(57)【要約】【課題】生体内において、腫瘍部位へ特異的かつ高感度に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブを提供することを課題とする。【解決手段】アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞の検出のためのプローブであって、Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に、二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが結合した融合タンパク質を含み、前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、プローブ。  ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列に含まれる３０〜１２０アミノ酸残基長の配列  ｂ）ａ）と８０％以上の同一性を有する配列【選択図】図１
2014105158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞の検出のためのプローブ用タンパク質であって、
Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に、二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが結合した融合タンパク質であり、
前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、タンパク質。
ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列に含まれる３０〜１２０アミノ酸残基長の配列
ｂ）ａ）と８０％以上の同一性を有する配列
【請求項２】
前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、請求項１に記載のタンパク質。
ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列のＮ末端から３０〜１２０番目のアミノ酸残基までの配列
ｂ）ａ）と８０％以上の同一性を有する配列
【請求項３】
前記二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク
質である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記野生型Ｔｉｍ４タンパク質が、ヒトＴｉｍ４タンパク質である、請求項１〜３の何れか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される前記融合タンパク質の分子量が１００ｋＤａ〜２５０ｋＤａである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
標識化された、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を含むプローブ。
【請求項７】
請求項６に記載のプローブを含む、腫瘍の画像診断剤。
【請求項８】
請求項７に記載の腫瘍の画像診断剤を含む、画像診断用キット。
【請求項９】
請求項６に記載のプローブを用いて、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス細胞やネクローシス細胞等の死細胞を検出し、該細胞の分子イメージングを可能にするプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における細胞死を検出し分子イメージングを行うことは、癌等の疾患の診断や薬剤の治療効果を判定するのに重要である。腫瘍組織の画像診断にはポジトロン断層法（ＰＥＴ）や単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などが確立されており、種々の分子イメージングプローブが用いられている。
【０００３】
そのような分子イメージングプローブには、フォスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｙｄｉｌｓｅｒｉｎｅ、以下ＰＳとも記す）を認識して結合する分子が含まれる。これは、アポトーシスやネクローシスを呈した細胞が、細胞膜表面上にＰＳを表出することに基づき、腫瘍組織における該細胞を検出するものである（非特許文献１）。具体的には、ＰＳ結合分子であるＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５やＳｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ ＩのＣ２Ａドメインを核種標識したものを、ＳＰＥＣＴ又はＰＥＴ用トレーサーとして用いることが提案されている。
【０００４】
ところで、免疫機能及び細胞の生存に関連するタンパク質のひとつとしてＴｉｍ４（Ｔ細胞免疫グロブリンタンパク質及びムチンドメイン４）が知られている（特許文献１）。Ｔｉｍ４は、保存されたＩｇＶ及びムチンドメインを有する細胞表面分子であり、ＰＳ受容体であることが確認されている（非特許文献６）。
Ｔｉｍ４は、一回膜貫通型のタンパク質で二量化してＰＳへ結合する。三次構造としては金属イオンポケットを有することがわかっているが（非特許文献２、３）、ＰＳへの結合にＣａ2+を要するＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５とは異なり、Ｃａ2+非依存的にＰＳへ結合する
ことも確認されている（非特許文献４、５）。
なお、これまでにＴｉｍ４タンパク質が分子イメージングプローブとして用いられた例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許４５７２２７６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Apotosis, (2010) 15, 1072-1082
