(57)【要約】【課題】低濃度でアメーバに対する高い駆除効果を有し、安価かつ安全に利用可能な魚類のアメーバ駆除方法、魚類のアメーバ駆除用薬浴液、魚類用のアメーバ駆除剤および飼料を提供する。【解決手段】魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除するために用いられる、水中に有効成分を溶解または分散させた薬浴液であって、有効成分は、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物であり、その濃度が０．３〜２０ｐｐｍである魚類のアメーバ駆除用薬浴液、前記薬液中に魚類を浸漬する魚類のアメーバ駆除方法、前記有効成分を含む魚類用のアメーバ駆除剤およびそれを含む魚類用の飼料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除する方法であって、
有効成分として、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を、０．３〜２０ｐｐｍの濃度で水中に溶解または分散させた薬浴液中に魚類を浸漬することを特徴とする魚類のアメーバ駆除方法。
【請求項２】
前記水が淡水または海水であることを特徴とする請求項１記載の魚類のアメーバ駆除方法。
【請求項３】
前記水が淡水であることを特徴とする請求項２記載の魚類のアメーバ駆除方法。
【請求項４】
魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除する方法であって、
有効成分として、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を含む組成物を魚類に経口投与し、または摂食させることを特徴とする魚類のアメーバ駆除方法。
【請求項５】
前記組成物に含まれる前記化合物の含有量が５０〜４０００ｐｐｍであることを特徴とする請求項４記載の魚類のアメーバ駆除方法。
【請求項６】
前記魚類が、サケ科(Salmoniformes)サケ目(Salmonidae)に属するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の魚類のアメーバ駆除方法。
【請求項７】
前記原生生物がNeoparamoeba spp.であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の魚類のアメーバ駆除方法。
【請求項８】
魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除するために用いられる、水中に有効成分を溶解または分散させた薬浴液であって、
前記有効成分は、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物であり、
前記有効成分の濃度が０．３〜２０ｐｐｍであることを特徴とする魚類のアメーバ駆除用薬浴液。
【請求項９】
前記水が淡水であることを特徴とする請求項８記載の魚類のアメーバ駆除用薬浴液。
【請求項１０】
チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を有効成分として含むことを特徴とする魚類用のアメーバ駆除剤。
【請求項１１】
前記有効成分の含有量が５０〜４０００ｐｐｍであることを特徴とする請求項１０記載の魚類用のアメーバ駆除剤。
【請求項１２】
チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を含むことを特徴とする魚類用の飼料。
【請求項１３】
前記化合物の含有量が５０〜４０００ｐｐｍであることを特徴とする請求項１２記載の魚類用の飼料。
【請求項１４】
サケ科(Salmoniformes)サケ目(Salmonidae)に属する魚類用の飼料であることを特徴とする請求項１２または１３記載の魚類用の飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類に寄生するアメーバの駆除に有用な魚類のアメーバ駆除方法、魚類のアメーバ駆除用薬浴液、魚類用のアメーバ駆除剤および飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
アメーバは、欧米やオーストラリアの養殖サーモンを始めとする養殖魚等に深刻な経済的損害を引き起こしている。このアメーバは、顕微鏡でしか見えない単細胞からなる原生生物である。魚類に寄生するアメーバの殆どは、宿主のエラに寄生し、ガス交換を阻害することにより発育障害を起こすため、そのまま処置をしなければ、養殖魚が大量に斃死する。ある推計によると、アメーバは、全世界の養殖魚業界において、年間１０億ドル以上の損失を生じさせている。
