(57)【要約】【課題】間葉系幹細胞を均一な形状で凝集化させ、分化状態が均一な細胞凝集体を高い確率で得ることができる細胞培養担体を提供する。【解決手段】容器状に形成され、かつ前記底壁部に複数のウェルが形成され、平均気孔径が０．１μｍ以上０．６μｍ以下、気孔率４０％以上５５％以下のセラミックス多孔体からなり、側壁部内周面が、底壁部上面に対して１００°以上１３５°以下の傾斜角度をもって上方に行くにしたがって開拡するように形成され、複数のウェルのうち少なくとも一つのウェルが、底壁部と側壁部との境界線に接した位置に形成され、あるいは境界線を跨ぎ、側壁部の水平寸法が側壁部への前記ウェルの入り込み寸法の２倍以上の長さを有し、かつ隣り合う一のウェルの開口部の外周線から他のウェルの開口部の外周線に至る、ウェルの中心を結ぶ中心線上の距離寸法が１０μｍ以上５０μｍ以下である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
底壁部と前記底壁部の周縁に設けられた側壁部とを有する容器状に形成され、かつ前記底壁部に複数のウェルが形成された、間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、
平均気孔径が０．１μｍ以上０．６μｍ以下、気孔率４０％以上５５％以下のセラミックス多孔体からなり、
前記側壁部内周面が、前記底壁部上面に対して１００°以上１３５°以下の傾斜角度をもって上方に行くにしたがって開拡するように形成されると共に、前記底壁部の上面の２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下、かつ長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３．０以下に形成され、
前記複数のウェルの開口部は均一の径を有する円形形状であると共に、前記ウェルの底部の直径が１００μｍ以上５５０μｍ以下で、前記ウェルの底部の断面形状が凹状に湾曲した曲面形状に形成され、
前記複数のウェルのうち少なくとも一つのウェルが、前記底壁部と前記側壁部との境界線に接した位置に形成され、あるいは前記境界線を跨ぎ、前記側壁部の水平寸法が前記側壁部への前記ウェルの入り込み寸法の２倍以上の長さを有し、
かつ隣り合う一のウェルの開口部の外周線から他のウェルの開口部の外周線に至る、前記ウェルの中心を結ぶ中心線上の距離寸法が１０μｍ以上５０μｍ以下であることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記側壁部に囲まれた前記底壁部の上面は円形形状であって、
前記側壁部と前記底壁部との境界線上に、少なくとも６個のウェルが形成され、
少なくとも６個のウェルの夫々の中心は、前記底壁部上面の中心を通る直線と、前記側壁部と前記底壁部との境界線との交差点上に配置され、
前記境界線上で隣り合う２つのウェルの中心を通る前記直線のなす角は、６０°以下であることを特徴とする請求項１に記載された細胞培養担体。
【請求項３】
前記底壁部の上面に形成された複数のウェルは、平面六方格子状に配列されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載された細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞を細胞凝集体として培養するのに好適に用いることができる細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織等中に存在する未分化細胞であり、自己増殖能の他、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等の中胚葉系細胞への分化能を有することが知られている。このため、間葉系幹細胞は、再生医療への利用が期待されており、自己再生が難しい部位に間葉系幹細胞を移植する細胞治療の臨床研究が行われている。
【０００３】
ところで、軟骨系の細胞は、前記のように間葉系幹細胞から分化誘導して得ることができるが、そのためには細胞凝集体を形成させる必要がある。しかしながら、間葉系幹細胞は、シャーレ上において偏平形状に接着・増殖し、自己凝集する性質は見られないという課題があった。
そこで、特許文献１においては、分化状態が均一な間葉系幹細胞の凝集体を大量に得るために、複数の凹部（以下、これをウェルと称呼する）を有する３次元的な形状の培養担体を用いて培養後、軟骨組織に分化誘導する方法が開示されている。
【０００４】
図２３に、特許文献１に記載された細胞培養担体を模式的に示す。
図２３（ａ）は細胞培養担体の平面図であり、図２３（ｂ）は図２３（ａ）に示したＣ−Ｃ断面図である。また図２３（ｃ）は、細胞培養担体を培養容器に収容した状態を示す断面図である。
図示する細胞培養担体５０は、プレート状のジルコニアセラミックス焼結体により形成され、その上面５１は所定の粗さ（２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ〜２８０ｎｍ）、かつ長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０であると共に、複数のウェル５２が配列されている。
また、各ウェル５２の開口部は円形状または矩形状（図では円形状のみ示す）であり、その開口径が７０μｍ〜５５０μｍに形成され、更に近接する前記ウェルの中心点の間隔が８０μｍ〜７００μｍに形成されている。
【０００５】
この細胞培養担体５０を用いて、軟骨系の細胞を培養するには、まず図２３（ｃ）に示すように細胞培養担体５０をプラスチック容器６０内に収容する。続いて、図２４（ａ）に示すように、前記プラスチック容器６０をプラスチック製ケース６１内に収容し、前記プラスチック容器６０内に間葉系幹細胞を培養するための第１の培養液（培地）６２を供給し、所定時間静置する。
前記プラスチック容器６０内に入れられた培養液（培地）は毛細血管作用により、細胞培養担体５０に進入し、ウェル５２内が第１の培養液（培地）６２で満たされる。
【０００６】
その後、図２４（ｂ）に示すように、前記プラスチック容器６０内を、間葉系幹細胞Ｃを含む第２の培養液（培地）６３で満たし、所定時間静置する。静置することにより、前記プラスチック容器６０内の間葉系幹細胞は重力で沈降し、ウェル５２内及び上面５１に堆積する。この状態のマイクロスコープ写真を図２５に示す。
そして、図２４（ｃ）に示すように、第１の培養液（培地）６２を前記プラスチック容器６０内に追加し、細胞培養担体５０の上面を覆い、所定時間静置する。
【０００７】
これにより、細胞培養担体５０の上面５１に堆積していた、間葉系幹細胞Ｃがウェル５２内に落下し、ウェル５２内では間葉系幹細胞の凝集化が進行し、ウェル５２内に細胞凝集体が形成される。この状態を写したマイクロスコープ写真を図２６に示す。
