(57)【要約】【課題】無菌性保証水準１０−６を満たすことができ、有効成分濃度の低下を十分に抑制することができ、広範囲の液体製剤に適用可能な液体製剤の滅菌方法を提供する。【解決手段】凍結状態の液体製剤（タンパク質製剤及び合成高分子製剤を除く）に、放射線を照射する工程を含む、液体製剤の滅菌方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結状態の液体製剤（タンパク質製剤及び合成高分子製剤を除く）に、放射線を照射する工程を含む、液体製剤の滅菌方法。
【請求項２】
前記放射線は、８ｋＧｙを超える放射線である、請求項１に記載の滅菌方法。
【請求項３】
前記放射線は、１２ｋＧｙを超える放射線である、請求項１又は２に記載の滅菌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体製剤の滅菌方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の滅菌方法には、高圧蒸気滅菌、ろ過滅菌、無菌操作法、放射線滅菌等が存在する。
【０００３】
しかしながら、高圧蒸気滅菌は、成分の劣化による有効成分濃度の低下、変質、臭い、着色が生じる場合があり、広く利用することができない。また、ろ過滅菌及び無菌操作法の無菌性保証水準（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ａｓｓｕｒａｎｃｅ  ｌｅｖｅｌ、ＳＡＬ）は１０−３であり、本来の滅菌に求められる１０−６（１００万個の製品あたり１個の製品に菌が残る可能性があるレベル）に達していない。また、液体製剤に放射線を照射すると、有効成分の分解による有効成分濃度の低下、着色等の問題が生じる場合がある。このため、滅菌目的で液体製剤に放射線を照射している事例は少ないのが現状である。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ポビドンヨードと水とヨウ化物とを混合して作製したポビドンヨード溶液に、１０ｋＧｙ以上５０ｋＧｙ以下の放射線を照射して滅菌された、ポビドンヨード製剤が記載されている。特許文献１によれば、ポビドンヨードに所定のヨウ化物を混合することにより、放射線の照射による有効ヨウ素の減衰が好適に抑制される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２６２４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の方法では、有効成分濃度の低下の抑制が不十分な場合がある。また、特許文献１の方法は、ポビドンヨード以外の液体製剤には適用できない場合がある。
【０００７】
そこで、本発明は、無菌性保証水準１０−６を満たすことができ、有効成分濃度の低下を十分に抑制することができ、広範囲の液体製剤に適用可能な液体製剤の滅菌方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、凍結状態の液体製剤（タンパク質製剤及び合成高分子製剤を除く）に、放射線を照射する工程を含む、液体製剤の滅菌方法を提供する。
【０００９】
上記本発明の滅菌方法によれば、無菌性保証水準１０−６を満たすことができる。また、液体製剤の有効成分濃度の低下を十分に抑制することができる。さらに、広範囲の液体製剤に適用することができる。
【００１０】
上記の放射線は、８ｋＧｙを超える放射線であることが好ましく、１２ｋＧｙを超える放射線であることが好ましい。
【００１１】
照射する放射線の線量が高いほど滅菌効果を高めることができる。一般的には、放射線の照射線量を高めると、有効成分濃度の低下がより大きくなる。これに対し、本発明によれば、１２ｋＧｙを超える線量の放射線を照射しても、有効成分濃度の低下を十分に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、放射線が物質に照射されたときの反応を説明する図である。
【図２】図２は、グルコン酸クロルヘキシジン製剤への放射線照射において、温度とグルコン酸クロルヘキシジンの濃度との関係を示すグラフである。
【図３】図３ａ及びｂは、氷結晶に放射線が照射された場合の影響を説明する図である。
【図４】図４は、氷に放射線が照射された場合の挙動を示す図である。
【図５】図５は、グルコン酸クロルヘキシジンのＨＰＬＣの結果を示すクロマトグラフである。
