(57)【要約】【課題】消化吸収効率の改善された肝保護剤およびその応用を提供すること。【解決手段】この肝保護剤は、卵殻膜含有微粉末を有し、その卵殻膜含有微粉末は、体積平均粒子径が６μｍ以下の卵殻膜含有微粉末および／または体積最大粒子径が２０μｍ以下の卵殻膜含有微粉末となっている。この値の卵殻膜含有微粉末（サンプルＣ）を含む飼料を与えた場合、試験群ＥＳＭは、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して肝障害群（ＣＣｌ４）は有意に体重低下を起こしたのに対し、卵殻膜摂取群（ＥＳＭ）は対照群と同等の体重を維持した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵殻膜含有微粉末を有し、その卵殻膜含有微粉末の体積平均粒子径が６μｍ以下であることを特徴とする肝保護剤。
【請求項２】
卵殻膜含有微粉末を有し、その卵殻膜含有微粉末の体積最大粒子径が２０μｍ以下であることを特徴とする肝保護剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の肝保護剤において、肝線維化抑制剤でもあることを特徴とする肝保護剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載の肝保護剤において、Ｔｇｆ−β３、Ｐｄｇｆｒα、Ｖｅｄｇｆ、Ｉｇｆｂｐ１、Ｌｔｂｐ１およびＬｔｂｐ４からなる群から選択されるいずれか１以上の遺伝子の発現抑制剤でもあることを特徴とする肝保護剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１に記載の肝保護剤および賦形剤を含有する、肝保護用または／および肝機能改善用の医薬組成物。
【請求項６】
錠剤である、請求項５に記載の肝保護用または／および肝機能改善用の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１に記載の肝保護剤を含有する食品添加物。
【請求項８】
請求項７に記載の食品添加物が添加された食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵殻膜成分、たとえば卵殻膜含有微粉末を含有する肝保護剤およびその応用に関する。ここで「肝保護」には、「肝機能改善」も含むものとし、肝保護と肝機能改善の両者を含む場合と、肝保護のみの場合と、肝機能改善のみの場合の３形態を含むものとする。なお、この明細書では、原則、「肝保護」には「肝機能改善」も含むものとして使用するが、両者を分けて使用する場合もある。
【背景技術】
【０００２】
卵殻膜は、鶏卵などの鳥類の卵の卵殻の内側にある膜で、オポケラチンとオポムシンを主成分とした強靭な繊維性のタンパク質よりなる網目状の構造を有している。これらのタンパク質は、酸、アルカリ、プロテアーゼに対し比較的安定で、水に不溶である。そのため、鶏卵卵殻膜は、食品産業における副産物としてほとんどが利用されずに廃棄されていたが、皮膚の再生を促進する働きや、特に胎児性コラーゲンとも称されるIII型コラーゲンの生成を促進させる作用を有することが知られており、生体に対する有効性が注目されている。
【０００３】
本発明者らは、四塩化炭素誘発性肝障害ラットを用い、卵殻膜成分を長期間にわたって摂取させた場合、四塩化炭素投与により生じた、（１）体重減少、（２）肝臓および腎臓の腫大、（３）上昇したＡＳＴ、ＡＬＴ活性、に対しての改善効果が認められ、同様に血漿中脂質、血漿Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｒａｔｉｏおよび肝臓中脂質のいずれも回復傾向を示したことを報告した（非特許文献１）。また、卵殻膜成分を長期摂取させたラットにおける遺伝子発現パターンの変化を解析した結果、卵殻膜摂取による肝臓への脂質蓄積抑制には、ＳＲＥＢＰ−１ｃ調節シグナルの調節因子であるＳＨＰを介した経路など、複数の経路が関わっている可能性があること、およびこれらのラットでは抗炎症、抗酸化酵素のヘムオキシゲナーゼ−１（Heme Oxygenase-1）、その上流の調節遺伝子ＡＰ−１、ＪＵＮの発現が上昇しており、酸化ストレスから生体を保護する応答が起きていることを明らかにした。
【０００４】
また、最近、末梢血単核球を用いた細胞実験において、卵殻膜粉末の水性抽出物を添加することにより、炎症を引き起こす因子であるＴＮＦ−αが減少したことがBensonらにより報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
このような卵殻膜を用いた従来の実験においては、市販の卵殻膜粉末が使用されていたが、このような市販の粉末は、７０メッシュで９０％以上通過した粒度を有するもの（非特許文献３）のように、粒子の比較的大きいものであった。なお、７０メッシュは、メッシュの規格にもよるが目開きで約２１３μｍ前後に相当する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「日本食品科学工学会  第５８回大会講演集」、５８頁、２Ｄａ１２、２０１１年９月
【非特許文献２】Benson, K.F. et al., J Med Food 2012 April;15(4):360-368
【非特許文献３】キューピー株式会社、ＥＭパウダー３００の製品カタログhttp://www.kewpie.co.jp/finechemical/products/pdf/01d/em300/em300_pamph.pdf#search='ＥＭパウダー３００'
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、このような卵殻膜成分の作用メカニズムや効率的な作用増強方法は十分にわかっていなかった。また、卵殻膜を構成する材料自体は上述したように網目構造の繊維質を主成分として構成され、水等に溶解し難いため、本来的に、人体に消化吸収され難い。このため、更なる消化吸収効率の改善が求められている。
【０００８】
消化吸収効率を改善するためには、たとえば、（１）卵殻膜を酸、アルカリ等により加水分解処理したり、あるいは、（２）卵殻膜を、より細かく粉砕して卵殻膜粒子の単位体積当たりの表面積を大きくしたり、することで、単位時間当たりの卵殻膜の成分を溶解・溶出させる効率を上げる方法なども挙げられる。
【０００９】
しかし、加水分解処理では、化学反応を利用するため、加水分解の過程において卵殻膜中に含まれる各種の有効成分が劣化・変性するというデメリットも生じやすい。この点を考慮すると、卵殻膜を機械的に粉砕する方が有利であると考えられる。そこで、卵殻膜をより細かく粉砕した場合の効果を調査すべく、本発明者らは、７０メッシュで分級処理して得られた卵殻膜と、１５０メッシュで分級処理して得られた卵殻膜とについて比較調査したが、両者の間には卵殻膜の消化吸収効率に関して有意な差異は全く見られなかった。すなわち、卵殻膜の消化吸収効率は、粒径に対して単純に比例して増加しない。このため、従来技術において利用されてきた範囲のレベルで粒径を変化させて卵殻膜を粉砕しても、更なる消化吸収効率の向上は望めない。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、従来よりも更に消化吸収効率が改善された、卵殻膜含有微粉末を有する肝機能改善剤、およびこれを用いた医薬組成物、食品添加物などの応用を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、四塩化炭素誘発性肝障害ラットにおける卵殻膜成分の作用を効率的に発揮させる方法を検討し、さらに、その作用メカニズムを詳細に調べた結果、卵殻膜の成分をある範囲の粒径の微粒子として摂取ないし投与することにより、肝保護作用または／および肝機能改善作用が増強されることを見出し、さらに卵殻膜成分がどのような遺伝子に作用してどのように効果を発揮するかを明らかにし、本発明を完成した。したがって、上記課題は以下の本発明により達成される。すなわち、本発明の肝保護剤は、体積平均粒子径が６μｍ以下である卵殻膜含有微粉末を有することを特徴とする。本発明の肝保護剤の一実施形態は、使用される卵殻膜含有微粉末の体積最大粒子径が２０μｍ以下であることが好ましい。
