(57)【要約】【課題】アズキの未利用な生理活性成分に着目し、骨粗鬆症の予防、治療に有効性を示す新規なアズキ由来骨代謝調節剤（骨代謝調節アズキ由来抽出物）を提供し、併せてこれを含む予防剤、治療剤、または食品を提供する。【解決手段】アズキ（Ｖｉｇｎａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ）を熱水で煮熟し生じた煮汁から上清を分離し、上清を合成吸着剤に吸着させた後、吸着後の合成吸着剤に１０％〜４０％エタノール水溶液を添加して溶出して得たアズキ由来抽出物を有効成分とし、当該アズキ由来抽出物は骨芽細胞への分化を促進し、かつ、破骨細胞への分化を抑制することを特徴とするアズキ由来骨代謝調節剤である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アズキを熱水で煮熟し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加して溶出して得たアズキ由来抽出物を有効成分とすることを特徴とするアズキ由来骨代謝調節剤。
【請求項２】
前記エタノール水溶液が１０％〜４０％エタノール水溶液である請求項１に記載のアズキ由来骨代謝調節剤。
【請求項３】
前記アズキ由来抽出物が、骨芽細胞への分化を促進し、かつ、破骨細胞への分化を抑制する請求項１または２に記載のアズキ由来骨代謝調節剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来骨代謝調節剤を含有してなる骨粗鬆症の予防剤または治療剤。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来骨代謝調節剤を含有してなる食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アズキ由来骨代謝調節剤に関し、特に、骨粗鬆症の予防、治療に有効に作用するアズキ由来抽出物であり、当該抽出物を含有する予防剤、治療剤、食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国における高齢化の急速な進行は、加齢進行に伴う高齢者特有の疾患を増加させ、医療費上昇の社会問題である。このような加齢性疾患のひとつとして骨粗鬆症があり、その主な原因は老化や閉経後のホルモンバランスの不均衡とされている。骨粗鬆症は骨折を頻繁に誘発することから生活行動を制約することとなり、生活の質（ＱＯＬ）を大きく低下させる。そのため、症状が悪化しやいように予防、対策が重要である。
【０００３】
生体における骨の代謝は静的ではなく極めて動的であり、恒常性を維持しながら系統的に調節されている。具体的に骨代謝（ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）とは、骨芽細胞の分化により骨が形成されると同時に破骨細胞により骨の溶解が進行することである。両細胞による骨の再生と破壊が好適な平衡状態を保つことによる新陳代謝の結果、健全な骨の再構築（リモデリング）が生じる。しかしながら、加齢による骨芽細胞の機能低下（低回転型）に加え、閉経後のエストロゲン量の減少に伴い破骨細胞の活動が骨芽細胞よりも優位となる機能促進（高回転型）が複雑に作用している。このため、骨形成よりも骨破壊が進行して骨密度低下が誘発される。
【０００４】
上記の骨代謝制御の変調による代表的な症状に骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）がある。現在、骨粗鬆症の治療に際し、カルシウム製剤、活性型ビタミンＤ3製剤、ビタミンＫ2製剤、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン製剤、イプリフラボン、ビスホスホネート製剤、エストロゲン製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）等の治療薬が用いられている。しかし、エストロゲン製剤に見られるホルモン剤は乳がん等の副作用を誘発することがあり、その使用には慎重さが求められる。前掲の治療薬には少なからず副作用も存在する。また、骨粗鬆症の進行は患者の生活習慣に多く影響される。このため、その影響を軽減する意味からも骨粗鬆症の予防として、あるいは、治療薬の使用と併用できる成分が求められている。
【０００５】
そこで、動植物等に由来する天然物抽出物を骨粗鬆症対策に役立てようとする試みが数多く報告されている（特許文献１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０等）。これらの文献によると、天然物抽出物は骨粗鬆症対策について一定の効果を発揮することを示している。しかし、専ら骨芽細胞の機能改善あるいは破骨細胞の作用抑制の限られた効果について言及、解明しているに留まっていた。
【０００６】
前述のとおり、骨の再構築には複数の細胞が関与し、各種のシグナル伝達により複雑に結びついている。例えば、骨芽細胞の表面に発現している膜結合型サイトカインのＲＡＮＫＬは、破骨細胞前駆細胞の表面の受容体のＲＡＮＫと結合し、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化を促している。このため、骨の再構築を総合的に把握した場合、単に骨芽細胞あるいは破骨細胞のいずれかに作用するのみでは、骨粗鬆症の改善に十分効果的ではないと考えることもできる。
【０００７】
前述の経緯とは別に、発明者らは、以前からアズキに着目して各種の研究を行ってきた。アズキ（小豆：Ｖｉｇｎａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ）は、主に煮熟（炊きあげ）による加熱により軟らかく加工され、赤飯等の料理の食材、あるいは、砂糖が加えられ「小倉あん」等の製菓用食材に加工される。アズキの加工に際し、アズキの煮汁が大量に生じる。アズキの煮汁には、ポリフェノール類、サポニン類、アントシアニン類、さらには糖分子と結合した配糖体等も含有されていることが知られている。しかし、現状、利用されることなくそのまま廃棄されることが多い。
【０００８】
アズキの煮汁に着目し、この中に含まれる生理活性成分についての有効活用として、例えば、アズキの煮汁のアルコール抽出物の生理作用については、抗アレルギー活性、血糖降下活性、細胞接着阻害、高脂血症予防等の効果が報告されている（特許文献１１等参照、非特許文献１、２、３、４、５等参照）。
【０００９】
前記の経緯を踏まえ、発明者はアズキから抽出される成分の生理活性効果についてさらに鋭意研究を重ねた結果、骨芽細胞及び破骨細胞の双方の分化に作用する知見を得た。すなわち、アズキ由来成分が骨粗鬆症の予防、治療に有効性を示す可能性を示唆する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−１３７７７５号公報
【特許文献２】特開２００８−２１４２３７号公報
【特許文献３】特開２００８−３０３１６６号公報
【特許文献４】特開２００９−１０７９９５号公報
【特許文献５】特開２００９−２５６３５０号公報
【特許文献６】特開２０１０−３０９０５号公報
【特許文献７】特開２０１０−２１５６０７号公報
【特許文献８】特開２０１０−２３５５３３号公報
【特許文献９】特開２０１０−２３５５３４号公報
【特許文献１０】特許第３９０９３９１号公報
【特許文献１１】特開２０１１−１７８６８０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔ．Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８（１２），２４２１−２４２６（２００４）
【非特許文献２】Ｔ．Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９（３），４４８−４５４（２００５）
【非特許文献３】Ｔ．Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  ２５，１３４−１４１（２００９）
