(57)【要約】【課題】不活化された内因性遺伝子座を有するトランスジェニックニワトリの提供。【解決手段】本発明は、トリＰＧＣの長期培養物から得たトランスジェニックニワトリおよび生産技術ならびに長期ＰＧＣ培養物由来のトランスジェニック鳥である。いくつかの実施形態において、これらのＰＧＣを、遺伝子構築物でトランスフェクションしてＰＧＣのＤＮＡを改変する、具体的には、外因性タンパク質をコードする導入遺伝子を導入することができる。公知の手順によって宿主トリ胚と組み合わせた場合、これらの改変ＰＧＣは、生殖系列を介して伝達されてトランスジェニック子孫が産生される。本発明は、ＰＧＣの長期培養物を含む組成物および遺伝子改変されたそれらに由来する子孫を含む。【選択図】図１９
2014239702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
トランスジェニック動物は、抗体などの有益な医薬品の継続的生産における大幅な進歩に可能性を付与する。しかし、トランスジェニック動物の生産は、多くの技術的障害があり、そのうちの数種しか克服されていない。外因性タンパク質をコードする遺伝子改変物を別の種のＤＮＡに組み込む能力には、いくつかの異なる技術が必要であり、この技術はそれぞれの種について開発されなければならない。動物の遺伝的および肉体的特徴を変化させる１つのアプローチは、動物のレシピエント胚に細胞を導入することである。これらの細胞は、レシピエント胚から誕生した動物の組織に寄与し、得られる動物のトランスジェニック子孫のゲノムに寄与する能力を有する。
【背景技術】
【０００２】
ある場合には、細胞を、タンパク質または抗体などの外因性産物をコードするＤＮＡを含む導入遺伝子で操作することができる。導入遺伝子は、タンパク質産生の青写真を含み、レシピエント胚への細胞の挿入から作製される動物組織中でのタンパク質発現が可能なコードエレメントおよび調節エレメントを十分に含む。いくつかの状況においては、発現は、全組織型で起こるように遍在することが望ましい。しかし、有益な抗体の回収などの有益なタンパク質が所望される多くの状況では、発現したタンパク質の回収を容易にする一定の特異的組織型に発現が制限されなければならない。例えば、ウシでは、乳中でのタンパク質発現により、単に牛乳の回収および外因性タンパク質の分離によってタンパク質を容易に回収することができる。また、ニワトリでは、卵白中の抗体の大量生産は、有益なタンパクの発現および回収のための魅力的なビヒクルを提供する。さらに、組織特異的発現がニワトリの卵管に特異的である場合、発現により、ヒト患者の治療で使用した場合に抗体の治療的有用性を増大させる一定の特異的な望ましい化学的特性を有する抗体が得られる。したがって、研究的および商業的開発の１つの特に魅力的な分野は、望ましい化学的性質を有するタンパク質の単離および回収を容易にするために卵白または卵黄のいずれかで抗体を選択的に発現する遺伝子操作ニワトリである。
【０００３】
外因性抗体の産生のために、トリの生体系は、多くの利点（効率的な農場での育成、迅速な成長、および経済的な生産が含まれる）を付与する。さらに、トリの卵は、抗体の大量合成ならびに産物の単離および回収の容易さの両方に理想的な生物学的設計を付与する。さらに、下記のように、本発明の文脈では、例えば、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系と比較したトランスジェニックニワトリ発現系の利点を容易に証明し、大量の抗体産物について固有の有利な化学的性質をもたらすために適用することができる。トランスジェニックニワトリを作製する目的は、何年にもわたって科学者が追求している。この目的は他の種（マウス、ウシ、およびブタなど）で到達しているが、レトロウイルステクノロジーまたは直接注入テクノロジーの使用による以外でトランスジェニックニワトリは作製されておらず、これらのテクノロジーは、トランスジェニック動物のＤＮＡに導入され得る導入遺伝子のサイズの固有の限界および／または発現欠如に悩まされる。その上、ウイルスベクターは、相同組換えにより提供されるものなどのゲノムに対する部位特異的変化を必要とする適用に従わない。
【０００４】
さらに、ある状況においては、動物自身の内因性遺伝子は、そのようなタンパク質を発現するように特別設計された遺伝子構築物を導入することから生じる有益なタンパク質の生産を妨げ得る。このような状況下では、理想的な解決は、動物の内因性遺伝子を不活化することである。残念なことに、ニワトリでの遺伝子工学における独特な挑戦のために、内因性遺伝子座の不活化をもたらす部位特異的改変を有するトランスジェニックニワトリは、記述されていない。またさらに、部位特異的遺伝子の不活化の導入は、内因性遺伝子機能を欠如する動物を産生し、そして、そのような動物は、そのゲノムに導入された補完的な特定の遺伝子改変を有する異なる動物と繁殖させることができる。例えば、特定の遺伝子が欠如している動物ファミリーを確立することができ、繁殖により、ヒトについての特定の遺伝子を含む動物と組み合わせることができた。この場合には、特定の動物の発現型の生産のために、または、内因性遺伝子の挿入によってコードされるタンパク質の生産のために導入されたゲノム改変のみならず、内因性遺伝子の不活化の両方を有する動物群が作製されるであろう。そのような動物は、現在、存在しないが、それは、ウイルスベクターが内因性ゲノムの部位特異的ターゲティングや組み込み事象のための選択能を可能としないからである。このように、ウイルスベクターは、内因性遺伝子座の活性化を達成することができるメカニズムを提供しない。
【０００５】
細胞培養物が、大きな導入遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれるようにするために、あるいは部位特異的変化をゲノムに導入させるために、十分に安定であるとき、任意のタンパク質の組織特異的発現をコードする導入遺伝子は、標的細胞および導入遺伝子として使用される特異的構築物に応じたいくつかの異なる技術によってトランスジェニック生物に継代され得る。同じ技術が、不活化された内因性遺伝子を有する生物を永続させるために使用され得る。全ゲノムを細胞ハイブリッド形成よって移入することができ、微小核細胞によってインタクトな染色体を移入することができ、染色体媒介性遺伝子移入によってサブ染色体セグメントを移入することができ、ＤＮＡ媒介性遺伝子移入によってキロベース範囲のＤＮＡフラグメントを移入することができる（非特許文献１）。微小核細胞媒介性染色体移入（ＭＭＣＴ）によってインタクトな染色体を移入することができる（ＭＭＣＴ）（非特許文献２）。外因性遺伝子を保有する任意のそのような導入遺伝子の特異的設計または遺伝子の不活化はまた、外因性遺伝子の内容、任意の遺伝子不活化の性質、および動物で得られる発現型の特徴も考慮しなければならない。
【０００６】
導入遺伝子を慎重に設計しない限り、内因性遺伝子座を不活化する、または組織特異的発現を可能にする導入遺伝子の挿入は、細胞の多能性を脅かす可能性がある。したがって、適切な細胞株は、遺伝子を不活化するのに、あるいは必要に応じて組織特異的および高レベルの発現に必要な全てのエレメントを含めるのに十分に大きく且つ複雑な遺伝子構築物で細胞をトランスフェクトする場合、培養中に安定であり、そして多能性が維持されなければならない。得られたトランスジェニック動物では、導入遺伝子を、場合により、導入遺伝子が発現されるように設計される特定の個別の組織型において選択的に発現することができる。導入遺伝子の遺伝子含有量に応じて、動物の生存率または得られたタンパク質の有利な化学的性質が弱められる場合、導入遺伝子を他の組織で発現させることができない。
【０００７】
ニワトリ始原生殖細胞は、ステージ１１〜１５の胚からの単離後、数時間以内にレトロウイルスベクターを使用して遺伝子改変されている（非特許文献３）。しかし、得られた改変は、ランダムに組み込まれており、導入遺伝子のサイズは、一般に約１５ｋｂ未満、通常１０ｋｂ未満、最も一般的には８ｋｂ未満に制限され、ゲノムの部位特異的変化をこの技術を使用して作製することができず、また、ランダム組み込みの排除に対する部位特異的改変を同定するために移入細胞を選択することもできない。培養トリＰＧＣゲノムへの１５ｋｂを超える外因性ＤＮＡの挿入が必要な安定な遺伝子改変は、以前に報告されていない。
【０００８】
長期ＰＧＣ細胞培養物中に安定に導入することができる任意のＤＮＡ導入遺伝子または構築物のサイズまたは部位特異性についてのいかなる制限も、培養物中のＰＧＣゲノムの有益な遺伝子改変を達成する能力における重要な制約であり、次に、生殖系列を介してレシピエント胚の子孫に継代することができる遺伝子改変物の型を制限する。例えば、不活化ベクター、またはトランスジェニックニワトリのゲノムへのタンパク質をコードする外因性ＤＮＡの導入は、非常に望ましい遺伝子改変である。このようなトランスジェニックニワトリ群を作製することができる場合、大量の有益なタンパク質をニワトリで発現させ、卵で回収することができる。トリの卵は、生物活性タンパク質の理想的な貯蔵所を提供し、タンパク質を単離することができる都合のよい環境を提供する。鳥類の動物は、広範な種々のトランスジェニック技術のための魅力的な候補でもある。しかし、遺伝子改変物を導入して生殖系列に伝達することができる培養細胞集団が存在しないために、トリ種への全範囲の哺乳動物トランスジェニック技術の適用は成功しなかった。最近の論文では、Ｓａｎｇらは、「ＰＧＣを培養物中で維持し、移入後に発生生殖腺に移動する能力を喪失することなく遺伝子ターゲティング事象を同定するために必要な長期間にわたって増殖することができる可能性は低い」と述べている（非特許文献４）。したがって、今日まで、遺伝的にトランスフェクトされたＰＧＣは作製されておらず、トリＰＧＣに導入された遺伝子改変物の成熟した生きている動物への伝達は証明されていない。
【０００９】
始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、精子および卵子の前駆体であり、大部分の動物での発育の初期段階で、体細胞組織から分離される。本発明に従えば、ニワトリＰＧＣは、生殖細胞系との関与を維持しながら、単離され、培養されて遺伝的に改変される。さらに、ＰＧＣは、胚生殖細胞（ＥＧＣ）に分化するように誘導され、そして、体細胞組織へのそれらの関与の点でニワトリ胚幹細胞（ＥＳＣ）に類似している。これらのＰＧＣは、体細胞組織と生殖細胞系に関与して、ニワトリでのゲノム遺伝子改変に対する固有の供給源を提供する。
【００１０】
遺伝子移入動物、特にマウスの生産は、哺乳類の遺伝子機能の解明にとって重要である。伝統的なアプローチは、導入遺伝子のゲノムへのランダム組み込みであるか、あるいは相同組み換えによる導入遺伝子の特異的遺伝子座への標的挿入である。
【００１１】
導入遺伝子のランダム挿入には、２つの不利点がある。第１の主な不利点は、多くの遺伝子が種々の発育段階で不可欠な機能を果たし、これらの遺伝子の転写の排除が、しばしば胚の死亡を引き起こすということである。胚の死亡は、例えば、組織特異性および発生段階調節型の遺伝子発現を与えるプロモーターの管理下でのＣｒｅ−ｌｏｘＰまたはＦＩｐ−ＦＲＴなどの特異的部位組み換えを用いて予防することができる。これらの場合、部位特異的組み換えは、そうでなければ通常動物（条件的遺伝子改変と呼ばれる）の文脈内の発育の過程での別々の細胞および／または別々の時間に遺伝子を不活化するのに使用される。例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系は、β細胞中のインスリン受容体遺伝子を特異的に不活化するのに用いられて、２型糖尿病におけるそれと類似しているインスリン分泌欠損を作出する（非特許文献５）。初めは、ＤＮＡポリメラーゼβのヌル対立遺伝子は、ホモ接合の場合には、胚致死性であることが示された。抗原受容体遺伝子配置のための可能な要件を分析するために、条件的ノックアウト手法が使用されてＴ−細胞におけるＤＮＡポリメラーゼβの欠損を作出した（非特許文献６）。
【００１２】
導入遺伝子のランダム挿入および標的挿入の両方は、トランスジェニック動物における導入遺伝子からポジティブ選択カセットを切り出すことができないことで悩まされる。選択カセットの存在は、いくつかの問題（例えば、選択カセット中にしばしば存在する強力転写制御エレメントによる近隣の遺伝子座における遺伝子発現の破壊など）を引き起こす（非特許文献７；非特許文献８）。ポジティブな選択カセットの除去は、組織特異的プロモーターの管理下、部位特異的組み換え酵素を用いて達成できる。
【００１３】
Ｃｒｅは、３４の塩基対ＤＮＡエレメントである２つのｌｏｘＰ部位間の組み換えを触媒する組み換え酵素である。２つのｌｏｘＰ部位が、同じ方向にゲノム中に組み込まれるとき、Ｃｒｅによって触媒される組み換えは、介在ＤＮＡを切り出す。ｌｏｘＰ部位は、ゲノムにランダムに挿入される前に導入遺伝子に組み込むことができ、あるいは、ｌｏｘＰ部位は、ターゲティングベクターを使用して正確な位置でゲノム中に挿入することができる。介在ＤＮＡの切り出しの後で、隣接ｌｏｘＰ部位は、単一のｌｏｘＰ部位に変換される。変異体のｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅ切り出しの後では十分に認められない産物を生成する。ＦＩｐ組み換え酵素、すなわち、部位特異的組み換え酵素であるλインテグレーススーパーファミリーの別の一員は、Ｃｒｅ組み換え酵素と同じメカニズムのＤＮＡ組み換えを共有する。Ｃｒｅと同様に、ＦＩｐ組み換え酵素は、２つの定義された３４の塩基対の標的部位（ＦＲＴ部位）でＤＮＡを組み替える。介在ＤＮＡの切り出し後で、隣接ＦＲＴ部位はまた、単一のＦＲＴ部位に変換される。
【００１４】
条件的ノックアウトの用途の１つは、発育の正確なステージの特定の組織において除去されるべき細胞中の致死性産物の発現である。例えば、非特許文献９は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を使用して、マウスでの骨格筋の発育を研究するために、筋細胞中で特異的にジフテリア毒素Ａフラグメントを発現させた。Ｃｒｅのリガンド制御形態は、インビトロで、または、インビボでの胚形成後期および／または成体組織における遺伝子変化の正確な誘導を可能とするＣｒｅ−ｌｏｘＰ系の一時的制御を加えるという目的で開発された。
【００１５】
染色体再構成は、遺伝性疾患および胎児死亡の主な原因であり、ガンの進行および維持に関係していた（非特許文献１０；非特許文献１１）。染色体転座は、しばしば、異常な遺伝子融合をもたらし、その結果、腫瘍特異的ｍＲＮＡｓおよびタンパク質は、遺伝子治療の魅力的な目標である。このように、部位特異的組み換え酵素を用いて特定の切断部位で染色体再構成を操作する能力は、ヒトの病気のマウスモデルを作製するのに用いられた。例えば、ヒト再構成ｔ（８：２１）（ｑ２２；ｑ２２）およびｔ（９：１１）（ｐ２２ｑ２３）に対応する転座は、急性白血病をモデル化するためにマウスで成功裏に誘導された（非特許文献１２；非特許文献１３）。ランダムな染色体欠失は、ゲノムのランダムな位置にｌｏｘＰ部位を挿入し、次いでＣｒｅ組み換え酵素を発現させることによって発生することができる（非特許文献１４）。
【００１６】
条件的遺伝子改変は、細胞系統の仕様の間、遺伝子発現を操作するための強力なツールであり、細胞の運命の分析は、正常な発育の理解に貢献した。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系は、例えば、中脳−後脳収縮で起こるエングレイルド２−発現細胞の大人の運命を定めるように、ネズミでの系統トレーサを遺伝学的に活性化するのに使用された（非特許文献１５）。このアプローチは、交配された２つのマウス株を含んだ。１匹のＣｒｅ組み換え酵素マウスは、胎仔の中脳−後脳収縮領域での発現に向かうエングレイルド２−（Ｅｎ−２）ゲノム制御フラグメントの管理下でＣｒｅを発現し、そして、指標／レポーター・マウスは、組換えが起きたことを「示す」導入遺伝子を有し、それを相続可能な系統マーカーに変えることによって、この事象の永久的な記録を提供する。指標株は、広く発現されたひよこのβアクチン遺伝子からの制御配列により駆動された転写／翻訳−ｌｏｘＰ−停止カセットのｌｏｘＰ−停止を有する。Ｅｎ２−Ｃｒｅマウスと指標マウスとの交配により、２重の組み換え体は、各導入遺伝子のコピーを保有する。Ｅｎ２制御要素の下でＣｒｅを発現した細胞のみが、レポーター構築物のｌｏｘＰ間で再構築を経て、そして、停止を切り出し、ｌａｃＺ発現を可能にした。Ｃｒｅ媒介切り出しは、細胞遺伝性であるので、Ｃｒｅがもはや発現されない後でさえ、マーク細胞およびすべてのそれらの子孫は、後のステージでｌａｃＺを発現した。このように、成熟した２重トランスジェニック動物の脳におけるＬａｃＺのための染色は、中脳−後脳収縮の進展の過程で、一時的にＣｒｅを発現したすべての細胞の子孫を明らかにした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｋｌｏｂｕｔｃｈｅｒ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｆ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：５３３−５５４，１９８１
【非特許文献２】Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｆ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４：３１９−３２３，１９７７
【非特許文献３】Ｖｉｃｋら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  ２５１，１７９−１８２
【非特許文献４】Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｃｋ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２１，１１７９−１１８６，（２００４）
【非特許文献５】Ｋｕｌｋａｒｎｉら、１９９９  Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｄｅｆｅｃｔ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  ９６：３２９−３９
【非特許文献６】Ｇｕら、１９９４．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｅｔａ  ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５：１０３−１０６
【非特許文献７】Ｌｅｒｎｅｒら、１９９３  ＣＤ３  ｚｅｔａ／ｅｔａ／ｔｈｅｔａ  ｌｏｃｕｓ  ｉｓ  ｃｏｌｉｎｅａｒ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｏｃｔ−１．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３１５２−６２
【非特許文献８】Ｏｈｎｏら、１９９４  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ３  ｅｔａ  ｌｏｃｕｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｃｔ−１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｔｒａｎｄ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：１１５７−６５
【非特許文献９】Ｇｒｉｅｓｈａｍｍｅｒら、１９９８  Ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｕｐｏｎ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｍａｓｓｉｖｅ  ｓｐｉｎａｌ  ａｎｄ  ｃｒａｎｉａｌ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｌｏｓｓ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１９７：２３４−４７
【非特許文献１０】Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓら、１９９５  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：７２０−４
【非特許文献１１】Ｒａｂｂｉｔｔｅら、２００１  Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．２７：２４９−５９
【非特許文献１２】Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、２０００  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０４７−５２
【非特許文献１３】Ｃｏｌｌｉｎｓら、２０００  Ｉｎｔｅｒ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ１１  ａｎｄ  Ａｆ９  ｇｅｎｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｒｅ−ｌｏｘＰ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．１：１２７−３２
【非特許文献１４】Ｚｈｕら、２００７．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４２，５７２−５７５
【非特許文献１５】Ｚｉｎｙｋら、１９９８  Ｆａｔｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｉｄｂｒａｉｎ−ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．８：６６５−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の要約
本発明は、トランスジェニックニワトリおよびトランスジェニック鳥の遺伝子工学を可能とする技術、ならびにターゲティング構築物を始原生殖細胞に相同組み込みすることから生じる不活化内因性遺伝子座を有するトランスジェニックニワトリを作出するために使用されるＰＧＣの長期培養物を含む。これらのトランスジェニックニワトリは、内因性遺伝子座の少なくとも一部の欠失により遺伝子の不活化をもたらす相同組み換えにより、ニワトリの始原生殖細胞のゲノムに組み込まれた導入遺伝子を有する。本発明は、導入遺伝子構築物を含み、これは導入遺伝子を有する始原生殖細胞の安定培養物であり、しばしば、ノックアウトベクター、ターゲティングベクター、ノックアウト構築物などと呼ばれ、ここで、内因性遺伝子不活化のために設計された導入遺伝子は、組み換え事象を達成するために、そして、トランスフェクションされた細胞を選択するために十分な時間、培養物中に維持される始原生殖細胞のゲノムに安定して組み込まれる。
【００１９】
本発明はまた、始原生殖細胞および得られるトランスジェニックニワトリを含み、そのゲノムは、内因性遺伝子座を不活化することにより改変されており、限定されないが、内因性遺伝子発現に必要な遺伝子の一部の部位特異的欠失を含むものである。前述の実施形態の全てに関して、本発明はまた、内因性ゲノムの部位特異的改変から作出されて得られるトランスジェニックニワトリを含む。本発明はまた、特定の適用において、それらの治療的有用性を強化する有利な化学的性質を有するニワトリで産生される抗体にも関する。ニワトリで産生される抗体は、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系で産生される抗体と比較して異なるパターンの化学的改変を有するため、毒素を標的組織、例えば腫瘍に結合させることを目的として患者に投与する場合、標的組織は増大した治療有効性によって処置される。１つの実施形態において、ＰＣＧの長期培養物は、特別に設計された遺伝子構築物で操作されて鳥に遺伝子改変を導入し、それは、外因性タンパク質の組織特異的発現をもたらす導入遺伝子の挿入を含む。同じ多能性細胞での不活化遺伝子座の操作により、または、不活化内因性遺伝子座を有するトランスジェニックニワトリの別々の群の操作のいずれかにより、外因性タンパク質の発現を容易にするために挿入された導入遺伝子を有する鳥でその後に繁殖させるために、タンパク質の発現をコードする外因性ＤＮＡの組み合わせを保有するトランスジェニックニワトリは、不活化内因性遺伝子座を有するトランスジェニックニワトリと組み合わされて、外因性タンパク質を発現する動物の固有の有利な群を提供する。
【００２０】
不活化された内因性遺伝子座を有するトランスジェニックニワトリはまた、遺伝子発現の研究のための、そして、選択された内因性遺伝子座を不活化させる能力なしでは可能でない固有の遺伝子機能を選択するための有益な動物モデルを提供する。同様に、内因性ニワトリ遺伝子座の不活化は、内因性免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の特定部分（免疫グロブリン遺伝子再構築を妨げるための、また、内因性抗体発現を不活化するためのＶ、Ｄ、またはＪ領域を含む）で行うことができる。その結果、本発明の１つの実施形態は、内因性ニワトリ免疫グロブリン遺伝子座の選択された部分で部位特異的遺伝子改変から生じる、内因性免疫グロブリン遺伝子発現および内因性免疫グロブリンタンパク質産生が実質的に欠如しているトランスジェニックニワトリを含む。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、内因性免疫グロブリン産生をコードする軽鎖および重鎖の両方の標的不活化のために構築される。本発明のトランスジェニック鳥はまた、輸卵管で導入遺伝子由来の抗体を発現することが可能でもあり、抗体は、卵に大量に沈積する。好ましい実施形態では、外因性抗体タンパク質は、天然ヒト抗体が内因性鳥抗体産生の非存在下でニワトリ輸卵管において発現され、それによって卵からヒト抗体のみを回収する能力を作出するように、内因性抗体産生が欠如している背景で発現されるヒトＤＮＡ配列によってコードされる。
