(57)【要約】【課題】二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗原結合蛋白質複合体及び二重特異性抗体の製造方法を提供する。【解決手段】二重特異性抗原結合蛋白質複合体、二重特異性抗体、前記抗体の製造方法及び医薬学的用途に係り、該蛋白質複合体を使用することにより、２個の抗原、または同一抗原の２個のエピトープを同時に認識する二重特異性抗体の効果的な製造が可能であり、該二重特異性抗体は、細胞増殖疾患または免疫疾患のような障害の診断、予防または治療目的に使用される。【選択図】図１
2014090721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１抗原結合部位をＮ末端に含む第１ポリペプチド、
第２抗原結合部位をＮ末端に含む第２ポリペプチド、並びに
前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドを連結するリンカー、を含み、
前記リンカーは両末端のうち少なくとも１つの末端にタグを含み、
前記タグが前記第１ポリペプチドのＣ末端及び前記第２ポリペプチドのＮ末端のうち少なくとも１つに連結され、前記タグは切断可能なアミノ酸配列を含む、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗原結合蛋白質複合体。
【請求項２】
前記リンカーは、両末端のうち１つの末端に第１タグを、及び前記第１タグとは反対の末端に第２タグを含み、
前記第１タグが前記第１ポリペプチドのＣ末端に連結され、前記第２タグが前記第２ポリペプチドのＮ末端に連結され、前記第１タグ及び前記第２タグは切断可能なアミノ酸配列をそれぞれ含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
【請求項３】
前記第１抗原結合部位及び前記第２抗原結合部位のうち少なくとも一つが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される、請求項１または２に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
【請求項４】
前記タグは、ユビキチン、ユビキチン類似蛋白質、及びＴＥＶ切断ペプチドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
【請求項５】
前記第１抗原結合部位及び第２抗原結合部位が、互いに独立して、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グローボＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭素脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、ミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）ＩＩ型受容体、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、線維芽細胞活性化蛋白質（ＦＡＰ）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ及びＣＤ６３、からなる群から選択される標的抗原に、特異的に結合する部位を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
【請求項６】
前記リンカーが、１から１００個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
【請求項７】
前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが、配列番号８から配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５から配列番号８１からなる群から選択される塩基配列を有することを特徴とする、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のポリヌクレオチドを挿入させた組み換え発現ベクターを構築する段階と、
前記組み換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる段階と、
前記形質転換された宿主細胞を培養する段階と、
前記宿主細胞で発現された二重特異性抗体を回収する段階と、を含む二重特異性抗体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の製造方法によって製造された二重特異性抗体の治療的有効量、及び薬剤学的に許容できるキャリアー、賦形剤または安定化剤を含み、増殖疾患、腫瘍疾患、炎症疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス疾患、アレルギー症状、移植片対宿主疾患及び宿主対移植片疾患からなる群から選択される、病気の予防用または治療用薬剤組成物。
【請求項１２】
前記二重特異性抗体が、第２活性化剤と結合された状態で存在し、前記第２活性化剤を病巣に標的化することを特徴とする、請求項１１に記載の予防用または治療用薬剤組成物。
【請求項１３】
請求項１０に記載の製造方法によって製造された二重特異性抗体を含む、増殖疾患、腫瘍疾患、炎症疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス疾患、アレルギー症状、移植片対宿主疾患及び宿主対移植片疾患からなる群から選択される、病気の診断用組成物。
【請求項１４】
前記診断用組成物が、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与用であり、検出可能な標識が接続された前記二重特異性抗体を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗原結合蛋白質複合体、二重特異性抗体の製造方法、二重特異性抗体の薬学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は新薬市場の目玉商品となっており、多様な標的に対する薬としてとして開発されている。しかしながら多くの場合、例えば、満足すべき薬効を示せないでいたり、抗体生産に費用がかかったりするなど、新薬の開発は制限されている。かような問題の１つの解決法として、１９８０年半ば以来、二重特異性抗体に対する研究が絶え間なく進められているが、多くの努力にもかかわらず、有力な技術は未だに現れていない。
【０００３】
従来の二重特異性抗体の製造法では、同質の二重特異性抗体を量産することが困難であったり、あるいは低い効能と副作用とによって実用化が困難であったりした。近年、抗体工学技術の発達に力を借りて、競争力のある新たな抗体プラットフォームが現れているが、依然として検証段階である。
【０００４】
従って、従来技術によってさえも、少なくとも２つの異種抗原または同一抗原の２個のエピトープに対して特異性を有する抗体、該抗体を調製するための新たなプラットフォーム、及びそれを製造するための方法の開発が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、２つの抗原結合部位を含む二重特異的抗原結合蛋白質複合体を提供することを課題とする。
【０００６】
本発明は、前記二重特異的抗原結合蛋白質複合体をコーディングするポリヌクレオチドを提供することを更なる課題とする。
【０００７】
本発明は、組み換え発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を使用した二重特異性抗体の製造方法を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明は、前記二重特異性抗体を含む薬剤組成物を提供することを課題とする。
【０００９】
本発明は、前記二重特異性抗体を含む診断用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、ある種の二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗原結合蛋白質複合体によって上記課題を解決できることを見出し、本発明の完成に至った。本発明は、以下の内容をその骨子とする。
（１）第１抗原結合部位をＮ末端に含む第１ポリペプチド、第２抗原結合部位をＮ末端に含む第２ポリペプチド、並びに前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドを連結するリンカー、を含み、前記リンカーは両末端のうち少なくとも１つの末端にタグを含み、前記タグが前記第１ポリペプチドのＣ末端及び前記第２ポリペプチドのＮ末端のうち少なくとも１つに連結され、前記タグは切断可能なアミノ酸配列を含む、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗原結合蛋白質複合体。
（２）前記リンカーは、両末端のうち１つの末端に第１タグを、及び前記第１タグとは反対の末端に第２タグを含み、前記第１タグが前記第１ポリペプチドのＣ末端に連結され、前記第２タグが前記第２ポリペプチドのＮ末端に連結され、前記第１タグ及び前記第２タグは切断可能なアミノ酸配列をそれぞれ含む、（１）に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
（３）前記第１抗原結合部位及び前記第２抗原結合部位のうち少なくとも一つが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される、（１）または（２）に記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
（４）前記タグは、ユビキチン、ユビキチン類似蛋白質、及びＴＥＶ切断ペプチドからなる群から選択されることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
（５）前記第１抗原結合部位及び第２抗原結合部位が、互いに独立して、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グローボＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭素脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、ミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）ＩＩ型受容体、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、線維芽細胞活性化蛋白質（ＦＡＰ）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ及びＣＤ６３、からなる群から選択される標的抗原に、特異的に結合する部位を有することを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
