(57)【要約】【課題】石油成分により汚染された土壌を短時間で効率良く浄化できる石油汚染土壌の浄化剤を提供する。【解決手段】本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ属のＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２３３）を含む。本発明の浄化剤は、更にＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属の担子菌に属するＳ１３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−４６１）や、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属のＤ７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７０３）を含むことが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ属のＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２３３）を含むことを特徴とする石油汚染土壌の浄化剤。
【請求項２】
更にＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属の担子菌に属するＳ１３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−４６１）を含むものである請求項１に記載の石油汚染土壌の浄化剤。
【請求項３】
更にＴｒａｍｅｔｅｓ属のＤ７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７０３）を含むものである請求項２に記載の石油汚染土壌の浄化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた石油汚染土壌の浄化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油成分による土壌汚染を安全且つ安価に処理する方法として、微生物による処理方法（バイオレメディエーション）の開発が検討されている。
【０００３】
例えば特許文献１および特許文献２には、石油汚染で特に問題となるＣ重油などの重質油に対して顕著な分解活性あるいは分解促進活性を有する新規な重質油分解性菌が開示されている。このうち特許文献１の実施例１には、新規菌株であるカウロバクターｓｐ．２Ｂ−２株と、公知の炭化水素分解微生物であるアルカニボラックス属に属する菌株との培養物０．１ｍＬを、ＮＳＷ基本培地にＣ重油５ｍｇ／ｍＬを添加した培地５ｍＬに植菌し、３０℃で１０日間振とう培養したとき、Ｃ重油を４４．７％分解できたことが記載されている。また、特許文献２の実施例１には、新規菌株であるハロモナスｓｐ．６Ｂ株と、公知の炭化水素分解微生物であるアルカニボラックス属に属する菌株との培養物０．１ｍＬを、ＮＳＷ基本培地にＣ重油５ｍｇ／ｍＬを添加した培地５ｍＬに植菌し、３０℃で１０日間振とう培養したとき、Ｃ重油を４４．０％分解できたことが記載されている。
【０００４】
また、本願出願人も、石油成分の分解能に極めて優れた微生物として、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ属の担子菌に属するＳ１３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−４６１）を特許文献３に開示している。特許文献３の実施例４では、高濃度のＣ重油汚染土壌（Ｃ重油濃度１５０００ｐｐｍ）を用いたときの分解効率を調べており、Ｓ１３３株にカポックパルプを添加した実験例１２では、Ｃ重油量（全石油炭化水素ＴＰＨの量）を、培養後３０日で約７６％、培養後６０日で約９３％まで効率よく分解できたことを開示している（表３）。更に上記実験例１２は、Ｃ重油を構成する各成分、すなわち、炭化水素（ａｋｌａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、芳香族化合物、窒素・硫黄・酸素を含む化合物（ＮＳＯ）、アスファルト（ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）についても約８３〜９６％もの高い分解率を有しており（表３〜表６）、分解が特に困難であったＮＳＯおよびアスファルトについても、培養後６０日で約８３％分解できたことを開示している（表６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−８３６５１号公報
【特許文献２】特開２０００−１３９４４６号公報
【特許文献３】特開２００９−１６６０２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように上記特許文献３に記載のＳ１３３株を用いれば、石油成分を高い分解率で分解することが可能であるが、更に一層高い分解能を有する微生物を含む、新規な石油汚染土壌の浄化剤の提供が望まれている。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、石油成分により汚染された土壌を短時間で効率良く浄化できる石油汚染土壌の浄化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決し得た本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ属のＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２３３）を含むところに要旨を有するものである。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、上記石油汚染土壌の浄化剤は、更にＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属の担子菌に属するＳ１３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−４６１）を含むものである。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態において、上記石油汚染土壌の浄化剤は、上記ＮＧ００７株と上記Ｓ１３３株に加え、更にＴｒａｍｅｔｅｓ属のＤ７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７０３）を含むものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、石油成分に汚染された土壌を、短時間で効率よく浄化することができる。本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、特に高濃度の石油成分に汚染された土壌や、石油成分のなかでも難分解性のアスファルトに汚染された土壌などを効率よく浄化することができるため、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を所定比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ）のアスファルト分解率（左軸）、各種酵素活性（右軸）の結果を示すグラフである（培地への栄養源の添加なし）。図１の上図は、培養後３０日の結果を示し、図１の下図は、培養後１５日の結果を、それぞれ、示す。
【図２】図２は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルト分解率（左軸）、各種酵素活性（右軸）の結果を示すグラフである（培養日数は３０日、培地への栄養源の添加なし）。
【図３】図３は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルト分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日）。図３の左図は栄養源添加なしの結果を、図３の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【図４】図４は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＡ重油分解率（左軸）、各種酵素活性（右軸）の結果を示すグラフである（培地への栄養源の添加なし）。図４の上図は培養日数３０日の結果を、図４の下図は培養日数１５日の結果を、それぞれ、示す。
【図５】図５は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＣ重油分解率（左軸）、各種酵素活性（右軸）の結果を示すグラフである（培地への栄養源の添加なし、培養日数１５日）。