【００２１】
本発明は、抗体の組織特異的発現を示す鳥群、外因性抗体発現を可能にする導入遺伝子構築物、ニワトリで産生され、特別に定義された化学的性質を有する抗体の分離された組成物、ならびに鳥の作出のための関連方法、抗体の産生、およびヒトでのそれらの治療的な使用を含む。本発明は、長期始原細胞培養物および特別な技術を用いて、長期ＰＧＣ細胞培養物に由来するキメラ鳥またはトランスジェニック鳥を生産し、ここで、培養細胞の子孫が安定して組み込まれた導入遺伝子を含むように、ＰＧＣのゲノムは、外因性タンパク質を発現する安定して組み込まれた導入遺伝子を有する。宿主の鳥の胚に導入される場合、以下に記す手順によって、それらの改変されたドナー細胞は、得られる動物の特定の選ばれた体細胞組織に導入遺伝子を発現させる鳥を生産する。
【００２２】
本発明はまた、トランスジェニックニワトリで発現されて、脊椎動物、植物または細菌の細胞系と比較して特定の望ましい化学的性質を有する外因性タンパク質の組成物を含む。具体的には、これらのタンパク質、特に抗体は、低濃度のフコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸と高濃度のマンノースとを有する。これらの特性の一部もしくは全部を有する抗体は、ヒトに投与した場合、増加した治療的有用性を示す。具体的には、これらの抗体組成物は、増強された抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を示す。したがって、本発明の方法は、トランスジェニックニワトリを用いて、トランスジェニックニワトリにおいて抗体を発現させることにより抗体組成物の治療的有用性をＡＤＣＣ効果に基づき強化することを含む。
【００２３】
本発明はまた、本明細書で定義された有利な化学的性質を有する外因性抗体を、輸卵管組織において、外因性抗体が卵白において定義された量で濃縮されるように発現するトランスジェニックニワトリを含む。１つの好ましい実施形態では、外因性タンパク質は、トランスジェニック鳥のゲノムに取り込まれた導入遺伝子構築物によってコードされたヒト配列モノクローナル抗体である。ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、輸卵管中での発現のために特異的に構築されており、そして組織特異的発現を容易にするための適切なプロモーターおよび調節配列を含む導入遺伝子内に含まれている。
【００２４】
本発明はまた、トリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養物に関し、いくつかのさらなる発明は、トリＰＧＣが成長し、ＰＧＣ培養物を培養物の生存能を４０日、６０日、８０日、１００日、またはそれを超えて延長するための複数回の継代によって延長することができる長期培養物の作製によって可能とするものである。本発明のＰＧＣは、長期培養物中で成長し、レシピエント胚に注入した場合に生殖系列キメラを産生する。
【００２５】
本発明はまた、望ましい結果を得るためのＰＧＣゲノムへの遺伝物質の導入にも関する。１つの実施形態において、ＨＳ４エレメントで囲まれた遺伝子構築物は、導入遺伝子産物の生産を確実にするために、本発明のＰＧＣに取り込まれる。別の実施形態では、遺伝子組み換えは、ニワトリゲノムの反復エレメントへの構築物の直接の挿入にインテグレースを使って実行される。別の実施形態では、選択マーカーをコードするＤＮＡは、遺伝子産物の生産を妨げるために、ニワトリゲノム領域に挿入される。
【００２６】
条件変異はニワトリ細胞で発生したが、Ｃｒｅを発現するトランスジェニック株が作出されたマウスとは異なり、遍在するか、組織特異性であるか、または発生段階調節型であるプロモーターの管理下でＣｒｅ組み換え酵素を発現するトランスジェニックニワトリ株は作出されなかった。マウス細胞では、Ｃｒｅ組み換え酵素の一過性の発現（Ａｒａｋｉｒら、１９９７  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｒｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２２：９７７−８２）および細胞透過性Ｃｒｅ組み換え酵素（Ｊｏら、２００１  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９２９−３３）は、ｌｏｘＰ部位間でＤＮＡを切り出すのに用いられた。ニワトリＤＴ４０細胞株では、しかし、Ｃｒｅ組み換え酵素の一過性の発現は、ｌｏｘＰ部位間でＤＮＡを除去することができなかった（Ｆｕｋａｇａｗａら、１９９９  Ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＨＰＲＴ  ｇｅｎｅ：ａ  ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＤＴ４０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１９６６−１９６９）。その後、Ｃｒｅ導入遺伝子は、ｌｏｘＰおよび／または変異体ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡ配列の切り出しを達成するために、ＤＴ４０細胞のゲノムに取り込まれた（Ｆｕｋａｇａｗａら、１９９９  Ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＨＰＲＴ  ｇｅｎｅ：ａ  ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＤＴ４０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２７，１９６６−１９６９；Ａｒａｋａｗａら、２００１  Ｍｕｔａｎｔ  ｌｏｘＰ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｒｅｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ  ＢＭＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，７−１４；Ｄｈａｒら、２００１  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＤＴ４０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０，２７３−８３；Ｋａｎａｙａｍａら、２００５  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｉｎ  ａ  ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２７，７０−７５）。
【００２７】
ニワトリで条件変異をもたらす能力は、有利である。例えば、ｌｏｘＰ部位に隣接した停止コドンの存在によりサイレントであるユビキタスプロモーターの管理下でアポトーシス誘導遺伝子を用いてＥＳ細胞に実質的に由来するニワトリを作出することが可能である。この株のニワトリは、明域で発現されるプロモーターの管理下でＣｒｅ組み換え酵素をコードする遺伝子を保有する鳥の株と交配させた場合、胚は発育しない。胚幹細胞をアポトーシス誘導遺伝子の発現と同時に胚に注入するならば、胚は胚幹細胞から実質的に由来し得る。
【００２８】
別の適用では、選択マーカーをコードする配列を含む導入遺伝子は、ｌｏｘＰ部位に隣接することができる。これらの導入遺伝子を保有するトランスジェニック鳥は、生殖細胞系で発現されるプロモーターの管理下でＣｒｅ組み換え酵素を発現する鳥と交配させることができる。この交配から作出された鳥は、選択マーカーの切り出し後に孵化するであろう。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
内因性遺伝子座の選択された部分の欠失を含むトランスジェニックニワトリ。
（項目２）
破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン遺伝子座である項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目３）
前記破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座である項目２に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目４）
前記破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座である項目２に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目５）
前記破壊された内因性遺伝子が、Ｖ−遺伝子セグメント、Ｊ−遺伝子セグメント、およびＣ−遺伝子セグメント、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子セグメントの検出を含む項目２に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目６）
破壊された内因性遺伝子座が、ターゲティング構築物を含む項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目７）
ターゲティング構築物が、停止コドン、ａｔｔ−ｐ部位、ナンセンス配列またはそれらの組み合わせを内因性遺伝子座に挿入する項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目８）
前記ターゲティング構築物が、内因性遺伝子座に対する２つの相同領域および相同領域間に位置する選択マーカーから構成される項目６に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目９）
重鎖の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子および内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の両方の機能性破壊を含む項目２に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目１０）
前記内因性遺伝子座の欠失部分が、少なくとも１０ｋｂを含む項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目１１）
トランスジェニックニワトリを生産する方法であって、ターゲティング構築物が細胞のゲノムへの安定した組み込みによって内因性遺伝子の少なくとも一部を破壊するようにターゲティング構築物をニワトリ始原生殖細胞に組み込み、始原生殖細胞をニワトリ胚に挿入し、胚からトランスジェニックニワトリを孵化させることを含み、ここで、該ニワトリは、内因性遺伝子の機能的な破壊を含む方法。
（項目１２）
前記内因性遺伝子が、免疫グロブリン遺伝子である項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記免疫グロブリン遺伝子が、軽鎖遺伝子である項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記免疫グロブリン遺伝子が、重鎖遺伝子である項目１２に記載の方法。
（項目１５）
ターゲティング構築物が、Ｖ−遺伝子セグメント、Ｊ−遺伝子セグメント、およびＣ−遺伝子セグメント、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるセグメントを欠失する項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記ターゲティング構築物が、停止コドン、ナンセンス配列、ａｔｔ−ｐ部位またはそれらの組み合わせを挿入する項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記ターゲティング構築物が、内因性遺伝子に対して少なくとも２つの相同領域から構成される項目１１に記載の方法。
（項目１８）
細胞ゲノムへの前記ターゲティング構築物の組み込みが、２つの相同領域の間に位置する選択マーカーをターゲティング構築物と内因性遺伝子との間に配置する項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ターゲティング構築物が、ポジティブ選択マーカーから構成される項目１１に記載の方法。
（項目２０）
前記ターゲティング構築物が、ネガティブ選択マーカーから構成される項目１１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａは、５４日間培養物中に維持されたＰＧＣを示す。細胞は付着しておらず、丸い形態を維持することに注目すべきである。矢印は、この培養物中で目視できるいくつかの分裂細胞を示す。図１Ｂでは、長期ＰＧＣ細胞培養物は、少なくとも１３６日間にわたって培養物中に維持された場合、安定であることが示される。これらの細胞は、照射を受けたＳＴＯ細胞のフィーダー層上で培養される。
【図２】生殖細胞マーカーＣＶＨ（Ｖａｓａ）およびＤａｚｌのＲＴ−ＰＣＲによって測定された遺伝子発現。細胞を３２日間培養物中に置いた。レーン１は、ＰＧＣアリコート中のＣＶＨおよびＤａｚｌの両方の発現を示す。レーン２中の第２サンプルは、アクチンの非存在下に測定されて、十分なｍＲＮＡを含まなかった。ＣＥＳ細胞も分析された；アクチンは発現されたが、ｃＥＳ細胞はＣＶＨを発現せず、Ｄａｚｌが弱く発現されただけであった。
【図３】１６６日間培養物中で維持された番号１３および番号１６のサンプルＰＧＣ培養物のウェスタン分析。ポジティブコントロールとして精巣を使用し、ネガティブコントロールとして肝臓を使用した。一次抗体としてウサギ抗ニワトリＣＶＨ  ＩｇＧを使用した。
【図４】テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイ。異なる希釈率の２つの異なるＰＧＣ細胞株の細胞抽出物（番号１３および番号１６）を、１４６日間培養物中で維持した。ポジティブコントロールは、形質転換ヒト腎臓細胞株２９３からなり、ネガティブコントロールは、テンプレートを添加しない溶解緩衝液のみであった。ＰＧＣおよびポジティブコントロールレーンでは、反復配列が認められ、これはテロメラーゼの存在を示す。
【図５】図５Ａは、培養物中に維持されたＰＧＣ由来のｃＥＧ細胞を示す。図５Ｂは、ニワトリ胚幹細胞を示す。両細胞型における小さな細胞、大きな核（淡灰色）、および明確な核小体に留意のこと。
【図６】始原生殖細胞（ＰＧＣ）株中のｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子のサザン分析。
【図７】ニワトリ管ホモログ（ＣＶＨ）および１Ｂ３に対する抗体で染色したＤＴ４０細胞（ネガティブコントロール集団）、ＥＧ細胞、ＥＳ細胞、およびＰＧＣのＦＡＣＳ分析。ＤＴ４０細胞、ＥＳ細胞、およびＥＧ細胞は、両マーカーについて陰性であったが、大部分のＰＧＣはＣＶＨおよび１Ｂ３の両方について染色された。使用した細胞株は、ＰＧＣ１０２；ＥＳ４３９およびＥＧ４５５であった。
【図８】２つの始原生殖細胞ＰＧＣ株におけるＨＳ４−β−アクチン−ｎｅｏ導入遺伝子のサザン分析。
【図９】始原生殖細胞（ＰＧＣ）株ＴＰ１０３におけるＨＳ４  β−アクチン−ｅＧＦＰ−β−アクチン−ｐｕｒｏ導入遺伝子のサザン分析。プラスミドコントロールＤＮＡをＮｏｔＩで線状化した。内部フラグメントは、ＤＮＡをＫｐｎＩで消化して放出させた。ＴＰ１０３およびプラスミドの両方で、同じサイズのフラグメントが放出された。ＴＰ１０３のゲノムＤＮＡの、ＮｃｏＩ、ＭｆｅＩ、およびＳｐｈＩによる消化は、消化されたプラスミドＤＮＡの対応するレーンに比べて大きいバンドを示すはずである。ＭｆｅＩ消化ＴＰ１０３ゲノムＤＮＡのレーンにおいては、大きすぎるバンドによる可能性があるバンドは見られない。ＮｃｏＩおよびＳｐｈＩ消化を表すレーンでは、フラグメントはプラスミドＤＮＡ中に放出されるフラグメントより実質的に大きいＴＰ１０３ゲノムＤＮＡ中に放出されたが、このことは、導入遺伝子がＴＰ１０３細胞株のゲノムに取り込まれることを示す。
【図１０】全染色体が二倍体であることを示すＧ−０９の核型。ＧＧＡ２の１コピーでは、ｐアームの大部分が失われているか、別の染色体に転座している。ＣＧＡ２の他のコピーは正常である。細胞は、ＺＺ（雄）である。
【図１１】ＤＡＰＩで染色した発育１８日目の精巣の切片。ＧＦＰ陽性生殖細胞は、細精管内で明確に見られる。
【図１２】ＤＡＰＩ染色パネルは、Ｅ１８精巣の細精管を通る切片を示す。ＧＦＰ発現細胞は、細精管内に位置し、抗ＣＶＨ抗体で染色される。
【図１３】β−アクチン−ＧＦＰ導入遺伝子で安定にトランスフェクトされたＰＧＣを保有するキメラ由来のトランスジェニック子孫は、ステージＸ（ＥＧ＆Ｋ）からステージ３４（Ｈ＆Ｈ）の間で生育する。これらの写真に示された組織の全ては、ＧＦＰの発現を示す。
【図１４】組織学的試験のために調製されたβ−アクチン−ＧＦＰ導入遺伝子で安定にトランスフェクトされたＰＧＣを保有するキメラ由来の組織。青色のＤＡＰＩ染色は，核の存在を明らかにし、そして、緑色蛍光は、組織の全てがＧＦＰ導入遺伝子を発現することを証明する。
【図１５】クローン由来のトランスフェクトされたＰＧＣ株がキメラニワトリの生殖細胞系に寄与し、ＥＧ細胞に分化することができることを示すサザンブロット分析。上方のパネル：ＨＳ４  ｂａｃｔｉｎ−ｅＧＦＰ−ｂａｃｔｉｎ−ｐｕｒｏ構築物でトランスフェクトされたＰＧＣに由来するゲノムＤＮＡ、トランスフェクトされたＰＧＣで作製したキメラ雄ニワトリ由来の３つの胚に由来するゲノムＤＮＡ、およびトランスフェクトされたＰＧＣ由来のＥＧ細胞に由来するゲノムＤＮＡを、導入遺伝子挿入の内部フラグメント（ＫｐｎＩ）および連結点フラグメント（ＮｃｏＩ、ＡｆｌＩＩ）を検出するために、制限酵素で消化した。消化したＤＮＡを、０．７％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロッティングし、放射能標識ｅＧＦＰ配列で探索した。ハイブリッド形成フラグメントのサイズは、ＰＧＣ、ＥＣ細胞、および緑色蛍光を示した２つの胚（ＧＦＰ＋胚）で同一であった。第３の非蛍光胚（ＷＴ胚）は、ハイブリッド形成を示さなかった。下方のパネル：構築物の概略図を示し、そして、制限部位の位置を示し、予想制限フラグメントサイズが下に示される。５．３ｋｂフラグメントが得られる２つのＫｐｎＩ部位が存在する。ＮｃｏＩおよびＡｆｌＩＩは、構築物内を１回切断し、それによって認められる制限フラグメントは、挿入部位において隣接ゲノムＤＮＡを構築物と連結する連結点フラグメントである。
【図１６】図１６Ａは、本研究で使用されたランダムインテグレーション構築物の図。２種類の基本的な構築物が使われた：強力プロモーターによって駆動される選択マーカーカセット（薬剤耐性マーカーおよびＥＧＦＰ）、およびＨＳ４インスレーターの２セットに隣接する類似した構築物。使用されるプロモーターは、マウスＰＧＫ、ニワトリβ−アクチン、β−アクチン＋ＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧ）またはＥＲＮＩであった。構築物は以下の通りである：ｎｅｏまたはｐｕｒｏ耐性遺伝子（一番上のライン）の発現を駆動するプロモーターからなる薬剤選択マーカーカセット；ＣＡＧ−ＥＧＦＰ遺伝子（２番目のライン）の付加；隔離された薬剤選択マーカーのみ（３番目のライン）；ＥＧＦＰ遺伝子（４番目のライン）を付加した同様の隔離された選択マーカーカセット；ならびにｌｏｘＰ部位に隣接する選択マーカーおよび対象となる特許遺伝子を有するＣＡＧ−ＥＧＦＰ  ＣＡＧ−ｎｅｏ構築物（星印の付いたボックス）。構築物はトランスフェクションの前に線状化され、示されたベクター構造をもたらす。図１６Ｂは、本研究で使われるインテグレース構築物の図。左側の図では、ａｔｔＢ含有プラスミドあり、そこでは、ａｔｔＢ部位が上記のＨＳ４−β−アクチン−ｐｕｒｏ構築物に付加されている。右側の図では、プラスミドが、ＣＡＧプロモーター由来細胞インテグレースを発現するのに用いられる。両方のプラスミドは、環状ＤＮＡとしてトランスフェクトされた。
【図１７】ａｔｔＢとトランスフェクトされたＰＧＣから得られたａｔｔＬ配列との配列比較。インテグレース媒介トランスフェクションに由来するＰＧＣクローンにおけるａｔｔＢプラスミドおよびゲノム配列の間の連結点が示される。一番上のラインは、コアＴＴＧを有する野生型ａｔｔＢ部位であり、該コアＴＴは、通常、下線が付された組み換えクロスオーバー点である。下には、ＰＧＣでのインテグレース媒介挿入物由来のａｔｔＬ配列が示される。スプライシングが、プラスミドのａｔｔＢとゲノムの疑ａｔｔＰ部位との間の何処で起きたかについて決定するために、ＰＧＣ配列を、ａｔｔＢと比較した。ＰＧＣ配列において、プラスミドによって与えられたａｔｔＢ配列は、小文字であり、そして、ゲノム疑ａｔｔＰ配列は大文字および太字である。
【図１８】図１８Ａは、ＰＧＣ挿入部位由来のＰＯ４１様反復とＰＯ４１コンセンサス配列とのアラインメント。ＰＯ４１様反復に挿入されたクローンの全てからのＰＧＣ隣接配列を、互いに、およびＰＯ４１コンセンサスとアラインメントした。最初から２１個のヌクレオチドは、ベクター（上の配列比較に示されるように）によって付与されたａｔｔＢ配列であり、そして、各々のクローンからのゲノム隣接配列が続く。配列の少なくとも半分によって共有されるヌクレオチドは、黒で囲われている。Ｂは、ａｔｔＰとＰＯ４１配列とのアラインメント。ａｔｔＰ部位の１００ｂｐを、ＰＯ４１の１００ｂｐ、すなわち４１ｂｐの約２．５コピーとアラインメントした。ａｔｔＰ中のコアクロスオーバーＴＴＧは、上付きの横線で示されている。
【図１９】ニワトリＩｇＬ遺伝子のターゲティング。
【図２０】図２０Ａは、一番上のラインは、ニワトリＩｇＬ遺伝子（ＩｇＬ  ｐＫＯ５）のためのターゲティングベクターの図である。ＩｇＬ遺伝子の２．３ｋｂのＪ−Ｃ領域をＨＳ４インスレーターに隣接した３．１ｋｂのＨＳ４−ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏ選択マーカーと置き換えるように設計される。２つの相同性アームは、２．３ｋｂおよび６．３ｋｂの長さである。３’末端において、β−アクチン−ＥＧＦＰ遺伝子は、標的クローンのために緑色蛍光を富化するためのｐｕｒｏ−耐性クローンのスクリーニングを可能にする。末端の点線は、ｐＫＯベクターバックボーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。中央のラインは、単一の可変領域遺伝子（Ｖ）、連結領域遺伝子（Ｊ）および定常領域遺伝子（Ｃ）を有する、ＩｇＬ遺伝子の生殖細胞系構成の野生型対立遺伝子の図である。標的クローンのサザン分析に使用される制限部位が、図示（（Ｓ、ＳａｃＩ；Ｂ、ＢｓｔＥＩＩ）され、そして、野生型フラグメントサイズが二重の矢尻でその下に示される。下方のライン上は、変異体対立遺伝子の構造であり、そこでは、ＪおよびＣ領域が欠失しており、ＨＳ４−ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏで置き換えられている。制限酵素地図が示され、下に変異体フラグメントのサイズが示されている。サザン分析において使われるプローブは両方とも、ターゲティングベクターの外側にあり、そして、それらの位置が示される。スケールバー＝１ｋｂ。図２０Ｂは、４つのクローンのサザンブロット分析。４つのピューロマイシン耐性クローンが分析され、そのうちの２つ（クローン１および２）は緑色でなくて、そして、そのうちの２つ（クローン３および４）は緑色であった。左のパネルでは、ＰＧＣクローンからのゲノムＤＮＡは、ＳａｃＩで消化されて、プローブＡとハイブリダイズされてＩｇＬ遺伝子の５’部位上でターゲティングを分析した。右のパネルでは、ＤＮＡはＢｓｔＥＩＩで消化されて、ＩｇＬ遺伝子の３’部位のターゲティングのためにプローブＢとハイブリダイズした。クローン２は、ヘテロ接合性の標的クローンについての予想されるサイズのフラグメントを示した。
【図２１】ＩｇＬノックアウトを保有するＰＧＣで作出されたＧＯ雄鳥からの精液の免疫グロブリン軽鎖遺伝子の不活化のためのマーカーであるＥＲＮＩ−ｐｕｒｏのＰＣＲ。精液サンプルから調製されたゲノムＤＮＡ１０ｎｇを、ＩｇＬノックアウト対立遺伝子に存在するＥＲＮＩ−ｐｕｒｏ選択マーカーのためにＰＣＲで使用した。対照として、内因性ニワトリβアクチン遺伝子に対するプライマーが含まれた。ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏ  ＰＣＲのためのポジティブコントロールとして、ＩｇＬノックアウト対立遺伝子を有するＰＧＣが使われた。
【図２２】ＢＮ鳥のＡＬＤＨ３Ａ２発現。上方のパネルは、２羽のホモ接合性ＢＮ鳥（ＢＮ／ＢＮ）、１羽のヘテロ接合性ＢＮ鳥（ＢＮ／＋）および１羽の野生型鳥（＋／＋）から分離されたＲＮＡ上で、ＡＬＤＨ３Ａ２についてのＲＴ−ＰＣＲを示す。さらに、ＲＴ−反応（−ＲＴ−コントロール）のネガティブコントロール、ポジチィブゲノムコントロール、およびＰＣＲ反応（−コントロールＰＣＲ）に対する２つのネガティブコントロールが示される。５４４および６８０ｂｐバンドは、第５エクソンと第６エクソンとの間にそれぞれスプライスされていないイントロンを有しないか、あるいは有するアルデヒドデヒドロゲナーゼのｍＲＮＡの存在を示す。下方のパネルの５９７ｂｐバンドは、すべてのサンプルでＲＮＡの存在を確認する。ＲＴ−ＰＣＲは、ＡＤＨがヘテロ接合性ＢＮ鳥では発現されたが、ホモ接合性ＢＮ鳥では発現されず、このことは、導入遺伝子の挿入がこの遺伝子の転写を止めたことを示した。
【図２３】アルデヒドデヒドロゲナーゼ３ファミリーメンバーＡ２転写での野生型対立遺伝子からのＲＴ−ＰＣＲ産物の配列。産物ＡおよびＢは、第５エクソンと第６エクソンとの間でそれぞれ、１３６ｂｐのスプライスされていないイントロンを有しないか、あるいは有する転写物に由来する。
