(57)【要約】【課題】ＣＤ８６アンタゴニストの多標的結合タンパク質の提供。【解決手段】本開示により、ＣＤ８６アンタゴニスト結合ドメインと、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである別の結合ドメインとで構成された多重特異性融合タンパク質を提供する。また、この多重特異性融合タンパク質には、他方のドメインを引き離す介在ドメインが含まれ得る。また、本開示により、該多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該融合タンパク質の組成物、ならびに該多重特異性融合タンパク質および組成物の使用方法を提供する。【選択図】図１
2014239700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，２８８号、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，２９７号、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，３０７号、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，３１５号、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，３１９号、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，３２７号、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，３３１号、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，３３４号、２００８年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０２，３３６号の米国特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張し、これら（９件）の仮出願は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（配列表に関する記載）
本出願書類に関連する配列表を、紙面コピーに代えてテキスト形式で提供し、引用により本明細書に組み込んでいる。配列表を含むテキストファイル名は、９１０１８０＿４２１ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは７０５ＫＢであり、２００９年１０月２日に作成したものであり、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出されている。
【０００３】
（背景）
（技術分野）
本開示は、一般的に、多重特異性結合分子およびその治療的適用の分野に関し、より詳しくは、ＣＤ８６アンタゴニスト結合ドメインと、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストなどの異種標的に特異的な別の結合ドメインとで構成された融合タンパク質、ならびにその組成物および治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（関連技術の説明）
ヒト免疫機構は、一般的には、異物および病原体による損傷から身体を保護する。免疫機構が身体を保護する様式の一例は、Ｔリンパ球またはＴ細胞と称される特殊細胞の産生によってもたらされるものである。Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との細胞間相互作用により、Ｔ細胞共刺激性（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）シグナルが生成され、これにより、抗原に対するＴ細胞応答がもたらされる。十分なＴ細胞の活性化には、抗原提示細胞上に存在する抗原−ＭＨＣ複合体に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合と、抗原提示細胞上、特に樹状細胞上に存在するＣＤ８６および／またはＣＤ８０リガンドに対するＴ細胞表面上の受容体ＣＤ２８の結合の両方が必要とされる。
【０００５】
ＣＤ８０（Ｂ７−１としても知られる）は、最初は、ヒトＢ細胞関連活性化抗原として報告され、その後、関連Ｔ細胞分子ＣＤ２８および細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ４）の受容体であることがわかった。後の研究において、ＣＤ８６として知られる（Ｂ７−０またはＢ７−２としても知られる）ＣＴＬＡ４の別の対抗受容体（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）が同定された。ＣＤ８６はＣＤ８０と、その細胞外領域において約２５％の配列同一性を共有している。ＣＤ８０とＣＤ８６は、一般的に、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞の増殖を開始させて維持する能力において機能的に同等であると考えられており（非特許文献１）、両分子のこの活性をブロックする可溶性ＣＴＬＡ４  Ｉｇ融合タンパク質を用いた臨床データにより臨床的有益性が示されている（非特許文献２）が、ＣＤ８６の特異的阻害が有益であり得るという証拠がいくつかある。例えば、ＣＤ８６またはＣＤ８０の関与はＢ細胞に対して異なる効果を有する。具体的には、ＣＤ８０は、正常Ｂ細胞とＢ細胞リンパ腫の両方の増殖およびＩｇＧ分泌に対して負のシグナルをもたらすが、ＣＤ８６は、Ｂ細胞の活性を高めることが示されている（非特許文献３）。また、Ｔ細胞に対するＣＤ８０の関与は免疫抑制性であり（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）、ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）シグナル伝達により、活性化されたＡＰＣまたはＴ細胞に対して、さらなる免疫抑制を媒介し得る（非特許文献７；非特許文献８）という証拠もいくつかある。したがって、ＣＤ８０阻害の非存在下でのＣＤ８６の阻害は、自己免疫疾患および炎症性疾患ならびにＢ細胞リンパ腫の処置において有益であり得る。
【０００６】
ＣＴＬＡ４は、主に活性化Ｔ細胞において発現される免疫グロブリンスーパーファミリーの１型膜貫通糖タンパク質であり、発現は一部、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）サブセットにも見られる。ＣＤ８６およびＣＤ８０は、ＣＴＬＡ４に対する唯一の内在性リガンドと考えられている。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ８６およびＣＤ８０に、ＣＤ２８と比べて大きな親和性およびアビディティで結合し（非特許文献９；非特許文献１０）、Ｔ細胞の活性化の負の調節因子として重要な役割を果たしていることが示されている。具体的には、ＣＤ８０／ＣＤ８６に対するＣＴＬＡ４の結合によりＴ細胞応答の下方調節がもたらされ、また、Ｔ細胞恒常性および末梢耐容性の保持がもたらされる。これは、ＣＤ２８依存性共刺激の拮抗作用と、ＣＴＬＡ４細胞質テールによる指令的な負のシグナル伝達の両方によるものと考えられる。ＣＴＬＡ４の構造および機能の概説については、Ｔｅｆｔら（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６５−９７を参照のこと。
【０００７】
上記のように、生産的免疫応答には、ＴＣＲの関与と、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に対するＣＤ２８の結合の両方が必要とされる。ＣＤ２８結合の非存在下でのＴＣＲ結合は、Ｔ細胞を、アポトーシスを受けるか、またはアネルギーとなるかのいずれかに導く。また、ＣＤ２８シグナル伝達により、Ｔ細胞によるサイトカイン産生が増大することが示されている。具体的には、ＣＤ２８の刺激により、ＩＬ−２、ＴＮＦα、リンホトキシン、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの産生が、活性化Ｔ細胞において５〜５０倍増大することが示されている。さらに、ＣＤ２８によるリンホカインおよび／またはサイトカイン遺伝子発現の誘導は、免疫抑制薬シクロスポリンの存在下であっても起こることが示されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：１３３３−１３３７）。また、ＣＤ２８は、抗アポトーシス性ＢＣＬ−ＸＬの上方調節を誘導することにより、Ｔ細胞の生存を増進させることが示されている（Ａｌｅｇｒｅら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２２０−２２８）。
【０００８】
ＣＴＬＡ４の可溶性形態が、ＣＴＬＡ４の可変様細胞外ドメインを免疫グロブリンの定常ドメインに融合させてＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を得ることにより構築された。可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇは、ＣＤ８６とＣＤ８０の両方に結合することにより、ＣＤ２８依存性共刺激を抑制すること（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：５６１−６９）、およびヒトにおいてＴ細胞の共刺激を抑止し、有益な免疫抑制効果を有すること（Ｂｒｕｃｅ  ＆  Ｂｏｙｃｅ（２００７）Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．４１：１１５３−１１６２）が示されている。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質であるアバタセプト（ａｂａｔａｃｅｐｔ）は、現在、関節リウマチの処置で、抗ＴＮＦα療法に対する応答が不十分である場合に使用されている。しかしながら、すべての患者がＣＴＬＡ４−Ｉｇに応答するわけではなく、おそらく、一部において、ＣＤ２８とＣＤ８６／ＣＤ８０との相互作用のブロックが、Ｔｒｅｇの弱い誘導因子であり、また、疾患環境において活性化エフェクターＴ細胞応答をブロックするのに不十分であるため、継続的な応答には頻繁な薬物投与が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｖａｓｉｌｅｖｋｏら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００２）２１：１３７−４９
【非特許文献２】Ｇｅｎｏｖｅｓｅら、ＮＥＪＭ（２００５）３５３：１１４−１１２３
【非特許文献３】Ｓｕｖａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００２）２７７：７７６６−７７７５
【非特許文献４】Ｌａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）１６８：３７８６−３７９２
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）１７２：３４−３９
【非特許文献６】Ｐａｕｓｔら、ＰＮＡＳ（２００４）１０１：１０３９８−１０４０３
【非特許文献７】Ｂｕｔｔｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００７）２７：１１１−１２２
【非特許文献８】Ｋｅｉｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）２６：６７７−７０４
【非特許文献９】Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１７４：５６１−６９
【非特許文献１０】Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７９３−８０１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（詳細説明）
本開示により、活性を改変するための抗原提示細胞（ＡＰＣ）の標的化が可能になる。例えば、ＣＤ８６に優先的に結合する第１結合ドメインと、第２結合ドメイン（異種結合ドメイン）とを含む多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質を提供することにより、Ｔ細胞の活性が調整され得る。一部の特定の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、第１および第２結合ドメイン、第１および第２リンカー、ならびに介在ドメインを含み、該介在ドメインの一端は、リンカーによって、ＣＤ８６結合ドメインである第１結合ドメインに融合されており、他端は、リンカーによって、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである第２結合ドメインに融合されている。
【００１１】
一部の特定の実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインは、ＣＴＬＡ４エクトドメイン、ＣＤ２８エクトドメイン、またはＣＤ８６に特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）（例えば、モノクローナル抗体３Ｄ１またはＦＵＮ１由来）である。一部の実施形態では、完全体より小さいエクトドメインが使用される。例えば、ＣＤ８６に結合してＣＤ２８に対するＣＤ８６の結合を抑制するＣＴＬＡ４エクトドメイン内のドメインが使用され得る。さらなる実施形態において、ＩＬ１０アゴニストはＩＬ１０またはその機能性領域である。さらなる実施形態において、ＨＬＡ−Ｇアゴニストは、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇムテインもしくはその機能性領域；ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ１もしくはＨＬＡ−Ｇムテインのエクトドメイン；またはＩＬＴ２、ＩＬＴ４もしくはＫＩＲ２ＤＬ４に特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）である。なおさらなる実施形態において、異種結合ドメインは、ＨＧＦもしくはそのサブドメインなどのＨＧＦアゴニストである。別の実施形態では、異種結合ドメインは、ＩＬ３５Ｒに特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）もしくはＩＬ３５またはその機能性領域などのＩＬ３５アゴニストである。さらなる実施形態において、ＬＩＧＨＴアンタゴニストは、ＬＩＧＨＴに特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）、またはＨＶＥＭエクトドメインまたはその機能性領域である。さらなる実施形態において、ＰＤ−１アゴニストは、ＰＤ−１に特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）、またはＰＤ−１リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）またはその機能性領域である。さらなる実施形態において、ＢＴＬＡアゴニストは、ＢＴＬＡに特異的な免疫グロブリン様可変領域結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）、またはＨＶＥＭエクトドメインまたはその機能性領域である。一部の特定の実施形態では、ＧＩＴＲＬアンタゴニストは、ＧＩＴＲＬに特異的な免疫グロブリン様可変領域結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）、またはＧＩＴＲエクトドメイン、可溶性ＧＩＴＲまたはその機能性領域である。一部の特定の実施形態では、ＣＤ４０アンタゴニストは、ＣＤ４０に特異的な免疫グロブリン様可変領域結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）である。
【００１２】
かかる多重特異性融合タンパク質（本明細書においてＸｃｅｐｔｏｒ分子と称する）の例示的な構造としては、Ｎ−ＢＤ−ＩＤ−ＥＤ−Ｃ、Ｎ−ＥＤ−ＩＤ−ＢＤ−Ｃ、Ｎ−ＢＤ１−ＩＤ−ＢＤ２−Ｃ、およびＮ−ＥＤ−ＩＤ−ＥＤ−Ｃが挙げられ、式中、Ｎ−および−Ｃは、それぞれ、アミノ末端およびカルボキシ末端を示す；ＢＤは、免疫グロブリン様または免疫グロブリン可変領域結合ドメインである；ＩＤは介在ドメインである；ＥＤは、細胞外またはエクトドメイン、例えば、受容体リガンド結合ドメイン、リガンド、Ｃ型レクチンドメイン、セマホリンまたはセマホリン様ドメインなどである。一部の構築物では、ＩＤは、第１結合ドメインと第２結合ドメインとの間に配置された免疫グロブリンの定常領域または部分領域を含むものであり得る。なおさらなる構築物では、ＢＤとＥＤは各々、ＩＤに、同じリンカーまたは異なるリンカー（例えば、１〜５０個のアミノ酸を含むリンカー）によって、例えば、免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、上側領域とコア領域で構成）もしくはその機能性改変体、またはレクチンドメイン間領域もしくはその機能性改変体、または表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（ＣＤ））分子ストーク（ｓｔａｌｋ）領域もしくはその機能性改変体によって連結されている。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
介在ドメインによって異種結合ドメインに連結されたＣＤ８６結合ドメインを含む多重特異性融合タンパク質であって、該異種結合ドメインは、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである、多重特異性融合タンパク質。
（項目２）
該ＣＤ８６結合ドメインが、ＣＴＬＡ４エクトドメインまたはＣＴＬＡ４エクトドメインのサブドメインである、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目３）
該ＣＤ８６結合ドメインが、ＣＤ８６に特異的なＦａｂ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、または重鎖のみの抗体である、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目４）
該ＣＤ８６結合ドメインが、ＦＵＮ１抗ＣＤ８６抗体またはそのヒト化改変体の軽鎖および重鎖の可変ドメインを含む、項目３に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目５）
該ＦＵＮ１結合ドメインが、配列番号１８７または２３７のアミノ酸１〜２５８を含む、項目４に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目６）
該ＣＤ８６結合ドメインが、配列番号１〜６のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目７）
該異種結合ドメインが、配列番号７、１４、１５、１８〜２２、２５、２６、２９、３２、３３、３９および４０のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目８）
該異種結合ドメインが、配列番号７に示すアミノ酸配列または８７位に点変異を含むその改変体を含むＩＬ−１０アゴニストを含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目９）
該異種結合ドメインが、配列番号１４または１５に示すアミノ酸配列を含むＨＬＡ−Ｇアゴニストを含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１０）
該異種結合ドメインが、配列番号１８〜２２のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含むＨＧＦアゴニストを含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１１）
該異種結合ドメインが、配列番号２５または２６に示すアミノ酸配列を含むＩＬ−３５アゴニストを含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１２）
該異種結合ドメインが、配列番号３２または３３に示すアミノ酸配列を含むＰＤ−１アゴニストを含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１３）
異種結合ドメインが、配列番号２９に示すアミノ酸配列を含むＢＴＬＡアゴニストを含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１４）
該異種結合ドメインが、配列番号２９に示すアミノ酸配列を含むＬＩＧＨＴアンタゴニストを含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１５）
該異種結合ドメインが、配列番号３９または４０に示すアミノ酸配列を含むＧＩＴＲＬアンタゴニストを含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１６）
該介在ドメインが、該ＣＤ８６結合ドメインと該異種結合ドメインとの間に配置される免疫グロブリンの定常領域または部分領域を含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１７）
該免疫グロブリンの定常領域または部分領域がＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３である、項目１６に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１８）
該介在ドメインが、第１リンカーと第２リンカーとの間に配置される免疫グロブリンの定常領域を含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目１９）
該第１リンカーおよび第２リンカーが、独立して、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に示すリンカーから選択される、項目１８に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目２０）
該介在ドメインが、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、トランスフェリン、または血清タンパク質に結合する骨格ドメインを含む、項目１８に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目２１）
該介在ドメインが、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下：
−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−
（式中：
Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、２〜約１５０個のアミノ酸を含むリンカーであり；
Ｘは、免疫グロブリンの定常領域もしくは部分領域、アルブミン、トランスフェリン、または別の血清タンパク質結合タンパク質である）
の構造を含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目２２）
該免疫グロブリンの定常領域または部分領域がＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３である、項目２１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目２３）
Ｌ１が、１つ以上のシステインが他のアミノ酸で置き換わるように任意選択で変異させられたヒト免疫グロブリンヒンジ領域である、項目２１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目２４）
Ｘが、ＦｃγＲＩ−ＩＩＩ相互作用を解消するがＦｃＲｎ相互作用は保持するように任意選択で変異させられたヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインまたはその少なくとも１つのＣＨドメインである、項目２１または２３に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目２５）
該介在ドメインが二量体化ドメインである、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。（項目２６）
下記の構造：
Ｎ−ＢＤ１−Ｘ−Ｌ２−ＢＤ２−Ｃ
（式中：
ＢＤ１は、ＣＴＬＡ４のエクトドメインと少なくとも約９０％同一であるＣＤ８６結合ドメインであり；
−Ｘ−は、−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−（式中、Ｌ１は、第１システインを置換することにより任意選択で変異させられた第１ＩｇＧ１ヒンジであり、−ＣＨ２ＣＨ３−は、ＦｃγＲＩ−ＩＩＩ相互作用を解消するがＦｃＲｎ相互作用は保持するように任意選択で変異させられたＩｇＧ１  ＦｃドメインのＣＨ２ＣＨ３領域である）であり；
Ｌ２は、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８から選択されるリンカーであり；
ＢＤ２は、該異種結合ドメインである）
を有する、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目２７）
配列番号９、１３、１７、２４、２８、３１、３５、３８、４２、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２３７、２３９、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６６、２７６、３０２、３３０、３３４、３３６、３３８、３４０、３５０、３５２、および３５４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む、項目１に記載の多重特異性融合タンパク質。
（項目２８）
前述の項目のいずれかに記載の１種類以上の多重特異性融合タンパク質と、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物。
（項目２９）
該多重特異性融合タンパク質が該組成物中で二量体または多量体として存在している、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
項目１〜２７のいずれか１項に記載の多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目３１）
配列番号８、１２、１６、２３、２７、３０、３４、３７、４１、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２３６、２３８、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６５、２７５、３０１、３２９、３３３、３３５、３３７、３３９、３４９、３５１および３５３のいずれか１つに示すポリヌクレオチドを含む、項目３０に記載のポリヌクレオチド。
（項目３２）
発現制御配列に作動可能に連結された項目３０または３１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目３３）
項目３２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目３４）
治療有効量の前述の項目のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質またはその組成物を投与することを含む、ＣＤ８６、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＧＦ、ＩＬ−３５、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬまたはＣＤ４０と関連している障害を有する被験体の処置方法。
（項目３５）
該障害が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは固形臓器移植である、項目３４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、種々のタンパク質、例えば、アバタセプト、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｎ２）（配列番号１１）、およびＩＬ１０に融合させたＣＴＬＡ４エクトドメインを含む多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質（配列番号９）によるＣＤ８０に対する結合を示す。
【図２】図２は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｎ２）（配列番号１１）、およびＩＬ１０に融合させたＣＴＬＡ４エクトドメインを含む多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質（配列番号９）が、可溶性ＩＬ１０Ｒａ（ｓＩＬ１０Ｒａ）に結合し得ることを示す。
【図３】図３はおよび図４は、ＩＬ１０に融合させたＣＴＬＡ４エクトドメインを含む多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質（配列番号９）がＰＢＭＣにおいてＳＴＡＴ３リン酸化を誘導し得ることを示す。
【図４】図３はおよび図４は、ＩＬ１０に融合させたＣＴＬＡ４エクトドメインを含む多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質（配列番号９）がＰＢＭＣにおいてＳＴＡＴ３リン酸化を誘導し得ることを示す。
【図５】図５は、３Ｄ１およびヒト化ＦＵＮ１モノクローナル抗体由来抗ＣＤ８６結合ドメインを含むｘｃｅｐｔｏｒがＷＩＬ２−Ｓ細胞上のＣＤ８６に結合することを示す。
【図６】図６は、ＣＤ８６結合ドメインおよびＩＬ１０を含むｘｃｅｐｔｏｒが、細胞表面ＣＤ８６とｓＩＬ１０Ｒａに同時に結合し得ることを示す。
【図７】図７は、ヒト化抗ＣＤ８６  ＦＵＮ１  ＳＭＩＰの種々の異なる変形型がＣＤ８６に結合し得ることを示す。
【図８】図８は、ＩＬ１０をｘｃｅｐｔｏｒのカルボキシ末端（ＢＤ２）に連接する種々のリンカーを有するＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０  ｘｃｅｐｔｏｒ分子がＩＬ１０Ｒ１−Ｉｇに結合し得ることを示す。白抜きの三角形−配列番号９；白抜きの菱形−配列番号１７１；黒塗りの円−配列番号３０２；黒塗りの三角形−配列番号１７３。
【図９】図９は、ＩＬ１０をｘｃｅｐｔｏｒのカルボキシ末端（ＢＤ２）を連接する短リンカーを有するＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０  ｘｃｅｐｔｏｒ分子がＩＬ１０Ｒ１−Ｉｇに結合し得ることを示す。白抜きの三角形−配列番号１７１；白抜きの菱形−配列番号１７５；黒塗りの円−配列番号１７７；黒塗りの三角形−配列番号１７９。
【図１０】図１０は、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がＣＤ８０に結合することを示す。
【図１１】図１１は、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がＣＤ８６に結合することを示す。
【図１２】図１２は、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がｓＩＬ１０Ｒａに結合することを示す。
【図１３】図１３は、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がＣＤ８０とｓＩＬ１０Ｒａに同時に結合し得ることを示す。
【図１４】図１４は、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がマウスＣＤ８０と交差反応性であることを示す。
【図１５】図１５は、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がマウスＣＤ８６と交差反応性であることを示す。
【図１６】図１６および図１７は、ＭＬＲアッセイにおいて、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がヒトＴ細胞応答をブロックすることを示す。
【図１７】図１６および図１７は、ＭＬＲアッセイにおいて、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がヒトＴ細胞応答をブロックすることを示す。
【図１８】図１８〜図２０は、ＭＬＲアッセイにおいて、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がマウスＴ細胞応答をブロックすることを示す。
【図１９】図１８〜図２０は、ＭＬＲアッセイにおいて、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がマウスＴ細胞応答をブロックすることを示す。
【図２０】図１８〜図２０は、ＭＬＲアッセイにおいて、いくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がマウスＴ細胞応答をブロックすることを示す。
【図２１】図２１および図２２は、ＭＬＲアッセイにおいて、改変体ＩＬ１０（Ｉ８７変異を有するＩＬ１０もしくはモノＩＬ１０のいずれか）または改変体ＣＴＬＡ４を含むいくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がヒトＴ細胞応答をブロックすることを示す。
【図２２】図２１および図２２は、ＭＬＲアッセイにおいて、改変体ＩＬ１０（Ｉ８７変異を有するＩＬ１０もしくはモノＩＬ１０のいずれか）または改変体ＣＴＬＡ４を含むいくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がヒトＴ細胞応答をブロックすることを示す。
【図２３】図２３は、ＭＣ／９細胞増殖アッセイにおいて、改変体ＩＬ１０（Ｉ８７変異を有するＩＬ１０またはモノＩＬ１０のいずれか）を含むいくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、マウスＩＬ１０よりも免疫賦活性が低いことを示す。
【図２４】図２４は、ＭＣ／９細胞増殖アッセイにおいて、改変体ＩＬ１０（Ｉ８７変異を有するＩＬ１０またはモノＩＬ１０のいずれか）を含むいくつかのｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、ヒトＩＬ１０よりも免疫賦活性が低いことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で用いる一部の用語の定義を示すことが、その理解を助けることになり得よう。さらなる定義は、本開示の至る箇所に示している。
【００１５】
本記載において、任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲または整数範囲は、特に記載のない限り、記載の範囲内の任意の整数値ならびに、適切な場合は、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されたい。また、任意の物理的特徴に関する本明細書に記載の任意の数値範囲（ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなど）は、特に記載のない限り、記載の範囲内の任意の整数を含むと理解されたい。本明細書で用いる場合、「約」または「本質的に〜からなる」は、特に記載のない限り、表示した範囲、値または構造の±２０％を意味する。用語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で用いる場合、列挙成分の「１つ以上」を指すことを理解されたい。代替的記載（例えば、「または／もしくは」）の使用は、該代替的記載のいずれか１つ、両方、またはその任意の組合せを意味すると理解されたい。本明細書で用いる場合、用語「ｉｎｃｌｕｄｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」（含む）は同義的に用いている。また、本明細書に記載の構造および置換基の種々の組合せにより得られる個々の化合物または化合物群は、各化合物または化合物群が、あたかも具体的に個々に示されているのと同程度に本出願書類に開示されていると理解されたい。したがって、具体的な構造または具体的な置換基の選択は本開示の範囲に含まれる。
