(57)【要約】【課題】疾患を引き起こす菌株のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅと菌株Ｒｄとの区別を行うこと。【解決手段】本明細書中に記載される発明は、ＩＶ型ピリ線毛をコードするＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅレギュロンに関する。特に、本発明は、分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）由来およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株ａ、ｂ、ｃ、ｅおよびｆ由来のＩＶ型ピリ線毛に関する。本発明は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのピリ線毛の単離されたポリヌクレオチドおよびそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドならびにその構造体の構築／分解に関するポリヌクレオチドおよびそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。本発明はまた、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答を誘発ならびにその感染の処置および予防する方法を含む、それらのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載される発明に関する実験研究は、ＮＩＨ／ＮＩＤＣＤからの助成金Ｒ０１  ＤＣ０３９１５およびＲ０１  ＤＣ００５９８０によって支援された。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書中に記載される発明は、ＩＶ型ピリ線毛をコードするＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）レギュロンに関する。特に、本発明は、分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）由来およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株ａ、ｂ、ｃ、ｅおよびｆ由来のＩＶ型ピリ線毛に関する。本発明は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのピリ線毛の単離されたポリヌクレオチドおよびそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドならびにその構造体の構築／分解に関するポリヌクレオチドおよびそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。本発明はまた、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答を誘発するための方法ならびにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを処置および予防する方法を含む、それらのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
中耳感染についての臨床的な用語は、中耳炎（ＯＭ）である。非特許文献１によると、ＯＭは、病気の小児が保険医療を求めるため、ならびに米国における小児が抗生物質を受けるためおよび全身麻酔薬を受けるための最も一般的な理由である。統計値は、２４５０万人の医師の職場訪問が、１９９０年にＯＭのために行われたことを示し、それは、１９８０年代に報告されたものより、２００％より高い増加を表す。死亡率とめったに関係しないが、ＯＭに関連する病的状態は、深刻である。聴力損失は、この疾患に関連する一般的な問題であり、それは、しばしば、小児の行動、教育および言語能力の発達に影響を与える（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ＯＭの社会経済的影響もまた大きく、ＯＭを診断および管理する直接的および間接的な費用は、米国単独において毎年５０億＄を超える（非特許文献５）。
【０００４】
ＯＭは、感染性要因、環境要因および宿主遺伝的要因の結果として生じると考えられる。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのような細菌が、ＯＭにおける最も一般的な感染性生物である。急性ＯＭは、中耳における炎症の急速な発症ならびに短期間の徴候および症状によって特徴付けられる疾患であるが、慢性ＯＭとは、中耳における比較的無症候性の流体（または滲出液）の存在によって定義される状態をいう。しかしながら、慢性ＯＭにおいて、急性感染の特定の徴候（すなわち、耳痛または発熱）の欠如にもかかわらず、それらの異常な中耳液は、３ヶ月を越える期間、存続し得る。抗生物質治療による急性ＯＭの処置は、一般的であるが、しかし抗生物質耐性細菌が、出現している。慢性ＯＭの外科的管理は、小児では、全身麻酔をしながら、耳の鼓膜を通す中耳腔換気用チューブの挿入を含む。この手順は、一般的（普及率が約１３％である；非特許文献６）であり、中耳の蓄積された流体を排出することによって、痛みの症状を軽減する点に関して非常に効果的であるが、それは、侵襲性であり、重なった危険性を保有する（非特許文献７；非特許文献６；非特許文献８；非特許文献９）。従って、ＯＭの管理および好ましくは、予防に対するさらなるアプローチについての必要性が、存在する。
【０００５】
ＯＭワクチンの開発は、７価の莢膜結合体ワクチンであるＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）（非特許文献１０）の最近の承認および発表によって証明されるように、急性ＯＭ（ＡＯＭ）の主用な原因因子である、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関して最も進んでいる。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）は、侵襲性の肺炎球菌疾患に関して非常に効果的であるが、ＯＭのための適用範囲は、ワクチンに含まれない血清型に起因するＯＭ症例数の増加が報告されており失望（６％〜８％）されている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。
【０００６】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、上に示したように、ＯＭにおいて役割を果たすグラム陰性細菌である。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの臨床単離体は、それぞれ、細菌上の型特異性の多糖莢膜の存在または欠如に依存して、血清型「ａ」から「ｆ」または分類不可能のいずれかとして分類される。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型のためのワクチンは、開発されている。Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）同様、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチンは、この生物の多糖莢膜を標的とし、従って、このワクチンは、タンパク質キャリアに結合された莢膜多糖から構成される。小児における急性ＯＭのうちの約２０％を引き起こし、滲出液を有する慢性ＯＭにおいて優勢である分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）のためのワクチンに関する進歩は、ほとんどなされていない（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。ＮＴＨｉはまた、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後感染および新生児感染、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、喉頭蓋炎（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）、心膜炎（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｓ）、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染症、乳様突起炎、大動脈移植感染、結膜炎（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｔｉｖｉｔｉｓ）、ブラジル紫斑熱、不顕性菌血症ならびに内在する肺疾患（例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症（ｂｒｏｎｃｈｉｅｔａｓｉｓ）および嚢胞性線維症）の再燃を引き起こし得る。原型ＮＴＨｉ単離体は、慢性ＯＭを有する小児から回収された継代数の少ない単離体８６−０２８ＮＰである。この菌株は、インビトロ（非特許文献１８；非特許文献１９）ならびにチンチラ科ＯＭモデル（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）において十分に特徴付けられている。ＮＴＨｉ株８６−０２６ＮＰは、２００１年１０月１６日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０に寄託されて、登録番号ＰＴＡ−４７６４が割り当てられた。菌株８６−０２８ＮＰのゲノム由来のコンティグセットは、非特許文献２３に見出され得る。
【０００７】
付着性およびコロニー形成は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの病因性において認められる最初の段階である。従って、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、血球凝集性ピリ線毛付着因子、線毛付着因子および非線毛付着因子を含む、複数の付着因子を発現する（非特許文献２４；非特許文献２５；および非特許文献２６）。特に、記載された付着因子のどれも、以前には運動性機能と関連付けられてなかった。さらに、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅはまた、運動性と関連付けられた鞭毛を発現しない。単収縮運動性は、湿気のある表面上の細菌転位の鞭毛非依存性形態であり、それは、ＩＶ型ピリ線毛として公知の極性構造の伸長、連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）、次いで、収縮によって起こる（非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０）。ＩＶ型ピリ線毛は、代表的に、直径５〜７ｍｍ、長さ数マイクロメートルであり、１回転につき５つのサブユニットを有する螺旋状コンホメーションに構築された単一のタンパク質サブユニットから構成される（非特許文献３１；非特許文献３２）。ＩＶ型ピリンサブユニットは、通常、長さ１４５〜１６０アミノ酸であり、それは、グリコシル化され得るか、またはリン酸化され得る。ピリンサブユニットの２つのクラス（ＩＶａ型およびＩＶｂ型）が存在し、それらは、Ｎ−メチル化アミノ酸が、成熟タンパク質のＮ末端部分を占めるリーダーペプチドおよび成熟サブユニットの平均長さならびに（ジスルフィド領域に関する）Ｄ領域の平均長さによって互いに区別される。呼吸性の病原体のほとんどは、クラスＩＶａピリンを発現するが、腸病原体は、より代表的に、クラスＩＶｂピリンを発現する。ＩＶａ型ピリ線毛は、高度に保存された疎水性のＮ−末端メチル化フェニルアラニンの存在によって区別される。
ＩＶ型ピリ線毛は、新しい表面の急速なコロニー形成の手段としての機能を果たす。従って、ＩＶ型ピリ線毛発現は、多くの細菌による付着およびバイオフィルム形成の両方にとって重要であり（非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６）、ならびに、とりわけＮｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、腸病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの毒性にとって重要である（非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３７；非特許文献３８）。バイオフィルムは、細菌により排出されたエキソポリサッカライドマトリクスを介して表面に固着される細菌の複合組織である。このマトリクスは細菌を包み、ヒト免疫系から細菌を防御する。非特許文献３９は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅによるバイオフィルム形成を記載している。ＩＶ型ピリ線毛とヒトの身体との間の相互作用を遮断することにより、細菌感染を避け得るか、または止め得ると推定されている（２００１年７月３１日に発行された特許文献１）。
ＩＶ型ピリ線毛発現は、複雑であり、高度に調節された細菌性機能である。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおいて、ＩＶ型ピリ線毛の生物発生および機能は、４０より多い遺伝子によって制御される（非特許文献３８）。現在まで、莫大な数の関連するＩＶ型ピリ線毛遺伝子のうちのサブセットしか（非特許文献２８；非特許文献４０）、ＨＡＰ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）ファミリーの数個のメンバーにおいて見出されていない（非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３）が、しかし、ＩＶ型ピリ線毛の発現も、単収縮運動性もあらゆるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単離体について今までに記載されていない。実際に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、菌株Ｒｄゲノム内の潜在性遺伝子クラスターの存在（非特許文献４４）にもかかわらず、それらの構造を発現しない細菌として古典的に記載されている（非特許文献４５；非特許文献４６）。菌株Ｒｄは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ血清型ｄ生物の非被包性誘導体である（非特許文献４７；非特許文献４８；非特許文献４９）。菌株Ｒｄは、いくつかの毒性特性を有するが、血清型ｄ菌株は一般に、片利共生生物であるとみなされ；それらは、頻繁には疾患を引き起こさない（非特許文献５０）。従って、疾患を引き起こす菌株のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅと菌株Ｒｄとの区別を行うことが、重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】Ｍｅｙｅｒら、米国特許第６，２６８，１７１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、２０００年、第１９巻（補遺１）、Ｓ２−Ｓ８
【非特許文献２】Ｂａｌｄｗｉｎ、「Ａｍ．Ｊ．Ｏｔｏｌ．」、１９９３年、第１４巻、ｐ．６０１−６０４
