(57)【要約】      （修正有）【課題】線虫抵抗性を付与する組成物及び方法を提供する。【解決手段】線虫の食道腺細胞分泌ポリペプチドに特異的な阻害性核酸を含む、遺伝子組換え植物又は細胞。他の態様は、少なくとも２種の異なる根瘤線虫種に抵抗性の遺伝子組換え植物又は細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫の食道腺細胞分泌ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも一部に特異的な阻害
性核酸を含む、遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項２】
少なくとも２種の異なる線虫種によって直接的に又は間接的に引き起こされる線虫性疾
患に抵抗性である、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項３】
Ｍ．インコグニタによって直接的に又は間接的に引き起こされる線虫病害に抵抗性であ
る、請求項２記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項４】
また、Ｍ．ジャバニカによって直接的に又は間接的に引き起こされる線虫病害に抵抗性
である、請求項３記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項５】
また、Ｍ．アレナリアによって直接的に又は間接的に引き起こされる線虫病害に抵抗性
である、請求項４記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項６】
また、Ｍ．ハプラ又はＭ．チットウッディによって直接的に又は間接的に引き起こされ
る線虫病害に抵抗性である、請求項５記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項７】
前記阻害性核酸が、所定量で、コントロールの植物又は細胞に比較して、該遺伝子組換
え植物又は細胞を与えた寄生線虫による食道のポリペプチドの発現を低減、阻害、又は阻
止する効果を有する、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項８】
前記阻害性核酸が、所定量で、コントロールの植物又は細胞に比較して、線虫病害を低
減、阻害、又は阻止する効果を有する、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項９】
前記阻害性核酸が、所定量で、コントロールの植物又は細胞に比較して、遺伝子組換え
植物又は細胞を常食とする少なくとも２種の寄生根瘤線虫による食道のポリペプチドの発
現を低減、阻害、又は阻止する効果を有する、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞
。
【請求項１０】
前記阻害性核酸が、所定量で、コントロールの植物又は細胞に比較して、少なくとも２
種の異なる根瘤線虫種によって引き起こされる線虫病害を低減、阻害、又は阻止する効果
を有する、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項１１】
前記線虫の食道のポリペプチド又はそのフラグメントが：前記植物又は細胞の遺伝子発
現；巨細胞の形成；該植物の根組織を介した線虫の遊走；該植物の細胞代謝；該植物細胞
内のシグナル転換の誘発；又は該線虫が該植物に形成された巨細胞から栄養を得ることを
可能にさせる栄養管の形成；を調節する、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項１２】
前記植物又は細胞の遺伝子発現が、前記線虫の食道腺細胞ポリペプチドによって直接的
に又は間接的に調節される、請求項１１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項１３】
前記遺伝子発現調節が根細胞内で起こる、請求項１２記載の遺伝子組換え植物又は細胞
。
【請求項１４】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞
。
【請求項１５】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１記載の
遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項１６】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、バラ科、マメ科、トケイソウ科、ウリ科、アオイ科
、トウダイグサ科、ブドウ科、ナス科、ヒルガオ科、アカネ科、マメ科植物（Leguminosa
e）、及びアブラナ科からなる群から選択される系統学的な科のメンバーである、請求項
１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項１７】
前記植物が、トマト、ナス、ジャガイモ、メロン、キュウリ、ニンジン、レタス、チョ
ウセンアザミ、セロリ、ウリ科植物、オオムギ、トウモロコシ、ピーナッツ、ダイズ、テ
ンサイ、ワタ、ササゲ、マメ類、アルファルファ、タバコ、柑橘類、クローバ、コショウ
、ブドウ、コーヒー、オリーブ又は茶である、請求項１６記載の遺伝子組換え植物又は細
胞。
【請求項１８】
前記阻害性核酸が、少なくとも、１以上の配列番号：１、２又は５〜５１によってコー
ドされるタンパク質をコードするｍＲＮＡの一部又は全てに相補的な部分を含む、請求項
１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項１９】
前記阻害性核酸が、低分子干渉ＲＮＡを含む、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細
胞。
【請求項２０】
前記阻害性核酸がミクロＲＮＡを含む、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項２１】
前記阻害性核酸がアンチセンスＤＮＡを含む、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細
胞。
【請求項２２】
前記阻害性核酸が、線虫の食道腺細胞ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害
する、又は該翻訳に干渉する、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項２３】
前記阻害性核酸が、線虫の食道腺細胞ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの分解を誘導
又は促進する、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項２４】
異なる線虫の食道腺細胞ポリペプチドに特異的な２以上の阻害性核酸を含む、請求項１
記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項２５】
前記阻害性核酸が、非天然型ヌクレオチド又は天然型ヌクレオチドを含む、請求項１記
載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項２６】
前記阻害性核酸が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項１記載の
遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項２７】
１以上の配列番号：１、２又は５〜５１、若しくはそのフラグメント又は相同体によっ
てコードされるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はそのフラグメントに特異的な阻害
性核酸を含む組成物であって、所定量で、線虫に与えた場合、１以上の配列番号：１、２
又は５〜５１、若しくはその相同体によってコードされるポリペプチドの発現阻害効果を
有する、前記組成物。
【請求項２８】
１以上の配列番号：１、２又は５〜５１によってコードされるポリペプチド又はそのフ
ラグメントが：前記植物又は細胞の遺伝子発現；巨細胞の形成；該植物の根組織を介した
線虫の遊走；該植物の細胞代謝；該植物細胞内のシグナル転換の誘発；又は該線虫が該植
物に形成された巨細胞から栄養を得ることを可能にさせる栄養管の形成；を調節する、請
求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
前記植物又は細胞の遺伝子発現が、前記ポリペプチドによって直接的に又は間接的に調
節される、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
前記遺伝子発現調節が根細胞内で起こる、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項２７記載の組成物。
【請求項３２】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である、請求項２７記載
の組成物。
【請求項３３】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、バラ科、マメ科、トケイソウ科、ウリ科、アオイ科
、トウダイグサ科、ブドウ科、ナス科、ヒルガオ科、アカネ科、マメ科植物、及びアブラ
ナ科からなる群から選択される系統学的な科のメンバーである、請求項２７記載の組成物
。
【請求項３４】
前記植物が、トマト、ナス、ジャガイモ、メロン、キュウリ、ニンジン、レタス、チョ
ウセンアザミ、セロリ、ウリ科植物、オオムギ、トウモロコシ、ピーナッツ、ダイズ、テ
ンサイ、ワタ、ササゲ、マメ類、アルファルファ、タバコ、柑橘類、クローバ、コショウ
、ブドウ、コーヒー、オリーブ又は茶である、請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
線虫の食道腺細胞ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はそのフラグメントに特異的な
阻害性核酸をコードする核酸を含む細胞であって、該線虫の食道腺細胞ポリペプチドが：
前記植物又は細胞の遺伝子発現；巨細胞の形成；該植物の根組織を介した線虫の遊走；該
植物の細胞代謝；該植物細胞内のシグナル転換の誘発；又は該線虫が該植物に形成された
巨細胞から栄養を得ることを可能にさせる栄養管の形成；を調節する、前記細胞。
【請求項３６】
線虫の食道腺細胞ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又に特異的な阻害性核酸をコード
する核酸に機能的に連結させたプロモーターを含むベクターであって、該線虫の食道腺細
胞ポリペプチドが：前記植物又は細胞の遺伝子発現；巨細胞の形成；該植物の根組織を介
した線虫の遊走；該植物の細胞代謝；該植物細胞内のシグナル転換の誘発；又は該線虫が
該植物に形成された巨細胞から栄養を得ることを可能にさせる栄養管の形成；を調節する
、前記ベクター。
【請求項３７】
前記線虫の食道腺細胞タンパク質が、１以上の配列番号：１、２又は５〜５１によって
コードされる、請求項３６記載のベクター。
【請求項３８】
植物に線虫抵抗性を付与する方法であって、該植物内で線虫の食道腺細胞タンパク質に
特異的な阻害性核酸を発現させることを含む、前記方法。
【請求項３９】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
植物に線虫抵抗性を付与する方法であって、前記植物を、線虫病害を低減するのに十分
な量で、１以上の線虫の食道腺細胞タンパク質に特異的な１以上の阻害性核酸に接触させ
ることを含む、前記方法。
【請求項４１】
前記１以上の線虫の食道腺細胞タンパク質が：前記植物又は細胞の遺伝子発現；巨細胞
の形成；該植物の根組織を介した線虫の遊走；該植物の細胞代謝；該植物細胞内のシグナ
ル転換の誘発；又は該線虫が該植物に形成された巨細胞から栄養を得ることを可能にさせ
る栄養管の形成；を直接的に又は間接的に調節する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記植物が、少なくとも２種の異なる根瘤線虫種由来の線虫病害に抵抗性である、請求
項４０記載の方法。
【請求項４４】
前記植物が、Ｍ．インコグニタ、Ｍ．ジャバニカ、Ｍ．アレナリア及びＭ．ハプラによ
って引き起こされる線虫病害に抵抗性である、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
寄生線虫の食道腺細胞分泌ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも一部を含む、遺
伝子組換え植物又は細胞。
【請求項４６】
前記食道腺細胞分泌ポリペプチドが、コントロールの植物又は細胞に比較して、前記遺
伝子組換え植物の根の成長を増強する、請求項４５記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項４７】
前記食道腺細胞分泌ポリペプチドが、コントロールの植物又は細胞に比較して、遺伝子
組換え植物又は細胞の根の成長を増強する効果を有する量で発現する、請求項４５記載の
遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項４８】
前記食道腺細胞分泌ポリペプチドが、根細胞内で発現する、請求項４５記載の遺伝子組
換え植物又は細胞。
【請求項４９】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項４５記載の遺伝子組換え植物又は細
胞。
【請求項５０】
前記線虫が、タイズシスト線虫類のメンバーでない、請求項４５記載の遺伝子組換え植
物又は細胞。
【請求項５１】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である、請求項４５記載
の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項５２】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、バラ科、マメ科、トケイソウ科、ウリ科、アオイ科
、トウダイグサ科、ブドウ科、ナス科、ヒルガオ科、アカネ科、マメ科植物、及びアブラ
ナ科からなる群から選択される系統学的な科のメンバーである、請求項４５記載の遺伝子
組換え植物又は細胞。
【請求項５３】
前記植物が、トマト、ナス、ジャガイモ、メロン、キュウリ、ニンジン、レタス、チョ
ウセンアザミ、セロリ、ウリ科植物、オオムギ、トウモロコシ、ピーナッツ、ダイズ、テ
ンサイ、ワタ、ササゲ、マメ類、アルファルファ、タバコ、柑橘類、クローバ、コショウ
、ブドウ、コーヒー、オリーブ又は茶である、請求項５２記載の遺伝子組換え植物又は細
胞。
【請求項５４】
前記核酸が、少なくとも配列番号：１、２又は５〜５１の一部を含む、請求項４５記載
の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項５５】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、異なる線虫の分泌ポリペプチドをコードする２以上
の核酸を含む、請求項４５記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項５６】
配列番号：１、２又は５〜５１、その相補体、フラグメント又は相同体を含み、植物体
内で発現させた場合に、所定量で、根の成長を強化又は促進する効果を有する核酸を含む
、組成物。
【請求項５７】
配列番号：１、２又は５〜５１、その相補体、フラグメント又は相同体によってコード
され、所定量で、根の成長を強化又は促進させる効果を有するポリペプチドを含む、組成
物。
【請求項５８】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項５７記載の組成物。
【請求項５９】
前記線虫がダイズシスト線虫類のメンバーである、請求項５７記載の組成物。
【請求項６０】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である、請求項５７記載
の組成物。
【請求項６１】
前記遺伝子組換え植物又は細胞が、バラ科、マメ科、トケイソウ科、ウリ科、アオイ科
、トウダイグサ科、ブドウ科、ナス科、ヒルガオ科、アカネ科、マメ科植物、及びアブラ
ナ科からなる群から選択される系統学的な科のメンバーである、請求項５７記載の組成物
。
【請求項６２】
前記植物が、トマト、ナス、ジャガイモ、メロン、キュウリ、ニンジン、レタス、チョ
ウセンアザミ、セロリ、ウリ科植物、オオムギ、トウモロコシ、ピーナッツ、ダイズ、テ
ンサイ、ワタ、ササゲ、マメ類、アルファルファ、タバコ、柑橘類、クローバ、コショウ
、ブドウ、コーヒー、オリーブ又は茶である、請求項６１記載の組成物。
【請求項６３】
根の成長を刺激する、線虫の食道腺細胞分泌ポリペプチドをコードする核酸を含む、細
胞。
【請求項６４】
植物の根の成長を刺激する、線虫の食道腺細胞分泌タンパク質をコードする核酸に機能
的に連結させたプロモーターを含む、ベクター。
【請求項６５】
前記線虫の食道腺細胞分泌タンパク質が、１以上の配列番号：１、２又は５〜５１によ
ってコードされる、請求項６４記載のベクター。
【請求項６６】
根の成長を刺激する、又は側根若しくは不定根の形成を強化させる方法であって、根細
胞の内部に線虫の食道腺細胞分泌ポリペプチドを送達させることを含む、前記方法。
【請求項６７】
１以上の線虫の食道腺細胞分泌ポリペプチドを、前記植物の細胞、組織又は器官へと導
入することを含む、改変植物、改変植物細胞又は改変植物組織の製造方法。
【請求項６８】
請求項４５の遺伝子組換え植物又は細胞によって製造された種子。
【請求項６９】
対応する野生型植物に比較して、増進した根の成長を示す組換え植物であって、制御配
列と機能的に連結させた線虫の食道腺細胞タンパク質又はそのフラグメントをコードする
組換え核酸を含む、前記組換え植物。
【請求項７０】
前記線虫の食道腺細胞タンパク質が、１以上の配列番号：１、２又は５〜５１によって
コードされる、請求項６９記載の組換え植物。
【請求項７１】
配列番号：１、２又は５〜５１、若しくはそのフラグメントによってコードされるポリ
ペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項７２】
オーキシン又はそのフラグメントを含む、請求項７１記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００４年１０月１３日に出願された米国仮出願番号60/618,097、及び２０
０５年８月２日に出願された米国仮出願番号60/704,560の利益並びに優先権を主張し、許
容可能な範囲で、その各々は引用によって全体が組み込まれる。
（連邦委託研究又は開発に関する記載）
本明細書で開示される研究の態様は、米国農務省から授与された助成金番号2003-35302
-13804によって一部支援された。米国政府は、特許請求の範囲に記載した対象に、一定の
権利を有し得る。
（１．  技術分野）
本開示は概して、植物寄生生物の制御用組成物、及び根の成長の増進用組成物、より詳
細には、線虫病害制御用核酸組成物、又は根の成長の強化用核酸組成物に関するものであ
る。
【背景技術】
【０００２】
（２．  関連分野）
線虫は、回虫、蟯虫、線虫（eelworm）又は線虫（nema）として一般的に言及される、
無脊椎動物のきわめて大きな群である。一部の線虫は植物寄生体であり、茎、芽、葉、及
び特に根を摂食することができる。植物寄生線虫の一つの重要な属は、根瘤線虫（root-k
not nematode）（ネコブ線虫類（Meloidogyne spp））である。これらの寄生線虫は、広
範囲の重要な田畑、野菜、果物及び観賞植物に感染する。２００１年に、根瘤線虫は、ワ
タのみで、２．００５億米国ドルの損失をもたらした。
【０００３】
既存の根瘤線虫病害の治療又は予防方法は、化学物質、殺虫剤、及び燻蒸剤の使用を含
む。植物を植える前の土壌における燻蒸剤の使用は、根瘤線虫及び他の植物寄生線虫の制
御に優れて効果的である。しかしながら、燻蒸剤型線虫駆除剤の大部分はもはや製造中止
で、かつ費用が高く、一般的条件下で適切に適用するのは困難である。
転作もまた、線虫病害の制御に使用されてきた。経済的に可能であれば、タマネギ、ニ
ンジン又はレタスを、スイートコーン及び他の穀類などの非宿主作物と転作することは、
北部の根瘤線虫の制御に効果があり得る。残念ながら、現在の有機土壌での転作は、病害
に感受性であるジャガイモ、マメ、セロリ、レタス、タマネギ及びニンジンを含むほとん
どの作物が生長するにつれて、価値が限定される。
【０００４】
被覆作物の使用もまた、線虫病害の制御に試みられている。主要作物間に生育する被覆
作物は、代替的な管理方法を提供し得る。ライムギ、オオムギ、カラスムギ、スーダング
ラス、ヒロハノウシケノグサ、一年生ライグラス及びコムギは、この線虫の非宿主である
こと、又はほとんど宿主ではないことが示されている。しかしながら、被覆作物を用いる
ことは、該被覆作物が、より価値の高い作物を育てるのに使用可能な土地を占有してしま
うので、高価であり得る。
【０００５】
生物学的制御生物もまた、作物の線虫病害を制御する試みに使用されてきた。市販の生
物学的制御生物の調合液は、該制御生物の生長を助けることができる範囲での使用に限定
される。さらに、ある生物を使用して他を制御することの結果は予測不可能であり、天気
や気候などの様々な要因に左右される。
さらに、根瘤線虫（ＲＫＮ）は、植物寄生線虫による作物の損失の主要原因である。最
も重要な種（Ｍ．インコグニタ（M. incognita）、Ｍ．ジャバニカ（M. javanica）、Ｍ
．アレナリア（M. arenaria）、Ｍ．ハプラ（M. hapla）、Ｍ．チットウッディ（M. chit
woodi））は広範な宿主範囲を有し、これは非宿主的転作の選択肢を限定する。様々な作
物において、宿主抵抗性遺伝子のいくつかの例が存在するが、宿主植物抵抗性の利用は、
大部分の作物に欠失している、適切な抵抗性遺伝子座を用いることに実質的に限定される
（Roberts, P. A.の論文 1992. Journal of Nematology 24:213-227）。さらに、該抵抗
性は、わずか数種のＲＫＮ又は集団にのみ限定され、かついくつかの抵抗性遺伝子は熱感
受性であるので、暑い生産地域には適さない。ＲＫＮの抵抗性崩壊型集団は、継続的な曝
露後に、例えば根瘤抵抗性トマトなどの抵抗性品種につくことができるので、天然の抵抗
性遺伝子の別の制限は、抵抗性の耐久性である。
【０００６】
したがって、植物における線虫病害を制御、予防、又は削減する組成物並びに方法が必
要である。
依然として、作物に影響を与える他の問題は、ほとんど発育しない根系に関するもので
ある。植物の根系は、植物の重要な部分であり、植物の生存に不可欠な多くの機能を備え
ている。例えば、根系は、植物の栄養素を貯蔵し、毒物を除去し、植物の生育制御を助け
、水分及び栄養素の吸収ネットワークを提供し、かつ植物体を支持し、土壌を強化する機