【００１６】
本開示による「結合ドメイン」または「結合領域」は、例えば、生物学的分子（例えば、ＣＤ８６）または１種類より多くの同じ分子もしくは異なる分子の複合体もしくは集合体もしくは凝集体（安定であれ一過性であれ）（例えば、ＣＤ８６／ＣＤ２８複合体）を特異的に認識して結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチドであり得る。かかる生物学的分子としては、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、アミノ酸、もしくはその誘導体、脂質、脂肪酸、もしくはその誘導体；糖質、糖類、もしくはその誘導体；ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド核酸、核酸分子、もしくはその誘導体；糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、リポタンパク質、プロテオリピド、もしくはその誘導体；例えば生物学的試料中に存在し得る他の生物学的分子；またはその任意の組合せが挙げられる。結合領域としては、目的の生物学的分子または他の標的に対する、天然に存在する、合成、半合成または組換え産生された任意の結合パートナーが挙げられる。特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するためのさまざまなアッセイが知られており、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ分析が挙げられる。
【００１７】
本開示の結合ドメインおよびその融合タンパク質は、例えば、約１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、特定の結合相互作用の平衡会合定数、単位は１／Ｍ）で標的分子に結合する場合、上記本開示の結合ドメインおよびその融合タンパク質は、標的に所望の度合まで結合（例えば、「特異的または選択的に結合」）し得、一方で試験試料中に存在する他の成分には有意に結合しないであろう。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１以上のＫａを有する結合ドメインをいう。あるいはまた、親和性は、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）で定義され得る（単位はＭ（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ））。本開示による結合ドメインポリペプチドおよび融合タンパク質の親和性は、慣用的な手法を用いて容易に測定され得る（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；および米国特許第５，２８３，１７３号；同第５，４６８，６１４号、またはその対応物参照）。
【００１８】
本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のようにして、または当該技術分野において知られたさまざまな方法によって作製され得る（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号；同第６，２９１，１５８号参照）。供給源としては、（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖもしくはＦａｂとして、例えばファージライブラリーにフォーマット化され得る）種々の種、例えば、ヒト、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、もしくはラマ由来；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７５：４１３）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：１１８０４）、魚類（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５４：３９）、齧歯類、鳥類、ヒツジに由来する抗体遺伝子配列、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、または代替非抗体骨格のループ領域内の操作された多様なアミノ酸をコードする配列、例えば、フィブリノゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３８８参照）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号参照）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４参照）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号参照）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ（２００５）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２：６１７９）、ｍＡｂ２もしくはＦｃａｂＴＭ（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００７／０９８９３４；ＷＯ２００６／０７２６２０参照）などが挙げられる。また、例えば、免疫原としての合成単鎖ＣＤ８６を、簡便な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウスＴＭ、ＫＭ−マウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において使用する、ハイブリドーマ開発のための従来のストラテジーも、本開示の結合ドメインの開発に使用され得る。
【００１９】
当業者によって抗体手法を示すものと理解されている用語は、本明細書において特に明示的に定義していない限り、各々、当該技術分野において得られている意味を示す。例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」は、それぞれ、抗体の軽鎖および重鎖に由来する可変結合領域をいう。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られる別個のよく定義された部分領域で構成されている。用語「ＣＬ」および「ＣＨ」は、「免疫グロブリンの定常領域」、すなわち、それぞれ、抗体の軽鎖または重鎖に由来する定常領域をいい、後者の領域は、その領域が由来する抗体アイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）に応じて、さらにＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４定常領域ドメインに分けることができると理解されている。定常領域ドメインの一部は、Ｆｃ領域（「結晶化可能断片」領域）を構成しており、該領域は、免疫グロブリンのエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）および補体結合、Ｆｃ受容体に対する結合、Ｆｃ領域欠損ポリペプチドと比べてより大きなインビボ半減期、プロテインＡ結合、ならびに場合によってはさらに胎盤移行を担うドメインを含む（Ｃａｐｏｎら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５参照）。さらに、Ｆｃ領域を含むポリペプチドでは、該ポリペプチドの二量体化または多量体化が可能になる。「ヒンジ領域」は本明細書では「リンカー」とも称し、これは、抗体の一本の鎖の可変結合領域と定常領域との間に介在し、これらを連結しているアミノ酸配列であり、抗体または抗体様分子に対してヒンジの形態で柔軟性を提供するものとして当該技術分野において知られている。
【００２０】
免疫グロブリンのドメイン構造は、抗原結合ドメインおよびエフェクター機能を付与するドメインが、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラス間で交換されることがあり得るため、操作に適している。免疫グロブリンの構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）に概説されている。組換え抗体手法のあらゆる態様に関するさらなる序論ならびに詳細な情報は、教科書Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９９）に見出すことができる。詳細な抗体操作実験プロトコルの包括的な収集は、Ｒ．ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ．Ｄｕｅｂｅｌ編，Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）に見出すことができる。また、さらなる関連プロトコルは、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡによって出版されたＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００９年８月）において入手可能である。
【００２１】
「誘導体」は、本明細書で用いる場合、親化合物と構造的に類似しており、該親化合物から（実際に、または理論的に）誘導可能な化学的または生物学的に修飾された型の化合物をいう。一般的に、「誘導体」は「類似体」と、「誘導体」の作製には親化合物が出発材料とされ得るが、「類似体」の作製には、必ずしも親化合物が出発材料として使用されなくてもよいという点で異なる。類似体は、親化合物と異なる化学的または物理的特性を有するものであってもよい。例えば、誘導体は、親化合物と比べて、より親水性であってもよく、改変された反応性（例えば、標的に対するその親和性を改変させるアミノ酸変化を有するＣＤＲ）を有するものであってもよい。
【００２２】
用語「生物学的試料」は、血液試料、生検被検物、組織外植片、器官培養物、生体液（例えば、血清、尿、ＣＳＦ）、または任意の他の組織もしくは細胞、または被験体もしくは生物学的供給源由来の他の調製物を包含する。被験体または生物学的供給源は、例えば、ヒトもしくは非ヒト動物、一次細胞培養物または適合化培養細胞株、例えば、染色体に組み込まれた、もしくはエピソーム組換え核酸配列を含むものであり得る遺伝子操作された細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、不死化もしくは不死化可能な細胞株、分化もしくは分化可能な細胞株、形質転換細胞株などであり得る。本開示のさらなる実施形態では、被験体または生物学的供給源は、疾患、障害もしくは病状、例えば、悪性の疾患、障害もしくは病状またはＢ細胞障害を有することが疑われるか、または有するリスクがある被験体または生物学的供給源であり得る。一部の特定の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、過剰増殖性、炎症性、または自己免疫性の疾患を有することが疑われるか、または有するリスクがある被験体または生物学的供給源であり得、本開示の一部の特定の他の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、かかる疾患、障害または病状のリスクまたは存在がないことがわかっている被験体または生物学的供給源であり得る。
【００２３】
（ＣＤ８６結合ドメイン）
本明細書に示すように、ＣＤ８６は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一構成員であるＩ型膜タンパク質を含む。ＣＤ８６は、抗原提示細胞によって発現され、２種類のＴ細胞タンパク質ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４のリガンドである。ＣＤ２８とＣＤ２８との結合は、Ｔ細胞の活性化に対する共刺激性シグナルであるが、ＣＤ２８とＣＴＬＡ４との結合は、Ｔ細胞の活性化を下方調節し、免疫応答を低減させる。選択的スプライシングにより、異なるアイソフォーム（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＰ＿７８７０５８．３およびＮＰ＿００８８２０．２）をコードする２種類の転写物改変体がもたらされる。
【００２４】
本開示のＣＤ８６結合ドメインは、ＣＤ２８に対するＣＤ８６の結合をブロックし、それにより、Ｔ細胞の活性化を下方調節し得るものである。想定されるＣＤ８６結合ドメインとしては、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインもしくはそのサブドメイン、ＣＤ２８細胞外ドメインもしくはサブドメイン、またはＣＤ８６特異的抗体由来結合ドメイン（ＦＵＮ１モノクローナル抗体由来のもの（例えば、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９３  Ｍａｒ；１６９（３）：３０９−１５参照）；もしくは３Ｄ１抗ＣＤ８６モノクローナル抗体由来のものなど）が挙げられる。
【００２５】
一部の実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインは、ヒトＣＴＬＡ４（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＰ＿００５２０５）の細胞外ドメイン（「エクトドメイン」）、例えば、配列番号１（シグナルペプチド：アミノ酸１〜３７）の成熟ポリペプチド配列である。シグナルペプチドなしのＣＴＬＡ４エクトドメインのアミノ酸配列は配列番号４１０に示す。本出願人らは、一部の研究ではＣＴＬＡ４エクトドメインの成熟ポリペプチドが配列番号１の３８位のメチオニンから始まることが示され、他の研究では該成熟ポリペプチドが３７位のアラニンから始まることが示されたことに言及する。さらなる実施形態において、ＣＤ８６結合ドメインは、ＣＤ８６に対して野生型よりも高いアビディティを有するように変異させたＣＴＬＡ４のエクトドメイン、または例えば米国特許出願公開ＵＳ２００３／００３５８１６に開示されているような非変異型ＣＴＬＡ４のエクトドメインである。一部の特定の実施形態では、該変異型ＣＴＬＡ４エクトドメインは、配列番号４１０の２９位のアミノ酸にアラニンもしくはチロシン、および／または１０４位にグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、イソロイシン、ロイシンもしくはトレオニンを含む。Ａ２９Ｙ  Ｌ１０４Ｅ  ＣＴＬＡ  ４エクトドメイン改変体のアミノ酸配列を、配列番号４１１に示す。一部の特定の実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４可変様ドメイン（配列番号３に示す配列など）、またはＣＴＬＡ−４可変様ドメインのＣＤＲ（配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）もしくは配列番号６（ＣＤＲ３）など）である。かかるＣＤＲは、例えば、米国特許７，４０５，２８８に記載されている。代替的実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインは、ＣＤ２８（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＰ＿００６１３０．１）の細胞外ドメイン（「エクトドメイン」）（配列番号２に示す配列など）である。配列番号２のアミノ酸１〜１８はシグナルペプチドである。シグナルペプチドなしのＣＤ２８のエクトドメインのアミノ酸配列を配列番号４１２に示す。
【００２６】
またさらなる実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインは、ＣＤ８６に特異的な単鎖免疫グロブリン様ドメイン（ｓｃＦｖなど）を含む。一部の特定の実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインは、モノクローナル抗体ＦＵＮ１または３Ｄ１由来の軽可変結合ドメインおよび重可変結合ドメインを含む。ＦＵＮ１および３Ｄ１抗ＣＤ８６モノクローナル抗体由来の重鎖、軽鎖、ｓｃＦｖ  リンカーおよびＣＤＲの配列を、それぞれ、配列番号３０５〜３１３および３１８〜３２６に示す。これらは、本開示のｘｃｅｐｔｏｒ分子に使用され得る。
【００２７】
一態様において、本開示のＣＤ８６結合ドメインまたはその融合タンパク質は、ＣＤ８６に特異的であり、解離定数（Ｋｄ）が約１０−３Ｍ〜約１０−８Ｍ未満の親和性を有する。一部の特定の好ましい実施形態において、ＣＤ８６結合ドメインまたはその融合タンパク質はＣＤ８６に、約０．３μＭの親和性で結合する。
【００２８】
実例としての一例において、本開示のＣＤ８６結合ドメインは、Ｆａｂファージ断片のライブラリーを用いて（例えば、Ｈｏｅｔら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４参照）、合成または組換えＣＤ８６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７８７０５８．３もしくはＮＰ＿００８８２０．２に示されるアミノ酸配列もしくはその断片を使用）に対する結合に関してスクリーニングすることにより同定され得る。一部の特定の実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインの作製に使用されるＣＤ８６分子は、さらに、本明細書に記載の介在ドメインまたは二量体化ドメイン（免疫グロブリンＦｃドメインまたはその断片など）を含むものであり得る。
【００２９】
一部の実施形態では、本開示のＣＤ８６結合ドメインは、本明細書に記載のＶＨおよびＶＬドメイン（例えば、ＦＵＮ１、３Ｄ１、またはそのヒト化誘導体）を含む。他の例示的なＶＨおよびＶＬドメインとしては、米国特許６，８２７，９３４に記載されたものが挙げられる。一部の特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトである。さらなる実施形態において、配列番号３０５および３０６、配列番号３１８および３１９の１つ以上の軽鎖可変領域（ＶＬ）または１つ以上の重鎖可変領域（ＶＨ）またはその両方、あるいは米国特許６，８２７，９３４（引用により本明細書に組み込まれる）に開示されたもののアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または少なくとも１００％同一である配列を有する本開示のＣＤ８６結合ドメインを提供し、ここで、各ＣＤＲは、０、１、２または３つのアミノ酸変化を有し得る（すなわち、ほとんどの変化はフレームワーク領域（１つもしくは複数）内に存在する）。
【００３０】
用語「同一の」または「同一性割合」は、２つ以上のポリペプチドまたは核酸分子配列との関連において、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって一致が最大となるように比較およびアラインメントし、当該技術分野において知られた方法（配列比較アルゴリズム、手作業によるアラインメント、または目視検査など）を用いて測定した場合、同じである２つ以上の配列または部分配列、または特定の領域にわたって同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが特定の割合（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性）である２つ以上の配列または部分配列を意味する。例えば、配列同一性および配列類似性の割合を調べるのに適した好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである（これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３に記載されている）。
【００３１】
ＶＬおよびＶＨドメインが所望され得る本明細書に記載のこれらまたは他の任意の実施形態において、ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＨドメインとＶＬドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８の１つ以上のいずれかに示すアミノ酸配列を含む（リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、リンカー１３１（配列番号１６４）、リンカー１１５（配列番号１４８）、または配列番号２４４に示すリンカーなど）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものである。
【００３２】
ＣＤＲは、当該技術分野において種々に定義されており、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、およびコンタクト（ｃｏｎｔａｃｔ）定義が挙げられる。Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づいており、ＣＤＲ領域の推定に最も一般的に使用されている定義である（Ｊｏｈｎｓｏｎら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１４）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造的ループ領域の位置に基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７）。ＡｂＭ定義は、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐによって作製された抗体構造モデリング用プログラムの一体型総合ソフトウェアである（Ｍａｒｔｉｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：９２６８；Ｒｅｅｓら，ＡＢＭＴＭ，抗体の可変領域のモデリング用のコンピュータープログラム，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．）。コンタクト定義として知られるさらなる定義が最近導入されており（ＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：７３２参照）、これは、入手可能な複合的結晶構造の分析に基づいている。
【００３３】
慣例により、重鎖のＣＤＲドメインはＨ１、Ｈ２およびＨ３と称され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かう順に連続的に番号付けされている。ＣＤＲ−Ｈ１は、約１０〜１２残基長であり、ＣｈｏｔｈｉａおよびＡｂＭの定義によれば、Ｃｙｓの４残基後ろから、またはＫａｂａｔ定義によれば５残基後ろから始まる。Ｈ１の後には、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、またはＴｒｐ−Ａｌａが存在し得る。Ｈ１の長さは、ＡｂＭ定義によれば、ほぼ１０〜１２残基であるが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義では最後の４残基を含めない。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＫａｂａｔおよびＡｂＭの定義によれば、Ｈ１の末端の１５残基後ろから始まり、ＣＤＲ−Ｈ２の前には、一般的に配列Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙが存在し（だが、いくつかのバリエーションが知られている）、後には、一般的に配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが存在する。Ｋａｂａｔ定義によれば、Ｈ２の長さは約１６〜１９残基であるが、ＡｂＭ定義では、長さは９〜１２残基であると推定されている。ＣＤＲ−Ｈ３は、通常Ｈ２の末端の３３残基後ろから始まり、その前には一般的にアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇが存在し、後にはアミノ酸Ｇｌｙが存在し、３〜約２５残基の範囲の長さを有する。
【００３４】
慣例により、軽鎖のＣＤＲ領域はＬ１、Ｌ２およびＬ３と称され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かう順に連続的に番号付けされている。ＣＤＲ−Ｌ１（ほぼ１０〜１７残基長）は、一般的に、ほぼ第２４残基から始まり、一般的にＣｙｓに続く。ＣＤＲ−Ｌ１の後の残基は常にＴｒｐであり、これは、以下の配列：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、またはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕのうちの１つを始める。ＣＤＲ−Ｌ２（約７残基長）は、Ｌ１の末端の約１６残基後ろから始まり、一般的に残基Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、またはＩｌｅ−Ｐｈｅに続く。ＣＤＲ−Ｌ３は、通常、Ｌ２の末端の３３残基後ろから始まり、一般的にＣｙｓに続き、この後には、一般的に配列Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙが存在し、約７〜１１残基の長さを有する。
【００３５】
したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＣＤ８６抗体の可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＣＤ８６に特異的であり、かつフレームワーク領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とを含み、（ａ）ＶＨドメインが重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｂ）ＶＬドメインが軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｃ）該結合ドメインが（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含むか；または該結合ドメインが（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨおよびＶＬが同じ参照配列内に見られる、ＶＨおよびＶＬドメインを含む。さらなる実施形態において、本開示の結合ドメインは、ＣＤ８６に特異的であり、かつフレームワーク領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とを含み、（ａ）ＶＨドメインが重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｂ）ＶＬドメインが軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｃ）該結合ドメインが（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含むか；または該結合ドメインが、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列が同じ参照配列に由来するものである、ＶＨおよびＶＬドメインを含む。
【００３６】
特異的ＣＤＲを含む本明細書に記載の任意の実施形態において、結合ドメインは、（ｉ）ＶＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン；または（ｉｉ）ＶＬドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン；または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインと（ｉｉ）のＶＬドメインの両方；または（ｉ）のＶＨドメインと（ｉｉ）のＶＬドメインの両方（ここで、ＶＨおよびＶＬは同じ参照配列に由来するものである）を含むものであり得、ここで、各ＣＤＲは３つまでのアミノ酸変化を有する（すなわち、該変化の多くはフレームワーク領域（１つもしくは複数）内に存在する）。
【００３７】
本開示のｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質のＣＤ８６結合ドメインは、免疫グロブリン骨格などの免疫グロブリン様ドメインであってもよい。本開示で想定される免疫グロブリン骨格としては、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、または重鎖のみの抗体が挙げられる。ｓｃＦｖにおいて、本開示では、重鎖と軽鎖の可変領域が、本明細書に記載の、または結合分子内の連接ドメインもしくは領域と適合性であることが当該技術分野において知られている任意のリンカーペプチドによって連接されていることを想定する。例示的なリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーモチーフ（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）など）を基礎としたリンカーである。本開示の融合タンパク質の結合ドメインが、非ヒト免疫グロブリンを基礎としたもの、または非ヒトＣＤＲを含むものである場合、該結合ドメインを、当該技術分野において知られた方法に従って「ヒト化」してもよい。
【００３８】
あるいはまた、本開示の融合タンパク質のＣＤ８６結合ドメインは、免疫グロブリン骨格以外の骨格であってもよい。本開示で想定される他の骨格は、機能性コンホメーションにおいてＣＤ８６特異的ＣＤＲ（１つまたは複数）を提示するものである。想定される他の骨格としては、限定されないが、Ａドメイン分子、フィブロネクチンＩＩＩドメイン、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、操作されたアンキリン反復結合分子、アドネクチン、ＫｕｎｉｔｚドメインまたはプロテインＡＺドメインアフィボディが挙げられる。
【００３９】
（ＩＬ１０）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＩＬ１０アゴニストである（すなわち、ＩＬ１０シグナル伝達を増大させ得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＩＬ１０アゴニスト結合ドメインは、ＩＬ１０もしくはＩＬ１０Ｆｃまたはその機能性サブドメインである。他の実施形態において、ＩＬ１０アゴニスト結合ドメインは、ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に特異的に結合する単鎖結合タンパク質（ｓｃＦｖなど）である。一部の実施形態では、ＩＬ１０アゴニスト結合ドメインは、配列番号７の８７位に点変異、例えば「Ｉ」から「Ａ」または「Ｓ」（本明細書において、それぞれ、Ｉ８７ＡまたはＩ８７Ｓと称する）を含むＩＬ１０である。Ｉ８７改変体ＩＬ１０分子は、野生型ＩＬ１０と比べて免疫賦活性が低いことがわかっている（Ｄｉｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：２１３，２０００）。また、ＩＬ１０は、通常、各単量体分子のアミノ末端ドメインが他方の単量体のカルボキシ末端ドメインに結合しているホモ二量体を形成している。一実施形態において、ＩＬ１０アゴニスト結合ドメインは、分子の２つのサブドメイン（アミノおよびカルボキシ末端ドメイン）を引き離す短いリンカー（ｇｇｇｓｇｇ  配列番号３７９）を有するＩＬ１０分子であり、そのため、これらのサブドメインが分子内二量体を形成し得ることも調べた。これを、本明細書においてモノＩＬ１０分子と称する。
【００４０】
ＩＬ１０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５６３．１；配列番号７）は、共通してα−ヘリックス構造を有するサイトカインスーパーファミリーの一構成員である。配列番号７のアミノ酸１〜１８は、前駆ＩＬ１０タンパク質のシグナルペプチドである。成熟ＩＬ１０タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４１８に示す。実験による証拠は存在しないが、このファミリーの構成員はすべて６つのα−ヘリックスを有することが示唆されている（Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，Ｈ．ら，（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：８９）。ＩＬ１０は４つのシステインを有し、そのうち１つだけがファミリー構成員間で保存されている。ＩＬ１０は、その二量体化に寄与するＶ形状のフォールディングを示すため、この構造に、ジスルフィド結合は不可欠ではないと思われる。ファミリー構成員のＩＬ１０とのアミノ酸同一性は、２０％（ＩＬ−１９）〜２８％（ＩＬ−２０）の範囲である（Ｄｕｍｏｕｔｅｒら，（２００２）Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．１３：５）。
【００４１】
ＩＬ１０は、最初は、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−αおよびＧＭ−ＣＳＦサイトカイン産生を阻害するマウスのＴｈ２サイトカインとして記載された（Ｍｏｏｒｅら，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：６８３；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら，（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：２０８１）。ヒトＩＬ１０は、１８アミノ酸のシグナル配列と１６０アミノ酸の成熟セグメントを有する１７８アミノ酸長のものである。その分子量は、ほぼ１８ｋＤａである（単量体）。ヒトＩＬ１０は、潜在的Ｎ連結グリコシル化部位を含まず、グリコシル化されない（Ｄｕｍｏｕｔｅｒら，（２００２）Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．１３：５；Ｖｉｅｉｒａら，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１１７２）。これは、２つの鎖間ジスルフィド結合を形成している４つのシステイン残基を含む。１つの単量体のヘリックスＡ→Ｄは、第２の単量体のヘリックスＥおよびＦと非共有的に相互作用し、非共有性のＶ形状のホモ二量体を形成する。ＩＬ１０分子において複数の機能性領域がマッピングされた。Ｎ末端では、プレヘリックスＡ残基♯１〜９が肥満細胞増殖に関与しており、一方、Ｃ末端では、ヘリックスＦ残基♯１５２〜１６０が白血球の分泌および化学走性を媒介する。
【００４２】
ＩＬ１０を発現することがわかっている細胞としては、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ミクログリア、ＣＤ１４＋（ＣＤ１６＋は違う）単球、Ｔｈ２  ＣＤ４＋細胞（マウス）、ケラチノサイト、肝星細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２  ＣＤ４＋  Ｔ細胞（ヒト）、黒色腫細胞、活性化マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞（ＣＤ５＋およびＣＤ１９＋）ならびに好酸球が挙げられる。Ｔ細胞に対して、最初に観察されたＩＦＮ−γ産生のＩＬ１０阻害は、現在、アクセサリー細胞によって媒介される間接効果であることが示唆されている。しかしながら、Ｔ細胞に対するさらなる効果としては、ＩＬ１０誘導性ＣＤ８＋  Ｔ細胞化学走性、ＩＬ−８に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞化学走性の阻害、活性化後のＩＬ−２産生の抑制、Ｂｃｌ−２上方調節によるＴ細胞アポトーシスの阻害、およびＣＤ２８共刺激に伴う低抗原曝露後のＴ細胞増殖の遮断が挙げられる（Ａｋｄｉｓら，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３：１３１）。
