(57)【要約】      （修正有）【課題】制御性T細胞の活性化を通じて免疫の異常な活性化を抑制することができるさらなる抗原ペプチドを同定すること、及び、当該エピトープを利用した関節リウマチ等のＨＬＡ−ＤＲ４陽性の自己免疫疾患の予防・治療に用いる医薬を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるペプチドで制御性Ｔ細胞を活性化するペプチド、前記ペプチドをコードする核酸、前記核酸を含む発現ベクター。前記ペプチド、前記核酸、並びに前記発現ベクターからなる群より選択されるいずれか１つを含む医薬組成物。ＨＬＡ−ＤＲ４陽性の自己免疫疾患は、関節リウマチ、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、および多発性硬化症からなる群より選択される、医薬組成物。【選択図】図４
2014204675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかのペプチド：
(i)  配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
(ii)  配列番号：１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチドであって、制御性T細胞を活性化するペプチド；及び
(iii)  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、制御性T細胞を活性化するペプチド。
【請求項２】
前記(ii)又は(iii)のペプチドであって、以下の配列を含む、請求項１に記載のペプチド：
Val−Xaa1−Xaa2−Lys−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Arg（配列番号：６）
［式中、Xaa1〜Xaa7はそれぞれ独立に任意のアミノ酸を表す。］。
【請求項３】
以下のいずれかのペプチド：
(iv)  配列番号：２〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
(v)  配列番号：２〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチドであって、制御性T細胞を活性化するペプチド；及び
(vi)  配列番号：２〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、制御性T細胞を活性化するペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド、請求項４に記載の核酸、並びに請求項５に記載の発現ベクターからなる群より選択されるいずれか１つを含む医薬組成物。
【請求項７】
ＨＬＡ−ＤＲ４陽性の自己免疫疾患の治療又は予防に用いられる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＨＬＡ−ＤＲ４陽性の自己免疫疾患は、関節リウマチ、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の治療又は予防に用いられるペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（Rheumatoid arthritis; RA）は、免疫が異常に活性化され、全身の関節炎が持続する結果、骨や軟骨の破壊に至る自己免疫疾患である。
RAの現在の治療戦略としては、炎症を抑制する抗炎症療法が主であり、免疫抑制薬であるステロイドやメトトレキサートが使用されている。また、近年、生物学的製剤による抗サイトカイン療法も用いられるようになった。しかしながら、これらの方法は、正常な免疫機能も抑制するため、感染症などの合併症を起こしやすく、また、約3割の患者では十分な治療効果が得られない。
【０００３】
RA発症の要因については、HLA-DR遺伝子の多型との関連が注目されており、この中でHLA-DR4がRAの発症に関与していることが知られている。
HLA-DR分子は、ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex; MHC）class II分子の1つである。MHC class II分子は、抗原提示細胞に発現し、抗原ペプチドをT細胞に提示する糖タンパク質である。この抗原ペプチドはエピトープとも呼ばれる。エピトープを提示したMHC class II分子を、CD4陽性T細胞のT細胞受容体が認識すると、CD4陽性T細胞が活性化される。
CD4陽性T細胞には、抗原による刺激を受けると増殖し、IL-10などの炎症性サイトカインの産生やB細胞の自己抗体産生の補助を通じて免疫を活性化するエフェクターT細胞と、抗原による刺激に対する応答性が低く、他のT細胞の増殖抑制を通じて免疫を抑制する制御性T細胞がある。自己免疫疾患においては、エフェクターT細胞と制御性T細胞のバランスが失われ、自己反応性エフェクターT細胞の活性化が過剰になっていると考えられる。
【０００４】
実際RAにおいても、CD4陽性T細胞は炎症関節に多く浸潤し、病態に深く関与していることが知られている。RAにおいては、HLA-DR4分子に結合・提示されやすい何らかの自己抗原由来のエピトープが存在し、そのエピトープを認識した自己反応性のエフェクターT細胞が活性化されて関節炎が発症するとの仮説が支持されている。
したがって、HLA-DR4分子に提示され、T細胞受容体と結合するエピトープを同定すれば、そのエピトープに対する免疫寛容を生じさせることで、RAの予防や治療に使用できる可能性が示唆された。
【０００５】
RA関連の自己抗原として、Immunoglobulin Binding Protein（BiP；GenBank AF188611）が知られている。本発明者らは、RA患者の血清中において、抗BiP抗体が増加していることを報告した（非特許文献１）。また、これまでに、BiP投与により、実験的関節炎が抑制されるという報告がある（非特許文献２）。
