(57)【要約】【課題】肺疾患に対する薬剤開発のための新規経路の同定の提供。【解決手段】本発明は、肺疾患を有するかまたは肺疾患を有するリスクがある個体の細胞学的に正常な気道細胞において活性化された発癌経路、ならびに該経路の活性化と関連している特異的遺伝子発現パターン（バイオマーカー）の同定を提供する。このようなバイオマーカーおよび経路により、肺疾患（例えば、肺癌）の予後および／または診断のインジケーターが提供され得る。さらに、このような経路およびバイオマーカーにより、肺疾患の処置のための治療標的、ならびに処置の有効性の評価のためのマーカーが提供され得る。【選択図】図１
2014204737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００７年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／９９４，６４３号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／９９４，６４３号の全ての教示は参考として本明細書中に援用される。
（連邦政府により後援された研究に関する申告）
本明細書中に記載された研究は、補助金番号第ＮＩＨ／ＮＣＩ  Ｒ０１ＣＡ１２４６４０および同ＮＩＨ／ＮＩＥＨＳ  Ｕ０１ＥＳ０１６０３５からの資金により支援された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
喫煙は、米国において肺癌の主な原因であり、全症例の推定９０％を占める［１］。しかしながら、喫煙によって引き起こされる損傷は、肺のみに限定されるだけでなく、呼吸器全体にわたって「広域損傷（ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｉｎｊｕｒｙ）」を構成する［２〜６］。広域損傷仮説の重要な成果は、一次肺組織の典型的な採取法よりも侵襲性の低い様式で得られ得る呼吸器のある領域（気管支気道など）において採取された細胞から臨床的に関連性のある情報が収集できることである。このアプローチに基づき、細胞学的に正常な気管支気道上皮において測定される遺伝子発現系のバイオマーカーであって、肺癌を有する喫煙者と肺癌のない喫煙者とが識別され得るバイオマーカーが開発された［７］。この気道遺伝子発現バイオマーカーでは、前向き試験セットで喫煙者が肺腫瘍を有するかどうかの予測において８３％の精度が得られ、臨床変数と相乗的に組み合わせると９４％の精度が得られた［７，８］。
【０００３】
肺癌の初期診断用ツールとして有用である以外に、細胞学的に正常な気道上皮における遺伝子発現の変化は、肺癌の初期段階において調節異常となるシグナル伝達事象の理解を高める可能性を有する。ヒトにおける肺癌の発生は、複雑な過程であり、多様な異常事象を伴い、この異常事象が蓄積されると、重要な細胞機能（例えば、細胞の生存および増殖）の調節異常がもたらされる。肺癌を有する患者から切除された原発腫瘍では、これまでに、多くのシグナル伝達経路、例えば、ｐ５３、ＲＡＳおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）などが調節異常となることがわかっている［９〜１１］。さらに、広域損傷および広域発癌（ｆｉｅｌｄ  ｃａｎｃｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の研究により、腫瘍形成の初期であると推定される一部の分子変化もまた、原発腫瘍隣接部と原発腫瘍遠位の両方の組織学的に正常な細胞に反映されることがわかっている。例えば、特定の染色体領域において同じｐ５３変異とヘテロ接合性の低いものが呼吸器全体にわたって同定された［５，１２］。
【０００４】
肺癌を有する喫煙者由来の細胞学的に正常な気管支気道細胞における発癌経路の調節異常に対する洞察により、悪性腫瘍への進行に関与している機構の解明が補助される。さらに、どの経路が調節異常となるか理解されることにより、肺癌の前悪性段階での治療および化学予防の機会がもたらされ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
これまでに、細胞学的に正常な気管支気道上皮の遺伝子発現プロファイリングにより、喫煙者の広域損傷が反映され、これは、感受性で特異的な肺癌の診断用バイオマーカーとして有用であり得ることが示されていた。特定の発癌経路のインビトロでの錯乱によって規定される遺伝子発現印章を使用すると、本明細書に記載のように、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の活性の有意な増大が、肺癌を有する喫煙者の細胞学的に正常な気道（ｎ＝１２９）、ならびに肺腫瘍組織（ｎ＝１０７）において同定された。ＰＩ３Ｋの活性の増大が肺癌の発生前に起こるのかどうかを評価するため、気道に中等度から重度の異形成病変を有するハイリスク喫煙者の細胞学的に正常な気道の上皮（ｎ＝１４）をプロファイリングすると、異形成のない健常喫煙者由来の気道上皮（ｎ＝ｌｌ）と比べて高いレベルのＰＩ３Ｋ経路遺伝子発現が見られた。さらに、化学予防剤ｍｙｏ−イノシトールでの処置後、異形成の有意な後退を有するハイリスク喫煙者の気道において、ＰＩ３Ｋ活性が低下した（ｎ＝１０）。インビトロ希釈実験により、ｍｙｏ−イノシトールがＰＩ３Ｋ経路を阻害することが確認され、これは、ｍｙｏ−イノシトールの作用機序を示すだけでなく、ＰＩ３Ｋ経路の活性と気道異形成の後退との治療上の可能性における関係を反映する。総合すると、このような所見は、ＰＩ３Ｋ経路の調節異常が肺癌の発生における初期の測定可能な可逆的段階であること、および喫煙者の気道遺伝子発現プロファイリングにより化学的予防および治療に対する個別化アプローチが可能となり得ることを示唆する。
【０００６】
一実施形態において、本発明は、肺疾患を有する個体の細胞学的に正常な気道上皮細胞において活性化された発癌経路のバイオマーカーを提供する。このようなバイオマーカーおよび経路により、肺疾患（例えば、肺癌）の予後および／または診断のインジケーターが提供され得る。さらに、このような経路およびバイオマーカーにより、肺疾患の処置の治療標的、ならびに処置の有効性の評価のためのマーカーが提供され得る。
【０００７】
一態様において、本発明は、肺疾患（例えば、肺癌）において活性化された発癌経路の遺伝子発現印章を同定するための遺伝子発現のプロファイリング方法の使用に関する。このような遺伝子発現印章により、肺疾患（例えば、肺癌）の予後または診断のインジケーターが提供され得る。さらに、肺疾患において活性化された発癌経路は、治療的介入の標的となり得る。一実施形態において、発癌経路は、例えば、ＰＩ３Ｋ経路およびＮｐ６３経路の１つ以上であり得る。
【０００８】
また、本発明は、個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＮｐ６３および／またはＰＩ３Ｋ経路の活性化状態を測定することを含み、Ｎｐ６３および／またはＰＩ３Ｋ経路の活性化は、前記個体が、Ｎｐ６３および／またはＰＩ３Ｋ経路が活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法に関する。特定の実施形態において、個体は、喫煙者または非喫煙者である。他の実施形態において、肺疾患は肺癌である。
【０００９】
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現データを用いて測定される。例えば、一部の実施形態では、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋが活性化されると増加する遺伝子であり、他の一部の実施形態では、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋが活性化されると減少する遺伝子である。また、ＰＩ３Ｋが活性化されると増加するバイオマーカーと減少するバイオマーカーの組合せも使用され得る。特定の実施形態では、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類がＰＩ３Ｋ活性化の上流である遺伝子であり、一方、他の実施形態では、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋ活性化の下流である遺伝子である。
【００１０】
特定の実施形態において、前記ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの発現データは、オリゴヌクレオチドのマイクロアレイを用いて得られる。他の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの１種類以上の遺伝子発現産物を用いて測定される。前記遺伝子発現産物は、ヌクレオチドまたはアミノ酸産物であり、当該技術分野で公知の方法を用いて検出され得る。
【００１１】
本発明の一部の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、ＩＧＦ１Ｒの活性化を評価することにより測定され、ＩＧＦ１Ｒの活性化はＰＩ３Ｋ経路の活性化を示す。本発明の他の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、ＰＫＣの活性化を評価することにより測定され、ＰＫＣの活性化はＰＩ３Ｋ経路の活性化を示す。
【００１２】
また、本発明は、個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＰＫＣの活性化状態を測定することを含み、ＰＫＣの活性化は、前記個体が、ＰＫＣが活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＩＧＦ１Ｒの活性化状態を測定することを含み、ＩＧＦ１Ｒの活性化は、前記個体が、ＩＧＦ１Ｒが活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法に関する。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの１種類以上のプローブが上面に固定化されており、他のバイオマーカーのプローブは該上面に固定化されていないオリゴヌクレオチドアレイを提供する。好ましい実施形態において、前記ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーは、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＫＣ、［２９］に開示されたバイオマーカー、およびその組合せからなる群より選択される。
【００１５】
また、本発明は、肺疾患のリスクのある個体に、ＰＩ３Ｋ経路を阻害する１種類以上の薬剤（例えば、１種類以上の薬剤、レジメンもしくは処置剤またはその組合せ）を投与することを含む、個体の肺疾患のリスクを低下させる方法に関する。特定の実施形態において、前記１種類以上の薬剤の投与前に、前記個体においてＰＩ３Ｋ経路が活性化されている。一実施形態において、肺疾患は肺癌である。別の実施形態において、前記１種類以上の薬剤は、肺疾患の発生前に、前記個体に予防的に投与される。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、正常気道上皮細胞における対象の生物学的経路の活性化と関連している遺伝子発現印章を同定することと、気道上皮細胞の分類と対象の生物学的経路の活性化間の１つ以上の相関関係を同定するために識別分類された気道上皮細胞における遺伝子発現を評価することと、細胞学的に正常な試験気道上皮細胞における遺伝子発現を評価することとを含み、ここで、分類対象の細胞学的に正常な気道上皮細胞の遺伝子発現プロフィールにより、対象の生物学的経路が活性化されているかどうかが示され、したがって該細胞が識別分類される、細胞学的に正常な試験気道上皮細胞を識別分類する方法に関する。
【００１７】
