(57)【要約】【課題】抗体タンパク質を効率的に精製することが可能な抗体タンパク質の精製方法を提供する。【解決手段】高温側で抗体タンパク質が吸着し、低温側で抗体タンパク質が脱離する温度応答性カチオン性イオン交換樹脂を用いた、抗体タンパク質の精製方法であって、溶液に含まれる、抗体タンパク質の単量体成分、及び抗体タンパク質の二量体以上の凝集体成分を、抗体タンパク質が温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着する第１の温度領域で、温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着させることと、抗体タンパク質の単量体成分が温度応答性カチオン性イオン交換樹脂から脱離する第２の温度領域の溶出液を用いて、温度応答性カチオン性イオン交換樹脂から抗体タンパク質の単量体成分を脱離させることを特徴とする抗体タンパク質の精製方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高温側で抗体タンパク質が吸着し、低温側で前記抗体タンパク質が脱離する温度応答性カチオン交換樹脂を用いた、抗体タンパク質の精製方法であって、
前記抗体タンパク質が前記温度応答性カチオン交換樹脂に吸着する第１の温度領域で、溶液に含まれる、抗体タンパク質の単量体成分、及び前記抗体タンパク質の二量体以上の凝集体成分を、前記温度応答性カチオン交換樹脂に吸着させることと、
前記抗体タンパク質の単量体成分が前記温度応答性カチオン交換樹脂から脱離する第２の温度領域の溶出液を用いて、前記温度応答性カチオン交換樹脂から前記抗体タンパク質の単量体成分を脱離させること、を特徴とする抗体タンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記抗体タンパク質が、モノクロナール抗体である、請求項１に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項３】
前記第１の温度領域が３０℃以上６０℃未満であり、前記第２の温度領域が０℃以上３０℃未満である、請求項１又は２に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項４】
前記温度応答性カチオン交換樹脂が、基材と、前記基材表面に固定された、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミドを含む共重合体と、を備え、
前記共重合体が、少なくとも強カチオン交換基を有し、
前記共重合体が、前記強カチオン交換基を、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに対してモノマー換算で０．０１〜５ｍｏｌ％含有する、
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項５】
前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、アクリル酸誘導体又はメタクリル酸誘導体であり、下記化学式（１）又は（２）で示される基を有する、請求項４に記載の抗体タンパク質の精製方法。
−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ2−ＳＯ3Ｈ      ・・・（１）
−ＣＨ（−ＳＯ3Ｈ）−ＣＨ2−ＯＨ      ・・・（２）
【請求項６】
前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、スルホン酸基を有するビニルモノマー由来である、請求項４に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項７】
前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3のそれぞれをＨ又はＭｅとして下記化学式（３）で示される、請求項６に記載の抗体タンパク質の精製方法。
−ＣＲ1Ｒ2−ＣＲ3（−ＳＯ3Ｈ）−      ・・・（３）
【請求項８】
前記温度応答性カチオン性イオン交換樹脂が、基材と、前記基材表面に固定された、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミドを含む共重合体と、を備え、
前記共重合体が、少なくとも強カチオン交換基を有し、
前記共重合体が、前記強カチオン交換基を有するモノマー及び/又は強カチオン交換基導入前駆体モノマーを、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに対して０．０１〜５ｍｏｌ％の割合で含有するモノマー組成物を、表面グラフト重合法によって重合して形成された、
請求項１又は２に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項９】
前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、アクリル酸誘導体又はメタクリル酸誘導体であり、下記化学式（４）又は（５）で示される基を有する、請求項８に記載の抗体タンパク質の精製方法。
−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ2−ＳＯ3Ｈ      ・・・（４）
−ＣＨ（−ＳＯ3Ｈ）−ＣＨ2−ＯＨ      ・・・（５）
【請求項１０】
前記強カチオン交換基導入前駆体モノマーの少なくとも一部が、アクリル酸誘導体又はメタクリル酸誘導体であり、前記共重合体が、下記化学式（６）又は（７）で示される側鎖を有する、請求項９に記載の抗体タンパク質の精製方法。
−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ2−ＳＯ3Ｈ      ・・・（６）
−ＣＨ（−ＳＯ3Ｈ）−ＣＨ2−ＯＨ      ・・・（７）
【請求項１１】
前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、スルホン酸基を有するビニルモノマー由来である、請求項１０に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項１２】
前記強カチオン交換基を有するモノマーの少なくとも一部が、スルホン酸基を有するビニルモノマーである、請求項８又は１１に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項１３】
前記強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部が、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3のそれぞれをＨ又はＭｅとして下記化学式（８）で示される、請求項８、１１、１２のいずれか１項に記載の抗体タンパク質の精製方法。
−ＣＲ1Ｒ2−ＣＲ3（−ＳＯ3Ｈ）−      ・・・（８）
【請求項１４】
前記強カチオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする、請求項４乃至１３のいずれか１項に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項１５】
前記表面グラフト重合法が、表面リビングラジカル重合法であることを特徴とする、請求項８乃至１３のいずれか１項に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項１６】
