(57)【要約】      （修正有）【課題】活性が強く、かつ安全性の高いアンチエイジングに関係するメイラード反応阻害剤の提供。及び、該阻外剤を含有する経口剤、外用剤及び食品の提供。【解決手段】マンゴスチン果皮の水抽出物由来である，下記Ｉ式で表わされるマクルリン又はその配糖体を有効成分として含有するメイラード反応阻害剤、およびかかる阻害剤を含有する経口剤、外用剤、食品。2014088376.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクルリン又はその配糖体を有効成分として含有するメイラード反応阻害剤。
【請求項２】
マクルリン又はその配糖体が植物抽出物由来である、請求項１記載のメイラード反応阻害剤。
【請求項３】
植物抽出物がマンゴスチン果皮の水抽出物である、請求項２記載のメイラード反応阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のメイラード反応阻害剤を含有する経口剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のメイラード反応阻害剤を含有する外用剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のメイラード反応阻害剤を含有する食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクルリン又はその配糖体を有効成分として含有するメイラード反応阻害剤に関するものである。また、本発明はかかるメイラード反応阻害剤を含有する経口剤、外用剤、食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
先進国では高齢化社会の到来に伴い、アンチエイジングが注目されている。そして、老化現象を引き起こす機序の一つとして、糖化（メイラード反応）が関与していることが報告されている。
【０００３】
メイラード反応は、還元糖のカルボニル基と蛋白質又はアミノ酸のアミノ基が非酵素的に縮合する反応で、シッフ塩基を経由して、アマドリ転移産物を生成する前期反応と、その後、アマドリ転移産物が分解され、さらに脱水、酸化、縮合、転移等の過程を経て、終末糖化産物群（ＡＧＥｓ）へと変化する後期反応とに分けられる。
ＡＧＥｓが加齢に依存して種々の生体組織に蓄積すること、また、糖尿病合併症、アルツハイマーや動脈硬化などの加齢関連疾患で、ＡＧＥｓの蓄積が有意に増加していることが報告されている。さらに、メイラード反応は、加齢に伴って生じる白内障や軟骨の弾力低下、皮膚の老化の原因となることが報告されている。ＡＧＥｓの一種であるＣＭＬ（カルボキシメチルリジン）は、肌の機能に関わりのある線維芽細胞のアポトーシスを誘導し、肌機能を低下させると考えられている。
【０００４】
このため、メイラード反応抑制作用を有する素材（抗糖化素材）を摂取することにより体内のＡＧＥｓの精製を抑制し、加齢に伴う諸症状を抑制することが期待できるとして、抗糖化素材を使用した食品の開発が盛んである。これらの食品は美容訴求関連食品やロコモティブシンドローム対策の食品としての可能性が期待される。
【０００５】
アミノグアニジンは、強力なメイラード反応阻害剤として知られている（例えば、特許文献１参照）。一方で、この化合物は強い副作用を有することが知られている。
【０００６】
マクルリンは天然染料色素として知られており、染毛性整髪用組成物として用いられている（例えば、特許文献２参照）。また、マンゴスチンに含まれる成分の一つとしてマクルリンが存在するが、その生理作用については知られていない（例えば、特許文献３、４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６２−１４２１１４号公報
【特許文献２】特許３３０９２２１号公報
【特許文献３】特表２００８−５２０５８５号公報
【特許文献４】特表２００６−５０４７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、メイラード反応阻害剤を提供することを主な目的とする。また、本発明は、かかる阻害剤を含有する経口剤、外用剤及び食品を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく検討した結果、マクルリン及び／又はその配糖体がメイラード反応阻害活性を有することを初めて見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明として、下記のものを挙げることができる。
（１）マクルリン又はその配糖体を有効成分として含有するメイラード反応阻害剤。
（２）マクルリン又はその配糖体が植物抽出物由来である、前記１記載のメイラード反応阻害剤。
