(57)【要約】      （修正有）【課題】従来公知の抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体が認識するエピトープ（  Ｎ末端ＥＧＦ様ドメイン）とは異なるエピトープを特異的に認識する抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体の提供。【解決手段】ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のＣＰ領域に対して特異的に反応するモノクローナル抗体、および受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−１４４９であるハイブリドーマにより産生される、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のＣＰ領域に対して特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のＮ末端ＥＧＦ様ドメインに反応しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
サブクラスがマウスＩｇＭである、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
受領番号がＮＩＴＥ ＡＢＰ−１４４９であるハイブリドーマＫＩＪＹ２により産生される、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項４に記載のモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）被験者から血液試料を採取する工程；および、
（ｂ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いて、前記血液試料に含まれる循環腫瘍細胞を検出する工程、
を含む、循環腫瘍細胞の検出方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が蛍光標識されたものである、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記（ｂ）工程において、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のＮ末端ＥＧＦ様ドメインに対して特異的に反応する第２のモノクローナル抗体をさらに用いる、請求項６または７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記第２のモノクローナル抗体が磁性ビーズに結合したものである、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記（ｂ）工程を、完全循環腫瘍細胞計数分析（ｉＣｅａｐ）法により行う、請求項６〜９のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の検出方法に用いられる循環腫瘍細胞検出用キットであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、循環腫瘍細胞検出用キット。
【請求項１２】
受領番号がＮＩＴＥ ＡＢＰ−１４４９であるハイブリドーマＫＩＪＹ２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来上皮細胞接着分子に対するモノクローナル抗体、およびこれを用いた循環腫瘍細胞の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ;ＣＴＣ）は、がん患者の末梢血流を循環する腫瘍細胞と定義され、原発腫瘍または転移腫瘍から血管中へ浸潤した腫瘍細胞である。このＣＴＣの検出は、転移性悪性腫瘍の早期発見の方法の一つとして近年注目されている。その理由は、Ｘ線写真や血清中の腫瘍マーカー検出よりも低侵襲かつ正確に転移性悪性腫瘍の診断を行え、患者の予後予測や治療効果の指標として利用できる点にある。
【０００３】
ＣＴＣは非常に稀少な細胞であり、転移性がん患者の血液に含まれる１０９〜１０１０個／ｍＬの血液細胞のうち、わずか１細胞程度しか存在しないことが知られている。このため、末梢血から稀少なＣＴＣを正確に検出するための技術開発に多大な努力が注がれている。これまでに開発されてきた主要な検出方法には、免疫組織化学法、ＰＣＲ法、フローサイトメトリー法などがある。しかしながら、前述したようにＣＴＣは非常に稀少な細胞であるため、血液をそのままこれらの検出方法に供することはできない。したがって、通常は前処理として、ＣＴＣの濃縮操作が必須であり、検出法に則したレベルまでＣＴＣを濃縮する必要がある。
【０００４】
ＣＴＣの濃縮方法として開発されてきた様々な手法の中で、最も広く利用されているのは、細胞表面の特異的抗原を標的とした腫瘍細胞の濃縮である。その多くは、上皮細胞接着分子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＥｐＣＡＭ；「ＣＤ３２６」とも称される）に対するモノクローナル抗体を固定化した磁気ビーズを血液試料と混合した後、磁石を用いて腫瘍細胞を濃縮する方法をとっている。
【０００５】
ＣＴＣの検出を効率的かつ正確なものにするためには、濃縮と検出といった技術を首尾一貫して行うことが必要である。多段階のハンドリング操作、例えば細胞の染色、洗浄、分離、分注などの操作はＣＴＣのロスを引き起こすため、可能な限りこれらの操作を避け、一体の検出装置中で分析が一貫して行える形が望ましい。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）（Ｖｅｒｉｄｅｘ社）システムはＣＴＣ検出装置として唯一ＦＤＡの認可を受けた装置であり、転移性乳がん、大腸がんおよび前立腺がんの無増悪生存率（ＰＦＳ）および全生存率（ＯＳ）を予測するのに用いられている。この装置では、全血に対して抗ＥｐＣＡＭ抗体固定化磁気ビーズによるＣＴＣの濃縮を行い、腫瘍細胞に対して免疫染色を行った後、自動化蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる。より具体的には、まず、血液試料７．５ｍＬをコニカルチューブに移し、緩衝液と混和した後に遠心分離器で赤血球層を分離し、除去する。その後、抗ＥｐＣＡＭ抗体がナノ鉄粒子に結合されてなる磁気ビーズにより血液中の多くの細胞から上皮細胞を特異的に分離・抽出する。次いで、分離された上皮細胞に蛍光標識サイトケラチンモノクローナル抗体を反応させるとともに蛍光性のＤＮＡ染色物質（ＤＡＰＩ）を用いて細胞の核を染色する。この際、混入した白血球をＣＴＣと識別するために、同様に蛍光標識した抗ＣＤ４５抗体を反応させる。このようにして、血液試料中のＣＴＣの検出・定量が行われるのである。
【０００６】
上述したＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムによる血液試料中のＣＴＣの検出・定量方法では、細胞内への抗体透過が必要なため、細胞固定と細胞膜透過処理を行う必要があった。したがって、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムによる分析が終了した試料を別途のさらなる分析（例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ − Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ−ＰＣＲ、染色体異数性検査、変異分析などの遺伝子診断・ゲノム解析）に供することはできない。
【０００７】
血液試料中のＣＴＣの検出・定量を経た血液試料が別途のさらなる分析に供されうるようにするためには、細胞の生存能力を維持したままＣＴＣの検出・定量の分析を行う必要がある。これを可能とする技術として、完全循環腫瘍細胞計数分析（ｉｎｔａｃｔ ＣＴＣ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；ｉＣｅａｐ）法が提案されている（例えば、非特許文献１）。
【０００８】
ｉＣｅａｐ法もまた、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムと同様にＣＴＣの表面に発現しているＥｐＣＡＭを標的とするものであるが、２種の異なる抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を用いる点で、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムとは異なる。ｉＣｅａｐ法では、用いられる２種の異なる抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体の一方を磁性ビーズに結合させ、他方を蛍光標識する（以下、ｉＣｅａｐ法において用いられる２種の異なる抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体のうち、磁性ビーズと結合するものを「第１の抗体」と称することがあり、蛍光標識されるものを「第２の抗体」と称することがある）。