前記表面グラフト重合法が、放射線ラジカル重合法であることを特徴とする、請求項８乃至１３のいずれか１項に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【請求項１７】
前記第１の温度領域から、前記第２の温度領域にカラム温度を変化させるとき、ステップワイズ溶出法を用いることを特徴とする、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の精製技術に関し、抗体タンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（抗体タンパク質）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬或いは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、抗体タンパク質の利用価値が高まっている。抗体タンパク質は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、抗体タンパク質を含有する血液や培養液は、抗体タンパク質以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分等の不純物成分を包含する。そのため、不純物成分から抗体タンパク質を分離精製するには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。
【０００３】
液体クロマトグラフィーは、抗体タンパク質の分離精製に重要である。抗体タンパク質を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体タンパク質が分離精製される。
【０００４】
イオン交換クロマトグラフィーは、基材表面のイオン交換基を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着することにより分離を行う方法である。基材の形状としては、ビーズや、平膜、中空糸等の膜などが採用されており、これらの基材にカチオン交換基又はアニオン交換基を結合したものが固体吸着剤（固定相）として市販されている。カチオン交換基を有する固体吸着剤は、抗体タンパク質を主として吸着し、他の夾雑物の大半を素通りさせる特性を有するため、抗体タンパク質の濃縮分離に用いられている。
【０００５】
カチオン交換基は、カルボキシル基等の弱カチオン交換基と、スルホン酸基等の強カチオン交換基と、に大別される。弱カチオン交換基を有する吸着剤は、移動相のｐＨが変化すると吸着剤表面の電荷が変化して、抗体タンパク質の結合容量が変動する欠点がある。そのため、弱カチオン交換基を有する吸着剤を抗体タンパク質の分離精製に用いた場合、分離の再現性が悪く、抗体タンパク質の回収率が低くなる可能性がある。一方、強カチオン交換基を有する吸着剤は、移動相のｐＨが変動しても吸着剤表面の電荷が変化しないため、抗体タンパク質の結合容量が変化しにくい。工業的な抗体タンパク質の分離精製プロセスでは、移動相のｐＨを一定に保つのが難しいにもかかわらず、一方では分離の再現性が厳しく要求されることから、強カチオン交換基を有する吸着剤が用いられている。
【０００６】
従来のイオン交換基を有する吸着剤を用いた抗体タンパク質の精製方法では、移動相の塩濃度を高めることにより、抗体タンパク質と、吸着剤と、の静電的相互作用を弱くして、固定相に吸着させた抗体タンパク質を溶出させることが一般的に行われている。ここで、移動相の塩濃度が高いほど、抗体タンパク質の溶出は容易になる傾向にある。しかし、移動相の塩濃度が高くなると、タンパク質どうしの疎水性相互作用が高くなり、タンパク質の会合体や凝集体が生じやすくなる傾向にある。このように、抗体タンパク質の溶出の容易さと、凝集体の生じやすさと、は、トレードオフの関係にある。そのため、抗体タンパク質の収率、濃度、及び溶出速度等、精製の際に要求される様々な条件を満たす移動相の塩濃度を設定することは困難である。
【０００７】
そこで、従来のイオン交換基を有する吸着材の問題を解決すべく、固定相に吸着させた抗体タンパク質等の生理活性物質を溶出する際に、移動相の塩濃度を高めるのではなく、表面の有効イオン交換基密度を温度によって変化させ、生理活性物質を溶出することが可能である温度応答性吸着剤が提案されている。
【０００８】
特許文献１では、固定相表面の有効荷電密度を温度変化によって変化させることが可能である、荷電を有する共重合体を含む充填剤、製造方法及びそれを用いた温度応答性クロマトグラフィー法が開示されている。特許文献２では、原子移動ラジカル重合法によって、基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを高密度に固定化した温度応答性クロマトグラフィーの固定相が開示されている。特許文献３には、イソプロピルアルコールを溶媒として、原子移動ラジカル法により、荷電を有し、０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させることを特徴とした温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法が開示されている。特許文献４では、水系移動相を含む特定の条件下で、生物学、医学、薬学等の分野において有用な高分子量の生理活性物質を分離できる、固体表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電ポリマーを固定した液体クロマトグラフィー用担体の製造方法が開示されている。非特許文献１では、原子移動ラジカル重合法により調製された、カルボキシル基を有する温度応答性クロマトグラフィー担体及びその製造法が開示されている。その中で、原子移動ラジカル重合法に用いるモノマー組成において、リゾチームの分離に最適化されたモノマー組成が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９９／０６１９０４号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−６９１９３号公報
【特許文献３】特開２００９−８５９３３号公報
【特許文献４】国際公開第０１／０７４４８２号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，Ｊａｐａｎ  Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．２，３Ｔ１−１３（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、上述した文献に開示された方法を用いてもなお、抗体タンパク質を効率的に精製することができない。そこで、本発明は、抗体タンパク質を効率的に精製することが可能な抗体タンパク質の精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、本発明者らは、高温側で抗体タンパク質を温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着させ、低温側で抗体タンパク質を温度応答性カチオン性イオン交換樹脂から脱離させると、低温においては、抗体タンパク質と、温度応答性カチオン性イオン交換樹脂と、の静電的相互作用が弱まると同時に、タンパク質どうしの疎水性相互作用も弱まるため、抗体タンパク質の凝集体の生成を抑制しつつ、効率的に抗体タンパク質を精製可能であることを見出した。
