(57)【要約】      （修正有）【課題】放射性標識されたｅｘｅｎｄｉｎ誘導体の製造方法の提供。【解決手段】式(１)の分子プローブ前駆体を、リジン又はリジン誘導体を標識可能な標識化合物を用いて標識するポリペプチドの製造方法。Y1-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2(１)、Y1は(２)のＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、Xaa12はリジン又はリジン誘導体を示し、Xaa27は側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示し、Y2はＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示す。His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp(２)Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(３)【選択図】図５
2014076949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性標識されたポリペプチドを製造する方法であって、
分子プローブ前駆体を、リジン又はリジン誘導体のアミノ基を標識可能な標識化合物を用いて標識することを含み、
前記分子プローブ前駆体は、式(１)のアミノ酸配列で表され、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド化されている、ポリペプチドの製造方法。
Y1-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (１)   （配列番号１）
前記式(１)において、
Y1は、式(２)で表されるアミノ酸配列、又は式(２)で表されるアミノ酸配列においてＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp   (２)   （配列番号２）
Xaa12は、リジン又はリジン誘導体を示し、
Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示し、
Y2は、式(３)で表されるアミノ酸配列、又は式(３)で表されるアミノ酸配列においてＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示す。
Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser   (３)   （配列番号３）
【請求項２】
前記標識化合物は、式（I）で表される化合物である、請求項１記載の製造方法。
【化１】
2014076949.tif 000019
式（I）において、Ａｒは、芳香族炭化水素基又は芳香族複素環基を示し、Ｒ1は、放射性核種を含む置換基を示し、Ｒ2は、水素原子、又は、Ｒ1とは異なる１又は複数の置換基を示し、Ｒ3は、結合手、Ｃ1−Ｃ6アルキレン基及びＣ1−Ｃ6オキシアルキレン基のいずれかを示す。
【請求項３】
前記式(１)において、Xaa27は、アルギニン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるいずれかを示す、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記分子プローブ前駆体は、式(４)又は(５)のアミノ酸配列で表される、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (４)   （配列番号４）
Asp-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (５)   （配列番号５）
前記式(４)及び(５)において、Xaa12は、リジン又はリジン誘導体を示し、Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示す。
【請求項５】
式(６)のアミノ酸配列で表されるポリペプチドであって、
Y1-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (６)   （配列番号６）
該ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基はアミド化されている、ポリペプチド。
前記式(６)において、
Y1は、式(２)で表されるアミノ酸配列、又は式(２)で表されるアミノ酸配列においてＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp   (２)   （配列番号２）
Xbb12は、放射性標識されたリジン又はリジン誘導体を示し、
Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示し、
Y2は、式(３)で表されるアミノ酸配列、又は式(３)で表されるアミノ酸配列においてＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示す。
Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser   (３)   （配列番号３）
【請求項６】
前記ポリペプチドは、式(７)又は(８)のアミノ酸配列で表される、請求項５に記載のポリペプチド。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (７)   （配列番号７）
Asp-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (８)   （配列番号８）
前記式(７)及び(８)において、Xbb12は、放射性標識されたリジン又はリジン誘導体を示し、Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示す。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の製造方法により得られる、請求項５又は６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載の製造方法に用いる分子プローブ前駆体であって、
式(１)のアミノ酸配列で表され、
Y1-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (１)   （配列番号１）
該分子プローブ前駆体のＣ末端のカルボキシル基はアミド化されている、分子プローブ前駆体。
前記式(１)において、
Y1は、式(２)で表されるアミノ酸配列、又は式(２)で表されるアミノ酸配列においてＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp   (２)   （配列番号２）
Xaa12は、リジン又はリジン誘導体を示し、
Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示し、
Y2は、式(３)で表されるアミノ酸配列、又は式(３)で表されるアミノ酸配列においてＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示す。
Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser   (３)   （配列番号３）
【請求項９】
請求項５から７のいずれかに記載のポリペプチド、又は請求項８記載の分子プローブ前駆体を含む、イメージング用組成物。
【請求項１０】
請求項５から７のいずれかに記載のポリペプチド、及び／又は請求項８記載の分子プローブ前駆体を含む、キット。
【請求項１１】
膵β細胞をイメージングするための方法であって、
請求項５から７のいずれかに記載のポリペプチドを投与された被検体から前記ポリペプチドの放射性シグナルを検出することを含む、イメージング方法。
【請求項１２】
前記検出されたシグナルを再構成処理して画像に変換し表示することを含む、請求項１１記載のイメージング方法。
【請求項１３】
請求項５から７のいずれかに記載のポリペプチドを投与された被検体から前記ポリペプチドの放射性シグナルを検出すること、及び、
検出したポリペプチドのシグナルから膵島量を算出することを含む、膵島量の測定方法。
【請求項１４】
算出した膵島量を提示することを含む、請求項１３記載の膵島量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性標識されたポリペプチドの製造方法、放射性標識されたポリペプチド、及び前記製造方法に用いる分子プローブ前駆体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本における２型糖尿病患者は２００７年度の統計で推定８８０万人を超え、年々増加し続けている。また、国際糖尿病連合（ＩＤＦ）によると、世界の糖尿病人口も同様に増加しており、２０１０年の時点で２億８５００万人、２０３０年には４億３５００万人に増加すると予測されている。
【０００３】
このため、この対策として耐糖能検査を基準とした糖尿病発症前の介入が行われているが、充分な成果が得られていない。その原因として、耐糖能検査で機能異常が明らかとなる境界型の段階では膵島の障害はすでに高度に進行しており、介入開始時期としては遅い可能性がある。
【０００４】
近年、国内外において、２型糖尿病においても発症時にすでに膵島量が減少していることが報告され、また、発症後の膵β細胞のさらなる減少が２型糖尿病の治療抵抗性の一つと考えられている。このため、膵島量及び/又は膵β細胞量を検知することができれば、２型糖尿病や１型糖尿病の病因解明、超早期の診断、及び、発症を予防することができる可能性がある。このため、これらを測定可能とする分子プローブの研究開発が行われている。
【０００５】
分子プローブの設計において、β細胞に特異的な機能性タンパク質を中心に、膵島細胞における様々な標的分子が検討されている。中でも、標的分子として、膵β細胞に分布し、かつ、７回膜貫通型のＧ−タンパク質共役受容体であるＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）が検討されている。
【０００６】
ＧＬＰ−１Ｒを標的分子とするイメージング用分子プローブとして、標識化分子がＣ末端に結合したＧＬＰ−１のペプチド誘導体、Ｅｘｅｎｄｉｎ−３のペプチド誘導体及びＥｘｅｎｄｉｎ−４のペプチド誘導体が検討されている（例えば、特許文献１、非特許文献１及び２）。また、その他には、ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）の誘導体が提案されている（例えば、特許文献２、非特許文献２及び３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５１１５５７号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１０／０３２５０９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】M. Gotthardt et al. A new technique for in vivo imaging of specific GLP-1 binding sites: First results in small rodents, Regulatory Peptides 137 (2006) 162-267
【非特許文献２】M. Beche et al. Are radiolabeled GLP-1 receptor antagonists useful for scintigraphy? 2009 SNM Annual Meeting, abstract, Oral Presentations No.327
【非特許文献３】H. Kimura et al. Development of in vivo imaging agents targeting glucagons-like peptide-1 receptor (GLP-1R) in pancreatic islets. 2009 SNM Annual Meeting, abstract, Oral Presentations No.326
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１には、標識前駆体として標識部位以外のアミノ基に保護基を結合させたｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）誘導体を準備し、それを標識化及び脱保護して分子プローブを得る方法が開示されている。しかしながら、この場合、標識後の脱保護が必須となることから標識後の手順が煩雑となり、また標識化から目的の分子プローブを得るまでに時間を要することから、得られる分子プローブの放射化学的純度及び放射化学的収率が低下する可能性がある。