（６）前記リンカーが、１から１００個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
（７）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが、配列番号８から配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体。
（８）（１）〜（７）のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合蛋白質複合体をコーディングするポリヌクレオチド。
（９）前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５から配列番号８１からなる群から選択される塩基配列を有することを特徴とする、（８）に記載のポリヌクレオチド。
（１０）（８）または（９）に記載のポリヌクレオチドを挿入させた組み換え発現ベクターを構築する段階と、前記組み換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる段階と、前記形質転換された宿主細胞を培養する段階と、前記宿主細胞で発現された二重特異性抗体を回収する段階と、を含む二重特異性抗体の製造方法。
（１１）（１０）に記載の製造方法によって製造された二重特異性抗体の治療的有効量、及び薬剤学的に許容できるキャリアー、賦形剤または安定化剤を含み、増殖疾患、腫瘍疾患、炎症疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス疾患、アレルギー症状、移植片対宿主疾患及び宿主対移植片疾患からなる群から選択される、病気の予防用または治療用薬剤組成物。
（１２）前記二重特異性抗体が、第２活性化剤と結合された状態で存在し、前記第２活性化剤を病巣に標的化することを特徴とする、（１１）に記載の薬剤組成物。
（１３）（１０）に記載の製造方法によって製造された二重特異性抗体を含む、増殖疾患、腫瘍疾患、炎症疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス疾患、アレルギー症状、移植片対宿主疾患及び宿主対移植片疾患からなる群から選択される、病気の診断用組成物。
（１４）前記組成物が、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与用であり、検出可能な標識が接続された前記二重特異性抗体を含むことを特徴とする、（１３）に記載の診断用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、２個の抗原、または同一抗原の２個のエピトープを同時に認識する二重特異性抗原結合蛋白質複合体または二重特異性抗体、及びその製造方法が提供される。該二重特異性抗原結合蛋白質複合体または二重特異性抗体は、細胞増殖疾患または免疫疾患のような障害の診断、予防または治療の目的に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明に係る二重特異性抗原結合蛋白質複合体及び二重特異性抗体の概路図である。
【図２】図２は、本発明に係る二重特異性抗原結合蛋白質複合体及び二重特異性抗体の概路図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明に係る二重特異性抗原結合蛋白質複合体のアミノ酸配列構造を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明に係る二重特異性抗原結合蛋白質複合体のアミノ酸配列構造を示している。
【図４】図４は、本発明に係る二重特異性抗体の発現及び精製についてのイオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。
【図５】図５は、本発明に係る二重特異性抗体をβ−メルカプトエタノール未処理群（−）、β−メルカプトエタノール処理群（＋）に分けた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図６】図６は、二重特異性抗体の二重抗原結合反応を示したセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
添付の図面にも例示されている本発明に係る態様について、より詳細に述べるが、類似の参照数字は全体を通して類似の要素について述べている。この点において、本発明に係る態様は別の形態を有してもよく、本明細書において説明される記述に限定されて解釈されるものではない。従って、図面を参酌することによって、単に本発明を説明するために本発明の態様は以下に記述される。本明細書で使用される「及び／または」という用語は、関連するリスト項目のいずれかまたは一つ以上の組み合わせをすべて含む。「少なくとも一つの」のような用語は、要素のリストの前で使用される場合は、要素のリスト全体を修正（ｍｏｄｉｆｙ）し、リストの個別要素を修正するのではない。
【００１４】
本明細書で開示される例示的な態様は、説明的な意味でのみ解釈され、限定の目的とされるべきでないと理解されるべきである。各態様の特徴や側面についての記述は、他の態様の他の類似する特徴や側面についても概して利用できると考えられる。
【００１５】
本発明の一態様は、第１抗原結合部位をＮ末端に含む第１ポリペプチド、第２抗原結合部位をＮ末端に含む第２ポリペプチド、並びに前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドを連結するリンカー、を含み、前記リンカーは両末端のうち少なくとも１つの末端にタグを含み、前記タグが前記第１ポリペプチドのＣ末端及び前記第２ポリペプチドのＮ末端のうち少なくとも１つに連結され、前記タグは切断可能なアミノ酸配列を含む、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗原結合蛋白質複合体を提供する。
【００１６】
本発明の他の態様は、第１抗原結合部位をＮ末端に含む第１ポリペプチド、第２抗原結合部位をＮ末端に含む第２ポリペプチド、並びに前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドを連結するリンカー、を含み、前記リンカーは両末端のうち１つの末端に第１タグを、及び前記第１タグとは反対の末端に第２タグを含み、前記第１タグが前記第１ポリペプチドのＣ末端に連結され、前記第２タグが前記第２ポリペプチドのＮ末端に連結され、前記第１タグ及び前記第２タグは切断可能なアミノ酸配列をそれぞれ含む、二重特異性抗原結合蛋白質複合体を提供する。
【００１７】
本明細書において使用される用語「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」は、２個の互いに異なる抗原、または同一抗原でも、互いに異なるエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対する結合特異性を有することを指す。エピトープは、２種の互いに異なる抗原に起源するか、あるいは同一抗原に起源するものでもある。本明細書において、用語「二重特異性抗原結合蛋白質複合体（単に「蛋白質複合体」とも称する。）」及び「二重特異性抗体」は、全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）抗体、及び抗原結合部位を有するそのフラグメントを有する全ての調製産物を意味する。抗体は、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体またはキメラ抗体でもある。
【００１８】
本明細書において使用される用語「抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）」は、抗原またはエピトープが結合する免疫グロブリン分子内の部位を意味し、抗原結合部位は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むこともある。ＣＤＲは、免疫グロブリンの重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）の高頻度可変性領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）に見出されるアミノ酸配列を意味する。重鎖及び軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲ（ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３；ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，ＣＤＲＬ３）を含む。ＣＤＲは、抗原が結合し、または抗体がエピトープに結合するための主要な接触残基（ｃｏｎｔａｃｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）を提供する。本明細書において使用される用語「重鎖」は、抗原に対する特異性を決定するアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＨ）、及び３個の不変ドメイン（ＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３）を有する不変領域を含む全長重鎖、並びにこれらのフラグメントをいずれも含む意味に解釈される。また、本明細書で使用される用語「軽鎖」は、抗原に対する特異性を決定するアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＬ）、及び不変領域（ＣＬ）を含む全長軽鎖、並びにこれらのフラグメントをいずれも含む意味に解釈される。
【００１９】
