(57)【要約】      （修正有）【課題】エキセンジン及びエキセンジン類似体について現存する欠点としては，短い投与間隔，長期間注射した患者における抗体の生成，ＰＥＧで修飾した後の生物活性の低下が挙げられる。これらの欠点を克服したエキセンジン又はエキセンジン類似体の提供。【解決手段】エキセンジンまたはエキセンジン類似体の１またはそれ以上のアミノ酸に結合していてもよい１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。ＰＥＧ誘導体は，例えば下式Ｉに示される分枝構造を有することができる。ＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む組成物，修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体を製造または投与する方法，及びその種々の用途も提供される。2014088384.tif 000010【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体の１またはそれ以上のアミノ酸に連結された１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体を含むＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体であって，前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体は分枝構造を含み，および前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体の分子量は２０，０００Ｄａを超える，ＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項２】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体の１またはそれ以上のアミノ酸に連結された１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体を含むＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体であって，前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体は，下記の式Ｉ：
【化５】
2014088384.tif 000006
［式中，Ｘは水素または保護基であり；ＰＥＧは−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−であり，ｑは正の整数であり；ｎ1は０−５の整数であり；ｍは０−５の整数であり；Ｙは，Ｏ，Ｓ，ＳＯ，ＳＯ2またはＮＲ1であり，ここで，Ｒ1は，水素または置換もしくは未置換の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基，または置換もしくは未置換のシクロアルキル基であり；ｋは０または１であり；およびｐは０−６の整数である］
に示される分枝構造を有することを特徴とする，ＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項３】
前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体は，下記の式ＩＩ：
【化６】
2014088384.tif 000007
［式中，ＰＥＧは−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−であり，ｑは正の整数であり，およびＭｅはメチル基である］
に示される分枝構造を有する，請求項２記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項４】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体の１またはそれ以上のアミノ酸に連結された１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体を含むＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体であって，前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体は，下記の式ＩＩＩ：
【化７】
2014088384.tif 000008
［式中，Ｘは，水素または保護基であり；ＰＥＧは−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−であり，ｑは正の整数であり；ｎ2は０−１０の整数であり；Ｚは，（ＣＨ2）i，（ＣＨ2）iＯＣＯ，（ＣＨ2）iＮＨＣＯ，および（ＣＨ2）iＣＯ（ｉは０−１０の整数である）から選択される基であり；Ｒ2は，水素，置換もしくは未置換の（Ｃ1−Ｃ12）アルキル基，置換されたアリール，アラルキルまたはヘテロアルキル基であり；およびｊは１−１２の整数である］
に示される分枝構造を有することを特徴とする，ＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項５】
前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体は，下記の式ＩＶ：
【化８】
2014088384.tif 000009
［式中，ＰＥＧは−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−であり，ｑは正の整数であり，およびＭｅはメチル基である］
に示される分枝構造を含む，請求項４記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項６】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む，請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項７】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む，請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項８】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，配列番号３−２２９に示される１またはそれ以上のアミノ酸配列を含む，請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項９】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，配列番号２３０−２６５に示される１またはそれ以上のアミノ酸配列を含む，請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項１０】
前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体は，２０，０００Ｄａを超えて約５０，０００Ｄａまでの範囲の分子量を有する，請求項１記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項１１】
前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体は，約５，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する，請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項１２】
前記１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体は，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されて前記エキセンジンまたはエキセンジン類似体に連結される，請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項１３】
１，２，３または４個の分枝鎖ＰＥＧ誘導体を含む，請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項１４】
１つの分枝鎖ＰＥＧ誘導体を含む，請求項１３記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体。
【請求項１５】
請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む組成物。
【請求項１６】
糖尿病の予防または治療用の医薬品の製造における，請求項１，２，３，４，または５のいずれかに記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体の使用。
【請求項１７】
