(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍細胞の増殖及び/又は生存を阻害する方法の提供。【解決手段】タモキシフェン耐性の腫瘍を含む対象を同定する段階、および該対象にTFF（トレフォイル因子）阻害性化合物を投与する段階を含む方法。該ＴＦＦ阻害性化合物は1つ若しくは複数のiRNA又は1つ若しくは複数のiRNAをコードする1つ若しくは複数のDNA分子を含み、発現されたiRNAはTFF1又はTFF2遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF1又はTFF2遺伝子の発現を阻害する、又該ＴＦＦ阻害性化合物はTFFのペプチドアンタゴニストを含み、腫瘍細胞中での内因性TFFとTFF受容体との結合を阻害するか又はTFFの二量体化、凝集若しくは機能活性を阻害する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖および/または生存を阻害する方法であって、タモキシフェン耐性の腫瘍を含む対象を同定する段階、および該対象にTFF阻害性化合物を投与する段階を含む方法。
【請求項２】
腫瘍細胞をトレフォイル因子(TFF)遺伝子の発現を阻害する化合物と接触させる段階を含む、腫瘍細胞の増殖および/または生存を阻害する方法であって、該TFF遺伝子はTFF1またはTFF2であり、該化合物は1つもしくは複数のiRNAまたは1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含み、発現されたiRNAはTFF1またはTFF2遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF1またはTFF2遺伝子の発現を阻害し、それによって該細胞の増殖および/または生存を阻害する方法。
【請求項３】
腫瘍細胞をトレフォイル因子3 (TFF3)遺伝子の発現を阻害する化合物と接触させる段階を含む、腫瘍細胞の増殖および/または生存を阻害する方法であって、該化合物は、SEQ ID NO:9〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数のiRNA、またはSEQ ID NO:9〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含み、発現されたiRNAはTFF3遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF3遺伝子の発現を阻害し、それによって該細胞の増殖および/または生存を阻害する方法。
【請求項４】
腫瘍細胞をTFFのペプチドアンタゴニストと接触させる段階を含む、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、該アンタゴニストは(a) 23、24、25、46、47または57位において非同一アミノ酸を含むSEQ ID NO:25のTFFの機能干渉性の変異体および(b) SEQ ID NO:25のTFFの断片からなる群より選択され、該アンタゴニストは該細胞中での内因性TFFとTFF受容体との結合を阻害するかまたはTFFの二量体化、凝集もしくは機能活性を阻害する方法。
【請求項５】
対象由来の組織試料においてTFF3発現レベルを検出する段階を含む、タモキシフェン耐性または該耐性を発症する素因を診断する方法であって、正常の対照レベルと比較した該レベルの増大は、該対象がタモキシフェン耐性の腫瘍を含むことまたは該腫瘍を発症する危険性があることを示す方法。
【請求項６】
1つもしくは複数のiRNAまたは1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含む組成物を投与することにより、TFF1またはTFF2である、トレフォイル因子(TFF)遺伝子の発現を調節する段階を含む、癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患をその必要がある対象において処置または予防する方法であって、発現されたiRNAはTFF1またはTFF2遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF1またはTFF2遺伝子の発現を調節し、それによって該癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患を処置または予防する方法。
【請求項７】
SEQ ID NO:9〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数のiRNA、またはSEQ ID NO:9〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含む組成物を投与することにより、トレフォイル因子3 (TFF3)遺伝子の発現を調節する段階を含む、癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患をその必要がある対象において処置または予防する方法であって、発現されたiRNAはTFF3遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF3遺伝子の発現を調節し、それによって該癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患を処置または予防する方法。
【請求項８】
1つもしくは複数のペプチドアンタゴニストまたは1つもしくは複数のペプチドアンタゴニストをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含む組成物を投与することにより、トレフォイル因子(TFF)タンパク質の発現または活性を調節する段階を含む、癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患をその必要がある対象において処置または予防する方法であって、発現されるペプチドアンタゴニストはTFFタンパク質の発現または活性に干渉し、それによって該癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患を処置または予防する方法。
【請求項９】
同定する段階が、正常の対照レベルと比較したTFF3発現レベルの増大を検出することによって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドアンタゴニストが(a) 23、24、25、46、47または57位において非同一アミノ酸を含むSEQ ID NO:25のTFFの機能干渉性の変異体、(b) SEQ ID NO:25のTFFの断片、およびc) その他任意のタンパク質と融合されたSEQ ID NO:25のTFFの全体もしくは断片もしくは変異体のキメラからなる群より選択され、該アンタゴニストは該細胞中での内因性TFFとTFF受容体との結合を阻害するかまたはTFFの二量体化、凝集もしくは機能活性を阻害する、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
TFFがTFF1、TFF2、およびTFF3からなる群より選択される、請求項1、4または8記載の方法。
【請求項１２】
組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1および5〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
1つまたは複数のiRNAをコードする1つまたは複数のDNA分子が細胞内で転写される、請求項2、3、6または7記載の方法。
【請求項１４】
1つまたは複数のiRNAがsiRNAとして細胞内で転写される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
TFF遺伝子の発現が低減されるまたは阻害される、請求項2、3、6または7記載の方法。
【請求項１６】
TFFタンパク質の発現が低減されるまたは阻害される、請求項4または8記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍または癌が肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、黒色腫、多発性骨髄腫、血液腫瘍、およびリンパ腫瘍からなる群より選択される、請求項1〜4および6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
癌がタモキシフェン耐性の癌である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
増殖性および/または生存性の疾患がケラチノサイト過剰増殖、炎症性細胞浸潤、サイトカイン変化、表皮嚢腫および類皮嚢腫、脂肪腫、腺腫、毛細血管性血管腫および皮膚血管腫、リンパ管腫、母斑病変、奇形腫、腎腫、筋線維腫症、骨形成腫瘍 、ならびにその他の形成異常塊からなる群より選択される、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
対象がヒトである、請求項1および5〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
化学療法薬または抗新生物薬である第2の化合物の投与をさらに含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
SEQ ID NO:3〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２３】
SEQ ID NO:3〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸を含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
ヌクレオチド配列がTFF3転写産物に対するiRNAである、請求項22または23記載の単離された核酸。
【請求項２５】
SEQ ID NO:1および2からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２６】
SEQ ID NO:1および2からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸を含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
ヌクレオチド配列がTFF1転写産物に対するiRNAである、請求項25または26記載の単離された核酸。
【請求項２８】
SEQ ID NO:5および6からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２９】
SEQ ID NO:5および6からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸を含む、薬学的組成物。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列がTFF2転写産物に対するiRNAである、請求項28または29記載の単離された核酸。
【請求項３１】
化学療法薬に対する薬物耐性腫瘍の感受性を増大させる方法であって、該薬物耐性腫瘍を、TFF遺伝子産物に結合する抗体組成物と接触させる段階を含む方法。
【請求項３２】
TFF遺伝子産物がTFF1である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
TFF遺伝子産物がTFF3である、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
抗体組成物が、TFF1に結合する抗体およびTFF3に結合する抗体を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
薬物耐性腫瘍がタモキシフェン耐性である、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
薬物耐性腫瘍が乳癌である、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
化学療法薬がタモキシフェンである、請求項31記載の方法。
【請求項３８】
化学療法薬がホルモンアンタゴニストである、請求項31記載の方法。
【請求項３９】
ホルモンアンタゴニストが抗エストロゲン化合物である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
SEQ ID NO:36 (TFF1)の20、21、42、43、または58位において非同一アミノ酸を含むTFF変異体を含む、TFFのペプチドアンタゴニスト。
【請求項４１】
SEQ ID NO:37 (TFF2)の21、22、43、または44位において非同一アミノ酸を含むTFF変異体を含む、TFFのペプチドアンタゴニスト。
【請求項４２】
SEQ ID NO:37 (TFF2)の70、71、92、93、または103位において非同一アミノ酸を含むTFF変異体を含む、TFFのペプチドアンタゴニスト。
【請求項４３】
アンタゴニストが異種ポリペプチドに連結される、請求項40、41、または42記載のアンタゴニスト。
【請求項４４】
異種ポリペプチドに連結されたTFF1、2、または3の断片を含む、TFFのペプチドアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
動物における細胞の増殖および/または生存の調節および制御は、いくつかの細胞因子およびその互いとの相互作用を伴う複雑な過程である。任意の数のこれらの細胞因子における変異または発現の変化が、細胞の無制御の増殖または成長を引き起こし、最終的に腫瘍および癌の発現に至ることがある。
【０００２】
ホルモンおよび/または成長因子は細胞の成長および発達の正常な調節および制御に関与する。例えば、成長ホルモン(GH)は正常な思春期の乳腺発達に関与しており(Walden et al., Endocrinology 139, 659-662, 1998（非特許文献１）; Kleinberg, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2, 49-57, 1997（非特許文献２）; Bchini et al., (1991) Endocrinology 128, 539-546, 1991（非特許文献３）; Tornell et al., Int. J. Cancer 49, 114-11, 1991（非特許文献４）; Nagasawa et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21, 1547-1551, 1985（非特許文献５）; Swanson and Unterman, Carcinogenesis 23, 977-982, 2002（非特許文献６）; Stavrou and Kleinberg, Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 30, 545-563, 2001（非特許文献７）; Okada and Kopchick, Trends Mol. Med. 7, 126-132, 2001（非特許文献８）; Ng et al., Nat. Med. 3, 1141-1144, 1997（非特許文献９）)、正常なヒト乳腺において発現される(Raccurt et al., J. Endocrinol. 175, 307-318, 2002（非特許文献１０))。GHなどのホルモンの発現レベルの変化は、細胞の異常な増殖を引き起こしうる。例えば、hGH遺伝子の上皮発現の増大は病的増殖の獲得と関係しており、最も高いレベルのhGH遺伝子発現が転移性乳癌細胞で認められている(Raccurt et al., J. Endocrinol. 175, 307-318, 2002（非特許文献１０))。自己分泌hGHの発現のそのような変化は、癌細胞への正常細胞の形質転換を引き起こしうる。
【０００３】
細胞増殖、細胞生存および/または発癌性形質転換を促進する任意の細胞因子の同定を含め、増殖性疾患の発生に及ぼすホルモンおよび/または成長因子の効果をさらに理解する必要がある。これは増殖および/または生存の調節の手段、特に癌などの増殖性疾患の処置の手段の同定に役立つであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Walden et al., Endocrinology 139, 659-662, 1998
【非特許文献２】Kleinberg, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2, 49-57, 1997
【非特許文献３】Bchini et al., (1991) Endocrinology 128, 539-546, 1991
【非特許文献４】Tornell et al., Int. J. Cancer 49, 114-11, 1991
【非特許文献５】Nagasawa et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21, 1547-1551, 1985
【非特許文献６】Swanson and Unterman, Carcinogenesis 23, 977-982, 2002
【非特許文献７】Stavrou and Kleinberg, Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 30, 545-563, 2001
