと、
カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを添加するステップと、
溶液の温度を約20℃を超えて上げるステップと、
溶液をインキュベートするステップと
を含む方法。
【請求項２】
インキュベーション温度が27〜30℃である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
インキュベーションが、約30分間〜約120分間にわたる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
インキュベーションが、少なくとも約90分間にわたる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
カプリレートの濃度が、約10mM〜約40mMである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
カプリレートの濃度が、約15mM〜約30mMである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
カプリレートの濃度が、約20mMである、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
pHが、約3.8〜約5である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
pHが約5である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
溶液を濾過するステップと、
限外濾過および透析濾過を実施するステップと、
溶液を調合およびバルク化するステップと、
アルブミンを滅菌、充填、低温殺菌するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
アルブミンを含む溶液からアルブミンを調製する方法であって、
溶液のタンパク質濃度を約5%未満へと調整するステップと、
溶液のpHを約pH5以下へと調整するステップと、
カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを、約20mMの濃度まで添加するステップと、
溶液の温度を約27〜30℃まで上げるステップと、
溶液を少なくとも約30分間〜約120分間にわたりインキュベートするステップと
を含む方法。
【請求項１２】
インキュベーションが、少なくとも約90分間にわたる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
pHが約5である、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
溶液を濾過するステップと、
限外濾過および透析濾過を実施するステップと、
溶液を調合およびバルク化するステップと、
アルブミンを滅菌、充填、低温殺菌するステップと
をさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
アルブミンを含む溶液におけるウイルスを不活化する方法であって、
溶液のタンパク質濃度をタンパク質約5%へと調整するステップと、
溶液のpHを約5未満へと調整するステップと、
カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを添加するステップと、
溶液の温度を約20℃を超えて上げるステップと、
溶液をインキュベートするステップと
を含む方法。
【請求項１６】
ウイルスが、脂質エンベロープウイルスである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
カプリレートの濃度が、約15mM〜約30mMである、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
温度が約27〜30℃である、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
インキュベーションが、少なくとも90分間にわたる、請求項15に記載の方法。
【請求項２０】
カプリレートの濃度が、20mMである、請求項15に記載の方法。
【請求項２１】
インキュベーションが、90分間である、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
温度が30℃である、請求項15に記載の方法。
【請求項２３】
ウイルスが、ヒトに感染する脂質エンベロープウイルスである、請求項16に記載の方法。
【請求項２４】
アルブミンを含む溶液におけるウイルスを不活化する方法であって、
溶液のタンパク質濃度をタンパク質約5%へと調整するステップと、
溶液のpHを約5未満へと調整するステップと、
カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを、約20mMの濃度まで添加するステップと、
溶液の温度を約27〜30℃まで上げるステップと、
溶液を少なくとも90分間にわたりインキュベートするステップと
を含む方法。
【請求項２５】
ウイルスが、ヒトに感染する脂質エンベロープウイルスである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
溶液を濾過するステップと、
限外濾過および透析濾過を実施するステップと、
溶液を調合およびバルク化するステップと、
アルブミンを滅菌、充填、低温殺菌するステップと
をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、アルブミンを血漿から精製する際に、カプリレートを用いてウイルスを不活化する方法が記載される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン(以下、アルブミン)とは、ヒト血漿中で最も豊富なタンパク質である。循環しているアルブミンは、585アミノ酸のタンパク質で、分子量は67kDaである。このタンパク質の血清半減期は約20日間であり、多くのホルモン、代謝物、および薬物の輸送のほか、コロイド浸透圧の維持および血液pHの緩衝にも関与している。アルブミンは、外傷患者、火傷患者、および手術患者において失われた体液を置換し、血液容量を回復する目的で、治療的に投与される。
【０００３】
ディファレンシャル分画(differential fractionation)を介するヒト血漿からのアルブミンの精製について最初に記載したのは、Cohnである。Cohnら、J. Am. Chem. Soc. 68: 459〜475頁(1946); Cohnら、J. Am. Chem. Soc. 69: 1753〜1761頁(1947);米国特許第2,390,074号、および同第2,469,193号を参照されたい。これらの方法は、Gerloughにより改善された。米国特許第2,710,293号および同第2,710,294号を参照されたい。このような方法では、アルブミンなどの血漿タンパク質を沈殿させるために、低温エタノール、ならびにpH、イオン強度、タンパク質濃度、および温度の操作を用いる。
【０００４】
医薬品用のアルブミンをヒト血漿から精製する手順は、典型的に、血液感染性ウイルスを伝染させる危険性を低減するためのウイルス不活化ステップを包含する。これらのウイルス不活化ステップは、加熱殺菌、有機溶媒、または有機溶媒と洗浄剤(例えば、トリ-n-ブチルホスフェートとポリソルベート80)との組合せを包含しうる。加えて、脂肪酸であるカプリル酸またはその塩(例えば、カプリル酸ナトリウム)も、ウイルス不活化剤として有効に用いられている。米国特許第4,939,176号;国際特許出願公開第WO1998/024485号および同第WO2000/056768号; LundbladおよびSeng、Vox Sang. 60:75-81 (1991); Johnston、Jonstone、およびWu、Biologicals 31: 213〜221頁(2003)を参照されたい。さらに、カプリレートはまた、治療用のヒトアルブミンを精製する際の安定化剤として、かつ、分配剤としても用いられている。米国特許第5,250,663号および同第5,561,115号を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第2,390,074号
【特許文献２】米国特許第2,469,193号
【特許文献３】米国特許第2,710,293号
【特許文献４】米国特許第2,710,294号
【特許文献５】米国特許第4,939,176号
【特許文献６】国際特許出願公開第WO1998/024485号
【特許文献７】国際特許出願公開第WO2000/056768号
【特許文献８】米国特許第5,250,663号
【特許文献９】米国特許第5,561,115号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cohnら、J. Am. Chem. Soc. 68: 459〜475頁(1946)
【非特許文献２】Cohnら、J. Am. Chem. Soc. 69: 1753〜1761頁(1947)
【非特許文献３】LundbladおよびSeng、Vox Sang. 60:75-81 (1991)
