(57)【要約】【課題】従来の薬剤とは異なる作用機序によって、認知機能の改善をもたらす薬剤及びその用途を提供することを課題とする。【解決手段】（１）インスリン様成長因子２タンパク質又は（２）インスリン様成長因子２遺伝子を保持する発現ベクターを有効成分として含む、神経幹細胞の増殖促進剤が提供される。また、当該増殖促進剤を含む認知障害用医薬が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）を有効成分として含む、神経幹細胞の増殖促進剤：
（１）インスリン様成長因子２タンパク質；
（２）インスリン様成長因子２遺伝子を保持する発現ベクター。
【請求項２】
インスリン様成長因子２タンパク質が、配列番号１〜７のいずれかに示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に等価なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の増殖促進剤。
【請求項３】
インスリン様成長因子２遺伝子が、配列番号８〜１０のいずれかに示す塩基配列又は該塩基配列に等価な塩基配列を含む、請求項１に記載の増殖促進剤。
【請求項４】
前記神経幹細胞が、増殖障害を受けている細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項５】
前記増殖障害が認知機能障害の原因となる、請求項４に記載の増殖促進剤。
【請求項６】
前記認知機能障害が、染色体22q11.2領域の微細欠失に伴うものである、請求項５に記載の増殖促進剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の増殖促進剤を含む、認知機能障害に対する医薬。
【請求項８】
統合失調症の治療用である、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
認知機能障害の患者に対して、以下の（１）又は（２）を有効成分として含む医薬を投与するステップを含む、認知機能障害の治療法：
（１）インスリン様成長因子２タンパク質；
（２）インスリン様成長因子２遺伝子を保持する発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経幹細胞の増殖促進剤及びその用途に関する。本発明の増殖促進剤は、例えば、認知機能障害の改善に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
認知機能（知覚、記憶、学習、思考、判断）が障害されると日常生活や社会活動に支障を来す。認知機能障害は認知症の患者はもとより、統合失調症の患者にも認められる症状の一つである。近年、社会構造の高齢会、複雑化により認知症や統合失調症などの精神疾患患者が増加しており、社会の活力の維持にとっても認知機能の改善は重要な課題である。
【０００３】
認知症は神経細胞の変性や細胞死を伴う不可逆的で進行性の難病である。脳血管障害やアルツハイマー病或いは加齢などが認知症の原因として考えられているが、発症機構の詳細は分かっていない。統合失調症についてもドーパミン仮説、グルタミン酸仮説などが提唱されているものの、基本的にその発症機構はよく分かっていない。尚、認知症の治療薬としてはアセチルコリンエステラーゼ阻害薬が使用されている。他方、統合失調症に対してはセロトニン・ドーパミン拮抗薬が使用されることが多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gage FH (2000) Mammalian neural stem cells. Science 287:1433-1438.
【非特許文献２】Zhao C, Deng W, Gage FH (2008) Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell 132:645-660.
【非特許文献３】Ming GL, Song H (2011) Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron 70:687-702.
【非特許文献４】Reif A, Fritzen S, Finger M, Strobel A, Lauer M, Schmitt A, Lesch KP (2006) Neural stem cell proliferation is decreased in schizophrenia, but not in depression. Mol Psychiatry 11:514-522.
【非特許文献５】Mao Y, Ge X, Frank CL, Madison JM, Koehler AN, Doud MK, Tassa C, Berry EM, Soda T, Singh KK, Biechele T, Petryshen TL, Moon RT, Haggarty SJ, Tsai LH (2009) Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell 136:1017-1031.
【非特許文献６】Guo W, Allan AM, Zong R, Zhang L, Johnson EB, Schaller EG, Murthy AC, Goggin SL, Eisch AJ, Oostra BA, Nelson DL, Jin P, Zhao X (2011) Ablation of Fmrp in adult neural stem cells disrupts hippocampus-dependent learning. Nat Med 17:559-565.
【非特許文献７】Botto LD, May K, Fernhoff PM, Correa A, Coleman K, Rasmussen SA, Merritt RK, O'Leary LA, Wong LY, Elixson EM, Mahle WT, Campbell RM (2003) A population-based study of the 22q11.2 deletion: phenotype, incidence, and contribution to major birth defects in the population. Pediatrics 112:101-107.
【非特許文献８】DiGeorge A (1965) A new concept of the cellular basis of immunity. Disabil Rehabil 67:907-908.
【非特許文献９】Shprintzen RJ, Goldberg RB, Lewin ML, Sidoti EJ, Berkman MD, Argamaso RV, Young D (1978) A new syndrome involving cleft palate, cardiac anomalies, typical facies, and learning disabilities: velo-cardio-facial syndrome. Cleft Palate J 15:56-62.
【非特許文献１０】Pulver AE, Nestadt G, Goldberg R, Shprintzen RJ, Lamacz M, Wolyniec PS, Morrow B, Karayiorgou M, Antonarakis SE, Housman D, et al. (1994) Psychotic illness in patients diagnosed with velo-cardio-facial syndrome and their relatives. J Nerv Ment Dis 182:476-478.
【非特許文献１１】Murphy KC, Jones LA, Owen MJ (1999) High rates of schizophrenia in adults with velo-cardio-facial syndrome. Arch Gen Psychiatry 56:940-945.
【非特許文献１２】Vorstman JA, Morcus ME, Duijff SN, Klaassen PW, Heineman-de Boer JA, Beemer FA, Swaab H, Kahn RS, van Engeland H (2006) The 22q11.2 deletion in children: high rate of autistic disorders and early onset of psychotic symptoms. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 45:1104-1113.
【非特許文献１３】Antshel KM, Aneja A, Strunge L, Peebles J, Fremont WP, Stallone K, Abdulsabur N, Higgins AM, Shprintzen RJ, Kates WR (2007) Autistic spectrum disorders in velo-cardio facial syndrome (22q11.2 deletion). J Autism Dev Disord 37:1776-1786.
【非特許文献１４】Karayiorgou M, Simon TJ, Gogos JA (2010) 22q11.2 microdeletions: linking DNA structural variation to brain dysfunction and schizophrenia. Nat Rev Neurosci 11:402-416.
【非特許文献１５】Kim VN (2005) MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nat Rev Mol Cell Biol 6:376-385.
【非特許文献１６】Stark KL, Xu B, Bagchi A, Lai WS, Liu H, Hsu R, Wan X, Pavlidis P, Mills AA, Karayiorgou M, Gogos JA (2008) Altered brain microRNA biogenesis contributes to phenotypic deficits in a 22q11-deletion mouse model. Nat Genet 40:751-760.
【非特許文献１７】Chen DY, Stern SA, Garcia-Osta A, Saunier-Rebori B, Pollonini G, Bambah-Mukku D, Blitzer RD, Alberini CM (2011) A critical role for IGF-II in memory consolidation and enhancement. Nature 469:491-497.
【非特許文献１８】Agis-Balboa RC, Arcos-Diaz D, Wittnam J, Govindarajan N, Blom K, Burkhardt S, Haladyniak U, Agbemenyah HY, Zovoilis A, Salinas-Riester G, Opitz L, Sananbenesi F, Fischer A (2011) A hippocampal insulin-growth factor 2 pathway regulates the extinction of fear memories. EMBO J 30:4071-4083.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
認知症や統合失調症の治療に用いられている薬剤（アセチルコリンエステラーゼ、セロトニン・ドーパミン拮抗薬等）は神経情報伝達物質又はその受容体を標的としたものであり、一時的な対処薬に過ぎず、認知機能の改善効果はあまり期待できない。即ち、認知機能の改善に特効的技術は存在しないのが現状である。そこで本発明は、従来の薬剤とは異なる作用機序によって認知機能の改善をもたらす薬剤及びその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