【図６】図６は、グルコン酸クロルヘキシジンの紫外吸収の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（放射線の作用）
図１は、放射線が物質に照射されたときの反応を説明する図である。放射線が物質に入った場合、加速粒子又は電磁波から放出されたエネルギーによる軌道（スパー）において、ランダムで局所的な反応が起こる。
【００１４】
例えば、低濃度の水溶液に常温で電子線を照射すると、量的に最も多い水の分解により様々な活性種（ラジカル及び安定分子）が生成される。具体的には、下記式（Ｉ）に示す反応により、最終的に６種の活性種が生成されることが知られている。また、これらのラジカルの多くは約１０−９秒でスパー内反応が終了し、１０−８秒で拡散が終了する。例えば、発生する活性種のなかでも反応性が高いＯＨラジカルは、寿命が７０ナノ秒と短い。このため、ＯＨラジカルの運動速度が仮に１０９ｍ／秒であったとしても移動距離は約２０ｎｍ程度と短い。そこで、ＯＨラジカルは、スパー内部のラジカル周辺に存在するものと反応する。このように、ラジカルは、生成後短時間のうちに近接する溶質（ＲＨ）及び溶媒と反応し、その後、下記式（ＩＩ）〜（Ｖ）に示すラジカル同士又は溶質との反応により失活する。
【００１５】
一方、同時に生成される過酸化水素等の安定分子は、寿命が長いため拡散により系内に広がり反応する。具体的には、下記式（ＶＩ）に示す反応等により、系内に拡散した安定分子が経時的に溶質に作用すると考えられる。以上のように、水溶液中では、放射線により発生した活性種による溶質の分解が起こり、有効成分濃度の低下が起こると考えられる。
【００１６】
Ｈ２Ｏ→ｅａｑ−＋・Ｈ＋・ＯＨ＋Ｈ２＋Ｈ２Ｏ２＋Ｈ３Ｏ＋  …（Ｉ）
ｅａｑ−＋Ｈ３Ｏ＋→・Ｈ＋Ｈ２Ｏ  …（ＩＩ）
・ＯＨ＋Ｈ２→Ｈ２Ｏ＋・Ｈ  …（ＩＩＩ）
ｅａｑ−＋Ｈ２Ｏ２→・ＯＨ＋ＯＨ−  …（ＩＶ）
ＲＨ＋・ＯＨ→Ｒ＋Ｈ２Ｏ  …（Ｖ）
ＲＨ＋Ｈ２Ｏ２→Ｒ＋Ｈ２Ｏ＋ＯＨ−  …（ＶＩ）
【００１７】
下記表１に示すように、７７Ｋで氷にγ線を照射した場合の電子スピン共鳴（ＥＳＲ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）測定の結果、ＯＨラジカルやＯＯＨラジカルが発生することが知られている。
【００１８】
【表１】
2014169250.tif 000002
【００１９】
しかしながら、発生したラジカルは、氷の結晶内に存在するため移動が制限される。後述する実験例１２において示すように、精製水を凍結させた氷に放射線を照射した結果、氷はグレーに着色することが明らかとなった。これは、氷に放射線を照射すると氷結晶内にカラーセンターが生成されるとともに、結果的に電子が氷結晶内に捕集されることを示している。この結果、生成されるラジカルの量が少なくなり、溶質への加速電子やラジカルの作用が緩和されると考えられる。このことが、有効成分濃度の低下の抑制に寄与していると考えられる。
【００２０】
（液体製剤）
液体製剤としては、水溶液、懸濁液、ゲル等の製剤が挙げられる。より具体的には、注射剤、輸液剤、点眼剤、透析溶剤、外用液剤等が挙げられる。ここで、液体製剤の有効成分は、放射線照射による有効成分濃度の低下の抑制の効果が高いことから、分子量約１万以下の低分子化合物であることが好ましい。後述する実験例１３において示すように、凍結状態で放射線照射した液体製剤中の低分子化合物は、水和によりエネルギー的に安定化される。低分子化合物のこのような挙動は、より高分子であるタンパク質や合成高分子とは異なっていると考えられる。このため、低分子化合物は、タンパク質や合成高分子よりも、凍結状態での放射線照射による有効成分濃度の低下の抑制の効果が高いと考えられる。
【００２１】
（凍結状態）
凍結状態とは、液体製剤の溶媒（水）が凍っている状態であり、大気圧下においては約０℃以下の状態である。好ましい凍結温度に下限は存在しないが、温度が低いほど凍結にコストがかかる観点から、−８０℃程度を下限としてもよい。液体製剤の凍結には、一般的なフリーザーを用いてもよいし、液体窒素等の冷却媒体を用いてもよい。凍結する液体製剤は、無菌性を確保する観点から、密封容器に収容されていることが好ましい。
【００２２】
