(57)【要約】      （修正有）【課題】弾性線維を増強させるための、水溶性フィブリリンの抽出方法、および水溶性エラスチンとの混合による皮膚線維芽細胞への刺激方法の提供。【解決手段】フィブリリン組成物を用いた弾性組織増強方法であり、水溶性フィブリリンの製造技術と、水溶性フィブリリンと水溶性エラスチンを複合化して皮膚線維芽細胞に作用させる弾性線維増強技術からなり、詳しくは生体弾性組織から得られる水溶性フィブリリンの抽出方法と、皮膚線維芽細胞表面上もしくは細胞周辺に形成する弾性線維を増強させる組成。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚線維芽細胞に作用して、肌の弾力性を改善する肌の弾力性改善剤であって、生体組織から抽出される水溶性フィブリリンを主成分とし、弾性線維の形成を刺激することを特徴とする肌の弾力性改善剤。
【請求項２】
前記水溶性フィブリリンは、pH6〜pH8の中性条件で完全に水溶解性であることを特徴とする請求項１に記載の肌の弾力性改善剤。
【請求項３】
前記水溶性フィブリリンは、pH8以上のアルカリ性条件で完全に水溶解性であることを特徴とする請求項１に記載の肌の弾力性改善剤。
【請求項４】
水溶性エラスチン、加水分解エラスチン、トロポエラスチン、低分子エラスチン、エラスチンペプチド、エラスチン分解物、エラスチン様ペプチド、α−エラスチン、β−エラスチン、κ−エラスチン、アイソタイプ型エラスチン（エラスチンＡ、エラスチンＢ、エラスチンＣ、エラスチンＤ）から選択される何れか一つまたは一つ以上の物質と混合することにより、弾性線維の形成が増強することを特徴とする請求項１〜３に記載の肌の弾力性改善剤。
【請求項５】
上記請求項１〜４に記載の肌の弾力性改善剤であって、肌における弾性線維の形成を誘導して肌の弾力性を改善することを特徴とする化粧組成物。
【請求項６】
上記請求項１〜４に記載の肌の弾力性改善剤であって、肌における弾性線維の形成を誘導して、肌の弾力性を改善することを特徴とする栄養補助組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフィブリリン組成物を用いた弾性組織増強法であり、水溶性フィブリリンの製造技術と水溶性フィブリリンと水溶性エラスチンを複合化して皮膚線維芽細胞に作用させる弾性線維増強技術からなり、詳しくは生体弾性組織から得られる水溶性フィブリリンの抽出方法と、皮膚線維芽細胞表面上もしくは細胞周辺に形成する弾性線維を増強させる組成に関わる。
【背景技術】
【０００２】
生体組織は細胞と細胞を支える基質（細胞外基質）から構成される。また生体組織は上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織の４種類に分類され、特に身体の形や構造を支える支持組織を結合組織と呼び、その主な構成は網目構造を形成する膠原線維と弾性線維からなり、こうした線維を生み出す線維芽細胞が組織中に存在し合成と分解を調節している。結合組織には筋肉組織および神経組織が付随して複合化し器官、臓器などの高次構造が構築されている。膠原線維はコラーゲンを主成分とする鋼の様な硬い構造を支え、弾性線維はエラスチンを主成分としフィブリリンとの複合化により張力を発揮させ伸縮性を有する構造を支えている。膀胱壁や心臓壁、血管壁などの臓器壁や肺の肺包、靭帯、弾性軟骨などの弾性組織は強度と変形性を兼ね備えた構造である。
【０００３】
皮膚組織は角質・上皮組織と、その下部に存在し構造を支えている結合組織である真皮組織から構成され、真皮組織の影響を大きく受ける。即ち、真皮組織に働く弾性線維の張力が肌のハリを担い表層のシワを防いでいる。真皮層の線維芽細胞は、基本的には膠原線維と弾性線維のどちらも合成できるが、老化に伴い（特に３０歳台以降）弾性線維の合成量が低下し、相対的に膠原線維の弾性線維に対する割合が増加していく。こうした支持構造の量的な減少に伴い張力が圧倒的に低下することで、肌のたるみを防ぐことが困難になりしわが発生すると考えられる。
【０００４】
弾性線維はエラスチンを主体として微細線維であるフィブリリンとの複合線維であることが知られる。また紫外線などによりダメージを受けることで分解され、通常よりも早い段階で減少する。炎症を伴う日焼けなどの際には白血球や増殖性の細胞からエラスチンを分解するエラスターゼが産生され、より多くの弾性線維が失われることになる。
【０００５】