特定の実施形態において、対象の生物学的経路は発癌経路である。一部の実施形態において、識別分類は、疾患の高リスク対疾患の低リスクであり、一方、他の実施形態では、識別分類が、処置に対する応答対処置に対する非応答である。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、肺疾患（例えば、肺癌）を有するか、または有するリスクがある哺乳動物における発癌経路の活性化を同定するための方法を提供する。該方法は、（ａ）生物学的試料、例えば、哺乳動物の気道由来の生物学的試料を準備すること、ここで該生物学的試料は、前記経路の活性化を示す少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を含む、および（ｂ）前記遺伝子の発現を検出すること、を含むものであり得る。例えば、該経路は、以下：Ｒａｓ、Ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ３、β−カテニン、Ｓｒｃ、Ｎｐ６３、ＰＩ３Ｋおよびその組合せの１つ以上であり得る。哺乳動物は、例えばヒトであり得る。生物学的試料は、例えば、気管支、鼻腔もしくは口腔の上皮、または生検の組織試料から得られたものであり得る。一実施形態において、遺伝子発現の検出は、該当遺伝子（１つまたは複数）のプローブである１つ以上のヌクレオチド配列またはその断片が上面に固定化されたオリゴヌクレオチドアレイを用いて行なわれる。発癌経路の活性化の同定により、哺乳動物が、前記経路の活性化を阻害する処置の候補、または疾患（例えば、癌）の発生を同定するためのさらなる、もしくはより高頻度のスクリーニングの候補であることが示され得る。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、肺疾患（例えば肺癌）の処置に有用であり得る候補治療用薬剤のスクリーニング方法を提供する。例えば、候補薬剤は、本明細書に記載の方法によって肺疾患と関連していると同定された発癌経路の活性化をモジュレートする（例えば、阻害する）能力に関してスクリーニングされ得る。薬剤が該経路の活性化をモジュレートする能力は、例えば、発癌経路の遺伝子発現印章を、疾患と関連している印章から疾患と関連していない（例えば、正常である）印章に改変させる能力によって評価され得る。あるいはまた、候補治療用薬剤は、該経路の特定の機能的効果または読み出し情報をモジュレートする能力に関して評価され得る。肺疾患と関連している活性化された発癌経路を阻害する能力を有すると同定された薬剤は、哺乳動物の肺疾患の処置に適したものであり得る。
【００２０】
また、処置レジメンの有効性は、処置過程における種々の時点で哺乳動物の遺伝子発現印章を評価することにより評価され得る。疾患と関連しているものから疾患と関連していないもの（例えば、正常な印章）への発癌経路の遺伝子発現印章のシフトは、有効な処置を示す。同様に、遺伝子発現印章の正常な印章へのシフトの非存在は、処置が有効でないこと、およびおそらく別の処置レジメンが適応されることを示す。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の活性化状態を測定することを含み、該ＰＩ３Ｋ経路の活性化は、前記個体が、ＰＩ３Ｋ経路が活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法。
（項目２）
前記個体が喫煙者である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記個体が非喫煙者である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記肺疾患が肺癌である、項目１に記載の方法。
（項目５）
ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態が、ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現データを用いて測定される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋが活性化されると増加する遺伝子である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋが活性化されると減少する遺伝子である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋ活性化の上流の遺伝子である、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現データが、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて得られる、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態が、ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの１種類以上の遺伝子発現産物を用いて測定される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態が、ＩＧＦ１Ｒの活性化を評価することにより測定され、ＩＧＦ１Ｒの活性化は該ＰＩ３Ｋ経路の活性化を示す、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態が、ＰＫＣの活性化を評価することにより測定され、ＰＫＣの活性化は該ＰＩ３Ｋ経路の活性化を示す、項目１に記載の方法。
（項目１３）
個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＰＫＣの活性化状態を測定することを含み、ＰＫＣの活性化は、前記個体が、ＰＫＣが活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法。
（項目１４）
個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＩＧＦ１Ｒの活性化状態を測定することを含み、ＩＧＦ１Ｒの活性化は、前記個体が、ＩＧＦ１Ｒが活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法。
（項目１５）
ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの１種類以上のプローブが上面に固定化されており、他のバイオマーカーのプローブは該上面に固定化されていない、オリゴヌクレオチドアレイ。
（項目１６）
前記ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーが、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＫＣおよびその組合せからなる群より選択される、項目１５に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
（項目１７）
肺疾患のリスクのある個体に、ＰＩ３Ｋ経路を阻害する１種類以上の薬剤を投与することを含む、個体の肺疾患のリスクを低下させる方法。
（項目１８）
前記１種類以上の薬剤の投与前に、前記個体においてＰＩ３Ｋ経路が活性化されている、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記肺疾患が肺癌である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記１種類以上の薬剤が、肺疾患の発生前に、前記個体に予防的に投与される、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
細胞学的に正常な試験気道上皮細胞を識別分類する方法であって、
正常気道上皮細胞における対象の生物学的経路の活性化と関連している遺伝子発現の特徴を同定すること、
気道上皮細胞の分類と対象の生物学的経路の活性化間の１つ以上の相関関係を同定するために識別分類された気道上皮細胞における遺伝子発現を評価することと、
細胞学的に正常な試験気道上皮細胞における遺伝子発現を評価することと、
を含み、
ここで、分類対象の細胞学的に正常な気道上皮細胞の遺伝子発現プロフィールにより、対象の生物学的経路が活性化されているかどうかが示され、したがって該細胞が識別分類される、
細胞学的に正常な試験気道上皮細胞を識別分類する方法。
（項目２２）
前記対象の生物学的経路が発癌経路である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記識別分類が、疾患の高リスク対疾患の低リスクである、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記識別分類が、処置に対する応答対処置に対する非応答である、項目２１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＰＩ３ＫおよびΔＮｐ６３が、肺癌を有する喫煙者において識別的に活性化されていることを示す図である。インビトロ遺伝子発現印章において訓練したバイナリ後退モデルを使用し、経路活性化の確率を、細胞学的に正常な気道から採取した試料において計算した。経路レベルを箱ひげ図を用いて要約する。図中、横線はメジアン値を表し、ボックスは、２５〜７５パーセンタイルのデータ点の範囲を表し、ひげは、残りの第１および第４四分位数の範囲を指定する。図１Ａに示されたように、活性化レベルを肺癌状態によって群分けすると（青は肺癌なし、赤は肺癌）、２つの経路は、ランダム順列検定後、統計学的に異なることがわかった：ＰＩ３Ｋ（ｐ＜０．００１）、およびΔＮｐ６３（ｐ＜０．００１）。肺癌を有する喫煙者の気道で見られた経路活性化において観察された差と混同する可能性があり得る変数を明らかにするため、健常喫煙未経験者（緑色）、喫煙経験者（茶色）および現在喫煙者（灰色）（図１Ｂ）、ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する現在喫煙者（橙色）または有しない現在喫煙者（灰色）（図１Ｃ）の経路活性化の確率も計算した。いずれの潜在的交絡変数でも、経路活性化において統計学的有意差は示されなかった。
【図２】図２は、肺腫瘍および隣接正常組織における発癌経路の活性を示す図である。発癌経路の活性を、肺腺癌および隣接正常組織のデータセットについて計算した［３２］。正常隣接部およびその対応腫瘍試料と比較すると、ＰＩ３Ｋ（ｐ＜０．００１）とΔＮｐ６３（ｐ＝０．００２）の増加が観察された。また、ＭｙｃおよびＥ２Ｆ３においても増加が見られ、Ｓｒｃでは減少がみとめられた。エラーひげをＳＥＭとして報告する。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、前向き収集気道試料におけるＰＩ３Ｋ活性の生化学的検証を示す図である。気道ブラシ擦過採取物をボストンおよびユタにおいて、肺癌を有する疑いのある患者から前向き収集した。図３Ａに示されたように、キナーゼアッセイを使用し、ＰＩ３Ｋ経路の活性のインビボレベルを測定した。肺癌を有する患者は、一般的に、肺癌のない患者よりも高いＰＩ３Ｋ活性レベルを有した。ボストンコホートのサブセットは、マイクロアレイ上で泳動されるさらなる試料を有し、そのため、コンピュータ計算により予測されたＰＩ３Ｋ活性をインビボ活性と相関させることができた。経路の活性の確率を、さらなる試料を有した患者の下方に示す。コンピュータ計算により予測されたＰＩ３Ｋ活性と生化学的に測定された活性とのピアソン相関係数は０．４８であった。図３Ｂに示されたように、ＰＩ３Ｋの上流と下流の両方のタンパク質をクエリーしたウエスタンブロットを定量し、次いで、図３Ａにおいて測定されたＰＩ３Ｋキナーゼレベルと相関させた。相関関係をヒートマップ様式で示し、図中、青は負の相関関係を表し、赤は正の相関関係を表す。また、相関関係の解析も、すべての試料、肺癌を有する試料のみ、および対照試料のみに分解される。ｐ−ＩＧＦ１Ｒおよびｐ−ＰＫＣはともに、肺癌を有する患者においてＰＩ３Ｋ活性と正に相関しており、これは、肺癌を有する喫煙者の気道におけるＰＩ３Ｋ経路の活性の増大を駆動する下位経路の可能性を示す。