【００４３】
Ｂ細胞に対しては、ＩＬ１０は、関連するが相違するいくつかの機能を有する。ＴＮＦ−βおよびＣＤ４０Ｌとともに、ＩＬ１０は、ナイーブ（ＩｇＤ＋）Ｂ細胞においてＩｇＡ産生を誘導する。ＴＧＦ−β／ＣＤ４０Ｌはクラススイッチングを促進させ、一方、ＩＬ１０は、分化と増殖を開始させると考えられる。ＴＧＦ−βが存在しない場合、ＩＬ１０はＣＤ４０Ｌと、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３（ヒト）の誘導において協働し、したがって、ＩｇＧサブタイプの直接的なスイッチング因子となり得る。興味深いことに、ＩＬ１０は、ＩＬ−４誘導性ＩｇＥ分泌に対して相違する効果を有する。ＩＬ１０が、ＩＬ−４誘導性クラススイッチングの時点で存在している場合、効果を逆転させる；ＩｇＥコミットメント（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）後に存在させると、ＩｇＥ分泌を増大させる。最後に、ＩＬ１０の存在下では、ＣＤ２７／ＣＤ７０相互作用により記憶Ｂ細胞からの形質細胞の形成が促進される（Ａｇｅｍａｔｓｕら，（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１：１７３）。
【００４４】
また、肥満細胞およびＮＫ細胞は、ＩＬ１０によって影響を受ける。肥満細胞では、ＩＬ１０は、ヒスタミンの放出を誘導するが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの放出はブロックする。ラットにおいて、ＩＬ１０が肥満細胞によって放出されることがわかっているため、この効果はオートクラインであり得る。その多面的性質の証拠として、ＩＬ１０は、ＮＫ細胞に対して反対の効果を有する。ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦ産生をブロックするのではなく、ＩＬ１０は、ＮＫ細胞に対して、実は、この機能を増進させる。また、ＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増強し、ＩＬ−１８によって刺激を受けたＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ分泌を助長する。ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１８の両者と協調して、ＩＬ１０は、ＮＫ細胞細胞傷害性を増強する（Ｃａｉら，１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６５８）。
【００４５】
ＩＬ１０は、好中球に対して顕著な抗炎症性の影響を有する。これは、ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＩＬ−８の分泌を阻害し、炎症促進性メディエータＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生をブロックする。また、好中球がスーパーオキシドを生成させる能力を低下させ、その結果、ＰＭＮ媒介性抗体依存性細胞性細胞傷害性を妨害する。また、ＩＬ−８およびｆＭＬＰ誘発化学走性を、おそらくＣＸＣＲ１を介してブロックする（Ｖｉｃｉｏｓｏら，（１９９８）Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．９：２４７）。
【００４６】
樹状細胞（ＤＣ）に対しては、ＩＬ１０は、一般的に免疫抑制効果を示す。これは、ＤＣを犠牲にしてＣＤ１４＋マクロファージの分化を促進させるようである。ＩＬ１０は、ＤＣがＴ細胞（特に、Ｔｈ１型細胞）を刺激する能力を低下させるようである。これは、ＭＨＣ−ＩＩ発現と比べて、下方調節され得るか、未変化であり得るか、または上方調節され得る（Ｓｈａｒｍａら，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５０２０）。ＣＤ８０およびＣＤ８６に関して、ＩＬ１０は、その発現を上方調節するか、または下方調節するかのいずれかである。Ｂ７−２／ＣＤ８６は、Ｔ細胞の活性化に重要な役割を果たしている。この分子について、ＩＬ１０は、上方調節と下方調節の両方に関与している。しかしながら、おそらく、最も有意な調整はＣＤ４０の場合で起こる（ＩＬ１０は、その発現を低減させるようである）。局所的レベルでは、ＩＬ１０は、炎症促進性サイトカインに応答したランゲルハンス細胞の移動を阻害することにより、免疫刺激をブロックすることがあり得る。あるいはまた、ＩＬ１０は、通常ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５の下方調節とＣＣＲ７の上方調節を伴う炎症誘発ＤＣ成熟工程をブロックする。このブロックにより、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５は保持され、ＤＣは局所的結節に移動されなくなる。その結果、非可動性となったＤＣは、Ｔ細胞を刺激するのではなく、炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）ケモカインに、応答することなく結合（そして排除）する（Ｄ−Ａｍｉｃｏら，（２０００）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：３８７）。
【００４７】
単球に対しては、ＩＬ１０は、いくつかの立証された効果を有する。例えば、ＩＬ１０は、細胞表面ＭＨＣ−ＩＩの発現を明白に低減させるようである。また、これは、刺激後のＩＬ−１２産生を阻害する。これはＭ−ＣＳＦともに、単球をマクロファージ移行へと促進するが、マクロファージの表現型は不明である（すなわち、ＣＤ１６＋／細胞傷害性対ＣＤ１６−）。また、ＩＬ１０は、単球ＧＭ−ＣＳＦの分泌およびＩＬ−８産生を低減させるが、ＩＬ−１ｒａの放出は促進させる（Ｇｅｓｓｅｒら，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１４６２０）。結合組織の一成分であるヒアルロネクチンは、現在、ＩＬ１０に応答した単球によって分泌されることがわかっている。ヒアルロネクチンが細胞外空間を介して細胞移動を遮断することがわかっており、ＩＬ１０が、細胞移動（特に、腫瘍細胞転移）において、なんらかの重要性を有している可能性がある（Ｇｅｓｓｅｒら，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１４６２０）。
【００４８】
マウスまたはマカクいずれかのＦｃ領域とのＩＬ１０の融合タンパク質（ＩＬ１０Ｆｃと称する）は、マクロファージの機能を阻害し膵島異種移植片の生存を長期化すること（Ｆｅｎｇら（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１７７５；Ａｓｉｅｄｕら（２００７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４０：１８３）、ならびにマウスモデルにおいて敗血症性ショックを低減させること（Ｚｈｅｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０）が示されている。
【００４９】
ヒトＩＬ１０Ｒ１は、９０〜１１０ｋＤａの１回貫通Ｉ型膜貫通糖タンパク質であり、限定的な数の細胞型上に発現される（Ｌｉｕら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１８２１）。膵臓、骨格筋、脳、心臓および腎臓では、弱い発現が見られる。胎盤、肺および肝臓では、中間レベルが示された。単球、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球およびＴ細胞では、高レベルで発現される（Ｌｉｕら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１８２１）。発現されるタンパク質は、２１アミノ酸のシグナルペプチド、２１５アミノ酸の細胞外領域、２５アミノ酸の膜貫通セグメント、および３１７アミノ酸の細胞質ドメインを含む５７８アミノ酸のタンパク質である。細胞外領域内には２つのＦＮＩＩＩモチーフが存在し、細胞質ドメインには、ＳＴＡＴ３ドッキング部位とＪＡＫ１関連領域が存在する（Ｋｏｔｅｎｋｏら，２０００  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：２５５７；Ｋｏｔｅｎｋｏら，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５８９４）。ＩＬ１０Ｒ１はヒトＩＬ１０に、２００ｐＭのＫｄで結合する。
【００５０】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に示すアミノ酸配列を含む（配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。さらなる実施形態において、本開示のＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２の可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に特異的であり、かつフレームワーク領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とを含むＶＬおよびＶＨドメインを含む。
【００５１】
（ＨＬＡ−Ｇ）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＨＬＡ−Ｇアゴニストである（すなわち、ＨＬＡ−Ｇシグナル伝達を増大させ得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト結合ドメインは、成熟タンパク質の１４７位のシステインが代替的アミノ酸（例えば、セリン）に変異させられた、ＨＬＡ−Ｇ１（配列番号１４）、ＨＬＡ−Ｇ５（配列番号１５）またはＨＬＡ−Ｇムテインである。それぞれＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５のアミノ酸１〜２４および１〜２３は、シグナルペプチドを示す。他の実施形態において、ＨＬＡ−Ｇアゴニストドメインは、フレキシブルリンカーによってＮ末端に結合されたβ−２  ミクログロブリンを有するか、または有しないかのいずれかである、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ５のエクトドメインである。かかるリンカーの例としては、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に示すもの、および後述するものが挙げられる。可溶性ＨＬＡ−Ｇ１の調製は、米国特許出願公開ＵＳ２００４／００４４１８２に記載されている。
【００５２】
また他の実施形態において、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト結合ドメインは、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４またはＫＩＲ２ＤＬ４に特異的に結合する免疫グロブリン可変結合ドメインまたはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）である。ＩＬＴ２、ＩＬＴ４またはＫＩＲ２ＤＬ４に特異的な抗体としては、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００３／０２３２０５１に記載されたものが挙げられる。
【００５３】
ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）は、重鎖と軽鎖からなるヘテロ二量体（β−２ミクログロブリン）であり、重鎖が膜内にアンカーされている非古典的主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子である。ＨＬＡ−Ｇは、免疫調節性分子としての機能を果たし、胎児の組織を母親の免疫機構から保護する。ＨＬＡ−Ｇの構成的発現は、胎児の組織、成人の胸腺髄質、角膜、膵島および赤血球系および内皮細胞前駆細胞に限定されるが、その発現は、がん、移植、多発性硬化症、炎症性疾患およびウイルス感染症において誘導されることがあり得る。ＨＬＡ−Ｇ一次転写物により、膜結合型タンパク質アイソフォームＨＬＡ−Ｇ１、−Ｇ２、−Ｇ３および−Ｇ４、ならびに可溶性タンパク質アイソフォームＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびＨＬＡ−Ｇ７をコードする７種類の選択的ｍＲＮＡが生成され、ＨＬＡ−Ｇ５は、細胞表面結合型ＨＬＡ−Ｇ１タンパク質の可溶性形態である。
【００５４】
ＨＬＡ−Ｇは有意な免疫賦活機能を有しないようであるが、これは、阻害性受容体、すなわち、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＫＩＲ２ＤＬ４およびＣＤ８に結合し、それによりＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および抗原提示細胞と相互作用することが示されている。ＨＬＡ−Ｇの二量体形態は、ＩＬＴ２に対して、ＩＬＴ４、ＫＩＲ２ＤＬ４またはＣＤ８に対する親和性よりも数桁大きい親和性を有する。ＨＬＡ−Ｇ１は、子宮および末梢血ＮＫ細胞の細胞溶解機能、細胞傷害性Ｔリンパ球の抗原特異的細胞溶解機能、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のアロ増殖性（ａｌｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）応答、Ｔ細胞および末梢血ＮＫ細胞の増殖、ならびに樹状細胞の成熟および機能を阻害することが示されている（例えば、Ｗｉｅｎｄｌら（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１２６：１７６−１８５参照）。ＨＬＡ−Ｇは、多発性硬化症と関連しているＣＮＳの炎症応答の低減に（Ｗｉｅｎｄｌら（２００５）Ｂｌｏｏｄ，１２８：２６８９−２７０４）、および移植での移植片に対する耐容性の増進における治療用薬剤として（Ｃａｒｏｓｅｌｌａら（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１１：４８６２−４８７０）有用であり得ることが示唆されている。
【００５５】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＩＬＴ２、ＩＬＴ４またはＫＩＲ２ＤＬ４に特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８の１つ以上のいずれかに示すアミノ酸配列を含む（リンカー１１５（配列番号１４８）、配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。
【００５６】
さらなる実施形態において、本開示のＩＬＴ２、ＩＬＴ４またはＫＩＲ２ＤＬ４に特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＩＬＴ２、抗ＩＬＴ４または抗ＫＩＲ２ＤＬ４  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＩＬＴ２、抗ＩＬＴ４または抗ＫＩＲ２ＤＬ４の可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。
【００５７】
（ＨＧＦ）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＨＧＦアゴニストである（すなわち、ＨＧＦシグナル伝達を増大させ得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＨＧＦアゴニスト結合ドメインはＨＧＦまたはその機能性サブドメインである。
【００５８】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、癌原性（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）ｃ−Ｍｅｔ受容体に結合した後、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化させることにより細胞増殖、細胞運動性および形態形成を調節する。ＨＧＦは、いくつかの細胞型に影響を及ぼし、種々の生体活動、例えば、サイトカイン産生、細胞移動、増殖および生存を調節している。ＨＧＦは、単一の不活性なポリペプチドとして分泌され、セリンプロテアーゼによって切断されて６９ｋＤａのα鎖と３４ｋＤａのβ鎖になる。α鎖とβ鎖との間のジスルフィド結合によって活性なヘテロ二量体分子がもたらされる。ＨＧＦ遺伝子の選択的スプライシングによって５種類の異なるアイソフォームが生じる（アイソフォーム１〜５；それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５９２．３、ＮＰ＿００１０１０９３１．１、ＮＰ＿００１０１０９３２．１、ＮＰ＿００１０１０９３３．１およびＮＰ＿００１０１０９３４．１；配列番号１８〜２２；これらの各配列のアミノ酸１〜３１はシグナルペプチドである）。
【００５９】
ＨＧＦは、疾患進行の抑制および減弱における重要な因子と考えられている（Ｉｔｏら（２００８）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６  Ｓｕｐｐｌ
１：８２−８７）。例えば、ＨＧＦは、マウスにおいて、コラーゲン誘発関節炎の抑制に有効であること（Ｏｋｕｎｉｓｈｉら（２００７）Ｊｎｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：５５０４−５５１３）、およびアレルギー性気道炎症のマウスモデルにおいて保護的役割を果たしていることが示されている（Ｏｋｕｎｉｓｈｉら（２００５）Ｊｎｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：４７４５−４７５３；Ｉｔｏら  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３２：２６８−２８０）。
【００６０】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＨＧＦに特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８の１つ以上のいずれかに示すアミノ酸配列を含む（配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。さらなる実施形態において、本開示のＨＧＦに特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＨＧＦ  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＨＧＦの可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＨＧＦに特異的であり、かつフレームワーク領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とを含むＶＬおよびＶＨドメインを含む。
【００６１】
（ＩＬ３５）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＩＬ３５アゴニストである（すなわち、ＩＬ３５シグナル伝達を増大させ得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＩＬ３５アゴニスト結合ドメインは、ＩＬ３５（例えば、配列番号２５および２６）またはその機能性サブドメインである。一部の特定の実施形態では、ＩＬ３５アゴニスト結合ドメインは、配列番号２５および２６またはその機能性サブドメインの配列を含む単鎖ポリペプチドである。かかる単鎖ポリペプチドは、１つ以上のリンカー（例えば、本明細書に記載のリンカー）を含むものであってもよい。他の実施形態において、ＩＬ３５アゴニスト結合ドメインは、ＩＬ３５アゴニスト活性を有するＩＬ３５Ｒに特異的な単鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ｓｃＦｖなど）である。
【００６２】
ＩＬ−３５は、ＩＬ−１２サイトカインサブファミリーの新たに記載されたサイトカインである。このヘテロ二量体分子は、ＩＬ−１２  ｐ３５およびＩＬ−２７  Ｅｂｉ３サブユニットで構成されている。これは、最近、関節炎のマウスモデルにおいて、Ｔｒｅｇ機能の強力な誘導因子であり、ＴＨ１７応答を改変する能力を有することが示された（Ｎｉｅｄｂａｌａら（２００７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：３０２１；Ｃｏｌｌｉｓｏｎら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：５６６）。したがって、ＩＬ−３５のアゴニスト作用をＣＤ８６阻害と組み合わせると、ＣＤ２８阻害単独の治療有益性が増大することが推定される。
【００６３】
調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）は、自己耐容性の維持と自己免疫の抑制、慢性炎症性疾患（喘息および炎症性腸疾患など）の制限、ならびに恒常的リンパ球増殖の調節に重要なＣＤ４＋  Ｔ細胞の不可欠な亜集団である。ＩＬ３５は、抗炎症性サイトカインであり、調節Ｔ細胞の増殖およびＴｈ１７細胞発生の抑制を刺激することにより、免疫応答を抑制することが示されている（Ｃｏｌｌｉｓｏｎら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：５６６−９）。ＩＬ３５は、エプスタイン―バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３；配列番号２５；シグナルペプチド：アミノ酸１〜２０）と、ＩＬ１２のｐ３５サブユニット（配列番号２６；シグナルペプチド：アミノ酸１〜５６）（Ｄｅｖｅｒｇｎｅら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２０４１−１２０４６；米国特許５，８３０，４５１；米国特許出願公開ＵＳ２００７／０２９９０２６）で形成されたヘテロ二量体である。これは、マウスコラーゲン誘発関節炎モデルにおいて、ＥｎｂｒｅｌＴＭと同等の治療効果を有することが示されており（Ｎｉｅｄｂａｌａら（２００７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：３０２１−３０２９）、したがって、臨床関節リウマチに対する治療用薬剤として提案されている。
【００６４】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＩＬ３５Ｒに特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８の１つ以上のいずれかに示すアミノ酸配列を含む（配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。さらなる実施形態において、本開示のＩＬ３５Ｒに特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＩＬ３５Ｒ  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＩＬ３５Ｒの可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＩＬ−３５Ｒに特異的であり、かつフレームワーク領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とを含むＶＬおよびＶＨドメインを含む。
【００６５】
（ＬＩＧＨＴ）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＬＩＧＨＴアンタゴニストである（すなわち、ＬＩＧＨＴシグナル伝達を阻害し得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト結合ドメインは、ＨＶＥＭエクトドメイン（ｓＨＶＥＭとも称する；配列番号２９；シグナルペプチド：アミノ酸１〜３８）またはその機能性サブドメインである。他の実施形態において、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト結合ドメインは、ＬＩＧＨＴに特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメイン（ｓｃＦｖなど）である。一部の特定の実施形態では、ＬＩＧＨＴアンタゴニストドメインは、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ  ０８／０２７３３８に記載されたＶＨおよびＶＬドメインを含む単鎖免疫グロブリン様可変ドメインである。
【００６６】
ＬＩＧＨＴは、ＴＮＦスーパーファミリーの一構成員であり、活性化Ｔリンパ球、単球、顆粒球および未成熟樹状細胞上に発現される。ＬＩＧＨＴには、２種類の別個のアイソフォームが報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３７９８．２およびＮＰ＿７４２０１１．１）。ＬＩＧＨＴは、ヘルペスウイルスエントリーメディエータ（ＨＶＥＭ）とリンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）を介したシグナル伝達によってＴ細胞免疫応答を調節することが示されている。ＨＶＥＭおよびＬＴβＲは、どちらもＬＩＧＨＴに高い親和性で結合し、ＨＶＥＭの発現は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞および内皮細胞において検出され、ＬＴβＲは、単球および間質細胞において発現されるが、Ｔ細胞およびＢ細胞では発現されない。ＬＩＧＨＴは、ＣＤ２８非依存性Ｔ細胞の活性化に対する共刺激性分子であり、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦ産生を優先的に誘導することが示されている。ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質または抗ＬＩＧＨＴ抗体のインビボ投与によるＬＩＧＨＴのブロックにより、マウスモデルにおいて、Ｔ細胞媒介性免疫応答の低減がもたらされ、対宿主性移植片病が改善される（Ｔａｍａｄａら（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２８３−９）。ＬＩＧＨＴの構成的発現により、組織破壊および自己免疫様疾患症候群がもたらされる（Ｇｒａｎｇｅｒ  ＆  Ｒｉｃｋｅｒｔ（２００３）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１４：２８９−９６）。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＬＩＧＨＴに特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８の１つ以上のいずれかに示すアミノ酸配列を含む（配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。
【００６８】
さらなる実施形態において、本開示のＬＩＧＨＴに特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＬＩＧＨＴ  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＬＩＧＨＴの可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＬＩＧＨＴに特異的であり、かつフレームワーク領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とを含むＶＬおよびＶＨドメインを含む。
【００６９】
（ＰＤ−１）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＰＤ−１アゴニストである（すなわち、ＰＤ−１シグナル伝達を増大させ得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＰＤ−１アゴニスト結合ドメインは、ＰＤ１−Ｌ１（例えば、配列番号３２；シグナルペプチド：アミノ酸１〜１８）、ＰＤ１−Ｌ２（例えば、配列番号３３；シグナルペプチド：アミノ酸１〜１９）またはその機能性サブドメインである。他の実施形態において、ＰＤ−１アゴニスト結合ドメインは、ＰＤ−１に特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメイン（ｓｃＦｖなど）である。ＰＤ−１に特異的な抗体としては、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００６／０２１０５６７に記載されたものが挙げられる。
【００７０】
ＰＤ−１（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＰ＿００５００９．１）は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーの一構成員であり、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄系細胞上に発現される。ＰＤ−１は、免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフを含む。ＰＤ−１は、プログラム死−１リガンド１（ＰＤ１−Ｌ１；ＣＤ２７４としても知られる）およびプログラム死−１リガンド２（ＰＤ１−Ｌ２）に結合することにより機能を発揮する。ヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、未成熟および成熟両方の樹状細胞、ＩＦＮγ処理単球および濾胞性樹状細胞上に発現される。ＰＤ−１欠損マウスはさまざまな自己免疫病態を示し、これは、ＰＤ−１が免疫応答の負の調節因子であることを示す（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ＆
Ｈｏｎｊｏ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６５；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：１４１）。ＰＤ−１をＰＤ１−Ｌ１およびＰＤ１−Ｌ２に結合させると、Ｔ細胞の活性化の下方調節がもたらされることが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７；Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６１；Ｃａｒｔｅｒら（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６３４）。
【００７１】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＰＤ−１に特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に示すアミノ酸配列を含む（配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。
【００７２】
さらなる実施形態において、本開示のＰＤ−１に特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＰＤ−１の可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。
【００７３】
（ＢＴＬＡ）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＢＴＬＡアゴニストである（すなわち、ＢＴＬＡシグナル伝達を増大させ得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＢＴＬＡアゴニスト結合ドメインは、ＨＶＥＭエクトドメイン（ｓＨＶＥＭとも称する；配列番号２９；シグナルペプチド：アミノ酸１〜３８）またはその機能性サブドメイン（例えば、配列番号２９のアミノ酸５４〜７８）である。他の実施形態において、ＢＴＬＡアゴニスト結合ドメインは、ＢＴＬＡに特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメイン（ｓｃＦｖなど）である。ＢＴＬＡに特異的なアゴニスト抗体は、例えば、Ｋｒｉｅｇら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：６４２０−６４７２に記載されている。
【００７４】
ＢＴＬＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０７８８２６．１およびＮＰ＿８６１４４５．３；それぞれ、アイソフォーム２および１）は、免疫グロブリンファミリーの一構成員である細胞表面タンパク質であり、Ｂ細胞、Ｔ細胞および抗原提示細胞上に発現される。ＢＴＬＡのリガンドはヘルペスウイルスエントリーメディエータ（ＨＶＥＭ）であり、これは、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの一構成員であり、また、ＬＩＧＨＴのリガンドとしての機能も果たす（Ｓｅｄｙら（２００５）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：９０−９８）。ＢＴＬＡに対する結合部位はＨＶＥＭのＣＲＤ１内に同定されている（配列番号２９のアミノ酸５４〜７８；ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００６／０６３０６７）。この部位は、ＬＩＧＨＴによって占有されるものとは相違するが、ＨＶＥＭのｇＤ結合部位と重複している。ＨＶＥＭがＬＩＧＨＴに結合すると、強力な免疫応答が誘導されるが、ＨＶＥＭがＢＴＬＡに結合すると、Ｔ細胞応答の負の調節がもたらされる（Ｍｕｒｐｈｙら（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６７１−６８１）。ＢＴＬＡがＨＶＥＭに結合すると、ＢＴＬＡのチロシンリン酸化が活性化され、それにより、タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２との会合が誘導されることが示されている（Ｇａｖｒｉｅｌｉら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１２：１２３６）が、一部のデータにより、ＳＨＰリクルートがＢＴＬＡの負の調節活性の一因となっているのかどうかは疑問視されている（Ｃｈｅｍｎｉｔｚら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：６６０３−６６１４）。
【００７５】
