(57)【要約】【課題】メチオノールや２−フェニルエタノール等の風味物質を含有する調味料の製造法を提供する。【解決手段】風味物質を生産する能力を有する酵母を、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物からなる群より選択される有機窒素源、ならびにメチオニンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸を含有する培地で培養することにより、風味物質を含有する調味料を製造する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
風味物質を生産する能力を有する酵母を、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物からなる群より選択される有機窒素源、ならびにメチオニンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸を含有する培地で培養することを特徴とする、風味物質を含有する調味料の製造方法であって、
培地中の前記アミノ酸の濃度が、２５ｍＭ以上であり、
前記風味物質が、メチオノールおよび２−フェニルエタノールからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記風味物質が、培地中に１００ｐｐｍ以上の濃度で蓄積する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地中の前記アミノ酸の濃度が、２５ｍＭ〜１００ｍＭである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
培地中の前記有機窒素源の濃度が、該有機窒素源に由来する総窒素の濃度が０．００５％〜０．４％となるような濃度である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機窒素源に由来する総窒素の濃度に対する前記アミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度／総窒素の濃度）が、１．９〜１５０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機窒素源に由来する総窒素の重量に対する前記アミノ酸の物質量の比率（アミノ酸の物質量／総窒素の重量）が、０．０１２５（ｍｏｌ／ｇ）〜１．０（ｍｏｌ／ｇ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記大豆タンパク質分解物が、醤油および大豆タンパク質を含む原料の酸加水分解物からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノ酸がメチオニンであり、前記風味物質がメチオノールである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アミノ酸がフェニルアラニンであり、前記風味物質が２−フェニルエタノールである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母が、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属酵母である、請求項１〜９
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母が、ジゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチオノールや２−フェニルエタノール等の風味物質を含有する調味料の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メチオノールや２−フェニルエタノールは、醤油や味噌に含まれる風味物質として知られている。例えば、通常の製法で製造された醤油もろみには、メチオノールおよび２−フェニルエタノールがそれぞれ数ｐｐｍ含まれている（非特許文献１）。
【０００３】
メチオノールは消臭効果を有し、魚の生臭さを弱める等の目的で利用できる。これまでに、例えば、メチオノールを含有し、且つ醤油香が低減された醤油の製法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、同製法によって製造された醤油中のメチオノール濃度は、わずか数ｐｐｍである。
【０００４】
また、化学合成や発酵によりメチオノールや２−フェニルエタノールを製造する試みがなされている。例えば、メチオニンを含有する培地で酵母を培養することによりメチオノールが生成されることが知られている（非特許文献２〜４）。しかしながら、これらの場合、培地成分としてnitrogen base等の喫食に適さない成分を利用しているため、生成し
たメチオノールを飲食用途で利用するためには培地からの分離精製が必要である。
【０００５】
一方、喫食に適する培地成分を用いた例としては、メチオニン、グルコース、および塩化ナトリウムを含有する培地で味噌酵母を培養することによりメチオノールが生成されることが知られている（非特許文献５）。しかしながら、この場合のメチオノールの生成量はわずか１．５ｐｐｍであり、得られた発酵液を調味料用途で利用するのは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４７８１４２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】田森純二ら、「酵母・乳酸菌添加により醸造した醤油諸味液の各種成分について」、農林水産消費技術安全センター調査研究報告、第１１号 (1987)
【非特許文献２】M. M. W. Etschmann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 80, 579-587 (2008)
【非特許文献３】Aoki Terumichi et al., Agric. Biol. Chem., 55(8), 2113-2116 (1991)
【非特許文献４】林部正也ら、醗酵工學雑誌, 48(1), 22-28 (1970)
【非特許文献５】石原和夫ら、「味噌の香気成分としての含窒素および含硫化合物と味噌酵母との関わり」、科研実績報告書 (1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、メチオノールや２−フェニルエタノール等の風味物質を含有する調味料の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、酵母エキスや大豆タ
ンパク質分解物等の有機窒素源およびメチオニンやフェニルアラニン等のアミノ酸を含有する培地で酵母を培養することにより、メチオノールや２−フェニルエタノール等の風味物質を含有する発酵液が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおり例示できる。
［１］
風味物質を生産する能力を有する酵母を、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物からなる群より選択される有機窒素源、ならびにメチオニンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸を含有する培地で培養することを特徴とする、風味物質を含有する調味料の製造方法であって、
培地中の前記アミノ酸の濃度が、２５ｍＭ以上であり、
前記風味物質が、メチオノールおよび２−フェニルエタノールからなる群より選択される、方法。
［２］
前記風味物質が、培地中に１００ｐｐｍ以上の濃度で蓄積する、［１］に記載の方法。［３］
培地中の前記アミノ酸の濃度が、２５ｍＭ〜１００ｍＭである、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
