(57)【要約】      （修正有）【課題】糖鎖をより短時間でセンサーチップに固定化することができるとともに、検出対象である毒素等を高感度に検出する糖鎖チップを作製することができる方法を提供する。【解決手段】細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素に特異的に結合する糖鎖を有する糖鎖含有化合物が基板表面に固定されている、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素の検出用センサーチップの作製方法であって、基板を当該糖鎖含有化合物の溶液に浸し、30℃〜45℃の一定温度に保ちながらマイクロ波を照射することにより、糖鎖含有化合物を基板表面に固定化することを特徴とする方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素に特異的に結合する糖鎖を有する糖鎖含有化合物が基板表面に固定されている、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素の検出用センサーチップの作製方法であって、
基板を当該糖鎖含有化合物の溶液に浸し、30℃〜45℃の一定温度に保ちながらマイクロ波を照射することにより、糖鎖含有化合物を基板表面に固定化することを特徴とする方法。
【請求項２】
基板が、表面に金ナノ粒子を固定した基板である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基板が、金ナノ粒子がシランカップリング剤を介して表面に固定されたガラス基板である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糖鎖含有化合物が糖脂質含有化合物であり、当該化合物に含まれる糖鎖が当該化合物の脂質部位をリンカーとして基板表面に固定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
糖脂質含有化合物の脂質部位が１,２-ジチオラン-３-イル基、１,２-ジチオラン-４-イル基、１,２-ジチアン-３-イル基および１,２-ジチアン-４-イル基からなる群から選ばれるジスルフィド基を有し、糖脂質含有化合物が、当該ジスルフィド基を介して金ナノ粒子に固定されることにより、基板表面に固定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖脂質含有化合物が以下の式(Ｉ)で表される化合物であり、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素がリシンである、請求項５に記載の方法。
【化１】
2014169994.tif 000016
【請求項７】
糖脂質含有化合物が以下の式(II)で表される化合物であり、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素がボツリヌス毒素である、請求項５に記載の方法。
【化２】
2014169994.tif 000017
【請求項８】
糖脂質含有化合物が以下の式で表される化合物(III)であり、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素がボツリヌス毒素である、請求項５に記載の方法。
【化３】
2014169994.tif 000018
【請求項９】
糖脂質含有化合物が以下の式(IV)で表される化合物であり、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素がコレラ毒素である、請求項５に記載の方法。
【化４】
2014169994.tif 000019
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって作製された、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素の検出用センサーチップ。
【請求項１１】
以下の式(II)で表される糖脂質含有化合物が基板表面に固定されている、ボツリヌス毒素の検出用センサーチップ。
【化２】
2014169994.tif 000020
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のセンサーチップを用いる、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性細菌やウィルスに由来するタンパク質、あるいは、食中毒の原因となり、また、テロに用いられることもある蛋白性の生物毒素等を高感度に検知するためのセンサーチップ作製に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原性細菌やウィルス、毒素を高感度に検出することは、感染症の診断や食の安全、さらには、国民の安全・安心な社会を構築する上で重要である。これらを高感度に検出することにより、食中毒の原因細菌を特定したり、インフルエンザの原因となっているウィルスを検出したり、生物テロに使用され得る毒素を検出したりすることができ、これらに対する対策を講じることができる。それゆえ、今日まで、さまざまなセンサーなどの分析技術の開発が行われてきた(非特許文献１)。例えば、抗原抗体反応に基づく関連蛋白質の検出、PCRを用いた関連遺伝子の検出などが知られている。
本発明者らは、最近、糖鎖を用いたバイオセンサーの開発を行い、サーズウイルス蛋白や、過去に暗殺やテロに用いられたリシン、病原性大腸菌Ｏ157の生産するベロ毒素、ボツリヌス菌毒素などを、糖鎖を用いて検出する方法を開発した(非特許文献２−４、特許文献１−５)。それらの研究では、糖鎖を自己集積化単分子膜作製法(Self-assembled monolayer technique：SAM)によってセンサーチップ用基板に固定化している。しかしながら、従来のSAM法による糖鎖の固定化には、通常10時間以上という、多くの時間が必要であるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2006-347908(特許第4742339号)
【特許文献２】特開2006-347909(特許第4742340号)
【特許文献３】WO2005/075493(特許第4844920号)
【特許文献４】WO2007/015377(特許第4815576号)
【特許文献５】特開2004-346209(特許第4009721号)
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Encyclopedia of Bioterrorism Defense; John Wiley & Sons：Hoboken, NJ, 2005.
