(57)【要約】      （修正有）【課題】卵巣癌などの癌疾患の治療および診断に使用するためのヒト抗ミュラーホルモンＩＩ型レセプタ（ＡＭＨＲ−ＩＩ）に特異的なモノクローナル抗体およびそのフラグメントを提供する。【解決手段】（ａ）可変ドメインが、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、ＣＤＲ−３について夫々特定の配列から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖；および／または（ｂ）可変ドメインが、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、ＣＤＲ−３について夫々特定の配列から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖；を含む、ヒト抗−ミュラーホルモンＩＩ型レセプタ（ＡＭＨＲ−ＩＩ）に対する特異性を有するモノクローナル抗体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）可変ドメインが、ＣＤＲ−１については配列番号２、ＣＤＲ−２については配列番号３およびＣＤＲ−３については配列番号４から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖；および／または
（ｂ）可変ドメインが、ＣＤＲ−１については配列番号６、ＣＤＲ−２については配列番号７およびＣＤＲ−３については配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖；
を含む、ヒト抗ミュラーホルモンＩＩ型レセプタ（ＡＭＨＲ−ＩＩ）に対する特異性を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
可変ドメインが、ＣＤＲ−１については配列番号２、ＣＤＲ−２については配列番号３およびＣＤＲ−３については配列番号４を含む重鎖を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
マウス抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−３６７３の下で入手できるハイブリドーマから獲得可能である、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
マウス／ヒトキメラ抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ヒト化抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２および二重特異性抗体フラグメントから成る群の中から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のフラグメント。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体または請求項７に記載のそのフラグメントをコードする配列を含む核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸および／または請求項９に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６６２の下で入手可能なＹＢ２／０細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
（ｉ）前記抗体の発現を可能にするのに適した条件下で請求項１０または１１に記載の形質転換された宿主細胞を培養するステップ、および（ｉｉ）発現された抗体を回収するステップから成るステップを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または請求項７に記載のそのフラグメントを生産する方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体および／または請求項７に記載のフラグメント、または請求項８に記載の核酸および／または請求項９に記載のベクター、および／または請求項１０または１１に記載の宿主細胞を薬学的に受容可能な担体と共に含む薬学組成物。
【請求項１４】
抗癌剤に抱合された、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または請求項７に記載のフラグメントを含む免疫抱合体。
【請求項１５】
前記抗癌剤が細胞毒性剤または成長阻害剤である、請求項１４に記載の免疫抱合体。
【請求項１６】
検出可能な分子または物質で標識されている、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体、または請求項７に記載のフラグメント。
【請求項１７】
卵巣癌の治療用に意図された薬剤の製造を目的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、または請求項７に記載のフラグメント、または請求項１４または１５に記載の免疫抱合体の使用。
【請求項１８】
卵巣癌の診断および／または監視用に意図されたキットの製造を目的とする、請求項１〜６および１６のいずれか１項に記載の抗体、または請求項７または１６に記載のフラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト抗ミュラーホルモンＩＩ型レセプタ（ＡＭＨＲ−ＩＩ）に対するモノクローナル抗体およびそのフラグメント、そして卵巣癌といったような癌疾患の治療および診断を目的とするその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌は、婦人科悪性腫瘍の主たる原因であり、女性の癌関連死の５番目に頻度の高い死因である。１００，０００人あたり約１０人という平均罹患率で、全欧州女性のうち合計１〜２％がその人生の或る時点で卵巣癌に罹患している（Ｂｌａｃｋ  ＲＪら、１９９７年）。
【０００３】
顆粒膜細胞腫（ＧＣＴ）は、卵巣悪性新生物の約５％そして卵巣性索−支質腫瘍の７０％を占めている。その悪性度は、疾病の最初の数年においては比較的低いものであるが、再発は、原発腫瘍の外科的除去後最長３０年にわたり出現する可能性がある（Ｓｉｎｇｈ−Ｒａｎｇｅｒ  Ｇら、２００４年）。腫瘍が腹膜上に広がる前の早期に診断が行なわれた場合、再発の予後は、外科的完全摘出によって著しく改善され得る（ＤｕｔｅｒｔｒｅＭ．ら、２００１年）。
【０００４】
上皮性卵巣癌は、卵巣腫瘍全体の約８０％を占めている。これらの癌腫が早期に診断された場合、生存率は約９０％である。残念なことに、診断時点でおよそ７５％の女性において腹腔内に疾病が大きく広がっている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ．２００１年、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）。これらの看護においては適切な治療にもかかわらず生存率は約２０〜２５％である（Ｒａｐｋｉｅｗｉｃｚ  ＡＶ．ら、２００４年）。
【０００５】
上皮性卵巣癌のためには、いくつかの分子マーカー、特にこれらの腫瘍の約８０％において過剰発現される癌抗原１２５の循環形態（ＣＡ１２５またはＭＵＣ１６）が提案された。しかしながら、そのレベルの上昇は、子宮内膜症または肝疾患といったような良性の身体条件および月経と関連性を有している可能性がある。
【０００６】
上皮性卵巣癌のために用いられる主要な治療戦略は、外科手術と化学療法である。例えば卵巣癌は一般にシスプラチンベースの化学療法で治療されてきたが、シスプラチン獲得耐性に起因して再発することが多い（Ｙａｈａｔａ，Ｈ．ら、２００２年）。大部分の患者は当初、完全応答を含めてプラチニウムおよびパクリタキセル化学療法に対し応答性を有するかもしれないが、再発率はおよそ８５％である（Ｇｏｒｄｏｎ  ＡＮら、２００４年）。ホルモン、抗血管新生因子およびモノクローナル抗体に基づく新しい標的療法が急速に発達した。モノクローナル抗体としては、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ、ＡｌｔａＲｅｘ）、免疫療法的治療として臨床試験で現在用いられているＣＡ１２５に対する調査用マウスモノクローナル抗体（Ｂｅｒｅｋ  ＪＳら、２００４年）、および上皮性卵巣癌患者の３０〜７０％で発現される表皮性成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）に対するセツキシマブ（Ｏｚｏｌｓ  ＲＦら、２００４年）が含まれる。
【０００７】
かくして、卵巣癌の治療のための新しい治療剤に対する重大なニーズが存在する。さらに、生体における卵巣癌の診断用の高感度の特異的バイオマーカーとして使用するために新しい卵巣癌関連タンパク質を識別することのニーズが明らかに存在する。
【０００８】
抗ミュラーホルモンＩＩ型レセプタは、男性生殖器系の発達に付随するミュラー管退行に関与している。このレセプタは往々にして、ヒトの上皮性卵巣腫瘍細胞上で発見される。卵巣癌細胞の成長を阻害するＡＭＨの能力が実証済みであることから、ＡＭＨＲ−ＩＩはかくして抗体ベースの免疫療法のための貴重な標的を構成し得ると考えられる。
【０００９】
ＡＭＨＲ−ＩＩの発現は、マウス生殖細胞系の遺伝子操作によって動物モデルにおいて研究されてきた。Ｄｕｔｅｒｔｒｅら（２００１年）は、ＡＭＨプロモータＳＶ４０腫瘍遺伝子構成体を用いて標的腫瘍形成によって得られる遺伝子導入マウスに由来する顆粒膜細胞卵巣腫瘍内の機能的ＡＭＨＲ−ＩＩの発現について報告した。最近開発されたマウスモデルの体内で、Ｃｏｎｏｌｌｙら（２００３年）は、調節配列の５’下流側でＡＭＨＲ−ＩＩの制御下で同じ腫瘍遺伝子の構成体を用いて、雌マウスの約５０％が上皮性卵巣腫瘍を発生させることを実証した。Ｍａｓｉａｋｏｓら（１９９９年）は同様に、ヒト上皮卵巣癌細胞系、患者から単離した腹水細胞の試料および卵巣癌腫患者からの充実性腫瘍内でのＡＭＨＲ−ＩＩの発現をも実証した。これらの治験責任医師は、乳房（Ｓｅｇｅｖ  ＤＬら、２０００年）または前立腺（Ｓｅｇｅｖ  ＤＬら、２００２年）といったようなその他の組織に由来する癌細胞系におけるＡＭＨＲ−ＩＩの発現についても報告している。これらのデータは、ヒトの癌、特に卵巣腫瘍におけるＡＭＨＲ−ＩＩの非常に特異的なプロファイルを示唆している。
【００１０】
２００４年に、Ｓａｌｈｉらは、ヒトＡＭＨＲ−ＩＩに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開発し、特徴づけし、免疫組織化学（ＩＨＣ）により、ヒトの顆粒膜細胞腫瘍（ＧＣＴ）およびヒトの睾丸上のセルトリ細胞およびライディヒ細胞によるＡＭＨＲ−ＩＩの強い発現を実証した。彼らはまた、高レベルの天然リガンド（ＡＭＨ）を発現してＡＭＨＲ−ＩＩ発現腫瘍内でのｍＡｂ１２Ｇ４のインビボ使用を可能にする顆粒膜細胞腫瘍内のｍＡｂ１２Ｇ４の非競合的結合をも明確に示した。
【００１１】
より最近になって、Ｙｕａｎら（２００６年）は、ヒト非免疫性ｓｃＦｖファージ表示型ライブラリからのＡＭＨＲ−ＩＩ特異的ヒトｓｃＦｖ（単一鎖可変フラグメント）分子の選択について記述した。彼らはさらに抗体ベースの構成体が、ヒト卵巣癌腫を診断し治療する目的でヒト卵巣癌腫細胞上でＡＭＨＲ−ＩＩをターゲッティングするきわめて特異的な手段を提供できるということを示唆した。
【００１２】
本発明は、発明人らがｍＡｂ１２Ｇ４と呼ぶ、Ｓａｌｈｉら（２００４年）が開発した特異的モノクローナル抗体の公に入手可能な供給源を与えている。実際、ｍＡｂ１２Ｇ４を産生するハイブリドーマが、ブダペスト条約の条項に従って、国立微生物培養収蔵機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（（ＣＮＣＭ）、パスツール研究所（ｌｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ）、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４パリ、Ｃｅｄｅｘ１５、フランス）に２００６年９月２６日付けで寄託された。寄託されたハイブリドーマのＣＮＣＭ寄託番号はＩ−３６７３である。発明人らは同様に、前記ｍＡｂ１２Ｇ４の軽鎖および重鎖の可変ドメインをクローニングし特徴づけし、かくして、前記抗体の相補性決定領域を決定した。
【００１３】
さらに、発明人らは、ｍＡｂ１２Ｇ４を用いた免疫組織化学によりさまざまな腫瘍に由来する組織切片内のＡＭＨＲ−ＩＩの発現を調査した。したがって、発明人らは、上皮性卵巣癌内のみならず、それぞれ悪性上皮性増殖および性索−支質腫瘍に属する漿液性および透明腺癌および成人顆粒膜細胞腫瘍といった特殊な亜型内でも、卵巣癌内のＡＭＨＲ−ＩＩの特異的発現プロファイルを実証した。発明人らはかくして、ＡＭＨＲ−ＩＩが卵巣ＡＭＨＲ−ＩＩ陽性癌のための新しい診断マーカーとなることができ、ｍＡｂ１２Ｇ４またはその誘導体を用いた免疫療法のための標的として使用され得る、ということを示した。
【００１４】
発明人らは、近年、免疫螢光実験により、ｍＡｂ１２Ｇ４が、ＡＭＨＲ−ＩＩ安定的にトランスフェクションされたＧＣＴ細胞系（ＣＯＶ４３４−ｐｌＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＡＭＨＲ−ＩＩ）（Ｚｈａｎｇ  Ｈら、２０００年）内で効率の良い内在化を示すことを実証した。この細胞系は、細胞１個あたり約１０４個のレセプタを発現する。発明人らは同様に、ＡＭＨＲ−ＩＩ発現ＣＯＶ４３４細胞の成長を阻害するこの抗体のインビトロ能力も示した。ｍＡｂ１２Ｇ４が、ＣＯＶ４３４−ｐｌＲＥＳＥＧＦＰ−ＡＭＨＲ−ＩＩ細胞で異種移植された無胸腺ヌードマウスのモデルにおいて腫瘍の成長を遅延させることができるということを示すインビボ実験も実施された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様は、かくして、ＣＤＲ−１については配列番号２または配列番号６、ＣＤＲ−２については配列番号３または配列番号７そしてＣＤＲ−３については配列番号４または配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを可変ドメインア含んでいる、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖に関する。
【００１６】
本発明の第２の態様は、
−  ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号２、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号３そしてＣＤＲ−Ｈ３については配列番号４から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを可変ドメインが含んでいる重鎖；および／または
−  ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号６、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号７そしてＣＤＲ−Ｌ３については配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを可変ドメインが含んでいる軽鎖、
を含む抗−ミュラーホルモンＩＩ型レセプタ（ＡＭＨＲ−ＩＩ）に対するモノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。
【００１７】
本発明の第３の態様は、本発明に従ったモノクローナル抗体またはそのフラグメントをコードする配列を含む核酸に関する。
【００１８】
