(57)【要約】【課題】β−フェランドレンを高純度かつ大量に取得するための一連の技術を提供する。【解決手段】ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸とが宿主細胞に導入されてなり、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する、β−フェランドレン生産能を有する組換え細胞が提供される。当該組換え細胞を培養することにより、当該組換え細胞にβ−フェランドレンを生産させるβ−フェランドレンの生産方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸とが宿主細胞に導入されてなり、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する、β−フェランドレン生産能を有する組換え細胞。
【請求項２】
宿主細胞は、メタンモノオキシゲナーゼを有さないものである請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
宿主細胞は、大腸菌又は酵母である請求項２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ−フェランドレンを生産可能である請求項１〜３のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項５】
ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである請求項１〜４のいずれかに記載の組換え細胞。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項６】
ネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードするものである請求項１〜５のいずれかに記載の組換え細胞。
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項７】
β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードするものである請求項１〜６のいずれかに記載の組換え細胞。
（ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項８】
イソペンテニル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する請求項１〜７のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項９】
イソペンテニル二リン酸の合成経路は、メバロン酸経路である請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
前記メバロン酸経路は、酵母又は放線菌のメバロン酸経路である請求項９に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え細胞を培養することにより、当該組換え細胞にβ−フェランドレンを生産させるβ−フェランドレンの生産方法。
【請求項１２】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ−フェランドレンを生産させる請求項１１に記載のβ−フェランドレンの生産方法。
【請求項１３】
組換え細胞の細胞外に放出されたβ−フェランドレンを回収する請求項１１又は１２に記載のβ−フェランドレンの生産方法。
【請求項１４】
組換え細胞の培養系の気相からβ−フェランドレンを回収する請求項１１〜１３のいずれかに記載のβ−フェランドレンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はβ−フェランドレン生産能を有する組換え細胞、及び当該組換え細胞を用いるβ−フェランドレンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノテルペンは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とが縮合したゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を生合成前駆体とする、炭素１０個を持つイソプレイン則に従う化合物の総称である。モノテルペンは、現在９００種類以上のものが知られている。
【０００３】
モノテルペンはバラや柑橘類のような芳香を持ち、香水などにも多用されている。例えば、リモネンはレモンなど柑橘類に含まれる香気成分であり、溶剤や接着剤原料などとしても利用されている。また、メントールは爽やかな芳香を持ち、菓子や医薬品に清涼剤として用いられている。一方、樹脂産業では、β−ピネン、α−ピネン、リモネン、α−フェランドレン等が、接着剤や透明樹脂等のモノマー原料として検討されている（非特許文献１）
【０００４】
モノテルペンの一種であるβ−フェランドレン（β-phellandrene）は、新たなポリマー材料としての用途が期待されている。β−フェランドレンは、α−フェランドレンに比べてより高分子量のポリマーを得る可能性がある。しかし、合成化学的手法によってβ−フェランドレンを得る場合には、その異性体であるα−フェランドレンの生成が避けられず、またこれらの異性体の分離は極めて困難である（非特許文献２）。そのため、高純度のβ−フェランドレンを得ることは難しく、このことがβ−フェランドレンのポリマー物性等を調べることを困難にしている。
【０００５】
一方、β−フェランドレンの生合成経路としては、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素又はネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素の作用によって、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又はネリル二リン酸（ＮＰＰ）が生合成される。続いて、β−フェランドレン合成酵素の作用により、ＧＰＰ又はＮＰＰからβ−フェランドレンが生合成される。そして、トマトとラベンダーにおいて、β−フェランドレン合成酵素が見出されている（非特許文献３，４）。
【０００６】
特許文献１には、環状テルペンシンターゼ（環状テルペン合成酵素）をコードする核酸が導入されたＣ１代謝宿主細胞の形質転換体を用いて、モノテルペンを製造する方法について記載されている。その実施例として、メチロモナス属細菌の形質転換体を用いてリモネンを製造した実験例が記載されている。しかし、β−フェランドレンについては、言及はあるものの、実施例は示されていない。β−フェランドレン合成酵素に関する言及もあるが、β−フェランドレン合成酵素とその遺伝子の具体例や取得方法、さらにβ−フェランドレンを生産できる形質転換体の具体的構成や構築方法については示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００５−５００８０５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Satou K., et al., Green Chemistry 2006, 8, 878-882
【非特許文献２】Mori K., Tetrahedron： Asymmetry 2006, 17, 2133-2142
【非特許文献３】Demissie, Z. A., et al.,, Planta. 2011, 233, 685-96.
