(57)【要約】【課題】本発明は、ラテックス免疫凝集測定法において、試料中の測定対象成分以外の成分によるいわゆるマトリクス効果を低減させる方法の提供を課題とする。【解決手段】ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の存在下にラテックス免疫凝集反応を行うことにより、マトリクス効果を低減させ、正確な測定をすることができた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、ラテックス免疫凝集法のための試薬：
（i）緩衝剤
（ii）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体
（iii）測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持するラテックス粒子。
【請求項２】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、平均分子量１０，０００〜１７，０００であり、かつ分子中のＥＯ含量が７５〜９５％である請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、平均分子量１０，８００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％であるか、平均分子量１３，３３３であり、かつ分子中のＥＯ含量が８５％であるか、平均分子量１５，５００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％であるものから選ばれる請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレングリコール（４０）、ポリオキシエチレン（２６０）ポリオキシプロピレングリコール（３５）、ポリオキシエチレン（２８０）ポリオキシプロピレングリコール（５５）から選ばれる請求項１に記載の試薬。
【請求項５】
測定対象物質に対する特異的親和性物質がモノクローナル抗体である請求項１〜４に記載の試薬。
【請求項６】
測定対象物質に対する特異的親和性物質が、ＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体である請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
以下の構成要素を含む、ラテックス免疫凝集法のためのキット：
緩衝剤を含有する第１試薬、および
測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持するラテックス粒子を含有する第２試薬；ここで、第１試薬と第２試薬の少なくとも一方がポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体を含有する。
【請求項８】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、平均分子量１０，０００〜１７，０００であり、かつ分子中のＥＯ含量が７５〜９５％である請求項７に記載のキット。
【請求項９】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、平均分子量１０，８００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％であるか、平均分子量１３，３３３であり、かつ分子中のＥＯ含量が８５％であるか、平均分子量１５，５００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％であるものから選ばれる請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレングリコール（４０）、ポリオキシエチレン（２６０）ポリオキシプロピレングリコール（３５）、ポリオキシエチレン（２８０）ポリオキシプロピレングリコール（５５）から選ばれる請求項７に記載のキット。
【請求項１１】
以下の工程を含む、ラテックス免疫凝集法：
生体由来の測定対象物質を含む試料に、i）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を接触させる工程、及びii）当該測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持するラテックス粒子を接触させる工程。
【請求項１２】
以下の工程を含む、ラテックス免疫凝集法において、マトリクス効果を低減させる方法：
生体由来の測定対象物質を含む試料に、i）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を接触させる工程、ii）当該測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持するラテックス粒子を接触させる工程、及びiii）当該測定対象物質と当該ラテックス粒子の凝集反応を測定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持させたラテックス粒子を用いるラテックス免疫凝集測定試薬および測定方法に関する。特に、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体の存在下にラテックス免疫凝集反応を行うことによりマトリクス効果を低減させることを目的としたラテックス免疫凝集測定試薬および測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中の測定対象物質（以下、目的成分ということがある）の測定方法として、ラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法ということがある）が臨床検査の分野で繁用されている。ＬＴＩＡ法は、例えば、目的成分に対する抗体を担持させたラテックス粒子（以下、抗体担持ラテックス粒子ということがある）を用い、目的成分である抗原と抗体担持ラテックス粒子とが抗原抗体複合物を形成して結合することによって生じるラテックス粒子の凝集（濁り）の程度を光学的手段（例えば、透過光を測定する比濁法、散乱光を測定する比朧法など）などにより検出する測定方法である。
【０００３】