糖尿病を治療する方法であって，請求項１，２，３，４，または５記載のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を被験者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は，中国特許出願２００６１０１１８３２６．Ｘ（１１月１４日出願２００６年）および中国特許出願２００７１０１３８７１８．７（７月２３日出願２００７年）に基づく優先権を主張し，これらの出願の全体を参照として本明細書に引用する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は，１９８７年に最初に発見され，グルコース依存性腸分泌性ホルモンペプチドとして同定された。ＧＬＰ−１ペプチドは，Ｇ蛋白質共役レセプター（ＧＰＣＲ）を通してシグナルを伝達し，β島細胞を刺激してインスリンを分泌させて，グルカゴン分泌，胃内容排出および胃酸分泌を阻害し，他の生理学的機能に影響を及ぼす。
【０００３】
エキセンジンは，毒性トカゲであるアメリカドクトカゲおよびメキシコドクトカゲの唾液分泌に見いだされるペプチドである（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２６５，２０２５９−２０２６２；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７，７４０２−７４０５）。エキセンジン−４に代表されるこれらのエキセンジンは，ＧＬＰ−１［７−３６］に非常に類似している。先の研究により，エキセンジンはＧＬＰ−１レセプターに結合して，インスリン分泌の刺激，食後の血糖レベルの有効な制御，ヘモグロビンの糖化レベルの低下および胃内容排出の阻害等の，同様の薬理学的効果を示すことができることが発見された。動物における試験から，ＧＬＰ−１レセプターペプチドを長期間使用すると，インスリンに対する耐性を有効に低下させることができることが見いだされ，これは糖尿病の悪化の復帰につながるかもしれない。さらに，多くのインスリン指向性アゴニスト，例えばＧＬＰ−１およびエキセンジン−４が，β島細胞の再生を刺激しうること（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００５，２３，８５７−８６１），および非アルコール性脂肪肝を改善しうること（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００６，４３，１７３−１８１）が見いだされている。これらの発見により，このようなペプチドは，糖尿病および脂肪過多症の研究における人気の分野となった。Ｗｕ  ＤｅｎｇｘｉおよびＳｕｎ  Ｙｕｋｕｎ（中国特許ＺＬ０１１１２８５６）は，エキセンジン−４を修飾して，天然のエキセンジン−４と同じ機能を有する一連のエキセンジン−４類似体を得た。最近，新規なエキセンジン系薬剤であるエキセンジン−４（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標））が米国で上市された。この薬剤は，ＡｍｙｌｉｎとＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙにより共同開発され，１日に２回の注射を必要とする。この薬剤は，糖尿病および脂肪過多症の治療の分野で注目されている。しかし，臨床研究により，そのような薬剤で３０週間治療した後，患者の約４１％がエキセンジン−４に対する抗体を生成することが発見された（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．２００４，２７，２６２８−２６３５）。
【０００４】
蛋白質／ペプチド薬剤は，典型的には，短い血中半減期，物理学的および化学的安定性の低さ，およびプロテアーゼによりインビボで分解される傾向などの欠点を有する。その結果，そのような薬剤は毎日多数回注射することが必要であり，患者に多くの痛みと不便を与えている。これらの薬剤の半減期をどのようにして延長するかは，バイオテクノロジー業界の長い間の難題であった。現在，この問題に対する，普遍的に受け入れられる解決策は見いだされていない。
【０００５】
ＰＥＧ修飾技術は１９７０年代に登場し，蛋白質／ペプチド薬剤を製造する技術に応用されている。ある種の蛋白質／ペプチドを直鎖または分枝鎖ＰＥＧで修飾すると，修飾は蛋白質／ペプチドに以下のような特徴を与える：（１）物理学的および化学的安定性の改良；（２）免疫原性の低下；（３）プロテアーゼ消化に対する耐性の増加；（４）腎臓クリアランスの低下につながるＰＥＧ分子量の増加による血中半減期の延長；および（５）薬剤の溶解性および細胞膜浸透の改良。Ａ．ＹａｎｇおよびＫ．Ｐｒｅｃｏｕｒｔの研究によれば，エキセンジン−４は主として腎臓クリアランスを通して代謝される。したがって，彼らは，５００から２０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するＰＥＧを用いてエキセンジンを修飾して（中国特許ＣＮ１３７２５７０Ａ），腎臓クリアランスの影響を低下させた。
【０００６】
しかしながら，ＰＥＧ技術の主な欠点は，一般に修飾した後に修飾薬剤の生物活性が顕著に低下することである。Ｈａｉｍ  Ｔｓｕｂｅｒｙらは，９−ヒドロキシメチル−７−スルホフルオレン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＦＭＳ）を用いてＰＥＧを活性化し，エキセンジン−４と結合させた。次にＰＥＧ基はインビボ加水分解によりエキセンジン−４から放出された。すなわち，エキセンジン−４の生物活性は回復した。この方法は，ＰＥＧ修飾による低い生物活性の問題の解決策を提供するが，未修飾エキセンジン−４がインビボ加水分解後に放出されること，および頻繁な注射に起因する免疫原性の問題がなお解決されていない（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９，３８１１８−３８１２４）。
【０００７】
既知のエキセンジンおよびエキセンジン類似体について現存する欠点としては，短い投与間隔，長期間注射した患者における抗体の生成，ＰＥＧで修飾した後の生物活性の低下が挙げられる。これらの欠点のため，エキセンジンおよびエキセンジン類似体を実際に適用することは困難であり，大用量のエキセンジンまたはエキセンジン類似体の投与を必要とし，このことはエキセンジン技術の応用を著しく妨げている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許ＺＬ０１１１２８５６
【特許文献２】中国特許ＣＮ１３７２５７０Ａ
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２６５，２０２５９−２０２６２
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７，７４０２−７４０５）
【非特許文献３】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００５，２３，８５７−８６１
【非特許文献４】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００６，４３，１７３−１８１
【非特許文献５】Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．２００４，２７，２６２８−２６３５
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９，３８１１８−３８１２４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ある態様においては，１またはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子または誘導体で修飾されたエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。ある態様においては，エキセンジンまたはエキセンジン類似体または誘導体の１またはそれ以上のアミノ酸に連結された１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体を有する，ＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。ＰＥＧ誘導体は，直鎖構造を有していても分枝構造を有していてもよい。ある態様においては，ＰＥＧ誘導体は，分枝構造，例えば，本明細書に記載される式（Ｉ−ＩＶ）のいずれかに示される分枝構造を有するものであってもよい。ある態様においては，ＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む組成物，そのような修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を製造または投与する方法，およびこれらの種々の用途，例えば糖尿病の治療が提供される。ＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，改良されたかつ予測しえない特性および特徴，例えば，血中における長い半減期，高い生物活性，および／または低い免疫原性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は，式Ｉの分枝鎖ＰＥＧ誘導体の構造である。