【図４】図４は、異形成を有する喫煙者がＰＩ３Ｋ経路の活性化の増大を有することを示す図である。ＰＩ３Ｋ経路が活性化されると増加する遺伝子（インビトロ錯乱によって規定）をヒートマップで示す。青は遺伝子の低発現を表し、一方、赤は遺伝子の高発現を表す。異形成を有する喫煙者の細胞学的に正常な気管支気道におけるこれらの遺伝子の発現レベルを健常喫煙者と比較すると、異形成を有する喫煙者においてＰＩ３Ｋ経路の活性化の増大が観察された。ＧＳＥＡを使用し、この遺伝子セットの富化を定量した（ｐ＜０．００１、ＦＤＲ  Ｑ＜０．００１）。異形成状態、パックイヤーならびにバッチ効果を示す確率変数が考慮された線形モデルを使用し、ＧＳＥＡのために遺伝子を順位付けした。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、Ｍｙｏ−イノシトールがＰＩ３Ｋ経路をインビトロで阻害することを示す図である。３種類の異なる細胞株、すなわち、（図５Ａ）ＢＥＡＳ−２Ｂ（気管支気道細胞株）、（図５Ｂ）ＢＴ５４９（乳癌細胞株）、および（図５Ｃ）ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓細胞株）において、インスリンを用いてＰＩ３Ｋ経路を活性化した。次いで、これらの細胞株を種々の用量のｍｙｏ−イノシトールおよびＬＹ−２９４００２で処理した。ＰＩ３Ｋ経路の活性化レベルを定量するためにＰＩＰ３レベルを測定した（ｙ−軸）。試験した各細胞株において、ｍｙｏ−イノシトールまたはＬＹ−２９４００２（既知ＰＩ３Ｋインヒビター）のいずれかでの処置後にＰＩＰ３レベルの低下がみとめられ、これは、ｍｙｏ−イノシトールがＰＩ３Ｋ経路をインビトロで阻害することを示す。このような実験を繰り返すと、同様の結果が得られた。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
呼吸器全体の内側に存在する上皮細胞におけるゲノムの変化は、喫煙に対する宿主の応答および喫煙による損傷を反映しているという概念に基づき、肺癌を有するリスクがある、または該リスクのない喫煙者の気道において、どの経路が調節異常となるのかが同定されることにより、腫瘍形成に至る初期事象に対するより良好な理解が得られ得る。経路の活性を評価するためのアプローチの一例は、遺伝子発現データの使用により、単離したシグナル伝達経路のインビトロ活性化を関連させ、患者試料における該経路の状態を予測することである。このアプローチは、イニシエーション事象が既知である細胞株ならびに腫瘍の経路の状態の予測において好成績である［１３］。インビトロで規定される経路印章の長所は、遺伝子発現レベルで経路の活性を同定することができ、単一のマイクロアレイ実験を用いて多様な経路の測定が可能になることである。さらに、遺伝子発現に基づいた経路の活性の予測は、特定の経路を標的化する薬物と有意に相関していることがわかっている［１３〜２０］。また、数多くの研究により、目的の治療剤を用いた臨床試験において、予測した経路の状態と治療応答性との相関関係が見い出されている［２２〜２５］。
【００２３】
本明細書に記載の研究では、インビトロ錯乱によって生じる発現印章を利用した。メタ遺伝子モデルを、肺癌を有する喫煙者と肺癌のない喫煙者の細胞学的に正常な気道上皮における発癌経路の活性の比較のために訓練した。本明細書に記載のように、上記の遺伝子発現に基づいた経路アプローチを使用すると、データにより、ＰＩ３Ｋ経路は、肺癌を有する喫煙者の細胞学的に正常な気管支気道細胞において活性レベルの増大、ならびに肺腫瘍組織自体において高レベルの活性を有することが示される。肺癌を有する患者および肺癌のない患者由来の気道試料から前向き収集したコホートのＰＩ３Ｋ活性をインビボで測定する生化学的アッセイにより、コンピュータ計算による予測を検証した。気道に異形成病変を有するハイリスク喫煙者の細胞学的に正常な気道の発現プロフィールを調べると、この場合も、ＰＩ３Ｋの活性の増大が示された。異形成は新生物発生前事象とみなされているため、これは、ＰＩ３Ｋレベルが肺癌の発生前に増大したことを示す。この結果に対して考えられ得る治療上の関連性を示すとすれば、化学予防剤ｍｙｏ−イノシトールに応答性であるハイリスク被検体は、ＰＩ３Ｋ活性の有意な低下および異形成病変の後退を示す。ｍｙｏ−イノシトールとＰＩ３Ｋとの関係は、ｍｙｏ−イノシトールがＰＩ３Ｋをインビトロで阻害することを示すことにより、さらに解明された。
【００２４】
総合すると、これらの結果により、ＰＩ３Ｋ経路は、細胞学的に正常な気道上皮において肺癌の発生前に活性化され、この経路のレベルはｍｙｏ−イノシトールでの化学的予防に対する応答と関連していることが示される。より広義には、このような所見は、気道での遺伝子発現が、喫煙者における特定の発癌経路の錯乱を反映し、場合によっては化学的予防および治療に対する個別化アプローチが可能になることを示唆する。
【００２５】
ＰＩ３Ｋ経路およびΔＮｐ６３経路は、肺癌を有する喫煙者の正常気道において活性化の増大を有する（図１Ａ）。これは、推測的に、細胞学的に正常な細胞が発癌経路調節異常の徴候を示すことが予測されないため、興味深い所見である。さらに、本明細書に記載のようにして使用される非肺癌対照が、同様にＰＩ３Ｋ経路に影響を及ぼし得る広範囲の別の病態を有し、単なる健常志願者でないことに注目することは重要である。しかしながら、活性の増大は、喫煙状態またはＣＯＰＤと相関していない（図１Ｂ、１Ｃ）。
【００２６】
また、新生物発生前のＰＩ３Ｋ経路の増大は、健常喫煙者と比較すると、気道に異形成病変を有するハイリスク喫煙者の細胞学的に正常な気道においても見られた。これは、ＰＩ３Ｋ活性が肺新生物の発生前に誘導されるという仮説を裏付ける。また、肺腫瘍では、隣接正常組織と比べて高いＰＩ３Ｋ活性レベルがみとめられ（図２）、これは、細胞変換としてのＰＩ３Ｋ活性のさらなる増大を示す。
【００２７】
肺腺癌のマウスモデルを用いた先の試験では、ＰＩ３Ｋが肺癌の悪性進行に必要とされること、およびこの経路の阻害により腫瘍形成が阻止されることが示された［４０］。また、ＰＩ３Ｋ経路の活性の増大は、これまでに肺癌を含む多くの種々の癌で観察されている［４１］。腫瘍の構成的活性化をもたらす調節異常の一般的な原因の一例としては、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける変異、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮの変異、欠失もしくは抑制、ＰＩ３Ｋ遺伝子コピー数の増加［４２］またはＰＩ３Ｋの触媒性サブユニットｐ１１０αにおける変異［４１］が挙げられる。
【００２８】
本明細書に記載の試験では、肺癌患者の正常気道上皮におけるＰＩ３Ｋ活性は、ＩＧＦ１Ｒ（上流）およびＰＫＣ（下流）の活性化と正に相関し、ＨＥＲ２（上流）およびＡＫＴ（下流）とは正に相関しない（図３）。このような結果は、このような細胞においてＰＩ３Ｋ活性化、続いて下流効果をもたらす特異的シグナル伝達カスケードを示す。一部の試験では、ＩＧＦシグナル伝達レベルの増大が肺癌と関連していた。さらに、ＩＧＦ経路の現在のインヒビターは、肺癌患者において有意な応答を有することがわかっている。ＰＫＣは、ＰＩ３Ｋの下流のキナーゼであり、これまでに、異形成病変および肺癌においてレベルが高いことがわかっている［３３，３４］。総合すると、本明細書に記載の結果は、ＩＧＦＲ１／ＰＩ３Ｋ／ＰＫＣ経路が肺癌の発生に対して中心的であり、前悪性状態でさえあることを示唆する。
【００２９】
臨床的に重要なのは、肺癌の発生前のＰＩ３Ｋレベルの低下によって、何らかの治療可能性がもたらされ得るかどうかである。現在市販されているシロリムスなどのＰＩ３Ｋ経路インヒビターは有害な副作用を有し、このため、予防選択肢としての長期使用が禁止されることがあり得る。この重要な課題への取り組みを補助するため、ｍｙｏ−イノシトールと称する肺癌化学予防剤での処置を受けたハイリスクコホートにおいて試験を行った。ｍｙｏ−イノシトールは、以前に、２〜３ヶ月間の経口処置後、気道内の異形成病変を低減させることがわかっているものである［３５］。シロリムスとは対照的に、ｍｙｏ−イノシトールは、引き起こされる副作用が非常に少ないため、長期間経口摂取される可能性を有する。気道内の異形成の後退によって示されるようにｍｙｏ−イノシトールに応答したこのコホート由来の患者では、ＰＩ３Ｋ活性の低下を反映する遺伝子発現パターンが観察された。この試験での比較的限定的な試料サイズ（ｎ＝１０）を考慮し、インビトロで試験を行うと、ｍｙｏ−イノシトールはＰＩ３Ｋ活性を直接阻害することがわかり、これはこの化合物の作用機序の可能性を示す（図５）。ｍｙｏ−イノシトールの化学予防性が大規模な臨床試験で確認されれば、気道においてＰＩ３Ｋ活性が錯乱したハイリスク喫煙者にこの化合物を使用することにより、肺癌発症が低減される可能性がある。また、処置後のこのような被検体における気道遺伝子発現のプロファイリングにより、長期治療の恩恵を被り得る患者のサブセットの同定が補助され得る。より広義には、これらの結果は、喫煙者の気道での遺伝子発現パターンが、特定の発癌経路の錯乱を反映し、場合によっては化学的予防および治療に対する個別化が可能になる。
【００３０】
原理上（ｉｎ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）、細胞学的に正常な気道上皮における発癌経路の活性の増大が説明され得る多くの仮説が存在する。重要なことは、これらの概念が相互に排他的ではなく、相乗的に作用して疾患が促進されているようであることである。第１に、調節異常は、肺癌に対する遺伝的素因（発癌性の生殖細胞系の変異など）によって引き起こされ得る。第２に、広域損傷仮説に従い、喫煙曝露によって呼吸器全体が損傷され、該損傷（体細胞変異など）が気道内で発癌活性源となり得る。損傷に対する感受性は、一部、喫煙に対する宿主の応答に依存し、これは、発癌性の生殖細胞系の変異によって影響を受ける。最後に、増殖に利点をもたらす体細胞変異が、クローン増殖のため、気道において発癌活性の増大を引き起こすことがあり得る。
【００３１】
累積的に、これらの試験によって、コンピュータ計算によるアプローチが成功裡に使用され、肺癌の発癌を駆動するシグナル伝達経路が同定され、ハイリスク集団において癌の発生が予防され得る合理的な目標治療アプローチが同定される。さらに、本発明者らの生化学的測定値は、患者試料のコンピュータ計算による解析と相関しており、このアプローチの特異性と感受性が強調される。経路活性化の検証も、インビトロ試験とインビボ試験において行なわれ、ｍｙｏ−イノシトール処置はＰＩ３Ｋ経路の阻害と関連している。これは、ＰＩ３Ｋ経路の調節異常が肺癌の発生における初期の測定可能で可逆的段階であり、ハイリスク喫煙者における化学予防的アプローチの誘導に有用であり得ることを示す。
【００３２】
したがって、本発明は、気道の細胞学的に正常な細胞における経路の状態（例えば、発癌経路の状態）を同定するための一般的なアプローチを提供し、該経路の状態は、肺疾患の早期予測因子として有用であり得、および／または治療的介入（例えば、早期介入）のための標的を提供し得る。このアプローチによれば、対象の発癌経路または他の経路は、細胞（例えば、ヒト上皮細胞、ヒト上皮一次細胞培養物）においてインビトロで活性化させ、経路活性化と関連している遺伝子発現印章またはパターンを同定する。例えば、細胞は、対象の経路の活性化成分または必要成分を発現するアデノウイルス（例えば、ｐ１１０または他の適当な因子を発現するアデノウイルス）を用いて錯乱させ得る。次いで、識別的分類対象の試料（例えば、肺癌患者由来の試料対肺癌のない個体由来の試料、処置応答性患者由来の試料対処置非応答性患者由来の試料など）が評価され、経路活性化を示す遺伝子発現プロフィールとのクラス関連性が同定され得る。すなわち、経路の状態（例えば、活性化）は、表現型（例えば、疾患状態、処置応答など）と相関している。その後、組織学的に正常な気道細胞は、特定の経路の活性化と関連している遺伝子発現パターンを同定するために試験され得、経路の状態と表現型との相関関係に基づいて、該細胞試料を採取した個体の表現型（例えば、癌性、非癌性などの疾患状態）が予測され得る。このようにして、疾患状態と経路の状態（遺伝子発現によって示される）との関係が同定され得、このような関係は、治療および予後での適用に活用され得る。同様に、１つ以上の経路活性化に対する候補薬剤および処置レジメンの影響は、前記経路（１つまたは複数）と関連している遺伝子発現のモニタリングによって評価され、所望の効果を有する薬剤および／またはレジメンが同定され得る。
