(57)【要約】【課題】マイクロドロップ法による細胞培養において、ミネラルオイルの使用量を低減できる細胞培養容器および細胞培養法を提供する。【解決手段】本発明は、上面が開口した細胞培養容器であって、底部に、細胞および培養液を収容するための凹部を有し、凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなるオイル収容部を有する、前記細胞培養容器に関する。に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面が開口した細胞培養容器であって、
底部に、細胞および培養液を収容するための凹部を有し、
凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなるオイル収容部を有する、
前記細胞培養容器。
【請求項２】
凹部の底面の面積が５ｍｍ２以上である、請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
凹部の底面に、細胞の位置決めをするための窪みが形成されている、請求項１又は２記載の細胞培養容器。
【請求項４】
凹部を複数有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞培養容器を用いて細胞を培養する方法であって、
培養液を凹部に添加する工程、
培養液を覆うように、オイル収容部にオイルを添加する工程、および
培養液中に細胞を添加する工程、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロドロップ法などの少量の培養液中での細胞培養に適した細胞培養容器、ならびに該細胞培養容器を用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養系で精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製して、さらに受精卵を卵割、桑実胚、胚盤胞の段階を経て、透明帯から孵化した脱出胚盤胞の段階まで培養することが可能となり、この卵割から胚盤胞の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る補助的生殖技術（ＡＲＴ）が、家畜領域のみならずヒトの不妊医療でも確立されている。
【０００３】
体外受精においては、容器中に培養液のドロップを作り、これをミネラルオイルで被覆し、培養液ドロップ中に受精卵を入れて体外培養するマイクロドロップ法が用いられることが多い。ミネラルオイルで被覆することにより、培養液の蒸発を避け、ｐＨと浸透圧を安定させることが可能であり、顕微操作が容易となる他、マイクロドロップによる乏精子症患者の媒精、培養液の節約などの利点がある。また、良好胚を選別するための受精卵の形態学的評価、前核期の核小体評価、多核胚評価を行うには、個々の受精卵を区別して培養しなければならないが、ミネラルオイルを用いると、容器の底部に形成された培養液のドロップが非常に小さくて済むので、各ドロップ間の間隔を広くすることができ、この結果、細胞が多少動いても混じりにくく、一つの容器で培養しても比較的容易に細胞同士を区別することができる。
【０００４】
従来、このマイクロドロップ法には、細胞培養容器として、底面が単一平面であり、直径が３０〜６０ｍｍのシャーレが使用されてきた。通常、該シャーレの底面に、培養液のマイクロドロップを、間隔をあけて複数個作製し、シャーレ全面をミネラルオイルで被覆することにより複数のマイクロドロップを被覆する方法が使用されてきた。この方法では、シャーレ底面においてマイクロドロップが存在するのは一部の領域にすぎないのに対し、シャーレ全面を覆うだけのミネラルオイルが必要になり、無駄が生じていた。
【０００５】
特許文献１には、凹部に培養液を入れ、リザーバで囲われた領域内へミネラルオイルを添加して凹部内の培養液を被覆するための容器が記載されている。しかし、このような容器においても、リザーバで囲われた領域全体をミネラルオイルで被覆しなければならず、ミネラルオイルの使用量を低減することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５３１６４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、マイクロドロップ法による細胞培養において、ミネラルオイルの使用量を低減できる細胞培養容器および細胞培養法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を行った結果、培養液と細胞を収容するための凹部を有する細胞培養容器において、凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなるオイル収容部を設けることにより、マイクロドロップ法による細胞培養において、ミネラルオイルの使用量を低減できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）上面が開口した細胞培養容器であって、