【非特許文献４】Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記現状に鑑み、本発明は、β−フェランドレンを高純度かつ大量に取得するための一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸とが宿主細胞に導入されてなり、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する、β−フェランドレン生産能を有する組換え細胞である。
【００１１】
本発明はβ−フェランドレン生産能を有する組換え細胞に係るものである。本発明の組換え細胞は、「ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸」と、「β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸」とが宿主細胞に導入されてなるもので、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する。すなわち、本発明の組換え細胞では、ＧＰＰ合成酵素及び／又はＮＰＰ合成酵素の発現能とβ−フェランドレン合成酵素の発現能とが、宿主細胞に対して新たに付加又は増強されている。
本発明の組換え細胞では、細胞内で発現されたＧＰＰ合成酵素の作用によってイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からＧＰＰが合成され、及び／又は、細胞内で発現されたＮＰＰ合成酵素の作用によってＩＰＰからＮＰＰが合成される。さらに、細胞内で発現されたβ−フェランドレン合成酵素の作用によって、ＧＰＰ及び／又はＮＰＰからβ−フェランドレンが合成される。その結果、本発明の組換え細胞を培養することにより、β−フェランドレンを高純度かつ大量に生産することができる。
【００１２】
好ましくは、宿主細胞は、メタンモノオキシゲナーゼを有さないものである。
【００１３】
好ましくは、宿主細胞は、大腸菌又は酵母である。
【００１４】
かかる構成により、組換え細胞を容易に大量培養することができる。
【００１５】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ−フェランドレンを生産可能である。
【００１６】
好ましくは、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
【００１７】
好ましくは、ネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードするものである。
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
【００１８】
好ましくは、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードするものである。
（ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【００１９】
好ましくは、イソペンテニル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。
【００２０】
かかる構成により、ＧＰＰ合成酵素やＮＰＰ合成酵素の基質となるＩＰＰが効率的に供給される。
【００２１】
好ましくは、イソペンテニル二リン酸の合成経路は、メバロン酸経路である。
【００２２】
好ましくは、前記メバロン酸経路は、酵母又は放線菌のメバロン酸経路である。
【００２３】
本発明の他の様相は、上記した組換え細胞を培養することにより、当該組換え細胞にβ−フェランドレンを生産させるβ−フェランドレンの生産方法である。
【００２４】
本発明は、β−フェランドレンの生産方法に係るものである。本発明では、上記した組換え細胞を培養することにより、当該組換え細胞にβ−フェランドレンを生産させる。本発明によれば、β−フェランドレンを高純度かつ大量に生産することができる。
【００２５】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ−フェランドレンを生産させる。
【００２６】
好ましくは、組換え細胞の細胞外に放出されたβ−フェランドレンを回収する。
【００２７】
好ましくは、組換え細胞の培養系の気相からβ−フェランドレンを回収する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、β−フェランドレンを高純度かつ大量に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例５で行った培養の気相画分をＧＣ−ＭＳで分析した結果を表すトータルイオンクロマトグラムであり、（ａ）はコントロールの組換え体、（ｂ）はβ−フェランドレン生産能を有する組換え体の場合である。
【図２】図１（ｂ）の各ピークをＧＣ−ＭＳで同定した結果を表すマススペクトルであり、（ａ）はピークＡ（β−フェランドレン）、（ｂ）はピークＢ（リモネン）、（ｃ）はピークＣ（ミルセン）の場合である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の組換え細胞は、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸とが宿主細胞に導入されてなり、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する組換え細胞であり、β−フェランドレン合成能を有するものである。
【００３１】
ＧＰＰ合成酵素としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（遺伝子）についても同様であり、組換え細胞内で正常に転写・翻訳されるものであれば特に限定はない。
ＮＰＰ合成酵素、β−フェランドレン合成酵素、及びこれらをコードする核酸についても同様である。
【００３２】
ＧＰＰ合成酵素の具体例としては、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のもの（GenBank Accession No.: Y17376/At2g34630; Bouvier, F., et al., Plant J,. 2000, 24, 241-52.）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のもの;（GenBank Accession No.: NP_215504; Mann, F. M., et al., FEBS Lett., 2011, 585, 549-54.）、等が挙げられる。
配列番号１に上記シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号２にアミノ酸配列のみを示す。配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸の一例となる。
【００３３】
