(57)【要約】      （修正有）【課題】天然ＩＸ因子（ＦＩＸ）と比較して血流中の延長された循環時間を有するある種の血液凝固ＦＩＸアナログ及び誘導体を提供する。【解決手段】位置１４６−１８０の天然アミノ酸残基の少なくとも一つがＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換され、特定位置の一又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有し、天然ＦＩＸのものと比較して延長された循環半減期を持ち（また患者への注射から一週間後に、注射後に達した初期活性ピーク値と比較して少なくとも約５％のＦＩＸ活性を保持している）、ｉｎｖｉｖｏにおける血餅形成についての生物学的活性を有するＦＩＸポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された、延長された循環半減期を持つＦＩＸアナログ。
【請求項２】
１４６−１８０位の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された請求項１に記載のＦＩＸアナログ。
【請求項３】
アミノ酸残基Ｅ１６２が、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された請求項２に記載のＦＩＸアナログ。
【請求項４】
化学基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される請求項１から３の何れか一項に記載のＦＩＸアナログ。
【請求項５】
ポリエチレングリコールが５００−１０００００、例えば１０００−７５０００、又は２０００−６００００の範囲の平均分子量を有している請求項４に記載のＦＩＸアナログ。
【請求項６】
アナログが野生型ＦＩＸのものの少なくとも１．５倍の循環半減期を有している請求項１から５の何れか一項に記載のＦＩＸアナログ。
【請求項７】
アナログが、凝固アッセイで測定した場合、野生型ＦＩＸの少なくとも２０％の生物学的活性を有している請求項１から６の何れか一項に記載のＦＩＸアナログ。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載のＦＩＸアナログを調製する方法であって、ａ）低分子チオール（ＲＳ−ＣＹＳ）にジスルフィド結合を介して結合した位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の群から選択される位置に少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたＦＩＸポリペプチドを、レドックスバッファーを含む混合物に該低分子量チオール結合ＦＩＸを反応させることによって選択的に還元する工程と、ｂ）選択的に還元されたシステイン（ＨＳ−Ｃｙｓ）部分の少なくとも一つを化学基と結合させる同時の又は続く工程を含む方法。
【請求項９】
請求項１から７の何れか一項に記載のＦＩＸアナログを調製する方法であって、ａ）低分子チオール（ＲＳ−ＣＹＳ）にジスルフィド結合を介して結合した位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の群から選択される位置に少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたＦＩＸポリペプチドを、トリアリールホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸化合物を含む混合物に該低分子量チオール結合ＦＩＸを反応させることによって選択的に還元する工程と、ｂ）選択的に還元されたシステイン（ＨＳ−Ｃｙｓ）部分の少なくとも一つを化学基と結合させる同時の又は続く工程を含む方法。
【請求項１０】
化学基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
化学基がポリエチレングリコール、特に５００−１０００００、例えば１０００−７５０００、又は２０００−６００００の範囲の平均分子量を有しているものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１−７に記載のＦＩＸアナログの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と共に含有する血友病患者の治療のための薬学的製剤。
【請求項１３】
請求項１−７の何れか一項に記載のＦＩＸアナログの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と共に患者に投与することを含む血友病患者の治療方法。
【請求項１４】
治療が少なくとも週に一回の処置を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療が週に一回だけの処置を含む請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然ＦＩＸと比較して血流中の延長された循環時間を有するある種の血液凝固ＦＩＸアナログ及び誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）は、凝固中における正しいトロンビン形成を支援するのに必要とされるＸａ因子の殆どをＸａｓｅ複合体の一部として生成することにより止血において重要な役割を果たすトリプシン様セリンプロテアーゼである（(Hoffman及びMonroe, III 2001)で概説されている)。ＩＸａ因子活性の先天性欠損は、およそ１：１００００００の男性が罹っているＸ連鎖出血疾患の血友病Ｂの原因である。これらの血友病患者は現在は組換え又は血漿誘導凝固因子ＦＩＸでの補充療法によって治療されている。しかしながら、推奨は現在伝統的なオンデマンドの治療から予防に移っている。現在の予防療法は毎週複数回の投薬を必要としているが、最適な血漿レベル及び効力に対しては毎日一回の注射が優れているであろう。毎日の投与に伴う現実的かつ経済的な制約のために、これは現在は患者にとっての選択肢ではない。よって、長期間に亘って作用する組換え型ＩＸ因子産物に対して明確な必要性がある。
【０００３】
ＷＯ２００６００５０５８はＩＸ因子部分と一又は複数の水溶性ポリマーのコンジュゲートで５−１５０ｋＤａのサイズのものに関する。ＷＯ２００６０１８２０４は修飾された活性化ペプチドを含む修飾されたビタミンｋ依存性ポリペプチドに関する。ＷＯ２００４１０１７４０は少なくとも一種の凝固因子と免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むキメラタンパク質に関する。ＷＯ２００５００１０２５はキメラ単量体・二量体ハイブリッドタンパク質に関し、該タンパク質は免疫グロブリン定常領域の一部と生物学的に活性な分子を含む第一ポリペプチド鎖と生物学的に活性な分子なしに免疫グロブリン定常領域の一部を含む第二ポリペプチド鎖を含む。ＵＳ２００６０４０８５６は、ペプチドと修飾基の間に介在され共有結合された無傷のグリコシル連結基を介して結合されたＩＸ因子とＰＥＧ部分の間のコンジュゲートに関する。
【０００４】
ＳＥ９５０１２８５Ａは、プロテインジスルフィドオキシドレダクターゼ（例えばプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ））、グルタレドキシン及びレドックスバッファーの混合物を使用する適切に折り畳まれた生物学的に活性なジスルフィド架橋タンパク質のインビトロ生産方法を開示している。分子内ジスルフィド結合に関与したシステインが集中して参照される。
ＷＯ２００６／１３４１７３はＩＸ因子ポリペプチドを含む少なくとも一つの非天然システインを含む組換え的に調製された操作タンパク質を選択的に還元し誘導体化する方法に関している。
血液凝固を支援するために十分な生物学的活性を保持しながら、天然ＦＩＸと比較して血流中の延長された循環時間を有する修飾されたＦＩＸアナログ及び誘導体を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本発明は、位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された、延長された循環半減期を持つＦＩＸアナログに関する。
好ましい実施態様では、ＦＩＸアナログは、位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０又は８４の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換されている。
他の好ましい実施態様では、ＦＩＸアナログは、位置８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１又は１４２の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換されている。
【０００６】
他の好ましい実施態様では、ＦＩＸアナログは、位置１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換されている。
他の好ましい実施態様では、ＦＩＸアナログは、１４６−１８０位の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換されている。
【０００７】
位置１４６−１８０は活性化されると除去されるＦＩＸの活性化(アクチベーション)ペプチドに対応するので、天然アミノ残基の少なくとも一つが１４６−１８０から選択される位置にシステインアミノ酸残基に置換され、該システインがＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基に結合されたＦＩＸアナログでは、この化学基は活性化後にアナログ上には存在しないであろうことが理解されなければならない。
【０００８】
他の好ましい実施態様では、ＦＩＸアナログは、位置１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７から選択された天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換されている。
他の好ましい実施態様では、ＦＩＸアナログは、位置１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６から選択された天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換されている。
他の好ましい実施態様では、ＦＩＸアナログは、アミノ酸残基Ｅ１６２が、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換されている。
【０００９】
本発明の他の態様は、少なくとも一つのシステイン残基がＣ末端Ｔ４１５に付加され、該システインがＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基に結合された、延長された循環半減期を持つＦＩＸアナログに関する。
本発明の好ましい実施態様では、化学基は非天然システイン残基ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合する。更に好ましい実施態様では、ポリエチレングリコールは５００−１０００００、例えば１０００−７５０００、又は２０００−６００００の範囲の平均分子量を有している。
好適なＦＩＸアナログは野生型ＦＩＸのものの少なくとも１．５倍の循環半減期を有している。
本発明の好ましいＦＩＸアナログでは、アナログは、凝固アッセイで測定した場合、野生型ＦＩＸの少なくとも２０％の生物学的活性を有している。
【００１０】
本発明の他の態様は、ＦＩＸアナログを調製する方法であって、ａ）低分子チオール（ＲＳ−ＣＹＳ）にジスルフィド結合を介して結合した位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の群から選択される位置に少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたＦＩＸポリペプチドを、レドックスバッファーを含む混合物に該低分子量チオール結合ＦＩＸを反応させることによって選択的に還元する工程と、ｂ）選択的に還元されたシステイン（ＨＳ−Ｃｙｓ）部分の少なくとも一つを化学基と結合させる同時の又は続く工程を含む方法に関する。
好ましい実施態様では、該方法は、還元され酸化されたグルタチオンとグルタレドキシンを含む混合物を含むレドックスバッファーを含む。更に好ましい実施態様では、レドックスバッファーはグルタレドキシンを更に含む。
【００１１】
本発明の他の態様は、ＦＩＸアナログを調製する方法であって、ａ）低分子チオール（ＲＳ−ＣＹＳ）にジスルフィド結合を介して結合した位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の群から選択される位置に少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたＦＩＸポリペプチドを、トリアリールホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸化合物を含む混合物に該低分子量チオール結合ＦＩＸを反応させることによって選択的に還元する工程と、ｂ）選択的に還元されたシステイン（ＨＳ−Ｃｙｓ）部分の少なくとも一つを化学基と結合させる同時の又は続く工程を含む方法に関する。