ここで、目的成分の濃度は、用いる測定法における濃度較正基準（キャリブレータ）の測定値（基準測定値）に基づいて換算・算出されるものであるが、生体試料中には目的成分以外の様々な成分（以下、非目的成分ということがある）が含まれるため、生体試料中での目的成分と非目的成分の量比など、測定時の生体試料の状態によっては、みかけの測定値が、得られるべき測定値に対して高くなったり、低くなったり、ばらついてかたより（以下、かたより等ということがある）、正確な測定ができない場合がある。例えば、精製した目的成分と非目的成分を共存させて測定すると、非目的成分を共存させた場合の測定値が、精製した目的成分のみ（非目的成分を共存させない場合）の測定値と乖離するような場合である。このような試料中の非目的成分の組成（マトリクス）が測定値に影響を与える現象は、マトリクス効果とよばれ、測定系を構築する際の課題となっている。なお、本明細書において非目的成分について言及する場合には、血清タンパクなどの生体試料が元来有している成分以外に、血漿採取の際の抗凝固剤であるＥＤＴＡなどの測定系外から生体試料に持ち込まれる成分も含むものとして記載している。
【０００４】
このマトリクス効果は、一般に洗浄工程により物理的に非目的成分の除去が可能なヘテロジニアス系よりも、洗浄工程を有さないホモジニス系で問題となる場合が多い。このマトリクス効果の起こる原因は複雑であり、ホモジニアス系であるＬＴＩＡ法を例にすれば、試料中の非目的成分が、抗原抗体反応に直接影響を与える場合（非目的成分の粘度が高くラテックス粒子の分散を阻害する場合や目的成分を介さずに抗体担持ラテックス粒子同士を非特異的に凝集させる場合など）、目的成分の構造変化の惹起や目的成分との複合体形成（抗原エピトープの露出や被覆）を起こす場合、非目的成分の抗体担持ラテックス粒子への非特異的吸着（抗体パラトープの被覆など）を起こす場合などが原因として挙げられるが、このような原因が特定できるとは限らず、また原因が単独ではなく複数である場合も多いと考えられる。
【０００５】
このようなマトリクス効果を排除する方法として、キャリブレータや生体試料の希釈液に予め非目的成分を添加しておく方法が知られているが、測定系の感度低下を招く場合などには採用することができない。一方、測定系に特定の物質を共存させてマトリクス効果を排除する方法としては、特許文献１〜３に記載の方法が知られている。
【０００６】
特許文献１には、一般式（Ｉ）で示される化合物を免疫反応液中に添加することで、夾雑蛋白、脂肪等（非目的成分に相当）による望ましくない副反応である非特異反応を抑制し、測定対象物の高濃度域におけるプロゾーンの発生を抑え、さらには測定対象物の低濃度域も精度良く測定できるという発明が開示されている。ここで式（Ｉ）の化合物の[ ]内はオキシエチレン基とオキシアルキレン基とのランダム共重合体であり、特許文献１の一般式（Ｉ）の化合物にはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体は含まれない。
【０００７】
特許文献２には、片末端にアルキル基を有するポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体を免疫測定前の試料に添加することで非特異反応を抑制する検体処理試薬組成物が開示されている。前記組成物は、片末端にアルキル基を有するポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体を用いることを必須要件としており、両末端が水酸基のポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体については、非特異的反応の要因となる糖タンパク等の夾雑物（非目的成分に相当）の変性が阻害される、処理液中への可溶性や分散性が落ちるなどの理由により、非特異的反応を抑制できないと記載されている（特許文献２明細書段落〔０００８〕）。そして、両末端が水酸基であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニックＬ−４４）では所望の効果がないことが比較例１としても示されている。また、本組成物で処理された検体については、免疫クロマトグラフィーにより当該検体中の測定対象の検出が行われており、本組成物による処理がＬＴＩＡ法においても同様の効果を奏するかどうかは明らかではない。
【０００８】
特許文献３には、第４級アンモニウム塩とポリエチレン−ポリプロピレン共重合体を反応系に添加することで非特異反応を抑制する免疫比濁測定方法が開示されている。しかし、本測定方法は、抗原抗体反応などによる分子会合体形成を抑制する効果をもつ第４級アンモニウム塩を測定系に添加することを必須としており、目的としない分子会合体形成を抑制しつつ、目的とする分子会合体形成には影響を及ぼさないようにするために、適切な濃度範囲を選択している。ここで、ポリエチレン−ポリプロピレン共重合体については、添加剤の一例として記載があるのみで実際に添加した実施例はなく、また、該共重合体の効果がどのようなものであるかという記載もない。なお、ポリエチレン−ポリプロピレン共重合体の市販品の例にはプルロニックＦ８８が含まれてはいるものの、前述のとおり、実施例および作用効果について、記載も示唆もない。
さらにまた、本免疫比濁測定方法は、ラテックス等の不溶性担体を用いずに抗原抗体反応で生じる不溶性の免疫複合体を測定するものであり、不溶性担体を用いた場合にも同様の効果を奏するかどうかは明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平２−１０３４６６号公報
【特許文献２】特開２００９−１８６３５９号公報
【特許文献３】特開平６−３００７６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持させたラテックス粒子を用いるラテックス免疫凝集測定法（ＬＴＩＡ法）において、いわゆるマトリクス効果を低減させる試薬ならびに該マトリクス効果を低減させたＬＴＩＡ法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＬＴＩＡ法における上記課題を解決するため、鋭意研究をおこなったところ、全く意外なことに、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の存在下にラテックス免疫凝集反応を行うと、生体試料あるいは測定系外から持ち込まれた成分（血漿採取の際の抗凝固剤であるＥＤＴＡなど）に由来するマトリクス効果を低減させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。上記特許文献１〜３のいずれにもポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を用いてマトリクス効果を低減させたラテックス免疫凝集測定法について記載されておらず、また示唆もされていない。
【００１２】
本発明は、以下の構成を有する。
（１）以下を含む、ラテックス免疫凝集法のための試薬：
（i）緩衝剤
（ii）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体
