(57)【要約】      （修正有）【課題】前骨髄細胞性白血病（ＰＭＬ）蛋白質を対象とし、腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等の好ましくない細胞に対して、細胞死を誘発する新規医薬組成物の提供。【解決手段】ＰＭＬ蛋白質及び／又はＰＭＬ蛋白質の過剰な発現を誘発する薬品と；ヒ素化合物、カスパーゼ阻害剤等から選択される少なくとも１種類の物質；とを組み合わせた医薬組成物。前記ヒ素化合物としては三酸化ヒ素が、前記カスパーゼ阻害剤としてはｚＶＡＤ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（Ｏ−メチル）フルオロメチルケトン）が好ましい。また、前記ＰＭＬ蛋白質の過剰な発現を誘発する薬品としてはインターフェロン（例えば、α、β、又はγインターフェロン）が好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくない細胞の死を誘発することおよび／または免疫反応を刺激することを意図する薬物を製造するために、ＰＭＬタンパク質および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する薬品と組み合わせた、ＰＭＬタンパク質を核体に向けることおよび／またはその安定化を促進する物質、および／またはヒ素化合物と、ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物と、カスパーゼ阻害剤および／または基質とから選択される物質の、少なくとも１種類の物質の使用であって、前記物質の投与、および／またはＰＭＬタンパク質および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する前記薬品の投与が同時または逐次的である、前記使用。
【請求項２】
前記物質が三酸化ヒ素である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記物質がｚＶＡＤである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する前記薬品が、インターフェロン、たとえば、α、β、またはγインターフェロンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
好ましくない細胞の死を誘発することおよび／または免疫反応を刺激することを意図する薬物を製造するためにインターフェロンと組み合わせた、ヒ素化合物と、ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物と、カスパーゼ阻害剤および／または基質とから選択される少なくとも１種類の物質の使用であって、前記物質の投与、およびインターフェロンの投与が同時または逐次的である、前記使用。
【請求項６】
好ましくない細胞を、ヒ素化合物と、ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物と、カスパーゼ阻害剤および／または基質とから選択される物質に接触させることを含む、好ましくない細胞の死を誘発するためのインビトロの方法であって、前記物質をＰＭＬタンパク質および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する薬品、好ましくはインターフェロンと組み合わせる、前記方法。
【請求項７】
１）医薬として許容されるビヒクルの存在下で、少なくとも１種類のヒ素化合物またはヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物、および／またはＰＭＬタンパク質、および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する少なくとも１種類の薬品、たとえば、インターフェロンと併用された、少なくとも１種類のカスパーゼ阻害剤および／または基質、または
２）医薬として許容されるビヒクルの存在下で、ＰＭＬタンパク質、および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する少なくとも１種類の薬品、たとえば、インターフェロンと組み合わせた、少なくとも１種類のヒ素化合物またはヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物、のいずれかを含有する医薬組成物。
【請求項８】
ａ）（１）医薬として許容されるビヒクルと組み合わせた、少なくとも１種類のカスパーゼ阻害剤および／または基質を含有する医薬組成物、および／または（２）医薬として許容されるビヒクルと組み合わせた、少なくとも１種類のヒ素化合物またはヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物を含有する医薬組成物、ならびに
ｂ）（３）医薬として許容されるビヒクルと組み合わせたＰＭＬタンパク質を含有する医薬組成物、および／または（４）医薬として許容されるビヒクルと組み合わせた、ＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する少なくとも１種類の薬品、たとえば、インターフェロンを含有する医薬組成物、を含むキットであって、
