(57)【要約】      （修正有）【課題】新たなＴＲＰＡ１刺激剤の提供。【解決手段】炭素数が１２〜２６であって、炭素−炭素二重結合を１以上有し、ヒドロキシル基又はヒドロペルオキシド基からなる群から選ばれる１以上の官能基を有する、脂肪酸（例えば、（１０Ｅ，１２Ｚ）−９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸、（１０Ｅ，１２Ｚ）−９−ヒドロペルオキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ）−１５−ヒドロペルオキシ−５，８，１１，１３−エイコサテトラエン酸、（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ｅ，１９Ｚ）−１７−ヒドロペルオキシ−４，７，１０，１３，１５，１９−ドコサヘキサエン酸等）を有効成分として含有する、ＴＲＰＡ１刺激剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数が１２〜２６であって、
炭素−炭素二重結合を１以上有し、
ヒドロキシル基又はヒドロペルオキシド基からなる群から選ばれる１以上の官能基を有する、
脂肪酸を有効成分として含有する、ＴＲＰＡ１刺激剤。
【請求項２】
前記脂肪酸の炭素数が１８〜２２である、請求項１に記載の刺激剤。
【請求項３】
前記脂肪酸が、炭素−炭素二重結合を１〜６有する、請求項１に記載の刺激剤。
【請求項４】
前記脂肪酸が、
（１０Ｅ，１２Ｚ）−９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸、
（９Ｚ，１１Ｅ）−１３−ヒドロキシ−９，１１−オクタデカジエン酸、
（９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｚ）−１３−ヒドロキシ−９，１１，１５−オクタデカトリエン酸、
（１０Ｅ，１２Ｚ）−９−ヒドロペルオキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸、
（９Ｚ，１１Ｅ）−１３−ヒドロペルオキシ−９，１１−オクタデカジエン酸、
（９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｚ）−１３−ヒドロペルオキシ−９，１１，１５−オクタデカトリエン酸、
（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ）−１５−ヒドロペルオキシ−５，８，１１，１３−エイコサテトラエン酸、
（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ｅ，１９Ｚ）−１７−ヒドロペルオキシ−４，７，１０，１３，１５，１９−ドコサヘキサエン酸、
（９Ｚ）−１２−ヒドロキシ−９−オクタデセン酸及び
（９Ｅ）−１２−ヒドロキシ−９−オクタデセン酸
からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の刺激剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＡ１刺激剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＡ１は、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＴＲＰともいう。）ファミリのメンバーであり、化学的刺激を受容するイオンチャネルである。ＴＲＰＡ１は、ヒトの口腔等で発現しており、ＴＲＰＡ１チャネルの活性化は、味覚や感覚に強い刺激をもたらす。ＴＲＰＡ１の活性化は、例えば非特許文献１で開示されているように、酸化ストレスに対する細胞保護タンパク質の発現、発汗、熱発散、消化の改善、血行等を促進する効果がある。
【０００３】
また、非特許文献２では、わさびの刺激成分であるイソチオシアネートに、ショウジョウバエに対する防虫効果があることが開示されている。さらに、イソチオシアネートに対するショウジョウバエの忌避行動には、ＴＲＰＡ１のショウジョウバエホモログであるｐａｉｎｌｅｓｓ遺伝子が関与していることが開示されている。