（iii）測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持するラテックス粒子。
（２）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、平均分子量１０，０００〜１７，０００であり、かつ分子中のＥＯ含量が７５〜９５％である（１）に記載の試薬。
（３）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、平均分子量１０，８００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％であるか、平均分子量１３，３３３であり、かつ分子中のＥＯ含量が８５％であるか、平均分子量１５，５００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％であるものから選ばれる（１）に記載の試薬。
（４）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレングリコール（４０）、ポリオキシエチレン（２６０）ポリオキシプロピレングリコール（３５）、ポリオキシエチレン（２８０）ポリオキシプロピレングリコール（５５）から選ばれる（１）に記載の試薬。
（５）測定対象物質に対する特異的親和性物質がモノクローナル抗体である（１）〜（４）に記載の試薬。
（６）測定対象物質に対する特異的親和性物質が、ＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体である（５）に記載の試薬。
（７）以下の構成要素を含む、ラテックス免疫凝集法のためのキット：
緩衝剤を含有する第１試薬、および
測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持するラテックス粒子を含有する第２試薬；ここで、第１試薬と第２試薬の少なくとも一方がポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体を含有する。
（８）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、平均分子量１０，０００〜１７，０００であり、かつ分子中のＥＯ含量が７５〜９５％である（７）に記載のキット。
（９）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、平均分子量１０，８００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％であるか、平均分子量１３，３３３であり、かつ分子中のＥＯ含量が８５％であるか、平均分子量１５，５００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％であるものから選ばれる（７）に記載のキット。
（１０）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレングリコール（４０）、ポリオキシエチレン（２６０）ポリオキシプロピレングリコール（３５）、ポリオキシエチレン（２８０）ポリオキシプロピレングリコール（５５）から選ばれる（７）に記載のキット。
（１１）以下の工程を含む、ラテックス免疫凝集法：
生体由来の測定対象物質を含む試料に、i）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を接触させる工程、及びii）当該測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持するラテックス粒子を接触させる工程
（１２）以下の工程を含む、ラテックス免疫凝集法において、マトリクス効果を低減させる方法：生体由来の測定対象物質を含む試料に、i）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を接触させる工程、ii）当該測定対象物質に対する特異的親和性物質を担持するラテックス粒子を接触させる工程、及びiii）当該測定対象物質と当該ラテックス粒子の凝集反応を測定する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、生体試料中あるいは測定系外から持ち込まれた成分などの非目的成分の影響を抑制し、マトリクス効果の低減されたＬＴＩＡ法が提供される。本発明により、ＬＴＩＡ法による生体試料中の目的成分の正確な測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】基準測定法（パナクリア（登録商標）ＭＭＰ−３「プレート」）での測定値とプルロニックＦ８８無添加ＬＴＩＡ法（対照例）あるいは０．００５％添加ＬＴＩＡ法（実施例）での測定値の相関性を試験した結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体）
本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する。
【００１６】
【化１】
2014206391.tif 000002
（式中、ａ，ｂ，ｃは任意の整数を表し、ａ＋ｃは４〜３００単位の平均重合度の酸化エチレンとなるよう決定され、かつｂは５〜１００単位の平均重合度の酸化プロピレンとなるよう決定される）
【００１７】
本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体は、上述のように疎水性のポリオキシプロピレンブロックポリマーが、２つの親水性のポリオキシエチレンブロックポリマーにより挟まれた構造より成り、非イオン性界面活性剤として挙動する。
なお、ポリオキシエチレン：（Ｃ2Ｈ4Ｏ）a又は（Ｃ2Ｈ4Ｏ）cは、ＥＯ、ＰＯＥなどの略号で、ポリオキシプロピレン：（Ｃ3Ｈ6Ｏ）bは、ＰＯ、ＰＯＰ、ＰＰＧなどの略号で表記される場合があり、本明細書においても同様の表記をすることがある。
【００１８】
本発明において使用するポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体を含有する市販品の具体的な例としては、一般に「プルロニック（登録商標）」の名称で販売されている非イオン性界面活性剤のうち「Ｆ」で括られる製品を挙げることができる。また「エパン（登録商標）」の名称で販売されている非イオン性界面活性剤も使用することができる。
なお、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体の成分としての表記方法は数種類存在し、各表記間で相互に同一性、類似性を確認できるが、同一名称の市販品であっても各表記間での数値が完全に一致しなかったり、ＥＯやＰＯの含量％から分子全体の分子量を計算しようとした場合などにも表示されている数値と完全に一致しないことがある。しかしながら、これらは重合性高分子に特有のものであり当業者は当然に理解しうる。
