(57)【要約】【課題】本出願は、キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ剤の組成物に関する。別の態様は、キメラ抗エンドグリン抗体及びベバシズマブの使用に関する。別の態様は、ＶＥＧＦ誘導型簇出を阻害するための組成物の使用に関する。別の態様は、血管新生を阻害するための組成物の使用に関する。【解決手段】本出願は、キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ剤の組成物、キメラ抗エンドグリン抗体及びベバシズマブ、ＶＥＧＦ誘導型簇出を阻害するための組成物、血管新生を阻害するための組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗エンドグリン抗体を含む組成物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物と細胞を接触させることによってＶＥＧＦ誘導型簇出を阻害する方法であって、
前記キメラ抗エンドグリン抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域（Ｆｃ）を含む、上記方法。
【請求項２】
対象中の癌増殖を抑制する方法であって、キメラ抗エンドグリン抗体を含む組成物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物を投与することを含み、
前記キメラ抗エンドグリン抗体が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域（Ｆｃ）を含む、上記方法。
【請求項３】
対象中の血管新生関連疾患を治療する方法であって、キメラ抗エンドグリン抗体を含む組成物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物を投与することを含み、
前記キメラ抗エンドグリン抗体が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域（Ｆｃ）を含む、上記方法。
【請求項４】
前記組成物が、許容される担体又は賦形剤を更に含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗エンドグリン抗体を治療用標識、診断用標識、又は両方で更に標識する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストを治療用標識、診断用標識、又は両方で更に標識する、請求項２から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
血管新生関連疾患が癌、又は転移である、請求項３から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
癌が固形腫瘍である、請求項２から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
癌が上皮系腫瘍である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
癌が肺癌、婦人科悪性腫瘍、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、頭部癌、膵臓癌、肝臓癌（肝細胞癌）、子宮癌、首部癌、腎臓癌（腎細胞癌）、肉腫、ミエローマ、及びリンパ腫から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
血管新生関連疾患が血管新生／新血管形成によって特徴付けられる眼部疾患、糖尿病性腎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、骨関節炎、癌、又は転移である、請求項３から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
眼部疾患が黄斑変性症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
眼部疾患が糖尿病性網膜症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
血管新生関連疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
血管新生関連疾患が関節リウマチである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
血管新生関連疾患が骨関節炎である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
キメラ抗エンドグリン抗体が組成物中に約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇの量で存在する、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦアンタゴニストが組成物中に約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ又は約１５ｍｇ／ｋｇの量で存在する、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
キメラ抗エンドグリン抗体及びＶＥＧＦアンタゴニストが同じ組成物中に存在する、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
キメラ抗エンドグリン抗体及びＶＥＧＦアンタゴニストが異なる組成物中に存在する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
キメラ抗エンドグリン抗体及びＶＥＧＦアンタゴニストを連続的に投与する、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
キメラ抗エンドグリン抗体及びＶＥＧＦアンタゴニストを同時に投与する、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
キメラ抗エンドグリン抗体及びＶＥＧＦアンタゴニストを同じ部位に投与する、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
キメラ抗エンドグリン抗体及びＶＥＧＦアンタゴニストを異なる部位に投与する、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つ又は複数の血管新生阻害剤を投与することを更に含む、請求項２から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
血管新生阻害剤が化学療法剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、又はそれらの組合せである、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その出願が参照として完全に本明細書に組み込まれる２００９年８月１７日に出願された米国仮出願第６１／２３４，５７４号の特典を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、冠状疾患に次ぐヒトの死の第二の主な原因である。世界中で毎年数百万人の人々が、癌が原因で死んでいる。米国単独で、癌は毎年五十万人をはるかに超える人々の死を引き起こし、一年当たり約１４０万の新たな症例が診断される。心臓疾患が原因の死は有意に減少している一方で、癌が原因の死は一般に増加している。来世紀の初期には、癌は死の主な原因になると予想される。
【０００３】
更に、その原発性癌を早期に生き延びた癌患者に関してさえ、それらの生命が劇的に変化するという一般的な経験が示されている。多くの癌患者は、再発又は治療の失敗に関する可能性を意識することにより駆り立てられる強い不安を経験する。多くの癌患者は、治療後に相当な身体の衰弱を経験する。
【０００４】
一般的に言うと、致命的な癌の管理における根本的な問題は、有効で非毒性の全身療法の欠如である。癌は、制御不能な細胞増殖をもたらす遺伝子突然変異によって特徴付けられる複雑な疾患である。癌細胞は全生物中に存在し、通常の条件下では、それらの過剰な増殖は様々な生理的要因によって密接に制御される。
【０００５】
血管新生は、それによって新たな血管が既存の血管から発生する生理的プロセスである。血管新生は、正常プロセスと病状プロセスの両方において役割を果たすことが示唆されている。例えば、血管新生プロセスは、動物の器官及び組織の脈管系の発生と関係がある。
【０００６】
特定の病状では、患部組織内の細胞に十分な血液及び栄養供給をもたらすための手段として血管新生が刺激される。これらの病状の多くは、異常な細胞増殖及び／又は制御と関係がある。固形癌及び滲出型黄斑変性症は、連続的増殖及び転移に関する新たな血液供給の動員に依存する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
エンドグリンと結合するキメラ抗体を本明細書で提供する。このような抗体には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの精製、検出、診断及び治療用途がある。エンドグリンの１つ又は複数の種又は変異体と結合し血管新生を阻害するキメラ抗体も本明細書で提供する。エンドグリンと結合するキメラ抗体を用いて血管新生関連疾患を治療する方法を、更に本明細書で提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
キメラ抗エンドグリン抗体を抗ＶＥＧＦ剤と併用して使用して、様々な型の癌、固形腫瘍、及び転移などを治療又は予防することができる。本明細書に記載する組成物の投与によって、様々な型の癌、固形腫瘍、及び転移などを治療する方法を本明細書で記載する。本明細書に記載する組成物は、血管を収縮する、疾患と関係がある内皮細胞増殖を阻害する、及び／又は血管漏出を防ぐこともできる。
【０００９】
本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を使用して、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症を治療又は予防することができる。本明細書に記載する抗体及び抗原結合断片の投与によって、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症を治療又は予防する方法を本明細書で記載する。本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体は、血管を収縮する、眼部疾患と関係がある内皮細胞増殖を阻害する、出血症状を除去する、不透明な視界を治療する、視力喪失の停止をもたらす、及び／又は血管漏出を防ぐこともできる。本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体は、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症又は増殖性硝子体網膜症を治療するための医薬品において使用することもできる。
【００１０】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（Ｆｃ）、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）を有するキメラ抗エンドグリン抗体を本明細書で提供する。
【００１１】
一態様では、本明細書に記載する抗体を修飾して、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、可溶性、生物学的利用能又は半減期などの、化合物の薬物動態性を変えることができる。このような修飾には、ＰＥＧ化及び／又はグリコシル化があるが、これらだけには限られない。
【００１２】
本明細書に記載する抗体は、従来の手段を使用して迅速又は長期の送達用に製剤化することができる。非制限的な一実施形態では、迅速な送達は例えば静脈内注射による。別の非制限的な実施形態では、長期の送達は例えば皮下デポジション（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）による。
【００１３】
本明細書に記載する抗体及び抗原結合断片と許容される担体又は賦形剤の組成物を本明細書で提供する。
【００１４】
本明細書に記載する抗体及びその抗原結合断片を使用して、血管新生と関係がある様々な疾患及び状態、例えば様々な型の癌、固形腫瘍、及び転移を治療することができる。更に、本明細書に記載するこれらの抗体及びその抗原結合断片は、様々な型の癌、固形腫瘍、及び転移と関係がある疾患及び状態を予防、治療、又は診断するための医薬品の製剤化において使用することができる。
【００１５】
本明細書に記載する抗体及びその抗原結合断片を使用して、血管新生／新血管形成によって特徴付けられる様々な型の眼部又は非眼部疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎症、慢性炎症性疾患（例えばＩＢＤ）、関節リウマチ及び骨関節炎を治療することができる。更に、本明細書に記載するこれらの抗体及びその抗原結合断片は、血管新生と関係がある疾患及び状態、例えば血管新生／新血管形成によって特徴付けられる様々な型の眼部又は非眼部疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎症、慢性炎症性疾患（例えばＩＢＤ）、関節リウマチ及び骨関節炎を予防、治療、又は診断するための医薬品の製剤化において使用することができる。
【００１６】
キメラ抗エンドグリン抗体を含有する第一の組成物、及び抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を含有する第二の組成物を患者に投与し、それによって有効な宿主免疫応答を誘導することによる、患者中の宿主免疫応答を誘導するための方法を本明細書で提供する。
【００１７】
キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を含有する組成物を患者に投与し、それによって有効な宿主免疫応答を誘導することによる、患者中の宿主免疫応答を誘導するための方法を本明細書で提供する。
【００１８】
宿主免疫応答は、液性免疫応答又は細胞媒介性免疫応答であってよい。免疫応答は、血管新生、血管新生依存性疾患又は血管新生依存性障害を抑制する応答であってよい。免疫応答は、細胞シグナル伝達経路（例えばＳｍａｄシグナル伝達）の誘導又は遮断も含む。一実施形態では、応答は血管新生を抑制する。
【００１９】
血管新生と関係がある細胞シグナル伝達経路に影響を与える方法を本明細書で提供する。（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ）で、細胞シグナル伝達経路を変えるのに十分な量の本明細書に記載する１つ又は複数の組成物と、血管新生細胞を接触させることが可能である。一実施形態では、抗体はキメラ抗エンドグリン抗体である。非制限的な一例では、抗体の結合に応答して、Ｓｍａｄ１、５及び／又は８シグナル伝達は血管新生細胞中で約１．５倍以上阻害される。別の非制限的な例では、Ｓｍａｄ３レベルは約１．５倍以上増大し、細胞が静止状態に戻ることを示す。抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を含有する組成物も、キメラ抗エンドグリン抗体を含有する組成物と共に投与する。
【００２０】
本明細書に提供する１つ又は複数の組成物を患者に投与することによって、対象中の血管新生又は血管新生依存性疾患若しくは障害を抑制する方法を本明細書で提供する。血管新生依存性疾患若しくは障害は、以下：様々な型の癌、固形腫瘍及び転移のいずれかであってよい。一実施形態では、血管新生又は血管新生依存性疾患若しくは障害の抑制は、その疾患若しくは障害と関係がある症状を緩和する。別の実施形態では、血管新生又は血管新生依存性疾患若しくは障害の抑制は、腫瘍サイズの低下、腫瘍進行の予防、細胞増殖の低下、アポトーシスの増大、又は対象の生存期間の増大をもたらす。
【００２１】
本明細書に提供する１つ又は複数の組成物を投与することによって、対象中の癌又は転移を予防又は治療する方法を本明細書で提供する。組成物の投与は、治療する対象の生命を延長することができる。治療する癌／腫瘍は固形腫瘍を含み、腫瘍は原発性腫瘍又は転移性腫瘍であってよい。例示的な固形腫瘍は、皮膚、メラノーマ、肺、膵臓、乳、卵巣、結腸、直腸、胃、甲状腺、咽頭、卵巣、前立腺、結腸直腸、頭、首、眼、口、喉、食道、胸、骨、精巣、リンパ、骨髄、骨、肉腫、腎臓、汗腺、肝臓、腎臓、脳、例えば多形膠芽腫及び同様の組織から選択される組織又は器官の腫瘍である。非制限的な一例では、固形腫瘍は、結腸腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、又はこのような腫瘍のいずれかの転移である。
【００２２】
以下：血管新生／新血管形成によって特徴付けられる様々な型の眼部又は非眼部疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、糖尿病性腎症、慢性炎症性疾患（例えばＩＢＤ）、関節リウマチ及び骨関節炎のいずれかを予防又は治療する方法を本明細書で提供する。一実施形態では、血管新生又は血管新生依存性疾患若しくは障害の抑制は、その疾患若しくは障害と関係がある症状を緩和する。別の実施形態では、血管新生又は血管新生依存性疾患若しくは障害の抑制は患者の機能をもたらす。治療する眼部組織は、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性症又は血管新生緑内障を有する患者の網膜組織であり、抑制される血管新生は網膜組織の新血管形成がある網膜組織血管新生である。
【００２３】
方法は更に、外科手術による腫瘍の除去及び／又は１つ若しくは複数の抗癌剤の投与を含むことができる。他の抗癌剤は、本明細書に記載する組成物の投与の前、それと同時に、又はその後に投与することができる。他の抗癌剤は、組成物投与前の一週間以内、組成物投与後の一週間以内に投与することができ、或いは他の抗癌剤は、組成物と同日に投与することができる。他の抗癌剤を組成物と同日に投与する場合、投与は同時であってよい。
【００２４】
血管新生を抑制するのに十分な治療有効量の本明細書に記載する１つ又は複数の組成物を細胞又は組織に接触させることによって、血管新生を抑制する方法を本明細書で提供する。腫瘍細胞の増殖を抑制するのに十分な治療有効量の本明細書に記載する１つ又は複数の組成物を腫瘍細胞に接触させること、又はそれを対象に投与することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を本明細書で提供する。
【００２５】
本明細書に記載する１つ又は複数の組成物を組織に接触させることを含み、接触が血管新生、細胞増殖、増殖、細胞分裂などを抑制する方法を本明細書で提供する。組織は培養組織生検サンプルであってよく、又は対象中に存在してよい。
【００２６】
細胞増殖障害を有する対象又は細胞増殖障害を有するリスクがある対象に、細胞増殖障害を治療するのに有効な有効量の本明細書に提供する１つ又は複数の組成物を投与することによって、細胞増殖障害を予防又は治療する方法を本明細書で提供する。細胞増殖障害は例えば良性又は悪性の固形又は非固形腫瘍である可能性があり、腫瘍は転移性又は非転移性である可能性がある。治療は対象の状態の改善をもたらすことができ、１つ又は複数の以下の要因：細胞増殖の低下、細胞数の低下、アポトーシスの増大、又は細胞増殖障害を含む細胞の少なくとも一部分の生存の低下が発生したかどうか決定することによって評価することができる。１つ又は複数のこれらの発生は、いくつかの場合、腫瘍又は転移の部分的又は完全排除及び患者の生存期間の延長をもたらす可能性がある。
【００２７】
治療有効量の本明細書に提供する１つ又は複数の組成物を対象に投与することによって、患者中の糖尿病性網膜症、黄斑変性症、脈絡膜血管新生又は血管新生緑内障を治療するための方法を本明細書で提供する。治療は対象の状態の改善をもたらすことができ、１つ又は複数の以下の要因：黄斑浮腫の低下、ＣＮＶ領域の減少、又は視力の増大が発生したかどうか決定することによって評価することができる。
【００２８】
別の態様は、本明細書に記載する１つ又は複数の組成物による対象中の慢性炎症性疾患の治療である。慢性炎症性疾患の非制限的な例には、ＩＢＤ、クローン病、及び潰瘍性大腸炎がある。
【００２９】
別の態様は、本明細書に記載する１つ又は複数の組成物の投与による対象中の関節リウマチの治療である。
【００３０】
別の態様は、本明細書に記載する１つ又は複数の組成物の投与による対象中の骨関節炎の治療である。
【００３１】
関節リウマチ及び／又は骨関節炎を有する対象の治療は、公開されたガイドラインに従い測定した適切なカテゴリーのＡＣＲスコアの改善を含めた、様々な手段によって評価することができる。
【００３２】
本明細書に提供する方法では、治療する対象はヒト又は非ヒト対象であってよい。本明細書に提供する組成物及び抗癌剤又は治療剤は、患者の健康状態、疾患又は状態の進行、及び治療の有効性に応じて一回又は多数回投与することができる。療法及び治療に対する調節は治療過程を通じて行うことができる（例えば、組成物中の抗体の用量）。
【００３３】
組成物は、例えば皮下、皮下、硝子体内、皮内、静脈内、動脈内投与、腹腔内又は筋肉内注射などによって、局所、領域又は全身に投与することができる。
【００３４】
更に、キメラ抗エンドグリン抗体を、ＶＥＧＦ経路を阻害する他の知られている治療剤及び／又は抗ＶＥＧＦ抗体と併用して使用することもできる。このような化合物の例には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがあるが、これらだけには限られない。
【００３５】
更に、本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を、癌を治療するための他の知られている治療剤及び／又は化合物と併用して使用することもできる。このような化合物の例には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがあるが、これらだけには限られない。他の療法の例には、照射、外科手術、又は１つ又は複数の化学療法剤の投与があるが、これらだけには限られない。
【００３６】
本明細書に提供する任意の１つ又は複数の方法の有効性をモニタリングする方法を本明細書で提供する。高レベルの可溶性エンドグリンは、癌患者の生存の減少と関連付けられている。したがって一態様では、可溶性エンドグリンのレベルは、治療前及び治療中にモニタリングすることができる。したがって、可溶性エンドグリンのレベルの低下は、治療レジメンが患者を治療する際に有効である１つの指標であり得る。
【００３７】
本出願の一実施形態は、本明細書に記載する任意の組成物を使用して、本明細書に記載する障害を治療するための医薬品を製剤化することを企図する。医薬品は治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づいて製剤化することができ、例えば癌組織の段階に基づいて一回又は複数回の製剤で製剤化することができる。医薬品は病院及びクリニックに配給するのに適したラベルを有する適切なパッケージ中にパッケージすることができ、そのラベルは対象中の本明細書に記載する障害の治療を示すものである。医薬品は一回又は複数回単位としてパッケージすることができる。本明細書に記載する組成物の用量及び投与に関する説明書を、パッケージ中に含めることができる。
【００３８】
参照による組込み
本明細書中に言及する全ての刊行物及び特許出願は、他に具体的に記さない限り、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が参照として全容が組み込まれることが具体的且つ個別に示される場合と同程度に、参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５シグナル伝達経路のダイアグラムを与える図である。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５経路（Ａ）は細胞増殖の阻害をもたらす。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路（Ｂ）は内皮細胞増殖を誘導し、ＡＬＫ１シグナル伝達にＣＤ１０５（エンドグリン）を必要とする。点線は不活性又は遮断経路を示す。太い矢印はシグナル伝達経路の刺激を示す。
【図２】本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体（ＴＲＣ１０５）のアミノ酸配列を与える図である。図２Ａはキメラ抗エンドグリン抗体の代表的な可変軽鎖（配列番号１）の図である。図２Ｂはキメラ抗エンドグリン抗体の代表的な定常軽鎖（配列番号２）の図である。図２Ｃはキメラ抗エンドグリン抗体の代表的な可変重鎖（配列番号３）の図である。図２Ｄはキメラ抗エンドグリン抗体の代表的な定常γ１重鎖（配列番号４）の図である。
【図３】コラーゲンに接種したＨＵＶＥＣ細胞スフェロイドを使用すると、ＴＲＣ１０５は用量依存的にＶＥＧＦ誘導型簇出を阻害することを示す図である（Ｎ＝３）。
【図４】ＴＲＣ１０５はＶＥＧＦ誘導型簇出を遮断する一方で（対角線のハッチング）、それはＨＵＶＥＣスフェロイドのｂＦＧＦ誘導型簇出を阻害しないことを示す図である（菱形のハッチング）（Ｎ＝２）。
【図５】ＶＥＧＦ誘導型簇出に対するＴＲＣ１０５の阻害効果（対角線のハッチング）は、ＶＥＧＦ阻害剤ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）との併用時に、ＨＵＶＥＣ簇出が完全に阻害されるように高まることを示す図である（菱形のハッチング）。
【図６】ＶＥＧＦ誘導型簇出に対するＴＲＣ１０５の阻害効果（対角線のハッチング）は、ＶＥＧＦ受容体キナーゼの阻害剤との併用時には高まらないことを示す図である（菱形のハッチング）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本出願は個々の処方又はプロセスパラメーターに限られないことは理解されよう。当然ながら、それらは変わる可能性があるからである。本明細書で使用する用語は単に個々の実施形態を記載する目的であり、限定的であることを意図するものではないことも理解されよう。更に、本明細書に記載する方法及び材料と類似又は均等ないくつかの方法及び材料は、本発明を実施する際に使用することができることは理解される。
【００４１】
本出願によれば、当技術分野で完全に説明されるように、従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技法を利用することができる。
【００４２】
キメラ抗エンドグリン抗体を抗ＶＥＧＦ剤と併用して使用して、様々な型の癌、固形腫瘍、及び転移などを治療又は予防することができる。本明細書に記載する組成物の投与によって、様々な型の癌、固形腫瘍、及び転移などを治療する方法を本明細書で記載する。本明細書に記載する組成物は、血管を収縮する、疾患と関係がある内皮細胞増殖を阻害する、及び／又は血管漏出を防ぐこともできる。
【００４３】
抗体に関する用語
本明細書で使用する用語「抗体」は、天然又は部分的若しくは完全に合成によって産生されたものであれ免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。この用語は、抗原結合ドメインである、又はそれと相同的である結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質も含む。この用語は、「抗原結合断片」及び以下に記載するような類似の結合断片に関する他の交換可能な用語を更に含む。キメラ抗体もこの用語によって企図される。
【００４４】
天然抗体及び天然免疫グロブリンは通常、２つの同一軽鎖（Ｌ）及び２つの同一重鎖（Ｈ）で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ三量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は典型的には１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合するが、一方でジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。それぞれの重鎖と軽鎖は、規則正しく配置した鎖間ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は、一端に可変ドメイン（「ＶＨ」又は「ＶＨ」）次にいくつかの定常ドメイン（「ＣＨ」又は「ＣＨ」）を有する。それぞれの軽鎖は、一端に可変ドメイン（「ＶＬ」又は「ＶＬ」）及びその他端に定常ドメイン（「ＣＬ」又は「ＣＬ」）を有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと一直線に並び、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一直線に並ぶ。個々のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。
【００４５】
本明細書で使用する用語「合成ポリヌクレオチド」、「合成遺伝子」又は「合成ポリペプチド」は、対応するポリヌクレオチド配列若しくはその一部分、又はアミノ酸配列若しくはその一部分が、設計された、又はｄｅ  ｎｏｖｏ合成された、又は修飾された、同等の本来存在する配列に匹敵する配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド（抗体若しくは抗原結合断片）又は合成遺伝子は、核酸又はアミノ酸配列の化学合成だけには限られないが、これを含めた当技術分野で知られている方法によって調製することができる。合成遺伝子は典型的には、アミノ酸、又はポリヌクレオチドレベルのいずれか（又は両方）で天然に存在する遺伝子と異なり、典型的には合成発現制御配列の状態内に位置する。合成遺伝子ポリヌクレオチド配列は、天然遺伝子と比較して、タンパク質及び異なるアミノ酸を必ずしもコードすることはできず、例えばそれらは、異なるコドンを取り込むが同じアミノ酸をコードする合成ポリヌクレオチド配列も包含することができる（即ち、ヌクレオチドの変化はアミノ酸レベルでのサイレント突然変異を表す）。
【００４６】
抗体に関して、用語「可変ドメイン」は、その個々の抗原に対するそれぞれ個々の抗体の結合及び特異性において使用される抗体の可変ドメインを指す。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体中に均一に分布されているわけではない。そうではなくて、可変性は軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方で（ＣＤＲとしても知られる）超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は「フレーム領域」又は「ＦＲ」と呼ばれる。非修飾重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、結合ループ、及びいくつかの場合β−シート構造の一部を形成する３つのＣＤＲと散在する、主にβ−シート形状をとる４個のＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含有する。それぞれの鎖中のＣＤＲはＦＲと非常に接近して一緒に保たれ、他の鎖由来のＣＤＲは抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），ｐａｇｅｓ６４７−６６９を参照）。
【００４７】
用語「超可変領域」及び「ＣＤＲ」は、本明細書で使用するとき、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは、抗原と相補的に結合しＶＨ及びＶＬ鎖のそれぞれに関してＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として知られる３つの配列領域由来のアミノ酸残基を含む。（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））によれば、軽鎖可変ドメイン中では、ＣＤＲは典型的にはおよそ残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）及び８９〜９７（ＣＤＲＬ３）に相当し、及び重鎖可変ドメイン中では、ＣＤＲは典型的にはおよそ残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）及び９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）に相当する。異なる抗体のＣＤＲは挿入部分を含有する可能性があり、したがってアミノ酸ナンバリングは異なる可能性があることは理解される。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムは、特定残基と結びつけた文字（例えば、軽鎖中のＣＤＲＬ１の２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、２７Ｄ、２７Ｅ、及び２７Ｆ）を利用するナンバリングスキームを用いてこのような挿入を説明し、異なる抗体間のナンバリング中の任意の挿入を反映する。或いは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））によれば、軽鎖可変ドメイン中では、ＣＤＲは典型的にはおよそ残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）及び９１〜９６（ＣＤＲＬ３）に相当し、及び重鎖可変ドメイン中では、ＣＤＲは典型的にはおよそ残基２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）及び９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）に相当する。
【００４８】
本明細書で使用する「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」は、抗原結合のポケット又は溝の一部を形成するフレームワークアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、フレームワーク残基は抗原結合のポケット又は溝の一部であるループを形成し、ループ中のアミノ酸残基は抗原と接触することができる、又は接触することができない。フレームワーク領域はＣＤＲ間の領域を一般に含む。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））によれば、軽鎖可変ドメイン中では、ＦＲは典型的にはおよそ残基０〜２３（ＦＲＬ１）、３５〜４９（ＦＲＬ２）、５７〜８８（ＦＲＬ３）、及び９８〜１０９に相当し、及び重鎖可変ドメイン中では、ＦＲは典型的にはおよそ残基０〜３０（ＦＲＨ１）、３６〜４９（ＦＲＨ２）、６６〜９４（ＦＲＨ３）、及び１０３〜１３３に相当する。軽鎖に関してＫａｂａｔのナンバリングを用いて前に論じたように、重鎖も同様の形式で挿入を説明する（例えば、重鎖中のＣＤＲＨ１の３５Ａ、３５Ｂ）。或いは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））によれば、軽鎖可変ドメイン中では、ＦＲは典型的にはおよそ残基０〜２５（ＦＲＬ１）、３３〜４９（ＦＲＬ２）５３〜９０（ＦＲＬ３）、及び９７〜１０９（ＦＲＬ４）に相当し、及び重鎖可変ドメイン中では、ＦＲは典型的にはおよそ残基０〜２５（ＦＲＨ１）、３３〜５２（ＦＲＨ２）、５６〜９５（ＦＲＨ３）、及び１０２〜１１３（ＦＲＨ４）に相当する。
【００４９】
抗体の定常ドメイン（Ｆｃ）は抗体と抗原の結合には直接関与しないが、そうではなくて、例えばＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用による抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示す。Ｆｃドメインは、患者への投与後循環中に、抗体の生物学的利用能を増大することもできる。ヒトＦｃドメインとマウスＦｃドメインの置換もＨＡＭＡ副反応を減らすことができる。
【００５０】
その重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主なクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメイン（Ｆｃ）はそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元形状はよく知られている。
【００５１】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ又は（「κ」）及びラムダ又は（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の１つに割り当てることができる。
【００５２】
用語「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」又は「抗体の機能的断片」は、本明細書で交互に使用して、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又は複数の断片を指す。このような用語内に含まれる抗体断片の非制限的な例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ断片を含有する二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の１アームのＶＬ及びＶＨドメインを含有するＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４  ５４６）、及び（ｖｉ）単離ＣＤＲがあるが、これらだけには限られない。この定義中に更に含まれるのは、一本の重鎖と一本の軽鎖を含む「２分の１」抗体である。ダイアボディなどの他の型の単鎖抗体も、本明細書に包含される。
【００５３】
「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」成分は、ペプシン及びパパインなどのプロテアーゼでＩｇを処理することによって生成することができ、２本の重鎖それぞれ中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合付近の免疫グロブリンを消化することによって作製される抗体断片を含む。例えば、パパインは２本の重鎖それぞれ中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合上流のＩｇＧを切断して、その中においてＶＬ及びＣＬ（軽鎖定常領域）で構成される軽鎖と、重鎖の定常領域中のＶＨ及びＣＨγ１（γ１）領域で構成される重鎖断片とがジスルフィド結合を介してそれらのＣ末端領域で結合した、２つの相同的抗体断片を作製する。この２つの相同的抗体断片のそれぞれがＦａｂ’と呼ばれる。ペプシンも２本の重鎖それぞれ中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合下流のＩｇＧを切断して、その中で２つの前述のＦａｂ’がヒンジ領域で結合した断片よりわずかに大きい抗体断片を作製する。この抗体断片はＦ（ａｂ’）２と呼ばれる。
【００５４】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステイン（単数又は複数）を含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基を加えることによって、Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、その中で定常ドメインのシステイン残基（単数又は複数）が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、本来はその間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００５５】
「Ｆｖ」は、完全抗原認識及び抗原結合部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、強力な、非共有又は共有結合状態の１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる（ジスルフィド結合したＦｖ’は当技術分野で記載されている。Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：１２３９−１２４５）。それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するのは、この形状中である。集合的に、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれ由来の１つ又は複数のＣＤＲの組合せは、抗体に抗原結合特異性を与える。例えばＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３は、レシピエント抗体又はその抗原結合断片のＶＨ鎖及びＶＬ鎖に移すと、抗体に抗原結合特異性を与えるのに十分である可能性があること、及びＣＤＲのこの組合せは、本明細書に記載する任意の技法を使用して結合、親和性などに関して試験することができることは、例えば理解されよう。１つの可変ドメイン（又は、抗原に特異的なわずか３つのＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえ、第二の可変ドメインと組合せたときよりおそらく低い親和性ではあるが、抗原を認識しそれと結合する能力を有する。更に、Ｆｖ断片の２ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）は別個の遺伝子によってコードされるが、ＶＬ及びＶＨ領域が対になり一価分子を形成する一本のタンパク質鎖としてそれらを作製することができる合成リンカーによる組換え法を使用して、それらを接合することができる（単鎖Ｆｖとして知られる（ｓｃＦｖ）；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；及びＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７８）。このようなｓｃＦｖｓも、用語抗体の「抗原結合部分」内に包含されると考えられる。特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨ及びＶＬ配列をＦｃ領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列と結合させて、完全Ｉｇ（例えばＩｇＧ）分子又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを作製することが可能である。ＶＨ及びＶＬは、タンパク質化学又は組換えＤＮＡ技術のいずれかを使用して、Ｆａｂ、Ｆｖ又はＩｇの他の断片の作製において使用することもできる。
【００５６】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは一本のポリペプチド鎖中に存在する。いくつかの実施形態では、ＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これはｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの総説に関しては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．  ２６９−３１５（１９９４）を参照。
