(57)【要約】【課題】本発明の課題は、乳癌の温存療法後における局所再発リスクを予測できる予測診断薬を提供することにある。【解決手段】乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるための診断薬であって、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔからなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、診断薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるための診断薬であって、
ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔからなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、診断薬。
【請求項２】
上記タンパク質及び／又はポリペプチドが、抗体及び／又はその断片である、請求項１に記載の診断薬。
【請求項３】
乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるためのキットであって、請求項１又は２に記載の診断薬を含む、キット。
【請求項４】
上記診断薬が、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の組合せのいずれかの２つの遺伝子の翻訳産物のそれぞれを特異的に検出できる２つの診断薬を含む、請求項３に記載のキット：
（ｉ）ＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００、並びに
（ｉｉ）ＥＢＬ５及びＣ−Ｍｅｔ。
【請求項５】
（Ａ）乳癌乳房温存療法を受けた患者から採取した生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔから成る群から選択される少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルをそれぞれ決定すること；並びに
（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測すること、
を含む、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する方法。
【請求項６】
工程（Ａ）における上記少なくとも２つの遺伝子が以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の組合せの何れかである、請求項５に記載の方法：
（ｉ）ＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００、並びに
（ｉｉ）ＥＢＬ５及びＣ−Ｍｅｔ。
【請求項７】
上記生体試料が乳房組織である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
工程（Ａ）において、上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが、それら遺伝子の翻訳産物をそれぞれ特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを用いた免疫組織化学法により決定される、請求項５から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記タンパク質及び／又はポリペプチドが抗体及び／又はその断片である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（Ａ）において、上記患者の非癌性乳房組織における上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物それぞれの発現レベルを対照として上記生体試料における上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定し、かつ工程（Ｂ）において、以下の判断基準により上記患者の乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する、請求項５から９の何れか１項に記載の方法：
（ｉ）工程（Ａ）において決定した上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルの全てが、対応する対照の発現レベルよりも高い場合には、上記患者は乳癌の局所再発リスクが高いと予測する；又は
（ii）工程（Ａ）において決定した上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルのうち一つでも、対応する対照の発現レベルよりも低いか、若しくは同等である場合には、上記患者は乳癌の局所再発リスクが低いと予測する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるための診断薬及びキット、並びに乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、早期乳癌の治療においては、乳房温存療法（Breast conservation therapy;ＢＣＴ）が広く承認された標準的な治療方法として確立されている（非特許文献１−３）。乳房温存療法は、腫瘍摘出術、及びそれに続く乳房全体への放射線照射療法、並びに化学療法やホルモン療法等の補助療法からなる治療法である。乳房温存療法は、患者の生活の質（Quality of life）をも考慮して、文字通り乳房を可能な限り温存することを目的とするものである。その治療法は、乳腺内の視認可能な病巣部だけを外科手術により切除し、組織生検により病巣部の取り残しが無いことを確認しつつ、細胞レベルで取り残した病巣部位は術後の放射線照射により根絶し、さらに乳房以外に存在し得るかもしれない微小転移巣は補助療法により根絶すると云う原理に基づく。しかしながら、このような原理に基づく乳癌温存療法であっても、８．８〜２０％の患者に乳房内局所再発が見られるのが現状である（非特許文献１−３）。
【０００３】
過去の報告によれば、年齢、Ｋｉ−６７抗原レベル、細胞増殖の核マーカー等の幾つかの因子が、乳癌温存療法後の局所再発に関するリスク因子として確認されている（非特許文献４）。さらに、乳癌の遺伝子発現シグナチュアに基づいて分類される、乳癌の５つの分子サブタイプ（即ち、"Luminal A-like"、"Luminal B-like"、"HER2-enriched"、"basal-like"及び"normal-like"）に応じて、乳癌温存療法後の再発頻度が変化することも報告されている（非特許文献５及び６）。さらに、外科手術による切除断端の状態(margin status)、結節状態（nodal status）、及び腫瘍悪性度（tumor grade）も、乳癌温存療法後の局所再発の頻度に相関することが報告されている（非特許文献７及び８）。
【０００４】
さらに、乳癌の遠隔転移及び全生存率の予測に関する臨床病理学的評価に有用であるとされる、７０遺伝子のクラスターからなる遺伝子発現シグナチュアに基づく乳癌再発診断法「マンマプリント」"MammaPrint"(Agendia社、アムステルダム、オランダ)が開発されており、この診断法は米国食品医薬品局に承認されている（非特許文献９、１０及び１１）。一方、「マンマプリント」では局所再発は予測できないこと（正答率18%）も示されている(Kreike et al., Clin Cancer Res 15: 4181-4190, 2009)。
【０００５】
