(57)【要約】【課題】キトサン及びヒアルロナンを含むナノサイズの複合粒子を効率よく製造する方法を提供する。【解決手段】ヒアルロナン、及びキトサンを、クエン酸緩衝液の存在下で複合化することにより、ヒアルロナンとキトサンの複合粒子を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナンとキトサンの複合粒子の製造方法であって、
ヒアルロナン、及びキトサンを、クエン酸緩衝液の存在下で複合化することを特徴とする、複合粒子の製造方法。
【請求項２】
ヒアルロナンをクエン酸緩衝液中に溶解する工程と、
キトサンをクエン酸緩衝液中に溶解する工程と、
ヒアルロナン溶液と、キトサン溶液とを混合撹拌する工程と、
を含む、請求項１に記載の複合粒子の製造方法。
【請求項３】
前記クエン酸緩衝液のｐＨが、７．０以下である、請求項１又は２に記載の複合粒子の製造方法。
【請求項４】
前記クエン酸緩衝液におけるクエン酸濃度が、０．１〜１０ｍＭである、請求項３に記載の複合粒子の製造方法。
【請求項５】
アミノ基とカルボキシル基の比率が１：０．１〜１：５となるように、ヒアルロナンとキトサンを複合化することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法によって製造された、ヒアルロナンとキトサンの複合粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤の原料として利用され得るナノ粒子、及びそのナノ粒子の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚外用剤の有効成分を角質細胞層内に送達するためには、従来以下のような点が問題とされてきた。
皮膚の角層細胞層は、外界からの異物の侵入を防ぐためにバリア機能を有しており、有効成分が角層細胞層内に到達しにくい。
特に、有効成分が高分子化合物である場合には、高分子化合物が低浸透性であるため角層細胞層内に浸透しにくく、有効成分が皮膚表面で凝集してしまう。
【０００３】
このような状況において、有効成分を角層細胞層内に送達するためのキャリアとして、ナノ粒子の開発が進められてきた。
特許文献１には、核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体；カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体；及びアニオン性ポリマーを含む複合体の凍結乾燥体が記載されている。
【０００４】
特許文献２には、直径１μｍ未満の活性成分の投与用のナノ粒子を得る方法であって、ａ）ヒアルロナン塩の水溶液を調製し、ｂ）カチオン性ポリマーの水溶液を調製し、ｃ）ポリアニオン塩を前記ヒアルロナン塩溶液に加え、
ｄ）前記ｂ）およびｃ）において得られた溶液を撹拌混合し、自然発生的にナノ粒子を得ることを含んでおり、前記ａ）、ｂ）またはｃ）において得られた溶液のうち１つに、あるいは前記ｄ）において得られたナノ粒子の懸濁液に、前記活性成分を溶解させ、ナノ粒子に吸着させる、方法が記載されている。
【０００５】
特許文献３には、生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系であって、前記ナノ粒子が、ａ）少なくとも５０重量％のキトサンまたはキトサン誘導体、およびｂ）５０重量％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体を含んでなる共役物を含んでおり、前記料成分ａ）とｂ）とが、キトサンアミノ基を介して共有結合しており、前記ナノ粒子が架橋剤により架橋していることを特徴とする系が記載されている。
【０００６】
特許文献４には、平均サイズ１マイクロメートル未満のナノ粒子を含み、ナノ粒子がａ）ヒアルロナンまたはその塩；およびｂ）キトサンまたはその誘導体、を含む生物活性分子の放出のための系であって、キトサンまたはその誘導体の分子量が９０ｋＤａ未満であることを特徴とする系が記載されている。また、生物活性分子として核酸等を含む系、網状化剤としてトリポリリン酸塩を含む系が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７／１３２８７３号パンフレット
【特許文献２】特表２００７−５２０４２４号公報
【特許文献３】特表２００８−５３３１０８号公報
【特許文献４】特表２００９−５３７６０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した通り、これまでナノ粒子の製造方法が提案されてきたが、より容易にナノ粒子を製造するための技術が求められている。