【非特許文献２】Biosens. Bioelectron. 2008, 24,929-933.
【非特許文献３】Biomacromolecules 2002, 3, 411-414.
【非特許文献４】ChemBioChem 2007, 8, 2117-2124.
【非特許文献５】有機合成化学協会誌、70, 250-264 (2012).
【非特許文献６】Angew. Chem. Int. Ed., 1998, 37, 2754 - 2794.
【非特許文献７】Chem. Rev., 2002, 102, 439-469.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、糖鎖をより短時間でセンサーチップ用の基板に固定化することができるとともに、検出対象である毒素等を高感度に検出する糖鎖チップを作製することができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、糖鎖の固定化を短時間に行うための手法について、鋭意検討した結果、マイクロ波照射することで、センサーチップ用基板に効率よく糖鎖を固定化できることを見出すとともに、マイクロ波照射の際の条件を最適化することにより、このようにして作製された糖鎖チップによって、マイクロ波を照射しない場合と匹敵する、あるいはこれを上回る、毒素等の検出レスポンスが得られることを見出した。特に、ラクトシド誘導体を固定化したリシン毒素検出用の糖鎖チップでは、毒素の検出レスポンスが大幅に向上するとともに、この場合に生じる非検出対象成分の非特異的吸着による擬陽性を抑制する効果も得られることを見出した。
【０００７】
マイクロ波照射は、有機合成化学の分野で用いられている、最近特に注目されている合成手法の１つである(非特許文献５)。有機合成化学の分野では、均一な溶液中における合成反応や、金属触媒を用いる不均一な反応系においてマイクロ波が用いられ、マイクロ波を照射しない場合と比べて、反応時間が短縮される、反応収率が向上するなどの効果が得られた事例が報告されている。また、マイクロ波照射による加熱効果のほか、マイクロ波による非加熱効果も示唆され、例えば、低温下におけるマイクロ波照射により熱に不安定な化合物の合成が成功した事例も報告されている(非特許文献５)。
しかしながら、本出願で示すように、ガラス板状のセンサーチップ用基板のような、やや大きな(W2.6cm×D1.2cm×H2mm)固体素材に対し、マイクロ波を用いて、糖鎖などのセンサー素子を固定することを試みた例は知られていない。
【０００８】
そこで本発明者らは、マイクロ波照射により、糖鎖をチップ上に固定化する方法について検討を行ったところ、その検討の中で、マイクロ波をある条件で照射したときに、単に糖鎖がチップに速やかに固定化されるのみならず、作製された糖鎖チップに対する毒素等の蛋白質の結合量が最大となり、上述の良好な毒素等の検出レスポンスが得られることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち、30℃に温度を保持しながら60分間、250Wの出力でマイクロ波を照射することにより、以下の式(Ｉ)に示すラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))を固定化して作製した糖鎖チップでは、リシン擬剤(RCA120)の結合量が最大となり、マイクロ波を照射しないで作製したチップ(コントロール、固定化温度30℃、固定化時間18時間)と比べて、RCA120の検出レスポンスが約3.6倍上昇した。10℃、20℃、45℃、60℃で、同じ出力のマイクロ波を照射したときは、いずれも、30℃でマイクロ波照射した場合と比べるとRCA120の結合量は小さくなったが、45℃では、30℃でマイクロ波を照射しない場合と比べて約2.8倍の検出レスポンスが得られ、20℃および60℃においても、30℃でマイクロ波を照射しない場合を上回る検出レスポンスが得られた。一方、10℃、60℃で作製したチップでは、ネガティブコントロールの牛血清アルブミン(BSA)の非特異的な吸着が認められたが、30℃および45℃で作製したチップでは、BSAによる擬陽性は認められなかった(図２)。
【化１】
2014169994.tif 000003
なお、本発明の実験においては、毒性タンパク質のリシンに代えて、リシン擬剤を用いている。リシン擬剤としては、ヒマ豆に含まれる120kDaからなる蛋白質、ヒマ凝集素(RCA120とよばれる)を用いた。リシンは、RCA120と同じく、ヒマ豆に含まれる60kDaからなる蛋白質(RCA60とよばれる)であり、両者の蛋白質相同性は、約90％である。リシン自体は猛毒であるため、この種の実験では、通常、リシンの擬剤としてRCA120が用いられる。
