(57)【要約】【課題】吸着性表面を有する微粒子、このような微粒子の作製方法およびその使用を提供すること。【解決手段】この微粒子は、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物など）を含み、そしてカチオン性、アニオン性または非イオン性の界面活性剤を用いて形成される。この微粒子の表面は、生物学的に活性な高分子（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチド、抗原およびアジュバント）を効率的に吸着する。代謝可能な油および乳化剤を有する油滴エマルジョンの組成物もまた提供される。免疫刺激量の抗原性物質および免疫刺激量のアジュバント組成物を有する免疫原性組成物もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、薬学的組成物に関する。特に、本発明は、吸着表面を有する微粒子、そのような微粒子を調製するための方法、および例えば、ワクチンとしてのその使用に関する。さらに、本発明は、油滴エマルジョンを含むアジュバント組成物、および例えばワクチンとしてのその使用に関する。さらに、本発明は、生分解性微粒子および／またはミクロエマルジョンを含む組成物に関し、ここで、生物学的に活性な薬剤（例えば、治療的ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗原およびアジュバント）がそれに吸着される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
粒子化されたキャリアは、治療化合物の徐放性の非経口的送達を達成するために用いられている。そのようなキャリアは、長時間にわたり送達系において活性薬剤を維持するように設計される。粒子化されたキャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のもの、ならびにポリ（ラクチド）由来の微粒子（例えば、ポリ（ラクチド）（米国特許第３，７７３，９１９号を参照のこと）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、（ＰＬＧとして知られる（例えば、米国特許第４，７６７，６２８号を参照のこと））およびポリエチレングリコール（ＰＥＧとして知られる（例えば、米国特許第５，６４８，０９５号を参照のこと））が挙げられる。ポリメチルメタクリレートポリマーは、非分解性であるが、ＰＬＧ粒子は、乳酸およびグリコール酸にたいするエステル結合の、ランダムな比酵素的加水分解により分解性であり、これらは、正常な代謝経路に沿って分泌される。
【０００３】
例えば、米国特許第５，６４８，０９５号は、経鼻、経口、肺および経口送達のための薬物送達系としてのカプセル化された医薬を有するミクロスフェアの使用を記載する。種々のポリペプチド増殖因子を含む徐放処方物もまた、記載されている。例えば、国際特許番号ＷＯ９４／１２１５８号、米国特許第５，１３４，１２２号および国際特許番号ＷＯ９６／３７２１６号を参照のこと。
【０００４】
Ｆａｔｔａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：１３７−１４３（１９９８）は、吸着されたオリゴヌクレオチドを有するポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）から調製されたナノ粒子を記載する。
【０００５】
粒子状キャリア（例えば、微粒子）もまた、適切な免疫応答を惹起する試みにおいて、吸着または捕捉された抗原とともに使用されている。そのようなキャリアは、その免疫系に対して選択された抗原の複数のコピーを提示し、そして局所のリンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。その粒子は、マクロファージによって貪食され得、そしてサイトカイン放出を通じて抗原提示を促進し得る。例えば、共有に係る同時係属中の出願第０９／０１５，６５２号（１９９８年１月２９日出願）は、細胞媒介性免疫学的応答を刺激するための抗原吸着および抗原カプセル化された微粒子の使用、ならびにその微粒子を作製する方法を記載する。
【０００６】
共有に係る仮特許出願第６０／０３６，３１６号においては例えば、微粒子を形成する方法が記載されており、これは、ポリマーを有機溶媒と合わせる工程、次いでエマルジョン安定剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を添加する工程、次いでその有機溶媒をエバポレートする工程、それにより、微粒子を形成する工程を包含する。この微粒子の表面は、ポリマーおよび安定剤を包含する。次いで、高分子（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチドおよび抗原）を、その表面上に吸着させ得る。
【０００７】
抗原吸着されたＰＬＧ微粒子は、他のより毒性の系よりも顕著な利点を提供する。他方、その微粒子表面に対する生物学的に活性な薬剤の吸着は、問題であり得る。例えば、しばしば、荷電されまたは嵩高い生物学的に活性な薬剤（例えば、ポリヌクレオチド、大きなポリペプチドなど）をその微粒子表面に吸着することは、困難または不可能である。従って、そのような薬剤についての柔軟な送達系について、そして、特に、非常に感受性が高く、そして処方が困難である薬物について継続された必要性が存在する。
【０００８】
アジュバントは、抗原に対して免疫応答を増強し得る化合物である。アジュバントは、体液性および細胞性の免疫の両方を増強し得る。しかし、特定の病原体は、細胞性免疫を刺激することが好ましく、特に、Ｔｈ１細胞はそうである。現在使用されるアジュバントは、Ｔｈ１細胞応答を適切に惹起しないし、そして／または有害な副作用を有する。
【０００９】
現在、米国でのヒトでの使用について承認されている唯一のアジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン）である。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病およびインフルエンザを含むいくつかのワクチンについて有用であるが、他のもの特に細胞媒介性免疫が保護に必要とされる場合には、有用でないかもしれない。例えば、複数の報告が、ミョウバンが百日咳およびチフスのワクチンの有効性を改善せず、アデノウイルスワクチンを用いてわずかに効果を提供したことを示している。さらに、例えば、注射部位での肉芽腫の誘発およびロットごとのミョウバン調整物の変動のような問題が経験されている。
【００１０】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、強力な免疫刺激剤であり、実験ベースでは、多くの抗原を用いて首尾よく使用されている。ＣＦＡは、３つの成分から構成される：ミネラルオイル、乳化剤（例えば、Ａｒｌａｃｅｌ  Ａ）および殺傷されたミコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。水性抗原溶液を、これらの化合物と混合して、油中水エマルジョンを作製する。しかし、ＣＦＡは、疼痛、膿瘍形成および熱を含む重篤な副作用を生じ、これらにより、ヒトまたは獣用ワクチンのいずれにおいても使用されていない。この副作用は、主に、ＣＦＡのミコバクテリア成分に対する宿主の反応に起因する。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、細菌成分を除いてＣＦＡに類似する。米国において使用について承認されてはいないが、ＩＦＡは、他の国ではいくつかの型のワクチンについて有用となっている。ＩＦＡは、ヒトにおいてインフルエンザおよびポリオのワクチンとともに、ならびに狂犬病、イヌジステンパー、および口蹄疫病を含むいくつかの動物ワクチンともに首尾よく使用されている。しかし、実験によって、ＩＦＡに使用される油および乳化剤の両方が、マウスにおいて腫瘍を生じ得ることが示されており、これは、代替のアジュバントがヒト使用についてのよりよい選択であることを示している。
【００１１】
ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、ＣＦＡとともに観察されるアジュバント活性を生成するミコバクテリア細胞壁複合体の最小単位を表す。Ｅｌｌｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９７４，５９，１３１７。広汎なアジュバント能力および副作用を示す、ＭＤＰの多くの合成アナログが生成されている。Ｃｈｅｄｉｄら、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ、１９７８，２５，６３。ＭＤＰの４つのアナログ（ＭＤＰのスレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８７、５、２２３；ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅｄｉｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９８２，３５，４１７）；およびムラミルトリペプチドの親油性誘導体（Ｇｉｓｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｙ．Ｙａｍａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｔａｎｉ，編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ  Ｍｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｐ．１６７））が、体液性および細胞媒介性の免疫を示し、そして低レベルの毒性を示すことが示されている。ＭＤＰの別の誘導体であるＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−３（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）は親油性である。ＭＰＴ−ＰＥは、脂質環境においてその分子の疎水性部分の会合を可能にするリン脂質テイルを有するが、ムラミルペプチド部分は、水性環境と会合する。従って、ＭＰＴ−ＰＥそのものは、乳化剤として作用して、水エマルジョンにおける安定な油を生成し得る。
【００１２】
レバミソール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）およびイソプリノシンは、宿主免疫を増強する他の合成アジュバントである。レバミソールは、テトラミソールのレボ異性体であり、そして体液性および細胞性の免疫を、Ｔ細胞依存性機構によって増強する。アデノシンおよびグアノシンのプリンの前駆体であるイノシンを含む複合体であるイソプリノシンは、Ｔ細胞有糸分裂誘発を促進する。イムノグロブリン（Ｉｇ）重鎖における配列に相同な４アミノ酸ペプチド（Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）であるタフトシン（Ｔｕｆｔｓｉｎ）は、主に、マクロファージを刺激する。
【００１３】
生分解性かつ生体適合性のポリマー（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）として知られる）から調製された微粒子は、多数の抗原について有効なビヒクルであることが実証されている。さらに、ＰＬＧ微粒子は、捕捉された抗原の放出速度を制御し得、そして従って単回用量ワクチンについての可能性を提供する。さらに、捕捉された抗原を有する生分解性ポリマーの投与は、広汎な動物モデルにおいて強力な免疫応答を誘発することが実証されている。Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１９９８，３２，２２５−２４６およびＳｉｎｇｈら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１９９８，３４，２８５−３０４、それらの開示はそのすべてが本明細書において参考として援用される。
【００１４】
スクアレン、三オレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５TM）、および均一な大きさにされた微小滴を提供するように微小流体化された、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０TM）を含むエマルジョン（すなわち、ＭＦ５９）もまた、強力な免疫応答を誘発することが示された。ＭＦ５９処方物は、ミョウバン塩アジュバントを用いて得られたものよりも抗体力価５→１００倍の誘発を示した。ＭＦ５９は、以下を含む、多数の供給源からの抗原に対する免疫応答を増強することが実証されている：例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、際とメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびマラリア。Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５、Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ、編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２７７−２９６；Ｓｉｎｇｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９８，１６，１８２２−１８２７；Ｏｔｔ  ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９５，１３、１５５７−１５６２；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ，１９９７、Ｆｅｂｒｕａｒｙ、６９−７５；および  Ｔｒａｑｕｉｎａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９９６，１７４，１１６８−７５、これらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。ＭＦ５９アジュバントは、サブユニット抗原の免疫原性を改善しつつ、ミョウバンアジュバントの安全性および寛容性のプロファイルを維持する。Ｖａｎ  Ｎｅｓｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９２，１９９２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、５７−６２およびＶａｌｅｎｓｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４，１５３，４０２９−３９、それらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。ＭＦ５９はさらに、同時係属中の米国特許出願第０８／４３４，５１２号（１９９９年５月４日出願）（本発明の譲渡者に譲渡される）に記載されている。これは、その全体が本明細書において参考として援用される。動物研究において、遺伝子毒性、催奇形性ではないことが見出され、感作を生じもしない。ＭＦ５９の作用機構は、強力なＣＤ４＋Ｔ細胞の生成、すなわちＴｈ２細胞の応答に依存するようである。しかし、ＭＦ５９アジュバントは、あったとしてもほとんどＴｈ１応答も細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答も惹起しない。
【００１５】
抗原と混合されたＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、強力なＴｈ１抗原応答を惹起することが実証されている。Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７，３，８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８，１６０，８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，２７，２３４０−２３４４；およびＭｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８，１６，１２１６−１２２４、これらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドは、比較的細菌ＤＮＡにおいて共通しているが、脊椎動物ＤＮＡにおいて過小抑制されそしてメチル化されている。Ｂｉｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、１９８７，３，３４２−３４７。メチル化されていないＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドもまた、以下を含む免疫応答を惹起することが知られている：Ｂ細胞増殖、インターロイキン６およびイムノグロブリンの分泌、ならびにアポトーシス耐性。Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７４，５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６，９３，２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６，１５７，１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１６７，７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８，７９，８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ａｎｄ  Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０２５５５；ＰＣＴ公開  ＷＯ９８／１６２４７；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１８８１０；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４０１００；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５５４９５；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３７９１９；およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２５８１、これらの開示は、その全体が、本明細書において参考として援用される。
【００１６】
一リン酸化リピドＡ（ＭＰＬ）は、当業者において、Ｔｈ１リンパ球応答を誘導することが知られている。Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ａｓ  ａｎ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編，１９９５、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．４９５−５２３。
【００１７】
カチオン性脂質ベースのエマルジョンは、遺伝子キャリアとして使用され得ることもまた示された。Ｓｅｅ、ｅ．ｇ．、Ｙｉら、Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ；ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ、ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２４：６５３−６５４（１９９７）；Ｋｉｍら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  Ｉｎｔｒａ  Ｎａｓａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’１．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２５：３４４−３４５（１９９８）；Ｋｉｍら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２６、＃５４３８（１９９９）。
【００１８】
従って、予防的処置および治療的処置のために使用され得る、Ｔｈ１細胞応答の増加を生じるアジュバントは、なお所望されている。そのような応答は、例えば、ウイルス感染の処置において、ならびにウイルス感染に対して感受性のある個体の免疫のために有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明者らは、本明細書において、広汎な種々の高分子を吸着し得る吸着表面を有する微粒子を形成する方法を発明した。この微粒子は、ポリマーおよび界面活性剤の両方から構成される。本発明の微粒子は、そのような高分子を、現在利用可能な微粒子よりも効率的に吸着する。
【００２０】
その微粒子は、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエーテル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、ポリシアノアクリレートなどから誘導され、そして界面活性剤（例えば、カチオン性、アニオン性、または非イオン性の界面活性剤）とともに形成される。この界面活性剤は、組合せで使用され得る。さらに、本発明者らは、これらの微粒子がウイルス抗原の吸着の改善を達成し、そしてＰＶＡのみを使用するプロセスにより形成される微粒子と比較して、優れた免疫応答を提供することを発見した。ＰＶＡのみを用いて作製された微粒子は、いくつかの高分子を吸着し得るが、他の界面活性剤を単独、組合せまたはＰＶＡとの組合せで使用する本発明の微粒子は、広汎な種々の高分子を吸着する。従って、次いで、本発明は、そのような微粒子、ならびにそれらを生成するためのプロセスおよびその微粒子を用いる方法に主に関する。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明は、吸着剤表面を有する微粒子に関し、ここで、その微粒子は、以下からなる群より選択されるポリマーを含む：ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレート。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、さらに、その微粒子の表面に吸着された選択された高分子を含む、そのような微粒子（例えば、医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、抗原、アジュバント、またはそれらの組合せなど）に関する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、微粒子組成物に関する。この微粒子組成物は、本発明の微粒子に吸着された、選択された高分子および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、吸着剤表面を有する微粒子を生産する方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレート（ここで、そのポリマーは、有機溶媒中で約１％〜約３０％の濃度で存在する）からなる群より選択されるポリマーを含むポリマー溶液と；
そのポリマー溶液に対するアニオン性、カチオン性または非イオン性の界面活性剤（ここで、その界面活性剤は、０．００１〜１０（ｗ／ｗ）の界面活性剤対ポリマー）の比で存在する）とを合わせて、ポリマー／界面活性剤混合物を形成する工程；
（ｂ）そのポリマー／界面活性剤混合物を分散させる工程；
（ｃ）その有機溶媒を除去する工程；および
（ｄ）その微粒子を回収する工程。
【００２５】
好ましくは、その有機溶媒を取り除く前にそのポリマー／界面活性剤混合物を乳化してエマルジョンを形成させる。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、上記方法によって調製された微粒子に関する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、吸着された高分子を有する微粒子を生産するための方法に関する：
（ａ）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含むポリマー溶液（ここで、そのポリマーは、有機溶媒中に約３％〜約１０％の濃度で存在する）と；
アニオン性、カチオン性または非イオン性の界面活性剤（ここで、その界面活性剤は、０．００１〜１０（ｗ／ｗ）の界面活性剤対ポリマー）の比で存在する）とを合わせて、ポリマー／界面活性剤混合物を形成する工程；
（ｂ）そのポリマー／界面活性剤混合物を分散させる工程；
（ｃ）そのエマルジョンからその有機溶媒を除去する工程；
（ｄ）その微粒子を回収する工程；および
（ｅ）その微粒子の表面に高分子を吸着させる工程であって、その高分子は、
以下からなる群より選択される工程：医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫調節因子、抗原、アジュバント、およびそれらの組合せ。好ましくは、その有機溶媒を除去する前にそのポリマー／界面活性剤混合物を乳化して、エマルジョンを形成させる。別の実施形態において、本発明は、上記の所望の方法によって調製された吸着された高分子を有する微粒子に関する。
【００２８】
別の実施形態において、吸着剤微粒子組成物を生成する方法に関する。この方法は、その表面上に高分子を有する吸着剤微粒子と、薬学的に受容可能な賦形剤とを組み合わせる工程を包含する。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体に、高分子を送達する方法に関する。この方法は、上記の組成物を脊椎動物被験体に投与する工程を包含する。
【００３０】
さらなる実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体において細胞性免疫応答を惹起するための方法に関する。この方法は、本発明の微粒子に吸着された、治療的に有効な量の選択された高分子を脊椎動物に投与する工程を包含する。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、免疫方法に関する。この方法は、脊椎動物に、治療的有効量の上記の微粒子組成物を投与する工程を包含する。その組成物は、必要に応じて、結合していない高分子を含み得、そしてまた、必要に応じて、リン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩を含むアジュバントを含み得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、その微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）から形成され；より好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から形成され；そして最も好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）である。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、微粒子調整物は、イオン表面活性剤とのサブミクロンエマルジョンを包含する。ＭＦ５９または他のものは、塩基粒子として使用され得るが、イオン表面活性剤は、以下を含み得るがそれらに限定されない：ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−エチルホスホコリン（ＤＥＰＣ）およびジオレオイルホスファチジン酸（ＤＰＡ）、これらは各々スクアレン中で可溶性である。
【００３４】
非網羅的な以前に記載された吸着剤微粒子の各々はまた、必要に応じて、それらに捕捉された高分子を有し得る。
【００３５】