これまでに肌のハリに重要な弾性線維を増強させるためには、主にエラスチンの産生を促す目的の物質が数多く開発され、そうした活性化物質として化粧品や栄養食品あるいは医薬品等に応用が試みられてきた。例えば特許文献１では経口用の皮膚老化予防・改善剤が示され、ムコ多糖と、コラーゲンまたはエラスチン、コエンザイムＱ１０を用いている。また特許文献２においては、エラスチンやコラーゲンに対してビタミン及び銅塩類を一定割合配合することで産生を促している。更に特許文献３、４および５においては、アオギヌゴケ、ナルコユリおよびシコマリンなどの植物抽出物を用いたエラスチン産生刺激が示されている。こうした多くの試みにも関わらず実際には弾性線維を充分に増強させることができず、また補充方法としても明確な原理は確立されていない。特に植物由来原料では、アレルギー反応等の免疫的な反応性が大きいことが問題になる。また特許文献６においては、活性ペプチド配列のＬｅｕ-Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａがエラスチン遺伝子の産生に効果的に作用するとある。特許文献７においては、Ｐｒｏ−Ｇｌｙのジペプチドが効果的な最小配列とある。こうした合成ペプチドによる検証は細胞表面のレセプターを刺激しやすいことが予想され、また吸収性の良さを鑑みるとエラスチンを産生させる効果は期待できる。
【０００６】
一方で、肌のハリはコラーゲンの含有量を増やすことで達成されるという考え方の化粧品や栄養食品が存在する。例えば特許文献８においてはオリーブの葉に含まれる成分とコラーゲンによりコラーゲンの産生を高めることができる食品の内容がある。特許文献９においても、燕窩酵素分解物がコラーゲンの産生を高めることが示されている。ところが、生体組織中のコラーゲンを主体とする膠原線維は、組織そのものを丈夫に、そして硬くするための特性を有する構成成分であり、肌を伸縮性に富ますための張力を発生させる弾性線維の様な構造的機能は期待できないことは明らかである。即ち、肌のハリを取り戻ししわの発生を防ぐ方法は、結合組織内の弾性線維を増強させることにあると考えられるが、エラスチンの産生を促すだけではその効果は不十分である。
【０００７】
弾性線維が減少していく大きな原因の一つに炎症などによる細胞外基質分解の加速が挙げられる。特に日焼けなどの紫外線による障害でフィブリリンが失われることが報告されている（非特許文献１）。フィブリリンはエラスチンの組織化構造を促進する足場を提供し弾性線維を形成させ、皮膚の弾力性を促進する働きが知られる。弾性線維は主にエラスチンとフィブリリンから構成されるが、伸縮性を担うのは架橋が進んだエラスチンであり、エラスチンを太い線維状に配置させ束ねることがフィブリリンの役割として知られる。この微細線維であるフィブリリンが存在することで、エラスチンが良好に線維化し、弾性線維による肌のハリが保たれる。
【０００８】
しかしながら、弾性線維を形成させる刺激として外部からフィブリリンを供給する発想はこれまでなかった。この理由として、フィブリリンの大量製造および水溶化技術が確立されていないことにある。フィブリリンはフィブリリン−１とフィブリリン−２の二種類が知られるが、生体組織からエラスチンを抽出製造する際に回収されることは、エラスチンを製造する同業者であれば周知の現象であるが、弾性線維からの分離が難しく純度の高い水溶性のフィブリリンを回収する方法は少なく、従って供給技術は極めて例が少ない。
【０００９】
そこで、フィブリリンの産生低下の改善あるいはフィブリリンの産生促進を目的とした技術の開発が試みられている。例えば特許文献９によればプレニル化イソフラボノイドを皮膚線維芽細胞に添加させることで、フィブリリンの産生が増加することが示されている。しかしながら、フィブリリンの産生を促すことでエラスチンの堆積を促すことはできても、皮膚の線維芽細胞からのエラスチンの産生を促す事が出来ずに、結果として弾性線維の増強効果は見込めず、しわの発生を防ぐ方法としては不十分であった。特にエラスチンの産生の際には、同一細胞からコラーゲンの産生も促進されることが多く、同一細胞の産生能力の中で考慮すると相対的にエラスチン産生能力が低下し、弾性線維の増強効果が見られないもしくは低い状態になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−１４３６７１
【特許文献２】特開２０１２−１３６４６２