【図２４】ＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子を保有するニワトリ。Ａ．３つのＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒトランスジェニック株（６−０３、６−５１および９−５１）のサザンブロット分析。Ｇ１鳥からのゲノムＤＮＡサンプルとＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒベクターとを、ＳｐＨＩまたはＢｃｌＩで消化した。消化されたＤＮＡを０．７％のアガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロッティングし、放射能標識されたＲｅａｐｅｒ特異的プローブとハイブリダイズして連結フラグメントを同定した。ハイブリッド形成フラグメントのサイズは、ベクターに対するよりも、ゲノムＤＮＡに対して大きく、導入遺伝子が組み込まれたことを示す。Ｂ．ＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ構築物の概略図。導入遺伝子は、ＵｂＣ−プロモーターとｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子とから構成される。ＳＶ４０ポリアデニル化信号（ＳＶ４０）とブラスチシジン耐性カセット（ｂｓｄ）は、ＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ導入遺伝子の３’側に挿入された。構築物は、５’と３’ＬＴＲに隣接した。制限酵素部位の位置が示され、予想される制限サイズが示される。
【図２５】ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有するニワトリ。Ａ．８つのＥＲＮＩ−Ｃｒｅ株のサザンブロット分析。ゲノムＤＮＡサンプルをＢｇｌＩＩで消化した。消化されたＤＮＡを０．７％のアガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロッティングし、放射能標識Ｃｒｅで探索した。ハイブリッド形成フラグメントのサイズは、予想された４．６ｋｂであった。Ｂ．ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子の概略図。導入遺伝子は、ＥＲＮＩプロモーターおよびＣｒｅ導入遺伝子からなる。ＳＶ４０ポリアデニル化信号（ＳＶ４０）およびブラスチシジン耐性カセット（ｂｓｄ）は、ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子の３’側に挿入された。構築物は、５’および３’ＬＴＲに隣接した。ＢｇｌＩＩ制限酵素部位の位置が示され、予想される制限サイズが示される。
【図２６】Ｄｏｃ−２細胞株からのＧＦＰ陽性細胞およびＧＦＰ陰性細胞のＦＡＣＳソーティング。２種類の細胞が、ＰＧＣでＣｒｅ組み換え酵素を発現するＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子を含む環状プラスミドでＤｏｃ−２細胞株をトランスフェクトして作製された。ＧＦＰ陰性細胞は、ＣＸ−ｅＧＦＰ遺伝子を保有するドッキング部位ベクター上のＬｏｘＰ部位間の配列の切り出しの結果である。
【図２７】１０，６５２ｂｐ導入遺伝子のＰＧＣのＤｏｃ−１株およびニワトリへの組み込みを示す２羽のひなのサザン分析。ＤＯＣｌ  ＰＧＣ株（Ｐ印のレーン）とＤＯＣｌ  ＰＧＣ（ＣｌおよびＣ２の目印のレーン）で作出されたＧ０キメラの繁殖に由来する２羽のひなからのゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩまたはＥｃｏＲＩで消化した。消化物をアガロースゲルで分画し、ナイロン膜に移し、放射能標識されたＥＧＦＰ配列とハイブリダイズした。この分析は、ベクター組み込み部位で隣接するゲノム配列に結合したドッキング部位ベクターを含む連結フラグメントを検出する。これらの連結フラグメントのサイズは、組み込み部位に依存して変化し、ＰＧＣにおける各導入遺伝子挿入事象について診断する。この場合、ＢｇｌＩＩフラグメントは、約１２ｋｂであり、ＥｃｏＲＩフラグメントは、１２ｋｂより大きい。フラグメントサイズは、ＰＧＣとそれらに由来するひなで同一であり、それは、これらのひながＤＯＣ１挿入物を保有するＰＧＣに由来したことを示す。
【図２８】ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅトランスジェニックニワトリの１０の異なる株によるＲｅａｐｅｒ導入遺伝子のＣｒｅ媒介組み換えに対するサザンブロットアッセイ。Ａ．ＤＮＡのサザンブロット分析は、Ｃｒｅ導入遺伝子の１コピーとｌｏｘＰ導入遺伝子の１コピーとを保有する２重トランスジェニック胚からの脳（ｂ）および筋肉（ｍ）から単離されたＤＮＡについてのサザンブロット分析。ゲノムＤＮＡをＳａｃＩで消化した。消化されたＤＮＡを、０．７％のアガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロッティングし、Ｒｅａｐｅｒ遺伝子とレンチウイルス・ベクター・バックボーン（ブラスチシジン遺伝子およびＳＶ４０配列）の部分からなるプローブにハイブリダイズした。このプローブは、全長および組み換えｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の両方に等しくハイブリダイズする。組み換え導入遺伝子に対する全長（非組み換え）のバンド強度の比率は、Ｃｒｅ株の活性を表す。Ｂ．ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子のＣｒｅ媒介組み換えの概要の説明。全長ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子は１．４ｋｂの配列を含み、それは停止カセットと呼ばれて、同じ方向にｌｏｘＰ部位に隣接する。２つのｌｏｘＰ部位間の組み換えは、染色体から１．４ｋｂの介在配列の切り出しをもたらし、１つのｌｏｘＰ部位を後に残す。切り出しの後、組み換えられたｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子は、サイズが１．４ｋｂ減少する。プローブおよびＳａｃＩ制限酵素部位の位置が示され、そして、予想される制限サイズが示される。
【図２９】Ｃｒｅ４株による３つの異なるＲｅａｐｅｒ  ｌｏｘＰカセット導入遺伝子（６−０３、６−５１および９−５１）の組み換え。Ａ：ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子（Ｒ）の１コピーのみを保有するトランスジェニック胚またはＣｒｅ４導入遺伝子の１コピーと３つの異なるｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ株（６−０３、６−５１と９−５１）に対するｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子（Ｃ＋Ｒ）の１コピーとを保有する２重トランスジェニック胚のサザンブロット分析。ゲノムＤＮＡをＳａｃＩで消化した。消化されたＤＮＡを、０．７％のアガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロッティングし、Ｒｅａｐｅｒ遺伝子とレンチウイルス・ベクター・バックボーン（ブラスチシジン遺伝子およびＳＶ４０配列）の部分からなる放射能標識プローブにハイブリダイズした。ハイブリッド形成フラグメントのサイズは、全長（非組み換え）ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒフラグメントに関して２．８ｋｂと予想通りであり、組み換えｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒフラグメントに関して１．４ｋｂであった。Ｂ：ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子のＣｒｅ媒介組み換えの概要の説明。全長ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子は、１．４ｋｂの配列（ＳＴＯＰカセットと呼ばれる）を含み、同じ方向にｌｏｘＰ部位に隣接する。２つのｌｏｘＰ部位の間の組み換えは、染色体から１．４ｋｂの介在配列の切り出しをもたらし、１つのｌｏｘＰ部位を残す。切り出しの後、組み換えられたｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子は、サイズが１．４ｋｂ減少する。プローブおよびＳａｃＩ制限酵素部位の位置が示され、そして、予想される制限サイズが示される。
【図３０】非切り出しＧＦＰに陽性のＤｏｃ２細胞株（レーン１）およびｃｘ−ＧＦＰ−ｃｘ−ｎｅｏ配列が欠失しているＤｏｃ２細胞（レーン２）のサザン分析。細胞は、緑色蛍光の発現に対するＦＡＣＳ分析によって分類された。２つの細胞集団からのゲノムＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、そして、ＤＮＡは、ピューロマイシン耐性遺伝子からの放射能標識配列にハイブリダイズした。５５２１ｂｐの予測されたフラグメントは、ＧＦＰ陽性（非切り出し細胞）細胞中に存在し、そして、１２６２ｂｐの予測されたフラグメントが切り出し細胞に存在した。この結果は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換えが、ＤＯＣ２細胞中に組み込まれたドッキング部位構築物における２つのｌｏｘＰ部位の間に存在するＣＸ−ＥＧＦＰ−ＣＸ−ｎｅｏ配列の欠失をもたらすことを示す。
【図３１】ＩｇＬ  ｐＫＯ５Ｂターゲティングベクターの図。一番上のラインは、ターゲティングベクターＩｇＬ  ｐＫＯ５Ｂの構築物を示す。このラインは、ｌｏｘＰ部位とａｔｔＰ部位とを含む５’相同領域、および３’相同領域に対するベクター構築物を示す。２番目のラインは、ニワトリ野生型ＩｇＬ対立遺伝子に対するターゲティングベクターの関係を示す。３番目のラインは、ＪおよびＣ遺伝子欠失または遺伝子破壊によって作出される変異体対立遺伝子を示す。
【図３２】ＫＯ−０７ノックアウトクローンにおけるＩｇＬ遺伝子座の欠失を示すサザンブロット分析。左側のパネル：ＩｇＬ  ｐＫＯ５Ｂでトランスフェクトされた５つのクローンＰＧＣ株からのＤＮＡを、ＳａｃＩで消化して、０．５ｋｂのＳａｃＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントで探索した場合の、５’相同領域に関して得られたハイブリダイゼーション。野生型ＩｇＬ遺伝子座は、約１０ｋｂであり、そして、標的欠失を有する変異体フラグメントは、約４ｋｂである。右側パネル：同じ５つのクローンからのＤＮＡを用いて、３’相同領域について得られたハイブリダイゼーション。ゲノムＤＮＡをＢｓｔＥＩＩで消化して、３’の１．７ｋｂのＮｓｉｌ−Ｍｆｅｌフラグメント（これは、ターゲティングベクターの外側にある）とハイブリダイズした。
【図３３】ＩｇＬノックアウトが、７つのニワトリ胚のうちの５つ（胚２、３、４、６および７）に伝達されたことを示すサザンブロット分析。胚１および５は、野生型胚であり、これはヘテロ接合性ＫＯ−０７ノックアウトＰＧＣからの野生型ＩｇＬ対立遺伝子を受け継いだ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本明細書中で使用されるように、用語「ニワトリ胚幹（ｃＥＳ）細胞」は、ＥＳ細胞の形態を示し、ステージＸ（Ｅ−Ｇ＆Ｋ）の胚（マウス胚盤胞にほぼ等しい）の明域由来のレシピエント胚中の体細胞組織に寄与する細胞を意味する。ＣＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞のいくつかのインビトロ特性（ＳＳＥＡ−１＋、ＥＭＡ−１＋、およびテロメラーゼ＋など）を共有する。ＥＳ細胞は、全ての体細胞組織をコロニー形成する能力を有する。
【００３１】
本明細書中で使用されるように、用語「始原生殖細胞（ＰＧＣ）」は、ＰＧＣの形態を示し、レシピエント胚中の生殖系列に排他的に寄与する細胞を意味し、ＰＧＣは、ステージ１２〜１７（Ｈ＆Ｈ）の胚から採取した全血に由来し得る。ＰＧＣ表現型は、（１）生殖系列特異的遺伝子ＣＶＨおよびＤａｚｌがこの細胞株で強く転写されること、（２）細胞がＣＶＨタンパク質を強く発現すること、（３）ステージＸやステージ１２〜１７（Ｈ＆Ｈ）のレシピエント胚に注入した場合に、細胞が体細胞組織に寄与しないこと、（４）細胞がＥＧ細胞を生じること（以下を参照のこと）、または（５）ステージ１２〜１７（Ｈ＆Ｈ）の胚に注入した場合に、細胞が生殖系列を介してＰＧＣ遺伝子型を伝達すること、によって確立することができる（Ｔａｊｉｍａら、（１９９３）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４０，５０９−５１９；Ｎａｉｔｏら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３９，１５３−１６１；Ｎａｉｔｏら、（１９９９）Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．１１７，２９１−２９８）。
【００３２】
本明細書中で使用されるように、用語「ニワトリ胚生殖（ｃＥＧ）細胞」は、ＰＧＣに由来し、機能がマウスＥＧ細胞に類似する細胞を意味する。ｃＥＧ細胞の形態は、ｃＥＳ細胞の形態に類似し、ｃＥＧ細胞は、ステージＸ（Ｅ−Ｇ＆Ｋ）のレシピエントに注入する場合、体細胞組織に寄与する。
【００３３】
本明細書中で使用される、用語「トランスジェニック」は、その体細胞および生殖細胞中で導入遺伝子をコードし、導入遺伝子によって与えられる特徴をその子孫に伝達することができる動物を意味する。用語「トランスジェニック」は、また、内因性遺伝子座における選択部位特異的遺伝子の不活化を含む動物を意味し、限定されるものではないが、内因性遺伝子座における有限の遺伝子セグメントの欠失を含み、これは、遺伝子の文字通りの欠失、機能性の破壊、停止コドン、もしくはナンセンス配列、ａｔｔＰ部位の挿入による遺伝子の不活化をもたらす始原生殖細胞のゲノムに組み込まれる導入遺伝子またはターゲティング構築物の使用、または部位特異的遺伝子改変による遺伝子座の機能的不活化を産む他の人工物の使用による欠失を含む。既存のレトロウイルス技術は、部位特異的改変または形質転換細胞の選別を可能としないので（つまり、ＰＧＣ細胞の長期の培養を持続させる、および部位特異的改変（例えば、遺伝子不活化など）の操作能力を有しない）、用語「トランスジェニック」は、レトロウイルス系を排除する。
【００３４】
しかし、選択された遺伝子の機能を変えて、遺伝子改変から望ましい表現型を与える部位特異的変更を有する動物は含まれる。これらの導入遺伝子とそれらに由来する動物は、一般に「ノック−イン」と呼ばれる。導入遺伝子は、少なくとも１０ｔｃｂ、望ましくは１０−２５’ｋｂの内因性ＤＮＡの欠失を挿入することができ、またはさらに遺伝子のサイズおよび構成に依存してターゲティングが選択される。好ましい実施形態では、トランスジェニック鳥は、全体的または部分的欠失または他の機能破壊のための内因性遺伝子標的に対応する任意の内因性遺伝子を欠如する。
【００３５】
本明細書の例では、ニワトリについて記載されているが、ウズラ、七面鳥、キジ、その他などの他の鳥の種が、不当な実験をすることなく、そして、本明細書に開示された方法の成功裏の実施を合理的に予測してニワトリと置き換えることができる。
【００３６】
組織特異的発現のために設計されたＤＮＡ構築物を培養物中のＥＳ細胞へ挿入することによって、ニワトリの卵白中で、有益な医薬品（例えばモノクローナル抗体など）を発現するニワトリが作出されている。参照：ＰＣＴ  ＵＳ０３／２５２７０  ＷＯ０４／０１５１２３（Ｚｈｕら）。そのような動物のための重要な実施可能な技術は、クローン化細胞の遺伝子型が培養中で操作されるために十分に長く生存し続けることができる、真に長期間のＥＳ細胞培養物の作製および維持である。
【００３７】
しかし、ＥＳ細胞と異なり、始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、短期間を基本としてのみ培養されている。一旦培養期間が短期間を超えて延長されると、これらの細胞は生殖系列に排他的に寄与する能力を失う。典型的には、現在の培養技術を使用して培養物中で維持されたＰＧＣは、増殖および増加しない。力強く成長しない場合、培養物は、「末期」であり、無期限に維持することができない。長期にわたり、これらの末期細胞培養物は分解され、細胞はその固有のＰＧＣ形態を失い、胚生殖（ＥＧ）細胞に戻る。胚生殖細胞は、ＰＧＣと異なる形態を獲得し、生殖系列に限定されなくなり、胚発生の初期段階に注入した場合に体細胞組織に寄与する能力を得る。予め決定した遺伝子型をレシピエント胚の生殖系列に導入し、それにより、動物が所望の遺伝子型を次世代に伝達することができるようにするために、ＰＧＣは精子および卵の前駆体であることが公知であるので、ＰＧＣは非常に魅力的である。
【００３８】
ＰＧＣの長期培養物は、遺伝子の不活化または外因性ＤＮＡの挿入のあるなしにかかわらず、いくつかの重要な利益（養鶏業に依存する重要なニワトリ交配株の有益な遺伝子の特徴の維持など）を提供する。現在、有益な交配株を事故または疾患による喪失から回避するために、特別な措置が取られている。これらの措置には、種畜としての多数の株メンバーの維持および世界中の複数の場所でのこれらの種畜の複製が必要である。交配株内の遺伝的多様性の保存も重要であるので、将来のために蓄えている多数の有益な動物を維持する必要がある。生きた保存種畜中よりもむしろＰＧＣ細胞培養物中のこれらの有益な交配株の遺伝的特徴の保存により、大量の保存用交配集団の費用が回避される。
【００３９】
ＰＧＣの長期培養物は、ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａｖｏｉｒ，Ｍ−Ｃ，Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｊ．，Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐ．，Ｈｅｙｅｒ，Ｂ．，Ｂｒａｄｓｈａｗ，  Ｒ．，Ｍａｔｈｅｒ−Ｌｏｖｅ，Ｃ．，Ｋｅｒｃｈｎｅｒ，Ａ．，Ｈｏｏｉ，Ｌ．，  Ｇｅｓｓａｒｏ，Ｔ．，Ｓｗａｎｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｄｅｌａｎｙ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｅｔｃｈｅｓ，Ｒ．Ｊ．（２００６）．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ
４４１，７６６−７６９に記載されている。
【００４０】
ＰＧＣを使用する遺伝子操作されたニワトリの生産は、ＰＧＣの遺伝子型に遺伝子改変を導入し、遺伝子改変が起きた希少細胞を分離し、分析とＧ０キメラを作製するためにレシピエント胚への導入に対するための遺伝子改変細胞集団の拡大を必要とする。培養物中の標的細胞の広範な遺伝子操作技術は周知である。しかし、１つの主な困難は、培養物中でＰＧＣの遺伝子型を変化させるために、遺伝子改変物を導入し、首尾よく形質転換した細胞を選択するのに適切な期間およびトランスフェクトした細胞が培養物中で成長および増殖する間、培養物の生存を長期間維持しなければならないということである。
【００４１】
増殖することができる首尾よく形質転換した細胞を、クローンまたは略クローンの誘導から数日〜数週間以内に、多数の細胞（例えば、１０４〜１０７細胞）を生成する能力によって区別する。創始細胞は、所望の遺伝子改変を保有する稀な細胞である。典型的には、これらの細胞が、周知の遺伝子改変テクノロジー（例えば、リポフェクションまたはエレクトロポレーション）の適用後に１０−４〜１０−７の頻度で培養物中に生成される。したがって、培養物中のＰＧＣの産生には、細胞が増殖し、培養物中の稀な遺伝子改変された細胞を選択するのに十分な数の細胞を生成するための空間および栄養を細胞に提供するように継代することが必要である。
【００４２】
そのような集団を提供するためには、培養条件は、個別の遺伝子改変細胞からインビトロでの遺伝子分析およびキメラの産生のために使用される１０４〜１０７個の細胞のコロニーへと細胞が増殖するために十分に頑強でなければならない。これらの操作されたＰＧＣは、得られた動物において成熟時に、精原細胞または卵原細胞の初期集団（すなわち、精子および卵子）に排他的に寄与するであろう。このような得られた動物では、体細胞組織全体はレシピエント胚に由来し、生殖系列はドナー細胞およびレシピエント胚の両方からの寄与を受けるであろう。生殖系列への合わさった寄与のため、これらの動物は、「生殖系列キメラ」として公知である。キメラの範囲に応じて、生殖系列キメラの子孫は、ドナー細胞またはレシピエント胚のいずれかに由来する。
【００４３】
ニワトリの生殖系列は、ステージＸ（Ｅ−Ｇ＆Ｋ）の胚の胚盤葉上層由来の細胞として開始され、初期胚盤葉下層に入る（Ｋａｇａｍｉら（１９９７）Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ  ４８，５０１−５１０；Ｐｅｔｉｔｔｅ，（２００２）Ｊ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ  ３９，２０５−２２８）。胚盤葉下層が前方に進行するにつれて、前始原生殖細胞は、巨大なグリコーゲン負荷細胞として同定することができる生殖三日月環に前進する。これらの形態基準による生殖系列中の細胞の最も早い同定は、インキュベーション開始から約８時間後（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，（１９５１）Ｊ  Ｍｏｒｐｈ  ８８，４９−９２によって確立された段階別分類を使用したステージ４）である。始原生殖細胞は、これらがステージ１２〜１７（Ｈ＆Ｈ）の間に脈管構造を介して移動するまで、ステージ４（Ｈ＆Ｈ）由来の生殖三日月環に存在する。この時点で、始原生殖細胞は、約２００個の細胞の小集団である。脈管構造から、始原生殖細胞が生殖隆起に移動し、性腺が分化するにつれて、卵巣または精巣に組み込まれる（Ｓｗｉｆｔ，（１９１４）Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１５，４８３−５１６；Ｍｅｙｅｒ，（１９６４）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１０，１５４−１９０；Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、（１９７６）Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．１８５，１３９−１５４）。
【００４４】
今まで試験されてきた全ての種では、始原生殖細胞は、ＥＧ細胞に分化することなく長期培養物中で増殖しなかった。従来のエレクトロポレーションまたはリポフェクションプロトコルによって遺伝子改変または不活化を導入するのに十分な数の細胞を産生するために、長期培養が必要である。典型的には、これらのプロトコルには、１０５〜１０７個の細胞が必要であり、したがって、全ての細胞分裂が、（１）同期に起こり、そして（２）２つの生きた娘細胞を産生すると仮定すると、１つの前駆体からのこれらの細胞の産生には、１７〜２４回倍増する必要がある。細胞ゲノムへの遺伝子改変物の導入は、稀な事象であり、典型的には、１×１０４〜１×１０６個の細胞に１回生じる。遺伝子改変後、細胞は、遺伝子改変物を保有および／または発現する１つの細胞からコロニーを確立することができなければならない。コロニーは、ＰＣＲまたはサザン分析によって分析して導入遺伝子の信頼性を評価することができる１０５〜１０７個の細胞集団に拡大することによって十分な数の細胞が得られなければならならず、次いで、ステージ１３〜１５（Ｈ＆Ｈ）のレシピエント胚に注入する。したがって、細胞集団を産生するために、さらに１７〜２４回の細胞分裂が必要であり、遺伝子改変細胞集団を産生するために全部で３４〜５８回倍増することが必要である。細胞周期が２４時間であると仮定すると、ステージ１３〜１５（Ｈ＆Ｈ）のレシピエント胚への注入のための遺伝子改変された始原生殖細胞を産生するために、最短で３４日間、一般に５８日間の培養が必要である。次いで、注入した細胞は、生殖系列をコロニー形成し、機能的配偶子を形成し、受精後に新規の個体に発育することができなければならない。
【００４５】
本明細書に記載される培養物において維持されるＰＧＣは、培養物中に維持される間、特徴のあるＰＧＣ形態を維持する。ＰＧＣ形態は、直接的観察によって観察することが可能であり、培養物中の細胞成長は、細胞が培養物中で確実に増殖させるための一般的な技術によって評価される。増殖する細胞培養物は、非末期であると定義されて、２つの異なる時点のうちの後の時点の方が培養物中の細胞数が多いことが認められる。本発明の培養物中のＰＧＣは、任意の特定の培養物中に１×１０５個以上の細胞を有することができ、この数は長期にわたって増加することが認められる。したがって、本発明は、培養物の寿命のうちのより早い時点と比較して、何日後、何週間後または何カ月後に多数の細胞を含む増殖ＰＧＣ培養物を含む。理想的には、培養物は、少なくとも１×１０５個の細胞を含み、培養物の任意の成長期間後により多数の細胞を有することを認めることができる。さらにまた、ＰＧＣは、培養物中の優占種であることが認められ、それは、非ニワトリのフィーダー細胞によってなされる最小の貢献を考慮した場合、細胞培養物の増殖成分は、他のニワトリ由来細胞を実質的に排除して、本質的にニワトリ始原生殖細胞から成る。
【００４６】
培養物は、また、既存の培養物由来の細胞のサンプルまたはアリコートを分離することができ、且つ、新規の培養培地中に入れた場合に強い成長を示すような継代による増殖特性も示す。定義により、細胞培養物を継代する能力は、細胞培養物が成長および増殖し、且つ末期ではないことを示す。さらに、本発明の細胞は、数回の継代後に生殖系列キメラを作製し、ＰＧＣ形態を維持する能力を証明する。本明細書中に記載のように、この増殖は、外因性ＤＮＡ配列の安定な組み込みに適切な任意の細胞培養物の不可欠な特徴である。
【００４７】
