(57)【要約】【課題】高濃度の液体洗剤組成物中においても、貯蔵時の液体洗剤組成物中のプロテアーゼ活性が十分抑制でき、作成から長期間経過しても洗浄性の低下が小さい液体洗剤組成物を提供することを課題とする。【解決手段】プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、界面活性剤（Ｃ）及び溶剤（Ｄ）を含有する液体洗剤組成物であって、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の含有量が、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、（Ａ）が０．００００１〜０．１重量％、（Ｂ）が０．００００００１〜５重量％、（Ｃ）が３６〜９４重量％、（Ｄ）が０．９〜６３．９９９９８９９重量％である液体洗剤組成物。プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：配列番号１のアミノ酸配列であるプロテアーゼ活性阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、界面活性剤（Ｃ）及び溶剤（Ｄ）を含有する液体洗剤組成物であって、
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の含有量が、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、（Ａ）が０．００００１〜０．１重量％、（Ｂ）が０．００００００１〜５重量％、（Ｃ）が３６〜９４重量％、（Ｄ）が０．９〜６３．９９９９８９９重量％である液体洗剤組成物。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：配列番号１のアミノ酸配列であるプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比｛（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数｝が０．０１〜１０である請求項１に記載の液体洗剤組成物。
【請求項３】
さらにプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）を含有する請求項１又は２に記載の液体洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体洗剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く存在が知られている。その応用分野としては、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工等）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤等があり、多くの分野で盛んに利用されている。
周知の通り、プロテアーゼ等の酵素は、分解力の高さから今や洗剤に欠かすことのできないものとなっている。一方、洗剤は使い勝手の点から、従来の固形洗剤から液体洗剤へと需要形態が変わりつつある。しかしながら、プロテアーゼは、液体洗剤中でプロテアーゼ自身や他の酵素を加水分解してしまい、プロテアーゼ自身や他の酵素の活性が経時的に著しく低下し、液体洗剤の洗浄性が著しく低下するという問題がある。そこで、プロテアーゼ自身や他のタンパク質の加水分解を抑えるために、プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼ活性阻害剤の研究が行われている。例えば、ボロニックアシッドがセリンプロテアーゼやズブチリシンの活性を阻害することが知られている（例えば、非特許文献１及び特許文献１）。
しかしながら、現在需要の増大している液体洗剤は、界面活性剤が高濃度（３５重量％より高い）で含まれている液体洗剤であり、通常の界面活性剤が低濃度（３５重量％以下）の液体洗剤と比較して、プロテアーゼの自己分解が速い。そのため、ボロニックアシッドを用いても、効果的にプロテアーゼの分解を阻害することができず、界面活性剤の濃度が高い液体洗剤では貯蔵時のプロテアーゼ活性を十分阻害できる方法が開発されておらず、洗浄性の低下が小さい高濃度の液体洗剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表平１１−５０７６８０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１９８３，ｐ５−ｐ３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、高濃度の液体洗剤組成物中においても、貯蔵時の液体洗剤組成物中のプロテアーゼ活性が十分抑制でき、作成から長期間経過しても洗浄性の低下が小さい液体洗剤組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の液体洗剤組成物は、プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、界面活性剤（Ｃ）及び溶剤（Ｄ）を含有する液体洗剤組成物であって、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の含有量が、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、（Ａ）が０．００００１〜０．１重量％、（Ｂ）が０．００００００１〜５重量％、（Ｃ）が３６〜９４重量％、（Ｄ）が０．９〜６３．９９９９８９９重量％であることを要旨とする。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：配列番号１のアミノ酸配列であるプロテアーゼ活性阻害剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の液体洗剤組成物は、作成から長期間経過後も洗浄性の低下が小さい。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の液体洗剤組成物は、プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、界面活性剤（Ｃ）及び溶剤（Ｄ）を含有する液体洗剤組成物であって、