成体ほ乳類の脳では、脳室下帯（SVZ）及び海馬歯状回顆粒細胞下層（SGZ）という二つの領域において、神経新生が一生涯を通じておきている（非特許文献１〜３）。近年の研究から、海馬における新生神経細胞は既存の神経回路とネットワークを構築し、機能的な情報を受けることができることが明らかになった（非特許文献３）。また、海馬における成体神経新生の異常は学習の異常や統合失調症、脆弱性X症候群といった神経疾患および精神疾患に関係することが示唆されている（非特許文献４〜６）。しかし、神経疾患の原因遺伝子の多くは成体の神経新生を制御することが明らかになったものの、精神・神経疾患の発症をもたらす分子機構は良くわかっていない。
【０００７】
染色体22q11.2領域は染色体の微小欠損症に関与する領域として最も一般的である。2,000〜4,000人に１人の確率で当該領域の微小欠損に伴う発症が認められる（非特許文献７）。この領域の片アレルの欠失は、いくつかの臨床所見を示すが、一番良く知られているものはDiGeroge症候群（非特許文献８）と口蓋心臓顔面症候群（非特許文献９）である。また、この22q11.2領域に欠失を持つ患者は高い確率で認知機能障害（非特許文献１０、１１）や行動学的異常（非特許文献１２、１３）を示すことが知られている。実際、統合失調症、自閉症などの精神疾患を引き起こす、最も重要な危険因子の一つとしてこの領域が認識されている。これまでのところ、28個の遺伝子が22q11.2領域に存在し、発症に関与することが示唆されている（非特許文献１４）。中でもDGCR8遺伝子はmiRNAの生合成において非常に重要な役割を担っていることが示されている（非特許文献１５）。それゆえ、脳におけるmiRNAの発現異常が22q11.2欠失症候群の発症に関与していることが疑われている。マウスを用いた過去の解析により、Dgcr8遺伝子のへテロ欠損はシナプスと樹状突起の発生に影響することで統合失調症様の症状を発症させることが示唆された（非特許文献１６）。しかし、統合失調症の発症の分子機構、及び海馬における神経新生の関与については不明である。
【０００８】
以上の状況下、本発明者らは統合失調症の発症機構の解明を目指し、統合失調症の発症過程における成体神経新生の関与ないし役割に注目して研究を進めた。まず、独自に樹立した統合失調症モデルマウス（Dgcr8遺伝子がヘテロに欠損したマウス）の海馬歯状回における神経新生の状態を解析した。その結果、興味深いことに当該マウスでは成体神経幹細胞の増殖が低下するとともに、神経新生も低下していた。また、当該マウスは空間作業記憶及び社会的行動の異常を呈することが判明した。そして、これらの障害の原因遺伝子を同定すべく、海馬における遺伝子発現プロファイルを解析した結果、驚くべきことに、複数の遺伝子に関して、統合失調症患者と同様の発現レベルの低下を認め、当該マウスが統合失調症の疾患モデルとして極めて有用であることが明らかとなった。この知見を得た後、発現レベルの低下を認めた遺伝子の一つであるインスリン様成長因子２遺伝子に着目して各種実験を行ったところ、インスリン様成長因子２の投与が成体神経幹細胞の増殖を促し、神経前駆細胞と未熟神経細胞が増加することが明らかとなった。また、インスリン様成長因子２の投与によって、上記マウスに認められる、神経幹細胞の増殖障害に起因する海馬依存的空間作業記憶の異常が改善した。この事実は特に重要であり、注目に値する。
【０００９】
ところで、インスリン様成長因子２に関しては、記憶の保持に有効であることを示唆する報告（非特許文献１７）があるが、疾患モデルではない動物（ラット）を用いた研究に関するものであり、障害状態において実際に効果を示すか否かは不明である。また、当該報告でのインスリン様成長因子２の作用機序（記憶の保持を増強し、代理記憶を促進し、そしてシナプスにおけるGSK3βの活性を介してGluR1の発現を短期で増強することで、記憶を忘れる事を抑制する）は、増殖障害を受けている神経幹細胞の増殖を促すという、本発明者らが見出した作用機序と異なる。従って、本発明者らが明らかにした事実、即ち、インスリン様成長因子２が神経幹細胞の増殖促進作用を有し、神経幹細胞の減少に伴う記憶障害に対して有効であることを当該報告は示唆するものではない。一方、マウスを用いた実験において、インスリン様成長因子２のシグナルの活性化を介した新生神経細胞の生存促進作用が恐怖記憶の消去に重要であることが示されているが（非特許文献１８）、上掲の報告と同様に、本発明者らが見出した作用機序を示唆するものではない。
【００１０】
以下に示す発明は、以上の成果及び考察に基づく。
［１］以下の（１）又は（２）を有効成分として含む、神経幹細胞の増殖促進剤：
（１）インスリン様成長因子２タンパク質；
（２）インスリン様成長因子２遺伝子を保持する発現ベクター。
［２］インスリン様成長因子２タンパク質が、配列番号１〜７のいずれかに示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に等価なアミノ酸配列を含む、［１］に記載の増殖促進剤。
［３］インスリン様成長因子２遺伝子が、配列番号８〜１０のいずれかに示す塩基配列又は該塩基配列に等価な塩基配列を含む、［１］に記載の増殖促進剤。
［４］前記神経幹細胞が、増殖障害を受けている細胞である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
［５］前記増殖障害が認知機能障害の原因となる、［４］に記載の増殖促進剤。
［６］前記認知機能障害が、染色体22q11.2領域の微細欠失に伴うものである、［５］に記載の増殖促進剤。
［７］［１］〜［６］のいずれか一項に記載の増殖促進剤を含む、認知機能障害に対する医薬。
［８］統合失調症の治療用である、［７］に記載の医薬。
［９］認知機能障害の患者に対して、以下の（１）又は（２）を有効成分として含む医薬を投与するステップを含む、認知機能障害の治療法：
（１）インスリン様成長因子２タンパク質；
（２）インスリン様成長因子２遺伝子を保持する発現ベクター。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Dgcr8+/-マウスの作製及び行動解析。A. マウス海馬歯状回におけるDgcr8の発現解析結果。脳切片に対して抗Dgcr8抗体にて染色を行った。細胞核はDAPIにて染色を行った。 B. Dgcr8遺伝子の構造とエクソン８と９の間のイントロンジーントラップの模式図。矢頭はジェノタイピングに使用したPCRプライマーの位置を示す。C. 標的アレルをPCRジェノタイピングで確認した。ゲノムDNAサンプルをDgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスから抽出し、Aに示したプライマーでPCRを行った。D. ２ヶ月齢マウスの海馬において野生型Dgcr8 mRNAが減少することを示す定量RT-PCR解析の結果(n=4)。E. ウエスタンブロット解析の結果。上段はDgcr8+/-マウス脳における120 kDa 野生型Dgcr8(下側の矢頭)タンパク質と、予想される220 kDaキメラタンパク質(上側の矢頭)の産生を示す。下段はアクチンタンパク質の量を示す。F. 雄Dgcr8+/-マウスの海馬におけるmiRNAの発現プロファイル。階層的にクラスター化したヒートマップによってDgcr8+/-マウスの海馬におけるmiRNAの発現量の相違を表した。相対発現レベルを薄い灰色（低い）〜濃い灰色（高い）で示した。G. ２ヶ月齢Dgcr8+/-マウスの海馬における成熟miRNAの定量RT-PCR解析の結果(n=3〜4)。
【図２】Dgcr8+/-マウスの行動解析。A, B. ２ヶ月齢Dgcr8+/-マウスの記憶機能をY字迷路テストによる自発的交替行動率で評価した。Dgcr8+/-マウスでは(雄,n=10; 雌, n=5)空間作業記憶がDgcr8+/+マウス(雄, n=9; 雌, n=5)に比較して有意に障害されていた(**p＜0.01雄Dgcr8+/- vs雄Dgcr8+/+,両側t検定,n=9-10; 平均値±標準誤差)。C.モリス水迷路テストによる空間作業記憶の解析結果。Dgcr8+/-はDgcr8+/+と比較して、標的四分画を占有時間が低下する傾向が示された(*p＜0.05 Dgcr8+/+TQとDgcr8+/-TQ,両側t検定,n=8-9,平均値±標準誤差;*p＜0.05 Dgcr8+/+TQとDgcr8+/-OP, 両側t検定,n=8-9,平均値±標準誤差)。 Dgcr8+/+,n=9;Dgcr8+/-,n=8;４分画名,target(TQ),adjacent left(AL),opposite(OP),adjacent right(AR) D, 強制水泳テストでの静止時間。E, F. 巣作り行動の異常。Dgcr8+/-マウスのケージとDgcr8+/+のケージの代表例。矢頭は巣を示す。G-J. Dgcr8+/-マウス及び野生型コントロールマウスのオープンフィールドにおける探索行動。Dgcr8+/-マウス(n=10)とDgcr8+/+マウス(n=13)の間で、総行動距離及び中心領域での滞在時間に有意差は認められない。
【図３】２ヶ月齢及び７ヶ月齢Dgcr8+/-マウス脳の形態学的解析。A-D. ２ヶ月齢及び７ヶ月齢Dgcr8+/-マウスの脳のヘマトキシリン・エオシン染色。側脳室の脳冠状断面(A, C)及び海馬領域(B, D)を示した。E, F. Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの顆粒細胞層(GCL)の平均厚。各群３〜４匹、一匹当たり少なくとも１０切片を用いて定量した。スケールバーは500μm。
【図４】Dgcr8欠損は成体歯状回における神経幹細胞の増殖に影響する。A. ２ヶ月齢Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの脳における神経幹細胞及び神経前駆細胞の免疫局在。脳切片を抗BrdU抗体、抗Ki67抗体、抗Sox2抗体、抗Nestin抗体、抗Gfap抗体及び抗Dcx抗体で染色した(矢頭)。Dgcr8+/-マウスでは、Dgcr8+/+マウスに比較して、Sox2陽性細胞、Gfap陽性細胞、nestin陽性細胞及びDcx陽性細胞が減少している。核をDAPIで染色した。スケールバーは50μm。B, C, D. SGZにおけるBrdU、Ki67又はSox2陽性細胞の数が減少することを示す定量解析の結果。各群３〜４匹、１匹当たり１０切片を定量解析に供した(*p＜0.05, **p＜0.01 Dgcr8+/- vs Dgcr8+/+,両側t検定,n=3-4; 平均値±標準誤差)。E. Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの成体海馬由来のニューロスフィアの培養。上段: bFGF及びEGFの存在下での培養で形成された成体海馬ニューロスフィアの明視野イメージ。Dgcr8+/-由来ニューロスフィアのサイズが減少した。下段:ニューロスフィアでのSox2の発現を示す免疫蛍光顕微鏡像。核をDAPIで染色した。スケールバーは100μm。F. Dgcr8+/-マウス(n=4)では、Dgcr8+/+マウス(n=5)に比較して、ニューロスフィア(20μm以上)の数が有意に減少している(*p＜0.05 Dgcr8+/- vs Dgcr8+/+,両側t検定,n=4-5; 平均値±標準誤差)。
【図５】Dgcr8の欠損は成体腹側両面SVZにおける神経幹細胞の増殖に影響しない。A. ２ヶ月齢Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの脳における神経幹細胞及び神経前駆細胞の免疫局在。脳切片を抗BrdU抗体、抗Nestin抗体及び抗Gfap抗体で染色した(矢頭)。核をDAPIで染色した。スケールバーは50μm。B. 腹側両面SVZにおけるBrdU陽性細胞の定量解析。各群５匹、１匹当たり５枚の２０倍の顕微鏡写真を撮影し、定量解析に用いた。C. Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの成体SVZ由来のニューロスフィアの培養。上段: bFGF及びEGFの存在下での培養で形成された成体SVZニューロスフィアの明視野イメージ。Dgcr8の欠損はスフィアサイズに影響しない。下段:ニューロスフィアでのSox2の発現を示す免疫蛍光顕微鏡像。核をDAPIで染色した。スケールバーは100μm。D. Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウス（各群、n=3）の成体SVZ由来のニューロスフィアの数及びサイズの定量解析。Dgcr8の欠損はニューロスフィアの数及びサイズに影響しない。