【０００９】
ｉＣｅａｐ法は、例えば、以下のように行われる。まず、血液試料中の赤血球を溶解させ、遠心分離した後、上清を除去してペレットを得る。これに第１の抗体−磁気ビーズ複合体および蛍光標識された第２の抗体を接触させる。ここで、非特許文献１では、第１の抗体としてＨＥＡ−１２５を用い、第２の抗体としてＥＢＡ−１を用いている。このとき、第１の抗体および第２の抗体はともにＣＴＣの表面に発現しているＥｐＣＡＭタンパク質を特異的に認識してこれに結合する。続いて、ＭＡＣＳ磁気細胞分離システムによりＣＴＣを磁気濃縮し、生存している細胞を識別するために核を染色するが、上述した第１の抗体および第２の抗体は試料に含まれる白血球の一部とも非特異的に結合することがある。このため、核を染色するのと同時に、蛍光標識した抗ＣＤ４５モノクローナル抗体を試料に添加しておき、このようにして得られた試料を用いてフローサイトメトリー法による分析を行うことで、生存／死滅しているＣＴＣをそれぞれ、白血球に対する非特異的な結合とは区別して検出・定量することが可能となる。
【００１０】
このｉＣｅａｐ法によるＣＴＣの検出・定量は、試料に含まれる細胞の生存能力にほとんど影響を及ぼさないことから、ｉＣｅａｐ法による分析が終了した試料については、上述したＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムを経た試料とは異なり、別途のさらなる分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、染色体異数性検査、変異分析などの遺伝子診断・ゲノム解析）に供することが可能である。少なくともこの点で、ｉＣｅａｐ法はＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムにはない利点を有する優れた分析技術であるといえる。
【００１１】
上述したように、非特許文献１に開示されているｉＣｅａｐ法の実施形態では、第１の抗体としてＨＥＡ−１２５抗体を用い、第２の抗体としてＥＢＡ−１抗体を用いている。従来知られている抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体としては、これらのＨＥＡ−１２５抗体やＥＢＡ−１抗体のほかにもＶＵ−１Ｄ９抗体などがあり、いずれもマウスに腫瘍細胞株を免疫処置することによって確立されたものである。そして、ＨＥＡ−１２５抗体はヒト由来ＥｐＣＡＭに特異的であるのに対し、ＥＢＡ−１抗体は他の動物に対しても交差反応性を示すものであることが従来知られていたことから、ＨＥＡ−１２５抗体が認識するヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質のエピトープとＥＢＡ−１抗体のエピトープとは異なることが示唆されていた。このため、非特許文献１ではこれら２種の抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体がそれぞれ第１の抗体および第２の抗体として採用されていたのである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Takao et al., Cytometry, Part A, 79A: 107-117, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、非特許文献１に開示されているｉＣｅａｐ法のさらなる改良のために鋭意検討を行った。そしてその過程において、驚くべきことに、上述したような従来の当業者による認識とは異なり、ＨＥＡ−１２５抗体およびＥＢＡ−１抗体はヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質において同一のエピトープを認識するという事実を突き止めた。具体的には、これら２種の抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体はいずれも、ヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質のＮ末端上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）様ドメインをエピトープとして認識することを見出したのである。
【００１４】
本発明は、上述した予期せぬ発見に基づきなされたものである。すなわち、ヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質の同一のエピトープを認識するＨＥＡ−１２５抗体とＥＢＡ−１抗体との組み合わせを用いてｉＣｅａｐ法を行うと、これらの抗体がエピトープ部位において競合的に拮抗してしまい、検出効率の低下といった問題が生じる虞がある。そこで本発明は、従来公知の抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体が認識するエピトープ（Ｎ末端ＥＧＦ様ドメイン）とは異なるエピトープを特異的に認識する抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を提供することを目的とする。また本発明は、当該モノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ、並びに、当該モノクローナル抗体を用いたＣＴＣの検出方法およびこれに用いるためのＣＴＣ検出用キットをも提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いてマウスに免疫処置を施し、ヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質に対する免疫応答を誘導した。そして、当該マウスの脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマの集団を作製し、ヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質のＮ末端ＥＧＦ様ドメインとは異なるエピトープを特異的に認識する抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを探索した。その結果、この条件を満たすハイブリドーマのクローンを選抜することに成功した。そして、当該ハイブリドーマから所望のモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明の第１の形態によれば、ヒト由来ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来ＥｐＣＡＭのＣＰ領域に対して特異的に反応するモノクローナル抗体が提供される。
【００１７】
上記第１の形態に係るモノクローナル抗体は、ヒト由来ＥｐＣＡＭのＮ末端ＥＧＦ様ドメインに反応しないものであることが好ましい。また、上記第１の形態に係るモノクローナル抗体のサブクラスは、マウスＩｇＭであることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の第２の形態によれば、受領番号がＮＩＴＥ ＡＢＰ−１４４９であるハイブリドーマＫＩＪＹ２により産生される、ヒト由来ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体が提供される。
【００１９】
さらに、本発明の第３の形態によれば、上記第２の形態に係るモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体が提供される。
【００２０】
また、本発明の第４の形態によれば、以下の工程：
（ａ）被験者から血液試料を採取する工程；および、
（ｂ）上記のいずれかのモノクローナル抗体を用いて、前記血液試料に含まれる循環腫瘍細胞を検出する工程、
を含む、循環腫瘍細胞の検出方法が提供される。
【００２１】
上記第４の形態に係る検出方法において、前記モノクローナル抗体は蛍光標識されたものであることが好ましい。また、上記第４の形態に係る検出方法では、前記（ｂ）工程において、ヒト由来ＥｐＣＡＭのＮ末端ＥＧＦ様ドメインに対して特異的に反応する第２のモノクローナル抗体をさらに用いることが好ましい。そして、前記第２のモノクローナル抗体は磁性ビーズに結合したものであることが好ましい。上記第４の形態における特に好ましい実施形態では、前記（ｂ）工程が、完全循環腫瘍細胞計数分析（ｉＣｅａｐ）法により行われる。
