(57)【要約】【課題】バイオ農薬の生産に用いられている枯草菌の培養の原料には、グルコースやポリペプトンが用いられているため、人間の食料やバイオ燃料と競合するという問題があった。さらに、原料の生産のために貴重な資源や多大なエネルギーを必要とするため生産コストが高いという問題があった。【解決手段】バイオ農薬生産のための出発原料として、焼酎の醸造プロセスで不用物として産生される焼酎粕を原料として用い、焼酎粕を適切に物理・化学処理することにより、バイオ農薬生産の主工程である枯草菌培養の培地として用いることを可能とした。これにより、人間の食糧と競合しない再生可能バイオマス原料を用いたバイオ農薬生産を可能とし、バイオ農薬の原料生産のための生産コストを低減させた。【選択図】図１
2014239657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗真菌リポペプチドを二次代謝物質として生産する枯草菌の培地として、物理・化学処理を施した焼酎粕を用いることを特徴とするバイオ農薬の生産方法
【請求項２】
抗真菌リポペプチドを二次代謝物質として生産する枯草菌の培地として、物理・化学処理を施した焼酎粕を固液分離し、その液体成分を用いることを特徴とするバイオ農薬の生産方法
【請求項３】
請求項１及び２記載の物理・化学処理法として、焼酎粕に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、乃至、水酸化カルシウムの水溶液を添加して、焼酎粕のｐHを酸性領域から中性領域に調整処理することを特徴とするバイオ農薬生産方法
【請求項４】
請求項１及び２記載の物理・化学処理法として、焼酎粕のｐHを酸性領域から中性領域に調整後、オートクレーブにより、高温・高圧処理することを特徴とするバイオ農薬生産方法
【請求項５】
請求項１及び２記載の物理・化学処理法として、焼酎粕のｐHを酸性領域から中性領域に調整後、超音波処理装置などキャビテーションを発生させる装置を用いてキャビテーション気泡の崩壊にともない発生する衝撃波によって処理することを特徴とするバイオ農薬生産方法
【請求項６】
請求項１及び２記載の物理・化学処理法として、焼酎粕のｐHを酸性領域から中性領域に調整後、フレンチプレスを用いて高圧処理することを特徴とするバイオ農薬生産方法
【請求項７】
請求項１及び２記載の物理・化学処理法として、焼酎粕のｐHを酸性領域から中性領域に調整後、請求項４記載の高温・高圧処理、請求項５記載の衝撃波処理、乃至、請求項６記載の高圧処理の３種類の処理の内、２種類以上の処理を組み合わせることを特徴とするバイオ農薬生産方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、焼酎醸造最終工程で発生する焼酎粕を、従来のように廃棄処分することなく、バイオマス資源として有効活用し高付加価値物質に変換することを可能とする、焼酎粕を原料としたバイオ農薬の生産方法に関わる。
【背景技術】
【０００２】
従来の代表的なバイオ農薬の生産方法としては、枯草菌をポリペプトンとグルコースを主要成分とする培地で培養し、枯草菌の二次代謝物質として抗真菌リポペプチドを生産し、抗真菌リポペプチドを含む培地をバイオ農薬として利用するというものであった。
（たとえば、特許文献１、特許文献２参照）
【０００３】
しかし、ポリペプトンやグルコースは、食料やバイオ燃料の原料であるため、世界的に供給が逼迫しており、かつ、バイオ農薬の原料としては高価であるため、ポリペプトンやグルコースに代わる再生可能資源を培地として用いる資源循環型のバイオ農薬の生産方法が求められてきた。
【０００４】
一方、焼酎粕は、一部、農地散布用の肥料や家畜の飼料の原材料として用いられているが、品質の点で満足のいくものではないため、大量に生産される焼酎粕の全量を肥料や飼料の原材料として消費できず、大半は、廃棄物として処分されているのが現状である。
【０００５】