【００１３】
係る本発明者らの知見に基づく本発明は、高温側で抗体タンパク質が吸着し、低温側で抗体タンパク質が脱離する温度応答性カチオン性イオン交換樹脂を用いた、抗体タンパク質の精製方法であって、溶液に含まれる、抗体タンパク質の単量体成分、及び抗体タンパク質の二量体以上の凝集体成分を、抗体タンパク質が温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着する第１の温度領域で、温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着させることと、抗体タンパク質の単量体成分が温度応答性カチオン性イオン交換樹脂から脱離する第２の温度領域の溶出液を用いて、温度応答性カチオン性イオン交換樹脂から抗体タンパク質の単量体成分を脱離させること、を特徴とする抗体タンパク質の精製方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る抗体タンパク質の精製方法によれば、抗体タンパク質を効率的に精製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１に係るプロテインＡカラムからの溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図２】実施例１に係る温度応答性吸着剤を充填したカラムからの溶出液の吸光度のグラフである。
【図３】図２で「１」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図４】図２で「２」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図５】図２で「３」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図６】図２で「４」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図７】図２で「５」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図８】実例１に係る温度応答性吸着剤を充填したカラムからの溶出画分と、比較例１に係るＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを充填したカラムからの溶出画分と、を電気泳動した結果の写真である。
【図９】比較例１に係るＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを充填したカラムからの溶出液の吸光度のグラフである。
【図１０】図９で「１」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図１１】図９で「２」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図１２】図９で「３」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図１３】図９で「４」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図１４】図９で「５」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図１５】図９で「６」で示した部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図１６】実施例２に係るプロテインＡカラムからの溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図１７】実施例２の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施の形態（以下において、「実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００１７】
実施の形態に係る抗体タンパク質の精製方法は、高温側で抗体タンパク質が吸着し、低温側で抗体タンパク質が脱離する温度応答性カチオン性イオン交換樹脂を、イオン交換クロマトグラフィーの固体吸着剤（固定相）として用いる。
【００１８】
実施の形態に係る抗体タンパク質の精製方法は、抗体タンパク質の単量体成分、及び抗体タンパク質の二量体以上の凝集体成分を含む抗体タンパク質溶液を、抗体タンパク質が温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着する第１の温度領域で、抗体タンパク質を温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着させることと、抗体タンパク質の単量体成分が温度応答性カチオン性イオン交換樹脂から脱離する第２の温度領域の溶出液を用いて、温度応答性カチオン性イオン交換樹脂から抗体タンパク質の単量体成分を脱離させることと、を含む。ここで、第２の温度領域では、抗体タンパク質の単量体成分が脱離し、抗体タンパク質の単量体成分を単離できる。
【００１９】
抗体タンパク質が温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着する第１の温度領域（以下において、「高温領域」ともいう。）とは、例えば３０℃以上６０℃未満、好ましくは３０℃以上５０℃未満、最も好ましくは３０℃以上４５℃未満である。また、抗体タンパク質が温度応答性カチオン性イオン交換樹脂から脱離する第２の温度領域（以下において、「低温領域」ともいう。）とは、例えば０℃以上３０℃未満、好ましくは１０℃以上３０℃未満、より好ましくは１５℃以上３０℃未満、さらにより好ましくは２０℃以上２７℃未満である。
【００２０】
実施の形態に係る方法が精製対象とする抗体タンパク質は、生化学における一般的な定義のとおり、脊椎動物の感染防禦機構としてＢリンパ球が産生する糖タンパク質分子（ガンマグロブリン又は免疫グロブリンともいう）である。例えば、実施の形態に係る方法で精製される抗体タンパク質は、ヒトの医薬品として使用され、投与対象であるヒトの体内にある抗体タンパク質と実質的に同一の構造を有する。
【００２１】
抗体タンパク質は、ヒト抗体タンパク質であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体タンパク質は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体タンパク質であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質とは、可変領域がマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体タンパク質である。また、ヒト化抗体タンパク質とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＦＲ）がヒト由来である抗体タンパク質である。ヒト化抗体タンパク質は、キメラ抗体タンパク質よりも免疫原性がさらに低減される。
【００２２】
