(57)【要約】【課題】マツ科モミ属由来のＰＰＡＲγリガンド、およびそれを有効成分とするメタボリックシンドロームを予防または改善する組成物、さらにインスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝からなる群より選ばれる２つ以上の状態または症状を予防または改善する組成物を提供することを課題とする。【解決手段】マツ科モミ属の植物の樹葉からの抽出物にＰＰＡＲαとＰＰＡＲγのデュアルのリガンド活性を見出し、さらにこれらの抽出物に含まれる活性成分がＰＰＡＲαとＰＰＡＲγリガンド活性を有するレボピマール酸およびネオアビエチン酸であることを見出し、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツ科モミ属植物の樹葉の抽出物またはその活性フラクションを有効成分とするＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【請求項２】
マツ科モミ属の植物がトドマツである請求項１に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【請求項３】
抽出物またはその活性フラクションが下記の式（Ｉ）、（ＩＩ）の化合物および該それらの化合物の医薬上若しくは飲食上許容される塩から選択される少なくとも１を含む請求項１または２に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【化１】
2014129275.tif 000009
【化２】
2014129275.tif 000010
【請求項４】
下記の式（Ｉ）、（ＩＩ）の化合物および該それらの化合物の医薬上若しくは飲食上許容される塩から選択される少なくとも１を含むＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【化３】
2014129275.tif 000011
【化４】
2014129275.tif 000012
【請求項５】
生活習慣病の予防または改善用である請求項１〜４のいずれか１に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【請求項６】
メタボリックシンドロームの予防または改善用である請求項１〜５のいずれか１に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【請求項７】
生活習慣病がインスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質異常症、高血圧、内臓脂肪型肥満または脂肪肝である請求項５に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤を含有する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トドマツ等のマツ科モミ属植物の樹葉の抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤、生活習慣病の予防または改善用の医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ＰＰＡＲ）
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor：  ＰＰＡＲ）は、脂質および糖代謝を維持する遺伝子群の発現制御を担う核内受容体ファミリーに属するリガンド依存性転写制御因子である。哺乳動物には、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（ＰＰＡＲβ、ＮＵＣ−１、ＦＡＡＲ）およびＰＰＡＲγの３種のサブタイプの存在が知られており、ＰＰＡＲαは主に肝臓で発現し、ＰＰＡＲδは普遍的に発現している。ＰＰＡＲγは、ＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲγ２の２種のアイソフォームが存在している。ＰＰＡＲγ１は、脂肪組織の他に免疫系臓器や副腎、小腸で発現している。ＰＰＡＲγ２は、脂肪組織で特異的に発現しており、脂肪細胞の分化・成熟を制御するマスターレギュレーターである（非特許文献１を参照）。
【０００３】
（ＰＰＡＲγリガンド）
ＰＰＡＲγリガンドとしては、１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２およびΔ１２−プロスタグランジンＪ２等のアラキドン酸代謝物、α−リノレン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の不飽和脂肪酸、９−ヒドロキシオクタデカジエン酸および１３−ヒドロキシオクタデカジエン酸等のエイコサノイド類が知られている（非特許文献２を参照）。
また、共役トリエン構造または共役テトラエン構造を有する炭素数１０〜２６の共役不飽和脂肪酸の他（特許文献１を参照）、デヒドロアビエチン酸、１３β−Δ８−ジヒドロアビエチン酸およびイソピマル酸等がＰＰＡＲγリガンドであることが開示されている（特許文献２を参照）。
さらに、合成化合物では、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンなどのチアゾリジン誘導体がＰＰＡＲγリガンドであることが知られている。
【０００４】
ＰＰＡＲγリガンドであるチアゾリジン誘導体は、ＰＰＡＲγを活性化することにより、前駆脂肪細胞から分化した正常機能を有する小型脂肪細胞を増加させ、またインスリン抵抗性を惹起するＴＮＦα、遊離脂肪酸の産生および分泌が亢進している肥大脂肪細胞をアポトーシスにより減少させることで、インスリン抵抗性を改善する（非特許文献３を参照）。さらに、ＰＰＡＲγリガンドであるチアゾリジン誘導体は、インスリン抵抗性を改善することにより、２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝等の症状の予防や改善にも有効である。