前記プラスチック容器６０内及び細胞培養担体５０内の培養液（培地）をアスピレータで吸い取った後、図２４（ｄ）に示すように、前記細胞培養担体５０内に、間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化誘導する低分子化合物やたんぱく質を含む第３の培養液（培地）６４を入れ、所定時間静置する。この静置した初期の状態を写したマイクロスコープ写真を図２７、中期の状態を写したマイクロスコープ写真を図２８に示す。
その後、凝集した間葉系幹細胞は軟骨細胞に分化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−５０４２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、前記細胞培養担体５０はプラスチック容器（培養容器）６０に配置使用されるため、前記プラスチック容器（培養容器）６０と細胞培養担体５０の隙間に細胞が逃げ（入り込み）、各ウェル５２間での細胞濃度が不均一になるという課題があった。
また、図２４（ｂ）に示すように、間葉系幹細胞を含む第２の培養液（培地）６３を前記プラスチック容器（培養容器）６０内に入れ、所定時間静置した際、細胞培養担体５０の上面５１に堆積していた間葉系幹細胞Ｃの全てが、ウェル５２内に落下せず、前記上面５１と前記プラスチック容器（培養容器）６０の側壁部６１との境界付近（隅部）に播種した細胞Ｃが堆積する（図２５を参照）。
その後、、図２４（ｃ）に示すように、第１の培養液（培地）を供給し、所定時間静置した際、リング状に細胞が集まり、リング状の細胞凝集体Ｒが形成されることがあった（図２６を参照）。尚、図２６では、リング状の細胞凝集体Ｒの一部が剥離している。
【００１０】
また、図２４（ｄ）に示すように、前記プラスチック容器（培養容器）６０内の細胞培養担体５０内に間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化誘導する低分子化合物やたんぱく質を含む第３の培養液（培地）６４を入れ、間葉系幹細胞Ｃを軟骨細胞に分化させる際、リング状の細胞凝集体が境界付近（隅部）から剥離し、ウェル５２内の間葉系幹細胞Ｃを取り込みながら、リング径を狭めて細胞培養担体５０の上面５１に薄片状に凝縮して、軟骨細胞６５に分化していく（図２７、図２８を参照）。
そして、最終的に、図２４（ｅ）に示すように、ウェル５２内の間葉系幹細胞Ｃ（変化後の軟骨細胞）は殆ど消失し、上面５１の中央で１つの大きな薄片状の軟骨細胞６５が形成される（図２９を参照）。
【００１１】
このように、特許文献１に開示された細胞培養担体を用いた場合にも、上記したような現象が比較的高い頻度で発生し、高い確率で分化状態が均一な間葉系幹細胞の細胞凝集体を大量に得ることが困難であることが判明した。また、従来のように培養容器と細胞培養担体とが別体に形成されているために、両者の間に隙間が生じ、細胞濃度が不均一なるという課題があった。
そこで、本発明者らは、この技術的課題を解決するために、特許文献１に記載された発明の更なる改良を進め、リング状の細胞凝集体を抑制すると共に、より高い確率でサイズが均一な細胞凝集体を形成することを鋭意研究し、本発明を想到するに至ったものである。
【００１２】
本発明の目的は、間葉系幹細胞を均一な形状で凝集化させ、分化状態が均一な細胞凝集体を高い確率で得ることができる細胞培養担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するためになされた、本発明に係る細胞培養担体は、底壁部と前記底壁部の周縁に設けられた側壁部とを有する容器状に形成され、かつ前記底壁部に複数のウェルが形成された、間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、平均気孔径が０．１μｍ以上０．６μｍ以下、気孔率４０％以上５５％以下のセラミックス多孔体からなり、前記側壁部内周面が、前記底壁部上面に対して１００°以上１３５°以下の傾斜角度をもって上方に行くにしたがって開拡するように形成されると共に、前記底壁部の上面の２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下、かつ長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３．０以下に形成され、前記複数のウェルの開口部は均一の径を有する円形形状であると共に、前記ウェルの底部の直径が１００μｍ以上５５０μｍ以下で、前記ウェルの底部の断面形状が凹状に湾曲した曲面形状に形成され、前記複数のウェルのうち少なくとも一つのウェルが、前記底壁部と前記側壁部との境界線に接した位置に形成され、あるいは前記境界線を跨ぎ、前記側壁部の水平寸法が前記側壁部への前記ウェルの入り込み寸法の２倍以上の長さを有し、かつ隣り合う一のウェルの開口部の外周線から他のウェルの開口部の外周線に至る、前記ウェルの中心を結ぶ中心線上の距離寸法が１０μｍ以上５０μｍ以下であることを特徴としている。
【００１４】
このように構成された細胞培養担体にあっては、間葉系幹細胞を均一な形状で凝集化させ、分化状態が均一な細胞凝集体を高確率で得ることができる。
【００１５】
特に、この細胞培養担体は容器状に形成されているため、培養時に担体を収容するプラスチック容器が必要なく、従来のようにプラスチック容器と担体とを別体に形成した場合に生じる隙間が生じないため、各ウェル間での細胞濃度を均一にすることができる。
【００１６】
また、本発明に係る細胞培養担体は、平均気孔径が０．１μｍ以上０．６μｍ以下、気孔率４０％以上５５％以下のセラミックス多孔体から構成されている。
前記平均気孔径が０．１μｍ未満、あるいは気孔率４０％未満の場合には、培養した細胞が三次元状に凝集せず、扁平状にセラミックス多孔体に接着することがあるため、好ましくない。
また、前記平均気孔径が０．６μｍを超え、あるいは気孔率が５５％を超える場合には、セラミックス多孔体の強度が不十分となり、セラミックス粒子が剥離し易く、この剥離した粒子をウェル内に形成する細胞凝集体が取り込むため、好ましくない。
【００１７】
また、側壁部の内周面が前記底壁部上面に対して１００°以上１３５°以下の傾斜角度をもって上方に行くにしたがって開拡するように形成されているため、リング状に間葉系幹細胞凝集体が形成されるのを抑制することができる。
前記側壁部の内周面が、前記底壁部上面に対して１００°未満の場合、底壁部と側壁部との境界線近傍に（角部）に播種した細胞が堆積して、リング状に細胞凝集体が形成されるため、好ましくない。