（３）植物抽出物がマンゴスチン果皮の水抽出物である、前記２記載のメイラード反応阻害剤。
（４）前記１〜３のいずれかに記載のメイラード反応阻害剤を含有する経口剤。
（５）前記１〜３のいずれかに記載のメイラード反応阻害剤を含有する外用剤。
（６）前記１〜３のいずれかに記載のメイラード反応阻害剤を含有する食品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るメイラード反応阻害剤（以下、「本発明阻害剤」という。）は、強い活性を有することから、メイラード反応が関与すると考えられる様々な症状、例えば、癌、糖尿病合併症、白内障、軟骨の弾力低下、皮膚の老化（皮膚の弾力低下、しわやたるみの原因となるコラーゲンの架橋形成、肌のくすみの原因となる色素沈着等）や老化の抑制に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】液液分配スキームを示す図である。
【図２】ｎ−ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）で液液分配した水（Ｈ２Ｏ）層のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。矢印は、マクルリン配糖体のピークを示す。
【図３】酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)で液液分配した水（Ｈ２Ｏ）層のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。矢印は、マクルリン配糖体のピークを示す。
【図４】水飽和ブタノール（ＢｕＯＨ）層のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。矢印は、マクルリン配糖体のピークを示す。
【図５】ＯＤＳカラム  フラクションＮｏ．１５−１８のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。
【図６】マクルリン配糖体のＨＰＬＣチャートを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。
【図７】マクルリン配糖体の吸光スペクトルを示す図である。縦軸は検出強度（ｍＡＵ）を示し、横軸は波長（ｎｍ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
マクルリン及びその配糖体
本発明にかかるマクルリン（Macrulin、一般名：（３，４−ジヒドロキシフェニル）（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）ケトン）は、次の化学式（I）で表される化合物である。また、次の化学式（II)で表される配糖体が存在する。
【００１４】
【化１】
2014088376.tif 000002
【００１５】
【化２】
2014088376.tif 000003
【００１６】
本発明に係るマクルリン及びその配糖体は、市販のものか、植物抽出物から単離したものを用いることができる。また、本発明に係るマクルリン及びその配糖体は、植物抽出物の状態であってもよい。
【００１７】
マクルリン又はその配糖体を含む植物としては、例えば、トウグワ（Ｍｏｒｕｓ  ａｌｂａ  Ｌ．）、アメリカハリグワ（Ｍａｃｌｕｒａ  ｐｏｎｉｆｅｒａ  （Ｒａｆ．）  Ｓｃｈｎｅｉｄ．）、ニオイイリス（Ｉｒｉｓ  ｆｌｏｒｅｎｔｉｎａ  Ｌ．）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ  Ｌ．）、モラル（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｒａ  ｔｉｎｃｔｏｒｉａ  （Ｌ．）  Ｇａｎｄｉｃｈ．）、ゲンチアナロダンザ（Ｇｅｎｔｉａｎａ  ｒｈｏｄａｎｔｈａ  Ｆｒａｎｃｈ．）、ゲンチアナヴェルナ（Ｇｅｎｔｉａｎａ  ｖｅｒｎａ  Ｌ．）、タマゴノキ（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｘａｎｔｈｏｃｈｙｍｕｓ  Ｈｏｏｋ．ｆ．ｅｘ  Ｔ．Ａｎｄｅｒｓ．）、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）が挙げられる。抽出に使用する植物の部位としては、マクルリン又はその配糖体が含まれている部位であれば特に限定されないが、例えば、花、花穂、果皮、果実、果肉、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子、虫えい、心材、地上部、地下部又は全草を用いることができる。中でも、マンゴスチンの果皮が好ましい。