可溶性ＨＶＥＭは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘発増殖を阻害することが示されており、この効果は抗ＢＴＬＡ抗体によって逆転される（Ｇｏｎｚａｌｅｚら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１１６−１１２１）。同様に、アゴニスト抗ＢＴＬＡモノクローナル抗体も、抗ＣＤ３媒介性ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を阻害することが示された（Ｋｒｉｅｇら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：６４２０−６４７２）。インタクトなＢＴＬＡ遺伝子のないマウスは、実験的自己免疫脳脊髄炎に対する感受性の増大（Ｗａｔａｎａｂｅら（２００３）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：６７０−６７９）および気道炎症の長期化（Ｄｅｐｐｏｎｇら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：３９０９−３９１３）を示す。
【００７６】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＢＴＬＡに特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に示すアミノ酸配列を含む（配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。
【００７７】
さらなる実施形態において、本開示のＢＴＬＡに特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＢＴＬＡ  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＢＴＬＡの可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。
【００７８】
（ＧＩＴＲＬ）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＧＩＴＲＬアンタゴニストである（すなわち、ＧＩＴＲＬシグナル伝達を阻害し得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＧＩＴＲＬアンタゴニスト結合ドメインは、ＧＩＴＲエクトドメイン（ｓＧＩＴＲとも称する；配列番号３９および４０；シグナルペプチド：これらの各配列のアミノ酸１〜２５）またはその機能性サブドメインである。他の実施形態において、ＧＩＴＲＬアンタゴニスト結合ドメインは、ＧＩＴＲＬに特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメイン（ｓｃＦｖなど）である。ＧＩＴＲＬに対するアンタゴニスト抗体は、例えば、米国特許出願公開２００５／００１４２２４号に記載されている。
【００７９】
グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ；ＡＩＴＲとしても知られる）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一構成員である（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉら（２００７）Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１１６５−６９）。ＧＩＴＲは、Ｔ細胞増殖およびＴＣＲ媒介性アポトーシスの調節において重要な役割を果たしている。ＧＩＴＲ発現はＴ細胞上で上方調節され、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞上では、高レベルのＧＩＴＲが構成的に発現されており（Ｋｗｏｎら（２００３）Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３５：８−１６）、また、マクロファージ、Ｂ細胞およびＮＫ細胞上でも発現が起こる（Ｌｉｕら（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：８２０２−８２１０）。ＧＩＴＲの同族リガンドであるＧＩＴＲＬは、樹状細胞およびＢ細胞などの抗原提示細胞上で構成的に発現されている。ＧＩＴＲがＧＩＴＲＬに結合すると、ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の阻害効果に対して抵抗性になることが示されている。ＧＩＴＲＬまたはアゴニスト抗体いずれかによるＧＩＴＲ活性化により、ＴＣＲ誘発Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生が増大すること、ならびにＴ細胞が抗ＣＤ３誘発アポトーシスから救済されることが示されている（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６２１６−６２２１）。また、ＧＩＴＲがＧＩＴＲＬに結合すると、Ｔ調節細胞が阻害され得、および／またはエフェクターＴ細胞が、Ｔ調節細胞媒介性抑制に対してより抵抗性となり得る（Ｋａｎａｍａｒｕら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：７３０６−７３１４）。
【００８０】
研究により、実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導期間中に抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂを投与すると、臨床疾患の重症度が有意に高まるとともに、ＣＮＳ炎症および自己反応性Ｔ細胞応答が増大することが示されている（Ｋｏｈｍら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：４６８６−４６９０）。また、ＧＩＴＲシグナル伝達の活性化により、マウスの喘息およびコラーゲン誘発関節炎がともに悪化する（Ｐａｔｅｌら（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：３５８１−９０）。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＧＩＴＲＬに特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に示すアミノ酸配列を含む（配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。
【００８２】
さらなる実施形態において、本開示のＧＩＴＲＬに特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＧＩＴＲＬ  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＧＩＴＲＬの可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＧＩＴＲＬに特異的であり、かつフレームワーク領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とを含むＶＬおよびＶＨドメインを含む。
【００８３】
（ＣＤ４０）
上記のように、一部の特定の実施形態では、本開示により、ＣＤ４０アンタゴニストである（すなわち、ＣＤ４０シグナル伝達を阻害し得る）結合領域またはドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＣＤ４０アンタゴニスト結合ドメインは、ＣＤ４０に特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメイン（ｓｃＦｖなど）である。ＣＤ４０に対するアンタゴニスト抗体は、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００８／００５７０７０、ならびに米国特許５，８７４，０８２号および同６，８３８，２６１号に記載されている。
【００８４】
ＣＤ４０は、正常および新生物性Ｂ細胞、樹状細胞、抗原提示細胞、内皮細胞、単球性細胞ならびに上皮細胞の表面上に見られる５５ｋＤの細胞表面抗原である。抗原提示細胞上でのＣＤ４０発現は、Ｔヘルパーおよび細胞傷害性Ｔリンパ球の作用において、重要な共刺激性の役割を果たしている。ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４としても知られる）の発現は、正常な免疫応答中にＴ細胞上で上方調節される。Ｔ細胞発現ＣＤ４０ＬがＢ細胞発現ＣＤ４０に結合することにより、Ｂ細胞の増殖と分化、抗体産生、同位体スイッチ（ｉｓｏｔｏｐｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）、およびＢ細胞記憶の発生がもたらされる。ヒト抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体は、ヒト慢性リンパ性白血病細胞に対して抗白血病活性を有することが示されている（Ｌｕｑｍａｎら（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１２：７１１−７２０）。
【００８５】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００８／００５７０７０に記載されているような、ＣＤ４０に特異的なＶＬおよびＶＨドメインを含む。一部の特定の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインはヒトである。ＶＬおよびＶＨドメインはいずれの向きに配置されてもよく、約３０個までのアミノ酸のリンカー（本明細書において開示）、または該２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性であるスペーサー機能をもたらすことができる任意の他のアミノ酸配列によって引き離されていてもよい。一部の特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインを連接するリンカーは、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に示すアミノ酸配列を含む（配列番号２４４に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）など）。多重特異性結合ドメインは、少なくとも２つの特異的サブ結合ドメイン（ラクダ科抗体の構成に類似）、または少なくとも４つの特異的サブ結合ドメイン（ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のペアのより慣用的な哺乳動物抗体の構成に類似）を有するものであり得る。
【００８６】
さらなる実施形態において、本開示のＣＤ４０に特異的な結合ドメインは、１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むもの、または複数コピーの１つ以上のかかるＣＤＲを含むものであり得、該ＣＤＲは、抗ＣＤ４０  ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から取得、誘導または設計したものである。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＣＤ４０の可変領域の単一のＣＤＲを含むものであってもよく、同じであっても異なっていてもよい複数のＣＤＲを含むものであってもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００８／００５７０７０に記載されているような、ＣＤ４０に特異的であり、かつフレームワーク領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とを含むＶＬおよびＶＨドメインを含む。
【００８７】
（多重特異性融合タンパク質）
本開示により、ＣＤ８６に結合するドメイン（「ＣＤ８６結合ドメイン」）と、ＣＤ８６以外の分子に結合するドメイン（「異種結合ドメイン」）とを含む多重特異性融合タンパク質を提供する。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである。
【００８８】
一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＩＬ１０アゴニスト、例えば、ＩＬ１０、ＩＬ１０Ｆｃ、またはＩＬ１０Ｒ１もしくはＩＬ１０Ｒ２に特異的に結合する単鎖結合ドメインである。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇムテイン、もしくはその機能性領域（エクトドメインなど）、またはＩＬＴ２、ＩＬＴ４もしくはＫＩＲ２ＤＬ４に特異的に結合する単鎖結合ドメインである。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＨＧＦアゴニスト、例えばＨＧＦまたはそのサブドメインである。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＩＬ３５アゴニスト、例えばＩＬ３５もしくはそのサブドメイン、単鎖ＩＬ３５もしくはそのサブドメイン、またはＩＬ３５Ｒに特異的であり、ＩＬ３５アゴニスト活性を有する単鎖免疫グロブリン様可変ドメインである。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、例えば、ＨＶＥＭエクトドメインもしくはそのサブドメイン、またはＬＩＧＨＴに特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメインである。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＰＤ−１アゴニスト、例えば、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２もしくはそのサブドメイン、またはＰＤ−１に特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメインである。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＢＴＬＡアゴニスト、例えば、ＨＶＥＭエクトドメインもしくはそのサブドメイン、またはＢＴＬＡに特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメインである。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＧＩＴＲＬアンタゴニスト、例えば、ＧＩＴＲエクトドメインもしくはそのサブドメイン、またはＧＩＴＲＬに特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメインである。一部の特定の実施形態では、異種結合ドメインは、ＣＤ４０アンタゴニスト、例えば、ＣＤ４０に特異的な単鎖免疫グロブリン様可変ドメインである。
【００８９】
一般的に、本発明の融合タンパク質は、リーダーペプチド（シグナルペプチド）を含まない成熟タンパク質を利用したものである。したがって、本明細書において提供する結合ドメインタンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５ならびに本明細書に記載の他のもの）についての一部の配列はリーダーペプチドを含むが、当業者には、シグナルペプチドを含む配列から成熟タンパク質配列をどのようにして判定するかが容易に理解される。一部の特定の実施形態では、リーダー配列を含むことが有用であり得る。
【００９０】
ＣＤ８６結合ドメインが、融合タンパク質のアミノ末端に存在し得、異種結合ドメインがカルボキシ末端に存在し得ることが想定される。一部の特定の実施形態では、ｘｃｅｐｔｏｒ分子は、配列番号９、１３、１７、２４、２８、３１、３５、４２、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８７、１８９、１９１、１９３、２１９、２２１、２２３、２３７、２６２、３０２、３３０、３３６、３３８、３４０、または４００に示すものである。また、異種結合ドメインがアミノ末端に存在し得、ＣＤ８６結合ドメインがカルボキシ末端に存在し得ることも想定される。一部の特定の実施形態では、ｘｃｅｐｔｏｒ分子は、配列番号１８３、１８５、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２１１、２１３、２５４、２５８、２６６、２７６、３５０、３５２、または３５４に示すものである。本明細書に示すように、本開示の結合ドメインは、介在ドメイン（例えば、該免疫グロブリンの定常領域またはその部分領域）の各末端に融合され得る。さらに、該２つ以上の結合ドメインを各々、本明細書に記載のリンカーによって介在ドメインに連接させてもよい。
【００９１】
本明細書で用いる場合、「介在ドメイン」は、該融合タンパク質が、組成物中で、主として（例えば、融合タンパク質集団の５０％以上）または実質的に（例えば、融合タンパク質集団の９０％以上）単鎖ポリペプチドとして存在するように、単純に、１つ以上の結合ドメインに対する骨格としての機能を果たすアミノ酸配列をいう。例えば、一部の特定の介在ドメインは、構造的機能（例えば、空間形成（ｓｐａｃｉｎｇ）、柔軟性、剛性）または生物学的機能（例えば、血漿中（例えば、ヒト血液中）での半減期の増大）を有するものであり得る。血漿中での本開示の融合タンパク質の半減期を増大させ得る例示的な介在ドメインとしては、アルブミン、トランスフェリン、血清タンパク質に結合する骨格ドメインなど、またはその断片が挙げられる。
【００９２】
一部の特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質に含まれる介在ドメインは、「二量体化ドメイン」であり、これは、非共有性もしくは共有性相互作用、例えば、水素結合、静電的相互作用、ファン・デル・ワールス力、ジスルフィド結合、疎水性相互作用など、またはその任意の組合せによる、少なくとも２つの単鎖ポリペプチドまたはタンパク質の会合を促進させ得るアミノ酸配列をいう。例示的な二量体化ドメインとしては、免疫グロブリン重鎖定常領域または部分領域が挙げられる。二量体化ドメインは、二量体またはそれより高次の多量体複合体（例えば、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体など）の形成を促進させ得るものであることを理解されたい。
【００９３】
「定常部分領域」は、本明細書において、供給源抗体の１つ以上の定常領域ドメインの一部または全部に対応または由来するが、全定常領域ドメインではないペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列を示すものと定義する用語である。好ましい一実施形態において、定常部分領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ＣＨ３、好ましくはＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３である。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）ならびに補体活性化および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のエフェクター機能がないか、または最小限であるが、一部のＦＣ受容体に結合する（ＦＣＲｎなどに結合する）力を保持し、および比較的長いインビボ半減期を保持しているものであり得る。一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインをヒトＩｇＧ１定常領域または部分領域に融合させ、該ＩｇＧ１定常領域または部分領域は、変異させた以下のアミノ酸：２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリシン（Ｋ３２０）、３２２位のリシン（Ｋ３２２）またはその任意の組合せ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）の１つ以上を有する。例えば、これらのアミノ酸の任意の１つ以上はアラニンに変更され得る。さらなる一実施形態において、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、アラニンに変異させられたＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２（ＥＵに従う番号付け）の各々（すなわち、それぞれ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ）、さらにその上任意選択でＮ２９７Ａ変異（すなわち、本質的にＣＨ２ドメインのグリコシル化の消失）も有する。
【００９４】
Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＦｃεＲ１、ＦｃＲｎ）または補体成分Ｃ１ｑ（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｐｒｅｓｔａ（２００２）Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３：２３７参照）とのＦｃ相互作用が改変され得る変異をＦｃドメインの内部または外部に作出するための方法は、当該技術分野において知られている。本開示の具体的な実施形態としては、ＦｃＲｎおよびプロテインＡに対する結合が保存されており、Ｆｃドメインが他のＦｃ受容体またはＣ１ｑと、もはや相互作用しないか、または相互作用が最小限である、ヒトＩｇＧ由来の定常領域または部分領域を有する免疫グロブリンまたは融合タンパク質を含む組成物が挙げられる。例えば、本開示の結合ドメインは、２９７位のアスパラギン（Ｋａｂａｔ番号付けでＮ２９７）を別のアミノ酸に変異させてこの部位のグリコシル化を低減または解消させ、したがって、ＦｃγＲおよびＣ１ｑに対する効率的なＦｃ結合が消去されるようにしたヒトＩｇＧ１定常領域または部分領域に融合させたものであり得る。別の例示的な変異はＰ３３１Ｓであり、これにより、Ｃ１ｑ結合が減弱されるがＦｃ結合は影響されない。
【００９５】
さらなる実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン参照配列と比べて改変されたグリコシル化パターンを有するものであり得る。例えば、グリコシル化部位を形成している具体的なアミノ酸残基の１つ以上（ＣＨ２ドメインのＮ２９７など（ＥＵ番号付け））を改変するために、任意のさまざまな遺伝的手法が使用され得る（Ｃｏら（１９９３）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０：１３６１；Ｊａｃｑｕｅｍｏｎら（２００６）Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ４：１０４７；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５：７９３４；Ｗａｒｎｏｃｋら（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９２：８３１参照）。あるいはまた、本開示の融合タンパク質を産生する宿主細胞を、改変されたグリコシル化パターンをもたらすように操作してもよい。当該技術分野において知られた方法の一例は、例えば、ＡＤＣＣを増大させるバイセクト型非フコシル化改変体の形態のグリコシル化の改変をもたらすものである。該改変体は、オリゴ糖修飾酵素を含む宿主細胞における発現により得られる。あるいはまた、ＢｉｏＷａ／Ｋｙｏｗａ  ＨａｋｋｏのＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ手法により、本開示によるグリコシル化された分子のフコース含量が低減されることが想定される。既知の方法の一例において、ＧＤＰ−フコースの産生によって免疫グロブリンＦｃ領域のグリコシル化パターンを修飾する組換え免疫グロブリン産生のためのＣＨＯ宿主細胞が得られる。
【００９６】
あるいはまた、化学的手法を用いて、本開示の融合タンパク質のグリコシル化パターンを改変する。例えば、さまざまなグリコシダーゼおよび／またはマンノシダーゼインヒビターにより、ＡＤＣＣ活性の増大、Ｆｃ受容体結合の増大、およびグリコシル化パターンの改変の所望の効果の１つ以上がもたらされる。一部の特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質（ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストに連結されたＣＤ８６アンタゴニストドメインを含む）を発現する細胞を、前記宿主細胞によって産生される免疫糖タンパク質分子のＡＤＣＣを増大させる濃度の糖鎖修飾剤を含む培養培地中で培養し、ここで、前記糖鎖修飾剤は８００μＭ未満の濃度である。好ましい一実施形態では、このような多重特異性融合タンパク質を発現する細胞を、１００〜８００μＭ（１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、または８００μＭなど）の濃度のカスタノスペルミンまたはキフネンシン、より好ましくはカスタノスペルミンを含む培養培地中で培養する。カスタノスペルミンなどの糖鎖修飾剤でグリコシル化を改変するための方法は、米国特許出願公開第２００９／００４１７５６号またはＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／０５２０３０に示されている。
【００９７】
別の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、エフェクター細胞Ｆｃ受容体に対する結合に影響を及ぼすアミノ酸修飾を有するものであり得る。このような修飾は、当該技術分野において知られた任意の手法（Ｐｒｅｓｔａら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３０：４８７に開示されたアプローチなど）を用いて行なわれ得る。別のアプローチでは、細胞死エフェクター機能を向上させるためにＦｃドメインに対応する定常部分領域を操作するのに、Ｘｅｎｃｏｒ  ＸｍＡｂＴＭ手法が利用可能である（Ｌａｚａｒら（２００６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０３：４００５参照）。このアプローチを使用することで、例えば、ＦＣγＲに対する特異性および結合性が改善され、それにより、細胞死エフェクター機能が向上した定常部分領域を作製することができる。
【００９８】
なおさらなる実施形態において、定常領域または部分領域は、任意選択で、かかる介在ドメインがない対応する融合タンパク質と比べて、血漿半減期または胎盤移送が増大し得るものである。一部の特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の延長された血漿半減期は、ヒトにおいて、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４０時間、少なくとも４８時間、少なくとも数日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも数週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも数ヶ月、またはそれ以上である。
【００９９】
定常部分領域は、以下のドメイン：ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥまたはＩｇＭ）のいずれかの一部または全部を含むものであり得る。したがって、本明細書において定義する定常部分領域は、免疫グロブリンの定常領域の一部分に対応するポリペプチドをいう場合があり得る。該定常部分領域は、同じか、または異なる免疫グロブリン、抗体アイソタイプまたは対立遺伝子改変体に由来するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むものであり得る。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは切断型であり、米国特許出願第１２／０４１，５９０号（これは、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７１０５２のＣＩＰである）に配列番号３６６〜３７１として記載されたカルボキシ末端配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示のポリペプチドの定常部分領域は、任意選択でアミノ末端リンカー、カルボキシ末端リンカー、または両端にリンカーを有するものであり得るＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。
【０１００】
「リンカー」は、他のペプチドまたはポリペプチドを連接または連結するペプチドであり、例えば、リンカーは約２〜約１５０アミノ酸である。本開示の融合タンパク質において、リンカーは、介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン由来定常部分領域）を結合ドメインに連接するものであり得、またはリンカーは、結合ドメインの２つの可変領域、あるいはヘテロ二量体分子から形成された単鎖ポリペプチド内の２つの領域（ＥＢＩ３（配列番号２５）と、ＩＬ３５のＩＬ１２（配列番号２６）のｐ３５サブユニットなど）を連接するものであり得る。例えば、リンカーは、抗体ヒンジ領域配列、結合ドメインを受容体に連結させる配列、または結合ドメインを細胞表面膜貫通領域もしくは膜アンカーに連結させる配列から取得、誘導または設計されたアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、生理学的条件下または他の標準的なペプチド条件（例えば、ペプチド精製条件、ペプチド貯蔵条件）下で、少なくとも１つのジスルフィド結合に参与し得る少なくとも１つのシステインを有するものであり得る。一部の特定の実施形態では、免疫グロブリンヒンジペプチドに対応または類似したリンカーは、該ヒンジのアミノ末端側に配置されたヒンジシステインに対応するシステインを保持している。さらなる実施形態において、リンカーは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２Ａヒンジ由来のものであり、ヒンジシステインに対応する１つのシステインまたは２つのシステインを有する。一部の特定の実施形態では、１つ以上のジスルフィド結合は、介在ドメイン間の鎖間ジスルフィド結合として形成されている。他の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、結合ドメインに直接融合された介在ドメインを有する（すなわち、リンカーまたはヒンジがない）ものであり得る。一部の実施形態では、介在ドメインは、ＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３  Ｆｃ部分などの二量体化ドメインである。
【０１０１】
本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインまたは二量体化ドメインは、１つ以上の末端結合ドメインに、ペプチドリンカーによって接続されていてもよい。空間形成機能がもたらされることに加え、リンカーにより、融合タンパク質の１つ以上の結合ドメインが適正な向きになるのに適した柔軟性または剛性がもたらされ得る（該融合タンパク質内および該融合タンパク質とその標的（１つもしくは複数）との間）。さらに、リンカーは、完全長の融合タンパク質の発現、ならびにインビトロおよびインビボ（該精製タンパク質を必要とする被験体（ヒトなど）に投与後）の両方での該タンパク質の安定性を補助するものであり得、好ましくは、該被験体において非免疫原性であるか、または免疫原性が乏しいものである。一部の特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインまたは二量体化ドメインのリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジの一部または全部を含むものであり得る。
【０１０２】
また、結合ドメインはＶＨドメインとＶＬドメインを含むものであり得、これらの可変領域ドメインがリンカーによって結合されていてもよい。例示的な可変領域結合ドメインリンカーとしては、（ＧｌｙｎＳｅｒ）ファミリー、例えば、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどに属するものが挙げられ、式中、ｎは１〜５の整数である（例えば、それぞれ、配列番号６４、７１、８８、１３１、１３２、１４９、１６３および１６４に対応するリンカー２２、２９、４６、８９、９０、１１６、１３０および１３１を参照のこと）。好ましい実施形態では、このような（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）系リンカーは、介在ドメイン（例えば、ＩｇＧ  ＣＨ２ＣＨ３）に、可変ドメインを連結させるために使用されるが、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を連結させるためには使用されない。
【０１０３】
介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン由来定常部分領域）を結合ドメインに連接させるために使用され得る例示的なリンカーまたは結合ドメインの２つの可変領域を連接させ得るリンカーを、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に挙げる。
【０１０４】
本開示において想定されるリンカーとしては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー構成員の任意のドメイン間領域（例えば、抗体ヒンジ領域）またはＩＩ型膜タンパク質ファミリーであるＣ型レクチンのストーク領域に由来するペプチドが挙げられる。このようなリンカーは、長さが、約２〜約１５０アミノ酸、または約２〜約４０アミノ酸、または約８〜約２０アミノ酸、好ましくは約１０〜約６０アミノ酸、より好ましくは約１０〜約３０アミノ酸、最も好ましくは約１５〜約２５アミノ酸の範囲である。例えば、リンカー１は２アミノ酸長であり、リンカー１１６は３６アミノ酸長である（リンカー１〜１３３を、それぞれ配列番号４３〜１６６に示す；さらなる例示的なリンカーを配列番号２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９、および３８３〜３９８に示す）。
【０１０５】
一般的な長さの考慮事項以外に、本開示の融合タンパク質における使用に適したリンカーとしては、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＡヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＩｇＥヒンジ、またはその改変体から選択される抗体ヒンジ領域が挙げられる。一部の特定の実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、またはその断片もしくは改変体から選択される抗体ヒンジ領域（上側およびコア領域）であり得る。本明細書で用いる場合、「免疫グロブリンヒンジ領域」であるリンカーは、ＣＨ１のカルボキシル末端と、ＣＨ２のアミノ末端（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの場合）またはＣＨ３のアミノ末端（ＩｇＥおよびＩｇＭの場合）との間にみられるアミノ酸をいう。「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、本明細書で用いる場合、抗体の重鎖にみられる、ＣＨ１とＣＨ２領域間（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの場合）に介在し、これらを接続しているか、またはＣＨ２とＣＨ３領域間（ＩｇＥおよびＩｇＭの場合）に介在し、これらを接続している天然に存在するアミノ酸配列をいう。好ましい実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒトである。
【０１０６】
