(57)【要約】【課題】本発明の目的は、肝臓において糖新生を抑制することのできる物質を有効成分として含む糖尿病治療用医薬組成物を提供することである。また、前記医薬組成物の有効成分を得るための簡便なスクリーニング系を提供し、更に、前記スクリーニング系により得られる物質を含有する糖尿病治療用医薬組成物を提供することにある。【解決手段】前記課題は、Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）による糖新生酵素の活性化を抑制する物質を有効成分として含むことを特徴とする、糖尿病、甲状腺機能亢進症、下垂体機能亢進症、副腎皮質機能亢進症、及び肥満症から選択される、血糖値の上昇を伴う疾患の予防又は治療用医薬組成物によって解決することができる。【選択図】図１
2014105177.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）による糖新生酵素の活性化を抑制する物質を有効成分として含むことを特徴とする、糖尿病、甲状腺機能亢進症、下垂体機能亢進症、副腎皮質機能亢進症、及び肥満症から選択される、血糖値の上昇を伴う疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記糖新生酵素の活性化が、肝臓におけるヒストンのアセチル化による糖新生酵素の活性化である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抑制物質が、Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡ、シクロペンチリデン−［４−（４’−クロロフェニル）チオザール−２−イル］ヒドラゾン（ＣＰＴＨ−２）、３−メチレン−４−ハイドロキシカルボニル−５−（１−プロピル）−テトラハイドロフラン−２−オン（ＭＢ−３）、３−メチルシクロペンチリデン−［４−（４０−シクロフェニル）チオザール−２−イル］ヒドラゾン（ＣＰＴＨ−６）、及びエチル−３−キノリンカルボキシレートからなる群から選択される抑制物質である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉の標的ｍＲＮＡ領域が、配列番号５で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号８で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号１１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号１４で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、及び配列番号１７で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、からなる群から選択されるｍＲＮＡ領域である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分の長さが１５〜４０ヌクレオチドである、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、配列番号５で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号８で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１１で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１４で表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び配列番号１７で表される塩基配列からなるＲＮＡ、からなる群から選択されるＲＮＡである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分において、
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているｓｈＲＮＡ、
（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチド、又は
（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖の一方又は両方の３’末端に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが結合し、突出末端を形成している二本鎖オリゴヌクレオチド、
である請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
被験物質のＫ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）によるヒストンのアセチル化を介する、肝臓の糖新生酵素の活性化の抑制を検出することを特徴とする、血糖値の上昇を伴う疾患の治療候補物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
（１）被験物質の肝臓糖新生酵素の活性化の抑制を検出する糖新生酵素抑制工程、及び
（２）被験物質のＫ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）によるヒストンのアセチル化の抑制を検出するアセチル化抑制工程、
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記糖新生酵素抑制工程（１）が、糖新生酵素のプロモーター活性の抑制の検出、及び／又は糖新生酵素の発現の抑制の検出であり、
前記アセチル化抑制工程（２）が、糖新生酵素のプロモーターにおけるヒストンのアセチル化抑制の検出である、請求項８又は９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記糖新生酵素が、グルコース６−ホスファターゼ、又はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病治療用医薬組成物及び有効成分のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（Ｋ（ｌｙｓｉｎｅ）  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２Ａ；以下、ＫＡＴ２Ａと称することがある）を抑制する物質を有効成分として含む医薬組成物により、糖尿病を治療することができる。
なお、ＫＡＴ２Ａは、従来ＧＣＮ５（General control of amino acid synthesis, yeast, homolog-like 2）と称されており、本明細書においてもＫＡＴ２ＡをＧＣＮ５と称することがある。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、血糖値（血液中のグルコース濃度）が、持続的に高く、病的な状態を示す疾患である。血糖値は、様々なホルモン（インスリン、及びグルカゴンなど）の作用により、一定に維持されているが、ホルモンによる調節機構が破綻した場合、血液中のグルコース濃度を維持することができなくなり糖尿病が発症する。
糖尿病は、主に１型糖尿病と２型糖尿病に分けられる。１型糖尿病は、膵臓のβ細胞が自己免疫疾患などによって破壊されることによって、血糖値を調節するホルモンの一つであるインスリンが枯渇し、発症する。一方、２型糖尿病は、肥満などを原因としてインスリン抵抗性となるか、又は膵臓のβ細胞からのインスリン分泌量が減少することによって、発症する。
【０００３】
正常な状態では、食事の後に血糖値が上昇すると、膵臓からのインスリン分泌が速やかに上昇し、そのインスリン濃度に反応して、肝臓での糖放出低下作用、並びに骨格筋及び脂肪組織での糖取り込み量の増加作用が生じ、血糖値が低下して正常に戻る。しかし、インスリン抵抗性を起こしている２型糖尿病患者では、組織におけるインスリンの感受性が低下しているため、インスリンに応答した筋肉及び脂肪組織で糖取り込みの上昇、又は肝臓での糖放出の低下が充分ではなく、食後高血糖又は空腹時高血糖といった異常な血糖値の変動を示すようになる。
糖尿病の治療は、軽症においては、食事療法、運動療法、及び肥満の改善等が主として行われ、更に進行すると、インスリン抵抗性を改善する糖尿病治療薬として、肝臓での糖放出抑制作用の増強を主作用とするビグアナイド剤などの投与が行われ、更に重症の場合は、インスリン製剤の投与が行われている。しかし、合併症や副作用などの問題があり、副作用のない、そしてより効果的な薬剤の開発が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００７０８５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」（米国）２００４年、第１０巻、ｐ．５３０−５３４
【非特許文献２】「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」（米国）２００９年、第２９６巻ｐ．Ｅ９４５−５４
【非特許文献３】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」（英国）２００５年、第４３４巻、ｐ．１１３−１１８
【非特許文献４】「セル・メタボリズム（Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」（米国）２００６年、第３巻、ｐ．４２９−４３８
【非特許文献５】「ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」（米国）２０１２年、第８巻、ｐ．６１２−６１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、肝臓において糖新生を抑制することのできる物質を有効成分として含む糖尿病治療用医薬組成物を提供することである。また、前記医薬組成物の有効成分を得るための簡便なスクリーニング系を提供し、更に、前記スクリーニング系により得られる物質を含有する糖尿病治療用医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特許文献１には、ＧＣＮ５の阻害剤により、ＰＧＣ−１αのアセチル化が抑制されることが開示されている。そして、ＰＧＣ−１αのアセチル化を抑制することによって、ＧＣＮ５の阻害剤が糖尿病の治療に用いることができることが開示されている。