前記医薬組成物が同時または逐次的に投与されることを意図している、前記キット。
【請求項９】
好ましくない細胞の死を誘発することおよび／または免疫反応を刺激することを意図する薬物を製造するための、ＰＭＬタンパク質を核体に向けることおよび／またはその安定化を促進する、ヒ素化合物以外の少なくとも１種類の物質の使用。
【請求項１０】
好ましくない細胞の死を誘発することおよび／または免疫反応を刺激することを意図する薬物を製造するための、カスパーゼ阻害剤および／または基質から選択された少なくとも１種類の物質の使用。
【請求項１１】
前記物質がｚＶＡＤである、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞死を誘発する新規な薬品の使用、具体的には好ましくない細胞の死を誘発するためにインターフェロンと併用して核体上でＰＭＬタンパク質を過剰に発現させる薬品の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核体は、機能が知られていない、またＰＭＬ、Ｓｐ１００、ＩＳＧ２０、ＰＩＣ−１／ＳＵＭＯ−１、ｌｙｓｐ１００、ＰＬＺＦ、Ｉｎｔ−６、ＣＢＰ、Ｒｂ、ＲＦＰ、およびリボソームのｐタンパク質を含む幾つかのタンパク質を含有する、核マトリックスと組み合わされた構造体である（Ｌａｍｏｎｄ等、１９９８）。ＰＭＬ（すなわち「ＰｒｏＭｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（前骨髄細肪性白血病）」）タンパク質をコードする遺伝子は、それと急性の前骨髄細胞性白血病（ＡＰＬ）に罹った患者に見出されるｔ（１５；１７）転位のＲＡＲα（レチノイン酸核受容体）遺伝子との融合により同定された。このＰＭＬ遺伝子はインターフェロンの標的遺伝子であり、その過剰な発現は或る細胞系の増殖を停止させる（Ｋｏｋｅｎ等、１９９５）。悪性のＡＰＬ細胞中では、ＰＭＬタンパク質はＰＭＬ−ＲＡＲαの発現のために核体上に位置せず、正規の場所から離れて位置する。酸化ヒ素はＰＭＬのその正常な位置への復帰ならびに細胞死を誘発する。ＰＭＬの位置が正常である正常な非ＡＰＬ細胞においては、ヒ素はＰＭＬを大きな変性体になるように凝集を誘導するが、その現象は細胞死を伴わない（Ｚｈｕ等、１９９７）。
【発明の概要】
【０００３】
さて本発明者等は、核体上に位置したＰＭＬタンパク質の過剰な発現が、カスパーゼにより誘発されたアポトーシスの機構とは異なる新規な機構により細胞死を引き起こすことを発見した。
この発見の主要な帰結は、ＰＭＬタンパク質を細胞体に向けることおよび／またはその安定化を促進する物質が、好ましくない細胞の死を誘発するために特に有用であるということである。
【０００４】
ＰＭＬタンパク質を細胞体に向けることおよび／またはその安定化を誘発する前記物質は当業技術者には既知の標準試験法により同定され、細胞質および核質の部分と、核体に関連した部分との間の細胞内移行、およびＰＭＬタンパク質の安定化の測定を、特にウェスタンブロット法により行なうことが可能である。
前記の好ましくない細胞は、特に腫瘍細胞、ウィルス感染細胞、寄生体または細菌、不適当な免疫反応に関係する免疫細胞、遺伝的に修飾された細胞、老衰または過形成細胞である。
【０００５】
「腫瘍」という表現は、特に充実性の癌と、白血病およびリンパ腫を含む任意の好ましくない良性または悪性腫瘍の細胞増殖を意味するものと解釈される。悪性腫瘍の中では、特に慢性の骨髄性白血病と成人Ｔリンパ様白血病（ＡＴＬ）、および黒色腫のことを云う。
したがって、本発明の主題は、好ましくない細胞の死を誘発することを意図する薬物を製造するための、ＰＭＬタンパク質を細胞体に向けることおよび／またはその安定化を促進する少なくとも１種類の物質の使用である。
【０００６】
ＰＭＬタンパク質の発現はインターフェロンにより誘発されるので、インターフェロンの存在が、たとえ内因性起源のものであろうと、患者に同時または逐次的に投与されたものであろうと想像される治療の有効性にとって必要である。
より具体的には本発明者等は、驚くべきことにｚＶＡＤ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（Ｏ−メチル）フルオロメチルケトン）が一方でＰＭＬタンパク質を安定化し、他方でインターフェロンにより誘発される細胞死を加速するということを発見した。
【０００７】
しかしながら、ｚＶＡＤはアポトーシス過程に含まれるプロテアーゼであるカスパーゼの阻害剤として初めのうちは知られていた（Ｓａｌｖｅｓｅｎ等、１９９７）。これに加えて研究（ＭｃＣａｒｔｈｙ等、１９９７）の結果は、ｚＶＡＤが細胞死を妨げ、または非常に遅らせることを示した。したがって、インターフェロンにより誘発される細胞死を阻止するのではなく、これとは対照的に細胞死を加速するという本発明者等による発見は、当業者により予期されたであろう結果とは一致しない。
【０００８】
より具体的には本発明の主題は、好ましくない細胞の死を誘発することを意図する薬物を製造するためのｚＶＡＤなどのカスパーゼ阻害剤および／または基質の使用である。認められる細胞死の加速はＰＭＬの安定化の結果である可能性があるが、また本発明の枠組みの中にある別の機構を含む可能性もある。