【図６】図６は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＡ重油分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、一部について更に６０日、１２０日）。図６の左図は栄養源添加なしの結果を、図６の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【図７】図７は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＣ重油分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日）。図７の左図は栄養源添加なしの結果を、図７の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【図８】図８は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ）のＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ］の分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日）。
【図９】図９は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１５０００ｐｐｍ）のＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ］の分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日）。
【図１０】図１０は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（３００００ｐｐｍ）のＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ］の分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日）。
【図１１】図１１は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルト分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日）。図１１の左図は栄養源添加なしの結果を、図１１の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルトを構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、ＮＳＯ部、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）］の分解率を調べたグラフである。培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日であり、培地中に栄養源は添加しなかった。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルトを構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、ＮＳＯ部、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）］の分解率を調べたグラフである。培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日であり、培地中に栄養源を添加した。
【図１３】図１３は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＣ重油分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日）。図１３の左図は栄養源添加なしの結果を、図１３の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ）のＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日）。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１５０００ｐｐｍ）のＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日）。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（３００００ｐｐｍ）のＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日）。
【図１５】図１５は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＡ重油分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日）。図１５の上図は栄養源添加なしの結果を、図１５の下図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルトを構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率を調べたグラフである。培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日であり、培地中に栄養源は添加しなかった。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルトを構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率を調べたグラフである。培養日数は１５日、３０日、６０日、１２０日であり、培地中に栄養源を添加した。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＡ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加なしのときの結果を示すグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＡ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加ありのときの結果を示すグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加なしのときの結果を示すグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加ありのときの結果を示すグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルトを構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加なしのときの結果を示すグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルトを構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部］の分解率について、培地への栄養源添加ありのときの結果を示すグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。
【図２０】図２０は、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＡ重油分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。図２０の左図は栄養源添加なしの結果を、図２０の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【図２１】図２１は、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＣ重油分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。図２１の左図は栄養源添加なしの結果を、図２１の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【図２２】図２２は、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルト分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日、６０日）。図２２の左図は栄養源添加なしの結果を、図２２の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す（培養日数は１５日、３０日、６０日）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、石油成分分解能に優れた微生物として上記Ｓ１３３株を開示した後も、特に高濃度の石油成分に汚染された土壌や、石油成分のなかでも難分解性のアスファルトなどを、より一層効率よく浄化できる微生物について検討を重ねてきた。
【００１４】
その結果、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ属のＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２３３）を用いれば所期の目的が達成されることを見出した。更には、ＮＧ００７株と、前述したＳ１３３菌株との二種類を組合わせて用いれば、高濃度の石油成分に汚染された土壌の浄化効率が高まり、種々の石油成分を、より一層、効率的に浄化できることを見出し、本発明を完成した。更には、これらのＮＧ００７株とＳ１３３菌株と、新規に見出されたＤ７株（詳細は後述する。）との三種類を組合わせて用いれば、高濃度の石油成分汚染土壌の浄化効率が一層高まり、種々の石油成分を、更に一層、効率的に浄化できることを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