【００１２】
本発明の方法の好ましい実施態様では、化学基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、特に５００−１０００００、例えば１０００−７５０００、又は２０００−６００００の範囲の平均分子量を有しているものから選択される。
本発明の他の態様は、本発明に係るＦＩＸアナログの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と共に含有する血友病患者の治療のための薬学的製剤に関する。
本発明の他の態様は、本発明に係るＦＩＸアナログの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と共に患者に投与することを含む血友病患者の治療方法に関する。
好ましい実施態様では、該方法は、治療が少なくとも週に一回の処置を含む。他の好ましい実施態様では、治療が週に一回だけの処置を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＦＩＸは、ＶＩＩ因子、プロトロンビン、Ｘ因子、及びプロテインＣと構造類似性を持つビタミンＫ依存性凝固因子である。約１８−３０時間の血漿半減期を有する循環チモーゲン形態は、Ｎ末端γ-カルボキシグルタミン酸リッチ（Ｇｌａ）ドメイン、２つのＥＧＦドメイン、及びＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む４つの別個のドメインに分けられる４１５のアミノ酸からなる。ＦＩＸの活性化はＡｒｇ１４５−Ａｌａ１４６及びＡｒｇ１８０−Ｖａｌ１８１における制限されたタンパク分解によって生じ、３５−ａａの断片である所謂活性化ペプチドを放出する (Schmidt and Bajaj 2003)。活性化ペプチドは重くグリコシル化され、２つのＮ結合及び４つまでのＯ結合グリカンを含んでいる。
【００１４】
例えばＰＥＧ化又は脂質付着による共有的修飾は幾つかのタンパク質ベースの医薬についてその薬物動態学的及び薬力学的プロファイルを改善するために成功裡に適用されている。天然又は操作システインを介してのコンジュゲーションはタンパク質表面上でのこのアミノ酸の希少性並びにチオールカップリング化学によってもたらされる高選択性のために魅力的な部位特異的修飾手段を提供する。しかしながら、実際には、このアプローチ法は、導入されたシステインが、続く修飾を妨げるシステイン及びグルタチオンのような低分子量（ＬＭＷ）チオールを有する混合ジスルフィドとして見出されるという事実によってしばしば複雑化する。
よって、かかるシステイン及び低分子量チオールの混合ジスルフィドを、天然ジスルフィド結合を保持しながら化学的に還元することができる方法が必要とされている。
【００１５】
ヒトＩＸ因子遺伝子は単離され哺乳動物細胞中で発現させられ（K. Kurachi及びE. W. Davie. Isolation and characterization of a cDNA coding for human factor IX. PNAS. 79 (21 I):6461-6464, 1982；K. H. Choo, K. G. Gould, D. J. Rees,及びG. G. Brownlee. Molecular cloning of the gene for human anti-haemophilic factor IX. Nature 299 (5879):178-180, 1982；R. J. Kaufman, L. C. Wasley, B. C. Furie, B. Furie,及びC. B. Shoemaker. Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cells. J.Biol.Chem. 261 (21):9622-9628, 1986)、アミノ酸配列がｃＤＮＡから推定されている。
【００１６】
ＦＩＸでの血友病Ｂの現在の治療は、通常、例えば抜歯又は手術の前のような必要時基準で注射が補填される毎週約２回の注射を含む。ＦＩＸは不活性なプロ型として循環し、出血が抑止される場合にのみ活性型ＦＩＸａに転換される。よって、例えば毎週１回の注射に基づく予防ＦＩＸ治療を達成するための一方法は患者の血流中におけるＦＩＸの循環時間を増大させることである。このようにして、如何なる時でも活性化されて患者の正常な血液凝固条件を確保する準備が整っているあるレベルのチモーゲンＦＩＸが常に存在する。
【００１７】
本発明に係るＦＩＸアナログはＦＩＸ中の天然アミノ酸残基の一又は複数をＣｙｓ残基で置換することによって修飾される。
システイン残基を導入するのに適したＦＩＸ中の位置の同定：
修飾されるアミノ酸位置は好ましくは＞５０％の相対的側鎖到達性を有する残基のプールから取り出される。重鎖及びＥＧＦ２ドメインに対する表面到達性は発表されている結晶学的データ(1RFN, Hopfner等, 1999)から計算する一方、ＥＧＦ１ドメインについての計算はブタＦＩＸａの結晶構造から構築された相同性モデルに基づいた(1PFX, Brandstetter等, 1995)。また、構造的情報が利用できない活性化ペプチド中の選択された残基（残基１５５−１７７）を重要と考えた。最近の刊行物において、活性化ペプチドの該セグメントはＦＩＸの生物学的活性を損なうことなく欠失できることが示されている(Begbie等 2005)。ヒトＦＩＸ中の全ての関連位置を表１に列挙する。
【００１８】
表１．  ＦＩＸの部位特異的修飾のための関連位置。「ＡＳＡ１」は全アミノ酸残基の到達性（Å２）、「ＡＳＡ２」は側鎖の到達性（Å２）、「Ｒｅｌ ＡＳＡ」は側鎖の部分(fractional)到達性である。配列番号付けはキモトリプシンに従い、ブタＦＩＸａの結晶構造の番号付け（１ＰＦＸ．ｐｄｂ）と同一である。星印（＊）又はマイナス（−）が付された側鎖は、それぞれＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体 (Chen, C.W.等. Thromb Haemost. 2002 ;88 :74-82)又はＦＶＩＩＩＡ(Autin, L.等 J. Thromb. Haem. 2005, 3: 2044-56)への結合に対して重要であると仮定している。
2014129354.tif 000002
【００１９】
2014129354.tif 000003
【００２０】
2014129354.tif 000004
2014129354.tif 000005
【００２１】
2014129354.tif 000006
【００２２】
本発明のＦＩＸアナログは野生型ＦＩＸと比較して長い循環半減期を有している。循環半減期は、例えば、McCarthy等 Thromb Haemost. 2002 May;87(5):824-30に記載されたような当業者に知られた方法によって測定することができる。
好ましい実施態様では、本発明のＦＩＸアナログの循環半減期は、同じアッセイ又はモデルで測定した場合、野生型ＦＩＸのものの少なくとも１．５倍、例えば１．６倍、例えば少なくとも１．７倍、例えば少なくとも１．８倍、例えば少なくとも１．９倍、例えば少なくとも２．０倍、例えば少なくとも２．２倍、例えば少なくとも２．４倍である。
【００２３】
本発明のＦＩＸアナログは血餅形成をインビボで支援する十分な生物学的活性を更に保持する。該生物学的活性は、例えば、McCarthy等 Thromb Haemost. 2002 May;87(5):824-30に記載されたような当業者に知られた方法によって測定することができる。
好ましい実施態様では、本発明のＦＩＸアナログの凝固活性は、同じアッセイで測定した場合、野生型ＦＩＸの凝固活性の少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも３５％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％である。
【００２４】
変異、発現及び精製
ＦＩＸアナログは組換え核酸技術によって生産することができる。一般に、クローニングしたヒト核酸配列を修飾して所望のＦＩＸアナログをコードするようにした後、発現ベクターに挿入し、これをついで宿主細胞中に形質転換又は形質移入する。高等真核生物細胞、特に培養された哺乳動物細胞が宿主細胞として好ましい。
アミノ酸配列の改変は様々な技術によって達成することができる。核酸配列の修飾は部位特異的突然変異誘発によるものとできる。部位特異的突然変異誘発の技術はよく知られており、例えば、Zoller及びSmith (DNA 3:479-488, 1984)又は「伸展重複によるスプライシング(Splicing by extension overlap)」Horton等, Gene 77, 1989, pp. 61-68に記載されている。よって、ＦＩＸのヌクレオチド及びアミノ酸配列を使用して、選択された変異を導入することができる。同様に、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡコンストラクトを調製するための手順は当業者によく知られている( PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAを参照)。
【００２５】
本発明のＦＩＸアナログをコードする核酸コンストラクトは、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによりＦＩＸの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られる、ゲノム又はｃＤＮＡ由来でありうる(Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版 Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照)。
ＦＩＸアナログをコードする核酸コンストラクトはまた、確立された標準的な方法、例えば、Beaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されたホスホラミダイト法、又はMatthes等, EMBO Journal 3 (1984), 801-805に記載された方法により、合成的に調製することもできる。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適切なベクター中にクローニングされる。ヒトＦＩＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えばＵＳ４６８３２０２、Saiki等, Science 239 (1988), 487-491、又は上掲のSambrook等に記載されているように、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
【００２６】
更に、核酸コンストラクトは、標準的な方法に従って合成、ゲノム又はｃＤＮＡ由来（適切な場合）の断片をライゲーションさせて調製される合成・ゲノム混合、合成・ｃＤＮＡ混合又はゲノム・ｃＤＮＡ混合由来であり得、該断片は核酸コンストラクト全体の様々な部分に対応する。
ＦＩＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、通常は、組換えＤＮＡ法を簡便に施すことができる任意のベクターでありうる組換えベクター中に挿入され、ベクターの選択はそれが導入される宿主細胞にしばしば依存する。よって、該ベクターは自己複製ベクター、つまり、プラスミドのように、染色体外体として存在し、その複製が染色体複製に独立であるベクターである。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００２７】
該ベクターは、好ましくは、ＦＩＸアナログをコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要な更なるセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。一般に、発現ベクターはプラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導され、又は両方のエレメントを含みうる。「作用可能に連結」なる用語は、セグメントが、それらがその意図する目的に対して協働して機能し、例えば転写がプロモータにおいて開始されポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にわたって進行するように配されていることを示す。
ＦＩＸアナログを発現するために使用される発現ベクターは、クローニングされた遺伝子又はｃＤＮＡの転写を方向付けることを可能にするプロモータを含むであろう。プロモータは、選択された宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞に相同か又は異種性であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導されうる任意のＤＮＡ配列でありうる。
【００２８】
