(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＴＬＶ−Ｉに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導活性を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド、該ペプチドを含有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤、これらを利用したＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答誘導用ワクチン並びに免疫機能検査診断薬等を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列、特定のアミノ酸配列における連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列もしくは前記アミノ酸配列とＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列、上記アミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するか、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列、のいずれかからなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド：
（Ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列：
（Ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列：
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列。
【請求項２】
ＨＬＡ−ＤＲ１に拘束されるＴａｘエピトープである請求項１に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド。
【請求項３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ１型ヘルパーＴ細胞である請求項１又は２に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド。
【請求項５】
ＨＬＡ−ＤＲ１と請求項１〜３のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体。
【請求項６】
ＨＬＡ−ＤＲ１と請求項１〜３のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体。
【請求項７】
請求項５に記載のタンパク−ペプチド結合体又は請求項６に記載のタンパク−ペプチド結合体の４量体と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
【請求項８】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドを有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤：（Ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列：
（Ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列：
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列。
【請求項９】
プロモーターと、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとを含み、該ポリヌクレオチドがプロモーターの下流に作動可能に連結されている発現ベクターを有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤：
（ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列：
（ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列：
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド配列に対して８０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列であって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列：
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列であって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列：
（ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答誘導用ワクチン。
【請求項１１】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドを有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬：
（Ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列：
（Ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列：
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列。
【請求項１２】
ＨＬＡ−ＤＲ１と請求項１〜３のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬。
【請求項１３】
ＨＬＡ−ＤＲ１と請求項１〜３のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬。
【請求項１４】
ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１５】
請求項８又は９に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤を用いて、ＨＬＡ−ＤＲ１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１６】
ＨＬＡ−ＤＲ１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを、以下の（Ｘ）及び（Ｙ）を用いて刺激することを特徴とする、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答及びＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ応答を含むＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答を誘導する方法：
（Ｘ）請求項８又は９に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤：
（Ｙ）前記ＡＴＬ患者のＨＬＡ−Ａ座の型に適合する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する活性を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドや、該ペプチドを含有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）は、極めて難治性のＣＤ４＋Ｔ細胞悪性腫瘍である成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ：adult T cell leukemia/lymphoma）の原因ウイルスである（非特許文献１及び２）。世界中で１０００〜２０００万人がこのウイルスに感染し、特に日本の南方地域、カリブ海地域、南米、メラネシア、及び赤道アフリカでの感染例が多い。ＨＴＬＶ−Ｉ血清反応陽性者の約５％がＡＴＬを発症し、それ以外にも２〜３％がＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症／熱帯性痙性不全対麻痺症まひ（ＨＡＭ／ＴＳＰ：HTLV-I associated myelopathy/ tropical spastic paraparesis）として知られる緩徐進行性神経疾患や種々の慢性炎症性疾患を発症する（非特許文献３）。ＨＴＬＶ−Ｉ感染者の大多数は、その生涯にわたって無症候性キャリアの状態にある。
【０００３】
ＡＴＬは予後が非常に悪いことを特徴とするが、これは主としてＡＴＬには抗癌剤への薬剤耐性が本質的に備わっているためである。自己造血幹細胞移植では果たせなかったＡＴＬの予後改善が、同種造血幹細胞移植（allo−ＨＳＣＴ：Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation）では認められたと報告されている（非特許文献４及び５）。血縁者を含む他人の幹細胞を移植する同種造血幹細胞移植の場合、患者のがん細胞を根絶やしにすると同時に、患者自身の免疫力を弱め、ドナー細胞を患者骨髄に生着させやくする目的で、移植前に大量抗がん剤投与や全身放射線照射を行い、患者の骨髄細胞を極限まで減らす前処置が従来行われていた。しかし近年、移植後に患者体内で増えるドナーリンパ球が、前処置によっても殺されずに残った患者がん細胞を非自己の異物として攻撃することで、やがては完治に導かれる移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）が知られるようになると、前処置として従来用いられていた抗がん剤や放射線の量を減らす（minimize）代わりに、ドナー造血幹細胞を生着させる為の免疫抑制剤を用いる緩和的前処置（ＲＩＣ：reduced intensity conditioning）が行われるようになった。緩和的前処置による同種造血幹細胞移植は、ミニ移植、あるいは、骨髄非破壊的移植とも呼ばれ、今まで同種造血幹細胞移植を受けられなかった高齢者、臓器障害のある患者にも適応可能な治療法として、広く認められつつある。
【０００４】
ＡＴＬ allo−ＨＳＣＴ研究グループが以前に実施した臨床試験では、緩和的前処置による同種造血幹細胞移植から３年以内の全生存率は３６％だった（非特許文献６）。同種造血幹細胞移植後に完全寛解を得たＡＴＬ患者の一部ではＨＴＬＶ−Ｉプロウイルスが検出されなくなり、かかる未検出の状態が継続したが、これにより同種造血幹細胞移植がＡＴＬの有効な治療であることが示唆された（非特許文献６〜８）。これらの研究に関連して、本発明者らは、同種造血幹細胞移植後に完全寛解を得たＡＴＬ患者の一部で、ドナー由来のＨＴＬＶ−ＩＴａｘ特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：cytotoxic T lymphocyte）が誘導されたことを報告し（非特許文献９）、ヒトＨＬＡ−Ａ２４に拘束されるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド（Ｔａｘ特異的ＣＴＬのエピトープ）を見いだしている（特許文献１）。前述のＣＴＬは、自己ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞をインビトロで溶解させることができた。このことから、ＣＴＬが移植片対白血病効果に寄与する可能性が示唆された。また、本発明者らは、ヒトＨＬＡ−Ａ１１に拘束されるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド（Ｔａｘ特異的ＣＴＬのエピトープ）も見いだしている（特許文献２）。一般にＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＴＬは、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）等が関与する種々の感染症においてウイルス複製の制御に重要な役割を果たしている。ＨＴＬＶ−Ｉ感染では、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がＴａｘ抗原（ｐＸ遺伝子産物）をプレドミナントに認識し、感染細胞の制御に寄与すると考えられている（非特許文献１０及び１１）。ＨＡＭ／ＴＳＰ患者及び一部の無症候性キャリア（ＡＣ：asymptomatic carrier）では、機能的なＴａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が高頻度で検出できたが、ＡＴＬ患者の大多数及びＡＣの小集団では、Ｔａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が著しく低減していた（非特許文献１２及び１３）。これらの患者でＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が抑制される機構についてはまだ十分には解明されていない。
【０００５】
ウイルス特異的ＣＴＬを誘導及び維持するため、多くのウイルス感染症においてウイルス特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答が必要であるが（非特許文献１４〜１８）、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ヘルパーＴ細胞応答についての報告は数少なかった（非特許文献１９〜２２）。これは恐らくＨＴＬＶ−Ｉ特異的ヘルパーＴ細胞がインビボ及びインビトロでＨＴＬＶ−Ｉ感染に対して感受性であり（非特許文献２３）、感染細胞は培養後数時間でＨＴＬＶ−Ｉ抗原を産生してしまう（非特許文献２４及び２５）ためと考えられる。他方、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者では、ＩＦＮ−γ及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α等の炎症性神経毒性サイトカインの自然産生を伴う初期進行性の炎症性脊髄損傷部位（非特許文献２６）でＣＤ４＋Ｔ細胞がプレドミナントに認められ（非特許文献２７〜２８）、これがＨＡＭ／ＴＳＰの発症に関与することが示唆される。しかし、ＨＴＬＶ−Ｉ感染におけるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の正確な役割は未だ解明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０９２３７３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０３５６８１号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hinuma Y, Nagata K, Hanaoka M, et al. Adult T-cell leukemia: antigen in an ATL cell line and detection of antibodies to the antigen in human sera. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981;78(10):6476-6480.
【非特許文献２】Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gazdar AF, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980;77(12):7415-7419.
【非特許文献３】Uchiyama T. Human T cell leukemia virus type I (HTLV-I) and human diseases. Annu Rev Immunol. 1997;15:15-37.
【非特許文献４】Tsukasaki K, Maeda T, Arimura K, et al. Poor outcome of autologous stem cell transplantation for adult T cell leukemia/lymphoma: a case report and review of the literature. Bone Marrow Transplant. 1999;23(1):87-89.
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【非特許文献６】Tanosaki R, Uike N, Utsunomiya A, et al. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation using reduced-intensity conditioning for adult T cell leukemia/lymphoma: impact of antithymocyte globulin on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 2008;14(6):702-708.
【非特許文献７】Okamura J, Utsunomiya A, Tanosaki R, et al. Allogeneic stem-cell transplantation with reduced conditioning intensity as a novel immunotherapy and antiviral therapy for adult T-cell leukemia/lymphoma. Blood. 2005;105(10):4143-4145.
【非特許文献８】Choi I, Tanosaki R, Uike N, et al. Long-term outcomes after hematopoietic SCT for adult T-cell leukemia/lymphoma: results of prospective trials. Bone Marrow Transplant. 2011;46(1):116-118.