以上により、ＰＰＡＲγリガンドは、インスリン抵抗性を基盤とする一連の病態群、すなわちメタボリックシンドロームの予防や改善に有効であることが知られている。
【０００５】
（レボピマール酸およびネオアビエチン酸）
レボピマール酸およびネオアビエチン酸は、マツ科の、マツ属（Pinus）、トウヒ属（Picea）、トガサワラ属（Pseudotsuga）、カラマツ属（Larix）等の樹葉や樹皮に含まれるジテルペン化合物である（非特許文献４〜９を参照）。レボピマール酸には、血小板凝集効果（非特許文献１０を参照）があることが知られている。この他、発癌プロモーション抑制効果（特許文献３を参照）やＴｈ１細胞依存性疾患の予防・治療効果（特許文献４を参照）等があることが知られている。
しかし、上記の化合物がＰＰＡＲαとＰＰＡＲγのデュアルなリガンド活性を有していることは知られていない。
【０００６】
｛マツ科モミ属（Ａｂｉｅｓ属）｝
マツ科の植物に関し、マツ科マツ属の植物は、古くよりアカマツの樹葉を原料とする松葉茶として慣れ親しまれている。これに対して、マツ科モミ属の植物の樹葉は、精油量が豊富で芳香が高いため、逆に茶葉としては顧みられておらず、国内ではほとんど利用されていないが、アビエス油として精油成分が輸入されているに過ぎなかった。
近年、マツ科モミ属の植物は、抗インフルエンザ薬としての利用がようやく試みられているが（特許文献５を参照）、実用には至っていないのが現状であった。
平成２２年度の北海道林業統計によれば、北海道のマツ科モミ属であるトドマツの材の蓄積は約２０２百万ｍ３、全樹種の蓄積の２７％程度に当たると見積もられている（参照：北海道水産林務部．２０１２．平成２２年度  北海道林業統計）。しかし、トドマツの樹葉については、ほとんど利用されていない現状である。このように、未利用資源としてのマツ科モミ属の植物の樹葉の利用が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−３５５５３８号公報
【特許文献２】国際公開２００７／０４０００６号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−８３０７７号公報
【特許文献４】特開２００６−１５１９２６号公報
【特許文献５】特開２０１１−１７３８０５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】河田照雄，医学のあゆみ，第184巻，pp519〜523，1998年
【非特許文献２】Johan Auwerx, Diabetologia，第42巻，pp1033〜1049，1999年
【非特許文献３】A. Okuno, et.al., The Journal of Clinical Investigation，第101巻，pp1354〜1361，1998年
【非特許文献４】CI Keeling, J.Bohlmann, Phytochemistry，第67巻，pp2415〜2423，2006年
【非特許文献５】C. Arrabal, Holzforschung，第56巻，pp261〜266，2002年
【非特許文献６】P. Kainulainen, J.K. Holopainen, ,Soil Biology & Biochemistry，第34巻，pp37〜42，2002年
【非特許文献７】D. Martin, D. Tholl, J. Gershenzon, J. Bohlmann，Plant Physiology，第129巻，pp1003〜1018，2002年
【非特許文献８】Dezene P. W. Huber,et.al., Tree Physiology，第25巻，pp1075〜1083，2005年
【非特許文献９】M. Sato, K. Seki, K. Kita, Y. Mariguchi, M. Hashimoto, K. Yunoki, M.Onishi, Journal of Wood Science，第55巻，pp32〜40，2009年
【非特許文献１０】H. Cheung, S. Fu & M. Smal, Arzneimittelforschung，第44巻，pp17〜25，1994年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＰＰＡＲγリガンドは、インスリン抵抗性を改善することから、メタボリックシンドロームを予防または改善する効果、２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝からなる群より選ばれる２つ以上の状態又は症状を予防または改善する効果が期待される。
よって、上記状況に鑑み、本発明は、マツ科モミ属の有効利用も考慮して、該属植物由来のＰＰＡＲγリガンド、およびそれを有効成分とするメタボリックシンドロームを予防または改善する組成物、さらにインスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝からなる群より選ばれる２つ以上の状態または症状を予防または改善する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、マツ科モミ属の植物の樹葉からの抽出物にＰＰＡＲαとＰＰＡＲγのデュアルのリガンド活性を見出し、さらに鋭意研究を重ねた結果、これらの抽出物に含まれる活性成分がＰＰＡＲγリガンド活性を有するレボピマール酸およびネオアビエチン酸であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は以下の通りである。