【非特許文献４】Johnston、Jonstone、およびWu、Biologicals 31: 213〜221頁(2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヒトアルブミンは、Cohn画分IV-1の流出物またはCohn画分Vから精製され、この工程は、アルブミンを濃縮し、ウイルスを不活化するためのアセトンによる乾燥ステップを含む。アセトン処理は費用がかかり、また火災または爆発の危険をもたらす大量のアセトンを用いる。したがって、代替的なウイルス不活化方法および濃縮方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、低pHおよび高温の条件下でカプリレートによるウイルスの不活化を用いてアルブミンをヒト血漿から精製した後、限外濾過/透析濾過(diafiltration)する方法が記載される。
【０００９】
本明細書では、アルブミンを血漿から精製する際に、カプリレートを用いてウイルスを不活化する方法が記載される。
【００１０】
本明細書で記載される一実施形態は、アルブミンを含む溶液からアルブミンを調製する方法であって、溶液のタンパク質濃度を約5%未満へと調整するステップと、溶液のpHを約pH5以下へと調整するステップと、カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを添加するステップと、溶液の温度を約20℃を超えて上げるステップと、溶液をインキュベートするステップとを含む方法である。
【００１１】
本明細書で記載される一部の態様では、インキュベーション温度が27〜30℃である。
【００１２】
本明細書で記載される一部の態様では、インキュベーションが、約30分間〜約120分間にわたる。
【００１３】
本明細書で記載される一部の態様では、インキュベーションが、少なくとも約90分間にわたる。
【００１４】
本明細書で記載される一部の態様では、カプリレートの濃度が、約10mM〜約40mMである。
【００１５】
本明細書で記載される一部の態様では、カプリレートの濃度が、約15mM〜約30mMである。
【００１６】
本明細書で記載される一部の態様では、カプリレートの濃度が、約20mMである。
【００１７】
本明細書で記載される一部の態様では、pHが、約3.8〜約5である。
【００１８】
本明細書で記載される一部の態様では、pHが約5である。
【００１９】
本明細書で記載される一部の態様では、方法が、溶液を濾過するステップと、限外濾過および透析濾過を実施するステップと、溶液を調合およびバルク化するステップと、アルブミンを滅菌、充填、低温殺菌するステップとをさらに含む。
【００２０】
本明細書で記載される別の実施形態は、アルブミンを含む溶液からアルブミンを調製する方法であって、溶液のタンパク質濃度を約5%未満へと調整するステップと、溶液のpHを約pH5以下へと調整するステップと、カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを、約20mMの濃度まで添加するステップと、溶液の温度を約27〜30℃まで上げるステップと、溶液を少なくとも約30分間〜約120分間にわたりインキュベートするステップとを含む方法である。
【００２１】
本明細書で記載される一部の態様では、インキュベーションが、少なくとも約90分間にわたる。
【００２２】
本明細書で記載される一部の態様では、pHが約5である。
【００２３】
本明細書で記載される一部の態様では、方法が、溶液を濾過するステップと、限外濾過および透析濾過を実施するステップと、溶液を調合およびバルク化するステップと、アルブミンを滅菌、充填、低温殺菌するステップとをさらに含む。
【００２４】
本明細書で記載される別の実施形態は、アルブミンを含む溶液におけるウイルスを不活化する方法であって、溶液のタンパク質濃度をタンパク質約5%へと調整するステップと、溶液のpHを約5未満へと調整するステップと、カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを添加するステップと、溶液の温度を約20℃を超えて上げるステップと、溶液をインキュベートするステップとを含む方法である。
【００２５】
本明細書で記載される一部の態様では、ウイルスが、脂質エンベロープウイルスである。
【００２６】
本明細書で記載される一部の態様では、カプリレートの濃度が、約15mM〜約30mMである。
【００２７】
本明細書で記載される一部の態様では、温度が約27〜30℃である。
【００２８】
本明細書で記載される一部の態様では、インキュベーションが、少なくとも90分間にわたる。
【００２９】
本明細書で記載される一部の態様では、カプリレートの濃度が、20mMである。
【００３０】
本明細書で記載される一部の態様では、インキュベーションが90分間である。
【００３１】
本明細書で記載される一部の態様では、温度が30℃である。
【００３２】
本明細書で記載される一部の態様では、ウイルスが、ヒトに感染する脂質エンベロープウイルスである。
【００３３】
本明細書で記載される別の実施形態は、アルブミンを含む溶液におけるウイルスを不活化する方法であって、溶液のタンパク質濃度をタンパク質約5%へと調整するステップと、溶液のpHを約5未満へと調整するステップと、カプリル酸(オクタン酸)またはカプリル酸ナトリウムを、約20mMの濃度まで添加するステップと、溶液の温度を約27〜30℃まで上げるステップと、溶液を少なくとも90分間にわたりインキュベートするステップとを含む方法である。