【００１０】
一方、標識部位以外のアミノ基に保護基を結合させることなくｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）をそのまま使用して放射性標識を行うことが試みられている。しかしながら、この場合、目的の標識部位を特異的に標識することは困難であった。さらには第１９番目のリジンが優先的に標識されることから、第４番目のリジン又はＮ末端のα−アミノ基が標識された分子プローブを得ることが困難であることが本発明者等の検討の結果、明らかとなった。また、本発明者等の検討の結果、ｅｘｅｎｄｉｎ−４についても同様の結果が得られている。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、目的の標識部位が放射性標識されたｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）誘導体及びｅｘｅｎｄｉｎ−４誘導体を高収率で製造できる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、放射性標識されたポリペプチドを製造する方法であって、分子プローブ前駆体を、リジン又はリジン誘導体のアミノ基を標識可能な標識化合物を用いて標識することを含み、前記分子プローブ前駆体は、式(１)のアミノ酸配列で表され、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド化されているポリペプチドの製造方法に関する。
Y1-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (１)   （配列番号１）
前記式(１)において、
Y1は、式(２)で表されるアミノ酸配列、又は式(２)で表されるアミノ酸配列においてＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp   (２)   （配列番号２）
Xaa12は、リジン又はリジン誘導体を示し、
Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示し、
Y2は、式(３)で表されるアミノ酸配列、又は式(３)で表されるアミノ酸配列においてＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示す。
Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser   (３)   （配列番号３）
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、目的の標識部位が放射性標識されたｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）誘導体及びｅｘｅｎｄｉｎ−４誘導体を高収率で製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１のポリペプチドを用いた体内分布実験の結果の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１のポリペプチドを用いた２次元イメージング解析の結果の一例を示す画像である。
【図３】図３は、実施例２のポリペプチドを用いた体内分布実験の結果の一例を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例２のポリペプチドを用いた２次元イメージング解析の結果の一例を示す画像である。
【図５】図５は、実施例３のポリペプチドを用いたＳＰＥＣＴ撮像の結果の一例を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、標識前駆体として式(１)のアミノ酸配列で表される分子プローブ前駆体を使用して標識を行うことにより、目的とする標識部位が特異的に放射性標識されたポリペプチドを高収率で製造できることができるという知見に基づく。また、本発明は、上記分子プローブ前駆体を使用することにより、十分な膵β細胞への親和性を示し、かつ膵島への集積を示す放射性標識されたポリペプチドを提供できるという知見に基づく。
【００１６】
すなわち、本発明は、
〔1〕 放射性標識されたポリペプチドを製造する方法であって、分子プローブ前駆体を、リジン又はリジン誘導体のアミノ基を標識可能な標識化合物を用いて標識することを含み、前記分子プローブ前駆体は、式(１)のアミノ酸配列で表され、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド化されているポリペプチドの製造方法、
Y1-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (１)   （配列番号１）
前記式(１)において、Y1は、式(２)で表されるアミノ酸配列、又は式(２)で表されるアミノ酸配列においてＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp   (２)   （配列番号２）
Xaa12は、リジン又はリジン誘導体を示し、Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示し、Y2は、式(３)で表されるアミノ酸配列、又は式(３)で表されるアミノ酸配列においてＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示す、
Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser   (３)   （配列番号３）;
〔2〕 前記標識化合物は、式（I）で表される化合物である〔1〕記載の製造方法、
【化１】
2014076949.tif 000003
式（I）において、Ａｒは、芳香族炭化水素基又は芳香族複素環基を示し、Ｒ1は、放射性核種を含む置換基を示し、Ｒ2は、水素原子、又は、Ｒ1とは異なる１又は複数の置換基を示し、Ｒ3は、結合手、Ｃ1−Ｃ6アルキレン基及びＣ1−Ｃ6オキシアルキレン基のいずれかを示す；
〔3〕 前記式(１)において、Xaa27は、アルギニン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、及びジアミノ酪酸からなる群から選択される〔1〕又は〔2〕に記載の製造方法；
〔4〕 前記分子プローブ前駆体は、式(４)又は(５)のアミノ酸配列で表される〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の製造方法、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (４)   （配列番号４）
Asp-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (５)   （配列番号５）；
前記式(４)及び(５)において、Xaa12は、リジン又はリジン誘導体を示し、Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示す；
〔5〕 式(６)のアミノ酸配列で表されるポリペプチドであって、
Y1-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (６)   （配列番号６）
該ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基はアミド化されているポリペプチド、
前記式(６)において、Y1は、式(２)で表されるアミノ酸配列、又は式(２)で表されるアミノ酸配列においてＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp   (２)   （配列番号２）
Xbb12は、放射性標識されたリジン又はリジン誘導体を示し、Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示し、Y2は、式(３)で表されるアミノ酸配列、又は式(３)で表されるアミノ酸配列においてＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示す、
Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser   (３)   （配列番号３）；
〔6〕前記ポリペプチドは、式(７)又は(８)のアミノ酸配列で表される〔5〕記載のポリペプチド、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (７)   （配列番号７）
Asp-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (８)   （配列番号８）
前記式(７)及び(８)において、Xbb12は、放射性標識されたリジン又はリジン誘導体を示し、Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示す；
〔7〕 〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の製造方法により得られる〔5〕又は〔6〕に記載のポリペプチド；
〔8〕 〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の製造方法に用いる分子プローブ前駆体であって、式(１)のアミノ酸配列で表され、
Y1-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (１)   （配列番号１）
該分子プローブ前駆体のＣ末端のカルボキシル基はアミド化されている、分子プローブ前駆体、
前記式(１)において、Y1は、式(２)で表されるアミノ酸配列、又は式(２)で表されるアミノ酸配列においてＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp   (２)   （配列番号２）
Xaa12は、リジン又はリジン誘導体を示し、Xaa27は、側鎖に前記標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示し、Y2は、式(３)で表されるアミノ酸配列、又は式(３)で表されるアミノ酸配列においてＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示す、
Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser   (３)   （配列番号３）
〔9〕 〔5〕から〔7〕のいずれかに記載のポリペプチド、又は〔5〕記載の分子プローブ前駆体を含むイメージング用組成物；
〔10〕 〔5〕から〔7〕のいずれかに記載のポリペプチド、及び／又は〔8〕記載の分子プローブ前駆体を含むキット；
〔11〕 膵β細胞をイメージングするための方法であって、〔5〕から〔7〕のいずれかに記載のポリペプチドを投与された被検体から前記ポリペプチドの放射性シグナルを検出することを含むイメージング方法；
〔12〕 前記検出されたシグナルを再構成処理して画像に変換し表示することを含む〔11〕記載のイメージング方法；
〔13〕 〔5〕から〔7〕のいずれかに記載のポリペプチドを投与された被検体から前記ポリペプチドの放射性シグナルを検出すること、及び、検出したポリペプチドのシグナルから膵島量を算出することを含む膵島量の測定方法；
〔14〕 算出した膵島量を提示することを含む〔13〕記載の膵島量の測定方法；
に関する。
【００１７】
本発明によれば、目的の標識部位が特異的に放射性標識されたポリペプチドを高い標識収率で製造でき、また標識に要する時間を短縮できることから、イメージングに有用な分子プローブを低い製造コストで効率よく提供できるという効果を好ましくは奏しうる。また、本発明の製造方法により得られる放射性標識されたポリペプチドは、例えば、膵β細胞に特異的に集積し、血液クリアランスに優れるため、２型糖尿病や１型糖尿病といった疾患の病因解明、超早期の診断、及び／又は発症の予防を可能にしうるという効果を奏しうる。
【００１８】
［放射性標識されたポリペプチドの製造方法］
本発明の放射性標識されたポリペプチドの製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）は、分子プローブ前駆体を標識化合物を用いて標識することを含む。