このような焼酎粕の処理の現状から、焼酎粕を廃棄物として処分するのではなく、高付加価値物質に変換する有効な焼酎粕の利活用方法が求められてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平7-203975
【特許文献２】特開平6-135811
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のバイオ農薬の生産には枯草菌が用いられ、枯草菌の培養の原料には、グルコースやポリペプトンが用いられているため、従来のバイオ農薬の原料が、人間の食料やバイオ燃料と競合するという問題があった。さらに、原料の生産のために貴重な資源や多大なエネルギーを必要とするため生産コストが高いという問題があった。
【０００８】
そこで本発明は上記課題を解決するもので、バイオ農薬生産のための出発原料として、焼酎の醸造プロセスで不用物として産生されるバイオマスとしての焼酎粕を原料として用い、焼酎粕を物理・化学処理して得られる焼酎粕処理物をバイオ農薬生産の主工程である枯草菌培養の培地として用い、枯草菌培養の二次代謝物質として抗真菌リポペプチドを生産するという，再生可能バイオマス原料を用いてバイオ農薬生産を可能とすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は上記の目的を以下のように達成する。
請求項１記載の発明は、抗真菌リポペプチドを二次代謝物質として生産する枯草菌の培地として、焼酎粕をそのまま培地に用いることでは実現できない抗真菌リポペプチドの生成を、焼酎粕に物理・化学処理を施すことにより可能とすることを特徴とするものである。
【００１０】
焼酎粕の物理・化学処理には大別して二つの効果がある。第一の効果は、請求項３記載の効果である。焼酎粕は、焼酎醸造プロセスで生成するクエン酸を代表とする多種類の有機酸を含むことから、ｐHが4.0程度と酸性度が高いため、そのまま枯草菌の培地として用いると枯草菌の生育が不能となり、枯草菌培養ができない。従って、請求項３記載の物理・化学処理の効果は、酸性度の高い焼酎粕をアルカリ化合物の水溶液による中和処理により枯草菌の培養が可能な中性領域に変換することである。
【００１１】
焼酎粕は、焼酎醸造プロセスで生成されるため、アルコール発酵のための酵母菌および酵母菌由来物質を主成分として含むものである。これら、酵母菌および酵母菌由来物質には、枯草菌培養のための栄養分が多く含まれるが、酵母の細胞壁に包含されているため、そのままでは枯草菌の栄養分として利用される効率は低いものである。従って、焼酎粕の物理・化学処理の第二の効果は、酵母細胞壁に囲まれて枯草菌にとって利用しづらい形態の栄養物質を酵母細胞壁を破砕することにより酵母細胞壁の外に抽出し、枯草菌に利用しやすくするという効果である。
【００１２】
本発明の請求項３記載の物理・化学処理効果は、既述したように、酸性度の高い焼酎粕を枯草菌の培養が可能な中性領域に変換するという効果に加えて、酵母細胞壁を破砕し、枯草菌にとって利用しづらい形態の栄養物質を酵母細胞壁の外に抽出し、枯草菌に利用しやすくするという効果を併せ持つ。
【００１３】
本発明の請求項４記載の物理・化学処理効果は、中和処理による二つの効果、すなわち、焼酎粕の中和処理により、枯草菌の培養が可能な中性領域に変換する効果と、酵母細胞壁を破砕し、枯草菌にとって利用しづらい形態の栄養物質を酵母細胞壁の外に抽出し、枯草菌に利用しやすくするという効果に対して、特に後者の効果に対して、オートクレーブによる高温高圧処理により枯草菌に対する栄養物質である蛋白質、アミノ酸、炭水化物などを酵母細胞壁の外に抽出する効果を促進し、枯草菌にとって栄養価の高い培地に変換する効果を持つものである。
【００１４】
本発明の請求項５記載の物理・化学処理効果は、先に記した中和処理による二つの効果に対して、特に第二の効果、すなわち、酵母細胞壁を破砕し、枯草菌にとって利用しづらい形態の栄養物質を酵母細胞壁の外に抽出し、枯草菌に利用しやすくするという効果に対して、超音波処理装置などを用いてキャビテーション気泡の崩壊にともない発生する衝撃波を酵母細胞壁に作用させることで酵母細胞壁破砕を促進させるという効果をもつものである。