【非特許文献３】Ｈｕｎｔｅｒら、「Ａｎｎ．Ｏｔｏｌ．Ｒｈｉｎｏｌ．Ｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．」、１９９４年、第１６３巻、ｐ．５９−６１
【非特許文献４】Ｔｅｅｌｅら、「Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．」、１９９０年、第１６２巻、ｐ．６８５−６９４
【非特許文献５】Ｋａｐｌａｎら、「Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．」、１９９７年、第１６巻、Ｓ９−１１
【非特許文献６】Ｂｒｉｇｈｔら、「Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ」、１９９３年、第８３巻７号、ｐ．１０２６−８
【非特許文献７】Ｂｅｒｍａｎら、「Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ」、１９９４年、第９３巻３号、ｐ．３５３−６３
【非特許文献８】Ｃｉｍｏｎｓ、「ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ」、第６０巻、ｐ．５２７−５２８
【非特許文献９】Ｐａａｐ、「Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．」、１９９６年、第３０巻１１号、ｐ．１２９１−７
【非特許文献１０】ＥｓｋｏｌａおよびＫｉｌｐｉ、「Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．」、２０００年、第１６巻、Ｓ７２−７８
【非特許文献１１】Ｂｌａｃｋら、「Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  Ｊ」、２０００年、第１９巻、ｐ．１８７−１９５
【非特許文献１２】Ｅｓｋｏｌａら、「Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  Ｊ．」、２０００年、第１９巻、Ｓ７２−７８
【非特許文献１３】Ｅｓｋｏｌａら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、２００１年、第３４４巻、ｐ．４０３−４０９
【非特許文献１４】Ｓｎｏｗら、「Ｏｔｏｌ．Ｎｅｕｒｏｔｏｌ」、２００２年、第２３巻、ｐ１−２
【非特許文献１５】Ｃｏｌｅｍａｎら、「Ｉｎｆ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、１９９１年、第５９巻５号、ｐ．１７１６−１７２２
【非特許文献１６】Ｋｌｅｉｎ、「Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  Ｊ．」、１９９７年、第１６巻、Ｓ５−８
【非特許文献１７】Ｓｐｉｎｏｌａら、「Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．」１９８６年、第１５４巻、ｐ．１００−１０９
【非特許文献１８】Ｂａｋａｌｅｔｚら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」、１９８８年、第５３巻、ｐ．３３１−５
【非特許文献１９】Ｈｏｌｍｅｓら、「Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．」、１９９７年、第２３巻、ｐ．１５７−６６
【非特許文献２０】Ｂａｋａｌｅｔｚら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、１９９７年、第１５巻、ｐ．９５５−６１
【非特許文献２１】Ｓｕｚｕｋｉら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」、１９９４年、第６２巻、ｐ．１７１０−８
【非特許文献２２】ＤｅＭａｒｉａら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」、１９９６年、第６４巻、ｐ．５１８７−９２
【非特許文献２３】インターネット<ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．ｏｒｇ>
【非特許文献２４】Ｇｉｌｓｄｏｒｆら、「Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ」、１９９６年、第３９巻、ｐ．３４３−３４８
【非特許文献２５】Ｇｉｌｓｄｏｒｆ．、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」、１９９７年、第６５巻、ｐ．２９９７−３００２
【非特許文献２６】Ｓｔ．Ｇｅｍｅ  ＩＩＩ、「Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００２年、第４巻、ｐ．１９１−２００
【非特許文献２７】Ｂａｒｄｙ．「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、２００３年、第１４９巻、ｐ．２９５−３０４
【非特許文献２８】ＴｏｎｊｕｍおよびＫｏｏｍｅｙ、「Ｇｅｎｅ」、１９９７年、第１９２巻、ｐ．１５５−１６３
【非特許文献２９】Ｗｏｌｆｇａｎｇら、「ＥＭＢＯ  Ｊ．」、第１９巻、ｐ．６４０８−６４１８
【非特許文献３０】Ｍａｔｔｉｃｋ、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」、２００２年、第５６巻、ｐ．２８９−３１４
【非特許文献３１】Ｂａｒｄｙら、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、２００３年、第１４９巻、ｐ．２９５−ｐ３０４
【非特許文献３２】ＷａｌｌおよびＫａｉｓｅｒ、「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、１９９９年、第３２巻、ｐ．１−１０
【非特許文献３３】Ｍａｔｔｉｃｋ、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００２年、第５６巻、ｐ．２８９−３１４
【非特許文献３４】Ｏ’ＴｏｏｌｅおよびＫｏｌｔｅｒ、「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、１９９８年、第３０巻、ｐ．２９５−３０４
【非特許文献３５】Ｋｌａｕｓｅｎら、「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００３年、第５０巻、ｐ．６１−６８
【非特許文献３６】Ｊｅｓａｉｔｉｓら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００３年、第１７１巻、ｐ．４３２９−４３３９
【非特許文献３７】Ｋｌａｕｓｅｎら、「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００３年、第４８巻、ｐ．１５１１−１５２４
【非特許文献３８】ＳｔｒｏｍおよびＬｏｒｙ、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、１９９３年、第４７巻、ｐ．５６５−５９６
【非特許文献３９】Ｅｈｒｌｉｃｈら、「ＪＡＭＡ」、２００２年、第２８７巻１３号、ｐ．１７１０−１７１５
【非特許文献４０】ＤａｒｚｉｎｓおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｇｅｎｅ」、１９９７年、第１９２巻、ｐ．１０９−１１５
【非特許文献４１】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、「Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００３年、第９２巻、ｐ．１２１−１３４
【非特許文献４２】Ｄｏｕｇｈｔｙら、「Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２０００年、第７２巻、ｐ．７９−９０
【非特許文献４３】ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＳｍｉｔｈ、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、第１４５巻、ｐ．４０１−４０９
【非特許文献４４】Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９９５年、第２６９巻、ｐ．４９６−５１２
【非特許文献４５】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００３年、第６９巻、ｐ．３６９５−３７００
【非特許文献４６】Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒら、「Ｇｅｎｅ」、１９９７年、第１９２巻、ｐ．１２５−１３４
【非特許文献４７】Ｚｗａｈｌｅｎら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」、１９８３年、第４２巻、ｐ．７０８−７１５
【非特許文献４８】ＢｅｎｄｌｅｒおよびＧｏｏｄｇａｌ、「Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、１９７２年、第７０巻、ｐ．４１１−４２２
【非特許文献４９】Ｒｉｓｂｅｒｇら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１９９９年、第２６１巻、ｐ．１７１−１８０
【非特許文献５０】Ｄａｉｎｅｓら、「Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００３年、第５２巻、ｐ．２７７−２８２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、特に分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株ａ、ｂ、ｃ、ｅおよびｆのＩＶ型ピリ線毛遺伝子クラスターに関する。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＰｉｌＡポリペプチド配列番号２、ＰｉｌＢポリペプチド配列番号４、ＰｉｌＣポリペプチド配列番号６、ＰｉｌＤポリペプチド配列番号８、ＣｏｍＡポリペプチド配列番号１０、ＣｏｍＢポリペプチド配列番号１２、ＣｏｍＣポリペプチド配列番号１４、ＣｏｍＤポリペプチド配列番号１６、ＣｏｍＥポリペプチド配列番号１８、ＣｏｍＦポリペプチド配列番号２０、ＰｉｌＦポリペプチド配列番号２２、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号２６、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号２６、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号２８、ＰｉｌＡポリ
ペプチド配列番号３０、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３２、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３４、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３６、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３８、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号４０、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号４２、またはｐｉｌＡポリペプチド配列番号４４のいずれか１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２）
ｐｉｌＡ配列番号１、ｐｉｌＢ配列番号３、ｐｉｌＣ配列番号５、ｐｉｌＤ配列番号７、ｃｏｍＡ配列番号９、ｃｏｍＢ配列番号１１、ｃｏｍＣ配列番号１３、ｃｏｍＤ配列番号１５、ｃｏｍＥ配列番号１７、ｃｏｍＦ配列番号１９、ｐｉｌＦ配列番号２１、ｐｉｌＡ配列番号２５、ｐｉｌＡ配列番号２７、ｐｉｌＡ配列番号２９、ｐｉｌＡ配列番号３１、ｐｉｌＡ配列番号３３、ｐｉｌＡ配列番号３５、ｐｉｌＡ配列番号３７、ｐｉｌＡ配列番号３９、ｐｉｌＡ配列番号４１またはｐｉｌＡ配列番号４３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目３）
項目１または２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目４）
項目１に記載のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントによってコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目５）
ＰｉｌＡポリペプチド配列番号２、ＰｉｌＢポリペプチド配列番号４、ＰｉｌＣポリペプチド配列番号６、ＰｉｌＤポリペプチド配列番号８、ＣｏｍＡポリペプチド配列番号１０、ＣｏｍＢポリペプチド配列番号１２、ＣｏｍＣポリペプチド配列番号１４、ＣｏｍＤポリペプチド配列番号１６、ＣｏｍＥポリペプチド配列番号１８、ＣｏｍＦポリペプチド配列番号２０、ＰｉｌＦポリペプチド配列番号２２、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号２６、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号２６、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号２８、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３０、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３２、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３４、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３６、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号３８、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号４０、ＰｉｌＡポリペプチド配列番号４２、またはＰｉｌＡポリペプチド配列番号４４、あるいはそれらのペプチドフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目６）
項目５に記載のポリペプチドまたはペプチドフラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
（項目７）
項目５に記載のポリペプチドまたはペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体。
（項目８）
項目８に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
（項目９）