【００２２】
さらに、本発明の第５の形態によれば、上記第４の形態に係る検出方法に用いられるＣＴＣ検出用キットであって、上記第１〜第３の形態のいずれかに係るモノクローナル抗体を含む、ＣＴＣ検出用キットが提供される。
【００２３】
そして、本発明の第６の形態によれば、受領番号がＮＩＴＥ ＡＢＰ−１４４９であるハイブリドーマＫＩＪＹ２が提供される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、従来公知の抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体が認識するエピトープ（Ｎ末端ＥＧＦ様ドメイン）とは異なるエピトープを特異的に認識する抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体が提供される。また、本発明によれば、当該モノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ、並びに、当該モノクローナル抗体を用いたＣＴＣの検出方法およびこれに用いるためのＣＴＣ検出用キットもまた、提供される。
【００２５】
本発明により新たに提供される抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体がエピトープとして認識するヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質のＣＰ領域は、その特性が未知のものである。したがって、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を利用することで、ＥｐＣＡＭタンパク質の構造および機能に関する研究のさらなる進展が期待される。また、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を利用することで、ｉＣｅａｐ法に代表されるようなＣＴＣの検出方法における検出感度や検出精度のよりいっそうの向上も期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例における「免疫染色」の実験において、ＨＥＡ−１２５−ＦＩＴＣおよびＫＩＪＹ２−５５５を用いて共免疫染色したＬＮＣａＰ細胞について、ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ−９０００（株式会社キーエンス）により撮影した位相コントラスト画像および蛍光画像である。図１において、左（ＰｈＣ）は位相コントラスト画像を示し、中央（ＨＥＡ １２５−ＦＩＴＣ）はＨＥＡ １２５−ＦＩＴＣによる蛍光画像を示し、右（ＫＩＪＹ２−５５５）はＫＩＪＹ２−５５５による蛍光画像を示す。なお、対物レンズとしては２０×Ｐｌａｎ Ｆｌを用いた。また、図１に示す画像において蛍光を呈している細胞内の部位は、ＨＥＡ−１２５−ＦＩＴＣおよびＫＩＪＹ２−５５５のいずれについても細胞膜である。
【図２Ａ】実施例における「ＥＬＩＳＡ」の実験において、固相ＥＬＩＳＡによる力価試験を行った結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】実施例における「ＥＬＩＳＡ」の実験において、液相ＥＬＩＳＡによる結合特異性試験を行った結果を示すグラフである。
【図２Ｃ】実施例における「ＰＣ−３細胞へのＫＩＪＹ２抗体の結合能の評価」の実験において、ＰＣ−３細胞の表面に発現したＥｐＣＡＭへのＫＩＪＹ２抗体の結合能を評価するために、ＫＩＪＹ２およびＶＵ−１Ｄ９抗体を並列で、ストレプトアビジン−ＰＥ共役体を用いて可視化した結果を示す写真である。図２Ｃの左は位相コントラスト画像であり、中央は１２ビット画像であり、右は輝度調整後の画像である。なお、中央の１２ビット画像において矢尻で示された円の部位は、左の輝度調整後の画像において可視化されるようになったＥｐＣＡＭ低発現ＰＣ−３細胞の位置を示す。
【図３】実施例における「エピトープマッピング」の実験において、ＫＩＪＹ２抗体のヒト由来ＥｐＣＡＭへの結合ドメインを同定する目的で、エピトープマッピングを行った結果を示す写真および説明図である。図３のそれぞれは以下の通りである。Ａ：空ベクター、Ｂ：全長ヒトＥｐＣＡＭ構築物、Ｃ〜Ｅ：マウスＥＧＦドメイン、ＴＹドメイン、またはＣＰ領域で置換されたＥｐＣＡＭ構築物（それぞれ、Ｈｙｂ．１、Ｈｙｂ．２、またはＨｙｂ．３）。図３のＡ〜Ｅについては、左からそれぞれ、位相コントラスト画像、ＦＩＴＣ蛍光画像、およびＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５蛍光画像を示す。また、図３のＦはエピトープマッピングの内容を要約した説明図であり、黒塗り領域は置換マウスＥｐＣＡＭを示す。
【図４】図４のＡは、実施例における「がん細胞の同時検出」の実験において、ＰＣ−３細胞へのＫＩＪＹ２抗体の反応性をさらに定量化する目的で、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析により、ＥＢＡ−１抗体、ＶＵ−１Ｄ９抗体、およびＫＩＪＹ２抗体の３種の抗体によるＰＣ−３細胞への競合的結合性を試験した結果を示す図である。処理したサンプルをＦＣＭ分析した結果を示すヒストグラムである。また、図４のＢは、ＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣおよび、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識されたＫＩＪＹ２抗体（ＫＩＪＹ２−６４７）によるＰＣ−３細胞の二重染色試験を行った結果を示す図である。なお、図４のＢにおいて、上段のパネルは、蛍光補正後に得られたスキャッタグラムである。また、図４のＢにおいて、下段のパネルは、ＫＩＪＹ２−６４７およびＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣの双方で染色された細胞のヒストグラムを、いずれか一方のみの抗体で染色したヒストグラムと比較した結果を示す図である（上のパネルがＫＩＪＹ２−６４７単独との対比であり、下のパネルがＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣとの対比である）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。
【００２８】
まず、ヒト由来ＥｐＣＡＭの構造について説明する。ヒト由来ＥｐＣＡＭは３１４個のアミノ酸からなる約４０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であり、上皮由来の細胞（すなわち、循環腫瘍細胞の多く）の表面に発現している。このヒト由来ＥｐＣＡＭの細胞外部分（ＥｐＥｘ）は、Ｎ末端ＥＧＦ様ドメイン、ＴＹ様ドメイン、および１回膜貫通へリックスに近接した未同定の低システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｐｏｏｒ；ＣＰ）領域から構成されている。このＥｐＥｘはＥ−カドヘリンを阻害して、カドヘリンを介する細胞−細胞接合を無効とし、腫瘍の浸出および局所侵入を促進させる。一方、膜内タンパク質分解によって放出されるＥｐＣＡＭの細胞内ショートドメイン（ＥｐＩＣＤ）は、転写因子ＬＥＦ／ＴＣＦとともに核シグナリングに役割を果たし、ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＡ／Ｅをアップレギュレートし、細胞増殖を促進させる。
【００２９】
従来公知の抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体は、いずれもこのＮ末端ＥＧＦ様ドメインを特異的に認識するものであった。ここで、「ＥＧＦ様ドメイン」について簡単に説明すると、上皮増殖因子（ＥＧＦ）は５３個のアミノ酸からなるペプチドで、６個のシステイン残基によって形成される３個のジスルフィドループからなる特徴的な構造を有している。数多くのタンパク質がこの構造を有しており、この構造が「ＥＧＦ様ドメイン」と称されているのである。
【００３０】
ヒト由来ＥｐＣＡＭをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ヒト由来ＥｐＣＡＭのアミノ酸配列も知られている。配列番号：１にヒト由来ＥｐＣＡＭをコードする遺伝子のＣＤＳ（終止コドン含む）のヌクレオチド配列（NCBI RefSeq Accession Number: NM_002354）を示し、配列番号：２にヒト由来ＥｐＣＡＭのアミノ酸配列（NCBI RefSeq Accession Number: NP_002345）を示す。
