(57)【要約】【課題】            裏面からの反射光を抑え、光学式センサーからの情報を高感度で検出するための光学式センサー用検出方法を提供すること【解決手段】          被検出物と反応する機能面51と、当該機能面51と平行に形成される裏面52とからなる光学式センサー50からの光（電磁波）の情報を検出するためのものであって、機能面51に光を照射する光照射工程と、裏面52に対する光照射側からの角度θoutが０°＜θout＜９０°の範囲における所定の位置で光学式センサー50からの光の情報を検出する光検出工程と、からなる光学式センサー用検出方法。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物と反応する機能面と、当該機能面と平行に形成される裏面とからなる光学式センサーからの光の情報を検出するための光学式センサー用検出方法であって、
前記機能面に光を照射する光照射工程と、
前記裏面に対する前記光照射側からの角度θoutが０°＜θout＜９０°の範囲における所定の位置で前記光学式センサーからの光の情報を検出する光検出工程と、
を有することを特徴とする光学式センサー用検出方法。
【請求項２】
前記光検出工程は、前記光学式センサーの裏面側の位置で前記光学式センサーからの光の情報を検出することを特徴とする請求項１記載の光学式センサー用検出方法。
【請求項３】
前記光照射工程は、光を前記光学式センサーの裏面側から照射することを特徴とする請求項１又は２記載の光学式センサー用検出方法。
【請求項４】
前記光検出工程は、前記検出角度θoutが、前記被検出物と反応させる前の前記光学式センサーから受け取る光の強度が最も高くなる角度で、前記光学式センサーからの光の情報を検出することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の光学式センサー用検出方法。
【請求項５】
前記光照射工程は、前記裏面に対する光の照射角度θinが、前記光検出工程において前記被検出物と反応させる前の前記光学式センサーから受け取る光の強度が最も高くなる角度で、光を照射することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の光学式センサー用検出方法。
【請求項６】
前記光検出工程は、前記機能面が被検出物と反応する前後の反射光の情報の連続的な変化を検出するものであることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の光学式センサー用検出方法。
【請求項７】
前記機能面は、フォトニック結晶として機能する凹凸構造を有するものであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の光学式センサー用検出方法。
【請求項８】
前記機能面は、前記被検出物と結合する認識素子を具備するものであることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の光学式センサー用検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学式センサーからの情報を検出するための光学式センサー用検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素や抗体、ＤＮＡ、化学物質等の被検出物の検出および定量を行うものとして、フォトニック結晶として機能する構造を利用した光学式センサー（例えば、特許文献１参照）や、金、銀又は白金などのナノメートルオーダーでの貴金属微粒子に発現する非線形光学現象である局在表面プラズモン共鳴（LSPR）を利用した光学式センサー（例えば、特許文献２参照）等がある。
【０００３】
これらの光学式センサーによる被検出物の検出方法としては、光学式センサーの機能面に対して所定の角度で光を入射させ、その反射光又は透過光を検出し、機能面と被検出物との反応によって生じる光の変化を観測している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０４４２７４号
【特許文献２】特許公開２００６−２５０６６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の方法では、検出した光に、裏面からの反射光などの被検出物を検出するために不要な光が含まれるため、機能面によって生じる光のわずかな変化を観測することが困難となり、感度が低くなるという問題があった。
【０００６】
そこで本発明では、裏面からの反射光等を抑え、光学式センサーからの情報を高感度で検出するための光学式センサー用検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の光学式センサー用検出方法は、被検出物と反応する機能面と、当該機能面と平行に形成される裏面とからなる光学式センサーからの光の情報を検出するための方法であって、前記機能面に光を照射する光照射工程と、前記裏面に対する前記光照射側からの角度θoutが０°＜θout＜９０°の範囲における所定の位置で前記光学式センサーからの光の情報を検出する光検出工程と、を有することを特徴とする。