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【非特許文献２３】Goon PK, Igakura T, Hanon E, et al. Human T cell lymphotropic virus type I (HTLV-I)-specific CD4+ T cells: immunodominance hierarchy and preferential infection with HTLV-I. J Immunol. 2004;172(3):1735-1743.
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【非特許文献２５】Sakai JA, Nagai M, Brennan MB, Mora CA, Jacobson S. In vitro spontaneous lymphoproliferation in patients with human T-cell lymphotropic virus type I-associated neurologic disease: predominant expansion of CD8+ T cells. Blood. 2001;98(5):1506-1511.
【非特許文献２６】Umehara F, Izumo S, Ronquillo AT, Matsumuro K, Sato E, Osame M. Cytokine expression in the spinal cord lesions in HTLV-I-associated myelopathy. J Neuropathol Exp Neurol. 1994;53(1):72-77.
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
背景技術にも記載したように、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する活性を有するペプチドはこれまでにいくつか見いだされており、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導用ワクチンとしての実用化が期待されている。しかし、ウイルス特異的ＣＴＬを誘導及び維持するためには、多くのウイルス感染症においてウイルス特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答が必要であるとされているため、より優れたワクチン開発などのためには、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する活性を有するペプチドが必要となる。しかし、ＨＴＬＶ−Ｉ感染はＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞で優先的に生じることなどから、かかるＣＤ４＋Ｔ細胞についての解析はあまり進んでおらず、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する活性を有するペプチドはこれまでに見いだされていなかった。
【０００９】
本発明の課題は、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する活性を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドや、該ペプチドを含有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤や、これらを利用したＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答誘導用ワクチン並びに免疫機能検査診断薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の背景技術の状況下で鋭意研究を行った結果、以下の（ａ）〜（ｃ）などの知見を見いだし、本発明を完成するにいたった。
（ａ）緩和的前処置による同種造血幹細胞移植前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞に対する、緩和的前処置による同種造血幹細胞移植後の同じ患者の細胞性免疫応答を調査したところ、緩和的前処置による同種造血幹細胞移植後のＡＴＬ患者において、Ｔａｘ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答がいずれも誘導されていること。
（ｂ）ヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１（以下、本明細書において「ＨＬＡ−ＤＲ１」とも表示する。）に拘束されるＴａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の最小エピトープ、すなわち、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドを特定したこと。
（ｃ）かかるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドと、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとを併用したところ、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド単独で用いた場合と比較して、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが顕著に増殖したこと。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド：
（Ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列：
（Ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列：
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列や、
（２）ＨＬＡ−ＤＲ１に拘束されるＴａｘエピトープである上記（１）に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドや、
（３）ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ１型ヘルパーＴ細胞である上記（１）又は（２）に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドや、
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチドや、
（５）ＨＬＡ−ＤＲ１と上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体や、
（６）ＨＬＡ−ＤＲ１と上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体や、
（７）上記（５）に記載のタンパク−ペプチド結合体又は上記（６）に記載のタンパク−ペプチド結合体の４量体と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質に関する。
【００１２】
また、本発明は、
（８）以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドを有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤：
（Ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列：
（Ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列：
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列や、
（９）プロモーターと、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとを含み、該ポリヌクレオチドがプロモーターの下流に作動可能に連結されている発現ベクターを有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤：
（ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列：
（ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列：
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド配列に対して８０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列であって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列：
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列であって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列：
（ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列や、
（１０）上記（８）又は（９）に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答誘導用ワクチンに関する。
【００１３】
さらに、本発明は、
（１１）以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドを有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬：
（Ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列：
（Ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列：
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列や、
（１２）ＨＬＡ−ＤＲ１と上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬や、
（１３）ＨＬＡ−ＤＲ１と上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬に関する。
【００１４】
また、本発明は、
（１４）ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法や、
（１５）上記（８）又は（９）に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤を用いて、ＨＬＡ−ＤＲ１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法や、
（１６）ＨＬＡ−ＤＲ１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを、以下の（Ｘ）及び（Ｙ）を用いて刺激することを特徴とする、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答及びＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ応答を含むＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答を誘導する方法：
（Ｘ）上記（８）又は（９）に記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤：
（Ｙ）前記ＡＴＬ患者のＨＬＡ−Ａ座の型に適合する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチド：に関する。
【発明の効果】
【００１５】
（１）本発明により、ＨＬＡ−ＤＲ１に拘束されるＴａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の最小エピトープが見いだされた。かかるエピトープは、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する活性を有している。したがって、かかるエピトープペプチドは、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドとして有用である。
（２）現在では、それぞれのＨＬＡについて親和性のあるアミノ酸アンカーモチーフからエピトープをある程度は予測可能である。しかしながら、生体内の病原体に対する宿主の免疫反応は必ずしもこの予測と一致しない。本発明により同定されたエピトープは感染個体から得られたものであり、しかも他のエピトープよりも非常に強い選択性を持って認識されている。
（３）本発明者らはこれまでにＴａｘ特異的ＣＴＬエピトープを見いだし、かかるエピトープペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性を有すること、及び、ＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬ誘導用ワクチンとして用い得ることを見いだしている。本発明者らが今回見いだしたＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドを、前述のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドと併用したところ、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド単独で用いた場合と比較して、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが顕著に誘導された。したがって、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドは、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤などとしても有用である。
（４）本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドや、ＨＬＡ−ＤＲ１と本発明のペプチドとが結合したタンパク質−ペプチド結合体や、該タンパク−ペプチド結合体の４量体は、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬としても有用である。かかる免疫機能検査診断薬を用いて、ＡＴＬ患者やＨＡＭ／ＴＳＰ患者などのＨＴＬＶ−Ｉ感染者におけるＴａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を観察することにより、ＡＴＬに対する新規のペプチドワクチンストラテジーの開発や、ＡＴＬの進行又は再発の防止ストラテジーの開発や、ＨＡＭ／ＴＳＰの病態解明などに有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】緩和的前処置による同種造血幹細胞移植後のＡＴＬ患者におけるＴａｘ特異的なＴ細胞の免疫応答を示す図である。（Ａ〜Ｂ）緩和的前処置による同種造血幹細胞移植後１８０日目におけるＡＴＬ患者１８名から得たＰＢＭＣ（Ａ）又は緩和的前処置による同種造血幹細胞移植後５４０日目の患者２名（＃３５０及び＃３４１）から得た全ＰＢＭＣ及びＣＤ８＋細胞枯渇ＰＢＭＣ（Ｂ）を、ＧＳＴタンパク質非存在下（白抜き）、ＧＳＴタンパク質存在下（グレー）、又はＧＳＴ−Ｔａｘタンパク質存在下（黒）で４日間培養し、上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡで定量した。（Ａ）の横点線は、検出限界（２３．５ｐｇ／ｍｌ）を示す。誤差範囲は、二重測定値の標準偏差を表す。（＊Ｐ＜０．０５）
【図２】患者＃３５０から作製したＣＤ４＋Ｔ細胞株（Ｔ４）の表現型及び機能を示す図である。（Ａ）Ｔ４細胞の細胞表面における表現型をフローサイトメトリーにより解析した。（Ｂ）ＬＣＬ−＃３５０（レーン１）、Ｔ４細胞（レーン２）、ＩＬＴ−＃３５０（レーン３）及びＭＴ−２（レーン４）から全ＲＮＡを抽出した。各細胞型のＴａｘ ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用した。（Ｃ）ホルムアルデヒドで固定したＩＬＴ−＃３５０細胞又はＬＣＬ−＃３５０細胞の存在／非存在下で、Ｔ４細胞を２４時間刺激した。上清中のサイトカイン濃度は、サイトメトリービーズアレイシステムにより定量した。
【図３】樹立したＴ４細胞に認識される優位なＴａｘ由来エピトープの同定過程を示す図である。（Ａ）ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ｂ、ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ｃ、又はＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃの混合物（ＧＳＴ−ＴａｘＡＢＣ）でドナー由来ＬＣＬ−＃３５０を２４時間ペプチド刺激し、その後、レスポンダー細胞／刺激細胞（Ｒ／Ｓ）比３にて、Ｔ４細胞との共培養を２４時間行った。Ｔ４細胞のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡで定量した。（Ｂ、Ｃ）Ｔａｘ−Ｂ領域中の２５ｍｅｒ（Ｂ）又は１５ｍｅｒ（Ｃ）のオーバーラッピング合成ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を用いてＬＣＬ−＃３５０を１時間ペプチド刺激し、レスポンダー細胞（Ｔ４）／刺激細胞（ＬＣＬ−＃３５０）の、Ｒ／Ｓ比率３にて共培養を６時間行い、上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）ホルムアルデヒドで固定したＩＬＴは、ポジティブコントロールの刺激細胞として用いた。（Ｄ、Ｅ）１２〜２５ｍｅｒのオーバーラッピング合成ペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）を用い、（Ｂ、Ｃ）同様に、Ｔ４細胞のＩＦＮ−γ産生能を調べた。（Ｆ）各濃度の１３〜１５ｍｅｒペプチドに対するＴ４細胞のＩＦＮ−γ産生を、（Ｂ、Ｃ）同様に測定した。各図、３回繰り返した実験のうちの１例を代表として示す。誤差範囲は、三重測定値の標準偏差を表す。統計的有意差は、独立ｔ検定で解析した。「ｎｓ」は有意差のないことを示す。
【図４】樹立したＴ４細胞に認識されるＴａｘ１５５−１６７のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１拘束性を示す図である。（Ａ）ブロッキング抗体（１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ヒトＨＬＡ−ＤＱ抗体、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体又はアイソタイプ対照抗体）の存在／非存在下で、Ｔ４細胞とＩＬＴ−＃３５０との共培養を６時間行い、培養上清中に放出されたＴ４細胞の産生するＩＦＮ−γを、ＥＬＩＳＡにより定量した。（Ｂ）Ｔａｘ１５５−１６７ペプチド刺激有り（黒）またはペプチド刺激無し（白抜き）の条件で１時間パルスした各ＬＣＬ（＃３５０；自己、＃３０７ ＃３４１ Ｋａｎ；同種）と、Ｔ４細胞（＃３５０由来）を６時間共培養した。各ＬＣＬ株のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を括弧内に示す。Ｔ４細胞のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡで測定した。誤差範囲は、三重測定値の標準偏差を示す。統計的有意差は、独立ｔ検定で解析した。（Ｃ）Ｔａｘの１５５〜１６７残基からなるアミノ酸配列には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１の推定アンカーモチーフが含まれていた。
【図５】ＣＴＬ誘導エピトープとＴａｘ１５５−１６７ペプチドとの共刺激によるＴａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖亢進を示す図である。緩和的前処置による同種造血幹細胞移植を受け、Major Histocompatibility Complex（ＭＨＣ）クラスＩとクラスIIがそれぞれ、ＨＬＡ−Ａ２４／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１であるＡＴＬ患者（＃３５０、＃３６４及び＃３４１）から得たＰＢＭＣを、１００ｎＭのＣＴＬエピトープ（Ｔａｘ３０１−３０９）単独、Ｔａｘ３０１−３０９ペプチド（１００ｎＭ）とＴａｘ１５５−１６７ペプチド（１００ｎＭ）の混合物、又は、ＤＭＳＯのみ（ネガティブコントロール）の存在下で、１３日間培養した。データは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に占めるＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ｔａｘ３０１−３０９テトラマー陽性細胞の割合（％）を示す。
【図６】ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１＋ＨＴＬＶ−Ｉ感染者検体中のＴａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出を示す図である。（Ａ）緩和的前処置による同種造血幹細胞移植を受けたＡＴＬ患者２名（＃３５０及び＃３６４）及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１＋血清反応陰性ドナー（＃３６５）由来の検体を用い、新鮮ＰＢＭＣと、Ｔａｘ１５５−１６７ペプチド（１００ｎＭ）存在下で１３〜１４日間培養したＰＢＭＣとにおいて、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１／Ｔａｘ１５５−１６７テトラマーに結合するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を分析した。データは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に占めるテトラマー陽性細胞の割合（％）を示す。（Ｂ）無症候性キャリア＃３１０及びＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症／熱帯性痙性不全対麻痺患者＃２９４から得た新鮮ＰＢＭＣにおけるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１／Ｔａｘ１５５−１６７テトラマーに結合するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を分析した。データは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に占めるテトラマー陽性細胞の割合（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド、すなわち、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する活性を有するペプチドとしては、以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド（以下、「本発明のペプチド」とも表示する。）であれば特に制限されるものではない。
（Ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列：
（Ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列：
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列：
（Ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列：
【００１８】
上記（Ａ）に列挙されている配列番号のアミノ酸配列はいずれも、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１拘束性Ｔａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープであり、配列番号４はＨＴＬＶ−ＩのＴａｘの１５４番目から１７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（Tax154-178）であり、配列番号１０はＨＴＬＶ−ＩのＴａｘの１５１番目から１６５番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（Tax151-165）であり、配列番号１１はＨＴＬＶ−ＩのＴａｘの１５４番目から１６８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（Tax154-168）であり、配列番号１２はＨＴＬＶ−ＩのＴａｘの１５５番目から１６９番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（Tax155-169）であり、配列番号１３はＨＴＬＶ−ＩのＴａｘの１５６番目から１７０番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（Tax156-170）であり、配列番号１６はＨＴＬＶ−ＩのＴａｘの１５５番目から１６８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（Tax155-168）であり、配列番号１７はＨＴＬＶ−ＩのＴａｘの１５５番目から１６７番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（Tax155-167）であり、配列番号１９はＨＴＬＶ−ＩのＴａｘの１５１番目から１７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（Tax151-178）である。これらのアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性に優れている点で、本発明のペプチドの中でも好適に例示することができ、中でも、配列番号１１（Tax154-168）、配列番号１２（Tax155-169）、配列番号１６（Tax155-168）、配列番号１７（Tax155-167）、配列番号４（Tax154-178）、配列番号１３（Tax156-170）を好適に例示することができ、中でも、配列番号１１（Tax154-168）、配列番号１２（Tax155-169）、配列番号１６（Tax155-168）、配列番号１７（Tax155-167）をより好適に例示することができ、ＨＬＡ−ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性Ｔａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの最小エピトープ（以下、単に「最小エピトープ」とも表示する。）である点で配列番号１７（Tax155-167）を特に好適に例示することができる。なお、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の好適な誘導を得る観点から、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドは、ＨＬＡ−ＨＬＡ−ＤＲＢ１のタイプがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１である対象に用いることが好ましい。
【００１９】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列は、Ｔａｘのアミノ酸配列（配列番号３２）おける連続する１４〜３０個、好ましくは１４〜２５個、より好ましくは１４〜２０個、さらに好ましくは１４〜１５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列である。かかるアミノ酸配列は最小エピトープを含んでいるため、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドである。
【００２０】
上記（Ｃ）のアミノ酸配列は、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列である。かかるアミノ酸配列は、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドである蓋然性が高い。
