(57)【要約】【課題】細胞培養系においてマスト細胞から成熟マスト細胞の作製方法を提供する。さらに本発明は、当該作製方法によって作製された成熟マスト細胞を提供する。【解決手段】成熟マスト細胞は、Wntでマスト細胞を刺激することで作製することができる。マスト細胞をWntを含む培地で培養することで成熟マスト細胞を作製することができる。より具体的には、5〜100 ng/ml、好ましくは20〜50 ng/mlのWntを含む培地に対して、1×105〜5×105 cells/mlの細胞を培養容器にて培養することにより達成される。マスト細胞は、37℃において少なくとも15日間培養することができる。培養の過程において、培地は適宜交換することができる。また成熟マスト細胞は、ヒト多能性幹細胞由来のマスト細胞を、線維芽細胞と共培養することにで作製することができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マスト細胞をWntで刺激することを特徴とする成熟マスト細胞の作製方法。
【請求項２】
マスト細胞が、人工多能性幹細胞、採取された胚性幹細胞及び造血幹細胞から選択されるいずれかの細胞由来のマスト細胞である、請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
マスト細胞をWntで刺激することが、1×105〜5×105 cells/mlのマスト細胞を、Wntが5〜100 ng/ml含まれる培地中で培養することによる、請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項４】
培地に、更に幹細胞増殖因子及び／又はインターロイキン３を含む、請求項３に記載の作製方法。
【請求項５】
WntがWnt5aである、請求項１〜４のいずれか１に記載の作製方法。
【請求項６】
ヒト多能性幹細胞由来のマスト細胞を、線維芽細胞と共培養することを特徴とする、成熟マスト細胞の作製方法。
【請求項７】
線維芽細胞が、Swiss  3T3線維芽細胞、間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞、マウスプライマリー皮膚線維芽細胞（MDF）から選択される、請求項６に記載の作製方法。
【請求項８】
ヒト多能性幹細胞由来のマスト細胞と線維芽細胞の共培養が、幹細胞増殖因子（SCF）およびインターロイキン６（IL-6）を添加した培地を用いて行われる、請求項６または７に記載の作製方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１に記載の方法で作製されたマスト細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マスト細胞からの成熟マスト細胞の作製方法に関する。さらには、前記作製方法により作製された成熟マスト細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
マスト細胞（mast cell）は、別名肥満細胞や顆粒細胞とも呼ばれ、哺乳類の粘膜下組織や結合組織などに存在する。マスト細胞は細胞内に顆粒を有し、顆粒は高度に硫酸化されたヘパリンの存在により、塩基性色素で強く染色される。生体内で形成されるマスト細胞は、他の血液細胞と同様に骨髄造血幹細胞由来である。また、好塩基性顆粒をもち血中に存在する好塩基球とは異なり、マスト細胞は末梢血中には成熟細胞としては存在しない。前駆マスト細胞として循環血中を経由した後、浸潤した組織において最終的な分化（成熟化）を遂げ、機能を発揮する。
【０００３】
マスト細胞はIgEを介したI型アレルギー反応の主体である。マスト細胞の顆粒内にはヒスタミンをはじめとした各種化学伝達物質（ケミカルメディエーター）があり、細胞表面に結合したIgEに抗原が結合しその架橋が成立すると、それがトリガーとなって細胞膜酵素の活性化がうながされ、結果的に顆粒内容物である特異顆粒、すなわちヒスタミンなどが放出される（脱顆粒）。また、細胞膜酵素の活性化は、アラキドン酸の生成と代謝を亢進させ（アラキドン酸カスケード）、代謝物であるロイコトリエン、血小板活性化因子（PAF）、プロスタグランジン、トロンボキサンA2などを細胞膜から遊離する。こうしたマスト細胞から遊離されたケミカルメディエーターのうち、ヒスタミンやロイコトリエンC4などは気管支平滑筋収縮作用、血管透過性亢進作用、粘液分泌作用などを有し、アレルギーにおける即時型反応を引き起こす。一方、血小板活性化因子やロイコトリエンB4などは遊走因子として好酸球や好中球などの炎症細胞を反応局所に呼び寄せる。これはアレルギーの遅延型反応（アレルギー性炎症）を引き起こす。
【０００４】
骨髄由来マスト細胞（bone marrow-derived mast cell：BMMC）を線維芽細胞株と幹細胞増殖因子（stem cell factor：SCF） 存在下で共培養することにより、成熟マスト細胞である結合組織型マスト細胞（connective tissue type mast cell：CTMC）様の培養マスト細胞が得られることが報告されている（非特許文献１）。ここでは、フィーダー細胞であるSwiss 3T3線維芽細胞株をマイトマイシンCで処理することにより、BMMCからCTMC様細胞への分化を進展させうる共培養系を確立することに成功したことが報告されている。また、BMMCを線維芽細胞株とヒアルロン酸量が低下した条件下で共培養することにより、成熟マスト細胞が得られることが報告されている（特許文献１）。マウスiPS細胞由来マスト細胞をOP9骨髄ストローマ細胞株（正常なM-CSF遺伝子を欠損したop/opマウスに由来する骨髄ストローマ細胞株）と共に培養することで、CTMC様の培養マスト細胞を得ることができたことが報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
