(57)【要約】【課題】安全性が高く、長期摂取可能な、新たなＨｓｐ発現促進剤の提供。【解決手段】ケール又はその加工物を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケール又はその加工物を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進剤。
【請求項２】
熱ショックタンパク質がＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ４０からなる群から選ばれる１種以上である請求項１記載の熱ショックタンパク質発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな熱ショックタンパク質（Heat Shock Protein、Ｈｓｐ）発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）は、細胞が熱等のストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して細胞を保護するタンパク質であり、分子シャペロンとして機能する。Ｈｓｐの発現促進は、肺線維症の予防又は治療に有効である可能性があることが報告されている。
【０００３】
肺線維症は、肺組織が長期にわたって傷害され、線維化する症状であり、原因には間質性肺炎、過敏性肺炎などが考えられている。肺線維症の治療法としてはステロイド療法が行なわれている（特許文献１）。
このため、Ｈｓｐの発現を促進し、肺線維症の予防又は治療に有用で、安全性が高く、長期摂取可能な物質の探索が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５２５３７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、安全性が高く、長期摂取可能な、新たなＨｓｐ発現促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、多くの植物素材の中からＨｓｐ発現促進剤を見出すべく検討した結果、ケール又はその加工物が優れたＨｓｐ発現促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ケール又はその加工物を有効成分とするＨｓｐ発現促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
ケール又はその加工物は、長期摂取可能であり、優れたＨｓｐ発現促進作用を有し、Ｈｓｐが関与する疾患、例えば肺線維症の予防治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ケール摂取マウスの脳におけるＨｓｐ７０タンパク質及びＨＳＦ１タンパク質の発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のＨｓｐ発現促進剤の有効成分は、ケール又はその加工物である。
【００１１】
ケールはアブラナ科の植物であり、青汁の原料として広く用いられている。ケールは、植物全体を使用してもよく、葉、茎、根、花、蕾などを使用してもよいが、葉を使用するのが特に好ましい。また、生葉を使用するのが、特に好ましい。
【００１２】
ケールの加工物としては、特に限定されるものではないが、ケールの粉砕物、その搾汁またはその抽出物を例示することができる。ケールの粉砕物としては、ケール葉の粉砕物が好ましい。ケールの粉砕物は、例えばケール葉を公知の手段で粉砕することにより得ることができる。
【００１３】
ケールの搾汁としては、ケール葉の搾汁が好ましい。搾汁は、その後粉末化して使用するのが、流通性、保存性の点で好ましい。
【００１４】
ケールの搾汁は、例えばケール葉を細断及び／又は粉砕した後、搾汁処理することにより得られる。搾汁処理手段としては、パルパー、スクリュープレス、フィルタープレス、デカンターなどの搾汁機で行うのが好ましい。また、ケール葉を必要により８０〜１００℃で１〜２０分間熱処理した後に搾汁処理することもできる。なお、搾汁の粉末化は、熱風乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥により行われる。
【００１５】
ケールの抽出物としては、種々の溶媒による抽出物が用いられる。
抽出に用いられる溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の低級アルコール；酢酸エチル等のエステル；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のグリコール類；ジエチルエーテル、石油エーテル等のエーテル類；アセトン、酢酸等の親水性溶媒；ベンゼン、ヘキサン、キシレン等の炭化水素などを挙げることができる。これらの溶媒は、単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１６】
抽出の際のケールと溶媒との比率はケール乾燥重量に対して溶媒が１〜１００倍、特に２〜４０倍であるのが好ましい。
【００１７】
抽出方法としては、一般的な方法を使用することができ、例えば、溶媒にケール葉を浸漬する方法、加温下（常温〜溶媒の沸点の範囲）で攪拌する方法等を挙げることができ、圧力式抽出釜等を用いて行うこともできる。
