(57)【要約】【課題】ナノ粒子内の色素充填率を上げ、粒子あたりの信号強度を向上させること。【解決手段】少なくともシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体と界面活性剤とから構成され、界面活性剤を除いた粒子構成要素に対するシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の比率が重量比で７０％以上であることを特徴とするナノ粒子によれば、色素あたりの信号強度（光吸収率）を弱めることなくナノ粒子内の色素充填率を上げ、粒子あたりの信号強度を向上させることが可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体と界面活性剤とから構成され、界面活性剤を除いた粒子構成要素に対するシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の比率が重量比で７０％以上であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２】
前記シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体は、化学式１で示されることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子。
【化１】
2014129317.tif 000012
（式中、R201、R202、R203、R204、R205、R206、R207、R208、R209、R210、R211、R212、R213、R214、R215、R216、R217、R218、R219、R220、R221、R222、R223、R224は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
また、R101、R102は各々が同一でも異なっていてもよく、−ＯＨ、−ＯＲ１１、−ＯＣＯＲ１２、−ＯＳｉ（−Ｒ１３）（−Ｒ１４）（−Ｒ１５）、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
ここで、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
【請求項３】
前記シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体は、シリコン  ２，３−ナフタロシアニン  ジヒドロオキサイド（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｄｉｏｃｔｙｌｏｘｉｄｅ）、シリコン  ２，３−ナフタロシアニン  ジクロリド（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ビス（ジイソブチル  オクタデシルシロキシ）シリコン  ２，３−ナフタロシアニン（Ｂｉｓ  （ｄｉ−ｉｓｏｂｕｔｙｌ  ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌｏｘｙ）  ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）  （ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
平均粒径が５ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
造影剤として用いられるものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
光音響イメージング法の造影剤として用いられるものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記界面活性剤が化学式２で示されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【化２】
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化学式２において、Ｒ２１乃至Ｒ２４はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＣＲ’から選択される。前記Ｒ’は炭素数１乃至１８の、飽和または不飽和アルキル基である。また、化学式２において、ｗ、ｘ、ｙ、ｚは、ｗとｘとｙとｚの総和が１０乃至３０となる整数である。
【請求項８】
さらに標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光音響造影剤用色素含有ナノ粒子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、非侵襲的に生体内部の情報を可視化する方法として、光音響イメージング法や蛍光イメージング法が注目されている。
【０００３】
光音響イメージング法を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算して可視化することができる。
【０００４】
蛍光イメージング法を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光吸収体が発する蛍光を測定することにより、被測定体内部の物質分布を可視化することができる。
【０００５】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波や蛍光を発するものを好適に用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体として、光吸収体から発せられた音響波を測定することが可能である。その他にも、近赤外波長領域の光を吸収する色素などを体内に投与し、造影剤として利用することもできる。近赤外波長領域の光は、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高いため、この光を吸収する色素は光音響イメージング法における造影剤や、蛍光イメージング法における造影剤として好適に用いることができる。なお、本明細書において色素とは、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲に含まれる波長の光を吸収することのできる化合物と定義する。
【０００６】
このような造影剤においては、信号強度（音響波や蛍光の強度）を有効に高めるために、色素を粒子、ミセル、ポリマーミセル、リポソーム等（総称して粒子等という）に集積することにより、色素密度を上げて、照射エネルギーの吸収効率を上げることが望まれる。このような粒子等として、例えば、特許文献1には、ナノエマルション法によって得た、シリコンナフタロシアニンを含有し粒子表面が界面活性剤で保護されたポリマーナノ粒子が開示されている。また、非特許文献１には、シリコンナフタロシアニンを親水性溶媒であるテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、Ｔｗｅｅｎ８０を界面活性剤として用いて得たシリコンナフタロシアニン含有ナノ粒子が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−０８３８６０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９６，  ６３（１）．  １３２−１４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１においては、シリコンナフタロシアニンとポリマーを粒子内に内包しているため、粒子内の色素充填率を上げることができず、粒子あたりの信号強度の向上が達成しにくいという課題がある。
【００１０】
また、非特許文献１においては、シリコンナフタロシアニンを親水性溶媒であるTHFに溶解させて粒子を作製し、０．４５μｍフィルターろ過精製を行っている。しかしながらこの手法では、粒径の大きな粒子が多いという課題がある。