【００１８】
植物抽出物は、マクルリン又はその配糖体を含む植物から通常用いられる方法により製造することができる。具体的には、植物の各部位をそのまま又は適当な大きさに切断し、必要に応じてブランチング又は乾燥し、搾汁又は溶媒で抽出することにより製造することができる。ブランチングは、例えば、植物の各部位を生のままあるいは、冷凍した後に解凍したものを６０℃以上の熱水に５分以内の間、浸すことにより行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水を用いることができる。水の使用量は、用いる植物原料等により異なるが、重量比で、１：２〜１：３０（植物原料：水）の範囲内が適当であり、１：３〜１：２０の範囲内が好ましく、１：５〜１：１０の範囲内がより好ましい。抽出時間は、1時間〜１５日の範囲内が適当である。抽出温度は、５〜１００℃の範囲内が適当であり、６０〜９５℃の範囲内が好ましい。抽出方法については特に制限されず、バッチ抽出、カラムを用いた連続抽出等、任意の方法を適用することができる。
【００１９】
得られた植物抽出物は、そのままの状態で用いることもできるが、必要に応じ、その活性に影響のない範囲内で更に精製処理を加えてもよい。このような精製処理は、通常の方法によって行えばよく、例えば、植物抽出物を常法によりろ過することにより行うことができる。また、得られたろ液を減圧濃縮、凍結乾燥することもできる。
【００２０】
植物抽出物から本発明に係るマクルリン又はその配糖体を単離する方法としては、特に限定されないが、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを挙げることができる。また、それらを組み合わせて単離してもよい。
【００２１】
本発明に係るマクルリン又はその配糖体としては、マンゴスチン果皮の水抽出物が好ましい。特に、６０〜１００℃の熱水で抽出したものが好ましい。より好ましくは、７０〜１００℃の範囲内である。
メイラード反応阻害剤
本発明阻害剤は、マクルリン又はその配糖体を有効成分として含有する。本発明阻害剤は、上記のようにして得られた植物抽出物又はマクルリン若しくはその配糖体を、そのまま又は担体として使用することのできる素材と混合し、次いで、常法により粉末状、塊状、液状等の各種形態に加工することにより製造することができる。
本発明阻害剤には、任意に医薬上又は食品上許容される添加物を配合することができる。かかる添加物としては、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、酸化防止剤、賦形剤、界面活性剤、紫外線防止剤、金属イオン封鎖剤、増粘剤、防腐剤、抗菌剤、保湿剤、色素を挙げることができ、これらを１種又は２種以上使用することができる。
本発明阻害剤におけるマクルリン又はその配糖体の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．０００１〜５０重量％（以下、単に「％」という）、の範囲内が適当であり、好ましくは、０．００１〜１０％の範囲内である。
【００２２】
本発明阻害剤の摂取量は、症状、剤型、投与対象者の年齢、体重等により異なるが、通常、成人１日当り、マクルリン又はその配糖体の重量として、０．０１ｍｇ〜１０ｇの範囲内とするのが適当であり、０．０３ｍｇ〜５ｇの範囲内とするのが好ましいが、必ずしもこの範囲に限られるものではない。かかる１日当りの摂取量は、１回で摂取してもよく、また、２〜４回に分割して摂取してもよい。
経口剤
本発明に係る経口剤は、本発明阻害剤を含有する、経口摂取が可能な組成物を意味する。本発明に係る経口剤は、本発明阻害剤をそのまま又は必要に応じて、経口剤を製造する際に用いられる医薬上又は食品上許容される添加剤とを適量配合したものを、常法により製剤化することにより得ることができる。かかる添加剤としては、賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、調味料、香料、滑沢剤等を挙げることができる。
本発明に係る経口剤の製剤化に際して、他の生理機能を有する素材を配合することもできる。
本発明に係る経口剤の剤型は特に限定されず、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤を挙げることができる。
本発明に係る経口剤におけるマクルリン又はその配糖体の含有量としては、剤型等に合わせて適宜調製すればよいが、例えば、製剤全量中、マクルリン又はその配糖体の量として、０．０００１〜５０％の範囲内が適当であり、好ましくは、０．００１〜１０％の範囲内である。