一方、側壁部の内周面が、前記底壁部上面に対して１３５°を超える場合、側壁部に間葉系幹細胞が付着し、底壁部と側壁部との境界線近傍に堆積して、リング状に細胞凝集体が形成されるため、好ましくない。
【００１８】
また、前記底壁部の上面の２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下、かつ長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３．０以下に形成されているため、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着せず、球状を維持し、最終的に最寄のウェルに進入させることができる。また間葉系幹細胞の培養初期段階に、間葉系幹細胞が上面に付着して扁平状になった場合においても、ある程度の時間が経過すると、扁平状になった間葉系幹細胞は球状化する。
【００１９】
更に、前記複数のウェルの開口部は均一の径を有する円形形状であると共に、前記ウェルの底部の直径が１００μｍ以上５５０μｍ以下で、前記ウェルの底部の断面形状が凹状に湾曲した曲面形状に形成されている。
前記複数のウェルの開口部は均一の径を有する円形形状であることによって、得られる間葉系幹細胞凝集体の大きさをより均等になすことができる。このためには、各ウェルの底部の直径も均一であることが好ましい。
また、ウェル内に形成される細胞は、前記ウェルの底部の直径によって決まるが、前記ウェルの底部の直径が１００μｍ以上５５０μｍ以下であることによって、細胞数が多く、かつ各細胞の均質性が高い間葉系幹細胞凝集体を得ることができる。
更に、前記ウェルの底部の断面形状が凹状に湾曲した曲面形状に形成されているため、ウェル内で複数の細胞凝集体の形成が抑制され、前記ウェルに１つづつの細胞凝集体を培養することができ、ウェル間での細胞凝集体の大きさを均一なものとすることができる。
【００２０】
また、この細胞培養担体は、前記複数のウェルのうち少なくとも一つのウェルが、前記底壁部と前記側壁部との境界線に接した位置に形成され、あるいは前記境界線を跨ぎ、前記側壁部の水平寸法が前記側壁部への前記ウェルの入り込み寸法の２倍以上の長さを有しているため、底壁部と側壁部との境界線近傍の細胞を前記ウェル内に落下させることができ、リング状の間葉系幹細胞凝集体の形成を抑制することができる。
また、底壁部と側壁部との境界線付近に細胞が集まったとしても、前記ウェルによって、リング状となる間葉系幹細胞凝集体を分断することができ、リング状の間葉系幹細胞凝集体の成長を抑制することができる。
【００２１】
ここで、前記側壁部の水平寸法が前記側壁部への前記ウェルの入り込み寸法の２倍未満の場合、このウェル及び側壁部に近いウェルに細胞混濁液中の細胞が集まりにくく、生成された細胞凝集体が他のウェルのものよりも小さくなり、均一な細胞凝集体を生成できないため、好ましくない。
尚、この作用効果は、前記側壁部の内周面の傾斜角度１００°以上１３５°以下の構成と相まって、より顕著な、かつ確実性の高いものとなる。
【００２２】
また、隣り合うウェルの開口部外周線間（内周面間）における、前記ウェルの中心を結ぶ中心線上の距離寸法が１０μｍ以上５０μｍ以下であるため、ほぼすべての間葉系幹細胞を底壁部に接着させず、ウェル内部に進入させることができる。
即ち、隣り合うウェルの開口部外周線間における、前記ウェルの中心を結ぶ中心線上の距離寸法が１０μｍ未満の場合には、ウェル間の強度が足りず、ウェルを配列させることができず、距離寸法が５０μｍを超える場合には、間葉系幹細胞がウェル部に完全に進入せず、底壁部にも接着するため好ましくない。
【００２３】
また、前記側壁部に囲まれた前記底壁部の上面は円形形状であって、前記側壁部と前記底壁部との境界線上に、少なくとも６個のウェルが形成され、少なくとも６個のウェルの夫々の中心は、前記底壁部上面の中心を通る複数の直線と、前記側壁部と前記底壁部との境界線との交差点上に配置され、前記境界線上で隣り合う２つのウェルの中心を通る前記直線のなす角は、６０°以下であることが望ましい。
このように前記境界線上に少なくとも６個のウェルが設けられることで、前記側壁部と前記底壁部に境界線近傍に生じるリング状の細胞凝集体の形成をより確実に、抑制することができる。
【００２４】
また、前記底壁部の上面に形成された複数のウェルは、平面六方格子状に配列されていることが望ましい。
このように複数のウェルが六方格子状に配列されることにより、全ての隣り合うウェル間の距離が、略均等となり、形成される細胞の大きさの均一性を向上することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、間葉系幹細胞を均一な形状で凝集化させ、分化状態が均一な細胞凝集体を高確率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１（ａ）は、本発明に係る細胞培養担体の第１の実施の形態を模式的に示す平面図であり、図１（ｂ）は、そのＩ−Ｉ矢視断面図である。
【図２】図２（ａ）は、図１の細胞培養担体が有するウェルの底部形状の変形例を示す断面図であり、図２（ｂ）は前記ウェルの底部形状の他の変形例を示す断面図である。
【図３】図３は、底壁部上面に配置された複数のウェルにおける隣り合うウェル間の距離を説明するための平面図である。
【図４】図４は、図１の細胞培養担体においてウェルが側壁部の内周面と底壁部との境界線に接している状態を説明するための平面図である。
【図５】図５は、図１の細胞培養担体においてウェルが側壁部に入り込んだ状態を説明するための図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ断面図である。
【図６】図６は、ウェルの好ましくない形成位置、好ましくない形状を示す断面図である。
【図７】図７は、底壁部上面と側壁部との境界線上に複数のウェルを配置する場合の好ましい条件を説明するための平面図である。
【図８】図８は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、細胞培養担体をケース内に収容した状態を示す図である。
【図９】図９は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、第１の培養液をケース内に供給した状態を示す図である。
【図１０】図１０は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、第１の培養液が細胞培養担体に進入した状態を示す図である。
【図１１】図１１は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、第２の培養液を細胞培養担体に供給した状態を示す図である。