本発明の第４の態様は、本発明に従った核酸を含むベクターに関する。
【００１９】
本発明の第５の態様は、上述の通りの核酸および／またはベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。
【００２０】
本発明の第６の態様は、本発明に従った抗体を生産する方法において、（ｉ）前記抗体の発現を可能にするのに適した条件下で上述の通りの形質転換された宿主細胞を培養するステップ、および（ｉｉ）発現された抗体を回収するステップから成るステップを含む方法に関する。
【００２１】
本発明の第７の態様は、上述の通りの抗体、および／または核酸、および／またはベクター、および／または宿主細胞を薬学的に受容可能な担体と共に含む薬学組成物に関する。
【００２２】
本発明の第８の態様は、抗癌剤または成長阻害剤に抱合された、本発明に従った抗体を含む免疫抱合体に関する。
【００２３】
本発明の第９の態様は、検出可能な分子または物質で標識された本発明に従った抗体に関する。
【００２４】
本発明の第１０の態様は、卵巣癌を治療するように意図された薬剤の製造を目的とする、上述の通りの抗体、または薬学組成物または免疫抱合体の使用に関する。
【００２５】
本発明の第１１の態様は、卵巣癌の診断および／または監視のための本発明に従った抗体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】所与のＶＨまたはＶκ遺伝子ファミリに対応するシグナルプライマと適切な不変プライマの組合せを用いた、ｍＡｂ１２Ｇ４の（Ａ）ＶＨおよび（Ｂ）Ｖκ鎖領域についてのＰＣＲ増幅産物を示す。高効率のプライマセットが、ＶＨ増幅については４５０ｂｐ産物およびＶκ増幅については３９０ｂｐ産物を増幅するはずである。
【図２】ｍＡｂ１２Ｇ４のＶＬ領域の核酸およびアミノ酸配列を示す。
【図３】ｍＡｂ１２Ｇ４のＶＨ領域の核酸およびアミノ酸配列を示す。
【図４】安定した形でトランスフェクションされたＣＯＶ４３４−ｐｌＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＡＭＨＲ−ＩＩ１Ｆ３細胞系上でのＨＥＲ２発現（灰色線）およびＡＭＨＲ−ＩＩ発現（黒色線）のフローサイトメトリ分析を示す。
【図５】ＭＴＳ試験により測定されたｍＡｂ１２Ｇ４、非特異的ｍＡｂ３５Ａ７および抗−ＨＥＲ２トラスツズマブおよびＦＲＰ５ｍＡｂｓの、ＣＯＶ４３４−ｐｌＲＥＳ−ＥＧＥＰ−ＡＭＨＲ−ＩＩ１Ｆ３細胞系統に対するインビトロ抗増殖性効果を示している。２つのうちの１つの代表的実験が示されている。
【図６】無胸腺ヌードマウスの体内のＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲＩＩ−１Ｆ３異種移植片の成長に対するｍＡｂ１２Ｇ４のインビボ効果の予備調査を示す。腫瘍が１２００ｍｍ３という規定の体積に達するのにかかった時間を用いた適合カプラン−マイヤー曲線。
【図７】ＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲＩＩ−１Ｆ３異種移植片の中のＡＭＨＲ−ＩＩ発現のウェスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
「コーディング配列」つまり発現産物例えばＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素を「コードする」配列は、発現された場合にそのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生を結果としてもたらすヌクレオチド配列であり、すなわちこのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のためのアミノ酸配列をコードする。１つのタンパク質のためのコーディング配列は、開始コドン（通常ＡＴＧ）と停止コドンを含み得る。
【００２８】
本書で使用される通り、特異的タンパク質（例えば抗体またはＡＭＨＲ−ＩＩ）に対する参照指示は、その由来または調製様式の如何に関わらず、未変性アミノ酸配列をもつポリペプチドならびに変異体および修飾形態を内含できる。未変性アミノ酸配列を有するタンパク質は、自然の中から獲得されたものと同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、天然に発生するＡＭＨＲ−ＩＩ）である。かかる未変性配列タンパク質は、自然の中から単離可能であるか、または標準的な組換え方法および／または合成方法を用いて調製可能である。未変性配列タンパク質は、具体的には、天然に発生する切形または可溶性形態、天然に発生する変異体形態（例えば代替的にはスプライスされた形態）、対立遺伝子多型および翻訳後修飾を含む形態を包含する。未変性配列タンパク質には、グリコシル化またはリン酸化といったような翻訳後修飾、または一部のアミノ酸残基のその他の修飾の後のタンパク質が含まれる。
【００２９】
「遺伝子」という用語は、１つ以上のタンパク質または酵素の全てまたは一部を含み、例えば遺伝子が発現される条件などを決定するプロモータ配列といったような調節ＤＮＡ配列を内含していてもいなくてもよいアミノ酸の特定の配列をコードするかまたはそれに対応するＤＮＡ配列を意味する。構造遺伝子ではない一部の遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され得るが、アミノ酸配列へと翻訳されることはない。その他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子としてかまたはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。特に、遺伝子という用語は、１つのタンパク質をコードするゲノム配列、すなわち、調節因子、プロモータ、イントロンおよびエクソン配列を含む配列のために意図されていてもよい。
【００３０】
本書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的には少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１２個、より好ましくは少なくとも１５個そしてさらに好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド、好ましくは１００個以下のヌクレオチド、さらに好ましくは７０個以下のヌクレオチドの核酸を意味する。
【００３１】
「機能保存的変異体」というのは、１つのタンパク質または酵素内の所与のアミノ酸残基が、類似の特性（例えば極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するものによるアミノ酸の交換を含めた（ただしこれに限定されるわけではない）ポリペプチドの全体的立体構造および機能を改変することなく変更されている変異体のことである。保存されたものとして標示されたもの以外のアミノ酸は、１つのタンパク質内で異なっていてよく、かくして、類似の機能をもつ任意の２つのタンパク質の間のタンパク質またはアミノ酸配列類似性百分率は、変動してよく、例えばクラスタ方法（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）などによるアラインメントスキームに従って決定された場合７０％〜９９％であり得、ここで類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいている。「機能保存的変異体」は、同様に、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定された場合に少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、そしてさらに一層好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ比較対象の未変性または親タンパク質と同じかまたは実質的に類似の特性または機能を有するポリペプチドを内含する。
【００３２】
２つのアミノ酸配列は、このアミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であるかまたは約９０％超、好ましくは９５％超がより短かい配列の全長にわたって類似している（機能的に同一である）場合に、「実質的に相同である」かまたは「実質的に類似である」。好ましくは、類似のまたは相同の配列は、例えばＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ＧＣＧパッケージ用プログラムマニュアル（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ），バージョン７、ウィスコンシン州マジソン））のｐｉｌｅｕｐプログラム、またはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどといった配列比較アルゴリズムのいずれかを用いたアラインメントにより同定される。
【００３３】
本発明に従うと、「抗体」または「免疫グロブリン」は同じ意味をもち、本発明において同等に使用される。抗体というのは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち免疫特異的に抗原を結合させる抗原結合部位を含有する分子を意味する。かくして、抗体という用語は、抗体分子体だけではなく、抗体フラグメントならびに抗体および抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）をも包含している。天然の抗体においては、２つの重鎖がジスルフィド結合によって互いにリンクされており、各々の重鎖はジスルフィド結合により軽鎖にリンクされる。軽鎖には、ラムダ（ｌ）とカッパ（ｋ）の２つのタイプがある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはイソタイプ）すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。各鎖は、全く異なる配列ドメインを含む。軽鎖は２つのドメイン、つまり可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を内含する。重鎖は４つのドメイン、つまり１つの可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（集合的ＣＨと呼ばれるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、結合認識および抗原に対する特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤可動度、補体結合、およびＦｃレセプタ（ＦｃＲ）に対する結合といった重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖と１つの重鎖の可変部分から成る。抗体の特異性は、抗体組合せ部位と抗原決定基の間の構造的相補性にある。抗体組合せ部位は、主として超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成されている。時として、非超可変またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基が、全体的ドメイン構造ひいては組合せ部位に影響を及ぼす。相補性決定領域またはＣＤＲというのは、未変性免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和力および特異性を共に定義づけるアミノ酸配列を意味する。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と呼称される３つのＣＤＲを各々有している。したがって、１つの抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを内含する。
【００３４】
フレームワーク領域（ＦＲｓ）というのは、ＣＤＲの間に介在させられたアミノ酸配列、すなわち、Ｋａｂａｔ、ら（免疫学的価値をもつタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベテスダ、１９９１年）によって定義されているように、単一の種の中の異なる免疫グロブリンの間で比較的保存されている免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の一部分を意味している。本書で使用される「ヒトフレームワーク領域」というのは、天然に発生するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的（約８５％以上、特に９０％、９５％または１００％）に同一であるフレームワーク領域である。
【００３５】
本書で使用されている「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、特異的抗原に対し向けられかつＢ細胞の単一クローンまたはハイブリドーマによって産生される単一アミノ酸組成物の抗体分子を意味する。
【００３６】
「キメラ抗体」という用語は、非ヒト動物に由来する抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、もう１つの抗体特にヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインを含む工学処理された抗体を意味する。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスタ、ウサギなどといったあらゆる動物を使用することができる。
【００３７】
「ヒト化抗体」という用語は、親免疫グロブリンのものと比べて異なる特異性をもつドナー免疫グロブリンからのＣＤＲを含むようにフレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が修飾された抗体を意味する。好ましい実施形態においては、「ヒト化抗体」を調製するべくヒト抗体のフレームワーク領域内に、マウスＣＤＲが移植される。
【００３８】
「抗体フラグメント」には、無欠抗体の一部分、好ましくは無欠抗体の抗原結合または可変領域が含まれる。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性抗体および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。「Ｆａｂ」という用語は、プロテアーゼ、パパインでＩｇＧを処理することにより得られたフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合を通して共に結合されている、約５０，０００の分子量と抗原結合活性をもつ抗体フラグメントを意味する。
【００３９】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、プロテアーゼ、ペプシンでＩｇＧを処理することによって得られるフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたＦａｂよりもわずかに大きい、約１００，０００の分子量と抗原結合活性を有する抗体フラグメントを意味する。
【００４０】
「Ｆａｂ’」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、約５０，０００の分子量と抗原結合活性を有する抗体フラグメントを意味する。
【００４１】