「１．マツ科モミ属植物の樹葉の抽出物またはその活性フラクションを有効成分とするＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
２．マツ科モミ属の植物がトドマツである前項１に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
３．抽出物またはその活性フラクションが下記の式（Ｉ）、（ＩＩ）の化合物および該それらの化合物の医薬上若しくは飲食上許容される塩から選択される少なくとも１を含む前項１または２に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【化１】
2014129275.tif 000002
【化２】
2014129275.tif 000003
４．下記の式（Ｉ）、（ＩＩ）の化合物および該それらの化合物の医薬上若しくは飲食上許容される塩から選択される少なくとも１を含むＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
【化３】
2014129275.tif 000004
【化４】
2014129275.tif 000005
５．生活習慣病の予防または改善用である前項１〜４のいずれか１に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
６．メタボリックシンドロームの予防または改善用である前項１〜５のいずれか１に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
７．生活習慣病がインスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質異常症、高血圧、内臓脂肪型肥満または脂肪肝である前項５に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤。
８．前項１〜７のいずれか１に記載のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤を含有する医薬品。」
【００１２】
すなわち、本発明は、トドマツ等のマツ科モミ属植物の樹葉の抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤、生活習慣病の予防または改善用の医薬品に関する。
さらに、本発明は、レボピマール酸、ネオアビエチン酸、および医薬上若しくは飲食上許容されるこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含むＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤、生活習慣病の予防または改善用の医薬品に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、上記のＰＰＡＲγアゴニスト剤を有効成分とするインスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝からなる群から選ばれる２つ以上の状態または症状を予防または改善する作用を有する医薬品に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、天然物由来のＰＰＡＲγリガンド、およびそれを有効成分として含有する組成物が提供される。本発明の組成物は、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝などを予防または改善する上で、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】トドマツ樹葉粉末のエタノール抽出物を、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ｎ−ブタノールを用いた溶媒分画に供して得られた画分と、さらに該ジエチルエーテル画分を５％塩酸水溶液を用いた溶媒分画（酸性画分）および５％水酸化ナトリウムを用いた溶媒分画（中性画分）に供して得られた画分のＰＰＡＲγ活性を測定した結果を示す図である。
【図２】（ａ）図１の結果から得られたＰＰＡＲγ活性画分のＧＣ／ＭＳ分析で得られたトータルイオンクロマトを示す図である。（ｂ）各化合物のｍ／ｚの相対強度を示す。
【図３】レボピマ−ル酸（levopimaric acid）、デヒドロアビエチン酸（dehydroabietic acid）、アビエチン酸（abietic acid）、ネオアビエチン酸（neoabietic acid）のＰＰＡＲα活性｛（ａ）｝およびＰＰＡＲγ活性｛（ｂ）｝を測定した結果を示す図である。
【図４】ＧＫラットを用いた試験において、体重を測定した結果を示す図である。
【図５】ＧＫラットを用いた試験において、臓器でのＰＰＡＲαとＰＰＡＲγ活性を測定した結果を示す図である。
【図６】トドマツ樹葉抽出物を投与したＧＫラットを用いた試験において、糖負荷後の血糖値の推移を測定した結果を示す図である。
【図７】レボピマール酸又はネオアビエチン酸を投与したＫＫＡＹマウスを用いた試験において、糖負荷後の血糖値の推移を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、針葉樹植物の抽出物またはその活性フラクションを有効成分とするＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤を提供するものである。