械的構造を提供する。より大きな根を持つ植物は、生育及びストレス耐性が増進している
。作物植物において、増進又は強化された根の成長は、該増進された根の成長が作物生産
高を増加させ得るので、特に有益であり得る。
【０００７】
多年生作物において、増進された根の成長は、再成長の速度を速め、生産力を増加させ
、かつ植物が冬を生き抜く可能性を高め得る。一年生植物において、増大した根のサイズ
は、変わりやすい環境条件下での生産力を保証し得る。根菜類において、強化された根の
成長は、より高い収穫高を意味し得る。
根の促進剤の存在は通常、肥料又は植物ホルモンを含み、植物又は該植物の近傍の土壌
に適用する場合、特定の濃度で混合して使用しなければならない。そのような促進剤の適
用を超えた植物への悪影響をもたらす可能性があり、適用中、望ましい結果を達成できな
い。さらに、植物ホルモンの適用は、好ましくない結果をもたらし得る。例えば、根の開
始剤として使用される一つの植物ホルモンは、オーキシン又はインドール−３−酢酸（Ｉ
ＡＡ）である。ＩＡＡは、発根開始に加えて、胚発生、葉形成、光屈性、重力屈性、頂芽
優勢、果実形成、器官離脱を含む、様々な植物の活動に重要な役割を果たす。
それゆえ、根の成長又は発達を刺激若しくは強化させる、新規組成物及び方法が必要で
ある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、線虫抵抗性の遺伝子組換え植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
一般的に、本開示の態様は、植物寄生線虫によって分泌されるタンパク質の発現を阻害
する核酸構築物を提供する。いくつかの態様において、該タンパク質は線虫によって分泌
され：植物又は細胞の遺伝子発現；巨細胞の形成；植物の根組織を介した線虫の遊走；植
物の細胞代謝；植物細胞内のシグナル転換の誘発；又は線虫が植物に形成された巨細胞か
ら栄養を得ることを可能にさせる栄養管の形成；を選択的に調節する。ある態様は、線虫
、特に根瘤線虫によって分泌される食道腺細胞タンパク質に特異的な阻害性核酸を提供す
る。他の態様は、例えば、線虫の食道腺細胞タンパク質発現を阻害又は低減させる阻害性
の二本鎖ＲＮＡ又は阻害性の一本鎖ＲＮＡなどの１以上の阻害性核酸を発現又は含む、遺
伝子組換え細胞又は植物を提供する。
【００１０】
別の態様は、例えばＲＫＮ種のような、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の線虫種の標的線虫寄生遺伝
子転写産物を下方調節する阻害性ＲＮＡを含む、遺伝子組換え植物を提供する。それゆえ
、本開示は、複数のＲＫＮ種によって引き起こされる病害に抵抗性である遺伝子組換え植
物を提供する。
【００１１】
開示する阻害性核酸によって標的化される代表的食道腺細胞タンパク質は、配列番号：
１、２、及び５〜５１によってコードされる１以上のタンパク質を含む。特定の態様にお
いて、１以上の阻害性核酸は、線虫が遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞へと侵
入し、遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞を摂食、若しくは遺伝子組換え植物又
は遺伝子組換え植物細胞と物理的に接触して侵入する場合に、寄生線虫に送達される。い
ったん該阻害性核酸が該寄生線虫に取り込まれると、該阻害性核酸は、例えば、１以上の
食道腺細胞タンパク質をコードする１以上のｍＲＮＡの翻訳に直接的又は間接的に干渉す
る、若しくは該翻訳を低減又は阻害することによって、標的食道腺細胞タンパク質の発現
に干渉する、若しくは該発現を低減又は阻害する。
【００１２】
さらに別の態様は、１以上の線虫の食道腺細胞タンパク質に特異的な阻害性核酸をコー
ドする異種核酸を形質導入した植物細胞を提供し、該細胞内で、該異種核酸は、線虫病害
を低減又は阻止するのに十分量発現している。ある態様において、前記遺伝子組換え植物
は阻害性核酸を発現し、かつ該阻害性核酸は、線虫が遺伝子組換え植物を摂食する、又は
遺伝子組換え植物を摂食するよう試みることで送達される。一般的に、該阻害性核酸は、
線虫に取り込まれる。阻害性核酸を内部移行させる典型的な方法は、該核酸の摂食又は該
核酸の吸収を含む。
【００１３】
さらに別の態様は、１以上の線虫の寄生ポリペプチドに特異的な阻害性核酸を含む遺伝
子組換え植物を提供し、該植物内で、該阻害性核酸は、例えば２以上の根瘤線虫種などの
２以上の線虫種に対する抵抗性を与える。
さらなる態様は、植物又は樹木における、根の成長又は発達の刺激用、促進用又は強化
用組成物を提供する。特定の態様は、線虫の食道腺細胞によって分泌されるタンパク質を
コードする核酸構築物を提供し、該タンパク質又はそのフラグメントは、植物に送達又は
接触した場合に、根の発達を刺激又は強化する。他の態様は、植物又は植物細胞に接触し
た場合に根の成長を刺激する、１以上の線虫の食道腺細胞タンパク質又はそのフラグメン
トを含む組成物を提供する。さらに他の態様は、１以上の線虫の食道腺細胞タンパク質又
はそのフラグメント、又は非遺伝子組換え植物又はコントロールの植物に比較して、根の
成長を刺激、強化又は促進するのに十分な１以上の線虫の食道腺細胞タンパク質又はその
フラグメントをコードする核酸を含む、遺伝子組換え植物を提供する。
【００１４】
代表的な線虫の食道腺細胞タンパク質（食道タンパク質としても言及される）は、配列
番号：１、２、及び５〜５１、又はそれらの組み合わせによってコードされる１以上のタ
ンパク質を含む。
さらに別の態様は、１以上の線虫の食道腺細胞タンパク質をコードする異種核酸を形質
移入した植物細胞を提供し、該細胞内で、該異種核酸は、根の成長又は発達を刺激、強化
、又は促進するのに十分量発現している。
１以上の実施態様の詳細は、以下の添付図面及び明細書に記載する。本開示の他の特性
、対象及び利点は、明細書及び図面並びに特許請求の範囲から明白である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（詳細な説明）
（１．定義）
本開示の様々な実施態様を説明する前に、本発明はその適用において、以下の明細書に
記載される構成要素の構成及び配置の詳細に限定されないことは、理解されるべきである
。他の実施態様が、様々な方法で実践又は実施可能である。さらに、本明細書で使用する
語法及び専門用語は、説明の目的のためであって、限定とみなされるべきでないことは、
理解されるべきである。
【００１６】
本開示を通して、様々な出版物、特許、及び公開された特許明細書が引用される。可能
な限り、これらの出版物、特許、及び公開された特許明細書の開示は、より完全に最先端
を記載するために、引用によりその全体が本開示へと組み込まれる。他に示すことがない
限り、本開示は、当該技術の範囲内で植物育種、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生
物学、及び組換えＤＮＡの従来技術を含む。例えば、Sambrook及びRussellの文献, 『分
子クローニング：研究室マニュアル』, 第３版 (2001)；『分子生物学の最新プロトコル
』 [(F. M. Ausubelらの文献,eds., (1987)]；『植物育種：原理と展望』（植物育種、１
巻）M. D. Hayward, N. O. Bosemark, I. Romagosaの文献； Chapman及びHallの文献, (1
993)； Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher及びWingfeld編 (1995)『タンパク質科学の最
新プロトコル』（John Wiley & Sons社）；『酵素学における方法』のシリーズ (Academi
c Press社)：ＰＣＲ２：実践的アプローチ (M. J. MacPherson, B. D. Hames及びG. R. T
aylor編 (1995)], Harlow及びLane編 (1988) 『抗体、研究室マニュアル、及び動物細胞
培養』[R. I. Freshney編 (1987)]を参照されたい。
【００１７】
他に記載がないならば、専門用語は、慣例的用法に従って使用する。分子生物学におけ
る一般的な用語の定義は、２０００年にOxford University Pressから出版されたLewinの
文献『Genes VII』；Kendrewらの文献 (編)、１９９９年にWiley-Interscience社によっ
て出版された『分子生物学の百科事典』；及び、１９９５年にVCH Publishers社から出版
されたRobert A. Meyersの文献 (ed.)『分子生物学及び生命工学、総合卓上参考書』；Au
subelらの文献 (1987) 『分子生物学の最新プロトコル』, Green Publishing；Sambrook
及びRussellの文献 (2001) 『分子クローニング：研究室マニュアル  第３版』に見出さ
れるであろう。
【００１８】
本開示の理解を助けるために、以下の定義を提供する：
植物細胞内で標的遺伝子の発現を「変える」ことは、本発明の方法を適用した後の植物
細胞内における該標的遺伝子の発現レベルが、本方法適用前の細胞における該遺伝子の発
現とは異なることを意味する。好ましく遺伝子発現を変えることは、植物内における該標
的遺伝子の発現が低減、好ましくは大きく低減、より好ましくは該遺伝子発現が検出不可
能になることを意味する。必須遺伝子の発現変化は、それに由来する、植物細胞又は植物
体のノックアウト突然変異表現型をもたらし得る。あるいは、改変された発現は、植物遺
伝子発現の上方調節を含み得る。
【００１９】
「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であ
り、該標的遺伝子ｍＲＮＡに結合することによってＲＮＡｉを誘導すると考えられている
。「センスＲＮＡ」は、前記アンチセンスＲＮＡに相補的な配列を有し、その相補的アン
チセンスＲＮＡに結合し、ｓｉＲＮＡを形成する。これらのアンチセンスＲＮＡ及びセン
スＲＮＡは従来、ＲＮＡ合成機を用いて合成されてきた。本発明において、これらのＲＮ
Ａは細胞内で、ｓｉＲＮＡ発現系を使用して、それぞれアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲ
ＮＡ（アンチセンスをコードするＤＮＡ及びセンスをコードするＤＮＡ）をコードするＤ
ＮＡから発現する。
【００２０】
用語「生体サンプル」は、哺乳動物、例えばヒトなどの任意の動物から得られた、身体
由来のサンプルをさす。生体サンプルは、例えば、血管患者、糖尿病患者又はガン患者か
ら得ることができる。生体サンプルは、ホモジナイズした組織などの組織抽出物、細胞抽
出物、又は細胞全体若しくは組織全体に加えて、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液
、卵胞液、精液、羊水、母乳、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液及び組織抽
出物などの生体液であり得る。
【００２１】
本明細書で使用するように、「緩衝液」は、酸塩基共役成分の作用によってｐＨの変化
に抵抗する、緩衝された溶液をさす。
発現をさす場合、「コントロール配列」は、特定の宿主生物内で、機能的に連結させた
コード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適するコントロール配列は
、例えば選択的に、オペレーター配列、リボソーム結合部位などのプロモーターを含む。
真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用する
ことが知られている。
【００２２】
用語「細胞」は、複製又は分裂可能な膜結合型の生物学的単位をさす。
用語「構築物」は、本発明の１以上の単離ポリヌクレオチド配列を含む組換え遺伝分子
をさす。
宿主生物内における導入遺伝子発現に使用する遺伝的構築物は、５'−３'の方向で：プ
ロモーター配列；本明細書で開示する阻害性核酸をコードする配列；及び終止配列を含む
。該翻訳領域は、センス方向又はアンチセンス方向のどちらの方向でもよい。該構築物は
さらに、選択可能な標識遺伝子（群）及び他の発現の制御エレメントを含んでよい。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「調節エレメント」又は「制御エレメント」は本明
細書で可換的に使用し、プロモーター活性に影響を与えるように、プロモーター配列内又
はプロモーターに近接して位置する配列を意味する。調節エレメントは、正の調節エレメ
ント又は負の調節エレメントであってよい。正の調節エレメントは、転写開始に制御因子
の結合を必要とする。多くのそのような正の調節エレメント及び負の調節エレメントが知
られている。異種の調節エレメントをプロモーターへと付加して、本明細書に記載するよ
うにプロモーター活性を変化させる場合、該調節エレメントを、機能的に連結させたポリ
ヌクレオチド配列を発現させるプロモーターの活性制御を補助するために、プロモーター
配列内又はプロモーターに近接して位置付ける。
【００２４】
用語「異種」は、通常では見いだされない所にエレメントが存在していることをさす。
例えばプロモーターを、例えば通常では見出されない、機能的にプロモーターへと連結さ
せた配列のような異種核酸へと連結させてよい。プロモーターエレメントを説明するため
に本明細書で使用する場合、異種は、配列、種類、又は数のいずれかにおいて、天然型に
通常見出されるものとは異なるプロモーターエレメントを意味する。例えば、プロモータ
ー配列中の異種調節エレメントは、プロモーター調節を強化するために付加した異なるプ
ロモーターの調節／制御エレメント、又は該同一プロモーターの付加的調節エレメントで
あってよい。
【００２５】
本明細書で使用するように、用語「相同体」は、「相同分子種」及び「パラログ（para
logue）」に包括的である。
用語「宿主植物」は、線虫病害の対象植物をさす。
本明細書で使用するように、熟語「発現を誘導する」は、特定の遺伝子を含む細胞を、
エフェクター又は誘導試薬若しくは誘導条件へと曝すことによって、特定遺伝子の転写及
び／又は翻訳の量若しくは速度を増加させることを意味する。
【００２６】
「誘導因子」は、細胞集団に適用した場合に、特定の遺伝子からの転写量を増加させる
、化学物質又は物理的作用剤である。これらは通常、効果が特定のオペロン又は遺伝子群
に特異的な小分子であり、糖類、リン酸、アルコール、金属イオン、熱、冷却などを含み
得る。例えば、イソプロピル（ベータ）−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及び
ラクトースは、ｔａｃＩＩプロモーターの誘導因子であり、Ｌ−アラビノースは、アラビ
ノースプロモーターの適切な誘導因子である。
【００２７】
本明細書に記載される様々な組成物を記載するために使用される場合、用語「単離され
た」は、その自然環境の構成要素から同定並びに分離及び／又は回収された物質を意味す
る。例えば、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチドは、天然には会合する少なく
とも１つの構成要素との会合がない。自然環境からの混入成分は通常、該ポリペプチド又
はポリヌクレオチドの診断的使用若しくは治療的使用に干渉する物質であり、酵素、及び
他のタンパク質性溶質又は非タンパク質性溶質を含み得る。単離物質は、組換え細胞内の
インサイチュウ（in situ）物質を含む。しかしながら通常、単離物質は、少なくとも１
精製工程で調製する。
【００２８】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、通常は天然資源と会合する、少なく
とも１つの混入核酸分子から同定及び分離された核酸分子である。単離核酸が例えば、自
然に会合する全ての構成要素と会合することはあり得ない。単離核酸分子は、自然界に見
出される形態又は設定以外である。
「ＩＰＴＧ」は、化合物「イソプロピル（ベータ）−Ｄ−チオガラクトピラノシド」で
あり、かつ本明細書でｌａｃオペロンの誘導因子として使用する。ＩＰＴＧは、ｌａｃリ
プレッサーの立体構造変化に影響を与えるｌａｃリプレッサーに結合し、ｌａｃオペレー
ターからｌａｃリプレッサーの解離をもたらす。ｌａｃリプレッサーがはずれると同時に
、機能的に連結させたプロモーターが活性化され、下流遺伝子が転写される。
【００２９】
用語「ｌａｃオペレーター」は、例えばJacobらの論文, 1961, J. Mol. Biol., 3: 318
-356に記載される、ｌａｃリプレッサーであるｌａｃＩが結合し得る核酸配列をさす。プ
ロモーターは、ｌａｃリプレッサーがｌａｃオペレーターに結合している場合には活性化
しない。ｌａｃリプレッサーがｌａｃオペレーターからの解離を誘導された場合に、該プ
ロモーターは活性化される。
【００３０】
用語「リーダー配列」は、興味あるコード配列の上流に位置する核酸配列である。本明
細書に記載するリーダー配列は、効率的にリボソームに結合することが知られている特定
の配列を含み、それゆえいくつかのポリヌクレオチドの転写開始のより高い効率をもたら
す。
本明細書で使用するように、用語「哺乳動物」は、ヒト、家畜（domestic animal）及
び家畜（farm animal）、並びにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの動物園動物、スポーツ用
動物又は愛玩動物を含む、哺乳動物として分類される全ての動物をさす。例えば、哺乳動
物はヒトであり得る。
【００３１】
用語「線虫の食道腺、又は線虫の食道腺細胞」は、３個の転写的に活性な腺細胞、すな
わち線虫の食道に位置する、１個の背側の腺細胞及び２個の亜腹側の腺細胞をさし、これ
らはクキセンチュウ目及びヨウセンチュウ目の植物寄生線虫による植物の感染及び寄生に
関与する分泌物（寄生タンパク質）の主要な源である。
機能的関連性を有する別の核酸配列に位置した場合、核酸配列又はポリヌクレオチドは
「機能的に連結される」。例えば、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として
発現させる場合、プレ配列ＤＮＡ又は分泌リーダーＤＮＡを、該ポリペプチドのＤＮＡに
機能的に連結させ；コード配列の転写に影響を与えさせる場合、プロモーター又はエンハ
ンサーを、機能的に該コード配列に連結させ；又は転写を促進させるために位置させる場
合、リボソーム結合部位を、機能的にコード配列に連結させる。一般的に、「機能的に連
結された」は、連結されたＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーである場合には連続
的かつ読み枠内にあることを意味する。連結は、適切な制限酵素認識部位での連結反応に
よって達成可能である。そのような部位が存在しない場合、慣習に従って、オリゴヌクレ
オチドアダプター又はリンカーを使用する。
【００３２】
用語「相同分子種」は、複数種中における同じ遺伝子の分離出現（separate occurrenc
e）をさす。該分離出現は、同一ではないが、似たアミノ酸配列を有し、配列類似度の程
度は、同遺伝子を有する共通祖先からの該種の進化距離に部分的に依存する。
本明細書で使用するように、用語「パラログ」は、ある種の遺伝子の分離出現を示す。
該分離出現は、同一ではないが、似たアミノ酸配列を有し、配列類似度の程度は、該分離
出現が生じた遺伝子重複という出来事からの進化距離に部分的に依存する。
【００３３】
用語「寄生タンパク質、寄生ポリペプチド、食道のポリペプチド、又は線虫の食道腺細
胞分泌型ポリペプチド」は、植物への線虫の寄生に関与する主要分子、植物寄生線虫の食
道腺細胞で発現する寄生遺伝子産物、及び探針を介して宿主組織へと注入されて植物への
寄生を仲介する産物をさす。
「パーセント（％）核酸配列同一性」は、候補配列中において、必要であれば該配列の
整列及び間隙の導入後、最大パーセントの配列同一性を達成する、参照核酸配列中のヌク
レオチドに同一なヌクレオチドのパーセンテージとして定義する。パーセント核酸配列同
一性を測定する目的での整列は、当業者に周知の様々な方法、例えば、BLAST、BLAST-2、
ALIGN、ALIGN-2又はMegalign (DNASTAR社)ソフトウエアなどのコンピュータソフトウエア
を使用して達成できる。比較配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な全てのア
ルゴリズムを含む、整列測定用の適切な変数は、既知の方法で決定可能である。
【００３４】
本明細書の目的上、所与の核酸配列Ｄへの所与の核酸配列Ｃの％核酸配列同一性、該核
酸配列Ｄとの所与の核酸配列Ｃの％核酸配列同一性、又は該核酸配列Ｄに対する所与の核
酸配列Ｃの％核酸配列同一性（これは代替的に、所与の核酸配列Ｄへの特定の％核酸配列
同一性、該核酸配列Ｄとの特定の％核酸配列同一性、又は該核酸配列Ｄに対する特定の％
核酸配列同一性を有する若しくは含む所与の核酸配列Ｃと表現することも可能である）は
、以下のように計算する：
分数Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは、Ｃ及びＤのプログラム整列という点で、配列整列プログラムによって完
全一致として得点化されたヌクレオチドの数であり、ＺはＤ中のヌクレオチドの総数であ
る。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、ＤへのＣの％核酸配列同一
性が、ＣへのＤの％核酸配列同一性と等しくないことは理解される。
【００３５】
用語「植物」は、その最も広い意味で用いる。用語「植物」は、これらには限定されな
いが、木本、観賞植物（ornamental plant）又は観賞植物（decorative plant）、作物植
物又は穀物植物、果物又は野菜、及び光合成緑藻類（例えば、クラミドモナス・レインハ
ードティ（Chlamydomonas reinhardtii））の全ての種を含む。用語「植物」はまた、任
意の植物の発達段階に存在する構造へと大部分が分化する、複数の植物細胞をさす。その
ような構造は、これらには限定されないが、果実、芽、茎、葉、花びらなどを含む。用語
「植物組織」は、培養細胞（例えば、単一細胞、原形質体、胚、カルスなど）に加え、根
、芽、葉、花粉、種子及び癌腫に存在する、植物の分化組織及び未分化組織を含む。植物
細胞は、植物体、器官培養、組織培養、又は細胞培養であってよい。本明細書で使用する
用語「植物部位」は、植物構造、植物器官、又は植物組織をさす。
【００３６】
非天然存在型植物は、ヒトの介入なしでは自然界で発生しない植物をさす。非天然存在
型植物は、遺伝子組換え植物、及び植物育種などの非遺伝子組換え手段によってもたらさ
れた植物を含む。
用語「植物細胞」は、植物の構造単位及び生理的単位をさし、原形質体及び細胞壁を含
む。植物細胞は、単離単一細胞又は培養細胞、若しくは例えば、植物組織、植物器官、又
は植物体全体などの、高度に組織化された単位の一部の形態であってよい。
【００３７】
用語「植物細胞培養」は例えば、原形質体、細胞培養細胞、植物組織、花粉、花粉管、