【非特許文献８】Okada and Kopchick, Trends Mol. Med. 7, 126-132, 2001
【非特許文献９】Ng et al., Nat. Med. 3, 1141-1144, 1997
【非特許文献１０】Raccurt et al., J. Endocrinol. 175, 307-318, 2002
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、トレフォイル因子(TFF)遺伝子産物の産生または腫瘍細胞でのそのような遺伝子産物の活性を減少させることにより、1つまたは複数の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。そのような方法で阻害される腫瘍は、正常な非癌性細胞に比べていっそう高いレベルのTFFを発現すると特徴づけられる腫瘍を含む。そのような腫瘍細胞の例としては、抗エストロゲン療法耐性の腫瘍などの薬物耐性の腫瘍およびエストロゲン感受性の乳癌などのホルモン感受性の腫瘍細胞(例えば、乳腺の腫瘍)ならびにその他、卵巣、頚部、前立腺などの生殖器の腫瘍; 胃腸管腫瘍(結腸、胃、肝臓、食道、膵臓); およびTFFが細胞増殖、生存および発癌性にとって重要なその他任意の腫瘍が挙げられる。その他のホルモン感受性の腫瘍は、アンドロゲン感受性の腫瘍、GH感受性の腫瘍、プロラクチン感受性の腫瘍、プロゲステロン感受性の腫瘍を含む。TFFを過剰発現する腫瘍に加えて、本発明の方法は、TFFが細胞増殖および生存にとって重要な腫瘍(TFF依存的な腫瘍)に適用できる。TFFを過剰発現する腫瘍は、正常な非腫瘍細胞と比較して、タンパク質または転写産物のレベルを測定する標準的な方法、例えば、ELISA法、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法、免疫組織化学法により同定される。すなわち、TFF依存的な腫瘍は、TFF阻害剤(例えば、ペプチドアンタゴニスト、TFF特異的な抗体)の存在下での、その非存在下と比べた増殖/生存の減少の検出により同定され; かつ、ホルモン感受性の腫瘍はホルモン阻害剤(例えば、ホルモン特異的なアンタゴニスト、抗体)の存在下での、その非存在下と比べた増殖/生存の減少の検出により同定される。
【０００６】
この方法は、いっそう高いレベルのTFFを発現する腫瘍、タモキシフェン耐性の腫瘍またはエストロゲン受容体陽性の乳癌などのホルモン感受性の腫瘍を有する対象を同定する段階および対象にTFF阻害性化合物を投与する段階を含む。同定する段階は、正常の対照レベル(例えば、癌の所見がない、健常な対象またはプールでのTFFのレベル)と比較したTFF1、TFF2、またはTFF3発現レベルの増大を検出することによって行われる。TFFの過剰発現は薬物耐性腫瘍の典型的な特徴であるので、タモキシフェン耐性の腫瘍細胞とその他の腫瘍細胞を区別するのに、TFF特異的な抗体、例えば、TFF1および/またはTFF3に特異的に結合する抗体が用いられる。そのような抗体は同様に、薬物耐性を阻害するのに、すなわち、薬物(例えば、タモキシフェン)感受性を増大させるのに、単独でも組み合わせても有用である。このように、抗体は任意で、抗エストロゲン薬(タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤)、抗アンドロゲン薬および本明細書において記述されるその他の抗新生物薬などの化学療法薬と同時に投与されてもよい。
【０００７】
TFF特異的な抗体はタモキシフェン耐性を覆すためおよび腫瘍の内分泌感受性を増大させるために有用である。したがって、化学療法薬に対する薬物耐性腫瘍の感受性を増大させる方法は、薬物耐性腫瘍を、TFF1、2、および/または3などのTFF遺伝子産物に結合する抗体組成物と接触させることにより行われる。好ましくは、抗体組成物は、TFF1に結合する抗体およびTFF3に結合する抗体などの抗体の混合物を含有する。後者の場合、TFF1およびTFF3抗体の効果は相乗効果である。一部の例では、腫瘍は、薬物耐性の乳癌などタモキシフェン耐性であり、そのような場合には、抗体をタモキシフェンなどの薬物と同時に投与する。ホルモン感受性の腫瘍の場合、抗体を任意で、抗エストロゲン化合物などのホルモンアンタゴニストと同時に投与してもよい。同時投与計画では、抗体組成物および化学療法薬を同時にまたは逐次的に供与する。
【０００８】
TFF特異的な抗体は、曝露されるドメインまたは残基(例えば、溶液中のタンパク質の三次構造における外側ループ構造の残基)、TFFの二量体化、凝集に関与するドメインまたは残基、ならびに細胞の増殖、生存、および発癌性を促進させるのに関与するドメインに結合するものを含む。例えば、抗体のエピトープ結合特異性は、細胞増殖、生存および発癌性の刺激に関与するドメインを含むTFF配列を含む。例えば、抗体はTFF3の成熟型の残基番号24、25、26、47、もしくは57、TFF1の残基番号20、21、42、43、もしくは58、またはTFF2の残基番号21、22、43、44、70、71、92、93もしくは103を含むエピトープに結合する。抗体はポリクローナル抗血清もしくはモノクローナル抗体またはそれらのいずれかの誘導体である。本発明は無傷のモノクローナル抗体だけでなく、免疫学的に活性な抗体断片、例えば、Fabもしくは(Fab)2断片、遺伝子操作された一本鎖Fv分子、またはキメラ分子、例を挙げれば、例えばマウス由来の、ある抗体の結合特異性と、例えばヒト由来の、別の抗体の残存部分とを含む抗体も包含する。その他のTFF結合抗体を用いて、破壊のため、TFFを過剰発現する細胞を直接標的にする。後者の場合、抗体、またはその断片は、抗体で処置された患者において補体を活性化する。好ましくは、抗体は、抗体で処置された患者での腫瘍細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する。抗体、またはその断片は、単独で投与されるかまたは細胞毒に結合される。TFFを発現する腫瘍細胞との抗体の結合によって、細胞の機能障害または死滅が起こり、それによって腫瘍量が低減する。抗体は任意で放射化学物質、または化学的タグに結合されてもよい。化学的タグは、これが結合された細胞を、放射線またはレーザーを介した殺傷に対して感受性にさせる。
【０００９】
本発明は同様に、細胞をTFF1またはTFF2などの、トレフォイル因子(TFF)遺伝子の発現を阻害する化合物と接触させることにより、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。例えば、化合物は1つもしくは複数のiRNAまたは1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含み、発現されたiRNAはTFF1、TFF2遺伝子のmRNAに干渉し、それによってTFF1またはTFF2遺伝子の発現を阻害し、これによって細胞の増殖を阻害する。
【００１０】
腫瘍細胞増殖の阻害は同様に、トレフォイル因子3 (TFF3)遺伝子の発現を阻害する化合物であって、SEQ ID NO:3〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含有する1つもしくは複数のiRNAまたはSEQ ID NO:3〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含有する1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含む化合物と細胞を接触し、それによってTFF3遺伝子の発現および同時に細胞の増殖を阻害することにより行われる。
【００１１】
本発明は同様に、細胞をTFFのペプチドアンタゴニストと接触させるかまたは細胞とのTFFの接近を阻止することにより、増殖を阻害するまたは腫瘍細胞とのTFFの接近を阻害する/阻止する方法を提供する。アンタゴニストは(a) 23、24、25、46、47もしくは57位において非同一アミノ酸を有するSEQ ID NO:25のTFFの変異体; (b) SEQ ID NO:25のTFFの断片；またはc) 関心対象の別のタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミンタンパク質、βカゼインなどの、TFFタンパク質以外のタンパク質)と融合されたSEQ ID NO:25のTFFの全体または断片または変異体のキメラからなる群より選択される。アンタゴニストはTFF受容体との内因性TFFの結合を阻害し、細胞中でのTFF受容体の凝集を阻止しまたは阻害しあるいはTFFポリペプチドの会合、例えば、TFF二量体化または凝集を阻害する。TFF変異体は発癌性および/または腫瘍細胞増殖の増強などの、内因性TFFの機能を阻害することが好ましい。TFFアンタゴニストは同様に、TFF1およびTFF2それぞれの構造中の対応残基に位置する残基が、野生型配列に対して同一でないアミノ酸と置換されているTFF1およびTFF2変異体を含む。
【００１２】
本発明は対象由来の組織試料においてTFF1、2、または3発現レベルを検出することにより抗エストロゲン療法耐性(例えば、タモキシフェン耐性)または耐性を発症する素因を診断する方法であって、正常の対照レベルと比較したレベルの増大は、対象がタモキシフェン耐性の腫瘍を含むまたは腫瘍を発症する危険性があることを示唆する方法を含む。例えば、耐性細胞をTFF特異的な抗体またはその他のTFF結合リガンドと接触させることにより、TFF発現活性、または二量体化を阻害することで、タモキシフェン耐性を低減する方法も含まれる。
【００１３】
癌または細胞増殖疾患をその必要がある対象において処置または予防する方法は、TFF1、2、または3遺伝子のmRNAに干渉し、TFF1、TFF2、またはTFF3遺伝子産物の発現を減少させる、1つもしくは複数のiRNAまたは1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含む組成物を投与することによって、TFF1、TFF2またはTFF3などの、トレフォイル因子(TFF)遺伝子の発現を調節する段階を含む。
【００１４】
1つもしくは複数のペプチドアンタゴニストまたは1つもしくは複数のペプチドアンタゴニストをコードする1つもしくは複数のDNA分子は、活性、例えば、発癌性または細胞増殖もしくは生存の誘導などのTFFタンパク質の機能活性を阻害するのに有用である。ペプチドアンタゴニストは(a) 23、24、25、46、47または57位において非同一アミノ酸を含むよう改変された配列SEQ ID NO:25を有するTFFの機能干渉性の変異体; (b) SEQ ID NO:25のTFFの断片または関心対象のタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミンタンパク質、βカゼイン)と融合されたSEQ ID NO:25のTFFの全体もしくは断片もしくは変異体のキメラからなる群より選択することができる。その他のアンタゴニストは、対応する改変をタンパク質配列中に有するTFF1およびTFF2を含む。
【００１５】
TFF1ペプチドアンタゴニストにはTFF1変異体であって、SEQ ID NO:36 (TFF1)の20、21、42、43、および/または58位において非同一アミノ酸を含む変異体が含まれ; TFF2aペプチドアンタゴニストにはTFF2a変異体であって、SEQ ID NO:37 (TFF2a)の21、22、43、および/または44位において非同一アミノ酸を含む変異体が含まれ、ならびに; TFF2aペプチドアンタゴニストにはTFF2a変異体であって、SEQ ID NO:37 (TFF2b)の70、71、92、93、および/または103位において非同一アミノ酸を含む変異体が含まれる。これらの変異体TFFポリペプチドは、対応する野生型の完全長分子と同じ長さまたはその分子よりも短く、任意で、ヒト血清アルブミンもしくはβ-カゼインなどの異種ポリペプチドに連結されても、例えば、結合されてもよくまたは組換えキメラタンパク質として産生されてもよい。ペプチドアンタゴニストは同様に、上記のように異種ペプチドに任意で連結されてもよいTFF断片を含む。好ましくは、TFF断片は長さが10、20、30、40、50、60、75、100アミノ酸または完全長の成熟TFFタンパク質に比べて少ないアミノ酸を含む任意の長さである。断片は天然の野生型TFF配列の連続アミノ酸を含み、野生型タンパク質ではその断片に生来隣接する配列から精製される。任意で、断片は天然配列に対して1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含むTFF変異体であってもよい。
【００１６】
アンタゴニストは細胞中のTFF受容体との内因性TFFの結合を阻害し、またはTFF二量体化を阻害し、またはTFF機能を阻害する。ペプチドTFFアンタゴニスト化合物は、腎臓による急速な排出が最小限に抑えられるような十分な分子量のものである。例えば、TFF結合組成物は複合化合物の分子量を増大させるため、別のペプチド(例えば、ヒト血清アルブミン、βカゼインまたはその他の適当なタンパク質)などの別の化合物と結び付けられる、例えば、それに融合される。好ましくは、アンタゴニストの分子量は、腫瘍細胞との内因性TFFの接近を阻害するのに十分である。例えば、アンタゴニストは、変異体TFF配列および非TFFペプチド配列を含むキメラタンパク質組成物であり、アンタゴニスト化合物の分子量は2、3、5、10、25、35、45、55、または65 kDaよりも大きい。
【００１７】
任意で、組成物は薬学的に許容される担体または第2の化合物を含んでもよい。例えば、第2の化合物は抗エストロゲン治療薬、化学療法薬または抗新生物薬、例えば、タモキシフェンである。そのような薬剤は逐次的に(アンタゴニストの前にもしくは後に)または同時に投与される。
【００１８】
腫瘍または癌は肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、黒色腫、多発性骨髄腫、血液腫瘍、およびリンパ腫瘍からなる群より選択される。好ましくは、癌は内分泌感受性の癌である。
【００１９】
増殖性疾患はケラチノサイト過剰増殖、炎症性細胞浸潤、サイトカイン変化、表皮嚢腫および類皮嚢腫、脂肪腫、腺腫、毛細血管性血管腫および皮膚血管腫、リンパ管腫、母斑病変、奇形腫、腎腫、筋線維腫症、骨形成腫瘍 、ならびにその他の形成異常塊を含む。
【００２０】
対象は哺乳類、好ましくは、異常なレベルのTFF遺伝子産物によって特徴づけられる腫瘍に苦しむまたはその腫瘍を発症する危険性があるヒトである。組成物および方法は同様に、例えば、家畜であるウマ、ウシなどに加えてネコ、イヌ、およびその他のペットの処置における、獣医用の使用に有用である。
【００２１】
他に規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記述されるものに類似のまたは等価な方法および材料を本発明の実践または試験で使用できるが、適当な方法および材料を以下に記述する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書によって統制されよう。さらに、材料、方法、および実施例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００２２】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】TFF3 cDNAでのMCF-7細胞の安定なトランスフェクションによるTFF3 mRNAの強制発現を実証するブロットの写真である(図1A)。MCF-7細胞を空のベクター(MCF7-VECTOR)またはTFF3 cDNA (MCF7-TFF3)を含むベクターのいずれかで安定的にトランスフェクションした。TFF3 mRNAのレベルを無血清条件の下でRT-PCRにより測定した。ベクターでトランスフェクションされた対照と比較したMCF-7-TFF3細胞によるTFF3ペプチド産生の増大を示すウエスタンブロットである(図1B)。ベクターでトランスフェクションされた群では、これらの細胞において内因性のTFF3レベルが示される。β-アクチンを添加対照として使用した。
【図２Ａ】細胞周期の進行(5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン取込み)に及ぼす乳癌細胞でのTFF3の強制発現の効果、アポトーシス/細胞生存および全細胞数を示す棒グラフである。MCF7-VECTORおよびMCF7-TFF3細胞を図のように無血清培地中でまたは10% FBSを補充した培地中で培養した。細胞周期の進行(BrdUrd取込み)を表示の条件の下で両細胞株において測定した。
【図２Ｂ】細胞周期の進行(5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン取込み)に及ぼす乳癌細胞でのTFF3の強制発現の効果、アポトーシス/細胞生存および全細胞数を示す棒グラフである。MCF7-VECTORおよびMCF7-TFF3細胞を図のように無血清培地中でまたは10% FBSを補充した培地中で培養した。アポトーシス細胞死を表示の条件の下で両細胞株において測定した。
【図２Ｃ】細胞周期の進行(5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン取込み)に及ぼす乳癌細胞でのTFF3の強制発現の効果、アポトーシス/細胞生存および全細胞数を示す棒グラフである。MCF7-VECTORおよびMCF7-TFF3細胞を図のように無血清培地中でまたは10% FBSを補充した培地中で培養した。全細胞数を表示の条件の下で両細胞株において測定した。