培地中の前記有機窒素源の濃度が、該有機窒素源に由来する総窒素の濃度が０．００５％〜０．４％となるような濃度である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記有機窒素源に由来する総窒素の濃度に対する前記アミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度／総窒素の濃度）が、１．９〜１５０である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記有機窒素源に由来する総窒素の重量に対する前記アミノ酸の物質量の比率（アミノ酸の物質量／総窒素の重量）が、０．０１２５（ｍｏｌ／ｇ）〜１．０（ｍｏｌ／ｇ）である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記大豆タンパク質分解物が、醤油および大豆タンパク質を含む原料の酸加水分解物からなる群より選択される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
前記アミノ酸がメチオニンであり、前記風味物質がメチオノールである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
前記アミノ酸がフェニルアラニンであり、前記風味物質が２−フェニルエタノールである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］
前記酵母が、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属酵母である、［１］〜［９
］のいずれかに記載の方法。
［１１］
前記酵母が、ジゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、メチオノールや２−フェニルエタノール等の風味物質を含有する調味料を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】種々の有機窒素源およびメチオニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のＯＤを示す図。
【図２】種々の有機窒素源およびメチオニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の生菌数を示す図。
【図３】種々の有機窒素源およびメチオニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のメチオノール濃度を示す図。
【図４】味液（ＴＮ濃度に換算して０．００５〜０．４％）およびメチオニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のＯＤを示す図。図中の凡例の数字は試験区の番号を示す（以下同じ）。
【図５】味液（ＴＮ濃度に換算して０．００５〜０．４％）およびメチオニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の生菌数を示す図。
【図６】味液（ＴＮ濃度に換算して０．００５〜０．４％）およびメチオニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のメチオノール濃度を示す図。
【図７】味液およびメチオニン（０〜１００ｍＭ）を含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のＯＤを示す図。
【図８】味液およびメチオニン（０〜１００ｍＭ）を含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の生菌数を示す図。
【図９】味液およびメチオニン（０〜１００ｍＭ）を含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のメチオノール濃度を示す図。
【図１０】種々の有機窒素源およびフェニルアラニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のＯＤを示す図。
【図１１】種々の有機窒素源およびフェニルアラニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の生菌数を示す図。
【図１２】種々の有機窒素源およびフェニルアラニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の２−フェニルエタノール濃度を示す図。
【図１３】味液（ＴＮ濃度に換算して０．００５〜０．４％）およびフェニルアラニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のＯＤを示す図。図中の凡例の数字は試験区の番号を示す（以下同じ）。
【図１４】味液（ＴＮ濃度に換算して０．００５〜０．４％）およびフェニルアラニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の生菌数を示す図。
【図１５】味液（ＴＮ濃度に換算して０．００５〜０．４％）およびフェニルアラニンを含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の２−フェニルエタノール濃度を示す図。
【図１６】味液およびフェニルアラニン（０〜１００ｍＭ）を含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際のＯＤを示す図。
【図１７】味液およびフェニルアラニン（０〜１００ｍＭ）を含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の生菌数を示す図。
【図１８】味液およびフェニルアラニン（０〜１００ｍＭ）を含有する培地でZygosaccharomyces rouxii CN 1380を培養した際の２−フェニルエタノール濃度を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、濃度は、特記しない限り質量を基準とする濃度である。すなわち、例えば、「％」は特記しない限り「質量％」を、「ｐｐｍ」は特記しない限り「質量ｐｐｍ」を示す。また、本発明において、アミノ酸（メチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸に限らない）は、特記しない限り、L体、D体、またはそれらの混合物であってよい。
【００１４】
本発明の方法は、風味物質を生産する能力を有する酵母を、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物からなる群より選択される有機窒素源、ならびにメチオニンおよびフェニル
アラニンからなる群より選択されるアミノ酸を含有する培地で培養することを特徴とする、風味物質を含有する調味料の製造方法である。
【００１５】
同方法において製造される調味料を、「本発明の調味料」ともいう。同方法において用いられる酵母を、「本発明の酵母」ともいう。同方法において用いられる培地を、「本発明の培地」ともいう。
【００１６】
＜１＞本発明の酵母
本発明の酵母は、風味物質を生産する能力を有する酵母である。「風味物質を生産する能力」とは、本発明の培地中で本発明の酵母を培養したときに、風味物質を生成し、培地中に蓄積する能力をいう。風味物質の培地中での蓄積量は、例えば、１００ｐｐｍ以上、２００ｐｐｍ以上、５００ｐｐｍ以上、または１０００ｐｐｍ以上であってよく、８０００ｐｐｍ以下、５０００ｐｐｍ以下、または３０００ｐｐｍ以下であってよい。本発明の酵母は、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物から選択される有機窒素源および／またはメチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸を含有しない培地で培養した場合には、風味物質を培地中に蓄積することができてもよく、できなくてもよい。
【００１７】
本発明において、「風味物質」は、メチオノールおよび２−フェニルエタノールから選択される。本発明においては、メチオノールおよび２−フェニルエタノールの片方が生成されてもよく、両方が生成されてもよい。
【００１８】
なお、メチオノールおよび２−フェニルエタノールの両方が生成する場合、上記例示した蓄積量は、メチオノールおよび２−フェニルエタノールのいずれか一方の蓄積濃度であってもよく、メチオノールおよび２−フェニルエタノールのそれぞれの蓄積濃度であってもよく、メチオノールおよび２−フェニルエタノールの蓄積濃度の合計であってもよい。
【００１９】
