(57)【要約】      （修正有）【課題】グルコラファニンを与えることができるブラシカ・ビロサからの新規組み換え遺伝子移入を含むブラシカ・オレラセア植物の植物、種子および派生物に関連する方法および組成を提供する。【解決手段】ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルおよび該Ｍｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルの欠失を含む、ブラシカ・オレラセア植物であって、該Ｍｙｂ２８アレルは、Ｍｙｂ２８アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える、植物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラシカ・ビロサ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｖｉｌｌｏｓａ）からのＭｙｂ２８アレルおよび該Ｍｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルの欠失を含む、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  Ｏｌｅｒａｃｅａ）植物であって、該Ｍｙｂ２８アレルは、Ｍｙｂ２８アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える、植物。
【請求項２】
植物がブロッコリー植物である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
植物が自殖である、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
植物が雑種である、請求項１に記載の植物。
【請求項５】
植物がブラシカ・ビロサからの該Ｍｙｂ２８アレルとホモ接合性である、請求項１に記載の植物。
【請求項６】
植物がブラシカ・ビロサからの該Ｍｙｂ２８アレルとヘテロ接合性である、請求項１に記載の植物。
【請求項７】
ＥＬＯＮＧアレルがブラシカ・オレラセア由来である、請求項１に記載の植物。
【請求項８】
請求項１に記載の植物の植物体の部分。
【請求項９】
該部分が、葉、胚珠、小花、花粉、花らい球または細胞である、請求項８に記載の植物体の部分。
【請求項１０】
請求項１に記載の植物を生成する種子。
【請求項１１】
ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルおよび該Ｍｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルの欠失を含む、染色体部分を含むブラシカ・オレラセア植物であって、該染色体部分は、Ｍｙｂ２８アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与え、染色体部分を含む種子のサンプルがＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３１６５の下に寄託されている、植物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の植物を生成する種子。
【請求項１３】
請求項１１に記載の植物の植物体の部分。
【請求項１４】
該部分が、葉、胚珠、小花、花粉、花らい球または細胞である、請求項１３に記載の植物体の部分。
【請求項１５】
ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルおよびブラシカ・オレラセアからのＥＬＯＮＧアレルを含む、組換えＤＮＡ断片。
【請求項１６】
細胞内に含まれるものとしてさらに定義される、請求項１５に記載のＤＮＡ断片。
【請求項１７】
種子内に含まれるものとしてさらに定義される、請求項１５に記載のＤＮＡ断片。
【請求項１８】
植物内に含まれるものとしてさらに定義される、請求項１５に記載のＤＮＡ断片。
【請求項１９】
所望のグルコシノレート組成を含むブラシカ植物を得るための方法であって、
ａ）上昇したグルコシノレートを与え、ブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルと植物内で遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルとヘテロ接合性である植物を得る；
ｂ）前記植物の後代を得る；および
ｃ）後代がブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含むがＥＬＯＮＧアレルを含まないように組換えが生じた少なくとも第一の後代植物を選抜することを含み、後代植物がブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルが存在し、ＥＬＯＮＧアレルが存在しないことにより、所望のグルコシノレート組成を有することとなる、
工程を含む、方法。
【請求項２０】
後代植物の選抜が、（１）ブラシカ・ビロサのＭｙｂ２８アレルと遺伝的に連結したマーカーを含む、および／または該ブラシカ植物の対応する遺伝子座に存在する遺伝子マーカーを欠く、および（２）ブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルと遺伝的に連結した遺伝子マーカーを欠く、および／または該ブラシカ植物の対応する遺伝子座に存在する遺伝子マーカーを含む、後代植物を同定することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
後代植物の選抜が、配列番号：１および配列番号：２の相補体に隣接した（ｆｌａｎｋｅｄ）該植物のゲノム中に見出された多型を検出することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該アレルが、オリゴヌクレオチドプライマー対を使用するＰＣＲベースの方法で検出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
後代植物の選抜が、図５に示される該後代植物中の多型を検出することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
該ブラシカ植物が、ブラシカ・オレラセア植物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含むがＥＬＯＮＧアレルを含まない、請求項１９に記載の方法によって生産された植物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の植物の部分であって、該植物の部分は細胞、種、根、茎、葉、花らい球、花および花粉からなる群から選択される、部分。
【請求項２７】
第一のブラシカ・オレラセア親植物を異なる遺伝子型の第二のブラシカ・オレラセア親植物と交雑することを含む上昇したグルコシノレートをもつ雑種ブラシカ・オレラセア植物を生産する方法であって、第一の親植物はＭｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルを欠く、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含み、Ｍｙｂ２８アレルは、Ｍｙｂ２８アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える、方法。
【請求項２８】
第一のブラシカ・オレラセア親植物を複数の異なる遺伝子型の第二のブラシカ・オレラセア親植物と交雑することを含む、複数の雑種ブラシカ・オレラセア植物を作出することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含み、Ｍｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルを欠く染色体部分を植物に遺伝子導入することを含む、所望の上昇したグルコシノレート含量をもつブラシカ・オレラセア植物を作出する方法であって、該部分はその部分を欠く植物と比較して所望のグルコシノレート含量を与え、その染色体部分を含む種子のサンプルがＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３１６５の下に寄託されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年１月３１日出願の米国仮出願第６１／７００，７６２号に基づく優先権を主張し、該仮出願の全開示事項は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