結晶学的研究によれば、ＩｇＧヒンジドメインは、機能的および構造的に、３つの領域：上側ヒンジ領域、コアまたは中央ヒンジ領域、および下側ヒンジ領域に細分され得る（Ｓｈｉｎら（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：８７）。例示的な上側ヒンジ領域としては、ＩｇＧ１に見られるＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号３８３）、ＩｇＧ２に見られるＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号３８４）、ＩｇＧ３に見られるＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号３８５）またはＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号３８６）、およびＩｇＧ４に見られるＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号３８７）が挙げられる。例示的な中央ヒンジ領域としては、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２に見られるＣＰＰＣＰ（配列番号３９８）、ＩｇＧ３に見られるＣＰＲＣＰ（配列番号３８８）、ならびにＩｇＧ４に見られるＣＰＳＣＰ（配列番号３８９）が挙げられる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４抗体は、各々、単一の上側ヒンジと中央ヒンジを有するようであるが、ＩｇＧ３は、タンデムに４つ−１つのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号３９０）と３つのＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号３９１）を有する。
【０１０７】
ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体にはＩｇＧ様コア領域がないようであり、ＩｇＤは、２つの上側ヒンジ領域をタンデムに有するようである（配列番号３９２および３９３参照）。ＩｇＡ１およびＩｇＡ２抗体に見られる例示的な野生型上側ヒンジ領域を、それぞれ配列番号３９４および３９５に示す。
【０１０８】
ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、対照的に、典型的なヒンジ領域の代わりに、ヒンジ様特性を有するＣＨ２領域を有する。ＩｇＥおよびＩｇＭの例示的な野生型ＣＨ２上側ヒンジ様配列を、それぞれ、配列番号３９６
【０１０９】
【化１】
2014239700.tif 000003
に示す。
【０１１０】
「改変された野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「改変された免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）３０％までのアミノ酸変化（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％もしくは５％までのアミノ酸置換もしくは欠失）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域、（ｂ）少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４もしくは１５アミノ酸長）であり、３０％までのアミノ酸変化（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％もしくは５％までのアミノ酸置換もしくは欠失）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分、または（ｃ）コアヒンジ領域（該部分は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５アミノ酸長であり得る）を含む野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分をいう。一部の特定の実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域内の１つ以上のシステイン残基が、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）で置換されていてもよい。あるいはまたさらに、改変された免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基が別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）で置換されたものであってもよい。
【０１１１】
接続領域として使用され得る代替的なヒンジ配列およびリンカー配列は、ＩｇＶ様ドメイン同士またはＩｇＣ様ドメイン同士を接続している細胞表面受容体の一部分から作出され得るものである。ＩｇＶ様ドメイン間の領域（ここで、細胞表面受容体が複数のＩｇＶ様ドメインをタンデムに含む）、およびＩｇＣ様ドメイン間の領域（ここで、細胞表面受容体が複数のタンデムＩｇＣ様領域を含む）もまた、接続領域またはリンカーペプチドとして使用され得る。一部の特定の実施形態では、ヒンジ配列およびリンカー配列は５〜６０アミノ酸長であり、主として柔軟性であり得るが、より剛性な特性をもたらすものであってもよく、主にα−ヘリックス構造を含み、β−シート構造は最小限であるものであってもよい。好ましくは、配列は、血漿中および血清中で安定であり、タンパク質分解性切断に対して抵抗性である。一部の実施形態では、配列は、分子のＣ末端を安定化させるための１つのジスルフィド結合または複数のジスルフィド結合の形成能を付与する、天然に存在するか、または付加されたモチーフ（ＣＰＰＣ（配列番号４２２）など）を含むものであり得る。他の実施形態において、配列は１つ以上のグリコシル化部位を含むものであり得る。ヒンジ配列およびリンカー配列の例としては、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６、およびＣＤ２４４のＩｇＶ様ドメインとＩｇＣ様ドメインとの間、またはＩｇＣ様ドメイン同士もしくはＩｇＶ様ドメイン同士のドメイン間領域が挙げられる。また、代替的なヒンジは、非免疫グロブリンスーパーファミリー構成員由来のＩＩ型受容体（ＣＤ６９、ＣＤ７２、およびＣＤ１６１など）のジスルフィド含有領域から作出され得るものである。
【０１１２】
一部の特定の実施形態では、本発明のリンカーはスコーピオンリンカーを含むものである。スコーピオンリンカーとしては、免疫グロブリンスーパーファミリー構成員のドメイン間領域に由来するペプチド、例えば、免疫グロブリンヒンジ領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＥなどのヒンジ領域）に由来するヒンジ様ペプチドが挙げられる。一部の特定の実施形態では、ヒンジ様スコーピオンリンカーは、生理学的条件下で鎖間ジスルフィド結合を形成し得る少なくとも１つのシステインを保持している。ＩｇＧ１に由来するスコーピオンリンカーは、１つのシステインまたは２つのシステインを有するものであり得、野生型ＩｇＧ１のＮ末端ヒンジシステインに対応するシステインを保持しているものであり得る。また、非ヒンジ様ペプチドもスコーピオンリンカーとして想定されるが、かかるペプチドにより、２つの結合ドメイン（中央よりに存在する定常部分領域ドメインよりもタンパク質の各末端（ＮおよびＣ）側に存在する）を形成し得る単鎖タンパク質が得られるよう十分な空間形成および柔軟性がもたらされるものとする。例示的な非ヒンジ様スコーピオンリンカーとしては、ＩＩ型膜タンパク質のＣ型レクチンストーク領域のストーク領域（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄのストーク領域）由来のペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、スコーピオンリンカーは、配列番号３５５〜３５９および３６５からなる群より選択される配列を含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、リンカーは、鎖間ジスルフィド結合の形成のためのシステイン残基を１つ有するものである。他の実施形態では、リンカーは、鎖間ジスルフィド結合の形成のためのシステイン残基を２つ有するものである。さらなる実施形態において、リンカーは、免疫グロブリンドメイン間領域（例えば、抗体ヒンジ領域）またはＩＩ型Ｃ型レクチンストーク領域（ＩＩ型膜タンパク質由来；例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００７／１４６９６８に示された例示的なレクチンストーク領域配列、例えば、該公開からの配列番号１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８７、２８９、２９７、３０５、３０７、３０９〜３１１、３１３〜３３１、３４６、３７３〜３７７、３８０、または３８１などを参照のこと、これらの配列は引用により本明細書に組み込まれる）に由来するものである。
【０１１４】
一態様において、本明細書に記載のＣＤ８６結合ドメインを含む例示的な多重特異性融合タンパク質はまた、ＣＤ８６以外の標的に特異的な少なくとも１つのさらなる結合領域またはドメイン（「異種結合ドメイン」）も含む。例えば、本開示の多重特異性融合タンパク質は、介在ドメインによって、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである結合ドメインに連結されたＣＤ８６結合ドメインを有する。一部の特定の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、第１および第２結合ドメイン、第１および第２リンカー、ならびに介在ドメインを含み、該介在ドメインの一端は、第１リンカーによって、ＣＤ８６結合ドメイン（例えば、ＣＴＬＡ４エクトドメイン、ＣＤ２８エクトドメイン、抗ＣＤ８６）である第１結合ドメインに融合されており、他端には、第２リンカーによって、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである異なる結合ドメインが融合されている。
【０１１５】
一部の特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の第１リンカーおよび第２リンカーは各々、独立して、例えば、配列番号４３〜１６６に示すリンカー１〜１３３ならびに配列番号２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８に示すリンカーから選択される。例えば、第１または第２リンカーは、リンカー４７、５８、１２６〜１３１（それぞれ、配列番号８９、１００、および１５９〜１６４）、または配列番号２４４もしくは３５５〜３７９に示すリンカーのいずれか１つまたはその任意の組合せであり得る。さらなる例では、一方のリンカーがリンカー４７（配列番号８９）またはリンカー１３２（配列番号１６５）であり、他方のリンカーが配列番号３５５に示すリンカーまたはリンカー１２７（配列番号１６０）であるか、あるいは、一方のリンカーがリンカー５８（配列番号１００）またはリンカー１３３（配列番号１６６）であり、他方のリンカーがリンカー１２６（配列番号１５９）であるか、あるいは一方のリンカーがリンカー５８（配列番号１００）またはリンカー１３３（配列番号１６６）であり、他方のリンカーがリンカー１２７（配列番号１６０）であるか、あるいは一方のリンカーがリンカー５８（配列番号１００）またはリンカー１３３（配列番号１６６）であり、他方のリンカーがリンカー１２８（配列番号１６１）であるか、あるいは一方のリンカーがリンカー５８（配列番号１００）またはリンカー１３３（配列番号１６６）であり、他方のリンカーがリンカー１２９（配列番号１６２）である。さらなる例では、ＣＤ８６に特異的なものなどのＶＨおよびＶＬドメインを含む本開示の結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらなる（第３）リンカー、例えば、配列番号２４４、配列番号８９に示すリンカー、リンカー４６（配列番号８８）、リンカー１３０（配列番号１６３）、またはリンカー１３１（配列番号１６４）などを有するものであり得る。任意のこのような実施形態において、該リンカーには１〜５個のさらなるアミノ酸が、内部側に隣接（ｆｌａｎｋ）していてもよく（例えば、リンカー１３１は、（Ｇ４Ｓ）コア配列に対して内部側にアラニンを有する）、いずれかの末端（例えば、リンカー１３０は、（Ｇ４Ｓ）コア配列のアミノ末端にセリンを有する）、または両方の末端（例えば、リンカー１２０は、（Ｇ４Ｓ）コア配列の一端に２つのアミノ酸（アスパラギン−チロシン）および他端に３つのアミノ酸（グリシン−アスパラギン−セリン）を有する）に隣接していてもよく、これは、単純に、かかる組換え分子の作製の結果であり得（例えば、核酸分子同士を連接するための特定の制限酵素部位の使用により、１〜数個のアミノ酸の挿入がもたらされることがあり得る）、本開示の目的上、任意の特定のリンカーコア配列の一部とみなされ得る。
【０１１６】
さらなる実施形態において、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、免疫グロブリンの定常領域または部分領域で構成されており、該介在ドメインは、ＣＤ８６結合ドメインと、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである結合ドメインとの間に配置されている。一部の特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、ＣＤ８６結合ドメインをアミノ末端に、およびＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである結合ドメインをカルボキシ末端に有する。他の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである結合ドメインをアミノ末端に、およびＣＤ８６結合ドメインをカルボキシ末端に有する。
【０１１７】
さらなる実施形態において、免疫グロブリンの定常領域の部分領域としては、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＣＨ２およびＣＨ３ドメインが挙げられる。関連実施形態において、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、以下のアミノ酸：２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリシン（Ｋ３２０）、３２２位のリシン（Ｋ３２２）またはその任意の組合せ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）の１つ以上が変異されている（すなわち、その位置に異なるアミノ酸を有する）。例えば、これらのアミノ酸のいずれか１つがアラニンに変更され得る。さらなる一実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けに従い、ＣＨ２ドメインは、アラニンに変異させられた各Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＧ２３７（すなわち、それぞれ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ）を有し、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインは、アラニンに変異させられた各Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２（すなわち、それぞれ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ）を有する。
【０１１８】
一部の特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、「小モジュール免疫薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」（ＳＭＩＰＴＭ）を含むものであり得る。これに関連して、用語ＳＭＩＰＴＭは、モノクローナル抗体および組換え抗体よりも薬物特性が高められた高度にモジュール型の化合物の一類型をいう。ＳＭＩＰは、例えば、抗体可変ドメインを基礎とした標的特異的結合ドメインを、所望のクラスのエフェクター細胞（例えば、マクロファージおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞など）の特異的リクルートおよび／または補体媒介性死滅の補強を可能にする可変ＦＣ領域との組合せで含む単一のポリペプチド鎖を含むものである。標的およびヒンジ領域の選択肢に応じて、ＳＭＩＰは、細胞表面受容体を介してシグナル伝達するもの、またはシグナル伝達をブロックするものであり得る。本明細書で用いる場合、「小モジュール免疫薬」または「ＳＭＩＰＴＭ製剤」と称される操作型融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００３／１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、および同第２００５／０１３６０４９号、ならびに国際特許出願公開ＷＯ０２／０５６９１０、ＷＯ２００５／０３７９８９、およびＷＯ２００５／０１７１４８に記載されているようなものである。
【０１１９】
一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００９／０１４８４４７号および国際特許出願公開ＷＯ２００９／０２３３８６に記載されたものなどのＰＩＭＳ分子を含むものであり得る。
【０１２０】
一部の特定の実施形態では、本発明の多重特異性融合タンパク質は、特定の細胞型を標的化するために異なるフロントおよびバック末端親和性を有するように操作され得る。例えば、ＣＤ８６に対する親和性が、操作型ＩＬ１０アゴニスト（例えば、Ｉ８７ＡもしくはＩ８７Ｓ変異またはモノＩＬ１０構造を有する）がｈｕＩＬ１０Ｒ１に対して有する親和性よりも高い、抗ＣＤ８６結合ドメイン（例えば、３Ｄ１、ＦＵＮ１、またはそのヒト化改変体）の使用、およびかかる分子を本開示（ｄｉｓｃｌｃｏｓｕｒｅ）のｘｃｅｐｔｏｒ分子に組み合わせることは、目的の特定の細胞型（抗原提示細胞（ＡＰＣ）など）を標的とすることに有利になるように使用され得る。これに関連して、標的とする所望の細胞型に応じて、ＣＤ８６に対する親和性が高いかまたは低い、あるいは、本明細書に記載の任意の異種標的タンパク質に対する親和性が高いかまたは低い融合タンパク質が作製され得る。好ましい実施形態では、ＣＤ８６アンタゴニスト結合ドメインが、異種結合ドメインがその結合パートナーに対して有する親和性よりも大きいＣＤ８６に対する親和性を有することにより、多標的特異的ｘｃｅｐｔｏｒ分子はＡＰＣを優先的に標的とする。
【０１２１】
一部の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインもしくはサブドメイン、ＣＤ２８細胞外ドメインもしくはサブドメイン、またはＣＤ８６特異的抗体由来結合ドメインを含むＣＤ８６結合ドメインを有する。一部の特定の実施形態では、ＣＤ８６特異的抗体由来結合ドメインは、ＦＵＮ１モノクローナル抗体に由来する（例えば、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １９９３  Ｍａｒ；１６９（３）：３０９−１５参照）；または３Ｄ１抗ＣＤ８６モノクローナル抗体に由来するものである。一部の特定の実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインは、配列番号１の成熟ポリペプチド配列などのｓＣＴＬＡ４である。一部の特定の実施形態では、ＣＤ８６結合ドメインは、配列番号１の配列などのｓＣＴＬＡ４、または配列番号３などのＣＴＬＡ４の可変様ドメインもしくはそのサブドメインである。他の実施形態において、ＣＤ８６結合ドメインは、配列番号２の成熟ポリペプチド配列（シグナルペプチド：アミノ酸１〜１８）などのｓＣＤ２８である。なおさらなる実施形態において、ＣＤ８６結合ドメインは、ＦＵＮ１（例えば、配列番号３０５および３０６）または３Ｄ１（例えば、配列番号３１８および３１９）由来の軽鎖および重鎖可変ドメインを、好ましくはｓｃＦｖの形態で含む。
【０１２２】
さらなる実施形態において、本開示の多重特異性融合タンパク質は、ＣＤ８６結合ドメインと、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである異種結合ドメイン（例えば、配列番号７、１４、１５、１８〜２２、２５、２６、２９、３２、３３、３６、３９および４０に示す異種結合ドメインのアミノ酸配列参照）とを有する。
【０１２３】
本明細書においてＸｃｅｐｔｏｒ分子と称するかかる多重特異性融合タンパク質の例示的な構造としては、Ｎ−ＢＤ１−ＩＤ−ＢＤ２−Ｃ、Ｎ−ＢＤ２−ＩＤ−ＢＤ１−Ｃが挙げられ、式中、ＮおよびＣは、それぞれ、アミノ末端およびカルボキシ末端を表す；ＢＤ１は、ＣＤ８６結合ドメイン（免疫グロブリン様もしくは免疫グロブリン可変領域結合ドメインまたはエクトドメインなど）である；Ｘは介在ドメインであり、ＢＤ２は、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである結合ドメインである。一部の構築物では、Ｘは、第１結合ドメインと第２結合ドメインとの間に配置された免疫グロブリンの定常領域または部分領域を含むものであり得る。一部の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下：−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−のような構造を含む介在ドメイン（Ｘ）を有し、式中、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、２〜約１５０個のアミノ酸を含むリンカーである；Ｘは、免疫グロブリンの定常領域または部分領域である。さらなる実施形態において、多重特異性融合タンパク質は、アルブミン、トランスフェリンまたは別の血清タンパク質結合タンパク質である介在ドメインを有し、該融合タンパク質は、組成物中で主に、または実質的に単鎖ポリペプチドとして保持される。
【０１２４】
例示的なＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号９、１３、１７、２４、２８、３１、３５、３８、４２、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２３７、２３９、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６６、２７６、３０２、３３０、３３４、３３６、３３８、３４０、３５０、３５２、および３５４（それぞれ、配列番号８、１２、１６、２３、２７、３０、３４、３７、４１、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２３６、２３８、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６５、２７５、３０１、３２９、３３３、３３５、３３７、３３９、３４９、３５１および３５３に示すポリヌクレオチド配列にコードされている）に示す。
【０１２５】
なおさらなる実施形態において、本開示の多重特異性融合タンパク質は、下記の構造：Ｎ−ＢＤ１−Ｘ−Ｌ２−ＢＤ２−Ｃを有し、式中、ＢＤ１は、ＣＤ８６結合ドメイン（ＣＴＬＡ４エクトドメインと少なくとも約９０％同一である結合ドメインなど）である；−Ｘ−は、−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−（式中、Ｌ１は、第１または第２システインを置換することにより任意選択で変異させられた第１ＩｇＧ１ヒンジであり、−ＣＨ２ＣＨ３−は、ＩｇＧ１  ＦｃドメインのＣＨ２ＣＨ３領域である）である；Ｌ２は、配列番号４３〜１６６、２４４、３０７、３２０、３５５〜３７９および３８３〜３９８から選択されるリンカーである；ＢＤ２は、本明細書に記載のＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである結合ドメインである。
【０１２６】
具体的な実施形態において、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号１または配列番号２の成熟ポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ８６結合ドメインと、（ｂ）配列番号７、１４、１５、１８〜２２、２５、２６、２９、３２、３３、３６、３９および４０に示す前述の異種結合タンパク質の対応する成熟ポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含む、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである結合ドメインとを有し、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、またはカルボキシ末端からアミノ末端に向かって、（ｉ）（ａ）のＣＤ８６結合ドメインまたは（ｂ）の結合ドメインが第１リンカーに融合されており、（ｉｉ）第１リンカーが、配列番号４０９および４１５〜４１７のいずれか１つに示すＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域に融合されており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２リンカーに融合されており、（ｉｖ）第２リンカーが（ａ）のＣＤ８６結合ドメインまたは（ｂ）の結合ドメインに融合されている。一部の特定の実施形態では、第１リンカーは、リンカー４７（配列番号８９）、リンカー１３２（配列番号１６５）またはリンカー１３３（配列番号１６６）であり、第２リンカーは、リンカー１２６〜１２９（配列番号１５９〜１６２）のいずれか１つであり、ＣＤ８６結合ドメインのＶＨドメインとＶＬドメインとの間のさらなる（第３）リンカーは、リンカー１３０（配列番号１６３）またはリンカー１３１（配列番号１６４）である。
【０１２７】
例示的なＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号９、１３、１７、２４、２８、３１、３５、３８、４２、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２３７、２３９、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６６、２７６、３０２、３３０、３３４、３３６、３３８、３４０、３５０、３５２、および３５４（それぞれ、配列番号８、１２、１６、２３、２７、３０、３４、３７、４１、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２３６、２３８、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６５、２７５、３０１、３２９、３３３、３３５、３３７、３３９、３４９、３５１および３５３に示すポリヌクレオチド配列にコードされている）に示す。
【０１２８】
（多重特異性融合タンパク質の作製）
本明細書に記載の任意の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質を効率的に作
製するため、発現されるポリペプチドおよび融合タンパク質の分泌を助長するためにリーダーペプチドが使用される。慣用的なリーダーペプチド（シグナル配列）のいずれかの使用により、新生の（ｎａｓｃｅｎｔｌｙ）発現ポリペプチドまたは融合タンパク質が分泌経路に指向されること、およびリーダーペプチドと成熟ポリペプチドまたは融合タンパク質との間の接合部またはその付近での該ポリペプチドまたは融合タンパク質からのリーダーペプチドの切断がもたらされることが予測される。具体的なリーダーペプチドは、当該技術分野において知られた考慮事項に基づいて、例えば、分子的操作を容易にするため、制限エンドヌクレアーゼ切断部位をリーダーペプチドのコード配列の最初または最後に容易に含めることを可能にするポリヌクレオチドにコードされた配列などを用いて選択される。ただし、かかる導入配列により、新生の発現タンパク質からのリーダーペプチドの任意の所望のプロセッシングを許容され得ないほど妨害しないか、またはポリペプチドまたは融合タンパク質の成熟中にリーダーペプチドが切断されない場合は、該ポリペプチドもしくは融合タンパク質分子の任意の所望の機能を許容され得ないほど妨害しないかのいずれかであるアミノ酸が指定されるものとする。本開示の例示的なリーダーペプチドとしては、天然リーダー配列（すなわち、天然タンパク質で発現されるもの）または異種リーダー配列、例えば、Ｈ３Ｎ−ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ（Ｘ）ｎ−ＣＯ２Ｈ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり、ｎは０〜３である）（配列番号１６７、４１９、４２０、および４２１）もしくはＨ３Ｎ−ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ−ＣＯ２Ｈ（配列番号１６８）の使用が挙げられる。
【０１２９】
本明細書において示しているように、本明細書に記載の結合ドメイン（エクトドメイン、軽および重可変領域ならびにＣＤＲなど）の改変体および誘導体が想定される。一例では、１つ以上のアミノ酸残基により特異的結合因子のアミノ酸配列が補われる挿入改変体を提供する。挿入を、該タンパク質のいずれかの末端または両端に存在させてもよく、該特異的結合因子のアミノ酸配列の内部領域内に配置してもよい。また、本開示の改変体生成物には、成熟特異的結合因子生成物、すなわち、リーダーまたはシグナル配列が除去され、得られたタンパク質がさらなるアミノ末端残基を有する特異的結合因子生成物も包含される。該さらなるアミノ末端残基は、別のタンパク質に由来するものであってもよく、特定のタンパク質由来のものであると同定可能でない１つ以上の残基を含むものであってもよい。さらなるメチオニン残基を−１位に有するポリペプチドが想定され、さらなるメチオニンとリシン残基を−２位と−１位に有する本開示のポリペプチドも同様である。さらなるＭｅｔ、Ｍｅｔ−ＬｙｓもしくはＬｙｓ残基（または１つ以上の一般的な塩基性残基）を有する改変体は、細菌宿主細胞における組換えタンパク質産生の向上に特に有用である。
【０１３０】
本明細書で用いる場合、「アミノ酸」は、天然（自然界に存在するもの）アミノ酸、置換型天然アミノ酸、非天然アミノ酸、置換型非天然アミノ酸またはその任意の組合せをいう。天然アミノ酸に対する表記は、本明細書において、標準的な１文字コードまたは３文字コードのいずれかで示す。天然極性アミノ酸としては、アスパラギン（ＡｓｐまたはＮ）およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；ならびに塩基性アミノ酸、例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）およびその誘導体；ならびに酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）およびその誘導体が挙げられる。天然疎水性アミノ酸としては、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）およびその誘導体；ならびに他の無極性アミノ酸、例えば、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）およびその誘導体が挙げられる。中間極性の天然アミノ酸としては、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）およびその誘導体が挙げられる。特に記載のない限り、本明細書に記載のアミノ酸はいずれも、Ｄ−配置またはＬ−配置のいずれであってもよい。
【０１３１】
置換改変体としては、アミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替的な残基で置き換えられた融合タンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、置換は本質的に保存的なものである；しかしながら、本開示は、非保存的である置換も包含する。アミノ酸は、物性ならびにタンパク質の二次および三次構造に対する寄与に従って分類され得る。保存的置換は、当該技術分野において、あるアミノ酸の、類似した特性を有する別のアミノ酸での置換と認識されている。例示的な保存的置換を、すぐ下の表１に示す（１９９７年３月１３日に公開されたＷＯ９７／０９４３３，第１０頁参照）。
【０１３２】
【表１】
2014239700.tif 000004
あるいはまた、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．  ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７）に記載のようにして群分けされ得、これを、すぐ下の表２に示す。
【０１３３】
【表２】
2014239700.tif 000005
また、改変体または誘導体は、特定の発現系の使用によって生成されるさらなるアミノ酸残基を有するものであってもよい。例えば、所望のポリペプチドが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合生成物の一部として発現される市販のベクターの使用により、所望のポリペプチドからのＧＳＴ成分の切断後、さらなるグリシン残基を−１位に有する所望のポリペプチドが得られる。他のベクター系での発現により得られる改変体も想定される（例えば、ヒスチジンタグがアミノ酸配列内に、一般的には該配列のカルボキシおよび／またはアミノ末端に組み込まれたもの）。
【０１３４】
また、本開示の結合ドメインにおいて１つ以上のアミノ酸残基が除去された欠失改変体も想定される。欠失は、該融合タンパク質の一端に行なわれたものであっても両端に行なわれたものであってもよく、アミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去によって行なわれたものであってもよい。
【０１３５】
一部の特定の実例としての実施形態において、本開示の融合タンパク質はグリコシル化されたものであり、グリコシル化パターンは、さまざまな要素、例えば、タンパク質を発現させる宿主細胞（組換え宿主細胞において調製する場合）および培養条件に依存性である。
【０１３６】
また、本開示は、該融合タンパク質の誘導体を提供する。誘導体としては、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外の修飾を有する特定の結合ドメインポリペプチドが挙げられる。一部の特定の実施形態では、該修飾は、本質的に共有性のものであり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分および無機部分との化学結合が挙げられる。本開示の誘導体は、特定の結合ドメインポリペプチドの循環半減期が増大するように調製され得るか、または所望の細胞、組織もしくは器官を該ポリペプチドが標的とする能力が改善されるように設計され得る。
【０１３７】
本開示は、さらに、１つ以上の水溶性ポリマー結合物、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号および同第４，１７９，３３７号に記載のようなポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールなどを含むように共有結合により修飾または誘導体化された融合タンパク質を包含する。当該技術分野において知られたさらに他の有用なポリマーとしては、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、および他の糖質系ポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにこれらのポリマーの混合物が挙げられる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化タンパク質である。水溶性ポリマーは、本開示によるタンパク質およびポリペプチドの特定の位置（例えば、アミノ末端）に結合させてもよく、該ポリペプチドの１つ以上の側鎖にランダムに結合させてもよい。治療能を改善するためのＰＥＧの使用は、米国特許第６，１３３，４２６号に記載されている。