【００１５】
本発明の請求項６記載の物理・化学処理効果は、先に記した中和処理による二つの効果に対して、特に第二の効果、すなわち、酵母細胞壁を破砕し、枯草菌にとって利用しづらい形態の栄養物質を酵母細胞壁の外に抽出し、枯草菌に利用しやすくするという効果に対して、フレンチプレスなどを用いて高圧を発生させ、酵母細胞壁に作用させることで酵母細胞壁破砕を促進させるという効果をもつものである。
【００１６】
本発明の請求項7記載の物理・化学処理効果は、先に記した中和処理による二つの効果に加えて、中和処理以外の物理・化学処理の方法を二つ以上組み合わせることにより、一つの物理・化学処理と比較して酵母細胞壁破砕を促進させ、枯草菌にとって利用しづらい形態の栄養物質を酵母細胞壁の外に抽出し、枯草菌に利用しやすくするという効果を促進させるという効果を持つ。
【００１７】
本発明の請求項2記載のように、枯草菌の培地として、物理・化学処理を施した焼酎粕を固液分離し、その液体成分を用いることは、バイオ農薬生産工程における原料の粘性を飛躍的に低減することにより、バイオ農薬生産工程の配管ラインなどの物質移動設計を簡素化させるという効果をもつ。また、培地として液体成分を用いることは、物理・化学処理を施した焼酎粕の固形分を除去することで、バイオ農薬の成分・品質を安定化させることができる。さらに、抗真菌リポペプチドの精製工程を簡素化することができるという効果を持つ。
【発明の効果】
【００１８】
上記のように本発明にあっては、バイオ農薬生産工程を、再生可能なバイオマスである焼酎粕を出発原料とする生産工程にすることにより、原料が食料やバイオ燃料と競合するという問題を回避できるという効果がある。
【００１９】
さらにまた、バイオ農薬生産工程を、現状では有効に利用されず大半を廃棄物として処分されている焼酎粕を出発原料とする生産工程にすることにより、低コストでバイオ農薬を生産できるという効果がある。
【００２０】
さらにまた、現状では有効に利用されず大半が廃棄物として処分されている焼酎粕を、出発原料として有効に利活用することにより、廃棄物処理で生ずる環境への負荷を飛躍的に軽減できるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施形態を示すバイオ農薬生産施設における抗真菌リポペプチドの生産工程
【図２】芋焼酎粕を濃度5 mol/dm3のNaOH水溶液でpH6.8〜7.2に調整後、超音波処理を施したサンプルに対し、6,000rpm（遠心加速度：3,500×g）10分の遠心処理により固液分離した液体成分（上清）の吸収スペクトル
【図３】図２で示した上清サンプルと同一のサンプルをBrix屈折計で測定したBrix値
【図４】芋焼酎粕をNaOH水溶液で中和処理し、超音波処理後、遠心処理した上清を培地として用いた大腸菌の増殖特性
【図５】異なる醸造時期において生成された芋焼酎粕（バッチ１と２）をNaOH水溶液で中和処理後、遠心処理（6,000rpm；10分）を行った上清の吸収スペクトル
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の構成について図面を参照して説明する。
【実施例１】
【００２３】
図１は、バイオ農薬生産施設における抗真菌リポペプチドの生産工程を表したものである。
【００２４】
バイオ農薬生産施設においては、第一段階の工程として、芋焼酎粕の原液に対しNaOH水溶液を添加し、中和処理を行う。この時用いられるNaOH水溶液の濃度は、0.5〜10 mol/dm3の濃度範囲が好ましいが、より高濃度のNaOH溶液を用いても可能である。また、中和処理ではpH6〜pH8の範囲に調整することが好ましい。この中和処理プロセスは、焼酎粕に含まれる酵母菌および酵母菌由来物質の細胞壁を一部破砕する効果も併せ持つ。
