(57)【要約】      （修正有）【課題】主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）領域中に位置する遺伝子であるＴＡＰ−１の発現が欠失した細胞が過剰増殖することに起因するＴＡＰ−１欠失癌（例えば、メラノーマ細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、子宮頸癌細胞など）を治療するための新規医薬組成物の提供。【解決手段】ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と、適切なアジュバント又は担体を含む医薬組成物。前記組成物の投与により、ＴＡＰ−１発現欠失細胞中のＴＡＰ−１遺伝子の発現と転写が促進され、前記細胞の免疫原性が増強される。前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤としては、トリコスタチンＡなどのヒストンＨ３デアセチラーゼ阻害剤が好ましい。前記組成物は、ＴＡＰ−１欠失癌に対するワクチン製剤と共にアジュバントとして使用されることが好ましく、この場合、投与するワクチンの治療有効量を大幅に低減させることが期待できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＰ−１欠失癌を治療するのに用いる医薬組成物であって、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、適切なアジュバント又は担体を含む、上記組成物。
【請求項２】
前記ＴＡＰ−１欠失癌が、メラノーマ細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞又は子宮頸癌細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＴＡＰ−１欠失癌が、ヘルペスウイルス抗原を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＴＡＰ−１欠失癌が、パピローマウイルス抗原を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記パピローマウイルス抗原が、Ｅ６及び／又はＥ７である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ヒストンＨ３デアセチラーゼ阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ワクチン製剤を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ＤＮＡワクチン、タンパク質系ワクチン、又はワクチンアジュバントの使用をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物及び医学的治療におけるその使用に関する。より詳細には本発明は、患者の身体中の選択した細胞の免疫原性を増強し、それによって細胞を身体の免疫系による認識及び排除に対してより敏感にするための、組成物及び医学的治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、それらの表面上で外来抗原を発現する感染又は悪性細胞及び侵入生物の免疫学的監視及び破壊において活発な、免疫系の主な構成要素である。抗原特異的Ｔ細胞受容体のリガンドは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と結合した外来抗原のペプチド断片で構成される複合体である。細胞障害性Ｔリンパ球は、ペプチド部分を含む三次構造複合体として細胞表面で通常発現されるＭＨＣクラスＩ分子と結合したペプチドを認識する。三次構造複合体の形成は、細胞質中でのタンパク質分解によって生成するペプチドの小胞体内腔への輸送を含む。
【０００３】
ＭＨＣ領域中に位置する２つの遺伝子、即ちＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２が同定されており、これらは細胞質からのこのペプチドの輸送に関与している。
【０００４】
従来技術に対する簡単な言及
２００２年３月２６日に発行されたＪｅｆｆｅｒｉｅｓらの米国特許第６，３６１，７７０号は、ＴＡＰ−１又はＴＡＰ−２をコードする核酸配列を標的細胞に導入し発現させることによって、標的細胞の表面上でのＭＨＣクラスＩ分子の発現を増強する方法を教示する。標的細胞中でのＴＡＰ−１又はＴＡＰ−２の発現は、標的細胞上でのＭＨＣクラスＩ表面分子の提示を増強し、したがって免疫系のＣＴＬによってそれらを検出及び排除することができる。この方法は、プロテアソーム成分の欠乏があり、したがって正常未満のＴＡＰ発現があり、その結果ＣＴＬによって認識される十分なＭＨＣクラスＩ表面分子を発現しない腫瘍細胞に関して特に有用である。加えた核酸配列からのＴＡＰのｉｎ  ｓｉｔｕでの増大した発現によって、標的細胞は免疫系のＣＴＬの認識及び作用下に移行する。
【０００５】
クロマチン構造の制御は、遺伝子発現を調節する際に重要な役割を果たすことは知られている。クロマチン構造の調節と関係がある遺伝子の脱制御は、無制御な細胞増殖、宿主の免疫学的監視の回避及び腫瘍の発達と密接に関連している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
クロマチンリモデリングは、抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）−１、抗原プロセシング機構の重要な構成要素の発現を制御する際に役割を果たすことが現在分かっている。クロマチン鋳型中、特にアセチル化感受性プロモーターの近接領域における高レベルのアセチル化コアヒストンは、転写活性部位と関係付けられることが以前に示されており、したがってヒストンＨ３アセチル化は、ＴＡＰ−１の転写を制御する際に重要な役割を果たすことが現在決定されている。特に、非常に特異的なヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡは、癌細胞におけるＴＡＰ−１の転写及び表面ＭＨＣクラス１の提示を促進し、それらの免疫原性の増強をもたらす際に非常に有効であることが分かっている。本発明者らは、ＴＡＰ−２、タパシン、ＭＨＣＩ、ＬＭＰ２、７などはいずれもＴＳＡによって上方制御されることを示す。
【０００７】
したがって本発明の第１の態様によれば、細胞障害性Ｔリンパ球細胞によって検出されるＭＨＣクラスＩ表面分子の提示を増大させることにより、細胞の免疫原性を増強する方法であって、細胞中の遺伝子の転写を促進して細胞のＭＨＣクラスＩ表面発現の増強を引き起こす有効量の生体許容物質を細胞に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
第２の態様によれば、本発明は、哺乳動物細胞のＭＨＣクラスＩ表面発現を増強するために哺乳動物に投与するための医薬組成物であって、細胞中のＴＡＰ−１遺伝子又はＭＨＣクラスＩの発現に関与する他の遺伝子の転写を促進して細胞のＭＨＣクラスＩ表面発現の増強を引き起こす生体許容物質、及び適切なアジュバント又は担体を含む組成物を提供する。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、過剰なＴＡＰ−１発現欠失細胞が関与する障害に罹患した哺乳動物に投与するための、細胞中のＴＡＰ−１遺伝子の転写を促進して細胞のＭＨＣクラスＩ表面発現の増強を引き起こすＴＡＰ−１発現増加量の物質、及び適切なアジュバント又は担体を含む組成物の調製又は製造における使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
好ましい実施形態によれば、生体許容物質は、ヒドロキサム酸系のヒストンＨ３デアセチラーゼ阻害剤などのヒストンＨ３デアセチラーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、又は固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する転写コアクチベーターである。
【００１１】
特定の好ましい実施形態によれば、この物質はトリコスタチンＡ、又はＣＢＰ／ｐ３００タンパク質ファミリーの少なくとも１つのメンバーを含むヒストンアセチルトランスフェラーゼである。
【００１２】
