(57)【要約】【課題】安定して維持培養できることにより、高効率な遺伝子導入が可能であるiPS前駆細胞を提供する。【解決手段】  ヒト体細胞へOCT4、SOX2、及びKLF4のうち何れか一つを導入し、MEK阻害剤、GSK3β阻害剤、及び白血病阻害因子LIFを含む培地にて培養することにより作製される。MEK阻害剤は、例えばPD0325901である。GSK3β阻害剤は、例えばCHIR99021である。iPS前駆細胞は、OCT4陰性、NANOG陰性、NESTIN陽性である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
OCT4陰性、NANOG陰性、NESTIN陽性であることを特徴とするiPS前駆細胞。
【請求項２】
請求項１記載のiPS前駆細胞から誘導されたことを特徴とするiPS細胞。
【請求項３】
ヒト体細胞へOCT4、SOX2、及びKLF4のうち何れか一つを導入し、MEK阻害剤、GSK3β阻害剤、及び白血病阻害因子LIFを含む培地にて培養することにより作製されることを特徴とするiPS前駆細胞。
【請求項４】
前記MEK阻害剤が、PD0325901であることを特徴とする請求項３に記載のiPS前駆細胞。
【請求項５】
前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021であることを特徴とする請求項３に記載のiPS前駆細胞。
【請求項６】
前記ヒト体細胞が、ヒト線維芽細胞であることを特徴とする請求項３に記載のiPS前駆細胞。
【請求項７】
ヒト体細胞への初期化因子の導入では、OCT4、SOX2、及びKLF4のうち何れか一つを導入することに加えて、NANOGをも導入することを特徴とする請求項３乃至６の何れか１項に記載のiPS前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、iPS細胞へ転換させることができるiPS前駆細胞、及び、iPS細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ES細胞やiPS細胞は、分化多能性を有した状態で長期にわたり継代培養することができるという性質をもつ。従って、細胞移植が有効な治療方法として期待されるパーキンソン病等の治療にこれらの多能性幹細胞を用いることが期待されている。
【０００３】
細胞移植療法においては、多能性幹細胞を、目的細胞又はその前駆細胞に分化誘導した上で移植する必要がある。例えば、パーキンソン病の治療にあたっては、多能性幹細胞を、神経細胞又はその前駆細胞へと分化誘導して移植する。ES細胞やiPS細胞の分化誘導には、主として外来遺伝子導入が用いられている。
【０００４】
しかしながら、外来遺伝子導入については、マウスES細胞やマウスiPS細胞（以下、マウスES/iPS細胞と略することがある。）ではおおむね良好な結果が得られるが、ヒトES細胞やヒトiPS細胞（以下、ヒトES/iPS細胞と略することがある。）では難しいとされている。にもかかわらず、この問題を解決すべき研究はほとんど実施されておらず、ヒトES/iPS細胞への遺伝子導入が困難であることの機構については全く不明である。予想される理由としては、ヒトES/iPS細胞はマウスES/iPS細胞と比べて増殖速度が遅く、更にヒトES/iPS細胞は単細胞分散培養が出来ないからであると考えられている。
【０００５】
この問題を克服するために、近年、ヒトES/iPS細胞をマウスES細胞の状態に初期化する試みがなされている。非特許文献１に記載されているように、Bueckerらは、ドキシサイクリン誘導レンチウイルスシステムでOCT4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4の5種類のリプログラミング因子をヒト線維芽細胞へ導入し、ドキシサイクリン及びLIF存在下で培養したところ、約30日後にナイーブ（初期状態に近い状態）なマウスES細胞と類似の形態を示すコロニーが出現することを発見している。
【０００６】
また、非特許文献２に記載されているように、Hannaらは、ヒト線維芽細胞においてドキシサイクリン存在下でOCT4、SOX2、KLF4の3因子の発現を持続させたまま、ERK1/2阻害剤PD0325901（PD）、GSK3阻害剤CHIR99021（CH）、LIFを含む無血清N2B27培地で培養すると、14日から25日後に、ナイーブなマウスES細胞様の形態を示すコロニーが出現することを発見している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】BueckerC, Chen HH, Polo JM, Daheron L, Bu L, Barakat TS, Okwieka P, Porter A, GribnauJ, Hochedlinger K, Geijsen N. A murine ESC-like state facilitates transgenesis andhomologous recombination in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2010,6 (6): 535-546.