【非特許文献４】Ｔ．Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  ２５，３１８−３２１（２００９）
【非特許文献５】Ｔ．Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，２６（７），１００３−１０１１（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は前記の点に鑑みなされたものであり、アズキの未利用な生理活性成分に着目し、骨粗鬆症等の予防、治療に有効性を示す新規なアズキ由来骨代謝調節剤（骨代謝調節アズキ由来抽出物）を提供し、併せてこれを含む予防剤、治療剤、または食品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、請求項１の発明は、アズキを熱水で煮熟し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加して溶出して得たアズキ由来抽出物を有効成分とすることを特徴とするアズキ由来骨代謝調節剤に係る。
【００１４】
請求項２の発明は、前記エタノール水溶液が１０％〜４０％エタノール水溶液である請求項１に記載のアズキ由来骨代謝調節剤に係る。
【００１５】
請求項３の発明は、前記アズキ由来抽出物が、骨芽細胞への分化を促進し、かつ、破骨細胞への分化を抑制する請求項１または２に記載のアズキ由来骨代謝調節剤に係る。
【００１６】
請求項４の発明は、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来骨代謝調節剤を含有してなる骨粗鬆症の予防剤または治療剤に係る。
【００１７】
請求項５の発明は、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来骨代謝調節剤を含有してなる食品に係る。
【発明の効果】
【００１８】
請求項１の発明に係るアズキ由来骨代謝調節剤によると、アズキを熱水で煮熟し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の合成吸着剤にエタノール水溶液を添加して溶出して得たアズキ由来抽出物を有効成分とするため、これまで廃棄されていたアズキの未利用な有効成分に着目し、新規のアズキ由来骨代謝調節剤を得ることができた。
【００１９】
請求項２の発明に係るアズキ由来骨代謝調節剤によると、請求項１の発明において、前記エタノール水溶液が１０％〜４０％エタノール水溶液であるため、より活性の高いアズキ由来骨代謝調節剤を得ることができた。
【００２０】
請求項３の発明に係るアズキ由来骨代謝調節剤によると、請求項１または２の発明において、骨芽細胞への分化を促進し、かつ、破骨細胞への分化を抑制するため、骨粗鬆症等の予防、治療に効果的な骨代謝活性を示す。
【００２１】
請求項４の発明に係る骨粗鬆症の予防剤または治療剤によると、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来骨代謝調節剤を含有してなるため、骨粗鬆症等の骨代謝異常の改善に効果を有する薬剤を得ることができる。
【００２２】
請求項５の発明に係る食品によると、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアズキ由来骨代謝調節剤を含有してなるため、食品に配合して食事から骨粗鬆症等の骨代謝異常の改善に効果を有する成分を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明のアズキ由来骨代謝調節剤を得る概略工程図である。
【図２】アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示すグラフである。
【図３】ＡＬＰ活性を示した培養細胞の写真である。
【図４】前駆骨芽細胞内のシグナル伝達や転写等の概略模式図である。
【図５】骨芽細胞内の転写因子発現のウエスタンブロットの比較写真である。
【図６】定量リアルタイム−ＰＣＲにより骨芽細胞内の転写因子量を推定したグラフである。
【図７】リン酸化Ｓｍａｄのウエスタンブロットの比較写真である。
【図８】Ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ等のウエスタンブロットの比較写真である。
【図９】骨型酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）活性を示すグラフである。
【図１０】ＴＲＡＣＰ染色の写真である。
【図１１】前駆破骨細胞内のシグナル伝達や転写等の概略模式図である。
【図１２】ｃ−Ｆｏｓ及びＮＦＡＴｃ１のウエスタンブロットの比較写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明のアズキ由来骨代謝調節剤（骨代謝調節アズキ由来抽出物）について、図１の概略工程図を用い、これを得る過程を説明する。はじめに、アズキ〔小豆（Ａｄｚｕｋｉ  ｂｅａｎｓ）：Ｖｉｇｎａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ〕は、適宜水洗の後、蒸煮釜等において９０℃ないし９５℃の熱水（熱湯）中で、２０分ないし６０分間煮熟される（煮熟については、煮沸や炊きあげ等とも称される。）。当該加熱後、アズキ（茹でられた豆）とアズキの煮汁（熱水抽出物）は分離される。通常、アズキの煮汁はそのまま廃棄され、加熱されたアズキについては砂糖等が添加され小倉あん等に加工される。
【００２５】
アズキの煮汁は、その種皮色から推察されるように、赤茶色を呈していることから、何らかの成分が溶解していることは予想される。そこで、未利用物の有効活用の途を開くべく、その解明を進めることとした。
【００２６】
アズキを煮熟した際に生じる煮汁は室温に冷まされ、煮汁は上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）と沈殿物（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）に分けられる。煮汁の分離には、フィルター濾過の他、後述の実施例の条件による遠心分離も用いられる。
【００２７】
煮汁の上清中には、各種の熱水可溶性成分が含まれている。そこで、上清内の成分の濃縮と溶出分離のため、上清はいったん合成吸着剤に吸着される。合成吸着剤は適宜の樹脂製カラム、樹脂ビーズ等である。後記の実施例では、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂からなる細孔を備えた粒径０．２５ｍｍ以上のビーズを用いた。
【００２８】
上清中の各種成分を吸着している合成吸着剤に対してエタノールの水溶液が添加、送通される。そして、合成吸着剤に吸着されているアズキの抽出物はエタノール水溶液中に溶出される。このように、アズキの煮熟、上清分離、吸着、溶出の過程を経ることにより得られる成分が、本発明に規定するアズキ由来骨代謝調節剤である。エタノール水溶液中に存在する溶出分の有無は、所定の波長（例えば２８０ｎｍ）の吸光度を確認することにより容易に把握することができる。
【００２９】
エタノール水溶液は、全量水の状態から徐々にエタノール濃度が連続的に高められる濃度勾配（グラジエント）の溶液（ｖ／ｖ％）として調製され、前記の抽出物の溶出に供される。実施例において、エタノール水溶液の濃度（ｖ／ｖ％）は、当初の０％（水のみ）から、１０％ないし４０％濃度の溶液、４０％ないし６０％濃度の溶液、６０％ないし８０％濃度の溶液の４種類としている。濃度勾配を形成する精度上、概ね前記の濃度域毎に分けられる。なお、合成吸着剤を乾燥させると分離能が変動してしまうため、濃度の切り替えの際に必要量の水も送通される。
【００３０】
各エタノール水溶液濃度の溶出の画分（フラクション）から水分等を蒸発、乾燥することにより、エタノール水溶液の濃度毎に振り分けた抽出物を得ることができる。その中において、１０％ないし４０％の濃度域のエタノール水溶液のアズキ由来抽出物の骨代謝調節に関わる活性発現が顕著である。抽出物はアズキの煮汁由来の成分であるため、配糖体、色素成分、各種カテキン類等のポリフェノール成分が含まれていると予想される。従って、本発明のアズキ由来骨代謝調節剤とは、前記の複数の成分を含む混合物であると考えられる。