それによって働くと考えられる作用又は生化学的機構の任意の特定の理論によって、本発明が制限されるはずであるとは意図しないが、本発明及びその実施のより良い理解のために以下の事項を提供し仮定する。
【００１３】
癌におけるＴＡＰ−１転写の障害は、一般的な転写因子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩの遺伝子のプロモーターへのアクセスを妨げる、ＴＡＰ−１プロモーター領域周辺のコンパクトなヌクレオソーム構造に起因する物的障壁によっておそらく引き起こされる。前に示したように、クロマチン鋳型中、特にアセチル化感受性プロモーターの近接領域における高レベルのアセチル化コアヒストンは、転写活性部位と関係付けられることが示されている。いくつかのネズミ癌細胞系のＴＡＰ−１プロモーターにおけるヒストンＨ３アセチル化のレベルの上昇は、ヒストンＨ３アセチル化はＴＡＰ−１転写の制御において役割を果たすことを示した。ヒストンＨ３は、その修飾が様々な遺伝子発現において役割を果たすことが示されたコアヒストンの唯一の型ではないが、ヒストンＨ３尾部のアセチル化と様々な遺伝子の活性化の間の相関関係は広く研究されてきており、現在は十分確立している。Ｔａｐ−２及びタパシンなども、このようにして同様に制御される。
【００１４】
本発明中で使用するのに好ましいヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、非常に特異的なトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）である。ＴＳＡは、遺伝子に選択的に作用し、培養腫瘍細胞中で発現される遺伝子のわずか約２％の転写を改変し、且つｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで抗癌作用を与える、ヒドロキサム酸系のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の一群に属する。
【００１５】
本発明の方法は、悪性細胞、ウイルスに感染した細胞及び細菌に感染した細胞を含めた、ＴＡＰ−１の発現欠失を示す哺乳動物細胞に対して一般に適用する。最も好ましいのは、悪性腫瘍細胞、特にメラノーマ細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞及び子宮頸癌細胞中のＴＡＰ−１の発現を増強する際の使用である。癌細胞はパピローマＥＥ６及びＥ７遺伝子を発現するので、パピローマウイルス抗原の認識の向上が本発明によって可能である。パピローマはヘルペスウイルスなので、この手法はすべてのヘルペスウイルスに予想通り働く。
【００１６】
本発明による組成物は、それらがＴＡＰ発現欠失細胞の部位（複数可）に到達するという条件で、様々な経路のうちの任意のものによって患者に投与することができる。このような経路には、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、鼻腔、非経口、さらに前記化合物で腫瘍又は樹状細胞を処理し次いでそれらを患者などに再導入することによるｅｘ  ｖｉｖｏでの腫瘍間経路がある。適切な用量は治療下の患者の状態及び障害の重度によって決定されるが、他の悪性治療薬剤との類似性に基づいて主治医の通常の技術範囲内にある。
【００１７】
本発明の組成物の特に好ましい使用は、知られている癌、細菌感染、原生及びウイルス感染治療と関連したアジュバントとしての使用である。本発明の組成物を、ワクチンなどの他の薬学的に有効な治療剤と共にアジュバントとして使用するとき、有効なワクチン量の多数倍の低下が予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
添付の図面の図１〜９は、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図１Ａ】添付の図面の図１Ａは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図１Ｂ】添付の図面の図１Ｂは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図１Ｃ】添付の図面の図１Ｃは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図２Ａ】添付の図面の図２Ａは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図２Ｂ】添付の図面の図２Ｂは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図２Ｃ】添付の図面の図２Ｃは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図２Ｄ】添付の図面の図２Ｄは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図３Ａ】添付の図面の図３Ａは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図３Ｂ】添付の図面の図３Ｂは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図３Ｃ】添付の図面の図３Ｃは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図３Ｄ】添付の図面の図３Ｄは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図３Ｅ】添付の図面の図３Ｅは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図３Ｆ】添付の図面の図３Ｆは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図４Ａ】添付の図面の図４Ａは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図４Ｂ】添付の図面の図４Ｂは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図５Ａ】添付の図面の図５Ａは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図５Ｂ】添付の図面の図５Ｂは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図６Ａ】添付の図面の図６Ａは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図６Ｂ】添付の図面の図６Ｂは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図６Ｃ】添付の図面の図６Ｃは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図６Ｄ】添付の図面の図６Ｄは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図７Ａ】添付の図面の図７Ａは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図７Ｂ】添付の図面の図７Ｂは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図８Ａ】添付の図面の図８Ａは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図８Ｂ】添付の図面の図８Ｂは、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【図９】添付の図面の図９は、以下にある程度詳しく記載し論じる様々な具体的な実験実施例から得た結果の、グラフ表示及び図的記述である。
【００１９】
本発明は、以下の「実験手順」及び「実施例」項中にさらに記載する。
【実施例】
【００２０】
実験手順
細胞系及び試薬
この試験では、３つの細胞系：ＴＣ−１、ＴＣ−１／Ｄ１１及びＴＣ−１／Ａ９をＨＰＶ−陽性癌モデルとして使用した。ＴＣ−１細胞系は、ＨＰＶ１６Ｅ６及びＥ７オンコジーン及び活性化Ｈ−ｒａｓを用いたネズミ初代肺細胞の形質転換から開発した［１］。ＴＣ−１／Ｄ１１及びＴＣ−１／Ａ９は、ＴＡＰ−１及びＭＨＣクラス１の発現が下方制御されたＴＣ−１細胞のクローンである［２］。ネズミ初代前立腺癌細胞系、ＰＡ、及びその転移、ＴＡＰ−及びＭＨＣクラスＩ欠失誘導体、ＬＭＤも使用した［３］。
【００２１】