【非特許文献２】HannaJ, Cheng AW, Saha K, Kim J, Lengner CJ, Soldner F, Cassady JP, Muffat J, CareyBW, Jaenisch R. Human embryonic stem cells with biological and epigeneticcharacteristics similar to those of mouse ESCs. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010,107 (20): 9222-9227.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述の両細胞株は多くのマウスES細胞の性質を有するものの、ナイーブ状態を安定して長期間維持することはできず、高効率な遺伝子導入が困難であるという問題点を有する。
【０００９】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、安定して維持培養できることにより、高効率な遺伝子導入が可能であるiPS前駆細胞を提供するとともに、このiPS前駆細胞から誘導されたiPS細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかるiPS前駆細胞は、OCT4陰性、NANOG陰性、NESTIN陽性であることを特徴とする。ここでiPS前駆細胞とは、iPS細胞へ転換させることができる細胞である。
【００１１】
また、本発明にかかるiPS前駆細胞は、ヒト体細胞へOCT4、SOX2、及びKLF4のうち何れか一つを導入し、MEK阻害剤、GSK3β阻害剤、及び白血病阻害因子LIFを含む培地にて培養することにより作製されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、安定して維持培養できる体細胞を提供できるため、高効率な遺伝子導入が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】2i-LRCsの形態を示す図である。
【図２】2i-LRCsにおける遺伝子発現解析の結果を示す図である。
【図３】2i-LRCsと、マウスES細胞又はヒトiPS細胞との倍加時間の比較を示す図である。
【図４】LIFを除去した培地にて培養した2i-LRCsの形態を示す図である。
【図５】ALK阻害剤で処理した後の2i-LRCsの形態を示す図である。
【図６】2i-LRCsにおける外来因子の除去によるコロニー形成能評価を示す図である。
【図７】図７はTet-On誘導系リプログラミング因子発現レンチウイルスベクターを示す図であり、そのうち（ａ）は、NANOGを用いずにOCT4、SOX2、KLF4、L-MYCの4因子の場合であり、（ｂ）は、NANOG、OCT、SOX2、KLF4、L-MYCの5因子の場合である。
【図８】図８はALP染色による2i-LRCsの樹立を示す図であり、そのうち（ａ）は、NANOGを用いない4因子の場合であり、（ｂ）は、NANOGを用いる5因子の場合である。
【図９】LD-5FiPS細胞における未分化マーカーの発現を示す図であり、そのうち（ａ）はOCT4であり、（ｂ）はNANOGであり、（ｃ）はSOX2であり、（ｄ）はSSEA4であり、（ｅ）はTRA-1-81である。
【図１０】2i-LRCsのLD-5FiPS細胞への転換を示す図である。
【図１１】2i-LRCsから分化誘導された運動神経細胞を示す図である。
【図１２】2i-LRCsから分化誘導された運動神経細胞の各種マーカーの発現を示す図である。
【図１３】IDE1及びIDE2を用いた場合において、2i-LRCsの中内胚葉分化誘導の結果を示す図である。
【図１４】IDE1及びIDE2を用いた場合において、各種マーカーの発現を示す図である。
【図１５】4kbのEGFP発現ベクターを電気穿孔法により遺伝子導入した状態を説明する図であり、そのうち（ａ）はGFP陽性の状態を示す図であり、（ｂ）は明視野の状態を示す図である。
【図１６】15kbのEGFP発現ベクターを電気穿孔法により遺伝子導入した状態を説明する図であり、そのうち（ａ）はGFP陽性の状態を示す図であり、（ｂ）は明視野の状態を示す図である。