さらに、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｃ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００３４】
ＮＰＰ合成酵素の具体例としては、トマト（Solanum lycopersicum）由来のもの（GenBank Accession No.: FJ797956）、等が挙げられる。
配列番号３に上記トマト由来ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸の一例となる。
【００３５】
さらに、ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｆ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００３６】
本発明の組換え細胞において、「ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸」と「ネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸」については、いずれか一方の核酸のみが導入されたものでもよいし、両方の核酸が導入されたものでもよい。
【００３７】
β−フェランドレン合成酵素及びそれをコードする核酸の具体例としては、トマト（Solanum lycopersicum）由来のもの（GenBank Accession No.: FJ797957; Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.）、ラベンダー（Lavandula angustifolia）由来のもの（GenBank Accession No.： HQ404305; Demissie, Z. A., et al., Planta, 2011,. 233, 685-96）、等が挙げられる。
配列番号５に上記トマト由来β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号６にアミノ酸配列のみを示す。
配列番号７に上記ラベンダー由来のβ−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号８にアミノ酸配列のみを示す。
配列番号５又は配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡは、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸の一例となる。
【００３８】
さらに、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｉ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００３９】
本発明の組換え細胞における宿主細胞としては特に限定はなく、原核細胞、真核細胞のいずれでもよい。原核細胞の例としては、細菌、放線菌、が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌等のエシェリヒア（Escherichia）属細菌、枯草菌等のバチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、シアノバクテリア（ラン藻）、クロストリディウム（Clostridium）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、等が挙げられる。この中でも、大量培養が容易な大腸菌が特に好ましい。
真核細胞の例としては、酵母、糸状菌、真核微細藻類、植物細胞、動物細胞が挙げられる。
【００４０】
酵母の例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロミセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・マルトサ（Candida maltosa）、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）、ピキア・ピヌス（Pichia pinus）、ピキア・バンリジイ（Pichia varijii）、ピキア・ファーメンタンス（Pichia fermentans）、ピキア・ギリエルモンディイ（Pichia guilliermondii）、ピキア・スチピチス（Pichia stipitis）、サッカロミセス・テルリス（Saccharomyces elluris）、カンジダ・ユーティリス（Candida utilis）、カンジダ・ギリエルモンディイ（Candida guilliermondii）、ハンセヌラ・ヘンリチイ（Hansenula henricii）、ハンセヌラ・カプスラタ（Hansenula capsulata）、ハンセヌラ・ポリモーファ（Hansenula polymorpha）、ハンセヌラ・サツルヌス（Hansenula saturnus）、リポミセス・コノネンコエ（Lypomyces kononenkoae）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、カンジダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、サッカロミコプシス・フィブリゲラ（Saccaromycopsis fibuligera）、サッカロミコデス・ルドウィギイ（Saccharomycodes ludwigii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、トレメラ・メセンテリカ（Tremella mesenterica）、チゴサッカロミセス・アシドファシエンス（Zygosaccharomyces acidofaciens）、チゴサッカロミセス・ファーメンタチ（Zygosaccharomyces fermentati）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、およびチゴサッカロミセス・ソヤ（Zygosaccharomyces soja）、等が挙げられる。この中でも、大量培養が容易な酵母を選択することが特に好ましい。
【００４１】
また宿主細胞は、メタンモノオキシゲナーゼ（ＥＣ １．１４．１３．２５）を有さないものであることが好ましい。
【００４２】
ＧＰＰ合成酵素、ＮＰＰ合成酵素、β−フェランドレン合成酵素をコードする各核酸を宿主細胞に導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた核酸を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記核酸（ＤＮＡ）を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記核酸（ＤＮＡ）、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