胚珠、胚嚢、接合体、及び様々な発生段階の胚の細胞などの、植物単位の培養物をさす。
用語「植物素材」は、葉、茎、根、花又は花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、
切花、培養細胞又は培養組織、若しくは植物の任意の他の部分又は産物をさす。
「植物器官」は、根、茎、葉、花芽、又は胚などの、植物の明瞭な可視的構造的部分及
び分化部分をさす。
【００３８】
「植物組織」は、構造単位及び機能単位へと組織化された植物細胞群をさす。植物体又
は培養体のどちらの植物組織も含む。用語「植物組織」は、これらには限定しないが、植
物体全体、植物器官、植物種子、植物培養物、並びに構造単位及び／又は機能単位へと組
織化された任意の植物細胞群を含む。先に一覧した植物組織の任意の特定の型、若しくは
この定義に包含される他の植物組織の任意の特定の型との関連又はその不在におけるこの
用語の使用は、任意の他の植物組織の型を排除する意図をもたない。
【００３９】
「プラスミド」は、大文字及び／又は数の前並びに／若しくは後の小文字「ｐ」で指定
する。本明細書でのプラスミドの開始は、市販されており入手可能な非制限的基盤、又は
公開手順に従って利用可能なプラスミドから構築し得るもの、のいずれかである。さらに
、記載したものに等価なプラスミドは当業者に既知であり、かつ当業者に明白である。
【００４０】
本明細書で使用するように、「ポリペプチド」は一般的に、約１０個のアミノ酸を有す
るペプチド及びタンパク質をさす。該ポリペプチドは、「異種」、すなわち、細菌細胞に
よって産生されるヒトポリペプチドなどの、該宿主植物が利用するのとは別のものを意味
する「外来性」であり得る。
「霊長類」は、ヒト、類人猿、サル、並びにキツネザル及びメガネザルなどの関連種を
含む、任意の哺乳動物目を意味するように解釈する。
【００４１】
用語「プロモーター」は、典型的には様々なエレメントと連動して、遺伝子又はタンパ
ク質コード配列の発現の制御に関与する、遺伝子又はタンパク質コード配列の上流（５'
）に位置する制御核酸配列をさす。本開示の構築物における使用に適するプロモーターは
、発明のポリヌクレオチドを発現させるために使用する植物体内及び宿主生物体内で機能
する。多くの植物性プロモーターが公的に知られている。プロモーターは、構成的プロモ
ーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター及び細胞特異的プロモーター、並
びに発生的に制御されたプロモーターを含む。典型的プロモーター並びに融合プロモータ
ーは、例えば引用によってその全てが本明細書に組み込まれる米国特許第6,717,034号に
記載される。
【００４２】
「精製」は、組成物から少なくとも１つの混入を（完全に、又は部分的に）除去するこ
とによって、該組成物中の物質の純度を高めることを意味する。「精製工程」は、「本質
的に純粋な」組成物を生じさせる、精製工程全体の一部であってよい。本質的に純粋な組
成物は、該組成物の総重量に基づき、興味ある物質重量の少なくとも約９０％を含み、か
つ重量の少なくとも約９５％を含み得る。
【００４３】
用語「制御エレメント」又は「調節エレメント」は、転写開始を制御するＤＮＡ配列を
さす。調節エレメント又は制御エレメントの例は、これらには限定されないが、ＴＡＴＡ
ボックス、オペレーター、エンハンサーなどを含む。制御エレメント又は調節エレメント
は、負の調節エレメント及び正の調節エレメントを含む。負の調節エレメントは、活性化
のために削除されるものである。多くのそのような負の調節エレメントが知られており、
例えばオペレーター／リプレッサーシステムがある。例えば、ＩＰＴＧのｌａｃリプレッ
サーへの結合は、ｌａｃオペレーターから解離して転写を活性化及び許可する。他の負の
エレメントは、大腸菌（E. coli）のｔｒｐ及びラムダシステムを含む。正の調節エレメ
ントは、活性化のために付加されるものである。多くのそのような正の調節エレメントが
知られている。
【００４４】
正の制御エレメント及び負の制御エレメントの両方を天然に含むプロモーターは稀であ
る。ｍｅｔＥプロモーターが１つの例である。例えば、Neidhardt編, 1996, 『大腸菌と
サルモネラ菌』, 第２版, １３００〜１３０９ページ目を参照されたい。既知の正の調節
エレメント及び負の調節エレメントの解説は、例えばこの参考文献中に見出すことができ
る。プロモーターの追加制御を達成するための、プロモーター内又はそれに近接する正の
調節エレメント又は負の調節エレメントの位置は既知であり、例えば『大腸菌とサルモネ
ラ菌』（上記参照）の１２３２〜１２４５ページ目に記載される。
【００４５】
小さなＲＮＡ分子は一般的に、２００ヌクレオチド未満の長さの一本鎖ＲＮＡ分子又は
二本鎖ＲＮＡ分子である。そのような分子は一般的に１００ヌクレオチド未満であり、通
常１０〜１００ヌクレオチドの長さで変化する。好ましい形式において、小さなＲＮＡ分
子は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２
３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドを有する。小さなＲＮＡ
は、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。ｍｉＲＮ
Ａは、Ｄｉｃｅｒ様酵素による、短いステム−ループ前駆体の切断によって産生される。
一方、ｓｉＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡ分子の切断によって産生される。ｍｉＲＮＡは一
本鎖であるが、ｓｉＲＮＡは二本鎖である。
【００４６】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、非毒性の短い二本鎖ＲＮＡである、低分子干渉ＲＮＡを意味す
る。一般的に、毒性を示さないｓｉＲＮＡの長さの特別な制限はない。「ｓｉＲＮＡ」は
、例えば、１５〜４９ｂｐ、好ましくは１５〜３５ｂｐ、及びより好ましくは２１〜３０
ｂｐの長さであり得る。あるいは、発現するｓｉＲＮＡの最終転写産物の二本鎖ＲＮＡ部
分が、例えば、１５〜４９ｂｐ、好ましくは１５〜３５ｂｐ、及びより好ましくは２１〜
３０ｂｐの長さであり得る。２本のＲＮＡ鎖が対合するｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ部分は
、完全にもう一方と対を形成することには限定されず、ミスマッチ（該対応ヌクレオチド
が相補的でない）、バルジ（一方の鎖の対応する相補的ヌクレオチドが欠如する）などの
による非対合部分を含んでよい。非対合部分は、ｓｉＲＮＡ形成を妨げない程度に含ませ
ることができる。本明細書で使用する「バルジ」は、好ましくは１〜２の非対合ヌクレオ
チドを含み、かつ２本のＲＮＡ鎖が対合するｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域は、好ましく
は１〜７個、より好ましくは１〜５個のバルジを含む。さらに、本明細書で使用する「ミ
スマッチ」は、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個で、２本のＲＮＡ鎖が対合
するｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域内に含まれる。好ましいミスマッチにおいて、一方の
ヌクレオチドはグアニンであり、該他方はウラシルである。そのようなミスマッチは、セ
ンスＲＮＡに対するＤＮＡコードにおける、ＣからＴ、ＧからＡへの変異、又はこれらの
混合のためであるが、これらに限定されない。さらに、本発明において、２本のＲＮＡ鎖
が対合するｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域は、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜
５個の数までの和のバルジ及びミスマッチを含んでよい。
【００４７】
ｓｉＲＮＡの末端構造は、ｓｉＲＮＡが、そのＲＮＡｉ効果によって、標的遺伝子の発
現を静め、低減させ、又は阻害する長さの平滑末端若しくは付着末端（突出末端）のいず
れかであり得る。付着末端（突出末端）構造は３'突出末端のみには限定されず、ＲＮＡ
ｉ効果を誘導し得る長さの５'突出末端構造を含んでよい。さらに突出末端ヌクレオチド
の数は、すでに報告されている２個又は３個には限定されず、ＲＮＡｉ効果を誘導し得る
任意の長さの突出末端であり得る。例えば、該突出末端は、１〜８個、好ましくは２〜４
個のヌクレオチドからなる。本明細書において、付着末端構造を有するｓｉＲＮＡの総長
は、対合した二本鎖部分の長さの合計として発現し、その対は両末端に、突出末端一本鎖
を含む。例えば、両末端に４ヌクレオチドの突出末端を有する、１９ｂｐの本鎖ＲＮＡ部
分の場合、その総長は、２３ｂｐとして発現する。さらに、突出末端配列は標的遺伝子に
対して低い特異性を有するため、該突出末端配列は、必ずしも標的遺伝子配列に対して相
補的（アンチセンス）又は同一（センス）ではない。さらに、ｓｉＲＮＡが該標的遺伝子
にその遺伝子抑制効果を維持することができる限り、ｓｉＲＮＡは、例えばその片末端の
突出末端部分で、低分子量ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ又はウイルスＲＮＡ、若しくは人
工ＲＮＡ分子などの天然型ＲＮＡ分子であってよい）を含んでよい。
【００４８】
さらに、「ｓｉＲＮＡ」の末端構造は、必ずしも先に記載したような両末端のカットオ
フ構造ではなく、二本鎖ＲＮＡの片側の末端がリンカーＲＮＡに連結しているステム−ル
ープ構造を有してもよい。二本鎖ＲＮＡ領域（ステム−ループ部分）の長さは、例えば、
１５〜４９ｂｐ、好ましくは１５〜３５ｂｐ、及びより好ましくは２１〜３０ｂｐ長であ
り得る。あるいは、発現したｓｉＲＮＡの最終転写産物である二本鎖ＲＮＡ領域の長さは
、例えば、１５〜４９ｂｐ、好ましくは１５〜３５ｂｐ、及びより好ましくは２１〜３０
ｂｐ長である。さらに、ステム部分の対合を妨げないような長さを有するリンカーの長さ
に、特別な制限はない。例えば、ステム部分の安定的対合、及び該部分をコードするＤＮ
Ａ間での組換えの抑制に関して、リンカー部分は、クローバ葉ｔＲＮＡ構造を有してよい
。リンカーは、たとえステム部分の対合を妨げる長さを有していたとしても、例えば、前
駆体ＲＮＡから成熟ＲＮＡへのプロセシングの間に切除され得るイントロンを含むリンカ
ー部分を構築することが可能であり、それによって該ステム部分の対合が可能となる。ス
テム−ループｓｉＲＮＡの場合、ループ構造をもたないＲＮＡのどちらかの末端（頭部又
は尾部）は、低分子量ＲＮＡを有してよい。先に記載したように、この低分子量ＲＮＡは
、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ又はウイルスＲＮＡなどの天然ＲＮＡ分子、若しくは人工ＲＮＡ分
子であってよい。
【００４９】
「シグナルペプチド」は、タンパク質の翻訳後輸送を指示する短い（１５〜６０アミノ
酸長）ペプチド鎖をさし、通常該ペプチドを、細胞の分泌経路へと指示する。
「形質転換された」、「遺伝子組換え」、「形質移入された」及び「組換え」は、異種
核酸分子を導入された細菌又は植物などの宿主植物をさす。該核酸分子は、該宿主のゲノ
ム中に安定的に組み込むことができ、又は該核酸分子はまた、染色体外分子として存在し
得る。そのような染色体外分子は自己複製可能である。形質転換細胞、形質転換組織、又
は形質転換植物は、形質転換工程の最終産物のみならず、その遺伝子組換え子孫を含むこ
とは理解される。「非形質転換」宿主、「非遺伝子組換え」宿主又は「非組換え」宿主は
、野生型の生物体、例えば、異種核酸分子を含まない細菌又は植物をさす。
【００５０】
「形質転換細胞」は、例えば分子生物学的手法によって、核酸分子を導入された細胞を
さす。本明細書で使用するように、用語「形質転換」は、核酸分子を、そのような細胞、
植物細胞又は動物細胞に導入し得る全ての手法を含み、それらはウイルスベクターを用い
た形質移入、アグロバクテリウムによる形質転換、プラスミドベクターを用いた形質転換
、及び電子穿孔法、リポフェクション、及びパーティクルガン加速による裸ＤＮＡの導入
を含み、かつ安定的形質転換体と同様に、一過性形質転換体も含む。
【００５１】
用語「遺伝子組換え植物」は、一般的にこの型の植物又は樹木には見出されず、かつ人
為的操作によって問題の植物（又は該植物前駆体）へと導入される組換え遺伝物質を含む
植物又は樹木をさす。それゆえ、形質転換によって組換えＤＮＡを導入した植物細胞から
成長した植物は遺伝子組換え植物であり、同様に導入遺伝子（有性生殖的産生又は無性生
殖的産生に関わらず）を含む植物の全ての子孫である。用語「遺伝子組換え植物」は、植
物体全体又は樹木全体、及び、例えば、子実、種子、花、葉、根、果実、花粉、茎などの
、植物又は樹木の一部を含むことは理解される。
【００５２】
用語「翻訳開始エンハンサー配列」は、本明細書で使用するように、遺伝子の翻訳開始
部位及び効率を決定できる核酸配列をさす（例えば、McCarthyらの論文, 1990, Trends i
n Genetics, 6: 78-85を参照されたい）。翻訳開始エンハンサー配列を拡張し、リボソー
ム結合部位の５'及び３'配列を含ませることができる。リボソーム結合部位は、最小限で
、シャイン・ダルガノ領域及び開始コドン、さらにその間の任意の塩基を含むものと定義
される。さらに、翻訳開始エンハンサー配列は、非翻訳領域又はシストロンの上流末端、
及びそれゆえ翻訳終止コドンを含み得る。例えば、米国特許第5,840,523号を参照された
い。
【００５３】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチド配列を宿主細胞へと導入するために使用する核
酸分子をさし、それによって形質転換宿主細胞を産生する。「ベクター」は、先に記載し
た遺伝的構築物、例えば、複製開始点（群）、選択可能な標識遺伝子、及び当業者に知ら
れている他の遺伝因子（例えば、遺伝物質を宿主細胞のゲノム中へと組み込むための配列
など）などの、１以上の宿主細胞内で複製可能な１以上の核酸配列に加えて、遺伝物質を
含んでよい。
【００５４】
（２．典型的な実施態様）
（線虫耐性遺伝子組換え植物）
１以上の線虫寄生遺伝子を下方調節することによって線虫の摂食サイクルを妨害するこ
とは、植物における線虫病害を低減、防止又は治療するのに効果的な方法であることが発
見されている。線虫寄生遺伝子は、腺細胞から、線虫の探針を介して宿主組織へと放出さ
れることで搬出される分泌タンパク質をコードする、食道腺細胞中で発現する遺伝子をさ
す。特に、宿主植物中の分化した摂食細胞形成に関連する、線虫によって分泌されるタン
パク質の発現を妨害することは、植物における線虫病害を低減予防又は治療するのに効果
的な方法であることが発見されている。例えば、阻害性ＲＮＡを用いて標的化され得る分
泌タンパク質をコードする代表的な寄生遺伝子は、表２に記載する遺伝子又はそれらのフ
ラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
線虫病害は、価値ある作物の実質的損失をもたらす。根瘤線虫であるメロイドジーン（
Meloidogyne）種は、自然界で最も成功した寄生生物である。メロイドジーン種は、様々
な植物科の２，０００種を超える植物種に寄生し、世界的な作物生産への大変な脅威を象
徴する。これらの生体栄養性病原体はそれらの宿主と、高度に特殊化し複雑化した摂食関
係をもって進化してきた。成功的な線虫−宿主相互作用は、植物の根細胞を直接的に又は
間接的に修飾する、該寄生生物から巨細胞と呼ばれる複雑な摂食細胞への分子シグナルを
必要とし、該巨細胞は、線虫の発育及び繁殖に必要とされる栄養素の唯一の供給源である
。植物−寄生線虫は、摂食時に、中空の突起可能な探針を介して植物細胞内にタンパク質
性分泌物を放出する。これらの分泌物はパラサイトーム（parasitome）と総称され、大き
く、かつ転写的に活性な食道腺細胞で発現する寄生遺伝子群によってコードされる。（Da
vis, E. L.、R. Allen、及びR. S. Husseyの論文 1994『メロイドジンインコグニタの探
針分泌物中の食道腺抗原の発育的発現とそれらの検出』Fundam. Appl. Nematol. 17:255-
262；Hussey, R. S.、E. L. Davis、及びT. J. Baum. 2002 『分泌の秘密：植物の線虫寄
生を制御する遺伝子群』Braz. J. Plant Physiol. 14:183-194）。メロイドジン種によっ
て誘導され巨細胞を形成する著しい細胞性修飾は、宿主の根細胞の遺伝子発現及び表現型
の変化の結果であり、これは線虫の探針を介して分泌される分子シグナルによって駆動さ
れる。
【００５６】
一実施態様は、１以上の線虫寄生遺伝子の１以上のｍＲＮＡに特異的な１以上の阻害性
ＲＮＡを含む植物又は細胞を提供する。例えば、本開示は、１以上の阻害性ＲＮＡが線虫
に吸収又は摂取された場合に線虫寄生遺伝子発現を下方調節する、１以上の阻害性ＲＮＡ
を発現する遺伝子組換え植物を提供する。遺伝子組換え植物を設計し、少なくとも２種の
異なる線虫、例えば２種の異なるＲＫＮにおける標的寄生遺伝子転写産物を下方調節する
阻害性ＲＮＡを発現させることができる。別の実施態様は、３、４、５、６、７、８、９
、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の
線虫種、例えばＲＫＮ種における標的寄生遺伝子転写産物を下方調節する阻害性ＲＮＡを
含む遺伝子組換え植物を提供する。それゆえ本開示は、複数のＲＫＮ種によって引き起こ
される病害に抵抗性である遺伝子組換え植物を提供する。
【００５７】
別の実施態様は、全てのＲＫＮ種、例えば許容される範囲で引用によってその全てが組
み込まれるJepson, S. B.の文献 1987『根瘤線虫（メロイドジン種）の同定』C. A. B. I
nternational, Oxford, United Kingdom. 1-265頁において言及される、所定量で、ＲＫ
Ｎ種に抵抗性を有する植物を提供するのに効果的な、１以上の線虫寄生遺伝子に特異的な
阻害性ＲＮＡを含む遺伝子組換え植物を提供する。
【００５８】
別の実施態様は、寄生線虫の１以上の分泌型ポリペプチドをコードする核酸の少なくと
も一部に特異的な１以上の阻害性核酸を含む又は発現している、遺伝子組換え植物又は遺
伝子組換え細胞を提供する。該阻害性核酸は典型的には、線虫の食道腺細胞タンパク質又
はポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的な小さな阻害性ＲＮＡ又はミクロＲＮＡで
ある。該阻害性核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの組み合わせであり得ることは、当業
者に十分に理解されるであろう。さらに、該阻害性核酸は一本鎖又は複数鎖であってよく
、並びにアンチセンス又は酵素的であってよい。一実施態様において、該阻害性核酸は、
標的ｍＲＮＡの転写を干渉、阻害又は低減させる。例えば、該阻害性核酸は標的ｍＲＮＡ
に結合することができ、該標的ｍＲＮＡの分解を誘導又は強化し、又は該標的ｍＲＮＡの
翻訳から機能的タンパク質への細胞性翻訳機構を物理的に阻害する。該分泌型ポリペプチ
ドの阻害は、コントロール、例えば該阻害性核酸を含まない又は発現しない植物又は細胞
に比較することができる。「コントロール」は、該コントロールサンプルが該阻害性核酸
を含まない又は発現しないことを除くすべての点で、開示する阻害性核酸を含むサンプル
と同一であることが既知である材料のサンプルをさす。
【００５９】
用語「食道腺細胞タンパク質又はポリペプチド」は、線虫寄生遺伝子によってコードさ
れる分泌型ポリペプチドをさす。一実施態様において、下方調節すべき食道腺細胞タンパ
ク質又はポリペプチドは一般的に、少なくとも１つの宿主植物遺伝子の発現を調節する分
泌タンパク質である。開示する組成物及び方法で下方調節される典型的線虫ポリペプチド
は、配列番号：１、２又は５〜５１、若しくはそれらのフラグメントによってコードされ
るポリペプチド又はフラグメントを含むが、これらに限定されない。該分泌型ポリペプチ
ドは、直接的に又は間接的に、宿主植物遺伝子の発現を増加又は減少させることができる
。例えば、直接的な調節は、食道腺細胞タンパク質又はポリペプチドが、ゲノムＤＮＡ、
ＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む宿主植物核酸に結合する場合に起こり得る。間接的な調節は、
例えば該ポリペプチドが１以上の他のタンパク質又は因子と結合して複合体を形成する場
合に起こり得る。該複合体はそれから宿主植物核酸に結合し、転写又は翻訳を強化あるい
は抑制することができる。該分泌タンパク質の下方調節は、線虫病害に関連する少なくと
も１つの症状を緩和又は低減させる。線虫病害の典型的な症状は、瘤、巨細胞、病斑、成
長阻害、栄養及び水分欠乏の形成、立ち枯れ、並びに植物に感染する多数の線虫の形成を
含むが、これらに限定されない。遺伝子組換え植物又は細胞における線虫病害レベルの低
減又は阻害は、コントロールの植物又は細胞における線虫病害レベルに比較することがで
きる。一実施態様において、該阻害性核酸は、線虫病害を低減、阻害、緩和、治療又は予
防する。
【００６０】
別の実施態様において、下方調節すべき食道腺細胞タンパク質又はポリペプチドは、巨
細胞の形成に関与する寄生遺伝子によってコードされる。さらに他の実施態様において、
該標的寄生遺伝子は、根組織を介する線虫遊走に関与するポリペプチド又は核酸をコード
し、細胞の代謝を変化させ、該受容細胞内のシグナル転換を誘発させるか、又は線虫が巨
細胞を摂食することを可能にさせる栄養管を形成する。さらに、該食道腺細胞タンパク質
又はポリペプチドは細胞壁修飾をもたらす可能性があり、細胞外空間におけるシグナル転
換受容体と潜在的に相互作用し、細胞の代謝、細胞周期、選択的タンパク質分解、限局的
防御反応、及び該植物細胞核内の制御活性に影響を与え得る。
【００６１】
該食道腺細胞タンパク質又はポリペプチドによって調節される典型的な植物遺伝子は、
巨細胞としても知られる特異的線虫接触細胞の形成に関与する遺伝子群を含むが、これら
に限定されない。例えば、線虫寄生遺伝子16D10は、スケアクロウ様（scarecrowlike）転
写制御因子に結合するタンパク質をコードする。線虫の食道腺細胞ポリペプチドによって
調節され得る代表的植物遺伝子は、これらに限定されないが、WUN1、POX、CAT、GST、Mia
-1、Mia-2、Mia-3、Mia-4、CHS1-CHS3、LOX、キチナーゼ、トリプシン阻害剤、ミラクリ
ン、HMGR、TSW12、LEA14、LEMMI9、C6-19、C27-45、TAS14、UBCDB#103、RPE、ISDGh、IPP
P、LPPL、mUCp、内膜タンパク質、20sプロテアソーム、DAPデカルボキシラーゼ、GRP、EN
OD40、ATAO1又はそれらの組み合わせを含む（許容可能な範囲でその全てが引用によって
組み込まれるGheysen, G.及びFenoll, C.の論文 2002. Annual Review of Phytopatholog