生物学的サンプルにおけるＮＴＨｉ細菌を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）項目１に記載のポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメントと生物学的サンプルとを接触させる工程、および
（ｂ）該サンプル内の該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションは、ＮＴＨｉ細菌の存在を示す、工程
を包含する、方法。
（項目１０）
生物学的サンプルにおけるＮＴＨｉ細菌を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメントと生物学的サンプルとを接触させる工程、および
（ｂ）該サンプル内の該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションは、ＮＴＨｉ細菌の存在を示す、工程
を包含する、方法。
（項目１１）
生物学的サンプルにおけるＮＴＨｉ細菌を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）項目７に記載の抗体と生物学的サンプルとを接触させる工程、および
（ｂ）該サンプル内の該抗体の結合を検出する工程であって、ここで、結合は、ＮＴＨｉ細菌の存在を示す、工程
を包含する、方法。
（項目１２）
項目９、１０または１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、血清、痰、耳液、血液、尿、リンパ液、および脳脊髄液からなる群より選択される、方法。
（項目１３）
ＮＴＨｉ細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該方法は、項目５に記載の１種以上のポリペプチドまたはペプチドフラグメントの免疫原性用量を、ＮＴＨｉ細菌感染の危険性がある患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１４）
ＮＴＨｉ細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該方法は、項目１に記載の１種以上のポリヌクレオチドの免疫原性用量を、ＮＴＨｉ細菌感染の危険性がある患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１５）
前記ポリヌクレオチドは、プラスミドまたはウイルス性ベクターに存在する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ＮＴＨｉ細菌感染を処置または予防する方法であって、該方法は、項目５に記載のポリペプチドの発現または活性を阻害する分子を、それらを必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１７）
必要とする患者に投与される前記分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
必要とする患者に投与される前記分子は、抗体である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
必要とする患者に投与される前記分子は、低分子である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記ＮＴＨｉ感染は、中耳に存在する、項目１６に記載の方法。
【００１１】
（本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
本発明は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅポリヌクレオチドおよび特に２つの遺伝子クラスターに加えて１つの他の遺伝子において配列されたレギュロン由来のオープンリーディングフレームを提供する。このレギュロンは、以前は特徴付けられていないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＩＶ型ピリ線毛の主要なサブユニットをコードする遺伝子（ｐｉｌＡ）を含む。このレギュロンは、ピリンポリペプチドＰｉｌＡ（主要なピリンサブユニット）、ＰｉｌＤ（リーダーペプチダーゼ）、ＰｉｌＢおよびＰｉｌＣ（ピリン構造体の構築／分解に関与する）をコードする遺伝子クラスター；ＣｏｍＡ、ＣｏｍＢ、ＣｏｍＣ、ＣｏｍＤ、ＣｏｍＥおよびＣｏｍＦ（形質転換およびピリ線毛発現のための能力に関与する）をコードする別の遺伝子クラスター；ならびにＰｉｌＦ（ＩＶ型ピリ線毛生物発生に必要とされる）をコードする遺伝子由来のポリヌクレオチドを含む（Ｗａｔｓｏｎら、Ｇｅｎｅ、４９：５６、１９９６）。１つの実施形態において、ピリ線毛レギュロンは、ＮＴＨｉ  Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株８６−０２８ＮＰのものである。
【００１２】
以下の配列番号に示されるＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰピリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明によって提供される：配列番号２におけるＰｉｌＡポリペプチド、配列番号４におけるＰｉｌＢポリペプチド、配列番号６におけるＰｉｌＣポリペプチド、配列番号８におけるＰｉｌＤポリペプチド、配列番号１０におけるＣｏｍＡポリペプチド、配列番号１２におけるＣｏｍＢポリペプチド、配列番号１４におけるＣｏｍＣポリペプチド、配列番号１６におけるＣｏｍＤポリペプチド、配列番号１８におけるＣｏｍＥポリペプチド、配列番号２０におけるＣｏｍＦポリペプチドおよび配列番号２２におけるＰｉｌＦポリペプチド。従って、代替のコドン使用法が、本発明によって具体的に企図される。１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、前述のポリペプチドをそれぞれコードする以下の配列番号に示されるＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ遺伝子配列を含む：配列番号１におけるｐｉｌＡ、配列番号３におけるｐｉｌＢ、配列番号５におけるｐｉｌＣ、配列番号７におけるｐｉｌＤ、配列番号９におけるｃｏｍＡ、配列番号１１におけるｃｏｍＢ、配列番号１３におけるｃｏｍＣ、配列番号１５におけるｃｏｍＤ、配列番号１７におけるｃｏｍＥ、配列番号１９におけるｃｏｍＦ；および配列番号２１におけるｐｉｌＦ。上記ポリヌクレオチド配列の各々は、終止コドンを表す最終的な３つのヌクレオチドを含む。
【００１３】
ＮＴＨｉ臨床単離体１７２８ＭＥＥ、１７２９ＭＥＥ、３２２４Ａ、１０５４８ＭＥＥ、１０６０ＭＥＥ、１８８５ＭＥＥ、１７１４ＭＥＥ、１２３６ＭＥＥ、１１２８ＭＥＥおよび２１４ＮＰ由来のＰｉｌＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。これらのＰｉｌＡポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４にそれぞれ示す。さらに、代替のコドン使用の可能性が、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて具体的に企図される。１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３に示されるヌクレオチド配列によって、それぞれコードされる。
【００１４】
本発明は、ストリンジェントな条件下で、（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３に示されるヌクレオチド配列の相補体；（ｂ）上に列挙した任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；（ｃ）上に列挙した任意のタンパク質の種のホモログをコードするポリヌクレオチド；または（ｄ）本発明のポリペプチドの特定のドメインもしくは短縮を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。他の分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株由来およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株ａ、ｂ、ｃ、ｅおよびｆ由来のＩＶ型ピリンポリヌクレオチドが、具体的に企図される。これらのポリヌクレオチドは、プローブまたはプライマーとしてそれぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３のポリヌクレオチドの一部または全てを使用するハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応のような当該分野における標準的な技術によって同定および単離され得る。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上に列挙したポリヌクレオチドと実質的に均等なヌクレオチド配列を含む。本発明に従うポリヌクレオチドは、上に列挙したＮＴＨｉポリヌクレオチドに対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％または少なくとも８９％、より代表的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％または少なくとも９４％およびさらにより代表的には少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。
【００１６】
本発明の核酸配列の範囲内に含まれるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３のＮＴＨｉヌクレオチド配列、あるいはそれらの相補体にハイブリダイズする核酸配列フラグメントであり、このフラグメントは、約５ヌクレオチドより大きい、好ましくは７ヌクレオチドより大きい、より好ましくは９ヌクレオチドより大きい、そして最も好ましくは１７ヌクレオチドより大きい。例えば、選択される（すなわち、本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つに特異的にハイブリダイズする）１５ヌクレオチド、１７ヌクレオチドもしくは２０ヌクレオチドまたはそれより大きなフラグメントが、企図される。本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし得るこれらの核酸配列フラグメントが、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドを検出するためにプローブとして使用され得、そして／または本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドと他の細菌性遺伝子とを区別し得、そして好ましくは、独特のヌクレオチド配列に基づく。
【００１７】
用語「ストリンジェント」とは、ストリンジェントとして当該分野において一般的に理解される条件をいうために本明細書中で使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についてのストリンジェントな条件の例は、６５℃〜６８℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。
【００１８】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高濃度のホルムアミド、または他の変性剤）もまた使用され得るが、しかし、ハイブリダイゼーションの速度が、影響される。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関与する場合において、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３７℃（１４塩基のオリゴについて）、４８℃（１７塩基のオリゴについて）、５５℃（２０塩基のオリゴについて）、および６０℃（２３塩基のオリゴについて）での、６×ＳＳＣ  ０．０５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄を含む。
【００１９】
他の因子が、非特異的ハイブリダイゼーションおよび／またはバックグランドハイブリダイゼーションを減少させる目的のためにハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、超音波処理したサケの精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適切な因子もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えずに変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で行われるが、しかしながら、代表的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件は、それらの可変物を適応させるため、および、異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成することを可能にするために、当業者によって調整され得る。
【００２０】
上に示したように、本発明によって企図されるポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３という特定のポリヌクレオチドに限定されないが、例えば、それらの対立遺伝子バリエーションおよび種バリエーションもまた、挙げられる。対立遺伝子バリエーションおよび種バリエーションは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３、好ましくはその中のオープンリーディングフレーム、それらの代表的なフラグメント、あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３内のオープンリーディングフレームに対して少なくとも９０％同一、好ましくは９５％同一のヌクレオチド配列において提供される配列を同じ種または別の種の別の単離体由来の配列と比較することによって、慣用的に決定され得る。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１２：３８７、１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０、１９９０）を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）から公に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために、使用され得る。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、天然の供給源から単離され得るか、または標準的な化学技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１）に記載されるホスホトリエステル法）によって合成され得る。
【００２２】
本発明のピリ線毛ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチドもまた、提供される。
【００２３】
本発明のポリペプチドとしては、ピリンポリペプチドＰｉｌＡ、ＰｉｌＤ、ＰｉｌＢ、ＰｉｌＣ、ＣｏｍＡ、ＣｏｍＢ、ＣｏｍＣ、ＣｏｍＤ、ＣｏｍＥ、ＣｏｍＦおよびＰｉｌＦが挙げられる。１つの実施形態において、上記ポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２にそれぞれ示されるＮＴＨｉ