【００１９】
より具体的な市販品の例を、確認できる成分としての表記（１），（２）とともに挙げる。
プルロニックＦ１０８：
（１）ポリオキシエチレン含量８０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ３２５０
（２）ＥＯ−ＰＯ数：（１４０ｘ２）／５５
プルロニックＦ７７：
（１）ポリオキシエチレン含量７０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２３０６
（２）ＥＯ−ＰＯ数：（５２ｘ２）／３５
プルロニックＦ８７：
（１）ポリオキシエチレン含量７０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２６４４
（２）ＥＯ−ＰＯ数：（６２ｘ２）／３９
プルロニックＦ９８：
（１）ポリオキシエチレン含量８０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２７５０
（２）ＥＯ−ＰＯ数：（１２５ｘ２）／４８
プルロニックＦ８８：
（１）ポリオキシエチレン含量８０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２６４４
（２）ＥＯ−ＰＯ数：（９７ｘ２）／３９
プルロニックＦ６８：
（１）ポリオキシエチレン含量８０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ１９６７
（２）ＥＯ−ＰＯ数：（７５ｘ２）／３０
エパン７８５：
（１）ポリオキシエチレン含量８５％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２０００
（２）ＥＯ−ＰＯ数：（１３０ｘ２）／３５
【００２０】
これらのうち、プルロニックＦ８８およびプルロニックＦ６８は、以下の内容で医薬部外品原料規格２００６にも収載されている。
プルロニックＦ８８：
外原規名：ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（２００Ｅ．Ｏ）（４０Ｐ．Ｏ）、
プルロニックＦ６８：
外原規名：ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（１６０Ｅ．Ｏ）（３０Ｐ．Ｏ）、
なお、上記の（  ）内の数値は各ブロックポリマーの平均重合度を表す。
【００２１】
上記した以外にも医薬部外品原料規格２００６にはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が多数収載されており、これらを参照して本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体を選抜することができる。
また、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体は、ＥＯ含有量（％）を横軸、ＰＰＧ分子量を縦軸として区分けする「プルロニックグリッド」と呼ばれる区分け法があり、市販品のカタログ等にも記載されており、これらを参照して本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体を選抜することができる。
【００２２】
本発明においては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体の平均分子量が１０，０００〜１７，０００であり、かつ分子中のＥＯ含量が７５〜９５％であるものが好適であり、また、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体の平均分子量が１０，８００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％（市販品名：プルロニックＦ８８）であるか、平均分子量が１３，３３３であり、かつ分子中のＥＯ含量が８５％（市販品名：エパン７８５）であるか、平均分子量１５，５００であり、かつ分子中のＥＯ含量が８０％（市販品名：プルロニックＦ１０８）であるものが好適であり、また、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が、ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレングリコール（４０）（市販品名：プルロニックＦ８８）、ポリオキシエチレン（２６０）ポリオキシプロピレングリコール（３５）（市販品名：エパン７８５）、ポリオキシエチレン（２８０）ポリオキシプロピレングリコール（５５）（市販品名：プルロニックＦ１０８）であるものが好適である。
なかでも、酸化エチレンの平均重合度が２００単位、酸化プロピレンの平均重合度が４０単位の共重合体が好ましく、成分名：ポリオキシエチレン(２００)ポリオキシプロピレングリコール（４０）を含有するプルロニックＦ８８を使用することが好ましい。
【００２３】
本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を用いたＬＴＩＡ試薬の調製方法について、臨床検査の分野で繁用される抗体担持ラテックス粒子を用いるＬＴＩＡ試薬を例として以下説明する。臨床検査の分野で繁用されるＬＴＩＡ試薬は、抗体担持ラテックス粒子を含有しない試薬（第１試薬）及び抗体担持ラテックス粒子を含有する試薬（第２試薬）の二試薬（二試液）系で構成されている場合が多い。そしてこの構成を採用する場合、第１試薬は、第２試薬が行う抗原抗体反応に好適な測定環境（例えば、目的成分の希釈や抗原エピトープの露出など）を準備する役割を担っている場合が多い。
本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体は、ＬＴＩＡ試薬を構成する抗体担持ラテックス粒子を含有しない試薬（第１試薬）あるいは抗体担持ラテックス粒子を含有する試薬（第２試薬）のいずれに添加してもよいが、上述の二試薬（二試液）の構成の場合には、目的成分と抗体担持ラテックス粒子が接触する前にマトリクス効果が低減していることが望ましいので、抗体担持ラテックス粒子を含有しない試薬（第１試薬）に添加するのが好ましい。また、上述の構成にこだわらず抗体担持ラテックス粒子を含有する試液に添加する場合には、その添加のタイミングは、ラテックス粒子への抗体担持効率を変動させる可能性があるため抗体担持前ではなく、抗体担持後に添加するのが好ましい。
【００２４】