ＨＰＶ１６Ｅ６及びＥ７オンコジーン及び活性化Ｈ−ｒａｓを用いたＣ５７ＢＬ／６初代肺細胞の形質転換から開発したＴＣ−１細胞系は、Ｄｒ．Ｔ．Ｃ．Ｗｕ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤによって提供された［７］。ＴＣ−１／Ｄ１１及びＴＣ−１／Ａ９細胞系は、Ｄｒ．Ｍ．Ｓｍａｈｅｌ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、プラハ、チェコ共和国によって提供された［１２］。ＴＣ−１／Ｄ１１及びＴＣ−１／Ａ９は、本文中ではそれぞれＤ１１及びＡ９と略す。ＣＭＴ．６４細胞系は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの自然発生肺癌から樹立した［４］。Ｌｔｋ（＝Ｌ−Ｍ（ＴＫ−））線維芽細胞系はＣ３Ｈ／Ａｎマウス（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から誘導した。前述のすべての細胞系はＤＭＥＭ培地中で増殖させた。それぞれ１２９／Ｓｖマウスの初代及び転移性前立腺癌から誘導したＰＡ及びＬＭＤ細胞系（Ｄｒ．Ｔ．Ｃ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸの贈答品）［３］、及びいずれもＣ５７ＢＬ／６マウスから誘導したＢ１６Ｆ１０（Ｂ１６）メラノーマ［５］及びＲＭＡリンパ腫［６］細胞系を、ＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。ＲＰＭＩ１６４０及びＤＭＥＭ培地に、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補充した。１ミリモルのピルビン酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８も、ＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９細胞用にＤＭＥＭ培地に加えた。細胞は未処理状態であったか、或いは１００ｎｇ／ｍｌのＴＳＡで（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）２４時間（ＣＭＴ．６４、Ｂ１６、ＰＡ及びＬＭＤ）又は４８時間（ＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９）、又は５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γで４８時間処理した。
【００２２】
逆転写ＰＣＲ分析
ＰＣＲ増幅に使用したプライマー（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を表１中に挙げる。全細胞ＲＮＡをトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）を使用して抽出し、ＤＮａｓｅ１（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）でＲＮＡサンプルを処理することによって汚染ＤＮＡを除去した。１μｇの全細胞ＲＮＡの逆転写は、２０μｌの合計体積でＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの逆転写キットを使用して実施した。ｃＤＮＡの２μｌのアリコートを、１×ＰＣＲバッファー、２５０μＭのデオキシヌクレオチド三リン酸、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２μＭの各プライマー及び２．５単位のＴａｑ又はＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む合計５０μｌの反応混合物におけるＰＣＲ用の鋳型として使用した。すべてのＰＣＲ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮから入手した。ｃＤＮＡ増幅は、変性（１分、９５℃）、アニーリング（１分、５４〜６４℃）、及び伸長（２分、７２℃）の２５〜３５サイクルでＴ勾配サーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）において特異的プライマー対を用いて実施した。サイクルは１０分間７２℃の最終伸長で終了した。２０マイクロリットルの増幅産物をアガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光下で写真撮影した。
【００２３】
リアルタイム定量ＰＣＲ分析
この試験では、クロマチン免疫沈降アッセイにおいて抗体と共沈降する内因性ＴＡＰ−１プロモーターのレベルの定量化、及び安定的にトランスフェクトした細胞中に組み込んだｐＴＡＰ１−ｌｕｃ構築体のコピー数の定量化のために、この方法を利用した。精製したゲノムＤＮＡは、合計１０μｌの反応混合物において２００〜５００ｎＭの各プライマー及び１μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｔａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用する増幅用の鋳型として使用した。変性（５秒、９５℃）、アニーリング（５秒、６１〜６３℃）、及び伸長（２０秒、７２℃）の３７サイクルは、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用して実施した。
【００２４】
クロマチン免疫沈降アッセイ
サンプル当たり７×１０６個の細胞を使用したクロマチン免疫沈降実験を、以前に記載されたのと同様に行った［７］。５マイクログラムの抗ＲＮＡｐｏｌＩＩ（Ｎ−２０、ｓｃ−８９９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、抗アセチルヒストンＨ３（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）又は抗ＣＢＰ（Ａ−２２、ｓｃ−３６９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）ポリクローナル抗体（Ａｂ）を免疫沈降に使用した。ネズミＴＡＰ−１プロモーター又は各サンプル由来の抗体との共沈降のレベルを、ＴＡＰ−１プロモーターに特異的なプライマーを使用するリアルタイムＰＣＲによって定量化した。ＴＡＰ−１プロモーターの３’末端に特異的なプライマーは、抗ＲＮＡｐｏｌＩＩ又は抗アセチルヒストンＨ３抗体を使用して鋳型が免疫沈降する場合ＰＣＲに使用し、一方５’末端に特異的なプライマーは、抗ＣＢＰ抗体を使用して免疫沈降する鋳型に使用した。ネズミＴＡＰ−１プロモーターを含むプラスミドの連続希釈を使用して、ＴＡＰ−１プロモーター特異的プライマー対を使用し標準曲線を作製した。
【００２５】
プラスミド構築体
ＴＡＰ−１プロモーターによって誘導されるＥＧＦＰ遺伝子を含むプラスミド（ｐＴＡＰ１−ＥＧＦＰ）を、以前に記載されたのと同様に構築した［８］。ＴＡＰ−１プロモーターによって誘導されるルシフェラーゼ遺伝子を含む同様の構築体（ｐＴＡＰ１−ｌｕｃ）を、ｐＧＬ４．１４［ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＳａｃＩ部位とＢｇｌＩＩ部位の間にＴＡＰ−１プロモーターを挿入することによって作製した。いくつかの切断型ＴＡＰ−１プロモーター構築体も、その５’末端切断部をｐＧＬ４．１４［ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ］ベクターにクローニングすることによって作製した。完全なＴＡＰ−１プロモーター及びその切断部のＰＣＲ増幅に使用したプライマーは表１に挙げる。
【００２６】
トランスフェクション及び選択
ＴＣ−１、Ｄ１１、Ａ９、ＰＡ及びＬＭＤ細胞に、ＥｘＧｅｎ５００  ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション試薬（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、ＴＡＰ−１プロモーター構築体又はプロモーターを含まないｐＧＬ４．１４［ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ］ベクターをトランスフェクトした。一過性トランスフェクタントはトランスフェクション後１２時間と７２時間の間で分析した。安定トランスフェクタントを得るために、トランスフェクト細胞は、以下の濃度のハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ）：ＴＣ−１細胞に関して５５０ｎｇ／ｍｌ、Ｄ１１、Ａ９及びＬＭＤ細胞に関して２５０ｎｇ／ｍｌ、ＰＡ細胞に関して２００ｎｇ／ｍｌの存在下において３週間で選択した。