ＰＧＣは、任意の公知の技術によって得ることができ、本明細書中に記載の培養条件で成長させることができる。しかし、全血をステージ１５の胚から取り出し、下記の培養培地に直接入れることが好ましい。このアプローチは、ＰＧＣを培地に入れる前に処理および分離工程に供する文献に記載の他のアプローチと異なる。最初は培地中に共存し得る全血由来のＰＧＣと他の細胞との間の頑強な差分成長は、本明細書中に記載の培養物中のＰＧＣの大集団を提供する。したがって、全血から直接由来のＰＧＣは、培養物中で大きな細胞濃縮物に成長し、無制限の回数の継代を行うことができ、培養物中のＰＧＣが本質的に成長および増殖している細胞のみであるような頑強な成長および増殖を示す。
【００４８】
本発明の１つの態様は、多数（３個超、４個超、５、１０、１５、および２０個超が含まれる）の生殖系列キメラ動物の作製であり、これらは全てその生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する。本発明の別の態様は、年齢差を集団内で有する、その生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する生殖系列キメラ集団の作製であり、このことは、生殖系列キメラを作製するための同一の長期細胞培養物の使用を反映する。年齢差は、始原生殖細胞を長期間培養するための現在利用可能な能力を超え、それは凍結することなく１９０日間にもなる。したがって、本発明は、細胞を凍結することなく、４０日間、６０日間、８０日間、１００日間、１９０日間などまたはその間の任意の他の整数値を超えて年齢が異なる、その生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する２個以上の生殖系列キメラを含む。本発明は、また、これらの生殖系列キメラを作製するために使用される非末期ＰＧＣ培養物の存在と共にその生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する性的に成熟した生殖系列キメラの存在を含み、これらからさらなる生殖系列キメラを作製することができる。
【００４９】
ＰＧＣを非常に安定な様式で培養物中に維持することができるので、細胞を低温保存し、解凍して、培養物中に維持されたＰＧＣの表現型によって定義された子孫を作製する能力を有する生殖系列キメラを作製するための長期保存方法を得ることもできる。
【００５０】
多数の生殖系列キメラを産生する能力により、生殖系列キメラの子孫にＰＧＣ由来遺伝子型を伝達する能力も得られる。したがって、本発明は、生殖系列中に不活化内因性遺伝子の遺伝子座を有する遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する生殖系列キメラの両集団を含むが、その遺伝子型および表現型が培養物中で成長したＰＧＣの遺伝子型によって完全に決定される生殖系列キメラの子孫も含む。ＰＧＣ由来ノックアウト表現型の生殖系列での取り込みが認められた。このように、本発明は、不活化内因性遺伝子座を含む始原生殖細胞の遺伝子型の生殖系列への伝達により作製される生殖系列キメラの子孫を含む。したがって、本発明は、部位特異的遺伝子不活化からなるＰＧＣを含む始原生殖細胞培養物、同じ始原生殖細胞をその生殖系列の一部として有する生殖系列キメラ、およびノックアウト遺伝子型および表現型を有する生殖系列キメラの子孫のそれぞれの存在を含む。
【００５１】
レシピエント胚中のドナー由来ＰＧＣとレシピエント由来ＰＧＣとの比を変化させて、ＰＧＣ由来のキメラ中の生殖系列のコロニー形成を助けることができる。発育中のニワトリおよびウズラ胚では、ブスルファンへの曝露により、始原生殖細胞集団が生殖三日月環から生殖隆起に移動するにつれて、始原生殖細胞集団が大幅に減少するか、または消失する（Ｒｅｙｎａｕｄ（１９７７ａ）Ｂｕｌｌ  Ｓｏｃ．Ｚｏｏｌ．Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  １０２，４１７−４２９；Ｒｅｙｎａｕｄ（１９８１）Ａｒｃｈ  Ａｎａｔ．Ｍｉｃｒｏ．Ｍｏｒｐｈ．Ｅｘｐ．７０，２５１−２５８；Ａｉｇｅ−Ｇｉｌ  ａｎｄ  Ｓｉｍｋｉｓｓ（１９９１）Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．５０，１３９−１４４）。２４〜３０時間のインキュベーション後に、ブスルファンを卵黄に注入する場合、５０〜５５時間のインキュベーション後に始原生殖細胞が脈管構造に再導入され、ドナー由来始原生殖細胞と共に生殖系列が再増殖され、その後、ドナー由来配偶子が産生される（Ｖｉｃｋら、（１９９３）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．９８，６３７−６４１；Ｂｒｅｓｌｅｒら、（１９９４）Ｂｒｉｔ．Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ．３５  ２４１−２４７）。
【００５２】
本発明の方法は、ニワトリから（例えば、ステージ１５の胚の全血などから）のＰＧＣを得ること、ＰＧＣを培養物中に入れること、内因性遺伝子の遺伝子座の不活化を操作すること、ＰＧＣを増殖させてその数を増加させること、多数の継代を可能にすること、操作されたＰＧＣの長期培養物から生殖系列キメラを作製すること、およびＰＧＣで操作された遺伝子不活化を示す遺伝子型および表現型を有する生殖系列キメラの子孫を得ることを含む。本発明の方法は、また、培養物中のＰＧＣ集団に不活化遺伝子または「ノックアウト」遺伝子を挿入して、不活化された、または機能的に破壊された内因性遺伝子座を有する、安定にトランスフェクトされたＰＧＣを作製する工程と、安定に組み込まれた導入遺伝子を保有するこの集団から細胞を選択する工程と、安定に組み込まれた導入遺伝子を保有する遺伝子改変細胞をレシピエント胚に注入する工程と、生殖系列に不活化された遺伝子座を含む生殖系列キメラに胚を発生させる工程と、生殖系列キメラを性的に成熟するまで飼育する工程と、生殖系列キメラを交配してトランスジェニック子孫を得る工程を含み、ここで、遺伝子不活化は、培養ＰＧＣに由来する。遺伝子不活性化を達成するためにＰＧＣに導入された遺伝子改変は、限定されるものではないが、ゲノムへの導入遺伝子のランダムインテグレーション、遺伝子のプロモーター領域へ挿入された導入遺伝子、ゲノム中の反復エレメントへの導入遺伝子の挿入、インテグラーゼを用いて導入されたゲノムに対する部位特異的変化、相同組換えにより導入されたゲノムに対する部位特異的変化、およびｌｏｘ部位または部位特異的組み換えの基質である他の配列に隣接したＤＮＡを切り出すことによりゲノムに導入された条件変異を含む。
【００５３】
下記するように、本発明によれば、ニワトリＰＧＣ細胞株は、ステージ１４〜１６（Ｈ＆Ｈ）の胚から採取した血液に由来し、大きな丸い形態をしている（図１）。これらの細胞は、長期培養後のその形態およびＰＧＣ由来子孫を産出する能力によってニワトリＰＧＣであることが確認される。さらに、ＰＧＣ培養物は、生殖系列特異的遺伝子であるＤａｚｌおよびＣＶＨを発現し（図２）、ＣＶＨタンパク質は、培養物中の細胞によって産生される（図３）。培養物中のＰＧＣは、また、テロメラーゼも発現し（図４）、これらが不死の表現型を有することを示す。さらに、ＰＧＣは、適切な培養条件で胚生殖（ＥＧ）細胞を生じる（図５）。類似性により、マウスおよびヒトのＰＧＣは、類似の様式で処理した場合にＥＧ細胞を生じる。マウスＥＧ細胞は体細胞組織に寄与し、キメラの黒色の羽の色素沈着によって示されるように、ニワトリＥＧ細胞も体細胞組織に寄与する。ニワトリＰＧＣは、サザン分析によって示されるように遺伝子改変されている（図６）。この実施形態では、ＣＸプロモーターは、ＰＧＣのゲノムに安定に組み込まれ、これを使用してＰＧＣのゲノムに共に組み込まれたアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする遺伝子の発現を容易にし、これを使用して培養培地に添加したネオマイシンへの耐性を付与し、遺伝子改変されたＰＧＣを選択する。
【実施例】
【００５４】
（実施例１。ニワトリＰＧＣ培養物の誘導）
ステージ１４〜１７（Ｈ＆Ｈ）の胚の終末静脈洞から採取した２〜５μＬの血液を、培地（幹細胞因子（ＳＣＦ；６ｎｇ／ｍｌまたは６０ｎｇ／ｍｌ）、ヒト組み換え線維芽細胞増殖因子（ｈｒＦＧＦ；４ｎｇ／ｍｌまたは４０ｎｇ／ｍｌ）、１０％ウシ胎仔血清、および８０％ＫＯ−ＤＭＥＭ馴化培地を含む）を含む９６ウェルプレート中でインキュベーションした。好ましくは、１〜３μＬを、ステージ１５〜１６（Ｈ＆Ｈ）の胚の脈管構造から採取した。９６ウェルプレートのウェルに、照射ＳＴＯ細胞を３×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。
【００５５】
ＫＯ−ＤＭＥＭ馴化培地を、１０％ウシ胎仔血清、１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸塩、１×ヌクレオシド、１×非必須アミノ酸、および０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールで補足し、５％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中での密集までのＢＲＬ細胞の３日間の成長によって調製した。２４時間後、培地を除去し、培地の新規のバッチを３日間馴化した。これを３回繰り返し、３つのバッチを合わせてＰＧＣ培養培地を作製した。
【００５６】
約１８０日間の培養後、ＰＧＣ株の１つを、４０％  ＫＯ−ＤＭＥＭ馴化培地、７．５％ウシ胎仔血清、および２．５％ニワトリ血清からなる培地中で成長させた。これらの条件下で、ＰＧＣの倍加時間は約２４〜３６時間であった。
【００５７】
培養開始時の主な細胞型は、胎仔赤血球であった。３週間以内の主な細胞型はＰＧＣの細胞型であった。２つのＰＧＣ細胞株は、各胚から開始された１８の培養物に由来した。
【００５８】
ＰＧＣ株を９ヶ月にわたって培養し、丸い形状を維持し、付着しないままである（図１ＡおよびＢ）。１０％血清および１０％  ＤＭＳＯを含むＣＯ２非依存性培地中での低温保存後に、ＰＧＣは首尾よく解凍された。
【００５９】
（実施例２。培養ＰＧＣはＣＶＨおよびＤａｚｌを発現する）
ＣＶＨは、ショウジョウバエ中の生殖系列特異的遺伝子ＶＡＳＡのニワトリホモログであり、その発現はニワトリの生殖系列内の細胞に限定され、生殖三日月環中の約２００個の細胞によって発現される（Ｔｓｕｎｅｋａｗａ，Ｎ．，Ｎａｉｔｏ，Ｍ．，Ｓａｋａｉ，Ｙ．，Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｔ．＆Ｎｏｃｅ，Ｔ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｖａｓａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｒａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，２７４１−５０．（２０００）。ＣＶＨ発現は、雄の生殖系列の適切な機能に必要であり、ＣＶＨ機能の喪失により雄マウスが不妊症を引き起こす（Ｔａｎａｋａ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｖａｓａ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４，８４１−５３．（２０００）。Ｄａｚｌの発現は、カエル（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｄ．Ｗ．＆  Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｌ．  Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｘｄａｚｌ，ａ  ｇｅｒｍ  ｐｌａｓｍ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ＲＮＡ，ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，４４７−５６，２０００）、アホロートル（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｂａｃｈｖａｒｏｖａ，Ｒ．Ｆ．，Ｄｒｕｍ，Ｍ．＆  Ｍａｓｉ，Ｔ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｘｏｌｏｔｌ  ＤＡＺＬ  ＲＮＡ，ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｇｅｒｍ  ｐｌａｓｍ：ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｏｎａｄ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２３４，４０２−１５，２００１）、マウス（Ｓｃｈｒａｎｓ−Ｓｔａｓｓｅｎ，Ｂ．Ｈ．，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｔ．，Ｃｏｏｋｅ，Ｈ．Ｊ．＆  ｄｅ  Ｒｏｏｉｊ，Ｄ．Ｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ  ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  Ｄａｚｌ−／−ｍｉｃｅ．  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６５，７７１−７７６，２００１）、ラット（Ｈａｍｒａ，Ｆ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９，１４９３１−６，２００２）、およびヒト（Ｌｉｆｓｃｈｉｔｚ−Ｍｅｒｃｅｒ，Ｂ．ら、Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＲＢＭ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｉｓ．  Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ３１，１１１６−１１２０，２０００）中の生殖系列に制限される。Ｄａｚｌの欠失により、トランスジェニックマウスの精子形成欠損が起こる（Ｒｅｉｊｏ，Ｒら、Ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｅｎｃｏｍｐａｓｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １０，３８３−９３，１９９５）。
【００６０】
３２日後、ＰＧＣをＰＢＳで洗浄し、ペレット化し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを組織サンプルから単離した。次いで、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用して、９μｌのｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。２μｌのｃＤＮＡを、その後のＰＣＲ反応で使用した。ＣＶＨ配列（アクセッション番号ＡＢ００４８３６）、Ｄａｚｌ配列（アクセッション番号ＡＹ２１１３８７）、またはβ−アクチン配列（アクセッション番号ＮＭ＿２０５５１８）由来のプライマー配列は、以下であった。
【００６１】
【化１】
2014239702.tif 000003
プライマーＶ−１およびＶ−２を使用して、ＣＶＨ転写物から７５１ｂｐのフラグメントを増幅させた。プライマーＤａｚｌ−１およびＤａｚｌ−２を使用して、Ｄａｚｌ転写物から５３６ｂｐのフラグメントを増幅させた。プライマーＡｃｔ−ＲＴ−１およびＡｃｔ−ＲＴ−Ｒを使用して、内因性ニワトリβ−アクチン転写物から５９７ｂｐのフラグメントを増幅させた。製造者の説明書にしたがってＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ反応を行った（図２）。
【００６２】
（実施例３．ＰＧＣはＣＶＨタンパク質を発現する）
Ｔ−Ｐｅｒ組織タンパク質抽出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して新たに単離したＰＧＣからタンパク質を抽出した。１％  ＮＰ４Ｏ、０．４％デオキシコール酸塩添加した６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中での細胞の溶解によって細胞からタンパク質を抽出した。サンプルを、４〜１５％  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬレディゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で泳動した。膜に移した後、説明書の通りにＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してウェスタンブロットを行った。一次抗体としてウサギ抗ＣＶＨ抗体を使用し（１：３００）、二次抗体としてＨＲＰ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、１：１００，０００）を使用した（図３）。
【００６３】
（実施例４。培養ＰＧＣはテロメラーゼを発現する）
始原生殖細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、その後、分析まで−８０℃で凍結した。細胞抽出物を調製し、テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）（Ｋｉｍ，Ｎ．ら、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｏｒｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６，２０１１−２０１４，１９９４）に基づいたＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼ検出キット（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、製造者の説明書にしたがって分析した。図４。
【００６４】
（実施例５。胚生殖（ＥＧ）細胞は、ＰＧＣ培養物に由来することができる）
細胞をプレートに接着させ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、およびニワトリ血清を除去し、細胞をＥＳ細胞培養物について用いられた条件と同一の条件下で培養することによって、ニワトリＥＧ細胞をＰＧＣから誘導した（ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａｖｏｉｒら、２００６  Ｈｉｇｈ  Ｇｒａｄｅ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２，３１−４１；ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａｖｏｉｒ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｒ−Ｌｏｖｅ（２００６）Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，印刷中）。ｃＥＧ細胞の形態は、ｃＥＳ細胞の形態と非常に似ている（図５Ａ、Ｂ）。ｃＥＧ細胞をステージＸ（Ｅ−Ｇ＆Ｋ）の胚に注入する場合、ｃＥＧ細胞は体細胞組織をコロニー形成して、ｃＥＳ細胞を使用して作製されたキメラと同一と思われるキメラを幼鳥として作製する能力を有する。新規の誘導されたトランスジェニックＰＧＣ株およびクローン誘導されたトランスジェニックＰＧＣ株の両方でニワトリＥＧ細胞が認められる。ＧＦＰ陽性ＰＧＣ由来のＥＧ細胞のサザン分析により、ＥＧ細胞がＰＧＣ起源であることが証明された（図１５）。
【００６５】
（実施例６。培養雄ＰＧＣは、雄鶏中で機能的配偶子を生じる）
雄始原生殖細胞株を、各Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ胚から誘導した。株の確立後、細胞を、ステージ１３〜１５（Ｈ＆Ｈ）の胚に注入した。表現型的に、孵化したニワトリは、白色レグホンに類似していた。雄を性的に成熟するまで飼育し、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雌鶏と交配させた（表１）。黒色の子孫は、注入したＰＧＣの生殖系列伝達を示す。雄鶏の生殖系列伝達率は、１％未満から８６％まで様々であった（表１）。
【００６６】
【表１】
2014239702.tif 000004
ＰＧＣを、ステージＸの胚の胚下腔に注入することもできる。培養２０９日後に１０００個または５０００個のＰＧＣを照射した胚に注入した。孵化した雄ひなを性的に成熟するまで成長させ、交配して生殖系列伝達を試験した。試験した４羽の雄鶏のうちの３羽で生殖系列伝達が認められ、その頻度は０．１５〜０．４５％で変化した。これは、原腸形成前に注入した場合にＰＧＣが生殖系列をコロニー形成することができることを示す。雄ＰＧＣの生殖系列伝達は、１４羽の雌キメラ由来の１，６２５羽の子孫で認められなかった。
【００６７】
（実施例７。培養雌ＰＧＣは雌鶏で機能的配偶子を生じる）
６６日間培養したＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ胚由来の雌ＰＧＣを、ステージ１３〜１６（Ｈ＆Ｈ）の白色レグホン胚に注入し、孵化した全ひなは、表現型が白色レグホンであった。雌鶏を性的に成熟するまで飼育し、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雄鶏と交配した。雌ＰＧＣは雌キメラを介して伝達され、その頻度は最大６９％であった（表２）。
【００６８】
【表２】
2014239702.tif 000005
雌ＰＧＣを、雄レシピエント白色レグホン胚にも注入した。雄キメラを性的に成熟するまで飼育し、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雌鶏と交配した。雌ＰＧＣの生殖系列伝達は、３羽の試験雄鶏の５０６羽の子孫で認められなかった。
【００６９】
（実施例８．ＰＧＣ由来の子孫は、生殖的に正常である）
３羽の雄および４羽の雌の非トランスジェニックＰＧＣ由来の子孫を互いに交配させた。５３％と１００％との間の卵が受精し（表３）、７９％と１００％との間の受精卵から胚が孵化胚を生じ（表３）、このことはＰＧＣ由来の子孫が生殖的に正常であることを示す。
【００７０】
【表３】
2014239702.tif 000006
（実施例９）
始原生殖細胞は、ステージ１４−１７の胚から分離されて、生殖細胞系に貢献することが示された（参照：実施例１〜８）。この場合、ＰＧＣは、脈管系を循環している。脈管系の形成の前に、ＰＧＣは、生殖三日月環（胚体の前にある）に位置した。生殖三日月環のＰＧＣの前駆体は、十分に分かっていないが、ＰＧＣがステージＸ（Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ  ａｎｄ  Ｋｏｃｈａｖ）の胚の明域にある細胞に由来すると通常、思われている（Ｐｅｔｉｔｔｅ，Ｊ．Ｎ．  ２００２．  Ｔｈｅ  Ａｖｉａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｃｈｉｃｋｅｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９，２０５−２２８）。ステージＸ胚にある間、ＰＧＣは、生殖三日月環でそれらの識別のために使われる古典的な形態学的基準を使って確認することができない。驚くべきことに、ステージＸのＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ胚からの分散細胞の配置は、ＰＧＣをもたらし、生殖細胞系列に寄与することが示された。本発明者らは、個々に胚盤葉を集めて、パスツールピペットで粉砕して機械的にそれらを分散させることによって、この原理を証明した。細胞は、洗浄し、実施例１で記載された培地を含む照射ＢＲＬ細胞で先に播種された４８ウェルプレートにプレート化された。培養物は、播種後、最初の期間６〜１０日間、継代された。その後、継代は、存在するＰＧＣの濃度に依存した。２つの雄細胞株（ＰＧＣ−Ａ１２とＰＧＣ−Ｂ１１）が確立されて、実施例６で記載したように、それぞれ培養の４５日と３６日後に、レシピエント胚に注入された。５つの雄キメラは、各細胞株から作出された。表４に示すように、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ表現型は、１０匹の雄のうち３匹の生殖系列により伝達され、機能的なＰＧＣになる運命にある細胞が提供された培地で培養することができたことを証明している。
【００７１】
【表４】
2014239702.tif 000007
（実施例１０。ネオマイシンおよびピューロマイシンに対するＰＧＣの感受性）
全組織中で）強く発現するＣＸ−プロモーターの調節下で抗生物質耐性を発現する細胞の成長に必要なピューロマイシンおよびネオマイシンの濃度を確立するために、ネオマイシンおよびピューロマイシンに対するＰＧＣの感受性を決定した。これらの実験は、全ての非トランスフェクション細胞を消失するために１０日間に３００μｇ／ｍｌの濃度のネオマイシンが必要であることを証明した。０．５μｇ／ｍｌの濃度のピューロマイシンは、７〜１０日間以内にＰＧＣを消失させるのに十分であった。
【００７２】
（実施例１１。ＰＧＣの遺伝子改変）
ＮｏｔＩ線状化ｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子（図６を参照のこと）の２０μｇ（２０μｌ）を、１６７日間培養した５．８×１０６個のＰＧＣ集団に添加した。細胞およびＤＮＡを、８００μｌのエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁し、６７２ボルトおよび持続時間１００秒の方形波パルスを８回印加した。１０分後、細胞を培養培地中に再懸濁し、２４ウェルプレートに等分した。エレクトロポレーションから２日後に、培地１ｍｌあたり３００μｇのネオマイシンを添加して、ｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子を発現する細胞を選択した。細胞を、１９日間選択下に維持した。１９日後、細胞を選択から取り出し、分析のために拡大した。ＰＧＣの比率を、３００μｇ／ｍｌ下にさらに３１日間保持することにより、ＰＧＣが抗生物質に機能的に耐性を示すことが証明された。
