(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプルからの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を検出及び／又は定量するための方法及び組成物、並びに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡを１回のアッセイにおいて検出及び／又は定量するために有用な方法及び組成物の提供。【解決手段】核酸を含むサンプルから、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出し、かつ、ＭＲＳＡの存在を特定する方法。いくつかの実施形態において、サンプルを、ｎｕｃ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１０クレオチドの少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ、並びに、ＭＲＳＡ菌株について特異的な少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブと接触させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１回のアッセイにおいて臨床サンプルから、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）菌株の存在を特異的に検出し、かつ、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株を特定する方法であって、
前記サンプルを、配列番号２００に含まれるＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列またはその相補体、あるいは、配列番号２００とは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド異なる任意の配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１１ヌクレオチドの少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと接触させる工程；
前記サンプルを、ＭＲＥＪ特異的な配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７または配列番号８８の少なくとも１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１０ヌクレオチドの少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと接触させる工程；および
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在および／または量を示すものとして、また、ＭＲＳＡの存在および／または量を示すものとして、アニーリングした１つまたは複数のプローブの存在および／または量を検出する工程、あるいは、前記プライマーが核酸にアニーリングすることにより生じた増幅産物の量を検出する工程
を含み、
前記ストリンジェントな条件は、５９℃において４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、４％のトレハロースを含む、方法。
【請求項２】
配列番号２００の配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする前記少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のいずれか１つあるいはその相補体の核酸の少なくとも１１個の連続するヌクレオチドにストリンジェントな条件のもとでアニーリングするオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸を含むサンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の存在を検出する方法であって、
配列番号１、配列番号６、配列番号３または配列番号８の１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを提供する工程；
前記サンプルの核酸を前記（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブとアニーリングさせる工程（ただし、アニーリングした（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブにより、前記サンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の存在が示される）；および
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在および／または量を示すものとして、アニーリングした（１つまたは複数の）プローブの存在および／または量を検出する工程、あるいは、前記プライマーが核酸にアニーリングすることにより生じた増幅産物の量を検出する工程
を含み、
前記ストリンジェントな条件は、５９℃において４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、４％のトレハロースを含む、方法。
【請求項４】
前記提供する工程が、配列番号１またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーと、配列番号６またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第２のプライマーとを含むプライマー対を提供する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号９または配列番号１０にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブを提供する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記提供する工程が、配列番号３またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーと、配列番号８またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第２のプライマーとを含むプライマー対を提供する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１１または配列番号１２あるいはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブを提供する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を１回のアッセイにおいて検出および特定する方法であって、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを提供する工程；
メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）菌株について特異的な少なくとも１つのプライマーを提供する工程（ただし、前記ＭＲＳＡ菌株は、細菌の核酸において挿入され、それにより、多型の右側先端接合（ＭＲＥＪ）または何らかの同等な術語によるものを生じさせる、ｍｅｃＡ遺伝子を含有するＳＣＣｍｅｃインサートが存在するために耐性であり、この場合、前記ＭＲＳＡ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘを含む多型ＭＲＥＪ核酸にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする）；
サンプルの核酸を前記（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブとアニーリングする工程（ただし、配列番号１〜配列番号１２を含むアニーリングした（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブにより、サンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の存在が示され、また、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘを含む多型のＭＲＥＪ核酸にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするアニーリングした（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブにより、サンプルにおけるＭＲＳＡ菌株の存在が示される）；および
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在および／または量を示すものとして、また、ＭＲＳＡの存在および／または量を示すものとして、アニーリングした（１つまたは複数の）プローブの存在および／または量を検出する工程、あるいは、前記プライマーが核酸にアニーリングすることにより生じた増幅産物の量を検出する工程
を含み、
前記ストリンジェントな条件が、５９℃において４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、４％のトレハロースを含む、方法。
【請求項９】
前記プライマーおよび／またはプローブが同じアニーリング条件のもとで前記サンプルの核酸にアニーリングする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマーおよび／またはプローブが同一の物理的容器に一緒に入れられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＲＳＡ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７または配列番号８８のいずれか１つで定義されるＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘの少なくとも１つにストリンジェントな条件のもとでアニーリングする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＲＳＡ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブが、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（タイプｉ〜タイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７（タイプｘｉ〜タイプｘｘ）または配列番号１９９のいずれか１つの核酸あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＲＳＡ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブが、配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３のいずれか１つの核酸またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１のいずれか１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプローブをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが少なくとも１つのプライマー対と接触させられ、前記プライマー対が、
配列番号１および配列番号５；
配列番号１および配列番号６；
配列番号２および配列番号６；
配列番号４および配列番号７；
配列番号４および配列番号８；
配列番号３および配列番号７；ならびに
配列番号３および配列番号８、または、それらの相補体
の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルを、
配列番号９９および配列番号１９９；
配列番号９９および配列番号１４４；
配列番号９９および配列番号１５０；
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体
の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む少なくとも１つのプライマー対と接触させる工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが複数のプライマー対と接触させられ、ただし、前記プライマー対が、
配列番号３および配列番号７；
配列番号９９および配列番号１９９；
配列番号９９および配列番号１４４；
配列番号９９および配列番号１５０；
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体
の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルを、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１のいずれか１つあるいはその相補体の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプローブと接触させる工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが複数のプライマー対と接触させられ、前記プライマー対が、
配列番号１および配列番号６；
配列番号９９および配列番号１９９；
配列番号９９および配列番号１４４；
配列番号９９および配列番号１５０；
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体
の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルを、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１のいずれか１つあるいはその相補体の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプローブと接触させる工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つの核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
核酸を含むサンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の存在を検出するためのキットであって、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、
前記ストリンジェントな条件が、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、４％のトレハロースを５９℃において含むキット。
【請求項２３】
前記プローブが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の核酸配列あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブをさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
ＭＲＳＡ菌株について特異的な少なくとも１つのプライマーをさらに含み、
前記ＭＲＳＡ菌株は、ｍｅｃＡ遺伝子を含有するＳＣＣｍｅｃインサートが存在するために耐性であり、
前記ＳＣＣｍｅｃは細菌の核酸において挿入されているために、多型の右側先端接合（ＭＲＥＪ）を生じさせ、
前記ＭＲＳＡについて特異的なプライマーおよび／またはプローブは、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘを含む少なくとも１つの多型ＭＲＥＪ核酸にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７または配列番号８８あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのＭＲＳＡ特異的オリゴヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＭＲＳＡ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（タイプｉ〜タイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７（タイプｘｉ〜タイプｘｘ）または配列番号１９９のいずれか１つあるいはその相補体の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
配列番号１、配列番号６、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３またはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプローブをさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
配列番号３、配列番号８、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３またはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプローブをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記サンプルを、配列番号２００に含まれるＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列、その相補体、または配列番号２００とは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド異なる任意の配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１１ヌクレオチドの少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと接触させて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株の存在を特異的に検出する方法。
【請求項３２】
前記サンプルを、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２またはそれらの相補体からなる群から選択される少なくとも１つの核酸にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１０ヌクレオチドの少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと接触させて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株の存在を特異的に検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／８７０，８２３号（２００６年１２月１９日出願、Ｊｅａｎ他、題名「黄色ブドウ球菌の検出およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の特定」）に基づく優先権を主張し、、これは、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
本出願は電子的形式での配列表と一緒に出願されている。配列表は、２００７年１１月２９日に作成されたＧＥＮＯＭ．０７２Ａ．ＴＸＴと題されるファイル（大きさが１２４ＫＢである）として提供される。配列表の電子的形式での情報はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（発明の背景）
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌は、広範囲の様々な病院感染症および市中感染症を世界中で引き起こす主要なヒト病原菌である。コアグラーゼ陽性種の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）がヒトの日和見病原菌として十分に立証されている（Ｍｕｒｒａｙ他編、２００３年、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第８版、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされる院内感染症は罹患および死亡の主要な原因である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされる最も一般的な感染症のいくつかには皮膚が関係し、そのような感染症には、フルンケルまたはおでき、蜂巣炎、膿痂疹、および様々な部位における手術後の創傷感染症が含まれる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによってもたらされるより重篤な感染症のいくつかには、菌血症、肺炎、骨髄炎、急性心内膜炎、心筋炎、心膜炎、脳炎、髄膜炎、熱傷様皮膚症候群および様々な膿瘍が含まれる。ブドウ球菌のエンテロトキシンによって媒介される食中毒は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに関連する別の重要な症候群である。毒素性ショック症候群は市中疾患の１つであり、これもまた、毒素産生性のＳ．ａｕｒｅｕｓによる感染またはコロニー形成に起因すると考えられている。
【０００４】
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、１９７０年代以前は皮膚の無害な片利共生菌と見なされていたが、今では、ヒト感染症の重要な原因として認識されている（Ｋｌｏｏｓ他（２００４）、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、７：１１７〜１４０）。臨床微生物学の研究室における最も頻繁に単離された細菌の１つであることに加えて、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は抗生物質耐性決定因子のリザーバーとして作用する（Ｂａｓｔｏｓ他（１９９９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８：３９３〜３９８）。そのようなものとして、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株を特徴づけ、他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌から区別することは重要である。
【０００５】
様々なＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株が、細胞外の熱安定性ヌクレアーゼ（熱安定性ＴＮａｓｅ）を、コアグラーゼを産生する頻度と類似する頻度で産生する。ＴＮａｓｅをコードする遺伝子（ｎｕｃ）の配列が１９８５年に最初に開示された（Ｋｏｖａｃｅｖｉ他（１９８５）、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１６２：５２１〜５２８）。ＴＮａｓｅは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を１００℃までの温度で分解する１７ｋＤａのタンパク質である。ＴＮａｓｅ活性はＳ．ａｕｒｅｕｓについて特異的なものではないものの、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的な配列が存在する。例えば、Ｂｒａｃｋｓｔａｄ他（１９９２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０：１６５４〜１６６０；Ｚｈａｎｇ他（２００４）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：４９４７〜４９５５；Ｃｈｅｓｎｅａｕ他（１９９３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、７：３０１〜３１０；Ｗｉｌｓｏｎ他（１９９１）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５７：１７９３〜１７９８；Ｐｏｕｌｓｅｎ他（２００３）、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏ．、５１：４１９〜４２１；Ｃｏｓｔａ他（２００５）、Ｄｉａｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５１：１３〜１７；Ｓｈｉｔｔｕ他（２００６）、Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．（２００６年７月１７日）を参照のこと。今日まで、そのようなＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的なｎｕｃ配列はどれも、大規模な特異性研究の手段として臨床的に有用であることが証明されていない。そのため、臨床サンプルからのＳ．ａｕｒｅｕｓの迅速な検出および特定において有用である、高い特異性および感度の両方を有することが証明されているオリゴヌクレオチドが求められている。
【０００６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌はともに、さらなる抗生物質耐性決定因子を蓄積し、それにより、多剤耐性菌株の形成を生じさせる顕著な能力を有する。この耐性は処置のための治療的選択肢を制限し、患者の罹患率および死亡率を実質的に増大させる。メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）が、病院における大きな臨床的および疫学的な問題の１つとして１９８０年代に出現した（Ｏｌｉｖｅｉｒａ他（２００２）、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．、２：１８０〜１８９）。ＭＲＳＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するために最も一般的に使用される抗生物質であるペニシリン系薬剤、セファロスポリン系薬剤、カルバペネム系薬剤およびモノバクタム系薬剤を含めて、すべてのβ−ラクタム剤に対して耐性である。ＭＲＳＡ感染症は、毒性がより大きく、より高価な抗生物質により処置され得るだけであり、そのため、そのような抗生物質は通常の場合には最後のとりでとして使用される。ＭＲＳＡは職員を介して患者から患者に容易に拡大し得るので、世界中の病院が、ＭＲＳＡを抑制するためにこの問題に直面している。