８６−０２８ＮＰアミノ酸配列が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に示されるＰｉｌＡポリペプチドが挙げられる。さらなる実施形態において、本発明のＩＶ型ピリンポリペプチドは、他の分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株のＩＶ型ピリンポリペプチドおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株ａ、ｂ、ｃ、ｅおよびｆ由来のＩＶ型ピリンポリペプチドである。
【００２４】
本発明のポリペプチドは具体的には、本発明の完全長ポリペプチドの１つ以上の生物学的特性または免疫原性特性を保持するペプチドフラグメント（すなわち、ペプチド）を含む。１つの実施形態において、本発明によって提供されるＰｉｌＡペプチドフラグメントは、命名されたＴｆｐＱ２、ＴＦＰＱ３、ＴｆｐＱ４およびＯＬＰ３であり、それぞれ、配列番号２のアミノ酸３５〜６８、配列番号２のアミノ酸６９〜１０２、配列番号２のアミノ酸１０３〜１３７、および配列番号２のアミノ酸２１〜３５を含む。
【００２５】
本発明はまた、ポリペプチドの生物学的活性および／または免疫原性活性に影響を与えない１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドを提供する。あるいは、本発明のポリペプチドは、生物学的活性を変化させてもよくまたは変化させなくてもよい、保存的アミノ酸置換を有するように企図される。用語「保存的アミノ酸置換」とは、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響しないような、元々のものでない残基（天然に生じるアミノ酸および天然に生じないアミノ酸を含む）による元々のアミノ酸残基の置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチドにおける非極性残基の、任意の他の非極性残基による置換から生じる。さらに、ポリペプチドにおける任意の元々の残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」の方法に従って、アラニンによって置換され得る。天然に生じるアミノ酸は、以下のように、それらの側鎖に基づいて特徴付けられる：塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸；無電荷極性：グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン；および非極性：フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン。アミノ酸置換についての一般的規則を、以下の表１に示す。
【００２６】
【表１】
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本発明はまた、生物学的活性および／または免疫原性活性を保持する、本発明のポリペプチドの改変体（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２のポリペプチドに対して、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、代表的には少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、より代表的には少なくとも約９８％、または最も代表的には少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を示すポリペプチド）を提供する。
【００２７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドが、増幅または発現のためのベクターに挿入され得ることを企図する。発現のために、上記ポリヌクレオチドは、適切な発現制御配列（例えば、プロモーター配列およびポリアデニル化シグナル配列）に作動可能に連結される。さらに提供されるのは、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。例示的な原核生物の宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｅｒｒａｔｉａのような細菌が挙げられる。その宿主細胞を増殖させ、そしてその宿主細胞または増殖培地からポリペプチドを単離することによって、本発明のポリペプチドを産生する方法が、具体的に企図される。ピリ線毛レギュロン由来からの１つ以上のポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現され得る。例えば、天然のピリ線毛構造体の構築に影響を与えるために、ピリ線毛レギュロン由来のｐｉｌＡ遺伝子単独の発現および複数のポリヌクレオチドの発現の両方が、具体的に企図される。あるいは、本発明のポリペプチドは、標準的な手段を使用する化学合成によって調製され得る。特に便利なのは、固相技術である（例えば、Ｅｒｉｋｓｏｎら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９７６）ｖ．２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２５５を参照のこと）。自動固相合成機は、市販されている。さらに、配列の改変は、適切な残基の置換、付加または欠失によって容易になされる。例えば、システイン残基は、キャリアタンパク質への簡便な結合のためのスルフヒドリル基を提供するために、カルボキシ末端に付加され得るか、またはスペーサーエレメント（例えば、付加的なグリシン残基）は、Ｃ末端において結合しているアミノ酸とペプチドの残りの部分との間の配列の中に組み込まれ得る。
【００２８】
用語「単離された」とは、その物質が元々存在する環境の他の成分から取り出された物質、およびその物質が元々存在する環境の他の成分を本質的に含まない物質をいう。例えば、ポリペプチドは、他の細胞タンパク質から分離されるか、またはＤＮＡは、そのＤＮＡが元々存在するゲノムにおいてそのＤＮＡと隣接する他のＤＮＡから分離される。
【００２９】
（抗体）
本発明は、本発明のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅピリ線毛ポリペプチドに独特の（すなわち、特異的な）抗原性エピトープに結合する抗体を提供する。複数のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅサブタイプの間で共通であるが、任意の他の抗原性エピトープに関して独特である抗原性エピトープに結合する抗体もまた提供される。この抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらが、それらの独特のエピトープに結合する能力を保持する抗体フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、単鎖抗体およびヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。抗体は、抗原として本発明のピリ線毛ポリペプチドまたは本発明のピリンポリペプチドを発現する宿主細胞を使用して、当該分野における標準的な技術によって産生され得る。
【００３０】
本発明は、本発明のピリンポリペプチドおよびそのフラグメントに特異的な抗体を提供し、それは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を殺傷する能力およびヒトを感染から防御する能力の両方を示す。本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を提供し、この抗体は、毒性を減少させ、付着を阻害し、バイオフィルム形成を阻害し、単収縮運動性を阻害し、細胞分裂を阻害し、そして／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の上皮への侵入を阻害し、そして／もしくはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の食作用を増強する。
【００３１】
インビトロでの補体媒介性殺菌アッセイシステム（Ｍｕｓｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３９：２９７−３０４、１９８３；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３１−３８、１９７２）が、抗ピリ線毛抗体の殺菌活性を測定するために使用され得る。
【００３２】
本発明のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅポリペプチドに対して予め形成された抗体の投与を介して、受動免疫治療によって宿主に短期間の防御を与えることもまた可能である。従って、本発明の抗体は、受動免疫治療において使用され得る。異種の免疫グロブリンは、その外来の免疫原性成分に対する免疫応答を誘発し得るので、ヒト免疫グロブリンは、ヒト医薬において好ましい。このような受動免疫は、特別な危険性を被っている免疫されていない個体の即座の防御のための緊急事態に使用され得る。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の抗体は、抗イディオタイプ抗体の産生において使用され得、それは、次いで、ピリンエピトープに対する免疫応答を刺激するための抗原として使用され得る。
【００３４】
（免疫応答を誘発するための方法およびそのための組成物）
本発明は、１種以上のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＩＶ型ピリ線毛ポリペプチドに対する免疫応答を個体において誘発する方法を企図する。特定の実施形態において、この方法は、ＰｉｌＡタンパク質に対する免疫応答を誘発する。これらの方法は、細菌複製を阻害する免疫応答、細胞へのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ付着を阻止する免疫応答、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単収縮を防止する免疫応答およびバイオフィルム形成を防止する免疫応答を含むが、これらに限定されない１つ以上の免疫応答を誘発する。１つの実施形態において、この方法は、本発明の１種以上のポリペプチドを含む免疫原性用量の組成物を投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、本発明の１種以上のポリペプチドを発現する細胞を含む免疫原性用量の組成物を投与する工程を包含する。さらに別の実施形態において、この方法は、本発明の１種以上のポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む免疫原性用量の組成物を投与する工程を包含する。このポリヌクレオチドは、任意の他の核酸と結合していないむきだしの（ｎａｋｅｄ）ポリヌクレオチドであり得るか、またはベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター））中に存在し得る。この方法は、単一の個体において組み合わせて使用され得る。この方法は、個体のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染の前または後に使用され得る。
【００３５】
本発明の方法の１つの実施形態において、本発明の組成物は、初回免疫用量として投与され、続いて、１つ以上の追加免疫用量として投与される。免疫応答を有利に増強するタンパク質またはポリペプチド（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘発分子（例えば、Ｌｅａｆ）または補助刺激分子）の同時投与もまた、企図される。
【００３６】
本発明の組成物の「免疫原性用量」は、投与前の検出可能な免疫応答と比較して、または投与前の標準的な免疫応答と比較して、投与後、検出可能な体液性免疫応答（抗体）および／または細胞性免疫応答（Ｔ細胞）を生じるものである。本発明は、上記方法から生じる免疫応答が保護性であり得、そして／または治療的であり得ることを企図する。好ましい実施形態において、上記抗体および／またはＴ細胞免疫応答は、個体をＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染、特に中耳および／または鼻咽頭気道もしくは下気道の感染から保護する。この使用において、正確な用量は、患者の健康状態および体重、投与様式、処方物の性質などに依存するが、しかし、一般的に、７０ｋｇの患者あたり、約１．０μｇ〜約５０００μｇ、より一般的には、７０ｋｇの体重あたり、約１０μｇ〜約５００μｇの範囲である。
【００３７】
体液性免疫応答は、多くの周知の方法（例えば、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、酵素免疫法（ＥＩＡ）および血球凝集抑制法（ＨＡＩ））によって測定され得る。特に、ＳＲＩＤは、試験される免疫原を含む、ゲル（例えば、アガロース）の層を利用する。このゲルに切り込みが入れられてウェルとされ、試験される血清が、そのウェル中に置かれる。ゲルの中へ出ていく抗体の拡散は、沈殿する輪の形成を導き、その面積は、試験される血清中の抗体の濃度に比例する。ＥＩＡは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）としてもまた公知であり、サンプル中の全抗体を測定するために使用される。免疫原は、マイクロタイタープレートの表面に吸着される。試験血清は、プレートに曝露され、続いて、酵素に結合した免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に曝露される。プレートに対して付着した酵素活性は、任意の便利な手段（例えば、分光測光法）によって定量され、試験サンプル中に存在する免疫原に対する抗体の濃度に比例する。ＨＡＩは、免疫原（例えば、ウイルスタンパク質）がニワトリの赤血球（など）を凝集させる能力を利用する。このアッセイは、中和抗体（すなわち、赤血球凝集を阻害し得る抗体）。試験血清の希釈液は、標準的な濃度の免疫原とともにインキュベートされ、続いて、赤血球を添加される。中和抗体の存在は、免疫原による赤血球の凝集を阻害する。細胞性免疫応答を測定するための試験は、遅発型過敏症の決定または標的免疫原に対するリンパ球の増殖性応答を測定することを含む。
【００３８】
本発明は、同様に、本発明のピリ線毛ポリペプチドに対する免疫応答を誘発するために適切な組成物を提供する。上に示したように、この組成物は、１種以上のピリ線毛ポリペプチド、１種以上のポリペプチドを発現する細胞、または１種以上のピリ線毛ポリペプチドをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。この組成物はまた、他の成分（例えば、キャリアおよびアジュバント）を含み得る。
【００３９】