密封容器の材質としては、保形性、耐薬品性、無菌状態を維持できるバリア性等を備えたものであれば特に限定されず、例えば、ガラスやプラスチックが挙げられる。プラスチックとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、環状ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。密封容器は、これらの材質からなる多層構造を有していてもよい。
【００２３】
（放射線の照射）
放射線としては、電子線、γ線、Ｘ線等を使用できる。放射線照射装置としては、通常の医薬品の放射線照射で使用されるものを使用することができる。照射する放射線の線量は、５ｋＧｙを超えることが好ましく、８ｋＧｙを超えることがより好ましく、１２ｋＧｙを超えることが更に好ましい。放射線の線量が高いほど滅菌効果が高い。しかしながら、高い線量においては有効成分濃度の低下がより大きくなるため、放射線の線量の上限は、例えば、約１００ｋＧｙであることが好ましい。
【００２４】
凍結状態の液体製剤に放射線を照射する。例えば、放射線照射装置に冷却機能がない場合には、ドライアイス等の冷却媒体上に凍結状態の液体製剤を設置して、放射線を照射してもよい。放射線の照射後の液体製剤は、常温又は低温で保管することができる。しかしながら、後述する実験例１１で示すように、ラジカルの反応を抑制する観点から、凍結された液体製剤の融解は例えば１０℃以下の低温で行うことが好ましく、保管は例えば５〜１０℃の低温で行うことが好ましい。これにより、有効成分濃度の低下を更に抑制することができる。
【実施例】
【００２５】
〔実験例１〕
（０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤への放射線照射）
（グルコン酸クロルヘキシジン製剤の調製）
２０．０（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン水溶液２．５ｍＬに精製水を加え、全量を１００ｍＬとした。続いて、ｐＨ調整のために、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を０．５ｍＬ添加し、０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤を調製した。
【００２６】
（凍結処理）
調製したグルコン酸クロルヘキシジン製剤を、−８０℃又は−２０℃のフリーザー中で２４時間以上放置し凍結させた。
【００２７】
（放射線照射）
−８０℃又は−２０℃で凍結させたグルコン酸クロルヘキシジン製剤に、以下の装置及び条件で３０又は６０ｋＧｙの電子線を均一に照射した。また、対照として、２０℃のグルコン酸クロルヘキシジン製剤にも電子線を照射した。
電子加速器：ダイナミトロン電子加速器
加速電圧：５ＭｅＶ
電流：２０ｍＡ
【００２８】
（成分分析）
放射線照射後の各グルコン酸クロルヘキシジン製剤を適宜希釈し、グルコン酸クロルヘキシジンの濃度を以下の条件下で高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により定量した。
カラム：５μｍオクタデシルシリル化シリカゲル、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
カラム温度：５０℃
移動相：メタノール：５％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液：リン酸＝８００：２００：１
流量：２．０ｍＬ／分
検出器：紫外線吸光光度計（測定波長２６０ｎｍ、感度０．０４ａｕｆｓ）
【００２９】
表２に、放射線を照射していないグルコン酸クロルヘキシジン製剤のグルコン酸クロルヘキシジンの濃度を１００％とした場合の、グルコン酸クロルヘキシジンの濃度（％）を示す。２０℃のグルコン酸クロルヘキシジン製剤は、照射する放射線の線量が増加するにつれてグルコン酸クロルヘキシジンの濃度が低下した。これに対し、凍結状態のグルコン酸クロルヘキシジン製剤は、照射する放射線の線量を増加してもグルコン酸クロルヘキシジンの濃度の低下が少ないことが明らかとなった。
【００３０】
【表２】
2014169250.tif 000003
【００３１】
〔実施例２〕
（０．１（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤への放射線照射）
