(57)【要約】【課題】蛍光イメージングや光音響イメージングの造影剤等として使用するインドシアニングリーン（ＩＣＧ）含有粒子において、血清内でのＩＣＧの粒子からの漏出を防ぎ、ＩＣＧを安定に保持することができる粒子を提供すること。【解決手段】インドシアニングリーンの会合体とリン脂質とを有することを特徴とする粒子によれば、血清内等での粒子からのＩＣＧの漏出を防ぎ、安定してＩＣＧを粒子内に保持することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）のＪ会合体と正帯電部位を有する脂質とを有することを特徴とする粒子。 
【請求項２】
波長８９５ｎｍの光の吸光度と７８０ｎｍの光の吸光度との比率が０．１以上であることを特徴とする、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記粒子の流体力学的平均粒子径は光散乱法で測定して１０００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の粒子。
【請求項４】
光音響イメージングに用いられることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項５】
腫瘍造影に用いられることを特徴とする請求項請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項６】
リンパ節造影に用いられることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項７】
粒子表面に界面活性剤を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項８】
さらに標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項９】
前記脂質はリン脂質であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１０】
前記脂質は二重膜を形成していることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１１】
前記脂質が粒子に占める割合は３０重量％以上であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１２】
前記粒子の平均粒径は２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１３】
前記脂質はリン酸ジエステル結合を有する脂質であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１４】
粒子表面にＰＥＧ鎖を有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の粒子と、前記粒子が分散された分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用の造影剤。
【請求項１６】
ＩＣＧのＪ会合体を含む粒子を有するリンパ節用造影剤。
【請求項１７】
リン脂質と、コレステロールと、インドシアニングリーンとを含む粒子であって、前記粒子の７８０ｎｍにおける吸光度に対する７００ｎｍにおける吸光度は１以上であることを特徴とする粒子。
【請求項１８】
さらにデキストランを含むことを特徴とする請求項１７に記載の粒子。
【請求項１９】
血清溶液中で３７℃で２４時間インキュベートした際のＩＣＧ保持率は６０％以上であることを特徴とする請求項１７または１８に記載の粒子。
【請求項２０】
前記リン脂質は二重膜を形成していることを特徴とする請求項１７乃至１９のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２１】
前記粒子はリポソームであることを特徴とする請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２２】
平均粒径は２０から２００ｎｍであることを特徴とする請求項１７乃至２１のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２３】
平均粒径は２０から１００ｎｍであることを特徴とする請求項１７乃至２２のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２４】
リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であることを特徴とする請求項１７乃至２３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２５】
さらにポリエチレングリコールを含むことを特徴とする請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２６】
ポリエチレングリコールは膜表面に導入されていることを特徴とする請求項２５に記載の粒子。
【請求項２７】
請求項１７乃至２６のいずれか１項に記載の粒子を中性緩衝水溶液で希釈する工程と、孔径１μｍ以下の孔を有するフィルタでろ過する工程と、超音波で分散する工程とを経て処理した粒子。
【請求項２８】
動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定したキュムラント解析による粒径分布の平均粒径は５０から６０ｎｍであることを特徴とする請求項２７に記載の粒子。
【請求項２９】
請求項１７乃至２８のいずれか１項に記載の粒子を有する造影剤。
【請求項３０】
光音響イメージングに用いられることを特徴とする請求項２９に記載の造影剤。
【請求項３１】
蛍光イメージングに用いられることを特徴とする請求項２９に記載の造影剤。
【請求項３２】
請求項１７乃至２６のいずれか１項に記載の粒子の製造方法であって、
リン脂質、コレステロールおよびインドシアニングリーンを含む粒子の原料を有機溶媒に溶解し、
有機溶媒を除去して乾固した後に粒子の原料を水系媒体に分散させる工程を含み、
水系媒体に、水系媒体の１.５重量％以上のデキストランが溶解された溶液を用いることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項１７乃至２６のいずれか１項に記載の粒子の製造方法であって、
リン脂質、コレステロールおよびインドシアニングリーンを含む粒子の原料を有機溶媒に溶解し、
前記粒子の原料が溶解された有機溶媒を水系媒体に滴下する工程を含み、
水系媒体にデキストランが溶解された溶液を用いることを特徴とする方法。
【請求項３４】
２．６重量％以上のデキストランが溶解された水系媒体を用いることを特徴とする請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２７または２８に記載の粒子の製造方法であって、
請求項１７乃至２６のいずれか１項に記載の粒子を中性緩衝水溶液で希釈する工程と、孔径１μｍ以下の孔を有するフィルタでろ過する工程と、超音波で分散する工程とを経て処理することを特徴とする方法。
【請求項３６】
インドシアニングリーンの会合体とリン脂質とを有することを特徴とする粒子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の粒子と分散媒とを有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドシアニングリーンを含有する粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、非侵襲的に診断ができるイメージング方法として、蛍光イメージング法や光音響イメージング法が注目されている。
【０００３】
蛍光イメージング法は蛍光色素に光を照射し、色素が発する蛍光を検出する方法で、各種イメージングに広く用いられている。光音響イメージング法は、光を照射された測定対象の分子が放出する熱が起こす体積膨張により生じる音響波の強度と音響波の発生位置を検出することで、測定対象の画像を得る方法である。蛍光イメージング法や光音響イメージング法において、測定対象部位からの蛍光の大きさや音響波の強度を大きくするための造影剤として色素を用いることができる。
【０００４】
このような造影剤においては、信号強度（蛍光や音響波の強度）を有効に増幅するために、光を吸収することで蛍光または音響波を発する色素を粒子、ミセル、ポリマーミセル、リポソーム等（以下、単に粒子という場合は、特に言及される場合を除き、これらの総称を意味する）に集積することにより、色素密度を上げて、照射エネルギーの吸収効率を上げることが望まれる。
【０００５】
光を吸収することで蛍光または音響波を発することが知られている色素として、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下、ＩＣＧと略すことがある）が知られている。なお、本明細書において、ＩＣＧとはシアニン骨格を有し、下記の化学式１で示される構造を有する化合物を指す。
【化１】
2014129318.tif 000002
ただし、対イオンはＮａ＋でなくともよく、Ｈ＋あるいはＫ＋でもよい。 
【０００６】
しかし、ＩＣＧは低分子であることからサイズが小さく、リンパ節内滞留性が低いため、よりサイズの大きいリンパ節用造影剤が望まれていた。また、粒子内にＩＣＧを内包させてより多くのＩＣＧを腫瘍部に到達させる検討もなされている。
ＩＣＧを含み、よりサイズの大きな粒子として、非特許文献１には、ポリビニルアルコール（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ：ＰＶＡ）を界面活性剤にしてエマルジョン溶媒拡散法によって得たＩＣＧ含有乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ：以下ＰＬＧＡと略すことがある）粒子が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２２００４５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，７４（２００４）２９−３８
【非特許文献２】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２２０，  １９９７，  Ｐａｇｅｓ  ３８５−３９２
【非特許文献３】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２２０，  １９９７，  Ｐａｇｅｓ  ３７３−３８４
【非特許文献４】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９，  ２００１，  Ｐａｇｅｓ  ３９９−４０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、非特許文献１に開示されたＩＣＧを含有する粒子には、ＩＣＧが親水性の官能基を有する色素であるため、血清などの水溶液中では、ＩＣＧが粒子外へと漏出するという問題があった。
【００１０】
ＩＣＧを含有する粒子の造影剤においては、生体内での粒子のＩＣＧ含有率が優れていることが必要である。粒子のＩＣＧ含有率が低い場合、標的組織へのＩＣＧ輸送量が減少し、造影感度が不十分になり、その結果、ＩＣＧ含有粒子を大量に投与する必要が生じることになる。患者に過度の負担を与えないためにも、ＩＣＧ含有率が優れたＩＣＧ含有粒子が求められていた。
【００１１】
そこで本発明は、ＩＣＧの会合体の一形態である、ＩＣＧのＪ会合体を用いることで、血清などの水溶液中、あるいは、マウスに投与した場合、において、色素を粒子内に安定に保持することのできる粒子を提供することを目的とする。
【００１２】
また、特許文献１に記載のＩＣＧを内包するリポソームは、ＩＣＧが有する親水性の構造のため、生体などの水溶液中でＩＣＧが粒子から漏出してしまうという問題があった。もし生体内でＩＣＧが漏洩し、粒子内のＩＣＧ含有量が低くなると、造影したい組織へのＩＣＧ輸送量が減少し、造影感度が不十分になる。その結果、ＩＣＧ内包リポソームを大量に投与する必要が生じることになる。患者に過度の負担を与えないためにも、生体内でＩＣＧの漏出を抑制した、内包率が高いＩＣＧ内包粒子が求められていた。そこで、別の本発明に係る粒子は、内包率が高いＩＣＧ内包粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係る粒子は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）のＪ会合体と正帯電部位を有する脂質とを有することを特徴とする粒子である。
【００１４】
別の本発明に係るＩＣＧ内包粒子は、少なくともリン脂質とコレステロール及びインドシアニングリーンを含む粒子であって、７００ｎｍにおける吸光度と７８０ｎｍにおける吸光度の比が1以上を示すことを特徴とする粒子である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る粒子は、ＩＣＧを粒子内に安定に保持することができる。
別の本発明に係る粒子は、粒子からＩＣＧが漏出しにくい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態における粒子の例である。
【図２】本発明の一実施形態における別の粒子の例である。
【図３】実施例１におけるリンパ節用造影剤J-ICG-0.2μmの吸収スペクトルである。比較のためにＩＣＧの吸収スペクトルを重ねてある。
【図４】実施例２におけるＩＣＧ含有ナノ粒子(ICG_NP)およびＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子(J-ICG_NP)の吸収スペクトルである。
【図５】実施例２においてDSPC仕込み量を変化させて作製した種々のＩＣＧ含有ナノ粒子(ICG_NP)およびＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子(J-ICG_NP)の平均粒子径を示したグラフである。
【図６】実施例２においてDSPC仕込み量を変化させて作製した種々のＩＣＧ含有ナノ粒子(ICG_NP)およびＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子(J-ICG_NP)の血清中への色素漏出率を示したグラフである。
【図７】実施例３におけるＩＣＧのＪ会合体を内包するリポソームJIL1-4Cの吸収スペクトルの一例である。
【図８】実施例３におけるＩＣＧのＪ会合体を内包するリポソームJIL1-4C及び比較例としてのＩＣＧを投与した担癌マウスの投与後２４時間のインビボ蛍光イメージの一例である。
【図９】J-ICG NP1の相対吸収スペクトル（測定範囲での吸収極大を１とした）および、光音響相対強度（測定波長でもっとも光音響強度が高いものを１とした）を示す図である。
【図１０】本発明における７００/７８０比が１以上をしめすＩＣＧ内包粒子の概念図。
【図１１】本発明の実施例７及び８で調製したＩＣＧ内包粒子の吸収スペクトルの一例。
【図１２】本発明の実施例７で調製したＩＣＧ内包粒子の透過電子顕微鏡観察像の一例。
【図１３】本発明の実施例７及び８で調製したＩＣＧ内包粒子の７００/７８０比と血清中２４時間後のＩＣＧ保持率との関係図。
【図１４】本発明の実施例７で調製したＩＣＧ内包粒子の調製に用いたデキストラン４０の添加濃度と７００/７８０比との関係図。
【図１５】本発明の実施例７及び８で調製した７００/７８０比が１以上を示すＩＣＧ内包粒子ＰＬＤ１及びＥＰＬＤ１ならびに比較例としてのＩＣＧを投与した担癌マウスの投与後２４時間の明視野像と蛍光像を重ね合わせたイメージの一例。
【図１６】本発明の小粒子化処理の工程フロー図。
【図１７】本発明の実施例１４における小粒径化処理の主要工程における動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定したキュムラント解析による粒径分布図。
【図１８】本発明の実施例１５において小粒径化処理の主要工程における動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定したキュムラント解析による粒径分布図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態に限られない。
【００１８】
本発明の実施形態に係る粒子は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）の会合体とリン脂質とを有することを特徴とする。ＩＣＧは単量体で存在する以外に２種類の会合体を形成することが知られ、ｐａｒａｌｌｅｌ  ｆａｓｈｉｏｎ（様式）による会合体からなるＨ会合体、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ  ｆａｓｈｉｏｎによる会合体からなるＪ会合体が存在する。ＩＣＧの単量体は会合してＪ会合体やＨ会合体を形成することで親水性が低下する。その結果、ＩＣＧは粒子から漏出しにくくなる。
また、このような粒子と分散媒とを有する光音響イメージング用造影剤は、ＩＣＧが粒子から漏出しにくいため、大きなモル吸光係数となり、光音響信号を得られる。
以下、本発明の実施形態の詳細について説明する。
【００１９】
（実施形態１）
本発明の一実施形態は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）のＪ会合体を含む粒子に係るものである。
【００２０】
（J会合体）
ＩＣＧは特定の条件下においてＪ会合体（J-aggregate）を形成することが知られている（非特許文献２、３及び４）。このＪ会合体は、数μｍの平均粒径を有する多量体であり、単量体に比べて、吸収極大波長が長波長側に大きく移動し、その吸収帯が鋭くなることが知られている。
本実施形態におけるＩＣＧのＪ会合体とは、ＩＣＧの多量体構造物である会合体のうち、吸収波長がずれて、８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大をもつものと定義する。なお、本実施形態において粒子にＩＣＧのＪ会合体が含まれるという場合、粒子にＩＣＧの単量体が含まれていてもよい。粒子の、波長８９５ｎｍ（Ｊ会合体に由来）の光の吸光度と７８０ｎｍ（単量体に由来）の光の吸光度との比率が０．１以上であれば、粒子内でのＪ会合体と単量体との存在比は特に限定されない。好ましくは、波長８９５ｎｍの光の吸光度と７８０ｎｍの光の吸光度との比率が１．０以上、さらに好ましくは２．０以上、特に好ましくは、５．０以上である。なお、ＩＣＧのJ会合体は脱塩カラムなどで処理して脱塩体として使用しても良い。
本実施形態では、ＩＣＧのＪ会合体を用いることにより、粒子からのＩＣＧの漏出を防いでＩＣＧを粒子内に安定に保持させ、さらにはリンパ節等の測定対象部位へのＩＣＧの集積を高めることが可能になる。
【００２１】
（粒子）
本実施形態の粒子は、ＩＣＧのＪ会合体を含む粒子である。粒子は、ＩＣＧ以外に正帯電部位を有する脂質等の添加物を含んでいてもよいし、添加物を含まない粒子でもよい。ＩＣＧのＪ会合体が上記吸収比を満足するように含まれている限り、粒子はミセル、ポリマーミセル、リポソーム等でもよい。また、この粒子表面には界面活性剤が存在していてもよい。
このような粒子の例として、ＩＣＧのＪ会合体のみからなる粒子のほか、図１に示すようなＩＣＧのＪ会合体１と添加物としてのリン脂質２からなる粒子や、図２に示すようなＩＣＧのＪ会合体１を含むリポソーム３の表面に界面活性剤４を含む粒子等が挙げられる。
【００２２】
（粒径）
本実施形態に係る粒子の粒径は特に限定されることはない。ただし、造影剤、特にリンパ節用の造影剤として用いる場合、流体力学的平均粒子径を１０００ｎｍ以下とすることで、リンパ管や組織内部への取り込みやすさ（組織浸透性）とリンパ節や組織への滞留性を高めることが可能となる。