本発明の一態様によれば、蛋白質複合体及び二重特異性抗体は、互いに異なる抗原または互いに異なるエピトープに結合する第１抗原結合部位及び第２抗原結合部位を含んでもいる。抗原結合部位に結合される抗原は、正常状態では発現されないか、または低レベルで発現されるが、特定の病的症状、例えば、腫瘍疾患または免疫疾患などで発現が増加する抗原でもある。そのような抗原は、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）ＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グローボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、フコシル（ｆｕｃｏｓｙｌ）ＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭素脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（ＳｏｎｉｃＨｅｄｇｅｈｏｇ、Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原（ｐｌａｓｍａ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、（膜結合性）ＩｇＥ、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ：ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ：ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ）４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）、胎児アセチルコリン受容体（ｆｅｔａｌ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ：Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、ＭＩＳＩＩ型受容体、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、線維芽細胞活性化蛋白質（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ及びＣＤ６３からなる群から選択されることが好ましい。すなわち、本発明の一態様では、第１抗原結合部位及び第２抗原結合部位が、互いに独立して、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グローボＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭素脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、ミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）ＩＩ型受容体、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、線維芽細胞活性化蛋白質（ＦＡＰ）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ及びＣＤ６３、からなる群から選択される標的抗原に、特異的に結合する部位を有する。
【００２０】
一定の生理学的効果を達成するために、互いに異なる抗原に結合する蛋白質複合体及び二重特異性抗体は、２種の抗原−抗体反応の相乗作用を誘発するか、または一連の関連した作用を可能にする抗原の組み合わせを使用することもある。このような組み合わせは、例えば、腫瘍細胞抗原（ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）及び細胞毒性誘発性分子抗原（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）を標的にする二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｙ：ＢｓＡｂ）、例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／抗Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌）、抗ＣＤ３／抗メラノサイト刺激ホルモンアナログ（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ）、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／抗ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合蛋白質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗ｐａｎ癌腫関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３；腫瘍細胞抗原及び抗毒素抗原を標的にするＢｓＡｂ、例えば、抗サポニン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポニン、抗ＣＤ７／抗サポニン、抗ＣＤ３８／抗サポニン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロンα（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリードマイディオタイブ（ａｎｔｉ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｉｄｉｏｔｙｐｅ）、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド（Ｖｉｎｃａ  ａｌｋａｌｏｉｄ）；酵素によって活性化される可変性プロドラッグのためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（ミトマイシンホスファターゼプロドラッグのミトマイシンアルコールへの変化を触媒する）；フィブリン分解剤として使用されるＢｓＡｂ、例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）；細胞表面受容体中の免疫コンプレックスを標的にするためのＢｓＡｂ、例えば、抗低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃ受容体（例：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲ１１、またはＦｃγＲＩＩＩ）；感染性疾病の治療のためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３／抗ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、抗Ｔ細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ；インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で腫瘍検出のためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）；ワクチンアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）としてのＢｓＡｂ；及び診断手段としてのＢｓＡｂ、例えば、抗ラビットＩｇＧ／抗フェリチン、抗ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
【００２１】
本発明の一態様によれば、抗原結合部位を含むポリペプチドは、完全な抗体または完全な抗体のフラグメント（抗原結合性フラグメント）でもある。
【００２２】
完全な抗体は、２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であり、軽鎖と重鎖がそれぞれジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で連結される。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域にはガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）のタイプがあり、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）がある。軽鎖の不変領域にはカッパ（κ）及びラムダ（λ）のタイプがある。
【００２３】
本明細書で使用される用語「抗原結合性フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、抗原結合部位を含むことにより抗原結合能力がある完全な抗体の、一部分を指す。本定義に含まれる抗原結合性フラグメントは、（ｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）、軽鎖不変領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、及び重鎖の第１不変領域（ＣＨ１）を有するＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を有するＦａｂフラグメントであるＦａｂ’フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する最小の抗体フラグメントであるＦｖフラグメント（二本鎖Ｆｖは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合で連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般的には、重鎖変領域と軽鎖可変領域とがペプチドリンカーを介して共有結合で連結され、または一本鎖ＦｖがＣ末端で直接に連結されていることにより二本鎖Ｆｖのようにダイマーを形成することもある）；（ｖｉ）ＶＨドメインによって構成されたｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ’フラグメントを含む、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）フラグメントであるＦ（ａｂ’）2フラグメント；（ｉｘ）一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３（１９８８））；（ｘ）同一のポリペプチド鎖に軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む、２個の抗原結合部位を有する「二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３））；（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと共に１対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「線形抗体」（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；並びに（ｘｉｉ）ＶＨ、ＣＨ２及びＣＨ３によって構成された重鎖のみを含む「単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」が挙げられる。抗原結合性フラグメントは、プロテアーゼを利用して得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）2を得ることができる）、組み換えＤＮＡ技術によってフラグメントを調製することもできる。