本発明はまた、イオン性界面活性剤を用いて処方された油滴エマルジョンを含むミクロエマルジョンに関する。そのような組成物は、容易に、ＤＮＡ、タンパク質および他の抗原性分子のような高分子を吸着する。アジュバント組成物は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含み得る。そのアジュバント組成物はまた、正に荷電したエマルジョンを生じる任意の成分を含み得る。この油滴エマルジョンは、好ましくは、代謝可能な油および乳化剤を含む。これらの薬剤は、好ましくは、実質的にすべてが１μｍ未満の直径である湯的を有する、水中油エマルジョンの形態で存在する。好ましくは、この組成物は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの非存在下で存在する。この油は、好ましくは、動物油、不法は炭化水素、テルペノイド（例えば、スクアレン）または植物油である。この組成物は、好ましくは、０．５〜２０容量％の油を水性媒体中に含む。この乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノ、ジ、もしくはトリエステルまたはソルビタンモノ、ジもしくはトリエーテル）を含む。好ましくは、その組成物は、約０．０１重量％〜約０．５重量％の乳化剤を含む。そのオリゴヌクレオチドは好ましくは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合またはペプチド核酸結合を含む。本発明の好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１〜２８。本発明の他の好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、２つのプリンがそのモチーフの５’直ぐに隣接し、そして２つのピリミジンがそのモチーフの３’直ぐに隣接するＣｐＧモチーフを含む。本発明の他の好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１９〜２８。配列番号２８において最も好ましいのは、配列番号２８にである。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、そのアジュバント組成物は、さらに、別々の免疫刺激剤を含む。この刺激剤は、好ましくは以下からなる群より選択される：ミョウバン、細菌細胞壁成分、およびムラミルペプチド。このアジュバント組成物は、微粒子の形態であり得る。
【００３６】
本発明はまた、免疫原性組成物に関する。この組成物は、免疫刺激量の抗原性物質、および免疫刺激量の本明細書に記載されるアジュバント組成物を含む。好ましくは、その抗原性物質は、タンパク質、タンパク質−ポリサッカリド、タンパク質−リポポリサッカリド、ポリサッカリド、およびリポポリサッカリドからなる群四厘選択される。本発明のいくつかの実施形態において、その免疫原性組成物は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとともに、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）微粒子に吸着された抗原性物質を含む。この吸着された抗原性物質は、好ましくは、組換えタンパク質である。本発明の好ましい実施形態において、その抗原性物質は、ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）、および狂犬病ウイルス）に由来する。好ましくは、その抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、およびＨＩＶｐ５５  ｇａｇからなる群より選択される。本発明の他の好ましい実施形態において、その抗原性物質は、細菌（例えば、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）に由来する。本発明の他の好ましい実施形態において、この抗原性物質は、寄生生物（例えば、マラリア寄生生物）に由来する。
【００３７】
本発明はまた、宿主細胞において免疫応答を刺激する方法に関する。この方法は、その動物に、本明細書において記載される免疫原性組成物を免疫応答を誘発するに有効な量で投与する工程を包含する。その宿主動物は、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００３８】
本発明はまた、ウイルス、細菌または寄生生物の感染に対して宿主動物を免疫する方法に関する。この方法は、その動物に、本明細書に記載される免疫原性組成物を、保護的応答を誘発するに有効な量で投与する工程を包含する。その宿主細胞は．好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００３９】
本発明はまた、宿主動物におけるＴｈ１免疫応答を増強する方法に関する。この方法は、その動物に、本明細書に記載される免疫原性組成物を、Ｔｈ１免疫応答を誘発するに有効な量で投与する工程を包含する。その宿主動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書における開示に鑑み、当業者には容易になる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）  吸着性表面を有するミクロエマルジョンであって、該ミクロエマルジョンは、以下：
（ａ）代謝可能な油；および
（ｂ）乳化剤；
を含む微小滴エマルジョンを含み、
ここで、該乳化剤は、界面活性剤を含む、ミクロエマルジョン。
（項目２）  前記油および前記乳化剤が、油滴を有する水中油型エマルジョンの形態で存在し、該油滴の実質的に全てが、直径１ミクロン未満であり、そして該組成物が、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの非存在下で存在する、項目１に記載のミクロエマルジョン。
（項目３）  前記油が、動物油、不飽和炭化水素、テルペノイドおよび植物油からなる群のメンバーである、項目２に記載のミクロエマルジョン。
（項目４）  前記油が、スクアレンであるテルペノイドである、項目３に記載のミクロエマルジョン。
（項目５）  前記組成物が、０．５〜２０容量％の前記油を水性媒体中に含む、項目２に記載のミクロエマルジョン。
（項目６）  前記組成物が、０．０１〜０．５重量％の前記乳化剤を含む、項目１に記載のミクロエマルジョン。
（項目７）  前記乳化剤が、非イオン性界面活性剤を含む、項目１に記載のミクロエマルジョン。
（項目８）  前記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステルまたはソルビタンモノエーテル、ソルビタンジエーテルもしくはソルビタントリエーテルを含む、項目７に記載のミクロエマルジョン。
（項目９）  前記乳化剤が、カチオン性界面活性剤を含む、項目１に記載のミクロエマルジョン。
（項目１０）  前記カチオン性界面活性剤が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンザルコニウムクロリド、ジメチルジオクトデシルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、メチルベンゼトニウムクロリドおよび４−ピコリンドデシル硫酸からなる群より選択される、項目９に記載のミクロエマルジョン。
（項目１１）  前記組成物が、０．０１〜０．５重量％の前記乳化剤を含む、項目９に記載のミクロエマルジョン。
（項目１２）  前記乳化剤が、アニオン性界面活性剤を含む、項目１に記載のミクロエマルジョン。
（項目１３）  その表面に吸着された生物学的に活性な高分子をさらに含み、該生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、薬剤、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、イムノモジュレーターおよびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、項目１に記載のミクロエマルジョン。
（項目１４）  前記高分子が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ミョウバン、細菌細胞壁成分およびムラミルペプチドからなる群より選択されるアジュバントである、項目１３に記載のミクロエマルジョン。
（項目１５）  前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、項目１４に記載のミクロエマルジョン。
（項目１６）  前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのペプチド核酸結合を含む、項目１５に記載のミクロエマルジョン。
（項目１７）  前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜２８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１６に記載のミクロエマルジョン。
（項目１８）  前記オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧモチーフのすぐ５’側に２つのプリンが、そして該モチーフのすぐ３’側に２つのピリミジンが隣接した該ＣｐＧモチーフを含む、項目１４に記載のミクロエマルジョン。
（項目１９）  前記抗原がウイルス由来である、項目１３に記載のミクロエマルジョン。
（項目２０）  前記ウイルス抗原が、ウイルスサブユニットを含む、項目１９に記載のミクロエマルジョン。
（項目２１）  前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）および狂犬病ウイルスからなる群より選択される、項目１９に記載のミクロエマルジョン。
（項目２２）  前記抗原が、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０およびＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇからなる群より選択される、項目１９に記載のミクロエマルジョン。
（項目２３）  前記抗原が、細菌由来である、項目１３に記載のミクロエマルジョン。
（項目２４）  前記細菌が、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａからなる群より選択される、項目２３に記載のミクロエマルジョン。
（項目２５）  前記抗原性物質が寄生生物由来である、項目１３に記載のミクロエマルジョン。
（項目２６）  前記寄生生物が、マラリア寄生生物を含む、項目２５に記載のミクロエマルジョン。
（項目２７）  宿主動物において免疫応答を誘導する方法であって、該動物に項目１３〜２６のいずれかに記載のミクロエマルジョンを投与する工程を包含する、方法。
（項目２８）  前記宿主動物が哺乳動物である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）  前記哺乳動物がヒトである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）  宿主動物をウイルス感染、細菌感染または寄生生物感染に対して免疫する方法であって、該動物に、防御応答を誘導するに有効な量の項目１３〜２６のいずれかに記載のミクロエマルジョンを投与する工程を包含する、方法。
（項目３１）  前記宿主動物が哺乳動物である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  前記哺乳動物がヒトである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）  Ｔｈ１免疫応答を宿主動物において誘導する方法であって、該動物に、項目１３〜２６のいずれかに記載のミクロエマルジョンを投与する工程を包含する、方法。
（項目３４）  項目１３に記載のミクロエマルジョンおよび吸着性表面を有する微粒子を含む組成物であって、該微粒子が、以下：
ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマー；ならびに
第２の界面活性剤、
を含む、組成物。
（項目３５）  前記微粒子が、その表面に吸着された生物学的に活性な第１の高分子をさらに含み、該生物学的に活性な第１の高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、薬剤、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、イムノモジュレーターおよびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）  前記微粒子が、該微粒子内にカプセル化された生物学的に活性な第２の高分子をさらに含み、該生物学的に活性な第２の高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、薬剤、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、イムノモジュレーターおよびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、項目３４に記載の組成物。
（項目３７）  前記微粒子が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）からなる群より選択されるポリ（α−ヒドロキシ酸）を含む、項目３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
（項目３８）  前記微粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含む、項目３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
（項目３９）  前記第２の界面活性剤が、カチオン性界面活性剤である、項目３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
（項目４０）  前記第２の界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である、項目３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
（項目４１）  前記第２の界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項目３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
（項目４２）  前記生物学的に活性な第１の高分子が、ｇｐ１２０、ｐ２４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇおよびインフルエンザＡ血球凝集素抗原からなる群より選択される抗原である、項目３５〜３６のいずれかに記載の組成物。
（項目４３）  前記生物学的に活性な第１の高分子が、ｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドである、項目３５〜３６のいずれかに記載の組成物。
（項目４４）  前記生物学的に活性な第２の高分子が、アジュバントである、項目３６に記載の組成物。
（項目４５）  前記微粒子に吸着された前記アジュバントが、アルミニウム塩である、項目３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
（項目４６）  薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、項目３４〜４５のいずれかに記載の組成物。
（項目４７）  吸着されていないアジュバントをさらに含む、項目３４〜４６のいずれかに記載の組成物。
（項目４８）  前記吸着されていないアジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＴＫ６３、ＬＴＲ７２、ＭＰＬ、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａおよびアルミニウム塩からなる群より選択されるメンバーである、項目４７に記載の組成物。
（項目４９）  前記吸着されていないアジュバントが、リン酸アルミニウムであるアルミニウム塩である、項目４８に記載の組成物。
（項目５０）  治療有効量の高分子を脊椎動物被験体に送達する方法であって、該脊椎動物被験体に、項目３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目５１）  項目３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８のいずれかに記載の組成物の、疾患の診断のための使用。
（項目５２）  項目３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８のいずれかに記載の組成物の、疾患の処置のための使用。
（項目５３）  項目３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８のいずれかに記載の組成物の、ワクチンのための使用。
（項目５４）  項目３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８のいずれかに記載の組成物の、免疫応答の惹起のための使用。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、好ましい免疫原性組成物によって生成される免疫グロブリンアイソタイプの代表的な結果を示す棒グラフである。この組成物は、本発明に従うＰＬＧ微粒子を含む。
【図２】図２は、好ましい免疫原性組成物によって生成される免疫グロブリンアイソタイプの代表的な結果を示す棒グラフである。この組成物は、本発明に従うＭＦ５９アジュバントを含む。
【図３】図３は、好ましいエマルジョンアジュバントを用いて免疫する際の血清抗ｐ５５ＩｇＧ力価の代表的な結果を示す図である。
【図４】図４は、好ましいエマルジョンアジュバントを用いて免疫する際のＣＴＬによる標的の溶解の代表的な結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、吸着した高分子を有する微粒子が改善された免疫応答を示すこと、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび代謝可能なな油もしくは生分解性のポリ間の組合せを含むアジュバントが免疫応答を増強するという驚くべき発見に基づく。さらに、吸着された高分子および油エマルジョンの組合せは、強力な免疫応答を惹起するために有用である。
【００４２】
本発明の実施は、タンパク質に言及しなければ、当該分野内の、化学、高分子化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ、Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７）およびＳｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｒ’ｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．、１９９６）を参照のこと。
【００４３】
本明細書において引用される、すべての刊行物、特許および特許出願は、それらが上記であろうと下記であろうと、その全体が本明細書において参考として援用される。
【００４４】
明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の参照形態を包含する。従って、例えば、用語「微粒子」とは、１つ以上の微粒子などを言及する。
【００４５】
（Ａ：定義）
本発明を記載するにあたり、以下の用語を使用し、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語「微粒子」とは、約１０ｎｍ〜約１５０μｍの、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子をいう。好ましくは、その微粒子は、針および毛細管を閉塞させることなく、非経口投与または粘膜投与を可能にする直径のものである。微粒子サイズは、光子相関比色計、レーザ回折法、および／または走査電子顕微鏡のような、当該分野において周知の技術によって容易に決定される。用語「粒子」とはまた、本明細書において定義される微粒子をも言及するように使用され得る。
【００４７】
本明細書において使用するための微粒子は、滅菌可能で、非毒性であり、そして生分解性である材料から形成される。そのような材料としては、限定することなく、以下が挙げられる：ポリ（ａ−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリシアノラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリレート。好ましくは、本発明を用いた使用のための微粒子は、以下に由来する：ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドもしくはグリコール酸とのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマー。微粒子は、任意の種々のポリマー性出発物質に由来し得る。これは、種々の分子量を有し、そしてＰＬＧのようなコポリマーの場合には、種々のラクチド：グリコリド比を有する。その選択は、大部分選択の問題であって、これは、同時投与される高分子に一部依存する。これらのパラメータは、以下により詳細に記載される。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語「界面活性剤」とは、表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）およびエマルジョン安定化剤を包含する。アニオン性界面活性剤としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＳＤＳ、ＳＬＳ、ＤＳＳ（ジスルホスクシネート）、硫酸化脂肪アルコールなど。カチオン性界面活性剤としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：セトリミド（ＣＴＡＢ），塩化ベンザルコニウム、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシルアノもニウムブロミド）、ＤＯＴＡＰなど。非イオン性界面活性剤としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ソルビタンエステル、ポリソルベート、ポリオキシエチル化グリコールモノエーテル、ポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポロキサマーなど。
【００４９】
用語「正味の（ｎｅｔ）の正電荷」とは、本明細書において使用される場合、その微粒子の表面上の電荷がＰＶＡを用いて作られた対応する微粒子の表面上の電荷よりも正であることを意味する。同様に、陽後「正味の負電荷」とは、本明細書において使用される場合、その微粒子の表面上の電荷がＰＶＡを用いて作られた対応する微粒子の表面上の電荷よりも負であることを意味する。正味の電荷は、カチオン性またはアニオン性の界面活性剤を用いて作製されたその微粒子のζ電位（動電学的電位ともいわれる）と、ＰＶＡで作製された対応する微粒子と比較することによって評価され得る。従って、「正味の正電荷」を有する微粒子表面は、ＰＶＡを用いて作製された微粒子の表面のζ電位よりも大きなζ電位を有し、そして「正味の負電荷」を有する微粒子表面は、ＰＶＡを用いて作製された微粒子の表面のζ電位よりも小さなζ電位を有する。明白なように、本発明の微粒子についての正味の電荷は、対応するＰＶＡ微粒子のζ電位に比較して算出される。
【００５０】
用語「ζ電位」とは、本明細書において使用される場合、すべての固体および液体の界面を横切って存在する電気的電位、すなわち、荷電されたコロイド粒子を囲むイオンの拡散層を横切る電位をいう。ζ電位は、電気泳動移動度（すなわち、当該分野で周知の技術を用いて測定されるべき表面に接触して配置される荷電された電極の間をコロイド粒子が移動する速度）から算出され得る。
【００５１】
用語「高分子」とは、本明細書において使用される場合、制限することなく、医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫調節剤，抗原、アジュバント、またはそれらの組合せを包含する。本発明において使用するための粒子状の高分子は、以下により詳細に記載される。
【００５２】
用語「医薬（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」とは、抗生物質、抗ウイルス剤、増殖因子、ホルモンなどのような生物学的に活性な化合物をいう。これらは以下により詳細に記載される。
【００５３】
用語「ポリヌクレオチド」とは、生物学的にアッセイな（例えば、免疫原性または治療的）タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子である。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質に依存して、ポリヌクレオチドは、１０ほどのヌクレオチドを含み得、例えば、ここで、ポリヌクレオチドは、抗原をコードする。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、二本鎖および一本鎖の両方の配列を含み得、そして、以下のことをいうがそれに限定されない：ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルス（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡのウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡからのゲノムＲＮＡおよびＤＮＡの配列、および特に、合成ＤＮＡ配列。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを包含する配列を包含し、そしてその核酸分子が、治療的または抗原性のタンパク質をコードする限り、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に天然で保存的である）を包含する。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介して意図的であり得るが、または抗原を生成する宿主の変異を介して偶然であり得る。
【００５４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして最小限の長さの生成物には限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、その定義に入る。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、その定義に包含される。この用語はまた、そのタンパク質が免疫学的応答を惹起する能力を維持するか、またはそのタンパク質が投与される被験体に対する治療的効果を有する限り、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換）を包含する（一般に、天然で保存的である）。
【００５５】
「抗原」とは、その抗原が本発明に従って提示されるときの細胞性の抗原特異的免疫応答または体液性抗体応答を起こすように宿主の免疫系を刺激し得る１つ以上のエピトープを含む分子を意味する。抗原は、それ自身が、または別の分子と組み合わせて存在するときに細胞性または体液性応答を惹起し得る。通常、エピトープは、約３〜１５、一般的に約５〜１５のアミノ酸を含む。所定のタンパク質のエピトープは、当該分野において周知の多数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、直鎖状のエピトープは、例えば、固体支持体の上で多数のペプチドを同時に合成すること（そのペプチドはタンパク質分子の部分に対応する）、およびそのペプチドがその支持体になおも付着される間にそのペプチドと抗体とを反応させることによって、決定され得る。そのような技術は当該分野において公知であり、そして例えば、以下に記載される：米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１  ：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５、これらすべては、その全体が本明細書において参考として援用される。同様に、コンフォメーション的エピトープは、アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することによって容易に同定される（例えば、Ｘ線結晶学、および二次元核磁気共鳴）。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、同上を参照のこと。
【００５６】
用語「抗原」とは、本明細書において使用される場合、サブユニット抗原（すなわち、その抗原が天然で付随する生物全体から分離されそして別個となっている抗原）および殺傷され、減弱されまたは不活化された細菌、ウイルス、寄生生物または微生物をいう。抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントのような抗体ならびに抗原または抗原性決定基を模倣し得る合成ペプチドミモトープもまた、本明細書において使用される抗原の定義の中に入る。同様に、インビボ（例えば、遺伝子治療および核酸免疫適用）治療的または免疫学的タンパク質、または抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書における抗原の定義に含まれる。