【００２７】
ルシフェラーゼアッセイ
一過性トランスフェクタントにおける相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＡ）を、トランスフェクション後１２〜７２時間以内にデュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した。（トランスフェクション後３週間〜１カ月の）安定トランスフェクタントにおけるＲＬＡはＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価し、プロモーターを含まないｐＧＬ４．１４［ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ］ベクターのみを用いたトランスフェクションから得られた対応する値を有する結果を差し引き、且つそれぞれの安定トランスフェクタントのゲノムに組み込んだプラスミドのコピー数と値をさらに正規化することによって決定した。
【００２８】
ウェスタンブロット
サンプル当たり５０マイクログラムのタンパク質を、６％（ｐ３００、ＣＢＰ及びＴＡＰ−１）又は１５％（β−アクチン及びアセチル−ヒストンＨ３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質はニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に移した。ブロットをＰＢＳに溶かした５％スキムミルクでブロッキングし、適切な抗体希釈でインキュベートした。以下のウサギポリクローナル抗体、（Ｌｉｎｄａ  Ｌｉ  ｉｎ  Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ  Ｌａｂによって作製された）抗マウスＴＡＰ−１、抗アセチル−ヒストンＨ３（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、抗ｐ３００（Ｃ−２０、ｓｃ−５８５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＣＢＰ（Ａ−２２、ｓｃ−３６９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）をこれらの試験中で使用した。使用した二次抗体は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）であった。充填対照用に、抗β−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、次にＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用した。Ｌｕｍｉ−ｌｉｇｈｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してブロットを発色させた。
【００２９】
細胞障害性アッセイ
１＊１０７ＴＣＩＰの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）をＣ５７Ｂ１６マウスに注射することによってＣＴＬエフェクター細胞を作製した。脾臓を７日後に回収し、均質化し、１μＭのＶＳＶ−ＮＰペプチド（ＲＧＹＶＹＱＧＬ）と共に、ＣＴＬ培地（１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のＮＥＡＡ、１％のピルビン酸ナトリウム、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び０．１％の２−ＭＥを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で５日間インキュベートした。１６時間７．５のＭＯＩでのＶＳＶによる感染前に、ＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９細胞をＩＦＮ−γ（５０ｎｇ／ｍｌ）で４８時間、ＴＳＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、又は未処理状態で放置した。細胞はＰＢＳで洗浄し、１時間２５０μｌのＣＴＬ培地中で１００μＣｉの５１Ｃｒ（クロム酸ナトリウムとして；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）と共に１０６個の細胞をインキュベートすることによって５１Ｃｒを添加した。ＰＢＳで３回洗浄した後、エフェクター細胞と共に標的細胞を示した割合で４時間インキュベートした。それぞれのウェルから１００μｌの上清を回収し、５１Ｃｒの放出をγ−カウンター（ＬＫＢ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって測定した。具体的な５１Ｃｒの放出は以下のように計算した、（（実験−培地対照）／（全体−培地対照））×１００％。５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を用いた細胞の溶解によって全体の放出を得た。
【００３０】
ＨＰＶ陽性癌異種移植片の定着及びトリコスタチンＡを用いた治療
ＰＢＳに溶かしたＴＣ−１又はＡ９の合計３×１０５個の細胞を、７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６同種マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＱＣ）に皮下注射した。マウスは各群４匹からなる３群に割り当てた。ＴＳＡは０．２ｍｇ／ｍｌの濃度までＤＭＳＯに溶かした。腫瘍細胞の注射後第７日から始めて２０日間の腹腔内注射によって、５０ｕｌのＴＳＡ（５００μｇ／ｋｇ）又はＤＭＳＯ（賦形剤対照）を用いた１日１回の治療を施した。マウスは週１回重量測定し、それらの挙動及び食物摂取は実験の行程を通じてモニタリングした。腫瘍は週３回測定し、腫瘍体積は式：腫瘍体積＝長さ×幅×高さ×π／６［３２］を使用して計算した。ＤＭＳＯ賦形剤対照で治療したＡ９群中の腫瘍の大きさによって試験期間を決定した。
【００３１】
実験結果：
（実施例１）
前に記載した試薬及び手順を使用して、マウス前立腺及びＨＰＶ−陽性癌モデルにおけるＥＰ−１のｍＲＮＡ発現は、それらの表面ＭＨＣクラスＩの発現と相関関係があることを実証した。
【００３２】
ＴＡＰ−１の発現レベルは、使用した細胞系の両群（マウス前立腺癌及びＨＰＶ−陽性癌モデル）において、ＭＨＣクラスＩの表面発現レベルと相関関係があることを確認した。これらの結果は図１に示す。ＴＡＰ−１プロモーターによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子の発現は、トランスフェクタントが安定状態になった後の内因性ＴＡＰ−１のレベルと一般に合致する。図１Ａは、それぞれＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーによる、ＴＡＰ−１及び表面ＭＨＣクラスＩの発現の分析を示す。斜線部分、薄線及び太線は、低レベル（Ａ９又はＬＭＤ）、中レベル（Ｄ１１）及び高レベル（ＴＣ−１又はＰＡ）のＭＨＣクラスＩの発現をそれぞれ表す。ＲＴ−ＰＣＲ分析において内対照として働いたβ−アクチンｃＤＮＡの増幅。データは３回の実験の代表的なものである。図１Ｂ−一過性トランスフェクタントにおける相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＡ）を、トランスフェクション後１２〜７２時間以内にデュアルルシフェラーゼアッセイによって評価した。（トランスフェクション後３週間〜１カ月の）安定トランスフェクタントにおけるＲＬＡは、プロモーターを含まないｐＧＬ４．１４［ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ］ベクターのみを用いたトランスフェクションから得られた対応する値を有する結果を差し引き、且つそれぞれの安定トランスフェクタントのゲノムに組み込んだプラスミドのコピー数と値をさらに正規化することによって決定した。最小値は１として任意に決定した。棒グラフ、４〜６回の実験の平均；バー、ＳＥＭ。前立腺癌モデルでは、ＬＭＤ細胞より高レベルの表面ＭＨＣクラスＩを発現したＰＡ細胞は、高レベルのＴＡＰ−１も発現した。同様に、ＨＰＶ−陽性癌モデルでは、それぞれ高、中及び低レベルの表面ＭＨＣクラスＩを発現するＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９細胞は、ＭＨＣクラスＩのレベルと同程度でＴＡＰ−１も発現した。