放射線照射時の水溶液の温度とグルコン酸クロルヘキシジンの濃度との関係を検討した。具体的には、０．１（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤に、２５、５、−５、−２０及び−８０℃で実験例１と同様にして２０ｋＧｙの電子線を均一に照射した。続いて、実験例１と同様にして、放射線照射後の各グルコン酸クロルヘキシジン製剤中のグルコン酸クロルヘキシジンの濃度を定量した。
【００３２】
表３に、放射線を照射していないグルコン酸クロルヘキシジン製剤のグルコン酸クロルヘキシジンの濃度を１００％とした場合の、グルコン酸クロルヘキシジンの濃度（％）を示す。また、図２に、この結果をグラフにしたものを示す。図２において、縦軸は放射線を照射していないグルコン酸クロルヘキシジン製剤のグルコン酸クロルヘキシジンの濃度を１００％とした場合の、グルコン酸クロルヘキシジンの濃度（％）を示す。また、横軸は、放射線照射したグルコン酸クロルヘキシジン製剤の温度（℃）を示す。
【００３３】
その結果、放射線を照射したグルコン酸クロルヘキシジン製剤が液体の場合と凍結状態の場合とで、グルコン酸クロルヘキシジンの濃度の低下量に差が認められた。放射線を照射したグルコン酸クロルヘキシジン製剤が凍結状態の場合に、グルコン酸クロルヘキシジンの濃度の低下の抑制が顕著に認められた。
【００３４】
【表３】
2014169250.tif 000004
【００３５】
〔実験例３〕
（１０．０（ｗ／ｖ）％アスコルビン酸製剤への放射線照射）
（アスコルビン酸製剤の調製）
アスコルビン酸１０．０ｇを精製水に溶解し、全量を１００ｍＬとし、１０．０（ｗ／ｖ）％アスコルビン酸製剤を調製した。
【００３６】
（放射線照射）
実験例１と同様にして、−８０℃又は−２０℃で凍結させたアスコルビン酸製剤に、０、１０、２０又は３０ｋＧｙの電子線を均一に照射した。また、対照として、２０℃のアスコルビン酸製剤にも電子線を照射した。
【００３７】
（成分分析）
放射線照射後の各アスコルビン酸製剤を適宜希釈し、アスコルビン酸の濃度を以下の条件下で高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により定量した。
カラム：５μｍオクタデシルシリル化シリカゲル、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
カラム温度：３０℃
移動相：精製水：リン酸＝１０００：２
流量：１．０ｍＬ／分
検出器：紫外線吸光光度計（測定波長２７５ｎｍ、感度０．０４ａｕｆｓ）
【００３８】
表４に、放射線を照射していないアスコルビン酸製剤のアスコルビン酸の濃度を１００％とした場合の、アスコルビン酸の濃度（％）を示す。２０℃のアスコルビン酸製剤は、照射する放射線の線量が増加するにつれてアスコルビン酸の濃度が低下した。また、経時的にアスコルビン酸の濃度の低下及び着色が発生した。アスコルビン酸の着色は、一般的には、アスコルビン酸が酸化され、デヒドロアスコルビン酸を経て着色すると考えられている。
【００３９】
これに対し、凍結状態のアスコルビン酸製剤は、照射する放射線の線量を増加してもアスコルビン酸の濃度の低下が少ないことが明らかとなった。また、凍結状態で放射線照射したアスコルビン酸製剤は、５℃で１ヶ月保管した後においても着色が見られなかった。
【００４０】
【表４】
2014169250.tif 000005
【００４１】
〔実験例４〕
（１．０（ｗ／ｖ）％リドカイン製剤への放射線照射）
（リドカイン製剤の調製）
リドカイン１．０ｇを希塩酸２ｍＬに溶解した。この溶液に、精製水を加えて全量を１００ｍＬとした。続いて、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを５．０〜７．０に調整し、１．０（ｗ／ｖ）％リドカイン製剤を調製した。
【００４２】
（放射線照射）
実験例１と同様にして、−８０℃又は−２０℃で凍結させたアスコルビン酸製剤に、０、１５又は３０ｋＧｙの電子線を均一に照射した。また、対照として、２０℃のアスコルビン酸製剤にも電子線を照射した。
【００４３】
（成分分析）
放射線照射後の各リドカイン製剤を適宜希釈し、リドカインの濃度を以下の条件下で高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により定量した。
