(57)【要約】【課題】アレルギー性鼻炎の非侵襲的判定方法の提供。【解決手段】患者の鼻粘膜中のフィラグリン遺伝子の発現量を測定することを特徴とするアレルギー性鼻炎の判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の鼻粘膜中のフィラグリン遺伝子の発現量を測定することを特徴とするアレルギー性鼻炎の判定方法。
【請求項２】
フィラグリン遺伝子の発現量が、初期値に比べて５０倍以上になったときに改善したと判定する請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
アレルギー性鼻炎治療薬の治療効果を評価するものである請求項１又は２記載の判定方法。
【請求項４】
患者が花粉症患者である請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項５】
フィラグリン遺伝子の発現量の測定が、ＰＣＲによるものである請求項１〜４のいずれかに記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性鼻炎の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性鼻炎は、ホコリ、ダニ、ハウスダスト、花粉などの吸入性アレルゲンの吸入により起こるくしゃみ、鼻みず、鼻づまりなど鼻粘膜のアレルギー性疾患であるが、近年の罹患率の増加から、国民病として知られている。一度アレルギー疾患を発症すると、それが皮膚、鼻、消化管、気管支のいずれから起きようとも、他の臓器に次々と一生涯アレルギーを発症する「アレルギーマーチ」が問題となっているが、アレルギー性鼻炎もその発症の低年齢化から、「アレルギーマーチ」の発火点となることが考えられる。その意味で、アレルギー疾患に対する早期介入が重要視されてきている。このことから、非侵襲的な鼻粘膜機能の把握が、早期介入開始の適切なタイミングの決定に、ひいては国民病の発症予防に繋がる可能性が考えられる。
【０００３】
アレルギー性鼻炎の主症状は、くしゃみ、鼻みず、鼻づまりであるが、その他に目のかゆみ、涙、頭痛、嗅覚障害ひいては作業効率の低下なども生じる。アレルギー性鼻炎の治療法としては主として抗ヒスタミン剤を代表とする抗アレルギー剤、吸入ステロイド薬等の薬物療法があげられる。また、花粉飛散前に抗アレルギー薬を投与する初期療法（季節前治療）が、飛散開始後あるいは症状増悪後より治療を開始するより所見、症状がよくなることが示唆されている。
【０００４】
しかし、一般的な薬物治療は患者により効果が異なり、一時的に症状は改善するが、眠気その他の副作用も生じることから、治療を継続すべきか否かの判定は困難である。また、ある治療法から他の治療法に変更すべきか否か等の判断も困難である。一方、アレルギーマーチの観点から、早期介入することにより、多臓器にわたるアレルギー疾患の発症進展を抑制することができれば、国民一人一人の問題のみならず医療経済上も非常に有益であると思われる。従って、アレルギー性鼻炎治療に関する非侵襲的判定方法の確立が望まれている。
【０００５】
一方、フィラグリンは、表皮の顆粒細胞で産生される塩基性タンパク質の一種であり、ヒスチジンリッチプロテインともよばれる。フィラグリンは、天然保湿因子である角層中の遊離アミノ酸の供給源として、またフィラグリンの一部がコーニファイドエンベロープに組み込まれること、プロフィラグリンの断片ペプチドがケラチノサイトのアポトーシスに関与するなど皮膚のバリア機能に重要な役割を果たしている（特許文献１など）。しかし、フィラグリンとアレルギー性鼻炎との関係は全く知られていない。アレルギーは上皮あるいは表皮の破綻により全てがはじまると考えられ始めている。ところが、アレルギー性鼻炎の本態である鼻粘膜上皮のフィラグリンの定量をした報告はなされておらず、また治療前後における検討も皆無である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／１３９１９１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、アレルギー性鼻炎の非侵襲的判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、容易に採取可能なアレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜を対象として種々のマーカーについて検討してきたところ、当該鼻粘膜中のフィラグリン遺伝子の発現の増加とアレルギー性鼻炎の改善度との間に相関性があることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の［１］〜［５］を提供するものである。
［１］患者の鼻粘膜中のフィラグリン遺伝子の発現量を測定することを特徴とするアレルギー性鼻炎の判定方法。
［２］フィラグリン遺伝子の発現量が、初期値に比べて５０倍以上になったときに改善したと判定する［１］記載の判定方法。