酵母としては、例えば、大豆を原料とする発酵調味料の製造に用いられるものを用いてよい。また、酵母としては、例えば、耐塩性を有するものを用いてよい。「耐塩性を有する」とは、例えば、１．２％以上、２．５％以上、または５％以上のＮａＣｌ濃度下で生育できることであってよい。
【００２０】
酵母としては、例えば、ジゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）等のジゴサッカロミセス属に属する酵母、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属に属する酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属に属する酵母、キャンディダ・ユティ
リス（Candida utilis）等のキャンディダ属に属する酵母、ピヒア・パストリス（Pichia
pastoris）等のピヒア属に属する酵母、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属に属する酵母が挙げられる。
【００２１】
酵母としては、例えば、ジゴサッカロミセス属に属する酵母が好ましく、ジゴサッカロミセス・ルキシーがより好ましい。ジゴサッカロミセス・ルキシーとして、具体的には、例えば、Zygosaccharomyces rouxii CN 1380 株が挙げられるが、それには限定されない
。同株は、China Center of Industrial Culture Collection（CICC）（郵便番号：100027  住所：Chaoyang District, Xiaoyun Road 32#, Beijing, China）から分譲を受けることができる。
【００２２】
＜２＞本発明の培地
本発明の培地は、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物からなる群より選択される有機窒素源、ならびにメチオニンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸を含有する。
【００２３】
＜２−１＞アミノ酸
本発明の方法において用いられるアミノ酸は、メチオニンおよびフェニルアラニンから選択される。アミノ酸としては、メチオニンおよびフェニルアラニンの片方を用いてもよく、メチオニンおよびフェニルアラニンの両方を組み合わせて用いてもよい。風味成分としてメチオノールを生成する場合は、少なくともメチオニンを用いる。また、風味成分として２−フェニルエタノールを生成する場合は、少なくともフェニルアラニンを用いる。なお、本発明において、「アミノ酸」とは、特記しない限り、「メチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸」を意味するものとする。また、メチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸以外のアミノ酸を、「他のアミノ酸」という場合がある。
【００２４】
本発明において、アミノ酸は、特記しない限り、いずれもフリー体、もしくはその塩、またはそれらの混合物である。
【００２５】
塩は、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。例えば、カルボキシル基等の酸性基に対する塩としては、具体的には、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。また、例えば、アミノ基等の塩基性基に対する塩としては、具体的には、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸、メチルマロン酸等の有機カルボン酸との塩が挙げられる。なお、塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
【００２６】
アミノ酸としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。
【００２７】
アミノ酸の製造方法は特に制限されず、例えば公知の方法を利用できる。例えば、アミノ酸は、化学合成、酵素反応、またはその組み合わせにより製造することができる。また、例えば、アミノ酸は、当該アミノ酸の生産能を有する微生物を培養し、培養液または菌体から当該アミノ酸を回収することで製造することができる。また、例えば、アミノ酸は、当該アミノ酸を含有する農水畜産物から回収することで製造することができる。
【００２８】
アミノ酸は、所望の程度に精製されていてもよく、そうでなくてもよい。例えば、アミノ酸としては、純度が３０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上、または９５％以上のものを用いてもよい。
【００２９】
また、アミノ酸としては、例えば、当該アミノ酸を含有する素材を用いてもよい。アミノ酸を含有する素材は、天然物であってもよく、人工物であってもよい。アミノ酸を含有する素材として、具体的には、例えば、当該アミノ酸の生産能を有する微生物を培養して得られた培養液、菌体、培養上清等の発酵生産物、当該アミノ酸を含有する農水畜産物、およびそれらの加工品が挙げられる。
【００３０】
＜２−２＞有機窒素源
本発明の方法において用いられる有機窒素源は、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物から選択される。有機窒素源としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。なお、本発明において、「有機窒素源」とは、特記しない限り、「酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物から選択される有機窒素源」を意味するものとする。また、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物から選択される有機
窒素源以外の有機窒素源を、「他の有機窒素源」という場合がある。
【００３１】
＜酵母エキス＞
酵母エキスとは、酵母菌体からの抽出物をいい、具体的には、酵母菌体を自己消化、酵素処理、熱水処理等の処理に供することにより得られる抽出物をいう。酵母エキスは、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。
【００３２】
酵母エキスとしては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。
【００３３】
市販品として、具体的には、例えば、酵母エキスＵＭ、スーパー酵母エキス、酵母エキスＮｏ．１、酵母エキスＮｏ．２、酵母エキスＮｏ．３、酵母エキスＲＫ、酵母エキスＲＫ−Ｍ（いずれも味の素株式会社製）、アロマイルド（株式会社興人社製）が挙げられる。
【００３４】
酵母エキスの製造方法は特に制限されず、例えば公知の方法を利用できる。具体的には、例えば、以下の手順により酵母エキスを製造することができる。
【００３５】
まず、酵母を培地で培養する。培養方法は、酵母が増殖し得るものであれば特に制限されない。培養は、例えば、酵母の培養に用いられる通常の培地を用いて、酵母の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分を含有する培地で酵母を培養することができる。なお、培地は、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物から選択される有機窒素源および／またはメチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸を含有していてもよく、含有していなくともよい。培地成分や培養条件については、後述する本発明の方法における培地成分や培養条件の記載を準用できる。
【００３６】
得られた酵母からの酵母エキスの調製は、例えば、酵母エキスの調製に用いられる通常の方法により行うことができる。例えば、酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出、酵素処理、自己消化、またはそれらの組み合わせに供することにより調製できる。このようにして得られた酵母エキスは、濃縮してもよいし、乾燥させて粉末等の固形状にしてもよい。
【００３７】
