(57)【要約】      （修正有）【課題】対象に投与されたときにより遅いクリアランス速度を示し、種々様々な疾患の治療及び診断に使用できる組成物の提供。【解決手段】ＤＤＤ（二量体化／ドッキングドメイン）配列に付着したエフェクター部分（Ａ）；およびＡＤ（アンカードメイン）配列に付着したＰＥＧ部分（Ｂ）を含み、２つのＤＤＤ配列が１つのＡＤ配列に結合してＰＥＧ化複合体を形成し、前記ＤＤＤ配列とＡＤ配列の間のジスルフィド結合をさらに含むＰＥＧ化複合体であって、ＤＤＤ配列が配列番号２を含み、エフェクター部分が酵素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体及び抗体断片からなる群より選択される。【選択図】図１
2014129395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＤＤＤ（二量体化／ドッキングドメイン）配列に付着したエフェクター部分；および
ｂ）ＡＤ（アンカードメイン）配列に付着したＰＥＧ部分を含み
２つのＤＤＤ配列が１つのＡＤ配列に結合してＰＥＧ化複合体を形成する、ＰＥＧ化複合体。
【請求項２】
前記ＤＤＤ配列とＡＤ配列間のジスルフィド結合をさらに含む、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
前記ＤＤＤ配列がＰＫＡ  ＲＩＩαの４４個のＮ末端アミノ酸を含む、請求項１記載の複合体。
【請求項４】
前記ＤＤＤ配列が配列番号：２を含む、請求項１記載の複合体。
【請求項５】
前記ＰＥＧ部分が、一方の端でメトキシ基によりキャッピングされている、請求項１記載の複合体。
【請求項６】
前記エフェクター部分が、酵素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項１記載の複合体。
【請求項７】
前記エフェクター部分が、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ−Ｉ（高移動度グループボックスタンパク質１）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＭＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ｈＧＨ、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、第ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびＬＩＦからなる群より選択される、請求項６記載の複合体。
【請求項８】
ＡＤ配列に付着した前記ＰＥＧ部分が、ＩＭＰ３５０、ＩＭＰ３６０、ＩＭＰ３６２、ＩＭＰ４１３、またはＩＭＰ４５７を含む、請求項１記載の複合体。
【請求項９】
前記エフェクター部分が、インターフェロン（ＩＦＮ）−α２ｂ、Ｇ−ＣＳＦ、またはエリスロポエチンである、請求項１記載の複合体。
【請求項１０】
ＤＤＤ配列に付着した前記エフェクター部分が、融合タンパク質である、請求項１記載の複合体。
【請求項１１】
各々の複合体が１つのＰＥＧ部分および２つのエフェクター部分を含む、請求項１記載の複合体。
【請求項１２】
前記ＰＥＧ化複合体の血清からのクリアランス速度が、ＰＥＧ化されていないエフェクター部分のクリアランス速度よりも少なくとも１桁遅い、請求項１記載の複合体。
【請求項１３】
ａ）ＡＤ配列に付着したエフェクター部分；および
ｂ）ＤＤＤ配列に付着したＰＥＧ部分を含み
２つのＤＤＤ配列が１つのＡＤ配列に結合してＰＥＧ化複合体を形成する、ＰＥＧ化複合体。
【請求項１４】
各々の複合体が２つのＰＥＧ部分および１つのエフェクター部分を含む、請求項１３記載の複合体。
【請求項１５】
前記ＰＥＧ化複合体の血清からのクリアランス速度が、ＰＥＧ化されていないエフェクター部分のクリアランス速度よりも少なくとも１桁遅い、請求項１３記載の複合体。
【請求項１６】
エフェクター部分をＰＥＧ化する方法であって、
ａ）エフェクター部分をＤＤＤ配列に付着させる工程；
ｂ）ＰＥＧ部分をＡＤ配列に付着させる工程；ならびに
ｃ）前記ＤＤＤ配列を前記ＡＤ配列に結合させて、２つのエフェクター部分−ＤＤＤ配列および１つのＰＥＧ−ＡＤ配列を含むＰＥＧ化複合体を形成させる工程
を含む方法。
【請求項１７】
前記エフェクター部分が、酵素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＥＧ化複合体の血清からのクリアランス速度が、ＰＥＧ化されていないエフェクター部分のクリアランス速度よりも少なくとも１桁遅い、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
エフェクター部分をＰＥＧ化する方法であって、
ａ）エフェクター部分をＡＤ配列に付着させる工程；
ｂ）ＰＥＧ部分をＤＤＤ配列に付着させる工程；ならびに
ｃ）前記ＤＤＤ配列を前記ＡＤ配列に結合させて、２つのエフェクター部分−ＤＤＤ配列および１つのＰＥＧ−ＡＤ配列を含むＰＥＧ化複合体を形成させる工程
を含む方法。
【請求項２０】
疾患を治療する方法であって、
ａ）前記エフェクター部分が前記疾患の治療剤である、請求項１記載のＰＥＧ化複合体を得る工程；および
ｂ）前記ＰＥＧ化複合体を、前記疾患を有する対象に投与する工程
を含む方法。
【請求項２１】
前記エフェクター部分が、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ−１（高移動度グループボックスタンパク質１）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、エオタキシン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＭＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ｈＧＨ、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、第ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびＬＩＦからなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が、癌、過形成、糖尿病、自己免疫疾患、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺高血圧、乾癬、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、オスラー・ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク血管新生、再狭窄症、血管外傷後の新生内膜形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、慢性炎症と関連する線維症、肺線維症、深部静脈血栓症、または創傷肉芽形成である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺症候群、水疱性類天疱瘡、若年型糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維化性肺胞炎である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、骨癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎癌、卵巣癌、膵癌、神経膠腫、黒色腫、肝癌、前立腺癌、および膀胱癌からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＥＧ化複合体が、各々のＰＥＧ化複合体に付着したＰＥＧ部分を１つだけ有する、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる、２００７年１０月２６日に出願された米国特許出願第１１／９２５，４０８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
［背景技術］
治療剤の効力は、いくつかの手段よってそのバイオアベイラビリティを向上させることにより増強し得る。これらの手段のうちの１つが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を関心となる治療剤に化学的に連結する方法であるＰＥＧ化であり、得られるコンジュゲートは増大した血清半減期を示す。また、ＰＥＧ化産物のさらなる利点として、より低い免疫原性、減少した投薬頻度、増大した溶解度、増強された安定性、および低下した腎クリアランスが挙げられ得る。ＰＥＧを付着させるための最も一般的なタンパク質（ペプチドを含む）上の反応部位がリジンのεアミノ基およびＮ末端残基のαアミノ基であるために、初期のＰＥＧ化法によって、複数部位が修飾される結果になり、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）（Ｇｒａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５；２８０：６３２７）およびＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｄｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５；１６：５０４）などの位置異性体の混合物からなるモノＰＥＧ化コンジュゲートだけでなく、２個以上のＰＥＧ鎖を含むアダクトも生じた。Ｎ末端残基のαアミノ基に単一ＰＥＧが部位特異的に付着したものが、ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ−ＡＬＤ）をＩＦＮ−β１ｂ（Ｂａｓｕｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００６；１７：６１８）またはＩＦＮ−β１ａ（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００１；２９７：１０５９）と低いｐＨで反応させたときの主産物であることが報告された。同様の戦略は、Ｇ−ＣＳＦ（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９６；１３：９９６）またはＩ型可溶性腫瘍壊死因子受容体（Ｋｅｒｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００２；１１：１８２５）のＮ末端に連結したＰＥＧを調製するために適用された。つい最近、組換えインターフェロンα２ａのＮ末端のＰＥＧ化のための固相法が報告された（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｃｔ．１８，２００７，ｅｐｕｂ）。
【０００３】
標的タンパク質に導入された遊離システイン残基の部位特異的ＰＥＧ化も、ＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧ−ＭＡＬ）を用いて、ＩＬ−２（Ｇｏｏｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｔｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９０：８：３４３）、ＩＦＮ−α２（Ｒｏｓｅｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５；１６：２００）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｄｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５；１６：１２９１）、ｓｃＦｖ（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２００３；１６：７６１）、およびミニ抗体（Ｋｕｂｅｔｚｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ；２００６；２０１：３５１８６）を含むいくつかの組換えコンストラクトについて達成されている。酵素の治療効力を向上させるための一般的なアプローチは、メチオニナーゼ（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：６６７３）、Ｌ−メチオニンγ−リアーゼ（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６：６６：２８０７）、アルギニンデアミナーゼ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００６；１７：１４４７）、アデノシンデアミナーゼ（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１；４６：６４９）、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｂｅｎｄｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８２；４８：２７３）、および肝カタラーゼ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７；２５２：３５８２）について知られているように、複数の小さいサイズのＰＥＧを含むコンジュゲートを調製することである。
【０００４】
ウシ血清アルブミン（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７；２５２：３５７８）、ヘモグロビン（Ｍａｎｊｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００３；１４：４６４）、ビソマント（Ｍｏｓｈａｒｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００７；３３６：２１５）、インテグリンα４βｌの阻害剤などの小分子（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００５；３１２：７４２）、リンパ腫標的化ペプチド（ＤｅＮａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２００３；９（Ｓｕｐｐｌ．）：３８５４ｓ）、抗ＶＥＧＦアプタマー（Ｂｕｎｋａ  ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋｌｅｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６；４：５８８）、およびオリゴデオキシヌクレオチド（Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｒｕｇＭｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２００４；３２：９８３）のＰＥＧ化も記載されている。しかしながら、候補薬剤の所定の位置に部位特異的に連結した単一ＰＥＧから構成されかつ未修飾対応物の生物活性を保持するモノＰＥＧ化コンジュゲートだけを産生する一般的なＰＥＧ化法に対する必要性が存在する。
【０００５】
［発明の概要］
本発明は、候補薬剤の選択された位置に付着する選択された数の付着ＰＥＧ残基を有するＰＥＧ化化合物を産生するための方法および組成物を開示する。好ましい実施形態において、薬剤をモノＰＥＧ化する。より好ましい実施形態において、以下により詳細に記載されるように、ＰＥＧ化される標的をＤＤＤ（二量体化／ドッキングドメイン）配列に付着させてもよく、ＰＥＧ部分をＡＤ（アンカードメイン）配列に付着させてもよい。ＤＤＤ配列の二量体は、ＡＤ配列の単量体に高い親和性で結合し、モノＰＥＧ化されたエフェクター部分の二量体を形成する。ＰＥＧ残基の結合の化学量比と位置は、ＤＤＤ／ＡＤ相互作用の特異性によって決定される。
【０００６】
より好ましい実施形態において、モノＰＥＧ化複合体は、ＤＤＤ配列およびＡＤ配列の適当な位置にシステイン残基を導入することにより共有結合的に安定化されて、この複合体を安定化するジスルフィド結合を形成してもよい。その他の実施形態において、ＰＥＧ試薬は、一方の端で線状または分岐状のメトキシ基によりキャッピングされてもよい（ｍ−ＰＥＧ）。
【０００７】
その他の好ましい実施形態において、ＤＮＬ法で作製されたＰＥＧ化複合体は、ＰＥＧ化されていないエフェクター部分よりも少なくとも１桁遅い血清からのクリアランス速度を示す。ある代わりの実施形態において、ＰＥＧ化複合体を代わりに、ＤＤＤ配列に付着したＰＥＧ部分およびＡＤ配列に付着したエフェクター部分を用いて構築し、複合体当たりのＰＥＧ部分とエフェクター部分の化学量比が２：１になるようにしてもよい。
【０００８】
当業者は、酵素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体およびその断片を含むが、これらに限定されない、インビボで投与されるほとんど全ての生理活性剤または治療活性剤が、ＰＥＧ化によって安定化され得るということを理解するであろう。例示的な薬剤としては、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ−１（高移動度グループボックスタンパク質１）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、エオタキシン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＭＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ｈＧＨ、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、第ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびＬＩＦが挙げられる。
【０００９】
モノＰＥＧ化複合体は、種々様々な治療用途および診断用途で使用するのに好適である。モノＰＥＧ化複合体の使用法は、疾患もしくはその他の医学的状態の検出、診断、および／または治療を含んでもよい。そのような状態としては、癌、過形成、糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺高血圧、乾癬、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、オスラー・ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク血管新生、再狭窄症、血管外傷後の新生内膜形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、慢性炎症と関連する線維症、肺線維症、深部静脈血栓症、または創傷肉芽形成が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００１０】