【００４３】
宿主細胞が大腸菌の場合に使用可能なベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。より具体的には、例えば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。ベクター上のプロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で作動できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、及びtacプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４４】
宿主細胞が酵母の場合も基本的に同様であり、当該ベクターの構成として、宿主酵母内で安定に維持するための複製系、挿入された上記核酸（ＤＮＡ）を転写可能なプロモーター、およびターミネーター配列を有することが好ましい。例えば、当該ベクターは、宿主酵母で複製し得るまたは宿主染色体内に組み込まれ得るプラスミドであってもよい。また当該ベクターは、各々が選択的な切断部位により分離される、所望ＤＮＡ配列の反復コピーの発現をコードし得るものでもよい。
酵母で作動可能なプロモーターの種類は特に限定されないが、例えば、イソクエン酸リアーゼ遺伝子のプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）プロモーター、ＡＤＨＩプロモーター、ＭＦα１プロモーター、およびＧＡＬ１０プロモーターなどを用いることができる。
【００４５】
ベクターを用いて各核酸を宿主細胞に導入する場合、各核酸を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の核酸を組み込む場合には、各核酸を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。
【００４６】
宿主細胞がα−フェランドレン合成酵素を有するものである場合には、宿主細胞のα−フェランドレン合成酵素をノックアウトしておくことが好ましい。ただし、一般にα−フェランドレン合成酵素を有する生物は植物のみであるので、少なくとも、細菌や酵母を宿主細胞とする場合においては当該操作は通常必要ない。
【００４７】
本発明の組換え細胞においては、ＧＰＰ合成酵素、ＮＰＰ合成酵素、β−フェランドレン合成酵素をコードする各核酸に加えて、他の核酸が導入されていてもよい。１つの実施形態では、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。導入される当該核酸は１種のみでもよいし、２種以上でもよい。
【００４８】
一般に、ＩＰＰの合成経路はメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）の２つに大別される。
メバロン酸経路は真核生物が備えているものであり、アセチルＣｏＡを出発物質としている。メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、が挙げられる。
【００４９】
一方、非メバロン酸経路は原核生物や葉緑体・色素体が備えているものであり、グリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰ）とピルビン酸を出発物質としている。非メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。
【００５０】
本実施形態でさらに導入される核酸がコードする「ＩＰＰ合成経路で作用する酵素」は、メバロン酸経路で作用する酵素が好ましい。
メバロン酸経路で作用する酵素群としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。このうち、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼからなる酵素群が宿主細胞内で発現するように、導入する核酸を選択すればよい。
【００５１】
メバロン酸経路は全ての真核生物が保有しているが、真核生物以外でも見出されている。真核生物以外でメバロン酸経路を有するものとしては、放線菌では、Streptomyces sp. Strain CL190 (Takagi M. et al., J. Bacteriol. 2000, 182 (15), 4153-7)、Streptomyces griseolosporeus MF730-N6 (Hamano Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65(7), 1627-35）が挙げられる。
細菌では、Lactobacillus helvecticus (Smeds A et al., DNA seq. 2001, 12(3), 187-190)、Corynebacterium amycolatum、Mycobacterium marinum、Bacillus coagulans、Enterococcus faecalis、Streptococuss agalactiae、Myxococcus xanthus等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99)。
アーキアでは、Aeropyrum属、Sulfolobus属、Desulfurococcus属、Thermoproteus属、Halobacterium属、Methanococcus属、Thermococcus属、Pyrococcus属、Methanopyrus属、Thermoplasma属等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99）。
上記メバロン酸経路で作用する酵素群の由来としては特に限定はないが、酵母又は放線菌のメバロン酸経路で作用する酵素群が特に好ましく採用される。
【００５２】
これらの酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチドでもよい。
【００５３】
本発明の組換え細胞を培養する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等に応じて適宜行うことができる。
組換え細胞が好気性や偏性嫌気性の場合には、例えば、液体培地を用いた通気・撹拌培養を行うことができる。
組換え細胞が絶対嫌気性の場合には、例えば、気相を高純度もしくは脱酸素処理された窒素等のガスで置換し、さらに培養液も硫化ナトリウム、システイン等の還元剤を適量添加することにより、培養を行うことができる。
培地についても、組換え細胞が成育する培地であれば特に限定はない。培地の主たる炭素原としては、糖類やタンパク質分解物のような有機炭素原を用いることが好ましい。糖類としては、単糖（グルコース等）、二糖（マルトース等）、オリゴ糖、多糖（デンプン等）、糖アルコールなどが挙げられる。タンパク質分解物としては、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸などが挙げられる。
【００５４】
本発明の組換え細胞を培養することにより、β−フェランドレンを大量に生産することができる。β−フェランドレンの生産能力としては、湿潤菌体１ｇあたりβ−フェランドレン１０ｍｇ以上の生産量が実現可能である。
【００５５】
本発明の組換え細胞を培養してβ−フェランドレンを生産する場合には、合成化学的手法で生産する場合と異なり、α−フェランドレンの混入は実質的に起こらない。
【００５６】
生産されたβ−フェランドレンは、組換え細胞の細胞外に放出されるか、細胞内に蓄積される。本発明においては、いずれのβ−フェランドレンを回収してもよく、具体的には、菌体破砕物、培養液（培養上清）、培養系の気相などから回収することができる。好ましくは、細胞外に放出されたβ−フェランドレンを回収し、具体的には、培養液（培養上清）や培養系の気相から回収する。
【００５７】
組換え細胞の培養物からβ−フェランドレンを単離・精製する方法としては、例えば、培養液（培養上清）をペンタン等の適切な溶媒で抽出し、さらに逆相クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによって高純度に精製することできる。細胞外に放出されたβ−フェランドレンは気相にも蒸発するため、コールドトラップ等でこれらを液化し、回収することも可能である。
【００５８】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５９】
本実施例では、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養してβ−フェランドレンを生産した。
【００６０】
（１）トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子の単離
トマト（Solanum lycopersicum）由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号９と配列番号１０で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、トマト由来ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸（トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子、配列番号３、GenBank Accession No.: FJ797956）を増幅した。得られた核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＥＴ２３ａベクター（Novagen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、トマト由来ＮＰＰ合成酵素発現ベクターｐＴ２１ＴＮＰＰを作製した。
【００６１】
（２）トマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子の単離
トマト由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１１と配列番号１２で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、トマト由来β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（トマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子、配列番号５、GenBank Accession No.: FJ797957）を増幅した。得られた核酸をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Novagen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、トマト由来β−フェランドレン合成酵素発現ベクターｐＡＣＴＰＤを作製した。
【００６２】
（３）β−フェランドレン生産能を有する組換え大腸菌の作製
上記（１）、（２）で得られた発現ベクターｐＴ２３ＴＮＰＰ及びｐＡＣＴＰＤを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、β−フェランドレン生産能を有する組換え大腸菌ＢＬ２１ＢＰＤ１を作製した。
コントロールとして、核酸が挿入されていないｐＥＴ２３ａベクターのみを導入した組換え大腸菌、並びに、核酸が挿入されていないｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターのみを導入した組換え大腸菌を別途作製した。
【００６３】
（４）β−フェランドレン生産
組換え大腸菌ＢＬ２１ＢＰＤ１をアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地（1.6% (w/v)Bacto Tripton, 1%(w/v) Yeast Extract, 0.5%(w/v)NaCl）にて、３０℃、１１０ｒｐｍ（旋回）の条件で３０時間培養した。この際、培養開始から１６時間後に密閉系にした。培養終了後、遠心分離により菌体と培養上清を得た。
菌体を破砕し、破砕液の上清をペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β−フェランドレンが検出された。また、気相画分を分析したところ、気相にもβ−フェランドレンが検出された。
培養上清についてもペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β−フェランドレンが検出された。
一方、ｐＥＴ２３ａベクターあるいはｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターのみを導入したコントロールの組換え大腸菌では、菌体、培養上清、及び気相のいずれからもβ−フェランドレンは検出されなかった。
以上のことから、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を培養することにより、β−フェランドレンを生産できることが示された。また生産されたβ−フェランドレンは、菌体、培養上清、及び気相から回収可能であった。
【実施例２】
【００６４】
本実施例では、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養してβ−フェランドレンを生産した。
【００６５】
（１）シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子の単離