また、本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を抗体担持後のラテックス粒子を含有する試液に添加した場合には、添加後に、さらに１〜６５℃の適当な温度で、適当な時間、インキュベーションをすることができる。このようにすると、いわゆるブロッキング効果と同様の効果を抗体担持ラテックス粒子に付加することも期待できる。インキュベーションをする場合、３０〜６５℃で行うことが好ましい。３０℃未満であると、ブロッキング効果が充分に備わらない場合があり、また６５℃を超えると、抗体などに、タンパク質としての変性がおこり抗体活性を喪失する場合がある。好適なインキュベーション温度の一例として、３７℃前後でのインキュベーションを挙げることができる。インキュベーションをする場合の時間についても、制限はなく、期待するブロッキング効果が得られるよう、温度とあわせて実験的に選択をすることができる。なお、本明細書においては、このような加温・インキュベーション操作をブロッキング処理ということがある。
【００２５】
本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の濃度は、例えば、ラテックス免疫凝集反応時の濃度で規定することができる。好ましい濃度としては、０．０００１％〜１％、０．０００２％〜１％、０．０００４％〜１％、０．０００８％〜１％、０．００２％〜１％、０．００３％〜１％、０．００６％〜１％、０．０１％〜１％、０．０３％〜１％、０．０５％〜１％、０．０００１％〜０．５％、０．０００２％〜０．５％、０．０００４％〜０．５％、０．０００８％〜０．５％、０．００２％〜０．５％、０．００３％〜０．５％、０．００６％〜０．５％、０．０１％〜０．５％、０．０３％〜０．５％、０．０５％〜０．５％、０．０００１％〜０．２％、０．０００２％〜０．２％、０．０００４％〜０．２％、０．０００８％〜０．２％、０．００２％〜０．２％、０．００３％〜０．２％、０．００６％〜０．２％、０．０１％〜０．２％、０．０３％〜０．２％、０．０５％〜０．２％、０．０００１％〜０．１％、０．０００２％〜０．１％、０．０００４％〜０．１％、０．０００８％〜０．１％、０．００２％〜０．１％、０．００３％〜０．１％、０．００６％〜０．１％、０．０１％〜０．１％、０．０３％〜０．１％、および０．０５％〜０．１％、が挙げられる。一般的には、０．０００１％〜１％が好適であり、好ましくは０．００１％〜０．５％、より好ましくは０．０１％〜０．１％である。
【００２６】
上記のように発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体は、ＬＴＩＡ法において、測定系としての所望の測定感度、測定範囲、再現性、あるいは試薬の安定性などが得られることを勘案したうえで、実用的に最適な種類、濃度、ＬＴＩＡ試薬の調製方法を選択し適宜利用することができる。なお、本願明細書で「マトリクス効果を低減させる」というときは、生体試料中の非目的成分が共存することにより、ＬＴＩＡ法による生体試料中の目的成分の測定値が、濃度較正基準（キャリブレータ）の測定値（基準測定値）に基づいて得られるべき測定値に対してかたより等する場合に、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体がＬＴＩＡ法測定系中に存在することにより、該かたより等が得られるべき測定値に収束することを意味する。収束の有無は、基準測定値とＬＴＩＡ法測定値との相関性が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の非存在時に対して存在時に向上・改善されているかにより評価することができる。
【００２７】
以上、測定対象物質に対する特異的親和性物質あるいは測定対象物質を担持させたラテックス粒子として、抗体担持ラテックス粒子の場合を例に説明を行ったが、担持させる物質が抗原である場合も同様に理解すべきであることは当然である。なお、特異的親和性物質から見れば、測定対象物質が特異的親和性物質である。また、抗原と抗体に限らず、目的成分と該目的成分に対して特異的な結合相手が担持されたラテックス粒子間で結合が形成され、目的成分の存在量に依存したラテックス粒子の凝集が形成される場合には、それらの反応も本発明でいうラテックス免疫凝集反応に含まれる。
【００２８】
（ラテックス粒子）
本発明において、ラテックス粒子という場合には、ポリスチレンラテックス粒子などをいうが、上記のラテックス免疫凝集反応に含まれる場合であって、目的成分に対して特異的な結合相手を担持する方法が疎水結合など物理的な方法によるものである場合には、金属コロイド、シリカ、カーボンなども本発明のラテックス粒子に含まれる。ラテックス粒子のサイズは、使用する光学的測定法（例えば、透過光を測定する比濁法、散乱光を測定する比朧法など）を考慮し、所望の測定感度、測定範囲などが得られるよう０．０５〜１μｍの範囲から適宜選択することができる。自動分析装置における光学的測定においては平均粒子径０．１〜０．４μｍが汎用されており、好ましくは０．１〜０．２μｍである。ラテックス粒子の平均粒子径は粒度分布計や透過型電子顕微鏡像などで確認することができる。ラテックス粒子の試液中の濃度は、使用するラテックス粒子の粒径や測定系全体の設計にあわせ、例えば０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲から適宜選択をすることができる。
【００２９】
（ＬＴＩＡ試薬としての構成など）
本発明のＬＴＩＡ試薬（試液）は、反応の主成分の他に、試料のｐＨ、イオン強度、浸透圧などを緩衝、調整する成分として、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、及びグッドの緩衝液や、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含んでも良い。また凝集形成を増強する成分としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでも良い。また、凝集の形成をコントロールする成分として、タンパク質、アミノ酸、糖類、金属塩類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質など汎用される成分を１種類、または複数の成分を組合わせて含んでも良い。
【００３０】