【００７３】
図６に関して、プラスミドコントロールのために、ｃｘ−ｎｅｏプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩで線状化し、次いで、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で認められたインタクトなプラスミドよりもわずかに小さなフラグメント（５ｋｂ）を産生した。約２ｋｂのｃｘ−ｎｅｏプラスミドの内部フラグメントを、ＳｔｙＩまたはＮｃｏＩでの消化によって放出させた。約２．６ｋｂのより大きな内部フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩでの消化によって放出させた。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩでのＰＧＣ株由来のゲノムＤＮＡの消化により、６ｋｂを超えるバンドが明らかとなり、これは、ｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子がＰＧＣゲノムに組み込まれたことを示す。ＫｐｎＩとのＳｔｙＩ、ＮｃｏＩ、およびＥｃｏＲＩでの消化後にプラスミドＤＮＡ中に明らかとなった内部フラグメントは、ＰＧＣのゲノムＤＮＡ中にも存在し、ｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子が変化することなくＰＧＣゲノムに組み込まれたことを示す。従来の導入遺伝子構築技術を使用して、さらなるエレメントを組み込むことができ、その例は、調節エレメント、組織特異的プロモーターおよびタンパク質をコードする外因性ＤＮＡである。
【００７４】
上記のように、トランスジェニック動物を産生するためのＰＧＣの遺伝子改変の能力は、非常に少数の種でのみ証明されている。類似の遺伝子操作を、マウスのＥＳ細胞を使用して行われる遺伝子操作を参照することによって、ニワトリＰＧＣ中で行うことができる。マウスでは、相同組換えの個別の使用およびその後のキメラ子孫およびトランスジェニック子孫の産生のための胚幹（ｍＥＳ）細胞への染色体移入は周知である。部位特異的相同組換えまたは遺伝子ターゲティングの強力な技術が開発されている（Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２，１９８７；Ｗａｌｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．，  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２：４９−６４，１９９２による総説を参照のこと）。クローン化ＤＮＡの挿入（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：７６１−７６３，１９９４）ならびにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系技術による染色体フラグメントの操作および選択（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｊら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９：３７６−３８５，１９９５；Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：７２０−７２４，１９９５；米国特許第４，９５９，３１７号；同第６，１３０，３６４号；同第６，１３０，３６４号；同第６，０９１，００１号；同第５，９８５，６１４を参照のこと）は、安定な遺伝子キメラを産生するための遺伝子操作およびｍＥＳ細胞への遺伝子移入に利用可能である。
【００７５】
始原生殖細胞のゲノムは、一般に、静止状態にあると考えられ、したがって、クロマチンは非常に濃縮された状態であり得る。従来のエレクトロポレーションプロトコルによる広範な試験により、ＰＧＣのゲノムに遺伝子改変物を導入するためには特別な方法が必要であることが示唆される。下記のように、導入遺伝子をニワトリβ−グロビン遺伝子座由来のインスレーターエレメントで取り囲んで発現を増強することができる。β−グロビンインスレーターエレメントを含めることによって成長することができるクローンが日常的に産生され、これを分析し、レシピエント胚に注入する。
【００７６】
抗生物質（例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ｈｉｓ−Ｄ、ブラストサイジン、ゼオシン、およびｇｐｔ）耐性遺伝子の発現を引き起こすために使用される従来のプロモーターは、遍在的に発現する。典型的には、プロモーターは、β−アクチン、ＣＭＶ、またはユビキチンなどの「ハウスキーピング」遺伝子に由来する。全細胞中で典型的に高レベル発現するので構成的プロモーターが有用である一方で、これらは、ニワトリの全寿命にわたって、全組織といわないまでも、ほとんどの組織で発現し続ける。一般に、発現は、発現を必要とする組織および発生段階のみに制限されるべきである。始原生殖細胞の選択のために、発現を必要とする期間は、培地中に抗生物質が存在する場合、インビトロで存在する期間である。一旦細胞が胚に挿入されると、選択マーカー（すなわち、抗生物質耐性遺伝子）の発現が終了することが好ましい。抗生物質耐性遺伝子の発現を制限するために、「神経誘導に対する初期応答」（ＥＲＮＩ）プロモーターを使用する。ＥＲＮＩは、発生の初期段階（例えば、ステージＸ（Ｅ−Ｇ＆Ｋ））および培養物中で選択的に発現する遺伝子であり、したがって、このプロモーターを使用して抗生物質耐性遺伝子の発現を駆動し、遺伝子改変物を保有するＰＧＣを選択する。発生の初期段階でＥＲＮＩのみが発現するので、抗生物質耐性を付与する遺伝子は、成熟動物中で発現しない。
【００７７】
（実施例１２。長期ＰＧＣ細胞培養物の均質性）
長期培養後のＰＧＣ培養物の均質性を決定するために、ＥＳ、ＥＧ、ＤＴ４０（ニワトリＢ細胞株）、およびＰＧＣを、抗ＣＶＨ、ニワトリ管ホモログに対する抗体、および１Ｂ３抗体で染色した（Ｈａｌｆｔｅｒ，Ｗ．，Ｓｃｈｕｒｅｒ，Ｂ．，Ｈａｓｓｅｌｈｏｒｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｈｒｉｓｔ，Ｂ．，Ｇｉｍｐｅｌ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｅｐｐｅｒｌｅｉｎ，Ｈ．Ｈ．，  Ａｎ  ｏｖｏｍｕｃｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｍｉｇｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ａｎｄ  ｒａｔ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，９１５−２３．１９９６））。ＣＶＨ抗体の発現は、生殖細胞に制限され、したがって、抗ＣＶＨ抗体は、生殖細胞の信頼できるマーカーである。１Ｂ３抗原は、性腺の移動およびコロニー形成の間にニワトリＰＧＣの表面上に存在するオボムチン様タンパク質を認識する。
【００７８】
細胞を、ＣＭＦ／２％ＦＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、再度洗浄した。脈管を染色すべき細胞アリコートに０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１〜２分間浸透させた。一次抗体を２０分間添加し、細胞を２回洗浄し、二次抗体（ＣＶＨおよびコントロールのためのＡｌｅｘａ  ４８８抗ウサギＩｇＧならびに１Ｂ３のためのＡｌｅｘａ  ４８８抗ウサギＩｇＭ）と共に１５分間インキュベートした。コントロールとして、細胞のアリコートを、二次抗体のみで染色した。さらに２回の洗浄後、ＦＡＣＳ分析用の細胞を調製した。
【００７９】
図７に関して、ＤＴ４０細胞、ＥＳ細胞、およびＥＧ細胞は、ＣＶＨおよび１Ｂ３抗体で染色した場合、全てバックグラウンドを示す。しかし、ＰＧＣは、ＣＶＨ抗体および１Ｂ３抗体の両方でさらにより強く染色される。ＣＶＨおよび１Ｂ３のいずれでも染色されないＰＧＣの小集団が存在し、細胞の小集団がＰＧＣ表現型を示さないことを示す。２つの親ＰＧＣ株およびＰＧＣ１３親細胞株由来の４つのトランスフェクトされた細胞株（Ｇ−０９、Ｐ８４、Ｐ９７／６、およびＰ９７／３３）を、脈管および１Ｂ３抗体（ＰＧＣ１３および１０２）を使用して試験した。全て同一のパターンを示し、これは、種々のＰＧＣ培養物が同一の高い比率でＰＧＣ表現型を発現する細胞を含むことを示す。
【００８０】
（実施例１３：始原生殖細胞の遺伝子改変）
環状ＣＸ−ＧＦＰプラスミドを使用したエレクトロポレーションにより、ＰＧＣの一過性トランスフェクション率は、１〜３０％の間で変動することが明らかとなった。８回の１００μ秒および８００Ｖの方形波パルスを使用して、本発明者らは、ＣＸ−ｎｅｏ構築物を保有するＰＧＣ細胞を得て、Ｇ−０９と命名した。図６を参照のこと。サザンブロット分析を使用して、構築物の組み込みを評価した。しかし、この安定にトランスフェクトされた株の単離は、非再現性の事象であった。Ｇ−０９を除き、方形波パルスおよび指数関数的減衰パルスの両方を使用した３７のトランスフェクション実験における線状化構築物を使用した１７×１０７個のＰＧＣのエレクトロポレーション後に、ＰＧＣは安定にトランスフェクトされなかった。これらの各実験では、ＰＧＣ数は、１×１０６〜１０×１０６に変化した。マウス、ニワトリ、およびヒトにおけるＥＳ細胞研究で広く使用されている以下のプロモーターを試験した：ＣＡＧとも呼ばれるＣＸプロモーター（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−９．１９９１）、ＣＭＶエンハンサーを含むニワトリβ−アクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＭＣ１プロモーター、およびＵｂｃプロモーターを含む。これらのプロモーターは、トランスフェクション効率を増加させなかった。選択マーカーの発現および遺伝子改変細胞株のクローン誘導を可能とするために、組み込まれた構築物と共にインスレーターを使用した。
【００８１】
インスレーターは、不活性なクロマチンドメインから活性なクロマチンドメインを分離し、隣接するエンハンサーの活性化効果または隣接する凝集クロマチンのサイレンシング効果から遺伝子を隔離するＤＮＡ配列である。ニワトリでは、β−グロビン遺伝子座の５’側に存在する５’ＨＳ４インスレーターが、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄおよび協力者によって十分に特徴づけられている（Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ，Ｂ．，Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｃ．，Ｇａｓｚｎｅｒ，Ｍ．，Ｌｉｔｔ，Ｍ．，Ｍｕｔｓｋｏｖ，Ｖ．，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，Ｆ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｍ．，Ｗｅｓｔ，Ａ．，ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，Ｇ．（２００２））．Ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９  Ｓｕｐｐｌ．４，１６４３３−７。このインスレーターは、β−グロビン遺伝子座を構成的に凝縮されたクロマチンの上流領域から保護する。本発明者らは、ニワトリβ−アクチン−ｎｅｏカセットの５’側および３’側の両方のインスレーターとしてニワトリβ−グロビン５’ＨＳ４配列を使用したネオマイシン耐性を引き起こすニワトリβ−アクチンプロモーターを使用して導入遺伝子を組み立てた。
【００８２】
ニワトリβ−グロビン遺伝子座由来の高感度部位４の２５０ｂｐコア配列を、以下のプライマー組を使用してＰＣＲ増幅した。
【００８３】
【化２】
2014239702.tif 000008
ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔにクローン化し、配列決定した。ＨＳ４部位の縦列重複を、ｐＧＥＭクローン中のＨＳ４をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化して挿入物を放出させ、ＢｇｌＩＩで消化してベクターを線状化することによって作製した。ＨＳ４フラグメントを、ＨＳ４インスレーターのコピーを含むベクターにライゲーションした。クローンをスクリーニングし、２つのＨＳ４コピーが同一方向であるクローンを選択した。これを、２×ＨＳ４と呼ぶ。
【００８４】
（実施例１４：ＨＳ４β−アクチン−ｎｅｏを使用したバルク選択）
β−アクチンｎｅｏを、Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ（クローン５７４）から得て、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに移入した。次いで、β−アクチンｎｅｏの５’末端および３’末端の両方で２×ＨＳ４をクローン化して、ＨＳ４−β−アクチンｎｅｏを産生した。この構築物を使用して、トランスフェクションを８回行った。各トランスフェクションのために、５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。１回の指数関数的減衰（ＥＤ）パルス（２００Ｖ、９００〜１１００μＦ）または８回の方形波（ＳＷ）パルス（２５０〜３５０Ｖ、１００μ秒）を印加した。トランスフェクション後、細胞を数日間成長させ、その後、ネオマイシン選択剤（３００μｇ／ｍｌ）を添加した。各画分をプールとして成長させた。５〜８個の画分から耐性細胞を単離した。
【００８５】
トランスフェクション細胞の２プールに対してサザン分析を行った（図８）。ＰＧＣ細胞株Ｐ８４およびＰ８５由来の２μｇのゲノムＤＮＡならびに２０ｐｇのプラスミド（ＨＳ４−β−アクチンｎｅｏ）を消化した。消化物を０．７％ゲルで泳動し、１０×ＳＳＣ中でナイロン膜に毛細管現象によって一晩移し、Ｒａｐｉｄ  Ｈｙｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中にて放射能標識ｎｅｏ遺伝子配列で２時間探索した。洗浄後、ブロットをフィルムに−８０℃で一晩感光した。図８に関して、レーン１はＰ８４であり、レーン２はＰ８５であり、レーン３はプラスミドである。プラスミドコントロールのために、ＨＳ４−β−アクチンｎｅｏプラスミドＤＮＡを、ＮｏｔＩで線状化した。２．３Ｋｂ内部フラグメントを得るために、ＰＧＣ  ＤＮＡおよび線状化プラスミドを、ＢａｍＨＩで消化した。Ｐ８４およびＰ８５の両方は、２．３Ｋｂのサイズの内部フラグメントを示す。約２．６ｋｂのより大きな内部フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩでの消化によって放出させた。さらに、この内部フラグメントは、Ｐ８４およびＰ８５消化物の両方に存在する。ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩでのＰ８４およびＰ８５のゲノムＤＮＡの消化により、導入遺伝子がゲノムに組み込まれた場合、２．９Ｋｂを超えるバンドが明らかとなるはずである。Ｐ８４では、連結点フラグメントは認められず、Ｐ８４がいくつかの異なるクローンの複合物であることを示す。Ｐ８５では、ＥｃｏＲＩ消化物中に４．５〜５Ｋｂの連結点フラグメントが存在し、ＢｇｌＩＩ消化物中に５Ｋｂの連結点フラグメントが存在し、このことは、Ｐ８５がゲノムに組み込まれ、培養物が実質的に１つのクローンから構成されることを示す。本実施例は、始原生殖細胞中の選択マーカーの信頼できる発現のための構築物の好ましいエレメントとしてのインスレーターの有用性を示す。
【００８６】
（実施例１５：遺伝子改変ＰＧＣのクローン誘導）
以下の実施例は、始原生殖細胞の遺伝子改変株をクローン的に誘導し得ることを示す。
【００８７】
第１に、β−アクチン−ｅＧＦＰを作製した。ｅＧＦＰ遺伝子を、ＸｍｎＩおよびＫｐｎＩを使用してＣＸ−ｅＧＦＰ−ＣＸ−ｐｕｒｏから放出させ、ＥｃｏＲＩおよびＸｍｎＩを使用してＨＳ４−β−アクチンｐｕｒｏからβ−アクチンを放出させ、２つを３方向ライゲーションとしてＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化してβ−アクチンＥＧＦＰを産生した。次いで、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩを使用してβ−アクチンｅＧＦＰを放出させ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化し）、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化したＨＳ４−β−アクチンｐｕｒｏにクローン化した。
【００８８】
この構築物を使用してトランスフェクションを５回行った。各トランスフェクションのために、５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。ＥＤパルス（１５０〜２００Ｖ、９００μＦ）またはＳＷ（３５０Ｖ、８パルス、１００μ秒）パルスを印加した。トランスフェクション後、細胞を４８ウェルにそれぞれプレートし、数日間成長させた後に選択剤（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。５回のトランスフェクションのうちの４回において、全部で５つのクローンが認められた。１つのクローンＴＰ１０３を、サザンによって分析した（図９）。図１１に関して、プラスミドコントロールＤＮＡを、ＮｏｔＩで線状化した。ＫｐｎＩでのＤＮＡの消化によって内部フラグメントを放出させた。ＴＰ１０３およびプラスミドの両方において、同サイズのフラグメントが放出された。ＮｃｏＩ、ＭｆｅＩ、およびＳｐｈＩでのＴＰ１０３のゲノムＤＮＡの消化により、消化したプラスミドＤＮＡの対応するレーンよりも大きなバンドが明らかとなるはずである。ＭｆｅＩ消化したＴＰ１０３ゲノムＤＮＡのレーンでバンドは認められず、これは、バンドが非常に大きいためである場合がある。ＮｃｏＩおよびＳｐｈＩ消化を示すレーンでは、ＴＰ１０３ゲノムＤＮＡ中に、プラスミドＤＮＡ中に放出されたフラグメントより実質的に大きいフラグメントが放出され、導入遺伝子がＴＰ１０３細胞株のゲノムに組み込まれたことを示す。
【００８９】
ＨＳ４−β−アクチン−ｐｕｒｏのクローン誘導
第１に、β−アクチンｐｕｒｏを、ＣＸ−ＥＧＦＰ−ＣＸ−ｐｕｒｏ由来のｐｕｒｏ（ＸｍｎＩ−ＥｃｏＲＩ）、ｐＢＳ中のβ−アクチンｎｅｏ由来のβ−アクチン（上記を参照のこと）（Ｓａｌ−ＸｍｎＩ）、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ）の３方向ライゲーションによって作製した。次に、ＢａｍＨＩ／ＳＡＰ処理２×ＨＳ４ベクターへのＢａｍＨＩ消化β−アクチンｐｕｒｏのライゲーションによって２×ＨＳ４の２つのコピーを含むｐＢＳにβ−アクチンｐｕｒｏをクローン化した。
【００９０】
この構築物を使用してトランスフェクションを３回行った。各トランスフェクションのために、４〜５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。２００Ｖ、９００μＦのＥＤパルスを印加した。トランスフェクション後、細胞を４８ウェルにそれぞれプレート化し、数日間成長させた後に選択剤（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。２回のトランスフェクションでクローンは認められなかった。第３のトランスフェクションから２つのコロニーを単離した。
【００９１】
ＨＳ４−ｃｘ−ｅＧＦＰ−ｃｘ−Ｐｕｒｏのクローン誘導
ＨＳ４−ｃｘ−ｅＧＦＰ−ｃｘ−Ｐｕｒｏを使用してトランスフェクションを３回行った。５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。３５０Ｖで１００μ秒のＳＷパルスを、各トランスフェクションに８回印加した。トランスフェクション後、細胞を４８ウェルにそれぞれプレート化し、数日間成長させた後にピューロマイシン選択剤（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。２回のトランスフェクションから全部で１６個のクローンが単離された。
【００９２】
ｃｘ−ｎｅｏのクローン誘導
ＰＧＣ１３細胞株は、ｃｘ−ｎｅｏ選択マーカーを保有するプラスミドを使用してエレクトロポレーションされた。ネオマイシンへの曝露後、ネオマイシンに耐性を示す細胞株（Ｇ−０９）を誘導した。この細胞株の核型を決定し、全ての細胞が第２染色体のｐアームを欠失していた（表５および図１０）。これらのデータは、Ｇ−０９が第２染色体のｐアーム中にサイン欠失を保有するＰＧＣにクローン的に由来することを証明する。
【００９３】
【表５】
2014239702.tif 000009
（実施例１６：ＰＧＣ中の選択マーカーの組織特異的発現）
遺伝子ＥＲＮＩは、ニワトリ胚の前原始線条段階から発現し、ヘンセン結節由来のシグナルに対する初期応答遺伝子である（Ｓｔｒｅｉｔ，Ａ．，Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｐａｐａｎａｙｏｔｏｕ，Ｃ．，Ｓｉｒｕｌｎｉｋ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｍ，Ｃ．Ｄ．（２０００）．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｅｆｏｒｅ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６，７４−８）。さらに、ＥＲＮＩは、ニワトリＥＳ細胞中で発現する（Ａｃｌｏｑｕｅ，Ｈ．，Ｒｉｓｓｏｎ，Ｖ．，Ｂｉｒｏｔ，Ａ．，Ｋｕｎｉｔａ，Ｒ．，Ｐａｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｓａｍａｒｕｔ，Ｊ．（２００１）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏ．  Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０３，７９−９１）。ＥＲＮＩ遺伝子（ｃＥＮＳ−１とも呼ばれる）は、固有の５’および３’ＵＴＲ配列に加えて、１つの長い読み取り枠が４８６ｂｐの直列反復配列に隣接する固有の構造を有する。この構造がレトロウイルスＬＴＲ様構造を連想させるという考えに基づいて、Ａｃｌｏｑｕｅら（２００１）は、プロモーター／エンハンサー活性のｃＤＮＡ配列の異なる部分をアッセイし、３’ＵＴＲ中の固有の配列領域がプロモーターとして作用することを見出した。ＰＣＲプライマーは、Ａｃｌｏｑｕｅら（２００１）に記載のように、本質的に設計されてＥＲＮＩ遺伝子の３’ＵＴＲの８２２ｂｐフラグメントを増幅した。ＥＲＮＩ配列の増幅後、ＳＶ４０ポリＡ部位を使用して、これらをネオマイシン耐性遺伝子の上流にクローン化して、ＥＲＮＩ−ｎｅｏ（１．８ｋｂ）を作製した。次いで、２×ＨＳ４インスレーターを、ＥＲＮＩ−ｎｅｏ選択マーカーカセットのいずれかの側にクローン化した。
【００９４】
ＨＳ４−Ｅｍｉ−ｎｅｏを使用してトランスフェクションを２回行った。５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。第１のトランスフェクションでは、１７５Ｖ、９００μＦのＥＤパルスを１回印加し、第２のトランスフェクションでは、１００μ秒および３５０ＶのＳＷパルスを８回印加した。トランスフェクション後、細胞を４８ウェルにそれぞれプレート化し、数日間成長させた後にネオマイシン選択剤（３００μｇ／ｍｌ）を添加した。第１のトランスフェクション（ＥＤパルス）で、５つのコロニーを単離し、第２のトランスフェクション（ＳＷパルス）で、１１のコロニーを単離した。
【００９５】
安定にトランスフェクトされたクローンの単離は、ＥＲＮＩがＰＧＣ中で発現され、これを組織特異的プロモーターとして使用することができることを示す。
【００９６】
（実施例１７：生殖系列へのトランスフェクトされたＰＧＣの寄与）
ＰＧＣをＨＳ４−βアクチン−ＧＦＰでトランスフェクトし、ステージ１３〜１５（Ｈ＆Ｈ）の胚の脈管構造に注入した。１８日目に、性腺を取り出し、固定し、切片にし、ＣＶＨ抗体で染色して生殖細胞を同定した。次いで、染色切片を、性腺中のＧＦＰ陽性細胞の存在について分析した。雄（図１１）および雌の両方の性腺中でＧＦＰ陽性生殖細胞が見出された。これらの胚の脳、心筋、および肝臓の組織学的調製物試験により、１つのスライドで４つの緑色細胞のみが示された。これらのデータは、少数の培養ＰＧＣが異所で見出されたが、大部分の培養ＰＧＣは生殖系列を優先的にコロニー形成することを証明する。
【００９７】
ＧＦＰ陽性細胞が生殖細胞であることを決定するために、切片を抗ＣＶＨ抗体で染色した。図１２に認められるように、ＧＦＰ陽性細胞はＣＶＨタンパク質についても染色され、ＧＦＰ陽性細胞が生殖細胞であることを示す。
【００９８】
図１２に関して、ＧＦＰ陽性細胞がこの切片中に存在し、ＤＡＰＩ／ＧＦＰパネルは、これらのＧＦＰ陽性細胞が精細管内に存在することを示す。生殖細胞を抗ＣＶＨ抗体で染色する場合、これらは、生殖細胞の細胞質の輪郭を描く強く赤色に染色された環を示す。ＤＡＰＩ／ＣＶＨパネルは、これらの細胞が精細管内に存在することを示す。最後のパネルは、ＧＦＰ陽性細胞がＣＶＨについても染色され、精細管がＧＦＰ陰性のＣＶＨ陽性生殖細胞を含むことを示す。