カラム：５μｍオクタデシルシリル化シリカゲル、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
カラム温度：３０℃
移動相：０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）：アセトニトリル＝１１：９の溶液１０００ｍＬにラウリル硫酸ナトリウム２．８８ｇを溶解したもの
流量：１．０ｍＬ／分
検出器：紫外線吸光光度計（測定波長２５４ｎｍ、感度０．０４ａｕｆｓ）
【００４４】
表５に、放射線を照射していないリドカイン製剤のリドカインの濃度を１００％とした場合の、リドカインの濃度（％）を示す。２０℃のリドカイン製剤は、照射する放射線の線量が増加するにつれてリドカインの濃度が低下した。これに対し、凍結状態のリドカイン製剤は、３０ｋＧｙの放射線照射後においてもリドカインの濃度の低下が少ないことが明らかとなった。
【００４５】
【表５】
2014169250.tif 000006
【００４６】
〔実験例５〕
（１．０（ｗ／ｖ）％グリチルリチン酸二カリウム製剤への放射線照射）
（グリチルリチン酸二カリウム製剤の調製）
グリチルリチン酸二カリウム１．０ｇを精製水に加温溶解し、全量を１００ｍＬとし、１．０（ｗ／ｖ）％グリチルリチン酸二カリウム製剤を調製した。
【００４７】
（放射線照射）
実験例１と同様にして、−８０℃又は−２０℃で凍結させたグリチルリチン酸二カリウム製剤に、０、１５又は３０ｋＧｙの電子線を均一に照射した。また、対照として、２０℃のグリチルリチン酸二カリウム製剤にも電子線を照射した。
【００４８】
（成分分析）
放射線照射後の各グリチルリチン酸二カリウム製剤を適宜希釈し、グリチルリチン酸二カリウムの濃度を以下の条件下で高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により定量した。
カラム：５μｍオクタデシルシリル化シリカゲル、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相：０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）：アセトニトリル＝６５：３５
流量：０．５ｍＬ／分
検出器：紫外線吸光光度計（測定波長２５０ｎｍ、感度０．０４ａｕｆｓ）
【００４９】
表６に、放射線を照射していないグリチルリチン酸二カリウム製剤のグリチルリチン酸二カリウムの濃度を１００％とした場合の、グリチルリチン酸二カリウムの濃度（％）を示す。２０℃のグリチルリチン酸二カリウム製剤は、照射する放射線の線量が増加するにつれてグリチルリチン酸二カリウムの濃度が低下した。これに対し、凍結状態のグリチルリチン酸二カリウム製剤は、３０ｋＧｙの放射線照射後においてもグリチルリチン酸二カリウムの濃度の低下が少ないことが明らかとなった。
【００５０】
【表６】
2014169250.tif 000007
【００５１】
〔実験例６〕
（０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤への放射線照射による分解生成物の検討）
グルコン酸クロルヘキシジン製剤に電子線を照射すると電子線の直接作用や活性種の影響によりグルコン酸クロルヘキシジンの分解が起きる。一般的に、グルコン酸クロルヘキシジン製剤は、光又は熱により分解し、経時的にｐ−クロルアニリンを生成することが知られている。グルコン酸クロルヘキシジンの分解生成物としては、ｐ−クロルアニリニンの他に、１−（４−クロロフェニル）グアニジン及びｐ−クロロフェニルビグアニドが考えられる。そこで、−２０℃で凍結した０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤及び常温の０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤に、実験例１と同様にして３０ｋＧｙの電子線を照射した後、ＨＰＬＣによりｐ−クロルアニリンを中心に分解生成物を検出した。また、電子線を照射していない０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤についても分解生成物の検出を行った。
【００５２】