【００３４】
本明細書で記載される一部の態様では、ウイルスが、ヒトに感染する脂質エンベロープウイルスである。
【００３５】
本明細書で記載される一部の態様では、方法が、溶液を濾過するステップと、限外濾過および透析濾過を実施するステップと、溶液を調合およびバルク化するステップと、アルブミンを滅菌、充填、低温殺菌するステップとをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】25AUのアルブミンペースト懸濁液中、27℃、pH5.1で1時間にわたる、カプリレート誘導されるウイルス不活化からの結果を示す図である。カプリレートの濃度0、10、15、および20mMを、0、0.5、および1時間の間隔で評価した。結果は、15mMのカプリレートが、ウシウイルス性下痢症ウイルスおよび水泡性口炎ウイルスを、27℃で1時間以内に検出限界まで有効に不活化することを示す。
【図２】25または65AUのアルブミン濃度、pH4.5または5.1、低温、例えば5、12、および20℃で6時間にわたる、20mMのカプリレートに誘導されるウイルス不活化からの結果を示す図である。結果は、低濃度のアルブミンでは、20℃で2時間後、20mMのカプリレートが、ウイルス不活性化剤として有効であったことを示す。しかし、ウイルスの不活化は、より低温下では頑健ではなく、pH、インキュベーション時間、およびアルブミン濃度に依存した。
【図３】温度(27.5℃)およびpH(4.5)を一定とする際の実験デザイン(DOE)応答、およびカプリレートの濃度の関数としてのタンパク質濃度について予測される低減対数値(LRV)を示す図である(パネルA)。パネルBは、温度(27.5℃)およびタンパク質濃度(11.5%)を一定とする際の応答、およびカプリレートの濃度の関数としてのpHについて予測されるLRVを示す図である。
【図４】温度(27.5℃)およびカプリレートの濃度(20mM)を一定とする際のDOE応答、およびタンパク質濃度の関数としてのpHについて予測されるLRVを示す図である。
【図５】40℃でカプリレートを30mMとする際のタンパク質濃度の関数としてのpHについて、95パーセント以上の信頼区間でLRVの応答表面を表すコンターグラフである(パネルA)。パネルBは、応答表面の三次元的表示を示す図である。LRVは、予測区間を最小の95%とし、40℃でpHを4.4、タンパク質濃度を5%、カプリル酸を30mMとする条件で最大化された(すなわち、100%となった)。
【図６】40℃でpHを3.96とする際のカプリレートの濃度の関数としてのタンパク質濃度について、95パーセント以上の信頼区間でLRVの応答表面を表すコンターグラフである(パネルA)。36.9℃でタンパク質を6.6%とする際のカプリル酸濃度の関数としてのpHについて、95パーセント以上の信頼区間でLRVの応答表面を表すコンターグラフである(パネルB)。
【図７】カプリレートによるウイルスの不活化ステップを包含する、改変アルブミン精製工程についてのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
現行のアルブミン精製工程は、アセトンによる乾燥ステップを包含する。アセトンによる乾燥ステップは、ウイルス不活化ステップとして検証されている。しかし、アセトンによるステップは、困難であり高価な稼働装置を要請し、用いられる大量のアセトンは、可燃性および/または爆発の問題を提示し、これは、広範な安全性に対する注意を要請する。アセトンによる乾燥ステップを置換することが望ましい。本明細書で記載されるカプリレートによるインキュベーションは、ウイルス不活化ステップとして用いることができ、次いで、限外濾過/透析濾過するステップを用いてアルブミンを濃縮することができる。
【００３８】
カプリル酸(caprylic acid)(カプリレート(caprylate);オクタン酸)は、有効なウイルス不活化剤でありうる。さらに、カプリレートは、現在のところアルブミン処方物において用いられており、このため、カプリレートによるウイルスの不活化は、溶媒または洗浄剤などのさらなる試薬を導入することなく、かつ、工程への変化を最小限として、アルブミン工程へと容易に組み込むことができる。
【００３９】
カプリル酸またはカプリル酸ナトリウムは、バルク化するステップにおける安定剤としてアルブミン処方物に添加される。しかし、バルク化するステップにおけるアルブミン溶液のpHは、ウイルス不活化に十分な遊離カプリル酸を生成させるには高すぎる(約7)。カプリレートは、既に低pH溶液である画分Vのペースト(アルブミンペースト)を懸濁させる際に添加することができる。カプリレートは、本質的にアルブミンの安定剤であるため、アルブミンに対するその効果は最小限である。UF/DF前の適正な濾過により、溶解しないカプリル酸の形態にあるカプリレートの大半が除去される。UF/DFステップでアルブミン処理を続けると、pHが上昇し、カプリル酸ナトリウムは、透析濾過により洗い流されて、通常のアルブミンをバルク化するステップが可能となる。