【非特許文献２】Immunity, (2007) 27(6), 941-951
【非特許文献３】Immunological Reviews, (2010) 235, 172-189
【非特許文献４】Nature (2007) 450, 435-439
【非特許文献５】Immunity (2007) 27, 927-940
【非特許文献６】Nature, 2007, Nov. 15, p.435-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＰＳ結合性プローブとして知られているＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５やＳｙｎａｐｔｏｔａｇ
ｍｉｎ ＩのＣ２Ａドメインは、肝臓又は腎臓へ非特異的に集積することが指摘されてお
り、核種標識したプローブとして適用すると生体への放射能の影響が懸念されるという問題がある。また、これらの分子は、ＰＳへの結合の際に多量（２．５ｍＭ以上）のＣａ2+
を必要とすることから、生体内において定量的な画像解析を行うのには適さない。
本発明はかかる状況に鑑み、生体内において、細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的かつ高感度に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の結果、ＰＳ結合分子であるＴｉｍ４と二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドとの融合タンパク質が、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を高感度に検出できることを見出した。さらに、Ｔｉｍ４タンパク質中のムチンドメインの大きさを野生型よりも小さいサイズとすることにより、アポトーシスを呈した腫瘍組織への集積の特異性を高めることができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞の検出のためのプローブ用タンパク質であって、
Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に、二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが結合した融合タンパク質であり、
前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、タンパク質（以下、「本発明のタンパク質」とも記す）。
ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列に含まれる３０〜１２０アミノ酸残基長の配列
ｂ）ａ）と８０％以上の同一性を有する配列
［２］前記Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、下記ａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されている、［１］に記載のタンパク質。
ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列のＮ末端から３０〜１２０番目のアミノ酸残基までの配列
ｂ）ａ）と８０％以上の同一性を有する配列
［３］前記二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タン
パク質である、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［４］前記野生型Ｔｉｍ４タンパク質が、ヒトＴｉｍ４タンパク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質。
［５］非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される前記融合タンパク質の分子量が１００ｋＤａ〜２５０ｋＤａである、［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質。
［６］標識化された、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質を含むプローブ（以下、「本発明のプローブ」とも記す）。
［７］［６］に記載のプローブを含む、腫瘍の画像診断剤。
［８］［７］に記載の腫瘍の画像診断剤を含む、画像診断用キット。
［９］［６］に記載のプローブを用いて、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を検出する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、死細胞を高感度に検出することができ、生体内において細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブが提供される。本発明のプローブは、生体内における細胞死を的確に検出し画像化して、疾患の診断や薬剤の試料効果判定に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｍＴｉｍ４−ＦｃまたはｍＴｉｍ４−Δ２３０−Ｆｃ投与４８時間後のマウスのＰＥＴ画像（写真、最大値投影表示）。
【図２】摘出腫瘍切片の免疫染色像（写真）。Ａ〜Ｃ：ＭＭＣ投与個体摘出腫瘍、Ｄ〜Ｅ：生理食塩水投与個体摘出腫瘍、Ａ及びＢ：抗活性化カスパーゼ３抗体による免疫染色像（赤）、Ｂ及びＥ：ＴＵＮＥＬ染色像（緑）、Ｃ及びＦ：抗活性化カスパーゼ３抗体による免疫染色像、ＴＵＮＥＬ染色像、及びＨｏｅｃｈｉｓｔ３３２５８による核染色像（青）の合成画像。
【図３】ＰＳに対する各ｈＴｉｍ−Ｆｃの結合性を示すドットブロッティング像（写真）。