「カスパーゼ基質」という表現は、カスパーゼと結合することができる任意の化合物を意味するものと解釈される。
【０００９】
また本発明者等はヒ素、より具体的には三酸化ヒ素が、一方でＰＭＬタンパク質を細胞体に向け、他方でインターフェロンにより誘発される細胞死を加速することを発見した。
より具体的には本発明の主題は、少なくとも１種類のインターフェロンと共同して好ましくない細胞の死を誘発することを意図する薬物を製造するためのヒ素化合物またはヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物の使用である。
【００１０】
認められるこの細胞死の誘発は、ＰＭＬタンパク質を細胞体に向ける結果である可能性があるが、また本発明の枠組みの中にある別の機構を含む可能性もある。
ヒ素化合物の中では特に三酸化ヒ素またはメルアルソプロール（ｍｅｌａｒｓｏｐｒｏｌ）を言及する。
【００１１】
「ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物」という表現は、ヒ素のように、ホスファターゼの阻害剤および／またはジチオール基と結合して共有結合アダクトを作ることができる任意の化合物を意味するものと解釈される。
好ましくはカスパーゼ阻害剤および／または基質、あるいはヒ素化合物、あるいはヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物は、好ましくない細胞の死を誘発するためにＰＭＬタンパク質と組み合わせて、および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する薬品と組み合わせて用いられる。ＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する薬品の中では、好ましくはα、β、またはγインターフェロンなどのインターフェロンが用いられる。
【００１２】
より具体的には本発明者等は、実はヒ素、特に三酸化ヒ素だけでなく、カスパーゼ基質、特にｚＶＡＤもまた細胞死を誘発し、加速するためにインターフェロンと相乗作用で働くということを発見した。
ＰＭＬ、またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する薬品、たとえば、インターフェロンの同時または逐次的な投与は、ＰＭＬ、または内因性起源のＰＭＬタンパク質、たとえば、インターフェロンの過剰な発現を誘発する薬品の量が十分である場合には必要ではないかも知れない。それにもかかわらず本発明の好ましい実施形態によれば、ヒ素、ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物並びにカスパーゼ阻害剤および／または基質から選択された物質の投与は、ＰＭＬタンパク質、および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する薬品、たとえば、インターフェロンの同時または逐次的な投与と組み合わされる。
【００１３】
本発明の構成部分は、好ましくない細胞の死を誘発するためにインターフェロンと組み合わせた、たとえそれが前記インターフェロンにより誘発されたＰＭＬタンパク質が仲介しようと、また前記インターフェロンにより誘発された別の機構が仲介しようと、ヒ素化合物、ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物並びにカスパーゼ阻害剤および／または基質から選択された物質の使用である。
【００１４】
また本発明の主題は、ヒ素化合物、ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物並びにカスパーゼ阻害剤および／または基質から選択された少なくとも１種類の物質の治療に有効な量を、医薬として許容されるビヒクルと組み合わせて処置などを必要とする患者に投与する治療的処置の方法である。
また、好ましくは、治療に有効な量のＰＭＬタンパク質、および／またはＰＭＬタンパク質、たとえば、インターフェロンの過剰な発現を誘発する薬品を前記患者に同時または逐次的に投与する。
【００１５】
また、本発明の主題は、
１）医薬として許容されるビヒクルの存在下で、少なくとも１種類のヒ素化合物またはヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物、および／またはＰＭＬタンパク質、および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する少なくとも１種類の薬品、たとえば、インターフェロン、と併用した少なくとも１種類のカスパーゼ阻害剤および／または基質；あるいは
２）医薬として許容されるビヒクルの存在下で、ＰＭＬタンパク質、および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する少なくとも１種類の薬品、たとえば、インターフェロンと組み合わせた少なくとも１種類のヒ素化合物またはヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物、
のいずれかを含む医薬組成物である。
【００１６】
また、本発明の主題は、