粒径が１０００ｎｍ以下の場合、ＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention、腫瘍血管の透過性亢進と腫瘍内滞留）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの粒子を集積させることができる。集積した粒子を、蛍光や光音響といった各種画像形成モダリティを用いて検出することによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、粒径が１０００ｎｍを超えると、リンパ管等の組織内への効率的な取り込みが期待できない。そのため、粒径は１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下とすることが好ましい。粒径は２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。粒子の粒径が２００ｎｍ以下であると、粒子が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
粒径は電子顕微鏡観察や動的光散乱法に基づく粒径測定法により測定することができる。動的光散乱法に基づいて粒径を測定する場合、動的光散乱解析装置（DLS-8000、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Dynamic Light Scattering, DLS）法によって流体力学的直径を測定する。
前述したように、ＩＣＧのＪ会合体は数μｍの粒径を有する。そのため、従来の知見によれば、ＩＣＧのＪ会合体はリンパ管内への効率的な取込みが期待できないものであった。しかし、本実施形態に係る実施例で実証されたように、後述する細孔フィルターによってろ過したり、後述するｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ法を用いたり、リポソーム等の粒子に含ませたりすることで、このような好ましいサイズの粒子を作成することができる。
【００２３】
（細孔フィルターによるサイズ制御）
先行文献に示されたようにＩＣＧのＪ会合体は数ミクロン、具体的には非常に多分散な平均粒子径３ミクロンのサイズを有する巨大粒子である。本実施形態に係る実施例では、このＩＣＧのＪ会合体の溶液を孔径１．２μｍの細孔フィルターで濾過することで１０００ｎｍ程度の粒子を得ることができることを明らかにした。しかし、孔径１．２μｍの細孔フィルターでろ過した場合、このＩＣＧのＪ会合体の多分散度指数としては０．４程度であり、分散性は悪い。したがって、本実施形態における粒子は、リンパ節用造影剤として用いたときの組織浸透性の観点からも、好ましくは、孔径０．４５μｍ以下、さらに好ましくは孔径０．２μｍ以下の細孔フィルターでろ過されることが好ましい。孔径０．２μｍ以下の細孔フィルターでろ過された場合、本実施形態における粒子のサイズは約３００ｎｍまでダウンサイジングすることができる。孔径０．２μｍ以下の細孔フィルターでろ過された粒子の粒子径分布は比較的狭くなり、多分散度指数としては０．２程度まで小さくできる。細孔フィルターは、所定の孔径を有する濾過膜であれば、特に限定されず、シリンジフィルターやエクストルーダーを使用して濾過することができる。この濾過膜としては、セルロースやポリカーボネートなどのタイプを適宜使用することができ、その孔径は０．０５〜０．４μｍ、好ましくは０．１〜０．２２μｍの範囲が望ましい。
【００２４】
（添加物）
本実施形態に係る粒子が含んでいてもよい添加物としては、正帯電部位を有する脂質等が挙げられる。ＩＣＧは親水性部位であるスルホン酸基を有する親水性色素であるが、正帯電部位を有する脂質を添加することにより、これらの添加物の有する正帯電部位がＩＣＧの親水性部位に会合し、ＩＣＧ（本実施形態においてはＩＣＧのＪ会合体）の疎水性を上げることができる。そのため、ＩＣＧをクロロホルム、ジクロロメタンなどの有機溶媒に可溶化することができると考えられる。
【００２５】
（正帯電部位を有する脂質）
正帯電部位を有する脂質とは、脂質のうちその構造の一部に、陽イオンの部分構造を有する脂質のことを言う。このような脂質の例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリン等のグリセロ脂質、スフィンゴミエリン、スフィンゴリン脂質及びスフィンゴシン等のスフィンゴ脂質、ノイラミン酸等のアミノ糖部分を有するスフィンゴ糖脂質等の糖脂質、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレン−Ｎ−ヒドロキシエチルアミン及び３−［（Ｎ−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール等の合成コレステロール類、ラウリルアミン、ステアリルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（略称DOTMA）及び２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（略称DOSPA）等の合成脂質、並びにエーテル型リン脂質及びカチオニック脂質等を挙げることができる。
【００２６】
また、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンの例としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン及びジアシルホスファチジルセリンなどが挙げられる。
【００２７】
また、正帯電部位を有する脂質は、さらにリン酸ジエステル結合を有することが好ましく、例えば、1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DSPE）、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DPPE）、1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DMPE）、1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DLPE）、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DOPE）、1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DLoPE）、1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DEPE）、1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine（DSPS）、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine（DPPS）、1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine（DMPS）、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine（DOPS）、1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DSPC）、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DPPC）、1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DMPC）、1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DLPC）、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DOPC）、1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DLoPC）などが挙げられる。
【００２８】
本実施形態における正帯電部位を有する脂質としては、他にも、1,2-di-o-acyl-sn-glycero-3-phosphocholine、1,2-diacyl-3-trimethylammonium propane chloride、o,o’-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolamine chloride、水素添加大豆ホスファチジルコリン（Hydrogenated Soy Phosphatidylcholine，ＨＳＰＣと略すことがある）等を使用することができる。
【００２９】
実施例で後述するように、本実施形態における粒子の調製時にリン脂質を使用することで、粒子のサイズを制御することができる。また、リン脂質をＩＣＧのＪ会合体の表面に吸着させることで、粒子の表面特性を変化させることができる。例えば、ＰＥＧ（Polyethylene glycol）化リン脂質をＩＣＧのＪ会合体の表面に吸着させることで、粒子の表面にＰＥＧを導入することができる。また、荷電リン脂質を用いることで表面電位を制御した粒子を得ることができる。
【００３０】
本実施形態に係る正帯電部位を有する脂質としては、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリンのうち少なくともいずれか一方であることが特に好ましい。
【００３１】
（リポソーム）
本実施形態においてリポソームとは、脂質、糖脂質、リン脂質、ステロール、ならびにそれらの組み合わせにより構成される単層リポソーム及び多重層リポソームを意味する。異なる脂質の混合物から構成されていてもよく、また脂質の誘導体、たとえばポリエチレングリコール結合リン脂質なども使用することができる。リポソームの調製方法は、従来公知の方法を利用でき、適宜選択して望ましい物性のリポソームを得ることができる。脂質の種類や量などは、リポソームの用途に応じて適宜選択することができる。例えば、脂質量や比率、脂質の荷電を考慮することで、リポソームの粒径や表面電位を制御することができる。
【００３２】
本実施形態のリポソームにおける好ましい中性リン脂質の例としては、大豆あるいは卵黄レシチン、リゾレシチン、またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体である。その他にも、半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジルイノシトール（PI）、スフィンゴミエリンも挙げられる。また、合成されたホスファチジン酸（PA）などのアルキルあるいはアルケニル誘導体も使用でき、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）などが挙げられる。
【００３３】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリドなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などが挙げられる。
【００３４】
脂質以外のリポソーム膜構成分子として、必要に応じ他の分子を加えることもできる。例として、膜安定化剤として作用するコレステロール類、エチレングリコールなどのグリコール類、デキストランなどの糖類、電荷制御のために添加されるリン酸ジアルキルエステル類、ステアリルアミンなどの脂肪族アミンが例示される。
【００３５】
（リポソームへのＩＣＧの内包）
本実施形態において粒子がＩＣＧを含有するというとき、リポソームにＩＣＧが内包される場合も含む。リポソーム内に内包されるＩＣＧ（本実施形態においてはＩＣＧのＪ会合体）は水溶性物質であり、典型的にはリポソームの内水相に内包される。しかし、ＩＣＧはリン脂質との親和性を有していることやＩＣＧ同士の多量体化を起こしやすいことから、リポソーム膜表面や脂質二重膜内の局在も起こりえる。本実施形態では上記３通りの場合、すなわち、「リポソーム内水相への内包」、「リポソームの膜内への局在」ならびに「リポソーム表面への局在」をあわせて「内包」という。
【００３６】
（界面活性剤）
本実施形態に係る界面活性剤としては、特に限定されることはなく、粒子のエマルジョンを形成することができればいかなるものでもよい。例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤又はリン脂質等を使用することができる。これらの界面活性剤は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。上記本実施形態における界面活性剤に使用する非イオン性界面活性剤としては、Tween20、Tween40、Tween60、Tween80及びTween85等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Brij35、Brij58、Brij76、Brij98、Triton X-100、Triton X-114、Triton X-305、Triton N-101、Nonidet P-40、Igepol CO530、Igepol CO630、Igepol CO720並びにIgepol CO730等を挙げることができる。
【００３７】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するアニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等を挙げることができる。
【００３８】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するカチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等を挙げることができる。
【００３９】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用する高分子界面活性剤としては、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール及びゼラチン等を挙げることができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールの市販品としては、プルロニックF68（シグマアルドリッチジャパン社製）、プルロニックF127（シグマアルドリッチジャパン社製）などが挙げられる。
【００４０】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するリン脂質としては、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基又はマレイミド基のいずれかの官能基を有するホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。また、界面活性剤に使用するリン脂質はＰＥＧ鎖を含むものであってもよい。
腫瘍へのパッシブターゲティングの原理として提唱されているＥＰＲ効果を生じさせるためには、高い血中滞留性を有することが造影剤には求められる。ポリエチレングリコールは血中タンパク質との相互作用を抑制することで肝臓などの細網内皮系細胞に貪食され難くなり、粒子の血中滞留性を向上させることができるため、本実施形態の粒子へのポリエチレングリコールの導入は非常に有益である。
【００４１】
ポリエチレングリコールの分子量や粒子への導入率を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。その分子量が５００から２０００００のポリエチレングリコールの使用が好ましく、特に２０００から１０００００が好適である、また粒子へのポリエチレングリコール導入率は、該粒子を構成する脂質に対して０．００１〜５０モル％、好ましくは０．０１〜３０モル％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。
【００４２】
粒子へのポリエチレングリコール導入方法は、公知の技術を利用することができる。好ましい例としては、粒子を被覆するリン脂質類の中に、予めポリエチレングリコール結合リン脂質などを含めて粒子を作製する方法である。ポリエチレングリコール結合リン脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミンのポリエチレングリコール誘導体、たとえばジステアロイルホスファチルジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）などがある。
【００４３】
官能基が水酸基、メトキシ基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基でありＰＥＧ鎖を含むような界面活性剤に使用するリン脂質としては、例えば、化学式２で示される1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[poly(ethylene glycol)] （DSPE-PEG-OH）、化学式３で示されるPoly(oxy-1,2-ethanediyl),α-[7-hydroxy-7-oxido-13-oxo-10-[(1-oxooctadecyl)oxy]-6,8,12-trioxa-3-aza-7-phosphatriacont-1-yl]-ω-methoxy- （DSPE-PEG-OMe）、化学式４で示されるN-(aminopropyl polyethyleneglycol)-carbamyl distearoylphosphatidyl-ethanolamine（DSPE-PEG-NH2）、化学式５示される3-(N-succinimidyloxyglutaryl) aminopropyl polyethyleneglycol-carbamyl distearoylphosphatidyl-ethanolamine（DSPE-PEG-NHS）、化学式６で示されるN-(3-maleimide-1-oxopropyl) aminopropyl polyethyleneglycol-carbamyl distearoylphosphatidyl-ethanolamine（DSPE-PEG-MAL）等のリン脂質を挙げることができる。なお、化学式２乃至６において、ｎは５以上５００以下の整数である。
【化２】
2014129318.tif 000003
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【００４４】
なお、本実施形態において用いる界面活性剤は１種類に限定されることはなく、２種類又はそれ以上の種類の界面活性剤を同時に用いてもよい。
【００４５】
（捕捉分子）
本実施形態おいて、上記の粒子の一部に、捕捉分子を固定化することにより、標的部位を特異的に標識することができる。
捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。
捕捉分子が化学結合された粒子を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。例えば、捕捉分子として腫瘍に特異的に結合する物質を採用すれば、腫瘍の特異的検出が可能となる。また捕捉分子として、特定の疾病部位の周辺に多く存在するタンパク質や酵素などの生体物質に特異的に結合する物質を用いれば、その疾病を特異的に検出することが可能である。なお、本実施形態に係る粒子によれば、捕捉分子を持たない場合でも、ＥＰＲ効果によって腫瘍を検出することは可能である。
【００４６】
（捕捉分子の固定化）
粒子に捕捉分子を固定化する方法としては、用いる捕捉分子の種類にもよるが、含有粒子に捕捉分子を化学結合させることができる限り、いかなる公知の方法をも使用することができる。例えば、前記した界面活性剤が有する官能基と捕捉分子の官能基とを反応させて化学結合する方法等を使用することができる。