【図１２】図１２は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、間葉系幹細胞が細胞培養担体の底壁部に落下する状態を示す図である。
【図１３】図１３は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、第１の培養液を細胞培養担体に供給した状態を示す図である。
【図１４】図１４は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、細胞培養担体のウェル内に細胞凝集体が生成される状態を示す図である。
【図１５】図１５は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、アスピレータで細胞培養担体及びケース内の培養液を除いた状態を示す図である。
【図１６】図１６は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、間葉系幹細胞を軟骨細胞に変える第３の培養液を供給した状態を示す図である。
【図１７】図１７は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、間葉系幹細胞が軟骨細胞に変化した状態を示す図である。
【図１８】図１８は、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図であって、第３の培養液を排出し、軟骨細胞を収集する状態を示す図である。
【図１９】図１９は、図１２に示した工程終了時のマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体の底壁部に焦点を合わせた図である。
【図２０】図２０は、図１４に示した工程終了時のマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体の底壁部に焦点を合わせた図である。
【図２１】図２１は、図１４に示した工程終了時のマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体のウェル内に焦点を合わせた図である。
【図２２】図２２は、図１８に示した工程終了時のマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体のウェル内に焦点を合わせた図である。
【図２３】図２３は従来の細胞培養担体を模式的に示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は、（ａ）のＣ−Ｃ矢視断面図、（ｃ）は容器に収容した状態を示す断面図である。
【図２４】図２４は、従来の細胞培養担体用いて、間葉系幹細胞を培養し、軟骨細胞へ分化誘導する工程を説明するための模式図である。
【図２５】図２５は、間葉系幹細胞を含む第２の培養液（培地）で満たし、培養容器内の間葉系幹細胞は重力で沈降し、ウェル内及び上面に堆積した状態を示すマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体の底壁部に焦点を合わせた図である。
【図２６】図２６は、間葉系幹細胞の凝集化が進行し、ウェル内に細胞凝集体が形成される状態を示すマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体の底壁部に焦点を合わせた図である。
【図２７】図２７は、間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化誘導する低分子化合物やたんぱく質を含む第３の培養液（培地）を入れ、静置した初期の状態を示すマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体の底壁部に焦点を合わせた図である。
【図２８】図２８は、間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化誘導する低分子化合物やたんぱく質を含む第３の培養液（培地）を入れ、静置した中期の状態を示すマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体の底壁部に焦点を合わせた図である。
【図２９】図２９は、生成された軟骨細胞を示すマイクロスコープ写真であって、細胞培養担体の底壁部に焦点を合わせた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明に係る細胞培養担体の実施形態について図面に基づき説明する。本発明に係る細胞培養担体は、間葉系幹細胞の培養に用いられる容器状に形成された細胞培養担体であって、底壁部の上面に細胞を培養するための複数のウェル（凹部）が形成されているものである。尚、図１（ａ）は、本発明に係る細胞培養担体を模式的に示す平面図であり、図１（ｂ）は、そのＡ−Ａ矢視断面図である。
【００２８】
図１（ａ）、図１（ｂ）に示す細胞培養担体１は、セラミックス焼結体からなり、円板状の底壁部２と、その周縁から立設された側壁部３とを有し、上部が開口した容器状に形成されている。
この細胞培養担体１を形成する前記セラミックス材料としては、生体親和性、生体適合性に優れており、細胞の足場として適しているものとして、ジルコニア、チタニア、アルミナ又はハイドロキシアパタイト等を用いることができる。これらの中でも、本発明においては、間葉系幹細胞の細胞凝集体を効率的に形成させることができることから、ジルコニアを用いることがより好ましい。
【００２９】
また、この細胞培養担体１は、平均気孔径が０．１μｍ以上０．６μｍ以下、気孔率４０％以上５５％以下のセラミックス多孔体から構成されている。
前記平均気孔径が０．１μｍ未満、あるいは気孔率４０％未満の場合には、培養した細胞が三次元状に凝集せず、扁平状にセラミックス多孔体に接着することがあるため、好ましくない。また、前記平均気孔径が０．６μｍを超え、あるいは気孔率が５５％を超える場合には、セラミックス多孔体の強度が不十分となり、セラミックス粒子が剥離し易く、この剥離した粒子をウェル内に形成する細胞凝集体が取り込むため、好ましくない。
尚、前記平均気孔径はＪＩＳ・Ｒ・１６５５（２００３）により測定したものであり、また気孔率は、ＪＩＳ・Ｒ・１６３４（１９９８）により測定したものである。
【００３０】
前記側壁部３の内周面３ａは、底壁部２上面に対して上方にいくにしたがって開拡するように傾斜している。より具体的には、図１（ｂ）に示すように内周面３ａの傾斜角θ１が１００°以上１３５°以下の角度に設定されている。
このように傾斜した内周面３ａを設けることにより、培養液中の間葉系幹細胞が内周面３ａと底壁部２上面との境界線６付近に集中することがなく、前記境界線６付近におけるリング状の細胞凝集体の生成を抑制することができる。