【００３３】
（実施例２）
ＴＡＰ−１転写の制御におけるクロマチンリモデリングの役割を調べた。蛍光顕微鏡検査法及びフローサイトメトリーによる以前の観察結果は、ＴＡＰ−１プロモーターによって誘導されるＥＧＦＰ遺伝子を含むレポーター構築体を用いた、ＴＡＰ発現及びＴＡＰ欠失細胞系の数群のトランスフェクション後数日で、ＴＡＰ欠失群中の多くの細胞は、ＴＡＰ発現群中の大部分の細胞が発現したのと同等又はより高いレベルのＥＧＦＰを発現し（データ示さず）、一方安定トランスフェクタント中のＥＧＦＰの発現レベルは、内因性ＴＡＰ−１の発現プロファイルと合致した（Ｓｅｔｉａｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、７４８５〜７４９２）ことを示した。この実験では、ｌｕｃ遺伝子の上流のマウスＴＡＰ−１プロモーターをｐＧＬ４．１４［ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（ｐＴＡＰ１−ｌｕｃ）にクローニングすることによって、ルシフェラーゼレポーター構築体を作製し、構築体は細胞系にトランスフェクトした。ＥＧＦＰレベルの以前の観察中と同様に、安定トランスフェクタント中のｌｕｃ遺伝子発現のレベルは、内因性ＴＡＰ−１の発現と一過性トランスフェクタントと安定トランスフェクタントの両方の等しく合致したプロファイルを示した前立腺癌モデル以外は、一過性トランスフェクタント中のレベルよりよく内因性ＴＡＰ−１の発現プロファイルと合致したことが分かった。これは図１Ｂに示す。さらに、図２に示すように、ＴＡＰ−１の発現レベルが低い細胞中でＴＡＰ−１プロモーターと結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）は、ＴＡＰ−１の発現レベルが高い細胞中のＲＮＡポリメラーゼＩＩより相対的に少量であった。それぞれの細胞系のＴＡＰ−１プロモーターにおけるＲＮＡ  ＰｏｌＩＩ又はアセチル−ヒストンＨ３のレベルを、それぞれ抗ＲＮＡｐｏｌＩＩ又は抗アセチル−ヒストンＨ３抗体を使用したクロマチン免疫沈降によって評価した。溶出ＤＮＡ断片を精製し、ＴＡＰ−１プロモーターの３’末端に特異的なプライマーを使用するリアルタイムＰＣＲ分析用の鋳型として使用した。相対的なＲＮＡｐｏｌＩＩ又はアセチル−ヒストンＨ３のレベルは、溶出ＴＡＰ−１プロモーターのコピー数と対応するインプットのコピー数の比として決定した。最小比は１として任意に決定した。棒グラフ、３〜６回の実験の平均；バー、ＳＥＭ。同じアッセイ中でより高いＭＨＣクラスＩを発現した細胞と比較して＊Ｐ＜．０５。
【００３４】
これらの結果は、一般的な転写因子及びＲＮＡｐｏｌＩＩのＴＡＰ−１プロモーターへのアクセスを低下させる物的障壁の存在を示す。というのは、このプロモーターはゲノムに組み込まれていたからである。ＬＭＤ細胞は、ＴＡＰ−１プロモーターによって誘導される遺伝子の転写を害するクロマチンリモデリングと無関係な因子の他の欠陥を有する可能性がある。
【００３５】
（実施例３）
ヒストンＨ３アセチル化がＭＨＣクラスＩ欠失癌のＴＡＰ−１プロモーターにおいて少ないことの実証
この実験は、ネズミ前立腺及び子宮頸癌細胞系のＴＡＰ−１プロモーターにおけるヒストンＨ３アセチル化のレベルを調べて、ＴＡＰ−１転写の制御におけるヒストンＨ３アセチル化の役割を決定した。ヒストンＨ３は、その修飾が他の場所で様々な遺伝子発現における役割を果たすことが示されているコアヒストンの唯一の型ではないが、この実験はそのアセチル化状態を調べた。というのは、ヒストンＨ３尾部のアセチル化と様々な遺伝子の活性化の間の相関関係は広く研究されてきており、現在は十分確立しているからである［９、１０、１１］。
【００３６】
ＴＡＰ−１プロモーターにおけるＲＮＡｐｏｌＩＩ及びＴＡＰ−１転写のレベルによれば（図１及び２）、アセチル−ヒストンＨ３のレベルは、低レベルのＴＡＰ−１を発現する細胞のＴＡＰ−１プロモーターにおいてより低いことが分かった（図２）。ＨＰＶ陽性癌モデルでは、ＴＣ−１及びＡ９と比較して中レベルのＴＡＰ−１を発現するＤ１１細胞は、ＴＡＰ−１プロモーターにおいて中レベルのアセチル−ヒストンＨ３を有することが結果として分かった。前立腺癌モデルでは、転移性、ＴＡＰ欠失ＬＭＤ細胞も、初代細胞、ＰＡ中よりＴＡＰ−１プロモーターとの少量のアセチル−ヒストンＨ３結合を有する。いくつか他のＴＡＰ発現（Ｌｔｋ及びＲＭＡ）及びＴＡＰ欠失（ＣＭＴ．６４及びＢ１６）細胞系のＴＡＰ−１プロモーターにおけるアセチル−ヒストンＨ３レベルも試験し、且つＣＭＴ．６４及びＢ１６中よりＬｔｋ及びＲＭＡ中の高レベルのアセチル−ヒストンＨ３レベル（データ示さず）が分かった。
【００３７】
（実施例４）
ＴＡＰ−１及び他の抗原プロセシング機構（ＡＰＭ）の構成要素の発現におけるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤処理の影響
ＴＡＰ−１プロモーターにおける低レベルのヒストンＨ３アセチル化は癌におけるＴＡＰ−１の欠失に貢献するらしいので、さらなる調査を実施して、ＴＳＡを用いたＴＡＰ欠失癌細胞の処理は、細胞中のＴＡＰ−１発現を増大させるかどうか決定した。結果は図３に表す。それぞれの細胞系のＴＡＰ−１プロモーターにおけるＲＮＡＰｏｌＩＩ又はアセチル−ヒストンＨ３のレベルを、それぞれ抗ＲＮＡｐｏｌＩＩ又は抗アセチル−ヒストンＨ３抗体を使用したクロマチン免疫沈降によって評価した。溶出ＤＮＡ断片を精製し、ＴＡＰ−１プロモーターの３’末端に特異的なプライマーを使用するリアルタイムＰＣＲ分析用の鋳型として使用した。相対的なＲＮＡｐｏｌＩＩ又はアセチル−ヒストンＨ３のレベルは、溶出ＴＡＰ−１プロモーターのコピー数と対応するインプットのコピー数の比として決定した。最小比は１として任意に決定した。棒グラフ、３〜６回の実験の平均；バー、ＳＥＭ。同じアッセイ中でより高いＭＨＣクラスＩを発現した細胞と比較して＊Ｐ＜．０５。
【００３８】
図３中のクロマチン免疫沈降の結果は、大部分の細胞系において、特にＴＡＰ欠失細胞において、ＴＳＡ処理はＴＡＰ−１プロモーターに対するＲＮＡｐｏｌＩＩ複合体の動員を増強したことを示した。ＨＰＶ陽性と前立腺癌モデルの両方で、ＴＳＡ処理は、ＴＡＰ発現細胞中と同様のレベルまで、ＴＡＰ欠失細胞のＴＡＰ−１プロモーターとのＲＮＡｐｏｌＩＩ結合のレベルを増大させた。
【００３９】
転写プロセスを開始させるための重要な事象であることが知られているＴＡＰ−１プロモーターとのＲＮＡｐｏｌＩＩの結合の増大と平行して、ｐＴＡＰ１−ｌｕｃ構築体で安定的にトランスフェクトした細胞中のｌｕｃ発現に基づいて測定したＴＡＰ−１プロモーター活性も、ＴＳＡを用いた処理によってＴＡＰ欠失細胞中で有意に増大していた（図３）。しかしながら、クロマチン免疫沈降分析は、ＴＳＡ処理は試験したすべての細胞系のＴＡＰ−１プロモーターにおけるアセチル−ヒストンＨ３のレベルを著しく変えなかったことを示した（図３）。これは、ＴＡＰ−１プロモーター活性を増強したＴＳＡの作用が、ＴＡＰ−１プロモーター自体におけるアセチル−ヒストンＨ３レベルの直接的改善によって起こらなかったことを示唆する。
【００４０】
添付の図面の図４は、ＭＨＣクラスＩ抗原提示におけるＴＳＡ処理の有効性を示す。
【００４１】
Ａ、すべての細胞系中、特にＴＡＰ欠失癌中のＴＡＰ−１及びいくつか他のＡＰＭ構成要素の発現は、ＴＳＡ処理によって上方制御された。ＩＦＮ−γ処理細胞からのＡＰＭｃＤＮＡの増幅を陽性対照として使用した。β−アクチンの発現は充填対照として働いた。データは３回の実験の代表的なものである。
【００４２】
Ｂ、特にＭＨＣクラスＩ欠失細胞における表面のＨ−２Ｋｂ発現は、ＴＳＡ処理によって高まった。未処理細胞（斜線部分）又は１００ｎｇ／ｍｌのＴＳＡ（太線）若しくは５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ（細線）で処理した細胞は、ＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂモノクローナル抗体で染色した。データは３回の実験の代表的なものである。