【００１１】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、光照射により大きな強度の信号を得ることができる粒子を提供することを目的とする。また、造影剤に適した大きさの粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係るナノ粒子は、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体を含有し、粒子表面が界面活性剤で保護され、更に界面活性剤を除いた粒子構成要素に対するシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の比率が重量比で７０％以上であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、造影剤として用いたときにより大きな強度の信号を得ることができるナノ粒子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】担癌マウスにＮＰ９を色素量として２６ｎｍｏｌ投与する前及び投与２４時間後の腫瘍部の光音響画像である。
【図２】担癌マウスにＮＰ９を投与した時の腫瘍部の光音響信号強度比（投与２４時間後/投与前）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（ナノ粒子）
本実施形態に係るナノ粒子は、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体を含有し、粒子表面に界面活性剤が結合していることを特徴とする。なお、本実施形態においてナノ粒子とは、粒径がｎｍ（ナノメートル）オーダー、すなわち１０００ｎｍ未満の粒子と定義する。ただし、後述の造影剤等として実際に使用する際などは、粒径が１０００ｎｍ以上の粒子が含まれていても、平均粒径が１０００ｎｍ未満の粒子の集合であれば本発明のナノ粒子の定義に含まれる。
【００１６】
（粒子内のシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の充填率）
本実施形態に係るナノ粒子は、界面活性剤を除いた粒子構成要素に対するシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の比率が重量比で７０％以上１００％未満であることを特徴とする。好ましくは、界面活性剤を除いた粒子構成要素に対するシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の比率は重量比で８０％以上１００％未満であり、さらに好ましくは９０％以上１００％未満であり、９５％以上であることが特に好ましい。粒子内に含まれる色素の比率を高めることで、造影剤として用いたときに、照射エネルギーの吸収効率が上がり、より少ない粒子を用いても大きな強度の信号を得ることが可能になる。また、本実施形態に係るナノ粒子を光音響イメージング法に用いるような場合、色素が粒子内で集積されていることで、蛍光の消光が起こり、照射エネルギーが蛍光発光に用いられることが防がれ、より多くの熱エネルギーに変換することが可能になる。そのため、さらに効率的に音響信号を得ることが可能となる。
本実施形態においては、色素あたりの光吸収量の低下の影響を低く抑えつつ、またはまったく光吸収量を低下させずに、色素を粒子内で上記高濃度に集積することが可能である。
【００１７】
（粒子サイズ）
本実施形態に係るナノ粒子の粒径は、５ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。粒径が１０００ｎｍ未満の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くのナノ粒子を集積させることができる。集積したナノ粒子を、光音響トモグラフィー等を用いて検出することによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、ナノ粒子の粒径は５ｎｍ以上5００ｎｍ以下であることがより好ましく、５ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。ナノ粒子の粒径が２００ｎｍ以下であると、ナノ粒子が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
本実施形態においてナノ粒子の粒径という場合、動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，  ＤＬＳ）法によって流体力学的直径を測定したものである。
【００１８】
（シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体）
本実施形態に係るシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体とは、ナフタロシアニン骨格を有し、中心にシリコン化合物を持つものであればいかなるものでもよい。ナフタロシアニン骨格は疎水性であるため、ナフタロシアニン骨格を有するシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体は、疎水性相互作用によって複数で集まりやすい。複数集まったシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体はさらに疎水性が高くなる。そのため、本実施形態に係るナノ粒子が血清などの水溶液中におかれた場合、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体は、粒子外へと漏出しにくくなる。
本実施形態において、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の構造は化学式１で示される。
【化１】
2014129317.tif 000003
（式中、R201、R202、R203、R204、R205、R206、R207、R208、R209、R210、R211、R212、R213、R214、R215、R216、R217、R218、R219、R220、R221、R222、R223、R224は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
また、R101、R102は各々が同一でも異なっていてもよく、−ＯＨ、−ＯＲ１１、−ＯＣＯＲ１２、−ＯＳｉ（−Ｒ１３）（−Ｒ１４）（−Ｒ１５）、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
ここで、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
前記シリコンナフタロシアニンとしては、例えば、シリコン  ２，３−ナフタロシアニン  ジヒドロオキサイド（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、シリコン  ２，３−ナフタロシアニン  ジオクチルオキサイド（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｄｉｏｃｔｙｌｏｘｉｄｅ）、シリコン  ２，３−ナフタロシアニン  ジクロリド（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ビス（ジイソブチル  オクタデシルシロキシ）シリコン  ２，３−ナフタロシアニン（Ｂｉｓ  （ｄｉ−ｉｓｏｂｕｔｙｌ  ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌｏｘｙ）  ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）  （ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）  、シリコン  ２，３−ナフタロシアニン  ビス（トリヘキシルシリルオキシド）（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｂｉｓ  （ｔｒｉｈｅｘｙｌｓｉｌｙｌｏｘｉｄｅ））（以下、化合物１と略すことがある）等を挙げることができ、特にＳｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｂｉｓ  （ｔｒｉｈｅｘｙｌｓｉｌｙｌｏｘｉｄｅ）が好ましい。
【００１９】
前記シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体は、生体透過性の優れた６００ｎｍから９００ｎｍの近赤外波長の吸収を持つ。本実施形態に係るナノ粒子はシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体を含有しているため、生体に照射したときに安全で、かつ、生体に対して比較的高い透過性をもつ近赤外波長領域（６００ｎｍから９００ｎｍの近赤外波長領域）の波長を吸収することができる。