【００１２】
本発明の肝保護剤の一実施形態は、肝線維化抑制剤である。また、本発明の肝保護剤の一実施形態は、Ｔｇｆ−β３、Ｐｄｇｆｒα、Ｖｅｄｇｆ、Ｉｇｆｂｐ１、Ｌｔｂｐ１およびＬｔｂｐ４からなる群から選択されるいずれか１以上の遺伝子の発現抑制剤である。
【００１３】
本発明の肝保護剤の一実施形態は、経口剤用および食品添加用から選択される少なくともいずれか１つの用途で利用されることが好ましい。
【００１４】
本発明の食品添加物は、本発明の肝保護剤からなる、またはそれを含有することを特徴とする。また、本発明の食品は、この食品添加物が添加されることを特徴とする。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、本発明の肝保護剤とともに賦形剤を含有することが好ましい。その場合、経口用とするのが好ましい。本発明の医薬組成物の一実施形態としては、錠剤が好ましい。
【００１６】
本発明の錠剤の他の実施形態は、卵殻膜成分を１０〜４０質量％の割合で含有することが好ましい。
【００１７】
本発明において使用される卵殻膜含有微粉末の製造方法は、卵殻の内面から剥離して取り出された卵殻膜を少なくとも含む卵殻膜含有原料をガス中で相互に衝突させて微粉砕する微粉砕工程を、少なくとも経て作製されることを特徴とする。
【００１８】
本発明において使用される卵殻膜含有微粉末の製造方法は、卵殻の内面に卵殻膜が付着した状態の卵殻を少なくとも含む卵殻膜含有原料をガス中で相互に衝突させて微粉砕する微粉砕工程を、少なくとも経て作製されることを特徴とする。
【００１９】
本発明において使用される卵殻膜含有微粉末の製造方法の一実施形態は、微粉砕工程を経た後に、目開き２０μｍ以下の篩で分級して粗大粒子を除去する分級工程を実施することが好ましい。
【００２０】
本発明において使用される卵殻膜含有微粉末の製造方法の他の実施形態は、微粉砕工程が、第一の微粉砕処理と、第二の微粉砕処理とを含み、第一の微粉砕処理を終えた後の原料粉末を高圧蒸気で滅菌処理した後、第二の微粉砕処理を行うことが好ましい。
【００２１】
錠剤の剤型の本発明の医薬組成物の製造方法は、卵殻膜含有微粉末を少なくとも含む打錠用原料を用いて、打錠することで裸錠を形成する裸錠形成工程を少なくとも経て錠剤を製造することが好ましい。
【００２２】
錠剤の剤型の本発明の医薬組成物の製造方法の一実施形態は、裸錠に対して保護コーティング処理を行う保護コーティング工程をさらに実施することが好ましい。
【００２３】
錠剤の剤型の本発明の医薬組成物の製造方法の一実施形態においては、打錠用原料が、卵殻膜含有微粉末と、賦形剤とを含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、従来よりも更に消化吸収効率が改善された卵殻膜含有微粉末からなる肝保護剤、およびその応用を提供することができる。本発明の肝保護剤によれば、従来の卵殻膜成分について観察された肝臓に対する作用が増強され、より短期間の投与ないし摂取でより強い作用を得ることができる可能性がある。また、本発明の肝保護剤は、卵殻膜成分の抽出・精製などの煩雑な工程を必要とせずに製造することができるため、製造時に生じる廃棄物およびロスがほとんどなく、高い収率で簡便に製造することができ、経済的および環境保護の観点からも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、肝障害モデルラットの体重に対する卵殻膜含有微粉末の影響を表す図である。左パネルは卵殻膜含有微粉末サンプルＣ（８００メッシュ、２％、７週間）、右パネルは卵殻膜含有微粉末サンプルＡ（７０メッシュ、１％、１３週間）をそれぞれ標準食に添加して摂取させた後の体重を示す。図１および以下の各図において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」＝肝障害誘発なし・標準食のみ、「ＣＣｌ４」＝肝障害誘発・標準食のみ、「ＥＳＭ」＝肝障害誘発・標準食＋卵殻膜微粉末サンプル、をそれぞれ表し、各数値は１群６匹の平均±ＳＤで示され、異なるアルファベット（ａ、ｂ、ｃ）を付したものは有意差（Ｔｕｒｋｙ，  ｐ＜０．０５）があることを表す。
【図２】図２は、肝障害モデルラットの肝臓・腎臓重量に対する卵殻膜含有微粉末の影響を表す図である。縦軸は、体重に対する各臓器の重量（％）である。上段はサンプルＡ、下段はサンプルＣをそれぞれ摂取させたラットの結果であり、各段において左パネルは肝臓、右パネルは腎臓の重量を示す。
【図３】図３は、肝障害モデルラットの血漿の肝機能マーカーに対する卵殻膜含有微粉末の影響を表す図である。上段はサンプルＡ、下段はサンプルＣをそれぞれ摂取させたラットの結果であり、各段において左パネルはアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、右パネルはアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の測定結果を示す。
【図４】図４は、肝障害モデルラットの過酸化脂質（ＴＢＡＲＳ）量に対する卵殻膜含有微粉末の影響を表す図である。上段はサンプルＡ、下段はサンプルＣをそれぞれ摂取させたラットの結果であり、各段において左パネルは血漿、右パネルは肝臓の測定結果を示す。
【図５】図５は、肝障害モデルラットの体重に対する卵殻膜含有微粉末（サンプルＣ）の影響を経時的に表す図である。
【図６】図６〜８は、肝障害モデルラットの遺伝子発現に対する卵殻膜含有微粉末（サンプルＣ）の影響を表す図である。縦軸は、ｍＲＮＡ量（Ｃｏｎｔｒｏｌ群の発現量を１とした相対値）で示す。図６は、以下の各遺伝子についての結果を表す：上段左から「Ｃｏｌ１ａ１」＝Ｉ型コラーゲンα１（Collagen, type I, alpha 1）、「Ｃｏｌ１ａ２」＝Ｉ型コラーゲンα２（Collagen, type I, alpha 2）、「Ｓｐｐ１」＝分泌型リンタンパク質１（Secreted phosphoprotein 1）、下段左から「Ａｓｐｎ」＝アスポリン（Asporin）、「Ｓｐｏｎ１」＝スポンジン１（Spondin 1, extracellularmatrix protein）、「Ｔｉｍｐ１」＝組織メタロプロテアーゼ阻害物質１（TissueInhibitor of Metalloproteinase-1）。
【図７】図７は、以下の各遺伝子についての結果を表す：左から「Ｐｄｇｆｒα」＝血小板由来増殖因子α受容体（platelet-derived growth factor alpha receptor）、「Ｉｇｆｂｐ１」＝インスリン様増殖因子結合タンパク質１（Insulin-like growth factor binding protein 1）、「Ｖｅｇｆ」＝血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）。
【図８】図８は、以下の各遺伝子についての結果を表す：左から「Ｔｇｆ−β３」＝トランスフォーミング成長因子β３（Transforming growth factor β３）、「Ｌｔｂｐ１」＝潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質１（Latent transforming growth factorbeta binding protein 1）、「Ｌｔｂｐ４」＝潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質４（Latent transforming growth factor beta binding protein 4）。
