(57)【要約】【課題】生体適合性に優れる金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー、及び前記ポリマーからなる生体適合性に優れる金属イオン含有ナノ粒子を提供する。前記金属イオン含有ナノ粒子を含む分子イメージング用分子プローブ、及び腫瘍診断用の放射性医薬品及び内照射治療用放射性医薬品などの薬剤搬送システムを提供する。【解決手段】サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーと、前記ポリマーに配位した金属イオンとを含む金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。前記金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子。【選択図】図１
2014105161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーと、前記ポリマーに配位した金属イオンとを含む金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【請求項２】
前記両親媒性ブロックポリマーは直鎖型である、請求項１に記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【請求項３】
前記両親媒性ブロックポリマーは分岐型であり、親水性ブロックが分岐構造を有する、請求項１に記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【請求項４】
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計は２〜３００個である、請求項１〜３のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【請求項５】
前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は５〜４００個である、請求項１〜４のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【請求項６】
前記金属イオンは、放射性金属イオンである、請求項１〜５のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【請求項７】
前記金属イオンは、インジウムイオン又はイットリウムイオンである、請求項１〜６のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子。
【請求項９】
粒子径が１０〜２００ｎｍである、請求項８に記載の金属イオン含有ナノ粒子。
【請求項１０】
以下の工程：
容器中に、サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムを得る工程、
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理及び／又は加温処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、及び
前記分子集合体の分散液と金属イオンの水溶液とを混合し、インキュベートして、前記ポリマーに金属イオンを配位させる工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項８又は９に記載の金属イオン含有ナノ粒子。
【請求項１１】
以下の工程：
容器中に、サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、
前記有機溶媒を除去して、分子集合体の分散液を得る工程、及び
前記分子集合体の分散液と金属イオンの水溶液とを混合し、インキュベートして、前記ポリマーに金属イオンを配位させる工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項８又は９に記載の金属イオン含有ナノ粒子。
【請求項１２】
前記インキュベートは、４０〜９８℃の加熱条件下にて行われる、請求項１０又は１１に記載の金属イオン含有ナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子を含む、分子イメージング用分子プローブ。
【請求項１４】
請求項６に記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子を含む、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ用放射性医薬品。
【請求項１５】
請求項６に記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子を含む、内照射治療用放射性医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超分子化学、医工薬学連携領域、及びナノメディシンの分野に属する。本発明は、生体適合性を有する金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー、及び前記ポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子に関する。また、本発明は、前記金属イオン含有ナノ粒子を含む分子イメージング用分子プローブ、及び腫瘍診断用の放射性医薬品及び内照射治療用放射性医薬品などの薬剤搬送システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
放射性金属イオンは測定装置における検出感度が高く、微量で生体組織中の放射性金属イオン定量が可能である。そのため、放射性金属イオンを用いた診断薬は、ポジトロン断層法ＰＥＴ(Positron Emission Tomography)や、単一光子放射断層法ＳＰＥＣＴ(Single Photon Emission Computed Tomography)診断に有用であり、これまで開発されてきた。しかし、従来の放射性金属イオンを用いたＰＥＴ及び／又はＳＰＥＣＴ用放射性医薬品（又は診断薬）は病変部位への集積選択性が低く、診断に有効に用いられているものは多くない。
【０００３】
近年、悪性リンパ腫などのがん部位に対する選択性の高い抗体にキレート剤を導入し、該キレート剤に放射性金属イオンを配位させた放射性金属イオン／抗体が開発され、これをがんの診断や治療に応用する研究開発が行われている。放射性金属イオン／抗体として、ゼヴァリン（登録商標）（Zevalin:バイエル／富士フイルムＲＩファーマ）が挙げられ、既に上市されている。ゼヴァリンにおいて、キレート剤としては、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−テトラアセテート（ＤＯＴＡ）が用いられ、放射性金属としては、111Ｉｎ（腫瘍イメージング用）又は90Ｙ（治療用）が用いられている。しかしながら、放射性金属イオン／抗体については、ヒト完全抗体の作製は高コストであり、また、抗体に賦与すべき機能には、標的（ターゲティング）性だけでなく、拮抗阻害やキナーゼ阻害などがあり、作用機序に工夫が必要である。さらに、キレート剤を導入することによる抗体の活性低下の問題もあり、キレート剤の導入のために高コストとなる。また、抗体治療薬は標的指向性が高く、逆に言えば、固形癌一般に結合する抗体の開発は難しい。また、固形癌一般に結合する抗体や、固形癌一般に結合できるペプチドリガンドなどには、想定外の副作用を示す場合も多く、毒性の予測が困難である。
【０００４】
また、国際公開ＷＯ２０１０／０２９７６０号公報には、キレート剤を含むポリマー結合体を含むイメージング剤が開示され、該キレート剤としては、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−テトラアセテート（ＤＯＴＡ）が挙げられ、該キレート剤に常磁性金属Ｇｄ(III)を配位させることが開示されている。
【０００５】
ところで、初期癌を見つけるための全身検査には、ＰＥＴファーストと呼ばれるように、糖代謝の亢進部位を検出するフルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）が有効である。しかしながら、ＦＤＧは、脳、腎臓、膀胱、胃などの癌の検出には適しておらず、また、高分化型の癌や原発性肝臓癌にも不適であることから、ＦＤＧを補完するもの、あるいは、さらに進んだプローブが求められている。
【０００６】
また、治療の方に目を向けると、早期治療後、及び外科的治療や放射線治療後の転移予防のためのがん治療においては、抗がん剤を用いた化学療法が行われる。抗がん剤は、正常組織へも大きな影響を与え副作用が問題となる。副作用の軽減のために種々の薬剤搬送システム（ＤＤＳ）が研究開発されている。この一つとして、がんの初期増殖時に顕著に見られる新生血管の特徴（ＥＰＲ効果：Enhanced Permeability and Retention Effect）を利用したナノ粒子をキャリアーとしたＤＤＳ抗がん剤の開発が注目され、種々のナノ粒子が検討されている。ＥＰＲ効果とは、血中に投与された粒径数十ｎｍ〜数百ｎｍ（例えば２０〜２００ｎｍ程度）のナノ粒子が、透過性が異常に亢進した毛細血管系より漏出し、増殖の速い腫瘍組織の間質腔に、リンパ管が未発達なことも手伝って蓄積する現象である。
【０００７】
これまで、種々のナノ粒子を用いた薬剤搬送システム（ＤＤＳ）が開発されている。代表的なものとして、両親媒性脂質で構成されベシクル構造（内部に水相を形成）を形成するリポソームや、高分子ミセル（内部に疎水コアを形成）が挙げられ、一部のものは臨床に応用されている。現在、生体中での非特異的集積を軽減する生体適合性材料として、その親水性を利用してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるナノ粒子の被覆が提案されている。例えば、米国特許５０１３５５６号には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆したリポソームが開示されている。しかしながら、ＰＥＧ被覆ナノ粒子は被覆内臓（特に肝臓）への集積軽減効果が十分ではない。ＤＤＳ抗がん剤としては２００７年１月に日本国内初となるターゲティング機能を持った抗がん剤ドキシル（ドキソルビシン内包ＰＥＧ修飾リポソーム製剤）が上市され、すでに全世界で用いられている。しかしながら、新たな副作用の報告などもある。この理由として、複数回投与時に体内動態が変化するＡＢＣ現象が近年報告されている。これを回避するために、ＰＥＧ以外の組成の探索や、粒子径の制御（小径化）などが検討されているが、実用化されている技術はない。ＡＢＣ現象とは、高分子ミセルを一度生体内に投与すると免疫系が賦活化され、同じ高分子ミセルを再び投与すると、免疫系の働きによって肝臓へ集積してしまう現象 (Accelerated Blood Clearance) である。
【０００８】