【００１０】
同様に、30℃に温度を保持しながら60分間、250Wの出力でマイクロ波を照射することにより、以下の式(II)に示すグルコシド糖誘導体(化合物(II))を固定化して作製した糖鎖チップでは、ボツリヌス毒素Ａ型重鎖(BTX/A/Hc)の結合量が最大となり、マイクロ波を照射しないで作製したチップ(コントロール、固定化温度30℃、固定化時間18時間)と比べて、BTX/A/Hcの検出レスポンスが約30％上昇した。一方、20℃、45℃、60℃で、同じ出力のマイクロ波を照射したときは、いずれも、30℃でマイクロ波照射した場合と比べてBTX/A/Hcの結合量は小さくなり、30℃でマイクロ波を照射しない場合をも下回った。なお、これらの糖鎖チップでは、いずれの場合も、BSAの非特異的な吸着は認められなかった(図４)。
【化２】
2014169994.tif 000004
本実験で使用したボツリヌス毒素は、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)が生産する蛋白質性毒素であり、食中毒の原因毒素として知られている。ボツリヌス毒素はＡ型からＧ型まで知られている。また、ボツリヌス毒素は、分子量５万の軽鎖(Lc)と分子量１０万の重鎖(Hc)から構成される。本実験では、Ａ型重鎖(BTX/A/Hc)を使用した。
また、ボツリヌス毒素は、GT1bなどの負電荷のシアル酸を有する複雑な構造のガングリオシド(糖脂質)に結合することが従来から知られているが、本発明者らは、今回、ボツリヌス毒素が、より単純なグルコシド糖誘導体(化合物(II))に結合することをはじめて見出し、これを用いた糖鎖チップが以下の式(III)に示すGT1b誘導体(化合物(III))を用いた糖鎖チップに匹敵するボツリヌス毒素の検出感度を示すことを見出した(図３)。
本実験は、このグルコシド糖誘導体を固定化した糖鎖チップを用いて行ったものである。
【化３】
2014169994.tif 000005
【００１１】
さらにまた、30℃に温度を保持しながら60分間、250Wの出力でマイクロ波を照射することにより、以下の式(IV)で示すガングリオシドGM1誘導体(化合物(IV))を固定化して作製した糖鎖チップでは、コレラ毒素の結合量が最大となり、マイクロ波を照射しないで作製したチップ(コントロール、固定化温度30℃、固定化時間18時間)と比べて、コレラ毒素の検出レスポンスが約6％上昇した。一方、10℃、20℃、45℃、60℃で、同じ出力のマイクロ波を照射したときは、いずれも、30℃でマイクロ波照射した場合と比べてコレラ毒素の結合量は小さくなり、30℃でマイクロ波を照射しない場合をも下回った。なお、これらの糖鎖チップでは、いずれの場合も、BSAの非特異的な吸着は認められなかった(図５)。
【化４】
2014169994.tif 000006
【００１２】
すなわち、この出願は、以下の発明を提供するものである。
〈１〉細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素に特異的に結合する糖鎖を有する糖鎖含有化合物が基板表面に固定されている、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素の検出用センサーチップの作製方法であって、
基板を当該糖鎖含有化合物の溶液に浸し、30℃〜45℃の一定温度に保ちながらマイクロ波を照射することにより、糖鎖含有化合物を基板表面に固定化することを特徴とする方法。
〈２〉基板が、表面に金ナノ粒子を固定した基板である、〈１〉に記載の方法。
〈３〉基板が、金ナノ粒子がシランカップリング剤を介して表面に固定されたガラス基板である、〈２〉に記載の方法。
〈４〉糖鎖含有化合物が糖脂質含有化合物であり、当該化合物に含まれる糖鎖が当該化合物の脂質部位をリンカーとして基板表面に固定される、〈１〉〜〈３〉に記載の方法。
〈５〉糖脂質含有化合物の脂質部位が１,２-ジチオラン-３-イル基、１,２-ジチオラン-４-イル基、１,２-ジチアン-３-イル基および１,２-ジチアン-４-イル基からなる群から選ばれるジスルフィド基を有し、糖脂質含有化合物が、当該ジスルフィド基を介して金ナノ粒子に固定されることにより、基板表面に固定される、〈４〉に記載の方法。
〈６〉糖脂質含有化合物が以下の式(Ｉ)で表される化合物であり、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素がリシンである、〈５〉に記載の方法。
【化１】
2014169994.tif 000007