１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、通常ペプチドコーディングリンカーによってリンクされたＶＨおよびＶＬコーディング遺伝子を内含する遺伝子融合から発現される、共有結合によりリンクされたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントには、好ましくは遺伝子組換え技術を用いることによって適切な立体構造に保持されるＣＤＲが含まれる。
【００４２】
「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。２価および多価の抗体フラグメントは、一価のｓｃＦｖｓの会合によって自然発生的に形成でき、そうでなければ、２価のｓｃ（Ｆｖ）２といったようなペプチドリンカーによって一価のｓｃＦｖｓをカップリングすることによって生成させることもできる。
【００４３】
「二重特異性抗体」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を伴う小さい抗体フラグメントを意味する。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短かすぎるリンカーを用いることにより、ドメインはもう１つの鎖の相補性ドメインと強制的に対合させられ２つの抗原結合部位を作り出す。
【００４４】
「ハイブリドーマ」という用語は、抗原特異性を有する所望のモノクローナル抗体を生産するマウスなどに由来する骨髄腫細胞との細胞融合に、抗原で非ヒト哺乳動物を免疫にすることによって調製したＢ細胞を付すことで得られる細胞を意味する。
【００４５】
「ＡＭＨＲ−ＩＩ」という用語は、抗ミュラーホルモンＩＩ型レセプタを意味する。ＡＭＨＲ−ＩＩ遺伝子は、ラット（Ｂａａｒｅｎｄｓ  ＷＭら、１９９４年）、ウサギ（ｄｉ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ  Ｎ．ら、１９９４年）、ヒト（ｈＡＭＨＲ−ＩＩ）（Ｉｍｂｅａｕｄ  Ｓら、１９９５年）およびマウス（ｍＡＭＨＲ−ＩＩ）（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＲら、１９９０年）の中で単離された。それは１１のエクソンを含む。すなわち、エクソン１〜３は、ヒトレセプタ内の１２７個のアミノ酸で構成された細胞外ドメインをコードし、エクソン４は、２６個のアミノ酸から成る膜内外ドメインについてコードする。ＡＭＨＲ−ＩＩの予測された配列は、ＴＧＦ−βファミリのその他のＩＩ型レセプタとおよそ３０％の全体的類似性を共有する。ＡＭＨＲ−ＩＩは、天然の組織標的、生殖器および生殖腺内で特異的に発現される。ＡＭＨ（抗ミュラーホルモン）がパラクリン機序による退行を誘発するミュラー管の中では、ＡＭＨＲ−ＩＩが間充組織内で発現される（Ｔｓｕｊｉ  Ｍら、１９９２年）。ＡＭＨＲ−ＩＩまたはＡＭＨ内の突然変異は、例えば雄の遺伝子導入マウスにおける仮性半陰陽（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＲら、１９９０年）（（ヒトにおいては持続性ミュラー管症候群（ＰＭＤＳ）として知られている（Ｂｅｌｖｉｌｌｅ  Ｃら、１９９９年））といった雄の性的異常をひき起こす。雌においては、ＡＭＨＲ−ＩＩ発現がミュラー管の長さに沿って維持され、正常なおよび妊娠子宮内で検出される（Ｔｅｉｘｅｉｒａ  Ｊら、１９９６年）。雌のＡＭＨＲ−ＩＩまたはＡＭＨ欠損マウスは正常であり、若年成体と同じ位の繁殖力を有する。ＡＭＨおよびＡＭＨＲ−ＩＩは、睾丸のセルトリおよび卵巣顆粒膜細胞内、および誘導された細胞、例えばそれぞれＳｍａｔ−１（Ｄｕｔｅｒｔｒｅ  Ｍら、１９９７年）およびＡＴ２９Ｃ（Ｒａｃｉｎｅ  Ｃら、１９９８年）の中で同時発現される。ＡＭＨＲ−ＩＩ単独の発現は、げっ歯類のライディヒ細胞内（Ｒａｃｉｎｅ  Ｃら、１９９８年；Ｌｅｅ  ＭＭら、１９９９年）およびヒトの細胞内（Ｍａｓｉａｋｏｓ  ＰＴら、１９９９年）で検出されたが、マウスの卵巣表面上皮内では検出されなかった（ｄｉ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅら、１９９４年；Ｂａａｒｅｎｄｓ  ＷＭら、１９９５年）。ヒトＡＭＨＲ−ＩＩのポリペプチド配列は、Ｕ２９７００という登録番号の下でＧｅｎｅｂａｎｋデータベース内に寄託されている。
【００４６】
「精製された」および「単離された」というのは、ポリペプチド（すなわち本発明の抗体フラグメント）またはヌクレオチド配列に言及している場合、指示された分子が同じタイプのその他の生物学的巨大分子の実質的な不在下で存在することを意味する。本書で使用される「精製された」という用語は、好ましくは、同じタイプの生物学的巨大分子の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、より好ましくはさらに少なくとも９５重量％そして最も好ましくは少なくとも９８重量％が存在することを意味している。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、対象のポリペプチドをコードしないその他の核酸分子を実施的に含まない核酸分子を意味している。しかしながら、分子は組成物の基本的特徴に有害な影響を及ぼさないいくつかの付加的な塩基または部分を内含していてよい。
【００４７】
本書で使用されている「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ科動物、イヌ科動物、および霊長類といったような哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明に従った対象は、ヒトである。
【００４８】
本発明の抗体、免疫グロブリン鎖およびポリペプチド：
本発明は、ヒトＡＭＨＲ−ＩＩに対する単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供している。特に、発明人らは、ブダペスト条約の条項に従って、国立微生物培養収蔵機関（ＣＮＣＭ，ｌｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４パリ、Ｃｅｄｅｘ１５、フランス）に２００６年９月２６日付けでｍＡｂ１２Ｇ４産生ハイブリドーマを寄託した。寄託されたハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号１−３６７３を有する。発明人らは、前記ｍＡｂ１２Ｇ４の軽鎖および重鎖の可変ドメインをクローニングし、特徴づけし、かくして、表１および図２および３で記述されているように前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
したがって、本発明は、ヒトＡＭＨＲ−ＩＩに対する特異性をもつモノクローナル抗体において、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号２、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号３そしてＣＤＲ−Ｈ３については配列番号４から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる重鎖を含むモノクローナル抗体に関する。
【００５１】
本発明は同様に、ヒトＡＭＨＲ−ＩＩに対する特異性をもつモノクローナル抗体において、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号６、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号７そしてＣＤＲ−Ｌ３については配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる軽鎖を含むモノクローナル抗体に関する。
【００５２】
本発明は同様に、ヒトＡＭＨＲ−ＩＩに対する特異性をもつモノクローナル抗体において、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号２または配列番号６、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号３または配列番号７そしてＣＤＲ−Ｈ３については配列番号４または配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる重鎖、および／または可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号２または配列番号６、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号３または配列番号７そしてＣＤＲ−Ｈ３については配列番号４または配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる軽鎖を含むモノクローナル抗体にも関する。
【００５３】
本発明のモノクローナル抗体は、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号２、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号３そしてＣＤＲ−Ｈ３については配列番号４から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる重鎖、および／または可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号６、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号７そしてＣＤＲ−Ｌ３については配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる軽鎖を含んでいてよい。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体は、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号２、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号３そしてＣＤＲ−Ｈ３については配列番号４から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる軽鎖、および／または可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号６、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号７そしてＣＤＲ−Ｌ３については配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる重鎖を含んでいてよい。特に、本発明は、抗ミュラーホルモンＩＩ型レセプタ（ＡＭＨＲ−ＩＩ）に対するモノクローナル抗体において、
−  可変ドメインが、
ａ）ＣＤＲ−Ｈ１領域内の配列番号２、ＣＤＲ−Ｈ２領域内の配列番号３およびＣＤＲ−Ｈ３領域内の配列番号４；または、
ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１領域内の配列番号６、ＣＤＲ−Ｈ２領域内の配列番号７およびＣＤＲ−Ｈ３領域内の配列番号８；
を含んでいる重鎖；
および／または
−  可変ドメインが、
ｃ）ＣＤＲ−Ｌ１領域内の配列番号６、ＣＤＲ−Ｌ２領域内の配列番号７およびＣＤＲ−Ｌ３領域内の配列番号８；または、
ｄ）ＣＤＲ−Ｌ１領域内の配列番号２、ＣＤＲ−Ｌ２領域内の配列番号３およびＣＤＲ−Ｌ３領域内の配列番号４、
を含んでいる軽鎖、
を含むモノクローナル抗体を提供する。
【００５５】
特定の１実施形態においては、前記抗体の重鎖可変ドメインが、配列番号１または配列番号５として示されているアミノ酸配列を有し、かつ／または、軽鎖可変ドメインが配列番号５または配列番号１として示されているアミノ酸配列を有する。
【００５６】
前記抗体は、当該技術分野において周知のあらゆる技術によって生産することができる。特に、前記抗体は、以下で記述するような技術により生産される。
【００５７】
１つの実施形態に従うと、本発明のモノクローナル抗体はマウス抗体である。特に、前記マウス抗体は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−３６７３の下で入手可能なハイブリドーマから得ることのできるものであってよい。
【００５８】
もう１つの実施形態においては、本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体である。特に、前記マウス／ヒトキメラ抗体は、ＣＮＣＭ−Ｉ−３６７３として寄託されたハイブリドーマから得ることのできる抗体の可変ドメインを含み得る。
【００５９】
もう１つの実施形態においては、本発明のモノクローナル抗体はヒト化抗体である。特に、前記ヒト化抗体において、可変ドメインは、ヒトアクセプタフレームワーク領域そして任意には、存在する場合ヒト定常ドメイン、そして非ヒトドナーＣＤＲ、例えば以上で定義したようなマウスＣＤＲ、を含んでいる。
【００６０】
本発明はさらに、限定的な意味なくＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２および二重特異性抗体を含む前記モノクローナル抗体のフラグメント、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を提供する。
【００６１】
もう１つの態様において、本発明は、可変ドメインが、ＣＤＲ−１については配列番号２または配列番号６、ＣＤＲ−２については配列番号３または配列番号７そしてＣＤＲ−３については配列番号４または配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖に関する。
【００６２】
特に本発明は、可変ドメインが、
−  ＣＤＲ−１については配列番号２、ＣＤＲ−２については配列番号３そしてＣＤＲ−３については配列番号４から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲ、または、
−  ＣＤＲ−１については配列番号６、ＣＤＲ−２については配列番号７そしてＣＤＲ−３については配列番号８から成る群の中から選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲ、
を含んでいる免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖を提供する。
【００６３】
好ましい実施形態においては、本発明は、可変ドメインが、
−  ＣＤＲ−１については配列番号２、ＣＤＲ−２については配列番号３そしてＣＤＲ−３については配列番号４；または
−  ＣＤＲ−１については配列番号６、ＣＤＲ−２については配列番号７そしてＣＤＲ−３については配列番号８、
を含んでいる免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖に関する。
【００６４】
１実施形態に従うと、本発明に従った免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖は、配列番号１または配列番号５として示されたアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む。
【００６５】
１実施形態においては、本発明に従った免疫グロブリン鎖は重鎖または軽鎖である。
【００６６】
本発明は、さらに、本発明に従った免疫グロブリン重鎖または軽鎖を含む免疫グロブリンに関する。特に、免疫グロブリンは、以上で定義づけされたような重鎖または軽鎖を含んでいてよい。
【００６７】
もう１つの態様においては、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から成る群の中から選択された配列を有するポリペプチドに関する。