本明細書において石油成分とは、原油や石油に含まれ得るものであれば良く、原油由来のものや石油由来のものに限定されない。なお、一般的に精製前の石油を特に原油というが、本発明では石油と原油を特に区別しないものとする。また、上記石油成分には、原油を用いた石油製品（例えば、重油、ガソリン、灯油、軽油など）も含まれる。
【００１６】
（１）ＮＧ００７株を含む石油汚染土壌の浄化剤および浄化方法について
上述したとおり、本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ属のＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１２３３）を含むところに特徴がある。
【００１７】
ＮＧ００７株は、以下に詳述するように、本発明者らによって見出された新規菌株である。ＮＧ００７株については、上記菌株由来の粗酵素に強いアゾ染料分解能を有することを見出し、特願２０１２−０５３２６９（以下、先願と呼ぶ。）に、上記菌株を含むアゾ染料分解剤を開示している。しかしながら、上記先願の出願時において、ＮＧ００７株が高い石油成分分解能を有することまでは認識されていなかった。
【００１８】
ＮＧ００７株は、日本国愛媛県松山市内の枯れ木材より分離した新規な糸状菌であり、非白色腐朽菌である。ＮＧ００７株は、以下の特徴から、ペスタロツチア（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）属に分類された。
【００１９】
気生菌糸は、白色で各壁を有し、その表面は滑らかで、直径約１〜３μｍである。分生子柄は、褐色から暗黒色で気生菌糸上に直立して形成され、その表面は平滑で棍棒状をしている。分生胞子は、紡錘形または楕円形であり、分生胞子の構成細胞数５細胞（内、有色細胞３）であり、３本の付属糸を有する糸状菌である。付属糸を除いた大きさは、長さ：約１０〜２５μｍ、幅：５μｍ〜１０μｍであり、先端細胞の付属糸の大きさは約５μｍ〜１５μｍ、後部細胞の小柄の大きさは約２μｍ〜６μｍである。
【００２０】
ＮＧ００７株は、培地上で白色の菌糸として生育し、約２〜３週間後に褐色から暗黒色の分生胞子を形成する。ＮＧ００７株を下記の麦芽エキス寒天培地で培養した場合、培地にカテコール１，２−ジオキシゲナーゼ活性が見られた。
【００２１】
麦芽エキス寒天培地（１Ｌ）
麦芽抽出物      ２０ｇ
グルコース      ２０ｇ
ペプトン          １ｇ
寒天            ２０ｇ
滅菌水            １Ｌ
ｐＨ              ４．５
【００２２】
ＮＧ００７株は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、２０１２年２月１４日付で寄託され（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）、２０１２年３月２３日に受託された（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２３３）。
【００２３】
後記する実施例に示すように、ＮＧ００７株は、原油のなかでも難分解性物質であるアスファルト（原油蒸留残渣の一つであり、原油に類似した組成を有するもの）を、特許文献３に記載のＳ１３３株よりも、短時間で効率よく分解できることが分かった。よって、上記菌株を用いることにより、高濃度のアスファルト汚染土壌を浄化することができる。
【００２４】
このように本発明に係るＮＧ００７株は極めて優れた石油成分分解能を有することから、石油汚染土壌をスラリー化したり汚染土壌中の石油成分を抽出しなくても、石油汚染土壌へＮＧ００７株を添加してＮＧ００７株と石油汚染土壌を接触させるのみで石油成分を分解することができる。
【００２５】
しかも本発明によれば、上述した種々の石油成分を高濃度に含む汚染土壌を効率よく分解し、浄化することができる。本発明によって処理可能な石油汚染土壌の好ましい濃度は、おおむね、２０，０００〜５０，０００ｐｐｍ程度である。上記濃度は、例えば、ＮＧ００７株を、好ましくは後記する栄養源や界面活性剤などと併用して培養したり、当該菌株の培養期間を長くするなどして、更に高めることができる。
【００２６】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤には、ＮＧ００７株を含む全ての態様のものが包含される。具体的には、以下に詳述する通り、本発明の浄化剤はＮＧ００７株を含む液体培地であってもよいし、ＮＧ００７株を生育させた木屑などの菌床であってもよい。また、栄養源や界面活性剤などを含むものであってもよい。
【００２７】
また、本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、液体培地や菌床上などでＮＧ００７株を十分に生育させたものであってもよいし、或いは生育させたものを冷蔵保存したものであってもよい。
【００２８】
次に、上記ＮＧ００７株を含む浄化剤を用いて石油汚染土壌を浄化する方法について説明する。上記浄化方法は、常法に従い、ＮＧ００７株を石油汚染土壌と接触させれば良い。
【００２９】
具体的には、例えば、ＮＧ００７株を液体培地などで培養したＮＧ００７株の培養物を石油汚染土壌に散布するなどして接触させる方法が挙げられる。用いられる培地としては、例えば、前述した麦芽エキス寒天培地のほか、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地、馬鈴薯−デキストロース寒天（ＰＤＡ）培地などが挙げられる。石油汚染土壌に散布されるＮＧ００７株の液体培地は、ＮＧ００７株の至適ｐＨに合わせて４．０〜８．５程度に調整することが好ましい。また、上記液体培地は、上記ｐＨになるように、適宜、希釈することが推奨される。
【００３０】
或いは、ＮＧ００７株は糸状菌であるので、菌床となり得る植物残渣を用いて培養したＮＧ００７株の培養物を石油汚染土壌に散布してもよい。使用可能な植物残渣としては、例えば、木屑、おが屑、鋸屑、米糠、おから、酒粕、大豆粕、製紙用パルプ、スラッジなどが挙げられる。上記植物残渣には、前述した培地成分（例えば麦芽エキスなど）が含まれていても良い。
【００３１】
上述したＮＧ００７株の培養物を得るための培地または菌床には、ＮＧ００７株の栄養源や界面活性剤を添加することが好ましい。栄養源はＮＧ００７株の生育を活発化し、ひいては石油成分の分解能を活性化することができる。また、界面活性剤は、脂溶性が高く親水性の低い石油成分を固体状の土壌から脱離させてＮＧ００７株の生育環境に存在し易くし、分解を促進する作用を有する。
【００３２】
ＮＧ００７株の栄養源としては、例えば、グルコース等の炭素源；ポリペプトン等の窒素源；マグネシウム塩、又はマンガン塩等の微量元素塩、又はマンガン塩等の微量元素源；植物繊維の破砕物（パルプ）等の植物材料などが挙げられる。栄養源は、糸状菌の栄養源として市販されているものを用いても良く、例えば、昭和産業社製の「しいたけの里」などが挙げられる。
【００３３】
栄養源の添加量は、ＮＧ００７株の量などに応じて適宜調整すればよいが、一般的には栄養源の量は多いほどＮＧ００７株の生育は良好であり、石油成分の分解効率は向上する。その一方で、植物材料の天然素材を除く炭素源や窒素源などの栄養源が多過ぎると環境への悪影響が懸念される。以上を考慮して、培地の全質量に対して、おおむね、５〜３０質量％であることが好ましい。
【００３４】
使用する界面活性剤としては、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤など特に制限されないが、ＮＧ００７株への悪影響が少ないことから非イオン界面活性剤が好適である。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。より具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０を用いることができる。
【００３５】
界面活性剤は、ＮＧ００７株の生育環境に対する石油成分の分散性を向上させることができる他、炭素源となるなどＮＧ００７株の生育を促進する可能性もある。しかし、界面活性剤の量が多過ぎるとかえってＮＧ００７株の生育に悪影響を与え得る。そこで、界面活性剤の添加量は、培地の全重量に対して、おおむね、０．０５質量％以上、１．０質量％以下程度にすることが好ましく、０．１質量％以上、０．７５質量％以下程度にすることがより好ましい。
【００３６】
上記培地には、クエン酸等のｐＨ調整剤等を添加してもよい。上記培地の好ましいｐＨは、ＮＧ００７株の生育などの観点から、おおむね、４．０〜８．５である。
【００３７】
培養工程では、上記培地にＮＧ００７株を接種し、菌糸蔓延した状態まで培養する。ＮＧ００７株の培地への接種量や培養条件は、処理対象である汚染土壌の汚染状態（石油成分の種類や含有量など）に応じて、適宜適切に調整すればよい。例えば、好ましい培養温度は、おおむね、１５〜４０℃である。
【００３８】