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット分析も、ＴＡＰ−１の発現がＴＳＡ処理によって上方制御されたことを示した（図４Ａ）。ＨＰＶ陽性癌細胞系におけるいくつか他のＡＰＭ構成要素の追加的なＲＴ−ＰＣＲ分析も、特にＴＳＡ処理時のＴＡＰ欠失細胞におけるＬＭＰ−２、ＴＡＰ−２及びタパシンの発現の上方制御を実証した（図４Ａ）。ＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９細胞中のＴＡＰ−１遺伝子（それぞれ高、中及び低）もＴＳＡ及びＩＦＮ−γによって誘導されるので、ＬＭＰ−２遺伝子とＴＡＰ−２遺伝子が類似した発現パターンを有することも観察した（図４Ａ）。
【００４４】
ＴＡＰ−１発現のウェスタンブロット分析は、２４〜４８時間２０〜２００ｎｇ／ｍｌのＴＳＡで予備処理した細胞の溶解物を使用して実施し、且つ１００ｎｇ／ｍｌのＴＳＡで２４時間（ＰＡ及びＬＭＤ）又は４８時間（ＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９）処理した細胞からの代表的なデータは図４Ａ中に示す。この分析は、ＴＳＡを用いた漸増用量の処理による、ＴＡＰ欠失細胞の全細胞溶解物中のアセチル−ヒストンＨ３の蓄積の増大と平行した、増大したレベルのＴＡＰ−１発現を示した（データ示さず）。ＬＭＤ、ＣＭＴ．６４及びＢ１６中でＴＡＰ−１発現の最適誘導をもたらした処理の最適用量及び期間は１００ｎｇ／ｍｌで２４時間であり、一方同じ用量のＴＳＡを用いた４８時間の処理がＤ１１及びＡ９細胞には必要であった。
【００４５】
（実施例５）
この実験は、ＴＳＡ処理が表面ＭＨＣクラスＩの発現及びＣＴＬによる癌細胞の殺傷を増大させることを実証した。
【００４６】
いくつかの抗原プロセシング機構の構成要素の発現はＴＳＡ処理によって増大するので、この処理が癌細胞系における表面ＭＨＣクラスＩ発現のレベルをさらに増大させ得るかどうか調べた。これはおそらく、腫瘍抗原提示及びＣＴＬによる後の癌細胞の殺傷を増強し得る。フローサイトメトリー分析は、ＴＳＡ処理はＭＨＣクラスＩ欠失細胞における表面のＨ−２Ｋｂ発現を約１０倍増大させ、一方高レベルの表面Ｈ−２Ｋｂを本来発現したＰＡ及びＴＣ−１細胞中では、そのレベルは同じ状態であったことを示した（図４Ｂ）。ＩＦＮ−γ処理は、全細胞系中の表面のＨ−２Ｋｂ発現を増大させた。ＴＳＡによるＭＨＣクラスＩの発現の同様の誘導は、ＴＡＰ欠失肺癌（ＣＭＴ．６４）及びメラノーマ（Ｂ１６）においても観察した（データ示さず）。
【００４７】
ＴＳＡ処理がＣＴＬによる腫瘍細胞の殺傷を高めｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を抑制する事実は、添付の図５に示す。
【００４８】
Ａ、未処理、又はＶＳＶによる感染前に４８時間ＴＳＡ若しくはＩＦＮ−γで処理した、非感染又はＶＳＶ感染ＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９細胞のＣＴＬ認識。すべての細胞は１６時間７．５のＭＯＩでＶＳＶに感染させた。棒グラフ、３回の実験の平均；バー、ＳＥＭ。
【００４９】
Ｂ、Ａ９（ＭＨＣクラスＩ欠失細胞）の腫瘍増殖は、ＤＭＳＯ賦形剤対照で処置したマウス（処置群当たりｎ＝４）と比較して、１日１回５００μｇ／ｋｇのＴＳＡで処置したマウスにおいて抑制された。多量のＭＨＣクラスＩ発現細胞を注射したマウスにおいてＴＣ−１群は腫瘍増殖を示した（ｎ＝４）。データは平均腫瘍体積±ＳＥＭを表す。
【００５０】
さらに、ＣＴＬアッセイを実施して、ＴＳＡ処理後の細胞中の高レベルの表面のＨ−２Ｋｂ発現が、ＶＳＶ特異的細胞障害性Ｔリンパ球によるＶＳＶ感染癌細胞の認識及び殺傷を後に増大させるかどうか試験した。標的細胞のＶＳＶ感染由来のペプチドはＫｂとの関連で提示され得る。ＣＴＬアッセイは０．８：１〜２００：１のエフェクター：標的比を使用して実施し、標的細胞としてＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９を使用した２２：１のエフェクター：標的比からの代表的なデータは図５Ａ中に示す。これらの結果は、ＴＣ−１が発現したより少量の表面Ｋｂを発現したＤ１１及びＡ９細胞は、ＣＴＬによってあまり殺傷されなかったことを示した。癌細胞のＶＳＶ感染前の２４時間のＴＳＡ処理は、ＣＴＬによるウイルス感染ＴＣ−１、Ｄ１１及びＡ９細胞の殺傷をそれぞれ約１．４、６及び７倍増強した。ＩＦＮ−γ処理は、全ＶＳＶ感染細胞系の殺傷レベルの最大の誘導をもたらした。標的細胞としてＶＳＶ感染ＣＭＴ．６４及びＢ１６を使用したＣＴＬアッセイにおいても同様の傾向を観察した（データ示さず）。ＶＳＶ感染前の２４時間のＣＭＴ．６４及びＢ１６細胞のＴＳＡ処理は、それぞれ５倍及び２０倍殺傷レベルを増強した。ＭＨＣクラスＩの発現とは無関係な未知の機構のために、ＩＦＮ−γによるＡＰＭ及びＭＨＣクラスＩ発現の誘導にもかかわらず、ＬＭＤ細胞はＣＴＬ殺傷に対する耐性が依然としてあった（Ｌｅｅ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０、１９２７〜３３を参照）。
【００５１】
（実施例６）
ＴＳＡ処理はｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を抑制する
ＴＣ−１及びＡ９細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、３×１０５個の各群の細胞を７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６同種マウスに皮下注射するまで８回未満継代した。ＴＳＡ又はＤＭＳＯ賦形剤対照を用いた１日１回の処置を、細胞への注射後第７日、動物が触診可能なＡ９腫瘍を増殖し始めたときに開始した。１日当たり１匹の動物当たり５００μｇ／ｋｇのＴＳＡの用量を選択した。というのは、それは、ネズミ腫瘍モデルにおける他の型の腫瘍増殖を抑制するために、他者によって首尾よく使用されていたからである。例えば、Ｃａｎｅｓ，Ｄら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１３、８４１〜８４８を参照。この試験では、ＤＭＳＯ対照群と比較して、ＴＳＡを用いた１日１回の処置を施したマウスにおいて腫瘍増殖が遅かったことを観察した（図５Ｂ）。さらに、表面上で高レベルのＭＨＣクラスＩを発現したＴＣ−１細胞は、Ａ９細胞より有意に発癌性が低いことが分かった（図５Ｂ）。ＴＣ−１腫瘍は、３×１０５〜４×１０５個の腫瘍細胞をマウスに皮下注射した後約３週間〜１カ月で増殖し始めた。３×１０５個未満のＴＣ−１腫瘍細胞の注射後１カ月より先では腫瘍を検出しなかった（データ示さず）。これらの観察結果は、ＡＰＭ構成要素の発現の増大及びＭＨＣクラスＩ抗原提示は癌細胞の高い殺傷率と相関関係があり、したがって腫瘍増殖を抑制することを実証した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの知見と合致した。
【００５２】
（実施例７）
ＩＦＮ−γによるＴＡＰ−１誘導の機構
ＩＦＮ−γは、癌細胞中のＴＡＰ−１及び表面ＭＨＣクラスＩの発現の強力なインデューサーとして知られているが（Ｓｅｔｉａｄｉ，Ａ．Ｆら、前掲書中）、しかしながら、ＩＦＮ−γによるＴＡＰ−１誘導をもたらす分子機構についてはほとんど知られていない。この試験では、ＩＦＮ−γ処理がＴＡＰ−１プロモーターにおけるアセチル−ヒストンＨ３及びＲＮＡｐｏｌＩＩのレベルを増大させたことが分かった。添付の図面の図６も、以前に記載されたのと同様に実施した、抗ＲＮＡｐｏｌＩＩ又は抗アセチル−ヒストンＨ３抗体を使用するクロマチン免疫沈降を示す。棒グラフ、３回の実験の平均；バー、ＳＥＭ。未処理細胞と比較して＊Ｐ＜．０５。
【００５３】
以前の試験は、プロモーターに対するＲＮＡｐｏｌＩＩ複合体の動員を増大させた転写アクチベーターは、プロモーター領域におけるヒストンアセチル化を平行して増大させるはずであると提案した（Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２、５９９〜６０６）。ここに示す結果は、ＩＦＮ−γによるＴＡＰ−１誘導の１つの考えられる機構は、ＴＡＰ−１プロモーター領域周辺の染色体構造を緩和し、それによってＴＡＰ−１プロモーターに対する一般的な転写因子及びＲＮＡｐｏｌＩＩ複合体のアクセス性を増大させる、ヒストンＨ３アセチル化の改善によるものであることを示唆する。