実施の形態に係る方法が精製対象とする抗体タンパク質のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体タンパク質は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施の形態に係る方法が精製対象とする抗体タンパク質は、５種類のクラスの何れであってもよい。また、ヒト抗体タンパク質においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。しかし、実施の形態に係る方法が精製対象とする抗体タンパク質のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施の形態に係る方法が精製対象とする抗体タンパク質に含まれ得る。
【００２３】
さらに、抗体タンパク質は、由来によっても分類することができる。しかし、実施の形態に係る方法が精製対象とする抗体タンパク質は、天然のヒト抗体タンパク質、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体タンパク質、モノクローナル抗体タンパク質、及びポリクローナル抗体タンパク質の何れであってもよい。これらの抗体タンパク質の中でも、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、ヒトＩｇＧが好適である。
【００２４】
実施の形態に係る精製方法で用いられる温度応答性カチオン性イオン交換樹脂を備える固体吸着剤は、例えば基材と、基材表面に固定されたＮ−イソプロピルアクリルアミド等を含む共重合体と、を含む。共重合体は、少なくともカチオン性イオン交換基を有する。例えば、実施の形態に係る温度応答性カチオン性イオン交換樹脂は、カチオン性イオン交換基を有するモノマー及び／又はカチオン性イオン交換基導入前駆体モノマーと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーと、からなるモノマー混合物を、表面グラフト重合法によって基材表面に重合して形成される。
【００２５】
実施の形態で使用する基材の形状は、特に限定されないが、例えばビーズ状、平板状、及び管状でありうる。基材の形状がビーズ状の場合、さまざまな粒径のビーズが入手可能である。ビーズ状の基材の粒径は、特に限定されるものではないが、例えば１〜３００μｍであり、好ましくは１０〜２００μｍであり、さらに好ましくは２０〜１５０μｍである。粒径が１μｍ以下であると、温度応答性カチオン性イオン交換樹脂が充填されるカラム内でビーズの圧密化が起きやすいために、カラムに溶液を高速で通すことが困難となる傾向にある。また粒径が３００μｍ以上であると、ビーズ間の隙間が大きくなり、抗体タンパク質を温度応答性カチオン性イオン交換樹脂に吸着させる際に、溶液の漏れが発生する傾向にある。
【００２６】
実施の形態で使用する基材は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されないが、例えば５〜１０００ｎｍであり、好ましくは１０〜７００ｎｍであり、さらに好ましくは２０〜５００ｎｍである。細孔径が５ｎｍ以下であると、分離できる抗体タンパク質の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以上であると、基材の表面積が少なくなり、抗体タンパク質の結合容量が小さくなる傾向にある。
【００２７】
基材の材料は、特に限定されないが、基材がビーズ状である場合、ガラス、シリカ、ポリスチレン樹脂、メタクリル樹脂、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースなどが使用できる。
【００２８】
実施の形態では、基材にカチオン交換基を有する温度応答性ポリマーが固定される。その固定方法としては、基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定し、その開始剤から触媒の存在下で温度応答性ポリマーを成長反応させる「原子移動ラジカル法」や、基材に放射線を照射してラジカルを生成し、生成したラジカルを起点として温度応答性ポリマーを成長反応させる「放射線グラフト重合法」等があるが、特に限定されない。他の固定方法としては、表面リビングラジカル重合法である「原子移動ラジカル重合法」がある。「原子移動ラジカル重合法」は、基材表面にポリマーを高密度に固定することができるため、好適に用いられる。
【００２９】
温度応答性ポリマーが「原子移動ラジカル重合法」で基材表面に固定される場合、その際に使用する開始剤は特に限定されるものではないが、基材が水酸基を有している場合、例えば、１−トリクロロシリル−２−（ｍ，ｐ−クロロメチルフェニル）エタン、２−（４−クロロスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、（３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル）ジメチルエトキシシラン、及び２−ブロモイソ酪酸ブロミドなどが挙げられる。この開始剤よりポリマー鎖を成長させる。その際の触媒としては特に限定されるものでないが、ハロゲン化銅（ＣｕIＸ）としてＣｕIＣｌ、ＣｕIＢｒ等を挙げることができる。また、そのハロゲン化銅に対するリガンド錯体も特に限定されるものではないが、トリス（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミン（Ｍｅ6ＴＲＥＮ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン（ＨＭＴＥＴＡ）、１，４，８，１１−テトラメチル １，４，８，１１−アザシクロテトラデカン（Ｍｅ4Ｃｙｃｌａｍ）、及びビピリジン等が挙げられる。
【００３０】
温度応答性ポリマーが「放射線グラフト重合法」で基材表面に固定される場合、基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用しうるが、基材に電離性放射線を照射すると、基材全体に均一なラジカルが生成するため、好適である。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
【００３１】
電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が１０００ｋＧｙを超えると、基材の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
【００３２】
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に基材にラジカルを生成した後、次いでラジカルを反応性化合物と接触させる前照射法と、膜を反応性化合物と接触させた状態で基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。実施の形態においては、いかなる方法も適用しうるが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
【００３３】
実施の形態において重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
【００３４】