本発明のＬＴＩＡ試薬は種々の生体試料を測定対象とすることができる。測定対象物質としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、理論的に測定可能な分子であれば特に制限はない。例としてＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ−３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、ＲＰＲ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、ＦＡＢＰ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＣＡ―ＲＦ、ＫＬ−６、ＰＩＶＫＡ―ＩＩ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＩＣ、ＰＡＩ、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩや、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどが挙げられる。
本発明において、測定対象物質に対する特異的親和性物質がモノクローナル抗体である場合の当該抗体の産生方法について説明する。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、KohlerとMilsteinの方法（Nature、第256巻495頁（1975年）参照）に準じ、測定対象物質で免疫した動物の脾臓細胞と同種のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを細胞融合して作製することができる。得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮して効果的に行うことができる。標準的な一例としては、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いる方法などにより、測定対象物質である抗原に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。具体的には、まず、ハイブリドーマの培養上清中の抗体を、プレートなどに固相化した抗原と反応させ、次いで標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により、抗原に対し高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
このように本発明において、モノクローナル抗体は、上記の試験方法に従って抗原を動物に免疫して作製したハイブリドーマより得ることもできるが、市販のモノクローナル抗体のうち所望の性質を有する抗体を用いることもできる。
【００３１】
本発明のＬＴＩＡ試薬は、前記したように一試液以上の複数の試液から構成される。複数の試液の例としては、測定対象物質を測定に好適な濃度に調整したり抗原抗体反応の環境を調整するなどを目的とする緩衝液からなる試液、抗体担持ラテックス粒子を含有する試液ほかが挙げられる。本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体は試薬を構成する全ての試液に含まれていても良いし、測定試薬を構成する試液のいずれかに選択的に含まれていても良い。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００３３】
〔実施例１〕本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の効果確認（１）
１．抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体の作製
（１）ハイブリドーマの作製
ａ．材料
・ヒトＭＭＰ−３:正常ヒト線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢ，理研ＲＣＢ，＃ＲＣＢ０２２２の培養上清より精製
・フロインド完全アジュバント：和光純薬工業社製，０１４−０９５４１
・ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）
・ＲＰＭＩ１６４０，ＧｌｕｔａＭＡＸ：ＧＩＢＣＯ社製，６１８７０−０３６
・Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ）：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４−００１−１Ａ
・ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ）：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製，Ｐ７３０６
・ＨＡＴ 培地：コスモバイオ社製，１６２１３００４
・９６穴プレート：ＮＵＮＣ社製，１６７００８
・ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）抗体：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製，１０３０−０５
【００３４】
ｂ．方法
（動物への免疫）
ヒトＭＭＰ−３とフロインド完全アジュバンドを等量ずつ混合して調製したエマルジョンを用い、オスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔もしくはフットパットに１匹あたり３０μｇを注射した。さらに、１週間の間隔で２〜７回、該エマルジョンの注射を繰り返した。マウス眼底静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００３５】
（抗体価の確認（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法））
上述のマウス抗血清中の抗ＭＭＰ−３抗体の存在を、ヒトＭＭＰ−３を固相化したＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）で確認した。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の詳細は以下である。
先ず、１μｇ／ｍＬになるようヒトＭＭＰ−３を、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解してＭＭＰ−３溶解液とし、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
前記各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）３００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳＴという）３００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。
