(57)【要約】【課題】本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１に結合し、コレステロールの吸収を阻害する薬剤を提供することを課題とする。【解決手段】ヤマブシタケの菌糸体培養濾液のヘキサン又は酢酸エチル抽出物を配合したことを特徴とするコレステロール吸収阻害剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤマブシタケ（山伏茸、学名：Hericium erinaceum）菌糸体培養後の培養濾液抽出物を配合したことを特徴とするコレステロール吸収阻害剤。
【請求項２】
ヤマブシタケ（山伏茸、学名：Hericium erinaceum）培養菌糸体培養後の培養濾液抽出物を配合したことを特徴とするＮＰＣ１Ｌ１を阻害する剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロール吸収阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中コレステロールの上昇は冠状動脈性心疾患の主要な危険因子である。血中コレステロールを低下させるためには、基本的に、低コレステロールの食物、胆汁酸性の金属イオン封鎖剤（コレスチラミンおよびコレスチポール）、ニコチン酸（ナイアシン）、フィブラート類およびプロブコールなどにかぎられていた。しかしこれらの薬剤や療法には治療の限界があった。
近年、ロバスタチン、シンバスタチンおよびプラバスタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤）が、冠動脈および頸動脈におけるアテローム性病変の進行を遅延させることが確認された。さらにシンバスタチンおよびプラバスタチンが冠状動脈性心臓病のリスクを低下させることが明らかとなった。
【０００３】
動脈硬化疾患において、コレステリルエステルは、アテローム性病変の主要な構成成分であり、動脈壁細胞におけるコレステロールの主要な貯蔵形態である。このコレステリルエステルの形成は、食餌性コレステロールの腸管吸収における重要なステップでもある。
小腸上皮細胞に取り込まれたコレステロールは、小腸上皮細胞内の小胞体にてコレステリルエステルに変換された後、カイロミクロンを形成して体内に吸収されることが知られている。従って、コレステリルエステルの形成阻害が、食餌性コレステロールの腸管吸収を阻止することが推測され、これに伴う血中コレステロールの減少が、アテローム性病変形成の進行を抑制し、動脈硬化の予防や改善につながるものと考えられている。
【０００４】
またエゼチミブ（Ezetimibe）などの特定のヒドロキシ置換アゼチジノン（特許文献1：米国特許第５，７６７，１１５号公報）は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防におけるコレステロール低下剤として有用であることが知られている。エゼチミブのコレステロール低下作用は、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスの研究から、小腸のコレステロール吸収を担う小腸の膜蛋白質であるNiemann Pick Type C 1 like 1（以下NPC1L1という）とエゼチミブが結合することによって阻害されることが明らかとなった（特許文献２：特開２０１０−２５２７９８号公報）。
従って、エゼチミブとNPC1L1の結合を阻害する物質は、消化管内のコレステロール吸収を阻害し、アテローム性動脈硬化を改善することが期待されている。
【０００５】
キノコは主として担子菌類や子嚢菌類の子実体の総称である。近年キノコの子実体からコレステロールの低下効果のある物質や、動脈硬化の予防効果を有するものが得られている。特許文献３にはプレウロツス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉ）ｖａｒ．ｆｅｒｕｌａｅやプロウロツス・オストレアツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｕｔｒｅａｔｕｓｕ）などプレウロツス属のキノコが高コレステロール血症の治療剤であるロバスタチンを産生することが開示されている（特許文献３：特表２００３−５２０５７６号公報）。また特許文献4には担子菌類のシイタケ、キクラゲ、マイタケ、レイシがアディポネクチンを分泌促進しコレステロール低下に効果を示すことが開示されている（特許文献４：特開２００８−２９７２５６号公報）。このようにキノコ類の特定の種の子実体がコレステロールを低下させ、動脈硬化を軽減する作用を示すことは従前から知られていた。また特許文献５にはヤマブシタケ（Hericium erinaceum）の子実体のエタノール抽出物が血中トリグリセリドやコレステロール低下作用を有することが開示されている（特許文献５：特開平１１−２６９０８８号公報）。