さらに、本発明は、レボピマール酸、ネオアビエチン酸、および医薬上若しくは飲食上許容されるこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含むＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤、生活習慣病の予防または改善用の医薬品を提供するものである。
加えて、本発明は、上記のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγアゴニスト剤を有効成分とするインスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝からなる群から選ばれる２つ以上の状態または症状を予防または改善する作用を有する医薬品を提供するものである。
該針葉樹植物は、特に限定されないが、マツ科モミ属植物が好ましい。特に好ましくはトドマツである。該抽出物は、針葉樹植物の植物体の全部または一部（葉、樹皮、幹、根、球果、松脂など）から抽出したものであれば良い。特に好ましくは、トドマツの樹葉からの抽出物が好ましい。
【００１７】
（活性フラクション）
本発明の活性フラクションとは、針葉樹植物の抽出物から単離されたフラクションであって、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγリガンド能（アゴニスト能）を有するフラクションを意味する。
該針葉樹植物の抽出物または該抽出物から単離されたフラクションが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγリガンド能を有することは、公知のＰＰＡＲ活性測定法を用いて確認することができる。公知のＰＰＡＲ活性測定法としては、例えば、Ｇｏｔｏら｛T. Goto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 337 (2005) 440-445｝に記載のＰＰＡＲレポーターアッセイ等が挙げられる。
【００１８】
（抽出物またはその活性フラクションの調製方法）
抽出物またはその活性フラクションは、脂溶性であることが好ましい。脂溶性の抽出物は、例えば、針葉樹植物の植物体、松脂、またはこれらの乾燥物や凍結乾燥物から疎水性の有機溶媒で抽出することにより取得することができる。
疎水性の有機溶媒としては、例えば、エタノールなどのアルコール類、ヘキサンなどの炭化水素類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルムなどのアルキルハライド等が挙げられる。
【００１９】
（ＰＰＡＲ活性化物質）
本発明のＰＰＡＲγ活性化物質とは、ＰＰＡＲγに結合する能力および／またはＰＰＡＲγのアゴニスト能力を有する物質を意味する。本発明のＰＰＡＲα活性化物質も同様に意味する。
哺乳類のＰＰＡＲでは、α、δおよびγの３種類が知られている。ＰＰＡＲαは、主に肝臓や骨格筋で脂肪酸の輸送や代謝に関連する遺伝子の発現を制御しており（Willson T. M. et al., J. Med. Chem. 43(4) 527-550 2000）、脂質代謝に深く関与していることから、高脂血症等の脂質異常症のための薬剤の標的タンパクとして注目されている。ＰＰＡＲγは、脂肪細胞の分化を司る調節因子であることが明らかにされている（Cell 79 : 1147-1156, 1994）。したがって、ＰＰＡＲγ活性化物質は、脂肪細胞分化を促進することにより、血液中の糖および遊離脂肪酸を低下させ、筋肉の遊離脂肪酸の低下とインスリン抵抗性を改善することができる。それゆえ、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγを活性化できる物質（ＰＰＡＲ活性化物質）は、生活習慣病の予防もしくは改善に有用である。
なお、本発明のＰＰＡＲα活性化物質は、ＰＰＡＲγ活性化物質と同様に、ＰＰＡＲαに結合する能力および／またはＰＰＡＲαのアゴニスト能力を有する物質を意味する。
【００２０】
（ＰＰＡＲ活性化剤）
本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、少なくとも有効成分として、以下の化合物（Ｉ）〜（ＩＩ）および該それらの化合物の医薬上若しくは飲食上許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む。加えて、必要に応じて、公知の担体、希釈剤、結合剤、吸収促進剤、滑沢剤、乳化剤、界面活性剤、酸化防止剤、着色剤、防腐剤、香料、甘味料等を含有してもよい。
さらに、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγに結合する能力および／またはＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγのアゴニスト能力を有し、特に特徴的な作用として、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγディアルアゴニスト能力を有する。
【００２１】
【化５】
2014129275.tif 000006
【化６】
2014129275.tif 000007
【００２２】
上記化合物（Ｉ）はレボピマール酸であり、上記化合物（ＩＩ）はネオアビエチン酸である。
本発明者らは、トドマツの抽出物には主として化合物（Ｉ）と（ＩＩ）が存在することを確認している。さらに、本発明者らは、これらの化合物がそれぞれ単独でもＰＰＡＲγ活性化能および／またはＰＰＡＲα活性化能を有していることを確認している。
【００２３】
（ＰＰＡＲ活性化剤の調製方法）
本発明のＰＰＡＲ活性化剤の調製方法は、上記述べた化合物（Ｉ）〜（ＩＩ）および該それらの化合物の医薬上若しくは飲食上許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含んでいれば、特に限定されない。