本発明者らは、BiPに注目して研究を重ねた結果、BiP由来ペプチド（BiP336-355）がHLA-DR4のエピトープとなり、BiP336-355を認識するCD4陽性T細胞が、RAの病態に関与していると考えられているIL-17を強く産生することを確認した。さらに、BiP336-355に対する免疫寛容を誘導することで関節炎の予防・治療が可能であることとRA治療への応用可能性について報告している（特許文献１）。
しかしながら、BiP336-355はエフェクターT細胞のエピトープであるため、投与によって免疫寛容が誘導される一方で、エフェクターT細胞を活性化してRAを悪化させる危険性が否定できなかった。そこで、より安全性の高い方法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2011/071039号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Shoda H. et al, Arthritis Res Ther, 13:R191, 2011
【非特許文献２】Brownlie RJ. et al., Arthritis Rheum 54:854, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、制御性T細胞を活性化することによって自己免疫疾患における免疫の異常な活性化を抑制することができるエピトープを同定すること、また、かかるエピトープを利用した医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、HLA-DR4陽性RA患者の末梢血単核細胞に種々のBiP由来ペプチドを投与し、制御性T細胞の活性化の指標となりうるIL-10濃度を測定したところ、IL-10の産生を高く誘導するペプチドBiPregを見出した。
BiPregは、抗HLA-DR抗体の存在下ではIL-10分泌を誘導しないことから、BiPregによるIL-10分泌の誘導は、HLA-DRとT細胞受容体を介した反応で誘導されていると考えられた。また、BiP336-355によるT細胞増殖の誘導が、BiPregの添加によって有意に抑制されることと、BiPregによる増殖誘導の抑制は抗IL-10抗体の存在下では見られないことから、当該抑制作用はIL-10を介していると考えられ、以上のことから、BiPregはIL-10を産生する制御性T細胞を活性化することが強く示唆された。
そして、マウス関節炎モデルにBiPregを経口投与すると、関節炎スコア及び発症頻度が改善されること；コラーゲン誘導性関節炎マウスでは、BiPregの投与により血清抗II型コラーゲン抗体価が有意に低下すること等を確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕以下のいずれかのペプチド：
(i)  配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
(ii)  配列番号：１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチドであって、制御性T細胞を活性化するペプチド；及び
(iii)  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、制御性T細胞を活性化するペプチド；
〔２〕前記(ii)又は(iii)のペプチドであって、以下の配列を含む、上記〔１〕に記載のペプチド：
Val−Xaa1−Xaa2−Lys−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Arg（配列番号：６）
［式中、Xaa1〜Xaa7はそれぞれ独立に任意のアミノ酸を表す。］；
〔３〕以下のいずれかのペプチド：
(iv)  配列番号：２〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
(v)  配列番号：２〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチドであって、制御性T細胞を活性化するペプチド；及び
(vi)  配列番号：２〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、制御性T細胞を活性化するペプチド；
〔４〕上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸；
〔５〕上記〔４〕に記載の核酸を含む発現ベクター；
〔６〕上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載のペプチド、上記〔４〕に記載の核酸、並びに上記〔５〕に記載の発現ベクターからなる群より選択されるいずれか１つを含む医薬組成物；
〔７〕ＨＬＡ−ＤＲ４陽性の自己免疫疾患の治療又は予防に用いられる、上記〔６〕に記載の医薬組成物；及び
〔８〕前記ＨＬＡ−ＤＲ４陽性の自己免疫疾患は、関節リウマチ、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、および多発性硬化症からなる群より選択される、上記〔７〕に記載の医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るペプチドは、BiPタンパク質から、制御性T細胞を活性化する部分のみを選択したものであるため、制御性T細胞を効率よく活性化して、正常な免疫を抑制することなく異常な免疫の活性化を抑制する。