【００５７】
さらに、本発明の目的のために、抗原は、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌、ならびに任意の種々の腫瘍抗原のいずれかに由来し得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、そのタンパク質が免疫学的応答を惹起する能力を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加、および置換（通常天然で保存的である）を包含するタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介して意図的であり得るが、または抗原を生成する宿主の変異を介して偶然であり得る。
【００５８】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する分子に対する体液性および／または細胞性の免疫応答の、被験体における発生をいう。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいう。他方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものである。細胞性免疫の重要な１つの局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異性応答を包含する。ＣＴＬは、腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と会合において提示され、そして細胞の表面に発現されるペプチド抗原について特異性を有する。ＣＴＬは、微生物の細胞内破壊またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導しそして促進することを助ける。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異性応答を包含する。ヘルパーＴ細胞は、その表面にＭＨＣ分子と会合したペプチド抗原を提示する細胞に対して非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激することおよびその活性に焦点を充てることを助けるように作用する。「細胞免疫応答」とはまた、活性化されたＴ細胞および／またはたの白血球による、サイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の産生をいう（これらには、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものが含まれる）。
【００５９】
細胞性免疫応答を惹起する、組成物（例えば、免疫原性組成物）またはワクチンは、その細胞表面においてＭＨＣ分子との会合において抗原の提示によって脊椎動物被験体を感作するよう作用し得る。細胞媒介性応答は、その表面において抗原を提示する細胞に対してまたはその付近に指向される。さらに、抗原特異的なＴリンパ球は、免疫された宿主の将来の保護を可能にするように生成され得る。
【００６０】
特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多数のアッセイ（例えば、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞障害性細胞アッセイ）、または感作された被験体において高原について特異的なＴリンパ球によって決定され得る。そのようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６；および以下の例を参照のこと。
【００６１】
従って、本明細書において使用される場合、免疫学的応答とは、ＣＴＬの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を惹起し得る。従って、免疫学的応答は、１つ以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／または目的の組成物もしくはワクチンに存在する抗原に対して特異的に指向されるサプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和するように作用し得、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対する保護を提供する。そのような応答は、当該分野において周知の標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００６２】
微粒子に対して吸着された、選択された抗原を含む組成物は、それがその微粒子と会合することなく送達されるときに等量のその抗原によって惹起される免疫応答よりも多い免疫応答を惹起する能力を有する場合、「増強された免疫原性」を示す。従って、組成物は、「増強された免疫原性」を示し得る。なぜなら、その抗原は、その微粒子に対する吸着によってより強く免疫原性であるからであるか、またはそれが投与される被験体においてより少ない用量の抗原が免疫応答を達成するに必要であるからである。そのようなおよび／または図供された免疫原性は、微粒子／抗原の組成物、および抗原コントロールを動物に投与すること、および当該分野において周知の放射イムノアッセイおよびＥＬＩＳＡのような標準的なアッセイを用いてその２つに対する抗体力価を比較することによって決定され得る。
【００６３】
用語「有効量」または「薬学的有効量」の高分子／微粒子は、本明細書において提供されるように、非毒性であるが所望の応答（例えば、免疫応答）および対応する治療的効果を提供するのに充分量の高分子／微粒子をいい、または治療タンパク質の送達の場合において、以下に規定するように、その被験体の処置を行うに充分な量をいう。以下に指摘されるように、必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢および一般的状態、処置される条件の重篤度、および目的の特定の高分子、投与形態などに依存して、被験体ごとにかわる。個々の症例における適切な「有効」量は、慣用実験を用いて当業者によって決定され得る。
【００６４】
「脊椎動物被験体」とは、脊椎動物亜門の任意のメンバーを意味する。これには、制限することなく、哺乳動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびヒト；家庭内動物（イヌ、およびネコ））；および鳥（家庭内、野生および競技用の鳥（例えば、ニワトリおよび雌ニワトリ（ヒヨコを含む）、シチメンチョウ、および他の家禽類鳥類）が包含される。この用語は、特定の年齢を意図しない。従って、成人および新生児の両方が網羅されることが意図される。
【００６５】
「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」とは、生物学的または他の意味で所望されないものではない物質（すなわち、所望されない生物学的効果を生ずることもなく、それが含まれる組成物の成分のいずれかとともに有害な様式で相互作用することもなく、その微粒子処方物とともに固体へ投与され得る物質）を意味する。
【００６６】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０（両端含む）の範囲のｐＨ、より代表的には約７．２〜７．６（両端含む）の範囲にあるｐＨを意味する。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「処置」とは以下のいずれかをいう：（ｉ）伝統的な意味におけるような感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少または除去；および（ｉｉｉ）問題の病原体もしくは障害の実質的もしくは完全な除去。処置は、予防的（感染前）または治療的（感染後）に行われ得る。
【００６８】
本明細書において使用される場合、用語「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらから形成されたキメラをいう。
【００６９】
本明細書において使用される場合、用語「少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをいう。少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣｐＧモチーフを含み得る。これらのオリゴヌクレオチドはまた、当該分野において、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」として知られる。本明細書において使用される場合、用語「ＣｐＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドに続いてグアノシンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに用いられ得る。
【００７０】
本明細書において使用される場合、用語「油滴エマルジョン」とは、代謝可能な油および乳化剤を含むエマルジョンをいう。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態に従って、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、細菌、または原生生物の感染および腫瘍に対して、予防的および／もしくは治療的に免疫するか、または治療する組成物および方法が提供される。本発明の方法は、予防的および／または治療的な免疫を哺乳動物（好ましくは、ヒト）に付与するのに有用である。本発明の方法はまた、生体医学研究のためにヒト以外の哺乳動物において実施され得る。
【００７２】
（Ｂ．一般的方法）
（１．吸着された高分子を有する微粒子）
本発明は、本発明のＰＬＡおよびＰＬＧの微粒子が生物学的に活性な高分子を吸着するという発見に基づく。さらに、これらの微粒子は、より多様な分子（荷電高分子および／または嵩高い（ｂｕｌｋｙ）高分子を含む）を、ＰＶＡを用いて調製された微粒子よりも容易に吸着する。従って、本発明の高分子／微粒子を送達系として使用して、広汎な種々の疾患を処置、予防および／または診断するために生物学的に活性な成分を送達し得る。
【００７３】
本発明を用いて、広汎で種々の高分子を送達し得る。これには、以下が挙げられるがそれらに限定されない：医薬（例えば、抗生物質および抗ウイルス剤、非ステロイド抗炎症薬、鎮痛剤、血管拡張剤、心臓血管薬物、向精神薬、神経弛緩薬、抑鬱剤、抗パーキンソン薬物、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ブラジキニンインヒビター、ＡＣＥインヒビター、血管拡張剤、プロラクチンインヒビター、ステロイド、ホルモンアンタゴニスト、ホルモンアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、セロトニンアンタゴニスト、ヘパリン、化学療法剤、抗新生物剤、および成長因子・増殖因子（以下を含むがそれらに限定されない：ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２、ＦＧＦ）、治療剤または免疫原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ワクチンにおいて使用するための免疫原性タンパク質およびそのエピトープ、ペプチドホルモン（例えば、インスリン、プロインスリン、成長ホルモン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＥＧＦ、ソマトスタチン、ＳＮＸ−１１１、ＢＮＰ、インスリノトロピン、ＡＮＰ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＳＨ  およびｈＣＧ、性腺ステロイドホルモン（アンドロゲン、エストロゲン、およびプロゲステロン）、甲状腺刺激ホルモン、インヒビン、コレシスキニン、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、ジノルフィン、エンドルフィン、エンドセリン、フィブロネクチンフラグメント、ガラニン、ガストリン、インスリノトロピン、グルカゴン、ＧＴＰ結合タンパク質フラグメント、グアニリン、ロイコキニン、マガイニン、マストラパン、デルマセプチン、システミン、ニューロメジン、ニューロテンシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、サブスタンスＰ、セクレチン、チモシンなど）を含むホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤（例えば、種々のサイトカイン（例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、およびγインターフェロン））、抗原、およびアジュバント。
【００７４】
好ましい実施形態において、高分子は抗原である。本発明の特定の利点は、吸着された抗原を有する微粒子が細胞媒介性応答を脊椎動物被験体において生成する能力である。本発明の抗原／微粒子が選択された抗原に対する細胞媒介性免疫応答を惹起する能力は、広汎で種々の病原体による感染に対する強力なツールである。従って、本発明の抗原／微粒子は、ワクチン組成物へと取り込まれ得る。
【００７５】
従って、慣用の抗体応答に加えて、本明細書において記載される系は、例えば、クラスＩＭＨＣ分子との発現された抗原の会合を提供し、その結果、目的の抗原に対するインビボ細胞性免疫応答が惹起され得、これが、ＣＴＬの産生を刺激して、その抗原の将来の認識を可能にする。さらに、この方法は、抗原特異的な応答をヘルパーＴ細胞によって惹起させ得る。従って、本発明の方法は、任意の高分子との用途が見出される。その用途について、細胞性および／または体液性の免疫応答が所望され、好ましくは、抗体を惹起し得るウイルス病原体、Ｔ細胞ヘルパーエピトープおよびＴ細胞細胞傷害性エピトープに由来する抗原が所望される。そのような抗原としては、ヒトおよび動物のウイルスが挙げられるがそれらに限定されず、そして構造または非構造的なタンパク質のいずれかに対応し得る。
【００７６】
本発明の微粒子は、細胞内のウイルスに対する免疫のために特に有用である。このウイルスは、通常貧弱な免疫応答を惹起する。例えば、本発明は、ヘルペスウイルス科に由来する広汎な種々のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための用途を見出す：単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型に由来するタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ；水痘‐帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原（ＣＭＶ  ｇＢおよびｇＨを含む）；ならびに他のヒトヘルペスウイルスに由来する抗原（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）。（例えば、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９０）ｐｐ．１２５−１６９を、サイトメガロウイルスの内容物をコードするタンパク質の概説について参照のこと；ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４を、種々のＨＳＶ−１コードタンパク質の概説について参照のこと；米国特許第５，１７１，５６８号を、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２  ｇＢおよびｇＤのタンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子の議論について参照のこと；Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７−２１１を、ＥＢＶゲノムにおける配列をコードするタンパク質の同定について参照のこと；ならびにＤａｖｉｓｏｎおよび  Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６を、ＶＺＶの概説について参照のこと）。
【００７７】
ウイルスの肝炎ファミリー（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、δ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ））からの抗原もまた、本明細書において記載される技術において簡便に使用され得る。例えば、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は公知であり、同様に、その配列を取得する方法も公知である。例えば、国際公開ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；および  ＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、ウイルスタンパク質（Ｅ１（Ｅとしても知られる）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても知られる）およびＮ末端核キャプシドタンパク質（「コア」と称する）を含む（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を、Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の議論について参照のこと）。これらのタンパク質の各々およびその抗原フラグメントは、この組成物および方法において用途を見い出す。
【００７８】
同様に、ＨＤＶからのδ抗原についての配列が公知である（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）。そして、この抗原はまた、この組成物および方法において簡便に使用され得る。さらに、ＨＢＶに由来する抗原（例えば、コア抗原、表面抗原ｓＡｇ、ならびにプレ表面配列、ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前ｐｒｅ−Ｓと呼ばれた））、ならびに上記の組合せ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）は、本明細書において用途が見出される。例えば、「ＨＢＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ」ｉｎ  Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ．ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、ｐｐ．１５９−１７６を、ＨＢＶの構造の議論について；ならびに米国特許第４，７２２，８４０号，第同５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号（これらは、本明細書において、参考としてそのすべてが援用される）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３  ６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；ａｎｄ  Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００７９】
他のウイルスに由来する抗原もまた、請求された組成物および方法における用途を見い出す（例えば、限定されることなく、とりわけ以下の科Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルスなど）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルスなど）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲ、などとしても知られる））（これらは以下を含むがそれらに限定されない：単離体ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN
）；ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−ｌUS4；ＨＩＶ−２からの抗原；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のメンバーからのタンパク質）。さらに、抗原もまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎ウイルスに由来し得る。例えば  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編  １９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、編  １９９１）を、これらおよび他のウイルスの説明について参照のこと）。
【００８０】
より詳細には、上記のいずれかのＨＩＶ単離体からのｇｐ１２０エンベロープタンパク質（ＨＩＶの種々の遺伝子サブタイプのメンバーを含む）が知られ、そして報告されている（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ａｎｄ  Ｍｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１  ：５７０−５７８を、種々のＨＩＶ単離体のエンベロープタンパク質の比較について参照のこと）。そしてこれらの単離体のいずれかに由来する抗原は、本方法において用途が見出される。さらに、本発明は、ｇｐ１６０およびｇｐ４１のような任意の種々のエンベロープタンパク質、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇのようなｇａｇ、ならびにｐｏｌ領域に由来するタンパク質を含む。
【００８１】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。具体的には、インフルエンザＡのそのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生成することについて特に有用である。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプが同定された（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら，「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ，」ｐ．１２７−１６８．Ｉｎ：Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。従って、これらの単離体のいずれかに由来するタンパク質もまた、本明細書において記載される組成物および方法において使用され得る。
【００８２】
本明細書において記載される組成物および方法はまた、多数の細菌抗原を用いた用途を見い出す（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病原状態を引き起こす生物（限定することなく、以下を包含する：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、および  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  Ｂ（ＨＩＢ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）からのものおよびそれらの組合せ）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｂからの抗原の例は、以下の共有に係る特許出願に開示されている：ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴＩＢ９８／０１６６５；ＰＣＴＩＢ９９／００１０３；および以下の米国仮特許出願６０／０８３，７５８；６０／０９４，８６９；６０／０９８，９９４；６０／１０３，７４９；６０／１０３，７９４；６０／１０３，７９６；および６０／１２１，５２８）。寄生生物抗原の例としては、マラリアおよびライム病を引き起こす生物に由来するものが挙げられる。
【００８３】
本発明を使用して広汎な種々の高分子を送達し得ること、およびそれゆえ大多数の疾患を処置、予防および／または診断し得ることは容易に明らかである。代替の実施形態において、本発明の高分子／微粒子組成物は、部位特異的な標的化送達について使用され得る。例えば、高分子／微粒子組成物の静脈内投与は、肺、肝臓、脾臓、血液循環または骨髄を標的化するために使用され得る。
【００８４】
吸着剤微粒子の表面（または、本発明のミクロエマルジョン）に対する高分子の吸着は、以下を含むがそれらに限定されない任意の結合相互作用機構によって生じる：イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス結合、および親水性／疎水性相互作用を介した結合。当業者は、吸着されるべき高分子の型について適切な界面活性剤を容易に選択し得る。
【００８５】
例えば、荷電界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤）の存在で製造される微粒子は、正味の負電荷または正味の正電荷を有する表面を有する微粒子である。これは、広汎で種々の分子を吸着し得る。例えば、アニオン性界面活性剤を用いて製造される微粒子（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、すなわちＳＤＳ−ＰＬＧ微粒子）は、正に荷電した抗原（例えば、タンパク質）を吸着する。同様に、カチオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子））を用いて製造される微粒子は、負に荷電した分子（例えば、ＤＮＡ）を吸着する。吸着されるべき高分子が正電荷および負電荷の領域を有する場合、カチオン性またはアニオン性の界面活性剤が適切であり得る。
【００８６】
本発明とともに使用するための微粒子を製造するための生分解性ポリマーは、以下から簡便に市販されている：例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ  およびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ。例えば、本明細書における微粒子を形成するための有用なポリマーは、以下に由来するものを包含する：ポリヒドロキシブチル酸；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリ無水物；およびポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（本明細書において両方とも「ＰＬＡ」として知られる）、ポリ（ヒロドキシブチレート）、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（本明細書において「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」と指定される）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマー。本明細書における使用について特に好ましいポリマーは、ＰＬＡおよびＰＬＧのポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり。そして所定の使用のための適切な分子量は、当業者に容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００から５０００のオーダーにある。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般に、約１０，０００から約２００，０００の範囲にあり、好ましくは、約１５，０００から約１５０，０００の範囲にあり、そして最も好ましくは約５０，０００から約１００，０００の範囲にある。
【００８７】