ＰＧＣ−１αは、様々な臓器においてエネルギー代謝経路の転写制御に関わる転写コアクチベーターとして働いている。２型糖尿病の骨格筋において、ＰＧＣ−１αとそのターゲット遺伝子である脂肪酸代謝、及び酸化的リン酸化に関する遺伝子の発現が減少していたことから、ＰＧＣ−１αの減少が２型糖尿病の病態に関連する可能性が指摘されていた。
ＰＧＣ−１αを肝臓でノックダウンすると、肝臓の糖新生系酵素の発現量が低下し、空腹時血糖値が低下した（非特許文献１）。また、全身でＰＧＣ−１αのｍＲＮＡ量が２倍に増加したトランスジェニックマウスの肝臓では糖産生が増加した（非特許文献２）。従って、ＰＧＣ−１αは、肝臓においては糖の新生に関与していることが明らかとなった。
また、ＰＧＣ−１αの脱アセチル化によって、糖新生系酵素の発現が増加して肝細胞からの糖産生が増加した（非特許文献３）。更に、ＧＣＮ５は、ＰＧＣ−１αをアセチル化するが、肝臓でＧＣＮ５を強発現させると、マウスの血糖値が低下することが報告された（非特許文献４）。従って、ＧＣＮ５によってＰＧＣ−１αがアセチル化されると肝臓での糖新生が低下するものと考えられた。
【０００８】
前記のように、特許文献１には、ＧＣＮ５の阻害剤が糖尿病の治療に用いることができることが開示されている。しかしながら、特許文献１における糖尿病の治療のメカニズムは、ＰＧＣ−１αのアセチル化が抑制されることによりＰＧＣ−１αの脂肪酸の酸化機能が亢進し、メタボリックシンドロームに関連する疾患のリスクを下げるものであり、従って糖尿病はいくつかのメタボリックシンドロームに関連する疾患の１つとして記載されているのみである。そして、ＧＣＮ５の阻害剤が血糖値を低下させる薬理データは、特許文献１には全く記載されていない。また、非特許文献３及び４の記載から、ＧＣＮ５によってＰＧＣ−１αがアセチル化されると肝臓での糖新生が低下すると考えられる。従って、ＧＣＮ５の阻害剤は、ＰＧＣ−１αを介して、肝臓での糖新生を促進し、血糖値を上昇させるものと考えられた。
このような状況下において、本発明者は肝臓における糖新生について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＧＣＮ５が肝臓においてヒストンをアセチル化することによって、糖新生に関連する酵素が活性化され、肝臓において糖新生が促進されることを見出した。そして、ＧＣＮ５を抑制することにより、肝臓における糖新生が抑制され、生体内の血糖値を低下させることができることを見出した。すなわち、ＧＣＮ５の抑制剤により、糖尿病を治療できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、
［１］Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）による糖新生酵素の活性化を抑制する物質を有効成分として含むことを特徴とする、糖尿病、甲状腺機能亢進症、下垂体機能亢進症、副腎皮質機能亢進症、及び肥満症から選択される、血糖値の上昇を伴う疾患の予防又は治療用医薬組成物、
［２］前記糖新生酵素の活性化が、肝臓におけるヒストンのアセチル化による糖新生酵素の活性化である、［１］に記載の医薬組成物、
［３］前記抑制物質が、Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡ、シクロペンチリデン−［４−（４’−クロロフェニル）チオザール−２−イル］ヒドラゾン（ＣＰＴＨ−２）、３−メチレン−４−ハイドロキシカルボニル−５−（１−プロピル）−テトラハイドロフラン−２−オン（ＭＢ−３）、３−メチルシクロペンチリデン−［４−（４０−シクロフェニル）チオザール−２−イル］ヒドラゾン（ＣＰＴＨ−６）、及びエチル−３−キノリンカルボキシレートからなる群から選択される抑制物質である、［１］又は［２］に記載の医薬組成物、
［４］前記ｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉の標的ｍＲＮＡ領域が、配列番号５で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号８で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号１１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号１４で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、及び配列番号１７で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、からなる群から選択されるｍＲＮＡ領域である、［３］に記載の医薬組成物、
［５］前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分の長さが１５〜４０ヌクレオチドである、［３］又は［４］に記載の医薬組成物、
［６］前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、配列番号５で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号８で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１１で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１４で表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び配列番号１７で表される塩基配列からなるＲＮＡ、からなる群から選択されるＲＮＡである、［３］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物、
［７］前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分において、（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているｓｈＲＮＡ、（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチド、又は
（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖の一方又は両方の３’末端に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが結合し、突出末端を形成している二本鎖オリゴヌクレオチド、である［３］〜［６］のいずれかに記載の医薬組成物、
［８］被験物質のＫ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）によるヒストンのアセチル化を介する、肝臓の糖新生酵素の活性化の抑制を検出することを特徴とする、血糖値の上昇を伴う疾患の治療候補物質のスクリーニング方法、
［９］（１）被験物質の肝臓糖新生酵素の活性化の抑制を検出する糖新生酵素抑制工程、及び（２）被験物質のＫ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）によるヒストンのアセチル化の抑制を検出するアセチル化抑制工程、
を含む、［８］に記載のスクリーニング方法
［１０］前記糖新生酵素抑制工程（１）が、糖新生酵素のプロモーター活性の抑制の検出、及び／又は糖新生酵素の発現の抑制の検出であり、前記アセチル化抑制工程（２）が、糖新生酵素のプロモーターにおけるヒストンのアセチル化抑制の検出である、［８］又は［９］に記載のスクリーニング方法、及び
［１１］前記糖新生酵素が、グルコース６−ホスファターゼ、又はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼである、［８］〜［１０］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の医薬組成物によれば、肝臓における糖新生酵素の活性を抑えることによって、血糖値を低下させ、糖尿病を治療することができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、ＫＡＴ２Ａによる糖新生酵素の活性化を抑制する物質を容易にスクリーニングすることができ、得られた抑制物質を含む医薬組成物により、糖尿病を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｃ５７ＢＬ６Ｎマウスにおける肝臓のＧＣＮ５をノックダウンした場合の、糖新生系酵素遺伝子Ｇ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫのｍＲＮＡの発現量の低下、並びに血糖値の低下を示したグラフである。
【図２】Ｃ５７ＢＬ６Ｎマウスにおいて、肝臓のＧＣＮ５をノックダウンした場合、糖新生の基質であるピルビン酸負荷による血糖値が低下することを示したグラフである。
【図３】糖尿病モデルマウスであるｄｂ／ｄｂマウスにおいて、肝臓のＧＣＮ５をノックダウンした場合、糖新生系酵素遺伝子Ｇ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫのｍＲＮＡの発現量が低下することを示したグラフである。
【図４】マウス初代培養肝細胞において、ＧＣＮ５をノックダウンした場合、糖新生系酵素遺伝子Ｇ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫのｍＲＮＡの発現量が低下することを示したグラフである。
【図５】マウス初代培養肝細胞において、ＧＣＮ５をノックダウンした場合、ｃＡＭＰ存在下でのグルコースの培地中への分泌が低下することを示したグラフである。
