(57)【要約】【課題】選択的ＮＧＦ経路インヒビターとしてのヒト抗ＮＧＦ中和抗体の提供。【解決手段】本発明は、ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）と相互作用または結合し、これによりＮＧＦの機能を中和する抗体を提供する。本発明はまた、前記抗体の薬学的組成物およびＮＧＦ機能を中和する方法、特に薬学的有効量の抗ＮＧＦ抗体を投与することによってＮＧＦ関連障害（例えば、慢性疼痛）を処置する方法も提供する。抗ＮＧＦ抗体を用いてサンプル中のＮＧＦの量を検出する方法も提供される。本発明によって、本発明のモノクローナル抗体を産生する、最も好ましくは細胞培養培地に分泌する細胞も提供される。本発明の抗体は、疼痛の処置および管理での使用に加えて、神経障害性および炎症性の疼痛関連応答の処置にも有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１０月９日に出願された米国特許出願番号（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．）１２／５７６，５２２への優先権を主張し、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／５７６，５２２は２００８年１１月２５日に出願された米国特許出願番号（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．）１２／２７７，９１９の一部継続出願であり、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／２７７，９１９は２００４年７月１５日に出願された米国特許出願番号（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．）１０／８９１，６５８の継続出願であり、２００３年７月１５日に出願された米国仮出願番号６０／４８７，４３１への優先権の利益を主張する。本出願はまた、２００７年６月２２日に出願された米国特許出願番号１１／７６７，３２６に関連し、米国特許出願番号１１／７６７，３２６はＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／８９１，６５８の分割出願である。これらの全出願の開示は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表は、電子形式のみで本出願と共に出願し、参考として本明細書に援用される。配列表のテキストファイル「０２−１２４０−Ｆ−ＣＩＰ．ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」は、２００８年１１月２５日に作成しており、そのサイズは７９，１１６バイトである。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）に結合するヒトモノクローナル抗体に関する。疼痛および疼痛関連障害を処置するための組成物および方法も説明する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
米国では、毎日、２百万人を超える人々が、慢性疼痛によって能力が損なわれている（ＪｅｓｓｅｌｌおよびＫｅｌｌｙ、１９９１、「Ｐａｉｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ」、ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＮＥＵＲＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ、第３版、（Ｋａｎｄｅｌ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、およびＪｅｓｓｅｌｌ編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。残念なことに、現在の疼痛の処置は、ある程度しか有効ではなく、多くのこれらの処置自体が、衰弱または危険な副作用をもたらす。例えば、非ステロイド性抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）、例えば、アスピリン、イブプロフェン、およびインドメタシンは、炎症性疼痛に対して中程度に有効であるが、腎毒性でもあり、大量投与は、胃腸刺激、潰瘍、出血、および精神錯乱をもたらす傾向にある。オピオイドで処置された患者も、多くの場合、錯乱を経験し、長期のオピオイドの使用は、耐性および依存と関連する。局所麻酔薬、例えば、リドカインおよびメキシレチンは、疼痛を阻害するのと同時に、通常の感覚を喪失させる。
【０００５】
疼痛とは、環境から受け取り、神経系によって伝達され、解釈されるシグナルに基づいた知覚である（概観については、非特許文献１を参照されたい）。有害な刺激、例えば、熱および接触により、皮膚の専門の感覚受容器が、中枢神経系（「ＣＮＳ」）にシグナルを送る。このプロセスは、痛覚と呼ばれ、このプロセスを媒介する末梢感覚ニューロンが、侵害受容器である。侵害受容器（複数可）からのシグナルの強度ならびにＣＮＳによるそのシグナルの抽出（ａｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）および加工（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）次第で、ヒトは、有害な刺激を疼痛として感じる場合も、感じない場合もある。疼痛の知覚が、刺激の強度に対して適切に較正されている場合、疼痛は、目的とする保護機能を果たす。しかしながら、一定の種類の組織損傷は、ヒトの疼痛の閾値が低下したために相対的に無害の刺激が強い疼痛として知覚される痛覚過敏または痛覚亢進（ｐｒｏｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ）として知られる現象を引き起こす。炎症および神経損傷は共に、痛覚過敏を引き起こし得る。炎症状態、例えば、日焼け、変形性関節症、大腸炎、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、および膠原血管病（関節リウマチおよび狼瘡を含む）などを患っているヒトは、しばしば、疼痛の感覚が強くなる。同様に、外傷、外科手術、切断術、膿瘍、カウザルギー、膠原血管病、脱髄疾患、三叉神経痛、がん、慢性アルコール中毒、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、ヘルペス感染、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、および化学療法は、過度の疼痛をもたらす神経傷害を引き起こす。
【０００６】
侵害受容器が正常の状態および痛覚過敏の状態で外部シグナルを伝達する機序が、良く理解されるようになったため、痛覚過敏に関与するプロセスを標的にして、疼痛閾値の低下を阻害し、これにより経験する疼痛の程度を小さくすることができる。
【０００７】
神経栄養因子は、生理学的および病理学的な疼痛の伝達に重要な役割を果たしていることが分かっている。神経成長因子（ＮＧＦ）は、特に重要であると思われる（概観については、非特許文献２；および非特許文献３を参照されたい）。ＮＧＦの局所投与および全身投与は共に、痛覚過敏および異痛を引き起こすことが分かっている（非特許文献４）。ヒトにおけるＮＧＦの静脈注射は、全身筋肉痛をもたらし、局所投与は、全身性の影響に加えて、注入部位の痛覚過敏および異痛を引き起こす（非特許文献５）。疼痛が顕著な特色である状態への内因性ＮＧＦの関与についての相当数の証拠も存在する。例えば、ＮＧＦは、末梢神経傷害後の少なくとも２ヵ月間後根神経節（ＤＲＧ）シュワン細胞において上方制御され、ＮＧＦレベルの上昇が、様々な関節炎モデルの動物の関節で報告された（例えば、非特許文献６）。ヒトでは、ＮＧＦレベルは、リウマチ様関節炎または他の種類の関節炎の患者の滑液で上昇する（例えば、非特許文献７）。さらに、ＮＧＦ機能の拮抗作用が、神経障害性疼痛および慢性炎症疼痛のモデルにおける痛覚過敏および異痛を防止することが実証されている。例えば、神経障害性疼痛（例えば、神経幹または脊髄神経の結紮）の動物モデルでは、ＮＧＦに対する中和抗体の全身注射が、異痛および痛覚過敏の両方を防止する（非特許文献８；および非特許文献９）。当技術分野で公知の抗ＮＧＦ抗体の例には、例えば、特許文献１、国際公開第０１／６４２４７号、同第０２／０９６４５８号、および同第２００４／０３２８７０号；米国特許第５、８４４、０９２号、同第５、８７７、０１６号、および同第６、１５３、１８９号；Ｈｏｎｇｏら、２０００、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２１５−２２７；Ｈｏｎｇｏら、１９９３、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５５９−５６８；ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３９６０８、Ｕ３９６０９、Ｌ１７０７８、またはＬ１７０７７が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０１／７８６９８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌａｎ、Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１９９９、５７：１−１６４
【非特許文献２】ＭｃＭａｈｏｎ、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．、１９９６、３５１：４３１−４０
【非特許文献３】Ａｐｆｅｌ、Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｉｎ、２０００、１６：Ｓ７−Ｓ１１
【非特許文献４】Ｌｅｗｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９４、６：１９０３−１９１２
【非特許文献５】Ａｐｆｅｌら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９９８、５１：６９５−７０２
【非特許文献６】Ａｌｏｅら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１９９３、９：１４９−１５５
【非特許文献７】Ａｌｏｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、１９９２、３５：３５１−３５５
【非特許文献８】Ｒａｍｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９９、１１：８３７−８４６
【非特許文献９】Ｒｏら、Ｐａｉｎ、１９９９、７９：２６５−２７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
明らかに、特に疼痛の小分子メディエーターまたは悪化因子（ｅｘａｃｅｒｂａｔｏｒ）、例えば、ＮＧＦを標的とすることによる、新規で安全かつ効果的な疼痛の処置への要望が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、疼痛管理に治療上有用である新規なヒトモノクローナル抗体を提供する。具体的には、本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）に結合するモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、このモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり、ＮＧＦの生物学的活性を中和し、ＮＧＦ媒介性疼痛応答の影響を緩和するのに有用である。また、本発明によって、本発明のモノクローナル抗体を産生する、最も好ましくは細胞培養培地に分泌する細胞も提供される。本発明の抗体は、疼痛の処置および管理での使用に加えて、神経障害性および炎症性の疼痛関連応答の処置にも有用である。
【００１２】
本発明は、抗体Ｆｃ領域の配列ならびに配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号７９〜１３０として同定された１つ以上の配列を含む融合タンパク質をさらに提供する。このような分子は、例えば、参考として組み入れられる、国際特許出願公開第００／２４７８２号に記載されているような方法を用いて調製することができる。このような分子は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）または細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）で発現させることができる。
【００１３】
一定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体であって、この重鎖が、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、この重鎖の可変領域が、配列番号１０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、抗体を提供する。好ましくは、重鎖は、配列番号４に示されているアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体、好ましくはヒト抗体、より好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体であって、この重鎖が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ重鎖定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域またはその任意の対立遺伝子改変体（参考として本明細書に組み入れられる、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ公表番号：９１−３２４２で議論されている）を含み、重鎖の可変領域が、配列番号１０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号４に示されているＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。  
【００１５】
一定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体、好ましくヒト抗体、より好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体であって、この軽鎖が、配列番号８に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、この軽鎖の可変領域が、配列番号１２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、抗体を提供する。
【００１６】
一定の態様では、本発明の抗体は、重鎖および軽鎖を含み、この重鎖の可変領域は、配列番号１０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。他の態様では、軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。さらなる態様では、重鎖は、配列番号１４、配列番号１８、もしくは配列番号２０のいずれかに示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。なおさらなる態様では、軽鎖は、配列番号１６、配列番号２０、もしくは配列番号２４のいずれかに示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００１７】
本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する抗体であって、その重鎖が、配列番号１０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む可変領域を有し、その軽鎖が、配列番号１２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む可変領域を有する、抗体を提供する。
【００１８】
本発明は、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって：
（ａ）配列番号７９に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
（ｂ）配列番号８１に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
（ｃ）配列番号８３に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８４に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；あるいは
（ｄ）配列番号８６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８７に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖を含む、ヒト抗体をさらに提供する。
【００１９】
一定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体であって、この重鎖が、重鎖可変領域を含み、この重鎖可変領域が、配列番号１０に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％の同一性を有する配列を含み、この軽鎖が、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域が、配列番号１２に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％の同一性を有する配列を含み、この抗体が、ＮＧＦに特異的に結合する、抗体も提供する。
【００２０】
本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する抗体であって、その重鎖が、配列番号１４に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、その軽鎖が、配列番号１６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、抗体を提供する。
【００２１】
一定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗体であって、この重鎖が、重鎖可変領域を含み、この重鎖可変領域が、配列番号１４、配列番号１８、または配列番号２２のいずれかに示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％の同一性を有する配列を含み、この軽鎖が、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域が、配列番号１６に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、この抗体が、ＮＧＦに特異的に結合する、抗体を提供する。
【００２２】
本発明はまた、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆ（ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ）’抗体、および（Ｆａｂ’）２抗体も提供する。
【００２３】
特定の態様では、本発明は、配列番号１６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖を提供する。
【００２４】
加えて、本発明は、配列番号１４、配列番号１８、もしくは配列番号２２のいずれかに示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖も提供する。
【００２５】
本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって：（ａ）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；ならびに（ｂ）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、抗体にも関する。特定の態様では、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域は、配列番号２２に示されている４Ｄ４と表されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖ＣＤＲ１領域とすることができ、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域は、配列番号２４に示されているｍＡｂ  ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１領域とすることができる。他の態様では、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域は、配列番号１８に示されているｍＡｂ  ４Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２領域とすることができ、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域は、配列番号２０に示されているｍＡｂ  ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２領域とすることができる。なお他の態様では、ヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１４に示されているｍＡｂ  ４Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３領域であり、ヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１６に示されているｍＡｂ  ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３領域である。
【００２６】
本発明はまた、重鎖および軽鎖を含む、神経成長因子に特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、この重鎖が、配列番号１０、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、もしくは配列番号８７に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む、ヒト抗体も提供する。
【００２７】
本発明は、重鎖および軽鎖を含む、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、この軽鎖が、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、もしくは配列番号１３１に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む、ヒト抗体をさらに提供する。
【００２８】
本発明の抗体は、ＮＧＦポリペプチドに関連したｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ活性の少なくとも１つを中和する能力によって特徴付けられる。好ましくは、本発明は、ＮＧＦポリペプチドに対して高親和性結合を有する単離された抗ヒトＮＧＦヒト抗体であって、ヒトＮＧＦポリペプチドに結合し、ＫｉｎＥｘＡで決定された約５０×１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトＮＧＦポリペプチドから解離するか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０でＮＧＦ誘導性生存を阻害する、抗ヒトＮＧＦヒト抗体を提供する。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明は、以下の特徴を有する単離された抗ヒトＮＧＦヒト抗体を提供する：
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて約１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でＮＧＦ誘導性生存を阻害する；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する；および
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００３０】
本発明はまた、高い親和性でＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントであって、前記抗体またはフラグメントが、約１×１０−９以下のＫＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離し、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和し、重鎖可変領域を含み、この重鎖可変領域が：
（ａ）以下の式のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域：
ａ１ａ２ａ３ａ４ａ５
（式中：ａ１は、極性親水性アミノ酸残基であり；ａ２は、芳香族アミノ酸残基であり；ａ３は、脂肪族、極性疎水性、芳香族アミノ酸残基であり；ａ４は、中性疎水性または脂肪族アミノ酸残基であり；およびａ５は、脂肪族または極性親水性アミノ酸残基である）；
（ｂ）以下の式のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域：
ｂ１ｂ２ｂ３ｂ４ｂ５ｂ６ｂ７ｂ８ｂ９ｂ１０ｂ１１ｂ１２ｂ１３ｂ１４ｂ１５ｂ１６ｂ１７
（式中：ｂ１は、脂肪族、極性疎水性、または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ２は、脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｂ３は、極性親水性または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ４は、極性親水性、疎水性、または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ５〜ｂ９は独立して、極性親水性または脂肪族アミノ酸残基であり；ｂ１０は、極性親水性、芳香族、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｂ１１は、芳香族または疎水性アミノ酸残基であり；ｂ１２は、脂肪族疎水性または極性親水性アミノ酸残基であり：ｂ１３は、脂肪族、疎水性、または極性親水性アミノ酸残基であり；ｂ１４およびｂ１６は独立して、極性親水性アミノ酸残基であり；ｂ１５は、脂肪族または芳香族疎水性アミノ酸残基であり；およびｂ１７は、脂肪族酸性アミノ酸残基である）；および
（ｃ）以下の式のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域：
ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ｃ７ｃ８ｃ９ｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３ｃ１４ｃ１５ｃ１６ｃ１７
（式中：ｃ１は、存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ２は、存在しないか、または極性親水性もしくは芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ３およびｃ４はそれぞれ、存在しないか、または極性親水性、芳香族疎水性、もしくは脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ５は、存在しないか、または極性親水性、脂肪族、もしくは芳香族アミノ酸残基であり；ｃ６は、存在しないか、または極性親水性もしくは脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ７は、極性親水性または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ８は、極性親水性、疎水性、または芳香族アミノ酸残基であり；ｃ９は、極性親水性、脂肪族、または芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１０は、極性親水性、芳香族疎水性、または脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１１〜ｃ１３は独立して、極性親水性または芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１４は、脂肪族または芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１５は、極性親水性または中性疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１６は、存在しないか、または極性親水性アミノ酸残基であり；およびｃ１７は、芳香族疎水性または脂肪族疎水性アミノ酸残基である）を含む、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを提供する。
【００３１】
一態様では、ａ１は、極性親水性アミノ酸残基であり；ａ２は、芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ａ３は、脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ａ４は、中性疎水性であり；ａ５は、極性親水性アミノ酸残基であり；ｂ１は、脂肪族または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ２は、Ｉｌｅであり；ｂ３は、極性親水性アミノ酸残基であり；ｂ４は、極性親水性または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ５〜ｂ９は独立して、極性親水性または脂肪族アミノ酸残基であり；ｂ１０は、脂肪族アミノ酸残基であり；ｂ１１は、Ｔｙｒであり；ｂ１２は、脂肪族疎水性アミノ酸残基であり：ｂ１３は、脂肪族または極性親水性アミノ酸残基であり；ｂ１４およびｂ１６はそれぞれ、極性親水性アミノ酸残基であり；ｂ１５は、脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｂ１７は、脂肪族酸性アミノ酸残基であり；ｃ１は、存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ２は、存在しないか、または極性親水性もしくは芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ３およびｃ４は独立して、存在しないか、または極性親水性、芳香族疎水性、もしくは脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ５は、存在しないか、または極性親水性アミノ酸残基であり；ｃ６は、存在しないか、または極性親水性もしくは脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ７は、極性親水性または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ８は、極性親水性、疎水性、または芳香族アミノ酸残基であり；ｃ９は、極性親水性、脂肪族、または芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１０は、極性親水性、芳香族疎水性、または脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１１〜ｃ１３は独立して、極性親水性または芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１４は、脂肪族または芳香族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１５は、極性親水性または中性疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１６は、存在しないか、または極性親水性アミノ酸残基であり；およびｃ１７は、芳香族疎水性または脂肪族疎水性アミノ酸残基である。
【００３２】
特定の態様では、ａ１は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、またはＴｈｒであり；ａ２は、Ｔｙｒであり；ａ３は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり；ａ４は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ５は、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＡｓｎであり；ｂ１は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＡｓｐであり；ｂ２は、Ｉｌｅであり；ｂ３は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり；ｂ４は、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＰｒｏであり；ｂ５は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり；ｂ６は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり；ｂ７は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙであり；ｂ８は、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＴｈｒであり；ｂ９は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＴｈｒであり；ｂ１０は、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、またはＰｈｅであり；ｂ１１は、Ｔｙｒであり；ｂ１２は、ＡｌａまたはＳｅｒであり：ｂ１３は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり；ｂ１４は、Ｓｅｒであり；ｂ１５は、ＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ１６は、ＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ１７はＧｌｙであり；ｃ１は、存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ２は、存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ３およびｃ４は独立して、存在しないか、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｕであり；ｃ５は、存在しないか、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＴｒｐであり；ｃ６は、存在しないか、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、またはＬｅｕであり；ｃ７は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＡｓｐであり；ｃ８は、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり；ｃ９は、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒであり；ｃ１０は、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり；ｃ１１〜ｃ１３は独立して、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、またはＡｓｎであり；ｃ１４は、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり；ｃ１５は、ＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ１６は、存在しないか、Ａｓｐ、またはＡｓｎであり；およびｃ１７は、ＴｙｒまたはＶａｌである。