【０００７】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおけるメチシリン耐性は、その耐性が、過剰の（ｓｕｒｎｕｍｅｒａｒｙ）β−ラクタム耐性ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）をコードする、他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）からのＤＮＡの獲得に起因し、これにより、細胞がβ−ラクタム系抗生物質にさらされたときには、そのＤＮＡが、正常なＰＢＰの生合成機能を引き受けるという点で他に例がない。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは通常、４つのＰＢＰを含有しており、そのうち、ＰＢＰ１、ＰＢＰ２およびＰＢＰ３が必須である。ＰＢＰ２ａ（またはＰＢＰ２’）と呼ばれるＭＲＳＡにおける低親和性ＰＢＰが染色体のｍｅｃＡ遺伝子によってコードされ、β−ラクタム耐性トランスペプチダーゼとして機能する。このｍｅｃＡ遺伝子はメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓには存在しないが、ブドウ球菌の他の種の間には広く分布しており、高度に保存されている（Ｕｂｕｋａｔａ他（１９９０）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３４：１７０〜１７２）。
【０００８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株Ｎ３１５（これは１９８２年に日本で単離された）に由来するｍｅｃＡ遺伝子を取り囲むＤＮＡ領域のヌクレオチド配列決定では、ｍｅｃＡ遺伝子が、染色体内に挿入される、ブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）と称される新規な遺伝子エレメントによって運ばれるという発見がもたらされた。ＳＣＣｍｅｃは、末端の逆位反復および同方向反復、１組の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子（ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢ）、ならびに、ｍｅｃＡ遺伝子複合体の存在によって特徴づけられる可動性の遺伝子エレメントである（Ｉｔｏ他（１９９９）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４３：１４４９〜１４５８；Ｋａｔａｙａｍａ他（２０００）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４４：１５４９〜１５５５）。ＳＣＣｍｅｃが、ｃｃｒＡ遺伝子およびｃｃｒＢ遺伝子によりコードされるリコンビナーゼによってＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株Ｎ３１５の染色体から正確に切り出され、特定のＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体部位に同じ向きで一体化する。ＭＲＳＡ菌株のＮＣＴＣ１０４４２（１９６１年に英国で単離された最初のＭＲＳＡ菌株）および８５／２０８２（１９８５年に単離されたニュージーランド由来の菌株）に由来するｍｅｃＡ遺伝子を取り囲むＤＮＡのクローニングおよび配列分析では、ＳＣＣｍｅｃの類似する構造的特徴を互いに有する２つの新規な遺伝子エレメントの発見がもたらされた。これら３つのＳＣＣｍｅｃは、これらの菌株の単離年に基づいて、タイプＩ（ＮＣＴＣ１０４４２）、タイプＩＩ（Ｎ３１５）およびタイプＩＩＩ（８５／２０８２）と呼ばれている（Ｉｔｏ他（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６）。Ｈｉｒａｍａｔｓｕ他は、これらのＳＳＣｍｅｃ  ＤＮＡがメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）の染色体において特定の部位に組み込まれることを見出している。ＳＳＣｍｅｃ  ＤＮＡの左側境界および右側境界（すなわち、それぞれ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）を取り囲む領域のヌクレオチド配列、ならびに、ＳＳＣｍｅｃ  ＤＮＡの組込み部位（すなわち、ＳＳＣｍｅｃ  ＤＮＡに対する細菌染色体付着部位であるａｔｔＢｓｃｃ）の周りの領域のヌクレオチド配列が分析された。ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位およびａｔｔＢｓｃｃ部位の配列分析では、ａｔｔＢｓｃｃが新規なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のｏｒｆＸの３’末端に位置することが解明された。このｏｒｆＸは、機能が不明であるいくつかの以前に特定されたポリペプチドとの配列相同性を示す仮想的な１５９アミノ酸のポリペプチドをコードする（Ｉｔｏ他（１９９９）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４３：１４４９〜１４５８）。近年、タイプＩＶおよびタイプＶと称される２つの新しいタイプのＳＣＣｍｅｃが記載された（Ｍａ他（２００２）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：１１４７〜１１５２；Ｉｔｏ他（２００４）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４８：２６３７〜２６５１；Ｏｌｉｖｅｉｒａ他（２００１）、Ｍｉｃｒｏｂ���Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．、７：３４９〜３６０）。Ｏｌｉｖｅｉｒａ他はまた、近年、ＳＣＣｍｅｃタイプＶＩの存在を報告した。Ｏｌｉｖｅｉｒａ他（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：３４５７〜３４５９。ＳＣＣｍｅｃタイプＩＶとして分類されたいくつかのブドウ球菌属菌株の右側先端の配列が決定されている。Ｍａ他（２００２）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：１１４７〜１１５２；Ｉｔｏ他（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６；Ｏｌｉｖｅｉｒａ他（２００１）、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．、７：３４９〜３６０を参照のこと。ＳＣＣｍｅｃタイプＩＶとして分類されるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株のＣＡ０５および８／６−３Ｐからの配列が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株Ｎ３１５のタイプＩＩ  ＳＳＣｍｅｃの配列に対して２０００ヌクレオチドにわたってほぼ同一であった（Ｍａ他（２００２）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：１１４７〜１１５２；Ｉｔｏ他（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６）。
【０００９】
ＭＲＳＡをｍｅｃＡ遺伝子およびＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的染色体配列の検出に基づいて検出および特定するための様々な方法が記載されている。Ｓｃｈｕｅｎｃｋ他、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（２００６）（印刷中）；Ｓｈｉｔｔｕ他（２００６）、Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（７月１７日）；Ｇｒｉｓｏｌｄ他（２００６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４５：７９〜８９；Ｃｏｓｔａ他（２００５）、Ｄｉａｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５１：１３〜１７；ＭｃＤｏｎａｌｄ他（２００５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：６１４７〜６１４９；Ｚｈａｎｇ他（２００５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：５０２６〜５０３３；Ｈａｇｅｎ他（２００５）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９５：７７〜８６；Ｍａｅｓ他（２００２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０：１５１４〜１５１７；Ｓａｉｔｏ他（１９９５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３：２４９８〜２５００；Ｕｂｕｋａｔａ他（１９９２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０：１７２８〜１７３３；Ｍｕｒａｋａｍｉ他（１９９１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９：２２４０〜２２４４；Ｈｉｒａｍａｔｓｕ他（１９９２）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３６：４４５〜４５３）を参照のこと。さらには、ＬｅｖｉおよびＴｏｗｎｅｒ（２００３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１：３８９０〜３８９２；および、Ｐｏｕｌｓｅｎ他（２００３）、Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５１：４１９〜４２１は、ＥＶＩＧＥＮＥ（商標）ＭＲＳＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを使用するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌およびＳ．ａｕｒｅｕｓにおけるメチシリン耐性の検出を記載する。
【００１０】
しかしながら、ｍｅｃＡ遺伝子はＳ．ａｕｒｅｕｓおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方に広く分布するので、上記で記載された方法のそれぞれが、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（「ＭＳＳＡ」）およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方を含有するサンプルと、ＭＲＳＡのみを含有するサンプル、または、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡの両方を有するサンプルとを識別することができない。
【００１１】
この問題に対処するために、Ｈｉｒａｍａｔｓｕ他は、ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩＩのＤＮＡの右側先端にハイブリダイゼーションするプライマーを、ＳＣＣｍｅｃ組込み部位の右側のヌクレオチド配列に対応する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ染色体に対して特異的なプライマーとの組合せで用いる、ＭＲＳＡについて特異的なＰＣＲ型アッセイを開発した（米国特許第６，１５６，５０７号、以下、「‘５０７号特許」という）。より近年には、Ｚｈａｎｇ他（２００５）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：５０２６〜５０３３）は、ＳＳＣｍｅｃタイプＩ〜ＳＳＣｍｅｃタイプＶのＭＲＳＡをサブタイプ決定するための多重アッセイを記載した。他のブドウ球菌種（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）におけるＳＣＣｍｅｃ組込み部位を取り囲むヌクレオチド配列は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて見出されるヌクレオチド配列とは異なっており、従って、ＳＳＣｍｅｃの右側先端およびＳ．ａｕｒｅｕｓの染色体にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを用いる多重ＰＣＲアッセイは、ＭＲＳＡの検出について特異的であるという利点を有する。
【００１２】
‘５０７号特許に記載されるＰＣＲアッセイはまた、ＳＣＣｍｅｃ  ＤＮＡの「ＭＲＥＰタイプ決定」（ｍｅｃ  ｒｉｇｈｔ  ｅｘｔｒｅｍｉｙ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ｍｅｃ右側先端多型）の開発に至った（Ｉｔｏ他（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６；Ｈｉｒａｍａｔｓｕ他（１９９６）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２：１１７〜１２９）。このＭＲＥＰタイプ決定方法は、３つのＭＲＥＰタイプのヌクレオチド配列が、３つのタイプのＳＳＣｍｅｃの中では組込み部位に隣接するＳＳＣｍｅｃ  ＤＮＡの右側末端において異なるという事実を利用する。タイプＩと比較した場合、タイプＩＩＩは特有のヌクレオチド配列を有し、一方、タイプＩＩはＳＳＣｍｅｃの右側末端への１０２ヌクレオチドの挿入を有する。Ｈｉｒａｍａｔｓｕ他によって記載されるＭＲＥＰタイプ決定法では、下記の命名法が使用される：ＳＳＣｍｅｃタイプＩはＭＲＥＰタイプｉであり、ＳＳＣｍｅｃタイプＩＩはＭＲＥＰタイプｉｉであり、ＳＳＣｍｅｃタイプＩＩＩはＭＲＥＰタイプｉｉｉである。その後、Ｈｉｒａｍａｔｓｕは、菌株Ｎ３１５および菌株Ｍｕ５０のゲノムの配列が発表されたことを考慮して、すなわち、これらの配列により、ＳＣＣｍｅｃエレメントがｏｒｆＸの下流側に位置することが解明されたので、この命名法を訂正した。その結果、今では、ＭＲＥＰはＭＬＥＰ（ｍｅｃ左側先端多型）として示され得る（Ｃｈｏｎｇｔｒａｋｏｏｌ他（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：１００１〜１０１２）。
【００１３】
近年、Ｃｈｏｎｇｔｒａｋｏｏｌ他は、ＳＳＣｍｅｃ命名法に代わる新しい命名法を使用することを提案した。Ｃｈｏｎｇｔｒａｋｏｏｌ他（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：１００１〜１０１２。Ｃｈｏｎｇｔｒａｋｏｏｌ他により提案された命名法はＳＳＣｍｅｃエレメントの構造に基づいており、３つの特徴を有する。第１の特徴はＳＣＣタイプの記載であり、ｃｃｒタイプおよびｍｅｃクラスによって定義される。第２の特徴は、ｍｅｃ複合体ならびにｃｃｒ複合体の間および周囲に位置するＳＣＣｍｅｃエレメントの一部であるＪ領域（ジャンクヤード領域）の記載である。第３の特徴は、それらの同定時期に従ったｃｃｒタイプおよびＪ領域の番号付けを可能にする列挙である。
【００１４】
上記で言及されたように、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩおよびＳＣＣｍｅｃタイプＩＶは、右側先端に対する同じヌクレオチド配列を有する。その結果、上記で記載されるＭＲＥＰタイプ決定法（または、近年の改訂によるＭＬＥＰタイプ決定法）は、Ｈｉｒａｍａｔｓｕ他によって記載されるＳＣＣｍｅｃタイプＩＶ（Ｍａ他（２００２）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：１１４７〜１１５２）をＳＣＣｍｅｃタイプＩＩと区別することができない。
【００１５】
本発明者らは近年、ＭＲＥＪと名付けられた、ＭＲＳＡにおけるＤＮＡ配列および領域を記載した（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。ＭＲＥＪの表現はｍｅｃ右側先端接合（Ｍｅｃ  Ｒｉｇｈｔ  Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を示す。ＭＲＥＪは、長さがおよそ１キロベース（ｋｂ）であり、ＳＣＣｍｅｃ組込み部位の右側に対する細菌の染色体ＤＮＡに加えてＳＣＣｍｅｃ右側先端に由来する配列を含む。重要なことに、ＭＲＥＪ／ＭＬＥＪ配列は、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩおよびＳＣＣｍｅｃタイプＩＶとして分類された菌株の間における鑑別を可能にするという点で、ＭＲＥＪ配列は、ＭＲＳＡを分類することにおいてＭＲＥＰ／ＭＬＥＰ配列を上回る利点を提供する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４において議論されるように、ＨｉｒａｍａｔｓｕがＭＲＥＰタイプｉ〜ＭＲＥＰタイプｉｉｉとして分類した菌株は、ＭＲＥＪタイプ決定システムによれば、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｉｉｉに該当する。本発明者らは近年、新規なＭＲＥＪタイプｉｖ〜ＭＲＥＪタイプｘｘを特定し、また、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘのＭＲＳＡの検出および特定を可能にする、遍在性が改善された核酸アッセイを開発した。（Ｈｕｌｅｔｓｋｙ他、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：１８７５〜１８８４、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４、米国特許出願第１１／２４８，４３８号）。ＭＲＥＰからＭＬＥＰへの改訂に基づいて、以前にＭＲＥＪ呼ばれていたタイプのものが、今では、ＭＬＥＪ（ｍｅｃ左側先端接合）として再分類され得ることを理解することができる。当業者は、様々な配列により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを特異的に検出することができ、また、メチシリンに対して耐性であるＳ．ａｕｒｅｕｓを特定することができるので、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡのいかなる分類システムも、本明細書中に開示される方法において意図されることが理解できる。
【００１６】
Ｍａｅｓ他は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓをコアグラーゼ陰性ブドウ球菌から識別し、かつ、血液培養におけるメチシリン耐性を決定するためのＰＣＲアッセイを記載する（Ｍａｅｓ他（２００２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０：１５１４〜１５１７）。Ｍａｅｓ他において記載されるアッセイは、ＭＲＳＡをメチシリン耐性のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌から区別することができない。
【００１７】
Ｐｏｕｌｓｅｎ他は、ＥＶＩＧＥＮＥ（商標）ＭＲＳＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを使用する、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌におけるメチシリン耐性およびＳ．ａｕｒｅｕｓにおけるメチシリン耐性の検出を記載する。Ｐｏｕｌｓｅｎ他において記載されるアッセイは、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方を有するサンプルと、ＭＲＳＡのみを含有するサンプル、または、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡの両方を有するサンプルとを識別することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国仮特許出願第６０／８７０，８２３号
【特許文献２】米国特許第６，１５６，５０７号
【特許文献３】国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４
【特許文献４】米国特許出願第１１／２４８，４３８号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｍｕｒｒａｙ他編、２００３年、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第８版、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
【非特許文献２】Ｋｌｏｏｓ他（２００４）、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、７：１１７〜１４０
【非特許文献３】Ｂａｓｔｏｓ他（１９９９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８：３９３〜３９８
【非特許文献４】Ｋｏｖａｃｅｖｉ他（１９８５）、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１６２：５２１〜５２８
【非特許文献５】Ｂｒａｃｋｓｔａｄ他（１９９２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０：１６５４〜１６６０
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ他（２００４）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：４９４７〜４９５５
【非特許文献７】Ｃｈｅｓｎｅａｕ他（１９９３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、７：３０１〜３１０
【非特許文献８】Ｗｉｌｓｏｎ他（１９９１）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５７：１７９３〜１７９８
【非特許文献９】Ｐｏｕｌｓｅｎ他（２００３）、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏ．、５１：４１９〜４２１
【非特許文献１０】Ｃｏｓｔａ他（２００５）、Ｄｉａｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５１：１３〜１７
【非特許文献１１】Ｓｈｉｔｔｕ他（２００６）、Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．
【非特許文献１２】Ｏｌｉｖｅｉｒａ他（２００２）、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．、２：１８０〜１８９
【非特許文献１３】Ｕｂｕｋａｔａ他（１９９０）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３４：１７０〜１７２
【非特許文献１４】Ｉｔｏ他（１９９９）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４３：１４４９〜１４５８
【非特許文献１５】Ｋａｔａｙａｍａ他（２０００）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４４：１５４９〜１５５５
【非特許文献１６】Ｉｔｏ他（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６
【非特許文献１７】Ｉｔｏ他（１９９９）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４３：１４４９〜１４５８
【非特許文献１８】Ｍａ他（２００２）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：１１４７〜１１５２
【非特許文献１９】Ｉｔｏ他（２００４）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４８：２６３７〜２６５１
【非特許文献２０】Ｏｌｉｖｅｉｒａ他（２００１）、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．、７：３４９〜３６０
【非特許文献２１】Ｏｌｉｖｅｉｒａ他（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：３４５７〜３４５９
【非特許文献２２】Ｍａ他（２００２）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：１１４７〜１１５２
【非特許文献２３】Ｉｔｏ他（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６
【非特許文献２４】Ｏｌｉｖｅｉｒａ他（２００１）、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．、７：３４９〜３６０
【非特許文献２５】Ｍａ他（２００２）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：１１４７〜１１５２
【非特許文献２６】Ｉｔｏ他（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６
【非特許文献２７】Ｓｃｈｕｅｎｃｋ他、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（２００６）（印刷中）
【非特許文献２８】Ｓｈｉｔｔｕ他（２００６）、Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（７月１７日）
【非特許文献２８】Ｇｒｉｓｏｌｄ他（２００６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４５：７９〜８９