【図６】ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）がヒストンのアセチル化、及びＰＧＣ−１αのアセチル化を起こすメカニズムを模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［１］医薬組成物
本発明の医薬組成物は、Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）による糖新生酵素の活性化を抑制する物質を有効成分として含む。
【００１３】
《ＫＡＴ２Ａ》
ＫＡＴ２Ａは、従来ＧＣＮ５（General control of amino acid synthesis, yeast, homolog-like 2）と称され、酵母において研究が進められていたタンパク質であり、酵母からヒトまで広く分布している。ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）は、ヒストンアセチル化転移酵素の活性を持つことが報告され、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ２Ａ、及びＨ２Ｂの４つのヒストンのうち、Ｈ３に対して高い基質特異性を示す。また、ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）は、出芽酵母において、単独で存在するわけではなく、ＳＡＧＡ、ＡＤＡ、及びＡ２などの複合体に含まれた状態で存在しており、複数のターゲットに作用している可能性がある。
一方、ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）は、肝臓においてＰＧＣ−１α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α）のアセチル化にも関与している。摂食時において、ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）とＰＧＣ−１αとが結合すると、ＰＧＣ−１αのアセチル化が亢進し、ＰＧＣ−１α活性が低下する。ＰＧＣ−１α活性の低下は、肝臓での糖新生酵素の活性を低下させ、肝臓での糖新生を抑制し、血糖値を低下させることが報告されている（非特許文献４，５）。
【００１４】
本発明の医薬組成物に含まれるＫＡＴ２Ａの抑制物質の標的となるＫＡＴ２Ａの機能は、哺乳動物における血糖値を低下させることができる限りにおいて限定されるものではないが、好ましくはＫＡＴ２Ａのヒストンアセチル化転移酵素活性であり、更に好ましくはＫＡＴ２Ａのヒストンアセチル化転移酵素活性を介した肝臓における糖新生酵素の活性化機能である。
一方、肝臓におけるＰＧＣ−１αアセチル基転移酵素活性は、最終的に血糖値を低下させるため、ＫＡＴ２Ａの抑制物質の標的となるＫＡＴ２Ａの機能としては好ましくない。
【００１５】
（糖新生酵素の活性化）
ＫＡＴ２Ａは、ＫＡＴ２Ａのヒストンアセチル化転移酵素活性を介し、肝臓における糖新生酵素を活性化する。肝臓において活性化される糖新生酵素は、特に限定されるものではないが、例えばグルコース６−ホスファターゼ（glucose 6-phosphatase：以下、Ｇ６Ｐａｓｅと称することがある）、又はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（phosphoenolpyruvate carboxykinase：以下、ＰＥＰＣＫと称することがある）を挙げることができる。これらの糖新生酵素は、ＫＡＴ２Ａによるヒストンのアセチル化により、糖新生酵素遺伝子の転写が活性化される。そして、肝臓における糖新生が活性化し、血糖値が上昇する。
従って、ＫＡＴ２Ａのヒストンアセチル化転移酵素活性を抑制することにより、血糖値を低下させることができる。
【００１６】
抑制物質の標的となるＫＡＴ２Ａは、血液中にグルコースを含む動物由来である限りにおいて、限定されるものではないが、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、ブウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブンチョウ、カナリア、オウム、又はキュウカンチョウのＫＡＴ２Ａを挙げることができる。これらの動物は、ヒストンアセチル化転移酵素活性を有するＫＡＴ２Ａの遺伝子を持っており、肝臓においてＫＡＴ２Ａを発現しているため、本発明の医薬組成物の治療対象となることができるからである。
配列番号１及び２に、それぞれマウスのＫＡＴ２Ａをコードする核酸配列、及びＫＡＴ２Ａのアミノ酸配列を示す。また、配列番号３及び４に、それぞれヒトのＫＡＴ２Ａをコードする核酸配列、及びＫＡＴ２Ａのアミノ酸配列を示す。
【００１７】
《ＫＡＴ２Ａの抑制物質》
本発明の医薬組成物に含まれる抑制物質は、ＫＡＴ２Ａを介して、肝臓の糖新生酵素の活性を抑制することのできる物質である限り、限定されない。すなわち、ＫＡＴ２Ａのヒストンアセチル化転移酵素活性を抑制することにより、肝臓の糖新生酵素の活性を抑制する物質でもよく、又はＫＡＴ２Ａのその他の機能を抑制することにより肝臓の糖新生酵素の活性を抑制する物質でもよい。しかしながら、ヒストンのアセチル化を抑制することにより、肝臓の糖新生酵素の活性を抑制することのできる物質が好ましい。
なお、ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）のＰＧＣ−１αのアセチル化を促進する機能を抑制する物質は、摂食時におけるＰＧＣ−１α活性を亢進させ、肝臓での糖新生酵素の活性を亢進させる。従って、最終的に肝臓での糖新生を促進し、血糖値を上昇させる為に好ましくない。
また、後述のｓｉＲＮＡは、ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）のｍＲＮＡの発現を抑制するため、ヒストンアセチル化転移酵素活性を抑制する活性及びＰＧＣ−１αのアセチル化を抑制する活性の２つを有している。従って、１つの抑制物質により、肝臓における糖新生の抑制及び肝臓における糖新生の促進がおきると考えられる。しかしながら、生体内においては、ヒストンアセチル化転移酵素活性を抑制する活性により、糖新生酵素の活性化の抑制が優位となることが多いため、本発明の医薬組成物の有効成分として、効果的に用いることが可能である。
【００１８】
ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）と、ヒストンのアセチル化及びＰＧＣ−１αのアセチル化の関係を、図６を用いて簡単に説明する。ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）は、ＣＩＴＥＤ及びｃＡＭＰの存在下では、ヒストンＨ３のアセチル化の作用が強く、ＰＧＣ−１αのアセチル化の作用が弱い。従って、ＫＡＴ２Ａ（ＧＣＮ５）の抑制物質により、ヒストンＨ３のアセチル化を抑制する作用が強く現れ、血糖値を低下させることができる。
【００１９】
ＫＡＴ２Ａは、前記のように出芽酵母において、ＳＡＧＡ、ＡＤＡ、及びＡ２などの複合体に含まれ、そのターゲットが異なる可能性が考えられる。従って、酵母以外の動物においても、ＫＡＴ２Ａはいくつかのターゲットを有しており、糖新生を促進することを含むいくつかの異なる機能を有している可能性がある。
本発明の医薬組成物に含まれる抑制物質は、ＫＡＴ２Ａの糖新生を特異的に抑制するものであることが好ましいが、ＫＡＴ２Ａの糖新生を抑制することができる限り、その他のＫＡＴ２Ａの機能を抑制するものでもよい。
【００２０】
本発明の医薬組成物の有効成分であるＫＡＴ２Ａの抑制物質は、どの動物由来のＫＡＴ２Ａを抑制するものでもよく、１種類の動物のＫＡＴ２Ａを特異的に抑制するものでもよく、２種類以上の動物のＫＡＴ２Ａを抑制することのできるものでもよい。ＫＡＴ２Ａの由来する動物種は、限定されるものではないが、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブンチョウ、カナリア、オウム、又はキュウカンチョウを挙げることができる。
【００２１】
本発明の医薬組成物に用いるＫＡＴ２Ａの抑制物質は、ＫＡＴ２Ａに対する抑制作用を有する限り限定されるものはなく、例えば低分子化合物、タンパク質（例えば、抗体、受容体、又はオリゴペプチド）、ＤＮＡ（例えば、アプタマー）、又はＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ又はアプタマー）を挙げることができる。具体的にはＫ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡ、シクロペンチリデン-[4-(4'-クロロフェニル)チアゾール-2-イル)ヒドラゾン（cyclopentylidene-[4-(4'-chlorophenyl)thiazol-2-yl]hydrazone；以下、ＣＰＴＨ２と称する）、３−メチレン−４−ハイドロキシカルボニル−５−（１−プロピル）−テトラハイドロフラン−２−オン（3-Methylene-4-hydroxycarbonyl-5-(1-propyl)-tetrahydrofuran-2-one；以下、ＭＢ−３と称する）、３−メチルシクロペンチリデン−［４−（４'−シクロフェニル）チアゾール−２−イル］ヒドラゾン（3-methylcyclopentilidene-[4-(4'-chlorophenyl)thiazol-2-yl]hydrazone；以下、ＣＰＴＨ６と称する）、又はエチル−３−キノリンカルボキシレート（Ethyl-3-quinolinecarboxylate）を挙げることができる。
【００２２】
（ｓｉＲＮＡ）