国際公開ＷＯ２００９／１４８１２１号公報及びバイオマテリアルズ（Biomaterials）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０に、疎水性ブロックがポリ乳酸鎖、親水性ブロックがポリサルコシン鎖である直鎖型の両親媒性ブロックポリマーが、水溶液中において自己組織化し、粒径が３０ｎｍ以上の高分子ミセル（ラクトソーム）を形成することが開示されている。ラクトソームは、高い血中滞留性を有するほか、それまでに既に開発されていた高分子ミセルと比べて肝臓への集積量が著しく減少することが分かっている。このラクトソームは、血中に滞留している粒子径が数十〜数百ｎｍのナノ粒子が癌疾に溜まりやすいという性質（ＥＰＲ効果）を利用することによって、癌疾部位を標的とした分子イメージング又は薬剤搬送用のナノキャリアとして適用可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０２９７６０号公報
【特許文献２】米国特許５０１３５５６号
【特許文献３】ＷＯ２００９／１４８１２１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】バイオマテリアルズ（Biomaterials）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０
【非特許文献２】バイオポリマーズ（Biopolymers）、１９８９年、第２８巻、ｐ．１２３５−１２４６
【非特許文献３】バイオポリマーズ（Biopolymers）、１９８９年、第２８巻、ｐ．１２４７−１２５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のような状況において、上記放射性金属イオン／抗体材料のような欠点がなく、生体適合性に優れる金属イオン含有ナノ粒子の開発が望まれる。
【００１２】
本発明の目的は、生体適合性に優れる金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー、及び前記ポリマーからなる生体適合性に優れる金属イオン含有ナノ粒子を提供することにある。また、本発明の目的は、前記金属イオン含有ナノ粒子を含む分子イメージング用分子プローブ、及び腫瘍（又は炎症部位）診断用の放射性医薬品及び内照射治療用放射性医薬品などの薬剤搬送システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、サルコシン単位を含む親水性ブロック及び乳酸単位を含む疎水性ブロックを有する両親媒性ブロックポリマーからなる高分子ミセル（ラクトソーム；Ｌａｃｔｏｓｏｍｅ）に、キレート剤を用いることなく、金属イオンを担持させ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーと、前記ポリマーに配位した金属イオンとを含む金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【００１５】
（２）  前記両親媒性ブロックポリマーは直鎖型である、上記（１）に記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【００１６】
（３）  前記両親媒性ブロックポリマーは分岐型であり、親水性ブロックが分岐構造を有する、上記（１）に記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【００１７】
（４）  前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計は２〜３００個である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【００１８】
（５）  前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は５〜４００個である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【００１９】
（６）  前記金属イオンは、放射性金属イオンである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【００２０】
（７）  前記金属イオンは、インジウムイオン又はイットリウムイオンである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマー。
【００２１】
（８）  上記（１）〜（７）のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子。
・  サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体に金属イオンが配位した金属イオン含有ナノ粒子。
・  前記直鎖型の両親媒性ブロックポリマーと前記分岐型の両親媒性ブロックポリマーの両者からなる金属イオン含有ナノ粒子。
【００２２】
（９）  粒子径が１０〜２００ｎｍである、上記（８）に記載の金属イオン含有ナノ粒子。
【００２３】
（１０）  以下の工程：
容器中に、サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムを得る工程、
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理及び／又は加温処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、及び
前記分子集合体の分散液と金属イオンの水溶液とを混合し、インキュベートして、前記ポリマーに金属イオンを配位させる工程、
を含む調製方法によって得られたものである、上記（８）又は（９）に記載の金属イオン含有ナノ粒子。
【００２４】
（１１）  以下の工程：
容器中に、サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、
前記有機溶媒を除去して、分子集合体の分散液を得る工程、及び
前記分子集合体の分散液と金属イオンの水溶液とを混合し、インキュベートして、前記ポリマーに金属イオンを配位させる工程、
を含む調製方法によって得られたものである、上記（８）又は（９）に記載の金属イオン含有ナノ粒子。
【００２５】
（１２）  前記インキュベートは、４０〜９８℃の加熱条件下にて行われる、上記（１０）又は（１１）に記載の金属イオン含有ナノ粒子。
【００２６】
（１３）  上記（１）〜（７）のいずれかに記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子を含む、分子イメージング用分子プローブ。
【００２７】
（１４）  上記（６）に記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子を含む、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ用放射性医薬品。
【００２８】
（１５）  上記（６）に記載の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる金属イオン含有ナノ粒子を含む、内照射治療用放射性医薬品。
【００２９】
・  容器中に、サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムを得る工程、
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、及び
前記分子集合体の分散液と金属イオンの水溶液とを混合し、インキュベートして、前記ポリマーに金属イオンを配位させる工程、
を含む、金属イオン含有ナノ粒子の製造方法。
【００３０】
・  容器中に、サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、
前記有機溶媒を除去して、分子集合体の分散液を得る工程、及び
前記分子集合体の分散液と金属イオンの水溶液とを混合し、インキュベートして、前記ポリマーに金属イオンを配位させる工程、
を含む、金属イオン含有ナノ粒子の製造方法。
【００３１】
・  前記インキュベートを、４０〜９８℃の加熱条件下にて行う、上記の金属イオン含有ナノ粒子の製造方法。
・  前記金属イオンを配位させる工程の後に、さらに、前記ポリマーに配位していない金属イオンを除去して精製する工程を行う、上記の金属イオン含有ナノ粒子の製造方法。
・  前記精製工程の後に、さらに、濃縮工程を行う、上記の金属イオン含有ナノ粒子の製造方法。
・  前記金属イオンは、放射性金属イオンである、上記の金属イオン含有ナノ粒子の製造方法。
・  前記金属イオンは、インジウムイオン又はイットリウムイオンである、上記の金属イオン含有ナノ粒子の製造方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によると、サルコシン単位を含む親水性ブロックと乳酸単位を含む疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーに金属イオンが配位した生体適合性に優れる金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーが提供される。本発明の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーにおいては、キレート剤を用いることなく、金属イオンがサルコシンのカルボニルに配位ないしは担持されているので、キレート剤による弊害がない。
【００３３】
本発明によると、前記金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーからなる生体適合性に優れる金属イオン含有ナノ粒子、すなわち金属イオン含有ラクトソームナノ粒子が提供される。本発明の金属イオン含有ナノ粒子は、腫瘍組織に特異的に集積し、すなわち腫瘍組織以外への組織への集積性が低く、生体に対する安全性が高い。金属イオンとして、標識となる放射性金属イオン（111Ｉｎなど）を用いると、腫瘍組織への特異的な集積によりＰＥＴやＳＰＥＣＴなどの分子イメージングシステムにおける有用な分子プローブとなる。また、ＦＤＧよりも幅広い腫瘍組織に対して特異的に集積することにより、ＦＤＧよりも有用な分子プローブとなる。金属イオンとして、β線を放出する放射性金属イオン（90Ｙ、77Ｌｕ、89Ｓｒなど）を用いると、前記金属イオンが薬剤として機能し、腫瘍組織への特異的な集積により非常に有用且つ腫瘍組織以外への組織への副作用が抑えられた安全な内照射治療用医薬品となる。
【００３４】
さらに、本発明の金属イオン含有ナノ粒子は、ＦＤＧのように腫瘍の検出診断のみではなく、放射性金属イオンを選択することによって、固形癌を含む腫瘍の検出診断薬、及び治療薬の双方に用いることができる。このように、本発明の金属イオン含有ナノ粒子は、腫瘍の検出診断薬、及び治療薬の双方に共通プラットホームとして用いることができるので、その観点からも非常に高いポテンシャルを有している。本発明の金属イオン含有ナノ粒子は、放射性金属イオン／抗体医薬のように、各種がんに対する特別の抗体を必要としないで、固形癌一般の検出に適用できる利点があり、小さな初期癌を見つける全身の検診にも向いている。
【００３５】