【特許文献３】特開２００６−６０３４１
【特許文献４】特開２００１−５１３５０９
【特許文献５】ＷＯ２００４/０８５４２９
【特許文献６】特開２００８−７４７８８
【特許文献７】特開２０１１−５２９９０８
【特許文献８】特開２００６−１９１８４５
【特許文献９】特開２０１１−００６３３１
【特許文献１０】特開２００９−０４０７１３
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｉｎｏｋａｗａら  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０５巻、２５４−２５８頁、１９９５年
【非特許文献２】ＨｉｎｅｋらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８１巻、３６９８−７１０頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明において解決しようとする課題は、上述の公知の技術が抱える問題点を解決することであり、具体的には生体弾性組織から効率よく水溶性フィブリリンを抽出する方法を提供し、抽出した水溶性フィブリリンを皮膚線維芽細胞に対し作用させることで細胞表面にエラスチンの足場を作り、また同時に水溶性エラスチンを作用させることで皮膚線維芽細胞に新しいエラスチンの産生を促し、同時にコラーゲンの産生比率を低下させ、この二種類の効果により結果的に細胞表面および周辺の弾性線維を増強させる組成を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は上記の課題を解決するため、皮膚線維芽細胞に対し水溶性フィブリリンと水溶性エラスチンを作用させことで、細胞が自ら産生する弾性線維が量的にも質的にも増強されて形成されるという知見を応用するものであり、加えて本発明者が従来から研究開発している水溶性エラスチン（特開２００９−０４０７１３）を基本技術として、これを改良することにより水溶性フィブリリンの製造を可能とし本発明に到達した。
【００１４】
フィブリリンは分子量３５０ｋＤａの高分子量を有し、動脈や肺、靭帯など生体組織の運動が重要な機能に結び付いている器官・臓器等に多く存在する弾性線維に含まれる細胞外基質タンパク質として知られる。弾性線維はエラスチックファイバーとも呼ばれ、主成分はエラスチンである。エラスチンは、細胞の小胞体でトロポエラスチンとして合成された後、エラスチンバインディングプロテイン（ＥＢＰ）、ノイラミニダーゼ１（Ｎｅｕ-1）およびカテプシンＡ（ＣＡ）の3量体とシャペロンを形成し、細胞表面に輸送される。その後、フィブリリンにより形成されたマイクロフィブリル上のガラクトース残基がＥＢＰに結合することでトロポエラスチンが細胞外に放出され、凝集現象であるコアセルベーションによりフィブリリン上に集積される。最後に、リジルオキシダーゼがエラスチンのリシンに作用し、デスモシンやイソデスモシンなどの架橋構造を形成させることでエラスチンとなり、マイクロフィブリルと共に弾性線維として完成する機構が知られている。（ＨｉｎｅｋらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８１巻、３６９８−７１０頁、２００６年）
【００１５】
しかしながら、これまで生体の弾性組織から大量にフィブリリンを抽出し、加えて水溶化させる技術は少なく、そのため水溶性のフィブリリンの効果に関する検証の例は少なかった。一般的にタンパク質を水溶化する場合には、酸あるいはアルカリによる分解や酵素による分解などが考えられる。フィブリリンは酸に耐性があり、熱にも有機溶媒にも強いが、その濃度や条件を上げることでアミノ酸レベルにまで分解することは可能である。しかし、単に加水分解等で低分子化して水溶化する方法では、高分子としてのフィブリリンの機能を破壊することになり、エラスチンの足場としての働きができずに弾性線維の形成は不可能と思われる。つまり、分子量をできるだけ低下させず、なおかつ中性や弱アルカリ性の生理条件下でも完全に溶解している状態が良好で扱いやすい素材であれば、水溶性エラスチンとの相互作用も大きく弾性線維を増強させることに期待できると思われる。
【００１６】
即ち、本発明は皮膚線維芽細胞が関与する肌の弾力性改善のための物質であって、前記肌質改善は弾性線維の形成を刺激し促すことから達成され、この前記物質は生体組織から抽出した水溶性フィブリリンとして選択される物質に関する。