【図４】各種リン脂質に対するｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃの結合性を示すドットブロッティング像（写真）。
【図５】ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ又はＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５によるアポトーシス誘導細胞の免疫染色像（写真）。Ａ：ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ及びＰＩによる免疫染色像、Ｂ：Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５及びＰＩによる免疫染色像。それぞれ、左列：ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ又はＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５の染色像、中央列：ＰＩの染色像、右列：蛍光画像と透過光像の合成画像。上下段とも同条件の別視野の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のプローブ用タンパク質は、Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に、二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドが結合した融合タンパク質である。
【００１２】
野生型Ｔｉｍ４タンパク質は、Ｎ末端側から順にシグナル配列、ＩｇＶドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質領域で構成される。ＩｇＶドメインはＰＳ結合部位であり、ムチンドメインは糖鎖結合部位である。
なお、野生型Ｔｉｍ４タンパク質のアミノ酸配列について、ヒトのものを配列番号２に、マウスのものを配列番号４に記すが、両者はアミノ酸配列において４８％の同一性がある。
【００１３】
本発明のタンパク質におけるＴｉｍ４タンパク質のムチンドメイン及びそのＣ末端側のドメインは、野生型のムチンドメインのＣ末端及び／又はＮ末端を欠損させて小型化したポリペプチドに置換されている。置換される領域は、Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質領域の一部又は全部であって少なくとも全長ムチンドメインを含む領域である。融合タンパク質の作製の簡便さの観点から、好ましくはムチンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質領域の全てが置換される。
野生型のムチンドメインのＣ末端及び／又はＮ末端を欠損させて小型化したポリペプチドとは、具体的には、ａ）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列に含まれる３０〜１２０、好ましくは４５〜８０、より好ましくは５０〜６０アミノ酸残基長のアミノ酸配列、又はｂ）ａ）と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。またはｃ）ａ）の配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、本発明の効果を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
野生型のムチンドメインの小型化は、そのＣ末端側を欠損させることが調製の容易さの観点から好ましい。すなわち、ａ’）野生型Ｔｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列のＮ末端から３０〜１２０番目、好ましくは４５〜８０番目、より好ましくは５０〜６０番目のアミノ酸残基までの配列に置換されることが好ましい。あるいは、ｂ’）ａ’）と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、またはｃ’）ａ’）の配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドに置換されていても
よい。
【００１４】
融合タンパク質中のＴｉｍ４タンパク質を、ムチンドメインのアミノ酸配列長を短くし、小型化した改変Ｔｉｍ４タンパク質とすることにより、腫瘍等の細胞死を呈した部位・組織を有する個体に標識化タンパク質（プローブ）として投与した場合に、標的とする死細胞を有する部位・組織へ特異的に集積しそれ以外の部位への非特異集積が抑えられる。
なお、ヒトＴｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列を配列番号６に、マウスＴｉｍ４タンパク質のムチンドメインのアミノ酸配列を配列番号８に示す。本発明のプローブを、臨床における画像診断等へ適用する際は、Ｔｉｍ４タンパク質はヒト由来のものを用いることが特に好ましい。
【００１５】
本発明のタンパク質におけるＴｉｍ４タンパク質のＩｇＶドメインは、野生型でも改変型でもよい。ここで、改変型とは、野生型のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＰＳ結合能を有するものをいう。前記ＩｇＶドメインは、ＰＳへの結合性維持の観点から、野生型の配列を有することが好ましい。
Ｔｉｍ４タンパク質のＰＳへの結合には、ＩｇＶドメイン中の内側の領域が主に関与することが知られているが（非特許文献２、３）、ＩｇＶドメインの両端に近い部位はβシート構造を形成してＴｉｍ４タンパク質の三次構造の維持に関与し、ＰＳへの結合性に間接的に寄与していると考えられている。そのため、前記改変型ＩｇＶドメインにおける改変においては、ＰＳへの結合性に加え、Ｔｉｍ４タンパク質の三次構造の維持の観点から、ＩｇＶドメイン中のＰＳ結合部位及び両端におけるβシート構造形成部位を保持することが好ましい。