そこで、本発明は、キトサン及びヒアルロナンを含むナノ粒子を製造する方法であって、新規な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、キトサン及びヒアルロナンを含む複合粒子を製造する方法において、ナノレベルの粒径を実現するための技術を求めて鋭意研究努力を重ねた結果、キトサン及びヒアルロナンの複合粒子を形成する際に、溶媒としてクエン酸緩衝液を用いることで、作製される複合粒子の粒径を容易に小さくすることができることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
前記課題を解決するための本発明は、ヒアルロナンとキトサンの複合粒子の製造方法であって、ヒアルロナン、及びキトサンを、クエン酸緩衝液の存在下で複合化することを特徴とする。
このような製造方法を用いることにより、製造される複合粒子の粒径を小さくすることが可能となる。
特に、大きな分子量のヒアルロナンを用いた場合にも、効率的にナノサイズの複合粒子（ナノ粒子）、例えば１６０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の複合粒子を製造することが可能となる。
【００１１】
本発明の好ましい形態では、前記複合粒子の製造方法は、ヒアルロナンをクエン酸緩衝液中に溶解する工程と、キトサンをクエン酸緩衝液中に溶解する工程と、ヒアルロナン溶液と、キトサン溶液とを混合撹拌する工程とを含む。
このような工程で、複合粒子を製造することにより、粒子の凝集を防ぎ、より小さい粒径の複合粒子を安定的に製造することが可能となる。
【００１２】
本発明の好ましい形態では、前記クエン酸緩衝液のｐＨは、７．０以下である。
ｐＨ７．０以下のクエン酸緩衝液を用いることにより、容易に小さい粒径の複合粒子を製造することが可能となる。
【００１３】
本発明の好ましい形態では、前記クエン酸緩衝液におけるクエン酸濃度は、０．１〜１０ｍＭである。
クエン酸緩衝液のクエン酸濃度を０．１〜１０ｍＭとすることにより、容易に小さい粒径の複合粒子を製造することが可能となる。
【００１４】
本発明の好ましい形態では、アミノ基とカルボキシル基の比率が１：０．５〜１：５となるように、ヒアルロナンとキトサンを複合化することを特徴とする。
このような比率で、ヒアルロナンとキトサンを複合化することにより、容易に小さい粒径の複合粒子を製造することが可能となる。
【００１５】
本発明は、上述した製造方法によって製造された、ヒアルロナンとキトサンの複合粒子にも関する。
本発明の複合粒子は、それ自体を有効成分として、又は皮膚の角質層内に他の有効成分を送達するためのキャリアとして、使用することが可能である。
【００１６】
本発明の複合粒子の粒子径は、好ましくは１００ｎｍ以下である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の製造方法を用いることにより、従来の方法を用いるのに比して、相対的に小さな粒径の複合粒子を製造することが可能となる。特に、大きな分子量のヒアルロナンを用いた場合にも、効率的にナノサイズの複合粒子（ナノ粒子）、例えば１６０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の複合粒子を製造することが可能となる。
【００１８】
また、従来の方法を用いるのに比して、比較的高濃度の溶液を用いてもナノ粒子を製造することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ヒアルロナンと、キトサンとの複合粒子の製造方法に関する。
まず、複合粒子を形成する各成分について説明する。
【００２０】
＜１＞ヒアルロナン
本発明で用いられるヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの二糖を繰り返し単位とする多糖である。
【００２１】
本発明で用いられるヒアルロナンの分子量は制限されないが、好ましくは１００〜２０００ｋＤａ、さらに好ましくは４００〜１３００ｋＤａのものを用いることができる。
後に詳述する本発明の方法を用いることにより、６００ｋＤａ以上の大きい分子量のヒアルロナンを用いても、１００ｎｍ以下のナノ粒子を形成することが可能である。
【００２２】
ヒアルロナンは、ヒアルロン酸、又はヒアルロン酸塩のいずれであっても良い。
ヒアルロン酸塩を形成する塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
ヒアルロナンは、市販品を用いることが可能である。
【００２３】
＜２＞キトサン