【００１９】
〔分子プローブ前駆体〕
本発明の製造方法に用いる分子プローブ前駆体（以下、「本発明の分子プローブ前駆体」ともいう）は、式(１)のアミノ酸配列で表され、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド化されている。
Y1-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (１)   （配列番号１）
【００２０】
式(１)において、Xaa27は、側鎖に標識化合物が反応する官能基を有さない塩基性アミノ酸を示す。本明細書において「塩基性アミノ酸」とは、塩基性側鎖を有するアミノ酸のことをいう。標識化合物は、リジン又はリジン誘導体のアミノ基を標識可能な化合物であって、例えば、後述する標識化合物であり、好ましくは式(I)で表される化合物、より好ましくは[18F]N-succinimidyl 4-fluorobenzoate([18F]SFB)、及び[123/124/125/131I]N-succinimidyl 3-iodobenzoate([123/124/125/131I]SIB)である。Xaa27としては、例えば、標識化合物による標識を行う条件下において、[18F]SFB及び/又は[123/124/125/131I]SIBと反応する官能基を側鎖に有さない塩基性アミノ酸が好ましく、より好ましくは[18F]SFB及び/又は[123/124/125/131I]SIBと反応するアミノ基を有さない塩基性アミノ酸である。Xaa27は、例えば、側鎖にグアニジル基を有する塩基性アミノ酸が好ましい。Xaa27は、天然アミノ酸であってもよいし、非天然アミノ酸であってもよい。Xaa27としては、例えば、アルギニン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、及びヒスチジン等が挙げられ、好ましくはアルギニン、ノルアルギニン、及びホモアルギニンである。
【００２１】
式(１)において、Xaa12は、リジン又はリジン誘導体を示す。本明細書において「リジン誘導体」としては、例えば、側鎖にリンカーが結合したリジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、及びジアミノ酪酸、並びに側鎖にリンカーが結合したこれらのアミノ酸等が挙げられ、好ましくは側鎖のアミノ基にリンカーが結合したリジンである。リンカーは、例えば、鎖状構造とアミノ基とを少なくとも含むことが好ましい。鎖状構造としては、例えば、アルキル鎖、及びポリエチレングリコール鎖等が挙げられる。リンカーとしては、より好ましくは式(II)で表される基である。Xaa12は、中でも、リジン、又は側鎖のアミノ基に式(II)で表される基が結合したリジンが好ましい。
【００２２】
【化２】
2014076949.tif 000004
【００２３】
式(II)において、ｌは、メチレン基の個数を示し、ｍは、オキシエチレン基の個数を示す。ｌは、例えば、０〜８の整数であり、好ましくは０〜５の整数、より好ましくは０〜３の整数、さらに好ましくは０又は１である。ｍは、例えば、０〜１４の整数であり、好ましくは０〜１２の整数、より好ましくは２〜８の整数、さらに好ましくは３、４、５、６、７、又は８である。
【００２４】
Y1は、式(２)で表されるアミノ酸配列、又は式(２)で表されるアミノ酸配列においてＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、中でも、式(２)で表されるアミノ酸配列、又はAspが好ましく、膵臓への集積及び血液クリアランスが高い放射性標識されたポリペプチドを得られうる点からは、式(２)で表されるアミノ酸配列がより好ましく、製造コストの点からは、Aspであることがより好ましい。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp   (２)   （配列番号２）
【００２５】
Y2は、式(３)で表されるアミノ酸配列、又は式(３)で表されるアミノ酸配列においてＣ末端側から１〜９個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を示し、好ましくは式(３)で表されるアミノ酸配列を示す。
Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser   (３)   （配列番号３）
【００２６】
分子プローブ前駆体は、式(４)又は(５)のアミノ酸配列で表されることが好ましく、膵臓への集積及び血液クリアランスが高い放射性標識されたポリペプチドを得られうる点からは、式(４)で表されるアミノ酸配列がより好ましく、製造コストの点からは、式(５)で表されるアミノ酸配列がより好ましい。式(４)及び(５)において、Xaa12及びXaa27は、上記のとおりである。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (４)   （配列番号４）
Asp-Leu-Ser-Xaa12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (５)   （配列番号５）
【００２７】
分子プローブ前駆体のＮ末端のα−アミノ基は、保護基により保護されていてもよいし、電荷を有さない修飾基により修飾されていてもよく、また非修飾であってもよい。Ｎ末端のα−アミノ基の正電荷を打ち消して放射性標識されたポリペプチドの腎臓への集積を抑制する点、より選択的な標識化を可能にする点、標識処理後の操作をより簡略化して製造時間を短縮する点からは、Ｎ末端のα−アミノ基は、電荷を有さない修飾基により修飾されていてもよい。
【００２８】
電荷を有さない修飾基としては、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、２，２，２-トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、４−メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）、アミノ基、３から２０個の炭素のアルキル基、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル基、キサンチル基（Ｘａｎ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル基（Ｍｔｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル基（Ｍｂｈ）、トシル基（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル基（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル基（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ基（ＢｚｌＯ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル基（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル基（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル基（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル基（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ基（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル基（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ基（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、アセチル基（Ａｃ）、トリフルオロアセチル基（ＴＦＡ）ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、２−クロロベンジル（Ｃｌ−ｚ）基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、イソプロピル基、ピバリル基、テトラヒドロピラン−２−イル基、トリメチルシリル基等が挙げられる。中でも、修飾基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシメチル基、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、２−クロロベンジル基、２，６−ジクロロベンジル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、イソプロピル基、ピバリル基、テトラヒドロピラン−２−イル基、トシル基、トリメチルシリル基、又はトリチル基が好ましく、より好ましくはアセチル基である。
【００２９】
保護基は、標識化する間に、分子プローブ前駆体のＮ末端のα−アミノ基を保護するものであって、そのような機能を果たしうる公知の保護基を使用できる。保護基としては、特に制限されず、例えば、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、Ｔｒｏｃ、Ａｌｌｏｃ、Ｍｍｔ、アミノ基、３から２０個の炭素のアルキル基、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｘａｎ、Ｔｒｔ、Ｍｔｔ、Ｍｔｒ、Ｍｔｓ、Ｍｂｈ、Ｔｏｓ、Ｐｍｃ、ＭｅＢｚｌ、ＭｅＯＢｚｌ、ＢｚｌＯ、Ｂｚｌ、Ｂｚ、Ｎｐｙｓ、Ｄｄｅ、２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ、２−Ｃｌ−Ｚ、２−Ｂｒ−Ｚ、Ｂｏｍ、ｃＨｘＯ、Ｂｕｍ、ｔＢｕＯ、ｔＢｕ、Ａｃ及びＴＦＡなどが挙げられ、取扱いの点から、Ｆｍｏｃ又はＢｏｃが好ましい。
【００３０】
本発明の分子プローブ前駆体は、式(１)、(４)又は(５)で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと相同性を有し、かつ標識後膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒに結合可能なポリペプチドを含み得る。該ポリペプチドと相同性を有するポリペプチドとしては、式(１)、(４)又は(５)で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから、１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチド、及び、該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドを含みうる。
【００３１】
本発明の分子プローブ前駆体の形態としては、例えば、溶液、粉末等が挙げられ、取扱いの点からは、粉末が好ましく、より好ましくは凍結乾燥された粉末（凍結乾燥製剤）である。
【００３２】
本発明の分子プローブ前駆体は、例えば、例えば、Ｆｍｏｃ法等の定法に従ったペプチド合成により製造することができ、ペプチドの合成方法は特に制限されない。
【００３３】
〔標識化合物〕
標識化合物は、リジン又はリジン誘導体のアミノ基を標識可能な標識化合物であって、例えば、放射性核種を有し、リジン又はリジン誘導体のアミノ基に反応して放射性標識基を導入可能なものであればよく、好ましくはリジン又はリジン誘導体の側鎖のアミノ基に反応してそのアミノ基に放射性標識基を結合させるものである。本発明の製造方法によれば、上記分子プローブ前駆体を使用するため、Xaa12のリジン又はリジン誘導体を特異的に標識することができる。
【００３４】
放射性核種としては、例えば、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、18Ｆ、64Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、77Ｂｒ、82Ｒｂ、99mＴｃ、111Ｉｎ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、及び186Ｒｅが挙げられる。ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）を行う観点からは、放射性核種は、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、18Ｆ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、68Ｇａ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82Ｒｂ、及び124Ｉなどのポジトロン放出核種が好ましい。シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を行う観点からは、放射性核種は、67Ｇａ、99mＴｃ、77Ｂｒ、111Ｉｎ、123Ｉ、及び125Ｉなどのγ線放出核種が好ましく、より好ましくは77Ｂｒ、99mＴｃ、111Ｉｎ、123Ｉ又は125Ｉである。これらの中でも、18Ｆ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、77Ｂｒ、123Ｉ、及び124Ｉなどの放射性ハロゲン核種がより好ましく、特に好ましくは18Ｆ、123Ｉ、又は124Ｉである。