その結果、放射線を照射していない０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤では、ｐ−クロルアニリン及びｐ−クロロフェニルビグアニドが検出されなかった。一方、常温で放射線照射した０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤では、ｐ−クロルアニリンの生成量が約２．４ｐｐｍ、ｐ−クロロフェニルビグアニドの生成量が約１．１ｐｐｍであった。また、−２０℃で放射線照射した０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤では、ｐ−クロルアニリン及びｐ−クロロフェニルビグアニドが検出されなかった。なお、ｐ−クロルアニリンは、医薬品原料基準において、０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤で１２．５ｐｐｍまで存在することが許容されている。
【００５３】
〔実験例７〕
（滅菌効果の確認）
医薬品等の放射線滅菌線量の設定は、ＩＳＯ１１１３７−２：２００６に準拠して行う必要がある。ここでは、ＳＡＬ（滅菌保証水準）＝１０−６（１００万個の製品あたり１個の製品に菌が残る可能性があるレベル）が担保されていることを、ＶＤｍａｘ１５法により検討した。
【００５４】
ＶＤｍａｘ１５法によると、滅菌線量１５ｋＧｙにおける平均バイオバーデン０．８個の滅菌対象に対する検定線量は２．５ｋＧｙである。ここで、バイオバーデンとは、サンプルに混入している微生物の数を意味する。したがって、滅菌対象のサンプル１０個に２．５ｋＧｙの放射線を均一に照射して、放射線照射後のサンプルの無菌試験を行い（菌の有無を検査）、陽性サンプル数が１個以下であれば、ＳＡＬ＝１０−６を満たす滅菌線量は１５ｋＧｙであると判断する。
【００５５】
１０ｍＬの滅菌精製水にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓの芽胞を平均０．８個接種したサンプルを２０個準備した。このうち１０個を−２０℃で凍結し、１０個を常温（１５℃）で保管した。続いて、実験例１と同様の方法により、各サンプルに２．５ｋＧｙの放射線を均一に照射した。放射線照射後に、各サンプルについて接種菌の生存を無菌試験により確認した。その結果、表７に示すように、常温のサンプル１個及び−２０℃の凍結状態のサンプル１個において無菌試験の結果が陽性であったが、ＩＳＯ１１１３７−２：２００６の基準はクリアし、滅菌線量１５ｋＧｙでＳＡＬ＝１０−６が担保されることが示された。
【００５６】
【表７】
2014169250.tif 000008
【００５７】
〔実験例８〕
（滅菌効果の確認２）
ＩＳＯ１１１３７−２：２００６には規定されていないが、確認のため、芽胞接種によるチャレンジ試験を実施した。１０ｍＬの滅菌精製水に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓの芽胞を１０００個接種したサンプルを１０個準備した。このうち５個を−２０℃で凍結し、５個を常温（１５℃）で保管した。続いて、実験例１と同様の方法により、各サンプルに１５ｋＧｙの放射線を均一に照射した。放射線照射後に、各サンプルについて無菌試験を実施した。その結果、表８に示すように、全てのサンプルにおいて無菌試験の結果が陰性であり、無菌であることを確認した。
【００５８】
【表８】
2014169250.tif 000009
【００５９】
〔実験例９〕
（放射線照射による有効成分濃度の低下に対するラジカル捕捉剤の添加の影響）
水中におけるグルコン酸クロルヘキシジンの放射線照射による分解を抑制する方法として、グルコン酸クロルヘキシジン製剤にラジカル捕捉剤を添加する方法が考えられる。そこで、グルコン酸クロルヘキシジン製剤に、ラジカル捕捉剤としてヨウ化カリウム又はパラベンを添加後、室温で放射線照射し、グルコン酸クロルヘキシジンの分解を抑制できるかについて検討した。
【００６０】
その結果、グルコン酸クロルヘキシジンはヨウ化カリウムと沈殿を生成してしまうため、グルコン酸クロルヘキシジン製剤にヨウ化カリウムを添加することができなかった。また、パラベンは、グルコン酸クロルヘキシジン製剤に添加しても沈殿を生成しなかったが、パラベンは水に十分に溶解しないため、パラベンの添加によっては、グルコン酸クロルヘキシジンの放射線による分解を抑制する効果が十分に得られなかった。
【００６１】