処理対象である石油汚染土壌は、採掘した上で容器に挿入し、ＮＧ００７株や栄養源などを添加し、ＮＧ００７株が良好に生育できるように温度や湿度を調整してもよい。しかし、土壌汚染は広範囲に及ぶことが多く、処理すべき土壌を逐一採掘するとかえって処理効率が低下し得る。よって、石油汚染土壌にそのままＮＧ００７株を添加してもよい。なお、ＮＧ００７株は２５℃で十分に生育することから、日本国内であれば、ＮＧ００７株は温度調節せずとも常温で石油成分を分解できると考えられる。但し、湿度は比較的高く保つべきであるので、適時水などを散布することが好ましい。
【００３９】
本発明者らによる知見によれば、ＮＧ００７株による石油汚染土壌の処理中は、好ましくは、遮光した方が効率的である。よって、石油汚染土壌にＮＧ００７株を添加した後は、ブルーシート等で被覆するなどして照射光量を抑えることが好ましい。
【００４０】
（２）更にＳ１３３株を含む石油汚染土壌の浄化剤および浄化方法について
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、更にＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属の担子菌に属するＳ１３３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−４６１）を含むことが好ましい。Ｓ１３３株と、前述したＮＧ００７株とを組合わせて用いることにより、それぞれの菌株を単独で用いた場合に比べ、石油成分の分解能が格段に向上する（後記する実施例を参照）。
【００４１】
Ｓ１３３株は、本発明者らによって見出された新規菌株であり、その詳細は、特許文献３に詳述している。Ｓ１３３株も、優れた石油分解能を有しており、例えば、１５０００ｐｐｍもの高濃度のＣ重油で汚染された石油汚染土壌を約２ヶ月間の比較的短期間で効率よく分解することができる。また、Ｃ重油を構成する成分のなかでも特に分解が困難であったＮＳＯおよびアスファルトについても、効率よく分解することができる。
【００４２】
しかしながら、驚くべきことに、Ｓ１３３株を上記ＮＧ００７株と併用することにより、Ｓ１３３株による高い石油成分分解能が一層促進されることが分かった。詳細は後記する実施例に示しているが、例えば、より高濃度の３００００ｐｐｍのＣ重油で汚染された石油汚染土壌を約１ヶ月間の比較的短期間で、５８％まで、効率よく分解することができた。
【００４３】
Ｓ１３３株の培養方法などの詳細は、特許文献３に記載されているので、特許文献３を参照すれば良い。
【００４４】
ＮＧ００７株とＳ１３３株の混合比率［各菌を、それぞれの適切な培地で一定期間（７日間）培養した後、培養液全体をホモジナイズした菌糸懸濁液の混合比率］は、分解対象である石油成分の種類や濃度などによっても相違し得、適宜適切に定めれば良いが、体積比率（容量比）にて、おおむね、ＮＧ００７株：Ｓ１３３株＝１０〜９０：９０〜１０の範囲内であることが好ましく、ＮＧ００７株：Ｓ１３３株＝７５〜２５：２５〜７５の範囲内であることがより好ましい。
【００４５】
上記の混合物を含む浄化剤を用いて石油汚染土壌を浄化する方法については、前述したＮＧ００７株を含む浄化剤を用いて浄化する方法と同様に行なえば良い。ＮＧ００７株もＳ１３３株も、好ましく用いられる培地や菌床の種類、好ましく添加される栄養源や界面活性剤の種類などが重複するからである。具体的には、例えば、それぞれの適切な培地で所定期間培養したＮＧ００７株の培養液とＳ１３３株の培養液とを、上記の好ましい混合比率で混合したものを、前述した方法で、石油汚染土壌に添加すれば良い。或いは、いずれの菌株も、共に麦芽エキス寒天培地で好ましく培養されるため、それぞれの菌を、麦芽エキスなどを含む植物残渣で成育させた菌床を適切な割合で混合したもの［石油汚染土壌に対して、おおむね、５〜３０％程度（乾燥土壌に対する質量比率）］を石油汚染土壌に添加してもよい。このときの好ましい培養温度は、おおむね、１５〜４０℃である。
【００４６】
（３）上記ＮＧ００７株とＳ１３３株と、Ｄ７株とを含む石油汚染土壌の浄化剤および浄化方法について
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、上記（２）に、更にＴｒａｍｅｔｅｓ属のｈｉｒｓｕｔｕｓ菌に属するＤ７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７０３）を加えた合計三種類の菌株を含むことが好ましい。上述したＳ１３３株とＮＧ００７株に、更にＤ７株を組合わせて用いることにより、それぞれの菌株を単独で用いた場合、またはＳ１３３株とＮＧ００７株の二種類を用いた場合に比べ、石油成分の分解能が向上する（後記する実施例を参照）。
【００４７】
ここで、Ｄ７株は、本発明者らによって見出された新規菌株であり、その詳細は以下のとおりである。
【００４８】
Ｄ７株は、日本国愛媛県伊予市郊外の枯れ木材より分離した新規な担子菌であり、白色腐朽菌である。Ｄ７株は、以下の特徴から、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に分類された。
【００４９】
表面は灰白色の半円形の傘を持ち、その幅は２〜７ｃｍ、厚さ２〜５ｍｍで、多数重生する。胞子の色は白色で、その大きさは、長さ：５〜７μｍ、幅：２〜３μｍである。Ｄ７株は培地上で白色の菌糸として成育し、この菌糸にはクランプコネクションが見られる。
【００５０】
Ｄ７株を下記の麦芽エキス寒天培地で培養した場合、培地にマンガンペルオキシダーゼ活性、ラッカーゼ活性が見られた。
【００５１】
麦芽エキス寒天培地（１Ｌ）
麦芽抽出物      ２０ｇ
グルコース      ２０ｇ
ペプトン          １ｇ
寒天            ２０ｇ
滅菌水            １Ｌ
ｐＨ              ４．５
【００５２】
Ｄ７株は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、２０１３年９月６日付で寄託され（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１７０３、受領日２０１３年９月６日）、受託された（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７０３、受託日２０１３年９月６日）。
【００５３】
Ｄ７株は、石油汚染土壌の浄化剤として有用である。特に、Ｄ７株と、前述したＮＧ００７株とＳ１３３株とを組み合わせて用いることにより、ＮＧ００７株とＳ１３３株を併用したときに比べ、高濃度のアスファルト汚染土壌などを、より短時間で、一層効率よく分解できることが分かった。例えば後記する表９に示すように、上記三種類の混合物を用いることにより、３００００ｐｐｍの高濃度で汚染されたＡ重油、Ｃ重油、アスファルトの各石油汚染土壌を約１ヶ月間の比較的短期間で、８４％（Ａ重油）、８２％（Ｃ重油）、６９％（アスファルト）まで、効率よく分解することができた（いずれも栄養源添加ありの結果）。更に培養後約２ヶ月目には上記の各分解率は一層向上する傾向が見られ、９１％（Ａ重油）、８９％（Ｃ重油）、７６％（アスファルト）であった。
【００５４】
Ｄ７株は、前述したＳ１３３株と同様、石油汚染土壌に添加してＤ７株と石油汚染土壌を接触させるのみで、石油成分を分解することができる。上記Ｄ７株によって処理可能な石油汚染土壌の濃度は、Ｄ７株を、好ましくは後記する栄養源や界面活性剤などと併用したり、当該菌株式の培養期間を長くするなどして高めることができ、おおむね、２０，０００〜５０，０００ｐｐｍ程度の汚染土壌を処理することができる。
【００５５】
Ｄ７株と石油汚染土壌を接触させる方法は常法に従えばよい。例えば、Ｄ７株を液体培地で培養した場合には、その培養液を石油汚染土壌に散布すればよい。或いは、Ｄ７株は担子菌であるので、菌床となり得る植物残渣を用いて培養したＤ７株を石油汚染土壌に散布してもよい。
【００５６】
石油汚染土壌に散布すべきＤ７株の液体培地は、希釈してもよい。また、当該液体培地のｐＨは、Ｄ７株の至適ｐＨに合わせて４．５〜６程度に調整することが好ましい。
【００５７】
Ｄ７株を培養するために用いる植物残渣としては、木屑、おが屑、鋸屑、米糠、おから、油粕、大豆粕などを挙げることができる。
【００５８】
Ｄ７株を石油汚染土壌に添加する場合には、Ｄ７株の栄養源や界面活性剤も添加することが好ましい。栄養源はＤ７株の生育を活発化し、ひいては石油成分の分解能を活性化することができる。また、界面活性剤は、脂溶性が高く親水性の低い石油成分を固体状の土壌から脱離させてＤ７株の生育環境に存在し易くし、分解を促進する作用を有する。
【００５９】
Ｄ７株の栄養源としては、昭和産業社製の「しいたけの里」など担子菌の栄養源として市販されているものを用いてもよいし、グルコースなどの炭素源；ポリペプトンなどの窒素源；マグネシウム塩やマンガン塩などの微量元素源；クエン酸などのｐＨ調整剤などを適宜選択して用いてもよい。また、Ｓ１３３株の栄養源として、植物材料も好ましく用いられ、代表的には、植物繊維の破砕物（パルプ）が挙げられる。Ｄ７株は、白色腐朽菌に属するＴｒａｍｅｔｅｓ属の一種であり、植物などの木材中のリグニン分解能力を有しているからである。パルプの原料としては、白色腐朽菌が利用できるものであれば特に限定されないが、針葉樹や広葉樹などの木材、綿、麻、ケナフ、バガスなどが挙げられる。具体的には、例えば、カポックの木を用いたカポックパルプ、綿の実に付着する短毛（綿クズ）を用いたリンターパルプ、綿の紡績から出る繊維（綿ボロ）を利用したラグパルプ、麻を原料としたリネンパルプなどが代表的に例示される。また、古紙パルプ（再生紙）を利用しても良い。
