(57)【要約】      （修正有）【課題】内因性造血系における内因性造血細胞の再増殖を誘導するための医薬の提供。【解決手段】放射線又は化学療法への暴露後特定期間内に胎盤の外側で培養されたＣＤ３４−の胎盤由来の接着性間質細胞の治療効果的な量、及びＣＤ３４＋の造血細胞の治療効果的な量の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性造血系における内因性造血細胞の再増殖を誘導するための医薬を製造することにおける、胎盤の外側で培養されたＣＤ３４−の胎盤由来の接着性間質細胞の治療効果的な量、及びＣＤ３４＋の造血細胞の治療効果的な量の使用。
【請求項２】
放射線又は化学療法への暴露後の特定期間内に、内因性造血系における内因性造血細胞の再増殖を強化するための医薬を製造することにおける、胎盤の外側で培養されたＣＤ３４−の胎盤由来の接着性間質細胞の第一の治療効果的な量、胎盤の外側で培養されたＣＤ３４−の胎盤由来の接着性間質細胞の第二の治療効果的な量、及びＣＤ３４＋の造血細胞の治療効果的な量の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を拡大培養する方法、そのような方法によって作製される細胞の集団、および、そのような細胞の使用に関する。具体的には、本発明は、（本ＰＣＴ全体に従って）胎盤組織または脂肪組織からの接着細胞を拡大培養する方法、および、その治療的使用（例えば、造血幹細胞移植のためのその治療的使用など）に関する。
【背景技術】
【０００２】
発展し続ける医療界では、成体幹細胞の需要は、細胞移植および組織工学の目的のためにますます高まっている。加えて、成体幹細胞治療は、様々な状態（例えば、造血障害、心臓疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、火傷、筋ジストロフィー、自己免疫障害、糖尿病および関節炎など）を処置および治療するために絶え間なく発達し続けている。
【０００３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄細胞系列およびリンパ系列両者の血液細胞タイプのすべてを生じさせる前駆体細胞である。移植されたＨＳＣによる造血の生着および開始は、移植されたＨＳＣ細胞がレシピエントのＢＭに向かい、レシピエントのＢＭにおいて増殖する能力に依存する。
【０００４】
幹細胞は生体内では骨髄内の個々独立した陥凹部と密に結合し、全体としてその分化および自己再生を媒介する様々な分子シグナルを、細胞・細胞の接触または近距離の相互作用を介してもたらすことが広く受け入れられている。これらの陥凹部は、骨髄細胞（すなわち、マクロファージ、線維芽細胞、脂肪細胞および内皮細胞）から構成される「造血誘導微小環境」（ＨＩＭ）の一部である。骨髄細胞は、ＨＩＭの機能的一体性を、細胞・細胞の接触を容易にする細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質および基底膜成分を提供することによって維持する。骨髄細胞はまた、造血細胞の制御された分化および増殖のために必要とされる様々な可溶性サイトカインまたは常在性サイトカインを提供する。
【０００５】
ＨＳＣと、間質との間での相互作用が、ＨＳＣの生存能を維持し、その分化を防止するために要求される。ＨＳＣ移植後、移植されたＨＳＣは、移植されたＨＳＣが増殖および分化する前に骨髄（ＢＭ）の微小環境に向かい、適切な陥凹部に定着しなければならない。このホーミングプロセス中に、移植されたＨＳＣは血流から離れ、ＢＭの内皮細胞バリアの両端におけるサイトカインの勾配に従うことによって移動して、その専用の陥凹部に到達する。その場合、ドナーＨＳＣは、ＨＳＣ分裂のためのより好ましい微小環境と遭遇し、また、連続した物理的および化学的な接触が、ＨＳＣと、間葉系細胞、ＥＣＭおよび分泌された増殖因子との間で確立され得る造血性陥凹部の中に向かわなければならない。これらすべてのプロセスにおいて、複雑な配列の分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、ステロイド、細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子、細胞間相互作用タンパク質、接着タンパク質およびマトリックスタンパク質などが関わる。
【０００６】
ＢＭ専用の陥凹部に生着する細胞の総数がＨＳＣ移植の成功の基礎となる。生着を達成するために、血液循環に移植されるドナーＨＳＣは、ドナーＨＳＣが機能的な造血増殖巣をもたらすレシピエントの骨髄の中に向かわなければならない。この増殖巣の数は、輸血された総ＨＳＣにその生着効率を乗じた積として求められる。
【０００７】
ＨＳＣ移植に関係する大きな問題の１つは、アクセプター系におけるこれらの細胞の生存率の低さである。静脈内に移植されたＨＳＣは、その輸血後、数分以内に循環から除去され、ＢＭにおいて可視化されることが広く報告されている。ＨＳＣ移植後３〜５時間で、ドナー細胞はレシピエントの末梢血中に検出されない［Ａｓｋｅｎａｓｙ  ｅｔ  ａｌ、２００２、“Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｅｄ  ｉｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０：３０１〜１０］。移植された圧倒的多数の細胞が輸血後すぐに破壊される。結果として、レシピエントの骨髄におけるコロニー形成は効率が低く、輸血された細胞のほんの１〜５％が移植後２〜３日でレシピエントのＢＭにおいて検出されるにすぎない［Ｋｅｒｒｅｅｔ  ａｌ．、２００１、２００１、“Ｂｏｔｈ  ＣＤ３４＋３８＋  ａｎｄ  ＣＤ３４＋３８−  ｃｅｌｌｓ  ｈｏｍｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ＮＯＤ／ＬｔＳＺ  ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ  ｍｉｃｅ  ｂｕｔ  ｓｈｏｗ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．”、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：３６９２〜８；Ｊｅｔｍｏｒｅｅｔ  ａｌ．、２００２、２００２、“Ｈｏｍｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（＋）  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．”、Ｂｌｏｏｄ、９９：１５８５〜９３］。
【０００８】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、種々のタイプの間葉系成熟細胞に分化することができる細胞の不均一集団である。細網内皮細胞、線維芽細胞、脂肪細胞および骨形成性前駆体細胞へのこれらの細胞の分化は、様々な生物活性因子からの影響に依存する。
【０００９】
ＨＳＣ生着を支持するためにＭＳＣを使用することがこの分野では知られている。いくつかの刊行物により、間葉系幹細胞と同時移植されたときにＨＳＣの生着効率がより大きくなることが明らかになっている［Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈｅｔ  ａｌ．、１９９９、１９９９、“Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｏｒ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．”、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６８：１３６２〜８；Ｆａｎｅｔ  ａｌ．、２００１、２００１、“Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  （ＢＭＴ）  ｂｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ：  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ＢＭＴ−ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．”、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１９：１４４〜５０］。ヒト・ヒツジ生着モデルにおけるヒト間葉系幹細胞の同時移植が動物におけるヒトＨＳＣキメラＢＭの長期にわたる生着の強化をもたらしたこともまた明らかにされた［Ａｌｍｅｉｄａ−Ｐｏｒａｄａｅｔ  ａｌ．、２０００］。免疫前の胎児ヒツジへのヒト間質細胞前駆体の同時移植により、循環中のヒトドナー細胞が早期に出現し、移植後の様々な後の時点において、骨髄中の細胞レベルが高まる［Ｂｌｏｏｄ、９５：３６２０〜７］。ＨＳＣと間葉系幹細胞との同時注入により造血が加速した［Ｚｈａｎｇｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２２：１２５６〜６２］。近年では、これらの知見がより近縁の動物モデル（アカゲザル）に拡大された。ハプロタイプ一致のＨＳＣ細胞および間葉系幹細胞が同時移植されたとき、ＨＳＣ生着が促進されることが明らかにされた［Ｌｉｕｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｘｕｅ  Ｙｅ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ、２６：３８５〜８］。ヒトを対象としたＨＳＣの生着を増進させるための間葉系幹細胞の使用も近年報告された［Ｋｏｃ  ＯＮ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０００、１８：３０７〜３１６；Ｌａｚａｒｕｓ  ＨＭ、Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００５（Ｍａｙ）、１１（５）：３８９〜９８］。
【００１０】
明らかに、造血生着に対するＭＳＣ寄与は、移植されたＨＳＣのホーミング能、自己再生能およびコミットメント能の媒介及び均衡に役立つＨＳＣ支持サイトカインを産生すること、ＨＳＣのホーミングおよび増殖のために必要とされる損傷した造血微小環境を再構築すること、ならびに、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こし得るドナー由来Ｔ細胞を阻害することにある［Ｃｈａｒｂｏｒｄ  Ｐ．およびＭｏｏｒｅ，Ｋ．、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０４４：１５９〜１６７（２００５）；米国特許第６０１０６９６号および同第６５５５３７４号］。例えば、Ｍａｉｔｒａによる研究［Ｍａｉｔｒａ  Ｂｅｔ  ａｌ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、３３（６）：５９７〜６０４（２００４）］では、ヒト間葉系幹細胞は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいて非関連のドナー造血幹細胞および抑制されたＴ細胞活性化を支持することが見出された。このことは、非関連のヒト骨髄由来ＭＳＣが同種移植の結果を改善し得ることを示している。
【００１１】
ＭＳＣを使用する際の１つの大きな障害は、これらの細胞の通常存在する集団を多量に単離することの困難さであり、そのような単離は、部分的には細胞の量が限られているために、技術的に困難であり、また、費用がかかる。ＭＳＣの最も明白な供給源は骨髄であるが、骨髄吸引物を得る際に伴う著しい不快さや生検のリスクが、これらの方法に対する欠点となる。ヒトの胚および胎児は独立した生命を形成するという広く行き渡った考えは、既に存在するロジスティックな困難さに加えて、宗教的および倫理的な側面からヒトの胚を幹細胞供給源として問題あるものにしている。
【００１２】
幹細胞を集めるための代替供給源を見出すことが近年試みられている。そのような代替供給源は、例えば、脂肪組織、毛嚢、精巣、ヒト嗅粘膜、胚性卵黄嚢、胎盤、思春期皮膚および血液（例えば、臍帯血や月経血までも）である。しかしながら、幹細胞をそのような代替供給源から治療目的および研究目的のために十分な量で集めることは、例えば、細胞または組織をドナー対象者または患者から集めること、細胞をインビトロで培養および／または増殖すること、切開などを伴うので、依然として限定され、また、一般に労力を要する。
【００１３】
胎盤は、不快感または倫理的制約を何ら伴わない、幹細胞の最も入手しやすい供給源の１つであると考えられる。胎盤由来のＭＳＣは、ＢＭ由来のＭＳＣと類似する特性を有することが見出された。胎盤由来のＭＳＣはプラスチック接着性であり、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０の膜マーカーを発現し、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲの表面分子を発現しない。しかしながら、ＢＭ由来のＭＳＣとは異なり、インターフェロン−γにより処理された胎盤由来（ＰＤ）のＭＳＣはＨＬＡ−ＤＲの亢進をほぼ最小限に抑えた。そのうえ、ＰＤ−ＭＳＣ細胞は、インターフェロン−γの存在下で強化される免疫抑制的性質を示す（Ｃｈａｎｇ  ＣＪ、Ｙｅｎ  ＭＬ、Ｃｈｅｎ  ＹＣ、Ｃｈｉｅｎ  ＣＣ、Ｈｕａｎｇ  ＨＩ、Ｂａｉ  ＣＨ、Ｙｅｎ  ＢＬ、“Ｐｌａｃｅｎｔａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−  ｇａｍｍａ．”、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００６（Ｎｏｖ）、２４（１１）：２４６６〜７７）。
【００１４】
ＭＳＣマーカーに加えて、ＰＤ−ＭＳＣは、それが非常に原始的な細胞であり得ることを示唆する、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６１およびＴＲＡ−１−８０の特異なＥＳＣ表面マーカーを呈示する（Ｙｅｎ  ＢＬ、Ｈｕａｎｇ  ＨＩ、Ｃｈｉｅｎ  ＣＣ、Ｊｕｉ  ＨＹ、Ｋｏ  ＢＳ、Ｙａｏ  Ｍ、Ｓｈｕｎ  ＣＴ、Ｙｅｎ  ＭＬ、Ｌｅｅ  ＭＣ、Ｃｈｅｎ  ＹＣ、“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｒｍ  ｐｌａｃｅｎｔａ．”、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００５、２３（１）：３〜９）。そのうえ、ＢＭ由来のＭＳＣではなく、ＰＤ−ＭＳＣ（胎児由来）は細胞内ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ）陽性である？（Ｃｈａｎｇ  ＣＪ、Ｙｅｎ  ＭＬ、Ｃｈｅｎ  ＹＣ、Ｃｈｉｅｎ  ＣＣ、Ｈｕａｎｇ  ＨＩ、Ｂａｉ  ＣＨ、Ｙｅｎ  ＢＬ、胎盤由来の多能性細胞は、インターフェロン−ガンマの存在下で強化される免疫抑制的性質を示す、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００６（Ｎｏｖ）、２４（１１）：２４６６〜７７）。
【００１５】