底部に、細胞および培養液を収容するための凹部を有し、
凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなるオイル収容部を有する、
前記細胞培養容器。
（２）凹部の底面の面積が５ｍｍ２以上である、（１）記載の細胞培養容器。
（３）凹部の底面に、細胞の位置決めをするための窪みが形成されている、（１）又は（２）記載の細胞培養容器。
（４）凹部を複数有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器を用いて細胞を培養する方法であって、
培養液を凹部に添加する工程、
培養液を覆うように、オイル収容部にオイルを添加する工程、および
培養液中に細胞を添加する工程、
を含む前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、マイクロドロップ法による細胞培養において、ミネラルオイルの使用量を低減できる細胞培養容器および細胞培養法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の細胞培養容器の一実施形態を示す概略図である。図１ａは斜視図を示し、図１ｂは断面図を示す。
【図２】従来の細胞培養容器および細胞培養方法の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の細胞培養容器および細胞培養方法の一実施形態を示す概略図である。
【図４】本発明の細胞培養容器および細胞培養方法の一実施形態を示す概略図である。図４ａは上面図を示し、図４ｂは断面図を示す。
【図５】本発明の細胞培養容器および細胞培養方法の一実施形態を示す概略図である。図５ａは上面図を示し、図５ｂは断面図を示す。
【図６】本発明の細胞培養容器および細胞培養方法の一実施形態を示す概略図である。図６ａは上面図を示し、図６ｂは断面図を示す。
【図７】本発明の細胞培養容器および細胞培養方法の一実施形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について説明する。
本発明の細胞培養容器は、例えば、図１に示すように、上面が開口した容器からなる細胞培養容器１であって、
底部に、細胞および培養液を収容するための凹部２を有し、
凹部の開口端３から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部４からなるオイル収容部を有する。
【００１３】
本発明の細胞培養容器においては、細胞および培養液を収容するための凹部（以下、細胞収容部と称する場合もある）を囲うように、その外縁に傾斜した壁部を有し、オイル収容部が形成されている。したがって、細胞収容部の周囲に余分な空間がないため、細胞収容部に培養液を添加したあと、培養液を被覆するため添加するオイルの使用量を低減することができる。一方、容器上面が大きく開口しているため、培養液への細胞の添加などの操作を簡便に実施できる。
【００１４】
図２に示すように、従来のシャーレを用いたマイクロドロップ法による培養では、シャーレ底面６’のマイクロドロップ７を被覆するためには、シャーレ全面を覆うだけのオイル８が必要であった。しかし、本発明の細胞培養容器を用いることにより、図３に示すように、マイクロドロップ７を被覆するためのオイルの量を低減することができる。凹部を深くし、凹部内にオイルを添加することによってオイルの量を低減することも考えられる。しかし、凹部が深くなることにより、細胞９をマイクロドロップ内に添加する操作などのピペット操作が困難になる。これに対し、本発明の細胞培養容器は、凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなるオイル収容部を有するため、ピペット操作が容易である。また、細胞培養容器を移動させる場合や細胞培養容器に振動が加わった場合に、培養液の一部が一時的に凹部からオイル収容部に乗り上げたり、オイルが移動して培養液が一時的に露出したりしても、オイル収容部が傾斜構造を有することにより、培養液やオイルが重力で凹部の中心方向へ戻るため、細胞培養を安定的に実施することができる。
【００１５】
本発明の細胞培養容器は、その底部に、細胞収容部を１つだけ有していてもよく、複数有していてもよい。細胞収容部が複数存在する場合、各細胞収容部の外縁には、傾斜した構造のオイル収容部が形成されていることが好ましい。凹部が２個整列して配置された一態様について図４に示す。