例えば、界面活性剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、アミノ基を有する捕捉分子と反応させて、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基は、グリシン、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
また、界面活性剤がマレイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、チオール基を有する捕捉分子と反応させて、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のマレイミド基は、Ｌ−システイン、メルカプトエタノール、又は末端にチオール基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
また、界面活性剤がアミノ基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、グルタルアルデヒドを用いて捕捉分子のアミノ基と反応させ、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等を反応させて未反応のアミノ基の活性をブロックすることが好ましい。あるいは、界面活性剤のアミノ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド基やマレイミド基に置換して、捕捉分子を固定化しても良い。
【００４７】
（粒子の製造方法）
本実施形態に係る粒子の製造方法は、ＩＣＧをＪ会合体とするステップと、ＩＣＧを含む粒子を調製するステップとを含む。本実施形態の粒子が得られる限り、これらのステップの順序は問わない。
【００４８】
（ＩＣＧをＪ会合体とするステップ）
ＩＣＧは、限定されることはないが、例えば下記「方法（１）」「方法（２）」「方法（３）」の方法でＪ会合体とすることができる。
【００４９】
方法（１）について
ＩＣＧの水溶液（ＩＣＧ濃度＝１．５ｍＭ）を暗所、６５度で３２時間加温する。次に、このＩＣＧ溶液を室温で５日間、暗所で保存することで、安定なＩＣＧのＪ会合体が形成される（非特許文献２、３及び４）。このＪ会合体は、数μｍの平均粒径を有する多量体であり、８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大をもつ。ＩＣＧをＪ会合体とするステップは、ＩＣＧを含む粒子を調製する前後、あるいは、粒子を調製しているときのいずれのタイミングで行ってもよい。このＩＣＧのＪ会合体を含む溶液を細孔フィルターによってろ過することで、数百ナノメートルの平均粒径の粒子を得ることができる。
【００５０】
方法（２）について
後述するナノエマルション法等により得られたＩＣＧ含有粒子を３７度で１２時間加温することにより、ＩＣＧのＪ会合体を含有する粒子を得ることができる。このようにして得られたＪ会合体含有粒子は粒子径が２００ｎｍ以下の平均粒径を有しており、８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大をもつ。
【００５１】
方法（３）について
後述するpH勾配法にてＩＣＧをリポソームに内包させることにより、ＩＣＧのＪ会合体を含有する粒子を得ることができる。このようにして得られたＪ会合体含有粒子は粒子径が約１００ｎｍの平均粒径を有しており、８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大をもつ。
【００５２】
（ＩＣＧを含む粒子を調製するステップ）
ＩＣＧを含む粒子も、公知の方法で調製することができる。
以下に、本実施形態に係る粒子の製造方法の非限定的な例を挙げる。
【００５３】
（ＩＣＧのＪ会合体を細孔フィルターでろ過する製造例）
まず、ＩＣＧの水溶液（ＩＣＧ濃度＝１．５ｍＭ）を暗所、６５度で２４時間加温する。次に、このＩＣＧ溶液を室温で５日間、暗所で保存することで、安定なＩＣＧのＪ会合体が形成される。次に、本実施形態に係る実施例で明らかにされたように、ＩＣＧのＪ会合体の水溶液を、孔径０．１μｍの細孔フィルターでろ過し、ろ液を回収することで、約３００ナノメートルの粒子を調製することができる。なお、ＩＣＧ水溶液を加温するときに、リン脂質、例えばＨＳＰＣやＤＳＰＣを３ｍＭになるように加えて粒子を調製してもよいし、ＩＣＧをＪ会合体とした後にリン脂質を添加して粒子を調製してもよい。本実施形態で得られる粒子は、従来の製造方法では取得不可能であった、数百ナノメートルの粒子径であることが特徴である。特に、ＩＣＧ水溶液を加温するときに、ＨＳＰＣを添加して得られる粒子は、ＩＣＧのＪ会合体を含む約３０ナノメートルの粒子であり、本実施形態の製造方法にでは、数十ナノメートルレベルまで粒子径のダウンサイジングが可能である。
【００５４】
（添加物を含む粒子の製造例）
添加物を含む粒子の場合、例えばナノエマルジョン法で調製することができる。ナノエマルジョン法により製造する工程の一例としては下記の通りである。
具体的には、以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程によりＩＣＧを含有する粒子の水分散液を得ることができる。
（Ａ）ＩＣＧおよび添加物を有機溶媒に溶解させて得られる第一液体を、界面活性剤を溶解させた水溶液である第二液体に加えて混合液を得る工程。
（Ｂ）前記混合液を乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョンを得る工程。
（Ｃ）前記エマルジョンの分散質から第一液体を留去する工程。
２種類以上の界面活性剤を用いる場合、あるいは界面活性剤を用いない場合は上記（Ａ）の工程で任意の組成を有する水溶液を第二液体として用いればよい。
【００５５】
（第一液体）
前記ナノエマルジョン法に用いる第一液体の溶媒として使用する有機溶媒としては、水への溶解性がないか又は溶解性が小さく、且つ、ＩＣＧと添加物からなる組成物を溶解することができるものであればいかなる有機溶媒をも使用することが可能である。ただし、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
このような有機溶媒としては、限定されるものではないが、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（エチルエーテル、イソブチルエーテル等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、及び芳香族炭化水素（ベンゼン、トルエン、キシレン等）等を用いることができる。これらの有機溶媒は単独で用いても良いし、あるいは２種類以上を適宜の割合で混合して用いることもできる。
また、第一液体におけるＩＣＧの濃度は、０．０００５〜１００ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。 
また、第一液体におけるＩＣＧと添加物との重量比は、１０：１〜１：２０の範囲であることが好ましい。
【００５６】
（第二液体）
上記ナノエマルジョン法に用いる第二液体は水溶液、より好ましくは界面活性剤を溶解した水溶液である。第二液体に界面活性剤をあらかじめ含ませておくと、第一液体と混合した際にエマルジョンを安定化させることができる。但し、本実施形態においては第一液体と第二液体とを混合した分散液に界面活性剤を含ませることができればよく、界面活性剤は必ずしも第二液体に予め溶解されている必要はない。
また、第二液体に含まれる界面活性剤の好ましい濃度は、用いる界面活性剤の種類及び第一液体との混合比にもよる。例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は高分子界面活性剤を用いたときは、第二液体中の濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。また、例えば、ＰＥＧ鎖を含むリン脂質を界面活性剤として用いたときは、第二液体中の濃度を０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。
また、２種類の界面活性剤（界面活性剤Ａおよび界面活性剤Ｂ）を用いる場合において、界面活性剤Ａとして非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は高分子界面活性剤を、界面活性剤ＢとしてＰＥＧ鎖を含むリン脂質を用いた場合の界面活性剤Ａと界面活性剤Ｂとの構成比は、モル比で１００：１〜１：１の範囲が好ましい。界面活性剤Ａと界面活性剤Ｂの構成比がこの範囲を超えると、ＩＣＧを含有する粒子の形成が困難になる為、好ましくない。一方、界面活性剤の構成比がこの範囲よりも小さくなると、捕捉分子を固定化する場合、固定化できる捕捉分子の個数が少なくなる。その結果、ＩＣＧを含有する粒子の標識性能が低下する為、好ましくない。 
【００５７】
（エマルジョン）
上記ナノエマルジョン法におけるエマルジョンは、本発明の目的を達成可能であればいかなる物性のエマルジョンでもよいが、１ピークの粒径分布を有し、且つ、平均粒径が１０００ｎｍ以下、より好ましくは５００ｎｍ以下、さらに好ましくは２００ｎｍ以下のエマルジョンであることが好ましい。
このようなエマルジョンは、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機及びタービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、並びにコロイドミル法、ホモジナイザー法及び超音波照射法等の従来公知の乳化手法によって調製することが可能である。これらの方法は単独で用いてもよいし、あるいは２種以上の方法を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルジョンは１段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、乳化手法は、本発明の目的を達成できる範囲においてこれらの手法に限定されるものではない。
エマルジョンは、第二液体に第一液体を加えて得られる混合液から調製される水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンである。ここで、第一液体と第二液体の混合とは、第一液体と第二液体とを空間的に隔離せずに互いに接触して存在させることを意味し、必ずしも互いに混和することを要さない。
混合液における第一液体と第二液体との割合は、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンを形成することができれば特に限定されることはないが、好ましくは、第一液体と第二液体との重量比が、１：２〜１：１０００となる範囲で混合することが好ましい。
【００５８】
（留去）
上記ナノエマルジョン法における留去とは、エマルジョンの分散質から第一液体を除去する操作である。即ち、ＩＣＧ、添加物、第一液体（有機溶媒）から構成された分散質から第一液体を除去することである。
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。加熱による除去の場合の加熱温度は、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを維持できれば特に限定されないが、好ましい温度は０℃から８０℃の範囲である。但し、留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
ＩＣＧをＪ会合体形成させるステップについては限定されるものではないが、例えば粒子の加温や超音波照射等を単独あるいは組み合わせて行うことができる。粒子の加温条件は、ＩＣＧのＪ会合体形成において公知の温度条件を用いてもよいが、本発明者らは３７℃でのＪ会合体形成を確認している。なお、ＩＣＧのＪ会合体形成は粒子化後に行ってもよいし、粒子化する前に行ってもよい。
【００５９】
（リポソームの調製方法）
本実施形態に係るリポソームの調製方法の一例として、ＩＣＧをリポソームに内包させ、その後、リポソーム内のＩＣＧをＪ会合体化させる方法、及びＩＣＧのＪ会合体をリポソームに内包させる方法の２つの方法が挙げられる。
リポソームは、公知のリポソーム製造方法により調製することができる。公知の技術としては、Bangham (J.Mol. Biol.、 13、 238(1965))らの方法、その変法（特開昭５２−１１４０１３号公報、特開昭５９−１７３１３３号公報、特開平２−１３９０２９号公報、特開平７−２４１４８７号公報）、超音波処理法（Biochem. Biophys. Res. Commun.、94、 1367(1980))、エタノール注入法(J. Cell. Biol.、 66、 621(1975)）、コール酸（界面活性剤）法（Biochim. Biophys. Acta、 455、 322(1976))、凍結融解法（Arch.Biochem. Biophys.、 212、 186(1981)）、逆相蒸発法（Pro. N. A.S. USA、 75、 4194(1978))、ならびに市販のキットを用いた方法などが挙げられ、これら公知の方法により調製されるリポソームを本実施形態で用いることができる。すなわち、リポソーム調製時あるいは後にＩＣＧを内包化させ、その後、必要に応じて加温や超音波処理によりＩＣＧをＪ会合体化させることができる。
【００６０】
本実施形態のＩＣＧのＪ会合体を内包するリポソームの製造方法の好ましい例は、Banghamらにより報告されたリポソーム作製方法に従うものである。すなわち、リン脂質などのリポソームの原料と高濃度のＩＣＧを有機溶媒に溶解、混合して、有機溶媒を減圧下で除去して脂質とＩＣＧを乾固させ、これを水系媒体で分散させ、超音波照射により均一化させることでリポソームを形成させるものである。その後、ＩＣＧをＪ会合体化するため、リポソーム溶液を加温あるいは超音波処理することもできる。リポソーム内でのＩＣＧのＪ会合体化は、リポソームの調製時あるいは調製後における加温や超音波照射により活性化されたＩＣＧが会合することによるものと考えられる。
【００６１】
あるいは以下のＪ会合体を内包するリポソームの製造例も挙げることができる。リン脂質などのリポソームの原料を有機溶媒に溶解、混合し、有機溶媒を減圧下で除去して溶質を乾固させる。これを中性緩衝液で分散させ、超音波照射により均一化させることでリポソームを形成させることにより、リポソーム内部に中性緩衝液を含むリポソームを調製する。その後、リポソーム外側の緩衝液を酸性緩衝液に置換することにより、リポソーム内側が中性、外側が酸性のｐＨ勾配を持ったリポソーム分散液を調製する。このリポソーム分散液に酸性緩衝液に溶解したＩＣＧ溶液を添加し、原料リン脂質の転移温度以上で３０分間加温撹拌することによりＪ会合体化したＩＣＧをリポソームに内包することができる。
ｐＨ勾配を利用した薬剤のリポソームへの内包方法は特表２００６−５０９７６９に記載されており、塩基性薬剤のリポソーム内への内包に有効である。しかしＩＣＧは酸性薬剤であるため、この文献とは逆のｐＨ勾配をもつリポソームを調製した。この条件でＩＣＧを内包させたところ、内包されたＩＣＧがほとんどＪ会合体化することがわかった。
【００６２】
一方、予めＩＣＧをＪ会合体化させておき、これを上記の公知のリポソーム調製方法により、ＩＣＧのＪ会合体をリポソーム内に内包させることもできる。ＩＣＧのＪ会合体の調製方法は、Chemical Physics,Volume 220, 1997, Pages 385-392に記載されており、例えば、ＩＣＧの水溶液（ＩＣＧ濃度＝１．５ｍＭ）を暗所、６５度で３２時間加温し、このＩＣＧ溶液を室温で５日間、暗所で保存することで、安定なＩＣＧのＪ会合体を調製することができる。得られたＩＣＧのＪ会合体を、上記の公知のリポソーム調製時あるいは調製後に内包化させることで、本実施形態のリポソームが得られる。
【００６３】
このようにしてＩＣＧのＪ会合体が内包されたリポソームを遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過などにより精製することで本実施形態のリポソームが調製される。本実施形態のＩＣＧのＪ会合体を内包するリポソームの調製において重要なポイントは、ＩＣＧをＪ会合体化させるためのＩＣＧの高濃度環境かつ加温や超音波処理による会合体形成のための刺激負荷のふたつである。非特許文献２、３で示されているように、溶液中のＩＣＧの濃度は少なくとも０．１ｍＭ以上、好ましくは１．０ｍＭ以上であり、加温は少なくとも２０℃、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは６５℃以上である。しかし、９０℃では色素の分解が促進されることから、好ましい加温温度範囲は、３７℃から６５℃である。超音波処理は色素が分解されない条件であれば特に制限されないが、例えば、２８ｋＨｚで３０分間、６０℃の条件、あるいは２８ｋＨｚで６０分間、６０℃の条件である。
【００６４】
（造影剤）
本実施形態に係る粒子はＩＣＧのＪ会合体を含んでおり、近赤外光を吸収して蛍光又は音響波を発することができるため、蛍光イメージング用又は光音響イメージング用の造影剤として用いることができる。また、ＩＣＧのＪ会合体は深緑色に着色しているため、目視で検出するための造影剤としても使用できる。
【００６５】
ここで、本明細書において「造影剤」とは、主に、検体内にあって観察したい組織や分子とその周囲の組織や分子とのコントラスト差を生じさせ、当該観察したい組織や分子の形態情報あるいは位置情報の検出感度を向上させることができる物質と定義する。ここで「蛍光イメージング」や「光音響イメージング」とは、上記の組織や分子を蛍光検出装置あるいは光音響信号検出機装置などによって、イメージングすることを意味する。
【００６６】
本実施形態に係る造影剤は、本実施形態に係る粒子及び前記粒子が分散された分散媒を有する。分散媒は、本実施形態に係る粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。また、造影剤は、食塩やグルコースなどの薬理上許容できる添加物を有していても良い。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００６７】
（蛍光イメージング法）
本実施形態に係る造影剤は、蛍光イメージング法に用いることもできる。本実施形態に係る造影剤を用いた蛍光イメージング法は、本実施形態に係る造影剤を検体もしくは前記検体から得られる試料に投与する工程と、前記検体もしくは前記検体から得られる試料に光を照射する工程と、前記検体内もしくは前記検体から得られる試料内に存在する前記粒子由来物質の蛍光を測定する工程と、を少なくとも有することを特徴とする。
【００６８】
本実施形態に係る造影剤を用いた蛍光イメージング法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、前記検体とは、ヒト、実験動物やペット等、その他、特に限定されることなく、あらゆる生物を指し、前記検体中もしくは検体より得られた試料としては、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。前記粒子の投与あるいは添加後、前記検体等に対し近赤外波長域の光を照射する。
【００６９】
本実施形態に係る光音響イメージング法において、照射される光の波長は使用するレーザー光源により選択することが可能である。本実施形態に係る蛍光イメージング法においては、効率良く音響信号を取得するために、生体内における光の吸収、拡散の影響が少ない「生体の窓」と呼ばれる６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの、近赤外光領域の波長の光を照射することが好ましい。
【００７０】
本実施形態に係る造影剤からの蛍光を蛍光検出器で検出し、電気信号に変換する。この蛍光検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の内の吸収体の位置や大きさを計算することができる。例えば、造影剤が基準とする閾値以上で検出されれば、その検体に前記粒子由来物質が存在すると推定され、又は、前記検体より得られた試料に前記粒子由来の物質が存在すると推定することができる。