【０００６】
しかし、これらの先行文献にも、キノコ抽出物が腸管でのコレステロール吸収に係わるＮＰＣ１Ｌ１蛋白質とコレステロールの結合を阻害し、コレステロールの吸収を抑制することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，７６７，１１５号公報
【特許文献２】特開２０１０−２５２７９８号公報
【特許文献３】特表２００３−５２０５７６号公報
【特許文献４】特開２００８−２９７２５６号公報
【特許文献５】特開平１１−２６９０８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１に結合し、コレステロール吸収阻害する薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するべく検討した結果、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）の培養菌糸体を培養した際の培養濾液抽出物が、コレステロール吸収に係わるＮＰＣ１Ｌ１とエゼチミブの結合を強く阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の構成は次の通りである。
（１）ヤマブシタケ（山伏茸、学名：Hericium erinaceum）菌糸体培養後の培養濾液抽出物を配合したことを特徴とするコレステロール吸収阻害剤。
（２）ヤマブシタケ（山伏茸、学名：Hericium erinaceum）培養菌糸体培養後の培養濾液抽出物を配合したことを特徴とするＮＰＣ１Ｌ１を阻害する剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、コレステロール吸収阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヤマブシタケ菌糸を２週間培養した濾液をヘキサンで抽出して得られた抽出物がエゼチミブのＮＰＣ１Ｌ１への結合阻害するＩＣ５０濃度を求めるためのグラフである。
【図２】ヤマブシタケ菌糸を２週間培養した濾液を酢酸エチルで抽出して得られた抽出物がエゼチミブのＮＰＣ１Ｌ１への結合阻害するＩＣ５０濃度を求めるためのグラフである。
【図３】ヤマブシタケ菌糸を３週間培養した濾液をヘキサンで抽出して得られた抽出物がエゼチミブのＮＰＣ１Ｌ１への結合阻害するＩＣ５０濃度を求めるためのグラフである。
【図４】ヤマブシタケ菌糸を３週間培養した濾液を酢酸エチルで抽出して得られた抽出物がエゼチミブのＮＰＣ１Ｌ１への結合阻害するＩＣ５０濃度を求めるためのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に使用するヤマブシタケ（山伏茸、学名：Hericium erinaceum）菌糸体培養後の培養濾液抽出物は、菌糸体を除去した培養液をヘキサンまたは酢酸エチルなどの非水溶性溶媒を用いて当業者が通常行う分配抽出処理により容易に製造することができる。抽出液は、減圧乾燥などにより溶媒を除去し乾燥エキスにすることができる。
本発明に使用するヤマブシタケの培養のための菌株としては、天然または栽培された子実体から分離し、純培養された菌株を用いることができる。また食用キノコとして品種登録された登録株の分譲を受けて培養しても良い。本発明実施例においては長野県林業総合センターから分譲された菌株を用いて行ったものである。
菌株の培養にあたっては、液体培養が好ましい。通常菌糸体の培養にあたっては、植菌後振盪フラスコを用いた振盪培養法またはジャーファメンターなどの撹拌通気培養装置を用いた撹拌培養法などを採用することができる。用いる培養液は、通常真菌類の振盪培養に供する培養液であれば使用可能である。たとえばポテトデキストロース培養液、ペプトンデキストロース培養液、酵母麦芽エキス培養液などが使用できる。これらの培養液に必要に応じてアミノ酸やビタミン、微量金属塩などを配合することもできる。
培養にあたっては、２０〜２５℃の温度条件で行うことが好ましい。培養期間は７〜３０日、好ましくは１４〜２１日である。
【００１４】
培養終了した培養液は濾過又は遠心分離法により菌糸体や沈殿物を除去し、培養液のみを回収する。回収した培養液は上述した溶媒による分配抽出操作に付す。
【００１５】