y 40:191）。一般的に、植物遺伝子は、根細胞の増殖、根細胞の分裂、又は該寄生線虫に
よって摂食される特定の栄養素の産生に直接的又は間接的に関与する。該遺伝子は、該植
物の根細胞又は他の全ての細胞で発現し得る遺伝子である。
【００６２】
一実施態様において、標的の線虫分泌タンパク質の発現は、該阻害性核酸が線虫に送達
された場合に、コントロールに比較して低減、阻害又は妨害される。該阻害性核酸の送達
は例えば、線虫が該遺伝子組換え植物又は細胞を摂食する場合と同様、線虫が入って該阻
害性核酸と接触した場合に達成され得る。線虫は摂食中に該阻害性核酸を消化することが
でき、若しくは該核酸は能動輸送又は受動核酸によって該線虫の細胞膜を通って輸送され
得る。該阻害性核酸は、線虫による該阻害性核酸の取り込みを誘導又は強化する作用物質
との組み合わせ若しくは該作用物質と交互に該線虫に送達可能であることは理解される。
典型的な誘導剤は、レゾルシノール（３−ヒドロキシフェノール）を含むが、これに限定
されない。
【００６３】
一実施態様において、該遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え細胞は、該阻害性核酸が線
虫に送達された場合に、該線虫の線虫食道腺細胞ポリペプチド又はタンパク質の発現を調
節するのに効果的な量で、該阻害性核酸を発現する。遺伝子組換え植物又は細胞における
該阻害性核酸の発現レベルは、例えば強力なプロモーター又は構成的に活性なプロモータ
ーを有するベクター、高コピー数のベクターなどの当業者に既知の方法を使用して制御可
能である。植物又は細胞は、安定的に又は一時的に形質移入するさせることができる。
【００６４】
典型的な寄生線虫は、根瘤線虫としても言及されるネコブ線虫類のメンバーを含むが、
これらに限定されない。代表的な種は、Ｍ．アレナリア、Ｍ．インコグニタ、Ｍ．ジャバ
ニカ、Ｍ．ハプラ、Ｍ．チットウッディ及びＭ．ナアシを含むが、これらに限定されない
。
宿主植物の代表的な系統生物学的科は、これらに限定されないが、キツネノマゴ科、カ
エデ科、マタタビ科、リュウゼツラン科）、ザクロソウ科、ヒユ科、バンレイシ科、セリ
科、キョウチクトウ科、サトイモ科、ウコギ科、ヤシ科、ウマノスズクサ科、ツリフネソ
ウ科、バーリングトニア科（Barringtoniaceae）、ツルムラサキ科、メギ科、カバノキ科
、ノウゼンカズラ科、ベニノキ科、キワタ科、ムラサキ科、ツゲ科、ビットネリア科（By
ttneriaceae）、サボテン科、カエサルピニア科（Caesalpiniaceae）、カンナ科、フウチ
ョウソウ科、スイカズラ科、パパイア科、ナデシコ科、モクマオウ科、ニシキギ科、アカ
ザ科、クロランサ科（Chloranthaceae）、ツユクサ科、ヒルガオ科、ミズキ科、コリラ科
（Corylaceae）、ベンケイソウ科、ウリ科、ヒノキ科、ヘゴ科、カヤツリグサ科、ダティ
ス科（Datiscaceae）、ビワモドキ科、ヤマノイモ科、マツムシソウ科、カキノキ科、ツ
ツジ科、トウダイグサ科、マメ科（Fabaceae）、イイギリ科、ケマンソウ科、リンドウ科
、フウロソウ科、イワタバコ科、ギンクゴア科（Ginkgoaceae）、グーデニア科（Goodeni
aceae）、オトギリソウ科、ヘモドラ科（Haemodoraceae）、マンサク科、オウムバナ科、
ハゼリソウ科、ハイペリカ科（Hypericaceae）、アヤメ科、クルミ科、イグサ科、シソ科
植物（Labiatae）、シソ科（Lamiaceae）、クスノキ科、ユリ科、アマ科、ロベリア科（L
obeliaceae）、フジウツギ科、ミソハギ科、モクレン科、キントラノオ科、アオイ科、ク
ズウコン科、ノボタン科、センダン科、ツヅラフジ科、ネムノキ科、クワ科、バショウ科
、ハマジンチョウ科、ヤマモモ科、ニクズク科、フトモモ科、オシロイバナ科、モクセイ
科、アカバナ科、ラン科、オスナ科（Othnaceae）、カタバミ科、ペオニア科（Paeoniace
ae）、タコノキ科、ケシ科、ゴマ科、ヤマゴボウ科、マツ科、コショウ科、ピットスポラ
科（Pittosporaceae）、オオバコ科、スズカケノキ科、イソマツ科、イネ科、カワゴケソ
ウ科、ハナシノブ科、ヒメハギ科、スベリヒユ科、サクラソウ科、ヤマモガシ科、ザクロ
科、キンポウゲ科、モクセイソウ科、クロウメモドキ科、バラ科、アカネ科、ミカン科、
ヤナギ科、ビャクダン科、ムクロジ科、サラセニア科、ユキノシタ科、ゴマノハグサ科、
サルトリイバラ科、ナス科、アオギリ科、エゴノキ科、ギョリュウ科、スギ科、テトラゴ
ニア科（Tetragoniaceae）、ツバキ科、テオフラスタ科、ジンチョウゲ科、シナノキ科、
ノウゼンハレン科、ターネラ科（Turneraceae）、ガマ科、ニレ科、イラクサ科、オミナ
エシ科、クマツヅラ科、スミレ科、ブドウ科、ザミア科（Zamiaceae）、ショウガ科又は
ハマビシ科を含む。
【００６５】
本開示に従った阻害性核酸を用いて形質移入させることができる宿主植物の一般名は、
これらに限定されないが、トマト、ナス、ジャガイモ、メロン、キュウリ、ニンジン、レ
タス、チョウセンアザミ、セロリ、ウリ科植物（メロン、スイカなど）、オオムギ、トウ
モロコシ、ピーナッツ、ダイズ、テンサイ、ワタ、ササゲ、マメ類、アルファルファ、タ
バコ、柑橘類、クローバ、コショウ、ブドウ、コーヒー、オリーブ又は茶を含む。
本開示が、５０以上の既知の根瘤線虫種の全てを含むことは、当業者に理解される。
【００６６】
別の実施態様は、１以上の配列番号：１、２又は５〜５１若しくはそれらの相同体によ
ってコードされるポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量で線虫に送達される場合、
例えば該線虫が該阻害性核酸を発現又は含有している植物体又は細胞を摂食する場合、１
以上の配列番号：１、２又は５〜５１又はそれらのフラグメント若しくは相同体によって
コードされるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はそのフラグメントに特異的な阻害性
核酸を有する組成物を提供する。該組成物は、１以上の線虫駆除剤、殺虫剤、殺菌剤又は
それらの組み合わせを含み得る。代表的な線虫駆除剤は、これらに限定されないが、クロ
ロピクリン、臭化メチル、１，３−ジクロロプロペン、メチルジチオカルバミン酸ナトリ
ウム、テトラチオカルバミン酸ナトリウム；及び２−メチル−２−（メチルチオ）プロピ
オンアルデヒド Ｏ−メチルカルバモイルオキシム（アルジカルブ）、２，３−ジヒドロ
−２，２−ジメチル−７−ベンゾフラノール メチルカルバメート（カルボフラン）、２
−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［［（メチルアミノ）カルボニル］オキシ］−２−オキソエ
タンイミドチオ酸メチル（オキサミル）、２−メチル−２−（メチルスルホニル）プロパ
ナール Ｏ−［（メチルアミノ）カルボニル］オキシム（アルドキシカルブ）、Ｏ−［４
−（メチルスルフィニル）フェニル］ホスホロチオ酸Ｏ，Ｏ−ジエチル（フェンスルホチ
オン）、Ｓ，Ｓ−ジプロピルホスホロジチオ酸Ｏ−エチル（エトプロップ）、及びエチル
−３−メチル−４−（メチルチオ）フェニル（１−メチルエチル）ホスホルアミデート（
フェナミホス）などのカルバメート類を含む。
【００６７】
別の実施態様は、ｍＲＮＡ又はそのフラグメントに特異的な阻害性核酸をコードする核
酸を含む細胞を提供し、ここで該核酸は：根細胞の遺伝子発現；根組織を介した線虫の遊
走；細胞の代謝；シグナル転換；を直接的又は間接的に調節する食道腺細胞タンパク質又
はポリペプチドをコードするか、又は線虫が巨細胞の形成に関与する少なくとも１つの植
物遺伝子の巨細胞を摂食するのを可能にさせる栄養管の形成に関与する。さらに、該食道
腺細胞タンパク質又はポリペプチド若しくは食道のポリペプチドは細胞壁修飾を引き起こ
す可能性があり、細胞外空間におけるシグナル転換受容体と潜在的に相互作用し、細胞の
代謝、細胞周期、選択的タンパク質分解、限局的防御反応、及び該植物細胞核内の制御活
性に影響を与え得る。該細胞は原核生物細胞又は真核生物細胞であり得、一般的には植物
細胞、特に根細胞である。
【００６８】
さらに別の実施態様は、線虫病害を低減させるのに十分な量で、該植物体を、１以上の
線虫の食道腺細胞タンパク質に特異的な１以上の阻害性核酸に接触させることによって、
植物体に線虫抵抗性を与える方法を提供し、ここで該１以上の線虫の食道腺細胞タンパク
質は：該植物又は細胞の遺伝子発現；巨細胞の形成；該植物の根組織を介した線虫の遊走
；該植物の細胞代謝；該植物細胞内のシグナル転換の誘発；又は該線虫が該植物に形成さ
れた巨細胞から栄養を得ることを可能にさせる栄養管の形成；を調節する。一態様は、線
虫、特に根瘤線虫によって分泌される食道腺細胞タンパク質に特異的な阻害性核酸を提供
する。該阻害性核酸を該植物に噴霧することが可能であり、又は別の方法で、該阻害性核
酸が寄生線虫と接触して入ることができるように該植物体に送達することができる。
【００６９】
さらに別の実施態様は、該植物体又は植物細胞を摂食する線虫に送達された場合に根瘤
線虫の食道腺細胞タンパク質を下方調節する阻害性核酸、例えばｓｉＲＮＡ又はミクロＲ
ＮＡを含む遺伝子組換え植物又は植物細胞を提供する。ＲＮＡ干渉は当業者に既知である
。例えば、Kreutzerらの文献, ＰＣＴ国際公開公報番号WO 00/44895；Zernicka-Goetzら
の文献, ＰＣＴ国際公開公報番号WO 01/36646；Fireの文献, ＰＣＴ国際公開公報番号WO 
99/32619；Plaetinckらの文献, ＰＣＴ国際公開公報番号WO 00/01846；Mello及びFireの
文献, ＰＣＴ国際公開公報番号WO 01/29058；Deschamps-Depailletteの文献, ＰＣＴ国際
公開公報番号WO 99/07409；Liらの文献, ＰＣＴ国際公開公報番号WO 00/44914；及びTric
kらの文献, US20040098761を参照されたい。
【００７０】
一実施態様において、該線虫は、ダイズシスト線虫ではない。
別の実施態様において、該阻害性核酸は、直接的に胚性致死又は成虫線虫致死ではなく
、線虫の繁殖力にも関与しないが、代わりに該遺伝子組換え植物又は植物細胞を摂食する
又はそれらから栄養を得る能力を阻害する。
いくつかの実施態様において、阻害性二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、「外因性鋳型」
由来である。そのような鋳型は、植物又は線虫のヌクレオチド配列の全体又は一部であっ
てよく；そのような鋳型は、ＤＮＡ遺伝子配列、又は例えば逆転写酵素によって寄生線虫
から単離されたｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡであってよい。該鋳型がＤＮＡ遺伝子配列
の全体又は一部である場合、該鋳型は該遺伝子の１以上又は全てのエキソンであるという
のが好ましい。ｄｓＲＮＡは内因性鋳型又は外因性鋳型由来であるが、該ｄｓＲＮＡを合
成し得る様式への限定ではない。例えば、該ｓｉＲＮＡは、化学的に合成、インビトロ転
写による産生；ＲＮａｓｅＩＩＩファミリー酵素（例えば、Ｄｉｃｅｒ、ＲＮａｓｅＩＩ
Ｉ）による長いｄｓＲＮＡの消化による産生；細胞内でのｓｉＲＮＡ発現プラスミド又は
ウイルスベクターからの発現；又は細胞内でＰＣＲ由来ｓｉＲＮＡ発現カセットから発現
；が可能である。
【００７１】
インビトロ調製したｓｉＲＮＡをそれから、形質移入、電子穿孔法、又は別の方法によ
って細胞へと直接的に導入する。あるいは、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させるＤＮＡを基
盤としたベクター及びカセットでの形質移入が使用可能である。手作業及び／又は自動化
された手順を用いて、インビトロ若しくはインビボでＲＮＡｉを合成してよい。インビト
ロ合成は、化学的合成、又は例えば、該内因性ＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）鋳型の転写用にク
ローン化されたＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）を使用する酵素的合
成、若しくはその両方の混合であってよい。
【００７２】
インビボで、ｄｓＲＮＡを、当業者に周知の組換え技術を使用して合成してよい（例え
ば、Sambrookらの文献、『分子クローニング；研究室マニュアル、第３版（２００１）』
を参照されたい）。例えば、送達されたｄｓＲＮＡ由来のＤＮＡ鋳型を含む発現ベクター
を用いて、細菌細胞を形質転換させることができる。あるいは、例えば遺伝子発現の阻害
を必要とする植物の細胞を、発現ベクター又は他の手段で形質転換してもよい。該鋳型の
１以上のコピーの双方向的な転写は、形質転換細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼ又は該発
現ベクター又は別の発現ベクターによってコードされるクローン化されたＲＮＡポリメラ
ーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）によるものであってよい。発現構築物の使用及び作
成は、当業者に既知である（WO98/32016；米国特許第5,593,874号、第5,698,425号、第57
12,135号、第5,789,214号及び第5,804,693号を参照されたい）。遺伝子発現の阻害は、特
に例えば該ｄｓＲＮＡが該植物細胞内でインビボ合成された場合に、器官、組織又は細胞
型；環境条件（例えば、温度、化学的条件）；及び／又は発育段階又は齢で転写を設計す
ることによって標的化してもよい。また既知の遺伝子送達系を使用して、ｄｓＲＮＡを特
定の組織又は細胞型に送達してもよい。これらの系の構成要素は、種子特異的レクチンプ
ロモーター、及びAPETALA3由来の花特異的プロモーターを含む。これらのベクターは単に
、当業者に利用可能な多くの市販のベクター及び周知のベクターの説明を目的として記載
する。
【００７３】
細胞外で合成した場合、該ＲＮＡを、細胞への導入に先立って精製してよい。精製は、
溶媒（フェノール／クロロホルムなど）又は樹脂を用いた抽出、沈殿（例えばエタノール
中）、電気泳動、クロマトグラフィー、若しくはそれらの組み合わせによるものでよい。
しかしながら、精製はｄｓＲＮＡの損失をもたらす可能性があり、それゆえ最小限又は全
く実施してはならない。該ＲＮＡを貯蔵用に乾燥させてよく、アニーリングを強化させる
緩衝液又は塩を含み得る水溶液中及び／又は該ＲＮＡ鎖の安定化剤に溶解させてもよい。
【００７４】
適切なｄｓＲＮＡはまた、１以上の修飾塩基を含むことができ、又は安定性を向上させ
る若しくは他の目的で修飾骨格を有することが可能である。例えば、天然のＲＮＡのホス
ホジエステル結合を修飾して、少なくとも１個の窒素又は硫黄ヘテロ原子を含んでよい。
さらに２つの例のみを挙げると、イノシンなどの一般的でない塩基、又はトリチル化塩基
などの修飾塩基を含むｄｓＲＮＡが使用可能である。きわめて多様な修飾が既知の多くの
目的に役立つＲＮＡを作ることは、当業者によく理解される。本明細書で使用する用語ｄ
ｓＲＮＡは、内因性鋳型に由来するという条件で、ｄｓＲＮＡの化学的、酵素的又は代謝
的修飾形態を含む。
【００７５】
二本鎖構造は、単独の自己相補的ＲＮＡ鎖、又は２つの別の相補的ＲＮＡ鎖によって形
成されてよい。ＲＮＡ二重鎖形成は、植物細胞の内側又は外側で開始されてよい。
ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖の配列は、該ｄｓＲＮＡに対して十分な標的ｍＲＮＡ
の少なくとも一部に相補的な領域、具体的には該標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする領域
を含む。一実施態様において、ｓｉＲＮＡは実質的に、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部に
同一である。当業者に知られるように、「同一性」は、該配列群を比較することによって
決定される、２以上のポリヌクレオチド（又はポリペプチド）配列間の関連性である。当
業界において、同一性はまた、そのような配列の文字列間の一致によって決定される、ポ
リヌクレオチド配列間での配列の関連性の程度を意味する。同一性は容易に計算できる（
『計算分子生物学』, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York, 1988；『バ
イオコンピューティング：情報科学及びゲノムプロジェクト』, Smith, D. W.編, Academ
ic Press, New York, 1993；『配列データのコンピュータ解析、パートＩ』, Griffin, A
. M.,及びGriffin, H. G.編, Humana Press, N.J., 1994；『分子生物学における配列解
析』, von Heinje, G.の文献, Academic Press, 1987；及び、『配列解析プライマー』, 
Gribskov, M及びDevereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991）。２つのポリヌ
クレオチド配列間の同一性を測定する数多くの方法が存在するが、該用語は当業者に周知
である（『分子生物学における配列解析』, von Heinje, G.の文献, Academic Press, 19
87；『配列解析プライマー』, Gribskov, M及びDevereux, J.編, M Stockton Press, New
York, 1991；及び、Carillo, H.及びLipman, D.の論文, SIAM J. Applied Math., 48: 1
073 (1988)）。配列間の同一性を決定するために一般的に使用される方法は、Carillo, H
.及びLipman, D.の論文, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に開示されるものを
含むが、これに限定されない。試験配列間で最大の一致を与える、好ましい同一性決定方
法を設計する。同一性決定方法は、コンピュータプログラムに成分化される。２つの配列
間の同一性を測定するコンピュータプログラム方法は、これらに限定されないが、ＧＣＧ
プログラムパッケージ（Devereux, J.らの論文, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1
984)）, BLASTP, BLASTN, 及びFASTA (Atschul, S. F.らの論文, J. Molec. Biol. 215: 
403 (1990))を含む。この手順を実行する、当業者に周知の別のソフトウエアパッケージ
は、CLUSTALプログラムである。CLUSTALプログラムは、２つのポリヌクレオチド配列を比
較し、適切な一方の配列にスペースを挿入することによって、最適配列を見つける。最適
配列の同一性もまた、BLASTxなどのソフトウエアパッケージを使用して計算できる。この
プログラムは、類似配列の最大範囲を整列させ、それに適合する値を割り当てる。いくつ
かの類似領域のパターン比較のいずれか１つを検出してよいため、その各々は異なるスコ
アを有する。当業者は、異なる長さの２つのポリヌクレオチドをより長いフラグメントの
全体にわたって比較してよいことを、よく理解する。代替的に、短い領域を比較してもよ
い。通常、比較に有用な同じ長さの配列を作成し、比較する。
【００７６】
一実施態様において、該阻害性核酸は、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部に、１００％の
配列同一性を有する。しかしながら、７０％、８０％、又は９０％若しくは９５％よりも
大きな配列同一性を有する阻害性核酸も使用してよい。それゆえ、遺伝的変異、系統多型
性又は進化的分岐に起因する、予想可能性のある配列変化を許容し得る。
該ＲＮＡの二重鎖領域は、該標的転写産物の一部にハイブリダイズすることができるヌ
クレオチド配列を有してよい（例えば、400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 
５０℃又は７０℃で１２〜１６時間のハイブリダイゼーション；その後、洗浄）。
【００７７】
ｄｓＲＮＡの最適長は標的遺伝子及び実験条件に従って変化してよいが、該ＲＮＡの二
重鎖領域は、少なくとも１９、２０、２１〜２３、２５、５０、１００、２００、３００
、４００又はそれ以上の塩基長であり得る。
標的遺伝子は、分泌タンパク質、特に、該植物又は細胞の遺伝子発現；巨細胞の形成；
該植物の根組織を介した線虫の遊走；該植物の細胞代謝；該植物細胞内のシグナル転換の
誘発；又は該線虫が該植物に形成された巨細胞から栄養を得ることを可能にさせる栄養管
の形成；を調節する分泌タンパク質をコードする線虫遺伝子である。一態様は、線虫、特
に根瘤線虫によって分泌される食道腺細胞タンパク質に特異的な阻害性核酸を提供する。
典型的には、該ｄｓＲＮＡ又は阻害性核酸は該標的遺伝子、すなわち該遺伝子の一部をコ
ードする遺伝子の全体に実質的に同一である。しかしながら、該ｄｓＲＮＡ又は阻害性核
酸は、該標的遺伝子の一部に実質的に同一であり得る。この部分のサイズは個々の標的遺
伝子次第であり、該ｄｓＲＮＡのサイズを変化させて該遺伝子の発現を阻害したかどうか
を観察することによって、当業者に測定可能である。
【００７８】
（根の成長を強化した植物体）
一実施態様は、寄生線虫の１以上の線虫の食道腺細胞ポリペプチド又はそれらのフラグ
メントをコードする１以上の核酸を含む若しくは発現する遺伝子組換え植物又は遺伝子組
換え細胞を提供する。植物体又は植物細胞における１以上の線虫の食道腺細胞ポリペプチ
ド又はそれらのフラグメントの発現は、非遺伝子組換え植物又はコントロールの植物に比
較して、遺伝子組換え植物の根の成長を促進、刺激又は強化する。根は、種子根、不定根
、一次側根、二次側根など、細根、一次根、二次根、及び粗根を含む。
【００７９】
本開示の実施態様を使用する線虫の食道腺細胞ポリペプチド又はフラグメントは、根の
サイズ、根の数、根の表面積、及び根系の全般的な質を増大させ得る。本開示の組成物及
び方法がない場合に生産された根菜類よりも長い根菜類を、本開示の組成物及び方法を用
いて生産することができる。本開示の組成物及び方法を使用して生産した他の作物は、干
ばつ、浸食、又は環境ストレスの増加に抵抗性であり得る。環境ストレスは、降雨、気温
及び湿度などの気候の変化を含む。
【００８０】
典型的な線虫の食道腺細胞ポリペプチド又はそれらのフラグメントは、配列番号：１、
２又は５〜５１によってコードされるポリペプチド、それらのフラグメント、又はそれら
の組み合わせを含むが、これらに限定されない。線虫の食道腺細胞ポリペプチド又はフラ
グメントは根の成長を、直接的又は間接的に増幅、刺激又は強化させることができる。例
えば、直接的な調節は、該線虫分泌型ポリペプチドが、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及びｍＲＮ
Ａを含む宿主植物核酸に結合する場合に起こり得る。間接的な調節は、該ポリペプチドが