【００３５】
標識化合物は、膵臓への集積及び血液クリアランスが高い放射性標識されたポリペプチドを得られうる点から、式(III)で表される基を有することが好ましく、より好ましくは式(III)で表される基がエステル結合を介してスクシンイミドと結合したスクシンイミジルエステル化合物であり、さらに好ましくは式(I)で表される化合物である。
【００３６】
【化３】
2014076949.tif 000005
【００３７】
式(I)及び(III)において、Ａｒは、芳香族炭化水素基又は芳香族複素環基を示す。芳香族炭化水素基は、炭素数６〜１８の芳香族炭化水素基が好ましく、例えば、フェニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、２，４−キシリル基、ｐ−クメニル基、メシチル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アンスリル基、２−アンスリル基、９−アンスリル基、１−フェナンスリル基、９−フェナンスリル基、１−アセナフチル基、２−アズレニル基、１−ピレニル基、２−トリフェニレニル基、ｏ−ビフェニリル基、ｍ−ビフェニリル基、ｐ−ビフェニリル基、ターフェニル基等が挙げられる。芳香族複素環基は、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１又は２個有し、かつ、５〜１０員の複素環基が好ましく、例えば、トリアゾリル基、３−オキサジアゾリル基、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、１−ピローリル基、２−ピローリル基、３−ピローリル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピラジル基、２−オキサゾリル基、３−イソオキサゾリル基、２−チアゾリル基、３−イソチアゾリル基、２−イミダゾリル基、３−ピラゾリル基、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基、８−キノリル基、１−イソキノリル基、２−キノキサリニル基、２−ベンゾフリル基、２−ベンゾチエニル基、Ｎ−インドリル基、及びＮ−カルバゾリル基等が挙げられる。これらの中でも、Ａｒは、フェニル基、トリアゾリル基、又はピリジル基が好ましく、フェニル基がより好ましい。
【００３８】
式(I)及び(III)において、Ｒ1は、放射性核種を含む置換基を示し、例えば、放射性核種、放射性核種により置換されたＣ1−Ｃ3アルキル基、及び放射性核種により置換されたＣ1−Ｃ3アルコキシ基等が挙げられる。放射性核種としては、上述のものが挙げられるが、中でも放射性ハロゲン核種が好ましい。
【００３９】
本明細書において「Ｃ1−Ｃ3アルキル基」とは、１〜３個の炭素原子を有するアルキル基をいい、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。本明細書において「放射性核種により置換されたＣ1−Ｃ3アルキル基」とは、１〜３個の炭素原子を有し、かつ、水素原子が放射性核種によって置換されたアルキル基をいう。本明細書において「Ｃ1−Ｃ3アルコキシ基」とは、１〜３個の炭素原子を有するアルコキシ基をいい、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられる。本明細書において「放射性核種により置換されたＣ1−Ｃ3アルコキシ基」とは、１〜３個の炭素原子を有し、かつ、水素原子が放射性核種によって置換されたアルコキシ基をいう。
【００４０】
Ｒ1は、例えば、18Ｆ、75/76/77Ｂｒ、又は123/124/125/131Ｉを含む置換基が好ましい。ＰＥＴを行う観点からは、Ｒ1は、18Ｆ、75Ｂｒ、76Ｂｒ又は124Ｉを含む置換基が好ましい。ＳＰＥＣＴを行う観点からは、Ｒ1は、77Ｂｒ、123Ｉ又は125Ｉを含む置換基が好ましい。なお、本明細書において、「75/76/77Ｂｒ」は、75Ｂｒ、76Ｂｒ又は77Ｂｒを意味し、「123/124/125/131Ｉ」は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、又は131Ｉを意味する。
【００４１】
式(I)及び(III)において、Ｒ2は、水素原子若しくはＲ1とは異なる１又は複数の置換基を示す。Ｒ2は、水素原子であっても、置換基であってもよいが、水素原子であることが好ましい。つまり、式(I)又は(III)において、Ａｒは、Ｒ1以外の置換基で置換されていないことが好ましい。Ｒ2が複数の置換基である場合、それらは、同一であっても良いし、異なっていてもよい。置換基としては、例えば、水酸基、電子求引性基、電子供与性基、Ｃ1−Ｃ6アルキル基、Ｃ2−Ｃ6アルケニル基、Ｃ2−Ｃ6アルキニル基等が挙げられる。電子求引性基としては、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子、カルボニル基、スルホニル基、アセチル基、スルホニル基、フェニル基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。本明細書において「Ｃ1−Ｃ6アルキル基」とは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基をいい、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基が挙げられる。本明細書において「Ｃ2−Ｃ6アルケニル基」とは、２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基をいい、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基が挙げられる。本明細書において「Ｃ2−Ｃ6アルキニル基」とは、２〜６個の炭素原子を有するアルキニル基をいい、例えば、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、及び３−ブチニル基が挙げられる。これらの中でも、置換基は、水酸基、又は電子求引性基が好ましい。
【００４２】
Ｒ3は、結合手、１〜６個の炭素原子を有するアルキレン基又は１〜６個の炭素原子を有するオキシアルキレン基を示すことが好ましい。１〜６個の炭素原子を有するアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチル基、ヘキシル基等の直鎖状又は分岐状のアルキレン基が挙げられる。１〜６個の炭素原子を有するオキシアルキレン基としては、例えば、オキシメチレン基、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブチレン基、及びオキシペンチル基等が挙げられる。Ｒ3としては、膵臓への集積及び血液クリアランスが高い放射性標識されたポリペプチドを得られうる点から、結合手、メチレン基、又はエチレン基が好ましく、より好ましくは結合手である。また、Ｒ1が18Ｆを含む置換基、好ましくは18Ｆである場合、Ｒ3は結合手であることが好ましい。Ｒ1が123/124/125/131Ｉを含む置換基、好ましくは123/124/125/131Ｉである場合、Ｒ3はメチレン基、エチレン基、又は結合手が好ましく、より好ましくは結合手である。
【００４３】
放射性化合物は、中でも、式(Ia)で表される化合物が好ましい。式(Ia)において、Ｒ1は、Ｒ3に対してオルト位、パラ位、及びメタ位のいずれに位置していてもよい。Ｒ1が18Ｆである場合、Ｒ1はＲ3に対してパラ位（４位）に位置することが好ましく、Ｒ1が123/124/125/131Ｉである場合、Ｒ1はＲ3に対してメタ位（３位又は５位）に位置することが好ましい。放射性化合物は、より好ましくは式(Ib)で表される化合物（[18F]N-succinimidyl 4-fluorobenzoate）、式(Ic)で表される化合物（[123/124/125/131I]N-succinimidyl 3-iodobenzoate）及び式(Id)で表される化合物であり、膵臓への集積及び血液クリアランスが高い放射性標識されたポリペプチドを得られうる点からは、式(Ic)で表される化合物及び式(Id)で表される化合物がさらに好ましく、汎用性の点からは、式(Id)で表される化合物がさらに好ましい。
【００４４】
【化４】
2014076949.tif 000006
【００４５】
標識化合物を用いた標識は公知の方法により行うことができるが、例えば、分子プローブ前駆体を含む溶液に標識化合物を添加し、ついでｐＨを所定のｐＨに調整して反応させることにより行うことができる。
【００４６】
本発明の製造方法は、標識後のポリペプチドに結合する保護基を除去するために放射性標識されたポリペプチドを脱保護することを含んでいてもよい。脱保護は、保護基の種類に応じた公知の方法で行うことができる。
【００４７】
本発明の製造方法は、純度の高い放射性標識されたポリペプチドを製造する点からは、標識後のポリペプチドを精製する工程をさらに含んでいてもよい。精製は、例えば、ペプチド又はタンパク質を精製するための公知の分離操作を用いて行うことができる。分離操作としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が挙げられ、必要に応じてこれらを組み合わせて行ってもよい。
【００４８】
本発明の製造方法は、標識化合物を合成する工程、及び／又は分子プローブ前駆体を合成する工程を含んでいてもよい。この場合、標識化合物の合成及び分子プローブ前駆体の標識と１つの自動合成装置によって行ってもよく、また、分子プローブ前駆体の合成、標識化合物の合成及び分子プローブ前駆体の標識と１つの自動合成装置によって行ってもよい。
【００４９】
［放射性標識されたポリペプチド］
本発明は、その他の態様として、式(６)のアミノ酸配列で表されるポリペプチドであって、該ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基はアミド化されているポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」ともいう）に関する。本発明のポリペプチドによれば、膵β細胞に特異的に集積し、血液クリアランスに優れる、イメージングに有用な分子プローブを提供できる。また、本発明のポリペプチドは、上述の本発明の製造方法により製造することができる。
Y1-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Y2   (６)   （配列番号６）
【００５０】
式(６)において、Y1、Xaa27、及びY2は、式(１)の通りである。
【００５１】
式(６)において、Xbb12は、放射性標識されたリジン又はリジン誘導体を示す。放射性標識されたリジンとしては、例えば、側鎖のアミノ基が放射性標識基と結合したリジンである。放射性標識基としては、後述のものが挙げられる。放射性標識されたリジン誘導体としては、例えば、放射性標識基を有するリンカーが側鎖に結合したリジン、放射性標識されたオルニチン、ジアミノプロピオン酸、及びジアミノ酪酸、並びに側鎖に放射性標識基を有するリンカーが結合したこれらのアミノ酸等が挙げられ、好ましくは側鎖のアミノ基に放射性標識基を有するリンカーが結合したリジンである。放射性標識基を有するリンカーは、例えば、鎖状構造と放射性標識基とを少なくとも含むことが好ましく、鎖状構造と放射性標識基とがアミノ基を介して結合しているものがより好ましい。鎖状構造としては、例えば、アルキル鎖、及びポリエチレングリコール鎖等が挙げられる。側鎖のアミノ基に放射性標識基を有するリンカーとしては、例えば、式(IV)で表される基が好ましい。Xbb12は、中でも、側鎖のアミノ基が放射性標識されたリジン、又は側鎖のアミノ基に式(IV)で表される基が結合したリジンが好ましい。
【００５２】
【化５】
2014076949.tif 000007
【００５３】