【図２】図２は，式ＩＩＩの分枝鎖ＰＥＧ誘導体の構造である。
【図３】図３は，分子量４０，０００Ｄａ（ダルトン）を有するＰＥＧ誘導体（式ＩＶ）で修飾したエキセンジン−４類似体の分離および精製のクロマトグラフィーの結果を示す。ラベル１は，サンプル負荷時の吸収ピークを示す；ラベル２は，溶出時の吸収ピークを示し，複数のＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体を示す；ラベル３は溶出時の吸収ピークを示し，単一のＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体を示す；ラベル４は，溶出時の吸収ピークを示し，未修飾エキセンジン−４類似体を示す。
【図４】図４は，分子量４０，０００Ｄａを有する単一のＰＥＧ誘導体（式ＩＶ）で修飾したエキセンジン−４類似体の電気泳動像であり，レーン１は単一のＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体のバンドを示す。
【図５】図５は，それぞれ分子量５，０００および２１，０００Ｄａを有する単一のＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体が動物に及ぼす２４時間薬剤効果試験の結果を示す。
【図６】図６は，それぞれ分子量２１，０００および４０，０００Ｄａを有する単一の直鎖または分枝鎖（式ＩＶ）ＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体が動物に及ぼす７２時間薬剤効果試験の結果を示す。
【図７】図７は，それぞれ分子量２１，０００Ｄａ（Ｕ２１Ｋ），３０，０００Ｄａ（Ｕ３０Ｋ）および４０，０００Ｄａ（Ｕ４０Ｋ）を有する単一のＰＥＧ誘導体（式ＩＩ）で修飾したエキセンジン−４類似体が動物に及ぼす７２時間薬剤効果試験の結果を示す。
【図８】図８は，それぞれ分子量２１，０００Ｄａ（Ｙ２１Ｋ），３０，０００Ｄａ（Ｙ３０Ｋ）および４０，０００Ｄａ（Ｙ４０Ｋ）を有する単一のＰＥＧ誘導体（式ＩＶ）で修飾したエキセンジン−４類似体が動物に及ぼす７２時間薬剤効果試験の結果を示す。
【図９】図９は，それぞれ分子量２１，０００Ｄａ（Ｌ２１Ｋ）および３０，０００Ｄａ（Ｌ３０ｋ）を有する単一の直鎖状ＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体が動物に及ぼす７２時間薬剤効果試験の結果を示す。
【図１０】図１０は，それぞれ分子量３０，０００Ｄａ（Ｕ３０Ｋ）を有する単一のＰＥＧ誘導体（式ＩＩ），で修飾した，および分子量４０，０００Ｄａ（Ｙ４０Ｋ）を有するＰＥＧ誘導体（式ＩＶ）で修飾したエキセンジン−４類似体の７２時間薬剤動態試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
ＰＥＧ修飾
以下の本発明の説明は，単に本発明の種々の態様を例示することを意図するものである。したがって，ここで議論される特定の修飾は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者には，本発明の範囲から逸脱することなく種々の同等物，変更，および改変をなしうることが明らかであり，そのような同等の態様も本発明に含まれることが理解される。
【００１３】
ある態様においては，１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体により修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。ある態様においては，エキセンジンおよび／またはエキセンジン類似体の新規なＰＥＧ修飾を用いて，改善された予測しえない特性および特徴を，例えば，血中における長い半減期，高い生物活性，および／または低い免疫原性を示すＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を作成する。
【００１４】
異なる化学構造のＰＥＧ誘導体は，そのようなＰＥＧ誘導体または分子で修飾したペプチドの生物活性に異なる影響を及ぼすであろう。ＰＥＧ誘導体は，直鎖構造または分枝構造を有することができる。分枝構造としては，例えば，二重分枝鎖，ならびに多重分枝鎖が挙げられる。二重分枝鎖を有するＰＥＧ誘導体としては，例えば，限定されないが，下記の式Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩおよびＩＶに示される構造が挙げられる。
【００１５】
ある態様においては，分枝鎖ＰＥＧ誘導体としては，例えば，限定されないが，下記の式Ｉに示される構造が挙げられる：
【化１】
2014088384.tif 000002
［式中，Ｘは水素または保護基である］。保護基は，ＰＥＧ誘導体の遊離ヒドロキシル基と反応することができ，同時に，他の基とのさらなる反応を防止することができる任意の基であることができる。保護基の例としては，例えば，限定されないが，メチル，ジメチル，エチル，プロピルおよびイソプロピル等のアルキル基が挙げられる。
【００１６】
さらに，ＰＥＧは，−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−であり，ｑは正の整数であり；ｎ1は０−５の整数であり；ｍは０−５の整数であり；Ｙは，Ｏ，Ｓ，ＳＯ，ＳＯ2またはＮＲ1であり，ここで，Ｒ1は，水素または置換もしくは未置換の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基，または置換もしくは未置換のシクロアルキル基であり；ｋは０または１であり；ｐは０−６の整数である。式Ｉに示される構造を有するＰＥＧは，慣用の化学的方法により合成することができる。例えば，式Ｉに示される構造を有するＰＥＧの合成方法は，米国特許６，５６６，５０６に記載されている。
【００１７】
ある態様においては，本発明において用いられる式Ｉの分枝構造を含むＰＥＧ誘導体は，下記の式ＩＩ：
【化２】
2014088384.tif 000003
［式中，ＰＥＧは−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−であり，ｑは正の整数であり，Ｍｅはメチル基である］
で示される特定の構造を有する。
【００１８】
ある態様においては，分枝鎖ＰＥＧ誘導体は，下記の式ＩＩＩ：
【化３】
2014088384.tif 000004
［式中，Ｘは水素または保護基であり；ＰＥＧは−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−であり，ｑは正の整数であり；ｎ2は０−１０の整数であり；Ｚは，（ＣＨ2）i，（ＣＨ2）iＯＣＯ，（ＣＨ2）iＮＨＣＯ，または（ＣＨ2）iＣＯであり，ここで，ｉは０−１０の整数であり；Ｒ2は，水素，置換もしくは未置換の（Ｃ1−Ｃ12）アルキル基，置換されたアリール，アラルキルまたはヘテロアルキル基であり；ｊは１−１２の整数である］
の構造を有する。上述の式ＩＩＩのＰＥＧ誘導体構造は，慣用の化学的方法により合成することができ，その１つは中国特許ＺＬ０３８０１１０５．０において提供されている。
【００１９】
ある態様においては，本発明において用いられる式ＩＩＩの分枝構造を含むＰＥＧ誘導体は，下記の式ＩＶ：
【化４】
2014088384.tif 000005
［式中，ＰＥＧは−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−であり，ｑは正の整数であり，Ｍｅはメチル基である］
に示される構造を有する。
【００２０】
ＰＥＧ誘導体の分子量は，ＰＥＧ修飾ペプチドの生物活性に影響を及ぼしうる。ある態様においては，用いられる直鎖または分枝鎖のＰＥＧ誘導体の分子量は約２００Ｄａまたはそれ以上である。好ましくは，分子量は約５，０００Ｄａまたはそれ以上，あるいは約２０，０００Ｄａまたはそれ以上である。ある態様においては，用いられるＰＥＧ誘導体の分子量は，約５，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの範囲内である。好ましくは，用いられるＰＥＧ誘導体の分子量は，２０，０００Ｄａから５０，０００Ｄａ，または２０，０００Ｄａから４５，０００Ｄａ，または２０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの範囲内である。本明細書に記載されるＰＥＧ誘導体の分子量は，特に記載しないかぎり，ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）の方法により測定される平均分子量（Ｍｎ）である（Ｄｏｎｇ  Ｙａｎｍｉｎｇ，Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ  Ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２００４，４１６−４２７）。種々の分子量を有するＰＥＧ誘導体は，商業的供給元から購入することができ，あるいは当該技術分野において知られる慣用的な方法を用いて合成することができる。