様々な研究は、ＰＤ−ＭＳＣの拡大能が成体ＢＭ由来ＭＳＣの拡大能よりも著しく高かったことを示している（Ｙｅｎ  ＢＬ、Ｈｕａｎｇ  ＨＩ、Ｃｈｉｅｎ  ＣＣ、Ｊｕｉ  ＨＹ、Ｋｏ  ＢＳ、Ｙａｏ  Ｍ、Ｓｈｕｎ  ＣＴ、Ｙｅｎ  ＭＬ、Ｌｅｅ  ＭＣ、Ｃｈｅｎ  ＹＣ、ヒト満期胎盤からの多能性細胞の単離、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００５、２３（１）：３〜９；Ｍ．Ｊ．Ｓ．ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ−Ｓｗｉｎｇｓ、Ｆｒａｎｓ  Ｈ．Ｊ．Ｃｌａａｓ、Ｗｉｌｌｅｍ  Ｅ．ＦｉｂｂｅおよびＨｕｍｐｈｒｅｙ  Ｈ．Ｈ．Ｐｉｅｔｅｒｎｅｌｌａ  Ｓ．ｉｎ‘ｔ  Ａｎｋｅｒ、Ｓｉｃｃｏ  Ａ．Ｓｃｈｅｒｊｏｎ、Ｃａｒｉｎ  Ｋｌｅｉｊｂｕｒｇ−ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｅｕｒ、Ｇｏｄｅｌｉｅｖｅ、ヒトからの胎児起源または母体起源の間葉系幹細胞の胎盤分離、Ｓｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００４、２２：１３３８〜１３４５）。加えて、胎盤由来の接着性細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化することができる。ＢＭ由来のＭＳＣと同様に、胎盤由来のＭＳＣは、臍帯血（ＵＣＢ）のリンパ球増殖を抑制することが見出された。このことは、ＨＳＣおよび胎盤由来（ＰＤ）ＭＳＣの混合移植により、レシピエントにおける起こり得る移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が軽減され得ること［Ｌｉ  ＣＤｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、Ｊｕｌ：１５（７）：５３９〜４７（２００５）］、および、造血支持が強化され得ること［Ｚｈａｎｇ  Ｙｉｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１１７（６）：８８２〜８８７（２００４）］を示唆する。羊膜上皮細胞のための供給源としての胎盤の使用が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／７３４２１に教示されているが、これらの細胞を得ることは依然として労働集約的であり、ＭＳＣの収率が非常に低い。
【００１６】
ＭＳＣの制限された量という問題を解決するための別の方法は、これらの細胞を、種々の培養条件を使用してエクスビボ拡大培養することである［例えば、米国特許第６３２６１９８号、同第６０３０８３６号、同第６５５５３７４号、同第６３３５１９５号、同第６３３８９４２号］。しかしながら、そのような方法の欠点は、そのような方法が要求する、時間がかかる特異的な選択手法および単離手法において依然として残っており、このことが、これらの方法を費用のかかる気むずかしい方法にしている。
【００１７】
細胞の三次元（３Ｄ）培養は、収率においてより効果的であることがいくつかの研究で見出された［Ｍａ  Ｔｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ、１５：７１５〜２４（１９９９）；Ｙｕｂｉｎｇ  Ｘｉｅ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（５）：５８５〜５９８（２００１）］。ＭＳＣの天然環境を模倣する３Ｄ培養手法の使用は、これらの細胞を、ポリアクティブ発泡体を含有する灌流バイオリアクターに播種すること［Ｗｅｎｄｔ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、８４：２０５〜２１４（２００３）］、“ｔｕｂｕｌａｒ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  （ＰＬＬＡ）  ｐｏｒｏｕｓ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｉｎ  ａ  Ｒａｄｉａｌ−ｆｌｏｗ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ”［Ｋｉｔａｇａｗａｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９３（５）：９４７〜９５４（２００６）］、また、造血幹細胞の成長および拡大培養のためのプラグフローバイオリアクターに播種すること（米国特許第６９１１２０１号）に基づく。
【００１８】
間質細胞を付着させる三次元構造物が米国特許第６０２２７４３号において示唆され、また、海綿状コラーゲンがＨｏｓｓｅｉｎｋｈａｍｉ，Ｈｅｔ  ａｌ．［Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１（９−１０）：１４７６〜１４８８（２００５）］において３Ｄマトリックスとして示唆された。しかしながら、ＨＳＣ移植後のＨＳＣのインビボ生着を支持するためにこれらの条件で成長させたＭＳＣの使用は、これらのどの研究においても示唆されていない。同様に、特定の細胞タイプのための様々な条件（例えば、灌流条件）または様々な単離技術の時間のかかる最適化が必要であった。
【００１９】
ＭＳＣを培養するための３Ｄリアクターとしての灌流された出産後胎盤の使用が、米国特許第７０４５１４８号、ならびに、米国特許出願公開第２００２０１２３１４１号、同第２００３００３２１７９号および同第２００５０１１８７１号において示唆された。しかしながら、この手法は、胎盤が剥離された後の２４時間までに限定され、また、灌流を伴うので、細胞の大量成長および長期にわたるその維持が不可能である。
【００２０】
従って、上記の制限を有しない、細胞を拡大培養する新規な方法、ならびに、そのような方法によって作製される細胞および馴化培地の治療のための使用が必要であることが広く認められており、従って、そのような方法および使用は非常に有益であると考えられる。
【発明の概要】
【００２１】
本発明の１つの態様によれば、胎盤組織または脂肪組織からの接着性細胞を、細胞の拡大培養を支持する三次元培養条件のもとで培養することを含む、細胞を拡大培養する方法を提供する。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、胎盤組織または脂肪組織からの接着性細胞を、細胞の拡大培養を可能にする三次元培養条件において培養すること、および、拡大培養された接着性細胞の馴化培地を集め、それにより、馴化培地を製造することを含む、馴化培地を製造する方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の態様によれば、上記の方法に従って作製された細胞の集団を提供する。
【００２４】
本発明のさらに別の態様によれば、ＳＣＦ、ＩＬ−６およびＦｌｔ−３からなる群から選択される少なくとも１つの因子を、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって分泌されるよりも高いレベルで分泌する、胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞を含む細胞の単離された集団を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、Ｈ２Ａヒストンファミリー（Ｈ２ＡＦ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼＸ（ＡＬＤＨ  Ｘ）、真核生物翻訳伸長因子２（ＥＥＥＦ２）、レチクロカルビン３、ＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメイン（ＲＣＮ２）およびカルポニン１塩基性平滑筋（ＣＮＮ１）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を、２Ｄ培養で成長させられた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現されるよりも高いレベルで発現する、胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞を含む細胞の単離された集団を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる態様によれば、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｈ１（Ｈｎｒｐｈ１）、ＣＤ４４抗原イソ型２前駆体、３ホスホアデノシン５ホスホ硫酸シンターゼ２イソ型ａ（Ｐａｐｓｓ２）およびリボソームタンパク質Ｌ７ａ（ｒｐＬ７ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現されるよりも低い発現レベルで発現する、胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞を含む細胞の単離された集団を提供する。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞よりも高い免疫抑制活性を特徴とする、胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞を含む細胞の単離された集団を提供する。
【００２８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、免疫抑制活性はＴ細胞増殖の低下を含む。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、上記の方法に従って作製される細胞の集団を有効成分として含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、上記の方法に従って作製される馴化培地を有効成分として含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、上記による細胞の単離された集団を有効成分として含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、間質細胞移植の必要性のある対象において、それが有益である疾患を治療する方法であって、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織の接着性細胞の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、対象において幹細胞移植が有益である疾患を治療することを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、間質細胞移植の必要性のある対象において、それが有益である疾患を治療する方法であって、胎盤組織および脂肪組織からなる群から選択される組織に由来する接着性細胞の馴化培地の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、対象において幹細胞移植が有益である疾患を治療することを含む方法を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、免疫応答をその必要性のある対象において軽減する方法であって、当該方法が、請求項３、４、５、６または７に記載される細胞の単離された集団の治療効果的な量を対象に投与し、その結果、免疫応答を対象において軽減するようにすることを含む方法を提供する。
【００３５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、対象は細胞療法により治療される。
【００３６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、該方法はさらに、幹細胞を投与することを含む。
【００３７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、幹細胞は造血幹細胞を含む。
【００３８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞が馴化培地または接着性細胞と同時に投与される。
【００３９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞が、馴化培地または接着性細胞を投与した後で投与される。
【００４０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、接着性細胞が三次元培養から得られる。
【００４１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、接着性細胞が二次元培養から得られる。
【００４２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、疾患は、幹細胞欠乏、心臓疾患、パーキンソン病、癌、アルツハイマー病、脳卒中、火傷、組織の欠損、血液の喪失、貧血、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎、多発性硬化症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、神経変性障害、自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本甲状腺炎（ＨＴ）、グレーヴズ病、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【００４３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、三次元培養は３Ｄバイオリアクターを含む。
【００４４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、バイオリアクターが、栓流バイオリアクター、連続撹拌槽型バイオリアクターおよび定常床バイオリアクターからなる群から選択される。
【００４５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞培養を培養培地の連続流のもとで行う。
【００４６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、三次元培養は、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラス繊維、セラミック粒子、マトリゲル、細胞外マトリックス成分、コラーゲン、ポリＬ乳酸および不活性金属繊維からなる群から選択される接着性材料を含む。
【００４７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、培養を少なくとも３日間行う。
【００４８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、培養を少なくとも３日間行う。
【００４９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、培養を、接着性細胞が少なくとも６０％のコンフルエンスに達するまで行う。
【００５０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、疾患には、造血幹細胞の生着促進が有益である。