【図９】図９は、タンパク質レベルでＴＧＦ−βの作用を説明する図である。「ＴＧＦ−β」＝トランスフォーミング成長因子β（transforming growth factor β）、「ＬＴＢＰ１」＝潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質１（latent transforming growth factorbeta binding protein 1）「ＬＡＰ」＝潜在性関連のタンパク質（latency associatedprotein）をそれぞれ表す。
【図１０】図１０は、タンパク質レベルでの肝障害、炎症、線維形成の発症メカニズムを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（肝保護剤）
本発明の肝保護剤は、卵殻膜（ＥＳＭ）含有微粉末を有する。本発明において使用される卵殻膜含有微粉末は、体積平均粒子径が６μｍ以下であることを特徴とする。また、本発明において使用される卵殻膜含有微粉末は、体積最大粒子径が２０μｍ以下であることを特徴とする。なお、本願明細書において、卵殻膜含有微粉末の「体積平均粒子径」および「体積最大粒子径」は、レーザー回折式粒度分布測定機（ＬＭＳ−３０、株式会社セイシン企業製）を用いて測定した値を意味する。ここで、「体積平均粒子径」は、粒度分布における小粒径側からの累積値が５０％における粒子径を意味する。また、卵殻膜含有微粉末の粒子径の測定に際しては、卵殻膜含有微粉末を、界面活性剤を用いて水に分散させた測定試料を用いた。
【００２７】
卵殻膜含有微粉末の体積平均粒子径が６μｍ以下、または、体積最大粒子径が２０μｍ以下となるように、卵殻膜含有微粉末の粒度分布を制御することにより、７０メッシュあるいは１５０メッシュで分級処理して得られた従来の卵殻膜粉末（最大粒子径で１００〜２００μｍの卵殻膜粉末）よりも更に消化吸収効率および肝保護・肝機能改善の効率を向上させることができる。
【００２８】
このような効果が得られる理由は定かではないが、本発明者は以下のように推定している。すなわち、最大粒子径で１００〜２００μｍ前後、平均粒子径で数十〜百数十μｍオーダの従来の卵殻膜粉末では、これらの粒径域レベルで最大粒子径あるいは平均粒子径を変化させて、より細かく粉砕しても消化吸収効率および肝保護効率は殆ど改善しない。この理由は、卵殻膜は、繊維状のタンパク質を主成分とした強固な網目状の構造を有しており、これらの粒径域レベルで粉砕された卵殻膜粒子においては、未だに強固な網目構造が維持されているためであると考えられる。すなわち、強固な網目構造が維持されているため、卵殻膜が経口摂取された場合でも胃液や唾液等の各種の消化液によって分解・溶解が促進され難いためであると考えられる。
【００２９】
また、一般的に、粒径が小さくなるほど、粒子の単位体積当たりの表面積はより大きくなる。このため、粒子が消化液に対して可溶性または易溶性の物質のみから構成されるのであれば、粒径が小さくなるに従い消化吸収効率が改善され、その結果、肝保護・肝機能改善の効率が向上するものと期待される。しかし、上述した粒径域においては、粒径が変化しても消化吸収効率は殆ど改善されない。このことからは、卵殻膜が粉砕される過程で生成した破断面・粉砕面などの一部分が消化液に対して溶解し易くなったに過ぎず、強固な網目構造を維持した状態の卵殻膜粒子の本体部は相変わらず消化液に対して不溶状態または難溶状態を維持しているものと推測される。
【００３０】
一方、本発明に使用される卵殻膜含有微粉末では、従来の卵殻膜粉末と比べて、消化吸収の効率、肝保護・肝機能改善の効率がそれぞれ大幅に向上する。このような消化吸収効率および肝保護・肝機能改善の効率の向上は、単純に粒径が小さくなったことに起因するものでは無く、卵殻膜を微粉化する過程において、卵殻膜微粒子全体において、卵殻膜が本来有する繊維状の強固な網目状の構造が破壊され、卵殻膜微粒子全体が消化液に対してより溶解し易くなったためであると推測される。
【００３１】
なお、消化吸収効率および肝保護・肝機能改善の効率をより一層改善する観点からは、卵殻膜含有微粉末の体積平均粒子径が６μｍ以下、かつ、体積最大粒子径が２０μｍ以下であることがより好ましい。なお、効果をそれほど期待せず、ほどほどの効果を望む場合には、卵殻膜含有微粉末の体積最大粒子径が２０μｍを超えるようにしたり、卵殻膜含有微粉末の体積平均粒子径が６μｍを超えるようにしたり、体積最大粒子径が２０μｍを超えかつ体積平均粒子径が６μｍを超えるようにしたりしてもよい。
【００３２】
本実施形態の卵殻膜含有微粉末を含む肝保護剤には、少なくとも、微粉化された卵殻膜成分が含まれるが、この他に、微粉化された卵殻カルシウム成分が含まれていてもよい。この場合、本実施形態の卵殻膜含有微粉末は、卵殻膜成分のみを含む形態（第一形態）、あるいは、卵殻膜成分および卵殻カルシウムのみを含む形態（第二形態）のいずれかであることが特に好ましい。第一形態の卵殻膜含有微粉末を含有する肝保護剤の場合は、純粋に卵殻膜成分のみを含むため、医薬組成物、特に錠剤などの固体剤型の医薬組成物、食品添加物等、各種の用途に幅広く利用することができる。なお、第一形態の卵殻膜含有微粉末および第二形態の卵殻膜含有微粉末のいずれにおいても、製造過程等において混入する不純物成分が含まれることは許容される。また、本実施形態の卵殻膜含有微粉末を含む肝保護剤には、卵殻膜成分と卵殻カルシウム成分の他に、その他の栄養素などが含まれてもよい。
【００３３】
卵殻膜は、卵殻の内側にある膜であり、卵殻膜は、卵殻カルシウムから構成される卵殻から剥離されて取り出される。また、卵殻膜成分を含有する錠剤を製造する場合、錠剤の硬度向上剤として卵殻カルシウムを利用できる。これに加えて、卵殻カルシウムは、人が摂取するカルシウム源としても好適である。これらの点を考慮すると、錠剤等の最終製品が、卵殻膜成分と卵殻カルシウム成分とを同時に含む場合、当該最終製品の製造には、第二形態の卵殻膜含有微粉末を用いることが特に好ましい。この場合、一連の製造過程において、卵殻膜を、卵殻カルシウムから剥離するプロセスを省くことができるため、製造工程の簡略化および低コスト化が図れる。なお、第二形態の卵殻膜含有微粉末を用いる場合、剥離された卵殻膜を用いるようにしてもよい。
【００３４】
本発明に使用される卵殻膜含有微粉末を構成する卵殻膜は、鳥類の卵の卵殻の内側にある膜（外卵殻膜および／または内卵殻膜）であればいずれも使用できる。そのうちでも、特に、鶏卵の卵殻膜が、入手の容易性、コストなどの点から好ましく用いられる。
【００３５】
本発明に使用される卵殻膜含有微粉末を製造する場合、市販の卵殻膜粉末、または、市販の卵殻膜粉末および卵殻カルシウムを利用し、これを、体積平均粒子径が６μｍ以下、および／または、体積最大粒子径が２０μｍ以下まで微粉砕すればよい。あるいは、卵殻に卵殻膜が付着した状態の原料を用いたり、当該原料と卵殻膜粉末とを併用することもできる。なお、市販の卵殻膜粉末としては、たとえば、商品名「ＥＭパウダー３００」（キューピー株式会社製）を利用できる。また、本実施形態の卵殻膜含有微粉末の製造方法の詳細については後述する。
【００３６】
（本発明の肝保護剤に使用される卵殻膜含有微粉末の製造方法）
本発明の肝保護剤の卵殻膜含有微粉末は、少なくとも、卵殻膜含有原料をガス中で相互に衝突させて微粉砕する微粉砕工程を経て、製造することができる。このような微粉砕工程では、ノズルから噴射される高圧の空気あるいは蒸気等のガスを超高速ジェットとして粒子に衝突させ、粒子どうしの衝撃によって数ミクロンのレベルの微粒子にまで粉砕する粉砕装置、いわゆるジェットミルが用いられる。このような粉砕方法は、従来の回転刃などの硬質の破砕部材を原料と衝突させて粉砕する粉砕方法と比べて、粉砕時に、破砕部材と原料との接触・衝突などに起因する摩擦熱が殆ど発生しない。このため、卵殻膜中に含まれるアミノ酸やタンパク質などの、熱により変性・劣化・分解しやすい成分へのダメージが少ない。すなわち、製造過程で、卵殻膜中の有効成分が失われにくくなる。これに加えて、原料を粉砕するために、破砕部材ではなく高圧ガスを使うため、粉砕装置由来の不純物が卵殻膜含有微粉末に混入することも無い。