【図６】Dgcr8+/-マウスにおける、海馬歯状回の成体神経新生の低下。A.２ヶ月齢Dgcr8+/+マウス及びDgcr8+/-マウスの脳における成熟ニューロンの免疫局在。脳切片を抗NeuN抗体および抗Calbindin抗体で染色した。核をDAPIで染色した。左から２、４番目のパネルに拡大像を示す。B. Dgcr8+/+マウス及びDgcr8+/-マウスの海馬歯状回での神経新生を評価するための実験スキーム。C. Dgcr8+/+マウス及びDgcr8+/-マウスの海馬歯状回でのBrdU及びNeuN免疫染色細胞の免疫局在。矢頭はBrdU(+)/NeuN(+)細胞を示す。核をDAPIで染色した。D. Dgcr8+/-マウスの海馬歯状回における総BrdUおよびBrdU/NeuN共陽性細胞の定量解析の結果。各群３匹、１匹当たり１０枚の２０倍の顕微鏡写真を撮影し、定量解析に用いた。Dgcr8+/-マウスの海馬では総BrdUおよびBrdU/NeuN共陽性細胞の数が減少していた（**p＜0.01 Dgcr8+/- vs Dgcr8+/+,両側t検定,n=3; 平均値±標準誤差）。E. Dgcr8+/-マウスの海馬におけるBrdU/NeuN共陽性細胞の神経分化した細胞の割合は影響を受けないことを示す定量解析の結果。スケールバーは50μm。
【図７】Dgcr8+/-マウスの海馬において過剰のアポトーシスは認められない。成体（２ヶ月齢又は７ヶ月齢）Dgcr8+/+ マウス及びDgcr8+/-マウスの脳(n=6〜8)について、活性型カスパーゼ３の免疫染色(A, C: 緑色、白色の矢頭)又はDNAの断片化(B, D: TUNEL)によって、アポトーシスが生じた細胞をin situで検出した。核をDAPIで染色した。スケールバーは50μm。
【図８】Dgcr8+/-マウス海馬のマイクロアレイ解析による、22q11.2欠失型関連統合失調症の原因遺伝子の同定。２ヶ月齢の雄Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの海馬から単離したmRNAを用い、マイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った。A. Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウス海馬のcDNAマイクロアレイデータの階層的クラスターを示すヒートマップ。赤及び緑の四角は、平均よりも発現レベルが高いこと及び低いことをそれぞれ示す。黒の四角は平均発現レベルを示す。B. マイクロアレイ解析の結果から得られた、22q11欠失型関連統合失調症の候補遺伝子を示す散布図。C. 定量PCR解析の結果。Dgcr8+/-マウス海馬ではAce遺伝子、Klotho遺伝子、Ttr遺伝子、Sulf1遺伝子、Htr2c遺伝子、Igf2遺伝子及びOtx2遺伝子の発現が有意に低下している(***p＜0.001 Dgcr8+/- vs Dgcr8+/+,両側t検定,n=4; 平均値±標準誤差)。D. ウエスタンブロット解析によるDgcr8+/+およびDgcr8+/-マウス海馬におけるIgf2の発現解析の結果。上段はDgcr8+/-マウス脳においてIGF2タンパク質の産生が低下していることを示す。下段はアクチンタンパク質の量に変化が無いことを示す。
【図９】Igf2はDgcr8+/-マウスの神経前駆細胞をin vitroとin vivoの両方において増加させるとともに、Dgcr8+/-マウス海馬依存性空間作業記憶の異常を回復させる。A. 所定の条件下の培養で形成されたニューロスフィアの明視野像。Dgcr8+/+マウス及びDgcr8+/-マウスの海馬由来のニューロスフィアを、Igf2の存在下及び非存在下、無血清培地で培養した。Igf2刺激によってニューロスフィアのサイズが増大した。B. 各条件でのスフィア形成前駆細胞数の定量(各条件n=3)。Igf2の海馬内投与によってSGZにおける神経前駆細胞の数がin vivoで増大した(C-E)。Igf2刺激によってニューロスフィアの数が増大した。C. SGZにおけるSox2/Ki67共陽性細胞の局在。Dgcr8+/-マウス脳におけるSox2/Ki67 共陽性細胞の数がIgf2投与で増加した。スケールバーは50μm。D. SGZにおけるSox2/Ki67共陽性細胞数の定量。各群３匹、１匹当たり５切片を用いて定量した。Dgcr8+/-マウス脳におけるSox2/Ki67共陽性細胞の数はIgf2の投与により有意に増加した。E. SGZにおけるDcx免疫染色細胞の局在。Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの両方において、Dcx陽性細胞の数がIgf2刺激で増加した。スケールバーは50μm。F. SGZにおけるDcx陽性細胞数の定量。各群３匹、１匹当たり５切片を用いて定量した。Dgcr8+/-マウス脳におけるDcx陽性細胞の数はIgf2の投与により有意に増加した。G. SGZにおける、BrdU及びNeuN免疫染色細胞の局在。Dgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの両方において、BrdU/NeuN共陽性細胞の数がIgf2刺激で増加した。スケールバーは50μm。H. SGZにおける、BrdU及びNeuN陽性細胞数の定量。各群３匹、１匹当たり５切片を用いて定量した。Dgcr8+/-マウス脳におけるBrdU/NeuN共陽性細胞の数はIgf2の投与により有意に増加した。
【図１０】Y字迷路テストを用いた自発的交替行動率で評価した空間作業記憶。PBS又はIgf2の海馬内投与から１週後、２週後、３週後及び４週後に自発的交替行動Y字迷路試験を行った結果(A: Dgcr8+/+, B: Dgcr8+/-)、Dgcr8+/-マウスではIgf2の海馬内投与によって空間作業記憶の異常が有意に回復した(n=5-7)。探索行動を反映する総アーム入室数は群間で差は認められない(C)。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の局面は神経幹細胞の増殖促進剤に関する。本発明の増殖促進剤の標的は、好ましくは中枢神経系の神経幹細胞であり、更に好ましくは、記憶や空間学習能力に関わる領域である海馬に存在する神経幹細胞である。
【００１３】
本発明の増殖促進剤は、増殖障害を受けている神経幹細胞に対して有効に作用する。「増殖障害を受けている」とは、正常な増殖能（健常脳における機能の維持に必要な増殖能）が欠失又は低下した状態をいい、その原因は特に問わない。典型的には、記憶ないし認知機能障害に伴い或いは起因して増殖障害を受けている神経幹細胞が、本発明の増殖促進剤の標的となる。様々な原因によって記憶ないし認知機能障害が生じ得る。当該障害の原因の一つとして染色体22q11.2領域の微細欠失を挙げることができる。染色体22q11.2領域の微細欠失はDiGeorge症候群を引き起こすことが知られている。
【００１４】
本発明の増殖促進剤は、有効成分として（１）インスリン様成長因子２タンパク質又は（２）インスリン様成長因子２遺伝子を保持する発現ベクターを含む。尚、本発明の増殖促進剤は通常（１）と（２）のいずれかのみを含むが、これら両者を含むことを妨げるものではない。
【００１５】
（１）インスリン様成長因子２タンパク質
インスリン様成長因子２（以下、略称「IGF2」を使用する）は、インスリン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。生体内においてIGF2は前駆体の状態で産生され、インスリンと同様にプロセシングを受け、成熟体となる。本発明の一態様では、ヒトIGF2の成熟体（配列番号１、GenPept(NCBI), DEFINITION: RecName: Full=Insulin-like growth factor II; Short=IGF-II; AltName: Full=Somatomedin-A; Contains: RecName: Full=Insulin-like growth factor II; Contains: RecName: Full=Insulin-like growth factor II Ala-25 Del; Contains: RecName: Full=Preptin; Flags: Precursor. ACCESSION: P01344, Region 25..91）を有効成分として用いる。別の態様では、当該成熟体の配列を内包し、生体内で成熟体を生成し得る前駆体等を有効成分として用いる。ここでの前駆体等の例を配列番号２（GenPept(NCBI), DEFINITION: insulin-like growth factor II [Homo sapiens]. ACCESSION: AAA60088）、配列番号３（GenPept(NCBI), DEFINITION: insulin-like growth factor II isoform 2 [Homo sapiens]. ACCESSION: NP_001121070）、配列番号４（GenPept(NCBI), DEFINITION  insulin-like growth factor II transcript variant 3 isoform 1, partial [Homo sapiens]. ACCESSION: ADO21455）、配列番号５（GenPept(NCBI), DEFINITION: insulin-like growth factor II transcript variant 3 isoform 2, partial [Homo sapiens]. ACCESSION: ADO21454）、配列番号６（GenPept(NCBI), DEFINITION  preproinsulin-like growth factor II, domains A-E [Homo sapiens]. ACCESSION: AAA52443）、配列番号７（GenPept(NCBI), DEFINITION  insulin-like growth factor 2 [Homo sapiens]. ACCESSION: ACC95538）に示す。尚、IGF2には、120番アミノ酸K（リシン）のN（アスパラギン）への置換、173番アミノ酸のP（プロリン）のQ（グルタミン）への置換、180番アミノ酸K（リシン）のN（アスパラギン）への置換等の天然バリアントの存在も知られており、これらバリアントをIGF2タンパク質として用いることにしてもよい。
【００１６】
上記の各タンパク質（配列番号１〜７）のアミノ酸配列に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドをIGF2タンパク質として用いることもできる。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、基準となるアミノ酸配列（配列番号１〜７のいずれか）と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（神経幹細胞の増殖促進に対して有効な作用）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。従って、基準となるアミノ酸配列（配列番号１〜７のいずれか）と、それに等価なアミノ酸配列との間には機能的に実質的な同一性が認められる。機能的に実質的な同一性の有無を判定するためには、例えば、後述の実施例に記載した実験系（疾患モデルによる評価）を用い、神経幹細胞の増殖促進に対する作用・効果の点において二つのアミノ酸配列の間に実質的な差がないことを確認すればよい。
【００１７】
「アミノ酸配列の一部で相違する」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違は上記機能の大幅な低下がない限り許容される。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち等価アミノ酸配列は、基準となるアミノ酸配列と例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の配列同一性を有する。