【００５１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、接着性細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９およびＣＤ１０５からなる群から選択される陽性のマーカー発現アレイを含む。
【００５２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、接着性細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ７９からなる群から選択される陰性のマーカー発現アレイを含む。
【００５３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、接着性細胞は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つの因子を、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織由来の接着性細胞によって分泌されるよりも高いレベルで分泌する。
【００５４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、接着性細胞は、Ｈ２Ａヒストンファミリー（Ｈ２ＡＦ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼＸ（ＡＬＤＨ  Ｘ）、真核生物翻訳伸長因子２（ＥＥＥＦ２）、レチクロカルビン３、ＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメイン（ＲＣＮ２）およびカルポニン１塩基性平滑筋（ＣＮＮ１）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織由来の接着性細胞によって分泌されるよりも高いレベルで発現する。
【００５５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、接着性細胞は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｈ１（Ｈｎｒｐｈ１）、ＣＤ４４抗原イソ型２前駆体、３ホスホアデノシン５ホスホ硫酸シンターゼ２イソ型ａ（Ｐａｐｓｓ２）およびリボソームタンパク質Ｌ７ａ（ｒｐＬ７ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織由来の接着性細胞によって発現されるよりも低い発現レベルで発現する。
【００５６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、接着性細胞または培地は、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞よりも大きい免疫抑制活性を特徴とする。
【００５７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、免疫抑制活性はＴ細胞増殖における低下を含む。
【００５８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞は、間質幹細胞表現型を有する細胞を含む。
【００５９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、間質幹細胞表現型はＴ細胞抑制活性を含む。
【００６０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、間質幹細胞表現型は造血幹細胞支持活性を含む。
【００６１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、上記で記載される細胞の集団は、移植のために特定される薬剤の製造のために用いられる。
【００６２】
本発明は、細胞を拡大培養するための新規の方法ならびにその方法によって作製される細胞および馴化培地の治療のための使用を提供することにより、現在知られている構成の欠点に成功裡に対処している。
【００６３】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
３  本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００６５】
【図１】図１ａ〜ｇは、３Ｄ担体を含有するバイオリアクターシステムにおいて作製される骨様微小環境を示す。図１ａ〜ｂは、天然骨（図１ａ）と、骨の微小環境を模倣する、接着性間質細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）を播種した７日後のＰｌｕｒｉＸ（商標）３Ｄ担体の構造（図１ｂ）との比較を示す電子顕微鏡写真である。図１ｃ〜ｆは、骨髄から作製される３Ｄ−ＡＳＣが播種されたＰｌｕｒｉＸ（商標）３Ｄマトリックスを播種後２０日で示す電子顕微鏡写真（図１ｃ〜ｄ、それぞれ１５０倍および２５０倍に拡大）および播種後４０日で示す電子顕微鏡写真（図１ｅ〜ｆ、それぞれ３５０倍および５００倍に拡大）である。図１ｇは、個々の部分を数字で定義したＰｌｕｒｉｘ３Ｄプラグフローバイオリアクターの略図である：培養培地リザーバー（１）、ガス混合物供給（２）、フィルター（３）、注入点（４）、３Ｄ担体が設置されるカラム（５）、流量モニター（６）、流量バルブ（６ａ）、分離用容器（７）、細胞成長分析計（８）、蠕動ポンプ（９）、サンプル採取点（１０）、溶存Ｏ２測定電極（１１）、ｐＨ測定電極（１２）、制御システム（１３）、新鮮な成長培地（１４）、使用後の成長培地（１５）。
【００６６】
【図２】図２は、バイオリアクターシステム内の３Ｄ成長条件で成長させた、胎盤由来の接着性間質細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）の異なる製造ロット（ロット５〜８）を示すグラフである。ＡＳＣ（２×１０６個）を１００００〜１５０００細胞／担体の密度でバイオリアクターに播種した。１２日間の培養の後、３Ｄ−ＡＳＣは１５００００〜２５００００細胞／担体の密度、すなわち、１５０個の担体を含有するバイオリアクターにおいて２２．５〜３７．５×１０６個に達した。
【００６７】
【図３】図３ａ〜ｂは、従来の２Ｄ培養条件で培養された胎盤細胞における膜マーカー（明紫色）に対して比較されたときの、胎盤由来の３Ｄ−ＡＳＣにおける発現した膜マーカー（暗紫色）の発現レベルにおける差を示す棒グラフである。接着性細胞をフラスコ（２Ｄ）において４〜６週間成長させ、または、ポリスチレン担体（３Ｄ）でバイオリアクターシステムにおいて２〜３週間成長させた。細胞をフラスコまたは担体のいずれかから集めた後、細胞をインキュベートし、ＭＳＣに特徴的な膜マーカー（図３ａ）または造血細胞に特徴的な膜マーカー（図３ｂ）を認識するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のパネルに結合させた。３Ｄ培養の接着性細胞において発現されるＭＳＣ膜マーカーと比較して、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ２９の膜マーカーについて示されるように、２Ｄ培養の細胞におけるＭＳＣ膜マーカーが著しく高く発現することに留意すべきである。特に、２Ｄ培養の細胞における８７％に対して、ＣＤ１０５は３Ｄ培養の細胞において５６％の発現を示した（図３ａ）。２Ｄおよび３Ｄ培養両者のＡＳＣは造血系の膜マーカーを何ら発現しなかった（図３ｂ）。
【００６８】
【図４ａ】図４ａは、２Ｄおよび３Ｄ条件のもとで培養された、胎盤から作製されるＡＳＣ、または、そのようなＡＳＣの馴化培地におけるタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４ａは、２Ｄおよび３Ｄ培養ＡＳＣの馴化培地においてＥＬＩＳＡによって分析されたときの、１×１０６細胞／ｍｌについて正規化された、Ｆｌｔ−３リガンドのレベル（図４ａ）をｐｇ／ｍｌ単位で示す。結果は３回の独立した実験のうちの１つを表す。
【図４ｂ】図４ｂは、２Ｄおよび３Ｄ条件のもとで培養された、胎盤から作製されるＡＳＣ、または、そのようなＡＳＣの馴化培地におけるタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４ｂは、２Ｄおよび３Ｄ培養ＡＳＣの馴化培地においてＥＬＩＳＡによって分析されたときの、１×１０６細胞／ｍｌについて正規化された、ＩＬ−６のレベル（図４ｂ）をｐｇ／ｍｌ単位で示す。結果は３回の独立した実験のうちの１つを表す。
【図４ｃ】図４ｃは、２Ｄおよび３Ｄ条件のもとで培養された、胎盤から作製されるＡＳＣ、または、そのようなＡＳＣの馴化培地におけるタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４ｃは、２Ｄおよび３Ｄ培養ＡＳＣの馴化培地においてＥＬＩＳＡによって分析されたときの、１×１０６細胞／ｍｌについて正規化された、ＳＣＦのレベル（図４ｃ）をｐｇ／ｍｌ単位で示す。結果は３回の独立した実験のうちの１つを表す。
【図４ｄ】図４ｄは、２Ｄおよび３Ｄ条件のもとで培養された、胎盤から作製されるＡＳＣ、または、そのようなＡＳＣの馴化培地におけるタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４ｄは、両者間で比較される、ｉＴＲＡＱ試薬により標識されたタンパク質サンプルを用いた質量分析法によって分析されたときの、種々の細胞タンパク質の発現レベルを示す。タンパク質サンプルを、２Ｄ条件下で成長させたＡＳＣ（白色棒）、および、３Ｄ条件下で成長させたＡＳＣ（灰色棒）から採取した。図は２つの反復実験の１つを表す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞および馴化培地でのいくつかのタンパク質の発現レベルにおける差に留意すべきである。
【００６９】
【図５】図５ａ〜ｄは、骨芽細胞への胎盤由来３Ｄ−ＡＳＣのインビトロ分化能を示す顕微鏡写真である。ヒトの胎盤由来ＡＳＣを、骨形成誘導培地（１０％のＦＣＳ、１００ｎＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１０ｍＭのＢ−グリセロリン酸を含有するＤＭＥＭ）で３週間の期間、培養した。図５ａ〜ｂは、アリザリンレッドＳ染色によって示されるように、石灰化したマトリックスを発現する細胞を示す。図５ｃ〜ｄは、骨形成誘導培地により処理されず、線維芽細胞様の表現型を維持したコントロール細胞を示し、石灰化を表していない。
【００７０】
【図６】図６は、移植後３．５週間で化学療法（連続した２週間にわたる２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンの腹腔内注入）により処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄（ＢＭ）において検出されるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。単核の臍帯血由来細胞から精製されたＣＤ３４＋細胞（１０００００個）だけを移植し（５匹のマウス、ａ）、または、２Ｄ条件で培養された０．５×１０６個の胎盤由来の接着性細胞（２Ｄ−ＡＳＣ）と同時移植し（２匹のマウス、ｂ）、または、ｐｌｕｒｉＸ（商標）バイオリアクターにおいて３Ｄ条件で培養された胎盤由来の接着性細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）と同時移植した（５匹のマウス、ｃ）。その後、ＢＭをマウスの大腿骨および脛骨から回収した。ＢＭにおけるヒト細胞をフローサイトメトリーによって検出した。ＣＤ４５を発現するヒト細胞の割合を、細胞を抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣとインキュベートすることによって求めた。ＨＳＣだけにより処置されたマウス（ａ）におけるヒト細胞の割合と比較して、２Ｄ−ＡＳＣが同時移植されたマウス（ｂ）、同様にまた、３Ｄ−ＡＳＣが同時移植されたマウス（ｃ）の骨髄におけるヒト細胞（ｈＣＤ４５＋）の割合がより高いことに留意すべきである。３Ｄ−ＡＳＣ培養細胞により処置されたマウスにおいて、２Ｄ−ＡＳＣ培養細胞により処置されたマウスと比較してより大きい生着が認められ、このことは、３Ｄ培養のＡＳＣに特有なより大きい治療上の利点を示している。
【００７１】
【図７】図７ａ〜ｂは、脂肪組織由来のＡＳＣが同時移植された場合のＣＤ３４＋細胞（図７ｂ）と比較した、ＣＤ３４＋細胞のみが移植されたマウス（図７ａ）におけるヒト移植片のＣＤ４５＋細胞のＦＡＣＳ分析である。ヒトＣＤ３４＋だけにより処置されたマウス（７ｂ、約１２％）と比較して、脂肪組織由来のＡＳＣが同時移植されたマウスにおけるヒト造血集団（ｈＣＤ４５＋）の割合が著しく高い（７ａ、約２９％）ことに留意すべきである。
【００７２】
【図８】図８は、ヒト臍帯血単核細胞（ＣＢ）と、等量の放射線照射（３０００Ｒａｄ）された臍帯血細胞（ｉＣＢ）、ヒト末梢血由来単球（ＰＢＭＣ）、２Ｄ培養（２Ｄ）もしくは３Ｄ培養（３Ｄ）の胎盤ＡＳＣ、または、ＰＢＭＣ、および２Ｄおよび３Ｄ培養の胎盤ＡＳＣの混合物（ＰＢＭＣ＋２ＤおよびＰＢＭＣ＋３Ｄ）との間で行われた混合リンパ球反応を示すグラフである。ＣＢ細胞集団のサイズが、培養の最後の１８時間の期間中に測定された（ＣＰＭ単位で測定される）３Ｈ−チミジン取り込みによって表される。刺激されたＣＢ細胞増殖が上昇するので、免疫応答のレベルがより大きくなる。接着性細胞とインキュベートされた細胞によって示される免疫応答レベルがより低くなること、および、特に、接着性細胞と同時インキュベートされたときにＰＢＭＣに対するＣＢ免疫応答が低下することに留意すべきである。３回の反復がそれぞれの反応について行われた。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、細胞を拡大培養するための新規の方法、ならびにその方法によって作製される細胞および馴化培地の、幹細胞に関連する治療、幹細胞生着、およびＨＳＣ支持のための使用の発明である。
【００７４】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００７５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００７６】
発展し続ける医療界では、幹細胞、より具体的には、間質幹細胞（「間葉系幹細胞」とも呼ばれる）の需要が臨床目的および研究目的のためにますます高まっている。ＭＳＣは、ＨＳＣ移植およびＨＳＣの生着を支持するために使用され、また、ますます多くの状態（例えば、心臓疾患、ＢＭ欠損、ニューロン関連疾患、および、臓器移植または組織移植を必要とする状態）を治療するためにも使用される。
【００７７】
幹細胞を使用する際の様々な障害は、これらの細胞の数がほとんどの組織において限られること、幹細胞を得るための手法に伴う不快さおよび危険性、ならびに、現在の回収手法による記憶Ｂ細胞および造血幹細胞の付随する喪失のために、幹細胞または始原体細胞の通常的に存在する集団を多量に単離することの技術的困難さにある。細胞をヒトの胚から得ることは、宗教的および倫理的な側面を既に存在する技術的困難さに加える。
【００７８】
骨髄由来の幹細胞のための代替供給源には、脂肪組織および胎盤が含まれる。しかしながら、現在、幹細胞をそのような組織から効率的に拡大培養するための方法がない。