上記で説明したように成熟マスト細胞は浸潤した組織において最終的な分化・成熟化を遂げるため、成熟マスト細胞を回収するのは困難である。効果的に成熟マスト細胞を作製することで、未だ明らかにされていないマスト細胞の末梢組織での成熟化メカニズムなどの解明が期待される。そこで、より効果的に成熟マスト細胞を作製するための開発が望まれている。
【０００６】
Wntファミリーは分泌型の糖タンパク質で、細胞生命の調節や様々な発生、発癌などに関わっているといわれている。Wntシグナルは生物種を超えて保存されており、発生初期における体軸形成や器官形成、細胞の増殖や分化を制御している。Wntシグナル伝達経路には、１）β-カテニンの細胞内蓄積を介して転写因子を制御するβ-カテニン経路、２）低分子量Ｇタンパク質であるRhoファミリーを介して平面内細胞極性(planar cell polarity)を制御するPCP経路、３）３量体Ｇタンパク質を介して細胞内でCa2+の動員を引き起こし、プロテインキナーゼＣ (PKC; protein kunase C)やCaMK II (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II)などを活性化するCa2+経路の３種類が少なくとも存在することが公知である（蛋白質核酸酵素, Vol.49(10), 1421-1427 (2004)）。また、Wntシグナルネットワークとその異常による病態についても報告がある（生化学, Vol.81(9), 780-792 (2009)）。これらの文献には、Wntシグナル経路の多様性については示されているものの、Wntシグナル経路とマスト細胞分化との関係については、一切記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開WO2013/047428号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】FEBS Letters 582 (2008) 1444-1450
【非特許文献２】STEM CELLS AND DEVELOPMENT, Volume 22, Number 5, 2013, DOI: 10.1089/scd.2012.0339
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細胞培養系においてマスト細胞から成熟マスト細胞の作製方法を提供することを課題とする。さらには、当該作製方法によって作製された成熟マスト細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、骨髄由来マスト細胞をSwiss 3T3細胞株又はOP9細胞株と共に培養することで、結合組織型マスト細胞様の成熟マスト細胞を得ることができたことに着目し、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、マスト細胞の成熟化メカニズムにWntシグナルが関与していることを初めて見出し、本発明を完成した。また、ヒト多能性幹細胞由来のマスト細胞を、線維芽細胞と共培養することにより、成熟マスト細胞を得ることができたことに基づき、本発明を完成した。
【００１１】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．マスト細胞をWntで刺激することを特徴とする成熟マスト細胞の作製方法。
２．マスト細胞が、人工多能性幹細胞、採取された胚性幹細胞及び造血幹細胞から選択されるいずれかの細胞由来のマスト細胞である、前項１に記載の作製方法。
３．マスト細胞をWntで刺激することが、1×105〜5×105 cells/mlのマスト細胞を、Wntが5〜100 ng/ml含まれる培地中で培養することによる、前項１又は２に記載の作製方法。
４．培地に、更に幹細胞増殖因子及び／又はインターロイキン３を含む、前項３に記載の作製方法。
５．WntがWnt5aである、前項１〜４のいずれか１に記載の作製方法。
６．ヒト多能性幹細胞由来のマスト細胞を、線維芽細胞と共培養することを特徴とする、成熟マスト細胞の作製方法。
７．線維芽細胞が、Swiss  3T3線維芽細胞、間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞、マウスプライマリー皮膚線維芽細胞（MDF）から選択される、前項６に記載の作製方法。
８．ヒト多能性幹細胞由来のマスト細胞と線維芽細胞の共培養が、幹細胞増殖因子（SCF）およびインターロイキン６（IL-6）を添加した培地を用いて行われる、前項６または７に記載の作製方法。