本発明の組成物において、組換え方法によって産生される場合、ピリ線毛ポリペプチドは、別のタンパク質と融合され得る。１つの実施形態において、他のタンパク質は、単独では、抗体を誘発しないかもしれないが、しかし、それは、第１のタンパク質を安定化し、免疫原性活性を維持する融合タンパク質を形成する。別の実施形態において、この融合タンパク質は、免疫原性である別のタンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはβ−ガラクトシダーゼ）、融合タンパク質を可溶化してその産生および精製を容易にする比較的大きい共タンパク質を含む。他のタンパク質は、免疫系の全身性の刺激を提供するという意味でアジュバントとして作用し得る。他のタンパク質は、本発明のＮＴＨｉタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに融合され得る。
【００４０】
本発明の他の組成物において、ピリ線毛ポリペプチドは、別の方法でキャリア物質に結合され得る。当該分野において公知のこのような結合を作製する任意の方法が、使用され得る。結合は、１つの官能基の末端におけるジスルフィド結合および他の官能基の末端におけるペプチド結合を生じるヘテロ二官能性因子（例えば、ジスルフィドアミド形成因子（例えば、Ｎ−スクシジミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｄｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ）））（例えば、Ｊａｎｓｅｎら、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２：１８５、１９８２を参照のこと）およびジスルフィド結合よりむしろチオエーテル結合を形成する二官能性カップリング剤（例えば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステル）、およびカルボキシル基と、スクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸（ナトリウム塩として例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ））とを結合させることによって、カルボキシル基を活性化するカップリング剤を用いて形成され得る。
【００４１】
ピリ線毛ポリペプチドは、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）酸付加塩が挙げられ、それは、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）あるいは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）、および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカイン）から誘導され得る。
【００４２】
本発明の組成物は、アジュバントをさらに含み得る。例えば、公知のアジュバントとしては、エマルジョン（例えば、フロイントのアジュバントおよび他のオイルエマルジョン）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ＭＦ５９、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ（ＱＳ２１）由来の精製されたサポニン、アルミニウム塩（例えば、水酸化物、リン酸塩およびミョウバン）、リン酸カルシウム（および他の金属塩）、ゲル（例えば、水酸化アルミニウム塩）、ムラミルジペプチドを含むミコバクテリア産物、固形物、粒子（例えば、リポソームおよびビロソーム）が挙げられる。アジュバントとして使用されることが公知の天然産物および細菌性産物の例としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＲＣ−５２９（合成ＭＰＬ様アシル化単糖類）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体であるＯＭ−１７４、ホロ毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）またはその誘導体の１つ、百日咳毒素（ＰＴ）およびＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性毒素（ＬＴ）またはその誘導体の１つ）、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。アジュバント活性は、多くの因子（例えば、キャリア効果、貯蔵物形成、変更されたリンパ球再循環、Ｔリンパ球の刺激、Ｂリンパ球の直接刺激およびマクロファージの刺激）によって影響され得る。
【００４３】
本発明の組成物は代表的に、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能物質として処方され；注射前の液体への溶解または懸濁に適切な固形もまた、調製され得る。この調製物もまた、乳化され得る。この活性免疫原性成分はしばしば、賦形剤と混合され、その賦形剤は、薬学的に受容可能であり、この活性成分と適合性である。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望される場合、ワクチンは、そのワクチンの効果を増強する少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバント）を含み得る。ワクチンは、慣例的に、非経口的に、注射（例えば、皮下または筋肉内のいずれか）によって投与される。
【００４４】
投与の他の様式のために適切なさらなる処方物としては、座剤およびいくつかの場合において、経口処方物が挙げられる。座剤に関して、伝統的結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルカレン（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ）グリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得；このような座剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲における活性成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物としては、例えば、薬学的な等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、通常使用される賦形剤が挙げられる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放処方物または粉剤の形態をとり、１０％〜９５％の活性成分、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。
【００４５】
組成物はまた、ジェット式注射器、マイクロニードル、エレクトロポレーション、ソノポレーション、マイクロカプセル化、ポリマーまたはリポソームを利用する、経皮経路、経粘膜経路ならびにネブライザー、エアロゾルおよび鼻スプレーを用いる鼻腔内経路を介して投与され得る。天然ポリマーまたは合成ポリマー（例えば、デンプン、アルギネートおよびキトサン、Ｄ−ポリＬ−ラクテート（ＰＬＡ）、Ｄ−ポリＤＬ−ラクチック−コグリコリックミクロスフェア、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリホスファゼンポリホスファタザン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔａｚａｎｅ））を用いるマイクロカプセル化は、経皮投与および経粘膜投与の両方のために有用である。合成ポリオルニテート、ポリ−リジンおよびポリ−アルギニンまたは両親媒性ペプチドを含むポリマー複合体は、経皮送達系のために有用である。さらに、それらの両親媒性の性質に起因して、リポソームは、経皮、経粘膜および鼻腔内のワクチン送達系のために企図される。ワクチン送達のために使用される一般的な脂質としては、Ｎ−（１）２，３−（ジオレイル−ジヒドロキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−メチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、ジオレイルオキシ−プロピル−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジミスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ｄｉｍｙｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ）（ＤＭＲＩＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）および９Ｎ（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が挙げられる。ヘルパー脂質とリポソームとの組み合わせは、皮膚を介するリポソームの取り込みを増強する。これらのヘルパー脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）が挙げられる。さらに、チリのソープツリー（ｓｏａｐ  ｔｒｅｅ）の樹皮（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のトリテルペノイドグリコシドまたはサポニンおよびキトサン（脱アセチル化チタン）は、鼻腔内および経粘膜でのワクチン送達のために有用なアジュバントとして企図されている。
【００４６】
処方物は、単位用量コンテナまたは複数用量コンテナ（例えば、密閉されたアンプルおよびバイアル）に存在し得、そして、使用の直前に滅菌した液体キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥した状態で貯蔵され得る。
【００４７】
（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを阻害する方法）
代替として、本発明は、個体におけるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＩＶ型ピリ線毛機能を阻害する方法を包含する。この方法は、例えば、ピリ線毛の機能を阻害する量において、本発明の１種以上の抗体；本発明の１種以上のポリペプチド；本発明の１種以上のアンチセンスポリヌクレオチド；１種以上のＲＮＡｉ分子；および／または１種以上の低分子を、個体に投与する工程を包含する。インビトロでのアッセイは、ピリ線毛の機能を阻害する能力を示すために、使用され得る。これらの方法の実施形態としては、例えば、ピリ線毛ポリペプチド合成および／またはピリ線毛構築のインヒビター、ＩＶ型ピリ線毛を介して媒介される付着のインヒビター、ＩＶ型ピリ線毛によって媒介される既存のバイオフィルムを破壊するインヒビター、および単収縮のインヒビターを用いる方法が挙げられる。
【００４８】
阻害は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに関与する任意の病理学的状態（例えば、ＯＭ、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後感染および新生児感染、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、喉頭蓋炎、心膜炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染症、乳様突起炎、大動脈移植感染、結膜炎、ブラジル紫斑熱、不顕性菌血症ならびに内在する肺疾患（例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症および嚢胞性線維症）の再燃）に関して企図される。
【００４９】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＩＶ型ピリ線毛機能のインヒビターを含む組成物が、提供される。この組成物は、前述の活性成分のうちの１つのみから構成されてもよく、前述の活性成分の組み合わせを含んでもよく、または細菌感染を処置するために使用されるさらなる活性成分を含んでもよい。上に議論したように、この組成物は、１種以上のさらなる成分（例えば、薬学的に効果的なキャリア）を含み得る。また、上に議論したように、こ
の組成物の投与用量および投与頻度は、標準的な技法によって決定され、そして、例えば、個体の体重および年齢、投与経路、ならびに症状の重篤度に依存する。薬学的組成物の投与は、当該分野において標準的な経路（例えば、非経口、静脈内、経口、口腔内、鼻、肺、直腸、鼻腔内、または膣内）によってであり得る。
【００５０】
（動物モデル）
本発明の方法は、ＯＭについての実験モデルとして広範に認められたチンチラモデルにおいて示され得る。特に、ＮＴＨｉ誘発ＯＭのチンチラモデルは、十分に特徴付けられており（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６８：８６５−８７２、１９９３；ＢａｋａｌｅｔｚおよびＨｏｌｍｅｓ、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４：２２３−２２５、１９９７；ＳｕｚｕｋｉおよびＢａｋａｌｅｔｚ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６２：１７１０−１７１８、１９９４；Ｍａｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１：３４５４−３４６２、２００３）、ＯＭに対する数個のＮＴＨｉ外膜タンパク質、外膜タンパク質の組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物の予防効力を決定するために、使用されている（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１５：９５５−９６１、１９９７；Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６７：２７４６−２７６２、１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６８：２７５６−２７６５、２０００；Ｋｙｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６６：２２７２−２２７８、２００３；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＢａｋａｌｅｔｚ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１、１９７８−１９８３、２００３）。
【００５１】
