(57)【要約】【課題】３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の固体状形態の提供。【解決手段】本発明は、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の実質的に結晶性の遊離固体状形態（形態Ｉ）、その薬学的組成物、及びそれを用いた治療方法に関する。2014088447.tif 000024【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許法§１１９の下、２００７年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０１２，１６２号の利益を主張し、この出願の全内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の固体状形態、例えば結晶形態、その薬学的組成物、及びそれを用いた方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＣＦＴＲは、吸収及び分泌上皮細胞を含めて、種々の細胞タイプにおいて発現されるｃＡＭＰ／ＡＴＰ媒介性陰イオンチャネルであり、膜を横切る陰イオンの流れ、並びに他のイオンチャネル及びタンパク質の活性を調節する。上皮細胞では、ＣＦＴＲの正常な機能は、呼吸器及び消化器組織を含めて、体全体にわたる電解質輸送の維持に重要である。ＣＦＴＲは、膜貫通領域の縦列反復で構成されるタンパク質をコードする、約１４８０個のアミノ酸で構成され、膜貫通領域の各々が６回膜貫通ヘリックスとヌクレオチド結合領域を含む。２つの膜貫通領域は、チャネル活性及び細胞内輸送を調節する複数のリン酸化部位を有する大きな極性調節（Ｒ）領域によって連結される。
【０００４】
ＣＦＴＲをコードする遺伝子は、特定され、配列決定されている（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｒ．  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：３８２−３８６；Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：３５８−３６２参照）、（Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１０６６−１０７３）。この遺伝子の欠陥は、ＣＦＴＲの変異を引き起こし、ヒトにおける最も一般的な致死的遺伝病である嚢胞性線維症（「ＣＦ」）をもたらす。嚢胞性線維症は、米国においては乳児２，５００名当たり約１名が罹患する。米国人口では、最高１０００万人が明白な発症なしに欠陥遺伝子の単一コピーを有する。これに対して、ＣＦ関連遺伝子の２個のコピーを有する個体は、慢性肺疾患を含めて、ＣＦの消耗性の致死的作用に苦しむ。
【０００５】
嚢胞性線維症患者では、呼吸上皮において内因的に発現されるＣＦＴＲの変異は、頂端側陰イオン分泌を減少させ、イオン及び体液輸送の不均衡を引き起こす。結果として生じる陰イオン輸送の減少は、肺における粘液蓄積の増加、及びＣＦ患者の死を最終的にもたらす付随的微生物感染症の一因になる。呼吸器疾患に加えて、ＣＦ患者は、典型的には、胃腸障害、及び無処置のまま放置すると死をもたらすすい不全に罹患する。さらに、嚢胞性線維症の男性の大多数は生殖能力がなく、嚢胞性線維症の女性は受精率が低下する。ＣＦ関連遺伝子の２個のコピーの激しい作用とは対照的に、ＣＦ関連遺伝子の単一コピーを有する個体は、コレラ、及び下痢に起因する脱水に対する抵抗が増加する。これは、恐らく、集団内のＣＦ遺伝子の発生頻度が比較的高いことを説明している。
【０００６】
ＣＦ染色体のＣＦＴＲ遺伝子の配列解析によって、種々の病原性変異が明らかになってきた（Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３６６−３６９；Ｄｅａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：８６３：８７０；及びＫｅｒｅｍ，Ｂ−Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１０７３−１０８０；Ｋｅｒｅｍ，Ｂ−Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８４４７−８４５１）。現在まで、ＣＦ遺伝子の１０００を超える病原性変異が特定された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔ．ｓｉｃｋｋｉｄｓ．ｏｎ．ｃａ／ｃｆｔｒ／）。最も一般的な変異は、ＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位のフェニルアラニンの欠失であり、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲと一般に称される。この変異は、嚢胞性線維症の症例の約７０％で起こり、重篤な疾患に関連する。
【０００７】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲにおける残基５０８の欠失は、新生タンパク質の正確な折りたたみを阻止する。その結果、変異タンパク質はＥＲを出ることができず、原形質膜に移動することができない。その結果、膜中に存在するチャネル数は、野生型ＣＦＴＲを発現する細胞で認められるよりもはるかに少ない。輸送障害に加えて、変異は、不完全なチャネル開閉をもたらす。膜中のチャネル数の減少と不完全な開閉は一緒に、上皮を横切る陰イオン輸送を減少させ、不完全なイオン及び体液輸送をもたらす。（Ｑｕｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｍ．（１９９０），ＦＡＳＥＢ  Ｊ．４：２７０９−２７２７）。しかし、複数の研究によれば、膜中の少数のΔＦ５０８−ＣＦＴＲは、野生型ＣＦＴＲより少なくても機能する。（Ｄａｌｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｏｎｄ．３５４：５２６−５２８；Ｄｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、上掲；Ｐａｓｙｋ  ａｎｄ  Ｆｏｓｋｅｔｔ（１９９５），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１２３４７−５０）。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲに加えて、不完全な輸送、合成及び／又はチャネル開閉をもたらすＣＦＴＲの別の病原性変異を上方又は下方制御して、陰イオン分泌を変え、疾患の進行及び／又は重症度を変化させることができた。
【０００８】
ＣＦＴＲは、陰イオンに加えて種々の分子を輸送するが、この役割（陰イオン輸送）が、上皮を横切ってイオン及び水を輸送する重要な機序における一要素であることは明らかである。別の要素としては、上皮Ｎａ＋チャネルＥＮａＣ、Ｎａ＋／２Ｃｌ−／Ｋ＋共輸送体、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ及び側底膜Ｋ＋チャネルが挙げられ、これらは細胞中への塩化物イオンの取り込みを担う。
【０００９】
これらの要素は一緒に作用して、細胞内の選択的発現及び局在化を介して、上皮を横切る定方向輸送を果たす。塩化物イオンの吸収は、頂端膜上に存在するＥＮａＣ及びＣＦＴＲと細胞の側底面で発現されるＮａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ及びＣｌ−チャネルとの協調活性によって起こる。管腔側からの塩化物イオンの二次性能動輸送は、細胞内塩化物イオンの蓄積をもたらし、次いで塩化物イオンは、Ｃｌ−チャネルを介して受動的に細胞から出て行くことができ、ベクトル輸送を生じる。側底面のＮａ＋／２Ｃｌ−／Ｋ＋共輸送体、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ及び側底膜Ｋ＋チャネルの配列と、管腔側のＣＦＴＲは、管腔側のＣＦＴＲを介した塩化物イオンの分泌を連係して調整する。水は恐らくそれ自体では決して能動輸送されないので、上皮を横切るその流れは、ナトリウム及び塩化物イオンの容積流によって生じるごくわずかの経上皮浸透勾配に依存する。
【００１０】
上述したように、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲにおける残基５０８の欠失は、新生タンパク質の正確な折りたたみを阻止し、その結果、この変異タンパク質がＥＲを出ることができず、原形質膜に移動することができないと考えられる。その結果、不十分な量の成熟タンパク質しか原形質膜に存在せず、上皮組織内の塩化物イオン輸送がかなり低下する。実際に、ＥＲ機構によるＡＢＣ輸送体の不完全なＥＲプロセシングのこの細胞現象は、ＣＦ疾患だけでなく、広範囲の他の単独の遺伝性疾患の根底にあることが示された。ＥＲ機構が機能不全を起こし得る２つの過程は、分解をもたらすタンパク質のＥＲ排出との結合不足、又はこれらの欠陥のある／誤って折りたたまれたタンパク質のＥＲ蓄積による［非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５］。
【００１１】
塩型の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸は、特許文献１（該刊行物を参照によりその全体を本明細書に援用する。）にＣＦＴＲ活性の調節物質として開示されており、したがって嚢胞性線維症などのＣＦＴＲ媒介性疾患の治療に有用である。しかし、治療用物質としての使用に適切な、薬学的組成物に容易に使用することができる前記化合物の安定な固体形態が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００７０５６３４１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ａｒｉｄｏｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５（７），ｐｐ７４５−７５１（１９９９）
【非特許文献２】Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｂ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４３，ｐｐ１−７（２００３）
【非特許文献３】Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ  Ｗｋｌｙ，１３２，ｐｐ２１１−２２２（２００２）
【非特許文献４】Ｍｏｒｅｌｌｏ，ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＰＳ，２１，ｐｐ．４６６−４６９（２０００）
【非特許文献５】Ｂｒｏｓｓ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔ．，１４，ｐｐ．１８６−１９８（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、以下の構造を有する３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（以下、「化合物１」）の固体形態に関する。
【００１５】
【化１】
2014088447.tif 000002
化合物１及び薬学的に許容されるその組成物は、嚢胞性線維症の治療又は重症度の低減に有用である。一態様においては、化合物１は、本明細書に記載され特徴づけられる形態Ｉと称する、実質的に結晶性であり、塩を含まない形態である。
【００１６】
本明細書に記載のプロセスを使用して、形態Ｉを含む本発明の組成物を調製することができる。プロセスに使用される成分の量及び特徴は、本明細書に記載するとおりである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
形態Ｉとして特徴づけられる３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸。
（項目２）
前記形態Ｉが、ＣｕＫアルファ照射によって得られたＸ線粉末回折における１５．２から１５．６度、１６．１から１６．５度、及び１４．３から１４．７度の１個以上のピークによって特徴づけられる、項目１に記載の形態Ｉ。