コポリマー（例えば、ＰＬＧ）が微粒子を形成するために使用される場合、種々のラクチド：グリコリド比が本明細書において有用であり、そしてその比は大いに選択の問題であり、これは、同時投与される高分子および所望される分解速度に部分的に依存する。例えば、５０：５０  ＰＬＧポリマー（５０％のＤ，Ｌ−ラクチドおよび５０％グリコリドを含む）は、迅速な吸着コポリマーを提供するが、７５：２５  ＰＬＧ  は、よりゆっくり分解し、そして８５：１５および９０：１０は、なおいっそうゆっくりと分解する。これは、増加したラクチド成分に起因する。これは、適切な比のラクチド：グリコリドは、当業者によって、抗原の性質および問題の障害に基づいて容易に決定される。さらに、抗原またはアジュバントが微粒子に捕捉される本発明の実施形態において、変動するラクチド：グリコリドの比を有する微粒子の混合物は、本明細書において、所定の高分子について所望の放出反応速度論を達成するため、ならびに一次および二次の免疫応答の両方を提供するための用途を見出す。本発明の微粒子の分解速度はまた、ポリマーの分子量およびポリマーの結晶性のような因子によって制御され得る。変動するラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、以下を含む多数の供給源から市販される：Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ。これらのポリマーはまた、以下に記載されるような当該分野において周知の技術を用いて乳酸成分の単純な重縮合によって合成され得る：たばたら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７−８５８。
【００８８】
高分子／微粒子は、当該分野において周知のいくつかの方法のいずれかを用いて調製される。例えば、二重エマルジョン／溶媒エバポレーション技術（例えば、以下に記載されるもの：米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３は、本明細書において使用されて、微粒子が作製され得る。これらの技術は、以下からなる群より選択される一次エマルジョンの形成を包含する。これは、次いで、粒子安定化剤／表面活性剤を含む連続水相と混合される。
【００８９】
あるいは、以下に記載されるように、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒エバポレーション系を使用して、微粒子を形成し得る：Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２。この技術において、この特定のポリマーは、酢酸エチル、ジメチルクロリド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなどの有機溶媒と合わされる。このポリマーは、約１〜３０％、好ましくは約２〜１５％、より好ましくは約３〜１０％、そして最も好ましくは約４％の溶液中、有機溶媒中に提供される。このポリマー溶液は、例えば、ホモジナイザを用いて乳化される。次いで、このエマルジョンは、必要に応じて、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ならびにカチオン性、アニオン性または非イオン性の界面活性剤のようなエマルジョン安定剤の大容量の水溶液と合わせられる。このエマルジョンは、１を超えるエマルジョン安定剤および／または界面活性剤（例えば、ＰＶＡおよび界面活性剤の組合せ）と合わせられ得る。特定の高分子は、安定剤および／または界面活性剤の組合せを有する微粒子により容易に吸着され得る。エマルジョン安定剤が使用される場合、代表的には、約２〜１５％溶液、より代表的には約４〜１０％溶液中に提供される。一般に、約１から約０．１：１の範囲内の重量対重量での界面活性剤対ポリマーの比が使用され、より好ましくは、約０．００１：１から約０．０１：１の範囲、そしてさらにより好ましくは約０．００５：１から約０。０１：１の範囲内のものが使用され得る。次いで、この混合物は、ホモジナイズされて、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンが生成する。次いで、有機溶媒がエバポレートされる。
【００９０】
処方物のパラメータは、０．０５μｍ（５０ｎｍ）のオーダーの小さな微粒子からそれより大きな微粒子の５０μｍよりさらに大きなものへの調製を可能にするように操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、減少された攪拌は、より大きな微粒子を生じる。なぜなら、内部相の容量が増加するからである。小さな粒子は、高濃度のエマルジョン安定剤を有する水性相の容量を減らすことによって生成される。
【００９１】
微粒子はまた、以下のように形成され得る：例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されるようなスプレー乾燥およびコアセルベーションを用いる；Ｈａｌｌら、（１９８０）Ｔｈｅ  「Ｗｕｒｓｔｅｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓ」ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｔｈｅｏｒｙ、ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、第２巻、ｐｐ．１３３−１５４  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ  ａｎｄ  Ｄｅａｓｙ、Ｐ．Ｂ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９に記載されるようなパンコーティング（ｐａｎ  ｃｏａｔｉｎｇ）およびＷｕｒｓｔｅｒコーティングのような空気懸濁コーティング技術；ならびに例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８−９１０に記載されるようなゲル化。
【００９２】
粒子サイズは、例えば、レーザー光散乱によって、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを取り込んだ分光光度計を用いて測定され得る。一般に、粒子サイズは、室温で測定され、そして粒子の直径についての平均値を得るために問題のサンプルの複数の分析を包含する（例えば、５−１０回）。粒子のサイズはまた、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて容易に決定される。
【００９３】
本発明の代替の実施形態は、イオン表面活性剤を有するサブミクロンのエマルジョンを含む微粒子調製物である。ＭＦ５９または他のものは基本的な粒子として使用され得るが、イオン性表面活性剤は、以下を包含し得るがそれに限定されない：ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＥＰＣ）およびジオレオイル−ホスファチジン酸（ＤＰＡ）。これらは各々、スクアレン中で可溶性である。プロトタイプのイオン性エマルジョンは、４−５２ｍｇ／ｍｌスクアレンの範囲の濃度で、スクアレン／１０％Ｓｐａｎ８５中に界面活性剤の各々を溶解することによって処方され得る。スクアレン／表面活性剤混合物は、０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０／Ｈ2０と、５ｍｌスクアレン／１００ｍｌ  Ｈ2０で乳化され得る。予備エマルジョンは、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザを用いたホモジナイゼーション（５分、５０００ＲＰＭ）によって処方され得、そして最終のエマルジョンは、微小流動化によって作製され得る（約１０，０００ｐｓｉ、５回通過、微小流体化器  １１０Ｓ）。
【００９４】
調製後、微粒子は、そのまま保存され得るか、または将来の使用のために凍結乾燥され得る。微粒子に対して高分子を吸着させるために、その微粒子調製物は、目的の高分子と単に混合され、そして得られた処方物を再び使用前に凍結乾燥され得る。一般に、高分子を、その微粒子に添加して約１から０．２５：１の、好ましくは１から０．１の、より好ましくは、０．０１から０．０５の、高分子対微粒子の重量対重量比を有する吸着された高分子を有する微粒子を得る。微粒子の高分子含量は、標準的な技術を用いて決定され得る。
【００９５】
本発明の微粒子は、その中に捕捉またはカプセル化された高分子、およびそこに吸着された高分子を有し得る。従って、例えば、当業者は、本発明に従って、そこの吸着されたタンパク質を有するカプセル化されたアジュバントを有する微粒子、またはそこに吸着されたアジュバントを用いてカプセル化されたタンパク質を有する微粒子を調製し得る。
【００９６】
一旦高分子が吸着した微粒子が生成されると、その微粒子は、薬学的組成物またはワクチンへと処方されて、広汎で種々の障害を、上記に記載されるように処置、予防および／または診断する。その組成物は、一般に、１つ以上の薬学的賦型剤またはビヒクル（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を含有する。さらに、補助的物質（例えば、湿潤剤または乳化剤）、生物学的緩衝化物質などが、そのようなビヒクル中に存在し得る。生物学的緩衝液は、薬学的に受容可能であり、そして所望のｐＨ（すなわち、生理学的範囲のｐＨ）を有する処方物を提供する、実質的に任意の溶液であり得る。緩衝溶液の例は、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などを包含する。
【００９７】
アジュバントを使用して、薬学的組成物の有効性を向上させ得る。このアジュバントを、例えば、同じ組成物または別個の組成物中で、本発明の微粒子とともに同時に投与し得る。あるいは、アジュバントは、本発明の微粒子組成物の前または後に投与され得る。別の実施形態において、免疫学的アジュバントのようなアジュバントは、微粒子中でカプセル化され得る。アジュバントは、任意の高分子と同様に、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかを用いて微粒子中にカプセル化され得る。例えば、米国特許第３，５２３，９０７号；Ｏｇａｗａら、Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９  ａｎｄ  Ｊｅｆｆｅｒｅｙら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２を参照のこと。あるいは、アジュバントは、任意の高分子について上気されるようにその微粒子上に吸着され得る。あるいは、アジュバントは、本発明の油滴エマルジョンを含み得る。
【００９８】
免疫学的アジュバントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激剤のあるなし）（例えば、（ａ）Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ  微小流体化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いてサブミクロン粒子へと処方された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の亮のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含むが必要ではない）を含有する、ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）微小流体化されてサブミクロンエマルジョンとされたか、またはボルテックスされてより大きな粒子サイズのエマルジョンが生成された、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有する、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノリン脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）からなる群より選択される１つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）（本明細書における使用のための適切なサブミクロン水中油エマルジョンのさらなる議論については、以下の共有に係る特許出願番号を参照のこと：  ０９／０１５，７３６（１９９８年１月２９日出願））；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｑｕｉｌ  ＡまたはＱＳ２１（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ））が使用され得るか、またはそれからＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のような粒子が生成され得る）；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（６）無毒化した細菌ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）の変異体（特に、ＬＴ−Ｋ６３（ここで、リジンが６３位の野生型アミノ酸に取って代わる）、ＬＴ−Ｒ７２（ここで、アルギニンが７２位の野生型アミノ酸に取って代わる）、ＣＴ−Ｓ１０９（セリンが１０９位の野生型アミノ酸に取って代わる）およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（リジンが９位の野生型アミノ酸に取って代わり、グリシンが１２９位のものに取って代わる））、（例えば、国際公開番号Ｗ０９３／１３２０２  および  Ｗ０９２／１９２６５を参照のこと）；（７）ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび他の免疫刺激配列（ＩＳＳ）；ならびに（８）その組成物の有効性を向上させる免疫刺激剤として働く他の物質。ミョ���バンおよびＭＦ５９が好ましい。
【００９９】
ムラミルペプチドとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：
Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン  （ＭＴＰ−ＰＥ）など。
【０１００】
アジュバントのさらなる例について、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ、Ｍ．Ｊ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を参照のこと。
【０１０１】
この組成物は、「治療有効量」の目的の高分子を含む。すなわち、ある量の高分子／微粒子が組成物に含まれ、これは、症状を予防、低減、除去または診断するために、十分な応答を生成することを被検体を引き起こす。必要な正確な量は、とりわけ、処置される被検体；処置される被検体の年齢および一般状態；処置される状態の重篤度；免疫学的応答の場合における、被検体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される保護の程度、ならびに選択される特定の抗原およびその投与形態に依存して変動する。適切な有効量は、当業者に容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、慣用的な試行を通じて決定され得る比較的広範囲に入る。例えば、高分子がポリヌクレオチドである場合の本発明の目的について、有効用量は、代表的に、約１ｎｇから約１ｍｇの、より好ましくは約１０ｎｇから約１μｇの、そしてより好ましくは、約５０ｎｇから約５００ｎｇの、１用量あたりに送達される高分子の範囲であり；高分子が抗原である場合、有効用量は、代表的に、１μｇから約１００ｍｇの、より好ましくは約１０μｇから約１ｍｇの、そして最も好ましくは約５０μｇから約５００μｇの範囲の、１用量あたりに送達される高分子の範囲である。
【０１０２】
一旦処方されると、本発明の組成物は、非経口的に投与され得る（例えば、注射）。この組成物は、経皮的、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかで注射され得る。投与の他の形態は、経鼻、経口、および肺への投与、坐剤ならびに経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）ならびに塗布を包含する。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数回用量スケジュールは、主要な投与処置は、１から１０の別個の用量を用いてであり得、続いて他の用量が、引き続き治療応答をを維持および／または強制するために選択された時間間隔で与えられ得る（例えば、数カ月後に第二用量として１から４カ月で引き続きの用量）。この投薬レジメンはまた、少なくとも部分的に、被検体の必要によって決定され、そして実行者の判断に依存する。
【０１０３】
さらに、疾患の予防が所望される場合、ワクチンにおける高分子は、一般に、目的の病原体を用いた主要な感染の前に投与される。処置が所望される場合（例えば、再発の症状の減少）、高分子は、一般的に主要な幹線の後に投与される。
【０１０４】
（２．油滴エマルジョン）
本発明の別の実施形態において、油滴エマルジョンは、代謝可能な油および乳化剤を含ませて調製される。少なくとも１つのＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドのような分子は、油滴エマルジョンと合わせらて、アジュバントを形成し得る。油滴エマルジョンは好ましくは、代謝可能な油および乳化剤を含む。ここで、油および乳化剤は、油滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在する。この油滴は実質的にすべてが、直径１ミクロン未満である。そのような小滴は、油および乳化剤を含むアジュバント組成物よりも驚くほどの優越性を示す。ここで、油滴は、本発明によって提供されるものよりも有意に大きい。好ましい実施形態において、そのエマルジョンは、カチオン正解面活性剤が乳化剤として使用される結果として正に荷電されているか、または代替的に、乳化剤とは別個のカチオン性界面活性剤を含む。これは、ヌクレオチド抗原性分子（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはウイルスＤＮＡ）の吸着を可能にする。あるいは、アニオン性界面活性剤の使用は、タンパク質のような分子の吸着を可能にする。
【０１０５】
本発明のアジュバント組成物の個々の成分は公知であるが、そのような組成物は、同様の様式では組み合わされてこなかった。従って、個々の成分は、一般的におよび好ましい実施形態についていくらか詳細にの両方で以下に記載されているが、当該分野において周知であり、そして本明細書において使用される用語（例えば、代謝可能な油、乳化剤、免疫刺激剤、免疫刺激剤、ムラミルペプチド、および脂溶性ムラミルペプチド）は、さらなる説明なしに、当業者にとって、これらの化合物を記載することが十分に周知である。
【０１０６】
これらの組成物の１成分は、代謝可能な、非毒性油、好ましくは約６から約３０炭素原子の１つ（以下を含むがそれらに限定されない：アルカン、アルケン、アルキン、および対応する酸およびアルコール、それらのエーテルおよびエステル、ならびにそれらの混合物）である。その油は、植物油、魚油、動物油、または合成調製された油であって、アジュバントが投与される宿主動物の体内で代謝され得そしてその被検体にとって非毒性であるもののいずれかであり得る。宿主細胞は、代表的に、哺乳動物であり、そして好ましくはヒトである。ミネラルオイルおよび類似の毒性石油蒸留油は、本発明から明示的に除外される。
【０１０７】
本発明の油成分はまた、任意の長鎖アルカン、アルケンまたはアルキンまたはその酸もしくはアルコール誘導体（これは、遊離酸、その塩またはモノエステル、ジエステルもしくはトリエステルのようなエステル（例えば、とりグリセリドおよび１，２−プロパンジオールまたは類似のポリヒドロキシアルコール））であり得る。アルコールは、アミノ官能または多官能酸（例えば、酢酸、プロパン酸、クエン酸など）を用いてアシル化され得る。長鎖アルコールに由来するエーテルであって本明細書において使用される油でありそしてその他の基準を満たすものもまた使用され得る。
【０１０８】
個々のアルカン、アルケン、またはアルキンの部分およびその酸またはアルコール誘導体は、一般に、約６から約３０炭素原子を有する。この部分は、直鎖または分岐鎖の構造を有し得る。これは、完全に飽和され得、または１つ以上の二重結合もしくは三重結合を有し得る。モノエステルまたはポリエステルあるいはエーテルベースの油が使用される場合、約６から約３０炭素原子の限定は、個々の脂肪酸または脂肪アルコール部分に適用され、全体の炭素数には適用されない。
【０１０９】
任意の代謝可能な油、特に動物、魚または植物の供給源に由来するものが本明細書において使用され得る。その油は、投与される宿主によって代謝されることが必須であり、そうでなければ、その油成分は、腫瘍、肉芽腫または癌腫でさえ生じ得るか、または（動物医療で使用される場合）ワクチン摂取された鳥類および動物の肉が、代謝されない油が消費者に対して与え得る有害効果に起因してヒトでの消費に受容可能でなくなり得る。
【０１１０】
植物油の例示的供給源としては、堅果、種子および穀物種子（ｇｒａｉｎ）が挙げられる。ピーナツ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブが最も共通して利用可能である、堅果油を例示する。種子油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物種子油の群には、コーン油が最も容易に利用可能であるが、他の穀物の種子（例えば、コムギ、オーツムギ、ライムギ、イネ（コメ）、テフ、ライコムギなどもまた使用され得る。
【０１１１】
植物油を取得するための技術は十分に開発されており、そして周知である。これらおよび他の類似の油の組成は、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘに見出され得、そして植物、栄養および植物技術における原料物質である。
【０１１２】
グリセロールと１，２−プロパンジオールとの６から１０の炭素脂肪酸エステルは、種子油には天然に存在しないが、堅果および種子の油からの適切な出発物質の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。これらの生成物は、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）という名称で、ＰＶＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、４１６  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｂｏｏｎｇｏｎ、ＮＪなどから市販されている。
【０１１３】
動物供給源に由来する油もまた、本発明のアジュバントおよび免疫原性組成物において使用され得る。動物油および脂肪は、それらがトリグリセリドとして存在し、そして油または植物からの油よりも高い程度の飽和度を有するという事実に起因して、生理的な温度では通常固体である。しかし、その脂肪酸は、部分的または完全なトリグリセリドのサポニン化（遊離脂肪酸を提供する）によって動物から入手可能である。哺乳動物乳汁からの脂質および油は代謝可能であり、そしてそれゆえ、本発明の実施において使用され得る。分離、精製、サポニン化のための手段、および動物供給源から純粋な油を入手するたに必要な他の手順は当該分野で周知である。
【０１１４】
ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油（例えば、鯨脳）は、本明細書において使用され得る魚油のいくつかを例示する。多数の分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、そして一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）（これは、本明細書において特に好ましい）と呼ばれる分岐不飽和テルペノイドを含有する。スクアレンに対する飽和アナログであるスクアランもまた、特に好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野における公知の方法によって入手され得る。
【０１１５】
これらのアジュバントおよび免疫原性組成物の油成分は、約０．５容量％から約２０容量％の量で存在するが、好ましくは、１５％以下であり、特に約１％から約１２％である。約１％から約４％の油を使用することが最も好ましい。
【０１１６】
これらのアジュバント組成物の水性部分は、好ましくは緩衝化生理食塩水であるか、または好ましくは、純水である。これらの組成物は、非経口的投与について意図されることから、免疫原性組成物として最終の緩衝化された溶液を構成して、その等張性（すなわち、重量オスモル濃度）を、通常の生理学的流体と本質的に同じようにさせて、その組成物と生理学的流体との間の異なるイオン濃度について、その組成物の投与後の膨張または迅速な吸収を予防することが好ましい。通常の生理学的条件と適合するｐＨを維持するためにその生理食塩水を緩衝化することもまたこのましい。また、特定の場合において、糖ペプチドのような特定の組成物成分の安定性を確保するために特定のレベルでｐＨを維持することが必要であり得る。
【０１１７】
任意の生理学的に受容可能な緩衝剤は、本明細書において使用され得るが、リン酸緩衝剤が好ましい。他の受容可能な緩衝剤（例えば、酢酸、ｔｒｉｓ、重炭酸、炭酸など）も、リン酸緩衝剤の代替として使用され得る。水性成分のｐＨは、好ましくは、約６．０から８．０の間である。
【０１１８】
しかし、ミクロエマルジョンがまず調製される場合、純水が、エマルジョンの水性成分として好ましい。塩濃度を増加させることで、所望の小滴サイズを達成することはより困難となる。最終の免疫原性組成物がアジュバントから調製される場合、免疫原性の材料が適切な重量オスモル濃度で緩衝液中に添加されて、所望の免疫原性組成物を提供し得る。
【０１１９】
これらの組成物において使用される水性成分の品質は、その組成物の価値を均一へともたらすのに必要な量である。すなわち、１００％とするに十分な水性成分のある量が上記の列挙される他の成分とともに混合され、その組成物がある容量へともたらされる。
【０１２０】
乳化剤および懸濁剤のかなりの数が、一般に、医薬品科学で使用されている。これらとしては、天然に由来する物質（例えば、樹木からのゴム、植物タンパク質、糖ベースのポリマー（例えば、アルギネートおよびセルロース）など）が挙げられる。特定のオキシポリマーまたは炭素骨格に水酸化置換基もしくは他の親水性置換基を有するポリマーは、表面活性活性を有する（例えば、ポビドン、ポリビニルアルコール、およびグリコールエーテルベースの一官能および多官能の化合物）。長鎖の脂肪酸誘導化合物は、本発明において使用され得る、乳化剤および懸濁剤の第三の実質的なグループを形成する。上記の表面活性剤のいずれも、非毒性である限り有用である。
【０１２１】
本発明に従って使用され得る適切な乳化剤（表面活性剤または界面活性剤とも呼ばれる）の適切な例は、以下を包含する：
１．水溶性石鹸（例えば、高級脂肪酸（Ｃ10からＣ22）のナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびアルカノールアニモニウム（ａｌｋａｎｏｌａｎｉｍｏｎｉｕｍ）塩、および特にナトリウムおよびカリウムの獣脂およびココナッツ石鹸。
【０１２２】
２．アニオン性合成非石鹸界面活性剤。これは、有機硫酸反応産物の水溶性の塩に代表され得る。この産物は、その分子構造において、約８から約２２の炭素原子ならびに硫酸および硫酸エステルラジカルからなる群より選択されるラジカルを含むアルキルラジカルを有する。これらの例は、獣脂およびココナッツ石鹸に由来するナトリウムもしくはカリウムアルキル硫酸塩；アルキルグリセリルエーテルスルホン酸ナトリウム；ココナツ油脂肪酸モノグリセリドスルホン酸ナトリウムおよびココナツ油脂肪酸モノグリセリド硫酸ナトリウム；１モルの高級脂肪酸アルコールおよび約１から約６モルのエチレンオキシドの反応産物の硫酸エステルのナトリウムもしくはカリウム塩；アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホン酸ナトリウムまたはカリウム（１分子当たり１から約１０単位のエチレンオキシドを有する、およびここでそのアルキルラジカルは、約８から約１２の炭素原子を含む；イソエチオン酸でエステル化され、そして水酸化ナトリウムを用いて中和された脂肪酸の反応産物；メチルタウリド（ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミドのナトリウムまたはカリウム塩；ならびにＳＯ3スルホン化Ｃ10からＣ24のαオレフィンのナトリ
ウム塩およびカリウム塩。
【０１２３】
３．有機疎水性化合物とアルキレンオキシド基との縮合によって作製された非イオン性合成界面活性剤。代表的な疎水性基としては、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合産物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドとエチレンジアミドとの縮合産物、約８から約２２炭素原子を有する脂肪族アルコール、ならびに脂肪酸のアミドが挙げられる。
【０１２４】