【００１６】
凹部は、壁面及び開口部を有し、壁面は、好ましくは底壁と側壁からなる。底面及び開口部の外縁の形状は特に制限されないが、好ましくは円状（円形及び楕円形を含む）である。ピペット等による操作性の観点から、凹部開口部の面積は、底面の面積より大きいことが好ましい。
【００１７】
細胞培養容器のサイズは、特に制限されないが、開口部の開口幅（例えば、図１のＢ）が、３０〜６０ｍｍのものが好ましく用いられる。これは従来の細胞培養に用いられているシャーレと同等のサイズであり、汎用のシャーレから簡便に作製できること、および既存の培養装置等に適合しやすいことから、上記のようなサイズのものが好ましい。
【００１８】
凹部底面６のサイズは、特に制限されないが、好ましくは細胞、特にヒト受精卵を、平面上で少なくとも３つ重なることなく配置できるサイズである。複数の細胞、特に受精卵を、同じ系で培養することにより、培養液内部に蓄積したタンパク質、ホルモン、酵素等の細胞分泌物が互いの細胞に作用するパラクライン効果を期待できる。また、細胞同士が平面上で重なっていると、顕微鏡等による細胞や受精卵の評価が困難であることから、凹部の底面は一定の面積を有することが好ましい。具体的には、凹部底面の面積は、好ましくは５ｍｍ２以上、より好ましくは１０ｍｍ２以上、さらに好ましくは３０ｍｍ２以上であり、好ましくは３００ｍｍ２以下、より好ましくは１００ｍｍ２以下、さらに好ましくは５０ｍｍ２以下である。凹部、すなわち細胞および培養液を収容する細胞収容部の容量を一定容量以下とすることにより、細胞分泌物によるオートクライン効果や複数の細胞の相互作用によるパラクライン効果を期待できる。
【００１９】
本発明の細胞培養容器は、凹部、ならびにその周囲にオイル収容部を有するが、それらの外周に、細胞培養容器全体を囲うように構成された外壁を有することが好ましい（例えば、図１の５）。外壁を設けることにより、オイル収容部に収容されたオイルが細胞培養容器からこぼれるのを防止できる。また、細胞培養容器に蓋をかぶせる場合に、外周を囲う外壁により蓋を支持することができる。
【００２０】
凹部の底面には、例えば図５に示すように、細胞を位置決めするための窪み１０が形成されていることが好ましい。窪み内に細胞を配置することにより、細胞の移動を抑制することができ、細胞をそれぞれ特定した上で評価や判定を行うことができる。この窪みの形状は特に制限されないが、開口部の外縁が円形であり、窪みの壁面が、最も低い位置から外縁に進むに従って高くなるように傾斜した曲面を有することが好ましい。窪みの壁面は、好ましくは円錐状又は円錐台状の部分を含む。円錐状又は円錐台状の部分は、培養容器の底部側に、円錐の頂点又は円錐台の上面及び下面のうち面積の狭い方がくるように形成される。円錐状には、円錐及び楕円錐、これらに類似の形状、例えば、円錐又は楕円錐の頂点が丸みを帯びている形状、円錐面が外側に膨らんでいる形状、円錐面が内側に凹んでいる形状などが含まれる。円錐台状には、円錐台及び楕円錐台、これらに類似の形状、例えば、円錐台又は楕円錐台の上面又は下面と円錐面との接合部が丸みを帯びている形状、円錐面が外側に膨らんでいる形状、円錐面が内側に凹んでいる形状などが含まれる。なお、窪み部１０は、上記に限らず、多角錐状、多角錐台状などの形態であってもよい。
【００２１】
窪みの寸法は、少なくとも１つの細胞を収容可能な寸法であれば特に制限されない。ここで、窪みの寸法は、窪みの開口部の外縁が形成する図形の最長径の長さをさす。従って、窪みの開口部の外縁が円形である場合、その直径は、培養する細胞の最大寸法と同じかそれより大きいものとなる。本発明の細胞培養容器により受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、円形の開口部の直径は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいものであることが望ましい。胚盤胞の段階の細胞の最大寸法は通常１００μｍ〜２８０μｍであることから、円形の開口部の直径は、通常１００μｍ以上である。また、窪みの開口部の外縁が円形である場合、その直径は、窪み間のピッチ、すなわち円の中心間の距離より短く、通常１ｍｍ未満である。ただし、上記寸法は収容する細胞の種類に依存して異なる。
【００２２】
例えば、ヒト受精卵の場合、窪みの開口部の直径は、通常１００μｍ以上、好ましくは２００μｍ以上、さらに好ましくは２５０μｍ以上であり、通常１０００μｍ以下、好ましくは９００μｍ以下、さらに好ましくは８００μｍ以下である。また、上記窪みの開口部の直径は、Ｘ＋α（ここでＸは細胞の最大寸法を表す）と規定することもできる。ここで、αは、好ましくは０．０１ｍｍ以上、さらに好ましくは０．０２ｍｍ以上である。