したがって、本発明に係るペプチドは、自己免疫疾患の予防又は治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、各種のBiP由来ペプチド刺激によるRA患者のPBMCからのIL-10産生誘導を調べた結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、BiPregによる健常人（HD）及びRA患者（RA）のPBMCからのIL-10産生誘導を調べた結果を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、抗HLA-DR抗体存在下又は非存在下で、BiPregによるIL-10産生誘導を調べた結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、BiP336-355によるPBMCの増殖誘導能と、BiPregによるこの増殖誘導能に対する抑制効果を調べた結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、様々な濃度の抗IL-10阻害抗体存在下で、BiP336-355によるPBMCの増殖誘導能に対するBiPregの抑制効果を調べた結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、BiPreg、又はBiPregのアミノ酸の1つをAlaに置換したペプチドと、HLA-DRB1*0405分子との結合の50% Inhibitory concentration (IC50)を測定した結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、HPLCによって、BiPregとHLA-DRB1*0405分子との結合を測定した結果を示す。
【図４】Ａは、コラーゲン誘導性関節炎（CIA）マウスにBiPregを経口投与して、関節炎スコアを測定した結果を示す。Ｂは、CIAマウスにBiPregを経口投与して、関節リウマチの発症頻度を測定した結果を示す。
【図５】図５は、CIAマウスにBiPregを経口投与して、血清中の抗II型コラーゲン抗体価を測定した結果を示す。
【図６】Ａは、CIAマウス脾臓CD4陽性T細胞をBiP、II型コラーゲンで再刺激し、増殖反応を測定した結果を示す。Ｂは、CIAマウス脾臓CD4陽性T細胞をBiP、BiPreg、II型コラーゲンで再刺激し、上清IL-10を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（ペプチド）
本発明に係るペプチドは、制御性T細胞を活性化するものであって、以下の(i)から(iii)のいずれかである。
(i)  以下の配列で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
DNQPTVTIKVYEGERPLTKD  （配列番号：１）
EDKKEDVGTVVGIDLGTTYS  （配列番号：２）
KGTGNKNKITITNDQNRLTP  （配列番号：３）
NRLTPEEIERMVNDAEKFAE  （配列番号：４）
GSAGPPPTGEEDTAELHHHH  （配列番号：５）
(ii)  配列番号：１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチド；及び
(iii)  配列番号：１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するペプチド。
【００１３】
制御性T細胞は、免疫活性化を抑制することで特徴付けられるT細胞であり、代表的な制御性T細胞としてはCD4陽性CD25陽性FOXP3陽性制御性T細胞、IL-10を産生するTr1細胞などが報告されている。制御性T細胞を生体から除去すると、各種の自己免疫疾患が発症し、その際、制御性T細胞を投与すると、自己免疫疾患の発病が阻止されることが知られている。全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性肝炎、Autoimmune polyendocrinopathy syndrome（APS） type-II、乾癬、重症筋無力症、川崎病、ANCA関連性血管炎などの自己免疫疾患の患者や、マウスの自己免疫疾患モデルにおいても、制御性T細胞の機能的又は量的異常が認められる。
【００１４】
本明細書において「制御性T細胞を活性化する」とは、制御性T細胞による免疫制御性の作用の少なくとも1つが高くなることをいう。制御性T細胞による免疫制御性の作用とは、例えば、TGF-β、IL-10などの免疫抑制性サイトカインの分泌を含むがこれらに限定されない。
「免疫制御性の作用が高くなる」という場合、正常な状態よりも高くなる場合と、低下している状態を回復させる場合を含む。また、統計的に有意に高くなる場合に加え、当業者が高くなっている傾向があると判断できる場合も含む。
【００１５】
また、本発明に係るペプチドは、配列番号：１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチド、又は、配列番号：１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するペプチドであって、抗原提示細胞においてHLA-DR4に提示されるもの、即ちHLA-DR4に結合するものとしてもよい。HLA-DR4に結合するか否かは、タンパク質間の相互作用を検出する公知の方法で確認することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる方法、プロテインマイクロアレイ、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
また、本発明に係るペプチドは、配列番号：１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチド、又は、配列番号：１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するペプチドであって、制御性T細胞のT細胞受容体に結合するものとしてもよい。制御性T細胞のT細胞受容体に結合するか否かも、タンパク質間の相互作用を検出する公知の方法で確認することができ、かかる方法として、アフィニティークロマトグラフィーによる方法、プロテインマイクロアレイ、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
本明細書において、ペプチドとは、2以上のアミノ酸がペプチド結合によって連なった化合物をいう。