【００２１】
上記（Ｄ）のアミノ酸配列は、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するアミノ酸配列である。ここで、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味し、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチドが、上記（Ａ）に列挙されているアミノ酸配列からなるペプチドと同様にＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有する同効物であれば特に制限されず、アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明においては、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ペプチドを包含する。
【００２２】
上記（Ｅ）のアミノ酸配列は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列である。上記（Ｅ）のアミノ酸配列における連続する１４〜３０個のアミノ酸の個数としては、好ましくは１８〜３０個、より好ましくは２２〜３０個であることを好適に例示することができる。
【００２３】
本明細書における「ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド」としては、ＨＴＬＶ−Ｉに特異的なＣＴＬを誘導する活性を有するペプチドである限り特に制限されず、中でも、Ｔａｘ特異的なＣＴＬ誘導活性ペプチドを好適に例示することができ、中でも、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ＣＴＬエピトープであるＴａｘ３０１−３０９（配列番号３４）（特許文献１参照）などを特に好適に例示することができる。近年、ヘルパーＴ細胞であるＣＤ４＋Ｔ細胞に対する癌抗原エピトープと、ＣＴＬであるＣＤ８＋Ｔ細胞に対する癌抗原エピトープを結合させた融合ペプチド（Helper/Killer-Hybrid Epitope Long Peptide）を被験対象に投与することによって、被験対象の癌細胞に対する免疫を効果的に高めることが知られている(例えばCancer Science (2012) 103, 150-153など)。本願発明においても、上記Ｅのアミノ酸配列のペプチドを用いることによって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬを誘導し、ＨＴＬＶ−Ｉに対する免疫を効果的に高めることができると考えられる。
【００２４】
なお、本明細書におけるＣＤ４＋Ｔ細胞としては、ヘルパーＴ細胞を好適に例示することができ、中でもＴｈ１型ヘルパーＴ細胞をより好適に例示することができる。
【００２５】
本発明のペプチドは、化学的又は遺伝子工学的手法により製造することができる。化学的方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
【００２６】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物(１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００２７】
なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
【００２８】
本発明のペプチドは、上記のように化学合成により得られる他、遺伝子工学的手法を用いて常法により製造することもできる。このようにして得られた本発明のペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００２９】
本発明の融合ペプチドとしては、本発明のペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３０】
本発明のタンパク−ペプチド結合体としては、ＨＬＡ−ＤＲ１と本発明のペプチドとの結合体であれば特に制限されるものではなく、例えばＨＬＡ−ＤＲ１分子と、上記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドとの結合体など、かかる結合体を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞に結合できる形態のものが好ましい。また、本発明のタンパク−ペプチド結合体の４量体としては、ＨＬＡ−ＤＲ１と本発明のペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体であれば特に制限されるものではなく、上記タンパク−ペプチド結合体を、ストレプトアビジンを核として４量体（テトラマー）としたものを例示することができ、例えばＨＬＡ−ＤＲ１のＣ末端に酵素Bir-Aの基質を発現させておき、Bir-A-dependent biotinilation法でビオチン化したＨＬＡ−ＤＲ１と、フィコエリトリン（ＰＥ）標識脱グリコシル化アビジンを４：１で混合することにより得ることができる（Altman, J.D., et al.: Science 274, 94-96, 1996）。これらタンパク−ペプチド結合体及びその４量体は、化学合成された本発明のペプチドと、ＨＬＡ−ＤＲ１遺伝子（GenBank アクセッションナンバーAF142457）を利用した遺伝子工学的手法を用いて常法により作製したＨＬＡ−ＤＲ１のα鎖及びβ鎖とを、リフォールディングバッファー中、インビトロで結合させることにより、あるいは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドとＨＬＡ−ＤＲ１遺伝子とをそれぞれ利用した遺伝子工学的手法を用いて常法により本発明のペプチドとＨＬＡ−ＤＲ１のα鎖及びβ鎖とを同一宿主細胞内で共発現させ、精製後にこれらを結合させることにより作製することができる。
【００３１】
本発明の融合タンパク質としては、上記タンパク−ペプチド結合体又はタンパク−ペプチド結合体の４量体とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、蛍光色素、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したタンパク−ペプチド結合体の精製や、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３２】
本発明のペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、ＡＴＬやＨＡＭ／ＴＳＰなどの診断に有用であるばかりでなく、本発明のペプチドのＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導の活性機構や分子機構を明らかにする上で有用である。
【００３３】
本発明のペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、本発明のペプチド、該本発明のペプチドと免疫原性を有するタンパク質との複合体、該本発明のペプチドを膜表面に提示した細胞等を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００３４】
また、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、すなわち、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも表示する。）であれば特に制限されるものではない。
（ａ）配列番号４、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列：
（ｂ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列：
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド配列に対して８０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列であって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列：
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列であって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列：
（ｅ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列：
【００３５】
上記（ａ）のポリヌクレオチド配列は、列挙されているいずれかのアミノ酸配列をコードしている限り特に制限されないが、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列として配列番号２４に示されるポリヌクレオチド配列を好適に例示することができ、配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列として配列番号２５に示されるポリヌクレオチド配列を好適に例示することができ、配列番号１１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列として配列番号２６に示されるポリヌクレオチド配列を好適に例示することができ、配列番号１２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列として配列番号２７に示されるポリヌクレオチド配列を好適に例示することができ、配列番号１３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列として配列番号２８に示されるポリヌクレオチド配列を好適に例示することができ、配列番号１６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列として配列番号２９に示されるポリヌクレオチド配列を好適に例示することができ、配列番号１７に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列として配列番号３０に示されるポリヌクレオチド配列を好適に例示することができる。
【００３６】
上記（ｂ）のポリヌクレオチド配列は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列である。かかるポリヌクレオチド配列は、前述のアミノ酸配列をコードしている限り特に制限されないが、配列番号３３に示すＴａｘのポリヌクレオチド配列において、前述のアミノ酸配列に対応する部分のポリヌクレオチド配列を好適に例示することができる。かかるポリヌクレオチド配列は、Ｔａｘ全体のアミノ酸配列を示す配列番号３２と、Ｔａｘ全体のポリヌクレオチド配列を示す配列番号３３を比較することにより、把握することができる。
【００３７】
上記（ｃ）のポリヌクレオチド配列は、上記（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列であって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００３８】
上記（ｄ）のポリヌクレオチド配列は、上記（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列であって、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。ここで、「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個の任意の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列を意味し、ヌクレオチドの「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたポリヌクレオチド配列がコードするペプチドが、上記（Ａ）に列挙されているアミノ酸配列からなるペプチドと同様にＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性を有する同効物であれば特に制限されず、かかるヌクレオチドの改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明においては、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ポリヌクレオチド配列を包含する。
【００３９】
上記（ｅ）のポリヌクレオチド配列は、列番号３２に示されるアミノ酸配列おける連続する１４〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１５５から１６７までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドのアミノ酸配列とを結合させたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列である。かかる（ｅ）のポリヌクレオチド配列は、上記（Ｅ）のアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド配列である。
【００４０】
また、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子工学的手法を用いた常法により本発明のペプチドを作製するときに有利に用いることができる他、特に本発明のポリヌクレオチドのアンチセンス鎖は、ＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断用プローブとして有用である。
【００４１】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤あるいはＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強用組成物（好ましくは医薬組成物）としては、「上記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド」や、「プロモーターと、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとを含み、該ポリヌクレオチドがプロモーターの下流に作動可能に連結されている発現ベクター」を有効成分として含有していれば特に制限されるものではない。