【００１６】
本発明のタンパク質における二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドは、前述した改変Ｔｉｍ４タンパク質のＣ末端に結合している。この二量体を形成するタンパク質は、Ｔｉｍ４タンパク質がＰＳへ結合する際に二量化するのを促すために導入される。
二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドとしては、ＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク質
、ロイシンジッパー構造を有するタンパク質又はポリペプチド等が挙げられる。また、任意のタンパク質又はポリペプチドをＴｉｍ４タンパク質に融合させて、２分子の融合タンパク質の該タンパク質又はポリペプチド同士をＳ−Ｓ結合させて融合タンパク質とした場合も、本発明のタンパク質に含まれる。これらのうち、適当な分子量としてプローブの標的部位以外への非特異的集積を抑制する観点、及び後述するプローブ作製におけるタンパク質の精製の容易さの観点から、ヒトＩｇＧ−Ｆｃタンパク質が好ましい。
【００１７】
本発明のタンパク質の分子量は、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、好ましくは１００ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、より好ましくは１３０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、さらに好ましくは１５０ｋＤａ〜１８０ｋＤａである。
生体内に投与したプローブ分子は、一般に、分子量が大きいものでは肝臓へ、分子量が小さいものは腎臓へ、非特異的に集積する傾向が見られる。そのため、本発明における融合タンパク質は、標的とする死細胞を有する部位・組織へ特異的に集積させ、それ以外の部位への非特異集積を抑える観点から上記の大きさとすることが好ましい。
【００１８】
本発明のタンパク質は、周知の遺伝子操作法を含む任意の方法で作製することができ、特に限定されない。
例えば、野生型のＴｉｍ４をコードするＤＮＡに対して、所望のアミノ酸長の改変型ムチンドメインが残るように該ＤＮＡ中のムチンドメインのＣ末端又はＮ末端側をコードする領域を欠損させて、改変型Ｔｉｍ４をコードするＤＮＡ断片を取得し、周知の方法で二量体を形成するタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ断片と連結して、融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を作製する。得られた融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａ断片を適当な発現ベクターに導入して、該ベクターで大腸菌を形質転換して周知の方法で融合タンパク質を発現、回収し、クロマトグラフィー等により適宜精製を行えばよい。
また、野生型の配列に欠失、置換、挿入、及び／又は付加等の変異も、周知の手法により導入することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質は、標識化することによりプローブとなり、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を検出するために適用できる。アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を有する腫瘍部位・組織の簡便な検出のため、標識化は検出可能な態様であれば特にその種類は限定されない。標識化は周知の方法で適宜行うことができ、例えば、ＦＩＴＣなどを用いる蛍光標識法、ペルオキシダーゼなどを用いる酵素標識法、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ等の画像診断に通常用いられる核種を用いるＲＩ標識法、ビオチン標識法などが挙げられる。
ＰＥＴやＳＰＥＣＴ等汎用されている画像診断法への適用の観点から、本発明のプローブはＲＩ標識化されていることが特に好ましい。ＰＥＴ核種としては、例えば、半減期が数日の64Ｃｕ、89Ｚｒ、68Ｇａ、124Ｉ、18Ｆ等が挙げられるが、これらに限定されない
。ＳＰＥＣＴ核種としては、例えば、半減期が数日の123Ｉ、111Ｉｎ、99mＴｃ等が挙げ
られるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明のタンパク質は、細胞膜に種々存在するリン脂質のうち、ＰＳに特異的に結合することができる。なお、その結合能は、既知のＰＳ結合タンパク質であるＡｎｎｅｘｉｎ
Ａ５と同等である。また、一般に標識体では標識前よりも標的分子への結合能の低下が
みられるが、本発明のタンパク質はＲＩ等で標識化したプローブの態様としてもＰＳへの結合性が低下せず維持される。
上記性質に基づき、本発明のプローブは、細胞膜表面にＰＳを表出させている細胞のＰＳに結合し、それにより該細胞を検出することができる。一般に、生細胞ではＰＳは細胞膜の内側に存在しているが、死細胞においては細胞膜表面にＰＳを表出させるため、本発明のプローブは死細胞を特異的に検出することができる。具体的には、アポトーシス細胞及びネクローシス細胞を検出することができ、アポトーシス誘導等で死につつある段階にある細胞も既に細胞死を起こした細胞も検出することができる。
【００２１】
また、本発明のタンパク質は、改変型Ｔｉｍ４タンパク質を融合タンパク質としたことにより、生体に投与した場合に腎臓への非特異的集積を生じず、アポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を有する部位・組織へ特異的に集積する。
さらに、本発明のタンパク質は、Ｃａ2+濃度に依存せずにＰＳへ結合するため、本発明のプローブを生体に投与した場合でも定量的な解析を可能にする。