【００２１】
ある態様においては，ＰＥＧ誘導体は，２０，０００Ｄａより大きい分子量をもつ分枝構造を有する。好ましくは，用いられる分枝鎖ＰＥＧ誘導体の分子量は２０，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａ，または２０，０００Ｄａから約４５，０００Ｄａ，または２０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの範囲である。
【００２２】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体のＰＥＧ修飾は，活性化したＰＥＧ誘導体を，エキセンジンまたはエキセンジン類似体のアミノ酸のアミノ酸残基の側鎖またはＮ末端またはＣ末端に連結させることにより行う。例えば，異なる活性化基を含むＰＥＧ誘導体は，異なる側鎖，アミノ酸のＮ末端またはＣ末端，または特定のアミノ酸に結合させることができる。活性化ＰＥＧ誘導体に化学的に結合させることができるアミノ酸の基としては，限定されないが，Ｎ末端のα−アミノ基，リジン残基側鎖のε−アミノ基，ペプチドのヒスチジン残基の側鎖イミダゾリル基のイミノ基，ペプチドのカルボキシル末端，アルパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボキシル基，セリンおよびトレオニンの側鎖ヒドロキシル基，システインの側鎖メルカプト基等が挙げられる。一般に，そのような化学的結合は，求電子反応および求核反応により達成される。例えば，Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドで活性化したＰＥＧ誘導体の，Ｎ末端のα−アミノ基，リジン側鎖ε−アミノ基および遊離アミノ基，例えば，ヒスチジン側鎖イミダゾリル基のイミノ基への結合は，そのような反応により形成される。さらに，アルデヒド活性化基を含むＰＥＧは，還元的アルキル化によりペプチドのＮ末端に特異的に連結させることができる。実際に，ある態様においては，種々の活性化基を用いてＰＥＧ誘導体をエキセンジンまたはエキセンジン類似体に結合させる方法，およびこれにより生成するＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供される。種々の活性化基を有するＰＥＧ誘導体は，商業的供給元から購入してもよく，関連する技術分野において知られる慣用の方法を用いて合成してもよい。
【００２３】
ある態様においては，１またはそれ以上のＰＥＧ誘導体と結合したエキセンジンまたはエキセンジン類似体が提供され，ここで，エキセンジンまたはエキセンジン類似体に結合するＰＥＧ誘導体の数は，エキセンジンまたはエキセンジン類似体上のフリーラジカル基の数，ＰＥＧ誘導体の活性化基，および／またはＰＥＧ誘導体の分子量に依存する。一般に，エキセンジンまたはエキセンジン類似体が有するフリーラジカル基が多ければ多いほど，より多くのＰＥＧ誘導体がこれに結合する。また一般に，活性化されたＰＥＧ誘導体の分子量が大きければ大きいほど，より少ないＰＥＧ誘導体がペプチドに結合する。ある態様においては，エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，１，２，３または４個のＰＥＧ誘導体で修飾する。好ましくは，エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，１または２個のＰＥＧ誘導体で修飾する。
【００２４】
ＰＥＧ誘導体をエキセンジンまたはエキセンジン類似体に結合させることにより生成する混合物は，慣用の手段，例えば，イオン交換分離，ゲル濾過分離，または逆相クロマトグラフィーにより効率よく分離することができる。イオン交換クロマトグラフィーとしては，アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。異なるイオン交換法は，分離および精製の結果に異なる影響を与えるであろう。異なるエキセンジンまたはエキセンジン類似体は異なる数および種類のアミノ酸を有し，したがって異なる分子量を有するため，ＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体の最終的な分子量は，ＰＥＧ誘導体の分子量とエキセンジンまたはエキセンジン類似体の分子量との合計である。分離，精製およびバッファー溶液交換の工程の後，ＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体をさらに加工して，医薬組成物を製造することができる。
【００２５】
エキセンジンまたはエキセンジン類似体
本明細書において，エキセンジンまたはエキセンジン類似体とは，天然のエキセンジンの部分配列または全配列と相同のまたは同一のアミノ酸配列を有するペプチドまたはペプチド誘導体を表す。エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，ＧＬＰ−１レセプターに結合して細胞シグナル伝達のカスケードを刺激することができる。そのようなペプチドは，固相化学合成または遺伝子工学により取得して，次に分離および精製することができる。
【００２６】
本明細書において，エキセンジンまたはエキセンジン類似体としては，限定されないが，天然のエキセンジン−３およびエキセンジン−４が挙げられる。天然のエキセンジン−３は下記のアミノ酸配列を有する：
［Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＯＨ］（配列番号１）
天然のエキセンジン−４は下記のアミノ酸配列を有する：
［Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ2］（配列番号２）
【００２７】
ある態様においては，エキセンジンまたはエキセンジン類似体としては，限定されないが，天然のエキセンジン−３およびエキセンジン−４のアミノ酸配列へのアミノ酸置換，付加または欠失により得られるペプチド類似体が挙げられる。エキセンジン−３およびエキセンジン−４のアミノ酸置換には，天然のアミノ酸ならびに非天然アミノ酸による置換が含まれる。非天然アミノ酸としては，限定されないが，アゼチジンカルボン酸，２−アミノ−ヘキサン二酸，３−アミノ−ヘキサン二酸，β−ラクタミン酸，アミノプロピオン酸，２−アミノ酪酸，４−アミノ酪酸，６−アミノヘキサン酸，２−アミノヘプタン酸，２−アミノ−２−メチルプロパン酸，３−アミノ−２−メチルプロパン酸，２−アミノヘプタン二酸，２−アミノ−３，３−ジメチル酪酸，デスモンシン，２，２−ジアミノヘプタン二酸，２，３−ジアミノプロパン酸，Ｎ−エチルグリシン，Ｎ−エチルアスパラギン，ホモプロリン，ヒドロキシリジン，アロ−ヒドロキシリジン，３−ヒドロキシプロリン，４−ヒドロキシプロリン，イソデスモンシン，アロイソロイシン，Ｎ−メチルアラニン，Ｎ−メチルグリシン，Ｎ−メチルイソロイシン，Ｎ，Ｎ−メチルペンチルグリシン，Ｎ−メチルバリン，ナフトアラニン，ノルバリン，ノルロイシン，オルニチン，ペンチルグリシン，ピペコリン酸及びチオプロリンが挙げられる。好ましくは，エキセンジン類似体は，１個，２個，３個，４個または５個のアミノ酸置換を含む。
【００２８】
ある態様においては，エキセンジン類似体は，天然のエキセンジン−３またはエキセンジン−４のアミノ酸配列に１またはそれ以上のアミノ酸を加えるかまたは除去することにより得られるペプチド類似体を含む。好ましくは，エキセンジン類似体は，天然のエキセンジン−３またはエキセンジン−４のアミノ酸配列に１から１２個のアミノ酸を加えるかまたは除去することにより得られるペプチド類似体を含む。ある態様においては，エキセンジン類似体は，天然のエキセンジン−３またはエキセンジン−４アミノ酸配列に１〜１５個のアミノ酸を加えるかまたはこれから除くことにより，または天然のエキセンジン−３またはエキセンジン−４アミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸を加えるかまたはこれから除くことにより，または天然のエキセンジン−３またはエキセンジン−４アミノ酸配列に１〜９個のアミノ酸を加えるかまたはこれから除くことにより得られるペプチド類似体を含む。
【００２９】
エキセンジン類似体は，そのＮ末端，Ｃ末端，または側鎖に，可逆的または不可逆的な化学的ブロッキングまたは修飾を有していてもよい。例えば，エキセンジンまたはエキセンジン類似体のＣ末端をアミド化してもよい。
【００３０】