【００５７】
用語「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」は、抗体及び抗体断片と無関係であり、いくつかのモジュラー、及びＡドメイン（クラスＡモジュール、相補型反復、又はＬＤＬ受容体クラスＡドメインとも呼ばれる）と呼ばれる再利用可能結合ドメインで構成される、ヒト起源クラスの治療用タンパク質を指す。それらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏエクソンシャッフリング及びファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインから開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３−１４９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。生成するタンパク質は、１エピトープ結合タンパク質と比較して改善された親和性（いくつかの場合、ナノモル未満）及び特異性を示す可能性がある、多数の独立した結合ドメインを含有することができる。例えば、その各々が参照として全容が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号、同第２００５／０１６４３０１号、同第２００５／００５３９７３及び同第２００５／００８９９３２号、同第２００５／００４８５１２号、及び同第２００４／０１７５７５６号を参照。
【００５８】
知られている２１７ヒトＡドメインのそれぞれは約３５アミノ酸（約４ｋＤａ）を含み、これらのドメインは平均５アミノ酸長のリンカーによって隔てられている。天然Ａドメインは、カルシウム結合及びジスルフィド形成によって主に仲介される均一な安定構造に、迅速且つ効率よくフォールディングする。わずか１２アミノ酸の保存足場モチーフは、この共通構造に必要とされる。最終結果は、そのそれぞれが別個の機能を示す多数のドメインを含有する１タンパク質鎖である。タンパク質のそれぞれのドメインは独立して結合し、それぞれのドメインのエネルギー貢献は付加的である。これらのタンパク質は、親和性多量体からＡＶＩＭＥＲ（商標）と呼ばれた。
【００５９】
用語「ダイアボディ」は２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、それらの断片は同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上において２ドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えばＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４  ６４４８（１９９３）中により完全に記載される。
【００６０】
抗原結合ポリペプチドは、例えばラクダ及びサメ由来の抗体などの重鎖二量体も含む。ラクダ及びサメ由来の抗体は、Ｖ様ドメインとＣ様ドメイン（いずれも軽鎖を有さない）の二本鎖のホモ二量体対を含む。ラクダにおける重鎖二量体ＩｇＧのＶＨ領域は軽鎖と疎水性相互作用する必要はないので、軽鎖と通常接触する重鎖中の領域はラクダ中では親水性アミノ酸残基に変わる。重鎖二量体ＩｇＧのＶＨドメインはＶＨＨドメインと呼ばれる。サメＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと呼ばれる）及び５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）のホモ二量体を含む。ラクダでは、抗体レパートリーの多様性は、ＶＨ又はＶＨＨ領域中のＣＤＲ１、２、及び３によって決定する。ラクダＶＨＨ領域中のＣＤＲ３は、その比較的長い長さ、平均１６アミノ酸によって特徴付けられる（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（９）：１１２９）。これは、多くの他種の抗体のＣＤＲ３領域と対照的である。例えば、マウスＶＨのＣＤＲ３は平均９アミノ酸を有する。ラクダの可変領域のｉｎ  ｖｉｖｏ多様性を維持するラクダ由来抗体可変領域のライブラリーは、例えば米国特許出願第２００５００３７４２１号中に開示された方法によって作製することができる。
【００６１】
「キメラ」型の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒトＩｇ由来の最小配列を含有するキメラ抗体を含む。大部分に関して、キメラ抗体は、その中で少なくとも一部分の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれが、マウスＦｃの代わりに挿入されたマウス抗体である。詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照。
【００６２】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に相同な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、その集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る考えられる天然突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、１つの抗原部位を対象とする。更に、異なる抗原決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含む可能性がある、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の１つの抗原決定基を対象とする。修飾語「モノクローナル」は、実質的に相同な抗体の集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈すべきでない。例えば、モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、又は組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。特定の実施形態では、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）中に記載された技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーからモノクローナル抗体を単離することができる。
【００６３】
飽和硫酸アンモニウム沈殿、ユーグロビン沈殿法、カプロン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２）、又は以下でより詳細に記載するように抗Ｉｇカラム又はプロテインＡ、Ｇ若しくはＬカラムを使用する親和性クロマトグラフィーによって、前述のように培養上清又は腹水から抗体を単離し精製することができる。
【００６４】
免疫グロブリン分子の構築時に、可変領域又はその一部分を、１つ又は複数の定常領域又はその一部分と融合、結合、又は他の場合は接合させて、本明細書に記載する任意の抗体を産生することが可能である。これは、分子クローニング技法又は分子をコードする核酸の直接合成だけには限らないが、これらを含めた、当技術分野で知られている様々な方法で実施することができる。
【００６５】
本明細書で使用する「免疫反応物質」は、アミノ酸残基の配列（「結合部位」又は「エピトープ」）に特異的である、ただし他のペプチド／タンパク質と交差反応し、それらがヒトへの投与用途のために製剤化されるレベルで毒性ではない場合、結合剤、抗体又はその断片を指す。用語「結合」は、塩架橋及び水架橋などの相互作用及び任意の他の従来結合手段を含めた、例えば生理条件下での共有、静電気、疎水性、並びにイオン及び／又は水素結合相互作用による、２分子間の直接結合を指す。用語「優先的に結合」は、結合剤が、それが無関係なアミノ酸配列と結合するより高い親和性で、結合部位と結合することを意味する。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する結合剤の親和性より、少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、又は少なくとも１０００倍高い可能性がある。用語「免疫反応性」と「優先的に結合」は本明細書で交互に使用する。
【００６６】
本明細書で使用する用語「親和性」は、２つの作用物質の可逆的結合に関する平衡定数を指し、Ｋｄとして表す。エピトープに対する抗体の親和性などの、リガンドに対する結合タンパク質の親和性は、例えば約１００ナノモル（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ〜約１フェトモル（ｆＭ）であってよい。本明細書で使用する用語「親和力」は、希釈後の解離に対する２つ以上の作用物質の複合体の耐性を指す。見かけの親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者が精通している任意の他の技法などの方法によって決定することができる。親和力は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析又は当業者が精通している任意の他の技法などの方法によって決定することができる。
【００６７】
「エピトープ」は、抗体の可変領域結合ポケットとの結合相互作用を形成することができる、抗原又は他のマクロ分子のその部分を指す。このような結合相互作用は、１つ又は複数のＣＤＲの１つ又は複数のアミノ酸残基との分子間接触として現れる可能性がある。抗原結合は、例えば、ＣＤＲ３若しくはＣＤＲ３対、又はいくつかの場合、ＶＨ及びＶＬ鎖の最大６個全てのＣＤＲの相互作用を含み得る。エピトープは直線状ペプチド配列（即ち「連続的」）であってよく、又は非隣接アミノ酸配列（即ち、「立体的」又は「不連続」）で構成されてよい。抗体は１つ又は複数のアミノ酸配列を認識することができ、したがってエピトープは２つ以上の異なるアミノ酸配列を画定することができる。抗体によって認識されるエピトープは、当業者によく知られるペプチドマッピング及び配列分析技法によって決定することができる。結合相互作用は、ＣＤＲの１つ又は複数のアミノ酸残基との分子間接触として現れる。ＴＲＣ１０５は、米国特許第５，９２８，６４１号、同第６，２００，５６６号、同第６，１９０，６６０号、及び同第７，０９７，８３６号中でＹ４−２Ｆ１又はＳＮ６ｊとして記載されたマウス抗体と同じアミノ酸配列である、マウス抗体である。Ｙ４−２Ｆ１及びＳＮ６ｊ、及びしたがってＴＲＣ１０５によって認識されるエピトープは以前に同定されている。
【００６８】
用語「特異的」は、抗体が、その抗体によって認識されるエピトープを含有する抗原以外の分子といかなる有意な結合も示さない状況を指す。この用語は、例えば抗原結合ドメインが、いくつかの抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、その場合抗体はそのエピトープを保有する様々な抗原と結合することが可能である。用語「優先的に結合」又は「特異的に結合」は、抗体が、それが無関係なアミノ酸配列と結合するより高い親和性でエピトープと結合すること、及びエピトープを含有する他のポリペプチドと交差反応する場合、それらがヒトへの投与用途のために製剤化されるレベルでは毒性ではないことを意味する。一態様では、このような親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性より、少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、又は少なくとも１０００倍高い。用語「免疫反応性」、「結合」、「優先的に結合」及び「特異的に結合」は本明細書で交互に使用する。用語「結合」は、塩架橋及び水架橋などの相互作用、及び任意の他の従来結合手段を含めた、例えば生理条件下での共有、静電気、疎水性、並びにイオン及び／又は水素結合相互作用による、２分子間の直接結合を指す。
【００６９】
（「実質的に純粋」と交互に使用する）「単離」は、ポリペプチドに適用するとき、本来又は操作によって、（ｉ）発現ベクターの一部分の発現産物として宿主細胞中に存在する、又は（ｉｉ）タンパク質又はそれが本来結合する化学成分以外の他の化学成分と結合した、又は（ｉｉｉ）本来存在しない、例えば、タンパク質が本来見られない形状であるように、タンパク質に少なくとも１つの疎水性成分を追加、又は付加することによって化学的に操作したタンパク質である、ポリペプチド又はその一部分を意味する。「単離」によって、（ｉ）化学的に合成された、又は（ｉｉ）宿主細胞中で発現され結合及び汚染タンパク質から精製されたタンパク質を更に意味する。この用語は、それらが本来共に存在した他のタンパク質及び核酸から分離されたポリペプチドを一般に意味する。典型的には、それを精製するために使用される抗体又はゲルマトリクス（ポリアクリルアミド）などの物質からも、ポリペプチドは分離される。
【００７０】
血管新生に関する用語
本明細書で使用する用語「血管新生阻害」、「血管新生を阻害する」又は「抗血管新生」は血管発生の阻害を含み、新血管形成の程度、量、又は割合の低下に影響を与えることを意味するものとする。組織中の内皮細胞増殖若しくは移動の程度、量、又は割合の低下に影響を与えることは、血管新生阻害の具体例である。
【００７１】
用語「血管新生阻害組成物」は、内皮細胞移動、増殖、血管形成などの血管新生仲介プロセスを阻害し、その後既存の血管からの新しい血管の発生の阻害をもたらし、結果として血管新生依存的状態に影響を与える組成物を指す。
【００７２】
本明細書で使用する用語「血管新生依存的状態」は、血管新生又は血管発生のプロセスが病的状態を維持若しくは増大し、又は正常な生理的プロセスに有利に影響を与える状態を意味するものとする。したがって、血管新生が病的状態を維持する血管新生依存的状態の治療は疾患の鎮静をもたらすことが可能であり、一方で血管新生が正常な生理的プロセスに有利に影響を与える血管新生依存的状態の治療は、例えば正常プロセスの向上をもたらす可能性がある。
【００７３】
血管新生とは、既存の毛細管又は後毛細管細静脈からの新しい血管の形成である。血管発生は、内皮細胞前駆体である血管芽細胞から生じる新しい血管の形成が原因である。いずれのプロセスも新しい血管の形成をもたらし、用語血管新生依存的状態の意味の中に含まれる。本明細書で使用する用語「血管新生」は、血管発生から生じる血管新生、及び既存の血管、毛細管及び細静脈の枝分かれ又は簇出から生じる血管新生などの、血管のｄｅ  ｎｏｖｏ形成を含むものとする。血管新生は、ＡＬＫ１シグナル伝達及び関連Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化及び／又はシグナル伝達の誘導も含むことができる。ＣＤ１０５もＡＬＫ１シグナル伝達経路に関与することが知られており、したがってこれも血管新生の意味の中に含まれる。
【００７４】
腫瘍開始ＣＤ１０５＋細胞集団はヒト腎臓癌中で発見されている。ＣＤ１０５＋細胞は、他の腫瘍型中に存在する癌幹細胞に関して以前に記載された腫瘍幹細胞の特徴を示した。観察されたＣＤ１０５＋細胞はクローン原性であり、幹細胞マーカーを発現し、分化マーカーを欠いており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで上皮及び内皮細胞型に分化する可能性があり、ｉｎ  ｖｉｖｏで連続移植可能な腫瘍を生成する可能性がある。これらの腫瘍は、間葉系マーカーを発現するクローンに由来するにもかかわらず腫瘍源としての上皮癌であり、ＣＤ１０５＋腫瘍原性集団の維持によって、及び非腫瘍原性の分化したＣＤ１０５集団の存在によって特徴付けられる。
【００７５】
「宿主の免疫応答の誘導」は、患者が疾患の兆候又は症状の緩和又は低減を経験することを意味し、具体的には、生存期間の延長を非制限的に含む。
【００７６】
本明細書で使用する用語「増殖障害」及び「増殖状態」は、異常又は望ましくない増殖によって特徴付けられる任意の病的又は非病的生理状態を意味する。用語「細胞増殖障害」及び「細胞増殖状態」は、異常又は望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる任意の病的又は非病的生理状態を意味し、且つ望ましくない又は望まない細胞増殖又は細胞生存（例えば、欠損アポトーシスが原因）によって特徴付けられる状態、欠損又は異常又は欠損アポトーシスによって特徴付けられる状態、及び異常又は望ましくない又は望まない細胞生存によって特徴付けられる状態を含む。用語「分化障害」は、異常又は欠損分化によって特徴付けられる任意の病的又は非病的生理状態を意味する。
【００７７】
治療の影響を受けやすい増殖又は分化障害は、異常又は望ましくない細胞数、細胞増殖又は細胞生存によって特徴付けられる、良性及び新生物性の疾患状態を含む。したがって、このような障害又は状態は疾患状態を構成する可能性があり、全ての型の癌増殖又は発癌プロセス、転移性組織又は悪性形質転換細胞、組織、又は器官を含む。
【００７８】
増殖又は分化障害を含む細胞は細胞塊に凝集する、又は散在する可能性がある。「非固形腫瘍」は、リンパ腫、ミエローマ及び白血病、又は本来広汎性の新形成などの、造血系の新形成を指す。それらは典型的には固形塊を形成しないからである。白血病の個々の例には、例えば、急性及び慢性リンパ性白血病、骨髄芽球性及び多発性骨髄腫がある。
【００７９】
用語「固形腫瘍」は、典型的には１つに凝集し塊を形成する新形成又は転移を指す。このような障害は、ほぼ任意の細胞又は組織型に影響を与える可能性がある新生物又は癌、例えば癌腫、肉腫、メラノーマ、転移性障害又は造血系新形成障害を含む。転移性腫瘍は、乳房、肺、甲状腺、頭頸部、脳、リンパ、胃腸（口、食道、胃、小腸、結腸、直腸）、尿生殖器官（子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、骨、筋肉、皮膚などだけには限られないが、これらを含めた多数の原発性腫瘍型から生じる可能性がある。
【００８０】
癌腫は上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍を指し、呼吸系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、睾丸癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、及びメラノーマを含む。例示的な癌腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、肝臓及び卵巣から形成される癌腫がある。この用語は、例えば癌腫及び肉腫組織で構成される悪性腫瘍を含む、癌肉腫も含む。腺癌は、腺組織の癌腫、又は腫瘍が腺様構造を形成する癌腫を含む。
【００８１】
治療される癌組織は、例えば異常なレベルのエンドグリンを発現する内皮組織である。本明細書で使用する用語「形質転換細胞」は、無制限な増殖の状態に自然に転換されている細胞を指し、即ちそれらは、培養中に無限数の分裂によって増殖する能力を獲得している。形質転換細胞は、それらの増殖制御の消失に関して新形成、退形成及び／又は過形成などの用語によって特徴付けることができる。本発明の目的で、用語「悪性哺乳動物細胞の形質転換した表現型」及び「形質転換した表現型」は、哺乳動物細胞の細胞形質転換、不死化、形態的又は増殖形質転換、及び細胞培養中の長期増殖、半固形培地中での増殖、又は免疫不全若しくは同系動物中での発癌性増殖によって検出される発癌性と関係がある以下の表現型形質のいずれかだけには限られないが、これらを含むものとする。
【００８２】
用語「腫瘍細胞抗原」は、無関係な腫瘍細胞、正常細胞、又は正常体液より、腫瘍細胞上又は体液中に多量に存在する抗原として本明細書では定義する。抗原の存在は当業者に知られている任意の数のアッセイによって試験することができ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、又はウエスタンブロットなどの、抗体を用いた陰性及び／又は陽性選択を非制限的に含む。
【００８３】
用語「アポトーシス」又は「プログラムされた細胞死」は、それによって望まない若しくは無用な細胞が、発生及び他の正常な生物学的プロセス中に除去される生理プロセスを指す。アポトーシスは、正常な生理条件下で起こる細胞死の一形態であり、細胞は自己の消滅への積極的な参加者である（「細胞の自殺」）。アポトーシスは、正常な細胞ターンオーバー及び組織ホメオスタシス、胚発生、免疫寛容の誘導及び維持、神経系の発生及びエンドグリン依存性組織萎縮中に最も頻繁に見られる。アポトーシスを経る細胞は、特徴的な形態的及び生化学的特徴を示す。これらの特徴には、クロマチン凝集、核及び細胞質濃縮、リボソーム、形態学的に完全なミトコンドリア及び核物質を含有する膜結合小胞（アポトーシス体）への細胞質及び核の分配がある。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、これらのアポトーシス体は、マクロファージ、樹状細胞又は隣接上皮細胞により迅速に認識され貪食される。ｉｎ  ｖｉｖｏでアポトーシス細胞を除去するのに有効なこのメカニズムのため、炎症応答が誘導されることはない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、アポトーシス体及び残りの細胞断片は、結局膨張し最終的に溶解する。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞死の末期は「第二次壊死」と呼ばれている。ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの露出、カスパーゼの活性化、シトクロームｃの放出などのような当業者に知られている方法によって、アポトーシスを測定することができる。死を誘導されている細胞は、本明細書では「アポトーシス細胞」と呼ぶ。
【００８４】
「アポトーシス誘導剤」は、アポトーシス／プログラムされた細胞死を誘導すると本明細書では定義し、例えば、細胞、例えば腫瘍細胞又は内皮細胞がプログラムされた細胞死を経るように誘導する、抗エンドグリン抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、照射、化学療法剤又は受容体リガンド剤を含む。例示的なアポトーシス誘導剤は以下でより詳細に記載する。
【００８５】
アポトーシスは、標準的なアネキシンＶアポトーシスアッセイを使用して試験することができる。ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞を６ウエルプレート（ＮＵＮＣ）中で増殖させ、４〜４８時間アンタゴニスト（又は別の抗癌剤と併用して）で照射又は処理し、洗浄し、１時間アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色する。細胞はフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によって分析し、ヨウ化プロピジウムで対比染色し、フローサイトメーターで再度分析する。
【００８６】
抗体を作製及び発現する方法
キメラ免疫グロブリンが遺伝子操作によって構築されている。以前に記載された大部分のキメラ免疫グロブリンは、マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ及びＶＬ並びにヒト抗体のＣＬ及びＦｃを含んでいる。本明細書に記載する任意のアイソタイプ由来のＦｃ領域を使用することができる。本明細書に記載するように、キメラは、それによって軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変鎖のフレームワーク中の限られた数のアミノ酸が修飾されて、抗体の親和性が増大する基準も含み得る。
【００８７】
一般にキメラ抗体は、ヒト療法における用途に関して、マウス抗体に優るいくつかの考えられる利点を有する。抗体のエフェクター部分はヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良く相互作用する（例えば、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）によってより効率よく標的細胞を破壊する）と考えられる。更に、ヒト免疫系は外来としてキメラ抗体の定常領域を認識しないはずであり、したがって、このような注射抗体に対する抗体応答は、典型的には、全く外来のマウス抗体に対する応答未満であるはずである。最後に、マウス抗体は、ヒト抗体の半減期よりはるかに短いヒト循環中の半減期を有することが知られている。おそらくキメラ抗体は、本来存在するヒト抗体と更に類似した半減期を有する可能性があり、より少量で低頻度の投与を与えることを可能にする。
【００８８】
キメラ抗体の高い親和性が望ましいとき、抗体のＣＤＲ内の残基を、他のアミノ酸で更に置換することができる。典型的には、ＣＤＲ中の４個を超えないアミノ酸残基が変わり、最も典型的には、重鎖ＣＤＲ２を除いたＣＤＲ中の２個を超えない残基が変わり、この場合１０個もの多くの残基が変わる可能性がある。親和性の変化は、本明細書に記載する方法などの従来の方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）によって測定することができる。
【００８９】
キメラ抗体は、当技術分野で知られている従来の技法を使用して構築及び産生することができる。更に、特に高レベルの発現ベクターを利用するとき、組換え調製抗体をしばしば多量に産生することができる。
【００９０】
獣医学的用途のため、非ヒトＦｃを使用することによって、非ヒト（例えば、霊長類、ウシ、ウマ、ブタなど）への投与用に抗体を合成することができる。
【００９１】
制限エンドヌクレアーゼ部位において組換え技法を使用して、アミノ酸配列をコードするヌクレオチドを修飾するために、本明細書で提供し組み込む技法などの当技術分野で認められる技法を使用することができる。
【００９２】
発現用に、発現系は、選択可能マーカーとしてグルタミンシンテターゼ遺伝子を使用してＧＳ系（Ｌｏｎｚａ）を利用する発現系である。簡単に言うと、選択可能マーカーとしてグルタミンシンテターゼ遺伝子を使用しＧＳ系（Ｌｏｎｚａ）を使用して、エレクトロポレーション（２５０Ｖ）によりＣＨＯ細胞においてトランスフェクションを実施する。野生型ＣＨＯ細胞を、１０％透析ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で増殖させる。６×１０７個のＣＨＯ細胞を、エレクトロポレーションによって３００μｇの線状ＤＮＡでトランスフェクトする。エレクトロポレーション後、細胞はグルタミンを含むＤＭＥＭ中に再縣濁し、３６×９６ウエルプレート（５０μｌ／ウエル）に平板培養し、５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートする。翌日、１５０μｌ／ウエルの選択培地（グルタミンを含まないＤＭＥＭ）を加える。約３週間後、陰性対照として無関係な抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ（以下参照）によってコロニーをスクリーニングする。２０μｇ／ｍｌより多く産生する全てのコロニーは２４ウエルプレート、次に二連のＴ２５フラスコに増殖させる。
【００９３】
高レベルの産生用に、広く使用される哺乳動物発現系は、デヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（「ｄｈｆｒ−」）チャイニーズハムスター卵巣細胞によってもたらされる遺伝子増幅手順を利用する発現系である。この系は、テトラヒドロ葉酸へのデヒドロ葉酸の転換を触媒するＤＨＦＲ酵素をコードする、デヒドロ葉酸レダクターゼ「ｄｈｆｒ」遺伝子に基づく。高い産生を得るために、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を、機能性ＤＨＦＲ遺伝子、及び所望のタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトする。この場合、所望のタンパク質は組換え抗体重鎖及び／又は軽鎖である。
【００９４】
競合ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサート（ＭＴＸ）の量を増大することによって、ｄｈｆｒ遺伝子を増幅することにより、組換え細胞は耐性が発達する。標準的な場合、利用する増幅単位はｄｈｆｒ遺伝子のサイズよりはるかに大きく、結果として抗体重鎖が同時に増幅される。
【００９５】
抗体鎖などのタンパク質の大規模産生が望ましいとき、利用する細胞の発現レベルと安定性の両方を考慮に入れる。長期培養中、組換えＣＨＯ細胞集団は、それらが片親クローンに由来するときでさえ、増幅中にそれらの特異的抗体産生に関する均一性を失う。
【００９６】
本出願は、本明細書に記載する抗体又はその一部分をコードする単離ポリヌクレオチド（核酸）、このようなポリヌクレオチドを含有するベクター、並びにポリペプチドにこのようなポリヌクレオチドを転写及び翻訳するための宿主細胞及び発現系を提供する。
【００９７】
本出願は、前述の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの型の構築物も提供する。
【００９８】
本出願は、前述の１つ又は複数の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。本明細書に記載する任意の抗体をコードする核酸は本出願の一態様を形成し、そのコード核酸からの発現を含む抗体の産生法も同様である。適切な条件下で核酸を含有する組換え宿主細胞を培養することによって、発現を好都合に実施することができる。発現による産生後、抗体又はその一部分は、任意の適切な技法を使用して単離及び／又は精製することができ、次いで必要に応じて使用することができる。
【００９９】
特異的抗体（又はその一部分）をコードする核酸分子及び本明細書に記載するそれらを含有するベクターは、例えばそれらの本来の環境から、実質的に純粋又は均質な形態で、単離及び／又は精製して提供することができる。核酸の場合は、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の、元の核酸又は遺伝子を含まない又は実質的に含まない。核酸配列はＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができ、完全又は部分的に合成状態であってよい。精製の方法は当技術分野でよく知られている。
【０１００】
様々な異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニング及び発現のための系はよく知られている。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母及びバキュロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現に関して当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウスミエローマ細胞及びその他多くがあるが、これらだけには限られない。
【０１０１】
広く様々な単細胞宿主細胞もＤＮＡ配列の発現において有用である。これらの宿主は、よく知られている真核生物及び原核生物宿主、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株など、酵母などの真菌、及びＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳ０、ＳＰ２／０、Ｒｌ．ｌ、Ｂ−Ｗ及びＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、及びＢＭＴ１０）などの動物細胞、昆虫細胞（例えばＳｆ９）、並びに組織培養中のヒト細胞及び植物細胞を含む。
【０１０２】
大腸菌などの原核生物細胞中での抗体又はその一部分の発現は、当技術分野で十分確立している。総説に関しては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：５４５−５５１（１９９１）を参照。
【０１０３】
培養中の真核生物細胞中での発現も、本明細書に記載する抗体の産生に関する選択肢として当業者には利用可能である。最新の総説に関しては、例えば、その各々が参照として全容が本明細書に組み込まれる、Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ６：５５３−５６０を参照。
【０１０４】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含めた適切な制御配列を含有する、適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、又はファージミドであってよい。更なる詳細に関しては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。例えば核酸構築物の調製において核酸を操作するための、多くの知られている技法及びプロトコール、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、及びタンパク質の分析は、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２中に詳細に記載される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌの方法の開示は参照として全容が本明細書に組み込まれ、当技術分野でよく知られている。
【０１０５】
したがって、更なる態様は、本明細書で開示する核酸を含有する宿主細胞を提供する。別の更なる態様は、宿主細胞にこのような核酸を導入することを含む方法を提供する。導入は任意の利用可能な技法を利用することができる。真核生物細胞に関して、適切な技法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、レトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニア、又は昆虫細胞用にバキュロウイルスを使用するリポソーム仲介トランスフェクション及び形質導入を含むことができる。細菌細胞に関して、適切な技法は、例えば、バクテリオファージを使用する、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びトランスフェクションを含むことができる。
【０１０６】
例えば遺伝子発現用の条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を発生又は可能にした後に導入を続けることができる。
【０１０７】
一実施形態では、核酸を宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込む。標準的な技法に従いゲノムでの組換えを促進する配列を封入することによって、組込みを促進することができる。Ｉｇエンハンサーを必要に応じて初期化して発現を最大にすることができる。
【０１０８】
本出願は、発現系中で前述の構築物を使用して前述の抗体（又はその一部分）を発現させることを含む方法も提供する。
【０１０９】
本出願は、エンドグリンと結合するキメラ抗体をコードする、組換えＤＮＡ分子又はクローン遺伝子、又はその変性変異体、突然変異体、アナログ、又はその断片などの単離核酸にも関する。
【０１１０】
更なる実施形態では、本明細書に記載する抗体又はその一部分の組換えＤＮＡ分子又はクローン遺伝子の完全ＤＮＡ配列を、適切な宿主中に導入することができる発現制御配列に作動可能に連結させることが可能である。したがって本出願は、抗体のＶＨ、ＶＬ、ＣＬ及び／又はＦｃをコードするＤＮＡ配列を含むクローン遺伝子又は組換えＤＮＡ分子で形質転換した単細胞宿主に広がる。
【０１１１】
別の特徴は、本明細書に開示するＤＮＡ配列の発現である。当技術分野でよく知られているように、ＤＮＡ配列を適切な発現ベクター中の発現制御配列に作動可能に連結させ、その発現ベクターを利用して適切な単細胞宿主を形質転換することによって、ＤＮＡ配列を発現させることが可能である。
【０１１２】
発現制御配列とＤＮＡ配列のこのような作動可能な連結は、当然ながら、すでにＤＮＡ配列の一部ではない場合、ＤＮＡ配列の上流において適切なリーディングフレームで、開始コドン、ＡＴＧを与えることを含む。
【０１１３】
ポリヌクレオチド及びベクターは、単離及び／又は精製型で提供することができる（例えば、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外の、元のポリヌクレオチドを含まない又は実質的に含まない）。本明細書で使用する、「実質的に純粋」及び「実質的に含まない」は、例えば約２０％以下の異物、約１０％以下の異物、約５％以下の異物、約４％以下の異物、約３％以下の異物、約２％以下の異物、又は約１％以下の異物を含有する溶液又は縣濁液を指す。
【０１１４】
広く様々な宿主／発現ベクターの組合せを、本発明のＤＮＡ配列の発現において利用することができる。有用な発現ベクターは、例えば染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントからなる可能性がある。適切なベクターには、ＳＶ４０及び知られている細菌プラスミドの誘導体、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌＥｌ、Ｐｃｒ１、Ｐｂｒ３２２、Ｐｍｂ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド、ファージＤＮＡ、例えばファージλ、例えばＮＭ９８９の多数の誘導体、及び他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及び繊維状単鎖ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、２ｕプラスミド又はその誘導体など、真核生物細胞中で有用なベクター、昆虫又は哺乳動物細胞中で有用なベクターなど、プラスミドＤＮＡとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列などを利用するように修飾されたプラスミドなどがあるが、これらだけには限られない。
【０１１５】
１つ又は複数のポリヌクレオチド構築物を含む組換え宿主細胞も本明細書で提供する。本明細書で提供する抗体をコードするポリヌクレオチドは本出願の一態様を形成し、１つ又は複数のポリヌクレオチドからの発現を含む抗体の産生法も同様である。例えば、適切な条件下でポリヌクレオチドを含有する組換え宿主細胞を培養することによって、発現を実施することができる。次いで抗体は任意の適切な技法を使用して単離及び／又は精製することができ、必要に応じて使用することができる。
【０１１６】
任意の広く様々な発現制御配列、それと作動可能に連結したＤＮＡ配列の発現を制御する配列をこれらのベクター中で使用して、ＤＮＡ配列を発現させることが可能である。このような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ又はアデノウイルス、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系の初期又は後期プロモーター、ファージλの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖系酵素に関するプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えばＰｈｏ５）のプロモーター、酵母接合因子のプロモーター、及び原核生物又は真核生物細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、及びそれらの様々な組合せがある。
【０１１７】
全てのベクター、発現制御配列及び宿主が、十分等しく機能して、ＤＮＡ配列を発現するわけではないことは理解されよう。全ての宿主が、同じ発現系で十分等しく機能するわけでもない。しかし当業者は、本出願の範囲から逸脱せずに、過度の実験なしで適切なベクター、発現制御配列及び宿主を選択して、望ましい発現を実施することが可能である。例えばベクターを選択する際に、宿主は考慮しなければならない。ベクターはその中で機能しなければならないからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び抗体マーカーなどのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現も考慮する。当業者は、本出願の範囲から逸脱せずに、適切なベクター、発現制御配列及び宿主を選択して、望ましい発現を実施することが可能である。例えばベクターを選択する際には、宿主を考慮する。ベクターはその中で機能するからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び抗体マーカーなどのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現も考慮することができる。
【０１１８】
本出願は、前述の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書中の他の箇所に記載するプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの型の構築物も提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含めた適切な制御配列を含有する、適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、ファージミドなどであってよい。更なる詳細に関しては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。例えば核酸構築物の調製において核酸を操作するための、多くの知られている技法及びプロトコール、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、及びタンパク質の分析は、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２中に詳細に記載される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌの方法及び開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
発現制御配列を選択する際に、様々な要因が通常考慮される。これらは、例えば、系の相対的な強さ、その制御能力、及び発現される特定ＤＮＡ配列又は遺伝子との、特に考えられる二次構造に関するその適合性を含む。適切な単細胞宿主は、例えば、選択したベクターとのそれらの適合性、それらの分泌特性、タンパク質を正確にフォールディングするそれらの能力、及びそれらの発酵要件、及び発現されるＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、及び発現産物の精製し易さを考慮して選択される。
【０１２０】
更なる態様は、本明細書で開示する１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。別の更なる態様は、任意の利用可能な技法によって、宿主細胞にこのような１つ又は複数のポリヌクレオチドを導入することを含む方法を提供する。真核生物細胞に関して、適切な技法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、レトロウイルス又は他のウイルス（例えばワクシニア）、又は昆虫用にバキュロウイルスを使用するリポソーム仲介トランスフェクション及び形質導入を含むことができる。細菌細胞に関して、適切な技法は、例えば、バクテリオファージを使用する、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びトランスフェクションを含むことができる。