【００２２】
したがって、本発明のタンパク質は、プローブの態様とすることで死細胞を高感度に検出することができ、生体内において細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブとなり得る。特に、ＲＩ等で適宜標識化することにより、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ等の画像診断におけるトレーサーとして用いることができる。したがって、本発明のプローブは、腫瘍の画像診断剤に含めることができ、また該画像診断剤を画像診断用キットの態様とすることもできる。
本発明のプローブを、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ等の画像診断におけるトレーサーとして用いた場合の利用態様としては、癌等の疾患診断、薬剤の治療効果判定へ適用を挙げることができる。対象となる癌や腫瘍組織の種類は特に限定されない。
【００２３】
本発明のプローブを用いてアポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞、あるいはこれらを含む腫瘍組織を検出する方法を行う場合は、一般的な手法に準じて行う。
インビトロにおいては、例えば、試料細胞に対して本発明のプローブを添加し、適当な時間反応させた後に、標識に応じた手法での検出を行えばよい。
生体においては、本発明のプローブを対象個体の静脈へ注射（局所又は全身）や輸液等の手段にて投与し、適当時間経過後、例えば投与後１〜２４時間経過後にＳＰＥＣＴ又はＰＥＴにて放射線を測定し、診断や判定に供する。診断、検査の方法、手技は、通常の癌の診断や検査、又は通常の画像診断の方法、手技と基本的に変わらない。
【００２４】
本発明のプローブを個体に投与する場合の適用量としては、特に限定されるものではないが、ヒトに対しては１０〜１００μｇ／個体が好ましく、１５〜７４μｇ／個体がより好ましい。または、ＲＩ標識化したプローブの場合においては、５０〜２５０ＭＢｑ／個体、好ましくは４０〜２００ＭＢｑ／個体、より好ましくは３７〜１８５ＭＢｑ／個体となるように投与する。
また、マウスに対する投与量としては、５００〜７００μｇ／ｋｇが好ましく、ＲＩ標識化したプローブの場合は１０〜２５ＭＢｑ／個体が好ましい。
【実施例】
【００２５】
＜野生型又は改変型ｍＴｉｍ４−Ｆｃの作製＞
以下の手順で、野生型又は改変型のマウスＴｉｍ４とヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク質
との融合タンパク質を作製した。
野生型マウスＴｉｍ４とヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク質との融合タンパク質（ｍＴｉ
ｍ４−Ｆｃ）の配列情報をコードしたプラスミドｐＴｉｍ４−Ｆｃ（長田重一教授提供、作製方法は非特許文献６を参照されたい）で、大腸菌（ＪＭ１０９、タカラバイオ）を形質転換し、プラスミドベクターを増幅した。該プラスミドベクターをＦＡＳＴＰＬＡＳＭＩＤ ＭＩＮＩ ＫＩＴ−２５０ ＰＲＥＰＳ（ＶＰｒｉｍｅ）を用いて精製し、得られた
ｐＴｉｍ４−Ｆｃを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）を用いてＰＣＲを行った。配列番号１１及び１２のプライマーを用いて、ｍＴｉｍ４−ΔＭ２３０−Ｆｃ（ｍＴｉｍ４部分において、野生型ｍＴｉｍ４のムチンドメインのＣ末端側を欠損させて、ムチンドメインのＮ末端から９６番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を残した改変型）をコードするＤＮＡ断片を調製した。また、配列番号１１及び１３のプライマーを用いて、ｍＴｉｍ４−ΔＭ１８４−Ｆｃ（ｍＴｉｍ４部分において、野生型ｍＴｉｍ４のムチンドメインのＣ末端側を欠損させて、ムチンドメインのＮ末端から５０番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を残した改変型）をコードするＤＮＡ断片を調製した。これらのＰＣＲ産物及びｐＴｉｍ４−Ｆｃをそれぞれ制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶ（ともにタカラバイオ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって目的のバンドを切り出し、精製した。精製後のＰＣＲ産物とｐＴｉｍ４−Ｆｃをライゲーションし、大腸菌に形質転換した。アンピシリン添加ＬＢプレート（０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン、１．５％ アガロース、４０カプセル／Ｌ、Ｃｉｒｃｌｅ ｇｒｏｗ、Ｑ−ＢＩＯ
ｇｅｎｅ）に形質転換した大腸菌を播種し、３７℃、１６時間インキュベートした。形
成されたコロニーを鋳型として配列番号１４及び１５のプライマーとＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＭＡＸ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）を用いてコロニーＰＣＲを行い、形質転換体を確認後、ＤＮＡ配列解析を行った。ｍＴｉｍ４−Ｆｃ、ｍＴｉｍ４−ΔＭ２３０−Ｆｃ、及びｍＴｉｍ４−ΔＭ１８４−ＦｃをコードするＤＮＡをそれぞれ含む目的のプラスミドベクターを用いて、以下に示す方法にて各融合タンパク質の発現を行った。なお、作製した各発現タンパク質のＤＮＡ配列とアミノ酸配列及びムチンドメインのアミノ酸残基数を表１に示す。
【００２６】
【表１】
2014105158.tif 000003
【００２７】