特定の実施形態において、開示された方法および組成物は、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺症候群、水疱性類天疱瘡、若年型糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維化性肺胞炎などの自己免疫疾患を治療するのに有用であり得る。
【００１１】
任意の種類の腫瘍および任意の種類の腫瘍抗原を標的にし得ることが予想されている。標的にし得る例示的な種類の腫瘍としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎癌、卵巣癌、膵癌、神経膠腫、黒色腫、肝癌、前立腺癌、および膀胱癌が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＤＮＬ法の模式的説明図。三角形は構成要素Ａを表しており、これは、二量体化／ドッキングドメイン（ＤＤＤ）によって仲介されるホモ二量体（ａ２）を形成する。人工的に作り出されたシステイン残基の遊離チオール基（ＳＨ）の位置が示されている。八角形は、アンカードメイン（ＡＤ）ペプチドを含む構成要素Ｂを表している。ＤＮＬ反応は、ＤＤＤペプチドとＡＤペプチドの結合を介する共有結合三量体構造の生成、およびその後のジスルフィド架橋の形成をもたらす。
【図２】ＩＭＰ３６２の模式図。２０ｋＤａ  ＰＥＧ（星形）、ＡＤ２ペプチド（らせん）、ＥＤＡＮＳ蛍光タグ（楕円形）、および遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）の位置が示されている。
【図３】ＩＭＰ４１３の模式図。３０ｋＤａ  ＰＥＧ（星形）、ＡＤ２ペプチド（らせん）、ＥＤＡＮＳ蛍光タグ（楕円形）、および遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）の位置が示されている。
【図４】抗ＩＦＮａイムノブロットおよびＥＬＩＳＡによるローラーボトル産生および精製の解析。試料を示したように希釈し、５μｌを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびポリクローナル抗ＩＦＮαを用いたイムノブロット解析に供した。各試料についての希釈、総容量、および総容量のうちの解析された分率（ｆ）が示されている。各バンド中のタンパク質の量を標準品から推定し、総容量で割って、総タンパク質の推定量を出した。ＥＬＩＳＡで決定した総タンパク質の測定値も示されている。
【図５】α２ｂ−３６２の模式図。ＩＦＮα２ｂ基（五角形）２０ｋＤａ  ＰＥＧ（星形）、ＡＤ２ペプチドおよびＤＤＤ２ペプチド（らせん）、ならびにＥＤＡＮＳ蛍光タグ（楕円形）が示されている。
【図６】α２ｂ−４１３の模式図。ＩＦＮα２ｂ基（五角形）３０ｋＤａ  ＰＥＧ（星形）、ＡＤ２ペプチドおよびＤＤＤ２ペプチド（らせん）、ならびにＥＤＡＮＳ蛍光タグ（楕円形）が示されている。
【図７】ｒｈＩＦＮ−α２ｂ標準品、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２、またはα２ｂ−３６２のいずれかの存在下で４日間培養した後のバーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）細胞のインビトロ増殖阻害を示す用量応答曲線。ＭＴＳ色素をプレートに添加し、このプレートを３時間インキュベートした後、ＯＤ４９０を測定した。未処置細胞から得られたシグナルの％をモル濃度の対数に対してプロットした。５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてシグモイドフィットの非線形回帰によって得た。
【図８】ＩＦＮαコンストラクトの薬物動態特性の評価。各試薬（試験および対照）を、等モルタンパク質用量で、ｒｈｕＩＦＮ−α２ａについては３μｇ、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）については５μｇ、α２ｂ−３６２については１１μｇ、およびα２ｂ−４１３については１３μｇの単回ボーラス静注としてＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに投与した。示した時点で血清試料を単離し、ＩＦＮ−αの血清濃度をＥＬＩＳＡで決定した。ｐＭ濃度を注射後の時間に対してプロットした。データは、２匹のマウスからの平均値を表す。
【図９】バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）を持つマウスにおけるＩＦＮαコンストラクトの治療効力の評価。８週齢メスのＳＣＩＤマウスに１．５×１０７個のＤａｕｄｉ細胞を静注した。５匹のマウスの群に、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）、α２ｂ−３６２、およびα２ｂ−４１３を、３，５００ユニット、７，０００ユニット、または１４，０００ユニットの用量で、週に１回、４週間投与した。Ｄａｕｄｉ細胞を移植した１日後に治療を開始した。注射時間は矢印で示されている。各グループについて生存曲線および生存中央値が示されている。
【図１０】胆腫瘍マウスの治療用の投薬スケジュールの評価。８週齢メスのＳＣＩＤマウスに１．５×１０７個のＤａｕｄｉ細胞を静注した。６〜７匹のマウスの群に、１４，０００ＩＵのＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）またはα２ｂ−４１３のいずれかを皮下注射で投与した。Ｄａｕｄｉ細胞をマウスに投与した１日後に治療を開始した。群に、１週間に１回（ｑ７ｄ×４）、２週間に１回（ｑ２ｗｋ×４）、または３週間に１回（ｑ３ｗｋ×４）投薬した。注射時間は矢印で示されている。全てのマウスが合計４回の注射を受けた。各群について生存曲線および生存中央値が示されている。
【図１１】Ｇ−ＣＳＦ−４１３の模式図。Ｇ−ＣＳＦ基（五角形）、３０ｋＤａ  ＰＥＧ（星形）、ＡＤ２ペプチドおよびＤＤＤ２ペプチド（らせん）、ならびにＥＤＡＮＳ蛍光タグ（楕円形）が示されている。
【図１２】ｈ６７９−Ｆａｂ−ＤＤＤ２（Ａ）、二量体ＥＰＯ−ＤＤＤ２（Ｂ）（これらがＤＮＬ法で結合してＥＰＯ−６７９（Ｃ）を生成する）の模式図。ｈ６７９  Ｆａｂの可変ドメインおよび定常ドメイン（楕円形）、ＡＤ２らせんおよびＤＤＤ２らせん、ＥＰＯ基（五角形）、ならびに遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）が示されている。
【図１３】ＥＰＯコンストラクトによる細胞増殖の刺激。ＥＰＯ応答性ＴＦ１細胞（１×１０４）を、ｒｈＥＰＯ、ＥＰＯ−ＤＤＤ２、またはＥＰＯ−６７９の存在下で７２時間培養した。相対的な生存細胞密度をＭＴＳアッセイで決定した。濃度（Ｕ／ｍＬ）の対数をＯＤ４９０に対してプロットした。
【図１４】ＥＰＯ−４１３の模式図。ＥＰＯ基（五角形）、３０ｋＤａ  ＰＥＧ（星形）、ＡＤ２ペプチドおよびＤＤＤ２ペプチド（らせん）、ならびにＥＤＡＮＳ蛍光タグ（楕円形）が示されている。
【図１５】ＩＭＰ−４２１の構造。
【図１６】ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋの構造。
【００１３】
ドック・ロック（ＤＮＬ）法
ＤＮＬ法は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットとＡキナーゼアンカリングタンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカリングドメイン（ＡＤ）との間で生じる特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を利用している（Ｂａｉｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４．Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡは、セカンドメッセンジャーｃＡＭＰのＲサブユニットへの結合によって引き起こされる最もよく研究されたシグナル伝達経路の１つで中心的な役割を果たしているが、これは１９６８年にウサギの骨格筋から最初に単離された（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットによって不活性形に保たれた２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは２種類のＲサブユニット（ＲＩおよびＲＩＩ）を有することが分かっており、各々の種類はαアイソフォームおよびβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。Ｒサブユニットは、安定な二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、最初の４４個のアミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。ｃＡＭＰのＲサブユニットへの結合は、広範囲のセリン／トレオニンキナーゼ活性のために活性触媒サブユニットの放出を引き起こし、この活性は、ＡＫＡＰとのドッキングを介したＰＫＡのコンパートメント化を通じて選択された基質へと向かう（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。
【００１４】
最初のＡＫＡＰである微小管関連タンパク質−２が１９８４年に特性解析されて以来（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、および小胞体を含む、様々な細胞内部位に局在する５０個を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトに及ぶ種で多様な構造を有することが同定されている（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰ間で全く異なっており、ＲＩＩ二量体について報告された結合親和性の範囲は２〜９０ｎＭである（Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。興味深いことに、ＡＫＡＰは、二量体のＲサブユニットにしか結合しない。ヒトＲＩＩαの場合、ＡＤは、２３個のアミノ末端残基により形成される疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメインとＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、同じＮ末端の４４個のアミノ酸配列中にあり（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：１６５１）、この配列を本明細書ではＤＤＤと呼ぶ。
【００１５】
リンカーモジュールとしてのヒトＲＩＩαのＤＤＤおよびＡＫＡＰのＡＤ
本発明者らは、ヒトＲＩＩαのＤＤＤおよびある種のアミノ酸配列のＡＤを、任意の２つの実体（以後、ＡおよびＢと表す）をドッキングさせて非共有結合複合体にするためのリンカーモジュールの優れたペアとして利用するためのプラットフォーム技術を開発した。この複合体は、図１に示すように、ＤＤＤとＡＤの両方の戦略的位置にシステイン残基を導入することによって、安定に連結された構造へとさらにロックして、ジスルフィド結合を形成しやすくすることができる。「ドック・ロック」アプローチの一般的方法論は以下の通りである。ＤＤＤ配列をＡの前駆体に連結することによって実体Ａを構築し、第一構成要素（以後、ａと表す）を生じさせる。ＤＤＤ配列は二量体を自発的に形成するので、Ａはａ２から構成される。ＡＤ配列をＢの前駆体に連結することによって実体Ｂを構築し、第二構成要素（以後、ｂと表す）を生じさせる。ａ２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列に結合するためのドッキング部位を作り出し、それによってａ２とｂの素早い会合を促進して、ａ２ｂから構成される２成分の三量体複合体を形成させる。この結合事象は、ジスルフィド架橋を介して２つの実体を共有結合的に固定するための次の反応で不可逆的になる。この反応は、有効局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に生じる。なぜなら、最初の結合相互作用がＤＤＤとＡＤの両方の上に配置された反応性チオール基を近接させて（Ｃｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）、部位特異的にライゲートするはずであるからである。
【００１６】
２つの前駆体の官能基から離れた所でＤＤＤおよびＡＤを付着させることにり、そのような部位特異的ライゲーションが２つの前駆体のもとの活性を保持することも期待される。このアプローチは、本質的にモジュール方式であり、ペプチド、タンパク質、核酸、およびＰＥＧを含む、広範囲の基質を、部位特異的かつ共有結合的に、連結するために潜在的に適用することができる。ＤＮＬ法は、２００５年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／７２８，２９２号；２００５年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／７５１，１９６号；および２００６年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／７８２，３３２号；ならびに２００６年３月２４日に出願された米国特許出願第１１／３８９，３５８号；２００６年３月２８日に出願された米国特許出願第１１／３９１，５８４号；２００６年６月２９日に出願された米国特許出願第１１／４７８，０２１号；２００６年１２月５日に出願された米国特許出願第１１／６３３，７２９号および２００７年１０月２６日に出願された米国特許出願第１１／９２５，４０８に開示された。
【００１７】
好ましい実施形態において、下記の実施例に示すように、ＰＥＧ化されるエフェクター部分は、タンパク質またはペプチドであり、これをＤＤＤユニットまたはＡＤユニットに連結して、融合タンパク質または融合ペプチドを形成させることができる。融合タンパク質を作製するための様々な方法が公知であり、関心となる融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生するための核酸の合成、ハイブリダイゼーション、および／または増幅が含まれる。そのような二本鎖核酸を、標準的な分子生物学の技術によって融合タンパク質産生用の発現ベクターに挿入してもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９参照）。そのような好適な実施形態において、ＡＤ部分および／またはＤＤＤ部分を、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付着させてもよい。しかしながら、当業者は、ＡＤ部分またはＤＤＤ部分のエフェクター部分への付着部位が、エフェクター部分およびその生理活性に関与するエフェクター部分の部分の化学的性質によって異なり得るということを理解するであろう。様々なエフェクター部分の部位特異的付着を、二価のクロスリンキング試薬の使用および／またはその他の化学的コンジュゲーション技術などの、当技術分野において公知の技術を用いて行なってもよい。
【００１８】
ＤＮＬによるＰＥＧ化
好ましい方法において、ＰＥＧ化される標的をＤＤＤ配列に連結し、ＤＤＤモジュールを作製する。望ましい分子サイズのＰＥＧ試薬を、関連するＡＤ配列で誘導体化し、得られたＰＥＧ−ＡＤモジュールをＤＤＤモジュールと組み合わせて、ＰＥＧ化コンジュゲートを産生する。このＰＥＧ化コンジュゲートは、ＤＤＤとＡＤの間に形成されたジスルフィド結合を介して２コピーのエフェクター部分と部位特異的につながれた単一ＰＥＧからなる。ＰＥＧ試薬は、一方の端でメトキシ基によりキャッピングされてもよく（ｍ−ＰＥＧ）、線状または分岐状であることができ、以下の官能基、すなわち、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、オルト−ピリジルチオエステル（ＯＰＴＥ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、チアゾリジン−２−チオン、炭酸スクシンイミジル（ＳＣ）、マレイミド、またはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＰＳ）のうちの１つを含んでもよい。ＰＥＧ化用の関心となり得るエフェクター部分の中には、酵素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体、および抗体断片が含まれる。本方法は限定的ではなく、開示された方法および組成物を用いて種々様々な薬剤がＰＥＧ化されてもよい。様々なサイズの、様々な反応性部分で誘導体化されたＰＥＧを、下記の実施例でより詳細に議論されるような市販源から入手してもよい。
【００１９】
サイトカインおよびその他の免疫モジュレーター
ある好ましい実施形態において、ＰＥＧ化されるエフェクター部分は、免疫モジュレーターである。免疫モジュレーターは、存在するときに、体の免疫系を変化させるか、抑制するか、または刺激する薬剤である。有用な免疫モジュレーターとしては、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせが挙げられ得る。特に有用なのは、リンホトキシン（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））、造血因子（例えば、インターロイキン（ＩＬ））、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、またはインターフェロン−γ）、および幹細胞成長因子（例えば、「Ｓ１因子」と表されるもの）である。
【００２０】