【００２０】
（界面活性剤）
本実施形態における界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤、リン脂質又は多糖類等を使用することができる。これらの界面活性剤は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。
【００２１】
上記本実施形態における界面活性剤に使用する非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル（例、化学式２で示される化合物）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｎ−１０１、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標） Ｐ−４０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標） ＣＯ５３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標） ＣＯ６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標） ＣＯ７２０並びにＩＧＥＰＡＬ（登録商標） ＣＯ７３０等を挙げることができる。
【化２】
2014129317.tif 000004
化学式２において、Ｒ２１乃至Ｒ２４はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＣＲ’から選択される。前記Ｒ’は炭素数１乃至１８の、飽和または不飽和アルキル基である。また、化学式２において、ｗ、ｘ、ｙ、ｚは、ｗとｘとｙとｚの総和が１０乃至３０となる整数である。
化学式２で示されるポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルとしては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８５等を挙げることができる。これらのうち、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０が特に好ましい。
【００２２】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するアニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等、更にラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸のナトリウム、カリウムおよびアンモニウム塩等を挙げることができる。
【００２３】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するカチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等を挙げることができる。
【００２４】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用する高分子界面活性剤としては、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体及びゼラチン等を挙げることができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体としては、化学式３で表される化合物が挙げられる。化学式３においてｘ、ｚはそれぞれ独立に７０以下１１０以下の整数で、７５以下１０６以下の整数であることが好ましい。また、化学式３において、ｙは２０以上８０以下の整数であり、３０以上７０以下の整数であることが好ましい。化学式３においてｘ及びｚが７５、ｙが３０であるものとしてプルロニック（登録商標）Ｆ６８、化学式３においてｘ及びｚが１０６、ｙが７０であるものとしてプルロニック（登録商標）Ｆ１２７を挙げることができる。
【化３】
2014129317.tif 000005
【００２５】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するリン脂質としては、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基又はマレイミド基のいずれかの官能基を有するホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。また、界面活性剤に使用するリン脂質はＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）鎖を含むものであってもよい。
【００２６】
官能基が水酸基、メトキシ基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基でありＰＥＧ鎖を含むような界面活性剤に使用するリン脂質としては、例えば、１，  ２−  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−  ｓｎ−  ｇｌｙｃｅｒｏ−  ３−  ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−  Ｎ−  ［ｃａｒｂｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨ），Ｐｏｌｙ  （ｏｘｙ−  １，  ２−  ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌ），  α−  ［７−  ｈｙｄｒｏｘｙ−  ７−  ｏｘｉｄｏ−  １３−  ｏｘｏ−  １０−  ［（１−  ｏｘｏｏｃｔａｄｅｃｙｌ）  ｏｘｙ］−  ６，  ８，  １２−  ｔｒｉｏｘａ−  ３−  ａｚａ−  ７−  ｐｈｏｓｐｈａｔｒｉａｃｏｎｔ−  １−  ｙｌ］−  ω−  ｍｅｔｈｏｘｙ−  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）、Ｎ−  （ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−  ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２）、３−  （Ｎ−  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｇｌｕｔａｒｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−  ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、Ｎ−  （３−  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−  １−  ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−  ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０−ＰＡ、  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０−ＣＮ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０５０−ＣＮ、Ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ＤＳＰＥ，  Ｍｗ１００００、Ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ＤＳＰＥ，  Ｍｗ２００００等のリン脂質を挙げることができる。
【００２７】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用する多糖類としては、デキストラン、ヘパリン等を挙げることができる。
【００２８】
（ナノ粒子の製造方法）
本発明の粒子の製造方法としては、公知の方法を利用することが出来る。例えば、Ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ法、Ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ法等を挙げることが出来る。