尚、内周面３ａの上端部には、水平な側壁部上面３ｂが形成されている。
【００３１】
前記側壁部３の内周面３ａの傾斜角θ１が、前記底壁部２上面に対して１００°未満の場合、底壁部２と側壁部３との境界線６近傍に（隅部）に播種した細胞が堆積して、リング状に細胞が集まり易くなり、リング状の細胞凝集体が生成される確率が高くなるため、好ましくない。
一方、側壁部３の内周面３ａの傾斜角θ１が、前記底壁部２上面に対して１３５°を超える場合には、側壁部３の内周面３ａに間葉系幹細胞が付着し、これら間葉系幹細胞が前記境界線６近傍に（角部）堆積する。
このように、リング状に間葉系幹細胞が集めるため、リング状の細胞凝集体が生成される確率が高くなり、好ましくない。
【００３２】
また、前記底壁部２の上面は、２乗平均粗さＲｑが１００以上２８０ｎｍ以下、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３．０以下の表面状態にあり、また前記底壁部２には、複数のウェル４が形成されている。
前記底壁部２の上面がこのような表面状態に形成されているため、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着せず、球状を維持し、最終的に最寄のウェルに進入させることができる。
また間葉系幹細胞の培養初期段階に、間葉系幹細胞が上面に付着して扁平状になった場合においても、ある程度の時間が経過すると、扁平状になった間葉系幹細胞は球状化する。
【００３３】
しかも、底壁部２の上面に複数のウェル４が形成されているため、球状の間葉系幹細胞が、ウェル４に移動、凝集し、間葉系幹細胞の凝集体を効率的に形成させ、間葉系幹細胞から硝子軟骨細胞組織細胞を効率よく分化誘導することができる。
尚、２乗平均粗さＲｑ及び線密度が上記数値範囲外である場合、細胞が扁平形状となり、該担体上面に接着して、細胞凝集体を形成しなくなる傾向がある。
【００３４】
ここで、２乗平均粗さＲｑ及び線密度は、表面粗さを規定するためのパラメータである。ここでいう線密度とは、面方向のパラメータであり、長さ１μｍあたりの粗さ曲線が平均面と交差する回数を表している。
尚、本発明における２乗平均粗さＲｑは、ＪＩＳ・Ｂ０６０１により測定したものである。また、線密度は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、スケール０．８μｍ、スキャンサイズ１０μｍ×１０μｍにて測定したものである。
【００３５】
また、各ウェル４は、その開口部の平面視の形状が円形形状であって、前記開口部上部の直径は１００μｍ以上５５０μｍ以下に形成されている。尚、前記開口部上部の直径は２００μｍ以上５５０μｍ以下に形成されていることが、より好ましい。
前記ウェル開口部の形状は、細胞の播種や細胞体の形成が容易であること、また、ウェルの加工容易性等の観点から、円形状であることが好ましい。
【００３６】
また、前記複数のウェルの開口部上部が均一の径を有することによって、得られる間葉系幹細胞凝集体の大きさをより均等になすことができる。
更に、上記範囲内のウェル開口径を有する細胞培養担体１で培養することにより、間葉系幹細胞の凝集体を軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞へ分化誘導する際、この担体１のウェル４内において、そのまま、間葉系幹細胞の凝集体のサイズをより制御しながら分化誘導することができる。
尚、前記ウェル４の開口径が１００μｍ未満又は５５０μｍを超える場合は、間葉系幹細胞が所望する３次元細胞凝集体を形成しにくくなる。
【００３７】
また、各ウェル４の底部は、図１（ｂ）に示すように凹状に湾曲した半球状に形成されている。前記底部の直径は、１００μｍ以上５５０μｍ以下に形成されている。より好ましくは、前記底部の直径は２００μｍ以上５５０μｍ以下に形成されている。
前記ウェル４の底部の断面形状は、前記のような半球状（半円状）に限定されるものではなく、凹状に湾曲した曲面形状であれば良く、例えば、図２（ａ）に示すように底部のみが凹状に緩く尖った断面形状や、図２（ｂ）に示すように開口部から底部に向けて縮径しながら凹状に緩く尖った断面形状であっても良い。
前記ウェル４の深さも、細胞凝集体のサイズの制御等の観点から、前記ウェル４の開口径と同様に、１００μｍ〜５５０μｍであることが好ましい。
【００３８】
また、ウェル４内に形成される細胞は、前記ウェル４の底部の直径によって決まるが、前記ウェル４の底部の直径が１００μｍ以上５５０μｍ以下であることによって、細胞数が多く、かつ各細胞の均質性が高い間葉系幹細胞凝集体を得ることができる。更に、前記ウェル４の底部の直径を２００μｍ以上とすることにより、各細胞の均質性がより高い間葉系幹細胞凝集体を得ることができる。
しかも、前記したように、ウェル４の底部の断面形状が凹状に湾曲した曲面形状に形成されているため、ウェル内で複数の細胞凝集体の形成が抑制され、前記ウェル４に１つづつの細胞凝集体を培養することができ、ウェル４間での細胞凝集体の大きさを均一なものとすることができる。
【００３９】
尚、前記ウェル４の開口部上部の直径は、前記ウェル底部の直径と同一である、即ちウェル４の内壁が垂直となるウェル４でも良く、またウェル４の開口部の直径が前記ウェル底部の直径より大きく（好ましくは１．０５倍、１．２０倍）、ウェル４の内壁（内周面）がテーパ状（斜面）となるウェル４であっても良い。
前記細胞凝集体をより確実に、各ウェル４に１つづつ形成するためには、ウェル４の開口部の直径が前記ウェル底部の直径より大きく、ウェル４の内壁（内周面）がテーパ状（斜面）となるウェルであることが望ましい。
【００４０】
前記細胞培養担体１のウェル４の少なくとも底面の表面状態も、前記底壁部２の上面の表面粗さと同様に、２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下、長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３．０以下であることが好ましい。
少なくとも前記ウェル４の底面も上記のような表面状態であれば、細胞が球状に維持されやすく、ウェル４内の空間内で、細胞凝集体をより形成しやすくなる。
一方、前記２乗平均粗さＲｑ及び線密度が上記数値範囲外である場合、細胞が該ウェル
４の底面に扁平形状に接着して、細胞凝集体が形成されにくくなる。
尚、前記ウェル４内は、上記底面のみならず、ウェル４の側壁部（内周面）も前記細胞培養担体１の底壁部２の上面と同じ２乗平均粗さＲｑと線密度との各数値範囲内であることがより好ましい。
【００４１】