ａ）（１）少なくとも１種類のカスパーゼ阻害剤および／または基質を、医薬として許容されるビヒクルと組み合わせて含有する医薬組成物、
および／または（２）少なくとも１種類のヒ素化合物またはヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物を、薬剤として許容されるビヒクルと組み合わせて含有する医薬組成物；ならびに
ｂ）（３）ＰＭＬタンパク質を医薬として許容されるビヒクルと組み合わせて含有する医薬組成物、
および／または（４）ＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する少なくとも１種類の薬品、たとえば、インターフェロンを、医薬として許容されるビヒクルと組み合わせて含有する医薬組成物；
を含むキットであって、前記医薬組成物が同時または逐次的な投与を意図されているキットである。
【００１７】
投与の仕方および投薬量は、患者の体重、年齢、および性別だけでなく処置すべき条件およびその進行状態に左右される。
本発明によれば本発明の薬物の処方は、具体的に経口、経肛門、経鼻、筋肉内、皮内、皮下、または静脈内の経路による投与を可能にする。
予想される投与量は、例えばヒ素化合物の場合、好ましくは静脈内の経路による１日当たり１〜５０ｍｇ、カスパーゼ基質、たとえば、ｚＶＡＤを体重１ｋｇ当たり１〜２５０ｍｇ、またインターフェロンの場合、好ましくは筋肉内または皮下の経路による毎日または２日に１回、１百万〜２０百万国際単位（ＭＩＵ）、好ましくは３〜５ＭＩＵである。
【００１８】
加えて本発明者等は、核体上に位置したＰＭＬタンパク質の過剰な発現により誘発される細胞死がカスパーゼにより誘発されるアポトーシスとは異なる特性を有することを発見した。ＰＭＬにより誘発される細胞死の場合、クロマチンの凝縮または核のフラグメンテーションなどのアポトーシスに特有な核の形態学的特徴は特に認められない。
【００１９】
さらに、インターフェロンのみにより誘発される細胞死はアポトーシスの特徴を示すが、本発明者等はインターフェロンとｚＶＡＤの相乗作用的組み合わせがこのアポトーシス表現型を消滅させ、次いで細胞死がアポトーシスとは異なる特徴を示すことを認めた。
この発見の主要な帰結の一つは、ＰＭＬにより誘発される機構により殺された好ましくない細胞の力が、ＰＭＬタンパク質により媒介された死を免れた類似の好ましくない細胞に対する免疫反応を引き起こすことである。
【００２０】
この特性は、好ましくない細胞の死を誘発するためにおよび／または免疫反応を誘発するために、ヒ素化合物、ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物並びにカスパーゼ阻害剤および／または基質から選択された物質を、好ましくはインターフェロンと組み合わせて使用することを特に有利にする。
したがって、これらの薬物の投与は、生き残っている好ましくない細胞を除去する免疫系の反応を引き起こすことにより、たとえ、それらが癌細胞、感染細胞、または疾病の進展に関係する他の好ましくない細胞であろうと免疫治療または「予防接種」の形態を可能にすることになる。
【００２１】
この特性は、これらの薬物、特にインターフェロンとｚＶＡＤの組み合わせまたは単独のｚＶＡＤが、好ましくない細胞において細胞の自殺で最もよくある生理的表現型であるアポトーシスの全特徴を示さない死の現象を引き起こすという事実と関連している。
特にカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤは、死にかかっている細胞において、ある種のカスパーゼの活性化に左右されるほとんどのアポトーシスの兆候が出現するのを妨げる。事実、カスパーゼは細胞の自殺の遂行に不可欠ではないが、他方でそれらはアポトーシス死の表現型の遂行の場合、細胞の自殺現象の間中不可欠であるらしい（Ｘｉａｎｇ  Ｊ．等の論文、ＰＮＡＳ  １９９６，９３：１４５５９；Ｑｕｉｇｎｏｎ  Ｆ．等の論文、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８，２０：２５９；Ｖｅｒｃａｍｍｅｎ  Ｄ．等の論文、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８，１８７：１４７７）。
【００２２】
幾つかの結果は、細胞の死に方が同様の特徴（例えば、それらを癌にかからせる異常性、またはそれらが含有する病原体の性質が含まれる）を持つ生き残っている細胞に向けられた免疫反応の誘発または別の形で重要な役割を演じることを示唆している。
細胞においてアポトーシス死現象の開始は、同様の特徴を持つ生き残っている細胞に対する免疫反応の誘発を制限する作用、あるいは免疫寛容の形態の誘発、すなわち同様の特徴を持つ生き残っている細胞に向けられた免疫応答の誘発の選択的阻害を促進する作用さえ有するであろう。幾つかの特定のモデル（インビトロまたはマウスの眼の前房によるインビボ）で得られた結果は、細胞のアポトーシス死が、一般にＣＤ４＋  Ｔリンパ球により仲介される遅延性過敏症型細胞依存性免疫反応（Ｔｈ１と呼ばれる）（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｔ．等の論文、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９６，５：７；Ｖｏｌｌ  Ｒ．等の論文、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３９０：３５０；Ｇａｏ  Ｙ．等の論文、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８，１８８：８８７）、すなわち好ましくない細胞に対する有効な免疫反応の本質的な兆候の一つを代表する反応の誘発を制限または阻害した可能性があることを示唆している。