【０００４】
ＴＲＰＡ１チャネルを活性化するアゴニストとしては、例えば非特許文献１及び２で開示されているように、わさびの刺激成分であるイソチオシアネート、生ニンニクの刺激成分であるアリシン、紫蘇の抽出物であるペリルアルデヒド及びペリラケトン、ガランガルの主な刺激成分であるアセトキシチャビコールアセテート、オリーブオイルの成分であるオレオカンタール等が挙げられる。また、特許文献１で開示されているように、アルデヒド類もＴＲＰＡ１アゴニストとして知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開第２０１１−４２６２４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｍｂｏ  Ｒｅｐ．，１２（１１）：１０９４−１０１項（２０１１）
【非特許文献２】Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．，１６：１０３４−４０項（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新たなＴＲＰＡ１刺激剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、炭素数が１２〜２６であって、炭素−炭素二重結合を１以上有し、ヒドロキシル基又はヒドロペルオキシド基からなる群から選ばれる１以上の官能基を有する脂肪酸がＴＲＰＡ１の応答を促進する作用があることを見出した。
【０００９】
以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、炭素数が１２〜２６であって、炭素−炭素二重結合を１以上有し、ヒドロキシル基又はヒドロペルオキシド基からなる群から選ばれる１以上の官能基を有する脂肪酸を有効成分として含有するＴＲＰＡ１刺激剤を提供する。かかる脂肪酸がＴＲＰＡ１アゴニストとして作用できることは今まで知られておらず、予想外であった。
【００１０】
上記脂肪酸は、炭素数が１８〜２２であることが好ましく、また、炭素−炭素二重結合を１〜６有することが好ましい。
【００１１】
より具体的には、上記脂肪酸は、（１０Ｅ，１２Ｚ）−９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（以下、９−ＨＯＤＥともいう。）、（９Ｚ，１１Ｅ）−１３−ヒドロキシ−９，１１−オクタデカジエン酸（以下、１３−ＨＯＤＥともいう。）、（９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｚ）−１３−ヒドロキシ−９，１１，１５−オクタデカトリエン酸（以下、１３−ＨＯＴともいう。）、（１０Ｅ，１２Ｚ）−９−ヒドロペルオキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（以下、９−ＨＰＯＤともいう。）、（９Ｚ，１１Ｅ）−１３−ヒドロペルオキシ−９，１１−オクタデカジエン酸（以下、１３−ＨＰＯＤともいう。）、（９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｚ）−１３−ヒドロペルオキシ−９，１１，１５−オクタデカトリエン酸（以下、１３−ＨＰＯＴともいう。）、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ）−１５−ヒドロペルオキシ−５，８，１１，１３−エイコサテトラエン酸（以下、１５−ＨＰＥＴＥともいう。）、（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ｅ，１９Ｚ）−１７−ヒドロペルオキシ−４，７，１０，１３，１５，１９−ドコサヘキサエン酸（以下、１７−ＨＰＤＨＡともいう。）、（９Ｚ）−１２−ヒドロキシ−９−オクタデセン酸（以下、１２Ｈ（９Ｚ）−ＯＤＥともいう。）及び（９Ｅ）−１２−ヒドロキシ−９−オクタデセン酸（以下、１２Ｈ（９Ｅ）−ＯＤＥともいう。）