、１以上の他のタンパク質又は因子に結合して複合体を形成する場合に起こり得る。該複
合体はそれから、宿主植物核酸に結合し、転写又は翻訳を促進又は抑制することができる
。
【００８１】
一実施態様において、遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え細胞は、所定量で、根の成
長又は発育を刺激、強化又は促進させるのに効果的な線虫の食道腺細胞ポリペプチド又は
それらのフラグメントを発現する。あるいは、線虫の食道腺細胞ポリペプチド又はそれら
のフラグメントは、植物体に直接的に送達可能である。遺伝子組換え植物又は細胞で発現
する線虫の食道腺細胞ポリペプチド又はそれらのフラグメントのレベルは、当業者に既知
の方法、例えば強力なプロモーター又は構成的に活性なプロモーター、高コピー数ベクタ
ーなどを有するベクターを使用して制御できる。植物体又は細胞は、安定的に又は一時的
に形質移入させることができる。
【００８２】
典型的な線虫は、根瘤線虫としても言及されるネコブ線虫類のメンバーを含むが、これ
らに限定されない。代表的な種は、Ｍ．アレナリア、Ｍ．インコグニタ、Ｍ．ジャバニカ
、Ｍ．ハプラ、Ｍ．チットウッディ及びＭ．ナアシを含むが、これらに限定されない。
宿主植物の代表的な系統生物学的科は、これらに限定されないが、キツネノマゴ科、カ
エデ科、マタタビ科、リュウゼツラン科）、ザクロソウ科、ヒユ科、バンレイシ科、セリ
科、キョウチクトウ科、サトイモ科、ウコギ科、ヤシ科、ウマノスズクサ科、ツリフネソ
ウ科、バーリングトニア科、ツルムラサキ科、メギ科、カバノキ科、ノウゼンカズラ科、
ベニノキ科、キワタ科、ムラサキ科、ツゲ科、ビットネリア科、サボテン科、カエサルピ
ニア科、カンナ科、フウチョウソウ科、スイカズラ科、パパイア科、ナデシコ科、モクマ
オウ科、ニシキギ科、アカザ科、クロランサ科、ツユクサ科、ヒルガオ科、ミズキ科、コ
リラ科、ベンケイソウ科、ウリ科、ヒノキ科、ヘゴ科、カヤツリグサ科、ダティス科、ビ
ワモドキ科、ヤマノイモ科、マツムシソウ科、カキノキ科、ツツジ科、トウダイグサ科、
マメ科、イイギリ科、ケマンソウ科、リンドウ科、フウロソウ科、イワタバコ科、ギンク
ゴア科、グーデニア科、オトギリソウ科、ヘモドラ科、マンサク科、オウムバナ科、ハゼ
リソウ科、ハイペリカ科、アヤメ科、クルミ科、イグサ科、シソ科植物、シソ科、クスノ
キ科、ユリ科、アマ科、ロベリア科、フジウツギ科、ミソハギ科、モクレン科、キントラ
ノオ科、アオイ科、クズウコン科、ノボタン科、センダン科、ツヅラフジ科、ネムノキ科
、クワ科、バショウ科、ハマジンチョウ科、ヤマモモ科、ニクズク科、フトモモ科、オシ
ロイバナ科、モクセイ科、アカバナ科、ラン科、オスナ科、カタバミ科、ペオニア科、タ
コノキ科、ケシ科、ゴマ科、ヤマゴボウ科、マツ科、コショウ科、ピットスポラ科、オオ
バコ科、スズカケノキ科、イソマツ科、イネ科、カワゴケソウ科、ハナシノブ科、ヒメハ
ギ科、スベリヒユ科、サクラソウ科、ヤマモガシ科、ザクロ科、キンポウゲ科、モクセイ
ソウ科、クロウメモドキ科、バラ科、アカネ科、ミカン科、ヤナギ科、ビャクダン科、ム
クロジ科、サラセニア科、ユキノシタ科、ゴマノハグサ科、サルトリイバラ科、ナス科、
アオギリ科、エゴノキ科、ギョリュウ科、スギ科、テトラゴニア科、ツバキ科、テオフラ
スタ科、ジンチョウゲ科、シナノキ科、ノウゼンハレン科、ターネラ科、ガマ科、ニレ科
、イラクサ科、オミナエシ科、クマツヅラ科、スミレ科、ブドウ科、ザミア科、ショウガ
科又はハマビシ科を含む。
【００８３】
本開示に従ったＲＫＮ食道腺細胞分泌型ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質移
入させることができる宿主植物の一般名は、これらに限定されないが、トマト、ナス、ジ
ャガイモ、メロン、キュウリ、ニンジン、レタス、チョウセンアザミ、セロリ、ウリ科植
物（メロン、スイカなど）、オオムギ、トウモロコシ、ピーナッツ、ダイズ、テンサイ、
ワタ、ササゲ、マメ類、アルファルファ、タバコ、柑橘類、クローバ、コショウ、ブドウ
、コーヒー、オリーブ又は茶を含む。
【００８４】
本開示が、宿主植物の発現を変化させるタンパク質を分泌する全ての線虫を含むことは
、当業者によってよく理解される。例えば、一実施態様は、ネコブ線虫類のメンバーによ
って分泌されるタンパク質をコードする核酸を含む遺伝子組換え植物又は細胞を提供し、
ここで該分泌タンパク質は根の成長又は発育を刺激、強化又は促進させる。
別の実施態様は、配列番号：１、２又は５〜５１又はそのフラグメント若しくは相同体
の配列を有する核酸を含む組成物を提供する。該組成物は、植物体又は植物細胞に送達さ
れた場合に、根の成長又は発育を刺激、強化又は促進させる。
【００８５】
さらに別の実施態様は、植物体又は植物細胞に送達された場合に、配列番号：１、２又
は５〜５１又はそれらの相同体によってコードされる１以上のポリペプチド又はそれらの
フラグメントを含む組成物を提供する。
本明細書で開示する根刺激組成物は、成長促進剤、肥料、１以上の線虫駆除剤、殺虫剤
、殺菌剤、又はそれらの組み合わせを選択的に含有することができる。代表的な線虫駆除
剤は、これらに限定されないが、クロロピクリン、臭化メチル、１，３−ジクロロプロペ
ン、メチルジチオカルバミン酸ナトリウム、テトラチオカルバミン酸ナトリウム；及び、
２−メチル−２−（メチルチオ）プロピオンアルデヒド Ｏ−メチルカルバモイルオキシ
ム（アルジカルブ）、２，３−ジヒドロ−２，２−ジメチル−７−ベンゾフラノール メ
チルカルバメート（カルボフラン）、２−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［［（メチルアミノ
）カルボニル］オキシ］−２−オキソエタンイミドチオ酸メチル（オキサミル）、２−メ
チル−２−（メチルスルホニル）プロパナール Ｏ−［（メチルアミノ）カルボニル］オ
キシム（アルドキシカルブ）、Ｏ−［４−（メチルスルフィニル）フェニル］ホスホロチ
オ酸Ｏ，Ｏ−ジエチル（フェンスルホチオン）、Ｓ，Ｓ−ジプロピルホスホロジチオ酸Ｏ
−エチル（エトプロップ）、及びエチル−３−メチル−４−（メチルチオ）フェニル（１
−メチルエチル）ホスホルアミデート（フェナミホス）などのカルバメート類を含む。
【００８６】
別の実施態様は細胞、例えば線虫の分泌ポリペプチド又はそのフラグメントをコードす
る１以上の核酸を含む植物細胞を提供し、該線虫の分泌ポリペプチドは、根の成長又は発
育を直接的に又は間接的に刺激、強化又は促進する。該細胞は原核生物細胞又は真核生物
細胞であり得、一般的には植物細胞、特に根細胞である。
さらに別の実施態様は、根の発達を刺激、強化又は促進させるのに十分な量で、該植物
体を、１以上の線虫の食道のタンパク質、又は１以上の線虫の食道のタンパク質をコード
する核酸に接触させることによって、干ばつ抵抗性を提供する方法を提供する。該組成物
は、該植物体に噴霧すること、該植物体の周りの土壌に適用すること、又は別の方法で該
組成物が植物体に接触することができるように該植物体に送達することが可能である。
【００８７】
（植物の形質転換技術）
本開示のＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を、慣習的な組換えＤＮＡ技術を使用して、植物細
胞又は細菌細胞内に組み込む。一般的に、本開示のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子は、形質転
換ベクターに含まれる。プラスミドなどの、当業者に既知の多くのそのようなベクター系
を使用してよい。また、例えば導入したＲＮＡフラグメントの発現を増加させる発現系の
構成要素も修飾してよい。例えば、切断型配列、ヌクレオチド置換又は他の修飾を利用し
てよい。当業者に既知の発現系を使用して、適切な条件下で全ての植物細胞を事実上形質
転換させてよい。本発明のＤＮＡ分子を含む導入遺伝子は好ましくは安定的に形質転換さ
れ、該宿主細胞内に組み込まれる。好ましくは、形質転換細胞を、全植物体へと再生する
。形質転換技術の詳細な説明は、当業者の知識の範囲内である。
【００８８】
レポーター遺伝子又は選択的マーカー遺伝子を、発現カセット内に含んでよい。当業者
に既知の適切なレポーター遺伝子の例は、例えば、『植物分子生物学マニュアル』中のJe
ffersonらの文献 (1991), Gelvinら編 (Kluwer Academic Publishers), 1-33頁；DeWetら
の論文 (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737；Goffらの論文 (1990) EMBO J. 9:2517-252
2；Kainらの論文 (1995) Bio Techniques 19:650-655；及び、Chiuらの論文 (1996) Curr
ent Biology 6:325-330中に見出すことができる。
【００８９】
形質転換細胞又は形質転換組織の選別用に選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質抵抗
性又は除草剤抵抗性を与える遺伝子を含み得る。適切な選択可能マーカー遺伝子の例は、
これらに限定されないが、クロラムフェニコール（Herrera Estrellaらの論文 (1983) EM
BO J. 2:987-992）；メトトレキサート（Herrera Estrellaらの論文 (1983) Nature 303:
209-213；Meijerらの論文 (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820）；ハイグロマイシン（
Waldronらの論文 (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108；Zhijianらの論文 (1995) Plant 
Science 108:219-227）；ストレプトマイシン（Jonesらの論文 (1987) Mol. Gen. Genet 
210:86-91）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnardらの論文 (1996) Transgenic Res.
5:131-137）；ブレオマイシン（Hilleらの論文 (1990) Plant Mol. Biol 7:171-176）；
スルホンアミド（Guerineauらの論文 1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136）；ブロモキ
シニル（Stalkerらの論文 (1988) Science 242:41 9423）；グリフォセート（Shawらの論
文 (1986) Science 233:478481）；フォスフィノスリシン（DeBlockらの論文 (1987) EMB
O J. 6:2513-2518）；への抵抗性をコードする遺伝子を含む。
【００９０】
最終産物に必要ではない可能性があるが遺伝子組換え事象の回復における有用な役割を
担い得る他の遺伝子は、これらに限定されないが、例えばＧＵＳ（ｂ−グルクロニダーゼ
；Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387)、ＧＦＰ (緑色蛍光タンパク質；Cha
lfieらの論文 (1994) Science 263:802）、ルシフェラーゼ（Riggsらの論文 (1987) Nucl
eic Acids Research. 15(19):8115及びLuehrsenらの論文 (1992) Methods Enzymol. 216:
397-414）、及びアントシアニン産生物をコードするメイズ（maize）遺伝子（Ludwigらの
論文 (1990) Science 247:449）などの例を含み得る。
【００９１】
興味ある異種ヌクレオチド配列に機能的に連結させたプロモーター配列を含む発現カセ
ットを使用して、任意の植物体を形質転換できる。この様式で、遺伝的に修飾された植物
体、植物細胞、植物組織、種子などを得ることができる。
ヌクレオチド配列を植物体に導入するプロトコルと同様、形質転換プロトコルは、形質
転換に標的化された植物型又は植物細胞型、すなわち、単子葉植物か双子葉植物かによっ
て変化してよい。ヌクレオチド配列を植物細胞へ導入し、次に該植物のゲノム中に挿入す
る適切な方法は、微量注入（Crosswayらの論文 (1986) Biotechniques 4:320-334）、電
子穿孔法（Riggsらの論文 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606）、アグロ
バクテリウム介在性形質転換（Townsendらの文献, 米国特許第5,563,055号；Zhaoらの文
献 WO US98/01268）、直接的遺伝子移入（Paszkowskiらの論文 (1984) EMBO J. 3:2717-2
722）、及び、弾道的粒子加速（例えば、Sanfordらの文献米国特許第4,945,050号；『植
物細胞、組織、及び器官培養：基本的方法』、Gamborg及びPhillips編(Springer-Verlag,
Berlin)中のTomesらの文献 (1995) 『微粒子銃を介した無傷植物細胞への直接的ＤＮＡ
移入』；並びに、McCabeらの論文 (1988) Biotechnology 6:923-926を参照されたい）；
を含む。また、Weissingerらの論文 (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477；Sanfordらの
論文 (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (タマネギ) ；Christouらの
論文 (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (ダイス) ；McCabeらの論文 (1988) Bio/Techn
ology 6:923-926 (ダイズ) ；Finer及びMcMullenの論文 (1991) In Vitro Cell Dev. Bio
l. 27P:175-182 (ダイズ)；Singhらの論文 (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (ダ
イズ)；Daftaらの論文 (1990) Biotechnology 8:736-740 (イネ)；Kleinらの論文 (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (トウモロコシ)；Kleinらの論文 (1988) Bi
otechnology 6:559-563 (トウモロコシ) ；Tomesの文献, 米国特許第5,240,855号；Buisi
ngらの文献, 米国特許第5,322,783号及び第5,324,646号；『植物細胞、組織、及び器官培
養：基本的方法』、Gamborg編(Springer-Verlag, Berlin)中のTomesらの文献 (1995) 『
微粒子銃を介した無傷植物細胞への直接的ＤＮＡ移入』(トウモロコシ) ；Kleinらの論文
(1988) Plant Physiol. 91:440-444 (トウモロコシ)；Frommらの論文 (1990) Biotechno
logy 8:833-839 (トウモロコシ)；Hooykaas-Van Slogterenらの論文 (1984) Nature (Lon
don) 311:763-764Bowenらの文献, 米国特許第5,736,369号(穀物類) ；Bytebierらの論文 
(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (ユリ科) ；『胚珠組織の実験的操作
』中のDe Wetらの文献 (1985), Chapmanら編 (Longman, N.Y.), 197-209頁 (花粉) ；Kae
pplerらの論文 (1990) Plant Cell Reports 9:415-418、及びKaepplerらの論文 (1992) T
heor. Appl. Genet. 84:560-566（ウイスカー（whisker）介在性形質転換）；D'Halluin
らの論文 (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (電子穿孔法)；Liらの論文 (1993) Plant Cel
l Reports 12:250-255、並びにChristou及びFordの論文 (1995) Annals of Botany 75:40
7-413 (イネ) ；Osjodaらの論文 (1996) Nature Biotechnology 14:745-750（アグロバク
テリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介したトウモロコシ）；
を参照されたく、これら全ては、引用によりそれらの全てが本明細書に組み込まれる。
【００９２】
形質転換された細胞は、従来技術に従って植物体へと成長し得る。例えば、McCormick
らの論文 (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照されたい。これらの植物体はそれか
ら成長し、同じ形質転換系統又は異なる形質転換系統のいずれかで受粉させ、特定の所望
の表現型の特徴の構成的発現を有する交配種を生じる。２世代以上成長し、所望の表現型
の特徴の構成的発現が安定的に維持され、遺伝されたことを確定的にすることができ、か
つそれから種子を収穫し、所望の表現型の特徴の構成的発現の達成を確定的にすることが
できる。
【００９３】
化学制御性プロモーターを使用して、外因性化学制御因子の適用を介して、植物に遺伝
子の発現を調節させることができる。該プロモーターは、対象によって、当該化学物質の
適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーター、又は当該化学物質の適用が遺伝子
発現を抑制する化学抑制性プロモーターであってよい。化学誘導性プロモーターは当業者
に既知であり、これらには限定されないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤安全化剤によ
って活性化されるトウモロコシ1n2-2プロモーター、発芽前除草剤として使用される疎水
性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、及びサリチル
酸によって活性化されるタバコPR-1aプロモーターを含む。他の興味ある化学制御性プロ
モーターは、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Schenaらの論文 (1991) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425及びMcNellisらの論文 (1998) Plant J. 14(2):247-
257中のグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照されたい）、並びにテトラサイク
リン誘導性プロモーター及びテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Gatzらの論
文 (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237、並びに米国特許第5,814,618号及び第5,789,1
56号を参照されたい）を含み、これらの全ては引用によって本明細書に組み込まれる。
【００９４】
構成的プロモーターは例えば、Rsyn7プロモーターのコアプロモーター、並びにWO 99/4
3838及び米国特許第6,072,050号に記載される他の構成的プロモーター；コアCAMV 35Sプ
ロモーター（Odellらの論文 (1985) Nature 313:810-812)；イネアクチン(McElroyらの論
文 (1990) Plant Cell 2:163-171）；ユビキチン（Christensenらの論文 (1989) Plant M
ol. Biol. 12:619-632、及びChristensenらの論文 (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689
）；pEMU（Lastらの論文 (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588)；MAS (Veltenらの論
文 (1984) EMBO J. 3:2723-2730）；ALSプロモーター（米国特許第5,659,026号）；など
を含む。他の構成的プロモーターは例えば、米国特許第5,608,149号、第5,608,144号、第
5,604,121号、第5,569,597号、第5,466,785号、第5,399,680号、第5,268,463号、第5,608
,142号を含む。
【００９５】
低レベルの発現を所望する場合、弱いプロモーターを使用してよい。一般的に、「弱い
プロモーター」によって、低レベルでコード配列の発現を駆動するプロモーターを意図す
る。低レベルによって、約1/1000のレベルの転写産物から約1/100,000のレベルの転写産
物、約1/1000のレベルの転写産物から約1/500,000のレベルの転写産物を意図する。ある
いは、弱いプロモーターはまた、少数の細胞内でのみ発現して他では発現せず、全体とし
て低レベルの発現を与えるプロモーターも含むことは認識される。プロモーターが許容不
可能なほどの高レベルで発現する場合、該プロモーター配列の一部を削除又は修飾し、発
現レベルを減少させることができる。
【００９６】
そのような弱い構成的プロモーターは例えば、Rsyn7プロモーターのコアプロモーター
（WO 99/43838、及び米国特許第6,072,050号）、コア35S CaMVプロモーターなどを含む。
他の構成的プロモーターは例えば、米国特許第5,608,149号；第5,608,144号；第5,604,12
1号；第5,569,597号；第5,466,785号；第5,399,680号；第5,268,463号；及び第5,608,142
号を含む。
【００９７】
「組織優先」プロモーターを使用して、特定の細胞内に遺伝子発現を標的化することが
できる。組織優先プロモーターは、Yamamotoらの論文 (1997) Plant J. 12(2)255-265；K
awamataらの論文 (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803；Hansenらの論文 (1997) 
Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343；Russellらの論文 (1997) Transgenic Res. 6(2):157
-168；Rinehartらの論文 (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341；Van Campらの論文 
(1996) Plant Physiol. 112(2):525-535；Canevasciniらの論文 (1996) Plant Physiol. 