本発明に係る経口剤の摂取量は、剤型、投与対象者の年齢、体重等により異なるが、通常、成人１日当り、マクルリン又はその配糖体の重量として、０．０１ｍｇ〜１０ｇの範囲内とするのが適当であり、０．０３ｍｇ〜５ｇの範囲内とするのが好ましいが、必ずしもこの範囲に限られるものではない。かかる１日当りの摂取量は、１回で摂取してもよく、また、２〜４回に分割して摂取してもよい。
外用剤
本発明に係る外用剤は、本発明阻害剤を含有する、外用で使用することが可能な組成物を意味する。
【００２３】
本発明に係る外用剤は、本発明阻害剤をそのまま又は必要に応じて、外用剤を製造する際に用いられる医薬上許容される添加剤を適量配合したものを常法により製剤化することにより得ることができる。かかる添加剤としては、軟膏用基剤、アルコール、多価アルコール、水溶性高分子、酸化防止剤、ｐH調整剤、紫外線防止剤、金属イオン封鎖剤、増粘剤、界面活性剤、精製水、防腐剤、抗菌剤、油剤、高級脂肪酸、脂肪酸エステル、保湿剤、色素、ビタミン類、アミノ酸類等を挙げることができる。
さらに、本発明阻害剤を、公知の医薬部外品、化粧品に配合して本発明に係る外用剤として用いることもできる。
本発明に係る外用剤には、本発明阻害剤のほか、老化抑制効果を高めるための成分を更に配合したり、他の生理機能を有する素材を配合することもできる。かかる成分としては、例えば、紫外線防止剤、酸化防止剤、保湿剤、細胞賦活剤、血流促進剤を挙げることができる。これらを1種又は２種以上使用することができる。
本発明に係る外用剤の具体的な使用態様としては、特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック、トニックを挙げることができる。
本発明に係る外用剤におけるマクルリン又はその配糖体の含有量としては、剤型等に合わせて適宜調製すればよいが、例えば、製剤全量中、０．０００１〜５０％の範囲内、好ましくは０．００１〜２５％、さらに好ましくは０．００５〜２０％の範囲内で配合すればよい。
本発明に係る外用剤の使用量は、剤型、投与対象者の年齢、体重等により異なるが、通常、成人１日当り、マクルリン又はその配糖体の重量として、０．０１ｍｇ〜１００ｇの範囲内とするのが適当であり、０．０３ｍｇ〜６０ｇの範囲内とするのが好ましいが、必ずしもこの範囲に限られるものではない。かかる１日当りの使用量は、１回で使用してもよく、また、２〜４回に分割して使用してもよい。
食品
本発明に係る食品は、本発明阻害剤と公知の食材又は飲食品とを混合して、常法により、食品に加工することにより得ることができる。
本発明に係る食品の形態は特に限定されず、例えば、粉末状、塊状、液状、シロップ状、ゼリー状を挙げることができる。
本発明に係る食品には、食品上許容される他の成分を配合することができる。かかる成分としては、例えば、栄養素、賦形剤、増量剤、甘味料、香味剤、着色剤、防腐剤、乳化剤、可溶化剤、多価アルコール、有機酸、無機酸、水溶性高分子を挙げることができる。これらを1種又は2種以上使用することができる。
本発明に係る食品の種類としては、例えば、飲料（清涼飲料、乳飲料、ジュース、茶類等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、練製品（畜肉ソーセージ、魚肉ソーセージ、かまぼこ、竹輪等）、惣菜（オムレツ、卵焼、ハンバーグ、コロッケ、ミーとボール、酢の物、酢豚、サラダ、餃子、しゅうまい、ロールキャベツ、豆腐、筑前煮、煮豆、ひじき煮、唐揚、天ぷら、フライ、茶碗蒸、胡麻和え、サラダ、カレー、シチュー、スープ、チャーハン、おにぎり、餅、ふりかけ、味噌汁等）、麺類（うどん、そうめん、そば、スパゲッティ、マカロニ、ラーメン等）、調理パン（ハンバーガー、ホットドッグ、サンドイッチ等）、パン（食パン、フランスパン等）、菓子（ケーキ、クッキー、ウエハース、クレープ、ヨーグルト、プリン、キャンディー、ガム、アイスクリーム、キャラメル、チョコレート、ドーナツ、せんべい、ようかん、ういろう、もなか、まんじゅう、大福餅、おはぎ、団子、甘納豆、中華まん等）を挙げることができる。この他、マヨネーズ、サラダドレッシング等も挙げることができる。
本発明に係る食品へのマクルリン又はその配糖体の添加量は、添加剤の有無や食品の種類等により異なるが、０．０００１〜５０％の範囲内とするのが適当であり、０．００１〜３０％の範囲内とするのが好ましいが、必ずしもこの範囲に限られるものではない。 
【００２４】
本発明に係る食品の摂取量は、摂取者の性別、年齢、体重、症状等によって異なる。かかる摂取量は、成人１日当り、マクルリン又はその配糖体の重量として、０．０１ｍｇ〜１０ｇの範囲内とするのが適当であり、０．０３ｍｇ〜５ｇの範囲内とするのが好ましいが、必ずしもこの範囲に限られるものではない。かかる１日当りの摂取量は、１回で摂取してもよく、また、２回以上に分割して摂取してもよい。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例、試験例を掲げて本発明をさらに詳述する。但し、本発明が下記実施例に限定されないことは言うまでもない。