前記ＫＡＴ２Ａの抑制物質として、ＫＡＴ２Ａを標的分子とするＲＮＡ干渉の作用を有するｓｉＲＮＡを用いることができる。ＲＮＡ干渉の標的は、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるＫＡＴ２ＡのｍＲＮＡ（以下、標的ｍＲＮＡ領域と称する）であれば特に限定されるものではない。ＲＮＡ干渉の標的となるＫＡＴ２Ａの代表例として、ヒトＫＡＴ２Ａの塩基配列を、ｃＤＮＡとして配列表の配列番号３に、マウスＫＡＴ２Ａの塩基配列をｃＤＮＡとして配列表の配列番号１に示す。マウスＫＡＴ２Ａのオープンリーディングフレームは６４番目のＡＴＧから始まる。具体的なマウスの標的ｍＲＮＡ領域として、配列番号５で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、配列番号１４で表される塩基配列、配列番号１７で表される塩基配列からなるか、又はそれらの塩基配列を含む標的ｍＲＮＡ領域を挙げることができる。特には、配列番号８で表される塩基配列、又は配列番号１１で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域が、ｓｉＲＮＡの効果が高く、好ましい。
また、ヒトを含む動物におけるＲＮＡ干渉の具体的な標的ｍＲＮＡ領域も限定されるものではないが、マウスの具体的な標的ｍＲＮＡ領域に対応するｍＲＮＡ領域を挙げることができる。
【００２３】
二重鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１９〜２５塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。二重鎖ＲＮＡ部分には、そのままｓｉＲＮＡとして機能するものも含まれるが、細胞内でＤｉｃｅｒにより切断されて、ｓｉＲＮＡとしてＲＮＡ干渉を誘導することのできる二重鎖ＲＮＡ部分も含むことができる。
【００２４】
二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＫＡＴ２ＡのｍＲＮＡに細胞内でハイブリダイズできるものであれば、限定されず、前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分（以下、標的相補ＲＮＡ部分と称する）の塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ部分からなるＲＮＡ部分を含むＲＮＡであることができるが、好ましくは、ＫＡＴ２ＡのｍＲＮＡの標的ｍＲＮＡに対して、完全に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分を含むＲＮＡ鎖であり、例えば、マウスのＫＡＴ２Ａにおいては、配列番号５で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、配列番号１４で表される塩基配列、配列番号１７で表される塩基配列に相補的なＲＮＡ鎖である。
また、ヒトを含む動物におけるＫＡＴ２Ａの具体的なアンチセンスＲＮＡ鎖も限定されるものではないが、マウスの具体的なアンチセンスＲＮＡ鎖に対応するＲＮＡ鎖を挙げることができる。
【００２５】
アンチセンスＲＮＡ鎖は、前記標的相補ＲＮＡ部分以外のＲＮＡ部分を含むことができ、そのＲＮＡ部分は、特に限定されるものではないが、ＫＡＴ２ＡのｍＲＮＡであって、標的ｍＲＮＡ領域以外のＫＡＴ２ＡのｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分が好ましい。また、アンチセンスＲＮＡ鎖の塩基配列は、標的ｍＲＮＡ領域における塩基配列に対して８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。また、アンチセンスＲＮＡ部分は、ｓｉＲＮＡの全体のＧＣ含量が７０％以下、好ましくは３０〜７０％、３０〜６０％程度となるように設計されるのが好ましい。
【００２６】
二重鎖ＲＮＡ部分のセンスＲＮＡ鎖は、アンチセンスＲＮＡ鎖と細胞内でハイブリダイズすることのできるＲＮＡであれば、限定されず、例えば、アンチセンスＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ鎖であることができ、好ましくは、アンチセンスＲＮＡの塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分を含むＲＮＡ鎖であり、例えば、標的ｍＲＮＡの塩基配列と同じ、配列番号５で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、配列番号１４で表される塩基配列、配列番号１７で表される塩基配列からなるＲＮＡ鎖である。
また、ヒトを含む動物におけるＫＡＴ２Ａの具体的なセンスＲＮＡ鎖も限定されるものではないが、マウスの具体的なセンスＲＮＡ鎖に対応するＲＮＡ鎖を挙げることができる。
【００２７】
また、センスＲＮＡ鎖は、前記標的ＲＮＡ部分以外のＲＮＡ部分を含むことができ、そのＲＮＡ部分は、特に限定されるものではないが、ＫＡＴ２ＡのｍＲＮＡであって標的ｍＲＮＡ領域以外のＫＡＴ２ＡのｍＲＮＡ塩基配列からなるＲＮＡ部分が好ましい。
【００２８】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチドも含まれ、このようなｓｉＲＮＡは十分なＲＮＡｉ活性を示す。
【００２９】
また、本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、突出末端を形成する二本鎖オリゴヌクレオチドも含まれる。前記オーバーハング部分は、それぞれ、５塩基以下の任意のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）であるが、２塩基のヌクレオチドが好ましい。ｓｉＲＮＡの３’側オーバーハングを構成するリボヌクレオチドとしては、例えば、ｕ（ウリジン）、ａ（アデノシン）、ｇ（グアノシン）、又はｃ（シチジン）のヌクレオチドを用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボヌクレオチドとしては、例えば、ｄｔ（チミジン）、ｄａ（デオキシアデノシン）、ｄｇ（デオキシグアノシン）、又はｄｃ（デオキシシチジン）のヌクレオチドを用いることができる。
【００３０】
前記オーバーハングとしては、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングが好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングがより好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングが特に好ましい。更に、具体的なオーバーハングとしては、例えばｃｕ−３’、ｇｇ−３’、ｇｕ−３’、ｕｇ−３’ｕｃ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’などの塩基配列が挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；以下、ｓｈＲＮＡと称する）が含まれる。ｓｈＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する前記センスＲＮＡ鎖とアンチセンス鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合し、前記センスＲＮＡ鎖とアンチセンス鎖が二本鎖構造を形成している。ヘアピンループを形成するＲＮＡ部分の鎖長及び塩基配列は、ヘアピンループを形成することができるものである限り、限定されるものではないが、鎖長は好ましくは３〜２３であり、例えば、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ（配列番号２８）、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣ及びＵＵＣＧからなる群より選択される少なくともひとつの塩基配列からなるＲＮＡを挙げることができる。
【００３２】
ｓｉＲＮＡは、公知の製造方法、例えば、化学合成、又は酵素合成法により製造することもできるし、あるいは、後述するように適当な発現ベクターに挿入し、遺伝子工学的に製造することもできる。ベクターは、哺乳動物細胞内でＫＡＴ２ＡのｍＲＮＡの発現を抑制することのできるｓｉＲＮＡを発現させるためのベクターであり、前記細胞内で効率良くｓｉＲＮＡを発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができるが、肝臓へ特異的にｓｉＲＮＡを導入するためには、アデノウイルスベクターが好ましい。
【００３３】
本発明のｓｉＲＮＡ及びベクターは、医薬組成物として、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、又はカチオン脂質法を用いて目的の組織、又は細胞内に導入することが可能である。骨格となるベクターとして、ウイルスベクターを用いる場合は、目的の細胞へのウイルスベクターの感染によってｓｉＲＮＡを導入することが可能である。
【００３４】
前記ｓｉＲＮＡ、あるいはｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能なベクターは、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＫＡＴ２Ａが関与する疾患、例えば癌の治療のために、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に、有効量で投与することができる。前記ｓｉＲＮＡ、あるいは、本発明のｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能なベクターは、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＫＡＴ２Ａの発現細胞の増殖を抑制することにより、癌を治療又は予防することができる。
【００３５】
（低分子化合物）
前記ＫＡＴ２Ａの抑制物質として、低分子化合物を用いることができる。
低分子化合物のＫＡＴ２Ａの抑制物質としては、下記式（１）
【化１】
2014105177.tif 000003
で表されるＣＰＴＨ２、下記式（２）
【化２】
2014105177.tif 000004
で表されるＭＢ−３、下記式（３）
【化３】
2014105177.tif 000005
で表されるＣＰＴＨ６、及び下記式（４）
【化４】
2014105177.tif 000006
で表されるエチル−３−キノリンカルボキシレートを挙げることができる。