【００１７】
また本発明は、前記水溶性フィブリリンが、pH6〜pH8の中性条件で完全に水溶解性であることを特徴とする中性溶解・水溶性であること。または、pH8以上の弱アルカリ性条件で完全に水溶解性であるアルカリ溶解・水溶性であることが望ましい。水溶性であることが皮膚線維芽細胞に刺激を与える効果が大きいことが理由である。
【００１８】
また本発明は、水溶性のフィブリリンに加えて、水溶性エラスチン、加水分解エラスチン、トロポエラスチン、低分子エラスチン、エラスチンペプチド、エラスチン分解物、エラスチン様ペプチド、α―エラスチン、β―エラスチン、κ―エラスチン、アイソタイプ型エラスチン（エラスチンＡ、エラスチンＢ、エラスチンＣ、エラスチンＤ）から選択される何れか一つまたは一つ以上の物質と同時に用いることにより、皮膚線維芽細胞からのエラスチンの産生を促し加えてエラスチンの集積を促進させることで、結果的に弾性線維の形成を誘導する効果を有する。以上の理由から、弾性線維の増強のためには、混合して作用させることが望ましい。特に水溶性エラスチンと水溶性フィブリリンの混合比率が９０％対１０％である場合が好ましく、より好ましくは９４〜９６％対６〜４％の比率である。この際に、両者の複合体化が顕著に進み、線維芽細胞表面や周辺への弾性線維の産生や堆積効果が加速するのがその理由である。
【００１９】
また本発明は、こうした皮膚線維芽細胞への刺激を誘導する活性化物質である水溶性フィブリリンを含む化粧品や栄養食品を作成することも可能で、水溶性エラスチンとの複合化から弾性線維の増強が期待でき、アンチエイジングなどのしわの発生を防止する効果をもたらす事が期待できる。
【発明の効果】
【００２０】
水溶性フィブリリン組成物を用いて水溶性エラスチンを複合化して皮膚線維芽細胞に作用させることで、エラスチンの新規産生と堆積が促進され、その結果形成された弾性線維が増強し、肌のしわの原因である弾性線維の減少や劣化を防止できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】水溶性フィブリリンの混合比率に対する水溶性エラスチン溶液の透過光強度
【図２】各種添加物に対する細胞外基質（コラーゲンおよびエラスチン）産生能       (a)コラーゲン産生、(b)エラスチン産生、(c)コラーゲンに対するエラスチン比率
【図３】免疫蛍光染色 （a)コントロール, (b)エラスチン添加,(c)エラスチンとフィブリリン添加
【図４】各種添加物に対する細胞当たりの 弾性線維産生能
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の第一の主題は、水溶性フィブリリンを弾性組織から抽出し精製する技術に関する。その一つの方法は生体の動脈組織から加水分解により水溶化する水溶性エラスチンを精製する過程（特許文献７）で生じ、通常は除去する不溶性部分を出発原料とすることで効果的に回収することが可能である。具体的には、不溶性エラスチンを酸により水溶化した溶液を中和することで、水溶性フィブリリンは水溶性エラスチンに結合し不溶化する。この現象を利用して、高純度のフィブリリンを回収する原理を用いる。こうして回収した不溶性部分は希釈していくことで、水溶性エラスチンが再度解離するため、大量の水を加え可溶性部分を除去して完全なる水溶性エラスチンを除去する工程を加える。この水洗操作を繰り返し行い、洗浄液中のエラスチン濃度が限りなくゼロになるまで行うことで、完全にフィブリリンを分離できる。更に、フィブリリン間で生じているＳ−Ｓ結合をセリン等の物質で還元して切断し、尿素を加えアンフォールディングさせて溶解性を増す工程により、中性可溶・水溶性フィブリリンの製造が可能になる。
【００２３】
本発明の第二の主題は、皮膚線維芽細胞表面およびその周辺に弾性線維を形成させるために、細胞が自らエラスチンを産生する刺激に関する。通常皮膚線維芽細胞はコラーゲンおよびエラスチンを産生する能力を有している。この刺激として用いる水溶性エラスチンが、細胞自身のエラスチン産生を促すことが可能な水溶性エラスチンに関する。通常、入手可能な水溶性エラスチンには、生体から抽出した不溶性エラスチンをシュウ酸分解したＥＣＭＬ社製のエラスチンＡ、エラスチンＢ、エラスチンＣおよびエラスチンＤ、またはＥＰＣ社製のα―エラスチンやβ―エラスチンおよびアルカリエタノール処理したκ―エラスチン、ＳＩＧＭＡ社製のトロポエラスチンなどがある。本発明には、こうした水溶性エラスチンの利用が可能であるが、特にアイソタイプ型エラスチンが好適に用いることができる。より望ましくは、クエン酸にて酸加水分解して調節したアイソタイプ型エラスチンである水溶性エラスチンであり、細胞の増殖を促進させ、またコラーゲンよりもエラスチンの産生をより促進することから、エラスチンの産生量を調節するのに好適であることがその理由である。