【００３３】
また、本発明は、個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞における発癌経路（例えば、Ｎｐ６３および／またはＰＩ３Ｋ経路）の活性化状態を測定することを含む、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法に関する。例えば、Ｎｐ６３および／またはＰＩ３Ｋ経路の活性化は、前記個体が、Ｎｐ６３および／またはＰＩ３Ｋ経路が活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す。特定の実施形態において、個体は、喫煙者または非喫煙者である。他の実施形態において、肺疾患は肺癌である。一部の実施形態において（Ｉ  ｓｏｍｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）、多様な経路（例えば、発癌経路）の活性化状態が同時に評価される。
【００３４】
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上（すなわち、１、２、３、４、５種類または５種類より多く）のバイオマーカーの遺伝子発現データを用いて測定される。例えば、一部の実施形態において、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋが活性化されると増加する遺伝子であり、他の一部の実施形態では、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋが活性化されると減少する遺伝子である。ＰＩ３Ｋが活性化されると増加するバイオマーカーと減少するバイオマーカーの組合せも使用され得る。特定の実施形態において、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類がＰＩ３Ｋ活性化の上流である遺伝子であり、一方、他の実施形態では、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、ＰＩ３Ｋ活性化の下流である遺伝子である。
【００３５】
本発明の一実施形態において、細胞学的に正常な気道上皮細胞から単離核酸を得、当該技術分野で公知の任意の遺伝子発現測定法（例えば、ｍＲＮＡ転写物の解析ならびにＤＮＡメチル化の解析）を使用し、１つの遺伝子または多数の遺伝子の発現を評価するために使用する。
【００３６】
ｍＲＮＡレベルを評価するための方法は、当業者には公知であろう。好ましい一実施形態において、遺伝子発現は、ＲＮＡ転写物の検出によって、例えば、ノザンブロッティング（例えば、この場合、ＲＮＡ調製物を変性アガロースゲル上で泳動させ、適当な支持体（活性化セルロース、ニトロセルロースまたはガラスまたはナイロン膜など）に移す）によって測定され得る。次いで、標識（例えば、放射性標識）ｃＤＮＡまたはＲＮＡを該調製物にハイブリダイズさせ、洗浄し、当該技術分野で公知の方法（オートラジオグラフィーなど）を用いて解析する。
【００３７】
さらに、ＲＮＡ転写物の検出は、既知の増幅方法を用いて行なってもよい。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡを逆転写した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うこと、または、単一の酵素を両方の工程に使用すること（米国特許第５，３２２，７７０号に記載）、またはｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、対称ギャップ（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｇａｐ）リガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を行うこと（Ｒ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４：８０−８４（１９９４）に記載）は、本発明の範囲に含まれる。
【００３８】
本明細書において使用され得る他の既知の増幅方法としては、限定されないが、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」手法（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０）に記載、およびＮａｔｕｒｅ  ３５０（Ｎｏ．６３１３）：９１−９２（１９９１）にも記載）、Ｑ−β増幅（公開欧州特許出願（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に記載）、鎖置換増幅（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９−１３（１９９６）および欧州特許出願第６８４３１５号に記載）、ならびに標的媒介性増幅（ＰＣＴ特許出願公開公報ＷＯ  ９３２２４６１に記載）が挙げられる。
【００３９】
また、インサイチュハイブリダイゼーション可視化も使用され得、この場合、放射性標識アンチセンスＲＮＡプローブを、薄い生検試料切片とハイブリダイズさせ、洗浄し、ＲＮａｓｅで切断し、オートラジオグラフィーのための感受性乳剤に曝露する。試料の組織学的組成を示すために試料をヘマトキシリンで染色してもよく、適当な光フィルターを用いた暗視野像形成では、現像乳剤が示される。また、ジゴキシゲニンなどの非放射性標識も使用され得る。
【００４０】
あるいはまた、ＲＮＡ発現（例えば、ＭＲＮＡの発現）は、ＤＮＡアレイ、チップまたはマイクロアレイ上で検出してもよい。目的遺伝子（１つまたは複数）に対応するオリゴヌクレオチドをチップ上に固定化し、次いで、これを、患者から採取した試験試料の標識核酸とハイブリダイズさせる。目的遺伝子の転写物を含有する試料では、陽性のハイブリダイゼーションシグナルが得られる。ＤＮＡアレイの調製方法およびその使用方法は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６１８，６７９６号、同第６，３７９，８９７号、同第６，６６４，３７７号、同第６，４５１，５３６号、同第５４８，２５７号、米国特許出願公開第２００３０１５７４８５号ならびにＳｃｈｅｎａらの１９９５
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：４６７−４７０、Ｇｅｒｈｏｌｄらの１９９９  Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４，１６８−１７３、およびＬｅｎｎｏｎらの２０００  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５：５９−６５（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照）。また、遺伝子発現の逐次解析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）を行なってもよい（例えば、米国特許出願公開第２００３０２１５８５８号参照）。
【００４１】
本発明の方法では、固相基材、例えば、一部の好ましい実施形態ではアレイが使用され得る。ポリマーアレイ合成に適用可能な方法および手法は、米国特許出願第０９／５３６，８４１号、ＷＯ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号および同第６，４２８，７５２号、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０（国際特許出願公開番号ＷＯ９９／３６７６０）およびＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５号（これらはすべて、引用により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００４２】
具体的な実施形態において合成手法が記載された特許としては、米国特許第５，４１２，０８７号、同第６，１４７，２０５号、同第６，２６２，２１６号、同第６，３１０，１８９号、同第５，８８９，１６５号、および同第５，９５９，０９８号が挙げられる。
【００４３】
本発明において有用である核酸アレイとしては、限定されないが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）から商標名ＧｅｎｅＣｈｉｐ７で市販されているものが挙げられる。アレイの例は、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍのウェブサイトに示されている。
【００４４】
また、本発明では、固相基材に結合させたポリマーの多くの用途が想定される。このような用途としては、遺伝子発現モニタリング、プロファイリング、ライブラリースクリーニング、遺伝子型判定および診断が挙げられる。遺伝子発現モニタリング法、およびプロファイリング法の例は、米国特許第５，８００，９９２号、同第６，０１３，４４９号、同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１３８号、同第６，１７７，２４８号および同第６，３０９，８２２号に示されている。遺伝子型判定およびその使用の例は、米国特許出願第６０／３１９，２５３号、同第１０／０１３，５９８号、ならびに米国特許第５，８５６，０９２号、同第６，３００，０６３号、同第５，８５８，６５９号、同第６，２８４，４６０号、同第６，３６１，９４７号、同第６，３６８，７９９号および同第６，３３３，１７９号に示されている。該使用の他の例は、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，９０２，７２３号、同第６，０４５，９９６号、同第５，５４１，０６１号、および同第６，１９７，５０６号に具体的に示されている。
【００４５】
ｍＲＮＡレベルをモニタリングするため、例えば、ｍＲＮＡを、試験対象の生物学的試料から抽出し、逆転写し、蛍光標識ｃＤＮＡプローブを作製する。次いで、目的遺伝子にハイブリダイズし得るマイクロアレイを、該標識ｃＤＮＡプローブとプローブ結合させ、スライドをスキャンし、蛍光強度を測定する。この強度は、ハイブリダイゼーション強度および発現レベルと相関している。
【００４６】
好ましい一実施形態において、遺伝子発現は、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定される。定量的リアルタイムＰＣＲは、増幅プロセス中、通常蛍光によって経時的にモニタリングし、特定の配列の増幅の程度に関するパラメータを測定するポリメラーゼ連鎖反応をいう。増幅サイクル中に放出される蛍光の量は、各ＰＣＲサイクルで増幅された生成物の量に比例する。
【００４７】