【非特許文献２９】Ｃｏｓｔａ他（２００５）、Ｄｉａｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５１：１３〜１７
【非特許文献３０】ＭｃＤｏｎａｌｄ他（２００５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：６１４７〜６１４９
【非特許文献３１】Ｚｈａｎｇ他（２００５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：５０２６〜５０３３
【非特許文献３２】Ｈａｇｅｎ他（２００５）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９５：７７〜８６
【非特許文献３３】Ｍａｅｓ他（２００２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０：１５１４〜１５１７
【非特許文献３４】Ｓａｉｔｏ他（１９９５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３：２４９８〜２５００
【非特許文献３５】Ｕｂｕｋａｔａ他（１９９２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０：１７２８〜１７３３
【非特許文献３６】Ｍｕｒａｋａｍｉ他（１９９１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９：２２４０〜２２４４
【非特許文献３７】Ｈｉｒａｍａｔｓｕ他（１９９２）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３６：４４５〜４５３
【非特許文献３８】ＬｅｖｉおよびＴｏｗｎｅｒ（２００３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１：３８９０〜３８９２
【非特許文献３９】Ｐｏｕｌｓｅｎ他（２００３）、Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５１：４１９〜４２１
【非特許文献４０】Ｉｔｏ他（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６
【非特許文献４１】Ｈｉｒａｍａｔｓｕ他（１９９６）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２：１１７〜１２９
【非特許文献４２】Ｃｈｏｎｇｔｒａｋｏｏｌ他（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：１００１〜１０１２
【非特許文献４３】Ｃｈｏｎｇｔｒａｋｏｏｌ他（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ＣｈｅｍｏＭａｅｓ他（２００２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０：１５１４〜１５１７ｔｈｅｒ．、５０：１００１〜１０１２
【非特許文献４４】Ｍａ他（２００２）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：１１４７〜１１５２
【非特許文献４５】Ｈｕｌｅｔｓｋｙ他、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：１８７５〜１８８４
【非特許文献４６】Ｍａｅｓ他（２００２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０：１５１４〜１５１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
そのため、現在においても、ＭＲＳＡおよびメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓの両方を同じ反応において検出および特定し、かつ、同じ反応においてＳ．ａｕｒｅｕｓをコアグラーゼ陰性ブドウ球菌から区別可能である迅速なアッセイが求められている。
【００２１】
本明細書中には、１回のアッセイにおいて臨床サンプルから、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）菌株の存在を特異的に検出し、かつ、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）菌株の存在を検出するための方法および組成物が開示される。本明細書によれば、サンプルからのＳ．ａｕｒｅｕｓの特異的な検出のための方法および組成物もまた提供される。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
いくつかの実施形態が、核酸を含むサンプルから、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出し、かつ、ＭＲＳＡの存在を特定する方法に関連する。いくつかの実施形態において、サンプルを、ｎｕｃ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１０クレオチドの少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブ、ならびに、ＭＲＳＡ菌株について特異的な少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと接触させることができる。様々なＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株が、細菌の核酸において挿入されるｍｅｃＡ遺伝子を含有するＳＣＣｍｅｃカセットが存在するためにメチシリン耐性であると見なされる。ＳＣＣｍｅｃカセットの挿入は多型の右側先端接合（ＭＲＥＪ）の１つを生じさせ得る。（１つまたは複数の）ＭＲＳＡ特異的なプライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、例えば、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘを含めて、多型のＭＲＥＪ核酸にストリンジェントな条件のもとでアニーリングすることができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的プライマーおよびＭＲＳＡ特異的プライマーは、例えば、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭのＫＣｌおよび５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の５９℃における条件のもとでアニーリングされる。アニーリングした（１つまたは複数の）プローブの存在および／または量、あるいは、プライマーが核酸にアニーリングすることにより生じた増幅産物の存在および／または量は、サンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ）およびＭＲＳＡの存在および／または量を示すものとして使用することができる。
【００２３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株について特異的なプライマーの少なくとも１つは、配列番号２００、その相補体、または、配列番号２００とは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド異なる任意の配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングすることができる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプライマーおよび／またはプローブの少なくとも１つは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする。好ましくは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプライマーおよび／またはプローブの少なくとも１つは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つを含むか、あるいは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つから本質的になるか、あるいは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つからなる。
【００２５】
好ましい実施形態において、（１つまたは複数の）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的なプライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、配列番号１〜配列番号１２のいずれか１つの核酸またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする。
【００２６】
さらにより好ましい実施形態において、サンプルはまた、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のいずれか１つの核酸あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブと接触させられる。いくつかの実施形態において、プローブは分子ビーコンプローブである。好ましくは、プローブは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を含むか、あるいは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列から本質的になるか、あるいは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列からなる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法はまた、内部コントロールＤＮＡをサンプルに加えること、ならびに、内部コントロールＤＮＡにストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを加えることを含む。例えば、いくつかの実施形態において、内部コントロールは、Ｅ．ｃｏｌｉから精製された線状化されている４．２３ｋｂのプラスミドが可能である。内部コントロールは、試料に由来する阻害性物質の存在をモニターするために使用することができる。
【００２８】
ＭＲＳＡ菌株について特異的なプライマーの少なくとも１つは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７および配列番号８８のいずれか１つ、または、その相補体、または、配列番号１４〜配列番号８８とは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド異なる任意の配列で定義されるようなタイプｉ〜タイプｘｘのＭＲＥＪ配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングすることができる。
【００２９】
好ましい実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的およびＭＲＳＡ特異的なプライマーおよび／またはプローブは、同じアニーリング条件のもとでサンプル核酸にアニーリングするように選ばれる。より好ましい実施形態において、そのような（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは同一の物理的容器に一緒に入れられる。
【００３０】
好ましい実施形態において、ＭＲＳＡ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（タイプｉ〜タイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８（タイプｘ〜タイプｘｘ）または配列番号１９９のいずれか１つの核酸あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする。好ましくは、ＭＲＳＡ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（タイプｉ〜タイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７（タイプｘｉ〜タイプｘｘ）または配列番号１９９のいずれか１つの核酸を含むか、あるいは、そのようないずれか１つの核酸から本質的になるか、あるいは、そのようないずれか１つの核酸からなる。いくつかの実施形態において、ＭＲＳＡ特異的プライマーはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ染色体のｏｒｆ２２にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含み、この場合、このプライマーは、ＭＲＥＪタイプｘを検出するために、配列番号１９７を用いた増幅反応において使用することができる。より好ましい実施形態において、ＭＲＳＡ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３のいずれか１つの核酸またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングし、例えば、配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３のいずれか１つの核酸を含むか、または、配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３のいずれか１つの核酸から本質的になるか、または、配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３のいずれか１つの核酸からなるプライマーおよび／またはプローブなどである。さらにより好ましい実施形態において、サンプルはまた、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１のいずれか１つの核酸またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブと接触させられる。いくつかの実施形態において、プローブは分子ビーコンプローブである。好ましくは、プローブは、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１のいずれか１つの核酸を含むか、または、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１のいずれか１つの核酸から本質的になるか、または、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１のいずれか１つの核酸からなる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記で記載されるサンプルならびに（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは増幅反応において使用され、例えば、ＰＣＲ反応、ＬＣＲ反応、ＮＡＢＳＡ反応、３ＳＲ反応、ＳＤＡ反応、ｂＤＮＡ反応、ＴＭＡ反応、ＣＰＴ反応、ＳＰＡ反応、ＮＤＳＡ反応、ローリングサークル増幅反応、固定鎖置換増幅反応、固相（固定化）ローリングサークル増幅反応またはＱβレプリカーゼ増幅反応などにおいて使用される。
【００３２】
他の局面が、核酸を含むサンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の特異的な検出に関連する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ遺伝子について特異的である少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブが提供される。そのようなプライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、ストリンジェントな条件のもとで、例えば、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２の５９℃における条件、または、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭのＫＣｌおよび５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の５９℃における条件などのもとで、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の核酸のいずれか１つあるいはその相補体の少なくとも１１個の連続するヌクレオチドにアニーリングすることができる核酸を含む。そのような（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブはサンプルの核酸にアニーリングさせることができる。アニーリングした（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブにより、サンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓの存在が示される。アニーリングした（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブを検出することができ、アニーリングした（１つまたは複数の）プローブの存在および／または量、プライマーが核酸にアニーリングすることにより生じる増幅産物の量により、サンプル中に存在するＳ．ａｕｒｅｕｓの存在および／または量が示される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記で記載されるサンプルならびに（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは増幅反応において使用され、例えば、ＰＣＲ反応、ＬＣＲ反応、ＮＡＢＳＡ反応、３ＳＲ反応、ＳＤＡ反応、ｂＤＮＡ反応、ＴＭＡ反応、ＣＰＴ反応、ＳＰＡ反応、ＮＤＳＡ反応、ローリングサークル増幅反応、固定鎖置換増幅反応、固相（固定化）ローリングサークル増幅反応またはＱβレプリカーゼ増幅反応などにおいて使用される。
【００３４】
好ましい実施形態において、配列番号１またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマー（例えば、配列番号１を含むか、または、配列番号１から本質的になるか、または、配列番号１からなるプライマーなど）と、配列番号６にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第２のプライマー（例えば、配列番号６を含むか、または、配列番号６から本質的になるか、または、配列番号６からなるプライマーなど）またはその相補体とを含むプライマー対を、サンプルの核酸にアニーリングさせることができる。より好ましい実施形態において、配列番号９または配列番号１０にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブ（例えば、配列番号９または配列番号１０を含むか、あるいは、配列番号９または配列番号１０から本質的になるか、あるいは、配列番号９または配列番号１０からなるプローブなど）またはその相補体もまた提供される。
【００３５】
他の好ましい実施形態において、配列番号３にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマー（例えば、配列番号３を含むか、または、配列番号３から本質的になるか、または、配列番号３からなるプライマーなど）またはその相補体と、配列番号８にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第２のプライマー（例えば、配列番号８を含むか、または、配列番号８から本質的になるか、または、配列番号８からなるプライマーなど）またはその相補体とを含むプライマー対を、サンプルの核酸にアニーリングさせることができる。より好ましい実施形態において、配列番号１１または配列番号１２にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブ（例えば、配列番号１１または配列番号１２を含むか、あるいは、配列番号１１または配列番号１２から本質的になるか、あるいは、配列番号１１または配列番号１２からなるプローブなど）またはその相補体もまた提供される。
【００３６】
さらに他の好ましい実施形態において、サンプルは、下記対の少なくとも１つの核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む少なくとも１つのプライマー対と接触させられる：
【００３７】
配列番号１および配列番号５；
【００３８】
配列番号１および配列番号６；
【００３９】
配列番号２および配列番号５；
【００４０】
配列番号２および配列番号６；
【００４１】
配列番号３および配列番号７；
【００４２】
配列番号３および配列番号８；
【００４３】
配列番号４および配列番号７；ならびに
【００４４】
配列番号４および配列番号８、または、それらの相補体。
【００４５】
例えば、好ましい実施形態において、サンプルは、下記対の少なくとも１つの核酸配列を含むか、または、下記対の少なくとも１つの核酸配列から本質的になるか、または、下記対の少なくとも１つの核酸配列からなる第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む少なくとも１つのプライマー対と接触させられる：
【００４６】
配列番号１および配列番号５；
【００４７】
配列番号１および配列番号６；
【００４８】
配列番号２および配列番号５；
【００４９】
配列番号２および配列番号６；
【００５０】
配列番号３および配列番号７；
【００５１】
配列番号３および配列番号８；
【００５２】
配列番号４および配列番号７；ならびに
【００５３】
配列番号４および配列番号８。
【００５４】
好ましい実施形態において、サンプルはまた、下記対の少なくとも１つの核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む少なくとも１つのプライマー対と接触させられる：
【００５５】
配列番号９９および配列番号１９９；
【００５６】
配列番号９９および配列番号１４４；
【００５７】
配列番号９９および配列番号１５０；
【００５８】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【００５９】
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体。
【００６０】
例えば、いくつかの実施形態において、サンプルは、下記対の少なくとも１つを含むか、または、下記対の少なくとも１つから本質的になるか、または、下記対の少なくとも１つからなる第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む少なくとも１つのプライマー対と接触させられる：
【００６１】
配列番号９９および配列番号１９９；
【００６２】
配列番号９９および配列番号１４４；
【００６３】
配列番号９９および配列番号１５０；
【００６４】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【００６５】
配列番号９９および配列番号１６３。
【００６６】
好ましい実施形態において、サンプルは複数のプライマー対と接触させられ、この場合、プライマーは下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする：
【００６７】
配列番号１および配列番号６；
【００６８】
配列番号９９および配列番号１９９；
【００６９】
配列番号９９および配列番号１４４；
【００７０】
配列番号９９および配列番号１５０；
【００７１】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【００７２】
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体；例えば、
【００７３】
配列番号１および配列番号６；
【００７４】
配列番号９９および配列番号１９９；
【００７５】
配列番号９９および配列番号１４４；
【００７６】
配列番号９９および配列番号１５０；
【００７７】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【００７８】
配列番号９９および配列番号１６３
の核酸配列を含むか、または、そのような核酸配列から本質的になるか、または、そのような核酸配列からなるプライマーなど。
【００７９】
他の好ましい実施形態において、サンプルは複数のプライマー対と接触させられ、この場合、プライマーは、下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする：
【００８０】
配列番号３および配列番号８；
【００８１】
配列番号９９および配列番号１９９；
【００８２】
配列番号９９および配列番号１４４；
【００８３】
配列番号９９および配列番号１５０；
【００８４】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【００８５】
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体；例えば、
【００８６】
配列番号３および配列番号８；
【００８７】
配列番号９９および配列番号１９９；
【００８８】
配列番号９９および配列番号１４４；
【００８９】
配列番号９９および配列番号１５０；
【００９０】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【００９１】
配列番号９９および配列番号１６３
の核酸配列を含むか、または、そのような核酸配列から本質的になるか、または、そのような核酸配列からなるプライマーなど。
【００９２】
好ましくは、サンプルはまた、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１のいずれか１つの核酸配列またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプローブと接触させられ、例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１のいずれか１つの核酸配列を含むか、または、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１のいずれか１つの核酸配列から本質的になるか、または、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１のいずれか１つの核酸配列からなるプローブなどと接触させられる。