マイクロソフトウィンドウズ（登録商標）オペレーティングシステムで８キロバイトと計測され、２０１２年９月１３日に生成された「ＳＥＭＢ００８ＵＳ＿ＳＴ２５」と名付けられたファイルに含まれる配列表が電子的に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
１．発明の分野
本発明は、組換え染色体部分のあるブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  Ｏｌｅｒａｃｅａ）植物の開発および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の記載
グルコシノレートは、植物種の１６種の科、特に、ブロッコリーがその典型例であるアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）に存在する作用物質である。現実に同定された１２０種以上の異なるグルコシノレートがあるが、密接に関連づけられた分類群は通常そのような小さい数の化合物だけを含む。グルコラファニンやグルコイベリンなどのブロッコリーで有意なグルコシノレートは、アミノ酸メチオニンから生化学的に得られる。グルコシノレート経路では、各回で単一の炭素単位をテールに加えることによる、ＥＬＯＮＧ（伸長）遺伝子座の活性により、メチオニンがホモメチオニンおよびジホモメチオニンに変換される。ジホモメチオニンが４−メチルチオブチルグルコシノレート（グルコラファニン；「ＭＳＢ」）に変換される一方で、ホモメチオニンは最終的に３−メチルチオプロピルグルコシノレート（グルコイベリン；「ＭＳＰ」）に変換される。これらのグルコシノレート（グルコイベリンおよびグルコラファニン）は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびキノンレダクターゼなどの、代謝および潜在性発がん物質の排泄を促進する、フェーズＩＩ解毒酵素の強力な誘導因子である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の概要
一つの態様において、本発明はブラシカ・ビロサ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｖｉｌｌｏｓａ）からのＭｙｂ２８アレルおよび該Ｍｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルの欠失を含む、ブラシカ・オレラセア植物を提供し、ここで、Ｍｙｂ２８アレルは、Ｍｙｂ２８アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える。
【０００４】
一つの実施形態において、植物はブロッコリー植物である。他の実施形態において、植物は自殖または雑種である。他の実施形態において、植物はブラシカ・ビロサからの該Ｍｙｂ２８アレルとホモ接合性である。さらに他の実施形態において、植物はブラシカ・ビロサからの該Ｍｙｂ２８アレルとヘテロ接合性である。また他の実施形態において、ＥＬＯＮＧアレルはブラシカ・オレラセアからのものである。
【０００５】
他の態様において、本発明は本発明の植物の部分を提供する。いくつかの実施形態において、植物部分はさらに葉、胚珠、小花（ｆｌｏｒｅｔ）、花粉、花らい球（ｈｅａｄ）、および細胞であり得る。
【０００６】
さらに他の態様において、本発明は本発明の植物を生成する種子を提供する。
【０００７】
また他の態様において、本発明はブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルおよび該Ｍｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルの欠失を含む、染色体部分を含むブラシカ・オレラセア植物を提供し、ここで、染色体部分は、Ｍｙｂ２８アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与え、染色体部分を含む種子のサンプルがＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３１６５の下に寄託されている。一つの実施形態において、本発明はそのような植物を生成する種子を提供する。他の実施形態において、本発明は植物の部分を提供し、該部分は、葉、胚珠、小花、花粉、花らい球、および細胞である。他の実施形態において、植物はブラシカ・オレラセア植物である。
【０００８】
本発明の他の態様において、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルおよびブラシカ・オレラセアからのＥＬＯＮＧアレルを含む、組換えＤＮＡ断片を提供する。一つの実施形態において、ＤＮＡ断片は細胞内に含まれるものとしてさらに定義される。他の実施形態において、ＤＮＡ断片は種子内に含まれるものとしてさらに定義される。さらに他の実施形態において、ＤＮＡ断片は植物内に含まれるものとしてさらに定義される。
【０００９】
他の態様において、本発明は、ａ）上昇したグルコシノレートを与え、ブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルと植物内で遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルとヘテロ接合性である植物を得る；ｂ）前記植物の後代を得る；およびｃ）後代がブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含むがＥＬＯＮＧアレルを含まないように組換えが生じた少なくとも第一の後代植物を選抜することを含み、後代植物がブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルが存在し、ＥＬＯＮＧアレルが存在しないことにより、所望のグルコシノレート組成を有することとなる、所望のグルコシノレート組成を含むブラシカ植物を得る方法を提供する
【００１０】
一つの実施形態において、後代植物の選抜は、（１）ブラシカ・ビロサのＭｙｂ２８アレルと遺伝的に連結したマーカーを含む、および／または該ブラシカ植物の対応する遺伝子座に存在する遺伝子マーカーを欠く、および（２）ブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルと遺伝的に連結した遺伝子マーカーを欠く、および／または該ブラシカ植物の対応する遺伝子座に存在する遺伝子マーカーを含む、後代植物を同定することを含む。
【００１１】
他の実施形態において、後代植物の選抜は、配列番号：１および配列番号：２の相補体に隣接した（ｆｌａｎｋｅｄ）該植物のゲノム中に見出された多型を検出することを含む。さらなる実施形態において、そのようなアレルはオリゴヌクレオチドプライマー対を使用するＰＣＲベースの方法で検出される。他の実施形態において、後代植物の選抜は、図５に示される該後代植物中の多型を検出することを含む。さらなる実施形態において、ブラシカ植物は、ブラシカ・オレラセア植物であり得る。
【００１２】
またさらなる態様において、本発明はブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含むがＥＬＯＮＧアレルを含まない、本発明の方法により得られる植物およびその後代を提供する。一つの実施形態において、本発明はそのような植物の部分を提供する。他の実施形態において、植物の部分は細胞、種、根、茎、葉、花らい球、花および花粉からなる群から選択される。
【００１３】
他の態様において、本発明は第一のブラシカ・オレラセア親植物を異なる遺伝子型の第二のブラシカ・オレラセア親植物と交雑することを含む上昇したグルコシノレートをもつ雑種ブラシカ・オレラセア植物を生産する方法を提供し、ここで、第一の親植物はＭｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルを欠く、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含み、Ｍｙｂ２８アレルは、Ｍｙｂ２８アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える。一つの実施形態において、方法はさらに、第一のブラシカ・オレラセア親植物を複数の異なる遺伝子型の第二のブラシカ・オレラセア親植物と交雑することを含む、複数の雑種ブラシカ・オレラセア植物を作出することを含む。
【００１４】