【００７１】
本実施形態に係る造影剤を検体に投与した場合、リンパ節、特にがん原発巣からリンパ管に流入したがん細胞が最初に到達するセンチネルリンパ節を好適に検出することできる。この場合、腫瘍内あるいは腫瘍周辺にリンパ節用造影剤を注射し、注射後の適切な時間に造影剤の検出を行う。
【００７２】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る造影剤は、光音響イメージング法に用いることができる。なお、本明細書において、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。本実施形態に係る造影剤を用いた光音響イメージング法は、本実施形態に係る造影剤を検体もしくは前記検体から得られる試料に投与する工程と、前記検体もしくは前記検体から得られる試料にパルス光を照射する工程と、前記検体内もしくは前記検体から得られる試料内に存在する前記粒子由来物質の光音響信号を測定する工程と、を少なくとも有することを特徴とする。
【００７３】
本実施形態に係る造影剤を用いた光音響イメージング法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、前記検体とは、ヒト、実験動物やペット等、その他、特に限定されることなく、あらゆる生物を指し、前記検体中もしくは検体より得られた試料としては、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。前記粒子の投与あるいは添加後、前記検体等に対し近赤外波長域のレーザーパルス光を照射する。
【００７４】
本実施形態に係る光音響イメージング法において、照射される光の波長は使用するレーザー光源により選択することが可能である。本実施形態に係る光音響イメージング法においては、効率良く音響信号を取得するために、生体内における光の吸収、拡散の影響が少ない「生体の窓」と呼ばれる６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの、近赤外光領域の波長の光を照射することが好ましい。
【００７５】
本実施形態に係る造影剤からの光音響信号（音響波）を、音響波検出器、例えば圧電トランスデューサで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の内の吸収体の位置や大きさ、あるいはモル吸光係数などの光学特性値分布を計算することができる。例えば、造影剤が基準とする閾値以上で検出されれば、その検体に前記粒子由来物質が存在すると推定され、又は、前記検体より得られた試料に前記粒子由来の物質が存在すると推定することができる。
【００７６】
本実施形態に係る造影剤を検体に投与した場合、リンパ節、特にがん原発巣からリンパ管に流入したがん細胞が最初に到達するセンチネルリンパ節を好適に検出することできる。この場合、腫瘍内あるいは腫瘍周辺にリンパ節用造影剤を注射し、注射後の適切な時間に造影剤の検出を行う。
【００７７】
本実施形態では、色素の漏出を抑制することで、色素の集積による消光を起こさせ、照射されたパルス光のエネルギーが蛍光発光に用いられることを防ぎ、より多くの熱エネルギーに変換することができる。そのため、より効率的に音響信号を取得することが可能となる。
【００７８】
（実施形態２）
本発明の実施形態に係る粒子の別の例は、波長７００ｎｍ（ＩＣＧのＨ会合体に由来）と７８０ｎｍ（ＩＣＧの単量体に由来）との吸収比（本実施形態において、７００/７８０比ともいう）が１以上の高い値を示すＩＣＧ内包粒子は、血清中でもＩＣＧ保持率が高く保たれるという新たな知見に基づくものである。
したがって、７００/７８０比が１以上であるＩＣＧ内包粒子を調製することにより、血清中でのＩＣＧ漏出が抑えられた、ＩＣＧ内包粒子を使った造影剤を提供することができる。
ＩＣＧの単量体の最大吸収波長は約７８０ｎｍであるが、Ｈ会合体を形成すると約７００ｎｍに短波長シフトすることが知られている。したがって、粒子の７００/７８０比が高い場合、脂質粒子内に内包されるＩＣＧはＨ会合体を形成していると推測される。
リポソームによる本発明の粒子の一例を図１０に示す。膜１０３で覆われたリポソームにＨ会合体のＩＣＧ１０１が内包される。ここでは膜１０３はリン脂質による二重膜だが、その他の成分からなる膜であってもよい。Ｈ会合体のＩＣＧ１０１はリポソームの内水相１０４に内包されるが、膜１０３の内部や表面に存在していてもよい。また、すべてのＩＣＧがＨ会合体である必要はなく、７００/７８０比が１以上であれば、Ｈ会合体以外、例えば単量体のＩＣＧ１０２が存在してもよい。
【００７９】
（粒子）
本実施形態において粒子とは少なくともリン脂質およびコレステロールを含む粒子であり、脂質が膜の主要な構成要素であるような脂質小胞あるいはリポソームも含まれる。通常リポソームは主にリン脂質から構成される二重膜が一枚あるいは多層の膜から構成される脂質小胞を意味するが、本実施形態でいう粒子は、少なくともリン脂質およびコレステロールを含む粒子全般を含む。本発明者らの知見によれば、本実施形態の粒子においては、コレステロールがＨ会合体の形成および粒子の安定化に寄与することで、７００/７８０比を高めていると考えられる。なお、ＩＣＧが膜に入り込み膜の秩序性が乱れていても、下記に示す粒子サイズの範囲で分散媒に分散していれば、本実施形態でいう粒子に含まれる。また粒子は脂質、糖脂質、ステロール誘導体、脂質誘導体またはそれらの組み合わせを構成成分に含んでもよい。粒子は、脂質を主要な構成要素とする脂質粒子であることが好ましい。このとき、粒子膜および上記その他の構成成分は異なる脂質の混合物から構成されていてもよい。また脂質誘導体として、たとえばポリエチレングリコール結合リン脂質なども使用することができる。
粒子は、その表面に界面活性剤を含んでいてもよく、また、粒子の一部に捕捉分子を固定化することにより、標的部位を特異的に標識することもできる。
粒子は、従来公知の方法で調製してよく、望ましい物性の粒子を得るために適宜、調製方法を選択することができる。脂質等の構成成分の種類や量などは、粒子の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、脂質粒子の場合、脂質の種類、脂質量、その比率、脂質の荷電を考慮することで、粒子の粒径（以下、粒子直径の平均値を「粒径」という）や表面電位を制御することができる。
本実施形態の粒子における好ましいリン脂質の例としては、合成されたジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）が挙げられるが、その他の合成されたホスファチジン酸（ＰＡ）などのアルキルあるいはアルケニル誘導体も使用でき、例えば、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）なども挙げられる。
その他のリン脂質として、大豆あるいは卵黄レシチン、リゾレシチン、またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体、あるいは半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリンも挙げられる。
構成成分に含まれる糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリドなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などが挙げられる。
粒子の構成材料として、必要に応じ他の材料を加えることもできる。例として、膜安定化剤として作用するエチレングリコールなどのグリコール類、電荷制御のために添加されるリン酸ジアルキルエステル類、ステアリルアミンなどの脂肪族アミンが例示される。
【００８０】
（粒子へのＩＣＧの内包）
粒子内に内包されるＩＣＧは水溶性物質であるため、例えばリポソーム状の脂質粒子であれば、典型的には内水相に内包される。また、粒子内部をポリマー等で充填して、ＩＣＧを粒子内に内包することもできる。しかし、ＩＣＧはリン脂質との親和性を有していることから、脂質膜表面や脂質二重膜内に存在することも起こり得る。本実施形態では上記３通りの場合、すなわち、「粒子内への内包」、「粒子の膜内に存在」ならびに「粒子表面に存在」を併せて「内包」という。
本実施形態に係る粒子は、ＩＣＧを内包する粒子であって、そのＩＣＧのＨ会合体形成割合が高いことが推測される。
本実施形態においてＩＣＧのＨ会合体は、ＩＣＧの多量体を指すが、ＩＣＧの単量体が含まれていてもよい。すなわち、本実施形態に係るＩＣＧ内包脂質粒子の波長７００ｎｍ（Ｈ会合体に由来）と７８０ｎｍ（単量体に由来）との吸収比が１以上であれば、特にその存在比は限定されない。
【００８１】
（７００/７８０比が１以上を示すＩＣＧ内包粒子の調製方法）
本実施形態に係る粒子の調製方法は、特に限定されることはなく、例えば公知のリポソーム製造方法により調製することができる。例えばバンガム法（単純水和法、ソニケーション法、エクストルージョン法）、ｐＨ勾配（リモートローディング）法対イオン濃度勾配法、凍結融解法、逆相蒸発法、メカノケミカル法、超臨界二酸化炭素法およびフィルムローディング法などが挙げられ、また市販の中空リポソームを用いた方法などが挙げられ、これら公知の方法により調製される粒子を本実施形態に供することができる。
ＩＣＧは、溶液内での濃度が高くなることによりＨ会合体を形成することがわかっているが、本実施形態はコレステロールおよび任意的に付加するデキストランにより、溶液内のＩＣＧ濃度を高めることなく、Ｈ会合体の形成を示す１以上の７００/７８０比を達成できると考えられる。
本実施形態の７００/７８０比が１以上を示すＩＣＧ内包粒子の製造方法の好ましい一例は、バンガム法によるリポソーム作製方法に従うものである。すなわち、リン脂質などの粒子の原料と高濃度のＩＣＧを有機溶媒に溶解、混合して、有機溶媒を減圧下で除去して粒子の原料を乾固させ、これを水系媒体で分散させ、超音波照射により均一化させることでリポソームを形成させるものである。このとき水系媒体にデキストランを添加することにより７００/７８０比を高めることができる。
本実施形態の７００/７８０比が１以上を示すＩＣＧ内包粒子の製造方法の好ましい別の例として、逆相蒸発法に準じた調製方法も挙げられる。すなわち、リン脂質などの粒子の原料と高濃度のＩＣＧを水と自由混合しにくい有機溶媒（例えばクロロホルムなどが挙げられる）に溶解し、水系媒体に滴下し、超音波照射によりＯ／Ｗエマルションを調製する。その後有機溶媒を減圧下で除去し、後述の実施例に記した精製工程を経て、ＩＣＧ内包脂質粒子を調製することができる。逆相蒸発法でのリポソームの調製は通常Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを用いるが、本実施形態ではＯ／ＷエマルションでもＩＣＧ内包粒子が作成できることがわかった。この方法では水系媒体にデキストランを添加しなくとも７００／７８０比が１以上のＩＣＧ内包粒子を調製できた。しかし水系媒体にデキストランを添加することにより７００/７８０比をさらに高めることができた。
なお、水と自由混合しにくい有機溶媒とは、ＩＣＧとリン脂質やコレステロールなどの粒子の原料との混合物を溶解することができ、水への溶解性がないか又は溶解性が小さい有機溶媒である。このような有機溶媒の具体例として、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）が挙げられる。疎水性溶媒は一種類で用いても良いし、あるいは２種類以上適宜の割合で混合して用いることもできる。但し、上記具体例に限定されるものではない。
【００８２】
（粒子サイズ）
本実施形態に係る粒子の粒径は特に限定されることはない。ただし、造影剤、特にリンパ節用の造影剤として用いる場合、流体力学的平均粒子径を１０００ｎｍ以下とすることで、リンパ管や組織内部への取り込みやすさ（組織浸透性）とリンパ節や組織への滞留性を高めることが可能となる。
粒径が１０００ｎｍ以下の場合、ＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention、腫瘍血管の透過性亢進と腫瘍内滞留）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの粒子を集積させることができる。集積した粒子を、蛍光や光音響といった各種画像形成モダリティを用いて検出することによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、粒径が１０００ｎｍを超えると、リンパ管等の組織内への効率的な取り込みが期待できない。そのため、平均粒径は１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下とすることが好ましい。平均粒径は２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがさらに好ましく、２０から１００ｎｍであることが特に好ましい。粒子の粒径が２００ｎｍ以下であると、粒子が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
粒径は電子顕微鏡観察や動的光散乱法に基づく粒径測定法により測定することができる。動的光散乱法に基づいて粒径を測定する場合、動的光散乱解析装置（DLS-8000、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Dynamic Light Scattering, DLS）法によって流体力学的直径を測定する。
【００８３】
（デキストラン）
本明細書においてデキストランは、下記の化学式７で示される化合物を表す。
【化７】
2014129318.tif 000008
ｎの違い、すなわちデキストランの分子量の違いによって、デキストラン４０（分子量４０ｋＤａ）、デキストラン７０（分子量７０ｋＤａ）とよび方が異なる。
本実施形態に係る粒子は、前記粒子を調製するときに用いる水系媒体にデキストランが溶解されていることが好ましい。デキストランは水系溶媒に溶解できれば使用可能であるが、好ましい分子量は２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、最適なデキストランとして日本薬局法収載のデキストラン４０（分子量４０ｋＤａ）とデキストラン７０（分子量７０ｋＤａ）を挙げることができる。
粒子調製時に用いるデキストラン濃度として水系媒体に１.５重量％以上、効果的なのは２．６重量％以上、最も効果が高かったのは１３重量％の濃度のデキストランを添加することにより７００/７８０比を高めることができる。
【００８４】
（ＩＣＧ保持率）
本実施形態において、ＩＣＧの粒子からの漏出のしにくさは、粒子を血清溶液中に３７℃で２４時間インキュベートした後のＩＣＧ保持率によって定量することができる。ＩＣＧ保持率とは、漏出せずに粒子内に残存するＩＣＧの割合を示し、後述の実施例に記載するように、２４時間のインキュベート後に粒子から溶媒中に漏出したＩＣＧの割合を、溶液の波長６５０〜９００ｎｍ間の吸光スペクトルの積分値と、遠心分離により粒子を沈殿した後の上澄みの波長６５０〜９００ｎｍ間の吸光スペクトルの積分値と、から求めたものである。
本実施形態の粒子は、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上のＩＣＧ保持率を有する。
【００８５】
（ポリエチレングリコール）
本実施形態に係る粒子は、膜表面にポリエチレングリコールが導入されていることが好ましい。本実施形態の粒子の用途の例として、腫瘍造影剤が挙げられる。腫瘍へのパッシブターゲティングの原理として提唱されているＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、腫瘍血管の透過性亢進と腫瘍内滞留）効果を生じさせるためには、高い血中滞留性を有することが造影剤には求められる。ポリエチレングリコールは補体等の血中タンパク質との相互作用を抑制することで肝臓などの細網内皮系細胞に貪食され難くなり、粒子の血中滞留性を向上させることができるため、本実施形態の脂質粒子へのポリエチレングリコールの導入は非常に有益である。
ポリエチレングリコールの分子量や粒子への導入率を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。その分子量が５００から２０００００のポリエチレングリコールの使用が好ましく、特に２０００から１０００００が好適である、また脂質粒子へポリエチレングリコールを導入する場合、好ましい導入率は、該脂質粒子を構成する脂質に対して０．００１〜５０モル％、さらに好ましくは０．０１〜３０モル％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。
粒子へのポリエチレングリコール導入方法は、公知の技術を利用することができる。好ましい例としては、粒子原料のリン脂質類の中に、予めポリエチレングリコール結合リン脂質などを含めて粒子を作製する方法である。ポリエチレングリコール結合リン脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミンのポリエチレングリコール誘導体、たとえばジステアロイルホスファチルジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）などがある。
【００８６】
（小粒径化処理）
一方で、上記、腫瘍へのパッシブターゲティングの原理として提唱されているＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を生じさせるためには、造影剤は小粒径であると、腫瘍血管の透過性が亢進されるため、有利である。たとえば、ＩＣＧを内包する粒子（例えばリポソームなど）を静脈注射を用いて生体内の造影したい組織へ移行させる場合において、生体内で造影したい組織への粒子移行を多くするための粒子サイズには、最適値があることが知られている。粒子サイズが大きすぎる場合は、血管から出にくく、血管内に滞留している間にクッパー細胞による貪食作用により代謝されるため、移行量が減ずる。逆に粒子サイズが小さすぎる場合にも、腎臓における排泄によって血中濃度が下がるため、移行量が減ずる。
リポソームの大きさ（サイズ）は、原理的には、平衡状態において、水和水などを含んだ脂質分子の形態に基づく自発曲率に依存して決まると考えられる。すなわち、リポソームは両親媒性分子が自己組織的にベシクル形成するものであるため、その粒径は、両親媒性材料・溶媒組成・濃度や温度や圧力などの環境因子に依存した平均値を中心に分布をもった範囲に含まれる。
リポソームの大きさは、形成に至る過程（調製操作等）にも強く影響される。通常、温和な条件の静置水和法ではＧＵＶ（Ｇｉａｎｔ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ）が、ボルテックス処理のような渦流下ではＭＬＶ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）が、高出力の超音波処理ではＳＵＶ（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）が形成される。
上記ベシクル形成後に、（平均）粒径を意図的に小さくする小粒径化処理、あるいは粒径分布を小さく（狭く）揃える整粒処理には、エクトルーダーという機器が一般に使われてきた。エクストルーダーは、リポソームを相転移温度以上に加温して可塑しやすくした状態にした上で、規定サイズの孔を通過させることにより、粒子を小粒径化・整粒化する機器である。例えば、上記調製方法で調製したＩＣＧ内包粒子を平均３０ｎｍ孔径のエクストルーダーで処理すると、１２０乃至１５０ｎｍの粒径の粒子が得られる。
【００８７】