【００９３】
他の局面が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの特異的な検出のために有用なオリゴヌクレオチドに関連する。いくつかの実施形態では、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つの核酸配列の少なくとも１１個の連続するヌクレオチドとストリンジェントな条件のもとでアニーリングするオリゴヌクレオチドが提供される；例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つを含むか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つから本質的になるか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つからなる核酸など。
【００９４】
さらに他の局面が、核酸を含むサンプルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の存在を検出するためのキットに関連する。キットは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことができる。例えば、キットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２から本質的になるか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことができる。好ましい実施形態において、キットはまた、少なくとも１つのプローブを含み、この場合、プローブは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の核酸配列あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングすることができる。好ましい実施形態において、プローブは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むことができるか、あるいは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２から本質的になることができるか、あるいは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２からなることができる。
【００９５】
好ましい実施形態において、キットはまた、ＭＲＳＡ菌株について特異的な少なくとも１つのプライマーを含む。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株は、細菌の核酸において挿入されるｍｅｃＡ遺伝子を含有するＳＳＣｍｅｃインサートが存在するためにメチシリン耐性であると見なされる。ＳＣＣｍｅｃインサートの挿入は多型の右側先端接合（ＭＲＥＪ）の１つを生じさせ得る。ＭＲＳＡ特異的なプライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、例えば、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘを含めて、多型のＭＲＥＪ核酸にストリンジェントな条件のもとでアニーリングすることができる。
【００９６】
好ましい実施形態において、キットは、下記の配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７および配列番号８８の１つまたはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのＭＲＳＡ特異的オリゴヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、キットは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドあり、かつ、下記の配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（タイプｉ〜タイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７（タイプｘｉ〜タイプｘｘ）または配列番号１９９のいずれか１つの核酸配列あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのＭＲＳＡ特異的オリゴヌクレオチドを含有することができる。いくつかの実施形態において、ＭＲＳＡ特異的オリゴヌクレオチドはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ染色体のｏｒｆ２２にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含むことができ、この場合、このオリゴヌクレオチドは、ＭＲＥＪタイプｘを検出するために、配列番号１９７を用いた増幅反応において使用することができる。好ましくは、ＭＲＳＡ特異的オリゴヌクレオチドは、下記の配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（タイプｉ〜タイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７（タイプｘｉ〜タイプｘｘ）または配列番号１９９のいずれか１つを含むことができるか、あるいは、そのようないずれか１つから本質的になることができるか、あるいは、そのようないずれか１つからなることができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、キットは、配列番号１、配列番号６、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のオリゴヌクレオチドを含有する。例えば、好ましい実施形態において、キットは、配列番号１、配列番号６、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３を含むか、または、配列番号１、配列番号６、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３から本質的になるか、または、配列番号１、配列番号６、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３からなる複数のオリゴヌクレオチドを含有することができる。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号３、配列番号８、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のオリゴヌクレオチドを含有し、例えば、配列番号３、配列番号８、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３を含むか、または、配列番号３、配列番号８、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３から本質的になるか、または、配列番号３、配列番号８、配列番号９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３からなる複数のオリゴヌクレオチドなどを含有する。好ましくは、キットはまた、下記の配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプローブを含み、例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１を含むか、あるいは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１から本質的になるか、あるいは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１からなる少なくとも１つのプローブなどを含む。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１Ａ】ＰＣＲ増幅反応の生成物を示すアガロースゲルの写真を示す。テンプレートＤＮＡのコピー数および供給源が示される（１５ｃｐ＝１５コピー；１８５ｃｐ＝１８５コピー）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ＝ＭＳＳＡ菌株ＡＴＣＣ２５９２３；ＭＲＳＡ＝ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ４３３００）。矢印はＰＣＲ産物のサイズおよびプライマーの二量体を示す。
【図１Ｂ】ＰＣＲ増幅反応の生成物を示すアガロースゲルの写真を示す。テンプレートＤＮＡのコピー数および供給源が示される（１５ｃｐ＝１５コピー；１８５ｃｐ＝１８５コピー）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ＝ＭＳＳＡ菌株ＡＴＣＣ２５９２３；ＭＲＳＡ＝ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ４３３００）。矢印はＰＣＲ産物のサイズおよびプライマーの二量体を示す。
【００９９】
【図２Ａ】分子ビーコンプローブを含有する反応液から測定されたＰＣＲ増幅曲線のグラフ表示を示す。反応液は、０コピー、２．５コピー、５コピー、１０コピー、１５コピーまたは２０コピーのＭＳＳＡテンプレートＤＮＡ、ならびに３０００コピーの内部コントロールＤＮＡを含有した。分子ビーコンプローブをそれぞれの反応液に加え、反応液の蛍光を測定した。ＦＡＭ標識のプローブがＭＲＳＡ特異的配列にハイブリダイゼーションし、ＴＥＴ標識のプローブが内部コントロールＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、テキサスレッド標識のプローブがＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にハイブリダイゼーションする。
【図２Ｂ】分子ビーコンプローブを含有する反応液から測定されたＰＣＲ増幅曲線のグラフ表示を示す。反応液は、０コピー、２．５コピー、５コピー、１０コピー、１５コピーまたは２０コピーのＭＲＳＡテンプレートＤＮＡ、ならびに３０００コピーの内部コントロールＤＮＡを含有した。分子ビーコンプローブをそれぞれの反応液に加え、反応液の蛍光を測定した。ＦＡＭ標識のプローブがＭＲＳＡ特異的配列にハイブリダイゼーションし、ＴＥＴ標識のプローブが内部コントロールＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、テキサスレッド標識のプローブがＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にハイブリダイゼーションする。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本明細書中に開示される方法および組成物は、サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓの検出および／または定量に関連し、また、１回のアッセイにおけるサンプルからの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）菌株の検出および／または定量、ならびに、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株の特定にも関連する。本明細書中に開示される実施形態は、任意のタイプのサンプル（例えば、任意の臨床サンプル、任意の環境サンプル、任意の微生物培養物、任意の微生物コロニー、任意の組織および任意の細胞株など）からのＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡの検出および／または定量のために有用である。
【０１０１】
ブドウ球菌はグラム陽性の球菌である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、血漿を凝固させる能力（コアグラーゼ反応）および凝集塊をフィブリノーゲンの存在下で形成する能力に基づいて結果が陽性であることによってブドウ球菌属の他の臨床的に関連した種から区別することができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、いくつかの他のブドウ球菌のように、熱安定性ヌクレアーゼ（ＴＮａｓｅ）を産生する能力を有する（Ｂｅｃｋｅｒ他（２００５）、Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．、５１：２３７〜２４４；Ｂｒａｋｓｔａｄ他（１９９５）、ＡＰＭＩＳ、１０３：２１９〜２２４；Ｃｈｅｓｎｅａｕ他（１９９３）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、７：３０１〜３１０）。それにもかかわらず、このヌクレアーゼをコードする遺伝子におけるいくつかのヌクレオチド配列はＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株について特異的である（Ｃｏｓｔａ他（２００５）、Ｄｉａｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５１：１３〜１７；ＭｃＤｏｎａｌｄ他（２００５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：６１４７〜６１４９；Ｚｈａｎｇ他（２００４）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：４９４７〜４９５５；Ｍａｅｓ他（２００２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０：１５１４〜１５１７）。
【０１０２】
［Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡを検出する方法］
いくつかの実施形態が、サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓを特異的に検出する方法に関連する。本明細書中には、ｎｕｃ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列（これは配列番号２００によって例示される）にアニーリングし、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを、他のブドウ球菌から、同様にまた、他のＴＮａｓｅ産生の細菌種から区別するために有用である新規なプライマーおよび／またはプローブ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２）が開示される。いくつかの実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブが提供される。例えば、いくつかの実施形態において、そのような少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むことができるか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２から本質的になることができるか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２からなることができる。そのような少なくとも１つのプライマーを、例えば、標準的なＰＣＲ条件またはストリンジェントな条件のもとで、サンプルの核酸にアニーリングさせることができる。アニーリングした（１つまたは複数の）プローブの存在および／または量、ならびに／もしくは、プライマーが核酸にアニーリングすることにより生じる増幅産物の量が検出され、それにより、サンプルに存在するＳ．ａｕｒｅｕｓの存在または量が示される。
【０１０３】
核酸に関連して用いられる場合、用語「から本質的になる」は、指定された核酸配列を示すことができ、また、指定された配列の基本的特徴および新規な特徴に実質的に影響しない任意のさらなるヌクレオチドを含むことができる。用語「から本質的になる」はまた、配列を調べることによって判断されるように、参照配列に実質的に類似し、かつ、重要でない様式で参照配列とは異なる変化体を示すことができる。例えば、同じアミノ酸配列をコードする核酸配列は、縮重位置での違い、あるいは、いずれかの非コード領域の長さまたは組成におけるあまり大きくない違いにもかかわらず、実質的に類似している。
【０１０４】
［プライマーおよび／またはプローブならびにヌクレオチド］
本明細書において、用語「プライマー」および用語「プローブ」はオリゴヌクレオチドまたは核酸に限定されず、むしろ、ヌクレオチドと同様に、ヌクレオチドのアナログである分子を包含する。本明細書において、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）ポリデオキシリボヌクレオチド、（Ｄ−リボースを含有する）ポリリボヌクレオチド、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、および、非ヌクレオチド骨格、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））、および、ポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、Ｏｒｅｇ）からＮＥＵＧＥＮＥ（商標）ポリマーとして市販されている）を含有する他のポリマー、ならびに、ポリマーが、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるような塩基対形成および塩基積み重なりを可能にする形態で核酸塩基を含有するならば、他の合成された配列特異的な核酸ポリマーに対する総称であるものとする。
【０１０５】
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの用語には、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミダート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、同様にまた、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ならびに、ＰＮＡと、ＤＮＡまたはＲＮＡとの間におけるハイブリッドが含まれる。これらの用語はまた、様々な周知のタイプの改変を含み、例えば、当該技術分野において周知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数をアナログにより置換すること、ヌクレオチド間の改変（例えば、非荷電の連結（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバマートなど）を有するヌクレオチド間の改変、負荷電の連結（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）を有するヌクレオチド間の改変、および、正荷電の連結（例えば、アミノアルキルホスホルアミダート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有するヌクレオチド間の改変など）、ペンダント状成分を含有する改変（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなどを含む）を含有する改変など）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を有する改変、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含有する改変、アルキル化体を含有する改変、改変された連結（例えば、α−アノマー核酸など）を有する改変を、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非改変形態と同様に含む。
【０１０６】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」および用語「ヌクレオチド」は、周知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、改変されている他の複素環式の塩基をも含有するそのような成分を含むことが理解される。そのような改変には、メチル化されたプリン類またはピリミジン類、アシル化されたプリン類またはピリミジン類、あるいは、他の複素環が含まれる。改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、様々な改変を糖成分に含む。この場合、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲンまたは脂肪族基により置換されるか、あるいは、エーテルまたはアミンなどとして機能化される。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する他の改変は、それぞれの相補的なピリミジンまたはプリンへの水素結合を形成するプリン塩基上またはピリミジン塩基上の官能基を再配列すること、あるいは、そのような官能基を取り付けること、あるいは、そのような官能基に置換すること、あるいは、他の場合には変化させることを伴う。得られる改変されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとではなく、他のそのような改変されたヌクレオチドユニットとの塩基対を形成することができる。例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を、イソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成するように改変することができる。そのような改変は、シトシンとの標準的な塩基対をもはや効果的に形成しないヌクレオシド塩基をもたらす。しかしながら、イソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン）を形成するためのシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミジン）の改変は、グアノシンとの効果的な塩基対を形成せず、しかし、イソグアノシンとの塩基対を形成する改変されたヌクレオチドをもたらす。イソシトシンが、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能である；イソシチジンを、Ｓｗｉｔｚｅｒ他（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：１０４８９〜１０４９６、および、それにおいて引用される参考文献によって記載される方法によって調製することができる；２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンを、Ｔｏｒ他（１９９３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１５：４４６１〜４４６７、および、それにおいて引用される参考文献によって記載される方法によって調製することができる；イソグアニンヌクレオチドを、Ｓｗｉｔｚｅｒ他（１９９３）（上掲）、および、Ｍａｎｔｓｃｈ他（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４：５５９３〜５６０１によって記載される方法を使用して、または、米国特許第５，７８０，６１０号（Ｃｏｌｌｉｎｓ他）に記載される方法によって調製することができる。κおよびπとして示される非天然型の塩基対を、２，６−ジアミノピリミジンおよびその相補体（１−メチルピラゾロ［４，３］−ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）を合成するために、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ他（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、３４３：３３〜３７に記載される方法によって合成することができる。独特の塩基対を形成す��他のそのような改変されたヌクレオチドユニットが、Ｌｅａｃｈ他（１９９２）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：３６７５〜３６８３；およびＳｗｉｔｚｅｒ他（上掲）に記載されており、あるいは、当業者には明らかである。
【０１０７】
プライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、長さが１０ヌクレオチド〜４５ヌクレオチドの間である。例えば、プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチドの長さが可能である。プライマーおよび／またはプローブは、例えば、固体支持体に結合された形態、液体、および、凍結乾燥された形態を含めて、任意の好適な形態で提供され得る。
【０１０８】
［アニーリングおよび特異的な結合］
標的核酸配列に対するプライマーおよび／またはプローブの結合またはアニーリングがハイブリダイゼーションによって達成される。特異的なハイブリダイゼーションが、標的核酸配列または参照核酸配列に対して少なくとも実質的に相補的である配列を選択することによって達成されることが当業者によって理解される。これには、オリゴヌクレオチド標的核酸配列がオリゴヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成することが含まれる。そのような配列は、互いに関して「完全に相補的である」として示すことができる。オリゴヌクレオチドが、本明細書中の核酸配列に関して「実質的に相補的である」として示されている場合、これら２つの配列は完全に相補的であってもよく、または、それらは、ハイブリダイゼーションしたときにミスマッチを形成するものでもあってもよいが、下記で議論されるようなストリンジェントな条件または標準的なＰＣＲ条件のもとでハイブリダイゼーションする能力を保持している。
【０１０９】
正の相関が、プローブの長さと、プローブが標的配列にアニーリングする効率および正確性の両方との間に存在する。具体的には、より長い配列は、より短い配列よりも高い融解温度（Ｔｍ）を示し、また、所与の標的配列の内部において反復される可能性がより少ないため、無差別的なハイブリダイゼーションを最小限に抑える。