例えば、基材表面に固定されるポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを有する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２度に下限臨界温度を有することが知られている。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを有するポリマーを基材表面に導入した固体吸着剤は、臨界温度で親水性／疎水性の表面物性を大きく変化させる。そのため、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを有するポリマーをクロマトグラフィーの充填剤の表面にグラフトもしくはコーティングして固体吸着剤とすることにより、固体吸着剤が抗体タンパク質を保持する力を温度によって変えることが可能となる。その結果、溶出液の組成を変化させずに、固体吸着剤の保持挙動を温度によって制御することができるようになる。
【００３５】
下限臨界温度を３２℃以上にするためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、及びビニルピロリドンなどを、親水性のコモノマーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。
【００３６】
また、下限臨界温度を３２℃以下にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどを、疎水性のコモノマーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。
【００３７】
例えば、基材表面に固定されるポリマーは、カチオン交換基として、スルホン酸基等の強カチオン交換基を有する。強カチオン交換基を与える方法は特に限定されないが、第１の方法として、基材表面に固定される温度応答性ポリマー鎖を合成する際、強カチオン交換基を有するモノマーを含めて共重合する方法が挙げられる。スルホン酸基を有するモノマー単位の例として、スルホン酸を有するポリマーの構成単位である（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸、ビニルスルホン酸、アクリルアミドｔ−ブチルスルホン酸、及びスチレンスルホン酸等が挙げられる。
【００３８】
例えば、共重合体のモノマー単位の少なくとも一部がビニルスルホン酸等のスルホン酸基を有するビニルモノマー由来である場合、スルホン酸基が、リンカーを介さず、主鎖に結合する。そのため、リンカーと、抗体タンパク質と、の疎水性相互作用が生じないため、抗体タンパク質を温度変化によって固体吸着剤の表面から溶出する際の温度溶出量を増大させることが可能になりうる。なお、強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3のそれぞれをＨ又はＭｅとして、下記化学式（１）でも表すことができる。
−ＣＲ1Ｒ2−ＣＲ3（−ＳＯ3Ｈ）−      ・・・（１）
【００３９】
実施の形態において、基材表面に固定されるポリマーに強カチオン交換基を与える第２の方法として、「強カチオン交換基導入前駆体」を有するモノマーを含めて共重合した後、前駆体をスルホン酸基に変換する方法が挙げられる。なお、「強カチオン交換基導入前駆体」とは、「強カチオン交換基の前駆体」を含みうる。また、「強カチオン交換基の前駆体」とは、例えば強カチオン交換基に保護基がついたものである。スルホン酸基の前駆体を有するモノマーとして、フェニルビニルスルホネート等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
実施の形態において、基材表面に固定されるポリマーに強カチオン交換基を与える第３の方法としては、強カチオン交換基導入前駆体モノマーとして強カチオン交換基を付与しうる官能基を有するモノマーを含めて共重合した後、強カチオン交換基を付与しうる官能基をスルホン酸基に変換する方法が挙げられる。強カチオン交換基を付与しうる官能基を有するモノマーとして、スチレン及びグリシジルメタクリレート等が挙げられる。強カチオン交換基を有するモノマーを表面リビングラジカル重合法により重合する場合、十分な重合速度が得られない場合が多いが、グリシジルメタクリレート等の少なくとも一部がメタクリル酸誘導体又はアクリル酸誘導体である強カチオン交換基導入前駆体モノマーを用いることで、十分な重合速度を得ることができる。
【００４１】
また、強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部がメタクリル酸誘導体又はアクリル酸誘導体であることにより、基材あるいは共重合体の他の部分と、抗体タンパク質と、の疎水性相互作用を抑制し、抗体タンパク質を温度変化によって固体吸着剤の表面から溶出する際の温度溶出量を増大させることが可能になりうる。
【００４２】
さらに、強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部がメタクリル酸誘導体又はアクリル酸誘導体であることにより、強カチオン交換基を有する共重合体のモノマー単位の少なくとも一部は、下記化学式（２）又は（３）で示される基を有する。
−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ2−ＳＯ3Ｈ      ・・・（２）
−ＣＨ（−ＳＯ3Ｈ）−ＣＨ2−ＯＨ      ・・・（３）
上記化学式（２）のモノマー単位のスルホン酸基は、少なくとも−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ2−を含むリンカーを介して、主鎖に結合している。また、上記化学式（３）のモノマー単位のスルホン酸基は、少なくとも−ＣＨ−を含むリンカーを介して、主鎖に結合している。リンカーにより立体障害が減るため、抗体タンパク質が、スルホン酸基にすばやく結合することが可能になりうる。またさらに、上記化学式（２）及び（３）のモノマー単位は、スルホン酸基の近傍に、水酸基を有する。そのため、水酸基が、基材あるいは共重合体の他の部分と、抗体タンパク質と、の疎水性相互作用を抑制し、抗体タンパク質を温度変化によって固体吸着剤の表面から溶出する際の温度溶出量を増大させることが可能になりうる。
【００４３】
実施の形態においては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに対する、強カチオン交換基を有するモノマー及び/又は前記強カチオン交換基導入前駆体モノマーの比率が、０．０１〜５ｍｏｌ％であるモノマー組成物を、表面グラフト重合法によって重合する。上記比率として、好ましくは０．１〜４ｍｏｌ％、より好ましくは０．２〜３ｍｏｌ％、さらに好ましくは０．３〜２ｍｏｌ％、最も好ましくは０．５〜１．５ｍｏｌ％である。上記比率が５ｍｏｌ％を超えると、共重合体中のＮ−イソプロピルアクリルアミドに対する強カチオン交換基の量が過剰量となってしまうため、温度応答性の固体吸着剤への抗体タンパク質の吸着量は増大するが、吸着した抗体タンパク質の大部分は温度変化によって溶出することが困難になる傾向にある。一方、上記比率が０．０１ｍｏｌ％未満では、強カチオン交換基導入量が少なすぎるため、固体吸着剤への抗体タンパク質の吸着量自体が少なくなってしまう傾向にある。
【００４４】
実施の形態おいて、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに対する、強カチオン交換基を有するモノマー単位の共重合比率（組成）は、基材表面に固定された共重合体を分析することによって定量することが可能である。共重合比率の分析には、元素分析やＮＭＲ等の様々な分析手法を用いることが可能である。共重合体を基材から単離した後に共重合比率を分析することは、分析に与える基材の影響を排除することができるため、分析精度の観点から好ましい。共重合体を基材から単離出来ない場合は、溶液中で基材を用いずに共重合体を重合することによって、共重合比率の分析に用いる共重合体を得ることができる。