哺乳動物細胞においてＦＩＸアナログをコードするＤＮＡの転写を方向付けるのに適したプロモーターの例はＳＶ４０プロモーター(Subramani等, Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 -864)、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター(Palmiter等, Science 222 (1983), 809 - 814)、ＣＭＶプロモーター(Boshart等, Cell 41:521-530, 1985)又はアデノウイルス２主要後期プロモーター(Kaufman及びSharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)である。
【００２９】
ＦＩＸアナログをコードするＤＮＡ配列はまた必要ならば適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter等, Science 222, 1983, pp. 809-814)又はＴＰＩ１(Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434)又はＡＤＨ３(McKnight等, The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099)ターミネータに作用可能に連結されうる。発現ベクターはまたプロモーターの下流でＦＩＸ配列自体に対する挿入部位の上流に位置するＲＮＡスプライス部位セットをまた含みうる。好ましいＲＮＡスプライス部位はアデノウイルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得られうる。発現ベクターにまた含まれるものは、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルである。特に好ましいポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０由来の初期又は後期ポリアデニル化シグナル(Kaufman及びSharp, 同文献)、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター(DeNoto等 Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981)又はヒトＦＩＸ遺伝子由来のポリアデニル化シグナルが含まれる。発現ベクターはまた非コード化ウイルスリーダー配列、例えばプロモーター及びＲＮＡスプライス部位間に位置するアデノウイルス２三者間リーダー；及びエンハンサー配列、例えばＳＶ４０エンハンサーを含みうる。
【００３０】
本発明のＦＩＸアナログを宿主細胞の分泌経路中に方向付けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている)を組換えベクター中に提供することができる。分泌シグナル配列は正しい読み枠でＦＩＸアナログをコードするＤＮＡ配列に結合される。分泌シグナル配列は一般にペプチドをコードするＤＮＡに５'端が位置している。分泌シグナル配列は、通常はタンパク質に付随するものであり得、又は他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子由来でありうる。
ＦＩＸアナログ、プロモーター及び場合によってはターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれコードするＤＮＡ配列をライゲートさせ、複製に必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される手順は当業者にはよく知られている(例えば、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照)。
【００３１】
哺乳動物細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えば、Kaufman及びSharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621；Southern及びBerg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341；Loyter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426；Wigler等, Cell 14 (1978), 725；Corsaro及びPearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham及びvan der Eb, Virology 52 (1973), 456；及びNeumann等, EMBO J. 1 (1982), 841-845に記載されている。
【００３２】
クローニングされたＤＮＡ配列は、例えばリン酸カルシウム媒介形質移入(Wigler等, Cell 14:725-732, 1978；Corsaro及びPearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981；Graham及びVan der Eb, Virology 52d:456-467, 1973)又は電気穿孔法(Neumann等, EMBO J. 1:841-845, 1982)によって培養された哺乳動物細胞中に導入される。外因性ＤＮＡを発現する細胞を同定し選択するには、選択可能表現型を付与する遺伝子（選択可能マーカー）が、一般には対象の遺伝子又はｃＤＮＡと共に細胞中に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートのような薬剤に対して耐性を付与する遺伝子が含まれる。選択可能マーカーは増幅可能な選択可能マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択可能マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列である。選択可能マーカーはThilly (出典明示によりここに援用するMammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA)によって概説されている。当業者であれば適切な選択可能マーカーを容易に選択できるであろう。
【００３３】
選択可能マーカーは対象遺伝子と同時に別個のプラスミドで細胞中に導入することができ、あるいはそれらを同じプラスミドで導入してもよい。このタイプのコンストラクトは当該分野で知られている(例えば、Levinson及びSimonsen, U.S. 4,713,339)。細胞中に導入される混合物に「キャリアＤＮＡ」として知られる更なるＤＮＡを付加することもまた有益であり得る。
細胞がＤＮＡを取り込んだ後、それらを典型的には１−２日、適切な成長培地中で増殖させ、対象遺伝子の発現を開始させる。ここで使用される場合、「適切な成長培地」なる用語は、細胞の増殖とＦＩＸアナログの発現に必要な栄養分と他の成分を含む培地を意味する。培地は、一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖類、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質及び成長因子を含む。ついで、薬物選択を適用して安定な形で選択可能マーカーを発現する細胞の増殖を選択する。増幅可能な選択可能マーカーで形質移入された細胞では、増加したコピー数のクローニング配列を選択し、発現レベルを増大させるために薬物濃度を増加させうる。ついで、安定に形質移入された細胞のクローンをＦＩＸアナログの発現についてスクリーニングする。
【００３４】
本発明において使用される哺乳動物細胞株の例は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）及び２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３；Graham等, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）細胞株である。好ましいＢＨＫ細胞株は、以後ＢＨＫ５７０細胞と呼ぶｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株(出典明示によりここに援用するWaechter及びBaserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982)である。ＢＨＫ５７０細胞株は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０３１４でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852に寄託されている。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株はまたＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６３２としてＡＴＣＣから入手できる。また、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ（ラット肝細胞種；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６００）、Ｒａｔ ＨｅｐＩＩ（ラット肝細胞種；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞(Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)を含む多くの他の細胞株を本発明において使用することができる。
【００３５】
本発明のＦＩＸアナログは細胞培養培地から回収され、ついで、限定するものではないが、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動法 (例えば分取等電点電気泳動(IEF)、差次的溶解度(例えば硫酸アンモニウム沈殿)、又は抽出(例えば、Protein Purification, J.-C. Janson及びLars Ryden編, VCH Publishers, New York, 1989を参照)を含む当該分野で知られている様々な手順によって精製され得る。好ましくは、それらは抗ＦＩＸ抗体でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。更なる精製は一般的な化学精製手段、例えば高速液体クロマトグラフィーによって達成することができる。他の精製方法も当該分野で知られており、ここに記載の新規ＦＩＸポリペプチドの精製に適用することができる（例えば、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照）。
治療目的に対しては、ＦＩＸアナログは、少なくとも約９０から９５％の均一性、好ましくは少なくとも約９８％の均一性になるまで精製される。純度は例えばゲル電気泳動及びアミノ末端アミノ酸シークエンシングによっって評価することができる。
【００３６】
選択的還元
組換え技術によって調製されたタンパク質の分子内ジスルフィド結合に関与しないシステインのチオール基を介した化学的コンジュゲーションに関する上述の障害に鑑みて、本発明は、低分子量チオール類と少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたタンパク質、例えばそのような操作された又は天然のシステインを有する凝固因子又はセリンプロテアーゼのトリプシンファミリーのタンパク質との間の混合ジスルフィド結合を選択的に還元するための（例えばチオール-ジスルフィド酸化還元触媒との併用で）定まった酸化還元バッファー混合物又はトリアリールホスフィンの使用を提供する。混合ジスルフィドの選択的還元に続いて、遊離システインは、ついで、当業者に知られているようなタンパク質に対するチオール・カップリング化学を使用するコンジュゲーションにより修飾することができる。
【００３７】
操作された又は天然のシステインを介した化学的コンジュゲーションは、単一の均一な生成物を生じるタンパク質の標的修飾の選択肢を提供する。しかしながら、システインが低分子量チオールにコンジュゲートされタンパク質が不安定な分子内ジスルフィド結合を含んでいる場合は、この方策は実行可能ではない。本発明は、低分子量チオール部分の選択的除去を可能にして、続く化学修飾のための遊離したシステインを調製する。
よって、本発明の一態様は、操作された、つまり少なくとも一つの非天然システインを含むＦＩＸの選択的還元方法であって、該ＦＩＸは低分子量チオールにジスルフィド架橋を介して結合した一又は複数のシステイン部分（ＲＳ-Ｃｙｓ）を含み、該部分はタンパク質がその活性型にある場合は分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に関与しない方法において、低分子量チオールコンジュゲートタンパク質を、酸化還元バッファーを含む混合物と反応させる工程を含む方法に関する。
【００３８】