４．非イオン性界面活性剤（例えば、アミンオキシド、ホスフィンオキシド、およびスルホキシド（これらは半極性の特徴を有する））。長鎖三級アミンオキシドの特定の例としては、以下が挙げられる：ジメチルドデシルアミンオキシドおよびビス−（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミン。ホスフィンオキシドの特定の例は、米国特許第３，３０４，２６３号（１９６７年２月１４日に発行）に見出され、そして以下を包含する：ジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメチル（２−ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシド。
【０１２５】
５．長鎖スルホキシド（式Ｒ1−ＳＯ−Ｒ2に対応するものを含む。ここで、Ｒ1およびＲ2は、置換されたアルキルラジカルまたは置換されていないアルキルラジカルであって、前者は約１０から約２８炭素原子を含有し、他方、Ｒ2は、１から約３炭素原子を含む）。これらのスルホキシドの特定の例としては、ドデシルメチルスルホキシドおよび３−ヒドロキシトリデシルメチルスルホキシドが挙げられる。
【０１２６】
６．両性合成界面活性剤（例えば、３−ドデシルアミノｄ−プロピオン酸ナトリウム、および３−ドデシルアミノプロパンスルホン酸ナトリウム）。
【０１２７】
７．双性イオン性合成界面活性剤（例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）プロパン−１−スルホネートおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホネート。
【０１２８】
さらに、以下の型の乳化剤のすべては、本発明の組成物中において使用され得る：（ａ）脂肪酸石鹸（すなわち、アルカリ塩）、ロジン（ｒｏｓｉｎ）酸、およびトールオイル；（ｂ）アルキルアレンスルホネート；（ｃ）アルキルスルフェート（分岐鎖および直鎖の疎水性基を有する表面活性剤、ならびに一次および二次のスルフェート基）；（ｄ）疎水性基と親水性基との間の中間体結合を含むスルフェートおよびスルホネート（例えば、脂肪アシル化メチルタウリドおよび硫酸化脂肪モノグリセリド；（ｅ）ポリエチレングリコールの長鎖酸エステル、特にトールオイルエステル；（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル；（ｇ）長鎖アルコールおよびメルカプタンのポリエチレングリコールエーテル；ならびに（ｈ）脂肪アシルジエタノールアミド。表面活性剤は、１つを超える様式で分類され得ることから、このパラグラフに開示される多数のクラスの表面活性は、以前に記載される表面活性剤クラスと重複する。
【０１２９】
生物学的状況のために特に設計され、そしてそこにおいて一般に使用される、多数の油乳化剤が存在する。例えば、多数の生物学的界面活性剤（表面活性剤）は、それ自体がＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙによってその１９８７  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓの３１０−３１６頁に列挙されている。そのような表面活性剤は、４つの塩基性型へと分割される：アニオン性、カチオン性、双性イオン性、および非イオン性。アニオン性界面活性剤の例は、以下を包含するがそれらに限定されない：アルギン酸、カプリル酸、コール酸、１−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、１−ドデカンスルホン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびタウロコール酸など。カチオン性界面活性剤は以下を包含するがそれらに限定されない：セトリミド（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド−ＣＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウム、ジメチル  ジオクトデシルアンモニウム（ＤＤＡ）ブロミド、ＤＯＴＡＰ、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルベンゼトニウム、および４−ピコリンドデシルスルフェートなど。双性イオン性界面活性剤の例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：３−  ［（３−  コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−ｌ−プロパンスルホネート（一般に、ＣＨＡＰＳと省略される）、３−［（コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］ヒドロキシ−ｌ−プロパンスルホネート  （一般に、ＣＨＡＰＳＯと省略される）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−ｌ−プロパンスルホネート、およびリゾ−α−ホスファチジルコリンなど。非イオン性界面活性剤の例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：デカノイル  −Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合物  （例えば、Ｌｕｂｒｏｌの商標名で販売される）、脂肪酸のポリオキシエチレンエーテル（特に、Ｃ12からＣ20の脂肪酸）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エーテル（例えば、Ｔｗｅｅｎの商標名で販売される）、およびソルビタン脂肪酸エーテル（例えば、Ｓｐａｎの商標名で販売される）など。正に荷電したエマルジョンを生じるアジュバント組成物の任意の成分は、例えば、上記のカチオン性界面活性剤のいずれかであり得る。あるいは、上記のカチオン性界面活性剤は、そのエマルジョンを正に荷電させるために上記の油滴エマルジョンのいずれかとともに使用され得る。
【０１３０】
界面活性剤の特に有用なグループは、ソルビタンベースの非イオン性表面活性剤である。これらの表面活性剤は、ソルビトールの脱水によって調製されて、１，４−ソルビタンを生じ、これは次いで、脂肪酸の１つ以上の等価物と反応される。脂肪酸置換された部分は、さらに、エチレンオキシドと反応されて表面活性剤の第二グループを形成し得る。
【０１３１】
脂肪酸置換されたソルビタン表面活性剤は、１，４−ソルビタンと、ラウリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、または類似の長鎖脂肪酸のような脂肪酸と反応させることによって作製されて、１，４−ソルビタンモノエステルである１，６−ソルビタンセスキエステルまたは１，４−ソルビタントリエステルを生じる。これらの表面活性剤についての一般的な名称は、例えば、以下を包含する：ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノエステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、およびソルビタントリオレエート。これらの表面活性剤は、ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名称で市販されている。通常、これには、種々のモノトリエステル、ジエステル、およびトリエステルで置換されたソルビタンとの間を識別する文字または数字の指定が伴う。
【０１３２】
ＳＰＡＮＳ（登録商標）およびＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の表面活性剤は、親水性であり、そして一般に油に可溶性もしくは分散性である。それらはまた、ほとんどの有機溶媒中で可溶性である。水中で、それらは、一般に、不溶性であるが分散性である。一般に、これらの表面活性剤は、１．８から８．６の間の親水性−親油性の平衡（ＨＬＢ）数を有する。そのような表面活性剤は、当該分野において公知の手段によって作製され得、または例えば、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥからＡＴＬＡＳ（登録商標）という登録商標で市販されている。
【０１３３】
表面活性剤の関連グループは、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリエステルを包含する。これらの材料は、エチレンオキシドを、１，４−ソルビタンモノエステルまたはトリエステルへと添加することによって調製される。ポリオキシエチレンの添加は、親油性ソルビタンモノエステルまたはトリエステルの表面活性剤を、親水性の表面活性剤に変換する。これは、水中で可溶性油分散性であり、そして有機液体において種々の程度で可溶性である。
【０１３４】
これらの材料は、ＴＷＥＥＮという名称で市販されており、水中油エマルジョンを調製するため、および油の可溶化をするため、ならびに無水軟膏水溶性または洗浄可能にさせるために有用である。ＴＷＥＥＮ表面活性剤は、関連するソルビタンモノエステルまたはトリエステル表面活性剤と合わせられて、エマルジョンの安定性を促進させ得る。ＴＷＥＥＮ表面活性剤は、一般に、９．６と１６．７との間のＨＬＢ値を有する。
【０１３５】
単独で、あるいはＳＰＡＮ（登録商標）、ＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）の表面活性剤と組み合わせて使用され得る、非イオン性表面活性剤の第三のグループは、長鎖脂肪酸とエチレンオキシドとの反応によって作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。最も一般的に利用可能なこの型の表面活性剤は、ＭＹＲＪ（登録商標）という商標の固体であり、そしてステアリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲＪ（登録商標）表面活性剤は、親水性であり、そしてＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性剤のように水中で可溶性もしくは分散性である。ＭＹＲＪ（登録商標）は、エマルジョンを形成する際に使用するために、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）／ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）混合物と混和され得る。ＭＹＲＪ（登録商標）表面活性剤は、当該分野において公知の方法によって作製され得るか、またはＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ  Ｉｎｃ  から市販されている。
【０１３６】
ポリオキシエチレンベースの非イオン性表面活性剤の第四のグループは、ラウリル、アセチル、ステアリル、およびオレイルのアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテルである。これらの材料は、上記のように、エチレンオキシドを脂肪アルコールへと添加することによって調製される。これらの表面活性剤についての商標名は、ＢＲＩＪ（登録商標）である。ＢＲＩＪ（登録商標）表面活性剤は、その表面活性剤中のポリオキシエチレン部分のサイズに応じて親水性であるかまたは親油性であり得る。これらの化合物の調製物は当該分野から入手可能であるが、それらはまた、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ  Ｉｎｃのような商業的供給源から容易に入手可能である。
【０１３７】
本発明の実施において潜在的に使用され得る、他の非イオン性界面活性剤は、例えば、以下である：ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エステル、ポリオキシエチレンを含む蜜蝋誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エステルまたは他のポリオキシエチレン酸アルコールまたは１２−２２炭素原子の長鎖脂肪酸のエーテル誘導体。
【０１３８】
本発明のアジュバントおよび免疫原性組成物は複数相系であることが意図されることから、約７から約１６の範囲のＨＬＢ値を有するエマルジョン形成非イオン性表面活性剤を選択することが好ましい。この値は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性剤のような単純な非イオン性表面活性剤の使用を通じて入手され得るか、またはソルビタンモノエステル、ジエステルまたはトリエステルベースの表面活性剤を有するような表面活性剤の混和物の使用によって達成され得る；ソルビタンエステルポリオキシエチレン脂肪酸；ポリオキシエチレンラノリン誘導体化表面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル；高ＨＬＢポリオキシエチレン脂肪エーテル表面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル表面活性剤；あるいはポリエチレン脂肪エーテル表面活性剤またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸。
【０１３９】
本発明の実施においてエマルジョン安定化させる非イオン性表面活性剤として単純な非イオン性表面活性剤を使用することがより好ましく、最も特定するとＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性剤である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０と称する表面活性剤は、他の様式では、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエートについてポリソルベートとしても知られているが、上記の表面活性剤の中で最も好ましい。
【０１４０】
十分な小滴サイズの減少は、０．０２重量％（ｗ／ｗ）から２．５重量％（ｗ／ｗ）で存在する表面活性剤を有することによって通常行われ得る。０．０５％から１％の量が好ましく、０．０１％から０．５％が特に好ましい。
【０１４１】
本発明の小滴が達成される様式は、本発明の実施にとっては重要ではない。サブミクロンの油滴が入手され得る１つの様式は、商業的乳化剤の使用による（例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡから入手されるモデル番号１１０Ｙ）。他の商業的乳化剤の例としては、Ｇａｕｌｉｎ  Ｍｏｄｅｌ  ３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ、Ｉｎｃ．、Ｅｖｅｒｅｔｔ、ＭＡ）およびＲａｉｎｎｉｅ  Ｍｉｎｉｌａｂ  Ｔｙｐｅ  ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄａｉｒｙ、Ｉｎｃ．、Ｈｕｄｓｏｎ、ＷＩ）が挙げられる。高剪断力の原理によって操作されるこれらの乳化剤は、高圧のもとで、小さな開口部を通じて液体を押しつけることによって開発される。モデル１１０Ｙ  が５，０００−３０，０００  ｐｓｉで操作される場合、１００−７５０  ｎｍの直径を有する油滴が提供される。
【０１４２】
油滴のサイズは、界面活性剤と油の比を変化させること（その比を増加させると小滴サイズが減少する）、圧力を操作する（操作圧力を増加すると小滴サイズは減少する）、温度（温度を上昇させると小滴サイズが減少する）、および両親媒性免疫刺激剤の添加（そのような薬剤を添加すると、小滴サイズが減少する）によって変動され得る。実際の小滴サイズは、特定の界面活性剤、油、および免疫刺激剤（あれば）ならびに選択された特定の操作条件によって変動する。小滴サイズは、サイズ変更する装置の使用（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  によって製造される市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ
Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  Ｎ４ＭＤ））によって確認され得、そしてそのパラメーターは、上記のガイドラインを用いて変動され得、その後、実質的に全ての小滴は１ミクロン未満の直径、好ましくは０．８ミクロン未満の直径、そして最も好ましくは０．５ミクロン未満の直径となる。実質的にすべてとは、少なくとも約８０％（数ベース）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８％を意味する。粒子サイズ分布は、代表的にはガウス分布であり、その結果、平均直径は、言及された限界よりも小さくなる。
【０１４３】
本発明は、好ましくは、先行技術文献において以前に教示される他の成分の非存在下で油エマルジョンを調製して、十分な免疫原性についてサブミクロンエマルジョン（すなわち、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えば、米国特許第４，７７２，４６６号および同第４，７７０，８７４号、ならびに欧州特許出願０  ３１５  １５３  Ａ２におけるアジュバントとともに使用することについて記載されるもの）とともに使用されることによって実施され得る。
【０１４４】
本発明のミクロエマルジョン組成物は、水中で代謝可能な油およびＰＯＰ−ＰＯＥコポリマー以外の乳化剤を含み得る。乳化剤は、何らかの特定の免疫刺激活性を有する必用はない。なぜなら、油組成物自身が、油滴がサブミクロン範囲にあるときにはアジュバントとして機能し得るからである。しかし、増加された免疫刺激活性は、公知の免疫刺激剤のいずれかをその組成物中に含ませることによって提供され得る。免疫刺激剤は、乳化剤および油とは別個であり得るか、または免疫刺激剤および乳化剤は１つのそして同じ分子であり得る。前者の状況の例としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような殺傷されたミコバクテリアおよびその細胞内成分と混合された代謝可能な油が挙げられる。さらなる免疫刺激物質としては、そのような細菌の細胞壁の成分であるムラミルペプチドを含み、そしてその誘導体を含む。乳化剤／免疫刺激剤を混合物の例は、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８８、１４１，１７２０−１７２７（この開示は本明細書においてその全体が参考として援用される）に記載される親油性ムラミルペプチドである。これらの材料は、塩基性のＮ−アセチルムラミルペプチド（親水性部分）（これは、免疫刺激基として作用する）を含むが、これはまた、得られる化合物に対して表面活性特徴を提供する親油性部分を包含する。そのような化合物、および他の型の両親媒性の免疫刺激物質は、免疫刺激剤および乳化剤の両方として作用し、そして本発明の実施において好ましい。さらに、本発明を実施することはまた、両親媒性免疫刺激性物質を、両親媒性ではない免疫刺激物質と組み合わせて使用することによって可能である。例は、本質的に置換されていない（すなわち、本質的に親水性の）ムラミルジペプチドと組み合わせた親油性ムラミルペプチドの使用である。
【０１４５】
好ましい油滴エマルジョンは、ＭＦ５９である。ＭＦ５９は、例えば、以下に記載される手順に従って作製され得る：Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５、Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ、Ｅｄｓ．、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２７７−２９６；Ｓｉｎｇｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９８，１６，１８２２−１８２７；Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９５，１３，１５５７−１５６２；ならびにＶａｌｅｎｓｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４，１５３，４０２９−３９、これらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０１４６】
他の油滴エマルジョンとしては以下が挙げられる：例えば、ＳＡＦ（１０％スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルジョンへと微小流体化されるか、またはボルテックスされてより大きな粒子サイズエマルジョンが生成される）、ならびにＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）（２％スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および以下からなる群より選択される１つ以上の細菌細胞壁成分を含む：一リン酸化リピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＪ）（本明細書での使用のために適切な水中油エマルジョのさらなる議論については、共有に係る、特許出願番号０９／０１５，７３６（１９９８年１月２９日出願）を参照のこと）。
【０１４７】
本発明のミクロエマルジョンを調製した後、高分子がそれに吸着されて、ミクロエマルジョンのアジュバント効果を増加させ得る。本発明の組成物のさらなる成分は、オリゴヌクレオチドである。これは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む。本明細書において使用される場合、用語「ＣｐＧモチーフ」とは、オリゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいい、これは、シトシンヌクレオチド、続いてグアノシンヌクレオチドを含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の従来のオリゴヌクレオチド合成を用いて調製され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変された骨格（例えば、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸）を含み、その結果、オリゴヌクレオチドへヌクレアーゼ耐性を付与する。改変された骨格は、当業者に周知である。好ましいペプチド核酸は、以下に詳細に記載されている：以下の米国特許第５，８２１，０６０号、第５，７８９，５７３号、第５，７３６，３９２号、および第５，７２１，１０２号、日本国特許公開１０−２３１２９０、欧州特許番号８３９，８２８、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４２７３５、ＷＯ９８／４２８７６、ＷＯ９８／３６０９８、ＷＯ９８／２７１０５、ＷＯ９８／２０１６２、ＷＯ９８／１６５５０、ＷＯ９８／１５６４８、ＷＯ９８／０４５７１、ＷＯ９７／４１１５０、ＷＯ９７／３９０２４、およびＷＯ９７／３８０１３、これらの開示は、その全体が参考として本明細書において援用される。
【０１４８】
このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約６と約１００との間のヌクレオチド、より好ましくは約８と約５０の間のヌクレオチド、最も好ましくは約１０と約４０の間のヌクレオチド。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、糖部分および窒素塩基部分の置換物を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、以下に開示される：Ｋｒｉｅｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８，９５，１２６３１−１２６３６、Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６，９３，２８７９−２８８３、Ｗｅｉｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７，９４，１０８３３−１０８３７、Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６，１６２３−１６３１，Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５５３−１５５５８、Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６，１５７，１８４０−１８４５、Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５６，４５７０−４５７５、Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６，１６７，７２−７８、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８，７９，８６６−８７３、Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７，１７５９−１７６４、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６，１５７、５３９４−５４０２、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８，１６０，４７５５−４７６１、Ｒｏｍａｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７，３，８４９−８５４、Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８，１６０，８７０−８７６、Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７，２７，２３４０−２３４４、Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８，１６，１２１６−１２２４、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０，５８９８−５９０６、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０２５５５，ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１６２４７、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１８８１０、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４０１００、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５５４９５，ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３７９１９、およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２５８１、これらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むが、複数のＣｐＧモチーフを含み得ることが理解されるべきである。
【０１４９】
好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようなヌクレオチド配列を含む：
【０１５０】
【化１】
2014169323.tif 000002
。本発明の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドはＣｐＧモチーフを含み、このＣｐＧモチーフは、モチーフの５’側で２個のプリンおよびモチーフの３’側で２個のピリミジンに隣接される。しかし、本明細書中に記載の油滴エマルジョンと組み合わせられる場合に、オリゴヌクレオチドがＴｈ１リンパ球刺激を増大させる限り、ＣｐＧモチーフを含む任意のオリゴヌクレオチドが本発明において使用され得ることが理解されるべきである。
【０１５１】
別の好ましい実施形態では、高分子は、ミクロエマルジョンに吸着した免疫原性ＤＮＡまたは免疫原性タンパク質である。このような吸着は、強力なアジュバント効果を有するミクロエマルジョンを作製する。
【０１５２】
本発明はまた、吸着された抗原性および／または免疫原性の分子を有する上記ミクロエマルジョンを含む免疫原性組成物に関する。アジュバント組成物は、一般的に、アジュバントと免疫原性組成物において使用される抗原性物質とを合わせる前に、上記成分から調製される。抗原または抗原性物質の用語は、以下を含む任意の物質をいう：動物の血流に対して外来性である場合に、このような動物の組織に接近するとすぐに特異的抗体の形成を刺激し、そしてインビボまたはインビトロにおいて同一抗体と特異的に反応する、タンパク質もしくはタンパク質−ポリサッカリド、タンパク質−リポポリサッカリド、ポリサッカリド、リポポリサッカリド、ウイルスサブユニット、ウイルス全体または細菌全体。さらに、これは、抗原に対するレセプターを有するＴ−リンパ球（好ましくは、Ｔｈ１リンパ球）の増殖を刺激し、そしてこのリンパ球と反応して、細胞性免疫と称される一連の応答を開始させ得る。