【０１１０】
本明細書において、「Ｔｍ」および「融解温度」は交換可能な用語であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子からなる集団の５０％が一本鎖に解離する温度を示す。ポリヌクレオチドのＴｍを計算するための様々な式が当該技術分野では広く知られている。例えば、Ｔｍを下記の式によって計算することができる：
Ｔｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６−５０／Ｌ
式中、Ｌはヌクレオチド単位でのプローブの長さである。
また、ハイブリッドポリヌクレオチドのＴｍは、ＰＣＲプライマーのＴｍを計算するために一般に用いられる式である、１Ｍの塩におけるハイブリダイゼーションアッセイから採用された式を使用して推定することができる。
（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃
例えば、Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ他、ＰＣＲ（第２版）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：１９９７年）、２４頁を参照のこと。
当該技術分野では、他のより洗練された様々なコンピューター計算が存在しており、これらは、Ｔｍの計算のために、配列特徴に加えて構造的特徴を考慮に入れている。計算されたＴｍは単なる推定値に過ぎず、最適な温度は一般には、経験的に決定される。
【０１１１】
大きいＧ＋Ｃ含有量を有するプライマー配列またはプローブ配列、もしくは、回文配列を含むプライマー配列またはプローブ配列は、意図された標的部位がハイブリダイゼーションするように、自己ハイブリダイゼーションする傾向がある。なぜなら、このような配列に関しては、二分子のハイブリダイゼーション速度論ではなく、むしろ、一分子のハイブリダイゼーション速度論が溶液において一般に有利であるためである。しかしながら、十分な数のＧ：Ｃヌクレオチド対形成を含有するプローブを設計することもまた重要である。というのも、ＡおよびＴ（または、ＡおよびＵ）の塩基が標的配列と結合するために対形成する際の水素結合が２つであるのに対して、それぞれのＧ：Ｃ対は３つの水素結合により形成されるため、より堅固で、より強い結合を形成するからである。好ましいＧ＋Ｃ含有量は約５０％である。
【０１１２】
ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイゼーション混合物に含まれ得る有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度と同様に、プローブのアニーリング効率とは逆の関係で変化するのに対して、塩濃度が増大すると、結合が促進される。ストリンジェントなアニーリング条件のもとでは、より長いハイブリダイゼーションプローブまたは合成プライマーは、より短いハイブリダイゼーションプローブまたは合成プライマーがハイブリダイゼーションするよりも効率的にハイブリダイゼーションするが、これはより許容性高いの条件のもとで十分である。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションが、参照核酸配列または標的核酸配列がプローブにハイブリダイゼーションすることを可能にする条件のもとでの好適な緩衝液において行われる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、（例えば、約１Ｍ未満の塩濃度から、より通常的には約５００ｍＭ未満の塩濃度から、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度から）変化させることができ、また、ハイブリダイゼーション温度は、例えば、０℃もの低さから、２２℃超、約３０℃超、（ほとんどの場合には）約３７℃を超えるまでの範囲が可能であり、これらはプローブの長さおよび／または核酸組成に依存する。ＰＣＲのためのストリンジェントなハイブリダイゼーションの温度は、プライマーの長さおよび組成に依存して、４０℃〜７５℃の範囲であり、好ましくは４５℃〜７０℃の範囲である。より長いフラグメントは、特異的なハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とする場合がある。いくつかの要因がハイブリダイゼーションのストリンジェント性に影響を及ぼすので、パラメーターの組合せは、１つだけの要因の絶対的尺度よりも重要である。従って、例として、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を、（１）洗浄のために低イオン強度および高温を採用する条件、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる条件、（２）ハイブリダイゼーション期間中に変性剤（例えば、ホルムアミドなど）を採用する条件、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを伴う０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）とともに用いる条件、または、（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を用い、４２℃の０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での洗浄、および、５５℃の５０％ホルムアミド中での洗浄、その後、ＥＤＴＡを含有する５５℃の０．１ｘＳＳＣからなる高ストリンジェント性洗浄を伴う条件によって特定することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェント性のさらなる詳細および説明については、Ａｕｓ���ｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５年）を参照のこと。例えば、用語「ストリンジェントな条件」は、下記で記載されるように、標準的なＰＣＲ条件を包含する。
【０１１３】
臨床微生物学に適用されるＰＣＲ技術（標準的ＰＣＲ条件を含む）の総説については、ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  Ｐ．、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔによって発行；Ｂｏｓｔｏｎ：Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ（２０００）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６７：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ（１９９７）；および“ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（１９９１年〜１９９５年）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。「ＰＣＲ条件」の限定されない例には、本明細書中に引用される参考文献に開示される条件、および、下記の実施例において同様に開示される条件が含まれる：例えば、７２℃のアニーリング温度を伴う５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；または、５９℃のアニーリング温度を伴う４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍｇのＢＳＡ、４％のトレハロース；または、５５℃のアニーリング温度を伴う５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２。
【０１１４】
プライマーおよび／またはプローブを記載するために使用されるとき、本明細書中で使用される用語「特異的」または用語「種特異的」は、指定された種またはタイプ（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＭＲＳＡ）の核酸にストリンジェントな条件および／または標準的なＰＣＲ条件のもとでハイブリダイゼーションまたはアニーリングし、かつ、関係のない核酸（例えば、指定された種またはＭＲＥＪタイプとは異なる核酸など）には同じ条件のもとで実質的にアニーリングまたはハイブリダイゼーションしないプライマーおよび／またはプローブを示す。
【０１１５】
１つの好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるプローブまたはプライマーは、標的配列（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列またはＭＲＥＪ配列など）にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする。別の好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるプライマーまたはプローブは、長さにおいて少なくとも１０ヌクレオチド〜４５ヌクレオチドにわたって１００％の相補性を示す。例えば、プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチドにわたって標的配列に対する相補性を示す。いくつかの実施形態において、プライマーまたはプローブは、少なくとも１つの位置（例えば、プライマーおよび／またはプローブがミスマッチを含有する）、２つの位置、３つの位置、４つの位置、５つの位置、６つの位置、７つの位置またはそれ以上を除いて合計で１０個〜４５個の連続するヌクレオチドにわたって標的配列に対する１００％の相補性を示す。
【０１１６】
本明細書中に記載されるようにハイブリダイゼーションすることができる配列を含み、かつ、標的配列にハイブリダイゼーションしない一部分（例えば、タグまたはマーカー）を同様に含むプローブまたはプライマーもまた意図される。例えば、いくつかの実施形態において、プライマーおよび／またはプローブは、検出可能な成分（例えば、蛍光性成分など）または任意の他の検出可能なマーカー（例えば、下記で記載される検出可能なマーカーなど）を含有することができる。いくつかの実施形態において、プライマーおよび／またはプローブは、その後の操作（例えば、重合反応など）または酵素反応（例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化など）およびその他を容易にする核酸成分または他の分子成分、あるいは、プライマーおよび／またはプローブを固体支持体にカップリングする核酸成分または他の分子成分を含有する場合がある。
【０１１７】
［増幅および検出］
本明細書中に記載される方法において、アニーリングしたプライマーおよび／またはプローブの検出は直接的であってもよく、間接的であってもよい。例えば、プローブを、試験対象のサンプルにアニーリングさせ、直接的に検出することができる。他方で、プライマーを、対象のサンプルにアニーリングさせ、その後、増幅工程を続けることもできる。増幅された生成物を直接的に検出することができ、あるいは、増幅産物にアニーリングするプローブの検出によって検出することができる。
【０１１８】
好ましい実施形態において、増幅工程および／または検出工程はアニーリング工程の後におこなわれる。他の好ましい実施形態において、検出はアニーリング工程の期間中に行われる。任意のタイプの核酸増幅技術を本明細書中に記載される方法に使用することができる。本明細書中に記載される方法において使用することができる増幅反応の限定されない例には、下記の技術が含まれるが、それらに限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）、および、ＰＣＲ  ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ（１９９５）、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．（Ｉｎｎｉｓ）を参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ（１９８９）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）、Ｇｅｎｅ、８９：１１７を参照のこと）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自律的配列複製（３ＲＳ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１８７４を参照のこと）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、分岐ＤＮＡシグナル増幅ｂＤＮＡ、転写媒介増幅（ＴＭＡ）（Ｋｗｏｈ（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１１７３を参照のこと）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、ネスティドＰＣＲ、多重ＰＣＲ、固相増幅（ＳＰＡ）、ヌクレアーゼ依存シグナル増幅（ＮＤＳＡ）、ローリングサークル増幅技術（ＲＣＡ）、固定鎖置換増幅、固相（固定化）ローリングサークル増幅、Ｑβレプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）。これらの技術および他の技術はまた、Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：３０７〜３１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｍｕｌｌｉｓ（１９８７）、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；Ａｍｈｅｉｍ（１９９０）、Ｃ＆ＥＮ、３６〜４７；Ｌｏｍｅｌｌ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３５：１８２６（１９８９）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：２９１〜２９４（１９９０）；Ｗｕ（１９８９）、Ｇｅｎｅ、４：５６０；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ（１９９５）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５６３〜５６４に記載される。
【０１１９】
好ましい実施形態において、ＰＣＲが、サンプル中の核酸を増幅するために使用される。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の期間中、微生物のゲノムに由来する熱変性された標的ＤＮＡのそれぞれの鎖にそれぞれ結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、標的ＤＮＡをインビトロ（ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ）で指数関数的に増幅するために使用される。連続した熱サイクルにより、それぞれのサイクルにおけるＤＮＡの変性、プライマーのアニーリングおよび新しい標的の合成が可能となる。（Ｐｅｒｓｉｎｇ他（１９９３）、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、アメリカ微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
【０１２０】
当業者は、標準的な増幅プロトコルが、反応混合物に対する改変を含めて、核酸増幅効率を改善するために改変され得ることを理解するであろう。（Ｒａｌｓｅｒ他（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、３４７：７４７〜５１；Ｋａｎｇ他（２００５）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、（２００５）、６４：１４７〜５１；ＣｈａｋｒａｂａｒｔｉおよびＳｃｈｕｔｔ（２００２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２：８６６〜８７４；Ａｌ−ＳｏｕｄおよびＲａｄｓｔｒｏｍ（２０００）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３８：４４６３〜４４７０；Ａｌ−ＳｏｕｄおよびＲａｄｓｔｒｏｍ、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４：３７４８〜３７５３；Ｗｉｌｓｏｎ、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３：３７４１〜３７５１）。増幅反応混合物のそのような改変には、様々なポリメラーゼの使用、または、核酸増幅促進因子（例えば、ベタイン、ＢＳＡ、スルホキシド、タンパク質ｇｐ３２、界面活性剤、カチオンおよびテトラメチルアンモニウム塩化物など）の添加が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
増幅された核酸の検出には、当業者に知られている任意のリアルタイム技術または増幅後技術が含まれ得る。古典的には、ＰＣＲ増幅産物の検出は標準的な臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動によって行われるが、当業者は、日常的な分析のためにより速く、また、より実用的であり得る、特定の増幅産物を検出するための他の方法、例えば、同時係属中の特許出願ＷＯ０１／２３６０４Ａ２に記載される方法などが使用され得ることを容易に理解するであろう。アンプリコンの検出はまた、増幅産物にハイブリダイゼーションする種特異的な内部ＤＮＡプローブを使用する固体支持体ハイブリダイゼーションまたは液体ハイブリダイゼーションによって行うことができる。そのようなプローブは、本明細書中に提供されるＭＲＥＪ核酸配列またはｎｕｃ核酸配列に由来する任意の配列から作製することができ、また、本明細書中に開示される方法を利用して得られたＤＮＡ増幅産物に対して特異的にハイブリダイゼーションするように設計することができる。代替として、アンプリコンを配列決定によって特徴づけることができる。例えば、検出方法および配列決定方法の例については、同時係属中の特許出願ＷＯ０１／２３６０４Ａ２を参照のこと。
【０１２２】
本明細書中に開示される実施形態において使用することができる核酸検出技術の他の限定されない例には、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく方法（例えば、プローブの隣接ハイブリダイゼーション（プローブ−プローブ法およびプローブ−プライマー法を含む）など）（Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ、“Ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）を参照のこと）、ＴａｑＭａｎプローブ技術（欧州特許ＥＰ０５４３９４２を参照のこと）、分子ビーコンプローブ技術（Ｔｙａｇｉ他（１９９６）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０３〜３０８を参照のこと）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ技術（Ｔｈｅｗｅｌｌ（２０００）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：３７５２を参照のこと）、ナノ粒子プローブ技術（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ他（１９９７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：１０７８〜１０８１を参照のこと）、および、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブ技術（米国特許第５，８６６，３６６号、同第６，０９０，５９２号、同第６，１１７，６３５号および同第６，１１７，９８６号を参照のこと）の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
好ましい実施形態において、分子ビーコンが標的核酸の検出のために使用される。分子ビーコンは、標的に結合しない限り、ヘアピン配座で存在する一本鎖オリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの５’末端は蛍光性色素を含有する。クエンチャー色素がオリゴヌクレオチドの３’末端に取り付けられる。ビーコンが標的に結合していないとき、ヘアピン構造は蛍光団およびクエンチャーを非常に近くに位置させ、その結果、蛍光を観測することができないようにする。しかしながら、ビーコンが標的とハイブリダイゼーションすると、ヘアピン構造が乱され、それにより、蛍光団とクエンチャーが引き離され、蛍光の検出が可能になる。（Ｋｒａｍｅｒ  ＦＲ、１９９６、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３：３０３〜８を参照のこと）。他の検出方法には、免疫学的方法による標的遺伝子核酸の検出、フィルター、チップまたは任意の他の固体支持体における固相ハイブリダイゼーション方法が含まれる。これらのシステムにおいて、ハイブリダイゼーションを、蛍光、化学発光、ポテンシオメトリー、質量分析法、プラズモン共鳴、偏光法、比色法、フローサイトメトリーまたはスキャノメトリーを含めて、当業者に知られているいずれかの好適な方法によってモニターすることができる。ジデオキシ末端停止による配列決定、または、ハイブリダイゼーションによる配列決定（例えば、ＤＮＡチップを使用する配列決定）を含めて、ヌクレオチド配列決定は、標的核酸（例えば、ｎｕｃ核酸配列またはＭＲＥＪ核酸配列など）を検出し、特徴づけるための別の方法を表す。
【０１２４】
［方法］
好ましい実施形態において、サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株を検出するための方法は、第１のプライマーおよび第２のプライマーを有するプライマー対を提供する工程を含む。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングすることができる；例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２から実質的になるか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２からなるプライマーなど。好ましい実施形態において、プライマー対は、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８、あるいは、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む。例えば、好ましい実施形態において、プライマー対は、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８を含むことができるか、あるいは、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８から本質的になることができるか、あるいは、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８からなることができる。サンプルをプライマー対と接触させることができ、サンプルがプライマー対にアニーリングすることを可能にすることができる。好ましくは、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）が、本明細書中に記載される技術を使用してＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列を増幅するために、アニーリングしたプライマー対により行われる。その後、増幅産物を、本明細書中に記載される方法のいずれかを使用して検出することができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、プライマー対は、配列番号１またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーと、配列番号６またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第２のプライマーとを含む；例えば、配列番号１および配列番号６を含むか、または、配列番号１および配列番号６から本質的になるか、または、配列番号１および配列番号６からなるプライマー対など。いくつかの実施形態において、プライマー対は、サンプルに存在するｎｕｃ配列を増幅するために使用される。必要な場合には、配列番号９または配列番号１０あるいはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブもまた提供され、例えば、配列番号９および配列番号１０を含むか、または、配列番号９および配列番号１０から本質的になるか、または、配列番号９および配列番号１０からなるプローブが提供される。いくつかの実施形態において、プローブは分子ビーコンプローブであり、得られる増幅産物をこのプローブによって検出することができる。
【０１２６】
他の好ましい実施形態において、配列番号３またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第１のプライマーと、配列番号８またはその相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする第２のプライマーとが提供され、例えば、配列番号３および配列番号８を含むか、または、配列番号３および配列番号８から本質的になるか、または、配列番号３および配列番号８からなるプライマー対などが提供される。いくつかの実施形態において、プライマー対は、サンプルに存在するｎｕｃ配列を増幅するために使用される。必要な場合には、配列番号１１または配列番号１２あるいはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでアニーリングするプローブもまた提供され、例えば、配列番号１１または配列番号１２を含むか、あるいは、配列番号１１または配列番号１２から本質的になるか、あるいは、配列番号１１または配列番号１２からなるプローブが提供される。いくつかの実施形態において、プローブは分子ビーコンプローブである。