【０１３８】
本開示の具体的な一実施形態は、免疫グロブリンまたはＦｃ融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、長い半減期、例えば、数時間、１日もしくはそれ以上、さらには１週間もしくはそれ以上を有するものであり得る（特に、Ｆｃドメインが新生児Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎと相互作用し得る場合）。また、Ｆｃドメイン内のＦｃＲｎに対する結合部位は、細菌プロテインＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質間の強固な結合は、例えば、タンパク質精製中にプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを用いることにより、本開示の抗体または融合タンパク質を精製するための手段として使用され得る。
【０１３９】
タンパク質精製手法は当業者に周知である。このような手法は、一レベルでは、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分の粗分画を含む。多くの場合では、一部または完全な精製（または均一になるまでの精製）を達成するため、クロマトグラフィーおよび電気泳動による手法を用いるさらなる精製が所望される。精製融合タンパク質の調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー；排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；および等電点電気泳動法である。特に効率的なペプチド精製法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣである。
【０１４０】
本開示の一部の特定の態様は、融合タンパク質の精製に関し、具体的な実施形態では、実質的な精製に関する。用語「精製融合タンパク質」は、本明細書で用いる場合、他の成分から単離可能な組成物であって、該融合タンパク質が、天然で得られ得る状態と比べて任意の度合まで精製されている組成物をいうことを意図する。したがって、精製融合タンパク質はまた、これが天然に存在し得る環境から遊離された融合タンパク質をいう。
【０１４１】
一般的に、「精製された」は、分別に供されて種々の他の成分が除去されている融合タンパク質組成物であって、該組成物が、発現されるその生物学的活性を実質的に保持しているものをいう。用語「実質的に精製された」が使用されている場合、この表記は、融合タンパク質が組成物の主要成分を形成している、例えば、組成物中、重量基準で、タンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上を構成している融合結合タンパク質組成物をいう。
【０１４２】
本開示に鑑みると、当業者には、精製度合を定量するための種々の方法がわかる。このような方法としては、例えば、活性画分の比結合活性の測定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による画分中の融合タンパク質の量の評価が挙げられる。タンパク質画分の純度を評価するための好ましい方法は、該画分の結合活性を計算し、これを、最初の抽出物の結合活性と比較し、かくして、本明細書において「精製倍数」で評価する精製度合を計算することである。結合活性の量を示すために用いる実際の単位は、もちろん、精製を追跡するのに選択される具体的なアッセイ手法、および発現された融合タンパク質が検出可能な結合活性を示すか否かに依存性である。
【０１４３】
タンパク質の精製における使用に適した種々の手法は、当業者に十分わかる。このような手法としては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体など、または熱変性による沈降、その後の遠心分離；クロマトグラフィー工程（イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーなど）；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の手法の組合せが挙げられる。当該技術分野において一般的に知られているように、種々の精製工程を行なう順序は変更してもよく、一部の工程を省いてもよく、それでもなお、実質的に精製されたタンパク質の調製に適当な方法であると考えられる。
【０１４４】
融合タンパク質がその最も精製された状態で常に得られる一般的な要件はない。実際、実質的に精製された状態に満たないタンパク質が、一部の特定の実施形態において有用性を有することが想定される。一部精製は、少ない回数の精製工程を組み合わせて使用すること、または同じ一般的な精製スキームの種々の形態を用いることによりなされ得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて行なわれるカチオン交換カラムクロマトグラフィーでは、一般的に、低圧クロマトグラフィー系を用いた同じ手法よりも良好な精製がもたらされることは認識される。相対的に低い度合の精製が示される方法は、タンパク質生成物の全回収または発現されたタンパク質の結合活性の維持において利点を有することがあり得る。
【０１４５】
ポリペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件が異なると、場合によっては有意に異なり得ることがわかっている（Ｃａｐａｌｄｉら（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ７６：４２５）。したがって、電気泳動条件が異なると、精製または部分精製融合タンパク質発現産物の見かけ分子量が異なり得ることが認識される。
【０１４６】
（ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞）
本開示により、本開示の多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（単離または精製または純粋なポリヌクレオチド）、かかるポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、クローニングベクターおよび発現ベクター）、ならびに本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。
【０１４７】
一部の特定の実施形態では、本開示の結合ドメインまたは１つ以上のかかる結合ドメインを含む多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）が想定される。該多重特異性融合タンパク質構築物をコードする発現カセットを、本明細書に付属の実施例に示す。
【０１４８】
また、本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含むベクター、特に、組換え発現構築物に関する。一実施形態において、本開示では、本開示のＣＤ８６結合ドメインと、ＩＬ−１０アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストドメインとを含む多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、かかる多重特異性融合タンパク質コード配列の転写、翻訳およびプロセッシングを誘起または助長する他のポリヌクレオチド配列とともに含むベクターを想定する。
【０１４９】
原核生物系および真核生物系宿主での使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）に記載されている。例示的なクローニング／発現ベクターとしては、クローニングベクター、シャトルベクター、およびプラスミド、ファージミド、ファスミド、コスミド、ウイルス、人工染色体を主体としたものであり得る発現構築物、あるいは当該技術分野において、内包されたポリヌクレオチドの増幅、移動および／または発現に適していることが知られた任意の核酸ビヒクルが挙げられる。
【０１５０】
本明細書で用いる場合、「ベクター」は、連結された別の核酸の輸送を行なうことができる核酸分子を意味する。例示的なベクターとしては、プラスミド、酵母人工染色体、およびウイルスゲノムが挙げられる。一部の特定のベクターは、宿主細胞内で自律的に複製できるものであり、他のベクターは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得、それにより宿主ゲノムとともに複製されるものである。また、一部の特定のベクターを、本明細書において「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と称し、これは、発現制御配列に作動可能に連結された核酸配列を含み、したがって、該配列の発現を指令できるものである。
【０１５１】
一部の特定の実施形態では、発現構築物は、プラスミドベクターから誘導されたものである。実例としての構築物としては、修飾型ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）（これは、アンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナルおよびＴ７プロモーター部位をコードする核酸配列を有する）；ｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ  ＩＣＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）（これらは、ＣＨＥＦ１プロモーターを有する）；ならびにｐＤ１８（Ｌｏｎｚａ）（これは、ＣＭＶプロモーターを有する）が挙げられる。他の適当な哺乳動物系発現ベクターは、よく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）参照；また、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪのカタログも参照のこと）。該融合タンパク質の産生レベルの向上を促進させるため（該レベルは、適切な選択薬剤（例えば、メトトレキサート）の適用後、遺伝子増幅により得られる）、適当な調節制御下にあるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）コード配列を含む有用な構築物が調製され得る。
【０１５２】
一般的に、組換え発現ベクターには、複製起点と、宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マーカーと、上記のような、下流構造の配列の転写を指令するための高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターとが含まれる。本開示によるポリヌクレオチドが作動可能に連結された状態のベクターにより、クローニングまたは発現構築物がもたらされる。例示的なクローニング／発現構築物は、本開示のポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御エレメント（例えば、プロモーター）を含む。また、さらなる発現制御エレメント、例えば、エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネータ、およびリボソーム結合部位なども、本開示によるベクターおよびクローニング／発現構築物において想定される。本開示によるポリヌクレオチドの異種構造配列は、適切な相において翻訳開始および終止配列と共にアッセンブルされる。したがって、例えば、本明細書において提供する該融合タンパク質コード核酸は、さまざまな発現ベクター構築物のいずれか１つに、かかるタンパク質を宿主細胞内で発現させるための組換え発現構築物として含めてもよい。
【０１５３】
適切なＤＮＡ配列（１つまたは複数）がベクター内に、例えば、さまざまな手順によって挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（１つまたは複数）内に、当該技術分野において知られた手順によって挿入される。クローニング、ＤＮＡの単離、増幅および精製のため、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを伴う酵素反応のための標準的な手法、ならびに種々の分離手法が想定される。いくつかの標準的な手法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｉｎｃ．  ＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１９９３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，１９８２）；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第Ｉ巻および第ＩＩ巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９８５）；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９８５）；などに記載されている。
【０１５４】
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、構成的プロモーターまたは調節プロモーター）に作動可能に連結される。かかる発現制御配列の代表例としては、上記のような、真核生物細胞またはそれらのウイルスのプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能マーカーを有する他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択され得る。真核生物系プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当該技術分野の通常の技能レベルの範囲内であり、本開示によるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターまたは調節プロモーターを含む一部の特に好ましい組換え発現構築物の調製を、本明細書において記載する。
【０１５５】
また、本開示のポリヌクレオチドの改変体も想定される。改変体ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の規定配列のポリヌクレオチドの１つと、少なくとも９０％、好ましくは９５％、９９％または９９．９％同一であるもの、または該規定配列のポリヌクレオチドの１つに、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、約６５〜６８℃もしくは０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０％ホルムアミド、約４２℃のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするものである。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に記載の機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコードする能力を保持している。
【０１５６】
用語「ストリンジェント」は、当該技術分野においてストリンジェントと一般に理解されている条件をいうために用いる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、および変性剤（ホルムアミドなど）の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関するストリンジェント条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、約６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０％ホルムアミド、約４２℃である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照）。
【０１５７】
よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤など）も使用してもよい；しかしながら、ハイブリダイゼーション率が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する場合、さらなる例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドの場合）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドの場合）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドの場合）、および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドの場合）での洗浄が挙げられる。
【０１５８】
本開示のさらなる一態様により、本開示の任意のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、あるいは本開示の任意のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物を含む宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現構築物は、適当な細胞内に、当該技術分野において知られた任意の方法、例えば、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入を用いて導入される。宿主細胞としては、エキソビボ細胞療法（例えば、エキソビボ遺伝子療法など）を受けている被験体の細胞が挙げられる。本開示によるポリヌクレオチド、ベクターまたはタンパク質を有する場合、本開示の一態様として想定される真核生物宿主細胞としては、被験体自身の細胞（例えば、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、発現される多価結合分子のグリコシル化パターンが変更され得るように修飾されたＣＨＯ細胞、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号参照）、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、ならびに当該技術分野において、本開示によるタンパク質またはペプチドの発現および任意選択で単離に有用であることがわかっている任意の他の真核生物細胞が挙げられる。また、原核生物細胞、例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ストレプトミセス属、または当該技術分野において、本開示によるタンパク質もしくはペプチドの発現および任意選択で単離に適していることがわかっている任意の原核生物細胞も想定される。原核生物細胞からのタンパク質またはペプチドの単離では、特に、封入体からタンパク質を抽出するための当該技術分野において知られた手法が使用され得ることが想定される。適切な宿主の選択は、本明細書における教示により、当業者の技能の範囲内である。本開示の融合タンパク質がグリコシル化される宿主細胞が想定される。  
【０１５９】
用語「組換え宿主細胞」（または、単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターを含む細胞をいう。かかる用語は、具体的な主題の細胞だけでなくかかる細胞の子孫も示すことを意図することを理解されたい。後継世代では、変異または環境による影響のいずれかによってある種の修飾が起こり得るため、かかる子孫は親細胞と同一でないことがあり得、実際、同一でないが、それでも本明細書で用いる用語「宿主細胞」の範囲に含める。
【０１６０】
組換え宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または特定遺伝子の増幅に適切なように修正された慣用的な栄養培地中で培養され得る。発現用に選択された具体的な宿主細胞のための培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、当業者には、容易にわかる。また、種々の哺乳動物細胞培養系も、組換えタンパク質の発現に使用され得る。哺乳動物系発現系の例としては、ＣＯＳ−７サル腎臓線維芽細胞株（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５に記載）、ならびに適合性のベクターを発現し得る他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物系発現ベクターには、複製起点、適当なプロモーターおよび任意選択でエンハンサー、また、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’−フランキング非転写配列（例えば、多価結合タンパク質発現構築物の調製に関して本明細書に記載のもの）が含まれる。ＳＶ４０スプライスに由来するＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位の使用により、必要とされる非転写遺伝要素が得られ得る。宿主細胞内への該構築物の導入は、当業者が熟知しているさまざまな方法によって、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって行なわれ得る。
【０１６１】
一実施形態において、宿主細胞は、本開示によるタンパク質またはポリペプチドの発現を指令する組換えウイルス構築物によって形質導入される。形質導入された宿主細胞は、ウイルス出芽の際にウイルス粒子によって組み込まれた宿主細胞膜の一部分に由来する発現タンパク質またはポリペプチドを含有するウイルス粒子を産生する。
【０１６２】
（組成物および使用方法）
ＣＤ８６、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＬ−３５、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬまたはＣＤ４０の調節不全と関連している疾患状態に罹患したヒトまたは非ヒト哺乳動物を処置するため、本開示の多重特異性融合タンパク質は、該被験体に、１回以上の投与過程後に該疾患状態の症状が改善されるのに有効な量で投与される。ポリペプチドであるため、本開示の多重特異性融合タンパク質を薬学的に許容され得る希釈剤（任意選択で、他の薬学的に許容され得る賦形剤である安定剤を含めてもよい）中に懸濁または溶解させてもよく、これは、注射または注入による静脈内投与に使用され得る（より詳しく後述する）。
【０１６３】
医薬有効用量は、疾患状態を予防、その発生を抑止、またはそれを処置（その症状をある程度、好ましくは全症状を軽減）するのに必要とされる用量である。医薬有効用量は、疾患の型、使用される組成物、投与経路、処置対象の被験体の型、処置の考慮下の具体的な被験体の身体的特徴、併用薬物療法、および医学分野の当業者に認識される他の要素に依存する。例えば、本開示の結合ドメインポリペプチドまたは多重特異性タンパク質融合体の効力に応じて、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（これは、単回用量として、あるいは毎時間、毎日、毎週、毎月または適切な間隔であるその任意の組合せで施与される複数回用量で投与され得る）の量の活性成分が投与され得る。
【０１６４】
一部の特定の態様では、該融合タンパク質の組成物が本開示により提供される。本開示の医薬組成物は、一般的に、１種類以上の型の該結合ドメインまたは融合タンパク質を、薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤との組み合わせで含む。かかる担体は、レシピエントに対して、使用される投薬量および濃度で無毒性のものである。治療的使用のための薬学的に許容され得る担体は、製薬技術分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ（編）１９８５）に記載されている。例えば、生理学的ｐＨの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水が使用され得る。保存料、安定剤、色素などを医薬用組成物に入れてもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが保存料として添加され得る（同書，第１４４９頁）。また、酸化防止剤および懸濁化剤を使用してもよい（同書）。本発明の化合物は、遊離塩基または塩形態のいずれかで使用され得、どちらの形態も、本発明の範囲に含まれるとみなされる。
【０１６５】
また、医薬組成物には、希釈剤（緩衝液など）、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、糖質（例えば、グルコース、スクロース、もしくはデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオンまたは他の安定剤もしくは賦形剤が含有され得る。非特異的血清アルブミンと混合された中性緩衝生理食塩水または生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。好ましくは、製品は、適切な賦形剤液が希釈剤として使用される凍結乾燥物として処方されたものである。
【０１６６】
本開示の組成物は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物において、ＣＤ８６、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＬ−３５、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬまたはＣＤ４０の調節不全の結果であるか、該調節不全と関連している疾患状態を処置するために使用され得る。上記のように、ＣＤ２８に対するＣＤ８６の結合を、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇの投与によってブロックすることは、関節リウマチなどの自己免疫障害の処置に有効であることが示されている。ＩＬ１０は免疫抑制性特性を有すること（Ｃｏｍｍｉｎｓら（２００８）Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２１：１１０８−１１；Ｍｉｎｇら，（２００８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：４６８−４７６）、ならびにＩＬ１０の投与後に有益な応答が乾癬の患者（Ａｓａｄｕｌｌａｈら（１９９９）Ａｒｃｈ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １３５：１８７−９２）および炎症性腸疾患の患者（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら（２０００）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１９：１４６１−７２）にみられることがわかっている。上記のように、ＨＬＡ−Ｇは、多発性硬化症と関連しているＣＮＳの炎症応答の低減に（Ｗｉｅｎｄｌら（２００５）Ｂｌｏｏｄ，１２８：２６８９−２７０４）、および移植での移植片に対する耐容性の増進における治療用薬剤として（Ｃａｒｏｓｅｌｌａら（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１１：４８６２−４８７０）有用であり得ることが示唆されている。ＨＧＦは、関節炎のマウスモデルおよび喘息のマウスモデルの両方において疾患の低減に有効であることが示されている。ＩＬ３５は、関節炎のマウスモデルの疾患の低減に有効であること、およびＴ細胞増殖を抑制することが示されている。上記のように、ＬＩＧＨＴアンタゴニストは、対宿主性移植片病の低減に有効であること、およびＴ細胞増殖を抑制することが示されている。また、ＬＩＧＨＴは、炎症性腸疾患およびクローン病において、ある役割を果たしていると考えられている。ＰＤ−１に対するＰＤ１−Ｌ１またはＰＤ１−Ｌ２は、Ｔ細胞の活性化とサイトカイン産生の低減に有効であることが示されている。ＢＴＬＡは、Ｔ細胞の活性化とサイトカイン産生の低減に有効であることが示されている。ＧＩＴＲに対するＧＩＴＲＬの結合により、喘息および関節炎の動物モデルにおいて疾患の重症度が増大することが示されており、Ｔ細胞炎症応答および免疫応答が増大することがわかっている。上記のように、ＣＤ４０シグナル伝達は、自己免疫疾患、がん、ならびに器官および組織移植片拒絶などの疾患に関与している。
【０１６７】
したがって、本開示の多重特異性融合タンパク質は、種々の自己免疫性および／または炎症性の障害、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、喘息、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、対宿主性移植片病、乾癬、多発性硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）自己免疫性肝炎、真性糖尿病１型、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、ギヤン−バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、尋常性天疱瘡、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られる）、自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、脈管炎、セリアック病、子宮内膜症、汗腺膿瘍、間質性膀胱炎、限局性強皮症、強皮症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、白斑および自己免疫性内耳疾患などの処置に有用である。また、本開示の多重特異性融合タンパク質は、器官移植片（例えば、固形臓器移植片または同種移植片）、細胞移植片などにおける有害な免疫アロ応答（ａｌｌｏｒｅｓｐｏｎｓｅ）の抑制に有用である。
【０１６８】
「薬学的に許容され得る塩」は、薬学的に許容され得、かつ親化合物の所望の薬理学的活性を有する、本開示の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質の塩をいう。かかる塩としては、以下のもの：（１）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）と形成される酸付加塩；もしくは有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンフルスルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸など）と形成される酸付加塩；または（２）酸性プロトンが親化合物に存在し、いずれかが、金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンもしくはアルミニウムイオン）で置き換えられた場合；あるいは有機塩基（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミンなど）と配位する場合に形成される塩が挙げられる。
【０１６９】
特別な実例としての実施形態において、本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質は、例えば、ボーラス注射または注入によって静脈内投与される。静脈内以外の投与経路としては、経口、経表面、非経口（例えば、舌下または口腔内）、舌下、経直腸、経膣、および鼻腔内が挙げられる。非経口という用語は、本明細書で用いる場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、空洞内、髄腔内、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、尿道内注射手法または注入手法を包含する。医薬用組成物は、患者に投与されると、内包された活性成分がバイオアベイラブルとなるように処方される。患者に投与される組成物は１以上の投薬量単位の形態をとり、この場合、例えば、錠剤は単一の投薬量単位であり得、エーロゾル形態の本開示の１種類以上の化合物の容器には、複数の投薬量単位が収容され得る。
【０１７０】
経口投与では、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストラン、シクロデキストリン、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースなどの賦形剤および／または結合剤を存在させ得る。甘味剤、保存料、色素／着色料、矯味矯臭向上剤またはその任意の組合せを、任意選択で存在させ得る。また、コーティングシェルが任意選択で使用され得る。
【０１７１】
注射による投与が意図される組成物では、界面活性剤、保存料、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、等張剤の１種類以上またはその任意の組合せが、任意選択で含まれ得る。
【０１７２】
核酸系処方物または本開示による発現産物を含む処方物では、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重が、例えば、皮内、皮下、筋肉内または静脈内経路によって、あるいは当該技術分野において所与の設定状況下で適当であることがわかっている任意の経路によって投与される。好ましい投薬量は、例えば約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、約５μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇが特に好ましい。当業者には、投与の回数および頻度が宿主の応答に依存性であることが明白である。
【０１７３】
本開示の医薬用組成物は、患者に対する投与を可能にする任意の形態、例えば、固形、液状またはガス（エーロゾル）などの形態であり得る。該組成物は、本明細書に記載の任意の経路による投与のための液状形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤または懸濁剤であり得る。
【０１７４】
液状医薬用組成物は、本明細書で用いる場合、液剤、懸濁剤または他の同様の形態のいずれの形態であれ、以下の成分：滅菌希釈剤（注射用水、塩水（例えば、生理食塩水）、リンゲル液、等張性塩化ナトリウムなど）、溶媒または懸濁媒体としての機能を果たし得る固定油（合成のモノグリセリドもしくはジグリセリドなど）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗細菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；酸化防止剤（アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなど）；緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；および張度の調整のための薬剤（ナトリウム、塩化物またはデキストロースなど）の１種類以上が含有され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアル内に封入され得る。生理食塩水は好ましい添加剤である。注射可能医薬用組成物は、好ましくは滅菌されている。
【０１７５】
また、該調製物中に、送達用ビヒクルなどの他の成分、例えば、アルミニウム塩、油中水型乳剤、生物分解性油性ビヒクル、水中油型乳剤、生物分解性マイクロカプセル、およびリポソームを含めることが望ましい場合があり得る。かかるビヒクルにおける使用のための佐剤の例としては、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−インターフェロン、およびＩＬ−１５が挙げられる。
【０１７６】