（項目３）
前記形態Ｉが１５．４、１６．３及び１４．５度の１個以上のピークによって特徴づけられる、項目２に記載の形態Ｉ。
（項目４）
前記形態Ｉが１４．６から１５．０度のピークによって更に特徴づけられる、項目２に記載の形態Ｉ。
（項目５）
前記形態Ｉが１４．８度のピークによって更に特徴づけられる、項目４に記載の形態Ｉ。
（項目６）
前記形態Ｉが１７．６から１８．０度のピークによって更に特徴づけられる、項目４に記載の形態Ｉ。
（項目７）
前記形態Ｉが１７．８度のピークによって更に特徴づけられる、項目６に記載の形態Ｉ。
（項目８）
前記形態Ｉが１６．４から１６．８度のピークによって更に特徴づけられる、項目６に記載の形態Ｉ。
（項目９）
前記形態Ｉが１６．４から１６．８度のピークによって更に特徴づけられる、項目８に記載の形態Ｉ。
（項目１０）
前記形態Ｉが１６．６度のピークによって更に特徴づけられる、項目９に記載の形態Ｉ。
（項目１１）
前記形態Ｉが７．６から８．０度のピークによって更に特徴づけられる、項目９に記載の形態Ｉ。
（項目１２）
前記形態Ｉが７．８度のピークによって更に特徴づけられる、項目１１に記載の形態Ｉ。
（項目１３）
前記形態Ｉが２５．８から２６．２度のピークによって更に特徴づけられる、項目１１に記載の形態Ｉ。
（項目１４）
前記形態Ｉが２６．０度のピークによって更に特徴づけられる、項目１３に記載の形態Ｉ。
（項目１５）
前記形態Ｉが２１．４から２１．８度のピークによって更に特徴づけられる、項目１３に記載の形態Ｉ。
（項目１６）
前記形態Ｉが２１．６度のピークによって更に特徴づけられる、項目１５に記載の形態Ｉ。
（項目１７）
前記形態Ｉが２３．１から２３．５度のピークによって更に特徴づけられる、項目１５に記載の形態Ｉ。
（項目１８）
前記形態Ｉが２３．３度のピークによって更に特徴づけられる、項目１７に記載の形態Ｉ。
（項目１９）
前記形態Ｉが、図１の回折パターンと実質的に類似した回折パターンによって特徴づけられる、項目１に記載の形態Ｉ。
（項目２０）
前記形態Ｉが、図２の回折パターンと実質的に類似した回折パターンによって特徴づけられる、項目１に記載の形態Ｉ。
（項目２１）
Ｄ９０の粒径分布が約８２μｍ以下である、項目１に記載の形態Ｉ。
（項目２２）
Ｄ５０の粒径分布が約３０μｍ以下である、項目１に記載の形態Ｉ。
（項目２３）
項目１に記載の形態Ｉと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
（項目２４）
ほ乳動物における嚢胞性線維症を治療する方法であって、有効量の項目１に記載の形態Ｉを該ほ乳動物に投与することを含む、方法。
（項目２５）
前記方法が、追加の治療薬を投与することを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
項目１に記載の形態Ｉ及びその使用説明書を含む、キット。
（項目２７）
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のＨＣｌ塩を適切な溶媒に有効時間懸濁又は溶解させることを含む、項目１に記載の形態Ｉを調製するプロセス。
（項目２８）
前記適切な溶媒が水又は５０％メタノール／水混合物である、項目２７に記載のプロセス。
（項目２９）
前記適切な溶媒が水である、項目２７に記載のプロセス。
（項目３０）
前記有効時間が２から２４時間である、項目２７に記載のプロセス。
（項目３１）
前記有効時間が２から６時間である、項目２７に記載のプロセス。
（項目３２）
単斜晶系、Ｐ２１／ｎ空間群、及び以下の単位格子寸法を有する、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の結晶形態：
ａ＝４．９６２６（７）Å          α＝９０°
ｂ＝１２．２９９４（１８）Å      β＝９３．９３８（９）°
ｃ＝３３．０７５（４）Å          γ＝９０°。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】形態Ｉの化合物１の単結晶構造から計算されるＸ線回折パターンを示したグラフである。
【図２】形態Ｉの化合物１の実際のＸ線粉末回折パターンを示したグラフである。
【図３】形態Ｉの化合物１の単結晶から計算されるＸ線回折パターンと、形態Ｉの化合物１の実際のＸ線粉末回折パターンとの重ね合わせを示したグラフである。
【図４】形態Ｉの化合物１の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）線を示したグラフである。
【図５】単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の配座図である。
【図６】カルボン酸基を介して形成された二量体としての、単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の配座図である。
【図７】分子が積層されたことを示す、単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の配座図である。
【図８】単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の配座図であり、異なる位置から見た図である（下方ａ）。
【図９】Ｔ（０）における５０ｍｇ／ｍＬ、０．５メチルセルロース−ポリソルベート８０懸濁液中の形態Ｉの化合物１の１Ｈ  ＮＭＲ分析結果を示したグラフである。
【図１０】室温で２４時間貯蔵された５０ｍｇ／ｍＬ、０．５メチルセルロース−ポリソルベート８０懸濁液中の形態Ｉの化合物１の１Ｈ  ＮＭＲ分析結果を示したグラフである。
【図１１】化合物１・ＨＣｌ標準の１Ｈ  ＮＭＲ分析結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書では、別段の記載がない限り、以下の定義を適用するものとする。
【００１９】
本明細書では「ＣＦＴＲ」という用語は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、又はΔＦ５０８  ＣＦＴＲ及びＧ５５１Ｄ  ＣＦＴＲを含めて、ただしそれだけに限定されない、制御因子活性能力のあるその変異体を意味する（ＣＦＴＲ変異体については、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔ．ｓｉｃｋｋｉｄｓ．ｏｎ．ｃａ／ｃｆｔｒ／を参照されたい。）。
【００２０】
本明細書では「結晶性」とは、構造単位が、固定された幾何パターン又は格子状に配置された化合物又は組成物を指し、その結果、結晶性固体は剛直な長距離秩序を有する。結晶構造を構成する構造単位は、原子、分子又はイオンとすることができる。結晶性固体は、明確な融点を示す。
【００２１】
本明細書では「調節」という用語は、例えば活性を、測定可能な量だけ増減させることを意味する。
【００２２】
一態様においては、本発明は、形態Ｉとして特徴づけられる３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の一形態を特徴とする。
【００２３】
別の一実施形態においては、形態Ｉは、ＣｕＫアルファ照射によって得られたＸ線粉末回折における１５．２から１５．６度、１６．１から１６．５度、及び１４．３から１４．７度の１個以上のピークによって特徴づけられる。
【００２４】
別の一実施形態においては、形態Ｉは、１５．４、１６．３及び１４．５度の１個以上のピークによって特徴づけられる。
【００２５】
別の一実施形態においては、形態Ｉは、１４．６から１５．０度のピークによって更に特徴づけられる。
【００２６】
別の一実施形態においては、形態Ｉは、１４．８度のピークによって更に特徴づけられる。
【００２７】
別の一実施形態においては、形態Ｉは１７．６から１８．０度のピークによって更に特徴づけられる。
【００２８】
別の一実施形態においては、形態Ｉは１７．８度のピークによって更に特徴づけられる。
【００２９】
別の一実施形態においては、形態Ｉは１６．４から１６．８度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３０】
別の一実施形態においては、形態Ｉは１６．４から１６．８度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３１】
別の一実施形態においては、形態Ｉは１６．６度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３２】
別の一実施形態においては、形態Ｉは７．６から８．０度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３３】
別の一実施形態においては、形態Ｉは７．８度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３４】
別の一実施形態においては、形態Ｉは２５．８から２６．２度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３５】
別の一実施形態においては、形態Ｉは２６．０度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３６】
別の一実施形態においては、形態Ｉは２１．４から２１．８度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３７】
別の一実施形態においては、形態Ｉは２１．６度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３８】
別の一実施形態においては、形態Ｉは２３．１から２３．５度のピークによって更に特徴づけられる。
【００３９】
別の一実施形態においては、形態Ｉは２３．３度のピークによって更に特徴づけられる。
【００４０】
一部の実施形態においては、形態Ｉは、図１の回折パターンと実質的に類似した回折パターンによって特徴づけられる。
【００４１】
一部の実施形態においては、形態Ｉは、図２の回折パターンと実質的に類似した回折パターンによって特徴づけられる。
【００４２】
一部の実施形態においては、形態ＩのＤ９０の粒径分布は約８２μｍ以下である。
【００４３】
一部の実施形態においては、形態ＩのＤ５０の粒径分布は約３０μｍ以下である。
【００４４】
一態様においては、本発明は、形態Ｉと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を特徴とする。
【００４５】
一態様においては、本発明は、有効量の形態Ｉをヒトに投与することを含む、ヒトにおけるＣＦＴＲ媒介性疾患を治療する方法を特徴とする。
【００４６】
一部の実施形態においては、方法は、追加の治療薬を投与することを含む。
【００４７】
一部の実施形態においては、疾患は、嚢胞性線維症、遺伝性気腫、遺伝性血色素症、プロテインＣ欠乏症などの凝固−線維素溶解欠乏症、１型遺伝性血管浮腫、家族性高コレステロール血症、１型カイロミクロン血症、無ベータリポタンパク質血症などの脂質プロセシング欠乏症、Ｉ細胞病／偽性Ｈｕｒｌｅｒ、ムコ多糖症などのリソソーム蓄積症、Ｓａｎｄｈｏｆ／Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ、Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ  ＩＩ型、多腺性内分泌障害／高インスリン血症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｅｍｉａ）、真性糖尿病、Ｌａｒｏｎ小人症、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、原発性副甲状腺機能低下症、黒色腫、糖鎖不全糖タンパク質症候群（ｇｌｙｃａｎｏｓｉｓ  ＣＤＧ）１型、遺伝性気腫、先天性甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノーゲン血症、ＡＣＴ欠乏症、尿崩症（ＤＩ）、神経垂体性（ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｅａｌ）ＤＩ、腎性（ｎｅｐｒｏｇｅｎｉｃ）ＤＩ、Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ  Ｔｏｏｔｈ症候群、Ｐｅｒｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ病、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻ひ（ｐｌａｓｙ）、Ｐｉｃｋ病などの神経変性疾患、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ、脊髄小脳（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｕｌｌａｒ）失調症Ｉ型、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂａｌ）淡蒼球ルイ体、筋緊張性ジストロフィーなどの幾つかのポリグルタミン神経疾患、並びに遺伝性Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ病などの海綿状脳症、Ｆａｂｒｙ病、Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、ＣＯＰＤ、ドライアイ疾患、及びＳｊｏｇｒｅｎ病から選択される。