【０１２７】
本発明の他の局面が、１回のアッセイまたは反応においてサンプルから、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株の存在を検出し、かつ、ＭＲＳＡ菌株を特定するための方法および組成物に関連する。用語「１回のアッセイ」または用語「１回の反応」は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するための工程、および、ＭＲＳＡを検出するための工程が、例えば、同一の物理的容器内で、同時に、または、実質的に同時に行われる状況を示すことが意図される。しかしながら、当業者は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するための工程、および、ＭＲＳＡを検出するための工程はまた、連続して行われ得ることを理解する。好ましい実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡが、例えば、多重ＰＣＲ反応において同時に検出される。
【０１２８】
いくつかの実施形態は、サンプルを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ遺伝子の種特異的な配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと接触させる工程と、サンプルを、ＭＲＳＡ菌株のＭＲＥＪ配列に対して特異的である配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと接触させる工程とを伴う。
【０１２９】
ＭＲＳＡ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、例えば、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘを含めて、多型のＭＲＥＪ核酸にストリンジェントな条件のもとでアニーリングすることができる。ＭＲＥＪの表現はｍｅｃ右側先端接合（Ｍｅｃ  Ｒｉｇｈｔ  Ｅｘｔｒｉｍｉｔｙ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を示す。ＭＲＥＪは、長さがおよそ１キロベース（ｂｐ）であり、ＳＳＣｍｅｃ右側先端からの配列、同様にまた、ＳＣＣｍｅｃ組込み部位の右側に対する細菌の染色体ＤＮＡを含む（Ｈｕｌｅｔｓｋｙ他（２００４）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：１８７５〜１８８４を参照のこと）。菌株Ｎ３１５および菌株Ｍｕ５０の全ゲノム配列の決定に基づいて、近年、命名法が改訂された。これは、ＳＣＣｍｅｃエレメントがｏｒｆＸの（上流側ではなく）下流側に位置するからである。その結果、ＭＲＥＰ（Ｍｅｃ右側先端多型）はまた、ＭＬＥＰ（Ｍｅｃ左側先端多型）として示される。同様な証拠によって、ＭＲＥＪタイプはＭＬＥＪ（ｍｅｃ左側先端接合）として示すことができる（Ｃｈｏｎｇｔｒａｋｏｏｌ他（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：１００１〜１０１２）。このような事情はあるものの、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株、すなわち、ＭＲＳＡ菌株を分類するための同等な様式はいずれも、本発明の範囲に含まれる。これは、様々な配列により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを特異的に検出し、メチシリンに対して耐性であるＳ．ａｕｒｅｕｓを特定することができるからである。
【０１３０】
ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘの配列の限定されない例が配列番号１４〜配列番号８８において列挙される。従って、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的なｎｕｃプライマーおよび／またはｎｕｃプローブ（例えば、下記の配列番号２００、その相補体、または、配列番号２００とは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド異なる任意の配列の１つにストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド）に加えて、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘ（例えば、配列番号１４〜配列番号８８）の少なくとも１つのＭＲＥＪ配列またはその相補体にストリンジェントな条件のもとで特異的にアニーリングする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブが提供される。ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘのＭＲＳＡを検出するために有用な例示的なプライマーおよびプローブ、ならびに、そのようなプライマーおよびプローブの組合せは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４、および、米国特許出願第１１／２４８，４３８号に見出される（これらはそれらの全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる）。例えば、いくつかの実施形態において、方法において提供されるそのような少なくとも１つのＭＲＳＡ特異的なプライマーおよび／またはプローブは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、かつ、下記の配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７（ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘ）または配列番号１９９の１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションすることができる。例えば、ＭＲＳＡ特異的プライマーは、下記の配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７（ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘ）または配列番号１９９の１つを含むことができるか、あるいは、そのような１つから本質的になることができるか、あるいは、そのような１つからなることができる。ｎｕｃ特異的なプライマーおよび／またはプローブ（これは、例えば、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の１つあるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含み、例えば、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むか、あるいは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２から本質的になるか、あるいは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２からなるオリゴヌクレオチドなどを含む）、および、ＭＲＳＡ（すなわち、ＭＲＥＪ）特異的なプライマーおよび／またはプローブ（これは、例えば、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号２０１（タイプｉ〜タイプｉｘ）、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７（タイプｘｉ〜タイプｘｘ）または配列番号１９９あるいはその相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含む）が、サンプルの核酸にアニーリングさせられ、アニーリングしたプライマーおよび／またはプローブの存在、あるいは、それらから生じる増幅産物の存在が検出され、これにより、ＭＲＳＡの存在および／または量に加えて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在および／または量が示される。例えば、いくつかの実施形態において、サンプルが、（ＭＲＥＪタイプｉを検出するための）配列番号９２および配列番号８２、配列番号９２および配列番号８３、配列番号９２および配列番号８４、配列番号１０４および配列番号８６、配列番号１０４および配列番号８７、配列番号１０４および配列番号８８、配列番号９９および配列番号８９、配列番号９９および配列番号１９９；（ＭＲＥＪタイプｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号８２、配列番号９２および配列番号１２９、配列番号９２および配列番号１３０、配列番号９３および配列番号８３、ならびに、配列番号９２および配列番号８４、配列番号９９および配列番号８９、配列番号９９および配列番号１９９；（ＭＲＥＪタイプｉｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１３６、配列番号９２および配列番号１３７、配列番号９２および配列番号１３８、配列番号９９および配列番号２０２、配列番号９９および配列番号１４４；（ＭＲＥＪタイプｉｖを検出するための）配列番号９２および配列番号１４１、配列番号９９および配列番号１０５、配列番号９９および配列番号１５０；（ＭＲＥＪタイプｖを検出するための）配列番号９２および配列番号１４６、配列番号９９および配列番号１９６、配列番号９９および配列番号１５５；（ＭＲＥＪタイプｖｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１５２、配列番号９９および配列番号１６１；（ＭＲＥＪタイプｖｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１５３、配列番号９２および配列番号１５４、配列番号９９および配列番号１６２、配列番号９９および配列番号１６３；（ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１６２、配列番号９２および配列番号１６３、配列番号９９および配列番号１７０；（ＭＲＥＪタイプｉｘを検出するための）配列番号９２および配列番号１６８、配列番号９９および配列番号１７７；（ＭＲＥＪタイプｘを検出するための）配列番号１９７、および、ｏｒｆ２２にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド；（ＭＲＥＪタイプｘｉを検出するための）配列番号１８９および配列番号１０６、配列番号１８９および配列番号９９、配列番号１８９および配列番号１９０、配列番号１８９および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｉ
を検出するための）配列番号１９４および配列番号１０６、配列番号１９４および配列番号９９、配列番号１０４および配列番号１９１、配列番号１９４および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉを検出するための）配列番号１７７および配列番号１０６、配列番号１７７および配列番号９９、配列番号１７７および配列番号１９０、ならびに、配列番号１７７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｖを検出するための）配列番号１７７および配列番号１０６、配列番号１７７および配列番号９９、配列番号１７７および配列番号１９３、配列番号１７７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖを検出するための）配列番号１８４および配列番号１０６、配列番号１０８および配列番号９９、配列番号１８４および配列番号１９１、配列番号１８４および配列番号１９１；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉを検出するための）配列番号８９および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉを検出するための）配列番号１８５および配列番号１０６、配列番号１８５および配列番号９９、配列番号１８５および配列番号１９１、配列番号１８５および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉを検出するための）配列番号１８６および配列番号１０６、配列番号１８６および配列番号９９、配列番号１８６および配列番号１９３、配列番号１８６および１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｘを検出するための）配列番号１８７および配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号９９、配列番号１８７および配列番号９１３、配列番号１８７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｘを検出するための）配列番号１８８および配列番号１０６、配列番号１８８および配列番号９９、配列番号１８８および配列番号９１３、ならびに、配列番号１８８および配列番号１０９、あるいは、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプライマー対と接触させられる。
【０１３１】
最も臨床的に関連したＭＲＳＡ菌株は、ＭＲＥＪタイプｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｖ、ＭＲＥＪタイプｖおよびＭＲＥＪタイプｖｉｉを有する。従って、好ましい方法および組成物は、サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓ、ならびに、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｖおよびタイプｖｉｉのＭＲＳＡの検出に関連する。少なくとも１つのＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的なｎｕｃ特異的プライマーおよび／またはｎｕｃ特異的プローブが提供され、また、ＭＲＥＪタイプｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｖ、ＭＲＥＪタイプｖおよびＭＲＥＪタイプｖｉｉの特異的な検出のために有用なプライマーおよび／またはプローブが提供される。例えば、いくつかの実施形態において、下記の配列番号のそれぞれまたはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマーおよび／またはプローブが提供される：配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３；例えば、下記の配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３の少なくとも１つを含むか、または、下記の配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３の少なくとも１つから本質的になるか、または、下記の配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３の少なくとも１つからなるプライマーおよび／またはプローブなど。場合により、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１またはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブが、タイプｉ、タイプｉｉ、タイプｉｉｉ、タイプｉｖ、タイプｖおよびタイプｖｉｉのＭＲＥＪ配列の検出のために提供される。例えば、下記の配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１の少なくとも１つを含むか、または、下記の配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１の少なくとも１つから本質的になるか、または、下記の配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０および配列番号１３１の少なくとも１つからなる少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブが提供される。
【０１３２】
他の好ましい実施形態において、ＭＲＥＪ配列にアニーリングするそのような少なくとも１つの（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、（タイプｉおよびタイプｉｉのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１９９、（タイプｉｉｉのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１４４、（タイプｉｖのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１５０、（タイプｖのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１５５、ならびに、（タイプｖｉｉのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドの対を含む。場合により、（タイプｉおよびタイプｉｉのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１９９、（タイプｉｉｉのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１４４、（タイプｉｖのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１５０、（タイプｖのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１５５、ならびに、（タイプｖｉｉのＭＲＥＪを検出するための）配列番号９９および配列番号１６３のそれぞれにストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドが提供される。場合により、サンプルはまた、ＭＲＥＪ配列を検出するための、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１の核酸、あるいは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃを検出するための、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２の核酸、あるいは、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含むプローブと接触させられる。
【０１３３】
好ましい実施形態において、ｎｕｃ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、サンプル中のＳ．ａｕｒｅｕｓを検出するために下記のオリゴヌクレオチド対またはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする少なくとも１つの第１のプライマー対を含む：配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８。例えば、いくつかの実施形態において、ｎｕｃ特異的な（１つまたは複数の）プライマーおよび／または（１つまたは複数の）プローブは、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８を含むか、あるいは、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８から本質的になるか、あるいは、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８からなる少なくとも１つの第１のプライマー対を含む。場合により、サンプルが、配列番号１および配列番号５、または、配列番号１および配列番号６、または、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１および配列番号５、または、配列番号１および配列番号６を含むか、あるいは、配列番号１および配列番号５、または、配列番号１および配列番号６から本質的になるか、あるいは、配列番号１および配列番号５、または、配列番号１および配列番号６からなるオリゴヌクレオチド）を含む第１のプライマー対と接触させられる実施形態において、サンプルはまた、配列番号９にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１０）またはその相補体を含むプローブと接触させることができる。場合により、サンプルが、配列番号３および配列番号７、または、配列番号３および配列番号８、または、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号３および配列番号７、または、配列番号３および配列番号８を含むか、あるいは、配列番号３よび配列番号７、または、配列番号３および配列番号８から本質的になるか、あるいは、配列番号３および配列番号７、または、配列番号３および配列番号８からなるオリゴヌクレオチド）を含む第１のプライマー対と接触させられる実施形態において、サンプルはまた、配列番号１１にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１２）またはその相補体を含むプローブと接触させることができる。好ましくは、第１のプライマー対は、配列番号１および配列番号６、または、配列番号３および配列番号８、または、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含む。
【０１３４】
場合により、サンプルはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ配列を検出するために、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２に、あるいは、ＭＲＥＪ配列を検出するために、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１に、あるいは、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させられ、例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１を含むか、あるいは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１から本質的になるか、あるいは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１からなる少なくとも１つのプローブなどと接触させられる。
【０１３５】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在および／または量を示すものとして、また、ＭＲＳＡの存在および／または量を示すものとして、アニーリングした（１つまたは複数の）プローブの存在および／または量を検出することができ、あるいは、プライマーが核酸にアニーリングすることから生じる増幅産物の量を検出することができる。
【０１３６】
［組成物およびキット］
さらに、本明細書によれば、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドを含むか、または、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドから本質的になるか、または、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドからなる組成物およびキットが提供される。好ましくは、オリゴヌクレオチドは長さが１０ヌクレオチド〜４５ヌクレオチドの間である。例えば、オリゴヌクレオチドは、長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。当業者によって理解されるように、本明細書中に開示される実施形態の核酸は一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）であってもよく、二本鎖であってもよい。また、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコード配列または非コード配列が、本明細書中に開示される実施形態の核酸に存在してもよく（ただし、必ずしも存在する必要はない）、また、核酸は他の分子および／または支持体物質に連結されてもよい（ただし、必ずしも連結されている必要はない）。
【０１３７】