【００３６】
（抗体）
前記ＫＡＴ２Ａの抑制物質として、抗体を用いることができる。抗体は、ＫＡＴ２Ａを抑制し、且つ肝臓の糖新生酵素の活性を抑制することのできる抗体である限り、限定されるものではない。
【００３７】
ＫＡＴ２Ａの抑制物質として用いられる抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。前記モノクローナル抗体は、免疫用抗原及びスクリーニング用抗原として、ＫＡＴ２Ａを用いることを除いて、公知の手段により得ることができる。
例えば、免疫用抗原を用いてマウスを免疫し、そのマウスから取得した脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞とを、Nature, 256, 495（1975）に記載の細胞融合法、あるいは、J.Immunol.Method, 100, 181-189（1987）に記載の電気細胞融合法を用いて細胞融合し、スクリーニング用抗原を用いてスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００３８】
また、ポリクローナル抗体も、免疫用抗原及びスクリーニング用抗原として、ＫＡＴ２Ａ用いることを除いて、公知の方法、例えば、以下に示す方法により調製することができる。すなわち、抗原を含む生理食塩水を等量のフロイント氏完全アジュバンド若しくは不完全アジュバンド、又はその等価物、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  ＴｉｔｅｒＭａｘＴＭ（フナコシ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＹＴ００１−００，東京，日本）と乳化混合して、哺乳動物（特にはウサギ又はヤギ等）の皮下、腹腔内、又は筋肉内などのいずれかに投与する（初回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から１〜２週間後に哺乳動物の頚動脈又は心臓から血液を採取して血清中に含まれるポリクローナル抗体を用いることができる。
【００３９】
前記抗体の抗体フラグメントもＫＡＴ２Ａの抑制物質として用いることができる。抗体フラグメントは、前記抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む）の部分断片であって、しかも、元の抗体と同じ反応特異性を有する限り、特に限定されるものではない。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを挙げることができる。抗体フラグメントは、例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離及び精製の常法に従って得ることができる。
【００４０】
ＫＡＴ２Ａの抑制物質として、更に、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト型抗体を用いることができる。ヒト以外の動物から得られる抗体は、ヒトに抗原性を示すアミノ酸配列からなるエピトープを含んでいる。従って、マウス等のモノクローナル抗体を含む医薬組成物を治療薬として投与した後に、抗体に対する患者の免疫応答により患者が危険な状態となったり、又はその抗体が生体内で破壊されることにより治療効果が無効となる。従って、前記の抗体をヒトにとって、比較的相同性の高いＦｃ領域に置き換えるか、可変領域の枠組み部分を置き換えるか、又はヒトの抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物から得られた抗体を使用することが推奨される。なお、本明細書においては、「ヒト型抗体」は、ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物から得られる抗体、及びヒトの抗体産生細胞をミエローマ細胞と細胞融合させて得ることのできるモノクローナル抗体を含む。
【００４１】
キメラ抗体は、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものである。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。
【００４２】
また、ヒト型抗体の取得方法としては前記のトランスジェニック動物から得る方法、ヒトの抗体産生細胞を細胞融合させて得る方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト型抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、前記配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。
【００４３】
《血糖値の上昇を伴う疾患》
本発明の医薬組成物の治療の対象となる疾患としては、血糖値の上昇を伴う疾患である限り、限定されるものではないが、例えば糖尿病、甲状腺機能亢進症、下垂体機能亢進症、副腎皮質機能亢進症、及び肥満症からなる群から選択される疾患を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、肝臓における糖新生を抑制し、血糖値を直接的に低下させる。従って、すべての血糖値の上昇を伴う疾患において、血糖値を低下させることができる。
【００４４】
（糖尿病）
前記血糖値の上昇を伴う代表的な疾患として、糖尿病が挙げられるが、１型糖尿病及び２型糖尿病のいずれも、本発明の医薬組成物によって予防又は治療することができる。１型糖尿病は、膵臓のβ細胞が自己免疫疾患などによって破壊され、インスリンが枯渇することによって発症する。２型糖尿病は、肥満などを原因としてインスリン抵抗性となることによって発症する。また、２型糖尿病は、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌量が減少することによっても発症する。いずれの病型においてもインスリンの作用不全により肝臓における糖新生酵素の発現が増加し、糖新生の病的亢進が起こる。
【００４５】
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００４６】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００４８】
《血糖値の上昇を伴う疾患の治療方法》
前記ＫＡＴ２Ａの抑制物質を、血糖値の上昇を伴う疾患の予防又は治療方法に用いることができる。
すなわち、本明細書は、Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）による糖新生酵素の活性化を抑制する物質を、血糖値の上昇を伴う疾患患者に投与することを特徴とする、糖尿病、甲状腺機能亢進症、下垂体機能亢進症、副腎皮質機能亢進症、及び肥満症から選択される疾患の予防又は治療方法を開示する。前記糖新生酵素の活性化は、肝臓におけるヒストンのアセチル化による糖新生酵素の活性化であることが好ましい。
【００４９】
《血糖値の上昇を伴う疾患の治療方法に使用するＫＡＴ２Ａ抑制物質》
前記ＫＡＴ２Ａの抑制物質は、血糖値の上昇を伴う疾患の治療方法に使用することができる。
すなわち、本明細書は、糖尿病、甲状腺機能亢進症、下垂体機能亢進症、副腎皮質機能亢進症、及び肥満症から選択される、血糖値の上昇を伴う疾患の予防又は治療方法における使用のための、Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）による糖新生酵素の活性化を抑制する物質を開示する。前記糖新生酵素の活性化は、肝臓におけるヒストンのアセチル化による糖新生酵素の活性化であることが好ましい。
【００５０】
《ＫＡＴ２Ａ抑制物質の医薬組成物の製造への使用》
前記ＫＡＴ２Ａの抑制物質は、血糖値の上昇を伴う疾患の治療用医薬組成物の製造へ使用することができる。
すなわち、本明細書は、Ｋ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）による糖新生酵素の活性化を抑制する物質の、糖尿病、甲状腺機能亢進症、下垂体機能亢進症、副腎皮質機能亢進症、及び肥満症から選択される、血糖値の上昇を伴う疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造への使用を開示する。前記糖新生酵素の活性化は、肝臓におけるヒストンのアセチル化による糖新生酵素の活性化であることが好ましい。
【００５１】
［２］スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、被験物質のＫ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）によるヒストンのアセチル化を介した、肝臓の糖新生酵素の活性化の抑制を検出するスクリーニング方法である。
本発明のスクリーニング方法は、肝臓の糖新生酵素の活性化の抑制が、ＫＡＴ２Ａによるヒストンのアセチル化を介しているものである限りにおいて、限定されるものではないが、（１）被験物質の肝臓糖新生酵素の活性化の抑制を検出する糖新生酵素抑制工程、及び（２）被験物質のＫ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）によるヒストンのアセチル化の抑制を検出するアセチル化抑制工程、を含むことが好ましい。糖新生の抑制を起こす被験物質が、ヒストンのアセチル化の抑制を起こしていることを確認できるからである。
【００５２】
《糖新生酵素抑制工程（１）》
被験物質の糖新生酵素の活性化の抑制を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば糖新生酵素のプロモーター活性の抑制を検出する方法及び／又は糖新生酵素の発現の抑制の検出する方法（例えば、糖新生酵素のｍＲＮＡの発現の抑制を検出する方法、又は糖新生酵素のタンパク質の発現の抑制を検出する方法）を挙げることができる。これらの方法のいずれか一つを用いてもよく、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５３】