より好ましい実施形態において、ＰＥＧ化されるエフェクター部分は、リンホカイン、モノカイン、成長因子、および従来的なポリペプチドホルモンなどの、サイトカインである。サイトカインに含まれるものとして、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ））；肝成長因子；プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ミューラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板成長因子；形質転換成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様成長因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−  ９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、ｋｉｔリガンド、またはＦＬＴ−３）、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えば、ＴＮＦ−α）ならびにＬＴが挙げられる。例示的なサイトカインのＰＥＧ化は、下記の実施例２〜１２に記載されている。
【００２１】
タンパク質免疫モジュレーターまたはペプチド免疫モジュレーター（例えば、サイトカイン）のアミノ酸配列は、当技術分野において周知であり、任意のそのような公知の配列を本発明の実施で使用し得る。当業者は、サイトカイン配列に関する公開情報の多くの源を知っている。例えば、ＮＣＢＩデータベースは、多数のサイトカインおよび免疫モジュレーター（例えば、エリスロポエチン（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ０００７９９）、ＩＬ−１β（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＡＡＨ０８６７８）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＡＡＡ５２５７８）、ＴＮＦ−α（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＣＡＡ２６６６９）、および上で列挙されたほとんど全てのペプチド免疫モジュレーターまたはタンパク質免疫モジュレーター）のタンパク質配列およびコード核酸配列の両方を含む。当業者が、関心となる本質的に全てのタンパク質またはペプチドのエフェクター部分についての適当なアミノ酸配列および／または核酸配列を同定するのは、日常的なことである。
【００２２】
抗体および抗体断片
その他の実施形態において、抗体または抗体の抗原結合断片をＰＥＧ化してもよい。抗原結合抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど）は、当技術分野において周知であり、任意のそのような公知の断片を使用してもよい。本明細書で使用するとき、抗原結合抗体断片とは、インタクト抗体または親抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する抗体の任意の断片を指す。関心となるほとんど全ての抗体または断片のＡＤコンジュゲートおよび／またはＤＤＤコンジュゲートを調製する技術が公知である（例えば、米国特許出願第１１／６３３，７２９号）。
【００２３】
治療剤とコンジュゲートされていない抗体またはその断片（「裸の」抗体またはその断片と表す）を使用してもよい。代わりの実施形態において、抗体または断片を、１つもしくは複数の治療剤および／または診断剤とコンジュゲートしてもよい。以下でより詳細に議論されるように、種々様々なそのような治療剤および診断剤が当技術分野において公知であり、任意のそのような公知の治療剤および診断剤を使用してもよい。
【００２４】
ほとんど全ての標的抗原に対するモノクローナル抗体を調製する技術が当技術分野において周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、およびＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第１巻，２．５．１−２．６．７頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。簡潔に述べると、モノクローナル抗体は、マウスに抗原を含む組成物を注射し、脾臓を摘出してＢリンパ球を採取し、そのＢリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを産生し、そのハイブリドーマをクローンニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、このハイブリドーマ培養液から抗体を単離することによって得ることができる。
【００２５】
ＭＡｂは、様々な十分確立された技術により、ハイブリドーマ培養液から単離および精製することができる。そのような単離技術には、プロテイン−Ａセファロースを用いる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（２．７．１−２．７．１２頁および２．９．１−２．９．３頁）を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  （ＩｇＧ）」（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第１０巻，７９−１０４頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２））を参照されたい。
【００２６】
免疫原に対する抗体を最初に作製した後に、その抗体の配列を決定し、次に組換え技術によって調製することができる。マウス抗体および抗体断片のヒト化およびキメラ化は当業者に周知である。ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体に由来する抗体成分を使用することにより、マウス定常領域の免疫原性と関連する潜在的な問題が未然に防がれる。
【００２７】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、マウス抗体の可変領域に置換されている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与されたときに減少した免疫原性および増大した安定性を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体を構築するための技術は当業者に周知である。一例として、Ｌｅｕｎｇら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９（１９９４））は、マウスＬＬ２、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体のＶκドメインおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列をそれぞれのヒトκ定常領域ドメインおよびＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることによって、ＬＬ２キメラを産生した。
【００２８】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを産生するための技術は当技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）、およびＳｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）参照）。キメラ抗体またはマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖由来のマウスＣＤＲをヒト抗体の対応する可変ドメインに移すことによってヒト化し得る。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もヒトＦＲ配列と置換される。マウスＣＤＲをヒトＦＲに単に移すだけでは、しばしば抗体親和性の低下または損失さえ起こるため、マウス抗体のもとの親和性を回復するためにさらなる修飾が必要になる場合がある。これは、そのエピトープに対して良好な結合親和性を保有する抗体を得るために、ＦＲ領域の１つまたは複数のあるヒト残基をマウスの相当部分と置換することにより達成することができる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。一般に、マウスの相当部分と異なりかつ１つもしくは複数のＣＤＲアミノ酸残基の近くに位置するかまたは該アミノ酸残基と接しているヒトＦＲアミノ酸残基が置換の候補となるであろう。
【００２９】
ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチまたはヒト免疫グロブリン座を形質転換したトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８；Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６；Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ  ３：５４４−５０）。完全ヒト抗体は、遺伝子または染色体トランスフェクション法、およびファージディスプレイ技術によって構築することもでき、これらの方法は全て当技術分野において公知である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。そのような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりもずっと少ない副作用を示すことおよび本質的に内在性のヒト抗体としてインビボで機能することが期待される。ある実施形態において、請求された方法および手順は、そのような技術によって産生されたヒト抗体を利用してもよい。
【００３０】
１つの代替法において、ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体を作製してもよい（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０）。ヒト抗体は、正常ヒトからまたは癌などの特定の疾患状態を示すヒトから作製してもよい（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。罹患した個人からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏っている可能性があるということである。
【００３１】
この方法論の１つの非限定的な例において、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレイライブラリーを構築した。一般に、トータルＲＮＡは、循環血液白血球から取得された（同上）。組換えＦａｂは、μ鎖、γ鎖、およびκ鎖の抗体レパートリーからクローニングされ、ファージディスプレイライブラリーに挿入された（同上）。ＲＮＡはｃＤＮＡに変換され、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン配列に対する特異的プライマー（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）を用いてＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用された。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら（２０００，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｂａｒｂａｓら（編），初版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ９．１〜９．２２頁）に従って行なわれた。最終的なＦａｂ断片が制限エンドヌクレアーゼで消化され、バクテリオファージゲノムに挿入されて、ファージディスプレイライブラリーが作製された。そのようなライブラリーは、当技術分野において公知であるような、標準的なファージディスプレイ法によってスクリーニングし得る。
【００３２】
ファージディスプレイを様々なフォーマットで行なうことができる。これらのフォーマットの総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。また、ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によって生成されてもよい。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照されたい。当業者は、これらの技術が例示的なものであり、ヒトの抗体または抗体断片を作製およびスクリーニングするための任意の公知の方法を利用し得るということを理解するであろう。
【００３３】
別の代替法において、ヒト抗体を産生するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物を用いて、標準的な免疫化プロトコルを用いて、本質的に全ての免疫原性標的に対する抗体を作製してもよい。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５（５５：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって開示されている。そのような系の非限定的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）からのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および同様の動物において、マウス抗体遺伝子は不活化され、機能的ヒト抗体遺伝子に置換されているが、残りのマウス免疫系はインタクトのままである。
【００３４】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、生殖系列の構成を持つＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換された。このＹＡＣは、アクセサリー遺伝子および調製配列の間に、可変領域配列の大部分を含むヒトのＩｇＨ座およびＩｇκ座の部分を含んでいた。ヒト可変領域レパートリーを用いて、抗体産生Ｂ細胞を作製してもよく、この抗体産生Ｂ細胞は、公知の技術で処理してハイブリドーマにし得る。標的抗原で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常な免疫応答によりヒト抗体を産生し、その抗体は、上で議論された標準的な技術により採取および／または産生され得る。様々な系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が利用可能であり、その各々は異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子組換えで産生されたヒト抗体は、正常ヒト抗体の薬物動態特性を保持しながら、治療潜在能力を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。当業者は、請求された組成物および方法が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されるのではなく、ヒト抗体を産生するように遺伝子改変されている任意のトランスジェニック動物を利用し得るということを理解するであろう。
【００３５】
抗体断片
特異的エピトープを認識する抗体断片を公知の技術によって作製することができる。抗体断片とは、抗体の抗原結合部分（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなど）である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化によって産生することができ、Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製することができる。あるいは、Ｆａｂ’発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’断片の迅速かつ簡単な同定を可能にすることができる。Ｆ（ａｂ）２断片は、抗体のパパイン消化によって作製し得、Ｆａｂ断片は、ジスルフィドの還元によって取得し得る。
【００３６】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、１つのＶＬドメインおよび１つのＶＨドメインを含む。ＶＬドメインおよびＶＨドメインが会合して、標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によってさらに共有結合的に連結される。ｓｃＦｖ分子を作製するための方法および好適なペプチドリンカーを設計するための方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．Ｒａａｇ  ａｎｄ  Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，「Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖｓ」，ＦＡＳＥＢ  第９巻：７３−８０（１９９５）、およびＲ．Ｅ．Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｂ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，「Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ」，ＴＩＢＴＥＣＨ，第９巻：１３２−１３７（１９９１）に記載されている。
【００３７】
抗体断片は、全長抗体のタンパク質分解的な加水分解によってまたは断片をコードするＤＮＡの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは別の宿主における発現によって調製することができる。抗体断片は、従来法による全長抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号、ならびにそれらの中に含まれている参考文献によって記載されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，第１巻，４２２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）、およびＣｏｌｉｇａｎ（２．８．１−２．８．１０および２．１０−２．１０．４頁）も参照されたい。
【００３８】
公知の抗体