本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、その誘導体や人工のアミノ酸を含む。本明細書においてアミノ酸としては、天然タンパク性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれに限定しない。
【００１８】
本明細書においてアミノ酸は、慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。一文字表記又は三文字表記で表されたアミノ酸は、それぞれの変異体や誘導体を含む場合もある。
【００１９】
本明細書において「1又は数個のアミノ酸が欠失、付加、若しくは置換されているペプチド」という場合、欠失等されるアミノ酸の個数は、そのペプチドが制御性T細胞を活性化する限り特に限定されないが、例えば、1個、2個、3個、4個、又は5個とすることができる。欠失、付加、置換される位置は、ペプチドのいずれかの末端であっても、中間であってもよく、1ヶ所であっても2ヶ所以上であってもよい。また、欠失、付加、及び置換のうち2以上が生じていてもよい。
【００２０】
本明細書において「配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有する」という場合、配列同一性が、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上である場合も含む。配列同一性は、各種の配列アライメントアルゴリズム（例えば、BLAST）を用いて調べることができる。
【００２１】
また、本発明に係るペプチドは、配列番号：１に係る上記(ii)又は(iii)のペプチドであって、以下の配列を含むものとしてもよい。
Val−Xaa1−Xaa2−Lys−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Arg（配列番号：６）
［式中、Xaa1〜Xaa7はそれぞれ独立に任意のアミノ酸を表す。］。
配列番号：６のN末端のValは、配列番号：１の6位のValに相当する。後述する実施例に示されるとおり、配列番号：１の6位のVal、9位のLys、及び15位のArgは、HLA-DR4との結合に重要である。
【００２２】
本発明のペプチドは、そのC末端がカルボキシル基又はカルボキシレート基のみでなく、アミドやエステルになっていてもよい。また、本発明のペプチドには、ペプチドの塩も含まれる。ペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基や酸との塩が用いられ、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（p-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
【００２３】
本発明のペプチドは、他の機能的なペプチドとの融合ペプチドとしてもよい。
例えば、宿主由来のプロテアーゼによる分解の抑制、膜透過性の付与等を目的として、他のペプチドとのキメラペプチドとすることができる。
膜透過性を付与する場合、膜透過性ペプチド（cell-penetrating peptide, CPP）と融合させてもよい。CPPは、細胞膜への親和性、細胞内への移行性を有するペプチドの総称であり、HIV-1ウイルスが発現するTrans-activator of transcription protein（TATタンパク質）の11個のアミノ酸からなるドメインであるprotein-transduction domain（PTD）や、ショウジョウバエのAntennapedia、ヘルペスウイルス由来のVP22、オリゴアルギニンなどが知られている。一般に、CPPはアルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸の含有率が高いものが多い。
【００２４】
また、本発明のペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化、糖鎖付加などの修飾が加えられたものであってもよい。他のペプチドやタンパク質と融合させたものであってもよい。
【００２５】
本発明のペプチドは、天然物から抽出して分解する方法；液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法；遺伝子組み換え法等、公知のポリペプチドの製造方法によって製造することができる。
天然物から抽出する場合、例えば、ヒト又はその他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ブタ等）の組織又は細胞から調製することができる。この場合、組織又は細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出し、抽出液を塩析、透析、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどで精製することによって、精製単離した後、プロテアーゼやペプチダーゼで切断すればよい。
【００２６】
固相法は、例えば、水酸基を有するレジンの水酸基と、α-アミノ基が保護基で保護された第一のアミノ酸（通常、目的とするペプチドのC末端アミノ酸）のカルボキシ基をエステル化反応させる。エステル化触媒としては、1-メシチレンスルホニル-3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール（MSNT）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。
次に、第一アミノ酸のα−アミノ基の保護基を脱離させるとともに、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第二のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第一及び第二のアミノ酸を結合させる。さらに、第二のアミノ酸のα-アミノ基を脱保護し、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第三のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第二及び第三のアミノ酸を結合させる。これを繰り返して、目的とする長さのペプチドが合成されたら、すべての官能基を脱保護する。