また、本発明では、一部の特定の好ましい実施形態において、試料の調製法が想定される。発現解析の前または同時に、核酸試料がさまざまな機構によって増幅され得、その一部ではＰＣＲが使用され得る。例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９９２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １，１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号  同第４，９６５，１８８号、および同第５，３３３，６７５号（これらは各々、引用により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）を参照のこと。試料をアレイ上で増幅してもよい。例えば、米国特許第６，３００，０７０号および米国特許出願第０９／５１３，３００号（これらは、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００４８】
他の適当な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７（１９８８）ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら  Ｇｅｎｅ  ８９：１１７（１９９０））、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３（１９８９）およびＷＯ８８／１０３１５）、自家持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）およびＷＯ９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｈｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、同第５，８６１，２４５号）ならびに核酸系配列増幅（ＮＡＢＳＡ）（米国特許第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号、および同第６，０６３，６０３号参照。これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。使用され得る他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、同第５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号および米国特許出願第０９／８５４，３１７号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００４９】
試料の調製および核酸試料の複雑さの低減手法のさらなる方法は、例えば、Ｄｏｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１、１４１８（２００１）、米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号ならびに米国特許出願第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号、同第０９／９１０，２９２号、および同第１０／０１３，５９８号に記載されている。
【００５０】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを行うための方法は、当該技術分野において充分開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、
適用用途に応じて異なり、既知の一般的な結合方法、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）において言及されたものに従って選択される。反復型および制御型のハイブリダイゼーション反応を行うための方法および装置は、例えば、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，８７４，２１９号、同第６，０４５，９９６号、および同第６，３８６，７４９号、同第６，３９１，６２３号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００５１】
また、本発明では、一部の特定の好ましい実施形態において、リガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検出が想定される。例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８３４，７５８号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，１４１，０９６号、同第６，１８５，０３０号、同第６，２０１，６３９号、同第６，２１８，８０３号、および同第６，２２５，６２５号、ならびに米国特許仮出願第６０／３６４，７３１号ならびにＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として公開）（これらもまた、各々、引用により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００５２】
シグナル検出および強度データ処理のための方法および装置の例は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８００，９９２号、同第５，８３４，７５８、５，８５６，０９２号、同第５，９０２，７２３号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１４１，０９６号、同第６，１８５，０３０号、同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号ならびにＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として公開）（これらもまた、各々、引用により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００５３】
また、本発明の実施では、従来の生物学的方法、ソフトウェアおよびシステムが使用され得る。本発明のコンピュータソフトウェア製品としては、典型的には、本発明の方法の論理ステップを実行するためのコンピュータ上で実行可能な命令を有するコンピュータ可読媒体が挙げられる。好適なコンピュータ可読媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが挙げられる。コンピュータ上で実行可能な命令は、適当なコンピュータ言語またはいくつかの言語の組合せで記載されたものであってもよい。基礎計算生物学方法は、例えば、ＳｅｔｕｂａｌおよびＭｅｉｄａｎｉｓら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ＢｉｏｌｏｇｙのＭｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）、Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ（編），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）、ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒのＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）ならびにＯｕｅｌｅｔｔｅおよびＢｚｅｖａｎｓｉのＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、第２版、２００１）に記載されている。
【００５４】
また、本発明では、さまざまな目的（プローブ設計、データ管理、解析、および機器の操作など）のために、種々のコンピュータプログラム製品およびソフトウェアが利用され得る。例えば、米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、同第５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号および同第６，３０８，１７０号を参照のこと。
【００５５】
さらに、本発明は、例えば、米国特許出願第１０／０６３，５５９号、第６０／３４９，５４６号、同第６０／３７６，００３号、同第６０／３９４，５７４号、同第６０／４０３，３８１号に示されているような、インターネットなどのネットワーク上で遺伝情報を提供するための方法を含む好ましい実施形態を有するものであり得る。
【００５６】
本明細書全体を通して、本発明の種々の態様を範囲形式で示している。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔さのためであると理解されるべきであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるべきでない。したがって、範囲の記載は、可能なすべての部分範囲ならびに該範囲内の個々の数値が具体的に開示されているとみなされたい。例えば、１〜６などの範囲の記載は、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、ならびに該範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５および６が具体的に開示されているとみなされたい。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。また、端数範囲も、例示された記載の量に含まれる。したがって、例えば、１〜３の範囲には、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６などの端数が含まれる。
【００５７】
他の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの１種類以上の遺伝子発現産物を用いて測定される。前記遺伝子発現産物は、ヌクレオチドまたはアミノ酸産物であり得、当該技術分野で公知の方法を用いて検出され得る。
【００５８】
本発明の一部の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、ＩＧＦ１Ｒの活性化を評価することにより測定され、ＩＧＦ１Ｒの活性化はＰＩ３Ｋ経路の活性化を示す。本発明の他の実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、ＰＫＣの活性化を評価することにより測定され、ＰＫＣの活性化はＰＩ３Ｋ経路の活性化を示す。本発明の一部の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態は、［２９］（その教示は、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されたＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの発現を評価することにより測定される。
【００５９】
一実施形態において、Ｎｐ６３経路の活性化状態は、Ｎｐ６３経路の１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現データを用いて測定される。例えば、一部の実施形態において、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類は、Ｎｐ６３が活性化されると増加する遺伝子であり、他の一部の実施形態では、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類が、Ｎｐ６３が活性化されると減少する遺伝子である。また、Ｎｐ６３が活性化されると増加するバイオマーカーと減少するバイオマーカーの組合せも使用され得る。特定の実施形態において、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類は、Ｎｐ６３活性化の上流である遺伝子であり、一方、他の実施形態では、前記１種類以上のバイオマーカーの少なくとも１種類は、Ｎｐ６３活性化の下流である遺伝子である。