また、前記側壁部３の内周面３ａも、２乗平均粗さＲｑが１００ｎｍ以上２８０ｎｍ以下、長さ１μｍあたりの線密度が１．６以上３．０以下の表面状態であることがより好ましい。
これによって、間葉系幹細胞を前記側壁部３に付着させず、前記側壁部３に入り込むウェル４に、または前記側壁部３により近いウェル４に、よりスムーズに、かつより確実に移動させることができる。
【００４２】
また、前記底壁部２の上面に形成された複数のウェル４は、図３に示すように、平面六方格子状に配列されているのが望ましい。
この複数のウェル４は、底壁部２の上面に平面六方格子状ではなく、単に縦横方向に等間隔に配列された四方格子状でも良いが、平面六方格子状に配列されることにより、全ての隣り合うウェル４間の距離が、略均等となり、形成される細胞の大きさの均一性を向上することができる。
【００４３】
また、図３に示すように、底壁部２上面に複数形成されたウェル４において、隣り合うウェル４の外周線間（内周面間）における、前記ウェル４の中心Ｏ２を結ぶ中心線上Ｌ２の距離寸法ｄ３が１０μｍ〜５０μｍに形成されている。
前記距離寸法が１０μｍ未満である場合、ウェル４間の強度が足りず、ウェル４を配列させることができない。一方、距離寸法が５０μｍを超える場合、球状化した細胞のウェル４内への移動が困難となり、間葉系幹細胞がウェル４に完全に進入せず、底壁部２にも接着するため好ましくない。
尚、底壁部２に配置される複数のウェル４が平面六方格子状の配列ではなく、縦横等間隔に配列された四方格子状の場合（図示せず）においても、隣り合うウェル４間の距離寸法ｄ３（隣り合うウェルの外周線間（内周面間）における、前記ウェル４の中心Ｏ２を結ぶ中心線上Ｌ２の距離寸法ｄ３）は、１０μｍ以上５０μｍ以下の範囲に形成される。
【００４４】
また、前記側壁部３の内周面３ａと底壁部２上面との境界線６上には、少なくとも１つの（図１では３つの）ウェル４が設けられている。
このように前記境界線６上に少なくとも１つのウェル４が設けられることで、リング状の細胞凝集体は分断あるいは阻止され、前記リング状の細胞凝集体の形成がより抑制される。
【００４５】
ここで、境界線６上に形成されたウェル４とは、図４に示すように、前記ウェル４の内周面（開口部外周線）が、前記底壁部２と側壁部３（内周面３ａ）との境界線６に接した位置に配置されたウェル４を含むものである。
このように前記ウェル４が境界線６に接した位置に配置されている場合にも、前記ウェル４により細胞凝集体は分断され、リング状の細胞凝集体が抑制される。
【００４６】
また、境界線６上に形成されたウェル４には、図５に示すように、境界線６を跨ぎ、側壁部３へのウェル４の内周面（開口部外周線）が入り込んだウェル４を含むものである。
前記ウェル４が前記側壁部３への所定寸法入り込んだ場合にも、該ウェル４により細胞凝集体は分断され、リング状の細胞凝集体を抑制することができる。
【００４７】
ここで、側壁部３の水平寸法Ｄは、ウェル４の開口部外周線の側壁部３への入り込み寸法（入り込み量ｄ１）の２倍以上の長さを有することが好ましい。
尚、ウェル４の側壁部３への入り込み量ｄ１は、底壁部２の中心Ｏ１とウェル４の中心Ｏ２を結ぶ線Ｌ１と境界線６との交点から、底壁部２の中心Ｏ１とウェル４の中心Ｏ２を結ぶ線上の最も側壁部３への入り込んだウェル４の外周線（内周面）まで距離をいう。
また、側壁部３の水平寸法Ｄとは、図５（ｂ）に示すように、傾斜部の水平方向での幅寸法をいう。
【００４８】
ここで、側壁部３の水平寸法Ｄが、側壁部３への入り込み寸法（入り込み量ｄ１）の２倍未満の場合には、側壁部に囲まれたウェル４内に細胞混濁液中の細胞が集まりにくく、前記ウェル４内の細胞凝集体が他のウェル４内の細胞凝集体よりも小さくなり、均一な細胞凝集体が生成し難い。
尚、前記ウェル４が、図６（ａ）に示すように側壁部３の上面３ｂに位置する場合には、細胞播種時に、間葉系幹細胞を含んだ培地が側壁部から毀れる可能性が高く、ウェル４内で均一なサイズの細胞凝集体を形成することができなくなるため、好ましくない。
また、図６（ｂ）に示すように、ウェル４が前記境界線６を跨ぎ、側壁部３への入り込んだウェル４の内周面が側壁部３の傾斜角と略同一の角度の傾斜面を有し、前記ウェル４の内周面から側壁部３の内周面に連続的に繋がる場合にも、前記ウェル４の内部形状が他のウェル４の内部形状と異なるため、好ましくない。このようにウェル４の内部形状が他のウェル４の内部形状と異なる場合には、均一な細胞凝集体を得るのが困難となる。
【００４９】
また、境界線６上に配置されるウェル４は、図７（平面図）に示すように、底壁部２上面の中心を通る複数の直線７と前記境界線６との交点上に配置され、前記側壁部３と前記底壁部２との境界線上に、少なくとも６個のウェル４が形成されるのが好ましい。
前記ウェル４の夫々の中心Ｏ２は、前記底壁部２の中心を通る複数の直線７と、前記側壁部３と前記底壁部２との境界線６との交差点上に配置され、前記境界線６上で隣り合う２つのウェル７の中心Ｏ２を通る前記直線のなす角θ２は、６０°以下となされる。
【００５０】
この場合、前記境界線６上に、少なくとも６つのウェル４が設けられることになり、前記境界線６に沿って存在する細胞が、境界線６上に設けられたウェル６に移動しやすくなる。このため、前記境界線６付近におけるリング状の細胞凝集体の形成を確実に抑制することができ、ウェル４中に形成される細胞凝集体の大きさの均一性を向上させることができる。
【００５１】
尚、図７においては、前記境界線６上を除き、底壁部２上面に形成される複数のウェル４については図示を省略している。また複数のウェル４は、隣り合う一のウェル４の開口部外周線から他のウェル４の開口部外周線に至る、前記ウェル４の中心を結ぶ中心線上の距離寸法が１０μｍ以上５０μｍ以下に形成されている。
【００５２】
このようにして形成された細胞培養担体１を用いて、培養を行う場合には、図８に示すように、プラスチックス製のケース１０内に配置する。
その後、図９に示すように、ケース１０内に間葉系幹細胞を培養するための第１の培養液（培地）１１を入れ、所定時間静置する。所定時間静置すると、図１０に示すように、毛細管現象によって、第１の培養液（培地）１１は細胞培養担体１の気孔に入り込み、ウェル４の開口部の高さまで達する。
【００５３】
この第１の培養液（培地）１１の種類は、特に限定されるものではないが、間葉系幹細胞の培養においては、例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好ましい。さらに、この培地に、ＦＢＳ（ウシ血清）、抗生物質等の細胞を維持するのに必要な物質が添加される。また、間葉系幹細胞を細胞治療のツールとして用いる場合は、市販されている無血清培地を用いることがより好ましい。
【００５４】