【００３１】
１０％ないし４０％のエタノール濃度域の溶出画分が良好な活性を発現する理由については必ずしも明らかではない。濃度勾配あるエタノール水溶液を用いて溶出するため、完全に親水性もしくは疎水性の物質ではなく、比較的親水性が良好であるとともに一部疎水性を備えた物質の分離が可能となる。特に、生体への投与後あるいは服用後、細胞内への良好な浸透を勘案した場合、細胞膜から細胞内への透過性と細胞内での拡散性から適度な両親媒性を備えた分子ほど生理活性効果が高いと考えられる。
【００３２】
アズキからの抽出により得たアズキ由来骨代謝調節剤は、後記実施例に詳述するように、骨の再構築（リモデリング）に関与する前駆骨芽細胞と前駆破骨細胞の双方へ働きかける成分である。当該アズキ由来骨代謝調節剤（骨代謝調節アズキ由来抽出物）は、前駆骨芽細胞に対し骨芽細胞への分化とその石灰化を亢進させる。また、当該アズキ由来骨代謝調節剤は前駆破骨細胞に対し破骨細胞への分化を抑制する。すなわち、骨芽細胞の機能低下（低回転型）及び破骨細胞の活動が骨芽細胞よりも優位となる機能促進（高回転型）の双方の骨代謝調節を可能にすることにより、骨破壊を抑えながら骨形成を進めることを示唆している。例えば、骨粗鬆症、骨軟化症（くる病）等の疾患の予防、治療に効果的とされる。
【００３３】
従前の骨粗鬆症の予防、治療に提案されている天然物抽出物の多くは、骨形成の亢進あるいは骨破壊の抑制のいずれかに作用することを目的としていた。これに対し、アズキ由来骨代謝調節剤は、成分を共通としながらも骨形成と骨破壊の骨代謝に関与する双方の細胞に作用できるため、骨量、骨密度を増加させて症状を好転させる骨代謝調節に有効となる。また、既存の骨粗鬆症等の治療に使用される薬剤に起因する副作用への対処として、その影響を軽減する意味からも骨粗鬆症の予防または治療のための代替薬としての使用、あるいは、予防薬や治療薬の使用と併用できる利点が大きい。
【００３４】
アズキ由来骨代謝調節剤（骨代謝調節アズキ由来抽出物）を骨代謝異常の改善のための予防剤もしくは治療剤として用いる場合、経口投与の剤型は錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等の適宜である。また、注射薬、座薬、点滴薬、スプレー薬、点鼻薬等とすることもできる。列記の薬剤においては、アズキ由来骨代謝調節剤を単独としても他の薬剤を加えて併用しても良い。
【００３５】
本発明のアズキ由来骨代謝調節剤は、天然物であり、古くから食用されているアズキに由来する抽出物である。そのことから、アズキ由来骨代謝調節剤は常用する食品と馴染み良い。よって、新たにアズキ由来骨代謝調節剤を添加したアズキ由来骨代謝調節剤含有食品を作ることができる。
【００３６】
アズキ由来骨代謝調節剤（骨代謝調節アズキ由来抽出物）を添加可能な食品は、具体的に、水ようかん、ようかん、小倉あん、どら焼き、アズキのムース、アイスクリーム、飴（キャンデー）、キャラメル、カスタードプディング、コーヒーゼリー、グミ、ババロア、マシュマロ、カステラ、ホットケーキ、クッキー、フルーツジュース、炭酸飲料等がある。さらにはサプリメントとなる錠剤等も挙げられる。
【００３７】
列記のアズキ由来骨代謝調節剤含有食品を製造するに際し、アズキ由来骨代謝調節剤の含有量は、当該食品自体の味覚及び添加後の味の変化、他の添加成分、１回当たりの喫食量、喫食頻度、季節性、販売形態、さらに年齢、性別を加味した需要者層等を総合的に考慮して規定される。食品に添加するアズキ由来骨代謝調節剤の量は自由であり、例えば０．０１重量％ないし１００重量％（つまり、全量アズキ由来骨代謝調節剤とする食品）、１重量％ないし８０重量％としても良い。
【実施例】
【００３８】
〔アズキ煮汁由来の抽出物の調製〕
原料となるアズキ（Ｖｉｇｎａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ）に北海道産の小豆を用いた。開放型の蒸煮釜にアズキを投入し、水から加熱して４５分間煮熟した。煮上がって軟らかくなったアズキとその煮汁と分けた。煮汁を室温付近（約２０℃）になるまで冷ました後、９０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離をした。遠心分離より得た上清１ｋｇに芳香族系合成吸着剤（三菱化学株式会社製  逆相吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０」）３００ｇを加えて４℃で１２時間攪拌した。合成吸着剤とそれ以外の液に分けた後、合成吸着剤を蒸留水により洗浄し、さらに４０％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）により数回溶出を行った。
【００３９】
前記の洗浄、溶出した合成吸着剤をカラム（内径５ｍｍ×全長３００ｍｍ）に充填した。当該合成吸着剤充填カラムを複数本用意した。合成吸着剤充填カラムに対し、はじめは蒸留水のみを送通し、次第にエタノールの割合を高めながら溶液を調製して送通した。本実施例では、当初の蒸留水のみの溶出から、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液、６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液とする４種類の濃度による溶出を行った。溶出に供したエタノールは濃度勾配（グラジエント）を伴う。このため、濃度を切り替えるに際し濃度に幅が不可避的に生じる。そこで、上記のとおり濃度域を持った溶出条件とした。
【００４０】
蒸留水のみの溶出、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液、及び６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液から得た画分（フラクション）のそれぞれについて、ロータリーエバポレーター（柴田科学株式会社製）を用い、画分中の水分等を蒸発、乾固した。こうして、溶出条件の異なる４種類のアズキ煮汁由来の抽出物を得た。以降の明細書、図面において、蒸留水のみの溶出から得た抽出物を「ＷＥｘ」、１０％ないし４０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．４０」、４０％ないし６０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．６０」、及び６０％ないし８０％濃度のエタノール水溶液の溶出から得た抽出物を「ＥｔＥｘ．８０」として表記する。当該アズキ由来の抽出物は暗紫色の粉末状であった。
【００４１】
〔細胞内機序の検証〕
４種類の抽出濃度の異なるアズキ煮汁由来の抽出物を調製後、骨代謝調節剤としての骨芽細胞への分化促進、並びに破骨細胞への分化抑制の作用機序を確認することにより、アズキ煮汁由来の抽出物の薬効性を確認した。以下、検証実験を述べる。
【００４２】
〔骨芽細胞への分化促進効果〕
実験に使用したマウス頭蓋冠由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（骨芽細胞様細胞）は、須藤ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ９６，１９１−１９８（１９８３））により樹立された細胞である。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、骨芽細胞のモデルとして次述のアルカリホスファターゼ活性（以下、ＡＬＰ活性）や石灰化の変化を比較的明瞭に示すことから選択した。