［３］アレルギー性鼻炎治療薬の治療効果を評価するものである［１］又は［２］記載の判定方法。
［４］患者が花粉症患者である［１］〜［３］のいずれかに記載の症状判定方法。
［５］フィラグリン遺伝子の発現量の測定が、ＰＣＲによるものである［１］〜［４］のいずれかに記載の判定方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、患者から容易に採取可能な鼻粘膜中のフィラグリン遺伝子の発現量を測定するだけで、速やかにアレルギー性鼻炎の病態の根幹をなすことが有力視されてきている上皮機能障害度が判定できるため、治療指針の判定に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明方法では、患者の鼻粘膜を試料として用いる。鼻粘膜、なかでも上皮細胞は、綿棒などにより容易に採取可能である。
採取した鼻粘膜中には、上皮擦過細胞が含まれているので、フィラグリン遺伝子含有量が測定できる。
患者としては、アレルギー性鼻炎が疑われる患者であればよく、例えば花粉症患者等が挙げられる。
【００１２】
フィラグリン遺伝子発現量の測定は、例えばＰＣＲにより行うことができるが、このうちリアルタイムＰＣＲにより行うのが、迅速かつ容易である。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法であり、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を使用する。蛍光モニター法は、インタカレーター法、TaqManプローブ法、サイクリングプローブ法のいずれでもよい。
具体的には、鼻粘膜上皮擦過細胞中のＲＮＡを安定化させ、次いで全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する。得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてTaqManプローブ法を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。
【００１３】
鼻粘膜中のフィラグリン遺伝子の発現量の増加とアレルギー性鼻炎の改善度とは正の相関を有している。例えば、治療前に比べて治療して症状が改善（くしゃみ、鼻みず、鼻づまりの症状スコアの総和が減少）した患者では、フィラグリン遺伝子の発現量は５０倍以上も増加している。また、当初薬剤治療により症状があまり改善しなかった例に対して、薬剤を変更することにより、フィラグリン遺伝子の発現量が症状の軽快に伴って増加したことも認められた。従って、鼻粘膜中のフィラグリン発現量が、初期値（例えば、季節前あるいは治療前）に比べて５０倍以上になったときには、症状は改善していると判定できる。より好ましい発現量の差は６０倍以上である。
【００１４】
鼻粘膜中のフィラグリン遺伝子が５０倍未満の増加の場合には、一時的に症状が改善していても、改善していると判断できない。また、ある治療手段を行ってもフィラグリン遺伝子の発現量が５０倍以上にならない場合には、治療手段を変更する必要がある。また、鼻粘膜中のフィラグリン発現量をモニターすれば、その患者の季節性のアレルギー性鼻炎の病態把握が可能になり、症状発症前に予防手段の早期介入が可能となる。ここでアレルギー性鼻炎治療薬としては、抗ヒスタミン剤などの抗アレルギー剤、鼻噴霧用ステロイド薬等が挙げられる。
【実施例】
【００１５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに制限されない。
【００１６】
実施例
花粉症によりアレルギー性鼻炎を発症している患者５名に対して、抗アレルギー剤による初期治療前後の下鼻甲介粘膜擦過細胞を綿棒で採取し、リアルタイムＰＣＲによりフィラグリン遺伝子発現量を測定した。具体的には、RNAprotect Cell Reagentで安定化させた後Total RNAを抽出し、ReverTra Ace qPCR RT kitでｃDNA逆転写した後、QIAGENのRNeasy Plus micro kitによりそれをテンプレートとして、タックマンプローブ（アプライドバイオシステムズ）を用い、ＡＢＩ７５００（アプライドバイオシステムズ）にてリアルタイムＰＣＲをおこなった。TaqMan gene expression assayで内在性コントロールをＧＡＰＤＨでΔΔＣｔ法を用いて解析した。測定機器は、アプライドバイオシステムズのStep-One Real time PCR systemを使用した。
【００１７】
治療前のフィラグリン発現量を１とし、症状（くしゃみ、鼻みず、鼻づまり）の改善群と症状不変又は悪化群との対比を表１に示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
表１より、鼻粘膜中のフィラグリン発現量の増加とアレルギー性鼻炎の症状改善度（くしゃみ、鼻水、鼻づまりの症状スコアの総和の減少）とは相関性があり、発現量の増加が５０倍以上の場合には症状が改善していることがわかる。