【００６８】
本発明の抗体およびポリペプチドは、単離された（例えば精製された）形態で使用され得るか、または膜または脂質小胞（例えばリポソーム）といったような、ベクター内に収納され得る。
【００６９】
核酸、ベクターおよび組換え型宿主細胞
本発明のさらなる目的は、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントをコードする核酸配列に関する。
【００７０】
特定の実施形態においては、本発明は、ｍＡｂ１２Ｇ４のＶＨドメインまたはｍＡｂ１２Ｇ４のＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。
【００７１】
標準的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターといったような適切な任意のベクターの中に内含され得るＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
【００７２】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するべく、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞内に導入することのできるビヒクルを意味する。
【００７３】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００７４】
かかるベクターには、対象に投与した時点で前記ポリペプチドの発現をひき起こすかまたは導くためのプロモータ、エンハンサ、ターミネータなどといった調節要素が含まれてよい。動物の細胞のための発現ベクターの中で使用されるプロモータおよびエンハンサの例としては、ＳＶ４０の早期プロモータおよびエンハンサ（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ら、１９８７年）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモータおよびエンハンサ（Ｋｕｗａｎａ  Ｙら、１９８７年）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモータ（Ｍａｓｏｎ  ＪＯら、１９８５年）およびエンハンサ（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤら、１９８３年）などが含まれる。
【００７５】
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入し発現することができるかぎりにおいて、動物細胞用の任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈら、１９９０年）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔら、１９８７年）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ  Ｇら、１９８４年）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ηａｒｅ  Ｋら、１９８１年）、ｐＳＧ１ベータｄ２−４−（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈら、１９９０年）などが含まれる。
【００７６】
プラスミドのその他の例としては、複製起点を含む複製プラスミドまたは例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどといったような組込みプラスミドが含まれる。
【００７７】
ウイルスベクターのその他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが含まれる。かかる組換え型ウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクションすること、またはヘルパープラスミドまたはウイルスでの過渡的トランスフェクションといったような当該技術分野において公知の技術により生産してよい。ウイルスパッケージング細胞の標準的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが含まれる。かかる複製欠損組換え型ウイルスを生産するための詳細なプロトコルは、例えば国際公開第９５／１４７８５号（ＷＯ９５／１４７８５）、国際公開第９６／２２３７８号（ＷＯ９６／２２３７８）、米国特許第５，８８２，８７７号（ＵＳ５，８８２，８７７）、米国特許第６，０１３，５１６号（ＵＳ６，０１３，５１６）、米国特許第４，８６１，７１９号（ＵＳ４，８６１，７１９）、米国特許第５，２７８，０５６号（ＵＳ５，２７８，０５６）および国際公開第９４／１９４７８号（ＷＯ９４／１９４７８）の中に見出すことができる。
【００７８】
本発明のさらなる目的は、本発明に従った核酸および／またはベクターによるトランスフェクション、感染または形質転換を受けた細胞に関する。
【００７９】
「形質転換」という用語は、所望の物質、標準的には導入された遺伝子または配列によりコードされたタンパク質または酵素を生産するため、導入された遺伝子または配列を宿主細胞で発現することになるような形での、宿主細胞への「外来性」（すなわち外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容するまたは発現する宿主細胞は、「形質転換」されたものである。
【００８０】
本発明の核酸は、適切な発現系において本発明の組換え型ポリペプチドを生産するために、使用可能である。「発現系」という用語は、ベクターが担持し宿主細胞に導入される外来性ＤＮＡによりコードされたタンパク質の発現などのための、適切な条件下にある宿主細胞および相容性あるベクターを意味する。
【００８１】
一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、そして哺乳動物宿主細胞およびベクターが含まれる。宿主細胞のその他の例としては、限定的な意味なく、原核細胞（例えば細菌）および真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が含まれる。特定の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞系（例えば例えばベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）ならびに初代または樹立哺乳動物細胞培養（例えば例えばリンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、含脂肪細胞などから産生されたもの）が含まれる。例としては同様に、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下「ＤＨＦＲ遺伝子」と呼ぶ）が欠如しているＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇら、１９８０年）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下「ＹＢ２／０細胞」と呼ぶ）なども含まれる。ＹＢ２／０細胞内で発現された場合キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が増強されることから、この細胞が好まれる。
【００８２】
本発明は同様に、本発明に従って本発明の抗体またはポリペプチドを発現する組換え型宿主細胞を生産する方法において、（ｉ）上述のとおりの組換え型核酸またはベクターをインビトロかまたはエクスビボでコンピーテント宿主細胞内に導入するステップ；（ｉｉ）得られた組換え型宿主細胞をインビトロまたはエクスビボで培養するステップおよび（ｉｉｉ）任意には前記抗体またはポリペプチドを発現かつ／または分泌する細胞を選択するステップから成るステップを含む方法にも関する。かかる組換え型宿主細胞は、本発明の抗体およびポリペプチドの生産のために使用可能である。
【００８３】
本発明の抗体の生産方法：
本発明の抗体およびポリペプチドは、限定的な意味なく任意の化学的、生物学的、遺伝子的または酵素的技術といった当該技術分野において公知のあらゆる技術を単独でまたは組合わせて用いることで生産可能である。
【００８４】
当業者であれば、所望の配列のアミノ酸配列がわかっていることから、ポリペプチドの生産のための標準的技術によって前記抗体またはポリペプチドを容易に生産できる。例えば、周知の固相方法を用いて、好ましくは市販のペプチド合成器具（例えばカリフォルニア州フォスター市のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されているものなど）を用いて、かつメーカーの指示事項に従って、これらを合成することができる。代替的には、本発明の抗体およびポリペプチドは、当該技術分野において周知の通り、組換え型ＤＮＡ技術によって合成可能である。例えば、これらのフラグメントは、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクター内に取込み、周知の技術を用いて後日そこからベクターを単離できる所望のポリペプチドを発現する適当な真核または原核宿主の中にかかるベクターを導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができる。
【００８５】
特に、本発明はさらに、本発明の抗体またはポリペプチドを生産する方法において、（ｉ）前記抗体またはポリペプチドの発現を可能にするのに適した条件下で本発明に従った形質転換された宿主細胞を培養するステップ；および（ｉｉ）発現された抗体またはポリペプチドを回収するステップから成るステップを含む方法に関する。
【００８６】
本発明の抗体およびポリペプチドは、例えばタンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析法または親和性クロマトグラフィといったような従来の免疫グロブリン精製手順によって培地から適切に分離される。
【００８７】
特定の実施形態においては、本発明のヒトキメラ抗体は、前述の通りＶＬおよびＶＨドメインをコードする核配列を得ること、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターの中に挿入することでヒトキメラ抗体発現ベクターを構築すること、そして動物の細胞内に発現ベクターを導入することでコーディング配列を発現すること、によって生産可能である。
【００８８】
ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、それはヒト免疫グロブリンに属するあらゆる領域であってよいが、ＩｇＧクラスのものが適切であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４といったようなＩｇＧクラスに属するサブクラスのうちのいずれかを使用することもできる。同様に、ヒトキメラ抗体のＣＬとしては、それは、Ｉｇに属するあらゆる領域であってよく、カッパクラスまたはラムダクラスのものを使用することができる。
【００８９】
キメラ抗体を生産するための方法には、従来の組換え型ＤＮＡが関与しており、遺伝子トランスフェクション技術が当該技術分野において周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．ら、（１９８４年）および米国特許第５，２０２，２３８（ＵＳ５，２０２，２３８）；および米国特許第５，２０４，２４４号（ＵＳ５，２０４，２４４）といった特許文献を参照のこと）。
【００９０】
本発明のヒト化抗体は、前述の通りＣＤＲドメインをコードする核酸配列を獲得すること、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクター内に挿入することでヒト化抗体発現ベクターを構築すること、そして動物細胞内発現ベクターを導入することにより遺伝子を発現することによって生産され得る。
【００９１】
ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上で存在しているタイプのものであってもよいし、または両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のものであってもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞内への導入の容易さ、および動物細胞内の抗体ＨおよびＬ鎖の発現レベル間の平衡に関しては、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好適である（Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋら、１９９４年）。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４（ＷＯ９７／１０３５４））、ｐＥＥ１８などが含まれる。
【００９２】
従来の組換え型ＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術に基づくヒト化抗体を生産するための方法は、当該技術分野において周知である（たとえばＲｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら、１９８８年；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ．ら、１９８５年を参照）。抗体は、例えばＣＤＲ移植（欧州特許第２３９，４００号（ＥＰ２３９，４００）；ＰＣＴ出願国際公開第９１／０９９６７（ＷＯ９１／０９９６７）；米国特許第５，２２５，５３９号（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，２２５，５３９）；第５，５３０，１０１号（５，５３０，１０１）；および第５，５８５，０８９号（５，５８５，０８９））、ベニアリングまたはリサーフェーシング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｒ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号（ＥＰ５９２，１０６）；欧州特許第５１９，５９６号（ＥＰ５１９，５９６）；Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ＧＭら（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａ  ＭＡ．ら（１９９４年））、およびチェインシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．５，５６５，３３２）を含む当該技術分野において公知のさまざまな技術を用いてヒト化可能である。かかる抗体の調製のための一般的な組換え型ＤＮＡ技術も、同様に公知である（欧州特許出願第１２５０２３号（ＥＰ１２５０２３）および国際特許出願第９６／０２５７６号（ＷＯ９６／０２５７６）を参照）。
【００９３】
本発明のＦａｂは、プロテアーゼ、パパインを用いてヒトＡＭＨＲ−ＩＩと特異的に反応する抗体を処理することによって得ることができる。同様に、Ｆａｂは、原核生物発現系または真核生物発現系のためのベクターの中に抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを挿入し、ベクターを（適宜）原核生物または真核生物内に導入してＦａｂを発現することによって生産可能である。