酵母エキスの原料として用いられる酵母は特に制限されず、上述したような酵母を用いることができる。それらの中では、例えば、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスを用いるのが好ましい。
【００３８】
酵母エキスとしては、１種の酵母エキスを用いてもよく、２種またはそれ以上の酵母エキスを組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
＜大豆タンパク質分解物＞
本発明において、「大豆タンパク質分解物」とは、大豆タンパク質を含有する原料を加水分解して得られるものをいう。大豆タンパク質分解物は、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。
【００４０】
大豆タンパク質を含有する原料は、大豆タンパク質を含有する限り特に制限されない。大豆タンパク質を含有する原料は、大豆タンパク質のみからなるものであってもよく、大豆タンパク質以外の成分を含有していてもよい。大豆タンパク質を含有する原料は、例えば、大豆タンパク質以外の、大豆に由来する成分を含有していてよい。すなわち、大豆タンパク質を含有する原料としては、例えば、大豆、その加工品、それらから得られた大豆タンパク質そのものが挙げられる。大豆の加工品としては、例えば、脱脂加工大豆が挙げ
られる。また、大豆タンパク質を含有する原料は、例えば、大豆以外に由来する成分を含有していてもよい。そのような成分としては、特に制限されないが、例えば、小麦や塩化ナトリウム等の、大豆を原料として用いる発酵製品を製造する際に用いられる副原料が挙げられる。
【００４１】
「大豆タンパク質を含有する原料を加水分解する」とは、原料中の大豆タンパク質の一部または全部が加水分解される限り、特に制限されない。加水分解は、例えば、微生物の発酵による加水分解であってもよく、酵素による加水分解であってもよく、酸による加水分解であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
【００４２】
すなわち、大豆タンパク質分解物としては、例えば、大豆タンパク質を含有する原料を用いた発酵製品、大豆タンパク質を含有する原料の酵素加水分解物、大豆タンパク質を含有する原料の酸加水分解物が挙げられる。大豆タンパク質を含有する原料を用いた発酵製品としては、例えば、醤油、味噌が挙げられる。
【００４３】
大豆タンパク質分解物に含まれる全成分に対する大豆由来の成分の比率は、本発明の培地中で本発明の酵母を培養した際に風味物質が生成される限り特に制限されない。例えば、窒素の比率で言えば、大豆タンパク質分解物中の全成分に由来する総窒素濃度に対する大豆タンパク質分解物中の大豆に由来する総窒素濃度の比率（大豆由来の総窒素濃度（％）／全成分由来の総窒素濃度（％））は、０．３以上、０．５以上、０．７以上、または０．９以上であってよい。
【００４４】
大豆タンパク質分解物としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。
【００４５】
市販品として、具体的には、例えば、各種醤油、各種味噌、味液（味の素株式会社製）が挙げられる。「味液」とは、大豆を含む植物タンパク質原料の塩酸加水分解物である。
【００４６】
大豆タンパク質分解物の製造方法は特に制限されず、例えば公知の方法を利用できる。
【００４７】
大豆タンパク質を含有する原料を用いた発酵製品は、例えば、大豆を原料とする発酵調味料を製造するのに用いられる通常の方法により製造できる。
【００４８】
大豆タンパク質を含有する原料の加水分解物は、例えば、タンパク質を加水分解するのに用いられる通常の方法により製造できる。
【００４９】
加水分解は、例えば、塩酸等の無機酸を用いて行うことができる。酸による加水分解の反応条件は、所望の分解率等の諸条件に応じて適宜設定できる。塩酸を用いる場合の反応条件として、具体的には、例えば、１００℃で１〜２日間が挙げられる。
【００５０】
加水分解は、例えば、プロテアーゼやペプチダーゼ等のタンパク質分解酵素を用いて行うこともできる。タンパク質分解酵素としては、例えば、タンパク質分解酵素を産生する微生物の培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、該菌体の処理物、それらから分離したタンパク質分解酵素が挙げられる。タンパク質分解酵素は、所望の程度に精製されていてもよく、そうでなくてもよい。タンパク質分解酵素を産生する微生物としては、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属真菌やバチルス（Bacillus）属細菌が挙げられる。酵素による加水分解の反応条件は、所望の分解率等の諸条件に
応じて適宜設定できる。反応条件としては、例えば、脱脂大豆より得る調味液の製造法（特開昭５１−７０８５２号公報）を参考にすることができる。
【００５１】
大豆タンパク質分解物が固形分を含む場合、大豆タンパク質分解物は固形分を除去してから用いてもよい。
【００５２】
大豆タンパク質分解物としては、１種の大豆タンパク質分解物を用いてもよく、２種またはそれ以上の大豆タンパク質分解物を組み合わせて用いてもよい。
【００５３】
＜２−３＞アミノ酸および有機窒素源の濃度
培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度は、本発明の培地中で本発明の酵母を培養した際に風味物質が生成される限り特に制限されない。
【００５４】
なお、本発明の培地が、有機窒素源とアミノ酸の両方に該当する成分、例えばメチオニンおよび／またはフェニルアラニンを遊離アミノ酸として含有する酵母エキス、を含有する場合、同成分は本発明の本発明の培地において、有機窒素源とアミノ酸の両方を兼ねる。すなわち、例えば、アミノ酸には、有機窒素源に含有されるメチオニンおよび／またはフェニルアラニンも含まれる。
【００５５】
培地中のアミノ酸の濃度は、例えば、２５ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってよい。培地中のアミノ酸の濃度は、例えば、２００ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってよい。培地中のアミノ酸の濃度は、具体的には、例えば、２５ｍＭ〜１００ｍＭであってよい。例えば、メチオニンとフェニルアラニンのいずれか一方を選択して用いる場合に、選択されたアミノ酸の濃度を上記例示した濃度範囲に設定してよい。また、例えば、メチオニンとフェニルアラニンの両方を用いる場合に、いずれか一方の濃度を上記例示した濃度範囲に設定してもよく、それぞれの濃度を上記例示した濃度範囲に設定してもよく、その合計濃度を上記例示した濃度範囲に設定してもよい。すなわち、本発明において、「アミノ酸の濃度」とは、メチオニンの濃度、フェニルアラニンの濃度、およびメチオニンとフェニルアラニンの合計濃度のいずれかを意味してよい。
【００５６】
なお、メチオニンとフェニルアラニンの両方を用いる場合、培地中のメチオニンとフェニルアラニンの合計濃度は、例えば、２５ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上であってもよい。培地中のメチオニンとフェニルアラニンの合計濃度は、例えば、４００ｍＭ以下、または２００ｍＭ以下であってもよい。培地中のメチオニンとフェニルアラニンの合計濃度は、具体的には、例えば、２５ｍＭ〜２００ｍＭであってもよい。
【００５７】
培地中の有機窒素源の濃度は、例えば、有機窒素源に由来する総窒素（total nitrogen）の濃度が０．００５％以上、または０．０１％以上となるような濃度であってよい。培地中の有機窒素源の濃度は、例えば、有機窒素源に由来する総窒素（total nitrogen）の濃度が１．０％以下、０．７％以下、または０．４％以下となるような濃度であってよい。培地中の有機窒素源の濃度は、具体的には、例えば、有機窒素源に由来する総窒素（total nitrogen）の濃度が０．００５％〜０．４％、または０．０１％〜０．４％となるような濃度であってよい。なお、２またはそれ以上の有機窒素源を用いる場合、有機窒素源の濃度とは、２またはそれ以上の有機窒素源の濃度の合計であってよい。
【００５８】
培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、本発明の培地中で本発明の酵母を培養した際に風味物質が生成される限り特に制限されない。