からなる群より選ばれる少なくとも１種であることがより好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新たなＴＲＰＡ１刺激剤が提供され、より詳細には、炭素数が１２〜２６であって、炭素−炭素二重結合を１以上有し、ヒドロキシル基又はヒドロペルオキシド基からなる群から選ばれる１以上の官能基を有する脂肪酸を有効成分として含有するＴＲＰＡ１刺激剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＴＲＰＡ１を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、９−ＨＰＯＤ（図１（ａ））又は１３−ＨＰＯＤ（図１（ｂ））の添加に対する応答を示す図である。ＲＲは、ＴＲＰＡ１阻害剤であるルテニウムレッドを示す。
【図２】ＴＲＰＡ１を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、９−ＨＯＤＥ又は１３−ＨＯＤＥの添加に対する応答を示す図である。ＲＲは、ＴＲＰＡ１阻害剤であるルテニウムレッドを示す。
【図３】ＴＲＰＡ１を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、１３−ＨＰＯＴ、１５−ＨＰＥＴＥ又は１７−ＨＰＤＨＡの添加に対する応答を示す図である。ＲＲは、ＴＲＰＡ１阻害剤であるルテニウムレッドを示す。
【図４】ＴＲＰＡ１を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、１２Ｈ（９Ｚ）−ＯＤＥ又は１２Ｈ（９Ｅ）−ＯＤＥの添加に対する応答を示す図である。ＲＲは、ＴＲＰＡ１阻害剤であるルテニウムレッドを示す。
【図５】ＴＲＰＡ１を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、１３−ＨＯＴの添加に対する応答を示す図である。ＲＲは、ＴＲＰＡ１阻害剤であるルテニウムレッドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の脂肪酸は、炭素数が１２〜２６である。また、上記脂肪酸は、炭素数が１６〜２２であることが好ましく、１８〜２２であることがより好ましい。上記脂肪酸の炭素数が上記上限値以下であると、良好な水溶性が得られる傾向がある。
【００１５】
本発明の脂肪酸はまた、炭素−炭素二重結合を１以上有する。好ましくは、上記脂肪酸は炭素−炭素二重結合を１〜６有する。また、上記脂肪酸はヒドロキシル基又はヒドロペルオキシド基からなる群から選ばれる１以上の官能基、好ましくは１又は２の官能基、より好ましくは１の官能基を有するものである。かかる脂肪酸を用いることにより、ＴＲＰＡ１の応答を促進することができる。
【００１６】
さらに、本発明の脂肪酸において、ヒドロキシル基又はヒドロペルオキシド基が結合している炭素原子は、不斉炭素となるが、その立体配置はＲ体でも、Ｓ体でも、ラセミ体でもよい。
【００１７】
また、本発明の脂肪酸は、例えば９−ＨＯＤＥ、１３−ＨＯＤＥ、１３−ＨＯＴ、９−ＨＰＯＤ、１３−ＨＰＯＤ、１３−ＨＰＯＴ、１５−ＨＰＥＴＥ、１７−ＨＰＤＨＡ、１２Ｈ（９Ｚ）−ＯＤＥ及び１２Ｈ（９Ｅ）−ＯＤＥであることが好ましい。これらの脂肪酸は、単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
かかる脂肪酸は、オキシリピンとして天然物から抽出することができ、例えば植物から抽出することができる。植物から抽出されるオキシリピンとしては例えば、９−ＨＯＤＥ、１３−ＨＯＤＥ、１３−ＨＯＴ、１２Ｈ（９Ｚ）−ＯＤＥ、１２Ｈ（９Ｅ）−ＯＤＥ等のようなヒドロキシル基を有するもの、９−ＨＰＯＤ、１３−ＨＰＯＤ、１３−ＨＰＯＴ、１５−ＨＰＥＴＥ、１７−ＨＰＤＨＡ等のようなヒドロペルオキシド基を有するもの等が挙げられる。
【００１９】
かかる脂肪酸はまた、人工的に合成することができる。合成する方法は例えば、ポリエン脂肪酸と、リポキシゲナーゼやサイトクロムＰ４５０ファミリ等の酵素とを用いることができる。
【００２０】
本発明の脂肪酸は、アゴニストとしてＴＲＰＡ１受容体に結合して作用し、ＴＲＰＡ１を刺激して活性化することができる。したがって、本発明の脂肪酸は、ＴＲＰＡ１刺激剤として使用することができる。
【００２１】