次に、図１１に示すように、未分化の間葉系幹細胞Ｃと前記間葉系幹細胞の栄養分を含む第２の培養液１２を底壁部２上面に滴下して、間葉系幹細胞Ｃを播種し、所定時間静置する。
このようにして、間葉系幹細胞Ｃを培養液１２に懸濁させた状態で前記担体１の上面に滴下して播種することにより、図１２に示すように、間葉系幹細胞Ｃに負荷なく、細胞培養担体１の底壁部２に沈降させることができ、前記ウェル４内でのスムーズな凝集化を達成することができる。
【００５５】
前記細胞培養担体１に播種する間葉系幹細胞数は、担体１ｃｍ２あたり１×１０４個以上１×１０６個以下であることが好ましい。
このような密度で間葉系幹細胞Ｃを播種することにより、前記細胞培養担体１を用いて、所望サイズの３次元細胞凝集体をより効率的に培養することができる。
【００５６】
そして、図１３に示すように、更に、ケース１０内に間葉系幹細胞を培養するための第１の培養液（培地）１１を入れ、所定時間静置する。
これにより、細胞培養担体１の底壁部２に堆積していた間葉系幹細胞Ｃが、図１４に示すようにウェル４内に落下し、ウェル４内で細胞の凝集化が進行し、細胞凝集体が形成される。
【００５７】
即ち、上記の第２の培養液１１の滴下による播種工程においては、ウェル内外を問わず、担体１表面のあらゆる箇所に細胞が付着しているが、図１３に示す工程において、第１の培養液１１中に細胞培養担体１全体を浸漬させて、好ましくは２４時間〜７２時間静置することにより、図１４に示すようにウェル４外の底壁部２上面に付着していた細胞が、細胞培養担体１から離脱することなく、ウェル４内に移動し、ウェル４内で細胞凝集体を形成する。
【００５８】
その後、図１５に示すように、ケース１０内及び細胞培養担体１内の培養液をアスピレータ（図示せず）で吸い取った後、図１６に示すように、ケース１０内の細胞培養担体１内に間葉系幹細胞Ｃを軟骨に分化誘導する低分子化合物やたんぱく質を含んだ第３の培養液１３を入れる。
このように、間葉系幹細胞Ｃの培養に用いた細胞培養担体１のままで、培養液を変えることにより、ウェル４内において、間葉系幹細胞Ｃから軟骨細胞への分化誘導を行うことができる。
【００５９】
そして、図１７に示すように、凝集した間葉系幹細胞Ｃが軟骨細胞１４に分化する。
また、前記第３の培養液１３は、凝集化した間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導するための培地であり、基本培地としてはＤＭＥＭを使用することができ、適宜改良して用いてもよい。また、間葉系幹細胞から軟骨、脂肪、骨芽細胞に誘導する分化誘導培地が市販されており、これらも使用可能であることはいうまでもない。
【００６０】
最後に、図１８に示すように、第３の培養液１３を排出後、軟骨細胞１４を各ウェル４から取り出し、収集する。
【００６１】
以上のように、本実施に係る実施の形態によれば、間葉系幹細胞を均一な形状で凝集化させ、分化状態が均一な細胞凝集体を高確率で得ることができる。
具体的には、細胞培養担体が容器状に形成されているため、従来のようにプラスチック容器と担体とを別体に形成した場合に生じる隙間が生じないため、各ウェル間での細胞濃度を均一にすることができる。また、所定の平均気孔径、所定の気孔率のセラミックス多孔体から構成されているため、セラミックス粒子が混入することなく、培養した細胞を三次元状に凝集させることができる。更に、側壁部の内周面が前記底壁部上面に対して、所定角度の傾斜角をもって上方に行くにしたがって開拡するように形成されているため、リング状に間葉系幹細胞塊が形成されるのを抑制することができる。
【００６２】
また、前記底壁部の上面が所定の表面状態に形成されているため、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着せず、球状を維持し、最終的に最寄のウェルに進入させることができる。
更に、前記複数のウェルの開口部は均一の径を有する円形形状であると共に、前記ウェルの底部の直径が所定の寸法に形成され、前記ウェルの底部の断面形状が凹状に湾曲した曲面形状に形成されているため、得られる間葉系幹細胞凝集体の大きさをより均等になすことができ、かつ各細胞の均質性が高い間葉系幹細胞凝集体を得ることができる。
【００６３】
また、前記複数のウェルのうち少なくとも一つのウェルが、前記底壁部と前記側壁部との境界線に接した位置に形成され、あるいは前記境界線を跨ぎ、前記側壁部の水平寸法が前記側壁部への前記ウェルの入り込み寸法の２倍以上の長さを有しているため、底壁部と側壁部との境界線近傍の細胞を前記ウェル内に落下させることができ、リング状の間葉系幹細胞凝集体の形成を抑制することができる。
また、隣り合うウェルの開口部外周線間における、前記ウェルの中心を結ぶ中心線上の距離寸法が所定の長さに形成されているため、ほぼすべての間葉系幹細胞を底壁部に接着させず、ウェル内部に進入させることができる。
【００６４】
また、記側壁部と前記底壁部との境界線上に、少なくとも６個のウェルが形成され、少なくとも６個のウェルの夫々の中心は、前記底壁部上面の中心を通る複数の直線と、前記側壁部と前記底壁部との境界線との交差点上に配置され、前記境界線上で隣り合う２つのウェルの中心を通る前記直線のなす角は、６０°以下とすることで、前記側壁部と前記底壁部に境界線近傍に生じるリング状の細胞凝集体の形成をより確実に、抑制することができる。また、前記底壁部の上面に形成された複数のウェルは、平面六方格子状に配列されていることにより、全ての隣り合うウェル間の距離が、略均等となり、形成される細胞の大きさの均一性を向上することができる。
【実施例】
【００６５】
本発明に係る細胞培養担体について、実施例に基づきさらに説明する。本実施例では、前記実施の形態に示した細胞培養担体を製造し、実験を行い、検証を行った。
【００６６】
［実験１］
実験１では、図１に示す形状（容器状）の細胞培養担体を、特開２０１２−５０４２６号（特許文献１）に示された製造方法により、底壁部上面に対する側壁部の内周面の傾斜角と、ウェルが底壁部と側壁部との境界線を跨ぐ個数等を条件にして、ジルコニアセラミックス焼結体により製造した。
尚、本発明の細胞培養担体の基材となるセラミックスの平均気孔径、気孔率、及び複数のウェルを有する底壁部と側壁部を備えた容器状とした場合の前記底壁部上面の２乗平均粗さＲｑと長さ１μｍあたりの線密度、並びに前記ウェルの形状（寸法、間隔）、前記側壁部の水平寸法、テーパ角度（傾斜角度）の制御は、セラミックス原料の配合粒度、鋳込条件（鋳型の材質、形状等）、乾燥・焼成条件（温度、時間、雰囲気等）を適宜、選択組み合わせることで行った。