【００４８】
一実施形態においては、本発明は、有効量の形態Ｉをヒトに投与することを含む、ヒトにおける嚢胞性線維症を治療する方法を提供する。
【００４９】
一態様においては、本発明は、形態Ｉ及びその使用説明書を含む、キットを特徴とする。
【００５０】
一態様においては、本発明は、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のＨＣｌ塩を適切な溶媒に有効時間分散又は溶解させることを含む、形態Ｉを調製するプロセスを特徴とする。
【００５１】
一実施形態においては、本発明は、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のＨＣｌ塩を適切な溶媒に有効時間分散させることを含む、形態Ｉを調製するプロセスを特徴とする。
【００５２】
一部の実施形態においては、適切な溶媒は、水又はアルコール／水混合物である。
【００５３】
一部の実施形態においては、適切な溶媒は、水又は５０％メタノール／水混合物である。
【００５４】
一部の実施形態においては、適切な溶媒は水である。
【００５５】
一部の実施形態においては、適切な溶媒は、メタノール５０％と水５０％を含む混合物である。
【００５６】
一部の実施形態においては、有効時間は約２から約１日である。一部の実施形態においては、有効時間は約２から約１８時間である。一部の実施形態においては、有効時間は約２から約１２時間である。一部の実施形態においては、有効時間は約２から約６時間である。
【００５７】
一態様においては、本発明は、単斜晶系、Ｐ２１／ｎ空間群、及び以下の単位格子寸法を有する、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の結晶形態を特徴とする：ａ＝４．９６２６（７）Å、ｂ＝１２．２９９４（１８）Å、ｃ＝３３．０７５（４）Å、α＝９０°、β＝９３．９３８（９）°及びγ＝９０°。
【００５８】
形態Ｉを調製する方法
一実施形態においては、形態Ｉは、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のＨＣＬなどの塩形態を適切な溶媒に有効時間分散又は溶解させて調製される。別の一実施形態においては、形態Ｉは、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のＨＣＬなどの塩形態を適切な溶媒に有効時間分散させて調製される。別の一実施形態においては、形態Ｉは、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾアート及びギ酸などの適切な酸から直接形成される。一実施形態においては、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のＨＣｌ塩形態が出発点であり、一実施形態においては、スキーム１〜３に従って酸塩化物部分をアミン部分とカップリングさせることによって調製することができる。
【００５９】
スキーム１.酸塩化物部分の合成
【００６０】
【化２】
2014088447.tif 000003
スキーム２.アミン部分の合成
【００６１】
【化３】
2014088447.tif 000004
スキーム３.３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソ
ル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の酸性塩の形成
【００６２】
【化４】
2014088447.tif 000005
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の、例えばＨＣｌ、塩形態を出発点として使用して、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のＨＣｌ塩形態を適切な溶媒に有効時間分散又は溶解させることによって、形態Ｉを高収率で形成することができる。例えば他の無機又は有機酸形態など、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の他の塩形態を使用することができる。他の塩形態は、対応する酸を用いたｔ−ブチルエステルの加水分解から生じる。他の酸／塩形態としては、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、安息香酸、マロン酸などが挙げられる。３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の塩形態は、使用溶媒に応じて可溶性でも非可溶性でもよいが、溶解性不足は、形態Ｉの形成を妨げない。３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のＨＣｌ塩形態は水にわずかしか溶解しないが、例えば、一実施形態においては、適切な溶媒は、水、又は５０％メタノール／水混合物などのアルコール／水混合物とすることができる。一実施形態においては、適切な溶媒は水である。
【００６３】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の塩形態から形態Ｉを形成するための有効時間は、２から２４時間以上の任意の時間とすることができる。一般に、高収率（約９８％）を得るのに２４時間を超える時間は不要であるが、ある種の溶媒は２４時間を超える時間を必要とし得る。必要な時間は、温度に逆比例することも認識されている。すなわち、温度が高いほど、酸の解離に作用して形態Ｉを形成するのに必要な時間が短くなる。溶媒が水であるときには、分散液を室温で約２４時間撹拌すると、形態Ｉが収率約９８％で得られる。３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の塩形態の溶液がプロセス目的で必要な場合には、高温を使用することができる。溶液を高温で有効時間撹拌後、冷却再結晶させると、実質的に純粋な形の形態Ｉが生成する。一実施形態においては、実質的に純粋とは、約９０％を超える純度を指す。別の一実施形態においては、実質的に純粋とは、約９５％を超える純度を指す。別の一実施形態においては、実質的に純粋とは、約９８％を超える純度を指す。別の一実施形態においては、実質的に純粋とは、約９９％を超える純度を指す。選択される温度は、使用溶媒にある程度依存し、当業者の決定能力の十分な範囲内である。一実施形態においては、温度は室温から約８０℃である。別の一実施形態においては、温度は室温から約４０℃である。別の一実施形態においては、温度は約４０℃から約６０℃である。別の一実施形態においては、温度は約６０℃から約８０℃である。
【００６４】
一部の実施形態においては、形態Ｉは、有機溶媒からの再結晶によって更に精製することができる。有機溶媒の例としては、トルエン、クメン、アニソール、１−ブタノール、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン又は（種々の比の）１−プロパノール／水が挙げられるが、それだけに限定されない。温度は、上述したように使用することができる。例えば、一実施形態においては、形態Ｉを完全に溶解するまで７５℃で１−ブタノールに溶解させる。溶液を速度０．２℃／分で１０℃に冷却すると、形態Ｉの結晶が生成する。この結晶は、ろ過によって単離することができる。
【００６５】
使用、処方及び投与
薬学的に許容される組成物
本発明の別の一態様においては、薬学的に許容される組成物が提供され、この組成物は、本明細書に記載の形態Ｉを含み、場合によっては、薬学的に許容される担体、補助剤又はビヒクルを含む。ある実施形態においては、この組成物は、場合によっては、１種類以上の追加の治療薬を更に含む。
【００６６】
上述したように、本発明の薬学的に許容される組成物は、さらに、薬学的に許容される担体、補助剤又はビヒクルを含む。薬学的に許容される担体、補助剤又はビヒクルとしては、本明細書では、所望の特定の剤形に適した、あらゆるすべての溶媒、希釈剤又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤などが挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）は、薬学的に許容される組成物の処方に使用される種々の担体、及びその調製のための公知技術を開示している。任意の従来の担体媒体が、例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じることによって、又は薬学的に許容される組成物の任意の他の成分（単数又は複数）と有害な様式で相互作用することによって、本発明の化合物に適合しない場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが企図される。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の幾つかの例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩又は電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、羊毛脂、ラクトース、グルコース、スクロースなどの糖；コーンスターチ、ジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂、坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油などの油；サフラワー油；ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油及びダイズ油；グリコール；かかるプロピレングリコール又はポリエチレングリコール；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、及びリン酸緩衝液が挙げられるが、それだけに限定されない。さらに、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒の適合した潤滑剤、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤も、処方者の判断に従って組成物中に存在することができる。
【００６７】
化合物及び薬学的に許容される組成物の使用
更に別の一態様においては、本発明は、ＣＦＴＲによって関係づけられる症状、疾患又は障害を治療する方法を提供する。ある実施形態においては、本発明は、ＣＦＴＲ活性の欠乏によって関係づけられる症状、疾患又は障害を治療する方法であって、本明細書に記載の形態Ｉの固体状形態を含む組成物をそれを必要とする対象、好ましくはほ乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
【００６８】