【図１７】GFP導入2i-LR細胞由来のiPS細胞の樹立を示す図であり、そのうち（ａ）はGFP陽性の状態を示す図であり、（ｂ）は明視野の状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本実施形態にかかるiPS前駆細胞は、OCT4陰性、NANOG陰性、及びNESTIN陽性である性質を有する。即ち、陰性マーカーとしてはOCT4及びNANOGを用い、陽性マーカーとしてはNESTINを用いる。陽性マーカーは例えば90%以上の細胞における発現を基準値とし、陰性マーカーは例えば10%以下の細胞での発現を基準とする。
【００１６】
細胞マーカーは、RT-PCR(ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction)等の公知の方法を用いて検出することができる。RT-PCRは、RNA鎖を鋳型に逆転写を行い、生成されたcDNAに対してPCRを行う方法である。また未分化細胞マーカーや各種蛋白質は、更にリアルタイムPCRと組み合わせて検出することもできる。そのような方法は、リアルタイムRT-PCRと呼ばれる。リアルタイムPCRは、PCRによって増幅する核酸をリアルタイムでモニタリングする方法である。
【００１７】
後述するように、本実施形態にかかるiPS前駆細胞は、ヒト体細胞へ、OCT4、SOX2、及びKLF4のうち何れか一つを導入し、MEK阻害剤（例えばPD0325901（PD））、GSK3β阻害剤（例えばCHIR99021（CH））、及び白血病阻害因子LIFを含む無血清N2B27培地にて培養することにより作製される。本実施形態にかかるiPS前駆細胞は、2i+LIFdependent reprogramming cells : 2i-LRCsと呼ぶことも可能である。この2i-LRCsは、少なくとも100継代以上にわたって培地存在下で維持できる。つまり、正常体細胞と違い不死化能を獲得した状態である。一方で、2i-LRCsは、多分化能を有さず、少なくとも神経幹細胞様の性質を獲得した細胞である。2i-LRCsのヌードマウス移植実験により、2i-LRCsはテラトーマ形成がないことも判明している。更に、2i-LRCsの安定的な増殖維持には、外来遺伝子の持続的な発現を要求する。また、2i-LRCsは単細胞分散培養が可能であり、高効率な遺伝子導入を実現させる。
【００１８】
次に、本実施形態にかかるiPS前駆細胞（2i-LRCs）の製造方法を説明する。
【００１９】
本実施形態にかかるiPS前駆細胞（2i-LRCs）の製造方法は、ヒト体細胞へ、OCT4、SOX2、及びKLF4のうち何れか一つを含む核初期化因子を導入する工程と、MEK阻害剤、GSK3β阻害剤、及び白血病阻害因子LIFを含む培地にて培養する工程と、を備える。
【００２０】
ヒト体細胞は、特に限定されるものではなく、任意のヒト体細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、又は神経幹細胞等の体細胞を使用することができる。ヒト体細胞は、生体より採取されたもの、又は細胞株として樹立されたもののどちらでも使用可能である。作製されたiPS前駆細胞から誘導されたiPS細胞を生体に移植する場合には、その生体自身から採取された体細胞よりiPS前駆細胞を誘導することが好ましい。
【００２１】
ヒト体細胞に核初期化因子を導入する工程は、例えば、化学物質等（例えば、PD0325901、５−アザ−２’デオキシシチジン、BIX-01294、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、バルプロ酸等）の薬剤により体細胞において内在性の当該因子の発現を誘導する方法、当該因子をコードする遺伝子を体細胞に導入する方法、当該因子のポリペプチドをヒト体細胞と接触している培養培地に添加する方法、当該因子のポリペプチドを体細胞に導入する方法、等により実施することができる。
【００２２】
なお、核初期化因子をコードする遺伝子を体細胞に導入する方法としては、例えば核初期化因子をコードする遺伝子を組み込んだベクターを体細胞に導入する方法が例示される。当該ベクターには特に限定はなく、公知のベクターより適切なものを選択して使用することができる。例えば、ウイルスベクターを使用する方法、又は非ウイルスベクターを使用する方法のいずれもが本発明に使用できる。