有用な抗体は、種々様々な公知の源から市販で入手し得る。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むが、これらに限定されない、様々な疾患標的に対する多くの抗体がＡＴＣＣに寄託されており、かつ／または該抗体は可変領域配列を公表しており、請求された方法および組成物で使用することができる。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；第７，２８２，５６７号；第７，１５１，１６４号；第７，０７４，４０３号；第７，０６０，８０２号；第７，０５６，５０９号；第７，０４９，０６０号；第７，０４５，１３２号；第７，０４１，８０３号；第７，０４１，８０２号；第７，０４１，２９３号；第７，０３８，０１８号；第７，０３７，４９８号；第７，０１２，１３３号；第７，００１，５９８号；第６，９９８，４６８号；第６，９９４，９７６号；第６，９９４，８５２号；第６，９８９，２４１号；第６，９７４，８６３号；第６，９６５，０１８号；第６，９６４，８５４号；第６，９６２，９８１号；第６，９６２，８１３号；第６，９５６，１０７号；第６，９５１，９２４号；第６，９４９，２４４号；第６，９４６，１２９号；第６，９４３，０２０号；第６，９３９，５４７号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，５３３号；第６，９１９，４３３号；第６，９１９，０７８号；第６，９１６，４７５号；第６，９０５，６８１号；第６，８９９，８７９号；第６，８９３，６２５号；第６，８８７，４６８号；第６，８８７，４６６号；第６，８８４，５９４号；第６，８８１，４０５号；第６，８７８，８１２号；第６，８７５，５８０号；第６，８７２，５６８号；第６，８６７，００６号；第６，８６４，０６２号；第６，８６１，５１１号；第６，８６１，２２７号；第６，８６１，２２６号；第６，８３８，２８２号；第６，８３５，５４９号；第６，８３５，３７０号；第６，８２４，７８０号；第６，８２４，７７８号；第６，８１２，２０６号；第６，７９３，９２４号；第６，７８３，７５８号；第６，７７０，４５０号；第６，７６７，７１１号；第６，７６４，６８８号；第６，７６４，６８１号；第６，７６４，６７９号；第６，７４３，８９８号；第６，７３３，９８１号；第６，７３０，３０７号；第６，７２０，１５号；第６，７１６，９６６号；第６，７０９，６５３号；第６，６９３，１７６号；第６，６９２，９０８号；第６，６８９，６０７号；第６，６８９，３６２号；第６，６８９，３５５号；第６，６８２，７３７号；第６，６８２，７３６号；第６，６８２，７３４号；第６，６７３，３４４号；第６，６５３，１０４号；第６，６５２，８５２号；第６，６３５，４８２号；第６，６３０，１４４号；第６，６１０，８３３号；第６，６１０，２９４号；第６，６０５，４４１号；第６，６０５，２７９号；第６，５９６，８５２号；第６，５９２，８６８号；第６，５７６，７４５号；第６，５７２；８５６号；第６，５６６，０７６号；第６，５６２，６１８号；第６，５４５，１３０号；第６，５４４，７４９号；第６，５３４，０５８号；第６，５２８，６２５号；第６，５２８，２６９号；第６，５２１，２２７号；第６，５１８，４０４号；第６，５１１，６６５号；第６，４９１，９１５号；第６，４８８，９３０号；第６，４８２，５９８号；第６，４８２，４０８号；第６，４７９，２４７号；第６，４６８，５３１号；第６，４６８，５２９号；第６，４６５，１７３号；第６，４６１，８２３号；第６，４５８，３５６号；第６，４５５，０４４号；第６，４５５，０４０号；第６，４５１，３１０号；第６，４４４，２０６号；第６，４４１，１４３号；第６，４３２，４０４号；第６，４３２，４０２号；第６，４１９，９２８号；第６，４１３，７２６号；第６，４０６，６９４号；第６，４０３，７７０号；第６，４０３，０９１号；第６，３９５，２７６号；第６，３９５，２７４号；第６，３８７，３５０号；第６，３８３，７５９号；第６，３８３，４８４号；第６，３７６，６５４号；第６，３７２，２１５号；第６，３５９，１２６号；第６，３５５，４８１号；第６，３５５，４４４号；第６，３５５，２４５号；第６，３５５，２４４号；第６，３４６，２４６号；第６，３４４，１９８号；第６，３４０，５７１号；第６，３４０，４５９号；第６，３３１，１７５号；第６，３０６，３９３号；第６，２５４，８６８号；第６，１８７，２８７号；第６，１８３，７４４号；第６，１２９，９１４号；第６，１２０，７６７号；第６，０９６，２８９号；第６，０７７，４９９号；第５，９２２，３０２号；第５，８７４，５４０号；第５，８１４，４４０号；第５，７９８，２２９号；第５，７８９，５５４号；第５，７７６，４５６号；第５，７３６，１１９号；第５，７１６，５９５号；第５，６７７，１３６号；第５，５８７，４５９号；第５，４４３，９５３号；第５，５２５，３３８を参照されたい。これらは、例示的であるに過ぎず、種々様々なその他の抗体およびそれらのハイブリドーマが当技術分野において公知である。当業者は、関心となる選択された疾患関連標的に対する抗体についてＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ、および／またはＵＳＰＴＯのデータベースを簡単に探索することにより、ほとんど全ての疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマを入手し得るということを理解するであろう。当技術分野において周知の標準的な技術を用いて、クローニングした抗体の抗原結合ドメインを増幅し、切り出し、発現ベクターにライゲートし、適合宿主細胞にトランスフェクトし、タンパク質産生に使用してもよい。
【００３９】
治療剤
代わりの実施形態において、細胞毒性剤、抗血管形成剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、またはその他の薬剤などの治療剤を本明細書に記載されるようにＰＥＧ化してもよい。例えば、ＳＮ３８（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２００８，１０：８４９−５９）、ウリカーゼ（Ｂｉｇｇｅｒｓ  ＆  Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２００８，９：４２２−２９）、ドセタキセル（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９７：３２７４−９０）、およびカンプトテシン（Ｈａｖｅｒｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １８：２１  １５−２１）について、ＰＥＧ化型の治療剤が開示されている。有用な薬物は、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生剤、アルカロイド剤、抗血管形成剤、アポトーシス促進剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬学的特性を保有していてもよい。
【００４０】
有用な例示的薬物としては、５−フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドホスフェート、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビンカアルカロイドが挙げられ得る。
【００４１】
有用な毒素としては、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）（例えば、オンコナーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素が挙げられる。
【００４２】
有用なケモカインとして、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、およびＩＰ−１０が挙げられ得る。
【００４３】
ある実施形態において、アンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰｌＧＦペプチドおよび抗ＰｌＧＦ抗体、抗血管成長因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体および抗Ｆｌｔ−１ペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン−１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキソエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミノトリアゾル、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン−２、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、またはミノサイクリンなどの、抗血管新生剤が有用であり得る。
【００４４】
その他の有用な治療剤は、オリゴヌクレオチド、特に、好ましくはオンコジーンおよびオンコジーン産物（例えば、ｂｃｌ−２またはｐ５３）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【００４５】
コンジュゲーション
小分子をタンパク質またはペプチド（例えば、ＡＤペプチドもしくはＤＤＤペプチド）にコンジュゲートするための様々な技術および組成物が公知であり、使用され得る。治療剤を、例えば、還元されたＳＨ基および／または炭水化物側鎖に付着させることができる。治療剤を、ジスルフィド結合の形成を通じてシステイン残基を含む還元されたタンパク質またはペプチドに付着させることができる。あるいは、そのような薬剤を、ヘテロ二官能性クロスリンカー（例えば、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））を用いて付着させることができる。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）。そのようなコンジュゲーションのための一般的な技術は当技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（編），１８７−２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５））；Ｐｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（編），６０−８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５））を参照されたい。
【００４６】
治療的使用
本明細書に記載された組成物は、様々な疾患状態の治療に特に有用である。好ましい実施形態において、疾患は、自己免疫疾患または癌（例えば、造血系癌もしくは固形腫瘍）であってもよい。開示された組成物および方法を用いて治療し得る例示的で非限定的な疾患としては、遅発性型のＢ細胞リンパ腫、侵攻型のＢ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにＧＶＨＤ、クリオグロブリン血症、溶血性貧血、同種感作、および臓器移植拒絶反応が挙げられる。免疫介在性血小板減少症（例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病）、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、関節リウマチ、多腺症候群、水疱性類天疱瘡、若年型糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、ならびに線維化性肺胞炎などのクラスＩＩＩ自己免疫疾患も挙げられる。
【００４７】
治療し得る固形腫瘍としては、神経芽腫、悪性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌、腎癌、結腸直腸癌、胃癌、膀胱癌、神経膠腫、肉腫、脳腫瘍、食道癌、上皮癌、骨肉腫、精巣癌、肝癌、および膵癌が挙げられる。
【００４８】
キット
様々な実施形態は、患者の罹患組織を治療または診断するのに好適な構成要素を含むキットに関係し得る。例示的なキットは、本明細書に記載されたような少なくともＰＥＧ化された治療剤を含んでもよい。投与用の構成要素を含む組成物が、経口送達のような、消化管経由の送達用に処方されていない場合、何らかのその他の経路を通してキット構成要素を送達することができる装置が含まれてもよい。非経口送達などの用途のための装置の１つの種類は、対象の体内に組成物を注射するのに使用される注射器である。吸入装置も使用してよい。ある実施形態において、ＰＥＧ化された治療剤は、滅菌された液体製剤または凍結乾燥調製物を含む前充填注射器または前充填自動注射ペンの形態で提供されてもよい。
【００４９】
キット構成要素をまとめて包装してもよくまたは２つ以上の容器に分けてもよい。いくつかの実施形態において、容器は、再構成に好適である滅菌凍結乾燥製剤の組成物を含むバイアルであってもよい。キットは、その他の試薬の再構成および／または希釈に好適な１つまたは複数の緩衝液も含んでよい。使用し得るその他の容器としては、ポーチ、トレイ、箱、チューブなどが挙げられるが、これらに限定されない。キット構成要素を容器に滅菌的に包装し、維持してもよい。含めることができる別の構成要素は、キットを使用する人への使用上の取扱説明書である。
【００５０】
実施例
以下の実施例は、限定されるわけではないが、本発明の特許請求の範囲を例証するために提供される。
【００５１】
実施例１．ＰＥＧ−ＡＤ２モジュールの作製
ＩＭＰ３５０の合成
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（ＳＳ−ｔｂｕ）−ＮＨ２（配列番号：１）ＭＨ＋２３５４
ＡＤ２の配列を組み入れたＩＭＰ３５０を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰＳ３ペプチド合成機でＦｍｏｃ法を用いて、Ｓｉｅｂｅｒ  Ａｍｉｄｅ樹脂を用いて０．１ｍｍｏｌスケールで作製した。Ｃ末端から順に、使用された保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであった。ペプチドを樹脂から切断し、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣで精製した。
【００５２】
ＰＥＧ２０−ＩＭＰ３５０の合成
ＩＭＰ３５０（０．０１０４ｇ）を、７ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８１）中で、０．１０２２ｇのｍＰＥＧ−ＯＰＴＥ（２０ｋＤａ，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）と混合した。その後、アセトニトリル（１ｍＬ）を添加して、懸濁された材料をいくぶん溶解した。この反応物を室温で３時間撹拌し、その後、０．０５４９ｇのシステインと共に０．０５２７ｇのＴＣＥＰを添加した。この反応混合物を１．５時間撹拌し、その後、水中の２０％エタノールで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムで精製した。この試料を溶出し、凍結し、凍結乾燥して、０．０９２４ｇの粗ＰＥＧ２０−ＩＭＰ３５０（ＭＡＬＤＩでＭＨ＋  ２３５０８）を得た。
【００５３】
ＩＭＰ３６０の合成
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（ＳＳ−ｔｂｕ）Ｇ−ＥＤＡＮＳ（配列番号：１）ＭＨ＋  ２６６０
ＡＤ２の配列を組み入れたＩＭＰ３６Ｏを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰＳ３ペプチド合成機でＦｍｏｃ法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＥＤＡＮＳ樹脂を用いて０．１ｍｍｏｌスケールで作製した。０．２３ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、０．２９ｇのＨＡＴＵ、２６μＬのＤＩＥＡ、７．５ｍＬのＤＭＦ、および０．５７ｇのＥＤＡＮＳ樹脂（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを樹脂に手作業で添加した。試薬を混合し、樹脂に添加した。この反応物を室温で２．５時間混合し、樹脂をＤＭＦおよびＩＰＡで洗浄して、余分な試薬を除去した。Ｃ末端から順に、使用された保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであった。ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【００５４】
ＩＭＰ３６２（ＰＥＧ２０−ＩＭＰ３６０）の合成
ＩＭＰ３６２の模式図を図２に示す。ＩＭＰ３６２の合成のために、ＩＭＰ３６０（０．０１１５ｇ）を、７ｍＬの１Ｍ  ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８１）中で０．１２７２ｇのｍＰＥＧ−ＯＰＴＥ（２０ｋＤａ，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）と混合した。その後、アセトニトリル（１ｍＬ）を添加して、懸濁された材料をいくぶん溶解した。この反応物を室温で４時間撹拌し、その後、０．０４３１ｇのシステインと共に０．０４１０ｇのＴＣＥＰを添加した。この反応混合物を１時間撹拌し、水中の２０％エタノールで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムで精製した。この試料を溶出し、凍結し、凍結乾燥して、０．１４７１ｇの粗ＩＭＰ３６２（ＭＨ＋  ２３７１３）を得た。
【００５５】
ＩＭＰ４１３（ＰＥＧ３０−ＭＰ３６０）の合成
ＩＭＰ４１３の模式図を図３に示す。ＩＭＰ４１３の合成のために、ＩＭＰ３６０（０．０１０３ｇ）を、７ｍＬの１Ｍ  ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８１）中で０．１６０１ｇのｍＰＥＧ−ＯＰＴＥ（３０ｋＤａ，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）と混合した。その後、アセトニトリル（１ｍＬ）を添加して、懸濁された材料をいくぶん溶解した。この反応物を室温で４．５時間撹拌し、その後、０．０４７３ｇのシステインと共に０．０４２３ｇのＴＣＥＰを添加した。この反応混合物を２時間撹拌した後、２日間透析した。透析した材料を凍結し、凍結乾燥して、０．１５５２ｇの粗ＩＭＰ４１３（ＭＨ＋  ３４４９９）を得た。
【００５６】
ＩＭＰ４２１の合成
ＩＭＰ４２１  Ａｃ−Ｃ−ＰＥＧ３−Ｃ（Ｓ−ｔＢｕ）ＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（Ｓ−ｔＢＵ）Ｇ−ＮＨ２（配列番号：９）