【００７９】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、胎盤組織または脂肪組織からの接着性細胞が３Ｄ培養条件で効率的に増殖し得ることを発見している。驚くべきことに、本発明者らは、そのような細胞が、ＭＳＣの特性と類似する機能的特性を含み、従って、これらの細胞、および、これらの細胞から作製される馴化培地が、治療目的のために、例えば、移植、組織再生およびインビボＨＳＣ支持などのために使用できることを発見した。
【００８０】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、間質幹細胞の特性を３Ｄ環境において含む、脂肪および胎盤に由来する接着性細胞を拡大培養することができた。それに応じて拡大培養された細胞は、接着・再増殖アッセイによって立証されるように、冷凍保存後に生存可能であることが見出された（実施例１参照）。胎盤由来の接着性細胞のフローサイトメトリー分析では、異なったマーカー発現パターンが発見された（図３ａ〜ｂ参照）。最も重要なことではあるが、２Ｄまたは３Ｄ環境で増殖した脂肪由来の接着性細胞および胎盤由来の接着性細胞はＨＳＣの生着を支持することができた（実施例２を参照のこと）。このことは、間質幹細胞としての本発明の細胞の臨床での使用を実証する。
【００８１】
従って、本発明の１つの態様によれば、細胞を拡大培養する方法が提供される。
【００８２】
この方法は、胎盤組織または脂肪組織からの接着性細胞を、細胞の拡大培養を支持する三次元（３Ｄ）培養条件のもとで培養することを含む。
【００８３】
本明細書中で使用される用語「拡大培養する」および用語「拡大培養」は、細胞および究極的には細胞成長を実質的な無分化で維持すること、すなわち、細胞集団の増大（例えば、少なくとも２倍）であって、そのような増大に付随する分化がないことを示す。
【００８４】
本明細書中で使用される用語「維持する」および用語「維持」は、実質的な無分化での細胞再生、すなわち、実質的に定常的な細胞集団であって、そのような定常性に付随する分化がないことを示す。
【００８５】
本明細書中で使用される表現「接着性細胞」は、足場依存的で、すなわち、インビトロで成長するために表面への付着を必要とする細胞の均一集団または不均一集団を示す。
【００８６】
本明細書中で使用される表現「脂肪組織」は、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）を含む結合組織を示す。
【００８７】
本明細書中で使用される用語「胎盤組織」は、子宮壁の内側を覆い、妊娠期間中は胎児を包む、胎児が臍帯によって結び付けられる哺乳動物の雌性器官の任意の部分を示す。出産後、胎盤は排出される（これは分娩後胎盤と呼ばれる）。
【００８８】
本明細書中で使用される表現「三次元培養条件」は、細胞を、細胞成長との適合性を有し、一方で、細胞が２層以上で成長することを可能にする条件に配置することを示す。生きている生物（または組織）における細胞のインサイチュー環境は三次元構成であることが十分に理解される。細胞は他の細胞によって取り囲まれる。細胞は、様々な局所的微小環境の確立を可能にする、細胞外マトリックスのナノスケール繊維の複雑な網状組織において保持される。それらの細胞外リガンドは、基底膜への結合だけでなく、様々な血管およびリンパ管へのアクセスを媒介する。酸素、ホルモンおよび栄養分が細胞に運ばれ、老廃物が運び去られる。本発明の三次元培養条件は、下記でさらに例示されるように、そのような微小環境を模倣するように構成される。
【００８９】
従って、本発明のこの態様の接着性細胞は脂肪組織または胎盤組織から回収される。
【００９０】
胎盤の細胞を満期または早産の胎盤から得ることができる。胎盤は、好ましくは、胎盤が完全に放血されると集められる。胎盤は、好ましくは、残存する細胞を除くために十分な期間にわたって灌流される。本明細書中で使用される用語「灌流する」または用語「灌流」は、流体を器官または組織に浴びせるか、または通すという行為を示す。胎盤組織は任意の哺乳動物に由来し得る。最も好ましくは、胎盤組織はヒト由来である。胎盤組織の好ましい供給源は分娩後の胎盤（例えば、１〜６時間）に由来する。しかしながら、胎盤組織もしくは胎盤細胞の供給源、または、胎盤組織を単離する方法は本発明にとって重要でない。
【００９１】
胎盤由来の接着性細胞を胎盤の胎児部分（すなわち、羊膜または胎盤の内側部分、実施例１参照）および母体部分（すなわち、基底脱落膜および壁側脱落膜）の両方から得ることができる。組織試料は生理学的緩衝液［例えば、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）またはハンクス緩衝液］で洗浄される。単細胞懸濁物が、組織を消化酵素により処理すること（下記参照）、または／および、組織部分を細かく刻み、ナイロンフィルターに通すことによって、あるいは、洗浄媒体とともに穏やかなピペッティングすること（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって作製される。
【００９２】
脂肪組織由来の接着性細胞を、当業者に知られている様々な方法によって単離することができる。例えば、そのような方法が米国特許第６１５３４３２号に記載されている。脂肪組織は、大網／内臓部位、乳房部位、性腺部位または他の脂肪組織部位に由来し得る。脂肪組織の好ましい供給源は大網脂肪である。ヒトでは、脂肪は典型的には脂肪吸引によって単離される。
【００９３】
脂肪組織からの単離された接着性細胞は、組織を消化酵素（例えば、コラゲナーゼ、トリプシンおよび／またはジスパーゼなど）、および／または、効果的な濃度のヒアルロニダーゼもしくはＤＮＡｓｅ、および、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）により、２５℃〜５０℃の間での温度で１０分〜３時間にわたって処理することによって取り出すことができる。その後、細胞は２０ミクロン〜８００ミクロンの間のナイロンまたはチーズクロスのメッシュフィルターに通すことができる。その後、細胞は直接に媒体での分画遠心法に供されるか、あるいは、ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌまたは他の微粒子の勾配による分画遠心法に供される。細胞は１００〜３０００ｘｇの間での速度において１分〜１時間にわたって４〜５０℃の間の温度で遠心分離される（米国特許第７０７８２３０号参照）。
【００９４】
胎盤組織または脂肪組織に由来する接着性細胞に加えて、本発明ではまた、（本明細書中下記においてさらに記載されるように）間質幹細胞表現型によって特徴づけられる他の細胞供給源からの接着性細胞の使用が想定される。接着性細胞を回収することができる組織供給源には、臍帯血、毛嚢［例えば、米国特許出願第２００６０１７２３０４号に記載されるように］、精巣［例えば、Ｇｕａｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００６（４月２７日）、４４０（７０８８）：１１９９〜２０３に記載されるように］、ヒト嗅粘膜［例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，ＣＴ．ｅｔ  ａｌ．、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、２００６（Ｊｕｎ）、２１（６）：６３３〜４３に記載されるように］、胚性卵黄嚢［例えば、Ｇｅｉｊｓｅｎ  Ｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００４（１月８日）、４２７（６９７０）：１４８〜５４に記載されるように］および羊水［Ｐｉｅｔｅｒｎｅｌｌａｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２２：１３３８〜１３４５］が含まれるが、これらに限定されない。これらはすべて、間葉系幹細胞を含むことが知られている。これらの組織供給源からの接着性細胞は、細胞を接着性の表面で培養する。従って、接着性細胞を最初の集団における他の細胞から単離することによって単離することができる。
【００９５】
起源（例えば、胎盤組織または脂肪組織）にかかわらず、細胞の回収は、好ましくは、無菌条件下で行われる。単離された細胞が得られると、単離された細胞は、接着性細胞をそれにより単離するために接着性材料（例えば、表面として構成される接着性材料）に接着させることができる。これは、３Ｄ培養条件での培養の前に行うことができ（実施例１参照）、または、３Ｄ培養条件での培養と同時に行うことができる。
【００９６】
本明細書中で使用される「接着性材料」は、細胞を表面に保持することができる化学的構造（例えば、荷電を帯びた表面露出基）を有する細胞非毒性（すなわち、生物学的に適合した）材料の合成物、天然物、または、それらの組合せを示す。
【００９７】
本発明のこの態様に従って使用することができる接着性材料の例には、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラス繊維、セラミック粒子、マトリゲル、細胞外マトリックス成分（例えば、フィブロネクチン、コンドロネクチン、ラミニン）、コラーゲン、ポリＬ乳酸および不活性金属繊維が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
間質幹細胞についての精製または富化のさらなる工程を、この分野では広く知られている方法を使用して、（例えば、本明細書中下記にさらに記載するように、間質幹細胞マーカーの発現を使用するＦＡＣＳなどによって）行うことができる。
【００９９】
本発明に従って培養することにおいて有用な基礎培地の限定されない例には、培地１９９、ＣＭＲＬ１４１５、ＣＭＲＬ１９６９、ＣＭＲＬ１０６６、ＮＣＴＣ１３５、ＭＢ７５２６１、ＭＡＢ８７１３、ＤＭ１４５、ウイリアムズＧ、ノイマン＆タイテル、ヒグチ、ＭＣＤＢ３０１、ＭＣＤＢ２０２、ＭＣＤＢ５０１、ＭＣＤＢ４０１、ＭＣＤＢ４１１、ＭＣＤＢ１５３をはじめとして、数多くの中で、最少必須培地イーグル、ＡＤＣ−１、ＬＰＭ（ウシ血清アルブミン非含有）、Ｆ１０（ＨＡＭ）、Ｆ１２（ＨＡＭ）、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＧＪ培地（フィトン・ジャクソン改変を含む培地および含まない培地）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ、アール塩基礎の添加を伴う培地）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−血清非含有）、ヤマネ、ＩＭＥＭ−２０、グラスゴー改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）、ライボビッツＬ−１５培地、マッコイ５Ａ培地、培地Ｍ１９９（Ｍ１９９Ｅ、アール塩基礎を伴う）、培地Ｍ１９９（Ｍ１９９Ｈ、ハンクス塩基礎を伴う）、最少必須培地イーグル（ＭＥＭ−Ｅ、アール塩基礎を伴う）、最少必須培地イーグル（ＭＥＭ−Ｈ、ハンクス塩基礎を伴う）、および、最少必須培地イーグル（ＭＥＭ−ＮＡＡ、非必須アミノ酸を伴う）が含まれる。本発明において使用される好適な培地はＤＭＥＭである。これらの培地および他の有用な培地を、とりわけ、ＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．、米国）およびＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔ  ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）から入手することができる。これらの培地のいくつかが、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂ．ＪａｋｏｂｙおよびＩｒａ  Ｈ．Ｐａｓｔａｎによって編集され、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．によって発行されるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（第ＬＶＩＩＩ巻、“Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ“、６２頁〜７２頁）に要約される。
【０１００】
培地には、例えば、血清（例えば、ウシまたは他の種の胎児血清など）、ならびに、場合により、または、代替として、ピコグラム／ｍｌ〜ミリグラム／ｍｌの間の濃度での増殖因子、サイトカインおよびホルモン（例えば、成長ホルモン、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン７、マクロファージコロニー刺激因子、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子、オステオプロテゲリンリガンド、インスリン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来増殖因子および骨形態形成タンパク質）などを補充することができる。
【０１０１】
さらなる成分が培養培地に加えられ得ることがさらに認識される。そのような成分は、抗生物質、抗真菌剤、アルブミン、アミノ酸、および、細胞の培養のためにこの分野で知られている他の成分であり得る。加えて、様々な成分を、必要とされるときには分化プロセスを強化するために加えることができる（さらには下記参照）。
【０１０２】
接着性細胞が得られると、接着性細胞は三次元環境に継代培養することができる（下記の実施例の節の実施例１参照）。だが、当然のことながら、細胞は（上記で述べたように）単離後直ちに３Ｄ形態のマトリックスに移すことができる。
【０１０３】
従って、本発明のこの態様の接着性材料は３Ｄ培養のために構成され、それにより、間質細胞の接着のための利用可能な付着表面を実質的に増大させ、その結果、組織（例えば、胎盤）の構造基盤を模倣する成長マトリックスを提供する。
【０１０４】
例えば、高さが０．５ｍｍの成長マトリックスについては、増大が、成長マトリックスの基部への突出によって計算されたとき、少なくとも５〜３０倍である。約５〜３０倍のそのような増大は単位層についてであり、積み重ねられるか、または、スペーサーなどにより隔てられる場合であっても、多数のそのような層が使用されるならば、５〜３０倍の倍数がそれぞれのそのような構造体について適用される。マトリックスがシート形態（好ましくは、不織繊維シート、または、開口した細孔の発泡ポリマーのシート）で使用されるとき、シートの好ましい厚さは約５０μｍ〜１０００μｍまたはそれ以上であり、この場合、十分な多孔性が、細胞の進入、栄養分の進入のために、また、シートからの老廃物の除去のために提供される。好ましい実施形態によれば、細孔は１０μｍ〜１００μｍの有効直径を有する。そのようなシートは、様々な厚さの繊維から調製することができ、この場合、好ましい繊維厚さ範囲または繊維直径範囲は約０．５μｍ〜２０μｍであり、一層より好ましい繊維は直径が１０μｍ〜１５μｍの範囲にある。
【０１０５】
本発明の構造体は、寸法安定性および物理的強度を提供する多孔性の支持シートまたは支持スクリーンによって支持され得るか、あるいは、一層良好には、そのようなシートまたはスクリーンに結合される。
【０１０６】
そのようなマトリックスシートはまた、同じ程度の厚さ（約５０μｍ〜１０００μｍ）とともに、約０．２ｍｍ２〜約１０ｍｍ２の程度の突出領域を有する粒子を提供するために、切断、穴開けまたは断片化することができる。
