(57)【要約】【課題】新規慢性炎症抑制又は癌転移抑制剤の提供。【解決手段】本発明は、(2R,3R)-2-[[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-1-オキソ-2-プロペニル]オキシ]-3-ヒドロキシブタン二酸（カフタル酸）、(2R,3R)-2,3-ビス｛[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロプ-2-エノイル]オキシ｝ブタン二酸（シコル酸）、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロペン酸（カフェー酸）、2-[3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロイルオキシ]コハク酸（カフェオイルリンゴ酸）及び(1S,3R,4S,5R)-1,3,4,5-テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（キナ酸）から成る群から選択される１種又は２種以上の化合物又はその塩を含んで成る慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤、を提供する。【選択図】図１
2014091707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(2R,3R)-2-[[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-1-オキソ-2-プロペニル]オキシ]-3-ヒドロキシブタン二酸（カフタル酸）、(2R,3R)-2,3-ビス｛[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロプ-2-エノイル]オキシ｝ブタン二酸（シコル酸）、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロペン酸（カフェー酸）、2-[3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロイルオキシ]コハク酸（カフェオイルリンゴ酸）及び(1S,3R,4S,5R)-1,3,4,5-テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（キナ酸）から成る群から選択される１種又は２種以上の化合物又はその塩を含んで成る慢性炎症抑制剤。
【請求項２】
(2R,3R)-2-[[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-1-オキソ-2-プロペニル]オキシ]-3-ヒドロキシブタン二酸（カフタル酸）、(2R,3R)-2,3-ビス｛[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロプ-2-エノイル]オキシ｝ブタン二酸（シコル酸）、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロペン酸（カフェー酸）、2-[3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロイルオキシ]コハク酸（カフェオイルリンゴ酸）及び(1S,3R,4S,5R)-1,3,4,5-テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（キナ酸）から成る群から選択される１種又は２種以上の化合物又はその塩を含んで成る癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過剰増殖や乾癬においてアップレギュレーションされるタンパク質としてＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が知られている。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、２０を超えるメンバーから構成されるＥＦ−ハンドカルシウム結合Ｓ１００タンパク質ファミリーに属する（非特許文献１：Marenholz I et al., Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122）。どちらのタンパク質も好中球、活性化単球、およびマクロファージによって分泌され、それらの細胞の走化性分子として機能し、炎症性細胞の漸増に関する正のフィードバックループに関与する（非特許文献２：Roth J et al., Trends Immunol (2003) 24:155-158）。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９陽性免疫細胞は、炎症領域内に浸潤する最初の細胞である（非特許文献３：Odink K et al., Nature (1987) 330:80-82）。慢性関節リウマチ（非特許文献４：Liao H et al., Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803）、多発性硬化症（非特許文献５：Bogumil T et al., Neurosci Lett (1998) 247:195-197）、クローン病（非特許文献６：Lugering N, et al., Digestion (1995) 56:406-414）、および結合組織疾患（非特許文献７：Kuruto R, et al., J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653）を含む多数のヒト炎症性疾患で高いＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９血清レベルの上昇が観察されている。従って、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、炎症の誘導および慢性化に重要な役割を担うと考えられている。
【０００３】
上皮細胞中でＳ１００Ａ８と１００Ａ９が果たす生物学的機能について、本発明者は以前、外因性Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９が複合体（Ｓ１００Ａ８／Ａ９）（別名：カルプロテクチン）を形成することで正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を刺激して乾癬性病変などにおいて発現亢進される炎症性サイトカインを産生させ、さらにＳ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカインがＮＨＥＫ中でのＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生および分泌を刺激することを明らかにした（非特許文献８：J Cell Biochem. 2007 Nov 28, Epub ahead of print)。さらに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９自体がＮＨＥＫの増殖を増強することも見出した。これらの結果は、主要メディエーターとしてＳ１００Ａ８／Ａ９が関与するＮＨＥＫの増殖と炎症の正のフィードバック機構の存在を明らかにした。即ち、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が炎症性サイトカインの産生を誘導して炎症性疾患を惹起し、その炎症が細胞増殖を誘導し、さらには細胞増殖が炎症を誘導するといったスパイラルを形成し、増殖・炎症が連鎖する慢性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬などの原因となることが示唆された。