さらに、本発明の金属イオン含有ナノ粒子は、その粒子径を制御できる。両親媒性ブロックポリマーにおける親水性ブロックが分岐構造であれば、粒子径は直鎖型のものに比べて小さくなる。例えば、直鎖型ポリマーからなる粒子の粒子径は３５〜２００ｎｍ程度をとり得るのに対して、分岐型ポリマーからなる粒子の粒子径は１０〜３０ｎｍ程度をとり得る。直鎖型ポリマーと分岐型ポリマーとを併用して、その比率を変化させることによって、さらに粒子径を制御できる。
【００３６】
例えば３０ｎｍを下回る小さい粒径とすれば、金属イオン含有ラクトソームナノ粒子は、腫瘍細胞周辺の血管壁にある間隙からより漏れ出やすくなり、より高いＥＰＲ効果によって、腫瘍部位への前記ラクトソームナノ粒子の集積速度を速めることが可能になる。また、より細い毛細血管への分布が促進され全身に分布することでバックグラウンドのシグナルを低下させることが可能になる。すなわち、腫瘍部位とバックグラウンドとのコントラスト比を向上させることができる。これにより、短時間でのイメージングが可能になる。
【００３７】
また、親水性ブロックにおける分岐構造により、粒子表面にサルコシン鎖の稠密なポリマーブラシ構造を有するラクトソームナノ粒子を調製することができ、粒子径が３０ｎｍを下回るか否かに関わらず、ＡＢＣ現象の発現を抑制することができる。
【００３８】
本発明の金属イオン含有ナノ粒子においては、キレート剤を用いることなく、金属イオンがサルコシンのカルボニル基に配位ないしは担持されているので、キレート剤による弊害がない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、各ナノ粒子のインジウム配位量についての測定結果を示すグラフである。図１（ａ）は、実施例１のＡＢ型ラクトソーム(AB Type Lactosome)ナノ粒子についての結果であり、図１（ｂ）は、実施例２のＡ３Ｂ型ラクトソーム(A3B Type Lactosome)ナノ粒子についての結果であり、図１（ｃ）は、比較例１のＰＥＧ−ＰＬＬＡナノ粒子についての結果である。
【図２】図２は、実施例１、実施例２及び比較例１における各ナノ粒子のインジウム配位量についての測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１で作製されたＡＢ型ラクトソーム粒子について、インジウム配位前及び後のＤＬＳ粒子径分布を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例２で作製されたＡ３Ｂ型ラクトソーム粒子について、インジウム配位前及び後のＤＬＳ粒子径分布を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例４及び５において、インジウム飽和配位量及び配位安定性についての測定結果を示すグラフである。図５（ａ）は、ＡＢ型ラクトソームナノ粒子についての結果であり、図５（ｂ）は、Ａ３Ｂ型ラクトソームナノ粒子についての結果である。
【図６】図６は、実施例６において、[111Ｉｎ]インジウム配位ＡＢ型ラクトソーム粒子の腫瘍への集積結果を示すＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像である。上段の画像は腫瘍部位のアキシャル(axial)像、下段の画像はコロナル(coronal)像である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
［１．両親媒性ブロックポリマー］
本発明の金属イオン含有両親媒性ブロックポリマーは、サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーと、前記ポリマーに配位した金属イオンとを含んでおり、直鎖型又は分岐型のいずれであってもよい。親水性ブロックと疎水性ブロックとは、リンカー部を介して結合している。
【００４１】
［１−１．親水性ブロック］
本発明において、両親媒性ブロックポリマーの親水性ブロックが有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロックの全体が、後述の疎水性ブロックとしてのポリ乳酸鎖に対して相対的に親水性が強い性質をいう。或いは、親水性ブロックが疎水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性をいう。さらに或いは、両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、特に粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性をいう。
【００４２】
本発明において、両親媒性ブロックポリマーは、親水性ブロックにおいて直鎖構造を有していてもよいし、分岐した構造を有していてもよい。分岐構造の場合には、親水性ブロックの分岐それぞれにサルコシンが含まれる。
【００４３】
親水性ブロックにおいて、構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。例えば、前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計は２〜３００個である。具体的には、直鎖型の場合、サルコシン単位の合計は、例えば、１０〜３００、２０〜２００、又は２０〜１００程度でありうる。構成単位数が上記範囲を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。上記範囲を下回ると、両親媒性ブロックポリマーとしての体をなさないか、又は、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００４４】
分岐型の場合、分岐全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、２〜２００、２〜１００、又は２〜１０個でありうる。あるいは、複数の親水性ブロック全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、３０〜２００、又は５０〜１００個でありうる。１つの分岐当たりのサルコシン単位数の平均は、例えば、１〜６０、１〜３０、１〜１０、又は１〜６でありうる。すなわち、親水性ブロックそれぞれは、サルコシン又はポリサルコシン鎖を含んで構成されることができる。構成単位数が上記範囲を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。上記範囲を下回ると、両親媒性ブロックポリマーとしての体をなさないか、又は、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００４５】
分岐型の場合、親水性ブロックにおける分岐は２以上であればよいが、分子集合体を形成する際に粒子形状のミセルを効率的に得る観点から、好ましくは３以上である。親水性ブロックにおける分岐の数の上限は特に限定されるものではないが、例えば２７である。特に、本発明においては、親水性ブロックの分岐の数が３であることが好ましい。分岐構造は、当業者が適宜設計できる。
【００４６】
サルコシン（すなわちＮ−メチルグリシン）は水溶性が高く、また、サルコシンのポリマーはＮ置換アミドを有することから通常のアミド基に比べてシス−トランス異性化が可能であり、さらに、Ｃα炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有するものである。このような構造を構成ブロックとして用いることは、当該ブロックに高い親水性の基本特性、又は、高い親水性と高い柔軟性とを併せ持つ基本特性が備わる点で非常に有用である。
【００４７】
さらに、親水性ブロックは、末端（すなわちリンカー部と反対側の末端）に親水性基（例えば水酸基に代表される）を有していることが好ましい。
【００４８】
なお、ポリサルコシン鎖においては、全てのサルコシン単位が連続していてもよいし、非連続であってもかまわないが、当該ポリペプチド鎖全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。
【００４９】
［１−２．疎水性ブロック］
本発明において、疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロックが、上記の親水性ブロックの全体に対して相対的に疎水性が強い領域であり、当該親水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。
【００５０】
１本の両親媒性ブロックポリマー中に存在する疎水性ブロックは分岐していなくともよいし、分岐していてもよい。しかしながら、疎水性ブロックは分岐していない方が、疎水性コア部に対して、親水性分岐型シェル部の稠密度が増すので、より小さい粒径の安定したコア／シェル型分子集合体を形成し易いと考えられる。
【００５１】
本発明において、疎水性ブロックは、ポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）を含むものである。疎水性ブロックにおいて構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。例えば、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は５〜４００個である。具体的には、例えば疎水性ブロックが分岐していない場合、乳酸単位の数は、例えば５〜１００、１５〜６０個、又は２５〜４５個でありうる。疎水性ブロックが分岐している場合は、分岐全てに含まれる乳酸単位の数の合計が、例えば１０〜４００、好ましくは２０〜２００個でありうる。この場合、１つの分岐当たりの乳酸単位数の平均は、例えば、５〜１００、好ましくは１０〜１００個である。
【００５２】
構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００５３】
疎水性ブロックが分岐する場合、分岐の数は特に限定されないが、分子集合体を形成する際に粒子形状のミセルを効率的に得る観点から、例えば、親水性ブロックにおける分岐数以下とすることができる。
【００５４】
ポリ乳酸は、以下の基本特性を有する。
ポリ乳酸は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。
また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内においてがん組織以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、がん組織への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
【００５５】
なお、疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）においては、全ての乳酸単位が連続していてもよいし、非連続であってもかまわないが、疎水性ブロック全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。
【００５６】
疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）は、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖（ＰＬＬＡ）か、又は、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖（ＰＤＬＡ）のいずれであってもよい。また、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成されていてもよい。この場合において、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とは、交互配列、ブロック配列、又はランダム配列のいずれであってもよい。
【００５７】
［１−３．サルコシン単位数の乳酸単位数に対する比］
両親媒性ブロックポリマーにおいて、サルコシン単位数（すなわち、親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の数、又は、親水性ブロックが分岐している場合には分岐全てに含まれるサルコシン単位の数の合計）をＮＳとし、ポリ乳酸単位数（すなわち、疎水性ブロックに含まれる乳酸単位の数、又は、疎水性ブロックが分岐している場合には分岐全てに含まれる乳酸単位数の合計）をＮＬとすると、それらの比ＮＳ／ＮＬは、例えば０．０５〜５又は０．０５〜４でありうる。さらに好ましくは、ＮＳ／ＮＬは、０．０５以上１．８未満、例えば０．０５以上１．７以下、０．０５以上１．６７以下、０．１以上１．７以下、又は０．１以上１．６７以下であってよい。
【００５８】
［１−４．ポリマー構造］
親水性ブロックと疎水性ブロックとを連結するリンカー部位の構造は、化学的に許容可能な構造であれば特に限定されるものではない。当業者が適宜分子設計できる。
【００５９】
分岐構造の場合、例えば、親水性ブロック側の分枝の数が２である場合は、ポリ乳酸鎖を含む分子鎖のリンカー部位にある１つのＮ原子から、ポリサルコシン鎖を含む２本の分子鎖が分岐しうる。言い換えれば、ポリ乳酸鎖に直接的又は間接的に結合しているＮ原子が、直接的又は間接的に２本のポリサルコシン鎖に結合していることができる。
【００６０】
また例えば、親水性ブロック側の分枝の数が３である場合は、ポリ乳酸鎖を含む分子鎖のリンカー部位にある１つのＣ原子から、ポリサルコシン鎖を含む３本の分子鎖が分岐しうる。言い換えれば、ポリ乳酸鎖に直接的又は間接的に結合しているＣ原子が、直接的又は間接的に３本のポリサルコシン鎖に結合していることができる。リンカー部位にある１つのＰ原子やＳｉ原子から分岐している場合や、両親媒性ブロックポリマー分子全体が四級アンモニウム分子を形成している場合も同様である。
【００６１】
親水性ブロック側の分枝の数が３を超える場合は、分枝がさらなる分岐構造を有するように分子設計されることができる。
【００６２】
疎水性ブロック側も分岐している場合についても、上記と同様の観点で分子設計されることができる。
【００６３】
下記式（I）に、親水性ブロック側の分岐の数が３、疎水性ブロック側の分岐なしである場合の分岐型両親媒性ブロックポリマーの好ましい構造を示す。
【００６４】
【化１】
2014105161.tif 000003
【００６５】
式（I）中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、それらの合計が３〜２００となる数、ｍは５〜１００の数を表し、Ｒは、水素原子又は有機基を表す。有機基の炭素数は、１〜２０でありうる。具体的には、アルキル基やアルキルカルボニル基などが挙げられる。
【００６６】
下記式（II）に、親水性ブロック側の分岐の数が３、疎水性ブロック側の分岐が２である場合の分岐型両親媒性ブロックポリマーの好ましい構造を示す。
【００６７】
【化２】
2014105161.tif 000004
【００６８】
式（II）中、ｎ１、ｎ２及びｎ３、並びにＲは、式（I）における場合と同じである。ｍ１及びｍ２は、それらの合計が１０〜４００となる数を表す。
【００６９】
［１−５．両親媒性ブロックポリマーの合成法］
直鎖型両親媒性ブロックポリマーの合成は、当業者が適宜行うことができる。例えば、疎水性ブロック部（ポリ乳酸部）の合成を行うと共に、ポリ乳酸鎖の一端に、親水性ブロック部（ポリサルコシン部）を連結するリンカーとなり得る官能基（例えば、アミノ基）を導入する。次に、このアミノ基にポリサルコシンを導入するとよい。
【００７０】
分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成においては、疎水性ブロック部（ポリ乳酸部）の合成、親水性ブロック部（サルコシン部又はポリサルコシン部）の合成、及びそれらブロックを連結するリンカー部の合成がなされる。
【００７１】
例えば、サルコシン又はポリサルコシン鎖とポリ乳酸鎖とを連結させるリンカー試薬を合成し、それを開始剤として、サルコシン部位の付加又はポリサルコシン部位の重合反応による伸長及びポリ乳酸部位の重合反応により伸長させることによって、分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
【００７２】
また例えば、サルコシンをリンカー試薬に付加させた後に、又は、ポリサルコシン鎖を親水性ブロックとして予め重合反応により調製し、リンカー試薬に付加させた後に、ポリ乳酸鎖を伸長させることによって、分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
【００７３】
さらに例えば、ポリサルコシン又はポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の両方をそれぞれ親水性ブロック及び疎水性ブロックとして予め用意しておき、別途合成されたリンカー試薬を用いてそれらブロックを連結させることによって、分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
【００７４】
リンカー試薬の構造は、乳酸モノマー（乳酸やラクチド）又はポリ乳酸鎖と結合可能な官能基（例えば、水酸基、アミノ基等）を１個又は所望の疎水性ブロック側分岐数に相当する数だけ有し、且つ、サルコシンモノマー（例えばサルコシンやＮ−カルボキシサルコシン無水物）又はポリサルコシンと結合可能な官能基（例えばアミノ基）を所望の親水性ブロック側分岐数に相当する数だけ有することができる。この場合、リンカー試薬において、サルコシンモノマー又はポリサルコシンと結合可能な官能基のそれぞれが可能な限り同様の反応性を有するように、当業者によって適宜分子設計がなされる。
【００７５】
乳酸モノマー又はポリ乳酸鎖と結合可能な官能基と、サルコシンモノマー又はポリサルコシンと結合可能な官能基とは、それぞれ保護基によって保護されうる。この場合、それぞれの保護基としては、必要に応じて選択的に脱離させることが可能なものが当業者によって適宜選択される。例えば、親水性ブロック側分岐数が３である分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成する場合のリンカー試薬は、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）構造を元に調製することができる。
【００７６】
さらに、疎水性ブロック側を分岐させる場合は、例えば上記のトリスヒドロキシメチルアミノメタン構造にさらに分岐点を増やした構造を元に調製することができる。さらに分岐点を増やした構造は、トリスヒドロキシメチルアミノメタンに、ポリ乳酸鎖と結合可能な官能基として例えばアミノ基を側鎖に有するアミノ酸（具体例として、リジン及びオルニチンが挙げられる）の、すべてのアミノ基が保護されているアミノ酸誘導体を付加し、その後脱保護することによって得ることができる。脱保護してフリーになったアミノ基に対して、さらに同様のアミノ酸誘導体を付加することによって、分岐点を増やしていくことができる。
【００７７】
ポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の合成方法は、リンカー試薬における官能基に応じて当業者が適宜決定することができるものであり、公知のペプチド合成法及びポリエステル合成法から選択されてよい。
ペプチド合成は、例えば、リンカー試薬におけるアミノ基などの塩基性基を開始剤として、Ｎ−カルボキシサルコシン無水物(サルコシンＮＣＡ)を開環重合することなどによって行うことが好ましい。
ポリエステル合成は、例えば、リンカー試薬におけるアミノ基などの塩基性基を開始剤として、ラクチドを開環重合することなどによって行うことが好ましい。
【００７８】
なお、分岐数が上記具体例と異なる分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成する場合は、有機化学的観点から当業者が種々の変更を適宜加えることによって調製することができる。
【００７９】
ポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の鎖長の調整は、重合反応における開始剤とモノマーとの仕込み比を調整することによって行うことができる。また、鎖長は、例えば 1ＨＮＭＲによって確認することができる。
【００８０】
［２．分子集合体］
［２−１．分子集合体］
本発明において、分子集合体（ラクトソーム）は、上記の直鎖型又は分岐型両親媒性ポリマーの凝集により、或いは自己集合的な配向により成り立つ構造体である。本発明は、内側（コア部）が疎水性ブロック、外側（シェル部）が親水性ブロックとなるように構成されたミセル形状の分子集合体であることが実用性の観点から好ましい。本発明の分子集合体は、適切な金属イオンを含有することによって、分子イメージングにおけるプローブとして、あるいは薬剤搬送システムにおける製剤として有用な構造体となる。
【００８１】
分岐型両親媒性ブロックポリマーは、分岐鎖としての複数のポリサルコシン鎖の存在により、直鎖型両親媒性ブロックポリマーに比べて親水性部位の分子断面積が大きくなる。このため、分岐型両親媒性ブロックポリマーから形成された分子集合体は、粒子としての安定性に優れている。さらにこの粒子は大きな曲率を備えることができる。このことから、分岐型ブロックポリマーからなる分子集合体は、粒子の小型化が可能になるという基本的特徴を有する。
【００８２】
また、分岐型両親媒性ブロックポリマーから構成される分子集合体は、分岐鎖としての複数のポリサルコシン鎖の存在により、直鎖型のラクトソームに比べて表面における親水性基の密度が高く、疎水性部位の露出が少ないという基本的特徴を有する。
【００８３】
［２−２．粒子径］
本発明の分子集合体の粒子径は、例えば１０〜２００ｎｍであり、その粒子径を制御できる。両親媒性ブロックポリマーにおける親水性ブロックが分岐構造であれば、それらから構成される粒子の粒子径は直鎖型のものに比べて小さくなる。例えば、直鎖型ポリマーからなる粒子の粒子径は３５〜２００ｎｍ程度をとり得るのに対して、分岐型ポリマーからなる粒子の粒子径は１０〜３０ｎｍ程度をとり得る。直鎖型ポリマーと分岐型ポリマーとを併用して、その比率を変化させることによって、さらに粒子径を制御できる。
【００８４】