【００３１】
【化１】
2014105159.tif 000003
【００３２】
本発明の第１の形態に係るモノクローナル抗体は、ヒト由来ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体であるが、従来公知の抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体とは異なり、ヒト由来ＥｐＣＡＭのＣＰ領域に対して特異的に反応する点に特徴を有している。
【００３３】
上記第１の形態に係るモノクローナル抗体は、ヒト由来ＥｐＣＡＭのＮ末端ＥＧＦ様ドメインに反応しないものであることが好ましい。また、上記第１の形態に係るモノクローナル抗体のサブクラスは特に制限されないが、マウスＩｇＭであることが好ましい。
【００３４】
本形態に係るモノクローナル抗体を製造する方法としては、公知の方法をそのまま採用することができ、例えばケーラーとミルシュタインの細胞融合法を基礎として製造することができる。概説すれば、ヒト由来ＥｐＣＡＭに対する免疫応答が誘導されたマウス等の動物の脾臓細胞とミエローマとを融合してハイブリドーマの集団を作製し、該ハイブリドーマの集団から所望のモノクローナル抗体を産生するものを選抜する。そして、選抜したハイブリドーマを培養し、その培養物から所望のモノクローナル抗体を単離・精製することができるのである。
【００３５】
ヒト由来ＥｐＣＡＭに対する免疫応答を誘導する方法としては、動物にヒト由来ＥｐＣＡＭ（タンパク質）を接種する一般的なタンパク免疫の手法によってもよいが、動物にヒト由来ＥｐＣＡＭ遺伝子を投与する遺伝子免疫の手法によってもよい。
【００３６】
タンパク免疫によって動物に免疫応答を誘導する場合には、一般的に行われている方法をそのまま採用することができる。例えば、精製したヒト由来ＥｐＣＡＭを用意し、アジュバントとの混合液を調製する。この混合液をマウス等に皮下注射し、ヒト由来ＥｐＣＡＭに対する免疫応答を誘導する。必要に応じて、間隔をあけて複数回投与し、追加免疫してもよい。また、後述する実施例に記載のように、ヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質を一過性に発現させた細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）をマウス等の動物に投与することによって、ヒト由来ＥｐＣＡＭに対する免疫応答を誘導してもよい。
【００３７】
免疫される動物としては特に限定はないが、好ましくは、マウスが用いられる。これにより、マウス由来のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３８】
ハイブリドーマの作製は、ケーラーとミルシュタインの方法によって行うことができる。すなわち、上記した手順でタンパク免疫または遺伝子免疫され、ヒト由来ＥｐＣＡＭに対する免疫応答が誘導された動物から脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取する。そして、脾臓細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマの集団を作製する。ハイブリドーマの選抜は、例えば、ＨＡＴ選択培地を用いて行うことができる。また、ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法により行うことができる。このようにして、ヒト由来ＥｐＣＡＭのＣＰ領域に反応（当該領域を特異的に認識して結合）する抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜して、クローニングすればよい。
【００３９】
本発明に係るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの１つは「ＫＩＪＹ２」と命名され、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託の詳細は以下のとおりである。
【００４０】
微生物の識別の表示：ＫＩＪＹ２
受領番号：ＮＩＴＥ ＡＢＰ−１４４９
受領日：２０１２年１１月２日
選抜およびクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、前記の性質を有する抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマの培養は、動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養する場合には、その培養液からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【００４１】
モノクローナル抗体の精製については、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて行うことができる。
【００４２】
ＫＩＪＹ２（受領番号がＮＩＴＥ ＡＢＰ−１４４９であるハイブリドーマ）により産生される抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体、換言すれば、ＫＩＪＹ２により産生される抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体と「機能的に同等」であるモノクローナル抗体も、本発明に含まれる。このようなモノクローナル抗体を得るには、例えば、ＫＩＪＹ２により産生される抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体のエピトープを、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質の部分ペプチド等を用いたエピトープマッピング法により解析する。そして、同定されたエピトープを含む合成ペプチドを抗原として用い、前記抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体を得ればよい。なお、２つの抗体についてエピトープが同一か否かを調べる方法としては、競合実験による方法が挙げられる。例えば、ＫＩＪＹ２により産生される抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を第一抗体とする。そして、当該第一抗体とヒトＥｐＣＡＭとの結合が、試験対象である第二抗体によって競合阻害を受ける場合には、当該第二抗体は、前記第一抗体と同じエピトープに結合するものであるといえる。
【００４３】
本発明に係るモノクローナル抗体は、種々の用途に使用できる。例えば、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体がエピトープとして認識するヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質のＣＰ領域は、その特性が未知のものである。したがって、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を利用することで、ＥｐＣＡＭタンパク質の構造および機能に関する研究のさらなる進展が期待される。また、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を利用することで、ｉＣｅａｐ法に代表されるような循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出方法における検出感度や検出精度のよりいっそうの向上も期待される。
【００４４】
以下、ｉＣｅａｐ法に代表される循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出方法について、説明する。
【００４５】
本発明に係るＣＴＣの検出方法は、以下の工程：
（ａ）被験者から血液試料を採取する工程；および、
（ｂ）上述した本発明に係るいずれかの抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を用いて、前記血液試料に含まれるＣＴＣを検出する工程、
を含む。
【００４６】
本明細書において、「被験者」は、がんに罹患するまたは罹患した可能性のある動物であればよく、ヒトへの適用が好ましい。本発明に係る検出方法は、このうち、がんに罹患している疑いのあるヒト、またはがんに罹患した後のヒト等において特に好ましく行われる。