【０１０７】
本発明を実施に移すために使用された成長マトリックスの製造、使用および／または利点に関するさらなる詳細が、米国特許第５１６８０８５号、および、特に、米国特許第５２６６４７６号に記載されている（これらはともに参考文献として本明細書中に組み込まれる）。
【０１０８】
接着性表面は、正方形、リング、円盤および十字形からなる群から選択される形状を有することができる。
【０１０９】
大規模製造のために、培養は好ましくは、３Ｄバイオリアクターにおいて行われる。
【０１１０】
そのようなバイオリアクターの例には、プラグフローバイオリアクター、連続撹拌槽型バイオリアクターおよび定常床バイオリアクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
実施例の節の実施例１において示されるように、三次元（３Ｄ）プラグフローバイオリアクター（米国特許第６９１１２０１号に記載されるようなバイオリアクター）は間質細胞の成長および長期間の維持を支持することができる。このバイオリアクターでは、間質細胞が、ポリエステルの不織布マトリックスから作製され、ガラスカラムに詰められ、それにより、大きな細胞数の増殖を比較的小さい体積で可能にするポロシブ（ｐｏｒｒｏｓｉｖｅ）担体に播種される。
【０１１２】
プラグフローバイオリアクターにおいて使用されるマトリックスは、シート形態、不織繊維シート、または、開口した細孔の発泡ポリマーのシートのものが可能であり、シートの好ましい厚さは約５０μｍ〜１０００μｍまたはそれ以上であり、この場合、十分な多孔性が、細胞の進入、栄養分の進入のために、また、シートからの老廃物の除去のために提供される。
【０１１３】
本発明とともに使用され得る他の３Ｄバイオリアクターには、下記のバイオリアクターが含まれるが、これらに限定されない：時定数定常状態をリアクター内で維持するために、培養培地がバイオリアクターに連続的に供給され、生成物が連続的に抜き取られる連続撹拌槽型バイオリアクター。繊維状床バスケットを有する撹拌槽型バイオリアクターを、例えば、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）から入手することができる。定常床バイオリアクター、エアーリフトバイオリアクター（このバイオリアクターでは、空気が、典型的には、中央通気管の底部に供給され、気泡を形成しながら上に流れ、排気ガスをカラムの上部から放出する）、ポリアクティブ発泡体を有する細胞播種灌流バイオリアクター［Ｗｅｎｄｔ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、８４：２０５〜２１４（２００３）に記載されるようなバイオリアクター］、ラジアルフロー灌流バイオリアクターにおける管状のポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）の多孔性足場［Ｋｉｔａｇａｗａｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９３（５）：９４７〜９５４（２００６）に記載されるようなバイオリアクター］。本発明に従って使用することができる他のバイオリアクターが、米国特許第６２７７１５１号、同第６１９７５７５号、同第６１３９５７８号、同第６１３２４６３号、同第５９０２７４１号および同第５６２９１８６号に記載される。
【０１１４】
細胞の播種が、好ましくは、播種時において１０００００〜１５０００００細胞／ｍｍで行われる。
【０１１５】
細胞は好ましくは、制御されない分化および老化を好ましくは避けながら、少なくとも約４０％、６０％または８０％のコンフルエンスに到達すると集められる。
【０１１６】
培養は、少なくとも約２日間、３日間、５日間、１０日間、２０日間、１ヶ月間またはそれ以上行われる。当然のことながら、バイオリアクターにおける培養はこの期間を長くし得る。継代培養もまた、細胞数を増大させるために行うことができる。
【０１１７】
本発明の接着性細胞は、好ましくは、少なくとも１つの「間質幹細胞表現型」を含む。
【０１１８】
本明細書中で使用される「間質幹細胞表現型」は、骨髄由来の間質幹細胞（すなわち、間葉系幹細胞）に典型的な構造的表現型または機能的表現型を示す。
【０１１９】
本明細書中で使用される表現「幹細胞」は、最終分化していない細胞を示す。
【０１２０】
従って、例えば、細胞は紡錘体形状を有することができる。代替として、または、加えて、細胞は、間質幹細胞に典型的な１つのマーカーまたは一連のマーカー（例えば、表面マーカー）を発現することができる。間質幹細胞表面マーカー（陽性および陰性）の例には、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ８０−、ＣＤ１９−、ＣＤ５−、ＣＤ２０−、ＣＤ１１Ｂ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ７９−、ＨＬＡ−ＤＲ−およびＦＭＣ７−が含まれるが、これらに限定されない。他の間質幹細胞マーカーには、チロシンヒドロキシナーゼ、ネスチンおよびＨ−ＮＦが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
間質幹細胞に典型的な機能的表現型の例には、Ｔ細胞抑制活性（これはＴ細胞を刺激せず、逆に、Ｔ細胞を抑制する）、造血幹細胞支持活性、ならびに、脂肪生成性分化、肝性分化、骨形成性分化および神経性分化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
これらの構造的特徴または機能的特徴はどれも、本発明の細胞を適格とするために使用することができる（下記の実施例の節の実施例１〜２参照）。
【０１２３】
本発明の教示に従って作製された細胞の集団は、実施例の節の実施例１において示されるような特異なタンパク質発現プロフィルを特徴とする。従って、例えば、発明の教示に従って作製された胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞は、高いレベルの選択された因子を発現および／または分泌することができる。例えば、そのような細胞は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、Ｈ２ＡＦまたはＡＬＤＨ  Ｘを、２Ｄ培養で成長させられた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるレベルよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、または、好ましくは１２倍大きく発現または分泌する。加えて、または、代替として、本発明の細胞の集団は、ＩＬ−６、ＥＥＥＦ２、ＲＣＮ２またはＣＮＮ１を、２Ｄ培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるレベルよりも少なくとも２倍、３倍または５倍大きいレベルで分泌または発現する。加えて、または、代替として、本発明の細胞の集団は、２Ｄ培養の細胞に対して比較されたとき、様々な他のタンパク質発現レベルがより低いことを特徴とする。従って、例えば、２Ｄ培養で成長させられた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるＨｎｒｐｈ１、ＣＤ４４抗原イソ型２前駆体、Ｐａｐｓｓ２またはｒｐＬ７ａの発現レベルの０．６、０．５、０．２５または０．１２５未満を分泌または発現する。
【０１２４】
本発明を実施にさらに移しているとき、本発明者らは、接着性の間質細胞が、具体的には、３Ｄ−ＡＳＣが、免疫抑制活性を示したことに気付いている。下記の実施例の節の実施例３において示されるように、接着性の間質細胞、具体的には、３Ｄ−ＡＳＣは、ヒト臍帯血単核細胞の免疫反応をＭＬＲアッセイにおいて抑制することが見出された。従って、本発明の細胞は、臨床において優先的に使用することができる生物学的活性（例えば、Ｔ細胞抑制活性、造血幹細胞支持活性）を含むことができる。
【０１２５】
本発明を実施にさらに移しているとき、本発明者らは、本発明の細胞の馴化培地が、臨床において優先的に使用することができる生物学的活性（例えば、Ｔ細胞抑制活性、造血幹細胞支持活性）を含み得ることに気付いている。
【０１２６】
従って、本発明ではさらに、馴化培地を集めること、および、そのままでのその使用、あるいは、この分野では広く知られている方法を使用する、濃縮、富化または分画化のさらなる工程の後でのその使用が想定される。好ましくは、本発明の馴化培地は、細胞の高い生存性の中期対数期培養から得られる。
【０１２７】
本明細書中上記で述べたように、本発明の細胞および馴化培地は間質幹細胞表現型を特徴とし、そのようなものとして、そのような細胞の使用が有益である任意の研究および臨床適用において使用することができる。
【０１２８】
移植されたＨＳＣの生着および造血の開始は、内皮細胞バリアの両端におけるケモカインの勾配に従って、骨髄に向かい、適切な陥凹部に定着すること、一方で、移植された細胞、ＥＣＭおよび陥凹部の間葉系細胞の間での物理的接触を確立することを含む複雑なプロセスに依存する。これらすべてのプロセスにおいて、複雑な配列の分子、例えば、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子、細胞間相互作用タンパク質および接着タンパク質、ならびに、マトリックスタンパク質などが関わる。
【０１２９】
輸血されたＨＳＣのほんの１〜５％が移植後２〜３日でレシピエントのＢＭにおいて検出されるにすぎないことが知られている［Ｋｅｒｒｅｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７：３６９２〜８（２００１）；Ｊｅｔｍｏｒｅｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、９９：１５８５〜９３（２００２）］。
【０１３０】
造血生着に対するＭＳＣ寄与は、部分的には、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こすドナー由来Ｔ細胞が生じることを阻害することによってであり［Ｃｈａｒｂｏｒｄ  Ｐ．およびＭｏｏｒｅ，Ｋ．、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０４４：１５９〜１６７（２００５）；Ｍａｉｔｒａ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、３３（６）：５９７〜６０４（２００４）；米国特許第６０１０６９６号および同第６５５５３７４号］、また、部分的には、造血幹細胞（ＨＳＣ）の支持を提供すること（すなわち、造血幹細胞の増殖、成熟化および／またはホーミングを持続し、助けること）によってある。
【０１３１】
下記の実施例の節の実施例２において示されるように、胎盤組織および脂肪組織に由来する接着性細胞は、驚くべきことに、ＨＳＣの生着を化学療法の後でさえ支持し得ることが見出された。
【０１３２】
これらの結果を考慮すると、本発明の細胞または培地は、間質幹細胞移植が使用される任意の臨床的適用において使用され得ることが考えられ得る。
【０１３３】
従って、本発明の別の態様によれば、間質幹細胞移植が有益である医学的状態（例えば、病理、疾患、症候群）をその必要性のある対象において処置する方法を提供する。
【０１３４】
本明細書中で使用される用語「処置する」は、病理の発達を阻害もしくは停止すること、および／または、病理の軽減、寛解もしくは退行を引き起こすことを示す。当業者は、様々な方法論およびアッセイが、病理の発達を評価するために使用され得ること、また、同様に、様々な方法論およびアッセイが、病理の軽減、寛解もしくは退行を評価するために使用され得ることを理解する。好ましくは、用語「処置する」は、ガン性疾患に［関連する症状を緩和または軽減することを示す。好ましくは、処置することにより、医学的状態に関連する症状が治り、例えば、実質的に除かれる。
【０１３５】
本明細書中で使用される「間質幹細胞移植が有益である医学的状態」は、本発明の細胞／培地の投与によって緩和され得る任意の医学的状態を示す。
【０１３６】
「移植」、「細胞置換」または「移植する」の用語または表現は、本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を目標の組織に導入することを示す。
【０１３７】
本明細書中で使用される用語「対象」は任意の対象（例えば、哺乳動物）を示し、好ましくは、ヒト対象を示す。
【０１３８】
本発明のこの態様の方法は、（本明細書中上記で記載される）本発明の細胞または培地の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、間質幹細胞移植が有益である医学的状態を対象において処置することを含む。
【０１３９】
本発明のこの態様に従って投与することができる細胞には、二次元環境または三次元環境のいずれかで培養され得る上記の接着性細胞、ならびに、その接着性細胞の間葉系および非間葉系の部分的に分化した誘導体または最終分化した誘導体が含まれる。
【０１４０】
系列特異的な細胞を本発明の間質幹細胞から誘導する様々な方法がこの分野では広く知られている。例えば、米国特許第５４８６３５９号、同第５９４２２２５号、同第５７３６３９６号、同第５９０８７８４号および同第５９０２７４１号参照。
【０１４１】
細胞は未感作であるか、または、目的とする系列を誘導するように遺伝子操作され得る（米国特許出願公開第２００３０２１９４２３号参照）。
【０１４２】
細胞および培地は、新鮮な調製物または凍結（例えば、冷凍保存）された調製物の自己供給源または非自己供給源（すなわち、同種または異種）のものであり得る。
【０１４３】
医学的状態に依存して、対象には、さらなる化学的薬物（例えば、免疫調節、化学療法など）または細胞が投与され得る。
【０１４４】
従って、例えば、幹細胞の生着を改善すること（例えば、レシピエントのＢＭにおける生存可能なＨＳＣの数を増大させること、および、正常な白血球数を最適に改善すること）のために、本発明の細胞／培地を、ＨＳＣ移植の前に、または、ＨＳＣ移植と同時に、または、ＨＳＣ移植の後で投与することができる。
【０１４５】
好ましくは、ＨＳＣおよび間質細胞は、共通するＨＬＡ抗原を互いに有する。好ましくは、ＨＳＣおよび間質細胞は１人の個体に由来する。代替として、ＨＳＣおよび間質細胞は異なる個体に由来する。
【０１４６】
「移植」、「細胞置換」または「移植する」の用語または表現は本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を目標の組織に導入することを示す。細胞はレシピエントに由来し得るか、あるいは、同種ドナーまたは異種ドナーに由来し得る。
【０１４７】
非自己細胞は、身体に投与されたとき、免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの取り組みが、非自己細胞の拒絶の可能性を軽減するために開発されている。これらには、レシピエントの免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を、移植前に、免疫隔離する半透膜でカプセル化することのいずれかが含まれる。
【０１４８】
カプセル化技術は一般には、小さい球状賦形剤を伴うマイクロカプセル化）およびより大きいフラットシート膜および中空繊維膜を伴うマクロカプセル化に分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．”、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２０００、４２：２９〜６４）。