同様の検討を行った結果、アスコルビン酸製剤及びリドカイン製剤においても、ラジカル捕捉剤を添加する方法によっては、放射線照射による有効成分濃度の低下を抑制する効果が十分に得られなかった。
【００６２】
〔実験例１０〕
（水及び氷への放射線照射による生成物並びにｐＨの変化）
一般的に、電子線照射により氷中において生成したラジカルは結晶内に存在し、ラジカル転移などで安定化するため拡散できず、水中より寿命が長くなる。このため、氷中に存在する溶質はラジカルと近接しなければ影響を受けない。しかしながら、氷が融解し液体になった場合には、結晶中のラジカルが解放され、溶質又は他のラジカルと反応する。この結果、多くのラジカルは氷の融解後に失活し、結果として安定な分子が残ることになる。
【００６３】
ここでは、常温（２０℃）の精製水及び−８０℃の氷に１００ｋＧｙの電子線を照射し、ＨＰＬＣで分析することにより、生成物を定量した。また、ｐＨの測定を行った。なお、氷については、融解後の水を用いてＨＰＬＣ分析及びｐＨの測定を行った。
【００６４】
表９に結果を示す。常温の精製水に１００ｋＧｙの電子線を照射した結果、微量の過酸化水素及び硝酸イオンの生成が確認された。また、−８０℃の氷に１００ｋＧｙの電子線を照射した結果、常温の精製水と同様に、微量の過酸化水素及び硝酸イオンの生成が確認されたが、生成量は常温の精製水と比較して少なかった。一般的には、水の放射線照射により発生する化学種は水素と過酸化水素であるが、硝酸イオンが生成されたのは空気中の窒素に由来するものと考えられる。また、硝酸イオンは、水素イオンとともに放射線照射後のｐＨ低下の原因と考えられる。また、氷の方がｐＨの低下がより大きいことから、氷の方が常温の精製水よりも水素イオン生成量が多いと考えられる。なお、放射線を照射していない精製水のｐＨは５．２６であった。
【００６５】
【表９】
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【００６６】
〔実験例１１〕
（放射線照射による活性種の生成量及び経時変化）
液体セリウム線量計は、４価の硫酸セリウム水溶液であり、放射線照射による水中のラジカル反応により３価のセリウムに変化する。そこで、液体状体（２０℃）及び凍結状態（−８０℃）の液体セリウム線量計に放射線照射を行い、ラジカルの生成量を測定し、吸収線量を計算した。
【００６７】
具体的には、まず、２０℃の液体セリウム線量計及び−８０℃で凍結させた液体セリウム線量計に、７、１５、３０ｋＧｙの電子線を照射した。続いて、放射線照射した液体セリウム線量計の３２０ｎｍの紫外域の吸光度を測定し、生成した３価のセリウム量（ｍｏｌ／Ｌ）を計算した。凍結させた液体セリウム線量計については、融解後に３２０ｎｍの紫外域の吸光度を測定した。
【００６８】
結果を表１０に示す。凍結状態での放射線照射により生成した３価のセリウム量は、液体状体での放射線照射により生成した３価のセリウム量と比較して約１／５の量であることが明らかとなった。３価のセリウムとラジカルは等価で反応することから、同じ線量の放射線を水と氷に照射した場合、最終的なラジカル発生量は氷の方が少なくなることが示された。このことから、水溶液を凍結させることで放射線の吸収線量が低下し、溶質の分解を抑制できる可能性が示された。
【００６９】
【表１０】
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【００７０】
ラジカルは低温で長時間保持できることが知られている。そこで、氷中でラジカルを保存すれば、溶質への影響は更に少なくなると考えられる。また、ラジカル反応は温度により影響されるので、氷の融解時の温度が低温であるほどラジカルの反応速度を抑制できると考えられる。このことから、氷中での溶質への影響を少なくするためには、放射線照射後できるだけ長く低温で保存し、氷の融解は低温で行うことが重要であると考えられる。
【００７１】
〔実験例１２〕
（氷による電子及び活性種の捕捉の検討）