【００２５】
中和処理工程の次の第二段階の工程として、オートクレーブを用いた高温高圧処理を行う。処理条件としては、180℃10気圧10分処理の条件で、高い酵母細胞壁の破砕効果が得られる。一般に滅菌処理に用いられる121℃2気圧20分処理によっても酵母細胞壁の破砕効果が得られる。このように、温度条件としては120〜200℃、圧力条件としては、2〜50気圧の範囲で設定され、処理時間は５〜60分の範囲で設定される（温度・圧力が高いほど処理時間は短くなる）。
【００２６】
図においては第二段階の工程として、オートクレーブを用いた高温高圧処理を示したが、この工程は、超音波処理装置などキャビテーションを発生させる装置を用いてキャビテーション気泡の崩壊にともない発生する衝撃波によって処理する工程、或いは、フレンチプレスを用いて高圧処理する工程によって置き換えることが可能である。また、高温高圧処理を含めた三種類の処理を二種類以上の処理として組み合わせる処理工程と置き換えることが可能である。
【００２７】
第一段階の中和処理工程と第二段階の酵母細胞壁破砕工程を経て得られる物理・化学処理焼酎粕は、次に、第三段階として固液分離工程で固液分離される。固液分離工程には、遠心分離機が用いられる。遠心分離条件は6,000rpm（遠心加速度：3,500×g）10分を標準として用いたが、遠心加速度及び遠心時間は、固液分離が可能な範囲で調整可能である。固液分離工程には、遠心分離以外の方法、例えば、フィルター濾過なども用いることができる。
【００２８】
このように調製された物理・化学処理焼酎粕液体成分は、必要であれば、滅菌処理を施し、枯草菌の培養リアクタの培地として用いられる。枯草菌培養の二次代謝物質として生産される抗真菌リポペプチドは、培養液から分離回収器により分離回収され、バイオ農薬としての抗真菌リポペプチドが生産される。
【００２９】
バイオ農薬の形態としては、抗真菌リポペプチドとしての形態だけでなく培養後の枯草菌と抗真菌リポペプチドが混在した培養液を用いることも出来る。この場合、培養液はバイオ農薬としての効能に留まらず、肥料や土壌改良材としての効能も併せ持つ。
【００３０】
図では、バイオ農薬生産工程の第三段階として固液分離工程を設けているが、この固液分離工程は省略することができ、第二段階の高温高圧処理を経て調製される物理・化学処理焼酎粕を、そのまま、枯草菌の培養リアクタの培地として用いることもできる。
【実施例２】
【００３１】
図２は、芋焼酎粕を濃度5 mol/dm3のNaOH水溶液でpH6.8〜7.2に調整後、超音波処理を施したサンプルに対し、6,000rpm（遠心加速度：3,500×g）10分の遠心処理により固液分離した液体成分（上清）の吸収スペクトルを示す。サンプルの吸光度値を信頼性のある範囲に設定するために、上清に対しイオン交換水を用いて３０倍に希釈したサンプルの吸収スペクトルとして示す。比較のために、超音波処理を施さない未処理試料の吸収スペクトルも示す。
【００３２】
蛋白質の吸収極大波長は280nmであり、波長範囲250〜300nmの吸収は、主として蛋白質の吸収を反映するとされている。図２より、波長範囲250〜300nmにおいて、超音波未処理サンプルよりも超音波10分処理サンプルの吸光度が高く、さらに、超音波20分処理サンプルの吸光度が10分処理サンプルよりも高いことが示された。
【００３３】
波長範囲250〜300nmの吸収は、主として蛋白質の吸収を反映するとことから、図２の結果は、超音波処理により、酵母細胞壁が破砕され、栄養物質である蛋白質、アミノ酸、炭水化物などが酵母細胞壁の外、すなわち、上清成分に抽出されることを示している。
【００３４】
図３は、図２で示した上清サンプルと同一のサンプルをBrix屈折計で測定したBrix値を示す。図３から、超音波未処理、超音波10分処理、超音波20分処理の順でBrix値が増加していることがわかる。Brix値は、一般に糖度計測に用いられる指標であり、溶液中の有機成分濃度を反映することから、図３の結果は、図２の結果と良く対応していることがわかる。