【０００８】
この場合、前記光検出工程は、前記光学式センサーの裏面側の位置で前記光学式センサーからの光の情報を検出する方が好ましい。また、前記光照射工程は、光を前記光学式センサーの裏面側から照射する方が好ましい。
【０００９】
また、前記光検出工程は、前記検出角度θoutが、前記被検出物と反応させる前の前記光学式センサーから受け取る光の強度が最も高くなる角度で、前記光学式センサーからの光の情報を検出する方が好ましい。
【００１０】
また、前記光照射工程は、前記裏面に対する光の照射角度θinが、前記光検出工程において前記被検出物と反応させる前の前記光学式センサーから受け取る光の強度が最も高くなる角度で、光を照射する方が好ましい。
【００１１】
また、前記光検出工程は、前記機能面が被検出物と反応する前後の反射光の情報の連続的な変化を検出するものである方が好ましい。
【００１２】
なお、本発明の光学式センサー用検出方法は、前記機能面に、フォトニック結晶として機能する凹凸構造を有するものに好適に使用できる。この場合、当該機能面は、前記被検出物と結合する認識素子を具備するものであっても良い。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の光学式センサー用検出方法は、裏面に対する光照射側からの角度θoutが０°＜θout＜９０°の範囲における所定の位置で光学式センサーからの光の情報を検出するので、裏面からの反射光のような被検出物を検出、定量するために不要な光が検出されるのを抑制することができ、機能面からの光の情報を高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の光学式センサー用検出方法を示す概略説明図である。
【図２】本発明の光学式センサー用検出方法を示す概略説明図である。
【図３】本発明の光学式センサー用検出方法を示す概略説明図である。
【図４】本発明の光学式センサー用検出方法を示す概略説明図である。
【図５】機能面上の溶液の屈折率の違いにおける検出角度と光強度との関係を示すグラフである。
【図６】機能面の構造の違いにおける検出角度と光強度との関係を示すグラフである。
【図７】本発明の学式センサー用検出方法で被検出物の検出を行った際のグラフである。
【図８】光学式センサーの構成を示す概略説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の光学式センサー用検出方法は、被検出物と反応する機能面51と、当該機能面51と平行に形成される裏面52とからなる光学式センサー50からの光（電磁波）の情報を検出するためのものであって、機能面51に光を照射する光照射工程と、裏面52に対する光照射側からの角度θoutが０°＜θout＜９０°の範囲における所定の位置で光学式センサー50からの光の情報を検出する光検出工程と、で主に構成される（図１〜図４参照）。
【００１６】
ここで、被検出物とは、化学物質や生体物質等を意味する。具体的には、抗原、抗体、レセプター、リガンド、レクチン、糖鎖化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ハプテン等が挙げられる。被検出物の機能から分類すると、ホルモン、イムノグロブリン、凝固因子、酵素、薬剤等が含まれる。物質名では、血清アルブミン、マクログロブリン、フェリチン、α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＩＶ−１Ｐ２４などが挙げられる。
【００１７】
また、光学式センサー50とは、被検出物と反応する機能面51と、当該機能面51と平行に形成される平坦な裏面52とからなり、光（電磁波）を照射すると、機能面51の機能により被検出物の有無や量によって反射光の波長や光強度が変化するものを意味する。なお、機能面51は微視的には凹凸構造を有する場合もあるが、ここでいう「機能面と平行」とは、巨視的に見た場合に平面と見なせる面と平行であることを意味する。
【００１８】
光学式センサー50の一例としては、図８に示すように、所定の被検出物を検出するためのもので、所定の形状が二次元的に周期配列されフォトニック結晶として機能する凹凸構造11を有する基層１と、被検出物と結合する認識素子２と、認識素子２と結合する認識素子結合因子32を有し、凹凸構造11の表面に形成される媒介手段３と、で構成されるものがある。
【００１９】
凹凸構造11は、フォトニック結晶として機能するものであればどのようなものでも良いが、例えば、所定の直径を有する孔や円柱を所定の間隔で二次元的に正確に周期配列した構造を用いることができる。また、凹凸構造11の間隔は、反射される光のピーク波長が可視領域となるように形成するのが好ましい。具体的には、50〜500ｎｍの直径を有する孔又は柱を50〜1000ｎｍのピッチで二次元的に周期配列したものを用いることができる。なお、３次元的に周期配列させたものでも構わない。