９．前項１〜８のいずれか１に記載の方法で作製されたマスト細胞。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、成熟マスト細胞を作製することができる。本発明の方法で作製された成熟マスト細胞によれば、生体内のマスト細胞の機能の理解が一段と深まることが期待される。さらに、マスト細胞の機能に着目した医薬品の開発に関しても貢献しうるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】骨髄由来マスト細胞（BMMC）をSwiss 3T3細胞株又はOP9細胞株と共培養することによる成熟マスト細胞の作製方法及び得られた細胞の性状を示す図である。Swiss 3T3細胞株又はOP9細胞株とBMMCを共培養した場合に、サフラニンO染色による染色が認められ、プロテアーゼ活性が上昇したことを示す図である。（参考例３）
【図２】各種マスト細胞のWnt受容体を確認した結果を示す写真図である。（参考例４）
【図３】OP9細胞株及びSwiss 3T3細胞株に共通して発現する液性因子を確認した結果を示す図である。（参考例５）
【図４】Wnt経路の活性化とマスト細胞の成熟化との関係を確認した結果を示す図である。マスト細胞の成熟化は細胞表面マーカー（CD81）の発現、Tryptase活性及びカルボキシペプチダーゼ A（CPA）活性の測定、並びにヒスチジン脱炭酸酵素（HDC）、マスト細胞プロテアーゼ5（MCP5）、CPAの発現で確認した。（実施例１）
【図５】BMMCをWnt5aで刺激したときのマスト細胞の成熟化について確認した結果を示す図である。マスト細胞の成熟化はTryptase活性及びCPA活性の測定、並びにHDC、MCP5の発現で確認した。（実施例２）
【図６】人工多能性幹細胞からEB（embryoid body, EB） を介してマスト細胞を分化誘導する際に、Wnt5aを含む系で培養したときのマスト細胞の成熟化について確認した結果を示す図である。マスト細胞の成熟化は、Tryptase活性及びCPA活性の測定、並びにHDCの発現確認により行った。（実施例３）
【図７】BMMCについて、Swiss 3T3細胞株と共に抗Wnt5a抗体を含む系で培養したときのマスト細胞の成熟化について確認した結果を示す図である。BMMCの成熟化は、CD81の発現及びTryptase活性の測定により確認した。（実験例１）
【図８】ヒト多能性幹細胞から分化誘導したマスト細胞を、各種支持細胞と共培養したときのマスト細胞の成熟化について確認した結果を示す図である。マスト細胞の成熟化は、Tryptase、キマーゼ、およびHDCの発現確認により行った。（実施例４）
【図９】ヒト多能性幹細胞から分化誘導したマスト細胞を、Wnt5aで刺激したときのマスト細胞の成熟化について確認した結果を示す図である。マスト細胞の成熟化は、HDCの発現確認により行った。（実施例５）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において「マスト細胞」とは、人工多能性幹細胞（iPS細胞: induced pluripotent stem cells）、採取された胚性幹細胞（ES細胞: embryonic stem cells）及び造血幹細胞から選択されるいずれの多能性幹細胞（PSC: pluripotent stem cells）由来であってもよい。背景技術の欄でも示したように、生体内で形成されるマスト細胞は骨髄造血幹細胞由来であるが、本発明の成熟マスト細胞の作製方法は、造血幹細胞の他、iPS細胞や採取されたES細胞由来のいずれのマスト細胞にも適用することができる。
【００１５】
iPS細胞とは、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより、受精卵、余剰胚やES細胞を利用せずに分化細胞の初期化を誘導し、ES細胞と同様な多能性や増殖能を有する誘導多能性幹細胞をいい、2006年にマウスの線維芽細胞から世界で初めて作られた。さらに、マウスiPS細胞の樹立に用いた４遺伝子のヒト相同遺伝子であるOCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYCを、ヒト由来線維芽細胞に導入してヒトiPS細胞の樹立に成功したことが報告されている(Cell 131: 861-872, 2007)。本発明で使用されるiPS細胞は、上記のような自体公知の方法により作製されたiPS細胞、又は今後開発される新たな方法により作製されるiPS細胞であってもよい。
【００１６】
ES細胞とは、一般的には胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊(inner cell mass)と呼ばれる細胞集塊をin vitro培養に移し、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。ES細胞は、M.J.Evans & M.H.Kaufman (Nature, 292, 154, 1981)に続いて、G.R.Martin (Natl.Acad.Sci.USA, 78, 7634, 1981)によりマウスで多分化能を有する細胞株として樹立された。ヒト由来ES細胞についても、既に多くの株が樹立されており、ES Cell International社、Wisconsin Alumni Research Foundation、National Stem Cell Bank (NSCB)等から入手することが可能である。ES細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもES細胞を作製することが可能である。また、異種動物の卵細胞、又は脱核した卵細胞を複数に分割した細胞小胞(cytoplasts, ooplastoids)に、所望の動物の細胞核を移植して胚盤胞期胚様の細胞構造体を作製し、それを基にES細胞を作製する方法もある。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこからES細胞を作製する試みや、ES細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有したES細胞を作る方法も報告されている。本発明で使用されるES細胞は、上記のような自体公知の方法、又は今後開発される新たな方法により作製されるES細胞であってもよい。