【００４７】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する「血液試料」としては、ＣＴＣが含まれる場合に当該ＣＴＣを検出できるものであれば特に制限されない。ただし、血液試料中の赤血球を溶解させ、遠心分離した後、上清を除去して得られたペレットを用いることが好ましい。また、血液試料には、凝固防止等を目的としてＥＤＴＡカリウム塩やヘパリン等の添加剤が添加されてもよい。被験者から血液試料を採取するために採血するタイミングは、特に制限されない。
【００４８】
本発明に係る検出方法で使用する血液試料は、被験者から採取直後のものを測定に用いることが好ましいが、保存したものを用いてもよい。血液試料の保存方法としては、試料中のＣＴＣの量が変化しない条件であれば特に制限はなく、例えば０〜１０℃の凍結しない程度の低温条件、暗所条件および無振動条件下が好ましい。
【００４９】
血液試料中のＣＴＣを検出（および場合によっては定量）する方法について特に制限はなく、従来公知の手法が適宜採用されうる。本発明の好ましい実施形態として、完全循環腫瘍細胞計数分析（ｉＣｅａｐ）法があるが、ｉＣｅａｐ法による場合には、例えば非特許文献１（Takao et al., Cytometry, Part A, 79A: 107-117, 2011）の記載が参照されうる。
【００５０】
ここで、例えばｉＣｅａｐ法などによってＣＴＣの検出（および定量）を行う場合には、上述した本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体は、蛍光標識されたものであることが好ましい。この際、蛍光標識するための蛍光色素について特に制限はなく、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７などが用いられうる。
【００５１】
また、上記（ｂ）工程において、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体とは異なるエピトープ（例えば、ＥｐＣＡＭのＮ末端ＥＧＦ様ドメイン）に対して特異的に反応する第２のモノクローナル抗体をさらに用いて、検出をより確実に行うこととしてもよい。この際、第２のモノクローナル抗体としては、従来公知の抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体であるＨＥＡ−１２５、ＶＵ−１Ｄ９、ＥＢＡ−１、Ｂｅｒ−ＥＰ４、３２３／Ａ３、３１１−１Ｋ１などが用いられうる。この第２のモノクローナル抗体は、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体とは異なる蛍光標識されたものであってもよいし、磁性ビーズに結合したものであってもよい。第２のモノクローナル抗体として磁性ビーズに結合したものを用いることによって、ｉＣｅａｐ法においてそうであるように、磁気を用いたＥｐＣＡＭ発現ＣＴＣの分離（磁気濃縮）と、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体によるその検出（免疫蛍光染色）との２つのメカニズムによって、ＣＴＣの存在を確実に把握し、場合によってはその存在量を定量することが可能となる。なお、場合によっては、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を磁性ビーズと結合したものとし、第２のモノクローナル抗体を上述した蛍光色素により蛍光標識して、同様に用いてもよい。
【００５２】
このような本発明に係る検出方法によれば、例えば本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体と、これとは異なるエピトープを認識する第２のモノクローナル抗体とを併用することで、エピトープに対する競合阻害の虞がなくなることから、ｉＣｅａｐ法などによるＣＴＣの検出効率のよりいっそうの向上が期待される。また、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体がエピトープとして認識するヒト由来ＥｐＣＡＭタンパク質のＣＰ領域は、その特性が未知のものである。したがって、本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を利用することで、ＥｐＣＡＭタンパク質の構造および機能に関する研究のさらなる進展も期待される。
【００５３】
本発明の他の形態によれば、上述したＣＴＣの検出方法に用いられるＣＴＣ検出用キットもまた、提供される。この検出用キットは、上述した検出方法で使用される試薬等を含むものである。具体的には、当該検出用キットに含まれる試薬として、上述した本発明に係る抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体（例えば、蛍光標識されたものや、磁性ビーズと結合したもの）が挙げられる。上述した第２のモノクローナル抗体（例えば、磁性ビーズと結合したものや、蛍光標識されたもの）もまた、当該検出用キットに含まれうる。さらに、検出用キットは、上記抗体や採取された試料を希釈するための緩衝液、洗浄液、二次抗体、蛍光色素、反応容器、陽性対照、陰性対照、検査プロトコールを記載した指示書等の構成要素をさらに含んでもよい。また、これらの構成要素は、必要に応じて予め混合または複合化しておくこともできる。この検出用キットを使用することにより、本発明に係るＣＴＣの検出が簡便となり、早期の治療方針決定や予後の診断、治療効果の確認などに非常に有用である。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を用いて本発明の実施形態をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例に限定されるわけではない。
【００５５】
（細胞株および培養）
乳腺腺がん細胞株であるＭＣＦ−７は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターの細胞バンクから入手した。転移性前立腺がん細胞株であるＬＮＣａＰおよびＰＣ−３は、国立大学法人東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。これらの細胞株については、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Gibco-Life Technologies）中で培養した。また、ＨＥＫ２９３細胞株および形質転換体は、抗生物質添加１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ（和光純薬工業株式会社）中で培養した。
【００５６】
（ＨＥＫ２９３細胞株におけるＥｐＣＡＭの発現）
ヒトまたはマウスのＥｐＣＡＭタンパク質をコードするｃＤＮＡを、それぞれNCBI RefSeq Accession Number: NM_002354（ヒト）およびGenBank: BC094465.1（マウス）のヌクレオチド配列に基づいてタカラバイオ株式会社に委託することにより合成した。なお、ヒト−マウスハイブリッドｃＤＮＡを作製するために、アミノ酸配列を変更することなくドメイン内に適切な制限酵素部位を導入した。そして、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ Ｎｅｏ（タカラバイオ株式会社）にクローニングした。また、ヒトＥｐＣＡＭ骨格中にマウスＥｐＣＡＭのＥＧＦドメイン、ＴＹドメインおよびＣＰ領域をそれぞれ有するＨｙｂ．１、Ｈｙｂ．２およびＨｙｂ．３ポリペプチドをコードする各ｃＤＮＡを、同様に発現ベクターｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ Ｎｅｏにクローニングした。ここで、Ｈｙｂ．１、Ｈｙｂ．２およびＨｙｂ．３のそれぞれをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は以下のとおりである（下線部がマウスＥｐＣＡＭに対応する配列である）。
【００５７】
【化２−１】
2014105159.tif 000004
【００５８】
【化２−２】
2014105159.tif 000005
【００５９】
【化２−３】
2014105159.tif 000006
【００６０】
その後、トランスフェクション試薬としてＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（ロシュ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞にそれぞれの発現ベクターをトランスフェクションした。そして、Ｇ４１８（ロシュ）を用いた選択によりそれぞれについて安定的なＨＥＫ２９３−ＥｐＣＡＭクローンを樹立した。
【００６１】
（マウスの免疫処置およびハイブリドーマクローンの作製）