【０１４９】
マイクロカプセルを調製する様々な方法がこの分野では知られており、これらには、例えば、Ｌｕ  ＭＺｅｔ  ａｌ．  “Ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−  ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）．“、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０００、７０：４７９〜８３）、Ｃｈａｎｇ  ＴＭおよびＰｒａｋａｓｈ  Ｓ”Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．“、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１、１７：２４９〜６０）、および、Ｌｕ  ＭＺｅｔ  ａｌ．”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）．”、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、２０００、１７：２４５〜５１）によって開示される方法が含まれる。
【０１５０】
例えば、マイクロカプセルが、修飾コラーゲンを、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー外皮により複合体化し、これにより、２〜５μｍのカプセル厚さを生じさせることによって調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電の滑らかな表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、２〜５μｍのさらなるターポリマー外皮によりカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ“、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００２、２３：８４９〜５６）。
【０１５１】
他のマイクロカプセルはアルギン酸塩（海洋多糖類）（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ、“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．“、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００３、５：６６５〜８）またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、塩化カルシウムの存在下における、ポリカチオンのポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩との、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムの間での多電解質複合体化によって調製することができる。
【０１５２】
細胞のカプセル化は、より小さいカプセルが使用されるときには改善されることが理解される。従って、カプセルサイズが１ｍｍ〜４００μｍに減少したとき、カプセル化細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が改善された（Ｃａｎａｐｌｅ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｉｚｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．“、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ、２００２、１３：７８３〜９６）。そのうえ、７ｎｍもの小さい十分に制御された細孔サイズ、目的に合わせて調節された表面化学および精密な微小構造を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾良く免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ、”Ｓｍａｌｌ  ｉｓ  ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ．”、Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、１０：６〜９；Ｄｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．、“Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．“、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００２、２：６３３〜４６）。
【０１５３】
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、エタネルセプト、ＴＮＦ．アルファ．遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的製剤、および、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて、細胞または培地はそれ自体で投与することができ、または、好ましくは、医薬的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物の一部として投与することができる。
【０１５５】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される化学的コンジュゲートの１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、医薬的に好適な担体および賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、対象に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１５６】
以降、用語「医薬的に許容され得る担体」は、対象に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しない担体または希釈剤を示す。担体の非限定的な例には、プロピレングリコール、生理食塩水、エマルジョンおよび有機溶媒と水の混合物がある。
【０１５７】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１５８】
本発明の好ましい実施形態によれば、医薬用担体は塩類の水溶液である。
【０１５９】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【０１６０】
医薬組成物を（本明細書中上記に詳述されるように）全身的な方法で投与することができる。あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０１６１】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１６２】
本発明に従って使用するための医薬組成物は活性な化合物を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む一つ以上の医薬的に許容され得る担体を使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。
【０１６３】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る、緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩水緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１６４】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロでアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。好ましくは、用量は所望の濃度または滴定量を得るために動物モデルにおいて配合される。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１６５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、決定されることができる。
【０１６６】
これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌ他、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。例えば、パーキンソン病の患者は、処置に対する肯定反応を示す改善された運動機能について症候的に監視されることができる。
【０１６７】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る、緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩水緩衝液など）において配合することができる。
【０１６８】
投薬量および投薬間隔は、移植された細胞による神経伝達物質の合成を効果的に制御するために十分である有効成分のレベルまで個々に調節することができる。所望の効果を達成するために必要な投薬量は、個体の特徴、および、投与経路に依存する。検出アッセイを、血漿中濃度を決定するために使用することができる。
【０１６９】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回投与であることも複数回投与であることも可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１７０】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。投薬量および投与のタイミングは、個々に変化する状態の慎重かつ継続的な監視に対応する。例えば、処置されているパーキンソン病の患者は、監視している徴候に基づいて、疾患の症状を緩和するのに十分な量の細胞を投与されるだろう。
【０１７１】
移植の後、本発明の細胞は好ましくは、治療効果が観察されるように、疾患領域においてある期間（例えば、少なくとも６ヶ月）にわたって生存する。
【０１７２】
適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、適応される状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０１７３】
本発明の組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴うことがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。
【実施例】
【０１７４】
下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１７５】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ他著；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９６）；なおこれらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７６】
実施例１
骨髄、胎盤組織および脂肪組織からの接着性間質細胞（ＡＳＣ）の作製および培養
接着性細胞を、３Ｄ担体を含有するバイオリアクターにおいて培養して、特異的な細胞マーカー発現プロフィルにより特徴づけられる３Ｄ−ＡＳＣ細胞を作製した。成長効率を細胞計数によって調べた。これらの細胞の分化能を、分化培地で培養することによって調べた。
【０１７７】
材料および実験手順
骨髄間質細胞−骨髄（ＢＭ）間質細胞を、開心術またはＢＭ生検を受ける血液学的に健康なドナーの吸引された胸骨骨髄から得た。骨髄吸引物をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で３倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）密度勾配遠心分離に供した。その後、骨髄単核細胞（１．０７７ｇｍ／ｃｍ３未満）を集め、ＨＢＳＳで３回洗浄し、成長培地［１０％のＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、１０−４Ｍのメルカプトエタノール（Ｍｅｒｃｋ、Ｗｈｉｔｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００ｕｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ；Ｂｅｉｔ  Ｈａ’Ｅｍｅｋ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｅｉｔ  Ｈａ’Ｅｍｅｋ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル）］に再懸濁した。個々のドナーからの細胞を、培養培地を毎週交換しながら、３７℃（５％ＣＯ２）で組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）において別々にインキュベートした。細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｂｅｉｔ  Ｈａ’Ｅｍｅｋ）を使用して３〜４日毎に剥がした。２〜４０回の継代培養の後、６０〜８０％のコンフルエンスに達したとき、細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。
【０１７８】
胎盤由来の間質細胞。満期出産胎盤の内側部分（Ｂｎｅｉ  Ｚｉｏｎメディカルセンター、Ｈａｉｆａ、イスラエル）を無菌条件下で切断し、ハンクス緩衝液により３回洗浄し、０．１％のコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ組織；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｅｗｉｓ、ＭＯ）とともに３７℃で３時間インキュベートした。その後、穏やかなピペッティングを使用して、懸濁された細胞を、１０％のＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００ｕｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）および２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭにより洗浄し、７５ｃｍ２フラスコに播種し、５％ＣＯ２を伴う加湿条件のもとで組織培養インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。その後、細胞をプラスチック表面に７２時間接着させ、その後、培地を３〜４日毎に交換した。６０〜８０％のコンフルエンスに達したとき（通常、１０〜１２日）、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。その後、培養細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。