ある態様においては，エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，配列番号１−２６５のアミノ酸配列を含む。好ましくは，エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，配列番号１−２のアミノ酸配列，または配列番号３−２２９のアミノ酸配列，または配列番号２３０−２６５のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本明細書に記載されるＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体の活性は，ＧｏｎｇＱｉｕｈｏｎｇらにより公開されたアッセイにしたがって，細胞レベルで試験することができる（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｙ，２００４，２０，５５９−５６０）。簡単には，アッセイは次のようにして実施することができる。グルコースおよび種々の濃度のＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体をＩＮＳ−１細胞に加え，４時間インキュベーションし，上清中のインスリンの量をラジオイムノアッセイにより検出し，そしてＲＴ−ＰＣＲ技術を用いてＩＮＳ−１細胞中のインスリンの量を半定量的アッセイで分析する。上述の方法を用いることにより，ＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体の活性の大規模スクリーニングを行うことができる。そのようなスクリーニングはまた，マウス（例えば，Ｃ５７またはｄｂ／ｄｂマウス）の投与後の様々な時点における血糖レベルの変化を調べることによって行うことができる。
【００３２】
医薬組成物およびその用途
ある態様においては，本明細書に記載されるＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体を含む医薬組成物または化合物が提供される。本明細書に記載されるＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジンまたはエキセンジン類似体は，種々の無機および有機酸またはアルカリと反応させて，塩を形成することができる。そのような塩には，有機酸および無機酸を用いて製造される塩が含まれ，ここで，有機酸および無機酸としては，限定されないが，塩酸，臭化水素酸，硫酸，リン酸，トリフルオロ酢酸，酢酸，ギ酸，メタンスルホン酸，トルエンスルホン酸，マレイン酸，フマル酸およびカンファースルホン酸が挙げられる。アルカリを用いて製造される塩としては，限定されないが，アンモニウム塩，アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩およびカリウム塩），およびアルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩）が挙げられる。好ましい塩としては，例えば，酢酸塩，塩酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が挙げられる。塩は慣用の方法により製造することができる。例えば，そのような塩は，得られる塩が不溶性である溶媒または媒体中で，または真空によるかまたは凍結乾燥により除去可能な溶媒，例えば水の中で，エキセンジンまたはエキセンジン類似体を１当量またはそれ以上の適当な酸またはアルカリと反応させることにより，または適当なイオン交換樹脂によって現存する塩のイオンを別のイオンと交換することにより，製造することができる。
【００３３】
ある態様においては，本明細書に記載されるＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，薬学的に許容しうる塩（例えば，酸の付加反応により得られる塩）および／またはこれらの複合体として製造することもできる。そのような塩の製造は，組成物がその生理学的効果を示すことを妨害せずに組成物の物理学的または化学的特性を変化させることにより，薬学的な使用を容易にすることができる。物理学的特性の有用な変更の例としては，融点を低下させて経粘膜投与を容易にすること，または溶解度を増加させて高濃度の薬剤の投与を容易にすることが挙げられる。
【００３４】
薬学的に許容しうる塩としては，例えば，酸付加塩，例えば硫酸塩，塩酸塩，リン酸塩，スルファミン酸塩，酢酸塩，クエン酸塩，乳酸塩，酒石酸塩，メタンスルホン酸塩，エタンスルホン酸塩，ベンゼンスルホン酸塩，ｐ−トルエンスルホン酸塩，シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキナ酸塩が挙げられる。薬学的に許容しうる塩はまた，種々の有機酸および無機酸，例えば，塩酸，硫酸，リン酸，スルファミン酸，酢酸，クエン酸，乳酸，酒石酸，マロン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，シクロヘキシルスルファミン酸，およびキナ酸を用いて製造することができる。そのような塩は，エキセンジンまたはエキセンジン類似体を，得られる塩が不溶性である溶媒または媒体中で，または水等の真空または凍結乾燥により除去可能な溶媒中で，１当量またはそれ以上の適当な酸またはアルカリと反応させることにより，または，適当なイオン交換樹脂上で現存する塩のイオンを別のイオンと交換することにより，製造することができる。
【００３５】
さらに，担体または賦形剤を用いて，組成物の被験者への投与を容易にすることができる。担体および賦形剤の例としては，例えば，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖（例えば，ラクトース，グルコースまたはショ糖），または種々のタイプのデンプン，セルロース誘導体，ゼラチン，植物油（例えばゴマ油，ピーナツ油，オリーブ油），ポリエチレングリコールおよび生理学的に適合性の溶媒が挙げられる。組成物または医薬組成物は，種々の経路で，例えば，静脈内，腹腔内，皮下および筋肉内，経口，局所および経粘膜投与により投与することができる。
【００３６】
所望の場合には，本発明の組成物の溶液は，メチルセルロース等の増粘剤を用いて粘度を高めてもよい。これらは，乳濁形態（例えば油中水または水中油）で製造することができる。当該技術分野において知られる任意の薬学的に許容しうる乳濁剤を用いることができ，これには例えば，アカシアゴム粉末，非イオン性界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ），またはイオン性界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ等のアルカリポリエーテルアルコールサルフェートまたはスルホネート）が含まれる。
【００３７】
組成物は，慣用の滅菌手法または濾過により滅菌することができる。組成物は，所望の生理学的条件とほぼ同じ条件を有する薬学的に許容しうる補助剤，例えばｐＨ緩衝剤等を含んでいてもよい。有用なバッファーとしては，例えば，酢酸ナトリウム／酢酸バッファーが挙げられる。皮下注射またはデリバリーの後，薬学的に有効量の製剤が長時間または数日にわたって血流中に残存するように，座剤または徐放機能を有する製剤の形を用いてもよい。
【００３８】
所望の等張性は，塩化ナトリウムまたは他の薬学的に許容しうる薬剤，例えば，グルコース，ホウ酸，酒石酸ナトリウム，ポリエチレングリコール，ポリオール（例えば，マンニトールおよびソルビトール），または他の無機または有機溶媒を用いて得ることができる。ナトリウムイオンを含有するバッファー用には，塩化ナトリウムが好ましい。
【００３９】
１つの態様においては，約７０ｋｇの体重の患者について，化合物の有効投与量は，１日あたり約０．０１または約０．０３から約５ｍｇ，好ましくは１日あたり約０．０１または約０．５から約２ｍｇ，より好ましくは１日あたり約０．０１または約０．１から約１ｍｇの範囲であり，１回またはそれ以上投与される。正確な投与量は，担当の医師が決定することができ，特定の化合物が上述の範囲内で存在するか否か，ならびに個々の患者の年齢，体重および症状により異なる。
【００４０】
ある態様においては，本明細書に記載されるＰＥＧ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体は，糖尿病を治療するために被験者に投与することができる。ある態様においては，化合物の投与は，糖尿病の症状が現れた直後か，または糖尿病と診断された直後に開始すべきである。任意に，別の態様においては，症状が現れる前に予防処置として化合物を投与してもよい。
【００４１】
化合物は，典型的にはヒト患者を治療するために用いられるが，他の霊長類，家畜（例えば．ブタ，ウシおよび家禽），スポーツ用動物またはペット（例えば，ウマ，イヌおよびネコ）等の他の脊椎動物において，同様のまたは同一の疾患を治療するために用いてもよい。
【００４２】
以下の実施例は，本発明をよりよく説明するために提供されるものであり，本発明を限定するものと解釈すべきではない。特定の物質について言及される場合，これは単に例示の目的のためであり，本発明を限定することを意図するものではない。当業者は，創作能力を発揮せずに，本発明の範囲を逸脱することなく，同等の手段または反応物を開発することができる。本明細書に記載される方法において，本発明の範囲内になお含まれる多くの変更をなしうることが理解される。そのような変更も本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【実施例】
【００４３】