【実施例３】
【００３５】
図４に、実施例２で示した芋焼酎粕をNaOH水溶液で中和処理し、超音波処理後、遠心処理した上清サンプルの微生物培養の培地としての適性を大腸菌（JM109株）の増殖特性として評価した結果を示す。OD660nmの測定には、10倍希釈した培養液を用い、読み取り値を10倍してOD値とした。比較のために、大腸菌の栄養培地であるLB培地（トリプトン：10g/L；酵母エキス：5 g/L；塩化ナトリウム: 10g/L）と芋焼酎粕を中和処理・超音波処理せずに遠心処理した上清を培地とした結果を示す。図から、芋焼酎粕を中和処理・超音波処理せずに遠心処理した上清を培地とした場合には、大腸菌は全く増殖しないことがわかる。これは上清のpHが4.1程度と高い酸性を示すことから大腸菌の培地として不適当であり、焼酎粕を微生物培地として用いるには、中和処理が不可決であることを示す。一方、芋焼酎粕を中和処理し、超音波処理後、遠心処理した上清を培地として用いた場合には、大腸菌の栄養培地であるLB培地の場合と同等の優れた増殖特性が得られた。
【実施例４】
【００３６】
焼酎粕物理・化学処理サンプルを培地として用いた枯草菌の培養による抗真菌リポペプチド（iturin A）の生産について以下の実験を行った。
【００３７】
まず、焼酎粕物理・化学処理サンプルは以下の５種類の処理で調製した。
A：芋焼酎粕（バッチ１）をNaOH水溶液で中和処理後、遠心処理した上清
B：芋焼酎粕（バッチ１）をNaOH水溶液で中和処理し、さらに、超音波処理を施した後に遠心処理した上清
C：芋焼酎粕（バッチ１）を遠心処理し、上清（ｐH4.1）を陰イオン交換樹脂により中和
D：芋焼酎粕（バッチ１）を超音波処理後、遠心し、上清（ｐH4.1）を陰イオン交換樹脂により中和
E:芋焼酎粕（バッチ２）をNaOH水溶液で中和処理後、121℃２気圧20分高温高圧処理
なお、A,B,C,Dのサンプルはオートクレーブにより滅菌処理を施した。
【００３８】
芋焼酎粕のバッチ１と２の表記は、異なる醸造時期において生成された芋焼酎粕を示す。図５に芋焼酎粕のバッチ１と２のNaOH水溶液で中和処理後、遠心処理（6,000rpm；10分）を行った上清の吸収スペクトルを示す。図5から明らかなように、バッチ２の吸収強度はバッチ１よりも高く、芋焼酎粕のNaOH水溶液で中和処理後遠心処理を施した上清の蛋白質濃度は焼酎醸造時期（バッチ）によりばらついており、バッチ２の方がバッチ１よりも栄養分が多量に含まれていることがわかる。
【００３９】
A〜Eの５種類の培地に対する枯草菌の植菌は、以下の操作で行った。枯草菌（B. subtilis RB14） のコロニーをLB培地
2 mlに植菌後、30℃で、200
rpm、16時間前培養した。前培養したB.subtilis
RB14 の培養液を1.5 mlチューブに200 ml 移し、13000rpm、1分間遠心を行い、上澄みの培地成分を取り除き、滅菌水0.2 ml を加え、1分間ボルテックスで混ぜ合わせた。その菌液を、５種類の焼酎粕物理・化学処理サンプルに対し0.1％植菌した。
【００４０】
各培地に植菌した枯草菌の培養は、30 ℃、200
rpmで行い、培養5日目の各培地における生菌数とiturin Aの生産量を測定した。iturin Aの測定はHPLC(溶媒：アセトニトリル35 %、10mM
酢酸アンモニウム65 %)を使用した。表１に各培地の生菌数を表２に各培地のiturin Aの生産量を示す。なお、通常のiturin  Aの生産に用いられる枯草菌培地no.3S（ポリペプトン：10g/L；グルコース：10g/L；KH2PO4：１g/L；MgSO4・７H2O：0.5
g/L）をコントロールとして用いた結果を比較として示す。
【００４１】
【表１】
2014239657.tif 000003
【００４２】
【表２】
2014239657.tif 000004
【００４３】