さらに他の態様において、本発明はブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含み、Ｍｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルを欠く染色体部分を植物に遺伝子導入することを含む、所望の上昇したグルコシノレート含量をもつブラシカ・オレラセア植物を作出する方法を提供し、ここで、部分はその部分を欠く植物と比較して所望のグルコシノレート含量を与え、その染色体部分を含む種子のサンプルがＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３１６５の下に寄託されている。
【００１５】
「約」の用語は、ある値が、該値を決定するために採用された装置または方法についての平均の標準偏差を含むことを示すために用いられる。特許請求の範囲における「または」の用語の使用は、選択肢のみに言及することが明示されるか、または選択肢が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために用いられる。特許請求の範囲において、「含む」の用語または他の開放型用語（ｏｐｅｎ  ｌａｎｇｕａｇｅ）と共に用いる場合、特に断りのない限り、「ある」および「ひとつの」の用語は「１つ以上」を意味する。「含む」、「有する」および「包含する」の用語は、開放型の連結動詞である。これらの動詞の１以上のあらゆる形態または時制、例えば「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「包含する」および「包含している」もまた開放型である。例えば、１以上の工程を「含む」、「有する」または「包含する」いかなる方法も、それら１以上の工程のみを有するものには限定されず、他の記載されていない工程をもカバーする。同様に、１以上の形質を「含む」、「有する」または「包含する」いかなる植物も、それら１以上の形質のみを有するものには限定されず、他の記載されていない形質をカバーする。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内における様々な変更および改変がかかる詳細な説明から当業者にとって明らかなものとなるため、該詳細な説明および提供されるいかなる具体例も、本発明の特定の態様を示すものではあるが、説明のみを目的として提供されているものであることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は雑種ブロッコリー品種アイアンマン（Ｉｒｏｎｍａｎ）（左）とＲＸ０５９９１１９９（右）からの花らい球を表す。品種は５０×５０ｃｍのスペースで夏に育てられた。
【００１８】
【図２】図２は雑種ブロッコリー品種アイアンマン（左）とＲＸ０５９９１１９９（右）からの茎の水平断面の切片を示す。品種は５０×５０ｃｍのスペースで秋に育てられた。
【００１９】
【図３】図３は雑種ブロッコリー品種アイアンマン（左）とＲＸ０５９９１１９９（右）からの花らい球および茎のプロファイルを示す。品種は５０×５０ｃｍのスペースで秋に育てられた。
【００２０】
【図４】図４は異なるＥＬＯＮＧアレルのＱＴＬ１−ＢｏＧＬＳ−ＥＬＯＮＧマーカーでのアッセイ結果を示す。Ｖアレルは、高い３−ＭＳＰ／４−ＭＳＢ比および高い全グルコシノレートをもたらす、Ｍｙｂ２８に関連するブラシカ・ビロサアレルである。Ａ、ＢおよびＣアレルはブラシカ・ビロサＥＬＯＮＧアレルなしのブロッコリーでみられるアレルの例である。
【００２１】
【図５−１】図５はＦＴ６９ブロッコリー品種に含まれるブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８遺伝子座のコンセンサス配列および増加したレベルのグリコシノレートのない、たとえばブラシカ・オレラセア（Ｏｌｅｒａｃｅａ）のコンセンサス配列間のアラインメントを示す（配列番号８−９）。
【図５−２】図５−１に同じ。
【図５−３】図５−１に同じ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は上昇した、グルコラファニンとしても知られる４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（ＭＳＢ）を与えることができるブラシカ・ビロサからの新規組み換え遺伝子移入を含むブラシカ・オレラセア植物の植物、種子および派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）に関連する方法および組成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８およびＥＬＯＮＧアレルを含む、雑種ＰＳ０５１５１６３９（米国特許出願公開番号２０１１／００５５９４５）のＭｙｂ２８ドナー親の場合のように、非組み換え遺伝子移入を含む親系統を用いるときに、実質的により可変になる一方で、遺伝子移入を含む植物が常にグルコイベリンに比較して上昇したグルコラファニン含量を示す雑種を生成することは驚くべきことであった。雑種品種を生産するために利用可能な優れたブラシカ・オレラセア親系統の数が限られているので、上昇したグルコラファニン含量および／またはグルコラファニンのグルコイベリンに対する比をもつ複数の優れた雑種後代を生成する能力は重要である。したがって、減少した遺伝子移入は自殖の有用性を実質的に増加させ、例えば潜在的に異なる生育環境、最終消費者、または他の評価基準に適合された、それぞれ所望のグルコラファニン含量を有する複数の雑種の生産を許容する。
【００２３】
ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８遺伝子座を含み、これまでそれに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧ遺伝子座を欠く新しい「減少した遺伝子移入」は、グルコイベリンに対して遺伝子移入で上昇したグルコラファニンを含む植物由来の雑種において常に与えることができる。それゆえ、本発明の一つの態様は、少なくとも一つのそのような減少した遺伝子移入を含むブラシカ・オレラセア植物を得るための方法に関し、ここで得られるブラシカ・オレラセア植物および／またはそれ由来の後代は遺伝子移入を欠く対照植物に対して所望のグルコラファニン含量を示す。それゆえ、本発明は、本発明の減少した遺伝子移入により与えられた所望のグルコラファニン含量を有する植物を提供する。ある実施形態において、そのような植物を得る方法は、上昇したグルコシノレートを与え、植物においてブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルと遺伝的に結合したブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルとヘテロ接合性のブラシカ・オレラセア植物を得る、そのような植物からの後代を得る、および１以上のそのような後代植物を選抜する、ことを含み、ここで遺伝的組み換えは、後代がブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを含み、ブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルを含まないように起こる。そのような後代またはそれらのさらなる後代もまた、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルの存在およびブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルの非存在の結果としての所望のグルコラファニン含量を有し得る。特定の実施形態において、方法は、Ｍｙｂ２８および／またはＥＬＯＮＧアレルと遺伝的に連結した１以上の遺伝子マーカーを同定することによる、そのようなアレルを含む後代植物を得ることをさらに含み得る。遺伝子マーカーの同定は、表現形の、遺伝子の、または、生化学的試験を含み、例えば、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレル、ブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルおよびブラシカ・オレラセアからのＥＬＯＮＧアレルなどを含む、本明細書に記載された１以上のアレルの存在に関する親および／または後代植物のスクリーニングを含み得る。
【００２４】
グルコイベリン含量に対するグルコラファニン含量などのある形質、またはブラシカ・ビロサＭｙｂ２８アレルにヘテロ接合性の雑種後代におけるグルコシノレートの予測できない型は、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルにおけるグルコシノレート形質およびブラシカ・ビロサ遺伝子移入からのＥＬＯＮＧアレルの共存のために見出される。それゆえ、Ｍｙｂ２８およびＥＬＯＮＧ  ＱＴＬの近くでの組み換え事象によって「減少している」遺伝子移入の形成が引き起こされることが理解される。減少している遺伝子移入を含む系統、すなわちグルコシノレートが上昇し、ＱＴＬの近くで組み換え事象を受けた系統は、分子および／または、表現型のマーカーの使用で効率的にスクリーニングされ得る。それゆえ、Ｍｙｂ２８およびＥＬＯＮＧ遺伝子移入で特定されるＱＴＬに関して隔離している（すなわち、ヘテロ接合性の）、植物群またはそのような植物群の後代が、例えば、グルコイベリンレベルに対して上昇したグルコラファニンレベルの組換え表現型を有する植物のためにスクリーニングされ得る。