【００１８】
基準となるアミノ酸配列と等価アミノ酸配列との間の相違が保存的アミノ酸置換基によって生じていることが好ましい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００１９】
ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の配列同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。配列同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、配列同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
【００２０】
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore=100、wordlength=12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。基準となるアミノ酸配列に等価なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore=50、wordlength=3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくは例えばNCBIのウェブページを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
【００２１】
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
【００２２】
IGF2タンパク質は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にして、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる。例えば、IGF2タンパク質をコードするDNAで適当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母、哺乳動物細胞等）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質としてIGF2タンパク質を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、IGF2タンパク質をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなるIGF2タンパク質を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００２３】
質的均一性及び純度の面などから、IGF2タンパク質を遺伝子工学的手法によって調製することが好ましい。しかしながら、IGF2タンパク質の調製法は遺伝子工学的手法によるものに限られない。例えば、天然材料から標準的な手法（破砕、抽出、精製など）によってIGF2タンパク質を調製することもできる。
【００２４】
（２）IGF2遺伝子を保持する発現ベクター
本発明の一態様では、IGF2遺伝子を保持する発現ベクターを有効成分とする。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。本発明に係る発現ベクターでは、IGF2遺伝子が発現可能に保持されることになる。IGF2遺伝子を標的細胞に導入し、標的細胞内で発現させることが可能である限り、ベクターの種類は特に限定されない。ここでの「ベクター」にはウイルスベクター及び非ウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、ウイルスが細胞へと感染する現象を巧みに利用するものであり、高い遺伝子導入効率が得られる。ウイルスベクターとしてアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が開発されている。
【００２５】
非ウイルスベクターとしてリポソーム、正電荷型リポソーム（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、HVJ(Hemagglutinating virus of Japan)-リポソーム（Dzau, V.J., Mann, M., Morishita, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:11421-11425, 1996、Kaneda, Y., Saeki, Y. & Morishita, R., Molecular Med. Today, 5:298-303, 1999）等が開発されている。本発明における発現ベクターをこのような非ウイルス性ベクターとして構築してもよい。また、YACベクター、BACベクター等を利用することにしてもよい。
【００２６】
アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターではベクターに組み込んだ外来遺伝子が宿主染色体へと組み込まれ、安定かつ長期的な発現が期待できる。レトロウイルスベクターの場合はウイルスゲノムの宿主染色体への組み込みには細胞の分裂が必要であることから非分裂細胞への遺伝子導入には適さない。一方、レンチウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターは非分裂細胞においても感染後に外来遺伝子の宿主染色体への組み込みが生ずる。従って、これらのベクターは非分裂細胞において安定かつ長期的に外来遺伝子を発現させるために有効である。
【００２７】
各ウイルスベクターは既報の方法に従い又は市販される専用のキットを用いて作製することができる。例えば、アデノウイルスベクターの作製はCOS-TPC法や完全長DNA導入法などで行うことができる。COS-TPC法は、目的のcDNA又は発現カセットを組み込んだ組換えコスミドと、親ウイルスDNA-末端タンパク質複合体（DNA-TPC）を293細胞に同時トランスフェクションし、293細胞内でおこる相同組換えを利用して組換えアデノウイルスを作製する方法である（Miyake,S., Makimura,M., Kanegae,Y., Harada,S., Takamori,K., Tokuda,C., and Saito,I. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1320.）。一方、完全長DNA導入法は、目的の遺伝子を挿入した組換えコスミドを制限消化処理した後、293細胞にトランスフェクションすることによって組換えアデノウイルスを作製する方法である（寺島美保、近藤小貴、鐘ヶ江裕美、斎藤泉（2003）実験医学 21（7）931.）。COS-TPC法はAdenovirus Expression Vector Kit (Dual Version)（タカラバイオ株式会社）、Adenovirus genome DNA-TPC（タカラバイオ株式会社）を利用して行うことができる。また、完全長DNA導入法は、Adenovirus Expression Vector Kit (Dual Version)（タカラバイオ株式会社）を利用して行うことができる。
【００２８】
一方、レトロウイルスベクターは以下の手順で作製することができる。まず、ウイルスゲノムの両端に存在するLTR（Long Terminal Repeat）の間のパッケージングシグナル配列以外のウイルスゲノム（gag、pol、env遺伝子）を取り除き、そこへ目的の遺伝子を挿入する。このようにして構築したウイルスDNAを、gag、pol、env遺伝子を構成的に発現するパッケージング細胞に導入する。これによって、パッケージングシグナル配列をもつベクターRNAのみがウイルス粒子に組み込まれ、レトロウイルスベクターが産生される。
【００２９】
アデノベクターを応用ないし改良したベクターとして、ファイバータンパク質の改変により特異性を向上させたもの（特異的感染ベクター）や目的遺伝子の発現効率向上が期待できるguttedベクター（ヘルパー依存性型ベクター）などが開発されている。本発明の発現ベクターをこのようなウイルスベクターとして構築してもよい。
【００３０】
発現ベクターに挿入されるIGF2遺伝子は、例えば、配列番号８（GenBank(NCBI), DEFINITION: Homo sapiens insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) (IGF2), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION: NM_000612）、配列番号９（GenBank(NCBI), DEFINITION: Homo sapiens insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) (IGF2), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION: NM_001007139）又は配列番号１０（GenBank(NCBI), DEFINITION: Homo sapiens insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) (IGF2), transcript variant 3, mRNA. ACCESSION: NM_001127598）に記載の塩基配列からなる。但し、これらの塩基配列に等価な塩基配列かならなるDNA（以下、「等価DNA」と呼ぶ）をIGF2遺伝子として用いることもできる。ここでの「等価な塩基配列」とは、基準の塩基配列（配列番号８〜１０のいずれか）と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（神経細胞の増殖促進に対して有効な作用）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。等価DNAの具体例は、基準の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００３１】
等価DNAの他の具体例として、基準の塩基配列に対して１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、神経幹細胞の増殖促進に対して有効なタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該DNAがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような等価DNAは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように基準の塩基配列を有するDNAを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価DNAを得ることができる。
【００３２】
等価DNAの更に他の例として、SNP（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるDNAを挙げることができる。
【００３３】
IGF2遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって調製することができる。例えば、IGF2遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用することによってヒトcDNAライブラリーよりIGF2遺伝子を単離（及び増幅）することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーとしては、例えば、配列番号８〜１０のいずれかの塩基配列に相補的なDNA又はその連続した一部が用いられる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、IGF2遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えばMolecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkが参考になる。
