(57)【要約】【課題】  がん治療のための組成物、キット、および方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、ＨＥＲ−２などの腫瘍関連抗原をコードする組換えＭＶＡウイルスを、特にタキサン類と組み合わせて使用する、がん治療のための組成物、キット、および方法に関する。タキサン類は、組換えＭＶＡウイルスに先だって、または組換えＭＶＡウイルスと同時に、または組換えＭＶＡウイルスの後に投与することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトがん患者を処置するための方法であって、
（ａ）ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードする組換えＭＶＡをその患者に投与すること；および
（ｂ）殺腫瘍量のタキサンをその患者に投与すること
を含む方法。
【請求項２】
ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮである、請求項１の方法。
【請求項３】
ＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンに先だって投与される、請求項１の方法。
【請求項５】
組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンと同時に投与される、請求項１の方法。
【請求項６】
組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサン後に投与される、請求項１の方法。
【請求項７】
タキサンがドセタキセルである、請求項４の方法。
【請求項８】
タキサンがパクリタキセルである、請求項４の方法。
【請求項９】
タキサンがドセタキセルである、請求項６の方法。
【請求項１０】
タキサンがパクリタキセルである、請求項６の方法。
【請求項１１】
タキサンが用量７５〜１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルである、請求項７の方法。
【請求項１２】
タキサンが用量１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルである、請求項８の方法。
【請求項１３】
タキサンが用量７５〜１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルである、請求項９の方法。
【請求項１４】
タキサンが用量１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルである、請求項１０の方法。
【請求項１５】
組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンの１〜２６週間前に投与される、請求項４の方法。
【請求項１６】
組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンの１〜３週間前に投与される、請求項４の方法。
【請求項１７】
組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンの２〜６０日後に投与される、請求項６の方法。
【請求項１８】
組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンの２〜７日後に投与される、請求項６の方法。
【請求項１９】
（ａ）ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードする組換えＭＶＡ；および
（ｂ）組換えＭＶＡを殺腫瘍量のタキサンによる処置に先だって投与するようにという指示を含む、がん患者を処置するためのキット。
【請求項２０】
（ａ）ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードする組換えＭＶＡ；および
（ｂ）組換えＭＶＡを殺腫瘍量のタキサンによる処置と同時に投与するようにという指示
を含む、がん患者を処置するためのキット。
【請求項２１】
（ａ）ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードする組換えＭＶＡ；および
（ｂ）組換えＭＶＡを殺腫瘍量のタキサンによる処置後に投与するようにという指示
を含む、がん患者を処置するためのキット。
【請求項２２】
ＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む、請求項１９のキット。
【請求項２３】
ＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む、請求項２０のキット。
【請求項２４】
ＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む、請求項２１のキット。
【請求項２５】
ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードし、そのＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む、組換えワクシニアウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年１０月６日に出願された仮出願第６０／８５０，０３１号の利益を主張し、前記仮出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、腫瘍関連抗原をコードするＭＶＡウイルスを、特にタキサン類と組み合わせて使用する、がんの処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
改変ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）ウイルスは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属のメンバーであるワクシニアウイルスと類縁関係にある。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で５１６代にわたって連続継代することによって作出された（概要については、非特許文献１を参照されたい）。これらの長期間にわたる継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムではそのゲノム配列のうち約３１キロ塩基が欠失しているので、複製に関して宿主細胞は鳥類細胞に著しく制限されると記載されている（非特許文献２）。得られたＭＶＡは著しく非病原性であることが、さまざまな動物モデルで示されている（非特許文献３）。また、このＭＶＡ株は、ヒト痘瘡疾患に対する免疫を与えるためのワクチンとして、臨床試験でも検討されている（非特許文献４；非特許文献６）。これらの研究には高リスク患者を含めて１２０，０００人を超える人々が関与し、これらの研究からＭＶＡは、ワクシニアに基づくワクチンと比較して、低下したビルレンスまたは感染性を持ちつつ、良好な特異的免疫応答を誘導することが判明した。
【０００４】
その後の数十年間に、ＭＶＡは、組換え遺伝子発現用のウイルスベクターとして使用するために、または組換えワクチンとして使用するために、改変された（非特許文献５）。
【０００５】
ＭＶＡがヒトおよび哺乳動物では著しく弱毒化されていて非病原性であることはＭａｙｒらが１９７０年代に証明したにもかかわらず、一部の研究者らは、哺乳動物細胞株およびヒト細胞株では、残存複製（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が起こるかもしれないので、ＭＶＡがこれらの細胞では完全には弱毒化されていないと報告している（非特許文献７；非特許文献８；特許文献１；非特許文献９）。これらの刊行物で報告された結果は、ＭＶＡのさまざまな既知株を使って得られたものであると考えられる。というのも、使用されたウイルスは、その性質、特にさまざまな細胞株におけるそれらの成長挙動が、本質的に異なるからである。そのような残存複製は、ヒトでの使用に関する安全性の懸念を含めて、さまざまな理由から望ましくない。
【０００６】
より安全な製品（例えばワクチンまたは医薬品）を開発するために強化された安全性プロファイルを持つＭＶＡの株が記載されている。特許文献２および特許文献３を参照されたい。そのような株は、非ヒト細胞および細胞株、とりわけニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）では増殖的複製（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が可能であるが、既知のワクシニア株で複製を許容することが知られている一定のヒト細胞株では有意な増殖的複製を行うことができない。そのような細胞株には、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（非特許文献１０）、ヒト頚部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ヒト胚性腎臓細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）、およびヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２）が含まれる。そのような株は、インビボでも、例えば重度の免疫低下状態にあって複製ウイルスに対する感受性が高いトランスジェニックマウスモデルＡＧＲ１２９などといった一定のマウス系統においても、有意な増殖的複製を行うことができない。特許文献２を参照されたい。「ＭＶＡ−ＢＮ」と呼ばれる、そのようなＭＶＡ株の一つ、ならびにその誘導体および組換え体が記載されている。特許文献２および特許文献３を参照されたい。
【０００７】
ＭＶＡおよびＭＶＡ−ＢＮはそれぞれ、組換え遺伝子発現用のウイルスベクターとして使用するために、または組換えワクチンとして使用するために、改変されている。例えば非特許文献５、特許文献２および特許文献３を参照されたい。
【０００８】
がん免疫療法へのいくつかのアプローチには、腫瘍関連抗原によるワクチン接種が含まれている。いくつかの例では、そのようなアプローチに、腫瘍関連抗原に対する宿主免疫応答を促進するための送達システムの使用が含まれている。いくつかの例では、そのような送達システムに、組換えウイルスベクターが含まれている。例えば非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３を参照されたい。
【０００９】
ＨＥＲ−２は、多くのがん患者の腫瘍細胞において過剰発現される腫瘍関連抗原である。さまざまなＨＥＲ−２ポリペプチドによる免疫化が、この抗原を発現させる腫瘍細胞に対する免疫応答を生じさせるために用いられてきた。例えば非特許文献１４；非特許文献１５を参照されたい。
【００１０】
パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン類は、がん患者に化学療法剤として使用されてきた。タキサン類による化学療法は、異なる腫瘍ワクチン処置と併用されて、さまざまな結果をもたらしてきた。非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；および非特許文献２０を参照されたい。がんワクチンと化学療法剤との組合せは、非特許文献２１、および非特許文献２２に概説されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】Ａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，  米国特許第５，１８５，１４６号
【特許文献２】米国特許第６，７６１，８９３号
【特許文献３】米国特許第６，１９３，７５２号
【非特許文献１】Ｍａｙｒ，  Ａ．ら，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，  ６−１４  （１９７５）
【非特許文献２】Ｍｅｙｅｒ，  Ｈ．ら，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２，  １０３１−１０３８  （１９９１）
【非特許文献３】Ｍａｙｒ，  Ａ．およびＤａｎｎｅｒ，  Ｋ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．  ４１：２２５−３４  （１９７８）
【非特許文献４】Ｍａｙｒら，  Ｚｂｌ．  Ｂａｋｔ．  Ｈｙｇ．  Ｉ，  Ａｂｔ．  Ｏｒｇ．  Ｂ  １６７，  ３７５−３９０  （１９８７）
【非特許文献５】Ｓｕｔｔｅｒ，  Ｇ．ら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０  （１９９４）
【非特許文献６】Ｓｔｉｃｋｌら，  Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．  Ｗｓｃｈｒ．  ９９，  ２３８６−２３９２  （１９７４）
【非特許文献７】Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，  １１５９−１１６７  （１９９８）
【非特許文献８】ＣａｒｒｏｌｌおよびＭｏｓｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８，  １９８−２１１  （１９９７）
【非特許文献９】Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ５５（５），  ５６９  （１９９９）
【非特許文献１０】Ｂｏｕｋａｍｐら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０６（３）：７６１−７１  （１９８８）
【非特許文献１１】Ｈａｒｒｏｐら，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １１：８０４−８１７  （２００６）
【非特許文献１２】Ａｒｌｅｎら，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ３２：５４９−５５５  （２００５）
【非特許文献１３】Ｌｉｕら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１  （ｓｕｐｐｌ．  ２）：１４５６７−１４５７１  （２００４）
【非特許文献１４】Ｒｅｎａｒｄら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７１：１５８８−１５９５  （２００３）
【非特許文献１５】Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆら，  Ｃａｎｃｅｒ  １０６：２３０９−２３１７  （２００６）
【非特許文献１６】Ｃｈｕら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２９：３６７−３８０  （２００６）
【非特許文献１７】Ｍａｃｈｉｅｌｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１：３６８９−３６９７  （２００１）
【非特許文献１８】Ｐｒｅｌｌら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５５：１２８５−１２９３  （２００６）
【非特許文献１９】Ａｒｌｅｎら，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：１７６−１７９  （２００６）
【非特許文献２０】Ａｒｌｅｎら，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：１２６０−１２６９  （２００６）