【００２９】
本製造方法で用いる溶媒としては、ヘキサン、シクロへキサン、ヘプタン等の炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒類、及びピリジン誘導体を挙げることが出来る。これらの溶媒は、単独で使用してもよく、任意に混合して使用してもよい。
【００３０】
Ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ法においては、従来公知の乳化手法によってエマルションを調製することが可能である。従来公知の方法とは、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機、タービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等がある。これらの方法は、単独で用いることも、あるいは複数を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルションは１段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、乳化手法は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００３１】
Ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ法においては、従来公知の、界面活性剤分散水溶液に有機溶媒分散液を混合し撹拌する方法、あるいは、有機溶媒分散液に界面活性剤分散水溶液を混合し撹拌する方法によって粒子を調製することが可能である。
【００３２】
（シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体を含む材料を溶解させた有機溶媒分散液）
Ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ法における、使用する界面活性剤分散水溶液と有機溶媒分散液の重量比としては、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルションを形成することができれば特に限定はない。好ましくは、有機溶媒分散液と水溶液の重量比が、１：２〜１：１０００となる範囲である。
Ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ法における、使用する界面活性剤分散水溶液と有機溶媒分散液の重量比としては、粒子を回収することが出来れば特に限定はない。好ましくは、有機溶媒分散液と水溶液の重量比が、１：１〜１：１０００となる範囲である。
【００３３】
（シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体を含む材料を溶解させた有機溶媒分散液中の材料濃度）
有機溶媒分散液中におけるシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の濃度はこれらが溶解する範囲であれば特に限定されない。好ましい濃度として、０．０００５〜３００ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００３４】
（粒子分散液中からの有機溶媒留去）
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。
Ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ法において、加熱による除去の場合の加熱温度は、Ｏ／Ｗ型のエマルションを維持できれば特に限定されないが、好ましい温度は０℃から８０℃の範囲である。
Ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ法において、加熱による除去の場合の加熱温度は、粒子の収率が低下する高次凝集が防げれば特に限定されないが、好ましい温度は０℃から８０℃の範囲である。
但し、留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００３５】
（粒子分散液の精製）
作製した粒子分散液の精製は、従来知られる何れの方法でも実施可能である。例えば、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法、限外濾過法、透析法、遠心分離法を挙げることが出来る。
但し、精製方法は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００３６】
（粒子）
本実施形態に係る粒子は、上記の疎水性金属フタロシアニン色素を有した粒子であればどのような形状でもよく、真球状、楕円状、平面状、一次元のひも状などのいずれでもよい。本実施形態に係る粒子のサイズ（粒径）は特に制限されないが、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００３７】
（捕捉分子）
本実施形態おいて、上記のナノ粒子の一部に、捕捉分子を固定化することにより、標的部位を特異的に標識することができる。
【００３８】
捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。
【００３９】
捕捉分子が化学結合されたナノ粒子を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、代謝等の追跡を行うことができる。
【００４０】
（捕捉分子の固定化）
ナノ粒子に捕捉分子を固定化する方法としては、用いる捕捉分子の種類にもよるが、ナノ粒子に捕捉分子を化学結合させることができる限り、いかなる公知の方法をも使用することができる。例えば、前記した第一の界面活性剤又は第二の界面活性剤が有する官能基と捕捉分子の官能基とを反応させて化学結合する方法等を使用することができる。
【００４１】
例えば、第一の界面活性剤又は第二の界面活性剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、アミノ基を有する捕捉分子と反応させて、ナノ粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基は、グリシン、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
【００４２】
また、第一の界面活性剤又は第二の界面活性剤がマレイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、チオール基を有する捕捉分子と反応させて、ナノ粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のマレイミド基は、Ｌ−システイン、メルカプトエタノール、又は末端にチオール基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
【００４３】
また、第一の界面活性剤又は第二の界面活性剤がアミノ基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、グルタルアルデヒドを用いて捕捉分子のアミノ基と反応させ、ナノ粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等を反応させて未反応のアミノ基の活性をブロックすることが好ましい。あるいは、界面活性剤のアミノ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド基やマレイミド基に置換して、捕捉分子を固定化しても良い。
【００４４】
（造影剤）
本実施形態に係る造影剤は、本実施形態に係るナノ粒子及び前記ナノ粒子が分散された分散媒を有する。また本実施形態に係る造影剤は、必要に応じて本実施形態に係るナノ粒子の他に薬理上許容できる添加物を有していても良い。
【００４５】
ここで分散媒は、本実施形態に係る粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝液などが挙げられる。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係るナノ粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係るナノ粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