【０１５３】
ハプテンは、この抗原の定義の範囲内である。ハプテンは、その免疫学的特異性を決定する、抗原性分子または抗原性複合体の部分である。通常、ハプテンは、天然に存在する抗原の中のペプチドまたはポリサッカリドである。人工の抗原において、これはアルサニル酸誘導体のような低分子量物質であり得る。ハプテンは、インビボまたはインビトロにおいて、同一抗体またはＴリンパ球と特異的に反応する。代替的な記述子は、抗原性決定基、抗原性構造基およびハプテン基である。
【０１５４】
本発明の好ましい実施形態では、抗原性物質は、例えば、以下のようなウイルス由来である：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）および狂犬病ウイルス。好ましくは、抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、およびＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇからなる群から選択される。本発明の他の好ましい実施形態では、抗原性物質は、例えば、以下のような細菌由来である：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、コレラ、ジフテリア、破傷風、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、および百日咳。本発明の他の好ましい実施形態では、抗原性物質は例えば、マラリア寄生生物のような寄生生物由来である。本発明の別の好ましい実施形態では、抗原は本発明の微粒子の表面に吸着される。
【０１５５】
抗原は、当該分野において公知の方法によって産生され得るか、または商業的供給源から購入され得る。本発明の範囲内である抗原としては、以下が挙げられる：不活化したウイルス粒子全体、単離されたウイルスタンパク質およびタンパク質サブユニット、細胞全体および細菌、細胞膜および細胞壁タンパク質など。いくつかの好ましい抗原を以下に記載する。
【０１５６】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｒｇＤ２は、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞において産生される組換えタンパク質である。このタンパク質は短縮化された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）正常なアンカー領域を有し、これは組織培養培地中に分泌されるグリコシル化タンパク質を生じる。このｇＤ２は、ＣＨＯ培地において９０％より高い純度まで精製され得る。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｅｎｖ−２−３は、遺伝子操作されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて産生されるＨＩＶエンベロープタンパク質の組換え形態である。このタンパク質は、ＨＩＶ  ｇｐ１２０のタンパク質領域全体を表すが、酵母から精製される場合にはグリコシル化されず、そして変性する。ＨＩＶ  ｇｐ１２０は、上記のｇＤ２に類似の様式でＣＨＯ細胞において産生される、完全にグリコシル化された分泌形態のｇｐ１２０である。免疫原性組成物における使用に適切なさらなるＨＳＶ抗原は、ＰＣＴ公開ＷＯ８５／０４５８７およびＷＯ８８／０２６３４（これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用される）に記載される。アンカー領域を欠失する短縮化された表面抗原であるｇＢ抗原およびｇＤ抗原の混合物が特に好ましい。
【０１５７】
免疫原性組成物における使用に適切なインフルエンザ抗原は、市販されている。以下の実施例において使用され得る抗原としては、ＦＬＵＯＧＥＮ（登録商標）（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓより製造）、Ｄｕｐｈａｒ（Ｄｕｐｈａｒ  Ｂ．Ｖ．より製造）、およびインフルエンザワクチンバッチＡ４１（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｔｃｈ  Ａ４１）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｖａｃｃｉｎｏｇｅｎｏ  Ｐｏｚｚｉより製造）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
免疫原性組成物における使用に適切なマラリア抗原は、米国特許出願番号３３６，２８８（１９８９年４月１１日出願）、および米国特許第４，８２６，９５７号（これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１５９】
免疫原性組成物における使用に適切なさらなるＨＩＶ抗原は、米国特許出願番号４９０，８５８号（１９９０年３月９日出願）および公開された欧州特許出願番号１８１１５０（１９８６年５月１４日）（これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１６０】
免疫原性組成物における使用に適切なサイトメガロウイルス抗原は、米国特許第４，６８９，２２５号、米国特許出願番号３６７，３６３（１９８９年６月１６日出願）、およびＰＣＴ公開ＷＯ８９／０７１４３（これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１６１】
免疫原性組成物における使用に適切なＣ型肝炎ウイルスは、以下において記載される：ＰＣＴ／ＵＳ８８／０４１２５、公開された欧州特許出願番号３１８２１６（１９８９年５月３１日）、公開された日本国特許出願番号１−５００５６５（１９８８年１１月１８日出願）、カナダ国特許出願番号５８３，５６１、およびＥＰＯ３８８，２３２（これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用される）。異なるセットのＨＣＶ抗原が、欧州特許出願番号９０／３０２８６６．０（１９９０年３月１６日出願）および米国特許出願番号４５６，６３７（１９８９年１２月２１日出願）、およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０１３４８（これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１６２】
本発明の免疫原性組成物は、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、ペスト、ポリオ、狂犬病、ロッキー山紅斑熱、風疹、痘瘡、腸チフス（ｔｙｐｈｏｉｄ）、チフス（ｔｙｐｈｕｓ）、ネコ白血病ウイルス、および黄熱病を含むが、これらに限定されない疾患および感染に対して、鳥類および哺乳動物を免疫するために使用され得る。
【０１６３】
本発明の免疫原性組成物の組成は、有効量の抗原を使用する。すなわち、アジュバントと組み合わせて、免疫したウイルス、細菌、真菌類、マイコプラスマ、または寄生生物への引き続く曝露から被験体に防御を与えるように、被験体に特異的かつ十分な免疫学的応答（好ましくは、Ｔｈ１リンパ球応答）を生じさせる量の抗原が含まれる。
【０１６４】
本発明において使用され得る各々すべての抗原について特定の指針を提供する、単回用量の指示は割り当てられ得ない。抗原の有効量は、その固有の活性および純度の関数であり、そして慣用的な実験を通して当業者によって経験的に決定される。本発明のアジュバント組成物は、細胞全体（すなわち、ウイルス性免疫原性組成物）と組み合わせて使用され得、同様に、精製された抗原（すなわち、組換えＤＮＡ技術または合成によって調製されるタンパク質サブユニット免疫原性組成物もしくはペプチド免疫原性組成物）と組み合わせて使用され得ることが意図される。本発明のアジュバント組成物は安定であるので、抗原およびエマルジョンは、単純に振盪することによって混合され得る。他の技術（例えば、このアジュバントと抗原の溶液または懸濁液との混合物を小さな開口部（例えば、皮下注射針）に急速に通過させること）によって、有用な免疫原性組成物は容易に提供される。
【０１６５】
本発明に従う免疫原性組成物は、約１ナノグラム〜約１０００マイクログラムの核酸（好ましくは、ＤＮＡ（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのような））を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、約１〜約３５０マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、約１００マイクログラムの核酸を含む。当業者は、任意の所望される量の核酸を含む免疫原性組成物を容易に処方し得る。本発明に従う免疫原性組成物は、無菌性で、かつ発熱物質を含まずに提供される。免疫原性組成物は、単位投薬量形態で都合良く投与され得、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０）（この開示は、その全体において本明細書中で参考として援用される）に記載されるような、薬学分野において周知の任意の方法によって調製され得る。
【０１６６】
本発明はまた、宿主動物において免疫応答を刺激する方法に関する。この方法は、免疫応答を誘導するに有効な量の上記免疫原性組成物を動物に投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。好ましい投与経路としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：筋内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口、ならびに経皮的または吸入もしくは坐剤による。最も好ましい投与経路としては、筋内注射、腹腔内注射、皮内注射、および皮下注射が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態に従って、免疫原性組成物は、無針注入デバイス（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ）（これは周知であり、そして広範に入手利用可能である）を使用して、宿主動物に投与される。当業者は、本明細書の教示に従って、無針注入デバイスを使用し、個体の細胞に免疫原性組成物を送達し得る。
【０１６７】
本発明はまた、ウイルス感染、細菌感染、または寄生生物感染に対して宿主動物を免疫する方法に関し、この方法は、防御応答を誘導するに有効な量の上記免疫原性組成物を動物に投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。好ましい投与経路は、上記されている。宿主動物の予防的または治療的処置は、任意の病原体に指向し得るが、好ましい病原体としては、上記のウイルス病原体、細菌病原体、および寄生生物病原体が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。
【０１６８】
本発明はまた、宿主動物においてＴｈ１免疫応答を増大させる方法に関する。この方法は、Ｔｈ１免疫応答を誘導するに有効な量の上記免疫原性組成物を動物に投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。好ましい投与経路は、上記されている。当業者は、Ｔｈ１リンパ球、ならびにその応答および測定に容易に精通する。
【０１６９】
本発明は、単独または互いとの組み合わせにおいて免疫応答を誘発するために使用される吸着抗原を有する微粒子またはミクロエマルジョンの使用を意図する。すなわち、本発明は、吸着された抗原を有する微粒子、吸着された抗原または免疫刺激分子を有するミクロエマルジョン、および吸着された抗原を有する微粒子と吸着された抗原もしくは免疫刺激分子を有するミクロエマルジョンとの組み合わせを包含する。
【０１７０】
以下の実施例によって示されるように、吸着された高分子を有する本発明の微粒子は、強力な免疫応答を誘発する。さらに、本発明の油滴エマルジョンはまた、強力な免疫応答を誘発する。従って、吸着された高分子を有する本発明の微粒子と本発明の油滴エマルジョンアジュバントとの組み合わせは、免疫応答を誘発するための強力なツールである。本発明はさらに、本発明を明らかにするために意図された以下の実施例によって例示される。前述の例は、本発明を例示することを意味し、そして如何なる様式でも本発明を制限すると解釈されるべきではない。当業者は、本発明の精神および範囲内である変更を認識する。本明細書中で引用されるすべての参考文献は、それらの全体において本明細書中で参考として援用される。
【０１７１】
（Ｃ．実験）
以下は、本発明の実施についての特定の実施形態の例である。この例は、例示目的のために提供され、そして如何なる様式でも本発明の範囲を制限するように意図されない。
【０１７２】
用いられた数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするように努力がなされたが、当然のことながら、幾分かの実験誤差および偏差は許容されるべきである。
【０１７３】
（実施例１）
（エマルジョン安定剤としてＰＶＡを使用するブランク微粒子の調製）
ブランク微粒子（例えば、吸着された高分子または捕捉された（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）高分子を有さない）を、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用して、以下のように作製した。溶液は、以下を使用した：
（１）ジクロロメタン中の６％ＲＧ  ５０４  ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の１０％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（ＩＣＮ）。
【０１７４】
特に、１０ｍｌのポリマー溶液と１．０ｍｌの蒸留水とを合わせること、そしてＯｍｎｉ  ｂｅｎｃｈｔｏｐホモジナイザーを使用し、１０Ｋ  ｒｐｍにて１０ｍｍプローブと共に３分間ホモジナイズして、水／油（ｗ／ｏ）エマルジョンを形成することによって、この微粒子は作製された。このｗ／ｏエマルジョンを４０ｍｌの１０％ＰＶＡ溶液に添加し、そして３分間ホモジナイズして、水／油／水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンを形成した。このｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒のエバポレーションのために一晩攪拌しながら放置し、微粒子を形成する。形成された微粒子を、４回の遠心分離によって水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、今後の使用のために、この微粒子をＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒ整粒器でサイズ分類した。
【０１７５】
（実施例２）
（ＣＴＡＢを使用するブランク微粒子の調製）
ブランク微粒子を、ＣＴＡＢを使用して、以下のように作製した。溶液は、以下を使用した：
（１）ジメチルクロリド中の４％ＲＧ  ５０４  ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の０．５％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１７６】
特に、１２．５ｍｌのポリマー溶液と１．２５ｍｌの蒸留水とを合わせること、そしてＯｍｎｉ  ｂｅｎｃｈｔｏｐホモジナイザーを使用し、１０Ｋ  ｒｐｍにて１０ｍｍプローブと共に３分間ホモジナイズして、ｗ／ｏエマルジョンを形成することによって、この微粒子は作製された。このｗ／ｏエマルジョンを５０ｍｌの０．５％ＣＴＡＢ溶液に添加し、そして３分間ホモジナイズして、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成した。このｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒のエバポレーションのために一晩攪拌しながら放置し、微粒子を形成する。次いで、形成された微粒子を、３８μメッシュを通して濾過し、４回の遠心分離によって水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、今後の使用のために、この微粒子をＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒ整粒器でサイズ分類した。
【０１７７】
（実施例３）
（ＳＤＳを使用するブランク微粒子の調製）
ブランク微粒子を、ＳＤＳを使用して、以下のように作製した。溶液は、以下を使用した：
（１）ジメチルクロリド中の６％ＲＧ  ５０４  ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の１％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１７８】
特に、１２．５ｍｌのポリマー溶液と５０ｍｌのＳＤＳ溶液とを合わせること、そしてＯｍｎｉ  ｂｅｎｃｈｔｏｐホモジナイザーを使用し、１０Ｋ  ｒｐｍにて１０ｍｍプローブと共に３分間ホモジナイズすることによって、この微粒子は作製された。このエマルジョンを溶媒のエバポレーションのために一晩攪拌しながら放置した。今後の使用のために、形成された微粒子を、３８μメッシュを通して濾過し、４回の遠心分離によって水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、今後の使用のために、この微粒子をＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒ整粒器でサイズ分類した。
【０１７９】
（実施例４）
（ブランク微粒子へのタンパク質の吸着）
タンパク質を以下のように微粒子に吸着させた。
【０１８０】
（Ａ．ｐ５５ｇａｇの１％および３％の理論上負荷（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ
ｌｏａｄ））
１％および３％の理論上負荷を達成するために、実施例３においてのように生成された５０ｍｇの凍結乾燥したブランクＳＤＳ／ＰＬＧ微粒子を、Ｎａｌｇｅｎｅ遠心管内に配置し、そして１０ｍｌの２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９）をｐ５５ｇａｇタンパク質（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を含有する６Ｍ尿素と共に添加した：（ａ）１％の理論上負荷のために、１０ｍｌの５０μｇ／ｍｌのｐ５５ｇａｇ溶液を使用した；そして（ｂ）３％の理論上負荷のために、１０ｍｌの１５０μｇ／ｍｌのｐ５５ｇａｇ溶液を使用した。この混合物を、振盪させながら、室温にて一晩インキュベートした。翌日、微粒子を遠心分離し、そして塩基加水分解（ｂａｓｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）、次ぐビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）アッセイ（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によりタンパク質負荷を分析して、吸着した量を決定した。今後の使用のために、微粒子を１０ｍｌのホウ酸塩／６Ｍ尿素緩衝液で２回洗浄し、そして３０ｍｌの水で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【０１８１】
（Ｂ．ＨＣＶコア抗原（ＨＣＶ  ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）の１％の理論上負荷）
１％の理論上負荷を達成するために、５０ｍｇの凍結乾燥したブランクＳＤＳ／ＰＬＧ微粒子を、Ｎａｌｇｅｎｅ遠心管内に配置し、そして１０ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を単一ＨＣＶコアタンパク質（１０ｍｌの５０μｇ／ｍｌ  ＨＣＶコアタンパク質溶液；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を含有する６Ｍ尿素と共に添加した。この混合物を、振盪させながら、室温にて一晩インキュベートした。翌日、微粒子を遠心分離し、そして、塩基加水分解、次ぐビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によりＨＣＶ濃度についてタンパク質負荷を分析して、吸着した量を決定した。今後の使用のために、微粒子を３０ｍｌのクエン酸塩／６Ｍ尿素緩衝液で２回洗浄し、そして３０ｍｌの水で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【０１８２】
（実施例５）
（微粒子の吸着効率）
実施例４からの吸着タンパク質を有する凍結乾燥微粒子を、塩基加水分解を使用して、吸着されたタンパク質の合計について、以下のように分析した。１０ｍｇの凍結乾燥した吸着された粒子を、５％のＳＤＳを有する２ｍｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で４時間加水分解し、中和し、１：１０に希釈し、そしてＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、タンパク質含量について分析した。表１に示されるように、改変された表面を有する微粒子をＣＴＡＢおよびＳＤＳのような界面活性剤を用いて調製し、両方とも単独のＰＶＡを使用して作製される微粒子よりも効率的にタンパク質を吸着した。
【０１８３】
【表１】
2014169323.tif 000003
（実施例６）
（Ａ．ｇａｇ−吸着微粒子の免疫原性）
実施例４に記載されるように、ＰＶＡまたはＳＤＳを使用して生成されるｇａｇ−吸着微粒子、ならびに付随した微粒子を有さないｐ５５ｇａｇ単独（ネガティブコントロールとして）およびワクシニアｇａｇ−ｐｏｌコントロール（ポジティブコントロールとして）を、マウスに筋内投与した。この動物を７日目および１４日目に追加免疫した。投与された総用量を、表２および３に示す。最後の免疫の２週間後に脾臓を収集し、そしてＤｏｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３：８５７８−８５８３に記載のように、ＣＴＬ活性をアッセイした。
【０１８４】
リンパ球培養物を、以下のように調製した。免疫したマウス由来の脾臓細胞（ｓｃ）を、２４ウェルディッシュにおいて１ウェルあたり５×１０6細胞で培養した。これらの細胞のうち、１×１０6個を、１０μＭの濃度で３７℃にて１時間、合成エピトープ性ペプチド形態ＨＩＶ−１SF2タンパク質で感作し、洗浄し、そして熱非働化胎仔ウシ血清、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、抗生物質、および５％インターロイキン２（Ｒａｔ  Ｔ−Ｓｔｉｍ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を補充した２ｍｌの培養培地［５０％  ＲＰＭＩ  １６４０および５０％α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）］において残存する４×１０6個の未処理ｓｃと共に同時培養した。３日目および５日目に、１ｍｌの新鮮な培養培地で細胞に給餌（ｆｅｅｄ）し、そして６日目に細胞傷害性をアッセイした。
【０１８５】
細胞傷害性細胞アッセイを、以下のように実施した。51Ｃｒ放出アッセイにおいて使用されたＳｖＢＡＬＢ（Ｈ−２d）（ＳｖＢ）およびＭＣ５７（Ｈ−２b）標的細胞は、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ではなく、クラスＩ  ＭＨＣ分子を発現する。約１×１０6個の標的細胞を、５０μＣｉ（１Ｃｉ＝３７Ｇｂｐ）の51Ｃｒおよび合成ＨＩＶ−１ペプチド（１ｍＭ）を含有する２００μｌの培地中で６０分間インキュベートし、そして３回洗浄した。エフェクター（Ｅ）細胞と５×１０3個の標的（Ｔ）細胞とを、９６ウェルの丸底組織培養プレート中の２００μｌの培養培地において種々のＥ／Ｔ比率で４時間培養した。二連のウェルからの平均ｃｐｍを使用して、特異的な51Ｃｒ放出の％を算出した。
【０１８６】
表２および３に示されるように、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５微粒子は、ワクシニアコントロールに匹敵し得る活性を有しており、そしてＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５微粒子およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物よりも活性であった。詳細には、表２において示されるように、ｐ５５ｇａｇタンパク質は、１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇの濃度で不活性であった。さらに、表３において示されるように、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５処方物は、ＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物よりも活性であり、このことは、このタンパク質が、ＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物と比較してＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５処方物において、より効率的に微粒子に吸着されたことを示す。
【０１８７】
【表２】
2014169323.tif 000004
（実施例７）
（改変した表面を有するｐＣＭＶ  ｇｐ１２０  ＤＮＡ吸着微粒子の調製）
吸着したｇｐ１２０をコードするプラスミドＤＮＡを有する微粒子を以下のように調製した。２０ｍｇのブランクの微粒子を、実施例１および２に記載するように調製し、これを４℃にて３時間１．０ｍｌ容積中で、ｐＣＭＶ  ｇｐ１２０
ＤＮＡの増加濃度でインキュベートした。インキュベーション後、この微粒子を遠心分離し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で２回洗浄し、そして一晩凍結乾燥した。この微粒子を実施例５に記載するように加水分解し、そしてＡ260ｎｍで吸着したＤＮＡの量について
分析した。
【０１８８】
表４は、ＰＬＧ−ＰＶＡおよびＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子の負荷効率を図示する。この表に示すようにＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子は、対応するＰＬＧ−ＰＶＡ粒子よりも効果的に吸着する。
【０１８９】
【表４】
2014169323.tif 000005
（実施例８）
（ＨＣＶ−Ｅ２吸着）
微粒子を、先の実施例に記載するように、ＰＶＡおよびいくつかの異なる界面活性剤を使用して調製した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＥ２タンパク質を以下のように微粒子の表面上に吸着させた：０．２ｍｇ／ｍｌのＥ２を、ＰＢＳ中で２０ｍｇの微粒子に添加し、全容量０．５ｍｌ中の０．５％ｗ／ｗ  Ｅ２／ＰＬＧでの溶液を形成した。この溶液を３７℃にて１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。上清を収集し、次いでｍｉｃｒｏＢＣＡによりタンパク質含有量のついて測定した。この結果を表５に示す。この結果は、本発明の微粒子による高分子の優れた吸着を確認した。
【０１９０】
【表５】
2014169323.tif 000006
（実施例９）
（ｇｐ１２０タンパク質の吸着）