【００９４】
本発明のＦ（ａｂ）’２は、プロテアーゼ、ペプシンを用いてＡＭＨＲ−ＩＩと特異的に反応する抗体を処理することによって得ることができる。同様に、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して以下で記述するＦａｂ’を結合することによって、Ｆ（ａｂ’）２を生産することもできる。
【００９５】
本発明のＦａｂ’は、還元剤ジチオトレイトールを用いてｈＡＭＨＲ−ＩＩと特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を処理することによって得ることができる。同様に、Ｆａｂ’は、原核生物のための発現ベクターまたは原核細胞のための発現ベクターの中に抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを挿入すること、そして（適宜）原核生物または真核生物内にベクターを導入してその発現を実施することによって得ることができる。
【００９６】
本発明のｓｃＦｖは、前述した通りＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを獲得すること、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、ＤＮＡを原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターの中に挿入すること、そして次に発現ベクターを（適宜）原核生物または真核生物内に導入してｓｃＦｖを発現することによって生産可能である。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成するためには、ドナーｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、既知の３次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワーク上にそれらを移植することが関与する、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用してもよい（たとえば国際公開第９８／４５３２２号（Ｗ０９８／４５３２２）；第８７／０２６７１号（ＷＯ８７／０２６７１）；米国特許第５，８５９，２０５号（ＵＳ５，８５９，２０５）；米国特許第５，５８５，０８９号（ＵＳ５，５８５，０８９）；米国特許第４，８１６，５６７号（ＵＳ４．８１６，５６７，）；欧州特許第０１７３４９４号（ＥＰ０１７３４９４））。
【００９７】
本発明の抗体の修飾
本書で記述されている抗体のアミノ酸配列修飾（単複）が企図されている。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性を改善することが望ましいかもしれない。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ内に非ヒト動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬ内のＣＤＲのみを単に移植するだけでヒト化抗体を生産する場合に、非ヒト動物に由来する原初の抗体のものと比べて抗原結合抗体は削減される、ということは公知である。ＣＤＲ内のみならずＦＲ内の非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの複数のアミノ酸残基が、抗原結合活性と直接的または間接的に結びつくと考えられている。かくして、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基でこれらのアミノ酸残基を置換することによって、結合活性は削減されるものと思われる。この問題を解決するためには、ヒトＣＤＲが移植された抗体において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、抗体に対する結合と直接結びつくか、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するか、または抗体の３次元構造を維持し、かつ抗原に対する結合と直接結びつくアミノ酸残基を同定する試みをなさなければならない。削減された抗原結合活性は、非ヒト動物に由来する当初の抗体のアミノ酸残基で同定されたアミノ酸を交換することによって増大させることができると考えられる。
【００９８】
本発明の抗体の構造およびそれらをコードするＤＮＡ配列内で、修飾および変更を行ない、なおも、望ましい特性をもつ抗体およびポリペプチドをコードする機能的分子を得ることができる。
【００９９】
アミノ酸の変更は、表２に従ってＤＮＡ配列内のコドンを変更することによって達成可能である。
【０１００】
【表２】
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【０１０１】
ポリペプチドのアミノ酸配列の変更を行なう際には、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮してよい。タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与する上でのヒドロパシー指数の重要性は、当該技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的ヒドロパシ特性が、結果として得られタンパク質の二次構造に寄与し、この二次構造自体が例えば酵素、基質、レセプタ、ＤＮＡ、抗体、抗原などといったその他の分子とタンパク質の相互作用を定義づけする、ということが受入れられている。各々のアミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて１つのヒドロパシー指数が割当てられており、これらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリンン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（＜ＲＴＩ３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン。
【０１０２】
本発明のさらなる目的は同様に、本発明の抗体の機能−保存的変異体をも包含する。
【０１０３】
例えば、一部のアミノ酸は、大きな活性損失なくタンパク質構造内のその他のアミノ酸によって置換され得る。１つのタンパク質の相互作用的能力および性質はそのタンパク質の生物学的機能活性を定義づけることから、１つのタンパク質配列内そして当然のことながらそのＤＮＡコーディング配列内でいくつかのアミノ酸置換を行ない、それでもなお同様の物性をもつタンパク質を得ることが可能である。かくして、本発明の抗体配列内または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列内で、それらの生物活性を著しく喪失することなく、さまざまな変更を行なうことができる、ということが企図されている。
【０１０４】
当該技術分野においては、一部のアミノ酸が類似のヒドロパシー指数またはスコアをもつその他のアミノ酸により置換され、なおも類似の生物活性をもつタンパク質を結果としてもたらす、すなわちなおも生物学的機能が等価であるタンパク質を得ることができる、ということは公知である。
【０１０５】
したがって、以上で概略的に記された通り、アミノ酸置換は一般に、例えばその疎水性、親水性、電荷、サイズなどといったアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいている。上述の特性のうちのさまざまなものを考慮する例示的置換は、当業者にとっては周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシンが含まれる。
【０１０６】
例えば、抗原の抗原−依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクタ機能に関して本発明の抗体を修飾することも望ましいかもしれない。これは、抗体のＦｃ領域内に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成可能である。代替的にまたは付加的に、システイン残基（単複）をＦｃ領域内に導入し、かくしてこの領域内での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にしてもよい。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力および／または増大した補体媒介型細胞殺滅および／または抗体依存性細胞型細胞障害（ＡＤＣＣ）を有し得る（Ｃａｒｏｎ  ＰＣ．ら、１９９２年；およびＳｈｏｐｅｓ  Ｂ．１９９２年）。
【０１０７】
本発明の抗体のアミノ酸修飾のもう１つのタイプは、抗体の原初のグリコシル化パターンを改変するために有用であり得る。
【０１０８】
「改変する」という用語は、抗体の中に見出される１つ以上の炭水化物部分を削除することおよび／または抗体内に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を添加することを意味する。
【０１０９】
抗体のグリコシル化は、標準的にＮ−リンクである。「Ｎ−リンク」というのは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の付着を意味する。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素付着のための認識配列である。かくして、ポリペプチド内のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。抗体に対するグリコシル化部位の添加は、それが（Ｎ−リンクグリコシル化部位のために）上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上のものを含んでいるような形でアミノ酸配列を改変させることによってうまく達成される。
【０１１０】
もう１つのタイプの共有結合修飾には、抗体に対して化学的にまたは酵素によりグリコシドをカップリングすることが関与する。これらの手順は、ＮまたはＯリンクのグリコシル化についてのグリコシル化能力をもつ宿主細胞内での抗体の産生を必要としないという点において有利である。使用されるカップリング様式に応じて、糖（単複）を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものといったような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、オルヒドロキシプロリンのものといったような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのものといったような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に対し付着させてよい。例えば、かかる方法は国際公開第８７／０５３３０号（ＷＯ８７／０５３３０）の中で記述されている。
【０１１１】
抗体上に存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的かまたは酵素的に達成可能である。化学的脱グリコシル化には、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価の化合物に対する抗体の曝露が必要である。この処理の結果、抗体を無傷のままに残しながら、リンクする糖以外の大部分または全ての糖が分割されることになる（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）。化学的脱グリコシル化については、Ｓｏｊａｈｒ  Ｈ．ら（１９８７年）およびＥｄｇｅ，ＡＳ．ら（１９８１年）により記述されている。抗体上の炭水化物部分の酵素分割は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，ＮＲ．ら（１９８７年）により記述されているように、さまざまなエンドおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって達成可能である。
【０１１２】
抗体のもう１つのタイプの共有結合修飾には、米国特許第４，６４０，８３５号（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６４０，８３５）；第４，４９６，６８９号（４，４９６，６８９）；第４，３０１，１４４号（４，３０１，１４４）；第４，６７０，４１７号（４，６７０，４１７）；第４，７９１，１９２号（４，７９１，１９２）または第４，１７９，３３７号（４，１７９，３３７）で示されている要領での例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンといったようなさまざまな非タンパク性重合体の１つに抗体を連結させることが含まれる。
【０１１３】
免疫抱合体
本発明は、細胞毒性剤または成長阻害剤といったような抗癌剤に抱合された本発明の抗体を含む免疫抱合体に関する。
【０１１４】
本書で使用する「成長阻害剤」というのは、細胞、特に卵巣癌細胞の成長をインビトロまたはインビボで阻害する化合物または組成物を意味する。成長阻害剤の例としては、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘発する作用物質といったような、細胞周期の進行を遮断する作用物質が含まれる。従来のＭ期ブロッカーにはビンカ（ビングリスチンおよびビンブラスチン）、タキサンおよびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの作用物質は同様に、Ｓ期停止、例えばＤＮＡアルキル化剤例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシルといったＤＮＡアルキル化剤にも波及する。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方ともイチイから誘導された抗癌薬である。ヨーロッパイチイから誘導されたドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセルの半剛性類似体である（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）。パクリタキセルおよびドセタキセルは、脱重合を防止して細胞内の有糸分裂を結果として阻害することにより、チュブリン二量体からの微小管の集合を促進し微小管を安定化させる。
【０１１５】
本書で使用されている「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害または防止しかつ／または細胞の破壊をひき起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、たとえばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたはその他の挿入剤、酵素およびそのフラグメント例えば核酸分解酵素、抗生物質および毒素例えば小分子毒素または、そのフラグメントおよび／または変異体を含めた細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的に活性な毒素、例えばゼロニン、リシン、サポリンおよび以下で開示されているさまざまな抗腫瘍または抗癌剤を内含するように意図されている。その他の細胞毒性剤が以下で記述されている。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊をひき起こす。
【０１１６】
細胞毒性剤または成長阻害剤と本発明の抗体の抱合は、限定的な意味なくＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ｂｉｓ−アジド化合物（例えばｂｉｓ（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ｂｉｓ−ジアゾニウム誘導体（例えばｂｉｓ−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６ジイソシアネート）およびｂｉｓ−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンを含むさまざまな２機能性タンパク質カップリング剤を用いて行なうことができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７年）で記述されている通りに調製され得る。炭素標識された１−イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性ヌクレオチドの抱合のための例示的キレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号（ＷＯ９４／１１０２６））。
【０１１７】
リンカーは、細胞内の細胞毒性剤または成長阻害剤の放出を容易にする「分割可能なリンカー」であってよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感応性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（例えば米国特許第５，２０８，０２０号（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２０８，０２０）参照）を使用してよい。
【０１１８】
代替的には、組換え型技術またはペプチド合成により、抗体および細胞毒性剤または成長阻害剤を含む融合タンパク質を作ることができる。ＤＮＡの長さは、抱合体の所望の物性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離されているかまたは互いに隣接している抱合体の２つの部分をコードするそれぞれの領域を含んでいてよい。
【０１１９】
本発明の抗体は同様に、プロドラッグ（例えば、ペプチジル系化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号（ＷＯ８１／０１１４５）参照）を活性抗癌薬（例えば国際公開第８８／０７３７８号（ＷＯ８８／０７３７８）および米国特許第４，９７５，２７８号（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９７５，２７８）参照）へと転換させるプロドラッグ活性化酵素に抗体を抱合させることによって、依存性酵素媒介型プロドラッグ療法において使用してもよい。ＡＤＥＰＴに有用な免疫抱合体の酵素構成要素には、より活性な細胞毒性形態へと転換させるような形でプロドラッグに対し作用する能力をもつあらゆる酵素が含まれる。本発明の方法において有用である酵素には、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物へと転換するために有用であるアルカリホスファターゼ；リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物へと転換するために有用なアリールスルファターゼ；非毒性フルオロシトシンを抗癌薬、５−フルオロウラシルへと転換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物へと転換させるために有用であるプロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、テルモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えばカテプシンＢおよびＬ）；Ｄ−アミノ酸置換体を含有するプロドラッグを転換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物へと転換するために有用なＯ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼといったような炭水化物分割酵素；Ｐ−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に転換するのに有用なＰ−ラクタマーゼそして、それぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でそのアミン窒素において誘導体化された薬物を遊離薬物へと転換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼといったようなペニシリンアミダーゼが含まれるが、これらに限定されるわけではない。酵素は、以上で論述されたヘテロ二官能性架橋試薬の使用といったような当該技術分野において周知の技術により抗体に共有結合され得る。
【０１２０】
診断方法および使用：
本発明のさらなる目的は、ＡＭＨＲ−ＩＩ発現と結びつけられる癌疾患を診断しかつ／または監視するための本発明の抗体の使用に関する。ＡＭＨＲ−ＩＩ発現と結びつけられる癌疾患には、標準的に卵巣癌が含まれる。好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、顆粒膜細胞腫瘍および上皮性卵巣癌を含めた卵巣癌を診断するために有用である。
【０１２１】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、検出可能な分子または物質、例えば螢光性分子、放射性分子または当該技術分野において既知のその他のあらゆる標識を用いて標識されてよい。一般にシグナルを（直接的または間接的に）提供する標識が、当該技術分野において公知である。
【０１２２】
本書で使用されている、抗体に関する「標識された」という用語は、抗体に対して放射性作用物質または蛍光プローブ（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））といったような検出可能な物質をカップリング（すなわち物理的連結）することによる抗体の直接的標識、ならびに検出可能な物質との反応性による抗体の間接的標識を包含するように意図されている。
【０１２３】
本発明の抗体を、当該技術分野にとって公知のあらゆる方法により放射性分子で標識してよい。例えば、放射性分子には、Ｉ１２３、１１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８といったようなシンチグラフ検査用の放射性原子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の抗体は同様に、イオジン−１２３、イオジン−１３１、インジウム−ＩＩＩ、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄といったような核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像法（磁気共鳴映像法ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識で標識してもよい。
【０１２４】
「生体試料」というのは、対象から得られたさまざまな試料タイプを包含し、診断または監視検定において使用できる。生体試料には生物由来の血液およびその他の液体試料、固体組織試料、例えば生検標本または組織培養またはそれらに由来する細胞およびその後代が含まれるがそれらに限定されるわけではない。例えば、生体試料には、ＡＭＨＲ−ＩＩ発現と結びつけられる癌疾患の疑いがある個体から、そして好ましい実施形態においては卵巣から収集された組織試料から得た細胞が含まれる。したがって、生体試料は、臨床試料、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液および組織試料を包含する。
【０１２５】
本発明の抗体は、ＡＭＨＲ−ＩＩ発現と結びつけられる癌疾患の病期分類（例えば放射性イメージングにおける）のために有用であり得る。例えば、本発明の抗体は、卵巣癌を病期分類するために有用であり得る。これらは、ＣＡＩ２５、ＨＥ４、およびメソテリンを含む（ただしそれらに限定されるわけではない）その他の卵巣癌マーカーと組合せた形でかまたは単独で使用可能である。
【０１２６】
本書で使用される「検出」という用語は、対照を基準にしたまたはこれを基準としない定性的および／または定量的検出（測定レベル）を含む。
【０１２７】
もう１つの態様においては、本発明は、本発明の抗体を用いて対象から細胞上のＡＭＨＲ−ＩＩを検出することにより対象の体内のＡＭＨＲ−ＩＩ発現に結びつけられる癌疾患を診断する方法である。特にこの診断方法は、
（ａ）ＡＭＨＲ−ＩＩ発現と結びつけられる癌疾患を患う可能性の高い対象の生体試料と本発明に従った抗体を、この抗体がＡＭＨＲ−ＩＩを発現する生体試料の細胞と錯体を形成するのに充分な条件で接触させるステップ；
（ｂ）前記錯体を検出しかつ／または定量化し、かくして前記錯体の検出が、ＡＭＨＲ−ＩＩの発現に結びつけられた癌疾患を標示するステップ；
から成るステップを含み得る。
【０１２８】
癌疾患を監視するためには、本発明に従った診断方法を異なる時間的間隔で反復して、試料に結合する抗体が増加するかまたは減少するかを見極め、かくして癌疾患が進行しているか退行しているかを判定することができる。
【０１２９】
治療方法および使用
本発明の抗体、フラグメントまたは免疫抱合体は、ヒトＡＭＨＲ−ＩＩの発現と結びつけられるあらゆる癌疾患を治療するのに有用であるかもしれない。本発明の抗体は、単独で、または任意の適切な作用物質と組合せた形で使用可能である。
【０１３０】
治療用モノクローナル抗体が、抗体によって特異的に認識される抗原を担持する細胞の枯渇を導き得るということは周知である。この枯渇は、少なくとも３つの機序、すなわち抗体媒介型細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性溶解および抗体によりターゲティングされた抗原を介して与えられたシグナルを通した腫瘍成長の直接的抗腫瘍阻害、を通して媒介され得る。
【０１３１】
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」というのは、補体の存在下での標的細胞の分解を意味する。従来の補体経路の活性化は、その同種抗原に結合した抗体に対する補体系の第１の構成要素の結合によって開始される。補体の活性化を査定するためには、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９７年）の中で記述されている通りのＣＤＣ検定を実施することができる。
【０１３２】
「抗体依存性細胞媒介型細胞毒性」つまり「ＡＤＣＣ」は、或る種の細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃレセプタ（ＦｃＲｓ）上に結合した分泌された抗体が、これらの細胞毒性エフェクタ細胞の抗原担持標的細胞に対する特異的結合そしてその後の標的細胞殺滅を可能にする、細胞毒性の１つの形を意味する。問題の分子のＡＤＣＣ活性を査定するためには、米国特許第５，５００，３６２号（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５００，３６２）または第５，８２１，３３７号（５，８２１，３３７）の中で記述されているもののようなインビトロＡＤＣＣ検定を実施してよい。
【０１３３】
もう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、前述の通りの成長阻害剤、細胞毒性剤またはプロドラッグ活性化酵素に抱合されてよい。本発明の抗体は実際、前記成長阻害剤、細胞毒性剤またはプロドラッグを、ＡＭＨＲ−ＩＩを発現する腫瘍細胞にターゲティングするために有用であり得る。
【０１３４】
かくして、本発明の１つの目的は、ＡＭＨＲ−ＩＩの発現と結びつけられる癌疾患を治療するための方法において、治療上有効な量の本発明の抗体、フラグメントまたは免疫抱合体を、それを必要としている対象に対して投与するステップを含む方法に関する。
【０１３５】
ヒトＡＭＨＲ−ＩＩの発現に結びつけられる癌疾患は、標準的には卵巣癌を含む。好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、顆粒膜細胞腫瘍および上皮性卵巣癌を含む卵巣癌を治療するために有用である。
【０１３６】
本発明に関しては、本書で使用されている「治療する」または「治療」という用語は、かかる用語が適用される障害または身体条件またはかかる障害または身体条件の１つ以上の症候群を逆行させる、軽減させる、その進行を阻害するまたはそれを予防することを意味する。本書に使用された通りの「卵巣癌を治療する」という用語は、卵巣癌細胞の成長の阻害を意味する。好ましくはかかる治療は、同様に、腫瘍成長の退行すなわち測定可能な腫瘍のサイズの減少も導く。最も好ましくは、かかる治療は、腫瘍の完全な退行を導く。
【０１３７】
本発明に従うと、「患者」または「それを必要とする患者」という用語は、ＡＭＨＲ−ＩＩの発現を伴う癌疾患に罹患したかまたは罹患する確率の高いヒトまたは非ヒト哺乳動物を意図している。
【０１３８】
本発明のポリペプチドの「治療上有効な量」というのは、あらゆる医療的処置に適用可能な適正な損益比で前記癌疾患を治療するのに充分な量の抗体を意味する。しかしながら、本発明の抗体および組成物の合計一日使用量は、健全な医療上の判断の範囲内で担当医により決定されるというように理解されるものとする。任意の特定の患者のための特定の治療上有効な用量レベルは、治療対象の障害およびこの障害の重症度；利用される特定の抗体の活性；利用される特定の組成物、患者の年令、体重、全身的健康状態、性別および食生活；利用される特定の抗体の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療の持続期間；利用される特定のポリペプチドと組合わせてまたはそれと同時に使用される薬物；そして医療の分野で周知の類似の要因を含めた、さまざまな要因により左右されるものである。例えば、所望の治療的効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を漸進的に増加させることは、当該技術分野の技能の範囲内において周知である。
【０１３９】
本発明のもう１つの目的は、ＡＭＨＲ−ＩＩの発現と結びつけられる癌疾患を治療するように意図された薬剤の製造のための本発明の少なくとも１つの抗体、フラグメントまたは免疫抱合体の使用に関する。
【０１４０】
本発明の抗体は、卵巣癌を治療するためのその他のあらゆる治療的戦略（例えば外部放射線治療、化学療法またはサイトカイン）と組合せた形で使用可能である。
【０１４１】
薬学組成物
本発明のポリペプチド、核酸または抱合体は、薬学的に受容可能な賦形剤そして任意には持続放出マトリクス例えば生分解性重合体と組合せて治療用組成物を形成することができる。
【０１４２】
「薬学的に」または「薬学的に受容可能な」という用語は、適宜哺乳動物特にヒトに投与した場合に副作用、アレルギー反応またはその他の有害な反応を生成しない分子的実体および組成物を意味する。薬学的に受容可能な担体または賦形剤というのは、あらゆるタイプの非毒性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料または処方助剤を意味する。
【０１４３】
薬学組成物の形態、投与経路、投薬量および投薬計画は、当然のことながら、治療すべき身体条件、疾病の重症度、患者の年令、体重および性別などによって左右される。