【００４５】
基材表面に固定されているポリマーは温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度域は０℃〜８０℃、好ましくは５℃〜５０℃、さらに好ましくは１０℃〜４５℃である。８０℃を越えると移動相が水であるので蒸発等が生じ、作業性が悪くなる傾向にある。また、０℃より低いと移動相が凍結する傾向にある。
【００４６】
実施の形態によって得られる温度応答性の固体吸着剤は、通常の液体クロマトグラフィー装置のカラムに充填されて、液体クロマトグラフィーシステムとして利用される。その際、温度応答性の固体吸着剤への温度の負荷方法は特に限定されないが、例えば温度応答性の固体吸着剤を所定の温度にしたアルミブロック、水浴、及び空気層に接触させるか、あるいは固体吸着剤をジャケットなどに装着すること等が挙げられる。
【００４７】
実施の形態に係る温度応答性の固体吸着剤を用いて抗体タンパク質を精製する際には、第１の温度領域で固体吸着剤に目的とする抗体タンパク質の単量体成分と、凝集体成分と、を一度吸着させ、その後、第１の温度領域よりも低い第２の温度領域に温度を変えて固体吸着剤表面の特性を変化させ、固体吸着剤に凝集体を吸着させたまま、固体吸着剤に吸着した抗体タンパク質の単量体成分のみを実質的に溶出させる、バインドアンドエリュート（Ｂ＆Ｅ）法が用いられる。固体吸着剤に与えられる抗体タンパク質の量は、固体吸着剤が吸着しうる量を超えていてもよく、超えていなくてもよい。抗体タンパク質の凝集体は、単量体よりも荷電量が多いため、イオン交換樹脂との結合が、単量体よりも強くなる傾向にある。さらに、凝集体は、単量体よりも疎水性が強いため、イオン交換樹脂の疎水性部分と相互作用（疎水性相互作用）し、イオン交換樹脂との結合が強くなる傾向にある。
【００４８】
実施の形態に係る固体吸着剤は、温度変化のみに依存して、表面特性が大きく変わりうるので、予め、固体吸着剤の表面特性が変わる温度を確認しておき、確認された温度を挟むようにして、第１の温度領域から第２の温度領域に温度を下げて、固体吸着剤に凝集体を吸着させたまま、固体吸着剤に吸着した抗体タンパク質を溶出することが好ましい。
【００４９】
第１の温度領域から、第２の温度領域にカラム温度を変化させる場合、温度を連続的に変化させるグラジエント溶出法と、第１の温度領域から第２の温度領域へ段階的に変化させるステップワイズ溶出法がある。ただし、ステップワイズ溶出法では、第１の温度領域から第２の温度領域へ１段階で変化させ、その後、一定の温度で溶出させてもよい。
【００５０】
ここで、第２の温度領域の温度が高くなるほど、固体吸着剤と凝集体成分及び単量体成分の吸着力は強くなるため、抗体タンパク質の凝集体除去能は上がる傾向にある。ただし、第２の温度領域の温度が高くなるほど、抗体タンパク質の単量体成分も溶出されにくくなるため、回収率は低くなる傾向にある。
【００５１】
本発明の実施形態においては、グラジエント溶出法とステップワイズ溶出法のいずれの方法も用いることができる。しかしながら、グラジエント溶出法とステップワイズ溶出法では、凝集体成分及び単量体成分と固体吸着剤との吸着力が異なり、抗体の回収率や凝集体除去能等に影響を与える場合がある。
【００５２】
抗体の回収率を向上させるためには、ステップワイズ溶出法が好適に用いられる。
【００５３】
さらに、第２の温度領域の好適条件がわかっている場合、ステップワイズ溶出法を用いると、抗体の精製純度を保つことができ、分離時間を短縮できるため好ましい。温度をステップワイズで変化させる場合は、あらかじめ第１の温度領域と第２の温度領域に設定したアルミブロック、水浴、及び空気層等をそれぞれ用意し、温度応答性の抗体吸着剤及び／または吸着剤に流入する移動相に接触させることで達成される。
【００５４】
なお、未知の抗体タンパク質について、抗体回収量や凝集体除去能を向上させるため、最も適した溶出温度を決定する際には、グラジエント溶出法が好適に用いられる。
【００５５】
実施の形態に係るクロマトグラフィーの移動相としては、中性の緩衝液を利用すればよく、有機溶媒を必要としないものである。ここで、緩衝液とは無機塩類を含む水溶液であって、具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、及び酢酸緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に限定されるものではない。その無機塩類の濃度は１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌがよく、好ましくは３〜４０ｍｍｏｌ／Ｌがよく、さらに好ましくは５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌがよい。
【００５６】
緩衝液における無機塩類の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌより低いと、溶質である抗体タンパク質の活性を損ねる傾向にある。さらに、緩衝液における無機塩類の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌより低いと、温度応答性吸着剤表面のイオン交換基の解離度が高くなり、温度応答性吸着剤表面へ抗体タンパク質が強固に吸着してしまい、その後の操作で吸着剤表面から抗体タンパク質を溶出することが困難となる傾向にある。
【００５７】
また、緩衝液における無機塩類の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌより高いと、温度応答性吸着剤表面のイオン交換基の解離度が低くなるため、吸着剤表面が抗体タンパク質の保持することが困難となる傾向にある。そのため、凝集体成分から、抗体タンパク質を効率的に分離することが困難となる傾向にある。
【００５８】
緩衝液の水素イオン濃度は、例えばｐＨ４．０〜７．５であり、好ましくはｐＨ４．５〜７．０であり、さらに好ましくはｐＨ５．０〜６．５である。緩衝液のｐＨが７．５より高くなると、抗体タンパク質（等電点７．５〜１０）が負に荷電するため、実施の形態の温度応答性吸着剤が有する強カチオン交換基と荷電反発し、吸着容量が低下する傾向にある。また、ｐＨが４．０より低くなると、抗体タンパク質の変性が起こり、活性の低下や、凝集体の生成等の品質低下が引き起こされる傾向にある。
【００５９】
以上に示してきた実施の形態に係る温度応答性カチオン交換樹脂に、高温側で抗体タンパク質の単量体と凝集体を吸着させ、低温側で抗体タンパク質の単量体を温度応答性カチオン交換樹脂から脱離させると、低温においては、抗体タンパク質の単量体と、温度応答性カチオン交換樹脂と、の静電的相互作用が弱まると同時に、抗体タンパク質どうしの疎水性相互作用も弱まるため、抗体タンパク質の凝集体の生成を抑制しつつ、効率的に抗体タンパク質の単量体を精製可能である。そのため、実施の形態に係る抗体タンパク質の精製方法によれば、医薬品等に利用できる極めて有用な抗体タンパク質を効率的に精製可能である。
【実施例１】
【００６０】
以下に、実施の形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは実施の形態を何ら限定するものではない。
実施例１では、原子移動ラジカル重合法によって、スルホン酸基を有するビーズ状の温度応答性吸着剤を合成した。
【００６１】