本発明の脂肪酸を有効成分として含有するＴＲＰＡ１刺激剤は、食品添加剤として食品に添加し、味覚を調整して改善することができる。本発明の脂肪酸を食品添加剤として用いることにより、天然物を用いて味覚を調整することができるため、安全面から優れている。
【００２２】
本発明の脂肪酸を有効成分として含有するＴＲＰＡ１刺激剤を食品添加剤として用いる場合、ＴＲＰＡ１刺激剤の食品中含有量を制御することにより食品の味覚を改善すること、新しい味覚を有する食品を提供すること等ができる。かかるＴＲＰＡ１刺激剤の食品中の含有量は、食品の形態等により当業者が適宜決めることができる。
【００２３】
本発明の脂肪酸を有効成分として含有するＴＲＰＡ１刺激剤はまた、昆虫忌避剤として用いることができる。それにより、安全性が高い天然物由来の昆虫忌避剤を提供することができる。昆虫忌避剤の形態は特に限定されず、固形、液体、噴霧剤等であってもよい。昆虫忌避剤中のＴＲＰＡ１刺激剤の含有量は、昆虫忌避剤の形態等により当業者が適宜決めることができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
ヒトＴＲＰＡ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＢＣ１５３００３、以下、ｈＴＲＰＡ１ともいう。）を哺乳類発現ベクターｐＢＡｐｏＥＦ１αＰｕｒに連結し、ｈＴＲＰＡ１発現ベクターを構築した。
【００２６】
ヒト胎児由来腎臓細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ、以下ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し、６ウェルプレートに８０〜９０％コンフルエントとした。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用い、ｈＴＲＰＡ１発現ベクターをマニュアルに従って導入した。
【００２７】
アッセイ前日に細胞をトリプシン消化により剥がし、９６ウェルブラックウォールプレート（ｌｕｍｏｘｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ９６  ｗｅｌｌ、グライナージャパン製品番号１２００９６）に５×１０５細胞／ウェルとなるように蒔いた。３７℃のインキュベータで２４時間培養した後、細胞をアッセイバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調製）を用いて洗浄した。ウェル内にバッファーを５０μＬ残し、ここにアッセイバッファーに溶解した１０μＭカルシウム蛍光指示薬Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を５０μＬ添加して２７℃で３０分インキュベートした。その後再度アッセイバッファーで洗浄した後、１００μＬをウェルに残して室温・暗所で１５分静置し、アッセイ用の細胞を調製した。
【００２８】
ＴＲＰＡ１刺激サンプルには以下のようにリガンド等を添加した。濃度が４００μＭとなるように（Ｓ）−９−ＨＰＯＤをアッセイバッファーに溶解し、細胞に１００μＬ添加した。（Ｓ）−９−ＨＰＯＤは、Ｋｕｒｏｄａらの方法に従って合成した（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：１６６１−１６６８項（２００５））。（Ｓ）−１３−ＨＰＯＤ（和光純薬社製）は、濃度が２００μＭとなるようにアッセイバッファーに溶解し、細胞に１００μＬ添加した。また、ＴＲＰＡ１阻害サンプルには、リガンドと共にＴＲＰＡ１阻害剤であるルテニウムレッド（以下、ＲＲともいう）をアッセイバッファーに予め溶解し、細胞に１００μＬ添加した。すなわち、（Ｓ）−９−ＨＰＯＤの最終濃度が２００μＭとなり、（Ｓ）−１３−ＨＰＯＤの最終濃度が１００μＭとなり、ルテニウムレッドの最終濃度が１０μＭとなるように添加した。また、陽性対照として、イオノマイシンをアッセイバッファー１００μＬに溶解し、細胞に添加した。なお、イオノマイシンの最終濃度は５μＭとした。
【００２９】