融合タンパク質をコードするプラスミドベクターで形質転換した大腸菌を0.1 mg/mL アンピシリン、２００ｍＬ ＬＢ培地で３７℃、１６時間振とう培養し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて増幅したベクターを精製した。精製ベクターをリン酸カルシウム法で２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、２４時間後に培地をＤＭＥＭ培地に交換した。培地交換から４８時間後に培地を回収し、１０００×ｇで５分間遠心分離を行い、上清を回収した。回収した培地５０ｍＬあたりＰｒｏｔｅｉｎ Ａ アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２５μＬ加え、４℃
で一晩ローテートした。翌日ビーズを回収し、ＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０)で５回洗浄し、１００μＬの１００ｍＭグリシンバッファー、ｐＨ３．０でビーズを懸濁し、室温に5分間静置後、遠心分離によ
って上清を回収した。回収した上清をアミコンウルトラ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、３０ｋＤａ ｃｕｔ）を用いてＰＢＳに置換・濃縮し、使用まで−２０℃にて保存した。この結果
、培養上清２００ｍＬから１００〜１５０μｇの各融合タンパク質を得ることができた。
【００２８】
＜ＰＥＴイメージング＞
以下の手順で、前述のようにして得た融合タンパク質（ｍＴｉｍ４−Ｆｃ、ｍＴｉｍ４−ΔＭ２３０−Ｆｃ、及びｍＴｉｍ４−ΔＭ１８４−Ｆｃ）をそれぞれＲＩ標識化した。
各融合タンパク質の保存液をＰＢＳ（D-PBS、和光純薬）に置換した。１０ｍＭ ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡ（ＮＯＴＡ、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）水溶液を０．１Ｎ Ｎａ
ＯＨでｐＨ７．９〜８．４に調整したものを、各融合タンパク質に対し１０００等量となるように加え、４℃にて一晩静置した。その後、ＰＢＳで平衡化した脱塩カラム（ＰＤ−１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉ.）でＮＯＴＡに結合した融合タンパク質と未反応のＮＯＴＡとを分離した。ＮＯＴＡ結合融合タンパク質分画をアミコンウルトラにて濃縮し、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）に置換し、ＮＯＴＡ結合融合タンパク質１μgあたり
６ＭＢｑの［64Ｃｕ］ＣｕＣｌ2水溶液を加え、４０℃、３０分間保温し、64Ｃｕのキレ
ート反応を行った。反応後、アミコンウルトラにて３００μＬの１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ６．５）で未反応の64Ｃｕを３回洗い出し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−
ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に置換し、タンパク質濃度を測定した。その結果、９０％以上の精製度で、比放射能はおよそ６００〜８００ＭＢｑ/ｎｍｏｌのＲＩ標識体をそれぞれ得た
（表２）。
【００２９】
【表２】
2014105158.tif 000004
【００３０】
ＰＥＴイメージング実験に際し、以下のようにモデル動物を作製した。
５〜６週齢の雄のBalb/c-Ajcl-nu/nuマウス（日本クレア）を用意し、２群（ＭＭＣ投
与群及びＶｅｈｉｃｌｅ群、各群３匹）に分けた。ＭＭＣ投与群にはＰＥＴ実験の２〜３週間前に、Ｖｅｈｉｃｌｅ群には１０日〜２週間前に、それぞれＡ４３１細胞を左大腿部に接種し、ＲＩ標識体投与の前日に腫瘍サイズが５０〜１２０ｃｍ3となった個体をＰＥ
Ｔ実験に使用した。ＲＩ標識体投与の１日、３日、５日前に、ＭＭＣ投与群にはＭＭＣ（マイトマイシンＣ）を５ｍｇ／６．２５ｍＬ／ｋｇとなるよう調整して尾静脈投与し、Ｖｅｈｉｃｌｅ群には６．２５ｍＬ／ｋｇの生理食塩水を尾静脈投与した。
前述のようにして調製した各64Ｃｕ標識体を０．２〜０．２５ｍｇ／ｋｇ（１５〜２５ＭＢｑ／ｂｏｄｙ）となるように尾静脈投与し、投与後４８時間に１時間のダイナミック撮像を行った（MicroPET Focus 220、Siemens）。得られた画像を図１に示す。
すべての撮像終了後にマウスを解剖し、各組織の放射能をγ-カウンターにて測定した
（表３）。
これらの結果、［64Ｃｕ］Ｔｉｍ４―Ｆｃを投与したＭＭＣ投与動物と生食投与動物間での差は見られなかったが、［64Ｃｕ］ｍＴｉｍ４−ΔＭ２３０−Ｆｃ、及び［64Ｃｕ］ｍＴｉｍ４−ΔＭ１８４−ＦｃではＭＭＣ投与動物において腫瘍への集積が認められた。
【００３１】
【表３】
2014105158.tif 000005
【００３２】
＜標的組織におけるアポトーシスの判定＞
前述のＰＥＴ実験終了後、マウスから腫瘍を摘出し凍結切片を作製した。作製した凍結
切片は冷却メタノール固定した後、使用まで−２０℃で保存し、解剖から３〜５日間の間に実験に使用した。
凍結切片をＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ、Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ（Ｄａｋｏ）でブロッ
キングし、ＤｅａｄＥｎｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いてＴＵＮＥＬ染色後、１０００倍希釈した一次抗体（Ｃｌｅａｖｅｄ
Ｃａｓｐａｓｅ−３（Ａｓｐ１７５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＣＳＴ）を室温で２時間反応