〈７〉糖脂質含有化合物が以下の式(II)で表される化合物であり、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素がボツリヌス毒素である、〈５〉に記載の方法。
【化２】
2014169994.tif 000008
〈８〉糖脂質含有化合物が以下の式で表される化合物(III)であり、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素がボツリヌス毒素である、〈５〉に記載の方法。
【化３】
2014169994.tif 000009
〈９〉糖脂質含有化合物が以下の式(IV)で表される化合物であり、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素がコレラ毒素である、〈５〉に記載の方法。
【化４】
2014169994.tif 000010
〈１０〉〈１〉〜〈９〉のいずれかに記載の方法によって作製された、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素の検出用センサーチップ。
〈１１〉以下の式(II)で表される糖脂質含有化合物が基板表面に固定されている、ボツリヌス毒素の検出用センサーチップ。
【化２】
2014169994.tif 000011
〈１２〉〈１０〉または〈１１〉に記載のセンサーチップを用いる、細菌またはウィルス由来のタンパク質、若しくは、生物毒素の検出方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、毒素等を検出するための糖鎖をチップに固定化する際に、マイクロ波を本発明者らが見出した条件で照射することによって、糖鎖の固定化を速やかに行うことができるばかりでなく、作製された糖鎖チップに対する毒素等の蛋白質の結合量(検出レスポンス)を、マイクロ波を用いない場合に匹敵する、あるいは、これを上回る、十分な量とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】糖固定化LSPRチップの作製手順を示す図。
【図２】チップへのラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))固定化時のマイクロ波照射温度と、得られた糖固定化チップのリシン擬剤検出レスポンスの関係を示す図。
【図３】ガングリオシドGT1b誘導体(化合物(III))を固定化したチップと、グルコシド糖誘導体(化合物(II))を固定化したチップに対するボツリヌス毒素Ａ型重鎖(BTX/A/Hc)の検出レスポンスを示す図。
【図４】チップへのグルコシド糖誘導体(化合物(II))固定化時のマイクロ波照射温度と、得られた糖固定化チップのBTX/A/Hc検出レスポンスの関係を示す図。
【図５】チップへのGM1糖誘導体(化合物(IV))固定化時のマイクロ波照射温度と、得られた糖固定化チップのコレラ毒素検出レスポンスの関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に用いられる基板としては、少なくとも表面が金で被覆された基板、例えば、表面に金ナノ粒子を固定した基板が用いられる。このような表面に金ナノ粒子を固定した基板としては、例えば、シランカップリング剤を用いてガラス基板上に金ナノ粒子を固定した基板などが挙げられる。金ナノ粒子としては、粒径5〜150nmのもの、好ましくは、20〜40nmのものが用いられる。
【００１６】
本発明で用いられる糖脂質含有化合物としては、例えば特許文献１〜５に記載されている、リンカー部位に１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上のジスルフィド基を有する基、好ましくは１,２-ジチオラン-３-イル基を有する、サーズウイルス蛋白、リシン毒素、ベロ毒素、コレラ毒素、またはボツリヌス毒素に対し結合活性を有する糖脂質含有化合物などが挙げられる。
【００１７】
例えば、リシン毒素に結合活性を有する糖脂質含有化合物としては、以下の式(Ｉ)で表されるラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))が挙げられる。
【化１】
2014169994.tif 000012
【００１８】
また、ボツリヌス毒素の結合する糖脂質含有化合物の代表的なものとしては、７糖のGT1bとよばれる、負電荷のシアル酸を３個有するガングリオシドが挙げられる。このほか、シアル酸を２個有する６糖のGD1b，GD1aやシアル酸を４個有する８糖のGQ1bが知られている(非特許文献６、７)。このようなガングリオシドを基板に固定するための誘導体の一例としては、以下の式(III)で表されるGT1b誘導体(化合物(III))が挙げられる。