以下のアミノ酸を以下に示す順序で樹脂に添加することによって、ペプチドＩＭＰ４２１（ＭＨ＋  ２８９１）をＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＲ樹脂（４８７．６ｍｇ，０．１１２ｍｍｏｌ）上に作製した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ３−ＣＯＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。Ｎ末端アミノ酸はアセチル誘導体として保護された。その後、ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、３２．７ｍｇの白色固体を生じた。
【００５７】
ＩＭＰ４５７の合成
ＡＤ２の配列を組み入れたＩＭＰ４２１（配列番号：９、図１５）を、標準的な化学的手段で合成した。１５．２ｍｇ（５．２６μｍｏｌ）のＩＭＰ４２１（Ｆ．Ｗ．２８９０．５０）と２７４．５ｍｇ（６．８６μｍｏｌ）のｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋのアセトニトリル溶液（１ｍＬ）に、７ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）を添加し、室温で３時間反応させた。余分なｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ（図１６）を４９．４ｍｇ  Ｌ−システインでクエンチした後、５９．１ｍｇ  ＴＣＥＰを用いて１時間かけてＳ−Ｓ−ｔＢｕ脱保護を行なった。この反応混合物を、２つの３〜１２ｍＬの限度容量の１０Ｋ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（各カセットに４ｍｌ）を用いて、５Ｌの５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）中に２〜８℃で終夜透析した。次の日、５Ｌの５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）緩衝液の交換をさらに３回行ない、各透析を少なくとも２．５時間続けた。精製産物（１９．４ｍＬ）を２つの２０ｍＬシンチレーションバイアルに移し、凍結し、凍結乾燥して、２４６．７ｍｇの白色固体が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ  ４２，９８２およびＩＭＰ−４５７  ４５，５００という結果が得られた。
【００５８】
実施例２．インターフェロン（ＩＦＮ）−α２ｂをベースにしたＤＤＤモジュールの作製
哺乳動物細胞での発現用のＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２の構築
ＩＦＮ−α２ｂのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、以下の特徴、すなわち、ＸｂａＩ−−−シグナルペプチド−−−ＩＦＮα２ｂ−−−６Ｈｉｓ−−−ＢａｍＨＩを含む配列（配列中、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩは制限部位であり、シグナルペプチドはＩＦＮ−α２ｂ由来のものであり、６Ｈｉｓはヘキサヒスチジンタグである）が結果として得られた。得られる分泌タンパク質は、そのＣ末端で配列番号：２からなるポリペプチドに融合したＩＦＮ−α２ｂからなる。
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：２）
【００５９】
全長ヒトＩＦＮα２ｂ  ｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＯＲＦヒトクローン  カタログ番号ＨＯＲＦ０１  クローン番号ＩＯＨ３５２２１）を鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅を遂行した。
ＩＦＮＡ２  ＸｂａＩ  左
５’−ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：３）
ＩＦＮＡ２  ＢａｍＨＩ  右
５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣ−３’（配列番号：４）
【００６０】
ＰＣＲ増幅物をｐＧｅｍＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。ＩＦＮ−α２ｂとのライゲーション用に、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを調製した。ＩＦＮ−α２ｂ増幅物を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲートして、発現ベクターＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を作製した。
【００６１】
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の哺乳動物発現
ＳａｌＩ酵素で消化することによって、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を線状化し、エレクトロポレーションでＳｐ／ＥＥＥミエローマ細胞内に安定的にトランスフェクトした（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、２００６年７月１４日に出願された米国特許出願第１１／４８７，２１５号参照）。２つのクローンが検出可能なレベルのＩＦＮ−α２ｂを有することがＥＬＩＳＡで分かった。２つのクローンのうちの１つ（９５と表す）を、生産性を実質的に減少させることなく、無血清培地中での増殖に適合させた。次に、このクローンを、０．１〜０．８μＭの増加するメトトレキサート（ＭＴＸ）濃度で５週間にわたって増幅させた。この段階で、クローンを限界希釈によりサブクローニングし、最も生産性の高いサブクローン（９５−５）を拡大した。市販のｒＩＦＮ−α２ｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＩＦ００７，ロット０６００８０３９０８４）を標準品として用いて、振盪フラスコで増殖させた９５−５の生産性が、２．５ｍｇ／Ｌであると推定した。
【００６２】
ローラーボトルで増殖させたバッチ培養物からのＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の精製
クローン９５−５を、合計２０Ｌの無血清Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ（０．８μＭ  ＭＴＸを含む）を含む３４個のローラーボトルに拡大し、最終培養物に到達させた。この上清液を遠心分離で清澄化し、濾過（０．２μＭ）した。この濾過物を１×結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾル、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）中に透析濾過し、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製に備えて３１０ｍＬに濃縮した。この濃縮物を３０−ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡカラムに充填し、これを５００ｍＬの１×結合緩衝液中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、その後、２９０ｍＬの３０ｍＭイミダゾル、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）で洗浄した。この産物を１１０  ｍＬの２５０ｍＭイミダゾル、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）で溶出した。約６ｍｇのＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２が精製された。図４は、ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２を定量するために用いた抗ＩＦＮαイムノブロットおよびＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００６３】
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の特性解析
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の純度を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した（図示せず）。クマシーブルー染色ゲルにより、ローラーボトルから産生されたバッチは、それより前のバッチよりも純度が高いということが示された（図示せず）。ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２は最も強く染色されたバンドであり、総タンパク質の約５０％を占めた（図示せず）。この産物は、分子量約２６ｋＤａのダブレットとして分離したが、これは、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ＳＰの計算分子量（２６ｋＤａ）と一致している。分子量３４ｋＤａの１つの主要な汚染物質と多くの微かな汚染バンドがあった（図示せず）。
【００６４】
実施例３．ＤＮＬによるＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ｂの作製
α２ｂ−３６２（ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ＩＭＰ３６２）の調製および精製
２０ｋＤａ  ＰＥＧに連結した２コピーのＩＦＮα２ｂを有するα２ｂ−３６２の構造を表した模式図を図５に示す。１１ｍｇの還元された凍結乾燥ＩＭＰ３６２を、２５０ｍＭイミダゾル、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）中の２．２５ｍｇ（３．５ｍｌ）のＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２に１０倍モル過剰で添加することにより、ＤＮＬ反応を行なった。室温、暗所で６時間後、この反応混合物を、４℃、暗所で、ＣＭローディング緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．５）に対して透析した。この溶液を、ＣＭローディング緩衝液で事前に平衡化した１−ｍＬ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ＣＭ−ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に充填した。試料を充填した後、カラムをＣＭローディング緩衝液でベースラインまで洗浄し、その後、１５ｍＬの０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で洗浄した。ＰＥＧ化産物を１２．５ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で溶出した。
【００６５】
コンジュゲーション過程を、クマシーブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、蛍光イメージング、および抗ＩＦＮαイムノブロッティングにより解析した（図示せず）。直接的なタンパク質質量比較用に試料を標準化するために、ＣＭ−ＦＦカラムから溶出した各画分を３．５ｍＬに濃縮して、反応容量を合わせた。非還元条件下で、クマシーブルー染色ゲルにより、反応混合物中に分子量１１０ｋＤａの主要バンドが存在することが明らかとなった。このバンドは、未結合画分または０．２５Ｍ  ＮａＣｌ洗浄画分には存在しなかったが、０．５Ｍ  ＮａＣｌ画分にはっきり示された（図示せず）。ＩＭＰ３６２上のＥＤＡＮＳタグを検出するために用いた蛍光イメージングにより、１１０ｋＤａバンドがＩＭＰ３６２を含むこと、ならびにクマシーブルーで染色されない、余分なＩＭＰ３６２が反応混合物および未結合画分中に存在することが示された（図示せず）。抗ＩＦＮαイムノブロッティングにより、ＩＦＮ−α２ｂと１１０ｋＤａバンドとの会合が確認された（図示せず）。これらのデータはともに、ＤＮＬ反応によって、ＩＭＰ３６２とＩＦＮ−α２ｂの二量体との部位特異的で共有結合的なコンジュゲーションが生じたことを示している。ジスルフィド結合を破壊する還元条件下で、ＤＮＬ構造物の構成要素は分離されなかった（図示せず）。α２ｂ−３６２の計算分子量は約７５ｋＤａであったが、これはＭＡＬＤＩ  ＴＯＦで決定された質量７６，７２８Ｄａとよく一致している。計算質量とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定質量の間に見られた食い違いはＰＥＧが原因であり、ＰＥＧ化産物がＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥ−ＨＰＬＣで解析された場合、ＰＥＧが分子サイズを大きくすることが知られている。全体に、ＤＮＬ反応によって、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した後、＞９０％純粋である均質な産物がほぼ定量的に得られた（図示せず）。
【００６６】
α２ｂ−４５７（ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ＩＭＰ４５７）の調製および精製
２．５ｍｇの還元された凍結乾燥ＩＭＰ４５７を、２５０ｍＭイミダゾル、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）中の１ｍｇ（１．７ｍｌ）のＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２に１０倍モル過剰で添加することにより、ＤＮＬ反応を行なった。室温で６０時間後、１ｍＭの酸化グルタチオンをこの反応混合物に添加し、その後、これをさらに２時間保持した。この混合物を、ＣＭローディング緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．５）で１：２０に希釈し、酢酸でｐＨ４．５に滴定した。この溶液を、ＣＭローディング緩衝液で事前に平衡化した１−ｍＬ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ＣＭ−ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に充填した。試料を充填した後、カラムをＣＭローディング緩衝液でベースラインまで洗浄し、その後、１５ｍＬの０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で洗浄した。ＰＥＧ化産物を２０ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で溶出した。ａ２ｂ−４５７を２ｍＬに濃縮し、０．４Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に透析濾過した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＦＮα  ＥＬＩＳＡで決定した場合、最終的な収量は、ａ２ｂ−４５７  約１ｍｇで、純度は＞９０％であった。
【００６７】
α２ｂ−４１３（ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ＩＭＰ４１３）の調製および精製
３０ｋＤａ  ＰＥＧに連結した２コピーのＩＦＮα２ｂを有するα２ｂ−４１３の構造を表した模式図を図６に示す。ＩＭＰ３６２の代わりにＩＭＰ４１３を用いてすぐ上で記載したようにα２ｂ−４１３を調製した。
【００６８】
実施例４．ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２、α２ｂ−３６２、およびα２ｂ−４１３のインビトロ効力の評価
インビトロ抗増殖アッセイ
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２およびα２ｂ−３６２を、バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）細胞の増殖の阻害についてアッセイした。簡潔に述べると、ＩＦＮ−α２ｂ標準品（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＩＦ００７，ロット０６００８０３９０８４）、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２（品番０１０２０７）、およびα２ｂ−３６２（品番０１０８０７）を、各々、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で５００ｐＭに希釈し、そこから３通りの３倍連続希釈を９６ウェル組織培養プレート中に作製した（５０μＬ試料／ウェル）。Ｄａｕｄｉ細胞を４×１０５細胞／ｍＬに希釈し、５０μＬを各ウェルに添加した（２０Ｋ／ウェル）。各試験試薬の濃度範囲は、５００ｐＭ〜０．００８ｐＭであった。３７℃で４日後、ＭＴＳ色素をプレートに添加し（ウェル当たり２０μＬ）、３時間後、このプレートをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）を用いて４９０ｎｍで読み取った。用量応答曲線を作成し（図７）、５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＧｒａｐｈｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を用いてシグモイドフィットの非線形回帰によって得た。ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２およびα２ｂ−３６２についての計算ＥＣ５０はよく似ており（約１６ｐＭ）、ＩＦＮ−α２ｂ標準品（ＥＣ５０  約４ｐＭ）よりも約５倍効力が小さかった。同様の実験で、α２ｂ−４１３は、α２ｂ−３６２と同様の効力を有していた。
【００６９】
抗ウイルスアッセイ
脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスをＡ５４９細胞に対して用いるウイルスチャレンジアッセイで、独立の分析実験室（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）が２通りの試料を解析した。プレートをクリスタルバイオレットで染色し、色素を溶解した後、９６ウェルプレートリーダーで分光光度法によりＯＤを測定した。データは、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）でシグモイドフィット（可変の傾き）の非線形回帰を用いて解析した。ＥＣ５０値をＩＦＮα標準品のＥＣ５０値と比較することによって、抗ウイルス力価を決定した。特異的な抗ウイルス活性は、α２ｂ−３６２およびα２ｂ−４１３について、それぞれ１．２×１０８Ｕ／ｍｇおよび８．８×１０６Ｕ／ｍｇと計算された。