【０００３】
養殖魚のアメーバ対策として、現在では２時間の淡水浴が実施されているが、定期的に繰り返し実施しなければ効果が認められず、経済的および肉体的な負担が非常に高い上に、養殖魚にも多大なストレスを与えるおそれがある。さらに、淡水浴後でも、６％〜１０％以上のアメーバが生存することが報告されており（非特許文献１参照）、これが再感染の原因となることが示唆されている。すべてのアメーバを死滅させることができない原因の１つとして、淡水浴中では、水がエラ組織の内部まで浸透しないため、エラ表面のアメーバしか死滅せず、組織に侵入したアメーバには淡水浴の効果がないことが考えられる。またアメーバはバイオフィルム（生物膜）を形成するため、バイオフィルム内のアメーバに対して淡水浴では効果があまり期待できないことが示唆されている。このバイオフィルムは、最も対策が難しいことが知られている。
【０００４】
過大な労力や時間、費用を要せず、しかも養殖魚にストレスを与えることなく、養殖魚に寄生する寄生虫を軽減することのできる養殖魚の寄生虫寄生軽減剤として、例えば、特許文献１では、カフェイン、オイゲノール、カルバクロール、チモール、パラクレゾール、シトロネラール、アニスアルデヒド、ケイヒアルデヒド及びコイクセノライドから選ばれる１種または２種以上を有効成分とすることを特徴とするものが開示されている。
【０００５】
In vitroでのアメーバに対する殺効果の評価は、多くの研究機関で実施されている。この中で、最も効果が高いと思われているビチオノールを用いた場合、最終濃度５ｐｐｍ、２４時間で、生存数が減少したが、死滅できなかったことが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
ガーリック抽出物を用いた実験でも、２５ｐｐｍ、２４時間の条件下でアメーバが完全には死滅しなかったことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−３０６７７７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】V. L. Findlay, B. L. Munday, Furtherstudies on acquired resistance to amoebic gill disease (AGD) in Atlanticsalmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases, Volume 21, Issue 2, 1998年3月, 121-125ページ, DOI: 10.1046/j.1365-2761.1998.00086.x
【非特許文献２】R. L. Florent, J. Becker, M. D. Powell,Further development of bithionol therapy as a treatment for amoebic gilldisease in Atlantic salmon, Salmo salar L., Journal of Fish Diseases, Volume32, Issue 5, 2009年5月, 391-400ページ, DOI: 10.1111/j.1365-2761.2008.01001.x
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１記載の養殖魚の寄生虫寄生軽減剤は、ベネデニア等の体表寄生虫を対象とするものであるため、エラの外側や組織内に寄生するアメーバに対する効果については必ずしも明らかではない。また、同文献記載の養殖魚の寄生虫軽減剤は、飼料に混合して使用するものであり、薬浴液等の外用剤としての用途への適用可能性については必ずしも明らかでない。さらにベネデニアは単性類に属する寄生虫であり、アメーバのような原生生物とは全く異なる生物と考えられており、原虫での軽減効果については明らかにされていない。
【００１０】
また、魚類に寄生するアメーバの駆除については、淡水浴や上記方法以外の有効な治療法や、高い駆除効果を有する治療・予防薬が確立していないのが現状である。