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の含有量が、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、（Ａ）が０．００００１〜０．１重量％、（Ｂ）が０．００００００１〜５重量％、（Ｃ）が３６〜９４重量％、（Ｄ）が０．９〜６３．９９９９８９９重量％である液体洗剤組成物である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：配列番号１のアミノ酸配列であるプロテアーゼ活性阻害剤。
【０００９】
本発明において、プロテアーゼ（Ａ）は、一般的にプロテアーゼとして知られているものが使用でき、低温（０〜５０℃）にプロテアーゼ活性の至適温度を有する低温至適プロテアーゼと高温（５０℃を超える）に至適温度を有する高温至適プロテアーゼが含まれる。（Ａ）としては、活性の有効性の観点から、セリンプロテアーゼが好ましく、さらに好ましくはスブチリシンである。市販されているものとしては、例えばノボザイムス社製のアルカラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、ＰＴＮ、及びジェネンコア社のピュラフェクト、ピュラフェクト  ＯＸＰ等が挙げられる。
【００１０】
本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）は、配列番号１のアミノ酸配列であるプロテアーゼ活性阻害剤である。
（Ｂ）には天然物から抽出したプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）及び遺伝子組み換え技術を活用して生産したプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−２）が含まれる。
【００１１】
天然物から抽出したプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）には、配列番号１のアミノ酸配列であるプロテアーゼ活性阻害剤であって、天然物（例えば、植物や動物の細胞、細胞外組織、種子、微生物の菌体内及び菌体外分泌物等）から抽出したプロテアーゼ活性阻害剤が含まれる。
抽出方法としては、細胞壁や細胞膜の破砕、遠心分離、硫安分画、クロマトグラフィー及び透析などの一般的なタンパク質を天然物から分離する工程が含まれる。
（Ｂ−１）のアミノ酸配列は、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって決定することができる。
また、天然物から抽出したタンパク質が、（Ｂ−１）に該当するかどうかは、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって抽出タンパク質のアミノ酸配列を決定し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供する相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて配列番号１のアミノ酸配列と一致するかを確認する。
【００１２】
宿主生産したプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−２）としては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている遺伝子組み換え法により組み換えた遺伝子を用いて、適当な宿主に形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得たものが含まれる。具体的には、アミノ酸配列が配列番号１であるタンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝子配列をクローニングし、適当な宿主に形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。
【００１３】
遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばｃＤＮＡライブラリ法及び人工合成遺伝子を用いる方法等が挙げられる。遺伝子変異手段としては、一般的に行われている部位特異的変異の方法でよく、具体的には、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社）等を用いた方法が挙げられる。
【００１４】
上記変異遺伝子を用いて（Ｂ−２）を生産する方法は、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記変異遺伝子を組込んだ組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、組み換えベクターを含む形質転換体を得る。得られた形質転換体を培養し、当該培養液から（Ｂ−２）を採取すればよい。
【００１５】
本発明において組換えベクターは、適当なベクターに上記変異遺伝子を挿入することによって得ることができる。
ベクターは種々のものが公知であり、市販品も多く存在する。当業者であれば、宿主の種類に応じて適切なベクターを容易に選択することができる。ベクターの具体例としては、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣシリーズ等が挙げられる。
組換えベクターの調製方法自体は周知の常法である。適当なベクターに変異遺伝子を挿入し、宿主を形質転換する具体的な方法としては、エレクトロポレーション法及びカルシウム法等が挙げられる。
【００１６】
本発明において宿主としては、動物細胞、微生物及び植物細胞等が挙げられる。
動物細胞としては、特に限定されないが、昆虫細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞及びＣＨＯ細胞等が挙げられる。
昆虫細胞としては、特に限定されないが、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等が挙げられる。
微生物としては、特に限定されないが、細菌及び酵母等が挙げられる。
細菌としては、真正細菌及び古細菌が含まれる。