【非特許文献２１】Ｃｈｏｎｇら，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｍａｃｏｔｈｅｒ．  ６：１−８  （２００５）
【非特許文献２２】Ｅｍｅｎｓら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：１−１７  （２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記に基づいて、当技術分野では、がん治療のための試薬および方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明はがん患者を処置するための方法を包含する。ある実施形態において、本方法は、ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードする組換えＭＶＡを患者に投与すること、および殺腫瘍量のタキサンを患者に投与することを含む。本併用処置はどちらか一方のみの処置よりも優れている。
【００１４】
好ましい一実施形態では、ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮである。
【００１５】
ある実施形態では、ＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む。
【００１６】
組換えＭＶＡは、殺腫瘍量のタキサンの前に、殺腫瘍量のタキサンと同時に、または殺腫瘍量のタキサンの後に投与することができる。
【００１７】
好ましい一実施形態では、タキサンがドセタキセルである。もう一つの好ましい実施形態では、タキサンがパクリタキセルである。ある実施形態では、タキサンが用量７５〜１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルである。ある実施形態では、タキサンが用量１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルである。
【００１８】
ある実施形態では、組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンの１〜２６週間前に投与される。ある実施形態では、組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンの１〜３週間前に投与される。
【００１９】
ある実施形態では、組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンの２〜６０日後に投与される。ある実施形態では、組換えＭＶＡが殺腫瘍量のタキサンの２〜７日後に投与される。
【００２０】
さらに本発明は、ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードする組換えＭＶＡと、組換えＭＶＡを殺腫瘍量のタキサンに先だって、または殺腫瘍量のタキサンと同時に、または殺腫瘍量のタキサンの後に投与するようにという指示とを含有する、がん患者を処置するためのキットを包含する。
【００２１】
さらに本発明は、ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードし、そのＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む、組換えワクシニアウイルスを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ａ〜Ｂ：ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を接種した後の初代ＣＥＦ細胞（Ａ）またはＨｅＬａ細胞（Ｂ）におけるｍＨＥＲ２発現のウェスタンブロット解析。実施例１で説明するように、細胞培養物に、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を、表示した希釈度で接種するか、ＴＢＳ緩衝液を接種した。２４時間後に培養物から細胞を収集し、細胞溶解物を調製した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。実施例１で説明するように、ウサギ抗ＨＥＲ−２抗血清と共にインキュベートした後、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギ抗体および発色性基質を使って検出することにより、ｍＨＥＲ２タンパク質を検出した。参照用に、完全長ＨＥＲ−２タンパク質およびＨＥＲ−２の細胞外ドメインを示す。矢印は、細胞培養物から得た溶解物中に抗ＨＥＲ−２抗血清によって検出されたタンパク質の位置を示す。
【図２】Ａ〜Ｃ：ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置された異なるマウス系統における抗ＨＥＲ−２抗体応答。実施例２で説明するように、Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｂ）マウス（各群５匹）を、１日目、１５日目および２９日目（矢印で示す）に、２Ｅ６（◆）、１Ｅ７（■）および５Ｅ７（▲）ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置した。血液試料を集め、実施例２で説明するように、プール血清の連続希釈液を抗ＨＥＲ−２  ＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡで分析した。バックグラウンドの２倍のシグナルが検出された力価または希釈率を、異なる時点について示す。（Ｃ）ＢＡＬＢ／ｃ（◆）およびＨＥＲ−２トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ  ＮｅｕＴ（■）マウスをＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（１Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）で処置した。パネルＡおよびＢの場合と同様に、抗ＨＥＲ−２  ＩｇＧ価を決定した。
【図３】Ａ〜Ｃ：ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２誘導性抗ＨＥＲ−２抗体応答の抗原特異性。（Ａ）実施例２で説明するように、微量滴定プレートのウェルをＨＥＲ−２  ｅｃｄ−Ｆｃ（黒い棒）、ＨＥＲ−３  ｅｃｄ−Ｆｃ（灰色の棒）およびＨＥＲ−４  ｅｃｄ−Ｆｃ（白い棒）でコーティングした。次に、モノクローナル抗ＨＥＲ−２抗体（ＨＥＲ−２  Ａｂ；ＡＢ−５、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、モノクローナル抗ヒトＩｇ  Ｆｃフラグメント抗体（Ｆｃ  Ａｂ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはモノクローナルアイソタイプ対照抗体（Ｃｏｎｔｒ  Ａｂ）を使って、抗原をＥＬＩＳＡによって検出した。（Ｂ）および（Ｃ）。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）で処置されたＣ５７ＢＬ／６（Ｂ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｃ）マウスから得た血清を使ってＥＬＩＳＡアッセイを行った。最初の処置の前に処置前血清を集め、処置後血清を４２日目（２週間間隔で行った３回の注射のうち最後の注射の２週間後）に集めた。表示のデータは平均±標準偏差（標準誤差バーで示す）である。
【図４】Ａ〜Ｄ：ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置された異なるマウス系統におけるＨＥＲ−２誘導性Ｔ細胞応答。実施例３で説明するように、Ｃ５７ＢＬ／６（ＡおよびＢ）またはＢＡＬＢ／ｃ（ＣおよびＤ）マウス（各群５匹）をＴＢＳまたは１Ｅ７  ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置した。最後の処置の５日後に脾臓を集め、インビトロ再刺激用に細胞懸濁液を調製した。分泌されたＩＦＮγを、実施例３で説明するように、標準的ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで検出した。ＡおよびＣ、増加する量のＨＥＲ−２  ｅｃｄ（黒塗りの記号）または培地のみ（白抜きの記号）を、ＴＢＳ（丸印）またはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（菱形）で処置されたマウスから得た脾細胞に加えた。ＢおよびＤ、実施例３で説明するように、ＴＢＳ（中空の棒）またはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（黒い棒）で処置されたマウスから得た脾細胞を、ＨＥＲ−２ペプチドまたは破傷風毒素ペプチドの一つ（ＴＴｐ２もしくはＴＴｐ３０）で再刺激した。表示のデータは平均±標準偏差（標準誤差バーで示す）である。
【図５】ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で前処置されたマウスにおける腫瘍成長の解析（予防的設定）。実施例５で説明するように、ＢＡＬＢ／ｃ  マウス（各群５匹）にＴＢＳ（黒い三角形）、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（２Ｅ７  ＴＣＩＤ５０、黒い丸印）またはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（２Ｅ６  ＴＣＩＤ５０、白抜きの丸印）を皮下注射した。最後の注射の６週間後に、マウスに、ＴＵＢＯ細胞（１Ｅ５個）を皮内注射でチャレンジした。その後、週に２回、腫瘍成長を決定した。表示のデータは平均±標準偏差（標準誤差バーで示す）である。
【図６】ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置されたマウスにおける腫瘍成長の解析。実施例５で説明するように、１日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群９匹）にＣＴ２６−ＨＥＲ−２をチャレンジし（５Ｅ５個の細胞を静脈内注射）、４日目にＴＢＳ、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）、またはＭＶＡ−ＢＮ（５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）による腹腔内処置を行った。マウスを１４日目に屠殺し、その肺を重量測定した。腫瘍チャレンジしたマウスの平均肺重量からナイーブマウスの平均肺重量を差し引くことによって、腫瘍質量を算出した。表示のデータは平均±標準偏差（標準誤差バーで示す）である。
【図７】ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２またはＭＶＡ−ＢＮで処置されたマウスにおける腫瘍成長の解析。実施例５で説明するように、１日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群９匹）にＣＴ２６−ＨＥＲ−２をチャレンジし（５Ｅ５個の細胞を静脈内注射）、同じ日にＴＢＳ、ＭＶＡ−ＢＮ（５Ｅ６もしくは５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）またはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ６もしくは５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）による腹腔内処置を行った。マウスを１４日目に屠殺し、その肺を重量測定した。腫瘍チャレンジしたマウスの平均肺重量からナイーブマウスの平均肺重量を差し引くことによって、腫瘍質量を算出した。表示のデータは平均±標準偏差（標準誤差バーで示す）である。
【図８】Ａ〜Ｂ：ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２およびドセタキセルで併用処置されたマウスにおける抗ＨＥＲ−２抗体応答。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、対照（トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）；５匹のＩ群）または５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５匹ずつの９群）による皮下処置を、１日目、２２日目および４３日目（３週毎×３）に行った。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置の２日前（−２日目）（Ａ）または１週間前（−７日目）に殺腫瘍量（３３ｍｇ／Ｋｇ）の薬物で動物を処置することにより、化学療法剤ドセタキセルが抗ＨＥＲ−２抗体誘導に及ぼす影響を評価した。表２に記載するように、薬物を１回、２回（３週毎×２）、３回（３週毎×３）または４回（３週毎×４）、ｉｖ注射した。
【図９】Ａ〜Ｂ：ドセタキセルおよびＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で前処置されたマウスにおける腫瘍成長の解析（予防的設定）。殺腫瘍量のドセタキセルで処置されたマウスにおいてＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２が誘導する免疫応答の完全性を、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の抗腫瘍活性を測定することによって、さらに評価した。図８の説明文で述べたように処置されたマウスに、７１日目にＭＣ３８−ＨＥＲ−２腫瘍細胞をチャレンジし、図５の説明文で述べたように腫瘍成長を評価した。
【図１０】Ａ〜Ｃ：ドセタキセルおよびＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で併用処置されたマウスにおける腫瘍成長の解析。各実験サブセットＡ、ＢおよびＣごとに、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４０匹）に、１日目にＭＣ３８−ＨＥＲ−２細胞をチャレンジし、次に、図に示したように各実験サブセットごとに、さまざまな時点で、対照（トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）；１０匹を３回処置）、ドセタキセルのみ（３３ｍｇ／Ｋｇ；１０匹を１回処置）、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０；１０匹を２回処置）またはドセタキセル（１回処置）およびＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（２回処置）による皮下処置を行った。２３日目に屠殺するまで腫瘍成長を週に２回評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ある実施形態において、本発明はがん治療のための組換えＭＶＡウイルスの使用を包含する。組換えＭＶＡはＭＶＡウイルスへの異種配列の挿入によって作製される。本発明の実施に役立ち、ブダペスト条約の要件に従って寄託されているＭＶＡウイルス株の例は、ソールズベリー（英国）のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号ＥＣＡＣＣ  ９４０１２７０７として１９９４年１月２７日に寄託されたＭＶＡ５７２株、および２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ  ００１２０７０７として寄託されたＭＶＡ５７５株である。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として２０００年８月３０日に寄託されたＭＶＡ−ＢＮ、およびその誘導体も、模範的な株である。