なお、本実施形態に係るナノ粒子は、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体が漏出しにくいため、粒子内にシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体が多く含まれる。含まれる色素が多いほど光吸収量が増加するため、本実施形態に係るナノ粒子は、後述するように、光音響イメージング用途、あるいは、蛍光イメージング用途として好適である。なお、濃度消光が生じるほどの多くの量の疎水性色素が含まれる場合は、本実施形態に係るナノ粒子は、光音響イメージング用途としてさらに好適である。
【００４６】
（造影方法）
生体内に投与された本実施形態に係るナノ粒子を、光音響イメージング法を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係るナノ粒子を検出する方法は以下の工程を有する。但し、本実施形態に係る造影方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係るナノ粒子を生体内に投与する工程。
（ｂ）生体に光を照射し、生体内から発せられる光音響信号を検出する工程。
【００４７】
上記（ａ）の工程において本実施形態に係るナノ粒子を生体内に投与する方法は特に限定されず、経口投与や注射等の方法によることができる。
【００４８】
上記（ｂ）の工程において生体に照射する光としては、生体に照射したときに安全で、かつ高い生体透過性を示す600nmから900nmの近赤外波長であることが好ましい。また、光を発生させる装置、音響信号を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。
【００４９】
本実施形態に係るナノ粒子を用いた造影方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍などの部位を造影することができる。
【００５０】
次に、生体内に投与された本実施形態に係る複合体を、蛍光イメージング法を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係るナノ粒子を検出する方法は以下の工程を有する。但し、本実施形態に係る造影方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ｃ）本実施形態に係るナノ粒子を生体内に投与する工程。
（ｄ）生体に光を照射し、生体内から発せられる蛍光を検出する工程。
【００５１】
上記（ｃ）の工程において本実施形態に係るナノ粒子を生体内に投与する方法は特に限定されず、経口投与や注射等の方法によることができる。
【００５２】
上記（ｄ）の工程において生体に照射する光としては、生体に照射したときに安全で、かつ高い生体透過性を示す600nmから900nmの近赤外波長であることが好ましい。また、光を発生させる装置、蛍光を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。
【００５３】
本実施形態に係るナノ粒子を用いた造影方法は、上記（ｃ）、（ｄ）の工程を経ることで腫瘍などの部位を造影することができる。
【００５４】
更に、捕捉分子を有するナノ粒子を生体中で用いた場合、捕捉分子を適宜選択することによって、種々の標的部位を特異的に検出することができる。例えば、捕捉分子として腫瘍に特異的に結合する物質を採用すれば、腫瘍の特異的検出が可能となる。また捕捉分子として、特定の疾病部位の周辺に多く存在するタンパク質や酵素などの生体物質に特異的に結合する物質を用いれば、その疾病を特異的に検出することが可能である。また、本実施形態に係るナノ粒子は、捕捉分子を持たない場合でも、EPR効果によって腫瘍を検出することができる。
【００５５】
（色素比率定量の方法）
本発明の界面活性剤を除いた粒子構成要素に対する色素の比率は、例えば以下のような工程を経ることで求めることができる。
（１）ナノ粒子とナノ粒子以外の部分とを分離する工程。
（２）ナノ粒子の成分を分析する工程。
上記（１）の工程において本実施形態に係るナノ粒子を粒子以外の部分を分離する方法は特に限定されず、遠心分離や限外濾過等の方法によることができる。
【００５６】
上記（２）の工程においてナノ粒子を分析する方法は特に限定されず、粒子を溶剤に溶解させクロマトグラフィーなどの分離分析手法により成分の定量を行う方法やＮＭＲなどの固有成分確認手法により既知成分の定量を行う方法などが考えられる。上記溶剤は、特に限定されず、クロロホルムなどのハロゲン系溶剤やＤＭＦ、ＤＭＳＯ等を用いることが可能である。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例で本発明のナノ粒子作製の際に用いる具体的な試薬や反応条件等を挙げているが、これらの試薬や反応条件等は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００５８】
（光音響信号強度の測定方法）
光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光を超純水中に設置したサンプル容器に照射し、容器内のサンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（LT-2211-PC、Lotis社製）を用いた。波長は780nm、エネルギー密度はおよそ10から20mJ/cm2、パルス幅は約20ナノ秒、パルス繰返し周波数は10Hzの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径1.27cm、中心帯域1MHzの非収束型超音波トランスデューサー（V303、Panametrics-NDT製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長0.1cm、サンプル容量は約200μLであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を2.5cmとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度+30dBの超音波プリアンプ（Model 5682、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（DPO4104、テクトロニクス製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを32回平均表示モードとし、レーザーパルス照射32回平均の光音響信号強度の測定を行った。
【００５９】
（腫瘍集積性の確認）
腫瘍集積性の確認においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。Ｎ８７（ヒト胃癌細胞）、Ｓｕｉｔ−２（ヒト膵癌細胞）、ｃｏｌｏｎ２６（マウス大腸癌細胞）、ｃｏｌｏｎ２６にEGFRファミリーである上皮成長因子受容体２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、以下、ＨＥＲ２と略すことがある）遺伝子を導入したＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞癌細胞を、マウスに皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全て定着しており、マウスの体重は１７〜２２ gであった。担癌させたマウスのマウス尾部に粒子分散液を、１００μＬ（色素として１３  ｎｍｏｌ又は１０４ｎｍｏｌ）を静脈注射した。
【００６０】
次に粒子分散液を投与したマウスを投与２４時間後に安楽死させた後、Ｎ８７腫瘍、Ｓｕｉｔ−２腫瘍、ｃｏｌｏｎ２６腫瘍、ＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍をそれぞれ摘出した。腫瘍組織をプラスチックチューブに移し、腫瘍組織の重量に対し１．２５倍量の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加し、ホモジネートした。次いで、腫瘍組織重量の２０．２５倍量のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた。ＩＶＩＳ（登録商標）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、ホモジネート溶液の蛍光強度を測定することで腫瘍組織中の色素量を定量した。