遺伝子発現プロファイルのデータセットを解析することにより、傷応答性シグナチュア（wound-response signature）（非特許文献１２）が、乳癌温存療法後の局所再発に有意に相関することも報告されている（非特許文献１３）。しかし、このシグナチュアはその後、同一研究グループにより否定されている (Kreike et al., Clin Cancer Res 15: 4181-4190, 2009)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fisher B, Anderson S, Bryant J, et al: Twenty-year follow-up of a randomized trial comparing total mastectomy, lumpectomy, and lumpectomy plus irradiation for the treatment of invasive breast cancer. N Engl J Med 347:1233-41, 2002
【非特許文献２】Veronesi U, Cascinelli N, Mariani L, et al: Twenty-year follow-up of a randomized study comparing breast-conserving surgery with radical mastectomy for early breast cancer. N Engl J Med 347:1227-32, 2002
【非特許文献３】Van Dongen JA, Voogd AC, Fentiman IS, et al: Long-term results of a randomized trial comparing breast-conserving therapy with mastectomy: European Organization for Research and Treatment of Cancer 10801 trial. J Natl Cancer Inst 92:1143-50, 2000
【非特許文献４】Elkhuizen PH, Voogd AC, van den Broek LC, et al: Risk factors for local recurrence after breast-conserving therapy for invasive carcinomas: a case-control study of histological factors and alterations in oncogene expression. Int J Radiat Oncol Biol Phys 45:73-83, 1999
【非特許文献５】Nguyen PL, Taghian AG, Katz MS, et al: Breast cancer subtype approximated by estrogen receptor, progesterone receptor, and HER-2 is associated with local and distant recurrence after breast-conserving therapy. J Clin Oncol 26:2373-8, 2008
【非特許文献６】Millar EK, Graham PH, O'Toole SA, et al: Prediction of local recurrence, distant metastases, and death after breast-conserving therapy in early-stage invasive breast cancer using a five-biomarker panel. J Clin Oncol 27:4701-8, 2009
【非特許文献７】Jones HA, Antonini N, Hart AA, et al: Impact of pathological characteristics on local relapse after breast-conserving therapy: a subgroup analysis of the EORTC boost versus no boost trial. J Clin Oncol 27:4939-47, 2009
【非特許文献８】Kunkler IH, Kerr GR, Thomas JS, et al: Impact of screening and risk factors for local recurrence and survival after conservative surgery and radiotherapy for early breast cancer: results from a large series with long-term follow-up. Int J Radiat Oncol Biol Phys 83:829-38, 2012
【非特許文献９】van de Vijver MJ, He YD, van't Veer LJ, et al: A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 347:1999-2009, 2002
【非特許文献１０】van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al: Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 415:530-6, 2002
【非特許文献１１】Buyse M, Loi S, van't Veer L, et al: Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 98:1183-92, 2006
【非特許文献１２】Chang HY, Nuyten DS, Sneddon JB, et al: Robustness, scalability, and integration of a wound-response gene expression signature in predicting breast cancer survival. Proc Natl Acad Sci U S A 102:3738-43, 2005
【非特許文献１３】Nuyten DS, Kreike B, Hart AA, et al: Predicting a local recurrence after breast-conserving therapy by gene expression profiling. Breast Cancer Res 8:R62, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の通り、非特許文献４〜８には、乳癌温存療法後の局所再発に関するリスク因子各種が記載されているものの、これらリスク因子に基づいて臨床の現場に応用出来る乳癌温存療法後の局所再発リスクを予測することは出来なかった（上述）。
【０００８】
さらに、非特許文献９〜１１に記載される乳癌再発診断法は、乳癌の再発一般を対象にするものであって、特に乳癌温存療法後における局所再発の予測を可能にする技術では無い。
さらに、非特許文献１２及び１３に記載の技術については、それ以降、大規模な患者群に基づく臨床試験の調査もされておらず、その有用性は定かではない。
【０００９】
そこで、本発明の課題は、乳癌の温存療法後における局所再発リスクを予測できる予測診断薬並びに予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ａｒｆ６経路に属する特定の遺伝子群のうち少なくとも２以上の遺伝子の共発現が乳癌温存療法後における局所再発に有意に相関することを見出した。本発明は、係る知見により完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は以下に関する。