させ、さらに二次抗体（Ｃｙ３標識抗ウサギＩｇＧ抗体）を室温で２時間反応させた。また、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ３３２５６（Ｄｏｊｉｎｄｏ）をもちいて核染色も行った。反応後、試料を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
結果を図２に示す。ＭＭＣ投与個体から採取した腫瘍の凍結切片では、全体に活性化カスパーゼ３抗体とＴＵＮＥＬの陽性細胞が観察された。一方、生理食塩水投与個体のものはいずれも陰性であった。このことから、ＭＭＣ投与個体の腫瘍ではアポトーシスが生じていることを確認した。
【００３３】
＜野生型又は改変型ｈＴｉｍ４−Ｆｃの作製＞
以下の手順で、ヒトＴｉｍ４（野生型、ムチンドメインの長さを様々に変えた改変型）とヒトＩｇＧ Ｆｃ領域タンパク質との融合タンパク質を作製した。
ｈＴｉｍ４配列をコードしたベクター（ｐＣＭＶ６−ＸＬ５ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １ ａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔｉｏｎ−ｒｅａｄｙ ＤＮＡ、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を鋳型として、５’末端にＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを含むプライマー（配列番号２２）及び３’末端にＢｇｌＩＩ制限サイトを含むプライマー（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物とヒトＩｇＧ−Ｆｃ領域をコードしたｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１ｅ３―Ｆｃ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）をそれぞれＥｃｏＲＶ及びＢｇｌＩＩで消化したものをライゲーションし、大腸菌（ＪＭ１０９、タカラバイオ）に形質転換させ、コロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドを抽出しＤＮＡ配列解析を行い、ｈＴｉｍ４配列の挿入されたコロニーを大量培養しベクターを得た。得られたベクターを配列番号２０及び２１に示すプライマーを用いて増幅し、タンパク質発現用ベクター（ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。挿入ベクターを大腸菌（Ｔ
ＯＰ１０、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換し、ＤＮＡ配列解析で挿入
方向を確認した。得られたベクター（ｐｈＴｉｍ４−Ｆｃ）を鋳型として、表４に示す各プライマーを用いて様々な長さのムチンドメインを持つベクターを作成した。ムチン様ドメインの削除にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タ
カラバイオ）を使用した。作製した各発現タンパク質のＤＮＡ配列とアミノ酸配列及びムチンドメインのアミノ酸残基数を表５に示す。
得られたベクター３７．５μｇを１×１０6個／ｍＬに調整したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３０ ｍＬにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｍ
ＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクションし、３７℃、８％ ＣＯ2の条件下で４日間振とう培養し、培養３日目に１０ｍＬの培地を追加した。回収した培養上清４０ｍＬに対しＰｒｏｔｅｉｎ Ａアガロースビーズ（
Ｐｉｅｒｃｅ）２５０μＬを加え、発現タンパク質を回収した。回収した発現タンパク質をゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ＰＢＳ ｐＨ６．８に置換し４℃で使用まで保存した。精製タンパク
質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、非還元状態における分子量を算出した（表６）。
【００３４】
【表４】
2014105158.tif 000006
【００３５】
【表５】
2014105158.tif 000007
【００３６】
【表６】
2014105158.tif 000008
【００３７】
＜野生型又は改変型ｈＴｉｍ４−ＦｃのＰＳに対する結合能の評価＞
以下の手順でドットブロッティングを行い、前述のように作製した各融合タンパク質（ｈＴｉｍ４−Ｆｃ）のＰＳに対する結合能を検討した。
１０ｍｍ角のＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に０．１５μｇのＰＳをスポ
ットし、２４穴プレート中で５００μＬのブロッキングバッファー（５％スキムミルク−ＰＢＳ−Ｔ）を用いて室温で１時間インキュベートし、ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーに各融合タンパク質を終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるように加え、４℃で一晩インキュベートした。コントロールはブロッキングバッファーのみとした。その後、ＰＶＤＦ膜を２ｍＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、５００μＬのブロッキングバッファーで１００００倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）溶液中で室温にて２時間インキュベートした。その後、２ｍＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＥＣＬ ｐ
ｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で化学発光させ、ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆ
ｉｌｍ）で検出した。
図３に示す結果のとおり、ｈＴｉｍ４−２４０−Ｆｃ、ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ、ｈＴｉｍ４−１８４−Ｆｃ、ｈＴｉｍ４−１８1-Fc、ｈＴｉｍ４−１７８−Ｆｃ、ｈＴｉｍ４−１７５−Ｆｃ及びｈＴｉｍ４−１６２−ＦｃでＰＳへの結合が確認された。
【００３８】
＜改変型ｈＴｉｍ４−ＦｃのＰＳに対する結合特異性の評価＞
以下の手順でドットブロッティングを行い、本発明の融合タンパク質の種々のリン脂質に対する結合性を検討した。
ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１００ｐｍｏｌ／μＬの３−ｓｎ−Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＥ）、Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＣ）、Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＰＩ）、及び３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）を各１μＬスポットし、２ｍＬのブロッキングバッファー（５％スキムミルク−ＰＢＳ）を用いて室温で１時間インキュベートし、ブロッキングを行った。各ウェルにブロッキングバッファーにｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃを終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるように加え、室温で２時間インキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜を５ｍＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄したのち、２ｍＬのブロッキングバッファーで１００００倍希釈したＨＲ
Ｐ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）溶液中で室温にて２時間反応させた。反応後、５ｍＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で化学発光させ、ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）で検出した。
図４に示す結果のとおり、ｈＴｉｍ４−１８７−ＦｃはＰＳにのみ結合することを確認した。
【００３９】
＜アポトーシス誘導細胞の検出＞
以下の手順で免疫染色を行い、アポトーシスを誘導した細胞に対するｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ又はＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５の結合性を検討した。
１×１０6個／ｍＬのＪｕｒｋａｔ細胞に終濃度１００μＭのＥｔｏｐｏｓｉｄを加え
、５％ ＣＯ2、３７℃で６時間培養し、アポトーシスの誘導を行った。細胞を回収し冷却ＰＢＳで洗浄後、２％ＦＢＳ−ＰＢＳに１×１０7個／ｍＬとなるよう懸濁した。ｈＴｉ
ｍ４−１８７−Ｆｃによる免疫染色は、前記細胞液に終濃度がそれぞれ０．５μｇ／ｍＬ
ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃ、２．５ｎｇ／ｍＬ ＣＦ４８８標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、２０μＬ／ｍＬ Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）溶液（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を加え、室温で５分間インキュベートした。その後冷却ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５による染色は、前記細胞液に対して
Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて行い、同様に蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図５に示す。既存のプローブであるＡｎｎｅｘｉｎ Ａ５同様に、ｈＴｉｍ４−
１８７−Ｆｃはアポトーシス誘導細胞に対して結合性を示し、また生細胞に対しては結合しないことが確認された。なお、ＰＩ陽性は死細胞を示すところ、Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５
と同様に、ｈＴｉｍ４−１８７−Ｆｃはアポトーシス誘導され死につつある段階にある細胞と死細胞とを検出できることも確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、死細胞を高感度に検出することができ、生体内において細胞死を呈した腫瘍部位へ特異的に集積し、さらに定量的な解析を可能とする分子イメージングプローブが提供される。したがって、生体内における細胞死を的確に検出し画像化して、疾患の診断や薬剤の試料効果判定に供することができるため、産業上非常に有用である。
【図１】
2014105158.tif 000009
【図２】
2014105158.tif 000010
【図３】
2014105158.tif 000011
【図４】
2014105158.tif 000012
【図５】
2014105158.tif 000013
【配列表】
2014105158000001.app