【００１１】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、低濃度かつ短時間でアメーバに対する高い駆除効果を有し、安価かつ安全に利用可能な魚類のアメーバ駆除方法、魚類のアメーバ駆除用薬浴液、魚類用のアメーバ駆除剤および飼料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、下記の［１］〜［７］に記載の魚類のアメーバ駆除方法、下記の［８］〜［９］に記載の魚類のアメーバ駆除用薬浴液、下記の［１０］〜［１１］に記載の魚類用のアメーバ駆除剤および下記の［１２］〜［１４］に記載の魚類用の飼料を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１３】
［１］  魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除する方法であって、有効成分として、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を、０．３〜２０ｐｐｍの濃度で水中に溶解または分散させた薬浴液中に魚類を浸漬する魚類のアメーバ駆除方法。
［２］  前記水が淡水または海水である上記［１］記載の魚類のアメーバ駆除方法。
［３］  前記水が淡水である上記［２］記載の魚類のアメーバ駆除方法。
［４］  魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除する方法であって、有効成分として、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を含む組成物を魚類に経口投与し、または摂食させる魚類のアメーバ駆除方法。
［５］  前記組成物に含まれる前記化合物の含有量が５０〜４０００ｐｐｍである上記［４］記載の魚類のアメーバ駆除方法。
［６］  前記魚類が、サケ科(Salmoniformes)サケ目(Salmonidae)に属するものである上記［１］から［５］のいずれか１項記載の魚類のアメーバ駆除方法。
［７］  前記原生生物がNeoparamoeba spp.である上記［１］から［６］のいずれか１項記載の魚類のアメーバ駆除方法。
【００１４】
［８］  魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除するために用いられる、水中に有効成分を溶解または分散させた薬浴液であって、前記有効成分は、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物であり、前記有効成分の濃度が０．３〜２０ｐｐｍである魚類のアメーバ駆除用薬浴液。
［９］  前記水が淡水である上記［８］記載の魚類のアメーバ駆除用薬浴液。
【００１５】
［１０］  チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を有効成分として含む魚類用のアメーバ駆除剤。
［１１］  前記有効成分の含有量が５０〜４０００ｐｐｍである上記［１０］記載の魚類用のアメーバ駆除剤。
【００１６】
［１２］  チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を含む魚類用の飼料。
［１３］  前記化合物の含有量が５０〜４０００ｐｐｍである上記［１２］記載の魚類用の飼料。
［１４］  サケ科(Salmoniformes)サケ目(Salmonidae)に属する魚類用の飼料である上記［１２］または［１３］記載の魚類用の飼料。
【００１７】
なお、本発明において、「１ｐｐｍ」は、薬浴液、アメーバ駆除剤または飼料１，０００，０００重量部に対し、有効成分または化合物１重量部が含まれていることを意味する。
【発明の効果】
【００１８】
チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオール、これらの異性体および誘導体を有効成分とする薬浴液を用いる本発明のアメーバ駆除方法によると、０．５〜１００ｐｐｍという低濃度で、かつ短時間のうちに魚類のエラの内部に寄生するアメーバについてもほぼ完全に死滅させることが可能である。また、飼料に添加した場合にも、短期間の投与でアメーバ等に対する高い駆除効果を発揮する。これらの有効成分は、天然のハーブや精油より得られるものであり、ごく少量かつ短期間の使用で優れた効果を発揮するため、ビチオノール等に見られるような摂食障害やそれに伴う斃死等の副作用のリスクが低く、安価かつ安全に利用可能であるという優れた効果を有している。かくして、本発明によると、低濃度かつ短時間でアメーバに対する高い駆除効果を有し、安価かつ安全に利用可能な魚類のアメーバ駆除方法、魚類のアメーバ駆除用薬浴液、魚類用のアメーバ駆除剤および飼料が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の第１の実施の形態に係る魚類のアメーバ駆除方法（以下、「アメーバ駆除方法」、「本方法」と略称する場合がある。）は、有効成分として、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を、０．３〜２０ｐｐｍの濃度で水中に溶解または分散させた薬浴液中に魚類を浸漬することにより、魚類に寄生するアメーバ属の原生生物（以下「アメーバ等」と略称する場合がある。）を駆除する方法である。