【化３】
2014169994.tif 000013
しかしながら、これらのガングリオシドは、シアル酸の有する負電荷による静電的反発が大きいため、高感度な検知チップを作製することは容易ではない。
これに対し、本発明者らは、ボツリヌス毒素と特異的に結合する糖脂質含有化合物を鋭意探索したところ、GT1b、GQ1b、GD1b、GD1aのようなガングリオシドではなく、シアル酸を持たないシンプルなβ-D-グルコースを含有する以下の式(II)で表される糖脂質化合物(化合物(II))を見出した。すなわち、本発明により、化合物(II)がGT1bとほぼ同じ感度(検出レスポンス)で、ボツリヌス毒素重鎖と結合することがはじめて明らかにされ、当該毒素を検出するセンサーに利用可能であることが実証された。β-D-グルコース部位を有する化合物(II)自体は公知化合物であるが(非特許文献２)、化合物(II)に限らず、β-D-グルコース部位をボツリヌス毒素が認識して結合する事実は今日まで知られていない。
【化２】
2014169994.tif 000014
【００１９】
また、コレラ毒素の結合する糖脂質含有化合物の代表的なものとしては、５糖のGM1とよばれる、負電荷のシアル酸を１個有するガングリオシドが挙げられる(非特許文献６、７)。このようなガングリオシドを基板に固定するための誘導体の一例としては、以下の式(IV)で表されるGM1誘導体(化合物(IV))が挙げられる。
【化４】
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【実施例】
【００２０】
以下に示す実施例において、図面を参照しながら、本発明を更に詳細に説明する。
なお、以下の実施例において、牛血清アルブミン(BSA)は、国産化学(株)より購入した。リシン擬剤(RCA120)は、VECTOR LABORATORIES社(米国)のものを使用した。ボツリヌス毒素Ａ型重鎖は、List Biological Laboratories社(米国)のものを使用した。コレラ毒素は和光純薬工業(株)より購入した。ラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))およびグルコシド糖誘導体(化合物(II))は、非特許文献２に従い合成した。ガングリオシドGT1b糖誘導体(化合物(III))は、特許文献３に従い合成した。ガングリオシドGM1糖誘導体(化合物(IV))は、特許文献３を参考に合成した。金ナノ粒子(20nm、40nm)は、田中貴金属工業(株)のものを使用した。マイクロ波照射装置は、Wave Magic MWO-1000S(2.45GHz、EYELA東京理化器械(株))を用いた。局在プラズモン共鳴(LSPR)装置を構成しているタングステン-ハロゲン光源(LS-1、wavelength range：360-2500nm)、光ファイバー(P400-1-UV/VIS, fiber core diameter：400nm)、分光器(QE65000、wavelength range：475-835nm)はOcean Optics社(FL、USA)より購入した。送液ポンプ(TE-361N)はテルモ(株)より購入した。温調セル(qpod、Z-height of 1mm)はQuantum Northwest社(WA、USA)から購入した。サンプルインジェクター(Rheodyne 9725 or 7725)はIDEX Health & Science LLC社(WA、USA)のものを使用した。組立フローセル(FLAB50-UV-02)はジーエルサイエンス(株)より購入した。
【００２１】
実施例１．糖修飾LSPRチップの作製(図１参照)
ガラスチップ(W2.6cm×D1.2cm×H2mm、特注品、竹田理化工業(株)製)をPiranha溶液(H2O2/H2SO4=1/3、v/v)に浸し、80℃で40分加熱した。その後、チップを超純水(ミリポア)で十分に洗浄し、50℃にて真空オーブン(楠本化成(株)、サーモバックVT 210P)を用いて1.5時間真空乾燥させた。次に、10％ 3-アミノプロピルトリメトキシシラン(和光純薬工業(株)、APTMS)-エタノール溶液で15分間処理した。アミノシラン処理したガラスチップを、次に、エタノールで軽く洗浄し、続いて、50℃で3時間、真空乾燥・焼結処理してチップ１を得た。冷却後、(A)チップ１を16.5mMのNHS-活性化リポ酸(N-hydroxysuccinimidyl lipoate)-DMF(N,N-ジメチルホルムアミド、20mL)溶液に浸し、48-64時間窒素雰囲気下で処理した(チップ２)。別法として、(B)8.3mMのNHS-活性化リポ酸を用い、マイクロ波照射(100W、70℃、600秒)することで、チップ１へのリポ酸の導入を行い、チップ２を得ることができた。このようにリポ酸で修飾されたチップ２を、次に、金ナノ粒子(20nm)で6時間処理して 表面に金ナノ粒子が固定化されたチップ(これをLSPRチップという、チップ３)を作製した。