【図２Ｄ】細胞周期の進行(5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン取込み)に及ぼす乳癌細胞でのTFF3の強制発現の効果、アポトーシス/細胞生存および全細胞数を示す線グラフである。MCF7-VECTORおよびMCF7-TFF3細胞を図のように無血清培地中でまたは10% FBSを補充した培地中で培養した。10日間にわたる全細胞数を表示の条件の下で両細胞株において測定した。
【図３】軟寒天コロニー形成に及ぼすTFF3の強制発現の効果を示す棒グラフ(図3A〜B)である。TFF3 cDNAで一過性に(A)または安定的に(B)トランスフェクションされたMCF-7細胞による軟寒天コロニー形成。TFF3の発現増大によって軟寒天コロニー形成の増強が起こり、TFF3が発癌性形質転換に有利に働くことが示唆される。結果は三つ組の実験の平均±S.D.として示されている。
【図４】懸濁培養での乳癌細胞増殖に及ぼすTFF3の発現の効果を示す線グラフである(図4A)。病巣形成に及ぼすTFF3の発現の効果を示すグラフおよび細胞の写真である(図4B)。結果は三つ組の実験の平均±S.D.として示されている。
【図５】ヒト乳癌細胞(MCF-7)での軟寒天コロニー形成に及ぼすTFF3発現の阻害の効果を示す、電気泳動ゲルの写真(図5A)であり、棒グラフ(図5B)である。MCF-7細胞を空のベクターまたはTFF3 RNAiを産生するベクターのいずれかで一過的トランスフェクションした。(A) MCF-7細胞でのTFF3 mRNAのレベルに及ぼすsiRNAの効果。(B) TFF3に対するsiRNAでトランスフェクションされたMCF-7細胞での軟寒天コロニー形成。結果は三つ組の実験の平均±S.D.として示されている。
【図６】不死化ヒト上皮細胞株MCF10AでのTFF3の強制発現によって、発癌性形質転換を示す軟寒天中でのコロニー形成が起こることを示した棒グラフである。空のベクターでのMCF-10A細胞のトランスフェクションでは、発癌性形質転換が起こらない。結果は三つ組の実験の平均±S.D.として示されている。
【図７】MCF-7細胞でのエストロゲン/エストラジオール(E2)およびタモキシフェンとのインキュベーションによるTFF3 mRNAの発現を示すブロットの写真である(図7A)。MCF-7細胞でのエストロゲン/エストラジオール(E2)およびタモキシフェンとのインキュベーション後のTFF3プロモーター活性の増大を示す棒グラフである(図7B)。
【図８】ヒト乳癌でのTFF3の強制発現によってタモキシフェン耐性が起こることを示す棒グラフである。ベクターによりトランスフェクションされたMCF-7細胞およびTFF3 cDNAでトランスフェクションされたMCF-7細胞による軟寒天コロニー形成をタモキシフェンの存在下および非存在下で測定した。TFF3の強制発現を有するMCF-7細胞は、軟寒天コロニー形成に及ぼすタモキシフェンの阻害効果に耐性であった。
【図９】エストロゲンおよびタモキシフェン処理によってMCF-7細胞でのTFF1の転写レベルが増大することを示すブロットの写真である(図9A)。タモキシフェン耐性MCF-7細胞でのTFF1プロモーター活性の増大を示すグラフである(図9B)。
【図１０】エストロゲン処理後のTFF3有りまたは無しでのMCF-7細胞の全細胞数を示すグラフである(図10A)。TFF3がエストロゲンの存在下で全コロニー数を増大させることを示すグラフおよび細胞の写真である(図10B)。
【図１１】タモキシフェン耐性MCF-7細胞でのTFF3プロモーター活性の増大を示すグラフである(図11A)。TFF3 mRNAがタモキシフェン耐性MCF-7細胞において過剰発現されることを示すブロットの写真である(図11B)。
【図１２】siRNAを用いたTFF3のノックダウンによってタモキシフェン耐性MCF-7細胞でのタモキシフェン感受性が増大することを示すグラフである(図12A)。軟寒天でのMCF-7細胞のコロニー形成に及ぼす、単独でまたは組合せで与えられた、TFF1およびTFF3 siRNAの阻害効果を示すグラフである(図12B)。
【図１３】TFF3生物活性に及ぼすTFF3およびヒト血清アルブミン(hSA)融合タンパク質の阻害効果を示す棒グラフである。CEACAM6遺伝子の転写に及ぼすTFF3およぼその変異体の効果。MCF-7細胞をSaint Mixトランスフェクション試薬によりCEACAM6ルシフェラーゼレポータープラスミドに加えてTFF3ならびにTFF3-C57F変異体、hasおよびTFF3-C57F-has融合タンパク質の発現プラスミドで同時にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を測定した。実験は3回繰り返して6ウェルプレートで行った。
【図１４】TFF3変異体でトランスフェクションされたMCF-7細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図１５】図15A〜Bは、細菌での組換えTFF1 (A)およびTFF3 (B)タンパク質の発現を示すイムノブロットの写真である。
【図１６Ａ】抗TFFポリクローナル抗体との48時間のインキュベーション後のMCF-7細胞の増殖の阻害を示す棒グラフである。MCF-7細胞を各抗体0、1、5および20 μg/ml濃度のアフィニティー精製されたウサギ抗TFF1もしくは抗TFF3抗体または対照としてその免疫前血清とともに96ウェルマイクロプレートに播種した。細胞を48時間インキュベーションし、材料と方法で記述した手順を用いMTTアッセイによって細胞増殖を測定した。
【図１６Ｂ】抗TFFポリクローナル抗体との72時間のインキュベーション後のMCF-7細胞の増殖の阻害を示す棒グラフである。MCF-7細胞を各抗体0、1、5および20 μg/ml濃度のアフィニティー精製されたウサギ抗TFF1もしくは抗TFF3抗体または対照としてその免疫前血清とともに96ウェルマイクロプレートに播種した。細胞を72時間インキュベーションし、材料と方法で記述した手順を用いMTTアッセイによって細胞増殖を測定した。
【図１６Ｃ】単独または組合せでのウサギ抗TFF1またはTFF3ポリクローナル抗体によるMCF-7細胞増殖の阻害を示す。
【図１７】抗TFFポリクローナル抗体とのインキュベーション後の軟寒天でのコロニー形成の阻止を示す、棒グラフ(図17)であり、免疫染色されたMCF-7細胞の一連の写真(図17B)である。
【図１８】抗TFFポリクローナル抗体とのインキュベーション後のタモキシフェン耐性MCF-7細胞の増殖の阻害を示す棒グラフである。
【図１９】タモキシフェン耐性MCF-7細胞の形態に及ぼす抗TFFポリクローナル抗体の効果を示す、免疫染色されたMCF-7細胞の一連の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
トレフォイル因子ファミリーのタンパク質は、3つの保存されたジスルフィド結合を含む40アミノ酸のトレフォイルモチーフによって特徴づけられる。3つの鎖内ジスルフィド結合がトレフォイルモチーフ(TFFドメイン)を形成する。トレフォイルモチーフは当技術分野、例えば、Taupin and Podolsky, Nat Rev Mol Cell Bio. 4(9):721-32, 2003; Hoffmann et al., Histol Histopathol 16(1):319-34, 2001; およびThim, Cell Mol Life Sci 53(11-12):888-903, 1997において公知である。
【００２５】
ヒトでは、トレフォイルペプチドの3つの異なるメンバーが同定されている。TFF1またはpS2は、エストロゲン誘導遺伝子として乳癌細胞株で最初に検出された。ヒトの胃では、それは胃粘膜の小窩細胞に主に位置している。TFF2 (以前は鎮痙性ポリペプチドまたはSP)は、ブタ膵臓から最初に精製されており、胃腺頸部粘液細胞、深部幽門腺、およびブルンナー腺で発現している。TFF3または腸トレフォイル因子(ITF)は、最後に同定されており、小腸および大腸の杯細胞で主に発現される。トレフォイルペプチドは粘膜の治癒過程に関与しており、新生物疾患において異常に上昇したレベルで発現される。広範囲のヒト癌腫および消化性潰瘍や大腸炎を含め、胃腸の炎症性の悪性病変、クローン症候群、膵炎、ならびに胆道疾患は、トレフォイルペプチドを異常に発現する。これらのヒトタンパク質のオルソログがその他の動物、例えば、ラット、マウスおよび霊長類で同定されている。
【００２６】
トレフォイルファミリーのペプチドは乳腺において多岐にわたる機能を保有しており、TFF1は分裂促進因子として機能し、TFF2は分岐形態形成や細胞生存を刺激する。TFF3はヒト乳腺の悪性病変においてTFF1と広く共発現されるのに対し、TFF2は乳房上皮細胞で発現されない。トレフォイルファミリーのペプチド間には機能および発現の多様性がいくらか存在するものの、本発明の結果から、TFFファミリーのいずれかのメンバー(すなわち、TFF1、TFF2またはTFF3)の調節(例えば、阻害)は類似の利点を有することが示唆される。
【００２７】
本明細書において「TFF」、「TFFタンパク質」、または「TFFファミリーのタンパク質」への言及は、TFF1、TFF2、およびTFF3を含め、関連するタンパク質の群を指す。TFFタンパク質は、同じ種のなかで少なくともおよそ28〜45%のアミノ酸同一性を共有する。
【００２８】
TFF3の機能分析から、その発現が、有糸分裂誘発および細胞生存の同時増大によって全細胞数の増大を刺激するのに十分であり、ヒト癌細胞の足場非依存性増殖、ならびに懸濁培養での増殖および病巣形成を含めて発癌性のその他の徴候を補助することが実証された。さらに、TFFは不死化された、しかしその他の点では正常なヒト上皮細胞の発癌性形質転換を補助した。siRNAを介したTFF3発現の低下は、それに調和してヒト癌細胞の足場非依存性増殖を抑止した。これらの結果から、TFF発現および/または活性の阻害が細胞増殖の低下をもたらし、癌およびその他の増殖性疾患の進行および重症度を低下させることが示唆される。類似の結果が、TFFファミリーのタンパク質のその他のメンバーで示されうる。
【００２９】
本明細書において記述されるデータは、以下の材料と方法を用いて得られた。
【００３０】
細胞培養
MCF-7 (HTB-22)およびMCF-10A (CRL-10317)細胞株はATCCから得た。MCF-7細胞(Kaulsay et al., Exp. Cell Res. 250:35-50, 1999)は、10%熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)、100単位/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミンを補充したRPMI中で5% CO2中37℃にて培養された。オリジナルのMCF7細胞はタモキシフェン感受性であり、タモキシフェンを含有する培地中で増殖することができない。タモキシフェン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)の漸増濃度に漸進的に曝露された後、MCF-7細胞はそれ自体が最大で1 μMのタモキシフェンを含有する培地中で増殖するよう適合された。これらのタモキシフェン耐性MCF-7細胞(MCF-7-TamRと呼ぶ)は、実験の開始前に6ヶ月を超える間1 μMのタモキシフェンを含有する培地中で維持された。MCF-7-TamR細胞のタモキシフェン耐性は、同一の培地であるがしかしタモキシフェンなしで培養されたMCF7親細胞と比較することによって確立された。
【００３１】
MCF-10A細胞および派生物は、5%ウシ血清(Invitrogen)に加えて2 mMグルタミン、100 μg/mlのストレプトマイシン、100 IU/mlのペニシリン、0.25 μg/mlのアンピシリンB、100 ng/mlのコレラ毒素、20 ng/mlの上皮成長因子(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)、0.5 μg/mlのヒドロコルチゾン(Calbiochem, La Jolla, CA)、および10 μg/mlのインスリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地/F-12培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で培養された。
【００３２】
全RNAの調製
全RNAを製造元の使用説明書にしたがってTRI-REAGENTを用いてMCF-7細胞から単離し、ピロ炭酸ジエチル処理水に再懸濁した。RNAの定量化および純度をA260/A280吸光度によって評価し、RNAの質をアガロースゲル電気泳動によって評価した。ハイブリダイゼーションのために標識化する前に、各細胞株から独立して得られた3つの全RNA試料をプールした。1.6よりも高い比率を有するRNA試料を、さらなる分析のため-80℃で保存した。
【００３３】
RT-PCRおよびプライマー
RT-PCRは鋳型mRNA 0.2 μg、0.6 μMプライマー、酵素ミックス2 ml、400 μMの各dNTP、10反応緩衝液、および10 Q-溶液を含有する最終容量50 ml中にて、Qiagen One-step RT-PCRキットの使用により行った。鋳型RNAを50℃で30分間cDNAに逆転写し、ホットスタートTaqDNAポリメラーゼを95℃で15分間加熱することにより活性化し、変性された鋳型cDNAを以下のサイクルによって増幅した: 94℃/30秒、55℃/30秒、および72℃/60秒。最終の伸長を72℃で10分間行った。PCR産物を半定量的に比較するため、15〜40サイクルのPCR (アニーリング温度55℃)を行ってPCR増幅の直線性を判定し、増幅されたβ-アクチンcDNAをcDNAの量と質の内部対照として役立てた。全てのRNA試料はDNase Iで処理して、ゲノムDNAの混入を回避した。
2014088393.tif 000002
【００３４】
増幅されたPCR産物を1%アガロースゲルで可視化した。増幅によって、予測されたサイズの各増幅断片が得られた。
【００３５】
ヒトTFF3のクローニング:
ヒトTFF3 cDNAをクローニングするため、TRI-REAGENTを用いて全RNAをMCF-7細胞から抽出し、cDNAをプライマー
2014088393.tif 000003
によって増幅し、PCR-script(商標) AmpSK+ベクターにクローニングした。TFF3 cDNA挿入物をプライマー
2014088393.tif 000004
で再増幅し、プライマー内に挿入された酵素部位HindIIIおよびSacIIを利用してpcDNA3.1/Myc-His-Bベクターにフレーム内でクローニングし、配列を検証した。TFF3の発現をRT-PCRおよびウエスタンブロット分析によって検証した。
【００３６】
ヒトTFF3に対するsiRNAの構築:
GenscriptのpRNA-U6.1/Hygroベクター中のヒトTFF3 RNAi構築体は、配列
2014088393.tif 000005
を標的化して得られた。MCF-7細胞5×104個を6ウェルプレートに播種し、上記のように培養した。それらをRNAi構築体またはpRNA-U6.1/Hygroベクター1 μgで一過的トランスフェクションし、さらに18時間増殖させた。
【００３７】
組換えTFF1およびTFF3タンパク質
Amersham BiosciencesのグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子融合システムを用いて、大腸菌(E. coli)で組換えTFF1およびTFF3タンパク質を産生させた。成熟タンパク質をコードする完全長のヒトTFF1およびTFF3 cDNA断片をMCF-7細胞からRT-PCRによって増幅した。5' EcoRIおよび3' XhoI消化によりRT-PCR産物をpGEX 4T1ベクター(Amersham Biosciences)にクローニングして、大腸菌でのGST融合タンパク質の発現用のpGEX 4T1-TFF1およびpGEX 4T1-TFF3プラスミドを作出した。プラスミドの配列はDNA配列決定によって検出した。
【００３８】
pGEX 4T1-TFF1またはpGEX 4T1-TFF3プラスミドを用いて、BL21-Gold細胞(Stratagene)に形質転換した。単一の組換え大腸菌コロニーをカルベニシリン(50 μg/ml)含有LB培地に植菌した。一晩培養物をLB培地/カルベニシリン、pH 7.4で200分の1希釈し、600 nmでの光学密度およそ0.5まで37℃で培養した。次に、終濃度0.2 mMまでイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えることでタンパク質発現を誘導し、培養物を37℃でさらに3〜4時間インキュベーションした。細胞を回収し、GST融合タンパク質を非変性条件の下で細菌細胞から抽出した。タンパク質を効果的な可溶化に向けた標準的な精製法によって単離し、その後、グルタチオンセファロース4Bマトリックス(Amersham Biosciences)に高い親和性で結合させた。カラムに結合したGST融合タンパク質をトロンビンで消化して、GSTからTFF1またはTFF3タンパク質を切断し、PBSでカラムから溶出させて、本質的に純粋な産物を得た。GST融合タンパク質ならびに精製TFF1およびTFF3タンパク質の完全性を4〜12%のNuPAGE Bis-トリスゲル(Invitrogen)でのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析し、クマシーブルー染色によって可視化した。精製された融合タンパク質の収量をブラッドフォードのアッセイによって推定した。
【００３９】
抗体産生