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１３と配列番号１４で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子、配列番号１、GenBank Accession No: Y17376）を増幅した。得られた核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＥＴ２３ａベクター（Novagen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素発現ベクターｐＴ２３ＡＧＰＰを作製した。
【００６６】
（２）ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子の単離
ラベンダー（Lavandula angustifolia）由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１５と配列番号１６で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子、配列番号７、GenBank Accession No.: HQ404305）を増幅した。得られた核酸をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Novagen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素発現ベクターｐＡＣＬＰＤを作製した。
【００６７】
（３）β−フェランドレン生産能を有する組換え大腸菌の作製
上記（１）、（２）で得られた発現ベクターｐＴ２３ＡＧＰＰ及びｐＡＣＬＰＤを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、β−フェランドレン生産能を有する組換え大腸菌ＢＬ２１ＢＰＤ２を作製した。
コントロールとして、核酸が挿入されていないｐＥＴ２３ａベクターのみを導入した組換え大腸菌、並びに、核酸が挿入されていないｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターのみを導入した組換え大腸菌を別途作製した。
【００６８】
（４）β−フェランドレン生産
組換え大腸菌ＢＬ２１ＢＰＤ２をアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地にて、３０℃、１１０ｒｐｍ（旋回）の条件で３０時間培養した。この際、培養開始から１６時間後に密閉系にした。培養終了後、遠心分離により菌体と培養上清を得た。
菌体を破砕し、破砕液の上清をペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β−フェランドレンが検出された。
培養上清についてもペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β−フェランドレンが検出された。また、気相画分を分析したところ、気相にもβ−フェランドレンが検出された。
一方、ｐＥＴ２３ａベクターあるいはｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターのみを導入したコントロールの組換え大腸菌では、菌体、培養上清、及び気相のいずれからもβ−フェランドレンは検出されなかった。
以上のことから、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を培養することにより、β−フェランドレンを生産できることが示された。また生産されたβ−フェランドレンは、菌体、培養上清、及び気相から回収可能であった。
【実施例３】
【００６９】
本実施例では、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母を作製し、当該組換え酵母を培養してβ−フェランドレンを生産した。
【００７０】
（１）トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子の単離
トマト由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１３と配列番号１４で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、トマト由来ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸（トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子、配列番号３、GenBank Accession No:FJ797956）を増幅した。得られた核酸をＢａｍＨＩで切断した後、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Invitrogen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、トマト由来ＮＰＰ合成酵素発現ベクターｐＰ３．５ＴＮＰＰを作製した。
【００７１】
（２）トマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子の単離
トマト由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１９と配列番号２０で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、トマト由来β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（トマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子、配列番号５、GenBank Accession No:FJ797957）を増幅した。得られた核酸をＢａｍＨＩで切断した後、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Invitrogen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、トマト由来β−フェランドレン合成酵素発現ベクターｐＰ３．５ＴＰＤを作製した。
【００７２】
（３）β−フェランドレン生産能を有する組換え酵母の作製
メタノール資化性酵母Pichia pastoris GS115株（Invitrogen社）を、上記（１）、（２）で得られた発現ベクターｐＰ３．５ＴＮＰＰ及びｐＰ３．５ＴＰＤの等量混合物で形質転換した。形質転換の方法は、Invitrogen社のマニュアル（No.25-0156、No. 25-0043）に従って行った。マルチコピーの遺伝子導入体を得るために、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（Invitrogen社）耐性株を取得した。これにより、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子及びトマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子をそれぞれ複数コピー保持する組換え酵母ＧＳＮＰ−１を取得した。