【００２０】
本方法に使用される薬浴液は、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を、０．３〜２０ｐｐｍの濃度で水中に溶解または分散させたものである。
【００２１】
有効成分であるチモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールは、それぞれ、下記の構造式化１〜化４で表される分子構造を有する化合物であり、主に植物より得られる精油の構成成分として知られている。これらの化合物は、それらの植物の植物体または精油（たとえば、チモールの場合はタチジャコウソウ（タイム）、シンナムアルデヒドの場合はケイ皮油、ペリルアルデヒドの場合はシソまたはシソ油、ゲラニオールの場合はゼラニウム）から任意の公知の方法を用いて単離してもよく、任意の方法を用いて化学的に合成したものを用いてもよい。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
【化２】
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【００２４】
【化３】
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【００２５】
【化４】
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【００２６】
薬浴液の有効成分としては、魚類に寄生するアメーバ属に属する原生生物の駆除活性を有している限りにおいて、上記の化合物以外に、これらの異性体または誘導体を用いてもよい。上記の化合物の異性体の例としては、構造異性体（例えば、チモールの構造異性体であるカルバクロールや３−メチル−４−イソプロピルフェノール等）、幾何異性体（例えば、（Ｚ）−シンナムアルデヒド）、光学異性体（例えば、４（Ｒ）−ペリルアルデヒド）等が挙げられる。また、上記の化合物の誘導体の例としては、アルデヒド基が窒素化合物と反応して生じるオキシム、イミド（Schiff塩基）、ヒドラジド、セミカルバジド等、芳香族環に置換基を有するもの等が挙げられる。
なお、上記の化合物ならびにそれらの異性体および誘導体のうち任意の２種類以上を任意の割合で混合したものを薬浴液の有効成分として使用してもよい。
【００２７】
これらの化合物のうち特に好ましいのがシンナムアルデヒドであり、数ｐｐｍ程度の低濃度で、短時間（数分〜数十分）の薬浴液中への浸漬により、エラの内部に寄生したアメーバ等をほぼ完全に駆除することができる。
【００２８】
薬浴液に含まれる有効成分の濃度は、０．３〜２０ｐｐｍ、好ましくは０．５〜１０ｐｐｍ、より好ましくは３〜１０ｐｐｍである。有効濃度の濃度が０．３ｐｐｍを下回ると、アメーバ等の駆除を十分に行うことができず、逆に２０ｐｐｍを上回ると、麻酔作用に伴う斃死の危険性の増大等、魚類への副作用が顕著に発現するおそれがある。
【００２９】
薬浴液の製造に用いられる水は、海水でもよいが、人工海水、淡水およびこれらの任意の割合での混合物であってもよい。薬浴液の製造に使用する水は、必要に応じて、浮遊物、細菌、重金属等の有害成分を除去するための処理に供してもよい。処理については、限外ろ過、任意の公知の方法を用いて行うことができる。
水としては、それ単独である程度の殺アメーバ活性を有する淡水を使用することが好ましい。
【００３０】
有効成分として用いられる化合物の水への溶解度または分散性を向上させるために、薬浴液は、魚油等の油脂、アルコール、乳化剤、非イオン性界面活性剤等を含んでいてもよい。また、魚類用の薬浴液に一般に使用される任意の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤の例としては、抗生物質等の他の薬剤、保存料、酸化防止剤等が挙げられる。
【００３１】
薬浴液の製造方法は特に制限されず、上記の各成分を混合し、有効成分を水中に溶解または分散させるための任意の公知の方法を用いて行うことができる。あらかじめ、有効成分として用いられる化合物を水、アルコール等の水溶性有機溶媒、油脂、またはこれらの任意の２種類以上を任意の割合で混合して得られる混合溶媒等の適当な溶媒に上記濃度範囲よりも高濃度で溶解した原液を作製しておき、これを水中に所定の割合で添加して、最終的に上記濃度範囲となるように希釈することにより製造してもよい。
