(57)【要約】【課題】ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−３２位に相当するポリペプチド（ｈＢＮＰ（３−３２））に特異的な抗体を提供し、かつそれを用いてｈＢＮＰ（３−３２）を特異的に測定する方法を提供する。【解決手段】ｈＢＮＰ（３−３２）と反応し、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドとは反応しないことを特徴とする、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体（Ａ）と、ｈＢＮＰ（３−３２）の認識部位が抗体（Ａ）とは異なる抗体（Ｂ）とを用いて、ｈＢＮＰ（３−３２）をサンドイッチ法により測定する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−３２位に相当するポリペプチドと反応し、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドとは反応しないことを特徴とする、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−３２位に相当するポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体において、認識部位に少なくともヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−６位に相当するアミノ酸残基を含む抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体において、認識部位に少なくともヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−８位に相当するアミノ酸残基を含む抗体。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の抗体において、認識部位がヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−８位に相当するアミノ酸残基である抗体。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載の抗体（Ａ）と、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−３２位に相当するポリペプチドの認識部位が抗体（Ａ）とは異なる抗体（Ｂ）とを用いて、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−３２位に相当するポリペプチドをサンドイッチ法により測定することを特徴とする、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの３−３２位に相当するポリペプチドの測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、ｈＢＮＰとする）の３−３２位に相当するポリペプチド（以下、ｈＢＮＰ（３−３２）とする）と反応し、ｈＢＮＰ及びヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、ｈｐｒｏＢＮＰとする）とは反応しないｈＢＮＰ（３−３２）特異抗体、及びそれを用いたｈＢＮＰ（３−３２）の測定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＢＮＰはブタの脳から最初に単離された（非特許文献１）ことから、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｂｒａｉｎ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＢＮＰ）と命名された。しかし、ヒトにおいて、ＢＮＰは心臓で合成・分泌されることが示唆され、（非特許文献２）、心臓より単離・同定された（非特許文献３）。従って、脳（ｂｒａｉｎ）という単語はＢ型に変更され、現在ではＢＮＰはＢ型ナトリウム利尿ペプチドを意味する。
【０００３】
ＢＮＰは血中を循環し、強力な心血管性および腎性作用を発揮する。ｈＢＮＰは３２アミノ酸残基からなり、ｈＢＮＰの前駆体であるｈｐｒｏＢＮＰのアミノ酸配列７７−１０８位に相当する。ｈＢＮＰは、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって閉じている１７アミノ酸からなる環状部、９アミノ酸からなるＮ末端尾部および６アミノ酸からなるＣ末端尾部からなる。また、血中でｈＢＮＰをインキュベートすると、Ｎ末端の２アミノ酸残基が脱離し、ｈＢＮＰ（３−３２）が生じることが知られている（非特許文献４）。ｈＢＮＰ（３−３２）は、ｈＢＮＰのアミノ酸配列３−３２位に相当し、ｈｐｒｏＢＮＰのアミノ酸配列の７９−１０８位に相当する。
【０００４】
血中のｈＢＮＰの濃度は、鬱血性心不全、虚血性心疾患、心房細動および腎機能障害心臓疾患を反映することが認められている。例えば、急性心筋梗塞および無症状または無症候の心室機能障害において、ヒト血漿中のｈＢＮＰレベルの上昇が報告されている（非特許文献５、６）。そのため血中のｈＢＮＰの測定は心機能・腎機能の診断などｈＢＮＰの増減を指標とする疾病の診断に役立つものである。これまでに、ｈＢＮＰのイムノアッセイなどのリガンド結合アッセイは当業界で公知であり、そのアッセイ用試薬が市販されている。
【０００５】
また、心室負荷症例と心房負荷症例において、血中のｈＢＮＰとｈｐｒｏＢＮＰの総量に対するｈＢＮＰの割合を比較したときに、心房負荷症例のほうが心室負荷症例よりも高値であることが見いだされた（非特許文献７）。このように、ｈＢＮＰ、ｈｐｒｏＢＮＰのそれぞれを個別に測定することにより、より詳細な病態情報が得られる可能性が示唆されている。しかし、血中のｈＢＮＰのほとんどはｈＢＮＰ（３−３２）に分解された状態にあるという報告（非特許文献４）がなされており、ｈＢＮＰ（３−３２）のみを測定することも重要だと考えられている。従来、液体クロマトグラフ質量分析の手法を用いて、血中のｈＢＮＰ（３−３２）、ｈＢＮＰ、ｈｐｒｏＢＮＰのそれぞれを定量測定することは可能であったが、該手法は操作が煩雑でかつ多検体処理に不向きであった。