コントロールとして、核酸が挿入されていないｐＰＩＣ３．５Ｋベクターのみを導入した、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（Invitrogen社）耐性株を取得した（組換え酵母ＧＳ１１５）。
【００７３】
（４）β−フェランドレン生産
ＧＳＮＰ−１をＭＧＹ培地（1.34%(w/v) YNB, 1%(w/v) glycerol, 4 X 10-5 %(w/v) biotin; YMB:13.4%(w/v) yeast nitrogen base, 10%(w/v)ammonium sulfate）（Invitrogen社マニュアルNo. 25-0043）にて前培養した後、菌体を回収し、回収菌体をFermentation basal salts培地（85% Phosphoric acid 26.7 ml, Calcium sulfate 0.093%(w/v), Potassium sulfate 1.82%(w/v), Magnesium sulfate-7H2O 1.49%(w/v), Potassium hydroxide 0.413%(w/v), Glycerol 4.0%(w/v)）（Invitrogen社マニュアルVer.B 053002）にて６４時間本培養した。この際、培養開始から２４時間後に密閉系にした。導入した酵素遺伝子の発現誘導のために、培養開始から２４時間経過時と４８時間経過時に、１／２００容の１００％メタノールを培養液に添加した。培養終了後、遠心分離により菌体及び培養上清を回収した。
菌体をガラスビーズ法（Invitrogen社マニュアルNo. 25-0043）によって破砕し、上清を得た。この上清のペンタン抽出物をガスクロマトグラフィーで分析したところ、β−フェランドレンが検出された。
培養上清についてもペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β−フェランドレンが検出された。また、気相画分を分析したところ、気相にもβ−フェランドレンが検出された。
一方、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクターのみを導入したコントロールの組換え酵母ＧＳ１１５では、菌体、培養上清、及び気相のいずれからもβ−フェランドレンは検出されなかった。
以上のことから、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母を培養することにより、β−フェランドレンを生産できることが示された。また生産されたβ−フェランドレンは、菌体、培養上清、及び気相から回収可能であった。
【実施例４】
【００７４】
本実施例では、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母を作製し、当該組換え酵母を培養してβ−フェランドレンを生産した。
【００７５】
（１）シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子の単離
シロイヌナズナ由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号２１と配列番号２２で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子、配列番号１、GenBank Accession No.: Y17376）を増幅した。得られた核酸をＢａｍＨＩで切断した後、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Invitrogen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素発現ベクターｐＰ３．５ＡＧＰＰを作製した。
【００７６】
（２）ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子の単離
ラベンダー由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号２３と配列番号２４で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子、配列番号７、GenBank Accession No.: HQ404305）を増幅した。得られた核酸をＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Invitrogen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素発現ベクターｐＰ３．５ＬＰＤを作製した。
【００７７】
（３）β−フェランドレン生産能を有する組換え酵母の作製
メタノール資化性酵母Pichia pastoris GS115株（Invitrogen社）を、上記（１）、（２）で得られた発現ベクターｐＰ３．５ＡＧＰＰ及びｐＰ３．５ＬＰＤの等量混合物で形質転換した。形質転換の方法は、Invitrogen社のマニュアル（No.25-0156、No. 25-0043）に従って行った。マルチコピーの遺伝子導入体を得るために、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（Invitrogen社）耐性株を取得した。これにより、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子及びラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子をそれぞれ複数コピー保持する組換え酵母ＧＳＮＰ−２を取得した。
【００７８】
（４）β−フェランドレン生産
ＧＳＮＰ−２をＭＧＹ培地（Invitrogen社マニュアルNo. 25-0043）にて前培養した後、菌体を回収し、回収菌体をFermentation basal salts培地（Invitrogen社マニュアルVer.B 053002）にて６４時間本培養した。導入した酵素遺伝子の発現誘導のために、培養開始から２４時間経過時と４８時間経過時に、１／２００容の１００％メタノールを培養液に添加した。この際、培養開始から２４時間後に密閉系にした。培養終了後、遠心分離により菌体及び培養上清を回収した。
菌体をガラスビーズ法（Invitrogen社マニュアルNo. 25-0043）によって破砕し、上清を得た。この上清のペンタン抽出物をガスクロマトグラフィーで分析したところ、β−フェランドレンが検出された。
培養上清についてもペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β−フェランドレンが検出された。また、気相画分を分析したところ、気相にもβ−フェランドレンが検出された。