【００４０】
全体として、改変アルブミン工程は、画分IV-1の流出物(または濾過物)またはCohn Vペーストを投入材料として用いるステップからなる。Cohn Vペーストを注射用冷水中に再懸濁させるか、または画分IV-1の流出物を、約25AUのタンパク質濃度(A280)まで希釈した。必要な場合は、カプリル酸ナトリウムをカプリレートの濃度20mMまで添加し、pHをpH5未満へと調整した。次いで、溶液を、27〜30℃で90分間にわたりインキュベートした。図7を参照されたい。
【００４１】
殺ウイルス有効性を調べるために、提起される製造工程のスケールダウンモデルを用いて、Cohn画分V懸濁液およびアルブミン懸濁液中のエンベロープウイルス(すなわち、ウシウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)、仮性狂犬病ウイルス(PRV)、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV))のパネルにより、ウイルスの不活化実験を実施した。画分Vペーストまたはアルブミンペーストを水中に懸濁させ、約5%のウイルスでスパイクし、必要な場合は、pHを適切な目標値へと調整した。カプリル酸ナトリウムを添加し、目標とするカプリレートの濃度を達成し、溶液のpHを検証し、溶液を適切な温度でインキュベートした。インキュベーション中の多様な時点で試料を取り出し、細胞ベースのアッセイを用いて滴定し、感染性ウイルスを定量化した。pH、カプリレートの濃度、タンパク質濃度、および温度の適切な条件下で、BVDV、PRV、およびHIVの迅速かつ有効な不活化が観察された。
【００４２】
提起される製造工程のスケールダウン(500gのペースト懸濁液)を用いて、工程の能力を、画分V懸濁液およびアルブミンペースト懸濁液の両方について個別に評価した。必要に応じてカプリル酸ナトリウムを添加し、pHを調整して、目標とするカプリレートの濃度およびpHを達成した。インキュベーション後、材料を濾過し、UF/DFを介して処理し、調合し、バルク化し、滅菌濾過し、低温殺菌した。ベンチスケールの研究による改変工程から導出される中間生成物および最終生成物についての特徴づけのデータは、ベンチスケールの対照試行から導出されたデータ、および現行のフルスケールの製造工程から導出されたデータと同等であった。
【００４３】
改変工程のベンチスケールでの試行は、Cohn画分Vまたはアルブミンペーストにより実施した。まず、約500gのペーストを、注射用冷水中に溶解させた。次いで、溶解させたペーストを約27℃の温度まで加熱し、カプリル酸ナトリウムを約20mMの濃度まで添加した。この溶解させたバルク溶液を、90分間にわたりインキュベートさせて、ウイルスの不活化を生じさせた。アルブミン溶液の清浄化は、一連のフィルターを介する濾過により達成した。次いで、清浄化されたアルブミン溶液を、限外濾過により約12%w/vまで濃縮し、タンパク質のバルクを、注入のための生理食塩液および冷水で透析濾過した。第2の限外濾過ステップにより約28%のタンパク質濃度を達成した。次いで、UF/DF処理したタンパク質のバルク溶液を、水酸化ナトリウム、トリプトファン、およびカプリル酸ナトリウムを添加することにより調合した。調合されたバルク溶液を、滅菌濾過し、バイアルへと充填し、止栓し、オーバーシール(overseal)した。次いで、これらのバイアルを60℃で10〜11時間にわたり低温殺菌して、最終容器へと至らせた。
【００４４】
驚くべきことに、カプリレートは、用いられたタンパク質濃度およびカプリレートの濃度、ならびにインキュベーションの長さおよびインキュベーション温度の工程において、ウイルス不活性化剤および安定剤のいずれとしても同時に機能しうることが見出された。これは、アルブミンが、カプリレートに結合し、カプリレートの濃度が、中程度のタンパク質濃度で、室温、短時間のインキュベーションによるウイルスの不活化に有効であることからも、驚くべきことであった。
【００４５】
アセトンによる乾燥ステップを含めた現行のアルブミン精製工程は、実施例1で記載されており、Cohn流出物IV-1またはCohn画分Vから始める。Cohnら、J. Am. Chem. Soc. 68: 459〜475頁(1946); Cohnら、J. Am. Chem. Soc. 69: 1753〜1761頁(1947);米国特許第2,390,074号、および同第2,469,193号を参照されたい。
【実施例１】
【００４６】
ヒトアルブミンの調製