【００１８】
抽出条件は原料の状態、使用する溶媒の種類等により異なるが、例えば、常圧ないし加圧条件、すなわち、１気圧〜２気圧の範囲で、室温或いは加温・加熱することが挙げられる。
【００１９】
ケールの抽出物もまた、前記搾汁と同様に粉末化して用いてもよい。
【００２０】
ケール又はその加工物は、後記実施例に示すように、優れたＨｓｐ発現促進作用を有する。Ｈｓｐには、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ９０（Ｈｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ３２等があり、本発明のＨｓｐ発現促進剤が発現を促進させるＨｓｐは特に限定されるものではないが、特に、Ｈｓｐの中でもＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０からなる群から選ばれる１種以上の発現促進作用が優れている。これらは、Ｈｓｐの中でも主要な分子種、若しくは主要な分子種のコファクターであり、これらの発現が促進されると、より強いＨｓｐの分子シャペロン機能が期待できる。また、Ｈｓｐの発現が促進される臓器は特に制限されるものではなく、脳や肝臓等あらゆる臓器で発現が促進されるものであるが、特に肝臓での発現促進効果が顕著である。従って、本発明のＨｓｐ発現促進剤は、前述の肺線維症の予防及び治療に有用である。肺線維症は、難病であり、通常、副作用の多いステロイド療法が行われている疾患であることから、安全性が高く、長期間摂取可能なケール又はその加工物により予防及び治療できることは、極めて有益である。
【００２１】
本発明においてＨｓｐ発現促進とは、ＨｓｐのｍＲＮＡの発現促進だけでなく、Ｈｓｐタンパク質の発現促進も意味する。すなわち、ケール又はその加工物は、ＨｓｐのｍＲＮＡのみならず、Ｈｓｐタンパク質の発現も促進する。また、ケール又はその加工物は、Ｈｓｐの転写因子であるＨＳＦ１（Heat shock transcription factor 1）を活性化する作用を有し、かかる作用によりＨｓｐ発現促進効果を生じるものと考えられる。
【００２２】
本発明のＨｓｐ発現促進剤の投与方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも使用できるが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００２３】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２４】
さらにケール又はその加工物としては、ケールの粉砕物、ケールの搾汁又は抽出物をそのまま用いた青汁又は粉末が好適に用いられる。
【００２５】
本発明のＨｓｐ発現促進剤の有効成分であるケールは、従来より利用され、その安全性も確認されているものであることから、これをＨｓｐ発現促進剤として使用する場合の投与量に厳格な制限はないが、その好適な投与量はケール由来の乾燥固形分として１日当たり、体重７０ｋｇのヒトとして２ｇ〜１００ｇであり、特に２０ｇ〜８０ｇが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
【００２７】
実施例１（マイクロアレイ解析）
ケールとして、ケールの搾汁の粉末（ケール由来の固形分４０％、以下ケール粉末という）を用いた。
【００２８】
（動物）
雄のＳＡＭＰ８マウス（日本エスエルシー社製）を使用した。
全てのマウスは温度２０−２３℃、湿度４０−７０％、明暗サイクルが１２ｈ／１２ｈで個別に飼育されている。
【００２９】
（実験計画）
１６週齢のマウスを８匹ずつ２つの群に分けた。
コントロール群はＭＦ飼料（オリエンタル酵母工業社製）で飼育し、ケール摂取群は、ケール粉末２％（ｗ／ｗ）（ケール由来固形分に換算すると０．８％）含有するＭＦ飼料で飼育した。
飼料と水は自由摂取とした。飼料摂取量はコントロール群とケール摂取群で有意差はなかった。
１６週後、解剖し、脳と肝臓を摘出した。これらの組織は無毒性組織保存薬（Sigma社製）、RIPA lysis buffer（Santa Cruz Biotechnology社製）、５mMのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸漬し、−８０℃で保存した。
【００３０】
（マイクロアレイ解析）
マイクロアレイ解析のサンプルは肝臓を用いた。
マイクロアレイ解析は、CodeLink Mouse Whole Genome Bioarray（Applied Microarrays社製）を用いた。検出は、GenePix4000B Array Scanner（Molecular Devices社製）を用いた。データ解析は、microArray Data Analysis Tool version 3.2（Filgen社製）を用いた。
【００３１】
（結果）
ｍＲＮＡが高発現している遺伝子を表１に示す。
【００３２】
【表１】
2014088378.tif 000002
【００３３】
ケール摂取群の肝臓組織では、Ｈｓｐ７０とＨｓｐ４０のｍＲＮＡが高発現していることがＤＮＡマイクロアレイ解析により示された。