【００６１】
（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｂｉｓ  （ｔｒｉｈｅｘｙｌｓｉｌｙｌｏｘｉｄｅ）を含有するナノ粒子）
（実施例１）
（ナノ粒子（ＮＰ１）の合成）
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）（以下、化合物１と略すことがある）（４．４ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液を調製した。
【００６２】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製、以下Ｔｗ２０と略すことがある）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルションを調製した。
【００６３】
次に前記エマルションを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した。次に、２００００ｇ、４℃で４５分遠心分離を行い、沈殿画分を回収しナノ粒子（ＮＰ１）を得た。遠心分離装置として、例えば微量高速冷却遠心機（株式会社トミー精工製、ＭＸ−３００）が挙げられる。
【００６４】
（実施例２）
（ナノ粒子（ＮＰ２）の合成）
Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液をＴｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）及びＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標)ＤＳＰＥ−０２０ＰＡ(１１ｍｇ、日油社製、以下ＤＡと略すことがある)を溶解した水溶液に変更した以外は実施例１と同様に作製し、ナノ粒子（ＮＰ２）を得た。
【００６５】
（実施例３）
（ナノ粒子（ＮＰ３）の合成）
ＤＡをリン脂質であるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０−ＣＮ（１１ｍｇ、日油社製、以下ＤＯ２ｋと略すことがある）へ変更した他は前述したＮＰ２と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ３）を得た。
【００６６】
（実施例４）
（ナノ粒子（ＮＰ４）の合成）
ＤＡをリン脂質であるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０５０−ＣＮ（１１ｍｇ、日油社製、以下ＤＯ５ｋと略することがある）へ変更した他は前述したＮＰ２と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ４）を得た。
【００６７】
（実施例５）
（ナノ粒子（ＮＰ５）の合成）
ＤＡをリン脂質であるＭｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ＤＳＰＥ，  Ｍｗ１００００（１１ｍｇ、Ｎａｎｏｃｓ  Ｉｎｃ社製、以下ＤＯ１０ｋと略すことがある）へ変更した他は前述したＮＰ２と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ５）を得た。
【００６８】
（実施例６）
（ナノ粒子（ＮＰ６）の合成）
ＤＡをリン脂質であるＭｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ＤＳＰＥ，  Ｍｗ２００００（１１ｍｇ、Ｎａｎｏｃｓ  Ｉｎｃ社製、以下ＤＯ２０ｋと略すことがある）へ変更した他は前述したＮＰ２と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ６）を得た。
【００６９】
（実施例７）
（ナノ粒子（ＮＰ７）の合成）
粒子の回収方法を変更した以外は、実施例１と同様に作製し、ナノ粒子（ＮＰ７）を得た。前記回収方法としては、２００００ｇ、４℃で４５分遠心分離を行い、上清画分を回収した。その後、前記上清画分を７２１００ｇ、４℃で１５分超遠心分離を行い、上清画分を回収した。その後、前記上清画分を４５１０００ｇ、４℃で１５分超遠心分離を行い、沈殿画分を回収した。超遠心分離装置として、例えば、ｈｉｍａｃ  ＣＳ１５０ＧＸＬ（日立工機社製）が挙げられる。
【００７０】
（実施例８）
（ナノ粒子（ＮＰ８）の合成）
Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液をＴｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）及びＤＡ（１１ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液に変更した以外は、実施例７と同様に作製しナノ粒子（ＮＰ８）を得た。
表１に、ナノ粒子ＮＰ１、ＮＰ２、ＮＰ３、ＮＰ４、ＮＰ５、ＮＰ６、ＮＰ７、ＮＰ８の粒径、エントラップメントエフィシエンシー（ＥＥ）、腫瘍集積性を示す。ＥＥは、回収したナノ粒子に含まれる化合物１回収量を化合物１仕込み量で除することにより、パーセント割合に換算した。
【００７１】
【表１】
2014129317.tif 000006
【００７２】
（実施例９）  
（ナノ粒子（ＮＰ９）の合成）
化合物１（８．８ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）をクロロホルム１６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液を調製した。
【００７３】
次に、ポリソルベート２０（１８００ｍｇ、和光純薬社製）を溶解した水溶液（２００ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルションを調製した。
【００７４】
次に前記エマルションを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した。その後、限外ろ過膜（オメガ限外ろ過メンブレン・ディスクフィルター  ３００Ｋ、日本ポール株式会社製）を用いて精製後、限外ろ過膜（ウルトラセル  ５０Ｋ、メルク株式会社製）を用いて濃縮し、ナノ粒子（ＮＰ９）を得た。
【００７５】
（実施例１０）
（ナノ粒子（ＮＰ１０）の合成）
ポリソルベート２０をポリソルベート８０（ＨＸ２）（４２０mg、日油社製）へ変更した他は前述したＮＰ９と同様の方法でナノ粒子１０（以下、ＮＰ１０と略す）を得た。
【００７６】
表2にナノ粒子ＮＰ９、ＮＰ１０の粒径、小粒子化率、腫瘍集積性を示す。ＮＰ１０の腫瘍集積性は、色素として１３ｎｍｏｌ，１０４ｎｍｏｌ投与し前述した方法に従い評価した。小粒子化率の算出は、精製前の溶液を１０００００ｇ、４℃で１５分遠心分離を行い、上清画分を回収し、回収した上清画分に含まれる化合物１回収量を化合物１仕込み量で除することにより、パーセント割合に換算した。
【００７７】
【表２】
2014129317.tif 000007
表２の結果より、ＮＰ１０では、投与量を変えても同等の腫瘍集積性が得られていることが確認された。
【００７８】
（実施例１１）
（ナノ粒子（ＮＰ１１）の合成）
化合物１（０．８８ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液を調製した。
【００７９】
次に、リン脂質であるＤＯ２ｋ（１８０ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルションを調製した。
次に前記エマルションを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した。その後、１０００００ｇ、４℃で１５分遠心分離を行い、上清画分を回収し、ナノ粒子（ＮＰ１１）を得た。
【００８０】
（実施例１２）
（ナノ粒子（NP１２）の合成）
ＤＯ２ｋをリン脂質であるＤＯ５ｋ（１８０ｍｇ、日油社製）へ変更した他は前述したＮＰ１１と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ１２）を得た。