カルシウムイメージング法を利用して、ＴＲＰＡ1を発現させた細胞における、リガンド添加に対する応答解析を行った。具体的には、蛍光顕微鏡上で３４０ｎｍと３８０ｎｍの励起波長を細胞に照射し、放出される蛍光を顕微鏡に取り付けたＣＣＤカメラでリアルタイムに撮影した。３４０ｎｍと３８０ｎｍの励起光の切り替えはフィルターホイールを用い、撮影間隔は４秒間とした。得られた画像をＭｅｔａＦｌｕｏｒシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）によって解析し、リガンド添加直後（０秒）に対する、リガンド添加から４０秒後の３４０ｎｍと３８０ｎｍとにおける蛍光強度比の増加を計算した。５μＭイオノマイシンを添加したときのＴＲＰＡ１応答を１００％として、それぞれのサンプルの反応を相対値として算出した。結果を図１（ａ）及び図１（ｂ）で示している。（Ｓ）−９−ＨＰＯＤ又は（Ｓ）−１３−ＨＰＯＤの添加によりカルシウムの細胞内への取り込みが顕著に上昇し、その上昇はＴＲＰＡ１阻害剤により抑制された。したがって、（Ｓ）−９−ＨＰＯＤ及び（Ｓ）−１３−ＨＰＯＤは、ＴＲＰＡ１応答を促進する作用を有し、ＴＲＰＡ１刺激剤として活性を有することが確認された。
【００３０】
［実施例２］
リガンドとして（Ｓ）−９−ＨＯＤＥ（Ｌａｒｏｄａｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）又は（Ｓ）−１３−ＨＯＤＥ（Ｌａｒｏｄａｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を、最終濃度が１００μＭとなるように細胞に添加した以外は、実施例１と同様にＴＲＰＡ１への刺激を定量し、ＴＲＰＡ１応答に対する相対値を算出した。結果を図２で示している。（Ｓ）−９−ＨＯＤＥ又は（Ｓ）−１３−ＨＯＤＥの添加によりカルシウムの細胞内への取り込みが顕著に上昇し、その上昇はＴＲＰＡ１阻害剤により抑制された。したがって、（Ｓ）−９−ＨＯＤＥ及び（Ｓ）−１３−ＨＯＤＥは、ＴＲＰＡ１応答を促進する作用を有し、ＴＲＰＡ１刺激剤として活性を有することが確認された。
【００３１】
[実施例３]
リガンドとして（Ｓ）−１３−ＨＰＯＴ、（Ｓ）−１５−ＨＰＥＴＥ又は（Ｓ）−１７−ＨＰＤＨＡ（全て和光純薬社製）を、最終濃度が１００μＭとなるように細胞に添加した以外は、実施例１と同様にＴＲＰＡ１への刺激を定量し、ＴＲＰＡ１応答に対する相対値を算出した。結果を図３で示している。（Ｓ）−１３−ＨＰＯＴ、（Ｓ）−１５−ＨＰＥＴＥ又は（Ｓ）−１７−ＨＰＤＨＡ添加によりカルシウムの細胞内への取り込みが顕著に上昇し、その上昇はＴＲＰＡ１阻害剤により抑制された。したがって、（Ｓ）−１３−ＨＰＯＴ、（Ｓ）−１５−ＨＰＥＴＥ及び（Ｓ）−１７−ＨＰＤＨＡは、ＴＲＰＡ１応答を促進する作用を有し、ＴＲＰＡ１刺激剤として活性を有することが確認された。
【００３２】
［実施例４］
リガンドとして１２Ｈ（９Ｚ）−ＯＤＥ又は１２Ｈ（９Ｅ）−ＯＤＥ（共に和光純薬社製）を、最終濃度が１００μＭとなるように細胞に添加した以外は、実施例１と同様にＴＲＰＡ１への刺激を定量し、ＴＲＰＡ１応答に対する相対値を算出した。結果を図４で示している。１２Ｈ（９Ｚ）−ＯＤＥ又は１２Ｈ（９Ｅ）−ＯＤＥの添加によりカルシウムの細胞内への取り込みが顕著に上昇し、その上昇はＴＲＰＡ１阻害剤により抑制された。したがって、１２Ｈ（９Ｚ）−ＯＤＥ及び１２Ｈ（９Ｅ）−ＯＤＥは、ＴＲＰＡ１応答を促進する作用を有し、ＴＲＰＡ１刺激剤として活性を有することが確認された。
【００３３】
［実施例５］
リガンドとして（Ｓ）−１３−ＨＯＴを、最終濃度が１００μＭとなるように細胞に添加した以外は、実施例１と同様にＴＲＰＡ１への刺激を定量し相対値を算出した。結果を図５で示している。（Ｓ）−１３−ＨＯＴによりカルシウムの細胞内への取り込みが顕著に上昇し、その上昇はＴＲＰＡ１阻害剤により抑制された。したがって、（Ｓ）−１３−ＨＯＴは、ＴＲＰＡ１応答を促進する作用を有し、ＴＲＰＡ１刺激剤として活性を有することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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