【００６０】
特定の実施形態において、前記Ｎｐ６３経路の１種類以上のバイオマーカーの発現データは、オリゴヌクレオチドのマイクロアレイを用いて得られる。他の実施形態において、Ｎｐ６３経路の活性化状態は、Ｎｐ６３経路の１種類以上のバイオマーカーの１種類以上の遺伝子発現産物を用いて測定される。前記遺伝子発現産物はヌクレオチドまたはアミノ酸産物であり得、当該技術分野で公知の方法を用いて検出され得る。
【００６１】
また、本発明は、個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＰＫＣの活性化状態を測定することを含み、ＰＫＣの活性化は、前記個体が、ＰＫＣが活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法に関する。
【００６２】
さらに、本発明は、個体由来の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＩＧＦ１Ｒの活性化状態を測定することを含み、ＩＧＦ１Ｒの活性化は、前記個体が、ＩＧＦ１Ｒが活性化されていない個体と比べて肺疾患のリスクが高いことを示す、肺疾患のリスクが高い個体の同定方法に関する。
【００６３】
他の実施形態において、本発明は、ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーの１種類以上のプローブが上面に固定化されており、他のバイオマーカーのプローブは該上面に固定化されていないオリゴヌクレオチドアレイを提供する。好ましい実施形態において、前記ＰＩ３Ｋ経路の１種類以上のバイオマーカーが、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＫＣ、［２９］に開示されたバイオマーカー、およびその組合せからなる群より選択される。
【００６４】
また、本発明は、肺疾患のリスクのある個体に、ＰＩ３Ｋ経路を阻害する１種類以上の薬剤（例えば、１種類以上の薬剤、レジメンもしくは処置剤またはその組合せ）を投与することを含む、個体の肺疾患のリスクを低下させる方法に関する。特定の実施形態において、前記１種類以上の薬剤の投与前に、前記個体においてＰＩ３Ｋ経路が活性化されている。一実施形態において、肺疾患は肺癌である。別の実施形態において、前記１種類以上の薬剤は、肺疾患の発生前に、前記個体に予防的に投与される。
【００６５】
本発明の実施には、特に記載のない限り、分子生物学（例えば、組換え手法）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の慣用的な手法が使用され、該手法は当業者には公知でであろう。かかる手法は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，２００１）、（本明細書では、まとめて「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」という）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、２００１年までの増刊を含む）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書では、まとめて「ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ」という）、ならびにＢｅａｕｃａｇｅら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）などに充分説明されている。
【００６６】
本明細書に挙げたすべての参考文献およびウェブサイトの教示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明を、以下の非限定的な例示的な実施形態によって、さらに説明する。
【実施例】
【００６７】
（例示的な実施形態）
（方法）
（患者集団）
気道上皮のブラシ擦過採取物を、ボストン医療センター、ボストン復員軍人援護局、レイヒー診療所およびセントジェームズ病院、の４つの施設において、診断用軟性気管支鏡検査を受け、肺癌の疑いのある現在喫煙者および喫煙経験者から収集した（［７］に既報、この試験で用いた試料については、表１の個体群統計参照）。さらなるブラシ擦過採取物を、健常な現在喫煙者、喫煙経験者および喫煙未経験者の志願者、ならびに気管支鏡検査を受けたＣＯＰＤを有する喫煙者（一部は［３１］に既報、表１と２の個体群統計）から収集した。気道異形成を有する現在喫煙者および喫煙経験者の細胞学的に正常な気管支気道由来のブラシ擦過採取物を、ブリティッシュコロンビア大学において、４０〜７４歳であり、３０パックイヤー以上の累積喫煙歴を有し、自己蛍光気管支鏡検査で１つ以上の気管支の異形成部位を有した志願者から収集した（表２の個体群統計参照）。この志願者のサブセットを、ｍｙｏ−イノシトールで２〜３ヶ月の期間処置し、さらなるブラシ擦過採取物を細胞学的に正常な気道上皮から、処置の最後の自己蛍光気管支鏡検査時に収集し、気管支内生検材料を用いて異形成における変化を調べた（ｎ＝２０試料、１０例の個体）［３５］。
【００６８】
生化学的検証に使用した前向き試料は、ボストン医療センターとユタ大学病院の両方で収集されたものであった。細胞学的に正常な気管支気道ブラシ擦過採取物は、臨床的な肺癌の疑いについて気管支鏡検査を受けた被検体において収集した（表３参照）。被検体は、気管支鏡検査後、最終診断または肺癌または別の肺病態が得られるまで追跡した。
【００６９】
本試験は、参加したすべての施設の治験審査委員会によって承認されたものであり、すべての被検体から書面によりインフォームドコンセントを得た。
（試料の収集および処理）
癌を有する喫煙者および癌のない喫煙者（ｎ＝１２９、ＧＳＥ４１１５）、ならびに現在喫煙者、喫煙経験者および喫煙未経験者（ｎ＝１０４、ＧＳＥ７８９５）ならびにＣＯＰＤを有する喫煙者（ｎ＝１２７）およびＣＯＰＤのない喫煙者（ｎ＝２０）（ＧＳＥ４１１５、ＧＳＥ７８９５およびＧＳＥＹＹＹＹのサブセット）由来の細胞学的に正常な気道上皮試料を収集し、既報［７，３１］のとおりに、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。肺腫瘍および正常隣接部の試験には、ＧＳＥ１００７２を使用した［３２］。
【００７０】
ブリティッシュコロンビア大学において、気道に異形成病変を有する患者由来の細胞学的に正常な気道上皮試料を、ｍｙｏ−イノシトールでの処置前および処置２〜３ヶ月後に収集し（ｎ＝２０、２つの試料について各々１０例の患者）、６つのさらなる試料を、ｍｙｏ−イノシトールでの前処置の際に用量応答試験の一部として収集した。この試験では、気管支のブラシ擦過採取を、１．７ｍｍの直径の気管支の細胞学的検査ブラシ擦過採取物を使用し、３種類の別々の第６〜８世代の気管支気道において行った（Ｈｏｂｂｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｔａｆｆｏｒｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＴ）。このブラシ擦過採取物を回収し、直ちにＲＮＡＬａｔｅｒ中に浸漬し、アッセイするまで−８０℃で凍結状態で維持した。代表的な気管支のブラシ擦過採取試料の上皮細胞含有量を、細胞ペレット細胞遠心分離（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ  Ｃｙｔｏｓｐｉｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）およびサイトケラチン抗体（Ｓｉｇｎｅｔ，Ｄｅｄｈａｍ  ＭＡ）での染色によって定量した。気管支ブラシ擦過採取物内の細胞は、９０％超の気管支上皮細胞を含んでいた。その後、少なくとも１μｇの各試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  ＳＴマイクロアレイに、製造業者のプロトコルに従ってハイブリダイズさせた。エキソンアレイからのデータを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェア内のＲＭＡ−スケッチを用いて標準化した。
【００７１】
生化学的検証のために前向き収集した気道試料を液体窒素中でスナップ凍結させた。患者のサブセットについて、さらなるブラシ擦過採取物を収集し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ  Ｕ１３３Ａ  ２．０チップにハイブリダイズさせた。マイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅで標準化したＭＡＳ５．０であった。
【００７２】
この試験に関する新たな発現データはすべて、ＧＥＯのＧＳＥＹＹＹＹにアクセスしてダウンロードすることにより入手可能である。
（発癌経路活性化の確率の計算）
以前の試験の発癌経路を使用し、既報［１３］にて詳述されたとおりに計算した。簡単には、乳腺上皮一次細胞を培養し、休止状態まで増殖させた。次いで、対象の経路を活性化させるため、特定の経路（例えば、ｐ１１０、ＰＩ３Ｋの触媒性サブユニット）の重要な構成員のアデノウイルス構築物にて、細胞培養物を感染させた。錯乱正常細胞培養物由来の試料を処理し、感染の１８時間後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ上で連にして（各経路に対してほぼ１０例の試料）ハイブリダイズさせた。統計学的解析の前に、プローブセットを、低発現または低分散に基づいてフィルタリングした（各々の最低２５％を除いた）。各経路の遺伝子印章は、クラス変数との相関関係（例えば、錯乱対ＧＦＰ対照）に基づいて２００のプローブセットを選択することにより規定した。メタ遺伝子モデルの訓練は、錯乱試料とＧＦＰ対照試料を使用し、まず、特異値分解（ＳＶＤ）の最も主要な成分を用いて訓練データにおける経路印章を要約し、次いで、プロビット回帰モデルのベイズ（Ｂａｙｅｓｉａｎ）フィッティングを使用することにより行った。これを各経路に対して行い、各モデルを対象の試料に適用した。得られた経路確率を０と１の間でスケール化した。発癌経路が識別的に活性化されているかを調べるため、まず順位和検定を行い、ｐ値が０．０５未満の場合、ランダム順列解析を行った。ランダム順列の際、対象のデータセット（例えば、気管支気道）内の遺伝子識別子を無作為化し、ウィルコクソン順位和検定のｐ値を計算して、クラス変数（例えば、肺癌対肺癌なし）の識別的活性化を調べた。これを１，０００回繰り返した。
【００７３】
マイクロアレイデータは、最初にＲＭＡ標準化によって前処理し、次いで、ＤＷＤを用いてバッチ効果を補正した［４３］。具体的には、メタ遺伝子モデルの開発において発現データを標準化するため、発癌経路印章マイクロアレイ試料と気管支気道マイクロアレイ試料間のバッチ効果の補正にＤＷＤを適用した。
【００７４】
予測ＰＩ３Ｋ活性を生化学的測定値と比較するためにマイクロアレイ上で泳動させた一連の前向き試料を、試料サイズが小さい（ｎ＝４）ためｍａｓ５によって標準化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ  ２．０チップを使用した。ＭＡＳ５．０標準化発癌経路印章を用いて経路活性を計算し、ＤＷＤ標準化は使用しなかった。
【００７５】
本原稿で使用したメタ遺伝子モデルと元の構成との違いは以下のとおりである。以前に、対象の試料に関して訓練データセットを標準化するため、全試料において特異値分解の解析を行い、２つの最も主要な成分を該モデルにおいて使用した。第１成分は、一般的に、印章データセットと対象のデータセット間のバッチ効果によって生じる分散で説明され、一方、第２成分は対象の経路で説明された。該モデルから標準化を除くため（これにより、モデルを訓練した場合の試験データセットの影響も除かれる）、事前にバッチ補正を行い（例えば、ＤＷＤを使用）、ＳＶＤを訓練データセットと試験データセットに別々に適用した（第１回は、モデルを訓練するために訓練セットに、および第２回は該モデルに適用するために対象のデータセットに適用した）。