このモデルにおいて、アデノウイルスは、チンチラをＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘発ＯＭに罹患しやすくし、それは、ＮＴＨｉの生物学的アセスメントについて適切な細胞、組織および器官の培養系の確立を可能にした（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６８：８６５−７２、１９９３；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６２：１７１０−８、１９９４）。単独のアデノウイルス感染は、誘導された血清抗体の鼓膜への漏出を評価するために使用されており（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４（２）：２２３−５、１９９７）、そして、それは、ＮＴＨｉと共に共病原体として、種々のＮＴＨｉ外膜タンパク質、ＯＭＰの組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、および中耳炎に対する痘苗原としてのアジュバント処方物を対象とする、数個の能動免疫レジメンおよび受動免疫レジメンの予防効力を決定するために使用されている（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６７（６）：２７４６−６２、１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６８（５）：２７５６−６５、２０００；Ｎｏｖｏｔｎｙら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６８（４）：２１１９−２８、２０００；Ｐｏｏｌｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（補遺１）：Ｓ１０８−１５、２０００）。
（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を検出する方法）
本発明によってまた提供されるのは、個体における細菌を検出するための方法である。１つの実施形態において、この方法は、ポリヌクレオチドに特異的に結合するプライマーまたはプローブを使用して、生物学的サンプルにおける本発明のピリ線毛ポリヌクレオチドを検出する工程を包含する。このポリヌクレオチドの検出は、例えば、ハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲを含む、当該分野における多数の慣用的な技術によって達成され得る。別の実施形態において、この方法は、このポリペプチドに特異的に結合する本発明の抗体を使用して、生物学的サンプルにおける本発明のピリ線毛ポリペプチドを検出する工程を包含する。この抗体は、当該分野において公知の任意の免疫学的検定システム（ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応（ｇｅｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、蛍光免疫学的検定、プロテインＡ免疫学的検定および免疫電気泳動アッセイが挙げられるが、それらに限定されない）において使用され得る。この方法において利用される生物学的サンプルとしては、血液、血清、耳液、髄液、痰、尿、リンパ液、および脳脊髄液が挙げられるが、それらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ＮＴＨｉ  Ｒｄ、８６−０２８ＮＰ（配列番号２）、１７２８ＭＥＥ（配列番号２６）、１７２９ＭＥＥ（配列番号２８）、３２２４Ａ（配列番号３０）、１０５４８ＭＥＥ（配列番号３２）、１０６０ＭＥＥ（配列番号３４）、１８８５ＭＥＥ（配列番号３６）、１７１４ＭＥＥ（配列番号３８）、１２３６ＭＥＥ（配列番号４０）、１１２８ＭＥＥ（配列番号４２）、２１４ＮＰ（配列番号４４）のＰｉｌＡポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
（発明の詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を例示し、ここで、実施例１は、本発明のＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ  ＩＶ型ピリ線毛遺伝子の配列および１３種の臨床的Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単離体におけるｐｉｌＡ遺伝子の検出を記載し、実施例２は、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰによる古典的なＩＶ型ピリ線毛に依存的な凝集体形成を示し、実施例３は、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰにおける単収縮運動性を示し、実施例４は、ネガティブ染色および透過型電子顕微鏡法によるＮＴＨｉ菌株８６−９２８ＮＰ上のＩＶ型ピリ線毛の観察を記載し、実施例５は、ｐｉｌＡ変異体の作製を記載し、実施例６は、ＮＴＨｉおよびｐｉｌＡ変異体ＮＴＨｉでの感染のチンチラモデルにおける実験を記載し、実施例７は、１０種のＮＴＨｉ臨床的単離体由来のｐｉｌＡ遺伝子を記載し、実施例８は、小児におけるＮＴＨｉピリ線毛に対する免疫応答を示す実験を記載し、そして実施例９は、免疫原としての使用のためのＮＴＨｉペプチドフラグメントの同定を記載する。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
ＩＶ型ピリ線毛レギュロンを、ＮＴＨｉのＯＭ単離体において同定した。
【００５５】
菌株８６−０２８ＮＰを含む、ＮＴＨｉの多くの菌株は、血球凝集性ＬＫＰピリ線毛の発現に必要とされるｈｉｆ遺伝子座を保有しない（Ｍｈｌａｎｇａ−Ｍｕｔａｎｇａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０（１７）、４６９３−４７０３、１９８８）が、ほとんどは、バイオフィルムを形成する。ピリ線毛は、他の細菌系においてバイオフィルム形成に重要であるため、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰのゲノム配列決定の成果（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．ｏｒｇまたは共有者に係る米国特許出願第６０／４５３，１３４号を参照のこと）由来のコンティグセットを、別のピリ線毛型をコードする可能性のある遺伝子について分析した。データセットは、ｗｗｗ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｃｏｍにおけるＰｉｌＱおよびＰｉｌＴを含むＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについてのＩＶ型ピリ線毛または単収縮運動性関連として注釈をつけたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａタンパク質を使用するデフォルトパラメーターを用いるｔｂｌａｓｎアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴｅｄであった。Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ＰｉｌＡタンパク質について翻訳されたポリペプチドもまた、この検索において使用した（Ｄｏｕｇｈｔｙら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７２、７９−９０、２０００）。
【００５６】
潜在性ＩＶ型ピリ線毛遺伝子座であるように最初は見えたものを、同定した。具体的には、菌株８６−０２８ＮＰにおいて、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株Ｒｄ、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａにおける遺伝子と高度に相同性である４つの遺伝子が存在する（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、９２、１２１−１３４、２００３；Ｄｏｕｇｈｔｙら、前出；Ｚｈａｎｇら、ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、１８９、１５−１８、２０００；およびＲｕｆｆｏｌｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５、３３９−３４３、１９９７）。これらの遺伝子は、菌株ＲｄにおいてＰｉｌＡ、ＰｉｌＢ、ＰｉｌＣおよびＰｉｌＤをコードする（ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＳｍｉｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４５（２）、４０１−４０９、１９９９）。
【００５７】
ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰレギュロンは、ピリンポリペプチドＰｉｌＡ（主要なピリンサブユニット）、ＰｉｌＤ（リーダーペプチダーゼ）、ＰｉｌＢおよびＰｉｌＣ（同じｍＲＮＡから転写されて、ピリン構造体の構築／分解に関与するように企図される）をコードするポリヌクレオチドの遺伝子クラスター；ピリンポリペプチドＣｏｍＡ、ＣｏｍＢ、ＣｏｍＣ、ＣｏｍＤ、ＣｏｍＥおよびＣｏｍＦ（形質転換およびピリ線毛発現に関する能力に関与する）をコードするポリヌクレオチドの遺伝子クラスター；およびＰｉｌＦ（ＩＶ型ピリ線毛生物発生に必要とされる）をコードする別の遺伝子を含む。ピリンポリペプチドのアミノ酸配列を、以下の配列番号に示す：配列番号２におけるＰｉｌＡ、配列番号４におけるＰｉｌＢ、配列番号６におけるＰｉｌＣ、配列番号８におけるＰｉｌＤ、配列番号１０におけるＣｏｍＡ、配列番号１２におけるＣｏｍＢ、配列番号１４におけるＣｏｍＣ、配列番号１６におけるＣｏｍＤ、配列番号１８におけるＣｏｍＥ、配列番号２０におけるＣｏｍＦおよび配列番号２２におけるＰｉｌＦ。上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列を、前述のポリペプチドをそれぞれコードする以下の配列番号に示す：配列番号１におけるｐｉｌＡ、配列番号３におけるｐｉｌＢ、配列番号５におけるｐｉｌＣ、配列番号７におけるｐｉｌＤ、配列番号９におけるｃｏｍＡ、配列番号１１におけるｃｏｍＢ、配列番号１３におけるｃｏｍＣ、配列番号１５におけるｃｏｍＤ、配列番号１７におけるｃｏｍＥ、配列番号１９におけるｃｏｍＦ；および配列番号２１におけるｐｉｌＦ。上記ポリヌクレオチド配列の各々は、終止コドンを表す最終的な３つのヌクレオチドを含む。
【００５８】
受容能力（すなわち、ＮＴＨｉが、その遺伝的多様性を増強または拡張する可能性のある外来のＤＮＡを取り込む生来の能力）の発達の間、ＮＴＨｉ遺伝子の調節を特徴付けるためにｃＤＮＡマイクロアレイを使用する遺伝子発現プロファイリング研究において、ｃｏｍ遺伝子ならびにｐｉｌ遺伝子が、受容能力発達の間に、アップレギュレートされる。
【００５９】
プローブとしてｐｉｌＡ配列を使用するサザンブロット実験において、慢性中耳炎のための鼓膜切開およびチューブ挿入を受けた患者から回収した１３種の継代数の少ない臨床的ＮＴＨｉ  ＯＭ単離体および嚢胞性線維症を有する患者から回収した１種の臨床的単離体は、それらのゲノム内に１コピーのｐｉｌＡを有した。これらの合計１４種の単離体に、それぞれ、以下の菌株番号を割り当てた：８６−０２８ＮＰ；１７２８ＭＥＥ；１７２９ＭＥＥ；１７１４ＭＥＥ；２１４ＮＰ；１２３６ＭＥＥ；１６５ＮＰ；１０６０ＭＥＥ；１１２８ＭＥＥ；１０５４８ＭＥＥ；３２２４Ａ；３１８５Ａ、１８８５ＭＥＥおよび２７Ｗ１１６７９ＩＮＩ。
【００６０】
この実験において、細菌の染色体ＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得られるＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キットを使用して単離し、ＭｆｅＩで消化し、この消化物を０．８％アガロースゲルで泳動した。ＤＮＡを、Ｔｕｒｂｏ  Ｂｌｏｔｔｅｒキット（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を使用して、Ｎｙｔｒａｎ  ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅ膜に移した。プローブを、プライマー５’ｔｇｔｇａｃａｃｔｔｃｃｇｃａａａａａ（配列番号２３）および５’ｔａａｔａａａａｇｇａａａａｔｇａａｔｇａ（配列番号２４）を使用して、８６−０２８ＮＰ  ｐｉｌＡ遺伝子配列コードのＰＣＲ増幅によって作製した。アンプリコンを、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、精製した。製造業者の指示書に従って、１００ｎｇの精製したＰＣＲ産物を、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＬａｂｅｌｉｎｇおよびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｓ、ＵＫ）を使用して、西洋ワサビオキシダーゼで標識した。現像したブロットを、Ｆｕｊｉ  Ｓｕｐｅｒ  Ｒｘ  Ｘ線フィルム（Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に曝露した。
【００６１】
ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰのＰｉｌＡポリペプチドは、約１４ｋＤａの推定および見かけの分子量を有し、Ｎ末端メチル化フェニルアラニンを含む。
【００６２】
（実施例２）
ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰは、栄養分枯渇の条件下で増殖させた場合、寒天下表面トランスロケーションアッセイおよび表面増殖アッセイにおいて古典的な凝集体を形成した。
【００６３】
ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰを、全ての実験の前に、１８〜２０時間（加湿雰囲気中で３７℃、５％ＣＯ２）、チョコレート寒天上で増殖させた。続いて、この生物を、ＮＴＨｉが非常によく増殖するリッチ培地であるｓＢＨＩまたは８３％ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ピルビン酸ナトリウム（８７．３ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、β−ＮＡＤ（０．００８７ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＨＥＭＥ−ヒスチジン（０．０１７５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）、ウラシル（０．０８７ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）、およびイノシン（１．７５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）から構成されるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの増殖を支持する化学的に規定された培地（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．、４１：４４０８−４４１０、２００３）のいずれかに接種した。
【００６４】