【０００４】
以前、本発明者らは、培養ケラチノサイトからＳ１００Ａ８及び／又はＡ９と結合するタンパク質を単離してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析にかけ、Ｓ１００Ａ９結合タンパク質を同定した結果、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、且つ膜貫通型の糖タンパク質であるエンプリン（Emmprin）(The extracellular matrix metalloproteinase inducer)（別名バシジン又はＣＤ１４７）がＳ１００Ａ９のレセプターであることを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2011-47932号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122
【非特許文献２】Trends Immunol (2003) 24:155-158
【非特許文献３】Nature (1987) 330:80-82
【非特許文献４】Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803
【非特許文献５】Neurosci Lett (1998) 247:195-197
【非特許文献６】Digestion (1995) 56:406-414
【非特許文献７】J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653
【非特許文献８】J Cell Biochem. (2008) 104:453-464
【非特許文献９】Nature Cell Biol. (2006) 8(12): 1369-1375
【非特許文献１０】Hum Genet (2002) 111:310-313
【非特許文献１１】Morrison TB et al., Biotechniques (1998) 24:954-958, 960, 962
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、エンプリンとＳ１００Ａ９との間の結合を阻害することで、慢性炎症の抑制、更には癌の転移を抑制することができるという自らの知見に基づき（特開2011-47932）、当該結合を阻害する物質をスクリーニングすることで本発明を完成させるに至った。
【０００９】
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）(2R,3R)-2-[[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-1-オキソ-2-プロペニル]オキシ]-3-ヒドロキシブタン二酸（カフタル酸）、(2R,3R)-2,3-ビス｛[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロプ-2-エノイル]オキシ｝ブタン二酸（シコル酸）、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロペン酸（カフェー酸）、2-[3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロイルオキシ]コハク酸（カフェオイルリンゴ酸）及び(1S,3R,4S,5R)-1,3,4,5-テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（キナ酸）から成る群から選択される１種又は２種以上の化合物又はその塩を含んで成る慢性炎症抑制剤。
（２）(2R,3R)-2-[[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-1-オキソ-2-プロペニル]オキシ]-3-ヒドロキシブタン二酸（カフタル酸）、(2R,3R)-2,3-ビス｛[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロプ-2-エノイル]オキシ｝ブタン二酸（シコル酸）、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロペン酸（カフェー酸）、2-[3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロイルオキシ]コハク酸（カフェオイルリンゴ酸）及び(1S,3R,4S,5R)-1,3,4,5-テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（キナ酸）から成る群から選択される１種又は２種以上の化合物又はその塩を含んで成る癌転移抑制剤。
【発明の効果】
【００１０】
エンプリンは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を誘導して癌の転移を誘導する。このように、エンプリンと悪性腫瘍との関係はよく知られている。また、Ｓ１００Ａ８／Ａ９についても、転移の好発部位は、癌細胞が出すＶＥＧＦ、ＴＮＦ等の因子などと反応して、Ｓ１００Ａ８／Ａ９を分泌し、これが癌細胞の転移を誘導することが知られている（非特許文献９：Nature Cell Biol. (2006) 8(12): 1369-1375）。本発明者らが培養ケラチノサイトおよびメラノーマ細胞（SK-MEL-2）をＳ１００Ａ８／Ａ９で刺激したところ、癌の浸潤に関与するＭＭＰは、当該刺激により発現が亢進されたものの、エンプリンをノックダウンした場合にはその発現が有意に抑制されることが確認された（結果は示さず）。従来、ＭＭＰの発現亢進はエンプリンの自己分泌ループによると考えられていたが、上記の結果は、ＭＭＰの発現はエンプリンのみでは亢進されず、Ｓ１００Ａ９刺激を経由することが必要であることを示している。
【００１１】
癌細胞の転移に関与しているエンプリンがＳ１００Ａ９のレセプターとして機能していることは、本発明者らによって初めて見出された。実際、エンプリンの発現を抑制することでＳ１００Ａ９によるサイトカインやＭＭＰの発現亢進は低下する。そのため、エンプリンとＳ１００Ａ９の関係を考慮すれば、癌の転移とその悪性度について新たな解釈が可能になる。更に、エンプリンは、Ｓ１００Ａ９と同様にアトピー性皮膚炎や乾癬の患者の表皮上層やメラノーマ細胞の表皮において発現していたため、両者はアトピー性皮膚炎、乾癬、癌等の慢性炎症にも関与している可能性が高い。従って、本発明によれば、エンプリンとＳ１００Ａ９との結合の阻害を指標とすることで、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の探索が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】種々の濃度のカフタル酸を添加した場合のELISA測定結果。
【図２】種々の濃度のシコル酸を添加した場合のELISA測定結果。
【図３】種々の濃度のカフェー酸を添加した場合のELISA測定結果。
【図４】種々の濃度のカフェオイルリンゴ酸を添加した場合のELISA測定結果。