分子量５，０００Ｄａの直鎖状ＰＥＧ誘導体はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。本発明で用いた他のＰＥＧ誘導体は，Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｊｅｎ  Ｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。
【００４４】
イオン交換実験において用いたＡ，Ｂ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｐｕｍｐ  ＡＫＴＡ精製装置，および他のカラムおよび充填剤は，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃから購入した。関連する試薬は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。実施例３−９で用いた天然のエキセンジン−４およびその類似体は，Ｃｈｅｎｇｄｕ  Ｓｈｅｎｎｕｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．から購入した。
【００４５】
実施例１．エキセンジン−４類似体の固相合成
実施例１は，下記のアミノ酸配列：
［Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＯＨ］（配列番号２３２）．
を有するエキセンジン−４類似体の固相合成の方法を示す。
（１）アミノ酸残基：
Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-Met-OH，Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-L-Phe-OH，Fmoc-L-Gln(Trt)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，Fmoc-L-His(Trt)-OH，Fmoc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Ile-OH，Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Val-OH
上記式中：
Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニルを表し；
ＢＯＣはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを表し；
Ｔｒｔはトリフェニルメチルを表し；
ＯｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチルエステルを表し；
ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチルを表す。
【００４６】
（２）合成用の装置および試薬
ペプチド合成は，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  ４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）を用いて行った。これらの合成に用いた試薬は，Ｎ−メチルピロリドン，二塩化メチレン，ヘキサヒドロピリジン，メタノール，ジメチルアミノピリジン／ＤＭＦ，Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン／ＮＭＰ，ＤＭＦ中ＨＢＴＵ１００ｍｍｏｌｅ／０．５Ｍ  ＨＯＢＴ，Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド／ＮＭＰである。ここで，ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを表し，ＮＭＰはＮ−メチルピロリドンを表し，ＨＯＢＴは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを表し，ＨＢＴＵは２−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−イル−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェートを表す。
【００４７】
（３）方法
ａ．合成
下記の方法において用いた試薬の量は，０．２５ｍｍｏｌの合成スケールに基づく。０．２５ｇのＨＭＰ樹脂を秤量し，合成反応容器に入れた。保護基を有する１ｍｍｏｌの種々のアミノ酸を秤量し，所望のインスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列のＣ末端からＮ末端の順番にしたがって合成機中に並べた。２５℃の室温で，Ｆｍｏｃ保護を除去し，残基を活性化し，そして活性化した残基をＨＭＰ樹脂に結合させる反応は，コンピュータプログラムの制御下で自動的に行った。かかる反応を，全てのペプチドが合成されるまで繰り返した。合成の完了後，アミノ酸側鎖に保護基を有する合成されたペプチドが結合した樹脂をペプチド合成機中で風乾し，その後秤量した。
【００４８】
ｂ．保護基の除去および樹脂からの解離
保護基を有する合成したペプチドが結合した樹脂を，栓をした三角フラスコに入れ，下記に示す切断試薬を加えた。
試薬                            量
水                              ０．５０ｍｌ
メチル−フェノキシド            ０．５０ｍｌ
フェノール                      ０．７５ｇ
メルカプトエタノール            ０．２０ｍｌ
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）    １０．０ｍｌ
【００４９】
この反応は，３０℃の一定温度で連続的に撹拌しながら６時間行った。その後，混合物を濾過し，水性濾液を回収し，樹脂を少量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ですすいだ。すすぎ溶液を回収した濾液と混合した。次に，混合物をエーテルで沈殿させ，沈殿物を少量のエーテルですすいだ。沈殿物を乾燥装置で乾燥させて，粗生成物を得た。
【００５０】
ｃ．ＨＰＬＣおよび凍結乾燥による分離および精製
調製用ＨＰＬＣで粗生成物を分離精製し，次に凍結乾燥して，最終生成物を得た。生成物の分子量は，クロマトグラフィーおよび質量分析を用いて分析した。合成されたペプチドの理論的分子量は４３００．６であり，測定された実際の分子量は４３１６．７であった。当業者は，上述の方法を用いて，他のエキセンジンまたはエキセンジン類似体を同様に合成することができる。
【００５１】
実施例２．遺伝子工学手法によるエキセンジン−４類似体の製造
この実施例は，下記のアミノ酸配列を有するエキセンジン−４類似体を遺伝子工学方法により製造する方法を説明する：
［Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＯＨ］（配列番号２５１）
【００５２】
Ａ．製造すべきエキセンジン類似体のアミノ酸配列に基づいて，下記の遺伝子フラグメントを合成した。
（１）５’ＡＡＴＴＣＣＡＴＧＣＡＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＴＴＡＡ（配列番号２６６）
（２）５’ＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＧＣＧＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＧＴＴＡＧＡ（配列番号２６７）
（３）５’ＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＧＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＡ（配列番号２６８）
（４）５’ＡＣＡＧＴＴＴＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＣＡＴＧＧ（配列番号２６９）
【００５３】
Ｂ．クローニング
ライゲーション：２つのチューブを用いた。遺伝子フラグメント（１）および（４）を一方のチューブに入れて混合した。遺伝子フラグメント（２）および（３）を他方のチューブに入れて混合した。ポリヌクレオチドキナーゼバッファー，ポリヌクレオチドキナーゼ，およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を各チューブに入れた。反応混合物を３７℃で６０分間インキュベーションして，遺伝子フラグメントの５’末端をリン酸化した。２つのチューブを９５℃の水浴に入れて１０分間インキュベーションした。次に，チューブを自然に室温まで冷却させた。Ｔ４リガーゼバッファーおよびＴ４リガーゼを各チューブに加え，混合物を１６℃で一晩インキュベーションして，遺伝子フラグメントをライゲーションさせた。
【００５４】