【００２４】
本発明の第三の主題は、上述のように作成した水溶性フィブリリンと水溶性エラスチンを混合して使用する技術に関する。水溶性エラスチンの中でも、特に分子内にデスモシン構造などの架橋部位濃度が少ないエラスチン（例えばエラスチンＥあるいはエラスチンＤ、またはトロポエラスチン等）では、皮膚線維芽細胞表面上のエラスチンレセプターとの結合性が大きいため、エラスチンの産生刺激を与えやすいと思われる。エラスチンの細胞表面への接着領域としてＶal−Ｇly−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｇlyなどのエラスチン上のアミノ酸配列が得られている。そのため、水溶性エラスチンＥを添加することにより、正常なエラスチン基質に障害が生じて分解された状況を醸したことに相当し、細胞内では新規にエラスチンを合成する反応が生じると考えられる。また、この反応は、架橋構造が多い水溶性エラスチンＡでは効果が小さくなることでも理解できる。架橋構造が多いことでその両脇に位置している接着領域が防がれ機能しにくいと推察できるからである。
【００２５】
本来フィブリリンはフィブリリン１とフィブリリン２の２つのタイプがあり、それぞれわずかにアミノ酸配列が異なるが、その機能に到っては不明な点が多い。フィブリリンは細胞表面に堆積しネットワークを作成する効果が期待できるが、エラスチンを産生するシグナルを与えることはできないため、エラスチンとの複合線維すなわち弾性線維を増強させるには至らない。
【００２６】
線維芽細胞表面に作用しているのはエラスチンペプチドであり、フィブリリンはエラスチンのガイドとして機能している。またエラスチンとフィブリリンは相互作用が大きくエラスチンの線維化を促進する効果が見られる。そのためより高密度、高頻度で細胞表面に刺激を与えやすくなり、細胞自身が産生する弾性線維を増強させる。またフィブリリンは他の弾性線維関連タンパクと質との相互作用を促し、本来の強靭な弾性線維を再生させる効果を促していると考えられる。
【００２７】
上述のようにして水溶性フィブリリンに水溶性エラスチンを作用させた状態を、皮膚線維芽細胞への刺激として利用する手法としては、種々の形態が考えられるが例えば化粧品として皮膚に塗布して用いる方法や、食品として経口で得る方法が通常方法として考えられる。皮膚への適用の場合には配合には特に限定されるものではないが、皮膚への浸透を促す効果のあるもの、例えばオイル、ナノカプセルなどと共に作用させる方法が挙げられる。しかしながら、こうした既存の浸透技術を用いても、またそのままの状態でも利用が可能である。食品として用いる場合においては、消化管内で分解吸収される過程において、低分子化される可能性があるため、本来の足場構造としての働きは期待できない。しかしながら、たとえば胃における分解を抑えるカプセルなどの併用で摂取することで、小腸内でのリンパ管系経路などからの比較的大きめの分子量の吸収経路を利用して、血液中に浸透させる技術を用いた方法が好適な方法として考えられる。血中に吸収されることで、体循環により組織に輸送されそこで線維芽細胞に弾性線維作成効果をもたらす可能性が期待できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例をもって本発明を詳細に説明するが、以下よって示される方法は、作用確認において用いたものであり、これに限定されるものではなく、その要旨を変更することなく様々に改変して実施することができる。
【００２９】
（製造例１−不溶性エラスチンの作製）
ブタ大動脈血管から脂肪を除去し水洗した後、１０％塩化ナトリウム水溶液に浸し１２時間冷蔵庫内で静置し、コラーゲンを溶解除去した。水洗後水を加え圧力鍋で１時間煮沸後、血管付着物を除去し、ミキサーに入れ組織片が１〜５mm片になるまで破砕した。その後、再度圧力鍋で１時間加熱し水洗した。メッシュ状袋に移し電動洗浄機で洗浄した後、エタノールを最終濃度７０％になるように加え１２時間静置した。最終的にエタノールを取り除き温風乾燥機内で不溶性エラスチン（血管１２kgより乾燥重量で約１ｋｇの収量）を得た。