112(2):513-524；Yamamotoらの論文 (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778；Lamの
論文 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196；Orozcoらの論文 (1993) Plant 
Mol. Biol. 23(6):1129-1138；Matsuokaらの論文 (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90
(20):9586-9590；及び Guevara-Garciaらの論文 (1993) Plant J. 4(3):495-505を含む。
そのようなプロモーターは、必要があれば、弱い発現用に修飾できる。
【００９８】
「種子優先」プロモーターは、「種子発芽」プロモーター（種子発芽中に活性なプロモ
ーター）に加えて、「種子特異的」プロモーター（種子貯蔵タンパク質プロモーターなど
の、種子発達中に活性なプロモーター）の両方を含む。引用によって本明細書に組み込ま
れるThompsonらの論文 (1989) BioEssays 10:108を参照されたい。そのような種子優先プ
ロモーターは、これらに限定されないが、Cim1（サイトカイニン誘導性伝達）；cZ19B1（
トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）；mi1ps（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）
；及びce1A（セルロースシンターゼ）を含む。ガンマ−ゼインは、好ましい胚乳特異的プロモーターである。Glob-1は、好ましい胚特異的プロモーターである。双子葉植物に関して、種子特異的プロモーターは、これらに限定されないが、マメベータ−ファゼオリン、ナピン（napin）、ベータ−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどを含む。単子葉植物に関して、種子特異的プロモーターは、これらに限定されないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ワクシー（waxy）、シュランケン（shrunken）１、シュランケン２、グロブリン１などを含む。
【００９９】
葉特異的プロモーターは当業者に既知である。例えば、Yamamotoらの論文 (1997) Plan
t J. 12(2):255-265；Kwonらの論文 (1994) Plant Physiol. 105:357-67；Yamamotoらの
論文 (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778；Gotorらの論文 (1993) Plant J. 3:5
09-18；Orozcoらの論文 (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138；及びMatsuokaらの
論文 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590を参照されたい。
【０１００】
根優先プロモーターが既知で、多くの利用可能な文献から選択することができ、又は様
々な適合種から新たに（de novo）単離してよい。例えば、Hireらの論文 (1992) Plant M
ol. Biol. 20(2): 207-218（ダイズ根特異的グルタミンシンテターゼ遺伝子）；Keller及
びBaumgartnerの論文 (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061（インゲンマメのGRP 1.8遺伝
子における根特異的調節エレメント）；Sangerらの論文 (1990) Plant Mol. Biol. 14(3)
:433-443（アグロバクテリウム・ツメファシエンスのマンノピンシンターゼ（mannopine 
synthase）(MAS)遺伝子の根特異的プロモーター）；及びMiaoらの論文 (1991) Plant Cel
l 3(1):l 1'-22（ダイズの根及び根粒で発現する細胞質性グルタミンシンテターゼ(GS)を
コードする全長ｃＤＮＡクローン）；を参照されたい。また、米国特許第5,837,876号；
第5,750,386号；第5,633,363号；第5,459,252号；第5,401,836号；第5,110,732号；及び
第5,023,179号を参照されたい。
【０１０１】
葉緑体標的化配列は当業者に既知であり、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラ
ーゼ(Rubisco)の小サブユニット（de Castro Silva Filhoらの論文 (1996) Plant Mol. B
iol. 30:769-780；Schnellらの論文 (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342）；５−
（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸シンターゼ（EPSPS）（Archerらの論文 (199
0) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810）；トリプトファンシンターゼ（Zhaoらの論文
(1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087）；プラストシアニン（Lawrenceらの論文 (
1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363）；コリスミ酸シンターゼ（Schmidtらの論
文 (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457）；及び集光性クロロフィルａ／ｂ結合
タンパク質（LHBP）（Lamppaらの論文 (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999）；を含
む。また、Von Heijneらの論文 (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126；Clarkらの論
文 (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550；Della-Cioppaらの論文 (1987) Plant Phys
iol. 84:965-968；Romerらの論文 (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-14
21；及びShahらの論文 (1986) Science 233:478-481；を参照されたい。
【０１０２】
葉緑体の形質転換方法が当業者に既知である。例えば、Svabらの論文 (1990) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530；Svab及びMaligaの論文 (1993) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 90:913-917；Svab及びMaligaの論文 (1993) EMBO J. 12:601-606；を参照された
い。該方法は、選択可能なマーカーを含むＤＮＡのパーティクルガン送達によっており、
相同組換えを介して該ＤＮＡを色素体ゲノムへと標的化させる。さらに、色素体の形質転
換は、核にコードされ、かつ色素体に指示されたＲＮＡポリメラーゼの組織優先発現によ
って、サイレント色素体−ボム（silent plastid-bome）導入遺伝子のトランス活性化に
よって達成してよい。そのような系は、McBrideらの論文 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 91:7301-7305において報告されている。
【０１０３】
葉緑体に標的化させた興味ある核酸を、葉緑体での発現用に最適化させ、植物核とこの
オルガネラとの間のコドンの使用における差異を説明してもよい。この様式で、興味ある
核酸を、葉緑体優先コドンを使用して合成してよい。例えば、引用によって本明細書に組
み込まれる米国特許第5,380,831号を参照されたい。
本開示に従って形質転換させた植物は単子葉植物又は双子葉植物であってよく、かつこ
れには限定されないが、任意の線虫宿主植物を含む。
【０１０４】
（植物発現カセットの構築に関する必要条件）
遺伝子組換え植物での発現を意図した核酸配列は、植物体内で発現可能な適切なプロモ
ーターの後方の発現カセット内に最初に集める。発現カセットはまた、導入遺伝子の発現
に必要とされる、又は選択される任意のさらなる配列を含んでよい。そのような配列は、
これらに限定されないが、転写ターミネーター、イントロン、ウイルス性配列、及び該遺
伝子産物を特定のオルガネラ及び細胞区画へと標的化させることを意図した配列などの発
現を強化させる外来性配列を含む。これらの発現カセットはそれから、後に記載する植物
形質転換ベクターへと容易に移行させることができる。
【０１０５】
（プロモーター）
発現カセットに使用するプロモーターの選択は、遺伝子組換え植物への導入遺伝子の空
間的及び時間的発現パターンを決定する。選択したプロモーターは、特定の細胞型（葉上
皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞など）又は特定の組織若しくは器官（例えば、根、葉又は
花）で導入遺伝子を発現させ、該選択は、該遺伝子産物の蓄積の所望部位を反映する。あ
るいは、選択したプロモーターは、様々な誘導条件下で、該遺伝子発現を駆動する。
【０１０６】
プロモーターはそれらの強度、すなわち、転写を促進させる能力が異なる。使用する宿
主系によって、当業者に既知の適切なプロモーターの任意の１つを使用してよい。例えば
構成的発現に関して、CaMV 35Sプロモーター、イネアクチンプロモーター、又はユビキチ
ンプロモーターを使用してよい。例えば制御可能な発現に関して、タバコ又はシロイヌナ
ズナ（Arabidopsis）由来の化学誘導性PR-1プロモーターを使用してよい（例えば、米国
特許第5,689,044号を参照されたい）。
【０１０７】
プロモーターの適切な範疇は、創傷誘導性のものである。創傷部位で発現する非常に多
くのプロモーターが記載されてきている。この種類の好ましいプロモーターは、Stanford
らの論文 Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989)、Xuらの論文 Plant Molec. Biol. 22:
573-588 (1993)、Logemannらの論文 Plant Cell 1: 151-158 (1989)、Rohrmeier及びLeh
leの論文, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993)、Firekらの論文 Plant Molec. Biol
. 22: 129-142 (1993)、及びWarnerらの論文 Plant J. 3: 191-201 (1993)、によって記
載されたものを含む。
【０１０８】
適切な組織特異的発現パターンは、緑色組織特異的発現パターン、根特異的発現パター
ン、茎特異的発現パターン、及び花特異的発現パターンを含む。緑色組織での発現に適切
なプロモーターは、光合成に関与する多くの制御遺伝子を含み、それらの多くは、単子葉
植物及び双子葉植物の両方からクローン化されている。適切なプロモーターは、ホスホエ
ノールカルボキシラーゼ遺伝子由来のトウモロコシPEPCプロモーターである（Hudspeth及
びGrulaの論文, Plant Molec.Biol. 12: 579-589 (1989)）。根特異的発現に適したプロ
モーターは、de Framondの論文（FEBS 290: 103-106 (1991)）に記載されたもの；EP 0 4
52 269に記載されたものであり、並びに根特異的プロモーターはT-1遺伝子由来のもので
ある。適切な茎特異的プロモーターは、米国特許第5,625,136号に記載されたものであり
、これはトウモロコシtrpA遺伝子の発現を駆動する。
【０１０９】
（転写ターミネーター）
様々な転写ターミネーターは、発現カセットでの使用に利用可能である。これらは導入
遺伝子を越えて、転写の終結及びその正確なポリアデニル化に関与する。適切な転写ター
ミネーターは植物体内での機能が既知のものであり、CaMV 35Sターミネーター、tm1ター
ミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、及びエンドウマメrbcS E9ターミネー
ターを含む。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方で使用する。
【０１１０】
（発現の強化又は制御用配列）
非常に多くの配列が転写単位内からの遺伝子発現を強化させることが見出されてきてお
り、該遺伝子に連結するこれらの配列を使用して、遺伝子組換え植物におけるそれらの発
現を増加させることができる。例えば、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロンなどの様々
なイントロン配列が、特に単子葉植物細胞における発現を強化させることが見出されてい
る。さらに、ウイルス由来の非翻訳リーダー配列の数もまた発現を強化することが知られ
、これらは特に双子葉植物細胞において効果的である。
【０１１１】
（コード配列の最適化）
選択した遺伝子のコード配列を、興味ある作物種における最適な発現のためのコード配
列を変化させることによって、遺伝的に操作してよい。特定の作物種における最適な発現
を達成するためにコード配列を修飾する方法は周知である（例えば、Perlakらの論文, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 (1991)；及びKozielらの論文, Bio/technol. 11: 1
94 (1993)を参照されたい）。
【０１１２】
別の実施態様は、直接的に色素体ゲノムへと形質転換されたＲＮＡ分子を提供する。色
素体形質転換技術は、米国特許第5,451,513号、第5,545,817号及び第5,545,818号、ＰＣ
Ｔ出願番号WO 95/16783、並びにMcBrideらの論文 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
1,7301-7305中に広範に記載される。葉緑体形質転換の基本的技術は、例えば微粒子銃又
は原形質形質転換（例えば、塩化カルシウム介在性形質転換、又はＰＥＧ介在性形質転換
）を使用して、適切な標的組織内へ興味のある遺伝子と共に、クローン化した色素体ＤＮ
Ａに隣接する選択可能なマーカー領域の導入を含む。標的化配列と名づけられた１〜１．
５ｋｂの隣接領域は、色素体ゲノムとの相同組換えを促進させ、それゆえ、プラストーム
の特定領域の置換又は修飾を可能にする。はじめに、スペクチノマイシン及び／又はスト
レプトマイシンへの抵抗性を与える、葉緑体16S rRNA遺伝子及びrps12遺伝子中の点変異
を、形質転換の選択可能マーカーとして利用する（Svab, Z., Hajdukiewicz, P.,及びMal
iga, P.の論文 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,8526-8530；Staub, J. M.,及びM
aliga, P.の論文 (1992) Plant Cell 4,39-45）。これらのマーカー間におけるクローニ
ング部位の存在は、外来ＤＮＡ分子の導入用の色素体標的化ベクターの作出を可能にさせ
た（Staub, J. M.及びMaliga, P.の論文 (1993) EMBO J. 12,601-606）。形質転換頻度の
実質的増加は、劣性ｒＲＮＡ又はｒ−タンパク質抗生物質抵抗性遺伝子を、優性の選択可
能マーカーであるスペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−３'−アデニルトラン
スフェラーゼをコードする細菌のaadA遺伝子で置換することによって得る（Svab, Z.及び
Maliga, P.の論文 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,913-917）。以前、このマー
カーは、緑藻クラミドモナス・レインハードチイ（Chlamydomonas reinhardtii）の色素
体ゲノムの高頻度な形質転換用に成功裏に使用されていた（Goldschmidt-Clermont, M. (
1991) Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089）。色素体の形質転換に有用な他の選択可能マー
カーは当業者に既知であり、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１３】
（植物形質転換ベクターの構築）
植物の形質転換に利用可能な非常に多くの形質転換ベクターが、植物形質転換業界の当
業者に既知であり、任意のそのようなベクターに連結する本開示に関する遺伝子が使用で
きる。ベクターの選択は、選択した形質転換技術、及び形質転換の標的種次第である。特
定の標的種に関して、異なる抗生物質又は除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換に常
に使用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連する抗生物質への抵抗性を与えるnp
t11遺伝子（Messing及びVierraの論文 Gene 19: 259-268 (1982); Bevanらの論文, Natur
e 304: 184-187 (1983)）、除草剤フォスフィノスリシンへの抵抗性を与えるbar遺伝子（
Whiteらの論文, Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990)、Spencerらの論文 Theor. Appl. Gen
et 79: 625-631 (1990)）、抗生物質ハイグロマイシンへの抵抗性を与えるhph遺伝子（Bl
ochinger及びDiggelmannの論文, Mol Cell Biol 4: 2929-2931）、マンノースの存在下で
の積極的な選抜を可能にするmanA遺伝子（Miles and Guest (1984) Gene, 32: 41-48；米
国特許第5,767,378号）、及びメトトレキサートへの抵抗性を与えるdhfr遺伝子（Bouroui
sらの論文, EMBO J. 2 (7): 1099-1104 (1983)）、並びにグリフォセートへの抵抗性を与
えるEPSPS遺伝子（米国特許第4,940,935号及び第5,188,642号）を含む。
【０１１４】
多くのベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用する形質転換に利用
可能である。これらは典型的に少なくとも１つのT-DNA境界配列を運び、pBIN19などのベ
クターを含む（Bevanの論文, Nucl. Acids Res. (1984)）。アグロバクテリウム形質転換
に適した典型的ベクターは、２成分ベクターpCIB 10及びそのハイグロマイシン選別誘導
体に加えて、２成分ベクターpCIB200及びpCIB2001を含む（例えば、米国特許第5,639,949
号を参照されたい）
【０１１５】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用しない形質転換は、選択した形質転換ベ
クターにおけるT-DNA配列の必要性を回避させ、結果的にT-DNA配列を含む先に記載したベ
クターなどのベクターに加えて、これらの配列を欠くベクターを利用する。アグロバクテ
リウムに依存しない形質転換技術は、微粒子銃、原形質体取り込み（protoplast uptake
）（例えば、ＰＥＧ及び電子穿孔法）、及び微量注入を介した形質転換を含む。ベクター
の選択は、形質転換される種への優先的選択に大部分を依存する。アグロバクテリウムを
用いない形質転換に適する典型的なベクターは、pCIB3064、pSOG 19、及びpSOG35を含む
（例えば、米国特許第5,639,949号を参照されたい）。
【０１１６】
（形質転換技術）
一度興味ある遺伝子を発現系にクローン化し、植物細胞へと形質転換させる。植物体の
形質転換及び再生の方法は、当業者に周知である。例えば、直接的ＤＮＡ取り込み、リポ
ソーム、電子穿孔法、微量注入、及び微粒子銃と同様、外来ＤＮＡの送達にＴｉプラスミ
ドベクターを利用してきた。さらに、アグロバクテリウム属からの細菌を利用して、植物
細胞を形質転換させることができる。
【０１１７】
双子葉植物に関する形質転換技術は当業者に周知であり、アグロバクテリウムに基づく
技術、及びアグロバクテリウムを必要としない技術を含む。アグロバクテリウムを用いな
い技術は、原形質体又は細胞による、直接的な外因性遺伝物質の取り込みを含む。これは
、ＰＥＧ介在性取り込み又は電子穿孔法介在性取り込み、微粒子銃介在性送達、又は微量
注入によって達成される。各々の場合において、当業者に既知の標準的技術を使用して、
植物体全体へと該形質転換細胞を再生してもよい。
【０１１８】
ほとんどの単子葉植物種の形質転換は、今日、若干日常的になっている。好ましい技術
は、アグロバクテリウム介在性形質転換に加えて、ＰＥＧ又は電子穿孔法技術を使用した
原形質体への直接的遺伝子移入、カルス組織又は組織化された構造体への微粒子銃を含む
。
当業者に周知の工程を利用して、形質転換事象由来の植物体を生育、増殖、繁殖させ、
所望の形質を有する子孫を生じさせ、所望の形質を有する種子を獲得する。該方法は、本
発明のＲＮＡフラグメントを含む植物細胞を生じさせることができ、前記植物細胞におけ
る前記標的遺伝子の発現を、前記ＲＮＡフラグメント、該植物細胞由来の植物体及びその
子孫、並びに該植物体由来の種子で改変する。
【０１１９】
本開示の阻害性核酸又はＲＫＮ食道腺細胞分泌ポリペプチドを単独で、又は対象へのＲ
ＮＡのインビトロ若しくはインビボ導入の実施に必要な少なくとも１つの試薬を有するキ
ットの構成要素として使用してよい。適切な構成要素は、ｄｓＲＮＡ、及び該ｄｓＲＮＡ
の導入を促進させる媒体である。そのようなキットはまた、該キットの使用者が本発明を
実施することを可能にする取扱説明書も含む。
【０１２０】
別の実施態様は、 線虫宿主植物細胞に、該標的ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な
ヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡを導入することによって、線虫病害へ
の抵抗性を与える方法；並びに、選択的に該標的ｍＲＮＡの発現阻害を検証する方法を提
供する。
一実施態様は、線虫の分泌タンパク質、例えば食道腺細胞タンパク質をコードするｍＲ
ＮＡの少なくとも一部に相補的である配列を有するｄｓＲＮＡを有する植物体内又は該植
物体上に寄生線虫を接触させることによって、植物における線虫病害の治療又は予防の方
法を提供し；ここで、該分泌タンパク質は、植物の遺伝子発現を調節する。
【０１２１】
さらに別の実施態様は、発現構築物を含む植物細胞を含む遺伝子組換え植物に加えて、
例えば線虫の分泌タンパク質、例えば食道腺細胞タンパク質をコードする標的ｍＲＮＡの
少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を形成するＲＮＡを
コードする発現構築物を含む植物細胞を提供する。
別の実施態様において、ＲＮＡフラグメントは２つの異なるＲＮＡ分子からなる。この
場合、該ＲＮＡフラグメントを、例えばそれらが二本鎖ＲＮＡ分子を形成できる条件下で
、前記細胞に導入する前に混合する。別の実施態様において、該ＲＮＡフラグメントを、
逐次的に前記細胞に導入する。好ましくは、各々のＲＮＡ分子の導入間の時間間隔は短く
、好ましくは１時間未満である。
【０１２２】
さらに別の実施態様において、ＲＮＡフラグメントは１つのＲＮＡ分子からなる。１つ
の単一ＲＮＡを使用することによって、２つの相補的ＲＮＡフラグメントは、対合及び二
本鎖形成に有利なように近接する。そのような場合において、該ＲＮＡ分子は、そこに含
まれる前記ＲＮＡフラグメントが二本鎖領域を形成するように好ましく折りたたむことが
できる。この場合において、該ＲＮＡフラグメントの相補的部分は互いを認識し、互いに
対合し、そして二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。他の実施態様において、該細胞への導入に
先立ち、該ＲＮＡフラグメントを、それらが二本鎖ＲＮＡ分子を形成可能な条件下でイン
キュベートする。さらに別の実施態様において、該ＲＮＡ分子は、該センスＲＮＡフラグ
メントと該アンチセンスＲＮＡフラグメントとの間のリンカーを含む。該リンカーは好ま
しくは、機能的遺伝子、例えば選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセットによてコード
されるＲＮＡ配列を含む。別の実施態様において、該リンカーは、例えばイントロンプロ
セシングシグナルを含む制御配列によってコードされるＲＮＡ配列を含む。
【０１２３】
別の実施態様は、前記ｄｓＲＮＡに機能的に連結させたプロモーターを有するｄｓＲＮ
Ａ構築物を提供し、該ｄｓＲＮＡ分子をさらに含んでよい。プロモーターは、例えば、組
織特異的プロモーター、発生的制御プロモーター、構成的プロモーター、分岐プロモータ
ー又は誘導性プロモーターなどの異種プロモーターであり得る。選択的に、終結シグナル
も該ＤＮＡ分子中に含む。
【０１２４】
好ましくは、単一のＲＮＡ分子又は２つの異なるＲＮＡ分子は二本鎖領域を形成するこ
とができ、該ＲＮＡフラグメントの相補的部分は、互いを認識し、互いに対合し、そして
二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。
別の実施態様は、原料、植込錠、顆粒、薄片などの形態で、開示する遺伝子組換え植物
物質を提供する。本明細書で開示する阻害性核酸は、先に記載した遺伝子組換え植物由来
の種子及び種子産物であり得る。別の実施態様は、種子上を被覆できる開示した阻害性核
酸を含む組成物を提供する。該被覆剤は、該阻害性核酸が、種子が成熟し、根に発達する
間、線虫の分泌タンパク質を阻害し続けることができるように製剤することができる。
【０１２５】
さらなる実施態様は、本開示の線虫の食道腺細胞タンパク質又はそれらのフラグメント
を含む、キメラタンパク質若しくは融合タンパク質を提供する。本明細書で使用するよう
に、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、外来ポリペプチドに連結させた線
虫の食道腺細胞タンパク質又はそのフラグメントを含む。「外来ポリペプチド」は、線虫
の食道腺細胞タンパク質又はそのフラグメントに実質的に相同でないポリペプチドである
。該外来ポリペプチドを、線虫の食道腺細胞タンパク質又はそのフラグメントのＮ末端若
しくはＣ末端に融合させることができる。
【０１２６】
該融合タンパク質は、リガンドに高親和性を有する部分を含むことができる。例えば、
該融合タンパク質は、線虫の食道腺細胞タンパク質又はそのフラグメントをＧＳＴのＣ末
端に融合させた、ＧＳＴ融合タンパク質であり得る。そのような融合タンパク質は、該ポ
リペプチドの精製を促進し得る。あるいは、該融合タンパク質は、そのＮ末端に、異種シ
グナル配列を含むことができる。特定の宿主細胞において、タンパク質の発現、分泌又は
輸送は、異種シグナル配列の使用を介して増強可能である。例えば植物細胞において、本
発明のポリペプチドを、葉緑体輸送ペプチドと融合させてよい。葉緑体輸送ペプチドは、
該ポリペプチドが、植物細胞の細胞質から葉緑体へと移行することを可能にさせ、それに
よって根の成長を増進させる。発現ベクターは、予め融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプ
チド）をコードする市販のものである。線虫の食道腺細胞タンパク質又はそのフラグメン
トをコードする核酸は、該融合部分が該ポリペプチドにインフレームで連結させたような
発現ベクターにクローン化することができる。
【０１２７】
以下は、ただの典型的な実施例である。本発明がこれらの実施例に限定されるべきでな
いことは理解すべきである。開示の他の重要な用途は、当業者によって容易に理解される
であろう。当業者によって潜在的に認識され得る他の用法もまた、本開示の一部である。
本明細書で言及した参考文献は、適用法で許容される最も大きな範囲で、それらの全体
が組み込まれる。
【実施例】
【０１２８】
（実施例１）：線虫及び植物
メロイドジーン種は、温室栽培トマト（リコペルシコン・エスクレンタム・シーブイ（
Lycopersicon esculentum cv.）マリオン（Marion）又はベターボーイ（Better-Boy））
の根上で繁殖する。メロイドジーンの卵を、（Hussey及びBarkerの文献, 1973）に記載さ
れるように回収した。前寄生第２期幼若体（Pre-parasitic second-stage juvenile）（p
re-J2）を、プラスチックボウル中の脱イオン水中の２５μｍ孔の篩上の孵化卵を介して
回収した。Ｍ．インコグニタの異なる寄生段階を、根の混合及び篩い分けによって回収し
た（Dingらの論文 1998）。De Boerらの論文 (1998)に記載されるような卵の播種後１３
〜１５日目に、インサイチュウハイブリダイゼーション用のＭ．インコグニタの混合した
寄生段階（ＭＳ）を回収した。同様に、ヘテロゲラ・グリシンズ（Heterogera glycines
）のpre-J2及びＭＳを、感染させたダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））の根
から回収した。ケノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）を、大腸
菌（E. coli）のOP50上で培養した（Brennerの文献, 1974）。１月齢の宿主植物の葉を、
グロースチャンバー栽培のニコチアナ・タバカム・シーブイ・ペティートハバナ（Nicoti
ana tabacum cv. Petite Havana）SR1、及びアラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis th
aliana）生態型Col-0から回収した。
【０１２９】
（実施例２）：核酸の操作
充填したPre-J2の線虫を、液体窒素を用いて１．５ｍｌ微小遠心管中で凍らせ、金属棒