【００２７】
固相合成のレジンとしては、Merrifield resin、MBHA resin、Cl-Trt resin、SASRIN resin、Wang resin、Rink amide resin、HMFS resin、Amino-PEGA resin（メルク社）、HMPA-PEGA resin（メルク社）等が挙げられる。これらのレジンは、溶剤（ジメチルホルムアミド（DMF）、2−プロパノール、塩化メチレン等）で洗浄してから用いることができる。
α-アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル（Cbz又はZ）基、tert−ブトキシカルボニル（Boc）基、フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル（Alloc）基等が挙げられる。Cbz基はフッ化水素酸、水素化等によって脱保護でき、Boc基はトリフルオロ酢酸（TFA）により脱保護でき、Fmoc基はピペリジンによる処理で脱保護できる。
α−カルボキシ基の保護は、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、tert−ブチルエステル、シクロヘキシルエステル等を用いることができる。
アミノ酸のその他の官能基として、セリンやトレオニンのヒドロキシ基はベンジル基やtert−ブチル基で保護することができ、チロシンのヒドロキシ基は2−ブロモベンジルオキシカルボニル希やtert−ブチル基で保護する。リジン側鎖のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシ基は、α−アミノ基、α−カルボキシ基と同様に保護することができる。
【００２８】
カルボキシ基の活性化は、縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDCあるいはWSC）、（1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（BOP）、1-［ビス（ジメチルアミノ）メチル］-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシドヘキサフルオロホスファート（HBTU）等が挙げられる。
【００２９】
レジンからのペプチド鎖の切断は、TFA、フッ化水素（HF）等の酸で処理することによって行うことができる。
またペプチド鎖が長い場合、ある程度固相法によって合成した後、ライゲーション法（例えば、ネイティブケミカルライゲーション法）によって合成したペプチドを連結することも可能である。
【００３０】
遺伝子組み換え法によるポリペプチドの製造方法は、後述するように本発明の核酸を用いて行うことができる。
【００３１】
（核酸）
本発明の核酸は、本発明のペプチドをコードする核酸であり、DNAであってもRNAであってもよい。
本発明の核酸は、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。例えば、自動合成装置によって合成することができる。得られたDNAをベクターに挿入するために制限酵素認識部位を加えたり、できたペプチド鎖を酵素などで切り出すためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んでもよい。
本発明のペプチドを他のペプチドと融合させる場合、本発明の核酸は、融合させるペプチドをコードする核酸も含む。
【００３２】
（発現ベクター）
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸を含む。本発明の核酸は、そのままで、又は制限酵素で消化して、又はリンカーを付加して、発現ベクターのプロモータの下流に挿入することができる。ベクターとしては、大腸菌由来プラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、バクテリオファージ（λファージ、M13ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、センダイウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられる。
【００３３】
プロモータは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、SV40（simian virus 40）由来プロモータ、CMV（cytomegalovirus）由来プロモータを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、trpプロモータ、T7プロモータ、lacプロモータ等を用いてもよい。
発現ベクターには、DNA複製開始点（ori）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ（FLAG、HA、GST、GFPなど）をコードする核酸等を組み込んでもよい。
【００３４】
本発明の発現ベクターは、以下に示すとおりin vitroで宿主を形質転換し、本発明のポリペプチドを発現させるために用いてもよく、そのまま対象に投与して、in vivoで本発明のポリペプチドを発現させるために用いることもできる。
【００３５】
（形質転換体）
本発明のペプチドは、本発明の発現ベクターで適当な宿主を形質転換して発現させることができる。宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞を用いることができる。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。