【００３３】
別の特定の態様では、ａ１は、ＳｅｒまたはＡｓｐであり；ａ２は、Ｔｙｒであり；ａ３は、ＡｌａまたはＳｅｒであり；ａ４は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ５は、ＨｉｓまたはＡｓｎであり；ｂ１は、ＴｙｒまたはＧｌｙであり；ｂ２は、Ｉｌｅであり；ｂ３は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり；ｂ４は、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＰｒｏであり；ｂ５は、ＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｂ６は、ＳｅｒまたはＡｒｇであり；ｂ７は、ＨｉｓまたはＧｌｙであり；ｂ８は、ＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ９は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＴｈｒであり；ｂ１０は、ＧｌｙまたはＰｈｅであり；ｂ１１は、Ｔｙｒであり；ｂ１２は、ＡｌａまたはＳｅｒであり；ｂ１３は、ＡｓｐまたはＧｌｙであり；ｂ１４は、Ｓｅｒであり；ｂ１５は、ＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ１６は、ＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ１７は、Ｇｌｙであり；ｃ１は、存在しないか、またはＧｌｙであり；ｃ２は、存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ３およびｃ４は独立して、存在しないか、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、またはＶａｌであり；ｃ５は、存在しないか、またはＳｅｒであり；ｃ６は、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；ｃ７は、ＧｌｙまたはＡｒｇであり；ｃ８は、ＴｒｐまたはＰｒｏであり；ｃ９は、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒであり；ｃ１０は、ＶａｌまたはＴｙｒであり；ｃ１１〜ｃ１３は独立して、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＡｓｐであり；ｃ１４は、ＰｈｅまたはＶａｌであり；ｃ１５は、ＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ１６は、存在しないか、またはＡｓｐであり；およびｃ１７は、ＴｙｒまたはＶａｌである。
【００３４】
他の特定の態様では、
（ａ）重鎖ＣＤＲ１は、配列番号２２に示されているアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号１８に示されているアミノ酸配列を有し、および重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１４に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ１は、配列番号９２に示されているアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号９３に示されているアミノ酸配列を有し、および重鎖ＣＤＲ３は、配列番号９４に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ１は、配列番号９８に示されているアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号９９に示されているアミノ酸配列を有し、および重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１００に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｄ）重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１０４に示されているアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号１０５に示されているアミノ酸配列を有し、および重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１０６に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｅ）重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１１０に示されているアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号１１１に示されているアミノ酸配列を有し、および重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１１２に示されているアミノ酸配列を有する、および
（ｆ）重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１１６に示されているアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号１１７に示されているアミノ酸配列を有し、および重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１１８に示されているアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントであって、この抗体またはフラグメントが、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域が：
（ａ）以下の式のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域：
ａ１ａ２ａ３ａ４ａ５ａ６ａ７ａ８ａ９ａ１０ａ１１ａ１２
（式中：ａ１は、極性親水性アミノ酸残基であり；ａ２、ａ１１、およびａ１２は独立して、脂肪族または疎水性アミノ酸残基であり；ａ３、ａ５、ａ７、およびａ８は独立して、脂肪族、極性親水性、または疎水性アミノ酸残基であり；ａ４は、極性親水性アミノ酸残基であり；ａ６は、脂肪族または疎水性アミノ酸残基であり；ａ９は、存在しないか、または脂肪族もしくは極性親水性アミノ酸残基であり；ａ１０は、脂肪族、芳香族、または疎水性アミノ酸残基である）；
（ｂ）以下の式のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域：
ｂ１ｂ２ｂ３ｂ４ｂ５ｂ６ｂ７
（式中：ｂ１は、脂肪族、極性疎水性、または疎水性アミノ酸残基であり；ｂ２は、脂肪族または疎水性アミノ酸残基であり；ｂ３およびｂ４は独立して、極性親水性、脂肪族、または疎水性アミノ酸残基であり；ｂ５は、極性親水性または脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｂ６は、極性親水性または脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｂ７は、極性親水性アミノ酸残基である）；および
（ｃ）以下の式のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域：
ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ｃ７ｃ８ｃ９ｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３ｃ１４ｃ１５ｃ１６ｃ１７
（式中：ｃ１およびｃ２は独立して、極性親水性アミノ酸残基であり；ｃ３は、極性親水性、脂肪族、または疎水性アミノ酸残基であり；ｃ４、ｃ５、およびｃ６は独立して、脂肪族、極性親水性、または疎水性アミノ酸残基であり；ｃ７は、存在しないか、または極性親水性もしくは脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ８は、極性親水性または疎水性アミノ酸残基であり；ｃ９は、極性親水性アミノ酸残基である）
を含み、前記抗体またはフラグメントが、約１×１０−９以下のＫＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離し、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントも提供する。
【００３６】
一態様では、ａ１、ａ３、ａ４、ａ７、およびａ８は独立して、極性親水性アミノ酸残基であり；ａ２、ａ６、ａ１１、およびａ１２は独立して、脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ａ５は、極性親水性または脂肪族アミノ酸残基であり；ａ９は、存在しないか、または脂肪族もしくは極性親水性アミノ酸残基であり；ａ１０は、脂肪族または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ１は、脂肪族、極性疎水性、または疎水性アミノ酸残基であり；ｂ２は、脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｂ３、ｂ４、およびｂ７は独立して、極性親水性アミノ酸残基であり；ｂ５およびｂ６は独立して、極性親水性または脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は独立して、極性親水性アミノ酸残基であり；ｃ３は、極性親水性、脂肪族、または疎水性アミノ酸残基であり；ｃ４、ｃ５、およびｃ６は独立して、脂肪族、極性親水性、または疎水性アミノ酸残基であり；ｃ７は、存在しないか、または脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；ｃ８は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ９は、極性親水性アミノ酸残基である。
【００３７】
特定の態様では、ａ１、ａ３、ａ４、およびａ７はそれぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、およびＳｅｒであり；ａ２は、Ａｌａであり；ａ５は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；ａ８は、ＳｅｒまたはＩｌｅであり；ａ９は、存在しないか、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり；ａ１０は、Ａｌａ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；ｂ１は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＶａｌであり；ｂ２およびｂ３はそれぞれ、ＡｌａおよびＳｅｒであり；ｂ４は、ＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｂ５は、ＬｅｕまたはＡｒｇであり；ｂ６は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、またはＧｌｎであり；ｂ７は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ１およびｃ２は、Ｇｌｎであり；ｃ３は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり；ｃ４は、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり；ｃ５は、ＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｃ６は、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅであり；ｃ７は、存在しないか、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり；ｃ８は、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり；およびｃ９は、Ｔｈｒである。
【００３８】
別の特定の態様では、ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、およびａ７はそれぞれ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、およびＳｅｒであり；ａ５は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；ａ８は、ＳｅｒまたはＩｌｅであり；ａ９は、存在しないか、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり；ａ１０は、ＡｌａまたはＴｙｒであり；ｂ１は、ＡｓｐまたはＧｌｙであり；ｂ２およびｂ３はそれぞれ、ＡｌａおよびＳｅｒであり；ｂ４は、ＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｂ５は、ＬｅｕまたはＡｒｇであり；ｂ６は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、またはＧｌｎであり；ｂ７は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ１およびｃ２は、Ｇｌｎであり；ｃ３は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり；ｃ４は、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり；ｃ５は、ＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｃ６は、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅであり；ｃ７は、存在しないか、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり；ｃ８は、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり；およびｃ９は、Ｔｈｒである。
【００３９】
別の特定の態様では、
（ａ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号２４に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号２０に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１６に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｂ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号９５に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号９６に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号９７に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｃ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１０１に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１０２に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１０３に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１０７に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１０８に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１０９に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１１３に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１１４に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１１５に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１１９に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１２０に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１２１に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｇ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１２２に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１２３に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１２４に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｈ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１２５に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１２６に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１２７に示されているアミノ酸配列を有する、
（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１２８に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１２９に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１３０に示されているアミノ酸配列を有する、および
（ｊ）軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１３２に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１３３に示されているアミノ酸配列を有し、および軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１３４に示されているアミノ酸配列を有する。
【００４０】
また、新規な抗ヒトＮＧＦヒト抗体をコードするポリヌクレオチド配列、抗ヒトＮＧＦヒト抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、抗ヒトＮＧＦヒト抗体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターで形質転換された宿主細胞、抗ヒトＮＧＦヒト抗体を含む処方物、ならびにこれらの作製および使用方法も本発明の一部である。
【００４１】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＮＧＦのレベルを検出するための方法であって、このサンプルを本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程を含む方法も提供する。本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦの検出および定量のために、任意の公知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接および間接的なサンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で使用することができる（Ｓｏｌａ、１９８７、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）。この抗体は、利用されるアッセイ方法に適切である親和性でＮＧＦに結合することができる。
【００４２】
加えて、本発明は、ＮＧＦの産生の上昇またはＮＧＦに対する感受性の上昇に関連した疾患を処置するための方法であって、本発明の少なくとも１つの抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む薬学的有効量の薬学的組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４３】
一定の実施形態では、本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）の発現の上昇またはＮＧＦに対する感受性の上昇によって引き起こされる状態を処置する方法であって、患者に薬学的有効量のＮＧＦ抗体を、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内、もしくは皮下経路による注射によって、持続放出システムによってまたは移植デバイスによって、投与する工程を含み、この状態は、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、術後疼痛（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐａｉｎ）、切断もしくは膿瘍による疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、がん、慢性アルコール中毒、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的な頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合血管症候群（ｍｉｘｅｄ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）もしくは非血管症候群（ｎｏｎ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、緊張性頭痛、一般的な炎症、関節炎、リウマチ病、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚病訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症状態、炎症性疼痛ならびにこれに関連した痛覚過敏および異痛、神経障害疼痛ならびにこれに関連した痛覚過敏および異痛、糖尿病性神経障害疼痛、カウザルギー、交感神経によって維持される疼痛（ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｐａｉｎ）、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織の損傷もしくは機能不全、単純ヘルペス、呼吸領域、尿生殖器領域、胃腸領域、もしくは血管領域における内臓運動の不調、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、そう痒（ｐｒｕｒｉｔｉｓ）、白斑、一般的な胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または内臓痛である、方法に関する。
【００４４】
一定の実施形態では、本方法は、薬学的有効量のＮＧＦ抗体を含み、変形性関節症膝疼痛の処置または防止に有用である。一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体の薬学的有効量は、皮下注射当たり約３ｍｇ〜約３０ｍｇである。一定の実施形態では、投与は、複数回の皮下注射を含む。ある実施形態では、投与は、単回皮下注射を含む。一定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、配列番号４４を含む軽鎖を含むＮＧＦ抗体を含む。一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、配列番号４０を含む重鎖を含む。さらなる実施形態では、ＮＧＦ抗体は、配列番号４４を含む軽鎖および配列番号４０を含む重鎖を含む。
【００４５】
したがって、本発明の上記説明によると、様々な態様では、本発明は、配列番号４４を含む軽鎖および配列番号４０を含む重鎖を含むＮＧＦ抗体を含む方法および組成物であって、この抗体の重鎖と軽鎖がフレキシブルリンカーによって連結されて単鎖抗体を形成している、方法および組成物に関する。この態様の一部の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２抗体、完全ヒト抗体、および／またはヒト化抗体を含む。この態様の一部の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦのシグナル伝達を阻害する。
【００４６】
この態様の一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、約１×１０−９以下、約１×１０−１０以下、または約１×１０−１１以下のＫＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離する。この態様の一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約１×１０−８以下、約１×１０−９以下、または約０．２×１０−９以下のＩＣ５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する。一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、上述のＫＤ値（複数可）でヒトＮＧＦポリペプチドから解離し、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて上述のＩＣ５０値でヒトＮＧＦ生物活性を中和する。
【００４７】
本発明の特有の好ましい実施形態は、以下の一定の好ましい実施形態のさらに詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）  神経成長因子（ＮＧＦ）の発現の上昇またはＮＧＦに対する感受性の上昇によって引き起こされる状態を処置する方法であって、該方法は、患者に薬学的有効量のＮＧＦ抗体を、経口的に、静脈内経路、腹腔内経路、脳内（実質内）経路、脳室内経路、筋肉内経路、眼内経路、動脈内経路、門脈内経路、病巣内経路、もしくは皮下経路による注射によって、持続放出システムによって、または移植デバイスによって、投与する工程を含む、方法。
（項目２）  上記注射が、皮下注射である、項目１に記載の方法。
（項目３）  上記ＮＧＦ抗体の上記薬学的有効量が、皮下注射あたり約３ｍｇ〜約３０ｍｇである、項目２に記載の方法。
（項目４）  上記皮下注射が、複数回の皮下注射を含む、項目２に記載の方法。
（項目５）  上記状態が、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、術後疼痛、切断もしくは膿瘍による疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、がん、慢性アルコール中毒、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的な頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合血管症候群もしくは非血管症候群、緊張性頭痛、一般的な炎症、関節炎、リウマチ病、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚病訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症状態、炎症性疼痛ならびにこれに関連した痛覚過敏および異痛、神経障害疼痛ならびにこれに関連した痛覚過敏および異痛、糖尿病性神経障害疼痛、交感神経によって維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織の損傷もしくは機能不全、単純ヘルペス、呼吸領域、尿生殖器領域、胃腸領域、もしくは血管領域における内臓運動の不調、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、そう痒、白斑、一般的な胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または内臓痛である、項目１に記載の方法。
（項目６）  上記変形性関節症が、変形性関節症膝疼痛である、項目５に記載の方法。
（項目７）  上記注射が、皮下注射である、項目６に記載の方法。
（項目８）  上記ＮＧＦ抗体の上記薬学的有効量が、皮下注射あたり約３ｍｇ〜約３０ｍｇである、項目７に記載の方法。
（項目９）  薬学的に許容され得るキャリアおよび単離された抗体を含む薬学的組成物を投与する工程を含み、該抗体が、配列番号４４を含む軽鎖および配列番号４０を含む重鎖を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）  上記抗体の上記重鎖および上記軽鎖が、フレキシブルリンカーによって結合されて単鎖抗体を形成している、項目９に記載の方法。
（項目１１）  上記ＮＧＦ抗体が、Ｆａｂ’抗体である、項目１に記載の方法。
（項目１２）  上記ＮＧＦ抗体が、（Ｆａｂ’）２抗体である、項目１に記載の方法。
（項目１３）  上記ＮＧＦ抗体が、完全ヒト抗体である、項目１に記載の方法。
（項目１４）  上記ＮＧＦ抗体が、ヒト化されている、項目１に記載の方法。
（項目１５）  上記ＮＧＦ抗体が、ＮＧＦシグナル伝達を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目１６）  上記ＮＧＦ抗体が、配列番号４４を含む軽鎖および配列番号４０を含む重鎖を含み、該抗体の該重鎖および該軽鎖が、フレキシブルリンカーによって結合されて単鎖抗体を形成している、項目１に記載の方法。
（項目１７）  上記ＮＧＦ抗体が、単鎖Ｆｖ抗体である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  上記ＮＧＦ抗体が、Ｆａｂ’抗体である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）  上記ＮＧＦ抗体が、（Ｆａｂ’）２抗体である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）  上記ＮＧＦ抗体が、完全ヒト抗体である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）  上記ＮＧＦ抗体が、ヒト化されている、項目１６に記載の方法。
（項目２２）  上記ＮＧＦ抗体が、ＮＧＦシグナル伝達を阻害する、項目１６に記載の方法。
（項目２３）  上記ＮＧＦ抗体が、約１×１０−９以下のＫＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離し、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約１×１０−８以下のＩＣ５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目１６に記載の方法。
（項目２４）  上記ＮＧＦ抗体が、約１×１０−１０以下のＫＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離し、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約１×１０−９以下のＩＣ５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目１６に記載の方法。
（項目２５）  上記ＮＧＦ抗体が、約１×１０−１１以下のＫＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離し、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約０．２×１０−９以下のＩＣ５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目１６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】図１は、ハイブリドーマ馴化培地から精製された４Ｄ４モノクローナル抗体による、ＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおけるＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示している。
【図１ｂ】図１は、ハイブリドーマ馴化培地から精製された４Ｄ４モノクローナル抗体による、ＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおけるＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示している。
【図２】図２は、ヒトＮＧＦ活性によって刺激されたＶＲ１の発現、およびハイブリドーマ馴化培地から精製された抗ＮＧＦモノクローナル抗体（４Ｄ４）による、ＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおけるＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示している。
【図３】図３は、ローラーボトル培養（Ｒ）またはスピナーフラスコ（Ｓ）のいずれかで増殖した細胞において、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２のいずれかとして発現された場合の、一過性発現組換え抗ＮＧＦ  ４Ｄ４モノクローナル抗体による、ＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおけるＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示している。
【図４】図４は、ニューロトロフィンの配列のアラインメントを示している。この配列の上の番号および二次構造エレメントは、成熟ヒトＮＧＦに関連している。保存された残基には星でマークが付けられており、低い配列相同性の領域には影が付けられている。ＮＧＦヒトは、配列番号１３５であり；ＮＧＦマウスは配列番号１３６であり；ＢＤＮＦは配列番号１３７であり；ＮＴ３は配列番号１３８である。
【図５】図５は、１４Ｄ１０（配列番号９８）、６Ｈ９（配列番号１０４）、７Ｈ２（配列番号１１０）、４Ｇ６（配列番号１１６）、１４Ｄ１１（配列番号９２）、および４Ｄ４（配列番号２２）の抗体についての抗ＮＧＦ  ＣＤＲ１重鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示している。
【図６】図６は、１４Ｄ１０（配列番号９９）、６Ｈ９（配列番号１０５）、７Ｈ２（配列番号１１１）、４Ｇ６（配列番号１１７）、１４Ｄ１１（配列番号９３）および４Ｄ４（配列番号１８）の抗体についての抗ＮＧＦ  ＣＤＲ２重鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示している。
【図７】図７は、１４Ｄ１０（配列番号１００）、６Ｈ９（配列番号１０６）、７Ｈ２（配列番号１１２）、４Ｇ６（配列番号１１８）、１４Ｄ１１（配列番号９４）、および４Ｄ４（配列番号１４）の抗体についての抗ＮＧＦ  ＣＤＲ３重鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示している。