本発明の阻害剤または予防もしくは改善剤は、通常使用される任意成分を含有する錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤などの剤形で経口により投与することができる。任意成分としては、例えば、賦形剤、結合剤、被覆剤、滑沢剤、糖衣剤、崩壊剤、増量剤、矯味矯臭剤、乳化・可溶化・分散剤、安定剤、ｐＨ調整剤、等張剤などが挙げられる。これらを常法に従って処理することにより、本発明の阻害剤等を製造することができる。
【００１６】
コレステロール吸収抑制剤として使用する場合の抽出エキスの投与量は、年齢、性別、体重などによって異なるが、通常、原生薬換算で成人１日あたり約50mg〜１００g、好ましくは500mg〜１００gである。
なお、剤には、医薬品のみならず、医薬部外品、健康食品なども包含される。
【実施例】
【００１７】
以下に製造例および試験例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する。
（製造例）
１．菌株および培地
Hericium erinaceum Y6  ( ヤマブシタケ Y6 )
長野県林業 総合センター（長野県塩尻市片丘5739）から分譲を受けた。なお本菌株は前記機関から無条件で分譲可能である。
下記の表１に示す組成のＮ培地を液体培養用の培養液として使用した。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
２．培養方法
シード培養液は、N培地5ml（試験管φ18 × 210 mm）にHericium erinaceum Y6の菌糸体を一白金耳量接種し、25 ℃、7日間振盪培養（100 spm）し調製した。
前培養液は、N培地60ml（500 ml溶三角フラスコ）にシード培養液1.2 ml を植菌し、25 ℃、7 日間振盪培養（100 spm）し調製した。
本培養は、N培地3 L （ジャーファーメンター、MDL型5Ｌ、丸菱バイオエンジ）に 、前培養液 60 ml を植菌し、25 ℃、 250 rpm、 通気量1.0 L/min の条件下、14、及び21日間行った。 消泡剤として、アクトコール(武田薬品工業) 3 ml を添加した。
【００２０】
３．培養濾液の調製法
ブフナー漏斗( φ150 mm )に定性濾紙No. 2 ( φ150 mm、ADVANTEC )を二枚重ねに置き、ヤマブシタケ菌糸体培養液を吸引濾過し、菌糸体を除いた培養濾液を得た。
【００２１】
４．培養濾液からの抽出方法
培養濾液500mlにヘキサン（Nacalai tesque）1Lを加え、分液漏斗を用いて液々分配した。回収したヘキサン相はロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固させ、ヘキサン抽出物とした。残渣は、同様な方法により、更に1Lの酢酸エチル（Nacalai tesque）で分液し、酢酸エチル抽出物とした。最後の残渣は凍結乾燥し、水可溶部とした。上記操作を複数回くり返し、培養濾液全量を処理した。
上記操作の結果は以下の通り
14日間培養のヘキサン抽出物    0.272g
14日間培養の酢酸エチル抽出物  3.33g
21日間培養のヘキサン抽出物    0.158g
21日間培養の酢酸エチル抽出物  3.52g
【００２２】
（試験例）
製造例で得られた各種溶媒抽出物を、下記の試験法でＮＰＣ１Ｌ１とエゼチミブの結合阻害活性を評価する試験を行った。
（１）ラットNPC1L1遺伝子のクローニング
ラット空腸由来1本鎖cDNA（ジェノスタッフ株式会社）を鋳型にiProof High-Fidelity DNA ポリメラーゼ（Biorad）を用いたPCR法により、5’端にHindIII、3’端にXbaIを付加したrNPC1L全長を増幅し、Zero Blunt TOPO PCRクローニング キット（invitrogen）を用いてpCR4 Blunt TOPOベクターにクローニングした。クローニングしたＤＮＡ配列を配列表配列番号１に示す。
なお使用したプライマーは次のとおりである。
Sense: 5’- aagcttaccatggcagctgcctggctgggatggc-3’（配列番号２）
Antisense: 5’- tctagattagaacttttggtcacttttgggc-3’ （配列番号３）
【００２３】
PCR条件
１．98℃ 30秒、２．98℃ 10秒、３．68℃ 30秒、４．72℃ 1.5分、５．72℃ 10分、２〜４を35サイクル実施する。
【００２４】
（２）ラットNPC1L1安定発現細胞の作製
pCR4 Blunt TOPO rNPC1L1ベクターをHindIII及びXbaI処理し、アガロース電気泳動後、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてrNPC1L1を抽出し、発現用ベクターpcDNA3.1（invitrogen）のHindIII、XbaIサイトにサブクローニングした。作製したpcDNA3.1 rNPC1L1の配列はプレミックスシーケンス解析サービス（タカラバイオ）を利用して確認を行った。