【００６０】
栄養源の添加量は、Ｄ７株の量などに応じて適宜調整すればよいが、一般的には栄養源の量は多いほどＤ７株の生育は良好であり、石油成分の分解効率は向上する。その一方で、植物材料の天然素材を除く炭素源や窒素源などの栄養源が多過ぎると環境への悪影響が懸念される。以上を考慮して、添加する栄養源の量は、処理対象である石油汚染土壌に対して５〜３０質量％程度にすることが好ましい。
【００６１】
使用する界面活性剤としては、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤など特に制限されないが、Ｄ７株への悪影響が少ないことから非イオン界面活性剤が好適である。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。より具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０を用いることができる。
【００６２】
界面活性剤は、Ｄ７株の生育環境に対する石油成分の分散性を向上させることの他、炭素源となるなどＤ７株の生育を促進する可能性もある。しかし、界面活性剤の量が多過ぎるとかえってＤ７株の生育に悪影響を与え得る。そこで、界面活性剤の添加量は、処理すべき石油汚染土壌に対して０．０５質量％以上、１．０質量％以下程度にすることが好ましく、０．１質量％以上、０．７５質量％以下程度にすることがより好ましい。
【００６３】
処理対象である石油汚染土壌は、採掘した上で容器に挿入し、Ｄ７株や栄養源などを添加し、Ｄ７株が良好に生育できるように温度や湿度を調整してもよい。しかし、土壌汚染は広範囲に及ぶことが多く、処理すべき土壌を逐一採掘するとかえって処理効率が低下し得る。よって、石油汚染土壌にそのままＳ１３３株を添加してもよい。なお、Ｄ７株は２５℃で十分に生育することから、日本国内であれば、Ｄ７株は温度調節せずとも常温で石油成分を分解できると考えられる。但し、湿度は比較的高く保つべきであるので、適時水を散布するなどすべきである。
【００６４】
Ｄ７株の添加量は、汚染土壌の汚染状態などに応じて適宜調整すればよい。
【００６５】
本発明者らによる知見によれば、Ｄ７株による石油汚染土壌の処理中は、遮光した方が効率が良い。よって、石油汚染土壌にＤ７株を添加した後は、ブルーシート等で被覆するなどして照射光量を抑えることが好ましい。
【００６６】
本発明では、このＤ７株を、前述したＮＧ００７株とＳ１３３株と組み合わせて使用する。具体的には、これら三種類の菌株の混合比率［各菌を、それぞれの適切な培地で一定期間（７日間）培養した後、培養液全体をホモジナイズした菌糸懸濁液の混合比率］は、分解対象である石油成分の種類や濃度などによっても相違し得、適宜適切に定めれば良いが、体積比率（容量比）にて、おおむね、ＮＧ００７株：Ｓ１３３株：Ｄ７株＝１〜６：１〜３：１〜３の範囲内であることが好ましく、ＮＧ００７株：Ｓ１３３株：Ｄ７株＝１〜２：１〜２：１〜２の範囲内であることがより好ましい。
【００６７】
上記の混合物を含む浄化剤を用いて石油汚染土壌を浄化する方法については、前述したＮＧ００７株を含む浄化剤を用いて浄化する方法と同様に行なえば良い。ＮＧ００７株もＳ１３３株も、好ましく用いられる培地や菌床の種類、好ましく添加される栄養源や界面活性剤の種類などが重複するからである。具体的には、例えば、それぞれの適切な培地で所定期間培養したＮＧ００７株の培養液とＳ１３３株の培養液とＤ７株の培養液を、上記の好ましい混合比率で混合したものを、前述した方法で、石油汚染土壌に添加すれば良い。或いは、いずれの菌株も、共に麦芽エキス寒天培地で好ましく培養されるため、それぞれの菌を、麦芽エキスなどを含む植物残渣で成育させた菌床を適切な割合で混合したもの［石油汚染土壌に対して、おおむね、５〜３０％程度（乾燥土壌に対する質量比率）］を石油汚染土壌に添加してもよい。このときの好ましい培養温度は、おおむね、１５〜４０℃である。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００６９】
なお、以下における「％」は、特に断りのない限り、全て「質量％」である。
【００７０】
実施例１
本実施例では、ＮＧ００７株およびＳ１３３株を単独または併用して用い、アスファルトで汚染された土壌に対する浄化能を調べた。
【００７１】
まず、実験に用いたＮＧ００７株およびＳ１３３株は、以下のようにして単離した。
【００７２】
（１）ＮＧ００７株の単離
愛媛大学農学部構内およびその近縁から採取した８２種のキノコおよび腐朽木材を試料として用いた。キノコの場合は、約５ｍｍ角に切り、前述した麦芽エキス寒天培地に添加し、暗所にて２５℃で２週間培養した。また、腐朽木材の場合は、約１．２ｇ（乾燥重量で約１ｇ）を滅菌水（９ｍＬ）に懸濁し、攪拌した後に１０分間静置した後、各上澄液（１ｍＬ）を、前述した麦芽エキス寒天培地に添加し、暗所にて２５℃で２週間培養した。麦芽エキス寒天培地上に生育してきた７２種の菌をそれぞれ採取し、アスファルト１０００ｐｐｍを上層した麦芽エキス寒天培地（具体的には、麦芽エキス寒天培地の上に、ジクロロメタンに溶解したアスファルト１０００ｐｐｍを塗布した後、ジクロロメタンを蒸発させることにより、麦芽エキス寒天培地の上にアスファルトを載せたもの）にて２５℃で７日間培養した。これらのうち、生育速度の速い菌を１０種採取し、アスファルト１５０００ｐｐｍを上層した麦芽エキス寒天培地にて、更に２５℃で７日間培養することによって、特に生育が活発であった糸状菌であるＮＧ００７株を単離した。
【００７３】
得られたＮＧ００７株を顕微鏡により観察したところ、白色で各壁を有し、その表面は滑らかで、直径約１〜３μｍであった。分生子柄は、褐色から暗黒色で気生菌糸上に直立して形成され、その表面は平滑で棍棒状をしていた。分生胞子は、紡錘形または楕円形であり、分生胞子の構成細胞数５細胞（内、有色細胞３）であり、３本の付属糸を有する糸状菌であった。付属糸を除いた大きさは、長さ：約１０〜２５μｍ、幅：５μｍ〜１０μｍであり、先端細胞の付属糸の大きさは約５μｍ〜１５μｍ、後部細胞の小柄の大きさは約２μｍ〜６μｍであった。これらはＰｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ属菌の形態学的特徴であることから、ＮＧ００７株はＰｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ属菌と同定した。
【００７４】
（２）Ｓ１３３株の単離
蒸留水（１００ｍＬ）に麦芽（２０ｇ／Ｌ）、グルコース（２０ｇ／Ｌ）、ポリペプトン（１ｇ／Ｌ）および寒天（２０ｇ／Ｌ）を添加した。さらに、当該混合物（２０ｍｌ）に、雑細菌や酵母などの繁殖を抑制するためにクロラムフェニコール（６ｍｇ）またはベニミル（６ｍｇ）を加え、麦芽エキス寒天培地を調製した。別途、１％のＴｗｅｅｎ８０を含むジメチルホルムアミドの１％クリセン溶液を調製した。上記麦芽エキス寒天培地（２０ｍｌ）上に、上記クリセン溶液（１ｍｌ）を添加して均一になるように広げた。
【００７５】
愛媛大学農学部構内およびその近縁から採取した１２４種の土壌（乾燥重量で１ｇ）を滅菌水（９ｍＬ）に懸濁し、攪拌した後に１０分間静置した。次いで、各上澄液（１ｍＬ）を上記麦芽エキス寒天培地に添加し、暗所にて２５℃で２週間培養した。培地上に生育してきた８７種の菌をそれぞれ採取し、同様の麦芽エキス寒天培地にて２５℃で７日間培養した。生育速度の速い菌を７種採取し、同様の操作をもう一度繰り返すことによって、特にクリセン存在下における生育が活発であった担子菌であるＳ１３３株を単離した。
【００７６】
得られたＳ１３３株を顕微鏡により観察したところ、中央に窪みがある平らで白色のカサを有し、その表面には褐色の鱗片が存在するものであった。柄は中心生であり、胞子は白色で長楕円形であった。これらはＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌の形態学的特徴であることから（今関六也ら編、「日本のキノコ」山と渓谷社、第４５０〜４５１頁（１９８８年）；およびＴｏｍａｓ  Ｌａｅｓｓoｅ著，「ＤＯＲＬＩＧ  ＫＩＮＤＥＲＳＬＥＹ−ＨＡＮＤＢＯＯＫＳ−ＭＵＳＨＲＯＯＭＳ」，Ｄｏｒｌｉｎｇ Ｋｉｎｄｅｒｓｌｅｙ  Ｌｔｄ．，ＬＯＮＤＯＮ，２０４，ｐｐ．２０２〜２１０（１９９８年）を参照）、Ｓ１３３株はＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌と同定した。
【００７７】
（３）アスファルト石油汚染土壌の調製
本実施例では、原油蒸留残渣であるアスファルトに汚染された土壌を用い、土壌中のアスファルト濃度が、１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、および３００００ｐｐｍのものを用意した。
【００７８】
まず、愛媛大学農学部附属農場から採取した土壌を３ｍｍのメッシュで篩い分けし、１２０℃で２時間滅菌した。別途、下記組成のアスファルト（３ｇ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、３％のアスファルト溶液を調製した。上記滅菌土壌（乾燥重量で３０ｇ）に上記アスファルト溶液（１ｍＬ）を加え、土壌中のアスファルト濃度を１０００ｐｐｍに調整した。
（アスファルトの組成）
脂肪族炭化水素部（ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｆｒ．）（３２％）