Biogene, Germanyによるウサギ抗TFF1および抗TFF3ポリクローナル抗体の作製に、大腸菌で産生された組換えTFF1およびTFF3精製タンパク質を用いた。各タンパク質に対しウサギ2羽を免疫した。抗体を抗血清からアフィニティー精製した。産生された抗体は、溶液中でその天然の三次構造のTFFタンパク質を認識し、そのタンパク質に結合した。エピトープ特異性は三次構造(例えば、TFFの3次元構造において曝露される残基)によって規定される。
【００４０】
MTT増殖アッセイ
MCF-7細胞を各量(0、1、5および20 μg/ml)のアフィニティー精製ウサギ抗ヒトTFF1またはTFF3抗体および対照としてその免疫前血清とともに、96ウェル平底組織培養用マイクロプレートに入った10% FBS含有RPMI-1640培地 100 μlに細胞5×103個/ウェルの濃度で播種した。細胞を37℃、5% CO2の加湿インキュベーター内で2日または3日間インキュベーションした。インキュベーション時間の後、MTT (3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)標識化試薬10 μlを終濃度0.5 mg/mlで各ウェルに加え、細胞をインキュベーター内で5時間標識した。インキュベーション時間が終わったところで、培地を除去し、変換された色素を可溶化液(0.01 N HClの10% SDS水) 100 μlで可溶化した。次いで、プレートを密閉し、一晩37℃で放置し、紫色のホルマザン結晶を完全に可溶化した。変換された色素の吸光度はSpectra Max 250マルチプレートリーダーを用い、650 nmでのバックグラウンドを差し引いて570 nmの波長で測定した。
【００４１】
細胞形態アッセイ
タモキシフェン耐性MCF-7-TamR細胞を細胞5×103個/96ウェルプレート中のウェルの濃度で、デキストラン炭末処理済みの10% FBSの入ったフェノールレッド不含RPMI 1640培地100 μl中にて培養基で培養した。プレートを37℃で24時間インキュベーションして、細胞を再び付着させ、再び平衡化させた。いかなる培地も除去せずに、抗TFF3抗体および/またはタモキシフェンを培地100 μlの容量中その終濃度で2回加えた。48時間後、細胞像を位相差顕微鏡(Olympus IX70)下にて倍率10×で撮影した。
【００４２】
5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン取込みアッセイおよびアポトーシスの測定
BrdUrdの取込みを測定することによって、有糸分裂誘発を直接的にアッセイした。BrdUrdの取込みのため、サブコンフルエントな細胞を20 mM BrdUrdで30分間パルス標識し、PBSで2回洗浄し、冷70%エタノール中で30分間固定した。BrdUrdの検出はZymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA)のBrdUrd染色キットの使用により、製造元の使用説明書にしたがって行った。3×300個以上の細胞の全集団をいくつかの任意に選択された顕微鏡視野内で分析して、BrdUrd標識率(DNAを合成する細胞の割合)を判定した。
【００４３】
Sigma Chemical Co. (St Louis, MO)のHoechst 33258での細胞DNA染色パターンの蛍光顕微鏡分析により、アポトーシス細胞死を測定した(Garverick et al., Reproduction 123:651-61, 2002)。細胞を0.5%トリプシンでトリプシン処理し、無血清培地で2回洗浄した。次いで、細胞を6ウェルプレート中のカバーガラススリップに播種し、無血清培地中でインキュベーションした。24時間の培養時間の後、細胞を4%パラホルムアルデヒドのPBS (pH 7.4)中で固定し、核親和性色素Hoechst33258（20g/ml）で室温にて10分間染色した。PBSで洗浄した後に、核形態を紫外線可視蛍光顕微鏡(Zeiss Axioplan)の下で調べた。アポトーシス細胞は、核の凝縮および断片化ならびに核の一層高い青色蛍光強度によって特徴づけられるその核形態により生存細胞と区別された。統計解析のため、3×300個の細胞を倍率400にて無作為の顕微鏡8視野内で計測した。
【００４４】
軟寒天コロニー形成
TFF3活性の増大の効果を検証するため、(5×104個の) MCF-7細胞を6ウェルプレートに播種し、上記のようにRPMI培地中で培養した。それらをTFF3-cDNA構築体またはpcDNA3.1/Myc-His-Bベクター1 μgで一過的トランスフェクションし、さらに18時間増殖させた。軟寒天コロニー形成アッセイのため、6ウェルプレートを寒天層(0.5%寒天および10% FBSの入ったRPMI 1640)で最初に覆った。上層には0.35%寒天および10% FBSの入ったRPMI 1640の中に細胞5×103個が含まれる。TFF3-cDNAまたはpcDNA3.1/Myc-His-Bでトランスフェクションされた細胞をトリプシン処理し、これを用いてTFF3の増大の効果を検証し、TFF3 RNAiまたはベクターpRNA-U6.1/Hygroトランスフェクション細胞を実験のなかで上記のように播種して、コロニー形成におけるTFF3の減少の効果を検証した。乾燥を防ぐため、培地を加えた。プレートを9日間(MCF-7細胞の場合)または14日間(MCF-10A細胞の場合)インキュベーションし、その後、培養物を検査し、写真に撮った。MCF10A-ベクターおよびMCF10A-TFF3細胞軟寒天コロニー形成アッセイを評価することは、上記のように、但しダルベッコ改変イーグル培地/F-12の中で行った。それらを37℃で9日間(MCF-7細胞)および14日間(MCF-10A細胞)インキュベーションした後にプレート中のコロニーを計測し、コロニーの相対数を計算した。MCF-7細胞のタモキシフェン処理の場合、1 μMタモキシフェンを寒天および培地層に加え、実験の間中、存在させた。
【００４５】
懸濁培養アッセイ
懸濁培養下の細胞(5×104個)を30 mm径のプラスチック製細菌用ディッシュ(Sterilin, Teddington, United Kingdom)の中で増殖させた。培養の後、細胞を回収し、計測した。
【００４６】
病巣形成アッセイ
70%サブコンフルエント培養物からのMCF7-VECまたはMCF7-TFF3の単一細胞5000個を35 mm径のディッシュに三つ組で播種した。3日おきに培地を交換しながら、細胞を完全培地中で2週間培養した。70%エタノールを用いて細胞を固定し、その後、0.01%クリスタルバイオレットのPBSで1時間染色し、PBS中で脱染(3回洗浄)した。脱染は、黒く染まった形質転換細胞の不連続な病巣が倒立顕微鏡下にて倍率4×で視覚化されるまで続けた。35 mm径のディッシュ1枚につき形成された病巣の総数を計測し、三つ組の平均および平均に対する標準誤差を計算した。
【００４７】
プラスミド構築
c-Mycエピトープタグの付いたヒトTFF3発現ベクターpIRESneo3-TFF3-Mycは、以下のように構築された: ヒトTFF3 cDNAを、プライマーセット
2014088393.tif 000006
を用いてPCRにより増幅し、PIRESneo3ベクター(Invitrogen)にクローニングした。2コピーのc-Myc tag EQKLISEEDL (SEQ ID NO:41)をコードする配列をTFF3の最後のアミノ酸とフレーム内で挿入した。TFF3のC57F変異体発現ベクターpIRESneo3-TFF3-C57F-Mycは、同一のセンスプライマーおよび
2014088393.tif 000007
のアンチセンスプライマーを用いることによって同じように作出された。
【００４８】
同様に、ヒト血清アルブミンcDNAを、プライマー:
2014088393.tif 000008
を用いてそのC末端位置の2コピーのc-Myc-タグとともにpIRESneo3ベクターに同じようにクローニングした。
【００４９】
TFF3のC57F変異体タンパク質が成熟ヒト血清アルブミンタンパク質、引き続いてC末端位置の2コピーのc-Mycタグに直接的に融合されるようなpIRESneo3-TFF3-C57F-hSA-Mycベクターを構築した。
【００５０】
ルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3-CEACAM6は次のように構築された: 1278塩基対のCEACAM6プロモーターを、プライマー対
2014088393.tif 000009
を使用し、MCF-7細胞から精製されたヒトゲノムDNAを鋳型として用いたVent DNAポリメラーゼでのPCRによって増幅した。得られたDNA断片をSma I消化済みの、プロモーターを持たないルシフェラーゼレポーターpGL3基本ベクター(Promega)に導入した。
【００５１】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
60〜80%コンフルエント時点のMCF-7細胞をSaint Mixトランスフェクション試薬により製造元の使用説明書(Syvolux therapeutics)にしたがってルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3-CEACAM6に加えてTFF3ならびにTFF3-C57F変異体、hSAおよびTFF3-C57F-hSA融合タンパク質の発現プラスミドで同時にトランスフェクションした。トランスフェクションから36時間後、細胞を冷PBS中で3回洗浄し、凍結融解サイクルによって1×溶解緩衝液200 μlで溶解し、溶解物を卓上遠心分離機中14,000 rpmで2分間の遠心分離により回収した。キット(Promega)を用いたルシフェラーゼ活性のアッセイに、上清20マイクロリットルを用いた。ルシフェラーゼ活性を細胞溶解物中のタンパク質の量に対して規準化した。実験は3回繰り返して行った。
【実施例】
【００５２】
実施例1: 発癌性を増大し発癌性形質転換を刺激するTFF3; 発癌性を低減するTFFの阻害
TFF3は乳癌細胞の有糸分裂誘発や生存、それ故に細胞数を増大する。本発明者らは完全なヒトTFF3 cDNAをクローニングし、そのクローンを配列確認した。本発明者らはその後、TFF3の安定な発現を伴うヒト乳癌(MCF-7)細胞株を作出し、これらの細胞の挙動を、ベクターでトランスフェクションされた対照細胞と比較した。TFF3の発現はTFF3 mRNAに対するRT-PCRによって確認した(図1)。TFF3の発現によって、ヒト乳癌細胞の有糸分裂誘発が増大し(核の5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン標識化で示されるように) (図2A)、血清枯渇条件での細胞生存が増大した(図2B)。その結果、TFF3は血清枯渇条件と血清含有条件の両方で乳癌細胞総数の増大をもたらした(図2C、D)。
【００５３】
TFF3はヒト乳癌細胞での足場非依存性増殖を増大する。発癌性に形質転換された細胞の特徴の1つは、足場非依存性増殖の能力である。足場非依存性増殖の尺度の1つが、軟寒天中での形質転換細胞のコロニー形成能である。TFF3の強制発現によってヒト乳癌細胞の足場非依存性増殖を調節できるかどうかを判定するため、本発明者らは、MCF-7細胞でのTFF3の強制発現後の過渡的な軟寒天コロニー形成を判定した。TFF3 cDNAでのヒト乳癌細胞の一過性のトランスフェクションによって、軟寒天コロニー形成で示されるように、ベクターでトランスフェクションされた細胞のものに比べ足場非依存性増殖の能力が増大した(図3A)。TFF3の安定な発現を伴うMCF-7細胞は同様に、ベクターでトランスフェクションされた対照細胞よりも軟寒天中において劇的に多くのコロニーをもたらした(図3B)。発癌性の別の指標は懸濁培養での増殖であり、乳癌細胞によるTFF3の産生によって、懸濁培養での乳癌細胞増殖が同様に増大する(図4A)。発癌性のさらに別の指標は病巣形成であり、乳癌細胞によるTFF3の産生によって、病巣形成が増大する(図4B)。
【００５４】
ここで使われたヒト乳癌細胞株は同様に、TFF3を内因的に産生する。本発明者らは、TFF3が足場非依存性増殖の能力を改変させられるなら、TFF3のノックダウンによって、軟寒天中での乳癌細胞のコロニー形成能も抑止されるものと推論した。本発明者らは、材料と方法で記述したように作出されたTFF3-RNAi構築体の一過性トランスフェクション後の乳癌細胞の足場非依存性増殖を調べた。TFF3に対するsiRNAによって、TFF3のレベルが減少した(図5A)。MCF-7細胞をベクターまたはTFF3-RNAi構築体のいずれかで一過的トランスフェクションし、軟寒天コロニー形成を調べた。TFF3発現の阻害では、軟寒天中でMCF-7細胞によって形成されるコロニーの数が半数以下に抑止された(図5B)。それ故に、TFF3の増加によってヒト乳癌細胞の発癌性が増大し、TFF3の減少によってヒト乳癌細胞の発癌性が低減する。TFF3は故に、ヒト乳癌細胞の発癌性を調節する。
【００５５】
不死化ヒト乳房上皮細胞でのTFF3の強制発現は発癌性形質転換を引き起こす。TFF3の発現増大がヒト乳房上皮細胞の発癌性形質転換を引き起こしうるかどうかを示すため、本発明者らは、不死化ヒト乳房上皮細胞株MCF-10Aを利用した。これらの細胞は、プラスチック基材に付着した状態で増殖した場合、正常な上皮形態を示し、軟寒天中でコロニーを形成しない。TFF3の発癌能を調べるため、MCF-10A細胞をTFF3 cDNAまたはベクターで一過的トランスフェクションし、軟寒天中でのコロニー形成について調べた。対照のトランスフェクション細胞では、軟寒天コロニー形成にほとんど効果がなかったのに対し、TFF3で一過的トランスフェクションされた細胞からはかなりの数のコロニーが形成された(図6)。一過性トランスフェクションは相対的に効率が悪いことやコロニー形成の判定前に細胞を軟寒天中で14日間増殖させたことを考慮すると、これは顕著である。このように、TFF3の発現増大は足場非依存性増殖および不死化ヒト乳房上皮細胞を発癌性に形質転換する可能性を補助するのに十分である。
【００５６】
これらのデータから、TFF3の発現がヒト乳房上皮細胞の足場非依存性の生存および増殖を補助するのに十分であることや、TFF3がヒト乳房上皮癌遺伝子であることが示唆される。このデータから同様に、TFF3を阻害することの治療的有用性が実証される。
【００５７】
実施例2: ヒト乳腺癌細胞においてTFFの転写レベルの増大を誘導するエストラジオールおよびタモキシフェン処理
MCF7細胞は内因性レベルのTFF3を産生することが明らかにされており、TFF3はエストロゲン受容体陽性の乳癌で過剰発現されることが明らかにされている。TFF3の発現がエストロゲン受容体の状態に関連するかどうかを判定することは、関心の対象であった。MCF7細胞を6ウェルプレート中にてデキストラン炭末処理済みのウシ胎仔血清10%の入ったフェノールレッド不含RPMI 1640中で24時間培養した。その後、細胞を10 nM E2または1 μM TAMの入った処理培地に移し換え、その培地中で24時間培養した。無血清培地中で培養された未処理細胞を対照として役立てた。図7Aは、エストラジオール(E2)で処理された細胞では非常に高いTFF3転写レベルの増大を、およびタモキシフェン(TAM)で処理された場合には同じほどではないが有意に高いTFF3転写レベルを示している。β-アクチンをRNA完全性の検査に使用し、添加対照としても役立てた。図7BはE2およびTAMによる処理から24時間後のTFF3プロモーター活性の増大を示す。＊、p <0.05。これらの結果から、E2およびTAM処理がMCF7細胞においてTFF3の転写レベルの増大を誘導することは明らかである。
【００５８】
実施例3: タモキシフェン誘発細胞死に対する耐性をもたらすTFF3
乳癌を処置するのに治療的に使用される薬剤に対するヒト乳癌細胞の反応性をTFF3が変えうるかどうかを判定するため、TFF3の強制発現の効果をタモキシフェンの存在下での軟寒天コロニー形成で試験した。TFF3の強制発現を伴うMCF-7細胞は、ベクターでトランスフェクションされた対照よりもタモキシフェンの存在下での軟寒天コロニー形成を4倍に増やして余りあった(図8)。TFF3はそれ故に、乳癌を処置するのに使用される抗エストロゲン物質の効果に対する細胞の感受性を低減する。
【００５９】
MCF7細胞は内因性レベルのTFF1を産生する。MCF7細胞を6ウェルプレート中にてデキストラン炭末処理済みのウシ胎仔血清10%の入ったフェノールレッド不含RPMI 1640中で24時間培養した。その後、細胞を10 nM E2または1 μM TAMの入った処理培地に移し換え、その培地中で24時間培養した。無血清培地中で培養された未処理細胞を対照として役立てた。図9Aは、E2およびタモキシフェンで処理された細胞においてTFF1転写レベルの非常に顕著な増大を示している。β-アクチンをRNA完全性の検査に使用し、添加対照としても役立てた。図9BはE2およびTAMによる処理から24時間後のTFF1プロモーター活性の増大を示す。＊、p <0.001、＊＊、p <0.0001。これらの結果から、エストラジオールおよびタモキシフェン処理がMCF細胞においてTFF1の転写レベルの増大を誘導することやTFF1およびTFF3が乳癌で同時に調節され、同時に発現されることは明らかである。
【００６０】
実施例4: TFFを用いてMCF7細胞の増殖および足場非依存性を媒介するエストロゲン