【００１２】
〔１〕  乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるための診断薬であって、
ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔからなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、診断薬。
〔２〕  上記タンパク質及び／又はポリペプチドが、抗体及び／又はその断片である、〔１〕に記載の診断薬。
〔３〕  乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるためのキットであって、〔１〕又は〔２〕に記載の診断薬を含む、キット。
〔４〕  上記診断薬が、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の組合せのいずれかの２つの遺伝子の翻訳産物のそれぞれを特異的に検出できる２つの診断薬を含む、〔３〕に記載のキット：
（ｉ）ＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００、並びに
（ｉｉ）ＥＢＬ５及びＣ−Ｍｅｔ。
〔５〕  （Ａ）乳癌乳房温存療法を受けた患者から採取した生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔから成る群から選択される少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルをそれぞれ決定すること；並びに
（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測すること、
を含む、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する方法。
〔６〕  工程（Ａ）における上記少なくとも２つの遺伝子が以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の組合せの何れかである、〔５〕に記載の方法：
（ｉ）ＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００、並びに
（ｉｉ）ＥＢＬ５及びＣ−Ｍｅｔ。
〔７〕  上記生体試料が乳房組織である、〔５〕又は〔６〕に記載の方法。
〔８〕  工程（Ａ）において、上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが、それら遺伝子の翻訳産物をそれぞれ特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを用いた免疫組織化学法により決定される、〔５〕から〔７〕の何れかに記載の方法。
〔９〕  上記タンパク質及び／又はポリペプチドが抗体及び／又はその断片である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕工程（Ａ）において、上記患者の非癌性乳房組織における上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物それぞれの発現レベルを対照として上記生体試料における上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定し、かつ工程（Ｂ）において、以下の判断基準により上記患者の乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する、〔５〕から〔９〕の何れかに記載の方法：
（ｉ）工程（Ａ）において決定した上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルの全てが、対応する対照の発現レベルよりも高い場合には、上記患者は乳癌の局所再発リスクが高いと予測する；又は
（ii）工程（Ａ）において決定した上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルのうち一つでも、対応する対照の発現レベルよりも低いか、若しくは同等である場合には、上記患者は乳癌の局所再発リスクが低いと予測する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、乳癌温存療法後における局所再発リスクを精度良く予測可能である。その結果、乳癌局所再発リスクを考慮した治療計画の決定が可能になり、乳癌温存療法後における局所再発を効果的に防止することが可能となる。また、従来の乳癌温存療法においては病変部位の生検組織試料に基づく病理診断が為されている。本発明によれば、その病理診断と同時に、それら生検組織試料において所定の遺伝子翻訳産物の発現を検出すれば実施可能である。そのため、本発明によれば、患者への負担も少なく、かつ簡便に乳癌温存療法後における局所再発リスクを予測することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例において取得した免疫組織化学染色の顕微鏡写真を示す図である。
【図２】実施例において取得した免疫組織化学染色の顕微鏡写真を示す図である。
【図３】ＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００の共発現と乳癌乳房温存療法の完了から局所再発までの期間との相関関係を調べた結果を示す図である。
【図４】ｃ−ＭＥＴ及びＥＢＬ５の共発現と乳癌乳房温存療法の完了から局所再発までの期間との相関関係を調べた結果を示す図である。
【図５】各種パラメータと乳癌乳房温存療法の完了から局所再発までの期間との相関関係を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
診断薬
本発明の一の態様によれば、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるための診断薬であって、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔからなる群から選択されるいずれか１つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、診断薬が提供される。
【００１６】
本発明において、「乳癌乳房温存療法」とは、乳房温存療法腫瘍摘出術とそれに続く乳房全体への放射線照射療法を含む治療法である。より具体的には、乳癌乳房温存療法は、乳腺内の視認可能な病巣部だけを外科手術により切除し、組織生検により病巣部の取り残しが無いことを確認しつつ、上記外科手術後に病巣側乳房全体に予防的処置としての放射線照射療を行う療法であり得る。加えて、乳癌乳房温存療法は、任意に化学療法やホルモン療法等の補助療法も含み得る。乳癌乳房温存療法は、文字通り乳房を温存することにより患者の生活の質（Quality of life）を向上させることを目的とするものであり、当該技術分野において早期乳癌に対して広く承認された標準的な治療方法である。
【００１７】
本発明において、「局所再発リスク」とは、乳癌乳房温存療法を受けた患者が、当該治療の完了後に乳房内に癌を再発するリスクを意味する。局所再発リスクは、乳癌乳房温存療法を受けた後、例えば、５年以内の早期再発リスクを主に意味する。但し、乳癌乳房温存療法を受けた後５年を超え、１０年以内の中期再発リスク、あるいは１０年を超える後期再発リスクを含み得る。
【００１８】
「局所再発リスクの予測」の方法については、「予測方法」において後述する。