【図５】種々の濃度のキナ酸を添加した場合のELISA測定結果。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の慢性炎症抑制剤及び癌転移抑制剤は、下記の化合物のうちの１種又は２種以上を有効成分とする：
【化１】
2014091707.tif 000003
(2R,3R)-2-[[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-1-オキソ-2-プロペニル]オキシ]-3-ヒドロキシブタン二酸（カフタル酸）；
【化２】
2014091707.tif 000004
(2R,3R)-2,3-ビス｛[(E)-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロプ-2-エノイル]オキシ｝ブタン二酸（シコル酸）；
【化３】
2014091707.tif 000005
3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロペン酸（カフェー酸）；
【化４】
2014091707.tif 000006
2-[3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロイルオキシ]コハク酸（カフェオイルリンゴ酸）；及び
【化５】
2014091707.tif 000007
(1S,3R,4S,5R)-1,3,4,5-テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（キナ酸）
【００１４】
上記化合物は、ＥＬＩＳＡ法に基づき、エンプリンとＳ１００Ａ９との結合における検量線を作製し、この結合を阻害する分子、すなわち吸光度を低下させる薬剤をスクリーニングする過程で選択された。本発明で使用される化合物は、無機塩又は有機塩であってもよい。その塩は特に限定されないが、例えば、無機塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。有機塩としては、酢酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、アミノ酸塩等が挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用する「慢性炎症」は、アトピー性皮膚炎、乾癬の他、癌なども包含する。また、本明細書で使用する「癌転移抑制」とは、癌細胞が原発巣である組織から、浸潤、血中およびリンパ管を通しての遊走、新たな組織への定着を経て、増殖を開始する過程のいずれかもしくは全てを抑制することを意味し、癌細胞の増殖抑制は異なる。
【００１６】
本発明の慢性炎症抑制剤は、Ｓ１００Ａ９に関連する慢性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬などの予防、治療といった改善等に有効な医薬品又は化粧品として利用できる。
【００１７】
本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤は、一種または二種以上の上記化合物を含んで成るものであるが、本発明の効果を損なわない範囲において、他の種々の成分を含有することができる。また、本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の慢性炎症抑制剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
【００１８】
本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の上記化合物の配合量は、用途に応じて適宜決定できる。
【００１９】
また、慢性炎症抑制剤中又は癌転移抑制剤中には、上記薬剤以外に、例えば、通常の食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２０】
さらに、本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
【００２１】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
エンプリン細胞外ドメインへのＳ１００Ａ９タンパク質の結合を阻害する薬剤のスクリーニング
１）リコンビナントＳ１００Ａ９の調製とビオチン化：
ヒトＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９をＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で産生させ、グルタチオン共有結合担体によるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。その後、ＧＳＴを切断・除去した。精製したＳ１００Ａ９タンパク質のビオチン化については次の方法をとる。各精製タンパク質濃度に対して３倍モル量の Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu (Dojindo社) を混合した。室温で 2 時間反応させた後に Nap-5 (GE Healthcare社) により未反応のビオチン化試薬を除いた。
【００２３】
２）エンプリン細胞外ドメインへのＳ１００Ａ９タンパク質の結合を阻害する薬剤のスクリーニング：
リコンビナントエンプリン細胞外ドメイン（signal peptideの後から、transmembrane domainの前に相当）を96 well プレート (Pierce社)４℃で一晩インキュベートしウェル上に結合させた。0.1%Tween20（PBS-T）を含むPBSでウェルを洗浄後、非特異的吸着を抑えるため、各ウェルはブロッキングのために5%BSAを含むPBS中でインキュベートとした。次に試験する薬剤（10、20又は40μg/ml又は5、10又は20μg/ml；対照としては、溶媒のみ（0μg/ml））をウェル内に添加して室温（３７℃）で 1 時間インキュベートした。ウェルをPBS-Tで洗浄後、抗S100A9抗体（PBS中1:2000の比率で希釈したもの）を添加し、当該抗体と結合したS100A9をHRP標識した抗 S100A9抗体（PBS中1:2000の比率で希釈したもの）を同ウェル内に添加して反応させた。３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン(TMB)−ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定（EIA）−基質−キット（BioRad Laboratories）で発色させ、そして0.1Mスルホン酸で反応を停止した後、ELISAリーダーで吸光度 (O.D.450 nm)を測定した。リコンビナントS100A9w（エンプリンの全長配列）を用い、上記と同様の手順により予め作成しておいた検量線に基づき、吸光度が有意に低下したものをエンプリンとS100A9タンパク質との間の結合を阻害する薬剤として評価した。
【００２４】
種々の化合物を上記スクリーニング方法にかけたところ、カフタル酸（図１）、シコル酸（図２）、カフェー酸（図３）、カフェオイルリンゴ酸（図４）及びキナ酸（図５）はコントロールよりも有意にエンプリンとS100A9との結合を阻害することが明らかとなった。中でも、カフタル酸とシコル酸はエンプリンとS100A9との結合阻害が顕著であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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