【００７０】
実施例５．α２ｂ−４１３およびα２ｂ−３６２のインビボ評価
薬物動態
成体メスのＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（約３５ｇ）で研究を行った。マウス２匹ずつの４つの異なる処置群があった。各試薬（試験および対照）を、単回ボーラス静注として、等モルタンパク質用量（３μｇのｒｈｕＩＦＮ−α２ａ、５μｇのＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）、１１μｇのα２ｂ−３６２、および１３μｇのα２ｂ−４１３）で投与した。マウスに、経後眼窩（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）法により様々な時点で（投薬前、注射５分後、２時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、および１６８時間後に）餌を与えた。血液を凝固させ、遠心分離し、血清を単離し、ＩＦＮ−α濃度のアッセイと、それに続く薬物動態（ＰＫ）解析まで−７０℃で保存した。
【００７１】
製造元の取扱説明書（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）に従ってヒトインターフェロンα  ＥＬＩＳＡキットを用いて血清試料中のＩＦＮ−αの濃度を決定した。簡潔に述べると、血清試料を、キットに提供されているヒトＩＦＮ−α標準品に準じて適切に希釈した。マイクロタイタープレートウェルに結合した抗体がインターフェロンを捕捉した。その後、第二の抗体を用いて、結合したインターフェロンを見えるようにした。これを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした抗二次抗体で定量した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。結果を図８に示す。
【００７２】
各薬剤のＰＫ特性を表１にまとめる。予想された通り、ｒｈＩＦＮ−α２ａは、注射されたマウスの血液から最も速やかにクリアランスされた。そのクリアランスは、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）よりも約３倍速く、ＤＮＬ−ＩＦＮ試薬よりも１３倍を上回って速かった。同様に、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）は、α２ｂ−３６２またはα２ｂ−４１３よりも４倍を上回って速く排除された。α２ｂ−３６２とα２ｂ−４１３の間に除去速度の相違はほとんどなかった。
【００７３】
平均滞留時間（ＭＲＴ）に関して、様々な試薬間でサイズとの明らかな相関があった。１９−ｋＤａ  ｒｈＩＦＮ−α２ａは、３１ｋＤａ  ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）よりも７倍短いＭＲＴを有し（それぞれ、０．７時間対５．１時間）、３１ｋＤａ  ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）は、７０ｋＤａ  α２ｂ−３６２（１０．３時間）と比較して、２倍短いＭＲＴを有していた。８０ｋＤａ  α２ｂ−４１３（２１．７時間）のＭＲＴは、α２ｂ−３６２よりも２倍長かった。最後に、生物学的同等性試験は、試験した試薬がＰＫに関してどれも同じではないことを示しており、この違いが本物であること（すなわち、循環半減期が、α２ｂ−４１３＞α２ｂ−３６２＞ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）＞ｒｈＩＦＮ−α２ａであること）を示している。
【表１】
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【００７４】
抗腫瘍治療効力
初期のインビボでの腫瘍治療研究により、ＤＮＬ−ＰＥＧ化インターフェロンは、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）と比較してより強力でかつより長く持続することが示された。８週齢メスのＣ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤマウスに、動物当たり１．５×１０７細胞のヒトバーキットリンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ）を静注した。マウス５匹ずつの１０の異なる処置群があった。同等の活性ユニットのＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）、α２ｂ−３６２、およびα２ｂ−４１３を、３つの異なる用量（３５００ユニット、７０００ユニット、および１４０００ユニット）で、左右いずれかの脇腹に皮下注射で、７日に１回投与した。Ｄａｕｄｉ細胞を移植した１日後に治療を開始した。
【００７５】
マウスの苦痛および麻痺の徴候を毎日観察した。マウスの体重を毎週測定した。マウスが体重の１５％超（しかし２０％未満）を損失した場合、マウスの体重が１５％未満の損失に戻るかまたは２０％を上回る損失のために屠殺されるかのいずれかになるまで、２日おきに体重を測定した。後肢麻痺を発症した場合またはそれとは別の形で瀕死になった場合にも、マウスを処分した。
【００７６】
この研究から作成した生存曲線を図９に示す。ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）、α２ｂ−３６２、およびα２ｂ−４１３は全て、生理食塩水対照マウスと比較して有意な生存の向上を示した（Ｐ＜０．００１６）。等しい活性用量で投与された場合、３，５００ＩＵ用量のα２ｂ−３６２を除き、α２ｂ−４１３とα２ｂ−３６２は両方とも、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）よりも優れていた（Ｐ＜０．００２７）。α２ｂ−３６２は、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）の２倍よりも大きい効力を示した。７，０００ＩＵ用量および３，５００ＩＵ用量のα２ｂ−３６２は、それぞれ１４，０００ＩＵ用量（Ｐ＝０．００１６）および７，０００ＩＵ用量（Ｐ＝０．００２７）のＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）よりも優れていた。３，５００ＩＵ用量のα２ｂ−４１３は、１４，０００ＩＵのＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）よりも優れていたので（Ｐ＝０．００２７）、α２ｂ−４１３は、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）の４倍を上回る効力がある。等しい用量で投与された場合、α２ｂ−４１３は、α２ｂ−３６２よりも有意に優れていた（Ｐ＜０．００２５）。しかしながら、３，５００ＩＵ用量およびその４６日の生存中央値と比較して、１４，０００ＩＵ用量により６０日の生存中央値が得られたにしても、α２ｂ−４１３の３つの用量の間には統計的に有意な差がなかった（Ｐ＝０．１２５５）。したがって、α２ｂ−３６２、α２ｂ−４１３、およびＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）について観察されたインビボ効力は、ＰＫデータとよく相関している。
【００７７】
ＰＫ解析で示されたα２ｂ−３６２およびα２ｂ−４１３のバイオアベイラビリティの増大は、ＤＮＬ−ＰＥＧ化ＩＦＮαのインビボでの抗腫瘍効力の増強に寄与する。同様に、これら２つの因子は、より頻度の少ない投薬スケジュールが腫瘍治療で用いられるのを可能にする。これは、上記と同様のインビボでの腫瘍治療研究で示された。この研究では、等しい活性ユニットのＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）またはα２ｂ−４１３が様々な投薬スケジュールで投与された。１．５×１０７個のＤａｕｄｉ細胞を静注した８週齢メスのＳＣＩＤマウスでこの研究を行った。マウス６〜７匹ずつの７つの異なる処置群があった。各試薬（試験および対照）を左右いずれかの脇腹に皮下注射で１４，０００ＩＵ投与した。Ｄａｕｄｉ細胞をマウスに投与した１日後に治療を開始した。ある組のマウスには、週に１回、４週間（ｑ７ｄ×４）投薬し、別の組のマウスには２週間に１回のスケジュールで８週間にわたって投薬し（ｑ２ｗｋ×４）、一方、３つ目の組のマウスには、３週間に１回、１２週間にわたって投薬した（ｑ３ｗｋ×４）。全てのマウスが合計４回の注射を受けた。
【００７８】
この研究から作成した生存曲線を図１０に示す。いずれかの形態のインターフェロンを様々なスケジュールのいずれかで受けたマウスは全て、生理食塩水対照マウスと比較して生存が有意に向上していた（Ｐ＜０．０００９）。重要なことに、ＩＦＮ−ＩＭＰ４１３で処置したマウスは全て、同じスケジュールで、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）で処置したマウスと比較して、生存が有意に向上していた（Ｐ＜０．００９７）。注目すべきことに、１週間おきにＩＦＮ−ＩＭＰ４１３で処置したマウス（ｑ２ｗｋ×４）は、同じスケジュールで、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）で処置したマウスと比較して、生存が有意に向上していただけでなく（ぞれぞれ、ＭＳＴ＝＞５４日対２８日；Ｐ＝０．０００２）、毎週ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）で処置したマウス（ｑ７ｄ×４）より有意に優れてもいた（ＭＳＴ＝３６．５日；Ｐ＝０．００４９）。さらに、３週間に１回、ＩＦＮ−ＩＭＰ４１３で処置したマウス（ｑ３ｗｋ×４）の生存は、２週間に１回、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）で処置したマウスよりも有意に優れており（ＭＳＴ＝５４日対２８日；Ｐ＝０．００２）、毎週ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（商標）で処置したマウスと比較したときの有意さに匹敵する（Ｐ＝０．０５９８）。
【００７９】
これらの研究により、ＩＦＮα２ｂのＤＮＬ−ＰＥＧ化が、その他のＰＥＧ化型のＩＦＮα２ｂと比較した場合でも、効力の向上および長期持続をもたらし、より頻度の少ない投薬を可能にすることが示された。この技術がその他のサイトカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯ）、成長因子、酵素、抗体、免疫モジュレーター、ホルモン、ペプチド、薬物、干渉ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ワクチン、ならびにその他の生物活性剤に適用されたとき、同様の増強が実現される。
【００８０】
実施例６．顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をベースにしたＤＤＤモジュールの作製
哺乳動物細胞での発現用のＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２の構築
Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、以下の特徴、すなわち、Ｘｂａｌ−−−シグナルペプチド−−−Ｇ−ＣＳＦ−−−６Ｈｉｓ−−−ＢａｍＨＩを含む配列（配列中、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩは制限部位であり、シグナルペプチドはヒトＧ−ＣＳＦ由来のものであり、６  Ｈｉｓはヘキサヒスチジンタグである）が結果として得られた。得られる分泌タンパク質は、そのＣ末端で配列番号：５からなるポリペプチドに融合したＧ−ＣＳＦからなっていた。
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：２）
【００８１】
全長ヒトＧ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＩＭＡＧＥ  ヒト  カタログ番号９７００２ＲＧ  クローン番号５７５９０２２）を鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅を遂行した。
Ｇ−ＣＳＦ  ＸｂａＩ  左
５’−ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：５）
Ｇ−ＣＳＦ  ＢａｍＨＩ−右
５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ−３’（配列番号：６）
【００８２】
ＰＣＲ増幅物をｐＧｅｍＴベクターにクローニングした。Ｇ−ＣＳＦとのライゲーション用に、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを調製した。Ｇ−ＣＳＦ増幅物を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲートして、発現ベクターＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を作製した。
【００８３】
Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２の哺乳動物発現
ＳａｌＩ酵素で消化することによって、Ｇ−ＣＳＦ−ｐｄＨＬ２を線状化し、エレクトロポレーションでＳｐ／ＥＥＥミエローマ細胞内に安定的にトランスフェクトした。０．１５μＭ  ＭＴＸを含む培地でクローンを選択した。サンドイッチＥＬＩＳＡにより、クローン＃４が、０．１５ｍｇ／ＬのＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２を産生することが示された。
【００８４】
ローラーボトルで増殖させたバッチ培養物からのＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２の精製
約３ｍｇのＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２を実施例２に記載されたように精製する。クローン４を、合計２０Ｌの無血清Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ（０．４μＭ  ＭＴＸを含む）を含む３４個のローラーボトルに拡大し、最終培養物に到達させる。この上清液を遠心分離で清澄化し、濾過（０．２μＭ）し、１×結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾル、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）中に透析濾過し、濃縮する。この濃縮物をＮｉ−ＮＴＡカラムに充填し、これを１×結合緩衝液中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、その後、３０ｍＭイミダゾル、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）で洗浄する。この産物を２５０ｍＭイミダゾル、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）で溶出する。
【００８５】
実施例７．ＤＮＬによるＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの作製
３０ｋＤａ  ＰＥＧに連結した２コピーのＧ−ＣＳＦを有するＧ−ＣＳＦ−４１３の構造を表した模式図を図１１に示す。還元された凍結乾燥ＩＭＰ４１３を、ＰＢＳ中のＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２に１０倍モル過剰で添加することにより、ＤＮＬ反応を行なう。室温、暗所で６時間後、この反応混合物を、Ｎｉ−ＮＴＡを用いた固定化金属親和性クロマトグラフィーによって精製する。
【００８６】
実施例８．エリスロポエチン（ＥＰＯ）をベースにしたＤＤＤモジュールの作製
哺乳動物細胞での発現用のＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２の構築
ＥＰＯのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、以下の特徴、すなわち、Ｘｂａｌ−−−シグナルペプチド−−−ＥＰＯ−−−６Ｈｉｓ−−−ＢａｍＨＩを含む配列（配列中、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩは制限部位であり、シグナルペプチドはヒトＥＰＯ由来のものであり、６Ｈｉｓはヘキサヒスチジンタグである）を含む配列が結果として得られた。得られる分泌タンパク質は、そのＣ末端で配列番号：２からなるポリペプチドに融合したＥＰＯからなる。
【００８７】
全長ヒトＥＰＯ  ｃＤＮＡクローンを鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅を遂行した。
ＥＰＯ  ＸｂａＩ  左
５’−ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣ−３’（配列番号：７）
ＥＰＯ  ＢａｍＨＩ  右
５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：８）
【００８８】
ＰＣＲ増幅物をｐＧｅｍＴベクターにクローニングした。ＥＰＯとのライゲーション用に、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを調製した。ＥＰＯ増幅物を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲートして、発現ベクターＥＰＯ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を作製した。
【００８９】
ＥＰＯ−ＤＤＤ２の哺乳動物発現