【０１２１】
例えば１つ又は複数のポリヌクレオチドからの１つ又は複数のポリペプチドの発現用の条件下で宿主細胞を培養することによって、１つ又は複数のポリヌクレオチドからの発現を発生又は可能にした後に導入を続けることができる。誘導系を使用することができ、発現は活性剤を加えることによって誘導することができる。
【０１２２】
一実施形態では、ポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込むことができる。標準的な技法に従いゲノムでの組換えを促進する配列を封入することによって、組込みを促進することができる。別の実施形態では、宿主細胞中のエピソームベクター上に核酸を維持する。
【０１２３】
発現系中で前述の構築物を使用して特定ポリペプチドを発現させることを含む方法を、本明細書で提供する。
【０１２４】
これら及び他の要因を考慮して、当業者は、発酵又は大規模動物培養においてＤＮＡ配列を発現する様々なベクター／発現制御配列／宿主の組合せを構築することが可能である。
【０１２５】
抗体又はその一部分をコードするポリヌクレオチドは、クローニングに加えて、又はクローニングではなく、組換えによって／合成によって調製することができる。適切なコドンを用いてポリヌクレオチドを設計することができる。一般に、配列が発現に使用される場合、目的の宿主に好ましいコドンを選択する。完全なポリヌクレオチドは、標準的な方法によって調製した重複オリゴヌクレオチドから構築することができ、完全なコード配列に構築することができる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６３１１（１９８４）を参照。
【０１２６】
抗体（又はその一部分）コード核酸と選択したアミノ酸位置変化の同時的取込みは、例えば組換え及び化学合成を含めた、当業者に知られる様々な方法によって実施することができる。
【０１２７】
抗エンドグリン抗体
エンドグリン（ＣＤ１０５）は、１８０ｋＤａのホモ二量体膜貫通タンパク質として細胞表面上で発現される。外部ドメインは高い親和性（５０ｎＭ）でＴＧＦ−β１及び−３アイソフォームと結合し、ＣＤ１０５の膜貫通ドメインと細胞内ドメインはベータグリカンと７１％の配列類似性を共有する。ヒトＣＤ１０５遺伝子は染色体９ｑ３４上に位置し、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して同定され、コード領域は１４のエクソンを含有し、ＴＧＦ−βと結合する能力を有するＣＤ１０５の２つの異なるアイソフォーム（Ｌ及びＳ）が特徴付けされている。６００アミノ酸残基及び１４アミノ酸細胞質尾部からなるＳ−ＣＤ１０５に対して、Ｌ−ＣＤ１０５は６３３アミノ酸残基及び４７アミノ酸残基細胞質尾部からなる。しかし、Ｌ−ＣＤ１０５が主要型である。ＣＤ１０５は内皮細胞中、主にセリン及びスレオニン残基では構成的にリン酸化されており、このリン酸化は細胞内の構成的に活性があるＴＧＦ−βＲＩＩによるものである。ＣＤ１０５とＴＧＦ−βの結合は、タンパク質キナーゼＣ阻害剤で見られる影響と類似した、リン酸化の下方制御をもたらす。ヒトＣＤ１０５アミノ酸配列は、細胞外ドメインの露出領域中に位置するトリペプチドアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含有する。ＲＧＤペプチドは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、Ｉ型コラーゲン、及びフィブリノゲンなどのＥＣＭタンパク質において見られる重要な認識構造であり、細胞表面インテグリンによって認識される。インテグリン接着は、ホメオスタシス、血栓症、血管新生及び炎症、内皮が重要な役割を果たすプロセスと関係している（Ｄｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１７：９８４−９９２（２００３））。
【０１２８】
ＣＤ１０５は、増殖内皮細胞によって発現されるＴＧＦ−β受容体ファミリーのメンバーである。正常レベルのＣＤ１０５が内皮細胞増殖に必要とされる。ＣＤ１０５の発現は、低酸素誘導因子−１−α（ＨＩＦ−１−α）の生成を介した細胞の低酸素状態によって増大し、アポトーシスから低酸素細胞を保護する。ＣＤ１０５のいくつかの機能はＴＧＦ−βシグナル伝達と関係がある。ＴＧＦ−βは、セリンキナーゼ、受容体Ｉ（ＲＩ）、及び受容体ＩＩ（ＲＩＩ）からなるヘテロ二量体受容体を介してシグナル伝達する。受容体の外部ドメインとＴＧＦ−βの結合は、ＴＧＦ−βＲＩをリン酸化し、したがってＳｍａｄタンパク質などの下流シグナル伝達物質と相互作用することができる細胞質ＲＩＩキナーゼ活性を除去する。ＣＤ１０５はＴＧＦ−β受容体複合体の一部を形成するが、それは細胞表面上で独立して存在することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは多くの細胞中で、ＣＤ１０５はＴＧＦ−βシグナル伝達を抑制する。
【０１２９】
ＣＤ１０５は、アクチビンＡ及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−１０、−９、−７及び−２などの他の増殖因子とも結合する。ＣＤ１０５とＴＧＦ−β又は増殖因子リガンドの結合は少なくとも受容体ＲＩＩの存在を必要とし、それはひとりでにリガンドと結合することはできない。受容体とＣＤ１０５結合が、リガンド自体に対するそれらの親和性を変えることはない。結合によって、ＣＤ１０５の細胞質ドメインはＴＧＦ−βＲＩ及びＴＧＦ−βＲＩＩ、次いでＴＧＦ−βＲＩＩではなくＴＧＦ−βＲＩによってリン酸化され、キナーゼは受容体複合体から解離する。
【０１３０】
ＣＤ１０５の発現はＴＧＦ−βＲＩＩのリン酸化レベルを阻害するが、ＴＧＦ−βＲＩのそれは増大させ、Ｓｍａｄ３ではなくＳｍａｄ２の増大したリン酸化をもたらす。Ｓｍａｄ２は様々な転写因子、コアクチベーター、及び抑制物質と相互作用することができるので、リン酸化したＳｍａｄ２は、遺伝子転写を調節する多重シグナルのインテグレーターとして作用することができる。したがって、ＣＤ１０５はＴＧＦ−βＲＩ及びＴＧＦ−βＲＩＩとの相互作用によってＴＧＦ−β機能を調節し、下流Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を改変する。
【０１３１】
ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ）、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）及びアクチビン受容体を含めた、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多数のキナーゼ受容体複合体のシグナル伝達を調節するために作用する。ＣＤ１０５の不在下において、ＴＧＦ−β受容体の活性化は、内皮細胞増殖を阻害するＳＭＡＤタンパク質（ＳＭＡＤ２及び３）のリン酸化をもたらす。しかし、ＴＧＦ−βによるＣＤ１０５の活性化は、（ＳＭＡＤ１、５及び８のリン酸化を含めた）ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化を調節する。最終結果は、内皮細胞に対するＴＧＦ−β受容体活性化の増殖阻害効果の表れである（図１参照）。驚くべきことではないが、抗ＣＤ１０５抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＣＤ１０５活性化の防止は、ＴＧＦ−βと共同作用して内皮細胞の増殖を抑制する。
【０１３２】
ＣＤ１０５プロモーターは２．６ｋｂ長であるが、ＴＡＴＡ又はＣＡＡＴ転写開始ボックスは含有しない。しかし、それは２つのＧＣ多量領域、Ｓｐ１、ｅｔｓ、ＧＡＴＡ、ＡＰ−２、ＮＧＦ−β、及びＭａｄのコンセンサスモチーフ、並びにＴＧＦ−β応答エレメントを有する。それにもかかわらず、ＣＤ１０５は比較的制限された細胞分布を有する。基底レベルの転写は、位置−６８にｅｔｓ部位、及びＳｐ１部位を必要とするようであるが、例えば内皮細胞に対する発現の相対的制限は、多数の制御領域、特に−１２９４〜−９３２における領域、及び転写開始部位と非常に近い別の領域と関係があるようである。ＣＤ１０５はＴＧＦ−βによって上方制御され、これは−３７〜−２９におけるＳｐ１部位を必要とし、（ＴＧＦ−βシグナル伝達によって活性化される）Ｓｍａｄｓ３及び／又は４と結合した１つ又は複数の並列した上流ＳＢＥ部位とも関係があることが示されている。低酸素は虚血組織及び腫瘍の一般的な特徴であり、血管内皮細胞（ＥＣ）中でのＣＤ１０５遺伝子発現の強力な刺激物質である。このような効果はＴＧＦ−β１を併用して高まる。上方制御されたＣＤ１０５は、ＥＣ中で低酸素ストレス下において自己防御的役割を果たすことができる。
【０１３３】
血管ＥＣはＣＤ１０５の主な供給源である。血管平滑筋細胞、線維芽細胞、マクロファージ、前Ｂ及び骨髄単球起源の白血病細胞、及び赤血球前駆体を含めた他の細胞型は、ＣＤ１０５を低い程度で発現する。
【０１３４】
ＣＤ１０５は血管新生に関与する。アンチセンス実験は、ＨＵＶＥＣ中でのＣＤ１０５発現の抑制はＴＧＦ−β１と併用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生の顕著な阻害をもたらすことを実証しており、ＣＤ１０５は内皮細胞中では血管新生促進成分であることを示す。血管新生におけるＣＤ１０５の重要な役割の更なる証拠は、ＣＤ１０５ノックアウトマウスに由来する。ＣＤ１０５欠損マウスは、初期胚段階で死をもたらす血管多重欠損及び心多重欠損を示す。ＣＤ１０５欠損マウス中で観察されるいくつかの血管障害は、ＣＤ１０５は胚外脈管構造中の成熟血管の形成に必要とされることを示し、血管新生におけるエンドグリンの直接的役割が更に確認される。
【０１３５】
特にＣＤ１０５又はｅｄｇ−１としても知られるエンドグリンは、増殖血管内皮細胞において高レベルで発現されるＩ型ホモ二量体膜糖タンパク質である。したがって、エンドグリンは主に、活性血管新生を経る内皮細胞の増殖関連マーカーである。しかし、正常組織の血管内皮によるエンドグリンの限られた発現が存在する可能性がある。ヒトエンドグリンは形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）と特異的に結合することが知られており、エンドグリンの推定アミノ酸配列はβ−グリカン、一型のＴＧＦ−β受容体に対して強い相同性を有する。
【０１３６】
エンドグリン（ＥＤＧ）は腫瘍血管系を減らす抗体ベースの方法における標的となっている。ＥＤＧは、内皮及び白血病細胞上の増殖関連抗原であるからである。その発現は腫瘍関連血管内皮中で上方制御され、ＥＤＧは血管新生に必要不可欠である。血管新生は、新血管形成をもたらす新しい毛細血管の形成、及び既存の血管系の維持を含む。それは、血管基底膜及び間質性マトリクスの内皮細胞仲介分解、内皮細胞の移動、内皮細胞の増殖、及び内皮細胞による毛細血管ループの形成を含む、一連の連続ステップを含む複雑なプロセスである。
【０１３７】
エンドグリンと結合するキメラ抗体を本明細書で提供する。エンドグリンは、既存の血管系を含み支持する細胞、及び新たな血管系の増殖を促進する、その一部となる細胞において見ることができる。これらの抗体は、エンドグリンと結合しそれによって血管新生を阻害することができ、既存の血管系又は既存の血管系の維持を阻害する、及び／又は小血管の拡張を阻害することができる。エンドグリンを精製するためのその使用以外に、これらの抗体は精製、検出及び診断目的、並びに治療目的で有用である。本明細書で提供する抗体は、様々な状態及び疾患を治療するための医薬品の製剤化、前記状態及び疾患を治療するための方法、及び検出又は診断の方法に使用することができる。本明細書で使用する血管新生は、新たな血管の増殖及び／又は発達（新血管形成とも呼ばれる）、小血管の拡張、過剰又は長期血管増殖、及び既存の血管系の維持を含む。血管新生状態及び疾患は、血管新生に関連する、それによって引き起こされる、又はそれと関係がある疾患及び状態を指す。このような疾患の非制限的な例には、例えば様々な型の癌（原発性腫瘍及び転移）がある。
【０１３８】
エンドグリン活性を調節しそれによって血管新生を阻害する及び／又は小血管の拡張を阻害するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、エンドグリンに対して産生されている。これらのマウス抗体は、その各々が参照として全容が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２８，６４１号、同第６，２００，５６６号、同第６，１９０，６６０号、及び同第７，０９７，８３６号中に記載される。更に、これらの抗体のいくつかのｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が実証されている。エンドグリンと結合するモノクローナル抗体は、エンドグリン調節化合物としての対象である。マウス抗体の治療用途は、しかし実現可能ではない。マウス抗体の投与には、例えばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の型での免疫原性を含めた、いくつかの制約があるからである。
【０１３９】
いくつかの抗エンドグリン抗体、特に抗エンドグリンモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）が記載されている。ＭＡｂＳＮ６は、ヒト白血病細胞の細胞膜の糖タンパク質混合物を用いたマウスの免疫処置から作製された抗体である（Ｈａｒｕｔａ  ａｎｄ  Ｓｅｏｎ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：７８９８−７９０２）。ＳＮ６は、ヒトエンドグリンを認識するマウスｍＡｂである。ＭＡｂ４４Ｇ４は、ヒト前Ｂ白血病細胞の全細胞縣濁液を用いたマウスの免疫処置から作製された抗体である（Ｇｏｕｇｏｓ  ａｎｄ  Ｌｅｔａｒｔｅ，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１９２５−１９３３；１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８３６１−８３６４）。４４Ｇ４も、ヒトエンドグリンを認識するマウスｍＡｂである。ＭＡｂＭＪ７／１８は、炎症状態のマウス皮膚を用いたラットの免疫処置から作製された抗体である（Ｇｅ  ａｎｄ  Ｂｕｔｃｈｅｒ，１９９４，上記）。ＭＪ７／１８も、ヒトエンドグリンを認識するｍＡｂである。ｍＡｂＴｅｃ−１１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いたマウスの免疫処置から作製された抗体である（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１６２３−１６３４）。Ｔｅｃ−１１は、ヒトエンドグリン限定の反応性を有するマウスｍＡｂである。それらの特異性を維持及び／又は改善しながら、低い免疫原性を示すエンドグリンと結合するキメラ抗体を、本明細書で記載する。更に、マウス抗体に関する問題に対処するため、それらの特異性を維持及び／又は改善しながら低い免疫原性を示す、エンドグリンと結合し血管新生を低減及び／又は阻害するキメラ抗体を、本明細書で記載する。これらのキメラ抗エンドグリン抗体は、様々な状態及び疾患の診断及び治療、並びにエンドグリンの精製及び検出に有用である。エンドグリンに対する抗体は、血管新生と関係がある、それによって影響される、又はそれによって悪影響を受ける、様々な疾患及び状態を治療するための療法開発の重要部分となる。
【０１４０】
エンドグリンと結合するそのキメラ抗体を本明細書で提供する。エンドグリンと結合し、血管新生／新血管形成、小血管の拡張を（部分的又は完全に）阻害又は管理／（部分的又は完全に）治療する、細胞の増殖を阻害する又は腫瘍増殖を阻害する、そのキメラ抗体も提供する。同様に、エンドグリン機能（例えば、シグナル伝達、結合、活性化など）の阻害も、阻害又は結合エンドグリンの意味の中に含まれる。更に別の実施形態では、キメラ抗体は、エンドグリンと結合することによって血管新生を阻害する。本出願は、キメラ抗体を産生するために使用することができる細胞系、これらの細胞系を生成するための方法、抗体を発現させそれらを精製するための方法も提供する。
【０１４１】
本明細書で記載する方法を使用して作製したエンドグリンと特異的に結合する抗体は、本明細書で提供するアッセイ又は当技術分野で知られているアッセイを使用して、ＥＬＩＳＡだけには限らないがこれを含めた従来の方法を使用して、エンドグリンと結合する能力に関して試験することができることは理解することができる。本明細書で記載する抗体の親和性も、Ｂｉａｃｏｒｅ又は表面プラズモン共鳴だけには限らないが、これらを含めた従来の方法を使用して決定することができる。
【０１４２】
エンドグリンと結合するキメラ抗体を本明細書で提供する。エンドグリンと結合し血管新生を阻害するキメラ抗体も、本明細書で提供する。
【０１４３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するガンマ１（γ１）定常領域（Ｆｃ）を含むキメラ抗体を本明細書で提供する。
【０１４４】
別の態様では、本出願は、抗体のＶＨ及びＶＬ配列を有する抗体の少なくとも５％が、ＥＬＩＳＡアッセイ中でこのような抗体との競合によってエンドグリンとの結合から遮断される条件下で、本明細書で記載するキメラ抗エンドグリン抗体と競合することができるキメラ抗体を提供する。
【０１４５】
エンドグリンと結合しエンドグリンの活性を調節する中和キメラ抗体を本明細書で提供する。中和抗体は、例えば、エンドグリンと結合することによって血管新生を阻害することができる。
【０１４６】
陰性対照より少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、又はそれより高いキメラ抗エンドグリン抗体による血管新生、細胞増殖及び／又は腫瘍増殖の阻害の割合（％）は、抗体が血管新生を阻害することを示す。陰性対照の２倍未満のキメラ抗エンドグリン抗体による血管新生、細胞増殖及び／又は腫瘍増殖の阻害の割合（％）は、抗体が血管新生を阻害しないことを示す。
【０１４７】
エンドグリンとキメラ抗体の結合は、部分的（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はその中の任意の数）又は完全に、血管新生、細胞増殖及び／又は腫瘍増殖を阻害することができる。キメラ抗体の中和又は阻害活性は、本明細書で記載するアッセイ又はそれ以外の当技術分野で知られているアッセイなどの当技術分野で認められているアッセイを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して決定することができる。
【０１４８】
本明細書で記載する抗体は、以下でより詳細に記載するように検出又は診断用途において有用である。本明細書で記載する抗体は、エンドグリンと結合するのに有用であり、したがって本明細書で記載するように血管新生を阻害することができる。
【０１４９】
抗ＶＥＧＦ剤
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞の増殖及び移動、並びにｉｎ  ｖｉｖｏで血管透過及び血管新生を誘導するタンパク質として、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が同定されている。それは血管増殖と透過性の両方を制御する。血管透過性因子（ＶＰＦ）としても知られ、血管内皮に対するその特異性及び効能のため、それは血管新生促進因子の中で特有である。それは新たに形成される血管中で内皮細胞の抗アポトーシス因子としても機能する。ＶＥＧＦは腫瘍細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、平滑筋細胞、腎臓細胞、メサンギウム細胞、ケラチノサイト、アストロサイト、及び骨芽細胞中で発現される。
【０１５０】
「ヒトＶＥＧＦ」は、一実施形態では、天然に存在する対立遺伝子及びプロセシング型のこれらの増殖因子と一緒に、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１３０６（１９８９）；及びＨｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，５：１８０６（１９９１）によって記載された、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子、及び関連１２１−、１８９−、及び２０６−アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子を指す。用語「ＶＥＧＦ」は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト種由来のＶＥＧＦも指す。いくつかの場合、特定種由来のＶＥＧＦを、例えばヒトＶＥＧＦに関してｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦに関してｍＶＥＧＦなどの用語によって示す。用語「ＶＥＧＦ」は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９又は１〜１０９を含む切断型のポリペプチドを指すためにも使用する。「切断型の」天然ＶＥＧＦに関するアミノ酸位置は、天然ＶＥＧＦ配列中に示すように番号処理する。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦ中のアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦ中でも位置１７（メチオニン）である。切断型の天然ＶＥＧＦは、天然ＶＥＧＦに匹敵する、ＫＤＲ及びＦｌｔ−１受容体に対する結合親和性を有する。一実施形態によれば、ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。
【０１５１】
ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、及び胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）を含めた７メンバーを含む。これらは全て、ＶＥＧＦ相同性ドメイン中に８システイン残基の共通構造を有する。更に、ＶＥＧＦ−Ａに関して、６個の異なるアイソフォームが存在し、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が主なアイソフォームである。全てのこれらのアイソフォームは、血管新生において明確な重複した機能を有する。ＶＥＧＦ遺伝子は染色体６ｐ．２１上に位置する。ＶＥＧＦファミリーの異なるメンバーは異なる物理的及び生物学的性質を有し、それらは特異的チロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、及びＶＥＧＦＲ−３）を介して作用する。ＶＥＧＦＲ−３受容体及びそのリガンド、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄはリンパ脈管新生と関係があり、一方ＰＩＧＦは動脈新生と関係がある。
【０１５２】
ＶＥＧＦに関する２つの高親和性受容体、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１）及びＶＥＧＦＲ−２／Ｋｄｒ／Ｆｌｋ−１（受容体／胎児肝臓キナーゼ−１を含有するキナーゼ挿入ドメイン）が特徴付けされている。第三の受容体、ＶＥＧＦＲ−３も知られている。これらの受容体はＰＤＧＦ受容体ファミリーに分類される。しかし、ＶＥＧＦ受容体は、（ＰＤＧＦファミリーの他のメンバー中の５個と対照的に）それらの細胞外ドメイン中に７個の免疫グロブリン様ループ及びより長いキナーゼ挿入を有する。ＶＥＧＦ受容体の発現は主に血管内皮細胞中で起こるが、いくつかは単核上及びメラノーマ細胞系上に存在する可能性もある。内皮細胞のみがＶＥＧＦに応答して増殖することが示されており、異なる供給源からの内皮細胞は異なる応答を示す。したがって、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３によって仲介されるシグナルは細胞型特異的であるようである。
【０１５３】
ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２は、高い親和性（それぞれ、Ｋｄ約２０ｐＭ及び２００ｐＭ）でＶＥＧＦ１６５と結合する。Ｆｌｋ−１受容体は、ＶＥＧＦに応答して自己リン酸化を経ることも示されている。ＶＥＧＦＲ−２は、この受容体を過剰発現するブタ大動脈内皮細胞の形態、アクチン再構成及び膜ラッフリングの劇的変化を引き起こすシグナルを仲介した。これらの細胞中では、ＶＥＧＦＲ−２はリガンド誘導性化学走性及び分裂促進性も仲介し、一方ＶＥＧＦＲ−１トランスフェクト細胞はＶＥＧＦに対する分裂促進応答を欠いた。対照的にＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ−１を発現するラット洞様毛細血管内皮細胞に対する強力な増殖刺激効果を有していた。ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２と共沈殿したリンタンパク質は異なり、異なるシグナル伝達分子は受容体特異的細胞内配列と相互作用することを示唆する。
【０１５４】
ＶＥＧＦは抗腫瘍療法の一標的となる。その発現が一定範囲の固形腫瘍において上方制御されるからである。ＶＥＧＦは、血管新生、既存の血管からの新たな血管の増殖の主なレギュレーターである。このプロセスは固形腫瘍の増殖の根本にあり、新たな血管の形成に頼るものである。特定の小分子療法剤は血管内皮増殖因子受容体（「ＶＥＧＦＲ」）を標的化することができ、小分子療法剤によるこのような標的化は抗癌効果をもたらすことができる。ＶＥＧＦ受容体標的化作用物質は、新たな血管形成の阻害によって腫瘍増殖を間接的に遮断する。ＶＥＧＦ誘導血管新生を阻害することによって、マクロファージ、骨芽細胞又は軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を著しく阻害せずに、抗腫瘍又は改善された抗腫瘍効果を発揮することができる。
【０１５５】
本明細書に提供する一実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト及びヒト化抗体だけには限られないが、これらを含めた抗体である。具体的な一実施形態によれば、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））である。別の実施形態によれば、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、半抗体、単鎖結合ポリペプチド、Ｆｖ断片、ダイアボディ及び線状抗体からなる群から選択される。
【０１５６】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦ又は１つ若しくは複数のＶＥＧＦ受容体又はそれらをコードする核酸とのその結合を含めたＶＥＧＦ活性を、中和、遮断、阻害、排除、低減又は干渉することができる分子を指す。いくつかの場合、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体と結合する。一実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦと結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖を阻害する。
【０１５７】
一実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、非ＶＥＧＦ又は非ＶＥＧＦ受容体より高い親和性でＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体と結合する。別の実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、１ｕＭと１μＭの間のＫｄでＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体と結合する。別の実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、５００ｎＭと１μＭの間でＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体と結合する。
【０１５８】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦと結合する抗体である。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患又は状態を標的化及び干渉する際に治療剤として使用することができる。抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ−Ｂ若しくはＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログ、又はＰ１ＧＦ、ＰＤＧＦ若しくはｂＦＧＦなどの他の増殖因子と通常結合しない。
【０１５９】
「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」又は「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ」は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９によって記載された方法に従い作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。それは、ヒトＶＥＧＦとその受容体の結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の、突然変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域及び抗原結合相補性決定領域を含有する。大部分のフレームワーク領域を含めたベバシズマブの約９３％アミノ酸配列はヒトＩｇＧ１に由来し、配列の約７％はマウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは約１４９，０００ダルトンの分子量を有し、グリコシル化状態である。ベバシズマブのマウスモノクローナル型及びヒト化と関係があるアミノ酸配列は、配列番号５〜１１として提供する。
【０１６０】
特定の実施形態では、併用組成物で投与するＶＥＧＦ受容体阻害剤はＶＥＧＦの小分子阻害剤である。他の実施形態では、併用組成物で投与するＶＥＧＦ受容体阻害剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。非制限的な一例では、併用組成物で投与するＶＥＧＦ受容体阻害剤はベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））である。ベバシズマブの例示的な、非制限的な用量は以下及び実施例中により詳細に論じる。
【０１６１】
修飾抗体又はその一部分
本明細書で記載する抗体は、治療用途で使用するための治療成分を更に含むことができる。
【０１６２】
本明細書で記載する抗体は、免疫複合体として使用することもできる。本明細書で使用するように、本明細書及び特許請求の範囲の目的で、免疫複合体は、本発明によるキメラ抗エンドグリン抗体又はその断片、及び少なくとも１つの治療標識を含む複合体を指す。治療標識は、抗腫瘍剤及び血管新生阻害剤を含む。このような抗腫瘍剤は当技術分野で知られており、毒素、薬剤、酵素、サイトカイン、放射性核種、光線力学的物質、及び血管新生阻害剤だけには限られないが、これらを含む。毒素は、リシンＡ鎖、突然変異シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒素、ストレプトニグリン、ボアマイシン、サポリン、ゲロニン、及びヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質だけには限られないが、これらを含む。薬剤は、ダウノルビシン、メトトレキサート、及びカリケアマイシンを含む。放射性核種は放射性金属を含む。サイトカインは、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β、インターロイキン、インターフェロン、及び腫瘍壊死因子だけには限られないが、これらを含む。光線力学的物質は、ポルフィリン及びそれらの誘導体だけには限られないが、これらを含む。他の治療標識は当技術分野で知られており、本明細書でも企図する。抗エンドグリンｍＡｂ又はその断片と少なくとも１つの抗腫瘍剤を複合体形成させるための方法は当技術分野でよく知られている（即ち、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６３：２０９−３４により総説された抗体複合体）。このような方法は、分子のカップリング又は結合に使用する、いくつかの利用可能なヘテロ二官能性試薬の１つを利用することができる。他の放射性核種は、治療及び診断標識などの分子を結合させるための他の方法と共に、本明細書で更に記載する。
【０１６３】
例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加などによって、当技術分野で知られている技法を使用して、様々な目的で抗体を修飾することができる。ＰＥＧの修飾（ＰＥＧ化）は、１つ又は複数の改善された循環時間、改善された可溶性、タンパク質分解に対する改善された耐性、低減した抗原性及び免疫原性、改善された生物学的利用能、低減した毒性、改善された安定性、及び形成し易さもたらすことができる（総説に関しては、Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ６８：１−１８，１９９８を参照）。
【０１６４】
抗体のＦｃ部分を修飾して、患者へ投与したときの血中循環の半減期を増大することができる。例えば参照として全容が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２１７，７９８号中に記載された手段などの、当技術分野の従来手段を使用して修飾を測定することができる。
【０１６５】
例えばその各々が参照として本明細書に組み込まれる米国特許第７，０９１，３２１号及び同第６，７３７，０５６号中に記載された方法などの、循環中の抗体ベースの融合タンパク質の半減期を改善する他の方法も知られている。更に、それらがその複合Ｎ−グリコシド結合糖鎖上にフコースを含有しないように、抗体を産生又は発現することが可能である。複合Ｎ−グリコシド結合糖鎖からのフコースの除去は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）だけには限られないが、これらを含めた、抗体及び抗原結合断片のエフェクター機能を増大することが知られている。同様に、エンドグリンと結合することができる抗体は、任意の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＭ、及び任意のアイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４由来の免疫グロブリン重鎖の全部又は一部と、それらのＣ末端において結合することができる。
【０１６６】
更に、本明細書で記載する抗体は、それらが血液脳関門を横断することができるように修飾することもできる。本明細書で記載する抗体のこのような修飾は、多形膠芽腫（ＧＢＭ）などの脳疾患の治療を可能にする。抗体などのタンパク質が血液脳関門を横断するのを可能にする例示的な修飾は、参照として全容が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００７００８２３８０号中に記載される。
【０１６７】
免疫グロブリンのグリコシル化は、それらのエフェクター機能、構造安定性、及び抗体産生細胞からの分泌率に対して有意な効果があることは示されている（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４０７（１９８５））。これらの性質を担う炭水化物群は、一般に抗体の定常（Ｃ）領域と結合する。例えば、ＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７におけるＩｇＧのグリコシル化は、補体依存性細胞溶解の古典的経路を活性化するＩｇＧの完全能力に必要とされる（Ｔａｏ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５（１９８９））。ＣＨ３ドメイン中のアスパラギン４０２におけるＩｇＭのグリコシル化は、抗体の適切な構築及び細胞溶解活性に必要である（Ｍｕｒａｏｋａ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：６９５（１９８９））。ＩｇＡ抗体のＣＨ１及びＣＨ３ドメイン中の位置１６２及び４１９におけるグリコシル化部位の除去は、細胞内分解及び少なくとも９０％の分泌阻害をもたらした（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４１９７（１９８８））。更に、それらがその複合Ｎ−グリコシド結合糖鎖上にフコースを含有しないように、抗体を産生又は発現することが可能である。複合Ｎ−グリコシド結合糖鎖からのフコースの除去は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）だけには限られないが、これらを含めた、抗体及び抗原結合断片のエフェクター機能を増大することが知られている。これらの「脱フコシル化」抗体は、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又はそれらがもはや酵素を含有しないように遺伝子操作された細胞系、及び複合Ｎ−グリコシド結合糖鎖中のフコースの封入に必要な生化学的経路（フコシルトランスフェラーゼノックアウト動物、植物、又は細胞としても知られる）だけには限られないが、これらを含めた、当技術分野で知られている分子クローニング技法を利用する様々な系によって産生することができる。フコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞となるように操作した細胞の非制限的な例には、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、及びＹＢ２／０細胞がある。
【０１６８】
可変（Ｖ）領域中の免疫グロブリンのグリコシル化も観察されている。Ｓｏｘ及びＨｏｏｄは、約２０％のヒト抗体はＶ領域中でグリコシル化されることを報告した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６６：９７５（１９７０））。Ｖドメインのグリコシル化はＶ領域配列中のＮ結合グリコシル化シグナルＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの偶然的発生から生じると考えられ、当技術分野では免疫グロブリン機能において役割を果たすとして認められていない。
【０１６９】
可変ドメインフレームワーク残基でのグリコシル化は、抗体と抗原の結合相互作用を変える可能性がある。本発明は、キメラ免疫グロブリン鎖のフレームワーク又はＣＤＲ中の限られた数のアミノ酸を選択して（例えば、残基の置換、欠失、又は付加によって）突然変異させ抗体の親和性を増大させる基準を含む。
【０１７０】
抗原結合に対する親和性は一般に、Ｖ領域フレームワーク、典型的には１つ又は複数のＣＤＲと隣接する領域中及び／又は１つ又は複数のフレームワーク領域中に、１つ又は複数の突然変異を導入することによって調節することができる。典型的には、このような突然変異は、グリコシル化部位配列を破壊又は作製するが、ポリペプチドのヒドロパシック構造性に実質的に影響を与えない保存的アミノ酸置換の導入を含む。典型的には、プロリン残基を導入する突然変異は回避する。抗体のグリコシル化は、グリコシル化に関して参照として本明細書に組み込まれる米国特許第６，３５０，８６１号中に更に記載される。
【０１７１】
抗体は短期送達又は広範囲（長期）送達用に製剤化することができる。
【０１７２】
エンドグリンと結合する抗体は、エンドグリンの精製及び／又はサンプル又は患者中のエンドグリンレベルの検出に使用して、以下でより詳細に記載するようにエンドグリンと関係がある疾患又は障害を検出又は診断することもできる。
【０１７３】
このような方法を使用して作製したエンドグリンと結合するキメラ抗体は、それらの結合親和性、親和力、及び中和能力の１つ又は複数に関して試験することができる。有用なキメラ抗体は、血管新生と関係がある疾患状態又は障害を予防、阻害、管理又は治療するために患者に投与することができる。
【０１７４】
抗体は、結合親和性、会合率、解離率及び親和力の１つ又は複数に関して評価することができる。一態様では、エンドグリン又はＶＥＧＦの活性を中和するそれらの能力に関して抗体を評価することができる。結合親和性、会合率、解離率及び親和力の測定は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析、ＢＩＡＣＯＲＥ解析（表面プラズモン共鳴）など、並びに一般に使用されており当業者に知られている他のアッセイだけには限られないが、これらを含めた、当技術分野で認められているアッセイを使用して実施することができる。
【０１７５】
エンドグリンと抗体の結合、及び／又は、例えば血管新生を阻害する抗体の能力の測定は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合結合アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、又は当技術分野で知られている任意の他の有用なアッセイを使用して決定することができる。これらのアッセイは一般に使用されており、当業者によく知られている。
【０１７６】
非制限的な一実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、エンドグリンと結合する特異的抗体の結合能力を測定することができる。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡなどのアッセイを使用して、他のそれに対する抗体と比較してエンドグリンに対する高い特異性を示す、それに対する抗体を同定することもできる。ＥＬＩＳＡなどのアッセイを使用して、１つ又は複数のポリペプチド上及び１又は複数種のエンドグリン又はＶＥＧＦ上のエピトープと結合する、それに対する抗体を同定することもできる。特異性アッセイは、エンドグリンエピトープを含有する異なるポリペプチド種上の１つ又は複数のエピトープと結合する能力に関して、試験抗体を別個のアッセイチャンバー内で同時にスクリーニングして、エンドグリンと結合するその抗体を同定する、平行ＥＬＩＳＡを行うことによって実施することができる。当業者が熟知している、見かけの結合親和性を測定するための別の技法は、（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００システムで分析された）表面プラズモン共鳴技法である（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ．Ｊ．２０００，１７：３２３−３２９）。標準的な測定法及び伝統的な結合アッセイは、Ｈｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｐ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．２００２，２８：２１７−２２９によって記載される。