当業者に公知の任意の適当な担体が、本開示の医薬用組成物において使用され得るが、担体の型は、投与様式および徐放が所望されるかどうかに応じて異なる。非経口投与では、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、緩衝液またはその任意の組合せを含むものであり得る。経口投与では、上記の任意の担体または固形担体、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、またはその任意の組合せが使用され得る。
【０１７７】
また、本開示の多重特異性融合タンパク質組成物を、第２の薬剤と組み合わせて投与することが想定される。第２の薬剤は、当該技術分野において特定の疾患状態（炎症、自己免疫およびがんなど）の標準的な処置剤と認められているものであり得る。想定される例示的な第２の薬剤としては、サイトカイン、増殖因子、ステロイド類、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、化学療法剤、放射線療法剤、または他の活性薬剤および補助薬剤が挙げられる。
【０１７８】
本開示では、本開示の医薬用組成物を含む投薬量単位を想定する。かかる投薬量単位としては、例えば、単回用量または複数用量のバイアルまたはシリンジ（例えば、一方に凍結乾燥形態の本開示の医薬用組成物を含み、他方に再構成用の希釈剤を含む２コンパートメント式のバイアルまたはシリンジ）が挙げられる。また、複数用量の投薬量単位は、例えば、静脈内注入デバイスに接続するためのバッグまたはチューブであってもよい。
【０１７９】
また、本開示では、単位用量または複数用量容器（例えば、バイアル）内の医薬用組成物と、本明細書に記載の障害に罹患した患者に該組成物を投与するための一セットの使用説明書とを含むキットを想定する。
【０１８０】
本明細書において言及した米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、非特許刊行物、表、配列、ウェブサイトなどはすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。以下の実施例は、本開示の例示を目的とし、限定を意図しない。
【実施例】
【０１８１】
（実施例）
（Ｘｃｅｐｔｏｒの配列）
ＣＴＬＡ４エクトドメインを有する例示的な多重特異性融合タンパク質のヌクレオチド発現カセットおよびアミノ酸の配列を、それぞれ、配列番号８、１２、１６、２３、２７、３０、３４、３７および４１、ならびに配列番号９、１３、１７、２４、２８、３１、３５、３８および４２に示す。これらの例示的な多重特異性融合タンパク質の活性を、以下の実施例１〜６に記載のようにして試験した。以下の実施例で使用する略語としては、以下の用語：ＰＢＳ−Ｔ：ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４および０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０；ワーキング緩衝液：１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ；ブロッキング緩衝液：３％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔが挙げられる。
【０１８２】
（実施例１）
（抗ＣＤ８６結合ドメイン）
ハイブリドーマ３Ｄ１およびＦＵＮ１を用いて、これらのモノクローナル抗体の抗ＣＤ８６可変結合ドメインをクローニングした。ＦＵＮ１および３Ｄ１抗ＣＤ８６モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖、ｓｃＦｖリンカー、およびＣＤＲの配列は、それぞれ、配列番号３０５〜３１３および３１８〜３２６を参照されたい。
【０１８３】
以下のヒト化ＦＵＮ１抗ＣＤ８６モノクローナル抗体可変結合ドメインを使用し、ＳＭＩＰタンパク質およびｘｃｅｐｔｏｒを構築した。ＦＵＮ１  ＣＤＲを、ヒト生殖系列配列内に以下のように移植した。（１）ＦＵＮ１−１１は、軽鎖ではＩｇｋｖ４−１＊０１
ＦＲおよび重鎖ではＩｇＨＶ１−Ｆ＊０１  ＦＲを有する；（２）ＦＵＮ１−２１は、軽鎖ではＩｇｋｖ４−１＊０１  ＦＲおよび重鎖ではＩｇＨＶ１−２＊０２  ＦＲを有する；（３）ＦＵＮ１−３１は、軽鎖ではＩｇｋｖ４−１＊０１  ＦＲおよび重鎖ではＩｇＨＶ３−１１＊０１  ＦＲを有する；（４）ＦＵＮ１−１２は、軽鎖ではＩｇｋｖ１−２７＊０１  ＦＲおよび重鎖ではＩｇＨＶ１−Ｆ＊０１  ＦＲを有する；（５）ＦＵＮ１−２２は、軽鎖ではＩｇｋｖ１−２７＊０１  ＦＲおよび重鎖ではＩｇＨＶ１−２＊０２  ＦＲを有する；ならびに（６）ＦＵＮ１−３２は、軽鎖ではＩｇｋｖ１−２７＊０１  ＦＲおよび重鎖ではＩｇＨＶ３−１１＊０１  ＦＲを有する。該ヒト化分子の生殖系列ＣＤＲは、元のＦＵＮ１分子と類似している。
【０１８４】
その結果、以下のようなヒト化ＦＵＮ１  ＳＭＩＰタンパク質の６種類の変形型も生成された：（１）ＦＵＮ１−１１（配列番号２２５）；（２）ＦＵＮ１−２１（配列番号２２７）；（３）ＦＵＮ１−３１（配列番号２２９）；（４）ＦＵＮ１−１２（配列番号２３１）；（５）ＦＵＮ１−２２（配列番号２３３）；および（６）ＦＵＮ１−３２（配列番号２３５）。これらのヒト化ＦＵＮ１  ＳＭＩＰ分子の結合活性を図７に示す。また、ＦＵＮ１可変ドメイン（ｓｃＦｖ）とヒト化ＦＵＮ１  ｓｃＦｖを使用し、ＩＬ１０：：ＦＵＮ１（配列番号１８３）；ＦＵＮ１：：ＩＬ１０（配列番号１８７）；ＦＵＮ１−２１：：ＩＬ１０（配列番号２３７）；ＩＬ１０：：ＦＵＮ１−２１（配列番号２５４）；ＩＬ１０  Ｉ８７Ａ：：ＦＵＮ１−２１（配列番号２５８）などのｘｃｅｐｔｏｒを作製し、また、短Ａ２ヒンジを用いてモノＩＬ１０：：ＦＵＮ１−２１結合ドメインも作製した（配列番号２７６）（ここで、Ａ２ヒンジアミノ酸配列は配列番号３６４に示したものである）。
【０１８５】
本明細書に記載のこれらおよびその他のすべての構築物を適切な哺乳動物系発現ベクター内にクローニングし、種々の細胞株において発現させ、特定の機能アッセイのためにタンパク質を産生させた。
【０１８６】
（実施例２）
（ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによるＩＬ１０−Ｒ１に対するＸｃｅｐｔｏｒ結合）
ＩＬ１０−Ｒ１結合活性を、ＣＴＬＡ４エクトドメインおよびＩＬ１０ドメインを含むＸｃｅｐｔｏｒ（配列番号９）で、実質的に以下のようにして調べた。
【０１８７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００  ＳＰＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）において、ＨＢＳ−Ｐ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を泳動緩衝液として用いて行なった。ＩＬ−１０Ｒ１（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２５μｇ／ｍＬ，ｐＨ４．０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＣＭ５チップ上に、標準的なアミンカップリング化学反応（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、最終固定化レベル８６７、２６８７および６７１９Ｒｕ（共鳴単位）で直接固定化した。ＩＬ−１０含有構築物を３００秒間、５０μｌ／分の流速で、１００ｐＭ〜１０ｎＭの一連の濃度で注入した。解離を１２００秒間モニタリングし、２Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ７．５８）を６０秒間注入した後、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＨＢＳ−Ｐ＋中）を６０秒間注入することにより表面を再生させた。表面との結合相互作用は、少なくとも３０回の再生サイクル中、安定であった。データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｔ１００用），バージョン２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。固定化ＩＬ−１０Ｒ１に対するＣＴＬＡ４／ＩＬ１０  Ｘｃｅｐｔｏｒの結合反応速度は、１：１ラングミュア結合モデルにはフィットできなかったが、二価アナライト結合モデルには高精度でフィットできた。各構築物の平衡解離定数（ＫＤ）は、飽和時の観察された応答を定常状態の平衡モデルにフィットさせることにより高精度で計算され得、以下の表３に示す。ＣＴＬＡ４エクトドメインをＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質に含めることは、ＩＬ１０／ＩＬ１０Ｒ１相互作用に対して明白な影響を及ぼさなかった。
【０１８８】
【表３】
2014239700.tif 000006
（実施例３）
（ＥＬＩＳＡによるＣＤ８０およびＣＤ８０とＩＬ１０の両方に対するＸｃｅｐｔｏｒの結合）
ＣＤ８０およびＩＬ１０Ｒ結合活性を、ＥＬＩＳＡにより、アバタセプト、ＣＴＬＡ４−Ｎ２と称するＣＴＬＡ４−Ｉｇ構築物（配列番号１１および１０）、ならびに配列番号９のＣＴＬＡ４／ＩＬ１０  Ｘｃｅｐｔｏｒで、実質的に以下のようにして調べた。
【０１８９】
（ＣＤ８０結合）
９６ウェル黒色Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＣＤ８０プレート（Ｎｕｎｃカタログ番号４３７１１１）プレートの各ウェルを、２μｇ／ｍｌ溶液のＣＤ８０−ｍＩｇ（Ａｎｃｅｌｌカタログ番号５１０−０２０）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをブロッキング緩衝液（３％無脂肪粉乳を含むＰＢＳ−Ｔ）でブロックした。ブロッキング緩衝液で連続希釈した試験対象のタンパク質の試料を、ＣＤ８０−ｍＩｇコートプレートのウェルに二連で添加し、プレートに覆いをし、室温で約１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌ／ウェルのホースラディッシュペルオキシダーゼヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）（ブロッキング緩衝液中１：１，０００に希釈）を添加し、プレートに覆いをして室温で６０分間インキュベートした後、ＱｕａｎｔａＢｌｕＴＭ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１５１６９）において、室温で１０分間インキュベーションした。各ウェルの吸光度の読取りを４２０ｎｍで行なった。非関連融合タンパク質ＴＲＵ−０１５を陰性対照として使用した。
【０１９０】
この実験の結果を図１に示す。このＥＬＩＳＡ形式において、ＣＴＬＡ４−Ｎ２は、アバタセプトと同様、ＣＤ８０−ｍＩｇに結合することがわかったが、ＣＴＬＡ４／ＩＬ１０  Ｘｃｅｐｔｏｒが示すＣＤ８０結合は、より弱いようであった。
【０１９１】
（ｓＩＬ１０Ｒ１とｓＣＤ８０の両方に対するＸｃｅｐｔｏｒ結合）
９６ウェル黒色Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＣＤ８０プレート（Ｎｕｎｃカタログ番号４３７１１１）プレートの各ウェルを、２μｇ／ｍｌ溶液のｓＩＬ１０Ｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号５１０−０２０）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをブロッキング緩衝液（３％無脂肪粉乳を含むＰＢＳ−Ｔ）でブロックした。ブロッキング緩衝液で連続希釈した試験対象のタンパク質の試料を、ｓＩＬ１０Ｒａコートプレートのウェルに二連で添加し、プレートに覆いをし、室温で約１時間インキュベートした。洗浄後、１０ｎｇ／ｕｌの抗ＣＤ１５２抗体（Ａｎｃｅｌｌ♯３５９−０２０）または５ｕｇ／ｍｌのＣＤ８０−ｍＩｇ（Ａｎｃｅｌｌ♯  ５１０−０２０）を添加した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｐｉｅｒｃｅ  ♯３１４３９）（ブロッキング緩衝液中１：１０，０００に希釈）を添加し、プレートに覆いをして室温で６０分間インキュベートした後、ＱｕａｎｔａＢｌｕＴＭ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１５１６９）において、室温で１０分間インキュベーションした。各ウェルの吸光度の読取りを４２０ｎｍで行なった。非関連融合タンパク質ＴＲＵ−０１５を陰性対照として使用した。
【０１９２】
図２は、ＣＴＬＡ４−Ｎ２および配列番号９のＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０  ｘｃｅｐｔｏｒで得られた結果を示す。この結果は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−ＩＬ１０  ＸｃｅｐｔｏｒのＣＴＬＡ４ドメインとＩＬ１０ドメインの両方が、そのリガンド／受容体に同時に結合し得ることを示す。
【０１９３】
（実施例４）
（Ｘｃｅｐｔｏｒ誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化）
ＩＬ１０−Ｒ１に対するＩＬ１０の結合によりＪａｋ−１およびＴｙｋが活性化され、これによりＳＴＡＴ３の活性化がもたらされることがわかっている（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２００７）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：６９６５−６９７５参照）。また、研究により、フローサイトメトリーを用いてＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ３のリン酸化が試験され得ることが示されている（Ｌａｆａｒｇｅら（２００７）ＢＭＣ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８：６４）。配列番号９のＣＴＬＡ４／ＩＬ１０  Ｘｃｅｐｔｏｒを含む種々のＩＬ１０含有構築物がヒトＰＢＭＣにおいてＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導する能力を、実質的に以下のようにして調べた。
【０１９４】
ＰＢＭＣをヒトドナーから単離し、完全培地（ＲＰＭＩ，１０％ＦＢＳ，ペニシリン／ストレプトマイシン）中で、２×１０６細胞／ｍｌで一晩培養した。翌朝、ＰＢＭＣを１回洗浄し、予備加温ＲＰＭＩ  １６４０（補給物なし）を用いて４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させ、３７℃で２．５時間インキュベートした。処理物を、０．２５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０中に２倍濃度で調製し、０．２５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０中の１×１０６のＰＢＭＣと混合した。次いで、試料を３７℃で１５分間インキュベートした。１５分間のインキュベーションが終了したら、０．５ｍＬの氷冷ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５４６５５）を各チューブに添加した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、次いで、２ｍｌのＤＰＢＳ＋２．５％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄した。試料のデカンテーションおよびボルテックス後、０．５ｍＬの氷冷ＢＤ  ＰＥＲＭ  ＢＵＦＦＥＲ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５８０５０）を各チューブに添加し、次いで、試料を氷上で３０分間インキュベートした。試料を２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、最終洗浄後、約０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。２０ｕＬのＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＳＴＡＴ３
ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＰＹ７０５）を各試料に添加した。細胞を、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。次いで、試料をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、結合していない抗体をすべて除去した。試料をＬＳＲＩＩフローサイトメータにて分析した。ＳＳＣおよびＦＳＣプロフィールに基づいてリンパ球生細胞にゲートを適用し、ＦＩＴＣのＭＦＩを測定した。
【０１９５】
図３および図４に示されるように、ＩＬ−１０含有構築物はすべて、ＳＴＡＴ３リン酸化を用量依存的様式で増大させた。
【０１９６】
（実施例５）
（ＣＤ８６およびＣＤ８６とＩＬ１０との両方に対するＸｃｅｐｔｏｒ結合）
ＣＤ８６を発現するヒトＢリンパ芽球系細胞株（ＷＩＬ２−Ｓ）を用いてＣＤ８６結合を調べ、ＣＤ８６を表面上に発現するＣＨＯ細胞株（ＨｕＣＤ８６−２Ａ２細胞）を、マウスＩｇＧ  Ｆｃに連結させた可溶性ＩＬ１０受容体１（ＩＬ１０Ｒ１）融合タンパク質または抗ＩＬ１０抗体と組み合わせて用い、ｘｃｅｐｔｏｒ分子上にみられるＣＤ８６アンタゴニストとＩＬ１０アゴニストの同時結合を調べた。簡単には、ＷＩＬ２−ＳまたはＨｕＣＤ８６−２Ａ２細胞を、飽和レベルからバックグラウンドレベルまでの範囲の濃度のＣＤ８６アンタゴニストを含む試験分子とともにインキュベートした。ＨｕＣＤ８６−２Ａ２細胞に、ＩＬ１０Ｒ１−ｍｕＩｇ融合タンパク質またはマウス抗ＩＬ１０抗体をさらに添加し、ＣＤ８６によって細胞表面に結合された試験分子との複合体を形成させた。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ｘｃｅｐｔｏｒ分子、ＩＬ１０Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質、または抗ＩＬ１０抗体のＦｃ部分に特異的なフルオロフォア（Ｒ−フィコエリトリン）タグ化Ｆ（Ａｂ’）２抗体。次いで、このタグ化細胞をフローサイトメータに通し、各試料の中央値蛍光強度をプロットすることによりデータを分析した。
【０１９７】
図５に示されるように、抗ＣＤ８６結合ドメイン（例えば、ハイブリドーマ抗体３Ｄ１およびＦＵＮ１由来）を含むｘｃｅｐｔｏｒ分子によるＷＩＬ２−Ｓ細胞上のＣＤ８６への結合では、ＣＴＬＡ４エクトドメイン含有ｘｃｅｐｔｏｒ分子の結合よりも高い親和性が示された。より詳しくは、抗ＣＤ８６  ３Ｄ１含有ｘｃｅｐｔｏｒ  ３Ｄ１：：ＩＬ１０（配列番号１８９）は、ＣＤ８６に対して、抗ＣＤ８６  ＦＵＮ１含有ｘｃｅｐｔｏｒ  ＦＵＮ１：：ＩＬ１０（配列番号１８７）よりもわずかに高い親和性を有したが、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（配列番号１１）およびＣＴＬＡ４含有ｘｃｅｐｔｏｒ（配列番号１７３）は、ＣＤ８６に対して、ハイブリドーマ抗体３Ｄ１およびＦＵＮ１由来の抗ＣＤ８６結合ドメインよりもずっと低い親和性を有した。
【０１９８】
図６に示されるように、ＣＤ８６アンタゴニストおよびＩＬ１０アゴニストを含むｘｃｅｐｔｏｒ分子は、ＨｕＣＤ８６−２Ａ２細胞（研究所内で開発したＣＤ８６を細胞表面発現するＣＨＯ細胞）上のＣＤ８６と可溶性ＩＬ１０Ｒ１とに、同時に結合し得た。さらに、図６は、これらのＩＬ１０改変体がＩＬ１０Ｒ１に対して異なる結合親和性を有したことを示す。例えば、ｘｃｅｐｔｏｒ分子ＣＴＬＡ４：：モノＩＬ１０（配列番号１８１）および（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７５（配列番号１７３）は、ＩＬ１０Ｒ１に対して同様の親和性を有したが、ウイルス変異型ＩＬ１０形態を含むｘｃｅｐｔｏｒであるＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０Ｉ８７Ａ（配列番号１９１）およびＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０Ｉ８７Ｓ（配列番号１９３）では、ＩＬ１０Ｒ１に対してずっと低い親和性が示された。
【０１９９】
別の実験において、ヒト化ＦＵＮ１  ＳＭＩＰの異なる変形型をＣＤ８６結合について試験した。ヒト化ＦＵＮ１  ＳＭＩＰの該６種類の異なる変形型で一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清を、ＨｕＣＤ８６−２Ａ２細胞を用いて、ＣＤ８６結合について調べた。図７は、ＦＵＮ１−２１（配列番号２２７）がＣＤ８６に対して最良の結合親和性を有し、続いてＦＵＮ１−２２（配列番号２３３）、次いで、ＦＵＮ１−１１（配列番号２２５）であり、残りのヒト化ＦＵＮ１  ＳＭＩＰタンパク質（ＦＵＮ１−１２，配列番号２２９；ＦＵＮ１−３１，配列番号２３１；ＦＵＮ１−３２，配列番号２３５）は検出可能な結合を示さなかったことを示す。
【０２００】
（実施例６）
（Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質における種々の結合ドメインリンカーの長さ）
ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０分子のリンカー安定性を調べた。リンカー改変体をすべて、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞内に安定的にトランスフェクトし、安定なバルク集団を３７℃で培養し、第３日目に３４℃にシフトした。タンパク質をプロテインＡカラムによって精製した後、第２工程のＳＥＣカラムによって精製した。ＥＬＩＳＡアッセイを行ない、ＩＬ１０Ｒ１−ｍＩｇ融合タンパク質に対するＩＬ１０結合を測定した。図８の結果により、ｘｃｅｐｔｏｒ（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６５（配列番号９）では、リンカーの不安定性によりＩＬ１０結合が低減されていたが、（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６８（配列番号１７１）、（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６９（配列番号３０２）、および（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７５（配列番号１７３）は、これらの培養条件において安定であることが示された。
【０２０１】
また、より短いリンカー改変体も、ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０  ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質において、ＩＬ１０Ｒ１に対する結合をＥＬＩＳＡにより試験した。この短いリンカー改変体を一過的にトランスフェクトし、タンパク質をプロテインＡカラムで精製した。ＥＬＩＳＡアッセイを行ない、ＩＬ１０Ｒ１−ｍＩｇ融合タンパク質に対するＩＬ１０結合を測定した。図９の結果により、この短いリンカー改変体（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７７（配列番号１７５）、Ｑ００３３（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７８（配列番号１７７）、および（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７９（配列番号１７９）は、後部末端ＩＬ１０結合親和性に関して、より長いリンカーと同様に機能することが示された（例えば、（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６８；配列番号１７１と比較）。
【０２０２】
（実施例７）
（Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質の血清安定性および薬物動態）
（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７５（配列番号１７３）の血清安定性を試験した。この実験では、配列番号１７３の精製タンパク質を、マウス血清中３７℃で、２４時間、７２時間およびＦ／Ｔ（凍結／解凍）およびアッセイ時点（Ｔ０）でスパイクイン（ｓｐｉｋｅ  ｉｎ）で処理した。すべての安定性試料を、ＣＤ８０に対するその結合について（ＣＤ８０発現１Ｆ６  ＣＨＯ細胞を使用）、ならびにＣＤ８０に対する同時結合およびｘｃｅｐｔｏｒ上のＩＬ１０に対する抗ＩＬ１０抗体の結合について試験した。その結果により、配列番号１７３は非常に安定であり、マウス血清中でのインキュベーション後も、試験濃度（約０．０１ｎＭ〜約１０ｎＭ）において抗ＩＬ１０結合を保持していることが示された。
【０２０３】
（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６８（配列番号１７１）および（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７５（配列番号１７３）について、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて各時点で３匹のマウスを用いて薬物動態（ＰＫ）試験を行なった。マウスには、２００μｇ／マウスで静脈内注射した。マウス血清を、処置後１５分、２時間、６時間、２４時間、４８時間、９６時間、７日および１４日の時点で採取した。試料を、ＣＤ８０結合（ＣＴＬＡ４アッセイ）およびＣＤ８０と抗ＩＬ１０抗体（ＩＬ１０アッセイ）とに対する同時結合について試験した。結果を以下の表４にまとめる。
【０２０４】
【表４】
2014239700.tif 000007
（実施例８）
（ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＬ１０Ｒ１に対するＸｃｅｐｔｏｒ結合）
ＣＤ８０およびＩＬ１０Ｒ１結合をＥＬＩＳＡにより調べ、ならびに／またはＣＤ８６およびＩＬ１０Ｒ１結合を、ＣＤ８６発現ＣＨＯ細胞およびＩＬ１０Ｒ１−Ｉｇまたは抗ＩＬ１０のいずれかを用いて調べた。マウスＣＤ８０およびＣＤ８６に対する結合を、ＥＬＩＳＡにより、ビオチン標識マウス抗体を用いて調べた。調べる分子には、対照ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（配列番号１１）融合タンパク質と、以下の試験ｘｃｅｐｔｏｒ分子：（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６５（配列番号９）；（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６８（配列番号１７１）；（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６９（配列番号３０２）、（ＣＴＬＡ４：：ＰＤＬ２）−６５（配列番号３３６）を含め、実質的に実施例３および５に記載のとおりにした。
【０２０５】
図１０および１１に示されるように、（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６５、（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６８、および（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６９  ｘｃｅｐｔｏｒ分子はすべて、ＥＬＩＳＡにより、ＣＤ８０および細胞上のＣＤ８６に結合した。図１２の結果は、ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０  ｘｃｅｐｔｏｒ分子がｈｕＩＬ１０Ｒ１と相互作用し得ることを示す。さらに、図１３に示されるように、ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０  ｘｃｅｐｔｏｒは、ＥＬＩＳＡにより、ＢＤ１（アミノ末端結合ドメイン）とＢＤ２（カルボキシ末端結合ドメイン）の両方を、ＣＤ８０およびＩＬ１０Ｒ１に同時に関与させ得る。また、図１４および１５は、（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６５、（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６８、および（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６９  ｘｃｅｐｔｏｒ分子（ヒト分子に特異的）が、マウスＣＤ８０およびマウスＣＤ８６の両方と交差反応し得ることを示す。
【０２０６】
（実施例９）
（ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによるＣＤ８０に対するＸｃｅｐｔｏｒ結合）
ＣＤ８０結合活性を、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を含むＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合体（ベラタセプト（ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ）と類似）（配列番号２１７）、各々、ＣＴＬＡ４エクトドメインとＩＬ１０ドメインとを有する３つのＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０  ｘｃｅｐｔｏｒリンカー改変体：（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６５（配列番号９）、（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−６８（配列番号１７１）、および（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７５（配列番号１７３）；Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を有するＣＴＬＡ４エクトドメインとＩＬ１０ドメインとを含むｘｃｅｐｔｏｒ（配列番号２１９）、ならびにＣＴＬＡ４エクトドメインとＰＤ−Ｌ１ドメインとを含むｘｃｅｐｔｏｒ（配列番号１３）で、実質的に本明細書に記載のようにして調べた。ＢＩＡｃｏｒｅによるＣＤ８０／８６に対するＣＴＬＡ４−Ｆｃの結合の試験は、既に報告されている（Ｇｒｅｅｎｅら（１９９６）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２６７６２−２６７７１；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅら（１９９７）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８５：３９３−４０３；Ｃｏｌｌｉｎｓら（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：２０１−２１０）。ＣＴＬＡ４によるＣＤ８０の結合は中程度の親和性（Ｋｄ＝約２００ｎＭ）であり、高いオン速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）（４〜８×１０５Ｍ−１ｓ−１）および中程度のオフ速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（０．０９０ｓ−１）を特徴とする。ＣＤ８０に対する二量体ＣＴＬＡ４−Ｆｃの結合は二相性であり、２つのオフ速度（０．００４、０．０８６ｓ−１）が報告されている。ＣＴＬＡ４−ＦｃにおけるＬ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異により、ＣＤ８０に対する親和性が、野生型ＣＴＬＡ４−Ｆｃと比べて２倍増大することが報告されており（Ｌａｒｓｅｎら（２００５）Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ５：４４３−４５３）、これは、主に初期オフ速度の減少による（０．００２２１ｓ−１に対して０．００１０８ｓ−１と報告）。
【０２０７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００  ＳＰＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）において、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を泳動緩衝液として用いて行なった。ＣＤ８０−ｍＩｇＧ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２５μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０；Ａｎｃｅｌｌ，Ｉｎｃ）をＣＭ５チップ上に、標準的なアミンカップリング化学反応（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、最終固定化レベル３１７、９７３、および１６７８Ｒｕ（共鳴単位）で直接固定化した。ＣＴＬＡ４含有構築物を１５０秒間、１０μｌ／分の流速で、５ｎＭ〜１μＭの一連の濃度で注入した。解離を６００秒間モニタリングし、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ４．０）を６０秒間注入することにより表面を再生させた。表面との結合相互作用は、少なくとも７５回の再生サイクル中、安定であった。データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｔ１００用）ソフトウェア（バージョン２．０．１，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。
【０２０８】
固定化ＣＤ８０に対するＣＴＬＡ４構築物の結合反応速度は、１：１ラングミュア結合モデルにフィットできなかったが、二価アナライト結合モデルには高精度でフィットできた。インジェクションの長さを長くすることにより会合相を増大させても、反応速度パラメータの計算値は変更されなかった。各構築物の平衡解離定数（ＫＤ）は、飽和時の観察された応答を定常状態の平衡モデルにフィットさせることにより高精度で計算され得た。すべてのＣＤ８０結合分子の結果を以下の表５にまとめる。
【０２０９】
【表５】
2014239700.tif 000008
Ｘｃｅｐｔｏｒの平衡親和性を測定すると、アバタセプトのもの、およびＣＴＬＡ４−Ｆｃで報告された親和性（２００ｎＭ；Ｇｒｅｅｎｅら  １９９６，同書）と類似していた。ＣＴＬＡ４：：ＰＤＬ１  ｘｃｅｐｔｏｒの結合反応速度は、アバタセプトまたはＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０  ｘｃｅｐｔｏｒのものと異なっていたが、オン／オフ速度を補正すると同様の親和性になる。これは、ＰＤ−Ｌ１がＣＤ８０に、ＣＴＬＡ４（２．５μＭのＫＤ）よりも弱い親和性で結合するためであろう。先の試験と同様、Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を含むＣＴＬＡ４改変体（配列番号２１７および２１９）は、ＣＤ８０に対してより高い親和性を有し、初期オフ速度のほぼ２倍の改善がみられた（配列番号２１７で０．００３７３ｓ−１に対してアバタセプトでは０．００６ｓ−１）。
【０２１０】
（実施例１０）
（ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによるＣＤ８６に対するＸｃｅｐｔｏｒ結合）