MCF7-VECTORおよびMCF7-TFF3細胞をデキストラン炭末処理済みのウシ胎仔血清10%入りのフェノールレッド不含RPMI 1640培地中で培養した。全細胞数のアッセイにより、培地からのエストロゲンの除去によって全細胞数が減少し、培地にエストロゲンを補充することによって全細胞数が、完全培地中で培養された対照細胞にまで回復することは明らかである(図10A)。軟寒天コロニー形成アッセイから、エストロゲン枯渇培地では、TFF3によって全コロニー数がほぼ10倍に増大し、培地にエストロゲンを加えることによってさらにMCF-TFF3において顕著にコロニー数が増大することは明らかである(図10B)。エストロゲン処理によって、コロニーサイズはその対照に比べMCF-TFF3細胞において有意に大きかった。＊、p <0.05。これらの結果から、エストロゲンがTFF3を用いて細胞の増殖および足場非依存性を媒介することは明らかである。
【００６１】
実施例5: タモキシフェン耐性細胞において過剰発現されるTFF
MCF7細胞をデキストラン炭末処理済みのウシ胎仔血清10%入りのフェノールレッド不含RPMI 1640培地中のタモキシフェンの漸増濃度に漸進的に曝露させた。細胞を1 μM中で6ヶ月間培養し、タモキシフェンに対するその耐性を、MTTアッセイを利用して、対照として使われた、同じ培地中で培養された野生型MCF7細胞と比較して試験した。タモキシフェン感受性の野生型MCF7 (TAMS)細胞およびタモキシフェン耐性(TAMR)の細胞を6ウェルプレート中に同等に播種し、TFF3-ルシフェラーゼ構築体でトランスフェクションした。タモキシフェンを含まない培地中で24時間培養した。細胞を溶解し、promegaルシフェラーゼ基質キットを用いて、その酵素活性を測定した。TAMRではTAMS細胞に比べて2倍を超えるTFF3プロモーター活性の増大が明らかである(図11A)。図11Bは試験細胞でのTFF3転写レベルを示し、TAMR細胞での転写産物の上方制御を示している。β-アクチンをRNA完全性の検査に使用し、添加対照としても役立てた。＊、p <0.05。これらの結果から、TFF3がタモキシフェン耐性(MCF-7)細胞で過剰発現されることは明らかである。
【００６２】
実施例6: iRNAを用いた腫瘍細胞によるTFF産生/発現の阻害
TFF iRNAがタモキシフェン感受性に及ぼす効果を判定するため実験を行った。TAMRおよびTAMS細胞をpRNA U6.1-siRNATFF3でトランスフェクションした。対照としてpRNA U6.1-VECTORトランスフェクション細胞を役立てた。各群からの細胞5000個を軟寒天に埋め込んだ。細胞をタモキシフェン有りでまたは無しで2週間培養した。コロニーを前述同様にスコア化した。図12Aから、TFF3がTAMR細胞においてタモキシフェン耐性を媒介しており、siRNAを用いたTFF3ノックダウンによって、これらの細胞でのタモキシフェン感受性が増大することは明らかである。＊、p <0.05。これらの結果から、siRNAを用いたTFF3阻害またはノックダウンによって、タモキシフェン耐性細胞でのタモキシフェン感受性が増大することは明らかである。
【００６３】
単独でおよび併用で投与された、TFF1およびTFF3 siRNAが軟寒天でのMCF-7細胞のコロニー形成に及ぼす阻害効果を判定するため、さらなる研究を行った。MCF-7細胞をSaint Mixトランスフェクション試薬により、単独のTFF1もしくはTFF3 siRNAプラスミド2 μgまたは一緒に混ぜ合わせたプラスミド(各1 μg)、あるいは対照として空のsiRNAベクターで一過的トランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、細胞をトリプシン処理し、各トランスフェクション細胞5,000個を軟寒天(0.35%)の10% FBS含有RPMI 1640中にて6ウェルプレートの培養基で培養した。クリスタルバイオレット染色から12時間後にコロニー形成を調べた。一緒に混ぜ合わせたTFF1 siRNAおよびTFF3 siRNAでは、媒体さらには単独のTFF1またはTFF3 siRNAと比較してコロニーの数が顕著に減少した(図12B)。
【００６４】
実施例7: TFFペプチドアンタゴニストおよびTFF3-ヒト血清アルブミン融合タンパク質がTFF3活性に及ぼす阻害効果
TFF1/TFF3二量体はC57アミノ酸残基間の分子間ジスルフィド結合を介して形成され、それ故にこのアミノ酸残基の交換およびヒト血清アルブミンまたはβカゼインなどの別のタンパク質の付加によってTFF3が二量体を形成するのを阻止できよう。野生型のように二量体を形成することができない、TFF1およびTFF3の両方のC57からFへの点変異によって、内因性TFFの活性が阻害される。
【００６５】
さらに、TFF1/TFF3二量体構造のなかでアミノ酸残基Y23、P24、H25、P46およびW47は、主に疎水性残基からなるタンパク質表面上のループ2と3との間の曝露溝を形成し、これはオリゴ糖またはタンパク質芳香族側鎖のいずれかを収容できる結合部位であって、その構造およびホモ二量体化に重要である。それ故に、これらの残基はTFF1/3アンタゴニストの開発のための変異誘発に向けた標的である。これらのまたは隣接の残基に結合する抗体は、発癌性ならびに腫瘍細胞の増殖および生存などのTFF機能を阻害する。そのような抗体はTFF二量体化を阻害する。
【００６６】
図13は、TFF3およびその変異体がCEACAM6遺伝子の転写に及ぼす効果を示す。MCF-7細胞をSaint Mixトランスフェクション試薬によりCEACAM6ルシフェラーゼレポータープラスミドに加えてTFF3、c-Myc-タグTFF3 (TFF3-タグ)、N末端欠失TFF3 (TFF3-Δ-1および-2)、TFF3-46R-47RおよびTFF3-C57F変異体、ならびにTFF3-C57F-hSA (ヒト血清アルブミン)融合タンパク質の発現プラスミド、さらに対照として空のベクターで同時にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性をキット(Promega)により測定した。実験は3回繰り返して6ウェルプレート中で行った。
【００６７】
図14Bは、TFF3およびTFF3-C57F変異体を安定に発現するMCF-7細胞の増殖曲線を示す。細胞を10% FBS含有RPMI 1640中にて6ウェルプレートの培養基で培養した。全細胞数を2日ごとに測定した。
【００６８】
TFF3はMCF-7細胞でのCECAM6発現を対照ベクターに比べて2倍刺激した。hSA (ヒト血清アルブミン)またはTFF3-C57F変異体単独では、CEACAM6発現にほとんど効果がなかったが、TFF3-C57F-has融合タンパク質はCECAM6の発現を対照ベクターに比べて3倍阻害した。成熟TFF3ペプチドの57位のシステインはTFF3二量体の形成に関与しているが、しかし、このシステインの除去によってCEACAM6遺伝子発現を活性化するTFF3の能力に目に見えて影響がなかったことから、その単量体が二量体と同じように振舞っていることが示唆された。しかしながら、この変異体は大きな血清タンパク質(65 kDa)に融合されると、その融合タンパク質は、下流の遺伝子CEACAM6の活性化に及ぼす野生型TFF3の活性を阻害するアンタゴニストとして働いた。
【００６９】
実施例8: 組換えTFFタンパク質および抗TFF抗体
ヒトTFF1およびTFF3成熟ペプチドをコードするcDNAをMCF-7細胞から単離されたRNAからRT-PCRによって増幅し、GST融合タンパク質発現ベクターpGEX 4T1にクローニングした(図15)。pGEX4T1-TFF1およびpGEX4T1-TFF3プラスミドをBL21-Gold細胞に形質転換した後に、GST-TFF1およびGST-TFF3の産生はIPTGでの誘導によって成功裏に達成された。しかしながら、GST-TFF1とTFF3の融合タンパク質はともに不溶性であり、したがって標準的な精製プロトコルの下では効率的に精製することができなかった。それ故に、改良されたプロトコルを用いて、GST融合タンパク質の溶解性およびその後のグルタチオンセファロース4Bマトリックスとの結合を最大限にした。TFF1およびTFF3をトロンビンによるカラム上での消化によりGSTから切断し、PBSで溶出させた。精製ヒトTFF1およびTFF3組換えタンパク質の完全性および純度を4〜12%のNuPAGE Bis-トリスゲルでのSDS-PAGEによって分析し、クマシーブルー染色によって可視化した。TFF1およびTFF3は、予想どおり、それぞれ9および7 kDのバンドとして示された。
【００７０】
大腸菌で産生された組換えTFF1およびTFF3精製タンパク質5マイクログラムを用いて、ウサギ抗TFF1および抗TFF3ポリクローナル抗体を作製した。各タンパク質に対しウサギ2羽を免疫した。抗体を抗血清からアフィニティー精製した。したがって、TFF1およびTFF3タンパク質の各々に対して2種のポリクローナル抗体、つまり抗TFF1-06および抗TFF1-07、ならびに抗TFF3-08および抗TFF3-09が存在することになる。免疫前血清を同様に、対照として各々で採取した。
【００７１】
産生された抗体は溶液中でTFFの天然の三次構造に結合した、すなわち、抗体が結合する残基はTFF1、2、および3の三次構造の表面に曝露される((Williams et al., 2001, FEBS Lett. 493(2-3):70-74; Muskett et al., 2003, Biochemistry 42 (51):15139-15147、このどちらも参照により本明細書に組み入れられる)。
【００７２】
実施例9: 用量および時間依存的にMCF-7細胞増殖を阻害する抗TFFポリクローナル抗体
MTTアッセイは、代謝的に活性な細胞だけが黄色のテトラゾリウム塩MTTを紫色のホルマザン結晶に切断することが可能で、その結晶を可溶化し、分光光度法によって定量化することに基づいている。それ故に、MTTアッセイは、細胞の増殖、生存能および外部因子への細胞集団の応答の活性化を定量的に測定するのに最も高感受性かつ高信頼性の細胞生物学的手法の1つとして受け入れられている。MCF-7細胞はTFF1とTFF3の両方を相対的に高いレベルで発現する。MTTアッセイを用いて、ウサギ抗TFF1および抗TFF3ポリクローナル抗体がMCF-7細胞の増殖に及ぼす効果を試験した。MCF-7細胞を各抗体0、1、5および20 μg/ml濃度のアフィニティー精製されたウサギ抗TFF1もしくは抗TFF3抗体または対照としてその免疫前血清とともに96ウェルマイクロプレートに播種した。同じ濃度を維持するため、併用効果を研究する場合には、各抗体または血清について示した濃度の半分を使用した。細胞を48時間または72時間インキュベーションし、細胞増殖をMTTアッセイによって材料と方法で記述した手順を用い測定した。CK-06、-07、-08および-09は、それぞれ、ヒトTFF1 (抗F1-06および-07)ならびにTFF3 (抗F3-08および-09)のウサギポリクローナル抗体に対する免疫前血清である。
【００７３】
図16Aに示されるように、試験された4種のポリクローナル抗体は全て、用量依存的にMCF-7細胞増殖を強力に阻害した。48時間のインキュベーション後、抗TFF1および抗TFF3の両抗体がMCF-7細胞の細胞増殖に及ぼす阻害効果は、0、1、5、最大で20 μg/mlに及ぶ抗体濃度の増大とともに増強された。
【００７４】
抗TFF1および抗TFF3の両抗体がMCF-7細胞増殖に及ぼす阻害効果は、用量依存的のみならず時間依存的でもあった。図16Bに示されるように、72時間のインキュベーション後、抗TFF1抗体1 μg/mlでは抗体の非存在下での対照に比べて15%の阻害効果が示されたのに対し、48時間のインキュベーション時間後では同じ濃度でほとんど阻害効果が示されなかった。先と同様に、72時間のインキュベーション後、抗TFF1抗体5 μg/mlでは抗体の非存在下での対照に比べて70%を超える阻害効果が示されたのに対し、48時間のインキュベーション時間後では同じ濃度で40%の阻害効果しか示されなかった。抗TFF3抗体の阻害効果も48時間から72時間へのインキュベーション時間の延長とともに強くなった。同様に、細胞増殖は対照と比べて72時間後に1 μg/mlの濃度で抗TFF3抗体により最終的に遮断されたのに対し、48時間後では同じ濃度で細胞増殖は60%に減らされただけであった。
【００７５】
抗TFF1および抗TFF3抗体の併用効果も試験した。最適下限濃度の抗TFF1および抗TFF3は、MCF-7細胞において単独の各TFFよりも併用で効果的であった(図16C)。これらのデータは、TFF特異的な抗体の組合せ(例えば、抗TFF1および抗TFF3、抗TFF1および抗TFF2、または抗TFF2および抗TFF3)によって相乗効果が得られることを示唆している。
【００７６】
いかなる場合でも、免疫前血清では、20 μg/mlでの処理が72時間のインキュベーション時間後に細胞にとって細胞傷害性であることが示された以外、MCF-7細胞増殖に全くまたはほとんど効果がなかった。それ故に、抗TFF1および抗TFF3抗体の阻害効果は特異的であった。
【００７７】
実施例10: 軟寒天中でのMCF-7細胞の足場非依存性増殖を阻害したウサギ抗TFF1および抗TFF3ポリクローナル抗体
ヒト乳癌MCF-7細胞は、その他全ての癌細胞と同様に、軟寒天中でコロニーを形成する能力を有する。MCF-7細胞5×103個を5 μg/mlのウサギ抗ヒトTFF1抗体または抗ヒトTFF3抗体および対照として免疫前血清有りまたは無しの10% FBS含有RPMI 1640中の軟寒天(0.35%)中にて6ウェルプレートの培養基で培養した。クリスタルバイオレット染色から10時間後にコロニー形成を調べた。倍率10×で写真を撮った。
【００７８】
図17Aおよび17Bに示されるように、抗TFF1または抗TFF3ポリクローナル抗体のいずれかを含有させることで、軟寒天中でのコロニー形成が著しく減少した。免疫前血清の存在下では、形成されたコロニーの数は、異なる処理間で160〜400個まで変化したのに対し、抗TFF1抗体(抗TFF1-06および-07)ならびに抗TFF1抗体(抗TFF1-08および-09)の存在下では、それぞれ、わずか10、35、8および1個のコロニーしか形成されなかった。それ故に、ウサギ抗TFF1および抗TFF3ポリクローナル抗体は、MTTアッセイで示されるようにMCF-7細胞の細胞増殖だけでなく、軟寒天中でのその足場非依存性増殖も阻止した。これらのデータから、TFF特異的な抗体は内因性TFFの発癌性を低減させることが示唆される。
【００７９】
実施例11: タモキシフェン耐性MCF-7-TamR細胞の細胞増殖を阻害する抗TFFポリクローナル抗体
MCF-7細胞はエストロゲン受容体(ER)陽性であり、抗エストロゲン薬タモキシフェンは細胞の増殖を遮断する。MCF-7-TamR細胞はオリジナルのMCF-7細胞の派生物であり、タモキシフェンの漸増濃度に漸進的に曝露させることによって樹立された。細胞を5×103個の細胞/100 μl/96ウェルプレート中のウェルで、デキストラン炭末処理済みの10% FBSの入ったフェノールレッド不含RPMI 1640培地中にて培養基で培養した。24時間のインキュベーション後、抗TFF3抗体および/またはタモキシフェン(TAM)を100 μlの容量中その終濃度で2回加えた。細胞増殖をMTTアッセイによって測定した。CK-09はヒトTFF3のウサギポリクローナル抗体(抗09)に対する免疫前血清である。
【００８０】
図18に示されるように、MCF-7-TamR細胞は抗TFF3抗体処理に感受性であった。タモキシフェンの非存在下では、抗TFF3抗体5 μg/mlによって細胞増殖が対照と比べて30%、および免疫前血清と比べて20%減少した。1 μMのタモキシフェンの存在下では、抗TFF3抗体は免疫前血清に比べて顕著な細胞死を引き起こした。それ故に、タモキシフェンは、抗TFF3抗体がタモキシフェン耐性MCF-7-TamR細胞の細胞増殖に及ぼす阻害効果を増強した。
【００８１】
実施例12: ウサギ抗TFF3ポリクローナル抗体によるタモキシフェン耐性MCF-7-TamR細胞の形態学的変化
細胞を5×103個の細胞/100 μl/96ウェルプレート中のウェルで、デキストラン炭末処理済みの10% FBSの入ったフェノールレッド不含RPMI 1640培地中にて培養基で培養した。24時間のインキュベーション後、抗TFF3抗体および/またはタモキシフェン(TAM)を100 μlの容量中その終濃度で2回加えた。その後、Olympus位相差顕微鏡を用いて倍率10×の下で細胞を写真撮影した。CK-09はヒトTFF3のウサギポリクローナル抗体(抗09)に対する免疫前血清である。
【００８２】
図19に示されるように、細胞形態アッセイはMTTデータを裏付けており、ポリクローナル抗TFF3抗体を用いてTFF3ペプチドを遮断する/中和することで、MCF-7-TamR細胞が死滅することを明確に示している。MCF-7-TamR細胞を、9ヶ月を超える間1 μM TAM中で培養し、TAM処理に完全に耐性であることが示された。実験条件の下で、TAM単独の処理細胞は正常かつTAM誘発細胞死に対する耐性を示す未処理細胞に似ているように思われる。抗体処理が野生型MCF-7細胞の大部分を死滅させた軟寒天コロニー形成アッセイ(図17)と一致して、本発明者らは、MCF-7-TamR細胞が抗体単独で処理された場合、対照に比べて非常に異なる形態を示すことをここで見出し、その処理によって細胞死が起こることを明らかにした。その細胞は縮んで丸くなったように見えたが、それでも正常に増殖する扁平な細胞も認められた。MCF-7-TamR細胞は抗TFF3抗体とTAMの両方で処理された場合、顕著な死を起こした。
【００８３】
癌療法用の組成物の投与
本明細書において記述されるTFF特異的な抗体を用いて、タモキシフェン感受性を増大させるか、ホルモンに基づく(例えば、抗エストロゲン)療法に対する感受性を増大させるか、腫瘍細胞の増殖を阻害するか、または腫瘍細胞を死滅させる。癌療法に加えて、その方法は前癌の状態もしくは病変または非癌性の過剰増殖性疾患に苦しむものあるいはそれらを発症する危険性があるものに臨床的有益性を与えるのに有用である。