【０００６】
このような状況下、特にｈＢＮＰ（３−３２）の血中濃度の臨床的重要性が理解されるようになるにつれて、ｈＢＮＰ（３−３２）のみを定量するリガンド結合アッセイが必要とされるようになってきた。しかしながら、現在、リガンド結合アッセイで用いられている抗ｈＢＮＰ抗体の認識部位は、ｈＢＮＰの環状部またはＣ末端尾部である。そのため、このようなリガンド結合アッセイを用いて血中のｈＢＮＰ（３−３２）を測定しようとすると、ｈＢＮＰ（３−３２）と同じ環状部およびＣ末端尾部を有するｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰも測定されてしまい、血中のｈＢＮＰ（３−３２）のみを測定することは不可能であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，７８−８１（１９８８）
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９，１４２７−１４３４（１９８９）
【非特許文献３】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５９，３４１−３４５（１９９０）
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３１６：１２９−１３５（２００２）
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，８７：１４０２−１４１２（１９９１）
【非特許文献６】Ｌａｎｃｅｔ，３４１：１１０９−１１１３（１９９３）
【非特許文献７】Ｃｕｒｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  Ｒｅｐ．Ｊｕｎ；８（２）：１４０−１４６（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体を提供し、かつそれを用いてｈＢＮＰ（３−３２）を特異的に測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記の課題に関し鋭意研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）ｈＢＮＰ（３−３２）と反応し、ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰとは反応しないことを特徴とする、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体。
（２）上述の（１）に記載の抗体において、認識部位に少なくともｈＢＮＰの３−６位に相当するアミノ酸残基を含む抗体。
（３）上述の（１）または（２）に記載の抗体において、認識部位に少なくともｈＢＮＰの３−８位に相当するアミノ酸残基を含む抗体。
（４）上述の（１）〜（３）いずれかに記載の抗体において、認識部位がｈＢＮＰの３−８位に相当するアミノ酸残基である抗体。
（５）上述の（１）〜（４）いずれかに記載の抗体（Ａ）と、ｈＢＮＰ（３−３２）の認識部位が抗体（Ａ）とは異なる抗体（Ｂ）とを用いて、ｈＢＮＰ（３−３２）をサンドイッチ法により測定することを特徴とする、ｈＢＮＰ（３−３２）の測定法。
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明のｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またキメラ抗体や免疫学的特性を保持する抗体断片であってもよい。中でも、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマから得ることができ、そのハイブリドーマは例えば次のようにして作製される。まずｈＢＮＰ（３−３２）のＮ末端、好ましくはｈＢＮＰの３−１０位のアミノ酸残基に相当するペプチド（以下、ｈＢＮＰ（３−１０）とする）を合成し、免疫原性を高めるために牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡとする）、オブアルブミン（以下、ＯＶＡとする）、またはキーホールリンペットヘモシアニン（以下、ＫＬＨとする）などと結合させる。得られたコンジュゲートをフロイントの完全アジュバント等の適当なアジュバントに乳濁し、マウスの免疫に用いる。免疫は上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔等に数回繰り返し接種することにより行なう。最終免疫の３日ないし５日後に脾臓を取り出し、抗体産生細胞として使用する。一方、抗体産生細胞と融合させてハイブリドーマを得るための親細胞としてミエローマ細胞株を用意し、これと抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマ作製における培地として、Ｅ−ＲＤＦ培地、ＧＩＴ培地などの通常良く使用されているものを用いることができる。融合にあたってはまず、親細胞であるミエローマと脾臓細胞を適当な割合で、例えば個数比で１：５の割合で用意し融合に用いる。白金電極による電気的細胞融合を用いる方法が、融合効率が高いとされている。融合株はＨＡＴ選択法により選択することが好ましい。生じたハイブリドーマのスクリーニングは、培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法などの既知の方法により行ない、目的の免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマのクローンを選択する。ハイブリドーマの単一性を確保するため、細胞培養プレートにハイブリドーマを１ウェルに１個より多くならないように蒔き、生育してくるクローンについて再びスクリーニングを行なう。このサブクローニングを繰り返すことにより、単一のハイブリドーマを得ることができる。