【００２０】
また、基層１の材料としては、フォトニック結晶を形成できるものであればどのようなものでも良いが、好ましくは、大面積で均一な凹凸構造11を再現性良く形成できるインプリント技術（熱インプリント、光インプリント等）を適用可能な材料が良い。例えば、光硬化性樹脂、熱硬化性樹脂、あるいは熱可塑性樹脂が該当する。
【００２１】
光硬化性樹脂又は熱硬化性樹脂としては、エポキシド含有化合物類、（メタ）アクリル酸エステル化合物類、ビニルエーテル化合物類、ビスアリルナジイミド化合物類のようにビニル基・アリル基等の不飽和炭化水素基含有化合物類等を用いることができる。この場合、熱的に重合するために重合反応性基含有化合物類を単独で使用することも可能であるし、熱硬化性を向上させるために熱反応性の開始剤を添加して使用することも可能である。更に光反応性の開始剤を添加して光照射により重合反応を進行させて成型パターンを形成できるものでもよい。熱反応性のラジカル開始剤としては有機過酸化物、アゾ化合物が好適に使用でき、光反応性のラジカル開始剤としてはアセトフェノン誘導体、ベンゾフェノン誘導体、ベンゾインエーテル誘導体、キサントン誘導体等が好適に使用できる。また、反応性モノマーは無溶剤で使用しても良いし、溶媒に溶解して塗布後に脱溶媒して使用しても良い。
【００２２】
熱可塑性樹脂としては、環状オレフィン開環重合／水素添加体（ＣＯＰ）や環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）等の環状オレフィン系樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ビニルエーテル樹脂、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）やポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等のフッ素樹脂、ポリスチレン、ポリイミド系樹脂、ポリエステル系樹脂等を用いることができる。
【００２３】
認識素子２は、被検出物を特異的に結合できるものであればどのようなものでも良い。例えば、抗原に対しては抗体、抗体に対しては抗原、ハプテンに対しては抗ハプテン抗体、抗ハプテン抗体に対してはハプテン、ＤＮＡに対してはハイブリダイズすることができるＤＮＡ又はＰＮＡ、ビオチンに対してはアビジンあるいはストレプトアビジン、アビジンあるいはストレプトアビジンに対してはビオチンあるいはビオチン化タンパク、ホルモン受容体（例えばインスリン受容体）に対してはホルモン（例えばインスリン）、ホルモン（例えばインスリン）に対してはホルモン受容体（例えばインスリン受容体）、レクチンに対しては対応する糖鎖、糖鎖に対しては対応するレクチンなどが挙げられる。また、認識素子２は、特異的結合能を有するそれらのフラグメントあるいはサブユニットなどをも含む。さらに、細胞自体を認識素子２として選択可能であり、この場合の被検出物は、該細胞のある一部（受容体等）を特異的に認識するものでよい。
【００２４】
媒介手段３は、凹凸構造11の表面に形成され、凹凸構造11に認識素子２を確実に結合させるためのものであり、媒介手段３を構成する材料には、認識素子結合因子32が含まれている。このように媒介手段３を設けることにより、基層１の凹凸構造11を精密に形成できる材料を認識素子２の結合を考慮することなく選択することができ、認識素子２は媒介手段３を介して凹凸構造11上に均一かつ確実に配置することができる。
【００２５】
認識素子結合因子32は、認識素子２と結合できるものであればどのようなものでも良く、認識素子２のアミノ基やカルボキシル基、チオール基を有する分子あるいは導入した分子（例えば、抗体などのタンパク質）と結合するN-ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）、アルデヒド基、カルボキシル基、マレイミド基等を用いることができる。例えば、アミノ基の場合、カルボキシル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）、アルデヒド基を用いることができ、チオール基の場合、マレイミド基を用いることができる。
【００２６】
また、媒介手段３は、被検出物以外の夾雑物との結合を防止する夾雑物非特異的吸着除去因子33を有する方が好ましい。夾雑物非特異的吸着除去因子33としては、被検出物以外の夾雑物との結合を防止することができるものであればどのようなものでも良いが、例えば、非特異的吸着除去能を有するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が該当する。
【００２７】