【００２４】
ＭＶＡ−ＢＮはその高い安全性（低い複製能）ゆえに好ましいが、本発明には全てのＭＶＡが適している。本発明のある実施形態によれば、ＭＶＡ株はＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体である。ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体の定義はＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８に記載されている。
【００２５】
一定の実施形態では、ＭＶＡが少なくとも一つの腫瘍関連抗原を含む。好ましい一実施形態では、その腫瘍関連抗原がＨＥＲ−２抗原である。ある実施形態では、そのＨＥＲ−２抗原が配列番号２の配列を含む。
【００２６】
さらなる実施形態では、腫瘍関連抗原が１つまたはそれ以上の外来ＴＨエピトープを含むように修飾される。そのようながん免疫治療剤の一つを、限定でない例として本明細書に記載し、「ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２」と呼ぶ。本明細書に記載するように、そのようながん免疫治療剤、例えばＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（ただしこれに限るわけではない）は、がんの処置に役立つ。本発明は、免疫低下患者を含むヒトおよび他の哺乳動物の初回（ｐｒｉｍｅ）／追加（ｂｏｏｓｔ）ワクチン接種レジメンでそのような薬剤を使用して、体液性および細胞性免疫応答の両方を誘導すること、例えば既存のＴｈ２環境におけるＴｈ１免疫応答の誘導などを可能にする。
【００２７】
「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸が互いにペプチド結合または修飾ペプチド結合で連結されたポリマーを指す。アミノ酸は天然アミノ酸であってもよいし、非天然アミノ酸、または天然アミノ酸の化学的類似体であってもよい。この用語は、タンパク質、すなわち、少なくとも一つのポリペプチドを含む機能的生体分子も指し、少なくとも２つのポリペプチドを含む場合、それらは複合体を形成するか、共有結合的に連結されるか、または非共有結合的に連結されうる。タンパク質中のポリペプチドは糖鎖付加され、かつ／または脂質付加され、かつ／または補欠分子族を含むことができる。
【００２８】
一定の実施形態では、ＭＶＡが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として２０００年８月３０日に寄託され、特許文献２および特許文献３に記載されているＭＶＡ−ＢＮである。これらの特許公報に記載されているように、ＭＶＡ−ＢＮは、細胞株２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａおよびＨａＣａｔ中で増殖的に複製しない。特にＭＶＡ−ＢＮは、ヒト胚性腎臓細胞株２９３では、０．０５〜０．２の増幅比を示す。ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂにおいて、ＭＶＡ−ＢＮは０．０〜０．６の増幅比を示す。ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト頚部腺癌細胞株ＨｅＬａでは０．０４〜０．８の増幅比を示し、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔでは０．０２〜０．８の増幅比を示す。ＭＶＡ−ＢＮはアフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＶ１：ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＣＬ−７０）では０．０１〜０．０６の増幅比を持つ。
【００２９】
特許文献２および特許文献３で述べられているように、ＭＶＡ−ＢＮの増幅比はニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ：初代培養物）では１を上回る。このウイルスはＣＥＦ初代培養物では５００を上回る比で容易に増殖、増幅させることができる。
【００３０】
一定の実施形態では、組換えＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮの誘導体である。そのような「誘導体」には、寄託株（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．Ｖ０００８３００８）と本質的に同じ複製特徴を示すが、そのゲノムの１つまたはそれ以上の部分に相違を示すウイルスが含まれる。寄託されたウイルスと同じ「複製特徴」を持つウイルスは、ＣＥＦ細胞および細胞株ＨｅＬａ、ＨａＣａｔおよび１４３Ｂにおいて寄託株と類似する増幅比で複製するウイルス；および例えばＡＧＲ１２９トランスジェニックマウスモデルで決定した場合に、インビボで類似する複製特徴を示すウイルスである。
【００３１】
一定の実施形態では、ＭＶＡが、ワクシニアウイルスにとって異種である追加ヌクレオチド配列を含有する組換えワクシニアウイルスである。そのような実施形態のいくつかでは、異種配列が、免疫系による応答を誘導するエピトープをコードする。したがって、一定の実施形態では、組換えＭＶＡを使って、そのエピトープを含むタンパク質または作用物質に対するワクチン接種が行われる。好ましい一実施形態では、エピトープが腫瘍関連抗原、好ましくはＨＥＲ−２である。ある実施形態では、ＨＥＲ−２抗原が配列番号２の配列を含む。
【００３２】
一定の実施形態では、異種核酸配列がウイルスゲノムの非必須領域に挿入される。これらの実施形態のいくつかでは、ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６に記載されているＭＶＡゲノムの天然欠失部位に、異種核酸配列が挿入される。ポックスウイルスゲノムに異種配列を挿入するための方法は当業者には知られている。
【００３３】
一定の実施形態では、医薬組成物が１つまたはそれ以上の薬学的に許容できかつ／または承認された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤および／または安定剤を含む。そのような添加剤には、例えば水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤または乳化剤、およびｐＨ緩衝物質が含まれるが、これらに限るわけではない。模範的な担体は、典型的には、大きくてゆっくり代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物などである。
【００３４】
ワクチンを製造するために、ＭＶＡを生理学的に許容できる形態に変換することができる。一定の実施形態では、そのような製造が、例えばＳｔｉｃｋｌ，  Ｈ．ら，  Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．  Ｗｓｃｈｒ．  ９９，  ２３８６−２３９２  （１９７４）に記載されているような、痘瘡のワクチン接種に用いられるポックスウイルスワクチンの製造における経験に基づいて行われる。
【００３５】
模範的な製造例を以下に述べる。精製ウイルスは、５×１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、約１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に製剤化して、−８０℃で保存される。ワクチン注射剤を製造するために、例えば２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のウイルス粒子１０２〜１０８個を、アンプル（好ましくはガラスアンプル）内で凍結乾燥することができる。あるいは、製剤中のウイルスを段階的に凍結乾燥することによって、ワクチン注射剤を製造することができる。一定の実施形態において、この製剤は、さらに、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドンなどの添加剤、または例えばインビボ投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくは組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などを含む（ただしこれらに限るわけではない）他の添加剤を含有する。次にアンプルを封止して、好適な温度で、例えば４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。ただし、必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。
【００３６】
ワクチン接種または治療を伴うさまざまな実施形態では、凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的もしくは局所的に、すなわち非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮内経路で、または熟練した医師に知られる他の任意の経路で投与することができる。投与様式、投与量および投与回数の最適化は、当業者の技量および知識の範囲内で行うことができる。
【００３７】
一定の実施形態では、免疫低下動物、例えばＳＩＶに感染したサル（ＣＤ４＜４００／μｌ血液）、または免疫低下状態のヒトにおける免疫応答を誘導するために、弱毒化ワクシニアウイルス株が役立つ。「免疫低下（状態）」という用語は、不完全な免疫応答しか示さないか、感染性物質に対する防御の効率が低下している個体の免疫系の状態を表す。
【００３８】
いくつかの模範的腫瘍関連抗原
一定の実施形態では、細胞関連ポリペプチド抗原に対する免疫応答を、対象内で生じさせる。そのような実施形態のいくつかでは、細胞関連ポリペプチド抗原が腫瘍関連抗原である。
【００３９】
一定の実施形態では、細胞関連ポリペプチド抗原が、さまざまな病的過程に関係する腫瘍関連抗原以外の自己タンパク質抗原、またはウイルス抗原、または細胞内寄生虫もしくは細菌に由来する抗原である。一定の例では、そのような病原体関連抗原が、しばしば比較的弱い免疫原（例えば結核菌およびライ菌などのマイコプラズマ由来の抗原、あるいはマラリア原虫などの原虫由来の抗原）である。
【００４０】
当技術分野では非常に多くの腫瘍関連抗原が知られている。模範的な腫瘍関連抗原には、例えば５アルファレダクターゼ、アルファ−フェトプロテイン、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、ＢＡＧＥ、ベータ−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡ−１２５、ＣＡＳＰ−８／ＦＬＩＣＥ、カテプシン類、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＣＤ３３  ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ｃ−ｍｙｃ、Ｃｏｘ−２、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ａ、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、ＧＡＧＥファミリー、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２、ＧｎＲＨ、ＧｎＴＶ、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｈＣＧ、ヘパランス（ｈｅｐａｒａｎｓｅ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＭＴＶ、Ｈｓｐ７０、ｈＴＥＲＴ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒ、ｉＮＯＳ、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、ＭＡＧＥファミリー、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、メソテリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ類、ムチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦ、ｕＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｎｔｉｎ）、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、チモシン−ベータ−１５、ＴＮＦ−アルファ、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが含まれるが、これらに限るわけではない。
【００４１】
模範的な腫瘍関連抗原の一つがＨＥＲ−２である。ＨＥＲ−２は、今のところ４つの異なる受容体、すなわちｃ−ｅｒｂＢ−１（ＥＧＦｒ）、ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２、ｃ−Ｎｅｕ）、ｃ−ｅｒｂＢ−３およびｃ−ｅｒｂＢ−４からなる上皮細胞成長因子受容体ファミリー（ｃ−ｅｒｂＢ）のメンバーである（Ｓａｌｏｍｏｎら，  １９９５）。ｃ−ｅｒｂＢ−３およびｃ−ｅｒｂＢ−４はＥＧＦｒおよびＨＥＲ−２ほど十分には特徴づけられていない。ＨＥＲ−２は内在性膜糖タンパク質である。成熟タンパク質は１８５ｋＤの分子量を持ち、ＥＧＦｒ受容体によく似た構造上の特徴を有する（Ｐｒｉｇｅｎｔら，  １９９２）。ＥＧＦｒも１つのサブユニットからなる内在性膜受容体である。これは１７０ｋＤａという見掛けの分子量を持ち、６２１アミノ酸の表面リガンド結合ドメイン、２３アミノ酸の単一疎水性膜貫通ドメイン、および５４２アミノ酸の高度に保存された細胞質チロシンキナーゼドメインからなる。このタンパク質はＮ−グリコシル化される（Ｐｒｉｇｅｎｔら，  １９９４）。
【００４２】
このファミリーに属するタンパク質は全てチロシンキナーゼである。リガンドとの相互作用は受容体のダイマー化につながり、それがチロシンキナーゼの触媒作用を増加させる（Ｂｅｒｎａｒｄ．  １９９５、Ｃｈａｎｔｒｙ  １９９５）。このファミリーのタンパク質は、ホモダイマー化よびヘテロダイマー化することができ、これはその活性にとって重要である。ＥＧＦｒは成長促進効果を伝達し、細胞によるグルコースおよびアミノ酸の取り込みを刺激する（Ｐｒｉｇｅｎｔら  １９９２）。ＨＥＲ−２も成長促進シグナルを伝達する。
【００４３】
上皮成長因子受容体は正常細胞では少量発現するが、多くのタイプのがんでは過剰発現する。ＥＧＦｒは、乳がん（Ｅａｒｐら，  １９９３、Ｅｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ  １９９４）、神経膠腫（Ｓｃｈｌｅｇｅｌら，  １９９４）、胃がん（Ｔｋｕｎａｇａら，  １９９５）、皮膚扁平上皮癌（Ｆｕｊｉｉ  １９９５）、卵巣がん（ｖａｎ  Ｄａｍら，  １９９４）などにおいて過剰発現する。ＨＥＲ−２も、数少ない正常ヒト組織で、最も特徴的には分泌上皮で、少量発現する。ＨＥＲ−２の過剰発現は、乳がん、胃がん、膵がん、膀胱がんおよび卵巣がんの約３０％で起こる。
【００４４】
これらの受容体の発現は腫瘍の分化度およびがんタイプに応じて変動し、例えば乳がんでは、原発腫瘍が両方の受容体を過剰発現させるのに対して、胃がんでは、転移性腫瘍において後期に過剰発現が起こる（Ｓａｌｏｍｏｎら，  １９９５）。癌細胞上の過剰発現された受容体の数は、いくつかの頭頚部癌、患者から単離された外陰がん、乳がんおよび卵巣がん株では、１０６／細胞を上回る（Ｄｅａｎら，  １９９４）。