本明細書では「ＣＦＴＲ媒介性疾患」は、嚢胞性線維症、遺伝性気腫、遺伝性血色素症、プロテインＣ欠乏症などの凝固−線維素溶解欠乏症、１型遺伝性血管浮腫、家族性高コレステロール血症、１型カイロミクロン血症、無ベータリポタンパク質血症などの脂質プロセシング欠乏症、Ｉ細胞病／偽性ハーラー、ムコ多糖症などのリソソーム蓄積症、Ｓａｎｄｈｏｆ／Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ、Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ  ＩＩ型、多腺性内分泌障害／高インスリン血症、真性糖尿病、Ｌａｒｏｎ小人症、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、原発性副甲状腺機能低下症、黒色腫、糖鎖不全糖タンパク質症候群１型、遺伝性気腫、先天性甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノーゲン血症、ＡＣＴ欠乏症、尿崩症（ＤＩ）、神経垂体性ＤＩ、腎性ＤＩ、Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ  Ｔｏｏｔｈ症候群、Ｐｅｒｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ病、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻ひ、Ｐｉｃｋ病などの神経変性疾患、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ、脊髄小脳失調症Ｉ型、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体、筋緊張性ジストロフィーなどの幾つかのポリグルタミン神経疾患、並びに遺伝性Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ病などの海綿状脳症、Ｆａｂｒｙ病、Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、ＣＯＰＤ、ドライアイ疾患、及びＳｊｏｇｒｅｎ病から選択される疾患である。
【００６９】
ある実施形態においては、本発明は、本明細書に記載の形態Ｉを含む有効量の組成物をヒトに投与するステップを含む、ヒトにおけるＣＦＴＲ媒介性疾患を治療する方法を提供する。
【００７０】
別の好ましい一実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の形態Ｉを含む組成物をヒトに投与するステップを含む、ヒトにおける嚢胞性線維症を治療する方法を提供する。
【００７１】
本発明によれば、形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物の「有効量」は、上記疾患のいずれかを治療又はその重症度を軽減するのに有効な量である。
【００７２】
形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物は、上記疾患の１つ以上を治療又はその重症度を軽減するのに有効な任意の投与量及び任意の投与経路で投与することができる。
【００７３】
ある実施形態においては、本明細書に記載の形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物は、呼吸器及び非呼吸器上皮の頂端膜において残留ＣＦＴＲ活性を示す患者における嚢胞性線維症の治療又は重症度の低減に有用である。上皮表面における残留ＣＦＴＲ活性の存在は、当分野で公知の方法、例えば標準的な電気生理学的、生化学的又は組織化学的技術を使用して、容易に検出することができる。かかる方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ
ｖｉｖｏ電気生理学的技術、汗若しくは唾液のＣｌ−濃度の測定、又は細胞表面密度をモニターするｅｘ  ｖｉｖｏ生化学的若しくは組織化学的技術を使用してＣＦＴＲ活性を確認する。かかる方法を使用して、最も一般的な変異であるΔＦ５０８に対して同型接合的又は異型接合的な患者を含めて、種々の異なる変異に対して異型接合的又は同型接合的な患者において残留ＣＦＴＲ活性を容易に検出することができる。
【００７４】
一実施形態においては、本明細書に記載の形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物は、残留ＣＦＴＲ活性、例えば、クラスＩＩＩ変異（調節又は開閉障害）、クラスＩＶ変異（コンダクタンス変化）又はクラスＶ変異（合成低下）を示すある遺伝子型内の患者において、嚢胞性線維症の治療又は重症度の低減に有用である（Ｌｅｅ  Ｒ．Ｃｈｏｏ−Ｋａｎｇ，Ｐａｍｅｌａ  Ｌ．，Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｔｙｐｅ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，ａｎｄ  Ｖ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｔａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ
ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：５２１−５２９，２０００）。残留ＣＦＴＲ活性を示す別の患者遺伝子型としては、これらのクラスの一つに対して同型接合的である患者、又はクラスＩ変異、クラスＩＩ変異若しくは分類されない変異を含めて、任意の他のクラスの変異と異型接合的である患者が挙げられる。
【００７５】
一実施形態においては、本明細書に記載の形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物は、ある臨床像、例えば、上皮の頂端膜における残留ＣＦＴＲ活性量と典型的に相関する中程度から軽度の臨床像内の患者において、嚢胞性線維症の治療又は重症度の低減に有用である。かかる臨床像としては、すい不全を示す患者、又は特発性すい炎及び先天性両側精管欠損症若しくは軽度の肺疾患と診断された患者が挙げられる。
【００７６】
正確な必要量は、対象の種、年齢及び全身状態、感染の重症度、個々の薬剤、その投与方法などに応じて、対象ごとに異なる。本発明の化合物は、好ましくは、投与の容易さ及び投与量の均一性のために、単位用量剤形で処方される。本明細書では「単位用量剤形」という表現は、治療すべき患者に適切な薬剤の物理的に分離した単位を指す。しかし、本発明の化合物及び組成物の１日の全使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることを理解されたい。任意の特定の患者又は生物体に対する具体的有効量レベルは、治療する障害及び障害の重症度；使用する具体的化合物の活性；使用する具体的組成物；患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別及び食事；使用する具体的化合物の投与時間、投与経路及び排出速度；治療期間；使用する具体的化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物を含めた種々の因子、並びに医学分野で周知の同様の因子に応じて決まる。本明細書では「患者」という用語は、動物、好ましくはほ乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【００７７】
本発明の薬学的に許容される組成物は、治療する感染症の重症度に応じて、ヒト及び他の動物に経口的に、直腸に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、（散剤、軟膏剤又は滴剤によって）局所に、頬に、経口又は経鼻噴霧剤としてなど、投与することができる。ある実施形態においては、本発明の化合物は、経口的又は非経口的に、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ対象体重／日、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇ対象体重／日の投与量レベルで、１日１回以上投与して、所望の治療効果を得ることができる。
【００７８】
ある実施形態においては、単位用量剤形の形態Ｉの投与量は１００ｍｇから１，０００ｍｇである。別の一実施形態においては、形態Ｉの投与量は２００ｍｇから９００ｍｇである。別の一実施形態においては、形態Ｉの投与量は３００ｍｇから８００ｍｇである。別の一実施形態においては、形態Ｉの投与量は４００ｍｇから７００ｍｇである。別の一実施形態においては、形態Ｉの投与量は５００ｍｇから６００ｍｇである。
【００７９】
注射用調製物、例えば、無菌注射用水性又は油性懸濁液剤は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の技術に従って処方することができる。無菌注射製剤は、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての、無菌注射液剤、懸濁液剤又は乳濁液剤とすることもできる。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒としては、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌不揮発性油が溶媒又は懸濁媒体として従来使用されている。この目的で、合成モノ又はジグリセリドを含めて、任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に使用される。
【００８０】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通してろ過することによって、又は使用前に滅菌水若しくは他の無菌注射用媒体に溶解若しくは分散させることができる無菌固体組成物の形の殺菌剤を混合することによって、滅菌することができる。
【００８１】
直腸又は膣投与用組成物は、好ましくは、カカオ脂、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスなどの適切な非刺激性の賦形剤又は担体を本発明の化合物と混合することによって調製することができる坐剤である。この賦形剤又は担体は、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸又は膣腔内で溶融して活性化合物を放出する。
【００８２】
経口投与用固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤などが挙げられる。かかる固体剤形においては、活性化合物は、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウムなどの少なくとも１種類の不活性な薬学的に許容される賦形剤若しくは担体、及び／又はａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸などの充填剤若しくは増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、アラビアゴムなどの結合剤、ｃ）グリセリンなどの湿潤剤、ｄ）アガー−−アガー、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリカート、炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリンなどの湿潤剤、ｈ）カオリン、ベントナイト粘土などの吸収剤、並びにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、その混合物などの潤滑剤と混合される。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、剤形は緩衝剤を含むこともできる。
【００８３】
類似のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖、高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いた軟及び硬ゼラチンカプセル剤中の充填剤として使用することもできる。錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、薬剤処方分野において周知である他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。これらの剤形は、場合によっては不透明化剤を含んでもよく、腸管のある一部において活性成分（単数又は複数）のみを、又は活性成分を優先的に、場合によっては遅延方式で、放出する組成とすることもできる。使用可能な埋め込み組成物の例としては、重合体物質及びワックスが挙げられる。類似のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖、高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いた軟及び硬ゼラチンカプセル剤中の充填剤として使用することもできる。