両親媒性ブロックポリマーにおける親水性ブロックが分岐構造の場合、分子集合体の粒子径は、例えば１０〜３０ｎｍでありうる。この範囲に含まれる上限値は、２８ｎｍ、２５ｎｍ、又は２３ｎｍであってもよい。また、下限値は１５ｎｍであってもよい。本発明において、分岐型両親媒性ブロックポリマーの鎖長を短く調整することによって、上記範囲の下限値より小さい分子集合体を得ることも可能である。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。直鎖型両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体に比べ、分岐型両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体の粒径は小さいので、生体内に投与した場合にＥＰＲ効果が得られやすい。
【００８５】
粒子径の調節の方法としては、例えば、分子集合体の分岐型両親媒性ブロックポリマーの鎖長を短くすることによってより小さい粒子径に調整すること、直鎖型両親媒性ブロックポリマーを用いないか、配合量をできるだけ少なくすることによってより小さい粒子径に調整することなどが挙げられる。目的に応じて、粒子径を制御できる。
【００８６】
本発明の分子集合体の大きさを測定するための方法は特に限定されるものではなく、当業者によって適宜選択されるものである。例えば、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope;ＴＥＭ）又は原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope;ＡＦＭ）による観察法や、動的光散乱（Dynamic Light Scattering;ＤＬＳ）法などが挙げられる。ＤＬＳ法においては、溶液中でブラウン運動している粒子の移動拡散係数を測定する。
【００８７】
［２−３．分子集合体の作成］
分子集合体の作成法は特に限定されず、所望する分子集合体の大きさ、特性、担持させる金属イオンの種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のように分子集合体を形成した後に、得られた分子集合体に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察によって行うと良い。
【００８８】
［２−３−１．フィルム法］
本発明における両親媒性ブロックポリマーは低沸点溶媒への溶解性を有するため、フィルム法を用いた分子集合体の調製が可能である。
【００８９】
フィルム法は、次の工程を含む。すなわち、容器（例えばガラス容器）中に、両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程；
前記の溶液から有機溶媒を除去し、容器の内壁に前記両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムを得る工程；及び、
前記の容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理又は加温処理を行い、フィルム状物質を、分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む。さらに、フィルム法は、分子集合体の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。
【００９０】
フィルム法に用いる有機溶媒としては、低沸点溶媒を用いることが好ましい。本発明における低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサンなどが挙げられる。このような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
【００９１】
有機溶媒が除去された後は、容器内壁に両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムが形成される。このフィルムが張り付いた容器中に、水又は水溶液を加える。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【００９２】
水又は水溶液が加えられた後、加温処理を行う。加温によりフィルムが容器内壁から剥がれる過程で分子集合体を形成する。加温処理は、例えば７０〜１００℃、５〜６０分の条件下で行うことができる。加温処理終了時には、分子集合体が前記の水又は水溶液中に分散された分散液が容器中に調製される。また、フィルムの剥離の際、必要に応じ超音波処理を併せて行ってもよい。このようにして、ラクトソーム分子集合体の分散液を得ることができる。
【００９３】
得られた分散液を凍結乾燥処理しても良い。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を特に限定されることなく用いることができる。たとえば、上記のようにして得られた分子集合体の分散液を液体窒素などによって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、分子集合体の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、分子集合体を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、分子集合体の分散液を得ることによって、分子集合体を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【００９４】
［２−３−２．インジェクション法］
インジェクション法は、以下の工程を含む。すなわち、容器（例えば試験管など）中に、両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記の溶液を水又は水溶液に分散させる工程、及び
有機溶媒を除去する工程が行われる。さらに、インジェクション法では、有機溶媒を除去する工程の前に、適宜精製処理工程を行ってもよい。
【００９５】
インジェクション法に用いる有機溶媒としては、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが用いられる。水又は水溶液としては、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが用いられる。
【００９６】
精製処理としては、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行うことができる。このようにして、ラクトソーム分子集合体の分散液を得ることができる。
【００９７】
［３．分子集合体への金属イオンの導入］
フィルム法又はインジェクション法で得られたラクトソーム分子集合体の分散液を用いて、分子集合体に金属イオンを導入する。すなわち、分子集合体の分散液と目的とする金属イオンの水溶液とを混合し、インキュベートして、分子集合体を構成している前記両親媒性ブロックポリマーポリマーに金属イオンを配位ないしは担持させる。
【００９８】
金属元素としては、目的に応じて、ＰＥＴやＳＰＥＣＴなどの分子イメージングシステムにおける分子プローブ用としては標識となる111Ｉｎなど、腫瘍治療用としてはβ線を放出する放射性金属イオン（90Ｙ、77Ｌｕ、89Ｓｒなど）を用いるとよい。
【００９９】
金属元素を含むハロゲン化物、例えば、塩化インジウム、塩化イットリウムなどの水溶液と分子集合体の分散液とを混合する。混合の方法としては、例えば、金属イオンの水溶液に分子集合体の分散液を添加するとよい。分子集合体の分散液に金属イオンの水溶液を添加してもよい。混合は、通常、室温（例えば、１５〜３０℃）にて行うとよい。混合した後、混合液を例えば４０〜９８℃程度、好ましくは８０〜９６℃程度の加熱条件下にてインキュベートする。インキュベート時間は適宜定められるが、例えば、１０〜６０分程度、２０〜３５分程度とするとよい。塩化インジウムの水溶液の場合には、具体的には、９５℃、３０分の条件とすることができる。このような加熱条件下でのインキュベートによって、金属イオンが、前記両親媒性ブロックポリマーに配位ないしは担持される。
【０１００】
前記金属イオンを配位させる工程の後に、さらに、前記ポリマーに配位していない金属イオンを除去して精製する工程を行うことが好ましい。精製は、ＰＤ−１０パックドカラム等を用いて行うことができる。必要に応じて、前記精製工程の後に、さらに、濃縮工程を行ってもよい。
【０１０１】
従来より、ペプチド結合に含まれるカルボニル基が種々の金属イオン錯体の配位子として作用することが知られている。しかしながら、その配位能力は低く複数のカルボニル基が一定の空間配置を保持し協同することではじめて安定な錯体を形成することができる。例えば、複数のサルコシン残基を含む環状ペプチドが金属イオンと錯体を形成することが知られている［Biopolymers, Vol.28, 1235-1246 (1989)，Biopolymers, Vol.28, 1247-1257 (1989)］。
【０１０２】
ポリサルコシン及びサルコシンを含有する化合物は、その生体適合性や生分解性の観点から好ましい。しかしながら、ポリサルコシン鎖が金属イオン配位子として機能し、金属イオンと錯体形成したという報告はない。その理由としては、ポリサルコシンの持つ高い親水性と運動性が考えられる。本発明者らは、鋭意検討した結果、ポリサルコシンの末端の運動性を制御することによって金属イオンとの錯体形成ができることを見出した。具体的には、下記の二つの方法に基づく。
【０１０３】
１）ポリサルコシン鎖の末端に疎水基（ポリ乳酸）を導入した両親媒性ブロックポリマーがその疎水基の分子間相互作用により自己組織化し（すなわち、コア／シェル構造のラクトソームの形成）、シェルを形成するポリサルコシン鎖の運動性をある程度制御すること。
このことにより、ポリサルコシン鎖のカルボニル基が金属イオン配位子として機能し、金属イオンと錯体形成しやすくなる。
【０１０４】
２）上記１）において、さらに、ポリサルコシン鎖に分岐構造を形成させ、複数のポリサルコシン鎖を近接させること。
このことにより、近接するポリサルコシン鎖同士のカルボニル基の協同により、さらに、金属イオン配位子としての機能が高くなり、金属イオンと錯体形成しやすくなる。
【０１０５】
本発明において、金属イオンがサルコシンのカルボニルに配位ないしは担持されていることは、実施例の項で例証するように、親水性ブロックとしてサルコシン鎖の代わりにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を用いた両親媒性ブロックポリマーＰＥＧ−ＰＬＡからなるナノ粒子では、金属イオンが担持されないことからも裏付けられる。
【０１０６】
また、両親媒性ブロックポリマーへの金属イオンの導入量については、特に限定されるものではないが、両親媒性ブロックポリマー1分子当たりに、例えば金属０．１〜１．５原子程度、好ましくは金属０．５〜１．１原子程度とするとよい。
【０１０７】
本発明の金属イオン含有ナノ粒子は、上記のようにして、ラクトソームナノ粒子に、キレート剤を用いることなく、直接的に金属イオンを配位させて導入したものである。このことによって、キレート剤による種々の欠点が解消され、本発明の金属イオン含有ナノ粒子は安価に供給することができる。
【０１０８】
［４．分子イメージング・薬剤搬送システム］