【００２５】
他の実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載されるように、ブラシカ・ビロサ由来の減少した遺伝子移入を含み、Ｍｙｂ２８およびＥＬＯＮＧアレル間の減数分裂組換えを含む、ブラシカ・オレラセア植物の同定を含み得る。特定の実施形態において、遺伝子移入の同定は、標準的なプロトコールを使用するグルコラファニンおよび／またはグルコイベリンの測定を含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載される減少した遺伝子移入を含む本発明の植物は、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８およびＥＬＯＮＧアレルを含む、またはブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８アレルを欠く植物と比べて、グルコイベリンに対してグルコラファニンの上昇した平均の割合を含む。一つの実施形態において、グルコイベリンに対してグルコラファニンの上昇した平均の割合を含むそのような植物は自殖系統であり、他の実施形態において、本発明の減少した遺伝子移入を含む植物を１以上の親として有するＦ１雑種として定義される。特定の実施形態において、本発明は、約１０：１、１２：１、１５：１、１８：１、２０：１、２３：１、２５：１、２８：１、３０：１、３５：１および約４０：１のグルコラファニンのグルコイベリンに対する比を含む植物を提供する。一つの態様において、増加したグルコラファニン含量はブロッコリー品種アイアンマンなどの標準的なブラシカ・オレラセア品種に関して増加したグルコラファニン含量が計算され得る。
【００２６】
Ａ．上昇したグルコラファニンを示すブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  Ｏｌｅｒａｃｅａ）系統の育種
本発明の一つの態様は、本明細書にて提供される減少したＭｙｂ２８／ＥＬＯＮＧ遺伝子移入を含む植物のそれ自身または第二の植物との交雑を含む方法、およびそのような方法により生産された種子および植物に関する。これらの方法は、ＭＳＢおよび／またはＭＳＰ含量を含む、所望のグルコシノレート組成を示す栽培種ブラシカ・オレラセア植物の生産および繁殖に使用できる。またさらに、上昇したグルコシノレート含量を有する本発明の植物は、上昇したグルコシノレートのない植物に対して、改善された植物の栄養価を含む。方法はまた、雑種ブラシカ・オレラセア種子およびそこから生育した植物を生産するためにも用いることができる。雑種種子は、そのような系統を第二のブラシカ・オレラセア植物系統と交雑することにより作出される。雑種は減少した遺伝子移入についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。
【００２７】
ブラシカ・ビロサは北西および中央シチリアに特有の野生種であり、それゆえ、当業者は野生から選択された植物からＭｙｂ２８アレルを得ることができる。あるいは、Ｍｙｂ２８アレルはＳＮＲ  ３４７（ＦＴ６９；Ｍｉｔｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，１０６：７２７−７３４；２００３において４２８−１１−６９と称される）、ＢＲ−３８４−０１４、ＳＮＰ１３（５８０３３３）、ＳＮＰ８８（ＢＲＭ５１−１２１０）、ＢＲ３８４−０２０、Ｂ１６３９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−９６７６）、ＢＲＭ５１−１１６２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−９６７５）およびＲＸ  ０５９９１１９９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１３１６５）を含む、発明で用いられる他の源から入手し得ることは当業者に周知である。本発明によると、本明細書において提供される植物はＭｙｂ２８アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルを通常欠く。このことは、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８およびＥＬＯＮＧアレルを含む植物と、標準的なブラシカ・オレラセア品種を含む、ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８およびＥＬＯＮＧアレルを含まないブラシカ植物との交雑を経る本発明により達成される。とりわけ、これは特に当技術で周知の多くのブロッコリー品種を含む。
【００２８】
野菜育種の目標は、様々な望ましい形質を単一の品種／雑種の中に結集させることである。かかる望ましい形質としては、より高い収量、昆虫または病気に対する抵抗性、環境ストレスに対する耐性および栄養価を含む、生産者および／または消費者にとって有益と考えられるあらゆる形質が挙げられる。所望の形質を得ようとするために用いられる育種技術は、植物の受粉方法を利用するものである。２つの一般的な受粉方法がある：ある花の花粉が同じ花または同じ植物の別の花に移動する場合、植物は自家受粉する。花粉が異なる植物の花からのものである場合、植物は他家受粉する。
【００２９】
均一な品種の作出には、ホモ接合性の自殖性植物の作出、これら自殖性植物の交雑、および該交雑の評価が必要である。系統育種および反復選抜は、育種集団から自殖性植物を作出するために用いられている育種方法の例である。これら育種方法は、２以上の植物または他の様々な広範囲の源からの遺伝的背景を集めて育種プールとし、該プールから、自殖および所望の表現型の選択によって新たな系統および雑種が作出される。
【００３０】
本発明によると、新規の品種は、本発明の植物を交雑し、その後均一な系統を開発するために、何世代にわたる所望の選抜および自殖が続くことにより作出され得る。新品種は、あらゆる第二の植物との交雑によって作出し得る。新規系統を作出するために交雑すべき第二の植物を選択する際には、それ自身が１以上の選択された望ましい特徴を示すか又は雑種組合せにおいて望ましい特徴を示す植物を選択することが望ましい場合もある。最初の交雑を行った後、自殖および選択を行って新品種を作出する。均一な系統の作出のためには、典型的には５世代以上の自殖および選択を伴うことが多い。
【００３１】
新品種の均一な系統は、倍加半数体の方法によっても作出し得る。この技術は、複数世代の自殖および選択を必要とせずに、固定された系統の作出を可能にする。この方法においては、固定された系統をわずか１世代で作出することができる。半数体胚は、小胞子、花粉、葯培養または子房培養から作成し得る。次いで、半数体胚は、自発的に、又は化学処理（例えばｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ処理）によって、倍加し得る。あるいは、半数体胚を半数体植物へと生育させて、染色体倍加を誘導する処理を行っても良い。いずれの場合においても、稔性のホモ接合性植物が得られる。本発明において、ホモ接合性系統を得るために、かかる技術のいずれかを本発明の植物およびその子孫に関して用いることができる。
【００３２】
自殖性植物を改良するために戻し交雑を用いることもできる。戻し交雑は、特定の望ましい形質を、１つの自殖性または非自殖性の源から、該形質を欠いている自殖系統へ移す。これは、例えば、優れた自殖系統（Ａ）（反復親）を、対象とする形質に関する１以上の適切な遺伝子座を有するドナー自殖系統（非反復親）に最初に交雑することによって達成することができる。次いで、かかる交雑の子孫を優れた反復親（Ａ）と戻し交雑し、その後、得られた子孫を非反復親から移すべき所望の形質について選択する。所望の形質についての選択を伴う５世代以上の戻し交雑の後、子孫は移入された特徴を有するが、ほとんどの又はほぼ全ての他の遺伝子座に関して優れた親と同様である。移入された形質に関して純粋な育種子孫を得るため、最後の戻し交雑世代を自殖するのがよい。
【００３３】