【００２３】
本発明の細胞培養容器においてオイル収容部は、凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなる。外縁に進むに従って高くなるとは、凹部の開口端に対して凹部の中心側を内側としたときに凹部の開口端よりも外側に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっていることをいう。例えば、凹部が複数存在する場合には、各凹部において各凹部の開口端よりも外側に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっている。壁部は、なだらかな傾斜面であってもよいし、階段状に傾斜を構成していてもよい。オイル収容部の壁部が、なだらかな傾斜面を形成し、例えば円錐台の側面を形成している場合、円錐台の上面及び下面のうち面積の狭いほうが細胞培養容器の底部側にくるように円錐台が配置されるような構成となる。オイル収容部を形成する壁部が円錐台の側面を形成している場合、円錐台の中心線（すなわち鉛直線）と母線とのなす角度（例えば、図１のα）は、通常５０〜８５°、好ましくは５５〜８０°、より好ましくは６０〜７５°である。一定の角度以下とすることにより、重力を駆動源として、オイルを凹部の中心方向へ移動させやすく、またオイルの節約効果を高めることができる。一定の角度以上とすることにより、開口面積が広がるためピペットなどによる操作性が高まる。なお、オイル収容部は、円錐台に限らず、多角錐台などであってもよい。
【００２４】
また、図６に示すように、円錐台の側面に、同心円状に線１１を付けることによって、その線を目印として、オイルの収容量およびオイル層の厚みを測ることができる。目印は、傾斜面に凹凸による線を形成してもよく、単にインク等で線を描いてもよい。線の数は特に制限されないが、２〜５の同心円を設けることが好ましい。例えば、凹部開口端から一番近い同心円までオイルを添加すれば１ｍｌ、二番目に近い同心円までオイルを添加すれば２ｍｌ添加することになるといったように、計量線の機能を果たす同心円を描くことができる。細胞培養において培養液をオイルで被覆する場合、オイル層の厚みが重要になるが、線１１は、オイル層の厚みに対する計量線の機能も有する。なお、線１１は同心円状に限らず、凹部の形態に応じて、点、直線、同心円状を含む曲線状、又は文字や記号といった種々の形態を採用することができる。
【００２５】
オイル層の厚みを一定に制御することで、外部と培養液間の水分、酸素等透過性を一定に保つことができる。例えば、オイル層の厚みが薄すぎると、培養液からの水分蒸発量が増え、培養液の容量減少、浸透圧上昇といった培養にとっての悪影響をもたらす。
【００２６】
上記のような目印を付けることによって、常に一定量のオイルを添加することができ、したがってオイル層の厚みも一定にすることができる。結果として、細胞培養容器ごとにオイル層の厚みが異なるといったことがなく、細胞培養を同条件でばらつきなく実施することができる。また細胞の種類や状態ごとに好適なオイル層の厚みが異なる場合もあるので、細胞の種類や状態ごとにどの目印までオイルを注ぐのがよいか記録することにより、その後の作業性を高めることができる。さらに特定の細胞や状態に対する好適なオイル添加量と目印との関係を記載したマニュアルを添付することもできる。
【００２７】
例えば、図７に示すように、オイル収容部の壁部が階段状に傾斜を構成している場合も、その階段構造により、オイルの収容量を測ることができる。段数は、好ましくは２〜５段程度である。壁部が階段状に傾斜を構成している場合、その傾斜角度は、オイル収容部の最上段の開口端と凹部の開口端とをつなぐ線と、鉛直線とのなす角度（例えば、図７のβ）として表すことができる。その傾斜角度も、同様の理由により、上記円錐台の中心線と母線とのなす角度と同様の範囲とすることが好ましい。
【００２８】
本発明の細胞培養容器の材質は、特に制限されない。具体的には、金属、ガラス、及びシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。本発明の培養容器は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。
【００２９】
本発明の細胞培養容器は、受精卵の発育を促進するような表面処理又は表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞（例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞）と共培養をする場合、これらの細胞をあらかじめ培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。