【００３７】
一方、破砕部材を原料と衝突させて粉砕する粉砕方法では、３０μｍレベルよりも小さく粉砕することは困難である。このような粉砕方法で原料を粉砕した場合の粉砕限界粒径は、たとえば、カッターミルでは５００μｍ前後、解砕機では１５０μｍ前後、アトマイザーでは５０μｍ前後、インペラーミルでは７０μｍ前後、コントラプレックスミル、ボールミルおよびＡＣＭパルペライザーミルでは３０μｍ前後である。このため、仮に、目開き２０μｍ程度の篩を用いて分級処理しても、本実施形態の卵殻膜含有微粉末を殆ど得ることができず、収率も極めて低い。また、上述した粉砕方法では、粉砕時に加熱された粉末が、粉砕後に冷却される段階で、空気中の水分を吸湿しやすくなる。その結果、雑菌・カビが繁殖しやすくなり易いというデメリットもある。
【００３８】
なお、微粉砕工程に用いる卵殻膜含有原料としては、（１）卵殻の内面から剥離して取り出された卵殻膜を少なくとも含む原料（第一形態の卵殻膜含有原料）、および／または、（２）卵殻の内面に卵殻膜が付着した状態の卵殻および卵殻膜を少なくとも含む原料（第二形態の卵殻膜含有原料）のいずれかを用いることができる。ここで、卵殻の内面から剥離して取り出された卵殻膜を少なくとも含む卵殻膜含有原料としては、たとえば、ＥＭパウダー３００（キューピー株式会社製）を用いることができる。また、後述する錠剤の製造等のように、後工程において、卵殻カルシウムと卵殻膜とを同時に使用する場合、生産性の観点から、第二形態の卵殻膜含有原料のうち、剥離されていない卵殻膜を用いる第二形態の卵殻膜含有原料を用いることが好ましい。
【００３９】
微粉砕工程では、ジェットミルにより、卵殻膜含有原料の体積平均粒子径が４０μｍ以下となるまで粉砕することが好ましく、２０μｍ以下となるまで粉砕することがより好ましく、１０μｍ以下となるまで粉砕することがさらに好ましい。また、この場合、体積最大粒子径は２０μｍ以下となるまで粉砕することが好ましい。一方、ジェットミルにより粉砕された卵殻膜含有原料の体積平均粒子径の下限は特に限定されないが、生産性等の実用上の観点からは４μｍ以上が好ましく、５μｍ以上がより好ましい。
【００４０】
ジェットミルにより粉砕された後の卵殻膜含有原料については、体積最大粒子径が２０μｍ以下、および／または、体積平均粒子径が６μｍ以下であれば、これをそのまま本発明の卵殻膜含有微粉末を含む肝保護剤として利用できる。一方、粒度分布において粒径２０μｍを超える粗大粒子を含む場合、微粉砕工程を経た後に、目開き２０μｍ以下の篩で分級して粗大粒子を除去する分級工程をさらに実施してもよい。
【００４１】
また、本発明の肝保護剤の卵殻膜含有微粉末の製造方法では、必要に応じてその他の工程・プロセスを実施してもよい。たとえば、微粉砕工程が、第一の微粉砕処理と、第二の微粉砕処理とを含み、第一の微粉砕処理を終えた後の原料粉末を高圧蒸気で滅菌処理した後、第二の微粉砕処理を行ってもよい。卵殻膜含有原料がジェットミルにより粉砕されて微細化される過程においては、卵殻膜の抗菌性が低下しやすくなるが、上述したように滅菌処理を行うことで本実施形態の卵殻膜含有微粉末にカビや細菌の繁殖を防ぐのが容易となる。
【００４２】
（医薬組成物）
本発明の医薬組成物は、本発明の肝保護剤とともに、少なくとも一種の賦形剤を含有する。本発明の肝保護剤を医薬組成物とする場合、経口摂取される用途、すなわち、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口医薬組成物とすることが好ましい。上記で例示したものを含む種々の剤型の医薬組成物を製造するための各種成分および製造法は、製剤学の分野で公知であり、当業者は必要に応じて適宜選択することができる。卵殻膜を高濃度で均一に含有し、保存時、流通時、服用時などに変形・崩壊が生じず、取扱い性に優れ、かつ、経口で簡単に服用できる観点からは、本発明の医薬組成物は、錠剤として用いられることが特に好ましい。
【００４３】
本発明の肝保護用または／および肝機能改善用の医薬組成物の有効投与量は、治療もしくは予防すべき肝疾患または症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型などによって異なる。本発明の肝保護用または／および肝機能改善用の医薬組成物は、有効性が高いので、一般に、公知の卵殻膜の有効量と比較して有意に少ない用量としたり、同等の用量で用いるのであれば投与回数または投与期間を低減させることが可能である。
【００４４】
なお、ここで「医薬組成物」は、ヒト用に限定されず、ペットや家畜として飼育されている犬や猫などの哺乳動物用の医薬組成物を含む。このような医薬組成物のヒト（体重６０ｋｇの成人）に対する投与量は、卵殻膜成分の量に換算して、好ましくは１日当たり１０ｍｇ〜５０，０００ｍｇである。具体的には、たとえば本発明の医薬組成物の有効投与量は、１日当たり卵殻膜成分を合計で１８ｍｇ〜４８，０００ｍｇとすることができ、さらに好ましい値として、５００ｍｇ〜２５,０００ｍｇとすることができる。
【００４５】
（錠剤）
以下に、本発明の肝保護剤を用いた医薬組成物の例として、錠剤について説明する。本実施形態の錠剤は、上記の卵殻膜含有微粉末と、賦形剤とを含有する。
【００４６】
本実施形態の錠剤に含まれる微粉末状の卵殻膜成分の含有量は特に制限されない。しかし、粒子への造粒および打錠が円滑に行われ、錠剤を経口で摂取（服用）した際の肝障害の予防および／または治療効果がより優れたものになり、生体内で生成した活性酸素の低減または消去能が高くなるなどの観点から、錠剤の全質量に対して、卵殻膜成分を５〜４０質量％の割合で含有することが好ましく１０〜２５質量％の割合で含有することがより好ましい。
【００４７】
卵殻膜成分の含有量を５質量％以上とすることにより、肝保護効果、活性酸素の低減または消去能を得るために、多量の錠剤を摂取する必要がなくなる。一方、錠剤における卵殻膜の含有量が４０質量％以下とすることにより、粒子への造粒および打錠が容易となり、錠剤を製造しやすくなる。
【００４８】
本実施形態の錠剤には、錠剤を形成するために各種の添加剤として、賦形剤に加えて、たとえば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、その他の栄養素等を適宜添加できる。
【００４９】
賦形剤は、有効成分が少ない場合に取扱うのに適当な量となるように添加される添加剤である。賦形剤としては、公知の賦形剤を適宜利用できるが、錠剤用としては、化工澱粉および乳糖の少なくとも１種が用いられることが好ましい。賦形剤の含有量は、賦形性の観点から卵殻膜成分の質量に対して０.５〜３質量倍であることが好ましく、１〜２.５質量倍であることがより好ましい。化工澱粉としては、焙焼デキストリン（白色デキストリン、黄色デキストリンなど）などのデキストリン類、酸化澱粉（次亜塩素酸酸化澱粉など）、低粘性変性澱粉（酸浸漬澱粉、酵素処理澱粉など）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。これらの中でも、化工澱粉としては、デキストリンが好ましく用いられ、具体例としては、日食株式会社製の「ワキシａ」、松谷化学株式会社製の「パインファイバー」などを挙げることができる。化工澱粉として、「ワキシａ」と「パインファイバー」を併用することが、打錠がより円滑に行われる点からより好ましい。「ワキシａ」と「パインファイバー」を併用する場合は、両者を、１：４〜４：１の質量比で用いることが好ましい。
【００５０】
また、賦形剤として、化工澱粉（特に「ワキシａ」および「パインファイバー」）と乳糖を併用する場合は、化工澱粉：乳糖の使用割合（質量比）が、１：５〜５：１であることが好ましく、１：３〜３：１であることがより好ましい。
【００５１】