実施例１  マンゴスチン果皮の熱水抽出物の製造
乾燥したマンゴスチン果皮１．５ｋｇを、そこに１００メッシュのフィルターを取り付けたφ１３．５ｃｍ×６０ｃｍのステンレス製カラムに充填し、上から熱水を加え、下から1時間当たり３リットルの速度で抽出液を集めた。これを濃縮機（ＲＶＴ−Ｔ、ＨＩＳＡＫＡ  ＷＯＲＫＳ  Ｌ．Ｔ．Ｄ．製）にてＢｒｉｘ（固形分濃度）２５％になるまで濃縮し、さらに、最終の固形分の２５％となるようにデキストリンを加え、Ｂｒｉｘ３０％に調整した。これをプレート殺菌機（ＳＴＳ−１００、日阪製作所製）にて１３０℃、３０秒殺菌したのち、スプレードライ（Ｌ−１２、大川原加工機（株）製）で粉末化し、パウダー状の抽出物を得た。
実施例２  マクルリン配糖体の単離および同定
乾燥したマンゴスチン果皮１．５ｋｇを、そこに１００メッシュのフィルターを取り付けたφ１３．５ｃｍ×６０ｃｍのステンレス製カラムに充填し、上から熱水を加え、下から1時間当たり３リットルの速度で抽出液を集めた。これを濃縮機（ＲＶＴ−Ｔ、ＨＩＳＡＫＡ  ＷＯＲＫＳ  Ｌ．Ｔ．Ｄ．製）にてＢｒｉｘ２５％になるまで濃縮した液をトレイに入れ、凍結乾燥器（ＲＬＥＩＩ−１０３、日精（株）製）にて乾燥させたものをブレンダーで粉砕し、パウダー状のマンゴスチン熱水抽出物を得た。
【００２６】
このパウダー２５ｇを図１に示すようなスキームで液液分配を行った。液液分配で得られたＨＰＬＣチャートを図２〜図７に示す。水飽和ブタノール（ＢｕＯＨ）層を蒸発乾固後、水で再溶解し、ＯＤＳオープンカラム（ＹＭＣ−ｇｅｌＯＤＳＡＱ１２Ｓ５０、φ２×１７ｃｍ、（株）ワイエムシィ製）にチャージし、水で溶出し１−７０のフラクションに分けた。この内、１５−１８番目のフラクションを集め、さらにＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ２５０×１０ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２ｎｍ、（株）ワイエムシィ製）にて分取し、目的化合物６．７ｍｇを単離した。
【００２７】
得られた化合物は次に示す条件でＨＰＬＣにて分析を行い、純品であることを確認し、吸光スペクトルを測定した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ａ３０２，Ｓ−５μｍ，１２ｎｍ  （１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、（株）ワイエムシィ製）
移動相：Ａ；０．１％  ギ酸水、Ｂ；０．１％ギ酸含アセトニトリル
【００２８】
【表１】
2014088376.tif 000004
【００２９】
さらに、単離した化合物はＮＭＲにて同定を行った。１３Ｃ、１Ｈの帰属結果を表２に示す。さらにＤＥＰＴ、１Ｄ−ＮＯＥＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ（４Ｈｚ、１２Ｈｚ）の結果から、マクルリン配糖体（化２）と同定した。
【００３０】
【表２】
2014088376.tif 000005
【００３１】
試験例１  マクルリン及びマクルリン配糖体のメイラード反応阻害活性測定
試験管内にリン酸バッファー（ｐＨ７．１５）、最終濃度０．８ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、２Ｍブドウ糖を加え、試料としてマクルリン（Ｓｉｇｍａ社製）を最終濃度０、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、６０℃で３０時間反応させた溶液を試験液とした。実施例２のマクルリン配糖体、アミノグアニジン（硫酸アミノグアニジン：和光純薬工業（株）製）、実施例１のマンゴスチン果皮熱水抽出物も同様に反応させた。
この試験液を蛍光測定器（ＭＴＰ−６００  コロナ電気（株）社製）にて、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて蛍光値を測定した。ブランク１として、ブドウ糖を加えないもの、ブランク２として試料を加えないもの、ブランク３としてブドウ糖と試料を加えないものを調整し、同様にインキュベートして蛍光値を測定した。阻害率（％）は下式により算出した。
【００３２】
阻害率  ＝  {１−（試料の蛍光値−ブランク1）÷（ブランク２−ブランク３）}×１００