（プロモーター活性の抑制）
例えば、糖新生酵素のプロモーター活性の抑制を検出する方法は、次のように行うことができる。糖新生酵素のプロモーターを、マーカー遺伝子を発現することのできるベクターのマーカー遺伝子の上流に挿入する。マーカー遺伝子としては、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ遺伝子を用いることができる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に糖新生酵素のプロモーターを組込み、ルシフェラーゼの発現の強弱によって、プロモーターの活性を検出できるベクターを構築する。このベクターを、細胞に導入する。ベクターを導入する細胞も限定されるものでなく、例えば大腸菌などの細菌、酵母、又は糸状菌などの真菌、昆虫細胞、又は動物細胞を挙げることができる。
このようなベクターの組込まれた細胞と、被験物質とを接触させ、ルシフェラーゼの発現を測定し、陽性コントロールの発現と比較することによって、被験物質による糖新生酵素のプロモーター活性の抑制を検出することができる。
【００５４】
（ｍＲＮＡの発現の抑制）
糖新生酵素のｍＲＮＡの発現の抑制を検出する方法は、限定されるものではないが、次のように行うことができる。例えば、肝臓由来の糖新生酵素のｍＲＮＡを発現する初代培養肝細胞、又は肝臓由来継代細胞（例えば、ＡＭＬ１２細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｆａｏ細胞、Ｈ４IIＥＣ細胞、Ｈ４IIＥ細胞、又はＨ２．３５細胞）と、被験物質とを接触させ、糖新生酵素のｍＲＮＡの発現を測定し、陽性コントロールの発現と比較することによって、被験物質による糖新生酵素のｍＲＮＡの発現の抑制を検出することができる。
ｍＲＮＡの発現の検出方法は、公知の方法を用いることが可能であり、例えばリアルタイムＰＣＲを用いることができる。
【００５５】
（タンパク質の発現の抑制）
糖新生酵素のタンパク質の発現の抑制を検出する方法は、限定されるものではないが、次のように行うことができる。例えば、肝臓由来の糖新生酵素のｍＲＮＡを発現する初代培養肝細胞、又は肝臓由来継代細胞（例えば、ＡＭＬ１２細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｆａｏ細胞、Ｈ４IIＥＣ細胞、Ｈ４IIＥ細胞、又はＨ２．３５細胞）と、被験物質とを接触させ、糖新生酵素のタンパク質の発現の抑制を測定し、陽性コントロールの発現と比較することによって、被験物質によるタンパク質の発現の抑制を検出することができる。
タンパク質の発現の検出方法は、公知の方法を用いることが可能であり、例えばウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法を用いることができる。
【００５６】
《アセチル化抑制工程（２）》
アセチル化抑制工程（２）は、被験物質のＫＡＴ２Ａによるヒストンのアセチル化の抑制を検出できる限りにおいて、限定されるものではない。すなわち、糖新生酵素遺伝子以外のヒストンのアセチル化の抑制を検出できる方法でもよいが、糖新生酵素のプロモーターにおけるヒストンのアセチル化抑制の検出方法であることが好ましい。
例えば、肝臓由来の糖新生酵素を発現する初代培養肝細胞、又は肝臓由来継代細胞（例えば、ＡＭＬ１２細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｆａｏ細胞、Ｈ４IIＥＣ細胞、Ｈ４IIＥ細胞、又はＨ２．３５細胞）と、被験物質とをｃＡＭＰの存在下で接触させる。これらの細胞を、例えば抗アセチル化ヒストン抗体を用いて、ＣｈＩＰ(chromatin immunoprecipitation assay)を行い、アセチル化の起きたヒストンを取得する。得られたヒストンが糖新生酵素のプロモーターのものであることを確認する。
（糖新生酵素）
本発明のスクリーニング方法において用いることのできる肝臓の糖新生酵素は特に限定されるものではないが、例えばグルコース６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、又はスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）を挙げることができる。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法により、得られたＫ（リシン）アセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＡＴ２Ａ）によるヒストンのアセチル化を介した、肝臓の糖新生酵素の活性化の抑制することのできる物質は、本発明の血糖値の上昇を伴う疾患の予防又は治療用医薬組成物の有効成分として用いることができる。
【００５８】
《スクリーニングキット》
本発明のスクリーニングキットは、前記スクリーニング方法に用いることができる。本発明のスクリーニングキットは、例えば、ベクター（例えば、糖新生酵素のプロモーターの活性を検出できるベクター）、ベクターを導入する宿主細胞（例えば、大腸菌などの細菌、酵母、又は糸状菌などの真菌、昆虫細胞、又は動物細胞）、肝臓由来の糖新生酵素を発現する細胞（例えば、初代培養肝細胞、又はＡＭＬ１２細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｆａｏ細胞、Ｈ４IIＥＣ細胞、Ｈ４IIＥ細胞、又はＨ２．３５細胞などの肝臓由来継代細胞）、抗アセチル化ヒストン抗体、ｃＡＭＰ、グルコース６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、スホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、及びＫＡＴ２Ａからない群から選択される１つ、又は２つ以上の組み合わせを含むことができる。更に、本発明のスクリーニングキットは、ＫＡＴ２Ａの抑制物質の陽性コントロールとして、ＣＰＴＨ２、ＭＢ−３、ＣＰＴＨ６、及びエチル−３−キノリンカルボキシレート（Ethyl-3-quinolinecarboxylate）からなる群から選択される１つ又は２つ以上の化合物を含むことができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００６０】
《実施例１：ｓｉＲＮＡの作成》
本実施例では、ＫＡＴ２Ａをターゲットとする５種類のｓｉＲＮＡを作製し、２９３細胞におけるノックダウン効率を調べた。
（Ａ）Ｍｙｃ−ＧＣＮ５発現ベクターの作製
マウスＧＣＮ５のｃＤＮＡを、以下プロトコールによってクローニングした。マウス肝臓よりＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとしてＮ端にＭｙｃタグを付加したＧＣＮ５  ｃＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩｓｉｔｅにサブクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）−Ｍｙｃ−ＧＣＮ５発現ベクターを作製した。
【００６１】
（Ｂ）ｓｉＲＮＡの合成
マウスＧＣＮ５の以下の５つの配列（標的配列２８４、５０４、１５７１、１７２１、及び２１２０）を標的とする５種類のｓｉＲＮＡ（２８４ｓｉＲＮＡ、５０４ｓｉＲＮＡ、１５７１ｓｉＲＮＡ、１７２１ｓｉＲＮＡ、及び２１２０ｓｉＲＮＡ）を合成した。
（ａ）２８４ｓｉＲＮＡ（標的配列２８４：ＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＡＡＣＵ）（配列番号５）
センスオリゴ：ｃｃａａｇａａｇｃｕｕｇａｇａａａｃｕＴＴ（配列番号６）
アンチセンスオリゴ：ａｇｕｕｕｃｕｃａａｇｃｕｕｃｕｕｇｇＴＴ（配列番号７）
（ｂ）５０４ｓｉＲＮＡ（標的配列５０４：ＧＧＧＡＡＵＧＧＵＡＧＵＡＧＡＵＧＵＡ）（配列番号８）
センスオリゴ：ｇｇｇａａｕｇｇｕａｇｕａｇａｕｇｕａＴＴ（配列番号９）
アンチセンスオリゴ：ｕａｃａｕｃｕａｃｕａｃｃａｕｕｃｃｃＴＴ（配列番号１０）
（ｃ）１５７１ｓｉＲＮＡ（標的配列１５７１：ＣＡＡＧＡＡＵＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＵＡ）（配列番号１１）
センスオリゴ：ｃａａｇａａｕｇｃｃｃａａｇｇａａｕａＴＴ（配列番号１２）
アンチセンスオリゴ：ｕａｕｕｃｃｕｕｇｇｇｃａｕｕｃｕｕｇＴＴ
（配列番号１３）
（ｄ）１７２１ｓｉＲＮＡ（標的配列１７２１：ＣＣＵＣＡＡＡＵＧＡＧＣＡＧＧＵＣＡＡ）（配列番号１４）
センスオリゴ：ｃｃｕｃａａａｕｇａｇｃａｇｇｕｃａａＴＴ（配列番号１５）
アンチセンスオリゴ：ｕｕｇａｃｃｕｇｃｕｃａｕｕｕｇａｇｇＴＴ（配列番号１６）
（ｅ）２１２０ｓｉＲＮＡ（標的配列２１２０：ＧＣＵＧＧＡＡＧＣＣＡＣＵＧＧＧＡＡＡ）（配列番号１７）
センスオリゴ：ｇｃｕｇｇａａｇｃｃａｃｕｇｇｇａａａＴＴ（配列番号１８）
アンチセンスオリゴ：ｕｕｕｃｃｃａｇｕｇｇｃｕｕｃｃａｇｃＴＴ（配列番号１９）
【００６２】
（Ｃ）ｓｉＲＮＡによるＧＣＮ５のノックダウン
前記のｓｉＲＮＡを２９３細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクション（終濃度１５ｎＭ）した。２４時間後にｐｃＤＮＡ３．１  Ｍｙｃ−ＧＣＮ５ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションし、更にその２４時間後に細胞を回収した。細胞ライゼートよりサンプルを調製してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｍｙｃタグに対する抗体によるウエスタンブロットでＭｙｃ−ＧＣＮ５に対するｓｉＲＮＡの効果を判定した。ノックダウン効率は２８４ｓｉＲＮＡが５０％、５０４ｓｉＲＮＡが７５％、１５７１ｓｉＲＮＡが８０％、１７２１ｓｉＲＮＡが７０％、２１２０ｓｉＲＮＡが１０％であり、５０４ｓｉＲＮＡ、１５７１ｓｉＲＮＡ、及び１７２１ｓｉＲＮＡが、特に強いＧＣＮ５ノックダウン効果を示した。
【００６３】