真正細菌には、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属)、ラクトコッカス属 (Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属)、エンテロコッカス属 (Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属)、ペディオコッカス属(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属)、リューコノストック属 (Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属)及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。
植物細胞としては、特に限定されないが、ＢＹ−２細胞等が挙げられる。
【００１７】
本発明において、宿主としては、クローニングの容易さの観点から、微生物が好ましく、さらに好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）及びシネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）であり、特に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）及びブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）である。
【００１８】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００１９】
本発明において、培養液から（Ｂ−２）を採取及び精製する方法としては、常法に準じて行うことができる。例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素をすることができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが、さらに公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２０】
界面活性剤（Ｃ）は非イオン性界面活性剤（Ｃ−１）、アニオン性界面活性剤（Ｃ−２）、カチオン性界面活性剤（Ｃ−３）及び両性界面活性剤（Ｃ−４）が挙げられる。
【００２１】
非イオン性界面活性剤（Ｃ−１）としては、アルキレンオキサイド付加型非イオン性界面活性剤（Ｃ−１−１）、多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｃ−１−２）及び脂肪酸アルカノールアミド（Ｃ−１−３）等が挙げられる。
【００２２】
（Ｃ−１−１）としては、高級アルコール（炭素数８〜１８）アルキレン（炭素数２〜４、好ましいのは２）オキサイド付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜３０）、アルキル（炭素数１〜１２）フェノールエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）付加物（付加モル数１〜３０）、高級アミン（炭素数８〜２２）アルキレン（炭素数２〜４、好ましいのは２）オキサイド付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜４０）、脂肪酸（炭素数８〜１８）ＥＯ付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜６０）、ポリプロピレングリコール（分子量２００〜４０００）ＥＯ付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜５０）、ポリオキシエチレン（重合度＝３〜３０）アルキル（炭素数６〜２０）アリルエーテル並びにソルビタンモノラウレートＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜３０）及びソルビタンモノオレートＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜３０）等の多価（２〜８価又はそれ以上）アルコール（炭素数２〜３０）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜３０）等が挙げられる。
【００２３】
（Ｃ−１−２）としては、グリセリンモノステアレート、グリセリンモノオレート、ソルビタンモノラウレート及びソルビタンモノオレート等の多価（２〜８価又はそれ以上）アルコール（炭素数２〜３０）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル等が挙げられる。
【００２４】
（Ｃ−１−３）としては、炭素数１２以上の脂肪酸のアルカノールアミドが含まれ、具体的には、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸ジエタノールアミド及びラウリン酸モノエタノールアミド等が挙げられる。
【００２５】
アニオン性界面活性剤（Ｃ−２）としては、アルキル（炭素数８〜２４）エーテルカルボン酸又はその塩、アルキル（炭素数８〜２４）（ポリ）オキシエチレンエーテルカルボン酸又はその塩［（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルスルホコハク酸２ナトリウム等］、アルキル（炭素数８〜２４）硫酸エステル塩、アルキル（炭素数８〜２４）（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩［ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸ナトリウム及びラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸−トリエタノールアミン塩等］、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸スルホン酸ナトリウム、アルキル（炭素数８〜２４）フェニルスルホン酸塩［ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等］、アルキル（炭素数８〜２４）リン酸エステル塩、アルキル（炭素数８〜２４）（ポリ）オキシエチレンリン酸エステル塩［ラウリルリン酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム等］、脂肪酸塩［ラウリン酸ナトリウム及びラウリン酸トリエタノールアミン等］、アシル化アミノ酸塩［ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム等］等が挙げられる。