【００８１】
（実施例１３）
（ナノ粒子（ＮＰ１３）の合成）
ＤＯ２ｋをリン脂質であるＤＡ（１８０ｍｇ、日油社製）へ変更した他は前述したＮＰ１１と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ１３）を得た。
【００８２】
（実施例１４）
（ナノ粒子（ＮＰ１４）の合成）
ＤＯ２ｋをリン脂質であるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０ＭＡ（１８０ｍｇ、日油社製、以下ＤＭと略すことがある）へ変更した他は前述したＮＰ１１と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ１４）を得た。
【００８３】
（実施例１５）
（ナノ粒子（ＮＰ１５の合成）
ＤＯ２ｋをプルロニックＦ６８（１８０ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製、以下Ｆ６８と略すことがある）へ変更した他は前述したＮＰ１１と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ１５）を得た。
【００８４】
表３にナノ粒子ＮＰ１１、ＮＰ１２、ＮＰ１３、ＮＰ１４、ＮＰ１５の粒径、小粒子化率、腫瘍集積性を示す。
【００８５】
【表３】
2014129317.tif 000008
【００８６】
（実施例１６）
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖの調製）
ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列（ｈｕ４Ｄ５−８）を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖを作製した。まずｈｕ４Ｄ５−８のＶＬ、ＶＨ遺伝子をペプチド（ＧＧＧＧＳ）３をコードするｃＤＮＡで連結したｃＤＮＡを作製した。５‘末端には制限酵素ＮｃｏＩ−  を、３’末端には制限酵素ＮｏｔＩの認識サイトを導入した。以下に塩基配列を示す。
【００８７】
配列番号１：
5’-CCATGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGTAGCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCGGCCGC-3’
（制限酵素の認識サイトを下線で示す。）
【００８８】
上記遺伝子断片ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＴ７／ｌａｃプロモーターの下流に挿入した。具体的には、制限酵素ＮｃｏＩ−とＮｏｔＩで消化処理したｐＥＴ−２２ｂ（＋）に、上記のｃＤＮＡをライゲーションする。
【００８９】
この発現プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に添加し、２８℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭでＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／５００  ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１ｌの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎｓｈａ）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８ｋＤａであることを確認した。以下に調製された抗体のアミノ酸配列を示す。以後、ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをｓｃＦｖと略す。
【００９０】
配列番号２：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAALEHHHHHHGGC
【００９１】
（実施例１７）
（ＮＰ２表面へのｓｃＦｖの修飾）
実施例１６で調製したｓｃＦｖを５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にバッファー置換後、１０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で約２時間、還元処理した。
【００９２】
ＮＰ２の表面に存在する１級アミノ基を介して、ｓｃＦｖの修飾を行った。まず、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］  ｅｓｔｅｒ  （ＳＭ（ＰＥＧ）２、サーモサイエンティフィック社) の０．１ｍｇ（２３３ｎｍｏｌ）を、ＮＰ２の水分散液（ＮＰ濃度：１．１Ｅ−０８Ｍ）の０．５ｍｌに溶解した。次に、０．０５６ｍｌのほう酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えた。この粒子懸濁液を室温で一晩撹拌した後、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、マレイミド基を導入したＮＰ２（以下、マレイミド化ＮＰ２と略す）と未反応のＳＭ（ＰＥＧ）２を、水を展開溶媒として分離し、マレイミド化ＮＰ２の水溶液を得た。この水溶液に終濃度が２０ｍＭとなるように１Ｍ    ２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］  ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）溶液を添加し、マレイミド化ＮＰ２のＨＥＰＥＳ溶液を得た。
前記還元処理したｓｃＦｖを、前記マレイミド化ＮＰ２のＨＥＰＥＳ溶液に添加し、４℃で一晩反応させた。仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／マレイミド化ＮＰ２）は、１０００で行った。ここで「仕込み」とは反応系に加えられた、という意味であり、「仕込みの反応モル比」とは、反応系に加えられたｓｃＦｖとマレイミド化ＮＰ２０のモル濃度比のことをいう。反応後、この溶液に、末端チオール基を有するポリエチレングリコール（分子量１０００、ＰＬＳ−６０６、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製）４．２ｎｍｏｌを加え、室温で３０分撹拌した。次いで、この溶液を１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過によりマレイミド化ＮＰ２へ結合しなかったｓｃＦｖを除去して、ｓｃＦｖが修飾されたナノ粒子（ｓｃＦｖ−ＮＰ２）を得た。
【００９３】
（実施例１８）
（ＮＰ８表面へのｓｃＦｖの修飾）
ｓｃＦｖの還元処理は、前述した実施例１７と同様に行った。
【００９４】
ＮＰ８の表面に存在する１級アミノ基を介して、ｓｃＦｖの修飾を行った。まず、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］  ｅｓｔｅｒ  （ＳＭ（ＰＥＧ）２、サーモサイエンティフィック社) の０．２５ｍｇ（５８２．５ｎｍｏｌ）を、ＮＰ８の水分散液（ＮＰ濃度：５．７Ｅ−０６Ｍ）の１．０ｍｌに溶解した。次に、０．１１１ｍｌのほう酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えた。この粒子懸濁液を室温で一晩撹拌した後、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、マレイミド基を導入したＮＰ８（以下、マレイミド化ＮＰ８と略す）と未反応のＳＭ（ＰＥＧ）２を、水を展開溶媒として分離し、マレイミド化ＮＰ８の水溶液を得た。この水溶液に終濃度が２０ｍＭとなるように１Ｍ    ２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］  ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）溶液を添加し、マレイミド化ＮＰ８のＨＥＰＥＳ溶液を得た。