【００８４】
活性化合物は、１種類以上の上記賦形剤と一緒にマイクロカプセル形態にすることもできる。錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティング、薬剤処方分野において周知である他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。かかる固体剤形においては、活性化合物をスクロース、ラクトース、デンプンなどの少なくとも１種類の不活性希釈剤と混合することができる。かかる剤形は、通常実施されるように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、錠剤化潤滑剤及び他の錠剤化助剤、かかるステアリン酸マグネシウム及び微結晶セルロースを含むこともできる。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、剤形は緩衝剤を含むこともできる。これらの剤形は、場合によっては不透明化剤を含んでもよく、腸管のある一部において活性成分（単数又は複数）のみを、又は活性成分を優先的に、場合によっては遅延方式で、放出する組成とすることもできる。使用可能な埋め込み組成物の例としては、重合体物質及びワックスが挙げられる。
【００８５】
本明細書に記載の形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物は、併用療法に使用することができ、すなわち、形態Ｉは、１種類以上の別の所望の治療法又は医療処置と同時に、その前に、又はその後に投与できることも理解されるであろう。併用投薬計画において使用する療法（治療法又は手順）の特定の組合せは、所望の治療法及び／又は手順の適合性、並びに達成すべき所望の治療効果を考慮したものとなる。採用される療法は、同じ障害に対して所望の効果を得ることができ（例えば、本発明の化合物は、同じ障害の治療に使用される別の薬剤と同時に投与することができる。）、又は該療法は、異なる効果（例えば、任意の有害作用の抑制）を得ることができることも理解されるであろう。本明細書では、特定の疾患又は症状を治療又は防止するのに通常投与される追加の治療薬は、「治療する疾患又は症状に適切である」として知られる。
【００８６】
一実施形態においては、追加の薬剤は、粘液溶解薬、気管支拡張剤（ｂｒｏｎｃｈｏｄｉａｌａｔｏｒ）、抗生物質、抗感染薬、抗炎症剤、本発明の化合物以外のＣＦＴＲ調節物質、又は栄養剤から選択される。
【００８７】
別の一実施形態においては、追加の薬剤は、ゲンタマイシン、クルクミン、シクロホスファミド、４−フェニルブチラート、ミグラスタット、フェロジピン、ニモジピン、Ｐｈｉｌｏｘｉｎ  Ｂ、ゲニエステイン（ｇｅｎｉｅｓｔｅｉｎ）、アピゲニン、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ調節物質、例えば、ロリプラム、シルデナフィル、ミルリノン、タダラフィル、アムリノン、イソプロテレノール、アルブテロール及びアルメテロール（ａｌｍｅｔｅｒｏｌ）、デオキシスパガリン、ＨＳＰ９０阻害剤、ＨＳＰ７０阻害剤、エポキソミシン、ラクタシスチンなどのプロテオソーム阻害剤から選択される化合物である。
【００８８】
別の一実施形態においては、追加の薬剤は、国際公開第２００４０２８４８０号、同２００４１１０３５２号、同２００５０９４３７４号、同２００５１２０４９７号又は同２００６１０１７４０号に開示された化合物である。
【００８９】
別の一実施形態においては、追加の薬剤は、ＣＦＴＲ調節活性を示すベンゾ（ｃ）キノリジニウム誘導体又はＣＦＴＲ調節活性を示すベンゾピラン誘導体である。
【００９０】
別の一実施形態においては、追加の薬剤は、米国特許第７２０２２６２号、同６９９２０９６号、米国特許出願公開第２００６０１４８８６４号、同２００６０１４８８６３号、同２００６００３５９４３号、同２００５０１６４９７３号、国際公開第２００６１１０４８３号、同２００６０４４４５６号、同２００６０４４６８２号、同２００６０４４５０５号、同２００６０４４５０３号、同２００６０４４５０２号又は同２００４０９１５０２号に開示された化合物である。
【００９１】
別の一実施形態においては、追加の薬剤は、国際公開第２００４０８０９７２号、同２００４１１１０１４号、同２００５０３５５１４号、同２００５０４９０１８号、同２００６００２４２１号、同２００６０９９２５６号、同２００６１２７５８８号又は同２００７０４４５６０号に開示された化合物である。
【００９２】
別の一実施形態においては、参照によりその全体を援用する、２００５年６月２４日に出願され、米国特許出願公開第２００６／００７４０７５号として公開された、米国特許出願第１１／１６５，８１８号に開示された化合物から選択される追加の薬剤。別の一実施形態においては、追加の薬剤は、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２，４−ジｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−カルボキサミドである。これらの組合せは、嚢胞性線維症を含めて、本明細書に記載の疾患の治療に有用である。これらの組合せは、本明細書に記載のキットにおいても有用である。
【００９３】
本発明の組成物中に存在する追加の治療薬の量は、該治療薬を唯一の活性薬剤として含む組成物中で通常投与される量以下である。好ましくは、ここに開示する組成物中の追加の治療薬の量は、該治療薬を唯一の治療有効薬剤として含む組成物中に通常存在する量の約５０％から１００％の範囲である。
【００９４】
本明細書に記載の形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物は、プロテーゼ、人工弁、移植血管、ステント、カテーテルなどの移植可能な医療用具をコーティングするための組成物に組み込むこともできる。したがって、本発明は、別の一態様においては、本明細書のクラス及びサブクラスにおいて、本明細書に記載の形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物と、移植可能な装置のコーティングに適切な担体とを含む、移植可能な装置をコーティングするための組成物を含む。更に別の一態様においては、本発明は、本明細書に記載の形態Ｉ又は薬学的に許容されるその組成物と移植可能な装置のコーティングに適切な担体とを含む組成物で被覆された、移植可能な装置を含む。適切なコーティング、及び被覆された移植可能な装置の一般的な調製は、米国特許第６，０９９，５６２号、同５，８８６，０２６号及び同５，３０４，１２１号に記載されている。コーティングは、典型的には、ヒドロゲルポリマー、ポリメチルジシロキサン、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、エチレン酢酸ビニル、その混合物などの生体適合性高分子材料である。コーティングは、場合によっては、フルオロシリコーン、多糖、ポリエチレングリコール、リン脂質又はその組合せの適切なトップコートで更に被覆して、組成物における制御放出特性を与えることができる。
【００９５】
本明細書に記載した発明をより十分に理解できるようにするために、以下の実施例を示す。これらの実施例は単に説明のためのものにすぎず、本発明を限定するものと決して解釈すべきではないことを理解すべきである。
【実施例】
【００９６】
方法及び材料
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
形態Ｉの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）データをＤＳＣ  Ｑ１００  Ｖ９．６  Ｂｕｉｌｄ  ２９０（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ）を用いて収集した。温度をインジウムを用いて較正し、熱容量をサファイアを用いて較正した。試料３〜６ｍｇをアルミニウムパンに計量し、１個のピンホールを有する蓋を圧着した。試料を２５℃から３５０℃まで加熱速度１．０℃／分、窒素ガスパージ５０ｍｌ／分で走査した。データをＴｈｅｒｍａｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｑ  ＳｅｒｉｅｓＴＭ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．０．２４８ソフトウェアによって収集し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１Ｄ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ）によって分析した。報告した数は、単一の分析結果である。
【００９７】
ＸＲＰＤ（Ｘ線粉末回折）
ＨＩ−ＳＴＡＲ２次元検出器及びフラットグラファイトモノクロメーターを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８  ＤＩＳＣＯＶＥＲ粉末回折計によって、形態１のＸ線回折（ＸＲＤ）データを収集した。Ｋα照射のＣｕ封管を４０ｋＶ、３５ｍＡで使用した。試料を２５℃のゼロバックグラウンドシリコンウェーハ上に置いた。各試料について、２個のデータフレームを各々２つの異なるθ２角度８°及び２６°で１２０秒目に収集した。データをＧＡＤＤＳソフトウェアによって積分し、ＤＩＦＦＲＡＣＴｐｌｕｓＥＶＡソフトウェアによってマージした。報告したピーク位置の不確実性は±０．２度である。
【００９８】
Ｖｉｔｒｉｄｅ（登録商標）（ナトリウムビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウム水素化物［又はＮａＡｌＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）２］、６５ｗｇｔ％トルエン溶液）をＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。
【００９９】
２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸をＳａｌｔｉｇｏ（ｔｈｅ  Ｌａｎｘｅｓｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの系列会社）から購入した。
【０１００】
本願のどこでも化合物の名称が化合物の構造を正確に記述することができない場合、構造が名称に取って代わり、基準となる。
【０１０１】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌの合成
酸塩化物部分
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−メタノールの合成
【０１０２】
【化５】
2014088447.tif 000006
市販２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸（１．０当量）をトルエン（１０体積）中でスラリーにする。Ｖｉｔｒｉｄｅ（登録商標）（２当量）を、温度を１５〜２５℃に維持する速度で添加漏斗を介して添加する。添加の最後に、温度を４０℃に２時間上昇させ、次いで１０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液（４．０当量）を添加漏斗を介して慎重に添加し、温度を４０〜５０℃に維持する。更に３０分間撹拌後、４０℃で層分離させる。有機相を２０℃に冷却し、次いで水（２×１．５体積）で洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、濃縮して、粗製（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−メタノールを得る。それを次のステップに直接使用する。
【０１０３】
５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソールの合成
【０１０４】
【化６】
2014088447.tif 000007