【００５９】
培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、例えば、有機窒素源に由来する総窒素の濃度に対するアミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度（％）／有機窒素源に由来する総窒素の濃度（％））が０．７５以上、０．８３以上、１．１以上、１．２以上、１．９以上、または２．１以上となるような比率であってよい。培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、例えば、有機窒素源に由来する総窒素の濃度に対するアミノ酸の
濃度の比率（アミノ酸の濃度（％）／有機窒素源に由来する総窒素の濃度（％））が１６６以下、１５０以下、８３以下、または７５以下となるような比率であってよい。培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、具体的には、例えば、有機窒素源に由来する総窒素の濃度に対するアミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度（％）／有機窒素源に由来する総窒素の濃度（％））が１．９〜１５０または１．９〜７５となるような比率であってもよく、２．１〜１６６または２．１〜８３となるような比率であってもよい。上記比率は、いずれも、アミノ酸がメチオニンとフェニルアラニンのいずれである場合に適用されてもよい。有機窒素源に由来する総窒素の濃度に対するアミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度（％）／有機窒素源に由来する総窒素の濃度（％））は、例えば、アミノ酸がメチオニンである場合に１．９〜１５０または１．９〜７５であってもよく、アミノ酸がフェニルアラニンである場合に２．１〜１６６または２．１〜８３であってもよい。
【００６０】
培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、例えば、有機窒素源に由来する総窒素の重量に対するアミノ酸の物質量の比率（アミノ酸の物質量／有機窒素源に由来する総窒素の重量）が０．００５（ｍｏｌ／ｇ）以上、０．００７５（ｍｏｌ／ｇ）以上、または０．０１２５（ｍｏｌ／ｇ）以上となるような比率であってよい。培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、例えば、有機窒素源に由来する総窒素の重量に対するアミノ酸の物質量の比率（アミノ酸の物質量／有機窒素源に由来する総窒素の重量）が１．０（ｍｏｌ／ｇ）以下、または０．５０（ｍｏｌ／ｇ）以下となるような比率であってよい。培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、具体的には、例えば、有機窒素源に由来する総窒素の重量に対するアミノ酸の物質量の比率（アミノ酸の物質量／有機窒素源に由来する総窒素の重量）が０．０１２５（ｍｏｌ／ｇ）〜１．０（ｍｏｌ／ｇ）、または０．０１２５（ｍｏｌ／ｇ）〜０．５０（ｍｏｌ／ｇ）となるような比率であってよい。
【００６１】
培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、例えば、有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総濃度に対するアミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度（％）／有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総濃度（％））が３．７５以上、４．１５以上、５．５以上、６．０以上、９．４以上、または１０．４以上となるような比率であってよい。培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、例えば、有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総濃度に対するアミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度（％）／有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総濃度（％））が８３０以下、７５０以下、４１５以下、または３７５以下となるような比率であってよい。培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、具体的には、例えば、有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総濃度に対するアミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度（％）／有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総濃度（％））が９．４〜７５０または９．４〜３７５となるような比率であってもよく、１０．４〜８３０または１０．４〜４１５となるような比率であってもよい。上記比率は、いずれも、アミノ酸がメチオニンとフェニルアラニンのいずれである場合に適用されてもよい。有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総濃度に対するアミノ酸の濃度の比率（アミノ酸の濃度（％）／有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総濃度（％））は、例えば、アミノ酸がメチオニンである場合に９．４〜７５０または９．４〜３７５であってもよく、アミノ酸がフェニルアラニンである場合に１０．４〜８３０または１０．４〜４１５であってもよい。なお、ここでいう「有機窒素源中の遊離アミノ酸（有機窒素源に由来する遊離アミノ酸）」は、メチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸に限られず、他のアミノ酸を包含する。
【００６２】
培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、例えば、有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総量に対するアミノ酸の物質量の比率（アミノ酸の物質量／有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総量）が０．０２５（ｍｏｌ／ｇ）以上、０．０３７５（ｍｏｌ／ｇ）以上、または０．０６２５（ｍｏｌ／ｇ）以上となるような比率であってよい。培地
中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、例えば、有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総量に対するアミノ酸の物質量の比率（アミノ酸の物質量／有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総量）が５．０（ｍｏｌ／ｇ）以下、または２．５（ｍｏｌ／ｇ）以下となるような比率であってよい。培地中のアミノ酸および有機窒素源の濃度の比率は、具体的には、例えば、有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総量に対するアミノ酸の物質量の比率（アミノ酸の物質量／有機窒素源に由来する遊離アミノ酸の総量）が０．０６２５（ｍｏｌ／ｇ）〜５．０（ｍｏｌ／ｇ）、または０．０６２５（ｍｏｌ／ｇ）〜２．５（ｍｏｌ／ｇ）となるような比率であってよい。なお、ここでいう「有機窒素源中の遊離アミノ酸（有機窒素源に由来する遊離アミノ酸）」は、メチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸に限られず、他のアミノ酸を包含する。
【００６３】
有機窒素源中の総窒素量としては、例えば、製造元のマニュアルや各種文献に記載された値を用いることができる。また、有機窒素源中の総窒素量は、例えば、公知の手法により決定することができる。
【００６４】