式(IV)において、ｌ及びｍは、式(II)の通りである。Ｚは、放射性標識基を示す。放射性標識基としては、公知の様々な標識基が使用でき、膵臓への集積及び血液クリアランスが高い放射性標識されたポリペプチドを得られうる点からは、式(V)で表される基が好ましく、より好ましくは式(Va)で表される基であり、さらに好ましくは式(Vb)、(Vc)又は(Vd)で表される基、さらにより好ましくは式(Vb)、又は(Vc)で表される基である。式(V)においてＡｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、式(I)の通りであり、式(Va)においてＲ1は、式(I)の通りである。
【００５４】
【化６】
2014076949.tif 000008
【００５５】
本発明のポリペプチドにおいて、放射性標識基は、金属放射性同位元素（放射性金属核種）で標識化する観点からは、放射性金属核種とその放射性金属核種をキレート可能なキレート部位とを含んでいてもよい。キレート部位を形成しうる化合物としては、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、dithisosemicarbazone（ＤＴＳ）、diaminedithiol（ＤＡＤＴ）、mercaptoacetylglycylglycylglycine（ＭＡＧ３）、monoamidemonoaminedithiol（ＭＡＭＡ）、diamidedithiol（ＤＡＤＳ）、及びpropylene diamine dioxime（ＰｎＡＯ）等が挙げられる。
【００５６】
本発明のポリペプチドのＮ末端のα−アミノ基は、非修飾であってもよいし、電荷を有さない修飾基により修飾されてもよい。電荷を有さない修飾基は、本発明の分子プローブ前駆体と同様である。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、式(７)又は(８)のアミノ酸配列で表されることが好ましく、膵臓への集積及び血液クリアランスが高い放射性標識されたポリペプチドを得られうる点からは、式(７)で表されるアミノ酸配列がより好ましく、製造コストの点からは、式(８)で表されるアミノ酸配列がより好ましい。式(７)及び(８)において、Xbb12及びXaa27は、上記のとおりである。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (７)   （配列番号７）
Asp-Leu-Ser-Xbb12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser      (８)   （配列番号８）
【００５８】
本発明のポリペプチドは、式(６)、(７)又は(８)で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと相同性を有し、かつ膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒに結合可能なポリペプチドを含み得る。該ポリペプチドと相同性を有するポリペプチドとしては、式(６)、(７)又は(８)で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから、１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチド、及び、該ポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドを含みうる。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、例えば、膵島イメージングに用いることができ、好ましくは膵β細胞のイメージング、より好ましくは膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒのイメージング用分子プローブに用いることができる。また、本発明のポリペプチドは、例えば、糖尿病の予防、治療又は診断のためのイメージングに用いられることができる。また、本発明のポリペプチドは、例えば、有効成分として本発明のポリペプチドを含む、上述する各種イメージングに用いる組成物、イメージング用試薬、造影剤、画像診断剤等として用いることができる。これらの組成物、画像診断剤等の取り得る形態としては、例えば、溶液、粉末等が挙げられ、放射性核種の半減期及び放射能減衰等を考慮すると、溶液が好ましく、注射液がより好ましい。
【００６０】
［イメージング用組成物］
本発明は、さらにその他の態様として、本発明のポリペプチド、又は本発明の分子プローブ前駆体を含むイメージング用組成物に関する。イメージング用組成物の形態は、例えば、溶液、粉末等が挙げられる。本発明のイメージング用組成物が本発明のポリペプチドを含む場合、放射性核種の半減期及び放射能減衰等を考慮すると、その形態は、溶液が好ましく、注射液がより好ましい。本発明のイメージング用組成物が本発明の分子プローブ前駆体を含む場合、取扱いの点からは、その形態は、粉末が好ましく、より好ましくは凍結乾燥された粉末（凍結乾燥製剤）である。
【００６１】
本発明のイメージング用組成物は、担体等の医薬品添加物を含んでいてもよい。本明細書において医薬品添加物は、日本薬局方、アメリカ薬局方及び／又はヨーロッパ薬局方等で医薬品添加物として許認可を受けている化合物をいう。担体としては、例えば、水性溶媒及び非水性溶媒が使用できる。水性溶媒としては、例えば、リン酸カリウム緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、及び蒸留水等が挙げられる。非水性溶媒としては、例えば、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキサイド、及びプロピレングリコール等が挙げられる。
【００６２】
［キット］
本発明は、さらにその他の態様として、本発明のポリペプチド、及び／又は本発明の分子プローブ前駆体を含むキットに関する。キットの態様としては、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのキット、膵β細胞のイメージングを行うためのキット、膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒのイメージングを行うためのキット、膵島量の測定を行うためのキット、及び糖尿病の予防又は治療又は診断のためのキット等が挙げられる。本発明のキットは、これらの各態様において、それぞれの形態に応じた取扱い説明書を含むことが好ましい。取扱い説明書は、キットに同梱されてもよいし、ウェブ上で提供されてもよい。
【００６３】
本発明のポリペプチドの形態は、特に制限されず、例えば、溶液、粉末等が挙げられ、放射性核種の半減期及び放射能減衰等を考慮すると、溶液が好ましく、注射液がより好ましい。本発明の分子プローブ前駆体の形態は、特に制限されず、例えば、溶液、及び粉末等が挙げられ、取扱いの点からは、粉末が好ましく、より好ましくは凍結乾燥された粉末（凍結乾燥製剤）である。
【００６４】
本発明のキットは、分子プローブ前駆体を含む場合、例えば、分子プローブ前駆体の標識に使用する標識化合物、標識化合物の出発原料となる化合物、放射性標識に用いるその他の試薬等を含んでいてもよい。標識化合物は、上述のとおりである。
【００６５】
出発原料としては、例えば、式(Ib)で表される標識化合物の出発原料、及び式(Ic)で表される標識化合物の出発原料が挙げられる。式(Ib)で表される標識化合物の出発原料としては、例えば、4-(trimethylammonium triflate) benzoic acidのエステル誘導体が挙げられる。4-(trimethylammonium triflate) benzoic acidのエステル誘導体としては、例えば、メチルエステル、エチルエステル、及びt−ブチルエステル及びペンタメチルエステル等が挙げられる。式(Ib)で表される標識化合物のその他の出発原料としては、例えば、ethyl 4-(trimethylammonium triflate) benzoate、ethyl 4-(tosyloxy)benzoate、及びethyl 4-(methylsulfonyloxy)benzoate等が挙げられる。前記式(Ic)で表される標識化合物の出発原料としては、例えば、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 3-(tributylstannyl)benzoate、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 3-bromobenzoate、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 3-chlorobenzoate、及び2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 3-iodobenzoate等が挙げられる。放射性標識に用いるその他の試薬としては、例えば、標識化合物の合成に使用する放射性核種を含む試薬等が挙げられる。
【００６６】
本発明のキットは、本発明のポリペプチド及び／又は本発明の分子プローブ前駆体を入れるための容器をさらに含んでいてもよい。容器としては、例えば、シリンジやバイアル瓶等が挙げられる。
【００６７】
本発明のキットは、例えば、バッファー、浸透圧調整剤等の分子プローブを調製するための成分や、注射器等のポリペプチドの投与に使用する器具等をさらに含んでいてもよい。
【００６８】
分子プローブ前駆体を含むキットは、例えば、標識化合物を合成するための自動合成装置を含んでいてもよい。自動合成装置は、標識化合物の合成に加えて、例えば、合成した標識化合物を用いた分子プローブ前駆体の標識化、標識後のポリペプチドの脱保護、及び分子プローブ前駆体の合成等が可能であってもよい。
【００６９】
［イメージング方法］
本発明は、さらにその他の態様として、膵β細胞をイメージングするための方法であって、本発明のポリペプチドを投与された被検体から前記ポリペプチドの放射性シグナルを検出することを含むイメージング方法に関する。本発明のイメージング方法によれば、本発明のポリペプチドを使用することから、膵β細胞のイメージング、好ましくは膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒのイメージングを行うことができる。被検体としては、例えば、ヒト及び／又はヒト以外の哺乳類が挙げられる。
【００７０】
本発明のイメージング方法は、第１の態様として、本発明のポリペプチドを予め投与された被検体から該ポリペプチドの放射性シグナルを検出することを含む。シグナルの検出は、例えば、ポリペプチド体を投与後、シグナルの検出に十分な時間が経過後に行うことが好ましい。
【００７１】
本発明のイメージング方法は、例えば、検出されたシグナルを再構成処理して画像に変換し表示すること、及び／又は検出されたシグナルを数値化して集積量を提示することを含んでいてもよい。表示には、例えば、モニタに表示すること、及び印字すること等を含む。提示には、例えば、算出した集積量を保存すること、及び外部に出力することを含む。
【００７２】
シグナルの検出は、使用するポリペプチドの放射性核種の種類に応じて適宜決定でき、例えば、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ等を用いて行うことができる。ＳＰＥＣＴは、例えば、本発明のポリペプチドを投与された被検体から放出されるγ線をガンマカメラにより測定することを含む。ガンマカメラによる測定は、例えば、ポリペプチドの放射性核種から放出される放射線（γ線）を一定時間単位で測定することを含み、好ましくは放射線が放出される方向及び放射線数量を一定時間単位で測定することを含む。本発明のイメージング方法は、放射線の測定により得られた測定されたポリペプチドの分布を断面画像として表すこと、及び得られた断面画像を再構成することをさらに含んでいてもよい。
【００７３】
ＰＥＴは、例えば、ポリペプチドを投与された被検体から、ポジトロンと電子との対消滅により生成するガンマ線をＰＥＴ用検出器で同時計数することを含み、さらに、計測した結果に基づきポジトロンを放出する放射性核種の位置の三次元分布を描写することを含んでいてもよい。
【００７４】
ＳＰＥＣＴ又はＰＥＴによる測定にあわせて、Ｘ線ＣＴ及び／又はＭＲＩの測定を行ってもよい。これにより、例えば、ＳＰＥＣＴ又はＰＥＴにより得られた画像（機能画像）と、ＣＴ又はＭＲＩにより得られた画像（形態画像）とを融合させた融合画像を得ることができる。
【００７５】