【０１７８】
エンドグリンと結合するキメラ抗体は、様々な型の癌（例えば、原発性腫瘍、再発腫瘍、及び転移）と関係がある血管新生に関する様々な疾患及び状態を治療する、それらの能力に関してアッセイすることもできる。当業者に知られている任意の適切なアッセイを使用して、このような効果をモニタリングすることができる。いくつかのこのような技法は本明細書に記載する。一例では、本明細書に記載する抗体を、エンドグリンと結合するそれらの能力に関してアッセイする。別の例では、本明細書に記載する抗体の親和性定数を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定する。更に別の例では、本明細書に記載する抗体を、血管新生の阻害に対するそれらの効果に関してアッセイする。
【０１７９】
ＩＩ．組成物
本明細書に記載するそれぞれの化合物は、許容される担体又は賦形剤との併用時に組成物として使用することができる。このような組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ分析に、又はｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏでの対象への投与に、開示する化合物で対象を治療するのに有用である。
【０１８０】
血管新生活性などの１つ又は複数のエンドグリンの生物活性を阻害することができるキメラ抗エンドグリン抗体を含有する組成物（医薬品）を、本明細書で提供する。
【０１８１】
一実施形態ではその細胞分裂促進活性、又は血管新生活性などの、１つ又は複数のＶＥＧＦの生物活性を阻害することができる抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）を含有する組成物（医薬品）を、本明細書で提供する。
【０１８２】
キメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）の組合せを含有する組成物（医薬品）も、本明細書で提供する。
【０１８３】
キメラ抗エンドグリン抗体を含有する組成物は、抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）を含有する組成物と順次又は同時に投与することができる。このような投与は、互いに約４週間以内、互いに約３週間以内、互いに約２週間以内、互いに約１週間以内、互いに１日以内、互いに約１２時間以内、互いに約６時間以内、互いに約３時間以内、互いに約１時間以内、互いに約３０分以内、同日、同時、又はこれらの組合せの投与だけには限られないが、これらを含む。多用量の本発明の組成物及び／又は併用療法成分を企図するとき、標準的な市販品を使用し対象の年齢、身長、体重、健康状態及び他の身体的特徴に基づいて、知られている用量及び濃度を使用して、それぞれの用量を経験的に決定することができることは理解される。
【０１８４】
組成物を順次に投与するとき、本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を含む組成物は、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）の前及び／又は後に投与することができる。或いは、本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を含む組成物を、抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）の後に投与する。
【０１８５】
組成物を同時に投与するとき、キメラ抗エンドグリン抗体を含有する組成物は、抗ＶＥＧＦ抗体を含有する組成物と同じ部位、又は異なる部位に投与することができる。
【０１８６】
更に別の実施形態において、細胞分裂促進活性、細胞増殖、腫瘍増殖、新血管形成、又は血管新生活性などの、それぞれエンドグリン又はＶＥＧＦの生物活性の１つ又は複数を阻害することができる、キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）を含有する組成物（医薬品）を本明細書で提供する。
【０１８７】
治療レジメンは、本明細書に記載するそれぞれの組成物の、単数回又は複数回の投与を含むことができることは理解されよう。組成物は単数回用量又は複数回用量で投与することができる。別個の組成物の投与は、同じ経路又は異なる経路による投与であってよい。
【０１８８】
一実施形態では、６〜１２サイクル又は腫瘍進行まで１〜３週毎に組成物を投与する。この方法は、最大２年間１〜１２週毎に組成物を投与するステップを更に含むことができる。別の非制限的な例では、キメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）の同時投与は第１週で行い、次に第１、２、３又は４週で組成物を追加投与し、この場合同時投与は６〜１２サイクル又は腫瘍進行まで繰り返し、次に最大２年間１〜１２週毎に組成物を投与する。
【０１８９】
患者中の癌を治療するための方法の非制限的な一例では、この方法は、外科手術による癌の除去、及び１２カ月間１〜３週又は腫瘍進行までキメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）の投与、次に１〜１２週一定用量でキメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）の同時投与を含む。更に、キメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）の同時投与は、最大６サイクルで１〜３週毎に繰り返すことができる。場合によっては、この方法は、最大２年間１〜１２週毎に、キメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）を投与することを更に含む。治療レジメンを本明細書で提供するモニタリング法と組合せて、他の用量のキメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）を投与する必要があるかどうか、及びいつ投与すべきかを決定することができることは理解されよう。
【０１９０】
併用療法は相乗及び／又は有益効果をもたらすことができ、低用量の組合せを与えて高度の安全性をもたらすことができる。本発明は、癌又は他の疾患を予防、管理、治療又は除去するための、キメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）の予防又は治療効果を高める治療プロトコールを包含する。
【０１９１】
一実施形態では、例えば（本明細書に記載する）血管新生阻害剤などの他の療法治療剤を対象に投与する。このような他の療法治療剤を含有する組成物は、本明細書に記載する他の組成物と併用して（順次又は同時のいずれかで）投与することができる。
【０１９２】
本明細書に提供する癌を治療するための１つの非制限的な方法では、他の療法治療は、外科手術による癌の除去、照射、１つ又は複数の化学療法剤、又はこれらの組合せ、及び本明細書に記載する１つ又は複数の組成物の同時投与を含む。一態様では、組成物の投与は、例えば２０分の静脈内注入であってよい。
【０１９３】
したがって組成物は、活性成分以外に、当業者によく知られている、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤又は他の物質を含むことができる。このような物質は無毒でなければならず、活性成分（単数又は複数）の有効性に干渉してはならない。担体又は他の物質の正確な性質は投与の経路に依存する。
【０１９４】
本明細書に記載する方法によって同定した抗体又は抗原結合断片を含む製剤は、望ましい純度を有するタンパク質と任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤を混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形で、保存用に調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、利用する用量及び濃度においてレシピエントに無毒である、担体、賦形剤又は安定剤であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー、アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含めた他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１９５】
許容される担体は投与する患者に対して生理的に許容され、それと共に／その中に投与する化合物の治療性を保持する。許容される担体及びそれらの製剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９０）中に一般的に記載される。１つの例示的な担体は生理食塩水である。本明細書で使用する語句「薬学的に許容される担体」は、一器官、又は身体の一部分の投与部位から別の器官、又は身体の一部分への、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系における対象化合物の運搬又は輸送に関与する、液体又は固形充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入剤などの、薬学的に許容される物質、組成物又は媒体を意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合性があり、それを投与する対象に有害ではない意味で許容される。許容される担体は、対象化合物の特異的活性を変えてもいけない。
【０１９６】
一態様において、投与と適合性がある、溶媒（水性又は非水性）、溶液、エマルジョン、分散媒、コーティング、等張及び吸収促進又は遅延剤を含む、薬学的に許容される又は生理的に許容される組成物を本明細書で提供する。したがって、組成物又は製剤は、対象における治療及び／又は診断用途に適した組成物を指す。組成物及び製剤は、一定量の本明細書に記載する化合物、及び薬学的又は生理的に許容される担体を含む。
【０１９７】
特定の投与経路（即ち、全身又は局所）と適合性があるように組成物を製剤化することができる。したがって組成物は、様々な経路による投与に適した、担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
【０１９８】
別の実施形態では、組成物は、必要な場合許容される添加剤を更に含み、組成物中の化合物の安定性を改善する及び／又は組成物の放出速度を制御することができる。許容される添加剤は対象化合物の特異的活性を変えない。例示的な許容される添加剤には、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、ラクトース及びこれらの混合物などの糖があるが、これらだけには限られない。許容される添加剤は許容される担体及び／又はデキストロースなどの賦形剤と組合せることができる。或いは、例示的な許容される添加剤には、ペプチドの安定性を増大し溶液のゲル化を低減するための、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０などの界面活性剤があるが、これらだけには限られない。界面活性剤は、溶液の０．０１％〜５％の量で組成物に加えることができる。このような許容される添加剤の添加は、保存中の組成物の安定性及び半減期を増大する。
【０１９９】
組成物は、例えば、皮下、硝子体内、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は筋肉内注射だけには限られないが、これらを含めた注射によって投与することができる。それぞれの注射型用の組成物の製剤化において使用するための賦形剤及び担体は、本明細書において企図される。以下の記載は単なる例であり、組成物の範囲を制限することを意味するものではない。注射用組成物には、例えば、水溶液（水溶性である場合）又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即席調製用の滅菌粉末がある。静脈内投与に関して、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物を含有する、溶媒又は分散媒であってよい。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。抗菌剤及び抗真菌剤は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールを含む。等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含めることができる。生成する溶液は使用するためにパッケージ、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物は後に、投与前に滅菌溶液と併用することができる。静脈内注射、又は患部への注射用に、活性成分は、発熱性物質を含まず適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形であってよい。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などの等張性媒体を使用して、適切な溶液を調製することが十分可能である。防腐剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を必要に応じて含めることができる。滅菌注射溶液は、必要に応じて前に列挙した成分の１つ又は組合せと共に適切な溶媒中に必要量の活性成分を取り込み、次に濾過滅菌によって調製することができる。一般に、分散液は、基本分散媒及び前に列挙した成分からの必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体中に、活性成分を取り込むことによって調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の方法は、事前に滅菌濾過したその溶液から活性成分及び任意の他の望ましい成分の粉末を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０２００】
組成物は従来どおり硝子体内投与、皮下投与、又は硝子体内移植によって投与することができる。
【０２０１】
組成物は、例えば単位用量の注射などによって、従来どおり静脈内投与することができる。注射用に、活性成分は、実質的に発熱性物質を含まず適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形であってよい。例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などの等張性媒体を使用して、適切な溶液を調製することが可能である。防腐剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を必要に応じて含めることができる。更に、組成物はエアロゾル化によって投与することができる（Ｌａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｔ−ｃｅｌｌ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｒｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ａｉｒｗａｙ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｇｅｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏ．，１３４：４９−５５（２００４））。
【０２０２】
一実施形態では、組成物を凍結保存して、例えば保存中の貯蔵寿命を増大する。本明細書に提供する医薬品又は任意の方法における使用に関して組成物を考慮するとき、組成物は実質的に発熱性物質を含まない可能性があり、したがって組成物は、ヒト患者に投与するとき、炎症反応又は危険なアレルギー反応を引き起こさないことは企図される。発熱性物質に関する組成物の試験及び実質的に発熱性物質を含まない組成物の調製は、当業者にはよく理解されており、市販のキットを使用して実施することができる。
【０２０３】
許容される担体は、組成物を安定化する、吸収を増大若しくは遅延する、又はクリアランスを増大若しくは遅延する化合物を含有することができる。このような化合物は、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストリンなどの炭水化物、低分子量タンパク質、ペプチドのクリアランス又は加水分解を低減する組成物、又は賦形剤又は他の安定剤及び／又はバッファーを含む。吸収を遅延する作用物質は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含む。洗浄剤を使用して、リポソーム担体を含めた組成物の吸収を安定化又は増大若しくは低減することもできる。消化から保護するために、化合物を組成物と複合体形成させて、それを酸及び酵素加水分解に耐性がある状態にすることが可能であり、又は化合物をリポソームなどの適切に耐性がある担体と複合体形成させることが可能である。消化から化合物を保護する手段は当技術分野で知られている（例えば、Ｆｉｘ（１９９６）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：１７６０  １７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９  １３５、及び治療剤の経口送達用の脂質組成物を記載する米国特許第５，３９１，３７７号を参照）。
【０２０４】
語句「薬学的に許容される」は、生理的耐性があり、対象に投与したとき、例えば胃の不調、めまいなどのアレルギー又は同様の悪反応を典型的にもたらさない分子体及び組成物を指す。
【０２０５】
用語「単位用量」は、治療用組成物に関して使用するとき、対象に関する単位の用量として適切な物理的に明確な単位を指し、それぞれの単位は、必要な希釈剤、即ち担体、又は賦形薬と共に望ましい治療効果をもたらすように計算された所定量の活性物質を含有する。
【０２０６】
組成物は投与製剤と適合性がある形式、及び治療有効量で投与することができる。投与する量は、治療する対象、活性成分を利用する対象の免疫系の能力、及び望まれる結合能力の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は実践者の判断に依存し、各個人に特有である。初回投与及び追加抗原刺激に適したレジメも様々であるが、初回投与、次に二次注射又は他の投与による１又は複数の時間間隔での反復投与によって類型化される。或いは、血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が企図される。
【０２０７】
一実施形態は、本明細書に記載する状態、疾患又は障害の治療用の医薬品を製造するための、本明細書に記載する組成物の使用を企図する。医薬品は治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づいて製剤化することができ、状態、疾患又は障害の段階に基づいて１つ又は複数の製剤に製剤化することができる。病院及びクリニックへの配給に適したラベルを有する適切なパッケージに医薬品をパッケージすることができ、この場合ラベルは本明細書に記載する疾患を有する対象を治療する指標である。医薬品は単数回又は複数回単位としてパッケージすることができる。組成物の用量及び投与に関する説明書は、以下に記載するようにパッケージと共に含めることができる。本出願は、本明細書で前に記載したキメラ抗ＶＥＧＦ抗体と薬学的に許容される担体の医薬品を対象とする。別の実施形態では、本出願は、本明細書で前に記載した抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）と薬学的に許容される担体の医薬品を対象とする。更に別の実施形態では、本出願は、本明細書で前に記載したキメラ抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体（又はその抗原結合断片）と薬学的に許容される担体の医薬品を対象とする。
【０２０８】
本発明の一実施形態では、それらがヒト患者への投与に許容されるように、組成物が発熱性物質を含まないように製剤化する。発熱性物質に関する組成物の試験及び発熱性物質を含まない組成物の調製は、当業者にはよく理解されている。
【０２０９】
本発明の一実施形態は、本発明の障害の治療用の医薬品を製造するための、本発明の任意の組成物の使用を企図する。医薬品は治療を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づいて製剤化することができ、障害に基づいて１つ又は複数の製剤に製剤化することができる。病院及びクリニックへの配給に適したラベルを有する適切なパッケージに医薬品をパッケージすることができ、この場合ラベルは本明細書に記載する対象中の障害を治療する指標である。医薬品は１回又は複数回単位としてパッケージすることができる。組成物の用量及び投与に関する説明書は、パッケージと共に含めることができる。
【０２１０】
ＩＩＩ．使用法
エンドグリンと優先的に結合するキメラ抗体の組成物を対象に投与することによって、対象（ヒト又は非ヒト）を治療する方法を本明細書で提供する。本明細書に記載する方法は、抗ＶＥＧＦ抗体の組成物を対象に投与することによって対象（ヒト又は非ヒト）を治療することを更に含む。特定の場合、これらの方法は、キメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体の両方を含有する一組成物を対象に投与することを含む。他の場合、これらの方法は、キメラ抗エンドグリン抗体とベバシズマブの両方を含有する一組成物を対象に投与することを含む。
【０２１１】
本発明の有効な応答は、具体的には生存期間の延長を非制限的に含む、疾患の兆候又は症状の部分的若しくは完全な緩和又は低減を、対象が経験するときに得られる。予想される無憎悪生存期間は、再発数、疾患の段階、及び他の要因を含めた予後予測因子に応じて、数カ月から数年で測定することができる。生存期間の延長は、少なくとも１カ月（ｍｏ）、約少なくとも２カ月、約少なくとも３カ月、約少なくとも４カ月、約少なくとも６カ月、約少なくとも１年、約少なくとも２年、約少なくとも３年、約少なくとも４年、約少なくとも５年などの時間を非制限的に含む。全体又は無憎悪生存期間も、数カ月から数年で測定することができる。或いは、有効な応答は、対象の症状又は癌負荷が停滞状態であり悪化しない応答であってよい。治療指標の更なる指標は以下でより詳細に記載する。
【０２１２】
本明細書に記載する抗体の組成物は非治療剤（例えば、親和性精製物質）として使用することができる。一般に、このような一実施形態では、対象のタンパク質は、当技術分野で知られている従来の方法を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂又は濾過紙などの固相上に固定する。固定タンパク質は精製する対象の標的（又はその断片）を含有するサンプルと接触させ、その後支持体を、固定抗体と結合した標的タンパク質以外の、サンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒で洗浄する。最後に支持体を、グリシンバッファー、ｐＨ５．０などの別の適切な溶媒で洗浄し、これによって標的タンパク質を切り離す。精製以外に、組成物は、エンドグリン、ＶＥＧＦ及び血管新生と関係がある疾患及び障害の検出、診断及び治療に使用することができる。
【０２１３】
本明細書で使用する用語「接触」は、化合物の溶液又は組成物と生物由来のポリペプチド、細胞、組織又は器官を含む液体培地を一緒に加えることを指す。或いは、「接触」は、化合物の溶液又は組成物と生物由来の血液、血清、又は血漿などの液体を一緒に混合することを指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用例に関して、組成物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの別の構成要素を含むこともできる。ＤＭＳＯは化合物の取込み又は化合物の可溶性を促進する。試験化合物を含む溶液は、ピペットベースのデバイス又はシリンジベースのデバイスなどの送達装置を利用することによって、細胞、組織又は器官を含む培地に加える、又は血液などの別の液体と混合することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ適用例に関して、例えば任意の適切な手段による患者への組成物の投与によって接触を行うことができ、薬学的に許容される賦形剤及び担体を含む組成物は前でより詳細に記載している。
【０２１４】
「対象」又は「患者」（例えば、ヒトなどの哺乳動物、又は霊長類、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ラマなどの非ヒト動物など）は、本明細書に記載する疾患又は障害の、１つ又は複数の臨床兆候及び／又は症状を示す哺乳動物であってよい。特定の状況では、対象は無症候性である可能性があり、疾患又は障害の臨床兆候を未だ依然として有する可能性がある。抗体は、治療成分、又は治療成分を含有する融合タンパク質と結合させることが可能である。抗体は、検出可能成分、又は検出可能成分を含有する融合タンパク質と結合させることが可能である。一実施形態では、抗体は、治療成分と検出可能成分の両方と結合させることが可能である。抗体は親和性タグ（例えば、精製タグ）と結合させる、又はそれらで組換え操作することが可能である。例えばＨｉｓ６タグ、アビジンなどの親和性タグは、当技術分野では従来のものである。
【０２１５】
本明細書で提供する抗体又はその断片は、それらが治療成分及び／又はイメージング又は検出可能成分及び／又は親和性タグと結合又は連結することができるようなものである。ポリペプチドの結合又は連結に関する方法は当技術分野でよく知られている。化合物と標識の間の会合（結合）は、共有及び非共有結合、化学結合及び組換え技法だけには限られないが、これらを含めた、当技術分野で知られている任意の手段を含む。
【０２１６】
「血管新生」は、血管の維持及び発達の全態様を含めるために本明細書で使用する。したがって血管新生は、新血管形成、並びに既存の血管系及び小血管の維持及び制御をもたらす、（ｄｅ  ｎｏｖｏ又は既存の血管からの形成であれ）新しい毛細血管の形成を含む。血管新生は、血管基底膜及び間質性マトリクスの内皮細胞仲介分解、内皮細胞の移動、内皮細胞の増殖、及び内皮細胞による毛細血管ループの形成を含む、一連の連続ステップを含む複雑なプロセスである。血管新生は、新たな血管の増殖及び／又は発達（新血管形成とも呼ばれる）、小血管の拡張、過剰又は長期血管増殖、及び既存の血管系の維持を含む。
【０２１７】
用語「血管新生関連疾患」は、本明細書及び特許請求の範囲の目的で本明細書において使用して、血管新生が異常に長引いているヒト中の特定の病的プロセスを意味する。これは更に、血管新生と関連する、それによって引き起こされる、又はそれと関係がある疾患及び状態などの、血管新生状態及び疾患を含む。このような疾患の非制限的な例には、様々な型の癌及び転移、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症がある。本明細書に記載する抗体を使用して、エンドグリンとの結合及び血管新生の阻害によって血管新生関連疾患を治療することができる。
【０２１８】
用語「抗血管新生療法」を本明細書において使用して、エンドグリンを発現する（静止状態の血管系と比較して増殖血管系において高レベルで発現する）細胞及び／又は血管系を標的化する療法を意味し、これは更に、血管新生（即ち、新血管形成をもたらす新しい毛細血管の形成）を対象とする療法、既存の血管系及び／又は過剰な血管形成又は血管増殖を対象とする療法、小血管の拡張を対象とする療法、及び疾患又は状態を対象とする療法（例えば、血管標的化療法）を含む。本発明内で企図される例示的な疾患又は状態には、様々な型の癌及び転移があるが、これらだけには限られない。
【０２１９】
用語「再発」、「ぶり返し」又は「ぶり返した」は、疾患消失の臨床評価後の癌又は疾患の逆行を指す。遠隔転移又は局所再発の診断は、ぶり返しと考えることができる。
【０２２０】
用語「維持療法」は、以前の治療効果の維持を助けるために与えられるスケジュール化された再治療を指す。維持療法は、疾患の進行とは無関係に、癌を軽減状態に保つ又は特定療法に対する応答を延長するのを助けるために与えられることが多い。
【０２２１】
腫瘍学における用語「無憎悪生存期間」は、癌が増殖しない治療中及びその後の時間の長さを指す。無憎悪生存期間は、患者が完全奏功又は部分奏功を経験した時間の量、及び患者が安定（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）を経験した時間の量を含む。
【０２２２】
一態様では、癌又は転移に罹患する患者に本明細書で提供する任意の組成物を投与することによって、対象中の癌又は転移を予防又は治療する方法を本明細書で提供する。このような患者は症候性又は無症候性であってよい。
【０２２３】
いくつかの場合、組成物の投与は、治療する患者の生命を延長し、腫瘍体積を低減し、腫瘍を除去し、細胞増殖を低下させ、腫瘍細胞のアポトーシスを増大する、又はこれらの組合せである。
【０２２４】
必要な場合、方法は、外科手術による癌の除去及び／又は追加的抗癌剤又は治療剤の投与を更に含むことができる。抗癌剤は本明細書の他の箇所で提供する。
【０２２５】
一態様では、癌に罹患する患者の症状を改善する。改善は、例えば痛みの低下、腫瘍サイズの低下、腫瘍の除去、腫瘍サイズの増大若しくは疾患の進行の予防、転移の形成の予防、又は転移増殖の阻害、又はこれらの組合せとして現れ得る。
【０２２６】
一態様では、組成物の投与は、患者が外科手術を受ける必要性、又は１つ又は複数の追加的抗癌剤又は治療剤を用いた治療を低減又は排除する。
【０２２７】
キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ剤を用いた治療
同時又は異なる時間で、キメラ抗エンドグリン抗体を含有する組成物と抗ＶＥＧＦ抗体を含有する組成物を投与し、それによって疾患又はその重度を予防、治療、改善、又は低減することを含む、血管新生／新血管形成、過剰な血管形成、腫瘍増殖、腫瘍細胞増殖又は小血管の拡張と関係がある１つ又は複数の疾患若しくは障害を予防又は治療する方法を本明細書で提供する。
【０２２８】
組成物の組合せを投与することを含む、血管新生／新血管形成と関係がある１つ又は複数の疾患若しくは障害を予防又は治療する方法を本明細書で提供する。
【０２２９】
本明細書で使用する「予防」は、症状の発症の予防法、予防、血管新生と関係があるか又はエンドグリン活性に関連する疾患若しくは障害の進行の予防を指す。本明細書で使用する「阻害」、「治療」及び「治療する」は交互に使用し、例えば、症状の停滞、生存期間の延長、症状の部分的又は完全な改善、及び腫瘍若しくは転移の部分的又は完全な根絶を指す。
【０２３０】
任意の医学治療に適用可能な妥当な利点／リスク比で疾患又は障害を阻害することによって、ある程度の望ましい治療効果をもたらすのに有効である治療有効量で、患者に組成物を投与することができる。ヒト患者への本発明の組成物の投与のため、当業者に知られている方法によって組成物を製剤化することができる。治療有効量は、器官又は組織において少なくとも部分的に望ましい治療又は予防効果を得る量である。疾患又は障害の予防及び／又は療法治療をもたらすのに必要なキメラ抗エンドグリン抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体の量は、それ自体は固定されていない。投与する抗体の量は、疾患又は障害に罹患する哺乳動物の疾患の型、疾患の拡大、及び大きさと共に変わる可能性がある。一実施形態では、本明細書に記載する２つの抗体を、前に記載したように併用して患者に投与する。投与の併用は、一組成物又は別個の組成物での投与を指すことができる。
【０２３１】
「投与」は、患者の身体内に組成物をもたらす形式で、患者に１つ又は複数の組成物を与えることを本明細書では指す。このような投与は、皮下、硝子体内、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は筋肉内投与（例えば注射）による局所、局部又は全身投与を非制限的に含む、任意の経路による投与であってよい。
【０２３２】
組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対する毒性なしで、特定の患者、組成物、及び投与の形式に望ましい治療応答を得るのに有効な量の活性成分を得るように変えることが可能である。選択する用量レベルは、利用する個々の化合物の活性、投与の経路、投与の時間、利用する個々の化合物の分泌率、治療の期間、利用する個々の化合物と併用使用する他の薬剤、化合物及び／又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態及び以前の病歴、及び医学分野でよく知られている同様の要因を含めた、様々な要因に依存する。
【０２３３】
本明細書に記載する抗体は、様々な投与量及び様々な時間枠で対象に投与することができる。非制限的な用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、又はこの間の任意の整数を含む。更に、（１つ又は複数の）用量の抗体を、週二回、週一回、２週毎、３週毎、４週毎、６週毎、８週毎、１２週毎、又はこれらの週の任意の組合せで投与することができる。例えば２、３、４、５又は６週、次に療法なしで１、２、３、４、５、又は６週の週一回又は二回の抗体投与などの、投与サイクルも企図される。或いは、療法に対する対象の応答性に応じて、治療間のサイクル時間は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２カ月であってよい。例えば本明細書に記載する異なる用量の組合せ及び週一回サイクルを含めた、別の投与サイクルも本発明の範囲内で企図される。
【０２３４】
「接触」は、本明細書に記載するように、本明細書で提供する組成物を細胞、器官、組織又は流体と物理的に近づける手段として本明細書では定義する。接触は、本明細書で提供する任意の組成物の全身又は局所投与を包含し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ  ｖｉｖｏの手順及び方法を比制限的に含む。「併用」と「接触」は本明細書では交互に使用して、同様に定義することを意味する。
【０２３５】
医師又は獣医師は、必要とされる組成物の有効量（ＥＤ５０）を容易に決定し処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、必要とされるより低いレベルにおいて組成物中に利用する化合物の投与で始め、望ましい治療効果を得て、望ましい効果が得られるまで用量を徐々に増大することが可能である。或いは、用量は一定に保つことができる。
【０２３６】
前に記載した経路などの任意の好都合な経路によって、患者に組成物を投与することができる。選択する投与の経路とは無関係に、適切な水和型で使用することができる本発明の化合物、及び／又は組成物は、以下に記載するように、又は当業者に知られている他の従来の方法によって許容される剤形に製剤化する。
【０２３７】
化合物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的である用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を決定するための、標準的な手順によって細胞培養又は実験動物において決定することができる。毒性と治療有効性の間の用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。毒性副作用を示す化合物を使用することができる一方で、罹患組織部位にこのような化合物を標的化する送達系を設計するのに注意を払い、健常細胞に対する考えられる損傷を最小にし、それによって副作用を減らさなければならない。
【０２３８】
細胞培養アッセイ及び／又は動物試験から得たデータは、ヒトにおける使用のために一定範囲の用量で製剤化する際に使用することができる。このような化合物の用量は、毒性がほとんど又は全くない状態で、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に存在することが好ましい。利用する剤形及び利用する投与経路に応じて、用量はこの範囲内で変わる可能性がある。任意の化合物に関して、治療有効用量は細胞培養アッセイから初期に推測することができる。用量は動物モデルにおいて処方して、細胞培養において決定するＩＣ５０（即ち、半最大阻害を得る試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得ることができる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。このような情報を使用して、ヒト中で有用な用量をより正確に決定することができる。化合物の組合せを含有する組成物は、任意のこれらの方法を使用して評価することもできる。
【０２３９】
一実施形態では、本発明は組織中の血管新生の阻害を企図する。組織中の血管新生の程度、及び、したがって得られる阻害の程度は、本明細書に記載するように様々な方法によって評価することができる。
【０２４０】
エンドグリン又はＶＥＧＦを認識し（例えば、優先的に結合する）血管新生を阻害する抗体の独自の特異性は、血管新生（新血管形成）、小血管の拡張、過剰な血管形成、腫瘍細胞増殖、及び／又は腫瘍増殖によって特徴付けられる疾患用の診断及び治療用途を与える。抗体は様々な型の癌（原発性腫瘍及び転移）に罹患する対象に投与することができる。
【０２４１】
本明細書に記載する組成物の投与以外に、１つ又は複数の追加的血管新生阻害剤で対象を治療することも可能であることが、本明細書において企図されることは理解されよう。
【０２４２】
用語「血管新生阻害剤」は、本明細書及び特許請求の範囲の目的で本明細書において使用して、血管新生を阻害するために機能する、ペプチド、タンパク質、酵素、多糖、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、組換えベクター、及び薬剤だけには限られないが、これらを含めた化合物又は分子を意味する。血管新生阻害剤は当技術分野で知られており、全ての型は本明細書において企図される。化合物及び分子の非制限的な例には、パクリタキセル、Ｏ−（クロロアセチル−カルボミル）フマギロール（「ＴＮＰ−４７０」又は「ＡＧＭ１４７０」）、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、アンギオスタチン、ヒト軟骨細胞由来血管新生阻害剤（「ｈＣＨＩＡＭＰ」）、軟骨由来血管新生阻害剤、血小板因子−４、グロ−β、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質１０（「ＩＰ１０」）、インターロイキン１２、Ｒｏ３１８２２０、トリシクロデカン−９−イルキサンテート（「Ｄ６０９」）、イルソグラジン、８，９−ジヒドロキシ−７−メチル−ベンゾ［ｂ］キノリジニウムブロマイド（「ＧＰＡ１７３４」）、メドロキシプロゲステロン、ヘパリンとコルチゾンの組合せ、グルコシダーゼ阻害剤、ゲニステイン、サリドマイド、ジアミノ−アントラキノン、ヘルビマイシン、ウルソル酸、及びオレアノール酸などの天然及び合成生体分子がある。抗体の非制限的な例には、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、又はエンドグリンの異なるエピトープなどの分子を対象とする抗体がある。更に、ＶＥＧＦ受容体の小分子阻害剤が知られており、本明細書において企図される。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非制限的な例には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ）、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ）、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがある。
【０２４３】
非制限的な一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤はラニビズマブである。例示的なラニビズマブの眼部用量は、月に一度硝子体内に投与する約０．５ｍｇを含む。非制限的な一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤はＶＥＧＦ−Ｔｒａｐである。例示的なＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの用量は、２又は３週毎に投与する約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇを含む。例示的なＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの眼部用量は、月１回又は年４回硝子体内に投与する約０．５〜約２．０ｍｇ／ｋｇを含む。
【０２４４】
非制限的な別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤はスニチニブである。例示的なスニチニブのレジメンは、４週間約５０ｍｇを投与し、次に２週間薬剤なしを含む。治療レジメンは周期的又は非周期的に繰り返すことができる。
【０２４５】
非制限的な別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤はソラフェニブである。例示的なソラフェニブの用量は、１日１回投与する約４００ｍｇを含む。
【０２４６】
非制限的な別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤はアキシチニブである。例示的なアキシチニブの用量は、１日２回投与する約３、約５、又は約１０ｍｇを含む。
【０２４７】
非制限的な別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤はペガプタニブである。例示的なペガプタニブの用量は、６週毎に硝子体内に投与する約０．３〜約３ｍｇを含む。
【０２４８】
非制限的な更に別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体阻害剤はパゾパニブである。例示的なパゾパニブの用量は、１日１回投与する約２００〜約１０００ｍｇを含む。
【０２４９】
これらのＶＥＧＦ受容体阻害剤の多数の併用は、本明細書に記載する組成物と共に投与することができる。一実施形態では、併用は低用量の記載する抗体又は抗原結合断片の使用をもたらす可能性がある。このような用量の改変は、抗体の併用の相乗効果に原因がある可能性がある。
【０２５０】
癌
ＣＤ１０５は腫瘍血管新生と関係があり、正常組織中のそれと比較して様々な腫瘍組織の内皮中で強く上方制御される。ＣＤ１０５は広範囲の腫瘍内皮において上方制御される。更に、対応する正常組織より強いＣＤ１０５の発現が腫瘍内皮において存在する。したがって、キメラ抗エンドグリン抗体を用いた血管新生の阻害は、癌性腫瘍の治療オプションとなる。本明細書に記載する組成物を使用して、癌性腫瘍及び転移を治療することができる。癌性腫瘍及び転移を治療するための医薬品の製剤化において、組成物を使用することもできる。
【０２５１】