【００４５】
受容体のＥＧＦｒファミリーが腫瘍免疫療法の適切なターゲットを構成する理由はいくつかある。第１に、これらは数多くのがんタイプで過剰発現され、それが免疫応答をその腫瘍に向かわせるはずである。第２に、腫瘍はこの受容体ファミリーのリガンドを発現または過剰発現させることが多く、一部の腫瘍はそれらのリガンドが媒介する増殖作用に対して過敏である。第３に、成長因子受容体を過剰発現させる腫瘍を持つ患者は予後不良であることが多い。過剰発現は特に乳がん、肺がんおよび膀胱がんでは、予後不良と密接に関連づけられており、従来の治療法に対する感受性がかなり低い浸潤性／転移性表現型と対応させることができる（Ｅｃｃｌｅｓら，  １９９４）。
【００４６】
修飾腫瘍関連抗原
一定の実施形態において、細胞関連ポリペプチド抗原は、ＡＰＣの表面にＭＨＣクラスＩ分子と会合して提示された場合に、ポリペプチド抗原に由来するエピトープをその表面に提示する細胞に対するＣＴＬ応答が誘導されるように修飾される。そのような実施形態のいくつかでは、少なくとも一つの第１外来性ＴＨエピトープが、提示される際に、ＡＰＣの表面でＭＨＣクラスＩＩ分子と会合する。そのような実施形態のいくつかでは、細胞関連抗原が腫瘍関連抗原である。
【００４７】
エピトープを提示する能力を持つ模範的なＡＰＣには樹状細胞およびマクロファージが含まれる。他の模範的ＡＰＣには、１）ＭＨＣクラスＩ分子に結合したＣＴＬエピトープおよび２）ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したＴＨエピトープを同時に提示する能力を持つ任意の飲作用性または食作用性ＡＰＣが含まれる。
【００４８】
一定の実施形態では、対象への投与後に、主としてＨＥＲ−２と反応するポリクローナル抗体が惹起されるように、ＨＥＲ−２への修飾が行われる。そのような抗体は腫瘍細胞を攻撃して排除すると共に、転移細胞が転移へと発達するのを防止することができるだろう。この抗腫瘍効果のエフェクター機構は、補体および抗体依存性の細胞性細胞傷害によって媒介されるだろう。また、誘導される抗体は、受容体の成長因子依存的なオリゴ−ダイマー化（ｏｌｉｇｏ−ｄｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）および内在化を阻害することによって、がん細胞成長を阻害することもできるだろう。一定の実施形態において、そのような修飾ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原は、腫瘍細胞によってディスプレイされる既知および／または予想ＨＥＲ−２エピトープに対するＣＴＬ応答を誘導することができるだろう。
【００４９】
一定の実施形態では、修飾ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原が、細胞関連ポリペプチド抗原のＣＴＬエピトープと、変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とを含み、その変異は外来性ＴＨエピトープの少なくとも一つのＣＴＬエピトープを含む。少なくとも一つのＣＴＬエピトープと、外来性ＴＨエピトープの少なくとも一つのＣＴＬエピトープを含む変異とを含むそのような修飾ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原のいくつか、およびそれらを製造する方法は、米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号および同第２００６／０００８４６５号に記載されている。
【００５０】
一定の実施形態では、外来性ＴＨエピトープが天然の「プロミスカス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」Ｔ細胞エピトープである。そのようなプロミスカスＴ細胞エピトープは、ある動物種または動物集団の個体の大部分において活性である。一定の実施形態では、ワクチンが、そのようなプロミスカスＴ細胞エピトープを含む。そのような実施形態のいくつかでは、プロミスカスＴ細胞エピトープの使用により、同じワクチンに極めて多数の異なるＣＴＬエピトープを使用する必要性が少なくなる。模範的なプロミスカスＴ細胞エピトープには、例えば破傷風毒素由来のエピトープ（Ｐ２およびＰ３０エピトープ（Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら，  １９８９）を含むがこれらに限るわけではない）、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、および熱帯熱マラリア原虫ＣＳ抗原などが含まれるが、これらに限るわけではない。
【００５１】
さらなるプロミスカスＴ細胞エピトープとして、異なるＨＬＡ−ＤＲによってコードされるＨＬＡ−ＤＲ分子の大部分を結合する能力を持つペプチドも挙げられる。例えばＷＯ  ９８／２３６３５（Ｆｒａｚｅｒ  ＩＨら，  クイーンズランド大学に譲渡）；Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ  Ｓら，  １９９８，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０：  ３３６３  ３３７３；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ  Ｆら，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：７７８  ７８０；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧら，  １９９５，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：４  １７８  ２２８；Ｃｈｉｃｚ  ＲＭら，  １９９３，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １７８：２７  ４７；Ｈａｍｍｅｒ  Ｊら，  １９９３，  Ｃｅｌｌ  ７４：１９７  ２０３；およびＦａｌｋ  Ｋら，  １９９４，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：２３０  ２４２を参照されたい。最後の参考文献はＨＬＡ−ＤＱおよび−ＤＰリガンドも扱っている。これらの参考文献に列挙されているエピトープは全て、これらと共通のモチーフを共有するエピトープと同様、本明細書に記載する天然エピトープ候補として重要である。
【００５２】
他の一定の実施形態では、プロミスカスＴ細胞エピトープが、ハプロタイプの大部分を結合する能力を持つ人工Ｔ細胞エピトープである。そのような実施形態のいくつかでは、人工Ｔ細胞エピトープが、ＷＯ  ９５／０７７０７および対応する論文Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら，  １９９４，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１  ７６１に記載のパンＤＲエピトープペプチド（ｐａｎ  ＤＲ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ；「ＰＡＤＲＥ」）である。
【００５３】
ｍＨＥＲ２
さまざまな修飾ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原と、それを製造するための方法が、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号および同第２００６／０００８４６５号に記載されている。これらの文書には、ＨＥＲ−２ポリペプチド中の異なる位置にプロミスカスＴ細胞エピトープを含むさまざまな修飾ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原が記載されている。
【００５４】
ヒトＨＥＲ−２配列は、タンパク質の一次構造だけに基づいて、いくつかのドメインに分割することができる。それらのドメインは次のとおりである。細胞外（受容体）ドメインはアミノ酸１〜６５４にわたり、以下のようにいくつかのサブドメインを含有する：ドメインＩ（成熟ポリペプチドのＮ末端ドメイン）はアミノ酸１〜１７３にわたる；ドメインＩＩ（システインリッチドメイン、２４個のシステイン残基）はアミノ酸１７３〜３２３にわたる；ドメインＩＩＩ（相同なＥＧＦ受容体中におけるリガンド結合ドメイン）はアミノ酸３２４〜４８３にわたる；そしてドメインＩＶ（システインリッチドメイン、２０個のシステイン残基）はアミノ酸４８４〜６２３にわたる。膜貫通残基はアミノ酸６５４〜６７５にわたる。細胞内（キナーゼ）ドメインはアミノ酸６５５〜１２３５にわたり、アミノ酸６５５〜１０１０にわたるチロシンキナーゼドメイン（コアＴＫドメインは７２５〜９９２にわたる）およびアミノ酸１０１１〜１２３５にわたるＣ末端ドメインを含有する。
【００５５】
Ｐ２またはＰ３０ヒトＴヘルパーエピトープのどちらか一方で置換されるべきＨＥＲ−２のアミノ酸配列中の部位の選択は、米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８および同第２００６／０００８４６５号に記載されている。要約すると、以下のパラメータが考慮された：
１．既知および予想ＣＴＬエピトープ；
２．関連受容体（特にＥＧＦＲ）に対する相同性；
３．システイン残基の保存；
４．予想されるループ、α−ヘリックスおよびβ−シート構造；
５．潜在的Ｎ−糖鎖付加部位；
６．露出および埋没アミノ酸残基の予想；
７．ドメイン構成。
【００５６】
ＣＴＬエピトープは、ドメインＩ、ドメインＩＩＩ、ＴＭドメイン中、およびＴＫドメイン内にある２または３箇所の「ホットスポット」中に集まっているようである。米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号および同第２００６／０００８４６５号で述べられているように、これらは大部分が保存されているはずである。
【００５７】
他の受容体との高度な相同性を持つ領域は、ＨＥＲ−２の「全体的な」三次元構造にとって、それゆえ抗体認識にとって、構造上重要であると思われるのに対して、相同性の低い領域は、おそらく結果として局所的な構造変化が起こるだけで、交換することができるだろう。
【００５８】
システイン残基は、多くの場合、分子内ジスルフィド橋形成に関与し、したがって三次構造に関与するので、変化させるべきでない。アルファ−ヘリックスまたはベータ−シート構造を形成すると予想される領域は、タンパク質のフォールディングに関与していると考えられるので、これらの領域は外来性エピトープの挿入点としては避けるべきである。
【００５９】
潜在的Ｎ−糖鎖付加部位は、タンパク質のマンノシル化が望まれるのであれば、保存されるべきである。
【００６０】
分子の内部にあると（その疎水性によって）予想される領域は、フォールディングに関与しうるので、好ましくは、保存されるべきである。対照的に、溶媒露出領域は、モデルＴＨエピトープＰ２およびＰ３０の挿入位置候補として役立つだろう。
【００６１】
最後に、タンパク質のドメイン構成は、タンパク質の構造と機能にとって重要であるから、考慮すべきである。
【００６２】
米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号および同第２００６／０００８４６５号で述べられているように、戦略の焦点はＨＥＲ−２の細胞外部分の構造を可能な限り保存することであった。なぜなら、タンパク質のなかでも、これが中和抗体のターゲットとして重要な部分だからである。対照的に、がん細胞の表面にあるネイティブ膜結合型ＨＥＲ−２の細胞内部分には、体液性免疫系はアクセスできない。
【００６３】
米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号および同第２００６／０００８４６５号には、ＨＥＲ−２のさまざまなドメインに挿入された破傷風毒素のＰ２およびＰ３０エピトープを使ったさまざまな模範的コンストラクトが記載されている。「ｍＨＥＲ２」と呼ばれる模範的修飾ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原の一つは、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの９アミノ酸；修飾ＨＥＲ−２ポリペプチドのドメインＩＩ中、アミノ酸残基２７３〜２８７の間に挿入されたＰ２エピトープ；および修飾ＨＥＲ−２ポリペプチドのドメインＩＶ中、アミノ酸残基６５５〜６７５の間に挿入されたＰ３０エピトープを含む。
【００６４】
組換えＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２
限定でない一実施形態では、腫瘍関連抗原を含む組換えＭＶＡ、例えばＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２が、以下のように構築される。複製を許容する細胞タイプ、例えばＣＥＦ細胞を使って、細胞培養での組換えによって、最初のウイルスストックを作製する。細胞に、弱毒化ワクシニアウイルス、例えばＭＶＡ−ＢＮを接種すると共に、腫瘍関連抗原（例えばｍＨＥＲ２）配列とウイルスゲノムの隣接領域とをコードする組換えプラスミド（例えばｐＢＮ１４６）をトランスフェクトする。限定でない一実施形態では、プラスミドｐＢＮ１４６が、ＭＶＡ−ＢＮ中にも存在する配列（１４Ｌおよび１５Ｌオープンリーディングフレーム）を含有する。ｍＨＥＲ２配列は、ＭＶＡ−ＢＮウイルスゲノムへの組換えが可能になるように、そのＭＶＡ−ＢＮ配列の間に挿入される。一定の実施形態では、プラスミドが、ＣＥＦ細胞における組換えコンストラクトの選択が可能なように、１つまたはそれ以上の選択遺伝子を含む選択カセットも含有する。好ましい一実施形態では、組換えＭＶＡが配列番号２を含むポリペプチドをコードする。
【００６５】
培養物の同時の感染およびトランスフェクションにより、ウイルスゲノムと組換えプラスミドの間で、相同組換えが起こりうる。次に、インサートを保持するウイルスを単離し、特徴づけ、ウイルスストックを調製する。一定の実施形態では、選択遺伝子ｇｐｔおよびＥＧＦＰをコードする領域を欠失させるために、選択の非存在下で、ウイルスをＣＥＦ細胞培養物で継代する。
【００６６】
細胞毒性剤との併用療法
細胞毒性剤は、ワクチン効力にとって有益であるだろう免疫調整活性を、サブ殺腫瘍量で示す。しかし、殺腫瘍量（高用量）では、これらの薬剤はワクチン活性にとって有害になりうる。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置の過程でマウスに投与されたヒト等価殺腫瘍量のドセタキセルは、ワクチンが誘導する抗ＨＥＲ−２抗体価に影響を及ぼさないことが、ここに証明された。そのうえ、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２によるマウスの処置は、インビボでドセタキセルに対する腫瘍の感受性を増加させた。したがって、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置と同時に、またはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置に先だって、またはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置の後に行われる化学療法は、どちらか一方の処置だけよりも優れている可能性がある。
【００６７】