本発明の他の態様は、操作された、つまり少なくとも一つの非天然システインを含むＦＩＸの選択的還元方法であって、該タンパク質は低分子量チオールにジスルフィド架橋を介して結合した一又は複数のシステイン部分（ＲＳ-Ｃｙｓ）を含み、該部分はタンパク質がその活性型にある場合は分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に関与しない方法において、低分子量チオールコンジュゲートタンパク質を、トリアリールホスフィン還元剤を含む混合物と反応させる工程を含む方法に関する。
「選択的に還元される」という用語は、低分子量チオールにジスルフィド架橋を介してコンジュゲートしたシステイン部分の主な部分、例えば６０％以上、又は８０％以上、例えば９０％以上のフラクションを還元して、他の基とのコンジュゲーションの準備ができているチオール基を有するシステイン部分を遊離させる一方、他のジスルフィド結合（典型的には分子内ジスルフィド結合）の主な部分、例えば６０％以上、又は８０％以上、例えば９０％以上を、操作タンパク質の生物学的活性が実質的に保存されるように保存することを意味する。
【００３９】
（Ａ）酸化還元バッファー
上述したように、本発明は、少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたタンパク質、例えば凝固因子又はセリンプロテアーゼのトリプシンファミリーのタンパク質の選択的還元方法をとりわけ提供する。当該タンパク質は、低分子量チオールにジスルフィド架橋を介して結合した一又は複数のシステイン部分（ＲＳ-Ｃｙｓ）を含み、該部分はタンパク質がその活性型にある場合は分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に関与せず、該方法は、低分子量チオールコンジュゲートタンパク質を、酸化還元バッファーを含む混合物と反応させる工程を含む。
ここで使用される場合、「酸化還元バッファー」なる用語は、タンパク質-低分子量チオール混合ジスルフィド（ＲＳ-Ｃｙｓ）を崩壊させるための十分な還元と同時に、タンパク質中の天然ジスルフィド結合の完全性を保存するための十分な酸化の比率のチオール/ジスルフィドの酸化還元ペアを意味するものである。
【００４０】
好ましくは、酸化還元バッファーは、低分子量チオール/ジスルフィド酸化還元ペアを含む。「低分子量」なる用語は、酸化還元ペアのチオール型が多くても５００ｇ/モルの分子量を有することを意味する。このような酸化還元ペアの具体例は、（ｉ）還元型及び酸化型グルタチオン、及び（ｉｉ）還元型及び酸化型γ−グルタミルシステイン、（ｉｉｉ）還元型及び酸化型システイニルグリシン、（ｉｖ）還元型及び酸化型システイン、（ｖ）還元型及び酸化型Ｎ−アセチルシステイン、（ｖｉ）システアミン、及び（ｖｉｉ）ジヒドロリポアミド／リポアミドから選択され、より好ましくは（ｉ）還元型及び酸化型グルタチオンから選択されるものである。
最適な酸化還元状態は、当業者に知られているように、タンパク質の酸化還元滴定を実施することによって決定することができる。Gilbert (1995)を参照。
【００４１】
一実施態様では、酸化還元バッファーは還元型及び酸化型グルタチオンの酸化還元ペアであり、還元型グルタチオンの濃度は０−１００ｍＭの範囲であり、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの比は２−２００の範囲である。
別の実施態様では、酸化還元バッファーは還元型及び酸化型グルタチオンの酸化還元ペアであり、還元型グルタチオンの濃度は０−１００ｍＭの範囲、例えば０.０１−５０ｍＭであり、酸化型グルタチオンの濃度は０−５ｍＭの範囲、例えば０.００１−５ｍＭである。ＩＸ因子ポリペプチドの場合、還元型グルタチオンの濃度は好ましくは０−５ｍＭの範囲、例えば０.０１−２ｍＭであり、酸化型グルタチオンの濃度は０.００１−２ｍＭの範囲、例えば０.００１−０.２００ｍＭである。
グルタチオン及び他の低分子量チオール類は一般に反応速度論的には劣った還元剤／酸化剤であるので、最も好ましくは、チオール/ジスルフィド酸化還元触媒が反応速度を高めるために酸化還元バッファーと組み合わせて混合液に含められる。
【００４２】
混合液に含められる適切なチオール/ジスルフィド酸化還元触媒は、ジチオール型及びモノチオール型グルタレドキシンを含む。グルタレドキシンとその機能は、Fernandes等(2004)に一般的に記載されている。グルタレドキシンの有用な例は、大腸菌由来のＧｒｘ１、Ｇｒｘ２又はＧｒｘ３ (Holmgren等, 1995)、酵母由来のＧｒｘ１ｐ、Ｇｒｘ２ｐ、Ｇｒｘ３ｐ、Ｇｒｘ４ｐ及びＧｒｘ５ｐ (Luikenhuis等 1998; Rodriguez-Manzaneque等, 1999; Grant, 2001)、ヒト由来のＧｒｘ１及びＧｒｘ２(Padilla等1995; Lundberg等, 2001)及びそれらの変異体から選択されるものである。変異体は、ＣＸＸＣモティーフのＣ末端のシステインが他のアミノ酸、典型的にはセリンと置換されたジチオール型グルタレドキシンを含むがこれに限定されるものではない（Yang等,1998を参照）。
酸化還元触媒（特にグルタレドキシン）は、好ましくは０.００１−２０μＭの濃度で使用される。
混合液がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を含まないことが好ましい。
酸化還元バッファーは、塩類、ｐＨバッファー等の他の成分を更に含んでもよく、本発明の方法は、当該タンパク質に適している任意の温度で実施でき、例えば−５℃から５０℃の範囲、例えば０℃から３７℃の範囲の温度であって、当然所与の条件下でタンパク質の安定性に依存する。
【００４３】
（Ｂ）トリアリールホスフィン還元剤
上述のように、本発明は、少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたタンパク質、例えば凝固因子又はセリンプロテアーゼのトリプシンファミリーのタンパク質の選択的還元方法をまた提供する。当該タンパク質は低分子量チオールにジスルフィド架橋を介して結合した一又は複数のシステイン部分（ＲＳ-Ｃｙｓ）を含み、該部分はタンパク質がその活性型にある場合は分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に関与せず、該方法は、低分子量チオールコンジュゲートタンパク質をトリアリールホスフィン還元剤と反応させる工程を含む。
「トリアリールホスフィン還元剤」なる用語は、一又は複数の置換基によって置換されていてもよいトリアリールホスフィンを意味するものである。
【００４４】
トリアリールホスフィン還元剤のアリール基は、好ましくはフェニル、ナフチル、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、アントラシル、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニル及びキサンテニル、特にフェニルから選ばれ、現在選択されている実施態様では、アリール基が好ましくは同一である。目下の最も興味深い実施態様では、全３個のアリール基はフェニルである。アリール基に、特にフェニル基に存在しうる置換基の例は、典型的にはスルホン酸、カルボキシル酸、Ｃ１-６-アルキル、Ｃ１-６-アルコキシ、及びＣ１-６-アルコキシ-Ｃ１-６-アルキル、又はＣ３-６-アルキレン（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）又はＣ２-６-アルキレンオキシ（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）又はＣ１-４-アルキレン-オキシ-Ｃ１-４-アルキレン（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）から選択されるものである。
現在最も興味深い実施態様では、少なくとも一つのアリール（例えばフェニル）は、スルホン酸及びカルボキシル酸、特にスルホン酸から選ばれる少なくとも一つの置換基を有する；該置換基は好ましくはリン光体原子の結合と比較してメタ位に配置されている。 
好ましくは、全３個のアリール基はスルホン酸置換基を有し、例えば全３個のアリール基はスルホン酸置換基及び少なくとも一つの更なる置換基を有し、特に少なくともリン光体原子の結合と比較してパラ位の置換基、特にこのパラ位に酸素置換基を有する。
【００４５】
好適な還元剤のアリール基はリン光体原子の結合と比較してオルト位に如何なる置換基も有しないと現在考えられる。
「Ｃ１-６-アルキル」なる用語は、１−６の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状の飽和炭化水素残基を含むことを意味する。特定の例は、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ｎ-ペンチル、イソペンチル及びｎ-ヘキシルである。同様に、「Ｃ１-４アルキル」なる用語は１−４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状の飽和炭化水素残基を含むことを意味する。「Ｃ１-６-アルキレン」、「Ｃ２-６-アルキレン」などの用語は、それぞれ「Ｃ１-６-アルキル」、「Ｃ２-６-アルキル」に対応する二価基をあらわす。
【００４６】
適切なトリアリールホスフィン還元剤は、還元電位及び立体障害の間で有用なバランスを有するものである。トリアリールホスフィン還元剤の化学的性質は、タンパク質の天然ジスルフィド結合の完全性を保存すると共に、タンパク質-低分子量チオール混合ジスルフィド（ＲＳ-Ｃｙｓ）を切断するその能力によって示される。現在非常に興味深い化合物は、トリアリールホスフィントリスルホン酸、例えばトリフェニルホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸とその類似体である。この具体例は、トリアリールホスフィン還元剤はトリフェニルホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸及びその類似体から選択されており、例えば下記の化合物９−１１の一つから選択される：
2014129354.tif 000007
【００４７】
トリアリールホスフィン還元剤は、好ましくは０.００１−１００ｍＭ、例えば０.０１−５０ｍＭ又は０.１−２５ｍＭの濃度で使用される。
興味深い一実施態様では、トリアリールホスフィン還元剤は担体に固定される。これは、タンパク質から還元剤の簡単な分離に役立つ。一般に、トリアリールホスフィン還元剤、例えば化合物９−１１は、当業者に知られている手段によって、例えばアリール基のうちの一つにリンカー基を導入することによって固定してもよい。トリアリールホスフィン試料１２は、１のリンク可能な変異体の例である。
2014129354.tif 000008
反応は、典型的には０−４０℃の範囲の温度で、例えば雰囲気温度で、５秒から場合によっては数日の期間の間で行われる。反応後には、その変換を確認するためにＨＰＬＣを後に続けてもよい。溶媒は好ましくはＤＭＳＯ又はＤＭＦのような共溶媒を任意に含む水性バッファーである。また、溶媒は塩類、例えばカルシウム塩を含んでもよい。 
【００４８】
コンジュゲーション
上に記載されている選択的還元法の一つの重要な目的は、化学基、例えば非ポリペプチド部分の結合（コンジュゲーション）に使うことができるシステイン基を遊離させることである。
従って、重要な一実施態様では、該方法は化学基を有する選択的に還元されたシステイン（ＨＳ-Ｃｙｓ）部分のうちの少なくとも一つを結合させる同時の及び／又は続く工程を更に含んでなる。
化学基を有する少なくとも一つの選択的に還元されたシステイン部分のコンジュゲーションは、同時にすなわち酸化還元バッファーを含む混合液にコンジュゲーションを導く一又は複数の試薬を加えることによって実施してもよく、あるいは、例えば選択的に還元したタンパク質の精製及び／又は単離の後のような、後に続く工程で実施してもよいことが理解されなければならない。
【００４９】
一実施態様では、化学基はプロトラクター基、すなわち、未修飾タンパク質又はポリペプチドと比較した場合に、タンパク質（例えばＩＸ因子ポリペプチド）のコンジュゲーション時に、上記タンパク質又はポリペプチドの循環半減期を増加させる基である。引き延ばし効果の背後の特定の原理は、増加したサイズ、ペプチダーゼ又は抗体によって認識され得るペプチド配列のシールド、又は例えば肝臓又はマクロファージ上に存在するグリカン特異的レセプターによっては認識されないようにするグリカンのマスキング、クリアランスの防止又は減少によって生じるものでありうる。また、プロトラクター基の引き延ばし効果は、例えばアルブミンのような血液成分に対する結合性又は血管組織に対する非特異的粘着力によって生じることがありえる。結合した糖タンパク質は、その生物学的活性を実質的に保存しなければならない。
【００５０】
本発明の一実施態様では、プロトラクター基は以下を含む群から選択される：
（ａ）  低分子性有機荷電基（１５−１０００Ｄａ）であって、一又は複数のカルボン酸、アミンスルホン酸、ホスホン酸又はそれらの組合せを含んでもよい。
（ｂ）  低分子性（１５−１０００Ｄａ）中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は分枝していてもよいポリエチレン鎖。
（ｃ）  低分子性（１５−１０００Ｄａ）疎水性分子、例えばその脂肪酸又はコール酸又はそれらの誘導体。