【００４２】
かかる本発明のペプチドや、かかる本発明の発現ベクターから発現する本発明のペプチドは、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導し、かかるＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用を増強する。本明細書において「ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用を増強する」ものとは、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導を介して、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド（ＨＴＬＶ−Ｉ特異的なＣＴＬを誘導する活性を有するペプチド）が発揮するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用を増強する能力を有しているものを意味する。ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドが発揮するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用を増強する能力をある物質が有するか否かは、例えば、その物質とＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとを併用した場合に、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド単独で用いた場合と比較して、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬがより顕著に誘導されるかどうかを調べることによって容易に確認することができる。併用した場合にＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬがより顕著に誘導されれば、その物質はＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドが発揮するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用を増強する能力をある物質が有するといえる。
【００４３】
上記発現ベクターとしては、プロモーターと、上記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとを含み、該ポリヌクレオチドがプロモーターの下流に作動可能に連結されている発現ベクターであればどのようなものでもよく、大腸菌（Escherichia coli）由来のプラスミド（例えばpET28、pGEX4T、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、及び他のプラスミドDNA）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5、及び他のプラスミドDNA）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YEp24、YCp50、及び他のプラスミドDNA）、λファージ（λgt11、λZAP等）、哺乳動物用プラスミド（pCMV、pSV40）、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクター等）、植物用ベクター（バイナリベクターpBI系等）、コスミドベクターなどを用いることができる。
【００４４】
上記プロモーターとしては特に制限されず、宿主に応じて適するプロモーターを選択すればよく、また当該技術分野で公知の構成的プロモーター、誘導性プロモーターのいずれを用いてもよい。プロモーターとして具体的には、CMVプロモーター、SV40プロモーター、CAGプロモーター、シナプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、CaMVプロモーター、解糖系酵素プロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、GAPDHプロモーター、GAL1プロモーター、PH05プロモーター、PGKプロモーターなどを挙げることができる。また、上記発現ベクターは、目的ポリヌクレオチドの下流にターミネーターをさらに含んでいてもよい。
【００４５】
上記の「ポリヌクレオチドがプロモーターの下流に作動可能に連結されている」とは、プロモーターがそのポリヌクレオチド配列の転写を開始することができるように、プロモーターと該ポリヌクレオチドが機能的に結合されていることを意味する。
【００４６】
上記発現ベクターを用いて本発明のペプチドを発現させる場合に用いる宿主細胞としては、該発現ベクターが本発明のペプチドを発現し得る宿主細胞であればどのようなものでもよく、例えば大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。また、本発明のペプチドを発現することができる発現ベクターの宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００４７】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤あるいはＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強用組成物（好ましくは医薬組成物）に含まれる本発明のペプチドや上記発現ベクター以外の任意成分として、例えば、医薬的に容認可能な担体又は希釈剤、免疫賦活剤、添加剤等を含んでいてもよく、かかる担体又は希釈剤としては、例えば、ＳＰＧＡなどの安定化剤や、ソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン等の炭水化物や、アルブミン、カゼイン等のタンパク質や、ウシ血清、スキムミルク等のタンパク質含有物質や、リン酸緩衝液、生理食塩水、水等の緩衝液などを具体的に挙げることができる。免疫賦活剤としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＨＦ−α）等のサイトカインを具体的に例示することができ、添加剤としては、低分子量のポリペプチド（約１０残基未満）、タンパク質、アミノ酸、グルコース又はデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、蛋白質安定化剤、微生物増殖阻止若しくは抑制剤等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。
【００４８】
また、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤あるいはＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強用組成物（好ましくは医薬組成物）は、経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内等により投与することができる形態のものが好ましい。投与すべき有効量は、医薬品や医薬組成物の種類・組成、投与方法、患者の年齢や体重等を考慮して適宜決定することができ、これらを１日あたり１〜数回投与することが好ましい。また、経口投与する場合、通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。この際、製剤に用いることができる担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することができ、これらの製剤は常法に従って調製され、特に液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすることもできる。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。またこれらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００４９】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答誘導用ワクチンとしては、前述の本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含有していれば特に制限されるものではない。ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドについては前述したとおりである。かかるワクチンによれば、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬを共に誘導することができ、しかも、そのＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬの誘導を顕著に行うことができる。本発明の免疫応答誘導用ワクチンはＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の治療に用いることができる。なお、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬの好適な誘導を得る観点から、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドは投与対象のＨＬＡ−Ａのタイプに適合したものを用いることが好ましい。また、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤として、上記（Ｅ）のアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド、又は、上記（ｅ）のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含有する場合は、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるため、別個に含める必要はない。本明細書において、「本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤と、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含有する」ことには、上記（Ｅ）のアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドの態様や、上記（ｅ）のポリヌクレオチドを含む発現ベクターの態様も便宜上含まれる。
【００５０】
また、本発明の免疫応答誘導用ワクチンとしては、さらに細胞性の又は局所的な免疫を増強する種々のアジュバントを含むものがより好ましく、かかるアジュバントとしては、例えば、効率よくペプチド特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞やＣＴＬを誘導することができる樹状細胞、ＣｐＧモチーフを含むＩＳＳ−ＯＤＮ（Immunostimulatory DNAsequences-oligodeoxynucleotide；Nat. Med. 3, 849-854, 1997）、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するＱＳ２１（Quil1aia saponaria、Cambridge Biotech，Worcester，MAより商業的に入手可能）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油性エマルジョン、サポニン、ビタミンＥ溶解物等を具体的に挙げることができる。アジュバントを用いる場合、アジュバントとなる種々の菌体成分や毒素等と、前記本発明の本発明のペプチドとを連続してコードするポリヌクレオチドから作製した組換え融合タンパクあるいは組換え融合ペプチドとして用いることもできる。
【００５１】
本発明の免疫機能検査診断薬としては、本発明のペプチド、本発明の発現ベクター、ＨＬＡ−ＤＲ１と本発明のペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体、又は、該タンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分とし、免疫機能、特にＨＴＬＶ−Ｉに対する免疫機能を検査・診断しうるものであれば特に制限されるものではないが、通常は、本発明のペプチドの標識体、発現産物が標識体となる本発明のペプチドを発現させることができる発現ベクター、ＨＬＡ−ＤＲ１と本発明のペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の標識体、又は該タンパク−ペプチド結合体の４量体の標識体を用いることが好ましい。標識体とするために用いられる標識化物質しては、上記のマーカータンパク質やペプチドタグの他、放射性同位元素を用いることができる。本発明の免疫機能検査診断薬としては、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬を好適に例示することができる。本発明の免疫機能検査診断薬を用いた免疫機能検査診断は、対象被験者の末梢血白血球（リンパ球）に本発明の免疫機能検査診断薬を接触させ、本発明のペプチド等におけるエピトープを認識するＣＤ４＋Ｔ細胞と結合させることによりＨＴＬＶ−Ｉ Ｔａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別することができる。免疫機能検査診断薬の中でも、上記タンパク−ペプチド結合体の４量体のＰＥ等の蛍光標識体はフローサトメトリーによるＣＤ４＋Ｔ細胞の検出・定量を可能にするため、免疫機能検査診断薬の他、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導効果の判定に特に有用である。例えば、ヘパリン末梢血検体から単核球分画を分離し、ＰＥ標識テトラマー（タンパク−ペプチド結合体の４量体）と、ＦＩＴＣやＰＥ-Ｃｙ５で標識したＣＤ４抗体等の活性化マーカー抗体とで２重染色し、フローサイトメーターでＣＤ４陽性テトラマー陽性の細胞数を計算することにより、対象被験者の免疫機能の検査・診断を行うことができる。また、新鮮血液検体ではテトラマー陽性細胞数が非常に少ないことがよくあることから、新鮮血液検体だけでなく、本発明のペプチドやその発現細胞などで一回刺激をした後、数日〜１週間培養後に同様の染色解析をすることもできる。