の平坦末端部で粉砕した。該凍結線虫断片を０．５ｍｌの抽出溶液（100 mM NaCl, 100 m
M トリス-HCl [pH8.0], 50 mM EDTA, 1% ドデシル硫酸ナトリウム, 4 mg/ml プロテイナ
ーゼＫ、及び１０μｇ／ｍｌ RNase）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。Ｄ
ＮＡをフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、それからイソプロパノールを用いて沈
殿させた（Sambrookらの文献, 1989）。該ＤＮＡをＨ２Ｏに再懸濁した。タバコ及びアラ
ビドプシスのゲノムＤＮＡを標準的技術を使用して抽出した（Dellaportaの文献 1993）
。
【０１３０】
製造業者の取扱説明書に従って、ダイナビーズｍＲＮＡダイレクトキット（Dynabeads 
mRNA DIRECT kit） (Dynal社, Lake Success, NY)を使用して、すりつぶした植物細胞か
らｍＲＮＡを抽出し、１０μｌのジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水で溶出し
、そして逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ スマートＰＣＲｃＤＮＡ合成キット（SMART PCR cDNA 
Synthesis kit）(BD Biosciences社, Palo Alto, CA)によって第一鎖（first-strand）ｃ
ＤＮＡへ変換させた。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、下記の構成要素を含んでいた：4.0μlの５×
第一鎖緩衝液（first-strand buffer）、2.0μlの20mM DTT、2.0μlの10mM 50×dNTP、1
μlの10μM 3'-CDSプライマー、10μlの単離したｍＲＮＡ、及び1μlのスーパースクリプ
トＩＩ逆転写酵素（Superscript II reverse transcriptase）(200 units/μl, Gibco BR
L社, Rockville, MD)。該反応物を、４２℃で１時間インキュベートした。
【０１３１】
（実施例３）：16D10 cDNAクローンの単離
分泌シグナル伝達ペプチドをコードするクローン16D10を、Ｍ．インコグニタの腺細胞
特異的ｃＤＮＡライブラリーのランダム配列決定の間に同定し、16D10と命名した（Huang
らの文献, 2003）。Ｔ７プライマー及びＳＰ６プライマーを使用することによって、配列
決定反応で、pGEM-Tイージーベクター（pGEM-T Easy vector）中の16D10の全長二本鎖ｃ
ＤＮＡ配列を獲得した。16D10 cDNA(364 bp)の最長翻訳領域は、シグナルＰ（Signal P）
(Nielsen et al, 1997)での予想通り、３０ａａのＮ末端疎水性シグナルペプチドを含む
４３ａａの推定タンパク質をコードしていた。１３ａａの成熟16D10ペプチド（GKKPSGPNP
GGNN, Mr 1,223 Da）（配列番号：５２）は、有意なBLASTX類似性を与えなかったが、１
３ａａの成熟16D10ペプチドは、PROSITE (Hofmannらの文献, 1999)によって予想されたよ
うなcAMP/cGMP依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位[KKpS]に加えて、アラビドプシス
のCLV3様タンパク質（Cock及びMcCormickの文献, 2001）の機能ドメインの保存されたＣ
末端の１３ａａモチーフ（KRLVPSGPNPLHN）（配列番号：５４）の８ａａ（K---PSGPNP--N
）（配列番号：５３）を含んでいた。
【０１３２】
（実施例４）：メロイドジーン種のゲノムクローン
Ｍ．インコグニタ16D10のｃＤＮＡ配列の５'末端及び３'末端から設計した、１対の遺
伝子特異的プライマー16D10GF（5'-GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTC-3'）（配列番号：５５
）及び16D10GR（5'-CAGATATAATTTTATTCAG-3’）（配列番号：５６）を使用して、２００
ｎｇのＭ．インコグニタ、Ｍ．ジャバニカ、Ｍ．アレナリア及びＭ．ハプラのゲノムＤＮ
Ａから、対応するゲノム配列（又は最も高度な相同体）を増幅させた。該ＰＣＲ産物を１
．２％アガロースゲルから切り出し、QIAクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extrac
tion kit）を用いて精製した。配列決定用に、該精製産物をpGEM-Tイージーベクター（Pr
omega社, Madison, WI）内にクローン化した。メロイドジーン種由来の16D10相同体は、
ヌクレオチドレベルで９５％を超える同一性を共有し、推定上のｃＤＮＡによってコード
される推定タンパク質は、Ｍ．インコグニタの16D10によってコードされるタンパク質に
同一であった。
【０１３３】
（実施例５）：サザンブロット解析
各サンプルに関して、１０μｇのゲノムＤＮＡを、５０単位のEcoRI又はBamHI（New En
gland Biolabs社, Beverly, MA）を用いて完全に消化し、０．７％（ｗ／ｖ）アガロース
ゲル上で分離し、ハイボンド−Ｎ ナイロン膜（Hybond-N Nylon membrane）（Amersham P
harmacia Biotech社, Piscataway, NJ）上に転写し、標準的な手順（Sambrookらの文献, 
1989）を使用してブロッティングした。Ｔ７及びＳＰ６プライマーを用いたpGEM-Tイージ
ーベクター中の挿入配列からの対応全長ｃＤＮＡの増幅によって、16D10プローブを作成
した。PCR-DIGプローブ合成システム（PCR-DIG probe synthesis system）（Roche Appli
ed Science社, Indianapolis, IN）を用いたＰＣＲによって、ゲル抽出したＰＣＲ産物を
標識した。各ハイブリダイゼーションに、１ｍｌ当たり約１５ｎｇのＤＩＧ標識プローブ
を使用した。DIGイージーハイブ溶液（DIG Easy Hyb solution）（Roche Applied Scienc
e社, Indianapolis, IN）中でのハイブリダイゼーションを４０℃で１６時間実施したの
に続き、室温の2×SSC/0.1% SDS溶液中で５分間で２回洗浄した。該膜をそれから、６８
℃で３０分間、0.5×SSC/0.1% SDSを用いて２回洗浄した。１％ブロッキング試薬中で１
時間、該膜をインキュベートした後、該膜を、１／１０，０００希釈したヒツジ抗DIGア
ルカリフォスファターゼ（ＡＰ）複合体と３０分間インキュベートした。マレイン酸洗浄
緩衝液（100 mM マレイン酸, 150 mM NaCl, pH7.5, 及び0.3% Tween 20）を用いた１５分
間の洗浄を２回行うことで、非結合抗体を除去した。ＡＰ検出緩衝液（100 mM トリス-HC
l, pH9.5, 100 mM NaCl, 及び50 mM MgCl2）中で１０分間のインキュベートに続いて、２
枚の透明フィルムに該膜を封着する前に、１：５０希釈した化学発光基質である３−（４
−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３
．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム（ＣＳＰＤ）（
Roche Applied Science社）とインキュベートし、該膜をＸ線フィルムに１．５時間感光
させた。16D10ｃＤＮＡとハイブリダイズしたＭ．インコグニタ、Ｍ．ジャバニカ、Ｍ．
アレナリア及びＭ．ハプラ由来のゲノムＤＮＡを含むブロットは、16D10が、４種の農業
的に重要なメロイドジーン種の各々において、３〜４のコピー又は相同体を有して存在す
ることを示した（図６）。ダイズシスト線虫Ｈ．グリシン（H.glycine）、非寄生性自由
生息線虫ケノルハブディティス・エレガンス、及び植物（タバコ及びアラビドプシス）由
来のゲノムＤＮＡからは、ハイブリダイゼーション検出されなかった。
【０１３４】
（実施例６）：配列解析
全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のBLASTプログラムであるPSI-BLAST
P及びBLASTX（Altschulらの文献, 1998）を使用して、配列類似性検索を実施した。Clust
alW1.8（Jeanmouginらの文献, 1994）を使用して、メロイドジーン16D10ゲノムＤＮＡ配
列の複数配列アラインメントを作成した。SignalPプログラム（Nielsenらの文献, 1997）
を使用して、分泌のシグナルペプチド及び切断部位の予測を実施した。
【０１３５】
（実施例７）：インサイチュウハイブリダイゼーション
16D10 ｃＤＮＡクローン特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し
て、非対称ＰＣＲ（Huangらの文献, 2003）によって、ジゴキシゲニン（DIG）標識したセ
ンス及びアンチセンスｃＤＮＡプローブ（Roche Applied Science社, Indianapolis, IN
）を合成した。ホルマリン固定し、透過処理したＭ．インコグニタの前寄生幼若体及び混
合した寄生段階（De Boerらの文献, 1998；Huangらの文献, 2003）を使用してインサイチ
ュウハイブリダイゼーションを行った。線虫内にハイブリダイズしたｃＤＮＡプローブを
、アルカリフォスファターゼと複合体化した抗DIG抗体、及び基質を用いて検出し、検体
を複合光顕微鏡（De Boerらの文献, 1998）を用いて観察した。インサイチュウｍＲＮＡ
ハイブリダイゼーションは、16D10が、寄生段階初期のＭ．インコグニタの２つの亜腹側
食道腺細胞において強く発現していることを示した。
【０１３６】
（実施例８）：免疫蛍光アッセイ
精製した16D10のポリクローナル抗血清を使用して、Goverseらの文献 (1994)に先行し
て記載されているように、Ｍ．インコグニタの前寄生Ｊ２、混合した寄生段階の切片中に
おける16D10発現を、間接免疫蛍光を用いて局在化させた。新しく調製した２％パラホル
ムアルデヒド含有ＰＢＳ緩衝液（80 mM Na2HPO4, 20 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl, pH7.4）
中に５日間４℃で固定した後、該線虫をＰＢＳ緩衝液で３回、脱イオン水で１回洗浄した
。固定した線虫を薄片に切り、１ｍｌ当たり０．６ｍｇのプロテイナーゼＫ（Roche Appl
ied Science社, Indianapolis, IN）を含有するリン酸緩衝液 (PBS)中で、３７度で１時
間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄した後、部分消化した線虫を−８０℃冷凍庫中
に２０分間静置し、ドライアイスで冷却したメタノール中で３分間インキュベートし、そ
れからドライアイスで冷却したアセトン中で１５分間インキュベートした。該線虫を、先
に記載されているように（Goverseらの文献, 1994）、プロテアーゼ阻害剤を修正したブ
ロッキング溶液（10% ヤギ血清, 0.02% NaN3, 1mM フッ化フェニルメチルスルホニル, 1
×PBS）を用いて１回洗浄して４℃で３日間インキュベートし、その後すぐに免疫蛍光に
使用した。ブロッキングした線虫を、９６ウエルのマルチスクリーンプレート（MultiScr
een plate）（Millipore社, Bedford, MA）のウエルに一定分量ごとに分け、室温一晩、
加湿器中でＥＬＩＳＡ希釈液（0.05% Tween, 0.02% NaN3, 1% BSA, 1×PBS）で１：２５
０希釈した精製16D10ポリクローナル抗体と攪拌した。線虫切片をＰＢＳＴ（1×PBS, 0.5
%トリトンＸ−１００（Triton X-100））を用いて５分で３回洗浄し、１：１０００希釈
したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigm
a-Aldrich社, St. Louis, MO）含有トリス-生理食塩水-BSA（0.15M NaCl, 0.01M トリス,
pH7.2, 0.2% トリトンＸ−１００, 3% BSA）中、室温で３時間、暗条件で攪拌した。Ｐ
ＢＳＴで２回、蒸留水で１回切片を洗浄した。１５μｌの水滴中の処理済切片を、予め５
μｌの０．１％ポリ−Ｌ−リジン（Sigma Chemical社）で被覆したマルチテストスライド
（ICN-Flow社, Horsham, PA）上のそれぞれのウエルに移した。スライド上の切片を風乾
させ、３μｌ滴の抗消光剤（非蛍光グリセロールを混合した0.02mg/ml フェニレンジアミ
ン含有500mM炭酸緩衝液, pH8.6）で被覆し、カバーガラスを適用した。Olympus製蛍光顕
微鏡で検体を観察した。ネガティブコントロールは、免疫前ウサギ血清からなっていた。
精製16D10抗血清は、前寄生型及び寄生型Ｊ２の亜腹側腺細胞内の分泌顆粒及びそれらの
細胞質性伸展並びに中手のポンプ室の後方に位置する拡大した膨大部に結合した。全ての
線虫検体において、ウサギ免疫前血清を用いた標識では特異性は観察されなかった。
【０１３７】
（実施例９）：タンパク質抽出
液体窒素中の微小遠心管中の２００μｌの抽出緩衝液［100mM トリス-HCl, pH7.0, 150
mM NaCl and 1×コンプリートプロテアーゼ阻害剤（complete protease inhibitors） (R
oche Applied Science社, Indianapolis, IN)］中のＭ．インコグニタ及びＨ．グリシン
の前寄生Ｊ２及び混合した寄生段階を粉砕することによって、線虫タンパク質を抽出した
。液体窒素中の微小遠心管中の２００μｌの抽出緩衝液［50mM トリス-HCl, pH7.0, 150m
M NaCl、及び1×コンプリートプロテアーゼ阻害剤（complete protease inhibitors） (R
oche Applied Science社, Indianapolis, IN)］中の遺伝子組換え苗又は根組織をすりつ
ぶすことによって、植物タンパク質（０．５ｇ）を抽出した。１３，０００ｒｐｍで１０
分間の遠心分離後、ホモジネートから上清を回収した。ＢＳＡを基準として用いて、（バ
イオラドタンパク質アッセイキットＩＩ（Bio-Rad Protein Assay Kit II）を用いて）全
てのタンパク質濃度を概算した。免疫検出アッセイ用ＴＸポジティブコントロールとして
、16D10ペプチド（GKKPSGPNPGGNN、＞95%の純度）（配列番号：５２）を、シグマ−ゲノ
シス（Sigma-Genosys）から合成した（実施例１２〜１３を参照されたい）。
【０１３８】
（実施例１０）：探針分泌物の回収
Davisらの文献 (1994)に記載されているように、Ｍ．インコグニタＪ２からの探針分泌
物を産生させ、インビトロで回収した。前寄生型Ｊ２を、加湿チャンバー内において室温
で６時間、０．４％レゾルシノール（Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO）中でインキュベ
ートした。等量の0.1M トリス-NaOH, pH11.0を添加することを介して、探針分泌物を可溶
化させた。可溶化させた探針分泌物を、ストラタクリーン（StrataClean）（Stratagene
社, La Jolla, CA）を用いて濃縮した。手短に言うと、可溶分泌タンパク質を、誘導混合
物（460ml）の上清中の１．５ｍｌのビーズを懸濁することを介して補足し、それを一定
の混合条件で１時間インキュベートした。該ビーズを遠心分離し、２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料緩衝液中に再懸濁し、３分間煮沸して吸収したタンパク質を放出させる。濃縮した探
針分泌物を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、並びに精製16D10抗血清を使用する免疫ブ
ロッティング解析に使用した（実施例１１〜１３を参照されたい）。両方のアッセイは、
Ｍ．インコグニタのＪ２及び混合した寄生段階の総抽出物と同様、探針分泌物中の16D10
ペプチドを同定した。
【０１３９】
（実施例１１）：抗血清の産生
２匹のウサギに、Eurogentec社 (Herstal, Belgium)から得た合成成熟（すなわちＮ末
端シグナルペプチドがない）16D10ペプチド（GKKPSGPNPGGNN）（配列番号：５２）を免疫
することによって、16D10に対するポリクローナル抗血清を作成した。該抗血清を、１５
ｍｌの最終未精製血清から、ペプチド抗原との親和性によって精製した。ペプチド親和性
精製済み16D10ポリクローナル抗血清を、免疫蛍光顕微鏡（Goverseらの文献, 1994）を使
用するＭ．インコグニタの検体中の16D10発現を局在化させるために使用し、探針分泌物
中の16D10並びに遺伝子組換え植物で発現する16D10又はインビトロで翻訳した16D10の免
疫検出に使用した。
【０１４０】
（実施例１２）：ウエスタンドットブロット解析
ハイボンドＥＣＬニトロセルロース上に、タンパク質サンプル（２μｌ）をスポットし
た。該ニトロセルロース膜を２０分間風乾させてもよい。該膜を、３７℃で一晩、ブロッ
キング溶液（2% 脱脂粉乳, 1×トリス緩衝化生理食塩水-Tween ［TBS-T: 20 mM トリス-H
Cl, pH7.4, 0.8% NaCl, 0.1% Tween 20］）中でインキュベートし、それから精製16D10ポ
リクローナル抗血清（１：２，０００）で処理した後、抗ウサギＩｇＧ（全分子）アルカ
リフォスファターゼ複合体（１：３０，０００）（Sigma社）で処理した。該膜を、室温
の１×ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中で洗浄し、着色するまで基質溶液（10 mlのAP緩衝液［100 mM 
トリス-HCl, pH9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl］中の、45μlのニトロブルーテトラゾリウ
ム［NBT］溶液、並びに35μlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸 トル
イジニウム［BCIP］溶液）中でインキュベートした。
【０１４１】
（実施例１３）：ＥＬＩＳＡアッセイ
Prattらの論文 (1986)のＥＬＩＳＡを修飾した。ダイナテックイムロンプレート（Dyna
tech Immulon plate）のウエルを、ホウ酸生理食塩水（0.2M ホウ酸ナトリウム, 75mM Na
Cl, pH8.5）で希釈した下記の原料：２μｌのＭ．インコグニタＪ２の１０００×濃縮探
針分泌物、１０μｇのＭ．インコグニタの前Ｊ２の総抽出タンパク質、Ｍ．インコグニタ
、前Ｊ２のＭＳ及びＨ．グリシンのＭＳ、又はネガティブコントロールとして１０μｇの
ＢＳＡ（Sigma Chemical社）由来タンパク質を用いて、４℃で一晩被覆した。ポジティブ
コントロールとして、ウエルを１００ｎｇの合成16D10ペプチド（＞95%の純度, Sigma-Ge
nosys社, TX）で被覆した。ウエルを洗浄緩衝液（10mM トリスHCl, pH8.0, 0.5M NaCl）
で３回すすぎ、室温で３０分間、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（32.9mM Na2HPO4, 1.77mM NaH2P
O4, 0.14M NaCl, pH7.4）でブロックした。洗浄緩衝液で１回すすいだ後、各被覆ウエル
を、室温で１時間、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：１，０００希釈した16D10精製ポリ
クローナル抗血清とインキュベートした。ネガティブコントロールは、一次ポリクローナ
ル抗体とのインキュベーション、及びウサギ免疫前血清とのインキュベーションの削除を
含んだ。該ウエルを３回洗浄し、室温で１時間、１：５，０００希釈のアルカリフォスフ
ァターゼ複合体化ヤギ抗ウサギ抗体（Sigma Chemical社）と共にインキュベートし、リン
酸比色分析基質を添加する前に３回洗浄した。製造業者の指示に従って、基質ｐ−ニトロ
フェニルリン酸をアルカリフォスファターゼ緩衝液（1M ジエタノールアミン, 0.5mM MgC
l2, pH 9.8）中に調製し、３Ｎ ＮａＯＨを用いて該反応を停止させるまで、室温で３０
分間、該処理済ウエル内でインキュベートした。ＥＬＩＳＡリーダー上で、４０５ｎｍ及
び４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１４２】
（実施例１４）：プラスミド構築
シグナルペプチド配列を有する16D10コード配列、又はシグナルペプチド配列をもたな
い16D10コード配列を、KpnI又はXbaI制限酵素認識部位（下線部）及び終止／開始コドン
（イタリック体部分）を導入したプライマー群、
【化１】
2014076052.tif 000002
又は
【化２】
2014076052.tif 000003
及び16D10R (5'-GCTCTAGATCAATTATTTCCTCCAGG-3') (配列番号：５９)を用いて全長ｃＤＮ
Ａから増幅させ、CaMV 35Sプロモーター制御下で、２成分ベクターpBIXのKpnI及びXbaI部
位へとクローン化して、それぞれpBIX(16D10S)及びpBIX(16D10)を作成し、配列決定によ
って確認した。pBIXはpBI101 (BD Biosciences社, Palo Alto, CA)由来であり、ｎｏｓプ
ロモーター−ｎｐｔＩＩ−ｎｏｓターミネーターカセット、３５Ｓプロモーター−ｇｕｓ
Ａ−ｎｏｓターミネーター、並びにKpnI及びXbaI部位を有するポリリンカーを有する第二
３５Ｓプロモーターを含む。clv3及び16D10の混成発現配列を、KpnI制限酵素認識部位（
下線部）を導入したプライマーC3K (5'-GGGGTACCATGGATTCTAAAAGCTTTG-3') (配列番号：
６０)及びシグナル配列用プライマーC3R (5'-CCACTAGGCTTTTTGCCAAGGAACAAGAAGCAG-3') (
配列番号：６１)を使用するアラビドプシスゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅によって作成
し、並びにプライマーC3F (5'-CTTCTGCTTCTTGTTCCTTGGCAAAAAGCCTAGTGG-3') (配列番号：
６２)、及び成熟ペプチドコード配列に対するXbaI制限酵素認識部位（下線部）を導入し
たプライマー16D10X (5'-GCTCTAGATCAATTATTTCCTCCAGG-3') (配列番号：６３)を使用して
、ベントポリメラーゼ（Vent polymerase）（New England Biolabs社, Beverly, MA）を
使用する16D10 ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅によって作成した。該２産物をそれから使用して
、融合ＰＣＲ反応で互いをプライム（prime）させた。該産物フラグメントをpBIX内にク
ローン化してpBIX(C3S-16D10)を作成し、配列決定で検証した。
【０１４３】
（実施例１５）：タバコ毛状根の形質転換
電子穿孔法(Shen及びFordeの文献, 1989)によって、プラスミドpBIX(16D10)、pBIX(16D
10S)、及びコントロールとして空ベクターpBIXをアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agro
bacterium rhizogenes）ATCC 15834中へと移入させ、Ａ．リゾゲネス介在性子葉形質転換
（Christeyの文献, 1997）を使用して、タバコ（ニコチアナ・タバカム・シーブイ・ペテ
ィートハバナSR1）へと形質転換させた。１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及びチメンチン
（timentin）（230.8 mg/Lのチカルシリン二ナトリウムに加えて7.69 mg/Lのクラブラン
酸カリウム）含有０．８％不活性型寒天を含む、ガンボルグのＢ−５プレート（Gamborg'
s B-5 plate）上でタバコ子葉をインキュベートして、形質転換毛状根を作成した。個々
の毛状根片（約０．５ｃｍ）を、２４℃の暗条件下で３週間培養し、個々の毛状根系由来
の２〜３本の根をＧＵＳ染色（Jeffersonらの文献, 1987）に用いた。ＰＣＲ解析で確認
した、細菌汚染のないカナマイシン抵抗性根系統及びＧＵＳ陽性根系統を使用して、毛状
根系統を確立した。該根片をガンボルグのＢ−５プレート上で、ホルモンなしで２週間ご
とに、根の成長アッセイ用に継代培養し、アッセイ用に該根を２４℃の暗条件下で該古い
プレート上で培養し続けた。根の成長アッセイに関して、プレートを水平にして暗条件下
で培養し、それぞれ３回繰り返した各遺伝子組換え系統由来の５本の毛状根を詳細に調べ
た。Doesらの文献, 1991に記載されているように、遺伝子組換えアラビドプシスのものと
同じ手順を使用して、同定した単一遺伝子組換えコピーを有する遺伝子組換え毛状根又は
カリ（calli）の相対的ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫ブロッティング解析を実施した。毛状根細
胞の細胞質における16D10の発現は、約６５％［２週間後の平均根長は、コントロール系
統の３．１５±０．３４ｃｍ（n = 90）に比較して、16D10遺伝子組換え系統で５．２０
±０．６１ｃｍ（n = 90）］の割合で根の成長を増加させ、外延的な側根を生じさせ、継
代培養５週間目に切断した根部分にカリの形成をもたらした。16D10発現のＲＴ−ＰＣＲ
解析は、カリ中における定常状態のｍＲＮＡレベルが、毛状根中のものよりも高いことを
示した。精製16D10抗血清を用いた免疫ブロッティング解析は、16D10が、毛状根及びカリ
の両方で産生されることを示した。コントロールベクターで形質転換した毛状根では、16
D10の発現は検出されなかった。
【０１４４】
（実施例１６）：アラビドプシス花浸漬形質転換
電子穿孔法（Shen及びFordeの論文, 1989）で、プラスミドpBIX(16D10)、pBIX(C3S-16D
10)、及びコントロールとしての空ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスC
58C1中に導入し、花浸漬法（Clough及びBentの文献, 1998）によって、Ａ．サリアナの野
生型Col-0植物体中に形質転換した。カナマイシン耐性の分離、ＧＵＳ−染色（Jefferson et al, 1987）、及び16D10発現をＰＣＲ解析に共役させて、遺伝子組換え相同Ｔ２系統の世代を確認した。逆ＰＣＲ（Inverse PCR）（Doesらの文献, 1991）は、分子的アッセイ及び根の成長アッセイ用のゲノムにおける、単一遺伝子組換えコピーを有する相同系統を同定した。それぞれ３回繰り返した各遺伝子組換え系統由来の３０個の植物体を、１６時間明条件（２４℃）／８時間暗条件（２０℃）サイクルで、３％スクロース含有ＭＳプレート上にインビトロ培養し、該プレートを根の成長アッセイ用に垂直方向に維持した。
【０１４５】
３５Ｓプロモーターの制御下で、シグナルペプチドのない16D10の単一コピーを含む、
４つの遺伝子組換えアラビドプシスＴ２相同系統を作成した。空の形質転換ベクターから
発生させた２つの遺伝子組換え系統もまた、コントロールとして作成した。ＲＴ−ＰＣＲ
及び免疫ブロッティング解析で、16D10が、該コントロール系統では発現していないが、
全ての16D10遺伝子組換え系統で発現していたことを確認した。コントロールに比較して
、アラビドプシス細胞の細胞質における16D10の発現は、一次根の長さを８５％［４つの1
6D10遺伝子組換え系統（n = 90/系統）で平均５４．０１±８．７５ｍｍ、及び２つのコ
ントロール系統（n = 90/系統）で平均２９．２０±８．７５ｍｍ］増加させ、側枝及び
不定根の数を、それぞれ１．４倍及び２．０８倍増加させた（図２及び図３）。増強され
た一次根の成長は、増強された側根及び増強された不定根の数と密接に関連していた。３
日にわたる根片の成長速度の測定は、16D10の根の成長点領域のみの長さを増加させる（
２０％）ことを示し、これは細胞数の増加であって、強化された根の成長に細胞のサイズ
は寄与していないことを示した。
【０１４６】
（実施例１７）：相補性検定
１３ａａの成熟16D10ペプチド（GKKPSGPNPGGNN）（配列番号：５２）は、アラビドプシ
スのCLV3様タンパク質（Cock及びMcCormickの文献, 2001）の機能ドメインの保存された
Ｃ末端の１３ａａのモチーフ（KRLVPSGPNPLHN）（配列番号：５４）の８ａａ（K---PSGPN
P--N）（配列番号：５３）を含んでいたので、機能的相補性検定用に、Ａ．ツメファシエ
ンスC58C1介在性花浸漬形質転換（Clough及びBentの文献, 1998）を介して、Ａ．サリア
ナのCLAVATA3シグナルペプチドを含むＭ．インコグニタの16D10をコードするプラスミドp
BIX(Clv3S-16D10)をＡ．サリアナのclv3変異体clv3-1 (中間体)に転移させた。コントロ
ールとして、プラスミドpBIX(16D10)及びpBIXもclv3変異体に導入した。各構築物の３つ
の遺伝子組換えＴ２相同系統も作成した。16D10で形質転換したclv3系統の表現型（花及
び茎頂分裂組織）を詳細に調べ、ベクターで形質転換したＡ．サリアナの野生型生態型Co
l-0及びFletcherらの文献 (1999)に記載されているようなclv3変異体子孫の表現型を比較
した。16D10はアラビドプシスCLV3様タンパク質の機能ドメインを含んでいたので、アラ
ビドプシスclv3変異体のアポプラスト又は細胞質における16D10の発現は野生型の表現型
を回復させず、16D10がCLV3様タンパク質として機能しないことを示した。
【０１４７】
（実施例１８）：組織学的解析
Ａ．サリアナの一次根組織を固定して脱水し（Dolanらの文献, 1993）、製造業者の取
扱説明書に従い、低粘度包埋キット（Low Viscosity Embedding kit）（Electron Micros
copy Sciences社, Hatfield, PA）を使用して、スパース（Spurrs）樹脂中に包埋した。
レイチャート−ジュングウルトラカットＥ（Reichert-Jung Ultracut E）上で薄切片（0.