【００８４】
精製された抗体調製物(例えば、精製されたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、抗体断片、または一本鎖抗体)を(同じ組織型の正常細胞に比べて)いっそう高いレベルのTFFを発現する腫瘍と診断された、またはその腫瘍を発症する危険性がある個体に投与する。抗体調製物は、受動免疫の分野において公知の方法を用いて、例えば、静脈内にまたは筋肉内に投与する。あるいは、調製物を腫瘍部位へ局所的に投与する。本明細書において記述される方法で使用される抗体は、生理学的に許容される賦形剤に処方される。そのような賦形剤、例えば、生理的食塩水は、当技術分野において公知である。任意で、タモキシフェンまたは別の化学療法薬が併用療法で投与されてもよい。抗体は高親和性抗体、例えば、IgGクラスの抗体またはその断片もしくは一本鎖であることが好ましい。抗体は任意でヒト化されてもよい。
【００８５】
ペプチドアンタゴニストおよび抗体調製物(または抗体-毒素調製物)は、毎週375 mg/m2の標準的な服薬スケジュールで投与する。別の標準的な投与計画は90分の注入として投与される4 mg/kgであり、毎週の維持量は30分の注入として投与される2 mg/kgとなる。そのような計画は当技術分野において公知である。用量は同時に投与される組成物(例えば、タモキシフェンまたはその他の薬物)に応じておよび患者の反応に応じて変わる。必要に応じて用量を毎週または毎月再投与して、処置施行個体での腫瘍量を低減する。
【００８６】
核酸構築体(アンチセンス、siRNA、タンパク質をコードする構築体、ペプチドをコードする構築体)は、公知の方法を用いて全身的にまたは局所的に投与する。DNAまたはmRNA投与量は一般に、約0.05マイクログラム/kg〜約50 mg/kg、通常は約0.005〜5 mg/kg体重、例えば、0.5〜5 mg/kgの範囲である。核酸の静脈内投与の投与量は、核酸分子およそ106〜1022コピーである。
【００８７】
このように、細胞の増殖および/または分化を調節する方法は、1つまたは複数のTFFタンパク質を阻害する段階を少なくとも含む。この方法は細胞内で(インビトロで)または対象内で(インビボで)実践される。好ましくは、TFF1、TFF2、またはTFF3タンパク質の1つまたは複数が阻害される。2つ以上のTFF産物、例えば、TFF1およびTFF3、TFF1およびTFF2、またはTFF2およびTFF3が阻害されるなら、その効果は相乗的である。すなわち、併用投与された各阻害性化合物の最適下限用量では、1つの阻害剤が単独で投与される場合に必要な量に比べて有益な治療効果が達成される。例えば、類似の効果に必要なTFF1/3混合物の抗体総量は、単独のTFF1特異抗体またはTFF3特異抗体のいずれかで必要な量よりも少なく、例えば、少なくとも10、20、30、40、50%未満の各TFF抗体を別のTFF抗体と併用して、臨床的有益性を達成する。
【００８８】
阻害性化合物はTFFを阻害するように適合された核酸またはTFFのペプチドアンタゴニストを含む。核酸はTFF転写産物に対するアンチセンス核酸、またはそのようなアンチセンスを発現するように適合された核酸、つまりTFF転写産物に対するiRNA、またはそのようなiRNAを発現するように適合された核酸である。好ましくは、核酸はTFF1、TFF2またはTFF3の転写または翻訳を阻害する。
【００８９】
本発明は同様に、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤とともに、使用時にTFFを阻害するように適合された1つもしくは複数の核酸またはTFFのペプチドアンタゴニストを含む組成物を提供する。
【００９０】
「増殖性疾患」は、対象内の1つまたは複数の細胞型の異常な増殖から生ずる疾患である。そのような疾患は良性または悪性でありうる。この疾患は癌または過剰増殖性疾患とすることができる。処置される各種の癌は、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、黒色腫、多発性骨髄腫、血液腫瘍、およびリンパ腫瘍を含むがこれらに限定されることはない。好ましくは癌は乳癌であり、より好ましくは癌はタモキシフェン耐性である。処置される各種の過剰増殖性疾患は、ケラチノサイト過剰増殖、炎症性細胞浸潤、サイトカイン変化、表皮嚢腫および類皮嚢腫、脂肪腫、腺腫、毛細血管性血管腫および皮膚血管腫、リンパ管腫、母斑病変、奇形腫、腎腫、筋線維腫症、骨形成腫瘍 、ならびにその他の形成異常塊を含むがこれらに限定されることはない。
【００９１】
本明細書において「対象」という用語は、関心対象の任意の動物を含む。特に、本発明は哺乳類、より詳しくはヒトに適用できる。「処置」という用語は増殖性疾患の調節もしくは制御、特定の疾患の症状もしくは重症度の改善、または特定の疾患を発症する危険性を予防することもしくは別の方法で低減することを含む。この用語は必ずしも対象が完全な回復まで処置されることを意味するものではない。
【００９２】
TFFタンパク質の「阻害」は、タンパク質の産生生物学的な活性の遮断、低下または低減をいうよう意図される。TFFタンパク質の活性を完全に阻害することが望ましい可能性があるが、TFFタンパク質または活性の前処理レベルに比べて5、10、20、25、50、75、90および最大で100%の阻害によって治療的有用性が得られる。TFFタンパク質の「阻害」は、TFFタンパク質の発現および産生のレベル(例えば、転写レベルまたは翻訳レベル)でまたはTFFタンパク質の機能を標的化することで行われることができる。
【００９３】
本発明はTFFタンパク質を阻害するのに利用される様々な手段および薬剤に関する。例証として、iRNA、アンチセンスおよび三重らせんDNAを含む核酸技術を利用して、発現を遮断することができる。さらなる例としては、ペプチドアンタゴニスト、およびTFFタンパク質に対して作製された抗体、またはそのような抗体の機能的誘導体を含め、TFFタンパク質の特異的アンタゴニストの使用が挙げられる。抗体およびその誘導体は、例えば、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ハイブリッドおよび組換え抗体(例えば、ヒト化抗体、二重特異性抗体、および一本鎖抗体を含む)、ならびに所望の活性を示す限り抗体断片を含む。
【００９４】
TFFを阻害する際の薬剤の有効性または治療的有用性は、腫瘍量または腫瘍体積の低下を検出することによって判定される。薬剤の有効性は有糸分裂誘発、細胞生存、細胞数、増殖の検出によっても判定される。好ましいTFF阻害剤は以下の特徴の1つまたは複数を有する: 1) 有糸分裂誘発を阻止する、低下させるまたは阻害する能力; 2) 細胞生存を阻止する、低下させるまたは阻害する能力; 3) 細胞数の増加を阻止するもしくは阻害するまたは細胞数を減少させる能力; 4) 足場非依存性増殖を阻止するもしくは抑止するまたは足場依存性増殖を助長するもしくは維持する能力; および5) 発癌性形質転換を阻止する、阻害するまたは低下させる能力。好ましくは、適当な薬剤はこれらの特徴の2つまたはそれ以上を示すであろう。
【００９５】
TFFタンパク質を阻害するために核酸が利用される。そのような核酸はDNA、RNA、一本鎖、または二本鎖とすることができる。本発明で用いられる核酸は、本明細書において「単離された」核酸と呼ぶことができる。「単離された」核酸は、同定された核酸であって、その天然状態において結び付いている少なくとも1つの混入核酸分子から分離された核酸である。したがって、単離された核酸は、それらが自然界に見られる形態または場面とは異なる形態で存在することが理解されよう。「単離された」とは、核酸分子が精製された度合いを反映していないことをさらに理解されたい。
【００９６】
本発明で用いられる単離された核酸は、当技術分野において知られるいくつかの技術を用いて得ることができる。例えば、組換えDNA技術を、例えばJoseph Sambrook and David W. Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAに記述されているように使用することができる。同様に化学合成(例えば、ホスホロアミダイトおよび固相化学を用いた)が使われてもよい。
【００９７】
本発明で用いられる核酸は、以下で例証されるように、特定のTFF核酸配列データ、ヌクレオチド塩基間の公知の相対的相互作用、および利用される特定の核酸技術に基づいてデザインすることができる。1つのTFF遺伝子/転写産物に対してデザインされた核酸が、関連するTFFの阻害に役立ちうる配列類似性は、種内のTFFタンパク質および遺伝子間にならびに種間に存在しており、例えば、本発明はTFF3を阻害するうえで有用な、TFF1に基づいてデザインされた核酸を提供する。
【００９８】
TFFを阻害するために干渉RNA (iRNA)または短い干渉RNA (siRNA)が利用される。iRNAおよびsiRNAは本明細書において交換可能に使用される。iRNA技術で用いられる核酸は、典型的にはその標的に対し100%の相補性を有するであろう。しかし、これは、iRNAがその標的に対する特異性や翻訳を遮断する能力を保持しているなら、そうである必要はないと理解されるべきである。例示的なiRNA分子は、3'ジヌクレオチド突出を有する約18〜21 bpの二本鎖RNAの形態とできるが、より短いまたはより長い分子が適切なこともある。iRNAが適切な核酸ベクターによりインビボで産生される場合には、それは典型的には、ステム-ループ構造を持つ(例えば、およそ19ヌクレオチドのステムおよび3'末端に2〜3個のUを有する9ヌクレオチドのループを持つ)RNA分子の形態をとるであろう。siRNAをデザインするのに用いられるアルゴリズムは、Cenix (Dresden, Germany - Ambion, Texas USA経由で)から入手できる。
【００９９】
本発明はTFF1転写産物に対する1つもしくは複数のiRNA分子または使用時にそのようなiRNAを発現するように適合された核酸を提供する。iRNAは以下の配列を標的にする群から選択することができる。
2014088393.tif 000010
【０１００】
TFF1に対するiRNAは以下の構造を有する群から選択することができる。
2014088393.tif 000011
【０１０１】
TFF1の例示的なヒト核酸およびアミノ酸配列データは、アクセッション番号NM_003225としてGenBankに示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。オルソログもその他の霊長類で、ならびにラットおよびマウスで報告されている。例示的なラット配列データは、アクセッション番号NM_057129としてGenBankに示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。例示的なマウス配列データは、アクセッション番号NM_009362として示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
本発明は同様に、TFF2転写産物に対する1つもしくは複数のiRNA分子または使用時にそのようなiRNAを発現するように適合された核酸を提供する。iRNAは以下の配列を標的にする群から選択することができる。
2014088393.tif 000012
【０１０３】
TFF2に対するiRNAは以下の構造を有する群から選択することができる。
2014088393.tif 000013
【０１０４】
TFF2の例示的なヒト核酸およびアミノ酸配列データは、アクセッション番号NM_005423としてGenBankに示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。ラットおよびマウスのオルソログが報告されている。例示的なラット配列データは、アクセッション番号NM_053844として示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。例示的なマウスデータは、アクセッション番号NM_009363として示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０５】
本発明は同様に、TFF3転写産物に対する1つもしくは複数のiRNA分子または使用時にそのようなiRNAを発現するように適合された核酸を提供する。1つの局面では、iRNAは以下の配列を標的にする群から選択される。
2014088393.tif 000014
【０１０６】
TFF3転写産物に対するiRNAは以下の構造を有する群から選択される。
2014088393.tif 000015
【０１０７】
TFF3の例示的なヒト核酸およびアミノ酸配列データは、アクセッション番号NM_003226としてGenBankに示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。その他の哺乳類種のならびにラットおよびマウスのオルソログが報告されている。例示的なラットTFF3の情報は、アクセッション番号NM 013042としてGenBankに見出され、これは参照により本明細書に組み入れられる。例示的なマウス配列は、アクセッション番号NM 011575として見出され、これは参照により本明細書に組み入れられる。例示的な哺乳類データは、アクセッション番号XM_525480およびXP_525480として示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。TFF3の構造はMuskettら(Biochemistry 42(51): 15139-47, 2003)によって明らかにされている。
【０１０８】
XXXXは、存在してもよい付加的なヌクレオチド、例えば、iRNAのクローニングおよび発現で役立ちうる終結シグナルおよび制限部位を示す。例証として、以下の核酸を用いて、iRNAをクローニングし、(所望のベクターにおいて)発現させることができる。
2014088393.tif 000016
【０１０９】
iRNA分子は、本明細書において記述される技術や当技術分野において知られる技術にしたがって産生される。そのような分子を産生およびデザインする方法に関するさらなる情報は、例えば、McManus and Sharp, Nature Rev Genet 3: 737-747, 2000; Dillin, Proc Natl Acad Sci USA 100(11): 6289-6291, 2003; およびTuschl, Nature Biotechnol 20: 446-448, 2002から得ることができる。
【０１１０】
腫瘍細胞によるTFF産生を阻害するアンチセンス分子。アンチセンスは、TFF転写産物に結合してその翻訳を阻止する任意の核酸(好ましくはRNA、しかし一本鎖DNAを含む)を意味する。典型的には、アンチセンス分子またはオリゴヌクレオチドは、その標的mRNAに完全に相補的な15〜25ヌクレオチドからなる。しかしながら、完全長cDNAを含む、いっそう大きなアンチセンスオリゴヌクレオチドも阻害性である。標的に完全に相補的ではないアンチセンス分子は、それらがその標的に対する特異性や翻訳を遮断する能力を保持しているなら利用される。
【０１１１】
アンチセンス、iRNA、リボザイムおよびDNAザイムを含めて、本発明で用いられる核酸分子を化学的に修飾して、安定性を増大させるかまたは分解もしくはその逆を阻止することができる。例えば、核酸分子は、非天然塩基、修飾された糖類(特にリボースの2'位置で)または改変されたリン酸骨格を有する類似体を含むことができる。そのような分子は同様に、それらが結合する任意の転写産物の標的分解を命令する配列を含むことができる。例えば、RNase Hに特異的な配列を含めることができる。別の例は外部ガイド配列(EGS)の使用であり、これはリボザイム(RNase P)を動員して、例えばアンチセンス分子が結合する転写産物を消化することができる。
【０１１２】
阻害性核酸は、インビトロで産生される合成核酸分子(例えば、一本鎖DNA、iRNA、アンチセンスRNA、DNAザイム)の形態をしており、またあるいは、それらはベクター中の配列によりコードされて、活性な阻害性化合物、例えば、アンチセンス分子、iRNA、リボザイムを産生する。当技術分野において知られる任意の適当なベクターは本発明の範囲内である。例えば、CMVプロモーターを利用する裸のプラスミドが使われる。アデノ随伴ウイルス(AAV)およびレンチウイルスなどの標準的なウイルスベクターが適当である。そのようなベクターは当技術分野において公知である: レトロウイルスベクターの使用はMiller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599, 1993およびBoesen et al., Biotherapy 6:291-302, 1994に報告されている; アデノウイルスベクターの使用は、例えば、Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503, 1993; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Rosenfeld et al., Cell 68:143-155, 1992; Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234, 1993; PCT公開WO 94/12649号; およびWang, et al., Gene Therapy 2:775-783, 1995に報告されている; ならびにAAVの使用はWalsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300, 1993; 米国特許第5,436,146号に報告されている。適当なプロモーターおよびウイルスベクターのその他の例は、本明細書において示される。