【００２６】
カチオン性界面活性剤（Ｃ−３）としては、第４級アンモニウム塩型［塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム及びエチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム等］及びアミン塩型［ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド乳酸塩、ジラウリルアミン塩酸塩及びオレイルアミン乳酸塩等］等が挙げられる。
【００２７】
両性界面活性剤（Ｃ−４）としては、ベタイン型両性界面活性剤［ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルヒドロキシスルホベタイン及びラウロイルアミドエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルベタインヒドロキシプロピルリン酸ナトリウム等］及びアミノ酸型両性界面活性剤［β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等］が挙げられる。
【００２８】
（Ｃ）としては、１種又は２種以上が使用できる。２種以上を使用する場合、その組み合わせとしては、例えばノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤と両性界面活性剤の組み合わせ等が挙げられる。
【００２９】
（Ｃ）として、洗浄性の観点から、ノニオン性界面活性剤単独での使用、及びノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤との組み合わせでの使用が好ましい。
ノニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）ＥＯ付加物（重合度＝１〜１００）が好ましく、さらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１８）ＥＯ付加物（重合度＝４〜２０）、次にさらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１５）ＥＯ付加物（重合度＝８〜１２）、特に好ましくはオレイルアルコールＥＯ１１モル付加物である。
アニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩、脂肪酸塩、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩が好ましく、さらに好ましくは、炭素数１２〜１６のアルキルフェニルスルホン酸塩及び炭素数８〜１６の脂肪酸塩、次にさらに好ましくは、ドデシルベンゼンスルホン酸モノエタノールアミン塩及びラウリン酸ナトリウムである。
【００３０】
溶剤（Ｄ）としては、水及び親水性溶剤｛炭素数１〜３のモノアルコール（メタノール、エタノール及びイソプロピルアルコール等）、炭素数１〜１０のポリオール（エチレングリコール、ジエチレングリコール及びプロピレングリコール等）｝並びにこれらの混合物等が挙げられる。
溶剤（Ｄ）としては、洗浄性の観点から、水が好ましい。
また、水としては、特に限定されるものではなく、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中にｐＨ調整剤を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
【００３１】
本発明の液体洗剤組成物に含まれるプロテアーゼ（Ａ）の含有量（重量％）は、０．００００１〜０．１であり、洗浄性の観点から、好ましくは０．０００１〜０．０１である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の含有量（重量％）は、０．００００００１〜５であり、洗浄性を長期間保つ観点から、好ましくは０．００００１〜３であり、さらに好ましくは０．００１〜３である。
界面活性剤（Ｃ）の含有量（重量％）は、３６〜９４であり、洗浄性の観点から、好ましくは４０〜９０であり、特に好ましくは６１〜８０である。
溶剤（Ｄ）の含有量（重量％）は、０．９〜６３．９９９９８９９であり、洗浄性の観点から、好ましくは６．９９〜５９．９９９８９、特に好ましくは１６．９９〜３８．９９８９である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比｛（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数｝は、洗浄性を長期間保つ観点から、０．０１〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１０であり、特に好ましくは０．３〜３である。
【００３２】
液体洗剤組成物には、必要により、公知のその他の成分、例えば特開２００４−２７１８１号公報に記載のビルダー、キレート剤、親水性溶媒、消泡剤、蛍光増白剤、漂白剤、柔軟剤、除菌剤、香料及び着色剤等を含有してもよい。
【００３３】
ビルダーとしては、ポリカルボン酸塩（アクリル酸塩ホモポリマー及びマレイン酸塩ホモポリマー等）、多価カルボン酸塩（クエン酸及びリンゴ酸等）、及びアルカリビルダー（苛性ソーダ、ソーダ灰、アンモニア、トリエタノールアミン、トリポリリン酸ソーダ及びケイ酸ソーダ等）等が挙げられる。キレート剤としては、ＥＤＴＡ及びＮＴＡ等が挙げられる。消泡剤としては、シリコーン系消泡剤、ポリオキシアルキレン系消泡剤及び鉱物油系消泡剤等が挙げられる。
【００３４】
その他の成分のうち、ビルダー及びキレート剤の含有率は、液体洗剤組成物、ビルダー及びキレート剤の全重量に基づいて、好ましくは１０重量％以下であり、更に好ましくは５重量％以下である。
蛍光増白剤、漂白剤、柔軟剤、酵素、除菌剤、香料、着色剤及び消泡剤の含有率は、液体洗剤組成物、蛍光増白剤、漂白剤、柔軟剤、除菌剤、香料、着色剤及び消泡剤の全重量に基づいて、好ましくは５重量％以下であり、更に好ましくは２重量％以下である。
【００３５】