具体的には、底壁部の上面の２乗平均粗さＲｑ、長さ１μｍあたりの線密度、セラミックス焼結体の平均細孔径、気孔率、ウェル開口径、深さ、隣り合うウェルの内周面間におけるウェルの中心を結ぶ中心線上の距離寸法を表１に示す条件とした。また、ウェルの底部の形状は図２（ａ）に示す形状とし、ウェルの個数は実施例１〜４では２００個、実施例５では２５００個、実施例６では１２５個とした。また、底壁部と側壁部との境界線を跨ぐウェルは、ウェルの中心が底壁部と側壁部との境界線上に位置するように配置した。また、側壁部の水平寸法をウェルの開口部の外周線の側壁部への入り込み寸法の１．５倍〜２．５倍とした。尚、実施例６にあっては、ウェルの外周線（内周面）が底壁部と側壁部との境界線に接するように、ウェルを配置した。
【００６７】
まず、上記のようにして得られた細胞培養担体を図８に示したように、プラスチックス製のケース内に配置する。
その後、図９に示すように、ケース内に間葉系幹細胞を培養するための第１の培養液（培地）を入れ、３７℃で６時間静置する。第１の培養液（培地）としては、ＭＳＣＧＭ−ＣＤ，ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いた。
【００６８】
次に、図１１に示すように、細胞培養担体に、ヒト間葉系幹細胞を含んだ（４×１０５個）第２の培養液として、ＭＳＣＧＭ−ＣＤ，ＢｕｌｌｅｔＫｉｔを入れ、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で，６時間静置し、培養した。
このときの状態を図１９に示す。図１９は底壁部２に焦点を合わせた写真である。細胞培養担体に播種したヒト間葉系幹細胞は、培養６時間静置後沈降し、ウェル内外に接着していることを確認した。
【００６９】
そして、第１の培養液を、細胞培養担体上面を覆うようにケース内に入れ、７２時間静置した。その後、ウェル内に凝集された細胞凝集体が形成される。このときの状態を図２０、図２１に示す。図２０は底壁部に焦点を合わせた写真であり、図２１は、ウェル内に焦点を合わせた写真である。
細胞培養担体に播種したヒト間葉系幹細胞は、培地添加後７２時間以内にウェル内に移動し、ウェル外（底壁部）に接着していた細胞は消失し、ウェル底部で細胞凝集体を形成することを確認した。
【００７０】
その後、図１５に示すように、ケース内及び細胞培養担体内の培養液をアスピレータで吸い取った後、図１６に示すように、ケース内の細胞培養担体内に間葉系幹細胞を軟骨に分化誘導する低分子化合物やたんぱく質を含んだ第３の培養液を入れる。第３の培養液としてＴＧＦβ―３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）を用い、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で、２１日間培養した。
【００７１】
そして、図１７、図１８に示すように、凝集した間葉系幹細胞１３が軟骨細胞１５に分化する。このときの状態を図２２に示す。図２２は、ウェル内に焦点を合わせた写真である。
細胞培養担体のウェル内で均一な形状の軟骨凝集体が形成されていることを確認した。
【００７２】
そして、細胞を固定化処理、サフラニン０染色後、マイクロスコープで観察して各ウェル内で形成される細胞の大きさの均一性の達成率について検証した。その結果を表１に示す。ここで、達成率とは、各形状の細胞培養担体３０枚に間葉系幹細胞を播種後、軟骨細胞に分化誘導した際、各担体底壁部に配列するウェルにおいて、均一サイズの細胞凝集体が形成されるウェルが８０％以上である細胞培養担体の割合である。尚、表１中の達成率は、小数点以下１桁を四捨五入した数字を記入している。
【００７３】
【表１】
2014204671.tif 000003
【００７４】
比較例１は、容器状の細胞培養担体の側壁部内周面の傾斜角度を９０°としたものであり、上述の従来技術の課題で説明したリング状の細胞凝集体が形成され、また薄片状の軟骨細胞に分化される現象（図２４、図２５〜図２９参照）が生じ、前記達成率が３３％と非常に低い値となった。
【００７５】
また、表１に示すように、側壁部の内周面の傾斜角が、１００°〜１３５°、底壁部と側壁部との境界線と接するウェルの個数が１個以上、あるいは底壁部と側壁部との境界線を跨ぐウェルの個数が１個以上の範囲において、良好な達成率（７０％以上の達成率）を得ることができた。更に、側壁部の内周面と底壁部上面との境界線上で隣り合うウェルの円弧の中心角が６０°以下の範囲において、良好な達成率（９０％以上の達成率）を得ることができた。
【００７６】
［実験２］
実験２は、比較例２として、側壁部の水平寸法Ｄが前記側壁部への前記ウェルの入り込み寸法ｄ１の１．５倍とした。その条件は、実施例１と同様にした。
この実験において、比較例２は、実施例１に対し、側壁部への入り込んだウェル内の細胞凝集体が他のウェル内の細胞凝集体よりも小さくなり、均一な細胞凝集体が生成し難いことが認められた。
したがって、側壁部の水平寸法Ｄが前記側壁部への前記ウェルの入り込み寸法ｄ１の２倍以上が好ましいことが判明した。
【００７７】
以上の実験１、２の結果より、本発明に係る細胞培養担体によれば、間葉系幹細胞を均一な形状で凝集化させ、分化状態が均一な細胞凝集体を高確率で得ることができることが確認された。
【符号の説明】
【００７８】
１      細胞培養担体
２      底壁部
３      側壁部
３ａ    内周面
４      ウェル
６      境界線
１０      ケース
１１      第１の培養液（培地）
１２      第２の培養液（培地）
１３      第３の培養液（培地）
１４      軟骨細胞
θ１    傾斜角
ｄ１    側壁部へのウェルの入り込み量
【図１】
2014204671.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014204671.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2014204671.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
2014204671.tif 000018
【図１６】
2014204671.tif 000019
【図１７】
2014204671.tif 000020
【図１８】
2014204671.tif 000021
【図２３】
2014204671.tif 000022
【図２４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
2014204671.tif 000029
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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