【００３０】
（製造例２−水溶性エラスチンＭＥの作製）
水溶性エラスチンの製法は発明者らが開発した方法（特許文献１０）を基に改良することで作成した。具体的には、不溶性エラスチン５ｋｇに対し１０％クエン酸を３０L加え１２０℃で８時間加熱した。分解反応液を氷水で冷やした後３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し不溶部分を除いた。可溶部に対し２０％水酸化ナトリウムを加え中和した（ｐＨ６．５）。中和の際に発生する沈殿を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し不溶部分を分離した。上澄み液を、分子量２０,０００〜３０,０００Ｄａの限外濾過膜を用いてろ過した。濾液を分子量３，０００Ｄａの限外濾過膜の透析モジュールを用いて、4℃に冷却した脱イオン水に対し、外液のｐＨが５〜６程度になるまで透析しクエン酸を除去した。溶液は再度限外ろ過膜による不溶部分の除去後に、高圧蒸気滅菌および限外ろ過膜処理を繰り返し、最終的に孔サイズ0.22μｍのフィルターによる滅菌を行い完全に無菌状態にする。ろ液をスプレードライヤーにより噴霧乾燥して水溶性エラスチン（約０．２ｋｇ）を得た。
【００３１】
（製造例３−水溶性エラスチンＭＡの作製）
製造例２で加熱後に除いた不溶部分５ｋｇに対し、１０％クエン酸を２０L加え１２０℃で５時間加熱し完全に溶解させた。分解反応液を氷水で冷やした後３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し少量の不溶部分を除いた。２０％水酸化ナトリウムを加え中和した（ｐＨ６．５）。中和の際に発生する沈殿を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し不溶部分を分離した。上澄み液を、分子量２０,０００〜３０,０００Ｄａの限外濾過膜を用いてろ過した。濾液を分子量３，０００Ｄａの限外濾過膜の透析モジュールを用いて、4℃に冷却した脱イオン水に対し、外液のｐＨが５〜６程度になるまで透析しクエン酸を除去した。溶液は再度限外ろ過膜による不溶部分の除去後に、高圧蒸気滅菌および限外ろ過膜処理を繰り返し、最終的に孔サイズ0.22μｍのフィルターによる滅菌を行い完全に無菌状態にする。ろ液をスプレードライヤーにより噴霧乾燥して水溶性エラスチンＭＡ（約１．０ｋｇ）を得た。
【００３２】
（製造例４−中性不溶性フィブリリンの作製）
製造例２の水溶性エラスチンＭＥ製造の過程で、水酸化ナトリウムで中和した際に生じる沈殿を分離した。この沈殿１０Ｌ程度に対し水を１０Ｌ程度加えて撹拌し、水溶性の分画を完全に溶解させる。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上澄みを除いた後に、再度１０Ｌ程度の水を加え撹拌し、この操作を繰り返し、完全に溶解物が無くなるまで洗浄を行う。沈殿部分を温風乾燥機にて乾燥し、中性不溶性フィブリリンを（約２００ｇ）を得た。なお、中性不溶性フィブリリンはｐＨ９以上の溶液では完全溶解するため、アルカリ溶解性・水溶性フィブリリンでもある。
【００３３】
（製造例５−中性溶解性・水溶性フィブリリンの作製）
乾燥した不溶性フィブリリン２００ｇに対し、６Ｍ尿素を５L加え、トリスヒドロキシアミノメタン６０ｇ、ＥＤＴＡ７０ｇおよびＬ−システイン５０ｇを加え撹拌した。４０℃で４８時間加熱した。分解反応液を分子量１０,０００〜１４,０００Ｄａの透析チューブを用い4℃に冷却した脱イオン水に対し、外液のｐＨが５〜６程度になるまで透析を行って尿素、ＥＤＴＡおよびシステインを除去した。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し不溶部分を分離し、更に上澄み液を１２０℃にて高圧蒸気滅菌を行った後、孔サイズが０．２２μｍの滅菌フィルターでろ過した。ろ液をスプレードライヤーにて噴霧乾燥して水溶性フィブリリン（約１０ｇ）を得た。
【００３４】
（実施例１−水溶性フィブリリンのアミノ酸組成）