腫瘍関連抗原ＨＥＲ−２を過剰発現させる細胞が媒介するがんを持つ患者は、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡとタキサンとの併用によって処置することができる。好ましい一実施形態では、ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮである。特に好ましい一実施形態では、ＭＶＡが配列番号２を含むポリペプチドをコードする。
【００６８】
ＨＥＲ−２抗原をコードする組換えＭＶＡは、全身的もしくは局所的に、すなわち非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮内経路で、または熟練した医師に知られる他の任意の経路で投与することができる。ある実施形態では、１０５〜１０１０ＴＣＩＤ５０の組換えＭＶＡが、患者に投与される。好ましくは、１０７〜１０１０  ＴＣＩＤ５０の組換えＭＶＡが患者に投与される。より好ましくは１０８〜１０１０ＴＣＩＤ５０の組換えＭＶＡが患者に投与される。最も好ましくは１０８〜１０９  ＴＣＩＤ５０の組換えＭＶＡが患者に投与される。
【００６９】
がんは、好ましくは、乳がん、肺がん、胃がん、膵がん、膀胱がん、または卵巣がんである。好ましい一実施形態では、がんが転移性乳がんである。
【００７０】
がん患者は、マウスまたはラットを含む任意の哺乳動物であることができる。好ましくは、がん患者が霊長類、最も好ましくはヒトである。
【００７１】
ある実施形態では、タキサンがドセタキセルである。もう一つの実施形態では、タキサンがパクリタキセルである。タキサンは好ましくは殺腫瘍量で投与される。ドセタキセルの「殺腫瘍量」は少なくとも５０ｍｇ／ｍ２である。好ましくは、ドセタキセルの殺腫瘍量は７５〜１００ｍｇ／ｍ２であり、これは約２５〜３３ｍｇ／ｋｇの投与量に相当する。パクリタキセルの「殺腫瘍量」は少なくとも９０ｍｇ／ｍ２である。好ましくは、パクリタキセルの殺腫瘍量は１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２である。タキサンの「サブ殺腫瘍量」とは、殺腫瘍投与量より低い投与量である。タキサンは、当業者に知られる手段で、例えば静脈内に、投与することができる。
【００７２】
ある実施形態では、タキサンと、ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードするＭＶＡとが、同時に投与される。この併用処置はどちらか一方の処置だけよりも優れている。
【００７３】
ある実施形態では、ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードするＭＶＡに先だって、タキサンが投与される。ある実施形態では、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが６ヶ月以内に投与される。一定の実施形態では、タキサン後、３ヶ月以内、２ヶ月以内、または１ヶ月以内に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。ある実施形態では、タキサン後、２１日以内に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。ある実施形態では、タキサン後、１４日以内に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。ある実施形態では、タキサン後、７日以内に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。通常、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡは、タキサンによる処置の少なくとも２日後に投与される。この併用処置はどちらか一方の処置だけよりも優れている。
【００７４】
ある実施形態では、ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードするＭＶＡの後に、タキサンが投与される。通常、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡは、タキサンによる処置の少なくとも１週間前に投与される。ある実施形態では、タキサンに先だつこと２年未満の間に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。一定の実施形態では、タキサンに先立つこと１年未満、６ヶ月未満、または３ヶ月未満の間に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。ある実施形態では、タキサンの１〜２６週間前に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。ある実施形態では、タキサンの１〜９週間前に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。ある実施形態では、タキサンの１〜３週間前に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。この併用処置はどちらか一方の処置だけよりも優れている。
【００７５】
一定の実施形態では、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡの前と後の両方に、タキサンが投与される。別の実施形態では、タキサンの前と後の両方に、ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡが投与される。ＭＶＡおよびタキサンの投与は、単回投与または複数回投与であることができる。例えば投与は、１、２、３、４、５、または６週間隔てて行うことができる。
【００７６】
本発明は、組換えＭＶＡを含むキットを包含する。組換えＭＶＡはバイアルまたは容器内に含まれうる。好ましくは、組換えＭＶＡが、ＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードする。さまざまな実施形態において、ワクチン接種用のキットは、第１バイアルまたは第１容器に第１ワクチン接種（「初回免疫」）用の組換えＭＶＡを含み、第２バイアルまたは第２容器に第２ワクチン接種（「追加免疫」）用の組換えＭＶＡを含む。
【００７７】
ある実施形態において、キットは、組換えＭＶＡと、殺腫瘍量のタキサンの投与前にその組換えＭＶＡを投与するようにという指示とを含有することができる。この指示は、ＭＶＡがタキサン投与の６ヶ月前から１週間前までのいずれかの時点に投与されるべきであることを指示することができる。好ましい実施形態において、指示は、ＭＶＡがタキサン投与の３ヶ月前から１週間前まで、６週間前から１週間前まで、１ヶ月前から１週間前まで、３週間前から１週間前まで、および２週間前から１週間前までの間のいずれかの時点に投与されるべきであることを指示する。ある実施形態において、指示は、ＭＶＡがタキサン投与の１週間前から０日前までの間のいずれかの時点に投与されるべきであることを指示することができる。
【００７８】
キットは、組換えＭＶＡと、殺腫瘍量のタキサンの投与と同時にその組換えＭＶＡを投与するようにという指示とを含有することもできる。
【００７９】
キットは、組換えＭＶＡと、殺腫瘍量のタキサンの投与後にその組換えＭＶＡを投与するようにという指示とを含有することもできる。この指示は、ＭＶＡがタキサン投与の１日後から６ヶ月後までのいずれかの時点に投与されるべきであることを指示することができる。好ましい実施形態において、指示は、ＭＶＡがタキサン投与の２日後から１週間後まで、２日後から２週間後まで、２日後から３週間後まで、２日後から１ヶ月後まで、２日後から２ヶ月後まで、２日後から３ヶ月後まで、および２日後から６ヶ月後までの間のいずれかの時点に投与されるべきであることを指示する。ある実施形態において、指示は、ＭＶＡがタキサン投与の０日後から２日後までの間のいずれかの時点に投与されるべきであることを指示することができる。
【実施例】
【００８０】
＜実施例１＞
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の構築および感染細胞におけるタンパク質発現の解析
培養物の同時の感染およびトランスフェクションにより、ウイルスゲノムと組換えプラスミドの間で、相同組換えを起こさせた。インサートを保持するウイルスを単離し、特徴づけ、ウイルスストックを調製した。
【００８１】
プラスミドｐＢＮ１４６は、ＭＶＡ−ＢＮ中にも存在する配列（１４Ｌおよび１５Ｌオープンリーディングフレーム）を含有する。ＭＶＡ−ＢＮウイルスゲノムへの組換えが可能になるように、ｍＨＥＲ２配列を、それらＭＶＡ−ＢＮ配列中に挿入した。こうして、ポックスウイルスプロモーター（具体的には牛痘ウイルスＡ型封入体遺伝子プロモーター）の下流にｍＨＥＲ２配列を含有するプラスミドが構築された。このプラスミドは、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｐｓ）、薬剤耐性遺伝子（グアニン−キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ；Ｅｃｏｇｐｔ）、内部リボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）、および強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を含む選択カセットも含有した。両方の選択遺伝子（ｇｐｔおよびＥＧＦＰ）が単一の２シストロン性転写物によってコードされた。
【００８２】
ＨＥＲ−２配列を、それに対する免疫応答を増加させるために、ｐ２およびｐ３０の破傷風毒素エピトープをコードするヌクレオチド配列の付加によって修飾した。ｍＨＥＲ２をＭＶＡ−ＢＮゲノムに挿入した後のウイルス「インサート領域」は以下の構造を持った：
ＡＴＩプロモーター−ｍＨＥＲ２配列−Ｐｓプロモーター−ｇｐｔ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ。このインサート領域が、細菌組換えプラスミドｐＢＮ１４６中のＭＶＡ−ＢＮ  Ｉ４Ｌ遺伝子間領域配列（Ｆ１およびＦ２）で挟まれた。このコンストラクトのヌクレオチド配列を以下に示す。
【００８３】
【化１】
2014129416.tif 000002
【００８４】
（配列番号１）
ＨＥＲ２開始および停止コドンを太字で示す。隣接配列を斜体で示す。
【００８５】
コードされているｍＨＥＲ２ポリペプチドの翻訳を以下に示す。
【００８６】
【化２】
2014129416.tif 000003
【００８７】
（配列番号２）
ｐ２およびｐ３０配列の破傷風毒素エピトープを太字で示す。
【００８８】
ＣＥＦ培養物にＭＶＡ−ＢＮを接種すると共に、ｐＢＮ１４６プラスミドＤＮＡもトランスフェクトした。次に、これらの細胞培養物から得た試料を、選択薬を含有する培地中のＣＥＦ培養物に接種し、ＥＧＦＰ発現ウイルスクローンをプラーク精製によって単離した。選択薬の存在下で成長してＥＧＦＰを発現させるウイルスストックを、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２と名付けた。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の作製およびウイルスストックの調製には、５回のプラーク精製を含む１２代の連続継代を要した。
【００８９】
次に、選択薬の非存在下で、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２をＣＥＦ細胞培養物中で継代した。選択薬の不在が、挿入された配列からの選択遺伝子ｇｐｔおよびＥＧＦＰをコードする領域ならびに関連プロモーター（選択カセット）の喪失を可能にした。選択カセットの喪失をもたらす組換えは、プラスミドｐＢＮ１４６中の選択カセットに隣接するＦ１  Ｉ４Ｌ領域およびその領域の小単位Ｆ１リピート（Ｆ１  ｒｐｔ）によって媒介される。これらの重複配列は、選択カセットの喪失をもたらしてＩ４Ｌ遺伝子間領域中に挿入されたｍＨＥＲ２配列だけを残すような組換えを媒介するために、含められたものである。
【００９０】
選択カセットを欠くプラーク精製ウイルスを調製した。その調製には、５回のプラーク精製を含む１５代の継代を要した。
【００９１】
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２ストックにおけるｍＨＥＲ２配列の存在および親ＭＶＡ−ＢＮウイルスの非存在をＰＣＲによって確認し、ネステッドＰＣＲを使って、選択カセット（ｇｐｔおよびＥＧＦＰ遺伝子）の非存在を検証した。
【００９２】
インビトロでＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を接種した細胞において、ｍＨＥＲ２タンパク質の発現を証明した。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）またはＨｅＬａ細胞の培養物に、表示した希釈度のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２もしくはＭＶＡ−ＢＮ、またはＴＢＳ緩衝液を接種した。２４時間後に培養物から細胞を収集し、細胞溶解物を調製した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４％−１２％ビス−トリスゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適用し、ＭＯＰＳ緩衝液中、還元条件下（ジチオスレイトール）で電気泳動した。Ｐｈａｒｍｅｘａ  Ａ／Ｓから入手した２つの参照標準、すなわちＨＥＲ−２標準およびＨＥＲ−２細胞外ドメイン標準（０．３ｕｇ  ＨＥＲ−２  ｅｃｄ）を含めた。ゲルをニトロセルロース膜上にエレクトロブロットし、それをウサギ抗ＨＥＲ−２抗血清（Ｐｈａｒｍｅｘａ  Ａ／Ｓから入手）と共にインキュベートした。結合したＨＥＲ−２抗体を、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギ抗体および発色性基質（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で明らかにした。
【００９３】
結果を図１に示す。矢印は、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を接種した細胞培養物から得られる溶解物中の、抗ＨＥＲ−２抗血清で検出されるタンパク質の位置を示す。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を接種したどちらの細胞タイプから得た溶解物でも、ＨＥＲ−２タンパク質参照標準と類似するサイズの抗原が検出された（図１の矢印で示す）。ＭＶＡ−ＢＮまたはトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）を接種した培養物から得られる溶解物には、ＨＥＲ−２タンパク質参照標準とサイズが類似するタンパク質は、検出されなかった。
【００９４】
これらのデータは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２による細胞の接種後に起こる、鳥類細胞およびヒト細胞におけるｍＨＥＲ２の発現を証明している。したがってＭＶＡ−ＢＮは、ｍＨＥＲ２のようなトランスジェニック抗原をヒト細胞で発現させるための有効な送達ビヒクルになる。
【００９５】
＜実施例２＞
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置されたマウスにおける抗ＨＥＲ−２免疫応答の誘導