本発明の治療薬が、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いることができることは、後述する実施例で示される通り、乳癌乳房温存療法を受け、かつその後乳癌が局所再発した患者群において、乳房組織で特定遺伝子の組合せの翻訳産物発現が見られる患者は、乳房組織で当該特定遺伝子の組合せの翻訳産物発現が見られない患者と比較して、統計的に乳癌乳房温存療法後、比較的早期（例えば、５年以内）に乳癌が局所再発する事が統計的有意さを持って示される。特定遺伝子の組合せとは、具体的には、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−ＭＥＴから成る群から選択される少なくとも２つの遺伝子であり、特にＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００の組合せ、又はＥＢＬ５及びｃ−Ｍｅｔの組合せの組合せで翻訳産物発現が見られる患者は統計的有意さを持って局所再発するリスクが高い。即ち、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する方法について後述する通り、乳房組織において上記遺伝子の組合せの翻訳産物の発現が一定レベルで認められる場合、当該患者は乳癌乳房温存療法後に乳癌を早期に局所再発するリスクが高いと予測される。このように、本発明において「乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測」とは、乳房組織における上記特定遺伝子の組合せの翻訳産物の発現を検出することを前提としていることから、当該予測に用いるための本発明の診断薬は、具体的にはそれら遺伝子翻訳産物の検出に用いるための試薬であって、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔからなる群から選択されるいずれか１つの遺伝子の翻訳産物を特定的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有するものである。
【００１９】
遺伝子ＡＭＡＰ１（ＧｅｎｅＩＤ：５０８０７）は、癌浸潤におけるＡｒｆ６の下流エフェクターである。
遺伝子ＧＥＰ１００（ＧｅｎｅＩＤ：９９２２）は、癌浸潤におけるＡｒｆ６活性化因子である。
遺伝子ＥＰＢ４１Ｌ５（略称ＥＢＬ５）（ＧｅｎｅＩＤ：５７６６９）は、癌浸潤におけるＡＭＡＰ１の結合パートナーであり、浸潤仮足形成に必須である。
遺伝子ｃ−Ｍｅｔ（ＧｅｎｅＩＤ：４２３３）は、癌浸潤においてＴＧＦβ１によってトランス活性化され、ＧＥＰ１００を活性化する細胞表面受容体である。自身のリガンドである、ＨＧＦによっても直接活性化され、浸潤を促す。
【００２０】
上記遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドとは、上記遺伝子のうち一の遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得るものであれば特に限定されるものでは無いが、例えば、当該翻訳産物に対する抗体及び／又はその断片が挙げられる。抗体及び／又はその断片としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及びポリペプチドの調製方法については、遺伝子翻訳産物に対する特異的結合を保持し得る限り、どのような方法も採用し得るが、当該遺伝子翻訳産物となるタンパク質及び／又はその断片を抗原として、公知の手法により所望のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等を調製することが出来る。
【００２１】
さらに、本発明の診断薬においては、単一の診断薬に、上記遺伝子のうち１つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質又はポリペプチド１つのみが含まれていてもよいし、或いは上記遺伝子の翻訳産物それぞれをそれぞれ特異的に認識可能な２以上のタンパク質及び／又はポリペプチドが含まれていてもよい。加えて、上記タンパク質及び／又はポリペプチドは、遺伝子翻訳産物の検出のために、標識物質で標識されていてもよく、標識物質としては、蛍光物質（例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、並びにフルオロセイン等の蛍光低分子化合物を含む）等が挙げられる。但し、これら標識物質による標識を有する物に限定される意図ではない。本発明の診断薬において上記タンパク質及び／又はポリペプチドが標識されていない場合には、当該遺伝子の翻訳産物の最終的な検出には、それらタンパク質及び／又はポリペプチド（一次抗体）に結合する二次抗体を用いたシステムを用いることができる。このような二次抗体を用いたシステムには市販の検出キットがあり、例えば、一次抗体に対する二次抗体がペルオキシダーゼで標識されており、試料中で目的遺伝子翻訳産物に特異的に結合した一次抗体にさらに上記二次抗体を特異的に結合させ、ペルオキシダーゼの発色基質となる3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドを当該試料に添加して発色を観察することにより遺伝子翻訳産物の検出することが出来る。さらに、本発明において、１つの診断薬に、上記遺伝子の翻訳産物それぞれをそれぞれ特異的に認識可能な２以上のタンパク質及び／又はポリペプチドが含まれていている場合には、例えば、それら２以上のタンパク質及び／又はポリペプチドをそれぞれ異なる波長の蛍光を発する異種の蛍光物質で標識しておけば、同一試料において目的の遺伝子翻訳産物それぞれを検出することが出来る。
【００２２】
診断薬は、任意に、緩衝剤、防腐剤、凍結防止剤等を含み得る。緩衝剤としては、例えば、トリス塩酸塩、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等を挙げることかできる。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム等を挙げることができる。凍結防止剤としては、例えば、グリセロール等を挙げることができる。
【００２３】
本発明の診断薬は、後述する乳癌温存療法後の局所再発リスクを予測する方法の工程（Ａ）において、所定の遺伝子翻訳産物の発現レベルを決定するために当該遺伝子の翻訳産物を検出するのに用いることができる。
【００２４】
キット
本発明の別の態様によれば、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるためのキットであって、上述の診断薬を含む、キットが提供される。
【００２５】
本発明のキットは、以下の乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する方法を実施する上で用いられ得る試薬及び部材等の要素をキットとして提供するものであり、上記診断薬を含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明のキットにおいては、本発明の診断薬が、（１）単一の診断薬において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−ＭＥＴのうち１つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質又はポリペプチド１つのみが含まれることにより１つの遺伝子の翻訳産物の検出が可能である診断薬であってもよいし、（２）単一の診断薬においてそれら遺伝子の翻訳産物それぞれをそれぞれ特異的に認識可能な２以上のタンパク質及び／又はポリペプチドが含まれることにより当該単一の診断薬が上記複数の遺伝子翻訳産物の検出が可能である単一の診断薬であってもよい。さらに、本発明のキットにおいては、上記（１）の１つの遺伝子の翻訳産物の検出が可能である診断薬、及び／又は上記（２）の複数の遺伝子翻訳産物の検出が可能である単一の診断薬が含まれ得る。さらに本発明のキットに含まれる診断薬が一種類であろうと二種類であろうと、当該キットに含まれる診断薬により複数の遺伝子翻訳産物の検出を可能とする場合には、以下の（i）〜（ii）のいずれかの組合せの遺伝子の翻訳産物を検出できる診断薬であることが好ましい。