例えば、トドマツの樹葉を材料とする場合、トドマツの樹葉の粉砕物を調製し、これをエタノールなどのアルコール類、ヘキサンなどの炭化水素類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類またはジクロロメタン、クロロホルムなどのアルキルハライドで抽出する。抽出溶媒の量は原料の粉砕物に対し通常３〜２０倍（ｗ／ｗ）である。また抽出温度は室温から使用する溶媒の沸騰点までの範囲でいずれでもよい。抽出液をろ過して残渣と分離したのち、濃縮してエキスを調製する。得られたエキスを、例えばヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ｎ−ブタノールにより溶媒分画することにより、高ＰＰＡＲ活性を有するジエチルエーテル画分が得られる。さらに、上記で得られたジエチルエーテル画分を５％塩酸、５％水酸化ナトリウム溶液で溶媒分画することにより、高ＰＰＡＲ活性を有するフラクションを調製することができる。
更に、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することもできる。
【００２４】
（レボピマール酸およびネオアビエチン酸）
なお、上記ＰＰＡＲ活性化剤に含有するレボピマール酸は、トドマツや針葉樹の松脂などから抽出調製したものでもよいし、Ｗｉｎｓｔｏｎらの方法｛Organic Syntheses, Coll. Vol. 5, p.699 (1973); Vol. 45, p.64 (1965)｝などにより合成したものや市販品なども使用できる。
また、上記ＰＰＡＲ活性化剤に含有するネオアビエチン酸は、トドマツや針葉樹の松脂などから抽出調製したものでもよいし、合成したものや市販品なども使用できる。
さらに、レボピマール酸、ネオアビエチン酸は、純粋な化合物を使用できるが、医薬品や食品として不適切な不純物を含有しない限り半精製のものも使用することができる。
【００２５】
（医薬上若しくは飲食上許容される塩）
本発明の医薬上若しくは飲食上許容される塩とは、医薬若しくは飲食物に使用する上で不適当なものでなければ特に限定されず、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ（又は土類）金属塩、アミン塩、ピリジニウム塩といった有機塩等の医薬若しくは飲食物において常用される塩類が広く包含される。
【００２６】
（ＰＰＡＲ活性化剤の投与形態）
ＰＰＡＲ活性化剤（特に、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤）は、単独又は自体公知の担体と共に飲食用および医薬用として利用することができ、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品などの飲食品、あるいはＯＴＣなど容易に入手可能な医薬品または医薬部外品などとして利用でき、動物およびヒトに投与することができる。
ＰＰＡＲ活性化剤の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ、好適には非経口剤を挙げることができる。
非経口剤の場合には、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人でレボピマール酸および／またはネオアビエチン酸の重量として１日あたり0.1 mg〜1000 mgの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。
経口投与の場合には、通常、成人でレボピマール酸および／またはネオアビエチン酸の重量として１日あたり0.1mg〜1000mgを摂取できるようなカプセル、サッシェ（sachets）、ロゼンジ（lozenges）又は錠剤等の個別の単位で、提供され、各々が、粉末又は顆粒として、水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、あるいは水中油型又は油中水型エマルションとして所定量のレボピマール酸および／またはネオアビエチン酸を含有し得る。
【００２７】
飲食品として用いる場合は、そのまま直接摂取することができ、また、公知の担体や助剤などの添加剤を使用して、カプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態に成型して摂取することができる。また、栄養強化を目的として、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどの各種ビタミン類を添加、併用して用いることもできる。さらに、飲食物材料に混合して、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；  アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；  茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料；  うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；  蒲鉾、竹輪、はんぺんなどの練り製品；  ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料；マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類；  パン、ハム、スープ、レトルト食品、冷凍食品など、すべての飲食物に使用することができる。
【００２８】
医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、座薬、貼付剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