本発明のイメージング方法は、第２の形態として、本発明のポリペプチドを被検体に投与すること、及び投与された被検体からポリペプチドの放射性シグナルを検出することを含む。シグナルの検出、及び再構成処理等は、第１の態様と同様に行うことができる。
【００７６】
被検体へのポリペプチドの投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与経路は、被検体の状態等に応じて適宜決定できるが、例えば、静脈、動脈、皮内、腹腔内への注射又は輸液等が挙げられる。ポリペプチドの投与量（用量）は、特に制限されず、イメージングのために所望のコントラストを得るために十分な量を投与すればよく、例えば、１μｇ以下とすることができる。本発明のポリペプチドは、担体等の医薬品添加物とともに投与することが好ましい。医薬品添加物としては、上述のとおりである。投与から測定までの時間は、例えば、ポリペプチドの膵β細胞への結合時間、ポリペプチドの種類及びポリペプチドの分解時間等に応じて適宜決定できる。
【００７７】
第２の態様のイメージング方法は、本発明のポリペプチドを用いたイメージングの結果に基づき、膵島又は膵β細胞の状態を判定することを含んでもよい。膵島又は膵β細胞の状態を判定することは、例えば、膵β細胞イメージングの画像を解析することにより膵島又は膵β細胞の有無を判断すること、膵島量の増減を判断すること等を含む。
【００７８】
本発明は、さらにその他の態様として、本発明のポリペプチドを投与された被検体から前記ポリペプチドの放射性シグナルを検出すること、及び、検出したポリペプチドのシグナルから膵島量を算出することを含む膵島量の測定方法に関する。本発明の膵島量の測定方法によれば、本発明のポリペプチドを使用することから、膵β細胞のイメージング、好ましくは膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒのイメージングを行うことができ、それらの結果から膵島量を測定することができる。本発明の膵島量の測定方法は、本発明のポリペプチドを予め投与された被検体からポリペプチドの放射性シグナルを検出すること、及び検出したポリペプチドのシグナルから膵島量を算出することを含むことが好ましい。
【００７９】
膵島量の算出は、例えば、検出したシグナルの量、シグナルを再構成して得られたイメージング画像を解析すること等により行うことができる。また、イメージングの結果からイメージングの対象物の定量を行うことは、当業者であれば、例えば、検量線や適当なプログラムを用いて容易に行うことができる。イメージングの対象物としては、例えば、膵島であり、好ましくは膵β細胞である。本発明の膵島量の測定方法は、検査・診断の用途の観点から、膵β細胞量の測定方法であることが好ましい。
【００８０】
本発明の膵島量の測定方法は、算出した膵島量を提示することをさらに含んでいてもよい。算出した膵島量を提示することは、例えば、算出した膵島量を保存又は外部に出力することを含む。外部に出力することは、例えば、モニタに表示すること、及び、印字すること等を含む。
【００８１】
［糖尿病の予防、治療、診断方法］
本発明は、さらにその他の態様として、糖尿病の予防又は治療又は診断方法に関する。上記のとおり、糖尿病の発症過程では、膵島量（とりわけ、膵β細胞量）が耐糖能異常に先行して減少するが、機能異常が検出・自覚される段階に至ってからでは、糖尿病はすでに治療が難しい段階となっている。しかし、本発明のポリペプチドを用いたイメージング方法及び／又は膵島量の測定方法によれば、膵島量及び／又は膵β細胞量の減少を早期に発見することができ、ひいては、新たな糖尿病の予防・治療・診断法が構築できる。糖尿病の予防・治療・診断の対象（被検体）としては、ヒト及び／又はヒト以外の哺乳類が挙げられる。
【００８２】
本発明の糖尿病の診断方法は、本発明のポリペプチドを用いて膵β細胞のイメージングを行うこと、及び、得られた膵島の画像及び／又は膵島量に基づき膵島の状態を判定することを含み、さらに、判定結果に基づき糖尿病の診断を行うことを含んでいてもよい。膵島の状態の判定は、例えば、得られた膵島の画像と基準となる膵島の画像とを比較すること、得られた膵島量と基準となる膵島量とを比較すること等により、膵島量の増減又は変化を判定することを含む。また、膵島の状態の判定は、情報処理装置を用いて行ってもよく、膵島量が減少していると判定したときには、その情報を提示し、膵島量が増加又は維持されていると判定したときには、その情報を提示することが好ましい。判定結果に基づく糖尿病の診断は、例えば、糖尿病発症のリスクを判定すること、糖尿病と判断すること、糖尿病の進行度合いを判断すること等を含む。
【００８３】
本発明の糖尿病の治療方法は、本発明のポリペプチドを用いた膵島のイメージング及びイメージング結果に基づく糖尿病の診断に加えて、診断に基づき糖尿病を治療することを含む。膵島のイメージング及び糖尿病の診断は、本発明の糖尿病の診断方法と同様に行うことができる。治療方法は、対象に対して行われる投薬や食事療法を含む治療効果を膵島量の変化に着目して評価することを含むことができる。
【００８４】
本発明の糖尿病の予防方法は、本発明のポリペプチドを用いた膵島のイメージング、及びイメージング結果に基づき膵島の状態を判定して糖尿病発症のリスクを判定することを含む。本発明の糖尿病の予防方法は、例えば、定期的に膵島量の測定を行い、膵島量の減少傾向の有無をチェックすることが含むことができる。
【００８５】
本発明は、好ましいその他の態様として、糖尿病の超早期診断方法に関する。本発明の糖尿病の超早期診断方法は、例えば、人間ドック、健康診断において本発明の方法により膵島のイメージング及び／又は膵島量の測定を行うこと、及び、得られた膵島の画像及び／又は膵島量に基づき膵島の状態を判定することを含むことができる。また、本発明の糖尿病の治療方法は、本発明の方法により膵島のイメージング及び／又は膵島量の測定を行うこと、及び、得られた膵島の画像及び／又は膵島量に基づき膵島の機能回復を評価することを含むことができる。
【００８６】
［その他の用途］
本発明のポリペプチドは、エキセンジン−４のアミノ酸配列（配列番号９）又はエキセンジン（９−３９）のアミノ酸配列（配列番号１０）と相同性を有しうる。上記の通り、エキセンジン−４及びエキセンジン（９−３９）は、ＧＬＰ−１類似体であり、膵β細胞上に発現するＧＬＰ−１Ｒに結合することが知られている。このため、本発明のポリペプチドは、膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒに結合可能であり、好ましくはＧＬＰ−１Ｒに特異的に結合可能であることから、例えば、ＧＬＰ−１Ｒ陽性の細胞のイメージング及び定量、ＧＬＰ−１Ｒの発現が関与する疾患の診断及び治療等に利用できる。したがって、上記膵島のイメージング・定量等と同様に、ＧＬＰ−１Ｒ陽性の細胞のイメージング及び定量、ＧＬＰ−１Ｒの発現が関与する疾患の診断及び／又は治療等を行うことができる。ＧＬＰ−１Ｒの発現が関与する疾患としては、例えば、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）等が挙げられる。神経内分泌腫瘍としては、例えば、インスリノーマ、小細胞気管支癌、及び膵癌等が挙げられる。
【００８７】
以下に、実施例及び参考例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。
【００８８】
なお、本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
Ａｃ：アセチル基
ＩＢ：３−ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｙｌ基
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  Ｒｅｓｉｎ（商品名、Ｍｅｒｃｋ製）：4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBA
ＨＢＴｕ：１−［ビスジメチルアミノメチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウムー３−オキシドーヘキサフルオロホスフェイト
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
Ｂｏｃ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ−３TM（商品名、Peptide International製）：Boc-11-Amino-3,6,9-trioxaundecanoic acid・DCHA
Ｂｏｃ：ブトキシカルボニル基
ＤＣＨＡ：ジシクロヘキシルアミン
ＷＳＣＤ：水溶性カルボジイミド
ＴＦＡ：テトラフドロフラン
ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＩＢ−Ｃｌ：３−Ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＯＢｕ：ブチルエステル基
Ｔｒｔ：トリチル基
Ｐｄｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル基
Ｍｍｔ：４−メトキシトリチル基
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
【実施例】
【００８９】
［Binding Assay］
式(１１)で表されるポリペプチド（配列番号１１）及び式(１２)で表されるポリペプチド（配列番号１２）（いずれもコールド体）を用いてBinding Assayを行った。
【００９０】
【化７】
2014076949.tif 000009
【００９１】
（コールド体の合成）
式(１１)で表されるポリペプチドの合成
式(１１)で表されるポリペプチドは、以下の手順で調製した。
【００９２】
まず、式(１３)で表される保護ペプチド樹脂を合成した。なお、式(１３)において、Ｌｙｓ（ＩＢ）以外は側鎖の保護基の表記を省略した。
Ac-DLSK(IB)QMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-Rink Amide MBHA   (13)  （配列番号１３）
【００９３】
式(１３)で表される保護ペプチド樹脂の合成は、アドバンスケムテック社製のペプチド合成機（ＡＣＴ９０）を用いて固相合成法により行った。出発樹脂担体として、Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  Ｒｅｓｉｎ（０．３９ｍｏｌ／ｇ、０．２５ｍｍｏｌ  ｓｃａｌ）を使用した。アミノ酸の原料としては、通常のＦｍｏｃ−ペプチド合成法に使われるＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を使用した。使用したＦｍｏｃアミノ酸誘導体のうち、側鎖に官能基のあるアミノ酸はそれぞれＡｓｐ（ＯＢｕ）、Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、及びＡｓｎ（Ｔｒｔ）を用いた。但し、第１位のアスパラギン酸にはＮ末端のα−アミノ基がアセチル基で保護されたＡｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ）を使用し、第４位のリジンにはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＩＢ）を使用した。原料となるＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、活性化剤であるＨＢＴｕ及びＨＯＢｔとＤＭＦに溶解して反応槽に加えて反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を脱離し、洗浄後、次のアミノ酸誘導体の縮合に進み、ペプチドの配列に従い逐次ペプチド鎖の延長を行い、式(１３)で表される保護ペプチド樹脂を得た。
【００９４】
つぎに、得られた保護ペプチド樹脂を、トリフルオロ酢酸を用いる定法の脱保護条件（ＴＦＡ−ＴＩＳ−Ｈ2Ｏ−ＤＴ（９５／２．５／２．５／２．５，ｖ／ｖ））で、室温で２時間処理して脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しとを同時に行った。反応液から担体樹脂をろ別した後、ＴＦＡを留去し、残渣にエーテルを加えて得られる粗生成物の沈殿をろ取した。
【００９５】
得られた粗生成ペプチドを、ＨＰＬＣ分取装置（商品名：ＬＣ−８Ａ−２、島津製作所製、カラム：ＯＤＳ３０ｘ２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水―アセトニトリルの系で分取精製し、目的のペプチドの分画を得た。ついで、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、式(１１)で表されるポリペプチドをトリフルオロ酢酸塩として得た。