【００１７】
本明細書の「マスト細胞」は、高親和性IgE 受容体であるFcεRIとSCFの受容体であるc-kit をともに発現する細胞として定義することができる。例えば、BMMCや幹細胞増殖因子（SCF）、インターロイキン３（IL-3）を用いて多能性幹細胞から誘導したマスト細胞が挙げられる。生体内では、染色性や刺激応答性に基づき、例えば、皮膚や腹腔などに分布する結合組織型マスト細胞（connective tissue-type mast cell, CTMC）や、粘膜型マスト細胞（mucosal mast cell, MMC）などの細胞が挙げられる。CTMCの分化は主としてSCF のシグナルに依存し、MMC の誘導にはIL-3やIL-10が関与しているといわれている。例えば、マウス骨髄細胞の場合、IL-3存在下で長期間培養することにより、ほぼ均一なマスト細胞の集団を得ることができる。これはIL-3依存性骨髄由来培養マスト細胞（BMMC）と呼ばれ、BMMCはc-kit とFcεRI の両方を発現し、IgEを介した抗原抗体反応により、脱顆粒、アラキドン酸代謝物産生、サイトカイン産生といった応答を示す。しかしながら、BMMC は、プロテオグリカンの成熟度や、ヒスタミン含量、顆粒内のプロテアーゼ発現、カチオン性刺激に対する脱顆粒応答といった指標等から、未成熟なマスト細胞の性質を反映する系と位置づけられている（生化学, Vol.82(11), 1021-1031 (2010)）。本明細書においてマスト細胞として、このようなBMMCを使用することができる。
【００１８】
本明細書において、その他のマスト細胞として、例えばiPS細胞やES細胞から自体公知の方法により胚様細胞塊を作製し、さらにSCF、IL-3やインターロイキン６（IL-6）を作用させて作製することができる。
ヒトiPS細胞またはヒトES細胞からマスト細胞を作製する場合は、まず、ヒトiPS細胞またはヒトES細胞から血液前駆細胞を分化誘導し、その後血液前駆細胞からマスト細胞を分化誘導して作製することができる。ヒトiPS細胞またはヒトES細胞から血液前駆細胞を分化誘導する方法は、例えばフィーダー細胞（好ましくはC3H10T1/2細胞）を予め播種した培養皿に、ヒトiPS細胞またはヒトES細胞を播種し、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）含有培地中で15〜19日間培養する方法が例示される。またヒトiPSまたはヒトES細胞を、フィーダー細胞と、アクチビンA、骨形成因子（BMP）4、Rhoキナーゼ阻害剤（好ましくはY-27632）を含む培地中で1〜3日間培養し、その後BMP4、VEGFを含む培地中で1〜3日間培養し、BMP4、VEGF、TGF-β受容体阻害剤（好ましくはSB431542）を含む培地中で1〜3日間培養し、その後BMP4、VEGF、SCF、トロンボポエチン（TPO）を含む培地中で1〜4日間培養することにより、血液前駆細胞を分化誘導することができる。本明細書にて血液前駆細胞とは、細胞表面マーカーのCD34とCD43が陽性である細胞（CD34+CD43+細胞）を意味する。細胞表面マーカーは自体公知の手法により確認することができる。
次に、得られた血液前駆細胞をマスト細胞に分化誘導する。血液前駆細胞を、SCF、IL-6、IL-3を含む培地中にて12〜16日間培養し、その後SCF、IL-6を含む培地を添加して14〜30日間培養し、その後顕微鏡下でコロニーを採取し、当該コロニーをSCF、IL-6を含む培地中にて10〜20日間培養することによりマスト細胞を分化誘導することができる。
【００１９】
本発明においては、マスト細胞をWntで刺激することにより成熟マスト細胞を作製する。本明細書においてマスト細胞に作用して成熟マスト細胞に分化誘導しうるWntは、分化誘導可能なWntであればよく、Wntシグナル伝達経路についても、１）β-カテニン経路、２）PCP経路、３）Ca2+経路のいずれの経路を介するものであってもよい。本明細書において使用可能なWntとしては、Wnt5aが挙げられる。
【００２０】
本発明の成熟マスト細胞は、Wntでマスト細胞を刺激することで作製することができる。具体的には、上述したマスト細胞をWntを含む培地で培養することで成熟マスト細胞を作製することができる。より具体的には、マスト細胞の種類に応じて適宜調整可能であるが、5〜100 ng/ml、好ましくは20〜50 ng/mlのWntを含む培地に対して、1×105 cells/ml〜5×105 cells/mlの細胞を培養容器にて培養することにより達成される。マスト細胞の培養は、37℃において10〜30日間行なうことができる。培養の過程において、培地は適宜交換することができる。
【００２１】