【００３２】
本方法の適用対象となる魚種については、アメーバ感染症を発症する任意の魚類が挙げられるが、特に、エラへのアメーバ等の寄生が大きな問題になっているターボット（イシビラメ）や、サケ科(Salmoniformes)サケ目(Salmonidae)に属する魚類が挙げられ、その具体例としては、シロザケ、アトランティックサーモン、ベニザケ、ギンザケ、キングサーモン、カラフトマス、サツキマス、サクラマス、マスノスケ、スチールヘッド等が挙げられる。
【００３３】
本方法による駆除の対象となるアメーバ属に属する原生生物としては、魚類に寄生して疾患を発症させ、斃死による養殖魚の歩留まりの低下や、商品価値の低下の原因となる任意のものが挙げられるが、特に、アメーバ性鰓病（ＡＧＤ）の原因寄生体であるNeoparamoeba pemaquidensis等が挙げられる。
【００３４】
数ｐｐｍの有効成分を含む薬浴液の場合、薬浴液への魚類の浸漬を数十分〜数時間程度行えば、寄生したアメーバ等をほぼ完全に死滅させることができる。有効成分の種類によっては、魚類が麻酔されたような状態を呈することがあるが、薬浴終了後に有効成分を含まない水に戻すことで速やかに回復する。
【００３５】
本発明の第２の実施の形態に係る魚類のアメーバ駆除方法は、魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除する方法であって、有効成分として、チモール、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールならびにこれらの異性体および誘導体からなる群より選択される１または複数種の化合物を含む組成物を魚類に経口投与し、または摂食させることにより、魚類に寄生するアメーバ属の原生生物を駆除する方法である。
【００３６】
組成物に含まれる化合物の種類、対象となる魚種、駆除対象となるアメーバ等については、第１の実施の形態に係る薬浴液の場合と同様であるので、詳しい説明を省略する。経口投与または摂食に供する場合の上記化合物の組成物への含有量は特に制限されないが、例えば、５０〜４０００ｐｐｍであり、魚種、体重、養殖条件、化合物の種類等に応じて適宜調節される。
【００３７】
組成物は、飼料に含有させて摂餌時に摂食させることにより経口投与してもよい。飼料の形態は特に制限されず、通常の養殖時に使用される餌に所定の含有量となるように配合すればよい。
【実施例】
【００３８】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
【００３９】
実施例１：in vitroでの殺アメーバ活性の評価
殺アメーバ活性の評価は、Florent らの「In
vitro toxicity of bithionol and bithionol sulphoxide to Neoparamoeba spp., the
causative agent of amoebic gill disease (AGD)」 Dis
Aquat Organ. 2010 Sep 17;91(3):257-62 記載の方法に準拠して実施した。方法の概略を以下に示す。
（１）丸型シャーレ底面に、均一にアメーバを付着させたシャーレを準備した。
（２）使用前に滅菌海水で１回洗浄した。
（３）添加物の最終濃度が任意の濃度（５ｐｐｍ，１ｐｐｍ，０．３ｐｐｍ）になるように調整した滅菌海水を加えた
（４）添加物で調整した海水を添加してから１０分後、１時間後、２時間後、２４時間後に顕微鏡下でシャーレを観察し、アメーバの生存状態を観察した。
（５）アメーバがシャーレ底面に付着して、形態に異常が認められないものについては、生存と判定し、底面から離れたものについては、遠心分離機を用いて回収した。
（６）回収したアメーバについては、ニュートラルレッド染色を用いて生死を確認した。
【００４０】
シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオールについての実験結果を、対照（ブランク）および比較例としてビチオノールに行った同様の実験結果と共に、下記の表１に示した。
【００４１】
【表１】
2014133720.tif 000006
【００４２】
表１の結果より、シンナムアルデヒドについては、最終濃度１ｐｐｍ以上で、１０分間以内に抗アメーバ効果を示すことが認められた。また、ペリルアルデヒドは、５ｐｐｍ以上１時間以内、ゲラニオールは５ｐｐｍ以上１０分間以内で抗アメーバ効果が認められた。一方、何も加えない対照区では、２４時間後でも、ほとんどすべてのアメーバが生存した。一方、ビチオノールを添加したものでは、５ｐｐｍ、１時間で生存数の減少は認められたものの、アメーバが生存した。