得られた形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするポリペプチドが発現する。このとき使用される培地は、宿主に合わせて適宜選択すればよい。例えば、HEK293T細胞の場合、ウシ胎児血清等の血清を添加したDMEM培地を用いることができる。
【００３６】
形質転換体の培養物からのペプチドの精製は、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから超音波処理、凍結融解などの方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS−PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
得られたペプチドは、公知の方法又はそれに準ずる方法で遊離体から塩に、又は塩から遊離体に変換してもよい。
【００３７】
翻訳合成系は、無細胞翻訳系としてもよい。無細胞翻訳系は、例えば、リボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）、リボソームRNA、アミノ酸、rRNA、GTP、ATP、翻訳開始因子（IF）伸長因子（EF）、終結因子（RF）、およびリボソーム再生因子（RRF）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を含む。発現効率を高くするために大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液を加えてもよい。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を加えてもよい。
これらを含む系に、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、数100μgから数mg/mLのペプチドを生産することができる。DNAからの転写を併せて行うためにRNAポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のRTS-100（登録商標）、PGI社のPURESYSTEM（登録商標）等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。
【００３８】
（医薬組成物）
本発明に係る医薬組成物は、上述した本発明のペプチド、核酸、又は発現ベクターを含む。本発明に係る医薬組成物は、制御性T細胞の活性化を通じて、免疫寛容を誘導し、免疫の異常な活性化を抑制することができる。したがって、本発明に係る医薬組成物は、自己免疫性疾患に有用である。
本明細書において「免疫寛容」は、ある抗原を経口等で予めある個体に投与し、その抗原自体に対する免疫応答を抑制する狭義の免疫寛容と、特定の疾患を有する個体に病原性のない抗原を投与し、他の病原性のある抗原に対する免疫応答を抑制することによってその疾患を抑制する広義の免疫寛容を含む。
本発明の医薬組成物の対象となる疾患は、本発明の医薬組成物が予防又は治療効果を奏するものである限り特に限定されない。ここで、予防又は治療とは、疾患の治癒、寛解に加え、発症の防止又は遅延、疾患の進行の防止又は遅延、疾患に関連する少なくとも1つの症状の緩和などのうち、少なくとも1つが生じることをいう。
【００３９】
本発明に係る医薬組成物は、自己免疫疾患の治療又は予防に有用であり、特に制御性T細胞の量又は機能に以上のある自己免疫疾患の治療又は予防に有用であると考えられ、中でもHLA-DR4に関連する自己免疫疾患の治療又は予防に有用であると考えられる。
自己免疫疾患としては、関節リウマチ（RA）、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、シェーグレン症候群、ANCA関連性血管炎、ベーチェット病、川崎病、混合性クリオグロブリン血症、多発性硬化症、ギランバレー症候群、筋無力症、1型糖尿病、バセドウ病、橋本病、アジソン病、IPEX、APS type-II、自己免疫性心筋炎、間質性肺炎、気管支喘息、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性若年性関節炎の多関節炎型などが挙げられる。
この中で、制御性T細胞の異常が関連していることが知られている自己免疫疾患としては、RA、全身性エリテマトーデス、川崎病、自己免疫性肝炎、APS type-II、乾癬、重症筋無力症、川崎病、ANCA関連性血管炎、混合性クリオグロブリン血症、多発性硬化症、IPEXなどが挙げられる。
HLA-DR4に関連する自己免疫疾患としては、RA、特発性若年性関節炎の多関節炎型、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、1型糖尿病、多発性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は、特に、RAにおける関節炎の炎症抑制や骨破壊の抑制にも有用である。また、本発明の医薬組成物は、抗BiP抗体が出現しているRA患者に投与することも好適である。
本発明の医薬組成物は、上記疾患に有用な他の医薬や治療法と併用してもよい。
【００４０】
本発明に係る医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射等の注射投与、経皮投与、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、経直腸）投与等が上げられる。
特に、本発明に係る医薬組成物を経口投与すると、腸管免疫寛容の機構を利用して、自己抗原BiP特異的制御性T細胞の作用を強化し、制御性サイトカインであるIL-10産生増強を通じて、自己免疫異常を改善することが可能である。
【００４１】
本発明に係る医薬組成物がペプチドを含む場合、代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて、各種の修飾を行うことができる。例えば、ペプチドにポリエチレングリコール（PEG）や糖鎖を付加して血中滞留時間を長くし、抗原性を低下させることができる。また、ポリ乳酸・グリコール（PLGA）などの生体内分解性の高分子化合、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これにポリペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