【００５２】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法としては、ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプ、すなわちＨＬＡ−ＤＲ１タイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激することを特徴とする、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する方法や、本発明のペプチドを用いて、ＨＬＡ−ＤＲ１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法や、上記本発明の発現ベクターを用いて、例えばＰＢＭＣ中の抗原提示細胞に遺伝子工学的にペプチドを発現させるなど、ＨＬＡ−ＤＲ１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法であれば特に制限されるものではなく、かかる誘導方法により得られるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤として用いることができる他、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導の活性機構や分子機構を明らかにしたり、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導とＡＴＬやＨＡＭ／ＴＳＰとの関連を調べる上でも有用である。
【００５３】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答及びＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ応答を含むＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答を誘導する方法としては、ＨＬＡ−ＤＲ１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを、以下の（Ｘ）及び（Ｙ）を用いて刺激することを特徴とする方法である限り特に制限されない。
（Ｘ）本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤：
（Ｙ）前記ＡＴＬ患者のＨＬＡ−Ａ座の型に適合する、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチド：
【００５４】
なお、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤として、上記（Ｅ）のアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチド、又は、上記（ｅ）のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含有する場合は、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるため、別個に用意してそれでＰＢＭＣを刺激する必要はない。上記ＰＢＭＣを、上記（Ｘ）及び（Ｙ）を用いて刺激することには、上記（Ｅ）のアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導活性ペプチドでＰＢＭＣを刺激することや、上記（ｅ）のポリヌクレオチドを含む発現ベクターでＰＢＭＣを刺激することも便宜上含まれる。
【００５５】
本発明の他の態様には、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強のための、本発明のペプチドの使用や、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答誘導のための、本発明のペプチド及びＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドの使用や、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法により得られるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、哺乳動物に投与することを特徴とするＡＴＬの予防、治療又は改善方法や、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答を誘導する方法により得られるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬを哺乳動物に投与することを特徴とするＡＴＬの予防、治療又は改善方法なども含まれる。
【００５６】
［参考例］
本発明者らは以前、ＨＬＡ型が同じ兄弟姉妹をドナーとして緩和的前処置による同種造血幹細胞移植（ミニ移植）を受けたＡＴＬ患者の一部でＴａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導されたことを報告した（非特許文献９）。本発明では、緩和的前処置による同種造血幹細胞移植を受けたＡＴＬ患者多数におけるＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を調べた。表１は、緩和的前処置による同種造血幹細胞移植から１８０日後のＡＴＬ患者１８名から末梢血を採取し、Ｔａｘ／ＨＬＡテトラマーを使用したフローサイトメトリーでＴａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）を検出した結果を臨床情報と併せて示している。前記期間中、全ての患者は、ドナー由来造血幹細胞が９５％を上回るという完全なキメラ状態にあった。入手可能な４種類のテトラマー（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｔａｘ１１−１９，ＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ｔａｘ３０１−３０９，ＨＬＡ−Ａ＊１１０１／Ｔａｘ８８−９６，ＨＬＡ−Ａ＊１１０１／Ｔａｘ２７２−２８０）を使用し、１４名の患者でＴａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を認めた（後述の表１の「テトラマ−陽性細胞（％）」の項目を参照）。殆どの症例でドナーは未感染者だったことから（表１の「ドナー血清抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体反応の（−）を参照）、Ｔａｘ特異的なドナー由来ＣＤ８＋Ｔ細胞がレシピエントにおいて誘導されたことは、ＨＴＬＶ−Ｉに対する新たな免疫応答がレシピエントに生じたことを示している。かかる証拠は本発明者らの以前の知見を補強するものである（非特許文献９や、Harashima N, Tanosaki R, Shimizu Y, et al. Identification of two new HLA-A*1101-restricted tax epitopes recognized by cytotoxic T lymphocytes in an adult T-cell leukemia patient after hematopoietic stem cell transplantation. J Virol. 2005;79(15):10088-10092）。
【００５７】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
Ａ［方法と材料］
Ａ−１  被験者
本実施例で用いた、ＡＴＬ患者の検体は、緩和的前処置による同種造血幹細胞移植を受けた１８例、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体血清反応陰性者１例（#３６５）、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１を保有する抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体血清反応陽性ドナー２例（無症候性キャリア１例：＃３６０、及びＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症／熱帯性痙性不全対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ）患者１例：＃２９４）から書面によるインフォームドコンセントを得た上で末梢血の提供を受けた。
【００５９】
【表１】
2014133712.tif 000002
【００６０】
上記表１中、「キメリズム（％）」は、患者由来Ｔ細胞キメリズム（移植細胞の生着率を示す）の割合を示し、「テトラマ−陽性細胞（％）」は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞中のテトラマー陽性細胞（Ｔａｘ抗原特異的ＣＴＬ）の割合を示し、「感染細胞率」は、核酸定量的に割り出した、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１０００あたりの感染細胞数を示し、「Ｍ」は男性を表し、「Ｆ」は女性を表し、「ＮＴ」は未検を表し、「ｒ−ＰＢ」は血縁者間末梢血幹細胞移植を行ったことを示し、「ｕｒ―ＢＭ」は、非血縁者間骨髄細胞移植を行ったことを示す。
【００６１】
上記表１中のＡＴＬ患者の約半数が、ＨＬＡ−Ａ−、Ｂ−及びＤＲ−が一致する兄弟姉妹ドナーからの同種末梢血幹細胞移植を受けており、残りの半数は、ＨＬＡ−Ａ−、Ｂ−及びＤＲ−が一致する抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体血清反応陰性の非血縁ドナーによる同種骨髄細胞移植を受けている（表１参照）。これらの患者は、日本の厚生労働省の支援による、ＡＴＬ同種造血幹細胞移植研究グループが実施した臨床試験の参加者であり、本願実施例の実験を行うにあたって、東京医科歯科大学倫理審査委員会の承認を得ている。
【００６２】
Ａ−２  患者及びドナー由来細胞株の樹立
Ficoll-Paque（登録商標）PLUS（GE Healthcare UK社製）を用いた密度勾配遠心分離法によりＰＢＭＣを単離し、Bambankerストック溶液（日本ジェネティクス株式会社製）中に懸濁したＰＢＭＣを、必要時まで液体窒素中に保存した。これらストック細胞の一部を使用して、ＩＬ−２依存性ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株（ＩＬＴ）及びEpstein-Barrウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球Ｂ細胞株（ＬＣＬ）を樹立した。患者＃３５０から、同種造血幹細胞移植前に得たＰＢＭＣの長期培養によって、自発的に不死化（がん化）したＩＬＴ−＃３５０を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Sigma Aldrich社製）と組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２；塩野義製薬株式会社製）３０Ｕ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies, Inc.社製）で継代培養した。同種造血幹細胞移植後のＡＴＬ患者＃３０７、＃３４１及び＃３５０からそれぞれ得たＰＢＭＣより、ＬＣＬ−＃３０７、ＬＣＬ−＃３４１及びＬＣＬ−＃３５０を樹立した。これらのＰＢＭＣを２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で継代培養し、その後、ＥＢＶを含有するＢ９５−８細胞株培養上清を用いて感染させた。同様に健常者由来のＰＢＭＣより、ＬＣＬ−Ｋａｎを樹立した。
【００６３】
Ａ−３  合成ペプチド
Ｔａｘ抗原の中央領域（１０３〜２４６残基）における、長さが１２〜２５ｍｅｒのオーバーラッピングペプチドをScrum Inc.社から合計で１８種類購入し（表２参照）、エピトープマッピングに使用した。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ＣＴＬエピトープ（Ｔａｘ３０１−３０９）（配列番号３４）（非特許文献９）は、Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（株式会社ホクドー社製）のインビトロ・ペプチド刺激に使用した。
【００６４】
【表２】
2014133712.tif 000003
【００６５】
Ａ−４  ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を用いたイムノアッセイ
ＨＴＬＶ−ＩのＴａｘのＮ末端、中央、及びＣ末端の各領域におけるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質（それぞれＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃ）（非特許文献１３、Kurihara K, Shimizu Y, Takamori A, et al. Human T-cell leukemia virus type-I (HTLV-I)-specific T-cell responses detected using three-divided glutathione-S-transferase (GST)-Tax fusion proteins. J Immunol Methods. 2006;313(1-2):61-73.）を使用し、ＨＴＬＶ−ＩＴａｘ特異的なＴ細胞の免疫応答を評価した。
【００６６】
＜ＥＬＩＳＡ＞
ＧＳＴ−Ｔａｘ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃタンパク質の混合物（ＧＳＴ−ＴａｘＡＢＣ）の存在／非存在下（存在又は非存在下）において、ＰＢＭＣ（１×１０６細胞／ｍｌ）を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（２００μｌ）で培養した。４日後に上清を回収し、OptiEIA Human IFN-γ ELISA Kit（BD Biosciences社製）を用いて上清中のＩＦＮ−γ濃度を測定した。このアッセイにおけるＩＦＮ−γの最少検出量は、２３．５ｐｇ／ｍｌであった。