表１から、焼酎粕の物理・化学処理の効果として、培地Bが培地Aよりも、枯草菌の培養特性に優れ、培地Bは、コントロールとして用いたno.3S培地と同程度以上の培養特性を有することがわかった。この結果は、焼酎粕をNaOH水溶液で中和処理し、さらに、超音波処理を施すことが枯草菌の培養にとって有効であることを示す。
【００４４】
陰イオン交換樹脂で中和処理した培地CとDを比較すると、超音波処理を施した培地Dが培地Cよりも枯草菌の培養特性に優れ、超音波処理の効果が有効であることがわかる。陰イオン交換樹脂による中和処理では、有機酸の除去を目的としたが、副次効果として、陰イオンを有するアミノ酸や蛋白質なども陰イオン交換樹脂に吸着除去されることにより、培地の栄養分が低下し、培地DとNaOH水溶液で中和処理を施した培地Bとを比較すると、培地Dの培養特性の方が低いことがわかる。
【００４５】
焼酎粕を中和処理後、高温高圧処理を施した培地Ｅは、遠心処理による固液分離を行っていない培地であるが、最も高い培養特性を示すことがわかった。
【００４６】
表２から、抗真菌リポペプチドiturin
Aの生産量を比較すると、培地Bが最も多く、コントロールとして用いたno.3S培地と同程度の生産性を有することがわかった。この結果は、枯草菌を用いたバイオ農薬生産に対して、焼酎粕の物理・化学処理として、NaOH水溶液で中和処理し、さらに、超音波処理を施すことが有効であることが示された。
【００４７】
また、培地Eにおいてもコントロールの1/2強の生産性を示し、中和処理のみの培地Aよりも７倍ほど高い生産性を示すことから、高温高圧処理が焼酎粕の物理・化学処理として有効であることが示された。
【実施例５】
【００４８】
実施例４に記した培地Eを用いて、培養温度を30℃から24 ℃に変更し、静置培養と振盪培養（200 rpm）の２条件で培養し、5日目の生菌数とiturin
Aの生産量を測定した。表３に、培地Ｅの培養条件と生菌数及びiturin A生産量との関係を示す。比較のために、30℃-振盪培養（200 rpm）条件の再実験の結果を示す。
【００４９】
【表３】
2014239657.tif 000005
【００５０】
表３から、iturin Aの生産には培養温度として30℃よりも24℃が適していることがわかった。また、静置培養と振盪培養を比較すると、僅かに、静置培養が優っていることがわかった。
【００５１】
以上、実施例４及び５から、以下の結果が得られた。
１）焼酎粕をNaOH水溶液で中和処理し、さらに、超音波処理を施した後に遠心処理した上清は、枯草菌の培地として十分な栄養特性を持つと共に、抗真菌リポペプチドiturin Aの生産のための培地として十分な特性を有する。
２）焼酎粕をNaOH水溶液で中和処理後、高温高圧処理した固液混合物は、枯草菌の培地として十分な栄養特性を持つと共に、抗真菌リポペプチドiturin Aの生産のための培地として十分な特性を有する。
３）抗真菌リポペプチドiturin Aの生産のための枯草菌培養条件としては、
24℃-静置培養条件が有効である。
４）抗真菌リポペプチドiturin Aの生産のための培地として、物理・化学処理した焼酎粕を固液分離して溶液（上清）として用いるか、或いは、固液分離せずにそのまま固液混合物として用いるかの二つの方法には、iturin Aの生産量という点では大きな差はなく、バイオ農薬の用途及び生産工程によって決められるものである。
【００５２】
なお、表２及び表３においては、抗真菌リポペプチドとして代表的なiturin Aの生産量を示したが、本発明におけるバイオ農薬の生産方法は、iturin A以外の枯草菌の二次代謝物質である抗真菌リポペプチドの生産にも適用できるものである。
【図１】
2014239657.tif 000006
【図２】
2014239657.tif 000007
【図３】
2014239657.tif 000008
【図４】
2014239657.tif 000009
【図５】
2014239657.tif 000010