4μM）を作成し、１％トルイジンブルーで染色した。根成長点内及び根成長点上の横断根
切片、及び根端での長軸切片は、細胞型の平均細胞サイズ及び細胞数並びに細胞層は、野
生型に比較して、遺伝子組換え系統で差がないことを示した。根の形態も我々の遺伝子組
換え植物では改変されず、成長の強化は、根系の加速的発達に付随していた。それゆえ、
異所性16D10発現は根の成長速度を速め、場合によっては成長点における細胞分裂の刺激
によって側根開始を誘導し、成長点組織を変化させずに細胞産生速度を高める。
【０１４８】
（実施例１９）：相対的ＲＴ−ＰＣＲ
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを、等量の植物組織から抽出したｍＲＮＡで実施した。先に記
載した16D10遺伝子特異的プライマー16D10F及び16D10Rを、次のＰＣＲ増幅で使用した。
コントロールにおいて、Ａ．サリアナ野生型生態型Col-0の一様に発現するUBQ10遺伝子（
ジーンバンク受入番号NM_202787）から設計したプライマー群UBQ1 (5'-GATCTTTGCCGGAAAA
CAATTGGAGGATGGT-3') (配列番号：６４)及びUBQ2 (5'-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAACAG
G-3') (配列番号：６５)を使用して、遺伝子組換えアラビドプシス系統から、４８３ｂｐ
のUBQ10の特有配列を増幅させた。ニコチアナ・タバカム・シーブイ・ペティートハバナS
R1の一様に発現しているアクチン遺伝子（ジーンバンク受入番号U60494）から設計したプ
ライマー群ActF (5'-CCGGTCGTGGTCTTACTGAT-3') (配列番号：６６)及びActR (5'-GCACCGA
TTGTGATGACTTG-3') (配列番号：６７)を使用して、遺伝子組換えタバコの毛状根から、２
７１ｂｐのタバコアクチン（Tob104）遺伝子の特有配列を増幅させた。ＰＣＲは以下の構
成要素を含む：5μlの10×ＢＤアドバンテージ２ＰＣＲ緩衝液（BD Advantage 2 PCR buf
fer）、1.0μlの10mM dNTPミックス、1.5μlの 5'プライマー、1.5μlの3'プライマー、2
μlのcDNA、38μlの水、及び1.0μlの50×ＢＤアドバンテージ２ポリメラーゼミックス（
BD Advantage 2 Polymerase Mix）(BD Biosciences社、Palo Alto、CA)。ＰＣＲサイクル
は、９４℃２分間の開始変性段階に続き、３５サイクルの９４℃１分間、５５℃３０秒間
、７２℃４０秒間、及び最後の１０分間は７２℃の伸長段階からなる。各ＲＴ−ＰＣＲ反
応物の１０マイクロリットル分量を、２％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜に
転写し、対応するＤＩＧ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＴ−ＰＣＲ解析
は、16D10転写産物が16D10遺伝子組換えタバコ毛状根及びアラビドプシス系統において安
定的に存在していたが、ベクター形質転換コントロール系統には存在していなかったこと
を示した。
【０１４９】
（実施例２０）：酵母２ハイブリッド（Two-hybrid）選別
酵母２ハイブリッド選別に、マッチメーカー酵母２ハイブリッドシステムＩＩ（MATCHM
AKER yeast two-hybrid system II）（BD Biosciences社, Palo Alto, CA）を使用した。
16D10の成熟ペプチドをコードするｃＤＮＡを、pGBKT7のGAL4結合ドメイン（ＢＤ）へと
インフレームでクローン化してpGBKT7(16D10)を作成し、囮として発現させ、pGADT7のGAL
4活性化ドメイン（ＡＤ）で、トマト根組織由来のｍＲＮＡから構築したトマト根ｃＤＮ
Ａライブラリーを選別した。ジーンバンクデータベース（Bolleの文献, 2004）中の対応
する配列に基づき、各遺伝子の特定プライマーを用いて、Ａ．サリアナの根組織由来のｍ
ＲＮＡから作成した根ｃＤＮＡプールから、１２個の全長ＳＣＬをコードするｃＤＮＡ群
（AtSCL1、AtSCL3、AtSCL5、AtSCL6、AtSCL9、AtSCL13、AtSCL14、AtSCL21、AtSCR、AtSH
R、AtRGA、AtGAI）を増幅させ、pGADT7へとインフレームでクローン化した。それぞれの
構築物を、pGBKT7(16D10)を用いて、酵母系統AH109へと導入した。AtSCL6及びAtSCL21の
特定領域をコードするｃＤＮＡをpGADT7へとクローン化し、それからpGBKT7(16D10)を用
いて系統AH109へと共形質転換させた。ｃＤＮＡライブラリー選別、陽性クローンの選択
、及びβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイを含む全ての手順を、マッチメーカー酵母２ハ
イブリッドシステムＩＩ（MATCHMAKER yeast two-hybrid system II）(BD Biosciences社
, Palo Alto, CA)のプロトコルに従って実施した。２つのアラビドプシスＳＣＬタンパク
質であるAtSCL6及びAtSCL21は、酵母内で16D10と相互作用した。ドメイン解析は、16D10
とAtSCL6及びAtSCL21との特異的相互作用、並びに16D10とＳＣＬタンパク質の残りのドメ
インとの相互作用がないことを示し、ＳＣＬ転写因子（群）が、植物のＲＫＮ寄生間の、
分泌された16D10の推定上の標的であることを示した。
【０１５０】
（実施例２１）：浸漬によるＲＮＡｉ
それぞれＲＮＡプライマー部位Ｔ７（下線部）を組み込むプライマー群16D10T7F1 (5'-
TAATACGACTCACTATAGGGCCTCAAAAATACCATAAAG-3')(配列番号：６８)及び16D10T7R1 (5'-TAA
TACGACTCACTATAGGGGAAATTAACAAAGGAAACC-3') (配列番号：６９)、並びに16D10T7F2 (5'-T
AATACGACTCACTATAGGGGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-3) (配列番号：７０)及び16D10T7R2 (5'-TAAT
ACGACTCACTATAGGGTCAATTATTTCCTCCAGG-3') (配列番号：７１)を使用して、全長ｃＤＮＡ
クローンから、それぞれ４２ｂｐ及び２７１ｂｐの16D10配列を増幅させた。製造業者の
説明書に従いメガスクリプトＲＮＡｉキット（MEGAscript RNAi kit）（Ambion社, Austi
n, TX）を使用して、インビトロの単反応で、センス16D10ＲＮＡ及びアンチセンス16D10
ＲＮＡの合成用プライマーとしてゲル精製ＰＣＲ産物を使用し、該反応物を１６時間イン
キュベートせずに、ＲＮＡ収量を増加させた。標準的手順（Sambrookらの文献, 1989）に
よって、生成した二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの量及び質を概算、定量した。該ｄｓＲＮＡ産物
をエタノール沈殿させ、１０〜１５μｇ／μｌとなるようヌクレアーゼ非含有水に再懸濁
した。
【０１５１】
約１０，０００の新しく孵化したＭ．インコグニタのＪ２を、1mg/mlの16D10 dsRNA、1
％レゾルシノール、0.13mg/ml ＦＩＴＣ異性体Ｉ、0.05% ゼラチン及び3mM スペルミジン
を含む１／４ Ｍ９緩衝液（10.9mM Na2HPO4, 5mM KH2PO4, 4.7mM NH4Cl, and 2.2mM NaCl
）中に浸し、室温で４時間、回転板上でインキュベートした。レゾルシノール（Ｒｅｓ）
を使用して、ｄｓＲＮＡの取り込み刺激を援助した。同じ溶液ではあるがレゾルシノール
又はｄｓＲＮＡを含まない溶液中に、コントロールサンプルをインキュベートした。浸漬
後、遠心分離によって、ヌクレアーゼ非含有水を用いて徹底的に５回線虫を洗浄し、オリ
ンパス製蛍光顕微鏡を用いて、約１００％の処理済線虫のｄｓＲＮＡの取り込みマーカー
であるＦＩＴＣの取り込みを観察した。ＦＩＴＣ標識遺伝子組換えＪ２をアッセイして、
鋳型として同数の処理済Ｊ２由来のｍＲＮＡから合成した第一鎖ｃＤＮＡ、並びにコント
ロールとしてＭ．インコグニタで構成的に発現するアクチン遺伝子（ジーンバンク受入番
号BE225475）の２８４ｂｐの増幅フラグメントを使用して、相対的ＲＴ−ＰＣＲ解析によ
る16D10転写産物のサイレンシングを測定した。根瘤線虫の第２期幼若体による、短い又
は全長16D10ｄｓＲＮＡの消化は、処理済線虫における16D10転写産物の顕著な現象をもた
らし（図４）、インビボでのＲＮＡｉによる根瘤線虫内の16D10標的化に関する直接的な
証拠を提供した。
【０１５２】
Ｍ．インコグニタのＪ２もまた先に記載したように、1 mg/mlの8H11 (配列番号：１７)
又は31H06 (配列番号：３３)特異的ｄｓＲＮＡに浸漬させた。相対的ＲＴ−ＰＣＲ解析
は、根瘤線虫の第２期幼若体による8H11 dsRNA及び31H06 dsRNAの消化は、処理済線虫中
のこれら２つの付加的寄生遺伝子の転写の顕著な現象をもたらしたことを示した（図５）
。
【０１５３】
（実施例２２）：ＲＮＡｉの植物体送達
それぞれXhoI、KpnI、ClaI又はXbaI 制限酵素認識部位（下線部）を導入した遺伝子特
異的プライマー群、16D10Xho1 (5'-CCGCTCGAGGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-3') (配列番号：７２
)及び16D10Kpn1 (5'-CGGGGTACCTCAATTATTTCCTCCAGG-3') (配列番号：７３)、16D10Cla1 (
5'-CCATCGATTCAATTATTTCCTCCAGG-3') (配列番号：７４) and 16D10Xba1 (5'-GCTCTAGAGGC
AAAAAGCCTAGTGGGC-3') (配列番号：７５)、16D10Xho3 (5'-CCGCTCGAGCCTCAAAAATACCATAAA
G-3'(配列番号：７６)及び16D10Kpn2 (5'-CGGGGTACCGAAATTAACAAAGGAAACC-3') (配列番号
：７７)、16D10Cla2 (5'-CCATCGATGAAATTAACAAAGGAAACC-3') (配列番号：７８)及び16D10
Xba3 (5'GCTCTAGACCTCAAAAATACCATAAAG-3') (配列番号：７９)を用いて、全長ｃＤＮＡク
ローンから、16D10のセンスｃＤＮＡ及びアンチセンスｃＤＮＡ（42bp又は271bp）を増幅
させた。該ＰＣＲ産物をゲル精製し、それぞれ制限酵素XhoI及びKpnI、又はClaI及びXbaI
を用いて消化した。該消化済ＰＣＲ産物をpHANNIBALのXho-KpnI部位及びClaI-XbaI部位へ
とクローン化し、それぞれpHANNIBAL(16D10#1)及びpHANNIBAL(16D10#2)を作成した。pHAN
NIBAL由来プラスミドのセンス16D10ｃＤＮＡ及びアンチセンス16D10ｃＤＮＡをNotIフラ
グメントとして２成分ベクターpART27 (Gleaveの文献, 1992)へとサブクローン化し、高
度に効率的なイントロン含有「ヘアピン」ＲＮＡ（ihpRNA）サイレンシング構築物（Wesl
eyらの文献, 2001）を作出した。pART27由来構築物を、Ａ．ツメファシエンスC58C1へ、
電子穿孔法で移入させた。該形質転換体を、リファンピシン（50mg/L）、ゲンタマイシン
（25mg/L）及びスペクチノマイシン（100 mg/L）含有ＬＢ培地上で選別し、それから先に
記載したように、花浸漬形質転換を介して、Ａ．サリアナ生態型Col-0へと導入した。CaM
V35Sプロモーター下の16D10特異的ihpRNAを構成的に転写する遺伝子組換え相同Ｔ２系統
は、根瘤線虫メロイドジーン種に対する抵抗性アッセイ用に作成した。
【０１５４】
（実施例２３）：抵抗性アッセイ
pART27由来構築物の形質転換から生じたＡ．サリアナ遺伝子組換え系統由来の種子を、
70% (v/v) エタノールで１分間、及び3% (v/v)ハイポクロライドナトリウムで５分間表面
を滅菌し、それから滅菌蒸留水で５回すすいだ。該滅菌済種子を重複させ、ガンボルグの
Ｂ−５培地で３週間成育させた。Ｍ．インコグニタの卵を滅菌し、それから先に記載した
ように（Sijmonsらの文献, 1991）、約５００個の卵を各植物体の根付近に植えつけた。
感染根の瘤の数及びサイズを、植え付け３週間後に解析し、該感染根をHwangらの文献, 2
000に記載されているように、酸性フクシンを用いて赤色に染色し、植え付け８週間後に、根１グラム当たりの卵の数をアッセイした。16D10ｄｓＲＮＡを発現する遺伝子組換えアラビドプシス系統は、４種の主要なメロイドジーン種、すなわちＭ．インコグニタ、Ｍ．ジャバニカ、Ｍ．アレナリア及びＭ．ハプラに抵抗性であった。根の瘤形成アッセイは、ベクター形質転換系統に比較して、16D10 ｄｓＲＮＡ遺伝子組換えアラビドプシス系統上の瘤の数（及びサイズ）の６３〜９０％の減少を示した（図１Ａ、１Ｂ、及び表１）。線虫再生産アッセイは、コントロール植物体に比較し場合、16D10 ｄｓＲＮＡ遺伝子組換え系統において、根１グラム当たりのＲＫＮの卵の数の７０〜９７％の減少を示した（図７）。
【０１５５】
【表１】
2014076052.tif 000004
【０１５６】
（実施例２４）：１６ｄ１０配列データ
16D10ゲノムＤＮＡ配列（840bp）
【化３】
2014076052.tif 000005
（４７６ｂｐの単一イントロン配列を太字で示す）
【０１５７】
16D10 ｃＤＮＡ配列（３６４ｂｐ）
GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTAATTATTCTTCAATCAAAAAAATGTTTACTAATTCA
ATTAAAAATTTAATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTGTCTCATTTGTGGATGCAGGCAA
AAAGCCTAGTGGGCCAAATCCTGGAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAATTAAACGATAAATG
GGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTTGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTGAATTTACTGA
ATAAAATTATATCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (配列番号：２)
【０１５８】
16D10のＲＮＡｉ構築物作成用に使用した16D10 ｃＤＮＡ配列領域
【化４】
2014076052.tif 000006
［太字の４２ｂｐの配列をpHANNIBAL(16D10#1)の構築用に使用し、下線を引いた２７１ｂ
ｐ配列をpHANNIBAL(16D10#2)構築用に使用した］
【０１５９】
pHANNIBAL(16D10#1):
（ａ）構築物：（XhoI + 42bpの16D10センス鎖配列 + KpnI = 54bp）+ Pdkイントロン + 
(ClaI + 42bpの16D10アンチセンス鎖配列 + XbaI = 54bp) 
【化５】
2014076052.tif 000007
【０１６０】
（ｂ）ＰＣＲ検出：プライマーH1F1及びH1R1 (234bpのＰＣＲ産物)
プライマー群H1F2及びH1R2 (273bpのＰＣＲ産物)
pHANNIBAL(16D10#2)
(1). 構築物#2: (XhoI + 271bpの16D10センス鎖配列 + KpnI = 283bp) + Pdkイントロン 
+ (ClaI + 271bpの16D10アンチセンス鎖配列 + XbaI = 283bp) 
【化６】
2014076052.tif 000008
【０１６１】
【表２】
2014076052.tif 000009
2014076052.tif 000010
2014076052.tif 000011
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2014076052.tif 000035
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１Ａは、Ｍ．インコグニタを植えつけた、16D10 ｄｓＲＮＡ発現Ａ．サリアナを示す。16D10 ｄｓＲＮＡを発現しているＡ．サリアナの根上には根瘤病害（瘤）がないことを示す。図１Ｂは、Ｍ．インコグニタを植えつけたコントロールの植物を示す。
【図２】図２は、16D10を発現しているＡ．サリアナの遺伝子組換え植物体の写真であり、コントロールの植物体（空ベクター）に比較して根の成長が強化されている。
【図３】図３は、コントロール系統（L2、L3）に比較して、４つの遺伝子組換えアラビドプシスT2相同系統L7、L10、L11、L17の強化された根の成長を示す。
【図４】図４は、16D10 ｄｓＲＮＡ（RNA1及びRNA2）で処理した根瘤線虫の第２期幼若体のＲＴ−ＰＣＲ解析であり、該処理済線虫における寄生遺伝子16D10の転写の顕著な減少を示す。レゾルシノール（Res）を使用して、該ｄｓＲＮＡの取り込み刺激を援助した。ｄｓＲＮＡ又はres単独を用いての転写の減少はない。Mi-actは、内部転写コントロールである。
【図５】図５は、線虫において、8H11又は31H06に指示されたＲＮＡｉが、寄生遺伝子である8H11又は31H06の発現を下方調節することを示す、ゲルの写真を示す。
【図６】図６は、制限酵素で消化した、４種のメロイドジーン種由来のゲノムＤＮＡの、ＤＩＧ標識した16D10プローブを用いた、ＤＮＡブロットハイブリダイゼーションを示す。Mi, Ｍ．インコグニタ；Mj, Ｍ．ジャバニカ；Ma, Ｍ．アレナリア；Mh, Ｍ．ハプラ。E, EcoRI；B, BamHI。 M, ｋｂにおける８０ｎｇのＤＩＧ標識した分子量マーカー。
【図７】図７は、16D10 ｄｓＲＮＡを発現している遺伝子組換えＡ．サリアナ上での、４種のメロイドジーン種（Mi, Ｍ．インコグニタ；Mj, Ｍ．ジャバニカ；Ma, Ｍ．アレナリア；Mh,Ｍ．ハプラ）の繁殖（根１グラム当たりの卵）が、コントロールの植物に比較して減少していたことを示す棒グラフを示す。
【図１】
2014076052.tif 000036
【図２】
2014076052.tif 000037
【図３】
2014076052.tif 000038
【図４】
2014076052.tif 000039
【図５】
2014076052.tif 000040
【図６】
2014076052.tif 000041
【図７】
2014076052.tif 000042
【配列表】
2014076052000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月6日(2013.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫の食道腺細胞分泌ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも一部に特異的な阻害性核酸を含む、遺伝子組換え植物又は細胞。
【外国語明細書】
2014076052000001.pdf