【００２４】
本発明の一態様によれば、抗原結合部位を含むポリペプチドは、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）でもある。本明細書で使用される用語「単一ドメイン抗体」は、１つの可変領域（ＶＨ）モノマーを有し、軽鎖及び重鎖のＣＨ１領域が存在しない、約１１０個のアミノ酸で構成されるペプチド鎖である。単一ドメイン抗体は、重鎖抗体、従来の４鎖抗体から由来した単一ドメイン抗体、人工抗体、及び抗原に由来していない単一ドメインスカフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を含む。単一ドメイン抗体分子は、ＩｇＧ分子の約１／１０倍サイズと非常に小さく、非常に安定した一本鎖ポリペプチドであって、極限ｐＨまたは温度条件でも安定性を維持する。また、従来の抗体とは異なり、単一ドメイン抗体分子はプロテアーゼの作用に対して耐性を有し、インビトロでの高い収率により量産が可能である。単一ドメイン抗体は、抗原結合部位及び結晶性フラグメント（Ｆｃ）領域を含む。抗原結合部位は、例えば、結合抗原がＶＥＧＦである場合は、添付の配列リストに示される配列番号２または３のアミノ酸配列を有することがあり、結合抗原がＥＦＧＲである場合は、配列番号５または６のアミノ酸配列を有することがある。Ｆｃ領域は、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、２個の不変領域（ＣＨ２及びＣＨ３）から構成され、例えば、添付された配列リストの配列番号４のアミノ酸配列を有することができる。
【００２５】
これらの抗原結合性フラグメントのうち、好ましくは第１抗原結合部位及び第２抗原結合部位のうち少なくとも一つが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される。
【００２６】
本発明の一態様では、第１抗原結合部位及び／または第２抗原結合部位は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、及び配列番号６のアミノ酸配列、並びに配列番号２、配列番号３、配列番号５、及び配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、抗原結合能力を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される。本発明の一態様によれば、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、配列番号８から配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することもある。また、本発明の一態様によれば、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、配列番号８から配列番号４４のアミノ酸配列、並びに配列番号８から配列番号４４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、抗原結合能力を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される。
【００２７】
本明細書で使用される用語、「タグ（ｔａｇ）」は、融合蛋白質（第１ポリペプチドまたは第２ポリペプチド）の末端に結合された蛋白質またはポリペプチドを意味し、該タグは互いに異なる融合蛋白質間を連結するための媒介になる。タグは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結されたものでもある。本発明の一態様によれば、タグは、インビトロまたはインビボで切断可能でもある。インビトロまたはインビボでの切断はプロテアーゼによることでもある。
【００２８】
本発明の一態様によれば、タグは、ユビキチン（Ｕｂ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ユビキチン類似蛋白質（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＴＥＶ切断ペプチド（ＴＥＶ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）からなる群から選択されてもよい。ユビキチン（Ｕｂ）は、自然界で発見される最も保存性のある（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）蛋白質であり、７６個のアミノ酸配列からなり、昆虫、ニジマス及び人間のような進化的に多様な種間の完璧な相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を示す水溶性蛋白質である。また、ユビキチンは、ｐＨの変化に対して安定した蛋白質として知られており、高温でも容易には変性せず、プロテアーゼに対しても安定性があるが、複数のプロテアーゼによって切断可能であることは当業者に知られており、インビトロまたはインビボで切断が可能なアミノ酸配列を有する。
【００２９】
ユビキチンまたはユビキチン類似蛋白質は、野生型ユビキチン、野生型ユビキチン類似蛋白質、突然変異ユビキチン及び突然変異ユビキチン類似蛋白質からなる群から選択される。本発明の一態様によれば、ユビキチンは、配列番号７のアミノ酸配列からなる。ユビキチン類似蛋白質は、ユビキチンとその特性が類似した蛋白質であり、例えば、Ｎｅｄｄ８、ＳＵＭＯ−１、ＳＵＭＯ−２、ＮＵＢ１、ＰＩＣ１、ＵＢＬ３、ＵＢＬ５及びＩＳＧ１５からなる群から選択される。突然変異ユビキチンは、野生型ユビキチンのアミノ酸配列を、他のアミノ酸配列に変えたものを意味し、例えば、野生型ユビキチンのＬｙｓをＡｒｇで置換したユビキチン、野生型ユビキチンＣ末端ＲＧＧをＲＧＡに変更させたユビキチンを含む。本発明の一態様によれば、野生型ユビキチンのＬｙｓをＡｒｇで置換した突然変異型ユビキチンで、該置換は、野生型ユビキチンの配列上６番目、１１番目、２７番目、２９番目、３３番目、４８番目及び６３番目に位置するＬｙｓで、それぞれ独立して、または組み合わせて起こることがある。
【００３０】
本発明の一態様によれば、ユビキチンまたはユビキチン類似蛋白質は、プロテアーゼによってインビトロまたはインビボで切断可能なアミノ酸配列を、好ましくはアミノ酸配列のＣ末端に含む。プロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列は、当業者に公知の検索データベースで確認することができる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ＿ｅｎｚｙｍｅｓ．ｈｔｍｌで検索されるプロテアーゼ、及びその切断可能なアミノ酸配列を利用することができる。切断可能なアミノ酸配列が含まれることで、蛋白質複合体は、インビトロまたはインビボでタグが切断され、蛋白質複合体が、二重特異性抗体としての三次構造を形成し、その機能を遂行することができる。
【００３１】
本発明の一態様によれば、前記蛋白質複合体は、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを互いに連結するリンカーを含んでもよい。リンカーは、ペプチドリンカーでもある。ペプチドリンカーは、当業者に公知の多様なリンカーを利用することができ、例えば、複数のアミノ酸からなるリンカーでもある。本発明の一態様によれば、リンカーは、例えば、１個から１００個、または２個から５０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドでもある。
【００３２】
ペプチドリンカーは、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間を十分な距離に離隔させることで、機能を発揮する二次構造または三次構造に折り畳まれる。例えば、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むことがあり、Ｔｈｒ及びＡｌａのような中性アミノ酸を含むこともある。ペプチドリンカーに適するアミノ酸配列は、当業者に知られている。一方、リンカーの長さは、融合蛋白質（抗原結合能を有するポリペプチド）の機能に影響を及ぼさない限度内で、その長さを多様に決定することができる。
【００３３】
本発明の一態様によれば、リンカーは、両末端のうち、少なくとも１つの末端にタグを含む。また、タグは、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドの末端に連結され、切断可能なアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明の他の具体例では、蛋白質複合体は、分泌のためのシグナル配列をさらに含んでもよい。
【００３５】
分泌のためのシグナル配列は、蛋白質コーディング配列のＮ末端に連結されることで、発現される蛋白質またはペプチドが細胞膜または細胞外に分泌されるように誘導する配列を意味し、１８個から３０個のアミノ酸によって構成されたペプチド配列でもある。細胞質外に輸送可能な全ての蛋白質は、いずれも特徴的なシグナル配列を有し、該シグナル配列は、シグナルペプチダーゼによって細胞膜にて切断される。一般的に、宿主細胞内では自然には発現されない外来蛋白質の場合、該蛋白質をペリプラズム若しくは培養液に分泌させるためのシグナル配列またはその変形配列が使用される。
【００３６】