中性溶解性・水溶性フィブリリンのアミノ酸組成は、試料を６Ｎ塩酸加水分解（１００℃、２４時間）処理した後、ＨＰＬＣにより分析した。製造例４で製造した水溶性フィブリリンの結果を表１に示す。なお、フィブリリン―１の理論値におけるシステインの含有率は１２．５７モル%であるが、システインは酸加水分解の際にシステイン酸誘導体に変換されるため、表１においては分析不能で表現される。そこでシステインの部分を抜いた理論値を計算し示した。測定した水溶性フィブリリンに関しては理論値との一致が多く、その純度は高いものと推定される。
【表１】
2014091694.tif 000003
※ 
Ｇｌｙ：グリシン、Ａｌａ：アラニン、Ｖａｌ：バリン、Ｐｒｏ：プロリン、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｓｅｒ：セリン、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｌｙｒ：リシン、Ａｒｇ：アルギニン、Ａｓｐ＋Ａｓｎ：アスパラギン酸＋アスパラギン、Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ：グルタミン酸＋グルタミン、Ｈｉｓ：ヒスチジン、Ｃｙｓ：システイン、Ｍｅｔ：メチオニン
【００３５】
（実施例２−水溶性エラスチンＭＥ/水溶性フィブリリン混合溶液の透過光強度測定）
水溶性エラスチンＭＥと水溶性フィブリリンの溶液中での相互作用を測定した。水溶性エラスチンの特徴的な現象の一つとして、温度を上げると凝集するコアセルべーションと呼ばれる現象がある。この複合体化による凝集状態は溶液の透過光強度を測定することで規定できる。具体的には特定波長（６４０nm）を試料溶液に照射し、入射光強度に対する透過光強度の割合を分光光度計により透過率として検出した。温度を２５℃で固定し透過率を測定した。製造例２および５で作成した水溶性エラスチンＭＥと水溶性フィブリリンの総濃度を１重量％に調整し、組成比率を０〜１００％まで変化させて透過率を測定した。その結果を表２および表３に示した。この結果から水溶性エラスチンＭＥと水溶性フィブリリンの混合比率が９４：６の場合で最も透過率が低く凝集性が大きい、即ち相互作用が大きいことが判明した。一般的な混合溶液の凝集挙動は、片側の特性からもう一方の特性までの間の連続的な変化として観察されるが、水溶性エラスチンと水溶性フィブリリンの場合は特有の濃度での変化が顕著である点から、特定の混合比率における複合体の増強化が示唆できる。
【表２】
2014091694.tif 000004
【表３】
2014091694.tif 000005
表２および表３の結果を図２にまとめてグラフ化した。このグラフから極小値の混合比率は水溶性エラスチン：水溶性フィブリリンとして９６：４である条件であることがわかった。
【００３６】
（実施例３−水溶性エラスチンの添加によるエラスチン産生試験）
外部から細胞に対して刺激を与えることにより、自らが産生した細胞外基質（コラーゲンおよびエラスチン）の相対的な量を比較しエラスチンの産生挙動を調査した。市販の正常ヒト皮膚線維芽細胞２.０×１０３（cells／well）を３５φ培養皿に播種し、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地中（増殖培地）で３７℃、５％ＣＯ2培養装置（ＯＬＩＭＰＵＳ ＭＩ−ＩＢＣ）でコンフルエントに到達するまで培養した。その後ＦＢＳ濃度を１％まで低下させ増殖を停止させた。水溶性エラスチン添加培地は１％ＦＢＳ入りＤＭＥM培地に添加タンパクの最終濃度が５００μg/mlになるように製造例２で製造した水溶性エラスチンＭＥと、製造例３で製造した水溶性エラスチンＭＡを添加した。培養は７日間行い、培地交換はせずに７日目に培地中のコラーゲン濃度およびエラスチン濃度をそれぞれコラーゲンアッセイおよびエラスチンアッセイにより測定し、この値を細胞外産生濃度とした。
【００３７】
培地を回収後の培養シャーレをＰＢＳで洗浄する。その後４％パラホルムアルデヒド（０．１Ｍリン酸バッファー）で１５分固定化し、再度ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２０分間処理し、一次抗体としてanti-human Collagen 抗体またはanti-human
tropoelastin 抗体を加え４℃で一夜静置する。その後一次抗体を除去し、二次抗体としてanti-IgG
FITC抗体とPIを加え、９０分間暗所にて静置し、最後にＰＢＳにて３回洗浄した。観察は共焦点レーザー顕微鏡にて行った。（細胞内産生濃度）