また本発明においては、ヒト多能性幹細胞由来のマスト細胞を、線維芽細胞と共培養することにより、成熟マスト細胞を作製する。本発明において用いられる線維芽細胞は、ヒト、マウス、ラット、サル等のいかなる生物種であってもよい。例えば、Swiss  3T3線維芽細胞、間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞、マウスプライマリー皮膚線維芽細胞（MDF）などが挙げられ、好ましくはC3H10T1/2細胞、MDFを用いることができる。培養時のマスト細胞と、線維芽細胞の濃度は、当業者が適宜調節可能であるが、例えばマスト細胞は1×105〜5×105 cells/mlであり、線維芽細胞は0.5×105〜5×105 cells/mlである。ヒト多能性幹細胞由来のマスト細胞と線維芽細胞との細胞数の割合は、マスト細胞：線維芽細胞＝１：0.5〜１の範囲である。
【００２２】
上記、マスト細胞を培養する際に使用する培地は、自体公知の基本培地に抗生物質（例えば 100 IU/mlペニシリン、100 mg/mlストレプトマイシン）や血清又はアルブミン（例えば、牛胎児血清、ウシアルブミン、ヒトアルブミン等）を10〜20%程度添加したものを使用することができる。基本培地としては、RPMI164培地やDMEM培地を使用することができる。また、培地には、適宜SCFやIL-3、IL-6を加え、分化誘導を促進することができる。その他、L-グルタミン、NEAA、ヌクレオシド、β-メルカプトエタノールやその他の成分も必要に応じて適宜添加することができる。
Wntでマスト細胞を刺激して成熟マスト細胞を作製する場合は、基本培地にSCFとIL-6とを添加した培地を用いて共培養を行うことが好ましい。より具体的には、50〜100ng/mlのSCF、50〜100ng/mlのIL-6を含む培地を用いてマスト細胞を培養容器にて培養し、Wntでマスト細胞を刺激することが好適である。
マスト細胞と線維芽細胞とを共培養して成熟マスト細胞を作製する場合は、基本培地にSCFとIL-6を添加した培地を用いて共培養を行うことが好ましい。より具体的には、50〜100ng/mlのSCFと50〜100ng/mlのIL-6を含む培地に対して、マスト細胞と線維芽細胞を培養容器にて培養することが好適である。
【００２３】
上記により得られた培養細胞が成熟マスト細胞であるかは、FcεRIやc-kitの発現を確認するほか、プロテアーゼ活性（Tryptase活性、CPA活性）、Tryptaseやキマーゼ（Chymase）、CD81、HDCの発現、サフラニン染色陽性度等によって確認することができる。
【００２４】
本発明は上記方法により作製された「成熟マスト細胞」にも及ぶ。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の理解を深めるために本発明をなすに至った経緯を参考例に示し、具体的な発明の内容を実施例及び実験例を示して説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００２６】
（参考例１）マウス骨髄由来マスト細胞（BMMC）の作製
本参考例では、BMMCの作製について、説明する。
C57BL/6マウスから骨髄を採取し、10 ng/mlのIL-3を含むRPMI1640培地（100 IU/ml ペニシリン、100 mg /mlストレプトマイシン、10%牛胎児血清含有）に骨髄細胞が5×105 cells/mlとなるように培養容器に播種し、37℃で培養した。5日に1度培地を交換した。4週間培養後には99%以上の細胞がFcεRI陽性c-kit陽性のマスト細胞で占められるようになった。回収した細胞をBMMCとして以下の実施例で使用した 。
【００２７】
（参考例２）マウスiPS細胞由来マスト細胞（iPSMC）の作製
本参考例では、iPSMCの作製について、説明する。
マウスiPS細胞（細胞の種類; 38C2、京都大学、山中伸弥教授から供与）は、EB培地（DMEM培地、ペニシリン、ストレプトマイシン、15%牛胎児血清、2 mM L-グルタミン、NEAA（非必須アミノ酸、Invitrogen）、ヌクレオシド（Millipore）、100μM β-メルカプトエタノール）に1×103 cells/100μl/wellとなるように低接着細胞培養容器（Lipidure(R)コート96well プレート：Nunc）に播種した。2日後にEB培地を80μl/wellを添加し、5日後に培地交換を行い、7日目にEB（胚様体）を回収した。その後、分化用培地１（DMEM培地、ペニシリン、ストレプトマイシン、15%牛胎児血清、2 mM L-グルタミン、NEAA、ヌクレオシド、100μM β-メルカプトエタノール、30 ng/ml IL-6、30 ng/ml IL-3、100 ng/ml SCF）に懸濁後、ペトリ皿に播種した。さらに7日後、細胞を回収し、分化用培地２（DMEM培地、ペニシリン、ストレプトマイシン、15%牛胎児血清、2 mM L-グルタミン、NEAA、ヌクレオシド、100μM β-メルカプトエタノール、30 ng/ml IL-3、100 ng/ml SCF）に懸濁後、培養皿に播種し、7日間培養を行い、得られた細胞をiPSMCとして以下の実施例で使用した。
【００２８】
（参考例３）従来法によるマスト細胞の成熟化の確認
本参考例では、マスト細胞をSwiss 3T3細胞株又はOP9細胞株と共培養することによる成熟マスト細胞の作製について説明する。