【００１１】
このようにして得られたハイブリド−マを培地中で培養し、培地からモノクロ−ナル抗体を採取することにより、モノクロ−ナル抗体を製造することができる。例えば、まず、上記で得られたハイブリド−マを培養容器中で培養する。培地は先に述べた通常の培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加したものでよく、この培地で３日から５日培養の後、培養上清からモノクロ−ナル抗体を得る。
【００１２】
このようにして本発明では、モノクロ−ナル抗体９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａを得た。この抗体は、後述の実施例に示される通り、ｈＢＮＰ（３−３２）と反応するが、ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰとは反応しないことから、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体である。また一般に、抗ペプチド抗体のエピトープは、連続する４つのアミノ酸残基が最小のエピトープとなる場合がある（特開２０１１−１４０４８３号公報）が、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体の最小のエピトープは、ｈＢＮＰ（３−３２）の１−６位のアミノ酸残基であり、これは即ちｈＢＮＰの３−８位のアミノ酸残基に相当するペプチドｈＢＮＰ（３−８）であった。
【００１３】
本発明はさらに、このようなｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体（Ａ）と、ｈＢＮＰ（３−３２）の認識部位が抗体（Ａ）とは異なる抗体（Ｂ）を用いて、ｈＢＮＰ（３−３２）をサンドイッチすることを特徴とするｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な免疫測定法を提供する。抗体（Ｂ）としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またキメラ抗体や免疫学的特性を保持する抗体断片でもよい。中でもモノクロ−ナル抗体が好ましく、例えばｈＢＮＰの環状部を認識するモノクロ−ナル抗体またはｈＢＮＰのＣ末端尾部を認識するモノクローナル抗体［ＢＣ２３−１１（特開２０１１−１２２９５７号公報）等］が挙げられる。
【００１４】
以下に、本発明のサンドイッチ測定法について説明する。
【００１５】
（１）標識抗体の調製
サンドイッチ法を行う場合、一方の抗体を標識化することが好ましい。標識としては特に限定されないが、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光物質等があげられる。例えば酵素としては、アルカリ性ホスファタ−ゼ（以下、ＡＬＰとする）、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ、ペルオキシダ−ゼ、グルコ−スオキシダ−ゼなどが利用可能である。これらの標識酵素と抗体との結合は、既知の方法に従って行なえばよい。標識する抗体は、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ−Ａｇａｒｏｓｅカラムなどにより精製されたものを用いる。本発明においては、特にＡＬＰが好ましく用いられる。なお、標識する抗体は、前述の抗体（Ａ）または（Ｂ）のどちらであってもよい。
【００１６】
（２）固相化抗体の作製
サンドイッチ法を行う場合、他方の抗体を固相化することが好ましい。この抗体は、標識した抗体（（Ａ）または（Ｂ））ではないもう一方の抗体（（Ｂ）または（Ａ））である。固相化する抗体は、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ−Ａｇａｒｏｓｅカラムなどにより精製されたものを用いる。該抗体を抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビ−ズ）あるいは球状物（ボ−ル）、チュ−ブ、プレ−トなどに吸着又は結合させればよい。
【００１７】
（３）ｈＢＮＰ（３−３２）の測定
試料、上記（１）で調製した標識抗体、上記（２）で作製した固相化抗体を接触させ、試料中のｈＢＮＰ（３−３２）を標識抗体及び固相化抗体と反応させる。このとき、接触の順序には特に限定はなく、順次接触させてもよく、また同時に接触させてもよい。反応後、上清を除去して洗浄し、サンドイッチ構造を形成した反応生成物中の標識を検出すればよい。例えば、標識がＡＬＰの場合は、ＡＬＰの基質として例えば４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）などを加えて反応させ、ＡＬＰ活性を測定する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の抗体は、ｈＢＮＰ（３−３２）と反応するが、ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰとは反応しないという特徴を有する、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体である。このような抗体を用いた本発明のｈＢＮＰ（３−３２）の測定法は、ｈＢＮＰ及び／又はｈｐｒｏＢＮＰの共存下であっても、ｈＢＮＰ（３−３２）を特異的に測定することができる。従って本方法は高血圧や心機能・腎機能の診断など、ｈＢＮＰ（３−３２）の増減を指標とする疾病の診断に有用であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体のエピトープ分析の結果を示したグラフである。
【図２】９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体のｈＢＮＰ（３−３２）、ｈＢＮＰおよびｈｐｒｏＢＮＰに対する反応性を示したグラフである。
【実施例】
【００２０】
［実施例１］