【００５４】
（実施例８）
ＴＡＰ発現及びＴＡＰ欠失細胞においてプロモーターの特異的活性を担うＴＡＰ−１プロモーター中の領域の同定
いくつかのＴＡＰ−１プロモーター構築体を、完全ＴＡＰ−１プロモーター（ｆｐＴＡＰ１）又はその５’末端切断部（４２７、４０１及び１５０）をｐＧＬ４．１４［ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ］ベクターにクローニングすることによって作製した。添付の図面の図７は、ＴＡＰ発現及びＴＡＰ欠失細胞において特異的活性を担うＴＡＰ−１プロモーター領域の分析を示す。
【００５５】
Ａ、転写因子結合モチーフ及び５’切断部位を有するＴＡＰ−１プロモーター配列。ＴＡＰ−１のＡＴＧコドンは＋１として任意に決定した。センス鎖上に位置するモチーフは（＋）によって示し、且つアンチセンス鎖上に位置するモチーフは（−）によって示す。
【００５６】
Ｂ、ＰＡ及びＬＭＤ細胞系中で完全及び切断型ＴＡＰ−１プロモーターによって誘導されたルシフェラーゼの相対的活性。安定トランスフェクタント中のＲＬＡは以前に記載されたように決定した。最大値は１として任意に決定した。棒グラフ、４回の実験の平均；バー、ＳＥＭ。
【００５７】
ＴＡＰ−１遺伝子のＡＴＧコドンは＋１として任意に番号処理し、且つ切断型プロモーターは、ＡＴＧコドンに対する順方向プライマーの開始塩基位置に基づいて名付けた（図７Ａ）。ＰＡ及びＬＭＤ細胞（それぞれＴＡＰ発現及びＴＡＰ欠失）の安定トランスフェクタントは、３週間ハイグロマイシンＢでトランスフェクトした細胞を選択した後に得た。次いでルシフェラーゼアッセイを、それぞれの安定トランスフェクタントからの１０，０００個の細胞を使用して実施した。約１６０塩基対のヌクレオチドがＴＡＰ−１プロモーター（構築体４０１）の５’末端から切断されると、ＰＡ細胞中のルシフェラーゼ発現が３倍を超えて、ＬＭＤ細胞中で完全ＴＡＰ−１プロモーターによって誘導されたルシフェラーゼと同じレベルまで低下したことが分かった（図７Ｂ）。「１５０」に対する最終的な切断は、ほぼ全体的なプロモーター活性の消失をもたらした（図７Ｂ）。これらの結果は、ＬＭＤ細胞と結合した転写アクチベーター（複数可）の欠如は、おそらくＴＡＰ−１プロモーターの塩基番号５５７と塩基番号約４０１の範囲内であることを示す。
【００５８】
（実施例９）
ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）の発現及びＴＡＰ−１プロモーターとのその結合の分析
この試験における結果は、ヒストンアセチル化はＴＡＰ−１発現の制御中に役割を果たすことを示すので、癌中で欠失又は非機能状態であるＴＡＰ−１の転写アクチベーター／コアクチベーターが、固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を有する転写アクチベーター／コアクチベーターであるかどうかをさらに調べた。固有のＨＡＴ活性を有するよく知られている転写コアクチベーターの１つ、即ち環状ＡＭＰ応答エレメント結合（ＣＲＥＢ）結合タンパク質（ＣＢＰ）の機能を分析した。というのは、ＣＲＥＢ結合部位が、ＴＡＰ発現及びＴＡＰ欠失細胞においてプロモーターの特異的活性を担うことが示されたＴＡＰ−１プロモーター領域内、特に塩基番号４２７と塩基番号４０１の間に見られたからである（図７Ａ及び７Ｂ）。さらに、ＣＢＰはヒストンＨ３及びＨ４をアセチル化することが知られ、且つＨＡＴ活性及びＣＢＰの動員はＳＰ−１及びＡＰ−１を含めた様々な転写因子によって刺激され（Ｌｅｇｕｂｅ，Ｇ．ら、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ４、９４４〜４７）、結合部位はＴＡＰ−１プロモーター中にも存在することが示された（図７Ａ）。
【００５９】
ウェスタンブロット分析は、ＣＢＰはＴＡＰ欠失癌中で欠失又は切断状態ではないことを示した（データ示さず）。しかしながら、ＴＡＰ−１プロモーターの５’末端に特異的なプライマーを使用するクロマチン免疫沈降分析は、その領域と結合したＣＢＰはＴＡＰ欠失癌中では有意に少なかったことを示した（図８−ＴＡＰ−１プロモーターと結合したＣＢＰはＴＡＰ欠失癌中ではより少なく、ＩＦＮ−γ処理によって増大する）。抗ＣＢＰ抗体を使用するクロマチン免疫沈降は前に記載したように実施した。棒グラフ、４回の実験の平均；バー、ＳＥＭ。未処理細胞と比較して＊Ｐ＜．０５。同じアッセイ中で最も高いＭＨＣクラスＩを発現した細胞と比較して＊＊Ｐ＜．０５。
【００６０】
さらに、ＬＭＤ、Ｄ１１及びＡ９細胞のＴＡＰ−１プロモーターと結合したＣＢＰは、ＩＦＮ−γを用いた処理によって増大することが分かった（図８）。これらの結果は、ＴＡＰ−１プロモーターにおいてＣＢＰによって与えられるＨＡＴ活性の欠如は、一般的な転写因子及びＲＮＡｐｏｌＩＩ複合体によるプロモーターのアクセス不能、及び後のＴＡＰ−１転写の阻害において役割を果たすことを示唆する。ＩＦＮ−γは、ヒストンアセチル化を誘導することができるＣＢＰなどの因子の動員を改善することによって欠失を修正し、したがって転写機構によるプロモーターのアクセス性を改善する。
【００６１】
前に報告した結果は、ＴＡＰ−１遺伝子上のプロモーター及びコード領域との低いＲＮＡｐｏｌＩＩ結合（図２）、及びレポーター構築体をＴＡＰ欠失細胞のゲノムに組み込んだときの低レベルのプロモーター活性を示し（図１）、ＴＡＰ−１プロモーターに対する一般的な転写因子及びＲＮＡｐｏｌＩＩ複合体のアクセスを制限する障壁の存在を示す。プロモーター領域周辺のコンパクトなヌクレオソーム構造は、転写アクチベーターとプロモーターの結合を妨げる物的障壁として作用するようであり、したがって転写プロセスを中断する。いくつかの型の遺伝子の発現を大幅に改善するらしいよく知られている後成的機構の１つは、領域中のヌクレオソーム構造の緩和を促進する、遺伝子の遺伝子座におけるヒストンＨ３尾部のアセチル化による機構である。したがってこれによって、この領域が転写機構に利用しやすくなる可能性がある。しかしながら、ヒストンアセチラーゼ及びデアセチラーゼは遺伝子に選択的に作用し、したがってすべての遺伝子の転写に例外なく影響を与えるわけではないことは知られている（Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ、前掲書中）。
【００６２】
本出願中において、ＴＡＰ−１プロモーターと結合したヒストンＨ３のレベルは、試験したすべての細胞系におけるＴＡＰ−１遺伝子座と結合したＲＮＡｐｏｌＩＩ、ＴＡＰ−１の発現、及び表面ＭＨＣクラスＩの発現のレベルと同様の傾向を示したことが実証される（図２）。これらの観察結果は、ＴＡＰ−１プロモーターにおけるヒストンＨ３アセチル化のレベルの違いはＴＡＰ−１転写の制御中に役割を果たすことを示すが、それはおそらく異なるレベルの遺伝子の転写に貢献する唯一の機構ではない。というのは、転写の活性化は一般にいくつかの因子の相乗作用を含むからである。
【００６３】
ＴＳＡ、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を用いたＴＡＰ欠失細胞の処理は、ＴＡＰ−１プロモーターと結合したＲＮＡｐｏｌＩＩ及びプロモーターの活性の有意な増大をもたらした（図３）。ＨＰＶ陽性癌モデルにおいて、ＴＳＡ処理は、ＴＡＰ発現細胞中と同様のレベルまでＴＡＰ欠失細胞中のＴＡＰ−１プロモーター活性を増強した。前立腺癌モデルにおいて、ＴＳＡ処理はＬＭＤ細胞におけるＴＡＰ−１プロモーター活性の統計上有意な改善をもたらしたが、ＴＡＰ−１プロモーターと結合したＲＮＡｐｏｌＩＩの高度な誘導にもかかわらず、その誘導の程度はＤ１１及びＡ９細胞により示された程度より低かった。ＴＡＰ−１プロモーター誘導型ｌｕｃ遺伝子発現のレベルは、一過性トランスフェクタントと安定トランスフェクタントの両方で内因性ＴＡＰ−１の発現プロファイルと同様に十分に合致したという以前の観察結果（図１）以外に、これはＬＭＤ細胞においてＴＡＰ−１プロモーター誘導型遺伝子転写を阻害する、未知の他の機構の存在を示唆する。
【００６４】