結合剤は、錠剤原料を構成する粉体同士を結着させる目的で用いられる添加剤である。結合剤としては、公知の結合剤が適宜利用できるが、たとえば、デンプン糊、アラビアゴム糊、ヒドロキシプロピルセルロースなどを挙げることができる。
【００５２】
崩壊剤は、唾液などの水分を吸収することで膨張するなどして錠剤を崩壊させることで、卵殻膜成分等の有効成分の放出を容易にするために添加される添加剤である。崩壊剤としては、公知の崩壊剤が適宜利用できるが、たとえば、セルロース類などを用いることができる。なお、デンプンは崩壊剤としての機能も有する。
【００５３】
滑沢剤は、錠剤原料を構成する粉体の流動性を高めて、打錠時の圧縮成形を容易とする目的で用いられる添加剤である。滑沢剤としては、公知の滑沢剤が適宜利用できるが、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステルなどのワックス類やタルク、ビタミンＣなどを挙げることができる。
【００５４】
さらに、本実施形態の錠剤は、錠剤の硬度を高くし、錠剤の変形や傷つきを防止して、包装時、保存時、流通時などにおける錠剤の取り扱い性を向上し、摂取性を良好なものにするために、硬度向上剤として卵殻カルシウムを含有することが特に好ましい。錠剤が卵殻カルシウムを含む場合、錠剤の製造に用いる原料としては、第一形態の卵殻膜含有微粉末および卵殻カルシウムを少なくとも用いるか、あるいは、第二形態の卵殻膜含有微粉末を少なくとも用いることができる。
【００５５】
卵殻カルシウムは、鶏卵などの鳥類の卵の殻を粉砕・乾燥してなる微粉末であり、本実施形態の錠剤においては、人が摂取可能な卵殻カルシウムであればいずれも使用できる。卵殻カルシウムとしては、例えば、従来から市販されているキューピー株式会社製の商品名「カルホープ」、太陽化学株式会社製の卵殻カルシウムなどをそのまま用いることができる。なお、第二態様の卵殻膜含有微粉末を用いて錠剤を製造する場合、これらの卵殻カルシウムの使用を省略してもよい。錠剤中に含まれる卵殻カルシウムの含有量は、錠剤の全質量に対して、５〜２０質量％であることが好ましく、８〜１５質量％であることがより好ましい。
【００５６】
本実施形態の錠剤は、卵殻膜の体内での吸収を速め、肝臓疾患の予防および／または治癒効果をより高めるために、また生体内に生成した活性酸素の低減または消去能をより高くするために、卵殻膜成分と共に、以下のものを含有させることが好ましい。すなわち、本実施形態の錠剤は、（１）公知の肝保護作用または／および肝機能改善作用を有する物質、（２）健康増進剤（たとえばビタミン類、β-カロチン、ローヤルゼリーなど）、（３）併用することのできる各種の医療用成分（たとえば抗炎症剤など）、のうちの少なくも１種を含有することが好ましい。
【００５７】
本実施形態の錠剤中に含有させるビタミンの種類は特に制限されず、ヒトまたは哺乳動物が摂取可能なビタミンであればいずれでもよい。たとえば、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫなどの脂溶性ビタミン類、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＨ、ビタミンＬなどの水溶性ビタミン類などを挙げることができ、本実施形態の錠剤は、これらのビタミン類の１種または２種以上を含有することができる。β−カロチンおよびビタミン類の含有量は、ヒトなどの対象が摂取するのに適するそれぞれのビタミンの量に応じて適宜決めることができる。
【００５８】
また、ローヤルゼリーの含有量は、本実施形態の錠剤の上記した作用効果を十分に発揮させ得る点、コストなどの点から、卵殻膜成分の全質量に対して０．１〜１．５質量倍であることが好ましく、０．２〜１質量倍であることがより好ましく、０．５〜０．８質量倍であることが更に好ましい。
【００５９】
本実施形態の錠剤は、錠剤中に含まれる成分の変質や分解を防止し、また錠剤表面の耐傷つき性の向上などの目的で、コーティング皮膜で覆われていることが好ましい。コーティング皮膜は、錠剤のコーティング皮膜として従来から用いられているのと同様の皮膜形成材料から形成することができる。皮膜形成材料としては、特に限定されるものではないが、例えば、岐阜セラック株式会社製の商品名「セラック」（トラック３０）などが利用できる。
【００６０】
また、本実施形態の錠剤は、経口での摂取をし易くするために、糖衣で覆われていることが好ましい。その際の糖衣としては、錠剤に従来から用いられている糖衣であればいずれでもよい。本実施形態の錠剤は、商品価値を高めるために、必要に応じて、適当な色に着色してあってもよい。また、着色後に、艶だし処理を行ってもよい。
【００６１】
本実施形態の錠剤の大きさは特に制限されず、適宜決めることができるが、一般には、直径が約７〜１０ｍｍ程度の円形や楕円形の錠剤とするのが、取り扱い性、服用のし易さなどの点から好ましい。
【００６２】
さらに、本実施形態の錠剤は、例えば、錠剤１個の重さが約３５０〜６００ｍｇ程度であることが好ましく、このような錠剤１個中に卵殻膜成分が約１８〜２４０ｍｇの量で含まれることが好ましく、３５〜１５０ｍｇがより好ましい。
【００６３】
たとえば、本実施形態の錠剤１個当たり、卵殻膜成分が約１８〜２４０ｍｇの割合で含有されると仮定する。この場合、成人では、当該錠剤を１日当たり１〜２００個（１日当たり卵殻膜成分を合計で１８〜４８，０００ｍｇ）摂取または投与すると、生体内に生成した活性酸素が消去または低減されて種々の肝疾患の予防や回復を促進することができる。
【００６４】
（錠剤の製造方法）
本実施形態の錠剤は、本実施形態の卵殻膜含有微粉末を少なくとも含む打錠用原料を用いて、公知の錠剤製造方法を適宜利用して製造することができる。具体的には、打錠用原料を用いて、打錠することで裸錠を形成する裸錠形成工程（打錠工程）を少なくとも経て本実施形態の錠剤を製造することができる。
【００６５】
なお、打錠用原料には、本実施形態の卵殻膜含有微粉末の他に、上記のような卵殻膜成分以外の有効成分が含まれていてもよい。これに加えて、通常、賦形剤、結合剤、崩壊剤等から選択される少なくとも１種の添加剤が含まれるが、賦形剤が少なくとも含まれることが好ましい。また、硬度向上剤として、卵殻カルシウムがさらに含まれていてもよい。
【００６６】
裸錠形成工程では、公知の打錠法が利用でき、たとえば、所定の原料を秤量・混合して得られた打錠用原料をそのまま打錠する直接打錠法で実施してもよく、打錠用原料を顆粒に造粒する造粒工程を経てから打錠する顆粒打錠法で実施してもよい。
【００６７】
造粒工程では、たとえば、以下の手順で、打錠用原料を顆粒化することができる。まず、打錠用原料１００質量部に対してアルコール（エタノール）を約１０質量部〜２０質量部の割合で添加してアルコール含有混合物を作製する。次に、このアルコール含有混合物を用いて従来既知の造粒法、例えば、撹拌造粒法、転動造粒法、噴霧造粒法などの造粒方法を採用して造粒を行う。そして、得られた粒子を、たとえば、４０℃〜７０℃程度の温度で加熱する乾燥工程を行うことで打錠用の顆粒を得ることができる。なお、得られた打錠用の顆粒は、篩を用いて分級して粒度を揃えてから打錠することが好ましい。
【００６８】
裸錠形成工程で用いる打錠装置は、医薬などの分野で錠剤を製造するのに従来から用いられているのと同様の打錠装置を採用して行うことができる。なお、打錠に際して造粒工程および乾燥工程を経て得られた打錠用の顆粒にビタミンＣおよびショ糖脂肪酸エステルなどの滑沢剤を添加して打錠を行うことが好ましい。この場合、粒子の流動性および滑艶性が高まり、打錠をより円滑に行うことができる。ここで、滑沢剤としてビタミンＣおよびショ糖脂肪酸エステルを用いる場合、その添加量は以下の通りとすることが好ましい。すなわち、打錠時におけるビタミンＣの添加量は、乾燥状態の打錠用の顆粒１００質量部に対して８〜１０質量部であることが好ましい。また、ショ糖脂肪酸エステルの添加量は、乾燥状態の打錠用の顆粒１００質量部に対して０．１〜３．０質量部であることが好ましい。
【００６９】