（ｄ）  ２０００−６００００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコール。
（ｅ）  ７００から２００００Ｄａの範囲、又はより好ましくは７００−１００００Ｄａの間の正確な分子質量を有するデンドリマーのような明確な精度を有するポリマー。
（ｆ）  実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン又は抗体又はＦｃドメインを含んでいてもよい抗体の一部。
（ｇ）  高分子量有機ポリマー、例えばデキストラン。
【００５１】
本発明の別の実施態様では、プロトラクター基は、デンドリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含むポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）を含むポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、分枝ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン／無水マレイン酸共重合体及びカルボキシメチルデキストランを含むデキストランからなる群から選択される。本発明の特に興味深い一実施態様では、プロトラクター基はＰＥＧ基である。
「分枝ポリマー」、又は互換可能な「樹状ポリマー」、「デンドリマー」又は「樹状構造」なる用語は、それらのモノマーの構築ブロック（幾つかは分枝を含む）の選択から組み立てられる有機ポリマーを意味する。
【００５２】
本発明の一実施態様では、プロトラクター基は血清タンパク質結合性リガンドからなる群から選択されるものであり、例えば脂肪酸、Ｃ５−Ｃ２４脂肪酸、脂肪族二酸（例えばＣ５−Ｃ２４）のようなアルブミンと結合する化合物である。プロトラクター基の別の例は、生理学的条件下の荷電特性を変える部分、例えばカルボン酸又はアミン、又はより小さいアルキル置換基（例えばＣ１−Ｃ５アルキル）のようなグリカン特異的な認識を防止する中性の置換基を含む小有機分子を含む。本発明の一実施態様では、プロトラクター基はアルブミンである。
一実施態様では、化学基は非ポリペプチドである。
【００５３】
興味深い一実施態様では、化学基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、特に５００−１０００００の範囲の平均分子量を有するもの、例えば１０００−７５０００又は２０００−６００００のものである。
コンジュゲーションは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１及びＷＯ０１／５８９３５Ａ２にて開示されているようにして行うことができる。
タンパク質にコンジュゲーションするための化学基としてのＰＥＧの使用は、特に興味深い。「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」なる用語は、ポリエチレングリコール化合物又はその誘導体を意味し、カップリング剤、結合又は活性化部分（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジン、オキシラン、ピリジルジチオ、ビニルスルホン、又は好ましくはマレイミド部分）の有無にかかわらない。マレイミドモノメトキシＰＥＧのような化合物が、本発明の活性化ＰＥＧ化合物の例である。
【００５４】
ＰＥＧが適切なポリマー分子であるが、それはデキストランのような多糖と比較して、架橋結合ができる反応基をほんの僅かしか有さないためである。特に、単官能基のＰＥＧ（例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が興味深く、それはそのカップリング化学が比較的シンプルであるためである（一つの反応基だけが、ポリペプチド上の結合基との結合に利用できる）。従って、架橋の危険がないので、得られるポリペプチドコンジュゲートはより均質であって、ポリペプチドを有するポリマー分子の反応が制御し易い。
【００５５】
ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合による付加を達成するために、ポリマー分子のヒドロキシ末端基は活性型、すなわち活性な官能基で与えられる。適切な活性ポリマー分子は、例えば、Shearwater社（ハンツヴィル、アラバマ、米国）又はPolyMASC Pharmaceuticals社（英国）から購入できる。あるいは、ポリマー分子は、例えばＷＯ９０／１３５４０に開示されているような当該分野で知られている通常の方法によって活性化することができる。本発明に用いられる活性化直鎖状又は分枝状のポリマー分子の具体例は、Shearwater社の１９９７年及び２０００年のカタログ（Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals、Polyethylene Glycol and Derivatives、出典明示によりここに援用）に記載されている。活性化ＰＥＧポリマーの具体的例としては、以下の直鎖状ＰＥＧが挙げられる：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えばＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧ及びＳＣＭ−ＰＥＧ、そしてＮＯＲ−ＰＥＧ）、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、及びＭＡＬ−ＰＥＧ、及びＰＥＧ２−ＮＨＳ及び米国特許第５９３２４６２号及び米国特許第５６４３５７５号（両者を出典明示によりここに援用）で開示されているような分枝ＰＥＧ。更に、以下の文献（出典明示によりここに援用）は、役立つポリマー分子及び／又はＰＥＧ化の化学を開示する：米国特許第５８２４７７８号、米国特許第５４７６６５３号、ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９１０８、ＥＰ４０２３７８、米国特許第４９０２５０２号、米国特許第５２８１６９８号、米国特許第５１２２６１４号、米国特許第５２１９５６４号、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、米国特許第５７３６６２５号、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、米国特許第５６２９３８４号、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、米国特許第５４７３０３４号、米国特許第５５１６６７３号、ＥＰ６０５９６３、米国特許第５３８２６５７号、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３及びＥＰ１５４３１６。
【００５６】
ポリペプチド及び活性型ポリマー分子のコンジュゲーションは、例えば以下の文献に記載されているような任意の従来法を用いて行われる（該文献は、ポリマー分子の活性化のための適切な方法も記載している）：R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson等, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.)。当業者であれば、使用するポリペプチドの結合基（その例は上記した）と共にポリマーの官能基（例えばアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン又はハロアセテートである）に依存して、活性化法及び／又はコンジュゲーション化学が使用されることを理解するであろう。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上の全ての利用できる結合基（すなわちポリペプチド表面に露出したかかる付加基）に対してコンジュゲーションを行ってもよく、又は一又は複数の特異的な結合基（例えばＮ末端基アミノ基（米国特許第５９８５２６５号））に対して行ってもよい。更に、コンジュゲーションは一工程で又は段階的形で達成してもよい（例えばＷＯ９９／５５３７７に記載されているようにする）。
【００５７】
ＰＥＧ化は、結合されたＰＥＧの数、分子のサイズと形状（例えば、それらが直鎖状か又は分枝状か）、ポリペプチドのどこに該分子が結合されるかに関して最適分子を産生するために設計されることが理解される。使用されるポリマーの分子量は、達成される所望の効果を考慮に入れて選択される。例えば、コンジュゲーションの主要な目的が高分子量及びより大きなサイズ（例えば、腎臓クリアランスを減らすため）を有するコンジュゲートの達成であれば、所望の効果を得るために、一つあるいは少数の高分子量ポリマー分子か、多数のより分子量の小さいポリマー分子のどちらかを結合させることを選択することができる。一実施態様では、低分子量の幾つかのポリマー分子が使用される。これはまた高度のエピトープシールドが望まれる場合もしかりである。かかる場合、例えば約５０００Ｄａの分子量を持つ２−８ポリマー、例えば３−６のかかるポリマーを例えば用いることができる。以下の例が示すように、ポリペプチドコンジュゲートの機能的インビボ半減期の改善に関しては、たとえ付加されたポリマー分子の全分子量が２つの場合で同じか同様である場合でも、高分子量の小数のポリマー分子（例えば１２０００−２００００のＭＷの１−３）と比較して低分子量のより多数のポリマー分子（５０００のＭｗの４−６）を有することが有利な場合がある。少なくともポリマー分子がポリペプチド表面に比較的均一に分布している場合、多数の小さいポリマー分子の存在は、例えば単一だが大きいポリマー分子よりも大きな径又は見かけのサイズを持つポリペプチドを提供する。
【００５８】
本発明のコンジュゲートの少なくとも主要部分の見かけのサイズ（「見かけの分子量」又は「見かけの質量」とも称される）が少なくとも約５０ｋＤａ、例えば少なくとも約５５ｋＤａ、少なくとも約６０ｋＤａ、例えば少なくとも約６６ｋＤａであるときに、有利な結果が得られることが更に見出された。これは、腎臓クリアランスが十分に大きな見かけのサイズを有するコンジュゲートに対して大幅に除去されるという事実によると考えられる。本明細書において、タンパク質コンジュゲート又はＩＸ因子ポリペプチドの「見かけのサイズ」は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ法で決定される。
更に、過剰ポリマーコンジュゲーションが化学基（例えば非ポリペプチド部分）が結合されるタンパク質（例えばＩＸ因子ポリペプチド）の活性の損失を導くことがあると報告されている。この問題は、例えば機能部位に位置する結合基を取り除くことによって、又はコンジュゲーション前にタンパク質の機能部位を可逆的にブロックし、コンジュゲーションの間にタンパク質の機能部位がブロックされるようにすることによって解消できる。すなわち、タンパク質と化学基（例えば非ポリペプチド部分）間のコンジュゲーションは、タンパク質の機能部位がヘルパー分子、例えばセリンプロテアーゼ阻害剤によってブロックされる状況下で行うことができる。好ましくは、ヘルパー分子はタンパク質の機能的部位を特異的に認識するもの、例えば触媒性トリアドに結合しその（好ましくは、触媒性トリアドの任意の原子の１０Å以内のアミノ酸残基として定義される）周辺領域を保護しているレセプター又は活性部位阻害剤である。
【００５９】
あるいは、ヘルパー分子は抗体であってもよく、特にタンパク質（例えばＩＸ因子ポリペプチド）を認識するモノクローナル抗体であってもよい。特に、ヘルパー分子は中和モノクローン抗体であってもよい。
タンパク質は好ましくはコンジュゲーションを遂行する前にヘルパー分子と相互に作用する。（しばしば、混合ジスルフィドが還元される工程で使用されるものと同じヘルパー分子（例えば阻害剤）を使用することが有利でさえある）。これは、タンパク質（例えばＩＸ因子ポリペプチド）の機能部位がシールドされるか又は保護され、従ってポリマーのように、化学基（例えば非ポリペプチド部分）による誘導体化には利用されないことを担保する。
ヘルパー分子からのその溶出に続いて、化学基とタンパク質のコンジュゲートは、少なくとも部分的に保存された機能部位と共に回収されうる。
【００６０】
製剤及び投与
他の態様では、本発明は、医師又は患者が使用前に溶媒及び／又は希釈剤を添加する乾燥形態でＦＩＸアナログを含む薬学的製剤に関する。「乾燥形態」とは、液状薬学的組成物又は製剤が、フリーズドライ(すなわち凍結乾燥；例えば、Williams及びPolli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59を参照)、噴霧乾燥(Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676；Broadhead等, (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18：1169-1206；及びMumenthaler等, (1994) Pharm. Res. 11：12-20)、又は空気乾燥(Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25：459-470；及びRoser (1991) Biopharm. 4：47-53)により乾燥されることを意図している。