ＳａｌＩ酵素で消化することによって、ＥＰＯ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を線状化し、エレクトロポレーションでＳｐ／ＥＥＥミエローマ細胞内に安定的にトランスフェクトした。０．１５μＭ  ＭＴＸを含む培地でクローンを選択した。Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質を捕捉するためのＮｕｎｃ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ  Ｎｉｃｋｅｌ−Ｃｈｅｌａｔｅプレートおよび抗ＥＰＯ抗体による検出を用いたＥＬＩＳＡにより、クローン＃４１、＃４９、および＃３７が各々約０．５ｍｇ／ＬのＥＰＯを産生することが示された。
【００９０】
ローラーボトルで増殖させたバッチ培養物からのＥＰＯの精製
約２．５ｍｇのＥＰＯ−ＤＤＤ２を実施例２に記載されたように９．６リットルの無血清ローラーボトル培養液からＩＭＡＣで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析により、精製産物が、ＩＭＡＣ後の総タンパク質の約１０％を構成することが示された（図示せず）。還元条件下では、ＥＰＯ−ＤＤＤ２ポリペプチドは、広範囲でかつ不均質なグリコシル化のためにその計算質量（２８ｋＤａ）よりも大きい分子量（４０〜４５ｋＤａ）を有する幅広いバンドとして分離された。非還元条件下では、ＥＰＯ−ＤＤＤ２は、主として分子量８０〜９０ｋＤａのジスルフィド結合した共有結合二量体として分離する。
【００９１】
実施例９．ＥＰＯ−ＤＤＤ２とＦａｂ−ＡＤ２モジュールとのＤＮＬコンジュゲーション
ｈ６７９は、ハプテンＨＳＧ（ヒスタミン−スクシニル−グリシン）に極めて特異的であるヒト化モノクローナル抗体である。図１２の模式図に表す、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２モジュールの産生は、以前に記載されている（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６；１０３：６８４１）。ＥＰＯ−ＤＤＤ２の二量体構造を表した模式図を図１２Ｂに示す。ＥＰＯ−６７９（ＥＰＯ−ＤＤＤ２  ×  ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２）の小規模な調製物をＤＮＬで作製した。ＥＰＯ−ＤＤＤ２（１ｍｇ）を、１ｍＭの還元グルタチオンおよび２ｍＭの酸化グルタチオンを含むＰＢＳ中でｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（１ｍｇ）と終夜反応させた。ＤＮＬコンジュゲートを、以前に記載されたように（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６；１０３：６８４１）ＨＳＧベースの親和性クロマトグラフィーで精製した。２つのＥＰＯ部分およびｈ６７９−Ｆａｂを有するＥＰＯ−６７９の構造を表した模式図を図１２Ｃに示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色により、ＥＰＯ−６７９の生成が示された（図示せず）。非還元条件下で分子量１５０〜１７０ｋＤａの幅広いバンドとして分離するＤＮＬ産物は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで示されるように、高度に精製され、３つの成分ポリペプチド（ＥＰＯ、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２、およびｈ６７９κ）のみからなっていた（図示せず）。
【００９２】
実施例１０．ＥＰＯ−ＤＤＤ２およびＥＰＯ−６７９の生物活性
組換えヒトＥＰＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を陽性対照として用いて、ＥＰＯ−ＤＤＤ２およびＥＰＯ−６７９が、ＥＰＯ応答性のＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ）の増殖を刺激する能力についてアッセイした。ＴＦ１細胞を、１×１０４細胞／ウェルを含む９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ培地（２０％ＦＢＳを補充、ＧＭ−ＣＳＦは補充せず）で増殖させた。ＥＰＯコンストラクトの濃度（ユニット／ｍｌ）を、市販のキット（ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡキット、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６３０）を用いて決定した。細胞を、９００Ｕ／ｍｌ〜０．００１Ｕ／ｍｌの範囲の濃度のｒｈＥＰＯ、ＥＰＯ−ＤＤＤ２、またはＥＰＯ−６７９の存在下で７２時間培養した。９６ウェルプレートリーダーでＯＤ４９０を測定する前に６時間インキュベートした２０μｌのＭＴＳ試薬／ウェルを用いてＭＴＳアッセイで生存細胞密度を比較した。用量応答曲線およびＥＣ５０値を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて作成した（図１３）。ＥＰＯ−ＤＤＤ２とＥＰＯ−６７９の両方が、ｒｈＥＰＯの効力の約１０％のインビトロ生物活性を示した。
【００９３】
実施例１１．ＤＮＬによるＰＥＧ化ＥＰＯの作製
３０ｋＤａ  ＰＥＧに連結した２コピーのＥＰＯを有するＥＰＯ−４１３の構造を表した模式図を図１４に示す。還元された凍結乾燥ＩＭＰ４１３を、ＰＢＳ中のＥＰＯ−ＤＤＤ２に１０倍モル過剰で添加することにより、ＤＮＬ反応を行なう。室温、暗所で６時間後、この反応混合物を、Ｎｉ−ＮＴＡを用いた固定化金属親和性クロマトグラフィーによって精製する。
【００９４】
実施例１２．２−ＰＥＧ：１−エフェクター部分複合体の産生
代わりの実施形態において、ＰＥＧ部分とエフェクター部分の分子量比が２：１のＰＥＧ化複合体を作製することが望ましい。そのようなＰＥＧ化複合体は、ＰＥＧ部分をＤＤＤ配列に付着させ、活性剤をＡＤ配列に付着させることにより、上記の実施例１〜３の方法で容易に作製される。実施例１〜３の方法を修正することにより、ＰＥＧとＩＦＮ−α２ｂの化学量比が２：１のＰＥＧ化複合体が調製される。この複合体は、血清中での安定性を示し、ＰＥＧとＩＦＮ−α２ｂの化学量比が１：２のＰＥＧ化複合体よりも低いインターフェロン活性を示す。しかしながら、バイＰＥＧ化複合体のクリアランス速度は、モノＰＥＧ化複合体のクリアランス速度よりも遅い。
【００９５】
実施例１３．ＰＥＧ化用の抗体断片の産生
Ｆａｂ抗体断片を、ＤＤＤ配列またはＡＤ配列のいずれかを含む融合タンパク質として産生してもよい。独立のトランスジェニック細胞株を各々のＦａｂ融合タンパク質用に開発する。ひとたび産生されれば、所望の場合にそのモジュールを精製するかまたは細胞培養上清液中に維持することができる。産生した後、ＰＥＧ化Ｆａｂコンストラクトを作製するために、任意の（Ｆａｂ−ＤＤＤ２）モジュールを任意のＰＥＧ−ＡＤモジュールと組み合わせることができ、または任意のＦａｂ−ＡＤモジュールを任意の（ＰＥＧ−ＤＤＤ）２モジュールと組み合わせることができる。
ＤＤＤ１：ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：１０）
ＤＤＤ２：ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：１１）
ＡＤ１：ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号：１２）
ＡＤ２：ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号：１）
【００９６】
プラスミドベクターｐｄＨＬ２が用いて、多くの抗体および抗体ベースのコンストラクトが産生されている。Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９），１２５：１９１−２０２；Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａ）（１９９７），８０：２６６０−６を参照されたい。ジシストロン性の哺乳動物発現ベクターは、ＩｇＧの重鎖および軽鎖の合成を導く。このベクター配列は、多くの異なるＩｇＧ−ｐｄＨＬ２コンストラクトとほとんど同一であり、可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）配列にのみ違いが存在する。当業者に公知の分子生物学のツールを用いて、これらのＩｇＧ発現ベクターをＦａｂ−ＤＤＤまたはＦａｂ−ＡＤ発現ベクターに変換することができる。Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターを作製するために、重鎖のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインのコード配列を、ヒンジの最初の４残基、１４残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、およびヒトＲＩＩαの最初の４４残基（ＤＤＤ１と表す）をコードする配列と置換する。Ｆａｂ−ＡＤ発現ベクターを作製するために、ＩｇＧのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの配列を、ヒンジの最初の４残基、１５残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、ならびにバイオインフォマティックスおよびペプチドアレイ技術を用いて作製され、ＲＩＩα二量体と非常に高い親和性（０．４ｎＭ）で結合することが示されたＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７残基の合成ＡＤ（ＡＤ１と表す）をコードする配列と置換する。Ａｌｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ（２００３），１００：４４４５−５０を参照されたい。
【００９７】
以下に記載されるように、ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターを、Ｆａｂ−ＤＤＤ１発現ベクターまたはＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターのいずれかに変換しやすくするために、２つのシャトルベクターを設計した。
【００９８】
ＣＨ１の調製
ＣＨ１ドメインを、ｐｄＨＬ２プラスミドベクターを鋳型として用いてＰＣＲで増幅した。左側のＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流（５’）およびＣＨ１コード配列の５’にあるＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位からなる。右側のプライマーは、ヒンジの最初の４残基（ＰＫＳＣ）と、それに続くＧＧＧＧＳ（その最後の２つのコドン（ＧＳ）がＢａｍＨＩ制限部位を含む）をコードする配列からなる。
ＣＨ１の５’  左側のプライマー
５’ＧＡＡＣＣＴＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧ−３’（配列番号：１３）
ＣＨ１＋Ｇ４Ｓ−Ｂａｍ  右
５’ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号：１４）
【００９９】
４１０ｂｐのＰＣＲ増幅物をｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｉｎｃ．）にクローニングし、クローンをＴ７（５’）方向での挿入についてスクリーニングした。
【０１００】
（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１の構築
二重鎖オリゴヌクレオチド（（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１と表す）は、ＤＤＤ１のアミノ酸配列と、それに続く１１残基のリンカーペプチド（その最初の２つのコドンがＢａｍＨＩ制限部位を含む）をコードするように、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，  ＵＫ）によって合成された。停止コドンおよびＥａｇＩ制限部位が３’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：１５）
【０１０１】
１７４ｂｐ  ＤＤＤ１配列の中央の１５４塩基対を含むように、３’末端で３０塩基対だけ重複する２つのオリゴヌクレオチド（ＲＩＩＡ１−４４上およびＲＩＩＡ１−４４下と表す）を合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）、結合させた。これらのオリゴヌクレオチドをアニールさせ、Ｔａｑポリメラーゼを用いたプライマー伸張反応に供した。
ＲＩＩＡ１−４４  上
５’ＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：１６）
ＲＩＩＡ１−４４  下
５’ＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号：１７）
【０１０２】
プライマー伸張の後、二重鎖を、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
ＧＳ４  Ｂａｍ  左
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号：１８）
１−４４  停止  Ｅａｇ  右
５’−ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号：１９）
【０１０３】
この増幅物をｐＧｅｍＴにクローニングし、Ｔ７（５’）方向での挿入についてスクリーニングした。
【０１０４】
（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１の構築
二重鎖オリゴヌクレオチド（（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１と表す）を、ＡＤ１のアミノ酸配列と、それに続く１１残基のリンカーペプチド（その最初の２つのコドンがＢａｍＨＩ制限部位を含む）をコードするように合成した（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）。停止コドンおよびＥａｇＩ制限部位が３’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号：２０）
【０１０５】
２つの相補的な重複するオリゴヌクレオチド（ＡＫＡＰ−ＩＳ上およびＡＫＡＰ−ＩＳ下と表す）を合成した。
ＡＫＡＰ−ＩＳ  上
５’ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号：２１）
ＡＫＡＰ−ＩＳ  下
５’ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号：２２）
【０１０６】
二重鎖を、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
ＧＳ４  Ｂａｍ  左
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号：２３）
ＡＫＡＰ−ＩＳ  停止  Ｅａｇ  右
５’−ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ−３’（配列番号：２４）
【０１０７】
この増幅物をｐＧｅｍＴベクターにクローニングし、Ｔ７（５’）方向での挿入についてスクリーニングした。
【０１０８】
ＤＤＤ１とＣＨ１とのライゲーション
ＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴから切り出し、その後、ＣＨ１−ｐＧｅｍＴの同位置にライゲートして、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴを作製した。
【０１０９】
ＡＤ１とＣＨ１とのライゲーション
ＡＤ１配列を含む１１０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いてｐＧｅｍＴから切り出し、その後、ＣＨ１−ｐＧｅｍＴの同位置にライゲートして、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴを作製した。
【０１１０】
ｐｄＨＬ２ベースのベクターへのＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のクローニング
このモジュラー設計を用いて、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のいずれかを、ｐｄＨＬ２ベクター中の任意のＩｇＧコンストラクトに組み入れることができる。ＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限断片（ＣＨ１−ＣＨ３）をｐｄＨＬ２から取り除き、それをそれぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り出されたＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片と置換することによって、重鎖定常ドメイン全体を上記コンストラクトのうちの１つと置換する。
【０１１１】
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
ｈＭＮ−１４抗体は、マウスＭＮ−１４  ＣＤＲ配列を含むヒト化ＣＥＡ結合抗体である（例えば、米国特許第６，６７６，９２４号参照）。Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、２コピーの融合タンパク質Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を含む安定二量体を産生するための発現ベクターである。この融合タンパク質Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４において、ＤＤＤ１は、柔軟なペプチドスペーサーを介してＣＨ１のカルボキシル末端でｈＭＮ−１４  Ｆａｂに連結している。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼで消化してＣＨ１−ＣＨ３ドメインを取り除き、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩでＣＨ１−ＤＤＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＤＤＤ１断片を挿入することにより、プラスミドベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２（これは、ｈＭＮ−１４  ＩｇＧを産生するのに使用されている）をＣ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２に変換した。