癌治療には外科的切除、局所療法、化学療法、放射線療法などがある。現在、患者のＱＯＬ（Quality of Life）向上とそれに伴う医療費軽減による医療経済効果向上のため、各種の低侵襲治療法が検討されている。局所療法は外科的切除に比べて低侵襲であるが局所再発の危険性が高く、現在、根治治療としては限られた早期ステージ癌への適用に留まっている。また、放射線療法には外照射療法と内照射療法がある。内照射療法はより低侵襲で頻回施行可能という特長があり、既に保険診療として甲状腺癌内照射療法（131Ｉ）、骨転移疼痛緩和療法（89Ｓｒ）、難治性悪性リンパ腫治療（90Ｙ標識抗ＣＤ２０抗体）が行われているが、まだ適用範囲は限定的である。
【０１０９】
現在、我が国における悪性腫瘍（癌）は死因第１位（全体の約３０％）を占めながら、人口高齢化に伴い罹患率も増加の一途であり、生存率やＱＯＬ向上への対策はもちろん、診断及び治療に係る医療費増加も著しく、これを抑制する対策も早急に求められている。癌患者の高齢化が進む一方で、癌の早期発見や悪性度・進行度の術前診断技術も進歩しており、癌治療において、早期癌に対する低侵襲な根治的治療へのニーズが高まっている。
【０１１０】
このような医療の現状において、本発明者らのグループは、現在までに、ポリサルコシン親水鎖とポリ乳酸疎水鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーの自己組織化により形成される「ラクトソーム」について、蛍光剤（ＩＣＧ）や放射性フッ素（18Ｆ）及びヨウ素（123Ｉ）の標識ラクトソームを用いて、種々の担がんマウス（皮下移植、肝臓、脳、膵臓、肺転移、大腸転移）を用いた系で体内動態を詳細に検討してきた。その結果、ラクトソームは、ＥＰＲ効果によって選択的に腫瘍組織に集積し、かつ肝臓や骨髄への集積が少ないことを、解剖所見に加え各種分子イメージグ技術［蛍光イメージング（ＩＣＧ標識）、ＰＥＴ（18Ｆ標識）、ＳＰＥＣＴ（123Ｉ標識）］により明らかにしてきた。さらに、β線放射性核種131Ｉ標識ラクトソームが担がんマウスを用いた実験で顕著な腫瘍体積抑制効果があることを見出している。そして、ラクトソームは同様の機序で炎症部位などに集積することも確認している。
【０１１１】
そこで、本発明において、目的に応じて金属元素を選択することによって、診断及び治療の両者を、同じラクトソームナノキャリアを用いて実現できる診断及び治療薬を提供する。まず、ＰＥＴやＳＰＥＣＴなどの分子イメージングシステムにおける標識となる111Ｉｎを配位させたラクトソームを生体に投与し、全身のスクリーニングを行うと共に、腫瘍の検出を行う。腫瘍が見つかった場合、次に、腫瘍部及び腫瘍部以外へのラクトソーム集積量をガンマカメラにより調べ、投与すべき治療薬とその投与量の決定、並びに、治療前に副作用を予測して治療に臨む。これにより副作用や内部被曝を低減や治療効率を確保する。治療薬としては、放射性金属イオン（90Ｙ、77Ｌｕ、89Ｓｒなど）を配位させたラクトソームを用いるとよい。
【０１１２】
本発明の金属イオン含有ナノ粒子を共通のラクトソームナノキャリアとして用いて診断及び治療の両者を行う場合に期待される波及効果は、根治的低侵襲治療法の確立による癌治療の促進、医療費削減である。本発明の金属イオン含有ナノ粒子は、乳酸を原料にした生分解性高分子を用いるため生体安全性が高く、特別の抗体を必要とする放射性金属イオン／抗体医薬に比べ、大幅な価格低減及び安定供給が可能となる。
【０１１３】
［４−１．分子集合体の投与対象］
本発明において、分子イメージング及び薬剤搬送システムは、本発明の金属イオン含有ラクトソームナノ粒子を生体内に投与することを含む。金属イオン含有ナノ粒子を投与される生体としては特に限定されないが、ヒト又は非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマなどが挙げられる。
【０１１４】
本発明において用いられる金属イオン含有ラクトソームナノ粒子は、血管病変部位（例えば、悪性腫瘍部位、炎症部位、動脈硬化部位、血管新生部位など）への特異的集積性に優れたものである。本発明のラクトソームナノ粒子は、ＥＰＲ効果によりこれらの病変部位の組織へ集積するため、その集積性は血管病変部位の組織の種類によらない。投与ターゲットとなりうるがんは多岐に亘る。例えば、肝臓がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、乳がん、大腸がんなどが挙げられる。この点において、特別の抗体を必要とする放射性金属イオン／抗体医薬に対する大きな優位性がある。
【０１１５】
［４−２．投与］
生体内への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。従って、投与の方法としては、全身投与及び局所投与とを問わない。すなわち、ラクトソームナノ粒子の投与は、注射（針有型、針無型）、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。
【０１１６】
本発明の金属イオン含有ラクトソームナノ粒子において、分岐型両親媒性ブロックポリマーからなる粒子の場合には、分岐構造により粒子表面にサルコシン鎖の稠密なポリマーブラシ構造を有する。このため、直鎖型両親媒性ブロックポリマーからなる粒子に比べて、粒子の疎水性部位の外部環境への露出が少なくなり、粒子外部環境による異物認識が抑制されると考えられる。そのため、分岐型両親媒性ブロックポリマーからなる粒子は、直鎖型粒子に比べ、異物認識抑制に起因するとみられるＡＢＣ現象の減弱化を可能にする。これにより、より複数回の投与が可能となる。例えば、同一個体に２回以上必要回数（例えば２〜１０回）を行ってよい。また、投与スパンは例えば１〜６０日とすることができる。
【０１１７】
［４−３．検出］
本発明の分子イメージングにおいては、投与された金属イオン含有ラクトソームナノ粒子に由来する金属イオンシグナルをＰＥＴやＳＰＥＣＴなどにより検出する工程を含む。投与された分子集合体を検出することによって、体外から投与ターゲットの様子（特にがんなどの組織の位置・大きさ）を観測することができる。
【０１１８】
投与から検出開始までの時間は、当業者が適宜決定することができる。例えば、投与後１〜２４時間とすることができる。腫瘍部及び腫瘍部以外へのラクトソーム集積量や集積量の時間変化をガンマカメラにより調べる。そのデータを基に、放射性金属イオン（90Ｙ、77Ｌｕ、89Ｓｒなど）を配位させたラクトソームから投与すべき治療薬を決定し、その投与量を決定する。そして、治療前に副作用を予測して治療に臨むことができる。分子イメージング診断及び治療において共通のラクトソームナノキャリアを用いるので、診断した部位に、治療用のラクトソームナノキャリアが確実に到達・集積する。
【実施例】
【０１１９】
以下に本発明をより詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【０１２０】
［合成例１：直鎖型両親媒性ブロックポリマー（PSar64-PLLA30）（ＡＢ型）の合成］
本合成例においては、直鎖型のポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar64-PLLA30）を合成した。なお、PSar64-PLLA30は、サルコシン単位数が６４であり、Ｌ−乳酸単位数が３０であることを示している。また、便宜上、直鎖型のポリサルコシン（Ａ）−ポリ乳酸（Ｂ）ブロックポリマーをＡＢ型と表記することがある。
【０１２１】
（アミノ化ポリＬ−乳酸（a-PLLA）の合成）
まず、Ｌ−ラクチド（化合物１）とＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（化合物２）とを用いて、アミノ化ポリＬ−乳酸（a-PLLA）を合成した。
【０１２２】
重合開始剤であるＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（化合物２）（310 mg, 1.60 mmol）に、オクタン酸スズ（6.91 mg）をトルエン（1.0 ｍL）に拡散させたものを加えた。トルエンを減圧留去した後、Ｌ−ラクチド（化合物１）（3.45 g, 24mol）を加え、Ａｒ雰囲気下、120 ℃にて重合反応を行った。１２時間後、反応容器を室温に空冷した。得られた黄白色固体を少量のクロロホルム（10 ｍＬ程度）に溶解させた。クロロホルムを冷メタノール（100 ｍＬ）に滴下することにより白色沈殿を得た。得られた白色沈殿は遠心分離により回収し、減圧乾燥した。
【０１２３】
得られた白色沈殿（500 mg）のジクロロメタン(１ｍＬ)溶液に25v/v％臭化水素／酢酸（2.0 ｍＬ）を加え、遮光、乾燥空気下にて２時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を冷メタノール（100 ｍＬ）に滴下し、析出してきた沈殿を遠心分離にて回収した。得られた白色沈殿はクロロホルムに溶解させた後、飽和NaHCO3水溶液にて洗浄し、無水MgSO4にて脱水操作を行った。セライト(R)濾過によりMgSO4を除去した後、真空乾燥することにより、白色のアモルファス状粉末のアミノ化ポリL-乳酸a-PLLA（440 mg）を得た。
【０１２４】
【化３】
2014105161.tif 000005
【０１２５】
（直鎖型両親媒性ブロックポリマー（PSar64-PLLA30）の合成）
サルコシン−ＮＣＡ（Sar-NCA）と上記アミノ化ポリＬ−乳酸（a-PLLA）とから、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar64-PLLA30）を合成した。
【０１２６】
【化４】
2014105161.tif 000006
【０１２７】
a-PLLA（383 mg, 0.17 mmol）とサルコシン−ＮＣＡ(Sar-NCA) (3.21 g, 27.9 mmol) に、Ａｒ雰囲気下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（140 ｍＬ）を加え、室温にて１２時間攪拌した。反応溶液を０℃に冷却した後、グリコール酸（72 mg, 0.95 mmol）、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HATU）（357 mg, 0.94 mmol）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（245 μＬ, 1.4 mmol）を加え、室温にて１８時間反応させた。
【０１２８】
ロータリーエバポレーターによりＤＭＦを減圧溜去した後、LH20カラムにて精製を行った。UV270 nmにてピークが検出されたフラクションを回収・濃縮した。得られた濃縮溶液を０℃にてジエチルエーテル中に滴下し、再沈澱することにより、目的物であるPSar64-PLLA30（1.7 g）を得た。
【０１２９】
［合成例２：分岐型両親媒性ブロックポリマー（P(Sar23)3-PLLA30）の合成（Ａ３Ｂ型）］
本合成例においては、１本のポリ乳酸（Ｌ−ポリ乳酸；ＰＬＬＡ）鎖に３本のポリサルコシン（ＰＳａｒ）鎖が結合した分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成した。なお、P(Sar23)3-PLLA30は、親水性ブロックにおけるポリサルコシン鎖は３本であり、各ポリサルコシン鎖のサルコシン単位数が２３であり、Ｌ−乳酸単位数が３０であることを示している。また、便宜上、このような分岐型のポリサルコシン（Ａ）３−ポリ乳酸（Ｂ）ブロックポリマーをＡ３Ｂ型と表記することがある。