【００６１】
更なる態様では、本発明は、ＦＩＸアナログとバッファーの水溶液を含有する薬学的製剤に関し、ＦＩＸアナログの凝固活性アナログが０．０１ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在し、該製剤は約２．０から約１０．０のｐＨを有している。
本発明の更なる実施態様では、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーの各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【００６２】
本発明の更なる実施態様では、製剤は薬学的に許容可能な保存料を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、保存料は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(３ｐ-クロロフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択される。本発明の更なる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる態様では、保存料は５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる態様では、保存料は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の保存料の各一が本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００６３】
本発明の更なる実施態様では、製剤は薬学的に等張剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択される。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用することもできる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用することができる。糖又は糖アルコールが液状調製物に可溶性であり、本発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を与えない限りは、使用量に決まった限界はない。一実施態様では、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。本発明の更なる実施態様では、等張化剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる実施態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる実施態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張化剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。医薬組成物に等張化剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００６４】
本発明の更なる実施態様では、製剤はキレート剤を更に含有する。キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択されうる。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は２ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中におけるキレート剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19版, 1995が参照される。
【００６５】
本発明の更なる実施態様では、製剤は安定剤を更に含有する。薬学的組成物中における安定剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19版, 1995が参照される。
本発明の薬学的組成物は組成物の貯蔵の間におけるポリペプチドの凝集体形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を更に含みうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せのことであり、任意の与えられたアミノ酸はその遊離塩基形態又はその塩形態で存在する。アミノ酸の組合せが使用される場合、アミノ酸の全てがその遊離塩基形態で存在し得、全てはその塩形態で存在し得、あるいは幾つかがその遊離塩基形態で存在し得る一方、他のものはその塩形態で存在する。一実施態様では、本発明の組成物を調製する際に使用するアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸のような荷電側鎖を担持しているものである。特定のアミノ酸（例えばグリシン、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物）の任意の立体異性体（つまりＬ、Ｄ、又はその混合体）又はこれら立体異性体の組み合わせは、特定のアミノ酸がその遊離塩基形態又はその塩形態の何れかで存在している限り、本発明の薬学的組成物中に存在しうる。一実施態様では、Ｌ立体異性体が使用される。本発明の組成物はまたこれらのアミノ酸の類似体と共に製剤化されうる。「アミノ酸類似体(アナログ)」とは、本発明の液体薬学的組成物の貯蔵中にポリペプチドによる凝集体形成を減少させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体のことである。適切なアルギニン類似体には、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチルＬ-アルギニンが含まれ、適切なメチオニン類似体には、エチオニン及びブチオニンが含まれ、適切なシステイン類似体にはＳ-メチル-Ｌシステインが含まれる。他のアミノ酸の場合と同様に、アミノ酸類似体はその遊離の塩基形態又はその塩形態で組成物中に導入される。本発明の更なる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止又は遅延させるのに十分な濃度で使用される。
【００６６】
本発明の更なる実施態様では、治療剤として作用するポリペプチドが酸化を受けやすい少なくとも一のメチオニン残基を含むポリペプチドである場合、メチオニン（又は他の含硫アミノ酸又はアミノ酸類似体）を添加してメチオニン残基がメチオニンスルホキシドへ酸化するのを阻害することができる。「阻害する」とは、メチオニンが酸化された種の経時的な蓄積の最小化のことである。メチオニンの酸化を阻害することはポリペプチドをその正しい分子形態に、より維持することとなる。メチオニンの任意の立体異性体（Ｌ、Ｄ、又はＤＬ異性体）又はその組み合わせを使用することができる。付加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関に受け入れられるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量でなければならない。典型的には、これは、組成物が約１０％以下から約３０％以下のメチオニンスルホキシドしか含まないことを意味する。一般に、これは、メチオニン残基に加えられるメチオニンの比が約１：１から約１０００：１、例えば１０：１から約１００：１の範囲であるようにメチオニンを添加することによって達成することができる。
【００６７】
本発明の更なる実施態様では、製剤は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、安定剤はポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロース又はその誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ、ＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノールのような硫黄含有物質、及び異なった塩（例えば塩化ナトリウム）から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の他の実施態様を構成する。
薬学的組成物はまたその中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に向上させる更なる安定剤を含有しうる。本発明にとって特に興味がある安定剤には、限定するものではないが、メチオニンの酸化からポリペプチドを保護するメチオニン及びＥＤＴＡと、凍結融解又は機械的せん断に伴う凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００６８】
本発明の更なる実施態様では、製剤は界面活性剤を更に含有する。界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えばプルロニック(登録商標)Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトンＸ-１００のようなポロキサマー類）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体（トゥイーン類、例えばＴｗｅｅｎ-２０、Ｔｗｅｅｎ-４０、Ｔｗｅｅｎ-８０及びＢｒｉｊ-３５）、そのモノグリセリド又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチン及びリン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン）、リン脂質誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）及びリゾリン脂質誘導体（例えばパルミトイルリゾホスファチジル-Ｌ-セリン及びエタノールアミン、コリン、セリンもしくはスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスフェートエステル）並びにリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び極性頭部基、つまり、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、正荷電ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニンの修飾体、及びグリセロリン脂質（例えばケファリン）、グリセロ糖脂質（例えばガラクトピラノシド）、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、ニワトリ卵白リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウム等々）、長鎖脂肪酸及びその塩Ｃ６−Ｃ１２（例えばオレイン酸及びカプリル酸）、アシルカルニチン及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含むジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と二つの荷電アミノ酸の任意の組合せを含むトリペプチドのＮα-アシル化誘導体、ＤＳＳ（ドキュセート・ナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７-１１-７］）、ドキュセート・カルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８-４９-４］、ドキュセート・カリウム、ＣＡＳ登録番号［７４９１-０９-０］、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシンもしくはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-��-プロパンスルホネート、アニオン性（アルキル-アリール-スルホネート）一価界面活性剤、両性イオン性界面活性剤（例えばＮ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート類、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート、カチオン性界面活性剤（第４級アンモニウム塩基）（例えば臭化セチル-トリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えばドデシルβ-Ｄ-グルコピラノシド）、エチレンジアミンへプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを連続添加して誘導される四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン（例えばテトロニックス(Tetronic's)）から選択することができ、あるいは該界面活性剤はイミダゾリン誘導体又はその混合物の群から選択されうる。これらの特定の界面活性剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。