【００３４】
実施例２（定量リアルタイムＰＣＲ）
（サンプル）
実施例１と同じ脳と肝臓の組織サンプルを用いた。
（定量リアルタイムＰＣＲ）
遺伝子発現量の定量は、定量リアルタイムＰＣＲ（StepOne Real-time PCR System、Applied BioSystems社製）を用いて行った。
リアルタイムＰＣＲは、KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit（Kapa Biosystems社製）を用いた。
サーマルサイクルプログラムは、初期変性：９５℃３分を１サイクル、変性：９５℃３秒、アニーリング／伸長反応：６０℃２０秒をセットで４０サイクル、最終解離：９５℃１５秒を１サイクルとした。
それぞれのサンプルの全ＲＮＡ量を同一にするために、β−アクチンを内部標準として用いた。プライマー配列は以下の通りである。
【００３５】
β-actin:5'-CACTATTGGCAACGAGCGGTTC-3'(forward)（配列番号１）
5'-ACTTGCGGTGCACGATGGAG-3' (reverse)（配列番号２）
Hsp70:5'-TGGTGCTGACGAAGATGAAG-3'(forward)（配列番号３）
5'-AGGTCGAAGATGAGCACGTT-3'(reverse)（配列番号４）
Hsp40:5'-CTCCAGTCACCCATGACCTT-3'(forward)（配列番号５）
5'-TGCTCTTTCCATCAGGGTTC-3'(reverse)（配列番号６）
Hsp90β:5'-GCGGCAAAGACAAGAAAAAG-3'(forward)（配列番号７）
5'-GAAGTGGTCCTCCCAGTCAT-3'(reverse)（配列番号８）
Hsp90α: 5'-AAAGGCAGAGGCTGACAAGA-3'(forward)（配列番号９）
5'-AGGGGAGGCATTTCTTCAGT-3'(reverse)（配列番号１０）
【００３６】
発現解析には、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用い、測定したい目的の遺伝子とハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンのＣｔ値の差（ΔＣｔ）を比較して、相対定量した。
【００３７】
（結果）脳組織の結果を表２に示し、肝臓組織の結果を表３に示した。
【００３８】
【表２】
2014088378.tif 000003
【００３９】
【表３】
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【００４０】
ケール摂取群の脳および肝臓組織ではHsp70、Hsp40、Hsp90β、Hsp90αのmRNAが高発現していることが定量的リアルタイムＰＣＲによって示された。
【００４１】
実施例３（ウエスタンブロッティング）
（サンプル）
実施例１と同じ脳の組織サンプルを用いた。
（ウエスタンブロッティング）
脳組織のサンプル（コントロール群、ケール摂取群、共にｎ＝６）にRIPA lysis buffer（Santa Cruz Biotechnology社製）を加え、ホモジネート後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し、得られた上清をタンパク質画分として回収した。１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦメンブレン（Clear Blot Membrane-P,ATTO社製）にタンパク質を転写した。一次抗体に抗Ｈｓｐ７０抗体（1:1,000,Enzo Life Sciences社製）、抗ＨＳＦ１抗体（1:1,000,Enzo Life Sciences社製）、およびβ−ａｃｔｉｎ抗体（1:1,000,Enzo Life Sciences社製）を用い、二次抗体にはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（1:5,000,Anaspec社製）を用いた。β−アクチンは内部標準として用いた。検出はWestern Blotting Substrate（Thermo scientific社製）を用いた化学発光法にて化学発光撮影装置（AE-9300 Ez-Capture）により行なった。結果を図１に示す。図１のＡは、各群のサンプル（ｎ＝６）の中から、代表例として選択した３サンプルのウエスタンブロッティングの結果を示す図であり、図１のＢおよびＣは、ｎ＝６の平均値に基づいた各群のタンパク質発現量を示すグラフであり、ケール摂取群のタンパク質発現量は、コントロール群のタンパク質発現量を１とした相対値で示されている。なお、図１のＢおよびＣにおいては、各サンプルのＨｓｐおよびＨＳＦ１のタンパク質発現量の実測値をβ−アクチンタンパク質の発現量の実測値で除した値を補正値とし、当該補正値を用いて各群のタンパク質発現量の平均値を算出した。
【００４２】
（結果）
図１に示すように、ケール又はその加工物を摂取することにより、Ｈｓｐタンパク質及びＨＳＦ１タンパク質の両者の発現が促進することがわかる。
【図１】
2014088378.tif 000005
【配列表】
2014088378000001.app