ＶＥＧＦは抗腫瘍療法の一標的となる。その発現が一定範囲の固形腫瘍において上方制御されるからである。ＶＥＧＦは、血管新生、既存の血管からの新たな血管の増殖の主なレギュレーターである。このプロセスは固形腫瘍の増殖の根本にあり、新たな血管の形成に頼るものである。特定の小分子療法剤は血管内皮増殖因子受容体（「ＶＥＧＦＲ」）を標的化することができ、小分子療法剤によるこのような標的化は抗癌効果をもたらすことができる。ＶＥＧＦ受容体標的化作用物質は、新たな血管形成の阻害によって腫瘍増殖を間接的に遮断する。ＶＥＧＦ誘導血管新生を阻害することによって、マクロファージ、骨芽細胞又は軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を著しく阻害せずに、抗腫瘍又は改善された抗腫瘍効果を発揮することができる。
【０２５２】
用語「腫瘍」は、（同型の正常組織による発現と比較して）エンドグリン及び／又はＶＥＧＦを発現する癌性組織を指すために本明細書で使用する。腫瘍は固形腫瘍及び半固形腫瘍を含むことができる。腫瘍の非制限的な例には、非Ｔ細胞型（非Ｔ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄単球性白血病を含めたヒト白血病、並びに、血管肉腫、乳癌腫、胃癌腫、結腸癌腫、ホジキンリンパ腫、リンパ腫、多形膠芽腫（ＧＢＭ）、肺癌腫、メラノーマ、ミエローマ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌腫、耳下腺腫瘍、咽頭癌腫、前立腺癌腫、肝細胞癌腫、腎臓癌腫、及び直腸Ｓ字結腸癌腫を含めた、ヒト固形腫瘍及び半固形腫瘍、並びに（同型の正常組織による発現と比較して）中〜高レベルでエンドグリンを発現するその周囲の血管系がある。
【０２５３】
治療する癌性組織は、例えば、異常なレベルのエンドグリン及び／又はＶＥＧＦを発現する内皮組織である。
【０２５４】
腫瘍組織の新血管形成の不在下では、腫瘍組織は必要な栄養素が得られず、増殖が遅れ、更なる増殖が停止し、退化し最終的には壊死状態になり、腫瘍の殺傷に至る。腫瘍の血管新生を阻害することによって、腫瘍の新血管形成を阻害する方法を本明細書で提供する。同様に、腫瘍の増殖を阻害する方法を本明細書で提供する。
【０２５５】
これらの方法は、転移の形成に対しても特に有効である。それらの形成は、転移性癌細胞が原発性腫瘍から出ることができるような原発性腫瘍の血管形成を必要とし、二次部位中でのそれらの樹立は転移増殖をサポートするための新血管形成を必要とするからである。
【０２５６】
本発明の「癌／転移に罹患する対象」は、突然変異タンパク質（腫瘍関連抗原）又は突然変異遺伝子を発現する可能性があり、未だ疾患の前兆を示していないことは理解されよう。（突然変異Ｋ−ｒａｓタンパク質と関連がある）結腸癌の非制限的な一実施形態では、結腸のいくつかの細胞中の突然変異Ｋ−ｒａｓタンパク質を有する対象は、その対象が未だ結腸癌の前兆を示していない可能性がある場合でも、治療する対象である。「疾患の前兆又は症状」は、臨床的に認められた疾患の出現又は指標を表す。
【０２５７】
腫瘍又は転移に罹患する対象を「治療すること」によって、対象の症状が、治療後に部分的に軽減されている、完全に軽減されている、又は停滞状態であることを意味する。治療されている患者は、腫瘍量の部分的又は完全な軽減を示すことができる。これは予防、療法及び治癒を含むものとする。非制限的な一例では、高転移性の癌（例えば、乳癌）に罹患する対象を治療し、この場合更なる転移がいずれかで生じる、又は治療を受けていない対象と比較して数が減少する。非制限的な別の例では、対象を治療し、この場合治療を受けていない対象と比較して、対象の固形癌は大きさが減少した状態、又は大きさが増大しない状態のいずれかになる。非制限的な更に別の例では、治療した対象中の癌細胞の数は、治療を受けていない対象中の癌細胞の数と比較して増大しないか、又は減少するかのいずれかである。例えば、細胞増殖の低下、細胞数の低下、アポトーシスの増大、及び／又は治療する対象の生存期間の増大として、改善を定義することもできる。
【０２５８】
本明細書で更に使用するように、癌の治療は、癌の増殖又は腫瘍の停滞、部分的又は完全な排除を含む。治療又は部分的排除は、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、又はこの間の任意の低下倍数などの、増殖又は腫瘍の大きさ及び／又は体積の一定倍数の低下を含む。同様に、治療又は部分的排除は、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はこの間の任意の低下率の、増殖又は腫瘍の大きさ及び／又は体積の低下率を含むことができる。
【０２５９】
本明細書に記載する方法中で治療する腫瘍又は癌には、肺癌、婦人科悪性腫瘍、メラノーマ、乳癌、脳癌（例えば、多形膠芽腫、「ＧＢＭ」又はグリオーマ）、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、頭部癌、肝臓癌（肝細胞癌）、頸部癌、腎臓癌（腎臓細胞癌）、陰茎癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌、肉腫、癌腫、ミエローマ、及びリンパ腫があるが、これらだけには限られない。一実施形態では、治療する腫瘍は固形又は半固形腫瘍である。別の実施形態では、治療する腫瘍は原発性腫瘍である。別の実施形態では、治療する腫瘍は転移性腫瘍である。一実施形態では、治療する腫瘍又は癌は上皮起源である。別の実施形態では、治療する癌はミエローマである。別の実施形態では、治療する癌は卵巣癌である。別の実施形態では、治療する癌は腎臓／腎癌である。更に別の実施形態では、治療する癌は肝細胞／肝臓癌である。
【０２６０】
肺癌
一態様において、肺癌を治療する方法を本明細書で提供する。最も一般的な型の肺癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であり、これは肺癌の約８０〜８５％を占め、扁平上皮細胞癌、腺癌、及び大細胞未分化癌に分けられる。小細胞肺癌は肺癌の１５〜２０％を占める。
【０２６１】
肺癌の段階付けは、その本来の源からの癌の拡大度の評価である。それは、肺癌の予後及び考えられる治療に影響を与える重要な因子である。非小細胞肺癌は、ＩＡ（「１Ａ」、最良予後）からＩＶ（「４」、最悪予後）に段階付けされる。小細胞肺癌は、それが胸部の半分に限られ一放射線領域内に存在する場合は限局型として分類され、それ以外の場合、それは進展型である。
【０２６２】
非小細胞肺癌は、ＥＵＳ（内視鏡超音波検査）又はＣＴ若しくはＭＲＩスキャンを使用して又は外科手術時に段階付けして、ＴＮＭシステムに従い疾患の程度を分類することができる。これらの対象は予後及び治療を考慮するプロセスの一部として段階を経る。ＡＪＣＣはＴＮＭ段階付け、次に更なるグループ分けを推奨する。
【０２６３】
原発性腫瘍（Ｔ）：ＴＸ：原発性腫瘍を評価することができない、又は痰又は気管支肺胞洗浄液中に悪性腫瘍細胞が存在するが、ただしイメージング又は気管支鏡検査法で見られない。Ｔｉｓ：癌腫、ｉｎ  ｓｉｔｕ。Ｔ０：原発性腫瘍の痕跡なし。Ｔ１：肺又は臓側胸膜によって囲まれた、その最大寸法で３ｃｍ未満の腫瘍、主気管支への気管支鏡検査法による進入なし。Ｔ２：３ｃｍを超える最大寸法、主気管支へ拡大した（ただし竜骨から２ｃｍを超えて遠位にある）、及び閉塞性肺炎（ただし肺全体は含まない）のいずれかである腫瘍。Ｔ３：胸壁、横隔膜、縦隔胸膜、又は壁側心膜に進入した、主気管支へ拡大した、竜骨の２ｃｍ以内、ただし竜骨を含まず、及び肺全体の閉塞性肺炎のいずれかである腫瘍。Ｔ４：縦隔、心臓、大血管、気管、食道、脊椎骨、又は竜骨に進入した、同じ肺葉中の別個の腫瘍節、及び悪性胸水のいずれかである腫瘍。リンパ節（Ｎ）：ＮＸ：リンパ節を評価することができない、Ｎ０：リンパ節を含まない、Ｎ１：同側気管支周囲又は同側肺門リンパ節に転移。Ｎ２：同側縦隔又は竜骨下リンパ節に転移、及びＮ３：同側鎖骨上リンパ節、同側斜骨筋リンパ節、及び反対側リンパ節のいずれかに転移。遠隔転移（Ｍ）：ＭＸ：遠隔転移を評価することができない、Ｍ０：遠隔転移無し、及びＭ１：遠隔転移が存在する。
【０２６４】
子宮癌／婦人科悪性腫瘍
子宮癌は、子宮内で生じる任意のいくつかの異なる型の癌、即ち、子宮肉腫（例えば、子宮筋層、又は子宮の筋肉層の肉腫は平滑筋肉腫であることが最も一般的である）、子宮体癌、及び子宮頸癌を指すことができる。
【０２６５】
別の態様において、子宮体癌を治療するための方法を本明細書で提供する。子宮体癌は、子宮体、子宮の内膜で始まる癌である。子宮及び子宮体の癌のいくつかの例には、腺癌、腺類癌、腺扁平上皮癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞腺癌、子宮肉腫、間質性肉腫、悪性混合ミュラー管腫瘍、及び平滑筋肉腫があるが、これらだけには限られない。
【０２６６】
別の態様において、方法は子宮頸癌、好ましくは頸部上皮の腺癌を治療する。この癌の２つの主な型、扁平上皮細胞癌及び腺癌が存在する。前者は全ての子宮頸癌の約８０〜９０％を構成し、子宮外膜（膣に最も近い部分）と子宮頸内膜（子宮に最も近い部分）が接合する箇所で発症する。後者は子宮外膜の粘液産生腺細胞中で発症する。いくつかの子宮頸癌はこの両方の特徴を有し、腺扁平上皮癌又は混合型癌腫と呼ばれる。
【０２６７】
卵巣癌
別の態様において、上皮性卵巣腫瘍を含めた卵巣癌を治療するための方法を本明細書で提供する。
【０２６８】
卵巣癌は、病理報告で得られる腫瘍の組織学に従って分類される。卵巣上皮癌としても知られる表面上皮−間質性腫瘍は、最も典型的な型の卵巣癌である。それは漿液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、及び粘液性嚢胞腺癌を含む。エストロゲン産生顆粒膜細胞腫瘍及び男性化セルトリライディッヒ細胞腫瘍又は男性胚細胞腫を含めた生殖索−間質性腫瘍は、卵巣癌の８％を占める。生殖細胞腫瘍は卵巣腫瘍の約３０％、ただし卵巣癌のわずか５％を占める。大部分の生殖細胞腫瘍は奇形腫であり、大部分の奇形腫は良性であるからである。生殖細胞腫瘍は、若い女性及び少女において生じる傾向がある。予後は生殖細胞腫瘍の具体的な組織学に依存するが、全体的に良好である。混合型腫瘍は、前述の腫瘍組織学のクラスの２つ以上の要素を含有する。
【０２６９】
卵巣癌は二次癌、身体中の他の箇所の原発性癌からの転移の結果である可能性もある。一般的な原発性癌は、乳癌及び胃腸癌である（この場合卵巣癌はクルーケンベルグ癌である）。表面上皮−間質性腫瘍は腹膜（腹腔の内膜）に由来する可能性があり、この場合卵巣癌は原発性腹膜癌の二次癌であるが、治療は基本的には腹膜に関する原発性表面上皮−間質性腫瘍と同じである。
【０２７０】
卵巣癌の段階付けはＦＩＧＯ段階付けシステムによるものであり、子宮全摘出手術、卵巣と輸卵管の両方の除去、細胞学のための腹腔内網、及び骨盤（腹膜）洗浄を含み得る外科手術後に得た情報を使用する。ＡＪＣＣの段階はＦＩＧＯの段階と同じである。
【０２７１】
段階Ｉは、１つ又は２つの卵巣に限られる卵巣癌を指す。ＩＡ−１つの卵巣に関する、被膜が完全状態、卵巣表面上に腫瘍なし、腹水又は腹膜洗浄液中に悪性腫瘍細胞なし、ＩＢ−２つの卵巣に関する、被膜が完全状態、卵巣表面上に腫瘍なし、陰性洗浄、及びＩＣ−以下のいずれか、被膜破裂、卵巣表面上の腫瘍である卵巣に限られる腫瘍、陽性洗浄。
【０２７２】
段階ＩＩは骨盤延長又は移植を指す。ＩＩＡ−子宮又は輸卵管への延長又は移植、陰性洗浄、ＩＩＢ−他の骨盤構造への延長又は移植、陰性洗浄、及びＩＩＣ−骨盤延長又は移植、及び陽性腹膜洗浄。
【０２７３】
段階ＩＩＩは顕微鏡で観察される骨盤外の腹膜移植を指し、又は小腸又は腹腔内網に延長した骨盤に限定する。ＩＩＩＡ−顕微鏡で観察される骨盤を超えた腹膜転移、ＩＩＩＢ−顕微鏡で観察される２ｃｍ未満の大きさの骨盤を超えた腹膜転移、及びＩＩＩＣ−２ｃｍを超える骨盤を超えた腹膜転移又はリンパ節転移。
【０２７４】
段階ＩＶは肝臓又は腹腔外への遠隔転移を指す。
【０２７５】
傍大動脈リンパ節転移は局所リンパ節と考えられる（段階ＩＩＩＣ）。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、以下：卵巣中の腺癌、及び卵巣から腹腔に移動した腺癌から選択される卵巣癌を治療する。
【０２７７】
メラノーマ
メラノーマは、主に皮膚だけでなく腸及び眼（ぶどう膜メラノーマ）でも見られるメラニン細胞の悪性腫瘍である。それは稀な型の皮膚癌の１つであるが、大部分の皮膚癌関連死を引き起こす。悪性メラノーマは、メラニン細胞と呼ばれる色素細胞の制御不能な増殖によって引き起こされる、重度の型の皮膚癌である。メラノーマは、脈絡膜メラノーマ、悪性メラノーマ、皮膚メラノーマ及び眼内メラノーマも含むが、これらだけには限られない。
【０２７８】
メラノーマは、以下の型、悪性ほくろ、悪性ほくろメラノーマ、表在性メラノーマ、末端性ほくろ性メラノーマ、粘膜メラノーマ、小節メラノーマ、ポリープ状メラノーマ、線維形成性メラノーマ、メラニン欠乏性メラノーマ、軟部組織メラノーマ、及びぶどう膜メラノーマに分けることができる。メラノーマの段階は以下の通りである：
【０２７９】
段階０−メラノーマｉｎ  ｓｉｔｕ（クラークレベルＩ）。
【０２８０】
段階Ｉ／ＩＩ−浸潤性メラノーマ、Ｔ１ａ：１．００ｍｍ未満の原発性、潰瘍形成なし、クラークレベルＩＩ−ＩＩＩ、Ｔ１ｂ：１．００ｍｍ未満の原発性、潰瘍形成あり又はクラークレベルＩＶ−Ｖ、及びＴ２ａ：１．００〜２．００ｍｍの原発性、潰瘍形成なし。
【０２８１】
段階ＩＩ−高リスクメラノーマ、Ｔ２ｂ：１．００〜２．００ｍｍの原発性、潰瘍形成あり、Ｔ３ａ：２．００〜４．００ｍｍの原発性、潰瘍形成なし、Ｔ３ｂ：２．００〜４．００ｍｍの原発性、潰瘍形成あり、Ｔ４ａ：４．００ｍｍ以上の原発性、潰瘍形成なし、及びＴ４ｂ：４．００ｍｍ以上の原発性、潰瘍形成あり。
【０２８２】
段階ＩＩＩ−局所転移、Ｎ１：１つの陽性リンパ節、Ｎ２：２〜３つの陽性リンパ節又は局所皮膚／未達転移、及びＮ３：４つの陽性リンパ節又は局所皮膚／未達転移。
【０２８３】
段階ＩＶ−遠隔転移、Ｍ１ａ：遠隔皮膚転移、正常ＬＤＨ、Ｍ１ｂ：肺転移、正常ＬＤＨ、及びＭ１ｃ：他の遠隔転移、又は任意の遠隔転移、及び高ＬＤＨ。
【０２８４】
一実施形態では、本明細書に記載する方法はメラノーマを治療する。
【０２８５】
結腸癌及び結腸直腸癌
（結腸癌又は大腸癌とも呼ばれる）結腸直腸癌は、結腸、直腸（肛門）及び突起中での癌増殖を含む。一年当たり世界中で６５５，０００人が死に至っており、それは癌の三番目に最も一般的な型であり、西欧諸国では癌関連死の第二の主たる原因である。多くの結腸直腸癌は、結腸中の腺腫性ポリープから生じると考えられる。これらのマッシュルーム様の増殖は通常良性であるが、いくつかは経時的に癌に発達する可能性がある。
【０２８６】
別の実施形態では、デュークス分類法を使用し、段階Ａ〜Ｄに基づいて結腸直腸癌を分類することができる。段階Ａは、粘膜に限られる（即ち、腸壁を介して浸潤していない）結腸直腸癌を指す。段階Ｂ１は、固有筋層に延長しているが、それに浸透していない（即ち、リンパ節が浸潤されていない）状態を指し、一方で段階Ｂ２の癌は固有筋層に浸透しているが、それに浸透していない（即ち、リンパ節が浸潤されていない）。段階Ｃ１は、固有筋層に延長しているがそれに浸透していない（即ち、リンパ節を含む）癌を指し、一方で段階Ｃ２は、固有筋層に延長しておりそれに浸透している（即ち、リンパ節を含む）癌を指す。段階Ｄは遠隔転移拡大を指す。ＴＮＭシステムを使用して、当技術分野で知られている従来の手段に従い結腸直腸癌を段階付けすることもできる。
【０２８７】
乳癌
本明細書に記載する方法によって治療することができる、いくつかの型の乳癌が存在する。ｉｎ  ｓｉｔｕ小葉癌及びｉｎ  ｓｉｔｕ乳管癌は、それぞれ小葉及び乳管において発達しているが、乳房又は身体の他の領域周辺の脂肪組織には拡大していない乳癌である。浸潤性（又は浸襲性）小葉癌及び乳管癌は、それぞれ小葉及び乳管において発達しているが、乳房の脂肪組織及び／又は身体の他の部分のいずれかに拡大している癌である。一態様において、乳腺中の管組織の乳管癌、Ｈｅｒ２−及び／又はＥＲ−及び／又はＰＲ−である乳癌などの、乳癌を治療するための方法を本明細書で提供する。これらの方法による治療から恩恵を受ける可能性がある他の乳癌は、髄様癌、粘液癌、管状癌、及び炎症性乳癌である。
【０２８８】
一実施形態では、ＴＮＭシステムに従い乳癌を段階付けする。予後は段階付けの結果と密接な関係があり、更に段階付けを使用して、臨床試験と臨床診察の両方で治療を患者に割り当てる。
【０２８９】
簡単に言うと、段階付けに関する情報は以下の通りである。ＴＸ：原発性腫瘍を評価することができない。Ｔ０：腫瘍の痕跡なし。Ｔｉｓ：癌腫、ｉｎ  ｓｉｔｕ、浸襲なし。Ｔ１：腫瘍が２ｃｍ以下である、Ｔ２：腫瘍は２ｃｍを超えるが、５ｃｍは超えない、Ｔ３：腫瘍が５ｃｍを超える、Ｔ４：胸壁又は皮膚、又は炎症性乳癌に増殖する任意の大きさの腫瘍。ＮＸ：付近のリンパ節を評価することができない。Ｎ０：癌が局所リンパ節に拡大していない。Ｎ１：癌が１〜３の上顎又は１つの内乳房リンパ節に拡大している。Ｎ２：癌が４〜９の上顎リンパ節又は多数の内乳房リンパ節に拡大している。Ｎ３：以下の１つに当てはまる。癌が１０つ以上の上顎リンパ節に拡大している、又は癌が鎖骨（鎖骨）下のリンパ節に拡大している、又は癌が鎖骨上のリンパ節に拡大している、又は癌が上顎リンパ節を含み、内乳房リンパ節が延長している、又は癌が４つ以上の上顎リンパ節を含み、微量の癌がセンチネルリンパ節生検における内乳房リンパ節において見られる。ＭＸ：遠隔拡大（転移）の存在を評価することができない。Ｍ０：明確な拡大なし。Ｍ１：（鎖骨上リンパ節を含まない）遠隔器官への拡大が生じている。
【０２９０】
膵臓癌
別の態様において、以下：膵管組織中の上皮性腫瘍、及び膵管中の腺癌から選択される、膵臓癌を治療する方法を本明細書で提供する。最も一般的な型の膵臓癌は、膵管の内膜中で生じる腺癌である。
【０２９１】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は膵臓癌を治療する。
【０２９２】
前立腺癌
他の一態様において、以下：腺癌又は骨に移動している腺癌から選択される、前立腺癌を治療する方法を本明細書で提供する。前立腺癌は、尿道の第一部分周囲の男性の前立腺器官で発症する。前立腺はいくつかの細胞型を有するが、９９％の腫瘍は精液の生成を担う腺細胞で発症する腺癌である。
【０２９３】
前立腺癌を段階付けするために一般に使用される２つのスキームが存在する。最も一般的なのは、腫瘍の大きさ、関連リンパ節の程度、及び任意の転移（遠隔拡大）を評価するＴＮＭシステムである。多くの他の癌と同様に、これらは４段階（Ｉ〜ＩＶ）に分けられることが多い。低頻度で使用される別のスキームはＷｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔ病期分類システムである。
【０２９４】
簡単に言うと、段階Ｉの疾患は、前立腺組織を良性前立腺肥大症などの他の理由で除去した、細胞が正常細胞に非常に類似している、診察する指が前立腺を正常だと感じるときに、サンプルの小部分中に偶然見られる癌である。段階ＩＩでは、より多くの前立腺が関与し、前立腺内に塊を感じることができる。段階ＩＩＩでは、腫瘍が前立腺被膜を介して拡大し、前立腺の表面上に塊を感じることができる。段階ＩＶ疾患では、腫瘍が近辺の構造に浸襲し、又はリンパ節若しくは他の器官に拡大している。段階付けは、疾患の破壊的可能性及び最終予後の評価を与える生検（グリーソン）からの細胞含有物及び組織構造に基づく。
【０２９５】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は前立腺癌を治療する。
【０２９６】
頭頸部癌
頭頸部癌（例えば経口、咽頭、鼻咽頭、食道など）は、唇、口腔（口）、鼻腔、副鼻腔、咽頭、及び咽頭部を含めた上部気道消化管由来の生物学的に類似した癌の群を指す。大部分の頭頸部癌は、これらの領域の粘膜内膜（上皮）由来の扁平上皮細胞癌である。頭頸部癌は首のリンパ節に拡大することが多く、これは診断時において最初の（及び時には唯一の）疾患の出現であることが多い。頭頸部癌は、喫煙、アルコール消費、及び性感染症ヒトパピローマウイルスの特定株を含めた、特定の環境及び生活習慣危険因子と強く関係している。頭頸部癌を有する患者の管理は依然として手に負えない仕事である。下咽頭癌、咽頭癌、鼻咽頭癌、中咽頭癌などの癌は、本明細書に記載する化合物を使用して治療することができる。
【０２９７】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は頭頸部癌を治療する。
【０２９８】
腎臓癌
別の態様において、腎臓癌を治療する方法を本明細書で提供する。（腎臓細胞癌、腎臓細胞癌腫、腎臓腺癌、及び副腎腫とも呼ばれる）腎臓癌は、腎細管の内膜中に悪性腫瘍細胞が見られる疾患である。腎臓細胞癌腫は、近位腎細管から生じる最も一般的な型の腎臓癌である。それは成人における最も一般的な型の腎臓癌であり、症例の約８０％を占める。
【０２９９】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は腎臓癌を治療する。
【０３００】
肝臓癌
別の態様において、原発性肝臓癌（肝臓中で始まる癌）を治療する方法を本明細書で提供する。原発性肝臓癌は、成人と子供の両方で生じる可能性がある。肝臓癌は、悪性肝臓腫瘍、肝臓上又は中の腫瘍若しくは増殖の存在によって特徴付けられる。それらは（癌そのもの以外の異なる理由でも）医用画像で発見することができ、又は腹部塊、腹部痛、黄疸、又はいくらか他の肝機能不全として患者中に存在する可能性がある。いくつかの型の肝臓癌が存在する。
【０３０１】
血管腫：これらは最も一般的な型の良性肝臓腫瘍である。これらは血管で始まる。大部分のこれらの腫瘍は症状を引き起こさず、これらは治療を必要としない。いくつかは出血する可能性があり、それが中程度から重度である場合は除去する必要がある。
【０３０２】
肝腺腫：これらの良性上皮肝臓腫瘍は肝臓内で発症する。それらは、大抵の場合右肝葉に位置し、孤立して見られることが多い。腺腫の大きさは１〜３０ｃｍの範囲である。肝腺腫と関係がある症状は、強烈な腹部痛を引き起こす可能性がある大きな病変といずれも関係がある。
【０３０３】
限局性結節性過形成：限局性結節性過形成（ＦＮＨ）は、二番目に最も一般的な肝臓の腫瘍である。この腫瘍は、先天性動静脈奇形の肝細胞の応答の結果である。このプロセスは肝臓の全ての正常成分が存在するプロセスであるが、それらが示されるパターンは異常である。これらの条件が存在する場合でも、肝臓は依然として正常範囲で機能するようである。
【０３０４】
肝細胞癌：肝細胞癌（ＨＣＣ）は、最も一般的な肝臓の癌である。それは過度の飲酒及びＢ型肝炎感染と関係があり、特にアジアで広まっている。大部分のＨＣＣは、外科的手術による治癒が可能ではないときに検出され、切除不能ＨＣＣの全身治療は１年未満の生存と関係がある。
【０３０５】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は肝臓癌を治療する。
【０３０６】
リンパ腫
リンパ腫は、免疫系のリンパ球において生じる型の癌である。それらはリンパ節において生じることが多く、節（腫瘍）の拡大として現れる。リンパ腫はリンパ性白血病と密接に関連があり、これもリンパ球において生じるが、典型的には循環血液及び骨髄（造血と呼ばれるプロセス中で血液細胞が生成される場所）のみと関係があり、通常腫瘍は形成しない。多くの型のリンパ腫が存在し、したがって、リンパ腫は血液腫瘍と呼ばれる広域群の疾患の一部である。いくつかの型のリンパ腫は無痛であり（例えば、小リンパ球性リンパ腫）、治療なしでも長寿と適合し、一方で他の型は攻撃性であり（例えば、バーキットリンパ腫）、急速な悪化及び死を引き起こす。
【０３０７】
２００１年に公開され２００８年に更新されたＷＨＯの分類法、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ−ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−ｉｓｂｎ９２−８３２−２４１１−６−２＃ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−ｉｓｂｎ９２−８３２−２４１１−６−２はリンパ腫の最新の分類法であり、「改訂版ヨーロッパ−アメリカリンパ腫分類法」（ＲＥＡＬ）内に築かれた礎に基づく。このシステムは、細胞型によってリンパ腫を分類し（即ち、腫瘍に最も類似した正常細胞型）、表現型、分子又は細胞発生特性を定義する。３つの大きな群、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー細胞腫瘍が存在する。他のあまり一般的ではない群も認められている。ホジキンリンパ腫は、ＷＨＯ（及び以前の）分類法内では別個に考えられているが、明らかに異常ではあるが、成熟Ｂ細胞系のリンパ球の腫瘍として現在は認められている。
【０３０８】
一実施形態では、本明細書に記載する方法はリンパ腫を治療する。
【０３０９】
肉腫
肉腫は中胚葉増殖をもたらす結合組織（骨、軟骨、脂肪）の癌である。
【０３１０】
これは、上皮起源（乳房、結腸、膵臓、及びその他）である癌腫とは対照的である。しかし、組織起源の進化を理解することにより、用語「肉腫」は、上皮組織から生じることが現在知られている腫瘍に時折適用する。用語、軟部組織肉腫を使用して、結合組織中に存在する要素を含むが、それには由来しない（筋肉及び血管などの）軟部組織の腫瘍を記載する。
【０３１１】
それらが生じる組織の型に基づいて、肉腫にはいくつかの異なる名称が与えられる。例えば、骨肉腫は骨から生じ、軟骨肉腫は軟骨から生じ、且つ平滑筋肉腫は平滑筋から生じる。肉腫は全ての年齢範囲の人々を襲うが、それらは非常に稀であり、癌の全症例の１％のみを占める。ＧＩＳＴは最も一般的な型の肉腫であり、米国では一年当たり約３０００〜３５００の症例が存在する。これは、北アメリカで一年当たり約２００，０００の症例が存在する乳癌と比較すべきである。
【０３１２】
約５０％の骨肉腫及び２０％の軟部組織肉腫は、３５才未満の人々において診断される。平滑筋肉腫、軟骨肉腫、及び消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）などの、いくつかの肉腫は、子供よりも成人においてより一般的である。ユーイング肉腫及び骨肉腫を含めた最高段階の骨肉腫は、子供及び若い成人において更により一般的である。
【０３１３】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は肉腫を治療する。
【０３１４】
癌腫
癌腫は、上皮細胞から生じる任意の悪性癌である。癌腫は周辺組織及び器官に浸襲し、リンパ節及び他の部位に転移、又は拡大する可能性がある。
【０３１５】
癌腫は、全ての新形成と同様に、その組織病理学的外見によって分類される。腺癌及び扁平上皮細胞癌、腫瘍の２つの一般的な記述用語は、これらの細胞が腺又は扁平上皮細胞の外見をそれぞれ有し得る事実を反映する。重度退形成性腫瘍は、それらが明確な組織学的外見を有さないように未分化状態である可能性がある（未分化癌腫）。
【０３１６】
時折、推定原発性器官（例えば、前立腺の癌）又は仮定細胞起源（肝細胞癌、腎臓細胞癌）によって腫瘍を指す。
【０３１７】
腺癌は、腺組織の上皮細胞において生じ腺構造を形成する悪性腫瘍である。これは肺中で一般的である（全肺癌の３０〜４０％を形成する）。それは末梢で見られ、杯細胞又はＩＩ型肺細胞から生じる。
【０３１８】
扁平上皮細胞癌は扁平上皮化生から生じる。これは肺腫瘍の２０〜３０パーセントを占め、通常は臍の緒起源である。
【０３１９】
小細胞癌はほぼ確実に喫煙によるものである。これらは初期に転移し、（患者のナトリウム濃度を低下させる）ＡＤＨを分泌する可能性がある。
【０３２０】
大細胞未分化癌腫は肺新生物の１０〜１５パーセントを占める。これらは攻撃的であり、未分化性のため認識するのは難しい。これらは最も一般的に肺の中心に存在する。
【０３２１】
鼻副鼻腔未分化癌腫。
【０３２２】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は癌腫を治療する。
【０３２３】
ミエローマ
（ＭＭ、ミエローマ、血漿細胞ミエローマとして、又はオットーカーレルにちなんでカーレル病としても知られる）多発性骨髄腫は血漿細胞の癌である。これらの免疫細胞は骨髄中で形成され、リンパ管中に多数存在し抗体を産生する。ミエローマは不治として考えられているが、ステロイド、化学療法剤、サリドマイド及び幹細胞移植によって鎮静を誘導することができる。ミエローマは、血液悪性腫瘍と呼ばれる広域群の疾患の一部である。
【０３２４】
多発性骨髄腫は後期胚中心Ｂリンパ球において発症する。免疫グロブリン重鎖遺伝子（第１４染色体、遺伝子座１４ｑ３２上）と発癌遺伝子（１１ｑ１３、４ｐ１６．３、６ｐ２１、１６ｑ２３及び２０ｑ１１が多い）の間の染色体転位が、多発性骨髄腫を有する患者において頻繁に観察される。この突然変異は、ミエローマの病状の重要な初期事象であると考えられる発癌遺伝子の異常調節をもたらす。結果は血漿細胞クローンの増殖及びゲノムの不安定化であり、これが更なる突然変異及び転位をもたらす。染色体１４の異常はミエローマの全症例の約５０％において観察される。第１３染色体の（一部の）欠失も症例の約５０％において観察される。
【０３２５】
血漿細胞によるサイトカイン（特にＩＬ−６）の産生は、骨粗しょう症などのその局所損傷の大部分を引き起こし、その中で悪性腫瘍細胞が生長する微小環境を生成する。血管新生（新しい血管の誘引）が増大する。
【０３２６】
一実施形態では、本明細書に記載する方法はミエローマを治療する。
【０３２７】
胃癌
胃又は胃腸癌は胃の任意の部分で発症する可能性があり、胃全体及び他の器官、特に食道、肺及び肝臓に拡大する可能性がある。胃癌は一年当たり世界中で約８００．０００の死を引き起こしている。
【０３２８】
転移は胃癌を有する８０〜９０％の個体で起こり、初期段階で診断した患者では６カ月で６５％の生存率であり、後期段階で診断した患者では１５％未満であった。
【０３２９】
胃癌は無症候性であることが多く、又はその初期段階では非特異的症状のみを引き起こす。症状が起こるまでに、癌は一般に身体の他の部分に転移し、その悪い予後の主な理由の１つである。
【０３３０】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は胃癌を治療する。
【０３３１】
甲状腺癌
甲状腺新生物又は甲状腺癌は通常、４種類の甲状腺の悪性腫瘍、乳頭、小胞、延髄又は退形成性腫瘍のいずれかを指す。乳頭及び小胞腫瘍が最も一般的である。それらはゆっくりと増殖し再発する可能性があるが、４５才未満の患者には一般に致命的ではない。延髄腫瘍は、甲状腺に限定した場合良い予後、及び転移が起こる場合は悪い予後を有する。退形成性腫瘍は急速に増殖し、治療にはあまり応答性がない。
【０３３２】
甲状腺癌は甲状腺機能が正常な患者において普通に見られるが、甲状腺機能亢進症又は甲状腺機能低下症の症状は、巨大又は転移性高分化型腫瘍と関連し得る。それらが２０才未満の患者において見られるとき、節は特に問題である。この年齢での良性節の出現は可能性が低く、したがって悪性腫瘍の可能性が一層高い。
【０３３３】
甲状腺癌は、それらの病状特性に従い分類することができる。以下の変異を区別することができる（様々な亜型における分布は局所変異を示し得る）：乳頭甲状腺癌（最大７５％）；小胞甲状腺癌（最大１５％）；延髄甲状腺癌（最大８％）；及び退形成性甲状腺癌（５％未満）。小胞型と乳頭型は「分化型甲状腺癌」として一緒に分類することができる。これらの型は、延髄及び未分化型より好ましい予後を有する。甲状腺腺腫は甲状腺の良性新生物である。
【０３３４】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は甲状腺癌を治療する。
【０３３５】
膀胱癌
膀胱癌は、膀胱の悪性腫瘍増殖の任意のいずれかの型を指す。膀胱癌は、異常な細胞が膀胱内で無制御に増殖する疾患である。膀胱は中空状態であり、尿を蓄える筋肉器官であり、それは骨盤中に位置する。最も一般的な型の膀胱癌は膀胱内側の細胞内膜で始まり、移行上皮癌（時には尿路上皮癌）と呼ばれる。
【０３３６】
９０％の膀胱癌は移行上皮癌である。他の１０％は、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫、小細胞癌及び身体中の他の箇所の癌からの二次堆積物である。
【０３３７】
以下の段階を使用して、ＴＮＭ（腫瘍、リンパ節、及び転移）段階付けシステムに従い、癌の位置、大きさ、及び拡大を分類する。段階０：癌細胞が膀胱の内膜のみで見られる。段階Ｉ：癌細胞が膀胱の内膜を越えて層に増殖しているが、膀胱の筋肉には増殖していない。段階ＩＩ：癌細胞が膀胱壁中の筋肉に増殖しているが、膀胱周辺の脂肪組織には増殖していない。段階ＩＩＩ：癌細胞が膀胱周辺の脂肪組織、及び前立腺、膣、又は子宮に増殖しているが、リンパ節又は他の器官には増殖していない。段階ＩＶ：癌細胞がリンパ節、骨盤又は腹部壁、及び／又は他の器官に増殖している。再発：治療した後に、膀胱内又は他の近隣器官内で癌が再発している。
【０３３８】
膀胱のＴＣＣは１９９７ＴＮＭシステムに従い段階付けする。Ｔａ、非浸襲性乳頭腫瘍、Ｔ１、浸襲性、ただし筋肉膀胱層に関してではない、Ｔ２、筋肉層に浸襲、Ｔ３、筋肉を越えて膀胱外の脂肪に浸襲、及びＴ４、前立腺、子宮又は骨盤壁のような周辺構造に浸襲。
【０３３９】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は膀胱癌を治療する。
【０３４０】
血管新生を伴う眼の状態
黄斑変性症状態及び糖尿病性網膜症
一態様において、本発明は、治療有効量の本明細書で提供する１つ又は複数の組成物を患者に投与することによって、患者中の糖尿病性網膜症、黄斑変性症、脈絡膜血管新生又は血管新生緑内障を治療するための方法を提供する。
【０３４１】
黄斑変性症（ＡＭＤ）は、高い視力を担う黄斑と呼ばれる中心網膜部分の光受容体の消失である。黄斑の変性は、網膜色素上皮と血管脈絡膜の間の膜中の、細胞外マトリクス要素及び他の残骸の異常な堆積と関係がある。この残骸様の物質は硝子小体と呼ばれる。硝子小体は眼底鏡検査で観察される。正常な眼が硝子小体を含まない黄斑を有する可能性はあるが、硝子小体は網膜周辺に多量に存在する可能性がある。黄斑視覚のいかなる消失もない状態での、黄斑中の柔らかい硝子小体の存在は初期段階のＡＭＤであると考えられる。黄斑変性症は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）層下の異常な血管の発達によって特徴付けられる。これらの血管はブルッフ膜を介して破裂し、網膜色素上皮を破壊し、出血し、黄斑瘢痕形成を最終的に引き起こし、これが中心視力の顕著な消失をもたらす（円盤状瘢痕形成）。
【０３４２】
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、他の眼部障害以外に黄斑変性症において一般に生じ、脈絡膜内皮細胞の増殖、細胞外マトリクスの過剰生産、及び維管束網膜下膜の形成と関係がある。網膜色素上皮細胞増殖及び血管新生因子の生成は、脈絡膜血管新生に影響を与えるようである。
【０３４３】
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、毛細血管基底膜の肥大が原因で糖尿病において発症する過剰な血管新生、及び毛細血管の周皮細胞と内皮細胞の間の接触の欠如によって特徴付けられる眼部障害である。周皮細胞の消失によって毛細血管の漏出が増大し、血液−網膜関門の破壊をもたらす。糖尿病性網膜症は微小血管網膜の変化の結果である。高血糖誘導性の周皮細胞死及び基底膜の肥大は、血管壁の不全をもたらす。これらの損傷は血液−網膜関門の形成を変え、更に網膜血管をより浸透性が高い状態にする。眼中の血管などの小血管は、低血糖（血中グルコース）調節の影響を特に受けやすい。グルコース及び／又はフルクトースの過剰蓄積は網膜中の小血管に損傷を与える。損傷血管が黄斑に液体及び脂質を漏出するときに、黄斑浮腫が発症する可能性もある。これらの液体が黄斑を膨張させ、それが視界を曇らせる。この損傷は網膜における酸素の欠如を更にもたらす。
【０３４４】
疾患が進行すると、網膜における酸素の欠如は、網膜及び眼の内側を満たす透明な、ゲル様の硝子体液に沿った血管新生を刺激する。適時の治療がない場合、これらの新しい血管は出血し、視界を曇らせ、網膜を破壊する可能性がある。維管束増殖は牽引性網膜剥離を引き起こす可能性もある。新しい血管は前眼房の角に増殖し、血管新生緑内障を引き起こす可能性もある。
【０３４５】
増殖性硝子体網膜症は、硝子体膜内及び網膜表面上の細胞及び線維膜の細胞増殖と関係がある。網膜色素上皮細胞の増殖及び移動はこの眼部障害に共通である。増殖性硝子体網膜症と関係がある膜は、コラーゲンＩ、ＩＩ、及びＩＶ型並びにフィブロネクチンなどの細胞外マトリクス要素を含有し、徐々に線維状になる。
【０３４６】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）及び糖尿病性網膜症は、先進国における２つの主な失明の原因である。マクロ分子ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、及びＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）の近年の承認によって、ＡＭＤ患者に利用可能な治療の選択肢が改善された。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）はＦａｂであり、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）はモノクローナル抗体である。これらはいずれも血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合し、ＡＭＤを治療する最も印象的な結果が今日までに実証されているが、しかし、少数の治療患者のみが視力の有意な改善を経験する。ＶＥＧＦ以外の標的に焦点を当てる抗血管新生療法は、ＶＥＧＦ経路を標的化する作用物質に関するいくつかの制約を克服することができる。
【０３４７】
本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を使用して、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症を治療又は予防することができる。本明細書に記載する抗体の投与によって、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症、又は増殖性硝子体網膜症を治療又は予防する方法を本明細書で記載する。本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体は、血管を収縮する、眼部疾患と関係がある内皮細胞増殖を阻害する、出血症状を除去する、不透明な視界を治療する、視力喪失の停止をもたらす、及び／又は血管漏出を防ぐこともできる。本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体は、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症又は増殖性硝子体網膜症を治療するための医薬品において使用することもできる。
【０３４８】
更に、本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を、黄斑変性症、ＣＮＶ、糖尿病性網膜症又は増殖性硝子体網膜症を治療するための知られている治療剤及び／又は化合物と併用して使用することもできる。このような化合物の例には、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ、パゾパニブ又はＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）があるが、これらだけには限られない。本明細書に記載する投与形態以外に、硝子体内経路によってキメラ抗エンドグリン抗体を投与することができる。硝子体内投与形態の非制限的な例には、硝子体内注射、及び硝子体内移植の使用がある。
【０３４９】
治療に対する改善及び応答性に関して患者を評価することができる。治療は、黄斑浮腫の減少、ＣＮＶ領域の減少、及び視力の増大を含むが、これらだけには限られない。症状の測定は当技術分野で知られており、以下の実施例中で更に記載する。
【０３５０】
慢性炎症性疾患
任意の様々な組織又は編成組織を含む器官は、皮膚、筋肉、消化管、結合組織、関節、骨、及び血管新生刺激によって血管が侵襲され得る同様の組織を含めた疾患状態において、血管新生をサポートする可能性がある。したがって、一実施形態では、治療する組織は炎症組織であり、阻害される血管新生は、炎症組織の新血管形成がある炎症組織の血管新生である。
【０３５１】
炎症性腸疾患
血管新生は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において重要な役割を果たす。ＩＢＤは、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含めた、一組の腸及び腸管の疾患又は状態に関する包括的用語である。クローン病は典型的には小腸と大腸の炎症によって特徴付けられ、一方で潰瘍性大腸炎は一般に結腸に局在する。異常又は病的血管新生は、クローン病と潰瘍性大腸炎の両方において中心的なものである。両疾患は増大した微小血管密度及び微小血管機能障害に関与し、この血管新生は、両疾患中で見られる組織病状及び炎症サイクルと一時的に関係する。エンドグリンはこれらの組織中で発現され、ＩＢＤ中の血管新生の異常調節において役割を果たすことが知られている。（Ｃｈｉｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９３：５−１８（２００７））。
【０３５２】
本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を使用してＩＢＤを治療することができる。更に、キメラ抗エンドグリン抗体は、クローン病又は潰瘍性大腸炎の治療に使用することができる。キメラ抗エンドグリン抗体は、ＩＢＤ、クローン病又は潰瘍性大腸炎用の外科手術及び／又は知られている療法剤と併用して使用することもできる。このような知られている療法剤の例には、アミノサリチル酸（例えば、メサラミン）、コルチコステロイド（例えば、ブデソニド、プレドニソンなど）、抗生物質（例えば、メトロニジゾールなど）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、タクロリムス、及びシクロスポリンなど）、及びタンパク質及び抗体（例えば、インフリキシマブなど）などの生物製剤があるが、これらだけには限られない。
【０３５３】
ＩＢＤの治療は、炎症組織の低下した血管形成によって評価することができる。治療は、ＩＢＤを特徴付ける潰瘍性病変の停滞、消散、及び／又は治癒によって評価することもできる。
【０３５４】
糖尿病性腎症及び腎移植虚血
糖尿病性腎症は、１型と２型両方の糖尿病における罹患率及び死亡率の主な原因である。それは世界中で末期段階腎臓疾患の主たる原因である。糖尿病性腎症は、血管新生促進因子の増大した合成が原因の糸球体微小血管損傷によって特徴付けられる。これらの血管新生促進因子は増大した内皮細胞増殖及びその後の血管新生を引き起こし、エンドグリンは慢性腎臓疾患において上方制御されることが知られている。この血管新生は糸球体の破壊、及び最終的には腎不全をもたらす。
【０３５５】
同様の影響が、移植器官の虚血及び障害をもたらす腎臓移植において見られる。エンドグリンの上方制御は、腎臓中の上方制御血管新生及び炎症をもたらす。逆に、エンドグリン欠損マウスを用いた試験は、移植／虚血後に有意に低減した腎臓障害及び増大した器官寿命を示す。
【０３５６】