従って、いくつかの実施形態は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ配列に由来する下記の配列のいずれかまたはその相補体の核酸とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする、約１０ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチドの間である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（好ましくは、長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチドである少なくとも１つのオリゴヌクレオチド）を含むか、または、そのような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから本質的になるか、または、そのような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからなる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２；例えば、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１つを含むか、あるいは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１つから本質的になるか、あるいは、下記の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１つからなるオリゴヌクレオチド。好ましい実施形態は、下記の配列番号１および配列番号５の対、配列番号１および配列番号６の対、配列番号２および配列番号５の対、配列番号２および配列番号６の対、配列番号３および配列番号７の対、配列番号３および配列番号８の対、配列番号４および配列番号７の対、または、配列番号４および配列番号８の対のいずれか、あるいは、それらの相補体とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマー対を含むか、あるいは、そのようなプライマー対から本質的になるか、あるいは、そのようなプライマー対からなる；例えば、下記の配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８を含むか、あるいは、下記の配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８から本質的になるか、あるいは、下記の配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８からなるプライマー対。いくつかの実施形態において、配列番号９および配列番号１１とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１０および配列番号１２）またはその相補体を含む少なくとも１つのプローブが提供される。
【０１３８】
他の局面が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡを１回の反応において検出するために有用な組成物に関連する。従って、いくつかの実施形態は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にハイブリダイゼーションする、長さが好ましくは約１０ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチドの間である少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブ（例えば、長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドなど）と、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘの少なくとも１つのＭＲＥＪ配列にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブとを含むか、あるいは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にハイブリダイゼーションするそのような少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘの少なくとも１つのＭＲＥＪ配列にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブとから本質的になるか、あるいは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にハイブリダイゼーションするそのような少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘの少なくとも１つのＭＲＥＪ配列にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブとからなる。いくつかの実施形態は少なくとも２つのプライマー対を提供し、この場合、第１のプライマー対はＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションし（例えば、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８）、第２のプライマー対はＭＲＥＪ配列にハイブリダイゼーションする（例えば、（ＭＲＥＪタイプｉを検出するための）配列番号９２および配列番号８２、配列番号９２および配列番号８３、配列番号９２および配列番号８４、配列番号１０４および配列番号８６、配列番号１０４および配列番号８７、配列番号１０４および配列番号８８、配列番号９９および配列番号８９、配列番号９９および配列番号１９９；（ＭＲＥＪタイプｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号８２、配列番号９２および配列番号１２９、配列番号９２および配列番号１３０、配列番号９３および配列番号８３、ならびに、配列番号９２および配列番号８４、配列番号９９および配列番号８９、配列番号９９および配列番号１９９；（ＭＲＥＪタイプｉｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１３６、配列番号９２および配列番号１３７、配列番号９２および配列番号１３８、配列番号９９および配列番号２０２、配列番号９９および配列番号１４４；（ＭＲＥＪタイプｉｖを検出するための）配列番号９２および配列番号１４１、配列番号９９および配列番号１０５、配列番号９９および配列番号１５０；（ＭＲＥＪタイプｖを検出するための）配列番号９２および配列番号１４６、配列番号９９および配列番号１９６、配列番号９９および配列番号１５５；（ＭＲＥＪタイプｖｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１５２、配列番号９９および配列番号１６１；（ＭＲＥＪタイプｖｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１５３、配列番号９２および配列番号１５４、配列番号９９および配列番号１６２、配列番号９９および配列番号１６３；（ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１６２、配列番号９２および配列番号１６３、配列番号９９および配列番号１７０；（ＭＲＥＪタイプｉｘを検出するための）配列番号９２および配列番号１６８、配列番号９９および配列番号１７７；（ＭＲＥＪタイプｘを検出するための）配列番号１９７、および、ｏｒｆ２２にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド；（ＭＲＥＪタイプｘｉを検出するための）配列番号１８９および配列番号１０６、配列番号１８９および配列番号９９、配列番号１８９および配列番号１９０、配列番号１８９および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｉを検出するための）配列番号１９４および配列番号１０６、配列番号１９４および配列番号９９、配列番号１０４および配列番号１９１、配列番号１９４および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉを検出するための）配列番号１７７および配列番号１０６、配列番号１７７および配列番号９９、配列番号１７７および配列番号１９０、ならびに、配列番号１７７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｖを検出するための）配列番号１７７および配列番号１０６、配列番号１７７および配列番号９９、配列番号１７７および配列番号１９３、配列番号１７７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖを検出するための）配列番号１８４および配列番号１０６、配列番号１０８および配列番号９９、配列番号１８４および配列番号１９１、配列番号１８４および配列番号１９１；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉを検出するための）配列番号８９および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉを検出するための）配列番号１８５および配列番号１０６、配列番号１８５および配列番号９９、配列番号１８５および配列番号１９１、配列番号１８５および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉを検出するための）配列番号１８６および配列番号１０６、配列番号１８６および配列番号９９、配列番号１８６および配列番号１９３、配列番号１８６および１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｘを検出するための）配列番号１８７および配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号９９、配列番号１８７および配列番号９１３、配列番号１８７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｘを検出するための）配列番号１８８および配列番号１０６、配列番号１８８および配列番号９９、配列番号１８８および配列番号９１３、ならびに、配列番号１８８および配列番号１０９）。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃプライマー対および／またはＭＲＥＪ特異的プライマー対によって生じる増幅産物にハイブリダイゼーションすることができる少なくとも１つのプローブもまた提供される（例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１）。
【０１３９】
従って、いくつかの実施形態は、下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマー対を含むか、または、下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマー対から本質的なるか、または、下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマー対からなる：
【０１４０】
配列番号１および配列番号６；
【０１４１】
配列番号９９および配列番号１９９；
【０１４２】
配列番号９９および配列番号１４４；
【０１４３】
配列番号９９および配列番号１５０；
【０１４４】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【０１４５】
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体。
【０１４６】
他の実施形態は、プライマーが下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のプライマー対を含むか、または、プライマーが下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のプライマー対から本質的なるか、または、プライマーが下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のプライマー対からなる：
【０１４７】
配列番号３および配列番号８；
【０１４８】
配列番号９９および配列番号１９９；
【０１４９】
配列番号９９および配列番号１４４；
【０１５０】
配列番号９９および配列番号１５０；
【０１５１】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【０１５２】
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体。
【０１５３】
さらに他の局面が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、または、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡを検出および／または定量するためのキットに関連する。いくつかの実施形態において、キットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ配列に由来する下記配列の核酸のいずれかまたはその相補体とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする、長さが約１０ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチドの間である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチドである少なくとも１つのオリゴヌクレオチドなど）を含むか、あるいは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ配列に由来する下記配列の核酸のいずれかまたはその相補体とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするそのような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから本質的になるか、あるいは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ配列に由来する下記配列の核酸のいずれかまたはその相補体とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするそのような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからなる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号尾４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２。好ましい実施形態は、下記の配列番号１および配列番号５の対、配列番号１および配列番号６の対、配列番号２および配列番号５の対、配列番号２および配列番号６の対、配列番号３および配列番号７の対、配列番号３および配列番号８の対、配列番号４および配列番号７の対、または、配列番号４および配列番号８の対のいずれか、あるいは、それらの相補体とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマー対を含むか、または、そのようなプライマー対から本質的になるか、または、そのようなプライマー対からなるキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号９および配列番号１１とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１０および配列番号１２）またはその相補体を含む少なくとも１つのプローブを提供する。
【０１５４】
他の実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡを一緒に検出するために有用なキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にハイブリダイゼーションする、長さが約１０ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチドの間である少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブ（例えば、長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチドである少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブなど）と、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘの少なくとも１つのＭＲＥＪ配列にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブとを含むか、あるいは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にハイブリダイゼーションするそのような少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘの少なくとも１つのＭＲＥＪ配列にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブとから本質的になるか、あるいは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にハイブリダイゼーションするそのような少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブと、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘの少なくとも１つのＭＲＥＪ配列にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブとからなる。いくつかの実施形態は、少なくとも２つのプライマー対を含むキットを提供する。第１のプライマー対はＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃ配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションすることができ（例えば、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、かつ、配列番号１および配列番号５、配列番号１および配列番号６、配列番号２および配列番号５、配列番号２および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号４および配列番号７、または、配列番号４および配列番号８、あるいは、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションすることができるプライマー）、第２のプライマー対はＭＲＥＪ配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションすることができる（例えば、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、かつ、（ＭＲＥＪタイプｉを検出するための）配列番号９２および配列番号８２、配列番号９２および配列番号８３、配列番号９２および配列番号８４、配列番号１０４および配列番号８６、配列番号１０４および配列番号８７、配列番号１０４および配列番号８８、配列番号９９および配列番号８９、配列番号９９および配列番号１９９；（ＭＲＥＪタイプｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号８２、配列番号９２および配列番号１２９、配列番号９２および配列番号１３０、配列番号９３および配列番号８３、ならびに、配列番号９２および配列番号８４、配列番号９９および配列番号８９、配列番号９９および配列番号１９９；（ＭＲＥＪタイプｉｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１３６、配列番号９２および配列番号１３７、配列番号９２および配列番号１３８、配列番号９９および配列番号２０２、配列番号９９および配列番号１４４；（ＭＲＥＪタイプｉｖを検出するための）配列番号９２および配列番号１４１、配列番号９９および配列番号１０５、配列番号９９および配列番号１５０；（ＭＲＥＪタイプｖを検出するための）配列番号９２および配列番号１４６、配列番号９９および配列番号１９６、配列番号９９および配列番号１５５；（ＭＲＥＪタイプｖｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１５２、配列番号９９および配列番号１６１；（ＭＲＥＪタイプｖｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１５３、配列番号９２および配列番号１５４、配列番号９９および配列番号１６２、配列番号９９および配列番号１６３；（ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉを検出するための）配列番号９２および配列番号１６２、配列番号９２および配列番号１６３、配列番号９９および配列番号１７０；（ＭＲＥＪタイプｉｘを検出するための）配列番号９２および配列番号１６８、配列番号９９および配列番号１７７；（ＭＲＥＪタイプｘを検出するための）配列番号１９７、および、ｏｒｆ２２にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド；（ＭＲＥＪタイプｘｉを検出するための）配列番号１８９および配列番号１０６、配列番号１８９および配列番号９９、配列番号１８９および配列番号１９０、配列番号１８９および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｉを検出するための）配列番号１９４および配列番号１０６、配列番号１９４および配列番号９９、配列番号１０４および配列番号１９１、配列番号１９４および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉを検出するための）配列番号１７７および配列番号１０６、配列番号１７７および配列番号９９、配列番号１７７および配列番号１９０、ならびに、配列番号１７７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｖを検出するための）配列番号１７７および配列番号１０６、配列番号１７７および配列番号９９、配列番号１７７および配列番号１９３、配列番号１７７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖを検出するための）配列番号１８４および配列番号１０６、配列番号１０８および配列番号９９、配列番号１８４および配列番号１９１、配列番号１８４および配列番号１９１；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉを検出するための）配列番号８９および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉを検出するための）配列番号１８５および配列番号１０６、配列番号１８５および配列番号９９、配列番号１８５および配列番号１９１、配列番号１８５および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉを検出するための）配列番号１８６および配列番号１０６、配列番号１８６および配列番号９９、配列番号１８６および配列番号１９３、配列番号１８６および１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｉｘを検出するための）配列番号１８７および配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号９９、配列番号１８７および配列番号９１３、配列番号１８７および配列番号１０９；（ＭＲＥＪタイプｘｘを検出するための）配列番号１８８および配列番号１０６、配列番号１８８および配列番号９９、配列番号１８８および配列番号９１３、ならびに、配列番号１８８および配列番号１０９、あるいは、それらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションすることができるプライマー）。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載されるＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ｎｕｃプライマー対および／またはＭＲＥＪ特異的プライマー対によって生じる増幅産物にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションすることができる少なくとも１つのプローブ（例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０または配列番号１３１あるいはそれらの相補体にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドを含むプローブ）を含む。
【０１５５】
従って、いくつかの実施形態は、下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマー対を含むか、または、下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマー対から本質的になるか、または、下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするプライマー対からなるキットを提供する：
【０１５６】
配列番号１および配列番号６；
【０１５７】
配列番号９９および配列番号１９９；
【０１５８】
配列番号９９および配列番号１４４；
【０１５９】
配列番号９９および配列番号１５０；
【０１６０】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【０１６１】
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体。
【０１６２】
他の実施形態は、プライマーが下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のプライマー対を含むか、または、プライマーが下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のプライマー対から本質的になるか、または、プライマーが下記の核酸配列にストリンジェントな条件のもとでアニーリングする複数のプライマー対からなるキットを提供する：
【０１６３】
配列番号３および配列番号８；
【０１６４】
配列番号９９および配列番号１９９；
【０１６５】
配列番号９９および配列番号１４４；
【０１６６】
配列番号９９および配列番号１５０；
【０１６７】
配列番号９９および配列番号１５５；ならびに
【０１６８】
配列番号９９および配列番号１６３、または、それらの相補体。
【０１６９】