芳香族炭化水素部（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｆｒ．）（４４％）
アスファルテン部（ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ  ｆｒ．）（１４％）
窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ部、ＮＳＯ  ｆｒ．）（１０％）
【００７９】
更に上記アスファルト溶液の添加量を調整することにより、土壌中のアスファルト濃度が１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍのものを用意した。
【００８０】
（４）アスファルト石油汚染土壌の浄化処理
ＮＧ００７株およびＳ１３３株の各菌株をそれぞれ、前述した麦芽エキス寒天培地にて、室温（２５℃）で７日間培養し、その培養液をホモジナイザーで５０００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズした菌糸懸濁液を用意した。このようにして得られた各菌株の菌糸懸濁液を、容量比にて、ＮＧ００７株：Ｓ１３３株＝０：１００、２５：７５、５０：５０、７５：２５、１００：０）となるように調整した。
【００８１】
（４−１）培地中への栄養源の添加なしの場合
上記のようにして得られた各容量比の培養物を、上記（３）で調製した石油汚染土壌に対して、１３．３％となるように加え、よく混合した後、暗所にて２５℃で培養した。
【００８２】
（４−２）培地中への栄養源の添加ありの場合
上記（３）で調製した石油汚染土壌に対して、栄養源として、グルコース、シイタケの里をそれぞれ１０％、１５％（乾燥土壌に対する質量比率）の比率で添加した。次いで、上記のようにして得られた各容量比の培養物を、石油汚染土壌に対して１３．３％（乾燥土壌に対する質量比率）となるように加え、よく混合した後、暗所にて２５℃で培養した。
【００８３】
（５）アスファルト分解率の測定
アスファルトの分解率（浄化率）を、Ｍｉｓｈｒａらの方法（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆ  ａｎ  Ｏｉｌｙ  Ｓｌｕｄｇｅ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｓａｎｊｅｅｔ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｊｅｅｖａｎ  Ｊｙｏｔ，Ｒａｍｅｓｈ  Ｃｈａｎｄｅｒ  Ｋｕｈａｄ，Ｂａｎｗａｒｉ，Ｌａｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，３２８−３３５（２００１））を参考にして測定した。
【００８４】
測定方法の概要は以下のとおりである。まず、培養開始から１５日間および３０日間経過後に土壌の一部を採取し、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した。それぞれの抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。一方、アスファルト汚染土壌（菌株の添加なし）の一部を採取し、上記と同様にして、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した各抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。
【００８５】
上記の抽出物にヘキサンを加え、ヘキサン可溶部と不溶部に分けた。このうちヘキサン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン、トルエン、クロロホルム：メタノール（１：１）で順次溶出し、各溶出部の重量を測定した。ヘキサン溶出部は脂肪族炭化水素部を、トルエン溶出部は芳香族炭化水素部を、クロロホルム：メタノール（１：１）溶出部はＮＳＯ部を、ヘキサン不溶部はアスファルテン部を、それぞれ、含んでいる。各溶出部の重量を測定し、石油汚染土壌の浄化処理前と浄化処理後の重量を比較することにより、脂肪族炭化水素部、芳香族炭化水素部、ＮＳＯ部、アスファルテン部の分解率（浄化率）をそれぞれ、算出した。本実施例では、このようにして得られた各成分の分解率の合計をＡ重油またはＣ重油の分解率とした。
【００８６】
（６）酵素活性の測定
本実施例では、参考のため、前述した先願と同様、下記（ア）〜（オ）の酵素（粗酵素）の酵素活性を測定した。先願に記載したように、これらの酵素は、アゾ染料分解作用に寄与していると考えられるが、本実施例でも、参考のため、各種酵素の酵素活性を測定した。
【００８７】
具体的には、上記（３）で調製した石油汚染土壌の一部（５ｇ）を採取し、蒸留水（３０ｍＬ）を加え、室温（２５℃）でホモジナイズ（５０００ｒｐｍ、１０分間）した後、その上澄み液を採取した。
【００８８】
このようにして得られた上澄み液中の各酵素の活性（Ｕ／ＬまたはＵ／ｌ）を、以下の方法で測定した。
【００８９】
（ア）マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）活性は、Ｂｒｏｗｎらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７２（６），ｐｐ．３１２５−３１３０（１９９０））により求めた（モル吸光度係数ε：４９６００ｍｏｌ-1ｃｍ-1）。
（イ）リグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）活性は、ＴｉｅｎとＫｉｒｋの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏ１．１６１，ｐｐ．２３８−２４９（１９８８））により求めた（モル吸光度係数ε：９３００ｍｏｌ-1ｃｍ-1）
（ウ）ラッカーゼ（Ｌａｃｃａｓｅ，Ｌａｃ）活性は、ＬｅｏｎｏＷｉｃｚとＧｒｚｙｗｎｏｕｉｃｚの方法（Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，ｐｐ，５５−５８（１９８１））により求めた（モル吸光度係数ε：６５００ｍｏｌ-1ｃｍ-1）
（エ）カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ（Ｃ１２０）活性は、ＮａｋａｚａｗａとＮａｋａｚａｗａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏ１．１７，ｐｐ，５１８１５２２（１９７０））により求めた（モル吸光度係数ε：１６０００ｍｏｌ-1ｃｍ-1）
（オ）カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ（Ｃ２３０）活性は、ＮａｋａｚａｗａとＮａｋａｚａｗａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ，５１８−５２２（１９７０））により求めた（モル吸光度係数ε：４４０００ｍｏｌ-1ｃｍ-1）。
【００９０】
これらの結果を図１〜図３に示す。
【００９１】
まず、図１を参照する。図１は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を図１に示す比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ）のアスファルト分解率（左軸）、各種酵素活性（右軸）の結果を示すグラフである（培地への栄養源の添加なし）。図１の上図は、培養後３０日の結果を示し、図１の下図は、培養後１５日の結果を、それぞれ、示す。
【００９２】
図１より、ＮＧ００７株とＳ１３３株を組合わせて用いることにより、それぞれを単独で用いた場合に比べ、アスファルトの浄化率が増加することが分かる。例えば培養後３０日（図１の上図）の浄化率を比較すると、ＮＧ００７株単独のアスファルト浄化率は６７％、Ｓ１３３菌単独のアスファルト浄化率は５９％であったのに対し、これらを１：１の比率で組合わせたときのアスファルト浄化率は、８９％まで増加した。
【００９３】
次に図２を参照する。図２は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルト分解率（左軸）、各種酵素活性（右軸）の結果を示すグラフである（培養日数は３０日、培地への栄養源の添加なし）。
【００９４】
図２より、アスファルト濃度が高濃度の汚染土壌であっても、１ヶ月の処理で、６８％（アスファルト濃度１５０００ｐｐｍ）、６３％（アスファルト濃度３００００ｐｐｍ）まで浄化できることが分かった。
【００９５】
次に図３を参照する。図３は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のアスファルト分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである（培養日数は１５日、３０日）。図３の左図は栄養源添加なしの結果を、図３の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【００９６】
図３より、共培養時に栄養源を添加することにより、アスファルトの浄化率が促進されることが分かる。
【００９７】
以上の実験結果より、本発明によれば、原油中の難分解性物質であるアスファルトを、短時間で効率よく浄化できることが分かった。