裸錠形成工程を経て得られた裸錠は、これをそのまま本実施形態の錠剤としてもよいが、裸錠に対して保護コーティング処理を行う保護コーティング工程をさらに実施してもよい。保護コーティング工程に用いるコーティング剤の種類は、上記したように特に制限されず、例えば岐阜セラック株式会社製の「セラック」などが用いられる。保護コーティング層のコーティング量は特に制限されないが、一般に、錠剤１個に対し、１〜５ｍｇ程度であることが好ましい。
【００７０】
なお、保護コーティングされた錠剤は、そのままで製品として流通、販売してもよいが、錠剤を服用し易くするために糖衣を施すことが好ましい。糖衣を施す糖衣コーティング工程は、１段で行ってもよいが、表面の仕上がりを綺麗にするためには、錠剤を粘度の高い糖分含有ペースト状物で被覆した後、乾燥し、さらに粘度の低い糖分含有ペースト状物や糖分含有液で再度被覆する多段による方法が好ましく採用される。
【００７１】
糖衣材料の種類は特に制限されず、錠剤への糖衣処理に従来から用いられている糖衣材料などのいずれもが使用でき、例えば、グラニュー糖、アラビアガムやゼラチンなどの増粘剤、卵殻カルシウム、焼成牛骨粉などを含有する糖衣材料を用いることができる。
【００７２】
糖衣を施した錠剤は、そのまま流通、販売してもよいが、さらに着色を施すことにより、より綺麗で商品価値の高いものとすることができる。その際の着色方法は特に制限されず、錠剤の表面に着色を施す従来既知の方法と同様にして行うことができる。また、着色後に艶だし処理を行うことによって、錠剤の外観を一層良好なものにすることができる。艶だしは、例えばカルナウバロウなどのような艶だし剤を用いて行うことができる。これにより得られる本実施形態の錠剤は、選別、計量、包装などを行うことによって出荷される。
【００７３】
（食品添加物）
本発明の肝保護剤を、単独で、または他の食品添加物などの生理的に許容される各種成分と組み合わせて、菓子類、健康食品、保存食品、加工食品などの食品に添加するための食品添加物とすることができる。本発明の食品添加物は、肝保護ないし肝機能改善を目的として、当該技術分野で公知の方法により各種食品に添加して使用することができる。たとえば、卵殻膜の食品への適用については、粉末状に粉砕した卵殻膜を含む錠剤や菓子類などが提案されている（特許第３８６２６００号、特開２００９−１６５４２１号公報）。これらに記載された錠剤や菓子類において使用されている卵殻膜粉末として、本発明の肝保護剤を含有する食品添加物を使用することができる。
【００７４】
なお、ここで、「食品」は、ヒト用に限定されず、ペットや家畜として飼育されている犬や猫などの哺乳動物用の餌料を含む。また、「食品」の概念には、通常の食品の他、飲料やいわゆるサプリメントや健康食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、特定保健用食品などが包含される。
【実施例】
【００７５】
以下に、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。
【００７６】
１．  卵殻膜含有粉末の製造
（１）卵殻膜含有粉末サンプルＡの準備
卵殻膜含有粉末サンプルＡ（以下「サンプルＡ」）として、キューピー株式会社の商品名「ＥＭパウダー３００」を用いた。このサンプルは、７０メッシュ（目開きで約２１３μｍ前後）で９０％以上通過した粒度を有するものである。レーザー回折式粒度分布測定機（株式会社セイシン企業製、ＬＭＳ−３０）を用いて粒径を測定したところ、体積最大粒子径は２１３μｍ、体積平均粒子径は３５μｍであった。
【００７７】
（２）卵殻膜含有粉末サンプルＢの準備
卵殻膜含有粉末サンプルＢ（以下「サンプルＢ」）として、ＥＭパウダー３００をジェットミルで粉砕したものを用いた。ジェットミルとしてはシングルトラックジェットミル（株式会社セイシン企業製、ＦＳ−４）を用いて、風量：１．２ｍ３／ｍｉｎ、動力：１１ｋｗにて、体積最大粒子径が３２５メッシュ（目開きで約４５μｍ）程度となるまで粉砕を実施した。
【００７８】
（３）卵殻膜含有粉末サンプルＣの準備
卵殻膜含有粉末サンプルＣ（以下「サンプルＣ」）として、ＥＭパウダー３００をジェットミルで粉砕したものを用いた。ジェットミルとしてはシングルトラックジェットミル（株式会社セイシン企業製、ＦＳ−４）を用いて、風量：１．２ｍ３／ｍｉｎ、動力：１１ｋｗにて、体積最大粒子径が８００メッシュ（目開きで約２０μｍ）程度となるまで粉砕を実施した。レーザー回折式粒度分布測定機（株式会社セイシン企業製、ＬＭＳ−３０）を用いて粉砕後の粒径を測定したところ、体積最大粒子径は１９．６μｍ、体積平均粒子径は５．８μｍであった。
【００７９】
２．  消化テスト
上記のとおり製造した卵殻膜含有粉末サンプルを用いて、消化効率を試験した。２００倍に希釈したサンプルＡの懸濁液０．８ｍｌを入れた試験管４本を準備した。次に、各々の試験管に消化酵素（豚膵臓由来のパクレアチン）を加えて３７℃でそれぞれ０分、３０分、６０分および１８０分加温した。その後、１００℃で５分間加熱し、反応停止後、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理を行った後、上清の可溶性タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。測定結果は、牛血清アルブミンを標準にして換算した。なお、ブランクとして、懸濁液の代わりに０．１Ｍのリン酸緩衝液を用いた。また、同様のテストを、サンプルＢ、Ｃについても実施した。
【００８０】
検出された可溶性タンパク質を加温時間に対して整理した結果を、表１に示す。表１から明らかなように、サンプルＣを分散させた懸濁液に消化酵素を加えた場合、サンプルＡ，Ｂを分散させた懸濁液に消化酵素を加えた場合と比べて、約２０％前後も可溶性タンパク質の検出量が大きいことが分かった。これに対して、サンプルＡを分散させた懸濁液に消化酵素を加えた場合と、サンプルＢを分散させた懸濁液に消化酵素を加えた場合とでは、可溶性タンパク質の検出量に差異は見られなかった。
【００８１】
【表１】
2014189521.tif 000003
【００８２】
３．  肝障害モデルラットにおける異なる粒径の卵殻膜含有粉末の効果
（１）肝障害モデルラットの作製
３週齢のラットを、１週間予備飼育後、無作為に１群を６匹として、対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）および肝障害群（「ＣＣｌ４」）には標準食（ＡＩＮ９３Ｇ）の餌を、卵殻膜摂取群（「ＥＳＭ」）には標準食に卵殻膜微粉末として上記で製造したサンプルＣ（８００メッシュ卵殻膜微粉末）２％（W/W）を添加した餌を、それぞれ給餌し、７週間飼育した。
【００８３】
飼育期間中、対照群以外のラットには、５０％（V/V）四塩化炭素／５０％（V/V）オリーブ油（１ｍｌ／ｋｇ）を週２回連続皮下投与し、肝障害を誘導した。一方、対照群にはオリーブ油（１ｍｌ／ｋｇ）を同様に皮下投与した。
期間中、週２回、体重および摂食量を測定した。実験終了時に、予め１２時間絶食後、ペントバルビタールで深麻酔し、頸動脈放血により採血し、肝臓および腎臓を摘出して重量を測定した。４℃で遠心分離（８００ｇ、１５分）して得られた血漿を生化学検査に供した。
【００８４】
比較のため、上記で製造したサンプルＡ（７０メッシュ卵殻膜微粉末）１％（W/W）を用い、試験期間を１３週間（長期摂取）としたこと以外は上記と同様の実験を行った。試験群の構成と、与えた飼料と、皮下投与の内容を一覧表にしたものを表２として示す。
【００８５】
【表２】
2014189521.tif 000004
【００８６】
（２）生化学検査
生化学検査において、血漿肝機能指標として、アラニントランスアミナーゼ（alanine
transaminase；ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate
transaminase；ＡＳＴ）を、商品名「トランスアミナーゼＣＩＩ−テスト」（和光純薬）を用いて測定した。また、酸化ストレスの指標として、過酸化脂質（thiobarbituric acid reactive substance；ＴＢＡＲＳ）を、「ＮＷＬＳＳＴＭ  Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ  Ａｓｓａｙ」（Northwest Life Science Specialties, LLC.）を用いて測定した。
【００８７】
（３）統計処理
統計処理は、以下のように行った。実験結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）で示した。群間有意差検定は、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分散分析をした後に、Ｔｕｋｅｙの多重比較を用いて行った。基本的に危険率５％以下（ｐ＜０．０５）をもって有意とした。
【００８８】
（４）結果
（体重変化）
試験期間終了時の各群のラットの体重（平均値±ＳＤ）を図１に示す。サンプルＣ摂取の場合は、対照群と比較して肝障害群は有意に体重低下を起こしたのに対し、卵殻膜摂取群は対照群と同等の体重を維持した。一方、サンプルＡ摂取の場合は、卵殻膜摂取群は、肝障害群よりは有意に体重低下が少なかったものの、対照群と比較して有意な体重低下を示した。なお、摂食量については、各群間で有意差はなかった（対照群、肝障害群、卵殻膜摂取群で、それぞれ１０００．２±４３．５ｇ、８９４．２±３３．４ｇ、９１１．６±１２０．０ｇ）。
【００８９】
（肝臓および腎臓の相対重量変化）
試験期間終了時の各群のラットの肝臓および腎臓の重量（平均値±ＳＤ）を図２に示す。縦軸は、体重を１００（％）とした場合の各臓器の相対重量を表す。サンプルＣ摂取およびサンプルＡ摂取のいずれの場合も、肝障害群は肝臓の相対重量が上昇したのに対し、卵殻膜摂取群は対照群と比較して肝臓重量については有意差が見られなかった。腎臓については、サンプルＡ摂取の場合に対照群と比較して肝障害群および卵殻膜摂取群では相対重量が有意に上昇したが、サンプルＣ摂取の場合には各群間で有意差は見られなかった。
【００９０】
（肝機能マーカーの変化）
肝機能マーカー（ＡＳＴ，ＡＬＴ）についての測定結果を図３に示す。
数値は平均値±ＳＤであり、同じ文字をつけていないグラフ同士は有意差を有する（Ｔｕｒｋｅｙ，ｐ＜０．０５）。
【００９１】
（過酸化脂質（ＴＢＡＲＳ）の生成量の変化）
過酸化脂質（ＴＢＡＲＳ）の生成量についての結果を図４に示す。
数値は平均値±ＳＤであり、同じ文字をつけていないグラフ同士は有意差を有する（Ｔｕｒｋｅｙ，ｐ＜０．０５）。
【００９２】
以上の結果から、卵殻膜粉末は、酸化ストレス抑制作用を通じて肝臓の炎症、障害を抑制することにより肝保護作用または／および肝機能改善作用を示すことが示唆された。また、粒径をサンプルＣのレベルまで小さくすることにより、より短期間で強い肝保護ないし肝機能改善作用が得られることがわかった。
【００９３】
４．  肝障害モデルラットにおけるサンプルＣの効果
サンプルＣを用いて、各群における血漿生化学検査、線維化指標、肝臓の脂質を比較検討し、さらに、ＤＮＡマイクロアレイを用い、炎症・線維化・酸化ストレス、脂質代謝関連遺伝子の発現を網羅的に検索した。
【００９４】
（１）肝障害モデルラットの作製
前記３．（１）と同様にして肝障害モデルラットを作製した（表２参照）。
【００９５】
飼育期間中、週２回体重および摂食量を測定した。実験終了時に、予め１２時間絶食後、ペントバルビタールで深麻酔し、頸動脈放血により採血し、肝臓、腎臓、および腸間膜脂肪、精巣周囲脂肪、後腹膜脂肪を摘出して重量を測定した。なお、３種類の脂肪の合計値を腹部脂肪として計算した。４℃で遠心分離（８００ｇ、１５分）して得られた血漿を生化学検査に供した。
【００９６】
（２）生化学検査
血漿生化学検査では、ＡＳＴおよびＡＬＴを、前記３．（２）と同様に測定した。血漿中トリグリセリド（ＴＧ）および肝臓ＴＧは、商品名「トリグリセライドＥ‐テスト」（和光純薬）を用いて測定した。線維化指標として、肝臓コラーゲン含量を、Ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ／Ｆａｓｔ  ｇｒｅｅｎ染色法で測定した。
【００９７】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ解析
以下のようにして常法によりＲＮＡを抽出した。肝臓組織約０．０５ｇを商品名「ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ」（Invitrogen）１．０ｍｌで速やかにホモジナイズした。室温で５分放置した後、クロロホルムを２００μｌ加えて激しく振とうし、室温で１０分放置後、遠心分離（１０，０００ｇ、１５  ｍｉｎ、４℃）した。上清に５００μｌのイソプロパノールを加えて混合し、１０分間室温で放置後、再度遠心分離（１０，０００ｇ、１０  ｍｉｎ、４℃）した。沈殿として得られた総ＲＮＡ（Total RNA）を７５％エタノールで洗い、乾燥した後、ＲＮアーゼ無含有水（RNase-free water）に溶かした。総ＲＮＡの濃度を、商品名「ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮＤ−１５０）」を用いて測定した後、２μｌの総ＲＮＡを用いて変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、２８Ｓと１８Ｓのバンドを確認することにより、ＲＮＡの品質の検証をした。総ＲＮＡは分析に供するまで−８０℃で保存した。
【００９８】
上記で調製した総ＲＮＡを用いて、ＤＮＡマイクロアレイ解析を常法により行った。肝臓から抽出した総ＲＮＡを各群の４個体から２μｇずつ混合し、プールした。総ＲＮＡから「ＴＲＩｚｏｌ」（登録商標）法によりｍＲＮＡに精製した後、Affymetrix社の商品名「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ」に従い、各群１５μｇの断片化したｃＲＮＡを含むハイブリダイゼーションカクテル（Hybridization Cocktail）を調製した。さらに、ハイブリダイゼーションカクテルを、商品名「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｒａｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  ２３０  ２．０  Ａｒｒａｙ」（Affymetrix）に添加して４５℃で１６時間ハイブリダイズさせた後、商品名「ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００」（Affymetrix）を用い、アレイの洗浄と染色を行った。染色したアレイについて、商品名「ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ」（Affymetrix）を用いてプローブアレイの蛍光強度を検出した。商品名「Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ＧＣＯＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０）」のＭＡＳ５（Microarray Suite version 5）を用いてシグナルの強度を解析し、比較分析を行った。さらに、抽出した遺伝子の発現量は逆転写（Reverse Transcription）ＰＣＲ法で確認した。
【００９９】
（４）統計処理
統計処理は、前記３．（３）と同様に行った。
【０１００】
（５）結果