両方の寒天を、滅菌した８ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ−ｔｅｃｈ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）における２つのフォーマットのうちの１つ、または滅菌した３５ｍｍのガラスペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｌｏｃａｔｉｏｎ）に注いだ。スライドガラスを、８ウェルチャンバースライドから分離した場合、寒天は、そのチャンバーの中に残り、従って、接種のための寒天の「底」表面の使用を可能にし、それは、この表面の相対的な滑らかさに起因する単収縮運動性のアッセイのために最適である（Ｓｅｍｍｌｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４５、２８６３−２８７３、１９９９およびＭａｔｔｉｃｋ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５６、２８９−３１４、２００２）。８ウェルチャンバースライド中で成型した寒天を、表面増殖表現型を示すために使用したが、ペトリ皿の中に注がれた寒天を、表面下寒天トランスロケーション（Ｓｅｍｍｌｅｒら、前出）の実証のために使用し、一方、８ウェルチャンバースライド中で成型した寒天を、寒天の表面の増殖表現型を示すために使用した。全てのアッセイを、別の日に最低３回繰り返した。
【００６５】
滅菌したガラスペトリ皿の中に注がれた寒天に、滅菌したマイクロピペットチップを使用して、上記のように増殖させたＮＴＨｉの０．５μｌの懸濁液を表面下で接種した。プレートを、２４時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後に観察して、次いで、寒天の底表面とガラスペトリ皿との間の細菌のトランスロケーションの徴候を再び判断する前に、さらに２４時間、室温（２５℃）で保持した。
【００６６】
ｓＢＨＩ培地上で、接種２４時間後、ＮＴＨｉは、寒天とガラスペトリ皿の底との間の接種部位の周囲の狭い面積（約０．５ｍｍ半径）において増殖したことが観察された。さらに２４時間後、増殖パターンは、２４時間で観察したものと類似のままであった。化学的に規定された培地上で、２４時間のインキュベーション後、ＮＴＨｉの増殖は、接種部位から２ｍｍ〜５ｍｍの距離で、寒天表面とガラスペトリ皿の底との間で観察された。細菌はまた、接種部位の周囲のハロ様パターンにおける小さなコロニーに凝集した。４８時間後、ＮＴＨｉは、非常に異なる整列のマイクロコロニーを形成し、その多くは、接種部位から５ｍｍよりはなれた距離で生じた。接種の元の部位から５ｍｍの距離までの微小付随体の形成は、化学的に規定された培地における増殖の顕著な特徴の知見であり、菌株８６−０２８ＮＰを、リッチ寒天上で増殖させた場合、決して見られなかった。
【００６７】
チャンバースライドを、１８時間〜２０時間チョコレート寒天で増殖させたＮＴＨｉの０．５μｌの懸濁液［発熱物質を含まない滅菌した生理食塩水で懸濁した（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ、ＩＬ）］で接種するか、またはシングルコロニーを、寒天の表面への移動のために、滅菌したつま楊枝を用いて、穿刺するかのいずれかをした。
【００６８】
ｓＢＨＩ培地において、接種後３０分、ＮＴＨｉは、寒天表面と密接に関連して現れて、シート様のパターンにおいて増殖した。２．５時間で、表面積の約８０％〜９０％が、細菌の薄いシートで覆われた。またこの時点で、ＮＴＨｉの微小凝集体が、現れ始めた。接種６時間〜７時間後、それらの微小凝集体は、肉眼で識別可能であり、ウェルにつき、約３〜５の微小凝集体が存在した。さらに、ＮＴＨｉはまだ、寒天表面の約５０％〜７０％を覆うシートとして増殖しているように観察された。接種２４時間後、ＮＴＨｉは、各接種部位において大きなシングルコロニーとして現れた。
【００６９】
ｓＢＨＩ上で観察されたものと同様、化学的に規定された培地において、接種３０分後、ＮＴＨｉは、シート状に増殖しているように見えたが、しかし、細菌の密度は、ｓＢＨＩ寒天上で観察されたものよりかなり低いようであった。接種２．５時間後、多数の微小凝集体は、寒天表面の全体にわたって明らかであった。示したものと対照的に、ＮＴＨｉをｓＢＨＩ寒天上に接種した場合、それらの微小凝集体は、外観上、より大きく、ずっと高密度であった。約３０〜４０の微小凝集体が、各ウェル上に見られ得た。さらに、この時点で、ＮＴＨｉのシート様の増殖の大きな領域が存在し、表面積の約８０％が細菌によって覆われた。接種６時間〜７時間後で、微小凝集体は、より大きく、より高密度で、肉眼で容易に見えた。また、放射状の増殖の領域またはハロは、ＮｅｉｓｓｅｒｉａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（参考文献）について記載された増殖パターンと同様に、大きなコロニーから外向きに放射状に広がって見えた。この期間までに、ほとんどの細菌が、小さな群れまたは微凝集体に整列されて、非常に少ない割合のものは、シートまたは単層として寒天表面を覆って見られた。２４時間後、各接種部位において大きなシングルコロニーが存在したが、しかし、接種点から離れた部位を含む、寒天表面全体にわたって存在する多くの小さな付随体コロニーもまた存在した。
【００７０】
従って、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰは、栄養分枯渇の条件下で増殖させた場合、ＩＶ型ピリ線毛発現Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｓｅｍｍｌｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４５（１０）、２８６３−２８７３、１９９９）について報告されたものと同様に、古典的な凝集体形成を示す。
【００７１】
（実施例３）
カバーガラスと滑らかな寒天表面との間での個々のＮＴＨｉ細胞の動きを、ビデオ顕微鏡検査によって追跡した。細胞は、約０．４２μｍ／秒で移動した。これは、単収縮するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＳｋｅｒｋｅｒおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８、６９０１−６９０４、２００１）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｍｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ、２０７、９８−１０２、２０００）について報告されたものと一致する。
【００７２】
２０時間、３７℃および５％ＣＯ２にてチョコレート寒天上で増殖させて、次いで、さらに２４時間、周囲温度で保持した白金耳量のＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰを、滅菌した水に懸濁して、得られた０．５μｌの懸濁液を、滅菌したスライドガラスの上に置いた。コントラストを与えて、それによって可視化を促進するために、０．５μｌのトリパンブルー（０．４％、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を、この細菌懸濁液に添加した。次いで、液滴を、滅菌したカバーガラスで覆い、光学顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐｅ  ４０、Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を通して見た。試料を、約１５分〜２０分間にわたって室温で観察した。細菌は、容易に観察可能であり、全てではないが、いくつかの細胞または細胞の微小凝集体の指向性の動きが注目された。活性を刺激するために、本発明者らは、０．５μｌのヘム溶液（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、滅菌したカバーガラスの片側に添加した。単収縮活性は、ビデオ［ＶＣＲに取り付けたビデオ耳鏡検査法システム（ＭＥＤＲＸＩｎｃ、Ｓｅｍｉｎｏｌｅ、ＦＬ）］ならびに長さおよび偏倚運動の速度を測定するためのさらなる画像の両方の捕捉によって実証された。
【００７３】
個々の細胞、または細胞の微小凝集体は、５１秒間かけて約１１．０μｍの総直線距離を移動した（速度約０．２２μｍ／秒）。しかしながら、観察の期間全体で、観察された単収縮運動の速度は、０．１４μｍ／秒〜０．４８μｍ／秒の範囲であった。
【００７４】
（実施例４）
ＩＶ型ピリ線毛を、ネガティブ染色および透過型電子顕微鏡法によって可視化した。
【００７５】
ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰの一晩の培養液を、ｓＢＨＩおよび規定した寒天プレート上に接種して、３７℃、５％ＣＯ２で２時間、６時間または２４時間、インキュベートした。さらに、培養液を、ｓＢＨＩブロスおよび規定したブロスの中に接種して、２．５時間または５．５時間インキュベートした。これらの後者の時点は、それぞれ、増殖の指数期および誘導期へ入ったことを示す。次いで、細菌を、滅菌水中に２．０％酢酸アンモニウムｗ／ｖ（Ｓｉｇｍａ）および２．０％モリブデン酸アンモニウムｗ／ｖ（Ｓｉｇｍａ）を含むＷｈａｔｍａｎフィルター処理した溶液を用いて、ネガティブ染色した（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、１９８８  ５６：３３１−５）。フォルムバールコーティングおよび炭素コーティングされた銅のグリッド（３００メッシュ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、寒天プレート上で増殖した個々のコロニーに接して、次いで、ネガティブ染色溶液の液滴の上に浮かせた。ブロス増殖培養物を粒状にし、細菌を滅菌水に再懸濁して、グリッドを、等しい体積の細菌懸濁液およびネガティブ染色液の上に浮かせた。５分後、グリッドを軽くぬぐい、風乾燥させ、その後、ビデオモニター（Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）およびデジタル画像システム（Ｇａｔａｎ、Ｉｎｃ．）が取り付けられたＨｉｔａｃｈｉ  Ｍｏｄｅｌ  Ｈ−６００透過型電子顕微鏡で観察した。
【００７６】
ＮＴＨｉをｓＢＨＩ上で増殖させた場合、ＩＶ型ピリ線毛様構造体は、観察されなかった。反対に、規定した栄養物条件下で増殖させた場合、ＮＴＨｉは、直径約６ｎｍ〜７ｎｍの構造体を発現することが見られた。これらの構造体の多くはまた、グリッド表面上に遊離して見出された。１つの細菌細胞につき、約５〜６のピリ線毛が存在し、それらは、適切な場所にあり極性を形成した。
【００７７】
（実施例５）
ＰｉｌＡの発現が欠失した変異体を、菌株８６−０２８ＮＰを、化学的に規定された培地上でアルカリ条件で増殖させた場合に観察された構造体の成分をさらに特徴付けるために、作製した。
【００７８】
菌株８６−０２８ＮＰからのｐｉｌＡ遺伝子ならびにこの遺伝子の５’側および３’側約１ｋｂを、ＰＣＲによって増幅させて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中へクローン化して、そのＤＮＡ配列を決定して、ＰＣＲ増幅の結果としてクローンにおいて配列に変化がないことを確認した。ｐｉｌＡ遺伝子において都合の良い制限酵素認識部位は存在しなかったので、ＢａｍＨＩ部位を操作して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用してこの遺伝子の中へ入れた。得られた構築物をＢａｍＨＩで直鎖化し、この遺伝子を、ΩＫｎ−２カセットを用いて挿入不活化した（Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｓａｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７３：２６１７−２６２４、１９９１）。得られた構築物を直鎖化し、ＭＩＶ法を使用して、菌株８６−０２８ＮＰに形質転換した（ＰｏｊｅおよびＲｅｄｆｉｅｌｄ、Ｈｅｒｂｅｒｔら（編）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ、２００３のｐ．５７−７０）。カナマイシン耐性クローンを選択して、８６−０２８ＮＰ  ｐｉｌＡ遺伝子の挿入不活化を、サザンハイブリダイゼーションによって選択されたクローンにおいて確認した。
【００７９】
ｐｉｌＡ変異体を、親の単離体（実施例４）においてＩＶ型ピリ線毛の増加した発現を誘導した条件下で増殖させた後のＩＶ型ピリ線毛の発現について評価した場合、細胞に結合したＩＶ型ピリ線毛も遊離ＩＶ型ピリ線毛も観察されず、ｐｉｌＡ遺伝子産物（および／または変異は下流の遺伝子産物を崩壊させるようであるｐｉｌＡであるため、ｐｉｌＢＣＤ遺伝子産物）が、ピリ線毛発現を必要とするこが確認された。
【００８０】
（実施例６）
ＩＶ型ピリ線毛が、鼻咽頭のコロニー形成、ならびに中耳におけるバイオフィルム中での生存および／またはバイオフィルムを形成する能力を必要とされるか否かを決定するために、本発明者らは、親の菌株８６−０２８ＮＰまたは同遺伝子系ｐｉｌＡ変異体（実施例５）のいずれかを用いて、１４匹の成体のチンチラを鼻腔内およびトランスブラリー（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒｌｙ）の両方でチャレンジした。チャレンジ後、２日目、５日目、１０日目、１５日目および２０日目に、鼻咽頭洗浄および鼓膜の上部の穿刺を行い、鼻および中耳の両方の鼓膜を１つの集団につき１〜２匹のチンチラから回収して、それらの解剖学的部位の各々におけるＮＴＨｉのｃｆｕを決定した。親およびｐｉｌＡ変異体の両方は、２０日間、チンチラ宿主において生存し得た。しかしながら、鼻粘膜の組織ホモジネートにおける付着性の小集団についてアッセイした場合、両方の菌株は、洗浄液および穿刺液において等価な量で存在したが、ｐｉｌＡ変異体は、５日目より後に回収したホモジネートの８０％に存在しなかったか、または本発明者らの検出能力未満であり、一方、親の単離体でチャレンジした動物から回収した８７％の同様の鼻粘膜は、培養陽性であった。
【００８１】
共焦点顕微鏡検査を、急速凍結した組織について行って、バイオフィルムが存在するか否かを決定した。中耳においてｐｉｌＡ変異体によって形成されたバイオマスは、親の単離体に特有の十分に構築されたバイオフィルムとは異なる特性のものであった。データは、ＮＴＨｉ  ＩＶ型ピリ線毛が、ＯＭの疾患過程において重要な役割を果たすことを示す。
【００８２】
（実施例７）
ＮＴＨｉの１０種の臨床的単離体のｐｉｌＡ遺伝子を、配列決定した。これらの単離体からのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ以下のように示す：配列番号２５および配列番号２６における１７２８ＭＥＥ、配列番号２７および配列番号２８における１７２９ＭＥＥ、配列番号２９および配列番号３０における３２２４Ａ、配列番号３１および配列番号３２における１０５４８ＭＥＥ、配列番号３３および配列番号３４における１０６０ＭＥＥ、配列番号３５および配列番号３６における１８８５ＭＥＥ、配列番号３７および配列番号３８における１７１４ＭＥＥ、配列番号３９および配列番号４０における１２３６ＭＥＥ、配列番号４１および配列番号４２における１１２８ＭＥＥ、配列番号４３および配列番号４４における２１４ＮＰ。これらのアミノ酸配列とＲｄからのｐｉｌＡポリペプチドのアミノ酸配列および８６−０２８ＮＰからのｐｉｌＡポリペプチドのアミノ酸配列とのアラインメントを、図１に示す。
【００８３】