本発明の態様では、例えば抗原特異性などの意図する機能または特性が実質的に変わらない範囲で、蛋白質複合体のアミノ酸配列を適切に変形させることができる。アミノ酸の変形は、アミノ酸残基置換体の類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、及び／または大きさなどに基づいて生じ、このため、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮されてもよい。該変形は、例えば、一部アミノ酸の置換、欠失、及び／またはアミノ酸の付加でもあり、特に置換は、保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）である。本明細書において使用される用語「保存的置換」は、結果として生じる分子の生物学的活性を有意に変更させない置換であり、置換されるアミノ酸が、蛋白質の三次構造や局所電荷状態に有意の影響を与えないものを指す。分子活性を全体的に変更させないアミノ酸置換は、本願技術分野に知られており、例えば、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙの間の置換が挙げられる。
【００３７】
本発明の他の態様は、二重特異性抗原結合蛋白質複合体をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
【００３８】
本明細書にて使用される用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＤＮＡから転写されたＲＮＡ配列を含み、特別に他の言及がない限り、糖または塩基の部位が変形されたアナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の一態様では、ポリヌクレオチドは、軽鎖ポリヌクレオチドである。
【００３９】
ポリヌクレオチドは、蛋白質複合体のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列だけではなく、その配列に相補的な配列も含む。相補的な配列は、完璧に相補的な配列だけではなく、実質的に相補的な配列も含み、それは、当業者に公知のストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件下で、抗原結合能力を有する該蛋白質複合体のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列を意味する。ストリンジェント条件とは、例えば、モレキュラークローニングラボラトリーマニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）に記載されている条件が挙げられる。例えば、ハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸を２０×ＳＳＣの組成とする。）、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％ＳＤＳ、２重量％ブロッキング試薬、５０重量％ホルムアミド）中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件である。インキュベーション後の洗浄には、例えば１×ＳＳＣ溶液（０．１重量％ＳＤＳ）を洗浄バッファーとして用いることができる。
【００４０】
また、蛋白質複合体のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列は、変形されてもよい。該変形は、ヌクレオチドの付加、欠失、非保存的置換または保存的置換であって、コーディングされる蛋白質複合体が抗原結合能力を有するものを含む。蛋白質複合体のアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものであると解釈される。実質的な同一性とは、蛋白質複合体をコーディングするヌクレオチド配列と、任意の他の配列とを最大限対応するようにアライン（ａｌｉｇｎ）し、当業者に一般的に利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合、８０％以上の相同性、９０％以上の相同性または９５％以上の相同性を示す配列でもある。
【００４１】
本発明の一態様によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号４５から配列番号８１からなる群から選択される塩基配列を有するものでもある。本発明の一態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号８から配列番号４４のアミノ酸配列、並びに配列番号８から配列番号４４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、抗原結合能力を有するポリペプチドを含む二重特異性抗原結合蛋白質複合体をコーディングする。
【００４２】
本発明に係る蛋白質複合体の製造は、ポリヌクレオチドを使用し、当業者に公知の遺伝子工学技術及び化学的合成を介して行われる。遺伝子工学技術では、クローニングベクター（ｖｅｃｔｏｒ）または発現ベクターを構築し、該ベクターによって宿主細胞を形質転換させ、目的蛋白質を発現させるために宿主細胞を培養することでもある。
【００４３】
従って、本発明の一態様は、前述の蛋白質複合体をコーディングするポリヌクレオチド配列を挿入させた組み換え発現ベクターを構築する段階、前記組み換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる段階、前記形質転換された宿主細胞を培養する段階、及び前記宿主細胞で発現された前記二重特異性抗体を回収する段階を含む、二重特異性抗体の製造方法を提供する。
【００４４】
本明細書における用語「ベクター」は、目的遺伝子を発現させるための手段であり、宿主細胞内に導入されたときに、ベクター及び細胞内部に独立してクローニング及び挿入された外来ＤＮＡのコピーを生産する。本明細書において使用される用語「組み換え発現ベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、特定蛋白質を増幅するため外来ＤＮＡフラグメントが挿入されたベクターであり、該外来ＤＮＡフラグメントは、本発明に係る蛋白質複合体をコーディングするポリヌクレオチドでもある。発現またはクローニングを目的にしたベクターシステムの構築方法は、当業者に知られている。
【００４５】
ベクターは、本発明係るポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）調節配列を含んでもよい。
【００４６】
本明細書における用語「調節配列」は、コーディング配列（標的ポリペプチド、蛋白質をコーディングする核酸配列）を発現するのに必要な核酸配列を指し、調節配列の性質は宿主生物によって異なる。原核生物では、調節配列は、一般的にプローモーター、リボソーム結合部位及び転写／翻訳ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）を含む。真核生物では、調節配列は、一般的にプローモーター、ターミネーター、及び一部の場合では、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、トランス活性化因子（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）及び／または転写因子を含む。本明細書における用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、前構成要素が意図したとおりに機能するように、機能的結合によって生じる並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を意味する。コーディング配列に作動可能に連結された調節配列は、コーディング配列の発現が、調節配列と両立することができる条件下でなるように連結される。
【００４７】
原核細胞を宿主として使用する場合、組み換えベクターは転写を進めることができる強力なプローモーター（例えば、ｔａｃプローモーター、ｌａｃプローモーター、ｌａｃＵＶ５プローモーター、ｌｐｐプローモーター、ｐＬλプローモーター、ｐＲλプローモーター、ｒａｃ５プローモーター、ａｍｐプローモーター、ｒｅｃＡプローモーター、ＳＰ６プローモーター、ｔｒｐプローモーター及びＴ７プローモーターなど）；翻訳開始のためのリボソーム結合サイト；及び転写／翻訳ターミネーターを含んでもよい。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が利用される場合、トリプトファン生合成経路のＥ．ｃｏｌｉプローモーター部位及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．（１９８４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４）、及び／またはファージλの左向きプローモーター（ｐＬλプローモーター；Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．及びＨａｇｅｎ，Ｄ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９−４４５）が調節領域（調節配列）として利用されてもよい。真核細胞を宿主として使用する場合、哺乳動物前駆細胞由来のプローモーター（例：メタロチオネインプローモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプローモーター（例：アデノウイルス後期プローモーター、ワクシニアウイルスプローモーター７．５Ｋ、ＳＶ４０プローモーターまたはサイトメガロウイルスプローモーター、及びＨＳＶのｔｋプローモーター）が利用され、転写ターミネーター配列としてポリアデニル化配列を有することもある。
【００４８】
調節配列以外に加えて、組み換え発現ベクターは、制限酵素部位、薬物抵抗性遺伝子のようなマーカー遺伝子、分泌シグナル配列及び／またはリーダー（ｌｅａｄｅｒ）配列などをさらに含むこともある。制限酵素部位は、制限酵素によって特異的に認識される特定の塩基配列を指す。制限酵素部位は、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩのような制限酵素によって特異的
に認識される配列である。マーカー遺伝子は選択マーカーとして機能し、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及び／またはテトラサイクリンのような薬物に対する薬剤耐性遺伝子でもある。分泌シグナル配列またはリーダー配列は、合成された蛋白質を細胞区画（例えば、ペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐａｃｅ））に移動させたり、または細胞外の培養培地に合成された蛋白質が分泌したりするように誘導する配列であり、その配列は、本発明に係るポリヌクレオチド配列のコーディング配列に添加されてもよい。該配列は、導入するＤＮＡ、宿主細胞の種類、及び／または培養培地の条件などによって、当業者によって適切に選択される。