【００９８】
実施例２
本実施例では、ＮＧ００７株およびＳ１３３株を単独または併用して用いたときの、Ａ重油汚染土壌およびＣ重油汚染土壌に対する浄化能を調べた。重油は、動粘度によって１種（Ａ重油）、２種（Ｂ重油）、３種（Ｃ重油）に分類される。Ｃ重油は、軽油のほか９０％以上が残渣油であり、Ａ重油は、軽油９０％に少量の残渣油を混合したものである。
【００９９】
まず、愛媛大学農学部附属農場から採取した土壌を３ｍｍのメッシュで篩い分けし、１２０℃で２時間滅菌した。別途、下記組成のＡ重油またはＣ重油（３ｇ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、３％のＡ重油溶液またはＣ重油溶液を調製した。上記滅菌土壌（乾燥重量で３０ｇ）に上記の各重油溶液（１ｍＬ）を加え、土壌中の各重油濃度を１０００ｐｐｍに調整した。
（Ａ重油組成）
脂肪族炭化水素部（ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｆｒ．）（７５％）
芳香族炭化水素部（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｆｒ．）（９％）
アスファルテン部（ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ  ｆｒ．）（１３％）
ＮＳＯ部（  ＮＳＯ  ｆｒ．）（３％）
（Ｃ重油組成）
脂肪族炭化水素部（ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｆｒ．）（４４％）
芳香族炭化水素部（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｆｒ．）（３１％）
アスファルテン部  （ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ  ｆｒ．）（１７％）
ＮＳＯ部（ＮＳＯ  ｆｒ．）（８％）
【０１００】
更に上記の各重油溶液の添加量を調整することにより、土壌中の各重油濃度が１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍのものを用意した。
【０１０１】
次いで、前述した実施例１と同様にして、各汚染土壌を浄化処理し、前述したＭｉｓｈｒａらの方法を参考にして、Ａ重油の分解率およびＣ重油の分解率を測定した。
【０１０２】
具体的には、まず、培養開始から１５日間および３０日間経過後に土壌の一部を採取し、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した。それぞれの抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。一方、Ａ重油汚染土壌またはＣ重油汚染土壌（菌株の添加なし）の一部を採取し、上記と同様にして、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した各抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。得られた抽出物にヘキサンを加え、ヘキサン可溶部と不溶部に分けた後、ヘキサン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン、トルエン、クロロホルム：メタノール（１：１）で順次溶出した。各溶出部の重量を測定し、処理前後の重量を比較することにより、脂肪族炭化水素部、芳香族炭化水素部、ＮＳＯ部、アスファルテン部の各分解率を算出した。本実施例では、このようにして得られた各成分の分解率の合計をＡ重油またはＣ重油の分解率とした。
【０１０３】
これらの結果を図４〜図１０、並びに表１〜表５に示す。表１は、図４に対応するものであり、各酵素活性の結果を示している。表２は、図５に対応するものであり、各酵素活性の結果を示している。なお、表２には、更に処理開始後３０日目の結果も併記している。表３〜表５は、図７に対応するものであり、各酵素活性の結果を示している。このうち、表３はＣ重油汚染土壌１０００ｐｐｍのときの結果を、表４はＣ重油汚染土壌１５０００ｐｐｍのときの結果を、表５はＣ重油汚染土壌３００００ｐｐｍのときの結果を、それぞれ、示す。
【０１０４】
【表１】
2014088548.tif 000002
【０１０５】
【表２】
2014088548.tif 000003
【０１０６】
【表３】
2014088548.tif 000004
【０１０７】
【表４】
2014088548.tif 000005
【０１０８】
【表５】
2014088548.tif 000006
【０１０９】
まず、図４を参照する。図４は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＡ重油分解率（左軸）、各種酵素活性（右軸）の結果を示すグラフである（培地への栄養源の添加なし）。図４の上図は培養日数３０日の結果を、図４の下図は培養日数１５日の結果を、それぞれ、示す。図４中、ＨＯＡは、Ａ重油汚染土壌を意味する。
【０１１０】
その結果、Ａ重油濃度が高濃度の汚染土壌であっても、１５日の処理で、６７％（Ａ重油濃度１５０００ｐｐｍ）、４９％（Ａ重油濃度３００００ｐｐｍ）まで浄化できること；更に１ヶ月の処理では、７８％（Ａ重油濃度１５０００ｐｐｍ）、６８％（Ａ重油濃度３００００ｐｐｍ）まで浄化できることが分かった。
【０１１１】
次に、図５を参照する。図５は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＣ重油分解率（左軸）、各種酵素活性（右軸）の結果を示すグラフである（培地への栄養源の添加なし、培養日数１５日）。図５中、ＨＯＣは、Ｃ重油汚染土壌を意味する。
【０１１２】
その結果、Ｃ重油濃度が高濃度の汚染土壌であっても、１５日間の処理で、６４％（Ｃ重油濃度１５０００ｐｐｍ）、５８％（Ｃ重油濃度３００００ｐｐｍ）まで浄化できることが分かった。
【０１１３】
次に、図６を参照する。図６は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ａ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＡ重油分解率について、培地への栄養源添加の影響を調べたグラフである。図６の左図は栄養源添加なしの結果を、図６の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【０１１４】
その結果、共培養時に栄養源を添加することにより、Ａ重油の浄化率が促進されることが分かる。
【０１１５】
次に、図７〜図１０を参照する。これらの図は、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、Ｃ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のＣ重油の分解率（図７）およびＣ重油を構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）、ＮＳＯ部の分解率（図８〜図１０）の結果を、それぞれ、示している。図８〜図１０のうち、図８はＣ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ）のときの結果を、図９はＣ重油汚染土壌（１５０００ｐｐｍ）のときの結果を、図１０はＣ重油汚染土壌（３００００ｐｐｍ）のときの結果を、それぞれ、示している。図８〜図１０において、□は栄養源添加なしの結果を、■は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【０１１６】
その結果、共培養時に栄養源を添加することにより、Ｃ重油の浄化率が促進されることが分かる（図７を参照）。
【０１１７】
以上の実験結果より、本発明によれば、原油中のアスファルトだけでなく、Ｃ重油やＡ重油に汚染された土壌も、効率よく浄化できることが分かった。
【０１１８】
実施例３
本実施例では、ＮＧ００７株とＳ１３３株を１：１の比率で共培養したときの、アスファルト汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）に対する浄化能をより詳しく調べるため、前述した実施例１（培養日数１５日、３０日）において培養日数を６０日、１２０日まで延長し、実施例１と同様にしてアスファルトの浄化率を測定した。その結果を図１１に示す。図１１の左図は栄養源添加なしの結果を、図１１の右図は栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。
【０１１９】
図１１より、栄養源無添加の場合は、アスファルトの濃度にかかわらず、培養日数を６０日、１２０日に延長してもアスファルトの浄化率は、培養日数３０日のときと殆ど変化しなかった（図１１の左図を参照）のに対し、栄養源を添加すると、アスファルトが高濃度の場合（１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）にアスファルトの浄化率が一層向上し、約９０％近傍の極めて高い浄化率を達成することができた。
【０１２０】