有機窒素源中の遊離アミノ酸の総量としては、例えば、製造元のマニュアルや各種文献に記載された値を用いることができる。また、有機窒素源中の遊離アミノ酸の総量は、例えば、公知の手法により決定することができる。
【００６５】
＜２−４＞その他の成分
培地は、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。その他の成分としては、例えば、酵母等の微生物の培養に用いられる成分を用いることができる。
【００６６】
その他の成分としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分が挙げられる。
【００６７】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。
【００６８】
窒素源として、具体的には、例えば、ペプトン、肉エキス等の他の有機窒素源が挙げられる。
【００６９】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩が挙げられる。
【００７０】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。
【００７１】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類、他のアミノ酸類、ビタミン類、核酸類、これらを含有するペプトン等の有機成分が挙げられる。
【００７２】
その他の成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００７３】
培地中のその他の成分の濃度は、本発明の培地中で本発明の酵母を培養した際に風味物質が生成される限り特に制限されない。例えば、その他の成分として窒素源を含有する場
合、有機窒素源が主要な窒素源である（ただしアミノ酸は除く）のが好ましい。「有機窒素源が主要な窒素源である（ただしアミノ酸は除く）」とは、酵母エキスおよび大豆タンパク質分解物から選択される有機窒素源由来の総窒素の量が、メチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸以外の全培地成分由来の総窒素の量に対して、例えば、５０％以上、７０％以上、または９０％以上であることを意味してよい。
【００７４】
本発明の培地は、例えば、炭素源を含んでいてよい。培地中の炭素源の濃度は、本発明の培地中で本発明の酵母を培養した際に風味物質が生成される限り特に制限されない。培地中の炭素源の濃度は、例えば、１％〜３０％、または５〜２０％であってよい。なお、有機窒素源等からの炭素源の持ち込みがある場合は、当該持ち込み分と合計して上記例示した濃度範囲となるように炭素源を添加してよい。
【００７５】
また、本発明の培地は、例えば、塩化ナトリウムを含んでいてよい。培地中の塩化ナトリウムの濃度は、本発明の培地中で本発明の酵母を培養した際に風味物質が生成される限り特に制限されない。培地中の塩化ナトリウムの濃度は、例えば、０．１％〜２０％、または０．５〜１０％であってよい。なお、有機窒素源等からの塩化ナトリウムの持ち込みがある場合は、当該持ち込み分と合計して上記例示した濃度範囲となるように塩化ナトリウムを添加してよい。
【００７６】
＜３＞培養条件
培養は、有機窒素源およびアミノ酸を含有する培地を用いること以外は、酵母の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。
【００７７】
培養は、液体培地を用いて好気的に行うことができる。培養は、具体的には、通気培養または振盪培養で行うことができる。培養温度は、例えば、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃であってよい。培地のｐＨは、例えば、５〜９であってよい。ｐＨ調整には、無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質を使用することができる。培養期間は、例えば、１０時間〜２４０時間、好ましくは２０〜１００時間であってよい。このような条件下で培養することにより、培地中に風味物質が蓄積する。
【００７８】
風味物質は、培地中に、例えば、１００ｐｐｍ以上、２００ｐｐｍ以上、５００ｐｐｍ以上、または１０００ｐｐｍ以上の濃度で蓄積してよく、８０００ｐｐｍ以下、５０００ｐｐｍ以下、または３０００ｐｐｍ以下の濃度で蓄積してよい。なお、メチオノールおよび２−フェニルエタノールの両方が生成する場合、上記例示した蓄積濃度は、メチオノールおよび２−フェニルエタノールのいずれか一方の蓄積濃度であってもよく、メチオノールおよび２−フェニルエタノールのそれぞれの蓄積濃度であってもよく、メチオノールおよび２−フェニルエタノールの蓄積濃度の合計であってもよい。
【００７９】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。
【００８０】
本発明において、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。有機窒素源およびアミノ酸は、少なくとも本培養の際に培地に含有される。
【００８１】
本発明において、各培地成分、すなわち有機窒素源、アミノ酸、およびその他の成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および／または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
【００８２】
有機窒素源およびアミノ酸は、それぞれ、初発培地、流加培地、またはその両方に、上記例示した濃度範囲で含有されていてよい。
【００８３】
また、有機窒素源が流加培地に含有される場合、有機窒素源は、流加後の培地中の有機窒素源濃度が上記例示した濃度範囲となるように、流加培地に含有されていてよい。また、アミノ酸が流加培地に含有される場合、アミノ酸は、流加後の培地中のアミノ酸濃度が上記例示した濃度範囲となるように、流加培地に含有されていてよい。
【００８４】
有機窒素源およびアミノ酸は、培養の全期間において一定の濃度範囲で培地に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。例えば、一定期間、有機窒素源および／またはアミノ酸が不足していてもよい。「不足する」とは、必要量を満たさないことをいい、例えば、培地中の濃度がゼロであることであってよい。「一定期間」とは、例えば、培養の全期間の内の、１０％以下の期間、２０％以下の期間、または３０％以下の期間であってよい。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、「一定期間」とは、例えば、本培養の全期間の内の、１０％以下の期間、２０％以下の期間、または３０％以下の期間であってよい。有機窒素源が不足する期間には、他の窒素源が充足されているのが好ましい。例えば、有機窒素源およびアミノ酸を含有せず、且つ、有機窒素源以外の窒素源等を含有する培地で培養を開始し、所定の期間経過後に有機窒素源およびアミノ酸を培地に添加し、培養を継続してもよい。このように、一定期間、有機窒素源および／またはアミノ酸が不足していても、有機窒素源およびアミノ酸を含有する培地での培養期間が存在する限り、「有機窒素源およびアミノ酸を含有する培地中で酵母を培養する」ことに含まれる。
【００８５】
流加培養または連続培養においては、流加は、培養の全期間を通じて継続されてもよく、培養の一部の期間においてのみ継続されてもよい。また、流加培養または連続培養においては、複数回の流加が間欠的に行われてもよい。
【００８６】
複数回の流加が間欠的に行われる場合、１回当たりの流加の継続時間が、例えば、複数回の流加の合計時間の３０％以下、２０％以下、または１０％以下となるように、流加の開始と停止を繰り返してもよい。
【００８７】
連続培養においては、培養液の引き抜きは、培養の全期間を通じて継続されてもよく、培養の一部の期間においてのみ継続されてもよい。また、連続培養においては、複数回の培養液の引き抜きが間欠的に行われてもよい。培養液の引き抜きと流加は、同時に行われてもよく、そうでなくてもよい。例えば、培養液の引き抜きを行った後で流加を行ってもよく、流加を行った後で培養液の引き抜きを行ってもよい。引き抜く培養液量は、流加させる培地量と同量であるのが好ましい。ここで、「同量」とは、例えば、流加させる培地量に対して９３〜１０７％の量であってよい。
【００８８】