【０１１３】
本発明で用いられる核酸ベクターまたは構築体は、誘導的な、構成的な、または組織特異的なプロモーターを含め、当技術分野において知られるようにプロモーター、エンハンサー、複製起点などの、適切な遺伝要素を含むことができる。ベクターは、適切な転写誘導因子の有無を制御することで核酸の発現を制御できるように、本発明の核酸(例えば、アンチセンスTFF3または適当なsiRNA)をコードする領域に作動可能に連結された誘導的なプロモーターを含むことができる。本発明のペプチドをコードする核酸分子を、ゲノム中の所望の位置での相同組換えを促進する領域に隣接させ、それにより所望の核酸の染色体内組込みをもたらすことができる(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。もちろん、ベクターは染色体外のままであってもよい。
【０１１４】
本発明によるTFFタンパク質を阻害するためペプチドおよび/またはタンパク質を利用することができる。「ペプチドアンタゴニスト」は、TFFの生物学的活性を遮断するか、低下させるかまたは減少させる用途での能力が有るペプチドである。TFFの活性を完全に阻害することが望ましい可能性があるが、これは必ずしも不可欠ではない。ペプチドアンタゴニストは、TFF受容体との結合をめぐって天然のTFFと競合するか、天然のTFFがTFF受容体に結合するのを阻止するか、TFFもしくはTFF受容体の二量体化を阻止するか、またはTFF受容体の活性化を阻止するペプチドを含む。
【０１１５】
ペプチドまたはタンパク質は「単離された」または「精製された」ペプチドである。「単離された」または「精製された」ペプチドは、同定されたものであって、それが天然に存在している環境から分離されたものである。「単離された」とは、ペプチドが精製された、またはそれが天然に存在している環境から分離された度合いを反映していないと理解されるべきである。好ましくは、関心対象のペプチドは、重量で、調製物中のタンパク質の少なくとも60%である。好ましくは、調製物中のタンパク質は重量で、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは少なくとも99%である。純度は任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、またはHPLC分析法によって測定される。
【０１１６】
ペプチドアンタゴニストは、本明細書において記述されるようにTFFに関する公開されたアミノ酸および核酸配列データに基づいてデザインされる。例えば、ペプチドアンタゴニストは、1つまたは複数の変異を配列の中に組込んだ天然のTFFアミノ酸配列に由来する。そのような変異は、例えば、アミノ酸の挿入、欠失、置換などを含む。あるいは、ペプチドアンタゴニストは完全長の天然TFFタンパク質の断片であり、これは変異を含んでもまたは含まなくてもよい。ペプチドアンタゴニストは同様に、異種ペプチドに融合された天然TFFタンパク質の断片を含むことができる。例えば、異種ペプチド(例えば、ヒト血清アルブミン)は血中半減期を増加させる(すなわち、タンパク質分解を減少させる)および/または腎臓による構築体の急速な排出を減少させる働きをする。異種ペプチドは同様に、TFFのその受容体との相互作用または受容体活性化を阻止するかまたは損なう集団効果(mass effect)を果たすことができる。
【０１１７】
TFF3の阻害
TFF3のいくつかのアミノ酸残基(すなわち、Tyr 23、Pro 24、His 25、Pro 46、およびTrp 47)は、TFF3の構造および潜在的な機能に重要である。さらに、アミノ酸残基Cys 57は、分子間ジスルフィド結合を形成させるうえで重要である。したがって、ペプチドアンタゴニストは、天然のTFF3アミノ酸配列に基づく上記の1つまたは複数の部位に改変を含む。例えば、疎水性アミノ酸Tyr 23、Pro 24、またはTrp 47はArgまたはLysに置き換えられる。さらなる例は、Cys 57がPheに置き換えられたペプチドを含む。あるいは、Cys 57の後にヒトβカゼインまたは別のペプチド配列が続く; すなわち、TFF3タンパク質が切断され、異種のペプチドまたはタンパク質に融合される。
【０１１８】
本明細書において用いられる場合、TFF3のアミノ酸位置に使われる付番は、以下に基づくようなものであり、番号は、＊1の印が付いたアミノ酸から始まる。
2014088393.tif 000017
【０１１９】
アミノ酸配列
2014088393.tif 000018
はTFF3前駆体開始配列に相当する。アミノ酸配列
2014088393.tif 000019
はTFF3シグナルペプチド配列に相当する。アミノ酸配列
2014088393.tif 000020
はTFF3ポリペプチドの成熟型に相当する。TFF阻害活性アンタゴニストは、TFF3に結合する、受容体結合をめぐってTFF3と競合する、TFF3もしくは受容体の二量体化を阻止する、TFF受容体の活性化を阻止するまたは細胞中でのTFF3の機能的効果を広く阻害するその能力を観察することによって判定される。
【０１２０】
TFFアンタゴニストとして機能するTFF1およびTFF2変異体は、それぞれ以下のアライメントに示されるように、TFF1およびTFF2の構造中の類似残基を置き換えることによって作出された。
2014088393.tif 000021
【０１２１】
上記のアライメントにおいて、SEQ ID NO:22は完全長のヒトTFF3配列を指し; SEQ ID NO:33は完全長のヒトTFF1配列を指し; SEQ ID NO:34は完全長のヒトTFF2配列のアミノ酸残基番号1〜73 (TFF2a)を指しおよびSEQ ID NO:35は完全長のヒトTFF2配列の74〜129のアミノ酸残基番号(TFF2b)を指す。点変異は以下のように判定される。
2014088393.tif 000022
【０１２２】
TFFアンタゴニストは同様に、野生型の完全長配列の断片を含む。例えば、以下の断片はタンパク質の一部分を欠失させること、すなわち、TFF3中のC残基の配列除去によって作出された。対応するTFF1およびTFF2は同じように作出される。
2014088393.tif 000023
TFF1、2、および3のドメインおよびループ構造は、各タンパク質のアミノ酸配列の以下の注釈付きの叙述でさらに規定される。以下のアライメントで開示される成熟型ヒトTFF3配列は、SEQ ID NO:25と呼ばれる。以下のアライメントで開示される成熟型ヒトTFF1配列は、SEQ ID NO:36と呼ばれる。以下のアライメントで開示される成熟型ヒトTFF2配列は、SEQ ID NO:37と呼ばれる。以下のアライメントで開示される成熟型ブタTFF2配列は、SEQ ID NO:38と呼ばれる。
2014088393.tif 000024
【０１２３】
ペプチドアンタゴニストは、化学的に修飾された可能性のあるペプチドを含む。そのような化学修飾はインビボでの安定性を増大し、または生来の翻訳後修飾を模倣する。例えば、ペプチドはアセチル化、グリコシル化、架橋結合、ジスルフィド結合形成、環化、分岐、リン酸化、所望の分子への結合もしくは付着(例えば、二重特異性抗体への結合)、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合性付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合性付着、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、プレニル化、ラセミ化、硫酸化、または例えば、生来の翻訳後修飾を模倣する別の方法によって修飾することができる。さらに、ペプチドは1つまたは複数の非天然のアミノ酸を含むように修飾することができる。ペプチドは必要に応じてLまたはDアミノ酸から構成されてもよい。本発明で用いられるペプチドは、特定の細胞または細胞膜を標的とするのを可能とするように修飾することができる。融合タンパク質も含まれる。当技術分野において知られるその他の適当な修飾は、本発明の範囲内である。
【０１２４】
任意で、ペプチドアンタゴニストは、これを細胞透過性にするモチーフ(細胞膜移行モチーフ)と融合されてもよく、またはそのモチーフを別の方法で取り入れてもよい。そのようなモチーフは、ペプチドに基づく膜移行モチーフであることが好ましい。しかしながら、細胞透過性を効果的に付与しうる代替的性質のモチーフ、例えば、細胞表面受容体、または脂質部分によって結合されるおよび内部に取り入れられるモチーフは本発明の範囲内である。例えば、Chariotトランスフェクション試薬は、生物学的に活性なタンパク質およびペプチドを生細胞へ透過するようデザインされている。
【０１２５】
本発明によるペプチドに基づく膜移行モチーフはペプチドを細胞透過性にするが、そのペプチドの所望の機能の度合いを少なくとも保持している。当技術分野において知られる適切なペプチドに基づく膜移行モチーフは、本発明の範囲内である。好ましいモチーフはペネトラチンおよびアルギニン重合体を含む。さらなる適当なペプチドに基づく膜移行モチーフは、Joliot and Prochiantz, Nat Cell Biol. 6(3):189-96, 2004による概説に記述されている。
【０１２６】
ペプチドアンタゴニストは同様に、適当なTFFペプチドアンタゴニストが別のタンパク質と融合されたまたは別の方法で組み合わされたキメラペプチドを含む。例証として、本発明は、成長ホルモン受容体、受容体アンタゴニスト、アンギオスタチン、エンドスタチン、およびトロンボスポンジンAを含むキメラペプチドを提供する。
【０１２７】
本発明は同様に、本発明のペプチドアンタゴニストの模倣体を含む。例えば、本発明のペプチドは、ペプチド由来のアミノ酸集団が骨格に並べられたペプチド模倣体に縮小されてもよく、または完全に化学的な小分子阻害剤にさらに縮小されてもよく、またはその混合物であってもよい。当技術分野において知られる任意の適当な模倣体は、本発明の範囲内である。本発明のペプチドの「模倣体」は、そのペプチドの所望の機能の度合いを少なくとも保持していよう。
【０１２８】
本発明で用いられるペプチドアンタゴニストは、TFF核酸およびアミノ酸配列情報の公開済みの詳細、ならびに本明細書における教示を考慮し、本発明が関係する技術分野において公知の技術および方法によって作出することができる。例証として、ペプチドアンタゴニストは化学合成によってまたは組換え技術を用いて作出することができる。
【０１２９】
ペプチドの化学合成の技術は、Fields GB, Lauer-Fields JL, Liu RQ and Barany G (2002) Principles and Practice of Solid-Phase peptide Synthesis; Grant G (2002) Evaluation of the Synthetic Product. Synthetic Peptides, A User's Guide, Grant GA, 第2版, 93-219; 220-291, Oxford University Press, New York)に記述されているようにFMOC化学によって行われる「固相」化学合成を含む。しかしながら、当技術分野において知られる任意の適切な技術を利用することができる。
【０１３０】
本発明で用いられるペプチドの組換え産生には一般に、適切な核酸ベクターまたは構築体を用いたクローニングおよび宿主細胞でのTFFの発現が含まれるであろう。本発明が関係する技術分野の当業者であれば、公開されているTFF配列データ、またはペプチドの所望のアミノ酸配列、遺伝コード、およびその中で分かっている縮重に関する知識に基づき、所望の融合またはキメラペプチドまたはタンパク質を含めて、本発明のペプチドをコードする核酸を同定することが容易にできよう。
【０１３１】
本発明による核酸構築体は一般に、異種の核酸配列、すなわち、本発明の核酸配列に隣接することが天然には見られない核酸配列とともに、所望のペプチドをコードする核酸を含むであろう。構築体またはベクターは、原核生物または真核生物のいずれかの、RNAまたはDNAのいずれかとすることができ、典型的には、ウイルスまたはプラスミドである。適当な構築体は、好ましくは、本発明の核酸を宿主細胞に送達するよう適合されており、そのような細胞内で複製する能力がある。
【０１３２】
本発明のペプチドアンタゴニストをクローニングおよび発現するのに用いられる構築体は調節配列、例えば、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、終結配列、および当技術分野において知られるようにその他の適切な調節配列を含むことができる。さらに、構築体は、発現されたペプチドがその宿主細胞から分泌されることを可能にする分泌配列を含むことができる。さらに、発現ベクターは、融合タンパク質またはペプチドとして本発明の挿入核酸配列の発現をもたらす融合配列(異種アミノ酸モチーフ、例えばユビキチン(これは精製に役立ちうる)をコードするものまたは本明細書の他の箇所に記述されるようにペプチド膜移行モチーフのようなものなどの)を含むことができる。当技術分野において知られる任意の適当な構築体またはベクターは、本発明の範囲内である。
【０１３３】
本発明によって含まれる組換え構築体またはベクターは、本発明が関係する技術分野の当業者に容易に知られる組換え技術によって作出することができる。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAを参照されたい。
【０１３４】
本発明によれば、宿主細胞への構築体の形質転換は、核酸配列を細胞に組み入れることができる任意の方法によって達成することができる。例えば、形質転換技術はトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、および吸着を含む。
【０１３５】
理解されるように、形質転換された核酸配列は染色体外のままであってよく、または発現されるべきその能力が保持されるように宿主細胞の染色体内の1つまたは複数の部位に組み入ることができる。
【０１３６】
当技術分野において知られる任意の数の宿主細胞を、本発明に関連した核酸配列をクローニングおよび発現する際に利用することができる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞とすることができる。適当な宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、昆虫細胞(例えばSF9細胞)、および大腸菌が挙げられる。
【０１３７】
組換えペプチドは当技術分野において標準的な各種技術を用いてその発現後に、形質転換された宿主細胞、または培地から回収することができる。例えば、界面活性剤抽出、浸透圧衝撃処理および封入体精製。ペプチドはアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、およびクロマト分画などの技術を用いてさらに精製することができる。
【０１３８】
本発明のペプチドは融合ペプチドまたはタンパク質、例えば、ペプチドに基づく膜移行モチーフ、またあるいは、またさらには、その後のペプチドの単離および精製に役立ちうるモチーフ(例えば、ユビキチン、ヒス-タグ、またはビオチン)に付着された本発明のペプチドの形態であってよい。先に述べられているように、そのような融合ペプチドを作出する手段は、当技術分野において容易に知られ、化学合成および融合ペプチドが組換え宿主細胞で発現される技術を含む。Strep-タグ(Sigma-Genosys)、Impact(商標)システム(New England Biolabs)、ヒス-タグ、およびeg pMAL(商標)-p2発現システム(New England BioLabs)は、本発明で特に有用である。さらに、組換えタンパク質の発現および精製で用られる融合タグは、R.C. Stevens.「Design of high-throughput methods of protein production for structural biology」Structure, 8, R177-R185 (2000)により記述されている。
【０１３９】
膜移行モチーフは、本発明が関係する技術分野において容易に知られる代替的手段によってペプチドに融合されてもよい。例えば、細胞透過化部分がタンパク質全体、脂肪酸および/または胆汁酸を含む場合、そのような分子はアミノ酸架橋によって、または非ペプチジル結合によって活性ペプチドに結合させることができる。
【０１４０】
本発明のペプチドアンタゴニストが天然のTFFアミノ酸配列に比べて変異(例えば、単一ヌクレオチドの挿入、欠失または置換)を含むことになる場合、各種の技術を利用できることを理解されたい。例証として、分子クローニング技術および部位特異的変異誘発法を利用することができる。本発明が関係する技術分野の当業者は、代替技術を容易に理解することができる; 例証として、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAを参照されたい。
【０１４１】
組換え核酸技術を用いて本発明のペプチドアンタゴニストを作出できるので、本発明は同様に、そのようなペプチドをコードする核酸に関する。さらに、ペプチドアンタゴニストは、インビトロで産生されたペプチドの形態で投与されてもよいが、それは使用時にペプチドアンタゴニストを発現するように適合された核酸の形態で与えられてもよい。したがって、本発明は、使用時に本発明のペプチドアンタゴニストを産生するように適合された核酸構築体を含めて、クローニングまたは発現の目的に適合された核酸および核酸構築体に関する。