【００２３】
MEK阻害剤は、例えばPD0325901であるが、特に限定されるものではなく、PD184352(CI-1040)とすることも可能である。GSK3β阻害剤は、例えばCHIR99021であるが、特に限定されるものではなく、GSK3βインヒビターVII、L803-mts、SB216763、GSK3βインヒビターIX（BIO）等とすることも可能である。白血病阻害因子LIF(leukocyteinhibitory factor)は、IL-6(interleukin-6)ファミリーに属するサイトカインの一種で、ES細胞の分化抑制因子である。LIFが、細胞膜上に存在するLiftβ/gp130のヘテロダイマー受容体に結合すると、Stat3が活性化されて、分化が抑制される。
【００２４】
核初期化因子を接触させたヒト体細胞を、通常のフィーダー細胞との共培養に供した後、培養を継続することも可能である。なお、ここでフィーダー細胞とは、誘導される多能性幹細胞の生育に有効な成分を供給しうるものであれば特に限定はなく、例えば胚線維芽細胞等の細胞が好適に使用される。
【００２５】
次に、本実施形態にかかるiPS細胞は、2i-LRCsから誘導されることにより作成される。2i-LRCsを外来遺伝子の発現を抑制した状態で、ヒトES細胞用培地で培養すると、ヒトiPS細胞へ転換する。即ち、2i-LRCsへ遺伝子導入を実施した後に、ヒトiPS細胞へ転換させることにより、ヒトiPS細胞への高効率な遺伝子導入が可能となる。結果として、遺伝子相同組換えによる遺伝子改変ヒトiPS細胞及び神経系細胞を容易に作製することが可能となる。
【実施例】
【００２６】
ドキシサイクリン誘導レンチウイルスシステムでOCT4、SOX2、NANOG、L-MYC、KLF4の5リプログラミング因子（5因子が同一ベクター上に搭載されており、更にloxP配列があるためCreによって除去可能）をヒト線維芽細胞へ導入し、ドキシサイクリン、LIF、N2B27、低分子化合物（PD0325901（PD）、GSK3阻害剤CHIR99021（CH））、アスコルビン酸及び2%血清代替物（ノックアウト血清代替物）を含む無血清N2B27培地にて、MEFフィーダー細胞上で培養した。
【００２７】
図１は、2i-LRCsの形態を示す図である。図１に示されるように、約30日後に小さくて密接につまったコロニーが出現し、このコロニーを単離して以下のクローナル解析に用いた。これらのコロニーは、偏平な二次元コロニー形態を示すヒトES細胞と対照的に、マウスES細胞のような密接につまった、光沢のある、ドーム型の形態を示した。これらの細胞を、2i-LRCs（2i+LIF dependentreprogramming cells）と名付けた。
【００２８】
細胞表面マーカーの発現を確認したところ、2i-LRCsは、ヒトES細胞マーカーであるSSES-4が陽性であった。図２は、2i-LRCsにおける遺伝子発現解析の結果を示す図である。図２に示されるように、2i-LRCsは、ヒトES細胞マーカーである内在性OCT4、NANOG、L-MYC、REX1、LEFTY1も発現していないことが示された。一方で、ヒトES細胞マーカーであるLIN28及びSTELLAは発現が観察された。2i-LRCsは、神経幹細胞マーカーであるSOX2、SOX1、NESTIN、PAX6も発現していたことから、2i-LRCsは神経幹細胞様の性質を有することが予想された。
【００２９】
図３は、2i-LRCsと、マウスES細胞又はヒトiPS細胞との倍加時間の比較を示す図である。図３に示されるように、ヒトiPS細胞の倍加時間は３０〜３５時間であったが、2i-LRCsは２３〜２５時間であり、2i-LRCsは、ヒトES細胞やiPS細胞よりも高い増殖率を示した。なお、マウスES細胞の倍加時間は１２〜１５時間であった。また、2i-LRCsはトリプシン消化によって増殖でき、単一細胞に解離後も増殖できた。
【００３０】
次に、2i-LRCsにおけるLIFの影響について調べた。図４は、LIFを除去した培地にて培養した2i-LRCsの形態を示す図である。図４に示されるように、LIFを除去した培地において、2i-LRCsはコロニーを維持することができないことが判明した。つまり、2i-LRCsはLIF依存性であり、LIF刺激に反応して形態及び性質が維持されることが示唆された。