プラスミド：Ｌａｃプロモーター（温度制御プロモーターＰＬ，またはＴａｃプロモーター）を含むプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し，フェノール／クロロホルム溶液で抽出した。混合物を遠心分離し，水性相を回収した。水性相をクロロホルムで抽出し，３回遠心分離した。得られた水性相をイソプロパノールで沈殿させ，遠心分離し，風乾した。
【００５５】
消化したプラスミドおよびライゲーションした遺伝子フラグメントを一緒に混合した。Ｔ４リガーゼバッファーおよびＴ４リガーゼを混合物に加え，室温で３−４時間インキュベーションした。
【００５６】
宿主細胞の培養：Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０３を，１０ｇのペプトン，５ｇの酵母エキスおよび５ｇのＮａＣｌを含むＬＢ培養液で３７℃で振盪しながら４時間インキュベーションした。細菌培養物を遠心分離し，沈殿物をＣａＣｌ2溶液で処理し，使用するまで４℃で保存した。
【００５７】
トランスフォーメーション：クローニングしたプラスミドをＥ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０３宿主細胞にトランスフォーメーションした。トランスフォーメーションした細菌細胞を氷浴中で３０分間インキュベーションし，次に４２℃で２分間インキュベーションした。細菌細胞をアンピリシンを含む寒天プレートに播種し，３７℃で一晩インキュベーションした。寒天プレート上に成長したコロニーを選択して組換えプラスミドを含むポジティブクローンとした。
【００５８】
Ｃ．発酵
所望のプラスミドを含む選択した宿主細菌株をＬＢ培養液で振盪しながらインキュベーションした。０．５ｍＭのイソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に加えて，所望のペプチドの発現を誘導した。一晩インキュベーションした後，細菌細胞を遠心分離により回収した。発現したペプチドは，１２％ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により同定した。
【００５９】
Ｄ．封入体
それぞれ３００ｍｌの細菌培養物を含む１０本のボトルを，上述の条件下で浸透しながらインキュベーションした。蛋白質発現を誘導した後，溶解溶液（１％ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ７．５）およびリゾチウムを培養液に加え，３０℃で３０分間インキュベーションし，次に遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を６Ｍグアニジン塩酸塩（Ｇｕ．ＨＣｌ）で処理して，封入体を溶解させた。溶液を遠心分離し，得られた上清を透析して，Ｇｕ．ＨＣｌを除いた。透析により生じた沈殿物を１％ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で３回すすいで，封入体を得た。
【００６０】
Ｅ．分解
封入体を８Ｍ尿素溶液に溶解した。次に塩酸および臭化シアンを溶液に加えた。溶液中の塩酸の最終濃度は５０ｍＭであった。溶液を暗所で窒素ガス保護下で２時間撹拌して，封入体を破壊した。工程はＨＰＬＣ分析を用いてモニターした。
【００６１】
Ｆ．精製
封入体を破壊した後，セファロースＧ−２５クロマトグラフィーにより粗生成物をを得た。粗生成物をＨＰＬＣによりさらに精製して，最終生成物を得た。化学工程により合成された生成物と同様に，得られたペプチドの質量分析機により測定した実験分子量は，その理論分子量と一致した。
【００６２】
実施例３．直鎖状メトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）誘導体（Ｍｆ：５，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４
１．０ｍｇのエキセンジン−４を３つのチューブのそれぞれに入れ，異なるｐＨ値を有する各リン酸バッファーに溶解した。５．８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ｍＰＥＧ（Ｍｆ：５，０００Ｄａ）を各チューブに加えた。混合物を振盪テーブルで室温で１時間反応させた。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣを用いて得られた生成物を分析して，未修飾エキセンジン−４の量を測定した（分析条件：溶媒Ａとして０．１％リン酸，溶媒Ｂとして０．１％リン酸＋８０％アセトニトリル，勾配：３５％−７０％溶媒Ｂ／２５分間）。結果を以下に示す。
エキセンジン−４のＰＥＧ化に及ぼすｐＨの相違の影響
ｐＨ値      未修飾エキセンジン−４
6.5            52%
7.5            21%
8.5            4%
【００６３】
上述の逆相分離により得られた溶液からアセトニトリルを除去した後，ｍＰＥＧ修飾エキセンジン−４を含む溶液（ｐＨ値３−４）を得た。
【００６４】
実施例４．直鎖状ｍＰＥＧ誘導体（Ｍｎ：２１，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体
１．０ｍｇのエキセンジン−４類似体をＮａＢＨ3ＣＮを含む２．０ｍｌのリン酸バッファー（ｐＨ４．５）と混合した。５．０ｍｇの分子量２１，０００Ｄａのアルデヒド活性化ｍＰＥＧ誘導体をエキセンジン−４類似体と混合し，振盪機に入れて室温で一晩反応させた。反応溶液は，Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−３００半調製用カラムを用いてＡｇｉｌｅｎｔ  １１００クロマトグラフィーにより精製した（分析条件：溶媒Ａとして０．１％リン酸；溶媒Ｂとして０．１％リン酸＋８０％アセトニトリル；勾配：３５％−７０％溶媒Ｂ／２５分間）。このようにして，Ｎ末端でｍＰＥＧで修飾したエキセンジン−４類似体を得た。
【００６５】
上述のように回収した溶液からロータリーエバポレータによりアセトニトリルを除去した後，脱塩カラムを用いて修飾エキセンジン−４のバッファー交換を行い，次にこれを０．００１−１．０％（ｗ／ｖ）の３−メチルフェノールを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．０−８．０）に溶解した。
【００６６】
実施例５．式ＩＶの構造を有するｍＰＥＧ誘導体（Ｍｎ：４０，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体
１．０ｍｇのエキセンジン−４類似体（配列番号２５１）を４．０ｍｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に加えた。２８０ｍｇの分子量４０，０００ＤａのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ｍＰＥＧ誘導体（式ＩＶ）を，上で製造したエキセンジン−４類似体と混合し，振盪テーブル上に置いて，室温で１時間反応させた。その後，２５０ｍｌのビーカー中で反応混合物を２００ｍｌのＢｒｉｓｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）で希釈して，以降の実験に用いた。
【００６７】
ＤＥＡＥ  ＦＦまたはＡＮＸ  ＦＦアニオン交換カラムをＢｉｓｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化した。希釈した反応混合物をアニオン交換カラムに負荷して，標的物質をアニオン交換樹脂に吸着させた。単一または複数修飾エキセンジン−４類似体は，異なる濃度のＮａＣｌの直線勾配溶出により溶出し，フラクションコレクターで溶出物を回収した。次に，１ＭＮａＣｌを用いて未修飾エキセンジン−４ペプチドを溶出した。分離および精製プロセスからの溶出画分を図３に示す。図中，ラベル２，３および４は，それぞれ，複数ｍＰＥＧ修飾エキセンジン−４類似体，単一ｍＰＥＧ修飾エキセンジン−４類似体および未修飾エキセンジン−４類似体の溶出ピークを示す。修飾エキセンジン−４類似体をＳＤＳ−ＰＡＧＥでゲル電気泳動で分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された修飾エキセンジン−４類似体の分子量（理論的分子量は４４，３００Ｄａである）は，４３，０００Ｄａよりわずかに大きく（図４），このことは，得られた生成物が確かに単一ｍＰＥＧ誘導体（Ｍｎ：４０，０００Ｄａ）修飾エキセンジン−４類似体であることを示す。
【００６８】
回収された単一ｍＰＥＧ修飾エキセンジン−４類似体を含む溶出物を限外濾過装置（限外濾過チューブまたは限外濾過デバイス）を用いて濃縮した。濃縮した溶液を脱塩カラムに負荷して，酢酸バッファーに交換した。最後に，等張調節剤（マンニトールおよび０．９％ＮａＣｌ等）および０．００１−１．０％（ｗ／ｖ）の抗菌剤（３−メチルフェノール等）を，修飾エキセンジン−４類似体を含む酢酸バッファーに加えた。
【００６９】
実施例６．単一ｍＰＥＧ誘導体（Ｍｆ：５，０００ＤａおよびＭｎ：２１，０００Ｄａ）修飾エキセンジン類似体の２４時間薬剤効果試験
試験動物：Ｃ５７マウス，２０ｇ＋／−２ｇ，各群につき８マウス，合計４群