【０１４４】
本発明の薬学組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋内、皮下または眼球内投与など向けに処方可能である。
【０１４５】
好ましくは、薬学組成物は、注射可能な処方物用として薬学的に受容可能であるビヒクルを含有している。これらは、特に等張で無菌の食塩溶液（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩酸ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムなどまたはかかる塩の混合物）または、場合に応じて滅菌水または生理食塩水を付加した時点で注射溶液を構成することのできる乾燥、特に凍結乾燥組成物であってよい。
【０１４６】
投与のために使用される用量はさまざまなパラメータの一関数として、特に、使用される投与様式、関連する病理また代替的には所望の治療持続期間の関数として適合させることができる。
【０１４７】
薬学組成物を調製するためには、有効量の抗体を薬学的に受容可能な担体または水性媒質中に溶解または分散させることができる。
【０１４８】
注射用に適した薬学的形態には、無菌水溶液または分散；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む処方物；および無菌注射溶液または分散の即席調製用無菌粉末が含まれる。全てのケースで、この形態は無菌でなくてはならず、容易に注入可能である程度に流動的でなくてはならない。それは、製造および貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌および真菌といったような微生物の汚染作用に対し保護されていなければならない。
【０１４９】
遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースといったような界面活性剤と適切に混合された水の中で調製可能である。グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物の中および油の中で分散を調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための防腐剤を含有している。
【０１５０】
本発明の抗体は、中性または塩形態で組成物の形に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成された）酸付加塩、および、無機酸例えば塩酸またはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などといった有機酸で形成される塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成された塩を、無機塩基例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどといった有機塩基から誘導することもできる。
【０１５１】
担体は同様に、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒質でもあり得る。適切な流動性は、例えばレシチンといったコーティングを使用することによって、分散の場合には所要粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって維持できる。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。数多くのケースにおいて、例えば糖または塩化ナトリウムといった等張剤を内含することが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといったような吸収を遅延させ作用物質を組成物中に使用することでもたらすことができる。
【０１５２】
無菌注射溶液は、必要に応じて以上で列挙したその他の成分のうちのさまざまなものと共に適切な溶媒中に所要量で活性化合物を取込み、その後ろ過滅菌を行なうことによって調製される。一般に、分散は、塩基性分散媒質および以上で列挙したものからのその他の所要成分を含有する無菌ビヒクル内にさまざまな滅菌済み活性成分を取込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および予め無菌ろ過されたその溶液からの付加的な所望の成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１５３】
極めて急速な浸透を結果としてもたらし小さな腫瘍部域に活性作用物質を高濃度で送達するように溶媒としてのＭＳＤの使用が想定される場合、直接注射のためのより高濃度または極めて高濃度の溶液の調製も企図される。
【０１５４】
処方時点で、溶液は、投薬量処方と相容性あるやり方でかつ治療上有効な量で投与される。これらの処方物は、上述の注射溶液のタイプといったようなさまざまな剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども同様に利用できる。
【０１５５】
例えば水溶液の形での非経口投与のためには、この溶液は、必要とあらば適切に緩衝され、液体希釈剤はまず最初に充分な食塩水またはグルコースで等張にされるべきである。これらの特殊な水溶液は、静脈内、筋内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、利用できる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者にとって公知のものである。例えば、１投薬量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解させ、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加するかまたは提案された輸液部位において注射することができると思われる（例えば「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。治療中の対象の身体条件に応じて、投薬量の幾分かの変動が必然的に発生する。投与を担当する人物は、いかなる場合でも、個々の対象について適切な用量を決定する。
【０１５６】
本発明の抗体は、治療用混合物内で、１用量あたり約０．０００１〜１．０ミリグラムまたは約０．００１〜０．１ミリグラムまたは約０．１〜１．０またさらには約１０ミリグラム程を含むように処方されてよい。複数回用量を投与することもできる。
【０１５７】
静脈内または筋内注射といったような非経口投与向けに処方された化合物に加えて、その他の薬学的に受容可能な形態には、例えば、経口投与用の錠剤またはその他の固体；徐放性カプセル；および現在使用されているその他のあらゆる形態が含まれる。
【０１５８】
或る実施形態においては、宿主細胞内への抗体の導入のために、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が企図されている。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は、当業者にとって公知である。
【０１５９】
ナノカプセルは一般に、安定した再現可能な形で化合物を封入することができる。細胞内重合体過負荷に起因する副作用を回避するため、かかる超微粒子（０．１μｍ前後のサイズ）は一般に、インビボで分解され得る重合体を用いて設計されている。これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が本発明での使用のために企図されており、かかる粒子は容易に作ることができる。
【０１６０】
水性媒質中に分散され自然発生的に多重膜同心２層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から、リポソームが形成される。ＭＬＶは一般に、２５μｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア内に水溶液を含有する２００〜５００Åの範囲内の直径をもつ小さい単膜小胞（ＳＵＶ）の形成を結果としてもたらす。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および２価のカチオンの存在により左右される。
【０１６１】
キット
最後に、本発明は、その少なくとも１つの抗体を含むキットをも提供している。本発明の抗体を収納するキットは、ＡＭＨＲ−ＩＩ発現を検出するためまたは治療または診断検定において使用される。本発明のキットは、固体支持体例えば組織培養平板またはビーズ（例えばセファロースビーズ）にカップリングされた抗体を収納することができる。例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて、インビトロでＡＭＨＲ−ＩＩを検出し定量化するための抗体を収納するキットを提供することができる。検出に有用なこのような抗体には、螢光または放射性標識といったような標識が備わっていてよい。
【実施例】
【０１６２】
Ａ．材料と方法：
マウスハイブリドーマからのＶＨおよびＶκ遺伝子のｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅：メーカーにより記述されているようにＲＮ  ｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて５×１０６個の１２Ｇ４ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した。抽出後、全ＲＮＡ調製物の小さな画分を取り上げて、試料の数量と全ＲＮＡ収量を決定した。ＲＮＡの濃度および純度を確認するために紫外分光法により検査を行なった。全ＲＮＡプロファイルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００生物分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州パロアルト）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐａキットを用いて分析して、その数量およびその無欠性を決定した。メーカーにより記述されている通りに、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いての２８０ｎｇ（１μｌ）の全ＲＮＡでｃＤＮＡ合成を実施した。第１−ｃＤＮＡ合成反応は、３’ポリ（Ａ）テールにハイブリッド形成するべくオリゴ（ｄＴ）を用いてプライミングした。ｃＤＮＡは使用するまで−２０℃に保った。
【０１６３】
ＰＣＲ増幅は、１μｌのｃＤＮＡ合成反応、１０μＭのｄＮＴＰ、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州ビバリー）を含有する２０μｌの最終体積でＰＣＲ増幅を実施した。それぞれ軽鎖または重鎖定常領域ＲｅｖＣκＳａｌｌおよびＲｅｖＣλＳａｌｌプライマと整合する適切な３’−オリゴヌクレオチドプローブおよびファミリ特異的５’プライマの各グループを用いて、１４のＶＨおよび１８のＶκＰＣＲ反応を設定した。使用されたプライマは、Ｃｈａｒｄｅｓら（１９９９年）によって記述されているものである（参考文献の表１および２を参照のこと）。
【０１６４】
全てＶＨまたはＶκ５’プライマを含有する２つの混合物も同様に設定した。ＶＨ１３（３６０９Ｎ）遺伝子ファミリに割当てられた唯一の報告済み成員がＰＣ３６０９の非機能的対立遺伝子であることから、この遺伝子ファミリに特異的なプライマで行なわれたＰＣＲ反応はなかった。使用された各プライマの量は、当初１０ｐＭであった。反応混合物を５分間９４℃まで加熱し、その後、２ＵのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、１時間９４℃、１分間５５℃、そして２分間７２℃の３０サイクルで増幅を実施した。７２℃で１０分間拡張した後、ＰＣＲ産物を１．５％のアガロースを通して分画し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで染色した。Ｖκ増幅用の３９０ｂｐ産物およびＶＨ増幅用の４５０ｂｐ産物を導く５’プライマと３’プライマのセットをこのファミリ特異的ＰＣＲスクリーニングから選択した。同じ選択されたプライマを用いた５つの複製を、前述の通りの新たなＰＣＲに付した。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ産物を１．５％の低溶融温度のアガロースゲル（Ｇｉｂｃｏ）上でゲル精製した。
【０１６５】
増幅されたＶ遺伝子の直接的ヌクレオチド配列決定；ＮＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ドイツ、ミュンヘン）の標準配列決定反応のためのＶａｌｕｅ  Ｒｅａｄサービスを用いて５００ｎｇの各ＰＣＲ産物から、直接的配列決定を実施した。
【０１６６】
Ｂ−結果
任意の免疫グロブリン遺伝子ファミリからのマウス可変領域の効率の良い増幅および直接配列決定方法を用いて、ｍＡｂ１２Ｇ４のＶＨおよびＶＬ領域の配列を決定した（Ｓｔｒｏｈａｌら、１９８７年）。簡単に言うと、アミノ酸および／またはヌクレオチド配列の類似性に基づいて、マウスＶ遺伝子を１５ＶＨおよび１８Ｖκ遺伝子ファミリへと分類した。全てのＶ遺伝子ファミリから免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子を潜在的に増幅しようとして、Ｓｔｒｏｈａｌらは、各々の重鎖および軽鎖ファミリの比較的保存されたシグナル配列内でハイブリッド形成するリーダープライマの２つの原初のセットを定義した。これらのプライマは、７個の異なるＶκおよび５個の異なるＶＨ遺伝子ファミリに属するドメインを含む、９個のマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）からの全長可変領域を増幅し直接配列決定するために彼らの実験所内で日常的に使用されてきたものである。彼らの戦略は、任意のＩｇ遺伝子ファミリからの可変領域の迅速かつ正確な配列決定が可能となり、臨床的に有利なキメラ抗体の設計を容易にするはずである。
【０１６７】
全ＲＮＡ分析：全ＲＮＡプロファイルを、Ａｇｉｌａｎｔ  ２１００生物分析装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐａキットを用いて分析して、その数量およびその無欠性を決定した。
【０１６８】
遺伝子ファミリ特異的シグナルプライマを用いたマウスハイブリドーマ１２Ｇ４からのＶ遺伝子のＰＣＲ増幅：図１は、所与のＶＨまたはＶκ遺伝子ファミリに対応するシグナルプライマと適切な定常プライマの組合せを用いた、ｍＡｂ１２Ｇ４の（Ａ）ＶＨおよび（Ｂ）Ｖκ鎖領域についてのＰＣＲ増幅産物を示している。高効率のプライマセットが、ＶＨ増幅については４５０ｂｐ産物、そしてＶκ増幅については３９０ｂｐ産物を増幅するはずである。抗−ＡＭＨＲ−ＩＩ−ｍＡｂ１２Ｇ４（ＩｇＧ１／Ｋ）を分泌するハイブリドーマ細胞のｃＤＮＡから、以下のプライマを用いて、予測されたサイズにおける主要なバンドが得られた（図１）：
−  重鎖増幅についてはＶＨ１−Ｊ５５８／ＲｅｖＣλＳａｌｌプライマセット。プライマＶＨ９（ＶＧａｍ３−８）、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２、ＶＨ１４およびＶＨ１５では全く増幅が得られなかった。
−  Ｖκ増幅についてはＶκ４／５／ＲｅｖＣκＳａＩＩまたはＶκ２１／ＲｅｖＣκＳａＩＩプライマセット。
【０１６９】