【００３４】
ヒトcDNAライブラリーに代えてヒト以外の哺乳動物細胞（例えば、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ）由来のcDNAライブラリーを用いれば等価DNAを調製可能である。
【００３５】
本発明の第２の局面は、本発明の増殖促進剤を含む、認知機能障害に対する医薬を提供する。「認知機能障害に対する医薬」とは認知機能障害の予防又は治療に用いられる医薬のことをいう。「認知機能障害」は認知症や統合失調症等の患者に認められる症状の一つである。統合失調症のモデル動物として極めて有用であることが判明したDgcr8+/-マウスにおいてIgf2の投与が有効であった事実に鑑みれば、本発明の医薬の好ましい治療標的の一つは統合失調症である。一方、成体神経幹細胞の増殖が低下しているDgcr8+/-マウスにおいてIgf2の投与により神経幹細胞の増殖が認められたこと、及び成体神経幹細胞の増殖異常が様々な精神疾患の発症原因となり得ることが示唆されていることに鑑みれば、IGF2の投与によって成体神経幹細胞の増殖を誘導すれば、それらの精神疾患の病態を改善できるといえる。従って、成体神経幹細胞の増殖異常が原因となる或いは成体神経幹細胞の増殖異常を伴う各種精神疾患に対して本発明の医薬が適用可能であることを期待できる。
【００３６】
本発明の医薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００３７】
IGF2遺伝子を保持する発現ベクターを有効成分とした場合、薬学的に許容可能な媒体を組み合わせて製剤化するとよい。「薬学的に許容可能な媒体」とは、発現ベクターの薬効（即ち認知機能障害に対する有効性）に実質的な影響を与えることなく発現ベクターの投与や保存等に関して利点ないし恩恵をもたらす物質をいう。「薬学的に許容可能な媒体」として、脱イオン水、超純水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、5%デキストロース水溶液等を例示できる。本発明の組成物に、懸濁剤、無痛化剤、安定剤（アルブミンやPrionex（登録商標、ペンタファームジャパン）等）、保存剤、防腐剤など、その他の成分を含有させてもよい。
【００３８】
IGF2遺伝子を保持する発現ベクターがウイルスベクターの形態の場合、生体適合性のポリオル（例えばpoloxamer407など）を併用することが好ましい。ポリオルの使用によってウイルスベクターの形質導入率を１０〜１００倍に上昇させ得る（March et al., Human  Gene Therapy 6:41-53, 1995）。従って、ポリオルを併用することにすればウイルスベクターの投与量を低く抑えることができる。尚、本発明の医薬の一成分としてポリオルを使用することにしても、本発明の医薬とは別にポリオル（又はそれを含む組成物）を調製することにしてもよい。後者の場合、本発明の医薬を投与するときにポリオル（又はそれを含む組成物）を併せて投与することになる。
【００３９】
製剤化する場合の剤形は特に限定されない。剤形の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤である。
【００４０】
本発明の医薬には、期待される治療効果（又は予防効果）を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の医薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量％〜約99重量％の範囲内で設定する。
【００４１】
本発明の医薬はその剤形に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜、脳内注射など）によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。
【００４２】
ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では本発明の医薬はヒトに対して適用される。
【００４３】
本発明の医薬の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に患者の症状、年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。例えば、IGF2タンパク質を有効成分とした場合、例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約0.1mg〜約1,000mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば１日１回〜数回、２日に１回、或いは３日に１回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【００４４】
以上の記述から明らかな通り本出願は、認知機能障害の患者に対して本発明の医薬を治療上有効量投与することを特徴とする、認知機能障害の治療法も提供する。
【実施例】
【００４５】
ヒト22q11.2欠失型統合失調症の原因遺伝子の一つであるDGCR8（DiGeorge syndrome critical region 8)遺伝子は、miRNAの生合成において必要不可欠な分子であり、海馬依存的な記憶、学習に重要な役割を担っている。一方、成体神経新生は海馬依存的な記憶の形成に重要なことが知られているが、統合失調におけるその役割はわかっていない。そこで、統合失調症の発症過程における、成体神経新生の寄与と分子機構を解明するため、Dgcr8遺伝子欠損マウスを作成し、海馬歯状回における神経新生の状態を解析した。
【００４６】
１．方法・材料
（１）動物
学校法人中部大学の動物取り扱い規定に従って動物実験を行った。
【００４７】
（２）Dgcr8+/-マウスの作成
標的ES細胞株(XG058)をBayGenomics (サンフランシスコ、米国)から入手した。β-geoカセットを用いたジーントラップ法でDgcr8遺伝子座に遺伝子操作した後、増幅させ、C57BL/6マウスの胚盤胞に注入した。その結果得られたキメラオスマウスをメスマウス（C57BL/6）と交配し、F1世代を得た。
【００４８】
（３）PCR法を用いた遺伝子型の決定
マウスの尾からゲノムDNAを抽出した。遺伝子型の決定にはプライマーgcr8-F（5’ -TCCTGCTGTGATAAAGTTCCATGAC-3’：配列番号１１）、プライマーDgcr8-R（5’-CATGTAATGCCAGAGACATTAGATCCT-3’：配列番号１２）及びプライマーGenetrap-R（5’-TGCAAGAAGCATGAATCAACTTTGG-3’：配列番号１３）を使用した。予想されるPCR増幅産物は、野生型Dgcr8アレルでは387 bpであり、トラップDgcr8アレルでは248 bpとなる。
【００４９】
（４）RNA抽出
全RNAの抽出にはTrizol（登録商標） total RNA isolation reagent (Gibco BRL, Life Technologies)を使用した。操作は取り扱い説明書に従った。
【００５０】
（５）mRNAの逆転写及びリアルタイムPCR
Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen) を用い、1μgの全RNAからcDNAを合成した。ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems)を用いて定量PCRを行った。SYBR Green (Applied Biosystems)蛍光色素の取り込み量で臨界閾値サイクル数を計算した。臨界閾値はGAPDHの値で標準化した。使用した各プライマーは次の通りである。
Dgcr8-F2: 5’-TGGTGTGACTTACGGATCTG-3’（配列番号１４）
Dgcr8-R2: 5’-CTTGTCAGCTCATAGACTCG-3’（配列番号１５）
GAPDH-F: 5’-GTGCCAAGGCTGTGGGCAAG-3’（配列番号１６）
GAPDH-R: 5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’（配列番号１７）
Ttr-F: 5’-TCGCTGGACTGGTATTTGTG-3’（配列番号１８）
Ttr-R: 5’-TGCCAAGTGTCTTCCAGTAC-3’（配列番号１９）
Sulf1-F: 5’-TCACTGGGAAGTACGTGCAT-3’（配列番号２０）
Sulf1-R: 5’-CAAATCCATGCTTCTCCTTG-3’（配列番号２１）
Ace-F: 5’-ACTCAAAGCTGCGAAGGATC-3’（配列番号２２）
Ace-R: 5’-TGGCATAGCTTCGTGAGGAA-3’（配列番号２３）
Klotho-F: 5’-GCCAGCGATAGTTACAACAAC-3’（配列番号２４）
Klotho-R: 5’-GCTCGGCATAATCCCTGAAA-3’（配列番号２５）
Otx2-F: 5’-AGCAGAATGGAGGTCAGAAC-3’（配列番号２６）
Otx2-R: 5’-GAAGCCTGAGTATAGGTCAT-3’（配列番号２７）
Igf2-F: 5’-GTCGATGTTGGTGCTTCTCA-3’（配列番号２８）
Igf2-R: 5’-GTCTCCAGGTGTCATATTGG-3’（配列番号２９）
Htr2c-F: 5’-GCTATGTGTGTTCAGGCATC-3’（配列番号３０）
Htr2c-R: 5’-GATTGACCGGCAGCTCTAAA-3’（配列番号３１）
【００５１】
（６）マイクロアレイ解析
２ヶ月齢Dgcr8+/+マウス及びDgcr8+/-マウスの海馬からTrizolを用いてRNAを単離した。遺伝子発現解析のために、100 ngの全RNAを用いてGeneChip(R) Mouse Gene 1.0 ST Array (Affymetrix)によるマイクロアレイ解析を行った。標識化、ハイブリダイゼーション、洗浄及びマイクロアレイのスキャンはBio Matrix Research社に委託した。データ解析にはGeneSpring GX software package (Agilent Technologies)を使用した。
【００５２】
miRNAの発現解析のために、250 ngの全RNA を用いて、miRCURY LNA（登録商標） microRNA Array (Exiqon)によるマイクロアレイ解析を行った。標識化、ハイブリダイゼーション、洗浄及びマイクロアレイのスキャンは株式会社バイオマトリックス研究所に委託した。データ解析にはR software package (R Foundation for Statistical Computing)を使用した。
【００５３】
（７）逆転写及びリアルタイムPCRによるmiRNAの定量
遺伝子特異的プライマーを用い、全RNAよりcDNAを合成した。操作はTaqMan MicroRNA アッセイ・プロトコールに準じた(Applied Biosystems)。miRNAの定量PCRにはApplied Biosystems 7300 Sequence Detection systemを使用した。10μlのPCR反応液には0.67μlの逆転写産物、1 × TaqMan ユニバーサルPCRマスターミックス及び1μlのプライマー及びプローブミックスを含む。デフォルトの設定を使用して閾値サイクル数を決定した。
【００５４】
（８）ウエスタンブロット解析
成体マウスの脳から調製した全タンパク質抽出物（50μg）をSDS-PAGEに供した。ウエスタンブロット解析は標準的なプロトコールで行った。抗Dgcr8抗体(Protein Tech Group, Inc.),抗IGF2抗体（Santa Cruz Biotechnology）及び抗アクチン抗体 (Santa Cruz Biotechnology)を使用した。
【００５５】
（９）BrdU導入及び検出