次に、非特許文献２に従い合成したラクトシド糖誘導体を、自己集積化単分子膜作製法(self-assembled monolayer technique：SAM)をマイクロ波照射下で行うことにより、先に作製したLSPRチップ(チップ３)上に固定化した。すなわち、ラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))のメタノール溶液(100ng/mL、2mL)にLSPRチップ(チップ３)を浸し、マイクロ波(照射パワー：250W)を各温度(10℃、20℃、30℃、45℃、60℃)にて照射した。マイクロ波照射中は、低温冷却用ユニット(MWC-1000、EYELA東京理化器械(株)製)を用いて所定の温度になるよう冷却した。マイクロ波照射時間は、60分である。マイクロ波照射後、得られたラクトシド修飾LSPRチップ(チップ４、Ｒ＝β-D-ガラクトース)をメタノールおよびミリQ水で十分に洗浄した。 
レファレンスとして、マイクロ波を照射しないで、チップ５(Ｒ＝β-D-ガラクトース)を作製した。すなわち、通常のSAM法に従い、チップ３をラクトシド糖誘導体-メタノール溶液(濃度は同上)に30℃で18時間浸漬して、チップ５を得た(Ｒ＝β-D-ガラクトース、コントロール)。
同様に、グルコシド糖誘導体(化合物(II))、ガングリオシドGT1b誘導体(化合物(III))、ガングリオシドGM1誘導体(化合物(IV))についても、ラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))と同様の方法でチップに固定化した。但し、化合物(II)、化合物(III)、化合物(IV)の固定化にあたっては、図１のチップ３の金ナノ粒子は、40nmのものを用いた。
【００２２】
実施例２．LSPR装置による、マイクロ波照射によりラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))を固定化したチップの評価(図２参照)
実施例１において作製した本発明の糖鎖修飾LSPRチップ(チップ４、Ｒ＝β-D-ガラクトース)と従来法による比較例の糖鎖修飾LSPRチップ(チップ５、Ｒ＝β-D-ガラクトース)について、LSPR装置を用い、RCA120およびBSAを用いて、毒素(擬剤)の検出感度および擬陽性の抑制の程度について評価した。
LSPR装置は、タングステン-ハロゲン光源、送液ポンプ、送液用チューブ、サンプルインジェクター(サンプルループ容量：リシン、リシン擬剤の場合250μL、以下の実施例におけるボツリヌス毒素、コレラ毒素の場合は１mL)、組立フローセル(光路長、0.025mm)、温調セル、分光器、吸光度の経時変化をモニタリングするためのPCから構成される。ランニング緩衝液は150mM NaClを含む10mMへぺス(HEPES)緩衝液(pH7.5)で、0.22μmのフィルターでろ過してから使用した。緩衝液は使用前に脱気した。ベースラインが安定した後に試料をサンプルインジェクターを用いてマニュアルにて注入した。濃度100ng/mLのリシン擬剤(RCA120)を、33.3μL/minの流速で7.5分間LSPR装置に注入した(注入量：250μL)。同様に、牛血清アルブミン(BSA)の300ng/mLも注入した。測定温度は25℃であった。露光時間は8ミリ秒で2000回積算してデータを取得した。検出レスポンスはA550-A720(550nmにおける吸光度-720nmにおける吸光度)であり、時間とともに追跡した。すべてのLSPRデータは、OOIBase32 software(Ocean Optics社, version 2.0)で処理した。
【００２３】