（ＧＳＥＡ）
遺伝子集合濃縮解析［３０］の計算を、ＧＳＥＡ  ｖ２を用いて行った。ＰＩ３Ｋの発癌経路印章を構成する遺伝子を使用し、ＰＩ３Ｋ遺伝子セットを規定した。重要なことは、ＰＩ３Ｋが活性化されると増加する遺伝子のセットを１つと、ＰＩ３Ｋが活性化されると減少する遺伝子のセットを１つという、２つの遺伝子セットを作製したことである。ＧＳＥＡによる３つの異なる解析を行い、そのうち２つでは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘエキソンアレイのマイクロアレイデータを使用した。第１に、健常な現在喫煙者（ｎ＝ｌｌ）を、異形成を有する喫煙者（ｎ＝１４）と比較した。以下の線形モデルを用いて遺伝子を順位付けした（Ｒで計算）：
Ｙ＝β０＋β１＋β２＋ｂ＋ε式中、Ｙは遺伝子の発現であり、β０は切片であり、β１は肺癌リスクの判定であり（試料が異形成を有するか否か）、β２は各人の累積喫煙曝露（パックイヤー）であり、ｂは、バッチ差を補正したランダム効果であり、εは、誤差項である。β１の係数を使用し、遺伝子をＧＳＥＡに関して順位付けした。第２に、ｍｙｏ−イノシトールでの処置前と処置後を比較するため、対応のあるウィルコクソン順位和検定を用いて試料を順位付けした。Ｕ１３３Ａ気道データセットにおいて行ったＧＳＥＡ解析では、デフォルト信号雑音順位付けを使用した。１００の遺伝子セット順列を用いてＦＤＲを計算した。
（キナーゼアッセイ）
８０％コンフルエントのＢＥＡＳ−２Ｂ、ＢＴ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞を、それぞれ、ＢＥＢＭ、ＲＰＭＩ、またはＤＭＥＭ培地中で飢餓状態にした（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）。これら培地には、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞の場合は０．１％の添加補給物を、またはＢＴ５４９およびＨＥＫ２９３細胞の場合は０．１％ウシ胎仔血清のいずれかを２４時間含めた。次いで、細胞を、漸増濃度のｍｙｏ−イノシトール（Ｓｉｇｍａ）またはＬＹ２９４００２（Ｓｉｇｍａ）で１６時間３７℃にて前処理した。刺激前、細胞を新鮮薬物でさらに３０分間処理し、次いで、５００ｕＭのインスリン（ＳＩＧＭＡ）を３７℃で１５分間添加した。０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１００ｕＭプロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＩＰＡバッファー（２０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）中で細胞を溶解させた。ライセートを１４０００ｒｐｍで２０分間４℃にて遠心分離し、モノクローナル抗ｐ８５  ＰＩ３Ｋ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体とともに４℃で１時間インキュベートした。結合タンパク質を５０ｕｌの５０％スラリー状プロテインＧセファロース（Ｓｉｇｍａ）により沈殿させ、溶解バッファーで３回、０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＬｉＣｌ、０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するバッファーで３回、および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するバッファーで２回洗浄した。ビーズを、２０ｕＭの冷ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含有するキナーゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で洗浄し、５ｕｌのＬ−ａ−ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）（１ｍｇ／ｍｌ）および２０ｕＣｉのＡＴＰ（３２−Ｐ）を含有するキナーゼバッファー４５ｕｌ中に、室温で２０分間再懸濁させた。１００ｕｌの１Ｎ  ＨＣｌの添加によって反応を停止させ、１６０ｕｌのＣＨＣ１３／ＭｅＯＨ（１：１）を用いて脂質を抽出した。シュウ酸カリウム含有ＣＨＣ１３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４溶液（４５：３５：１．５）で前処理したシリカ６０プレート上でのＴＬＣによって、リン酸化生成物を分離した。ＰＩＰ３の生成を、オートラジオグラフィーによって評価し、デンシトメトリー解析およびシンチレーション解析によって定量した。各細胞株での実験はすべて少なくとも２回繰り返し、同様の結果であった。
（ウエスタンブロット解析）
患者組織試料を気管支鏡検査によって収集し、直ぐに液体窒素中でスナップ凍結させた。気管支鏡検査ブラシ擦過採取物由来の細胞抽出物を、２００ｕｌのＲＩＰＡバッファーの添加によって調製した。ブラシからの細胞の剥離を容易にするため、チューブを３回５秒間ボルテックスした。細胞と気管支鏡検査ブラシ擦過採取抽出物の両方を１４０００ｒｐｍで２０分間４℃にて遠心分離し、ペレットを廃棄した。タンパク質収量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって定量し、相当量のタンパク質を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。膜を、ブロッキングバッファー（０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０および２．５％のＢＳＡを含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水、または０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０および５％の低脂肪乳を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）中で１時間ブロックし、一次抗体（０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０および２．５％のＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）中に４℃で一晩中配置した。この試験に使用した一次抗体は、ウサギホスホ−ＰＫＣ（ｐａｎ）（βＩＩ  Ｓｅｒ６６０）比１：１００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎ．）、ウサギホスホ−ＩＧＦ−Ｉ受容体β（Ｔｙｒ１１３１）／インスリン受容体β（Ｔｙｒ  １１４６）比１：１００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎ．）、ウサギホスホ−ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）比１：５００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎ．）、ウサギホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）比１：１００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎ．）、ヤギＰＩ３−キナーゼｐ１１０α（Ｃ１７）比１：５０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ウサギホスホ−ＥＲＫ  比１：１００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギＧＡＰＤＨ、比１：１０００（ＡｂＣａｍ）である。
ニトロセルロースを、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０および／または０．１％のＮＰ−４０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中で３回洗浄した。一次抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて検出し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化した。
（結果）（肺癌を有する喫煙者の細胞学的に正常な気管支気道上皮細胞におけるＰＩ３Ｋ経路活性化）
細胞学的に正常な気管支気道上皮細胞ブラシ擦過採取物を、肺癌の疑いに関する軟性気管支鏡検査を受けた現在喫煙者および喫煙経験者から採取し、既報［７］のようしてＤＮＡマイクロアレイハイブリダイズさせた（ｎ＝１２９、表１の患者個体群統計参照）。これらの細胞における発癌経路のシグナル伝達の変化を解明するのを補助するため、本発明者らは、以前に公開された遺伝子発現データセットおよびコンピュータ計算によるアプローチを利用した［１３，２６〜２８］。発癌経路印章［１３］を、ヒト上皮一次細胞内での特定の癌遺伝子の発現によって経路を活性化することにより、実験的に誘導した。次いで、遺伝子発現印章を、どの遺伝子が経路活性化後に改変されるかを同定することによって規定し、他のインビボ試料での経路の活性を予測するために使用した。この方法論を使用し、７つのシグナル伝達経路（Ｒａｓ、Ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ３、Ｓｒｃ、β−カテニン、ΔＮｐ６３およびホスファチジルイノシトール３’キナーゼ（ＰＩ３Ｋ））の発癌経路活性化の確率を、肺癌の疑いのある現在喫煙者および喫煙経験者の気管支気道上皮について計算した［７］。これらの患者のほぼ半数が最終的に原発肺癌と診断された（残りは、別の肺病態を有することがわかった）が、近位主気管支（すなわち、腫瘍または肺病変に隣接していない）から収集したブラシ擦過採取物は細胞学的に正常であり、９０％超が上皮であったことに注目することは重要である。したがって、推測的に、肺癌を有する喫煙者の正常気道において識別的な発癌経路の活性は予測され得ない。
【００７６】
試験した７つの経路のうち、ランダム順列解析後、２つのみが、肺癌を有する喫煙者の気道において、別の肺病態を有する対照と比べて有意かつ識別的に活性化されていることがわかった。この２つとは、ΔＮｐ６３およびＰＩ３Ｋ（ｐ＜０．００１、図１Ａ）である。さらに、ホスファチジルイノシトールシグナル伝達系経路において役割を果していることがわかっていた遺伝子［２９（その教示は、引用により本明細書に組み込まれる）］はまた、肺癌患者において有意に上方制御されていることもわかった（遺伝子集合濃縮解析［３０］を使用（ＧＳＥＡ、ｐ＝０．０３４、ＦＤＲ  ｑ＝０．０９９））。ＰＩ３Ｋの上方制御は、特定の癌細胞型、腫瘍位置または腫瘍病期に限定されなかった（データ表示せず）。
（ＰＩ３Ｋ活性化は、累積喫煙曝露またはＣＯＰＤと有意に相関しない）