一方、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクターのみを導入したコントロールの組換え酵母ＧＳ１１５（実施例３で作製）では、菌体、培養上清、及び気相のいずれからもβ−フェランドレンは検出されなかった。
以上のことから、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母を培養することにより、β−フェランドレンを生産できることが示された。また生産されたβ−フェランドレンは、菌体、培養上清、及び気相から回収可能であった。
【実施例５】
【００７９】
本実施例では、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養して、フェランドレンの生成確認と副生成物の同定を行った。
【００８０】
実施例２で作製したｐＡＣＬＰＤより、ＮＣＯＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を切り出し、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１(Novagen社)のＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位へ導入し、ｐＣＯＤＬＦＳを構築した。一方、実施例１で作製したｐＴ２１ＴＮＰＰを鋳型として配列番号２５および２６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子を増幅した。増幅した断片をＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで切断し、上記ｐＣＯＤＬＦＳのＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ切断部位へ導入し、共発現ベクターｐＣＯＬＤＦＳＮＳを構築した。上記ｐＣＯＬＤＦＳＮＳをＲｏｓｅｔｔａ２(ＤＥ３)へ導入し、ラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素およびトマト由来ＮＰＰ合成酵素を共発現する組換え大腸菌ＲＯＦＳＮＳを得た。コントロール大腸菌としてｐＣＯＬＡ Ｄｕｅｔ−１のみを有する組換え大腸菌ＲＯＣＯＬＡも作製した。
【００８１】
組換え大腸菌ＲＯＦＳＮＳおよびＲＯＣＯＬＡをクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、およびカナマイシン１５μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地（1.6% (w/v)Bacto Tripton, 1%(w/v) Yeast Extract, 0.5%(w/v)NaCl）にて、１８℃、１１０ｒｐｍ（旋回）の条件下で、密閉系で２４時間培養した。培養終了後、気相画分をＧＣ−ＭＳによって分析した。図１に示すようにＲＯＦＳＮＳではβ−フェランドレンが検出され（ピークＡ）、副生成物と思われるピークＢおよびＣも検出された。一方、ＲＯＣＯＬＡではこれらのピークは検出されなかった。また各ピークの同定を行ったところ、図２に示すようにＲＯＦＳＮＳの培養気相では、主要生成物であるβ−フェランドレン以外にも、リモネン（ピークＢ）およびミルセン（ピークＣ）が副生成物として少量生成していた。
ＲＯＦＳＮＳによるβ−フェランドレンの気相での生成量は７５０μｇ／Ｌ培養液であった。
【実施例６】
【００８２】
本実施例では、放線菌由来メバロン酸経路遺伝子、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子、およびラベンダー由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養してβ−フェランドレンを生産した。
【００８３】
Streptomyces griseolosporeus (Kitasatospora griseola)のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７と配列番号２８で表されるプライマーを使用したＰＣＲによって、S. griseolosporeusのメバロン酸経路酵素をコードする核酸（配列番号２９）を増幅した。この核酸には、Mevalonate kinase、Mevalonate diphosphate decarboxylase、Phosphomevalonate kinase、IPP isomerase、HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) reductase (HMGR)、及びHMG-CoA synthaseをコードする遺伝子クラスターが含まれている。得られた増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７-Ｂｌｕｅ Ｔ ベクターへクローニングし、ｐＴ７ＳＭＶを構築した。
【００８４】
上記ベクターｐＴ７ＳＭＶより、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩによる切断によって回収した遺伝子断片をｐＣＯＬＡ Ｄｕｅｔ-１ (Novagen社)のＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ切断サイトへ導入し、ｐＣＳＭＶを構築した。
ｐＣＳＭＶのＮｄｅＩ−ＫｐｎＩ切断部位へ、配列番号３０で示されるトマトＮＰＰ合成酵素遺伝子、ラベンダーβ−フェランドレン合成酵素遺伝子オペロンの合成核酸を導入し、放線菌メバロン酸経路遺伝子、トマトＮＰＰ合成酵素遺伝子、及びラベンダーβ−フェランドレン合成酵素遺伝子を含むｐＣＳＭＶＮＳＦＳを構築した。発現ベクターｐＣＳＭＶＮＳＦＳを大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２(ＤＥ３)へ導入し、組換え大腸菌ＲＯＳＭＶＮＳＦＳを得た。
【００８５】
組換え大腸菌ＲＯＳＭＶＮＳＦＳをクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、およびカナマイシン１５μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地（1.6% (w/v)Bacto Tripton, 1%(w/v) Yeast Extract, 0.5%(w/v)NaCl）にて、１８℃、１１０ｒｐｍ（旋回）の条件下で、密閉系で２４時間培養した。培養終了後、気相画分をガスクロマトグラフィーによって分析したところ、β−フェランドレンが検出された。β−フェランドレンの気相での生成量は８．５ｍｇ／Ｌ培養液であった。
以上の結果と実施例５でのβ−フェランドレン生成量とから、放線菌ＭＶＡ経路遺伝子をさらに導入することで、β−フェランドレンの産生量を増大させることが可能であった。
【図１】
2014076042.tif 000003
【図２】
2014076042.tif 000004
【配列表】
2014076042000001.app