【００３０】
本発明はまた、上記細胞培養容器を用いた細胞培養方法に関し、該方法は、
培養液を凹部に添加する工程、
培養液を覆うように、オイル収容部にオイルを添加する工程、および
培養液中に細胞を添加する工程、
を含む。
【００３１】
培養対象となる細胞は、特に制限されないが、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞及び成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚及び８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞及び脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性又は全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本発明において細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。
【００３２】
本発明の細胞培養容器は、好ましくは哺乳動物及び鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒト及びサルなどの霊長類、マウス、ラット及びウサギなどの齧歯類、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマ及びブタなどの家畜が挙げられる。本発明の培養容器は、ヒトの受精卵の培養に特に好適である。
【００３３】
凹部に添加する培養液は、細胞を培養する能力を有するものであれば特に制限はないが、受精卵培養用の培養液としては、例えば、Ｍ１６が挙げられる。オイル収容部に添加して培養液の蒸発を防ぐためのオイルは、当技術分野で通常用いられるものであれば特に制限されないが、好ましくはミネラルオイルを添加する。ミネラルオイルとしては、純度の高いものが好ましく用いられ、例えば、Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｏｉｌ  ｔｙｐｅ  Ｈｅａｖｙ（ｋｉｔａｚａｔｏ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）が挙げられる。
【００３４】
通常、凹部に培養液を添加した後、培養液を覆うようにオイル収容部にオイルを添加し、さらに培養液中に細胞を添加する。これらの作業は、通常ピペットやガラスキャピラリー等の器具を用いて実施される。本発明の細胞培養容器は、オイル収容部の開口が大きいので、これらの操作を比較的容易に実施できる。
【００３５】
培養は、通常、細胞培養容器を培養細胞の発育及び維持に必要なガスを含む環境雰囲気及び一定の環境温度をもたらすインキュベーターに入れることにより実施される。必要なガスには、水蒸気、遊離酸素（Ｏ２）及び二酸化炭素（ＣＯ２）が含まれる。環境温度とＣＯ２含有量を調節することにより、培養液のｐＨを一定時間内に安定させることができる。安定なＣＯ２含有量と安定な温度により安定なｐＨが得られる。画像比較プログラムにより、培養中の細胞の画像を予め保存された画像と比較することにより、培養の際の温度、ガス及び培地などの培養条件を調節することもできる。
【００３６】
例えば受精卵を培養する場合には、通常、培養後に、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否かが判別される。判別は自動で行ってもよいし、顕微鏡等により手動で行ってもよい。培養細胞の自動判別においては、顕微鏡により取得された培養容器内の細胞の画像をＣＣＤカメラ等の検出装置によって撮像し、得られた像を輪郭抽出処理に付し、画像中の細胞に該当する部分を抽出し、抽出された細胞の画像を画像解析装置で解析することによりその質を判別することができる。画像の輪郭抽出処理については、例えば、特開２００６−３３７１１０に記載された処理を利用できる。
【００３７】
本発明の細胞培養容器を用いることにより、受精卵等の培養において、オイルの使用量を低減することができる。また、オイル収容部が傾斜していることから、オイルを添加する過程でオイルの添加量がわかりやすく、細胞培養容器ごとのオイル添加量のばらつきを防止でき、また迅速な操作が可能である。
【符号の説明】
【００３８】
１：細胞培養容器
２：凹部
３：凹部の開口端
４：オイル収容部
５：外壁
６：容器底面
７：培養液
８：オイル
９：細胞
１０：凹部の窪み
１１：計量線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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