参考のため、各濃度のアスファルト汚染土壌を用いたときの各酵素活性（Ｕ／ｌ）を表６Ａ（１０００ｐｐｍ）、表６Ｂ（１５０００ｐｐｍ）、表６Ｃ（３００００ｐｐｍ）に示す。これらの酵素活性は、前述した実施例２と同様にして調べたものであり、各表における括弧書の太字部分は、栄養源を添加した後の酵素活性を示す。栄養源は培養後、１５日目、３０日目、６０日目、９０日目に添加した。例えば表６ＡのＣ１２Ｏにおいて、３０日間培養の欄に記載の括弧書の数値（９２０Ｕ／ｌ）は培養後１５日目に栄養源を加えて更に１５日間（合計３０日間）培養したときの値であり；６０日間培養の欄に記載の数値（９５２５Ｕ／ｌ）は培養後１５日目および３０日目に栄養源を加えて更に３０日間（合計６０日間）培養したときの値であり；１２０日間培養の欄に記載の数値（１０４２５Ｕ／ｌ）は培養後１５日目、３０日目、６０日目、９０日目に栄養源を加えて更に３０日間（合計１２０日間）培養したときの値である。
【０１２１】
【表６Ａ】
2014088548.tif 000007
【０１２２】
【表６Ｂ】
2014088548.tif 000008
【０１２３】
【表６Ｃ】
2014088548.tif 000009
【０１２４】
更に前述した実施例２と同様にして、アスファルトを構成する各成分［脂肪族炭化水素部（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族炭化水素部（Ａｒｏｍａｔｉｃ）、ＮＳＯ部、アスファルテン部（Ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）］の分解率を調べた。その結果を図１２に示す。図１２Ａは栄養源添加なしの結果を、図１２Ｂは栄養源添加ありの結果を、それぞれ、示す。図１２Ａおよび図１２Ｂにおける、各成分の各濃度（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）のそれぞれについて、左から順に、培養後１５日、３０日、６０日、１２０日の結果を示している。その結果、いずれの成分においても、共培養時に栄養源を添加することにより浄化率が促進され、特に高濃度の場合（１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）に浄化率が一層向上する傾向が見られた。
【０１２５】
実施例４
本実施例では、汚染土壌としてＣ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）を用いたこと以外は前述した実施例３と同様にして、培養日数を６０日、１２０日まで延長したときのＣ重油の浄化率（図１３）、Ｃ重油を構成する各成分の浄化率（図１４Ａ〜図１４Ｃ）、各酵素活性（表７Ａ〜表７Ｃ）を測定した。その結果、図１３、図１４Ａ〜図１４Ｃに示すように、栄養源の添加によりＣ重油の浄化率は増加する傾向が見られ、特にＣ重油が高濃度の場合（１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）、栄養源添加培地で培養後１２０日には３００００ｐｐｍで約８０％、１５００００ｐｐｍで約１００％に近い浄化率を達成することができた。
【０１２６】
【表７Ａ】
2014088548.tif 000010
【０１２７】
【表７Ｂ】
2014088548.tif 000011
【０１２８】
【表７Ｃ】
2014088548.tif 000012
【０１２９】
実施例５
本実施例では、汚染土壌としてＡ重油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）を用いたこと以外は前述した実施例３と同様にして、培養日数を６０日、１２０日まで延長したときのＡ重油の浄化率（図１５）、Ａ重油を構成する各成分の浄化率（図１６Ａ〜図１６Ｃ）、各酵素活性（表８Ａ〜表８Ｃ）を測定した。その結果、図１５、図１６Ａ〜図１６Ｃに示すように、栄養源の添加によりＡ重油の浄化率は増加する傾向が見られ、特にＡ重油が高濃度の場合（１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）、栄養源添加培地で培養後１２０日には、いずれの濃度も約１００％に近い浄化率を達成することができた。
【０１３０】
【表８Ａ】
2014088548.tif 000013
【０１３１】
【表８Ｂ】
2014088548.tif 000014
【０１３２】
【表８Ｃ】
2014088548.tif 000015
【０１３３】
実施例６
本実施例では、ＮＧ００７株とＳ１３３株とＤ７株を１：１：１の比率で共培養したときの、石油汚染土壌（１０００ｐｐｍ、１５０００ｐｐｍ、３００００ｐｐｍ）に対する浄化能を調べた。具体的には、前述した実施例１および実施例２と同様にして、培地中に栄養源添加あり・添加なしの場合における、Ａ重油、Ｃ重油、およびアスファルトの浄化率（培養日数１５日、３０日、６０日）、これらを構成する各成分の浄化率（培養日数１５日、３０日、６０日）を調べた。また、参考のため、前述した実施例２と同様にして、Ａ重油、Ｃ重油、およびアスファルトのそれぞれについて、各酵素活性を調べた（培養日数１５日、３０日、６０日）。
【０１３４】
本実施例に用いた三種類の菌株のうち、ＮＧ００７株およびＳ１３３株は、前述した実施例１と同様にして単離した。
【０１３５】
また、Ｄ７株の単離方法は以下のとおりである。
【０１３６】
愛媛県伊予市郊外の腐った木から採取した１２種のキノコを採取した。これらを約５ｍｍ角に切り、色素ＲＢＢＲ（レマゾ-ルブリリアントブルーＲ）（１００ｐｐｍ）を含む前述した麦芽エキス寒天培地に添加し、暗所にて２５℃で２週間培養した。その麦芽エキス寒天培地上に生育してきた１２種の菌をそれぞれ採取し、Ｃ重油１０００ｐｐｍを上層した麦芽エキス寒天培地（具体的には、麦芽エキス寒天培地の上に、ジクロロメタンに溶解したＣ重油１０００ｐｐｍを塗布した後、ジクロロメタンを蒸発させることにより、麦芽エキス寒天培地の上にＣ重油を載せたもの）にて２５℃で７日間培養した。これらのうち、生育速度の速い菌を３種採取し、Ｃ重油１５０００ｐｐｍを上層した麦芽エキス寒天培地にて、更に２５℃で７日間培養することによって、特に生育が活発であった担子菌であるＤ７株を単離した。
【０１３７】
得られたＤ７株を顕微鏡により観察したところ、表面は灰白色の半円形の傘を持ち、その表面は粗毛で覆われ、環紋をあらわす。その幅は２〜７ｃｍ、厚さ２〜５ｍｍで、多数重生する。胞子は白色で、その大きさは長さ５〜７μｍ×幅２〜３μｍである。これらはＴｒａｍｅｔｅｓ属菌の形態学的特徴であることから、Ｄ７株はＴｒａｍｅｔｅｓ属菌と同定した。
【０１３８】
上述した三種類の各菌株をそれぞれ、前述した麦芽エキス寒天培地にて、室温（２５℃）で７日間培養し、その培養液をホモジナイザーで５０００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズした菌糸懸濁液を用意した。このようにして得られた各菌株の菌糸懸濁液を、容量比にて、ＮＧ００７株：Ｓ１３３株：Ｄ７株＝１：１：１となるように調整し、上記の実験を行なった。
【０１３９】
Ａ重油を用いたときの結果を図１７、図２０、および表１０に示す。詳細には、Ａ重油を構成する各成分の浄化率を図１７Ａ、図１７Ｂに示すと共に、Ａ重油の浄化率を図２０に示した。また、表１０には、各酵素活性の結果を示した。
【０１４０】
Ｃ重油を用いたときの結果を図１８、図２１、および表１１に示す。詳細には、Ｃ重油を構成する各成分の浄化率を図１８Ａ、図１８Ｂに示すと共に、Ｃ重油の浄化率を図２１に示した。また、表１１には、各酵素活性の結果を示した。
【０１４１】
アスファルトを用いたときの結果を図１９、図２２、および表１２に示す。詳細には、アスファルトを構成する各成分の浄化率を図１９Ａ、図１９Ｂに示すと共に、アスファルトの浄化率を図２２に示した。また、表１２には、各酵素活性の結果を示した。
【０１４２】
更に、Ａ重油、Ｃ重油、アスファルトを用いたときの浄化率の結果を表９にまとめて示す。
【０１４３】
【表９】
2014088548.tif 000016
【０１４４】
【表１０】
2014088548.tif 000017
【０１４５】
【表１１】
2014088548.tif 000018
【０１４６】
【表１２】
2014088548.tif 000019
【０１４７】
三種類の混合物（ＮＧ００７株＋Ｓ１３３株＋Ｄ７株）を用いたときの結果を、前述した二種類の混合物（（ＮＧ００７株＋Ｓ１３３株）を用いたときの結果と対比すると、三種類の混合物を用いることにより、石油汚染土壌の浄化率が向上する傾向が見られた。この傾向は。特にＡ重油およびＣ重油を用いたときに顕著に見られた。例えば、Ａ重油の場合、図２０（三種類の混合物）と図１５（二種類の混合物）を対比すると、栄養源添加の有無やＡ重油の濃度に関わらず、培養後１５日、３０日、６０日のいずれにおいても、三種類の混合物を用いたときの方が、Ａ重油の浄化率が向上した。同様の傾向はＣ重油を用いたときにも見られ、図２１（三種類の混合物）と図１３（二種類の混合物）を対比すると、栄養源添加の有無やＣ重油の濃度に関わらず、培養後１５日、３０日、６０日のいずれにおいても、三種類の混合物を用いたときの方が、Ｃ重油の浄化率が向上した。
【０１４８】
上記実施例１〜実施例６の結果より、本発明の石油汚染土壌浄化剤は、従来法では短時間の高い分解処理が困難であった高濃度石油汚染土壌を十分に浄化できる技術として極めて有用であることが十分実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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