【０１７９】
脂肪由来の間質細胞−間質細胞を脂肪吸引法のヒト脂肪組織から得た（Ｒａｍｂａｍ  Ｈａｉｆａ、イスラエル）。脂肪組織を等体積のＰＢＳにより徹底的に洗浄し、コラゲナーゼ（２０ｍｇ／ｍｌ）により３７℃で３０分間消化した。その後、細胞を、１０％のＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００ｕｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭにより洗浄し、１２００ｒｐｍにおいてＲＴで１０分間遠心分離し、溶解液（１：１０；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル、赤血球を除くために）により再懸濁し、遠心分離し、１０％のＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００ｕｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭにより再懸濁した。その後、洗浄された細胞を無菌の組織培養培地フラスコに３〜１０×１０７細胞／フラスコで播種した。翌日、細胞をＰＢＳにより洗浄して、残留ＲＢＣおよび死細胞を除いた。細胞を、５％ＣＯ２を伴う加湿条件のもとで組織培養インキュベーターにおいて３７℃で保った。培地を３〜４日毎に交換した。６０〜８０％のコンフルエンスで、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。２〜４０回の継代培養の後、６０〜８０％のコンフルエンスに達したとき、細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。
【０１８０】
ＰｌｕｒｉＸ（商標）プラグフローバイオリアクター−ＰｌｕｒｉＸ（商標）プラグフローバイオリアクター（Ｐｌｕｒｉｓｔｅｍ、Ｈａｉｆａ、イスラエル；図１ｇに例示されるようなもの；米国特許第６９１１２０１号もまた参照のこと）に、ポリエステルの不織布マトリックスから作製された１〜１００ｍｌの充填された３Ｄポロシブ担体（直径、４ｍｍ）を負荷した。これらの担体は大きい細胞数の増殖を比較的小さい体積において可能にする。ガラス器具はＰｌｕｒｉｓｔｅｍによって設計および製造された。バイオリアクターは３７℃のインキュベーターにおいて維持され、流量がバルブ（図１ｇにおける６ａ）および蠕動ポンプ（図１ｇにおける９）によって調節およびモニターされた。バイオリアクターは、細胞の連続した播種を可能にするサンプリングおよび注入点（図１ｇにおける４）を含有する。培養培地がリザーバー（図１ｇにおける１）からｐＨ６．７〜７．４で供給された。リザーバーには、空気／ＣＯ２／Ｏ２を異なる割合で含有するろ過されたガス混合物（図１ｇにおける２、３）が、バイオリアクターにおける細胞密度に依存して供給された。Ｏ２の割合は、モニター（図１ｇにおける６）によって求められるバイオリアクターの出口での溶存Ｏ２のレベルに合わせられた。ガス混合物がシリコーンチューブまたはディフューザー（Ｄｅｇａｎｉａ  Ｂｅｔ，Ｅｍｅｋ  Ｈａｙａｒｄｅｎ、イスラエル）を介してリザーバーに供給された。培養培地は、循環している非接着性細胞の捕集を可能にする分離用容器（図１ｇにおける７）に通された。培地の循環が蠕動ポンプ（図１ｇにおける９）によって得られた。バイオリアクターはさらに、さらなるサンプリング点（図１ｇにおける１０）、および、連続した培地交換のための容器を備えた。
【０１８１】
３Ｄ接着性間質細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）の作製−上記のように成長させた非コンフルエントな初代ヒト接着性２Ｄ細胞培養物をトリプシン処理し、洗浄し、１０％のＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００ｕｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）および２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭに再懸濁し、注入点を介して無菌のプラグフローバイオリアクター（図１ｇ参照）における３Ｄ担体に播種した（１０３〜１０５細胞／ｍｌ）。接種前に、バイオリアクターはＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル）で満たされ、オートクレーブ処理され（１２０℃、３０分）、１０％の熱不活化ウシ胎児血清およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００ｕｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）を含有するダルベッコ成長培地により洗浄された。流れが０．１〜５ｍｌ／分の速度で保たれた。播種プロセスでは、２〜４８時間にわたる循環の中断が伴い、それにより、細胞が担体に留まることを可能になった。バイオリアクターは、無菌の空気およびＣＯ２が必要に応じて供給されるインキュベーターを使用して、制御された温度（３７℃）およびｐＨ（ｐＨ＝６．７〜７．４）の条件のもとで保たれた。成長培地を週に２〜３回取り替えた。循環培地を、４時間毎〜７日毎に、新鮮なＤＭＥＭ培地により取り替えた。１×１０６〜１×１０７細胞／ｍｌの密度で（１２〜４０日の成長の後）、全培地体積をバイオリアクターから取り出し、バイオリアクターおよび担体をＰＢＳにより３〜５回洗浄した。その後、３Ｄ−ＡＳＣ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル；穏やかな撹拌とともに３〜１５分、１〜５回）により担体から剥離し、その後、ＤＭＥＭに再懸濁し、凍結保存した。
【０１８２】
３Ｄ−ＡＳＣの性状の生物学的アッセイ−凍結保存された３Ｄ−ＡＳＣ細胞を解凍し、計数した。細胞生存能の評価のために、２×１０５個の細胞を１５０ｃｍ２組織培養フラスコに播種し、その接着能および再増殖を播種後７日以内に評価した。その後、３Ｄ−ＡＳＣの膜マーカー表現型を、蛍光モノクローナル抗体フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０１８３】
フローサイトメトリーアッセイを使用する３Ｄ培養の接着性細胞および２Ｄ培養の接着性細胞の細胞膜マーカープロフィルの比較−２Ｄ培養および３Ｄフローシステム培養からの１０００００〜２０００００個の接着性細胞を５ｍｌのチューブにおいて０．１ｍｌの培養培地に懸濁し、下記ＭＡｂ、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ９０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ７３（Ｂａｃｔｌａｂ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｃｅａｓａｒｅａ、イスラエル）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１０５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ２９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｃｙ７−ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ４５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１９（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１４  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１１ｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）およびＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ３４（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）のそれぞれの飽和濃度と、または、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ  ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ）とインキュベートした（４℃、３０分、暗所）。インキュベート後、細胞を、１％の熱不活化ＦＣＳを含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５００μｌホルムアルデヒド（０．５％）に再懸濁し、ＦＣ−５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０１８４】
質量分析法による分析を使用する３Ｄ培養の接着性細胞および２Ｄ培養の接着性細胞のタンパク質プロフィルの比較−２Ｄ由来培養手法および３Ｄ由来培養手法のＡＳＣを上記のように胎盤から作製した。簡単に記載すると、２Ｄ培養物を、０．３〜０．７５×１０６個の細胞を、６０〜８０％のコンフルエンスに達するまで、加湿５％ＣＯ２雰囲気のもと、３７℃で、１７５ｃｍ２フラスコにおいて４日間培養することによって作製した。２〜１０×１０６細胞／ｍｌを、２０００個の担体を含有するバイオリアクターに播種し、１８日間培養することによって、３Ｄ培養物を作製した。回収後、細胞を（３回）洗浄して、全血清を除き、ペレット化し、凍結した。タンパク質を製造者のプロトコルに従ってペレットから単離した［Ｔｒｉ試薬キット（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、米国）を使用し、トリプシンにより消化し、ｉＴＲＡＱ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により標識した］。簡単に記載すると、ｉＴＲＡＱ試薬は、非ポリマーの、等重核のタグ化試薬である。それぞれのサンプルに含まれるペプチドが、それらのＮ末端および／またはリシン側鎖を介して４つの等重核の同位体コードタグのうちの１つにより標識される。４つの標識されたサンプルが混合され、ペプチドが質量分析法により分析される。ペプチドがフラグメント化されたとき、それぞれのタグが、異なった質量レポーターイオンを放出する。従って、４つのレポーターの比率により、サンプルにおける所与ペプチドの相対的な存在量が与えられる（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／００１１３３７９．ｐｄｆにおける情報）。
【０１８５】
胎盤由来ＡＳＣの２Ｄ培養対３Ｄ培養のプロテオミックス分析を、ＱＴＯＦ−ＰｒｅｍｉｅｒでのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を使用してＳｍｏｌｅｒプロテオミックセンター（Ｂｉｏｌｏｇｙ部門、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）において行い、同定および分析をｎｒデータベースのヒト部分に対してＰｅｐ−Ｍｉｎｅｒソフトウエア［Ｂｅｅｒ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４、９５０〜６０（２００４）］によって行った。分析されたタンパク質は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｈ１（Ｈｎｒｐｈ１、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００５５１１）、Ｈ２Ａヒストンファミリー（Ｈ２ＡＦ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３４５６６．１）、真核生物翻訳伸長因子２（ＥＥＥＦ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３１９３３．１）、レチクロカルビン３、ＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメイン（ＲＣＮ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０６５７０１）、ＣＤ４４抗原イソ型２前駆体（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１００１３８９）、カルポニン１塩基性平滑筋（ＣＮＮ１、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１２９０）、３ホスホアデノシン５ホスホ硫酸シンターゼ２イソ型ａ（Ｐａｐｓｓ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００４６６１）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ｒｐＬ７ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００９６３）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼＸ（ＡＬＤＨ  Ｘ、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号Ｐ４７７３８）であった。すべての実験が２回行われた。分析の性質のために、すべてのタンパク質は、サンプルにおいて現れたペプチドの数に従って分析された（それぞれの分析において１つのタンパク質から２〜２０個のペプチドが出現した）。
【０１８６】
ＥＬＩＳＡを使用する３Ｄ培養の接着性細胞および２Ｄ培養の接着性細胞における分泌タンパク質の比較−胎盤から作製された２Ｄ由来培養手法および３Ｄ由来培養手法のＡＳＣを上記のように作製した（３Ｄ培養物は２４日の期間にわたった）。その後、馴化培地を集め、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−６、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）について、３回の独立した実験で、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して分析した。結果を１×１０６細胞／ｍｌについて正規化した。
【０１８７】
骨芽細胞分化培地−細胞を、１０％のＦＣＳ、１００ｎＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１０ｍＭのＢ−グリセロリン酸が補充されたＤＭＥＭを含有する骨芽細胞分化培地で３週間の期間、培養することによって、骨形成性分化を評価した。石灰化したマトリックスがアリザリンレッドＳ染色によって示され、アルカリホスファターゼがアルカリホスファターゼアッセイキットによって検出された（すべての試薬がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｅｗｉｓ、ＭＯ）から得られた）。
【０１８８】
結果
ＰｌｕｒｉＸ（商標）バイオリアクターシステムは生理学的な類似する微小環境をもたらす。