【００２７】
（i）ＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００、並びに
（ii）ＥＢＬ５及びｃ−Ｍｅｔ。
【００２８】
本発明のキットには、上記診断薬に加えて、ブロッキング試薬、診断薬に含まれるタンパク質及び／又はポリペプチド（抗体）の検出に用いるための標識化二次抗体、発色試薬、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する方法に関する実験プロトコルを記述した指示書等が任意に含まれ得る。ブロッキング試薬としては、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等を挙げることができる。
【００２９】
予測方法
本発明の別の態様によれば、以下の乳癌温存療法後の局所再発リスクを予測する方法が提供される。
（Ａ）乳癌乳房温存療法を受けた患者から採取した生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔから成る群から選択される少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルをそれぞれ決定すること；並びに
（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測すること、
を含む、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する方法。
【００３０】
本発明の方法において、「乳癌乳房温存療法」の定義は、上記した通りである。本発明の方法において、患者とは、上記の乳癌乳房温存療法を受けた患者である。
【００３１】
本発明の方法において、「生体試料」とは、上記乳癌乳房温存療法を受けた患者から採取された任意の生体試料である。生体試料は、乳房組織であることが好ましく、さらに、乳房組織としては、乳癌乳房温存療法の腫瘍摘出術の際に患者から摘出した乳癌病変部位の組織であってもよいし、病変部位が存在していた近傍の乳房組織であって腫瘍摘出術の後に採取した乳房組織もよい。但し、患者への負担を極力軽減し、かつ局所再発リスクの精度良い予測を達成する観点から、乳房組織は、乳癌乳房温存療法の腫瘍摘出術の際に患者から摘出した乳癌病変部位の組織であることが好ましい。
【００３２】
本発明の方法の工程（Ａ）においては、上記生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＢＬ５、及びｃ−Ｍｅｔから成る群から選択される少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルをそれぞれ決定する。これら遺伝子は、Ａｒｆ６経路に属する遺伝子である。以下の実施例で示される結果によれば、乳癌患者の乳房組織においてＡｒｆ６経路に属する遺伝子が組織レベルで発現し、Ａｒｆ６経路の稼働が推定される場合には、当該患者は相対的に乳癌乳房温存療法後に早期に局所再発するリスクが高いことが裏付けられている。従って、Ａｒｆ６経路に属する遺伝子のうちの少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物の発現レベルを決定し、それら二つの遺伝子の発現が確認された場合、乳癌乳房温存療法後の局所再発を促進するものと考えられるＡｒｆ経路の稼働が推定され、当該患者は早期に乳癌を局所再発する蓋然性が高いと判断し得ることから、本願発明の方法の工程（Ａ）では、Ａｒｆ経路に属する遺伝子から成る群から選択される少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルをそれぞれ決定する。
【００３３】
なお、ＧＥＰ１００、Ａｒｆ６、及びＡＭＡＰ１等の遺伝子群を含むＡｒｆ６経路が、乳癌の浸潤及び転移を促進するのに重要な役割を果たすことが報告されており、このＡｒｆ６経路に属する遺伝子のうち、ＧＥＰ１００及びＥＧＦＲ、或いはＡｒｆ６及びＡＭＡＰ１の組合せが共発現している場合、乳癌の悪性度及び浸潤度が高いことが示されている（Morishige M, Hashimoto S, Ogawa E, et al: GEP100 links epidermal growth factor receptor signalling to Arf6 activation to induce breast cancer invasion. Nat Cell Biol 10:85-92, 2008；Hashimoto S, Onodera Y, Hashimoto A, et al: Requirement for Arf6 in breast cancer invasive activities. Proc Natl Acad Sci U S A 101:6647-52, 2004；Onodera Y, Hashimoto S, Hashimoto A, et al: Expression of AMAP1, an ArfGAP, provides novel targets to inhibit breast cancer invasive activities. EMBO J 24:963-73, 2005）。加えて、Ａｒｆ６経路に属する遺伝子の高レベル発現が、乳癌乳房温存療法後の再発に相関する可能性があることが考えられ（ＪＭＴＯ,Newsletter, 2012年９月、No.14,p3-4;福井大学医学部ライフサイエンスイノベーション推進機構セミナー兼第３７１回学内セミナー（大学院セミナー）要旨：p53 mutation and TGFβ signaling culminate in cancer invasiveness via GEP100-Arf6-AMAP1 pathway）、そのうち、ＧＥＰ１００及びＥＧＦＲの共発現が、乳癌乳房温存療法後の再発に相関するか否かが、まず検討された（R. Kinoshitaら、International Journal of Radiation Oncology・Biology・Physics, Volume 84, Number 3S, Supplement 2012 Poster Viewing Abstracts, S227, 2026：Co-overexpression of GEP100 with EGFR correlates with early recurrence after breast conservation therapy (BCT)）。その結果、その後の詳細な検討も含め、ＧＥＰ１００及びＥＧＦＲの組合せ共発現では乳癌乳房温存療法後の局所再発を有意に予測できない事がわかり、かつＡｒｆ６経路に属するその他遺伝子が乳癌乳房温存療法後の局所再発に有意に相関することもこれ迄には明らかにされていない。
【００３４】