【００２３】
マウスの腫瘍の特定のモデルでは、死にかかっている癌細胞中でアポトーシス表現型の部分の開始を妨げる遺伝子をこれら癌細胞中に人為的に導入することが、同様の特徴を示す生きている癌細胞に向けられた有効な免疫反応の誘発を可能にするのに対し、癌細胞におけるアポトーシス死現象の開始は、同様の特徴を示す生きている癌細胞に向けられた有効な免疫反応の誘発を起こさないことを示したが、この遺伝子を癌細胞中に人為的には導入しなかった（Ｍｅｌｃｈｅｒ等の論文、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐｐ５８１〜５８７）。
【００２４】
したがって、本出願に記載の薬物が死にかかっている細胞中でアポトーシス表現型の開始を引き起こさずに（または妨げながら）好ましくない細胞の死を引き起こすという発見は重要である。それは、これらの薬物が好ましくない細胞の死を引き起こす効果のみならず、薬物により誘発される死を免れた好ましくない細胞の同時に起こるまたは引き続いて起こる排除を可能にする、有効な免疫反応の付随する誘発を可能にする効果も有することを意味する。
【００２５】
この特性はまた、例えばわずかに残留する悪性腫瘍細胞を通常含有する製剤など、白血病患者の移植体を意図した骨髄製剤を患者に投与する前に、好ましくない細胞を含有しそうな細胞の組合わせを生体外で処理するために利用することができる。このような処理は、製剤に含有される好ましくない細胞の死を誘発することを可能にするのみならず、処理された細胞製剤が投与される患者の体の中に存在する好ましくない細胞に向けて免疫反応を引き起こすことを可能にする。
【００２６】
したがってまた本発明の主題は、好ましくない細胞をヒ素化合物、ヒ素と同じ生物学的特性を有する化合物並びにカスパーゼ阻害剤および／または基質から選択された物質と接触させることを含む、好ましくない細胞の死を誘発するためのインビトロの方法であって、前記物質を好ましくはＰＭＬタンパク質と、および／またはＰＭＬタンパク質の過剰な発現を誘発する薬品、好ましくはインターフェロンと組み合わせることができる。
【００２７】
下記の実施例および図は本発明を例示するものであって、その範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】いろいろな濃度のＺｎＣｌ2に４時間暴露した後のクローンＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ中における９０ｋＤのＰＭＬタンパク質の誘発を示す図である。
【図１Ｂ】１５０μＭのＺｎＣｌ2に４時間３０分暴露した後のＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞または対照細胞のＦＡＣＳ分析を示す図である。左側のパネルは細胞の大きさに対するＤＮＡ含有量を示す。右側のパネルは蛍光の関数としてＤＮＡ含有量を示す（ＴＵＮＥＬ法）。
【図１Ｃ】ＺｎＣｌ2、エトポシド、またはカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤで処理した、または処理しないＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞のサイトメトリー分析を示す図である。標識はアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（左側のパネル）またはローダミン１２３（右側のパネル）で行なう。アポトーシス細胞の百分率を示す。
【図２Ａ】ＰＭＬにより誘発された細胞死の間ＰＡＲＰの開裂がないことを示す図である。細胞は１５０μＭ  ＺｎＣｌ2、エトポシド、またはｚＶＡＤで処理した。
【図２Ｂ】対照ＲＥＦ（Ｔ）細胞またはＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞中のＤＥＶＤ−ｐＮＡの開裂により決定されるカスパーゼＣＰＰ３２の活性を示す図である。３回の独立の測定に対する相対的吸光度の値を示す。
【図３Ａ】１０００Ｕ／ｍｌのＩＮＦαで処理した単核細胞の生存率を示す図である。５つのうちの１つの代表的な実験を示す。ＴＵＮＥＬ試験は細胞数の減少がアポトーシスによることを示している。
【図３Ｂ】ｚＶＡＤ（１００μＭ）添加２４時間後の効果を示すヒストグラムを表す図である。１１回の実験の平均値±標準偏差を示す。
【図４Ａ】ｚＶＡＤがＲＥＦ（Ｔ）細胞中のＰＭＬタンパク質を安定化させることを示す図である。
【図４Ｂ】αインターフェロン（１０００Ｕ／ｍｌ）がＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞中のラットのＰＭＬを誘発させることを示す図である。矢印はＰＭＬの特異なイソ型タンパク質を示す。