接着性細胞のための効率的な培養条件を与えるために、生理学的に類似する微小環境（図１ａに示す）が、ＰｌｕｒｉＸ（商標）バイオリアクター（Ｐｌｕｒｉｓｔｅｍ、Ｈａｉｆａ、イスラエル；担体が図１ｇに例示され、播種前が図１ｂに示される）を使用して人工的に作製された。図１ｃ〜ｆに示されるように、播種後の２０日（図１ｃ〜ｄ、それぞれ１５０倍および２５０倍に拡大）および４０日（図１ｅ〜ｆ、それぞれ３５０倍および５００倍に拡大）において、骨髄から作製された３Ｄ−ＡＳＣ細胞が首尾良く培養され、３Ｄマトリックス上で拡大培養された。
【０１８９】
ＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステムで成長させた細胞は著しく拡大培養された。胎盤由来３Ｄ−ＡＳＣの種々の製造ロットをＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステムで成長させた。播種密度は１３３００細胞／担体であった（合計で２×１０６細胞）。播種後１４日で、細胞密度は１５倍になり、およそ２０００００細胞／担体に達し（図２）、すなわち、１５０個の担体のバイオリアクターにおいて３０×１０６個に達した。異なる実験において、細胞が１．５×１０４細胞／ｍｌの密度でバイオリアクターに播種され、播種後３０日で、担体は、５０倍を超える大きい細胞数、すなわち、およそ０．５×１０６細胞／担体または０．５×１０７細胞／ｍｌを含有した。成長カラムの様々なレベルでの担体上の細胞密度は一致していた。このことは、細胞への酸素および栄養分の均一な移動を示している。従って、この３Ｄ培養システムは、生着および成功した移植を支持するという目的のために十分な量に効率的に成長させることができる、高密度の間葉系細胞培養の成長および長期にわたる維持のための支持条件を提供することが判明した。
【０１９０】
３Ｄ−ＡＳＣは特異な膜マーカー特徴を示す。骨環境を模倣する３Ｄ培養手法によって行われたとき、可溶性分子の分泌プロフィルおよびタンパク質産生における違いを明確にするために、ＦＡＣＳ分析を行った。図３ａに示すように、細胞マーカーのＦＡＣＳ分析は、３Ｄ−ＡＳＣが、２Ｄ条件で成長させた接着性細胞とは異なるマーカー発現パターンを呈示することを示す。２Ｄ培養の細胞は、３Ｄ培養の細胞と比較して、陽性の膜マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ２９の膜マーカー）のレベルが著しく上昇した。例えば、ＣＤ１０５は、２Ｄ培養の細胞における８７％に対して、３Ｄ培養の細胞では５６％の発現を示した。２Ｄおよび３Ｄの両方の胎盤培養のＡＳＣは造血系の膜マーカーを何ら発現しなかった（図３ｂ）。
【０１９１】
３Ｄ−ＡＳＣは可溶性因子の特異なプロフィルを示す。造血陥凹部は、大量のサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子を産生するサポーター細胞を含む。２Ｄ培養のＡＳＣと、３Ｄ培養のＡＳＣとの違いをさらに明確にするために、２Ｄおよび３ＤのＡＳＣ培養物の馴化培地における４つの主要な造血系分泌タンパク質のプロフィルをＥＬＩＳＡによって行った。図４ａ〜ｃは、３Ｄ条件で成長させられた細胞が、より高いレベルのＦｌｔ−３リガンド（図４ａ）、ＩＬ−６０（図４ｂ）およびＳＣＦ（図４ｃ）を含む馴化培地をもたらし、一方、低いレベルのＩＬ−６、ゼロに近いレベルのＦｌｔ−３リガンドおよびＳＣＦが２Ｄ培養物の馴化培地において検出されたことを示す。トロンボポエチン（ＴＰＯ）の産生は両方の培養物において非常に低く、等しかった。
【０１９２】
３Ｄ−ＡＳＣは特異なタンパク質プロフィルを質量分析法による分析において示す。２Ｄ培養のＡＳＣと、３Ｄ培養のＡＳＣとの違いをさらに明確にするために、これらの細胞のタンパク質プロフィルを質量分析法によって分析した。図４ｄは、２Ｄ培養のＡＳＣおよび３Ｄ培養のＡＳＣが顕著に異なるタンパク質発現プロフィルを示すことを示す。下記の表１に示されるように、３Ｄ培養の細胞では、Ｈ２ＡＦおよびＡＬＤＨ  Ｘの発現レベルがはるかにより大きいこと（それぞれ、９倍超および１２倍超）、また、ＥＥＥＦ２、ＲＣＮ２およびＣＮＮ１のタンパク質のレベルがより大きいこと（それぞれ、約３倍、２．５倍および２倍）が示される。加えて、３Ｄ培養の細胞では、Ｈｎｒｐｈ１およびＣＤ４４抗原イソ型２前駆体のタンパク質の発現レベルが約１／２であり、Ｐａｐｓｓ２およびｒｐＬ７ａの発現レベルが約１／３であることが示される。
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【０１９３】
３Ｄ−ＡＳＣは、骨芽細胞に分化する能力を有する。−３Ｄ−ＡＳＣをさらに特徴づけるために、細胞を骨芽細胞分化培地で３週間の期間、培養した。その後、カルシウム沈殿を行った。分化した細胞は、カルシウム（これは図５ａ〜ｂにおいて赤色に示される）を産生することが示され、これに対して、コントロール細胞は線維芽細胞様の表現型を維持し、石灰化を示さなかった（図５ｃ〜ｄ）。これらの結果は、胎盤由来の３Ｄ−ＡＳＣが、骨芽細胞にインビトロで分化する能力を有することを示す。
【０１９４】
実施例２
ＨＳＣの生着を改善する胎盤由来の３Ｄ−ＡＳＣの能力の評価
３Ｄ−ＡＳＣがＨＳＣ生着を支持することを、亜致死量の放射線が照射された免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス、または、化学療法により前処理された免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて検出されるヒト造血細胞（ｈＣＤ４５＋）のレベルによって評価した。
【０１９５】
材料および実験手順
ＣＤ３４＋細胞の単離−臍帯血サンプルを出産時に無菌条件下で採取し（Ｂｎｅｉ  Ｚｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）、単核細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  Ａｓ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）密度勾配遠心分離を使用して分画し、冷凍保存した。解凍した単核細胞を洗浄し、抗ＣＤ３４抗体とインキュベートし、ｍｉｄｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して単離した。２つ以上のサンプルからの細胞を、所望の数（５００００〜１０００００個の細胞）を達成するためにプールした。
【０１９６】
放射線照射マウスにおける移植細胞の検出−７週齢のオスおよびメスのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ−ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ；Ｈａｒｌａｎ／Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔ．、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を無菌の開放系ケージにおいて維持し、無菌の餌およびオートクレーブ処理の酸性水が与えられた。マウスには、亜致死量の放射線（３５０ｃＧｙ）が照射され、その後（放射線照射後４８時間で）、５００００〜１０００００個のｈＣＤ３４＋細胞が、胎盤組織または脂肪組織に由来するさらなるＡＳＣ（０．５×１０６個〜１×１０６個）とともに、または、伴うことなく（それぞれの群において３〜７匹のマウス）、側尾静脈への静脈内注入によって移植された。移植後４〜６週間で、マウスを脱臼によって屠殺し、ＢＭを、大腿骨および脛骨の両方をＦＡＣＳ緩衝液（５０ｍｌのＰＢＳ、５ｍｌのＦＢＳ、０．５ｍｌの５％アジ化ナトリウム）により洗い流すことによって集めた。マウスＢＭにおけるヒト細胞をフローサイトメトリーによって検出し、処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるヒトおよびマウスのＣＤ４５造血細胞マーカー発現細胞の割合を、細胞を抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ＩＱ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）とインキュベートすることによって求めた。明確なヒト生着についての最低の閾値が０．５％で示された。
【０１９７】
化学療法により処置されたマウスにおける移植細胞の検出−６．５週齢のオスのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＪｈｋｉＨｓｄ−ｓｃｉｄ；Ｈａｒｌａｎ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を、放射線照射マウスについて本明細書中上記で記載されたように維持し、ブスルファンを腹腔内注射した（２５ｍｇ／ｋｇ、２日間連続）。２回目のブスルファン注射の２日後、マウスには、ＣＤ３４＋細胞が単独で、または、胎盤から作製された０．５×１０６個のＡＳＣと一緒に注入された。移植後３．５週間で、マウスを屠殺し、ヒト造血細胞の存在を、放射線照射マウスについて本明細書中上記で記載されたように求めた。
【０１９８】
結果
３Ｄ−ＡＳＣは放射線照射マウスにおいてＨＳＣの生着を改善した−ヒトＣＤ３４＋造血細胞と、胎盤組織または脂肪組織に由来する３Ｄ−ＡＳＣとを、放射線照射されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに同時移植した。生着効率を同時移植後４週間で評価し、ＨＳＣが単独で移植されたマウスと比較した。表２および図６に示すように、３Ｄ−ＡＳＣおよびＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の同時移植は、ＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞だけにより処置されたマウスと比較したとき、レシピエントマウスのＢＭにおける相当高い生着率およびより高いレベルのヒト細胞をもたらした。
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【０１９９】
３Ｄ−ＡＳＣは、化学療法により処置されたマウスにおいてＨＳＣの生着を改善した−ヒトＣＤ３４＋造血細胞を、化学療法により前処置されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、胎盤に由来する５０００００個の２Ｄ−ＡＳＣまたは３Ｄ−ＡＳＣとともに同時移植した。生着効率を同時移植後３．５週間で評価し、ＨＳＣだけが移植されたマウスと比較した。表３に示すように、ＡＳＣ細胞およびＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の同時移植は、ＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の単独と比較したとき、レシピエントマウスのＢＭにおいてより高い生着レベルをもたらした。そのうえ、表３に示すように、生着の平均レベルが、ＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステムで成長させた胎盤由来の接着性細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）が同時移植されたマウスの方が、従来の静的な２Ｄ培養条件（フラスコ）で成長させた、同じドナーからの細胞によるマウス同時移植の場合よりも大きかった。
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【０２００】
図７ａ〜ｂに示すＦＡＣＳ分析結果により、ＡＳＣをｈＨＳＣと同時移植することの利点（図７ｂ）、および、ＡＳＣはＨＳＣ移植後の造血系の回復を改善することができることが明らかになる。
【０２０１】
まとめると、これらの結果は、ＡＳＣが、ＨＳＣ移植（自家または同種）の後の造血回復を改善するための支持細胞として役立ち得ることを示す。ＨＳＣ移植後の造血幹細胞および／または前駆体細胞の生着を高める３Ｄ−ＡＳＣの能力は、移植された細胞のホーミング能、自己再生能および増殖能を改善し得るＨＳＣ支持サイトカインを分泌する３Ｄ−ＡＳＣの能力から生じ得るか、または、移植可能なＨＳＣのホーミングおよび増殖のために必要とされる損傷した造血微小環境を再建するそのような細胞の能力から生じ得る。
【０２０２】
実施例３
２Ｄ培養のＡＳＣおよび３Ｄ培養のＡＳＣによるリンパ球応答の抑制
接着性細胞、具体的には、３Ｄ−ＡＳＣは、ヒト臍帯血単核細胞の免疫反応をＭＬＲアッセイにおいて抑制することが見出された。
【０２０３】
材料および実験手順
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ−胎盤から作製された、２Ｄ由来培養手法のＡＳＣおよび３Ｄ由来培養手法のＡＳＣの免疫抑制特性および免疫特権特性を、応答（増殖性）細胞および刺激（非増殖性）細胞の混合培養における不適合リンパ球の増殖率によって行われるような、ＨＬＡ座における組織適合性を測定するＭＬＲアッセイによって求めた。ヒト臍帯血（ＣＢ）単核細胞（２×１０５個）を応答細胞として使用し、等量（１０５個）の放射線照射（３０００Ｒａｄ）されたヒト末梢血由来単球（ＰＢＭＣ）と、あるいは、胎盤から作製された２Ｄ培養もしくは３Ｄ培養の接着性細胞、または、接着性細胞およびＰＢＭＣの組合せと同時培養することによって刺激した。それぞれのアッセイを３回繰り返した。細胞を９６ウエルプレートにおいてＲＰＭＩ１６４０培地（２０％のＦＢＳを含有する）で（加湿５％ＣＯ２雰囲気のもと、３７℃で）４日間にわたって同時培養した。プレートを、培養の最後の１８時間、１μＣの３Ｈ−チミジンによりパルス処理した。その後、細胞をガラス繊維フィルター上に集め、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンターにより定量した。
【０２０４】
結果
図８は、ＰＢＭＣにより刺激されたとき、これらの細胞の増殖の高まりによって表されるようなＣＢ細胞の免疫応答を示す。これは、理論によって拘束されることはないが、おそらくは、ＨＬＡ不適合性に対する応答におけるＴ細胞の増殖に関連する。しかしながら、相当低いレベルの免疫応答が、本発明の接着性細胞とインキュベートされたとき、これらの細胞によって示された。そのうえ、ＰＢＭＣに対するＣＢの免疫応答が、これらの接着性細胞と同時インキュベートされたとき、実質的に減少した。従って、ＭＳＣに類似した様式で、ＡＳＣは、ＧｖＨＤに典型的なドナー細胞のＴ細胞増殖を減少させる潜在的能力を有することが見出された。両方の培養物（２Ｄおよび３Ｄ）はリンパ球の免疫応答を減少させたが、また、本明細書中上記で記載される３Ｄ−ＡＳＣの他の利点と一致して、３Ｄ  ＡＳＣはより免疫抑制的である。
【０２０５】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２０６】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図５】
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【図７】
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