参考例１で作製したBMMCについて、100 ng/mlのSCFを含むRPMI1640培地に5×105 cells/mlとなるように播種し、マイトマイシンCで処理したSwiss 3T3細胞株又はOP9細胞株と共に計16日間培養した。なお、4日に1度、新しく播種したSwiss 3T3細胞株又はOP9細胞株上に播種しなおした。成熟化は、サフラニンOによるプロテオグリカンの染色及びアルシアンブルーによるグリコサミノグリカンの染色、並びにプロテアーゼ活性（Tryptase活性、CPA活性）の測定により行った。Tryptaseは、マスト細胞顆粒内に豊富に含まれる中性セリンプロテアーゼで、アルギニン、リジン残基でタンパク質を切断する酵素であり、Tryptase活性は合成基質（S-2288、積水メディカル）を用いて測定した。また、CPAは基質の C-末端のペプチド結合を加水分解する酵素であり、CPA活性は合成基質（M-2245、Bachem）を用いて測定した。
【００２９】
上記の結果、培養後得られた細胞について、Swiss 3T3細胞株又はOP9細胞株で培養したBMMCはサフラニンOによる染色が認められプロテアーゼ活性も共培養しないBMMCに比べて高い活性が認められた。その結果、いずれの場合もマスト細胞の成熟化が観察された（図１参照）。
【００３０】
（参考例４）マスト細胞表面マーカーの確認
本参考例では、１．未熟マスト細胞（BMMC）、２．成熟マスト細胞（BMMC+SCF+IL-3）について、細胞表面マーカーを確認した。各マスト細胞は、以下の方法で作製した。
１．BMMC：参考例１で作製したものを用いた。
２．BMMC+SCF+IL-3：参考例１で作製したBMMC 5×105 cells/mlについて、100 ng/mlのSCF及び1 ng/mlのIL-3を含むRPMI1640培地で20日間培養し、浮遊細胞を回収した。
【００３１】
その結果、各種マスト細胞にはWnt受容体が発現していることが確認された（図２参照）。
【００３２】
（参考例５）液性因子の探索
参考例３において、マスト細胞であるBMMCをOP9細胞株又はSwiss 3T3細胞株と共培養したことで、BMMCが成熟マスト細胞の性質を示したことが確認されたことから、OP9細胞株及びSwiss 3T3細胞株が産生する液性因子を確認した（図３参照）。その結果、OP9細胞株及びSwiss 3T3細胞株に共通して発現される液性因子として、Wnt3、Wnt4、Wnt5a等の種々のWntの発現が確認された（図３参照）。
【００３３】
（実施例１）Wnt経路活性化によるマスト細胞の成熟化について
本実施例では、参考例５の結果に基づいて、Wnt経路の活性化がマスト細胞の成熟化に関与するのではないかと考えた。そこで、GSK3β阻害剤である6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）を用いたWntシグナルの活性化と、マスト細胞の成熟化について検討を行った。
【００３４】
BIOによって、GSK3β阻害と細胞質β-cateninの安定化を伴い、Wntシグナルの活性化が認められる。そこで、参考例１で作製したBMMCについて、BIO（0.5μM、1.0μM）を含む系と、コントロールとしてBIOの代わりにDMSOを含む系で培養したときのマスト細胞の成熟化について確認した。BMMC 5×105 cells/mlを、BIO又はDMSOの他、100 ng/mlのSCF及び 1 ng/mlのIL-3を含むRPMI1640培地で20日間培養し、5日に1度培地を交換した（図４Ａ参照）。成熟化はCD81の発現、プロテアーゼ活性の測定、及びHDC、MCP5、CPAの発現確認により行った。CD81はFACS分析により測定した。プロテアーゼ活性は参考例３と同手法により測定した。HDCは哺乳類の末梢におけるヒスタミンの合成に関与する蛋白である。MCP5及びCPAは、マスト細胞内に存在する酵素である。HDC、MCP5、CPAの発現は、RT-PCRの手法により確認した。
【００３５】
上記の結果、BIOを含む系で培養した場合に、コントロールに比べて細胞表面にCD81がやや強く発現していることが確認された（図４Ｂ参照）。また、Tryptase活性やCPA活性もBIOの濃度依存的に上昇していることが確認された（図４Ｃ参照）。さらに、HDC、MCP5、CPA mRNAの発現に関しても、BIOの濃度依存的に上昇していることが確認された（図４Ｄ参照）。このことから、Wntシグナルの活性化により、マスト細胞が成熟化することが示唆された。
【００３６】
（実施例２）Wnt5aによるマスト細胞の成熟化について
本実施例では、BMMCについて、Wnt5a（25 ng/ml）を含む系で培養したときのマスト細胞の成熟化について確認した。
【００３７】
参考例１で作製したBMMC 5×105 cells/mlを、Wnt5aの他、100ng/mlのSCF及び1 ng/mlのIL-3を含むRPMI1640培地で20日間培養した。5日に1度培地を交換した（図５Ａ参照）。成熟化は、CD81の発現、Tryptase活性及びCPA活性の測定、並びにHDCの発現確認により行った。Tryptase活性及びCPA活性は参考例３と同手法により測定した。CD81、HDC、MCP5の発現は、実施例１と同手法により確認した。
【００３８】
上記の結果、Wnt5aを含む系で培養した場合に、コントロールに比べて細胞表面にCD81がやや強く発現した（図５Ｂ参照）。また、プロテアーゼ活性も上昇し、さらに、HDC及びMCP5 mRNAの発現も有意に高い値を示した（図５Ｃ、Ｄ参照）。このことから、Wnt5aによるWntシグナルの活性化により、マスト細胞が成熟化することが確認された。