前記還元処理したｓｃＦｖを、前記マレイミド化ＮＰ８のＨＥＰＥＳ溶液に添加し、４℃で一晩反応させた。仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／マレイミド化ＮＰ８）は、１０で行った。ここで「仕込み」とは反応系に加えられた、という意味であり、「仕込みの反応モル比」とは、反応系に加えられたｓｃＦｖとマレイミド化ＮＰ２０のモル濃度比のことをいう。反応後、この溶液に、末端チオール基を有するポリエチレングリコール（分子量１０００、ＰＬＳ−６０６、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製）４２ｎｍｏｌを加え、室温で３０分撹拌した。次いで、この溶液を１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過によりマレイミド化ＮＰ８へ結合しなかったｓｃＦｖを除去して、ｓｃＦｖが修飾されたナノ粒子（ｓｃＦｖ−ＮＰ８）を得た。
【００９５】
表４にナノ粒子ｓｃＦｖ−ＮＰ２、ＮＰ２、ｓｃＦｖ−ＮＰ８、ＮＰ８の粒径、粒子当たりのｓｃＦｖの修飾量、腫瘍集積性を示す。粒子当たりｎｏｓｃＦｖの修飾量は、ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、ビシンコニン酸）法を用いて算出した。
【００９６】
【表４】
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【００９７】
表４の結果より、ｓｃＦｖを修飾した粒子の方がＨＥＲ２陽性細胞であるＮ８７への腫瘍集積性が高かった。また、ｓｃＦｖを修飾した粒子はＨＥＲ２陰性細胞であるＳｕｉｔ−２に比べてＨＥＲ２陽性細胞であるＮ８７のほうが腫瘍集積性が３倍以上高く、ＨＥＲ２結合機能を持ったｓｃＦｖ−ＮＰ２、ｓｃＦｖ−ＮＰ８が選択的にＮ８７へ集積していることが確認された。したがって、本実施例において作製したナノ粒子は、腫瘍の光音響イメージングをするための造影剤として適していると考えられる。
【００９８】
（実施例１９）
（ナノ粒子（ＮＰ１０１）の合成）
有機溶媒溶液の調製：
化合物１（０．８８ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）をテトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦ と略すことがある）４．０ｍＬに溶解し、色素溶液を調製した。
得られた溶液は緑色の透明な溶液であった。
分散安定化剤分散液の調製：
Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌して、分散安定化剤液を調整した。
粒子分散液の調製：
分散安定化剤分散液をマグネチックスターラーで撹拌しながら前記色素ＴＨＦ溶液を滴下し、滴下開始から２０分間撹拌を続けて、粒子分散液を調製した。
溶媒の留去：
上記粒子分散液を４０℃に設定したウォーターバス（ヤマト科学製、ＢＭ１００）に入れ、８００ｒｐｍで２時間撹拌した。その後、ウォーターバスのヒーターを切り、そのまま室温で１６時間、撹拌を継続した。
粒子の精製：
上記工程で得られたナノ粒子分散液を超遠心分離装置（日立工機社製、ｈｉｍａｃ  ＣＳ１５０ＧＸＬ）にて４℃で、１００，０００ｇ、１５分間遠心し、上清画分を６００μＬ回収した。
この回収液を、５．０μｍ、１．２μｍ、０．８μｍ、０．４５μｍ、０．２２μｍのフィルターで順次濾過し、ナノ粒子（ＮＰ１０１）を得た。ＮＰ１０１の粒径は、１４．７ｎｍ、ＥＥは、３７％であった。
【００９９】
（実施例２０）
（ナノ粒子（ＮＰ１０２）の合成）
Ｔｗｅｅｎ２０をデキストラン４０（１８０ｍｇ、東京化成社製）に変更し、粒子の精製工程を超遠心分離から０．２２μｍフィルターろ過へ変更した他は前述したＮＰ１０１と同様の方法でナノ粒子（ＮＰ１０２）を得た。ＮＰ１０２の粒径は、１３．８ｎｍであった。
【０１００】
（実施例２１）
（腫瘍造影能の確認）
前述したｃｏｌｏｎ２６を担癌したマウスの投与前の腫瘍部の光音響信号をＮｅｘｕｓ  １２８（Ｅｎｄｒａ社製）を用いて測定した。次に、ＮＰ９粒子分散液を、色素量として２．６，５．２，１３，２６，５２ｎｍｏｌ尾静脈より投与し、投与２４時間後の腫瘍部の光音響信号を同様に測定した。図１は、色素量２６ｎｍｏｌの粒子分散液を投与する前及び投与２４時間後の腫瘍部の光音響画像である。各投与量における投与２４時間後と投与前の光音響信号強度比を図２に示す。図１より投与前に比べ投与２４時間後の腫瘍部の信号強度の向上が確認された。また、図２より投与した色素量が増えると信号強度比も高くなることが確認された。以上のことより、ＮＰ９は、腫瘍を造影することが可能であり、光音響イメージング法の腫瘍造影剤としての有効性が示された。
【０１０１】
（比較例１）
（ナノ粒子（ＮＰＡ１）の合成）
化合物１、Ｔｗｅｅｎ８０（ｓｉｇｍａ社製）を用いて非特許文献１に従いナノ粒子（ＮＰＡ１）を得た。ＮＰＡ１の粒径は、１４２ｎｍ、回収率は、５％であった。回収率は、化合物１回収量を化合物1仕込み量で除することにより算出した。
【０１０２】
（比較例2）
（ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ１）の合成）化合物１（０．８８ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）およびポリ乳酸グルコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）（５ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液を調製した。
【０１０３】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルションを調製した。
【０１０４】
次に前記エマルションを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＰＬＧＡ中に前記化合物１を含むポリマーナノ粒子（ＰＮＰ１）を得た。ＰＮＰ１の粒径は、１０７ｎｍ、ＥＥは、４２％であった。
【０１０５】
表５にナノ粒子ＮＰ１、ＮＰ２、ＮＰ３、ＮＰ４、ＮＰ７、ＮＰ８、ＮＰ９、ＮＰ１０、ＮＰＡ１、ＰＮＰ１の色素あたりの光音響信号（ＰＡ信号）強度、粒子当たりのＰＡ信号、界面活性剤を除いた粒子構成要素に対する色素の比率を示す。界面活性剤を除いた粒子構成要素に対する色素の比率は、ＮＭＲ測定、吸光度測定、凍結乾燥重量測定で得られたサンプル中の各構成材料の固体重量から算出した。ＮＭＲ測定は、（Ｂｒｕｋｅｒ社製、ＡＶＡＮＣＥ  ５００；共鳴周波数：５００ＭＨｚ；測定核種：  １Ｈ；測定温度：室温；溶媒：重クロロホルム）を用いて行った。
【０１０６】
【表５】
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【０１０７】
表５の結果より、本発明のナノ粒子ＮＰ１、ＮＰ２、ＮＰ３、ＮＰ４、ＮＰ７、ＮＰ８、ＮＰ９、ＮＰ１０では、ＰＮＰ１と比較して、色素あたりの信号強度（光吸収率）を弱めることなく、色素の比率を高めることが可能であることがわかる。そのため、造影剤として用いたときに、照射エネルギーの吸収効率が上がり、強度の大きい信号を得ることが可能となる。
【０１０８】
（実施例２２）
（腫瘍からの光音響信号強度の算出）
腫瘍からの光音響信号は以下の式により算出した。
腫瘍からの光音響信号＝投与２４時間後の腫瘍集積量（ｎｍｏｌ／ｇ）×粒子の色素当たりの光音響信号（Ｖ／Ｊ／ｄｙｅ  Ｍ）
ＮＰＡ１の投与２４時間後の腫瘍集積量（ｎｍｏｌ／ｇ）は、非特許文献１に記載の腫瘍集積量よりｉｓｏＢＯＳＩＮＣの分子量を１５６４．４４として計算した。
表６にＮＰ９、ＮＰＡ１の投与２４時間後の腫瘍集積量（ｎｍｏｌ／ｇ）、粒子の色素当たりの光音響信号（Ｖ／Ｊ／ｄｙｅ  Ｍ）、腫瘍からの光音響信号強度を示す。表６の結果より本発明のナノ粒子ＮＰ９は、ＮＰＡ１と比べ腫瘍集積性、粒子当たりの光音響信号強度が共に高い。そのため、腫瘍からの光音響信号強度を高めることが可能であり、光音響イメージング法の造影剤として有効である。
【表６】
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【図２】
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【図１】
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【配列表】
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