【００４３】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度として、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁し、２４穴マルチウェルプレートに播種した。１２時間の培養後、アスコルビン酸を含む骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ：Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ）（和光純薬工業株式会社製，終濃度５０μｇ／ｍＬ）、β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（シグマアルドリッチ社製，終濃度１０ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−ｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（シグマアルドリッチ社製，終濃度５ｍＭ）を添加、調製した培地にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の培地を交換し、同細胞を分化誘導した。以下、単に骨芽細胞分化培地またはＯＤＭと記した場合についてもアスコルビン酸を含む培地を意味する。
【００４４】
骨芽細胞分化培地に前記の調製から得たＥｔＥｘ．４０について濃度を変えて添加した。培地交換から７２時間経過後、ＡＬＰ活性の測定及びアリザリンレッドＳ（Ａｌｉｚａｒｉｎ  ＲｅｄＳ）染色を行った。
【００４５】
〈アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定〉
骨芽細胞が分化して骨細胞に変化する際、同細胞内では石灰化を阻害するピロリン酸を分解するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ；Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発現が高まる。そこで、アルカリホスファターゼの活性を指標として利用することができる。
【００４６】
ＡＬＰ活性の測定に際し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１．５Ｍ）、ＺｎＣｌ2（１ｍＭ）、及びＭｇＣｌ2（１ｍＭ）を含有するトリス緩衝液（アッセイ用バッファー）を調製した。同時に、同トリス緩衝液に界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，和光純薬工業株式会社製）を１％量溶解した界面活性剤入りトリス緩衝液も調製した。
【００４７】
前記の骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）にて培養後、氷冷したＰＢＳ（−）（リン酸緩衝生理的食塩水）によりＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２回洗浄して培地を取り除いた。続いて、界面活性剤入りトリス緩衝液を添加し、室温下で３０分間静置して細胞中のタンパク分を抽出した。その後、適量のトリス緩衝液で希釈し、同量のｐＮＰＰ（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，和光純薬工業株式会社製，１０ｍＭ）を含むトリス緩衝液を添加し、３７℃、３０分間インキュベートした。このとき生じた反応生成物（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）の量を波長４０５ｎｍの吸光度により測定してＡＬＰ活性を評価した（ｎ＝５点）。ＡＬＰ活性の単位は、「ｕｎｉｔｓ／ｍｇタンパク量」とした。
【００４８】
結果は図２のグラフである。骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）を使用せずに培養した細胞（ＯＤＭ（−））はほとんどＡＬＰ活性が上昇しなかった。これに対し、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）のみを使用して培養した細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ではＡＬＰ活性は上昇した。次に、本発明のアズキ由来骨代謝調節剤であるＥｔＥｘ．４０の添加した培地にて培養した細胞においては、骨芽細胞分化培地のみの培養（Ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬと濃度依存的に有意にＡＬＰ活性は上昇した。このことから、ＥｔＥｘ．４０は、その濃度に応じて骨芽細胞から骨細胞への分化促進作用を示唆する。
【００４９】
なお、ＥｔＥｘ．４０以外のＷＥｘ、ＥｔＥｘ．６０、及びＥｔＥｘ．８０についても同様に培養した。しかしながら有意な差異を見出すことができなかった。このため、分化促進作用の契機となる成分は希薄とみなしてＥｔＥｘ．４０について以下検証することにした。
【００５０】
〈アリザリンレッドＳ染色〉
培養細胞内の石灰化の評価に際しアリザリンレッドＳ染色法を用いた。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞について、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）を使用せず（ＯＤＭ（−））、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）を使用（Ｃｏｎｔｒｏｌ，ＯＤＭ（＋））、細胞分化培地（ＯＤＭ）にＥｔＥｘ．４０を１０μｇ／ｍＬ添加（ＯＤＭ（＋）＋ＥｔＥｘ．４０，１０μｇ／ｍＬ）、細胞分化培地（ＯＤＭ）にＥｔＥｘ．４０を２０μｇ／ｍＬ添加（ＯＤＭ（＋）＋ＥｔＥｘ．４０，２０μｇ／ｍＬ）の４種類の培地条件の下で２１日間培養した。培養後、細胞を氷冷したＰＢＳ（−）で２回洗浄して培地成分を除去し、適量のエタノールを添加して１５分間静置し細胞を固定した。その後、エタノールを除き蒸留水で細胞を洗浄してアリザリンレッドＳ水溶液を添加し染色した。
【００５１】
〈培養細胞の観察〉
図３の上段（ＡＬＰ）は培地成分とＡＬＰ活性発現の様子を示した顕微鏡写真（倍率４０倍）である。図３の下段（Ａｌｉｚａｒｉｎ  ＲｅｄＳ）は培地成分とアリザリンレッドＳ染色の様子を示した顕微鏡写真（倍率４０倍）である。いずれの写真も最左列のＯＤＭ（−）では薄い色であり発現、発色は少ない。左から右にＯＤＭ（＋）、ＥｔＥｘ．４０の濃度順に色が濃くなった。すなわち、ＡＬＰ活性及び細胞内の石灰化はアズキ抽出物ＥｔＥｘ．４０の存在により高まり、さらにその濃度に依存して上昇することを確認した。
【００５２】
〔骨芽細胞内の転写因子発現〕
図４は骨芽細胞内において骨細胞へ分化する際に関係する転写因子、遺伝子、タンパク質発現等を概略した模式図である。骨芽細胞のＢＭＰレセプターにＢＭＰ−２（リガンド）が結合後、細胞内のＲ−Ｓｍａｄ、ＴＡＫ１等のシグナル伝達を介して核内にて、「Ｒｕｎｘ２」（Ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２）、「ＯＳＸ」（Ｏｓｔｅｒｉｘ）、「Ｄｌｘ５」（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ５）等に代表される転写因子の発現量が高まり、核内移行してプロモーター領域に付着して転写が促進する。そこで、前記の転写因子の発現とアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の関係を検証した。
【００５３】
〈ウエスタンブロットによる骨芽細胞分化関連タンパク質の発現〉
はじめに、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の有無と転写因子であるＲｕｎｘ２、ＯＳＸ、及びＤｌｘ５の各タンパク質と、内在性コントロールとしてのβ−ａｃｔｉｎの発現をウエスタンブロットにて確認した。図５は骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）を使用して培養し、ＥｔＥｘ．４０なし（−）とＥｔＥｘ．４０（２０μｇ／ｍＬ）あり（＋）の相違とした。図示から把握できるように、バンドは幾分濃く、太くなったことから、Ｒｕｎｘ２等の転写因子量の増大を示唆する。タンパク質の標識用一次抗体にＳａｎｔａｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＲｕｎｘ２、ＯＳＸ、及びＤｌｘ５、ＳＩＧＭＡ社製のβ−ａｃｔｉｎを使用した。