【図８】図８は、１４Ｄ１０（配列番号９５）、６Ｈ９（配列番号１０７）、７Ｈ２（配列番号１１３）、４Ｇ６ａ（配列番号１１９）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２２）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２５）、４Ｇ６ｄ（配列番号１２８）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３２）、１４Ｄ１１（配列番号９５）、および４Ｄ４（配列番号２４）の抗体についての抗ＮＧＦ  ＣＤＲ１軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示している（４Ｇ６ａは、様々な図では２００３１０２８３４０として示されている；４Ｇ６ｂは、様々な図では２００３１０２８３５１として示されている；４Ｇ６ｃは、様々な図では２００３１０７１５２６として示されている；４Ｇ６ｄは、様々な図では２００３１０２８３４４として示されている；４Ｇ６ｅは、様々な図では２００３１０００５２８として示されている）。
【図９】図９は、１４Ｄ１０（配列番号９６）、６Ｈ９（配列番号１０８）、７Ｈ２（配列番号１１４）、４Ｇ６ａ（配列番号１２０）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２３）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２６）、４Ｇ６ｄ（配列番号１２９）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３３）、１４Ｄ１１（配列番号９６）、および４Ｄ４（配列番号２０）の抗体についての抗ＮＧＦ  ＣＤＲ２軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示している（４Ｇ６ａは、様々な図では２００３１０２８３４０として示されている；４Ｇ６ｂは、様々な図では２００３１０２８３５１として示されている；４Ｇ６ｃは、様々な図では２００３１０７１５２６として示されている；４Ｇ６ｄは、様々な図では２００３１０２８３４４として示されている；４Ｇ６ｅは、様々な図では２００３１０００５２８として示されている）。
【図１０】図１０は、１４Ｄ１０（配列番号９７）、６Ｈ９（配列番号１０９）、７Ｈ２（配列番号１１５）、４Ｇ６ａ（配列番号１２１）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２４）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２７）、４Ｇ６ｄ（配列番号１３０）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３４）、１４Ｄ１１（配列番号９７）、および４Ｄ４（配列番号１６）の抗体についての抗ＮＧＦ  ＣＤＲ３軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示している（４Ｇ６ａは、様々な図では２００３１０２８３４０として示されている；４Ｇ６ｂは、様々な図では２００３１０２８３５１として示されている；４Ｇ６ｃは、様々な図では２００３１０７１５２６として示されている；４Ｇ６ｄは、様々な図では２００３１０２８３４４として示されている；４Ｇ６ｅは、様々な図では２００３１０００５２８として示されている）。
【図１１】図１１は、１４Ｄ１０（配列番号８２）、６Ｈ９（配列番号８４）、７Ｈ２（配列番号８６）、４Ｇ６ａ（配列番号８８）、４Ｇ６ｂ（配列番号８９）、４Ｇ６ｃ（配列番号９０）、４Ｇ６ｄ（配列番号９１）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３１）、１４Ｄ１１（配列番号８０）、および４Ｄ４（配列番号１２）の抗体についての抗ＮＧＦ軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示している（４Ｇ６ａは、様々な図では２００３１０２８３４０として示されている；４Ｇ６ｂは、様々な図では２００３１０２８３５１として示されている；４Ｇ６ｃは、様々な図では２００３１０７１５２６として示されている；４Ｇ６ｄは、様々な図では２００３１０２８３４４として示されている；４Ｇ６ｅは、様々な図では２００３１０００５２８として示されている）。
【図１２】図１２は、４Ｄ４（配列番号１０）、４Ｇ６（配列番号８７）、１４Ｄ１０（配列番号８１）、１４Ｄ１１（配列番号７９）、７Ｈ２（配列番号８５）、および６Ｈ９（配列番号８３）の抗体についての抗ＮＧＦの重鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示している。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
（特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書に使用される節の見出しは、単にまとめることを目的とするだけであり、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。本出願に引用される全ての参考文献は、あらゆる目的に対して参考として本明細書に明確に組み入れられるものとする。
【００５０】
（定義）
従来の技術を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織の培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に用いることができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書にしたがって、または当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載されるように行うことができる。前述の技術および手順は一般に、当技術分野で周知の方法にしたがって、本明細書で引用され議論されている様々な一般的な参考文献およびさらに詳細な参考文献に記載されているように行うことができる。例えば、あらゆる目的に対して参考として本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。特段の記載がない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬学の化学と関連して利用される命名法、ならびにその実験室手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。同様に、従来の技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、処方、および送達、ならびに患者の処置に用いることができる。
【００５１】
本開示にしたがって利用される場合、以下の用語は、特段の記載がない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：本発明の抗体に関する語句「生物学的特性」、「生物学的特徴」、および用語「活性」は、本明細書で交換可能に使用され、これらには、限定されるものではないが、エピトープ親和性および特異性（例えば、ヒトＮＧＦに結合する抗ヒトＮＧＦヒト抗体）、標的のポリペプチドの活性（例えば、ＮＧＦ活性）をアンタゴナイズする能力、この抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ならびにこの抗体の免疫原性特性が含まれる。当技術分野で認められている抗体の他の同定可能な生物学的特性または特徴には、例えば、交差反応性（すなわち、一般的には、標的にされるポリペプチドの非ヒトホモログとの交差反応性、または他のタンパク質もしくは組織との交差反応性）、および哺乳動物細胞においてタンパク質の高い発現レベルを保つ能力が含まれる。前述の特性または特徴は、当技術分野で認められている技術を用いて観察または測定することができ、これらの技術には、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分析、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ中和アッセイ（例えば、実施例２）、およびヒト、霊長類、または必要に応じて任意の他の供給源を含む様々な供給源由来の組織切片を用いた免疫組織化学が含まれる。抗ヒトＮＧＦヒト抗体の特定の活性および生物学的特性は、以下の実施例にさらに詳細に記載される。
【００５２】
本明細書で使用される用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成起源のポリヌクレオチド、またはこれらのある組み合わせを意味するものであり、その起源によっては、単離されたポリヌクレオチドは、（１）ポリヌクレオチド（その単離されたポリヌクレオチドは、天然では、そのポリヌクレオチド中に見られる）の全てまたは一部に結合していない、（２）天然では連結されないポリヌクレオチドに連結されている、または（３）より大きい配列の一部としては、天然に発生しない。
【００５３】
本明細書で使用される用語「単離されたタンパク質」は、対象のタンパク質が、（１）通常は共に見出される他のタンパク質の少なくとも一部を含まない、（２）同じ供給源由来、例えば同種由来の他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異種由来の細胞によって発現される、（４）天然では会合している、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物もしくは他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）この「単離されたタンパク質」が天然では会合しているタンパク質の一部と、（共有結合性相互作用によっても、または非共有結合性相互作用によっても）会合していない、（６）天然には会合していないポリペプチドと作動可能に会合している（共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって）、または（７）天然では発生しないことを意味する。このような単離されたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは合成起源の他のＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせによってコードすることができる。好ましくは、この単離されたタンパク質は、その用途（治療、診断、予防、研究などの用途）を妨げ得る、天然の環境で見られるタンパク質、ポリペプチド、または他の混入物を実質的に含まない。
【００５４】
「単離された」抗体とは、同定されて、その天然の環境の成分から分離され、かつ／または収集されたものである。その天然の環境の混入物成分は、抗体の診断または治療での使用を妨げる物質であり、これには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定される、抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニング・カップ・シークエネーターの使用によって、Ｎ末端アミノ酸配列もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマーシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いて、還元条件下もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が含まれる。
【００５５】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、天然のタンパク質、すなわち天然に存在する細胞、特に非組換え細胞によって、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生されるタンパク質の配列を有する分子を意味し、この天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはこの天然の配列の１つ以上のアミノ酸が欠失した、付加された、かつ／もしくは置換された分子を含む。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、特に、抗ＮＧＦ抗体または抗ＮＧＦ抗体の１つ以上のアミノ酸が欠失した、付加された、かつ／もしくは置換された配列を含む。
【００５６】
用語「ポリペプチドフラグメント」は、アミノ末端、カルボキシ末端、および／または内部が欠失したポリペプチドを指す。一定の実施形態では、フラグメントは、少なくとも５〜約５００アミノ酸長である。一定の実施形態では、フラグメントは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０アミノ酸長であることを理解されたい。特に有用なポリペプチドフラグメントには、結合ドメインを含む機能的なドメインが含まれる。抗ＮＧＦ抗体の場合、有用なフラグメントには、限定されるものではないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部、または２つのＣＤＲを含むその可変領域のみなどが含まれる。
【００５７】
用語「特異的結合物質」は、標的に特異的に結合する天然または非天然の分子を指す。特異的結合物質の例には、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物および脂質が含まれる。一定の実施形態では、特異的結合物質は抗体である。
【００５８】
用語「ＮＧＦに対する特異的な結合物質」は、ＮＧＦの任意の部分に特異的に結合する特異的な結合物質を指す。一定の実施形態では、ＮＧＦに対する特異的な結合物質は、ＮＧＦに特異的に結合する抗体である。
【００５９】
本明細書で使用される用語「免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の少なくともＣＤＲを含むポリペプチドフラグメントを指す。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、抗原に結合することができる。好ましい実施形態では、この抗原は、レセプターに特異的に結合するリガンドである。これらの実施形態では、本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントの結合は、そのレセプターへのリガンドの結合を防止し、リガンドのこのレセプターへの結合から生じる生物学的応答を遮る。好ましくは、本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、ＮＧＦに特異的に結合する。最も好ましくは、このフラグメントは、ヒトＮＧＦに特異的に結合する。
【００６０】
本明細書で使用され、物体に対して用いられる用語「天然に存在する」は、その物体が天然で見られ得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離することができ、かつ人間によって意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が、天然に存在する。
【００６１】
用語「作動可能に連結された」は、この用語が用いられる成分が、適切な条件下で固有の機能を果たすことができる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列の転写活性に適合する条件下でこのタンパク質コード配列の発現が達成されるように、このタンパク質コード配列に連結されている。
【００６２】
本明細書で使用される用語「制御配列」は、制御配列が連結されるコード配列の発現、プロセシング、または細胞内局在化を可能にするポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なり得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれ得る。他の特定の実施形態では、真核生物の転写制御には、転写因子の１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、転写終結配列、およびポリアデニル化配列が含まれ得る。一定の実施形態では、「制御配列」には、リーダー配列および／または融合パートナー配列が含まれ得る。
【００６３】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０ヌクレオチド長の一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。一定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの型のヌクレオチドの改変型であり得る。前記改変型には、塩基改変型、例えば、ブロモウリジン、リボース改変型、例えば、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボース、ならびにヌクレオチド間連結改変型、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、およびホスホロアミデートが含まれる。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、ＤＮＡの一本鎖型および二本鎖型を含む。
【００６４】
本明細書で言及する用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するオリゴヌクレオチド連結および／または天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって互いに連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび改変されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、２００ヌクレオチド以下の長さを有し、一般的には一本鎖であるメンバーを含むポリヌクレオチドのサブセットである。一定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０ヌクレオチド長である。一定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝的変異体の構築に使用する場合、一本鎖でも二本鎖でも良い。本発明のオリゴヌクレオチドは、タンパク質コード配列に関してセンスオリゴヌクレオチドでもアンチセンスオリゴヌクレオチドでも良い。
【００６５】
用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「改変されたヌクレオチド」は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。用語「オリゴヌクレオチド連結」は、オリゴヌクレオチド連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデートなどを含む。例えば、あらゆる目的に対して、開示が参考として本明細書に組み入れられる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：９０８１；Ｓｔｅｃら、１９８４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎら、１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９；Ｚｏｎら、１９９１、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６：５３９；Ｚｏｎら、１９９１、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、１９９０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能にする検出可能な標識を含み得る。
【００６６】
用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を含む。ベクターの１つのタイプに「プラスミド」があり、プラスミドは、追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターに、ウイルスベクターがあり、このウイルスベクターでは、追加のＤＮＡセグメントをそのウイルスゲノムに連結することができる。一定のベクターは、それらが導入された宿主細胞で自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際し、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、これによりその宿主ゲノムとともに複製される。さらに、一定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では、「組換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるため、交換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たす、このような他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含むものとする。
【００６７】
語句「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を含む。このような用語は、特定の対象の細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すことを意図することを当業者には理解できよう。一定の改変が、変異または環境的影響のいずれかによって次世代で起こり得るため、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも、本明細書に使用される用語「宿主細胞」の範囲内には含まれる。細菌、酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含め、多種多様な宿主発現系を用いて、本発明の抗体を発現させることができる。適切な細菌発現ベクターの例は、ｐＵＣ１９である。抗体を組換え的に発現させるためには、宿主細胞を、その抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを有する１つ以上の組換え発現ベクターでトランスフェクトして、その軽鎖および重鎖が、宿主細胞中で発現される、好ましくは宿主細胞が培養されている培地中に分泌されるようにし、この培地から、抗体を収集することができる。標準的な組換えＤＮＡ方法論を使用して、抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子を得て、これらの遺伝子を組換え発現ベクター中に組み込み、次いでこのベクターを宿主細胞、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）およびＢｏｓｓらに付与された米国特許第４，８１６，３９７号に記載されているような宿主細胞に導入する。
【００６８】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換された細胞、または核酸配列で形質転換することができる細胞であって、後に目的の選択された遺伝子を発現する細胞を指すために使用される。この用語には、親細胞の子孫が含まれ、この子孫は、この選択された遺伝子が存在する限り、形態学的または遺伝子構成においてもともとの親と同一であっても同一でなくても良い。
【００６９】
用語「形質導入」は、一般にはファージによる、遺伝子のある細菌から別の細菌への移動を指すために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞の配列の獲得および移動も指す。
【００７０】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されると、「トランスフェクトされた」ことになる。多数のトランスフェクション技術が、当技術分野で周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら、１９８６、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら、１９８１、Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。
【００７１】
本明細書で使用される用語「形質転換」は、細胞の遺伝子的特徴における変化を指し、細胞は、新たなＤＮＡを含むように改変されると形質転換されたことになる。例えば、細胞は、その天然の状態から遺伝子的に改変されると形質転換されたことになる。トランスフェクションまたは形質導入の後、この形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体への物理的な組み込みによって細胞のＤＮＡと組み換えられても良いし、または複製されることなくエピソームエレメントとして一時的に維持されても良いし、またはプラスミドとして独立して複製しても良い。細胞は、細胞分裂でＤＮＡが複製されると安定的に形質転換されたと見なされる。
【００７２】
生物学的物質、例えば核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などに関して使用される場合の用語「天然に存在する」または「天然の」は、天然で見出され、人間によって操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で使用される「天然に存在しない」または「非天然の」は、天然で見出されない物質、または人間によって構造的に改変もしくは合成された物質を指す。
【００７３】
用語「抗原」は、選択的な結合物質、例えば抗体によって結合され得、さらに動物に使用してその抗原のエピトープに結合できる抗体を産生することができる分子または分子の一部を指す。抗原は、１つ以上のエピトープを有しても良い。
【００７４】
用語「同一性」は、当技術分野で公知であるように、２つ以上のポリペプチド分子の配列間の関係、または２つ以上の核酸分子の配列間の関係であって、これらの配列を比較することによって決定される関係を指す。当技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、２つ以上のヌクレオチド配列のストリング間または２つ以上のアミノ酸配列のストリング間の一致によって決定される、核酸分子間またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すな
わち、「アルゴリズム」）によって行われるギャップアラインメント（存在する場合）を用いて２つ以上の配列のうちの小さい方の配列間の同一の一致のパーセントを測定する。
【００７５】
用語「類似性」は、関連性の概念に関連して当技術分野で使用されるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一の一致および保存的置換の一致の両方を含む関連性の尺度を指す。２つのポリペプチド配列が、例えば、２０個のうちの１０個が同一のアミノ酸を有し、残りが全て非保存的置換であるとすると、同一性パーセントおよび類似性パーセントは、両方とも５０％となる。同じ例で、さらに５つの位置で保存的置換があるとすると、同一性パーセントは、５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（２０のうちの１５）となる。したがって、保存的置換が存在する場合は、２つのポリペプチド間の類似性パーセントは、これらの２つのポリペプチド間の同一性パーセントよりも高い。
【００７６】
関連する核酸およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法には、限定されるものではないが、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、１９８８、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＲＯＪＥＣＴＳ、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）、１９９３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ、Ｐａｒｔ  １、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編）、１９９４、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＰＲＩＭＥＲ、（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、１９９１、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃａｒｉｌｌｏら、１９８８、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３；ならびにＤｕｒｂｉｎら、１９９８、ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている方法が含まれる。
【００７７】
同一性を決定する好ましい方法は、検査される配列間で最大の一致が得られるように設計される。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、限定されるものではないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０）を含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０（前出））から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性の決定に用いることができる。
【００７８】
２つのアミノ酸配列を整列させるための一定のアラインメントスキームでは、２つの配列の短い領域のみの一致しか得ることができず、この短い整列された領域は、たとえ２つの完全長配列間に有意な関係が存在しなくても、極めて高い配列同一性を有し得る。したがって、一定の実施形態では、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）によって、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続したアミノ酸にまたがるアラインメントが得られる。
【００７９】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性パーセントを決定すべき２つのポリペプチドを、これらの各アミノ酸の最適な一致のために整列させる（アルゴリズムによって決定される「一致したスパン」）。一定の実施形態では、ギャップ・オープニング・ペナルティー（これは、平均ダイアゴナル（ｄｉａｇｏｎａｌ）を３倍して計算される；「平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全なアミノ酸の一致に対して割り当てられるスコアまたは数値である）と、ギャップ伸長ペナルティー（通常は、ギャップ・オープニング・ペナルティーの１０分の１）と、比較マトリックス、例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２を、このアルゴリズムと共に使用する。一定の実施形態では、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ  ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５：３４５−３５２を参照されたい；ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）も、アルゴリズムによって使用される。
【００８０】
一定の実施形態では、ポリペプチド配列の比較についてのパラメーターには以下が含まれる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２、前出によるＢＬＯＳＵＭ  ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記のパラメーターを用いると有効であろう。一定の実施形態では、前述のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチドの比較（エンドギャップについてのペナルティーを含まない）用のデフォルトパラメーターである。
【００８１】
用語「相同性」は、タンパク質の配列間または核酸の配列間の類似性の程度を指す。相同性の情報は、一定のタンパク種または核酸種の遺伝的関連性を理解するのに有用である。相同性は、配列の整列および比較によって決定することができる。典型的には、アミノ酸の相同性を決定する際には、タンパク質配列を、公知のタンパク質配列のデータベースと比較する。相同な配列は、配列のいずれかの位置で共通の機能的同一性を共有する。高度の類似性または同一性は、通常は相同性を示唆するが、低度の類似性または同一性は、必ずしも相同性の欠如を示すものではない。
【００８２】
いくつかの手法を用いて、ある配列のアミノ酸を別の配列のアミノ酸と比較して相同性を決定することができる。一般に、この手法は、以下の２つに分類される：（１）物理的特徴、例えば、極性、荷電およびファン・デル・ワールス容積を比較して、類似性マトリックスを作成する；ならびに（２）公知の相同なタンパク質からの多くのタンパク質配列の観察に基づいて、任意の他のアミノ酸によって配列中のアミノ酸の考えられる置換を比較して、Ｐｏｉｎｔ  Ａｃｃｅｐｔｅｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ（ＰＡＭ）を作成する。
【００８３】
同一性のパーセンテージはまた、デフォルトパラメーター（例えば、ＧＡＰペナルティー５、ＧＡＰオープニングペナルティー１５、ＧＡＰ伸長ペナルティー６．６）を用いて、ベクターＮＴＩスイート９．０．０ソフトウェアパッケージのモジュールとして、プログラムニードル（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）もしくはストレッチャー（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）またはプログラム整列Ｘを使用することによって計算することもできる。
【００８４】
本明細書では、２０個の従来のアミノ酸およびその省略形は、従来の使用法にしたがう。あらゆる目的に対して参考として本明細書に組み入れられる、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ−Ａ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ、１９９１を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄアミノ酸）；非天然のアミノ酸、例えば、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来とは異なるアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドの適切な成分であり得る。従来とは異なるアミノ酸の例には、以下が含まれる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチドの表記において、標準的な使用法および慣習にしたがって、左側の方向がアミノ末端方向であり、右側の方向がカルボキシ末端方向である。
【００８５】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいたクラスに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン（Ｎｏｒ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
（２）極性親水性；Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（４）脂肪族疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（５）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
（１０）芳香族疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。