【実施例】
【００２９】
材料および方法
プラスミド構築物；マウスのメタロチオネインプロモーターのＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ断片（−６９、＋５５塩基対）をプラスミドｐＫＳに挿入し、ＰＭＬｃＤＮＡのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片と融合してプラスミドｐＫＳｍＭＴ−ＰＭＬとした。ＧＦＰ−ＰＭＬの融合のため、同一のＰＭＬ断片をベクターｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢｇｌＩＩ部位に挿入した。またＰＭＬを発現するレトロウィルスのベクターも、ＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒ等、１９９１）のＥｃｏＲＩ部位にＰＭＬ用の完全長さのｃＤＮＡ（ｄｅ  Ｔｈｅ等、１９９１）を挿入することにより構築した。
【００３０】
細胞の培養
ＲＥＦ（Ｔ）およびＭＥＦ（Ｔ）細胞は、ＳＶ４０Ｔ発現ベクターにより不死化したラットおよびマウスの胎児性繊維芽細胞である。ＲＥＦ（Ｋ１）細胞はＲｂを結合しないＳＶ４０Ｔ変異体により不死化され、Ｆ１１１細胞は自然に不死化した３Ｔ３ラットの繊維芽細胞である。クローン生成性試験のために、直径１０ｃｍの培養皿で細胞に１０μｇのＳＲαｔｋｎｅｏ−ＰＭＬまたはＳＲαｔｋｎｅｏをトランスフェクトし、ネオマイシン（５００μｇ／ｍｌ）により選択した。誘導クローンを得るために、ＲＥＦ（Ｔ）細胞のプールにプラスミドｐＫＳｍＭＴ−ＰＭＬおよびヒグロマイシン耐性ベクター（ＤＳＰ−Ｈｙｇｒｏ）を共トランスフェクトした。耐性コロニーをＺｎＣｌ2（１５０μＭ）で４時間処理した後、ＰＭＬの発現を試験し、限界希釈によりクローニングの第二周期を受けさせた。誘導ＣＨＯクローンを同様の方法で構築した。単核細胞はＥｓｔａｑｕｉｅｒ等（１９９７）の方法に従って調製した。エトポシド（１００μＭで１６〜２４時間用いた）はＢｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから調達し、ｚＶＡＤ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐフルオロメチルケトン、２５０μｇ／ｍｌで用いた）はＢａｃｈｅｍから販売されており、またラットＩＦＮαはＡｃｃｅｓｓ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌから販売されている。ヒトのαインターフェロンはＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈにより提供された。ヒトのＰＭＬタンパク質に対する抗体についてはＤａｎｉｅｌ等（１９９３）による記事の中に記載されている。ラットの内因性ＰＭＬタンパク質のウェスタンブロット実験は、ラットのＰＭＬとヒトのＰＭＬの両方を検出するモノクローナル抗体５Ｅ１０により行なった。
【００３１】
細胞死の評価
細胞は、熱で不活性化したウシ胎児血清の存在下または不存在下で１５０μＭ  ＺｎＣｌ2で２時間処理（別に指定されない限り）し、次いで細胞を洗浄し、ＺｎＣｌ2を含まない培地でインキュベートした。ＴＵＮＥＬ試験は、固定化のステップ（リン酸塩ＰＢＳ緩衝液に溶かした４％ホルムアルデヒドで１０分間）を除いては製造元の手引き書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、生体内原位置で細胞死を検出するためのキット）に従って行なった。細胞ＤＮＡの含有量は４℃のＲＮアーゼＡ  １００μｇ／ｍｌの存在下、ヨウ化プロピジウム５０μｇ／ｍｌ中で１０分間インキュベートすることにより求めた。細胞膜の外側シート上のホスファチジルセリンの発現分析は、アネキシン−Ｖ−フルオスによる標識化（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびローダミン１２３（分子プローブ）によるミトコンドリアの極性の喪失を用いて、製造元の手引き書に従って行なった。
【００３２】
試料はＦＡＣＳｃａｎアナライザー（ＬｙｓｉｓＩＩソフトウェア、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。カスパーゼの基質の開裂には、５×１０6個の細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、４℃の溶解緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、ＣＨＡＰＳ  ０．１％）２００μｌ中で１時間インキュベートした。遠心分離した後、上澄み液２０μｌと、反応緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、グリセロール  ２％、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０μＭ  ＤＥＶＤ−ｐＮＡ（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））１８０μｌとを混合し、３７℃で４時間インキュベートした後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。抗ＰＡＲＰポリクローナル抗体ＳＡ−２５２はＢｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより販売されている。