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−メタノール（１．０当量）をＭＴＢＥ（５体積）に溶解させる。触媒作用量のＤＭＡＰ（１ｍｏｌ％）を添加し、ＳＯＣｌ２（１．２当量）を添加漏斗を介して添加する。反応器内の温度を１５〜２５℃に維持する速度でＳＯＣｌ２を添加する。温度を３０℃に１時間上昇させ、次いで２０℃に冷却し、次いで水（４体積）を添加漏斗を介して添加し、温度を３０℃未満に維持する。更に３０分間撹拌後、層分離させる。有機層を撹拌し、１０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ水溶液（４．４体積）を添加する。１５から２０分間撹拌後、層分離させる。次いで、有機相を脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、濃縮して、粗製５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソールを得る。それを次のステップに直接使用する。
【０１０５】
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−アセトニトリルの合成
【０１０６】
【化７】
2014088447.tif 000008
５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール（１当量）のＤＭＳＯ（１．２５体積）溶液を、ＤＭＳＯ（３体積）中のＮａＣＮ（１．４当量）のスラリーに添加し、温度を３０〜４０℃に維持する。混合物を１時間撹拌し、次いで水（６体積）、続いてＭＴＢＥ（４体積）を添加する。３０分間撹拌後、層分離させる。水層をＭＴＢＥ（１．８体積）で抽出する。混合有機層を水（１．８体積）で洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、濃縮して、粗製（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−アセトニトリル（９５％）を得る。それを次のステップに直接使用する。
【０１０７】
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルの合成
【０１０８】
【化８】
2014088447.tif 000009
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−アセトニトリル（１．０当量）、５０ｗｔ％ＫＯＨ水溶液（５．０当量）１−ブロモ−２−クロロエタン（１．５当量）及びＯｃｔ４ＮＢｒ（０．０２当量）の混合物を７０℃で１時間加熱する反応混合物を冷却し、次いでＭＴＢＥ及び水で処理する。有機相を水及び塩水で洗浄し、次いで溶媒を除去して、（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルを得る。
【０１０９】
１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸の合成
【０１１０】
【化９】
2014088447.tif 000010
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルを６Ｍ  ＮａＯＨ（８当量）を用いてエタノール（５体積）中で８０℃で終夜加水分解する。混合物を室温に冷却し、エタノールを減圧蒸発させる。残留物を水及びＭＴＢＥにとり、１Ｍ  ＨＣｌを添加し、層分離させる。次いで、ＭＴＢＥ層をジシクロヘキシルアミン（０．９７当量）で処理した。スラリーを０℃に冷却し、ろ過し、ヘプタンで洗浄して、対応するＤＣＨＡ塩を得る。塩をＭＴＢＥ及び１０％クエン酸にとり、すべての固体が溶解するまで撹拌する。層分離させ、ＭＴＢＥ層を水及び塩水で洗浄する。溶媒をヘプタンに交換し、続いてろ過し、真空乾燥機中で５０℃で終夜乾燥後、１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸を得る。
【０１１１】
１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの合成
【０１１２】
【化１０】
2014088447.tif 000011
１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸（１．２当量）をトルエン（２．５体積）中でスラリーにし、混合物を６０℃に加熱する。ＳＯＣｌ２（１．４当量）を添加漏斗を介して添加する。トルエン及びＳＯＣｌ２を３０分後に反応混合物から蒸留する。追加のトルエン（２．５体積）を添加し、再度蒸留する。
【０１１３】
アミン部分
ｔｅｒｔ−ブチル−３−（３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾアートの合成
【０１１４】
【化１１】
2014088447.tif 000012
２−ブロモ−３−メチルピリジン（１．０当量）をトルエン（１２体積）に溶解させる。Ｋ２ＣＯ３（４．８当量）、続いて水（３．５体積）を添加し、混合物をＮ２気流下で６５℃に１時間加熱する。次いで、３−（ｔ−ブトキシカルボニル）フェニルボロン酸（１．０５当量）及びＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２・ＣＨ２Ｃｌ２（０．０１５当量）を添加し、混合物を８０℃に加熱する。２時間後、熱を切り、水を添加し（３．５体積）、層分離させる。次いで、有機相を水（３．５体積）で洗浄し、１０％メタンスルホン酸水溶液（ＭｓＯＨ  ２当量、７．７体積）で抽出する。水相を、５０％ＮａＯＨ水溶液（２当量）を用いて塩基性にし、ＥｔＯＡｃ（８体積）で抽出する。有機層を濃縮して、粗製ｔｅｒｔ−ブチル−３−（３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾアート（８２％）を得る。それを次のステップに直接使用する。
【０１１５】
２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキシドの合成
【０１１６】
【化１２】
2014088447.tif 000013
ｔｅｒｔ−ブチル−３−（３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾアート（１．０当量）をＥｔＯＡｃ（６体積）に溶解させる。水（０．３体積）、続いて尿素−過酸化水素（３当量）を添加する。無水フタル酸（３当量）を固体として分割添加して、反応器内の温度を４５℃未満に維持する。無水フタル酸の添加終了後、混合物を４５℃に加熱する。更に４時間撹拌後、熱を切る。１０％ｗ／ｗＮａ２ＳＯ３水溶液（１．５当量）を添加漏斗を介して添加する。Ｎａ２ＳＯ３の添加終了後、混合物を更に３０分間撹拌し、層分離させる。有機層を撹拌し、１０％ｗ／ｗ  Ｎａ２ＣＯ３水溶液（２当量）を添加する。３０分間撹拌後、層分離させる。有機相を１３％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ水溶液で洗浄する。次いで、有機相をろ過し、濃縮して、粗製２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキシド（９５％）を得る。それを次のステップに直接使用する。
【０１１７】
ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾアートの合成
【０１１８】
【化１３】
2014088447.tif 000014
２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキシド（１当量）とピリジン（４当量）のＭｅＣＮ（８体積）溶液を７０℃に加熱する。メタンスルホン酸無水物（１．５当量）のＭｅＣＮ（２体積）溶液を添加漏斗を介して５０分間添加し、温度を７５℃未満に維持する。全量添加後、混合物を更に０．５時間撹拌する。次いで、混合物を周囲温度に冷却する。エタノールアミン（１０当量）を添加漏斗を介して添加する。２時間撹拌後、水（６体積）を添加し、混合物を１０℃に冷却する。３時間以上撹拌後、固体をろ過によって収集し、水（３体積）、２：１  ＭｅＣＮ／水（３体積）及びＭｅＣＮ（２×１．５体積）で洗浄する。固体を真空乾燥機中で５０℃でわずかなＮ２気流で一定重量（差＜１％）に乾燥させて、ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾアートを赤黄色固体として得る（収率５３％）。
【０１１９】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾアートの合成
【０１２０】
【化１４】
2014088447.tif 000015
粗製酸塩化物をトルエン（酸塩化物に基づいて２．５体積）に溶解させ、ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾアート（１当量）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．０２当量）及びトリエチルアミン（３．０当量）の混合物のトルエン（ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾアートに基づいて４体積）溶液に添加漏斗を介して添加する。２時間後、水（ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾアートに基づいて４体積）を反応混合物に添加する。３０分間撹拌後、層分離させる。次いで、有機相をろ過し、濃縮して、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾアートの濃厚な油を得る（定量的粗収率）。ＭｅＣＮ（粗生成物に基づいて３体積）を添加し、結晶化が起こるまで蒸留する。水（粗生成物に基づいて２体積）を添加し、混合物を２時間撹拌する。固体をろ過によって収集し、１：１（体積）ＭｅＣＮ／水（粗生成物に基づいて２×１体積）で洗浄し、フィルター上で減圧下である程度乾燥させる。固体を真空乾燥機中で６０℃でわずかなＮ２気流で一定重量（差＜１％）に乾燥させて、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾアートを褐色固体として得る。
【０１２１】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣＬ塩の合成
【０１２２】
【化１５】
2014088447.tif 000016
ＭｅＣＮ（３．０体積）中の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾアート（１．０当量）のスラリーに水（０．８３体積）、続いて濃ＨＣｌ水溶液（０．８３体積）を添加する。混合物を４５±５℃に加熱する。２４から４８時間撹拌後、反応が終了し、混合物を周囲温度に冷却する。水（１．３３体積）を添加し、混合物を撹拌する。固体をろ過によって収集し、水（２×０．３体積）で洗浄し、フィルター上で減圧下である程度乾燥させる。固体を真空乾燥機中で６０℃でわずかなＮ２気流で一定重量（差＜１％）に乾燥させて、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌをオフホワイト固体として得る。
【０１２３】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（形態Ｉ）の合成
【０１２４】
【化１６】
2014088447.tif 000017
水（１０体積）中の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌ（１当量）のスラリーを周囲温度で撹拌する。２４時間撹拌後、試料を採取する。試料をろ過し、固体を水（２×）で洗浄する。固体試料をＤＳＣ分析にかける。ＤＳＣ分析によって形態Ｉへの完全な転化が示された後、固体をろ過によって収集し、水（２×１．０体積）で洗浄し、フィルター上で減圧下である程度乾燥させる。固体を真空乾燥機中で６０℃でわずかなＮ２気流で一定重量（差＜１％）に乾燥させて、形態Ｉをオフホワイト固体として得る（収率９８％）。1HNMR(400 MHz, DMSO-d6)  9.14 (s, 1H), 7.99-7.93 (m, 3H),7.80-7.78 (m, 1H),7.74-7.72(m, 1H), 7.60-7.55 (m, 2H), 7.41-7.33 (m, 2H),2.24 (s, 3H), 1.53-1.51(m, 2H),1.19-1.17 (m, 2H).