Ｉ．抗ｈＢＮＰ（３−３２）モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マの作製と抗体の産生
（１）免疫用コンジュゲ−ト液の作製
ｈＢＮＰ（３−１０）は、業者にペプチド合成を依頼して得た。該ペプチドフラグメント溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）と、マレイミド活性化ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで溶解したもの）を、体積比で１：１で混和し、室温で２時間撹拌して反応させた。その後、反応液をＰＢＳに対して２日間４℃で透析することにより、免疫用コンジュゲート液を得た。
【００２１】
（２）免疫
上述の免疫用コンジュゲート液（１ｍｇ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを等量ずつ混合して乳濁液とし、これをマウス（雌、６週令）の腹腔内に０．１ｍｌずつ１週間間隔で計４回注射した。マウス１匹１回当たりのコンジュゲ−ト投与量は５０μｇであった。更に最終免疫の１週間後に、ブ−スタ−として免疫用コンジュゲート液をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈したもの（０．１ｍｌ）を腹腔内に投与した。
【００２２】
（３）細胞融合
ブ−スタ−免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、その細胞を赤血球溶解バッファーにて赤血球を破壊した。残った細胞をＥ−ＲＤＦ培地に懸濁して細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に同じくＥ−ＲＤＦ培地に懸濁したミエローマ細胞０．４×１０７個を脾リンパ球１．６×１０７個と混合し、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去した。細胞沈殿物をマンニトール緩衝液（２５０ｍＭ  マンニトール、１００ｍＭ  塩化カルシウム、１００ｍＭ  塩化マグネシウム）に懸濁し、電気的細胞融合を行なった。電気的細胞融合を行なった細胞懸濁液をＨＡＴ培地（１００μＭ  ヒポキサンチン、０．４μＭ  アミノプテリン、１６μＭ  チミジンを含むＧＩＴ培地）２００ｍｌに懸濁し、３８４ウエル細胞培養プレ−ト１０枚の各ウエルに０．０５ｍｌずつ分注した。約７日後にはハイブリド−マの増殖が認められた。
【００２３】
（４）ハイブリド−マの選択
ハイブリド−マが増殖してきたウエルについて、培養上清を用いて抗ｈＢＮＰ（３−３２）抗体産生の有無をＥＬＩＳＡ法で検定した。まず、ｈＢＮＰ（３−１０）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで希釈したもの）とマレイミド活性化ＯＶＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで希釈したもの）を混和し、室温で２時間撹拌して反応させることにより得たｈＢＮＰ（３−１０）−ＯＶＡコンジュゲート液を、該コンジュゲートが１μｇ／ｍｌとなるように固相化用緩衝液（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温でインキュベートし、該コンジュゲートをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。
【００２４】
該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で１回洗浄した後、市販の抗マウスＩｇＧ抗体−ＡＬＰコンジュゲートを含むアッセイ緩衝液（１５％  ＦＣＳ、５％  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸、１００ｍＭ  スクロース、５０ｍＭ  塩化マグネシウム）を添加した。さらに特開２００８−７９５１７号公報に記載の多穴プレート用レプリケータを用いてハイブリドーマの培養上清を添加し、１時間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ４−ＭＵＰ）を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度をプレートリーダーで測定した（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）。陰性対照としてハイブリドーマの培養上清の代わりに培地を添加したものを用い、陰性対照の５倍以上の蛍光強度を示したものを抗体陽性とした。全部で２３個のハイブリドーマが抗体陽性と判定された。
【００２５】
（５）モノクロ−ン化
上記（４）によって抗体陽性と判定されたハイブリド−マのうち、蛍光強度が高いほうから１０個を選択し、限界希釈法でクロ−ニングした。即ち、３８４ウエル細胞培養プレ−トにハイブリド−マを１個／５０μｌ／ウエルの濃度で培養し、ハイブリド−マが増殖してきたウエルの培養上清について、（４）のＥＬＩＳＡを行なった。抗体陽性と判定され、かつ顕微鏡観察でモノクローンに見えるハイブリド−マを選択した。この操作を２〜３回繰り返し、最終的に、ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰとの反応性が最も低い抗体を産生する抗体産生細胞株９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ株を確立した。またこの株が産生するモノクローナル抗体を９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体とした。
【００２６】
ＩＩ．モノクロ−ナル抗体のクラス・サブクラスの決定