さらに、各試料について、縦軸に阻害率、横軸に試料の濃度をプロットし、近似曲線から５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。その結果を、表３に示す。
【００３３】
【表３】
2014088376.tif 000006
【００３４】
マクルリン及びその配糖体は、アミノグアニジンと比較して高いメイラード反応阻害活性を示した。
【００３５】
試験例２  マクルリン及びマクルリン配糖体のＣＭＬ（カルボキシメチルリジン）生成反応阻害活性測定
ＣＭＬ−ＢＳＡ（ＣＭＬ−ＢＳＡ／Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ−ＢＳＡ、Ｃａｔ＃ＣＹ−Ｒ２０５２、ＣｙｃＬｅｘ社製）をバッファーで２５００倍希釈し、ＥＬＩＳＡ用の９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌになるように加え、３７℃１時間で固相化した。そして、９６穴プレートの溶液を捨てた後、洗浄バッファーで一度洗浄した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇバッファーを２００μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃１時間インキュベートした。
９６穴プレートの溶液を捨てた後、洗浄バッファーで一度洗浄し、抗ＣＭＬ抗体（ａｎｔｉ−ＣＭＬ／Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ、Ｃａｔ＃ＣＹ−Ｍ１０２８、ＣｙｃＬｅｘ社製）をバッファーで１００００倍希釈したもの５０μｌと、０、０．０３７、０．０７８、０．１５６、０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５μｇ／ｍｌに調整したＣＭＬスタンダード、または０、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌに調整したマクルリンを５０μｌとを混合したものをプレートに加え、プレートシェーカーで撹拌（３００ｒｐｍ）し、室温で１時間反応させた。
反応後、９６穴プレートの溶液を捨てた後、洗浄バッファーで４回洗浄し、二次抗体（ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｇｏａｔ、Ｃａｔ＃Ａ３６７３、Ｓｉｇｍａ社製）をバッファーで１００００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、プレートシェーカーで撹拌（３００ｒｐｍ）し、室温で１時間反応させた。反応後、９６穴プレートの溶液を捨てた後、洗浄バッファーで４回洗浄し、ＴＭＢ溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、１０分反応させたの後、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えたものを、４５０ｎｍの吸光値をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００、コロナ電気（株）社製）で測定した。
マクルリン配糖体、アミノグアニジン、プロシアニジンＢ２、αマンゴスチン、マンゴスチン果皮熱水抽出物も同様に反応させた。
その結果を表４に示す。
【００３６】
【表４】
2014088376.tif 000007
【００３７】
マクルリン及びその配糖体は、アミノグアニジンと比較して高いＣＭＬ生成阻害活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明阻害剤は、優れたメイラード阻害作用を有するため、老化に伴って生じる現象、例えば、白内障、軟骨の弾力低下、皮膚の老化（皮膚の弾力低下、しわやたるみの原因となるコラーゲンの架橋形成、肌のくすみの原因となる色素沈着等）の抑制に用いることができる。また、本発明に係る抗酸化剤は、活性酸素が関与することが知られている、糖尿病合併症（例えば、心筋梗塞、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症）の改善、予防又は治療に用いることもできる。
【図１】
2014088376.tif 000009
【図２】
2014088376.tif 000010
【図３】
2014088376.tif 000011
【図４】
2014088376.tif 000012
【図５】
2014088376.tif 000013
【図６】
2014088376.tif 000014
【図７】
2014088376.tif 000015