被験マウスの海馬における細胞の増殖及び神経新生を検出すため、ブロモデオキシウリジン(BrdU)溶液(Roche)(10 mg/mL PBS中)を２ヶ月齢のマウスの腹膜腔に導入した（120mg/kg）。歯状回での前駆細胞の増殖を調べるために、導入から24時間後にマウスを屠殺した。SVZの前駆細胞の増殖を調べる際には、導入から2時間後にマウスを屠殺した。細胞運命解析のために、BrdU溶液を１日３回の頻度で３日間導入し、４週後にマウスを屠殺した。既報の方法（Wojtowicz and Kee, 2006）に準じてBrdUの取り込みを可視化した。脳冠状切片（10μm厚）を2N HClで37°C、20分間処理し、DNAを変性させた。PBSで洗浄後、対応する抗体と反応させた。SGZ及びSVZでのBrdU陽性細胞数を定量するために、1匹当たり少なくとも10個又は5個の切片を用い、各領域でのBrdU陽性核を計数した。
【００５６】
（１０）免疫組織化学
脳を摘出し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、30%ショ糖溶液で脱水処理した。OCT(サクラ精機株式会社)で包埋後、凍結切片（10μm厚）を作製し、免疫組織化学に供した。１次抗体は2%BSA含有PBSで希釈した。必要に応じて、HistoVTによる抗原の賦活化処理、Triton X-100 (0.1%)による透過処理を行った。１次抗体には、抗nestin抗体(BD Biosciences)、抗Gfap抗体(Sigma)、抗Dcx抗体(Abcam)、抗Ki67抗体（Abcam）、抗Sox2抗体(Upstate)、抗calretinin抗体(Millipore)、抗calbindin D28K抗体(Millipore)、抗NeuN抗体(Upstate)及び抗活性型カスパーゼ３抗体(Santa Cruz)を使用した。Alexa Fluor 488又はAlexa Fluor 594を結合した２次抗体によって１次抗体を可視化した。核をDAPIで対比染色した。蛍光及び微分干渉コンストラストイメージを顕微鏡下で観察し、デジタルカメラで撮影した。共焦点蛍光イメージは共焦点顕微鏡を用いて取得した。
【００５７】
（１１）TUNELアッセイ
in situ cell-death detection kit (Roche)を用いてマウス脳におけるアポトーシスを検出した。
【００５８】
（１２）ニューロスフィア培養
成体ニューロスフィアを既報の方法（Bull and Bartlett, 2005）で単離した。まず、成体オスマウス（２ヶ月齢）を頸椎脱臼により屠殺した後、脳を摘出した。海馬細胞を調製するために、成体マウス脳アトラス（Paxinos and Franklin, 2001）を参照し、2mm厚の脳の冠状切片を#0.70〜#2.70 mmで切断した。尾側から海馬領域を採取し、慎重に全ての白質を取り除いた。SVZ細胞を調製するために、側脳質の内側部及び外側部を両脳半球から切り取った。組織サンプルをハサミで細片化し、0.1%トリプシン-EDTAで37℃、10分間処理した。0.02%（w/v）トリプシンインヒビターを添加し、酵素反応を停止させた。
【００５９】
5,000個/mlの細胞密度で6cm又は10cm非真空プラズマ処理プレート(BD Biosciences)に細胞を播種した。培養液には、20 ng/mlヒト組換え上皮成長因子(hEGF)(Peprotech, Inc.)、10 ng/ml ヒト組換えFGF2(Peprotech, Inc.)、N-2(Invitrogen)、B27(PAA)及び100 U/ml ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco BRL)を添加した無血清DMEM/F-12培地を使用した。初代海馬細胞及びSVZ細胞を加湿5% CO2条件下で2週間培養し、ニューロスフィアを形成させた。形成したニューロスフィアを計数し、免疫組織化学用にサンプリングした。２次ニューロスフィアの形成のために、１次ニューロスフィアをトリプシン処理し、ピペッティングによって細胞を解離させ、5 × 102個/培養皿の細胞密度で6cm培養皿に播種した。２週間後、２次ニューロスフィアを計数するとともに直径を測定した。最短部の直径が20μm以上のものをニューロスフィアと判断した。
【００６０】
（１３）In vivoインジェクション
既報の方法（Mira et al., 2010）に準じて、背側海馬（ブレグマより前後方向 -2 mm,中外側方向 ±1.5 mm, 頭蓋より背腹方向 -2.3 mm）にマイクロシリンジを挿入した。簡単に説明すると、麻酔下の成体マウス（２ヶ月齢）に対して、32Gのマイクロシリンジを右側海馬歯状回に挿入し、2.5μlの組換えIgf2（R&D; 滅菌PBSで100 ng/mlに溶解したもの）又はPBSを定位注入した。
【００６１】
（１４）自発的交替行動Y字迷路試験
自発的交替行動を対照的Y字迷路を用いて試験した（Ohno et al., 2004）。各マウスの動きをモニターし、SMART animal activity monitoring system (PANLAB)で解析した。マウスのアームの入順序及び入室回数を記録した。
【００６２】
（１５）モリス水迷路試験
最初の２日間、４箇所に順に設置したvisible platformを見つけられるように、トレーニングを行った（１ブロック当り４回）。一日あたり、一時間の時間を空けて３ブロックのトレーニングをマウスに行った。最初の試験日より１０日後、hidden platformを見つけられるように、連続３日間トレーニングを行った。マウスは水槽の真ん中に入れ、６０秒間Platformの探索をさせ、３０秒間platformの上に置いた。一日あたり、３ブロック（１分ロック回）のトレーニングをマウスに行った。翌日、Platformを除去し、マウスを水槽の真ん中に入れた。解析時間は３分とし、その期間、それぞれの４分割領域に存在する時間を記録した。
【００６３】
（１６）強制水泳試験
マウスを室温の水にて半分満たしたプラスティックの容器に入れた。解析時間は６分とし、静止時間を記録した。
【００６４】
（１７）巣作り試験
綿繊維からなる２片の巣作り材料をゲージに入れ、マウスを飼育した。１週間後に巣の状態をデジタルカメラで撮影し、コンピュータで解析した。
【００６５】
（１８）オープン・フィールド・テスト
20分間にわたって、新規オープン・フィールド（50×50×50 cm）での活動量をSMART animal activity monitoring system (PANLAB)で測定した。
【００６６】
（１９）統計処理
スチューデントの両側ｔ検定でデータを解析した。平均値±SEMで示した。p値<0.05のときに有意差ありと判断した。* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, N.S., 有意差なし
【００６７】
２．結果
（１）Dgcr8遺伝子のヘテロ欠損は成体マウス海馬におけるmiRNAの生合成を乱す
Dgcr8遺伝子はRNAseIII酵素であるDroshaと複合体を形成し、miRNAの生合成において重要な働きをする遺伝子であり、海馬歯状回においてはユビキタスに発現している（図１Ａ）。Dgcr8遺伝子欠損マウスの作成にあたり、本発明者らはDgcr8遺伝子のイントロン８番にβ-geo遺伝子の導入されたXG058という胚性幹細胞株（ES細胞株）を用いた（図１Ｂ）。その結果、作成したDGCR8遺伝子ヘテロ欠損マウス（Dgcr8+/-マウス）はメンデルの法則に従った割合で得られ、繁殖力を持ち、正常な平均寿命であった。一方、Dgcr8遺伝子欠損マウス（Dgcr8-/-マウス）は、以前に他のES細胞株を用いて作成されたDgcr8遺伝子欠損マウスの結果と同様に（Stark et al., 2008）、全身の細胞増殖の低下により、胎生５日目あたりにおいて致死となった。
【００６８】
まず、Dgcr8遺伝子の発現レベルを確認するために、海馬組織に対して定量PCR（qRT-PCR）による解析を行った。その結果、Dgcr8+/-マウスでは予想どおりDgcr8 mRNAの発現レベルが約半分ほどに低下していた（図１Ｃ、図１Ｄ）。また、ウエスタンブロットで解析したところ、翻訳融合によって生じた、Dgcr8とβ-geoのキメラタンパク質（約220kDa）と野生型の120kDaの翻訳産物の減少が確認された（図１Ｅ）。変異体Dgcr8タンパク質は、Dgcr8の二つの機能的な二重鎖RNA結合ドメインを欠失していることから、miRNAの生合成に関する機能を持たないと考えられる。そこで、次にmiRNAの生合成の変動を確認するために、マイクロアレイによる発現解析を行った。２ヶ月齢のDgcr8+/-マウスおよびDgcr8+/+マウス海馬よりRNAを精製し、miRCURY LNA（登録商標） microRNA Arrayを用いてmiRNAの発現の変動の解析を行った（図１Ｆ）。その結果、予想どおり、Dgcr8+/-マウスでは大半のmiRNAの発現が減少していることが明らかになったが、いくつかのmiRNAの発現は増強していることが確認された（図１Ｆ）。
【００６９】
TaqMAN qRT-PCRにて１１種のmiRNAの海馬における発現を調べたところ、Let-7c、Let-7g、miR-143及びmiR-200aはDgcr8+/-マウス海馬において有意に減少していることが確認されたが、Let-7a、Let-7b、miR-145、miR-1、miR-125b及びmiR-21等のmiRNAはDgcr8+/-マウスとDgcr8+/+マウス間において変化を認めなかった（図１Ｇ）。更には、miR-1191の発現レベルに関しては、コントロールに対して有意に発現が上昇（約1.6倍）していることが確認された（図１Ｇ）。これらの結果より、Dgcr8遺伝子の欠損は海馬におけるmiRNAの発現を乱すことが確認された。また、この発現変動が遺伝子発現に影響を及ぼしていることが考えられる。
【００７０】
（２）Dgcr8+/-遺伝子ヘテロ欠損マウスは認知機能の低下及び行動異常を示す
次に、作成したDgcr8+/-マウスの空間作業記憶の評価を行うため、Y字迷路を用いた自発的交替行動率を測定した。興味深いことに、雌では確認されなかったが、雄のDgcr8+/-マウスでは野生型コントロールに比較して有意な自発的交替行動率の低下が確認された（図２Ａ）。また、Y字迷路の解析における総アーム入室数については有意な変化は認められなかった。従って、新規環境に対する探究心はDgcr8遺伝子の欠損によって低下していないと予想される（図２Ｂ）。以上の結果を踏まえ、雄のDgcr8+/-マウスを用いて、22q11.2欠失型統合失調症の分子機構に関して更なる解析を行った。一方、モリス水迷路を用いた解析からも、Dgcr8+/-マウスでは空間作業記憶に異常が見られることが確認された(図２Ｃ)。また強制水泳試験によるうつ及び無気力症状の解析を行った結果、Dgcr8+/-マウスはコントロール野生型マウスと比較し、静止時間が増加することが確認された（図２Ｄ）。更には、巣作り試験及びオープン・フィールド試験によって、雄のDgcr8+/-マウスの社会的行動性と自発運動を評価した。その結果、野生型マウスでは確認可能な巣をケージ内に作るものの（図２Ｅ）、Dgcr8+/-マウスでは巣を作らず、巣作りの材料を粉々にちりばめる傾向を認めた（図２Ｆ）。一方、オープン・フィールド試験の解析結果から、自発運動には有意差が無いことが確認された（図２Ｇ〜Ｊ）。
【００７１】
以上の結果より、雄のDgcr8+/-マウスは海馬依存的な空間作業記憶及び社会的行動性に異常があり、無気力症状を示すことが判明した。
【００７２】
（３）Dgcr8遺伝子のヘテロ欠損は脳の発生において形態的異常を引き起こさない
Dgcr8+/-マウスでは脳の発生過程における形態形成の異常が行動学的異常を引き起こしている可能性を考え、生後２ヶ月齢のDgcr8+/-マウスの脳の構造を組織化学的手法にて解析した。その結果、Dgcr8+/-マウスの脳には目立った異常は見当たらなかった（図３Ａ、３Ｂ）。また、顆粒細胞層の厚さ、顆粒細胞の密度に関してもDgcr8+/-マウスには異常が認められなかった（図３Ｂ、３Ｅ）。一方、いくつかの海馬の変性疾患において顆粒細胞層の厚さに異常が認められることから（Maekawa et al., 2005）、生後７ヶ月齢のDgcr8+/-マウスにおける顆粒細胞層の厚さも解析したところ、コントロールと比較した有意な差は認められなかった（図３Ｄ、３Ｆ）。以上の結果から、Dgcr8遺伝子の欠損は脳構造の形態発生及び形態的維持に異常を与えていないことが示唆された。
【００７３】
（４）Dgcr8遺伝子へテロ欠損マウスでは海馬歯状回における成体神経幹細胞の増殖低下が認められたが、側脳室の神経幹細胞では異常が認められなかった