薬学的組成物中における界面活性剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19版, 1995が参照される。
【００６９】
その他の成分が本発明のペプチド薬学的製剤中に存在することもありうる。そのような更なる成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジンのようなアミノ酸）が含まれる。そのような更なる成分は、当然ながら、本発明の薬学的製剤の全体の安定性に悪影響を及ぼしてはならない。
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジにより、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射することにより実施されうる。あるいは、非経口投与は、輸液ポンプにより実施されうる。更なる選択肢は、点鼻薬又は肺スプレーの形態でのＦＩＸ化合物の投与のための溶液又は懸濁液であってもよい組成物である。また更なる選択肢として、本発明のＦＩＸ化合物を含む薬学的組成物は、経皮投与に、例えば針のない注射又はパッチ、場合によってはイオン注入パッチ、又は経粘膜、例えば口腔投与に適合化させることもできる。
【００７０】
定義
ここで使用される「ＩＸ因子」又は「ＦＩＸ」は、内在的凝固経路のメンバーであり血液凝固に本質的であるヒト血漿ＩＸ因子糖タンパク質を意味する。この定義にはこのヒト血漿ＩＸ因子糖タンパク質の天然並びに組換え型を含むことが理解される。別段の定義がなされ又は示されない限り、ここで使用される場合、ＩＸ因子は、凝固におけるその正常な役割において任意のその断片、アナログ(類似体)及び誘導体を含むあらゆる機能的なヒトＩＸ因子タンパク質分子を意味する。
「天然ＦＩＸ」は配列番号１に示す全長ヒトＦＩＸ分子である。アミノ酸残基位置の番号付けは、最初のＮ末端アミノ酸残基が１番等である配列番号１に従う。
【００７１】
ここで使用される「アナログ(類似体)」又は「アナログ群」なる用語は、親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換され、及び／又は親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が欠失され、及び／又は一又は複数のアミノ酸がタンパク質に挿入され、及び／又は一又は複数のアミノ酸が親タンパク質に付加された配列番号１の配列を有するＦＩＸ因子を意味するものである。かかる付加は親タンパク質のＮ末端又はＣ末端の何れか又は双方で生じうる。この定義内の「アナログ」又は「アナログ群」はその活性化型でＦＩＸ活性をなお有している。一実施態様では、変異体は配列番号１の配列と７０％同一である。一実施態様では、変異体は配列番号１の配列と８０％同一である。他の実施態様では、変異体は配列番号１の配列と９０％同一である。更なる実施態様では、変異体は配列番号１の配列と９５％同一である。ここで使用される場合、特定の位置に対する言及は、配列番号１における対応の位置を意味する。
【００７２】
特段の記載がない限り、ＩＸ因子ドメインは次のアミノ酸残基を含む：残基Ｔｙｒ１から残基Ｌｙｓ４３までの領域であるＧｌａドメイン；残基Ｇｌｎ４４から残基Ｌｅｕ８４までの領域であるＥＧＦ１；残基Ａｓｐ８５から残基Ａｒｇ１４５までの領域であるＥＧＦ２；残基Ａｌａ１４６から残基Ａｒｇ１８０までの領域である活性化ペプチド；及び残基Ｖａｌ１８１から残基Ｔｈｒ４１４までの領域であるプロテアーゼドメイン。軽鎖はＧｌａドメイン、ＥＧＦ１及びＥＧＦ２を包含する領域を意味し、重鎖はプロテアーゼドメインを意味する。
「ＦＩＸ半減期」は、当業者に知られた標準的な手順による薬物動態によって決定され、マウス又はヒトのような動物において決定される、血液循環中におけるＩＸ因子の半減期を意味する。
【００７３】
「ＦＩＸ活性」又は「ＦＩＸ生物学的活性」は凝固カスケードに機能し、活性化された血小板上のＦＶＩＩＩａとの相互作用を介してＦＸａの形成を誘導し、血餅の形成を支援する能力として定義される。該活性は、McCarthy等Thromb Haemost. 2002 May;87(5):824-30に記載されているような凝固分析のような技術、及び当業者に知られた他の技術によってインビトロで評価することができる。
「持続性ＦＩＸ」は天然ヒトＦＩＸと比較して投与後に延長された期間の間患者内を循環するＦＩＸ化合物を意味する。
【００７４】
「挿入されたアミノ残基」なる用語は、天然ＦＩＸ分子の所定の位置に通常は見出されない他のアミノ酸残基での天然のアミノ酸残基の置換と、天然ＦＩＸ分子へのアミノ酸残基の付加の双方を含むものである。アミノ酸残基の付加は天然ＦＩＸ分子の２つの存在するアミノ酸残基の間又はＮ末端又はＣ末端の何れかでありうる。
「ＰＥＧ化ＦＩＸ」なる用語はＦＩＸ分子にコンジュゲートしたＰＥＧ分子を有するＦＩＸを意味する。「システイン-ＰＥＧ化ＦＩＸ」なる用語はＦＩＸ分子に導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートしたＰＥＧ分子を有するＦＩＸを意味する。
【００７５】
使用されるアミノ酸置換に対する用語法は次の通りである。最初の文字はヒトＦＶＩＩＩの位置に天然に存在するアミノ酸を表している。次の番号はヒトＦＩＸにおける位置を表している。第二の文字は天然のアミノ酸に置換される（置き換える）異なったアミノ酸を表している。一例はＥ１６２Ｃであり、ヒトＦＩＸ因子の１６２位のリジンがシステインによって置き換えられている。
本明細書において、アミノ酸の三文字又は一文字表記は表２に示すような一般的な意味で使用されている。明示的に示さない限り、ここで言及するアミノ酸はＬ-アミノ酸である。更に、ペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端は、特段の記載がない限り、それぞれＮ末端及びＣ末端である。
【００７６】
2014129354.tif 000009
【００７７】
「低分子量チオールコンジュゲート（ＲＳ−Ｃｙｓ）型」なる用語及び類似用語は、当該タンパク質のシステインのチオール基がチオール基を有する化合物であって５００Ｄａ未満の分子量を有している化合物とコンジュゲートしていることを意味するものである。そのような化合物の例はグルタチオン、γ-グルタミルシステイン、システイニルグリシン、システイン、Ｎ-アセチルシステイン、システアミン等々である。
「活性型」なる用語は、例えば触媒（酵素）、チモーゲン、又は共因子等のような、所望の作用を実施することができるタンパク質の型（又は型群）を意味する。「活性型」はしばしば「正しく折り畳まれた型」と称される。
タンパク質は一般には天然タンパク質と比較して少なくとも一つの非天然システインを含む「操作された」ポリペプチドである。そのような「操作」ポリペプチドは、好ましくは、当業者に明らかであるような組換え技術によって調製される；ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１及びＷＯ０１／５８９３５Ａ２を参照。
【００７８】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解してはならない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
本発明は、適用される法律によって許容される限り、添付の特許請求の範囲に記載の発明の範囲の全ての変形態様及び均等態様を含む。
【００７９】
本発明の実施態様
１．  位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された、延長された循環半減期を持つＦＩＸアナログ。
２．  位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０又は８４の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された実施態様１に記載のＦＩＸアナログ。
３．  位置８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１又は１４２の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された実施態様１に記載のＦＩＸアナログ。
４．  位置１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された実施態様１に記載のＦＩＸアナログ。
５．  １４６−１８０位の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された実施態様１に記載のＦＩＸアナログ。
６．  位置１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７から選択された天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された実施態様１に記載のＦＩＸアナログ。
７．  位置１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６から選択された天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された実施態様１に記載のＦＩＸアナログ。
８．  アミノ酸残基Ｅ１６２が、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された実施態様７に記載のＦＩＸアナログ。
９．  少なくとも一つのシステイン残基がＣ末端Ｔ４１５に付加され、該システインがＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基に結合された、延長された循環半減期を持つＦＩＸアナログ。
１０．  化学基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される上記実施態様の何れかに記載のＦＩＸアナログ。
１１．  ポリエチレングリコールが５００−１０００００、例えば１０００−７５０００、又は２０００−６００００の範囲の平均分子量を有している実施態様１０に記載のＦＩＸアナログ。
１２．  アナログが野生型ＦＩＸのものの少なくとも１．５倍の循環半減期を有している上記実施態様の何れかに記載のＦＩＸアナログ。
１３．  アナログが、凝固アッセイで測定した場合、野生型ＦＩＸの少なくとも２０％の生物学的活性を有している上記実施態様の何れかに記載のＦＩＸアナログ。
１４．  実施態様１から１３の何れか一に記載のＦＩＸアナログを調製する方法であって、ａ）低分子チオール（ＲＳ−ＣＹＳ）にジスルフィド結合を介して結合した位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の群から選択される位置に少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたＦＩＸポリペプチドを、レドックスバッファーを含む混合物に該低分子量チオール結合ＦＩＸを反応させることによって選択的に還元する工程と、ｂ）選択的に還元されたシステイン（ＨＳ−Ｃｙｓ）部分の少なくとも一つを化学基と結合させる同時の又は続く工程を含む方法。
１５．  レドックスバッファーが、還元され酸化されたグルタチオンとグルタレドキシンを含む混合物を含む実施態様１４に記載の方法。
１６．  実施態様１−１３の何れか一に記載のＦＩＸアナログを調製する方法であって、ａ）低分子チオール（ＲＳ−ＣＹＳ）にジスルフィド結合を介して結合した位置４４、４６、４７、５０、５３、５７、６６、６７、６８、７０、７２、７４、８０、８４、８７、８９、９０、９１、９４、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２５、１２９、１３８、１４０、１４１、１４２、１４６−１８０、１８５、１８６、１８８、１８９、２０１、２０２、２０３、２２４、２２５、２２８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４７、２４９、２５２、２５７、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２７７、２８０、３１４、３１６、３１８、３２１、３４１、３７２、３７４、３９１、３９２、４０６、４１０、４１３又は４１５の群から選択される位置に少なくとも一つの非天然システインを含む操作されたＦＩＸポリペプチドを、トリアリールホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸化合物を含む混合物に該低分子量チオール結合ＦＩＸを反応させることによって選択的に還元する工程と、ｂ）選択的に還元されたシステイン（ＨＳ−Ｃｙｓ）部分の少なくとも一つを化学基と結合させる同時の又は続く工程を含む方法。
１７．  化学基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される実施態様１４−１６に記載の方法。
１８．  化学基がポリエチレングリコール、特に５００−１０００００、例えば１０００−７５０００、又は２０００−６００００の範囲の平均分子量を有しているものである実施態様１７に記載の方法。