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２による処置後に起こる抗ＨＥＲ−２免疫応答の誘導を、免疫学的バックグラウンドまたはハプロタイプが異なる２つのマウス系統ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方で評価した。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２による処置後に起こる抗ＨＥＲ−２免疫応答の誘導を、トランスジェニックＨＥＲ−２マウス系統ＢＡＬＢ／ｃ  ＮｅｕＴマウスでも評価した。これらの研究では、２Ｅ６〜５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０の範囲にわたるさまざまな用量のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を、以下に詳述するように評価した。以下に述べるように、各処置の前日ならびに処置中および処置後のさまざまな時点で、血液試料を収集した。体液性応答（抗ＨＥＲ−２  ＩｇＧの産生）をＥＬＩＳＡアッセイによって解析した。最終処置後に脾細胞を集め、細胞性応答をＥＬＩＳｐｏｔで解析した。これらの研究を実施例３で説明する。
【００９６】
マウス系統：８〜１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをＨＳＤから入手した。ＢＡＬＢ／ｃ  ＮｅｕＴマウスはＧｕｉｄｏ  Ｆｏｒｎｉの厚意で提供された。このマウスは、キメラマウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターの制御下にある活性化ＨＥＲ−２／Ｎｅｕがん遺伝子を発現させる。ＢＡＬＢ／ｃ  ＮｅｕＴ雌は、３週齢までは乳腺の形態学的異常を示さない。次にこれらは非定型過形成を経て上皮内小葉癌に進行する。２５週齢までに１０個の乳腺全てが浸潤癌を示す（Ｂｏｇｇｉｏら，  １９９８，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．）。全ての実験に、１群あたり５〜１０匹のマウスを使用した。
【００９７】
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置したマウスにおける抗ＨＥＲ−２抗体応答の誘導
ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、およびＢＡＬＢ／ｃ  ＮｅｕＴマウスに、対照溶液（トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ））、または２Ｅ６、１Ｅ７、もしくは５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を、１日目、１５日目および２９日目に皮下注射した。これらの試験処置群はそれぞれ５匹とした。０日目、１４日目、２８日目、４２日目および５６日目に、血液試料を集めた。各試験群の５匹の動物のそれぞれから得た血清をプールし、ＥＬＩＳＡアッセイを使って抗ＨＥＲ−２  ＩｇＧの存在について分析した。
【００９８】
ＥＬＩＳＡアッセイは以下のように行った。まず、ＥＬＩＳＡプレートを、２μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）の組換えＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラ（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、コーティング緩衝液（２００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．６）に希釈したもの）により、室温で１時間コーティングした。プレート洗浄機（Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を使ってプレートをＰＢＳ＋０．０５％ツイーンで６回洗浄した後、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンで１時間ブロックした。プレートを再び６回洗浄した。マウス血清をＰＢＳ＋０．０５％ツイーンに希釈し、５０μｌ／ウェルずつ加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。次にプレートを６回洗浄し、ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｊ３００３−ＶＩ４５１３）を加えた（５０μｌ／ウェル、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンに１：１０００希釈したもの）。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を全てのウェルに加えた。プレートを暗所で２０分間インキュベートした後、１００μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を全てのウェルに加えた。プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を使って、各ウェルにおける４５０ｎｍでの吸光度を決定した。
【００９９】
結果を図２Ａ〜Ｃに示す。図２Ａおよび２Ｂは、抗ＨＥＲ−２抗体応答が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでもＢＡＬＢ／ｃマウスでも、全てのＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置群で検出されることを示している。どちらの系統においても、抗ＨＥＲ−２抗体価はＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の複数回投与によって増加し、処置を停止した後はプラトーに達した。図２Ｃは、ＨＥＲ−２を構成的に発現させるＨＥＲ−２トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ  ＮｅｕＴマウスでも抗ＨＥＲ−２抗体応答が検出されたことを示している。こうして、これらのデータは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２がＨＥＲ−２に対する免疫寛容を克服することのできる強力な免疫原であること（これはがん患者の処置に役立ちうる属性である）を証明している。
【０１００】
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２誘導性抗ＨＥＲ−２抗体応答の抗原特異性
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置マウスの血清を、上述の手法を使って、同様にＥＬＩＳＡで評価した。ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、およびＨＥＲ−４  ｅｃｄ−Ｆｃキメラタンパク質を、微量滴定プレートのウェルにコーティングされる抗原として使用した。モノクローナル抗ＨＥＲ−２抗体（ＨＥＲ−２  Ａｂ；ＡＢ−５、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、モノクローナル抗ヒトＩｇ  Ｆｃフラグメント抗体（Ｆｃ  Ａｂ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはモノクローナルアイソタイプ対照抗体（Ｃｏｎｔｒ  Ａｂ）を使って抗原を検出した。結果を図３に示す。図３ＡはＥＬＩＳＡ対照を示し、モノクローナル抗ＨＥＲ−２抗体がＨＥＲ−２  ｅｃｄ−Ｆｃ被覆ウェルだけと特異的に反応するのに対して、モノクローナル抗ヒトＩｇ  Ｆｃフラグメント抗体は３つのキメラタンパク質の全てと反応する。図３Ｂおよび３Ｃは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスのどちらにおいても、血清がＨＥＲ−２  ｅｃｄ−Ｆｃキメラだけを検出したことを示している。これらのデータは、どちらのマウス系統でも、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置後に誘導される抗体応答は、ＨＥＲ−２に対して高度に特異的であり、上皮成長因子受容体ファミリーの他の一定のメンバー、例えばＨＥＲ−３およびＨＥＲ−４とは、交差反応しないことを示している。
【０１０１】
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置マウスにおける抗ＨＥＲ−２抗体の誘導を、ヒトＨＥＲ−２を発現させるマウス細胞株（ＣＴ２６−ＨＥＲ−２；後述）を使って、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）解析でも評価した。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置されたマウスの血清は、ヒトＨＥＲ−２を発現させる細胞に結合するが、この受容体を発現させないその親対応物には結合しない抗体を含有した（データ未掲載）。
【０１０２】
要約すると、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２によるマウスの処置が、ヒトＨＥＲ−２ポリペプチドに結合する能力および細胞表面に発現されたヒトＨＥＲ−２に結合する能力を持つ抗体の形成を刺激することを、これらのデータは証明している。
【０１０３】
＜実施例３＞
抗ＨＥＲ−２  Ｔ細胞応答の誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス（各群５匹）に、対照（ＴＢＳ）または１Ｅ７  ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を、１日目、１５日目、２９日目、および４３日目に皮下注射した。４８日目に動物から脾臓を収集し、各試験群から得た細胞懸濁液を分析用にプールした。インビトロ抗原特異的再刺激後のＩＦＮγ産生を測定するＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、Ｔ細胞応答の誘導を評価した。再刺激には、ＨＥＲ−２  ｅｃｄ、ＭＨＣクラスＩ  ＨＥＲ−２ペプチド、およびｍＨＥＲ２配列に含まれる破傷風毒素由来の２つのＭＨＣクラスＩＩ  Ｔヘルパーペプチドを、個別に使用した。クラスＩ  ＨＥＲ−２ペプチドはアミノ酸配列ＴＹＬＰＴＮＡＳＬ（配列番号３）を持った。ＭＨＣクラスＩＩ  Ｔヘルパー破傷風毒素ペプチドＰ２はアミノ酸配列ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号４）（図４ではＴＴｐ２と表記）を持ち、ＭＨＣクラスＩＩ  Ｔヘルパー破傷風毒素ペプチドＰ３０はアミノ酸配列ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号５）（図４ではＴＴｐ３０と表記）を持った。
【０１０４】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは以下のように行った。１５μｌの３５％エタノールを各ウェルに加えることにより、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ９６ウェル濾過プレートの膜を前もって濡らして、アッセイプレートの準備をした。エタノールを直ちに払い落とし、プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。プレートを、２μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル、ＰＢＳに希釈）のラット抗マウスＩＦＮ−γ捕捉抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５１２１６、ロット番号３４５０３）でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。コーティング抗体を払い落とし、プレートを滅菌条件下にＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ−１０（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋β−メルカプトエタノール）により、プレートを室温で３０分間ブロックした後、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１０５】
エフェクター細胞を５０μｌのＲＰＭＩ−１０（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋２−ＭＥ  ５×１０−５Ｍ＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ．）に表示した濃度で加えた。ＨＥＲ−２タンパク質、ＨＥＲ−２ペプチド、または破傷風毒素タンパク質およびペプチドをＲＰＭＩ−１０に希釈し、適当な希釈度（通常、タンパク質の場合は１０ｕｇ／ｍｌ、ペプチドの場合は２５μＭから出発するが、実験によって変動する）で、エフェクターウェルに加えた（５０μｌ／ウェル）。プレートをＣＯ２培養器中、３７℃で、約１８時間インキュベートした。
【０１０６】
細胞をウェルから払い落とし、１００μｌ／ウェルのｄＨ２Ｏを全てのウェルに室温で５分間加えた。ウェルを１００μｌ／ウェルのｄＨ２Ｏで３回洗浄した。次に、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンを洗浄緩衝液として、プレートをプレート洗浄機（Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）で６回洗浄した。
【０１０７】
５０μｌ／ウェルの抗ＩＦＮ−γ−ビオチン（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ１５４８Ｂ、バッチ番号０８０３）を、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ中、１：５０００の希釈度で、全てのウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンを洗浄緩衝液とし、プレート洗浄機（Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を使って、プレートを６サイクル洗浄した。次に、５０μｌ／ウェルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５４０６５、ロット番号４６４８４）を、ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ中、１：５０００の希釈度で全てのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。
【０１０８】
次に、プレート洗浄機（Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を使って、プレートを再び６サイクル洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を１５分間加えることにより、暗所で発色させた。基質を流しに払い落とし、水道水で十分に洗浄した。プレートの裏材を取り除き、プレートをドラフト内で乾燥させた。ＣｅｌｌＣｏｕｎｔ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔプレートスキャナーで、プレートをスキャンし、読み取った。
【０１０９】
結果を図４Ａ〜Ｄに示す。図４ＡおよびＣは、ＨＥＲ−２  ｅｃｄによる再刺激時に、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス（図４Ａ）およびＢＡＬＢ／ｃ系統マウス（図４Ｃ）のどちらの脾細胞でも、用量依存的なＴ細胞応答が検出されたことを示している。
【０１１０】