《実施例２：ｓｈＲＮＡの作成》
本実施例では、標的配列５０４及び標的配列１５７１に対するタンデムｓｈＲＮＡを作成した。
【００６４】
（Ａ）タンデムｓｈＲＮＡの作成
ターゲット配列５０４、１５７１に対するｓｈＲＮＡを発現するベクターの作製を行った。まず以下のオリゴヌクレオチドの合成を行った。
ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ５０４  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
Ｔｏｐ  Ｓｔｒａｎｄ  
５’−ｇａｔｃｃＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴｇ−３’（配列番号２０）
Ｂｏｔｔｏｍ  Ｓｔｒａｎｄ
５’−ａａｔｔｃＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＣｇ−３’（配列番号２１）
ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ１５７１  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
Ｔｏｐ  Ｓｔｒａｎｄ
５’−ｇａｔｃｃＧＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴｇ−３’（配列番号２２）
Ｂｏｔｔｏｍ  Ｓｔｒａｎｄ
５’−ａａｔｔｃＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＴＧＣｇ−３’（配列番号２３）
【００６５】
それぞれのオリゴヌクレオチドをアニーリングして、制限酵素ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩで処理したｐＳＩＲＥＮ−ＤＮＲ−ＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓベクター  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にライゲーションした。ヒトＵ６プロモーターの制御下にそれぞれＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ５０４、ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ１５７１を発現するベクターを作製した。
次に、ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ５０４、ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ１５７１を同時に発現することで強力なノックダウン効果を得るために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ５０４、ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ１５７１をタンデムに配置したタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡベクターの作製を試みた。まずｐＳＩＲＥＮ−ＤＮＲ−ＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ５０４を制限酵素ＳａｌＩ、ＮｏｔＩで処理した後、ヒトＵ６プロモーターとその下流のＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ５０４、ＣＭＶプロモーターとその下流のＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓを含むＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（１）を精製した。次にｐＳｉｒｅｎ−ＤＮＲ−ＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ１５７１を制限酵素ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩで処理した後、ｈＵ６プロモーターとその下流のＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ１５７１を含むＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（２）を精製した。ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（１）とＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（２）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋ベクターにライゲーションすることで、ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ５０４、ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ１５７１、ＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓを同時に発現するタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡベクターを作製した。またＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ５０４、ＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ１５７１、タンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡのいずれかを２９３細胞にＭｙｃ−ＧＣＮ５発現ベクターと共発現してＭｙｃ−ＧＣＮ５に対するノックダウン効果を比較したところ、タンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡは単独のｓｈＲＮＡに比較してより強いノックダウン効率（９０％）を示した。
【００６６】
（Ｂ）アデノウイルスベクターの作成
次に、タンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターの作製をＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｄｕａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。タンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋ベクターより制限酵素ＳｍａＩ、ＨｉｎｃII処理によって精製し、コスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔ２ベクターのＳｍｉＩ  ｓｉｔｅにサブクローニングした。構築した組み換えコスミドは制限酵素ＢｓｐＴ１０４１処理後、Ｌｉｐｏｆａｃｔｅｍｉｎｅ  ２０００を用いて６ｃｍ  細胞培養シャーレ上の２９３細胞にトランスフェクションし、翌日９６ウェルプレートに播き直した。７〜１５日後に細胞が変成したウェルより細胞及び培養液を回収して凍結融解を６回行った後、上清をタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスの１次ウイルス液とした。
【００６７】
次にアデノウイルスの増幅を行った。２４ウェルプレートに培養した２９３細胞の培養液を５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  ５００μＬに交換して、１次ウイルス液１０μＬを加え、３日後に細胞が完全に変成したウェルより培養液と細胞を回収して凍結融解を６回行った後、上清を２次ウイルス液とした。６ｃｍ細胞培養シャーレ上の２９３細胞の培養液を５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  ２ｍＬに交換して、２次ウイルス液を１０μＬ感染させ、完全に細胞が変成した後回収して凍結融解を３回行った後、上清を３次ウイルス液とした。１０ｃｍ細胞培養シャーレ上の２９３細胞の培養液を５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  ４ｍＬに交換して３次ウイルス液を１００μＬ感染させ、完全に細胞が変成した後回収して凍結融解を３回行った後、上清を４次シードとした。１０ｃｍ細胞培養シャーレ（１０枚）上の培養液を５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  ４ｍＬに交換して４次ウイルス液をそれぞれ１００μＬ感染させ、完全に細胞が変成した後回収して凍結融解を３回行った後、上清を４次ウイルス液とした。
【００６８】
次に２９３細胞を培養した１５ｃｍ細胞培養シャーレを９０枚用意した。培養液を５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  １２ｍＬ／枚に交換した後、４次ウイルス液  ３００μＬをそれぞれ感染させた。３日後に変成した細胞を培養液と共に５０ｍＬ  ｔｕｂｅに回収して３５００ｒｐｍ×３ｍｉｎ遠心して細胞ペレットとし、最終的に培養液４５ｍＬで懸濁してウイルス濃縮液とした。
【００６９】
ウイルス濃縮液を４回凍結融解した後、超音波破砕を行った。その後、４℃で８０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ遠心し、その上清を用いてＣｓＣｌを用いた密度勾配遠心法によってウイルス液を精製した。ウイルス液は透析膜を用いて１０％グリセロールＰＢＳで４℃で、１６時間透析した。透析後のウイルス液は分注して−８０℃に保存した。
コントロールであるタンデムコントロールｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスについても、タンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスと同様に作製し、増幅及び精製を行った。アデノウイルスの力価はＡｄｅｎｏ−Ｘ  ｒａｐｉｄ  ｔｉｔｅｒ  ｋｉｔ  （Ｔａｋａｒａ）を用いて測定した。
【００７０】
《実施例３：ｓｈＲＮＡによるマウス血糖値の低下》
マウスの肝臓におけるタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡの効果を、アデノウイルスベクターを用いた肝臓におけるＧＣＮ５ノックダウンによって検討した。雄の８週齢Ｃ５７ＢＬ６Ｎマウス（各群ｎ＝７）を用いて、タンデムコントロールｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス又はタンデムＧＣＮ５ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを、２．０×１０９ｉｆｕ／ｂｏｄｙで尾静脈より注入し、７２時間後より１６時間の絶食を行った後血糖値をグルテストセンサー（三和化学研究所）で測定し、その後安楽死して肝臓を採取した。肝臓からはＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンプレートとした定量的ＰＣＲによって糖新生系酵素遺伝子Ｇ６Ｐａｓｅ、及びＰＥＰＣＫのｍＲＮＡ量を測定した。定量的ＰＣＲには以下のプライマーを用いた。
Ｇ６Ｐａｓｅ：
フォワードプライマー：ＣＴＧＴＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＣＣＴＴＧＣＴＧ（配列番号２４）
リバースプライマー：ＡＡＴＡＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴ（配列番号２５）
ＰＥＰＣＫ：
フォワードプライマー：ＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧ（配列番号２６）
リバースプライマー：ＡＧＧＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＧＧＧＣＡＣＴ（配列番号２７）
【００７１】
結果を図１に示す。タンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡの肝臓への導入により、ＧＣＮ５がノックダウンされ、肝臓の糖新生系酵素Ｇ６Ｐａｓｅ、及びＰＥＰＣＫの発現が減少した。そして、摂食時及び絶食時のいずれにおいても血糖値が有意に低下した。
【００７２】
《実施例４：ピルビン酸負荷を行った場合のｓｈＲＮＡによるマウス血糖値の低下》
本実施例では、糖新生の基質であるピルビン酸負荷時のタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡによるマウス血糖値に与える影響を検討した。
雄の８週齢Ｃ５７ＢＬ６Ｎマウス（各群ｎ＝７）を用いてタンデムコントロールｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス又はタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを２．０×１０９ｉｆｕ／ｂｏｄｙで尾静脈より注入し、７２時間後より１６時間の絶食を行った後、血糖値をグルテストセンサー（三和化学研究所）で測定した。その後ピルビン酸２ｇ／ｋｇを腹腔内投与し、３０分毎に１２０分後まで血糖測定を行った。
その結果ピルビン酸負荷後の血糖上昇は肝臓におけるＧＣＮ５のノックダウンによって抑制され、ＧＣＮ５のノックダウンによって糖新生が抑制されることが明らかとなった（図２）。
【００７３】
《実施例５：糖尿病モデルマウスにおけるｓｈＲＮＡによるマウス血糖値の低下》
本実施例では、肥満糖尿病モデルマウスであるｄｂ／ｄｂマウスにおける、タンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡによるマウス血糖値を検討した。
まず、肥満糖尿病モデルマウスであるｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧＣＮ５蛋白の発現量を検討した。８週齢のｄｂ／ｍマウス（コントロール）及びｄｂ／ｄｂマウス（各群ｎ＝６）の肝臓より核蛋白を抽出し、ＧＣＮ５抗体によってウエスタンブロットを行ったところ、ＧＣＮ５蛋白の発現はｄｂ／ｄｂマウスの肝臓で著明に増加していることが明らかとなった（図３）。
次に、ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧＣＮ５の効果を、アデノウイルスベクターを用いた肝臓におけるＧＣＮ５ノックダウンによって検討した。雄の８週齢ｄｂ／ｄｂマウス（各群ｎ＝８）を用いてタンデムＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスとタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを３．０×１０９ｉｆｕ／ｂｏｄｙで尾静脈より注入し、７２時間後より１６時間の絶食を行った後血糖値をグルテストセンサー（三和化学研究所）で測定、その後安楽死して肝臓を採取した。肝臓からはＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンプレートとした定量的ＰＣＲによって糖新生系酵素遺伝子Ｇ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫのｍＲＮＡ量を測定した。定量的ＰＣＲに用いたプライマーは、実施例３で用いたものである。
ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧＣＮ５のノックダウンにより、肝臓における糖新生系酵素Ｇ６Ｐａｓｅ、及びＰＥＰＣＫの発現亢進が、有意に改善した（図３）。
【００７４】
《実施例６：マウス初代培養肝細胞におけるｓｈＲＮＡの効果》
本実施例では、マウス初代培養肝細胞においてグルカゴンのセカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰ依存性の糖新生系酵素Ｇ６Ｐａｓｅ、及びＰＥＰＣＫの発現誘導に対するＧＣＮ５のノックダウンの効果を検討した。マウス初代培養肝細胞をコラーゲンコート６ウェルプレートに０．８×１０６／ウェルの細胞密度で播いて、タンデムコントロールｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスとタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスをそれぞれ５ＭＯＩ培養液中に加えることで感染させ、８時間後に培養液を交換した。４８時間後に培養液を無血清培地に交換して、１６時間のｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行い、刺激（−）もしくはｐＣＰＴ−ｃＡＭＰ  １００μＭで６時間の刺激をした後、培養液を廃棄して、液体窒素で凍結し、−８０℃に保存した。
保存したプレートよりＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンプレートとした定量的ＰＣＲによって糖新生系酵素遺伝子Ｇ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫのｍＲＮＡ量を測定した。定量的ＰＣＲに用いたプライマーは、実施例３で用いたものである。
マウス初代培養肝細胞におけるｃＡＭＰ依存性の糖新生系酵素の発現誘導はＧＣＮ５のノックダウンによって減弱した（図４）。
【００７５】
《実施例７：マウス初代培養肝細胞におけるｓｈＲＮＡの効果》
マウス初代培養肝細胞における糖産生に対するＧＣＮ５のノックダウンの効果を検討した。マウス初代培養肝細胞をコラーゲンコート６ウェルプレートに１．０×１０６／ウェルの細胞密度で播いて、タンデムコントロールｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスとタンデムＧＣＮ５  ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスをそれぞれ５ＭＯＩ培養液中に加えることで感染させ、８時間後に培養液を交換した。更に４８時間後に培養液を無血清培地（刺激もしくはｃＡＭＰ１００μＭ）に交換して、１６時間のｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った。その後培養液をｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （グルコース、ピルビン酸０．２２ｇ／Ｌ、乳酸２．２４ｇ／Ｌ）に交換して刺激もしくはｃＡＭＰ１００μＭで刺激し、６時間後に培養液を回収してグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は各ウェルの蛋白濃度で補正した。
マウス初代培養肝細胞において、ＧＣＮ５のノックダウンによって糖産生が減少した（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の医薬組成物は、糖尿病などの血糖値の上昇を伴う疾患の予防又は治療に用いることができる。また、本発明のスクリーニング方法は、ＫＡＴ２Ａを介した糖新生酵素の活性化を抑制する物質のスクリーニングに用いることができる。本発明により、副作用がなく、そして効果的に糖尿病を治療することが可能である。
【図１】
2014105177.tif 000007
【図２】
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【図４】
2014105177.tif 000009
【図５】
2014105177.tif 000010
【図６】
2014105177.tif 000011
【図３】
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【配列表】
2014105177000001.app