ＣＤ８６結合活性を、アバタセプト、Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を含むＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合体（ベラタセプトと類似）（配列番号２１７）、ＣＴＬＡ４エクトドメインとＩＬ１０ドメインとを含むｘｃｅｐｔｏｒ（配列番号９）、Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を有するＣＴＬＡ４エクトドメインとＩＬ１０ドメインとを含むｘｃｅｐｔｏｒ（配列番号２１９）、ならびに３Ｄ１およびＦＵＮ１抗ＣＤ８６抗体由来の抗体可変ドメインを含む種々の構築物（ＳＭＩＰ、ＰＩＭＳ、およびｘｃｅｐｔｏｒ）で、実質的に本明細書に記載のようにして調べた。ＣＴＬＡ４によるＣＤ８６の結合は低親和性（Ｋｄ＝約２．２μＭ）であり、高いオン速度（２〜１３×１０５Ｍ−１ｓ−１）および中程度のオフ速度（０．４２ｓ−１）を特徴とする。ＣＴＬＡ４−ＦｃにおけるＬ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異により、ＣＤ８６に対する親和性が、野生型ＣＴＬＡ４−Ｆｃと比べて４倍増大することが報告されている（Ｌａｒｓｅｎら（２００５）Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ５：４４３−４５３）、これは、主に初期オフ速度の減少による（０．００８１６ｓ−１に対して０．００２０６ｓ−１と報告）。明らかに、３Ｄ１またはＦＵＮ１抗体の反応速度または平衡親和性データはこれまでに公表されておらず、そのためこれらの相対親和性を求めた。
【０２１１】
ＣＴＬＡ４エクトドメインを基礎とする低親和性ＣＤ８６結合ドメイン。ＳＰＲの測定を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００  ＳＰＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）において、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を泳動緩衝液として用いて行なった。ＣＤ８６−ｍＩｇＧ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２５μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０、Ａｎｃｅｌｌ，Ｉｎｃ）をＣＭ５チップ上に、標準的なアミンカップリング化学反応（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、最終固定化レベル３７、３７３、および９０３Ｒｕで直接固定化した。ＣＴＬＡ４含有構築物を１５０秒間、１０μｌ／分の流速で、４ｎＭ〜１０μＭの一連の濃度で注入した。解離を６００秒間モニタリングし、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）を６０秒間（野生型ＣＴＬＡ４）、または１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）（Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ  ＣＴＬＡ４）を注入することにより表面を再生させた。表面との結合相互作用および固定化レベルは、少なくとも１００回の再生サイクル中、安定であった。データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｔ１００用）ソフトウェア（バージョン２．０．１，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。ＣＤ８６に対するＣＴＬＡ４の低親和性、ならびに非常に高いオン速度およびオフ速度（文献値は、０．２〜１．３×１０６Ｍ−１ｓ−１のｋａおよび０．４２ｓ−１のｋｄ，ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００計測器の検出限界である）のため、固定化ＣＤ８６に対するアバタセプトの結合反応速度は測定され得なかった。しかしながら、Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ  ＣＴＬＡ４ドメインを有する構築物（配列番号２１７；配列番号２１９）の固定化ＣＤ８６に対する結合反応速度は、観察された応答を二価アナライトモデルにフィットさせることによりほどほどの精度で測定され得た。すべての構築物の平衡解離定数（ＫＤ）は、飽和時の観察された応答を定常状態の平衡モデルにフィットさせることにより高精度で計算され得た。結果を以下の表６に示す。
【０２１２】
３Ｄ１およびＦＵＮ１抗体可変ドメインを基礎とする高親和性ＣＤ８６結合ドメイン。ＳＰＲの測定を、以下の：ＨＢＳ−Ｐ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を泳動緩衝液として使用したこと；解離を１２００秒間モニタリングしたこと；および１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）を６０秒間注入することにより表面を再生させたこと以外は上記のようにして行なった。固定化ＣＤ８６に対する結合反応速度は、すべての場合で測定され得た。しかしながら、各構築物の平衡解離定数（ＫＤ）は、飽和時の観察された応答を定常状態の平衡モデルにフィットさせることにより高精度で計算され得た。結果を以下の表６に示す。
【０２１３】
【表６】
2014239700.tif 000009
アバタセプトの平衡親和性（３．２μＭ）は、ＣＴＬＡ４−Ｆｃで報告された親和性（２．２μＭ；Ｇｒｅｅｎｅら  １９９６，同書）と類似していた。先の試験と同様、Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を含むＣＴＬＡ４改変体（配列番号２１７；配列番号２１９）は、ＣＤ８６に対して４〜５倍高い親和性を有していた（６７０〜７７２ｎＭ）。３Ｄ１マウス単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）をＮ末端に含む構築物（３Ｄ１  ＳＭＩＰ，配列番号３１７；３Ｄ１：：ＩＬ１０，配列番号１８９）は、３Ｄ１  ｓｃＦｖをＣ末端に有する対応構築物（３Ｄ１  ＰＩＭＳ，配列番号３１９；ＩＬ１０：：３Ｄ１，配列番号１８５）よりも高い親和性を有しており（１１．７、２６．５ｎＭ）；結合反応速度を調べると、これは、高い初期オン速度と低い初期オフ速度の両方のために生じているようであったが、すべての場合で、ＣＤ８６に対する親和性は、アバタセプトよりも少なくとも１００倍高かった。ＦＵＮ１抗体について、親マウスモノクローナル抗体を、２種類のヒト化単鎖ＦＵＮ１抗体断片を含むＳＭＩＰタンパク質（配列番号２２５および２２７）とともに調べた；２つのうちの後者（配列番号２２７）では、ＣＤ８６に対して、親ＦＵＮ１  ｍＡｂと同様の結合反応速度および全体親和性が示され（それぞれ、２６．９、３６ｎＭ）、この場合も、アバタセプトよりも有意に高かった。ヒト化ＦＵＮ１抗体断片をカルボキシ末端に含むＸｃｅｐｔｏｒまたはＰＩＭＳ分子（ＩＬ１０：：ＦＵＮ１−２１，配列番号２５４；（ＩＬ１０  Ｉ８７Ａ：：ＦＵＮ１−２１）−７５，配列番号２５８；（モノＩＬ１０−Ａ２ヒンジ：：ＦＵＮ１−２１）−７５，（配列番号２７６）；ＦＵＮ１−２１  ＰＩＭＳ，配列番号４０２）は、アミノ末端に親抗体配列を含むｘｃｅｐｔｏｒ（ＦＵＮ１：：ＩＬ１０，配列番号１８７）またはＳＭＩＰタンパク質上のアミノ末端の同じＦＵＮ１−２１結合配列（配列番号２２７）よりも低い親和性を有した。
【０２１４】
（実施例１１）
（ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによるマウスＣＤ８６に対するＸｃｅｐｔｏｒ結合）
マウスＣＤ８６結合活性を、アバタセプト、Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を含むＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合体（ベラタセプトと類似）（配列番号２１７）、異なるＢＤ２リンカーを含むが同じＣＴＬＡ４およびＩＬ１０ドメインを含む２種類のｘｃｅｐｔｏｒ（配列番号１７１および１７３）、Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を有するＣＴＬＡ４エクトドメインとＩＬ１０ドメインとを含むｘｃｅｐｔｏｒ（配列番号２１９）、ヒトＦｃドメインとのマウスＣＴＬＡ４融合体（配列番号４０４）、ならびにラットＧＬ１抗マウスＣＤ８６抗体由来の抗体可変ドメインを含む種々の構築物、例えば、ＧＬ１抗体断片およびヒトＩＬ１０ドメインを含む２種類のｘｃｅｐｔｏｒ（ＧＬ１：：ＩＬ１０，配列番号２５２；およびＩＬ１０：：ＧＬ１，配列番号２５６）で、実質的に以下に記載するようにして調べた。ヒトＣＴＬＡ４は、マウスＣＤ８６と交差反応性であることがわかっているが、本発明者らが知る限り、反応速度または親和性の測定はこれまでに報告されていない。同様に、ラットＧＬ１抗体は、マウスＣＤ８６に特異的であることが報告されているが、反応速度または親和性の測定は報告されていない。
【０２１５】
ＳＰＲの測定を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００  ＳＰＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）において、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を泳動緩衝液として用いて行なった。マウスＣＤ８６−ｍＩｇＧ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２５μｇ／ｍＬ，ｐＨ４．０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）をＣＭ５チップ上に、標準的なアミンカップリング化学反応（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、最終固定化レベル１５０、４９３、および７４６Ｒｕで直接固定化した。ＣＴＬＡ４含有構築物を１５０秒間、１０μｌ／分の流速で、４ｎＭ〜８μＭの一連の濃度で注入した。解離を６００秒間（ＣＴＬＡ４構築物）または１２００秒間（ＧＬ１構築物）モニタリングし、１０ｍＭ  グリシン（ｐＨ１．７）を６０秒間注入することにより表面を再生させた。表面との結合相互作用および固定化レベルは、少なくとも１００回の再生サイクル中、安定であった。データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｔ１００用）ソフトウェア（バージョン２．０．１，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。固定化マウスＣＤ８６に対する結合反応速度は、すべての構築物で測定され得、高精度で二価アナライトモデルにフィットできた（表７）。また、各構築物の平衡解離定数（ＫＤ）も、飽和時の観察された応答を定常状態の平衡モデルにフィットさせることにより高精度で計算され得た。ＣＴＬＡ４改変体（配列番号１７１、１７３、２１７、２１９、および４０４）について、３つの異なる固定化密度の３種類の全フローセルにわたる同時平衡フィットにより、任意の１つのフローセルのフィットよりも精度の高い結果が得られ（いわゆる「多重Ｒｍａｘ」フィット）、その親和性を示す。結果を以下の表７に示す。
【０２１６】
【表７】
2014239700.tif 000010
ヒトＣＴＬＡ４およびヒトＩＬ１０ドメインを含むＸｃｅｐｔｏｒ（配列番号１７１および１７３）のマウスＣＤ８６に対する親和性（１．５４、１．８１μＭ）は、ヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃで報告されたヒトＣＤ８６に対する親和性（２．２μＭ；Ｇｒｅｅｎｅら  １９９６）よりもわずかに高かった。Ｌ１０４Ｅ  Ａ２９Ｙ変異を含むヒトＣＴＬＡ４改変体（配列番号２１７および２１９）のマウスＣＤ８６に対する親和性は２倍しか高くなく（８７０〜９２０ｎＭ）；これは、マウスＣＤ８６に対する有益な高い初期オン速度と不利益な高い初期オフ速度の組合せにより生じているようである。マウスＣＴＬＡ４は、マウスＣＤ８６に対して、ヒトＣＴＬＡ４と同様かまたはわずかに低い全体親和性を有するようである。ＧＬ１抗体について、親ラットモノクローナル抗体を、単鎖ＧＬ１抗体断片を含むＳＭＩＰ（ＧＬ１  ＳＭＩＰ，配列番号２３９）とともに調べた；両者で、マウスＣＤ８６に対する同様の結合反応速度および全体親和性が示され（それぞれ、３７．７、２６．２ｎＭ）、これは、ヒトまたはマウスＣＴＬＡ４含有構築物よりも有意に高かった（約５０倍）。ＩＬ−１０およびＧＬ１抗体断片を含むＸｃｅｐｔｏｒ（配列番号２５２および２５６）では、マウスＣＤ８６に対して、親抗体またはＳＭＩＰと比べて３倍低い親和性が示されたが、これは、各場合において、低い初期オン速度またはオフ速度のいずれかのために生じるようであった。
【０２１７】
（実施例１２）
（ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによるＰＤ１に対するＸｃｅｐｔｏｒ結合）
ＰＤ１結合活性を、ＰＤＬ１−Ｆｃ（配列番号２６８）およびＰＤＬ２−Ｆｃ（配列番号２７０）、ならびにＣＴＬＡ４エクトドメインとＰＤＬ１（配列番号１３）またはＰＤＬ２（配列番号３３６）ドメインのいずれかを含むｘｃｅｐｔｏｒで、実質的に以下のようにして調べた。ＰＤＬ２によるＰＤ１の結合は、一般的に、ＰＤＬ１によるＰＤ１の結合よりも親和性が高いと報告されている；以前の反応速度分析（Ｙｏｕｎｇｎａｋら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ３０７、６７２）で、中程度の親和性が示唆された（ＰＤＬ１で１１２ｎＭ、ＰＤＬ２で３７ｎＭ）が、別の形式で行なわれた平衡分析（Ｂｕｔｔｅら，（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７、１１１）では、より弱い親和性が示唆された（ＰＤＬ１で７７０ｎＭ、ＰＤＬ２で５９０ｎＭ）。
【０２１８】
ＳＰＲの測定を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００  ＳＰＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）において、ＨＢＳ−Ｐ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を泳動緩衝液として用いて行なった。Ｃ末端ＡｖｉＴａｇＴＭに融合させたＰＤ１エクトドメインを有する構築物（配列番号４０６）を、まず、ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ）（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中、ｐＨ８．０）を用いてビオチン化し、緩衝液をＰＢＳに交換した。ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中１００μｇ／ｍＬ，ｐＨ４．０，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）をＣＭ５チップ上に、標準的なアミンカップリング化学反応（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、最終固定化レベル１９１、７７１、および１５２２Ｒｕで直接固定化し、これを用いて、それぞれ、１７１、５９７、および１２４４Ｒｕレベルでビオチン化ＰＤ１を捕捉した。ＰＤＬ１／２含有構築物を１２０秒間、３０μｌ／分の流速で、６ｎＭ〜２μＭの一連の濃度で注入した。解離を１２００秒間モニタリングし、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌを３０秒間注入することにより表面を再生させた。表面との結合相互作用および固定化レベルは、少なくとも５０回の再生サイクル中、安定であった。
【０２１９】
データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｔ１００用）ソフトウェア（バージョン２．０．１，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。固定化ＰＤ１に対する結合反応速度は、すべての構築物で測定され得、二価アナライトモデル（配列番号２６８および２７０）または１：１結合モデル（配列番号１３および３３６）のいずれかに対して高精度でフィットできた（表８）。また、各構築物の平衡解離定数（ＫＤ）は、飽和時の観察された応答を定常状態の平衡モデルにフィットさせることにより高精度で計算され得た。結果を以下の表８に示す。
【０２２０】
【表８】
2014239700.tif 000011
ＰＤＬ１−Ｆｃ（配列番号２６８）およびＰＤＬ２−Ｆｃ（配列番号２７０）では、文献に報告されたものと同様の結合反応速度および全体親和性が示された。ＣＴＬＡ４と、カルボキシ末端に融合されたＰＤＬ１またはＰＤＬ２ドメインを含むＸｃｅｐｔｏｒ（配列番号１３および３３６）は、ＰＤ１に対して、アミノ末端ＰＤＬ１／ＰＤＬ２融合体（２４６、４２ｎＭ）よりも著しく弱い（約１０倍）親和性（２．３６、０．３４μＭ）を有した；これは、主に、初期オフ速度の顕著な増大（０．１６５、０．０３９５対０．０５４４、０．００７２４）により生じ、該結合ドメインがＢＤ２（カルボキシ末端）の位置に存在すると、ＰＤＬ１／２：ＰＤ１複合体が不安定化され得ることを示す。
【０２２１】
（実施例１３）
（Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質はヒトＴ細胞応答をブロックする）
この実施例は、本開示のｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質がヒトＴ細胞応答をブロックし得ることを示す。混合型リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用し、ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質によるブロックを試験した。簡単には、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２例のドナーから、標準的な方法を用いて単離し、別々に維持した。先の試験に基づき、第１のドナー由来のＰＢＭＣを「応答群」集団と命名し、第２のドナー由来のＰＢＭＣを「刺激群」集団と命名した。どちらのドナーＰＢＭＣも、標準的な方法を用いてＣＦＳＥで標識した。細胞分裂を抑制するため、刺激群ＰＢＭＣをマイトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）で処理した。ＭＭＣ（Ｓｉｇｍａ  ♯Ｍ４２８７−２ｍｇ）を、滅菌蒸留水（Ｇｉｂｃｏ  ♯１５２３０）中にて０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で再構成させた。刺激群ＰＢＭＣは、１×１０６／ｍｌの濃度で完全培養培地（ＣＭ）（１０％ヒトＢ血清，１００Ｕ／ｍｌペニシリン，１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン，２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，ＮＥＡＡ，ピルビン酸Ｎａを含むＲＰＭＩ−１６４０（０．２ｕｍ濾過ＣＭ））中に懸濁させ、ＭＭＣを、終濃度２５μｇ／ｍｌまで添加した。次いで、刺激群ＰＢＭＣ／ＭＭＣ混合物を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、細胞をＣＭで３回洗浄した。応答群および刺激群の細胞を４×１０６／ｍｌの濃度でＣＭ中に懸濁させ、９６ウェル平底組織培養プレートのウェルあたり０．０５ｍｌの各細胞集団を最終２×１０５細胞／ウェル／ドナーで添加した。図に示した表示濃度のすべての処理物をプレートに、細胞と同時に添加した（注：抗体および融合タンパク質について示した濃度はモル当量である）。次いで、ＭＬＲ条件（９６ウェルプレートＰＢＭＣ処理設定）を、３７℃、５％ＣＯ２で実験期間中インキュベートした。ＭＬＲ実験物を第７〜８日目に収集し、このとき、細胞をＣＤ５（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣＤ２５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光タグ化抗体で染色し、フローサイトメータ（ＬＳＲ  ＩＩ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）にて流した。データを、ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリーソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。ゲートストラテジーは以下のとおりとした：ＦＳＣ：ＳＳＣリンパ球ゲートに含まれる細胞をＣＤ５発現について分析し、その後続いて、ＣＤ５＋ゲートに含まれる細胞を、ＣＦＳＥ希釈およびＣＤ２５上方調節について分析した。ＣＤ５＋、ＣＦＳＥ低およびＣＤ２５高である細胞を、を活性化Ｔ細胞とみなした。
【０２２２】
図１６、１７、２１および２２は、ＣＤ８６アンタゴニストを異種結合ドメインとの組合せで含む多くの異なる種類のｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、応答群／刺激群ＭＬＲ条件に対するＴ細胞応答をブロックし得ることを示す。
【０２２３】
（実施例１４）
（ＣＤ８６アンタゴニストＸｃｅｐｔｏｒはマウスＴ細胞応答をブロックする）
２種類の異なるマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６（またはＢ６Ｄ２Ｆ１）およびＢＡＬＢ／ｃに由来するマウス脾細胞を、メス／ナイロンメッシュおよびＲＢＣ溶解法を用いて単離した。先の試験に基づき、マウス系統Ｃ５７Ｂｌ／６（またはＢ６Ｄ２Ｆ１）由来脾細胞を「応答群」集団と命名し、マウス系統ＢＡＬＢ／ｃ由来脾細胞を「刺激群」集団と命名した。どちらのマウス系統脾細胞も、上記のようにＣＦＳＥで標識した。細胞分裂を抑制するため、刺激群脾細胞をマイトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）で処理した。ＭＭＣ（Ｓｉｇｍａ  ♯Ｍ４２８７−２ｍｇ）を、滅菌蒸留水（Ｇｉｂｃｏ  ♯１５２３０）中にて０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で再構成させた。刺激群脾細胞は、５×１０７／ｍｌ濃度で、完全培養培地（ＣＭ）（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ、ピルビン酸Ｎａ、および０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０）中に懸濁させ、ＭＭＣを終濃度５０μｇ／ｍｌまで添加した。次いで、刺激群脾細胞／ＭＭＣ混合物を３７℃、５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした後、細胞をＣＭで３回洗浄した。応答群および刺激群の細胞を８×１０６／ｍｌの濃度でＣＭ中に懸濁させ、９６ウェル平底組織培養プレートのウェルあたり０．０５ｍｌの各細胞集団を最終４×１０５細胞／ウェル／系統で添加した。図１８〜２０に示した表示濃度のすべての処理物をプレートに、細胞と同時に添加した（注：抗体および融合タンパク質について示した濃度はモル当量である）。次いで、ＭＬＲ条件（脾細胞を有する９６ウェルプレート／処理設定）を３７℃、５％ＣＯ２で実験期間中インキュベートした。ＭＬＲ実験物を第４〜５日目に収集し、このとき、細胞をＣＤ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ２５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光タグ化抗体で染色し、フローサイトメータ（ＬＳＲ  ＩＩ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）にて流した。データを、ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリーソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。ゲートストラテジーは以下のとおりとした：ＦＳＣ：ＳＳＣリンパ球ゲートに含まれる細胞をＣＤ５発現について分析し、その後続いて、ＣＤ５＋ゲートに含まれる細胞をＣＦＳＥ希釈およびＣＤ２５上方調節について分析した。ＣＤ５＋、ＣＦＳＥ低およびＣＤ２５高である細胞を活性化Ｔ細胞とみなした。
【０２２４】
図１８−２０は、ＣＤ８６アンタゴニストを異種結合ドメインとの組合せで含む多くの異なる種類のｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、応答群（Ｂ６Ｄ２Ｆ１）／刺激群（ＢＡＬＢ／ｃ）ＭＬＲ条件に対するマウスＴ細胞応答をブロックし得ることを示す。
【０２２５】
（実施例１５）
（ＩＬ１０を含むＸｃｅｐｔｏｒ分子の免疫賦活活性）
種々のｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質におけるＩＬ１０の免疫賦活活性を、インビトロ細胞増殖アッセイにおいて試験した。特に、ＭＣ／９マウス肝臓脂肪細胞株を以下のようにして使用した。ＭＣ／９細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ♯ＣＲＬ−８３０６）をＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳおよび５％Ｒａｔ  Ｔ−ＳＴＩＭ（ＢＤ  ♯３５４１１５）中で培養した。Ｒａｔ  Ｔ−ＳＴＩＭなしの培地中でＭＣ／９細胞を洗浄し、一晩おいて置いた（３７℃、５％ＣＯ２でインキュベート、９６ウェル平底プレート内、１×１０５細胞／ウェル、１００μｌ／ウェル）。種々の濃度のＩＬ１０タンパク質およびｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質を２４時間インキュベートし、６時間後、増殖を［３Ｈ］チミジン取込みによって評価した。
【０２２６】
ＩＬ１０のＩ８７改変体は、野生型ＩＬ１０と比べて免疫賦活性が低いことがわかっている（Ｄｉｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：２１３，２０００）。ＩＬ１０は、通常、各単量体分子のアミノ末端ドメインが他の単量体のカルボキシ末端ドメインに結合しているホモ二量体を形成している。ＩＬ１０  Ｉ８７  改変体（Ｉ８７ＡおよびＩ８７Ｓ）を、ＩＬ１０の該２つのサブドメインをさらに引き離し、これらのサブドメインが分子内二量体を形成することを可能にする短いリンカー（ｇｇｇｓｇｇ；配列番号３７９）を有するＩＬ１０分子とともに、ｘｃｅｐｔｏｒ形式にて免疫賦活活性について調べた。
【０２２７】
図２３は、マウスＩＬ１０が、ＭＣ／９細胞増殖を、ＩＬ１０のアミノ酸８７に単一の変異を含むＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０−Ｉ８７Ａ（配列番号１９１）ｘｃｅｐｔｏｒよりも高い程度まで増進させ得ることを示す。図２４は、ヒトＩＬ１０と（ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０）−７５（配列番号１７３）がともに、ＣＴＬＡ４：：ＩＬ１０−Ｉ８７Ａ（配列番号１９１）またはＣＴＬＡ４：：モノＩＬ−１０（配列番号１８１）のいずれかよりも大きくＭＣ／９細胞増殖を増進させ得ることを示す。
【０２２８】
（実施例１６）
（Ｘｃｅｐｔｏｒ分子が特定の細胞型を標的とするようにする操作）
この実施例では、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質が特定の細胞型を標的とするようにする操作を説明する。これは、ＢＤ１およびＢＤ２の親和性を操作することによりなされる。４種類のＸｃｅｐｔｏｒ分子を、ＣＤ８６およびｈｕＩＬ１０Ｒ１に対して異なる親和性を有するように操作した。表９は、これらの４種類の分子の異なる親和性比を示す。例えば、ＣＤ８６結合ドメイン（例えば、３Ｄ１またはヒト化ＦＵＮ１）およびｈｕＩＬ１０Ｒ１に対して低い親和性を有する操作型ＩＬ１０分子（Ｉ８７Ａ）の使用によってＣＤ８６に対する親和性を改善することにより、次いで、かかる配置は、目的の特定の細胞型（ＡＰＣなど）を標的とするのに有利になるように使用され得る。
【０２２９】
【表９】
2014239700.tif 000012
（実施例１７）
（インビボ関節リウマチ動物モデルにおけるＸｃｅｐｔｏｒ活性）
（関節リウマチ）
本明細書において開示する任意のｘｃｅｐｔｏｒ分子の治療効能を、関節リウマチ（ＲＡ）、すなわちコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルおよびグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｇ６ＰＩ）モデルの２つのマウスモデルの少なくとも一方において調べる。これらの各モデルは、ＲＡにおける一部の特定の類型の治療用薬物の効能の推定に有用であることが示されている（Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．２：１６９；Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０３：８６；Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３６：１８５；ＭｃＤｅｖｉｔｔ，Ｈ．（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．２：８５；ＫａｍｒａｄｔおよびＳｃｈｕｂｅｒｔ（２００５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．７：２０参照）。
【０２３０】
（（ａ）ＣＩＡモデル）
ＣＩＡモデルは、その病因および免疫学的根拠に関して最も十分に特性評価された関節炎のマウスモデルである。また、これは、最も広く使用されているＲＡモデルであり、薬物が患者の疾患を抑止する能力の推定について完璧ではないが、ＲＡの新たな潜在的治療薬を研究する際には、多くの場合でモデル選択肢に考慮される（Ｊｉｒｈｏｌｔら（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．３：８７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｗ．Ｂ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｐ．４：２３２；Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ（２００３）Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）。
【０２３１】
ＣＩＡモデルでは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）で雄性ＤＢＡ／１マウスの免疫処置によって関節炎を誘導する。具体的には、マウスにＣＩＩ（ＣＦＡ中）を第−２１日目に皮内／皮下注射し、第０日目に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のＣＩＩで追加刺激する。マウスは、ＣＩＩ／ＩＦＡでの追加刺激の数日以内に関節炎の臨床徴候を発現する。ＣＩＩ／ＣＦＡで免疫処置したサブセット（０％〜１０％）のマウスは、追加刺激なしで第０日目またはその前後に関節炎の徴候を示し、これらは実験から除外する。一部のＣＩＡ実験では追加刺激を省き、代わりにマウスのＸｃｅｐｔｏｒまたは対照での処置を、ＣＩＩ／ＣＦＡでの免疫処置の２１日後（すなわち、最初の処置日を第０日目とする）から開始する。
【０２３２】
マウスは、Ｘｃｅｐｔｏｒ、ビヒクル（ＰＢＳ）、または陰性もしくは陽性対照で、予防的および／または治療的レジメンにおいて処置する。予防的処置は第０日目に開始し、対照（無処置）マウスの疾患がピークの間中、継続する。治療的処置は、大部分のマウスが軽度の関節炎の徴候を示したときに開始する。ＣＩＡおよびＧ６ＰＩの両関節炎誘発モデルにおいて良好な効能を有することが示されているＥｎｂｒｅｌ（登録商標）が、陽性対照として使用される。実験毎に収集するデータとしては、関節炎の臨床スコアおよび累積発生数が挙げられる。ＣＩＡモデルにおける関節炎の臨床徴候は、以下の表１０に示す０から４までの段階を用いてスコアリングされる。
【０２３３】
【表１０】
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（（ｂ）Ｇ６ＰＩモデル）
Ｇ６ＰＩモデルでは、アジュバント中のＧ６ＰＩでのＤＢＡ／１マウスの免疫処置によって関節炎を誘導する（ＫａｍｒａｄｔおよびＳｃｈｕｂｅｒｔ（２００５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．７：２０；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：４５０３；Ｂｏｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ら（２００５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．７：Ｒ１３１６；Ｉｗａｎａｍｉら、（２００８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５８：７５４；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、（２００８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．１０：Ｒ６６）。Ｇ６ＰＩは、事実上、体内のすべての細胞中に存在する酵素である。なぜ免疫処置によって関節特異的疾患が誘導されるのかはわかっていない。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））および抗ＩＬ６受容体モノクローナル抗体などのいくつかの薬剤により、Ｇ６ＰＩモデルにおいて関節炎の発症が抑止されることが示されている。
【０２３４】
関節炎を誘導するために、雄性ＤＢＡ／１マウスを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＧ６ＰＩで免疫処置する。具体的には、マウスにＣＦＡ中のＧ６ＰＩを第０日目に皮内／皮下注射すると、免疫処置の数日以内に関節炎の臨床徴候を発現する。上記のＣＩＡモデルと同様、マウスをｘｃｅｐｔｏｒ、ビヒクル（ＰＢＳ）、または陰性もしくは陽性対照で、予防的および／または治療的レジメンにおいて処置する。予防的処置は第０日に開始し、対照マウスの疾患がピークの間中、継続する。治療的処置は、大部分のマウスが軽度の関節炎の徴候を示したときに開始する。ＣＩＡおよびＧ６ＰＩの両関節炎誘発モデルにおいて良好な効能を有することが示されているＥｎｂｒｅｌ（登録商標）が、陽性対照として使用される。実験毎に収集するデータとしては、関節炎の臨床スコアおよび累積発生数が挙げられる。Ｇ６ＰＩモデルにおける関節炎の臨床徴候は、ＣＩＡモデルで使用されるものと同様の段階を用いてスコアリングされる。
【０２３５】
本発明を、本明細書に概略を示した具体的な実施形態と共に説明したが、多くの代替例、修正例および変形例が当業者に自明であることは明白である。したがって、上記に示した本開示の実施形態は例示であって限定を意図しない。以下の特許請求の範囲に規定される本開示の精神および範囲を逸脱することなく、種々の変更がなされ得る。本明細書において言及した、および／または出願データシートに列挙した特許、特許出願公開、特許出願、および非特許刊行物はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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