Cohn画分Vを、注射用冷水中に懸濁させた。代替的に、流出物IV-1を画分Vの代わりに用いることもできる。低温変性エタノール(SDA-3A)を添加して、約10%のアルコール溶液を得る一方で、溶液を約0℃の温度まで冷却した。溶液を約0℃で約1時間にわたり混合し、次いで、深層濾過により清浄化した。
【００４７】
次いで、pHを調整し、低温変性エタノール(SDA-3A)を添加し、溶液を低温でインキュベートすることにより、アルブミン画分を流出物IV-1または画分Vから沈殿させた。低温度によるインキュベーション後、アルブミン画分を、遠心分離により分離した。
【００４８】
アセトンによるウイルスの不活化
次いで、アルブミン画分を低温アセトン中に懸濁させ、約0℃で約数分間にわたり保持した。タンパク質をスラリーから分離し、低温アセトンですすいだ。水分を含むアルブミン粉末は、乾燥した窒素および/または空気を粉末中に通気させることにより乾燥させた。
【００４９】
濃度および濾過
乾燥させたアルブミン粉末を、注射用冷水に約7%のタンパク質濃度まで溶解させた。アルブミン溶液は、0.2μmの最終アブソリュートフィルターまで多孔性に段階をつけた一連のフィルター(必要に応じて珪藻土を用いて濾過の一助とした)を介する濾過により清浄化した。アルブミン溶液のpHを約pH7へと調整し、限外濾過して、溶液を約2倍に濃縮し、次いで、3%NaClの後、注入用水で透析濾過した。次いで、必要な場合、限外濾過により、アルブミン溶液を、適切なタンパク質濃度(約25%)まで濃縮した。
【００５０】
バルク化、滅菌、充填、および低温殺菌
限外濾過/透析濾過したアルブミン溶液を、カプリル酸ナトリウム、賦形剤、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、および注射用水で調整して、20mMのカプリル酸ナトリウム、25%のタンパク質、およびpH7を達成することにより、アルブミンの水性バルクを調製した。必要な場合は、1.0Mの炭酸ナトリウムおよび/または1.0MのHClでpHを調整した。
【００５１】
アルブミン溶液は、0.2μmの最終アブソリュートフィルターまで多孔性に段階をつけた一連のフィルターを介する濾過により滅菌した。滅菌アルブミン溶液は、滅菌ボトルへと無菌的に充填し、約60℃で約10時間にわたり低温殺菌した。最終容器は、25℃で約2週間にわたりインキュベートし、次いで、室温で保管した。
【実施例２】
【００５２】
ウイルス不活化実験
アルブミンペーストに対するアセトン処理は、極めて有効なエンベロープウイルス不活化ステップであるが、工程の障害であり、多くの洗浄問題および安全性問題(火災の危険)を随伴する。結果として、カプリレートによる処理が、アセトンによる懸濁および乾燥への可能な代替法となる。アルブミンペースト懸濁液のカプリレートによる処理を介するエンベロープウイルスの不活化を評価するために、実験を実施した。研究のため、タンパク質濃度を25AUとするアルブミンペースト懸濁液を、ウシウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)または水泡性口炎ウイルス(VSV)でスパイクし、0、10、15、または20mMカプリレートと共に、27℃、pH5.1で1時間にわたりインキュベートした。データは、15mMのカプリレートによる処理後において、ウイルスが検出限界まで不活化されることを示す。Table 1(表1)および図1を参照されたい。
【００５３】
【表１】
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【実施例３】
【００５４】
低温におけるカプリレートの殺ウイルス能を評価するために、実験を実施した。アルブミンおよび画分Vペースト懸濁液を25および65吸光度単位(AU)まで希釈し、カプリル酸ナトリウムを20mMの最終濃度まで添加した。5、12、または20℃におけるインキュベーションの前に、溶液をpH4.5または5.1へと調整し、pHを調整したBVDVでスパイクした。スパイキング時(0時間)、ならびに0.5、2、および6時間後に、滴定、pH、および/またはタンパク質濃度(すなわち、A280)のための試料を取り出した。
【００５５】
アルブミンおよび画分Vペースト懸濁液のいずれについても、カプリレートによるウイルス不活化は、高温および低タンパク質濃度の場合に大きかった。図2を参照されたい。25AUおよび65AUの画分V懸濁液では、ウイルス不活化は、pH4.5の場合の方がpH5.1の場合より大きかった。ウイルス不活化はまた、25AUのアルブミン懸濁液でも、pH4.5の場合の方が大きかった。しかし、65AUのアルブミン懸濁液では、ウイルス不活化は、pH5.1の場合の方がpH4.5の場合より大きかった。カプリレートによるウイルス不活化の機構は、カプリレートの非イオン化形態に帰せられ、この非イオン化形態の濃度は、pH4.5の場合の方がpH5.1の場合より大きいはずであるため、65AUのアルブミンによる結果は、予測外であった。