【００４９】
前述の要素を具備した適切な発現ベクターは知られており、例えば、オカヤマ−バーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡ若しくはｐＥＦ−ｎｅｏ、あるいはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）が挙げられる。
【００５０】
本発明のある態様では、宿主細胞は、組み換え発現ベクターまたは二重特異性抗原結合蛋白質複合体で、宿主を形質転換またはトランスフェクションさせることで調製される。
【００５１】
宿主細胞は、組み換えベクターを安定化して継続的にクローン化及び発現する、当業者に知られた任意の原核生物細胞または真核細胞でもある。原核生物は、蛋白質の発現を目的としてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が形質転換されたバクテリアを指す。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス  チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス  ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス  カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ））、ラットチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）などがある。真核細胞は、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む。本発明の一態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞でもある。有用な哺乳動物細胞としては、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓細胞株（ＨＥＫ−２９３細胞または懸濁培養で成長するようにサブクローニングされたｈＥＫ−２９３細胞；Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及び／またはヒト肝腫瘍細胞株（ＨｅｐＧ２）などを含んでもよい。
【００５２】
組み換え発現ベクターの宿主細胞への形質転換は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムトランスフェクション（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）及び／または感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）によって行われる。
【００５３】
宿主細胞の培養は、当業者に公知の適切な培地及び培養条件を使用して行われる。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、ＭＥＭ（最小必須培地、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ）などが利用される。必要な場合、ホルモン若しくはその他の成長因子、塩、緩衝剤、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素及び／またはグルコースなどが、公知の適する濃度で補充されてもよい。培養条件、例えば、温度及び／またはｐＨは、選択された宿主細胞によって、当業者によって適切に決定される。
【００５４】
宿主細胞によって発現された二重特異性抗原結合蛋白質複合体は、分泌シグナルペプチドによって細胞外に分泌され、その場合、培養液または培地から回収することによって蛋白質複合体は得られる。例えば、蛋白質フィルタを使用して培養上清液を濃縮し、抗体蛋白質を分離することができる。しかし、分泌シグナル配列無しで発現された場合、蛋白質複合体は細胞内ペリプラズム空間に存在するので、細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）から直接回収されてもよい。ペリプラズム空間へ分泌された抗体を単離する工程は当業者に知られており、一般的に、微粒子フラグメント（宿主細胞のフラグメントまたは分解された宿主細胞）を遠心分離または限外濾過によって除去することができる。
【００５５】
選択肢として、培養物から得られた二重特異性抗体を、当業者に知られた方法によって、さらに精製することができる。例えば、回収される抗体次第で、二重特異性抗体に、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親水性、疎水性及び／またはサイズ排除）、クロマトフォーカシング、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、分画溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）のような、通常の蛋白質精製技術を使用することができる。本発明の一態様では、二重特異性抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。アフィニティーリガンドとして、プロテインＡの適合性は、抗体に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプによって異なる。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは、アガロースでもあるが、それに限定されるものではなく、機械的に安定したマトリックス（例えば、調節されたポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）は、アガロースと比べて、流速及びプロセシング時間が向上することもある。
【００５６】
本発明の他の態様は、前述の二重特異性抗体、及び薬剤学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または安定化剤を含む薬剤組成物に関する。
【００５７】
該薬剤組成物は、治療メカニズムとして、二重特異性抗体の二重特異性抗原−抗体結合によって引き起こされる生理学的効果を有することで、疾患の予防や治療に使用されたり、または該組成物は、抗原−抗体反応によって病巣を標的化することに使用されたりする。本発明の一態様では、該症状または疾患は、例えば、増殖疾患、腫瘍疾患、炎症疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス疾患、アレルギー症状、移植片対宿主疾患（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）及び宿主対移植片疾患（ｈｏｓｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｇｒａｆｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられる。
【００５８】
例えば、ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体の場合、二重特異性抗体を含む薬剤組成物は、血管新生の抑制及び／または上皮細胞増殖の抑制によって改善される疾患、例えば、腫瘍疾患の予防及び／または治療に使用される。腫瘍疾患は、肺扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮細胞癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃腺癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、グリア芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌若しくは子宮癌、唾液腺癌、腎細胞癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫及び多様なタイプの頭頚部癌；Ｂ細胞リンパ腫（低級／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）非ホジキンリンパ腫、中級／濾胞性非ホジキンリンパ腫、中級拡散非ホジキンリンパ腫、高級免疫芽球性非ホジキンリンパ腫、高級リンパ芽球性非ホジキンリンパ腫、高級小非切断細胞性非ホジキンリンパ腫、バルキー病非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストロームマクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ  ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄性白血病；移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）；及び／若しくは母斑症（ｐｈａｃｏｍａｔｏｓｉｓ）と係わる血管内皮細胞の異常増殖、浮腫（脳腫瘍と係わる浮腫）並びに／またはメージュ症侯群（Ｍｅｉｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などでもある。
【００５９】
本発明の一態様では、薬剤組成物の二重特異性抗体は、第２活性化剤（機能性分子）と結合された状態で含まれてもよい。第２活性化剤は、対象疾患の予防活性または治療活性を示す任意の機能性分子でもあり、化合物、ペプチド、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質または無機粒子を含んでもよい。薬剤組成物において、二重特異性抗体それ自体が治療活性を有することもできるが、結合された第２活性化剤を、特定の病巣（病巣領域）に標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）する機能を、二重特異性抗体は果たすことができる。病巣領域は、二重特異性抗体が特異的に結合する抗原が密集して分布する器官、組織、細胞などでもある。標的化された薬物は病巣に高濃度で存在することになるので、対投与量換算での薬効を上昇させることができる。従って、本発明に係る医薬組成物は薬剤耐性がある腫瘍の治療に有用であり、薬物の非特異的分布に起因する副作用及び有害薬剤反応を低減させることができる。
【００６０】