【００５４】
〈定量リアルタイム−ＰＣＲ法による検証〉
各転写因子の発現を定量的に把握するため、リアルタイムＰＣＲ法（定量Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ法）を使用した。Ｒｕｎｘ２、ＯＳＸ、及びＤｌｘ５のタンパク質へ翻訳する際に生じるｍＲＮＡ量から最終的に発現するタンパク質の量の多少を推定することができる。
【００５５】
１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を６ウェルマルチプレートに播種し、１２時間前培養した。その後、ＥｔＥｘ．４０（２０μｇ／ｍＬ）を添加して２４時間刺激後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製／インビトロジェン社製）を１ｍＬ／ウェル加えて細胞を溶解後、１．５ｍＬの蓋付きチューブ（エッペンドルフ株式会社製）に移した。
【００５６】
次に２００μＬのクロロホルムを加え、３０秒間ボルテックスミキサーにより振動攪拌の後、１１５００ｒｐｍ、１５分間、４℃の状態で遠心分離し、上清を新しい１．５ｍＬの蓋付きチューブ（前記社製）に移し２−プロパノールを加えて１０分間静置した。１０分の静置後、１１５００ｒｐｍ、１０分間、４℃の状態で遠心分離して上清を慎重に除去し、残渣分に７５％エタノール５００μＬを加えて洗浄した。この残渣分を９０００ｒｐｍ、５分間、４℃の状態で遠心分離して回収し、洗浄液を慎重に捨てて３０分間風乾した。３０分の風乾後、ＤＥＰＣ水（ジエチルピロカーボネート水）（インビトロジェン社製）を１８０μＬ、×１０のＢｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社製）を２０μＬ、ＤＮａｓｅ１を２μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
【００５７】
その後、酢酸ナトリウム（株式会社ニッポンジーン製，３Ｍ，ｐＨ５．２）を４０μＬと、フェノールクロロホルム溶液（インビトロジェン社製）を１５０μＬ加え、ボルテックスミキサーにより振動攪拌した。フェノールクロロホルムとサンプル溶液の入ったチューブを１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を新しい１．５ｍＬの蓋付きチューブ（前記社製）に移し、８００μＬのエタノールにて総ＲＮＡを抽出した。その後、１５０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の状態で遠心分離し、総ＲＮＡを回収した。最後に上清を捨て、風乾後、ＤＮａｓｅ−ＲＮａｓｅフリーの水に溶解した。
【００５８】
バイオフォトメーターによりサンプルの総ＲＮＡ量を測定後、それぞれのＲＮＡサンプルを１００ｎｇ／μＬに調整した。タカラバイオ株式会社製「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ」を用いて逆転写反応を行った。ＰＣＲの条件は「３７℃：１５分、８５℃：２分、４℃：継続」とした。逆転写反応で得たサンプルｃＤＮＡと、タカラバイオ株式会社製のプライマーＲｕｎｘ２（ＭＡ０７３７５８）、ＯＳＸ（ＭＡ１１７８９１）、Ｄｌｘ５（ＭＡ０９０８０２）、ＧＡＰＤＨ（ＭＡ０９５４５２）を用意し、タカラバイオ株式会社製「ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ」に準じ、リアルタイムＰＣＲ（アプライドバイオシステム社製，ステップワン）を使用し発現解析を行なった。発現量はＧＡＰＤＨを内部標準として評価した。
【００５９】
図６はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内で発現する転写因子Ｒｕｎｘ２、ＯＳＸ、及びＤｌｘ５について、定量ＲＴ−ＰＣＲ法に基づいてｍＲＮＡのコピー数からタンパク質発現量を推定した棒グラフである。図６（ａ）はＲｕｎｘ２、同（ｂ）はＯＳＸ、同（ｃ）はＤｌｘ５のｍＲＮＡのコピー数である。ＧＡＰＤＨ（グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）との相対割合として示す。各転写因子の棒グラフは、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）の使用の有無（＋／−）、ＥｔＥｘ．４０（２０μｇ／ｍＬ）の有無（＋／−）の培地条件の相違を示す。いずれもｐ＜０．０５、ｎ＝５とした。
【００６０】
結果、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）の使用、さらにはアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の投与の順に、ｍＲＮＡの発現レベルから、骨芽細胞の分化に関与する転写因子Ｒｕｎｘ２、ＯＳＸ、及びＤｌｘ５の増加を確認した。特に、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の存在下で培養した細胞の発現レベルは顕著に増加した。前掲の図４に示すように、ＯＳＸの発現は、Ｒｕｎｘ２やＤｌｘ５の調整を受ける。このことから、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０によりＲｕｎｘ２、Ｄｌｘ５の発現が促され、これに同調してＯＳＸの発現が高まった可能性を示唆する。従って、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０は骨芽細胞の分化に関与する遺伝子発現を調節する作用を有する成分であるといえる。
【００６１】
〔アズキ由来抽出物の前駆骨芽細胞への作用機構〕
図４の概略模式図に示すとおり、ＯＳＸ（Ｏｓｔｅｒｉｘ）発現に関与する経路として、次の２種類が考えられている。ＢＭＰレセプターにＢＭＰ−２が結合後、Ｒ−Ｓｍａｄのリン酸化を介してＲｕｎｘ２等が発現する経路と、ＴＡＫ１（ＴＧＦ−β−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １）を介してＰ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅがリン酸化し最終的にＯＳＸ（Ｏｓｔｅｒｉｘ）が発現する経路である。
【００６２】
そこで、分化刺激後の受容体型Ｓｍａｄ１／５／８の活性化（リン酸化）がアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の有無により影響されるか否かを検証した。骨芽細胞培養培地にて培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞にアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０（２０μｇ／ｍＬ）を投与しておき、２時間後にアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０を含んだ骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）で刺激した。ＯＤＭ刺激直後から６０分経過時までのＳｍａｄ１／５／８リン酸化レベルをウエスタンブロットにて確認した。図７はそのときのブロッティング像であり、ＥｔＥｘ．４０（−）は投与なし、ＥｔＥｘ．４０（＋）は投与ありである。標識用一次抗体にＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８を使用した。
【００６３】