【０１３０】
【化５】
2014105161.tif 000007
【０１３１】
概略として、まず、リンカー試薬の合成を行った。リンカー試薬は、PLLA重合の開始剤となるアミノ基１つと、サルコシン部位のＮＣＡ（N-carboxy anhydride）重合法のための開始剤となる水酸基３つとを有するトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）１から合成した。さらに、Tris１のアミノ基及び水酸基を必要に応じて脱保護することができるように、適切な保護基を付加した。具体的には、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（EEDQ）存在下、Ｎ‐tert‐ブトキシカルボニルグリシン（Boc-Gly-OH）を用い、Boc基を有する保護基でアミノ基が保護された化合物２を得て、さらに、ジクロロジシアノベンゾキノン（DDQ）及びジメチルアミノピリジン（DMAP）存在下、ベンジルオキシカルボニルサルコシン（Cbz-Sar-OH）を用い、Cbz基を有する保護基で水酸基が保護された化合物３をリンカー試薬として得た。HCl-Dioxaneを用いてリンカー試薬３のBoc基のみを選択的に脱保護することよりアミノ基含有化合物４を得た。
具体的な合成手順は以下の通りである。
【０１３２】
（化合物２）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 1.9 g（0.016 mol）のEtOH溶液（75 mL）にBoc-glycine 2.5 g（0.014 mol）とEEDQ 6.0 g（0.024 mol）とを加え、リフラックス（95℃）しながら4.5時間撹拌した。反応終了後、濾紙で沈殿物を取り除き、EtOHを減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製を行った（溶離液は、CHCl3/MeOH混合比（v/v）が1/0、40/1、及び10/1のものの順に用いた）。得られた生成物２の重量は3.2 g（0.012 mol）、収率82%であった。
【０１３３】
（化合物３）
化合物２（278 mg, 1.0 mmol）、Cbz-Sar-OH（804 mg, 3.6 mmol）、DCC（887 mg, 4.3mmol）、及びDMAP（26 mg, 0.21 mmol）の混合物に氷冷したジクロロメタンを10 mL加えた後、室温にて一晩撹拌した。反応終了後、酢酸エチルにて洗浄し、白色沈殿（ウレア）を除去した後、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った（溶離液は、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル混合比（v/v）が2/1、1/1、及び1/2のものの順に用いた）。これにより、目的とする化合物３（719 mg）を収率84%で得た。
【０１３４】
（化合物４）
氷冷した化合物３（710 mg）に4 mol/L HCl/Dioxane（7.0 mL）を加えて溶解させた後、室温で５分撹拌した。その後、反応溶液から溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った（溶離液は、CHCl3/MeOH混合比（v/v）が10/0のものを用いた）。得られた白色沈殿をクロロホルムに溶解させ、1N NaOH水溶液と分液操作をすることによって、末端アミノ基のHCl塩の脱塩操作を行った。引き続き、無水硫酸マグネシウムにて脱水し、セライト濾過によって硫酸マグネシウムを除去することで化合物４を得た。
【０１３５】
【化６】
2014105161.tif 000008
【０１３６】
次に、アミノ基含有化合物４を開始剤とし、ラクチド５を重合反応に供することによって、PLLA鎖の合成を行い、化合物６を得た。化合物６の残りの保護基であるCbz基を、HBr-AcOHで脱保護すると同時にPLLA末端の水酸基をアセチル基で保護した。化合物７における3つのアミノ基を開始剤として、サルコシン−ＮＣＡをＮ−カルボキシ無水物重合反応に供することによって、PS鎖の合成を行い、化合物８を得た。さらに、化合物８に、グリコール酸、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HATU）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を加えてカルボキシル基を導入し、分岐型両親媒性ブロックポリマー９を得た。なお、式中、重合数の表記を省略している。
具体的な合成手順は以下の通りである。
【０１３７】
（化合物６）
開始剤４（485 mg, 0.61 mmol）の溶解したDMF溶液（2 mL）に開始剤に対して15等量（1.32 g, 9.2 mmol）のL-lactide５とDMAP（75 mg, 0.61 mmol）とを加えた後、アルゴン雰囲気下中、55℃にて一晩（約15時間）撹拌した。減圧留去によって反応溶媒であるDMFをある程度除去、濃縮した後、冷MeOH中に滴下した。得られた白色沈殿を遠心分離することによって回収することで、化合物６を得た。
【０１３８】
（化合物７）
化合物６をジクロロメタン10 mLに溶解させ、反応溶液を0 ℃に冷却した後、25% HBr-AcOHを20 mL加えた。室温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧留去し、得られた白色沈殿についてNMR測定を行うことによって、Cbz基の脱保護が完了していることを確認した。
得られた白色沈殿をクロロホルムに溶解させ、1N NaOH水溶液と分液操作をすることによって、末端アミノ基のHBr塩の脱塩操作を行った。引き続き、無水硫酸マグネシウムにて脱水し、セライト濾過によって硫酸マグネシウムを除去することで化合物７を得た。
【０１３９】
（化合物８及び９）
化合物７をマクロイニシエーターとして親水性部位の重合反応を行った。化合物７のDMF溶液に、開始剤に対して40又は60当量のSar-NCAを加えた後、Sar-NCA濃度が0.50 Mとなるように調整した。室温にて24時間撹拌し化合物８を得た後、グリコール酸とHATU及びDIEAとをそれぞれ加え、更に24時間撹拌した。反応終了後、サイズ排除クロマトグラフィー（Sephadex LH20, 溶離液：DMF）を用いて濃縮した反応溶液を精製し、目的の両親媒性ブロックポリマー９を得た。
【０１４０】
［合成例３：ポリエチレングリコール−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PEG-PLLA）の合成］
本合成例においては、比較用として、ポリサルコシン鎖の代わりにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を用いた直鎖型のポリエチレングリコール−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PEG114-PLLA30）を合成した。
【０１４１】
a-PLA（0.47 g、206 μmol)を溶解したDMF溶液中に、SUNBRIGHT ME-050AS（日油）を1.1モル当量加え、アルゴンガス雰囲気下、３０℃にて一晩撹拌した。反応終了後、得られた溶液を約5.0 mLまで濃縮し、ゲル濾過カラム（Sephadex LH-20、DMF溶出）にて精製を行なった。フラクションは、波長270 nmの吸光度を測定し、目的ポリマーを検出した。それぞれの回収溶液を濃縮し、氷冷したジエチルエーテルに滴下し、析出した白色沈殿を遠心分離によって回収した。収率は48％（0.71 g）であった。
【０１４２】
【化７】
2014105161.tif 000009
【０１４３】
［実施例１：ＡＢ型ラクトソームナノ粒子形成及び金属イオンの導入］
以下のようにして、両親媒性ブロックポリマーからのナノ粒子形成を行い、金属イオンの配位量について、以下の方法により評価した。
【０１４４】
合成例１で得られた両親媒性ブロックポリマーPLLA30-PSar64 （ＡＢ型）９ｍｇを試験管（１５ｍｍ×１００ｍｍ）にとり、クロロホルム１ｍＬで溶解させた。その後、エバポレータを用いて減圧留去し、続いて凍結乾燥器を用いて一晩乾燥させ、両親媒性ブロックポリマーの薄膜を試験管内面に作製した。その試験管に酢酸アンモニウム水溶液（１００ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ, １５０ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＨ６）（１ｍＬ）を添加し、バス型ソニケータを用いて超音波照射（８５℃、２分間）し、無色透明の分散液（ＡＢ型ラクトソーム粒子の分散液）を得た。
【０１４５】
以下において、金属塩化物として、Ｋ，Ｍｇ，Ｃａ，Ａｌ，Ｙ，Ｇｄ，及びＩｎの各塩化物を用いた。
【０１４６】
上記ＡＢ型ラクトソーム分散液０．５ｍＬに各金属塩化物水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を３２μＬ添加し、室温（２５℃）又は９５℃にて３０分間インキュベート処理した。その後、生理食塩水（２５ｍＬ）で置換したＰＤ−１０パックドカラム（担体：Sephadex G-25,１４．５ｍｍ×５０ｍｍ）を用いて、上記の混合液を生理食塩水にて精製および分取した。０．５ｍＬずつエッペンドルフチューブに分取し、５−９本目に溶出するラクトソーム分画を回収した。
【０１４７】
分取した各フラクション（０．５ｍＬ）に生理食塩水（１ｍＬ）を添加して測定に用いた。検量線を各金属塩化物水溶液について１０ｍｇ／Ｌ，１ｍｇ／Ｌ，０ｍｇ／Ｌの標準液を用いて作成し、各フラクションについてＩＣＰ発光分析をＳＩＩ製ＩＣＰ発光分析装置 SPS3500を用いて行った。インジウムイオン含有量についての測定結果を図１（ａ）に示す。５−９本目のラクトソーム分画の合計の金属イオン含有量（添加量を１００％とした割合）を表１に示す。
【０１４８】
【表１】
2014105161.tif 000010
【０１４９】
表１より、インジウムイオンの場合、添加量の７８％がラクトソーム分画に存在していることが明らかになった。この結果から、インジウムイオンがラクトソームに配位しやすいことがわかる。また、室温でのインキュベート処理の場合には、インジウムの場合でも配位量は９％程度であった。このことから、インキュベート処理は加熱条件下で行うことが好ましい。
【０１５０】
［実施例２：Ａ３Ｂ型ラクトソームナノ粒子形成及び金属イオンの導入］
合成例１で得られた両親媒性ブロックポリマーPLLA30-PSar64 （ＡＢ型）９ｍｇの代わりに、合成例２で得られた両親媒性ブロックポリマー（P(Sar23)3-PLLA30）（Ａ３Ｂ型）９ｍｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、フィルム法により無色透明の分散液（Ａ３Ｂ型ラクトソーム粒子の分散液）を得た。
【０１５１】