実験期間中の体重推移を図５に、肝臓重量、腹部脂肪および生化学検査の結果を表３に示す。体重および肝重量の結果では、対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）に比べ、肝障害群（「ＣＣｌ４」）では第２８日以降体重が有意に減少し、肝臓重量が有意に増加したのに対し、卵殻膜摂取群（「ＥＳＭ」）では体重減少および肝臓腫大の改善傾向がみられた。腹部脂肪には有意差がみられなかったものの、肝障害群が減少傾向にあったのに対し、卵殻膜摂取群では対象群と同等であった。
【０１０１】
【表３】
2014189521.tif 000005
【０１０２】
四塩化炭素により肝障害を誘発させると、肝毒性および肝線維化マーカーであるＡＳＴ、ＡＬＴおよびコラーゲンの含量はともに著しく上昇した。これに対し、卵殻膜微粉末摂取群（「ＥＳＭ」）においては、各値の上昇が抑えられた。一方、血中および肝臓中の脂質（ＴＧ）の測定結果では、四塩化炭素の投与により減少した血漿中脂質および増加した肝組織脂質について、有意差はなかったものの、卵殻膜を摂取することによりいずれも改善傾向がみられた。
【０１０３】
これらの卵殻膜微粉末による影響のメカニズムを解明するため、ＤＮＡマイクロアレイを用い、遺伝子発現レベルを比較検討した。各群間の比較で発現が１．５倍以上増大または低減した遺伝子数を表４に示す。
【０１０４】
【表４】
2014189521.tif 000006
【０１０５】
肝障害群（「ＣＣｌ４」）と比べ、卵殻膜摂取群（「ＥＳＭ」）で１．５倍以上発現増加した２２個の遺伝子および発現減少した９３個の遺伝子を抽出し、解析ツールである商品名「Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」（Ingenuity）を用い、脂質代謝、炎症、アポトーシス、酸化ストレスに関するネットワーク解析を行った。
【０１０６】
図９に説明するように、ＴＧＦ−βは、通常ＬＡＰ（latency associated protein；「ＬＡＰ」）、ＬＴＢＰ（latent TGF-β-binding protein）と結合して複合体として存在するが、肝障害やプロテアーゼなどにより複合体から解離することにより活性化され、放出されたＬＴＢＰの活性などを調節する。
【０１０７】
図１０に説明するように、肝臓内の組織傷害に対する創傷治癒機転の結果、Ｉ型コラーゲンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が過剰に蓄積し、肝細胞を線維化させる。肝臓における主要なＥＣＭ産生細胞である肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝障害においてクッパー細胞や炎症性細胞からのサイトカインや増殖因子の作用で活性化する。活性化ＨＳＣがさらにコラーゲンなどＥＣＭの遺伝子発現を亢進させる。
【０１０８】
解析の結果を図６〜８に示す。ＥＳＭ群では、肝線維化に関わる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分であるＩ型コラーゲン（Collagen, type I, alpha 1；「Ｃｏｌ１ａ１」、Collagen,
type I, alpha 2；「Ｃｏｌ１ａ２」）やアスポリン（Asporin；「Ａｓｐｎ」）などの発現が有意に減少したことから、卵殻膜微粉末摂取が線維化形成を媒介するＥＣＭの増加を抑制することが示唆された。さらに、肝星細胞活性化及び肝線維化に関連するサイトカインであるＰｄｇｆｒα（platelet-derived growth factor alpha receptor；「Ｐｄｇｆｒα」）、Ｔｇｆ−β３（Transforming growth factor β；「Ｔｇｆ−β３」）、Ｖｅｄｇｆ（vascular endothelial growth factor；「血管内皮成長因子」）、および関連因子のＩｇｆｂｐ１（インシュリン様成長因子結合タンパク質１（Insulin-like growth factor binding protein 1）；「Ｉｇｆｂｐ１」）、Ｌｔｂｐ１（（Latent transforming growth factor beta binding protein 1）；「Ｌｔｂｐ１」）、Ｌｔｂｐ４（Latent transforming growth factor beta binding protein 4；「Ｌｔｂｐ４」）の発現が減少したことから、卵殻膜微粉末はこれらの発現を抑えることにより肝線維化を抑制したと考えられる（図１０）。これらの因子の変化が、卵殻膜微粉末摂取における肝機能保護作用の主機構である可能性が示された。  以上の結果から、微粉末形態の卵殻膜成分は、線維化形成を抑えることで、結果的に肝臓の炎症拡大、さらに進行する肝障害を抑制していると考えられる。なお、サンプルＡについて同様のＤＮＡマイクロアレイ解析を行った場合は、卵殻膜成分の作用を裏付ける顕著な変動がみられなかった。
【０１０９】
以上の結果から、微粉末形態の卵殻膜成分は、線維化形成を抑えることで、結果的に肝臓の炎症拡大、さらに進行する肝障害を抑制していると考えられる。
【０１１０】
５．  医薬組成物（錠剤）の製造
（１）打錠用の顆粒の製造
卵殻膜含有粉末サンプルＣ：２０．０ 質量部、日食株式会社製「ワキシａ 」：１０．０質量部、松谷化学株式会社製「パインファイバー」：２０．０質量部、乳糖（メグレ社製）：２５．９質量部、卵殻カルシウム（キューピー株式会社製「カルホープ」）：１０質量部、β−カロチン：５．０質量部、ビタミンＢ：２０．０５質量部、ビタミンＥ：０．０５質量部およびナイアシン：２．０質量部を、Ｖ型混合機を用いて混合することにより、原料混合物を調製した。次いで、この原料混合物９３．０質量部に対して、エチルアルコール１５質量部を混合し、これにより得られた混合物を、湿式造粒装置を用いて造粒し、次いで温度５０℃ で約１６時間乾燥して、打錠用の顆粒を製造した。
【０１１１】
（２）打錠
次に、打錠用の顆粒１００質量部に対して、ビタミンＣを９質量部およびショ糖脂肪酸エステルを１質量部の割合で混合し、それにより得られた混合物を、打錠装置を使用して、１粒が２００ｍｇの裸錠を製造した。
【０１１２】
（３）保護コーティング
次に、裸錠の表面に、コーティング装置を使用して、岐阜セラック株式会社製「セラック」の水溶液を塗布し、温度４０℃ で２時間乾燥して、保護コーティングされた錠剤（保護コーティング錠）を得た。
【０１１３】
（４）糖衣被覆
十分に乾燥させた保護コーティング錠の表面に、糖衣被覆装置を使用して、糖衣用ペーストＡ（グラニュー糖７０質量部、アラビアガム３質量部、ゼラチン４質量部、卵殻カルシウム３質量部および水６５質量部を混合したペースト）を被覆した後、温度約４０℃で約４ 時間乾燥した。その後、糖衣用ペーストＡに水を加えて希釈した糖衣用ペーストＢを調製した。さらに、糖衣用ペーストＡでコーティング処理および乾燥処理された錠剤の表面に、糖衣被覆装置を使用して、糖衣用ペーストＢを、被覆した後、温度約４０℃で約４ 時間乾燥した。これにより糖衣用ペーストでコーティングされた錠剤（糖衣コーティング錠）を得た。
【０１１４】
（５）色付け
糖衣コーティング錠の表面に、三栄源社製「ＳＲレッドＫ３」を含む着色液を塗布した後、４０〜５０℃で４時間乾燥して、赤色に着色した錠剤（着色錠）を製造した。
【０１１５】
（６）艶だし
着色錠の表面に、カルナウバロウを用いて、艶だしを行った。これにより得られた錠剤１個の質量は４００ｍｇであり、錠剤１個当たり卵殻膜成分を約４０ｍｇの割合で含有していた。
【０１１６】
（７）選別−計量−包装
艶出し処理を行った錠剤を選別して不良品を除き、製品検査後に計量し、乾燥剤を同封した二重袋で包装した。なお、錠剤は、十分な硬度および形状保持性を有しており、選別、検査、包装時に変形したり、崩壊したりすることがなく、取り扱い性に優れていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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