前記各ウェルをＢＳＡ−ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１０倍から１００倍に希釈したマウス抗血清５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、５０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。
前記各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の結果、抗体価の高かったマウスから、脾臓もしくはリンパ節を摘出して、脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞を調製し、細胞融合に用いた。
【００３６】
（細胞融合）
前記脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞を細胞数で６対１の割合で混合し、ＰＥＧを添加して細胞融合させた。該融合させた細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ＣＯ2インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ2にて８日間培養して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
【００３７】
（２）ハイブリドーマの選別
（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法での選別）
上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、マウス抗血清の代わりに融合細胞の培養上清を用いた以外は、同様の方法を行った。測定の結果、吸光度の高いウェルを抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択し、抗ＭＭＰ−３抗体産生株を選抜した。
【００３８】
（競合ＥＬＩＳＡ法での選別）
上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、ヒトＭＭＰ−３を共存させて、競合ＥＬＩＳＡ法を行った。
測定の結果、吸光度の高いウェルを抗ＭＭＰ−３抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択し、抗ＭＭＰ−３抗体産生株を選抜した。
上述の２種類の選別方法でともに抗ＭＭＰ−３抗体産生株として選択されたハイブリドーマを用いて、ハイブリドーマの単クローン化とモノクローナル抗体の精製を行った。
【００３９】
（３）モノクローナル抗体の精製
単クローン化は定法（限界希釈法）で行い、上述の２種類のＥＬＩＳＡ法と同様の方法で陽性ウェルを選別し、最終的に２６種の抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。
各細胞の約１０5個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら１晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム０〜３００ｍＭの濃度勾配で溶出させて得たＩｇＧ画分を５０ｍＭグリシン緩衝液で透析して、２６種の抗体を得た。
【００４０】
（４）抗体の組み合わせ検討
（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）
得られた抗体２６種それぞれを９６穴プレートのウェルに固相化し、ヒトＭＭＰ−３溶解液を各ウェルに添加して反応させた。次いでそれぞれビオチン標識した２６種の抗体を添加して反応させ、さらにＨＲＰ標識ストレプトアビジンを添加して反応させた。０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、室温で反応させた後、４．５Ｎ硫酸により酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で高感度が得られた抗体の組み合わせ（８２２０８抗体と８２２１６抗体）を選択して、ＬＴＩＡ法に用いた。
【００４１】
２．サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＭＭＰ−３の定量（基準測定法例）
ａ．材料
・パナクリア（登録商標）ＭＭＰ−３「プレート」：積水メディカル社製，３１０７７５
・ヒト血清検体（ｎ=７）：プルロニックＦ８８非添加の第１試薬を使用するＬＴＩＡ法測定で、基準測定法の測定値に収束しなかった検体
【００４２】
ｂ．方法
パナクリアＭＭＰ−３「プレート」の添付書類に従って行った。測定にはＥＬ８０８（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いた。
パナクリアＭＭＰ−３「プレート」は、ＭＭＰ−３分子上の異なる部位を認識する２種類のモノクローナル抗体を使用するワンステップＥＬＩＳＡ法であり、免疫複合体を形成させた後、洗浄工程が必須である。
【００４３】
３．ＬＴＩＡ法によるＭＭＰ−３の定量（対照例、実施例）
（抗体担持ラテックス粒子の調製）
ａ．材料
・抗ＭＭＰ−３抗体８２２０８（８２２０８抗体）液：１．５Ａｂｓ／ｍＬ（２８０ｎｍ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）），受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２１９
・抗ＭＭＰ−３抗体８２２１６（８２２１６抗体）液：１．５Ａｂｓ／ｍＬ（２８０ｎｍ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）），受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４８６
・１％ラテックス粒子液：平均粒子径０．２６μｍ
・１％ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製，Ａ−７０３０
本明細書において、特にことわらない限り％濃度は（ｗ／ｖ）％を意味する。
【００４４】
ｂ．方法
８２２０８抗体と１％ラテックス粒子液を等容量混合して、４℃、１時間撹拌した。さらに混合液と等容量の１％ＢＳＡを添加して４℃にて３０分間撹拌し、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を除去したあと、沈殿をＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁し、抗体担持ラテックス粒子溶液とした。