マイクロ波照射した各温度における、RCA120(濃度：100ng/mL)の結合量(A550-A720)を図２に示す。ここでは、図１のチップ３の金ナノ粒子に、直径20nmのものを使用した。糖の固定化においてマイクロ波を照射しないで作製したチップ５(Ｒ＝β-D-ガラクトース、コントロール、固定化温度30℃、固定化時間18時間)と比べて、30℃にてマイクロ波照射して作製したチップ４(Ｒ＝β-D-ガラクトース)の方が、RCA120の結合量が約3.6倍上昇することがわかった。このことは、上記条件でマイクロ波照射した方が、RCA120を3.6倍高感度に検出できることを意味している。30℃より高温(45℃、60℃)にしたときには、結合レスポンスは減少した。45℃では、マイクロ波を照射しないで作製したチップ５(Ｒ＝β-D-ガラクトース、コントロール)よりも結合レスポンスが増大したが、30℃には及ばなかった。高温の60℃では、コントロールとさほど大きな違いは見られなかった。一般に、高温になると糖固定化条件が強くなるので、結合量(結合レスポンス)は増大すると考えられるが、そうはならなかった。このことは、単純に高温下でマイクロ波を照射しても、優れた検出チップは得られないことを意味している。
温度を20℃にした場合、コントロールと同程度のレスポンスが得られた。10℃では、コントロールよりもレスポンスは下がった。
【００２４】
次に、ネガティブコントロールの牛血清アルブミン(BSA)が、非特異的に結合しないか検討した。BSAは、ラクトシドのような糖には本来結合しない蛋白質である。
図２に結果を示す。30℃、および、45℃にて固定化したチップについては、RCA120(100ng/mL)よりも高濃度のBSA(300ng/mL)を注入しても非特異的な結合はなかったが、10℃と60℃では、BSAが非特異的に結合した。このことは、30℃、および、45℃にて作製したチップを用いなければ、擬陽性が出てしまい、現場では使用できないことを意味する。
【００２５】
実施例３.ガングリオシドGT1b誘導体(化合物(III))とグルコシド糖誘導体(化合物(II))のボツリヌス毒素に対する検出レスポンスの比較(図３参照)
ラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))と同様にグルコシド糖誘導体(化合物(II))およびガングリオシドGT1b誘導体(化合物(III))を固定化したチップを用いて、両チップのボツリヌス毒素に対する検出レスポンスの比較を行った。但し、この実施例では、化合物(II)および化合物(III)の固定化は、45℃にてマイクロ波を１時間照射して行い、その際、実施例１で用いた低温冷却用ユニット(MWC-1000、EYELA東京理化器械(株)製)は用いなかった。また、ボツリヌス毒素として、ボツリヌス毒素Ａ型重鎖を使用した。その結果を図３に示す。
化合物(III)を固定した糖鎖チップは、200ng/mLの濃度のボツリヌス毒素Ａ型重鎖に対し、A550-A720値が約0.00068の検出レスポンスを示した。一方、化合物(II)を固定した糖鎖チップでは、同じく200ng/mLの濃度に対し、約0.00061の検出レスポンスを示した。このように、本発明者らがボツリヌス毒素に対し結合性を有することを新たに見出したグルコシド糖誘導体(化合物(II))を固定した糖鎖チップは、従来から知られているボツリヌス毒素が結合する代表的なガングリオシドであるGT1b誘導体(化合物(III))を固定した糖鎖チップとほぼ同じ、良好な検出感度でボツリヌス毒素Ａ型重鎖を検出できることが確認された(図３)。
化合物(II)のグルコシド誘導体は、シアル酸を持たないため、ガングリオシドに比べて安定であり、長期保存が可能であるといった特長を有する。また、ガングリオシドに比べて、グルコシド糖誘導体の方が、原料が安価である。
図３の結果は、より不安定なガングリオシド(化合物(III))を固定化したチップを使用しなくとも、安価で合成が容易で、かつ、より安定性の高いグルコシド糖誘導体(化合物(II))をボツリヌス毒素の検出に使用できることを示している。グルコシド糖誘導体(化合物(II))を固定化した毒素検出用チップは、ガングリオシド(化合物(III))を固定化したチップよりも保存安定性に優れている。
【００２６】
実施例４．LSPR装置による、マイクロ波照射によりグルコシド糖誘導体(化合物(II))を固定化したチップの評価(図４参照)
ラクトシド糖誘導体(化合物(Ｉ))を固定化したチップと同様にして、さまざまな温度でマイクロ波照射によりグルコシド糖誘導体(化合物(II))を固定化したチップを用い、ボツリヌス毒素Ａ型重鎖をバイオセンサー装置に注入したときの検出レスポンスを測定した。結果を図４に示す。
ここでは、図１のチップ３の金ナノ粒子に、直径40nmのものを使用した。30℃にてマイクロ波照射して作製したチップ４(Ｒ＝Ｈ)は、糖の固定化においてマイクロ波を照射しないで作製したチップ５(Ｒ＝Ｈ、コントロール、固定化温度30℃、固定化時間18時間)と比べて、ボツリヌス毒素Ａ型重鎖(BTX/A/Hc)の結合量が約30％倍上昇した。このことは、上記条件でマイクロ波照射した方が、BTX/A/Hcをより高感度に検出できることを意味している。30℃より高温(45℃、60℃)でマイクロ波照射して作製したチップ及び20℃でマイクロ波照射して作製したチップでは、結合レスポンスは減少した。