全ての単離体のｐｉｌＡ遺伝子は、２つの単離体ならびに菌株Ｒｄにおいて６位におけるＱをＬに置換することを除いて、大部分が不変である１２残基のリーダーペプチドをコードする。成熟ＰｉｌＡは、１３７残基を含み、＋１位に特徴的なメチル化フェニルアラニンを含むと予測される。＋２４位および＋２７位にあり、サブユニット−サブユニット相互作用に関与すると考えられるチロシン残基は、＋５０位、＋６０位、＋１１９位および＋１３２位における４つのＣｙｓ残基と同様に高度に保存される。興味深いことに、ＮＴＨｉ  ＰｉｌＡタンパク質は、新しいクラスのＩＶ型ピリ線毛を表すように見える。リーダーペプチドは、ＩＶ型ピリンに特徴的なもの（代表的に長さ５〜６残基）より長く、さらに代表的なＩＶｂリーダーペプチドより短い（１５〜３０残基）。１３７残基において、成熟ＮＴＨｉピリンは、クラスＩＶａピリンまたはＩＶｂピリン（それぞれ、１５０残基および１９０残基）のいずれよりも短い。ＮＴＨｉ  ＰｉｌＡタンパク質は、Ｎ−メチル化フェニルアラニンで開始されるため、それらは、クラスＩＶａピリンの可能性がより高いが、しかし、電子顕微鏡写真において、遊離ＮＴＨｉ  ＩＶ型ピリ線毛は、逆並行の相互作用によって自己会合する能力に起因して、クラスＩＶｂピリンとより古典的に関連した表現型である側面が会合した束状態で常に出現する。
【００８４】
ＮＴＨｉ  ＰｉｌＡ配列多様性に関して、全体的にそれらの配列は、高度に相同性である。図１を参照のこと。保護的な免疫優勢または付着因子結合機能に起因して、表面が利用しやすく、また、ワクチン開発を目的とする場合、潜在的に重要な多様性の２つの領域は、５５〜６４位および７９〜８７位に存在する。第１の領域内で、臨床的単離体の間に、２つの主要な改変体が存在するように見え、一方、多数派（１１種の単離体のうち７種、６４％）を示し、配列：ＮＥＴ／ＩＴＮＣＴ／ＭＧＧＫによって特徴付けられ、他方は、少数派（１１種の単離体のうち４種、３６％）を示し、配列：ＧＫＰ／ＬＳＴ／ＳＣＳＧＧＳによって特徴付けられる。しかしながら、多数派のグループ分けにおいて＋５７位および＋６１位、ならびに少数派のグループ分けについて＋５７位および＋５９位でのいくつかのさらなる小数のバリエーションが存在する。＋６１位に示される多様性は、現在のところ１種の単離体（菌株＃１８８５）にのみ見られ、ＴをＭにする置換が存在する。第２の焦点を合わせた相違領域（７９位〜８７位）内で、臨床的ＮＴＨｉ単離体の間で２つの等しく分配された改変体が存在するようである。配列ＡＳＶＫＴＱＳＧＧが、１１種の臨床的単離体のうちの５種（約４５％）において存在するが、配列ＫＳＶＴＴＳＮＧＡは、１１種の臨床的単離体のうちの６種（約５５％）において存在する。
【００８５】
全体的に、５５位〜６４位において多数派の配列を有する７種の単離体のうちの５種の単離体はまた、領域７９〜８７においてＫＳＶＴＴＳＮＧＡモチーフを有し、残りの２つの単離体は、この領域においてＡＳＶＫＴＱＳＧＧモチーフを有する。５５位〜６４位において少数派の配列を有する４種の残っている臨床的単離体のうちの３種はまた、領域７９〜８７においてＡＳＶＫＴＱＳＧＧモチーフを有し、１つの単離体のみが、このドメインにおいてＫＳＶＴＴＳＮＧＡ配列を有する。従って、これらが保存的置換であるか否かおよび、配列が、表面の利用可能な抗原性指標の高い親水性領域内に存在し、それによって、ワクチン開発の標的となるかに依存して、それらは、ＮＴＨｉに対する免疫応答を誘発するためのＩＶ型ピリ線毛ベースの成分として含まれることを必要としても、必要としなくてもよい。
【００８６】
（実施例８）
ＮＴＨｉ誘発ＯＭにおけるＩＶ型ピリ線毛の役割を調べるため、そして、生まれつきの疾患中の小児からの抗体が、ＩＶ型ピリ線毛を認識するかどうかを決定するために、４つの連続的な合成ペプチド（これは、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰの成熟ＰｉｌＡの配列番号２のアミノ酸２１〜１３７を表す）を合成し、ＯＭを有する小児から得られた小児の血清および中耳滲出液のパネルに対してバイオセンサーによってアッセイした。ＮＴＨｉに起因するＯＭを有する２ヶ月、６ヶ月〜７ヶ月または１８ヶ月〜１９ヶ月および４歳〜６歳の年齢の小児からの血清を、ＯＭのエピソードの数によって決定して、低い発生率および高い発生率の群に分けた。
【００８７】
現在のところ、高いＯＭの発生率または低いＯＭの発生率のいずれかの２ヶ月齢および６ヶ月〜７ヶ月齢の小児から得られた血清中の抗体は、ＩＶ型ピリ線毛ペプチドのいずれかと制限された反応性を示し、それぞれ、３〜３８および４〜６１の共鳴単位（ＲＵ）の値を有した。しかしながら、これらの群の間の著しい相違が、１８ヶ月齢〜１９ヶ月齢で得られた血清で見られた。低い発生率の１８ヶ月〜１９ヶ月の群からの血清で得られた値は、４４ＲＵ〜１０５ＲＵであったが、高い発生率のパネルからの血清は、ＩＶ型ピリ線毛ペプチドを５倍高く（８１ＲＵ〜５２８ＲＵ）まで認識した。４歳〜６歳の年齢において、小児が生まれつきＯＭを消散する場合、ＩＶ型ピリ線毛ペプチドに対する反応性は、２つの発生率の群の間で、再び同様であった。ここで観察された反応性が、ＮＴＨｉに起因する疾患に特異的であることを確認するために、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因するＯＭを有する小児からの血清もまた、アッセイした。全ての場合において、１６〜１２０のＲＵ値が、全てのＩＶ型ピリ線毛ペプチドに対して得られた。中耳から得られた滲出液においてＩＶ型ピリ線毛に対する抗体の存在についてアッセイするために、本発明者らはまた、バイオセンサーによってそれらの液体をアッセイした。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに起因するＯＭを有する小児からの滲出液は、未反応であったが、ＮＴＨｉに起因するＯＭを有する小児から回収された滲出液は、ＩＶ型ピリ線毛ペプチドと高度に反応した。集合的に、このデータは、ＯＭの疾患経過の間に、ＮＴＨｉ  ＩＶ型ピリ線毛が、インビボにおいて発現されること、および、それらの構造体が免疫原性であることを強く示唆する。
【００８８】
（実施例９）
ＮＴＨｉに対する広い交差防御免疫応答を与える免疫原の同定を、以下のように行いうる。
【００８９】
（ＮＴＨｉピリンペプチドの合成）
ＰｉｌＡの免疫優性ドメインおよび付着因子結合ドメインをマッピングするために、重なり合う連続的なペプチドならびに既知の多様性の２つの焦点を合わせた領域由来のペプチド（上記の実施例６を参照のこと）のパネルを、合成する。例えば、５残基の重なりを有する１３の１５マーペプチドを、１３７残基の成熟ピリンタンパク質の全体をマッピングするために合成する。最終的なＣ末端ペプチドは、成熟ＰｉｌＡの最終的な２つのアミノ酸を組み込むために、実際には残基１２１〜１３７にわたる１７マーである。２つの記載した多様性領域を適合させるために、残基５１〜６５に及ぶ２つのペプチド改変体および残基７９〜９５に及ぶ２つのペプチド改変体を、合成する。この後者の多様性領域を完全に適合させるために、多様性領域は、実際には残基７９〜８７に及ぶため、２つのペプチドを、Ｎ末端における１つのアミノ酸ずつ長さを変えて作製する。付加的な残基に起因して、これらの後者の２つのペプチドの各々は、長さが１６マーである。従って、合計１５のペプチドを合成する：１２は、１５マーであり、１つは、１７マーであり、そして２つは、１６マーペプチドである。このペプチドを以下の表２に示し、ここで、アミノ酸残基の数は、配列番号２のアミノ酸と一致する。
【００９０】
【表２−１】
2014204718.tif 000003
【００９１】
【表２−２】
2014204718.tif 000004
（組換えＮＴＨｉピリン（ｒＰｉｌＡ）の作製）
組換えＰｉｌＡタンパク質（ｒＰｉｌＡ）を、アッセイにおいて完全なピリンサブユニットタンパク質を示すために使用するための、より容易に再生可能な産物として役立たせるために作製し得る。このようにするために、天然のピリンサブユニットの機能的な品質を所有するためにはｒＰｉｌＡが同様に適切に折りたたまれていることが重要であるので、４つのＣｙｓ残基を有したピリンを研究したＫｅｉｚｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２４１８６−１４１９３、２００１）の公開されたプロトコルを利用する。手短かにいうと、先端を切り取ったピリンを操作し、ここで、最初の２８残基を、凝集を防止するために、Ｎ末端から取り除き、この先端を切り取ったピリンをさらに、構築物にＯｍｐＡリーダー配列の組み込みによって、ペリプラズムに運ばれるように操作する。この戦略を使用して、Ｋｅｉｚｅｒらは、インビトロでのアッセイにおいてそのレセプター（アシアロＧＭ１）に結合し得る組換え可溶性モノマーのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａピリンタンパク質を作製して、異種チャレンジの前にこのペプチドを１５分送達した場合、マウスにおける罹患率および死亡率を減少させた。このＮＴＨｉ  ＰｉｌＡの可溶性モノマー性の先を切り取った形態は、以下に記載した研究において有用である。
【００９２】
（ＰｉｌＡの免疫優性ドメインのマッピング）
ペプチドならびに天然ＰｉｌＡタンパク質および組換えＰｉｌＡタンパク質を、ＮＴＨｉに起因する実験的または生まれつきのＯＭを受けているチンチラおよび小児からの中耳液に加えて、急性でかつ回復期にあるチンチラおよび小児血清（本発明者らの現在の試料収集物内で全て入手可能であるか、または別の発案の一部分として収集物が計画されている）の両方において合わせて使用して、ＥＬＩＳＡおよびまたバイオセンサーアッセイによって、ＰｉｌＡの免疫優性ドメインをマッピングする。手短にいうと、ＰｉｌＡペプチド、ｒＰｉｌＡおよび天然のピリ線毛を、９６ウェルマイクロタイタープレートまたはバイオセンサーチップ表面に結合させ、次いで、血清または中耳液サンプル内の各ペプチドに結合する抗体の相対量をアッセイする。
【００９３】
これらの研究は、チンチラ宿主およびヒトの小児の両方によって認識される場合に、ピリンサブユニットのうちの他のものよりも比較的免疫優性である領域を同定する。最もＮ末端の合成ペプチドは、非常に無極性（疎水性）のアミノ酸から構成され、従って、ピリ線毛繊維内に埋没するようであり、抗体に接近できないという事実に起因して、この１５マーペプチドは、本明細書中に記載されるアッセイについての内部のネガティブコントロールとして役立つと予想される。正常な小児の血清および未刺激のチンチラ血清は、ネガティブ血清コントロールとして役立ち、未刺激の動物から回収される中耳の洗浄液は、中耳のＮＴＨｉ感染の間に回収される滲出液についてのネガティブコントロールとして使用される。
【００９４】
（ＰｉｌＡの付着因子結合ドメインのマッピング）
ＰｉｌＡの真核細胞結合ドメインをマッピングするために、競合的ＥＬＩＳＡアッセイを行い、ならびに共焦点顕微鏡検査によって、合成ピリンペプチドが細胞培養物における真核細胞に対するＮＴＨｉ結合を阻害する能力の評価を行う。最初のスクリーニングアッセイのために、適切な真核生物標的細胞を、９６ウェルマイクロタイターディッシュ内で増殖させる。細胞を洗浄し、次いで、合成ピリンペプチド、ｒＰｉｌＡまたは天然のＮＴＨｉピリ線毛［ＰＢＳにおいて０．２μｇ］とともに予備インキュベートして、それらの真核生物へのＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ（ピリン発現を促進することが公知の条件下で増殖させた）の結合をブロックするそれらの相対能力を決定した。ＮＴＨｉの相対的付着性を、相同な完全ＮＴＨｉ  ＯＭＰ調製物およびＨＲＰ結合プロテインＡに対するポリクローナル抗血清を使用して、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で発色させて決定する。適切なこれらのアッセイのために、上皮標的細胞［すなわち、チンチラの中耳上皮細胞（ＣＭＥＥ）、正常なヒト気管支／気管の細胞（ＮＨｕＢｒ）、ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞株（Ａ５４９）］、ＮＴＨｉが付着しない臨床的に関連性がない上皮標的細胞（ＣＨＯ）ならびに内皮標的細胞［ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）］を使用する。
【００９５】
抑制活性を示すペプチド（代表的に、カットオフは、コントロールに対して１５％以上の付着性阻害である）について、観察された細菌付着ブロック能力に対するあらゆる用量依存性を決定する。相互作用をさらに、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムを使用して、付着性遮断アッセイを行うことによって評価し得、ここで、気道上皮細胞（ＣＭＥＥおよびＮＨｕＢｒ）を、空気−流体界面で増殖させる。これらの細胞を、目的の第１の合成ペプチド（または適切なコントロール、すなわち、それぞれ、付着性に関与するか、または関与しないＮＴＨｉ表面タンパク質についてのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとしての単離されたＯＭＰ  Ｐ５およびＰ２、ならびにｒＰｉｌＡ）とともにインキュベートして、利用可能なＴｆｐレセプターをブロックすることを試み、次いで、それらを、新鮮な増殖培地で５回洗浄し、続いて、本発明者がＴｆｐの発現を促進すると知っている条件下で増殖させた約２〜５×１０７のＮＴＨｉを接種する。培養物を洗浄して、非付着性の細菌を除去し、次いで、５分間、氷上でメタノールで固定し、風乾し、ＰＢＳでリンスし、膜をＴｒａｎｓｗｅｌｌから取り出して、共焦点顕微鏡検査によて画像化するためにカバーガラスの上に置く。付着性ＮＴＨｉを検出するために、チンチラの超免疫抗ＮＴＨｉ  ＯＭＰ血清およびＦＩＴＣ−プロテインＡを使用して、ＮＴＨｉとその上皮標的細胞との相互作用、あるいは逆に、ＰｉｌＡの推定付着因子結合ドメインを示すペプチドによるこの相互作用の遮断を実証する。
【００９６】
（免疫原の選択）
上記に得られたデータに基づいて、免疫原性ペプチドを、相対的免疫優性ならびに呼吸器の上皮標的細胞に対するＮＴＨｉの付着性を阻害する能力の両方に基づいて選択する。目的の領域の生化学的特性および構造的特性に依存して、このペプチドを、合成ペプチドまたは組換えペプチドのいずれかとして産生する。
【００９７】
ＰｉｌＡ免疫原の免疫原性効力および防御効力を、本明細書中に開示したチンチラ動物モデルおよびヒト試験において最初に評価する。
【００９８】
（実施例の要旨）
前述の証拠は、ＮＴＨｉが、それらの表面上に機能的ＩＶ型ピリ線毛を発現することを示す。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、分類可能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅにおける形質転換能力に重要であると公知であり、同様にＮＴＨｉによるバイオフィルム形成のために重要であると本明細書中に企図される。集団的に、これらの観察は、ＮＴＨｉが、ヒト宿主という栄養物を制限された環境におけるＩＶ型ピリ線毛の発現をアップレギュレートするようであることを示す。従って、ＩＶ型ピリ線毛は、ＮＴＨｉならびにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株ａ、ｂ、ｃ、ｅおよびｆによって引き起こされる病原性状態のためのワクチンならびに／または抗菌戦略について優れた目的を示す。
【図１】
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【配列表】
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