【００８６】
保存的アミノ酸置換には、これらのクラスのあるクラスのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換が含まれ得る。保存的アミノ酸置換には、天然には存在しないアミノ酸残基が含まれ得、このようなアミノ酸残基は、典型的には、生物系における合成ではなく、化学的なペプチド合成によって組み込まれる。このようなアミノ酸残基には、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の反転型（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）または逆位型（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）が含まれる。
【００８７】
非保存的置換には、これらのクラスのあるクラスのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換が含まれ得る。このような置換残基は、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域に導入しても良いし、または分子の非相同領域に導入しても良い。
【００８８】
このような変化の形成では、一定の実施形態によると、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。各アミノ酸には、その疎水性および荷電の特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。この疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００８９】
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能の付与におけるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当技術分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照されたい）。一定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換することができ、置換されても類似の生物学的活性を維持することは公知である。疎水性親水性指標に基づいた変化の形成では、一定の実施形態では、疎水性親水性指標が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が含まれる。一定の実施形態では、疎水性親水性指標が±１の範囲内であるアミノ酸の置換が含まれ、一定の実施形態では、疎水性親水性指標が±０．５の範囲内である置換が含まれる。
【００９０】
特に、同様のアミノ酸の置換によって作製される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、本明細書に開示されているように免疫学的な実施形態で使用されることが意図される場合、同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に行うことができることも当技術分野で理解されている。一定の実施形態では、あるタンパク質の最大の局所平均親水性（その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される）は、このタンパク質の免疫原性および抗原性、すなわちそのタンパク質の生物学的特性に相関する。
【００９１】
以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づいた変化の形成では、一定の実施形態では、親水性値が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が含まれ、一定の実施形態では、親水性値が±１の範囲内であるアミノ酸の置換が含まれ、一定の実施形態では、親水性値が±０．５の範囲内であるアミノ酸の置換が含まれる。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００９２】
例示的なアミノ酸置換を表１に示す。
【００９３】
【表１】
2014169326.tif 000002
当業者は、周知の技術を用いて本明細書に記載のポリペプチドの適切な改変体を決定することができる。一定の実施形態では、当業者は、活性にとって重要であるとは思われない領域を標的とすることによって活性を損なわずに変化させることができる分子の適切な領域を同定することができる。他の実施形態では、当業者は、同様のポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を同定することができる。さらなる実施形態では、生物学的活性または構造にとって重要であり得る領域でさえも、生物学的活性を損なうことなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすこともなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【００９４】
加えて、当業者は、活性または構造にとって重要な類似のポリペプチドにおける残基を同定する構造−機能の研究を検討することができる。このような比較を考慮して、当業者は、類似したタンパク質の活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に相当する、あるタンパク質のアミノ酸残基の重要性を推測することができる。当業者は、このように推測された重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができる。
【００９５】
当業者はまた、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似したポリペプチドにおけるその構造に関して分析することができる。このような情報を考慮して、当業者は、抗体のアミノ酸残基のアラインメントをその三次元構造に対して推測することができる。一定の実施形態では、当業者は、タンパク質の表面に存在すると推定されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るため、このような残基に対して大幅な変化を形成しないように選択することができる。さらに、当業者は、それぞれの望ましいアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含む試験改変体を作製することができる。次いで、この改変体を、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。このような改変体を用いて、適切な改変体についての情報を集めることができる。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、活性の消失、望ましくない減少、または不適切な活性をもたらすことが発見された場合は、このような変化を有する改変体を回避することができる。言い換えれば、このようなルーチンの実験から収集された情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独で、または他の変異と共に、回避されるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【００９６】
多数の科学出版物が、二次構造の予測に力を注いでいる。Ｍｏｕｌｔ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−２４５；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２；Ｃｈｏｕら、１９７８、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８；Ｃｈｏｕら、１９７９、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照されたい。さらに、コンピュータプログラムが、現在、二次構造の予測の支援に利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％よりも高い配列同一性または４０％よりも高い配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造的トポロジーを有する場合が多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の発達により、ポリペプチドの構造またはタンパク質の構造内での可能な折り畳み回数を含め、二次構造の予測可能性が向上した。Ｈｏｌｍら、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所定のポリペプチドまたはタンパク質には限られた数の折り畳みが存在すること、ならびに構造の臨界数（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｎｕｍｂｅｒ）が判明すれば、構造の予測が大幅に正確になること、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【００９７】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）、および「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ、１９９９、前出；およびＢｒｅｎｎｅｒ、１９９７、前出を参照されたい）が含まれる。
【００９８】
一定の実施形態では、抗体改変体には、グリコシル化部位の数および／または種類が、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変更されているグリコシル化改変体が含まれる。一定の実施形態では、タンパク質改変体は、天然タンパク質よりも多いかまたは少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、このＸとしたアミノ酸残基は、プロリン以外のあらゆるアミノ酸残基とすることができる。この配列を形成するためのアミノ酸残基の置換により、Ｎ連結炭水化物鎖の付加のための潜在的な新たな部位が得られる。あるいは、この配列を除去する置換により、既存のＮ連結炭水化物鎖を除去する。また、１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（典型的には天然に存在する部位）が除去され、１つ以上の新たなＮ連結部位が形成される、Ｎ連結炭水化物鎖の再配置も提供される。さらなる好ましい抗体改変体には、親アミノ酸配列と比較して、１つ以上のシステイン残基が欠失したか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されたシステイン改変体が含まれる。システイン改変体は、不溶性封入体の単離の後などに、生物学的に活性なコンフォメーションに抗体を再び折り畳まなければならない場合に有用であろう。システイン改変体は、一般に、天然タンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、典型的には、不対システインによる相互作用を最小化するために偶数のシステイン残基を有する。
【００９９】
さらなる実施形態では、抗体改変体には、改変Ｆｃフラグメントまたは改変重鎖定常領域を含む抗体が含まれ得る。「結晶化するフラグメント」を表すＦｃフラグメント、または重鎖定常領域は、変異によって改変されて抗体に変更された結合特徴を付与することができる。例えば、全てが参考として本明細書に組み入れられる、ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ、１９９２、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５１：１−８４；ＲａｖｅｔｃｈおよびＢｏｌｌａｎｄ、２００１、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５−９０；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１−６６０４；ＴｅｌｌｅｍａｎおよびＪｕｎｇｈａｎｓ、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １００：２４５−２５１；Ｍｅｄｅｓａｎら、１９９８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０９２−２１００を参照されたい。このような変異は、置換、付加、欠失またはそれらの任意の組み合わせを含み得、典型的には、本明細書に記載の方法および当技術分野で公知の方法（例えば、参考として本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、第１５２巻、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照されたい）にしたがって１つ以上の変異原性オリゴヌクレオチド（複数可）を用いた部位特異的変異誘発によって形成される。
【０１００】
一定の実施形態によると、アミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を低減する、（２）酸化に対する感受性を低減する、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更する、（４）結合親和性を変更する、および／または（５）このようなポリペプチドに他の物理化学的特性または機能的特性を付与するかまたはこれらの特性を変更する、アミノ酸置換である。一定の実施形態によると、単一または複数のアミノ酸置換（一定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列（一定の実施形態では、分子間接触を形成するドメイン（複数可）外のポリペプチドの一部）で行うことができる。好ましい実施形態では、保存的アミノ酸置換は、典型的には、親配列の構造的特徴を実質的に変化させない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊する傾向も、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向も有するべきではない）。当技術分野で認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、それぞれが参考として本明細書に組み入れられる、ＰＲＯＴＥＩＮＳ、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、１９８４、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編）、１９９１、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５に記載されている。
【０１０１】
ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬として製薬産業で一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれている。あらゆる目的に対して参考として本明細書に組み入れられる、Ｆａｕｃｈｅｒｅ、１９８６、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、１９８５、ＴＩＮＳ  ｐ．３９２；ならびにＥｖａｎｓら、１９８７、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９を参照されたい。このような化合物は、多くの場合、コンピュータ分子モデリングの支援によって開発される。治療上有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣物を用いて、同様の治療効果または予防効果を得ることができる。一般に、ペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的な特性または薬理学な活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体に構造的に類似しているが、当技術分野で周知の方法によって、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合により任意選択で置換される１つ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の、同じタイプのＤアミノ酸での系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりに、Ｄ−リジン）を一定の実施形態で用いて、より安定したペプチドを作製することができる。加えて、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列の変更形態を含む拘束ペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、当技術分野で公知の方法（あらゆる目的に対して参考として本明細書に組み入れられる、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ、１９９２、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）；例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによって作製することができる。
【０１０２】
「抗体」または「抗体ペプチド（複数可）」は、インタクトな抗体、または特定の結合についてそのインタクトな抗体と競合するその結合フラグメントを指す。一定の実施形態では、結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって作製される。さらなる実施形態では、結合フラグメントは、インタクトな抗体の酵素的切断または化学的切断によって作製される。結合フラグメントには、限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体が含まれる。
【０１０３】
用語「重鎖」は、ＮＧＦに対する特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを含む。用語「軽鎖」は、ＮＧＦに対する特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを含む。完全長重鎖は、可変領域ドメイン、ＶＨならびに３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。このＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシ末端にある。本明細書で使用される用語「重鎖」は、完全長重鎖およびそのフラグメントを包含する。完全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、および定常領域ドメインＣＬを含む。重鎖と同様に、軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。本明細書で使用される用語「軽鎖」は、完全長軽鎖およびそのフラグメントを含む。Ｆ（ａｂ）フラグメントは、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆ（ａｂ）分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、１つの軽鎖および１つの重鎖を含み、この重鎖は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にさらに定常領域を含むため、鎖間ジスルフィド結合を２つの重鎖間で形成してＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。Ｆｖ領域は、重鎖および軽鎖の両方に由来の可変領域を含むが、定常領域は含まない。単鎖抗体は、Ｆｖ分子であり、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがフレキシブルリンカーによって結合されて単一ポリペプチド鎖を形成し、この単一ポリペプチド鎖が抗原結合領域を形成している。単鎖抗体は、国際特許出願公開第８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号に詳細に説明されている。
【０１０４】
特定の実施形態では、「多特異的」抗体または「多機能性」抗体以外の二価抗体は、同一の抗原特異性を有する結合部位を含むと考えられている。
【０１０５】
本発明にしたがった抗体結合および抗体特異性の評価では、抗体は、過剰な抗体がレセプターに結合するリガンドの量を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、またはそれ以上（とりわけ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイを用いて測定した場合）低下させた場合、リガンドのレセプターへの付着を実質的に阻害する。
【０１０６】
「中和抗体」は、この中和抗体が結合する標的抗原のエフェクター機能を阻止するか、または実質的に低下させることができる抗体分子を意味する。したがって、「中和」抗ＮＧＦ抗体は、エフェクター機能、例えば、ＮＧＦのレセプター結合および／または細胞応答の誘発を阻止するか、または実質的に低下させることができる。「実質的に低下させる」は、標的抗原（例えば、ヒトＮＧＦ）のエフェクター機能の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の低下を意味するものとする。
【０１０７】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合することができる任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。一定の実施形態では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性なグループ（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基を含み、一定の実施形態では、特定の三次元構造の特徴および／または特定の荷電の特徴を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。一定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われている。好ましい実施形態では、抗体は、平衡解離定数が１０−８Ｍ以下である場合、より好ましくは平衡解離定数が１０−９Ｍ以下である場合、最も好ましくは平衡解離定数が１０−１０Ｍ以下である場合に、抗原に特異的に結合すると言われている。
【０１０８】
２つの抗体が同一かまたは立体的に重複するエピトープを認識した場合、ある抗体は、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が同一かまたは立体的に重複するエピトープに結合するか否かを決定するために最も広く使用されている迅速な方法は、標識抗原または標識抗体のいずれかを用いて様々な形式で構成することができる競合アッセイである。通常は、抗原が支持層上に固定され、未標識抗体が標識抗体の結合を阻止する能力が、放射性標識または酵素標識を用いて測定される。
【０１０９】
本明細書で使用される用語「物質」は、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的物質から作製された抽出物を意味する。
【０１１０】
本明細書で使用される用語「標識」または「標識された」は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の組み込みによる検出マーカーの組み込み、または標識されたアビジン（例えば、検出マーカー、例えば、光学法または比色定量法によって検出することができる蛍光マーカー、化学発光マーカー、または酵素活性を含むのが好ましいストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの付着を指す。一定の実施形態では、この標識は、治療的であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に開示された方法で有利に使用することができる。ポリペプチド用の標識の例には、限定されるものではないが、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネートすなわちＦＩＴＣ、ローダミン、またはランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ハプテン標識、例えば、ビオチニル基、および二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、またはエピトープタグ）が含まれる。一定の実施形態では、標識は、様々な長さのスペーサーアーム（例えば、（ＣＨ２）ｎ、このｎは約２０未満）によって取り付けられて潜在的な立体障害を低減する。
【０１１１】
本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、限定されるものではないが、生物（ｌｉｖｉｎｇ  ｔｈｉｎｇ）または死んだ生物（ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｌｉｖｉｎｇ  ｔｈｉｎｇ）由来の任意の量の材料を含む。このような生物には、限定されるものではないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、および他の動物が含まれる。このような材料には、限定されるものではないが、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節、および皮膚が含まれる。
【０１１２】
本明細書で使用される用語「薬学的物質または薬物」は、患者に適切に投与されると、望ましい治療効果を誘導し得る化合物または組成物を指す。本発明の抗体の１つまたは複数を含む薬学的組成物に関しての表現「薬学的有効量」は、本発明によると、外部刺激に対する感受性閾値の低下を、考慮される患者で無効にすることができ、健常な被験体で観察される閾値に相当するレベルまでこの感受性閾値を回復させる前記薬学的組成物の量を意味すると理解される。
【０１１３】
「障害」とは、本発明による処置から恩恵を受け得るあらゆる状態のことである。「障害」および「状態」は、本明細書では交換可能に使用され、哺乳動物を問題の障害に罹患させやすくする病理的状態を含め、慢性および急性のＮＧＦ媒介性障害またはＮＧＦ媒介性疾患を含む。
【０１１４】
用語「ＮＧＦ媒介性疾患」および「ＮＧＦ媒介性状態」は、ＮＧＦのレベルの上昇またはＮＧＦに対する感受性の上昇に関連したあらゆる医学的状態または障害を含み、このような医学的状態または障害には、限定されるものではないが、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、術後疼痛、切断もしくは膿瘍による疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、がん、慢性アルコール中毒、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的な頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合血管症候群もしくは非血管症候群、緊張性頭痛、一般的な炎症、関節炎、リウマチ病、狼瘡、変形性関節症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚病訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症状態、炎症性疼痛ならびにこれに関連した痛覚過敏および異痛、神経障害疼痛ならびにこれに関連した痛覚過敏および異痛、糖尿病性神経障害性疼痛、カウザルギー、交感神経によって維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織の損傷もしくは機能不全、単純ヘルペス、呼吸領域、尿生殖器領域、胃腸領域、もしくは血管領域における内臓運動の不調、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、そう痒、白斑、一般的な胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆流、膵炎、および内臓痛が含まれる。
【０１１５】
本明細書で使用される用語「有効量」および「治療有効量」は、ビヒクル組成物または薬学的組成物（１つ以上の抗ヒトＮＧＦヒト抗体を含む）に関して使用される場合、望ましい結果（すなわち、本発明のビヒクルまたは抗ヒトＮＧＦヒト抗体での治療では、望ましい効果は、例えば、炎症および／または疼痛の望ましい軽減である）を得るのに十分な量または用量、またはＮＧＦの１つ以上の生物学的活性のレベルの観察可能な低下を支持するのに十分な量または用量を指す。より具体的には、治療有効量とは、物質を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで処置される被験体において、問題の状態、例えば、炎症または疼痛に関連した臨床的に定義される病理学的プロセスの１つ以上を一定期間にわたって阻害するのに十分な抗ヒトＮＧＦヒト抗体（複数可）の量のことである。本発明では、抗ＮＧＦ抗体の「有効量」は、任意の医学的疼痛状態に関連した疼痛の知覚を防止、停止、制御、または軽減することができる。本発明の方法では、用語「制御」およびその文法上の変更形態を、望ましくない事象、例えば、疼痛の防止、部分的もしくは完全な阻害、軽減、遅延、または減退を指すために使用する。有効量は、選択される特定のビヒクルまたは抗ＮＧＦヒト抗体（複数可）によって異なり得、かつ処置されるべき被験体に関連した様々な因子および状態、ならびに障害の重篤度によっても異なる。例えば、ビヒクルまたは抗ヒトＮＧＦヒト抗体（複数可）がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合、因子、例えば、患者の年齢、体重、および健康状態、ならびに前臨床動物研究で得られた用量応答曲線および毒性データが考慮するべきものに含まれる。この物質が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞と接触する場合は、当業者は、取り込み、半減期、用量、毒性などのパラメーターを評価するために、様々な前臨床インビトロ研究をデザインすることもできる。所定の物質の有効量または治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１６】
本明細書で使用される用語「神経成長因子」および「ＮＧＦ」は、配列番号３０に示されている、組換えヒトＮＧＦ１−１２０を含む、全ての哺乳動物種の天然配列ＮＧＦと定義される。
【０１１７】
本明細書で使用される「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」は、主な種として存在している化合物または種（すなわち、モル基準で、上記化合物または種が、この組成物中のあらゆる他の個々の種よりも多く存在すること）を意味する。一定の実施形態では、実質的に精製された画分は、この種が存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準で）を構成する、組成物である。一定の実施形態では、実質的に純粋な組成物では、その組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％よりも多くを構成する。一定の実施形態では、この種は、本質的に均一まで精製され（混入種は、従来の検出法ではこの組成物中で検出することができない）、この組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。
【０１１８】
用語「患者」は、ヒトおよび動物の被験体を含む。
【０１１９】
「処置」または「処置する」は、治療的処置および予防または防止手段の両方を指す。処置を必要とする被験体には、既に障害を有する被験体の他、障害を有する傾向にある被験体、または障害が防止されるべき被験体が含まれる。
【０１２０】
文脈で必要ない限り、単数形の用語は、複数形を包含し、複数形の用語は、単数形を包含する。
【０１２１】
本発明の一定の実施形態によると、ＮＧＦに対する抗体は、限定されるものではないが、上述のものを含め、神経障害性および炎症性の疼痛、ならびにＮＧＦ媒介性疾患を処置するために使用することができる。
【０１２２】
本発明の一態様では、ヒトＮＧＦに対して惹起され、かつヒトＮＧＦへの結合に対する生物学的および免疫学的特異性を有する完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。別の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子のアミノ酸配列、特にその可変領域に相当する配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明のこの態様の特定の実施形態は、本発明によって提供される重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、特にＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に相当する配列である。なお別の態様では、本発明は、免疫グロブリン分子および抗体、好ましくは本発明のモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞および細胞系を提供する。本発明はまた、生物学的および免疫学的に精製された抗体の調製物、好ましくはヒトＮＧＦに対して惹起されて、ヒトＮＧＦへの結合について生物学的および免疫学的特異性を有するモノクローナル抗体の調製物を提供する。
【０１２３】
酵母人工染色体（ＹＡＣ）においてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローン化および再構築して、マウス生殖系列にそれらを導入する能力により、非常に大きい、すなわち大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的成分を解明し、ヒト疾患の有用なモデルを作製する、有利な手法がもたらされる。さらに、マウス遺伝子座のヒト等価物での置換へのこのような技術の利用により、発生中のヒト遺伝子産物の発現および調節、他の系とのそれらの情報伝達、ならびに疾患誘導および進行におけるそれらの関与に対するユニークな洞察が得られる。
【０１２４】
このような戦略の重要な実際の適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入により、抗体のプログラムされた発現およびアッセンブリの基礎となる機構、ならびにＢ細胞発生におけるその役割を研究する機会が得られる。さらに、このような戦略により、完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の供給源が提供される。
【０１２５】
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に相当する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。一定の実施形態では、ヒト抗体は、限定されるものではないが、げっ歯類、例えば、マウスおよびラット、ならびにウサギ目の動物、例えば、ウサギを含む非ヒト哺乳動物で産生される。一定の実施形態では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞で産生される。一定の実施形態では、ヒト抗体は、組換え的に産生される。
【０１２６】
抗体についての用語「組換え体」は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離される抗体を含む。代表的な例には、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組換え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５、（１９９２）を参照されたい）；または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の方法によって、調製、発現、作製、または単離された抗体が含まれる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。