近年、海馬歯状回における成体神経新生が行動学的異常において重要な役割を担っている事が明らかになってきている（Gage, 2000; Zhao et al., 2008; Deng et al., 2010; Ming and Song, 2011; Sahay et al., 2011）。そこでまず、Dgcr8遺伝子の欠損が海馬歯状回における成体神経幹細胞および前駆細胞の増殖に影響を与えるか調べることにした。生後２ヶ月齢のDgcr8+/-マウス及びコントロールマウスに対してBrdUを腹腔内に導入することで増殖細胞をラベルし、24時間後に脳を摘出した。興味深い事に、Dgcr8+/-マウスのSGZにおけるBrdU陽性細胞数はコントロールに比べ減少していた（図４Ａ、４Ｂ）。さらに抗Ki67抗体による染色を行った結果、Dgcr8+/-マウスのSGZでは細胞増殖が低下していることが確認された（図４Ｃ）。また、免疫組織化学的解析によって、Sox2、Gfap及びNestin陽性の成体神経幹細胞の数も、Dgcr8+/-マウスSGZでは減少している事が明らかになった（図４Ａ、図４Ｄ）。さらには、神経前駆細胞および未熟神経細胞のマーカーであるDoublecortin(Dcx)陽性細胞数も減少していた（図４Ａ）。
【００７４】
次に、成体Dgcr8+/-マウスSGZにおける成体神経幹細胞の増殖低下を検証するため、ニューロスフィア法を用いて、成体神経幹細胞の自己複製能を直接的に評価した。海馬組織より単離した成体神経幹細胞を、増殖因子存在下、低細胞密度で培養し、Dgcr8遺伝子の欠損がニューロスフィアの形成において、その数、大きさに影響を与えるかどうか検討した。その結果、期待通り、Dgcr8+/-マウス由来ニューロスフィアは、野生型マウス由来のものよりも小さいことが明らかになった（図４Ｅ）。また、免疫組織化学的解析から、これらのニューロスフィアはSox2陽性であることを確認した（図４Ｅ）。Dgcr8+/-マウス海馬由来のニューロスフィアの数はコントロールに比較して0.2倍ほどに減少している事が明らかになった（図４Ｆ）。
【００７５】
一方、同様の方法を用い、SVZの成体神経幹細胞の増殖に関して解析したところ、Dgcr8+/-マウスSVZにおけるBrdU陽性細胞数はコントロールと比較して差がない事が明らかになった（図５Ａ、５Ｂ）。またNestin及びGfapの免疫染色結果からも、これらの２つのサンプルに差を認めらなかった（図５Ａ）。SVZに存在する成体神経幹細胞の自己複製能の評価を行うため、SVZ由来の一次ニューロスフィアを単一細胞に乖離し、再度播種することにより、２次ニューロスフィア形成能を評価した（図５Ｃ、５Ｄ）。その結果、ニューロスフィアの大きさと形成数には有意な差は認められなかった。
【００７６】
以上の結果より、Dgcr8遺伝子の海馬組織での発現はSGZの成体神経幹細胞の維持に必要であるが、SVZの神経幹細胞の維持には重要でない事が明らかになった。
【００７７】
（５）Dgcr8+/-マウス海馬歯状回における成体神経新生は低下していた
Dgcr8遺伝子の発現低下に起因する、海馬歯状回における成体神経幹細胞の増殖低下が神経新生に与える影響を明らかにするため、成熟ニューロンマーカー（神経分化マーカー）の発現を解析した。生後２ヶ月齢におけるNeuN及びcalbindinの発現には大きな差は認められなかった（図６Ａ）。次に成体神経新生を解析するため、BrdUを投与し成体神経幹細胞、神経前駆細胞を標識した。４週後、BrdU陽性細胞の細胞運命を神経分化マーカーであるNeuNを指標に解析した（図６Ｂ、６Ｃ）。その結果、成体神経幹細胞数の低下に伴って、全BrdU陽性細胞数及びNeuNとBrdU共陽性の細胞数はコントロールマウスに比較して有意に低下している事が明らかになった（図６Ｃ、６Ｄ）。しかし、Dgcr8+/-マウスにおける、神経分化した細胞の割合には変化が見られなかった（図６Ｅ）。
【００７８】
（６）Dgcr8遺伝子の欠損は海馬歯状回における細胞の生存に大きな影響を与えない
成体神経新生では十分な数の新生神経細胞が日々生じているが、約60〜80%の未熟神経細胞がアポトーシスにより脱落し、一部の生存神経細胞のみが成熟した神経細胞に分化してゆく（Dayer et al., 2003; Sun et al., 2004）。新生神経細胞の生存は海馬歯状回における成熟した神経細胞の供給を維持する上で重要である。
【００７９】
Dgcr8+/-マウスにおける新生神経細胞の減少が細胞死の増加に起因する可能性を検証するため、生後２ヶ月齢及び生後７ヶ月齢のDgrc8+/-マウスの脳におけるアポトーシスを抗活性型カスパーゼ３抗体及びTUNELアッセイを用いて解析した（図７Ａ〜Ｄ）。抗活性型カスパーゼ３を用いた海馬歯状回の切片に対する免疫組織化学的解析の結果、Dgcr8+/-マウスとコントロールマウスの間に有意な差は認められなかった（図７Ａ、７Ｃ）。また海馬歯状回におけるTUNEL陽性のアポトーシスを起こした細胞の数を定量したところ、Dgcr8+/-マウスにおいてアポトーシスの増加は検出できなかった（図７Ｂ、７Ｄ）。更には、側脳室においても過剰なアポトーシスは検出できなかった（データ示さず）。
【００８０】
これらの結果からDgcr8遺伝子の欠損は海馬歯状回における細胞の生存に影響を与えない事が明らかになった。
【００８１】
（７）Dgcr8+/-マウス海馬ではいくつかの統合失調症関連遺伝子の発現が低下していた
Dgcr8遺伝子が関与する、成体神経幹細胞の制御の分子機構明らかにするため、マイクロアレイを用い、Dgcr8遺伝子によって制御されている遺伝子群の発現解析を行った。生後２ヶ月齢の雄のDgcr8+/+マウス及びDgcr8+/-マウスの海馬よりそれぞれRNAを精製し、Affymetrix GeneChip（登録商標） Mouse gene 1.0 ST arrayを用いて遺伝子発現の変化を解析した。その結果、多くの遺伝子では発現パターンに目立った変化は認められなかったものの、Ace、Klotho、Ttr、Sulf1、Htr2c、Igf2、Otx2といった特定のサブセットの遺伝子群ではDgcr8+/-マウス海馬において劇的な発現低下が認められた(図８Ａ、８Ｂ)。この結果を確認するため、定量RT-PCRを用いてこれらの遺伝子の発現レベルを解析した(図８Ｃ)。その結果、マイクロアレイの結果と同様に、これら全ての遺伝子の発現において有意な発現低下を確認した(図８Ｃ)。IGF2の発現に関しては、ウエスタンブロッティング法にて解析を行ったところ発現の低下が確認された（図８Ｄ）。興味深いことに、この遺伝子群のいくつかの遺伝子は、統合失調症の患者において発現の低下が報告されているものであった。例えば、Transthyretin(TTR)は近年、統合失調症患者の脳脊髄液において有意に発現が低下していることが報告されている分子である（Huang et al., 2006）。また、HTR2C遺伝子及びSULF1遺伝子は統合失調症患者の前頭前皮質において発現低下していることが報告されている（Castensson et al., 2005; Narayan et al., 2008）。同様に、ACEは統合失調症患者の脳において発現が低下していることが報告されている（Arregui et al., 1979）。
【００８２】
以上の結果は、Dgcr8+/-マウスが統合失調症患者と極めて近い病態を呈しているということを示唆する。また驚くことに、近年、記憶の保持と恐怖記憶の消滅において重要な機能を担っていることが明らかになったIgf2の発現も（Agis-Balboa et al., 2011; Chen et al., 2011）、Dgcr8+/-マウスでは劇的に低下していることが明らかになった。
【００８３】
（８）IGF2はin vitro及びin vivoでDgcr8+/-マウスの神経幹細胞の増殖を促進できる
SVZにおける神経幹細胞の増殖（Lehtinen et al., 2011, Brancko et al., 2012, Ziegler et al., 2012）と海馬依存的な記憶の保持（Chen et al., 2011）にIGF2が必要であることが最近報告されたことから、SGZに内在する成体神経幹細胞におけるIGF2の機能に着目して解析を進めた。in vitroの条件下での増殖に対するIGF2の効果を調べるため、成体神経幹細胞を、IGF2の存在下及び非存在下、浮遊培養系で培養した。その結果、期待どおり、IGF2で刺激すると、Dgcr8+/-マウス由来ニューロスフィアの大きさが増大した(図９Ａ)。また、IGF2の添加はDgcr8+/-マウスにおけるニューロスフィアの形成細胞数も、IGF2を添加していないコントロール群と比較して、約2倍に増加していた(図９Ｂ)。一方、IGF2刺激をしたDgcr8+/+マウス由来のニューロスフィアでは、大きさに関してはあまり大きな差が確認されなかったが、IGF2の添加により形成数は増加していた(図９Ｂ)。
【００８４】
次にin vivoの条件下での神経幹細胞の増殖におけるIGF2シグナルの機能を明らかにするため、250 ngの組換えIGF2又はPBSを生後２ヶ月齢のマウスの背側海馬に投与し、３日後、SGZにおけるSox2/Ki67共陽性細胞の数を解析した。その結果、in vitroでの解析結果と一致して、IGF2の投与は、PBS投与Dgcr8+/-マウスに比較して、Dgcr8+/-マウスSGZにおけるSox2/Ki67共陽性成体神経幹細胞数を増加させることが明らかになった(図９Ｃ、９Ｄ)。また、Dcx陽性細胞数も、IGF2を投与したマウスにおいて有意に増加していた(図９Ｅ、９Ｆ)。さらには、成体における神経新生を解析するため、BrdUを用いて増殖細胞を標識史、４週間後にBrdU/NeuN共陽性細胞の解析を行った（図９Ｇ、図９Ｈ）。その結果、成体神経幹細胞の増加と同様に、IGF2を投与したDgcr8+/-マウスではPBSを投与したDgcr8+/-マウスに比較してBrdU/NeuN共陽性細胞の数が増加していた（図９Ｇ、図９Ｈ）。一方、Sox2/Ki67,Dcx及びBrdU/NeuN共陽性細胞の数の平均値には増加の傾向が見られたが、この増加には有意差は認められなかった。
【００８５】
これらの結果から、IGF2はDgcr8+/-マウスにおける成体神経幹細胞の増殖をin vivoの条件下で促進し、神経前駆細胞と新生神経細胞の数を増加させることが明らかになった。
【００８６】
（９）IGF2の投与はDgcr8+/-マウスにおける行動異常を改善できる
次にIGF2の成体海馬における投与がDgcr8+/-マウスの学習異常を改善できるか調べることにした。IGF2の投与による、Dgcr8+/-マウスにおける記憶の異常の改善効果を評価するため、生後２ヶ月齢のDgcr8+/-又はDgcr8+/+マウスの海馬にIgf2若しくはPBSを投与し、４週間にわたり、Y字迷路を用いた自発的交替行動率を解析した。その結果、Igf2投与後1週間以内では有意な改善は確認されなかったものの(データ示さず)、Igf2を投与したDgcr8+/-マウス及びDgcr8+/+マウスの自発的交替行動率は時間とともに改善することが明らかになった(図１０Ａ、１０Ｂ)。投与後1週間において、Igf2を投与したDgcr8+/-マウスの自発的交替行動率は、PBSを投与したコントロールマウスに比較して有意に改善していた(図１０Ｂ)。投与後２週間目において、IGF2を投与したマウスの自発的交替行動率の値は、野生型コントロールの初期の値より改善していた。３週間後においてはIGF2を投与したDgcr8+/- 及びDgcr8+/+マウスにおける自発的交替行動率の値は75％より高い値になっていた(図１０Ａ、１０Ｂ)。これらのIGF2を投与したDgcr8+/- 及びDgcr8+/+マウスにおける自発的交替行動率には有意差は認められなかった(図１０Ａ、１０Ｂ)。一方、PBSの投与によって野生型コントロールマウスにおける自発的交替行動率は減少傾向が認められたが、IGF2を投与した野生型マウスでは４週間後における自発的交替行動率の値が有意に向上した(図１０Ａ)。また総アーム入室数には差が見られなかったことから、新規環境に対する探究心は差がないことが確認された(図１０Ｃ)。
【００８７】
以上の結果より、Dgcr8+/-マウスに見られた海馬依存的空間作業記憶の異常をIGF2の海馬内への投与により改善できることが示唆された。
【００８８】
３．考察