対照群１：滅菌水を各マウスの皮下に注射した。
対照群２：０．０２５μｇのエキセンジン−４類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群１：０．６２５μｇの単一ｍＰＥＧ誘導体（Ｍｆ：５，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群２：単一ｍＰＥＧ誘導体（Ｍｎ：２１，０００Ｄａ）で修飾した０．６２５μｇのエキセンジン−４類似体を各マウスの皮下に注射した。
【００７０】
薬剤注射から４，８，１２，１６および２４時間後に各マウス群から血液サンプルを採取した。血液サンプリングの３０分前に２００μｌの２０％グルコース溶液を各マウスの腹部に注射した。血糖レベルは，グルコース試薬キット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｈｅｎ  Ｓｕｏ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて測定した。図５に示すように，ｍＰＥＧ誘導体（Ｍｎ：２１，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体は，注射の１６時間後も有効であった。ｍＰＥＧ（Ｍｆ：５，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体の有効時間は薬剤注射後１２−１６時間の間であった。未修飾エキセンジン−４類似体の有効時間は１２時間未満であった。血糖レベルを低下させる有効時間は，より大きい分子量の直鎖状ｍＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体を用いた場合，より小さい分子量の直鎖状ｍＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体より長かった。
【００７１】
実施例７．直鎖状ｍＰＥＧ（Ｍｎ＝２１，０００Ｄａ）および式ＩＶの構造を有する（Ｍｎ＝４０，０００Ｄａ）分枝鎖ｍＰＥＧで修飾したエキセンジン類似体の７２−時間薬剤効果試験
試験動物：Ｃ５７マウス，２０ｇ＋／−２ｇ，各群につき８匹のマウス，合計５群
対照群１：滅菌水を各マウスの皮下に注射した。
対照群２：０．０２５μｇのエキセンジン−４ペプチドを各マウスの皮下に注射した。
対照群３：０．０２５μｇのエキセンジン類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群１：０．６２５μｇのｍＰＥＧ（Ｍｎ：２１，０００Ｄａ）修飾エキセンジン−４類似体を各マウスの皮下に注射した。
薬剤群２：０．６２５μｇのｍＰＥＧ（Ｍｎ：４０，０００Ｄａ）修飾エキセンジン−４類似体を各マウスの皮下に注射した。
【００７２】
薬剤注射の４，８，２４，４８および７２時間後に各マウス群から血液サンプルを採取した。それぞれの血液サンプリングの３０分前に２００μｌの２０％グルコース溶液を各マウスの腹部に注射した。血糖レベルはグルコース試薬キットを用いて測定した。図６に示されるように，分枝鎖ＰＥＧ誘導体（Ｍｎ：４０，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体は薬剤注射の少なくとも７２時間後まで有効であった。直鎖状ｍＰＥＧ誘導体（Ｍｎ：２１，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体は薬剤注射後約２４時間有効であった。
【００７３】
実施例８．単一のｍＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体の薬剤効果試験
試験サンプル：合計８サンプル，それぞれ２１，０００Ｄａ，３０，０００Ｄａ，４０，０００Ｄａの分子量を有する単一のｍＰＥＧ誘導体（式ＩＩ）修飾したエキセンジン−４類似体；それぞれ２１，０００Ｄａ，３０，０００Ｄａ，４０，０００Ｄａの分子量を有する単一のｍＰＥＧ誘導体（式ＩＶ）で修飾したエキセンジン−４類似体；それぞれ分子量２１，０００Ｄａおよび３０，０００Ｄａの直鎖状ｍＰＥＧ誘導体で修飾したエキセンジン−４類似体
試験動物：Ｃ５７マウス，２０ｇ＋／−２ｇ，３サンプリング群，各サンプリング群につき２４匹のマウス
【００７４】
マウスは頻繁な血液サンプリングに耐えられないため，サンプルを注射した後の異なる時間にサンプリング群から血液を採取するよう設計した。薬剤注射後の血液サンプリングスケジュールは以下のとおりであった。
第１群    ２，８，７２時間
第２群    ４，２４，４８時間
第３群    １６，３６，６０時間
【００７５】
各サンプリング群をさらに８のサブグループに分けた。各サブグループは３匹のマウスから構成された。試験の最初に各サブグループに異なる修飾エキセンジン−４類似体を注射した。これらは，Ｌ２１Ｋ，Ｌ３０Ｋ（それぞれ分子量２１，０００Ｄａおよび３０，０００Ｄａの単一の直鎖状ｍＰＥＧ誘導体による修飾）；Ｙ２１Ｋ，Ｙ３０Ｋ，Ｙ４０Ｋ（式ＩＶの構造を有し，それぞれ分子量２１，０００Ｄａ，３０，０００Ｄａおよび４０，０００Ｄａの単一のｍＰＥＧ誘導体による修飾），Ｕ２１Ｋ，Ｕ３０Ｋ，Ｕ４０Ｋ（式ＩＩの構造を有し，それぞれ分子量２１，０００Ｄａ，３０，０００Ｄａおよび４０，０００Ｄａの単一のｍＰＥＧで修飾したエキセンジン−４類似体）と称される。種々のｍＰＥＧ修飾エキセンジン−４類似体はすべて０．６２５μｇのエキセンジン−４類似体を含んでいた。薬剤注射の直後に，２００μｌの２０％グルコースをマウスの腹部空間に注射した。３０分後，血液サンプルをすべてのマウスから採取した。続く血液サンプリングは，上述のサンプリングスケジュール表にしたがって実施した。各血液サンプリングの３０分前にマウスの腹部空間に２００μｌの２０％グルコースを注射した。図７−９は，ＰＥＧ誘導体の分子構造および分子量がエキセンジン−４類似体の生物活性に大きく影響することを示す。薬剤注射後７２時間，式ＩＩの構造を有する単一のｍＰＥＧで修飾したエキセンジン−４類似体の生物活性は，式ＩＶの構造を有するＰＥＧおよび直鎖状ＰＥＧで修飾したエキセンジン−４類似体より長時間有効であった。同じ分枝構造を有する単一のＰＥＧで修飾したエキセンジン−４類似体については，分子量が大きければ大きいほど，７２時間の間に血糖レベルを低下させるより高い生物活性を示した。Ｌ３０Ｋは，薬剤注射の７２時間後までには顕著な生物活性を有さず，このことは，より大きい分子量の直鎖状ＰＥＧは修飾エキセンジン−４類似体の生物活性に負の影響を有することを示す。
【００７６】
実施例９．単一のＰＥＧで修飾したエキセンジン−４類似体の薬物動態試験
試験動物：ＳＤマウス，雄，２５０ｇ−３００ｇ，２群，各群につき４匹のマウス
薬剤群１：それぞれのマウスに，４．３７５μｇのエキセンジン−４類似体（Ｕ３０Ｋ）を含有する，単一のｍＰＥＧ誘導体（式ＩＩ，Ｍｎ：３０，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体（配列番号２５１）を注射した。
薬剤群２：それぞれのマウスに，４．３７５μｇのエキセンジン−４類似体（Ｙ４０Ｋ）を含有する，単一のｍＰＥＧ誘導体（式ＩＶ，Ｍｎ：４０，０００Ｄａ）で修飾したエキセンジン−４類似体（配列番号２５１）を注射した。
【００７７】
薬剤注射の０，２，４，８，１２，１６，２４，３６，４８，６０および７２時間後にすべてのマウス群から血液サンプルを採取した。血液中のエキセンジン−４の濃度は，Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ）を用いて測定した。データは，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．０．２（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｈｏｎｇｎｅｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて分析した。結果を図１０に示す。Ｕ３０Ｋの半分が吸収されるのに要した時間は１０．７８時間であり，Ｕ３０Ｋの半分が排除されるのに要した時間は２１．４４時間であった。Ｙ４０Ｋの半分が吸収されるのに要した時間は５．５３時間であり，Ｙ４０Ｋの半分が排除されるのに要した時間は４０．７７時間であった。２つのサンプルが血液中でピーク濃度に到達した時間は，薬剤注射の約１２時間後であった。血中の２つのサンプルのピーク濃度は約２０ｎｇ／ｍｌであった。
【００７８】
上で述べたように，上述の記載は単に本発明の種々の態様を例示することを意図するものである。上述した特定の修飾は，本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。当業者には，本発明の範囲から逸脱することなく種々の同等物，変更，および改変をなすことができることが明らかであり，そのような同等の態様も本明細書に含まれることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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