キトサンは、キチンの脱アセチル化により得られ、グルコサミンを繰り返し単位とする多糖である。キトサンの脱アセチル化度は、例えば５０〜９８％程度である。
本発明で用いられるキトサンの分子量は制限されないが、例えば１〜５００ｋＤａ、好ましくは１０〜３００ｋＤａ、さらに好ましくは１９〜１１０ｋＤａのものを用いることができる。
【００２４】
キトサンは、キトサンの誘導体であっても良い。たとえば、アセチル化、アルキル化、スルホン化、チオール化誘導体が挙げられる。また、塩酸、酢酸、クエン酸、硝酸、乳酸等の塩も使用できる。
キトサンは、市販品を用いることが可能である。
【００２５】
＜３＞その他の成分
また、本発明においては、製造される複合粒子の保存安定性を高める目的で、複合粒子の成分として、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーをさらに組み合わせることが好ましい。
アニオン性ポリマーとしては、ヒアルロナンよりもキトサンに親和性が高いものであればよい。
たとえば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、フコイダン、ケラタン硫酸、ヘパリンなどの硫酸化多糖や、硫酸化ポリビニルアルコールなどの強酸性ポリマーや、ポリアクリル酸、ポリアルギン酸、ポリアスパラギン酸などのカルボキシル基高含有ポリマーなどが挙げられる。
【００２６】
＜４＞複合粒子の製造方法
本発明では、ヒアルロナンとキトサンを、クエン酸緩衝液の存在下で複合することにより複合粒子を製造する点に特徴を有する。
クエン酸緩衝液のｐＨは、好ましくは７．０以下、さらに好ましくは６．８以下、より好ましくは６．５以下である。また、ｐＨの下限値は特に制限されないが、例えば皮膚外用剤などに用いる場合には、皮膚への刺激性の観点などから、ｐＨ５．５程度を下限とすることが好ましい。
【００２７】
また、クエン酸緩衝液におけるクエン酸濃度は、好ましくは０．１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜５ｍＭ、特に好ましくは１〜２ｍＭである。
【００２８】
以下、具体的な実施形態について、説明する。
（１）ヒアルロナン溶液の調製
溶媒として、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、ヒアルロナン溶液を調製する。
ヒアルロナン溶液におけるヒアルロナンの濃度は、好ましくは２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。
このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でキトサン溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。
【００２９】
（２）キトサン溶液の調製
溶媒として、上述したクエン酸緩衝液を用い、キトサン溶液を調製する。
キトサン溶液におけるキトサンの濃度は、好ましくは２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。
このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でヒアルロナン溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。
【００３０】
上述したアニオン性ポリマーを用いる場合は、同様にクエン酸緩衝液を用いてアニオン性ポリマー溶液を調製する。
アニオン性ポリマー溶液におけるアニオン性ポリマーの濃度は、好ましくは２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。
【００３１】
（３）ヒアルロナン溶液とキトサン溶液の混合
続いて、調製したヒアルロナン溶液とキトサン溶液を混合する。
両者の混合割合は、例えば以下を基準として決定することが好ましい。
キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロナン由来のカルボキシル基の数が、０．１以上、好ましくは０．２〜５、より好ましくは０．５〜１である。
混合後の溶液に対するヒアルロナンの濃度が、好ましくは１〜２０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬである。
混合後の溶液に対するキトサンの濃度が、好ましくは１〜１０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬである。
【００３２】