一方で、本実施形態においては、上記調製方法で調製したＩＣＧ内包粒子を、バッファ水溶液で希釈し、孔径１μｍ以下のフィルタによるろ過でμｍサイズ以上の粒子を除去し、超音波で再分散を行うことにより、造影剤としてさらに有効な最適範囲の粒子サイズのリポソーム粒子を提供することができる。この本実施形態における小粒径化処理によれば、平均粒径が５０乃至６０ｎｍの、造影剤としてさらに好適な粒径を有する粒子を得ることができる。ここでいう平均粒径は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定したキュムラント解析による粒径分布の平均粒径である。
バッファ水溶液での希釈倍率は１０倍程度が特に好適であり、４倍乃至１００倍が好適な範囲である。希釈の効果は粒子同士の凝集を抑制することにあり、凝集性はリポソームを構成する材料、リポソームの初期濃度および初期粒径、ならびに環境要因に依るところがあるため一律ではない。比較実験として、希釈せずにフィルタだけを通して超音波再分散を行ったところ、粒径は小さくならなかった。すなわち、初期粒径はその環境において最適な値となっているため、再分散しても変化が認められなかった。本実施形態の小粒径化処理では、希釈という環境変化（体積中リポソーム個数の変化）によって最適な粒径が小さい値にシフトするものと思われる。
バッファ水溶液としては、生体へ投与したときの影響を考慮すると、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピぺラジニル］−エタンスルホン酸）等の中性緩衝水溶液が好ましい。
続いて、孔径１μｍ以下の孔を有するフィルタろ過によってμｍサイズ以上の粒子を除去する。フィルタの孔径は、１μｍ以下０．２μｍ以上が好適である。この工程において超音波装置による再分散前の初期粒径を小さくする効果があると考えられる。超音波装置による分散処理はリポソームをせん断する作用があるとされているが、初期粒径が小さければそれだけ小さい成分・画分が増えるといえる。
再分散はバス型の超音波装置を用いるのが好適で、周波数は２０ｋＨｚ乃至１００ｋＨｚの範囲、特に好ましくはこの範囲で複数の周波数を一定時間ごとに切り替えて処理を行うのが好ましい。出力は特に限定されないが、日本製であれば１００Ｗ乃至２００Ｗが一般的に入手可能である。
【００８８】
本実施形態において粒子とは少なくともリン脂質およびコレステロールを含む粒子であり、脂質が膜の主要な構成要素であるような脂質小胞あるいはリポソームも含まれる。通常リポソームは主にリン脂質から構成される二重膜が一層あるいは多層の膜から構成される脂質小胞を意味するが、本実施形態でいう粒子は、少なくともリン脂質およびコレステロールを含む粒子全般を含む。よって、処理温度はリポソームの相転移温度に限定されることはなく、それ以上の温度であってもよい。例えばリン脂質がＤＳＰC（ジステアロイルホスファチジルコリン）であれば４０℃乃至７０℃、特に好ましくは５５℃以上６５℃以下である。
再分散にバス型の超音波装置を用いると、希釈して容積が増えたリポソーム分散液に対して均一に超音波分散処理を施すことができるために好適である。超音波分散装置にはプローブ型と呼ばれるタイプも知られているが、超音波の強度は距離の二乗で減衰するため、プローブ型においては処理効果がプローブ近傍の距離範囲に限定され、一般に大容積の分散には向かない。バス型であれば超音波浴槽のほぼ全面に渡って超音波が届く。
複数の周波数の超音波を組み合わせて使うことができる装置を使えば、低周波超音波で広い範囲の処理を行い、高周波超音波で局所的範囲の処理を集中して行うことができるため、大容積の分散に好適である。
リポソームの超音波分散処理では、リポソーム構成物質の相転移温度以上に浴槽液温度を昇温することが多いが、バス型は処理時の温度制御が容易で浴槽液温度を浴槽内の場所や時間によらず一定に保ちやすいため好適である。
この小粒径化処理においては、バッファ水溶液で希釈することにより粒子同士の凝集を抑制し、さらにはフィルタろ過によって１μｍサイズ以上の粒子を除去することにより、再分散前の初期粒径を小さくするため、粒径の小さい粒子を得ることができると考えられる。
上記小粒径化処理は、粒子中にＩＣＧを含む場合、また、界面活性剤としてリン脂質、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧなどを用いる場合に好適な方法である。また、上記小粒径化処理は、バンガム法、ナノエマルション法によって調製した粒子を小粒径にする際に好適な方法である。
このようにして小粒径化した粒子は、組織浸透性の高い造影剤に用いることができる。
【００８９】
（造影剤）
本実施形態に係る粒子はＩＣＧを内包しているため、近赤外光を吸収して蛍光あるいは音響波を発することができ、蛍光イメージング用あるいは光音響イメージング用の造影剤として用いることができる。また、本実施形態に係る粒子は深緑色に着色しているため、目視で検出するための造影剤としても使用できる。
ここで、本明細書において「造影剤」とは、主に、検体内にあって観察したい組織や分子とその周囲の組織や分子とのコントラスト差を生じさせ、当該観察したい組織や分子の形態情報あるいは位置情報の検出感度を向上させることができる物質と定義する。ここで「蛍光イメージング」や「光音響イメージング」とは、上記の組織や分子を、蛍光検出装置あるいは光音響信号検出機装置などによってイメージングすることを意味する。
本実施形態に係る造影剤は、本実施形態に係る粒子及び前記粒子が分散された分散媒を有していてもよい。分散媒は、本実施形態に係る粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
本実施形態に係る粒子を主成分とする造影剤は、薬理上許容できる添加物を有していても良い。例えばショ糖やグルコースなどの糖類あるいはグリセリンあるいはプロピレングリコールなどの多価アルコールなどの等張化剤やｐＨ調整剤、安定化剤などが挙げられる。生体内に投与する前に当該造影剤と任意の添加物を混合して使用することができる。
本実施形態に係る粒子を主成分とする造影剤を用いたイメージング方法は、当該造影剤を被験体に投与する工程と、前記造影剤を標的組織に蓄積させる工程と、前記標的組織に存在する前記造影剤を検出する工程と、を有する。前記造影剤を検出する方法は、肉眼での直接観察法や、近赤外蛍光法や光音響法などが挙げられる。
【００９０】
本実施形態に係る光音響イメージング方法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る粒子を有する造影剤を検体に投与する。なお、前記検体とは、ヒトあるいはそれ以外の実験動物やペット等の哺乳類、その他、特に限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏであってもｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい。当該造影剤の投与後、前記検体等に対し近赤外波長領域のレーザーパルス光を照射する。次に、当該造影剤からの光音響信号（音響波）を音響波検出器、例えば圧電トランスデューサで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の中の吸収体の位置や大きさ、あるいは光吸光係数などの光学特性値分布を計算することができる。本実施形態に係る脂質粒子を主成分とする造影剤の好ましい用途の一例は、腫瘍を検出することである。
なお、本実施形態に係る蛍光イメージング方法の一例は以下の通りである。上記光音響イメージング方法において、近赤外波長領域のレーザーパルス光を照射する代わりに、励起光を照射し、当該造影剤からの蛍光を検出する。
【実施例】
【００９１】
（実施形態１に対応する実施例）
以下の実施例でＩＣＧのＪ会合体を含む粒子を作製する際に用いる具体的な試薬や反応条件を挙げているが、これらの試薬や反応条件は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００９２】
（実施例１）
（実施例１−１）
（ＩＣＧのＪ会合体の調製）
ＩＣＧのＪ会合体の調製は、Chemical Physics,Volume 220, 1997, Pages 385-392に示されている方法を参考にして行った。まず、ＩＣＧ  ２３．４ｍｇに対して、蒸留水  ２０ｍＬを添加し、３分間超音波照射して１．５ｍＭのＩＣＧ水溶液を調製した。このＩＣＧ水溶液を暗所で、65度で24時間加温した。次に、ＩＣＧ水溶液を暗所で、室温で５日間静置することでＩＣＧのＪ会合体を得た。以後、このようにして調製されたＩＣＧのＪ会合体をJ-ICGと略す。J-ICG水溶液は、調製後は冷蔵で保存した。
【００９３】
（細孔フィルターを用いた濾過）
本発明に係るＩＣＧのＪ会合体を含む粒子を取得するため、J-ICG水溶液を細孔フィルターを用いて濾過し、ろ液を回収した。用いた細孔フィルターの孔径は、１．２μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍならびに０．１μｍであり、細孔フィルターろ過により得られたそれぞれのJ-ICGを以後、J-ICG-1.2μm、J-ICG-0.45μm、J-ICG-0.2μmならびにJ-ICG-0.1μmと略す。
【００９４】
（吸収スペクトル測定）
得られたJ-ICG、J-ICG-1.2μm、J-ICG-0.45μm、J-ICG-0.2μmならびにJ-ICG-0.1μmの７８０ｎｍと８９５ｎｍの吸光度を測定した。以後、本明細書中では、特に断らない限り、吸収スペクトルならびに吸光度の測定には、GeneQuant 100（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いた。参考としてICG水溶液も同様に測定した。図３にJ-ICG-0.2μmとＩＣＧ水溶液の吸収スペクトルの例を示す。７８０ｎｍの吸収はＩＣＧの単量体（モノマーと言うことがある）に由来し、８９５ｎｍはＪ会合体に由来する。すなわち、８９５ｎｍの吸光度と７８０ｎｍの吸光度の比は、Ｊ会合体の形成率を示すと考えられる。表１にそれぞれの水溶液の８９５ｎｍの吸光度（Ａｂｓ８９５と略すことがある）と７８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ７８０と略すことがある）、ならびにそれらの比（Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０と略すことがある）を示した。なお、測定には光路長１ｃｍの石英セルを用い、J-ICG水溶液を蒸留水で約４００倍に、J-ICG-0.1μmでは２００倍に希釈した水溶液を用いた。表１から明らかなように、J-ICGでは、ＩＣＧに比べてモノマーの吸収が減少し、Ａｂｓ８９５ｎｍの吸収が出現していることから、Ｊ会合体の存在を確認できた。また、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０については、５．０から６．０を示した。ＩＣＧ水溶液ではＪ会合体を形成していないため、Ａｂｓ８９５ｎｍの吸収は出現しなかった。
【００９５】
【表１】
2014129318.tif 000009
【００９６】
（粒子径測定）
得られたJ-ICG、J-ICG-1.2μm、J-ICG-0.45μm、J-ICG-0.2μmならびにJ-ICG-0.1μmの粒子径をＤＬＳ法により測定した。参考としてICG水溶液も同様に測定した。表２から明らかなように、ICGでは粒子形成（会合体形成）は認められないが、J-ICGでは３ミクロン程度の粒子径が算出された。また、非常に多分散な粒度分布であった。先行文献によれば、Ｊ−ＩＣＧは数ミクロンの構造体であることが報告されており、今回の結果と一致した。一方、細孔フィルターで濾過されたJ-ICG-1.2μm、J-ICG-0.45μm、J-ICG-0.2μmならびにJ-ICG-0.1μmはフィルターの孔径に依存した粒子径を示したJ-ICG-0.1μmで、２９３ｎｍの粒子径であり、意外にも多分散度指数も０．２まで小さくなり、細孔フィルター濾過前に比べて粒度分布が改善されていることがわかった。 また、J-ICG-1.2μm、J-ICG-0.45μm、ならびにJ-ICG-0.2μmの粒子径を７日間観察した結果、その変化は見られず安定であった。
【００９７】
【表２】
2014129318.tif 000010
【００９８】
（血清中における会合体の安定性評価）
得られたJ-ICG、本発明に係るJ-ICG-0.2μmならびにJ-ICG-0.1μmの血清中における会合体の安定性を評価した。比較例としてICGも同様に測定した。評価方法は、まずそれぞれのサンプル水溶液０．１ｍＬをサンプルチューブに移し、これに０．９ｍＬのウシ血清を加えた。次にこれを暗所、３７度で２４時間インキュベートした。次に、それぞれの水溶液の８９５ｎｍの吸光度（Ａｂｓ８９５と略すことがある）と８００ｎｍの吸光度（Ａｂｓ８００とそれぞれ略すことがある）を測定した。次に、サンプルを超遠心（２８万Ｇ、１７分、室温、サンプル体積０．５ｍＬ）することでＪ会合体を沈殿させた。遠心後、上清の吸収を測定した。遠心分離装置は、ｈｉｍａｃＣＳ１５０ＧＸＬ（日立工機（株）製）を用いた。この遠心条件ではＩＣＧはほとんど沈殿し、一方でＪ会合体はほとんど沈殿する。したがって、もしＪ会合体が血清中で崩壊し、ＩＣＧ単量体に戻った場合は、沈殿量が減少し、遠心前後の溶液（遠心後の場合は上清）のＩＣＧ吸光度はＩＣＧの場合と等しくなる。したがって、会合体の安定性を以下のように定義し、安定であれば１となり、不安定であれば０まで小さくなる。
会合体の安定性（血清中）  ＝１−（遠心後の遠心上清の８００ｎｍの吸光度／遠心前の８００ｎｍの吸光度）
【表３】
2014129318.tif 000011
表３から明らかなようにJ-ICGは血清中においても安定であり、ＩＣＧ単量体への解離は非常に少ないことが分かった。本発明に係るJ-ICG-0.2μmならびにJ-ICG-0.1μmの安定性は、J-ICGよりも高いことが分かった。サイズのより小さな会合体の方が血清中での安定性が高いと考えられ、細孔フィルター濾過により、小さな会合体の割合が高まったことを反映した結果であると考えられる。
【００９９】
（リンパ節集積率の評価）
得られたJ-ICG-1.2μmならびにJ-ICG-0.2μmをマウスの足底皮下に投与し、投与後24時間後に膝下リンパ節への集積率を測定した。投与量はＩＣＧ13nmolとした。比較例としてICG水溶液も同様に測定した。表４から明らかなように、ICGに比較してJ-ICG-1.2μmならびにJ-ICG-0.2μmではリンパ節への集積率が増加した。また集積率に対するJ-ICGのサイズ依存性が認められ、小さなサイズのJ-ICGにおいて良好なリンパ節集積率が示された。この結果より、ICGのＪ会合体を数百ナノメートルのサイズとした本発明の粒子はリンパ節の造影用として機能できることが分かった。
【表４】
2014129318.tif 000012
【０１００】
（リンパ節の蛍光イメージング）
J-ICG-1.2μmならびにJ-ICG-0.2μmをマウスの足底皮下に投与し、投与後２４時間後に膝下リンパ節を摘出し蛍光イメージングを行った結果、蛍光信号がリンパ節より確認された。比較例として未投与のリンパ節からは、蛍光信号は確認されなかった。この結果より、本発明の粒子はリンパ節造影用の蛍光造影剤として機能できることが分かった。
【０１０１】
（光音響信号の測定）
J-ICG-0.2μmの光音響信号の強度を測定した。比較例としてICG水溶液も同様に測定した。光音響信号の計測は、パルスレーザー光をサンプルに照射し、サンプルから光音響信号を圧電素子を用いて検出し，高速プリアンプで増幅後，デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザ（Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７８０ｎｍあるいは８９５ｎｍ、エネルギー密度は１２ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は２０ナノ秒、パルス繰返しは１０Ｈｚの条件とした。超音波トランスデューサとしては、型式Ｖ３０３（Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ社製）を用いた。中心帯域は１ＭＨｚ、エレメントサイズはφ０．５、測定距離は２５ｍｍ（Ｎｏｎ−ｆｏｃｕｓ）、アンプは＋３０ｄＢ（超音波プリアンプ  Ｍｏｄｅｌ  ５６８２  オリンパス社製）の条件である。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。溶媒は水を用いた。計測器は、ＤＰＯ４１０４（テクトロニクス社製）を用いて、トリガー：光音響光をフォトダイオードで検出、Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：１２８回（１２８パルス）平均の条件で測定を行った。
波長は７８０ｎｍにおける光音響信号測定の結果、J-ICG-0.2μmはＩＣＧに比較して、１．７倍の光音響信号を発生することが分かった。色素が会合しており、単位色素あたりのグリューナイゼン係数が増加しているためと考えられる。またJ-ICGでは８９５ｎｍの吸収波長においても光音響信号を発生させることができることがわかった。ＩＣＧは８９５ｎｍに吸収を有さないため、検出できなかった。
【０１０２】
（実施例１−２）
（リン脂質を含むＩＣＧのＪ会合体の調製）
ＩＣＧ  ２３．４ｍｇに対して、蒸留水  ２０ｍＬを添加し、これにリン脂質ＤＳＰＣを４７．８ｍｇ加えて、３分間超音波照射して、ＤＳＰＣを含む１．５ｍＭのＩＣＧ水溶液を調製した。このＩＣＧ水溶液を暗所で、６５度で２４時間加温した。次に、ＤＳＰＣを含むＩＣＧ水溶液を暗所で、室温で５日間静置することでＤＳＰＣを含むＩＣＧのＪ会合体を得た。以後、このようにして調製されたＤＳＰＣを含むICGのＪ会合体をJ-ICG-DSPCと略す。J-ICG-DSPC水溶液は、調製後は冷蔵で保存した。
【０１０３】
（細孔フィルターを用いた濾過）
J-ICG-DSPC水溶液を細孔フィルターを用いて濾過し、ろ液を回収した。用いた細孔フィルターの孔径は、０．２μｍであり、細孔フィルターろ過により得られたJ-ICG-DSPCを以後、J-ICG-DSPC-0.2μmと略す。
【０１０４】
（吸収スペクトル測定）
実施例１−１と同様にして、得られたJ-ICG-DSPC-0.2μmの７８０ｎｍと８９５ｎｍの吸光度を測定した。表５にＡｂｓ８９５とＡｂｓ７８０、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０を示した。表５から明らかなように、J-ICG-DSPC-0.2μmのＪ会合体の存在を確認できた。
【表５】
2014129318.tif 000013
【０１０５】
（粒子径測定）
実施例１−１と同様にして、得られたJ-ICG-DSPC-0.2μmの粒子径をＤＬＳ法により測定した。粒子径は１７８ｎｍであり、多分散度指数は０．２４であった。 
【０１０６】
（リンパ節集積率の評価）
実施例１−１と同様にして、得られたJ-ICG-DSPC-0.2μmをマウスの足底皮下に投与し、投与後２４時間後に膝下リンパ節への集積率を測定した。J-ICG-DSPC-0.2μmではリンパ節への集積率は０．９７％であり、ＩＣＧに比較して９．７倍の増強が見られた。
【０１０７】
（リンパ節の蛍光イメージング）
実施例１−１と同様にして、得られたJ-ICG-DSPC-0.2μmをマウスの足底皮下に投与し、投与後２４時間後に膝下リンパ節を摘出し蛍光イメージングを行った。蛍光信号がリンパ節より確認された。
【０１０８】
（実施例１−３）
（リン脂質ＨＳＰＣを含むＩＣＧのＪ会合体の調製）