医薬部外品として用いる場合は、必要に応じて他の添加剤などを添加して、例えば、軟膏、リニメント剤、エアゾール剤、クリーム、石鹸、洗顔料、全身洗浄料、化粧水、ローション、入浴剤などに使用することができ、局所的に用いることができる。
【００２９】
（メタボリックシンドロームの予防または改善等の効能を有するＰＰＡＲ活性化剤）
本発明のＰＰＡＲ活性化剤（特に、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤）は、メタボリックシンドロームの予防または改善する作用を有し、ならびに、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝からなる群から選ばれる２つ以上の状態又は症状を予防または改善する作用も有する。
【００３０】
（メタボリックシンドローム）
メタボリックシンドロームとは、インスリン抵抗性を基盤とする２型糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝などの一連の病態群を合併した状態を表し、シンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、内臓脂肪症候群、マルチプルリスクファクター症候群などの呼称で知られている。本発明において、メタボリックシンドロームの予防とは、上記の病態群より選ばれる少なくとも２つ以上の病態において、その症状になるのを防ぐ又は遅らせることを指す。本発明において、メタボリックシンドロームの改善とは、上記の病態群より選ばれる少なくとも２以上の病態において、その症状を緩和又は治癒することを指す。
【００３１】
（インスリン抵抗性）
本発明において、インスリン抵抗性とは、骨格筋・脂肪細胞・肝臓で、インスリンの主な作用である糖の吸収促進作用が弱っている状態を指す。インスリン抵抗性の予防とは、ＳＳＰＧ（Steady-State Plasma Glucose）法などによるインスリン抵抗性の指標となる値がより悪化するのを防ぐ又は遅らせることを指す。インスリン抵抗性の改善とは、上記のインスリン抵抗性の指標となる値をより改善することを指す。
【００３２】
（２型糖尿病の予防）
本発明において、２型糖尿病の予防とは、日本糖尿病学会が糖尿病治療ガイド２００２−２００３（２００２年５月発行）にて定義している糖尿病の状態または境界域の状態になるのを防ぐまたは遅らせることを指す。また、糖尿病の改善とは、上記の糖尿病の状態または境界域の状態から、上記ガイドにて正常域と定義している状態に近づけることを指す。
【００３３】
（高脂血の予防）
本発明において、高脂血の予防とは、日本動脈硬化学会が動脈硬化性疾患診療ガイドライン（２００２年９月発行）にて定義している高脂血症の状態または境界域の状態になるのを防ぐ又は遅らせることを指す。また、高脂血の改善とは、上記に示す高脂血症の状態または境界域の状態から、上記ガイドラインにて正常域と定義している状態に近づけることを指す。
【００３４】
（高血圧の予防）
本発明において、高血圧の予防とは、日本高血圧学会が高血圧治療ガイドライン（２０００年６月発行）にて、高血圧と定義している状態になるのを防ぐ又は遅らせることを指す。また、高血圧の改善とは、上記ガイドラインで高血圧と定義されている状態から、上記ガイドラインにて正常域と定義している状態に近づけることを指す。
【００３５】
（内臓脂肪型肥満の予防）
本発明において、内臓脂肪型肥満の予防とは、ＭＲＩで臍の位置の断面像にて見られる内臓脂肪面積が増加することを防ぐ又は遅らせることを指す。内臓脂肪型肥満の改善とは、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で臍の位置の断面像にて見られる内臓脂肪面積を減少させることを指す。
【００３６】
（脂肪肝）
本発明において、脂肪肝とは、肝臓内に脂質、主にトリグリセリドなどの中性脂肪が過剰に蓄積した状態、すなわち、肝細胞のほぼ半数以上に脂肪空胞が認められる状態を指す。脂肪肝の予防とは、上記の状態になるのを防ぐ又は遅らせることを指す。脂肪肝の改善とは、上記の状態から正常な肝臓に近づけることを指す。
【００３７】
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【実施例１】
【００３８】
（トドマツ抽出物のＰＰＡＲγ活性フラクションの特定）
トドマツ抽出物のＰＰＡＲγ活性フラクションの特定を行った。詳細は、以下の通りである。
【００３９】
（トドマツ抽出物の調製）
トドマツ（Abies sachalinensis Masters）の樹葉に液体窒素を加え、ホモジナイザー｛（株）日本精機製作所｝を使用して粉砕した。これにエタノールを粉砕物の４〜５倍容加え、振とう抽出した。抽出操作は３回行い、合わせた抽出液をろ過した。抽出液を濃縮し、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ブタノールにより逐次、溶媒分画を行った。抽出物は１ｍｇ／ｍＬに調製し、ＰＰＡＲγ活性の測定に供した。
【００４０】
（ＰＰＡＲγ活性測定）
ＰＰＡＲγ活性測定には、ＰＰＡＲγレポーターアッセイを用いた。レポーターアッセイはDual Luciferase Reporter Assay System｛Promega（株）｝を用いて行った。
ＣＶ−１細胞（アフリカミドリザル腎細胞由来細胞株）で行ったアッセイ系は、ＰＰＡＲγのＦｕｌｌ−レングス８ｎｇ／ｗｅｌｌ＋ヒトＲＸＲ８ｎｇ／ｗｅｌｌとして，レポーターベクター  Ａｏｘ−ＰＰＲＥ  ＴＫ１を使用した。抽出物溶液は１ｍｇ／ｍＬに調製して使用した。コントロールとしてはエタノールを、ポジティブコントロールとしてはＰＰＡＲγの選択的アゴニストであるトログリタゾン１μＭを使用した。活性は、エタノールに対する相対比で評価した。