本発明方法の工程（Ａ）において、生体試料における上記所定の遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する方法としては、特に限定されるものでは無いが、具体的には、本発明の診断薬について上記した如く、検出の対象となる遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質又はポリペプチド（診断薬）を用いて当該遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定することが可能である。より具体的には、生体試料である組織切片において遺伝子翻訳産物の発現強度及び発現分布を正確に把握して発現レベルを決定出来ることから、特に、それらタンパク質及び／又はポリペプチド（診断薬）を用いた免疫組織化学法により当該遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定することが好ましい。なお、免疫組織化学法については、各種公知の手法が知られている。本発明においては、それら公知の手法を用いても良いし、或いは新たに開発された手法を用いてもよく、対象となる遺伝子翻訳産物の発現レベルを決定できるものである限り、特に限定されるものではない。
【００３５】
さらに、本発明においては、遺伝子翻訳産物の特異的な検出を確保するために、上記タンパク質及び／又はポリペプチドは、検出の対象となる遺伝子翻訳産物に対する抗体及び／又はその断片であることが好ましい。
【００３６】
さらに、本発明方法の工程（Ａ）において、本発明所定の少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルをそれぞれ決定するには、具体的には、生体試料において任意のタンパク質検出法で検出されたシグナル強度を一定の基準と比較することにより、本発明所定の遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定することが出来る。一定の基準の例としては、同一患者から採取した非癌性組織（特に、非癌性乳房組織）における本発明所定の遺伝子翻訳産物発現レベルを対照とする形態が挙げられる。この場合、具体的には、同一患者から採取した非癌性組織（特に、非癌性乳房組織）における本発明所定の遺伝子翻訳産物発現について同一のタンパク質検出法で検出されたシグナル強度と、対象生体試料における本発明所定の遺伝子翻訳産物のシグナル強度を比較し、本発明所定の少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルをそれぞれ決定することができる。さらに、「翻訳産物発現レベルを決定する」との具体的な形態としては、例えば、上記一定の基準又は対照と比較して対象生体試料における本発明所定の少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現のシグナル強度が「高い」、「同等」又は「低い」と判定することができる。或いは、例えば上記一定の基準又は対照におけるシグナル強度を基準として対象生体試料における本発明所定の少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現のシグナル強度をスコア化することが挙げられる。シグナル強度をスコア化については、例えば、対照試料における遺伝子翻訳産物のシグナル強度を０とし、そのシグナル強度と対照生体試料における遺伝子翻訳産物のシグナル強度を比較して、例えば、−１から３等の整数でスコア化することが出来る。
【００３７】
本発明方法の工程（Ｂ）においては、工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測する。
【００３８】
工程（Ｂ）において乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測するには、具体的には、工程（Ａ）に関し上記に説明した通り、上記一定の基準又は対照と比較により取得した「高い」、「同等」又は「低い」、或いはシグナル強度をスコア化した値に基づいて、乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクを予測することが出来る。より具体的には、対象生体試料における上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが「高い」と判断された場合には、当該患者は乳癌の局所再発リスクが高いと判断し、対象生体試料における上記少なくとも２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが「同等」又は「低い」と判断された場合には、当該患者は乳癌の局所再発リスクが低いと判断することが出来る。或いは、上記の通り遺伝子翻訳産物発現レベルをスコア化した形態を採用した場合には、予めスコアに局所再発リスクが「高い」、「低い」又は「中程度」等の判定基準を割り振っておき、上スコア化により得られた対象生体試料についてのスコアに基づいて乳癌の局所再発リスクを「高い」、「低い」又は「中程度」等と判定してもよい。さらに加えて、乳癌の局所再発リスクの予測は、「高い」、「低い」又は「中程度」のような結果を得るだけでなく、乳癌乳房温存療法後から乳癌を発症するリスクが５０〜９０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％等）である期間がどの程度であるかを判定することも含み得る。
【００３９】
治療又は予防方法
さらに、本発明の別の態様によれば、乳癌の再発を治療又は予防する方法が提供される。具体的には、乳癌の局所再発を治療又は予防する方法とは、上記乳癌温存療法後の局所再発リスクを予測する方法により得られた予測結果に基づいて、乳癌の再発を治療又は予防する方法である。
【００４０】
具体的には、本方法は、抗癌剤を用いた化学療法、ホルモン療法、放射線療法、外科的処置、食事療法、生活指導等、任意の乳癌の再発を治療又は予防し得る手段を含む。
【００４１】
本方法は、上記乳癌温存療法後の局所再発リスクを予測する方法により得られた予測結果に基づいて、乳癌の再発を治療又は予防する限り特に限定されるものではなく、上記乳癌温存療法後の再発リスクを予測する方法の方法工程を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
＜材料及び方法＞
（材料及び方法）
（１）患者集団
１９８８年から２００８年にかけて、北海道大学病院（日本国、北海道）において乳房温存手術を受け、その後、乳房全体への放射線照射治療を受けた４７９人の乳がん患者に関し、彼らの４８３の乳房について過去を遡って分析した。２０１０年の５月までに、追跡期間中央値５４か月で、２０人の患者において総計２０の再発が観察された。これら２０人の患者のうち、１９人の病理組織標本が解析に利用可能であった。ただ一人が、不全の最初の部位として乳房に再発を生じた。残りの一人において、放射線療法の完了後、最初の４か月で局所リンパ節に再発が生じ、かつ１８か月において乳房に再発が生じた。乳房における再発時期を１９人の患者における解析に用いた。
なお、本試験は、北海道大学の治験審査委員会によって承認されたものである。
【００４４】
（２）治療方法
８人の患者は、腫瘤摘出術を受け、８人の患者は乳房４／１切除術を受けた。１９人の患者のうち１６人（８４％）は、腋窩リンパ節郭清を受けており、その他３人（１６％）は、センチネルリンパ節生検を受けていた。ＴＮＭ分類（ＵＩＣＣ第５版）がcT3N1M0である患者１人は、トランツズマブ（trastuzumab）投与を含む術前化学療法を受けており、さらに手術後に、補助療法としてトランツズマブ投与を受けていた。１人の患者は、手術の間に化学療法を受けていた。１人の患者は、手術の間、及び手術の後に化学療法を受けていた。３人の患者は、放射線療法の後に化学療法を受けていた。５人の患者は放射線療法の後にホルモン療法を受けていた。全ての患者が、罹患側の乳房に全乳房接線照射を受けていた。１人の患者は、胸骨傍リンパ節及び鎖骨上リンパ節の部位に照射を受けていた。顕微鏡検査により完全な切除を受けた患者に対する処方線量は、１８回の照射において４５Ｇｙであり、顕微鏡検査により不完全な切除となった患者[切除断端陽性又は切除断端近接(close margin) (５ｍｍ未満)]の処方線量は、２０回の照射において５０Ｇｙであった。２００５年７月以来、５０歳未満の患者は、切除断端の状態に関わらず、２０回の照射において５０Ｇｙの照射を受けていた。