【００９９】
（実施例１８。遺伝子改変ＰＧＣの生殖系列伝達）
以下の導入遺伝子：βアクチン−ｎｅｏ、βアクチン−ｅＧＦＰ−βアクチン−ｐｕｒｏ、またはｃｘ−ｅＧＦＰ−ｃｘ−ｐｕｒｏの１つでトランスフェクトされたＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ  ＰＧＣを、ステージ１３〜１４（Ｈ＆Ｈ）の胚の脈管構造に注入した。ニワトリのひなを孵化させ、雄鶏を性的に成熟するまで成長させ、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雌鶏と交配させて導入遺伝子の生殖系列伝達を決定した。全ての黒色子孫はＰＧＣに由来し、これらを導入遺伝子の存在について試験した（表６）。生殖系列伝達率を、羽の色をスコアリングした全ニワトリひな数で黒色ニワトリひな数を割ることによって計算した（表６）。
【０１００】
【表６】
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（実施例１９。導入遺伝子は、メンデルの法則で遺伝する）
βアクチン−ｎｅｏ、βアクチン−ＧＦＰ、またはｃｘ−ＧＦＰの１つを含むように遺伝子改変されたＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ  ＰＧＣを保有するキメラ雄鶏の交配に由来する黒色子孫を、導入遺伝子の存在について分析した。表７に示すように、導入遺伝子は、ＰＧＣ子孫の約５０％に遺伝し、メンデル性遺伝を示す。
【０１０１】
【表７】
2014239702.tif 000011
（実施例２０：遺伝子改変ＰＧＣを保有するキメラの子孫における導入遺伝子の遍在発現）
βアクチン−ＧＦＰがゲノムに安定に組み込まれたＰＧＣを保有するキメラを、野生型雌鶏と交配し、胚をＧＦＰの発現についてスコアリングした。胚中の発現の例を図１３に示し、これは、ＧＦＰが発生のステージ３４（Ｈ＆Ｈ）までのトランスジェニック子孫の全組織中で発現することを示す。より高齢の動物では、凍結切片を使用した組織学的実験のために組織を調製した。１〜２週齢のニワトリひなの膵臓、皮膚、肺、脳、卵巣、腎臓、嚢、十二指腸、胸部、心臓、肝臓、および脾臓由来の組織は、孵化後の発現が動物中に遍在したままであることを証明する（図１４）。
【０１０２】
（実施例２１：導入遺伝子を含むＨＳ４をニワトリゲノムのプロモーター領域に挿入する）
ＨＳ４を含む構築物がサイレンシングを避けて、選択マーカーの発現を可能とするゲノムの特定領域に優先的に挿入されたかどうかを述べるために、本発明者らはクローン性トランスフェクトされたＰＧＣ株で、導入遺伝子挿入部位を確認した。ゲノムＤＮＡを、トランスフェクトされたＰＧＣ株から抽出し、導入遺伝子を切断しない制限酵素または一度ＨＳ４エレメントを切断する制限酵素のいずれかで消化した。ＤＮＡは自己連結されて、大腸菌に形質転換された。細胞をアンピシリンプレートにプレート化し、ゲノム配列隣接ベクターに結合したプラスミドからのａｍｐ遺伝子を含むコロニーを単離した。
【０１０３】
プラスミドを精製し、ＨＳ４−構築物がトランスフェクトされた３１のＰＧＣ株から配列決定した。本発明者らは、ＢＬＡＴ（ＵＣＳＣ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｇａｔｅｗａｙ）およびＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）探索を行って挿入物の各々のゲノム位置の地図を作成した。注目すべきことに、３１のＨＳ４を含む構築物のうちの２５は、ＣｐＧアイランドに挿入され、そして、それはプロモーター領域（特にハウスキーピング遺伝子領域）の近くで一般に見られる。ＣｐＧアイランドでの挿入のうち、遺伝子は、ＥＳＴ（表８）によって定義される既知の遺伝子または新規遺伝子のそれらのほとんど（２３／２５）と関係していることが分かった。ＣｐＧアイランドは、第１エクソンを経て第１イントロンに、数百の塩基対から転写開始点の上流にしばしば拡大し、そして、挿入物はこれらの領域の全てで見られた。偏りは、内因性遺伝子と比較してベクターの転写方向にはなかった。これらの遺伝子の多くは、ハウスキーピング遺伝子（例えば、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア溶質担体）としての既知の機能に基づき、ＰＧＣで発現されると予測される。挿入物のうちの７つは、ＥＳＴによって定義されるように、新規遺伝子の中にあった。これらのＥＳＴのうちの５つは、生殖腺またはＰＧＣライブラリから当初クローン化され、これらの遺伝子は、また、本発明者らのＰＧＣ細胞株でも発現され得ることを示唆した。遺伝子への挿入物のうちの３つは、ＣｐＧアイランドにではなく、むしろより遠位のイントロンの中にあった。挿入物のうちの５つは、何らの明白な遺伝子のない領域にあった。これらの挿入物のうちの３つは、ＬＩＮＥまたはサテライト反復の非常に近傍にあった。
【０１０４】
【表８−１】
2014239702.tif 000012
【０１０５】
【表８−２】
2014239702.tif 000013
（実施例２２：ｐｈｉＣ３１インテグラーゼによる効率的な組み込み）
本発明者らは、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ系を使用したが、この系は、ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間での部位特異的組み換えを触媒して外因性ＤＮＡをニワトリのゲノムに挿入する。ｐｈｉＣ３１  ａｔｔＢとａｔｔＰ部位の間の組み換えは、非可逆的であり、そのため、ａｔｔＢ部位を有する環状構築物のゲノムへの挿入は、安定であり、インテグラーゼの継続した存在においてでさえ、ループを形成しない。アフリカツメガエル（Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｗｅｅｋｓ  ２００５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，９７５−９．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｉＣ３１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）、マウス（Ｏｌｉｖａｒｅｓら、２００２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，１１２４−８．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ；Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，３２１−４．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｏｕｓｅ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｈｉＣ３１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）およびヒト細胞（Ｇｒｏｔｈら、２０００  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９７，５９９５−６０００．Ａ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ；Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１，３９２６−３４．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅｐｈｉＣ３１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）では、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼが、ａｔｔＢ含有プラスミドを改変されていないゲノムへの組み込みを調節し、これらの種のゲノムがインテグラーゼによって認識される細菌のａｔｔＰ部位と十分な配列相同性を有する偽ａｔｔＰ部位を含むことを示すことが証明された。また、挿入されるプラスミドは、効果的な組み込みのためにａｔｔＰ部位よりもむしろａｔｔＢ部位を保有しなければならないことが示された（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３；Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ２００１）。ａｔｔＢ部位は、隔離されたＨＳ４β−アクチンＥＧＦＰ  β−アクチンｐｕｒｏ（ＨＳ４  ＢＧＢＰ）構築物に付加されて、ａｔｔＢ  ＨＳ４  ＢＧＢＰをもたらした。図１６Ｂの左のパネルを参照して、この研究において使われるインテグラーゼ構築物は、ａｔｔ−Ｂ部位がＨＳ４β−アクチンＥＧＦＰβ−アクチンｐｕｒｏ構築物に付加されたａｔｔ−Ｂ含有プラスミドを含むことが示される。図１６Ｂの右側のパネルを参照して、ＣＡＧプロモーター由来細胞中でインテグラーゼを発現するために用いられるプラスミドが示される。インテグラーゼの２つのバージョンが作製され、１つはＳＶ４０核局在化シグナルを有するものと、１つはそれを有しないものとである。ａｔｔ��  ＨＳ４  ＢＧＢＰとＣＡＧ−インテグラーゼプラスミドＤＮＡｓは、ＰＧＣへの環状プラスミドとして、コトランスフェクションされた。非インテグラーゼの線状化ＨＳ４  ＢＧＢＰと比較して、２０ｕｇの線形ＤＮＡを有する１０６個の細胞あたり０．３のコロニーからわずか５ｕｇのＤＮＡを有する１０６個の細胞あたり５〜１０コロニーへのコロニー形成の大きな増加が認められたが、これはＤＮＡにつきコロニーの２０倍の増加を表す。インテグラーゼのＮＬＳバージョンは、非ＮＬＳバージョンと比較して、わずかに少ないコロニーを産生した。これらのデータは、インテグラーゼがニワトリゲノム中の偽ａｔｔＰ部位を認識することができ、そして、それがＰＧＣでの効率的な安定したトランスフェクションのために使うことができることを示唆した。
【０１０６】
（実施例２３：インテグラーゼクローンのための挿入部位の同定）
インテグラーゼとａｔｔＢを含むプラスミドを用いる安定したトランスフェクション効率の増加は、ニワトリゲノムがｐｈｉＣ３１インテグラーゼにより認識することができる偽ａｔｔＰ部位を含むことを示唆した。ａｔｔＢ  ＨＳ４  ＢＧＢＰプラスミドが、ベクターのランダム破壊によってではなく、インテグラーゼ媒介反応を経由して組み込まれたことを証明するために、５つの独立したＰＧＣクローンからのゲノムＤＮＡのサザンブロット分析が実行され、そして、無傷の全長導入遺伝子が各々のケースで観察され、ａｔｔＢ部位（データは示されていない）経由の組み込みと一致する構造を有した。ヌクレオチドレベルで組み換えブレークポイントをさらに特徴づけるために、偽ａｔｔＰ部位を同定するために、および挿入の染色体位置を特定するために、本発明者らのインテグラーゼＰＧＣ株のうちの１２でのベクターとゲノム挿入部位との間の連結点が、クローン化されて配列決定された。プラスミドレスキューは、非インテグラーゼ株のために上記のように実行された。本発明者らは、連結点フラグメントのクローン化効率での劇的な減少を認めた；得られた大腸菌のコロニーの数は、非インテグラーゼＰＧＣ株についての形質転換につき平均６９のコロニーから、形質転換あたりインテグラーゼ媒介ＰＧＣ株からの３．１コロニーとなった。これの理由は不明であるが、１つの可能性は、インテグラーゼクローン（下記参照）に隣接する反復ＤＮＡを制限酵素で消化するのがより困難であったからである。プラスミドＤＮＡは、コロニーから精製され、配列決定され、そして、ａｔｔＬと隣接配列が決定された（下記の表９を参照）。ゲノムＤＮＡは、導入遺伝子内で切断する酵素で消化されたので、ベクターバックボーン上のａｍｐ遺伝子に隣接した隣接ゲノムＤＮＡだけは、この方法で同定することができた；導入遺伝子挿入の他方の部位の隣接ＤＮＡは、分析しなかった。
【０１０７】
図１７を参照して、インテグラーゼ媒介トランスフェクションに由来するＰＧＣクローンでのａｔｔＢプラスミドとゲノム配列の間の連結点を示す。一番上のラインは、コアＴＴＧを有する野生型ａｔｔＢ部位であって、該コアは、通常、下線が付された組み換えクロスオーバー点であり（配列番号９）、その下には、インテグラーゼ媒介挿入由来のａｔｔＬ配列が示される（配列番号１０〜２１）。スプライシングが、プラスミドのａｔｔＢとゲノムの偽ａｔｔＰ部位との間の何処で起きたかについて決定するために、ＰＧＣ配列をａｔｔＢ（配列番号９）と比較した。ＰＧＣ配列において、プラスミドによって与えられたａｔｔＢ配列は小文字で、そして、ゲノム偽ａｔｔＰ配列は大文字および太字で表わしている。
【０１０８】
プラスミド上でａｔｔＢ配列のおよそ半分から成るａｔｔＬ配列は、ゲノム内で偽ａｔｔＰ部位と結合した各々のケースで見られ、インテグラーゼが組み換え反応を媒介したことを示唆した。プラスミド由来のａｔｔＢとゲノムの間の組み換えは、正確でなくて、通常ａｔｔＢのコアＴＴＧヌクレオチドで起こらなかった。ＢＬＡＴとＢＬＡＳＴ探索により挿入物の各々のゲノム位置の地図を作成した。注目すべきことに、マップ化することができた１１の挿入のうち７つは、反復ＤＮＡ配列で起きた。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）とＣｌｕｓｔａｌＷ配列アラインメントを使って、反復が分析され、配列が先に確認されたＰＯ４１反復（Ｗｉｃｋｅｒら）として分類できることが判明した。図１８Ａに関して、ＰＧＣ挿入部位からのＰＯ４１様反復とＰＯ４１コンセンサス配列（配列番号２９）の配列比較が示される。ＰＯ４１様反復に挿入されたクローンの全てからのＰＧＣ隣接配列は、互いにＰＯ４１コンセンサス（Ｗｉｃｋｅｒら、２００４）を用いて配列した。始めから２０のヌクレオチドは、ベクター（上記アラインメントに示されるように）によって付与されたａｔｔＢ配列であり、そして、各々のクローンからのゲノム隣接配列が続いた。その配列の半分より多くが共有されるヌクレオチドは、黒のボックスで囲ってある。配列アラインメントは、ＰＧＣ株の２つ（２−４７  配列番号２３および１８−５−３６−２  配列番号２２）が同じゲノム部位でａｔｔＢ  ＨＳ４  ＢＧＢＰの挿入物を保有することを示した。ａｔｔＢ偽ａｔｔＰ連結点のヌクレオチド配列が２つの間で異なるという事実で示されるように、２つの挿入は独立している。もう一つの配列（１８−３−１２  配列番号２４）は、２０ｂｐ挿入物を除いて最初の２つと同じであった。挿入物において確認されたＰＯ４１反復のいずれもが、コンセンサス配列の正確なコピーではなく、ＰＯ４１コンセンサスと挿入部位反復の間の配列相同性のレベルは、４７％（１８−３−４３）から７７％（１−３０）のヌクレオチド相同性の範囲であった。図１８Ｂに関して、１００ｂｐのＰＯ４１コンセンサス反復の１００ｂｐのａｔｔＰとの配列比較は、約４６％の配列相同性を示したが、これはヒト細胞（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ２００１）の偽ａｔｔＰ部位について認められたものよりも高かった。ＰＯ４１反復は、ゲノムで２５９の位置に存在すると考えられ（Ｗｉｃｋｅｒら）、各位置は、数キロベースの４１ｂｐ繰り返し単位からなる。隣接ゲノムフラグメントのいくつかは、１０〜１２ｋｂのサイズ範囲であった；これらのフラグメントの２つの末端が配列決定されたとき、両方とも反復的であったが、このことは、繰り返しの全体的なサイズが大きかったことを示唆した。このように、ＰＯ４１配列は、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼに対するニワトリゲノムで大きな、好ましい標的を意味する。
【０１０９】
残りの４つのインテグラーゼ媒介挿入物は、固有のＤＮＡ配列の中にあった。配列のうちの１つ（１９−１−１  配列番号１２）は、２１番染色体の固有配列の遺伝子間領域にあり、１つ（１−４１  配列番号１０）は、５番染色体のＷｉｌｍ腫瘍（ＷＴ１）遺伝子のニワトリ相同分子種のプロモーター領域に挿入された。１つの配列（５−７  配列番号１１）は、１番染色体の複数の場所にあり、局所的遺伝子ファミリーまたは低コピー数反復を表わすことができた。１つの配列（１８−４−１１  配列番号１３）は、ニワトリゲノムまたは一般的な「非重複データベース」での既存配列と一致しなかったが、このように、まだ配列決定されていないゲノムの領域にあるようである。１つの最後の挿入物（２−３８  配列番号２１）は、偽ａｔｔＰ部位からなる非常に短い配列のみを与え、これはデータベースで同定することができなかった。
【０１１０】
【表９】
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（実施例２３：遺伝子改変染色体の同定）
本発明者らは、位置を割り当てることができた固有配列への挿入物を含んだそれらの株について、挿入が起きた染色体に注目した。ＰＧＣへの２８の独立した挿入の間で、ニワトリ核型の３８の染色体のうちから、本発明者らは１７の異なる染色体（表８および９）への挿入を認めた。挿入物のおよそ半分は、マクロ染色体の中にあり（染色体１〜６；１３の挿入）、そして、残り半分は、マイクロ染色体（染色体７〜３８；１４の挿入）の中にあり、１つの挿入物は、Ｚ染色体の中である。マクロ染色体とマイクロ染色体への挿入の比率は、ゲノムに対するそれらの物理的な寄与に比例し、組み換えに対する領域の偏りがないことを示す。
【０１１１】
（実施例２４：遺伝子ターゲティング）
ターゲティングベクターは、相同組み換えにより内因性遺伝子座に挿入する場合、免疫グロブリン軽鎖遺伝子のＪ領域およびＣ領域をＨＳ４  ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏ選択カセットと置き換えるように設計された（図１９）。上記したように、ＥＲＮＩプロモーター（ピューロマイシンカセットを引き起こす）は、初期胚で特異的に発現され（Ａｃｌｏｑｕｅら、２００１、上記）、そして、他のプロモーターに類似した頻度でＰＧＣにおいて薬物耐性コロニーを産出することが期待された。図２０を参照して、一番上のラインは、ニワトリＩｇＬ遺伝子（ＩｇＬ  ＫＯ５）のためのターゲティングベクターの図である。ＩｇＬ遺伝子の２．３ｋＢ）のＪ−Ｃ領域を３．１ｋｂのＨＳ４  ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏ選択マーカー（ＩおよびＨＳ４インスレーターとして示される）と置き換えるように設計される。２つの相同性アームは、２．３ｋＢと６．３ｋＢの長さである。３’末端で、β−アクチンＥＧＦＰ遺伝子は、標的クローンのために緑色蛍光を富化するためのｐｕｒｏ耐性クローンのスクリーニングを可能にする。末端の点線は、ｐＫＯベクターバックボーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。中央のラインは、単一の可変領域遺伝子（Ｖ）、連結領域遺伝子（Ｊ）および定常領域遺伝子（Ｃ）を有するＩｇＬ遺伝子の生殖細胞系構成の野生型対立遺伝子の図である。標的クローンのサザン分析に使用される制限部位（Ｓ、ＳａｃＩ；Ｂ、ＢｓｔＥＩＩ）が図示され、そして、野生型フラグメントサイズが二重の矢尻でその下に示される。下方のライン上は、変異体対立遺伝子の構造であり、そこでは、ＪとＣ領域が欠失しており、ＨＳ４  ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏで置換されている。制限酵素地図が示され、その下に変異体フラグメントのサイズを示す。サザン分析において使われるプローブは両方とも、ターゲティングベクターの外側にあり、それらの位置を示す。
【０１１２】
４つのクローンが、合計１．０５×１０８個の細胞と線状化ＤＮＡの２１０μｇを用いて２１のトランスフェクションから単離された。クローンのうちの２つは、ＧＦＰを発現し、それらがゲノムでランダムに組み込まれてＧＦＰ遺伝子を保持したことを示す。組みこみの両側からのプローブを用いる４つのクローンのサザンブロット分析により、緑色でないクローンの１つ（クローン２）は、標的変異に対してヘテロ接合性であることを示した。図２０に関して、４つのピューロマイシン耐性クローンがサザン分析された。クローン１と２は緑色ではなく、その一方、クローン３と４は、ＧＦＰを発現した。左のパネルでは、ＰＧＣクローンからのゲノムＤＮＡをＳａｃＩで消化し、プローブＡとハイブリダイズされてＩｇＬ遺伝子の５’側でターゲティング分析をした。右のパネルでは、ＤＮＡをＢｓｔＥＩＩで消化し、ＩｇＬ遺伝子の３’側のターゲティングのためにプローブＢとハイブリダイズされた。クローン２は、ヘテロ接合性の、標的クローンに関して予想サイズのフラグメントを示した。
【０１１３】
（実施例２５：Ｊ−Ｃノックアウトベクターを保有するＧ０キメラ）
実施例２４で記載されたＪ−Ｃノックアウトを保有するＰＧＣを、ステージ１３〜１５（Ｈ＆Ｈ）白色レグホンレシピエント胚の脈管構造に注入した。発現型的に、孵化したひなは、白色レグホンに似ていた。雄は性的に成熟するまで飼育し、精液が腹部マッサージによって集められた。そして、
【０１１４】
【化３】
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を用いたＰＣＲ分析が、図２１に示される。図２１を参照して、予想される２４８ｂｐサイズの増幅されたＤＮＡは、Ｇ０キメラの少なくとも２つからの精液に存在したが、これは遺伝子的に改変された始原生殖細胞が生殖細胞系列に入ったことを示している。
【０１１５】
（実施例２６：β−アクチン−ｎｅｏのアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子座への挿入）
親細胞株１３からのＰＧＣを成長させ、４００μｌ中の５×１０６個の細胞を、１９８Ｖと９００μＦの指数関数的減衰パルスを使用して、線状化β−アクチン−ｎｅｏ構築物でエレクトロポレーションし、４８−１ｃｍ２ウェルにプレート化して単一のクローンを得た。細胞は、ネオマイシンの存在下で成長させてネオマイシン耐性クローンをもたらし、これは拡大するために新しいウェルに移した。細胞をサザン分析により分析して導入遺伝子の安定な組み込みを確立し、配列決定により、構築物がアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（アルデヒド代謝に関与する酵素）のプロモーター領域で１９番染色体に組み込まれた。
【０１１６】
β−アクチン−ｎｅｏ構築物を保有するＰＧＣを成長させ、ステージ１３〜１６（Ｈ＆Ｈ）のレシピエント胚に注入した。胚を孵化させ、そして、４羽の雄鶏を性的に成熟するまで成長させ、生殖細胞系列伝達について試験した。雄鶏の生殖細胞系列伝達率は、それぞれ０、０、０．５、および０．５％であった。これらの雄鶏のうちの１羽からのヘテロ接合性の子孫を性的に成熟するまで成長させ、交配させてホモ接合性の子孫を得た。
【０１１７】
【表１０】
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ヘテロ接合性雄鶏と雌鶏の５組の繁殖ペアは、合計７３羽のひなを生産し、それらはＢＮ導入遺伝子の存在について評価された。合計１０羽（１４％）のひなが野生型であり、４６羽（６３％）のひながヘテロ接合性であり、そして、１７羽（２３％）のひながホモ接合性であった（表１０）。この分布は、メンデル分離（カイ二乗＝６．５５）から予想される１８．２５／３６．５／１８．２５の分布と、有意差（Ｐ＞０．０１）はなかった。孵化時期の近くで死んだひなの割合は、遺伝子型の間で同じであった。これらの結果は、ＢＮ導入遺伝子の挿入が致死性表現型を誘発しなかったことを示す。
【０１１８】
ホモ接合の雄鶏は、性的に成熟するまで成長させて繁殖力を試験した。５羽の雄鶏が野生型雌鶏と繁殖させ、繁殖力、胚の死亡および孵化率が計算された（表１１）。２羽の雄鶏の繁殖力は、比較的低かったが、これらの鳥の精液産生は弱く、したがって、授精あたりの精子の数も低かった。鳥のうちの２羽の繁殖力が非常に良好（＞９０％）であり、そして、１羽の鳥の繁殖力は中程度であった。すべての鳥からの受精卵の孵化率は、正常範囲内であった。合わせて考えると、これらのデータは、ＢＮ／ＢＮ鳥の繁殖機能が正常であったことを示す。
【０１１９】
【表１１】
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ＢＮ導入遺伝子が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子に組み込まれ、何らの効果もホモ接合性の鳥の生存率に関して見られなかったので、本発明者らはアルデヒドデヒドロゲナーゼメッセージの転写を評価した。
【０１２０】
ｍＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、２羽のＢＮ／ＢＮホモ接合性の鳥、１羽のＢＮ／＋ヘテロ接合性の鳥、および１羽の野生型の鳥（＋／＋）の血から調製された。それから、一本鎖ｃＤＮＡ合成のためのＴｈｅｒｍｏ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡを５ｍｌのＲＮＡから合成した。１ｍｌのｃＤＮＡが、以下のプライマーを使用するその後のＰＣＲ反応に使用された：
【０１２１】
【化４】
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ＡＬＤＨ３Ａ２−３とＡ２−４プライマー（配列番号３４、３５）は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ３のファミリーメンバーＡ２転写用の５４４ｂｐと６８０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅するために使用した。アクチンＲＴ−１とＲＴ−２プライマー（配列番号３６、３７）をアクチン転写用の５９７ｂｐのＰＣＲ産物を増幅するのに用いた。図２２に示されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼ３のファミリーメンバーＡ２転写物が、ヘテロ接合性（ＢＮ／＋）の鳥および野生型の鳥（＋／＋）で検出されたが、ホモ接合性ＢＮ鳥（ＢＮ／ＢＮ）では、検出されず、これは、βアクチン−ｎｅｏ導入遺伝子の挿入が、形態学的な表現型を有しないアルデヒドデヒドロゲナーゼ３遺伝子の挿入性ノックアウトを引き起こしたことを示している。