増幅産物の直接配列決定に従ったｍＡｂ１２Ｇ４からの可変領域の遺伝子特徴づけ：増幅産物の直接配列決定による組立てられた遺伝子のさらなる分析によって、ＶＨ遺伝子が主要ＶＨ遺伝子ファミリー（ＶＨ１）に属していることが示された。Ｖκ４／５遺伝子ファミリは、Ｖκ１２Ｇ４遺伝子をコードする遺伝子ファミリであるものと判定された。Ｖκ２１プライマで増幅されたＶκＰＣＲ産物は、原発性ＭＯＰＣ２１腫瘍に由来するＮＳ１のような骨髄腫細胞系内で転写された非機能的に再構成されたカッパ軽鎖に対応する（Ｃｈａｒｄｅｓら、１９９９年）。各遺伝子ファミリの内部で、最も近い生殖細胞遺伝子を、ＩＭＧＴデータベースを用いて配列決定された可変領域について同定した。ＶＬおよびＶＨ領域の配列を、それぞれ図２および３に示す。
【０１７０】
実施例２：
材料
モノクローナル抗体：
抗−ＡＭＨＲ−ＩＩｍＡｂ１２Ｇ４：細菌内で発現されＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として精製されたヒトＡＭＨＲ−ＩＩ（ＥＣＤ−ｈＡＭＨＲ−ＩＩ）の組換え型細胞外ドメイン（Ｇｏｕｅｄａｒｄ  Ｌ．ら、２０００年）を免疫原として使用した。１回目の注射のためには完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中そしてその後の注射については不完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の２０μｇのタンパク質を用いて、３週間の間隔で、腹腔内で４回ＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫付与することによって、マウスハイブリドーマを生成した。４回目の免疫付与から３週間後にＥＣＤ−ｈＡＭＨＲ−ＩＩの静脈内ブースタ注射を行なった。３日後に、マウス骨髄腫細胞系Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．８．６５３と、免疫付与したマウスからの脾細胞を融合させた。新たに生成されたクローンからの上清を、ＥＣＤ−ｈＡＭＨＲ−ＩＩを用いてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。上清のｈＡＭＨＲ−ＩＩに対する特異性を、ＡＭＨＲ−ＩＩ陽性細胞についての螢光活性化細胞選別（ＦＡＣ）によって確認した。
【０１７１】
抗−ＨＥＲ２ＭＡｂ：マウスｍＡｂＦＲＰ５（Ｈａｒｗｅｔｈ  Ｉ．ら、１９９２年）およびヒト化トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を使用した。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンフランシスコ）から購入した。
【０１７２】
対照として用いられるＭＡｂ：対照実験においては、（ＣＥＡ  Ｇｏｌｄ２エピトープについて特異的である）抗−ＣＥＡモノクローナル抗体３５Ａ７（Ｈａｓｋｅｌｌ  Ｃ．ら、１９８３年；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｓ．ら、１９８９年）およびＰＸ（マウス骨髄腫Ｐ３−Ｘ６３から精製された正常なマウスＩｇＧ１（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．１９７５年）を、無関連抗体として使用した。全てのマウスＩｇＧ１ＭＡｂを、硫酸アンモニウム沈降（４℃で４５％飽和）とそれに続くＰＥ５２セルロース上のイオン交換クロマトグラフィによりマウスハイブリドーマ腹水から精製した（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｂａｌｓｔｏｎ、英国）。
【０１７３】
細胞系および培養条件：ヒト顆粒膜腫瘍細胞系ＣＯＶ４３４は、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  −  Ｂａｋｋａｎチーム（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ−  Ｂａｋｋｅｒ  Ｃ．ら、１９９３年）から提供して頂いた。トランスフェクションを受けたＡＭＨＲ−ＩＩ−陽性ＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲ−ＩＩ１Ｆ３細胞系統を得るために、我々は、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクター（ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクションキット、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてヒトＡＭＨＲ−ＩＩについてのコーディングｃＤＮＡでＧＣＴ腫瘍細胞系ＣＯＶ４３４を安定した形でトランスフェクションし、その後ＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲ−ＩＩ１Ｆ３細胞系をサブクローニングした。
【０１７４】
全ての細胞系を、１０％の熱不活性化されたウシ胎仔血清、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ペニシリン（０．１ＩＵ／ｍＬ）およびアンフォテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭＦ１２培地内で成長させた。細胞を５％のＣＯ２雰囲気内で３７℃で成長させ、培地を一週間に２回交換した。トリプシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）ＥＤＴＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を用いて細胞の収穫を行なった。すべての培地補足物は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，メリーランド州ゲイサーズバーグ）から購入した。トランスフェクションした細胞については、培地内にジェネティシン（０．６７％）を添加した。
【０１７５】
Ｂ．方法と結果
インビトロおよびインビボ研究のためのＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲ−ＩＩ１Ｆ３細胞系のフローサイトメトリ分析：それぞれにマウス抗−ＡＭＨＲ−ＩＩ（１２Ｇ４）および抗−ＨＥＲ２（ＦＲＰ５）抗体を用いてフローサイトメトリ（ＦＡＣ）によりＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲ−ＩＩ１Ｆ３を分析した。洗浄後、一次抗体を検出するべく抗マウスＦＩＴＣ抱合モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。二次抗体との細胞の直接的インキュベーションを、背景測定のために使用した。最低２００００件の事象を観察することによって、ＦＡＣＳｃａｎＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国カリフォルニア州マウンテンビュー）上で試料を分析した。負の対照として、野生型（ｗｔ）ＣＯＶ４３４細胞系を使用した（図４）。ＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ，デンマーク）を用いたこの技術により、我々は、約１０４個のＡＭＨＲ−ＩＩレセプタ／細胞および１０３個のＨＥＲ２レセプタ／細胞の発現速度を評価することができた。
【０１７６】
ＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲ−ＩＩ−１Ｆ３でトランスフェクションされた細胞系内でのｍＡｂ１２Ｇ４の内在化の免疫螢光研究：ＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲ−ＩＩ−１Ｆ３細胞内で内在化する抗体の能力を免疫螢光を用いて視覚化した。各々の検定について、３５ｍｍのペトリ皿内に置かれた２２ｍｍの正方形のガラスカバースリップ上でＲＰＭＩを用いて５・１０４個の細胞を成長させた。２日後、対数成長期の間、細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）上で１０μｇ／ｍＬの抗体（無関連ｍＡｂ（ＰＸ）、抗−ＡＭＨＲ−ＩＩ（１２Ｇ４）、抗−ＨＥＲ２（ＦＲＰ５）または抗体無しのいずれか）と共に細胞をインキュベートし、４℃（非内在化条件）に置くかまたは３７℃のインキュベータ（内在化条件）に移した。１８０分経過した時点で、上清を除去し、細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで２回、ＰＢＳで一回洗浄した。ホルマリン（ＰＢＳ中の３．７％のｐ−ホルムアルデヒド）の中で２０分間インキュベートした後、細胞を−２０℃のアセトン中で３０秒間透過性付与した。ＰＢＳの体積を増大させることによって連続的に溶液を希釈した。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中のＦＩＴＣ標識されたヤギ抗マウスＩｇＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｓｉｌｅｎｕｓ、Ｅｕｒｏｂｉｏ、フランス）と共に暗所にて１時間これをインキュベートした。次にこれらをＰＢＳ−ＢＳＡで３回そしてＰＢＳで１回洗浄し、次に１５分間５０μｌの４，６ジアミニド−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ，Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）でインキュベートし、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）による螢光顕微鏡視覚化のために前処理した。
【０１７７】
抗−ＡＭＨＲ−ＩＩ１２Ｇ４および抗−ＨＥＲ２ＦＲＰ５抗体は、３７℃で細胞内で内在化できるもののＰＸはそうではないということが実証された。実際、螢光性小胞が細胞の細胞質内に明確に見える。したがって、ＭＡｂｓも同様に４℃でインキュベートした。全ての活性輸送経路を阻害するものとして知られているこの低い温度で、膜のはるかに強い標識が、４℃でさえ両方の特異的抗体について観察された。これらの特異的抗体のいずれも、観察された強い膜結合にも関わらず、細胞内部に見出されなかった。
【０１７８】
ｍＡｂ１２Ｇ４のインビトロ抗増殖性効果（ＭＴＳ試験）：細胞の生存能力に対するトラスツズマブ、１２Ｇ４、ＦＲＰ５または３５Ａ７の効果をテトラゾリウム塩（ＭＴＳ）および電子カップリング試薬（ＰＭＳ）検定を用いて評価した。簡単に言うと、１００μｌの培地中で５０００細胞／ウェルの割合で９６ウェルのマイクロタイタープレート内でＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲ−ＩＩ−１Ｆ３細胞を平板固定した。９６時間のインキュベーションの後、細胞をＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）試薬に曝露し、２時間３７℃でインキュベートした。４９０ｎｍで吸光度を測定し、生存能力の阻害百分率を、未処理の培養と比較した増殖細胞の百分率として計算した。全ての実験をトリプリケートで実施した。
【０１７９】
結果は、１μｇ／μｌでｍＡｂ１２Ｇ４またはトラスツズマブのいずれかを用いて約２０％の生存能力阻害百分率が観察できるものの、一方同じ濃度で、抗−ＣＥＡ３５Ａ７ｍＡｂでは全く阻害が観察されないということを示している（図５）。トラスツズマブの抗増殖性効果が大々的に実証されてきていることから、これを正の対照として使用した。
【０１８０】
予備的インビボ腫瘍成長阻害研究：実験動物研究のためのフランスの指針（（契約第Ｂ３４−１７２−２７号））に合わせて、全てのインビボ実験を実施した。６〜８週令の雌の無胸性ヌードマウスであるヌードマウスをＨａｒｌａｎ（フランス、ガナ）から購入した。
【０１８１】
５０％の培地および５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，フランス、ルポンドクレ）の中にＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲＩＩ−１Ｆ３（１０・１０６）細胞を懸濁させ、無胸腺ヌードマウスの右脇腹内に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍をもつマウス、腫瘍がおよそ同じ体積に達した時点で異なるグループに無作為に振り分けた。０．９％のＮａＣｌまたはｍＡｂ１２Ｇ４を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）することによってマウスを処置した。ｍＡｂの各回注射量は、連続して５週間週二回で注射一回につき２００μｇであった。
【０１８２】
腫瘍の寸法を週一回キャリパで測定し、Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３／２という公式で体積を計算した。
【０１８３】
腫瘍が１２００ｍｍ３という規定の体積に達するのにかかった時間を用いて、適合カプラン−マイヤー生存率曲線により、結果を表現した（図６）。５０％のマウスが規定の体積に達した腫瘍を有する時点として遅延中央値を定義し、この遅延中央値が対照ＮａＣｌグループに比べ処置を受けたグループについて１４日間長いということが示されている。
【０１８４】
異種移植片におけるＡＭＨＲ−ＩＩ発現の免疫ブロット分析：異種移植された腫瘍からの細胞をレスキューしＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のデオキシコール酸塩、１％のＮＰ４０、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳおよび１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）に溶解させた。還元条件下で１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での電気泳動の後、５％の脱脂粉乳を含有するＰＢＳ中で飽和させたポリニフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，マサチューセッツ州ベッドフォード）にタンパク質を移し、次に抗−ＡＭＨＲ−ＩＩ１２Ｇ４抗体でインキュベートした。
【０１８５】
ＡＭＨＲ−ＩＩは、切除された腫瘍の３つの異なる切片の中で強力に発現させられ、６５ｋＤａで移動する（図７）。
参考資料
【０１８６】
【化１】
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【０１８７】
【化２】
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【０１８８】
【化３】
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【０１８９】
【化４】
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【０１９０】
【化５】
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【０１９１】
【化６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図７】
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【配列表】
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