８２２１６抗体と１％ラテックス液を用い、同様の方法で抗体担持ラテックス粒子溶液とした。
【００４５】
（ＬＴＩＡ法第１試薬の調製）
ａ．材料
・Ｔｒｉｓ
・ＮａＣｌ
・ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製，Ａ−７０３０
・ＰｒｏＣｌｉｎ(登録商標)３００：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製，４８９１２−Ｕ
・プルロニックＦ８８：ポリオキシエチレン(２００)ポリオキシプロピレングリコール（４０），アデカ社製
【００４６】
ｂ．方法
５００ｍＭの塩化ナトリウム、１％ＢＳＡ、０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含む３０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、０．００５％になるようプルロニックＦ８８を添加して実施例の第１試薬とした。また、プルロニックＦ８８を添加しない前記Ｔｒｉｓ緩衝液を対照例の第１試薬とした。
【００４７】
（第２試薬の調製）
ａ．材料
・８２２０８抗体担持ラテックス溶液
・８２２１６抗体担持ラテックス溶液
・ＭＯＰＳ
・ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製，Ａ−７０３０
【００４８】
ｂ．方法
８２２０８抗体担持ラテックス粒子溶液と８２２１６抗体担持ラテックス粒子溶液をラテックス粒子の含量比で１：１になるよう混合し、０．５％ＢＳＡを含むＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で最終吸光度４．０ＯＤとなるように希釈して第２試薬とした。
【００４９】
（測定方法）
第１試薬と第２試薬とを組合せ、日立７１７０形自動分析装置を用いて上述の基準測定法例で用いたヒト血清検体（ｎ=７）を測定した。具体的には、ヒト血清３μＬに、第１試薬１５０μＬを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬５０μＬを加えて攪拌した。その後５分間の凝集形成に伴う吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。別途、上述のＭＭＰ−３溶解液の希釈系列をキャリブレータとして測定し、検量線を作成し、ヒト血清中のＭＭＰ−３濃度を算出した。
【００５０】
４．結果
プルロニックＦ８８を第１試薬に添加したＬＴＩＡ試薬での測定値（実施例）は、プルロニックＦ８８を第１試薬に添加しないＬＴＩＡ試薬での測定値（対照例）と比較して、基準測定値に対するかたより等が収束し、基準測定値との相関性が向上した（図１）。
【００５１】
〔実施例２〕本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の効果確認（２）
１．試薬及び測定方法
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体として、表１記載の種類及び濃度を選び第１試薬を調製した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ヒト血清検体（ｎ＝２０）中のＭＭＰ−３を測定し、基準測定値との関係を解析し、本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の効果を確認した。
【００５２】
２．結果
結果を表１に示した。本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体（プルロニックＦ８８、プルロニックＦ１０８（以上、アデカ社製）、あるいはエパン７８５（第一工業製薬社製））を第１試薬に添加したＬＴＩＡ試薬での測定値（実施例２ａ〜２ｆ）は、本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を第１試薬に添加しないＬＴＩＡ試薬での測定値（対照例）と比較して、基準測定値に対するかたよりが収束した。
【００５３】
【表１】
2014206391.tif 000003
【００５４】
〔実施例３〕本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の効果確認（３）
１．試薬及び測定方法
０．０１５％になるようプルロニックＦ８８を添加して実施例の第１試薬とした。同一ヒト個体から採取した血清検体及びＥＤＴＡ血漿検体中のＭＭＰ−３を測定し、マトリクス成分としてのＥＤＴＡが測定系にあたえる影響を、本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体が回避可能か両検体の測定値及び両検体の測定値の比率（ＥＤＴＡ血漿の測定値/血清の測定値）で評価した。
【００５５】
２．結果
結果を表２に示した。本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を第１試薬に添加しないＬＴＩＡ試薬（対照例）での比率に対して、本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体であるプルロニックＦ８８を第１試薬に添加したＬＴＩＡ試薬での比率は１００％に近づき、本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体が、マトリクス成分としてのＥＤＴＡが測定系にあたえる影響を低減できることが確認された。
【００５６】
【表２】
2014206391.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、試料中の成分の影響を抑制し、マトリクス効果の低減されたＬＴＩＡ法が提供される。本発明により、ＬＴＩＡ法による正確な測定を行うことが可能になる。
【受託番号】
【００５８】
［寄託された微生物への言及］
（１）８２２０８抗体を産生するハイブリドーマ８２２０８
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２４年１月２７日（２０１２年１月２７日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２１９
（２）８２２１６抗体を産生するハイブリドーマ８２２１６
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２２年４月２７日（２０１０年４月２７日）（原寄託日）
平成２４年５月２５日（２０１２年５月２５日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４８６
【図１】
2014206391.tif 000005