【０１４２】
TFFを阻害するのに用いられる薬剤(例えば、本発明のペプチドまたは核酸)はそのままで、あるいは1つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、担体および/または賦形剤と組み合わせて組成物の形態で使用することができる。
【０１４３】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される希釈剤、担体および/または賦形剤」という語句は、薬学的組成物の調製に有用であって、本発明による薬剤と同時に投与されながらも薬剤がその意図した機能を果たすのを可能にできる、一般に安全で、毒性がなく、生物学的にもまたはその他の点でも望ましくないことのない物質を含むよう意図される。薬学的に許容される希釈剤、担体および/または賦形剤の例としては、溶液、溶剤、分散媒、遅延剤、乳濁液などが挙げられる。希釈剤、担体および/または賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強する物質などの、微量の添加物を含むことができる。
【０１４４】
当技術分野において知られる様々な薬学的に許容される希釈剤、担体および/または賦形剤を本発明の組成物に利用することができる。理解されるように、そのような希釈剤、担体および/または賦形剤の選択は、使用される薬剤の性質、意図される組成物剤形、およびその投与方法によってある程度まで影響されるであろう。例証として、アンチセンスまたはiRNAを発現するように適合されたベクターなどの核酸の投与の場合、適当な担体は等張液、水、生理食塩水溶液、デキストロース水溶液などを含む。
【０１４５】
標準的な希釈剤、担体および/または賦形剤に加えて、本発明の薬学的組成物は、薬剤の活性を増強するようにまたは薬剤の完全性を保護するのに役立つように、さらなる構成物質と、またはそのように処方することができる。例えば、組成物は、対象への投与時に、分解に対する防御を付与する、または薬剤の抗原性を低減させる補助剤または構成物質をさらに含むことができる。あるいは、薬剤は特定の細胞、組織または腫瘍への標的化を可能とするように修飾されてもよい。
【０１４６】
本発明のペプチドまたは核酸は、徐放系を取り入れるように処方することができる。このようなために、組成物は半透性重合体マトリックスを造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態で含むことができる。徐放マトリックスはポリラクチド(米国特許第3,773,919号; EP 58,481)、L-グルタミン酸およびL-グルタミン酸-γ-エチルの共重合体(Sidman et al., Biopolymers: 22: 547-56, 1983)、ポリ(メタクリル酸2-ヒドロキシエチル) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267, 1981)、エチレン酢酸ビニル(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267, 1981)、またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)を含む。
【０１４７】
本発明のペプチドまたは核酸をリポソーム中に処方することもできる。化合物を含有するリポソームは、本発明が関係する技術分野において公知の技術を用いて調製することができる。例証として、DE 3,218,121、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、日本国特許出願第83-118008号、米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号、ならびにEP 102,324を参照されたい。通常、リポソームは、脂質含量が約30 mol%のコレステロールを超える小さな(約200〜800オングストロームの)単層型のものであって、選択される割合は、最も効果のある療法に応じて調整される。
【０１４８】
本発明で用いられる本発明のペプチドまたは核酸をPEG化して、その寿命を増大させることもできる。
【０１４９】
さらに、本発明による組成物は、個別の事例において対象のためになりうるその他の成分とともに処方されてもよいと考えられる。例えば、適切な場合、1つまたは複数の抗新生物薬を組み入れることが利益になることがある。そのような薬剤の例としては、アルキル化剤(例えば、クロラムブシル(リューケラン(Leukeran)(商標)); シクロホスファミド(エンドキサン(Endoxan)(商標)、シクロブラスチン(Cycloblastin)(商標)、ネオサール(Neosar)(商標)、シクロホスファミド(Cyclophosphamide)(商標)); イホスファミド(ホロキサン(Holoxan)(商標)、イフェス(Ifex)(商標)、メスネックス(Mesnex)(商標)); チオテパ(チオプレックス(Thioplex)(商標)、チオテパ(Thiotepa)(商標))、代謝拮抗剤/S期阻害剤(例えば、メトトレキサートナトリウム(フォレックス(Folex)(商標)、アビトレキサート(Abitrexate)(商標)、エデルトレキサート(Edertrexate)(商標)); 5-フルオロウラシル(エフディックス(Efudix)(商標)、エフデックス(Efudex)(商標))、ヒドロキシウレア(ドロキシア(Droxia)(商標)、ヒドロキシウレア(Hydroxyurea)、ヒドレア(Hydrea)(商標))、アムサクリン、ゲムシタビン(ジェムザール(Gemzar)(商標))、ダカルバジン、チオグアニン(ランビス(Lanvis)(商標))、代謝拮抗剤/核分裂毒(例えば、エトポシド(エトポフォス(Etopophos)(商標)、エトポシド(Etoposide)、トポサール(Toposar)(商標))、ビンブラスチン(ヴェルベ(Velbe)(商標)、ベルバン(Velban)(商標))、ビンデスチン(vindestine)(エルデシン(Eldesine)(商標))、ビノレルビン(ナベルビン(Navelbine)(商標))、パクリタキセル(タキソール(Taxol)(商標)))、抗生物質類の薬剤(例えば、ドキソルビシン(ルベックス(Rubex)(商標))、ブレオマイシン(ブレノキサン(Blenoxane)(商標))、ダクチノマイシン(コスメゲン(Cosmegen)(商標))、ダウノルビシン(セルビジン(Cerubidin)(商標))、マイトマイシン(ムタマイシン(Mutamycin)(商標)))、ホルモン剤(例えば、アミノグルテチミド(シタドレン(Cytadren)(商標)); アナストロゾール(アリミデックス(Arimidex)(商標)); エストラムスチン(エストラサイト(Estracyt)(商標)、(エムシット(Emcyt)(商標)); ゴセレリン(ゾラデックス(Zoladex)(商標)); ヘキサメチルメラニン(ヘキサメット(Hexamet)(商標)); レトロゾール(フェマーラ(Femara)(商標)); アナストロゾール(アリミデックス(Arimidex)(商標)); タモキシフェン(エストロキシン(Estroxyn)(商標)、ゲノックス(Genox)(商標)、ノバルデックス(Novaldex)(商標)、ソルタモックス(Soltamox)(商標)、タモフェン(Tamofen)(商標)))または任意の2つもしくはそれ以上の抗新生物薬の任意の組合せ(例えば、アドリアマイシン/5-フルオロウラシル/シクロホスファミド(FAC); シクロホスファミド/メトトレキサート/5-フルオロウラシル(CMF))が挙げられる。本発明のペプチドまたは核酸は同様に、一般に認められた薬学的実践によって、本明細書において具体的に記述されるもの以外の、化合物および薬剤とともに処方されてもよい。
【０１５０】
理解されるように、核酸の投与の場合、それらはウイルス送達系の中にパッケージングされてもよく、このウイルス系はそれ自体が、本明細書に記述されるように組成物の中に処方されてもよい。本発明が関係する技術分野の当業者は、種々の適当なウイルスベクターおよび本明細書において記述される本発明の性質を考慮したそのようなベクターを満たすように利用できる方法を理解することができる。しかしながら、例証として、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)を使用することができる。
【０１５１】
使用される投与方法、ならびに本明細書において先に記述される適当な薬学的賦形剤、希釈剤および/または担体によって、本発明の組成物を溶液、経口的に投与可能な液体、注射可能な液体、錠剤、被覆錠剤、カプセル、丸剤、顆粒剤、坐剤、経皮パッチ、懸濁液、乳濁液、徐放性製剤、ゲル、エアロゾル、リポソーム、粉末および免疫リポソームのような通例の剤形に変換することができる。選択される剤形は、使用されることが望まれる投与方法、処置される疾患および使用される薬剤の性質を反映するであろう。特に好ましい剤形は、経口的に投与可能な錠剤、ゲル、丸剤、カプセル、半固形物、粉末、徐放性製剤、懸濁液、エリキシル剤、エアロゾル、軟膏または局所投与用の溶液、および注射可能な液体を含む。
【０１５２】
当業者であれば、適切な剤形および処方法を容易に認識するであろう。組成物は特定の薬剤および成分を互いに接触させるかまたは混合することで調製することができる。その後、必要ならば、生成物を所望の処方物に成形する。例証として、組成物を処方するある種の方法は、Gennaro AR: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000などの参考文献の中で見出すことができる。
【０１５３】
組成物中の本発明のペプチドまたは核酸の量は、組成物のタイプ、単位投与量のサイズ、担体、希釈剤および/または賦形剤の種類、ならびに当業者に周知のその他の要因に応じて、大きく異なりうる。最終組成物は0.0001重量パーセント(% w)〜100% w、好ましくは0.001% w〜10% wの本発明の活性物を含有し、その残りは、存在するその他任意の活性剤ならびに/または担体、希釈剤および/または賦形剤とすることができる。
【０１５４】
本発明の薬剤または組成物のいずれかの投与は、所望の活性(TFFの阻害)を対象の体内の標的部位に送達できる任意の手段によるものとすることができる。「標的部位」は、増殖性疾患にかかっているまたはかかりやすい可能性のある体内の任意の部位とすることができ、1つまたは複数の細胞、組織または特定の腫瘍を含むことができる。
【０１５５】
例えば、投与は非経口投与経路、全身投与経路、経口および局所投与を含むことができる。例えば、投与は注射、皮下、眼窩内、眼、脊髄内、嚢内、局所、注入(例えば、持続放出装置または小型ポンプ、例えば、浸透圧ポンプまたは皮膚パッチを用いた)、インプラント、エアロゾル、吸入、乱切、腹腔内、関節内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、経口、口腔、経皮、肺、直腸または膣を経由してもよい。理解されるように、選択される投与経路は、対象の体内の標的部位の位置、および使用される薬剤または組成物の性質に依存しうる。
【０１５６】
核酸の場合、それらは、例えば、欠損もしくは弱毒化レトロウイルスもしくはその他のウイルスベクターを用いた感染によって(米国特許第4,980,286号)、あるいは裸のDNAの直接注入によって、あるいは微粒子衝撃(例えば、遺伝子銃; バイオリスティック(Biolistic)、Dupont)、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション試薬での被覆、リポソーム、微小粒子、もしくはマイクロカプセル中での封入の利用によって、あるいは核に入ることが知られているペプチドに結合させてそれらを投与することによって、受容体を介した飲食作用に供されるリガンドに結合させてそれを投与すること(例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987)(これは受容体を特異的に発現する細胞型を標的にするのに使用できる)などによって投与することができる。さらに、核酸-リガンド複合体を形成させることができ、その場合、リガンドにはエンドソームを破壊して、核酸分子にリソソーム分解を回避させる融合ウイルスペプチドが含まれる。
【０１５７】
核酸分子は、例えばWO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188およびWO 93/20221に記述されるように、特異的受容体を標的にすることによって、細胞特異的な取込みや発現をインビボで標的にすることができる。または、核酸分子を細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のため宿主細胞のDNA内に組み入れることができる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935, 1989; Zijlstra et al., Nature 342:435-438, 1989)。
【０１５８】
本発明の目的のために核酸を導入できる細胞は、任意の所望とされる、利用可能な細胞型を包含する。適切な細胞型は、処置される疾患の性質に依存するであろう。しかしながら、例証として、核酸は任意の過剰増殖性細胞または新生細胞に導入される。
【０１５９】
理解されるように、投与される組成物または本発明のペプチドまたは核酸の用量、投与の期間、および全般的な投与計画は、処置される状態の性質、対象の症状の重症度、処置される任意の腫瘍のサイズ、処置される標的部位、選択される投与方法、ならびに対象の年齢、性別および/または全般的健康などの変量に応じ、対象の間で異なりうる。本発明が関係する技術分野の当業者であれば、過度の実験なしに、そのような要因を考慮して適切な投与計画を容易に理解しまたは決定できるであろう。本発明の薬剤の投与は、所望の反応を少なくとも部分的に得るのに必要な量にある。
【０１６０】
投与は毎日1回の用量または適切な場合にはいくつかの別々の分割用量の投与を含むことができると理解されるべきである。
【０１６１】
投与計画では異なる、投与の方法または経路を組み合わせることができる。例えば、腫瘍内注入と全身投与を組み合わせることができる。
【０１６２】
本発明の方法は、処置される状態を考慮して対象に有益でありうる付加的な薬剤または組成物の投与などのさらなる段階をさらに含むことができると理解されるべきである。例えば、増殖性疾患を処置するのに用いられるその他の薬剤(上述の抗新生物薬などの)を投与することができよう。そのような付加的な薬剤および組成物を本発明の薬剤および組成物と同時に、または逐次的な方法で投与できる(例えば、付加的な薬剤または組成物を本発明の薬剤または組成物の投与の前または後に投与できる)と理解されるべきである。薬剤または組成物の逐次的送達に関して、一方の薬剤または組成物の、他方の後での逐次的投与は必ずしもすぐに行われる必要はないが、これは好ましい可能性があると理解されるべきである。薬剤または組成物の送達の間に時間の遅延があってもよい。遅延の期間は、処置される状態および送達される組成物または薬剤の性質などの要因に依存するであろう。しかしながら、例証として、遅延の期間は数時間から数日または数ヶ月の間とすることができる。
【０１６３】
本発明をその詳細な説明とともに記述してきたが、先の記述は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例証しており、限定するものではないと意図される。その他の局面、利点、および変更は添付の特許請求の範囲内である。
【０１６４】
本発明を、添付の特許請求の範囲に記述される本発明の範囲を限定するものではない以下の例でさらに記述する。
【図１】
2014088393.tif 000025
【図２Ａ】
2014088393.tif 000026
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
2014088393.tif 000030
【図４】
2014088393.tif 000031
【図５】
2014088393.tif 000032
【図６】
2014088393.tif 000033
【図７】
2014088393.tif 000034
【図８】
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【図９】
2014088393.tif 000036
【図１０】
2014088393.tif 000037
【図１１】
2014088393.tif 000038
【図１２】
2014088393.tif 000039
【図１３】
2014088393.tif 000040
【図１４】
2014088393.tif 000041
【図１５】
2014088393.tif 000042
【図１６Ａ】
2014088393.tif 000043
【図１６Ｂ】
2014088393.tif 000044
【図１６Ｃ】
2014088393.tif 000045
【図１７】
2014088393.tif 000046
【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
2014088393000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月17日(2013.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖および/または生存を阻害する方法であって、タモキシフェン耐性の腫瘍を含む対象を同定する段階、および該対象にTFF阻害性化合物を投与する段階を含む方法。