１）開始剤の固定
架橋ポリビニルアルコールビーズ１ｇ（粒径１００μｍ）を純水で湿潤させ、３００ｍLのガラス製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、テトラヒドラフラン（安定剤不含、関東化学（株）社製）２００ｍＬ、２−ブロモイソ酪酸ブロミド（東京化成工業（株）製）１．２３ｍＬ、及びトリエチルアミン（和光純薬工業（株）社製）１．４０ｍＬを加え、室温で１６時間震とうさせた。反応後、ろ過してから２００ｍLエタノールで３回洗浄し、脱水イソプロパノール中で保存した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）開始剤である２−ブロモイソ酪酸ブロミドが導入された。
【００６２】
２）表面グラフト重合
スルホン酸基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ、東京化成工業（株）製）を、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに対して１ｍｏｌ％の割合で含有するモノマー組成物を調整した。具体的には、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ、和光純薬工業（株）製）１８．４０ｇ、ＧＭＡ０．２３１ｇ、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ、東京化成工業（株）製）１．２１７ｇ、塩化銅Ｉ（ＣｕＣｌ、和光純薬工業（株）製） ０．０８５ｇ、及び塩化銅ＩＩ（ＣｕＣｌ2、和光純薬工業（株）製）０．０１２ｇを９０容量％イソプロパノール（ＩＰＡ）水溶液４２．８ｍＬに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にトリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン（Ｍｅ6ＴＲＥＮ）（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社製）０．２２１ｇを加えて、５分間攪拌しＣｕＣｌ／ＣｕＣｌ2／Ｍｅ6ＴＲＥＮの触媒を形成させた。この反応溶液を窒素雰囲気下で開始剤導入架橋ポリビニルアルコールビーズに反応させ、室温で１６時間のＡＴＲＰをおこなった。反応後、エタノール、５０ｍｍｏｌ／Ｌ―ＥＤＴＡ水溶液、純水の順に洗浄し、モノマー、ポリマー、及び銅触媒を洗浄した。
【００６３】
３）スルホン酸基の導入
原子移動ラジカル重合法によりグラフト鎖を導入したビーズを、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄した。その後、このビーズを０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄し、実施例１に係る温度応答性吸着剤とした。温度応答性吸着剤は、カラムに充填した。
【００６４】
４）共重合比率の測定
スルホン酸基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ、東京化成工業（株）製）を、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに対して１ｍｏｌ％の割合で含有するモノマー組成物を用い、基材を用いずに共重合体を重合した。具体的には、上記２）記載の反応溶液を窒素雰囲気下で２−ブロモイソ酪酸エチルに反応させ、室温で１６時間のＡＴＲＰをおこなった。反応後、反応溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＭＷＣＯ１０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に入れ、エタノール、５０ｍｍｏｌ／Ｌ―ＥＤＴＡ水溶液、純水の順に浸漬することにより、モノマー、及び銅触媒を除去した。次に反応溶液を凍結乾燥することで得られた共重合体を、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、反応溶液を透析膜に入れ、純水に浸漬することにより、亜硫酸ナトリウムとＩＰＡを除去し、さらに反応溶液を凍結乾燥することで共重合体を得た。
【００６５】
上記共重合体３０ｍｇを重水６７０ｍｇに溶解し、核磁気共鳴装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖｅｎｖｅ−６００）を用いて１Ｈ−ＮＭＲを測定した。その後、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単位由来シグナル積分値と、スルホン酸基由来シグナル積分値と、から、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに対する、強カチオン交換基を有するモノマー単位の共重合比率（組成）を計算した。その結果、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに対する、強カチオン交換基を有するモノマー単位の共重合比率（組成）は０．７２ｍｏｌ％であった。
【００６６】
（細胞培養液の調整）
抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１１５ｍｇ／Ｌ含む培養上澄みを用意した。ＡＥ６Ｆ４産生細胞は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞の培養は、文献（日本生物工学会講演要旨集、１９９４年、６５巻、６５ページ）を参考に培養した。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名  ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）  ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、抗体を含む溶液（培養上澄）を取得した。ろ過は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。
【００６７】
（プロテインＡカラムによる抗体タンパク質の精製）
リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））１０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔを充填したもの）に、ろ過した培養液を１０ｍＬ添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））２０ｍＬを通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム＋３００ｍＭ（ｐＨ３．０））を１０ｍＬ通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、回収した。回収した溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、図１に示すように、吸光ピークの立ち上がりが急峻ではなく、抗体タンパク質の単量体のみならず、抗体タンパク質の凝集体成分も含んでいることを示していた。
【００６８】
（ウイルス不活性化処理）