また、調製される複合粒子の表面電荷は、好ましくは−１０ｍＶ以下、さらに好ましくは−２０ｍＶ〜−５０ｍＶである。
混合の方法としては、両溶液を一度に混合する方法、一方の溶液に、もう一方の溶液を滴下する方法などが挙げられる。いずれも、溶液を撹拌しながら混合を行うことが、凝集を回避する観点から好ましい。
また、一方の溶液に、もう一方の溶液を滴下する方法においては、ヒアルロナン溶液をキトサン溶液に滴下する方法が、より小さな粒径の粒子を作製する観点から好ましい。
また、アニオン性ポリマー溶液をさらに加える場合は、一度に混合しても良いし、予めキトサン溶液と混合しておいて、後にヒアルロナン溶液を滴下しても良い。
【実施例】
【００３３】
複合粒子の作製には、以下の成分を用いた。
ヒアルロン酸ナトリウム（発酵法由来、平均分子量４８０ｋＤａ）MRCポリサッカライド社製
ヒアルロン酸ナトリウム（トサカ由来、平均分子量６００ｋＤａ）生化学工業社製
ヒアルロン酸ナトリウム（発酵法由来、平均分子量８００ｋＤａ）MRCポリサッカライド社製
ヒアルロン酸ナトリウム（発酵法由来、平均分子量９１０ｋＤａ）MRCポリサッカライド社製
ヒアルロン酸ナトリウム（発酵法由来、平均分子量１３００ｋＤａ）MRCポリサッカライド社製
キトサン（平均分子量３４．３ｋＤａ）焼津水産化学社製
【００３４】
＜試験例１＞
表１に示す割合で、種々の分子量のヒアルロン酸ナトリウムとキトサン（３４．３ｋＤａ）を用いて、複合粒子を作製した。
すなわち、溶媒として、クエン酸緩衝液（クエン酸濃度が１ｍＭ、ｐＨ６．５）、ＰＢＳ（ｐＨ６．５、PBSの組成は、[ＫＣｌ］＝２．７ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝１．５ｍＭ、［ＮａＨ２ＰＯ４・７（Ｈ２０）］＝８．１ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１３７ｍＭ）、又はＭＯＰＳ（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）を用いて、ヒアルロン酸ナトリウム溶液とキトサン溶液を調製し、キトサン溶液を撹拌しながら、キトサン溶液にヒアルロン酸溶液を滴下した。
表１に、得られた複合粒子の粒子径と、複合粒子の表面電荷を示す。
複合粒子の平均粒子径は、Zetasizer  Nano-ZS  ZEN3600,  Malvern社（動的光散乱法）を用いて測定した。
複合粒子の表面電荷は、Zetasizer  Nano-ZS  ZEN3600,  Malvern社（レーザードップラー法）を用いて測定した。
【００３５】
【表１】
2014076971.tif 000002
【００３６】
上記表に示す通り、溶媒としてＭＯＰＳを用いて、ヒアルロナン濃度１７２μｇ／ｍＬ程度、キトサン濃度８３．５μｇ／ｍＬ程度で作製したＮｏ．１〜４では、作製された複合粒子の平均粒子径は１８０ｎｍよりも大きいものであった。特に１３００ｋＤａの分子量の大きいヒアルロナンを用いた場合には、２００ｎｍより大きい平均粒子径となった。
なお、溶媒としてＭＯＰＳを用いた場合でも、ヒアルロナン濃度とキトサン濃度を小さくすることにより（Ｎｏ．５〜１０）、粒子径を小さくすることが可能であった。
一方、溶媒としてクエン酸緩衝液を用いて、Ｎｏ．１〜４と同様のヒアルロナン濃度とキトサン濃度で作製したＮｏ．１６と１８は、平均粒子径が有意に５０ｎｍ程度小さくなった。また、高濃度の溶液を用いて作製したＮｏ．１５も、１５０ｎｍ以下の微粒子であった。さらに、Ｎｏ．１１〜１４を見るとわかるように、クエン酸緩衝液を用いることにより、ヒアルロン酸ナトリウムの分子量が大きくなっても、作製される複合粒子の粒子径はほとんど増大しないことが分かった。
なお、ＰＢＳを用いたＮｏ．１９は、凝集が起こり、複合粒子が形成されなかった。
これにより、クエン酸緩衝液を用いてヒアルロナンとキトサンの複合粒子を製造することにより、小さな径の複合粒子を製造することができることが分かった。特に、高分子量のヒアルロンナンを用いて、ナノサイズの複合粒子を製造することができることが分かった。
また、クエン酸緩衝液を用いることにより、他の緩衝液を用いる場合に比べて高濃度のヒアルロナン及びキトサンを含む溶液から複合粒子を製造することができるため、用いる溶媒の量を低減でき、製造効率の向上、コスト削減の観点からも効果的であることが分かった。
【００３７】
＜試験例２＞
さらにクエン酸緩衝液の効果を検証するため、ヒアルロナンとキトサンの比率を変えた以外は、試験例１と同様にして複合粒子を作製した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
2014076971.tif 000003