液体洗剤組成物には、上記以外に、必要により、塩（Ｇ）、糖（Ｈ）、アミノ酸（Ｉ）、脂肪酸（Ｋ）、油脂（Ｌ）、その他の低分子有機化合物（Ｊ）及びプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）を含有することができる。
【００３６】
塩（Ｇ）として、無機塩｛塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等｝及び有機塩（ギ酸ナトリウム等）が挙げられる。
【００３７】
糖（Ｈ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００３８】
アミノ酸（Ｉ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。
【００３９】
脂肪酸（Ｋ）として、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸等が挙げられる。
【００４０】
油脂（Ｌ）としては、上記脂肪酸（Ｋ）のモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドが挙げられる。
【００４１】
その他の低分子有機化合物（Ｊ）としては、酢酸ベンジル、メチルサリチル酸、ベンジルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、けい皮酸、カフェ酸、カテキン類、アスコルビン酸及びカロテノイド等が挙げられる。
【００４２】
プロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）としては、特に限定するものではないが、プロテアーゼ以外の酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられ、具体的には、プロテアーゼ以外の酵素｛セルラーゼ（エンドラーゼ等）、アミラーゼ、リパーゼ及びペルオキシダーゼ等｝、血清アルブミン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン及びシルクペプチド等が挙げられる。
【００４３】
本発明の液体洗剤組成物に含まれる塩（Ｇ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から液体洗剤組成物の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜５、特に好ましくは０〜３である。
本発明の液体洗剤組成物に含まれる糖（Ｈ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から液体洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の液体洗剤組成物に含まれるアミノ酸（Ｉ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から液体洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の液体洗剤組成物に含まれるその他の低分子有機化合物（Ｊ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、液体洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の液体洗剤組成物に含まれる脂肪酸（Ｋ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から液体洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の液体洗剤組成物に含まれる油脂（Ｌ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、液体洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の液体洗剤組成物に含まれるプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｍ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、液体洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
【００４４】
本発明の液体洗剤組成物は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）撹拌機及び加熱冷却装置を備えた混合槽に、界面活性剤（Ｃ）と溶剤（Ｄ）及びその他の成分を投入順序に特に制限なく投入し、２０〜５０℃で均一になるまで撹拌する。
（２）プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を添加し、２０〜５０℃で３０分〜２時間攪拌する。
（３）プロテアーゼ（Ａ）を加えてさらに２０〜５０℃で均一になるまで攪拌する。
【００４５】
上記本発明の液体洗剤組成物は、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤及びコンタクトレンズ用洗浄剤等に使用できる。
【００４６】
液体洗剤組成物の使用方法は、従来の液体洗剤組成物の使用方法と同じでよく、特に限定されるものではない。衣料用洗浄剤としての使用方法の１例を下記に示す。
（１）洗濯物が入った洗濯機に水道水を張り、液体洗剤組成物を２５℃で添加し、軽く撹拌して溶解させる。
（２）洗濯機で洗濯物を洗浄する。
（３）洗濯機から液を抜き、水道水で１〜２回すすぐ。
（４）適宜脱水をかける。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４８】
＜製造例１：プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を発現するプラスミドの作製＞