【００３１】
次に、Activin/Nodalシグナリングを阻害するALK阻害剤（A-83-01）を用いて、2i-LRCsにおけるActivin/Nodalシグナリング経路の役割を解析した。図５は、ALK阻害剤で処理した後の2i-LRCsの形態を示す図である。図５に示されるように、2i-LRCsの形態及び増殖には影響を与えないことが観察された。つまり、ヒトES細胞の維持において重要とされるActivin/Nodalシグナリング経路は、2i-LRCsにおいては要求されないことが示唆された。この現象は、ナイーブ状態のマウスES細胞の性質と類似している。
【００３２】
次に、2i-LRCsは外来性の5つのリプログラミング因子（OCT4、SOX2、NANOG、L-MYC、KLF4）なしでも安定的に増殖できるのかを調べた。図６は、2i-LRCsにおける外来因子の除去によるコロニー形成能評価を示す図である。図６に示されるように、ドキシサイクリンを除去したところ、除去後28日目にはコロニー形態が失われ、全ての細胞が増殖能を消失することが観察された。
【００３３】
次に、外来性のNANOG発現の存在又は非存在下での2i-LRCs樹立について解析した。培地は、LIF/PD/CH添加N2B27培地を含む2i-LRCs維持培地を用いた。図７（ａ）は、NANOGを用いずにOCT4、SOX2、KLF4、L-MYCの4因子の場合において、Tet-On誘導系リプログラミング因子発現レンチウイルスベクターを示す図である。図７（ｂ）は、NANOG、OCT4、SOX2、KLF4、L-MYCの5因子の場合において、Tet-On誘導系リプログラミング因子発現レンチウイルスベクターを示す図である。図８（ａ）は、NANOGを用いない4因子の場合において、ALP染色による2i-LRCsの樹立を示す図である。図８（ｂ）は、NANOGを用いる5因子の場合において、ALP染色による2i-LRCsの樹立を示す図である。
【００３４】
図８（ａ）及び図８（ｂ）に示されるように、NANOGを用いずにOcCT4、SOX2、KLF4、L-MYCの4因子のみでもiPS前駆細胞は樹立できたが、iPS前駆細胞への誘導効率が低くなることが判明した。その結果、iPS前駆細胞を体細胞から高効率に誘導するには、NANOGの存在下が好ましいことが判明した。
【００３５】
次に、成長因子環境の変化によって、2i-LRCsを安定的な多能性状態に変換できるのかを調べた。クローナルな2i-LRCs株を、ドキシサイクリンを除去したbFGFを含む培地へ1.5x105cellsでMEFフィーダー細胞上へ播種した。約28日後に、外来リプログラミング因子の除去により典型的なヒトiPS細胞様のコロニー形態を示す細胞が0.001%の割合で出現した。この細胞を2i-LRCs-derived5 factors iPS（LD-5FiPS）細胞と命名した。図９は、LD-5FiPS細胞における未分化マーカーの発現を示す図であり、そのうち（ａ）はOCT4であり、（ｂ）はNANOGであり、（ｃ）はSOX2であり、（ｄ）はSSEA4であり、（ｅ）はTRA-1-81である。図９に示されるように、LD-5FiPS細胞は、ヒトiPS細胞様の性質を備えると考えられる。
【００３６】
次に、LIF及び低分子化合物が、2i-LRCsの変換にポジティブな影響を及ぼすのか調べた。2i-LRCsをヒトLIF、ドキシサイクリン、bFGF及びバルプロ酸（VPA）を含む培地へ1.5x105cellsでMEFフィーダー細胞上へ播種し、28日後にこの培地からドキシサイクリン/LIF/VPAを除き、bFGFのみの存在下で更に21日間培養した。
【００３７】
図１０は、2i-LRCsのLD-5FiPS細胞への転換を示す図である。図１０に示されるように、外来リプログラミング因子の除去によりほとんどの2i-LRCsが典型的なヒトiPS細胞様のコロニー形態を示す細胞（LD-5FiPS細胞）へ転換することが判明した。この条件は、bFGFのみと比べて10倍以上も変換効率を増加させることが判明した。
【００３８】