本発明者らは、次に、ＰＩ３Ｋの経路の活性の増大が肺内の癌の存在によるものであるのかどうか、または他の交絡因子、例えば、累積喫煙曝露の差（癌を有する患者は高度の累積曝露を有する。表１参照）もしくは他の肺疾患によって引き起こされるのかどうかを調べようとした。第１に、共変量として累積喫煙曝露を用いたＡＮＣＯＶＡを使用し、肺癌を有する患者と肺癌のない患者とでの識別的経路活性化の検定を行った。ＰＩ３Ｋ（ｐ＝２．０８×１０−８）は、煙草曝露の差の考えられ得る交絡性の影響に対処した後も、有意に識別的に活性化された状態のままであった。第２に、現在喫煙者（ｎ＝５２）、喫煙経験者（ｎ＝３１）および喫煙未経験者（ｎ＝２１）の健常喫煙者から収集した気管支気道上皮の全ゲノム遺伝子発現データセットを使用し［３１］、本発明者らは、７つすべての経路について、既報のものと同じ方法論を用いて経路活性化の確率を計算した。７つの経路のうちいずれも、健常な現在喫煙者、喫煙未経験者および喫煙経験者間で識別的に活性化されていなかったが、ΔＮｐ６３経路は、喫煙未経験者および現在喫煙者と比較すると、有意に活性化されている傾向にあった（ｐ＝０．０９、図１Ｂ）。最後に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する喫煙者（ｎ＝１７）および有しない喫煙者（ｎ＝２０）から得た気管支気道遺伝子発現データセットを使用すると、Ｒａｓは、識別的に活性化される唯一の経路であった（ｐ＜０．００１、データ表示せず）（図１Ｃ）。これは、正常な気管支気道における発癌経路ＰＩ３Ｋの有意な識別的活性化が、肺癌を有する個体に特異的であるという証拠をもたらすが、識別的活性化の機構は不明である。ｐ５３関連経路（ΔＮｐ６３など）の調節異常は環境的ストレス要因に応答性であることが知られているため、ならびにｐ５３／ｐ６３経路の治療用モジュレーターとして知られたものはないため、本発明者らは、さらなる試験のすべてに対してＰＩ３Ｋ経路に着目することを選択する。
（ＰＩ３Ｋは、肺癌組織において活性化される）
肺癌を有する患者の細胞学的に正常な気道上皮細胞におけるＰＩ３Ｋの調節異常から、本発明者らは、肺癌組織におけるＰＩ３Ｋ活性を調べるに至った。本発明者らには、発癌経路において肺癌の発生中の腫瘍の増殖と生存に不可欠な有意な増大が予測され得た。この解析では、本発明者らは、肺腺癌および適合隣接非腫瘍組織（ｎ＝１０７）で構成された公表データセットを使用した［３２］。経路の状態は、上記に詳述した同じゲノムアプローチを用いて予測した。図２に示されたように、悪性肺腫瘍は、隣接非腫瘍組織と比べて高度に有意な（ｐ＜０．００１）ＰＩ３Ｋ活性の増大を有した。また、ΔＮｐ６３経路は、程度は低いが、腫瘍細胞においても増大した（ｐ＝０．００２）。この結果は、細胞の悪性進行におけるＰＩ３Ｋ経路の中心的な役割を強調し、ＰＩ３Ｋ活性化が肺癌腫瘍形成に重要であるという本発明者らの仮説を裏付ける。また、有意な増大は、肺腫瘍におけるＭｙｃ、Ｅ２Ｆ３およびＳｒｃ経路でも見られ、肺腫瘍の増殖と発生における役割が確認される。肺腫瘍は分裂細胞で構成されており、正常組織よりも高い増殖レベルを有するため、本発明者らには、細胞増殖に関与している経路（Ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ３、Ｓｒｃ）もまた、この解析において増大すると予測され得た。
（気管支気道におけるＰＩ３Ｋ経路の活性の生化学的解析）
本発明者らの遺伝子発現の所見を検証するため、本発明者らは、臨床的な肺癌の疑いについて気管支鏡検査を受けた被検体由来の細胞学的に正常な気道上皮試料の前向き収集コホートにおいて、ＰＩ３Ｋ酵素活性を測定した。試料は、ボストン医療センターとユタ大学病院から２００７年１０月から２００８年６月の間に独立して入手した。被検体は、気管支鏡検査後、肺癌の最終診断または別の肺病態が得られるまで追跡した。重要なことに、肺癌のない被検体は、一連の他の病態、例えば、非肺起源の転移性癌、サルコイドーシス、敗血症性塞栓、および肺炎を有していた。気道ブラシ擦過採取物からのタンパク質の抽出後、ＰＩ３Ｋキナーゼアッセイを行った。本発明者らのゲノム予測に基づき、本発明者らには、癌を有する患者由来の試料の大部分が高いＰＩ３Ｋ活性を有し、別の病態を有する患者由来の試料の少数割合のみが高いＰＩ３Ｋ活性を有すると予測され得た。
【００７７】
図３Ａに見られるように、ＰＩ３Ｋは、肺癌を有する患者の大部分において、肺癌のない患者（３０％）と比べて高い活性化を示した（ゲノム解析における肺癌試料の７０％はＰＩ３Ｋ活性の上位半分に含まれていた）。具体的には、本発明者らは、両コホートについてＰＩ３Ｋ活性と肺癌状態との間に高い相関関係があると考える（ボストン：Ｒ＝０．４９９、ユタ：Ｒ＝０．３８９）。これらの試料のサブセットについて（ｎ＝４）、本発明者らは、さらなる気管支上皮細胞を収集することができ、マイクロアレイ解析を行い、元のデータセットで使用したものと同じアプローチを用いてＰＩ３Ｋ活性を予測した。予測ＰＩ３Ｋ活性は、同じ個体において生化学的に測定されたＰＩ３Ｋレベルと相関していた（Ｒ＝０．４８）。総合すると、これらの結果は、肺癌を有する患者の正常気道においてＰＩ３Ｋ活性が増大しているという結論を裏付け、遺伝子発現データから計算されたＰＩ３Ｋ活性に対する本発明者らのコンピュータ計算による予測が検証される。これらの結果は、同様にＰＩ３Ｋ活性に影響している可能性のある対照患者の病態の多様性を考慮すると、さらに特筆すべきことである。
【００７８】
ＰＩ３Ｋ活性の上昇の原因と結果をさらに規定する試みにおいて、本発明者らは、重要なＰＩ３Ｋ経路成分のリン酸化状態のウエスタンブロッティング解析を行った。ＩＧＦ１Ｒのリン酸化はＰＩ３Ｋキナーゼ活性と正に相関していたが（ボストン：Ｒ＝０．９１、ユタ：Ｒ＝０．３４）、ＨＥＲ２はそうではなく（ボストンＲ＝−０．６１、ユタＲ＝−０．４１）（図３Ｂ）、この受容体が、肺癌を有する患者の正常気道上皮組織においてＰＩ３Ｋ活性化の上流エフェクターであることを示唆する。肺癌を有する患者における生化学的に測定されたＰＩ３Ｋ活性とＩＧＦ１Ｒ間の相関関係は、高い正の相関関係を示し、ＩＧＦ１Ｒ活性化とＰＩ３Ｋ活性との潜在的関係性をさらに裏付ける（ボストンＲ＝０．９８、ユタＲ＝０．９０）（図３Ｂ）。次に、ＰＩ３Ｋの主要な下流エフェクターであるＡｋｔとＰＫＣの被測定リン酸化を測定した。ＰＫＣの方が、肺癌を有する患者において、生化学的に測定されたＰＩ３Ｋ活性との高い相関関係を有したが、Ａｋｔでは有意な相関関係は見られず（図３Ｂ）、この場合も、肺癌を有する患者における特定のＰＩ３Ｋ経路の活性化が強調される。累積的に、これらの結果は、ＰＩ３Ｋ活性が、他の病態を有する患者と比べて肺癌を有する患者の正常肺細胞において富化され、ＩＧＦ１Ｒの活性化がこの活性の潜在的機構であるという本発明者らのゲノム所見を裏付ける［３３，３４］。（異形成を有するハイリスク喫煙者におけるＰＩ３Ｋ経路活性化）
ＰＩ３Ｋの活性化の増大が肺癌の発生の初期事象であるという仮説を評価するため、本発明者らは、健常喫煙者群（ｎ＝ｌｌ）由来の細胞学的に正常な気道の上皮における遺伝子発現を、中等度から重度の気道異形成を有する喫煙者群（ｎ＝１４、［３５］より）のものと比較した（表２参照）。異形成は新生物発生前事象とみなされているため、このコホートは、肺癌になる尤度の高い「ハイリスク」喫煙者を表す［３６，３７］。異形成を有するハイリスク喫煙者が健常喫煙者より高いレベルのＰＩ３Ｋを有する場合、これは、気道上皮における活性の増大が肺癌の発生前に起こることを示唆し得る。ハイリスクコホートならびに健常な現在喫煙者コホートを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  エキソンアレイにハイブリダイズさせた。発癌経路印章によるプラットフォームの差のため、本発明者らは、経路の活性の計算にメタ遺伝子モデルを使用することができなかった。代わりに、ＧＳＥＡを用いて２つの群間のＰＩ３Ｋ活性を比較し、インビトロ実験によって規定されたＰＩ３Ｋ遺伝子印章を、ＰＩ３Ｋ活性化に伴って増加または減少する遺伝子によって規定される２つの遺伝子セットに分割した（ＰＩ３Ｋ＿Ｕｐ、ＰＩ３Ｋ＿Ｄｏｗｎ）。２つの群間で累積煙草曝露に有意差が存在したことを考慮し、バッチ効果とパックイヤーの両方が組み込まれた線形モデルを使用し、ＧＳＥＡにおける使用のための遺伝子を順位付けした。異形成を有する被検体の細胞学的に正常な気道においてＰＩ３Ｋ活性の有意な増大が見られた（ＰＩ３Ｋ＿ＵｐおよびＰＩ３Ｋ＿Ｄｏｗｎ遺伝子セットについて、それぞれ、ｐ＜０．００１、ＦＤＲ  Ｑ＝Ｏ．０２２およびｐ＜０．００１、Ｑ＜０．００１）（図４）。異形成を有する人の気道におけるＰＩ３Ｋの活性の増大は、ＰＩ３Ｋの調節異常が肺癌腫瘍形成の初期事象であることを示す。
（ｍｙｏ−イノシトールで処置したハイリスク喫煙者におけるＰＩ３Ｋ活性の可逆性）
ハイリスク喫煙者ならびに肺癌を有する喫煙者両方でのＰＩ３Ｋ活性の上昇を考慮し、本発明者らは、次に、ＰＩ３Ｋ活性の低下が異形成病変の後退と相関している可能性かあるかどうかを調べようとした。Ｌａｍら［３５］によって公表された最近のフェーズ１臨床試験では、肺癌化学予防剤としてｍｙｏ−イノシトールがハイリスク喫煙者において試験された。この試験では、３０パックイヤー以上の喫煙歴の喫煙者である志願者が、気道内の異形成の存在に関して、自己蛍光気管支鏡検査を用いてスクリーニングされた。気管支内生検において中等度から重度の異形成を有すると記録された１０例の現在喫煙者と喫煙経験者に、次いで、経口ｍｙｏ−イノシトールを２〜３ヶ月与え、異形成病変の状態を再度、該部位の反復気管支内生検によって測定した。プラセボで処置された対照患者と比較すると、ｍｙｏ−イノシトールは、異形成の後退速度を有意に増大させることがわかった。また、細胞学的に正常な気管支の上皮の気道ブラシ擦過採取物を、処置前と処置後の両方で収集し、遺伝子発現プロファイリングを行った（表２の個体群統計参照）。
【００７９】
この場合もＧＳＥＡ解析を使用し、ＰＩ３Ｋ経路における遺伝子発現の変化を調べた。ｍｙｏ−イノシトールでの処置前と処置後を比較すると、処置に応答した被検体（ｎ＝６、１２試料）は、ＰＩ３Ｋ  Ｄｏｗｎ遺伝子セットにおいて遺伝子発現の増大を示し（ｐ＝０．０４、ＦＤＲ  Ｑ＝Ｏ．１７７）、これは、ｍｙｏ−イノシトールでの処置後のＰＩ３Ｋレベルの低下を示す。処置に応答しなかった被検体（ｎ＝３、６試料）は、ＰＩ３Ｋ遺伝子セットのレベルにおいて変化はなかった。ｍｙｏ−イノシトールに応答する患者で見られる気道ＰＩ３Ｋ活性の低下は、異形成の後退がこの経路の活性レベルと相関していることを示す。
（ＰＩ３ＫインヒビターとしてのＭｙｏ−イノシトール）
ｍｙｏ−イノシトールに応答し、気道内の異形成の後退を有した患者におけるＰＩ３Ｋ活性の低下により、ＰＩ３Ｋ活性レベルの上昇と新生物発生前の気道病変の存在との関連性を補強する。しかしながら、ｍｙｏ−イノシトールの作用機序は未だ不明であり、試験は、比較的小さい試料サイズに限定された。ｍｙｏ−イノシトールとＰＩ３Ｋ活性との関係をさらに調べるため、本発明者らは、ｍｙｏ−イノシトールがＰＩ３Ｋをインビトロで阻害する能力を試験した。細胞をインスリンで処理することによるＰＩ３Ｋの活性化後、細胞を、漸増用量のｍｙｏ−イノシトールまたはＬＹ−２９４００２（既知ＰＩ３Ｋインヒビター）のいずれかで処理した。ＰＩ３Ｋ活性（ＰＩＰ３レベルによって測定）を、次いで、標準的なキナーゼアッセイプロトコル［３８，３９］を用いて定量した。この実験では、３種類の異なる細胞株、すなわちＢＥＡＳ−２Ｂ（気道）、ＢＴ５４９（乳癌）およびＨＥＫ２９３（胚性腎臓）を、連にして解析した。３種類の細胞株すべてにおいて、ｍｙｏ−イノシトールはＰＩ３Ｋ活性レベルを用量依存的に阻害した（図５）。したがって、ｍｙｏ−イノシトールは、ＰＩ３Ｋのインヒビターであり、気道上皮細胞における異形成の後退と関連する化学予防性を有する。
表：
【００８０】
【表１】
2014204737.tif 000003
【００８１】
【表２】
2014204737.tif 000004
参考文献
【００８２】
【化１】
2014204737.tif 000005
【００８３】
【化２】
2014204737.tif 000006
【００８４】
【化３】
2014204737.tif 000007
【００８５】
【化４】
2014204737.tif 000008
【００８６】
【化５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
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