検討の結果、22q11.2欠失症候群の原因遺伝子であるDgcr8遺伝子のヘテロ欠損は、海馬歯状回における成体神経幹細胞の増殖を減少させ、神経新生を低下させることが明らかになった。マイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析結果から、Igf2を含めたいくつかの統合失調症関連遺伝子の発現がDgcr8+/-マウス海馬において低下していることが明らかになった。また、IGF2の投与はDgcr8+/-マウスの成体神経幹細胞の増殖をin vivo及びin vitroで回復し、Dgcr8+/-マウスにおける空間作業記憶の異常を改善した。これらの結果は、成体神経新生の異常が22q11.2欠失型統合失調症における空間作業記憶の異常に寄与しており、この異常はIGF2の投与によって回復できる可能性を示唆する。
【００８９】
成体海馬での神経新生の脳高次機能における役割は長い間、議論の対象となってきた。しかし、近年の研究成果の蓄積から、記憶と学習において成体神経新生は重要な役割を担っている事が強く示唆され始めている。
【００９０】
近年、GuoらはNestin陽性成体神経幹細胞特異的Fragile X mental retardation protein(Fmrp; 脆弱性X症候群原因遺伝子)遺伝子条件付き遺伝子欠損マウスを用いた解析から、成体神経新生の役割を実証した（Guo et al., 2011）。さらには、disrupted in schizophrenia 1(DISC1; 精神疾患における主要な原因遺伝子)はGSK3β/βカテニンの経路を介して神経前駆細胞の増殖を促進し、GSK3阻害剤はDISC1をノックダウンしたマウスにおける行動と増殖の異常を回復できる事が示された（Mao et al., 2009）。これらの結果に一致して、今回作成した22q11.2欠失型統合失調症モデルマウスでは成体神経幹細胞の増殖が低下している事を発見した。IGF2の投与による神経幹細胞の増殖の改善は、Dgcr8遺伝子欠損マウスにおける行動異常を回復するのに十分な効果を発揮した。これらの結果は、海馬における成体神経幹細胞の増殖の異常は精神疾患の発症に十分であることを示すとともに、成体神経幹細胞の増殖の異常は回復可能であることを示唆する。実際、統合失調症の患者の脳の検体では海馬での細胞増殖が低下していることから、海馬歯状回における成体神経幹細胞は、統合失調症をはじめとした各種精神疾患の治療において新たな標的になると期待される。
【００９１】
Dgcr8遺伝子へテロ欠損マウスにおいて確認された行動異常の分子機構を明らかにするため、Dgcr8+/-マウスの海馬における遺伝子発現の解析を行った。その結果、興味深い事に、22q11.2欠失型統合失調症における、新しいいくつかの原因遺伝子を同定する事ができた。これまでに他の研究グループによって、1.3Mbの染色体領域（Df(16)+/-, Dgcr2からHira遺伝子までの領域）を欠失したマウスを用いたマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析が行われているが（Stark et al., 2008）、Dgcr8遺伝子の下流に存在する特異的な遺伝子は同定されていない。
【００９２】
Starkらの報告では、遺伝子オントロジーに基づいた遺伝子分類解析から、Df(16)+/-マウスではシナプス、被覆小胞関連遺伝子群の発現に異常が見られることが示されたが、本研究でのマイクロアレイの解析からは少し異なる結果が得られた。Dgcr8+/-マウス海馬では多くの遺伝子発現にはあまり変動が見られなかったものの、Ace、Klotho、Ttr、Sulf1、Htr2c、Igf2、Otx2などの特定の遺伝子群において劇的な発現低下が認められた。特筆すべき事に、これらの遺伝子のほとんどが統合失調症との関連性が過去に報告されている（Castensson et al., 2005; Huang et al., 2006; Narayan et al., 2008）。この事実は、Dgcr8+/-マウスは統合失調症患者と極めて近い病態を呈していることを示唆する。
【００９３】
マイクロアレイ解析の結果、機能解析の価値のある興味深い遺伝子が数多く見つかったが、本研究では海馬におけるIGf2シグナルに着目して解析を行った。IGfシグナルは神経幹細胞の増殖も含め、多くの細胞機能に関与しており、幹細胞を維持するNiche因子として、Dgcr8+/-マウスにおいて神経幹細胞の細胞増殖と空間作業記憶の形成に貢献している可能性が考えられる。全てではないが、ほとんどのIGF2の細胞増殖促進作用は、細胞内にチロシンキナーゼ活性を持ったヘテロ４量体膜貫通型タンパク質であるIGF1受容体を介して行われる（Baker et al., 1993; Liu et al., 1993; Efstratiadis, 1998）。逆にIGF2/マンノース6リン酸受容体は、IGF2を除去し、IGF2の活性を落とす事で細胞増殖の抑制作用を発揮する事が一般に知られている（Lau et al., 1994; Efstratiadis, 1998）。
【００９４】
これまでのマウス海馬におけるIGF受容体の発現解析から、海馬歯状回のSGZに内在する増殖性の神経前駆細胞はIGF1受容体を高発現しており、IGF2受容体mRNAの発現は低い事が知られている（Zhang et al., 2007）。また、IGF2は一番豊富なIGFであり（Russo et al., 2005）、特に海馬において強く発現している事が知られていることから（Kar et al., 1993）、Igf2がSGZに内在する神経幹細胞の増殖に寄与していることが予想されている。これに一致して、nestin陽性細胞特異的、欠損変異型IGF1受容体遺伝子発現マウスでは、歯状回の大きさを含めた脳の大きさに顕著な低下が認められている。また、興味深い事にIGF2遺伝子欠損マウスでは脳の大きさが小さくなる事が報告されている（Backer et al., 1993）。
【００９５】
Dgcr8+/-マウスでは海馬の細胞の生存と歯状回の体積は影響を受けなかったものの、成体SGZの神経幹細胞の細胞自立的な細胞増殖に有意な低下が認められた。Igf2の投与により、Dgcr8+/-マウスの神経幹細胞の増殖をin vitro、in vivoの両方において回復する事ができたことから、確認された表現型において一番重要な役割をIgf2の発現低下が担っている事が考えられる。興味深いことに我々の結果に一致して、近年の成体神経幹細胞における遺伝子発現の解析からIGF2はSVZではなく、SGZにおける成体神経幹細胞の自己分泌型制御因子であることが明らかになった（Brancko et al., 2012）。この著者らは外因性のIGF2の添加により、神経幹細胞の増殖にはあまり大きな影響を示さないものの、IGF2遺伝子の発現抑制により低下した細胞増殖を回復できることを示している。この結果に一致して、我々の解析からIGF2はin vitroの環境においてbFGF, EGF存在下では細胞増殖を促進するものの、in vivoの条件ではIGF2を投与したマウスでしか有意な成体神経幹細胞の細胞増殖の促進は確認されなかった。これらの結果から生理的な条件下においてIGF1の受容体は自己分泌されているIGF2によって飽和しており、この自己分泌型のIgf2/Igf1受容体のシグナルは海馬歯状回における幹細胞Nicheにおいて重要な機能を担っていると考えられる。
【００９６】
驚いた事にDgcr8+/-マウスにおける海馬依存的空間作業記憶の異常は、IGF2の投与により改善された。この結果は統合失調症モデルマウスの治療においてIGF2の有効性を示した初めての解析例である。
【００９７】
近年、海馬におけるIGF2の機能に関して２つの興味深い文献が報告されている。一つはラットを用いた実験においてIGF2の投与は記憶の保持を増強し、代理記憶を促進し、そしてシナプスにおけるGSK3βの活性を介してGluR1の発現を短期で増強することで、記憶の忘却を抑制したことを報告する（Chen et al., 2011）。もう一つはマウスを用いた実験において、恐怖記憶の消去にIGF2のシグナルの活性化による17〜19日目の新生神経細胞の生存促進作用が重要であることを報告する（Agis-Balboa et al., 2011）。このように、認知機能と精神疾患におけるIGF2の機能は注目されつつある。しかし、今回の発見は、これらの文献での報告・知見と少し異なる。本研究ではIGF2の投与後、3日ほどで成体神経幹細胞、未熟神経細胞の増加が確認されたが、この短期間では行動学的改善は認められなかった。興味深い事に、Dgcr8+/-マウスにおけるY字迷路を用いた空間作業記憶の改善効果の解析では、IGF2導入後、２週間後以降に野生型の水準を超えるようになった。成体における神経新生において、新生後１〜４週目の新生神経細胞は、完全に分化した神経細胞より可塑性が非常に高く、重要な成熟過程が行われることから（Zhao et al., 2008）、Dgcr8+/-マウスにおけるIGF2依存的な空間作業記憶の改善では、新生された神経細胞の統合が必要であると推測される。
【００９８】
Dgcr8+/-マウスでは成体神経幹細胞の数が減少しているものの海馬歯状回の大きさには影響は認められなかった。この結果は近年のFmrp条件特異的遺伝子欠損マウスにおける成体神経幹細胞由来細胞数の減少によっても歯状回の大きさには影響を与えない結果に一致している（Guo et al., 2011）。さらには、他の研究成果からC57Bl/6Jマウスでは２ヶ月齢から７ヶ月齢の間に海馬歯状回におけるKi67陽性の増殖細胞が、歯状回の体積に影響を与えずに90％ほど劇的に減少することが報告されている(Kitamura and Sugiyama.,2006; Ben Abdallah et al., 2010)。このことから、Dgcr8+/-マウスにおける神経新生の低下は、歯状回の厚さに大きな影響を与えないことが考えられる。
【００９９】
我々の解析結果から、雄のDgcr8+/-マウスのみが、空間作業記憶に異常を示すことが明らかになった。この結果に対応して、近年、研究成果の蓄積から女性より男性の方が、４０％ほど発症率が高いことが明らかになってきた（Kulkarni et al., 2012）。この統合失調症の発症率の性差の分子機構として、エストロゲンによる保護作用が重要な役割を担っていることが考えられている。我々の解析では、雌のDgcr8+/-マウスの神経新生とエストロゲンの影響に関してはまだ解析ができていないが、少なくともDgcr8およびIgf2のmRNAの発現レベルは、低下していることが明らかになっている（データ示さず）。統合失調症の発症の性差の分子機構の解明には、更なる解析が必要であると考えられる。
【０１００】
以上のように、Igf2は海馬において、歯状回の神経細胞の新生やシナプスの可塑性の制御など、様々な方法で機能していると考えられる。本研究での解析結果から、Igf2の発現低下は、成体神経新生を介して22q11.2欠失型統合失調症に関連した行動異常、神経学的異常に対して、少なくとも部分的に関与していることが示唆された。統合失調症の治療において、IGF2のシグナルの活性化や成体神経新生の増強などの新しい治療法が有効であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の有効成分は神経幹細胞の増殖促進作用を示す。認知機能障害に対しては神経情報伝達物質の濃度の制御によって機能の改善を図る方法が取られてきたが、この方法では失われた神経細胞は補填されないことから、いわば一時的な対処療法といえる。対照的に本発明は、神経細胞数を増加させるという優位な作用機序で認知機能を改善させるものであり、認知機能の恒久的な改善を期待できる。また、統合失調症に対する治療効果も期待できる。
【０１０２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【０１０３】
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【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号１１〜３１：人工配列の説明：ＰＣＲプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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