【００４５】
（３）組織標本
１９の病理標本は全て、広範な切除により得た外科的標本であった。１人の患者が、手術前に術前補助化学療法を受けていた。切除断端の病理学的特徴及び無腫瘍状態について、盲検下において、本試験における疾患パラメータを把握していない病理学者が調査した。
【００４６】
以下の通り切除断端の状態を定義し、病理学者による評価を行った。
（i）切除の染色縁(inked edge)に腫瘍[浸潤性乳管癌（invasive ductal carcinoma; IDC)又は非浸潤性乳管癌（ductal carcinoma in situ; DCIS）］が認められる場合は切除断端陽性；
（ii）切除断端から５ｍｍ以下に腫瘍（ＩＤＣ又はＤＣＩＳ）が認められる断端近接(close margin)；並びに
（iii）切除断端から５ｍｍ超で無腫瘍である断端は断端陰性。
【００４７】
（４）免疫組織化学（Immunohistochemistry；ＩＨＣ）
ＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００に対する抗体は過去に報告されたものであった（Onodera et al., 2006; Morishige et al., 2008）。ＥＰＢ４１Ｌ５抗体は、はそのヒト蛋白質のアミノ酸558番目から733番目までを含むペプチドを抗原としウサギに免疫した後、標準的手法によって抗血清を採取、抗原にてアフィニティ精製したものを用いた。ｃ−ＭＥＴに対する抗体はAbcam、ＥＧＦＲ抗体はNichirei、ＨＥＲ２に対する抗体はDAKOから、それぞれ購入した。
【００４８】
免疫組織化学染色は、以下の通り、厚さ４μｍのホルマリン固定パラフィン包埋連続切片を用いて実施した。全てのスライドは、最初にキシレンにおいて脱パラフィン処理を行い、段階的なアルコールにおいて脱水処理を実施し、次いで、切片をトリス緩衝食塩水(TBS: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)でリンスした。
【００４９】
その後、以下の条件により、各抗原について切片の抗原賦活化処理を行った。
（i）ＨＥＲ２又はＥＰＢ４１Ｌ５（ＥＢＬ５）：クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で９５℃、４０分インキュベート；
（ii）ＥＧＦＲ：ペプシン溶液で３７℃、１０分インキュベート；
（iii）ＡＭＡＰ１又はＧＥＰ１００：抗原賦活化液（EDTA solution、ｐＨ９、Nichireiから購入 ）で９５℃、４０分インキュベート；
（iv）ｃ−ＭＥＴ：：抗原賦活化液（EDTA solution、ｐＨ9、Nichireiから購入）で９５℃、４０分インキュベート。
【００５０】
次いで、室温で０．３％Ｈ2Ｏ2／メタノールにインキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。切片をＴＢＳで洗浄した後、ＥＧＦＲ（１：５０）、ＨＥＲ２（１：２００）、ＡＭＡＰ１（１：５００）、ＧＥＰ１００（１：１００）、ＥＰＢ４１Ｌ５（ＥＢＬ５；１：１０００）、又はｃ−ＭＥＴ（１：５０）に対する一次抗体（括弧内の比率は希釈倍率）と共に、室温で３０分間、インキュベートした。さらにＴＢＳで洗浄した後、二次抗体としてEnVision（商標） (DAKO、日本国)を用いて各一次抗体の検出を行い、ジアミノベンジジンを用いて発色させた。各切片は、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、水洗した後、定常法に従い透徹処理・封入処理を行った。
【００５１】
（５）評価
全ての試料は、それぞれ独立に、盲検下で、二人の病理学者により評価した。
【００５２】
ＥＧＦＲについては、陽性度は、０〜２＋のシグナル強度に基づき、同一患者における正常（非癌性）乳管をコントロールの１＋とし、各試料について評価を行った。
【００５３】
ＨＥＲ２については、各試料は、シグナル強度と、細胞膜の染色度合及びその細胞数の割合に基づいて評価した。強い膜染色が認められる腫瘍細胞が３０％超の場合は３＋とし、「弱い」から「中程度」の膜染色が認められる腫瘍細胞が１０％〜３０％の場合、又は強い膜染色が認められる腫瘍細胞が１０％未満の場合は２＋とし、僅かの膜染色が認められる腫瘍細胞が１０％未満の場合は１＋とし、膜染色が全く観察されないか、若しくは僅かな膜染色が１０％未満の腫瘍細胞にしか観察されない場合には０とした。
【００５４】
ＡＭＡＰ１については、正常なバックグランドの染色を１＋とし、細胞膜及び細胞質の両方に染色が認められた場合は２＋と評価した。
【００５５】
ＧＥＰ１００については、各試料は、シグナル強度に基づいて１＋及び２＋で評価した。正常腺細胞質の染色については１＋と決定した。
【００５６】
ｃ−ＭＥＴについては、コントロールである正常（非癌性）乳管試料より、シグナル強度が低いものを０と評価し、正常乳管試料と同等のシグナル強度のものは１＋とし、正常乳管試料よりもシグナル強度が高いものを２＋と評価した。
【００５７】
ＥＰＢ４１Ｌ５（ＥＢＬ５）については、まず、細胞質に染色が認められないもの、即ちコントロールである正常乳管試料と同等の染色シグナル強度のものは０と評価し、正常乳管試料と比較して中程度に染色シグナル強度が高いものを１＋と評価し、正常乳管試料と比較して染色シグナル強度が顕著に高いものを２＋と評価した。
【００５８】
（６）統計分析
年齢及び切除断端の状態等、予測因子と考えられてきた因子が、放射線治療の完了から再発までの期間に有意な影響を与えるか否かを決定するために、カプラン・マイヤー曲線を求めた。段階的重回帰分析（InstituteSas IS: JMPR 10 Modeling and Multivariate Methods, Cary, NC: SAS Institute Inc, 2012 pp. 139-160）を用いて、放射線治療の完了から再発までの期間の自然対数と発現が相関するマーカーを同定した。段階的重回帰分析の候補となった予測因子変数は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＰＢ４ＩＬ５（ＥＢＬ５）、ｃ−ＭＥＴ、及びそれらの交互作用項である。因子を入力又は残すのに用いたｐ値の閾値は０．０５である。各サブグループ、選択したマーカーの組合せに応じて決定した。再発までの対数時間を、チューキー・クレイマー（Tukey-Kramer）HSD（honestly significant difference）検定を用いた分散分析により、サブグループ間で比較した。サブグループのイベントまでの時間に関しカプラン・マイヤー曲線を求めた。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意な相関があると判断した。これらの解析は、JMP（登録商標）(Version 10, SAS Institute Inc., NC.)を用いて実施した。
【００５９】
＜結果＞
（１）患者の臨床的特徴及び病理学的特徴
患者の特徴及び治療方法については、以下の表１に示す。加えて、患者の病理学的特徴、並びに放射線治療完了の後再発までの期間を表２に示す。さらに、各マーカーについて、免疫組織化学スコアを表３に示す。
【００６０】
【表１】
2014169917.tif 000002
【００６１】
【表２】
2014169917.tif 000003
【００６２】
【表３】
2014169917.tif 000004