培養液を連続的に引き抜く場合には、例えば、流加の開始前に、流加と同時に、または流加の開始後に、引き抜きを開始してよい。具体的には、例えば、流加の開始後５時間以内、３時間以内、または１時間以内に、引き抜きを開始してよい。
【００８９】
培養液を間欠的に引き抜く場合には、例えば、風味物質の濃度が所望の濃度に到達したときに、培養液を一部引き抜き、新たに培地を流加して培養を継続してよい。
【００９０】
また、引き抜いた培養液を培養上清と菌体に分離し、菌体を発酵槽に戻して再利用してもよい。
【００９１】
培地中に風味物質が蓄積したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。
【００９２】
＜４＞本発明の調味料
このようにして得られた風味物質を含有する培養物は、調味料として、飲食品の調味に利用できる。培養物は、そのまま調味料として利用してもよく、適宜処理を行ってから調味料として利用してもよい。処理としては、例えば、固形分を除去する処理、滅菌処理、濃縮、希釈、精製が挙げられる。これらの処理は適宜組み合わせて実施できる。
【００９３】
例えば、培養物から得られた培養上清を調味料として利用してもよい。培養上清は、培養物を遠心分離や濾過等の固形分を除去する処理に供することにより得られる。また、培養物や培養上清は、滅菌処理に供してから調味料として利用してもよい。滅菌処理は、例えば、６０℃で１０分以上の加熱、または０．４５μｍのフィルター濾過により行うことができる。また、培養物や培養上清は、濃縮または希釈してから調味料として利用してもよい。また、風味物質を所望の程度に精製してから調味料として利用してもよい。精製は、化合物の精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【００９４】
また、培養物や上述したようなその処理物は、他の成分と組み合わせて調味料として利用してもよい。他の成分は経口摂取可能であれば特に制限されない。例えば、調味料や飲食品に配合して利用されるものを利用することができる。
【００９５】
「その他の成分」として、具体的には、例えば、砂糖、蜂蜜、メープルシロップ、スクロース、グルコース、フルクトース、異性化糖、オリゴ糖等の糖類；キシリトール、エリスリトール等の糖アルコール類；天然または人工甘味料；食塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；酢酸、クエン酸等の有機酸類およびその塩；グルタミン酸、グリシン等のアミノ酸類（メチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸には限らない）およびその塩；イノシン酸、グアニル酸、キサンチル酸等の核酸類およびその塩；食物繊維、ｐＨ緩衝剤、香料、食用油、エタノール、水が挙げられる。塩については、上述のメチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸の塩の記載を準用できる。
【００９６】
これらの成分は、単独で、あるいは任意の組み合わせで利用されてよい。
【００９７】
本発明の調味料の形態は特に制限されず、例えば、粉末状、顆粒状、液状、ペースト状、キューブ状等のいかなる形態に調製されてもよい。
【００９８】
本発明の調味料における風味物質の濃度は、本発明の調味料を用いて調味した飲食品を喫食する際に風味物質としての効果が得られる限り特に制限されない。本発明の調味料における風味物質の濃度は、本発明の調味料の形態や飲食品の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の調味料における風味物質の濃度は、例えば、１００ｐｐｍ以上、２
００ｐｐｍ以上、５００ｐｐｍ以上、または１０００ｐｐｍ以上であってよく、８０００ｐｐｍ以下、５０００ｐｐｍ以下、または３０００ｐｐｍ以下であってよい。なお、本発明の調味料がメチオノールおよび２−フェニルエタノールの両方を含有する場合、上記例示した濃度は、メチオノールおよび２−フェニルエタノールのいずれか一方の濃度であってもよく、メチオノールおよび２−フェニルエタノールのそれぞれの濃度であってもよく、メチオノールおよび２−フェニルエタノールの濃度の合計であってもよい。
【００９９】
本発明の調味料におけるその他の成分の濃度は、本発明の調味料を用いて調味した飲食品を喫食する際に風味物質としての効果が得られる限り特に制限されない。本発明の調味料におけるその他の成分の濃度は、本発明の調味料の形態や飲食品の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【実施例】
【０１００】
本発明は、以下の実施例によって更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定する意図と解してはならない。なお、以下の実施例で用いたメチオニンおよびフェニルアラニンは、いずれもＬ体である。ただし、別途、Ｄ−メチオニンを用いても同様の効果が得られることを確認した。
【０１０１】
実施例１：有機窒素源およびメチオニンを含有する培地を用いたメチオノール生成
【０１０２】
本実施例では、種々の有機窒素源およびメチオニンを含有する培地で酵母を培養し、メチオノールの生成量について確認した。
【０１０３】
有機窒素源としては、醤油「Light Soy Sauce」（AMOY製）、「味液」（味の素株式会
社製）、および「酵母エキスＮｏ．１」（味の素株式会社製）を用いた。なお、「味液」とは、大豆を含む植物タンパク質原料の塩酸加水分解物である。これら有機窒素源に含まれる総窒素（total nitrogen；ＴＮ）量およびＮａＣｌ量を表１に示す。
【０１０４】
【表１】
2014204715.tif 000003
【０１０５】
Zygosaccharomyces rouxii CN1380を、下記条件でシード培養およびメイン培養に供し
た。培地の組成を表２に示す。シード培養およびメイン培養ともに、有機窒素源由来の総窒素濃度が０．１％となるように有機窒素源を配合した。また、メイン培養では、終濃度が１．０％となるようにＮａＣｌを補填した。メイン培養開始後０、２４、４８、７２、９６時間目に、各フラスコから培養液（０時間目は５ｍＬ、２４〜９６時間目は１０ｍＬ）を採取し、０〜９６時間目にＯＤおよび生菌数を、４８〜９６時間目にメチオノール濃度を、それぞれ測定した。生菌数は、培養液を１０2、１０4、１０6、１０8倍希釈したものをそれぞれＰＤＡプレートに０．５ｍＬ塗布し、出現したコロニー数をカウントすることにより測定した。メチオノール濃度は、ＧＣ−ＭＳにより測定した。
【０１０６】
＜シード培養の培養条件＞
培養系    坂口フラスコ
培地容量  100 mL
シード量  グリセロールストック 0.2 mL（0.2 %）
温度      30 ℃
振とう    120 rpm
培養時間  72 hr
培地組成  表２のとおり
【０１０７】
＜メイン培養の培養条件＞
培養系    坂口フラスコ
培地容量  150 mL
シード量  シード培養液 0.75 mL（0.5 %）
温度      33 ℃
振とう    120 rpm
培養時間  96 hr
培地組成  表２のとおり
【０１０８】
【表２】
2014204715.tif 000004
【０１０９】
結果を図１〜３に示す。いずれの有機窒素源を用いた場合にも、メチオノールの生成量は１００ｐｐｍ以上であった（図３）。すなわち、有機窒素源およびメチオニンを含有する培地で酵母を培養することにより、十分量のメチオノールが生成した。
【０１１０】
実施例２：メチオニンと総窒素の比率がメチオノール生成に与える影響
本実施例では、有機窒素源を種々の濃度でメチオニンと併用し、メチオニンと総窒素の比率がメチオノール生成に与える影響について評価した。有機窒素源としては、「味液」を用いた。
【０１１１】
Zygosaccharomyces rouxii CN1380を、メイン培養の培地として表３に示す組成の培地
を用いたこと以外は実施例１と同様の条件で、シード培養およびメイン培養に供した。メイン培養では、「味液」由来の総窒素濃度が０．００５％〜０．４％となるように「味液」を配合した。また、メイン培養では、終濃度が２．７％となるようにＮａＣｌを補填した。メイン培養開始後、実施例１と同様の条件で、培養液を採取し、ＯＤ、生菌数、およびメチオノール濃度を測定した。生菌数は、培養液を１０2、１０4、１０6倍希釈したも