【００６７】
＜サイトカイン定量測定＞
Dynabeads M-450 CD8（インビトロゲン社製）を、製造者のプロトコールに従ったネガティブセレクション法により、上記培養ＰＢＭＣからＣＤ８＋細胞を除去した。ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株のサイトカインプロファイリングを行うため、ホルムアルデヒドで固定したＩＬＴ−＃３５０で上記分離細胞を４８時間刺激した。培養上清を回収し、Cytokine Beads ArrayのヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（BD Biosciecnes社製）を使用して種々のサイトカインを測定した。
【００６８】
Ａ−５  ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株（Ｔ４細胞）の誘導
緩和的前処置による同種造血幹細胞移植から１８０日目に完全寛解を得た、患者＃３５０のＰＢＭＣ（１×１０６細胞／ｍｌ）を、Ｔａｘ３０１−３０９ペプチド（１００ｎＭ）存在下で２週間培養した。培養ＰＢＭＣは、次に、Human CD4 T lymphocyte Enrichment Set-DM（BD Biosciecnes社製）を用いたネガティブセレクションにより、ＣＤ４＋細胞が単離され、２０％ＦＣＳ及びｒｈＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０で継代培養された。その後２〜３週間毎に、ホルムアルデヒドで固定したＩＬＴ−＃３５０で単離ＣＤ４＋細胞を刺激した。
【００６９】
Ａ−６  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ISOGEN（株式会社ニッポンジーン社製）及びTURBO DNA-free（Life Technologies, Inc.社製）を用いて、細胞から全ＲＮＡを単離した。ReverTra Ace-α-kit（TOYOBO社製）に含まれるReverTra Aceプライマー及びOligo(dt)２０プライマーを使用し、ＲＮＡ０．５μｇから第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。ReverTra Dash（TOYOBO社製）、ＨＴＬＶ−ＩｐＸ特異的プライマー（pX1:5'-CCA CTT CCC AGG GTT TAG ACA GAT CTT C-3'（配列番号２０）及びpX4:5'-TTC CTT ATC CCT CGA CTC CCC TCC TTC CCC-3'（配列番号２１））各０．５μＭ、及びｃＤＮＡ２μｌを含む反応混合液５０μｌ中でＰＣＲを行った。内部標準として、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）特異的プライマー（ＧＡＰＤＨ５’：5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'（配列番号２２）、及びＧＡＰＤＨ３’：5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'（配列番号２３））を使用した。熱サイクル条件として、初期活性化ステップを９４℃で１分間行い、その後、変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（６０℃、２分）及び伸長（７４℃、３０秒）からなるサイクルを３０サイクル行った。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドによりＰＣＲ産物を可視化した。
【００７０】
Ａ−７  フローサイトメトリー
細胞表面染色には、以下の蛍光色素標識マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した。ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＵＣＨＴ１、BioLegend社製）；ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４、BioLegend社製）；ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ８、BioLegend社製）及びＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５（ＨＩＴ８ａ、BD Biosciences社製）。テトラマー染色用に、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識したＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｔａｘ１１−１９、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１／Ｔａｘ８８−９６、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１／Ｔａｘ２７２−２８０、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ｔａｘ３０１−３０９の各テトラマーをＭＢＬ社（Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.、株式会社医学生物学研究所）から購入した。ＰＥ標識ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１／Ｔａｘ１５５−１６７テトラマーはＭＢＬに特別注文して新たに作製した。ＰＥ標識Ｔａｘ／ＨＬＡテトラマーはＣＤ３−ＦＩＴＣと、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５またはＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ５の組み合わせで、全血又は培養細胞を染色した。全血試料は赤血球を溶血させ、ＢＤ ＦＡＣＳ溶解液（BD Biosciences社製）で固定してから洗浄した。FACS Calibur（Becton Dickinson社製）を用いて試料を分析し、データ解析には、FlowJoソフトウエア（Tree Star, Inc.社製）を用いた。
【００７１】
Ａ−８  エピトープマッピング
Ｔ４細胞（３×１０５細胞／ｍｌ）は、種々の合成ペプチドおよび濃度条件下のもと３７℃で１時間ペプチド刺激されたＬＣＬ−＃３５０と、レスポンダー細胞（Ｔ４）／刺激細胞（ＬＣＬ−＃３５０）のＲ／Ｓ比率３にて、６時間共培養された。回収した培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い、Ｔ４細胞が種々のペプチド特異的な刺激により産生したＩＦＮ−γを定量した。
【００７２】
Ａ−９  ＨＬＡクラスII拘束性の解析
抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（１０μｇ／ｍｌ；Ｌ４２３、BioLegend社製）、抗ヒトＨＬＡ−ＤＱ抗体（１０μｇ／ｍｌ；ＳＰＶＬ３、Beckman Coulter, Inc.社製）又は抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体（１０μｇ／ｍｌ；Ｗ６／３２、BioLegend社製）の存在／非存在下で、Ｔ４細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）とＩＬＴ−＃３５０（１×１０５細胞／ｍｌ）との共培養を６時間行った。上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで定量した。
Ｔ４細胞に対する抗原提示に関与するＨＬＡクラスII分子を同定するため、種々のＨＬＡ型ＬＣＬ（ＬＣＬ−＃３５０、ＬＣＬ−＃３４１、ＬＣＬ−＃３０７及びＬＣＬ−Ｋａｎ）を用いて、Ｔａｘ１５５−１６７ペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生応答を評価した。これらのＬＣＬ（１×１０５細胞／ｍｌ）を１００ｎｇ／ｍｌのＴａｘ１５５−１６７ペプチドで１時間刺激し、２％ホルムアルデヒドで固定した後、Ｔ４細胞（３×１０５細胞／ｍｌ）の存在下で６時間培養した。培養上清を回収し、上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。
【００７３】
Ａ−１０  増殖能の解析
１００ｎＭの抗原ペプチドの存在／非存在下で、ＰＢＭＣ（１．０×１０６細胞／ｍｌ）を１３日間又は１４日間培養した。ＨＬＡ／Ｔａｘテトラマー−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５またはＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ５の組み合わせで細胞を染色し、フローサイトメトリー分析を行った。
【００７４】
Ａ−１１  統計解析
統計的有意性は、Graphpad Prism 5（Graphpad Prism Software, Inc.社製）により、独立ｔ検定を用いて評価した。全ての症例において、両側Ｐ値が０．０５未満を有意とした。
【００７５】
Ｂ［結果および考察］
Ｂ−１  緩和的前処置による同種造血幹細胞移植後のＡＴＬ患者におけるＴａｘ特異的なＴ細胞の免疫応答
Ｔａｘ特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を用いたイムノアッセイ（上記Ａ−４参照）を行った。ＧＳＴ−Ｔａｘ融合タンパク質を用いた免疫学的機能測定法は、ＨＬＡ型に関係なくＣＤ４＋Ｔ細胞応答とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方について解析可能である。かかるアッセイの結果を図１に示す。図１Ａの患者ＰＢＭＣ１６例の結果から、ＩＦＮ−γ産生を基準としたＴａｘタンパク質刺激に対する免疫応答の程度が、多様であることが明らかとなった。また、かかるアッセイにより、患者１６名中１１名（＃２３９，＃２４１，＃３０１，＃３１７，＃３４１，＃３４４，＃３５０，＃３５１，＃３５２，＃３５８，＃３６４）、すなわち、６８．８％もの患者のＴａｘ特異的Ｔ細胞応答を検出できることが分かった。更に、Ｔ細胞が産生するＩＦＮ−γのうち、Ｔａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の寄与を明確にするため、ＣＤ８＋細胞枯渇ＰＢＭＣ（”CD8(-)”）と比べて解析したところ、全ＰＢＭＣ（”whole”）と比較してＩＦＮ−γ産生量は低下しているものの、＃３５０および＃３４１の２検体ともに、ＣＤ８＋細胞枯渇ＰＢＭＣすなわちＣＤ４＋を主とするＴ細胞が、Ｔａｘタンパク質刺激に応答して有意にＩＦＮ−γ産生を行っていることが示された（図１Ｂ）。
【００７６】
Ｂ−２  患者＃３５０からのＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株の誘導
ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株（ＩＬＴ−＃３５０）を抗原提示細胞として使用し、緩和的前処置による同種造血幹細胞移植後１８０日目の同患者＃３５０ＰＢＭＣから、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導した。単離したばかりの患者ＰＢＭＣをＴａｘ３０１−３０９（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に提示されるＣＴＬ優位なエピトープ）で２週間ペプチド刺激することで、Ｔａｘ特異的ＣＴＬを誘導し、患者ＰＢＭＣ中に元々存在していたＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を除去した。次に、培養細胞からＣＤ４＋細胞を単離し、ホルムアルデヒドで固定したＩＬＴ−＃３５０で２〜３週間毎に刺激した。樹立した細胞株の細胞表面における表現型をフローサイトメトリー（上記Ａ−７参照）により解析したところ、その細胞がＣＤ３及びＣＤ４を発現するもののＣＤ８は発現しなかったことから（図２Ａ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞株であることが確認された。以下、これをＴ４細胞と呼ぶ。
【００７７】
ＨＴＬＶ−Ｉは、インビボとインビトロの両方でＣＤ４＋Ｔ細胞を優先的に感染させることが知られる（非特許文献２３）。ＲＴ−ＰＣＲ（上記Ａ−７参照）により、前述のＴ４細胞でのＨＴＬＶ−Ｉ感染を調べたところ、ｐＸで示される位置にバンドは確認されず（図２Ｂ）、ＨＴＬＶ−Ｉに感染していないＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞であることが示された。なお、ＴａｘはｐＸ遺伝子産物であり、細胞中にＴａｘがないことはＨＴＬＶ−Ｉに未感染であることを示す。また、ＥＢウイルス形質転換Ｂ細胞株のＬＣＬ−＃３５０は、ネガティブコントロールとして、ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株のＩＬＴ−＃３５０と、ＡＴＬ細胞株のＭＴ−２は、ポジティブコントロールとして使用した。
【００７８】
次に、Ｔ４細胞における様々なサイトカイン産生を調べるために、ホルムアルデヒドで固定したＩＬＴ−＃３５０細胞又はＬＣＬ−＃３５０細胞の存在／非存在下で、Ｔ４細胞を２４時間刺激し、その上清中のサイトカイン濃度をサイトメトリービーズアレイシステムにより定量した。その結果、Ｔ４細胞はＩＬＴ−＃３５０に応答してＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを大量に産生し、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０も低量だが産生したが、ＬＣＬ−＃３５０に対する産生は認められなかった（図２Ｃ）。従って、Ｔ４細胞がＨＴＬＶ−Ｉ特異的であり、Ｔｈ１型のＣＤ４＋細胞株であることが示された。
【００７９】
Ｂ−３  Ｔ４細胞が認識する最小エピトープの決定
Ｔ４細胞に認識されるＴａｘタンパク質の抗原エピトープを調べるため、ＧＳＴ−Ｔａｘタンパク質で刺激したＬＣＬ−＃３５０を抗原提示細胞として用い、それぞれのＴａｘペプチドに対する、Ｔ４細胞の応答性を調べた（上記Ａ−４やＡ−８参照）。その結果を図３に示す。