これらのチップでは、ネガティブコントロールのBSAは、BTX/A/Hcの３倍高濃度(300ng/mL)を注入しても検出されず、擬陽性はないことがわかった。
従って、本技術により、標的毒素を特異的に高感度に検出できる、信頼性の高いチップが提供されることが確認された。
【００２７】
実施例５．LSPR装置による、マイクロ波照射によりGM1糖誘導体(化合物(IV))を固定化したチップの評価(図５参照)
コレラ毒素は、コレラ菌が生産する蛋白質性の毒素であり、シアル酸を１個有するGM1とよばれるガングリオシドに結合する(非特許文献６、非特許文献７)。
天然のGM1ガングリオシドから、化合物(Ｉ)〜(III)と同様の方法によって、GM1誘導体(化合物(IV))を合成した。得られた化合物(IV)を、化合物(Ｉ)〜(III)と同様の方法で、40nmの金ナノ粒子に固定化した。作製したGM1固定化チップを用い、コレラ毒素に対する検出レスポンスを、本バイオセンサーを用いて比較した(図５)。
その結果、化合物(Ｉ)や化合物(II)と同様に、30℃にてマイクロ波を照射して作製したチップにおいて、コレラ毒素の検出レスポンスが最大となり、マイクロ波を照射しないで作製したチップ(コントロール、固定化温度30℃、固定化時間18時間)と比べて約６％、検出レスポンスが増大した。一方、10℃、20℃、45℃、60℃でマイクロ波照射して作製したチップでは、いずれも、30℃で固定化した場合よりも、毒素検出レスポンスは減少した。
30℃でマイクロ波照射して作製したチップの検出レスポンスの増加の程度は、化合物(Ｉ)や化合物(II)を用いた場合と比べて少ない。このことは、化合物(IV)のように、シアル酸のような負電荷を有する糖誘導体は、化合物(Ｉ)や化合物(II)のような電荷を持たない中性糖に比べれば、マイクロ波照射による固定化が起こりにくく、その結果が、毒素検出レスポンス(毒素検出感度)の増大の程度の差に反映しているものと考えられる。しかしながら、このような場合でも、マイクロ波照射を行わない場合と比べて1/18程度の短時間で、マイクロ波照射を行わない場合に匹敵し、あるいは、これを上回る検出レスポンスが得られており、マイクロ波照射による効果が十分得られていることは明らかである。
【００２８】
以上のとおり、猛毒のリシンの擬剤であるRCA120、ボツリヌス毒素Ａ型重鎖、及び、コレラ毒素について、糖鎖チップによるこれらの検出感度について検討したところ、糖鎖チップの作製時のマイクロ波照射温度が検出感度に影響し、検出レスポンスが最大となるための、最適な糖鎖固定化のための温度条件があることを見出した。特に、糖鎖がラクトシド糖誘導体の場合に生じる非検出対象による擬陽性も、マイクロ波照射温度を最適化することにより、解消する。また、同時に、ボツリヌス毒素の検出に関しては、グルコシド糖誘導体が、従来のガングリオシド系列の糖脂質とほぼ同じ感度で当該毒素を検出できることを見出した。
本発明に従い、SAM法によりセンサーチップ用基板に糖鎖を固定する際に、最適な温度条件でマイクロ波照射を行えば、従来のSAM法に比べて、短時間にセンサーチップを作製でき、かつ、これを用いて、より高感度に毒素等の蛋白質を検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明により、従来のセンサーチップに匹敵する、あるいは、これを上回る検出感度の高いセンサーチップをより簡便に作製することができ、これを用いた食中毒の原因毒素検出、感染症診断、生物毒素の高感度検出などにより、安全・安心な社会を実現するために、本発明を活用できる。
なかでも、ボツリヌス毒素を検出するためのグルコシド糖誘導体(化合物(II))、および、それを固定化したチップは、現行検知機で使用されている抗体と比べて安定であり、抗体のように低温での保管が不要で室温で保管可能であり、また、抗体に比べてコストも安く、当該チップを用いたバイオセンサーは、生物テロ発生事案において、有効な検知技術となり得ると期待される。また、従来のガングリオシドを用いた検出法では、ガングリオシドそのものが加水分解を受けやすいため、低温下で保管する等、作製した検出チップの保存安定性にやや問題があったが、本発明のグルコシド糖誘導体は、ガングリオシドに比べると、加水分解を受けにくく、より安定な検出チップを提供できるといった特長を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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