適切な反復親の選択は、戻し交雑手法の成功のために重要な工程である。戻し交雑プロトコールの目的は、元の品種における単一の形質または特徴を変化させるか又は置換することである。これを達成するため、所望の遺伝子以外の残部の本質的に全てを保持し、それにより元の品種の所望の生理学的および形態学的構成を保持しつつ、反復品種の単一の遺伝子座を、非反復親からの所望の遺伝子座によって改変または置換する。特定の非反復親の選択は、戻し交雑の目的に依存する；主な目的の一つは、何らかの商業的に望ましい形質を植物に付加することである。正確な戻し交雑プロトコールは、変化させる特徴または形質、ならびに反復および非反復親の間の遺伝的距離に依存する。戻し交雑法は、移入される特徴が優性のアレルである場合には単純化されるが、劣性のアレル、または付加的（ａｄｄｉｔｉｖｅ）アレル（劣性および優性の間）も移入することができる。この場合、所望の特徴がうまく移入されたかどうかを決定するため、子孫の検定を導入することが必要となり得る。
【００３４】
ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  Ｏｌｅｒａｃｅａ）品種は、２種より多くの親から作出することもできる。改変戻し交雑として知られる方法は、戻し交雑の間に異なる反復親を用いる。改変戻し交雑は、元の反復親を特定のより望ましい特徴を有する品種によって置換するために用いることができ、あるいは、複数の親を用いて、各々から異なる望ましい特徴を得ることもできる。
【００３５】
新規自殖系統の作出においては通常選択されないが戻し交雑技術によって改良することができる多くの単一遺伝子座形質が同定されている。単一遺伝子座形質は、遺伝子組み換えによるものであっても、そうでなくてもよい；これらの形質の例としては、これらに限定されないが、除草剤抵抗性、細菌性、真菌性またはウイルス性病害に対する抵抗性、昆虫抵抗性、改変された脂肪酸または炭水化物代謝、および変化した栄養価が挙げられる。これらは、通常核を介して遺伝する遺伝子を含む。
【００３６】
単一の遺伝子座が優性形質として働く場合、直接選択を適用し得る。育種のためのブロッコリー植物の選択は必ずしも植物の表現型に依存するわけではなく、代わりに遺伝学的調査に基づくものであってもよい。例えば、目的の形質に遺伝的に密接に連鎖する適切な遺伝マーカーを利用することができる。これらのマーカーの１つを、特定の交雑の子孫における形質の有無を同定するために用いることができ、また、継続される育種の間、子孫の選択において用いることができる。この技術は一般に、マーカー利用選抜（ｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）と称される。植物における目的の形質の相対的有無を同定することができるあらゆる他のタイプの遺伝マーカーまたは他のアッセイも、育種にとって有用である。
【００３７】
マーカー利用選抜の手順は、付与する形質の遺伝子移入のために、特に有用である。本発明において用い得る周知の遺伝マーカーのタイプとしては、必ずしもこれらに限定されないが、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）、開裂増幅多形配列（ＣＡＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、配列特性増幅領域（ＳＣＡＲ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、および一塩基多型（ＳＮＰ）が挙げられる。
【００３８】
Ｂ．遺伝子工学によって得られる植物
戻し交雑によって、および直接的に植物に導入することができる多くの有用な形質は、遺伝的形質転換技術によって導入されるものである。そのため、遺伝的形質転換は、選択された導入遺伝子をブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物に挿入するために用いることができ、あるいは戻し交雑によって導入し得る導入遺伝子の調製のために用いることができる。ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）を含む植物の形質転換方法は当業者に周知である。
【００３９】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、ベクターが細胞において挿入ＤＮＡを発現できるかぎり限定されない。例えば、ブラシカ細胞において構成遺伝子発現のためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）および外因性の刺激により誘導されるプロモーターを含むベクターが使用できる。好適なベクターの例はｐＢ１バイナリーベクターである。ベクターが導入される「ブラシカ細胞」は、様々な形態のブラシカ細胞、例えば組織細胞懸濁物、プロトプラスト、葉の切片およびカルスを含む。
【００４０】
ベクターは、ポリエチレングリコール法、ポリカチオン法、エレクトロポレーション、粒子銃、アグロバクテリウム媒介形質転換、およびプロトプラストによる直接ＤＮＡ取り込みなどの既知の方法により、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）細胞に導入される。
【００４１】
エレクトロポレーションによる形質転換を行うために、細胞の懸濁培養等の脆弱な組織、または胚形成カルスを用いてもよく、あるいは、未熟な胚または他の組織化された組織を直接形質転換してもよい。この技術においては、選択した細胞の細胞壁を、ペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ（ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ））に暴露することによって部分的に分解するか、または制御された方法で組織を機械的に傷つけるのがよい。
【００４２】
形質転換ＤＮＡセグメントを植物細胞へ送達するための効率的な方法は、微粒子銃である。この方法においては、粒子を核酸で被覆し、推進力によって細胞内へ送達する。代表的な粒子としては、タングステン、白金、および好ましくは金によって構成されるものが挙げられる。撃ち込み（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）のために、懸濁状態の細胞をフィルターまたは固形培地上で濃縮する。あるいは、未熟な胚または他の標的細胞を固形培地上に準備してもよい。撃たれる細胞を、適切な距離でマクロプロジェクタイル（ｍａｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）停止プレートの下に置く。微粒子銃の技術は広く適用可能であり、事実上あらゆる植物種を形質転換するために用い得るものである。
【００４３】
アグロバクテリウム媒介移入は、植物細胞へ遺伝子座を導入するために広く適用できる別のシステムである。該方法の利点は、ＤＮＡを植物組織全体に導入することができ、それによりプロトプラストからインタクトな植物を再生させる必要を回避できることである。近代のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウム（および他の根粒菌）において複製する能力があり、容易な操作を可能にしている。さらに、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入用のベクターにおける近年の技術進歩により、様々なポリペプチドをコードする遺伝子を発現することができるベクターの構築を促進するよう、ベクター中の遺伝子および制限部位の配置が改良されている。記載されるベクターは、挿入されるポリペプチドコード遺伝子の直接発現のためのプロモーターおよびポリアデニル化部位と隣接する便利なマルチリンカー領域を有している。さらに、武装（ａｒｍｅｄ）および非武装（ｄｉｓａｒｍｅｄ）両方のＴｉ遺伝子を含むアグロバクテリウムを、形質転換のために用いることができる。
【００４４】
アグロバクテリウム媒介形質転換が効率的である植物系統においては、遺伝子座移入の容易かつ定義された性質のため、これが最適な方法である。ＤＮＡを植物細胞へ導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組込みベクターの使用は、当該技術分野において周知である（米国特許第５，５６３，０５５号）。例えば、米国特許第５，３４９，１２４号は、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて植物細胞を形質転換する方法を記載する。鱗翅類の幼虫に対して毒性の蛋白質を発現する完全長Ｂ．ｔ．トキシンをコードするＤＮＡコーディング配列を有するキメラ遺伝子を挿入することにより、そのような昆虫に抵抗性を有する植物をもたらす。
【００４５】