【００４３】
ビチオノールでは、最終濃度５ｐｐｍで２４時間接触させたにもかかわらず、アメーバの生存が認められたのに対し、今回の３種類の披検物質では５ｐｐｐｍ１時間以内ですべてのアメーバが死滅した。このことより、これらの化合物は、低濃度の投与で短時間のうちに高い抗アメーバ活性をしめすことが確認された。
【００４４】
特にシンナムアルデヒドについては、最終濃度１ｐｐｍ以上の低濃度で、１０分間以内に抗アメーバ効果が認められた。また、最終濃度が０．３ｐｐｍ，１０分間以内でも、アメーバの減少効果が認められたことより、これらの被験物質のうち最も優れた抗アメーバ活性を持つ物質であることが示唆された。
【００４５】
実施例２：安全性の検討
実施例１の結果を受けて、上記３種類の被験物質について、実際に野外で使用する場合の条件について検討を行った。使用に際して最も考慮しなければならないことは、アメーバはエラの表面もしくは組織に寄生し、さらにバイオフィルムを生成することより、これらの物質がある一定の濃度および一定時間、エラに感作していなければならない。
【００４６】
実施例１の結果によると、理論的には、シンナムアルデヒドの場合、１ｐｐｍの濃度で１０分間、ペリルアルデヒドの場合５ｐｐｍで１時間、ゲラニオールは５ｐｐｍで１０分間の濃度と時間があれば、アメーバ対策の効果が期待できる。これらを簡易に、しかも持続的にエラに感作させる方法としては、魚では薬浴が用いられている。薬浴を実施する場合、これらの物質の類似物質は効率的に皮膚から吸収され組織に浸透することが報告されている。たとえば、これらと同じモノテルペンの仲間であるオイゲノールやカルバクロールは、皮膚やエラからの吸収に優れ、魚の全身麻酔薬として広く使用されている。このため、淡水浴もしくは海水で混合することにより使用することは、組織内に侵入したアメーバに対して効果があることが期待される。さらにバイオフィルムに浸透性の高い物質としてシンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ゲラニオール等が報告されている。
【００４７】
したがって淡水または海水において、これらの物質の最低有効濃度が保たれれば、エラの表面だけではなく、組織内のアメーバについても効率的に減少することが期待できる。また、最も駆除が難しいとされるバイオフィルム内のアメーバに対しても治療が期待できる。この方法としては、海水もしくは淡水に最小有効濃度以上の濃度が必要である。これを実行するためには、海水もしくは淡水に混合したときの、魚への安全性が担保されなければならない。以上に鑑みて、これらの被験物質の安全性を担保するため下記の実験を実施した。
【００４８】
３５０Ｌ海水もしくは淡水のタンクに１００ｇ程度のサーモン３０尾を準備した。これらのタンクの海水および淡水について、それぞれの物質の最終濃度が２０ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１ｐｐｍに調整した。ただし、最小有効濃度の関係で１ｐｐｍの試験はシンナムアルデヒドのみとした。試験開始後、それぞれの魚の状態を確認し、すべての魚が安全である時間を計測した。試験時間は最大で２時間（１２０分間）で実施した。海水を用いて調製した薬浴液についての検討結果を下記の表２に示す。
【００４９】
【表２】
2014133720.tif 000007
【００５０】
海水を用いて調製した薬浴中での最終濃度１０ｐｐｍでの安全性（すべての魚が生存可能な最大浸漬時間）は、シンナムアルデヒドで６０分間、ペリルアルデヒドで４５分間、ゲラニオールで７５分間であった。試験終了後は、全ての魚が麻酔された状態になるが、通常のタンクに戻したところ蘇生した。最終濃度５ｐｐｍでは、すべての魚が２時間の薬浴中に浸漬しても問題なく生存した。
【００５１】
これらと同じモノテルペンの仲間であるオイゲノールやカルバクロールを用いて、海水で麻酔を実施した場合、アメーバが減少することが報告されている。ただし、実験１のin vitroの実験では、オイゲノールやカルバクロールの抗アメーバ活性の最終濃度は２０ｐｐｍであった（データ未発表）。このことより、オイゲノールやカルバクロールより抗アメーバ活性が高く、同様な組織浸透性を持つ、上記３種類の物質は薬浴に最も優れた物質であることが期待できる。海水で薬浴を実施する場合は、最終濃度１０ｐｐｍであった場合、それぞれの物質について３０分間以内に抑えて実施することが望ましいことが確認された。また濃度を変えて検討する場合、最終濃度５ｐｐｍで６０分間以内に抑えて実施することが望ましい。万が一、魚が麻酔にかかった状態に陥った場合、即座に薬浴を中止し海水に戻すことで安全性が担保されるため、薬浴を即座に中止することにより即座に蘇生するため、本方法の安全性は極めて高いと思われる。