ブロッティング像からわかるとおり、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の有無に関わらずリン酸化Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化レベルに差異は認められなかった。いずれの場合も、骨芽細胞分化培地刺激誘導から経時的にリン酸化レベルは増加した。この結果から、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０は、Ｓｍａｄの経路には影響していないといえる。
【００６４】
次に、ＴＡＫ１を介したｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ（ｐ３８）の情報伝達経路がアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の有無により影響されるか否かを検証した。骨芽細胞培養培地にて培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞にアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０（２０μｇ／ｍＬ）を投与しておき、２時間後にアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０を含んだ骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）で刺激した。ＯＤＭ刺激直後から６０分経過時までのｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅのリン酸化レベルをウエスタンブロットにて確認した。タンパク質の標識用一次抗体にＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅを使用した。
【００６５】
図８は各タンパク質のウエスタンブロットによるブロッティング像である。ＯＤＭ刺激から１５分経過時のｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ（ｐ３８）のリン酸化レベルは上昇した。アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０を含むＯＤＭ培地で分化誘導刺激した細胞では、同アズキ抽出物を含まないＯＤＭ培地で分化誘導刺激した細胞よりもリン酸化レベルは亢進した。
【００６６】
すなわち、本発明のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０は、ＴＡＫ１を介したｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅのリン酸化を促進するといえる。図７及び図８の結果より得た知見をまとめると、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０（図示中央）は、ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ（ｐ３８）に作用し、そのリン酸化物であるＰｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ（ｐ−ｐ３８））が転写因子の活性化を促しプロモーター領域上に付着して新たな転写発現を増進する。そして、最終的にＯＳＸ（Ｏｓｔｅｒｉｘ）が発現し、同転写因子により骨芽細胞から骨細胞へ分化が促進する機構を提唱することができる（図４参照）。
【００６７】
〔破骨細胞への分化抑制効果〕
破骨細胞は造血系幹細胞に由来し、複数の細胞が融合した多核細胞である。破骨細胞は酸性加水分解酵素の骨型酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ：Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、骨型酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼについてはＴＲＡＣＰと称する。））をその細胞質に含む。破骨細胞が骨に吸収する際にＴＲＡＣＰは細胞質から漏出することから破骨細胞数やその骨吸収活性の直接の指標となるマーカーとして多用される。従って、ＴＲＡＣＰ活性は破骨細胞への分化程度の指標となり、ＴＲＡＣＰ活性が低ければ骨破壊は抑制され、結果的に骨粗鬆症の抑制につながる。
【００６８】
前駆破骨細胞が破骨細胞へ分化する際、ＴＮＦファミリーに属し骨芽細胞から分泌される分化誘導シグナルのＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦκＢ  ｌｉｇａｎｄ）（ｓＲＡＮＫＬも同義、ｓはｓｏｌｕｂｌｅの略）は、レセプターのＲＡＮＫに結合し分化を誘導する（図１１参照）。そこで、マウス由来単球白血病細胞株の前駆破骨細胞様細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞を用い、ｓＲＡＮＫＬ刺激存在下におけるアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０有無の影響を調べた。ＲＡＷ２６４．７細胞はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（以下、Ｍ−ＣＳＦと称する。））を必要としなくても分化可能であり、対照として都合がよい。
【００６９】
〈骨型酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）活性の測定〉
マウス前駆破骨細胞様細胞のＲＡＷ２６４．７細胞を５．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度として、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ培地（ＤＭＥＭ培地）に懸濁し、２４時間培養した。この培養後、同ＤＭＥＭ培地により段階的に希釈して２４ウェルプレートに播種するとともに、本発明のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０について、無投与（ｃｏｎｔｒｏｌ）、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬの順に濃度を高めて投与し、さらに２時間事前培養した。
【００７０】
各ウェル内にｓＲＡＮＫＬを１００ｎｇ／ｍＬの濃度で投与し、また、Ｍ−ＣＳＦを５０ｎｇ／ｍＬの濃度で投与して分化刺激を与えた。Ｍ−ＣＳＦ（＋）は投与あり、Ｍ−ＣＳＦ（−）は投与なしである。各成分の投与後、５日間培養した。培養後、ウェルプレートから上清を取り除き、１０％ホルマリン溶液１０μＬ／ウェルを添加し１０分間固定した。固定後に上清を取り除き、９０％エタノール５μＬ／ウェルを添加して乾燥した。ここにＴＲＡＣＰ活性測定液（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（５．５ｍＭ）、酒石酸ナトリウム（５０ｍＭ）、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５））を１ウェル当たり０．４ｍＬ添加し、３７℃で１ないし２時間振とうした。予め別の測定用のウェルに０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を１ウェル当たり２０μＬ分注し、ここにＴＲＡＣＰ活性測定液を添加して反応させた反応液を１００μＬずつ分注した。各ウェルについて、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００７１】
結果は図９のＴＲＡＣＰ活性のグラフである（ｎ＝５）。ｓＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦを含むｃｏｎｔｒｏｌと比較して、本発明のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０を含む培養条件下では有意にＴＲＡＣＰ活性は低減した。このことから、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０は、Ｍ−ＣＳＦの刺激存在下においても破骨細胞への分化抑制を示唆する。