本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を使用して、糖尿病性腎症、移植後の腎不全、及び／又は移植後の虚血性腎障害を治療又は予防することができる。
【０３５７】
本明細書に記載する抗体の投与によって、糖尿病性腎症、移植後の腎不全、及び／又は移植後の虚血性腎障害を治療又は予防する方法を、本明細書に記載する。本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体は、糖尿病性腎症、移植後の腎不全、及び／又は移植後の虚血性腎障害を治療するための医薬品において使用することもできる。更に、本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を、糖尿病性腎症、移植後の腎不全、及び／又は移植後の虚血性腎障害を治療するための知られている治療剤及び／又は化合物と併用して使用することもできる。
【０３５８】
患者は治療の有効性に関して、例えば腎機能の改善によって評価することができる。
【０３５９】
関節リウマチ及び骨関節炎
関節リウマチは過剰な血管新生によって特徴付けられ、この点において十分理解されている。滑膜液中で見られる炎症及び破壊は、滑膜組織周辺及び中で見られる増大した血管新生と直接関係がある。多数の血管新生促進因子が、関節リウマチ患者の患部組織中に存在する。
【０３６０】
骨関節炎は、滑膜関節に影響を与える慢性不能状態の一群である。血管新生及び炎症は疾患の病態生理における必要不可欠なプロセスであり、それらは、ＭＭＰ生成及び軟骨内骨化の刺激だけには限られないが、これらを含めた様々な機構による関節損傷に貢献する。更に、骨関節炎における血管新生は更なる神経分布を誘導し、これが各々が互いを刺激し続けるフィードバックループに発達する。
【０３６１】
本明細書に記載するキメラ抗エンドグリン抗体を使用して、関節リウマチ及び骨関節炎を治療又は予防することができる。本明細書に記載する１つ又は複数の組成物の投与によって、関節リウマチ及び骨関節炎を治療又は予防する方法を、本明細書に記載する。本明細書に記載するヒト化キメラ抗エンドグリン抗体は、関節リウマチ及び骨関節炎を治療するための医薬品において使用することもできる。
【０３６２】
臨床試験におけるＲＡ改善の２つの十分認められた混成測定基準は、パウラスの基準及びアメリカリウマチ学会の基準（ＡＣＲ）である。パウラスの基準は、以下の４つ、圧痛及び膨張関節数、朝のこわばり、患者の疾患活性評価、医師の疾患活性及び赤血球沈降速度（ＥＳＲ）範囲の評価の改善として定義される。改善のレベルはこれらの変数各々の改善率として設定する。即ち、パウラス２０の分類は、６パラメーターの４つにおいて２０％の改善を示した応答者を示す。
【０３６３】
関節リウマチは、アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）のスコアリングを使用して評価することもできる。簡単に言うと、関節リウマチの臨床的寛解の決定に関するＡＣＲの分類基準は、少なくとも２カ月連続で存在する５つ以上の以下の要因の存在によって評価する：
ａ．朝のこわばり、１５分未満、
ｂ．疲労なし、
ｃ．関節痛なし、
ｄ．運動時の関節圧痛又は痛みなし、
ｅ．関節又は腱鞘中の軟部組織の膨張なし、及び
ｆ．ＥＳＲ（ウエステルグレン法）、女性に関して３０ｍｍ／時間又は男性に関して２０ｍｍ／時間未満。
【０３６４】
除外を実施することができ、活性血管炎、心膜炎、胸膜炎又は筋炎の臨床症状を含み、説明不能な近年の体重減少又は関節リウマチが原因の発熱は完全な臨床的寛解の現れを妨げる（Ｐｉｎａｌｓ  ＲＳ，ｅｔ．ａｌ．：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ２４：１３０８，１９８１）。更に、関節リウマチにおける機能状態のＡＣＲ分類基準は、以下の患者の能力に基づく分類を含む：
クラスＩ：日常生活の通常の活動を完全に実施することができる（自己管理、職業、及び趣味）、
クラスＩＩ：通常の自己管理及び職業活動は実施することができるが、ただし趣味の活動に限られる、
クラスＩＩＩ：通常の自己管理活動は実施することができるが、ただし職業及び趣味の活動に限られる、及び
クラスＩＶ：通常の自己管理、職業、及び趣味の活動を実施する能力が限られる。
【０３６５】
骨関節炎はＡＣＲのスコアリングを使用して評価することもできる。臀部の骨関節炎に関するＡＣＲ臨床的分類基準は、患者の病歴、身体検査及び検査所見を利用して評価し、患者は臀部の痛み及び以下の１つに関して評価する：
（１）１５度未満の臀部内側回転角、及び４５度ｍｍ／時間以下のＥＳＲ、又はＥＳＲが利用不能な場合１１５度以下の臀部屈曲、又は
（２）１５度未満の臀部内側回転角、臀部内側に関する痛み、６０分以下の臀部の朝のこわばり、及び患者が５０才を超えること。
【０３６６】
病歴、身体検査、検査及びＸ線写真で見た所見を使用すると、従来の形式は臀部の痛み及び以下の指標の２つである：２０ｍｍ／時間未満のＥＳＲ、Ｘ線写真で見た大腿及び／又は寛骨臼骨増殖体、又はＸ線写真で見た関節空間狭窄（上部、軸面、及び／又は中心）。分類樹は以下の通りである：（１）Ｘ線写真で見た大腿及び／又は寛骨臼骨増殖体又は（２）２０ｍｍ／時間以下のＥＳＲ及びＸ線写真で見た軸面関節空間狭窄と関係がある臀部の痛み（Ａｌｔｍａｎ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ３４：５０５，１９９１）。
【０３６７】
膝の骨関節炎に関するＡＣＲ臨床的分類基準
膝の骨関節炎に関するＡＣＲ臨床的分類基準を、以下の基準、以下の３つに関する膝の痛みを利用する病歴及び身体検査を使用して評価する：
（１）患者が５０才を超えること、
（２）３０分未満の朝のこわばり、
（３）活動時のコツコツ音、
（４）骨の圧痛、
（５）骨の肥大、及び
（６）滑膜の感じられる暖かさなし。
【０３６８】
患者の病歴、身体検査及びＸ線写真で見た所見を使用して、膝の痛みを以下の患者の特性、（１）患者が５０才を超えること、（２）３０分未満の朝のこわばり、及び（３）活動時及び骨増殖体におけるコツコツ音の１つに関して評価することができる。病歴、身体検査及び検査所見を使用して、膝の痛みを以下の特性の５つに関して評価することができる：
（１）患者が５０才を超えること、
（２）３０分未満の朝のこわばり、
（３）活動時のコツコツ音、
（４）骨の圧痛、
（５）骨の肥大、
（６）滑膜の感じられる暖かさなし、
（７）ＥＳＦが４０ｍｍ／時間未満であること、
（８）１：４０未満のリウマチ因子（ＲＦ）、及び
（９）骨関節炎の滑膜液（ＳＦ）兆候。
例えば、Ａｌｔｍａｎ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ２９：１０３９，１９８６参照。
【０３６９】
手の骨関節炎に関するＡＣＲ臨床的分類基準は、以下の、（１）以下の２つ以上の関節（両手の第二及び第三遠位指節間関節、第二及び第三近位指節間関節、及び第一手根中手関節）の硬部組織の肥大、（２）２つ以上の遠位指節間関節の硬部組織の肥大、（３）３つより少ない膨張ＭＣＰ関節、及び（４）（１）で前に列挙した少なくとも１つの関節の奇形の３つに関して、手の痛み、しびれ又はこわばりで以下のように評価することができる。
【０３７０】
併用療法
本明細書に記載する実施形態によれば、本明細書に記載する組成物は、単独で、又は１つ若しくは複数の他の活性若しくは不活性剤と併用して投与することができる。併用を使用するとき、キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体（その抗原結合断片）の同時又は連続投与を使用することができる。
【０３７１】
化合物は、必要に応じて、アドリアマイシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、ペメトレキセド、テモゾロミド、オキサリプラチン、エルビツクス、ベクチビックス、ソラフェニブ、スニチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、レナリドマイド、サリドマイド、キセローダ、タキソテール、及び本明細書に記載する多くの他の従来の癌治療剤だけには限られないが、これらを含めた、１つ若しくは複数の他の療法治療剤と併用して投与することができる。本明細書で使用する「放射線」は、例えば、マイクロ波、紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）、又はα−、β−若しくはγ−放射線を指す。放射線は、従来技法を使用して体全体を照射せずに１つ若しくは複数の腫瘍部位に「焦点を当てる」、又はそこに放射線を向けて局所送達することができる。以下に列挙する治療レジメンの一覧は従来の療法を表すが、本発明が、本明細書で具体的に開示しない他の知られている治療レジメンを包含することは理解されるであろう。
【０３７２】
一実施形態では、癌は卵巣癌であり、１つ若しくは複数の他の療法治療は、外科手術、化学療法剤（例えば、ドキソルビシン、ドキシル、ゲムシタビン、ルビテカン、及び白金系化学療法剤、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンなど）、メルファラン、トポテカン及びイリノテカンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤、タキサン系化学療法剤、ホルモン、放射線療法、全身低体温法、フェノキソジアルなどのイソフラボン誘導体、エポチロンなどの細胞障害性マクロライド、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤、トラツズマブなどのシグナル伝達阻害剤、遺伝子療法、ＲＮＡｉ療法、免疫療法、モノクローナル抗体、ラパマイシンなどのホスファチジルイノシトール様キナーゼ阻害剤、又はこれらの任意の組合せである。本明細書に記載する抗体と卵巣癌療法剤の併用療法は、療法剤の同時投与からの相乗効果により、低用量の１つ又は２つの療法をもたらすこともできる。
【０３７３】
一実施形態では、癌は腎臓／腎臓癌であり、１つ若しくは複数の他の療法治療は、外科手術、化学療法剤、パゾパニブ、インターフェロン−α又はＩＬ−２である。更に別の実施形態では、他の作用物質はＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非制限的な例には、前に記載した阻害剤、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがある。本明細書に記載する抗体と腎臓癌療法剤の併用療法は、療法剤の同時投与からの相乗効果により、低用量の１つ又は２つの療法をもたらすこともできる。
【０３７４】
一実施形態では、癌はミエローマであり、１つ若しくは複数の他の療法治療は、外科手術、放射線療法、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、レナリドマイド、又はサリドマイドである。一実施形態では、他の作用物質はＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）である。任意のこれらの療法に関する用量は当技術分野で知られており、必要に応じて併用療法で調節することができる。
【０３７５】
一実施形態では、癌は前立腺癌であり、１つ若しくは複数の他の療法治療は、外科手術、放射線療法（例えば、外部ビーム又は小線源治療）、ホルモン剥奪療法（アビラテロンを含めたアンドロゲン抑制）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）阻害剤、化学療法剤（例えば、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、サトラプラチン及びオキサリプラチン、タキサン、エストラムスチンなどの白金系化学療法剤）、プレドニソン又はプレドニソロン、スタチンなどのコレステロール低下薬、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、ＲＮＡｉ療法、樹状細胞系療法、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌するように遺伝的に改変された完全腫瘍細胞（ＧＶＡＸとしても知られる）、又はこれらの任意の組合せである。更に別の実施形態では、他の作用物質はＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非制限的な例には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがある。
【０３７６】
一実施形態では、癌は肺癌であり、１つ若しくは複数の他の療法治療は、外科手術、放射線療法（例えば、胸部放射線療法、帯電粒子を用いた放射線療法）、ウラシル−テガフール及び白金系化学療法剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなど）、及びビノレブリン、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィニチブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、抗上皮増殖因子受容体抗体（例えば、セツキシマブ）、チロシンキナーゼの小分子阻害剤、肺癌細胞増殖に関与するタンパク質の直接阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、レーザー誘導温熱療法、ＲＮＡｉ療法、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌するように遺伝的に改変された完全腫瘍細胞（ＧＶＡＸとしても知られる）、又はこれらの任意の組合せである。他の療法治療剤はタキソール又はペメトレキセドを含む。更に別の実施形態では、他の作用物質はＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非制限的な例には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがある。任意のこれらの療法に関する用量は当技術分野で知られており、必要に応じて併用療法で調節することができる。
【０３７７】
一実施形態では、癌は乳癌であり、１つ若しくは複数の他の療法治療は、外科手術、モノクローナル抗体（例えば、Ｈｅｒ−２抗体、ヘルセプチン）、単剤化学療法又は併用化学療法などのアジュバント化学療法（例えば、アントラサイクリン−及びタキサン系多剤化学療法、タキソール、又は標的特異的トラツズマブ、エンドクリン操作あり又はなし、ＰＭＲＴ操作あり又はなし、ビノレルビン）、アドリアマイシン、シクロホスファミド、ゼローダ、タキソテール、タモキシフェン及びラロキシフェンなどの選択的エストロゲン受容体モジュレーター、トリロスタンなどのアロステリックエストロゲン受容体モジュレーター、放射線療法（例えば、腸内小線源治療、マンモサイトデバイス、３次元等角外部放射及び術中放射線療法）、全身合成を抑制するアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、エクセメスタン及びレトロゾール）、ＲＮＡｉ療法、テムシロリムス（ＣＣＩ７７９）などの免疫抑制があり抗増殖性である静脈内用ラパマイシンアナログ、又はこれらの任意の組合せである。乳癌の三次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養モデルを実施するための方法の総説は、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ８５（３）：２８１−９１（２００４）によって記載される。癌を試験するための他のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは知られており、本明細書に記載する抗体を試験するために使用することができる。更に別の実施形態では、他の作用物質はＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非制限的な例には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがある。任意のこれらの療法に関する用量は当技術分野で知られており、必要に応じて併用療法で調節することができる。
【０３７８】
一実施形態では、癌は結腸癌であり、１つ若しくは複数の他の療法治療は、外科手術、放射線療法、及び化学療法剤（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レバミゾール、ロイコボリン又はセムスチン（メチルＣＣＮＵ））、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アクリジン−４−カルボキシアミド及び他の関連カルボキシアミド抗癌剤、非トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、イリノテカン、リポソームトポテカン、タキサンクラスの抗癌剤（例えば、パクリタキセル又はドセタキセル）、キサンテノン酢酸クラスの化合物（例えば、５，６−ジメチルアンテノン−４−酢酸ＰＭＡＡ）、ラミナリン、部位選択的環状ＡＭＰアナログ（例えば、８−クロロアデノシン３’，５’−環状リン酸）、Ｃｏｘ−２のピラノインドール阻害剤、Ｃｏｘ−２のカルバゾール阻害剤、Ｃｏｘ−２のテトラヒドロカルバゾール阻害剤、Ｃｏｘ−２のインデン阻害剤、ＮＳＡＩＤＳの局所阻害剤（例えば、アンスラニル酸、アスピリン（５−アセチルサリチル酸）、アゾジサルナトリウム、ヘテロ複素環式炭酸、カルプロフェン、クロラムブシル、ジクロフェナク、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェノプロフェン、フルフェナム酸、フルビプロフェン、フルプロフェン、フロセミド、チオマレイン酸ナトリウム金、イブプロフェン、インドメタシン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロナゾラック、ロキソプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メルファラン、ナプロキセン、ペニシラミン、フェニル酢酸、プロピオン酸、サリチル酸、サラゾスルファピリジン、スリンダク、トルメチン、ピラゾロンブタゾンプロパゾンＮＳＡＩＤ、メロキシカム、オキシカム、ピロキシカム、フェルデン、ピロキシカムβシクロデキストラン、テノキシカム、エトドラック、及びオキサプロジン）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの阻害剤、ＲＮＡｉ療法、ＧＭ−ＣＳＦ、モノクローナル抗体（例えば、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体、抗ＣＥＡ抗体、Ａ３３（ＨＢ８７７９）、１００−２１０（ＨＢ１１７６４）及び１００−３１０（ＨＢ１１０２８））、エルビツクス、ベクチビクス、ホルモン療法、ピリミジンアミン、カンプトテシン誘導体（例えば、ＣＰＴ−１１）、フォリン酸（ＦＡ）、ゲムシタビン、Ａｒａ−Ｃ、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンなどの白金系化学療法剤、ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ阻害剤、又はこれらの任意の組合せである。一実施形態では、他の療法治療剤は５−ＦＵ、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）である。一実施形態では、他の療法治療剤は５−ＦＵ、イリノテカン及びロイコボリンの組合せ（ＩＦＬ）である。一実施形態では、他の作用物質はエルビツクスである。一実施形態では、他の作用物質はベクチビクスである。更に別の実施形態では、他の作用物質はＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非制限的な例には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがある。任意のこれらの療法に関する用量は当技術分野で知られており、必���に応じて併用療法で調節することができる。
【０３７９】
一実施形態では、癌は膵臓癌であり、１つ若しくは複数の他の療法治療は、療法治療の組合せ、外科手術、放射線療法（ＲＴ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びＲＴ、全身療法、ステント挿入、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ゲムシタビン及びＲＴ、セツキシマブ、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、化学的放射、又はこれらの任意の組合せである。更に別の実施形態では、他の作用物質はＶＥＧＦ受容体阻害剤である。ＶＥＧＦ受容体阻害剤の非制限的な例には、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アキシチニブ、ペガプタニブ及びパゾパニブがある。
【０３８０】
治療レジメン前、最中、及び後を含めた１回又は多数回の時間地点で、いくつかの症状に関して患者を評価することができる。治療は対象の状態の改善をもたらすことができ、１つ又は複数の以下の要因：腫瘍の大きさの低下、細胞増殖の低下、細胞数の低下、新血管形成の低下、アポトーシスの増大、又は細胞増殖障害を含む細胞の少なくとも一部分の生存の低下が発生したかどうか決定することによって評価することができる。１つ又は複数のこれらの発生は、いくつかの場合、癌の部分的又は完全排除及び患者の生存期間の延長をもたらす可能性がある。或いは、末期段階の癌に関して、治療は疾患の停滞、より良い生活の質及び／又は生存期間の延長をもたらす可能性がある。
【０３８１】
機能アッセイ
本明細書に記載する組成物は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏアッセイ中で評価することができる。当技術分野で知られている任意の適切なアッセイを使用して、このような影響をモニタリングすることができる。いくつかのこのような技法は本明細書に記載する。
【０３８２】
ＣＤ１０５のシグナル伝達及び機能に関するアッセイ
ＣＤ１０５（エンドグリン）は増殖内皮細胞によって発現されるＴＧＦ−β受容体ファミリーのメンバーであり、正常レベルのＣＤ１０５が内皮細胞増殖に必要とされる。ＣＤ１０５は固形腫瘍の血管新生脈管構造中で強く発現され、血管新生／血管発達に関与し、補助的形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）受容体である。ＣＤ１０５は、白血病細胞及び内皮細胞において発現されるホモ二量体細胞膜糖タンパク質である。それらの細胞質尾部のアミノ酸配列が異なる、２つのアイソフォームのＣＤ１０５、Ｌ−エンドグリン（１７０ｋＤａ）及びＳ−エンドグリン（１６０ｋＤａ）が特徴付けされている。
【０３８３】
ＣＤ１０５の発現は、低酸素誘導因子−１−α（ＨＩＦ−１−α）の生成を介した細胞の低酸素状態によって増大し、アポトーシスから低酸素細胞を保護する。ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ）、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）及びアクチビン受容体を含めた、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多数のキナーゼ受容体複合体のシグナル伝達を調節するために作用する。ＣＤ１０５の不在下において、ＴＧＦ−β受容体の活性化は、内皮細胞増殖を阻害するＳＭＡＤタンパク質のリン酸化をもたらす。しかし、ＴＧＦ−βによるＣＤ１０５の活性化は、ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化を調節する。最終結果は、内皮細胞に対するＴＧＦ−β受容体活性化の増殖阻害効果の表れである。
【０３８４】
抗ＣＤ１０５抗体によるＣＤ１０５活性化の防止は、ＴＧＦ−βと共同作用して内皮細胞の増殖を抑制する。ＴＧＦ−βは、内皮細胞中とは逆の効果で２つの異なるＩ型受容体／ＳＭＡＤシグナル伝達経路を刺激することができる。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５シグナル伝達経路（Ａ）は細胞の増殖及び移動の阻害をもたらし、一方ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路（Ｂ）は内皮細胞の増殖及び移動を誘導する。血管新生中に高度に発現されるＣＤ１０５、補助的ＴＧＦ−β受容体は、ＡＬＫ１シグナル伝達に必要不可欠である。ＣＤ１０５の不在下では、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５シグナル伝達経路が主要であり、静止状態の内皮を維持する。高いＣＤ１０５発現はＡＬＫ１経路を刺激し、ＡＬＫ５シグナル伝達を間接的に阻害し、したがって血管新生の活性化状態を促進する。
【０３８５】
非制限的な一実施形態では、血管新生の阻害及び内皮細胞増殖に関して、キメラ抗体を評価することができる。キメラ抗エンドグリン抗体とＨＵＶＥＣの結合が、ＴＧＦ−βとＨＵＶＥＣの後の結合を妨げることはない。したがって、抗エンドグリン抗体による内皮細胞増殖の直接抑制は、それによって抗血管新生及び腫瘍抑制効果がｉｎ  ｖｉｖｏで観察される根底メカニズムの１つを表す。別の実施形態では、Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化及び／又はシグナル伝達の予防による血管新生の遮断に関して、キメラ抗体を評価することができる。ＣＤ１０５はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１のシグナル伝達を介した血管新生の促進に関与し、したがってこれはＳｍａｄ２／３タンパク質のリン酸化の低下及び／又は遮断と関係する。更に別の実施形態では、Ｓｍａｄ２／３リン酸化及び／又はシグナル伝達の増大による血管新生の遮断に関して、キメラ抗体を評価することができる。
【０３８６】
ＴＧＦ−β／ＡＬＫ１シグナル伝達経路及び／又はＳｍａｄ１／５のリン酸化に対する本明細書で提供するキメラ抗体の遮断又は阻害効果をアッセイするための方法及び技法には、知られている分子学的技法があるが、これらだけには限られない。例えば、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路中の任意のタンパク質に特異的な抗体を用いるウエスタンブロッティングを使用して、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路に対する本明細書で開示するキメラ抗エンドグリン抗体の阻害及び／又は刺激効果を決定することができる。同様に、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路に関与するタンパク質のｍＲＮＡの検出又はｍＲＮＡの制御を使用して、本明細書で開示するキメラ抗体の阻害及び／又は刺激効果をアッセイすることができる。ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５又はＴＧＦ−β／ＡＬＫ１経路に関する細胞のシグナル伝達をアッセイするための他の方法は当技術分野で知られており、本明細書において企図する。
【０３８７】
本明細書で開示するキメラ抗エンドグリン抗体の活性は、当技術分野で認められているアッセイを使用して、例えばＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡなどの結合アッセイ、表面プラズモン共鳴、及び以下でより詳細に記載するＨＵＶＥＣ細胞に対する影響によって評価することができる。
【０３８８】
ＶＥＧＦのシグナル伝達及び機能に関するアッセイ
ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）とのＶＥＧＦ結合を特異的に阻害する抗体は、競合及び／又は機能アッセイを使用して評価することができる。アッセイには、ＥＬＩＳＡをベースとする競合アッセイがあるが、これらだけには限られない。競合アッセイでは、様々な量の試験抗体（例えば、１００倍〜１０００倍モル過剰）とＶＥＧＦを事前混合又は混合し、ＶＥＧＦＲ２とのＶＥＧＦ結合を減らす試験抗体の能力を決定する。ＶＥＧＦは予め標識し直接検出することができ、又は（二次）抗ＶＥＧＦ抗体若しくは二次及び三次抗体検出システムを使用して検出することができる。このような競合アッセイのＥＬＩＳＡ形式は１つのこのような形式であるが、任意の型の免疫競合アッセイを実施することができる。
【０３８９】
（非遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を含めた）全く無関係な抗体の存在下でのＶＥＧＦＲ２とのＶＥＧＦ結合は、このような競合アッセイ中では対照高値（１００％）である。試験アッセイ中では、試験抗体の存在下でのＶＥＧＦＲ２とのＶＥＧＦ結合の有意な減少は、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）とのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する抗体の指標である。
【０３９０】
抗体がＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）とのＶＥＧＦ結合を阻害することを同定及び／又は確認するための別の結合アッセイは、共沈降アッセイである。共沈降アッセイは、溶液中の１つ又は複数の受容体とＶＥＧＦの結合を遮断する抗体の能力を試験する。このようなアッセイでは、ＶＥＧＦ又は検出可能に標識したＶＥＧＦを適切な型の受容体とインキュベートする。
【０３９１】
免疫沈降又は共沈降アッセイを実施するための多くの形式が存在する。本発明の場合、「適切な型の受容体」はＶＥＧＦＲ２受容体又は受容体の細胞外ドメインであってよい。したがって免疫沈降は、標準的試薬と共に、ＶＥＧＦＲ２受容体又はＶＥＧＦが結合する部位と異なる受容体の細胞外ドメイン上のエピトープに対する抗体の存在を必要とする。
【０３９２】
適切な受容体とは無関係に、対照を用いて免疫沈降又は共沈降アッセイを実施する。選択した受容体と結合するＶＥＧＦ単独の能力は、抗ＶＥＧＦ抗体の不在下での沈降によって確認することができる。平行インキュベーションは、対照として働くための知られている結合性を有する抗体の有無の下で実施することができる。遮断対照と非遮断対照抗体の両方を使用するアッセイは平行して実施することができる。
【０３９３】
次いで任意の結合免疫種を、例えばプロテインＡ組成物又はプロテインＡセファロースビーズなどの、有効な免疫沈降組成物とのインキュベーションによって免疫沈降させる。次いで沈降はＶＥＧＦの存在に関して試験する。初期インキュベーション中のＶＥＧＦが、放射標識ＶＥＧＦなどの検出可能に標識したＶＥＧＦであった場合、免疫沈降中の任意のＶＥＧＦを直接検出することができる。免疫沈降中の任意の非標識ＶＥＧＦは、他の適切な手段によって、例えばゲル分離及び抗ＶＥＧＦ抗体を用いた免疫的検出によって検出することができる。
【０３９４】
このような共沈降アッセイ中で、ＶＥＧＦＲ２などのＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ結合を遮断する抗体の能力は容易に定量化することができるが、定性的結果も貴重である。定量化は標識ＶＥＧＦの直接測定によって、又は例えば免疫的に検出したＶＥＧＦの濃度測定分析によって実施することができる。ＶＥＧＦＲ２とのＶＥＧＦ結合を阻害する、再現性のある、即ち、絶えず観察される能力を示す抗体をしたがって検出することができ、前述の定量基準に従い有用な抗体を選択することができる。
【０３９５】
ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）とのＶＥＧＦ結合を有意に阻害しない抗ＶＥＧＦ抗体も、前に記載したように共沈降アッセイを実施することによって、ただしＶＥＧＦＲ２ではなくＶＥＧＦＲ１を使用して、容易に同定することができる。したがって、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）とのＶＥＧＦ結合を有意に阻害せずに、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）とのＶＥＧＦ結合を阻害する抗ＶＥＧＦ抗体も、このような方法を使用して容易に同定することができる。
【０３９６】
抗体がＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）とのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することを同定及び／又は確認するための機能アッセイを使用することもできる。これらは一般に、特定の明確な生物学的応答を担う受容体としてのＶＥＧＦＲ２の同定に関する。無細胞系で実施され最も再現性のある前述の競合型アッセイほど典型的には使用されないが、確実で、労力節約型で、且つコスト効率の良い、以下のアッセイはそれにもかかわらず有用である。
【０３９７】
例えば、ＶＥＧＦＲ２遮断、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ仲介内皮細胞増殖を阻害する（ＶＥＧＦの細胞分裂活性を阻害する）能力を試験することによって同定することができる。任意の適切なアッセイを、試験抗体の有無の下ＶＥＧＦの存在下において、任意の様々な内皮細胞を使用して実施することができる。ＶＥＧＦを含まないアッセイ、及び明確な性質（遮断と非遮断の両方）の対照抗体を用いるアッセイなどの、二連アッセイを平行して実施することができる。内皮細胞増殖は、比色定量アッセイを含めた細胞数を決定する任意の許容される手段によって、決定し正確に定量化することができる。
【０３９８】
ＶＥＧＦ仲介内皮細胞増殖を阻害する能力を有する抗体は、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％などの、絶えず観察されるＶＥＧＦ仲介内皮細胞増殖の阻害を一般に示し得る。このような範囲内の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生を阻害するのに十分な性質を有する抗体を示し得る。より有意な阻害活性を有する抗体を本発明から除外するわけではない。
【０３９９】
抗体を同定するための更なる機能アッセイは、ＶＥＧＦ誘導型リン酸化の遮断を試験するためのアッセイを含む。任意の適切なアッセイを、任意の型の天然又は組換えリン酸化ＶＥＧＦＲ２を発現する任意の様々な内皮細胞を使用して利用することができる。試験する抗体の有無の下で適切な時間の間、細胞はＶＥＧＦとインキュベートする。ＶＥＧＦを含まないアッセイ、及び明確な性質（遮断と非遮断の両方）の対照抗体を用いるアッセイなどの、二連アッセイを平行して実施することができる。
【０４００】
本発明によりＶＥＧＦＲ２遮断、抗ＶＥＧＦ抗体を同定するための他の更なる機能アッセイは、ＶＥＧＦ誘導型血管透過性の阻害を試験するためのアッセイである。任意のこのようなアッセイを使用することができるが、１つの適切なアッセイはＭｉｌｅｓの透過性アッセイであり、この場合モルモットなどの動物にエバンスブルー色素などの色素を注射し、動物皮膚中の色素の出現を試験抗体の有無の下でＶＥＧＦを与えた後に決定する。ＶＥＧＦを含まない試験、及び明確な性質（遮断と非遮断の両方）の対照抗体を用いる試験などの、二連試験を平行して実施することができる。動物皮膚中の色素の出現は、典型的には動物の背部中の、青色スポットなどのスポットとしてであり、これを写真撮影し測定することができる。
【０４０１】
ＳＣＩＤ／ヌードマウス
腫瘍増殖をアッセイするための１つの方法は、以下のようにＳＣＩＤマウスを利用する。半密集状態のヒトＭ２１メラノーマ細胞を採取し、洗浄し、滅菌ＰＢＳ（１ｍＬ当たり２０×１０６）中に再縣濁する。ＳＣＩＤマウスには、１００μＬのＭ２１ヒトメラノーマ細胞（２×１０６）縣濁液を皮下注射する。腫瘍細胞注射後３日で、マウスは未治療状態であるか、或いは１つ又は複数の対照又は試験組成物で静脈内又は腹腔内治療する（例えば、１００μｇ／マウス）。マウスは２４日間一日一回治療する。腫瘍の大きさはカリパスで測定し、体積は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して測定し、前式でＶは体積に等しく、Ｌは長さに等しく、且つＷは幅に等しい。
【０４０２】
腫瘍増殖をアッセイするための１つの方法は、以下のようにヌードマウスを利用する。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞（０．４×１０６細胞／マウス）、５０μｌＰＢＳ中を、メスヌードマウス（５〜６週齢）の乳腺脂肪体中に正所移植する。腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３の平均体積に達したとき、マウスをランダムに処理し（少なくとも１０／群）、１週間当たり２回の、１つ又は複数の抗体、投与当たり１μｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）又は２００μｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）、又は１００μｇ対照抗体、１００μｌＰＢＳ中、又は賦形剤ＰＢＳ１００μｌを用いた静脈内又は腹腔内治療を開始し、いくつかの試験では、未治療群も評価することができる。腫瘍の大きさはカリパスで測定し、体積は式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して測定し、前式でＶは体積に等しく、Ｌは長さに等しく、且つＷは幅に等しい。
【０４０３】
ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスモデル
或いは、ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスモデルを利用して、抗体により、又は例えばＴｓｕｊｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２９：１０８７−１０９４（２００６）によって例証され本明細書に記載するように、腫瘍増殖及びその阻害を評価することもできる。
【０４０４】
キメラマウス
別のアッセイはキメラマウス：ヒトマウスモデルにおける血管新生を測定し、キメラマウスアッセイと呼ばれる。このアッセイは他者によって詳細に記載されており、本明細書で更に記載して血管新生、新血管形成、及び腫瘍組織の退行を測定する。Ｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：９８６−９９６を参照。
【０４０５】
キメラマウスアッセイは、移植皮膚片が組織学的に正常なヒトの皮膚と非常に似ているので、ｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生の有用なアッセイモデルであり、全組織の新血管形成が起こり、この場合実際のヒト血管は、移植したヒトの皮膚から、移植したヒトの皮膚の表面上のヒト腫瘍組織に増殖する。ヒト移植片への新血管形成の起源は、ヒト特異的内皮細胞マーカーを用いた新血管の免疫組織化学的染色によって実証することができる。
【０４０６】
キメラマウスアッセイは、新血管増殖の退行の量と程度の両方に基づいて、新血管形成の退行を実証する。更に、腫瘍組織などの移植片皮膚上に移植した任意の組織の増殖に対する影響を、モニタリングすることは容易である。最後に、アッセイシステム中に毒性に関する内部対照が存在するので、このアッセイは有用である。キメラマウスは任意の試験試薬に曝し、したがってマウスの健康状態は毒性の指標である。本明細書に記載し当技術分野で知られている他の動物モデルも、本明細書に記載する方法中で利用することができる。
【０４０７】
ウサギの眼のアッセイ
血管新生の別の測定法はｉｎ  ｖｉｖｏウサギの眼モデルであり、ウサギの眼のアッセイと呼ばれる。ウサギの眼のアッセイは他者によって詳細に記載されており、Ｄ’Ａｍａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（９）：４０８２−４０８５によって例証されたように、これを使用して血管新生阻害剤の存在下で血管新生と新血管形成の両方が測定されている。
【０４０８】
ウサギの眼のアッセイはｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生の認められているアッセイモデルである。角膜の縁から角膜に増大するウサギの血管によって例証される新血管形成プロセスは、本来透明な眼の角膜によって容易に見ることができるからである。更に、新血管形成又は新血管形成の退行の刺激又は阻害の程度と量の両方を、経時的に容易にモニタリングすることができる。
【０４０９】
最後に、ウサギは任意の試験試薬に曝し、したがってウサギの健康状態は試験試薬の毒性の指標である。
【０４１０】
簡単に言うと、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイを実施し、脈管構造発達に対する影響を、１つ又は複数の対照又は試験化合物を含有する０．５％カルボキシメチルセルロースペレットの移植後４８時間で記録する。角膜の新血管形成は、スクラルフェート（ショ糖硫酸エステルアルミニウム塩；Ｂｕｋｈ  Ｍｅｄｉｔｅｃ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）と結合した６５０ｎｇの強力な血管新生タンパク質塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有するポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｈｙｄｒｏｎ；Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）の移植ペレットによって誘導する。ペレットへのスクラルフェートの添加はｂＦＧＦが分解するのを妨げ、その徐放をもたらし、したがってｂＦＧＦ／Ｈｙｄｒｏｎ単独によって誘導される血管新生より顕著な絶えず攻撃性のある血管新生をもたらす。スクラルフェート／Ｈｙｄｒｏｎを含有するペレットからのｂＦＧＦの放出は、Ｈｙｄｒｏｎのみを有するペレットのわずか１日と比較して、ペレット形成後最大４日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出することができる。ペレットは１２μｇの組換えｂＦＧＦ（Ｔａｋｅｄａ，Ｏｓａｋａ）を含有する１１０μｌの生理食塩水と４０ｍｇのスクラルフェートを混合することによって作製し、この縣濁液を８０μｌの１２％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｈｙｄｒｏｎ、エタノール中に加える。次いでこの混合物のアリコート（１０μｌ）をテフロンペグにピペットで加え、放置乾燥させて、約１７ペレットを生成する。
【０４１１】
縁から２ｍｍの麻酔済みメスニュージーランドホワイトウサギのそれぞれの眼の角膜マイクロポケットにペレットを移植し、次に角膜の表面上にエリスロマイシン軟膏を１回局所施用する。数日連続の組織学的検査は、角膜中ペレットでの段階的な血管増殖を実証し、わずかな炎症細胞のみが見られる。この血管新生応答が全身照射による重度の免疫抑制によって変わることはなく、スクラルフェートのみを有するペレットが血管新生を誘導することはない。新しい血管は、炎症によってではなくｂＦＧＦによって主に誘導される。０．５％カルボキシメチルセルロース又は賦形剤単独に縣濁した１つ又は複数の化合物を用いる胃洗浄による移植後２日から、動物には毎日エサを与える。免疫抑制動物には、ペレットの移植直前に６分間６Ｇｙの全身照射を与える。この照射線量は、顕著な白血球減少、並びに第２日までに８０％超及び第３日までに９０％超の白血球数の減少、以前の報告と一致する結果をもたらす。