【０１２７】
ヒト抗体は、ヒトの治療での使用において、非ヒト抗体およびキメラ抗体よりも優れた少なくとも３つの利点を有する：
（１）抗体のエフェクター部分がヒトであるため、ヒト抗体は、ヒト免疫系の他の部分と良好に相互作用し得る（例えば、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効率的に破壊する）；
（２）ヒト免疫系は、ヒト抗体を外来物として認識しないはずであり、したがってこのような注入された抗体に対する抗体応答は、完全に外来性の非ヒト抗体または部分的に外来性のキメラ抗体に対してよりも少ないはずである；
（３）注入された非ヒト抗体は、ヒトの循環での半減期がヒト抗体の半減期よりもかなり短いことが報告されている。注入されたヒト抗体は、天然に存在するヒト抗体と本質的に同一の半減期を有し、より少ない用量を低い頻度で与えることが可能となる。
【０１２８】
したがって、完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス由来ＭＡｂに固有の免疫原性およびアレルギー性の応答を最小限にし、これにより投与される抗体の効力および安全性を高めることが期待されている。したがって、本発明の完全ヒト抗体は、抗体の反復投与を必要とする、慢性および再発性の疼痛の処置に使用することができる。したがって、本発明の抗ＮＧＦ抗体の１つの特定の利点は、この抗体が完全ヒト抗体であり、ヒト抗マウス抗体または他の前述の非ヒト種由来の不完全ヒト抗体に一般に関連する有害反応を最小限にしながら、患者に非急性的に投与できるということである。
【０１２９】
当業者であれば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きいフラグメントを用いてマウス抗体を産生しないマウス株を操作することができ、このようなマウスは、マウス抗体の非存在下でヒト抗体を産生する。大きいヒトＩｇフラグメントは、大きな可変遺伝子多様性、ならびに抗体の産生および発現の適切な調節を保存し得る。抗体の多様化および選択ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の欠如についてのマウス細胞機構を利用することにより、これらのマウス株で再現されるヒト抗体レパートリーが、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対して高い親和性抗体をもたらす。ハイブリドーマ技術を用いて、望ましい特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを作製して選択することができる。
【０１３０】
内因性免疫グロブリンを産生せず、免疫化に際してヒト抗体の完全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を利用することができる。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動により、抗原チャレンジに際してヒト抗体が産生される（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８、（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．、７：３３（１９９３）；Ｎａｔｕｒｅ  １４８：１５４７−１５５３（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：９９５−９９９（２０００）；ならびに米国特許第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第、５，７７０，４２９号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，５６９，８２５号、および同第５，５４５，８０６号（あらゆる目的に対して、それぞれが参考として、その全容が本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーで作製することもできる（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９２）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５（１９９１））。
【０１３１】
組換えヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を用いる場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異）に供され得るため、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に関連するアミノ酸配列に由来するが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖系列レパートリー内に天然では存在しない場合がある配列である。
【０１３２】
一定の実施形態では、当業者であれば、ヒト可変領域（複数可）と共に、ヒト以外の種に由来する定常領域をこのようなマウスに使用してキメラ抗体を作製することができる。
【０１３３】
（天然に存在する抗体構造）
天然に存在する抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。それぞれのこのような四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、それぞれの対は、１つの完全長「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの完全長「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。典型的には、それぞれの軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、典型的に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、典型的には、κ軽鎖およびλ軽鎖に分類される。重鎖は、典型的には、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。ＩｇＧは、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含め、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、限定されるものではないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡは、同様に、限定されるものではないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡを含むサブクラスに分けられる。完全長軽鎖および完全長重鎖において、典型的には、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、この重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｃｈ．７、第２版（Ｐａｕｌ，Ｗ．編）、１９８９、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（あらゆる目的に対して参考として全容が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。それぞれの軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。
【０１３４】
可変領域は、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域に連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という、同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列させられ、これが特定のエピトープへの結合を可能にし得る。Ｎ末端からＣ末端において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方が、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、典型的には、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７および１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ）またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の定義にしたがっている。
【０１３５】
（二重特異性抗体または二機能性抗体）
二重特異性抗体または二機能性抗体は、典型的には、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマの融合またはＦ（ａｂ’）フラグメントの連結を含む様々な方法によって作製することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。
【０１３６】
（抗体の調製）
本発明は、ヒトＮＧＦに結合する抗体を提供する。これらの抗体は、完全長ＮＧＦまたはそのフラグメントを用いた免疫化によって作製することができる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であっても良く、かつ／または組換え抗体であっても良い。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、例えば、ヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物の免疫化によって調製されるヒト抗体である（例えば、国際特許出願公開第９３／１２２２７号を参照されたい）。
【０１３７】
本発明の抗ＮＧＦ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、同じ種または別の種由来のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することができる。一定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲを、コンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定する。抗ＮＧＦ抗体の重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲで置換することができる。抗ＮＧＦ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲにおけるまれなアミノ酸は、典型的には、置換されないが、残りのＦＲアミノ酸は置換することができる。まれなアミノ酸とは、通常はＦＲでは見出されない、ある位置にある特定のアミノ酸である。本発明の抗ＮＧＦ抗体由来の移植された可変領域は、抗ＮＧＦ抗体の定常領域とは異なる定常領域と共に使用することができる。あるいは、移植された可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移植は、あらゆる目的に対して参考として本明細書に組み入れられる、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，５３０，１０１号などに記載されている。
【０１３８】
本発明の抗体は、好ましくは、マウスの抗体産生細胞に挿入されたヒト抗体産生遺伝子座の実質的な部分を有し、かつ内因性マウス抗体を産生しないようにさらに操作されたトランスジェニックマウスを用いて調製される。このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができ、かつマウス免疫グロブリン分子および抗体を産生しないか、またはこれらを実質的に少ない量で産生する。この結果を達成するために利用される技術は、本明細書に開示された特許、出願、および参考文献に開示されている。好ましい実施形態では、当業者は、あらゆる目的に対して参考として本明細書に組み入れられる、国際特許出願公開第９８／２４８９３号に開示されている方法を利用することができる。また、あらゆる目的に対して参考として本明細書に組み入れられる、Ｍｅｎｄｅｚら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６も参照されたい。
【０１３９】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５）を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原理上は、モノクローナル抗体を作製する他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは腫瘍形成性形質転換を利用することもできる。
【０１４０】
ハイブリドーマの調製に好ましい動物系は、マウスである。マウスにおけるハイブリドーマの産生は、十分に確立されており、免疫化プロトコル、および融合のための免疫化脾細胞の単離技術は、当技術分野で周知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も、公知である。
【０１４１】
好ましい実施形態では、ＮＧＦに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。これらのトランスジェニックマウスは、本明細書では「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれ、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的化変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子に、クラススイッチおよび体細胞変異が起きて、高親和性ヒトＩｇＧ  κモノクローナル抗体が作製される（Ｌｏｎｂｅｒｇら、前出；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ、１９９５、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、全体として参考としてその全容が本明細書に組み入れられる、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎら、１９９３、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ、１９９４、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒら、１９９４、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
６：５７９−５９１；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ、１９９５、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に詳細に記載されている。さらに、全体として参考としてその全容が本明細書に組み入れられる、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号、ならびにＳｕｒａｎｉらによる米国特許第５，５４５，８０７号；１９９３年６月２４日公開の国際特許出願公開第９３／１２２７号；１９９２年１２月２３日公開の国際特許出願公開第９２／２２６４６号；および１９９２年３月１９日公開の国際特許出願公開第９２／０３９１８号を参照されたい。あるいは、以下の実施例に記載されたＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、およびＫＭトランスジェニックマウス株を使用してヒト抗ＮＧＦ抗体を作製することができる。
【０１４２】
本発明は、生物活性ヒトＮＧＦポリペプチドに特異的であって、これを中和するヒトモノクローナル抗体を提供する。また、ＮＧＦポリペプチドに高度に特異的であり、このＮＧＦポリペプチドに結合するとこれを中和する、抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列も提供する。この高い特異性により、抗ヒトＮＧＦヒト抗体および同様の特異性を有するヒトモノクローナル抗体は、ＮＧＦ関連性疾患の有効な免疫療法となり得る。
【０１４３】
一態様では、本発明は、本明細書で提供される４Ｄ４抗体と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する単離されたヒト抗体を提供する。
【０１４４】
一態様では、本発明は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、および７９〜１３０に示されているアミノ酸配列の少なくとも１つを含む単離されたヒト抗体であって、高い親和性でＮＧＦポリペプチドエピトープに結合し、かつＮＧＦポリペプチド活性をアンタゴナイズする能力を有する、抗体を提供する。好ましくは、これらの抗体は、本明細書で提供される４Ｄ４抗体と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する。
【０１４５】
好ましい実施形態では、単離されたヒト抗体は、１×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＮＧＦポリペプチドに結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０でＮＧＦ誘導性生存を阻害する。より好ましい実施形態では、単離されたヒト抗体は、１×１０−１０Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＮＧＦポリペプチドに結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０でＮＧＦ誘導性生存を阻害する。なおさらに好ましい実施形態では、単離された抗ＮＧＦヒト抗体は、１×１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトＮＧＦポリペプチドに結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でＮＧＦ誘導性生存を阻害する。前述の結合および中和の基準を満たす抗ヒトＮＧＦヒト抗体の例が、本明細書に提供される。
【０１４６】
本発明の最も好ましい抗ヒトＮＧＦヒト抗体は、本明細書では４Ｄ４と呼ばれ、それぞれ配列番号１２および配列番号１０に示されているＶＬポリペプチド配列およびＶＨポリペプチド配列を有する。４Ｄ４のＶＬおよびＶＨをコードするポリヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号１１および配列番号９に示されている。本発明の抗ヒトＮＧＦヒト抗体の特性は、実施例に詳細に開示されている。特に顕著な特性は、ＮＧＦポリペプチドに対する高い親和性、および本明細書で実証されるＮＧＦポリペプチド活性をアンタゴナイズする高い能力である。
【０１４７】
抗ヒトＮＧＦヒト抗体の解離定数（ＫＤ）は、実施例９に一般的に記載されるような表面プラズモン共鳴によって決定することができる。一般に、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、リガンド（バイオセンサーマトリックス上に固定された組換えＮＧＦポリペプチド）と分析物（溶液中の抗体）との間のリアルタイムの結合相互作用を測定する。表面プラズモン分析はまた、分析物（バイオセンサーマトリックス上の抗体）を固定して、リガンド（溶液中の組換え体Ｖ）を提示することによっても行うことができる。抗ヒトＮＧＦヒト抗体の解離定数（ＫＤ）は、ＫｉｎＥｘＡ方法論を用いて決定することもできる。本発明の一定の実施形態では、この抗体は、約１０−８Ｍ〜１０−１２ＭのＫＤでＮＧＦに結合する。本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すものとする。本発明のために、ＫＤを、実施例９に示されているように決定した。
【０１４８】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ、またはＩｇＧ４アイソタイプである。好ましくは、この抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。さらに好ましくは、この抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。最も好ましくは、この抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。他の実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＭアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、またはＩｇＤアイソタイプである。本発明の好ましい実施形態では、この抗体は、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖、ヒトＩｇＧ３重鎖、またはヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ２重鎖定常領域を含む本発明の抗体の発現が、以下の実施例に記載されている。特定の実施形態では、この抗体の可変領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ、またはＩｇＧ４アイソタイプの定常領域以外の定常領域に結合する。一定の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローン化されている。
【０１４９】
一定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体の重鎖および軽鎖に対する保存的改変（およびコーディングヌクレオチドに対する対応した改変）は、本明細書に開示されている抗ＮＧＦ抗体の機能的および化学的特徴と類似の特徴を有する抗ＮＧＦ抗体を作製する。対照的に、抗ＮＧＦ抗体の機能的および／または化学的特徴における実質的な改変は、（ａ）置換の領域における分子骨格の構造、例えば、シートもしくはらせんコンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、の維持に対する影響が有意に異なる重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における置換を選択することによって達成することができる。
【０１５０】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、置換位置でのアミノ酸残基の極性または荷電に対する影響が殆どまたは全く存在しないような、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意の天然残基も、「アラニンスキャニング変異誘発」に関して既に記載されているように、アラニンで置換することができる。
【０１５１】
望ましいアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらない）は、このような置換が望まれる時点で当業者によって決定することができる。一定の実施形態では、アミノ酸置換を用いて、抗ＮＧＦ抗体の重要な残基を同定するか、または本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体の親和性を上昇もしくは低下させることができる。
【０１５２】
周知のとおり、アミノ酸配列における小さな変化、例えば、１個、２〜３個、またはさらには数個のアミノ酸の欠失、付加、または置換は、実質的に同一の特性を有する、元のタンパク質の対立遺伝子型をもたらし得る。したがって、本明細書に詳細に記載される抗体に加えて、他の「実質的に相同な」抗体を、当業者に周知の様々な組換えＤＮＡ技術を利用して容易にデザインおよび製造することができる。一般に、遺伝子の改変は、様々な周知の技術、例えば、部位特異的変異誘発よって容易に達成することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示される抗ＮＧＦヒト抗体に実質的に類似した特徴を有する「改変体」または「変異体」の抗ＮＧＦヒト抗体を企図する（例えば、参考として本明細書に組み入れられる、国際公開第００／５６７７２号を参照されたい）。したがって、抗ＮＧＦヒト抗体に関する用語「改変体」または「変異体」は、あらゆる結合分子（分子Ｘ）を意味し、ここで、（ｉ）重鎖の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３または軽鎖の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、全体としてみた場合に、配列番号１４、１８、および２２、または配列番号１６、２０、および２４のそれぞれに示されている超可変領域に対して、少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ましくは少なくとも９５％相同であり、（ｉｉ）改変体または変異体は、分子Ｘのフレームワーク領域と同一のフレームワーク領域を有する参照抗ＮＧＦヒト抗体と同じ程度までヒトＮＧＦの活性を阻害することができる。
【０１５３】
通常、抗ＮＧＦヒト抗体改変体は、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを有し、この重鎖および／または軽鎖ＣＤＲは、全体としてみた場合に、配列番号１４、１８、および２２、ならびに／または配列番号１６、２０、および２４のそれぞれに示されているアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５４】
さらに好ましくは、抗ＮＧＦヒト抗体改変体は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を有し、この軽鎖可変領域は、全体としてみた場合に、配列番号１２、８０、８２、８４、８６、８８、８９、９０、もしくは９１に示されているアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有しており、この重鎖可変領域は、全体としてみた場合に、配列番号１０、８１、８３、８５、もしくは８７に示されているアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５５】
ポリヌクレオチドに関する「改変体」は、本発明のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％の核酸配列同一性を有する核酸分子を指すものとする。通常は、ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に開示される新規な核酸配列と少なくとも約７５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する。
【０１５６】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体に対して一定の割合の同一性を有する抗体、または本明細書の実施例１０および図５〜図１０に示されるように、本発明の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３領域に対して一定の割合の同一性を有する重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３領域を含む抗体を提供する。
【０１５７】
一定の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、かつ重鎖および軽鎖を含む単離されたヒト抗体を提供し、この重鎖は、配列番号１０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、または７５％同一であるアミノ酸配列；配列番号８１に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、または９５％相同であるアミノ酸配列；配列番号８３に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、または９５％同一であるアミノ酸配列；配列番号８５に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、または８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号８７に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、または８０％同一であるアミノ酸配列；配列番号７９に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも５６％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１５８】
一定の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、かつ重鎖および軽鎖を含む単離されたヒト抗体を提供し、この軽鎖は、配列番号１２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、または９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号８０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号８８に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７４％、９０％、または９４％同一であるアミノ酸配列；配列番号８９に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、または８７％同一であるアミノ酸配列；配列番号９０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、または９４％同一であるアミノ酸配列；配列番号９１に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列；配列番号８２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９６％同一であるアミノ酸配列；配列番号８４に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号８６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５９】
一定の他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、かつヒト重鎖ＣＤＲ１を含む単離されたヒト抗体を提供し、この重鎖ＣＤＲ１は、配列番号９８、配列番号１０５、配列番号１１０、もしくは配列番号２２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも４０％または６０％同一であるアミノ酸配列である。
【０１６０】
他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、かつヒト重鎖ＣＤＲ２を含む単離されたヒト抗体を提供し、この重鎖ＣＤＲ２は、配列番号９９に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８２％、または９４％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または７６％同一であるアミノ酸配列；配列番号１８に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも５９％同一であるアミノ酸配列；配列番号１１７に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１１に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、または８０％同一であるアミノ酸配列である。
【０１６１】
なお他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、かつヒト軽鎖ＣＤＲ１を含む単離されたヒト抗体を提供し、このＣＤＲ１は、配列番号１０１に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８０％同一であるアミノ酸配列；配列番号９５に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、または９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１１９に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、または９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、または９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２５に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列；配列番号２４に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、または９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０７に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８０％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１３に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８０％同一であるアミノ酸配列である。
【０１６２】
さらなる実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、かつヒト軽鎖ＣＤＲ２を含む単離されたヒト抗体を提供し、このＣＤＲ２は、配列番号１０２に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号９６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２３に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２９に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号２０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０８に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１３３に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１４に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８５％同一であるアミノ酸配列である。
【０１６３】
他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、かつヒト軽鎖ＣＤＲ３を含む単離されたヒト抗体を提供し、このＣＤＲ３は、配列番号１０３に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号９７に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２１に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２７に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１３０に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１６に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０９に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％または８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１３４に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７８％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１５に示されているアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列である。