１９．  実施態様１−１３に記載のＦＩＸアナログの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と共に含有する血友病患者の治療のための薬学的製剤。
２０．  実施態様１−１３の何れか一に記載のＦＩＸアナログの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と共に患者に投与することを含む血友病患者の治療方法。
２１．  治療が少なくとも週に一回の処置を含む実施態様２０に記載の方法。
２２．  治療が週に一回だけの処置を含む実施態様２１に記載の方法。
【実施例】
【００８０】
次の実施例において使用されるアミノ酸置換の用語法は次の通りである。最初の文字は配列番号１の位置に天然に存在するアミノ酸を表している。次の番号は配列番号１の位置を表している。第二の文字は天然のアミノ酸に置換される異なったアミノ酸を表している。一例はＩＸ因子Ｅ１６２Ｃであり、配列番号１の１６２位のグルタミン酸がシステインによって置き換えられている。
【００８１】
材料−  還元され酸化されたグルタチオン（それぞれＧＳＨ及びＧＳＳＧ）はＳｉｇｍａから購入した。ＰＥＧ５ｋ−マレイミド（２Ｅ２Ｍ０Ｈ０１）、ＰＥＧ２０ｋ−マレイミド（２Ｅ２Ｍ０Ｐ０１）、ＰＥＧ４０ｋ−マレイミド（２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）はＮｅｋｔａｒ・Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ(Huntsville, AL)から購入した。全ての他の化学薬品は分析用グレード又はそれより良いものとした。
【００８２】
濃度の決定−  原液中のＧＳＳＧの濃度を、３８１Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して２４８ｎｍのその吸光度から決定した(Chau 及びNelson, 1991)。ＧＳＨの濃度を、Ｅｌｌｍａｎ試薬(５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸))及び４１２ｎｍの２-ニトロ-５-チオ安息香酸のモル吸光係数として１４１５０Ｍ−１ｃｍ−１を使用して決定した(Riddles等, 1979)。
【００８３】
グルタレドキシンのクローニングと発現−  大腸菌グルタレドキシン２（Ｇｒｘ２）に対するＤＮＡコード配列を、製造者の推奨に従ってＥｘｐａｎｄ・Ｈｉｇｈ・Ｆｉｄｅｌｉｔｙ・ＰＣＲ系(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)と、フランキングＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を導入するプライマー対ｏＨＯＪ９８−ｆ／ｏＨＯＪ９８（プライマー配列は表１に列挙する）を使用するＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ反応のためのゲノム鋳型ＤＮＡは、刊行された手順(Grimberg等, 1989)に従って大腸菌から調製した。精製したＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の対応部位にライゲートしてｐＨＯＪ２９４を得た。終止コドンがベクターによって与えられているので、遺伝子はＣ末端ＬＥＨＨＨＨＨＨ親和性タグをコードする３'ベクター誘導伸展を備えていた。クローニングされた配列の正しい同一性をＤＮＡ配列決定によって証明した。
【００８４】
発現については、２９４プラスミドを化学薬品コンピテントＢＬ２１(ＤＥ３)細胞中に導入した。新鮮な一晩の形質転換体を５００ｍｌのテリフィックブロス((Sambrook等, 1989))及び３０μｇ／ｍｌのカナマイシン中に０．０２の初期ＯＤ６００まで播種した。培養物を２３０ｒｐｍで整流化フラスコ中において３７℃にて中央ｌｏｇ相（ＯＤ６００ ３−４）まで増殖させ、その時点で、温度を２５℃まで下げ、０．１ｍＭのイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＴＰＧ）によってタンパク質の発現を誘導した。一晩の発現後、細胞を遠心分離によって集め、５０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭのリン酸カリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中に再懸濁させ、三回の凍結融解サイクルで溶解させた。清澄な可溶化液を、５ｍｌ／分の流量の溶解バッファーで平衡にした２０−ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ・Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)カラムに充填した。溶解バッファーでの洗浄後、結合したタンパク質を、溶解バッファー中０−２００ｍＭのイミダゾールの線形勾配で溶出させた。ピークフラクションをプールし、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に対する広範な透析の前に２０分間、２０ｍＭのジチオスレイトールで処理した。そのタンパク質を−８０℃で保存し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって＞９０％純粋であると判断した。濃度は２１７４０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸光度によって推定した。
【００８５】
ＩＸ因子及びＩＸ因子Ｅ１６２Ｃ及びＩＸ因子４１６Ｃ変異体をコードするＤＮＡの作製−  ＩＸ因子Ｅ１６２Ｃ及びＩＸ因子４１６ＣをそれぞれコードするプラスミドｐＨＯＪ３３８及びｐＨＯＪ３５８を、製造者の指示書に従って(Stratagene, La Jolla, CA)鋳型としてプライマー対ｏＨＯＪ１３７−ｆ／ｏＨＯＪ１３７−ｒ及びｏＨＯＪ１５５−ｆ／ｏＨＯＪ１５５−ｒ（表１を参照）を使用するＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ(登録商標)部位特異的突然変異誘発によって作製した。全てのクローニングされた配列の正しい同一性はＤＮＡ配列決定により証明した。
【００８６】
ＩＸ因子と変異体の精製−  ＩＸ因子と変異体をArruda等 (2001) Blood, 97, 130-138に記載されたようにして精製する。但し、ＩＸ因子(Ｃｙｓ変異体)を含むフラクションをプールし、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０に対して透析し、−８０℃で保存する。
【００８７】
ＰＥＧ-マレイミドでのＦＩＸ Ｃｙｓ変異体の修飾−  選択的還元は、全容量４．４ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０、０．５ｍＭのＧＳＨ、２０μＭのＧＳＳＧ、及び１０μＭのＧｒｘ２を含むバッファー中で３０℃にて５時間、４．８ｇのＦＩＸ Ｃｙｓ変異体をインキュベートすることによって実施される。ついで、生成された遊離チオールは、０．８ｍＭの最終濃度までＰＥＧ５ｋ−マレイミド、ＰＥＧ２０ｋ−マレイミド、又はＰＥＧ４０ｋ−マレイミド（水に溶解）の添加によって選択的に修飾される。チオールアルキル化は、０．５ｍＭのシステインでの停止時に室温で１５分間進行させる。ＥＤＴＡを過剰のカルシウムで（２０ｍＭの最終濃度）添加し、ＦＩＸ Ｃｙｓ変異体を捕捉するためにバッファーＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）で平衡にした１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に全内容物を充填した。バッファーＡでの洗浄後、結合タンパク質の一段階溶出を、ＨｉＴｒａｐカラムの前に搭載したＨｉＬｏａｄ・Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １６／６０ｐｇカラム(Amersham Biosciences)で直接バッファーＢ(１０ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．０)を用いて実施する。ＰＥＧ化及び非ＰＥＧ化種を１ｍｌ／分の流量で分離し、２８０ｎｍでの吸光度によって検出する。ＰＥＧ化したＦＩＸ Ｃｙｓ変異体を含むピークを集め、−８０℃で保存する。
【００８８】
表１
プラスミド作製に使用したＤＮＡオリゴ
2014129354.tif 000010
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００８９】
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【配列表】
2014129354000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月21日(2014.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置１４６−１８０の天然アミノ酸残基の少なくとも一つが、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換され、
配列番号：１のアミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有し、延長された循環半減期を持ち、ｉｎｖｉｖｏにおける血餅形成についての生物学的活性を有するＦＩＸポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸残基Ｅ１６２が、ＦＩＸポリペプチドの分子量を増大させる化学基が結合されたシステインアミノ酸残基に置換された請求項１に記載のＦＩＸポリペプチド。
【請求項３】
化学基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される請求項１または２に記載のＦＩＸポリペプチド。
【請求項４】
ポリエチレングリコールが５００−１０００００の範囲の平均分子量を有している請求項３に記載のＦＩＸポリペプチド。
【請求項５】
野生型ＦＩＸのものの少なくとも１．５倍の循環半減期を有している請求項１から４の何れか一項に記載のＦＩＸポリペプチド。
【請求項６】
凝固アッセイで測定した場合、野生型ＦＩＸの少なくとも２０％の生物学的活性を有している請求項１から５の何れか一項に記載のＦＩＸポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載のＦＩＸポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）低分子チオールにジスルフィド結合を介して結合した非天然システインを位置１４６−１８０に少なくとも一つ含む操作されたＦＩＸポリペプチドを、レドックスバッファーを含む混合物に該低分子量チオール結合ＦＩＸを反応させることによって選択的に還元する工程と、ｂ）選択的に還元されたシステイン部分の少なくとも一つを化学基と結合させる工程であって、上記工程ａ）と同時の又は上記工程ａ）に続く工程を含む方法。
【請求項８】
請求項１から６の何れか一項に記載のＦＩＸポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）低分子チオールにジスルフィド結合を介して結合した非天然システインを位置１４６−１８０に少なくとも一つ含む操作されたＦＩＸポリペプチドを、トリアリールホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸化合物を含む混合物に該低分子量チオール結合ＦＩＸを反応させることによって選択的に還元する工程と、ｂ）選択的に還元されたシステイン部分の少なくとも一つを化学基と結合させる工程であって、上記工程ａ）と同時の又は上記工程ａ）に続く工程を含む方法。
【請求項９】
化学基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
化学基が、５００−１０００００の範囲の平均分子量を有しているポリエチレングリコールである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１−６に記載のＦＩＸポリペプチドの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と共に含有する血友病患者の治療のための薬学的製剤。
【請求項１２】
請求項１−６の何れか一項に記載のＦＩＸポリペプチドの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と共に含む血友病患者の治療のための医薬。
【請求項１３】
治療が少なくとも週に一回の処置を含む請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
治療が週に一回だけの処置を含む請求項１３に記載の医薬。
【外国語明細書】
2014129354000001.pdf
2014129354000002.pdf
2014129354000003.pdf