上記Ａ３Ｂ型ラクトソーム分散液０．５ｍＬにインジウム塩化物水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を３２μＬ添加し、９５℃にて３０分間インキュベート処理した。実施例１と同様にして、ＩＣＰ発光分析を行い、Ａ３Ｂ型ラクトソームのインジウムイオン含有量（添加量を１００％とした割合）を求めたところ、インジウムイオン含有量は７２％であった。
【０１５２】
［比較例１：ナノ粒子形成及び金属イオンの導入］
合成例１で得られた両親媒性ブロックポリマーPLLA30-PSar64 （ＡＢ型）９ｍｇの代わりに、合成例３で得られたポリエチレングリコール−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマーPEG114-PLLA30９ｍｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、フィルム法によりPEG114-PLLA30ナノ粒子の分散液を得た。
【０１５３】
上記PEG114-PLLA30ナノ粒子分散液０．５ｍＬにインジウム塩化物水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を３２μＬ添加し、９５℃にて３０分間インキュベート処理した。実施例１と同様にして、ＩＣＰ発光分析を行い、PEG114-PLLA30ナノ粒子のインジウムイオン含有量（添加量を１００％とした割合）を求めたところ、インジウムイオン含有量は１％に満たなかった。このことから、PEG114-PLLA30ナノ粒子において、外層のＰＥＧ鎖にはインジウムイオンを配位ないしは保持できる能力はないことが明らかとなった。すなわち、本発明の金属イオン含有ラクトソームナノ粒子において、外層のポリサルコシン鎖に金属イオンが配位ないしは保持されていることが強く示唆された。
【０１５４】
図１は、各ナノ粒子のインジウム配位量についての測定結果を示すグラフである。図１（ａ）は、実施例１のＡＢ型ラクトソーム(AB Type Lactosome)ナノ粒子についての結果であり、図１（ｂ）は、実施例２のＡ３Ｂ型ラクトソーム(A3B Type Lactosome)ナノ粒子についての結果であり、図１（ｃ）は、比較例１のＰＥＧ−ＰＬＬＡナノ粒子についての結果である。横軸は上記カラム精製におけるラクトソームの分画番号(Fraction Number)であり、左縦軸はインジウム配位量(Mount of Indium)（μｇ）であり、右縦軸は２２０ｎｍの吸光度(Absorbance Intensity)である。各グラフにおいて、実線はインジウム配位量（左縦軸）を表し、破線は２２０ｎｍの吸光度（右縦軸）を表す。図１（ａ）及び（ｂ）から、ＡＢ型ラクトソームナノ粒子及びＡ３Ｂ型ラクトソームナノ粒子が含まれている５−９本目のラクトソーム分画に、インジウムも含まれていることが示された。一方、図１（ｃ）から、ＰＥＧ−ＰＬＬＡナノ粒子については、５−９本目の分画にＰＥＧ−ＰＬＬＡナノ粒子が多く含まれているが、インジウムはほとんど含まれていないことが示された。
【０１５５】
図２は、各ナノ粒子のインジウム配位量についての測定結果を示すグラフである。縦軸はインジウム配位量(Recovery Rate)（％）であり、ラクトソーム分画から回収されたインジウム配位量のインジウム添加量に対する割合を示している。実施例１のＡＢ型ラクトソームナノ粒子、及び実施例２のＡ３Ｂ型ラクトソームナノ粒子では、高いインジウム配位量（７８％、７２％）が得られた。一方、ＰＥＧ−ＰＬＬＡナノ粒子については、粒子分画を回収しても、高々１％であった。
【０１５６】
［実施例３：粒子径］
ＡＢ型ラクトソーム及びＡ３Ｂ型ラクトソームそれぞれについて、インジウム配位による粒子径の変化を調べた。得られた各ラクトソーム粒子の粒子径は、動的光散乱測定装置(Malvern Instruments社製Zetasizer Nano)を用いて、動的散乱法（ＤＬＳ）によって測定した。
【０１５７】
実施例１で作製されたPLLA30-PSar64 からなるＡＢ型ラクトソーム粒子については、インジウムを配位させる前の粒子径は３５．９ｎｍであり、インジウムを配位させた後の粒子径は３９．７ｎｍであり、粒子径はインジウムの配位により少しだけ大きくなったが、大きな変化は見られなかった。図３は、実施例１で作製されたＡＢ型ラクトソーム粒子について、インジウム配位前及び後のＤＬＳ粒子径分布を示すグラフである。横軸は粒子径（ｎｍ）であり、縦軸は散乱強度（％）である。実線はインジウム配位前の粒子径分布を表し、破線はインジウム配位後の粒子径分布を表す。
【０１５８】
実施例２で作製されたP(Sar23)3-PLLA30からなるＡ３Ｂ型ラクトソーム粒子については、インジウムを配位させる前の粒子径は２０．９ｎｍであり、インジウムを配位させた後の粒子径は２２．８ｎｍであり、粒子径はインジウムの配位により少しだけ大きくなったが、大きな変化は見られなかった。図４は、実施例２で作製されたＡ３Ｂ型ラクトソーム粒子について、インジウム配位前及び後のＤＬＳ粒子径分布を示すグラフである。横軸は粒子径（ｎｍ）であり、縦軸は散乱強度（％）である。実線はインジウム配位前の粒子径分布を表し、破線はインジウム配位後の粒子径分布を表す。
【０１５９】
［実施例４：インジウム飽和配位量］
この実施例では、両親媒性ブロックポリマーへのインジウム飽和配位量について検討した。
【０１６０】
添加するインジウムイオン量を１０倍量とした以外は、実施例１と同様の実験を行った。すなわち、上記ＡＢ型ラクトソーム分散液０．５ｍＬにインジウム塩化物水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を３２０μＬ添加し、９５℃にて３０分間インキュベート処理した。その後、生理食塩水（２５ｍＬ）で置換したＰＤ−１０パックドカラム（担体：Sephadex G-25,１４．５ｍｍ×５０ｍｍ）を用いて、上記の混合液を生理食塩水にて精製および分取した。０．５ｍＬずつエッペンドルフチューブに分取し、５−９本目に溶出するラクトソーム分画を回収した。ＩＣＰ発光分析を行い、ラクトソーム分画のインジウムイオン含有量を求めたところ、ＡＢ型両親媒性ブロックポリマー４．５ｍｇ当たりに換算して、３８．８μｇ／４．５ｍｇ（０．８６ｗｔ％）であった。図５（ａ）に、ラクトソーム各分画のインジウム配位量（実線）を示す。
【０１６１】
同様に、添加するインジウムイオン量を１０倍量とした以外は、実施例２と同様の実験を行った。ＩＣＰ発光分析を行い、ラクトソーム分画のインジウムイオン含有量を求めたところ、Ａ３Ｂ型両親媒性ブロックポリマー４．５ｍｇ当たりに換算して、５４．３μｇ／４．５ｍｇ（１．２ｗｔ％）であった。図５（ｂ）に、ラクトソーム各分画のインジウム配位量（実線）を示す。
【０１６２】
以上から、ＡＢ型ラクトソーム及びＡ３Ｂ型ラクトソームのいずれにおいても、両親媒性ブロックポリマーに対して１ｗｔ％程度のインジウムイオンが配位し、Ａ３Ｂ型ラクトソームの方が多い配位インジウムイオン量を示した。分岐構造により複数のポリサルコシン鎖が近接し、近接するポリサルコシン鎖同士のカルボニル基の協同により、インジウムイオンの配位能が高くなったと考えられる。また、１ｗｔ％程度のインジウムイオン量は、ラクトソームを形成しているポリマー分子数から計算すると、ほぼ両親媒性ブロックポリマー１分子にインジウムが１原子配位していることになる。この値が、インジウム飽和配位量の目安である。
【０１６３】
［実施例５：インジウム配位の安定性］
この実施例では、両親媒性ブロックポリマーへのインジウム配位の安定性について検討した。
【０１６４】
上記実施例４における各ラクトソーム分画について、４０℃、１２時間の安定性試験を行った。その後、再度前記ＰＤ−１０パックドカラム処理を行い、各ラクトソーム分画のインジウムイオン含有量を求めた。ＡＢ型ラクトソームについては、安定性試験前を基準として、６５％のインジウムイオンが保持されていた。Ａ３Ｂ型ラクトソームについては、安定性試験前を基準として、ほぼ１００％のインジウムイオンが保持されていた。このように、インジウム配位の安定性についても、ＡＢ型ラクトソームに比べ、Ａ３Ｂ型ラクトソームの方が優れていることが示された。分岐構造により複数のポリサルコシン鎖が近接し、近接するポリサルコシン鎖同士のカルボニル基の協同により、インジウムイオンの配位安定性が高くなったと考えられる。
【０１６５】
図５は、実施例４及び５において、インジウム飽和配位量及び配位安定性についての測定結果を示すグラフである。図５（ａ）は、ＡＢ型ラクトソームナノ粒子についての結果であり、図５（ｂ）は、Ａ３Ｂ型ラクトソームナノ粒子についての結果である。横軸は上記カラム精製におけるラクトソームの分画番号(Fraction Number)であり、縦軸はインジウム配位量(Mount of Indium)（μｇ）である。各グラフにおいて、実線は安定性試験前のインジウム配位量（実施例４）を表し、破線は安定性試験後のインジウム配位量（実施例５）を表す。
【０１６６】
［実施例６：[111Ｉｎ]インジウム配位ラクトソームを用いたＳＰＥＣＴによる腫瘍イメージング］
実施例１におけるのと全く同様にして、合成例１で得られた両親媒性ブロックポリマーPLLA30-PSar64からなるＡＢ型ラクトソーム粒子の分散液を調製した。
【０１６７】
[111Ｉｎ]塩化インジウム（111ＩｎＣｌ3）水溶液（日本メジフィジックス株式会社）（８９ＭＢｑ）をバイアル瓶に取り、上記調製したラクトソーム分散液（１ｍＬ）を添加し、９５℃、３０分間処理した。処理後、生理食塩水（２５ｍＬ）で置換したＰＤ−１０パックドカラム（担体：Sephadex G-25,１４．５ｍｍ×５０ｍｍ）を用いて、生理食塩水にて精製および分取した。０．５ｍＬずつエッペンドルフチューブに分取し、５−９本目にインジウム111標識ラクトソームを回収した（２５．５ＭＢｑ）。さらに溶媒濃縮回収システムSoltra mini（テクノシグマ）を用いて、投与量である２００μＬにまで濃縮し、右大腿部に腫瘍細胞を移植したマウスに投与した。
【０１６８】
動物は、Balb/c nu/nu mice（クレア）８週齢を用い、ヒトすい臓がん細胞(Suit2)を、マウスの右下肢に５×１０5個／０．０２ｍＬ皮下移植した。２週間後にがん組織が３〜７ｍｍに成長した時点で、マウスを下記造影試験に供した。
【０１６９】
上記担がんマウスをイソフルランにより麻酔し、[111Ｉｎ]インジウム配位ＡＢ型ラクトソーム粒子９ｍｇ（１４．３ＭＢｑ）を投与し、経時的にＳＰＥＣＴ／ＣＴ観察を行った。ＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置は、ＧＭＩ社製ＦＸ３０００を用いた。
【０１７０】
投与後、１時間から２４時間までの測定結果として得られた画像を図６に示す。上段の画像は腫瘍部位のアキシャル(axial)像、下段の画像はコロナル(coronal)像である。これより、投与後３時間から[111Ｉｎ]インジウム配位ＡＢ型ラクトソーム粒子の腫瘍への集積が確認され、９時間後に最も集積していたことがわかる。
【図１】
2014105161.tif 000011
【図３】
2014105161.tif 000012
【図４】
2014105161.tif 000013
【図５】
2014105161.tif 000014
【図２】
2014105161.tif 000015
【図６】
2014105161.tif 000016