水及び塩基を使用した３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（形態Ｉ）の合成
【０１２５】
【化１７】
2014088447.tif 000018
周囲温度で撹拌された水（１０体積）中の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌ（１当量）のスラリーに５０％ｗ／ｗＮａＯＨ水溶液（２．５当量）を添加する。混合物を１５分以上又は均一な溶液まで撹拌する。濃ＨＣｌ（４当量）を添加して、形態Ｉを結晶化させる。混合物を必要に応じて６０℃又は９０℃に加熱して、ｔ−ブチルベンゾアートエステルのレベルを低下させる。ＨＰＬＣ分析によって０．８％（ＡＵＣ）以下のｔ−ブチルベンゾアートエステルが示されるまで、混合物を加熱する。次いで、混合物を周囲温度に冷却し、固体をろ過によって収集し、水（３×３．４体積）で洗浄し、フィルター上で減圧下である程度乾燥させる。固体を真空乾燥機中で６０℃でわずかなＮ２気流で一定重量（差＜１％）に乾燥させて、形態Ｉをオフホワイト固体として得る（収率９７％）。
【０１２６】
ベンゾアートからの直接的な３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（形態Ｉ）の合成
【０１２７】
【化１８】
2014088447.tif 000019
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾアート（１．０当量）のギ酸（３．０体積）溶液を７０±１０℃に加熱する。反応が終了するまで（１．０％ＡＵＣ以下の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾアート）、又は８時間以下加熱して、反応を続ける。混合物を周囲温度に冷却する。５０℃で加熱された水（６体積）に溶液を添加し、混合物を撹拌する。次いで、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾアートのレベルが０．８％（ＡＵＣ）以下になるまで、混合物を７０±１０℃に加熱する。固体をろ過によって収集し、水（２×３体積）で洗浄し、フィルター上で減圧下である程度乾燥させる。固体を真空乾燥機中で６０℃でわずかなＮ２気流で一定重量（差＜１％）に乾燥させて、形態Ｉの化合物１をオフホワイト固体として得る。
【０１２８】
形態Ｉの化合物１の単結晶構造から計算されるＸ線回折パターンを図１に示す。表１に、図１の計算されたピークを示す。
【０１２９】
【表１】
2014088447.tif 000020
形態Ｉの化合物１の実際のＸ線粉末回折パターンを図２に示す。表２に、図２の実際のピークを示す。
【０１３０】
【表２】
2014088447.tif 000021
形態Ｉの化合物１の単結晶構造から計算されるＸ線回折パターンと、形態Ｉの化合物１の実際のＸ線粉末回折パターンとの重ね合わせを図３に示す。重ね合わせは、計算と実際のピーク位置の良好な一致を示し、差はわずか約０．１５度にすぎない。
【０１３１】
形態Ｉの化合物１のＤＳＣ線を図４に示す。形態Ｉの化合物１の融解は、約２０４℃で起こる。
【０１３２】
単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の配座図を図５〜８に示す。図６〜８は、二量体のカルボン酸基間の水素結合、及びその結果結晶中で起こる積み重ねを示す。分子の密な充填が結晶構造から明らかである。形態Ｉの化合物１は単斜晶、Ｐ２１／ｎであり、以下の単位格子寸法を有する：ａ＝４．９６２６（７）Å、ｂ＝１２．２９９（２）Å、ｃ＝３３．０７５（４）Å、β＝９３．９３８（９）°、Ｖ＝２０１４．０Å３、Ｚ＝４。構造データから計算される形態Ｉの化合物１の密度は、１００Ｋで１．４９２ｇ／ｃｍ３である。
【０１３３】
化合物１の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図９〜１１に示す（図９及び１０は、５０ｍｇ／ｍＬ、０．５メチルセルロース−ポリソルベート８０懸濁液中の形態Ｉの化合物１を示し、図１１はＨＣｌ塩としての化合物１を示す。）。
【０１３４】
下表３に化合物１の追加の分析データを列挙する。
【０１３５】
【表３】
2014088447.tif 000022
アッセイ
化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ修正特性を検出及び測定するアッセイ
化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節特性を評価する膜電位光学方法
光膜電位アッセイは、Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＴｓｉｅｎによって記述された電位感受性ＦＲＥＴセンサー（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ（１９９５）”Ｖｏｌｔａｇｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ”Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ６９（４）：１２７２−８０、及びＧｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ（１９９７）”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈａｔ  ｕｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ”Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４（４）：２６９−７７参照）を、Ｖｏｌｔａｇｅ／Ｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＶＩＰＲ）などの蛍光変化測定器と組み合わせて利用した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．，Ｋ．Ｏａｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）”Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ
ａｎｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｏｎ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｔａｒｇｅｔｓ”Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ４（９）：４３１−４３９参照）。
【０１３６】
これらの電位感受性アッセイは、膜可溶性電位感受性色素ＤｉＳＢＡＣ２（３）と蛍光性リン脂質ＣＣ２−ＤＭＰＥとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の変化に基づく。ＣＣ２−ＤＭＰＥは、原形質膜の外側リーフレットに結合し、ＦＲＥＴ供与体として作用する。膜電位（Ｖｍ）の変化は、負に帯電したＤｉＳＢＡＣ２（３）を原形質膜全域に再分布させ、ＣＣ２−ＤＭＰＥからのエネルギー移動量がそれに応じて変化する。蛍光発光の変化をＶＩＰＲＴＭ  ＩＩによってモニターした。ＶＩＰＲＴＭ  ＩＩは、９６又は３８４ウェルマイクロタイタープレート中で細胞を用いたスクリーニングを実施するように設計された一体型の液体処理装置と蛍光検出器である。
【０１３７】
１．修正化合物の特定
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲに関連する輸送欠陥を修正する小分子を特定するために、単回添加ＨＴＳアッセイ形式を開発した。試験化合物の存在下又は非存在下（負の対照）で、細胞を無血清培地中で３７℃で１６時間インキュベートした。正の対照として、３８４ウェルプレートに蒔いた細胞を２７℃で１６時間インキュベートして、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを「温度修正」した。続いて、細胞をＫｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒｓ液で３回リンスし、電位感受性色素を添加した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化するために、１０μＭフォルスコリン及びＣＦＴＲ増強物質ゲニステイン（２０μＭ）をＣｌ−非含有培地と一緒に各ウェルに添加した。Ｃｌ−非含有培地の添加は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの活性化に応答してＣｌ−流出を促進した。生じた膜脱分極を、ＦＲＥＴに基づく電圧センサー色素を使用して光学的にモニターした。
【０１３８】
２．増強物質化合物の特定
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの増強物質を特定するために、２回添加ＨＴＳアッセイ形式を開発した。最初の添加中に、試験化合物を含む又は含まないＣｌ−非含有培地を各ウェルに添加した。２２秒後、２〜１０μＭフォルスコリンを含むＣｌ−非含有培地の第２の添加分を添加して、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化した。両方の添加後の細胞外Ｃｌ−濃度は２８ｍＭであり、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性化に応答してＣｌ−流出を促進した。生じた膜脱分極を、ＦＲＥＴに基づく電圧センサー色素を使用して光学的にモニターした。
【０１３９】
３．溶液
浴溶液＃１：（ｍＭ）ＮａＣｌ  １６０、ＫＣｌ  ４．５、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  １０、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４
塩化物イオン非含有浴溶液：浴溶液＃１中の塩化物塩をグルコン酸塩で置換する。
【０１４０】
ＣＣ２−ＤＭＰＥ：ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液として調製し、−２０℃で保管。
【０１４１】
ＤｉＳＢＡＣ２（３）：ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液として調製し、−２０℃で保管。
【０１４２】
４．細胞培養
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を膜電位の光学的測定に使用する。１７５ｃｍ２培養フラスコ中の２ｍＭグルタミン、１０％ウシ胎仔血清、１×ＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補充したダルベッコ変法イーグル培地中で３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９０％で細胞を維持する。すべての光学的アッセイについて、３８４ウェルｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート中に細胞を３０，０００個／ウェルで蒔き、３７℃で２時間培養後、増強物質アッセイのために２７℃で２４時間培養した。修正アッセイのために、細胞を２７℃又は３７℃で化合物と一緒に、さらに、化合物なしで、１６〜２４時間培養する。
【０１４３】
化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節特性を評価する電気生理学的アッセイ
１．チャンバーアッセイの使用
チャンバー実験の使用を、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを発現する分極された上皮細胞について実施して、光学的アッセイにおいて特定されたΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節物質を更に特徴づけた。Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｎａｐｗｅｌｌ細胞培養挿入物上で成長させたＦＲＴΔＦ５０８−ＣＦＴＲ上皮細胞をＵｓｓｉｎｇチャンバー（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に取り付け、電位固定システム（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ  Ｉｏｗａ，ＩＡ及びＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単層を連続的に短絡させた。経上皮の抵抗を２ｍＶパルスを印加して測定した。これらの条件下で、ＦＲＴ上皮は４ＫΩ／ｃｍ２以上の抵抗を示した。溶液を２７℃で維持し、空気をバブリングさせた。電極オフセット電位及び流体抵抗を、無細胞挿入物を使用して補正した。これらの条件下で、電流は、頂端膜において発現されるΔＦ５０８−ＣＦＴＲを介したＣｌ−の流れを反映する。ＭＰ１００Ａ−ＣＥインターフェース及びＡｃｑＫｎｏｗｌｅｄｇｅソフトウェア（ｖ３．２．６；ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して、ＩＳＣをデジタル方式で取得した。
【０１４４】
２．修正化合物の特定
典型的なプロトコルは、側底から頂端膜のＣｌ−濃度勾配を利用した。この勾配を設定するために、正常リンゲル液を側底膜に使用し、一方、頂端側ＮａＣｌを等モルの（ＮａＯＨでｐＨ７．４に滴定された）グルコン酸ナトリウムで置換して、上皮を横切る大きいＣｌ−濃度勾配を得た。すべての実験を無処置単層を用いて実施した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを十分に活性化するために、フォルスコリン（１０μＭ）及びＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ（１００μＭ）を適用し、続いてＣＦＴＲ増強物質ゲニステイン（５０μＭ）を添加した。