【００３９】
（実施例３）Wnt5aによるマスト細胞の成熟化について
参考例２で作製したiPS細胞由来マスト細胞について、Wnt5aを含む系で培養したときのマスト細胞の成熟化について確認した。EBを、100 ng/mlのSCF、30 ng/mlのIL-3及び、30 ng/mlのIL-6を含む分化用培地１で7日間培養したのち、100 ng/mlのSCF及び30 ng/mlのIL-3を含む分化用培地２で7日間培養した。さらに25 ng/mlのWnt5aの他、100 ng/mlのSCF及び30 ng/mlのIL-3を含む分化用培地２で14日間培養した（図６Ａ参照）。成熟化は、Tryptase活性及びCPA活性の測定、並びにHDCの発現確認により行った。Tryptase活性は参考例３と同手法により、CPA活性及びHDCの発現は実施例２と同手法により測定した。
【００４０】
上記の結果、Wnt5aを含む系で培養した場合に、コントロールに比べてTryptase活性及びCPA活性が上昇していることが確認された（図６Ｂ参照）。さらにHDCの発現も有意に高い値を示した（図６Ｃ参照）。このことから、Wnt5aによるWntシグナルの活性化により、マスト細胞が成熟化することが確認された。
【００４１】
（実験例１）Wnt5aによるマスト細胞の成熟化の確認試験
本実験例では、参考例１で作製したBMMCについて、Swiss 3T3細胞株と共に抗Wnt5a抗体を含む系で培養したときのマスト細胞の成熟化について確認した。5×105 cells/mlのBMMC、Swiss 3T3細胞株、及び1μg/mlの抗Wnt5a抗体の他、100 ng/mlのSCFを含むRPMI1640培地で16日間培養した（図７Ａ参照）。抗Wnt5a抗体に対するコントロールとしてnrIgG抗体を用いた。成熟化は、CD81の発現及びTryptase活性の測定により行った。測定は、前述の参考例及び実施例と同手法により行った。
【００４２】
上記の結果、抗Wnt5a抗体を含む系で培養した場合に、コントロールに比べて細胞表面にCD81の発現がやや抑制されたことが確認され、Tryptase活性も抑制していることが確認された（図７Ｂ，Ｃ参照）。このことからも、Wnt5aによるWntシグナルの活性化により、マスト細胞が成熟化することが確認された。
【００４３】
（参考例６）ヒトiPS細胞由来マスト細胞の作製
（１）ヒトiPS細胞から血液前駆細胞への分化誘導
分化誘導開始の前日に50 Gy放射線照射し増殖を止めたC3H10T1/2細胞株をゼラチンコートした10 cm培養皿に7 x 105個で播種し、フィーダー細胞として用いた。マウスiPS細胞（細胞の種類; 38C2、京都大学、山中伸弥教授から供与）は、5〜10×104個/10 cm 培養皿となるようにフィーダー細胞上に播種した。細胞の播き直しをは行わず、50 ng/ml vascular endothelial growth factor（VEGF）（Peprotech社）含有培地を9日目までは3日毎、9日目から15日目までは2日毎に交換することにより血液前駆細胞の誘導を行った（Takayama N, Nishikii H, Usui J, Tsukui H, Sawaguchi A, Hiroyama T, Eto K, Nakauchi H.  Blood. 2008 Jun 1;111(11):5298-306. doi: 10.1182/blood-2007-10-117622.）。セルソーターにてCD34+CD43+血液前駆細胞を分離した。
【００４４】
（２）ヒトiPS細胞由来血液前駆細胞からマスト細胞への分化誘導
上述の（１）にて得られたCD34+CD43+血液前駆細胞を、200 ng/ml SCF、50 ng/ml IL-6、5 ng/ml IL-3含有培地の懸濁後、MethoCult H4236メチルセルロース培地（Stem Cell）と混和し、low binding 24 well プレート（Nunc）に播種した。2週間後、200 ng/ml SCFおよび50 ng/ml IL-6含有IMDM（培地）とMethoCult H4236メチルセルロース培地を混和し重層した。その2週間後（Week 5）、200 ng/ml SCFおよび50 ng/ml IL-6含有IMDMをさらに重層した（Saito H, Kato A, Matsumoto K, Okayama Y.  Nat Protoc. 2006;1(4):2178-83.）。メチルセルロース中での培養6週間目に、顕微鏡下でコロニーをピックアップし、さらに100 ng/mL SCFおよび100 ng/mL IL-6含有培地にて２週間培養し、得られた細胞を、ヒトiPS細胞由来のマスト細胞として、以下の実施例で使用した。
【００４５】
（実施例４）線維芽細胞との共培養法によるマスト細胞の成熟化