多数のプロモーターが、これらに限定されないが、選択可能なマーカー、点数化可能なマーカー、有害生物（ｐｅｓｔ）耐性、病害抵抗性、栄養強化のための遺伝子、および農業上興味の対象となるあらゆる他の遺伝子を含むあらゆる目的遺伝子の、植物遺伝子発現のために有用である。ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物遺伝子発現に有用な構成的プロモーターの例としては、これらに限定されないが、単子葉植物（例えばＤｅｋｅｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０；Ｔｅｒａｄａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ、１９９０を参照）を含むほとんどの植物組織において構成的な高レベル発現をもたらすカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）Ｐ−３５Ｓプロモーター；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの直列重複バージョン、増強された３５Ｓプロモーター（Ｐ−ｅ３５Ｓ）、ノパリン合成酵素プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター；および米国特許第５，３７８，６１９号に記載のゴマノハグサモザイクウイルス（Ｐ−ＦＭＶ）プロモーターおよびＰ−ＦＭＶのプロモーター配列が直列に重複したＦＭＶプロモーターの増強されたバージョン（Ｐ−ｅＦＭＶ）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓプロモーター、サトウキビ桿状ウイルスプロモーター、ツユクサ黄斑ウイルスプロモーター、ならびに植物細胞において発現することが知られている他の植物ＤＮＡウイルスプロモーターが挙げられる。
【００４６】
本発明の植物へ導入し得る代表的な核酸としては、例えば、別の種からのＤＮＡ配列または遺伝子、または同じ種に由来するかもしくは同じ種の中に存在するが、伝統的な繁殖または育種技術ではなく遺伝子操作法によって受容細胞へ取り込まれる遺伝子または配列が挙げられる。しかし、「外来性」の用語は、形質転換される細胞に通常は存在しない遺伝子、またはおそらく単に形質転換するＤＮＡセグメントもしくは遺伝子において見出されるのと同じ形や構造等において存在しない遺伝子、または通常存在し、天然の発現パターンとは異なる様式で発現させること、例えば、過剰発現させることを望む遺伝子をも意味する。したがって、「外来性」遺伝子またはＤＮＡの用語は、同様の遺伝子が受容細胞中に既に存在しているかどうかに関わらず、受容細胞に導入されるあらゆる遺伝子またはＤＮＡセグメントを意味する。外来性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの型には、植物細胞に既に存在しているＤＮＡ、別の植物からのＤＮＡ、異なる生物からのＤＮＡ、または外部で生成されたＤＮＡ、例えば遺伝子のアンチセンスメッセージ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍｅｓｓａｇｅ）を含むＤＮＡ配列、または遺伝子の合成もしくは改変されたバージョンをコードするＤＮＡ配列が含まれ得る。
【００４７】
数千とは言わないまでも数百の異なる遺伝子が知られており、これらは潜在的に本発明のブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物へ導入することができるであろう。ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物へ導入するために選択し得る特定の遺伝子および対応する表現型の非限定的な例としては、昆虫耐性のための１以上の遺伝子、例えばバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂ．ｔ．）遺伝子、有害生物耐性、例えば真菌性病害制御のための遺伝子、除草剤耐性、例えばグリホサート耐性をもたらす遺伝子、および質の改良、例えば収量、栄養強化、環境またはストレス耐性、または植物の生理、生育、発達、形態または植物の生産物におけるあらゆる望ましい変化のための遺伝子が挙げられる。例えば、構造遺伝子には、これらに限定されないが、引用により全体が本明細書に取り込まれるＷＯ  ９９／３１２４８、引用により全体が本明細書に取り込まれる米国特許第５，６８９，０５２号、引用により全体が本明細書に取り込まれる米国特許第５，５００，３６５号および第５，８８０，２７５号に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）昆虫制御タンパク質遺伝子を含む、昆虫耐性をもたらすあらゆる遺伝子が包含される。別の態様において、構造遺伝子は、これらに限定されないが、引用により全体が本明細書に取り込まれる米国特許第５，６３３，４３５号に記載されるアグロバクテリウムＣＰ４株のグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４）、または引用により全体が本明細書に取り込まれる米国特許第５，４６３，１７５号に記載されるグリホサート酸化還元酵素遺伝子（ＧＯＸ）を含む遺伝子によってもたらされる、除草剤グリホサートに対する耐性をもたらすことができる。
【００４８】
あるいは、ＤＮＡをコードする配列は、内在性遺伝子の発現の標的化された抑制を引き起こす非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔａｂｌｅ）ＲＮＡ分子をコードすることによって、例えばアンチセンスまたはコサプレッションに媒介されるメカニズムを介して、これらの表現型に影響を及ぼすことができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１を参照）。ＲＮＡは、所望の内在性ｍＲＮＡ産物を切断するよう操作された触媒性ＲＮＡ分子（即ち、リボザイム）であってもよい（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｌｌｉｔｏ、１９９７を参照）。したがって、興味のある表現型または形態の変化をもたらすタンパク質またはｍＲＮＡを生産するあらゆる遺伝子が、本発明の実行のために有用である。
【００４９】
Ｄ．定義
本明細書中の説明および表において、多くの用語が用いられる。明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する：
【００５０】
アレル：遺伝子座の１以上の代替形態のいずれかであり、そのアレルのすべてが１つの形質または特徴に関連する。二倍体の細胞または生物においては、所与の遺伝子の２つのアレルが１対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。
【００５１】
戻し交雑：育種家が、雑種子孫、例えば一代雑種（Ｆ１）を、該雑種子孫の親の一方と繰り返し交雑する過程。戻し交雑は、ある遺伝的背景からの１以上の単一遺伝子座変換を別の遺伝的背景の中へ導入するために用いることができる。
【００５２】
栽培系品種：消費に適しており、商業栽培への要求を満たすブラシカ・オレラセア品種。例はブロッコリー品種である。植物それ自身、消費に適したそれらの部分、例えば花らい球または葉に加えて、本発明は繁殖に適した植物の派生物の部分を含む。繁殖に適した部分の例は、葉、茎、根、芽などの器官組織、培養物中のプロトプラスト、体細胞胚、葯、葉柄、細胞などである。本発明の植物は従来の方法だけでなく、植物部分からの組織培養技術によっても、栽培または繁殖できる。
【００５３】
交雑：２つの親植物を交配すること。
【００５４】
他家受粉：異なる植物からの２つの配偶子の結合による受精。
【００５５】
二倍体：２セットの染色体を有する細胞または生物。
【００５６】
酵素：生物学的反応において触媒として働く分子。
【００５７】
Ｆ１雑種：２つの非同質遺伝子（ｎｏｎｉｓｏｇｅｎｉｃ）植物の交雑の第一世代子孫。
【００５８】
遺伝子型：細胞または生物の遺伝的構成。
【００５９】
半数体：二倍体における２セットの染色体のうちの１セットを有する細胞または生物。
【００６０】
連鎖：同じ染色体上のアレルが、それらの伝達が独立である場合に偶然によって期待されるよりも頻繁に、一緒に分離する傾向にある現象。
【００６１】
マーカー：環境分散の要素が全く無い、即ち遺伝率が１である、容易に検出できる表現型であり、好ましくは共優性の様式で遺伝する（二倍体ヘテロ接合体における遺伝子座の両方のアレルが容易に検出できる）もの
【００６２】
表現型：遺伝子発現の現れである、細胞または生物の検出可能な特徴。