【００４１】
（ＰＰＡＲγ活性測定結果）
ＰＰＡＲγ活性測定結果を図１に示す。図１から明らかなように、ジエチルエーテル画分に強いＰＰＡＲγ活性が認められた。
さらに、ＰＰＡＲγ活性が認められたジエチルエーテル画分を５％塩酸水溶液と５％水酸化ナトリウム水溶液により溶媒分画し、得られた画分のＰＰＡＲγ活性を測定した。ジエチルエーテル画分の酸性画分は、ジエチルエーテル画分の約６９％を占めることから、活性成分は、酸性画分に含まれていることを確認した。
【実施例２】
【００４２】
｛トドマツ抽出物のＰＰＡＲγ活性画分（酸性画分）中に含有される化合物の同定｝
上記実施例１で得られたＰＰＡＲγ活性画分（酸性画分）中に含有される化合物の同定を行った。詳細は、以下の通りである。
【００４３】
（ＧＣ／ＭＳ分析）
ＰＰＡＲγ活性画分（酸性画分）のＧＣ／ＭＳ分析を行った。一定量の画分に内部標準物質としてヘプタデカン酸（１７：０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を加え、これをジアゾメタンによりメチル化した後、ＧＣ−ＭＳに供した。カラムにはＤＢ−１ＭＳ｛30m×0.25mmi.d., film thickness 0.25 μm; Agilent Technologies（株）｝を用い、カラム温度は４０℃から２８０℃まで４℃／ｍｉｎで昇温した。ヘリウムをキャリアガスとし、注入口温度は２７０℃、イオン化電圧は７０ｅＶとした。ピークの同定は標品の保持時間およびマススペクトルとの比較によって行った。
【００４４】
（ＧＣ／ＭＳ分析結果）
ＧＣ／ＭＳ分析結果を図２に示す。図２に示すとおり、主要成分はレボピマ−ル酸、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸およびネオアビエチン酸であることが明らかとなった。
【実施例３】
【００４５】
（ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ活性化を有する化合物の確認）
ＰＰＡＲγ活性画分（酸性画分）の主要成分であるレボピマ−ル酸、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸およびネオアビエチン酸が、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ活性化能を有するか否かを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４６】
（ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ活性測定）
ＰＰＡＲα活性測定：コントロールとしてエタノールを、ポジティブコントロールとしてＰＰＡＲαの選択的アゴニストである wy−14643（100μＭ）を使用して、実施例１と同様にＰＰＡＲα活性測定を行った。なお、レボピマ−ル酸、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸、およびネオアビエチン酸は100μＭで測定した。 
ＰＰＡＲγ活性測定：コントロールとしてエタノールを、ポジティブコントロールとしてＰＰＡＲγの選択的アゴニストであるトログリタゾン１μＭを使用して、実施例１と同様にＰＰＡＲγ活性測定を行った。なお、レボピマ−ル酸、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸、およびネオアビエチン酸は100μＭで測定した。
【００４７】
（ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ活性測定結果）
ＰＰＡＲα活性測定結果およびＰＰＡＲγ活性測定結果を図３（ａ）および（ｂ）に示した。
図３から明らかなように、レボピマ−ル酸およびネオアビエチン酸のみ、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ活性化能の両方を有していることを確認した。
さらに、レボピマ−ル酸のＰＰＡＲγ活性化能はデヒドロアビエチン酸のＰＰＡＲγ活性化能と比較して約２倍となり、ネオアビエチン酸のＰＰＡＲγ活性化能はデヒドロアビエチン酸のＰＰＡＲγ活性化能と比較して約１．６倍という顕著な効果を示した。
【実施例４】
【００４８】
（トドマツ樹葉抽出物投与によるＧＫラットによる評価〕
トドマツ樹葉抽出物投与によるラットの影響を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４９】
（動物および飼育）
１０週齢の糖尿病モデルＧＫラット（♂、日本医科学）に１週間一般飼料を与えて予備飼育した。予備飼育終了後、コントロール群６匹、トドマツ樹葉抽出物摂取群の２群に群分けして高脂肪飼料に切り替えて試験を開始し、２週間摂食試験を行った。トドマツ樹葉抽出物摂取群には、実施例１により得られたＰＰＡＲγ活性を有する「トドマツ抽出物由来のエタノール抽出物」を加えた飼料を与えた。飼料の配合比は、下記表１の通りである。飼料および水は自由摂取とした。試験期間中の体重の変化を測定した。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
（トドマツ樹葉抽出物投与によるＧＫラットによる評価確認）
試験期間中の体重の変化を図４に示した。ラットは、トドマツ樹葉抽出物を摂食しても体重は増加しており、脾臓の肥大が認められなかった。すなわち、トドマツ樹葉抽出物は毒性が無いことを確認した。
【実施例５】
【００５２】
（肝臓中のＰＰＡＲαとＰＰＡＲγの発現量の評価）