ＴＳＡを用いたＨＰＶ陽性及び前立腺癌細胞の処理時に観察したＴＡＰ−１発現の上方制御は、ＴＡＰ−１プロモーター自体と結合したアセチル−ヒストンＨ３の直接的増大の結果として起こったわけではない（図３）。これはＴＳＡ作用が、ＴＡＰ−１遺伝子と隣接したＴＡＰ−１プロモーター領域内のヒストンＨ３の直接的アセチル化以外の機構を含むことを示唆する。さらにこれは、ＴＡＰ−１プロモーターにおけるヒストンＨ３アセチル化の欠如は、ＴＳＡ作用によって阻害され得る異常なヒストンデアセチラーゼ活性ではなく、ヒストンアセチルトランスフェラーゼによる初期アセチル化の欠如が原因であることも暗示し得る。
【００６５】
ＴＡＰ−１発現の改善以外に、ＴＳＡを用いた処理は、ＴＡＰ−２、ＬＭＰ−２及びタパシンなどのいくつか他のＡＰＭ構成要素の上方制御、及びＴＡＰ欠失細胞におけるＭＨＣクラスＩの表面発現をさらにもたらした（図４）。これはＫｂとの関連でウイルスペプチドを提示するＶＳＶ感染癌細胞の能力の改善をもたらし、したがってＶＳＶ特異的ＣＴＬによるウイルス感染癌細胞の殺傷を改善した（図５Ａ）。さらに、ＴＳＡを用いた１日１回の処置は、Ａ９癌細胞を接種したマウス中の腫瘍増殖を抑制したことが示された（図５Ｂ）。これらの知見は、特異的ＣＴＬによるウイルス感染又は腫瘍性細胞の認識及び殺傷を改善するための方法としての、ウイルス又は腫瘍抗原提示を増大させることを目的とする治療手法の開発を促している。
【００６６】
ＭＨＣクラスＩ抗原提示及びＣＴＬによる癌細胞の殺傷を改善する際のＴＳＡの有効性にもかかわらず、ＴＳＡ処理から生じた誘導のレベルは、ＩＦＮ−γによって生み出された効果ほど常に強力ではなかった（図４〜６）。本発明者らの結果は、ＭＨＣクラスＩ抗原提示を改善する際の２つの物質の特異的能力をもたらした重要な違いの１つは、ＴＡＰ−１プロモーターにおけるヒストンＨ３アセチル化のレベルを増強するそれらの能力の違いであることを実証した。ＩＦＮ−γは、ＴＡＰ欠失細胞のＴＡＰ−１プロモーターにおけるヒストンＨ３アセチル化を、ＴＳＡより一層高いレベルまで（図３及び６）、ＴＡＰ発現細胞のＴＡＰ−１プロモーターにおける同等又はさらに高いレベルのアセチルヒストンＨ３まで増強することができた。ＩＦＮ−γ処理はおそらく、ＴＡＰ−１遺伝子座周辺のヌクレオソーム構造の緩和の最高状態をもたらす可能性があり、したがって十分なレベルの一般的な転写因子及びＲＮＡｐｏｌＩＩとＴＡＰ−１プロモーターの結合、及び遺伝子の効率良い転写活性を可能にする。
【００６７】
さらに本発明者らは、ＴＡＰ発現及びＴＡＰ欠失前立腺癌細胞においてプロモーターの特異的活性を担うＴＡＰ−１プロモーター中の領域は、プロモーターの５’末端領域の塩基番号５５７と塩基番号約４０１の間に存在し（図７）、そこにはＣＲＥＢタンパク質結合モチーフが位置する（図７Ａ）ことを見出した。本発明者らは、ＴＡＰ欠失細胞中でＴＡＰ−１プロモーターのこの領域と結合したＣＢＰのレベルは、より多量のＴＡＰ−１を発現した細胞中より低く（図８）、よく知られている転写コアクチベーターによって与えられるヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性の欠如は、癌細胞におけるＴＡＰ−１欠失において役割を果たすことが示されたことを見出した。
【００６８】
ＩＦＮ−γ処理は、ＴＡＰ欠失細胞中でのＴＡＰ−１プロモーターとＣＢＰの結合を、ＴＡＰ発現細胞中と同等のレベルまで増強することが分かった（図８）。この影響はＳＴＡＴ−ｌａとＣＢＰのＩＦＮ−γ誘導型結合に起因する可能性があり（Ｍａ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ７８、５１５〜５２３を参照）、これらの因子とプロモーターの結合によってＴＡＰ−１プロモーター活性を調節する。或いは、ＩＦＮ−γはＳＴＡＴ−１非依存的経路によって、新規なＩＦＮ−γ活性化転写エレメントによって、前初期タンパク質及び転写因子などによって作用することもできる（Ｒａｍａｎａ，Ｃ．Ｖ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｏｌ．２３、９６〜１０１を参照）。根本的転写機構、及び１つ又は複数の上流転写因子と同時に相互作用することによって、ＣＢＰは転写複合体を安定化させる物理的架橋として機能することができる。
【００６９】
本明細書に表す結果は、ＴＡＰ−１プロモーターにおけるヒストンＨ３アセチル化の欠如は、癌細胞の抗原プロセシング能力の欠陥及び免疫回避機構に少なくとも部分的に関与することを示す。
【００７０】
（参考文献）
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【００７１】
図９は、ＴＳＡ処置はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、免疫不全Ｒａｇ１−／−マウス中ではなくＣ５７Ｂ１／６マウス中のＴＡＰ欠失細胞由来の腫瘍の増殖を抑制するという証拠を与え、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果は、腫瘍増殖の阻害又は腫瘍のアポトーシスの促進に対する影響によってではなく、免疫応答によって仲介されることを実証する。Ａ９腫瘍増殖は、ＤＭＳＯ賦形剤対照で処置したマウスと比較して（白線）、５００μｇ／ｋｇのＴＳＡで２０日間１日１回処置したＣ５７Ｂ１／６マウス中で抑制された（黒線）。しかしながらＴＳＡ処置は、Ｒａｇ１−／−マウス中のＡ９腫瘍増殖に対してはまったく影響がなかった。
【００７２】
選択実施形態において本発明は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の活性を細胞中で誘導しアポトーシス促進活性を誘導しない細胞処理レジメン用のアッセイを提供する。このアッセイは、１つ又は複数の試験濃度で１つ又は複数の試験化合物に細胞を曝すこと、及び細胞中のヒストンデアセチラーゼ活性のレベルをアッセイすること、及び細胞中のアポトーシス活性のレベルをアッセイすることを含むことができる。アポトーシス活性は、例えばアネキシンＶアッセイ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃによって販売されるＡｐｏＡｌｅｒｔアネキシンＶアッセイなど）、又は精製カスパーゼ酵素（カスパーゼ−３／７酵素など）の活性又は阻害に関するアッセイを使用して測定することができる。アポトーシスアッセイは、アポトーシスの誘導直後に起こる、原形質膜の内側（細胞質）小葉から外側（細胞表面）小葉へのホスファチジルセリン（ＰＳ；１〜３）の転位を反映する特徴を測定することができる（アネキシンＶタンパク質はホスファチジルセリンに対する強力で特異的な親和性を有し、したがって標識アネキシンＶの結合はこのようなアッセイの土台を提供する）。
【００７３】
代替実施形態では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、例えばトリコスタチンＡ、デプシペプチド、スベロニルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡのアミド類似体、トラポキシン、トラポキシンのヒドロキサム酸類似体、スクリプタイド（６−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２−イル）−ヘキサン酸ヒドロキシアミド）、スクリプタイド類似体、又は例えば（参照として本明細書に組み込まれる）Ｄｏｋｍａｎｏｖｉｃら「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤：概観及び展望（Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．）」Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；５：９８１〜９８９中に開示された、他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ヒストンメチル化阻害剤（参照として本明細書に組み込まれる、Ｏｕら、「生化学的薬理学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」７３（２００７）１２９７〜１３０７）であってもよく、且つ例えば酪酸ナトリウム、４−フェニル酪酸、及びＤＡＤＳ（ガーリック由来）を含み得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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