【００５２】
淡水を用いて調製した薬浴液についての検討結果を下記の表３に示す。
【００５３】
【表３】
2014133720.tif 000008
【００５４】
淡水での安全性については最終濃度１０ｐｐｍでの安全性は、シンナムアルデヒド６０分間、ペリルアルデヒド５０分間、ゲラニオール６５分間であった。海水を用いて調製した薬浴液の場合と同様、全ての魚が麻酔状態になったあと、通常のタンクに戻したところ即座に蘇生した。最終濃度５ｐｐｍの場合、全ての魚が２時間の薬浴後、問題なく生存した。
【００５５】
淡水での安全性も、海水とほとんど変わらなかった。このため、薬浴については、海水と同じ条件で実施することが可能である。これらの物質を投与することにより、淡水浴のみでは殺せなかった組織内のアメーバが殺せる可能性が高い。また、対応の難しいバイオフィルムにも対応できる可能性が高い。このため、淡水浴と併用しながら実施するとより高い治療効果が期待できる。
【００５６】
実施例３：飼料への添加によるエラ寄生アメーバの殺効果の検討
実施例２の薬浴でアメーバ対策を実施する以外に、これらの物質を餌に添加後、経口で投与することにより、アメーバの感染を防ぐ可能性が考えられる。この方法は、薬浴と比較して少ない労働力で実施でき魚への負担も少ないものと思われる。ただし、これらの物質の吸収、体内動態、代謝、排出について、魚類での報告は皆無であり、実際に魚を用いて評価を実施する以外方法はない。これらの物質を経口投与することにより、アメーバに感染した魚に対する治療効果を証明するためには、アメーバに感染しているサーモンにこれらの飼料を投与し、対照区と比較してアメーバの数が減少していれば効果が認められたことになる。
【００５７】
アメーバに感染した末期の感染魚を準備する。これらは、試験開始前に肉眼的にアメーバの感染を評価し、同程度のものを選択して使用する。これらの評価は、エラのアメーバによる炎症度合いを５段階に分類し、最も炎症が激しいものを使用した。最終濃度が２０００ｐｐｍになるように調整した飼料を２．５％／Ｋｇ・ＢＷの割合で、３日間サーモンに強制的に投与した（強制的に投与することにより、添加物の吸収、体内動態が確実に判定できる。）。３日後に、取り上げてエラのアメーバ寄生数を評価した。評価数は各３尾とした。
評価は、Philip らの方法（Int J Parasitol. 2005
Nov;35(13):1417-23. Epub 2005 Jul 18）に準拠して実施した。具体的には次のとおりである。
（１）すべてのエラを摘出した。
（２）５分間試験管の中に滅菌海水を入れゆっくり攪拌し、アメーバをエラから離した。
（３）シャーレに撒き２時間後、シャーレに付着したアメーバを計測する。
（４）計測方法は、１０〜３０の視野を確認しその平均を出した。
（５）対照区と比較してその効果を検証した。
【００５８】
各披検物質を経口で３日間投与後のアメーバの各視野の平均個数を下記の表４に示す。
【００５９】
【表４】
2014133720.tif 000009
【００６０】
何も投与しない対照区では、すべての実験に供された魚のエラから多数の寄生虫が分離され、シャーレ底面に付着し、すべての視野で５０以上のアメーバが確認できた。シンナムアルデヒドを投与した区の３尾では各視野でアメーバがほとんど認められない、もしくは２個から５個以内であった。ペリルアルデヒドを投与した区の３尾では各視野でアメーバがほとんど認められない、から１０個以内であった。ゲラニオールを投与した区の３尾では各視野でアメーバがほとんど認められない、から１０個以内であった。
これら３種類の披検物質を投与することにより、エラのアメーバの寄生数が減少した。
【００６１】
上記の結果より、これら３種類の化合物を経口投与することにより、アメーバ感染症が制されることが示唆された。このことは、これら３  種類の披検物質の経口投与により、確実に腸管内から吸収され、エラに分布し、排出され寄生虫を殺したことを示唆している。このため、経口投与によりアメーバ症を抑えることは可能だと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明により提供される魚類のアメーバ駆除方法、魚類のアメーバ駆除用薬浴液、魚類用のアメーバ駆除剤および飼料は、サーモン等の養殖魚のエラに寄生するアメーバの駆除等に利用可能である。