【０４１２】
同じ角膜専門家（Ｍ．Ｓ．Ｌ．）によって一日おきに、密閉状態においてスリットランプで動物を調べる。角膜新血管形成の領域は、レティキュールで縁からの血管長（Ｌ）、及び関連縁の実働時間数（Ｃ）を測定することによって決定する。式：Ｃ／１２×３．１４１６［ｒ２−（ｒ−Ｌ）２］を使用して環状帯分節領域を決定し、この場合ｒ＝６ｍｍ、測定したウサギの角膜の径である。ペレット近辺の新血管形成の均一な隣接帯を測定し、したがって新血管形成の全体的阻害を評価することができる。
【０４１３】
マウスマトリゲルプラグ血管新生アッセイ
血管新生に対する組成物の影響を確認するために、マウスマトリゲルプラグ血管新生アッセイを使用することができる。様々な増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦ）（２５０ｎｇ）及びヘパリン（１ｍＬ当たり０．００２５単位）を、以前に記載されたように（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８３，９７：１６４８−１６５２；Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７６：８１３５−８１４１）低増殖因子マトリゲルと混合する。本明細書に記載する組成物又は対照抗体は、１つ又は複数の用量群の動物を利用してマトリゲル調製物に含めることができる。対照実験では、マトリゲルは増殖因子の不在下で調製する。マウスには０．５ｍＬのマトリゲル調製物を皮下注射し、１週間インキュベーションする。インキュベーション時間後、マウスを屠殺し、重合マトリゲルプラグは外科手術によって除去する。マトリゲルプラグ内の血管新生は、免疫組織化学的分析及びヘモグロビン含有量（Ｆｕｒｓｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２００２，３：２９８−３０２；Ｖｏｌｐｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００２，２（６）：４７３−８３；及びＳｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３，６３：３５８５−３５９２）を含めた、２つの確立した方法によって定量化する。免疫組織化学的分析用に、マトリゲルプラグはＯＣＴ中に包埋し、急凍結し、４μｍ切片を調製する。凍結切片はメタノール／アセトン（１：１）中に固定する。凍結切片はＣＤ３１を対象とするポリクローナル抗体で染色する。２０倍高倍（２００Ｘ）顕微鏡視野内の微小血管密度数によって血管新生を定量化する。
【０４１４】
ヘモグロビン含有量は、以前に記載されたように（Ｓｃｈｎａｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３，２５６：２３５−２４６；Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８３，９７：１６４８−１６５２；Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７６：８１３５−８１４１；及びＧｉｇｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６，１００：１１５４−１１６４）定量化することができる。マトリゲルインプラントはドライアイス上で急凍結し、一晩凍結乾燥させる。乾燥したインプラントは１時間１．０％サポニン０．４ｍＬ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に再縣濁し、強度のピペット処理で破壊する。調製物は１４，０００Ｘｇで１５分間遠心分離して、いかなる粒子も除去する。次いで上清中のヘモグロビン濃度を、４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって直接決定し、精製ヘモグロビンの標準濃度と比較する。
【０４１５】
細胞移動をアッセイする方法
細胞移動に関するアッセイは文献中で、例えばＢｒｏｏｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １９９７，９９：１３９０−１３９８によって記載されており、細胞移動を測定するための方法は当業者に知られている。本明細書に記載する細胞移動を測定するための一方法では、トランスウエル移動チャンバーからの膜を基質（ここでは、エンドグリン及び／又はＶＥＧＦ）でコーティングし、トランスウエルを洗浄し、非特異的結合部位はＢＳＡで遮断する。半密集状態の培養物由来の腫瘍細胞を採取し、洗浄し、アッセイ抗体の有無の下で移動バッファー中に再縣濁する。コーティングしたトランスウエル膜の下側に腫瘍細胞を移動させた後、膜の上側に残存する細胞を除去し、下側に移動した細胞はクリスタルバイオレットで染色する。次いで細胞移動は、顕微鏡視野当たりの直接細胞数によって定量化する。
【０４１６】
細胞増殖をアッセイする方法
細胞増殖は当業者に知られている方法によってアッセイすることができる。本明細書に記載するように、半密集状態のヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＥＣＶ又はＥＣＶＬ細胞由来のＣＭ（２５μＬ）の有無の下で低濃度（５．０％）血清を含有する増殖バッファー中に再縣濁することができ、内皮細胞は２４時間増殖することができる。市販のＷＳＴ−１アッセイキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用してミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって、増殖を定量化することができる。更に、本明細書に記載するように、標準的な方法を使用して３Ｈの取込みを測定することによって、増殖を定量化することができる。（Ｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０８：２５１−２５７（２００４））。
【０４１７】
細胞増殖を評価する他の方法は当技術分野で知られており、本明細書において企図する。更なる非制限的な例は実施例中でより詳細に記載する。
【０４１８】
ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びオプソニン作用を誘導する方法
様々な療法が、形質転換細胞に対する身体の本来の免疫応答を高めることを対象としている。従来のエフェクター法には、補体依存性細胞溶解反応（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及びファゴサイトーシス（標的細胞を免疫グロブリンでコーティングした後の細網内皮系による除去）がある。抗体の存在下では、抗体のＦｃ領域に対する表面結合受容体を有するリンパ球細胞などの特定のエフェクター細胞は、標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）反応を仲介することが知られている。ＡＤＣＣによって、これらのエフェクター細胞は、このような標的細胞に対して細胞溶解活性を発揮する。
【０４１９】
２つの型のＡＤＣＣ反応がｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証されている。古典的ＡＤＣＣ反応では、エフェクター細胞は抗体コーティング標的細胞と結合し、後に標的細胞の細胞溶解を引き起こす（Ａ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２１，ｐ．７１９（１９７５））。エフェクターと標的細胞の間のこの結合は、標的細胞コーティング抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞のＦｃ受容体の相互作用に起因する。この型のＡＤＣＣ反応の１つの欠点は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に対する標的細胞結合抗体と競合し様々な疾患に関与することが多い循環抗原−抗体複合体によって、それが妨害される可能性があることである（Ｉ．Ｃ．Ｍ．ＭａｃＬｅｎｎａｎ，「Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｏｎ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，ｐ．２７５（１９７２））。古典的ＡＤＣＣのこの欠点のため、第二の型のＡＤＣＣ反応、抗体対象ＡＤＣＣを利用することができる。抗体対象ＡＤＣＣでは、標的特異的抗体がエフェクター細胞と最初に結合し、次いで生成した複合体が、標的細胞表面上のその特異的抗原に対する抗体によって「対象にされる」。有利なことに、抗体対象ＡＤＣＣが、宿主系を循環する抗原−抗体複合体の存在によって影響を受ける可能性はない。Ｆｃ領域／Ｆｃ受容体結合を介した抗体とエフェクター細胞の間の相互作用は通常弱い。更に、いくつかの場合、標的細胞の溶解を可能にするほど十分な時間の間、抗体はエフェクター細胞との結合状態を保たない。この潜在的な問題を鑑みて、ポリエチレングリコールとフタル酸油の混合物を用いた前処理を使用して、抗体とエフェクター細胞を結合させている（Ｊ．Ｆ．Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｍ．Ｓｅｇａｌ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ（ＡＤＣＣ）  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５，ｐｐ．９２６−３３（１９８０））。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療に関するこの方法の適用性は、抗体−エフェクター細胞複合体上の任意のポリエチレングリコールとフタル酸油残基が身体に対して有し得る毒性効果によって低下する可能性がある。
【０４２０】
或いは、細胞傷害性薬剤を用いたアジュバント化学療法によって、抗体対象ＡＤＣＣを高めるための方法が提案されている（Ｉ．Ｒ．Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｆｆｅｃｔ  Ｏｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｍｅｌｐｈａｌａｎ  Ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１６，ｐｐ．９８−１００（１９８３））。例えば米国特許第５，７５６，０９７号などの、ＡＤＣＣを試験するためのアッセイは当技術分野でよく知られている。
【０４２１】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、その新血管形成又は血管新生において役割を有し、ファゴサイトーシスを高め細胞を殺傷し、それによってｉｎ  ｖｉｖｏでの防御を高めることができる、細胞と結合することができる抗体を提供する。このような抗体と結合することができ同じ効果を有する、結合部位又はエピトープと免疫反応、特異的に結合、又は優先的に結合する、他の抗体及びその機能断片も提供する。
【０４２２】
更に抗体はオプソニン性である可能性があり、又は新血管形成又は血管新生において役割を有する細胞（例えば、内皮細胞）に対するオプソニン活性を示す可能性がある。当業者が理解しているように、「オプソニン活性」は、抗原又は細胞受容体と結合して、食細胞と抗原又は細胞受容体の結合を促進し、それによってファゴサイトーシスを高める、オプソニン（一般に、抗体又は血清因子Ｃ３ｂのいずれか）の活性を指す。オプソニン抗体でコーティングしたとき、及び血中からのそれらのクリアランス率が著しく高まるときに、特定の細胞は好中球及びマクロファージなどの食細胞に非常に誘引された状態になる。例えば米国特許第６，６１０，２９３号中に記載されたような任意の従来の形式で、オプソニン活性を測定することができる。
【０４２３】
別の非制限的実施形態において、血管新生障害又は血管新生依存性障害を有する患者は、血管新生から抗原／ペプチド（例えばエンドグリン）を除去する。これらの抗原／ペプチドは「腫瘍関連抗原」であってよい。このような患者には抗原／ペプチド（例えばエンドグリン）に対する抗体を全身投与することができ、本明細書に記載する経路のいずれかを開始して、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、オプソニン作用、又は任意の他の型の細胞仲介型殺傷を誘導することができる。
【０４２４】
他のアッセイ
例えば以下の実施例中に記載するアッセイなどの、当技術分野で知られている他のアッセイを使用して、本明細書に記載する組成物の影響を試験することもできる。
【０４２５】
パッケージ及びキット
他の更なる実施形態では、本出願は、前に記載した化合物と共に使用するためのキットに関する。エンドグリンと優先的に結合するキメラ抗体、及びＶＥＧＦと優先的に結合する抗体をキット中に提供することができる。キットは１つ又は複数の適切な容器手段を含むことができる。
【０４２６】
キットの容器手段は、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、及び／又はその中に少なくとも１つのポリペプチドを配置、及び／又は好ましくは適切に等分することができる他の容器手段を一般に含み得る。キットは、少なくとも１つの融合タンパク質、検出可能成分、レポーター分子、及び／又は市販の十分密閉された任意の他の試薬容器を含有するための手段を含むことができる。このような容器は、その中に所望のバイアルを保持する射出及び／又はブロー成型プラスチック容器を含むことができる。キットは、キット中の材料を使用するための印刷物も含むことができる。
【０４２７】
パッケージ及びキットは、製剤中に緩衝剤、防腐剤及び／又は安定剤を更に含むことができる。キットのそれぞれの構成要素は個々の容器内に封入することができ、全ての様々な容器は１つのパッケージ内に存在してよい。キットは低温保存又は室温保存用に設計することができる。
【０４２８】
更に、調製物はキットの貯蔵寿命を増大するための安定剤を含有することができ、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥調製物を再構成するための溶液の調製物を、キットは更に含有することができる。許容される再構成溶液は当技術分野でよく知られており、例えば薬学的に許容されるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【０４２９】
更に、本明細書で提供するパッケージ又はキットは、本明細書で提供する任意の他の成分、例えば１つ又は複数のレポーター分子、及び／又は１つ又は複数の検出可能な成分／作用物質などを更に含むことができる。
【０４３０】
パッケージ及びキットは、例えばＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイ用の、１つ又は複数の構成要素を更に含むことができる。本出願中で試験するサンプルには、例えば血液、血漿、組織／腫瘍切片及び分泌液、尿、リンパ、及びこれらの生成物がある。パッケージ及びキットは、サンプルを回収するための１つ又は複数の構成要素（例えば、シリンジ、カップ、スワブなど）を更に含むことができる。
【０４３１】
パッケージ及びキットは、例えば、製品の記載、投与の形態及び／又は治療の指示を指定するラベルを更に含むことができる。本明細書で提供するパッケージは、本明細書に記載する任意の組成物を含むことができる。パッケージは、様々な型の癌及びそれらの転移の治療に関するラベルを更に含むことができる。
【０４３２】
用語「パッケージ材料」は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。パッケージ材料は構成要素を滅菌状態で維持することができ、このような目的で一般に使用される材料（例えば紙、波状線維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）で構成されてよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、適切な書面の説明書を含むことができる。したがってキットは、本明細書に記載する任意の方法中でキットの構成要素を使用するための、ラベル又は説明書を更に含むことができる。キットは、本明細書に記載する方法中で化合物を投与するための説明書と一緒に、パック、又はディスペンサー中に化合物を含むことができる。
【０４３３】
本明細書に記載する診断法及びアッセイを利用するキットを更に提供する。いくつかの実施形態では、キットは、その発現レベルが患者由来の癌細胞のサンプル中の血管新生阻害剤に対する感受性又は耐性と関連している、１つ又は複数の遺伝子を検出するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、及びＣＤ１０５から選択される。いくつかの実施形態では、キットはＶＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、キットはＶＥＧＦ受容体を含む。いくつかの実施形態では、キットはＣＤ１０５を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、及びＣＤ１０５の少なくとも２つを含む。いくつかの実施形態では、キットは、血管新生阻害剤に対する感受性と関連している少なくとも２つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、キットは、血管新生阻害剤に対する耐性と関連している少なくとも２つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、キットは、血管新生阻害剤に対する感受性と関連している少なくとも１つの遺伝子、及び血管新生阻害剤に対する耐性と関連している１つの遺伝子を含む。
【０４３４】
他の更なる実施形態では、キットは、治療する患者由来の腫瘍細胞のサンプル中のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、及びＣＤ１０５発現レベルを検出するための試薬、及び例えばカプセル、カプレット、ゲルキャップ、縣濁液用粉末などの様々な剤形で、本明細書に記載する抗体だけには限らないが、これらを含めた１又は複数用量の阻害剤を含む。治療する患者由来の腫瘍細胞のサンプル中のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、及びＣＤ１０５発現レベルを検出するための試薬を含有するキットは、少なくとも１つの他の血管新生阻害剤を同時投与するための任意の前述のキットの実施形態を更に含むことが更に企図される。
【０４３５】
説明書は、治療法を含めた本明細書に記載する任意の方法を実施するための説明書を含むことができる。説明書は、満足のいく臨床終点若しくは発生し得る任意の悪い症状の表示、又は食品医薬品局などの統制機関によって必要とされるヒト対象における使用に関する他の情報を更に含むことができる。
【０４３６】
説明書は、「印刷物」上、例えばキット内若しくはキットに添付された紙若しくは厚紙上、又はキット若しくはパッケージ材料に添付された、又はキットの構成要素を含有するバイアル若しくはチューブと結合したラベルに存在してよい。説明書は更に、ディスク（フロッピーディスク又はハードディスク）、ＣＤ−又はＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光学ＣＤ、磁気テープなどのコンピュータ可読媒体、ＲＡＭ及びＲＯＭ、ＩＣチップなどの電子保存媒体、及び磁気／光学保存媒体などのこれらのハイブリッドに含まれてもよい。
【０４３７】
本出願の化合物及び方法の実施形態は、例示的及び非制限的であると考えられる。変形及び変更、エンドグリンの結合に関してほぼ本来の機能を維持しながら、記載する変形周囲のエンドグリンと結合するキメラ抗体の変化と関係し得る変形及び変更は、具体的に前述の教示に照らして、当業者によって作製することができる。したがって、記載する範囲内にあり開示する個々の実施形態の変更形態を作製することができることは理解されるはずである。
【実施例】
【０４３８】
本出願は、本出願の例示的な実施形態として与える以下の非制限的な実施例を参照することによって、より良く理解することができる。以下の実施例は例示的な実施形態をより完全に例示するために表すが、しかし、決して本出願の広範囲を制限するものとして解釈すべきではない。本出願の特定の実施形態を本明細書で示し記載しているが、このような実施形態は単なる例によって与えられることは明らかであろう。多くの変更、変化、及び置換が存在する可能性があり、本明細書に記載する実施形態に対する様々な実施形態を、本明細書に記載する方法を実施する際に利用することができることは理解されるはずである。
【０４３９】
（例１）
ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴：ＳＰＲ）分析
キメラ抗エンドグリン抗体の結合
抗体の親和性は、標準的なプロトコールを使用して、例えばＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して評価することができる。簡単に言うと、抗ヒスチジンタグ抗体をヒスチジンタグ組換えヒトエンドグリンの捕捉用のＢＩＡｃｏｒｅチップとカップリングさせ、次いでそれを使用してキメラ抗エンドグリン抗体の結合を測定する。ＳＰＲアッセイの進行は、少なくとも２チップの調製バッチ及び８チップの分析バッチで実施する。以下のパラメーターをアッセイの進行中に評価する：
【０４４０】
（ａ）ＣＭ５チップと抗ヒスチジンタグ抗体のカップリング
ＥＤＣ／ＮＨＳを使用し従来のアミン化学法によって、抗ヒスチジンタグ抗体をＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５チップにカップリングさせる。反応条件（濃度及びｐＨ）は最適化する。
【０４４１】
（ｂ）ヒトエンドグリンの結合及びバイオセンサーチップの再生
ヒトエンドグリンの結合及びチップの再生に関する条件を、（以前の経験に基づき）様々なバッファーを使用し結合抗体を溶出することによって試験する。候補となる再生法を開発した後、１チップ表面の結合能力及びバックグラウンドを少なくとも２５サイクルにわたり測定する。目的は、平均でサイクル当たり１０ＲＵ未満のバックグラウンドの増大及びサイクル当たり未満の１％能力の低下を得ることである。
【０４４２】
（ｃ）ヒトエンドグリンの結合
ヒトエンドグリンの用量応答を測定して、最大結合に近づくのに適した濃度を決定する。
【０４４３】
（ｄ）キメラ抗エンドグリン抗体の結合
キメラ抗エンドグリン抗体の用量応答を測定して、（相対的運動定数、ｋａとｋｄの比較、又は平行線法による相対的効力の比較を含み得る）運動又は平衡状態結合実験に適した範囲を決定する。
【０４４４】
（ｅ）予備確認実験
結合実験を、異なるときに異なるチップ、異なるフローセルを使用し選択した条件下で少なくとも３回繰り返して、測定の精密度及び精度に関する予備情報を得る。全てのＢＩＡｃｏｒｅ実験は、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー中で２５℃において実施する。
【０４４５】
抗ＶＥＧＦ抗体の結合
抗体の親和性は、標準的なプロトコールを使用して、例えばＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して評価することができる。簡単に言うと、抗ヒスチジンタグ抗体をヒスチジンタグ組換えヒトＶＥＧＦの捕捉用のＢＩＡｃｏｒｅチップとカップリングさせ、次いでそれを使用して抗ＶＥＧＦ抗体の結合を測定する。ＳＰＲアッセイの進行は、少なくとも２チップの調製バッチ及び８チップの分析バッチで実施する。以下のパラメーターをアッセイの進行中に評価する：
【０４４６】
（ａ）ＣＭ５チップと抗ヒスチジンタグ抗体のカップリング
ＥＤＣ／ＮＨＳを使用し従来のアミン化学法によって、抗ヒスチジンタグ抗体をＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５チップにカップリングさせる。反応条件（濃度及びｐＨ）は最適化する。
【０４４７】
（ｂ）ヒトＶＥＧＦの結合及びバイオセンサーチップの再生
ヒトＶＥＧＦの結合及びチップの再生に関する条件を、（以前の経験に基づき）様々なバッファーを使用し結合抗体を溶出することによって試験する。候補となる再生法を開発した後、１チップ表面の結合能力及びバックグラウンドを少なくとも２５サイクルにわたり測定する。目的は、平均でサイクル当たり１０ＲＵ未満のバックグラウンドの増大及びサイクル当たり未満の１％能力の低下を得ることである。
【０４４８】
（ｃ）ヒトＶＥＧＦの結合
ヒトＶＥＧＦの用量応答を測定して、最大結合に近づくのに適した濃度を決定する。
【０４４９】
（ｄ）抗ＶＥＧＦ抗体の結合
キメラ抗エンドグリン抗体の用量応答を測定して、（相対的運動定数、ｋａとｋｄの比較、又は平行線法による相対的効力の比較を含み得る）運動又は平衡状態結合実験に適した範囲を決定する。
【０４５０】
（ｅ）予備確認実験
結合実験を、異なるときに異なるチップ、異なるフローセルを使用し選択した条件下で少なくとも３回繰り返して、測定の精密度及び精度に関する予備情報を得る。全てのＢＩＡｃｏｒｅ実験は、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー中で２５℃において実施する。
【０４５１】
（例２）
キメラ抗エンドグリン抗体の結合に関するＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを使用してエンドグリンとキメラ抗エンドグリン抗体の結合をアッセイすることができる。簡単に言うと、ＥＬＩＳＡを以下のステップに従い実施する：
１．１５００ｎｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中、１００μｌ／ウエルでＭＡＢ９８１１−０１（ポリクローナル抗エンドグリン抗体）を用いてＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートをコーティングする。シーラーでプレートを覆い、４℃で（１６〜〜２４時間）一晩インキュベートする。
２．（Ｔｗｅｅｎを含まない）約２００μｌのＰＢＳでプレートを２回洗浄する。
３．２００μｌ／ウエルのＢＳＡブロッキング溶液（１％ＢＳＡ）を加え、室温で６０分インキュベートする。
４．ＢｉｏＴｅｋプレート洗浄液を使用して、Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）を含有するＰＢＳでプレートを３回洗浄する。
５．１００μｌ／ウエルのＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ  １０９７−ＥＮ）を、１００ｎｇ／ｍｌ、ＰＢＳ−Ｔ及び０．１％ＢＳＡ中で加え、室温で６０分インキュベートする。
６．ＢｉｏＴｅｋプレート洗浄液を使用して、ＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄する。
７．試験ウエル中：１００μｌ／ウエルのキメラ抗エンドグリン抗体を（ＰＢＳ−Ｔ及び０．１％ＢＳＡ中に希釈し）２０、１０、４、２、１、０．５及び０．２ｎｇ／ｍｌで加え、室温で６０分インキュベートする。陰性対照ウエル中：１００μｌ／ウエルのアイソタイプ適合対照抗体を加える。
８．ＢｉｏＴｅｋプレート洗浄液を使用して、ＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄する。
９．ＰＢＳ−Ｔ及び０．１％ＢＳＡ中に１：１００００希釈した、１００μｌ／ウエルのＨＲＰと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を全てのウエルに加え、室温で３０〜６０分インキュベートする。
１０．ＢｉｏＴｅｋプレート洗浄液を使用して、ＰＢＳ−Ｔでプレートを５回洗浄する。
１１．１００μｌ／ウエルのＴＭＢ基質溶液を加え、１５分間暗所において非被覆状態でインキュベートする。
１２．１００μｌ／ウエルのＴＭＢ停止溶液を加えることにより反応を停止させる。
【０４５２】
サンプルは三連で処理し、光学濃度を読取り標準曲線を構築し、結合定数を決定する。統計解析は、スチューデントのｔ−検定又は別の標準検定を使用して実施する。
【０４５３】
同様のプロトコールを使用して、抗体とＶＥＧＦの結合に関して試験することができることは理解されよう。
【０４５４】
（例３）
エンドグリン発現細胞における抗体親和性及び利用可能なエピトープの数
エンドグリン発現細胞における抗体親和性及び利用可能なエピトープの数は、標準的なプロトコールを使用しスキャッチャードプロット解析を利用して評価することができる。
【０４５５】
簡単に言うと、エンドグリン発現ＫＭ−３白血病細胞及び半密集状態の増殖ＨＵＶＥＣと放射性標識キメラ抗エンドグリン抗体の直接結合の、スキャッチャードプロット解析を実施する。精製抗エンドグリン抗体は、Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎを使用して当業者に知られている標準的な方法に従い、１２５Ｉで個別に放射性標識する。放射性標識キメラ抗エンドグリン抗体は、ＩｇＧ分子当たりの平均ヨウ素原子に関してそれぞれアッセイする。滴定実験は一定量（０．１μｇ）の各１２５Ｉ標識ｍＡｂ及び２倍連続増量のエンドグリン発現ＫＭ−３又はＨＵＶＥＣ細胞を使用して実施し、抗原結合活性を決定する。結合データのスキャッチャードプロット解析は知られている方法に従い実施する。平衡定数及びｍＡｂ結合／細胞の平均最大数はこの解析によって評価する。
【０４５６】
（例４）
遮断活性に関するウエスタンブロットアッセイ
ＣＤ１０５を発現する細胞のＣＤ１０５刺激活性化を遮断するキメラ抗エンドグリン抗体の能力を、ウエスタンブロットによりアッセイして、ＣＤ１０５シグナル伝達経路に関与するタンパク質のリン酸化を検出することができる。
【０４５７】
知られているウエスタンブロット技法に従い、ウエスタンブロット分析を実施してリン酸化Ｓｍａｄ１／５／８又はＳｍａｄ２を同定する。ＰＳｍａｄ１及びＰＳｍａｄ２抗体は、非トランスフェクト内皮細胞においてリン酸化Ｓｍａｄ１／５又はリン酸化Ｓｍａｄ２を特異的に認識する。Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ５、Ｉｄ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びエンドグリンに対する一次抗体を利用してサンプル中の分子を検出する。検出は増大した化学発光（ＥＣＬ）によって実施する。
【０４５８】
（例５）
ＨＵＶＥＣ増殖の阻害及び３Ｈ−チミジン取込みアッセイ
いくつかのアッセイが細胞増殖の阻害を評価するのに利用可能である。
【０４５９】
一例では、半密集状態下で３７℃においてＣＯ２インキュベーター中、７５−ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）内でＨＵＶＥＣを培養する。１５分間３７℃において、ハンクスの平衡塩類溶液、及び１５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中、ｐＨ７．３とインキュベートすることにより細胞を脱着させる。氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞は２５，０００細胞／ｍｌの濃度で内皮細胞増殖培地中に再縣濁する。別の実験では、ヒト臍帯静脈内内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を縣濁し、ＦＢＳ及びウシ脳抽出物を含まない内皮細胞増殖培地中で培養する。細胞縣濁液のアリコート２００μｌを、９６−ウエル培養プレートのそれぞれのウエルに接種する。キメラ抗エンドグリン抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、キメラ抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体の組合せ、対照ＩｇＧ又はＴＧＦ−β１を三連で加える前に、一晩ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において細胞を培養する。培養プレートは７２時間インキュベーター中に保ち、その間に新たな培地及び抗体又は対照を２４時間毎に交換する。３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）をそれぞれのウエルに加え、プレートは２０時間インキュベートする。細胞はＰＢＳで洗浄し、次に１５分間３７℃において１００μｌ／ウエルのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％のトリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）で処理する。細胞はＨａｒｖｅｓｔｅｒ９６（ＴＯＭＴＥＣ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）を使用してグラスファイバーフィルター（Ｗａｌｌａｃ  Ｐｒｉｎｔｅｄ  ＦｉｌｔｅｒｍａｔＡ）上に採取し、３Ｈ−放射能はＴｒｉｌｕｘ  １５４０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ液体シンチレーション及び発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）において測定する。
【０４６０】
（例６）
ＭＴＳアッセイによるＨＵＶＥＣ増殖の阻害
いくつかのアッセイが内皮細胞増殖の阻害を評価するのに利用可能である。
【０４６１】
一例では、０．５％のウシ胎児血清及び３０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含有するＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中にウエル当たり５，０００細胞で、半密集状態下で３７℃においてＣＯ２インキュベーター中、９６ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）内でＨＵＶＥＣを培養する。細胞は少なくとも２４時間培養フラスコに接着させ、次いで抗ＶＥＧＦ抗体有り、キメラ抗エンドグリン抗体有り又は無しでインキュベートする。培養プレートは７２時間インキュベーター中に保ち、その間に新たな培地及び抗体又は対照を２４時間毎に交換する。抗体を用いた治療の３日後に、ＭＴＳテトラゾリウム化合物を１時間ウエルに加え、製造者の説明書（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い４９０ｎｍで吸光度を定量化する。全てのサンプルは三連で処理する。
【０４６２】
（例７）
細胞移動の阻害に関するアッセイ
細胞増殖及び活性化の指標としての移動（化学運動性）を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを使用し測定する。
【０４６３】
簡単に言うと、細胞移動を以下のように評価する。Ｃｏｓｔａｒヌクレオポアフィルター（８ｍｍ孔）は４℃において一晩フィブロネクチンでコーティングする。チャンバーはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、下部チャンバーには、血清有り又は無し及びＴＧＦ−β３有り又は無しでＤＭＥＭを充填した。細胞はトリプシン処理し、対照抗体、キメラ抗エンドグリン抗体、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの組合せの存在下においてＤＭＥＭ中に５０，０００細胞／ｍｌの最終濃度で縣濁する。細胞縣濁液のアリコート１５０μｌを上部チャンバーに加え、３７℃でインキュベートする。１６時間後、細胞を洗浄し、上側表面を拭いて非移動性細胞を除去する。膜はメタノール中に固定し、水で洗浄し、染色して下側表面上に存在する細胞数を数える。
【０４６４】
（例８）
ＡＤＣＣアッセイ
本明細書に記載する抗体は、例えば以下のプロトコールを使用して、ＩＬ−２活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成しＡＤＣＣを誘導するそれらの能力に関して評価することができる。
【０４６５】
ＮＫの単離及びＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の生成
ＰＢＭＣを単離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で４℃において２４時間放置する。次いでＰＢＭＣは２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中に置き（合計体積＝５０ｍＬ）、１０ｍＬの細胞縣濁液をペトリ皿に平板培養する。ＰＢＭＣは３７℃で２時間インキュベートし、非接着性細胞を回収する。ＮＫ細胞は４８時間８×１０６／ｍＬ及び１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で培養し、次にアッセイ中で使用する前に５〜８日間通常培養する。
【０４６６】
及びＡＤＣＣアッセイナチュラルキラー細胞障害性
ＮＫ細胞を培養プレートからかき取り、５０ｍＬ円錐形チューブ中に回収する。細胞はＲＰＭＩ完全培地で一回洗浄し、１０分間１２００ｒｐｍで遠心分離する。次いでＮＫ細胞を５ｍＬのＲＰＭＩ完全培地中に再縣濁し計数する。アッセイを実施する前に、ＮＫ細胞数を１０：１のエフェクター：標的比に標準化する。標準化したＮＫ細胞は平板培養し、１０μＬのキメラ抗エンドグリン抗体を指定ウエルに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。対照サンプルは、未処理又は対照抗体処理した細胞集団を含む。
【０４６７】
対象の標的細胞を回収し（ＨＵＶＥＣ細胞）、洗浄し、１０分間１２００ｒｐｍで遠心分離し、５ｍＬのＲＰＭＩ完全培地中に再縣濁する。標的細胞を再度洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬの最終濃度まで無血清ＲＰＭＩ中に再縣濁する。次いで標的細胞を３７℃で１時間、最終濃度５ｕｇ／ｍＬのＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで標識し、次にＲＰＭＩ完全培地で２回洗浄する。次いで標的細胞を再縣濁し、ＮＫ細胞ウエルに加える。標的細胞／ＮＫ細胞の組合せを３７℃で４時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを５分間１２００ｒｐｍで遠心分離し、細胞を洗浄し、ＤＰＢＳ中に再縣濁する。蛍光は４５０／５３０ｎｍの励起／発光を使用して読み取り、発光は抗体によって仲介される細胞殺傷の指標である。
【０４６８】
（例９）
投与に関する用量
本明細書に記載する抗体の最適用量は、当技術分野で認められている方法を使用して前に記載したように決定することができる。
【０４６９】
非制限的な一実施形態では、本明細書に記載する抗体を、様々な用量及び様々な時間枠で対象に投与することができる。非制限的な用量には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、又は間の任意の整数がある。更に、（１又は複数）の用量の抗体を、週２回、週１回、２週毎、３週毎、４週毎、６週毎、８週毎、１２週毎、又はこれらの週の任意の組合せで投与することができる。例えば抗体投与、４週間の間週に１回又は２回、次に２週間治療なしなどの、投与サイクルも企図される。例えば本明細書に記載する用量及び週サイクルの異なる組合せを含めた、別の投与サイクルも本明細書で企図される。
【０４７０】
別の実施形態では、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））を以下の用量及びレジメンに基づいて投与することができる：
【表１】
2014088401.tif 000002
【０４７１】
（例１０）
固形腫瘍型におけるエンドグリン（ＣＤ１０５）の発現
固形腫瘍におけるエンドグリンの発現を、免疫組織化学法を使用して評価した。凍結及びアセトン固定ヒト癌サンプルは、１０，０００倍希釈の抗エンドグリン抗体ＳＮ６ｊ腹水又はアイソタイプ適合対照ＩｇＧ腹水と反応させ、ＤＡＫＯ染色キットで染色した。対比染色はヘマトキシリンで実施した。ＳＮ６ｊは腫瘍内の血管と結合したが、一方でアイソタイプ適合対照ＩｇＧはいかなる染色も示さなかった。試験した全ての腫瘍型が腫瘍血管内でエンドグリン発現を示した。
【表２】
2014088401.tif 000003
【０４７２】
（例１１）
ＳＣＩＤマウスに移植したヒト皮膚中で予め形成されたヒト乳癌腫瘍の抗血管新生療法
本明細書に記載する抗体の影響は、ＳＣＩＤマウスに移植したヒト皮膚中で予め形成されたヒト乳癌腫瘍に対するそれらの抗血管新生効果に関して評価することができる。
【０４７３】
簡単に言うと、ＭＣＦ−７細胞（０．１ｍｌのＰＢＳ中に８×１０６個の細胞）を、移植が炎症、収縮又は拒絶の兆候を示さないとき、ＳＣＩＤマウスに移植したヒトの完全厚皮膚に皮内移植する。明らかで触知可能な腫瘍（多くの場合直径３〜６ｍｍ）が出現するまでマウスは未治療状態で放置する。明らかな腫瘍を有するマウスは治療試験用に数群に分ける。（１）キメラ抗エンドグリン抗体、（２）ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、（３）キメラ抗エンドグリン抗体とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の組合せ、又は（４）アイソタイプ適合対照ＩｇＧを含有する溶液（組成物）を、マウス血清アルブミンを含有する滅菌ＰＢＳでそれぞれ希釈する（０．０５％の最終濃度）。ｍＡｂ治療用に、マウスの尾静脈を介して２００μｇ／０．２ｍＬの試験抗体又は対照ＩｇＧを静脈内（ｉ．ｖ．）投与する。投与は２〜３日毎に与える。
【０４７４】
治療中、腫瘍サイズ及び罹患率に関してマウスを毎日モニタリングする。電子天秤（ＯＨＡＵＳ（商標）Ｍｏｄｅｌ  ＧＴ２１０）を使用して週に２回マウスを重量測定する。腫瘍サイズは、ＯｐｔｏＤｅｍｏ（商標）ソフトウェア（Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏ．）を使用してコンピュータに接続した、電子カリパス（ＰＲＯ−ＭＡＸ  ６インチカリパス；Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）を使用して週に３回測定する。測定した腫瘍径は、例えば以下の式：Ｖ＝長さ×幅×高さ×ｐｉ／６を使用して腫瘍体積に変換する。異なるマウス群の比較に関するデータの統計解析は、スチューデントのｔ−検定を使用して実施する。
【０４７５】
（例１２）
卵巣癌のマウスモデル
キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の能力を決定するため、又は卵巣癌を治療するために、ＳＣＩＤ、トランスジェニック又はヌードマウスにおいて、卵巣癌細胞系を使用することができる。
【０４７６】