上記で樹立した一過性ＥｐＣＡＭ発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫処置した。なお、ハイブリドーマクローンの作製およびモノクローナル抗体の精製は、委託研究として株式会社日本バイオテスト研究所において行われた。その手法を概説すれば、まず、免疫処置したマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取し、これをミエローマＰ３Ｕ１細胞株と細胞融合してハイブリドーマの集団を作製した。このようにして得られたハイブリドーマの集団から、所望のハイブリドーマクローンをＥｐＣＡＭ過剰発現細胞株であるＭＣＦ−７細胞株を用いてスクリーニングした。陽性をさらに親のＨＥＫ２９３陰性細胞およびＥｐＣＡＭ安定発現ＨＥＫ２９３陽性細胞を基準としてスクリーニングした。その結果得られたハイブリドーマクローンを「ＫＩＪＹ２」と名付け、無血清培地中で培養した。そして、これが産生する抗体（ＫＩＪＹ２抗体）を均質に精製した。なお、ＫＩＪＹ２抗体は、有意な非特異的結合を有しないＩｇＭに属する。
【００６２】
（免疫染色）
精製したＫＩＪＹ２抗体を、メーカー説明書に従ってＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）系標識キット（株式会社同仁化学研究所）で蛍光標識した。ＬＮＣａＰ細胞を３５ｍｍ培養ディッシュ中で培養し、ＰＢＳを用いて洗浄し、上記で得られた蛍光色素結合ＫＩＪＹ２抗体と反応させた。そして、ＨＥＡ−１２５−ＦＩＴＣ（ミルテニーバイオテク）に対する適切な希釈およびＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５―結合ＫＩＪＹ２抗体（ＫＩＪＹ２−５５５）に対する濃度を１〜２×１０５／サンプルの培養細胞に対してそれぞれ１／２５および０．４μｇ／ｍＬと決定した。
【００６３】
ＨＥＡ−１２５−ＦＩＴＣおよびＫＩＪＹ２−５５５を用いて共免疫染色したＬＮＣａＰ細胞について、ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ−９０００（株式会社キーエンス）により、位相コントラスト画像および蛍光画像を得た。
【００６４】
得られた画像を示す写真を図１に示す。図１において、左（ＰｈＣ）は位相コントラスト画像を示し、中央（ＨＥＡ １２５−ＦＩＴＣ）はＨＥＡ １２５−ＦＩＴＣによる蛍光画像を示し、右（ＫＩＪＹ２−５５５）はＫＩＪＹ２−５５５による蛍光画像を示す。なお、対物レンズとしては２０×Ｐｌａｎ Ｆｌを用いた。また、図１に示す画像において蛍光を呈している細胞の部位は、ＨＥＡ−１２５−ＦＩＴＣおよびＫＩＪＹ２−５５５のいずれについても細胞膜である。
【００６５】
（ＥＬＩＳＡ）
ＥｐＣＡＭを発現するＭＣＦ−７細胞およびＰＣ−３細胞（〜５×１０４／ｍＬ）をそれぞれ９６ウェル ポリ−Ｌ−リジンコートマイクロプレート（住友ベークライト株式会社）上に播種し、２４時間培養した。接着細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）のＰＢＳ溶液を用いて１５分間固定し、これをＥＬＩＳＡにおける抗原として用いて、ハイブリドーマクローンを選択し、力価試験を行い、滴定曲線を作成した。
【００６６】
固相ＥＬＩＳＡについては、ＨＲＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｋｉｔ（ＫＰＬ）を用いて行った。この際、抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体であるＨＥＡ−１２５（ＩｇＧ１、ａｂ４６７１４、Ａｂｃａｍ、ＵＫ）をポジティブコントロールとして用いた。そして、未希釈のＨＥＡ−１２５または５０μｇ／ｍＬのＫＩＪＹ１抗体もしくはＫＩＪＹ２抗体から始めて、文献に記載されているＭＣＦ−７細胞およびＰＣ−３細胞に対して力価を決定した。ＫＩＪＹ２抗体の検出用に、二次抗体を抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ等価物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で置換した。
【００６７】
この固相ＥＬＩＳＡによる力価試験の結果を図２Ａに示す。図２Ａに示すように、ＨＥＡ−１２５ではＭＣＦ−７細胞よりもＰＣ−３細胞を検出する際により高濃度の抗体を要することがわかる。また、予期せぬことに、ＫＩＪＹ２抗体はＭＣＦ−７細胞にはある程度結合するものの、ＰＣ−３細胞にはほとんど結合しなかった。これにより、ＫＩＪＹ２抗体のエピトープがＰＦＡ処理に対して非常に高い感受性を示す一方で、そのままの（非固定）細胞に対する結合能は維持できることが示された。
【００６８】
次に、懸濁液における非固定細胞の結合特異性を試験する目的で、以下の手法により液相ＥＬＩＳＡを行った：ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて剥離したＰＣ−３細胞を４％ＰＦＡ含有ＰＢＳ中に懸濁し、１０５細胞／サンプルで低結合マイクロチューブ（ＰＲＯＴＥＯＳＡＶＥ ＳＳ、住友ベークライト株式会社）に分けた。次いで、すぐに１０×体積の培地で希釈し、活性剤フリーＰＢＳで２回洗浄して、得られた細胞ペレットを液相ＥＬＩＳＡに用いた。なお、液相ＥＬＩＳＡにはＭ−Ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ）を用いた。また、パラホルムアルデヒド感受性を試験するために、ＨＥＡ−１２５（１／１０希釈）またはＫＩＪＹ２抗体（５μｇ／ｍＬ）の過剰量を分析条件中維持し、同様の実験を３回行った。
【００６９】
この液相ＥＬＩＳＡによる結合特異性試験の結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示すように、ＨＥＡ−１２５のエピトープは４％ＰＦＡによる処理の直後に若干露出した（最大１．５倍）。一方、ＫＩＪＹ２抗体のエピトープは４％ＰＦＡによる処理の後、迅速に消失した。ここで、ＥｐＣＡＭは多量体を形成しうること、および、他のタンパク質と相互作用しうることが知られている。ＥｐＣＡＭのこれらの性質は、ＰＦＡによる固定エピトープへのＫＩＪＹ２抗体の接近可能性を阻害する可能性がある。また、他の可能性としては、ＰＦＡ処理によってＥｐＣＡＭの固有の構造が壊れることも考えられるが、いずれにせよ、細胞の固定化が免疫反応性に影響を及ぼすことがあることに留意すべきであろう。
【００７０】
（ＰＣ−３細胞へのＫＩＪＹ２抗体の結合能の評価）
天然のがん細胞（ＰＣ−３細胞）の表面に発現したＥｐＣＡＭへのＫＩＪＹ２抗体の結合能を評価するために、ＫＩＪＹ２およびＶＵ−１Ｄ９抗体を並列で可視化した。具体的には、それぞれの抗体に結合した細胞を、ストレプトアビジン−ＰＥ共役体を用いて可視化した。ここで、ＰＣ−３細胞のＥｐＣＡＭレベルは既知のＥｐＣＡＭ陽性がん細胞株の中では比較的低く、かつ、ＥｐＣＡＭの発現レベルの異なる亜集団を含む。このため、本実験では、ＣＴＣ検出への実用化を考慮し、検出が困難ながん細胞株として、ＰＣ−３細胞が選ばれたのである。
【００７１】
具体的には、ＢＳＡフリーの抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体であるＶＵ−１Ｄ９（サンタクルーズバイオテクノロジー）およびＫＩＪＹ２抗体（各１００μｇ）をビオチン標識キット−ＮＨ２（株式会社同仁化学研究所）を用いて並行してビオチン化した。ＰＣ−３細胞をビオチン化モノクローナル抗体（０．４μｇ／１０５細胞）の存在下、Ｍ−Ｂｕｆｆｅｒ中、室温にて３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をストレプトアビジン−ＰＥ（ベクターラボラトリーズ）と推奨希釈（１／１００）で１５分間混合した。懸濁液中の細胞をディスポーザブル血球計算板Ｃ−Ｃｈｉｐ（ソウル、韓国）中に静置し、ＢＺ−９０００によって分析した（対物レンズ:１０×Ｐｌａｎ Ａｐｏ）。
【００７２】
１００μＬ細胞懸濁液中でＨＥＫ２９３一過性形質転換体（１．５〜２×１０５細胞／サンプル）にＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣ（４μＬ）およびＫＩＪＹ２（０．４μｇ）を混合し、上述したようにＣ−Ｃｈｉｐ中でモニターした。
【００７３】