のをそれぞれＰＤＡプレートに０．５ｍＬ塗布し、出現したコロニー数をカウントすることにより測定した。メチオノール濃度は、ＧＣ−ＭＳにより測定した。
【０１１２】
【表３】
2014204715.tif 000005
【０１１３】
結果を図４〜６に示す。いずれの試験区でも、メチオノールの生成量は１００ｐｐｍ以上であった（図６）。すなわち、メチオニン濃度：ＴＮ濃度が１．９：１〜１５０：１（メチオニンの物質量／ＴＮ重量が０．０１２５（ｍｏｌ／ｇ）〜１．０（ｍｏｌ／ｇ））の場合に、十分量のメチオノールが生成した。
【０１１４】
実施例３：メチオニン濃度がメチオノール生成に与える影響
本実施例では、メチオニンを種々の濃度で有機窒素源と併用し、メチオニン濃度がメチオノール生成に与える影響について評価した。有機窒素源としては、「味液」を用いた。
【０１１５】
Zygosaccharomyces rouxii CN1380を、メイン培養の培地として表４に示す組成の培地
を用いたこと以外は実施例１と同様の条件で、シード培養およびメイン培養に供した。メイン培養では、「味液」由来の総窒素濃度が０．１％となるように「味液」を配合した。また、メイン培養では、終濃度が０〜１００ｍＭとなるようにメチオニンを配合した。メイン培養開始後、実施例１と同様の条件で、培養液を採取し、ＯＤ、生菌数、およびメチオノール濃度を測定した。生菌数は、培養液を１０2、１０4、１０6倍希釈したものをそ
れぞれＰＤＡプレートに０．５ｍＬ塗布し、出現したコロニー数をカウントすることにより測定した。メチオノール濃度は、ＧＣ−ＭＳにより測定した。
【０１１６】
【表４】
2014204715.tif 000006
【０１１７】
結果を図７〜９に示す。メチオニンを添加していない試験区ではメチオノールの生成が見られなかったのに対し、メチオニンを２５ｍＭ以上添加した試験区では、メチオノールの生成量は１００ｐｐｍ以上であった（図９）。すなわち、メチオニン濃度が２５ｍＭ〜１００ｍＭの場合に、十分量のメチオノールが生成した。
【０１１８】
実施例４：有機窒素源およびフェニルアラニンを含有する培地を用いた２−フェニルエタノール生成
【０１１９】
本実施例では、種々の有機窒素源およびフェニルアラニンを含有する培地で酵母を培養し、２−フェニルエタノールの生成量について確認した。
【０１２０】
有機窒素源としては、醤油「Light Soy Sauce」（AMOY製）、「味液」（味の素株式会
社製）、および「酵母エキスＮｏ．１」（味の素株式会社製）を用いた。
【０１２１】
Zygosaccharomyces rouxii CN1380を、下記条件でシード培養およびメイン培養に供し
た。培地の組成を表５に示す。シード培養およびメイン培養ともに、有機窒素源由来の総窒素濃度が０．１％となるように有機窒素源を配合した。また、メイン培養では、終濃度が１．０％となるようにＮａＣｌを補填した。メイン培養開始後０、２４、４８、７２、９６時間目に、各フラスコから培養液（０時間目は５ｍＬ、２４〜９６時間目は１０ｍＬ）を採取し、０〜９６時間目にＯＤおよび生菌数を、４８〜９６時間目に２−フェニルエタノール濃度を、それぞれ測定した。生菌数は、培養液を１０2、１０4、１０6倍希釈し
たものをそれぞれＰＤＡプレートに０．５ｍＬ塗布し、出現したコロニー数をカウントすることにより測定した。２−フェニルエタノール濃度は、ＧＣ−ＭＳにより測定した。
【０１２２】
＜シード培養の培養条件＞
培養系    坂口フラスコ
培地容量  100 mL
シード量  グリセロールストック 0.2 mL（0.2 %）
温度      30 ℃
振とう    120 rpm
培養時間  72 hr
培地組成  表５のとおり
【０１２３】
＜メイン培養の培養条件＞
培養系    坂口フラスコ
培地容量  150 mL
シード量  シード培養液 0.75 mL（0.5 %）
温度      33 ℃
振とう    120 rpm
培養時間  96 hr
培地組成  表５のとおり
【０１２４】
【表５】
2014204715.tif 000007
【０１２５】
結果を図１０〜１２に示す。いずれの有機窒素源を用いた場合にも、２−フェニルエタノールの生成量は１００ｐｐｍ以上であった（図１２）。すなわち、有機窒素源およびフェニルアラニンを含有する培地で酵母を培養することにより、十分量の２−フェニルエタノールが生成した。
【０１２６】
実施例５：フェニルアラニンと総窒素の比率が２−フェニルエタノール生成に与える影響
本実施例では、有機窒素源を種々の濃度でフェニルアラニンと併用し、フェニルアラニンと総窒素の比率が２−フェニルエタノール生成に与える影響について評価した。有機窒素源としては、「味液」を用いた。
【０１２７】
Zygosaccharomyces rouxii CN1380を、メイン培養の培地として表６に示す組成の培地
を用いたこと以外は実施例４と同様の条件で、シード培養およびメイン培養に供した。メイン培養では、「味液」由来の総窒素濃度が０．００５％〜０．４％となるように「味液」を配合した。また、メイン培養では、終濃度が２．７％となるようにＮａＣｌを補填した。メイン培養開始後、実施例４と同様の条件で、培養液を採取し、ＯＤ、生菌数、および２−フェニルエタノール濃度を測定した。生菌数は、培養液を１０2、１０4、１０6倍
希釈したものをそれぞれＰＤＡプレートに０．５ｍＬ塗布し、出現したコロニー数をカウントすることにより測定した。２−フェニルエタノール濃度は、ＧＣ−ＭＳにより測定した。
【０１２８】
【表６】
2014204715.tif 000008
【０１２９】
結果を図１３〜１５に示す。いずれの試験区でも、２−フェニルエタノールの生成量は１００ｐｐｍ以上であった（図１５）。すなわち、フェニルアラニン濃度：ＴＮ濃度が２．１：１〜１６６：１（フェニルアラニンの物質量／ＴＮ重量が０．０１２５（ｍｏｌ／ｇ）〜１．０（ｍｏｌ／ｇ））の場合に、十分量の２−フェニルエタノールが生成した。
【０１３０】
実施例６：フェニルアラニン濃度が２−フェニルエタノール生成に与える影響
本実施例では、フェニルアラニンを種々の濃度で有機窒素源と併用し、フェニルアラニン濃度が２−フェニルエタノール生成に与える影響について評価した。有機窒素源としては、「味液」を用いた。
【０１３１】
Zygosaccharomyces rouxii CN1380を、メイン培養の培地として表７に示す組成の培地
を用いたこと以外は実施例４と同様の条件で、シード培養およびメイン培養に供した。メイン培養では、「味液」由来の総窒素濃度が０．１％となるように「味液」を配合した。また、メイン培養では、終濃度が０〜１００ｍＭとなるようにフェニルアラニンを配合した。メイン培養開始後、実施例４と同様の条件で、培養液を採取し、ＯＤ、生菌数、および２−フェニルエタノール濃度を測定した。生菌数は、培養液を１０2、１０4、１０6倍
希釈したものをそれぞれＰＤＡプレートに０．５ｍＬ塗布し、出現したコロニー数をカウントすることにより測定した。２−フェニルエタノール濃度は、ＧＣ−ＭＳにより測定した。
【０１３２】
【表７】
2014204715.tif 000009
【０１３３】
結果を図１６〜１８に示す。フェニルアラニンを添加していない試験区では２−フェニルエタノールの生成が見られなかったのに対し、フェニルアラニンを２５ｍＭ以上添加した試験区では、２−フェニルエタノールの生成量は１００ｐｐｍ以上であった（図１８）。すなわち、フェニルアラニン濃度が２５ｍＭ〜１００ｍＭの場合に、十分量の２−フェニルエタノールが生成した。
【図１】
2014204715.tif 000010
【図２】
2014204715.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014204715.tif 000019
【図１１】
2014204715.tif 000020
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2014204715.tif 000023
【図１５】
2014204715.tif 000024
【図１６】
2014204715.tif 000025
【図１７】
2014204715.tif 000026
【図１８】
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