図４Ｂ（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）および図４Ｄ（ＢＡＬＢ／ｃマウス）は、このアッセイでは、ＨＥＲ−２  ＭＨＣクラスＩペプチドならびに両破傷風毒素ＭＨＣクラスＩＩペプチドと共にインキュベートした後に、ＩＦＮγ産生も検出されたことを示している。この結果は、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置されたマウスでは、ＭＨＣクラスＩ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞とＭＨＣクラスＩＩ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞がどちらも誘導されたことを示している。これらのデータは、ｍＨＥＲ２中の破傷風毒素ペプチドがＴヘルパーエピトープとして作用することをことを裏付け、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置が、ネイティブＨＥＲ−２タンパク質中に存在するエピトープと反応するＴ細胞（ＣＤ８  Ｔ細胞を含む）を誘導することを示している。
【０１１１】
要約すると、これらの研究は、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２によるマウスの反復処置が、抗体ならびにＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞サブタイプの両方を含む幅広い抗原特異的適応免疫応答を誘導することを示している。同様の結果がＣ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスの両方で得られたことで、異なるＭＨＣハプロタイプを持つ動物が同じように応答することが示された。上記実施例２で述べたように、ＨＥＲ−２寛容マウスにおいて特異的抗体応答が得られた。したがってＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置は、複数の経路による、さまざまなＭＨＣ環境での、自己抗原発現腫瘍細胞の排除を媒介する潜在能力を持ち、それは癌処置にとって望ましい。したがって、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の複数回注射を使用する処置レジメンを、ヒトがん患者の処置に使用することができる。
【０１１２】
＜実施例４＞
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置マウスにおけるＴｈ１免疫調整
上記実施例のデータは、ＭＶＡ−ＢＮが、強い免疫原性をも示す効率のよい導入遺伝子送達ビヒクルであることを示している。ＭＶＡが、痘瘡からの防御を付与するＴｈ１適応免疫応答をトリガーし（Ｅａｒｌら，  ２００４；Ｗｙａｔｔら，  ２００４）、先天免疫応答も誘導すること（Ｂｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚら，  １９９２；Ｄｏｋｕｎら，  ２００１）は、以前に報告されている。したがって、ＭＶＡ−ＢＮの固有の免疫特性は、導入遺伝子に対する免疫応答を調整するのに、潜在的に役立ちうる。
【０１１３】
免疫原の投与後に産生される一定の抗体サブタイプを調べることにより、免疫応答の一定の特徴が明らかになることが知られている。例えば、Ｔｈ１免疫環境ではＩｇＧ２ａ抗体が優勢になるのに対して、Ｔｈ２免疫応答が誘導されると、ＩｇＧ１抗体が優勢になる。Ｔｈ１免疫環境は、免疫応答の体液性成分と細胞性成分を両方とも含むので、がん免疫治療においては望ましいであろう長期にわたる防御応答に貢献する。対照的に、Ｔｈ２免疫環境は、がん免疫治療においてはそれほど望ましくない短寿命な免疫応答の体液性成分を含む。したがって、マウスにおいて免疫原を投与した後のＩｇＧ２ａサブタイプとＩｇＧ１サブタイプとの比を測定することは、免疫応答のＴｈ１／Ｔｈ２特徴を評価する手段になる。免疫原の投与後に起こるＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の増加は、Ｔｈ１環境へのシフトのしるしである。逆に、比の低下はＴｈ２応答へのシフトを示す。
【０１１４】
ＨＥＲ−２配列を含むさまざまな製剤でマウスを処置した後に産生される抗ＨＥＲ−２  ＩｇＧ２ａ抗体サブタイプとＩｇＧ１抗体サブタイプとの比を測定することにより、ＨＥＲ−２に対する免疫応答を調整するＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の能力を評価した。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２、フロイントアジュバントエマルション中のｍＨＥＲ２タンパク質、またはＨＥＲ−２（＋）腫瘍細胞株のいずれか一つによるＢＡＬＢ／ｃマウスの処置後に誘導される抗ＨＥＲ−２抗体のＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を、抗体サブタイプ特異的検出抗体を用いるＥＬＩＳＡによって決定した。このＥＬＩＳＡアッセイは、検出抗体を取り替えた点以外は、上述のように行った。結果を下記表１に示す。
【０１１５】
これらの結果は、フロイントアジュバント中のＨＥＲ−２またはＨＥＲ−２（＋）腫瘍細胞で処置されたマウスと比較して、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置されたマウスでは、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比が有意に高かったことを示している。さらにまた、これらの結果は、ＨＥＲ−２（＋）腫瘍細胞株で処置されたマウスから得られる血清における抗体のＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比が、これらのマウスをＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で併用処置した場合には増加したことも示している。この結果は、ＨＥＲ−２（＋）腫瘍細胞株の投与によってもたらされたＴｈ２環境においてさえ、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の追加投与によって、Ｔｈ１応答が効果的に誘導されたことを示している。
【０１１６】
【表１】
2014129416.tif 000004
【０１１７】
要約すると、これらのデータは、Ｔｈ１免疫応答への強いバイアスを特徴とするＭＶＡ−ＢＮの固有の免疫原性が、ＨＥＲ−２に対する免疫応答に、Ｔｈ１環境に向かう影響を及ぼすことを証明している。これは、ＨＥＲ−２を発現させる腫瘍細胞によって誘導されるＴｈ２に偏った抗ＨＥＲ−２抗体応答が存在する場合にも当てはまる。乳がん患者では腫瘍によって誘導された既存の抗ＨＥＲ−２抗体応答が報告されているので、治療との関連において、本明細書に記載するＭＶＡ−ＢＮの強力な免疫調整特性は望ましい。したがって、たとえＨＥＲ−２に対する望ましくないＴｈ２応答が既に存在していたとしても、患者をＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置することにより、免疫応答の性質がＴｈ１プロファイルへと方向を変えるはずである。
【０１１８】
＜実施例５＞
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置されたマウスにおける抗腫瘍活性
予防的処置
予防的状況において腫瘍成長を防止するというＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の能力を、マウスにおける乳がんモデルとして、移植されたＴＵＢＯ細胞を使って評価した。ＴＵＢＯ細胞は、トランスフォーミングラットＨＥＲ−２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）がん遺伝子が導入されたトランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスで発生した乳腺癌に由来する（Ｒｏｖｅｒｏら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５，  ５１３３−５１４２（２０００））。ＨＥＲ−２配列はラットとヒトの間で高度に保存されているので、ＨＥＲ−２のラットまたはヒトホモログのどちらか一方を含むワクチンの効力を評価するために、ＴＵＢＯ細胞は日常的に使用される（Ｄｅｌａ  Ｃｒｕｚら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３，  ４７９３−４８０３  （２００５））。
【０１１９】
この効力研究では、マウスを上述のようにＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で免疫化した（すなわち、ＴＢＳまたはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（２Ｅ６もしくは５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）のどちらか一方を２週間隔で３回）。次に、処置したマウスを、最後のワクチン注射の６週間後に、３Ｅ５個のＴＵＢＯ細胞を皮内注射することによる腫瘍チャレンジに付した。その後、注射部位における腫瘍成長を週に２回観察し、ノギスを使って皮膚下の固形腫瘍のサイズを測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２［式中、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅］を使って算出した（１ｍｍ３＝１ｍｇ）。図５に示す結果は、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で前処置された動物における腫瘍が、対照処置マウスにおける腫瘍より、有意に小さかったことを示している。
【０１２０】
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２をいずれかの用量で与えられたマウスでは、ＴＢＳ処置マウスにおける腫瘍のサイズと比較して、腫瘍サイズの相違が統計的に有意だった（ｐ＜０．００５）。２５日目に、数匹のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置マウスが、腫瘍の安定化、退縮、さらには根絶を示した。最後のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置の６週間後にマウスに腫瘍細胞をチャレンジしたので、これらのデータは、観察された腫瘍成長の阻害が、おそらくは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２投与によって誘導された記憶免疫応答の想起によって媒介されたのであろうことを示している。
【０１２１】
要約すると、これらのデータは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２によるマウスの処置が、抗原特異的適応免疫応答および免疫記憶の樹立を誘導することを示している。その後に、ＨＥＲ−２を発現させる腫瘍細胞をマウスにチャレンジすると、その免疫記憶が想起されて、腫瘍細胞の成長を阻害する。
【０１２２】
治療的処置：ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を使った処置による定着腫瘍の抑制
定着腫瘍を抑制するＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の能力を、ヒトＨＥＲ−２を安定して発現させるＣＴ２６細胞を用いる実験的肺転移モデルで評価した。ＣＴ２６は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの化学的に誘導された結腸直腸癌である（Ｂｒａｔｔａｉｎら，  １９８０）。このモデルでは、ＣＴ２６−ＨＥＲ−２細胞がＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射され、腫瘍小結節が成長する肺における腫瘍量が評価される。
【０１２３】
１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２細胞（５Ｅ５個）を静脈内注射によってマウスにチャレンジし、４日目に、ＴＢＳ、ＭＶＡ−ＢＮ（５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）またはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）の腹腔内への単回注射によって、マウスを処置した。次に、１４日目にマウスを屠殺し、その肺を重量測定した。ナイーブマウス（腫瘍細胞をチャレンジしていないもの）の平均肺重量を腫瘍チャレンジしたマウスの平均肺重量から差し引くことによって、腫瘍質量を算出した。
【０１２４】
結果を図６に示す。これらの結果は、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置されたマウスにおける腫瘍量が、対照マウスにおける腫瘍量よりも有意に低いことを示している（ｐ＜０．０００００１）。実際、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２群の全ての動物において、対照群と比較して、明確に減少した肺重量が観察された。対照的に、対照群およびＭＶＡ−ＢＮ処置群のマウスでは、腫瘍量は類似していた。要約すると、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２によるマウスの処置は、マウスにおける定着ＨＥＲ−２（＋）腫瘍の成長を阻害する。
【０１２５】
治療的処置：ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２またはＭＶＡ−ＢＮによる処置後の防御先天免疫の誘導
先天免疫をトリガーすることによってＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の抗腫瘍活性に寄与するＭＶＡ−ＢＮの能力を、上述のＣＴ２６腫瘍モデルで評価した。この実験では、腫瘍チャレンジの日に（この時点で腫瘍量は少ない）、ＭＶＡ−ＢＮ（５Ｅ６もしくは５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）またはＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ６もしくは５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）のどちらか一方で、マウスを処置した。チャレンジされたマウスの肺において、上述のように腫瘍量を評価した。結果を図７に示す。これらの結果は、ＭＶＡ−ＢＮ（５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０）を使った処置による腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）が＞７０％であったこと（ｐ＜０．０００１
）を示している。ＭＶＡ−ＢＮ（５Ｅ６  ＴＣＩＤ５０）による処置は５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０による処置ほど効率がよくなかった（３２％ＴＧＩ；ｐ＝０．００２）ので、ＭＶＡ−ＢＮの抗腫瘍活性は用量依存的だった。対照的に、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ６または５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０のどちらか一方）で処置したマウスは、類似する防御を示した（＞７０％ＴＧＩ；ｐ＜０．０００００１）。