【００９６】
式(１２)で表されるポリペプチドの合成
式(１２)で表されるポリペプチドは、保護ペプチド樹脂として式(１４)で表される保護ペプチド樹脂を合成した以外は、式(１１)で表されるポリペプチドと同様の手順で調製した。なお、第１位のヒスチジンとしてＡｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を使用し、第１２位のリジンとしてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＩＢ）を使用した。式(１４)において、Ｌｙｓ（ＩＢ）以外は側鎖の保護基の表記を省略した。
Ac-HGEGTFTSDLSK(IB)QMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-Rink Amide MBHA   (14)  （配列番号１４）
【００９７】
（Binding Assayの手順）
Binding Assayは以下の手順で行った．まず、マウスから単離した膵島を５０ｍｌチューブに回収し、遠心（２０００ｒｐｍ、２分）した後、冷ＰＢＳ２０ｍＬで１回洗浄した。トリプシン−ＥＤＴＡ（トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％／０．５３ｍＭ）３ｍＬに、ＰＢＳを含む０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４（ＮａＯＨ））１２ｍＬを加えたもの）を１５ｍＬ加え、３７℃で振とうしながら１分間インキュベートした後、直ちに氷上に置いた。ついで、スポイト付１０ｍＬピペットで泡立てることなく勢いよく２０回ピペッティングした後、冷ＰＢＳを最終量が３０ｍＬになるように加えた。遠心（３０００ｒｐｍ、２分）した後、冷ＰＢＳ  ３０ｍＬで２回洗浄した。上清を除去して膵島細胞サンプルを得た。得られた膵島細胞サンプルは−８０℃で保存した。
【００９８】
１００μＬ／チューブとなるように膵島細胞サンプルをＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍｌ  ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で懸濁した。ついでＢｕｆｆｅｒ  ８８０μＬ、式(１１)で表されるポリペプチド又は式(１２)で表されるポリペプチドを含む溶液（ポリペプチドの終濃度：０、１×１０-6〜１×１０-12Ｍ）１０μＬ、[125I]Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）を含む溶液（[125I]Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（製品コード：ＮＥＸ３３５、1．８５ＭＢｑ／ｍＬ＝５０μＣｉ／ｍＬ，２２．７３ｐｍｏｌ／ｍＬ＝７６．５７ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）１０μＬにＢｕｆｆｅｒ９０μＬを添加したもの）１０μＬを添加し、室温で６０分インキュベーションした。なお、[125I]標識Ｂｏｌｔｏｎ−ＨｕｎｔｅｒＥｘｅｎｄｉｎ（９−３９）の終濃度は０．０５μＣｉ／チューブとした。ついで予め湿らせたガラス繊維フィルタ(Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃ  ｆｉｌｔｅｒ)をセットした吸引装置を用い、吸引によりＢ／Ｆ分離した後、フィルタを氷冷のＰＢＳ５ｍｌで３回洗浄した。フィルタをチューブに入れ、γカウンターにより放射能の測定を行った。
【００９９】
式(１１)で表されるポリペプチド及び式(１２)で表されるポリペプチドはいずれも、ＧＬＰ−１Ｒと[125I]Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）との結合を濃度依存的に阻害した。式(１１)で表されるポリペプチドのＩＣ50は３２．１ｎＭであり、式(１２)で表されるポリペプチドのＩＣ50は２３．６ｎＭであった。
【０１００】
（製造例１）
式(１５)で表されるポリペプチド（配列番号１５）の合成
式(１５)で表されるポリペプチドを以下の手順で調製した。
【０１０１】
【化８】
2014076949.tif 000010
【０１０２】
まず、式(１６)で表される保護ペプチド樹脂を合成した。保護ペプチド樹脂の合成は、第４位のリジンとしてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）を使用した以外は、上記のコールド体の合成と同様の手順で行った。なお、式(１６)において、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）以外は側鎖の保護基の表記を省略した。
Ac-DLSK(Boc)QMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-Rink Amide MBHA   (16)  （配列番号１６）
【０１０３】
ついで、得られた保護ペプチド樹脂を、トリフルオロ酢酸を用いる定法の脱保護条件（ＴＦＡ−ＴＩＳ−Ｈ2Ｏ−ＤＴ（９５／２．５／２．５／２．５，ｖ／ｖ））で、室温で２時間処理して脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しとを同時に行った。反応液から担体樹脂をろ別した後、ＴＦＡを留去し、残渣にエーテルを加えて得られる粗生成物の沈殿をろ取した。
【０１０４】
得られた粗生成ペプチドを、ＨＰＬＣ分取装置（商品名：ＬＣ−８Ａ−２、島津製作所製、カラム：ＯＤＳ３０ｘ２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水―アセトニトリルの系で分取精製し、目的のペプチドの分画を得た。ついで、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、式(１７)で表される分子プローブ前駆体をトリフルオロ酢酸塩として得た。
Ac-DLSKQMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-CONH2   (17)  （配列番号１７）
【０１０５】
式(１７)で表される分子プローブ前駆体（７５０μｇ）を、アセトニトリル、Ｂｏｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．８）に溶解させ、それに[125I]N-succinimidyl 3-iodobenzoate（[125I]ＳＩＢ）を加えた。反応溶液をｐＨ８．５〜９．０に調整して３０分間反応させることにより、４番目のリジンの側鎖のアミノ基に[125I]3-iodobenzoyl基（[125I]ＩＢ）を結合させて放射性標識し、目的物である式(１５)で表されるポリペプチドを得た（放射化学的収率：４７．５％、放射化学的純度：＞９９％）。また、標識に要した時間は、３．５時間であった。
【０１０６】
（比較製造例１）
式(１７)で表される分子プローブ前駆体に替えて、式(１８)で表される分子プローブ前駆体を用い、[125I]ＳＩＢとの反応による放射性標識後、ＤＭＦ及びピペリジンを加えることで脱保護反応を行った以外は、製造例１と同様に放射性標識を行い、式(１９)で表されるポリペプチド（配列番号１９）を調製した（放射化学的収率：１８．４％、放射化学的純度：９６．４％）。また、標識に要した時間は、５．５時間であった。
Fmoc-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK(Fmoc)NGGPSSGAPPPS-CONH2  (18)  （配列番号１８）
【０１０７】
【化９】
2014076949.tif 000011
【０１０８】
製造例１及び比較製造例１に示すように、第１９番目のＬｙｓをＡｒｇに置換した式(１７)で表される分子プローブ前駆体を使用して放射性標識を行うことにより、該置換を行っていない式(１８)で表される分子プローブ前駆体を使用した場合と比較して、放射性標識されたポリペプチドの収率が２．５倍以上向上するとともに、高純度の標品を得ることができた。また、標識に要する時間についても、短縮することができた。したがって、本発明の分子プローブ前駆体によれば、放射性標識されたポリペプチドを高純度で効率よく製造することができる。
【０１０９】
（製造例２）
式(２０)で表されるポリペプチド（配列番号２０）の合成
式(２０)で表されるポリペプチドを以下の手順で合成した。
【０１１０】
【化１０】
2014076949.tif 000012
【０１１１】
式(２０)で表されるポリペプチドは、式(１７)で表される分子プローブ前駆体に替えて、式(２１)で表される分子プローブ前駆体（８２０μｇ）を用いた以外は、製造例１と同様の方法で調製した（放射化学的収率：３７．０％、放射化学的純度：９９％）。また、標識に要した時間は、２．５時間であった。
Ac-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-CONH2   (21)  （配列番号２１）
【０１１２】
（比較製造例２）
式(２１)で表される分子プローブ前駆体に替えて、式(２２)で表される分子プローブ前駆体を用い、[125I]ＳＩＢとの反応による放射性標識後、ＤＭＦ及びピペリジンを加えることで脱保護反応を行った以外は、製造例２と同様に放射性標識を行い、式(２３)で表されるポリペプチド（配列番号２３）を調製した（放射化学的収率：１８．４％、放射化学的純度：９７．２％）。また、標識に要した時間は、４．５時間であった。
Fmoc-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK(Fmoc)NGGPSSGAPPPS-CONH2  (22)  （配列番号２２）
【０１１３】
【化１１】
2014076949.tif 000013
【０１１４】
製造例２及び比較製造例２に示すように、第２７番目のＬｙｓをＡｒｇに置換した式(２１)で表される分子プローブ前駆体を使用して放射性標識を行うことにより、該置換を行っていない式(２２)で表される分子プローブ前駆体を使用した場合と比較して、放射性標識されたポリペプチドの収率が２倍以上向上するとともに、高純度の標品を得ることができた。また、標識に要する時間についても短縮することができた。したがって、本発明の分子プローブ前駆体によれば、放射性標識されたポリペプチドを高純度で効率よく製造することができる。
【０１１５】
（実施例１）
式(１５)で表されるポリペプチド（以下、「実施例１のポリペプチド」ともいう）を用いてマウスの体内分布実験、及び二次元イメージング解析を行った。
【０１１６】
［体内分布］
実施例１のポリペプチド（０．７５μＣｉ）を無麻酔の６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重３０ｇ）に静脈注射（尾静脈）により投与した。投与５分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に各臓器を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。その結果の一例を下記表１及び図１に示す。図１は、各臓器への実施例１のポリペプチドの集積の経時変化の一例を示すグラフである。また、下記表２に、実施例１のポリペプチドの各臓器への集積量に基づき、それらの膵/肝比（膵臓の集積量/肝臓の集積量）、膵/腎比（膵臓の集積量/腎臓の集積量）、及び膵/血比（膵臓の集積量/血液の集積量）を示す。
【０１１７】
【表１】
2014076949.tif 000014
【０１１８】
【表２】
2014076949.tif 000015
【０１１９】
表１及び図１に示すとおり、実施例１のポリペプチドの膵臓への集積は、投与後早期に１５%dose/gを超えるレベルに達し、投与後３０分までの時間帯でそのレベルが維持された。また、実施例１のポリペプチドは、甲状腺への集積に大きな変化が見られなかったことから、生体内で実施例のポリペプチドが脱ヨウ素代謝を受けていないことが示唆された。
【０１２０】
表２に示すように、実施例１のポリペプチドは、膵/肝比が投与後３０分の時間帯で１を越える値を示し、膵/腎比についてもすべての時間帯で略１又はそれを超える値を示した。
【０１２１】
［２次元イメージング解析］