得られた溶出画分に、溶出画分の体積の０．５％の１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて、溶出画分の水素イオン指数をｐＨ３．８に調整した。さらに、溶出画分にクエン酸を滴下して、溶出画分の水素イオン指数をｐＨ３．５にして、溶出画分を一時間放置し、ウイルスの不活性化処理を行った。その後、トリス緩衝液を用いて、溶出画分の水素イオン指数をｐＨ５．０にし、酢酸バッファー（１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０））にバッファー交換を行った。
【００６９】
（凝集体成分の除去）
温度応答性吸着剤（１．７ｍｌ）を充填したカラムに、ウイルス不活性化処理を行ったプロテインＡカラムからの溶出画分を加え、温度応答性吸着剤に抗体タンパク質の単量体と、凝集体と、を吸着させた。加えた溶出画分の量は２０ｍＬ（０．５７ｍｇ／ｍＬ）であり、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎであり、温度は４０℃であった。その後、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで流れる４０℃の酢酸バッファー（１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０））で温度応答性吸着剤を充填したカラムを洗浄した。次に、図２に示すように、溶出バッファー（１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０））の温度勾配を４０℃から１０℃に設定して、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで溶出バッファーを温度応答性吸着剤を充填したカラムに流した。
【００７０】
図２中、「１」乃至「５」の番号を振った部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけたところ、図３乃至図７に示すように、吸光ピークの立ち上がりが急峻であり、抗体タンパク質の単量体が精製されたことを示していた。また、図２中、「１」乃至「５」の番号を振った部分の溶出画分のそれぞれについて非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施したところ、図８に示すように、低分子の不純物成分もほとんど確認されなかった。
また温度応答性クロマトグラフィーに投入した抗体量（ｍｇ）をＡ、図２中の第２温度領域で溶出した抗体量（ｍｇ）をＢとすると回収率（＝Ｂ／Ａ）は、５４．３％であった。
【００７１】
［比較例１］
実施例１と同様に細胞培養液からプロテインＡカラムを用いて抗体タンパク質を精製し、ウイルスを不活性化した。その後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）（１．７ｍＬ）を充填したカラムに、ウイルス不活性化処理を行ったプロテインＡカラムからの溶出画分を、加えた。加えた溶出画分の量は２０ｍＬ（０．５７ｍｇ／ｍＬ）であり、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎであり、温度は室温であった。その後、実施例１と同様に、ＳＰセファロース・ビーズを充填したカラムを洗浄した。次に、図９に示すように、溶出バッファー（１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０））の塩濃度（伝導度）を上昇させながら、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで溶出バッファーをＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを充填したカラムに流した。
【００７２】
図９中、「１」乃至「６」の番号を振った部分の溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィーにかけたところ、図１０及び図１１に示すように、「１」、「２」の番号を振った部分の溶出画分の吸光ピークの立ち上がりは急峻であったが、図１２乃至図１５に示すように、「３」乃至「６」の番号を振った部分の溶出画分の吸光ピークの立ち上がりは乱れており、タンパク質の凝集体成分が除去されていないことを示していた。これは、塩濃度が上昇することにより、タンパク質どうしの疎水性相互作用が強くなったためと思われる。また、図９中、「１」乃至「６」の番号を振った部分の溶出画分のそれぞれについて非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施したところ、図８に示すように、「１」の番号を振った部分の溶出画分において、低分子の不純物成分が確認された。
【００７３】
[実施例２]
実施例１と同様に細胞培養液からプロテインＡカラムを用いて抗体タンパク質を精製し、ウイルスを不活性化した。回収した溶出画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、図１６に示すように、吸光ピークの立ち上がりが急峻ではなく、抗体タンパク質の単量体のみならず、抗体タンパク質の凝集体成分も含んでいることを示していた。また凝集体成分の量は実施例１、比較例１と比較して多かった。
【００７４】
その後、実施例１と同様に作成したビーズ温度応答性吸着剤（２．０ｍＬ）を充填したカラムに、ウイルス不活性化処理を行ったプロテインＡカラムからの溶出画分を加え、温度応答性吸着剤に抗体タンパク質の単量体と、凝集体と、を吸着させた。加えた溶出画分の量は４ｍＬ（４．９７ｍｇ／ｍＬ）であり、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎであり、温度は３７℃であった。その後、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで流れる３７℃の酢酸バッファー（１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０））で温度応答性吸着剤を充填したカラムを洗浄した。次に、温度を5℃に設定した溶出バッファー（１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０））を、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで温度応答性吸着剤を充填したカラムに２０ｍｌ流した。
【００７５】
温度応答性クロマトグラフィーで精製し、回収した溶出画分２０ｍｌをサイズ排除クロマトグラフィーにかけたところ、図１７に示すように、吸光ピークの立ち上がりが急峻であり、抗体タンパク質の単量体が精製されたことを示していた。
また温度応答性クロマトグラフィーに投入した抗体量（ｍｇ）をＡ、溶出した抗体量（ｍｇ）をＢとすると回収率（＝Ｂ／Ａ）は、８２．６％であった。
このように、ステップワイズ溶出法により、第１の温度領域（３７℃）から第２の温度領域（５℃）へ変化させることで、回収率は大幅に向上した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
実施の形態に係る方法に依れば、抗体タンパク質の単量体を温度変化によって工業規模で精製できるようになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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