また、媒介手段３は、基層１に被覆することによって形成することもできるが、媒介手段３に基層１を構成する材料と結合する基層結合因子31を設ければ、媒介手段３を基層１に直接形成することもできる。基層結合因子31としては、基層１を構成する材料と結合できるものであればどのようなものでも良く、例えば、基層１の材料が環状オレフィン系樹脂の場合には、シラノール基を用いることができる。
【００２８】
光学式センサー50をこのように形成することにより、凹凸構造11に光を照射すると、フォトニック結晶の機能によって凹凸構造11に応じた特定の波長の光が反射される。また、凹凸構造11に所定の被検出物が吸着し、凹凸構造11に微妙な変化があると、それに応じて反射光の波長や強度が変化する。この変化によって、所定の被検出物を検出することが可能となる。
【００２９】
なお、光学式センサー50の機能面51はフォトニック結晶として機能する凹凸構造に限定されるものではなく、例えば、局在表面プラズモン共鳴を利用したものなど、光学式センサー50からの光（電磁波）の情報を検出することにより被検出物を検出又は定量できるものであれば他のものであっても構わない。
【００３０】
このような光学式センサー50は、チップとして用いても良いし、マルチウェルプレートやディッシュ等の容器の底面に配置して用いても良い。
【００３１】
光照射工程では、光学式センサー50の機能面51に光（電磁波）を照射するものである。照射する光の波長は、光学式センサー50から光の情報を受けることができる範囲のものであれば特に限定はされないが、好ましくは所定範囲の波長、更に好ましくは単波長のものを用いる方が良い。また、取り扱いが簡単であることから、可視光である方が好ましい。
【００３２】
光の照射角度θinも、光学式センサー50から光の情報を受けることができる範囲であれば特に限定されるものではないが、被検出物と反応させる前の光学式センサー50から光検出手段70が受け取る光の強度が最も高くなるように設定するのが好ましい。
【００３３】
なお、光学式センサー50の機能面51側には、被検出物を含む溶液等が存在することから、当該溶液の影響を排除するため、図１又は図２に示すように、光照射工程は、光を光学式センサー50の裏面52側から照射する方が好ましい。
【００３４】
光源60としてはどのようなものでも良いが、例えば、タングステン・ハロゲン光源や発光ダイオード、ＬＥＤ、重水素ランプ、有機ＥＬ、レーザー等を用いれば良い。また、光ファイバーを用いて光源60の光を機能面に照射しても良い。
【００３５】
光検出工程は、裏面52に対する光照射側からの検出角度θoutが０°＜θout＜９０°の範囲における所定の位置で光学式センサー50からの光の情報を検出するものである。換言すると、光照射工程で照射した光が機能面51に当たるまでの経路を裏面52に投影した直線に垂直な面のうち、光の照射側の方向で光学式センサー50からの光の情報を検出することを意味する。上記条件を満たせば、光を検出する方向は、光学式センサー50の機能面51側からでも裏面52側からでも良い。なお、光の情報とは、ピーク波長や光強度等の光学特性を意味する。
【００３６】
従来は、検出角度θoutが９０°≦θout＜１８０°の範囲における所定の位置で光学式センサー50からの光の情報を検出していたが、この角度では、裏面からの反射光の影響が大きく、機能面の機能に基づくわずかな光の変化を捉えるのが困難で感度の低下を招いていた。これに対し、本発明のように検出角度θoutを０°＜θout＜９０°にすれば、裏面からの反射光の影響を抑えることができ、機能面からの光の情報を高感度に検出することができる。
【００３７】
光の検出角度θoutは、０°＜θout＜９０°の範囲であれば特に限定されるものではないが、被検出物と反応させる前の光学式センサー50から受け取る光の強度が最も高くなるように設定するのが好ましい。また、光源60と光検出手段70が一体となった反射プローブを用いることができるという観点からは、光の照射角度と光の検出角度を同じにしても良い。
【００３８】
なお、光学式センサー50の機能面51側には、被検出物を含む溶液等が存在することから、当該溶液の影響を排除するため、図１又は図３に示すように、光検出工程は、光学式センサー50の裏面52側の位置で光学式センサー50からの光の情報を検出する方が好ましい。
【００３９】
また、当該光検出工程は、機能面51が被検出物と反応する前後の反射光の情報の連続的な変化を検出するものであれば、より高感度かつ迅速に被検出物を検出することができる。
【００４０】
また、光を検出する光検出手段70には、例えば、マルチチャンネル分光器やＣＣＤイメージセンサー、ＣＭＯＳセンサー等を用いることができる。また、光ファイバーを用いて光センサーからの光を光検出手段70に取り込んでも良い。また、取得した情報の処理には、コンピュータ等の情報処理手段を用いれば良い。
【００４１】