トドマツ樹葉抽出物投与による肝臓中のＰＰＡＲαとＰＰＡＲγの発現量の変化を評価した。詳細は、以下の通りである。
【００５３】
（リアルタイムＰＣＲによる肝臓中のＰＰＡＲαとＰＰＡＲγの発現量の測定）
ラット肝臓０．１〜０．１５ｇから、常法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。逆転写反応キットＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ｛タカラバイオ（株）｝を用いて逆転写反応を行い，ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  プローブ法によりＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ１．５（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行なった。内部標準としてＲＰＬ３２Ｐ３（Ｐｒｉｍｅｒ：Ｈｓ  ００２９９１８９＿ｍｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＰＰＡＲα（Ｒｎ  ００５５６１９３＿Ａ１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及びＰＰＡＲγ（Ｒｎ  ００４４０９４５＿Ａ１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を定量した。
【００５４】
（リアルタイムＰＣＲによる肝臓中のＰＰＡＲαとＰＰＡＲγの発現量の測定結果）
コントロール群とトドマツ樹葉抽出物摂取群の肝臓でのＰＰＡＲαとＰＰＡＲγの発現量を図５に示す。
図５から明らかなように、トドマツ樹葉抽出物摂取群ではＰＰＡＲαとＰＰＡＲγ発現量の増加が同時に認められた。すなわち、トドマツ樹葉抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤であることを確認した。
なお、ＰＰＡＲγ活性剤は糖代謝を改善するが、副作用として体重増加（脂質の蓄積）が報告されている。よって、トドマツ樹葉抽出物が脂質異常を改善するＰＰＡＲαのアゴニストであることも非常に有用である。
【実施例６】
【００５５】
（トドマツ樹葉抽出物投与による血糖値の上昇抑制効果の確認）
レボピマ−ル酸およびネオアビエチン酸を含むトドマツ樹葉抽出物がマウスの血糖値の上昇を抑制することができるかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５６】
｛経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ、Oral glucose tolerance test）｝
試験開始２８日目に経口糖負荷試験を実施した。具体的には、マウスを２４時間絶食後、尾静脈から採血を行い（これを０分とする）、２ｇ／ｋｇ体重となるようにＤ−（＋）−グルコースを経口投与した。以降、３０、６０、９０および１２０分後にそれぞれ尾静脈から採血を行って血糖値を測定した。
【００５７】
（経口糖負荷試験の結果）
糖負荷後の血糖値の推移を図６に示した。図６から明らかなように、レボピマ−ル酸およびネオアビエチン酸を含むトドマツ樹葉抽出物摂取群は、糖負荷後の血糖値の上昇を有意に抑制した。
以上により、トドマツ樹葉抽出物は、血糖値の上昇を抑制できる効果を有する。
【実施例７】
【００５８】
（レボピマ−ル酸またはネオアビエチン酸投与による血糖値の上昇抑制効果の確認）
レボピマ−ル酸またはネオアビエチン酸がマウスの血糖値の上昇を抑制することができるかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５９】
｛経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ、Oral glucose tolerance test）｝
５週齢の糖尿病モデルＫＫＡＹマウス（♂、東京実験動物）に１週間一般飼料を与えて予備飼育した。予備飼育終了後、コントロール群（図７：control）、レボピマール酸群（図７：ＬＡ）、ネオアビエチン酸群（図７：ＮＡ）の３群に振り分けて試験を開始し、４週間摂食試験を行った（１群４−６匹）。
レボピマール酸及びネオアビエチン酸は純品の試薬を一般げっ歯目用固形飼料に１ｍｇ／匹／日になるように染込ませて摂食させた。飼料および水は自由摂取とした。試験期間中の体重の変化を測定した。
上記実施例６と同様に、試験開始２８日目に経口糖負荷試験を実施した。具体的には、マウスを２４時間絶食後、尾静脈から採血を行い（これを０分とする）、２ｇ／ｋｇ体重となるようにＤ−（＋）−グルコースを経口投与した。以降、３０、６０および９０分後にそれぞれ尾静脈から採血を行って血糖値を測定した。
【００６０】
（経口糖負荷試験の結果）
糖負荷後の血糖値の推移を図７に示した。図７から明らかなように、レボピマ−ル酸摂取群およびネオアビエチン酸摂取群は、糖負荷後の血糖値の上昇を抑制した。
以上により、レボピマ−ル酸および／またはネオアビエチン酸は、血糖値の上昇を抑制できる効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、トドマツ等のマツ科モミ属植物の樹葉の抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγデュアルアゴニスト剤、生活習慣病の予防または改善用の医薬品を提供することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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