【００６３】
病理腫瘍病期については、７人の患者がTisであり、９人の患者がＴ１であり、３人の患者がＴ２であった。７人のＤＣＩＳ患者のうち一人が、手術前に化学療法を受けており、その患者の生検試料は、臨床腫瘍病期がＴ３である浸潤性乳管癌と診断されていた。１５人の患者がリンパ節転移陰性であり、４人の患者がリンパ節転移陽性であった。１２人の患者が、切除縁陰性と診断されたのに対し、３人の患者が切除断端近接と診断され、かつ４人の患者が切除断端陽性であった。これら１９人の患者について、放射線治療完了後局所再発までの中位期間は３８月（８〜１７９月の範囲に分布）であった。
【００６４】
（２）臨床因子及び局所再発までの期間
先ず、切除断端の状態、年齢、ＥＲ陽性、又はＰｇＲ陽性が、ＢＣＴ後の局所再発のまでの期間に相関関係があるか否かについて調査した。その結果、切除断端陰性であった患者は、ＢＣＴ後、局所再発無しの生存期間に関し４０月の中央値を示した（図５Ａ）。これに対して、切除端近接又は切除端陽性であった患者は３８月の中央値を示した（図５Ａ）。同様に、５０歳未満の患者は３５月の中央値を示したのに対し、５０歳以上の患者も３５月の中央値を示した（図５Ｂ）。ＥＲ陽性の患者は、３５月の中央値を示したのに対し、ＥＲ陰性の患者は３１．５月の中央値を示した（図５Ｃ）。ＰｇＲ陽性の患者は３５月の中央値を示したのに対し、ＰｇＲ陰性の患者は２０．５月の中央値を示した（図５Ｄ）。対数順位検定によって求められた通り、切除断端状態（ｐ＝０．４８）、年齢（ｐ＝０．９７）、ＥＲ状態（ｐ＝０．５８）、並びにＰｇＲ状態（ｐ＝０．３２）に関し、ＢＣＴ後局所再発の中位期間において統計学的な差異は無かった。
【００６５】
（３）ＧＥＰ１００−Ａｒｆ６−ＡＭＡＰ１経路における遺伝子翻訳産物の発現
ＧＥＰ１００とＡＭＡＰ１の高レベルな共発現は、局所再発に相関することが判明した。ＧＥＰ１００−Ａｒｆ６−ＡＭＡＰ１経路は、上述したEGFR及びＨer２等、幾つかの受容体型チロシンキナーゼ（receptor tyrosine kinase）で活性化され得る。そこで、ＡＭＰ１及びＧＥＰ１００、さらにＥＧＦＲ及びHer2のタンパク質発現について解析した。
【００６６】
ＥＧＦＲについては、５つの事例（２７．７％）でスコア１＋の発現が認められ、１３の事例（７２．２％）が陰性（スコア０）であり、１つの事例が当てはまらなかった。ＨＥＲ２については、５つの事例（２６．３％）、８つの事例（４２．１％）、４つの事例（２１．０％）、及び２つの事例（１０．５％）が、それぞれ３＋、２＋、１＋、及び０とスコア付けされた。ＡＭＡＰ１については、５つの事例（２６．３％）が２＋とスコア付けされ、１４の事例（７３．７％）が１＋とスコア付けされた。ＧＥＰ１００については、８つの事例（４２．１％）が２＋とスコア付され、１１の事例（５７．９％）が１＋とスコア付けされた。ｃ−Metについては、７つの事例（３６．８％）が２＋とスコア付けされ、６つの事例（３１．６％）が１＋とスコア付けされ、６つの事例（３１．６％）が０とスコア付された。ＥＰＢ４１Ｌ５（ＥＢＬ５）については、２つの事例（１０．５％）が３＋とスコア付けされ、４つの事例（２１．１％）が２＋とスコア付けされ、５つの事例（２６．３％）が１＋とスコア付され、８つの事例（４２．１％）が０とスコア付された。（表３）。さらに、免疫組織化学染色の顕微鏡写真の例を図１及び図２に示す。
【００６７】
段階的重回帰分析法（InstituteSas IS: JMP（登録商標）10 Modeling and Multivariate Methods, Cary, NC: SAS Institute Inc, 2012 pp. 139-160）を利用した解析により、ＧＥＰ１００及びＡＭＡＰ１の組合せで遺伝子翻訳産物が高レベルに共発現しているケースでは、ＢＣＴの完了から局所再発までの期間の短さと有意な相関を有し（Ｐ＜０．００１）、さらにその交互作用効果もまた同期間の短さと有意な相関を有することが見出された(Ｐ＝０．００１８)。
【００６８】
ＢＣＴの完了後、時間の経過に伴いどれだけの患者が再発を免れているかを示す、カプラン・マイヤー曲線による解析の結果を図３及び図４に示す。図３において、"Homo"はＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００が共発現していたケースを示し、"Wild/Hetero"はＡＭＡＰ１又はＧＥＰ１００の何れか一方のみが発現していたケース、 並びにそれら遺伝子の何れも発現していなかったケースを示す。図４において、Homo"はｃ−ＭＥＴ及びＥＢＬ５が共発現していたケースを示し、"Wild/Hetero"はｃ−ＭＥＴ又はＥＢＬ５の何れか一方のみが発現していたケース、 並びにそれら遺伝子の何れも発現していなかったケースを示す。
【００６９】
図３のカプラン・マイヤー曲線によれば、"Homo"群と"Wild/Hetero"との間において統計学的に優位な差を示した（Ｐ＝０．０００１）（図３）。一方、ＧＥＰ１００又はＡＭＡＰ１の高レベル発現自体は、そのような優位性は示さなかった（図３）。さらに、図４のカプラン・マイヤー曲線によれば、"Homo"群と"Wild/Hetero"との間において統計学的に優位な差を示した（Ｐ＝０．０００５）（図４）。一方、ｃ−ＭＥＴ又はＥＢＬ５の高レベル発現自体は、そのような優位性は示さなかった（図４）。
【００７０】
なお、ＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ２自体、又はＧＥＰ１００若しくはＡＭＡＰ１の何れかとＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ２との共発現は、何れも、局所再発の迅速性に対して優位性は示さなかった。
【００７１】
浸潤性乳管癌及び非浸潤性乳管癌の早期段階に対する乳房温存療法（ＢＣＴ）は、優れた局所制御率及び患者の生存を提供する。しかしながら、依然として、ＢＣＴ後に局所再発を経験する患者の有意な集団が存在する。本実施例においては、ＢＣＴ後に局所再発を経験した集団に注目した結果、切除断端の状態及び年齢は局所再発までの期間の短さとは相関関係が認められなかったが、ＧＥＰ１００タンパク質及びＡＭＡＰ１タンパク質の組合せ、並びにｃ−ＭＥＴ及びＥＢＬ５の組合せによる共発現それぞれは、局所再発までの期間の短さに統計学的に優位に相関することが見出された。一方、ＧＥＰ１００、ＡＭＡＰ１、ｃ−ＭＥＴ及びＥＢＬ５のうちの何れか１つの発現だけでは、局所再発までの期間の短さとは相関が認められなかった。これらの結果によれば、ＧＥＰ１００、ＡＭＡＰ１、ｃ−ＭＥＴ及びＥＢＬ５がＡｒｆ６経路の成分であると言う仮説と合致しており、つまり、これら遺伝子のうち一つのみの発現では、活性Ａｒｆ６経路を構成しないことになる。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲ又はＰｇＲ何れかの発現自体も、過去に報告されている通り局所再発までの期間の短さに相関が無かった（Millar EK, Graham PH, O'Toole SA, et al: Prediction of local recurrence, distant metastases, and death after breast-conserving therapy in early-stage invasive breast cancer using a five-biomarker panel. J Clin Oncol 27:4701-8, 2009）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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