ＩＣＧ  ２３．４ｍｇに対して、蒸留水  ２０ｍＬを添加し、これに水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ、ＮＣ−２１Ｅ，日油製）を４．８ｍｇ，２３ｍｇ、４７．８ｍｇ、ならびに２４０ｍｇ加えた。ＩＣＧに対するＨＳＰＣのモル比（ＨＳＰＣ／ＩＣＧ）は、それぞれ、０．２，１．０，２．０、ならびに９．９であった。それぞれの溶液を、３分間超音波照射して、ＨＳＰＣを含む１．５ｍＭのＩＣＧ水溶液を調製した。対照としてＨＳＰＣを加えない１．５ｍＭのＩＣＧ水溶液も調製した（ＨＳＰＣ／ＩＣＧは０）。このＩＣＧ水溶液を暗所で、６５度で２４時間加温した。次に、ＨＳＰＣを含むＩＣＧ水溶液を暗所で、室温で５日間静置することでＨＳＰＣを含むＩＣＧのＪ会合体を得た。以後、ＩＣＧに対するＨＳＰＣのモル比（ＨＳＰＣ／ＩＣＧ）０、０．２、１．０、２．０、ならびに９．９で調製されたICGのＪ会合体を、J-ICG-HSPC-0、J-ICG-HSPC-0.2、J-ICG-HSPC-1.0、J-ICG-HSPC-2.0、ならびにJ-ICG-HSPC-9.9と略す。これらの水溶液は、調製後は冷蔵で保存した。
【０１０９】
（細孔フィルターを用いた濾過）
J-ICG-HSPC水溶液を細孔フィルターを用いて濾過し、ろ液を回収した。用いた細孔フィルターの孔径は、０．２μｍならびに０．１μｍであり、それぞれの細孔フィルターろ過により得られたJ-ICG-HSPCを以後、J-ICG-DSPC-X-0.2μm、J-ICG-DSPC-X-0.1μmと略す。ここでXはＩＣＧに対するＨＳＰＣのモル比（ＨＳＰＣ／ＩＣＧ）を示す。たとえば、ＩＣＧに対するＨＳＰＣのモル比（ＨＳＰＣ／ＩＣＧ）が１．０であり、０．２μｍの細孔フィルターろ過により得られたJ-ICG-HSPCを、J-ICG-HSPC-1.0-0.2μmと略す。
【０１１０】
（吸収スペクトル測定）
実施例１−１と同様にして、得られたJ-ICG-HSPCの７８０ｎｍと８９５ｎｍの吸光度比（Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０）ならびに７００ｎｍと７８０ｎｍの吸光度比（Ａｂｓ７００／Ａｂｓ７８０）を測定した。ここで、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０はＪ会合体の形成率を、Ａｂｓ７００／Ａｂｓ７８０はＨ会合体の形成率を表すパラメーターである。表６にＩＣＧに対するＨＳＰＣのモル比（ＨＳＰＣ／ＩＣＧ）、細孔フィルターのポアサイズ、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０と、Ａｂｓ７００／Ａｂｓ７８０の関係を示した。表６から明らかなように、ＨＳＰＣ／ＩＣＧの増加は、Ｊ会合体の形成率を低下させる一方、Ｈ会合体の形成率は増加させることが分かった。つまり、多量のＨＳＰＣはＪ会合化を阻害する効果があることがわかった。
【０１１１】
【表６】
2014129318.tif 000014
【０１１２】
（粒子径測定）
実施例１−１と同様にして、得られたJ-ICG-HSPCの粒子径をＤＬＳ法により測定した。
表７にＩＣＧに対するＨＳＰＣのモル比（ＨＳＰＣ／ＩＣＧ）、細孔フィルターのポアサイズと粒子径ならびに多分散度指数との関係を示した。表７から明らかなように、ＨＳＰＣ／ＩＣＧの増加は、粒子径を小さくすることがわかった。表６より、ＨＳＰＣはＪ会合化を阻害する効果があるが、一方で粒子径を小さくする効果があり、ＨＳＰＣ／ＩＣＧが９．９の場合では、ＩＣＧのＪ会合体を含む粒子としては最も小さい30〜40nmの粒子が得られることがわかった。また、細孔フィルターのポアサイズの効果としては、０．２μｍに比べ、０．１μｍでろ過された粒子の方が、サイズが小さくなる傾向が見られた。
【表７】
2014129318.tif 000015
【０１１３】
（血清中における会合体の安定性評価）
表８に結果を示した。なお、ＨＳＰＣ／ＩＣＧが９．９の場合では、この実験条件では、遠心分離で粒子が沈殿しなかったため、安定性の計測ができなかった。表８より、ＨＳＰＣ／ＩＣＧの増加は、若干の安定性の低下をもたらすものの、ＩＣＧ単量体への解離は非常に少なく、十分安定であることが明らかとなった。
【表８】
2014129318.tif 000016
【０１１４】
以上の結果より、ＨＳＰＣを含むＩＣＧのＪ会合体は、ナノサイズの粒子径を有し、血清環境においても十分安定であることが示され、さらにＨＳＰＣの量によりサイズ制御化可能であることがわかった。本発明により、ＩＣＧのＪ会合体粒子において、従来の方法では達成できなかった、数十ナノメートルという小さなサイズの粒子を得ることが初めて可能になった。
【０１１５】
（実施例２）
（実施例２−１）
（Ｊ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子１の合成）
ＩＣＧ（４．４ｍｇ、（財）日本公定書協会製）をメタノール１ｍｌに溶解し、ＩＣＧメタノール溶液を調製した。ＤＳＰＣ（９ｍｇ、日油（株）製）をクロロホルム１ｍｌに溶解し、ＤＳＰＣクロロホルム溶液を調製した。ＩＣＧメタノール溶液１ｍｌとＤＳＰＣクロロホルム溶液１ｍｌを混合した後、減圧下４０℃で溶媒を留去した。蒸発乾固したＩＣＧとＤＳＰＣをクロロホルム１．６ｍｌに溶解して、ＩＣＧとＤＳＰＣがクロロホルムに溶解してなる、ＩＣＧ組成物１を調製した。
次に、化学式２で示されるリン脂質（７．３ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＣＨ３、ＰＥＧのＭ．Ｗ．２０００、日油（株）製）を溶解した水溶液（２０ｍｌ）に、前記ＩＣＧ組成物１を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
次に、前記エマルジョンをロータリーエバポレーター（４０℃で２時間）で減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＣＨ３で保護されたＩＣＧ含有ナノ粒子の水分散液を得た。以後、このＩＣＧ含有ナノ粒子をICG_NP1と呼ぶ。
さらに、前記ＩＣＧ含有ナノ粒子を３７℃で２４時間インキュベートすることにより、Ｊ会合体ＩＣＧを含有したナノ粒子の水分散液１を得た。以後、このＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子をJ-ICG_NP1と呼ぶ。
【０１１６】
（Ｊ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子２の合成）
ＤＳＰＣ量を１８ｍｇとした以外は前記と同様の方法でナノ粒子の水分散液を得た。以後、この時得られたナノ粒子をICG_NP2, J-ICG_NP2とそれぞれ呼ぶ。
【０１１７】
（Ｊ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子３の合成）
ＤＳＰＣ量を２７ｍｇとした以外は前記と同様の方法でナノ粒子の水分散液を得た。以後、この時得られたナノ粒子をICG_NP3, J-ICG_NP3とそれぞれ呼ぶ。
【０１１８】
（実施例２−２）
（Ｊ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子の吸収スペクトル評価）
ICG_NPおよびJ-ICG_NPの吸収数ペクトルを測定した。参考としてICG水溶液も同様に測定した。図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）にICG_NPとJ-ICG_NPの吸収スペクトルをそれぞれ示す。図４から明らかにＩＣＧのＪ会合体に由来する８９５ｎｍ付近の吸収極大が存在していることから、Ｊ会合体の存在を確認できた。
【０１１９】
（実施例２−３）
（粒子径測定）
ＩＣＧ含有ナノ粒子（ICG_NP）およびＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子（J-ICG_NP）の粒子径を動的光散乱解析装置（大塚電子（株）製、DLS-8000）で分析した。表９に得られた平均粒子径および多分散度指数（ＰＤＩ）をそれぞれ示す。Ｊ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子はＩＣＧがＪ会合体形成しているにも関わらず、２００ｎｍ以下の平均粒子径を保持していることが確認できた。さらに、図５から明らかなように、ＩＣＧのＪ会合体を含む粒子では、ＤＳＰＣの添加量が増加するにつれて粒子径が減少する傾向が見られた。
一方で、これまで報告されているＩＣＧのＪ会合体は一般に平均粒子径が数ミクロン程度の粒度分布の広い多分散体であるが、本実施例で得られるＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子は平均粒径が２００ｎｍ以下で、かつ粒子の多分散度指数も小さいことが確認できた。さらに、ＤＳＰＣ添加量に依存してＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子の粒子径が制御されていることが示唆された。
本実施例により得られたＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子の粒子径はイメージングに好適な粒子径範囲である２００ｎｍ以下のＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子であることがＤＬＳ法により確認された。
【表９】
2014129318.tif 000017
【０１２０】
（実施例２−４）
（血清中における会合体の安定性評価）
ICG_NPおよびJ-ICG_NPを用いて、実施例１と同様の方法で牛胎児血清（ＦＢＳ）中での血清中における会合体の安定性を評価した。ただし、図６から明らかなように、ＩＣＧ含有ナノ粒子のＩＣＧをＪ会合体形成させることで血清中での色素漏出が大きく減少していることが確認できた。
【０１２１】
（実施例２−５）
（Ｊ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子中のＩＣＧおよびＤＳＰＣ組成）
J-ICG_NPを用いて、粒子中のＩＣＧおよびＤＳＰＣの組成を算出した。ＩＣＧ量、ＤＳＰＣ量、粒子重量は以下の方法で算出した。
ＩＣＧ量：あらかじめ９０％  ＤＭＦに各種濃度のＩＣＧを溶解させて濃度と吸光度の検量線を作成した。その上でサンプルを９０％  ＤＭＦに溶解させて上記の方法で吸光度を計測し、その際のＩＣＧ量を算出した。
ＤＳＰＣ量：サンプル中のＤＳＰＣ量はリン脂質Ｃ−テストワコーを用いて行った。添付の操作法に従ってＤＳＰＣ量を算出した。
粒子重量：サンプルの粒子重量は凍結乾燥法により算出した。
表１０に得られたＩＣＧおよびＤＳＰＣの組成（重量％）をそれぞれ示す。これらの結果からＩＣＧおよびＤＳＰＣの粒子重量に占める割合は30重量％以上であることが確認できた。
【表１０】
2014129318.tif 000018
【０１２２】
（実施例２−６）
（界面活性剤を用いないＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子の合成および物性評価）
ＤＳＰＣ量を２７ｍｇとし、水溶液中に界面活性剤を添加しない以外は前記と同様の方法でＪ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子の水分散液を得た。以後、この水分散液をJ-ICG_NP4と呼ぶ。J-ICG_NP4の吸収スペクトル測定および粒子径測定を上記の方法で実施した。図４（ｄ）および表１１からも明らかなように、J-ICG_NP4は粒子径が２００ｎｍ以下のＪ会合ＩＣＧから構成されていることが確認できた。
【表１１】
2014129318.tif 000019
【０１２３】
（実施例２−７）
（Ｊ会合体ＩＣＧ含有ナノ粒子の光音響測定）
実施例２−１の方法で作製したJ-ICG NP1を用いて光音響スペクトル評価を実施した。光音響信号測定は市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８  Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。測定容器としては、ポリエチレン製のチューブ（内径１ｍｍ）を用いた。J-ICG NP1をウシ胎児血清（ＦＢＳ）で１０μMの色素濃度に希釈してチューブ内に充填させ光音響測定を実施した。得られた光音響データから画像解析ソフト(Micro VIEW,ＧＥヘルスケア)を用いて関心領域（ＲＯＩ）での光音響信号を取得した。図９にJ-ICG NP1の相対吸収スペクトル（測定範囲での吸収極大を１とした）および、光音響相対強度（測定波長でもっとも光音響強度が高いものを１とした）をそれぞれ示す。この結果からも明らかにＪ会合体化させることで９００ｎｍ付近に吸収極大が出現し、それに伴って９００ｎｍ付近の光音響信号強度も増加していることが確認できた。
【０１２４】
（実施例３）
（実施例３−１）
（ＩＣＧを内包するリポソームの調製（１））
水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ、ＮＣ−２１Ｅ，日油製）９５．８ｍｇと、ジステアロイルホスファチルジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、日油製）３１．９ｍｇ、コレステロール３１．９ｍｇをクロロホルム１０ｍＬに溶解させた。これにＩＣＧ１１．７ｍｇを加え、５分間超音波照射（３周波超音波洗浄器 VS-100III、アズワン、２８ｋＨｚ）した。次いで、この溶液をナスフラスコに移し、クロロホルムを４０℃で減圧留去した後、真空乾燥を一晩行った。得られた脂質とＩＣＧの乾固物に対して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．２）１０ｍＬを加え、超音波照射を行った。超音波照射は２８ｋＨｚで１０秒、４５ｋＨｚで１０秒、１００ｋＨｚを１０秒のサイクルを繰り返し、全体として３０分間行った。その後、さらに２８ｋＨｚで３０分間超音波照射を行った。超音波照射時の温度は６０度に設定した。その後、プローブ型の超音波照射装置を用いて、１５分間超音波処理を行った。その後、孔径０．２μｍのシリンジ濾過フィルターでろ過した。以後、得られたリポソームをJIL1と言う。JIL1のＨＥＰＥＳ溶液は４℃で保存した。
【０１２５】
（実施例３−２）
（ＩＣＧのＪ会合体を内包するリポソームの調製（２））
実施例３−１で得られたJIL1のＨＥＰＥＳ溶液を、遮光下で、４℃、３７℃、ならびに６５℃でそれぞれ加温した。加温時間は１７時間とし、加温後、孔径０．２μｍのシリンジ濾過フィルターでろ過した。得られた溶液を４℃で保存した。以後、得られたＩＣＧのＪ会合体を内包するリポソームをそれぞれ、JIL1-4、JIL1-37、ならびにJIL1-65と略す。 
【０１２６】
（実施例３−３）
（吸収スペクトル測定）
実施例３−２で得られたJIL1-4、JIL1-37、ならびにJIL1-65の７８０ｎｍと８９５ｎｍの吸光度を測定した。７８０ｎｍの吸収はＩＣＧの単量体に由来し、８９５ｎｍはＪ会合体に由来する。すなわち、８９５ｎｍの吸光度（Ａｂｓ８９５と略すことがある）と７８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ７８０と略すことがある）の比（Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０と略すことがある）は、Ｊ会合体の形成率を示すと考えられる。表１２にそれぞれの水溶液のＡｂｓ８９５とＡｂｓ７８０、ならびにＡｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０を示した。なお、測定には光路長１ｃｍの石英セルを用い、実施例３−２で得られたリポソーム溶液を蒸留水で２００倍に希釈した水溶液を用いた。表１２から明らかなように、全てのサンプルで８９５ｎｍに吸収が出現しており、ＩＣＧのＪ会合体の形成が認められた。温度が高くなるとＪ会合体の形成が促進された。驚くことに、加温をしていないJIL1-4においてもＪ会合体の形成が認められた。リポソーム調製時の超音波処理が会合体形成のトリガーとなっていると考えられる。
【表１２】
2014129318.tif 000020
【０１２７】
（実施例３−４）
（粒径測定）
実施例３−２で得られたJIL1-4、JIL1-37、ならびにJIL1-65の粒径をＤＬＳ法により測定した。表１３から明らかなように、全てのサンプルで約１００ｎｍの粒径であった。ＩＣＧのＪ会合体は数μｍの平均粒径を有することが知られているが、これまでに１００ｎｍかつ比較的単分散なＩＣＧのＪ会合体は報告されていない。本発明のリポソームでは、リポソームのナノサイズ環境内でＩＣＧのＪ会合体形成を成功させることができた。
【表１３】
2014129318.tif 000021
【０１２８】
（実施例３−５）
（遠心によるリポソームの精製）
実施例３−２で得られたJIL1-4を超遠心（２８００００ｘｇ、室温、１７分）し、沈殿物を回収した。再度、沈殿物を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液で再懸濁し、超遠心（２８００００ｘｇ、室温、１７分）し、沈殿物を回収した。沈殿物を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液で再懸濁し、遠心（２００００ｘｇ、室温、５分）上清を回収し、孔径０．２μｍのシリンジ濾過フィルターでろ過した。以後、得られたリポソームをJIL1-4Cと言う。JIL1-4Cの粒径をＤＬＳ法により測定した結果、１０２．５ｎｍであり、多分散度指数（ＰＤＩ）は０．１１であった。遠心により不純物としてのリン脂質やＩＣＧ、ＩＣＧのＪ会合体が除去され、その結果、ＰＤＩが小さくなった、すなわち粒度分布が狭くなったと考えられる。JIL1-4Cの吸収スペクトルを図７に示す。Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０は４．５であった。またJIL1-4Cのゼータ電位を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中で測定した結果、−５５．１ｍＶであった。
【０１２９】
（実施例３−６）
（血清中におけるＩＣＧ内包率評価）
実施例３−５で得られたJIL1-4Cの生体内におけるＩＣＧ内包率を測定するため、生体内モデルとして血清溶液を用いた。つまり、血清中におけるJIL1-4CのＩＣＧ内包率を評価した。評価方法は、まずJIL1-4C水溶液０．１ｍＬをサンプルチューブに移し、これに０．９ｍＬのウシ血清を加えた。次にこれを暗所、３７度で２４時間インキュベートした。次に、JIL1-4CのＡｂｓ８００を測定した。次に、サンプルを超遠心（２８万Ｇ、17分、室温、サンプル体積０．５ｍＬ）することでJIL1-4Cを沈殿させた。遠心後、上清のＡｂｓ８００を測定した。この遠心条件ではＩＣＧは沈殿しないことを確かめてある。したがって、血清中におけるＩＣＧ内包率を以下のように定義する。
血清中におけるＩＣＧ内包率（％）  ＝１−（遠心上清のＡｂｓ８００／遠心前のＡｂｓ８００）
JIL1-4Cの血清中におけるＩＣＧ内包率は、５４．９％であった。
【０１３０】
（実施例３−７）
（リンパ節集積率の評価）
実施例３−５で得られたJIL1-4Cをマウスの足底皮下に投与（ＩＣＧとして１３ｎｍｏｌ）し、投与後２４時間後に膝下リンパ節への集積率を測定した。比較例としてＩＣＧ水溶液も同様に測定した。投与後２４時間後に膝下リンパ節を摘出し、摘出リンパ節を１％Triton-X100水溶液でホモジネートし、この溶液のＡｂｓ８００を測定することでリンパ節に集積した色素量（ｍｏｌ）を求めた。次いで、この値を投与量である１３ｎｍｏｌで割り、１００をかけることでリンパ節集積率（％）を算出した。
表１４から明らかなように、ＩＣＧに比較してJIL1-4Cではリンパ節への集積率が１２倍増加した。この結果より、JIL1-4Cのリンパ節造影剤としての有効性が示された。
【表１４】
2014129318.tif 000022
【０１３１】
（実施例３−８）
（リンパ節の蛍光イメージング）