微粒子を、先の実施例に記載するようにＰＶＡを使用して、調製した。微粒子をまた、以下のように、ＮａＯｌｅａｔｅ、陰イオン性界面活性剤を使用して調製した：ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、内部水相として１．６７ｍｌの３０ｍＭのＮａＣｉｔｒａｔｅ（ｐＨ６）、溶媒として１６．７ｍｌのジクロロメタン中の６％ポリマーＲＧ  ５０５  ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）（油相）、および外部水相として６６．８ｍｌの０．４％ＮａＯｌｅａｔｅを用いて調製した。これらの微粒子を、「ＮａＯｌｅａｔｅ−ＰＬＧ（ｗ／ｏ／ｗ）」として以下の表６に表す。さらに、微粒子を、水中に油の製剤形態で、ＮａＯｌｅａｔｅを使用して調製し、そしてこれらの微粒子を「ＮａＯｌｅａｔｅ−ＰＬＧ（ｏ／ｗ）」として以下の表６に表す。ｇｐ１２０タンパク質を、以下のように、調製した微粒子の表面に吸着させた：０．３８８ｍｇ／ｍｌのタンパク質をＰＢＳ中の約２０ｍｇの微粒子に添加し、総容量０．８ｍｌ中の約１．４％ｗ／ｗのｇｐ１２０／ＰＬＧでの溶液を形成した。この溶液を、３７℃にて１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。上清を収集し、次いでｍｉｃｒｏＢＣＡによりタンパク質含有量について測定した。結果を表６に示す。この結果は、本発明の微粒子による高分子の優れた吸着を確認した。
【０１９１】
【表６】
2014169323.tif 000007
（実施例１０）
（リステリオリジン（ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）タンパク質の吸着）
微粒子を、先の実施例に記載するようにＰＶＡおよびＣＴＡＢを使用して調製した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のリステオリジンタンパク質（ＬＬＯ）を、以下のように微粒子の表面上に吸着させた：１．０ｍｇ／ｍｌのＬＬＯをＰＢＳ中の１００ｍｇの微粒子に添加し、総容量５ｍｌ中の１％ｗ／ｗ  ＬＬＯ／ＰＬＧでの溶液を形成した。この溶液を３７℃にて１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。上清を収集し、次いでｍｉｃｒｏＢＣＡによりタンパク質含有量について測定した。結果を表７に示す。この結果は、本発明の微粒子による高分子の優れた吸着を確認した。
【０１９２】
【表７】
2014169323.tif 000008
（実施例１１）
（アジュバントとしてのアルミニウム塩の効果）
ｐ５５ｇａｇＤＮＡ吸着ＰＬＧ微粒子をＣＴＡＢを使用して上記のように調製した。この微粒子を２種類の濃度でマウスに筋肉内注射し、そしてコントロールとして、ＤＮＡのみを同じ２種類の濃度で注射した。さらに、ある試験で、５０μｇのリン酸アルミニウムを注射したＣＴＡＢ組成物に添加した。各処方物を１０匹のマウスに注射した。このマウスを２８日後にブーストした。二度目の免疫化の２週間後、血清を収集し、そして標準誤差（ＳＥ）と一緒に、各血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を測定した。この結果を表８で要約し、一次的な値および対数値の両方で表す。各数は、１０匹のマウスから得た結果の平均である。
【０１９３】
【表８】
2014169323.tif 000009
これらの結果を統計学的に比較するために、各々についてＰ−値を求めた：ＤＮＡ−ＣＴＡＶ  対  ＤＮＡ−ＣＴＡＢ＋ＡＬＵＭ（Ｐ−値＝０．００１７）；ＤＮＡ−ＣＴＡＢ＋ＡＬＵＭ  対  ＤＮＡのみ（Ｐ−値＜０．０００１）；およびＤＮＡ−ＣＴＡＢ（１０μｇ）  対  ＤＮＡのみ（１０μｇ）（Ｐ−値＜０．０００１）。これらのＰ−値は、表８中の値の統計学的有意性を確認した。
【０１９４】
（実施例１２）
（ζ電位の測定）
ζ電位の測定をＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ  ３３１１６製のＤＥＬＳＡ  ４４０  ＳＸ  ゼータサイザー（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）で行った。このシステムを、Ｃｏｕｌｔｅｒ製の移動度標準物質（ＥＭＰ  ＳＬ７、ポリスチレンラテックスビーズの水性懸濁液）を使用して較正した。滅菌水でサンプルセルをリンスした後、サンプルをサンプルセルに添加した。次いで、ビームをその最も低い値に合わせることにより計数器をゼロに設定した。参照について電流を０．７ｍＡ、そしてサンプルについて２０Ｖに設定した。４つ全てのビームからの検出器レベルを確認し、次いでソフトウエアから「ｒｕｎ」を選択することによりサンプルを実行し、そして周波数測定を読み出した。このビームは２０Ｈｚ離れているべきである。次いで、各サンプルについて平均ζ電位を読み出す。
【０１９５】
本発明のいくつかの微粒子処方物についての測定を読み出し、そして結果を表９に示す。結果が示すように、高分子の微粒子表面への吸着が微粒子のζ電位を変化させる。
【０１９６】
【表９】
2014169323.tif 000010
（実施例１３）
（カプセル化した高分子および吸着した高分子を有する微粒子）
（Ａ）．ＰＬＧ微粒子を、ＲＧ５０５ＰＬＧおよびＰＶＡを使用して調製し、そしてこれは、アジュバントＬＴＫ６３をカプセル化する。１００ｍｇの微粒子を４００μｇ／ｍｌのｐ２４ｇａｇタンパク質を含む５ｍｌのＰＢＳとインキュベートした。次いで、この混合物を一晩室温で揺り動かしながらインキュベートし、遠心分離することにより２０ｍｌのＰＢＳで２回、そして水で１回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。塩基性加水分解および中和後、吸着したタンパク質％およびカプセル化したアジュバント％を測定し；結果を表１０に表す。
【０１９７】
（Ｂ）．ＰＬＧ微粒子を、以下のように、ＳＤＳおよびＲＧ５０５ＰＬＧを使用して調製し、そしてこれは、アジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドをカプセル化する：５ｍｌのＤＣＭ中の６％ＲＧ５０５ポリマーを、０．５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ中の５ｍｇ／ｍｌのＣｐＧと乳化し、ｗ／ｏエマルジョンを形成した。このｗ／ｏエマルジョンを２０ｍｌの１％ＳＤＳに添加し、次いで乳化し、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成した。微粒子を、一晩、溶媒エバポレーションにより形成し、次いで洗浄し、遠心分離し、そして乳化した。１０ｍｇのＣｐＧ−カプセル化微粒子を１ｍｌのＤＣＭに溶解した。０．５ｍｌの水を抽出オリゴヌクレオチドに添加し、次いで混合物を遠心分離し、そして水層を移動相としてＰＢＳでサイズ排除カラム上に注入した。１０ｍｇのプラセボ微粒子を１００μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合し、そしてＤＣＭで上記のように抽出し、そして標準物質としてカラム上に流した。粒子中に存在する閉じ込められたＣｐＧオリゴヌクレオチドの量を、標準物質に対して算出した。
【０１９８】
ｐ５５ｇａｇを以下のようにＣｐＧ−カプセル化微粒子上に吸着した：５０ｍｇの乳化したＣｐＧ−カプセル化微粒子を、１４０μｇのｐ５５ｇａｇタンパク質を含む６Ｍウレア（ｐＨ９）と５ｍｌの２５ｍＭ  ホウ酸塩と共に一晩インキュベートした。この混合物を室温で一晩揺り動かしながらインキュベートし、２０ｍｌのホウ酸緩衝液／６Ｍウレアで２回、そして２０ｍｌの水で２回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。
【０１９９】
１０ｍｇのＣｐＧ−カプセル化／ｐ５５ｇａｇ吸着した微粒子を、塩基加水分解し、そして取り込んだ高分子％および吸着した高分子％を測定した。他に記載しない限り、目標の負荷は、１．０％であった。結果を表１０に表す。
【０２００】
【表１０】
2014169323.tif 000011
（実施例１４）
（２種類の吸着高分子を有する微粒子）
（Ａ）．本発明に従って、２種類以上の高分子を、両方の高分子を吸着している微粒子を含む組成物中に投与し得るか、または各々単一の高分子を吸着している、２種類以上の異なる微粒子を含む組成物中に投与し得る。例えば、以下のように、微粒子を調製し、これは、Ｅ２ポリペプチドおよびアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドの両方を吸着している：ブランクのＰＬＧ−ＣＴＡＢを先に記載したように調製した。２０ｍｇの乳化した微粒子を生理食塩水中の１ｍｌの２００μｇ／ｍｌのＥ２と４時間インキュベートした。この混合物を室温で４時間揺り動かし、１０，０００Ｇで遠心分離することにより２０ｍｌの正常な生理食塩水で２回洗浄し、そしてペレットを、室温で４時間、２００μｇ／ｍｌのＣｐＧを含む１ｍｌのＴＥ緩衝液中のＣｐＧ溶液に再懸濁した。最後の上清を、遠心分離することによりＴＥ緩衝液で２回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。１０ｍｇの吸着したＣｐＧおよびＥ２を有する微粒子を塩基加水分解し、そしてタンパク質濃度をＢＡＣにより決定し、そして上清中の残りの量のＣｐＧをＨＰＬＣにより分析し、微粒子上に吸着したＣｐＧの量を測定した。結果を表１１に表し、これは、両方の微粒子についてポジティブな吸着を示す。
【０２０１】
（Ｂ）．微粒子を本発明に従って調製した。一部をＥ２ポリペプチドを吸着するために使用し、一方、他部分をアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドを吸着するために使用した。ブランクのＰＬＧ−ＣＴＡＢを先に記載するように調製した。２０ｍｇの凍結乾燥した微粒子を生理食塩水中の１ｍｌの２００μｇ／ｍｌのＥ２と４時間インキュベートした。この混合物を室温で４時間揺り動かし、１０，０００Ｇで遠心分離することにより、２０ｍｌの正常な生理食塩水で２回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。別々に、２０ｍｇの凍結乾燥した微粒子をＴＥ緩衝液中の１ｍｌの２００μｇ／ｍｌのＣｐＧと４時間インキュベーションした。この混合物を室温で４時間揺り動かし、２０ｍｌのＴＥ緩衝液と１０，０００Ｇで遠心分離することにより２回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。吸着した高分子のパーセントの測定の結果を表１１に現す。
【０２０２】
【表１１】
2014169323.tif 000012
（実施例１５）
（界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）とＰＶＡの組み合わせを使用して形成された微粒子）
以下の手順を使用して、２種類の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を含む微粒子を形成した：ＰＶＡおよび界面活性剤：１０ｍｌのＤＣＭ中の５％ＰＬＧポリマーおよび０．２％の界面活性剤ＤＯＴＡＰを１．０ｍｌの蒸留水と３分間１２，０００ｒｐｍで乳化し、第１のｗ／ｏエマルジョンを形成した。このｗ／ｏエマルジョンを４０ｍｌの０．８％ＰＶＡに添加し、そして３分間乳化し、第２のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成した。この第２のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを一晩攪拌し、溶媒をエバポレートし、そして微粒子を形成した。この微粒子を蒸留水中で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、この微粒子を本発明に従って、高分子の吸着に用意した。
【０２０３】
同じ手順を使用して、ＰＶＡおよび界面活性剤ＤＤＡの組み合わせを含む微粒子を形成した。
【０２０４】
（実施例１６）
（吸着したｐ５５ＤＮＡを有する微粒子の免疫原性）
微粒子を界面活性剤ＣＴＡＢまたはＤＤＡを使用して、先の実施例のように形成した。ｐ５５ＤＮＡを微粒子へ吸着させ、そして免疫原性を先の実施例に記載する手順を使用して評価した。結果を以下の表１２に要約する。
【０２０５】
【表１２】
2014169323.tif 000013
（実施例１７）
（吸着したルシフェラーゼＤＮＡを有する微粒子を使用したインビボルシフェラーゼ発現）
微粒子をＰＬＧおよび界面活性剤ＣＴＡＢを使用して、上記の手順を使用して形成した。ルシフェラーゼＤＮＡを先に記載の方法を使用して、これらの微粒子上に吸着させた。５μｇ用量のルシフェラーゼＤＮＡを使用するインビトロルシフェラーゼ発現を、ルシフェラーゼＤＮＡのみ（１２４８ｐｇ）および上に吸着したルシフェラーゼＤＮＡを有する微粒子（２２５０ｐｇ）を使用して測定した。インビボでのルシフェラーゼ発現を、以下のように投与後１日および１４日目に筋肉において測定した：２つの群のマウス（ｎ＝５）を５０μｇのルシフェラーゼプラスミドまたは５０μｇのＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ルシフェラーゼＤＮＡ微粒子のどちらかで各々注射した。マウスの両方の群を２本の肢で前脛骨（ＴＡ）筋に筋肉内注射した。２つの群における各マウスからの両方のＴＡ筋肉を、１日または１４日のどちらかで採取し、そして−８０℃冷凍庫中で保存した。この筋肉を、ドライアイス上で乳鉢と乳棒ですった。粉状にした筋肉を、０．５ｍｌの１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒでエッペンドルフチューブに収集した。このサンプルを室温にて１５分間ボルテックスした。３回の凍結／吸引後、サンプルを１０分間１４，０００ｒｐｍでスピンした。各マウスのＴＡ筋の上清を各時点でプールし、そして２０ｕｌのサンプルをルシフェラーゼ発現について強化閃光下で、ＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を使用してアッセイした。
【０２０６】
ルシフェラーゼ決定を化学発光アッセイを使用して行った。緩衝液を調製し、これは、１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む。１０ｍｇ／ｍｌでルシフェラーゼ酵素ストック（Ｐｒｏｍｅｇａ）を標準物質として使用して、５００ｐｇ／２０ｕｌの濃度に希釈した。この標準物質を１：２に連続的に希釈し、Ｍｉｃｒｉｌｉｔｅ２プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に落とし、標準曲線を作成した。２０μｌのブランクおよびサンプルをまた、プレート上に置き、１：２に連続的に希釈した。このプレートをＭＬ３０００中に置き、そこで１００ｕｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ
Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルごとに注入した。強化閃光下で相対的光ユニットを各サンプルについて測定した。
【０２０７】
結果を、表１３において以下に作表する。
【０２０８】
【表１３】
2014169323.tif 000014
（実施例１８）
（吸着した抗原  対  包括した抗原を用いる微粒子の免疫原性）
微粒子を、先の実施例において議論した手順を用いて調製した。次いで、Ｅ２タンパク質を、上記のようにその上に吸着させた。Ｅ２を用いて、その上に吸着させるのではなく、その中に包括させた微粒子もまた、上記のように調製した。この微粒子を、各型の微粒子を用いる１０匹のマウスの免疫後にＩｇＧ抗体を誘導するそれらの能力について評価した。各マウスからの血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を測定し、次いで、１０匹の動物のグループについて平均した。標準誤差（ＳＥ）もまた計算した。フィッシャーのＰＬＳＤ（有意性レベル５％）をｐ＝０．０００６で測定した。その結果を以下の表１４に示す。この結果は、本発明の吸着した微粒子を使用する体液性免疫応答の卓越した誘導を明確に実証する。
【０２０９】
【表１４】
2014169323.tif 000015
（実施例１９）
（ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２タンパク質を吸着した微粒子の免疫原性）
ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子を、先の実施例において議論した手順を用いて調製した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）からのＥ１Ｅ２タンパク質をその上に吸着させた。その粒子を、ミョウバンアジュバントのあるなしで、１０μｇまたは１００μｇのタンパク質のいずれかを提供するように計算された微粒子の投薬量でマウスを免疫するために使用した。相乗平均力価を計算し、そしてその結果を以下の表１５に示す。
【０２１０】
【表１５】
2014169323.tif 000016
この結果が示すように、タンパク質を吸着した微粒子は、１０μｇ用量で卓越した免疫応答を産生する。このことは、この微粒子が、遊離のＤＮＡがこのような応答を生成することができない、低い用量で免疫応答を誘発する際に有用である利点を有することを実証する。
【０２１１】
（実施例２０）
（ｐ２４ｇａｇタンパク質を吸着した微粒子の免疫原性）
ＰＬＧ−ＰＶＡ微粒子を、先の実施例に議論した手順を用いて調製した。次いで、タンパク質ｐ２４ｇａｇを、上記のようにその上に吸着させた。その微粒子を、１０匹のマウスの免疫後にＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ２ａ抗体を誘導するそれらの能力について評価した。２回目の免疫後２週間（２ｗｐ２）マウスおよび３回目の免疫後２週間（２ｗｐ３）のマウスから収集した血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を測定し、次いで、１０匹の動物のグループについて平均した。標準誤差（ＳＥ）もまた計算した。その結果を以下の表１６に示す。この結果は、本発明の吸着した微粒子を使用する体液性免疫応答の卓越した誘導を明確に実証する。
【０２１２】
【表１６】
2014169323.tif 000017
（実施例２１）
（ｐ５５ｇａｇタンパク質および種々のアジュバントのＩＭ免疫）
ＰＬＧ／ＣＴＡＢ、ＰＬＧ／ＳＤＳ、およびＰＬＧ／ＰＶＡ微粒子を、先の実施例において上記に記載したように形成した。微粒子上に吸着した抗原ｐ５５ｇａｇタンパク質を用いてマウスを免疫すること  対  遊離の可溶性ｐ５５ｇａｇを提供することの異なる効果を分析するために、そして、他の微粒子上にもまた吸着したか、あるいは可溶性形態で供給されるかの、アジュバントＣｐＧ（ＣｐＧモチーフを有する２０塩基長の一本鎖オリゴヌクレオチド）を有することの効果を決定するために、微粒子の８つのグループを作製した。異なるグループは以下のように調製した：
グループ１は、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した可溶性ｐ５５ｇａｇタンパク質（２Ｍ  尿素を有するｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液中で２ｍｇ／ｍｌで酵母において産生された組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質）を使用した。
【０２１３】
グループ２は、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した、ｐ５５ｇａｇが吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０２１４】
グループ３は、遊離のＣｐＧと混合した、ｐ５５ｇａｇが吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０２１５】
グループ４は、ｐ５５ｇａｇが吸着し、アジュバントを有さないＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０２１６】
グループ５は、ＣｐＧが吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した、ｐ５５ｇａｇが包括されたＰＬＧ／ＰＶＡ粒子を使用した。
【０２１７】
グループ６は、コントロールであり、抗原を使用せず、そして可溶性ＣｐＧを使用した。
【０２１８】
グループ７は、別のコントロールであり、可溶性ｐ５５ｇａｇタンパク質を使用し、そしてアジュバントを使用しなかった。
【０２１９】
グループ８は、別のコントロールであり、ｇａｇ遺伝子を発現するワクシニアウイルス（ｖｖ  ｇａｇ）のみを使用し、アジュバントを使用しなかった。
【０２２０】
各グループについて、１０匹のマウスを、十分な量の微粒子または遊離の分子で免疫し、その結果、グループ８（これは、１０×１０7ｐｆｕの用量で使用した）を除いて、ｐ５５ｇａｇ抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量は各２５μｇである（グループに存在する場合）。免疫の経路は、グループ８（この経路はＩＰである）を除いて、ＩＭであった。免疫後、血清抗ｐ５５  ＩｇＧ力価を測定し、その結果は以下の表１７Ａに見られる（３ｗｐ２、２回目の免疫３週間後）。表１７Ｂは、アイソタイプであるＩｇＧ１成分およびＩｇＧ２ａ成分の分析を提供し、これは、ＩｇＧ２Ａ／ＩｇＧ１の比を含む。ＣＴＬによる標的の溶解はまた、各グループを用いて測定された。それらの結果は、以下の表１８Ａおよび１８Ｂに見られる（２つの別々の実験）。
【０２２１】
【表１７Ａ】
2014169323.tif 000018
【０２２２】
【表１７Ｂ】
2014169323.tif 000019
【０２２３】
【表１８Ａ】
2014169323.tif 000020
aＳｖＢ細胞株を、関連性のないペプチドでパルスした
bＳｖＢ細胞株を、ｐ７ｇペプチドでパルスした
【０２２４】
【表１８Ｂ】
2014169323.tif 000021
aＳｖＢ細胞株を、関連性のないペプチドでパルスした
bＳｖＢ細胞株を、ｐ７ｇペプチドでパルスした
（実施例２２）
（ｐ５５ｇａｇタンパク質またはｐ５５  ＤＮＡおよび種々のアジュバントのＩＭ免疫）
ＰＬＧ微粒子を、以前に上記で記載されるように形成した。微粒子のグループを、微粒子に吸着したｐ５５  ｇａｇタンパク質でマウスを免疫すること  対  遊離の可溶性ｐ５５ｇａｇを提供することの異なる効果を分析するため、および、他の微粒子上にまた吸着したか、または遊離の可溶性形態で提供したかのアジュバントＣｐＧ（ＣｐＧ１またはＣｐＧ２、異なるオリゴヌクレオチドのグループを表す）を有する効果を決定するために作成した。１０匹の動物のグループを、以下のようにして異なる処方で免疫した：
グループ１は、ｐ５５ｇａｇタンパク質（２Ｍ  尿素を有するｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液中で２ｍｇ／ｍｌで酵母において産生された組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質）と混合した、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２２５】
グループ２は、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子と混合した、ＣｐＧ１を吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２２６】
グループ３は、遊離のＣｐＧと混合した、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０２２７】
グループ４は、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着し、アジュバントを有さないＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０２２８】
グループ５は、ＣｐＧ１が吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子およびＰＶＡ／ｐ５５ｇａｇタンパク質が包括されたＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２２９】
グループ６は、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子と混合した、ＣｐＧ２を吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子である。
【０２３０】
グループ７は、コントロールであり、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子およびブランクＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を使用する。
【０２３１】
グループ８は、別のコントロールであり、遊離のＣｐＧ２のみを使用する。
【０２３２】
グループ９は、別のコントロールであり、遊離のＣｐＧ１のみを使用する。
【０２３３】
グループ１０は、別のコントロールであり、遊離の可溶性ｐ５５ｇａｇタンパク質１のみを使用する。
【０２３４】
各グループについて、１０匹のマウスを、十分な量の微粒子または遊離の分子で免疫し、その結果、ｐ５５ｇａｇ抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量は各２５μｇであった（そのグループに存在する場合）。免疫の経路はＩＭ  ＴＡであった。免疫後、血清抗ｐ５５  ＩｇＧ力価を測定し、その結果は以下の表１９Ａに見られる。その血清を２ｗｐ２（２回目の免疫２週間後）および２ｗｐ３（３回目の免疫２週間後）で測定した。
【０２３５】
【表１９Ａ】
2014169323.tif 000022
同様の実験を、種々のＰＬＧ微粒子を使用して、界面活性剤としてＣＴＡＢを使用して、抗原としてｐ５５ｇａｇＤＮＡを使用して、アジュバントしてＣｐＧまたはＬＴＫ６３を使用して、および以下のグループを使用して行った：
グループ１は、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＰＶＡ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２３６】
グループ２は、１０μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＰＶＡ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２３７】
グループ３は、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２３８】
グループ４は、１０μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２３９】
グループ５は、粒子またはアジュバントなしで、１μｇの可溶性ｐ５５ｇａｇＤＮＡを使用した。
【０２４０】
グループ６は、粒子またはアジュバントなしで、１０μｇの可溶性ｐ５５ｇａｇＤＮＡを使用した。
【０２４１】
グループ７は、遊離のＣｐＧと混合した、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２４２】
グループ８は、吸着したＣｐＧ１を有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２４３】
グループ９は、遊離のＬＴＫ６３と混合した、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２４４】
グループ１０は、吸着したＬＴＫ６３を有するＰＬＧ／ＳＤＳ粒子と混合した、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２４５】
各グループについて、１０匹のマウスを、十分な量の微粒子または遊離の分子で免疫し、その結果、示されるように、ｐ５５ｇａｇ抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量は各２５μｇであった（そのグループに存在する場合）。免疫の経路はＩＭ  ＴＡであった。免疫後、血清抗ｐ５５  ＩｇＧ力価を測定し、その結果は以下の表１９Ｂに見られる。その血清を２ｗｐ２（２回目の免疫２週間後）で測定した。
【０２４６】
【表１９Ｂ】
2014169323.tif 000023
同様の実験を、種々のＰＬＧ微粒子またはＭＦ５９ミクロエマルジョンを使用して、界面活性剤としてホスファチジン酸（ＰＡ）、ＤＳＳ、ＤＯＴＡＰ、またはＣＴＡＢを使用して、抗原としてｇｐ１２０タンパク質を使用して、および以下のグループを使用して行った：
グループ１は、遊離のｇｐ１２０タンパク質を有するＭＦ５９エマルジョンを使用した。
【０２４７】
グループ２は、吸着したｇｐ１２０タンパク質を有するＭＦ５９／ＰＡエマルジョンを使用した。
【０２４８】
グループ３は、包括されたｇｐ１２０タンパク質を有するＰＬＧ／ＤＳＳを使用した。
【０２４９】