本明細書に開示される診断キット、プライマーおよびプローブは、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）適用および／またはインサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）適用の両方において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓと、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘのＭＲＳＡとを検出および／または特定することに加えて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出および／または特定するために使用することができる。例えば、キットは、ＭＲＥＪタイプｉ〜ＭＲＥＪタイプｘｘのＭＲＳＡを検出するために、何らかの以前に記載されたプライマー／プローブとの組合せで使用され得ることが意図される。本明細書に開示される診断キット、プライマーおよびプローブは、単独で、あるいは、微生物を検出および／または特定するために好適な何らかの他のアッセイとの組合せで使用され得ることもまた意図されている。そのようなアッセイには、核酸の検出に基づく任意のアッセイ、任意の免疫アッセイ、任意の酵素アッセイ、任意の生化学的アッセイ、任意の溶菌型アッセイ、任意の血清学的アッセイ、任意の鑑別培養培地、任意の濃縮培養培地、任意の選択培養培地、任意の特異的アッセイ培地、任意の同定培養培地、任意の計数用培養培地、任意の細胞染色、特定の細胞株での任意の培養、および、動物での任意の感染性アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
本発明を一般的に記載してきたが、ここに記載される具体的な実施例を参照することにより、さらに本発明が理解されるであろう。ここに記載される具体的な実施例は例示目的のために記載するものであり、本発明をこれらの実施例に限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１７１】
本実施例は、ＰＣＲを使用するサンプルからのＳ．ａｕｒｅｕｓの最適化された特異的な検出のために選ばれた様々なプライマー対の有用性を例示する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８は、ｎｕｃ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的領域にアニーリングするように設計された。ＰＣＲ反応混合物には、それぞれが０．５μＭの前記のプライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、２ｍＭのＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）、１ユニットのＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ＥＭＤ）、１０ｍＭのＫＣｌ（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｍａｔ）および５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＳＩＧＭＡ）が含まれた。
【０１７２】
試験対象のそれぞれのプライマー対について、異なる量の染色体テンプレートＤＮＡを含有する３つの反復反応を行った。１つの反応組では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株ＡＴＣＣ４３３００（ＭＲＳＡ）に由来する１５コピーの染色体テンプレートＤＮＡが含まれた。別の反応組では、１８５コピーのＡＴＣＣ４３３００テンプレートＤＮＡが含まれた。添加されたテンプレートＤＮＡを何ら有していない陰性コントロールもまた行った。並行した反応組を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株ＡＴＣＣ２５９２３（ＭＳＳＡ）に由来する染色体テンプレートＤＮＡを用いて行った。
【０１７３】
ＰＣＲ反応を、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＱＴ−ＰＣＲ装置（Ｃｅｐｈｅｉｄ）を使用して行った。サイクル処理パラメーターは以下の通りであった：
９５℃で９００分間の後、９５℃で５秒間、５９℃で１５秒間、２０秒間の７２℃で２０秒間を４５サイクル。
増幅された生成物をアガロースゲルで可視化した（図１Ａおよび図１Ｂ）。
【０１７４】
図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、下記のプライマー対は、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの両方のＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株から得られるＤＮＡの特異的な増幅において特に良好な結果を示した：
【０１７５】
配列番号１および配列番号５；
【０１７６】
配列番号１および配列番号６；
【０１７７】
配列番号２および配列番号６；
【０１７８】
配列番号４および配列番号７；
【０１７９】
配列番号４および配列番号８；
【０１８０】
配列番号３および配列番号７；ならびに
【０１８１】
配列番号３および配列番号８。
【０１８２】
生じた増幅産物の相対的な量からわかるように、配列番号２および配列番号５のプライマー対は、他のプライマー対と比較して感度が低かった。
【実施例２】
【０１８３】
１回の反応でＳ．ａｕｒｅｕｓを検出し、かつ、ＭＲＳＡを特定することができるかを調べた。多重ＰＣＲ反応は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの種特異的なｏｒｆＸ配列、および最も一般的に臨床的に遭遇されるＭＲＳＡタイプ（すなわち、ＭＲＥＪタイプｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｖ、ＭＲＥＪタイプｖ、ＭＲＥＪタイプｖｉｉのＭＲＳＡ）のＳＣＣｍｅｃ右側先端接合（ＭＲＥＪ）の配列に標準的ＰＣＲ条件のもとでアニーリングするプライマーを含めるよう設計された。配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３を、ＭＲＥＪタイプｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｖ、ＭＲＥＪタイプｖおよびＭＲＥＪタイプｖｉｉのＭＲＳＡを検出するために使用した。ｎｕｃ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的領域に同じ条件のもとでアニーリングするプライマー（配列番号３および配列番号８）を、ＭＲＳＡ菌株およびＭＳＳＡ菌株の両方を試験反応において検出するための反応で使用した。ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）装置において、ＦＡＭチャンネル、テキサスレッドチャンネルまたはＴＥＴチャンネルで検出可能である分子ビーコンプローブを、ＭＲＳＡ特異的反応の増幅産物に対するハイブリダイゼーションのために（配列番号１２６および配列番号１３０）、ｎｕｃ／Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的反応の増幅産物に対するハイブリダイゼーションのために（配列番号１２）、また、内部コントロールの増幅産物に対するハイブリダイゼーションのためにそれぞれ設計した。
【０１８４】
ＰＣＲ反応液には、０．９μＭの配列番号９９、０．４μＭの配列番号１９９、０．６μＭの配列番号１４４、０．３μＭの配列番号１５０、０．２μＭの配列番号１５５、０．７μＭの配列番号１６３、０．１μＭの配列番号３、０．１μＭの配列番号８、０．１μＭの配列番号１２６、０．１μＭの配列番号１３０、０．２５μＭの配列番号１２、０．２μＭのコントロールＤＮＡ、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、４ｍＭのＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）、２．８ユニットのＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）（ＥＭＤ）、１０ｍＭのＫＣｌ（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｍａｔ）、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＳＩＧＭＡ）、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、４％のトレハロース（ＳＩＧＭＡ）、３０００コピーの内部コントロールテンプレートＤＮＡ、２７８０コピーのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ染色体ＤＮＡ、および、０コピー、２．５コピー、５コピー、１０コピー、１５コピーまたは２０コピーのＭＳＳＡ染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ菌株２５９２３から単離されたもの）、あるいは、０コピー、２．５コピー、５コピー、１０コピーまたは２０コピーのＭＲＳＡ染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ菌株４３３００から単離されたもの）のいずれかが含まれた。
【０１８５】
ＰＣＲ反応をＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）装置（Ｃｅｐｈｅｉｄ）で行った。サイクル処理パラメーターは以下の通りであった：
９５℃で９００分間の後、９５℃で５秒間、５９℃で１５秒間、２０秒間の７２℃で２０秒間を４５サイクル。
適切な波長で蛍光を連続して測定した。その測定結果は図２Ａおよび図２Ｂにグラフで示してある。
【０１８６】
図２Ａは、ＭＳＳＡテンプレートＤＮＡを含有する反応液の蛍光読み取り値を示す。これらの反応条件のもとにおいて、２．５コピーのＭＳＳＡ  ＤＮＡが容易に検出されており（テキサスレッドチャンネル）、多重ＰＣＲにおける配列番号３、配列番号８および配列番号１２の有用性を示している。予想された通り、ＴＥＴチャンネルには陽性シグナルも存在している。このことは、内部コントロールが正しく働いたこと、および、阻害剤が反応液中に存在しなかったことを示している。
【０１８７】
図２Ｂは、ＭＲＳＡテンプレートＤＮＡを含有する反応液の蛍光読み取り値を示す。これらの反応条件のもとにおいて、２．５コピーのＭＲＳＡ  ＤＮＡが容易に検出されており（ＦＡＭチャンネル）、ＭＲＳＡを含むすべてのＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株を検出することができる多重ＰＣＲにおける配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１５０、配列番号１５５、配列番号１４４、配列番号１２６および配列番号１３０の有用性を示している。テキサスレッドチャンネルにおいて示されるように、ｎｕｃ特異的なプライマーおよびプローブ（配列番号３、配列番号８および配列番号１２）により、２．５コピーのＤＮＡが検出された。ＴＥＴチャンネルには陽性シグナルも存しており、内部コントロールが正しく働いたこと、および、阻害剤が反応液に存在しなかったことを示している。
【０１８８】
本実施例は、ＭＲＳＡ由来のＭＲＥＪ配列およびＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のｎｕｃ配列を内部コントロールとともに増幅するＰＣＲ多重アッセイを用いて得ることができる感度が非常に高いことを強調している。
【実施例３】
【０１８９】
ＭＲＳＡ由来のＭＲＥＪ配列およびＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のｎｕｃ配列を増幅する多重ＰＣＲアッセイの特異性を分析した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ以外の８０の細菌種に由来する染色体ＤＮＡを、実施例２において記載されるような多重ＰＣＲアッセイにおけるテンプレートＤＮＡとして使用した。試験対象とした菌株が表２に列挙されている。
【０１９０】
０．９μＭの配列番号９９、０．４μＭの配列番号１９９、０．６μＭの配列番号１４４、０．３μＭの配列番号１５０、０．２μＭの配列番号１５５、０．７μＭの配列番号１６３、０．１μＭの配列番号３、０．１μＭの配列番号８、０．１μＭの配列番号１２６、０．１μＭの配列番号１３１、０．２５μＭの配列番号１１、０．２μＭの内部コントロールＤＮＡ、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、４ｍＭのＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）、２．８ユニットのＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）（ＥＭＤ）、１０ｍＭのＫＣｌ（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｍａｔ）、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＳＩＧＭＡ）、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、４％のトレハロース（ＳＩＧＭＡ）、３０００コピーの内部コントロールテンプレートＤＮＡおよび２７８０コピーのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＤＮＡを含有する各別のシーケンス反応溶液に、表１に示されるそれぞれの細菌種から単離された染色体ＤＮＡの１ｎｇを用いた。
【０１９１】
それぞれの反応は三連で行った。反応を実施例２において示されるパラメーターに従って進行させた。表２には、反応の結果がまとめられる。試験対象とされた８０の異なる細菌種について、ＦＡＭチャンネルおよびテキサスレッドチャンネルにおいては、陽性シグナルが認められなかった。試験対象とされた８０の異なる細菌種のそれぞれについて、ＴＥＴチャンネルにおいては陽性シグナルが検出された。このことは、反応液が阻害剤を含有しなかったことを示している。結果を解釈するアルゴリズムが表３にまとめられている。
【０１９２】
【表２−１】
2014204717.tif 000002
【表２−２】
2014204717.tif 000003
【表２−３】
2014204717.tif 000004
【０１９３】
【表３】
2014204717.tif 000005
【０１９４】
本実施例は、ＭＲＳＡ由来のＭＲＥＪ配列およびＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のｎｕｃ配列を内部コントロールとともに増幅するＰＣＲ多重アッセイにより達成される特異性が完全であることを強調している。
【実施例４】
【０１９５】
ＭＲＳＡ由来のＭＲＥＪ配列およびＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のｎｕｃ配列を増幅するＰＣＲ多重アッセイが、正確にＳ．ａｕｒｅｕｓを検出し、創傷試料から直接ＭＲＳＡを特定することができるかを調べた。
【０１９６】
多重ＰＣＲ反応を、すべてのＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株のｎｕｃ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的領域にアニーリングするプライマー（例えば、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ）に加えて最も臨床的に関連したＭＲＳＡのＭＲＥＪ領域に対して特異的な配列を増幅するためのプライマー（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ種特異的ｏｒｆＸ配列およびＳＣＣｍｅｃ配列にアニーリングするプライマー）を同条件のもとで含めるよう設計した。概略を記載すると、配列番号９９、配列番号１９９、配列番号１４４、配列番号１５０、配列番号１５５および配列番号１６３を、ＭＲＥＪタイプｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｉｉ、ＭＲＥＪタイプｉｖ、ＭＲＥＪタイプｖおよびＭＲＥＪタイプｖｉｉの様々なＭＲＳＡのＭＲＥＪ領域の配列を増幅するために使用した。ＭＲＳＡ菌株およびＭＳＳＡ菌株の両方を検出するための試験反応において、ｎｕｃ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的領域に同じ条件のもとでアニーリングするプライマー（配列番号３および配列番号８）を使用した。ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）装置において、ＦＡＭチャンネル、テキサスレッドチャンネルおよびＴｅｔチャンネルで検出可能である分子ビーコンプローブを、ＭＲＳＡ特異的反応（配列番号１２６および配列番号１３０）、ｎｕｃ／Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的反応（配列番号１２）、および部コントロールのそれぞれの増幅産物に対するハイブリダイゼーション用に設計した。
【０１９７】
Ａｍｉｅｓ液体スワブ（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、１０３の創傷サンプルを、様々な患者について集めた。サンプルを血液寒天平板（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養および継代培養した。それらの形態学に基づいて、疑われるＳ．ａｕｒｅｕｓを、コアグラーゼ試験（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．およびＷ．Ｅ．Ｋｌｏｏｓ、１９８７、ブドウ球菌感染症（Ｂ．Ｂ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ（編）、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、第７版、アメリカ公衆衛生協会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．））により特定し、一部の場合にはラテックス凝集（Ｓｔａｐｈａｕｒｅｘ，Ｒｅｍｅｌ  Ｉｎｃ．）により特定した。メチシリン耐性を、ＶＩＴＥＫ（商標）細菌同定システム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を使用して決定した。
【０１９８】
ＩＤＩ（商標）溶解キット（ＧｅｎｅＯｈｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、単離体からＤＮＡを単離した。単離体のスワブを１ｍＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）の中で壊し、高速度で１分間ボルテックス処理した。５０μＬの細胞懸濁物を、ガラスビーズを含有する溶解チューブに移し、高速度で５分間ボルテックス処理した。チューブを１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、９５℃で２分間加熱した。チューブは反応で使用するまで氷上に置いた。
【０１９９】
０．９μＭの配列番号９９、０．４μＭの配列番号１９９、０．６μＭの配列番号１４４、０．３μＭの配列番号１５０、０．２μＭの配列番号１５５、０．７μＭの配列番号１６３、０．１μＭの配列番号３、０．１μＭの配列番号８、０．１μＭの配列番号１２６、０．１μＭの配列番号１３０、０．２５μＭの配列番号１２、０．２μＭの内部コントロールＤＮＡ、０．３μＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、４ｍＭのＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）、２．８ユニットのＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）（ＥＭＤ）、１０ｍＭのＫＣｌ（ＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅＭａｔ）、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＳＩＧＭＡ）、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、４％のトレハロース（ＳＩＧＭＡ）、３０００コピーの内部コントロールＤＮＡおよび２７８０コピーのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ染色体ＤＮＡを含有するＰＣＲミックスに３μＬの溶解反応液を加えた。
【０２００】
実施例２において示されるのと同じサイクル処理パラメーターを使用してＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）でＰＣＲを行った。ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウエアを使用して、それぞれの試料について、ＦＡＭチャンネル、テキサスレッドチャンネルおよびＴＥＴチャンネルにおけるサイクル閾値（ＣＴ）を、決定した。アッセイ結果は、表３に示されるように解釈された。
【０２０１】
上記の多重ＰＣＲアッセイは、テキサスレッドチャンネルにおいてすべてのＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株が陽性シグナルを生じるように設計される。臨床的に関連したＭＲＳＡの存在はＦＡＭチャンネルにおいて陽性シグナルを生じさせる。従って、テキサスレッドチャンネルにおける陽性の結果とＦＡＭチャンネルにおける陰性の結果の組合わせは、ＭＳＳＡの存在を示している。
【０２０２】
上記の培養アッセイと、多重ＰＣＲ反応との間で結果の不一致が見られた場合、スワブを含有するＴＥ緩衝液チューブにＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈを加え、３５℃で一晩インキュベーションした。５０μＬの一晩培養物を血液寒天平板に置床し、単離体を、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡまたは陰性（非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）として特定した。
【０２０３】
集められたデータが、下記の表４Ａ、表４Ｂおよび表４Ｃに示されている。
【０２０４】
【表４Ａ】
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【０２０５】
【表４Ｂ】
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【０２０６】
【表４Ｃ−１】
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【表４Ｃ−２】
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【表４Ｃ−３】
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【表４Ｃ−４】
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【０２０７】
表４Ａおよび表４Ｂに示されるように、多重アッセイはＭＲＳＡについて１００％の感度であり、このことは、ＰＣＲアッセイで達成された陽性のＭＲＳＡ結果のいずれもが、解明前および解明後の両方で、培養での同定における陽性の結果に対応したことを示している。解明後におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ検出についてのＰＣＲアッセイの感度は９０．５％であり、２１のＭＳＳＡ菌株のうちの１９がＰＣＲアッセイにおける陽性の結果を示した。しかしながら、重要なことに、ＭＳＳＡでないとして誤って特定された２つの菌株は、以前にはＭＳＳＡであったものの、ＳＣＣｍｅエレメントの一部を失い、ＰＣＲ増幅プライマーがハイブリダイゼーションするｏｒｆＸ付近の接合部を保持していた菌株である。
【０２０８】
表４Ｃは、不一致の結果を解明した後での、１０３の創傷試料のそれぞれについての個々のＰＣＲ結果および培養結果を示す。影が付けられた項目部分は、培養試験およびＰＣＲアッセイで得られた結果が一致していたことを示している。印が付けられた欄（ＣＴ）は、陽性シグナルがバックグランドノイズを超えて検出可能になるＰＣＲサイクルを示す。表に示されるように、４つのサンプルが、サンプルにおける反応阻害剤の存在のためにＰＣＲアッセイでは解明することができなかった。
【０２０９】
上記の結果は、創傷試料に対して直接に適用された多重ＰＣＲアッセイの感度および特異性が大きいことを示している。従って、この多重アッセイは、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方について特異的であり、これまでにない、使い勝手がよく、信頼性が高い、高感度な特異的アッセイを提供する。
【０２１０】
本明細書中に記載される方法、組成物およびデバイスは、現時点での好ましい実施形態を表すものである。それらは例示であって、本発明の範囲にの限定を意図するものではない。当業者であれば、本発明の精神に包含され、あるいは本開示の範囲によって規定されるその様々な変更および他の用途を想起するであろう。従って、様々な置換および修正が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書中に開示される発明に対して行われ得ることが、当業者には明らかである。
【０２１１】
本発明の特許請求の範囲および本明細書の開示を通して、表現「から本質的になる」が用いられる場合、この表現の後に列記された何らかのエレメントで、列記されたエレメントについての開示において具体的に述べられる活性または作用を妨げない他のエレメント、あるいは、そのような活性または作用に寄与する他のエレメントに限定される何らかのエレメントを含むことを意味する。従って、表現「から本質的になる」は、列記されたエレメントが要求されるかあるいは必須であるが、他のエレメントは選択的であり、他のエレメントの存否は、列記されたエレメントの活性または作用に影響を及ぼすか否かに依存することを示す。
【０２１２】
数多くの文献および特許参考文献が本特許出願において引用されている。本特許出願において引用される参考文献はいずれもそれぞれがその全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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