また、本発明に係る医薬組成物がペプチドを含む場合、抑制性の機能を有する樹状細胞に提示された状態で投与（例えば、経静脈投与）してもよい。
【００４２】
本発明に係る医薬組成物が核酸又は発現ベクターを含む場合、各種のDNA導入法を用いることができる。例えば、発現ベクターとして、レトロウイルス（レンチウイルスなど）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターを用い、これを注射、吸入、塗布などの方法で患部組織に注入したり、患者自身の血球などを一旦体外に取り出し、体外でベクターを導入してから患者に戻す方法などをとることができる。
【００４３】
上記医薬組成物は、有効成分をそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。
製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。
製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、等が挙げられるがこれらに限定されない。
上記医薬組成物が、ペプチドを含む場合、ペプチド等の経粘膜吸収されにくい難吸収性薬物の吸収を改善する吸収促進剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、サポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸等の胆汁酸塩；EDTA、サリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、N-アシルコラーゲンペプチド、N-アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、一酸化窒素供与体等を用いることができる。
【００４４】
丸剤又は錠剤は、糖衣、胃溶性、腸溶性物質で被覆することもできる。
注射剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等を含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、防腐剤等を加えることができる。
【００４５】
本発明の医薬組成物を、哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、30μg〜1000mg、100μg〜500mg、100μg〜100mgを1回又は数回に分けて投与することができる。注射投与の場合、患者の体重により、1μg/kg〜3000μg/kg、3μg/kg〜1000μg/kgを1回又は数回に分けて投与してもよい。
【００４６】
（治療方法）
本発明は、対象に本発明に係るペプチド、核酸、又は発現ベクターを投与する工程を含む自己免疫疾患の治療又は予防方法も包含する。
【００４７】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
１．IL-10産生を誘導するBiP由来エピトープのスクリーニング
HLA-DR4陽性RA患者の末梢血を静脈採血により採取し、Ficoll-Paqueにより密度遠心することで末梢血単核細胞(PBMC)を分離したうえで、PBMCを10%FCSを添加したRPMI1640培地(Gibco)にて1 x 106/mLに調整し、BiP由来ペプチド 10mg/mLを添加したうえで、Corning社製96 well plate上で37℃、5%CO2インキュベーター内で72時間培養を行った。培養上清中のIL-10濃度をELISA法(eBioscience)にてキットのプロトコールに準じて測定した。結果を図１Ａに示す。図１Ａに示されるとおり、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが、RA患者のPBMC（T細胞を含む）において、IL-10の産生を最も強く誘導した。このペプチドをBiPregとして、以降の実験に用いた。図１Ｂに示されるとおり、BiPregペプチドはRAおよび健常人(Healthy donor (HD))においてPBMCからのIL-10産生を誘導した。
BiPreg：DNQPTVTIKVYEGERPLTKD  （配列番号：１）
また以下の配列もPBMCからのIL-10産生を誘導した。
BiP A: EDKKEDVGTVVGIDLGTTYS  （配列番号：２）
BiP F: KGTGNKNKITITNDQNRLTP  （配列番号：３）
BiP G: NRLTPEEIERMVNDAEKFAE  （配列番号：４）
BiP I: GSAGPPPTGEEDTAELHHHH  （配列番号：５）
また、図１Ｃに示されるとおり、抗HLA-DR阻害抗体(clone L243, 10mg/mL)を加えて培養すると、BiPregによるIL-10産生誘導は有意に抑制された。このことから、IL-10分泌は、HLA-DRとT細胞受容体を介した反応で誘導されていることが強く示唆された。
【００５０】
２．BiP336-355ペプチドによるPBMC増殖誘導と、BiPregによる増殖誘導の抑制
HLA-DR4陽性RA患者の末梢血単核細胞(PBMC)  1 x 106/mLにBiP336-355ペプチド、およびBiPregペプチド 10μg/mLを添加し、72時間培養を行い、3H-Thymidineを添加後18時間で取り込み法により増殖反応を測定した。
結果を図２Ａ及びＢに示す。図２Ａに示されるとおり、BiP336-355（RSTMKPVQKVLEDSDLKKSD；配列番号：７）は、PBMC増殖を誘導した。一方、BiP336-355に加えて等量のBiPregを添加すると、BiP336-355によるPBMCの増殖は有意に抑制された。