【００５６】
ウイルスの不活化は、pH、曝露時間、タンパク質濃度、および生成物の組成に依存する。BVDVを、30分間以内に検出限界未満まで不活化した27℃における処理(データは示さない)とは異なり、5℃で最適条件(25AU、pH4.5)下における処理は、BVDVの完全な不活化に2時間を要請した。5℃のアルブミン/画分Vに対するカプリレートによるインキュベーションステップは、エンベロープウイルスの不活化には有効でなかった。
【実施例４】
【００５７】
ウイルスの不活化工程の変数についての実験研究のデザイン
アルブミン試料または画分V試料におけるカプリレートによるウイルス不活化についての初期の結果に基づき、殺ウイルス活性を最大化する条件を評価するための実験研究のデザインを企図した。最適化された変数は、アルブミン濃度(5%〜20%);カプリレートの濃度(10mM〜30mM);溶液のpH(3.8〜5.5);インキュベーション温度(20℃〜40℃);およびインキュベーション時間(10分間および120分間)であった。応答変数は、ウイルス低減対数値(LRV)、アルブミン濃度、凝集率(単量体%)、およびハプトグロブリン濃度であった。各変数の3つのレベル(すなわち、低値、中程度値、および高値;Table 2(表2)を参照されたい)を調べるために、線形的な実験デザインをデザインした。
【００５８】
【表２】
2014034575.tif 000003
【００５９】
計28の個別の実験を実施した。Table 3(表3)を参照されたい。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
以下の通りに実験を実施した:画分Vペーストを注射用水中に懸濁させ、2〜8℃で一晩にわたり保持した。次いで、温度を27〜30℃へと上げ、濃度(280nmにおける吸光度に基づく)を、3つの実験値例えば、5、11.5、または18%(すなわち、100mL当たりのアルブミンg;それぞれ、26.5、60.95、または95.4AU;それぞれ、約0.75M、1.7M、または2.7M)のうちの1つへと調整した。その後、溶液のpHを調整した(pH3.8、4.5、または5.2)。次いで、試料を、実験温度(例えば、15、27.5、または40℃)でインキュベートした。次いで、ウイルスを1%の濃度で添加した。次いで、カプリレートを、3つの濃度:10、20、または30mMのうちの1つで添加した。次いで、試料を、実験温度で120分間にわたりインキュベートした。また、カプリレートによる殺ウイルス活性の反応速度を決定するために、滴定試料(カプリレートを添加する前、ならびに5、10、15、30、60、90、および120分間後)も得た。最後に、各実験についてLRVを決定した。実験結果を、Table 4(表4)および図3〜6に示す。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
殺ウイルス活性に有効な一連のカプリレートの濃度、タンパク質濃度、温度、およびpHが存在した。DOE研究において調べた条件に基づくと、以下の一般的傾向が明らかとなった:
・温度を上昇させると、殺ウイルス活性が増強されること;
・インキュベーション時間を延長すると、殺ウイルス活性が増強されること;
・カプリレートの濃度を増大させると、殺ウイルス活性が増強されること;
・タンパク質濃度(アルブミン)を低下させると、殺ウイルス活性が増強されること;および
・pHを低下させると、殺ウイルス活性が増強される。
【００６４】
さらに、最小の95%の予測信頼区間による以下の結合変数状況において、0〜100のスケールによる予測LRVは最大化される、すなわち、100%に等しくなる(2.16のLRVと同等になる)(図6〜7を参照されたい):
・カプリレートの濃度:30mM;
・アルブミン濃度:5%(約26.5AU;750mM);
・pH:4.4;
・温度:40℃;および
・インキュベーション時間:120分間。
【００６５】
これらのデータに基づき、以下の条件を、アルブミン精製工程におけるウイルス不活化ステップのための実用的条件として決定した:
・タンパク質濃度:≦25AU(A280)(すなわち、<5%;<750mM)
・カプリレートの濃度:≧20mM;
・pH:≦5.0;
・温度:27〜30℃;および
・インキュベーション時間:≧90分間。
【００６６】
これらの条件は、殺ウイルス活性を最大化する一方で、アルブミン精製工程における製造費用および製造時間を低減する。
【００６７】
本明細書で記載される条件、方法、および工程の範囲は、本明細書で記載されている実施形態、態様、例、ステップ、および優先事項の全ての組合せを包含する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
2014034575000001.pdf