実施例１のポリペプチド（５μＣｉ／１００μｌ）を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により投与し、投与３０分後及び６０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝１）。摘出した膵臓から切片を切り出し、切片をスライドガラス上に置き、その上にカバーガラスを載せた。切片の蛍光及び放射能（オートラジオグラフィー）は、画像解析装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）を用いて測定した（露光時間：１８時間）。その結果の一例を図２に示す。
【０１２２】
また、標識していないeｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（コールドプローブ、配列番号１０）を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により前投与した（５０μｇ／１００μｌ）。前投与から３０分後に実施例１のポリペプチド（５μＣｉ／１００μｌ）を静脈注射により投与し、上記ポリペプチドの投与から３０分後及び６０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝２）。摘出した膵臓から切片を切り出し、得られた切片について、上記と同様にして蛍光及び放射能の測定を行った。その結果の一例を、ブロッキングなし（前投与なし）の結果とあわせて図２に示す。
【０１２３】
図２は、実施例１のポリペプチドを投与したＭＩＰ−ＧＦＰマウスの膵臓切片のイメージング解析の結果の一例であって、蛍光シグナルを示す画像（上図）及び式(１５)で表されるポリペプチドの放射性シグナルを示す画像（下図）を示す。
【０１２４】
図２に示すように、ＭＩＰ−ＧＦＰマウスの膵臓切片において、画像解析装置によって蛍光ＧＦＰシグナル及び放射性シグナルがそれぞれ検出された。また、実施例１のポリペプチドの放射性シグナルの局在性は、ＧＦＰシグナルとほぼ一致していた。これらのことから、実施例１のポリペプチドが、膵β細胞に特異的に集積することが確認できた。また、コールドプローブを前投与して受容体をブロッキングすることにより、実施例１のポリペプチドの放射性シグナルシグナルはほとんど検出されなかった。したがって、実施例１のポリペプチドが、膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒに特異的に集積していることが示唆された。
【０１２５】
ここで、125Ｉ、123Ｉ及び131Ｉはいずれもγ線放出核種である。さらに、125Ｉ及び123Ｉは核スピン数も同一である。これらのことから、実施例１のポリペプチドの放射性ヨウ素原子を、[123I]ヨウ素原子又は[131I]ヨウ素原子とした場合であっても、実施例１のポリペプチドとほぼ同様の挙動を示すことが推測される。また、[124I]ヨウ素原子とした場合であっても、実施例１のポリペプチドとほぼ同様の挙動を示すと推測される。したがって、実施例１のポリペプチドにおいて[125I]ヨウ素原子を[123/124/131I]ヨウ素原子とすることにより、例えば、ＳＰＥＣＴやＰＥＴ等での膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒの非侵襲の三次元イメージング、好ましくは膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒの定量が可能なことが示唆された。
【０１２６】
（実施例２）
式(２０)で表されるポリペプチド（以下、「実施例２のポリペプチド」ともいう）を用いてマウスの体内分布実験、及び二次元イメージング解析を行った。
【０１２７】
［体内分布］
実施例２のポリペプチド（０．５１μＣｉ）を無麻酔の６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重３０ｇ）に静脈注射（尾静脈）により投与した。投与５分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に各臓器を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。その結果の一例を下記表３及び図３に示す。図３は、各臓器への実施例２のポリペプチドの集積の経時変化の一例を示すグラフである。また、下記表４に、実施例２のポリペプチドの各臓器への集積量に基づき、それらの膵/肝比、膵/腎比、膵/血比を示す。
【０１２８】
【表３】
2014076949.tif 000016
【０１２９】
【表４】
2014076949.tif 000017
【０１３０】
表３及び図３に示すとおり、実施例２のポリペプチドの膵臓への集積は、投与後早期に２２%dose/gを超えるレベルに達し、それ以降も高いレベルで維持された。また、実施例２のポリペプチドは、甲状腺への集積に大きな変化が見られなかったことから、生体内で実施例２のポリペプチドが脱ヨウ素代謝を受けていないことが示唆された。
【０１３１】
表４に示すように、実施例２のポリペプチドは、膵/肝比が投与後早期に５を越える値を示した。また、実施例２のポリペプチドの膵/血比が投与後早期で２を越える値を示し、良好な血液クリアランスを示した。このように膵臓への集積量が高い一方で、膵/肝比が高く、血液クリアランスに優れる実施例２のポリペプチドによれば、膵β細胞のイメージング、好ましくは膵β細胞のＧＬＰ１−Ｒのイメージングを行った際に、明瞭な画像が得られることが示唆された。
【０１３２】
［２次元イメージング解析］
実施例２のポリペプチドを使用し、その投与量を２．７μＣｉ／１００μｌとし、露光時間を１９時間とした以外は、実施例１と同様の手順で、蛍光及び放射能の測定を行った。その結果を図４に示す。
【０１３３】
図４は、実施例２のポリペプチドを投与したＭＩＰ−ＧＦＰマウスの膵臓切片のイメージング解析の結果の一例であって、蛍光シグナルを示す画像（上図）及び式(２０)で表されるポリペプチドの放射性シグナルを示す画像（下図）を示す。
【０１３４】
図４に示すように、ＭＩＰ−ＧＦＰマウスの膵臓切片において、画像解析装置によって蛍光ＧＦＰシグナル及び放射性シグナルがそれぞれ検出された。また、実施例２のポリペプチドの放射性シグナルの局在性は、ＧＦＰシグナルとほぼ一致していた。これらのことから、実施例２のポリペプチドが、膵β細胞に特異的に集積することが確認できた。また、コールドプローブを前投与して受容体をブロッキングすることにより、実施例２のポリペプチドの放射性シグナルシグナルはほとんど検出されなかった。したがって、実施例２のポリペプチドが、膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒに特異的に集積していることが示唆された。
【０１３５】
（実施例３）
式(２４)で表されるポリペプチド（配列番号２４）を用いてＳＰＥＣＴによる三次元イメージングを行った。
【０１３６】
【化１２】
2014076949.tif 000018
【０１３７】
［ポリペプチドの調製］
式(２４)で表されるポリペプチドは、[125I]ＳＩＢに替えて[123I]ＳＩＢを用いた以外は、製造例２と同様の手順で調製した。
【０１３８】
［三次元イメージング］
式(２４)で表されるポリペプチド（４８０μＣｉ（１７．８ＭＢｑ））を６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重約３０ｇ）に静脈注射により投与し、ポリペプチドの投与後１５分からインフルラン吸入麻酔を開始した。ついで、ポリペプチドの投与後２１分からＳＰＥＣＴ撮像を行った。ＳＰＥＣＴ撮像は、ガンマカメラ（製品名：ＳＰＥＣＴ２０００Ｈ−４０、日立メディコ製）を用いて下記の撮像条件で行った。得られた画像を下記の再構成条件で再構成処理を行った。
撮像条件
コリメータ      ：ＬＥＰＨ  コリメータ
収集範囲        ：３６０°
ステップ角度    ：１１．２５°
収集時間        ：１方向あたりの収集時間６０秒
６０秒ごと１フレーム×３２フレーム（計３２分間）
再構成条件
前処理フィルタ：Butterworthフィルタ（order：１０、cutoff周波数：０．１５）
【０１３９】
その結果の一例を図５に示す。図５に示す画像は、ポリペプチドの投与後２１〜５３分の画像であって、左から順に横断像（transverse view）、冠状断像（coronal view）、及び矢状断像（sagittal view）であり、膵臓の位置を白矢印で示す。
【０１４０】
図５に示すように、式(２４)で表されるポリペプチドを用いたＳＰＥＣＴ撮像により、マウスにおいて非侵襲的に膵臓の位置を確認することができた。このように、ヒトよりも膵臓のサイズが小さくかつ臓器が密集しているマウスにおいて、膵臓の位置を非侵襲的に確認できたことから、マウスよりも膵臓のサイズが大きくかつ臓器が密集していないヒトであれば、膵臓の位置及びサイズをより明確に判別することができ、さらには膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒに結合するポリペプチドの量を測定できることが示唆された。
【０１４１】
以上の結果より、本発明のポリペプチドであれば、ヒトにおいて非侵襲的な膵島の三次元イメージングが可能であることが示唆された。したがって、本発明のポリペプチドを用いて膵β細胞のＧＬＰ−１Ｒを非侵襲的に三次元イメージングすることによりヒトの膵β細胞量（又は膵島量）を定量することが可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
以上説明した通り、本発明は、例えば、医療分野、分子イメージング分野、糖尿病に関する分野などで有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列番号１：本発明の分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号２：Y1のアミノ酸配列
配列番号３：Y2のアミノ酸配列
配列番号４〜５：分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号６〜８：本発明のポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号９：ｅｘｅｎｄｉｎ−４のアミノ酸配列
配列番号１０：ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）のアミノ酸配列
配列番号１１〜１２：Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙに使用したポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号１３〜１４：Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙに使用したポリペプチドの作製に使用した保護ペプチド樹脂のアミノ酸配列
配列番号１５：製造例１で製造したポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号１６：製造例１で製造した保護ペプチド樹脂のアミノ酸配列
配列番号１７：製造例１で製造した分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号１８：比較製造例１で使用した分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号１９：比較製造例１で製造したポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号２０：製造例２で製造したポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号２１：製造例２で製造した分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号２２：比較製造例２で使用した分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号２３：比較製造例２で製造したポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号２４：実施例３で製造したポリペプチドのアミノ酸配列
【図１】
2014076949.tif 000020
【図３】
2014076949.tif 000021
【図２】
2014076949.tif 000022
【図４】
2014076949.tif 000023
【図５】
2014076949.tif 000024
【配列表】
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