また、LD-5FiPS細胞は、多能性遺伝子が発現しており、TRA-1-60、SSEA4陽性であり、また、内在性のOCT4、NANOGの発現が誘導された（図９参照）。また、グローバルな遺伝子発現がLD-5FiPS細胞はヒトES/iPS細胞と高度に類似しているのに対し、2i-LRCsはこれらとは離れたクラスターを形成すること、胚葉体及びテラトーマ形成により三胚葉に分化できることが示された。
【００３９】
また、2i-LRCsの神経幹細胞としての機能評価のために、2i-LRCsの運動神経細胞への分化誘導を行った。2i-LRCsを、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ（SHH）、bFGFを含む運動神経細胞基礎培地（DMEM/F12、Neurobasal medium、N2、NEAA、GlutaMax、アスコルビン酸を含む培地）へ1.5x105cellsで、CellSTARTコーティングディッシュへ播種し、7日間培養後、更にBDNF、GDNF添加し、10日から30日間培養を行った。図１１は、2i-LRCsから分化誘導された運動神経細胞を示す図である。図１２は、2i-LRCsから分化誘導された運動神経細胞の各種マーカーの発現を示す図である。図１１及び図１２に示されるように、2i-LRCsは、HB9、Islet1、ChAT、HoxA5、HoxC5の発現が陽性である運動神経細胞へと分化した。
【００４０】
一方、ヒト及びマウスES細胞における中内胚葉系細胞への分化誘導剤であるIDE1及びIDE2を用いて、2i-LRCsの中内胚葉分化誘導を試みた。図１３は、IDE1及びIDE2を用いた場合において、2i-LRCsの中内胚葉分化誘導の結果を示す図である。図１４は、IDE1及びIDE2を用いた場合において、ヒトiPS細胞における各種マーカーの発現を示す図である。図１３及び図１４に示されるように、2i-LRCsは中内胚葉系への分化能を持たないことが観察された。
【００４１】
2i-LRCsは、マウスES細胞の多くの特徴を示したことから、標準的な電気穿孔法を用いた外来遺伝子挿入がより成功しやすいのではないかと考えられる。そこで、緑色蛍光タンパク質（EGFP）を恒常的に発現する4kbのベクターのトランスフェクション効率を調べた。図１５は、4kbのEGFP発現ベクターを電気穿孔法により遺伝子導入した状態を説明する図であり、そのうち（ａ）はGFP陽性の状態を示す図であり、（ｂ）は明視野の状態を示す図である。図１５に示されるように、2i-LRCsは、約80％のGFP陽性の細胞が観察された。なお、同じ条件でヒトiPS細胞へ遺伝子導入を行った場合のGFP陽性細胞は0％であった。
【００４２】
同様にして、EGFPを恒常的に発現する15kbのベクターのトランスフェクション効率を調べた。図１６は、15kbのEGFP発現ベクターを電気穿孔法により遺伝子導入した状態を説明する図であり、そのうち（ａ）はGFP陽性の状態を示す図であり、（ｂ）は明視野の状態を示す図である。図１６に示されるように、2i-LRCsは、約40％のGFP陽性の細胞が観察された。
【００４３】
以上の結果、2i-LRCsへの遺伝子導入効率が極めて高いことから、2i-LRCsは遺伝子導入後の相同組換えが可能な細胞であることが予想された。つまり、2i-LRCsへ遺伝子操作を行った後に、ヒトiPS細胞及び神経系細胞へと誘導することで、遺伝子改変ヒトiPS細胞及び遺伝子改変神経系細胞が容易に作製されることが示唆された。
【００４４】
このことを確証すべく、電気穿孔法によりEGFPの発現ベクターを2i-LR細胞へ導入後（EGFP-2i-LR細胞）、ヒトiPS細胞用培地下でEGFP-2i-LR細胞のiPS細胞への転換を試みた。図１７は、GFP導入2i-LR細胞由来のiPS細胞の樹立を示す図であり、そのうち（ａ）はGFP陽性の状態を示す図であり、（ｂ）は明視野の状態を示す図である。図１７に示されるように、EGFPの発現が陽性であるヒトiPS細胞の出現が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
2i-LRCsを用いれば、細胞治療や創薬スクリーニングのための遺伝子改変ヒトiPS細胞及び神経系細胞を安定的に準備することができ、医薬、創薬の分野で活用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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