【０１６４】
４Ｄ４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列はそれぞれ、配列番号１０および１２に示されている。しかしながら、多くの潜在的なＣＤＲ接触残基は、他のアミノ酸による置換を受けやすいが、なお抗体の抗原に対する実質的な親和性の維持を可能にしている。同様に、重鎖および軽鎖におけるＣＤＲと接触していない多くのフレームワーク残基は、ヒト抗体の親和性または非免疫原性を有意に喪失することなく、ヒトコンセンサスアミノ酸による、他のヒト抗体の対応する位置のアミノ酸での置換、または他のマウス抗体のアミノ酸での置換を有し得る。様々な代替のアミノ酸の選択を用いて、親和性、特異性、非免疫原性、製造の容易さ、および他の望ましい特性の様々な組み合わせを有する、開示された抗ＮＧＦ抗体およびそのフラグメントの型を作製することができる。
【０１６５】
代替の実施形態では、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現させることができる。これらの実施形態では、特定の抗体をコードする配列を適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使用することができる。これらの実施形態によると、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（それぞれが、あらゆる目的に対して参考としてそれらの全容が本明細書に組み入れられる）に例示されているように、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクター）にパッケージングしてウイルス（またはベクター）により宿主細胞に形質導入する方法、または当技術分野で公知のトランスフェクション手順による方法を含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するあらゆる公知の方法を用いて形質転換を達成することができる。一般に、用いられる形質転換手順は、形質転換される宿主によって決まるだろう。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は、当技術分野で周知であり、この方法には、限定されるものではないが、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームにおけるポリヌクレオチド（複数可）の被包、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０１６６】
本発明のＮＧＦ抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、または軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を用いて適切な発現ベクター中に挿入する。好ましい実施形態では、抗ＮＧＦ抗体の重鎖または軽鎖定常領域を、適切な可変領域のＣ末端に付加して、発現ベクターに連結する。このベクターは、典型的には、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、このベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こり得るように、宿主細胞の機構に適合している）。発現ベクターの概観については、ＭＥＴＨ．ＥＮＺ．１８５（Ｇｏｅｄｄｅｌ、編）１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１６７】
典型的には、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミドの維持のため、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローン化および発現のための配列を含む。このような配列は、一定の実施形態では、まとめて「フランキング配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ばれ、典型的には、次のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメント。これらの各配列は、以下に説明する。
【０１６８】
任意選択で、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、抗ＮＧＦ抗体ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含んでも良い；このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス血球凝集素）、またはｍｙｃ（これらには、市販の抗体が存在する）をコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現に際してポリペプチドに融合され、宿主細胞からのＮＧＦ抗体のアフィニティー精製または検出の手段として機能し得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィーによって達成することができる。任意選択で、続いて、タグを、様々な手段、例えば、切断用の一定のペプチダーゼの使用によって、精製された抗ＮＧＦ抗体ポリペプチドから除去することができる。
【０１６９】
フランキング配列は、相同（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源由来のフランキング配列の組み合わせ）、合成、または天然であっても良い。したがって、フランキング配列の供給源は、このフランキング配列が宿主細胞の機構で機能的であり、かつこの宿主細胞の機構によって活性化され得るのであれば、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎生物もしくは無脊椎生物、または任意の植物であっても良い。
【０１７０】
本発明のベクターで有用なフランキング配列は、当技術分野で周知の任意のいくつかの方法によって得ることができる。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピングによって、および／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって既に同定されているため、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織供給源から単離することができる。場合によっては、フランキング配列の全ヌクレオチド配列が公知であり得る。ここでは、フランキング配列は、核酸の合成またはクローン化のために本明細書に記載される方法を用いて合成することができる。
【０１７１】
フランキング配列の全てまたは一部のみが公知であるか否かにかかわらず、フランキング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ならびに／または適切なプローブ、例えば、同種もしくは別種由来のオリゴヌクレオチドおよび／もしくはフランキング配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる。フランキング配列が公知でない場合、フランキング配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列またはさらに別の遺伝子（複数可）を含み得るＤＮＡの大きい断片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡフラグメントを形成し、次いでアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法を用いて単離して達成することができる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者は容易に分かるであろう。
【０１７２】
複製起点は、典型的には、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この複製起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。最適なベクターが複製起点部位を含んでいない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成して、ベクターに連結することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、殆どのグラム陰性細菌に適切であり、様々なウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはパピローマウイルス、例えば、ＨＰＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、多くの場合、単にウイルス初期プロモーターも含むという理由で使用される）。
【０１７３】
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の３’側末端に位置し、転写を終結させる役割を果たす。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、ポリＴ配列が続くＧ−Ｃリッチフラグメントである。この配列は、ライブラリーから容易にクローン化され、またはさらにベクターの一部として市販されているが、核酸合成法、例えば、本明細書に記載の方法を用いて容易に合成しても良い。
【０１７４】
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地で増殖させられる宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する耐性を付与する；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を相補する；あるいは（ｃ）複合培地または既定培地から得ることができない重要な栄養物を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子はまた、原核生物および真核生物宿主細胞の両方で選択に用いることができる。
【０１７５】
他の選択遺伝子を用いて、発現される遺伝子を増幅することができる。増幅とは、増殖または細胞の生存に重要であるタンパク質の産生に必要な遺伝子が、組換え細胞の後続世代の染色体内で縦列に反復されるプロセスである。哺乳動物細胞の適切な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子およびプロモーターのないチミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を、ベクターに存在する選択遺伝子によって形質転換体のみが独自に適合して生存する選択圧力下に置く。選択圧力は、培地中の選択物質の濃度が連続的に上昇する条件下で形質転換細胞を培養することによって課し、これにより、選択遺伝子の増幅、および別の遺伝子、例えば、ＮＧＦポリペプチドに結合する抗体をコードするＤＮＡの増幅の両方がもたらされる。結果として、多量のポリペプチド、例えば、抗ＮＧＦ抗体が、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１７６】
リボソーム結合部位は、通常は、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側および発現されるべきポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。
【０１７７】
場合によって、例えば、真核生物の宿主細胞発現系においてグリコシル化が望ましい場合は、様々なプレ配列またはプロ配列を操作してグリコシル化または収率を改善することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更しても良いし、またはプロ配列（これも、グリコシル化に影響を与え得る）を付加しても良い。最終タンパク質産物は、−１位（成熟タンパク質の第一アミノ酸に対して）に、発現に付随する１つ以上の追加のアミノ酸を有し得、これは、完全に取り除かれなくても良い。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合されたペプチダーゼ切断部位に見られる１つまたは２つのアミノ酸残基を有しても良い。あるいは、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域において切断する場合、いくつかの酵素切断部位の使用により、望ましいポリペプチドの僅かに切断された形態となり得る。
【０１７８】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、抗ＮＧＦ抗体をコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドン（一般に、約１００〜１０００ｂｐ内）に対して上流（すなわち、５’側）に位置する非転写配列であり、構造遺伝子の転写を制御する。プロモーターは、慣習的に次の２つのクラスの内の１つに分類される：誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター。誘導性プロモーターは、培養条件における何らかの変化、例えば、栄養物の有無または温度の変化に応答して、それらの制御下のＤＮＡからの上昇したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、作動可能に連結されている遺伝子を均一に転写する。すなわち遺伝子発現に対する制御が殆どまたは全くない。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、制限酵素消化によって供給源のＤＮＡからプロモーターを除去して、望ましいプロモーター配列をベクターに挿入することによって、本発明の抗ＮＧＦ抗体を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０１７９】
酵母宿主に使用するのに適切なプロモーターも、当技術分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。哺乳動物宿主細胞に使用するのに適切なプロモーターは、周知であり、このようなプロモーターには、限定されるものではないが、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られたプロモーターが含まれる。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
【０１８０】
対象となり得るさらなるプロモーターには、限定されるものではないが：ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｍｓｅｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８１：６５９−６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子由来のプロモーターおよび調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；ならびに原核生物プロモーター、例えば、βラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：２１−２５）が含まれる。同様に、対象となるものは、組織特異性を示し、かつトランスジェニック動物で利用されている次の動物転写制御領域である：膵臓腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞で活性なマウス哺乳動物腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓で活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓で活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞で活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳におけるオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓ���ｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；ならびに視床下部で活性な生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１８１】
高等真核生物による本発明の抗ＮＧＦ抗体を含む軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を上昇させるために、エンハンサー配列をベクターに挿入することができる。エンハンサーは、プロモーターに対して転写を上昇させるように働く、通常は約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、向きおよび位置に比較的依存せず、転写単位の５’および３’の両方の位置に見られる。哺乳動物遺伝子から得ることができるいくつかのエンハンサー配列は公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、およびインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当技術分野で公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベクター内でコード配列の５’または３’のいずれかに位置し得るが、典型的には、プロモーターの５’部位に位置する。
【０１８２】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの開始ベクターから構築することができる。このようなベクターは、望ましいフランキング配列の全てを含んでも含まなくても良い。本明細書に記載されるフランキング配列の１つ以上があらかじめベクターに存在しない場合は、そのフランキング配列を個々に入手してベクターに連結することができる。各フランキング配列を得るために用いた方法は、当業者に周知である。
【０１８３】
ベクターが構築され、軽鎖、重鎖、または抗ＮＧＦ抗体を含む軽鎖および重鎖をコードする核酸分子がこのベクターの適切な部位に挿入されたら、この完全なベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞に挿入することができる。抗ＮＧＦ抗体用の発現ベクターによる選択された宿主細胞の形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、または他の公知の技術を含む周知の方法によって達成することができる。選択される方法は、場合によっては、用いられる宿主細胞の型による。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載されている。
【０１８４】
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、抗ＮＧＦ抗体を合成し、次いでこの抗体を培養培地から（宿主細胞が培地中にこの抗体を分泌する場合）またはこの抗体を産生している宿主細胞から直接（この抗体が分泌されない場合）収集することができる。適切な宿主細胞の選択は、様々な因子、例えば、望ましい発現レベル、活性のために望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さによって決まる。
【０１８５】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当技術分野で周知であり、これには、限定されるものではないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系が含まれ、この不死化細胞系には、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、および多数の他の細胞系が含まれる。一定の実施形態では、どの細胞系が高い発現レベルを有し、かつＮＧＦ結合特性を有する抗体を構成的に産生するのかを決定することにより、細胞系を選択することができる。別の実施形態では、それ自体の抗体を産生しないが、異種の抗体を産生して分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞系を選択することができる。
【０１８６】
本発明の抗体は、生物学的サンプル中のＮＧＦの検出、およびＮＧＦタンパク質を産生する細胞または組織の同定に有用である。ＮＧＦに特異的に結合する本発明の抗体は、ＮＧＦ媒介性疾患の処置に有用であり得る。このような抗体は、ＮＧＦを検出するための結合アッセイ、およびＮＧＦがＮＧＦレセプターとの複合体を形成することを阻害するために使用することができる。ＮＧＦに結合して、他の結合化合物との相互作用を阻止するこのような抗体は、ＮＧＦ媒介性疾患の調節において治療に使用することができる。好ましい実施形態では、ＮＧＦに対する抗体は、そのレセプターに対するＮＧＦ結合を阻止することができ、これによりＮＧＦ誘導性シグナル伝達カスケードの破壊がもたらされ得る。
【０１８７】
本発明はまた、本明細書に開示される任意の１つの障害または状態などの、患者においてＮＧＦの発現の上昇またはＮＧＦに対する感受性の上昇によって引き起こされる疼痛性の障害または状態の処置のための医薬の製造における本発明の１つ以上の抗体の使用にも関する。
【０１８８】
好ましい実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントと共に、治療有効量の１つまたは複数の本発明の抗体を含む薬学的組成物を提供する。好ましくは、許容され得る処方物の材料は、使用される用量および濃度では、レシピエントに対して非毒性である。好ましい実施形態では、治療有効量の抗ＮＧＦ抗体を含む薬学的組成物が提供される。
【０１８９】
一定の実施形態では、許容され得る処方物の材料は、好ましくは、使用される用量および濃度では、レシピエントに対して非毒性である。
【０１９０】
一定の実施形態では、本薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、清澄度、色調、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、組成物の吸着もしくは浸透を改変する、維持する、または保つための処方物の材料を含み得る。このような実施形態では、適切な処方物の材料には、限定されるものではないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）；増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；ならびに他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；着色剤、矯味矯臭薬、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；張度増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤、および／または薬学的アジュバントが含まれる。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編）、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【０１９１】
一定の実施形態では、最適な薬学的組成物は、例えば、意図する投与経路、送達形態、および望ましい用量に応じて当業者によって決定される。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、前出を参照されたい。一定の実施形態では、このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響を与え得る。
【０１９２】
一定の実施形態では、薬学的組成物における主なビヒクルまたはキャリアは、本質的には、水性であっても非水性であっても良い。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用の水、生理学的食塩水、または人工脳脊髄液であり得、場合によっては、非経口投与用の組成物中で一般的な他の材料を補充しても良い。中性緩衝生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ−２０、および／またはこれらの適切な代用物をさらに含んでも良い。本発明の一定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体組成物は、望ましい程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意選択の処方物質（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、前出）と混合することによって貯蔵用に調製することができる。さらに、一定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体産物は、適切な賦形剤、例えば、スクロースを用いて凍結乾燥物として処方しても良い。
【０１９３】
本発明の薬学的組成物は、非経口送達用に選択することができる。あるいは、この組成物は、吸入用、または経口のような消化管を通る送達用に選択することができる。このような薬学的に許容され得る組成物の調製は、当技術分野の技術の範囲内である。
【０１９４】
処方物成分は、好ましくは、投与部位に対して許容され得る濃度で存在する。一定の実施形態では、緩衝剤を用いて、この組成物を生理学的なｐＨ、または僅かに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持する。
【０１９５】
非経口的投与が企図される場合、本発明で使用される治療組成物は、薬学的に許容され得るビヒクル中に望ましい抗ＮＧＦ抗体を含む、発熱物質を含まない非経口的に許容可能な水溶液の形態で提供することができる。非経口注射用に特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、抗ＮＧＦ抗体は、滅菌等張液として処方されて適切に保存される。一定の実施形態では、この調製物は、産物の制御放出または持続放出を提供し得る注射用マイクロスフェア、生分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ酪酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの作用物質を伴った望ましい分子の処方物を含み得る（これは、蓄積注射によって送達され得る）。一定の実施形態では、循環中での持続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸も使用することができる。一定の実施形態では、移植薬物送達デバイスを用いて、望ましい抗体分子を導入することができる。
【０１９６】
本発明の薬学的組成物は、吸入用に処方することができる。これらの実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は、吸入可能な乾燥粉末として有利に処方される。好ましい実施形態では、抗ＮＧＦ抗体吸入溶液も、エアロゾル送達用の推進剤とともに処方することができる。一定の実施形態では、溶液は噴霧することができる。したがって、肺投与および処方方法は、参考として本明細書に組み入れられる、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達が記載された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載されている。
【０１９７】
処方物を経口投与できることも意図される。この様式で投与される抗ＮＧＦ抗体は、固体投薬形態、例えば、錠剤およびカプセルの調合に習慣的に用いられるキャリアと共に、またはそれなしで処方することができる。一定の実施形態では、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大であり、かつ前全身分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小であるときに、胃腸管のある部位でこの処方物の活性部位を放出するようにデザインすることができる。抗ＮＧＦ抗体の吸収を促進するためにさらなる作用物質を含んで良い。希釈剤、矯味矯臭薬、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用することができる。
【０１９８】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、１または複数の抗ＮＧＦ抗体の有効量が、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に含まれるように提供される。滅菌水、または別の適切なビヒクルに錠剤を溶解することにより、単位用量形態で溶液を調製することができる。適切な賦形剤には、限定されるものではないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウム；または結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、もしくはアカシア；または潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクが含まれる。
【０１９９】
さらなる薬学的組成物は、当業者には明らかであり、このような薬学的組成物には、持続送達または制御送達処方物中に抗ＮＧＦ抗体を含む処方物が含まれる。様々な他の持続送達または制御送達手段、例えば、リポソームキャリア、生分解性微粒子もしくは多孔質ビーズ、および蓄積注射剤を処方する技術も当業者には公知である。例えば、参考として本明細書に組み入れられる、薬学的組成物の送達用の多孔質ポリマー微粒子の制御放出が記載された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい。持続放出調製物は、成形製品の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えばフィルムまたはマイクロカプセルを含み得る。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（それぞれ参考として本明細書に組み入れられる、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第０５８４８１号に開示されている）、Ｌグルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、前出）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号）が含まれ得る。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知の任意のいくつかの方法によって調製することができるリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号；同第０８８，０４６号および同第１４３，９４９号（参考として本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される薬学的組成物は、典型的には、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通る濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能な栓を備えたバイアルに入れられる。
【０２０１】
薬学的組成物が処方されたら、この薬学的組成物を、溶液、懸濁物、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として滅菌バイアル内に保存することができる。このような処方物は、すぐに使える形態、または投与の前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。
【０２０２】
本発明はまた、単一用量投与単位を作製するためのキットも提供する。本発明のキットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性処方物を有する第２の容器の両方を備え得る。本発明の一定の実施形態では、単一および複数チャンバを備えた充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
【０２０３】
治療に使用される抗ＮＧＦ抗体含有薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の事情および目的によって決まる。当業者であれば、処置に適切な用量のレベルは、ある程度は、送達される分子、抗ＮＧＦ抗体が使用される適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、または器官のサイズ）および／または状態（年齢および全身の健康状態）によって異なることを理解できよう。一定の実施形態では、最適の治療効果を得るために、臨床医は、用量を漸増（ｔｉｔｅｒ）し、投与経路を変更することができる。典型的な用量は、上述の因子によって、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。好ましい実施形態では、用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ；またはさらに好ましくは５μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２０４】
一定の実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与することができる。上記のように、投与量は、臨床医が決定することができるが、一定の実施形態では、皮下注射によって投与される組成物中のＮＧＦ抗体の薬学的有効量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体の薬学的有効量は、皮下注射に付き約３ｍｇ〜約３０ｍｇである。一定の実施形態では、投与は、複数回の皮下注射を含む。なお他の実施形態では、投与は、単回皮下注射を含む。
【０２０５】
投与頻度は、使用される処方物中の特定の抗ＮＧＦ抗体の薬物動態パラメーターによって決まる。典型的には、臨床医は、望ましい効果を達成する用量が得られるまで組成物を投与する。したがって、この組成物は、単回投与として、もしくはある時間にわたる２回以上の投与（同じ量の望ましい分子を含んでも含まなくても良い）として、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した連続注入として、投与しても良い。適切な用量のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、これは、当業者によって日常的に行われる作業の範囲内である。適切な用量は、適切な用量応答データを使用して確定することができる。一定の実施形態では、本発明の抗体は、長期間にわたって患者に投与することができる。本発明の抗体の慢性投与により、非ヒト動物においてヒト抗原に対して惹起される抗体、例えば、非ヒト種で産生される不完全ヒト抗体に一般に関連する有害な免疫応答またはアレルギー応答が最小限になる。
【０２０６】
薬学的組成物の投与経路は、既知の方法に合致し、例えば、経口的、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射；持続放出システムまたは移植デバイスによる。一定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって投与するか、もしくは注入によって連続的に投与するか、または移植デバイスによって投与することができる。