次に本発明の実施例を説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。光学式センサーとしては、環状オレフィン系熱可塑性樹脂（ＣＯＰ）製であって、ピッチ460nm、直径230nm、深さ200nmのホールを三角配置したフォトニック結晶として機能する機能面を有する光学式センサーＡと、ピッチ600nm、直径400nm、深さ400nmのホールを三角配置したフォトニック結晶として機能する機能面を有する光学式センサーＢを用いた。また光源60には、波長が470nmの青色ＬＥＤ（出力2.66W：700mA、3.8V）を用い、当該光は光ファイバーを介して機能面に照射した。また、光検出手段70には、Ocean Optics社製の分光器（USB4000）を用いた。光センサーからの光は、光ファイバーを用いて当該分光器に取り込んだ。
【実施例１】
【００４２】
センサーＡを35mmディッシュの底面とし、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）を２ml入れた。このセンサーＡの底面側から照射角度θinを５５°として光を照射し、底面側における検出角度θoutを５５°、９０°、１２５°としてピーク波長の光強度を調べた。その結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
検出角度が９０°の場合には、ピーク波長を観測することができなかった。また、検出角度が１２５°の場合には、裏面からの反射光が強すぎるため、機能面で反射される光のわずかな変化を検出するのには適さないことがわかった。
【実施例２】
【００４５】
センサーＡを35mmディッシュの底面とし、屈折率の異なる３種類の溶液を２ml入れた。溶液としては、屈折率が1.33の超純水（ミリＱ）、屈折率が1.37のショ糖溶液（25w％）、屈折率が1.42のショ糖溶液（50w％）を用いた。このセンサーＡの底面側で検出角度θoutが４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°における反射光の光強度を調べた。なお、当該実施例では、光源と光検出手段が一体となった反射プローブを用いたため、θinとθoutは同一の値である。その結果を図５に示す。
【００４６】
図５より、溶液の屈折率を変えても反射光強度が変化するだけで、最適な検出角度θoutは変わらなかった。
【実施例３】
【００４７】
センサーＡとセンサーＢについて光の検出角度θoutと光強度との関係を調べた。まず、センサーＡおよびセンサーＢをそれぞれ35mmディッシュの底面とし、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）を２ml入れた。次に、各センサーの底面側で検出角度θoutが４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°における反射光の光強度を調べた。なお、当該実施例では、光源と光検出手段が一体となった反射プローブを用いたため、θinとθoutは同一の値である。その結果を図６に示す。
【００４８】
センサーＡは検出角度θoutが５５°、センサーBは検出角度θoutが６５°のときが最も光強度が高い。したがって、機能面に形成されたフォトニック結晶の構造が変わると、最適な検出角度θoutも変化することがわかる。
【実施例４】
【００４９】
センサーＡが被検出物であるウシ血清アルブミン（BSA）を吸着し易くするために、機能面に親水化処理を行い、当該センサーＡを96ウェルプレートの底面とした。このウェルに、0.05w%の界面活性剤（Tween20）を含むｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）を100μl入れた。次に、当該溶液を50μl抜き、代わりに被検出物としてウシ血清アルブミン（BSA）溶液を50μl加え、ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を加えてからの時間と、反射光の光強度との関係を調べた。加えたウシ血清アルブミン（BSA）溶液は、50mg/ml、5mg/ml、0.5mg/mlの３種類の濃度を用いた。したがって、加えた後の各ウシ血清アルブミン（BSA）溶液は、25mg/ml、2.5mg/ml、0.25mg/mlとなる。また、反射光の検出は、底面側で検出角度θoutが６０°となる位置で行った。また、当該実施例では、光源と光検出手段が一体となった反射プローブを用いたため、光の照射角度θinも６０°である。その結果を図６に示す。被検出物を短時間で高感度に検出できることがわかる。
【符号の説明】
【００５０】
１    基層
２    認識素子
３    媒介手段
１１  凹凸構造
３１  基層結合因子
３２  認識素子結合因子
３３  夾雑物非特異的吸着除去因子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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