【０１２２】
プライマーが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ３のファミリーメンバーＡ２転写物を増幅したという確証は、５４４ｂｐと６８０ｂｐのＰＣＲ産物の配列決定により得られた。５４４ｂｐ産物は、６８０ｂｐのＰＣＲ産物内に全部含まれ、それは、また、エクソン５と６の間で１３６ｂｐのスプライシングされていないイントロンを含む（図２３）。これらの配列を発表されたニワトリゲノムのそれらと比較することにより、それらが同一であることを示した。
【０１２３】
（実施例２７：β−アクチン−ｇｆｐ−ｂβ−アクチン−ｐｕｒｏの未知ＥＳＴへの挿入）
親の細胞株５４からのＰＧＣを成長させ、そして、５×１０６個の細胞を、線状化β−アクチン−ＧＦＰ−β−アクチン−ｐｕｒｏ構築物の２０μｇでエレクトロポレーションし、そして、４８−１ｃｍ２のウェルにプレート化して単一クローンを得た。細胞は、ピューロマイシンの存在下で成長させてピューロマイシン耐性クローンのみの成長をもたらした。耐性クローンを拡大するために新しいウェルに移した。細胞は、サザンブロット分析により分析して導入遺伝子の安定な組み込みを確立し、配列決定により、構築物が新規遺伝子（ＥＳＴ  Ｃ０７６９９５１）の８番染色体に組み込まれた。
【０１２４】
ＰＧＣ構築物を成長させ、ステージ１３〜１６（Ｈ）Ｈレシピエント胚の脈管構造に注入した。胚を孵化させ、８羽の雄鶏を性的に成熟するまで成長させ、生殖細胞系伝達について試験した。雄鶏の生殖細胞系列伝達率は、それぞれ０、１、１１、１２、１３、１６、２８および９２％であった。これらの雄鶏からのヘテロ接合性の子孫を、性的に成熟するまで成長させ、ホモ接合性の子孫を得るために交配させた（表１２）。
【０１２５】
【表１２】
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ヘテロ接合性雄鶏と雌鶏の８組の繁殖ペアは、合計２９８羽のひなを産み、それらはＢＧＢＰ導入遺伝子の存在について評価された。合計９０羽（３０％）のひなが野生型であり、１２８羽（４６％）のひながヘテロ接合性であり、そして、８０羽（２５％）のひながホモ接合性であった。これらの結果は、２５％の野生型子孫、５０％のヘテロ接合性子孫、および２５％のホモ接合性子孫の予想と一致し、このことは、導入遺伝子がメンデル機能で引き継がれたことを示す。大多数のホモ接合性子孫は、６週令までに孵化時に、または孵化時期の近くで全死亡のうちの９５％が死亡した。これらの結果は、ＢＧＢＰ導入遺伝子の挿入が生存に必須の遺伝子機能的ノックアウトをもたらしたことを示す。
【０１２６】
この問題を回避するために、コントロールされていないランダムな挿入よりもむしろ予め定められた位置に導入遺伝子を挿入することが有利である。導入遺伝子をゲノム中の既知の位置に挿入する能力は、ランダムな挿入よりも更なる潜在的な利点を有する。タンパク質産物の過剰発現の目的で挿入された導入遺伝子は、発現の高水準を可能とすることが公知の、そして異質染色質の侵害によるサイレンシングを受けない場所に挿入することができる。さらにまた、導入遺伝子の挿入は、ヘテロ接合性状態であるかホモ接合性状態のいずれかでの動物または細胞株に有害な影響を引き起こさないことが予測され得る。したがって、多数の異なるランダム挿入をスクリーニングして高水準の発現を有するものを見つけることは不必要となり、そして、それは重要な内因性遺伝子を妨げない。
【０１２７】
（実施例２８。条件つきのアポトーシス誘導遺伝子（Ｒｅａｐｅｒ）を保有するトランスジェニック鳥の作出）。
【０１２８】
Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の設計
Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子（ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ構築物）を以下のようにして生成した。Ｒｅａｐｅｒ  ｃＤＮＡをＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ胚のポリ（Ａ）＋ＲＮＡおよびＲＥＡＰＥＲ  Ｆ１
（ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＡＡＣ  ＧＡ  配列番号３８）プライマーおよびＲｅａｐｅｒ  Ｆ２（ＴＧＴ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＣ）プライマー（配列番号３９）を用いてＲＴ−ＰＣＲによりクローン化した。Ｒｅａｐｅｒ  ｃＤＮＡは、ＣＸ−Ｒｅａｐｅｒ構築物を生成するＣＸ−バックボーンのＲＩ部位に挿入された。ＫｐｎＩ部位を、部位特異的変異により開始コドンのＲｅａｐｅｒ  ｃＤＮＡの３’側に挿入した。ｐＢＳ３０２（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）からの１．５ｋｂのｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰカセットを、ＫｐｎＩ部位でクローン化してＣＸ−ＬｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒを生成した。ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒフラグメントを、ＲＩとＮｏｔＩ部位を用いてｐＥＮＴＲＢ２クローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。次いで、ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ＲｅａｐｅｒフラグメントをＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ構築物を作るｐＬｅｎｔｉ６／ＵｂＣ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＬｅｎｔｉ  Ｇａｔｅｗａｙ  ベクター）に組み換えた。
【０１２９】
ＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルス発現システムを用いるトランスジェニック鳥の生産
ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子を保有するレンチウイルスを作出するために、ＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、４．８×１０９ｃｆｕ／ｍｌまでの高力価が生成された。ウイルス生産のために、２９３Ｔ細胞が、ＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ構築物とプラスミドをコードするＶＳＶ−Ｇを含むｖｉｒａｐｏｗｅｒ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｍｉｘで、リポフェクタミンを使用してコトランスフェクションされた。ウイルス上澄液をトランスフェクションの２４時間後に回収し、遠心分離によって濃縮した。ウイルス力価は、ＨＴ１０８０細胞をウイルス上澄みで形質導入することにより測定した。高力価を得て高い形質導入と生殖細胞系列伝達効率を確実とした。
【０１３０】
ニワトリ胚をウイルスに感染させるために、濃縮ウイルス溶液の１．５ｕｌを、ステージＸ胚の胚下腔に注入した。３７．５〜３８℃で３日間インキュベーションした後、胚を別の代理棚に移し、孵化するまで３７．５〜３８℃、５０％湿度でインキュベーションした。合計３９８の胚に、ＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子を保有するウイルスを注入した。１５５羽の鳥が孵化し、導入遺伝子の存在および性別について、鶏冠組織から分離されたＤＮＡのＰＣＲにより分析した。１３羽の雄のひなは、ＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子に対して陽性であった。また、それらのうちの１０羽は、精液から分離されたＤＮＡのＰＣＲにより、ＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子に対して陽性であった。３羽の雄（６−０３、６−５１および９−５１のＧ０ファウンダー雄）は、導入遺伝子を次世代に伝達した。６−０３、６−５１および９−５１についての伝達頻度は、それぞれ、０．３２％、０．２６％および０．１６％であった（表１３）。
【０１３１】
【表１３】
2014239702.tif 000020
Ｇ０ファウンダー雄（６−０３、６−５１および９−５１、異なる挿入物を保有）は、繁殖用雌鶏まで飼育された。そして、それらのＧ１子孫は、導入遺伝子の存在と導入遺伝子の組み込み部位について分析された。個々の鳥からのゲノムＤＮＡをサザンブロット分析により分析した。ゲノムサンプルとＵｂＣ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒベクター（対照）をＳｐｈＩまたはＢｃ１Ｉで消化した。消化されたＤＮＡを０．７％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロッティングし、放射能標識Ｒｅａｐｅｒ特異的プローブで探索して連結点フラグメントを同定した。図２４に示すように、ハイブリダイジング・ゲノム・フラグメントのサイズは、対照よりも大きく、これは導入遺伝子が組み込まれたことを示す。６−０３、６−５１および９−５１株のためのハイブリダイジング・ゲノム・フラグメントは、異なるサイズを有したが、このことは６−０３、６−５１および９−５１が独立した株であることを示す。
【０１３２】
（実施例２９。Ｃｒｅ−組み換え酵素を保有するニワトリの作出）
Ｃｒｅ導入遺伝子の設計と組み立て
ニワトリでＣｒｅ組み換え酵素を発現するために、Ｃｒｅ遺伝子がニワトリＥＲＮＩプロモーターの転写調節の下に置かれた導入遺伝子が作出された。ＥＲＮＩ遺伝子（ｃＥＮＳ−１としても知られている）は、初期ニワトリ胚（ほぼステージＸ、すなわち、新たに産まれた卵の段階で、胚が原腸形成前の細胞未分化シートであるとき）および神経組織で発現される。このように、Ｃｒｅ導入遺伝子は、初期胚で発現されるように設計され、そこでは、それがｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子のｌｏｘＰ部位またはゲノムに配置された他のｌｏｘＰ含有導入遺伝子の組み換えを触媒する。Ｃｒｅは初期段階で発現されるので、得られた発育するニワトリは、組み換えられた導入遺伝子を体の全胚葉と全細胞に保有しているはずである。
【０１３３】
Ｃｒｅ導入遺伝子をニワトリ生殖細胞系列に導入するために、レンチウイルス・ベクター・アプローチが取られた。レンチウイルス導入遺伝子は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＬｅｎｔｉ６−Ｖ５  Ｄｅｓｔレンチウイルスベクターに基づいて構築された。ｐＬｅｎｔｉ６−Ｖ５  Ｄｅｓｔのレンチウイルスベクター要素は、ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ遺伝子と結合されてｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ構築物を生成する。レンチウイルスが産生されて、初期胚を感染させるために使用され、そこでは、それは安定してゲノムに組み込まれた。ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有する約２０羽のトランスジェニックファウンダー鳥が作出された。
【０１３４】
ニワトリＥＲＮＩプロモーターは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅された。
【０１３５】
【化５】
2014239702.tif 000021
８２２ｂｐのＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化し、配列決定した。次いで、ＥＲＮＩプロモーターをＳａｃＩＩ（その後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化する）とＳｐｅＩで消化してベクターから放出した。ＣＭＶプロモーターをＣｌａＩ（その後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化する）とＳｐｅＩで消化してレンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ６  Ｖ５−Ｄｅｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から除去した。次いで、ＥＲＮＩプロモーターをｐＬｅｎｔｉ６  Ｖ５−Ｄｅｓｔレンチウイルス・ベクター・バックボーンにライゲーションし、その中のＥＲＮＩプロモーターをＣＭＶプロモーターと置き換えて、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩをもたらした。
【０１３６】
Ｃｒｅの遺伝子は、Ｎ−末端とクローニング（５’末端でのＢｇｌＩＩおよび３’末端でのＥｃｏＲＩ）のための便利な制限部位にあるＳＶ４０核局在配列により、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅された。
【０１３７】
【化６】
2014239702.tif 000022
１０４０ｂｐのＰＣＲ産物は、ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩとで消化し、ゲルを精製した。シャトルベクターｐＥＮＴＲ  ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、ベクターバックボーンをゲル精製した。ＣｒｅＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ  ２Ｂにライゲーションし、クローンを得た。Ｃｒｅ遺伝子が予想されたものであり、ＰＣＲ増幅の間、何らの変異も獲得しなかったことを決定するために、クローンの配列決定がされた。
【０１３８】
Ｃｒｅ遺伝子をｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ構築物に再結合して、ＥＲＮＩプロモーターの転写調節の下にそれを配置するために、ＬＲクロナーゼ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、Ｃｒｅ遺伝子源としてのｐＥＮＴＲ  ２Ｂ−ＣｒｅクローンおよびレシピエントとしてのｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩベクターを使用して実行された。最終的な構築物（ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ（８４０８ｂｐ））がこのようにして得られ、そして、それはＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有するレンチウイルスを産生するのに用いられた。
【０１３９】
ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有するトランスジェニック鳥の生産
ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅレンチウイルスが２９３ＦＴ細胞で産生された。レンチウイルスを生産するために２９３ＦＴ細胞へのトランスフェクションごとに、７５％集密度の８００万個の２９３ＦＴ細胞が、リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して環状ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−ＣｒｅプラスミドＤＮＡの３ｕｇでトランスフェクションされた。Ｖｉｒａｐｏｗｅｒ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、２９３ＦＴ細胞中でレンチウイルスを作るのに必要なウイルスタンパク質を発現するために使用された。レンチウイルスを含む細胞培養上澄みは、トランスフェクションの２日後に集められ、細胞破片を除去し、レンチウイルス粒子を４８，０００ｇ、９０分間の遠心分離によって濃縮した。ウイルスペレットを培養上澄みの開始容量の１／２００に再懸濁し、４０ｕｌの分割量を−８０℃で凍結した。
【０１４０】
レンチウイルスストックの各バッチの感染力価は、ウイルスストック１０−４〜１０−８を段階希釈し、ポリブレンの１ｕｌをＨＴ１０８０の培養物に添加することによりＨＴ１０８０細胞で測定された。レンチウイルスの添加２日後に、ブラスチシジン選択（５ｕｇ／ｍｌ）を開始した。細胞がブラスチシジン毒性で死亡するので、培養基は２日おきに取り換えた。ブラスチシジン選択を開始して１０日後に、コロニーはクリスタルバイオレットで染色し、計数し、そして、力価が算出された。１０８〜２×１０９の力価を得た。ニワトリ胚をウイルスで感染させるために、濃縮ウイルス溶液１．５ｕｌをステージＸ胚の胚下腔に注入した。３７．５〜３８℃で３日間インキュベーションした後、胚を別の代理棚に移し、３７．５〜３８℃、５０％湿度で孵化するまでインキュベーションした。合計３１０の胚に、Ｅｒｎｉ−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有するウイルスを注入した。９６羽のひなが孵化し、導入遺伝子の存在および性別について、鶏冠組織から分離されたＤＮＡのＰＣＲにより分析された。８羽の雄のひなは、Ｅｒｎｉ−Ｃｒｅ導入遺伝子に対して陽性であった。また、１３羽の雄は、精液から分離されたＤＮＡのＰＣＲにより、Ｅｒｎｉ−Ｃｒｅ導入遺伝子に対して陽性であった。試験された６羽の雄のうち４羽は、Ｅｒｎｉ−Ｃｒｅ導入遺伝子を次世代に伝達した。Ｅｒｎｉ−Ｃｒｅ  Ｇ０雄鶏についての生殖細胞系列伝達頻度は、０．２４〜１．３２％の間で変動した（表１４）。
【０１４１】
【表１４】
2014239702.tif 000023
ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有するトランスジェニックニワトリ
ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子がニワトリゲノムに完全に組み込まれたことを実証するために、サザンブロット分析を使用した。Ｃｒｅ導入遺伝子を保有することがＰＣＲによって最初に同定されたニワトリからのゲノムＤＮＡは、全長の完全な導入遺伝子が観察されるように、抽出し、ウイルスの５’および３’ＬＴＲ配列を切断する酵素（ＢｇｌＩＩ）で消化した。導入遺伝子の異なる、独立した挿入を有する鳥が、分析のために選択された。ゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩ酵素で消化し、ナイロン膜に移し、放射能標識Ｃｒｅ遺伝子で探索した。図２５は、８つのＥＲＮＩ−Ｃｒｅ株の代表的なサザンブロティングを示す。試験された１１の株のうち、１０株は予想された４．６ｋｂのＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子バンドを含み、ゲノムに完全に組み込まれたことを示した。１つの株は、より小さなバンドを示し、導入遺伝子の欠失または再構成を示した。
【０１４２】
（実施例３０。導入遺伝子の部位特異的組み込みを可能とする細胞株の確立）
ホストゲノムの予め定められた位置に外部ＤＮＡを挿入するためには、２つの主要な方法がある：相同組み込み（遺伝子ターゲティング）またはａｔｔＰなどの認識部位への部位特異的組み換え。相同組み換えは、大部分の脊椎動物の細胞型では効率が悪く、通常、多くのクローンを選別して、望ましい挿入を有する１つまたは少数のクローンを同定することが要求される。部位特異的組み換えは、多数のクローンを選別することなく外部のＤＮＡを予め定められた部位に挿入するために使用することができる、高再現性で非常に効率的なプロセスである。部位特異的挿入は、ａｔｔＢ含有構築物をゲノム中の固有のａｔｔＰ部位または偽ａｔｔＰ部位に挿入するためのｐｈｉＣ３１インテグラーゼの使用に依存する。ゲノムに配置された真正のａｔｔＰ部位をドッキング部位として使うために、ａｔｔＰ部位は、好ましい、予め定められた位置に配置されなければならない。ａｔｔＰ部位は、ランダム挿入または相同組み換えによってゲノムの中のそのような好ましい位置に入れられる。認識部位が、ランダム挿入によってゲノムに入れられるならば、挿入位置は重要な遺伝子が破壊されなかったことを確実とするために確認しなければならない。次に、ゲノムに入れられた認識部位は、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼを用いる導入遺伝子の挿入のための「ドッキング部位」として用いられる。
【０１４３】
特にドッキング部位でのインテグラーゼ媒介導入遺伝子挿入のために選択するために、選択マーカーシステムは、正しい挿入を選択するのに使用される。ａｔｔＰ部位が薬物選択マーカー（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子）にプロモーターなしで隣接するように、ドッキング部位は設計される。ドッキング部位を保有する細胞は、このようにピューロマイシンを用いた薬物選択に感受性である。ドッキング部位に挿入される導入遺伝子は、そのａｔｔＢ部位に隣接したプロモーターを含むが、選択マーカーを含まない。導入遺伝子のドッキング部位への挿入は、選択マーカーの上流にプロモーターを置き、そして、その転写を活性化し、ピューロマイシン耐性を与える。ゲノムの他の位置への導入遺伝子の挿入は、薬物耐性に至らず、そのような挿入は、薬物選択によって除かれる。
【０１４４】
ａｔｔＰドッキング部位構築物は、プロモーターのない薬物選択マーカー（例えば、ピューロマイシン耐性など）に隣接して置かれたａｔｔＰ部位から成る。ピューロマイシン耐性遺伝子は、発現されないので、別の選択マーカー（例えば、ネオマイシン選択マーカーを引き起こすβ−アクチンプロモーターなど）もまた含まれなければならない。ＥＧＦＰ遺伝子を含むこともできる。これらの要素の隣接する各側は、近隣のクロマチンから構築物を隔離するためのβ−グロビンＨＳ４インスレーターの２つのコピーである。構築物のβ−アクチンｎｅｏとＥＧＦＰ部分の将来的な除去のために、ｌｏｘＰ部位はこれらの要素に隣接して置かれる。構築物のこれらの部分の全ては、ゲノムへの真正なａｔｔＰ部位への送達のための伝達手段として用いられる。ＤＮＡエレメントの順序は、以下の通りである：ＨＳ４；ａｔｔＰ；プロモーターのないピューロマイシン耐性遺伝子；ｌｏｘＰ；β−アクチンまたはＣＡＧプロモーター；ＥＧＦＰ；β−アクチンまたはＣＡＧプロモーター；ネオマイシン耐性遺伝子；ＨＳ４；プラスミドバックボーン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）。構築物は、線状化され、培養ＰＧＣにトランスフェクションされ、そして、薬物耐性コロニーを得る。これらのコロニーは、さらなる分析のために拡大される。
【０１４５】
ゲノムでのドッキング部位が、どこに位置しているかを知ることは重要であるので、各々のクローンのドッキング部位構築物の染色体挿入部位が決定される。隣接ゲノムＤＮＡを得て、配列決定し、ニワトリ・ゲノム・データベースと比較する。大部分のクローンがＣｐＧアイランドに挿入されるのが分かり、それは通常、遺伝子、特にハウスキーピング遺伝子または遍在遺伝子のプロモーター領域と関連したゲノム領域である。さらにまた、大部分の挿入物は、遺伝子のプロモーター領域、遺伝子の第１エクソン、または第１イントロンにあることが決定される。このように、挿入の多くは、これらの遺伝子の機能を損なうと予測される（実施例２９；表８を参照）。これらの遺伝子は、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列に基づく既知の遺伝子か、あるいは予測された遺伝子である。好ましい細胞株は、ＤＯＣ１またはＤＯＣ３３などの遺伝子を破壊しないように見える株である。
【０１４６】
ドッキング部位のＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＣＡＧ−ｎｅｏ部分は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換えによって欠失させることができる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換えの後、ドッキング部位に残るすべては、ＨＳ４インスレーター、ａｔｔＰ部位、およびプロモーターのないｐｕｒｏ遺伝子である。これは、細胞とトランスジェニックニワトリで生産される外部タンパク質（これは、特にＣＡＧまたはβ−アクチンなどの強力プロモーターから偏在的に発現される場合、ニワトリの健康に影響を及ぼす場合がある）の数を減少させる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換えは、環状Ｃｒｅ発現ベクターによるドッキング部位クローンの一過性のトランスフェクションによって、細胞培養物中で行うことができる。数日後に、培養は、ＣＡＧ−ＥＧＦＰ遺伝子の切り出しに起因するＥＧＦＰ発現の喪失に関してモニタリングされる。細胞の約５０％は、もはやＥＧＦＰを発現せず、そして、これらの細胞は、それらを精製するためにフローサイトメトリで分類することができる（図２６）。
【０１４７】
あるいは、Ｃｒｅ組み換えは、ドッキング部位構築物を保有するトランスジェニックニワトリをＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有するニワトリ（Ｃｒｅ４鳥）と交配させることにより行うことができる。