【００３９】
上記表に示す通り、ＭＯＰＳを用いたＮｏ．１〜４では、表面電荷が中性に近い粒子が形成してしまい、成分が凝集してしまい複合粒子を形成することができなかった。一方、クエン酸緩衝液を用いたＮｏ．５〜８では、大きな負電荷を有する複合粒子が形成された。特に、分子量が８００ｋＤａ以上のヒアルロン酸ナトリウムを用いた場合には、平均粒子径が１００ｎｍ程度以下の複合粒子が形成された。
これにより、クエン酸緩衝液を用いてヒアルロナンとキトサンを用いることにより、大きな負電荷を有する複合粒子が形成され、これが凝集を引き起こさず複合粒子の形成に寄与することが分かった。
【００４０】
＜試験例３＞
次に、クエン酸緩衝液におけるクエン酸濃度と、複合粒子の粒子径について検討した。
表３に結果を示す。
【００４１】
【表３】
2014076971.tif 000004
【００４２】
表に示す通り、クエン酸濃度が１ｍＭの緩衝液を用いたＮｏ．１のサンプルのほうが、クエン酸濃度が２ｍＭの緩衝液を用いたＮｏ．２のサンプルに比して、小さい粒子径の複合粒子を製造することができた。
これより、クエン酸緩衝液のクエン酸濃度は、１〜２ｍＭ程度が特に好ましいことが分かった。
【００４３】
＜試験例４＞
次に、ヒアルロナンとキトサンとの二元複合体と、ヒアルロナン（ＨＡ）、キトサン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の三元複合体を作製した。
ヒアルロナン：４８０ｋＤａ、ヒアルロナン濃度３４．３μｇ／ｍＬ（混合前の調製時濃度は１０３μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
キトサン：３４．３ｋＤａ、キトサン濃度１６．７μｇ／ｍＬ（調製時濃度は５０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
コンドロイチン硫酸：２２ｋＤａ、２．０μｇ／ｍＬ（調製時濃度は６．０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）：クエン酸濃度１ｍＭ
【００４４】
三元複合体は、コンドロイチン硫酸をヒアルロン酸溶液に加え、混合した後に、混合液にキトサン溶液を滴下して撹拌し、作製した。
すなわち、１ｍｇ／ｍＬ  ＨＡクエン酸溶液、１ｍｇ／ｍＬキトサンクエン酸溶液、１ｍｇ／ｍＬ  ＣＳクエン酸溶液にクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を所定量加え希釈し、室温で１５分間静置した。希釈したＨＡ溶液とＣＳ溶液を十分混合した後、希釈したキトサン溶液を加えて室温で１５分間静置することで、ＨＡ/キトサン/ＣＳ三元複合体ナノ粒子を作製した。混合比は、キトサンのアミノ基（Ｎ）、ＨＡのカルボキシル基（ｃ）、コンドロイチン硫酸のカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）に基づいて設定した。
二元複合体、三元複合体を、製造に用いたクエン酸緩衝液中、低温条件（４℃）で保存した。
結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
2014076971.tif 000005
【００４６】
表４から分かるように、二元複合体は、作製１日後に平均粒子径が大きくなり、作製１週間後には、２倍近くまでに平均粒子径が大きくなった。一方、三元複合体は、作製１日後には平均粒子径がほとんど変わらず、作製１週間後でも、２０％程度の増大であった。
【００４７】
＜試験例５＞
次に、試験例４で用いた二元複合体及び三元複合体を、調製時および保存時のキトサン濃度は変えずに、室温で保存した。
その結果、二元複合体及び三元複合体のいずれにおいても、作製直後と作製１週間後で平均粒子径はほとんど変化しなかった。
試験例４の結果と併せて、三元複合体は、二元複合体に比べて、低温保存時の粒子の安定性に大きく優れていることが分かった。
【００４８】
＜試験例６＞
次に、試験例４で用いた二元複合体及び三元複合体を、調製時および保存時のキトサン濃度を２５１μｇ／ｍＬ、ヒアルロナン濃度を４１６μｇ／ｍＬとして、４℃及び室温でそれぞれ保存した。
その結果、二元複合体及び三元複合体のいずれにおいても、作製直後と作製１週間後で平均粒子径はほとんど変化しなかった。
試験例４の結果と併せて、三元複合体は、二元複合体に比べて、高濃度、低温保存時の粒子の安定性に大きく優れていることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、高分子化合物を有効成分として用いる化粧料の製造に応用できる。