薬剤組成物は、意図した純度を有する二重特異性抗体を薬剤学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または安定化剤と混合して調製されてもよい。薬剤学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量及び濃度において受容体に無毒性であり、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸及びメチオニン）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールまたはｍ−クレゾール）；低分子量（１０残基未満）ポリペプチド；蛋白質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類及びその他炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩生産性カウンターイオン；金属錯体；及び／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮTM（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳTM（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含んでもよい。それ以外にも、製剤化方法によって、一般的に使用される充填剤、希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、及び／または界面活性剤が、当業者によって適切に選択されてもよい。
【００６１】
二重特異性抗体を含む本発明に係る薬剤組成物中の活性成分は、例えば、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル、ゼラチンマイクロカプセル、ポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物デリバリーシステム（リポソーム、アルブミン小胞子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及び／若しくはナノカプセル）、またはマクロエマルジョンのようなコアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセルに封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）させてもよい。
【００６２】
また、二重特異性抗体は、徐放性（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）タブレットに製剤化されてもよい。徐放性タブレットは、例えば、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透科性マトリックスでもある。マトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの形態でもあり、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴTM（登録商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドを含む注射可能なマイクロスフェア）、及び／またはポリＤ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸でもある。カプセル化された抗体蛋白質が長期間体内に留まる場合、３７℃の温度で湿気に露出される結果、抗体は変性または凝集し、生物学的活性を喪失し、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）に変化が生ずることがあので、抗体安定化のための適切な方法が考慮される。例えば、凝集メカニズムが、チオジスルフィド交換を介した細胞間Ｓ−Ｓ結合形成であるときは、スルフヒドリル基を形成させ、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を調節し、適切な添加剤を使用すること、及び／または特定のポリマーマトリックスを開発することで、抗体を安定化させてもよい。
【００６３】
本発明の他の態様は、増殖疾患、腫瘍疾患、炎症疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス疾患、アレルギー症状、移植片対宿主疾患及び宿主対移植片疾患からなる群から選択される状態の予防または治療のために、治療的有効量の薬剤組成物を個体に投与する段階を含む、予防及び／または治療方法に関する。
【００６４】
本発明に係る薬剤組成物は、ラット、マウス、家畜、及び／または人間を含む個体に多様な経路で投与されてもよい。投与の全ての方式は予想可能なものであるが、例えば、経口、経直腸、静脈内、経鼻、腹腔内、皮下または局所への投与などが可能である。該組成物はまた、当該技術分野に知られた他の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ最新版に記載された方法）を使用して投与されてもよい。
【００６５】
本明細書で使用される「治療的有効量」は、合理的な利益／リスクの比率で疾患の治療に十分な量を意味する。治療的有効量は、疾患の種類、重症度、発病時期、個体の年齢、体重、排泄速度、反応感応性、健康状態、及び／若しくは合併症のような患者側の要因；並びに／または薬物の活性、投与経路、投与期間、回数及び／若しくは併用薬物のような薬物側の要因；によって異なり、当業者が目的とする治療に応じて適切に選択することができる。投与量は、例えば、大人の体重を基準に、１日当たり０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ範囲になるように、任意に数回に分けて投与することができる。
【００６６】
本発明のさらに他の態様は、前述の二重特異性抗体を含む、増殖疾患、腫瘍疾患、炎症疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス疾患、アレルギー症状、移植片対宿主疾患及び宿主対移植片疾患からなる群から選択される病態の診断用組成物に関する。
【００６７】
本発明の一態様によれば、該診断用組成物は生物学的試料に適用され、ある疾患で特異的に見出される抗原を検出するのに使用されてもよい。用語「生物学的試料」は、細胞、組織、全血、血清、血漿、組織剖検試料（脳、肌、リンパ節、及び脊髓など）、細胞培養上清、及び／または破裂した真核細胞などを含んでもよい。本発明に係る組成物の適用は、採取された生物学的試料を対象に、インビトロで行われるか、あるいは該組成物を被検個体内に投与し、インビボでも行われる。
【００６８】
本明細書で使用される用語「検出」は、本発明に係る診断用組成物の二重特異性抗体を生物学的試料と反応させ、抗原−抗体複合体の形成を確認することを意味し、公知の検出可能な標識（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｌａｂｅｌ）及び検出方法によって行われる。検出方法は、比色法（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）、肉眼測定法（ｖｉｓｕａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）またはシンチレーション計数法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）などである。検出可能な標識は、酵素、蛍光物質、発光物質、リガンド、ナノ粒子または放射性アイソトープでもある。標識として使用される酵素は、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリンホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ及び／またはβ−ラクタマーゼが挙げられる。蛍光物質は、フルオレセイン、Ｅｕ3＋、Ｅｕ3＋キレートまたはクリプテートを含んでもよい。発光物質は、アクリジニウムエステル及び／またはイソルミノール誘導体を含んでもよく、リガンドは、ビオチン誘導体を含んでもよく、ナノ粒子はコロイドまたは金着色ラテックスを含んでもよく、放射性アイソトープは、57Ｃｏ、3Ｈ、125Ｉ、125Ｉ−ボントン（Ｂｏｎｔｏｎ）及び／またはハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）試薬などを含んでもよい。本発明の一態様では、抗原―抗体複合体の検出は、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）によって行われてもよい。また、診断用組成物を個体内に投与することで抗原―抗体反応を検出する場合、検出可能な標識を二重特異性抗体に結合、カップリング、または接続させた状態で投与してもよい。
【００６９】
本発明のさらなる態様は、前述の二重特異性抗体を含むキットに関する。該キットは、前述の組成物と同様に、増殖疾患、腫瘍疾患、炎症疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス疾患、アレルギー症状、移植片対宿主疾患及び宿主対移植片疾患からなる群から選択される状態を診断し、治療し、または予防するための医学的キットでもある。
【００７０】
本発明に関するタンパク質複合体を用いて、２種の抗原または同じ抗原の２種のエピトープを認識する二重特異性抗体の効率的な調製が可能である。二重特異性抗体は、細胞増殖疾患または免疫疾患のような病気の診断、予防、及び／または治療の目的に使用される。
【００７１】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、一つ以上の具現例を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
図１及び図２は、本発明の一態様である、抗原結合部位を含む二重特異性抗原結合蛋白質複合体及び二重特異性抗体の概路図である。
【００７３】
図１から分かるように、第１抗原結合部位１０１を含む第１ポリペプチド１００、及び第２抗原結合部位２０１を含む第２ポリペプチド２００は、それぞれその末端に、第１タグ１０２及び第２タグ２０２が連結されており、ポリペプチドからなるリンカー３００の末端に、前記第１タグ１０２及び第２タグ２０２が連結されている。前記第１タグ１０２及び第２タグ２０２は、ユビキチンまたはユビキチン類似蛋白質のような蛋白質からなっているので、インビトロまたはインビボで切断が可能である。インビトロまたはインビボのいずれかで、前記第１抗原結合部位１０１を含む第１ポリペプチド１００、及び第２抗原結合部位２０１を含む第２ポリペプチド２００は、完全な自発的結合（ジスルフィド結合）を介して互いに結合され、互いに異なる抗原結合部位を有する二重特異性抗体を形成することができる。