【０１４５】
他の細胞型において認められるように、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＦＲＴ細胞の低温インキュベーションによって、原形質膜中のＣＦＴＲの機能密度が増加する。修正化合物の活性を求めるために、細胞を１０μＭ試験化合物と一緒に３７℃で２４時間インキュベートし、続いて記録前に３回洗浄した。化合物で処理した細胞においてｃＡＭＰ及びゲニステインによって媒介されるＩＳＣを、２７℃及び３７℃の対照に対して正規化し、活性百分率として表した。細胞を修正化合物と一緒にプレインキュベートすると、ｃＡＭＰ及びゲニステインによって媒介されるＩＳＣが３７℃の対照に比べてかなり増加した。  
【０１４６】
３．増強物質化合物の特定
典型的なプロトコルは、側底から頂端膜のＣｌ−濃度勾配を利用した。この勾配を設定するために、正常リンゲル液を側底膜に使用し、ナイスタチン（３６０μｇ／ｍｌ）で透過性にし、一方、頂端側ＮａＣｌを等モルの（ＮａＯＨでｐＨ７．４に滴定された）グルコン酸ナトリウムで置換して、上皮を横切る大きいＣｌ−濃度勾配を得た。すべての実験をナイスタチン透過化処理の３０分後に実施した。フォルスコリン（１０μＭ）及びすべての試験化合物を細胞培養挿入物の両側に添加した。推定上のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ増強物質の有効性を、公知の増強物質ゲニステインの有効性と比較した。
【０１４７】
４．溶液
側底溶液（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１３５）、ＣａＣｌ２（１．２）、ＭｇＣｌ２（１．２）、Ｋ２ＨＰＯ４（２．４）、ＫＨＰＯ４（０．６）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（１０）及びデキストロース（１０）。ＮａＯＨを使用して溶液をｐＨ７．４に滴定した。
【０１４８】
頂端溶液（ｍＭ）：側底溶液と同じ。ただし、ＮａＣｌをグルコン酸Ｎａ（１３５）で置換した。
【０１４９】
５．細胞培養
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを発現するＦｉｓｈｅｒラット上皮（ＦＲＴ）細胞（ＦＲＴΔＦ５０８−ＣＦＴＲ）を、本発明者らによる光学的アッセイから特定された推定ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節物質のＵｓｓｉｎｇチャンバー実験に使用した。細胞をＣｏｓｔａｒ  Ｓｎａｐｗｅｌｌ細胞培養挿入物上で培養し、５％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＣｏｏｎ改変Ｈａｍ  Ｆ−１２培地中で３７℃及び５％ＣＯ２で５日間培養した。化合物の増強物質活性を特徴づけるのに使用する前に、細胞を２７℃で１６〜４８時間インキュベートして、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを修正した。修正化合物の活性を求めるために、細胞を２７℃又は３７℃で化合物と一緒に、さらに、化合物なしで、２４時間インキュベートした。
【０１５０】
６．ホールセル記録
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現する、温度及び試験化合物で修正されたＮＩＨ３Ｔ３細胞における巨視的ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ電流（ＩΔＦ５０８）を、穿孔パッチホールセル記録を使用してモニターした。手短に述べると、ＩΔＦ５０８の電位固定記録を、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて室温で実施した。すべての記録をサンプリング周波数１０ｋＨｚで取得し、１ｋＨｚの低域フィルターにかけた。ピペットは、細胞内液で満たすと５〜６ＭΩの抵抗を有した。これらの記録条件下で、室温でのＣｌ−の計算逆転電位（ＥＣｌ）は−２８ｍＶであった。すべての記録は、シール抵抗＞２０ＧΩ及び直列抵抗＜１５ＭΩであった。パルス発生、データ取得及び分析を、Ｃｌａｍｐｅｘ  ８に接続されたＤｉｇｉｄａｔａ  １３２０  Ａ／Ｄインターフェースを備えたＰＣ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を使用して実施した。浴は、食塩水＜２５０μｌを含み、重力駆動の潅流システムを使用して速度２ｍｌ／分で連続的に洗い流した。
【０１５１】
７．修正化合物の特定
原形質膜中の機能的ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの密度を増加させる修正化合物の活性を求めるために、本発明者らは、上記穿孔パッチ記録技術を使用して、修正化合物で２４時間処理した後の電流密度を測定した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを十分に活性化するために、１０μＭフォルスコリン及び２０μＭゲニステインを細胞に添加した。本発明者らの記録条件下では、２７℃で２４時間インキュベートした後の電流密度は、３７℃で２４時間インキュベートした後に観察された電流密度より高かった。これらの結果は、原形質膜中のΔＦ５０８−ＣＦＴＲの密度に対する低温インキュベーションの公知の効果と一致する。ＣＦＴＲ電流密度に対する修正化合物の効果を求めるために、細胞を１０μＭ試験化合物と一緒に３７℃で２４時間インキュベートし、電流密度を２７℃及び３７℃の対照と比較した（％活性）。記録前に、細胞を細胞外記録培地で３回洗浄して、残留試験化合物を除去した。１０μＭ修正化合物と一緒にプレインキュベートすると、ｃＡＭＰ及びゲニステインに依存性した電流が３７℃の対照に比べてかなり増加した。
【０１５２】
８．増強物質化合物の特定
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞において巨視的ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流（ＩΔＦ５０８）を増加させるΔＦ５０８−ＣＦＴＲ増強物質の能力も穿孔パッチ記録技術を用いて調べた。光学的アッセイから特定された増強物質は、光学的アッセイにおいて認められた類似の作用強度及び効力でＩΔＦ５０８の用量依存的増加を惹起した。試験したすべての細胞において、増強物質の適用前及び適用中の逆転電位は、約−３０ｍＶであった。約−３０ｍＶは、計算したＥＣｌ（−２８ｍＶ）である。
【０１５３】
９．溶液
細胞内液（ｍＭ）：アスパラギン酸Ｃｓ（９０）、ＣｓＣｌ（５０）、ＭｇＣｌ２（１）、ＨＥＰＥＳ（１０）及び２４０μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（ＣｓＯＨを用いて７．３５に調節されたｐＨ）。
【０１５４】
細胞外液（ｍＭ）：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）−Ｃｌ（１５０）、ＭｇＣｌ２（２）、ＣａＣｌ２（２）、ＨＥＰＥＳ（１０）（ＨＣｌを用いて７．３５に調節されたｐＨ）。
【０１５５】
１０．細胞培養
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞をホールセル記録に使用する。１７５ｃｍ２培養フラスコ中の２ｍＭグルタミン、１０％ウシ胎仔血清、１×ＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補充したダルベッコ変法イーグル培地中で３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９０％で細胞を維持する。ホールセル記録の場合、２，５００〜５，０００個の細胞をポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上に蒔き、２７℃で２４〜４８時間培養した後、増強物質の活性を試験するのに使用した。さらに、修正化合物と一緒に、又は修正化合物なしで、３７℃でインキュベートして、修正化合物の活性を測定した。
【０１５６】
１１．単一チャネル記録
ＮＩＨ３Ｔ３細胞中で安定に発現された温度修正ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの単一チャネル活性、及び増強物質化合物の活性を、切り出したインサイドアウト膜パッチを使用して観察した。手短に述べると、単一チャネル活性の電位固定記録を、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて室温で実施した。すべての記録をサンプリング周波数１０ｋＨｚで取得し、４００Ｈｚの低域フィルターにかけた。パッチピペットは、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｋｏｖａｒ  Ｓｅａｌｉｎｇ＃７０５２ガラス（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）から作製され、細胞外液で満たしたときに５〜８ＭΩの抵抗を有した。切り出し後に１ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ及び７５ｎＭ  ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＰＫＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加することによってΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化した。チャネル活性が安定化された後、重力駆動微小潅流システムを使用してパッチを洗い流した。流入液をパッチに隣接して置き、１〜２秒以内に溶液を完全に交換した。急速な洗い流し中にΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性を維持するために、非特異的ホスファターゼ阻害剤Ｆ−（１０ｍＭ  ＮａＦ）を浴溶液に添加した。これらの記録条件下で、チャネル活性は、パッチ記録の期間（最高６０分間）を通して一定のままであった。細胞内液から細胞外液に移動する陽電荷（反対方向に移動する陰イオン）によって生成される電流を正電流として示す。ピペット電位（Ｖｐ）を８０ｍＶで維持した。
【０１５７】
２個以下の活性チャネルを含む膜パッチからチャネル活性を分析した。最高同時開口数によって、実験過程中の活性チャネル数が決まった。単一チャネルの電流振幅を測定するために、１２０秒のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性から記録されたデータを１００Ｈｚで「オフライン」でフィルターし、次いでそれを使用して全点振幅（ａｌｌ−ｐｏｉｎｔ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）ヒストグラムを構築した。全点振幅ヒストグラムは、Ｂｉｏ−Ｐａｔｃｈ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｃｏｍｐ．Ｆｒａｎｃｅ）を使用してマルチガウシアン関数に当てはめられた。合計の微小電流及び開口率（ＰＯ）を、１２０秒のチャネル活性から決定した。ＰＯを、Ｂｉｏ−Ｐａｔｃｈソフトウェアを使用して、又は関係式ＰＯ＝Ｉ／ｉ（Ｎ）から、決定した。式中、Ｉ＝平均電流、ｉ＝単一チャネル電流振幅、及びＮ＝パッチ中の活性チャネル数である。
【０１５８】
１２．溶液
細胞外液（ｍＭ）：ＮＭＤＧ（１５０）、アスパラギン酸（１５０）、ＣａＣｌ２（５）、ＭｇＣｌ２（２）及びＨＥＰＥＳ（１０）（Ｔｒｉｓ塩基を用いて７．３５に調節されたｐＨ）。
【０１５９】
細胞内液（ｍＭ）：ＮＭＤＧ−Ｃｌ（１５０）、ＭｇＣｌ２（２）、ＥＧＴＡ（５）、ＴＥＳ（１０）及びＴｒｉｓ塩基（１４）（ＨＣｌを用いて７．３５に調節されたｐＨ）。
【０１６０】
１３．細胞培養
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を、切り出された膜のパッチクランプ記録に使用する。１７５ｃｍ２培養フラスコ中の２ｍＭグルタミン、１０％ウシ胎仔血清、１×ＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ及び２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳを補充したダルベッコ変法イーグル培地中で３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９０％で細胞を維持する。単一チャネル記録の場合、２，５００〜５，０００個の細胞をポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上に蒔き、使用前に２７℃で２４〜４８時間培養した。
【０１６１】
上記手順を使用して化合物１の活性、すなわちＥＣ５０を測定し、表４に示した。
【０１６２】
【表４】
2014088447.tif 000023
【図１】
2014088447.tif 000025
【図２】
2014088447.tif 000026
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014088447.tif 000032
【図９】
2014088447.tif 000033
【図１０】
2014088447.tif 000034
【図１１】
2014088447.tif 000035
【外国語明細書】
2014088447000001.pdf