配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号５）（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号２のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１）を作成した。このプラスミドと４８位のメチオニンをグリシンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号３、４）を用い、以下の条件でプラスミド（Ｐ１）に変異導入を行った。即ち、プラスミド（Ｐ１）を０．５μＬ（１０ｎｇ）、１０μＭの変異導入用プライマー各０．７５μＬ（７．５ｐｇ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液２．５μＬ（タカラバイオ製）、２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混液２μＬ（タカラバイオ製）、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ０．２５μＬ（タカラバイオ製）及び脱イオン水１７μＬを混合した後、ＴａＫａＲａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラバイオ製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９８℃１０秒間、５０℃１０秒間、６８℃６．５分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）で精製後（５０μＬ）、６μＬの１０倍濃度のＤｐｎＩ用緩衝液及び３μＬの制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ製）を加え、３７℃で１時間、テンプレートを分解した。得られた制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを大腸菌ＤＨ５αへの形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間過熱した。ここＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７度で一晩培養した。現れたコロニーをＬＢ培地１ｍＬで１２時間培養したのち、Ｑｕａｎｔｕｍｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に供し、配列番号１のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を発現するプラスミド（Ｐ２）を精製した（１００μＬ）。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス解析サービス（マクロジェンジャパン社）に解析を依頼し、変異が導入されたことを確認した。
【００４９】
＜製造例２：プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の作製＞
製造例１で得られたプロテアーゼ活性阻害剤発現プラスミド（Ｐ２）を大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に同様の方法で形質転換した。得られたプロテアーゼ活性阻害剤発現株をＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作成し、０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い前培養液を作成した。前培養液を５０ｍＬの培養液｛水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン｝に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％  グリセリン、５０ｇ／Ｌ  ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ  消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン）の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液（Ｑ−１）を回収した。
得られた培養液（Ｑ−１）をＨｉｓ-ｔａｇ精製用担体（ＧＥヘルスケア社製  Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）で分離し、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の溶液（Ｒ−１）を得た。（Ｒ−１）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌであった。また、（Ｂ）の分子質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めたところ、約８０００であった。
【００５０】
＜実施例１〜９＞
表１の割合で３０℃で配合し、本発明の液体洗剤組成物（Ｓ−１）〜（Ｓ−９）を得た。
【００５１】
＜比較例１〜３＞
表１の割合で３０℃で配合し、比較用の液体洗剤組成物（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−３）を得た。
【００５２】
【表１】
2014088534.tif 000002
【００５３】
表１中、プロテアーゼ（Ａ）及びその他のタンパク質（Ｍ）は下記を用いた。
○プロテアーゼ（Ａ）
サビナーゼ水溶液：ノボザイムス社製、商品名「サビナーゼ  １６Ｌ」、分子質量：２６７００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥよりサビナーゼ含量は１ｇ／Ｌと推定
○その他のタンパク質（Ｍ）
エンドラーゼ水溶液：ノボザイムス社製、商品名「エンドラーゼ」、ＳＤＳ−ＰＡＧＥよりエンドラーゼ含有量は１ｇ／Ｌと推定
【００５４】
＜液体洗剤組成物を３７℃で１週間保管後における希釈時のプロテアーゼの残存活性の測定＞