【００７４】
図２は、図１に開示された具体例による抗原結合部位を含む２以上のポリペプチドを含む蛋白質複合体で、第２タグ２０２（図１）がない形態の例を示す。前述のように、インビトロまたはインビボでの切断を介して、互いに異なる抗原結合部位を有する二重特異性抗体を蛋白質複合体は形成するが、；図２で開示された蛋白質複合体は第２タグ２０２を有していないので、第２抗原結合部位２０１を含む第２ポリペプチド２００にリンカー３００が結合された形態で存在するが、；リンカー３００は、２個から５０個の短いアミノ酸配列を含むので、前記第２抗原結合部位２０１を含む第２ポリペプチド２００の機能に影響を及ぼさない。
【００７５】
［実施例１．抗ＶＥＧＦ−ＥＧＦＲ二重特異性蛋白質複合体発現ベクターの製造］
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対してそれぞれ特異的な結合部位を含む二重特異性抗体を製造するため、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対してそれぞれ特異的な二重特異性蛋白質複合体の発現ベクターをＧｅｎｅＡｒｔに依頼して製造した。蛋白質発現用ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃ／ｈｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【００７６】
具体的には、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示すように、分泌のためのシグナル配列（ｓｓ：ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（配列番号１）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）結合部位であるＶ１またはＶ２（Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ）（配列番号２または３）及びヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含むＦｃドメイン（Ｈｉｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）（配列番号４）から構成される単一ドメイン抗体；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合部位であるＥ１またはＥ２（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ）（配列番号５または６）及びヒンジを含むＦｃドメイン（配列番号４）から構成される単一ドメイン抗体；少なくとも１つのユビキチンタグ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）（配列番号７）；並びにリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）（Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎペプチド）によって構成された蛋白質複合体のアミノ酸配列に相当する一本鎖ＤＮＡ（Ｖ１／Ｖ２及びＥ１／Ｅ２の長さ、リンカーの長さ、並びにユビキチンの個数の組み合わせによって、総３７種）；を合成した。前記蛋白質複合体を発現させるためにプラスミドに挿入されるＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を、配列番号４５から配列番号８１で示した。前記挿入ＤＮＡフラグメントは、ＥｃｏＲＩで切断することができるヌクレオチド配列を５’末端に、ＸｈｏＩで切断することができるヌクレオチド配列を３’末端に含み、ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃ／ｈｉｓＡベクターのＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ１制限酵素サイトに挿入される。
【００７７】
［実施例２．抗ＶＥＧＦ−ＥＧＦＲ二重特異性抗体の発現及び精製］
実施例１で得られた組み換えベクターのうち、配列番号７８のＤＮＡフラグメントが挿入された組み換えベクターを、ＨＥＫ−２９３細胞株（Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ−２９３  ｃｅｌｌ）（韓国セルラインバンク）にリポソームを使用してトランスフェクションし、それにより、ＶＥＧＦ−ＥＧＦＲ二重特異性蛋白質複合体を発現させた。二重特異性蛋白質複合体のユビキチンタグがＨＥＫ−２９３細胞内で切断され、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）結合部位を含む単一ドメイン抗体と、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合部位を含む単一ドメイン抗体とが自発的結合を介して互いに結合されることにより生成した二重特異性抗体を、ＨＥＫ−２９３細胞から分離及び精製した。
【００７８】
５００ｍＬ三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）に、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地１００ｍＬを使用し、ＨＥＫ−２９３細胞を１×１０6細胞／ｍＬの濃度で播種し、ＤＮＡ−リポソーム混合液の調製にはＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標）ＭＡＸを使用した。ＤＮＡ−リポソーム複合体の調製の際は、室温で１０分間反応させ、複合体混合液をＨＥＫ−２９３細胞に添加した。３７℃の８％ＣＯ2撹拌インキュベータ（ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）内で、細胞を７日間培養して蛋白質発現を誘導した。
【００７９】
二重特異性抗体を含む前記二重特異性蛋白質複合体発現細胞の培養液を、０．２μｍフィルタを利用して濾過した。プロテインＡアフィニティーカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、細胞培養液のクロマトグラフィーを行った。細胞培養液に含まれた二重特異性抗体を、プロテインＡカラムに結合させた後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、溶出液（１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）を利用して、プロテインＡカラムから抗体を溶出した。溶出液を中和するため、１／１０体積のトリスバッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を溶出液に加えた。脱塩カラムを利用し、溶出液を緩衝溶液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に置換し、ＭｏｎｏＳカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライしてイオン交換クロマトグラフィーを行った。その結果、図４に示すように、前記二重特異性抗体を溶出した。
【００８０】
得られた溶出液中に二重特異性抗体が存在することは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって確認した。二重特異性抗体のモノマー形態の分子量を確認するため、ゲルにローディングする前に、二重特異性抗体をβ−メルカプトエタノールによって処理した。その結果、図５に示すように、ＶＥＧＦ結合部位を含む単一アーム（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ）抗体、及びＥＧＦＲ結合部位を含む単一アーム抗体がそれぞれモノマーの形態で検出されたことを確認した。
【００８１】
［実施例３：抗ＶＥＧＦ−ＥＧＦＲ二重特異性抗体の抗原結合力の検証］
実施例２で製造した二重特異性抗体の二重特異性抗原・抗体反応を確認するため、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を使用して、ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲに対する抗体の結合力を検証した。約２，０００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔ、反応単位）の濃度となるように、ヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をアミンカップリング化学反応によってＣＭ５チップに固定化した。実施例２で製造された二重特異性抗体を１０μｌ／分の流速で１分間流した。結合を確認した後、ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン（Ｐｒｏｓｐｅｃ）を、１０μｌ／分の流速で１分間流した。結合を確認した後、グリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．０）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０μｌ／分の流速で１分間流して表面を再生させた。
【００８２】
前記分析の結果、二重特異性抗体が、ヒトＶＥＧＦとヒトＥＧＦＲとに同時に結合する能力を有するということが確認された（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明にかかる二重特異性抗原結合蛋白質複合体及び二重特異性抗体の製造方法は、例えば、新薬開発関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【符号の説明】
【００８４】
１００        第１ポリペプチド
１０１        第１抗原結合部位
１０２        第１タグ
２００        第２ポリペプチド
２０１        第２抗原結合部位
２０２        第２タグ
３００        リンカー
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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