【００３３】
実施例１
ＰＭＬはｚＶＡＤと無関係に細胞死を誘発する：
様々な繊維芽細胞系へのＰＭＬ発現ベクター（ｐＳＧ５−ＰＭＬ）のトランスフェクションは、細胞増殖巣の形成を実質的に低下させた。ＰＭＬはＰＭＬをトランスフェクトされた細胞から得られたクローン中には検出されないので、これらの結果はＰＭＬが細胞周期または細胞の生存のいずれかに主要な阻害効果を発揮することを意味する。この効果の基礎を形成する機構を理解するために、ＳＶ４０Ｔで形質転換したラットの胚の繊維芽細胞（ＲＥＦ）のプールにプラスミドｐＫＳｍＭＴ−ＰＭＬをトランスフェクトした。そのＰＭＬの発現はマウスのメタロチオネインプロモーターの制御下にある。続いて、得られた３つのＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬクローンを試験し、一方空のベクターを持つ３つのＲＥＦ（Ｔ）クローンを対照として試験した。ＰＭＬタンパク質はＺｎＣｌ2に２時間暴露した後、ウェスタンブロット法により検出した（発現は５０μＭ以上のＺｎＣｌ2から検出され、１５０μＭのＺｎＣｌ2で平衡状態を示す）（図１Ａ）。
【００３４】
ＰＭＬの発現は、５０μＭのＺｎＣｌ2に対する４８時間から、１５０μＭに対する６時間まで変化する反応速度を有する全細胞集団の同調した細胞死を誘発した。１５０μＭのＺｎＣｌ2による３時間の誘発の結果、３つのＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬクローンには形態学的変化が観察された。細胞は細胞質の明らかな収縮により集まり（図１Ｂ）、ＴＵＮＥＬ試験で陽性になり（図１Ｂ）、次いで皿から徐々に離れた。それにもかかわらず、これらはトリパンブルーを排除する能力を維持した。これらの変化は、適度のサブＧ１  ＤＮＡ含有量（図１Ｂ）、膜ホスファチジルセリンの外面化（図１Ｃ）、およびミトコンドリアのトランスメンブレンポテンシャルの低下（図１Ｃ）と関連している。類似の変化は遺伝子毒性物質のエトポシドにより誘発されたアポトーシスに観察されたが、ＺｎＣｌ2で処理した対照のＲＥＦ（Ｔ）細胞には全く見られなかった（図１ＢおよびＣ）。エトポシドによる処理とは異なり、ＰＭＬにより誘発された細胞死は、細胞死の過程の後期でさえクロマチンの凝縮または核の断片化などのアポトーシスに特有な核の形態学的特徴とは関連がない。ＤＮＡの開裂（陽性サブＧ１（図１Ｂ）およびＤＮＡ粘度の低下）にもかかわらず、ＰＭＬにより誘発された細胞死はインターヌクレオソームのＤＮＡ規模とは関連がなく、弱い正のＴＵＮＥＬ信号と一致する（図１Ｂ）。
【００３５】
対照
ＲＥＦ（Ｔ）細胞はＳＶ４０Ｔにより形質転換された細胞系であるので、ＰＭＬにより誘発された細胞死に対するＳＶ４０ウィルスの「大型Ｔ」癌遺伝子の寄与を排除するために幾つかの実験を行なった。最初に、ＰＭＬの発現はＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞中のＳＶ４０Ｔの発現または位置決めに悪影響を及ぼさず、ｐ５３、またはＳＶ４０ウィルスの「大型Ｔ」癌遺伝子からのｐ５３の放出物も分解させなかった。第二に、融合タンパク質ＧＦＰ−ＰＭＬまたはＧＦＰ単独のいずれかを一時的にトランスフェクトされたＨｅＬａまたはＣＨＯ細胞において、全てのＧＦＰ−ＰＭＬ陽性細胞は、対照のＧＦＰ陽性細胞とは異なり次第に皿から離れるようになり死ぬ。第三に、プラスミドｐＫＳｍＭＴ−ＰＭＬを安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において、ＺｎＣｌ2による誘発はここで再びＰＭＬタンパク質を発現するクローンの死に繋がった。最後に、熱に敏感なＳＶ４０Ｔ変異体を発現するＲＥＦ細胞では、ＳＶ４０Ｔの３９．５℃における分解はＰＭＬにより引き起こされる細胞死に影響しなかった。
【００３６】
細胞死の誘発は新たに転写を必要としてもよく、あるいは先在する経路の引金をひくことを考慮してもよい。ＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞を最初にＺｎＣｌ2およびシクロヘキシミドと共に２時間インキュベートし、こうして翻訳ではなくＰＭＬ用のｍＲＮＡの合成を可能にする。次いで細胞を洗浄し、ｍＲＮＡの新合成ではなくＰＭＬ用のｍＲＮＡの翻訳を可能にするために、単独のアクチノマイシンＤと共にインキュベートした。この実験において阻害剤なしで細胞死が認められ、これは新たに転写を必要としないことを示している。ＰＭＬにより誘発される死は細胞周期のＳ期に向けて転位を必要とせず、また誘発しない。事実、ＰＭＬはアフィジコリンで処理することによりＧ１／Ｓ段階で阻止されてきたＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞の死の常に引金になる。さらに、ＺｎＣｌ2で誘発した後、ＢｒｄＵに様々な回数暴露した結果、ＤＮＡの複製は２時間までは変更されなかったが３時間後に停止したこと、および細胞死は細胞周期の全ての期に存在したことが示された（図１Ｂ）。