精製水及び０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤を−８０℃で凍結させ、生成した氷に放射線を照射した。その結果、氷はグレーに着色した。氷を融解すると着色は消失した。放射線照射直後に氷表面の反射光を色差計で測定した結果、放射線未照射の氷と比較して明らかな色差が生じ発色していることが明らかとなった。表１１に色差測定の結果を示す。表１１に示すように、放射線を照射した氷（精製水）は、色スケールＬ＊、ａ＊、ｂ＊の中でａ＊及びｂ＊の値が増加していることから、赤色系及び黄色系が強く発色しており、ΔＥ＊は３．５、イエローインデックス（ＹＩ）は７．０であることが示された。また、０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤の氷に放射線を照射した場合においても同様の傾向が認められた。カラーセンター全体の色調は、結晶構造、結晶周期性、正孔に入る電子によって異なることから、氷の色調は、氷の温度、結晶構造、溶質、溶媒の種類によって変化すると考えられた。
【００７２】
【表１１】
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【００７３】
通常、室温で水に放射線を照射すると、水は分解し、様々なラジカル及び安定分子が生成される。電子が水和した水和電子の寿命は室温で１０−１３から１０−１１秒程度であり、活性が高いため、短時間の間に他の短寿命のラジカルや溶質と反応する。したがって、常温の水への放射線の照射では、電子は水和電子になるか自由電子となって化学反応に寄与し失活するため、水中に捕捉されることは少ない。
【００７４】
一方、氷はＩｈ型の六方晶系の結晶構造を取り、また、冷却の条件によりアモルファス又は他の結晶形を取ることが報告されている。図３ａ及びｂは、氷結晶に放射線が照射された場合の影響を説明する図である。図３ａに示すように、氷結晶に放射線が照射されると、加速電子により氷結晶中のマイナスに荷電した酸素原子の電子が励起され、図３ｂに示すように電子は酸素原子から離れ、その部分に格子欠陥（正孔）が発生する。その格子欠陥に自由電子が入り安定化する。一方、電子が抜けてできた正孔は結晶中を移動し、生じた正孔とトラップは紫外域から可視域における吸収を持つカラーセンターとなり、結果として氷は発色すると考えられる。上述した氷の着色はこの現象によるものであると考えられる。
【００７５】
実験例１１及び１２の結果から、氷中では、氷に照射された加速電子の一部が氷結晶に取り込まれて安定化し、水中よりも加速電子の作用は緩和されていると考えられる。その結果、ラジカルの発生量が低くなり、ラジカルによる溶質の分解が抑制されるものと考えられる。
【００７６】
また、実験例１２において、氷を融解すると着色は消失した。このことから、氷の融解によりカラーセンターが崩壊し、一部の水和電子やラジカルも消失したと考えられる。図４は、氷に放射線が照射された場合の挙動を示す図である。図４に示す通り、氷の融解後、一部の水和電子やラジカルは他の活性種と反応し消失すると考えられる。
【００７７】
また、以下の実験例１３に示すように、氷の融解後、氷に取り込まれた溶質は、エネルギー的に安定な水和物になることが示された。
【００７８】
〔実験例１３〕
（凍結状態における放射線照射による水和物の生成）
０．５（ｗ／ｖ）％グルコン酸クロルヘキシジン製剤を−８０℃で凍結させ、３０ｋＧｙの放射線を照射した。続いて、放射線照射後のグルコン酸クロルヘキシジン製剤を解凍し、ＨＰＬＣでグルコン酸クロルヘキシジンを定量し、また、紫外吸収を測定した。図５にＨＰＬＣの結果を示し、図６に紫外吸収の測定結果を示す。その結果、図５に示すように、ＨＰＬＣによる測定において、グルコン酸クロルヘキシジンのピークの増加が観察された。また、図６に示すように、紫外吸収の測定において、２００〜３００ｎｍの範囲にわたる紫外吸収の増加が認められた。放射線照射を行うと、グルコン酸クロルヘキシジンの２６０ｎｍにおける紫外吸収のピークは低くなるはずであるが、−８０℃で放射線照射を行った後には逆に高くなり、また、２００〜３００ｎｍ全体にわたり紫外吸収が高くなっていることが明らかとなった。続いて、サンプルを加熱し、水和を崩壊させた後、同サンプルを再び凍結させて放射線を照射した結果、ＨＰＬＣにおけるグルコン酸クロルヘキシジンのピークの増加及び２００〜３００ｎｍの範囲にわたる紫外吸収の増加が認められた。
【００７９】
以上の結果より、凍結状態で放射線照射後、グルコン酸クロルヘキシジンの一部は水和物になっていると考えられた。一般的に、水和物は無水物よりエネルギー的に安定である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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