実施例３−７の実験で得られた、足底皮下にJIL1-4Cを投与したマウスの膝下リンパ節を摘出後、蛍光イメージングを行った。蛍光信号が摘出リンパ節より確認された。この結果より、JIL1-4Cのリンパ節蛍光造影剤としての有効性が示された。
【０１３２】
（実施例３−９）
（リポソームの腫瘍造影能の確認）
実施例３−５で得られたJIL1-4Cの腫瘍造影能を評価した。JIL1-4Cを投与した担癌マウスの蛍光イメージングを行った。蛍光イメージング実験においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、京都大学医学部（京都府、日本）の動物施設で、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約２週間前に２×１０６個のＮ８７ヒト胃癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８２２）を、マウスの肩と大腿部に皮下注射した。マウスは、本発明にかかるJIL1-4Cならびに対照としてのＩＣＧの2群で比較を行った。投与量はマウス当たり、色素量として１３ｎｍｏｌで、１００μＬのＰＢＳ溶液としてマウス尾静脈に注射した。プローブを投与したマウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、投与２４時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。図８は投与後２４時間目のマウスの蛍光イメージである。図８（Ａ）は、JIL1-4Cを投与したマウスで、白矢印で示される担癌部位での蛍光信号が認められた。図８（Ｂ）は、対照であるＩＣＧを投与したマウスで、白矢印で示される担癌部位での蛍光信号は確認できなかった。肝臓と腸からの信号が認められた。この結果より、JIL1-4Cは腫瘍を造影することが可能であり、腫瘍造影剤としての有効性が示された。
【０１３３】
（実施例３−１０）
（リポソームの腫瘍集積の確認）
実施例３−９で実施した腫瘍造影実験のマウスの癌組織中色素量を定量した。まず、投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、癌組織を摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％Triton-X100水溶液を添加し、ホモジネートした。次いで、癌組織重量の２０．２５倍量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳO）を加えた。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、ホモジネート溶液の蛍光強度を測定することで癌組織中の色素量を定量した。その結果、対照であるＩＣＧ投与マウスの癌組織では、色素は検出されなかったが、JIL1-4C投与マウスの癌組織では色素が検出され、投与量に対する癌組織への移行率は１．７％（癌組織１ｇあたり）であった。
【０１３４】
（実施例３−１１）
（Ｊ会合体化していないＩＣＧを内包するリポソームの調製と血清中におけるＩＣＧ内包率評価）
Ｊ会合体化していないＩＣＧを内包するリポソームを調製するため、実施例３−１に従って、リポソームを調製した。ただし、クロロホルムの減圧留去後の超音波照射は氷冷下で行い、直ちに実施例３−５に記載の精製を行った。得られたリポソームをJIL1-Ctrlと言う。JIL1-Ctrlの粒径をＤＬＳ法により測定した結果、１２７．７ｎｍであり、多分散度指数（ＰＤＩ）は０．１５であった。JIL1-CtrlのＡｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０は０．０９であり、ＩＣＧはＪ会合体化していないことを確認した。精製後、直ちに実施例３−６と同様に、血清中におけるＩＣＧ内包率評価を行った。その結果、JIL1-Ctrlの血清中におけるＩＣＧ内包率は、４２．７％であった。
実施例３−５ならびに３−６で示されたように、本発明のJIL1-4C の粒子径は１０２．５ｎｍ、多分散度指数（ＰＤＩ）は０．１１、血清中におけるＩＣＧ内包率は、５４．９％であった。JIL1-Ctrlとの比較の結果より、ＩＣＧのＪ会合体化は血清中におけるリポソームのＩＣＧ内包率を向上させることが分かった。また、粒子径も小さくなり、分散性も改善された。
【０１３５】
（実施例４）
ｐＨ勾配法によるＪ会合体化ＩＣＧを内包したリポソームの調製例を以下に記す。
【０１３６】
（実施例４−１）
（ｐＨ勾配を利用したリポソームへの内包  （１）空リポソームの調製）
内水相（Ａ溶液）、外水相（Ｂ溶液）の種類を変えて、表１５に示した１０種の空リポソーム分散液を調製した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ−８０８０、日本油脂製）、コレステロール（和光純薬製）、ジステアロイルホスファチルジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、日本油脂製）をそれぞれ重量比で３：１：１に秤量した。３種の脂質の合計量１０２ｍｇあたりメタノール・クロロホルム（１：１）溶液２ｍｌに溶解し、３７℃で1時間撹拌した後、溶媒留去し、さらに室温で一晩、真空乾燥した。得られた脂質乾固物（３種の脂質の合計量１０２ｍｇにつき）に表１５に示したＡ溶液を１０ｍｌをそれぞれ添加し、３７℃で１時間撹拌した。そして６０℃で３０分間、バス型超音波装置（３周波超音波洗浄器 ＶＳ−１００ＩＩＩ、アズワン製）により超音波処理（２８ｋＨｚ６０秒→４５ｋＨｚ６０秒→１００ｋＨｚ３秒のサイクルで照射）した後、６５℃でエクストルーダー処理（ＬＩＰＥＸ １００ｍＬ Ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ 社製）し、ポアーサイズ１００ｎｍ膜を通過させた。通過した空リポソーム分散液の粒径を光動的散乱法（ＤＬＳ，ゼータサイザーナノ、マルバーン社製）で測定し、その結果を表１５に示した。その後、空リポソーム分散液の外水相を限外ろ過（撹拌式セル、限外ろ過膜３００ＫＤａ、ミリポア製）により表１５に示したＢ溶液にそれぞれ置換した後、濃縮し、ＤＳＰＣとコレステロールの合計脂質濃度を４０ｍｇ/ｍＬに調整した。ＤＳＰＣとコレステロールの定量は市販定量キット（リン脂質Ｃテストワコー、コレステロールＥ-テストワコー、和光純薬製）で行った。ただしＨＥＰＥＳ緩衝液で適当に希釈した空リポソーム液と４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、キシダ化学製）水溶液を１：１に混和し、１００℃、５分間加温したものを定量した。
【０１３７】
【表１５】
2014129318.tif 000023
【０１３８】
ＨＥＰＥＳ（インビトロジェン製）は濃度１０ｍＭ（ｐＨ７.３）の緩衝液である。デキストランはデキストラン４０（東京化成製）を用いた。クエン酸はクエン酸一水和物（ナカライテスク製）とクエン酸三ナトリウム二水和物（ナカライテスク製）を溶解しｐＨ３.0に調製した緩衝液であり、濃度は１０ｍＭで使用した。
【０１３９】
（実施例４−２）
（ｐＨ勾配を利用したリポソームへの内包  （２）ＩＣＧの内包・精製）
インドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）をＢ溶液に溶解し、ＩＣＧ濃度、６ｍｇ/ｍｌ、２ｍｇ/ｍｌ、０．１ｍｇ/ｍｌとなるＩＣＧ溶液を作製した。上記１０種類の空リポソーム分散液にそれぞれ３濃度のＩＣＧ溶液を添加し、３０種類の条件でＩＣＧ内包処理したリポソームを調製した。以下に１条件での調製法を記すが、他の条件も同様に操作した。ＩＣＧ溶液及び空リポソーム分散液を６０℃の恒温槽中に１５分置いて６０℃に加温した。２．５ｍＬの空リポソーム分散液に２．５ｍＬのＩＣＧ溶液を添加し、６０℃で３０分撹拌した後、Ｂ溶液１５ｍｌを添加した。６５℃でエクストルーダー処理を行い、ポアーサイズ５０あるいは８０ｎｍ膜を通過させた。エクストルーダー処理後のリポソームは、氷冷したビーカー中に回収した。
B溶液を注入しながら、回収したリポソーム分散液を限外ろ過（限外ろ過膜３００ＫＤａ）処理し、遊離のＩＣＧを除去し精製した。精製後、液量をおよそ１/１０に濃縮し回収した。
【０１４０】
（実施例４−３）
（吸収スペクトル測定）
実施例４−２で得られた３０種のＩＣＧ内包化処理リポソームを適当にＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈し、波長５００〜１０００ｎｍ間の吸光度を測定し、最大吸収波長及びＡｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比を求め、リポソーム中のＪ会合体の形成を確認した。
その結果を表１６に示した。ｐＨ勾配を施した、外水相にクエン酸緩衝液を用いて調製したリポソーム（ｐ１−２, ｐ１−３, ｐ２−２, ｐ２−３, ｐ３−２, ｐ３−３, ｐ５−２, ｐ５−３, ｐ７−２, ｐ７−３, ｐ９−２, ｐ９−３）は、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比が２以上と高く、また８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大を示したことにより、Ｊ会合体ＩＣＧを内包したリポソームを調製できることがわかった。ただし、ＩＣＧ添加濃度を０．１ｍｇ/ｍｌで調製した場合（ｐ１−１, ｐ２−１, ｐ３−１, ｐ５−１, ｐ７−１, ｐ９−１）、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比が低く、また８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大を示さなかったことより、ＩＣＧをＪ会合体形成させるためには、添加ＩＣＧ濃度を０．１ｍｇ/ｍｌより高くする必要があることが分かった。
一方、ｐＨ勾配を施さず、外水相にＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて調製したリポソーム（ｐ４−１,ｐ４−２, ｐ４−３, ｐ６−１, ｐ６−２, ｐ６−３, ｐ８−１, ｐ８−２, ｐ８−３, ｐ１０−１, ｐ１０−２, ｐ１０−３）は、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比が０.２以下と低く、また最大吸収波長も８９５ｎｍ前後を示さず、ほとんどリポソーム内のＩＣＧはＪ会合体を形成していないことが分かった。Ｊ会合体化ＩＣＧを内包したリポソームを調製するためには、ｐＨ勾配を施す必要があることが分かった。
さらに、内水相にデキストラン４０や塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加することにより、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比を高めることができることも分かった。
【０１４１】
（実施例４−４）
（粒径測定）
実施例４−２で得られた３０種のＩＣＧ内包化処理リポソームの粒径をＤＬＳ（ゼータサイザーナノ、マルバーン社製）で測定した。
結果は表１６に示した。どのＪ会合体化ＩＣＧ内包リポソームも１００ｎｍ前後の粒径として調製できることが分かった。
【０１４２】
（実施例４−５）
（ＩＣＧ定量、ＩＣＧ含有率、モル吸光係数の測定）
実施例４−２で得られた３０種のＩＣＧ内包化処理リポソームにおいて以下の分析評価を行った。
ＩＣＧ定量：ＨＥＰＥＳ緩衝液で適当に希釈したリポソーム液とジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）を１：９に混和し、ＯＤ７９０ｎｍの吸光度を測定した。またＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解したＩＣＧ標準溶液を同様にＤＭＦと混和し、ＯＤ７９０ｎｍの吸光度測定することにより標準曲線を作成し、リポソーム中のＩＣＧ濃度を求めた。
ＩＣＧ含有率：リポソーム乾燥重量中のＩＣＧ量の割合を算出した。
モル吸光係数：リポソーム粒子濃度１Ｍ中の最大吸収波長の吸光度（光路長１ｃｍ）を測定した。リポソーム粒子濃度は以下の通り求めた。リポソーム平均粒径より算出したリポソーム体積より比重１とみなしてリポソーム１個あたりの重量を算出した。このリポソーム重量とリポソーム乾燥重量よりリポソーム濃度を算出した。
これらの結果を表１６に示した。Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比が高いほど、ＩＣＧ濃度、ＩＣＧ含有率、モル吸光係数が高くなることが分った。ＩＣＧをリポソームに内包させるとき、pH勾配をかけることよってＩＣＧをJ会合体形成させながら導入する方法は、リポソームへのＩＣＧ含有率を高めることができ、高いモル吸光係数を持つ光音響イメージング用のリポソーム型造影剤調製に効果的であることが分かった。
【０１４３】
（実施例４−６）
（ＤＳＰＣ定量）
ＨＥＰＥＳ緩衝液で適当に希釈したリポソーム液と４％ＳＤＳ水溶液を１：１に混和し、１００℃、５分間加温したものをリン脂質定量キット（リン脂質Ｃテストワコー）で測定した。またＤＳＰＣ含有率をリポソーム乾燥重量中のＤＳＰＣ量の割合により算出した。
その結果を表１６に記した。すべてのサンプルにおいてＤＳＰＣの粒子重量に占める割合は３０重量％以上であることが確認できた。
【０１４４】
【表１６】
2014129318.tif 000024
【０１４５】
（実施例５）
内包処理時のＩＣＧ添加量を増加することにより、ＩＣＧ含有量をさらに高められるか確認した。
【０１４６】
（実施例５−１）
（空リポソームの調製）
実施例４−１における空リポソーム２の調製条件である、内水相（Ａ溶液）としてデキストラン添加ＨＥＰＥＳ溶液、外水相（Ｂ溶液）としてスクロース添加クエン酸緩衝液を用いて、実施例４−１と同様に空リポソームを調製した。ただし、エクストルーダー処理回数を変えることにより空リポソーム粒径として、１８４ｎｍ 、１１４ｎｍのサイズが異なる空リポソームを調製した。
【０１４７】
（実施例５−２）
（ｐＨ勾配を利用したＩＣＧの内包・精製）
インドシアニングリーンを外水相溶液であるスクロース添加クエン酸緩衝液に溶解し、ＩＣＧ濃度６ｍｇ/ｍｌのＩＣＧ溶液を作製した。２種の空リポソーム分散液それぞれにＩＣＧ溶液を添加し、実施例４−２同様の操作により、ｐ１１−１,ｐ１２−１を調製した。
ただしエクストルーダー処理は行わなかった。また精製及び濃縮処理後、０．４５μｍのフィルター処理を行った。
【０１４８】
更にＩＣＧ含有率を高めることができるか確かめるため、上記操作において、ＩＣＧ溶液（２．５ｍＬ）をリポソーム分散液（２．５ｍＬ）に添加し、６０℃で３０分撹拌した後の反応液にＩＣＧ溶液（２．５ｍＬ）を追加し、更に６０℃で３０分撹拌した。その後の操作は上記同様に行い、ｐ１１−２,ｐ１２−２を調製した。
【０１４９】
（実施例５−３）
（吸収スペクトル測定）
実施例５−２で得られた４種のＩＣＧ内包化処理リポソームの最大吸収波長を測定し、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比を求めることにより、リポソーム中のＪ会合体の形成を確認した。
その結果を表１７に示した。すべてのサンプルにおいて、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比６以上であり、ＩＣＧのＪ会合体形成を確認できた。
【０１５０】
（実施例５−４）
（粒径測定）
実施例５−２で得られた４種のＩＣＧ内包化処理リポソームの粒径をＤＬＳにより測定した。
結果は表１７に示した。空リポソーム粒径の大きいｐ１１−１、ｐ１１−２はＩＣＧ内包後、粒径が小さくなり、一方空リポソーム粒径の小さいｐ１２−１、ｐ１２−２はＩＣＧ内包後、粒径が大きくなった。空リポソーム粒径からＩＣＧ内包後のリポソーム粒径は変化し、所望の粒径のリポソームを調製するためには更なる検討が必要ではあるが、およそ空リポソーム粒径によりＩＣＧ内包後のリポソームの粒径を変えることができることが分かった。
【０１５１】
（実施例５−５）
（ＩＣＧ定量、ＩＣＧ含有率、モル吸光係数の測定）
実施例５−２で得られた４種のＩＣＧ内包化処理リポソームにおいて、実施例４−５同様にＩＣＧ濃度、ＩＣＧ含有率、モル吸光係数を測定した。
これらの結果を表１７に示した。ＩＣＧを２倍量添加したｐ１１−２、ｐ１２−２は、ＩＣＧを１倍量添加のｐ１１−１、ｐ１２−１に比較して、ＩＣＧ濃度、ＩＣＧ含有率、モル吸光係数をおよそ２倍高めることができた。リポソームへのＩＣＧ含有率をさらに高められることが確認でき、高いモル吸光係数を持つ光音響イメージング用のリポソーム型造影剤調製に効果的であることが分かった。
【０１５２】
（実施例５−６）
（ＤＳＰＣ定量）
実施例４−６同様にＤＳＰＣを定量し、ＤＳＰＣ含有率を算出した。
その結果を表１７に記した。すべてのサンプルにおいてＤＳＰＣの粒子重量に占める割合は３０重量％以上であることが確認できた。
【０１５３】
（実施例５−７）
（血清中におけるＩＣＧ保持率）
ＨＥＰＥＳ緩衝液中ではＩＣＧの最大吸収波長は７８０ｎｍであり、牛胎児血清（ＦＢＳ）中では最大吸収波長は８００ｎｍに変化する。またＨＥＰＥＳ中とＦＢＳ中の吸光度差が最も大きくなるのは８１０ｎｍである。遊離のＩＣＧの存在割合に応じて、ＨＥＰＥＳ中とＦＢＳ中の８１０ｎｍの吸光度の差が大きくなることを利用して、血清中でのＩＣＧのリポソーム内への保持率を評価した。
既知濃度のＩＣＧを溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液及びＦＢＳの標準溶液を作成し、ＦＢＳ標準溶液とＨＥＰＥＳ標準溶液の８１０ｎｍの吸光度差を測定し、ＩＣＧ濃度と８１０ｎｍの吸光度差により標準曲線を作成した。
ＩＣＧ内包リポソーム(ｐ１1−１, ｐ１２−１)をＩＣＧ濃度５μｇ／ｍｌになるようにＨＥＰＥＳ緩衝液とＦＢＳでそれぞれ希釈した。２４時間３７℃遮光下で加温後、８１０ｎｍの吸光度を測定し、ＦＢＳとＨＥＰＥＳ緩衝液中のＩＣＧ内包リポソームの８１０ｎｍ吸光度差を求めた。その吸光度差を標準曲線よりＩＣＧ遊離量に換算し、リポソーム中へのＩＣＧ保持率を求めた。
ＩＣＧ保持率％＝遊離ＩＣＧ濃度μｇ/ｍｌ／５μｇ/ｍｌ×１００
その結果は表１７に示した。どちらもＩＣＧ保持率８５％以上であり、血清中でもＩＣＧはリポソーム中に保持されていることが分かった。
【０１５４】
【表１７】
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【０１５５】
（実施例６）
空リポソームの粒径を小さくすることにより、さらに小さいＩＣＧ内包リポソームを調製できるか確認した。
【０１５６】
（実施例６−１）
（小粒径空リポソームの調製）
実施例４−１における空リポソーム２の調製条件である、内水相（Ａ溶液）としてデキストラン添加ＨＥＰＥＳ溶液、外水相（Ｂ溶液）としてスクロース添加クエン酸緩衝液を用いて、実施例４−１と同様に空リポソームを調製した。ただし、エクストルーダー処理に代えて以下の操作を行った。空リポソーム分散液をプローブ型超音波分散装置（ＵＤ−２００、トミー精工製）により、氷水中で冷却しながら１０分間超音波分散処理（照射レベル４）した。その後ＨＥＰＥＳ緩衝液で４.２倍希釈した空リポソーム分散液を、超遠心機（ｈｉｍａｃ ＣＳ１５０ＧＸＬ、日立工機製）により、２８８０００Ｇ、１７分間超遠心し、上清を回収した。回収した小粒径空リポソームの粒径は６０ｎｍであった。
その後、小粒径空リポソーム分散液の外水相を限外ろ過により置換した後、濃縮し、ＤＳＰＣとコレステロールの合計脂質濃度を４ｍｇ/ｍＬに調整した。
【０１５７】
（実施例６−２）
（ｐＨ勾配を利用したＩＣＧの内包・精製）
インドシアニングリーンをスクロース添加クエン酸緩衝液に溶解し、ＩＣＧ濃度６ｍｇ/ｍｌのＩＣＧ溶液を作製した。小粒径空リポソーム分散液１４．４ｍｌにＩＣＧ溶液１．４４ｍｌを添加し、実施例４−２同様の操作により、ｐ１３−１を調製した。