９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体のクラス・サブクラスの決定は、マウスイムノグロブリン各クラス・サブクラスに特異的な抗体（Ｒｏｃｈｅ社、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉＢｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用いて行なった。その結果、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体は、抗ＩｇＧ２ｂ抗体との間のみ沈降線が認められ、ＩｇＧ２ｂに属することがわかった。
【００２７】
ＩＩＩ．モノクローナル抗体のエピトープ分析
９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体と反応するｈＢＮＰ（３−３２）のエピトープを、下記のＥＬＩＳＡにより決定した。該抗体が１μｇ／ｍｌとなるように固相化用緩衝液で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温でインキュベートし、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体をＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で１回洗浄した後、ｈＢＮＰ（３−３２）、ｈＢＮＰペプチドフラグメント、及びＡＬＰ標識したＢＣ２３−１１を含むアッセイ緩衝液を添加し、１時間室温でインキュベートした。このとき、ｈＢＮＰ（３−３２）は５００ｐＭとなるように添加した。またｈＢＮＰペプチドフラグメントは、ｈＢＮＰの１−１０位，３−６位，３−７位，３−８位，３−９位又は３−１０位のアミノ酸残基に相当するペプチド（以下、それぞれｈＢＮＰ（１−１０）、ｈＢＮＰ（３−６）、ｈＢＮＰ（３−７）、ｈＢＮＰ（３−８）、ｈＢＮＰ（３−９）又はｈＢＮＰ（３−１０）とする）の６種類を用い、５０または５００ｎＭとなるように添加した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、４−ＭＵＰ溶液を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度をプレートリーダーで測定した。
【００２８】
結果を図１に示す。図１のとおり、ｈＢＮＰ（１−１０）、ｈＢＮＰ（３−６）またはｈＢＮＰ（３−７）を添加したときは、蛍光強度の減少はごくわずかしか観察されなかった。一方、ｈＢＮＰ（３−８）、ｈＢＮＰ（３−９）、ｈＢＮＰ（３−１０）を添加したときは、濃度依存的に蛍光強度が減少した。この測定系では、蛍光強度は、固相化した９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体に結合したｈＢＮＰの量に依存する。つまり、ｈＢＮＰペプチドフラグメントの添加により蛍光強度が減少するということは、該ｈＢＮＰペプチドフラグメントが、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体とｈＢＮＰの結合を阻害することを示している。阻害を生じる最小のｈＢＮＰペプチドフラグメントはｈＢＮＰ（３−８）であったため、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体が認識する最小のエピトープはｈＢＮＰ（３−８）であることが明らかとなった。
【００２９】
ＩＶ．モノクロ−ナル抗体を用いたｈＢＮＰ（３−３２）、ｈＢＮＰおよびｈｐｒｏＢＮＰのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ＩＩＩに記載の方法で９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体を固相化し、スキムミルクでブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、ｈＢＮＰ（３−３２）とＡＬＰ標識したＢＣ２３−１１を含むアッセイ緩衝液を添加し、１時間室温でインキュベートした。このとき、ｈＢＮＰ（３−３２）は５００ｐＭとなるように添加した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、４−ＭＵＰ溶液を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度をプレートリーダーで測定した。ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰのサンドイッチＥＬＩＳＡは、上記のｈＢＮＰ（３−３２）の代わりにｈＢＮＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｂｒａｉｎ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−３２  ｈｕｍａｎ）またはｈｐｒｏＢＮＰ（ＨｙＴｅｓｔ社、Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏＢＮＰ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）を用いて測定した。陰性対照として、ＡＬＰ標識したＢＣ２３−１１を含むアッセイ緩衝液のみを添加し、同様に測定した。結果を図２に示す。図２のとおり、ｈＢＮＰ（３−３２）を添加した場合は陰性対照の５５倍程度の蛍光強度を示したが、ｈＢＮＰおよびｈｐｒｏＢＮＰを添加した場合は陰性対照と同等の蛍光強度を示した。これは、固相化した９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体はｈＢＮＰ（３−３２）と結合するが、ｈＢＮＰおよびｈｐｒｏＢＮＰと結合しないことを示している。すなわち、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体は、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体であることが明らかとなった。
【図１】
2014091719.tif 000003
【図２】
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