実施例及び比較例で得た液体洗剤組成物について、３７℃で１週間保管した後の液体洗剤組成物（Ｓ−１）〜（Ｓ−９）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−３）を１０μＬ、９９９０μＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ＋１ｍＭＣａＣｌ２緩衝液（ｐＨ８、２５℃）で希釈し、溶液（Ｔ−１）〜（Ｔ−９）及び（Ｔ’−１）〜（Ｔ’−３）とした。溶液（Ｔ−１）〜（Ｔ−９）及び（Ｔ’−１）〜（Ｔ’−３）７００μＬに、５０ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ＋１ｍＭＣａＣｌ2緩衝液（ｐＨ８、２５℃）で溶解、ナカライテスク）をそれぞれ７０μＬ添加して溶液（Ｕ−１）〜（Ｕ−９）及び（Ｕ’−１）〜（Ｕ’−３）を作成し、酵素反応を開始した。溶液（Ｕ−１）〜（Ｕ−９）及び（Ｕ’−１）〜（Ｕ’−３）を作成直後及び１５分ごとに３回、反応溶液のうち１５０μＬを取り出し、１５％トリクロロ酢酸溶液２００μＬと混合した。１５，０００×ｇの条件で５分間遠心し、上清に０．１Ｎ  ＮａＯＨを４００μＬ加え、分光光度計を用い４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。溶液（Ｕ−１）〜（Ｕ−９）及び（Ｕ’−１）〜（Ｕ’−３）を作成直後の吸光度をＡλ0及び溶液（Ｕ−１）〜（Ｕ−９）及び（Ｕ’−１）〜（Ｕ’−３）を作成からｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｖ1）を求めた。なお、ブランクとして、比較例１の作成直後の液体洗剤組成物（Ｓ’−１）を用いて求めた直線の傾き（係数ｖ1）を直線の傾き（係数ｖ0）として、下記数式（１）から、液体洗剤組成物（Ｓ−１）〜（Ｓ−９）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−３）のプロテアーゼの残存活性を求めた結果を表１に示す。
３７℃１週間保管後の残存活性（％）＝ｖ1／ｖ0×１００（１）
【００５５】
＜３７℃３ヶ月保管後の希釈時のプロテアーゼの残存活性の測定＞
上記「３７℃で１週間保管後における希釈時のプロテアーゼの活性測定」において、「３７℃で１週間保管した後の液体洗剤組成物」に変えて、「３７℃で３ヶ月保管した液体洗剤組成物」を用いる以外は同様にして、液体洗剤組成物（Ｓ−１）〜（Ｓ−９）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−３）を３７℃３ヶ月保管後の残存活性（％）を求めた。結果を表１に示す。
【００５６】
＜活性の持続性＞
上記３７℃１週間保管後の残存活性と３７℃３ヶ月保管後の残存活性から、下記数式により活性の持続性を算出し、結果を表１に記載した。
活性の持続性（％）＝｛３７℃３ヶ月保管後の残存活性｝／｛３７℃１週間保管後の残存活性｝×１００
【００５７】
表１の結果から、比較例１〜３の液体洗剤組成物は活性の持続性が５０％以下とプロテアーゼ活性が半減しているのに対し、実施例１〜９の本発明の液体洗剤組成物は、活性の持続性が６２％以上と高く、プロテアーゼ活性が低下しにくいことが分かる。
【００５８】
＜洗浄性試験＞
＜３７℃１週間保管後の洗浄性＞
実施例及び比較例で得た液体洗剤組成物について、３７℃で１週間保管した後の液体洗剤組成物（Ｓ−１）〜（Ｓ−９）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−３）の作成後直ちに液体洗剤組成物をそれぞれ０．８ｇを水９９９．２ｇに溶解させ溶液を得た。この溶液に、湿式人工汚染布（４ｃｍ×４ｃｍ）５枚を投入し、ターゴトメーター（大栄化学社製）を用いて以下の条件にて洗浄及びすすぎをした後、布を取り出し、ギヤーオーブン（ＴＡＢＡＩ社製、ＧＰＳ−２２２）を用いて７０℃で６０分間乾燥し、試験布を得た。ついで、多光源分光測色計（スガ試験機社製）を使用して、この試験布の５４０ｎｍの反射率を、試験布１枚ごとに表裏２個所ずつ計４個所（試験布５枚で合計２０個所）測定し、この平均値を求め、以下の式にて３７℃１週間保管後の洗浄性（％）を算出した。結果を表１に記載した。
（洗浄条件）
時間：１０分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（すすぎ条件）
時間：１分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（洗浄性）
３７℃１週間保管後の洗浄性（％）＝｛（ＲW−ＲS）／（ＲI−ＲS）｝×１００
なお、ＲIは清浄布の反射率、ＲWは洗浄布の反射率、ＲSは汚染布の反射率を示す。
また、使用した湿式人工汚染布は、表２の汚垢組成を有する財団法人洗濯科学協会製の湿式人工汚染布（５４０ｎｍにおける反射率が４０±５％）である。
【００５９】
【表２】
2014088534.tif 000003
【００６０】
＜３７℃３ヶ月保管後の洗浄性＞
実施例及び比較例で得た液体洗剤組成物について、上記＜３７℃１週間保管後の洗浄性＞において、「３７℃で１週間保管した後の液体洗剤組成物」に代えて、「３７℃で３ヶ月保管した後の液体洗剤組成物」を用いる以外は同様に洗浄性試験をおこない、３７℃３ヶ月保管後の洗浄性を算出した。結果を表１に記載した。
【００６１】
＜洗浄性の持続性＞
上記３７℃１週間保管後の洗浄性と３７℃３ヶ月保管後の洗浄性から、下記数式により洗浄性の持続性を算出し、結果を表１に記載した。
洗浄性の持続性（％）＝｛３７℃３ヶ月保管後の洗浄性｝／｛３７℃１週間保管後の洗浄性｝×１００
【００６２】
表１の結果から、プロテアーゼ活性阻害剤を含まない比較例１の液体洗剤組成物は、洗浄性の持続性が５３％と極めて低く、長期間保管することで洗浄性が低下したことがわかる。また、従来の阻害剤を含む比較例２の液体洗剤組成物は、洗浄性の持続性が６６％と低く、長期保管により洗浄性が低下することがわかる。また、比較例３は、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を含むものの、本発明の範囲外であるが、洗浄性の持続性が６３％と低く、プロテアーゼ活性を十分に阻害できておらず、洗浄性が低下することがわかる。
一方、本発明の液体洗剤組成物である実施例１〜９は、洗浄性の持続性が７３％以上と高く、長期間保管後も洗浄性が低下しにくいことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の液体洗剤組成物は、長期保管後も洗浄性が低下しにくいので、製造から家庭での使用までに長期間を要する衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤及びコンタクトレンズ用洗浄剤として好適に使用でき、特に衣料用液体洗剤として有用である。
【配列表】
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