ただしエクストルーダー処理は行なわず、精製及び濃縮処理後、０．４５μｍのフィルター処理を行った。
【０１５８】
（実施例６−３）
（吸収スペクトル測定）
実施例６−２で得られたｐ１３−１の最大吸収波長を測定し、Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比を求めることにより、リポソーム中のＪ会合体の形成を確認した。
その結果を表１８に示した。Ａｂｓ８９５／Ａｂｓ７８０比は４.５９であり、ＩＣＧのＪ会合体形成を確認できた。
【０１５９】
（実施例６−４）
（粒径測定）
実施例６−２で得られたｐ１３−１の粒径をＤＬＳにより測定した。
結果は表１８に示した通り、空リポソーム粒径より２４ｎｍ大きくなっているが、ＩＣＧ内包後のリポソーム粒径は８４ｎｍであった。これまで調製したＪ会合体化ＩＣＧ内包リポソームと比較して、小粒径空リポソームを用いることにより粒径を小さくできることが分かった。造影剤において、体内での組織浸透性を高めるために、より小さな粒径が好ましく、この調製方法により効果的な造影剤の調製が可能であることが確認できた。
【０１６０】
（実施例６−５）
（ＩＣＧ定量、ＩＣＧ含有率、モル吸光係数の測定）
実施例６−２で得られたｐ１３−１のＩＣＧ濃度、ＩＣＧ含有率、モル吸光係数を測定した。これらの結果は表１８に示した通りである。
【０１６１】
（実施例６−６）
（ＤＳＰＣ定量）
実施例４−６同様にＤＳＰＣを定量し、ＤＳＰＣ含有率を算出した。
その結果を表１８に記した。ＤＳＰＣの粒子重量に占める割合は３０重量％以上であることが確認できた。
【０１６２】
（実施例６−７）
（血清中におけるＩＣＧ保持率）
実施例５−７同様にｐ１３−１の血清中でのＩＣＧ保持率を求めた。
表１８に示した通り、ＩＣＧ保持率９１％であり、血清中でのＩＣＧ保持率は高いことが確認できた。
【０１６３】
【表１８】
2014129318.tif 000026
【０１６４】
（実施形態２に対応する実施例）  
以下の実施例で７００/７８０比が１以上を示すＩＣＧ内包脂質粒子を作製する際に用いる具体的な試薬や反応条件を挙げているが、これらの試薬や反応条件は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
以下に記した試薬は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、ＭＣ−８０８０、日本油脂製）、ジステアロイルホスファチルジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日本油脂製）、コレステロール（和光純薬製）、デキストラン４０（東京化成製）、デキストラン７０（東京化成製）、クロロホルム（キシダ化学特級）、メタノール（キシダ化学特級）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、同仁化学製）を用いた。なお、下記実施例で用いたデキストランのうち、分子量４０ｋＤａのものは上記のデキストラン４０、分子量７０ｋＤａのものは上記のデキストラン７０である。
【０１６５】
（実施例７）（比較例）
（ＩＣＧを内包する脂質粒子の調製１）
ＤＳＰＣ ６１．２ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０．４ｍｇ、コレステロール２０．４ｍｇをクロロホルム１ｍＬに溶解した。ＩＣＧ １５ｍｇをメタノール１ｍＬに溶解した。クロロホルム溶液１ｍＬとメタノール溶液１ｍＬをナス型フラスコに入れ混合し、４０℃で溶媒を減圧留去（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２０５、ビュッヒ製）した後、真空乾燥（Ｖａｃｕｕｍ  ｏｖｅｎ  ＶＯＳ−３０１ＳＤ、ＥＹＥＬＡ製）を一晩行った。得られた脂質とＩＣＧの乾固物に対して、デキストランを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．３）(以後ＨＥＰＥＳ溶液と呼ぶ)に溶解したデキストラン溶液（デキストラン濃度は表１９に示した濃度） ２．５ｍＬを添加し、６０℃で超音波照射（３周波超音波洗浄器 ＶＳ−１００III、アズワン）３０分間行った。次いでプローブ型の超音波照射装置（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  ＵＤ−２００、ＴＯＭＹ製）を用いて、氷水中で１０分間超音波処理（ＯＵＴＰＵＴレベル４）を行った。その後、ＨＥＰＥＳ溶液を８ｍＬ添加したものを室温で２８００００×ｇ、１７分間超遠心（日立工機株式会社製、ＣＳ１５０ＧＸＬ）し、沈殿物を回収した。さらに次のとおり遠心操作を２回繰り返した。沈殿物をＨＥＰＥＳ溶液１ｍＬで再懸濁し、超遠心（条件同上）し、沈殿物を回収した。合計３回の超遠心を経て得られた沈殿物をＨＥＰＥＳ溶液０．５ｍＬで再懸濁し、ＩＣＧ内包脂質粒子を調製した。表１９に示したようにデキストラン分子量、デキストラン濃度をかえて７種類のＩＣＧ内包脂質粒子を調製した。各サンプル名も表１９に示した。
【０１６６】
尚、サンプルＣ０とＰＬＤ１は上記同様にもう一度調製し、合計２ロット調製して調製再現性を確認した。
【０１６７】
【表１９】
2014129318.tif 000027
【０１６８】
（実施例８）
（ＩＣＧを内包する脂質粒子の調製２）
ＤＳＰＣ ９０ｍｇ、コレステロール３０ｍｇをクロロホルム１ｍＬに溶解した。ＩＣＧ １５ｍｇをメタノール１ｍＬに溶解した。クロロホルム溶液１ｍＬとメタノール溶液１ｍＬをナス型フラスコに入れ混合し、４０℃で溶媒を減圧留去し、脂質とＩＣＧの乾固物を得た。この脂質とＩＣＧの乾固物をクロロホルム１．６ｍＬで溶解し、脂質ＩＣＧクロロホルム溶液とした。
【０１６９】
デキストラン４０  ２．６ｇとＤＳＰＥ−ＰＥＧ ３０ｍｇをＨＥＰＥＳ溶液２０ｍＬに溶解したＤＳＰＥ−ＰＥＧデキストラン溶液に、脂質ＩＣＧクロロホルム溶液を全量滴下し、プローブ型の超音波照射装置により氷水中で冷却しながら２分間超音波処理を行いエマルション液を得た。このエマルション液をロータリーエバポレーターを使い、４０℃でクロロホルムを２時間減圧留去した。クロロホルム留去した液１９ｍｌを限外ろ過器（アミコンウルトラ１５、１００ＫＤ分画用、ミリポア製）を用いて、ＨＥＰＥＳ溶液で溶媒置換を行い、溶媒置換された溶液を１０ｍｌとして回収した。溶媒置換は元の液がＨＥＰＥＳ溶液で１／３４希釈されるまでおこなった。溶媒置換された溶液を実施例７同様に３回の超遠心し、ＩＣＧ内包脂質粒子  ＥＰＬＤ１を調製した。
【０１７０】
また上記ＤＳＰＥ−ＰＥＧデキストラン溶液のかわりにデキストラン４０を添加していないＤＳＰＥ−ＰＥＧ溶液を用いたＩＣＧ内包脂質粒子  ＥＰＬＤ０を調製した。ＥＰＬＤ０はＥＰＬＤ１調製方法において限外ろ過器を使った溶媒置換操作を省略したこと以外は同様に調製した。
【０１７１】
（実施例９）
（吸収スペクトル測定）
実施例７と８で得られた９種類のＩＣＧ内包脂質粒子の吸収スペクトルを測定し、図１１に示した。
７８０ｎｍの吸収はＩＣＧの単量体に由来し、７００ｎｍはＨ会合体に由来する。すなわち、７００ｎｍの吸光度と７８０ｎｍの吸光度の比（７００／７８０比と略すことがある）は、Ｈ会合体の形成率を示すと考えられる。表２０に７００／７８０比を示した。なお、測定には光路長１ｃｍの石英セルを用い、脂質粒子液をＨＥＰＥＳ溶液で適当に希釈した水溶液を用いた。
【０１７２】
（実施例１０）
（脂質粒子の粒径）
実施例７と８で得られた９種類（１１サンプル）のＩＣＧ内包脂質粒子の粒径を動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した結果、すべて単分散粒子として計測され、キュムラント解析粒径は９４〜１３６ｎｍの間の粒径であった。各サンプルの粒径は表２０に示した。 
【０１７３】
（実施例１１）
（脂質粒子の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察）
ＩＣＧ内包脂質粒子の形態を確認するため、サンプルＰＬＤ１とＣ０のＴＥＭ観察を行った。酢酸ウラニル染色剤を使ったネガティブ染色法にて染色し、ＴＥＭ（Ｈ−７１００ＦＡ、日立製）で観察した。ＴＥＭ像は図１２に示した。
観察の結果、ＰＬＤ１とＣ０共に典型的なリポソームの形態を呈し、一枚膜リポソームが主体で、一部多層膜リポソームもみられた。大きさもおよそ１００ｎｍ前後であり、ＤＬＳ計測での粒径とほぼ一致していると思われる。
【０１７４】
（実施例１２−１）
（血清中における粒子内ＩＣＧ保持率の評価）
実施例７と８で得られた９種類（１１サンプル）のＩＣＧ内包脂質粒子の生体内における脂質粒子内ＩＣＧ保持率を測定するため、生体内モデルとして血清溶液を用いた。つまり、血清中における脂質粒子内ＩＣＧ保持率を評価した。評価方法は次の通りである。
【０１７５】
各サンプルをＨＥＰＥＳ溶液で希釈し、９６−ウエルプレート吸光度計（ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ 、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で吸光度を測定し、各サンプルを最大吸収波長で吸光度３の濃度に調整した。これらをサンプルチューブに移し、ウシ胎児血清でそれぞれ１０倍希釈し、血清混合液を調製した。血清混合液のＩＣＧ濃度はおよそ５μｇ／ｍＬ濃度に相当し、後述するマウス腫瘍の生体内蛍光イメージング時における血中濃度に相当する。
【０１７６】
次に血清混合液を暗所、３７℃で２４時間インキュベートした後、９６−ウエルプレート吸光度計で波長６５０〜９００ｎｍ間の吸光スペクトルを測定した。次に、この血清混合液１ｍＬを超遠心（２８万Ｇ、１７分、室温）することで血清中のＩＣＧ内包脂質粒子を沈殿させた。そして遠心上清の波長６５０〜９００ｎｍ間の吸光スペクトルを測定した。この遠心条件ではＩＣＧは沈殿しないことを確かめてある。
【０１７７】
したがって、血清中における脂質粒子内ＩＣＧ保持率を式１のように定義する。
ＩＣＧ保持率（％）＝（１−遠心上清のスペクトル積分値／遠心前のスペクトル積分値）×１００      （式１）
各サンプルの血清中ＩＣＧ保持率結果は、表２０に示した。
【０１７８】
【表２０】
2014129318.tif 000028
【０１７９】
（実施例１２−２）
（７００／７８０比とＩＣＧ保持率との関係）
実施例７と８で得られた９種類（１１サンプル）の吸光度７００／７８０比とＩＣＧ保持率の関係を図１３に示した。７００／７８０比とＩＣＧ保持率の相関係数０.９７２と非常に高い正相関をすることが分かった。ただし相関係数を算出するに当たりＰＬＤ１はＩＣＧ保持率が１００％近く、ＩＣＧ保持率の数値が頭打ちになっているため、サンプルＰＬＤ１のデータ２点は除外して相関係数を求めた。
図１３に示した通り７００／７８０比が高くなるにつれて、血清中でのＩＣＧ保持率は高くなることを見出した。このように７００／７８０比が１以上になるＩＣＧ内包脂質粒子を調製することより、従来のＩＣＧ内包リポソーム（従来モデルとしてＣ０をここでは示した）より血清中でのＩＣＧ保持率を高めることができることが明らかである。
【０１８０】
（実施例１２−３）
（デキストラン添加濃度と７００／７８０比との関係）
実施例７で得られたＰＬＤ１、ＰＬＤ２及びＣ１のデキストラン４０添加濃度と吸光度７００／７８０比との関係を図１４に示した。デキストラン４０添加濃度と吸光度７００／７８０比の相関係数０.９９７と非常に高い正相関をすることが分かった。
【０１８１】
図１４に示した通りデキストラン４０添加濃度が高くなるにつれて、７００／７８０比は高くなることを見出した。図１４から、デキストラン添加濃度が水系媒体に１５ｍｇ／ｍｌ（１．５重量％）以上のときに、７００／７８０比が１以上になるＩＣＧ内包脂質粒子を調製することができると考えられる。
【０１８２】
（実施例１３）
（脂質粒子の腫瘍造影能の確認）
血清中で高いＩＣＧ保持率を示したＰＬＤ１とＥＰＬＤ１の腫瘍造影能を評価するため、担癌マウスに両サンプルを投与し、腫瘍部の蛍光イメージングを行った。蛍光イメージング実験においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。イメージング実験の約２週間前に２×１０６個のＮ８７ヒト胃癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８２２）を、マウスの肩と大腿部に皮下注射した。本発明にかかるＰＬＤ１とＥＰＬＤ１ならびに対照としてのＩＣＧをマウスに投与し、３群で比較を行った。投与量はマウス当たり、色素量として１３ｎｍｏｌ（およそ１０μｇ）で、１００μＬのＨＥＰＥＳ溶液としてマウス尾静脈に注射した。プローブを投与したマウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（登録商標）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、投与２４時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。図１５は投与後２４時間目のマウスの明視野像と蛍光イメージを重ねたものである。図１５のＰＬＤ１及びＥＰＬＤ１を投与したマウスには白矢印で示される担癌部位での蛍光信号が認められた。腫瘍部蛍光強度と非腫瘍部のバックグランド蛍光強度の比（Ｔ／Ｂ比）を計算すると、両サンプルともに、２．１〜２．３であり明瞭に腫瘍部の造影できることが確認できた。またＩＣＧを投与したマウスでは、白矢印で示される担癌部位での投与２４時間後の蛍光信号は確認できなかった。この結果より、ＰＬＤ１とＥＰＬＤ１はともに腫瘍を造影することが可能であり、腫瘍造影剤としての有効性が示された。
【０１８３】
（実施例１４）
（小粒径化処理）
本実施例の作業工程を図１６に示す。ＤＳＰＣ ６１．２ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０．４ｍｇ、コレステロール２０．４ｍｇをクロロホルム１ｍＬに溶解した。ＩＣＧ １５ｍｇをメタノール１ｍＬに溶解した。クロロホルム溶液１ｍＬとメタノール溶液１ｍＬをナス型フラスコに入れ混合し、４０℃で溶媒を減圧留去（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２０５、ビュッヒ製）した後、真空乾燥（Ｖａｃｕｕｍ  ｏｖｅｎ  ＶＯＳ−３０１ＳＤ、ＥＹＥＬＡ製）を一晩行った。得られた脂質とＩＣＧの乾固物に対して、デキストランを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．３）に溶解したデキストラン溶液（デキストラン濃度は１３０ｍｇ／ｍｌ） ２．５ｍＬを添加し、６０℃で超音波照射（３周波超音波洗浄器 ＶＳ−１００III、アズワン）３０分間行った。次いでプローブ型の超音波照射装置（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  ＵＤ−２００、ＴＯＭＹ製）を用いて、氷水中で１０分間超音波処理（ＯＵＴＰＵＴレベル４）を行った。以下、粒径は動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定したキュムラント解析による粒径分布で示す。
【０１８４】
このようにして得られたリポソーム分散液に、以下の手順で小粒径化処理を行った。処理前および各工程後の粒径分布を図１７に示す。
図１７は本発明の実施例１４における小粒径化処理の主要工程における動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定したキュムラント解析による粒径分布図であって、（１７−ａ）は初期リポソーム分散液、（１７−ｂ）は初期リポソーム分散液をＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．３）で１０倍希釈したリポソーム分散液、（１７−ｃ）はＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．３）で１０倍希釈したリポソーム分散液を孔径０．４５μｍフィルタでろ過したリポソーム分散液、（１７−ｄ）は超音波で再分散したリポソーム分散液の粒径分布図である。
上記の初期リポソーム分散液（粒径分布図１７の１７−ａ、平均粒径のピーク：５５．６ｎｍおよび１２８．５ｎｍ）２．５ｍＬを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．３）２２・５ｍｌに滴下し１０倍希釈を行った。（粒径分布図１７の１７−ｂ、平均粒径のピーク：９４．４５ｎｍ）
続いて、ザルトリウス・メカトロニクス・ジャパン製ミニザルト  （孔径０．４５μｍ、サイズ  ２６ｍｍ、  膜材質  ＣＡ）フィルタを用いてろ過を行った。（粒径分布図１７の１７−ｃ、平均粒径のピーク：１０１．２ｎｍ）
１０本のナスフラスコに２．５ｍｌずつ分注し、６０℃で超音波照射（３周波超音波洗浄器 ＶＳ−１００III、アズワン）３０分間行った。（粒径分布図１７の１７−ｄ、平均粒径のピーク：５８．３５ｎｍ）
【０１８５】
（実施例１５）
（小粒径化処理の再現性）
別ロットで実施例１４と同様の処理を行い、それぞれのロットにおいて本発明の小粒径化処理を施した。処理前および各工程後の粒径分布を１枚の粒径分布図にまとめたものを図１８に示す（粒径分布図１８の１８−ｅ、粒径分布図１８の１８−ｆ）。
粒径分布図１８の１８−ｅに示すロットでは、初期リポソーム分散液の平均粒径は１０３．８ｎｍだったが、本発明の小粒径化処理により平均粒径は５９．４２ｎｍになった。粒径分布図１８の１８−ｆに示すロットでは、初期リポソーム分散液の平均粒径は１２７．５ｎｍだったが、本発明の小粒径化処理により平均粒径は５２．９０ｎｍになった。
【０１８６】
実施例１４および１５からわかるように、小粒径化処理前は平均粒径が１００ｎｍ以上だったが、本発明の小粒径化処理前により、平均粒径５０ｎｍから６０ｎｍの範囲に再現性よく収束する小粒径リポソームを得た。
図１８は本発明の実施例１５において小粒径化処理の主要工程における動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定したキュムラント解析による粒径分布図であって、（１８−ｅ）および（１８−ｆ）は、各々別ロットのリポソーム分散液について、初期リポソーム分散液・ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．３）で１０倍希釈したリポソーム分散液・孔径０．４５μｍフィルタでろ過したリポソーム分散液・超音波で再分散したリポソーム分散液について粒径分布を１枚にまとめた粒径分布図である。
【符号の説明】
【０１８７】
１  Ｊ会合体
２  リン脂質
３  リポソーム
４  界面活性剤
１０１  インドシアニングリーン（Ｈ会合体） 
１０２  インドシアニングリーン（単量体） 
１０３  膜
１０４  内水相
【図３】
2014129318.tif 000029
【図４】
2014129318.tif 000030
【図７】
2014129318.tif 000031
【図９】
2014129318.tif 000032
【図１４】
2014129318.tif 000033
【図１７】
2014129318.tif 000034
【図１８】
2014129318.tif 000035
【図１】
2014129318.tif 000036
【図２】
2014129318.tif 000037
【図５】
2014129318.tif 000038
【図６】
2014129318.tif 000039
【図８】
2014129318.tif 000040
【図１０】
2014129318.tif 000041
【図１１】
2014129318.tif 000042
【図１２】
2014129318.tif 000043
【図１３】
2014129318.tif 000044
【図１５】
2014129318.tif 000045
【図１６】
2014129318.tif 000046