【００７２】
〈ＴＲＡＣＰ染色〉
ＴＲＡＣＰ染色を目的として、ＲＡＷ２６４．７細胞をｓＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含み、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０の有無並びに１０μｇ／ｍＬまたは２０μｇ／ｍＬの濃度別に、ＤＭＥＭ培地を用い前述の培養条件に従って培養した。ＴＲＡＣＰ染色に際し、染色キット（タカラバイオ株式会社製，ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ）を使用した。
【００７３】
図１０の写真はＴＲＡＣＰ染色を行った培養細胞である。最左は誘導因子やアズキ由来抽出物を含まない培養細胞であり対照である。ｓＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦの誘導因子の存在下、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０が存在しなければ、赤褐色の斑点（図示の写真上では黒い点）が頻出し、ＴＲＡＣＰ活性が高まったことを示す。つまり、破骨細胞への分化が進んでいる状態である。これに対し、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０存在下では、斑点の数が減少した。特に、濃度依存的ということができる。これは、前記のＴＲＡＣＰ活性の結果と一致する。すなわち、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０は、破骨細胞への分化を促進する環境下においても破骨細胞への分化抑制を示唆する。
【００７４】
〔アズキ由来抽出物の前駆破骨細胞への作用機構〕
図１１の概略模式図に示すとおり、破骨細胞表面のＲＡＮＫにＲＡＮＫＬ（ｓＲＡＮＫＬ）が結合すると、同細胞内ではＴＲＡＦ６（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ６）を起点にＪＮＫ、ＥＲＫ、ｃ−Ｆｏｓ、ＮＦ−κＢ等のシグナル伝達物質を介し、ｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｆｏｓからヘテロ二量体タンパク質の転写因子であるＡＰ−１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）が形成される。ＮＦ−κＢはＮＦＡＴｃ１（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ）を誘導する。ＮＦＡＴｃ１にＡＰ−１が結合することにより、ＮＦＡＴｃ１はさらに増加する。ＡＰ−１及びＮＦＡＴｃ１はその他の核内移行シグナルを伴い核内へ移行し、プロモーター領域上に付着して新たな転写発現を増進する。最終的にＴＲＡＣＰやカテプシンＫの産生、受容体ＯＳＣＡＲの発現等につながり、破骨細胞への分化を増進する。この結果、破骨細胞による骨代謝（骨破壊）が促進する。
【００７５】
従って、当該経路を遮断することができれば、破骨細胞への分化を抑制することができ、最終目標である骨破壊の原因物質の産生抑制による骨破壊を低減することができる。
【００７６】
図１１の前駆破骨細胞内のシグナル伝達を踏まえ、本発明のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０はどの伝達物質に作用しているのかを検証した。ＲＡＷ２６４．７細胞をｓＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含み、ＤＭＥＭ培地を用い前述の培養条件に従って培養した。ここに、アズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０（２０μｇ／ｍＬ）を投与し、経時的にｃ−Ｆｏｓ及びＮＦＡＴｃ１をウエスタンブロットにて確認した。図１２はそのときのブロッティングの写真であり、ＥｔＥｘ．４０（−）は投与なし、ＥｔＥｘ．４０（＋）は投与ありである。指標としてβアクチンを用いた。ｃ−Ｆｏｓの標識用一次抗体にＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製の抗体を使用し、ＮＦＡＴｃ１の標識用一次抗体にａｂｃａｍ社製の抗体を使用した。
【００７７】
図示から理解できるように、ＥｔＥｘ．４０の投与ありの条件下では、ｃ−Ｆｏｓの発現量が低下した。これに同調してＮＦＡＴｃ１も減少した。そこで、ＡＰ−１の形成も阻害でき、ＡＰ−１及びＮＦＡＴｃ１の核内移行を抑制して転写量を低減可能とする強力な証拠となる。当該知見から、本発明のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０は前駆破骨細胞におけるシグナル伝達を阻害し転写抑制的に作用する。それゆえ、前駆破骨細胞の破骨細胞への分化抑制に貢献することを示唆する。
【００７８】
〔アズキ由来抽出物の作用機序のまとめ〕
骨芽細胞並びに破骨細胞の前段階の細胞に対するアズキ由来抽出物の作用を勘案すると、同一の抽出物でありながら、双方の細胞への作用を明らかにした。前駆骨芽細胞に対してはその分化を促進することから骨芽細胞への分化と石灰化が明らかとなった。すなわち、骨量増加に貢献する。同時に、前駆破骨細胞に対してはその分化を抑制することから骨破壊を軽減する。このように、本発明のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０は、骨破壊を抑えながら骨形成を進めるという骨代謝調節剤に求められる性能を好適に具備する。
【００７９】
〔製剤例〕
本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物は骨代謝調節剤として有効に作用し骨粗鬆症等の予防、治療に効果的であると考えられる。そこで、本発明のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０を含有する薬剤を試作した。左欄に組成、右欄に配合割合（重量パーセント表記）を開示する。むろん、剤型、配合量等は適宜である。
【００８０】
〈製剤例１：錠剤〉
セルロース            ３０．００
ステアリン酸カルシウム  ２．５０
二酸化ケイ素            １．５０
デンプン粉末          ４９．４０
乳糖                  １０．００
アズキ由来抽出物        ６．６０
（合計）            １００．００
【００８１】
〈製剤例２：カプセル剤〉
乳糖                  ５０．００
アズキ由来抽出物      ５０．００
（合計）            １００．００
上記の成分を公知のカプセル内に封入する。
【００８２】
〔食品への応用〕
本発明のアズキ由来抽出物ＥｔＥｘ．４０は、古来よりヒトが常食しているアズキの煮汁に由来するため、食品に配合して食事から有効成分を摂取することが望ましいといえる。そこで、当該アズキ由来抽出物（骨代謝調節剤）を個々の食品に配合して、実際に調理、製造した。以下に、食品・飲料の名称、そのレシピ（組成）：左欄、及び配合割合（重量パーセント表記）：右欄を開示する。列記の食品、飲料は例示である。本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物（骨代謝調節剤）の添加対象は、当然これら以外の食品、飲料にも広げることができる。また、配合割合も開示の量に限定されることはなく、必要により加減できる。
【００８３】
〈１．水ようかん〉
寒天                    ０．４０
水                    ４５．３５
砂糖                  ２７．００
生あん                ２７．００
食塩                    ０．１０
アズキ由来抽出物        ０．１５
（合計）            １００．００
【００８４】
〈２．ようかん〉