ストレプトアビジン−ＰＥ共役体を用いてＰＣ−３細胞を可視化した結果を図２Ｃに示す。図２Ｃにおいて、上段はＫＩＪＹ２抗体を用いた結果を示し、下段はＵＶ−１Ｄ９を用いた結果を示す。また、図２Ｃの左は位相コントラスト画像であり、中央は１２ビット画像であり、右は輝度調整後の画像である。なお、中央の１２ビット画像において矢尻で示された円の部位は、左の輝度調整後の画像において可視化されるようになったＥｐＣＡＭ低発現ＰＣ−３細胞の位置を示す。図２Ｃに示す結果から、ＫＩＪＹ２抗体およびＵＶ−１Ｄ９の双方のモノクローナル抗体が、ＥｐＣＡＭの発現レベルの高いＰＣ−３細胞（中央）および発現レベルの低いＰＣ−３細胞（右）の亜集団を同様にして検出しうることがわかる。これにより、ＫＩＪＹ２抗体は、細胞におけるＥｐＣＡＭの発現レベルにかかわらず、ＶＵ−１Ｄ９抗体と同程度に有効に無傷の（ｉｎｔａｃｔ）がん細胞を検出しうることが示された。
【００７４】
（エピトープマッピング）
続いて、ＫＩＪＹ２抗体のヒト由来ＥｐＣＡＭへの結合ドメインを同定する目的で、エピトープマッピングを行った。
【００７５】
ここでは、ＥｐＣＡＭタンパク質の三次元分子構造をそのまま維持したハイブリッドタンパク質を得るために、ヒト−マウスＥｐＣＡＭハイブリッドｃＤＮＡ構築物を調製した。具体的には、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質のＥＧＦドメイン、ＴＹドメイン、またはＣＰ領域をそれぞれマウスのカウンターパートによって置換して、Ｈｙｂ．１、Ｈｙｂ．２、およびＨｙｂ．３を得た。一時的にこれらのキメラタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣおよびＫＩＪＹ２−５５５を用いて同時に染色した。
【００７６】
染色の結果を図３に示す。図３のそれぞれは以下の通りである。Ａ：空ベクター、Ｂ：全長ヒトＥｐＣＡＭ構築物、Ｃ〜Ｅ：マウスＥＧＦドメイン、ＴＹドメイン、またはＣＰ領域で置換されたＥｐＣＡＭ構築物（それぞれ、Ｈｙｂ．１、Ｈｙｂ．２、またはＨｙｂ．３）。図３のＡ〜Ｅについては、左からそれぞれ、位相コントラスト画像、ＦＩＴＣ蛍光画像、およびＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５蛍光画像を示す。なお、対物レンズとしては２０×Ｐｌａｎ Ａｐｏを用いた。また、図３のＦはエピトープマッピングの内容を要約した説明図であり、黒塗り領域は置換マウスＥｐＣＡＭを示す。
【００７７】
図３に示す結果から、ＨＥＡ−１２５およびＫＩＪＹ２抗体は、それぞれＥｐＣＡＭ分子の異なる部分を認識することを示している。具体的には、図３のＢに示されるように、完全なＥｐＣＡＭはＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣおよびＫＩＪＹ２−５５５の双方により染色された。そして、図３のＣに示されるように、ＥＧＦドメインを欠くＨｙｂ．１はＫＩＪＹ２−５５５により染色されたが、ＨＥＡ−１２５により染色されなかった。この結果は、ＨＥＡ−１２５がヒト由来ＥｐＣＡＭのＥＧＦドメインを認識するという従来の知見を裏付けるものである。また、図３のＥに示されるように、ＣＰ領域を欠くＨｙｂ．３はＨＥＡ−１２５により染色されたが、ＫＩＪＹ２−５５５により染色されなかった。この結果から、ＫＩＪＹ２抗体はヒト由来ＥｐＣＡＭのＣＰ領域を特異的に認識し、これと反応するものであることが示された。
【００７８】
ＥｐＣＡＭは細胞膜から切断される現象が知られている。この切断を調べるために、膜に近接するＣＰ領域に特異的なモノクローナル抗体であるＫＩＪＹ２抗体は、ＥｐＣＡＭ切断を評価するのに有用であろう。また、ＣＰ領域に特異的な抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体である３１１−１Ｋ１は、未変性のＥｐＣＡＭを染色せず、かつ、ＦＣＭではうまく作用しないが、初期の報告では使用されていた。ＫＩＪＹ２抗体は、ＦＣＭでうまく作用するため未変性のＥｐＣＡＭによりよく結合している図２Ｃに示される画像から、ＫＩＪＹ２抗体はＶＵ−１Ｄ９抗体と同様にＥｐＣＡＭ低発現ＰＣ−３細胞（ＥｐＣＡＭｌｏｗ）を検出できることが示されている。また、この画像から、ＫＩＪＹ２およびＶＵ−１Ｄ９抗体が共局在化していることもわかる。
【００７９】
（がん細胞の同時検出）
ＰＣ−３細胞へのＫＩＪＹ２抗体の反応性をさらに定量化するために、ＦＣＭ分析を行った。まず、従来エピトープがマッピングされていなかった抗ヒト由来ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体であるＥＢＡ−１、ＥＧＦドメインに特異的な抗ヒト由来ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体であるＶＵ−１Ｄ９、および上記でＣＰ領域に特異的なことが判明したＫＩＪＹ２抗体の３種の抗体によるＰＣ−３細胞への競合的結合性を試験した。
【００８０】
具体的には、まず、ＰＣ−３細胞（１００μＬのサンプル中に、２×１０５細胞）を、６０分間、Ｍ−Ｂｕｆｆｅｒ中で１００μＬの非希釈ＨＥＡ−１２５（Ａｂｃａｍ、ａｂ４６７１４）、４μｇのＶＵ−１Ｄ９、４μｇのＥＢＡ−１（サンタクルーズバイオテクノロジー）、または４μｇのＫＩＪＹ２抗体（いずれも過剰量）とともに、またはこれらを含まずにプレインキュベートした。その後、１５分間、１０μＬのＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣを混合した。
【００８１】
上記のように処理したサンプルをＦＣＭ分析した結果（ヒストグラム）を図４のＡに示す。図４のＡに示すように、ＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣによって染色されたＰＣ−３細胞のみがダブルピークのヒストグラムを示すことが繰り返し観察された（図４のＡ、最上段パネル）。なお、ＦＳ／ＳＳスキャッタグラムでは特定の亜集団は識別されなかった（図示せず）。従来、同様のヒストグラムが報告されていることから、異種ＥｐＣＡＭ発現が本来のＰＣ−３細胞株の性質であると考えられる。また、細胞をＨＥＡ−１２５、ＶＵ−１Ｄ９、またはＥＢＡ−１抗体とともにプレインキュベートすると、陽性のシグナルが消え、またはかなり減弱した（図４のＡ、下の３つのパネル）。これらの結果から、ＥＢＡ−１はＥｐＣＡＭのＥＧＦドメインに特異的なモノクローナル抗体であり、ＥＢＡ−１およびＶＵ−１Ｄ９抗体はＥＧＦドメインでＨＥＡ−１２５のエピトープに対して競合的に結合することが示された。これに対し、ＫＩＪＹ２抗体でプレインキュベートしたサンプルのＦＩＴＣヒストグラムにはほとんど変化がなかった（図４のＡ、上から２つめのパネル）。このことから、ＫＩＪＹ２抗体の事前の結合は、その後のＨＥＡ−１２５の結合反応を妨げなかったことがわかる。つまり、ＫＩＪＹ２抗体のエピトープは、ＨＥＡ−１２５とは異なることが確認された。
【００８２】
続いて、ＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣおよび、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識されたＫＩＪＹ２抗体（ＫＩＪＹ２−６４７）によるＰＣ−３細胞の二重染色試験を行った。
【００８３】
具体的には、ＰＣ−３細胞を、３０分間、ＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣ（１０μＬ）およびＫＩＪＹ２−６４７（０．４μｇ）と同時に混合した。洗浄後、細胞をＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマン・コールター）によって分析した。なお、励起波長は、ＦＩＴＣで４８８ｎｍ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７で６３３ｎｍであった。また、検出チャンネルは、ＦＬ１（４９５〜５５５ｎｍ）およびＦＬ４（６４５〜７０５ｎｍ）であった。比較のために、１００００事象ごとのデータを取得した。
【００８４】
結果を図４のＢに示す。なお、図４のＢにおいて、上段のパネルは、蛍光補正後に得られたスキャッタグラムである。このスキャッタグラムに示されるように、ＰＣ−３細胞株細胞集団におけるＥｐＣＡＭ高発現の亜集団（ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ）およびＥｐＣＡＭ低発現の亜集団（ＥｐＣＡＭｌｏｗ）をともに共染色することができた。
【００８５】