また、図２Ｂに示されるとおり、BiPregによるこの抑制効果は、抗IL-10阻害抗体(clone 25209)の添加により、阻害抗体の用量依存的に中和されたことから、当該抑制作用はIL-10を介しているものと考えられ、BiPregがIL-10産生制御性T細胞を活性化していることが強く示唆された。
【００５１】
３．BiPregとHLA-DRB1*0405分子との結合
HLA-DRA*0101, HLA-DRB1*0405遺伝子のpMTベクターを作成し、S2細胞にcellfectin(invitrogen) を用いて遺伝子導入することでHLA-DRB1*0405蛋白を作成した。HLA-DRB1*0405分子と、予め結合することが判明しているHA307-319 (PKYVKQNTLKLAT（配列番号：８）)をビオチン化したペプチドおよび配列の一部をアラニン残基に変更したBiPregペプチドを37度16時間反応させたのちに、ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼを反応させ、酵素活性を測定した。すなわち、BiPregペプチドのHLA-DR分子への結合により、濃度依存的に酵素活性が低下することが考えられ、IC50測定により結合の強さを推定できる。
結果を図３Ａに示す。図３Ａに示されるとおり、BiPregのIC50は336 nMであり、HLA-DRB1*0405分子と中等度の結合能を示した。また、各アミノ酸をAlaに置換して結合能を測定した結果、配列番号：１の6位のVal、9位のLys、及び15位のArgが、HLA-DRB1*0405分子との結合に重要であることが示唆された。
また、HLA-DRB1*0405分子にペプチドが結合する場合に、分子量が変化することでHPLCの移動時間のシフトが生じることにより結合の有無を確認した。
結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示されるとおり、HPLCによる測定の結果、HLA-DRB1*0405分子とBiPregとが実際に結合していることが確認された。
【００５２】
４．BiPreg投与によるマウス関節炎抑制実験
DBA/1Jマウス(メス、6週齢)にウシII型コラーゲン100mg(Chondrex)とComplete Freund's adjuvant(Chondrex) 50mlを皮下免疫し、21日目にウシII型コラーゲン100mgとincomplete Freund's adjuvant(Chondrex) 50mlを追加免疫するコラーゲン誘導性関節炎(CIA)において、発症直前の28日目から5日間連続でBiPregペプチド200mgを経口投与する群と、PBSを等量経口投与する群(コントロール)を置き、関節炎スコア、発症率を観察した。
結果を図４に示す。コントロールと比較して、BiPreg投与群では関節炎スコア（図４Ａ）、発症頻度（図４Ｂ）ともに改善された。
【００５３】
５．BiPreg投与による抗II型コラーゲン抗体の低下
CIAマウスでは、II型コラーゲンに対する抗体が関節炎を引き起こすと考えられていることから、BiPreg投与したマウス血清における抗II型コラーゲン抗体価を測定した。
CIAマウス初回免疫後42日目で血清を採取し、II型コラーゲン 10mg/mL、16時間でコートし、3% skim milkでブロックしたプレートに、100倍希釈血清を室温1時間反応させたうえで、3000倍希釈したanti-mouse IgG-HRP抗体を室温1時間反応させ、TMB solutionにより基質を発色させることで、血清中抗II型コラーゲンIgG抗体価を測定した(ELISA法)。
結果を図５に示す。BiPreg経口投与群（CIA BiPreg OT+）では、抗II型コラーゲン抗体価の有意な低下が認められた。このことは、BiPregが、制御性T細胞への作用を介して免疫の異常な活性化を抑制していることを示唆する。
【００５４】
５．BiPregの経口投与によるT細胞への影響
CIAマウス初回免疫後42日目の脾臓CD4陽性T細胞をMACS法によりnegative selectionにより分離し、1 x105/mLの濃度で72時間培養した。同時に抗原提示細胞として放射線照射後の脾臓細胞(1 x 106/mL)および抗原としてBiP、BiPregペプチド、II型コラーゲン 10mg/mLを添加した。72時間後に3H-thymidine法により細胞増殖を測定した。また培養上清を回収し、IL-10濃度をELISA法により測定した。また対象として免疫をしていないマウス群(no immunized)を置いた。
結果を図６に示す。BiPreg経口投与群(CIA BiPregOT+)では、コントロール群(CIA)に比較して、II型コラーゲン（BC2）とBiPタンパク質に対するCD4陽性T細胞増殖は抑制され（図６Ａ）BiPおよびBiPregに反応したIL-10産生は増加していた（図６Ｂ）。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号：１は、BiPregのアミノ酸配列を表す。
配列番号：２は、BiP Aのアミノ酸配列を表す。
配列番号：３は、BiP Fのアミノ酸配列を表す。
配列番号：４は、BiP Gのアミノ酸配列を表す。
配列番号：５は、BiP Iのアミノ酸配列を表す。
配列番号：６は、本発明に係るペプチドの一態様のアミノ酸配列の一般式である。
配列番号：７は、BiP336-355のアミノ酸配列を表す。
配列番号：８は、HA307-319のアミノ酸配列を表す。
【図１Ａ】
2014204675.tif 000003
【図１Ｂ】
2014204675.tif 000004
【図１Ｃ】
2014204675.tif 000005
【図２Ａ】
2014204675.tif 000006
【図２Ｂ】
2014204675.tif 000007
【図３Ａ】
2014204675.tif 000008
【図３Ｂ】
2014204675.tif 000009
【図４】
2014204675.tif 000010
【図５】
2014204675.tif 000011
【図６】
2014204675.tif 000012
【配列表】
2014204675000001.app