【０１１２】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生するための発現ベクターである。Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４は、１４アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＦｄのカルボキシル末端に付加されたＤＤＤ２の二量体化／ドッキング配列を有する。分泌される融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有結合相互作用によって結び付いている２つの同一コピーのｈＭＮ−１４  Ｆａｂから構成される。
【０１１３】
この発現ベクターを以下のように人工的に作製した。リンカーペプチドの一部（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ、配列番号：２５）およびＤＤＤ２の残基１〜１３のコード配列を含む、２つの重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成により作製した。このオリゴヌクレオチドをアニールさせ、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化し、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化したＤＮＡとのライゲーションに適合する５’末端および３’末端上の突出を生じさせた。
Ｇ４Ｓ−ＤＤＤ２  上
５’ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡ−３’（配列番号：２６）
Ｇ４Ｓ−ＤＤＤ２  下
５’ＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号：２７）
【０１１４】
この二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化することにより調製したシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴとライゲートして、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴを作製した。５０７ｂｐ断片を、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩでＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴから切り出し、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩで消化することにより調製したＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２とライゲートした。最終的な発現コンストラクトは、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２である。
【０１１５】
実施例１４．Ｆａｂ抗体断片のＰＥＧ化
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ１４−ｐｄＨＬ２ベクターをＳｐ／ＥＥＥ細胞（米国特許出願第１１／４８７，２１５号）にトランスフェクトし、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生するのに用いる。このジジストロン性発現ベクターは、ｈＭＮ−１４κ軽鎖とＣ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４の両方の合成および分泌を導き、これらが組み合わさって、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４を形成する。このＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４は、自発的に二量体を形成する。この二量体を等モル量のＩＭＰ３６２、ＩＭＰ４１３、またはＩＭＰ４５７と混合し、ＰＥＧ化Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４二量体を産生させる。ｈＭＮ−１４  Ｆａｂ部分は、ＣＥＡ抗原に対する結合特異性を保持する。ＣＥＡ発現腫瘍を持つヌードマウスへの注射により、ＰＥＧ化Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４が、非ＰＥＧ化ｈＭＮ−１４  Ｆ（ａｂ）２と比べて顕著に長い循環半減期を示し、より頻度の少ない投薬スケジュールで効力が向上するということが示されている。
【０１１６】
実施例１５．Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターの作製
ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターは、多くの組換えＩｇＧの発現を仲介するのに用いられている。任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターをＣ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターに変換しやすくするために、プラスミドシャトルベクターを産生した。Ｆｃ（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）の遺伝子を、ｐｄＨＬ２ベクターを鋳型とし、オリゴヌクレオチドＦｃ  ＢｇｌＩＩ左およびＦｃ  Ｂａｍ−ＥｃｏＲＩ右をプライマーとして用いて増幅した。
Ｆｃ  ＢｇｌＩＩ  左
５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号：２８）
Ｆｃ  Ｂａｍ−ＥｃｏＲＩ  右
５’−ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：２９）
【０１１７】
この増幅物をｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクターにクローニングした。Ｆｃインサート断片をｐＧｅｍＴから切り出し、ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターとライゲートして、シャトルベクターＦｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を作製した。
【０１１８】
任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターをＣ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターに変換するために、８６１ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限断片を前者から切り出し、Ｆｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターから切り出された９５２ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限断片と置換する。ＢｓｒＧＩはＣＨ３ドメイン内で切断し、ＮｄｅＩは発現カセットの下流（３’）で切断する。
【０１１９】
実施例１６．Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧの産生
エプラツズマブ、すなわちｈＬＬ２  ＩｇＧは、ヒト化抗ヒトＣＤ２２  Ｍａｂである（例えば、米国特許第５，４４３，９５３号；第５，７８９，５５４号；第６，１８７，２８７号；第７，０７４，４０３号参照）。Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２ＩｇＧ用の発現ベクターを、実施例１５に記載されたように、ｈＬＬ２  ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２から作製し、エレクトロポレーションでＳｐ２／０ミエローマ細胞にトランスフェクトするのに用いた。トランスフェクション後、細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、トランスジェニッククローンを、メトトレキサートを含む培地で選択した。ｈＬＬ２特異的な抗イディオタイプＭＡｂでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートおよびペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧによる検出を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって、クローンのＣＨ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧ生産性をスクリーニングした。クローンをタンパク質産生用のローラーボトルに拡大し、Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧを、プロテイン−Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて一段階で使用済み培養培地から精製した。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析により、２つのタンパク質ピークが分離された（図示せず）。より遅く溶出されるピークの保持時間（８．６３分）は、ｈＬＬ２  ＩｇＧと類似している。より速く溶出されるピークの保持時間（７．７５分）は、約３００ｋＤａのタンパク質と一致する。後に、このピークが、Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２−ＩｇＧのジスルフィド結合二量体に相当することが明らかにされた。この二量体は、ＤＮＬ反応中に単量体型に還元される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、精製されたＣ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２−ＩｇＧが、単量体型とジスルフィド結合二量体型の両方のモジュールからなることが示された（図示せず）。これら２つの型に相当するタンパク質バンドは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかであるが、還元条件下では、全ての型が、これらの成分ポリペプチド（重鎖ＡＤ２およびκ鎖）に相当する２つのバンドに還元される。その他の汚染バンドは検出されなかった。
【０１２０】
実施例１７．Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧの産生
ｈＡ２０  ＩｇＧは、ヒト化抗ヒトＣＤ２０  ＭＡｂである（例えば、米国特許第７，１５４，１６４号参照）。Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧ用の発現ベクターを、実施例１５に記載されたように、ｈＡ２０  ＩｇＧ−ｐＤＨＬ２から作製し、エレクトロポレーションでＳｐ２／０ミエローマ細胞にトランスフェクトするのに用いた。トランスフェクション後、細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、トランスジェニッククローンを、メトトレキサートを含む培地で選択した。ｈＡ２０特異的な抗イディオタイプＭＡｂでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートおよびペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧによる検出を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって、クローンのＣ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧ生産性をスクリーニングした。クローンをタンパク質産生用のローラーボトルに拡大し、Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧを、プロテイン−Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて一段階で使用済み培養培地から精製した。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、実施例１６のＣ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧ  について得られた結果と非常によく似た結果が得られた。
【０１２１】
実施例１８．ＰＥＧ化ＩｇＧの産生
Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧ抗体またはＣ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧ抗体をＰＥＧ−ＤＤＤ２と混合して、ＰＥＧ化されたｈＬＬ２またはｈＡ２０を形成させる。ｈＬＬ２およびｈＡ２０は、それぞれＣＤ２２抗原およびＣＤ２０抗原に対する結合特異性を保持する。ＣＤ２０またはＣＤ２２を発現するリンパ腫を持つヌードマウスへの注射により、これらのＰＥＧ化抗体が、非ＰＥＧ化抗体と比べて顕著に長い循環半減期を示し、より頻度の少ない投薬スケジュールで効力が向上するということが示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月3日(2014.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＤＤＤ（二量体化／ドッキングドメイン）配列に付着したエフェクター部分；および
ｂ）ＡＤ（アンカードメイン）配列に付着したＰＥＧ部分を含み
２つのＤＤＤ配列が１つのＡＤ配列に結合してＰＥＧ化複合体を形成し、前記ＤＤＤ配列とＡＤ配列の間のジスルフィド結合をさらに含む、ＰＥＧ化複合体。
【請求項２】
前記ＤＤＤ配列がＰＫＡ  ＲＩＩａの４４個のＮ末端アミノ酸を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ＤＤＤ配列が配列番号：２を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記ＰＥＧ部分が、一方の端でメトキシ基によりキャッピングされている、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記エフェクター部分が、酵素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記エフェクター部分が、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ−Ｉ（高移動度グループボックスタンパク質１）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−ＩＡ、ＭＩＰ−ＩＢ、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−Ｉ、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＭＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ｈＧＨ、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、第ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびＬＩＦからなる群より選択される、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
ＡＤ配列に付着した前記ＰＥＧ部分が、ＩＭＰ３５０、ＩＭＰ３６０、ＩＭＰ３６２、ＩＭＰ４１３、またはＩＭＰ４５７を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記エフェクター部分が、インターフェロン（ＩＦＮ）−α２ｂ、Ｇ−ＣＳＦ、またはエリスロポエチンである、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記ＰＥＧ化複合体の血清からのクリアランス速度が、ＰＥＧ化されていないエフェクター部分のクリアランス速度よりも少なくとも１桁遅い、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
ａ）ＡＤ配列に付着したエフェクター部分；および
ｂ）ＤＤＤ配列に付着したＰＥＧ部分を含み
２つのＤＤＤ配列が１つのＡＤ配列に結合してＰＥＧ化複合体を形成する、ＰＥＧ化複合体。
【請求項１１】
前記ＰＥＧ化複合体の血清からのクリアランス速度が、ＰＥＧ化されていないエフェクター部分のクリアランス速度よりも少なくとも１桁遅い、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
エフェクター部分をＰＥＧ化する方法であって、
ａ）エフェクター部分をＤＤＤ配列に付着させる工程；
ｂ）ＰＥＧ部分をＡＤ配列に付着させる工程；ならびに
ｃ）前記ＤＤＤ配列を前記ＡＤ配列に結合させて、２つのエフェクター部分−ＤＤＤ配列および１つのＰＥＧ−ＡＤ配列を含むＰＥＧ化複合体を形成させる工程
を含む方法。
【請求項１３】
前記エフェクター部分が、酵素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＥＧ化複合体の血清からのクリアランス速度が、ＰＥＧ化されていないエフェクター部分のクリアランス速度よりも少なくとも１桁遅い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
エフェクター部分をＰＥＧ化する方法であって、
ａ）エフェクター部分をＡＤ配列に付着させる工程；
ｂ）ＰＥＧ部分をＤＤＤ配列に付着させる工程；ならびに
ｃ）前記ＤＤＤ配列を前記ＡＤ配列に結合させて、２つのエフェクター部分−ＤＤＤ配列および１つのＰＥＧ−ＡＤ配列を含むＰＥＧ化複合体を形成させる工程
を含む方法。
【外国語明細書】
2014129395000001.pdf