シーケンス用primer
Sense:5’-cactgcttactggcttatcg-3’ （配列番号４）
Sense:5’-gccttttatcagcgcagcttt-3’（配列番号５）
Sense:5’-aactctcaccccataccatc-3’ （配列番号６）
Sense:5’-cagtacttccagaacaaccg-3’ （配列番号７）
Sense:5’-ttctactcctacctgggtgt-3’ （配列番号８）
Sense:5’-cttcttccgcaagatatacgc-3’（配列番号９）
Sense:5’-ccacagcggaacagtttcat-3’ （配列番号１０）
Sense:5’-tccctcatcaaccttgtcac-3’ （配列番号１１）
Sense:5’-gtccatgcttcttgctgatg-3’ （配列番号１２）
【００２５】
次いで、ヒト腎臓由来HEK293細胞（ATCC）に、Fugene HD（Roche）を用いてpcDNA3.1 rNPC1L1をトランスフェクションし、最終濃度1mg/ml G418-sulfate（Wako）にてセレクションを行った。更に限界希釈法によりセレクションを行い、HEK/rNPC1L1安定発現細胞の単一クローンを得た。
【００２６】
（３）膜画分の調製
φ150mmdish（Nunc）にHEK293/rNPC1L1安定発現細胞を播種し、DMEM（Nacalai tesque）+10%FBS（Gibco）にてコンフルエントになるまで培養し、最終濃度4mM Sodium Butyrate（Sigma Aldrich）24時間処理後の細胞をCell Dissociation Buffer（invitrogen）を用いて回収した。800rpm、3分の遠心後、残渣の細胞を8%Sucrose含有20mM HEPES/Tris Buffer（pH7.4）+proteinase inhibitor（Roche）に懸濁し、超音波を用いて破砕した。4000rpm、4℃、10分の遠心後、上清を48000rpm（125000G）、4℃、3時間、超遠心し、残渣を膜画分として回収した。膜画分は160mM NaCl、5%Glycerol含有20mM HEPES/Tris Bufferに再懸濁し、BCA assay（Thermo Scientific Pierce）にて蛋白質濃度を定量後、使用するまで-80℃に保存した。
【００２７】
（４）結合阻害実験
96well plate（Nunc）に最終濃度25nM [3H]Ezetimibe-glucuronide（American Radiolabeled Chemicals, Inc.）、1.25mg/ml HEK/rNPC1L1由来膜蛋白質、各濃度の被験物質を緩衝液A（26mM NaHCO3、0.96mM NaH2PO4、5mM HEPES、5.5mM Glucose、117mM NaCl、5.4mM KCl、0.03% Sodium taurocholate、0.05% Digitonin、pH7.4）に加えTotal volume 30μlとなるよう調製し、室温、1時間反応させた。反応液はHarvester（PerkinElmer）を用いてUniFilter-96 GF/C（PerkinElmer）にトラップし、ミリQ水（ミリポア）を用いて遊離[3H]Ezetimibe-glucuronideを洗浄した。乾燥後、Microscint-20（PerkinElmer）を15μl/well添加し、Topcount（PerkinElmer）によりrNPC1L1と結合した[3H]Ezetimibe-glucuronideの放射活性を測定した。
【００２８】
（５）結果
図１、図３にヘキサン抽出物の希釈濃度系列ごとのＮＰＣ１Ｌ１結合阻害結果を、図２図４に酢酸エチル抽出物のＮＰＣ１Ｌ１結合阻害結果を示す。また抽出物の希釈濃度系列から結合の５０％阻害値（ＩＣ５０）を求めた。結果を下記表２に示す。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
エゼチミブのＮＰＣ１Ｌ１結合阻害は、２週間培養した培養液をヘキサンで分配抽出した抽出物が最も高かった。
以上の試験結果から、ヤマブシタケの菌糸体培養液の抽出物はコレステロール吸収阻害剤として有用であることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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