【００６３】
量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）：量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）とは、通常連続的に分布する数的に表すことができる形質をある程度制御する遺伝子座をいう。
【００６４】
組換え事象は、減数分裂の交差の手段として理解される。
【００６５】
再生：組織培養物からの植物の発生。
【００６６】
自家受粉：同じ植物の葯から柱頭への花粉の移動。
【００６７】
単一遺伝子座変換植物：戻し交雑と呼ばれる植物育種技術によって作出され、戻し交雑技術を介しておよび／または遺伝的形質転換によって品種へ導入される単一遺伝子座の特徴に加えて、ブロッコリー品種の本質的に全ての所望の形態学的および生理学的特徴が回復している植物。
【００６８】
実質的に等価：比較した場合に、平均から統計学的に有意な差異（例えば、ｐ＝０．０５）を示さない特徴。
【００６９】
組織培養物：同一のもしくは異なる型の単離された細胞または植物体の部分へと組織化されたかかる細胞の集合を含む組成物。
【００７０】
導入遺伝子：形質転換によってブロッコリー植物のゲノム中へ導入された配列を含む遺伝子座。
【００７１】
前述の発明は、明確化および理解のため、例証および実施例によってある程度詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲によってのみ制限され、本発明の範囲内においていくらかの変更および修正が行われ得ることは自明である。
【００７２】
本明細書において引用した全ての参考文献は、引用によって明確に本明細書に取り込まれる。
【００７３】
Ｇ．寄託情報
寄託は、本明細書に記載される、ブラシカ・ビロサ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｖｉｌｌｏｓａ）からのＭｙｂ２８アレルおよびブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  Ｏｌｅｒａｃｅａ）からのＥＬＯＮＧアレルを含む減少した遺伝子移入を含む、ブロッコリー雑種ＲＸ  ０５９９１１９９の少なくとも２５００個の種子で行われた。寄託は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ、に行った。寄託は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３１６５を与えられた。寄託を行った日は、２０１２年８月２４日であった。寄託へのアクセスは、出願が係属している間、資格者に請求に応じて利用可能となるであろう。寄託は公共の寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関において、３０年の期間、または最後の請求の後５年間、または特許の有効期間のいずれか長い期間の間維持され、その期間中において必要であれば交換される。出願人は、本願特許または植物新種保護法（７Ｕ．Ｓ．Ｃ．２３２１以下参照）を含むいかなる他の形式の様々な保護で与えられたそれらの権利のどんな侵害も放棄しない。
【実施例】
【００７４】
実施例１
改善されたＭＳＢプロファイルをもつ親系統の開発
現在の発明の１つの利点は、親系統が本発明の減少している遺伝子移入を含みながら作成され得、ここで、それに由来する系統および雑種が、ＭＳＢ／ＭＳＰの増加する割合、および／または、ＭＳＢ発現の、よりよい安定性を示す。Ｍｙｂ２８／ＥＬＯＮＧの減少した遺伝子移入を含むブロッコリー系統の開発は以下の通りまとめることができる：
【００７５】
ブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８およびＥＬＯＮＧ遺伝子座の存在の結果としての植物化学物質ＭＳＰ（グルコイベリン）の上昇したレベルを有する、系統ＦＴ６９（Ｍｉｔｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．，１０６：７２７−７３４）を指定された育種系統ＢＲ９と交雑した。得られた後代は、アイアンマン（ＢＲＭ  ５６−３９０５  ＳＩ）からの雄親と交雑した。Ｆ１後代はワーヘニンゲン（Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ）の選択試験において複製して生育された。４０８、４０９、４１０、４１１および４１２と指定されたプロットから、グルコイベリン（ＭＳＰ）およびグルコラファニン（ＭＳＢ）を分析した８９植物を選抜した。最も高いＭＳＢがある６植物を選抜した。
【００７６】
全ての６植物が、反復親ＢＲＭ  ５６−３９０５  ＳＩで自殖され、戻し交雑された。６つの自殖系統および６つのＢＣ１は、ワーヘニンゲンの選択試験において複製して植え付けされた。各ＢＣ１（ここでＢＣは戻し交雑）は、２４植物／プロットの２プロットを有した。これらの１２プロットから、反復親に最も類似していた合計８４の植物が、選択された。これらの選抜群からの花らい球を、ＭＳＰおよびＭＳＢ分析のために送付した。最も高いＭＳＢがある７植物がさらなる自殖とＢＣに供された。全ての７つのＢＣ植物が、自殖および反復親（ＢＲＭ  ５６−３９０５  ＳＩ）と戻し交雑された。自殖系統および５ＢＣ２群がワーヘニンゲンの秋選択試験において複製して植え付け、および選抜された。ＭＳＰ／ＭＳＢ分析のために、反復親に最も類似していた合計７３植物を選抜して、送付した。最も高いＭＳＢレベルがある８つのＢＣ２植物がさらなる自殖とＢＣに供された。
【００７７】
全ての８つのＢＣ２植物が、自殖および反復親（ＢＲＭ  ５６−３９０５  ＳＩ）と戻し交雑された。４つのＢＣ３が得られ、ワーヘニンゲンにおいて１−４複製で植え付けられた。反復親に最も類似していた４７植物がＭＳＰ／ＭＳＢ分析のために送付された。最も高いＭＳＢレベルをもつ７つのＢＣ３植物がさらなる自殖とＢＣに供された。全ての７つのＢＣ３植物が、自殖および反復親（ＢＲＭ  ５６−３９０５  ＳＩ）と戻し交雑された。６つのＢＣ４が得られ、これらは選抜試験において植え付けられた。ＭＳＰ／ＭＳＢ分析のために、反復親に最も類似していた合計５４植物を選抜して、送付した。最も高いＭＳＢレベルがある８つのＢＣ４植物がさらなる自殖とＢＣに供された。
【００７８】
全ての８つのＢＣ４植物が、自殖された。７つのＢＣ４植物が自殖種子から生成され、ＢＣ４Ｆ２が複製なしでワーヘニンゲンの選択圃場に植え付けられた。反復親に最も類似していた３７のＢＣ４Ｆ２植物が選択され、ＭＳＰ／ＭＳＢ分析のために送付された。最も高いＭＳＢレベルがある４つのＢＣ４植物がさらなる自殖とＢＣに供された。
【００７９】
全ての４つのＢＣ４Ｆ２植物が、自殖された。全ての４つのＢＣ４Ｆ３植物が自殖種子から生成され、４つのＢＣ４Ｆ２が複製なしでワーヘニンゲンの選択圃場に植え付けられた。反復親に最も類似していた１２のＢＣ４Ｆ３植物が選択され、ＭＳＰ／ＭＳＢ分析のために送付された。最も高いＭＳＢレベルがある４つのＢＣ４植物がさらなる自殖とＢＣに供された。プロット１１６９から選択された全ての植物（５７０１１４）は平均で２．３ｍｍｏｌ／ｋｇ、また標準の参照品種（Ｇｅｎｅｒａｌ）の約５倍の、等しく高いＭＳＢレベルを有した。このことは、高いＭＳＢが固定されたアレルを有する源であることを示した。
【００８０】
１１６９からのすべての３つの選択品（ＢＣ４Ｆ３）を自殖した。３つ全てが種子を生産し、選択圃場に植え付けられた。ＳＮＰ１３−５８０３３３（１１６９−１、Ａ７５−１）が型で最も均一であり、５つの植物がＭＳＢチェックのために選択された。５つ全てが約３．２ｍｍｏｌ／ｋｇの等しく高いレベルのＭＳＢを示した。ＢＲＭ  ５３−３９３４  ＳＩとも指定された１１６９−１は、ＲＸ−１１９９（ＲＸ  ０５９９１１９９）の雄性親としての使用および増殖のために、組織培養に置かれた。ＢＲＭ５３−３９３４ＳＩの分析は、以下に示すように、それが、ブラシカ・ビロサＥＬＯＮＧ遺伝子座を有する植物に対して増加されたＭＳＢ／ＭＳＰ比を含むグルコシノレートをもつ後代を継続して産生する能力を有する親系統をもたらす、Ｍｙｂ２８減少遺伝子移入を含むことを明らかにした。
【００８１】
実施例２
上昇したグルコラファニンを有する雑種ブロッコリー系統の分析