寒天                    ０．６５
水                    ２４．００
砂糖                  ２４．００
生あん                ４８．００
水あめ                  ３．２０
アズキ由来抽出物        ０．１５
（合計）            １００．００
【００８５】
〈３．小倉あん〉
アズキ                ３１．００
砂糖                  ３５．８０
食塩                    ０．０５
水                    ３３．００
アズキ由来抽出物        ０．１５
（合計）            １００．００
【００８６】
〈４．どら焼き〉
薄力粉                ２０．２０
上白糖                １７．００
全卵                  １７．５０
はちみつ                ２．５０
重曹                    ０．２０
水                    １２．４５
アズキ由来抽出物        ０．１５
小倉あん              ３０．００
（合計）            １００．００
【００８７】
〈５．小豆のムース〉
生あん                ３１．００
粉ゼラチン              １．４０
生クリーム            １４．２０
卵白                  １０．５０
砂糖                    ４．３０
水                    ３８．４５
アズキ由来抽出物        ０．１５
（合計）            １００．００
【００８８】
〈６．アイスクリーム〉
卵黄                  １１．００
グラニュー糖          １７．８０
牛乳                  ５３．２０
生クリーム            １７．８０
バニラ香料              ０．０５
アズキ由来抽出物        ０．１５
（合計）            １００．００
【００８９】
〈７．キャンデー〉
水あめ                ４５．００
砂糖                  ５４．７５
アズキ由来抽出物        ０．１５
（合計）            １００．００
【００９０】
〈８．キャラメル〉
水あめ                ３４．５０
砂糖                  １９．７０
小麦粉                  ４．８５
無糖練乳              ３４．６０
食塩                    ０．２０
ショートニング          ５．９０
アズキ由来抽出物        ０．２５
（合計）            １００．００
【００９１】
〈９．カスタードプディング〉
牛乳                  ５８．９０
卵                    ２４．００
砂糖                  １７．００
アズキ由来抽出物        ０．１０
（合計）            １００．００
【００９２】
〈１０．コーヒーゼリー〉
コーヒー（液体）      ８２．９０
砂糖                    ８．３０
粉ゼラチン              １．４０
コーヒーリキュール      ０．３０
水                      ７．００
アズキ由来抽出物        ０．１０
（合計）            １００．００
【００９３】
〈１１．グミ〉
グラニュー糖          ３９．００
水                    ５１．８５
ゼラチン                ６．８０
クエン酸                ０．５０
フルーツ香料            １．６０
アズキ由来抽出物        ０．２５
（合計）            １００．００
【００９４】
〈１２．ババロア〉
牛乳                  ４７．４０
生クリーム            １９．００
卵黄                  １２．６０
砂糖                  １９．００
ゼラチン                １．９０
アズキ由来抽出物        ０．１０
（合計）            １００．００
【００９５】
〈１３．マシュマロ〉
水あめ                ４６．３０
砂糖                  ５０．９０
ゼラチン                ２．７０
アズキ由来抽出物        ０．１０
（合計）            １００．００
【００９６】
〈１４．カステラ〉
全卵                  ３４．３０
卵黄                    ３．８０
砂糖                  ３４．３０
はちみつ                ４．８０
米飴                    １．９０
薄力粉                １８．００
水                      ２．８０
アズキ由来抽出物        ０．１０
（合計）            １００．００
【００９７】
〈１５．ホットケーキ〉
卵                    １９．７０
砂糖                  １３．４０
牛乳                  ２３．４０
ベーキングパウダー      １．８０
薄力粉                ３６．００
バター                  ５．４０
食塩                    ０．１５
バニラ香料              ０．０５
アズキ由来抽出物        ０．１０
（合計）            １００．００
【００９８】
〈１６．クッキー〉
マーガリン            １２．２０
ショートニング        １２．２０
砂糖                  １８．４０
全卵                    ８．２０
薄力粉                ４４．８０
強力粉                  ４．１０
アズキ由来抽出物        ０．１０
（合計）            １００．００
【００９９】
〈１７．フルーツジュース〉
フルーツ果汁          ５０．００
果糖ブドウ糖液糖      １０．００
クエン酸                ０．３０
フルーツ香料            ０．２０
水                    ３９．２５
アズキ由来抽出物        ０．２５
（合計）            １００．００
【０１００】
〈１８．炭酸飲料〉
果糖ブドウ糖液糖      １１．００
クエン酸                ０．２０
クエン酸ナトリウム      ０．０５
フルーツ香料            ０．２０
炭酸水                ８８．４５
アズキ由来抽出物        ０．１０
（合計）            １００．００
【０１０１】
本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物（骨代謝調節剤）は、広汎な食品種に添加することができるため、通常の食事からの摂取が可能となる。従って、日常生活の質（ＱＯＬ）の改善への効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物（骨代謝調節剤）は、広汎な食品種に添加することができるため、通常の食事から無理なく摂取が可能となる。また、有効成分を高めて薬剤とすることにより、骨粗鬆症等の骨代謝異常の改善に効果を有し予防、治療に有効な薬剤を得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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