【０２０７】
この組成物はまた、望ましい分子が吸着されたかまたは被包された膜、スポンジまたは別の適切な材料の移植によって局所投与することもできる。移植デバイスが使用される一定の実施形態では、移植デバイスは、任意の適切な組織または器官に移植することができ、望ましい分子の送達は、拡散、時限式放出ボーラス、または連続的投与によって行うことができる。
【０２０８】
一定の実施形態では、本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）の発現の上昇またはＮＧＦに対する感受性の上昇によって引き起こされる状態を処置する方法であって、患者に薬学的有効量のＮＧＦ抗体を、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内、もしくは皮下経路による注射によって、持続放出システムによってまたは移植デバイスによって、投与する工程を含み、この状態は、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、術後疼痛、切断もしくは膿瘍による疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、がん、慢性アルコール中毒、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的な頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合血管症候群もしくは非血管症候群、緊張性頭痛、一般的な炎症、関節炎、リウマチ病、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚病訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症状態、炎症性疼痛ならびにこれに関連した痛覚過敏および異痛、神経障害疼痛ならびにこれに関連した痛覚過敏および異痛、糖尿病性神経障害疼痛、カウザルギー、交感神経によって維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織の損傷もしくは機能不全、単純ヘルペス、呼吸領域、尿生殖器領域、胃腸領域、もしくは血管領域における内臓運動の不調、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、そう痒、白斑、一般的な胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または内臓痛である、方法に関する。
【０２０９】
一定の実施形態では、本方法は、薬学的有効量のＮＧＦ抗体を含み、変形性関節症膝疼痛の処置または防止に有用である。一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体の薬学的有効量は、皮下注射当たり約３ｍｇ〜約３０ｍｇである。一定の実施形態では、投与は、複数回の皮下注射を含む。ある実施形態では、投与は、単回皮下注射を含む。一定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、配列番号４４を含む軽鎖を有するＮＧＦ抗体を含む。一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、配列番号４０を含む重鎖を含む。さらなる実施形態では、ＮＧＦ抗体は、配列番号４４を含む軽鎖および配列番号４０を含む重鎖を含む。
【０２１０】
したがって、本発明の上記説明によると、様々な態様では、本発明は、配列番号４４を含む軽鎖および配列番号４０を含む重鎖を含むＮＧＦ抗体を含む方法および組成物であって、この抗体の重鎖および軽鎖がフレキシブルリンカーによって連結されて単鎖抗体を形成している、方法および組成物に関する。この態様の一部の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２抗体、完全ヒト抗体、および／またはヒト化抗体を含む。この態様の一部の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦのシグナル伝達を阻害する。
【０２１１】
この態様の一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、約１×１０−９以下、約１×１０−１０以下、または約１×１０−１１以下のＫＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離する。この態様の一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約１×１０−８以下、約１×１０−９以下、または約０．２×１０−９以下のＩＣ５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する。一定の実施形態では、ＮＧＦ抗体は、上述のＫＤ値（複数可）でヒトＮＧＦポリペプチドから解離し、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて上述のＩＣ５０値でヒトＮＧＦ生物活性を中和する。
【０２１２】
本発明による抗ＮＧＦ抗体の薬学的組成物をｅｘ  ｖｉｖｏで使用することも望ましいであろう。このような場合、患者から取り出された細胞、組織、または器官を抗ＮＧＦ抗体の薬学的組成物に曝露し、次いでその細胞、組織、および／または器官を患者に移植して戻す。
【０２１３】
具体的には、抗ＮＧＦ抗体は、本明細書に記載される方法などの方法を用いてポリペプチドを発現して分泌するように遺伝子操作された一定の細胞を移植することによって送達することができる。一定の実施形態では、このような細胞は、動物細胞でもヒト細胞でも良く、自家、異種、またはゼノジニック（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であっても良い。一定の実施形態では、細胞は不死化することができる。他の実施形態では、免疫学的応答の可能性を低下させるために、細胞を被包して、周囲組織の浸潤を回避することができる。さらなる実施形態では、被包材料は、典型的には、タンパク質産物（複数可）の放出は可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する生体適合性の半透性ポリマーのエンクロージャー（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）または膜である。
【実施例】
【０２１４】
行った実験および得られた結果を含む以下の実施例は、単なる例示目的のために示すものであり、本発明を限定すると解釈するべきではない。
【０２１５】
（実施例１）
（大腸菌細胞からのヒトＮＧＦタンパク質の生産）
（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１〜１２０）のクローン化）
ヒトＮＧＦをコードするヌクレオチド配列を、配列番号２７および配列番号２８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーならびに標準的なＰＣＲ技術を用いてｃＤＮＡから増幅した。５’プライマーは、成熟配列のコドン１（セリン）の直前にＮｄｅＩ制限部位およびメチオニン開始コドンを形成する。３’プライマーは、終止コドンの直後にＢａｍＨＩ制限部位を形成する。得られたＰＣＲ産物を、ゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、同様にＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化されたベクターｐＣＦＭ１６５６に連結した。連結されたＤＮＡで、大腸菌株６５７のコンピテント宿主細胞を形質転換した。組換えタンパク質産物を産生する能力、および正確なヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２９）を有するプラスミドを保有する能力について、クローンをスクリーニングした。組換えヒトＮＧＦ１〜１２０のアミノ酸配列は、配列番号３０に示されている。
【０２１６】
発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ♯６９５７６）を、米国特許第４，７１０，４７３号に記載されている発現ベクター系から得た。ｐＣＦＭ１６５６プラスミドは、（ａ）Ｔ４ポリメラーゼ酵素での末端の充填、これに続く平滑末端ライゲーションによって２つの内因性ＮｄｅＩ制限部位を破壊し；（ｂ）合成ＰＬプロモーターを含む唯一のＣｌａＩ制限部位とＡａｔＩＩ制限部位との間のＤＮＡ配列を、ＰＬプロモーターを含むｐＣＦＭ６３６（米国特許第４，７１０，４７３号）から得た同様のフラグメントで置換し、次いで（ｃ）唯一のＣｌａＩ制限部位とＫｐｎＩ制限部位との間の小さいＤＮＡ配列を、配列番号３１および配列番号３２に示されているヌクレオチド配列を有する２つのプローブのアニーリングから得たオリゴヌクレオチドで置換することによって、記載されたｐＣＦＭ８３６プラスミド（米国特許第４，７１０，４７３号）から得ることができる。
【０２１７】
大腸菌Ｋ１２宿主株（Ａｍｇｅｎ株６５７）は、大腸菌Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ（ＣＧＳＣ株６１５９）から得た大腸菌Ｗ１４８５（Ｋ１２株）の誘導体である。
【０２１８】
（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１〜１２０）の発現）
ＮＧＦ発現構築物（上記のような）を含む大腸菌細胞を、流加様式で富栄養培地で発酵させた。細胞を、６００ｎｍでのＯＤが４９になるまで３０℃で増殖させ、次いで４２℃に温度を変更することによって誘導した。細胞を、誘導の４時間後に遠心分離によって収集した。最終ＯＤは、７５であった。発現収率は、約０．１５ｇ／Ｌであることが決定された。
【０２１９】
（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１〜１２０）のリフォールディングおよび精製）
細胞ペーストを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒで溶解させ、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを１％のデオキシコール酸で洗浄し、上記のように遠心分離し、次いで得られたペレットを冷水で洗浄して再び遠心分離した。得られたペレット（ＷＩＢ−洗浄された封入体）を、変性剤（８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５（１０ｍＭ  ＤＴＴ含有））で再懸濁し、室温で１時間可溶化し、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、その上清を注意深くデカントし、次いで４℃のレドックス対を含む水性緩衝液で２５倍に希釈して５日間置いた。次いで、得られたリフォールディング物を、ｐＨ３．０にまでｐＨ調整し（ｔｉｔｒａｔｅ）、０．４５μＭのフィルターに通して濾過した。このリフォールディング物を、標準的なＮａＣｌ勾配を用いるＳｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラムで精製した。続いて、陽イオン交換カラムからのプールを濃縮し、アリコートを−８０℃で凍結させた。このタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価し、クマーシーブルー染色によって分析した。精製されたタンパク質は、この方法によると、主バンドが９０％を超えていた。
【０２２０】
（実施例２）
（神経成長因子（ＮＧＦ）に対するヒトモノクローナル抗体の生産）
（トランスジェニックＨｕＭａｂおよびＫＭマウス）
ＮＧＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体を、それぞれがヒト抗体遺伝子を発現する、トランスジェニックマウスのＨＣｏ７株、ＨＣｏ１２株、ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２株、およびＫＭ株を用いて調製した。これらのマウス株のそれぞれでは、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎら（１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）に記載されているようにホモ接合性に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、国際特許出願公開第０１／０９１８７号（参考として組み入れられる）の実施例１に記載されているようにホモ接合性に破壊されていた。これらの各マウス株は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）に記載されているようにヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を有する。ＨＣｏ７株は、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、および同第５，５４５，８０７号（参考として組み入れられる）に記載されているようにＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ１２株は、国際特許出願公開第０１／０９１８７号（参考として組み入れられる）の実施例２に記載されているようにＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２株は、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２の両方の重鎖導入遺伝子を有し、それぞれの導入遺伝子に対して半接合性である。ＫＭマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６，１３３−１４３および２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９７，７２２−７２７）に記載されているようにＳＣ２０重鎖導入遺伝子を含む。この導入遺伝子は、マウス染色体には組み込まれないが、代わりに独立した染色体フラグメントとして増殖させられる。このフラグメントは、約１５ＭＢのヒト第１４染色体を含む。これは、全てのＶＨ、Ｄ、およびＪＨ遺伝子セグメントならびに全ての重鎖定常領域アイソタイプを含むヒト重鎖遺伝子座全体を含む。全てのこれらの株は、本明細書ではＨｕＭａｂマウスと呼ばれる。
【０２２１】
（ＨｕＭａｂ免疫化）
ＮＧＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、ＨｕＭａｂマウスを、抗原として大腸菌細胞由来の精製組換えＮＧＦを用いて免疫化した（実施例１）。ＨｕＭａｂマウスの一般的な免疫化スキームは、Ｌｏｎｂｅｒｇらに記載されている（それぞれの教示が参考として本明細書に組み入れられる、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、前出、および国際特許出願公開第９８／２４８８４号）。マウスは、抗原の最初の注入に際し、６〜１６週齢であった。ＮＧＦ抗原の精製組換え調製物（２５〜１００μｇ）を用いて、ＨｕＭａｂマウスを腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）で免疫化した。
【０２２２】
ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスの免疫化は、完全フロイントアジュバント中の抗原、２回の注射、次いで不完全フロイントアジュバント中の抗原を用いた２〜４週間のＩＰ免疫化（最大で合計９回の免疫化）を用いて行った。数ダースのマウスをそれぞれの抗原に対して免疫化した。ＨＣｏ７株、ＨＣｏ１２株、ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２株、およびＫＭ株の合計１１８匹のマウスをＮＧＦ抗原で免疫化した。免疫応答を、眼窩後からの採血によってモニタリングした。
【０２２３】
ヒトＮＧＦに結合する抗体を産生するＨｕＭａｂマウスを選択するために、免疫化マウス由来の血清を、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、前出、によって記載されているようにＥＬＩＳＡによって試験した。簡単に述べると、マイクロタイタープレートを、１〜２μｇ／ｍＬの大腸菌由来の精製組換えＮＧＦ（実施例１）を含むＰＢＳで、５０μＬ／ウェルで、４℃で一晩インキュベートしてコーティングし、次いで５％ニワトリ血清を含むＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で、１ウェルに付き２００μＬでブロッキングした。ＮＧＦ免疫化マウス由来の血漿希釈物を、各ウェルに添加して、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬とともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ａ−１８８８、０．２２ｍｇ／ｍＬ）を用いて発色（ｄｅｖｅｌｏｐ）させ、４１５〜４９５ｎｍの波長で光学密度（ＯＤ）を決定することによって分光光度法で分析した。抗ＮＧＦヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを用いて、下記のようにモノクローナル抗体を作製した。
【０２２４】
（ＮＧＦに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製）
モノクローナル抗体産生用のマウスを調製し、屠殺の２日前に抗原で静脈内に追加免疫を行い、その後に脾臓を取り出した。ＨｕＭａｂマウスからマウス脾細胞を単離して、標準的なプロトコルを用いてＰＥＧでマウス骨髄腫細胞系に融合した。典型的には、各抗原に対して１０〜２０の融合を行った。
【０２２５】
簡単に述べると、免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁物を、５０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、アクセッション番号ＣＲＬ１５８０）の総数の４分の１に融合させた。細胞を、平底マイクロタイタープレートの１ウェルに付き約１×１０５でプレーティングし、続いて１０％ウシ胎仔血清、１０％Ｐ３８８Ｄ１−（ＡＴＣＣ、アクセッション番号ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３）馴化培地、３〜５％ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）を含むＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＲＬ１００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含む）、ならびに５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＣＲＬ  Ｐ−７１８５）を含む選択培地で約２週間インキュベートした。１〜２週後、細胞を、ＨＡＴをＨＴで置換した培地で培養した。
【０２２６】
得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。個々のウェルを、ヒト抗ＮＧＦモノクローナルＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡ（上記）によってスクリーニングした。広範囲にわたるハイブリドーマの増殖が起きたら、通常は１０〜１４日後に、培地をモニタリングした。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティング（ｒｅｐｌａｔｅ）し、再びスクリーニングし、依然としてヒトＩｇＧに対して陽性である場合は、抗ＮＧＦモノクローナル抗体を、限界希釈法によって少なくとも２回サブクローン化した。次いで、安定なサブクローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して、特徴づけのために組織培養培地で少量の抗体を産生させた。
【０２２７】
（ＮＧＦに結合するヒトモノクローナル抗体の選択）
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＮＧＦ免疫原で陽性反応性を示すハイブリドーマをスクリーニングした。ＮＧＦに対して高い結合活性で結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをサブクローン化してさらに特徴付けた。液体窒素中に保存する５〜１０のバイアルの細胞バンクを作るために、親細胞の反応性を維持している（ＥＬＩＳＡによって決定）各ハイブリドーマ由来の１つのクローンを選択した。
【０２２８】
アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡを行って、本明細書に開示されるように作製したモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。これらの実験では、マイクロタイタープレートウェルを、１μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトκ軽鎖を含むＰＢＳ溶液で、１ウェルに付き５０μＬでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。５％ニワトリ血清でブロッキングした後、プレートを、各試験したモノクローナル抗体の上清および精製されたアイソタイプコントロールと反応させた。プレートを、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。次いで、ウェルを、様々なヒトＩｇＧ特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ヒトポリクローナル抗血清と反応させ、プレートを発色させ、そして上記のように分析した。
【０２２９】
ＥＬＩＳＡによって検出される、ＮＧＦに対する有意な結合性を示したハイブリドーマ上清から精製したモノクローナル抗体を、下記のような様々なバイオアッセイを用いて生物学的活性についてさらに試験した。
【０２３０】
（実施例３）
（強力なＮＧＦ中和活性を有する抗ＮＧＦ抗体の選択およびクローン化）
ＮＧＦ活性のインヒビターとして（すなわち、ＮＧＦ「中和」）、実施例２で最初に同定された抗体の有効性を、それぞれの改変されたペプチドが、バニロイドレセプター−１（ＶＲ１）発現のＮＧＦ誘導を阻止する能力を測定することによって評価した。
【０２３１】
（後根神経節ニューロン培養）
時期を見て妊娠させた、終末麻酔したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の子宮から外科的に取り出した、胎齢１９日（Ｅ１９）のラットの全ての脊髄分節から、無菌条件下で後根神経節（ＤＲＧ）を１つずつ切り離した。５％熱不活化ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含む氷冷Ｌ−１５培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）にＤＲＧを集め、任意の疎性結合組織および血管を取り除いた。ｐＨ７．４の、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で、ＤＲＧを２回リンスした。次いで、ＤＲＧを、パパイン解離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を用いて単一細胞懸濁物へと解離させた。簡単に述べると、ＤＲＧを、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）において２０Ｕ／ｍＬのパパインを含む消化溶液中、３７℃で５０分間インキュベートした。１：１のＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、１ｍｇ／ｍＬオボムコイドインヒビター、および１ｍｇ／ｍｌオボアルブミン、および０．００５％デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）からなる解離培地中で、先端熱加工（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ）パスツールピペットを用いたすりつぶしによって細胞を解離させた。
【０２３２】
解離した細胞を、５分間、２００×ｇでペレット化し、１ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１ｍｇ／ｍＬのオボアルブミン、および０．００５％ＤＮａｓｅを含むＥＢＳＳで再懸濁した。細胞懸濁物を、１０ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１０ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンを含む勾配溶液で、２００×ｇで６分間遠心分離して細胞デブリを除去し、次いで８８μｍのナイロンメッシュ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に通して濾過して全ての凝集塊を除去した。血球計数器を用いて細胞数を決定し、細胞を、完全培地中、１０×１０３細胞／ウェルで、ポリ−オルニチン１００μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびマウスラミニン１μｇ／ｍＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）でコーティングした９６ウェルプレートに入れた。この完全培地は、１：１の最小必須培地（ＭＥＭ）およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、および１０％熱不活化ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）から構成された。この培養物を、３７℃、５％ＣＯ２、および１００％の湿度で維持した。非ニューロン細胞の増殖を制御するために、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（７５μＭ）およびウリジン（１８０μＭ）を培地に含めた。
【０２３３】
（ＮＧＦおよび抗ＮＧＦを用いた処置）
プレーティングの２時間後に、細胞を、組換えヒトβ―ＮＧＦ（Ａｍｇｅｎ）または組換えラットβ−ＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で、１０ｎｇ／ｍＬの濃度（０．３８ｎＭ）で処理した。連続希釈した抗ＮＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む陽性コントロールを、それぞれの培養プレートに適用した。試験抗体を、３．１６倍の連続希釈法を用いて１０個の濃度で添加した。全てのサンプルを、培養物に添加する前に完全培地で希釈した。インキュベーション時間は、ＶＲ１発現の測定の前の４０時間とした。
【０２３４】
（ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１発現の測定）
培養物を、４％パラホルムアルデヒドを含むハンクス平衡塩溶液で１５分間固定し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でブロッキングし、０．２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて室温で１時間、透過処理した。培養物を、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳで１回リンスし、ウサギ抗ＶＲ１  ＩｇＧと共に室温で１時間半インキュベートし、続いてＥｕ標識した抗ウサギ二次抗体（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）と共に室温で１時間インキュベーションした。それぞれの抗体のインキュベーション後に、ＴＢＳで洗浄した（ゆっくり振盪しながら３×５分）。増強溶液（１５０μＬ／ウェル、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ）を培養物に添加した。次いで、蛍光シグナルを、時間分解蛍光光度計（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ）で測定した。改変ペプチドで処理したサンプル中のＶＲ１発現を、０〜１０００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ漸増標準曲線と比較することによって決定した。ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１発現に対するＮＧＦ効果の阻害パーセント（最大可能阻害と比較）を、ＮＧＦ処理されていないコントロールと比較することによって決定した。結果を表２および表５に示す。
【０２３５】
細胞系に、♯１１０〜♯１２９のラベルを付けた。細胞系♯１１９、♯１２４、および♯１２５由来の抗体は、非常に強力なＮＧＦ中和活性を実証した（図１）。♯１２４細胞系は、４Ｄ４とも呼ばれる親細胞系であった。♯１１９および♯１２５細胞系は、４Ｄ４親のサブクローンであった。ハイブリドーマ♯１２４（４Ｄ４）を含むもともとのバイアルからさらなるサンプルを増殖させて、♯１６７（４Ｄ４）のラベルを付けた。
【０２３６】
ハイブリドーマ♯１６７（４Ｄ４）によって産生された抗体を、前のサンプルと同じＤＲＧニューロンベースのＮＧＦ中和アッセイに供した。抗体♯１６７（４Ｄ４）は、ＩＣ５０が０．５０ｎＭの強力な抗ＮＧＦ活性を実証し（図２）、これは、サンプル♯１１９、♯１２４、および♯１２５の活性に一致する。４つのサンプルの活性を表２に示す。
【０２３７】
【表２】
2014169326.tif 000003
（Ｎ末端配列決定および質量分析）
精製した抗ＮＧＦハイブリドーマ抗体サンプルを、タンパク質の配列決定およびＬＣ／ＭＳ分析のために調製した。容積が１５ｍＬ未満になるまでＡｍｉｃｏｎ  ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０を用いて培地を濃縮することにより、抗体を馴化培地から精製した。ｒＰｒｏＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）レジンのバッチを、ＰＢＳで４回洗浄し、最後の洗浄の後にＰＢＳで５０％スラリーを形成した。適切な量のｒＰｒｏＡレジン（レジン１μＬあたり約５μｇの抗体であるが、少なくとも５０μＬのレジンを使用する）を、抗体サンプルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。Ａｂ−レジン混合物を遠心分離し、未結合の画分を収集した。０．５ｍＬ  ＰＢＳを添加して０．４５μｍ  Ｓｐｉｎ−Ｘ（ＣｏＳｔａｒ）管に移した後、サンプルを１００００ｒｐｍで３分間遠心分離した。次に、レジンを０．５ｍＬ  ＰＢＳで少なくとも３回洗浄し、次いで０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．７）をレジンの１．５倍量で添加し、室温で１０分間インキュベートし、続いて１００００ｒｐｍで３分間さらに遠心分離し、上清を収集した。この溶出工程をさらに２回繰り返し、次いで合わせた上清を、１／２５倍量の１．０Ｍ  ｔｒｉｓ（ｐＨ９．２）で中和した。
【０２３８】
新たなＳｐｉｎ−Ｘ管（０．２μｍ）を用いた最終濾過工程の後、標準としてヒトＩｇＧを用いる標準Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて、または大きいサンプルには代替として２８０の吸光度を用いて、抗体を定量化した。またゲルを、２μｇの各サンプルと共に２μｇのヒトＩｇＧ１，ｋ（Ｓｉｇｍａ）を用いて泳動させた。質量分析のために、４μｇのサンプルを脱グリコシル化し、還元し、Ｆｉｎｉｎｇａｎ  ＬＣＱ質量分析にオンライン接続されたＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０）にロードした。軽鎖を、逆相ＨＰＬＣによって重鎖から分離した。また軽鎖および重鎖を、Ｎ末端タンパク質配列決定分析のために収集した。
【０２３９】
抗ＮＧＦ♯１６７（４Ｄ４）抗体のサンプルの軽鎖および重鎖の両方のＮ末端配列が、抗ＮＧＦ♯１１９（４Ｄ４）抗体のサンプルの両方のＮ末端配列に一致した。加えて、抗体の測定質量により、♯１６７および♯１１９ハイブリドーマ由来の単離された抗体が同じであることが示された。抗ＮＧＦ♯１６７の軽鎖の測定デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）質量（２３０９６）は、抗ＮＧＦ  Ａｂ♯１１９の軽鎖の測定質量（２３０９６）に一致した。
【０２４０】
（抗ＮＧＦ抗体の重鎖および軽鎖のクローン化）
最も強力なＮＧＦ結合モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ、４Ｄ４．Ｄ７を供給源として使用して、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、伸長アダプター（５’−ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＮ  ＮＮＮ  ＮＮＴ−３’）（配列番号３３）と共にランダムプライマーを用いて合成し、次いで５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）調製アッセイ（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ）を、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造業者の取扱説明書にしたがって行った。完全な軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、順方向プライマーを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭネスト化プライマーとし、逆方向プライマーを、５’−ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＡＧＧ−３’（配列番号３４）とした。重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを調製するために、順方向プライマーを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭネスト化プライマーとし、逆方向プライマーを、５’−ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＣＡＣ  Ｇ−３’（配列番号３５）とした。ＲＡＣＥ産物を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、その配列を決定した。コンセンサス配列を用いて、完全長の抗体鎖ＰＣＲ増幅用のプライマーをデザインした。
【０２４１】
抗ＮＧＦ４Ｄ４．Ｄ７κ軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、５’ＰＣＲプライマーは、シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限酵素部位、および最適化Ｋｏｚａｋ配列（５’−ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ−３’；配列番号３６）をコードした。３’プライマーは、カルボキシル末端および終止コドン、ならびにＳａｌＩ制限部位（５’−ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ
ＴＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  Ｃ−３’；配列番号３７）をコードした。得られたＰＣＲ産物のフラグメントを精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、次いでゲル単離し、哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲα２０に連結した（あらゆる目的に対して参考として本明細書に組み入れられる国際特許出願公開第９０／１４３６３号を参照されたい。ｐＤＳＲα２０は、部位特異的変異誘発によってｐＤＳＲａ１９のヌクレオチド２５６３を「グアノシン」から「アデノシン」に変更することによって作製した）。
【０２４２】
抗ＮＧＦ  ４Ｄ４．Ｄ７重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、５’ＰＣＲプライマーは、シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限酵素部位、および最適化Ｋｏｚａｋ配列（５’−ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  Ｔ−３’；配列番号３８）をコードした。３’プライマーは、カルボキシル末端および終止コドン、ならびにＳａｌＩ制限部位（５’−ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  Ｇ−３’；配列番号３９）をコードした。得られた産物を精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、ゲル単離し、ｐＤＳＲα２０ベクターに連結した。
【０２４３】
抗ＮＧＦ  Ａｂ  ４Ｄ４クローンの軽鎖のＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を予測されるアミノ酸に翻訳して、そのアミノ酸の分子量を合算することによって決定した計算質量（２３０９９）は、質量分析によって決定された測定質量に一致した。抗ＮＧＦ  Ａｂ♯１６７の重鎖の測定されたデコンボリューション質量（４９４７９）は、機器によるずれの範囲内で、抗ＮＧＦ  Ａｂ♯１１９の重鎖の測定質量（４９４８４）に一致し、さらに抗ＮＧＦ  Ａｂ  ４Ｄ４クローンの重鎖のＤＮＡ配列の理論質量（４９４８４）に一致した（表３）。
【０２４４】
Ｎ末端のタンパク質配列およびＬＣ／ＭＳのデータにより、ハイブリドーマ♯１１９がハイブリドーマ♯１６７と同じ抗体を発現したことが確認された。加えて、配列に基づいた抗体の計算質量により、この観察結果がさらに確認された。
【０２４５】
【表３】
2014169326.tif 000004
（実施例４）
（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における抗ＮＧＦ抗体の発現）
４Ｄ４抗ＮＧＦ  ｍＡｂの安定な発現を、リン酸カルシウム法を用いた、４Ｄ４−重鎖／ｐＤＳＲα１９  ＩｇＧ２または４Ｄ４重鎖／ｐＤＳＲα１９  ＩｇＧ１およびＮＧＦ−κ／ｐＤＳＲα１９プラスミドの、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（ＤＨＦＲ−）無血清適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への共トランスフェクションによって達成した。トランスフェクト細胞を、透析血清を含むがヒポキサンチン−チミジンを含まない培地で選択して、ＤＨＦＲ酵素を発現する細胞の増殖を確認した。トランスフェクトクローンを、アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡでスクリーニングして、馴化培地中における４Ｄ４抗ＮＧＦ  ｍＡｂの発現を検出した。発現が最大のクローンに対して、ＤＨＦＲ増幅のためにメトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度を上昇させた。馴化培地中における４Ｄ４抗ＮＧＦ  ｍＡｂのさらに高い発現を検出するために、ＭＴＸ増幅クローンを、アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。発現が最大のクローンを、サブクローン化に供して均一な集団を得て、細胞バンクを作製した。
【０２４６】
本発明の組換え抗ＮＧＦ抗体を、抗ＮＧＦモノクローナル抗体用の上記のプロトコルと同じプロトコルを用いて、ＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞において作製することができる。本発明の各抗ＮＧＦ抗体の完全な重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターにクローン化する。ＣＨＯｄ−細胞を、適切な抗ＮＧＦ抗体の完全な重鎖を発現できる発現ベクターおよび完全な軽鎖を発現できる発現ベクターを用いて共トランスフェクトする。例えば、抗ＮＧＦ抗体を作製するために、配列番号４０に示されているアミノ酸配列を含む完全な重鎖を発現できるベクターおよび配列番号４４に示されているアミノ酸配列を含む完全な軽鎖を発現できるベクターを用いて細胞を共トランスフェクトする。表４は、様々なＩｇＧの重鎖定常領域を有する４Ｄ４抗体についての完全な重鎖および完全な軽鎖のまとめである。
【０２４７】
【表４】
2014169326.tif 000005
（実施例５）
（抗ＮＧＦ  ４Ｄ４抗体の活性の特徴付け）
スピナー（Ｓ）またはローラー（Ｒ）の条件下で増殖した細胞で作製された、一過性発現抗ＮＧＦ  ４Ｄ４抗体を、上記（実施例３）のように行われるＤＲＧニューロンベースのＮＧＦ中和バイオアッセイにおいて、ＮＧＦを中和する能力を確認するために試験した。
【０２４８】
ＮＧＦ抗体は、無血清懸濁適応２９３Ｔ細胞で一過性に発現された。５００ｍＬまたは１Ｌの培養物のいずれかとしてトランスフェクションを行った。手短に述べると、細胞接種物（５．０×１０５細胞／ｍＬ×培養容積）を２，５００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離して馴化培地を除去した。細胞を、無血清ＤＭＥＭで再懸濁し、再び２，５００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離した。洗浄液を吸引した後、細胞を、１Ｌまたは３Ｌのスピナーフラスコ培養における増殖培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）＋１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム補充物＋１×Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ  Ｇｌｕｔ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．０１％  プルロニック  Ｆ６８］で再懸濁した。スピナーフラスコ培養物を、３７℃および５％ＣＯ２に維持される加湿インキュベーターに入れられた磁気撹拌プレート上で１２５ＲＰＭで維持した。プラスミドＤＮＡを、５０ｍＬコニカルチューブ内でトランスフェクション試薬と複合体化させた。ＤＮＡ−トランスフェクション試薬複合体を、無血清ＤＭＥＭ中、５％最終培養容積において調製した。培養物１ｍＬ当たり１μｇのプラスミドＤＮＡを、まず無血清ＤＭＥＭに添加し、続いて培養物１ｍＬ当たり１μＬのＸ−ＴｒｅｍｅＧｅｎｅ  ＲＯ−１５３９を添加した。この複合物を、室温で約３０分間インキュベートし、次いでスピナーフラスコの細胞に添加した。トランスフェクション／発現を７日間行った後、この馴化培地を、４，０００ＲＰＭ、４℃の６０分間の遠心分離によって収集した。
【０２４９】
ローラーボトルの一過性トランスフェクションのために、本発明者らは、５％ＦＢＳ＋１×非必須アミノ酸＋１×Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ  Ｇｌｕｔ＋１×ピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭで増殖させて維持した２９３Ｔ接着細胞を使用した。約４〜５×１０７個の２９３Ｔ細胞を、８５０ｃｍ２のローラーボトル中に一晩置いた（ｓｅｅｄ）。次いで、あらかじめ置いておいた細胞を、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を用いて翌日トランスフェクトした。ＤＮＡ−トランスフェクション試薬混合物を、約６．７５ｍＬの無血清ＤＭＥＭで調製した。６７５μＬのＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を、まず添加し、続いて１１２．５μｇのプラスミドＤＮＡを添加した。この複合体を、室温で３０分間インキュベートした。次いで全混合物をローラーボトルに添加した。このローラーボトルに、５％ＣＯ２ガス混合物を供給し、しっかりとキャップを締め、０．３５ＲＰＭで回転するローラーラック上に置き、３７℃のインキュベーターに入れた。トランスフェクションを２４時間行った後、培地を、１００ｍＬ  ＤＭＥＭ＋１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム補充物＋１×Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ  Ｇｌｕ＋１×非必須アミノ酸＋１×ピルビン酸ナトリウムで交換した。典型的には、２つの１００ｍＬの４８時間後の回収物を各ローラーボトルから得た。この回収した無血清馴化培地を一緒にプールして、４，０００ＲＰＭ、４℃で３０分間遠心分離した。
【０２５０】
４Ｄ４．ＩｇＧ１および４Ｄ４．ＩｇＧ２は共に、ヒトＮＧＦに対して約０．１４ｎＭ〜約０．２ｎＭのＩＣ５０値を有する強力な活性を示した（図２）。活性アッセイの結果は表５にまとめる。これらの抗体は、ラットＮＧＦに対してほとんど活性を示さなかった（図３）。この結果は、上記のハイブリドーマから直接試験した抗体の活性に類似している。
【０２５１】
【表５】
2014169326.tif 000006
（実施例６）
（抗ＮＧＦ抗体の生産）
抗ＮＧＦ抗体を、ＣＨＯ細胞のクローン系での発現によって生産する。それぞれの産生を行うために、１つのバイアル由来の細胞を無血清細胞培養培地で解凍する。この細胞を、まずＴフラスコで増殖させ、続いてスピナーフラスコで増殖させ、次いで２０００Ｌバイオリアクターまで規模が拡大するステンレススチールリアクターで増殖させる。生産は、流加培養法を用いて２０００Ｌバイオリアクターで行い、ここでは細胞の増殖および培養物の生存度を維持するために濃縮された培地成分を含む栄養供給物を加える。生産は約２週間続き、この間、抗ＮＧＦ抗体が上記細胞によって構成的に産生され、細胞培養培地に分泌される。
【０２５２】
生産リアクターは、設定したｐＨ、温度、および溶存酸素レベルにおいて制御する：ｐＨは、二酸化炭素ガスおよび炭酸ナトリウムの添加によって制御する；溶存酸素は、空気、窒素、および酸素のガスフローによって制御する。
【０２５３】
生産の最後に、細胞ブロスをディスクスタック遠心分離して、培養上清を細胞から分離する。この濃縮物を、デプスフィルター、続いて０．２μｍのフィルターに通してさらに浄化する。次いで、浄化した馴化培地を、接線流限外濾過によって濃縮する。馴化培地を１５〜３０倍に濃縮する。次いで、得られた濃縮馴化培地を、精製によって処理するか、または後日精製するために凍結する。
【０２５４】
（実施例７）
（他のニューロトロフィンとの交差反応性）
４Ｄ４抗体を、ヒトＮＴ３についてのＤＲＧニューロン生存アッセイおよびヒトＢＤＮＦについての培養ＤＡニューロンにおけるＤＡ取り込みのアッセイを含む様々なバイオアッセイにおいて、ヒトＮＴ３またはヒトＢＤＮＦに対するその交差反応性について試験した。
【０２５５】
（ＮＴ３、抗ＮＴ３、および抗ＮＧＦ抗体を用いたＤＲＧ培養物の処理）
プレーティングの２時間後、ＤＲＧ細胞（実施例３で上記された単離手順）を、１００ｎｇ／ｍＬ（３．８ｎＭ）の組み換えｈＮＴ−３で処理した。連続希釈した抗ｈＮＴ３抗体（Ｒ＆Ｄ）を陽性コントロールとして用いた。未知の物質（抗ＮＧＦ  Ａｂサンプル）を、１０ポイントの３．１６倍連続希釈の様々な濃度で添加した。全てのサンプルを完全培地で希釈してから培養物に添加した。
【０２５６】
（ＤＲＧニューロンにおけるＭＡＰ２発現の測定）
培養物を、４％パラホルムアルデヒドを含むハンクス平衡塩溶液を用いて１５分間固定し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）で１時間ブロッキングし、０．２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて室温（ＲＴ）で１時間、透過処理した。培養物を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳで１回リンスし、マウス抗ＭＡＰ２ＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と共に室温で１．５時間インキュベートし、続いてＥｕ標識した抗マウス二次抗体（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）と共に室温で１時間インキュベーションした。それぞれの抗体のインキュベーション後に、ＴＢＳで洗浄した（おだやかに振盪しながら３×５分）。増強溶液（１５０ｍＬ／ウェル、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ）を培養物に添加し、次いで蛍光シグナルを、時間分解蛍光光度計（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ）で測定した。
【０２５７】
（胚性中脳培養物）
胎齢１９日（Ｅ１９）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を使用した。ドーパミン作動性ニューロンが豊富な腹側中脳組織を取り出して、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）に移した。組織フラグメントは、パパイン解離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を用いて単一細胞懸濁物へと解離させた。簡単に述べると、組織フラグメントを、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）において２０単位／ｍＬのパパインを含む消化溶液中、３７℃で５０分間インキュベートした。１：１のＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、１ｍｇ／ｍＬオボムコイドインヒビター、および１ｍｇ／ｍＬオボアルブミン、および０．００５％デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）からなる解離培地で、先端熱加工パスツールピペットを用いたすりつぶしによって細胞を解離させた。解離した細胞を、５分間、２００×ｇでペレット化し、１ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１ｍｇ／ｍＬのオボアルブミン、および０．００５％ＤＮａｓｅを含むＥＢＳＳで再懸濁した。細胞懸濁物を、１０ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１０ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンを含む勾配溶液で、２００×ｇで６分間遠心分離して細胞デブリを除去し；２５μｇＮｉｔｅｘナイロンメッシュ（Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．）に通して濾過して凝集塊を除去した。解離した細胞を、１００，０００／ｃｍ２の密度で組織培養プレートにプレーティングした。このプレートは、既に記載したように、ポリ−オルニチン１００μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）およびマウスラミニン１μｇ／ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で事前にコーティングした（Ｌｏｕｉｓ  ＪＣら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９２；２６２：１２７４−１２８３）。この培養培地は、１：１の最小必須培地（ＭＥＭ）／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、１２％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、および２．５μｇ／ｍＬのインスリン（Ｓｉｇｍａ）から構成された。この培養物を、３７℃、５％ＣＯ２、および１００％の湿度で６日間維持した。
【０２５８】
（ＢＤＮＦおよび抗ＢＤＮＦまたは抗ＮＧＦを用いた中脳培養物の処理）
プレーティングの２時間後に、１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦを細胞に添加し、続いて連続濃度の抗ＮＧＦ  Ａｂサンプルを添加した。抗ＢＤＮＦ抗体（Ａｍｇｅｎで生成）を陽性コントロールとして用いた。
【０２５９】
（中脳ニューロンにおけるＤＡ取り込み）
ドーパミン取り込みアッセイを、既に記載されているように行った（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｌ．およびＭｙｔｉｌｉｎｅｏｕ，Ｃ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９８７；７９：６５−７２）。６日目に、培養物を、５．６ｍＭグルコース、１．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５ｍＭパルギリン、モノアミンオキシダーゼインヒビターを含む予め温めたクレブス−リンゲルリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１回洗浄した。この培養物を、５０ｎＭ［３Ｈ］ＤＡ（ＮＥＮ）を含む取り込み緩衝液中、３７℃で６０分間インキュベートした。取り込み緩衝液を除去して取り込みを停止させ、培養物をクレブス−リンゲルリン酸緩衝液で３回洗浄した。細胞を液体シンチレーションカクテル、ｏｐｔｉｃｐｈａｓｅ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｗａｌｌａｃ）を添加することによって溶解させ、［３Ｈ］ＤＡを培養物に直接放出させた。次いで、この細胞溶解物を、ｍｉｃｒｏｂｅｔａ−ｐｌｕｓ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｉｎｃ．）で放射活性についてカウントした。０．５ｍＭ  ＧＢＲ１２９０９、高親和性のＤＡ取り込み部位の特異的なインヒビター（Ｈｅｉｋｋｉｌａ  ＲＥおよびＭａｚｉｎｏ  Ｌ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９８４；１０３：２４１−８）を取り込み緩衝液に添加することによって低親和性のＤＡ取り込みを評価して、この値を総取り込み量から減じて高親和性ＤＡ取り込み値を得た。
【０２６０】
【表６】
2014169326.tif 000007
（実施例８）
（抗ＮＧＦ抗体のエピトープの同定）
（限定タンパク質分解によるエピトープマッピング）
５マイクログラム（μｇ）のＮＧＦを、４Ｄ４（１１μｇ）と共に０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、この複合体をプロテアーゼ（サブチリシン）１μｇを用いて３７℃で１時間および２時間消化した。ＨＰＬＣペプチドマップを、４Ｄ４抗体によって保護されたペプチドを探すために互いに比較した。ＮＧＦの限定タンパク質分解により、いくつかの大きなペプチドがＮＧＦから最初に放出されたことが示された。特に興味深いペプチドＳ１８．３、Ｓ１８．５およびＳ３４．４が産生され、タンパク質分解から抗体で保護された。他のピークは、有意に形成または保護されなかった。２つの実験での保護されたペプチド（１時間および２時間の消化）を表７に示す。
【０２６１】
【表７】
2014169326.tif 000008
保護のパーセンテージは、ペプチドのピーク高から計算した。Ｓ１８．５は、２つのペプチドを含んでいたが、１つのペプチド（ＳＳＳＨＰＩＦＨＲ；配列番号４６）のみが、４Ｄ４抗体で保護された。なぜなら他方のペプチドのピーク（ＨＷＮＳＹ；配列番号４７）は、２８０ｎｍの吸光度で検出されたように、４Ｄ４抗体の添加によって変化しなかったためである。ペプチドＳ１８．３は、Ｓ３４．４のＣ末端部分であり、両方とも同じループ領域由来である。Ｎ末端および中心ループ領域も、潜在的なエピトープであった。
【０２６２】
（消化されたペプチドのＭｉｃｒｏｃｏｎによる分離）
サブチリシンで消化された材料（それぞれ３μｇ）を、活性な４Ｄ４抗体および不活性なモノクローナル抗体（♯１６２）（８μｇ）と共に、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中、４℃で３０分間インキュベートした。結合／非結合のペプチドを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）によって分離し、抗体に結合したペプチドを探すために両方の画分（結合および非結合）をＨＰＬＣによって分析した。４Ｄ４抗体および♯１６２で処理し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ分離した後、非結合画分のＨＰＬＣ比較によって同定された２つの低下ピークを回収し、抗体結合ペプチドを示した。４Ｄ４結合ペプチドは：
Ｓ１（４．４）−−−−ＳＲＫＡＶＲＲ（１１３〜１１９）（配列番号４９）、Ｃ末端；および
Ｓ２（２８．３）−−−−ＥＶＭＶＬ（３５〜３９）（配列番号５０）、ループ領域であった。
【０２６３】
代替的に、ＮＧＦサンプルを、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｋ）を用いて２４時間消化した。システイン残基を変性剤を用いずに還元してカルボキシメチル化した。サンプルを、モノクローナル抗体４Ｄ４およびＡＭＧ１６２と共にインキュベートし、続いてＭｉｃｒｏｃｏｎ  １００で分離した。結合画分および非結合画分を、逆相ＨＰＬＣによって分析した。２つのペプチドのみが、以下に示されているように抗体結合Ｋペプチドとして同定された。配列分析によって決定したペプチドの計算質量とそのペプチドの質量分析は一致していた。以下に示されているように、これらのペプチドを、Ｎ末端およびＣ末端領域にマッピングした。
Ｋ１（３７．６）−−−−ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫ（配列番号５１）
計算質量＝２８２１；観察質量＝２８２８．２；Ｎ末端
Ｋ２（３９．５）−−−−ＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫ（配列番号５２）計算質量＝２４５２；観察質量＝２４５９．５；Ｃ末端。
【０２６４】
前のエピトープマッピング実験により、Ｎ末端領域（１〜９）、内部領域（４６〜５７）、およびＣ末端（９６〜９８）領域を含む少なくとも３つの領域が、４Ｄ４抗体の潜在的なエピトープであることが示された。加えて、ＡｓｐＮ消化により、−−−ＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣ−−−（配列番号５３）からなるペプチドフラグメントが４Ｄ４抗体によって保護されることが明らかになった一方、トリプシン消化により、−−−ＳＳＨＰＩＦＨＲ−−−（配列番号５４）からなるペプチドフラグメントが４Ｄ４抗体によって保護されないことが示された。したがって、Ｎ末端では、ＧＥＦＳＶＣ（配列番号５５）の配列が、４Ｄ４抗体への結合に最も重要である。
【０２６５】
抗ＮＧＦ抗体４Ｄ４．ＩｇＧ１のエピトープをさらに明確に定義するために、全ヒト成熟ＮＧＦ（ｈＮＧＦ）配列に基づく標準的な技術を用いて、合計２３個のペプチドを合成的に作製した（表８）。このペプチドは、１０アミノ酸まで重複している１５アミノ酸長であり、Ｃ末端のシステインテイルがマトリックスへの結合を可能にしている。上記のヒト抗ｈＮＧＦ  Ａｂ  ４Ｄ４．ＩｇＧ１を、マッピング実験に使用した。
【０２６６】
【表８−１】
2014169326.tif 000009
【０２６７】
【表８−２】
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ヒトＮＧＦペプチドフラグメントを、５％ＤＭＳＯおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ、ｐＨ６．２３で希釈した。最終ペプチド濃度は、同じモル濃度に標準化した（５５μＭ（約１００μｇ／ｍＬ））。ペプチドを、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ活性化９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号１５１５０）において、１ウェルに付き１００μＬで、室温で２時間インキュベートし、次いで４℃で一晩撹拌した。ヒトＮＧＦ（１００μｇ／ｍＬ）を陽性コントロールとして用いた。このプレートを、洗浄緩衝液（ＫＰＬ）で洗浄し、０．２％脱脂粉乳（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液に含まれている、ｐＨ６．２３）を用いて室温で２時間ブロッキングし、次いで５％
ＢＳＡを用いてさらに１時間ブロッキングした。次いで、プレートを、様々な濃度（０、３、１０、３０μｇ／ｍＬ）のヒト抗ＮＧＦ抗体と共にインキュベートし、続いてヤギ抗ｈＦｃ  Ａｂ−ＨＲＰ（ＫＰＬ）と共に２時間インキュベートした。シグナルをＴＭＢ基質で発色させて、停止溶液（ＫＰＬ）の添加後に４５０ｎｍで読み取った。
【０２６８】
２３個のヒトＮＧＦペプチドにわたって、４Ｄ４結合を示す少なくとも４つの主なピークが観察された。これらのピークは、以下のペプチドに一致した：ペプチド♯１（配列番号５６）、ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣ（１〜１５）；ペプチド♯１０（配列番号６５）、ＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＡＲＤ（４６〜６０）；ペプチド♯１６〜１７（配列番号７１〜配列番号７２）、ＷＮＳＹＡＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬ−−−（７６〜９５）；およびペプチド♯１８〜２１（配列番号７３〜配列番号７６）、ＴＴＴＨＴ−−−ＬＳＲＫＣ（１００〜１１５）。
【０２６９】
４Ｄ４の４つの結合ピークを、Ｗｅｉｓｍａｎｎら（１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：１８４−８）に記載されているように、ＮＧＦにおけるＮ末端、Ｃ末端、内部ドメインならびに、ループＬ２およびＬ４にマッピングした。これらの結果を表９にまとめる。
【０２７０】
【表９】
2014169326.tif 000011
Ｗｉｅｓｍａｎｎらは、ｔｒｋＡレセプターに結合したｈＮＧＦの結晶構造を解明し、これによりＮ末端（残基２〜９）がレセプター結合に重要であることを示した（Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：１８４−８）。また、ＮＧＦにおけるこのセグメントの残基は、ｔｒｋＢレセプターまたはｔｒｋＣレセプターよりもｔｒｋＡレセプターへの特異性にとって重要である。抗体４Ｄ４は、恐らく、ヒトＮＧＦと他のニューロトロフィンとの間のＮ末端の相違のために、マウス／ラットＮＧＦ、ならびにＢＤＮＦおよびＮＴ−３よりもヒトＮＧＦに対して選択的である。
【０２７１】
抗体４Ｄ４は、ループＬ２およびＬ４のそれぞれに相当するペプチド♯１０（配列番号６５）（ＮＳＶＦＫ−−−、４６〜６０）およびペプチド♯１７（配列番号７２）（ＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＣ、８１〜９５）に結合し、ループＬ２およびＬ４は、ニューロトロフィンにおける平均の配列多様性よりも高い配列多様性を有する７つの別個の領域の内の２つを表す。これらの７つの領域のＮＧＦとＢＤＮＦとの間のスワッピング実験により、Ｌ２およびＬ４が、ＮＧＦの生物学的活性にとって重要であることが示された。さらに、ループＬ２およびＬ４における５つのＮＴ３残基のＮＧＦの残基での置換により、ＮＴ３活性を維持したままＮＧＦ様活性が導入された。したがって、Ｌ２およびＬ４は、抗体４Ｄ４がＢＤＮＦまたはＮＴ−３ではなくＮＧＦに選択的に結合するための領域である可能性が高い。
【０２７２】
抗体４Ｄ４はまた、ＮＧＦ結晶構造の内部ドメインに一致するペプチド♯１６（配列番号７１）（ＷＮＳＹＡＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬ、７６〜９０）に結合する。この領域は、ヒトＮＧＦとマウスＮＧＦとの間で１００％相同であるが、他のニューロトロフィンとは異なっている。４Ｄ４は、ヒトＮＧＦに対する活性と比較すると、ラット／マウスＮＧＦに対してかなり弱い活性を示した。したがって、ＮＧＦのこの部分への結合は、種特異性にとっては重要ではない可能性が高いが、ニューロトロフィンの中での選択性にとっては重要である。
【０２７３】
抗体４Ｄ４はまた、ＮＧＦを他のニューロトロフィン（ＢＤＮＦおよびＮＴ３）から区別するヒトＮＧＦの領域の１つである、ＮＧＦのＣ末端領域（ペプチド♯１９〜２１（配列番号７４〜配列番号７６）ＴＭＤＧＫ−−−ＬＳＲＫＣ、９１〜１１５）に結合する。この領域への結合は、なぜ４Ｄ４が他のニューロトロフィンに対して活性ではないのかの説明に役立つ。さらに、ヒトＮＧＦとマウスＮＧＦとの間ではＣ末端に１つのアミノ酸の相違があり、このことは、この１つのアミノ酸は、種の相違が観察されるＮ末端と同様に、４Ｄ４がラット／マウスＮＧＦよりもヒトＮＧＦに対して選択性であることの理由の１つであり得ることを示唆している。
【０２７４】
最後に、４Ｄ４はまた、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣではなくｔｒｋＡへの優先的なＮＧＦ結合にとって重要な領域である、ヒトＮＧＦのペプチド♯１０（配列番号６５）（−−−ＫＡＲＤＣ、５０〜６０）によって記載される内部ドメインとも相互作用し、これは、ヒトＮＧＦに対するその選択的中和活性をさらに説明している。
【０２７５】
（実施例９）
（ＫｉｎＥｘＡによるモノクローナル抗体の親和性測定）
Ａｂ  ４Ｄ４（３８８５９〜８０）のｈｕＮＧＦ（２９７１４〜９１）に対する結合を、ＫｉｎＥｘＡで試験した。簡単に述べると、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ  ６×（Ｐｉｅｒｃｅ）をｈｕＮＧＦでプレコーティングして、ＢＳＡでブロッキングした。１０ｐＭおよび３０ｐＭのＡｂ  ４Ｄ４サンプルを、様々な濃度のｈｕＮＧＦ（Ａｍｇｅｎ）と共に室温で８時間インキュベートしてから、ｈｕＮＧＦがコーティングされたビーズに通した。ビーズが結合した抗体の量を、蛍光（Ｃｙ５）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって定量化した。結合シグナルは、平衡状態での遊離抗体の濃度に比例していた。解離平衡定数（ＫＤ）を、双対曲線一部位均一結合（ｄｕａｌ−ｃｕｒｖｅ  ｏｎｅ−ｓｉｔｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）モデル（ＫｉｎＥｘＴＭソフトウェア）を用いて競合曲線の非線形回帰から得た。ＫＤは、Ａｂ  ４Ｄ４のｈｕＮＧＦに対する結合について約４ｐＭであった。
【０２７６】
（実施例１０）
（さらなる抗ＮＧＦ抗体の同定）
上記の実施例２および３に記載されたように作製され同定されたさらなる抗ＮＧＦ抗体（１４Ｄ１０、６Ｇ９、７Ｈ２、１４Ｆ１１、および４Ｇ６と命名）をさらなる研究のために選択した。簡単に述べると、馴化培地を結合活性について試験した。培地から抗体を精製して配列決定した。予測質量を、馴化培地の抗体の質量分析データと比較した。抗体をクローン化した。クローンの内の２つが、ＣＨＯ細胞で発現され、上記のように活性について試験した。この結果を表１０に示す。
【０２７７】
【表１０】
2014169326.tif 000012
次いで、これらの抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列を、４Ｄ４抗体の配列と比較し、さらに互いに比較した（図５および図６）。これらの比較から同定された重鎖可変領域の相同性パーセントを表１１に示す。軽鎖可変領域の相同性パーセントを表１２に示す。さらに、様々な抗体のＣＤＲ領域の相同性パーセントを図５〜図１０に示す。
【０２７８】
【表１１】
2014169326.tif 000013
【０２７９】
【表１２−１】
2014169326.tif 000014
【０２８０】
【表１２−２】
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（実施例１１）
（ヒトにおける皮下ＮＧＦ抗体の安全性および耐容性）
この試験の目的は、変形性関節症（ＯＡ）膝疼痛の被験体において、神経成長因子に対する抗体（ＮＧＦ抗体）の複数回の皮下（ＳＣ）投与の安全性および耐容性を評価し、かつＯＡ膝疼痛の被験体に対してＮＧＦ抗体の複数回ＳＣ投与を施した後、ＮＧＦ抗体の血清薬物動態（ＰＫ）を調査することにあった。複数回ＳＣ投与の臨床上の利点を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ  ａｎｄ  ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｉｎｄｅｘ［ＷＯＭＡＣＴＭ３．１］によって評価した。
【０２８１】
第１相、逐次無作為、二重盲検プラセボ対照、複数回投与、用量漸増試験をＯＡ膝疼痛の被験体に対して行った。この試験は、被験体の４つのコホートを含み、各コホートに８人の被験体が含まれるようにデザインした（ｎ＝３２）。ＮＧＦ抗体の３つの用量レベル（３ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ）を使用した。この試験に使用したＮＧＦ抗体は、本明細書に記載された手順と同様に作製された完全ヒトモノクローナル抗体とした。
【０２８２】
有効性データのばらつきが大きく、この試験は、有効性の尺度の統計的有意性を評価できるものではないが、疼痛関連処置の効果は明らかであろう。平均ＷＯＭＡＣ総合スコア、平均ＷＯＭＡＣ下位区分スコア、患者による疾患の平均全体評価、および医師による疾患の平均全体評価は、投与期間にわたって効果が維持された処置群において、最初の投与後の最初の時点において、改善の一般的な傾向を示した。これらの傾向は、プラセボ群では明確ではなかった。ＮＧＦ抗体の最終投与の後、処置効果は、経時的にベースラインに近づく傾向にあった。
【０２８３】
ＯＡ膝疼痛の被験体への単回または複数回ＳＣ投与を施した後、ＮＧＦ抗体曝露は、３ｍｇ〜２０ｍｇの用量範囲において、ほぼ用量に比例して上昇するようであった。平均Ｔｍａｘは、７．５〜１１．５日の範囲であった。処置に関連した有害事象（ＡＥ）が、処置群の１０人の被験体（５６％）およびプラセボ群の２人の被験体（３３％）で報告された。いずれの被験体も、ＡＥのために初期に試験を中止することはしなかった。しかしながら、グレード２の神経感覚ＡＥのために、プロトコルに明記された停止規則が適用されたため、コホートの５人の被験体（２人がプラセボ群、３人が処置群）は、治験製品の第４および最終の投与を受けなかった。神経感覚ＡＥは、用量依存性のようであった。
【０２８４】
年齢が３６歳〜６３歳までの男性および女性のＯＡ被験体では、複数回ＳＣ投与は、処置で発生し、恐らく用量依存性の神経感覚事象（重症度が軽度または中程度）を除き（これは、２０ｍｇの抗体が投与された６人の被験体の内の４人で報告された）、この試験で投与された用量では十分に耐容であるようであった。ＮＧＦ抗体曝露は、３ｍｇ〜２０ｍｇの用量範囲において、用量にほぼ比例して上昇するようであった。最終相の半減期（ｔ１／２、ｚ）は、２０．３〜２６．４日の範囲であった。
【０２８５】
前述の開示は本発明の特定の実施形態を強調していること、それらの実施形態に等価な全ての改変形態または代替形態も、添付の特許請求の範囲で規定される本発明の精神および範囲内であることを理解されたい。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2014169326000001.pdf