また、図４のＢにおいて、下段のパネルは、ＫＩＪＹ２−６４７およびＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣの双方で染色された細胞のヒストグラムを、いずれか一方のみの抗体で染色したヒストグラムと比較した結果を示す図である（上のパネルがＫＩＪＹ２−６４７単独との対比であり、下のパネルがＨＥＡ１２５−ＦＩＴＣとの対比である）。これらのヒストグラムに示されるように、ＦＩＴＣおよびＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７の双方において蛍光強度の若干の減少およびＥｐＣＡＭｈｉｇｈからＥｐＣＡＭｌｏｗへの分布シフトが、各単一色素を用いた染色のヒストグラムに対して観察された。ここで、ＥｐＣＡＭはダイマーまたはテトラマーを形成する傾向にあることが知られており、上述したようにＫＩＪＹ２抗体はＰＦＡで固定されたＥｐＣＡＭを認識しない（図２Ｂ）。このように、ＫＩＪＹ２抗体は、他の抗体またはＰＦＡ架橋による構造が固定化された分子よりも、膜での遊離形態のＥｐＣＡＭ分子を優先的に認識している可能性がある。
【００８６】
なお、ＫＩＪＹ２−６４７は、ＨＥＡ−１２５が存在するか否かにかかわらず、バックグラウンドシグナルから全ＰＣ−３細胞を識別できるという点に留意すべきである。ＰＣ−３が５１，６６７ ＥｐＣＡＭ／細胞を発現するという従来の報告によると、ＥｐＣＡＭ低発現細胞の下限は、ＦＣＭ分析で約２，０００ ＥｐＣＡＭ／細胞と推定される。この値は、転移性がん患者から推定されるＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣにおけるＥｐＣＡＭの発現量（細胞あたり、９，９００〜２４６，０００分子）をカバーするのに十分である。
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
〔配列番号：１〕
ヒト由来ＥｐＣＡＭをコードする遺伝子のＣＤＳ（終止コドン含む）のヌクレオチド配列（NCBI RefSeq Accession Number: NM_002354）である。
【００８８】
〔配列番号：２〕
ヒト由来ＥｐＣＡＭのアミノ酸配列（NCBI RefSeq Accession Number: NP_002345）である。
【００８９】
〔配列番号：３〕
実施例において合成したＨｙｂ．１（マウスＥｐＣＡＭのＥＧＦドメインを有する）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００９０】
〔配列番号：４〕
実施例において合成したＨｙｂ．２（マウスＥｐＣＡＭのＴＹドメインを有する）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００９１】
〔配列番号：５〕
実施例において合成したＨｙｂ．３（マウスＥｐＣＡＭのＣＰ領域を有する）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図１】
2014105159.tif 000007
【図２Ａ】
2014105159.tif 000008
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月3日(2013.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のＣＰ領域に対して特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のＮ末端ＥＧＦ様ドメインに反応しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
サブクラスがマウスＩｇＭである、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−１４４９であるハイブリドーマＫＩＪＹ２により産生される、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項４に記載のモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）被験者から血液試料を採取する工程；および、
（ｂ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いて、前記血液試料に含まれる循環腫瘍細胞を検出する工程、
を含む、循環腫瘍細胞の検出方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が蛍光標識されたものである、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記（ｂ）工程において、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のＮ末端ＥＧＦ様ドメインに対して特異的に反応する第２のモノクローナル抗体をさらに用いる、請求項６または７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記第２のモノクローナル抗体が磁性ビーズに結合したものである、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記（ｂ）工程を、完全循環腫瘍細胞計数分析（ｉＣｅａｐ）法により行う、請求項６〜９のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の検出方法に用いられる循環腫瘍細胞検出用キットであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、循環腫瘍細胞検出用キット。
【請求項１２】
受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−１４４９であるハイブリドーマＫＩＪＹ２。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
また、本発明の第２の形態によれば、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−１４４９であるハイブリドーマＫＩＪＹ２により産生される、ヒト由来ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
そして、本発明の第６の形態によれば、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−１４４９であるハイブリドーマＫＩＪＹ２が提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
微生物の識別の表示：ＫＩＪＹ２
受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１４４９
受託日（原寄託日）：２０１２年１１月２日
選抜およびクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、前記の性質を有する抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマの培養は、動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養する場合には、その培養液からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
ＫＩＪＹ２（受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−１４４９であるハイブリドーマ）により産生される抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体、換言すれば、ＫＩＪＹ２により産生される抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体と「機能的に同等」であるモノクローナル抗体も、本発明に含まれる。このようなモノクローナル抗体を得るには、例えば、ＫＩＪＹ２により産生される抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体のエピトープを、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質の部分ペプチド等を用いたエピトープマッピング法により解析する。そして、同定されたエピトープを含む合成ペプチドを抗原として用い、前記抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体を得ればよい。なお、２つの抗体についてエピトープが同一か否かを調べる方法としては、競合実験による方法が挙げられる。例えば、ＫＩＪＹ２により産生される抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を第一抗体とする。そして、当該第一抗体とヒトＥｐＣＡＭとの結合が、試験対象である第二抗体によって競合阻害を受ける場合には、当該第二抗体は、前記第一抗体と同じエピトープに結合するものであるといえる。