参考例６の方法により得られた、ヒトiPS細胞由来のマスト細胞（1×105cells/ml）を100 ng/mL SCF、100 ng/mL IL-6存在下で、前日播種した種々の支持細胞（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）（1×105cells/ml）、Swiss 3T3線維芽細胞株（1×105cells/ml）、間葉系幹細胞株であるC3H10T1/2細胞（1×105cells/ml）、マウスプライマリー皮膚線維芽細胞（MDF）（1×105cells/ml））と7日間共培養した。その後、NucleoSpin RNA XS（TaKaRa）を用いてTotal RNAを抽出した。各Total RNAをRNase-free DNase I（New England Biolabs）で処理した後、Superscript VILO cDNA synthesis kit（Life Technologies）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。その後、cDNAをFast SYBR Green Master Mix（Life Technologies）にて増幅し定量した（StepOne Plus ; Life Technologies）。
【００４６】
本実施例では、生体内でマスト細胞が血管周囲に多く存在することからヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）、Swiss 3T3線維芽細胞株、間葉系幹細胞株であるC3H10T1/2細胞、マウスプライマリー皮膚線維芽細胞（MDF）との共培養を試みた。その結果、ヒトiPS細胞由来マスト細胞は、C3H10T1/2細胞株やMDFと共培養することによりキマーゼやHDCm RNA量の増加が観察された。よって、線維芽細胞と共培養することでヒトマスト細胞の成熟化も促進されることが示された（図８）。
【００４７】
（実施例５）Wnt5aを用いたマスト細胞の成熟化
参考例６の方法で得られた、ヒトiPS細胞由来のマスト細胞（1×105cells/ml）を100 ng/mL SCF、100 ng/mL IL-6、50 ng/mL Wnt5a存在下で2週間培養した。得られた細胞から、上述した方法によりcDNAを合成後、Fast SYBR Green Master Mixにて増幅し定量した。
【００４８】
本実施例では、ヒトiPS細胞由来マスト細胞の成熟化を、Wnt5aが促進するか否かについて検討を行った。ヒトiPS細胞由来マスト細胞にWnt5aを作用させた結果、HDC mRNA量の増加が観察された（図９）。よって、Wnt5aはマウスだけでなくヒトマスト細胞の成熟化にも有用な因子であることが示された。
【００４９】
（参考例７）ヒトiPS細胞から血液前駆細胞への分化誘導（EB形成法）
参考例６の（１）の代替法として、以下のEB形成法により、ヒトiPS細胞から血液前駆細胞への分化誘導を行った。
ヒトiPS細胞（細胞の種類; 201B7、京都大学、山中伸弥教授から供与）をAccutase（Millipore）により培養ディッシュから剥離し、10 μM Y27632（Wako）を含むEB形成培地［50 μg/ml アスコルビン酸（Sigma）と450 μM Monothioglycerol（Sigma）、付属のサプリメントを加えたmTeSR（Stem Cell）］中でピペッティングすることにより単細胞に解離した。その後、1×106個のiPS細胞と前日放射線処理した6×105個C3H10T1/2細胞を2 ng/ml ActivinA（R&D Systeme）、2 ng/ml bone morphogenic protein 4（BMP4）（R&D System）、10 μM Rho-associated coiled-coil forming kinase （ROCK）inhibitor （Y-27632 ; Wako）を含むEB形成培地に懸濁し、ペトリディッシュに播種した。2日後（Day 2）、2 ng/ml BMP4、5 ng/ml VEGFを含むEB分化培地［50 μg/ml アスコルビン酸（Sigma）と450 μM Monothioglycerol（Sigma社）、2 mM L-グルタミン（Life Technologies）、インスリントランスフェリン（Life Technologies）を加えたIMDM（Sigma）］に置き換えた。その2日後（Day 4）、2 ng/ml BMP4、5 ng/ml VEGF、10 μM SB431542（Wako）を含むEB分化培地で半分培地を交換し、更に2日培養した（SB431542の終濃度は5 μM）。分化誘導から6日目（Day 6）に、2 ng/ml BMP4、5 ng/ml VEGF、20 ng/ml stem cell factor （SCF; Pepotech）、20 ng/ml Thrombopoietin（TPO; Peprotech）を含むEB分化培地に培地を交換した。2日後（Day 8）に半分培地交換を行い、血液前駆細胞の誘導を行った。得られた血液前駆細胞は、参考例６（２）の方法等により、マスト細胞の分化誘導に用いることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上詳述したように本発明の方法で作製された成熟マスト細胞によれば、生体内のマスト細胞の機能の理解が一段と深まることが期待される。特にマスト細胞欠損マウス等のモデル動物に移入することで、局所のマスト細胞の機能を解析し、多様な免疫応答に対するマスト細胞による制御機構が明らかにされるものと期待される。さらに、マスト細胞の機能に着目した医薬品の開発に関しても貢献しうるものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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