【０１４８】
これらのドッキング部位組み込みを有するトランスジェニックニワトリが作出される場合、得られるホモ接合性ニワトリは、遺伝子に挿入物を有するにもかかわらず、健康で、繁殖力がある。そのような株の一例は、ＴＰ８５株（ＢＮとも呼ばれる；実施例２６を参照）であり、それは、ニワトリ１９番染色体上でアルデヒドデヒドロゲナーゼ３ファミリーメンバーＡ２をコードする遺伝子への挿入である。構築物は、ＨＳ４−遮断β−アクチンネオ導入遺伝子であり、遺伝子の転写開始点のおよそ１０ｂｐ以内のプロモーター領域に挿入された。挿入物に対してホモ接合性の鳥は、健康で、繁殖力がある。
【０１４９】
しかし、場合によっては、挿入は悪影響（例えば、発育障害、解剖学的または生理学的障害、不妊など）もたらす場合がある。実施例２７を参照されたい。したがって、動物で何らの悪影響も引き起こさないことを確認するためにランダムに挿入されたドッキング部位挿入を確認することは重要である。
【０１５０】
（実施例３１：発現ＤＮＡの１０．５ｋｂ超からなるドッキング細胞株の確立）
Ｄｏｃ−１細胞株は、ＨＳ４；ａｔｔＰ；プロモーターのないピューロマイシン耐性遺伝子；ｌｏｘＰ；ＣＡＧプロモーター；ＥＧＦＰ；ＣＡＧプロモーター；ネオマイシン耐性遺伝子；ＨＳ４（実施例２９を参照）からなる導入遺伝子を保有する。構築物は、線状化され、培養ＰＧＣにトランスフェクションされて、薬物耐性コロニーが得られた。これらのコロニーは、さらなる分析のために拡大された。Ｄｏｃ−１細胞株をレシピエント胚に注入し、Ｇ０キメラひなを孵化させた。雄鶏を性的に成熟するまで成長させ、それらの精子を、ＧＦＰ陽性精液の存在についてのＦＡＣＳ分析によって分析した。２羽の雄鶏は繁殖のために選択され、その生殖細胞系列伝達率は、３％と８％であった。血液がＧＦＰ陽性のひなから採取され、サザン分析によって分析されてドッキング部位の存在を確認した。
【０１５１】
（実施例３２：ドッキング部位の標的挿入）
遺伝子のＣｐＧアイランドへの真正ａｔｔＰ部位の配置を回避するために、遺伝子ターゲティングを使用してａｔｔＰ部位をニワトリゲノム中の予め定められた部位に配置することは可能である。ゲノムの領域が選択され、相同アームが、正確性の高いＰＣＲまたはプラスミドベクター中でのゲノムクローニングによって調製され、ターゲティングベクターがＰＧＣクローンのトランスフェクションまたは選択のための選択マーカーを用いて組み立てられる。
【０１５２】
（実施例３３：ドッキング部位を保有する細胞株への部位特異的挿入）
ドッキング部位への挿入のために、ａｔｔＢ部位を含む環状構築物が構築される。ａｔｔＢ部位含有構築物は、上記実施例で使用されたものと類似しており、重要な違いは、選択マーカーがないことである。その代わりに、プロモーター（例えば、ＥＲＮＩプロモーターなど）は、ドッキング部位への組み込みの際に、プロモーターがドッキング部位での選択マーカーの発現を引き起こす位置に配置されるように、ａｔｔＢ部位に隣接して配置される。
【０１５３】
プロモーターａｔｔＢバックボーンは、ａｔｔＰ−プロモーターのないｐｕｒｏドッキング部位への挿入のために選択することに使用される。ａｔｔＢ構築物は、例えば、抗体などの医薬タンパク質をコードする遺伝子の発現を引き起こす組織特異的プロモーターなどの関心のある他の遺伝子を保有する。
【０１５４】
ドッキング部位の機能性およびドッキング部位での組み込み効率は、ドッキング部位を含むＰＧＣ細胞株で試験された。５×１０６個の細胞をＥｒｎｉ−ａｔｔＢを含む構築物の０．５μｇとインテグラーゼを発現する環状構築物の０．５μｇでコトランスフェクションした。エレクトロポレーション後、細胞を４８−１ｃｍ２ウェルに再プレート化して単一コロニーを得た。４８ウェルのうち４２ウェルで、コロニーが認められた。
【０１５５】
ＥＲＮＩ−ａｔｔＢ構築物が、ａｔｔＰでのａｔｔＢの組み換えによって生み出されるａｔｔＬ部位の増幅によってドッキング部位に正しく組み込まれたことをＰＣＲは明らかにした。１つのプライマーは、ＥＲＮＩ配列中にあり、１つのプライマーは、ピューロマイシン配列中にあり、そして、ＥＲＮＩプロモーターが、ピューロマイシン遺伝子の上流に組み込まれた場合にのみ増幅が起こり得る。３つのプライマーセットが使われ、そして、すべてが陽性結果をもたらした：
ＥＲＮＩ−３７Ｆ＋ｐｕｒｏ−８Ｒ  生成物サイズ１５２ｂｐ
ＥＲＮＩ−１３３Ｆ＋ｐｕｒｏ−８Ｒ  生成物サイズ２４８ｂｐ
ＥＲＮＩ−３４２Ｆ＋ｐｕｒｏ−８３Ｒ  生成物サイズ５２２ｂｐ
【０１５６】
【化７】
2014239702.tif 000024
ＤＯＣ２細胞へトランスフェクションされたＥＲＮＩ−ａｔｔＢからの４つの独立したクローンは、ＰＣＲによって試験され、そして、４つの全てが３つのプライマーセットですべて正しいサイズの増幅生成物を示した。Ｅｒｎｉ−１３３Ｆ（配列番号３２）＋ｐｕｒｏ−８Ｒ（配列番号３３）プライマーで生成したＰＣＲ産物は、クローン化され、配列決定されてＰＣＲ産物が正しかったことを証明した。配列は予想されたａｔｔＬ配列（ａｔｔＢとａｔｔＰの組み合わせ）に完全に合致して、予想される部分的なＥＲＮＩ配列とピューロマイシン配列を含んだ。インテグラーゼ媒介組み換えクロスオーバー事象が、このようにａｔｔＢとａｔｔＰ部位の正しいコアヌクレオチドで起き、真正なものとして実証された。
【０１５７】
（実施例３４：Ｃｒｅは、ニワトリ胚でＬｏｘＰ部位を効率的に組み換える）
完全なｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子（および再編成されたＥＲＮＩ−Ｃｒｅ導入遺伝子を有する１つの株）を有する１０個のＣｒｅ株が、Ｃｒｅ組み換え酵素活性について試験された。ＥＲＮＩプロモーターは、初期胚でＣｒｅ組み換え酵素の高水準発現を引き起こすことが予想されたが、もし導入遺伝子がゲノムの好ましからぬ領域（「位置効果」として知られている現象）に偶然組み込まれる場合には、導入遺伝子は発現することができない。したがって、望ましいレベルの活性を有する１つまたは複数の株を選択するために、本発明者らのＣｒｅ株の全てでＣｒｅ組み換え酵素の活性を測定することは重要であった。
【０１５８】
本発明者らのＣｒｅ導入遺伝子の活性レベルを測定するために、Ｃｒｅ導入遺伝子の１つのコピーとｌｏｘＰ導入遺伝子の１つのコピーを保有する２重トランスジェニック胚でｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の組み換えを触媒するＣｒｅの能力が、サザンブロットによって分析された。ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子は、１．４ｋｂの配列を含み、それは、ＳＴＯＰカセットと呼ばれ、同じ方向にｌｏｘＰ部位と隣接している。２つのｌｏｘＰ部位の間の組み換えは、染色体から１．４ｋｂの介在配列の切り出しをもたらし、単一のｌｏｘＰ部位を後に残す。それから、介在配列は染色体にはもはや結合されないので、介在配列は失われる。切り出し後、ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子は、大きさが１．４ｋｂ減少する。サザンブロット分析評価が展開されて、そこでは、ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の大きさの減少は、Ｃｒｅ組み換え酵素活性を測定するために用いられる。Ｒｅａｐｅｒ遺伝子とレンチウイルス・ベクター・バックボーン（ブラスチシジン遺伝子とＳＶ４０配列）の部分からなるプローブとハイブリダイズしたとき、制限酵素ＳａｃＩによる消化は、約２．８ｋｂの全長（非組み換え）のｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒフラグメントを生産する。１．４ｋｂのＳＴＯＰ配列のＣｒｅ媒介組み換えと切り出しの際、同じプローブとハイブリダイズした場合、ＳａｃＩフラグメントの大きさは約１．４ｋｂに減少する。プローブは、Ｃｒｅ組み換えに影響を受けない配列とハイブリダイズし、したがって、それは全長の、そして組み換えられたｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の両方と等しくハイブリダイズする。
【０１５９】
いろいろなｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅトランスジェニック株により発現されたＣｒｅ活性のレベルを推定するために、全長（非組み換え）の、および組み換えられた導入遺伝子のバンド強度の比率を測定する。Ｃｒｅが活性でないならば、組み換えＲｅａｐｅｒは、ほとんどまたは全く観察されず、全長だけが観察される。Ｃｒｅが適度に活性である場合、両方のＳａｃＩフラグメントが観察され、組み換えがいくらかの細胞では起きたが、他の細胞では起きなかったことを示す。Ｃｒｅが非常に活性であるならば、ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子のみが観察されたが、それは組み換えｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子があらゆる細胞で組み換えられたからである。
【０１６０】
Ｃｒｅ株の活性をまとめたデータが、図２８に示される。試験された１１株のＣｒｅ活性は、株の間で非常に可変性であり、いくつかのケースでは、株内でも同様に変動した。１１の株のうち１つだけが、ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子（Ｃｒｅ４株）の１００％組み換えを触媒した。この株では、試験されたすべての胚（１８中１８）は、１００％組み換えを示した。他の株では、組み換えレベルは、約５％から最大約８０％に変動した。これらの株（Ｃｒｅ１、Ｃｒｅ２、Ｃｒｅ１１およびＣｒｅ２０）のいくつかに関して胚から胚で組み換えのレベルでかなりの可変性があった。例えば、Ｃｒｅ１１とＣｒｅ２０は、いくつかの胚で約１０％組み換えだけを触媒したが、他の胚では、最高６０％組み換えを触媒した。大部分の胚について、脳と骨格筋組織が分析され、そして、組み換えのレベルは、あらゆる場合に両組織で同様であった。ＥＲＮＩプロモーターは、神経組織で活性であると考えられるので、おそらく、脳が組み換えの増加したレベルを示すと予想されたが、しかし、脳と筋肉の組み換えは、常にほぼ同じであった。観察されるＣｒｅ組み換え酵素活性における変化が、Ｃｒｅ発現のレベルにおける変化に、または、Ｃｒｅ活性が発現される時間の長さにおける変化に起因するかどうかは不明である。例えば、Ｃｒｅ４株では、Ｃｒｅが低レベルで絶え間なく発現され、１００％発育の１５日目まで蓄積された組み換えに至るが、一方、組み換えがあらゆる細胞で起こる前に、他の株は初期の時期にＣｒｅ発現をしない可能性がある。あるいはまた、Ｃｒｅ４は、初期の発育にだけ非常に高レベルのＣｒｅタンパク質の発現をすることができ、１００％の組み換えを触媒する。
【０１６１】
組み換えを示さなかった唯一の株は、再編成または欠失導入遺伝子を有する株であった。
【０１６２】
（実施例３５：異なるｒｅａｐｅｒ挿入物を保有する３羽のニワトリ株の成功した組み換え）
ｐＬｅｎｔｉ−ＥＲＮＩ−Ｃｒｅトランスジェニックニワトリ中のＣｒｅ組み換え酵素が、異なるｌｏｘＰ基質の組み換えを触媒することができることを示すために、Ｃｒｅ４株を３つの異なるｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ株（６−０３、６−５１および９−５１と呼ばれる）と交配した。以前に１００％の組み換えを示したので、Ｃｒｅ４株が選択された。ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の１つとＣｒｅ４導入遺伝子のコピーを受け継いだ胚が選択された。
【０１６３】
３つのｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の組み換えレベルを測定するために、Ｃｒｅ４導入遺伝子の１コピーとｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の１コピーとを保有する２重トランスジェニック胚の組み換えを触媒するＣｒｅの能力をサザンブロットによって分析した。ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子は、１．４ｋｂの配列（ＳＴＯＰカセットとも呼ばれる）を含み、同じ方向に隣接している。２つのｌｏｘＰ部位の間の組み換えは、染色体から１．４ｋｂの介在配列の切り出しをもたらし、後に単一のｌｏｘＰ部位を残す。次いで、介在配列は、染色体にはもはや結合されないので、介在配列は失われる。切り出し後、ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子は、大きさが１．４ｋｂ減少する。サザンブロットアッセイが展開されて、そこでは、ｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の大きさの減少は、Ｃｒｅ組み換え酵素活性を測定するために用いられる。Ｒｅａｐｅｒ遺伝子とレンチウイルス・ベクター・バックボーン（ブラスチシジン遺伝子とＳＶ４０配列）の部分からなるプローブにハイブリダイズしたとき、制限酵素ＳａｃＩによる消化は、約２．８ｋｂの全長（非組み換え）のｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒフラグメントを産生する。１．４ｋｂのＳＴＯＰ配列のＣｒｅ媒介組み換えと切り出しの際、同じプローブにハイブリダイズした場合、Ｒｅａｐｅｒ  ＳａｃＩフラグメントの大きさは約１．４ｋｂに減少する。プローブは、Ｃｒｅ組み換えに影響を受けない配列とハイブリダイズし、したがって、それは全長の、そして組み換えられたｌｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子の両方と等しくハイブリダイズする。
【０１６４】
ＬｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ株の各々のＣｒｅ−ｌｏｘ組み換え量を評価するために、全長（非組み換え）の組み換え導入遺伝子に対するバンド強度の比率を測定する。Ｃｒｅ４が，３つのすべてのＲｅａｐｅｒ株においてＳＴＯＰカセットを切り出すことが可能であるならば、そのときには、組み換えＲｅａｐｅｒバンドのみが観察されるが、これは、ＬｏｘＰ−Ｒｅａｐｅｒ導入遺伝子が全ての細胞において組み換えられたからである。結果が図２９に示され、これは、３つのすべてのＲｅａｐｅｒ株が、Ｃｒｅ４導入遺伝子の存在下、ＳＴＯＰカセットの１００％の切り出しを受けることを示す。
【０１６５】
（実施例３７：ニワトリゲノムに組み込まれたドッキング部位からのＥＧＦＰとｎｅｏのＣｒｅ媒介切り出し）
Ｃｒｅ組み換えは、培養ＰＧＣ中、インビトロで、また同様にトランスジェニック鳥で行うことができる。培養ＰＧＣ中で、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換えを実行するために、細胞をＣｒｅ発現ベクターで一時的にトランスフェクトする。
【０１６６】
ＤＯＣ２細胞が、Ｃｒｅ発現ベクターでトランスフェクトするために使われた。このＰＧＣ株は、ＰｒｋｚといくつかのＥＳＴに結合したＣｐＧアイランドで２１番染色体に組み込まれたドッキング部位構築物を保有する。開始ＤＯＣ２培養物中の細胞の全ては、緑色蛍光であったが、これは細胞がドッキング部位構築物中にＣＸ−ＥＧＦＰ遺伝子を保有するからである。２つのＣｒｅ発現ベクターを使用した：ヒトＣＭＶプロモーターの転写管理下のＣｒｅ遺伝子を有するｐＢＳ１８５、またはＥＲＮＩプロモーターがＣｒｅ発現を引き起こすＥＲＮＩ−Ｃｒｅ構築物。
【０１６７】
Ｃｒｅ発現構築物を、ＤＯＣ２細胞に一時的にトランスフェクトした。数日後に、培養物は緑色蛍光の喪失についてモニタリングされ、そして、それは細胞がＣｒｅ構築物を取り上げ、Ｃｒｅを発現し、ＣｒｅがＣＸ−ＥＧＦＰ−ＣＸ−ｎｅｏを含む、ドッキング部位ベクター上のｌｏｘＰ部位間の配列の切り出しを引き起こしたインジケータとみなされた。Ｃｒｅトランスフェクション後、培養物は緑色の細胞と緑色でない細胞とから成るものであった。２つの集団を精製するために、培養物を緑色蛍光に基づきフローサイトメトリによって分類した。各集団（緑色および緑色でない）の数百万個の細胞を回収した。
【０１６８】
ＥＧＦＰ遺伝子が細胞の緑色でない集団に切り出されたことを証明するために、サザンブロット分析を使用した（参照：図３０）。細胞（緑色および緑色でない）の２つの集団からのゲノムＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化した。ＤＮＡをアガロースゲルで分画し、ナイロン膜に移し、ドッキング部位に存在するピューロマイシン耐性遺伝子からの放射能標識配列にハイブリダイズした。ｐｕｒｏ遺伝子は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換えによって切り出されないドッキング部位構築物の領域にあり、したがって、ｐｕｒｏプローブは、ＤＯＣ２切り出し細胞および非切り出し細胞の両方からのゲノムＤＮＡのフラグメントを検出する。予測サイズのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、以下の通りである：ＥＧＦＰ＋（非切り出し）、５５２１ｂｐ；ＥＧＦＰ−（切り出し）、１２６２のｂｐ。予想フラグメントが観察され、非緑色細胞中で、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換えが、ＤＯＣ２細胞に組み込まれたドッキング部位構築物における２つのｌｏｘＰ部位間に存在するＣＸ−ＥＧＦＰ−ＣＸ−ｎｅｏ配列の欠失をもたらしたことを示した。
【０１６９】
（実施例３８：ＩｇＬ  ｐＫＯ５Ｂターゲティングベクターの調製）
ニワトリＩｇＬ遺伝子座を標的とするために、目標とした組み換えの際に、遺伝子座の内因性Ｊ領域とＣ領域を欠失したターゲティングベクターが調製された（図３１）。選択マーカーが変わったこと以外は、ベクターは先に記載したＩｇＬ  ｐＫＯ５と同じであった。ベクターの５’側の相同領域は、ＩｇＬ  Ｖ領域の近傍の２３２７ｂｐフラグメントから成り、３’側の相同領域は、Ｃ領域の下流からの６３４６ｂｐフラグメントから成るものであった。相同アームは、ターゲティングトランスフェクションの際に使われる細胞株から得られた同質遺伝子系統ＤＮＡからクローン化された。ターゲティング構築物は、発現を妨げる１つ以上の方法（例えば、停止コドン、ナンセンス配列、ａｔｔＰ部位またはそれらの組み合わせ）を含んだ。ベクターは、また、選択可能なマーカー遺伝子と部位特異的組み換え部位を含んだ。
ＨＳ４  ＥＲＮＩ−ｎｅｏ：８０４ｂｐネオマイシン耐性遺伝子を、ＰＧＣにおける発現のために、８００ｂｐのＥＲＮＩプロモーターの転写管理の下に置いた。ニワトリでのＥＲＮＩ発現は、非常に初期の胚に限られ、そのために、選択マーカーは成熟したニワトリでは発現しないはずである。ニワトリβ−グロビン遺伝子座からの２５０ｂｐのコアＨＳ４インスレーター要素は、タンデム複製され、複製されたインスレーターは、ＥＲＮＩ−ｎｅｏ選択マーカーの両側に配置された。単一のｌｏｘＰ部位（Ｃｒｅ媒介組み換えのための）は、ＨＳ４−ＥＲＮＩ−ｎｅｏの上流でクローン化された。
【０１７０】
【化８】
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ａｔｔＰ−ｐｕｒｏ：６００ｂｐのｐｕｒｏ遺伝子は、プロモーターなしで、４３ｂｐのａｔｔＰ部位（ｐｈｉＣ３１媒介組み換えのための）に連結された。それから、ａｔｔＰ−ｐｕｒｏは、ＨＳ４−ＥＲＮＩ−ｎｅｏの下流でクローン化された。合わせて、ｌｏｘＰ−ＨＳ４−ＥＲＮＩ−ｎｅｏ−ａｔｔＰ−ｐｕｒｏ選択マーカーカセットは、４０８９ｂｐである。
【０１７１】
【化９】
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５’相同アーム：２３２７ｂｐのフラグメントは、
【０１７２】
【化１０】
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を用いて、ＰＧＣ３５ゲノムＤＮＡから複製された、ＰＧＣ３５  ＩｇＬ  ＳａｃＩクローン＋３３３ｂｐのＮｏｔＩ−Ｎｃｏｌ  ＰＣＲ産物からの１９９４ｂｐ  ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをライゲーションすることにより生成される。ＰＣＲフラグメントは、２つのフラグメントを結合する重複ゲノムＮｃｏＩ部位を含んだ。
【０１７３】
得られた２３２７ｂｐフラグメントは、ｐＫＯベクターバックボーンへのクローニングのためのＮｏｔＩとＢａｍＨＩを用いてＨＳ４  ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏの上流で放出された。ＮｏｔＩ部位は、ゲノム中には存在せず、ＰＣＲによって付加された。
３’−相同アーム：６３４６ｋｂのＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントが、一緒に以下の３つのフラグメントをライゲーションすることにより生成された：ＳａｃＩゲノムクローンからのＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、およびＥｃｏＲＩ−ＭｆｅＩゲノムクローンからのＥｃｏＲＩ−ＡｐａＬＩクローン、およびＥｃｏＲＩ−ＭｆｅＩクローンから複製された３００ｂｐのＡｐａＬＩ−ＢｇｌＩＩ  ＰＣＲフラグメント
【０１７４】
【化１１】
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ＢｇｌＩＩ部位は、ゲノムに存在しなかったが、ＰＣＲによって付加された。３’−相同アームは、ＨＳ４  ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏとＨＳ４  ｂ−アクチンＥＧＦＰの間でｐＫＯベクターバックボーンにクローン化された。
ＨＳ４  ｂ−アクチンＥＧＦＰ：１．３ｋｂのニワトリｂ−アクチンプロモーターは、７００ｂｐのＥＧＦＰ遺伝子の発現を引き起こすために使用された。複製されたＨＳ４インスレーターの１コピーが、末端に付加されて、位置効果からランダムに挿入されたターゲティングベクターを隔離して、ＥＧＦＰ発現を可能とした。
【０１７５】
最終的なＩｇＬ  ｐＫＯ５Ｂターゲティングベクターは、１７，６８１ｂｐのサイズを有し、ＰＧＣにトランスフェクトする前にＮｏｔＩで線状化した。
【０１７６】
（実施例３９：ＰＧＣのトランスフェクションとＫＯ−０７  ＩｇＬノックアウトＰＧＣ細胞株の生成）
エレクトロポレーション緩衝液（ＡｍａｘａからのＶ緩衝液）のｌ００μｌの５ｘ１０６個の細胞の３８アリコートを、各ｌ０μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。すべてのアリコートを、Ａｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｐｕｌｓｅ  Ａ３３（Ａｍａｘａ）でエレクトロポレーションした。９つのクローンが得られ、そのうちの４つは、ＧＦＰ陽性であり、さらには追跡しなかった。５つのＧＦＰ非発現クローンが、サザン分析のために拡大され、ＫＯ−０７、０８、０９、１０および１１と命名された。
【０１７７】
（実施例４０：サザンブロット分析）
相同組み換えの５’側について、ＩｇＬ  ｐＫＯ５Ｂでトランスフェクトされた５つのクローン性ＰＧＣ株からのゲノムＤＮＡを、ＳａｃＩ制限酵素で消化して、０．７％アガロースゲルで分画した。ＤＮＡをナイロン膜に移し、相同アーム（すなわち、外因性プローブ）として使われる領域からの上流で、ニワトリＩｇＬ遺伝子座からのプローブにハイブリダイズした。プローブは、０．５ｋｂのＳａｃＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントであり、約１０ｋｂの野生型フラグメントと約４ｋｂの変異体フラグメントを検出する（図３２、左のパネル）。ターゲティングの３’側に関して、ゲノムＤＮＡをＢｓｔＥＩＩで消化し、ブロットを３’側の１．７ｋｂのＮｓｉＩ−ＭｆｅＩフラグメント（また、ターゲティングベクターの外側にある）にハイブリダイズさせた（図３２、右側パネル）。
【０１７８】
（実施例４１：生殖細胞系列キメラの生産）
３０００個のＰＧＣを、ステージ１５〜１６（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ＆Ｈａｍｉｌｔｏｎ）の胚毎に背側大動脈へ注入した。胚を代理棚でインキュベートした。孵化したひなを性的に成熟するまで成長させた。
【０１７９】
キメラ雄鶏を、人工授精によって野生型Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雌鶏と交配させた。精液を９羽の雄鶏から集めて、雌鶏を授精させた。雄鶏のうちの６羽は、黒い羽の表現型を子孫に伝達し、そして、ＩｇＬノックアウトＰＧＣの生殖細胞系列伝達を示した（表１）。雄鶏（ＩＶ７５−４１）のうちの１羽は、５０％を超える割合で伝達した。
【０１８０】
【表１５】
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（実施例４２：ノックアウト胚のサザンブロット分析）
発育１４日目の黒色羽毛の胚を安楽死させ、ゲノムＤＮＡを骨格筋から調製した。サザンブロットが実行されて、ノックアウトが、実験で試験された７つの胚の５つに伝達されたことを示す（胚２，３、４、６および７）。胚１と胚５は、野生型胚であり、これらは、ヘテロ接合性の目標とされたＫＯ−０７ノックアウトＰＧＣから野生型ＩｇＬ対立遺伝子を受け継いだ（図３３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２６】
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【図３０】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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