簡単に言うと、卵巣癌細胞をＳＣＩＤ、トランスジェニック又はヌードマウスに移植して卵巣腫瘍を作製する。定着腫瘍を有するマウス群を、（１．８ｍｇ／体重１ｋｇで開始する）段階的用量のキメラ抗エンドグリン抗体、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、キメラ抗エンドグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の組合せ、又は対照ＩｇＧの静脈内投与によって治療する。治療は週当たり２又は３回実施する。全ての群で化学療法を使用することができる。マウスをモニタリングし、腫瘍増殖は週当たり２又は３回測定する。
【０４７７】
（例１３）
腎臓癌のマウスモデル
腎臓癌を治療するキメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の能力を決定するため、ＳＣＩＤ、トランスジェニック又はヌードマウスにおいて腎臓癌細胞系を使用する。
【０４７８】
簡単に言うと、腎臓癌細胞をＳＣＩＤ、トランスジェニック又はヌードマウスに移植して腎臓腫瘍を作製する。定着腫瘍を有するマウス群を、（１．８ｍｇ／体重１ｋｇで開始する）段階的用量のキメラ抗エンドグリン抗体、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、キメラ抗エンドグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の組合せ、又は対照ＩｇＧの静脈内投与によって治療する。治療は週当たり２又は３回実施する。全ての群で化学療法を使用することができる。マウスをモニタリングし、腫瘍増殖は週当たり２又は３回測定する。
【０４７９】
（例１４）
結腸直腸癌のマウスモデル
結腸直腸癌を治療するキメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の能力を決定するため、ＳＣＩＤ、トランスジェニック又はヌードマウスにおいて乳癌細胞系を使用する。
【０４８０】
簡単に言うと、乳癌細胞をＳＣＩＤ、トランスジェニック又はヌードマウスに移植して結腸直腸腫瘍を作製する。定着腫瘍を有するマウス群を、（１０ｍｇ／体重１ｋｇで開始する）段階的用量のキメラ抗エンドグリン抗体、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、又はキメラ抗エンドグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の組合せの静脈内投与によって治療する。対照動物には対照ＩｇＧを投与する。治療は週当たり２又は３回実施する。全ての群で化学療法を使用することができる。マウスをモニタリングし、腫瘍増殖は週当たり２又は３回測定する。
【０４８１】
（例１５）
脳癌のマウスモデル
脳癌を治療するキメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の能力を決定するため、ＳＣＩＤ、トランスジェニック又はヌードマウスにおいて多形性膠芽腫細胞系を使用する。
【０４８２】
簡単に言うと、多形性膠芽腫癌細胞をＳＣＩＤ、トランスジェニック又はヌードマウスに移植して乳房腫瘍を作製する。定着腫瘍を有するマウス群を、（１０ｍｇ／体重１ｋｇで開始する）段階的用量のキメラ抗エンドグリン抗体、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、又はキメラ抗エンドグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の組合せの静脈内投与によって治療する。対照動物には対照ＩｇＧを投与する。治療は週当たり２又は３回実施する。全ての群で化学療法を使用することができる。マウスをモニタリングし、腫瘍増殖は週当たり２又は３回測定する。
【０４８３】
（例１６）
結腸直腸癌に関する併用療法の臨床試験
この実施例は、結腸直腸癌を有する患者においてキメラ抗エンドグリン抗体とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））を併用する安全性及び有効性の予備アセスメントを与えるために設計した、ランダム化、盲検化、プラセボ対照、多施設、第ＩＩ相又は第ＩＩＩ相試験を記載する。およそ約１００〜約８００の患者を登録し、約５０〜約４００の患者を治療群に割り当て、約５０〜約４００の患者をプラセボ群に割り当てる。臨床試験は、約０．１約１０ｍｇ／ｋｇで反復用量のキメラ抗エンドグリン抗体の静脈内投与、又は６〜１０サイクルで２〜３週毎に第１日に約５ｍｇ／ｋｇでベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））と併用した１〜３週毎にプラセボの静脈内投与を含む。全ての群で化学療法を使用することができる。試験の時間枠は約６カ月〜約５年で推定し、初期試験の最後に必要を示す応答者には治療を続ける。他の結果測定法は以下の通りである：
【０４８４】
主要評価項目測定：奏功率。この試験の１つの目的は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びプラセボを用いた約４０％からベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びキメラ抗エンドグリン抗体を用いた約６０％（以上）までの、奏功率の増大を実証することである。
【０４８５】
評価することができる二次評価項目測定は、奏功期間、腫瘍進行の時間、全体的生存率、重度及び軽度の有害事象を含む。例えば、治療は疾患の進行を予防することができ（即ち安定状態）、又は改善をもたらすことができる。代替的、又は追加的に、以下の１つ又は複数、腫瘍負荷の減少、新血管形成の減少、副作用の低下、有害反応の減少、及び／又は患者のコンプライアンスの向上に関する、他の目的を測定することができる。
【０４８６】
（例１７）
腎臓癌に関する併用療法の臨床試験
この実施例は、腎細胞癌（腎臓癌）を有する患者においてキメラ抗エンドグリン抗体とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））を併用する安全性及び有効性の予備アセスメントを与えるために設計した、ランダム化、盲検化、プラセボ対照、多施設、第ＩＩ相又は第ＩＩＩ相試験を記載する。およそ約１００〜約８００の患者を登録し、約５０〜約４００の患者を治療群に割り当て、約５０〜約４００の患者をプラセボ群に割り当てる。臨床試験は、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇで反復用量のキメラ抗エンドグリン抗体の静脈内投与、又は３〜６サイクル若しくは進行まで２週毎に約２．５〜約１５ｍｇ／ｋｇでベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））と併用した１〜３週毎にプラセボの静脈内投与を含む。インターフェロンも両治療群で使用することができる。試験の時間枠は約６カ月〜約５年で推定し、初期試験の最後に必要を示す応答者には治療を続ける。他の結果測定法は以下の通りである：
【０４８７】
主要評価項目測定：無憎悪生存期間。この試験の１つの目的は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びプラセボ群における約９〜１３カ月からベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びキメラ抗エンドグリン抗体群における約１４〜１８カ月（以上）までの、無憎悪生存期間の増大を実証することである。
【０４８８】
評価することができる二次評価項目測定は、奏功期間、腫瘍進行の時間、全体的生存率、重度及び軽度の有害事象を含む。例えば、治療は疾患の進行を予防することができ（即ち安定状態）、又は改善をもたらすことができる。代替的、又は追加的に、以下の１つ又は複数、腫瘍負荷の減少、新血管形成の減少、副作用の低下、有害反応の減少、及び／又は患者のコンプライアンスの向上に関する、他の目的を測定することができる。
【０４８９】
（例１８）
肝細胞癌に関する併用療法の臨床試験
この実施例は、肝細胞癌（肝臓癌）を有する患者においてキメラ抗エンドグリン抗体とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））又はソラフェニブを併用する安全性及び有効性の予備アセスメントを与えるために設計した、ランダム化、盲検化、プラセボ対照、多施設、第ＩＩ相又は第ＩＩＩ相試験を記載する。およそ約１００〜約８００の患者を登録し、約５０〜約４００の患者を治療群に割り当て、約５０〜約４００の患者をプラセボ群に割り当てる。臨床試験は、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇで反復用量のキメラ抗エンドグリン抗体の静脈内投与、又は３〜６サイクル若しくは進行まで２〜３週毎に約２．５〜約１５ｍｇ／ｋｇでベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））若しくは毎日約４００ｍｇのソラフェニブと併用した１〜３週毎のプラセボの静脈内投与を含む。試験の時間枠は約６カ月〜約５年で推定し、初期試験の最後に必要を示す応答者には治療を続ける。他の結果測定法は以下の通りである：
【０４９０】
主要評価項目測定：無憎悪生存期間。この試験の１つの目的は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））（又はソラフェニブ）及びプラセボ群における約３〜９カ月からベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））（又はソラフェニブ）及びキメラ抗エンドグリン抗体群における約６〜１２カ月（以上）までの、無憎悪生存期間の増大を実証することである。
【０４９１】
評価することができる二次評価項目測定は、奏功期間、腫瘍進行の時間、全体的生存率、重度及び軽度の有害事象を含む。例えば、治療は疾患の進行を予防することができ（即ち安定状態）、又は改善をもたらすことができる。代替的、又は追加的に、以下の１つ又は複数、腫瘍負荷の減少、新血管形成の減少、副作用の低下、有害反応の減少、及び／又は患者のコンプライアンスの向上に関する、他の目的を測定することができる。
【０４９２】
（例１９）
卵巣癌に関する併用療法の臨床試験
この実施例は、卵巣癌を有する患者においてキメラ抗エンドグリン抗体とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））を併用する安全性及び有効性の予備アセスメントを与えるために設計した、ランダム化、盲検化、プラセボ対照、多施設、第ＩＩ相又は第ＩＩＩ相試験を記載する。およそ約１００〜約８００の患者を登録し、約５０〜約４００の患者を治療群に割り当て、約５０〜約４００の患者をプラセボ群に割り当てる。臨床試験は、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇで反復用量のキメラ抗エンドグリン抗体の静脈内投与、又は第１日に約１５ｍｇ／ｋｇでベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））と併用し１〜３週毎にプラセボの静脈内投与、次に５サイクルで２１日毎に１５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与を含む。化学療法を両治療群で使用することもできる。試験の時間枠は約６カ月〜約５年で推定し、初期試験の最後に必要を示す応答者には治療を続ける。他の結果測定法は以下の通りである：
【０４９３】
主要評価項目測定：無憎悪生存期間。この試験の１つの目的は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びプラセボ群における約３〜６カ月からベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びキメラ抗エンドグリン抗体群における約４〜１２カ月（以上）までの、無憎悪生存期間の増大を実証することである。この試験の１つの目的は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びプラセボを用いた約２０％からベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びキメラ抗エンドグリン抗体を用いた約３０％（以上）までの、奏功率の増大を実証することである。
【０４９４】
評価することができる二次評価項目測定は、奏功期間、腫瘍進行の時間、全体的生存率、重度及び軽度の有害事象を含む。例えば、治療は疾患の進行を予防することができ（即ち安定状態）、又は改善をもたらすことができる。代替的、又は追加的に、以下の１つ又は複数、腫瘍負荷の減少、新血管形成の減少、副作用の低下、有害反応の減少、及び／又は患者のコンプライアンスの向上に関する、他の目的を測定することができる。
【０４９５】
（例２０）
多形性膠芽腫に関する併用療法の臨床試験
多形性膠芽腫（脳癌）を有する患者においてキメラ抗エンドグリン抗体とベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））を併用する安全性及び有効性の予備アセスメントを与えるために設計した、ランダム化、盲検化、プラセボ対照、多施設、第ＩＩ相又は第ＩＩＩ相試験を記載する。およそ約１００〜約８００の患者を登録し、約５０〜約４００の患者を治療群に割り当て、約５０〜約４００の患者をプラセボ群に割り当てる。臨床試験は、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇで反復用量のキメラ抗エンドグリン抗体の静脈内投与、又は３〜６サイクル若しくは進行まで２〜３週毎に約２．５〜約１５ｍｇ／ｋｇでベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））と併用した１〜３週毎のプラセボの静脈内投与を含む。試験の時間枠は約６カ月〜約５年で推定し、初期試験の最後に必要を示す応答者には治療を続ける。他の結果測定法は以下の通りである：
【０４９６】
主要評価項目測定：無憎悪生存期間。この試験の１つの目的は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びプラセボ群における約３〜９カ月からベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及びキメラ抗エンドグリン抗体群における約４〜１２カ月（以上）までの、無憎悪生存期間の増大を実証することである。評価することができる二次評価項目測定は、奏功期間、腫瘍進行の時間、全体的生存率、重度及び軽度の有害事象を含む。例えば、治療は疾患の進行を予防することができ（即ち安定状態）、又は改善をもたらすことができる。代替的、又は追加的に、以下の１つ又は複数、腫瘍負荷の減少、新血管形成の減少、副作用の低下、有害反応の減少、及び／又は患者のコンプライアンスの向上に関する、他の目的を測定することができる。
【０４９７】
（例２１）
カニクイザルにおける全身毒性試験
ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））と併用したキメラ抗エンドグリン抗体の毒性を処理するための試験においてカニクイザルを利用する。
【０４９８】
簡単に言うと、１０．０ｍｇ／ｋｇ、３０．０ｍｇ／ｋｇ又は１００．０ｍｇ／ｋｇのキメラ抗エンドグリン抗体と２．５、５、７．５、１０又は１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））を、３週間にわたり週１回サルに投与する。プラセボ動物には、抗体の不在下において適切な溶液を同じスケジュールで投与する。いくつかの用量を３０〜６０分にわたり静脈内ボーラスとして投与し、少なくとも６匹の動物にそれぞれの用量レベルで投与する。毒性は以下の指標の１つ又は複数、重量測定、基本生理現象の臨床測定、一連の血清化学的検査、血液学的評価及び病理組織学的評価によって評価する。
【０４９９】
（例２２）
カニクイザルにおける局所毒性試験
硝子体内注射により与えるときにラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））と併用する、キメラ抗エンドグリン抗体の毒性を処理するための試験においてカニクイザルを利用する。
【０５００】
簡単に言うと、０．２５、１．２５及び２．５ｍｇのキメラ抗エンドグリン抗体と０．５ｍｇのラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））を、６週間にわたり硝子体内注射により週１回サルに投与する。プラセボ動物には、抗体の不在下において適切な溶液を同じスケジュールで投与する。いくつかの用量を硝子体内注射として投与し、少なくとも６匹の動物にそれぞれの用量レベルで投与する。毒性は以下の指標の１つ又は複数、重量測定、基本生理現象の臨床測定、一連の血清化学的検査、血液学的評価及び病理組織学的評価によって評価する。
【０５０１】
（例２３）
チューブ状ネットワークの形成
血管形成の二次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて血管新生を試験することができる。
【０５０２】
一例では、８時間抗ＶＥＧＦ抗体、キメラ抗エンドグリン抗体、又は抗ＶＥＧＦ抗体とキメラ抗エンドグリン抗体の両方の存在下において、半密集状態下で３７℃においてＣＯ２インキュベーター中、フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）内の５％のウシ胎児血清及び増殖因子を含有するＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中でＨＵＶＥＣを培養する。無関係なＩｇＧ抗体を別の対照として含める。次いでＨＵＶＥＣ細胞を軽くトリプシン処理し、１０，０００〜１５，０００個の細胞を重合ＥＣＭａｔｒｉｘゲル（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイキット、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に接種する。一晩インキュベートした後、細胞は顕微鏡下で目に見える状態にし、クローズドポリゴンの数を数え、連続内皮細胞の長さを測定し写真を撮る。全ての実験条件は三連で試験する。
【０５０３】
（例２４）
簇出アッセイ
簇出の三次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて血管新生を試験することができる。
ＨＵＶＥＣを臍帯から単離し、３℃及び５％ＣＯ２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及び内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を補充したＭ１９９中で増殖させ、２〜４回継代したＨＵＶＥＣを全ての実験に使用する（第０代は初代培養である）。肺線維芽細胞（ＬＦ）を、３７℃及び５％ＣＯ２で、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で通常通り増殖させ、Ｐ１０とＰ１５の間で使用する。ＡＴＣＣから入手可能な他の線維芽細胞系を使用することもできる。
【０５０４】
細胞の調製
ＨＵＶＥＣ及び線維芽細胞を、ビーズ処理前に１〜２日、Ｍ１９９／１０％ＦＢＳ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（１：１００）中で増殖させる。ＨＵＶＥＣ用に、培地はビーズ処理前日にＥＧＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に交換する。線維芽細胞用に、培地は包埋前日にＥＧＭ−２に交換する。ビーズ処理はビーズ当たり約４００のＨＵＶＥＣを必要とする。線維芽細胞は、２４ウエルプレートに関してウエル当たり２０，０００個の細胞で使用する。９６ウエルプレートを使用し、それによって量を測定することもできる。
【０５０５】
Ｃｙｔｏｄｅｘ３ビーズ調製
例えばＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズをアッセイ中で使用することができる（Ａｍｅｒｓｈａｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。
【０５０６】
乾燥ビーズ（０．５ｇ）を水和させ、５０ｍｌチューブ中で室温（ＲＴ）において少なくとも３時間５０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で膨張させ、それをロッカーに置く。
【０５０７】
ビーズを沈殿させる（約１５分）。上清を廃棄し、ビーズは新たなＰＢＳ（５０ｍｌ）中で数分間洗浄する。
【０５０８】
洗浄したＰＢＳは廃棄し、新たなＰＢＳに交換する。
【０５０９】
ビーズ縣濁液は（例えば、Ｗｉｎｄｓｈｉｅｌｄ  Ｗｉｐｅｒ又はＳｉｇｒｎａｃｏｔｅからの）シリコン処理したガラス容器中に置く。１１５℃で１５分間のオートクレーブ処理によってビーズを滅菌し、次いで４℃で保存する。
【０５１０】
試薬
フィブリノゲン溶液
フィブリノゲン溶液を、３７℃の水浴においてＤＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを溶かすことによって作製する。次いで溶液を、攪拌ではなくチューブを逆にすることによって混合する。凝固性タンパク質の割合を、したがって決定及び調節することができる。次いで溶液を０．２２μｍのフィルターに通して滅菌する。
【０５１１】
アプロチニン
凍結乾燥アプロチニンはＤＩ水中に４Ｕ／ｍｌで元に戻し、滅菌濾過することができる。それぞれ１ｍｌのアリコートを作製し−２０℃で保存する。
【０５１２】
トロンビン
トロンビンは５０Ｕ／ｍｌで滅菌水中で元に戻す。０．５ｍｌのアリコートを作製し−２０℃で保存する。
【０５１３】
ＨＵＶＥＣを用いたビーズのコーティング（第１日）
ＨＵＶＥＣ細胞はトリプシン処理する。（遠心分離せずに）ビーズを沈殿させ、上清を吸引し、ビーズは１ｍｌの温かいＥＧＭ−２培地中で軽く洗浄する。ビーズ（２５００）はＦＡＣＳチューブにおいて１．５ｍｌの温かいＥＧＭ−２培地中の１×１０６のＨＵＶＥＣと混合させ、インキュベーター中に垂直に置く。（これは約１０ウエルに関して十分である。必要な場合スケールアップを実施することができる）。
【０５１４】
混合物は３７℃で４時間インキュベートし、逆にして２０分毎にチューブを混合する（ビーズはビーズ処理後に小さなゴルフボールのように見えるはずであり、それは簇出に十分なコーティングを示す。）
【０５１５】
４時間後、コーティングビーズはＴ２５組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移し、３７℃及び５％ＣＯ２において５ｍｌのＥＧＭ−２培地中で一晩インキュベートする。
【０５１６】
フィブリンゲル中へのコーティングビーズの包埋（第０日）
２．０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン溶液を前に記載したように調製し、０．１５単位／ｍｌのアプロチニンをフィブリノゲン溶液に加える。
【０５１７】
コーティングビーズは１５ｍＬの円錐形チューブに移し、ビーズを沈殿させる。
【０５１８】
ビーズは１ｍｌのＥＧＭ−２培地中に再縣濁し、１．５ｍｌの遠心分離チューブに移す。ビーズは１ｍｌのＥＧＭ−２培地で３回洗浄し、ピペット処理によって混合し、Ｐ１０００ピペットでゆっくりと降下させる。ビーズはカバーガラス上で計数し、５００ビーズ／ｍｌの濃度でフィブリノゲン溶液中に再縣濁する。
【０５１９】
トロンビン（０．６２５単位／ｍｌ）は２４ウエルプレートのそれぞれのウエルに加える。フィブリノゲン／ビーズ縣濁液（０．５ｍｌ）をそれぞれのウエルに加え、それぞれのウエルに関してピペット先端を変える。
【０５２０】
トロンビンとフィブリノゲン／ビーズはピペット処理によって混合し、約４〜５回ゆっくりと上下させ、フィブリンゲル中での気泡の生成を回避する。対照サンプルの一方は、抗体又は１つ又は複数の対照抗体の不在下で処理する。試験サンプルは、抗エンドグリン抗体単独、抗ＶＥＧＦ抗体単独、又はこれらの組合せで処理する。多数の濃度の作用物質を試験することができる。フィブリノゲン／ビーズ溶液は５分間室温で、次いで１５分間３７℃／５％ＣＯ２で凝固させる。フィブリンのせん断を最小にするために凝固の最初の５分間はプレートに手を加えないことは重要であり、これによって簇出の低下をもたらすことができる。
【０５２１】
ＥＧＭ−２（１ｍＬ）を一滴ずつそれぞれのウエルに加える。肺線維芽細胞は２０，０００細胞／ウエルの濃度で塊の上部に接種する。望ましい増殖が得られるまで一日おきに、培養培地は新たなＥＧＭ−２培地に交換する。
【０５２２】
フィブリンゲルが形成されるとき、小さな気泡がゲル中に存在する可能性があり、それらは３〜４日中に消失する。簇出は第２日と第４日の間は明らかであるはずである。内腔形成は第４〜５日ごろ始まり、芽は伸長し続ける。新たに形成される管は第４〜６日ごろ枝分かれし始める。第６〜７日までに、微小血管様構造は付近の管と網状につながり始め、ウエル当たりのビーズ数の増大は初期の交差連絡をもたらす。
【０５２３】
図３中に示すように、コラーゲンに接種したＨＵＶＥＣスフェロイドを使用すると、キメラＴＲＣ１０５は用量依存的にＶＥＧＦ誘導型簇出を阻害する（Ｎ＝３）。
【０５２４】
更に、図４中に示すように、キメラＴＲＣ１０５はＶＥＧＦ誘導型簇出を遮断する一方で（対角線のハッチング）、それはＨＵＶＥＣスフェロイドのｂＦＧＦ誘導型簇出を阻害しない（菱形のハッチング）（Ｎ＝２）。
【０５２５】
図５中に示すように、ＶＥＧＦ誘導型簇出に対するキメラＴＲＣ１０５の阻害効果（対角線のハッチング）は、ＶＥＧＦ阻害剤ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）ベバシズマブとの併用時に高まった（菱形のハッチング）。
【０５２６】
図６は、ＶＥＧＦ誘導型簇出に対するキメラＴＲＣ１０５の阻害効果（対角線のハッチング）は、キナーゼ阻害剤ＰＴＫ７８７との併用時には高まらなかったことを示す（菱形のハッチング）。
【０５２７】
（例２５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの簇出的血管新生の免疫細胞化学
内皮細胞（ＥＣ）核染色用に、フィブリンゲルを１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで２％パラホルムアルデヒド中に一晩固定する。１×ＰＢＳで更に２回洗浄した後、次いでゲルを４’，６−ジアミノジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で染色する。
【０５２８】
免疫染色用に、１０×トリプシンを用いたゲルの簡単な処理によってＬＦを最初に除去する。全ての線維芽細胞を除去した直後に、血清で消化を停止させる。次いでゲルはＨＢＳＳ、１×（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を用いて広範囲で洗浄する。次いで培養物を１０％ホルマリン中に１０分間固定し、５分間０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で浸透処理する。非特異的結合は２時間ＰＢＳに溶かした５％ＢＳＡ溶液で遮断する。
【０５２９】
一次抗体はブロッキングバッファー中に１／１００希釈で使用し、４℃で一晩インキュベートする。広範囲の洗浄後、結合した抗体は、１／１０００希釈で種特異的Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって検出する。アイソタイプ特異的非結合抗体は対照抗体として使用する。高いバックグラウンドが存在する場合、一次又は二次抗体の濃度を低下させることが可能であり、必要な場合、インキュベーション及び／又は洗浄時間を増大することが可能である。Ｆ−アクチンは０．２μＭの濃度でＴＲＩＴＣ−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて染色する。
【０５３０】
位相差画像と蛍光画像を、デジタルカメラと接続したＩＸ７０  Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡で捕捉する。蛍光Ｚシリーズ画像スタックは２光子Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ顕微鏡で捕捉し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ  ＰＡ）を用いて三次元レンダリングに編集する。したがって、様々なマーカーの発現を容易に検出することができる。
【０５３１】
培養のｚ−軸に沿った蛍光光学画像スタックを捕捉して、血管の３Ｄ画像を作成することができる。核はＤＡＰＩ（緑）によって染色し、血管壁はビメンチンを染色する（オレンジ）。内皮細胞の単層に囲まれた、広い、空洞の管腔が明らかに目で見ることができる。これらの画像によって、マトリゲルアッセイ中でしばしば見られるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ中に存在する管腔は細胞内の隙間ではなく細胞内に存在することを確認する。更に、それらが管腔に面した頂端膜、及びコラーゲンＩＶ多量基底膜及びフィブリンゲルと対向した基底膜を有する点で、ＨＵＶＥＣが分極状態であることを確認することができる。
【０５３２】
（例２６）
脈絡膜血管新生の抑制
動物は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）自体は発症しないが、ＡＭＤで見られるそれと似た脈絡膜血管新生をレーザーを使用して生成し、ブルッフ膜及びその上の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の焦点障害をもたらすことはできる。この障害はＲＰＥ層及び網膜下空間への底部脈絡膜毛細血管の異常な増殖を刺激し、ブルッフ膜の障害は、湿潤型のＡＭＤを特徴付けるものを含めた全ての型の脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に一般的である。
【０５３３】
脈絡膜血管新生のレーザー誘導型モデルにおいて、９又は１０マウスの群を、レーザー障害の１日前及びレーザー後の第２、５、８、及び１１日に、（１）キメラ抗エンドグリン抗体単独、（２）抗ＶＥＧＦ抗体単独、（３）同じ組成物又は異なる組成物中に抗ＶＥＧＦ抗体と併用したキメラ抗エンドグリン抗体、又は（４）対照抗体の皮下（ｓｃ）注射で治療する。レーザー障害後第１４日に、マウスにフルオレセイン標識デキストラン（５０ｍｇ）を静脈内注射し、安楽死させ、眼は脈絡膜の平坦部分をすぐに切開し、又は最適切断温度包埋化合物に凍結し、病巣の評価のため切断する。
【０５３４】
（例２７）
レーザー誘導型脈絡膜血管新生に対する本明細書に記載する組成物の影響を、成体カニクイザルにおいても評価する。
【０５３５】
この実験では、（１）キメラ抗エンドグリン抗体単独、（２）抗ＶＥＧＦ抗体単独、（３）同じ組成物又は異なる組成物中に抗ＶＥＧＦ抗体と併用したキメラ抗エンドグリン抗体、又は（４）対照抗体を静脈内又は硝子体内注射によって投与する。それぞれの動物にはそれぞれの網膜に９又は１０のレーザー障害を与え、活性脈絡膜血管新生病巣の発生は、治療開始前及びレーザー治療後第１５、２０及び２９日に一度、蛍光眼底造影法によって評価する。組成物はレーザー障害前１週間で始めて週当たり１回静脈内投与する。硝子体内注射はレーザー前１週間で始めて２週毎に１回、又はレーザー後２週間に１回行い、そのとき活性ＣＮＶ病巣がすでに形成されている。対照動物には、レーザー前１週間で始めて、週に１回静脈内又は２週に１回硝子体内注射でプラセボを与える。
【０５３６】
ＣＮＶ病巣は蛍光眼底造影法によって眼に見える状態にし、標準的な手順に従い等級付けする。
【０５３７】
（例２８）
加齢性黄斑変性症の治療
第一試験
加齢性黄斑変性症の症状を示す患者を、（１）キメラ抗エンドグリン抗体単独、（２）ラニビズマブ単独、（３）同じ組成物又は異なる組成物中にラニビズマブと併用したキメラ抗エンドグリン抗体、又は（４）対照抗体の硝子体内注射により治療して、血管新生、黄斑疾患、及び網膜障害の発生を低減又は予防する。
【０５３８】
治療の第一ステップとして、患者は完全な眼科検査を受けて眼部健康のベースラインを確定する。眼科検査は、間接的眼底検査、細隙灯生体鏡検、周辺部網膜検査、眼内圧測定、視力（肉眼及び最高矯正）症候学、眼底撮影法、蛍光眼底造影法、光干渉断層法、網膜電図写真及びＡ−スキャン測定を含む。
【０５３９】
予備検査後、前に記載した硝子体内注射を、ＡＭＤの症状を示す患者の罹患した眼に与える。両眼が罹患している場合、それらは別々に治療することができる。治療する眼には点眼液を注射する。
【０５４０】
治療後、患者の眼は第１、２、７、１５、３０及び６０日に、及びその後は２年間にわたり毎月検査する。再発の可能性があるため、患者はその後１カ月単位の定期健診に戻らなければならない。それぞれの検診日に、硝子体液化に関して患者をモニタリングする。更に、間接的眼底検査及び強膜圧迫法を使用して、後部硝子体剥離に関して患者をモニタリングする。最後に、患者によって示されるＡＭＤの程度を、定期的網膜検査、光干渉断層法及び蛍光眼底造影法により絶えずモニタリングして、網膜下液、血液、滲出液、ＲＰＥ剥離、網膜内嚢胞様変化の存在、又はグレーがかった緑色の網膜下血管新生膜の存在をモニタリングする。再発する血管新生の兆候が観察される場合、別の治療が必要とされる可能性がある。別の治療は１週間又は１カ月単位で与えることができる。好ましい実施形態では、初期治療に１〜６カ月間隔の間で二次治療を続ける。
【０５４１】
第二試験
目的：血管新生加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するための硝子体内でのキメラ抗エンドグリン抗体及びラニビズマブの有効性を実証すること。
【０５４２】
方法：ＡＭＤが原因である中心眼窩の脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を有する５０〜５００の患者（５０〜５００の眼）が、承認された場所での試験に関与する。
【０５４３】
再注射の基準は、黄斑中の流体の存在、少なくとも１００ミクロンの増大した中心網膜厚（ＣＲＴ）、黄斑中の増大した流体に関連した少なくとも５視標の消失、新古典的ＣＮＶ、又は新黄斑出血である。主要評価項目測定は、１２カ月後に１５視標未満を失う眼の割合である。最高矯正視力及び眼の臨床検査は、第１週、第１カ月で、及び次いで５〜１２カ月間月に１回実施する。
【０５４４】
平均視力及び平均ＣＲＴはベースラインと比較して測定する。眼部及び／又は全身副作用を記す。
【０５４５】
（例２９）
損傷誘導型脈絡膜血管新生の阻害
脈絡膜血管新生を、３ナイロン縫合糸の基質内配置によって、又は角膜上皮の化学的損傷（ＮａＯＨ）及び機械的除去によって、オスＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導する。（１）キメラ抗エンドグリン抗体単独、（２）抗ＶＥＧＦ抗体単独、（３）同じ組成物又は異なる組成物中に抗ＶＥＧＦ抗体単独と併用したキメラ抗エンドグリン抗体、又は（４）対照抗体を、損傷直前又は損傷後に一回又は多数の時間地点で腹腔内投与する、複数の実験を実施する。
【０５４６】
角膜新生血管の増殖は細隙灯生体鏡検及び組織学的評価によって評価する。脈管は内皮細胞特異的フルオレセイン結合レクチンで標識し、血管新生は、ＰＥＣＡＭ免疫組織化学法を使用して角膜の平坦部分及び横断面において評価する。角膜浮腫の存在は細隙灯生体鏡検を使用して評価し、角膜の厚さは横断面で測定し、角膜の厚さの増大は浮腫の量を反映する。多形核白血球（ＰＭＮ）及びマクロファージの数は、それぞれＨＥＭＡ−３又はラット抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体で横断面を染色することによって決定する。
【０５４７】
本明細書に記載する実施形態は、本発明の精神若しくはその本質的特徴から逸脱せずに、他の型で具体化することができ、又は他の方法で実施することができる。したがって本開示は、全態様において制限的ではなく例示的として考えられ、均等性の意味及び範囲内に入る全ての変形はその中に包含されると考えられる。
【図１】
2014088401.tif 000004
【図２】
2014088401.tif 000005
【図３】
2014088401.tif 000006
【図４】
2014088401.tif 000007
【図５】
2014088401.tif 000008
【図６】
2014088401.tif 000009
【配列表】
2014088401000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月16日(2013.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ誘導型簇出阻害剤の製造のための、キメラ抗エンドグリン抗体を含む組成物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物の使用であって、
該キメラ抗エンドグリン抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域（Ｆｃ）を含み；
該ＶＥＧＦアンタゴニストが、ラニビズマブ、アフリベルセプト、スニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、ペガプタニブ、パゾパニブ、パクリタキセル、Ｏ−（クロロアセチル−カルボミル）フマギロール、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、アンギオスタチン、ヒト軟骨細胞由来血管新生阻害剤、軟骨由来血管新生阻害剤、血小板因子−４、グロ−β、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質１０、インターロイキン１２、Ｒｏ３１８２２０、トリシクロデカン−９−イルキサンテート、イルソグラジン、８，９−ジヒドロキシ−７−メチル−ベンゾ［ｂ］キノリジニウムブロマイド、メドロキシプロゲステロン、ヘパリンとコルチゾンの組合せ、グルコシダーゼ阻害剤、ゲニステイン、サリドマイド、ジアミノ−アントラキノン、ヘルビマイシン、ウルソル酸、及びオレアノール酸からなる群から選択される；
上記使用。
【請求項２】
薬剤を製造するための、キメラ抗エンドグリン抗体を含む組成物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物の使用であって、
該キメラ抗エンドグリン抗体が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域（Ｆｃ）を含み；
該ＶＥＧＦアンタゴニストが、ラニビズマブ、アフリベルセプト、スニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、ペガプタニブ、パゾパニブ、パクリタキセル、Ｏ−（クロロアセチル−カルボミル）フマギロール、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、アンギオスタチン、ヒト軟骨細胞由来血管新生阻害剤、軟骨由来血管新生阻害剤、血小板因子−４、グロ−β、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質１０、インターロイキン１２、Ｒｏ３１８２２０、トリシクロデカン−９−イルキサンテート、イルソグラジン、８，９−ジヒドロキシ−７−メチル−ベンゾ［ｂ］キノリジニウムブロマイド、メドロキシプロゲステロン、ヘパリンとコルチゾンの組合せ、グルコシダーゼ阻害剤、ゲニステイン、サリドマイド、ジアミノ−アントラキノン、ヘルビマイシン、ウルソル酸、及びオレアノール酸からなる群から選択される；
上記使用。
【請求項３】
対象中の血管新生関連疾患の治療用薬剤を製造するための、キメラ抗エンドグリン抗体を含む組成物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物の使用であって、
該キメラ抗エンドグリン抗体が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域（Ｆｃ）を含み；
該ＶＥＧＦアンタゴニストが、ラニビズマブ、アフリベルセプト、スニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、ペガプタニブ、パゾパニブ、パクリタキセル、Ｏ−（クロロアセチル−カルボミル）フマギロール、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、アンギオスタチン、ヒト軟骨細胞由来血管新生阻害剤、軟骨由来血管新生阻害剤、血小板因子−４、グロ−β、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質１０、インターロイキン１２、Ｒｏ３１８２２０、トリシクロデカン−９−イルキサンテート、イルソグラジン、８，９−ジヒドロキシ−７−メチル−ベンゾ［ｂ］キノリジニウムブロマイド、メドロキシプロゲステロン、ヘパリンとコルチゾンの組合せ、グルコシダーゼ阻害剤、ゲニステイン、サリドマイド、ジアミノ−アントラキノン、ヘルビマイシン、ウルソル酸、及びオレアノール酸からなる群から選択される；
上記使用。
【請求項４】
前記組成物が、許容される担体又は賦形剤を更に含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
血管新生関連疾患が癌、又は転移である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
薬剤が癌の増殖を阻害する、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
癌が上皮系腫瘍を含む固形腫瘍である、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
癌が肺癌、婦人科悪性腫瘍、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、頭部癌、膵臓癌、肝臓癌（肝細胞癌）、子宮癌、首部癌、腎臓癌（腎細胞癌）、肉腫、ミエローマ、及びリンパ腫から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
血管新生関連疾患が血管新生／新血管形成によって特徴付けられる眼部疾患、糖尿病性腎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、又は骨関節炎である、請求項３に記載の使用。
【請求項１０】
眼部疾患が黄斑変性症又糖尿病性網膜症である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
キメラ抗エンドグリン抗体が組成物中に０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇの量で存在する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ＶＥＧＦアンタゴニストが組成物中に２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇの量で存在する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体が連続して、又は同時に投与される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
キメラ抗エンドグリン抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体が同じ部位に投与されるか又は違う部位に投与される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。