自殖および異系交配は、表１に示すように、以下との交雑において雌性親として異なる標準ブロッコリー系統を用いて行われた：（１）（１）ＦＴ６９（ブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧおよびＭｙｂ２８をもつ高いグルコイベリン系統）、（２）ＳＮＰ１３−５８０３３３（上記で記載された、ブラシカ・オレラセアからのＥＬＯＮＧおよびブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８をもつ高いグルコラファニン系統）、および（３）ＳＮＰ８８−ＢＲＭ５１−１２１０（ブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧおよびＭｙｂ２８をもつ高いグルコイベリン系統）。読み取れるように、通常のブロッコリー系統は比較的低い量の全グルコシノレートを有する。ＭＳＢおよびＭＳＰの間の比率は、ブラシカ・ビロサからＥＬＯＮＧおよびＭｙｂ２８アレルを含むＦＴ６９（４２８−１１−６９）の場合において、通常のブロッコリー雌性系統に依存していることを特に示す。対照的に、ＳＮＰ１３−５８０３３３があるすべての交雑では、グルコシノレートの大部分はグルコラファニンである。このことは、複数の異なる第二の親との交雑における上昇したグルコラファニンを含む雑種を継続して生産することにおける減少した遺伝子移入の利益を示す。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００８２】
実施例３
ブロッコリー雑種の作出
上述のとおり、本発明の一つの実施形態は、一つまたは両方の、雑種の親がＭｙｂ２８減少遺伝子移入を含み、その結果、遺伝子移入を含む親を欠く雑種に対して上昇したＭＳＢ含量および／またはより安定なＭＳＢ含量を有する、ブロッコリー雑種を生産することを含む。そのような雑種の一例は雑種ＲＸ−０５９９１１９９である。この雑種は親ＢＲＭ  ５３−３９３４  ＳＩおよびＢＲＭ  ５６−３９０７  ＣＭＳ、典型的にはＢＲＭ  ５３−３９３４  ＳＩを雄性親として交雑することにより作出される。ＢＲＭ  ５３−３９３４  ＳＩの作出は上記実施例１に記載される。説明したとおり、この親はＭｙｂ２８減少遺伝子移入を含む。雌性親ＢＲＭ  ５６−３９０７  ＣＭＳは市販の雑種「アイアンマン」の親としての役割を果たす既知の自殖系統である。ＢＲＭ  ５６−３９０７  ＣＭＳは、２００７年６月１８日に認められた、ＥＵ植物品種保護権認証番号＃２０３４１の対象であり、そこに記載される。
【００８３】
ブロッコリー雑種ＲＸ  ０５９９１１９９およびその親系統の植物の生理学的および形態学的特徴の説明を、以下に示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【００８４】
雑種「ヘリテージ（Ｈｅｒｉｔａｇｅ）」に対する雑種ＲＸ  ０５９９１１９９のＭＳＢ含量は、客観解析の対象であった。分析の結果を以下に示す。
【表４】
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【００８５】
複数の位置および植付けにおける雑種アイアンマンに対するＲＸ  ０５９９１１９９のグルコラファニン（ＭＳＢ）含量についての一対一試験（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）もまた行われた。結果を以下に示す。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【００８６】
実施例４
減少した遺伝子移入の同定および追跡のための遺伝子マーカーの使用
遺伝子マーカーアッセイはＭｙｂ２８およびＥＬＯＮＧアレルの遺伝子型に開発された。その結果、アッセイは本発明に従った減少した遺伝子移入の同定ならびにいかなる他の遺伝子型への減少した遺伝子移入のマーカー利用導入を可能にする。
【００８７】
Ａ．ＥＬＯＮＧの検出のためのマーカー
ＱＴＬ１−ＢｏＧＬＳ−ＥＬＯＮＧに設計されたマーカーが開発され、ブラシカ・ビロサＥＬＯＮＧアレルの存在または不存在の検出を可能にする。このマーカーは、プライマー対ＡＦ３９９８３４Ｆ２：５’−ｃｇｇａｔｔｔｔｃａａａｔｔｔｔｃｔｃｇ−３’（配列番号：１）およびＡＦ３９９８３４Ｒ２：５’−ａｔｔｔｃｇｃａｔｇａｃｃａｃｔａｇｇｃ−３’（配列番号：２）を使用して検出できる。マーカーを検出するために、プレートが２μＬ容量での２０ｎｇのＤＮＡテンプレート（試料）でロードされた。３μＬのマスターミックス（０．４３７μＬの水、２．５μＬのＱ  ＰＣＲ（ＲＯＸ）ミックス、０．０６３μＬのアッセイミックス）が各々のウェルに最終容量５μＬで添加された。ＰＣＲ条件は以下のとおり：９５℃１５分間の後、９５℃１５秒間、６０℃１分間、を４０サイクル。図４はこのマーカーを使用した異なるＥＬＯＮＧアレルのアッセイ結果を示す。Ｖアレルはブラシカ・ビロサＥＬＯＮＧアレルを示し、一方でＡ、ＢおよびＣアレルはブラシカ・ビロサＥＬＯＮＧアレルのないブロッコリーで見出されるアレルの例である。
【００８８】
Ｂ．Ｍｙｂ２８の検出のためのマーカー
Ｍｙｂ２８アレルでの遺伝的多型の識別および遺伝子マーカーとしてのそれらの使用は、本願と同時に出願され、その内容全体が参照として本明細書に組み込まれる米国仮出願第６１／７００，７３１で説明される。特に、配列アラインメントは、選択のＭｙｂ２８アレルのためのマーカーベースの選択に使用できる多型を同定するためにブラシカ・オレラセアアレルに対応するＭｙｂ２８系列の間でそこで説明される。結果を図５に示す。図５は、ブロッコリー品種ＦＴ６９に含まれるブラシカ・ビロサからのＭｙｂ２８遺伝子座のコンセンサス配列および増加したレベルのグルコシノレートのないブロッコリー、例えば、ブラシカ・オレラセア（Ｏｌｅｒａｃｅａ）からの対応する場所のコンセンサス配列の間のアラインメントである。示されているのは、全長２２０２ｂｐの配列内で検出された２６の多型（例えば、１６のＳＮＰと１０のインデル（ｉｎｄｅｌ）がある一塩基多型（ＳＦＰ））である。これらか他の同定された多型のいずれかは、ブラシカ・オレラセアまたはブラシカ・ビロサからの所望のMyb28の存在または不在のための遺伝子マーカーとして使用され得る。
【００８９】
ＴａｑＭａｎアッセイ（ＮＢＯＬＩ００９１１１３７０）は以下の通り特定された配列多型の１つに基づいて設計されました：
ＮＢＯＬＩ００９１１１３７０配列（配列番号：３）：ＧＡＣＣＡＣＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴ［Ｃ／Ｔ］ＴＡＴＧＧＡＡＴＡＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＣＡＣＡＴＡＴＴＧＣＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧＴＣＡＡＡＴＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ
フォワードプライマー（配列番号：４）：ＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴ
リバースプライマー（配列番号：５）：ＧＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＣＡＣＡＴＣＡ
Ｖｉｃプローブ（配列番号：６）：ＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣ
Ｆａｍプローブ（配列番号：７）：ＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣ
アッセイは、以下の標準手順を使用することで行われた:５μＬ容量での２０ｎｇＤＮＡテンプレートをプレートにロードする。１０μＬのマスターミックス（各々２部の１×ＰＣＲミックス、０．４３７μＬの水、２．５μＬのＱ  ＰＣＲ（ＲＯＸ）ミックス、０．０６３μＬのアッセイミックス、２μＬの５ｎｇ／μＬのプライマー）を各々のウェルに最終容量１５μＬで加える。
ＰＣＲ条件は以下のとおり：５０℃２分間の後、９５℃２分間とし、その後９５℃１５秒間、６０℃１分間を４０サイクル。
【００９０】
本明細書で開示され、請求された全ての組成および／または方法は、本明細書で公開された観点から、過度の実験なしで作成または実施できる。本発明の組成および方法が好ましい実施形態として記載されている一方で、当業者は、本発明の概念、精神および範囲から離れることなく、本明細書に記載された組成および／または方法および方法の工程、工程の順序に改変を加えられることは明らかである。より具体的に、本明細書に記載されたある剤と化学的および物理的の両方に関連するある剤を置き換えて、同じまたは同様の結果が得られるであろうことは明らかである。当業者に明らかなそのような同様のすべての置換および改変は、添付された請求項で明確になるように、本発明の精神、範囲、および概念に含まれると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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