【００３７】
実施例２
ヒ素はＰＭＬにより引き起こされた細胞死を促進する：
ＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞をＺｎＣｌ2および１０-6Ｍ  Ａｓ2Ｏ3で処理した場合、細胞死と関連した形態学的変化が激しく加速されることが認められた。同様の方法でＴＵＮＥＬ試験により判定されるＤＮＡの開裂を増大させた（ＺｎＣｌ2単独の場合の４５％に対して、ＺｎＣｌ2およびＡｓ2Ｏ3で共処理した場合の陽性細胞は１１７％、一方Ａｓ2Ｏ3単独では基底水準に対して少しの増加も誘発しなかった）。ヒ素が核体上のＰＭＬの位置決めと同時に細胞死の誘発を増大させるという事実は、核体の近くにＰＭＬを位置決めすることが細胞死にとって重要であることを示唆している。
【００３８】
実施例３
ＰＭＬにより引き起こされる死はカスパーゼの活性化とは関連がない：
プログラム化された細胞死の実行は、核および細胞質のタンパク質の開裂によるアポトーシスの表現型変化を誘発するカスパーゼのタンパク質加水分解の活性化を伴うことが知られている（Ｓａｌｖｅｓｅｎ等、１９９７）。エトポシドにより誘発されるアポトーシスを阻止するカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤは、ＰＭＬにより誘発される細胞死を阻害せず（図１Ｃ）、逆説的にそれを加速しさえする（正のＴＵＮＥＬ信号はＺｎＣｌ2単独では４５％に対して、ｚＶＡＤとＺｎＣｌ2では７１％）。これらの観察は、ｚＶＡＤに敏感な執行薬品はＰＭＬにより誘発される細胞死にとって必要ではないことを意味する。さらに、ＣＰＰ３２（カスパーゼ３）すなわちアポトーシスに関わる最も重要なカスパーゼは、その基質の一つであるＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ）が非開裂性のまま残るので、ＰＭＬにより誘発される細胞死の間ずっと活性化されないように見える（図２Ａ）。エトポシドとは異なり、比色カスパーゼ基質、ＹＶＡＤ−ｐＮａ（カスパーゼクラス１、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、およびＤＥＶＤ−ｐＮａ（カスパーゼクラス３、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）はＰＭＬによる誘発後、著しい開裂を検出することができなかった（図２Ｂ）。
【００３９】
実施例４
ヒ素およびｚＶＡＤは、ＰＭＬおよびインターフェロンにより誘発される細胞死を増大させる：
αインターフェロンに曝された一次単核細胞には段階的な細胞死がもたらされ、７日後に細胞培養物は完全に消滅した（図３Ａおよび３Ｂ）。αインターフェロンと共にｚＶＡＤを添加している間中、インターフェロン単独の場合に認められた核の断片化およびクロマチンの凝縮なしに細胞集団全体の死が２４時間以内に認められた（図３Ａおよび３Ｂ）。ｚＶＡＤ単独の場合、細胞死は２０日間ほとんどの一次培養物（８／１１）においてほとんどまたは全く認められなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。ｚＶＡＤ単独の場合、１１のうち３つの培養物で７日後に一部の培養物の死を誘発したが、この結果は多分インターフェロンの内因性分泌を反映している。同様の結果はＤＥＶＤなどの他のカスパーゼ阻害剤でも得られた。
【００４０】
下記の表は、ＴＵＮＥＬ法により求めたＩＦＮα  １０００Ｕ／ｍｌと、１０-6ＭのＡｓ2Ｏ3またはｚＶＡＤとで２日間処理したＲＥＦ（Ｔ）ＰＭＬ細胞の細胞死を表す。
【００４１】
【表１】
2014129404.tif 000002
【００４２】
ＲＥＦ（Ｔ）細胞において、αインターフェロンとｚＶＡＤ、またはαインターフェロンとＡｓ2Ｏ3のいずれかの間でかなりの相乗作用が見られた（正のＴＵＮＥＬ信号はαインターフェロン単独では４２％、ｚＶＡＤおよびヒ素ではそれぞれ６０％および６３％）。
ｚＶＡＤはＰＭＬの発現レベルを増大させ（図４Ａ）、またヒ素はその核体との結合を増大させ、一方ＰＭＬの総量は低下した。ｚＶＡＤおよびヒ素の相乗作用と、ＰＭＬおよびインターフェロンにより引き起こされた細胞死との類似性は、ＰＭＬがインターフェロンにより誘発される細胞死に関わっていることを示唆している。さらにαインターフェロンは５０μＭ  ＺｎＣｌ2と同様の反応速度をもつ細胞死を誘発し、この２つは同様な量のＰＭＬタンパク質を誘発した（図４Ｂ）。
【図１Ａ】
2014129404.tif 000003
【図１Ｂ】
2014129404.tif 000004
【図１Ｃ】
2014129404.tif 000005
【図２Ａ】
2014129404.tif 000006
【図２Ｂ】
2014129404.tif 000007
【図３Ａ】
2014129404.tif 000008
【図３Ｂ】
2014129404.tif 000009
【図４Ａ】
2014129404.tif 000010
【図４Ｂ】
2014129404.tif 000011