グループ４は、吸着したｇｐ１２０タンパク質を有し、そしてアジュバントを有さないＰＬＧ／ＤＳＳ粒子を使用した。
【０２５０】
グループ５は、吸着したｇｐ１２０タンパク質が吸着したＰＬＧ／ＤＳＳ粒子およびＣｐＧが吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２５１】
グループ６は、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２５２】
グループ７は、ＣｐＧ１を吸着したＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ  ８０粒子と混合した、吸着したｇｐ１２０タンパク質を有するＰＬＧ／ＤＳＳ粒子を使用した。
【０２５３】
グループ８は、ＣｐＧ１を吸着したＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ  ８０エマルジョンを使用した。
【０２５４】
グループ９は、ｇｐ１２０タンパク質を吸着するＭＦ５９／ＰＡ粒子と混合した、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２５５】
グループ１０は、遊離のＣｐＧ１および可溶性ｇｐ１２０タンパク質を使用した。
【０２５６】
各グループについて、１０匹のマウスを、十分な量の微粒子または遊離の分子で免疫し、その結果、ｇｐ１２０抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量は各２５μｇであった（そのグループに存在する場合）。免疫の経路はＩＭ  ＴＡであった。免疫後、血清抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ力価を測定し、その結果は以下の表１９Ｃに見られる。その血清を２ｗｐ２（２回目の免疫２週間後）および２ｗｐ３（３回目の免疫２週間後）で測定した。
【０２５７】
【表１９Ｃ】
2014169323.tif 000024
上記のデータは、ｇｐ１２０タンパク質抗原の場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが他のＰＬＧ粒子またはＭＦ５９／ＤＯＴＡＰエマルジョンに吸着されていても、いなくても、ＰＬＧ粒子に吸着された抗原で免疫されたグループにおいて最も高い免疫応答が誘発されたことを実証する。対照的に、抗原がＭＦ５９／ＤＯＴＡＰエマルジョンに吸着され、そしてＣｐＧオリゴヌクレオチドがＰＬＧ粒子に吸着された場合、免疫応答は基本的に些細であった。本明細書中の教示によって、当業者は、任意の特定の抗原についての最適な吸着された微粒子のおよび／またはミクロエマルジョンの組み合わせを容易に決定し得る。
【０２５８】
（実施例２３  ｐ５５ＤＮＡの吸着および捕捉）
吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を上記の実施例に記載されるように形成し、そしてブランク粒子、遊離ＣＴＡＢ、および遊離ｐ５５ＤＮＡに対するＩＭ免疫後４週間および２度目のＩＭ免疫後２週間の抗体の誘導について試験した。結果を以下の表２０Ａに表し、そして結果は、溶液中で遊離するよりも微粒子に吸着されたｐ５５ＤＮＡを有することの明瞭な利点を示す。
【０２５９】
（表２０Ａ）
【０２６０】
【表２０Ａ】
2014169323.tif 000025
ＣＴＬの誘導を同じ処方物で調べ、そして標的：エフェクターの比（４：１、１５：１、および６０：１）を使用しての１度目の免疫後３週後に測定した。結果を以下の表２０Ｂに表し、結果は微粒子に吸着されたｐ５５ＤＮＡの利点を示す。
【０２６１】
【表２０Ｂ】
2014169323.tif 000026
吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微量粒子、および捕捉されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＰＶＡ微粒子を、上記の実施例に記載されるように形成した。マウスのＩＭ免疫および抗体の誘導（血清の収集および分析）を、１度目の免疫後４週間（４ｗｐｌ）で、および２度目の免疫後２、４、６、１３、ならびに１５週間（それぞれ２ｗｐ２、４ｗｐ２、６ｗｐ２、１３ｗｐ２、ならびに１５ｗｐ２）で、上記の実施例に記載されるように行った。以下の表２０Ｃに示される結果は、捕捉されたｐ５５および遊離のｐ５５の両方にわたって吸着された微粒子の明瞭な利点を実証する。
【０２６２】
（表２０Ｃ）
【０２６３】
【表２０Ｃ】
2014169323.tif 000027
吸着されたｐ５５ＤＮＡ（１％ＤＮＡ）を有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ／ＰＶＡ粒子を、上記の実施例に記載されるように調整し、そしていくつかの特徴について測定した。結果を以下の表２０Ｄに表す。
【０２６４】
（表２０Ｄ）
【０２６５】
【表２０Ｄ】
2014169323.tif 000028
ＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子およびＰＬＧ／ＰＶＡ／ＣＴＡＢ粒子を、上記のように調製し、そしてｐ５５ＤＮＡをそれらの粒子上に吸着した。マウスをｐ５５ＤＮＡの用量が、１μｇまたは１０μｇのいずれかである粒子で免疫した。２度目の免疫後２週間の抗体誘導実験の結果を上記の表１９Ｂに表し、そして以下の表２０Ｅに要約した。
【０２６６】
（表２０Ｅ）
【０２６７】
【表２０Ｅ】
2014169323.tif 000029
界面活性剤としてＤＯＴＡＰまたはＣＴＡＢを使用し、かつ抗原としてｐ５５ＤＮＡを使用する種々のＰＬＧ微粒子、またはＭＦ５９ミクロエマルジョンを調製し、そして以下のようにマウスを免疫するために使用した：
グループ１は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２６８】
グループ２は、捕捉されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２６９】
グループ３は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＤＯＴＡＰ粒子を使用した。
【０２７０】
グループ４は、遊離ＣＴＡＢおよび遊離ｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ粒子を使用した。
【０２７１】
グループ５は、遊離ｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ８０エマルジョンを使用した。
【０２７２】
グループ６は、遊離ｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９エマルジョンを使用した。
【０２７３】
グループ７は、遊離ｐ５５ＤＮＡを単独で使用した。
【０２７４】
グループ８は、ブランクＰＬＧ粒子および遊離したｐ５５ＤＮＡを使用した。
【０２７５】
グループ９は、ブランクＰＬＧ粒子、遊離ＣＴＡＢ、および遊離したｐ５５ＤＮＡを使用した。
【０２７６】
各グループについて、１０匹のマウスを十分量のｐ５５ＤＮＡの用量が１μｇである微粒子または遊離分子で免疫した。免疫の経路は、ＩＭ  ＴＡであった。免疫後、血清抗ｐ５５ＤＮＡの力価を測定し、測定結果を以下の表２０Ｆに表した。血清を３ｗｐ１（１度目の免疫後、３週間）および３ｗｐ２（２度目の免疫後、３週間）で測定した。
【０２７７】
（表２０Ｆ）
【０２７８】
【表２０Ｆ】
2014169323.tif 000030
抗原として１μｇの用量（他に示されない場合を除いて）で、ＤＯＴＡＰ４０またはＤＯＴＡＰ８０、およびｐ５５ＤＮＡを使用するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子およびＰＬＧ微粒子、およびＭＦ５９ミクロエマルジョンを、上記に記載されるように調製し、そして以下のようにマウスを免疫するために使用した：
グループ１は、バーストされていない吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した（すなわち、これらの粒子は、免疫の前にインビトロでバーストされる）。
【０２７９】
グループ２は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２８０】
グループ３は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子（比フリーズドライ）を使用した。
【０２８１】
グループ４は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ４０エマルジョンを使用した。
【０２８２】
グループ５は、１０μｇの用量で、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ４０エマルジョンを使用した。
【０２８３】
グループ６は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ８０エマルジョンを使用した。
【０２８４】
グループ７は、１０μｇの用量で、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ８０エマルジョンを使用した。
【０２８５】
グループ８は、遊離ｐ５５ＤＮＡを使用した。
【０２８６】
グループ９は、１０μｇの用量で、遊離ｐ５５ＤＮＡを使用した。
【０２８７】
グループ１０は、１０μｇの用量で、遊離ｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９エマルジョンを使用した。
【０２８８】
各グループについて、１０匹のマウスを十分量のｐ５５ＤＮＡの用量が、示されるように１または１０μｇの用量である微粒子または遊離分子で免疫した。免疫の経路は、ＩＭ
ＴＡであった。免疫後、血清抗ｐ５５ＤＮＡ力価を測定し、測定結果を以下の表２０Ｇに表す。この血清を、４ｗｐ１（１度目の免疫後、４週間）および２ｗｐ２（２度目の免疫後、２週間）で測定した。
【０２８９】
（表２０Ｇ）
【０２９０】
【表２０Ｇ】
2014169323.tif 000031
（実施例２４  モルモットにおける免疫応答の微粒子誘導）
吸着されたｇｐ１２０ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を、上記の実施例において記載されるように形成した。他のサンプルを以下の表２０に示し、そしてそれらとしては、ｇｐ１２０ＤＮＡによってコードされる微粒子（リン酸アルミニウムを有するか、有さない）、コントロールの遊離可溶性ｇｐ１２０（リン酸アルミニウムを有するか、有さない）、およびＭＦ５９タンパク質が挙げられる。モルモットのＩＭ免疫および抗体の誘導（血清の収集および分析）を上記の実施例に記載されるように行った。結果を以下の表２１に示す。
【０２９１】
（表２１）
【０２９２】
【表２１】
2014169323.tif 000032
（実施例２５  微粒子に吸着されたｐ５５ＤＮＡを有する鼻腔内（ＩＮ）免疫）
吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子、および吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＤＤＡ微粒子を、上記の実施例に記載されるように形成した。２５または１００μｇでのマウスのＩＮ免疫、抗体誘導（血清の収集および分析）、およびＣＴＬ誘導を上記の実施例において記載されるように、１度目の免疫後、２週間および４週間（２ｗｐ１、４ｗｐ１）で、２度目の免疫後、２週間および４週間（２ｗｐ２、４ｗｐ２）で、および３度目の免疫後、２週間および４週間（２ｗｐ３、４ｗｐ３）で行った。コントロールとしては、可溶性ｐ５５ＤＮＡ単独、または１０μｇのコレラ毒素を有する免疫が挙げられる。抗体誘導についての結果を、表２２に示し、そしてＣＴＬによる溶解（４度目の免疫後、４週間で）の結果を、以下の表２３に示した。
【０２９３】
（表２２）
【０２９４】
【表２２】
2014169323.tif 000033
（表２３）
【０２９５】
【表２３】
2014169323.tif 000034
（実施例２６  アジュバント組成物の調整）
ＭＴＰ−ＰＥは、ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ（Ｂａｓａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供された。スクアレンおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より得た。ＣＦＡおよびＩＦＡをＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）より得た。水酸化アルミニウム（Ｒｅｈｓｏｒｐｔａｒ）をＲｅｈｅｉｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ  ＮＪ）より得た。
【０２９６】
油滴の調製を多くの方法によって行った。第１の方法において、４％スクアレン、０．００８％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、２５０μｇ／ｍｌＭＴＰ−ＰＥおよび抗原（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中）を含む混合物を６回、２３ゲージ針を通過させた。油滴からなるこのエマルジョンは、１０ミクロンの範囲のサイズであり、そしてＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯと称される。第２の方法は、上記の混合物をＫｉｒｋｌａｎｄ乳化剤を５回、通過させる工程を包含する。油滴からなるこのエマルジョンは、主に１〜２ミクロンであり、そしてＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥと称される。このＫｉｒｋｌａｎｄ乳化剤（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ、ＣＡ）は、小型の市販のナイフの刃をつけたホモジナイザー（例えば、Ｇａｕｌｉｎ  Ｍｏｄｅｌ  ３０ＣＤおよびＲａｉｎｎｉｅ  Ｍｉｎｉｌａｂ  Ｔｙｐｅ  ８．３０Ｈ）であり、作業チャンバーにおいて約１０００ｐｓｉを産生する。第３の方法において、０．３〜１８％スクアレンおよび０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＰ−ＰＥ（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むか、含まない）を含む混合物を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（型番１１０Ｙ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を５，０００〜３０，０００ｐｓｉで通過させた。代表的には、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ中で５０ｍｌのエマルジョンを、５分、または１００ｍｌを１０分混合した。生じるエマルジョンは、スクアレン、ＭＴＰ−ＰＥならびに界面活性剤の濃度、およびにｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒの操作圧力ならびに温度に依存する１００〜７５ｎｍの油滴からなった。この組成物は、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦと称される。
【０２９７】
（実施例２７  ＣＴＡＢを使用する微粒子の調製）
ブランク微粒子をＣＴＡＢを使用して以下のように産生した。使用した溶液：
（１）ジメチルクロライド中の４％ＲＧ５０４ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）。
（２）水中の０．５％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０２９８】
特に、１２．５ｍｌのポリマー溶液と１．２５ｍｌの蒸留水とを混合し、ｗ／ｏエマルジョンを形成するために１０Ｋｒｐｍで１０ｍｍプローブを備えたＯｍｎｉベンチトップ（ｂｅｎｃｈｔｏｐ）ホモジナイザーを使用して３分ホモジネートし、微粒子を作製した。ｗ／ｏエマルジョンを５０ｍｌの０．５％ＣＴＡＢ溶液に添加し、そしてｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成するために３分間、ホモジネートした。ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒の蒸発のために一晩攪拌し続け、微粒子を形成した。次いで、形成された微粒子を３８μメッシュを通して濾過し、４回遠心分離することにより水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、微粒子を将来の使用のためにＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒサイズで分類した。
【０２９９】
（実施例２８  免疫応答表現型に対するＭＰＬおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドの効果）
１０匹のマウスのグループを以下のように免疫した：グループ１）ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下および非存在下で組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９；グループ２）ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質を有するモノホスホリル脂質（ｌｉｐｄ）Ａ（ＭＰＬ）を取り込むＭＦ５９；グループ３）ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下および非存在下で表面に吸着されたＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質を有するＳＤＳ／ＰＬＧ微粒子；グループ４）ＭＰＬを有する微粒子に吸着されたＳＤＳ／ＰＬＧ  ｐ５５；グループ５）ＭＰＬを有する組換えタンパク質；およびグループ６）組換えタンパク質単独。ＭＦ５９の用量は、２５μｌ／動物であり、そしてＨＩＶ  ｐ５５タンパク質は２５μｇ／動物であり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５０μｇ／動物であり、ＭＰＬは１０μｇ／動物で与えられた。微粒子は、２５μｇのタンパク質を含む用量で与えられた。
【０３００】
ＭＰＬをＲｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔａｎａ）より得た。ＭＰＬ／ＭＦ５９を、ＣＨＣｌ3中にＭＰＬを溶解し、スクアレン／Ｓｐａｎ８５に溶液を移し、そして標準ＭＦ５９エマルジョンをＴｗｅｅｎ８０／Ｈ2Ｏと処方することによって調製した。
【０３０１】
組換え酵母ｐ５５  ｇａｇタンパク質を、当業者に公知の標準的発酵技術（酵母がダイノミル（ｄｙｎｏｍｉｌｌ）によって分裂する）によって産生した。ｐ５５タンパク質を、尿素／ＮａＣｌ緩衝液中の細胞溶解物より得たペレット物質より抽出した。尿素溶液タンパク質を、６Ｍの尿素の存在下でアニオン交換クロマトグラフィーによって９０％以上の均一性まで精製した。
【０３０２】
毎週の間隔で３度の筋肉内注射を受けたマウス、および血清サンプルを、３度目の注射後２週間で収集し、そしてＣＡ  Ａｅｑｕｏｒｎ（Ｓｅａｌｉｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）に基づく化学発光ＥＬＩＳＡアッセイを使用して総ＩｇＧ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについてアッセイした。代表的なアッセイの結果を図１および２に示す。吸着された微粒子の場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを受けた動物は、吸着された粒子単独のＩｇＧ２ａ応答より１９倍高いＩｇＧ２ａ応答、ＭＰＬを有する吸着された粒子よりも７倍高い応答、そしてタンパク質単独よりも１７倍高い応答を示した。ＭＦ５９を有するタンパク質の場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを受けた動物は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの非存在下で誘導されたＩｇＧ２ａ応答よりも７倍高いＩｇＧ２ａ応答を示し、ＭＦ５９およびＭＰＬの組み合わせよりも２．６倍より高く、ＭＰＬを有するタンパク質よりも１５倍より高く、そしてタンパク質単独よりも２３倍より高かった。これらの結果は、ＭＦ５９またはＰＬＧ微粒子のいずれかと組み合わされたＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＭＦ５９またはＰＬＧ微粒子のいずれかを有するＭＰＬによって誘導されたリンパ球応答よりも有意により高いＴｈ１リンパ球応答を刺激することを示す。
【０３０３】
オリゴヌクレオチドはＯｌｉｇｏ  Ｅｔｃ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ、ＯＲ）によって調製された。ＣｐＧ１は、配列番号２８を含む。ＣｐＧ２は、非ＣｐＧ配列ｔｃｃａｇｇａｃｔｔｃｔｃｔｃａｇｇｔｔ（配列番号２９）を含む。
【０３０４】
（実施例２９  ｐ５５  ｇａｇタンパク質のＩＭ免疫および種々のアジュバント）
９匹のマウスのグループを以下のように筋肉内免疫した（記載される場合を除く）：グループ１）ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの存在下での組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９、およびＤＯＴＡＰ８０；グループ２）ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの存在下での組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９、およびＤＯＴＡＰ１６０；グループ３）組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９およびＤＯＴＡＰ；グループ４）組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９；グループ５）ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの存在下での組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９；グループ６）組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質およびＤＯＴＡＰ１６０；グループ７）組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質およびＣｐＧ１オリゴヌクレオチド；グループ８）ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの存在下での組換えＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇタンパク質、およびＤＯＴＡＰ１６０；およびグループ９）ｖｖ−ｇａｇ−ｐｏｌ（２×１０7ｐｆｕ）ＩＰ。ＭＦ５９ｎｏ用量は２５μｌ／動物であり、ＨＩＶ  ｐ５５タンパク質は２５μｇ／動物であり、そしてＣｐＧオリゴヌクレオチドは５０μｇ／動物であった。免疫後、血清抗ｐ５５  ＩｇＧ力価を測定し、測定結果を図３に示した。示されるように、正に荷電したエマルジョン（ＤＯＴＡＰを有する）の存在下での抗体力価は、正に荷電したエマルジョン（ＤＯＴＡＰを有さない）の存在下の２倍の高さである。ＣＴＬによる標的（ＳｖＢ細胞株）の溶解をまた、各グループで測定し、測定結果を図４に表した。示されるように、正に荷電したエマルジョンを生じるためのＤＯＴＡＰの添加は、ＣＴＬ応答を増加する。
【０３０５】
（実施例３０  イオン性エマルジョンアジュバント）
イオン性界面活性剤を含む１ミクロン未満のエマルジョンを、非イオン性安定化ＭＦ５９処方物を使用して処方した。いくつかのイオン性界面活性剤をスクアレン中の溶解度について試験した。３つのイオン性界面活性剤ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＥＰＣ）およびジオレオイル−ホスファチジン酸（ＤＰＡ）が、スクアレンに可溶性であることを見出した。各界面活性剤を、４〜５２ｍｇ／ｍｌスクアレンの範囲の濃度で、スクアレン／１０％Ｓｐａｎ８５に溶解することによって、プロトタイプイオン性エマルジョンを処方した。スクアレン／界面活性剤混合物を５ｍｌのスクアレン／１００ｍｌ  Ｈ2Ｏの０．５％Ｔｗｅｅｎ８０／Ｈ2Ｏを用いて乳化した。プレエマルジョンをＳｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザーを用いてホモジネート（５分、５０００ＲＰＭ）することによって生成し、そして最終エマルジョンを微小流動化（約１０，０００ｐｓｉ、５回の通過、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ１１０Ｓ）によって作製した。各型のエマルジョンを液滴のサイズおよびζ電位について試験した。これらの結果を以下の表２４に示す。
【０３０６】
【表２４】
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ＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ／１６０およびＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ／８０をＤＮＡおよびＣｐＧ  ＯＤＮの両方の結合について試験した。２つのＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ処方物、１６０ｍｇ／１００ｍｌＤＯＴＡＰおよび８０ｍｇ／１００ｍｌＤＯＴＡＰ使用してｐ５５ＤＮＡを吸着した。これらのエマルジョンを各々５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌのＤＮＡと共に４℃で一晩インキュベートした。ＤＯＴＡＰを含まないＭＦ５９／水のコントロールもまた５０、１００および２００μｇのＤＮＡと共にインキュベートした。これらのエマルジョンをエアーフュージ（ａｉｒ  ｆｕｇｅ）を使用して遠心分離し、そして各サンプルについての浮遊物（ｓｕｂｎａｔａｎｔ）を酸加水分解し、そしてＤＮＡアッセイを行った。（なぜなら、Ａ２６０測定を妨げる十分な濁度が存在するから）。ＤＯＴＡＰコントロールサンプルを有さないＭＦ５９を使用して標準曲線を確立した。この標準曲線よりＭＦ５９／ＤＯＴＡＰサンプルの浮遊物中に残ったＤＮＡの量を算出し、これらの結果を以下の表２５に示す。
【０３０７】
【表２５】
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ＭＦ５９をスクアレン中のＤＰＴＡＰを使用して作製した。これを０．５ｍｇ／ｍｌＣｐＧと共に一晩インキュベートし、翌日そのエマルジョンを、エッペンドルフ（ｅｐｐｉｎｄｏｒｆ）遠心分離中で５０分間、遠心分離し、そして浮遊物をＧＰＣカラムにかけた。０．５／ｍｌＣｐＧを通常のＭＦ５９に添加し、そしてスピンダウンし、次いでカラム上で分析した。ＭＦ５９／Ｄｏｔａｐ浮遊物におけるＣｐＧの量は、ＣｐＧでスパイクしたＭＦ５９の量の５０％であった。このことは、ＣｐＧの投入量のほとんど５０％が、実際に油相にあることを示す。
【０３０８】
吸着等温線（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）が、次になされ、ここでＣｐＧが、１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌおよび２ｍｇ／ｍｌで、ＭＦ５９／Ｄｏｔａｐに添加された。これを４℃で約４日間放置し、ついで、エアーフュージでサンプルを遠心分離し、続いて０．５ｍｇ／ｍｌＣｐＧで、ＭＦ５９をスパイクした。
【０３０９】
浮遊物（非常に透明である）を、ＧＰＣカラムにかけ、次いで０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇおよび２０μｇでスパイクされたＭＦ５９を用いて標準曲線を作製した。吸着の百分率を測定し、そして測定結果を以下の表２６に示した。
【０３１０】
【表２６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2014169323000001.pdf