【００８０】
Ｔ４細胞は、ＧＳＴ−ＴａｘＡＢＣ及びＧＳＴ−ＴａｘＢ（ＴａｘＢ：配列番号３２のアミノ酸番号１１３〜２３７のアミノ酸配列）に対しては、ＧＳＴタンパク質（コントロール）と比べ、著しく高い値のＩＦＮ−γを産生したが、ＧＳＴ−ＴａｘＡ（ＴａｘＡ：配列番号３２のアミノ酸番号１〜１２７のアミノ酸配列）やＧＳＴ−ＴａｘＣ（ＴａｘＣ：配列番号３２のアミノ酸番号２２４〜３５３のアミノ酸配列）に対しては、有意に高い産生はみられなかった（図３Ａ）。このことは、Ｔ４細胞が、Ｔａｘタンパクの主に中央領域を、抗原として認識したことを示す。
【００８１】
次に、Ｔａｘの中央部（１０３〜２４６残基）を領域とする、２５ｍｅｒのオーバーラッピングペプチド８種類を合成し（配列番号１〜８；上記Ａ−３及び表２参照）、それらペプチドのＴ４細胞に対する刺激能を分析した。その結果、Ｔａｘ１５４−１７８（配列番号４）でペプチド刺激した場合のみ、Ｔ４細胞株のＩＦＮ−γ産生は高い値を示した（図３Ｂ）。
【００８２】
次に、更にエピトープの領域を狭め、Ｔａｘの１５４〜１７８残基の領域から、１５ｍｅｒのオーバーラッピングペプチドを４種類作製し（配列番号１０、１３、１４、１５；上記Ａ−３及び表２参照）、各エピトープペプチドに対するＴ４細胞のＩＦＮ−γ産生能を調べた。その結果、Ｔａｘ１５１−１６５（配列番号１０）及びＴａｘ１５６−１７０（配列番号１３）は、Ｔａｘ１５４〜１７８（配列番号４）に匹敵する水準ではなかったものの、有意にＴ４細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導した（図３Ｃ）。これらの結果から、Ｔ４細胞に認識されるエピトープが、Ｔａｘ１５４−１７８のＮ末端側の半分に存在している可能性が示唆された。
【００８３】
そこで、Ｔａｘ１５４−１６８（配列番号１１）、Ｔａｘ１５５−１６９（配列番号１２）、Ｔａｘ１５６−１７０（配列番号１３）のエピトープペプチドを作製又は用意し（上記Ａ−３及び表２参照）、同様に調べたところ、Ｔａｘ１５６−１７０ではＴａｘ１５４〜１７８と同程度のＩＦＮ−γ産生が認められ、Ｔａｘ１５４−１６８やＴａｘ１５５−１６９ではＴａｘ１５６−１７０に対して有意に高いＩＦＮ−γ産生が誘導された。これらの結果から、最小エピトープが、Ｔａｘの１５５〜１６８残基中に存在する可能性が示唆された（図３Ｄ）。
【００８４】
次に、Ｔ４細胞に認識される最小エピトープを同定するため、Ｔａｘの１５５残基から始まり、長さが１２〜１４ｍｅｒのオーバーラッピングペプチドを３種類合成した（配列番号１６〜１８；上記Ａ−３及び表２参照）。Ｔａｘ１５５−１６７では、Ｔａｘ１５５−１６９及びＴａｘ１５５−１６８と同レベルのＩＦＮ−γ産生が誘導されたが、Ｔａｘ１５５−１６６では同等のレベルに至らなかった（図３Ｅ）。
【００８５】
さらに、Ｔａｘ１５５−１６９、Ｔａｘ１５５−１６８、Ｔａｘ１５５−１６７、Ｔａｘ１４６−１６０（ネガティブコントロール）について、その濃度条件を変えてＩＦＮ−γ産生を調べた。Ｔａｘ１５５−１６７に対し濃度依存性にＴ４細胞で産生されるＩＦＮ−γの量は、Ｔａｘ１５５−１６９及びＴａｘ１５５−１６８に対する産生量に匹敵していることが分かった（図３Ｆ）。
【００８６】
上記Ｂ−３の一連の実験結果により、Ｔ４細胞に認識される最小エピトープはＴａｘ１５５−１６７であることが明確に示された。
【００８７】
Ｂ−４  Ｔａｘ特異的Ｔ４細胞のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１拘束性
上記Ｂ−３で判明した最小エピトープ（Ｔａｘ１５５−１６７）の抗原提示に関与するＨＬＡクラスII分子の種類を調べるため、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＨＬＡ−ＤＱ及び抗ＨＬＡクラスＩブロッキング抗体の存在／非存在下で、ＩＬＴ−＃３５０刺激によるＴ４細胞の免疫応答を解析した（上記Ａ−９参照）。ＨＬＡ−ＤＲのブロッキングにより、ＩＬＴ−＃３５０からの刺激に対するＴ４細胞のＩＦＮ−γ産生が抑制されたため、このエピトープがＨＬＡ−ＤＲ拘束性であることが示された（図４Ａ）。
【００８８】
さらに、異なるＨＬＡ−ＤＲをディスプレイする４種類のＨＬＡ型ＬＣＬを使用し、最小エピトープの提示に関与するＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を調べた（上記Ａ−９参照）。Ｔａｘ１５５−１６７が自己ＬＣＬ−＃３５０（ＤＲ１／１４）及び同種ＬＣＬ−＃３４１（ＤＲ１／１５）によって提示されると、Ｔ４細胞によるＩＦＮ−γの産生が確認された（図４Ｂ）。この結果は、このエピトープが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１によって抗原提示細胞上に提示されることを明確に示している。同定したエピトープＴａｘ１５５−１６７中に、公知のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１モチーフ（Rammensee HG, Friede T, Stevanoviic S. MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics. 1995;41(4):178-228.）の有無を探索したところ、このエピトープがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１モチーフを含むことが分かった（図４Ｃ）
【００８９】
Ｂ−５  Ｔａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルプによるＴａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の亢進
次に、患者＃３５０の新鮮ＰＢＭＣにおけるＴａｘ特異的ＣＴＬ増殖に対する、Ｔａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルパー機能を評価した。緩和的前処置による同種造血幹細胞移植から５４０日後に患者＃３５０から単離されたばかりのＰＢＭＣ（Ａ２４／２６、ＤＲ１／１４）を、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬエピトープであるＴａｘ３０１−３０９ペプチド及び／又はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１拘束性Ｔｈ１型エピトープであるＴａｘ１５５−１６７ペプチドで１３日間刺激し、Ｔａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ｔａｘ３０１−３０９テトラマーを用いて測定した（上記Ａ−１０参照）。これは、かかるテトラマーがＴａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合する性質を利用するものである。この測定の結果を図５に示す。Ｔａｘ３０１−３０９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔａｘ３０１−３０９単独で刺激した場合、９．２６％まで増殖したのに対し（図５の上段の中央パネル）、Ｔａｘ３０１−３０９及びＴａｘ１５５−１６７の両方を用いてインビトロ刺激したところ、Ｔａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が６２．３％まで著しく増加した（図５の上段の右パネル）。その他２名の緩和的前処置による同種造血幹細胞移植を受けたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１＋ＨＴＬＶ−Ｉ感染患者についても同様の方法で測定を行った。患者＃３６４では、移植から１８０日後に同患者から単離されたばかりのＰＢＭＣ（Ａ２４／２６、ＤＲ１／−）を用い、患者＃３４１では、移植から３６０日後の同患者から単離されたばかりのＰＢＭＣ（Ａ２４／３３、ＤＲ１／１５）を用いた。ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬエピトープであるＴａｘ３０１−３０９単独でＰＢＭＣを刺激した場合、Ｔａｘ３０１−３０９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は０．８５％（患者＃３６４）及び７．７％（患者＃３４１）に増殖したのに対し（図５の中段の中央パネル、下段の中央パネル）、Ｔａｘ３０１−３０９及びＴａｘ１５５−１６７の両方でＰＢＭＣを共刺激した場合、Ｔａｘ３０１−３０９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は１５．５％（患者＃３６４）及び５９．６％（患者＃３４１）まで著しく増加した（図５の中段の右パネル、下段の右パネル）。また、３人の患者（＃３５０、＃３６４、＃３４１）のＰＢＭＣには、Ｔａｘエピトープで刺激する前の段階で、前述のテトラマーに結合するＴａｘ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出可能なレベルで存在した。
以上の結果から、緩和的前処置による同種造血幹細胞移植を受けたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１＋ＨＴＬＶ−Ｉ感染者において、Ｔａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が存在し、Ｔａｘ３０１−３０９／Ｔａｘ１５５−１６７の混合エピトープ刺激により、Ｔａｘ３０１−３０９単独刺激に比してＣＤ８＋Ｔ細胞応答が顕著に亢進されることが示された。
【００９０】
Ｂ−６  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１＋ＨＴＬＶ−Ｉ感染者ではＴａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が維持される
次に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１／Ｔａｘ１５５−１６７テトラマーを作製し、Ｔａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を直接検出することで、同種造血幹細胞移植を受けたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１＋患者２名から単離したばかりのＰＢＭＣ中に、Ｔａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が存在するかどうかを確認した。患者＃３５０では、移植から５４０日後に同患者から単離されたばかりのＰＢＭＣ（Ａ２４／２６、ＤＲ１／１４）を用い、患者＃３６４では、移植から１８０日後に同患者から単離されたばかりのＰＢＭＣ（Ａ２４／２６、ＤＲ１／−）を用い、患者＃３４１では、移植から３６０日後の同患者から単離されたばかりのＰＢＭＣ（Ａ２４／３３、ＤＲ１／１５）を用いた。患者＃３５０では、Ｔａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が培養や刺激無しに（ex vivo）検出可能な水準で存在し（０．１１％）（図６Ａの上段の左パネル）、Ｔａｘ１５５−１６７ペプチドによる刺激から１３日後では、１１．６％まで増殖した（図６Ａの上段の右パネル）。患者＃３６４では、ex vivoではＴａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は検出されなかったが（図６Ａの中段の左パネル）、Ｔａｘ１５５−１６７ペプチドによりインビトロで刺激したところ、０．３７％まで増殖した（図６Ａの中段の右パネル）。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１＋血清反応陰性ドナー＃３６５（ネガティブコントロール）では、ex vivoではＴａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は検出されず（図６Ａの下段の左パネル）、Ｔａｘ１５５−１６７ペプチドによる刺激１３日後でも検出不可能だった（図６Ａの下段の右パネル）。
【００９１】
さらに、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１を保有するＨＴＬＶ−Ｉ感染者２名（無症候性キャリア（ＡＣ）＃３１０及びＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症／熱帯性痙性不全対麻痺患者＃２９４）での、Ｔａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在の有無を調べたところ、末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞中それぞれ０．１８％と０．３１％のテトラマー陽性細胞を検出した（図６Ｂ）。
【００９２】
以上の結果から、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１対立遺伝子を発現するＨＴＬＶ−Ｉ感染者において、造血幹細胞移植の有無に関係なく、Ｔａｘ１５５−１６７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が維持されていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に関連する分野などに利用することができる。より詳細には、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導作用増強剤や、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的免疫応答誘導用ワクチンや、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を識別するための免疫機能検査診断薬や、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導方法などに関する分野に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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