それぞれ、無添加条件（コントロール）の結果で規格化することで、コントロール値を１として図２(a)および(b)に示した。更にコラーゲン産生能に対するエラスチン産生能という意味で、(a)および(b)の値を以下の式に当てはめて算出した。
[（細胞内エラスチン）×（細胞外エラスチン）]/ [（細胞内コラーゲン）×（細胞外コラーゲン）]
結果を図２(c)に示した。水溶性エラスチンＭＥの添加条件では、皮膚線維芽細胞のエラスチン産生が促進され、コラーゲン産生が抑制され、コラーゲンの産生量に対するエラスチンの産生量で示される産生バランスがコントロール値（１：１）に比較して、水溶性エラスチンＭＥの刺激により７．１と他の条件に比較して顕著にエラスチンの産生が向上することがわかった。
【００３８】
（実施例４−水溶性エラスチンＭＥおよび水溶性フィブリリンとの共添加培地による皮膚線維芽細胞表面上での弾性線維形成試験）
エラスチンなどの細胞外基質タンパク質は、培養細胞表面上に堆積または自己組織化を行い網目状の線維構造を構築することが知られる。この網目状の線維構造中のエラスチンを免疫染色により検出することで、細胞に対する応答を評価することができる。弾性線維増強試験の原理は、細胞表面上に細胞が産生し堆積したエラスチンマトリックスの量を測定し、細胞１つ当たりで換算し、刺激なしのコントロールの状態と比較することで増強されたか否かを判断する試験法である。
【００３９】
市販の正常ヒト皮膚線維芽細胞２.０×１０３（cells／well）を３５φ培養皿に播種し、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地中（増殖培地）で３７℃、５％ＣＯ2培養装置（ＯＬＩＭＰＵＳ ＭＩ−ＩＢＣ）でコンフルエントに到達するまで培養した。その後ＦＢＳ濃度を１％まで低下させ増殖性を停止させた。水溶性エラスチン添加培地は１％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に添加タンパクの最終濃度が５００μg/mlになるように製造例２で製造した水溶性エラスチンＭＥと、製造例４で製造した水溶性フィブリリンを添加した。培地は３日に一度交換した。培養は最終的に１０日間行い、１０日目に抗エラスチン抗体による免疫染色を行った。無添加条件をコントロールとした。
【００４０】
培養後の培養シャーレから培地を静かに除去し、ＰＢＳで洗浄する。その後４％パラホルムアルデヒド（０．１Ｍリン酸バッファー）で１５分固定化し、再度ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２０分間処理し、一次抗体としてanti-human tropoelastin 抗体を加え４℃で一夜静置する。その後一次抗体を除去し、二次抗体としてanti-IgG FITC抗体とPIを加え、９０分間暗所にて静置し、最後にＰＢＳにて３回洗浄した。観察は共焦点レーザー顕微鏡にて行った。染色結果を図３に示した。緑色がエラスチンを赤色が細胞核を表す。コントロールでも少し弾性線維が観察されるが図３(a)、水溶性エラスチンＭＥを添加した条件でその線維量の増加が確認できる図３(b)。水溶性フィブリリンを同時に添加したものに関しては、更に線維の量が多くより太くなっているのがわかる図３(c)。この染色写真を同一条件でランダムに異なる場所を７カ所撮影し、イメージアナライザーにより染色強度を測定し、更に視野内の細胞数で規格化したグラフを図４に示した。このグラフにより、水溶性エラスチンＭＥを添加したもので１．１倍、更に水溶性フィブリリンを添加した条件で１．２倍にまで弾性線維が増強されていることが明らかになった。単純に計算すると弾性線維の１．２倍の増加は、弾性特性としては最大荷重が１．２倍に相当し、すなわち組織に対する弾性が１０日間で２０％増強したことになることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明によれば、生体組織から安全に水溶性のフィブリリンを製造することができる。これを水溶性のエラスチンと組み合わせることにより肌の弾力性を改善でき、飲食品、化粧品、医薬品等として用いることができるという産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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