【０１２６】
総合すると、図６および７に示すデータは、ＭＶＡ−ＢＮとＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２はどちらも抗腫瘍活性を持っているが、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の活性の方が優れていることを証明している。実際、肺転移モデルでは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ６  ＴＣＩＤ５０）による１日目のマウスの処置（図７）は、同じ用量のＭＶＡ−ＢＮによる処置よりも有効だった。このモデルでは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２による４日目のマウスの処置（図６）も腫瘍成長を抑制したが、ＭＶＡ−ＢＮでは効果がなかった。したがって、一定の設定において観察されたＭＶＡ−ＢＮの抗腫瘍活性は、おそらくは、先天免疫の刺激によるものであるだろう。全ての実験で観察されたＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の優れた活性は、先天免疫系の刺激と特異的抗ＨＥＲ−２適応免疫応答の誘導との組合せによるものと思われる。
【０１２７】
＜実施例６＞
細胞毒性剤との併用療法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、対照（トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）；５匹のＩ群）または５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５匹ずつの９群）による皮下処置を、１日目、２２日目および４３日目（３週毎×３）に行った。化学療法剤ドセタキセルが抗ＨＥＲ−２抗体誘導に及ぼす影響を、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置の１週間前（−７日目）または２日前（−２日目）に殺腫瘍量（３３ｍｇ／Ｋｇ）の薬物で動物を処置することによって評価した。薬物を、１回、２回（３週毎×２）、３回（３週毎×３）または４回（３週毎×４）、ｉｖ注射した。動物群の配置、投与レジメンおよびスケジュールを、表２に要約する。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
−９日目（前採血）、各ワクチン処置の１３日後（ｄ１４、３５、５６）および最後の薬物処置の１週間後（ｄ７０）に、血液試料を収集した。各試験群から得た血清をプールし、ＥＬＩＳＡにより、微量滴定プレートのウェル上にコーティングされる抗原として市販のＨＥＲ−２  ｅｃｄ−Ｆｃキメラタンパク質を使って分析した。このキメラタンパク質は、ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメインに融合されたネイティブヒトＨＥＲ−２の細胞外ドメインを含む。図８ＡおよびＢに示すように、抗ＨＥＲ−２抗体応答は、全てのＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置群で、どの時点においても検出され、ワクチン接種の２日前または７日前にマウスを殺腫瘍量のドセタキセル（３３ｍｇ／Ｋｇ）で前処置した場合、力価は有意に異ならなかった。さらにまた、ドセタキセル処置を３回のワクチン接種スケジュールの全体にわたって継続した場合でも、抗体応答は影響を受けなかった。
【０１３０】
ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２の抗腫瘍活性を測定することにより、殺腫瘍量のドセタキセルで処置されたマウスにおいてＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２が誘導する免疫応答の完全性を、さらに評価した。実際、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２は、ワクチン接種後に移植された腫瘍の成長を遅らせる能力を持つ記憶応答を誘導することが、先に（実施例５）に示されている（予防的腫瘍モデル）。そこで、上記表２の試験群のマウスに、７１日目にＭＣ３８−ＨＥＲ−２腫瘍細胞（Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４９，  １７９−１８８（１９９９））をチャレンジし、実施例５で説明したように、腫瘍成長を評価した。図９ＡおよびＢに示すように、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２で処置したマウス群の全てにおいて、腫瘍成長が遅延した。殺腫瘍量のドセタキセルによる前処置および同時処置は、腫瘍成長遅延に有意な影響を持たなかった。この実験は予防的設定で行ったので、測定された抗腫瘍効果は、おそらく、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２誘導性抗ＨＥＲ−２免疫応答によって媒介されたものであり、ドセタキセルは腫瘍に対する直接の細胞傷害効果を持たなかったのだろう。実際、ドセタキセル処置と腫瘍チャレンジの間の最短の時間間隔は９日だった（６２日目にドセタキセル投与を受けた第６群）。化学療法剤の薬理学的性質を考えると、腫瘍移植の時点では薬物濃度が低すぎて有効ではなかったと思われる。したがって、このデータにより、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２とドセタキセルとの併用処置は、このワクチンによる防御免疫応答の誘導にとって有害でないことが確認された。このことは、ヒトでの標準的処置レジメンを反映して殺腫瘍量の化学療法剤を３週間間隔で使用した場合にも当てはまる。
【０１３１】
次に、化学療法と免疫療法の併用処置によってもたらされる潜在的利益を、治療的設定のマウスＭＣ３８−ＨＥＲ−２腫瘍モデルで評価した。この実験では、１回の化学療法処置がそれぞれ２回の免疫療法処置前、２回の免疫療法処置中、または２回の免疫療法処置後に行われる３つのサブセット（サブセットＡ、ＢおよびＣ）に、動物を分割した。
【０１３２】
サブセットＡでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４０匹）に１日目にＭＣ３８−ＨＥＲ−２細胞をチャレンジした後、対照（トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）；ｄ１、８および１５に１０匹を処置）、ドセタキセルのみ（３３ｍｇ／Ｋｇ；ｄ１に１０匹を処置）、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２（５Ｅ７  ＴＣＩＤ５０；ｄ８および１５に１０匹を処置）、または１日目にドセタキセルの後、ｄ８および１５にＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２を使って皮下処置を行った。２３日目に屠殺するまで、腫瘍成長を週に２回評価した。図１０Ａに示すように、１日目のドセタキセル処置が腫瘍成長のわずかな一過性の遅延（統計的に有意な差は１９日目までしか検出されなかった）をもたらしたのに対して、８日目および１５日目のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置は腫瘍成長に影響を持たなかった。対照的に、ｄ８および１５におけるＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２投与に先だってドセタキセル（ｄ１）を投与する併用処置は、この研究の全体を通して腫瘍成長を阻害するのに、著しく有効だった（２３日目でｐ＝０．００１）。
【０１３３】
サブセットＢでは、同じ４つの動物群で実験を行ったが、ドセタキセルをｄ８に与えたのに対して、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２は１日目および１５日目に投与した。腫瘍サイズが重量で５０ｍｇ（このモデルでは８日目付近でこの重量に到達する）をひとたび超えると、ドセタキセルがＭＣ３８−ＨＥＲ−２成長に影響を持たないことは、以前に決定されている。予想どおり、８日目のドセタキセル処置が腫瘍成長に何の影響も持たなかったのに対し（図１０Ｂ）、２週間間隔で２回のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２投与（１日目および１５日目）は腫瘍成長の阻害に著しく有効だった（２３日目でｐ＝０．００２）。さらに重要なことに、この抗腫瘍活性は、ワクチン処置の間に投与された高用量のドセタキセルによって、負の影響を受けなかった（図１０Ｂ）。
【０１３４】
サブセットＣでは、同じ４つの動物群で実験を行ったが、ドセタキセルをｄ１５に与えたのに対して、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２は１日目および８日目に投与した。サブセットＢと同様に、全ての群において腫瘍は、化学療法処置の時点（１５日目）で、ＭＣ３８−ＨＥＲ−２成長の低減に関してドセタキセルが無効になるサイズ限界を超えた。そして予想どおり、図１０Ｃは、ドセタキセルが、単独で投与された場合に、腫瘍成長に影響を持たなかったことを示している。サブセットＡと同様に、１週間間隔で行われる２回のＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２投与からなるワクチン処置も最適ではなく、同様に腫瘍成長には影響を持たなかった。驚いたことに、ワクチン投与後にドセタキセルを与えられたＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置群に属するマウスの平均腫瘍サイズは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２だけで処置されたマウスの腫瘍サイズの平均よりも有意に小さかった（２３日目でｐ＝０．０３６）。このデータは、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置がインビボでドセタキセルに対するＭＣ３８−ＨＥＲ２の感受性を増加させることを示している。
【０１３５】
全体として、このデータは、ワクチンの効力に有害な影響を及ぼすことなく、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２と殺腫瘍量の化学療法剤とを併用できることを示している。実際、化学療法前処置はワクチン効力を増大させ、ワクチン前処置は化学療法に対する腫瘍の感受性を増加させたので、これら二つの治療法を併用することは互いに有益でありうることが見出された。したがって、ワクチンと化学療法とを継続的に交互投与するという併用処置は、より強力ながん処置レジメンを作成するための新しい手段にもなると考えられる。
【０１３６】
＜実施例７＞
エピトープ／抗原拡大（ｅｐｉｔｏｐｅ／ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）
エピトープ／抗原拡大は、瀕死の腫瘍細胞からのエピトープ／抗原の露出によってトリガーされる免疫応答の誘導によってもたらされる。ワクチンが誘導するエピトープ／抗原拡大は、最大限の抗腫瘍活性にとって著しく有利である。ＨＥＲ−２＋腫瘍に対して保護されたマウスは、ＨＥＲ−２を発現させない親腫瘍による２回目のチャレンジに抵抗するので、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２処置はエピトープ／抗原拡大をもたらすことが見出された。したがって、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２は、ＨＥＲ−２以外の腫瘍抗原にも拡大することができる幅広い防御免疫応答のトリガリング（これは、不均一な腫瘍を処置し、腫瘍エスケープを防止するための前提条件である）を可能にする。
【０１３７】
＜実施例８＞
ＮｅｕＴマウスにおける自然発生腫瘍
異種ＨＥＲ−２（例えばヒトＨＥＲ−２）で処置されたラットＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現させるトランスジェニックマウス（ＮｅｕＴマウス）において生じる自然発生腫瘍を遅延させるには、高力価かつ広スペクトルの抗体が要求される。裸のＤＮＡのような異種ＨＥＲ−２のワクチン製剤はこのモデルにおける腫瘍成長を遅延させることができなかったが、ウイルスに基づく製剤は抗腫瘍活性を示した。ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２は、処置を腫瘍発生の後期に開始した場合でさえ、ＮｅｕＴにおける自然発生腫瘍成長を遅延させることが見出された。したがってＭＶＡ−ＢＮは抗腫瘍活性を誘導するための優れた抗原製剤を与える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月8日(2014.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトがん患者を処置するための医薬組成物の製造におけるＨＥＲ−２抗原を含むポリペプチドをコードする組換えＭＶＡおよび殺腫瘍量のタキサンの使用。
【請求項２】
ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮである、請求項１の使用。
【請求項３】
ＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む、請求項１の使用。
【請求項４】
ＨＥＲ−２抗原が配列番号２を含む、請求項２の使用。
【請求項５】
タキサンがドセタキセルである、請求項１の使用。
【請求項６】
タキサンがパクリタキセルである、請求項１の使用。
【請求項７】
タキサンがドセタキセルである、請求項２の使用。
【請求項８】
タキサンがパクリタキセルである、請求項２の使用。
【請求項９】
タキサンがドセタキセルである、請求項３の使用。
【請求項１０】
タキサンがパクリタキセルである、請求項３の使用。
【請求項１１】
タキサンがドセタキセルである、請求項４の使用。
【請求項１２】
タキサンがパクリタキセルである、請求項４の使用。
【請求項１３】
タキサンが用量７５〜１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルである、請求項５の使用。
【請求項１４】
タキサンが用量１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルである、請求項６の使用。
【請求項１５】
タキサンが用量７５〜１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルである、請求項７の使用。
【請求項１６】
タキサンが用量１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルである、請求項８の使用。
【請求項１７】
タキサンが用量７５〜１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルである、請求項９の使用。
【請求項１８】
タキサンが用量１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルである、請求項１０の使用。
【請求項１９】
タキサンが用量７５〜１００ｍｇ／ｍ２のドセタキセルである、請求項１１の使用。
【請求項２０】
タキサンが用量１３５〜１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルである、請求項１２の使用。
【外国語明細書】
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