(57)【要約】【課題】  投与後、時間がたったときでも、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい、光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。【解決手段】  アルブミンと、近赤外波長領域の光を吸収する有機色素と、が共有結合した複合体を有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンと、近赤外波長領域の光を吸収する有機色素と、が共有結合した複合体を有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項２】
下記式（Ｉ）で示される複合体を有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【化１】
2014129332.tif 000042
（Ｉ）
式（Ｉ）においてＡは、アルブミンのうち、１つのアミノ基を除いた部位を表す。Ａ’は下記式（ｉ）または式（ｉｉ）を表し、下記式（ｉ）、（ｉｉ）の＊は式（Ｉ）の窒素原子（Ｎ）に結合する。
【化２】
2014129332.tif 000043
（ｉ）
【化３】
2014129332.tif 000044
（ｉｉ）
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、Ｚは水素原子、スルホン酸基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホン酸基で置換されていてもよい。
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、Ｒ１は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）のいずれかである。Ｒ１がアルキル基である場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、ａは１乃至１０のいずれかの整数であり、ｎは２または３である。
式（ｉｉ）において、Ｒ４は炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
【請求項３】
前記式（ｉ）が、下記の式（ｉ−１）乃至（ｉ−６）のいずれかで表されることを特徴とする請求項２に記載の光音響イメージング用造影剤。
【化４】
2014129332.tif 000045
（ｉ−１）
【化５】
2014129332.tif 000046
（ｉ−２）
式（ｉ−２）において、Ｙ−はハロゲンイオン、または有機酸イオンである。
【化６】
2014129332.tif 000047
（ｉ−３）
【化７】
2014129332.tif 000048
（ｉ−４）
【化８】
2014129332.tif 000049
（ｉ−５）
【化９】
2014129332.tif 000050
（ｉ−６）
上記式（ｉ−３）乃至（ｉ−６）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
【請求項４】
前記式（ｉｉ）が、下記の式（ｉｉ−１）または（ｉｉ−２）で表されることを特徴とする請求項２に記載の光音響イメージング用造影剤。
【化１０】
2014129332.tif 000051
（ｉｉ−１）
【化１１】
2014129332.tif 000052
（ｉｉ−２）
上記式（ｉｉ−１）乃至（ｉｉ−２）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
【請求項５】
前記複合体が下記式（Ｉ−１）で示されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【化１２】
2014129332.tif 000053
（Ｉ−１）
上記式（Ｉ−１）において、Ａはアルブミンのうち、１つのアミノ基を除いた部位を表す。
【請求項６】
前記近赤外波長領域の光を吸収する有機色素が下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とする請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
Ｂ−Ｂ’      （ＩＩ）
式（ＩＩ）において、Ｂは下記式（ｉ）または下記式（ｉｉ）を表し、Ｂ’は下記式（ｉｉｉ）乃至（ｖｉ）のいずれかを表す。
式（ｉ）、（ｉｉ）の＊は式（ＩＩ）のＢ’と結合し、式（ｉｉｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（ＩＩ）のＢと結合する。
【化１３】
2014129332.tif 000054
（ｉ）
【化１４】
2014129332.tif 000055
（ｉｉ）
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、Ｚは水素原子、スルホン酸基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホン酸基で置換されていてもよい。
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、Ｒ１は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）のいずれかである。Ｒ１がアルキル基である場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、ａは１乃至１０のいずれかの整数であり、ｎは２または３である。
式（ｉｉ）において、Ｒ４は炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。  
【化１５】
2014129332.tif 000056
（ｉｉｉ）
【化１６】
2014129332.tif 000057
（ｉｖ）
【化１７】
2014129332.tif 000058
（ｖ）
【化１８】
2014129332.tif 000059
（ｖｉ）
【請求項７】
前記近赤外波長領域の光を吸収する有機色素が下記式（２）乃至（７）のいずれかで表されることを特徴とする請求項６に記載の光音響イメージング用造影剤。
【化１９】
2014129332.tif 000060
（２）
【化２０】
2014129332.tif 000061
（３）
【化２１】
2014129332.tif 000062
（４）
【化２２】
2014129332.tif 000063
（５）
【化２３】
2014129332.tif 000064
（６）
【化２４】
2014129332.tif 000065
（７）
【請求項８】
前記アルブミンがヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの改変体、ヒト血清アルブミンの断片、ヒト血清アルブミンの改変体の断片のいずれかであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項９】
前記複合体が粒子であり、前記粒子の流体力学的平均粒子径が動的光散乱法で測定して２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１０】
前記粒子の流体力学的平均粒子径が動的光散乱法で測定して５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項９に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１１】
捕捉分子をさらに有することを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１２】
下記式（ＩＩＩ）で示される複合体を有することを特徴とする請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
ＡＬＢ−Ｌ−Ｃ      （ＩＩＩ）
式（ＩＩＩ）において、ＡＬＢは前記有機色素が共有結合したアルブミンであり、Ｃは捕捉分子であり、Ｌはリンカーであり、ＡＬＢはリンカーＬに結合し、ＬはＣに結合する。
【請求項１３】
前記捕捉分子がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドであることを特徴とする請求項１１または１２に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１４】
前記タンパク質が一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１３に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１５】
腫瘍の造影に用いられることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１６】
リンパ節の造影に用いられることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１７】
添加剤をさらに有することを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光音響イメージング用造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算した画像を得ることができる。
【０００３】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴ装置における造影剤として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記の式（１）で示される化合物を指す。
【０００４】
【化１】
2014129332.tif 000002
（１）
【０００５】
ただし、対イオンはＮａ＋でなくてもよく、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンを用いることができる。
【０００６】
しかし、ＩＣＧは血中での半減期が数分程度と短いことが知られている。非特許文献１では、単独のＩＣＧを用いてラットの脳血管の光音響イメージングを行った例が報告されている。この報告によると、単独のＩＣＧを血中に投与してから数十分後に、光音響信号強度が血液と同じレベルにまで低下しており、投与した物質が投与後速やかに血中から消失することが示唆されている。
【０００７】
このように、単独のＩＣＧは血中に投与してから数十分後に血中から消失してしまうことから、投与後時間がたったときの腫瘍への集積性が低いと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（７），７３０（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明では、投与後時間がたったときでも、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい、光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、アルブミンと近赤外有機色素とが結合した複合体を有することを特徴とする。
【００１１】
別の本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、下記式（Ｉ）で示される複合体を有することを特徴とする。
【００１２】
【化２】
2014129332.tif 000003
（Ｉ）
【００１３】
式（Ｉ）においてＡは、アルブミンのうち、１つのアミノ基を除いた部位を表す。Ａ’は下記式（ｉ）または式（ｉｉ）を表し、下記式（ｉ）、（ｉｉ）の＊は式（Ｉ）の窒素原子（Ｎ）に結合する。
【００１４】
【化３】
2014129332.tif 000004
（ｉ）
【００１５】
【化４】
2014129332.tif 000005
（ｉｉ）
【００１６】
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、Ｚは水素原子、スルホン酸基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホン酸基で置換されていてもよい。
【００１７】
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、Ｒ１は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）のいずれかである。
【００１８】
Ｒ１がアルキル基である場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
【００１９】
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、ａは１乃至１０のいずれかの整数であり、ｎは２または３である。
【００２０】
式（ｉｉ）において、Ｒ４は炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤によれば、アルブミンと、ＩＣＧなどの近赤外波長領域に吸収がある有機色素と、が結合した複合体を有するため、ＩＣＧを単独で投与した場合に比べて、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施例で調製したＩＣＧ−ＨＳＡ（７）を腫瘍移植モデルマウスに投与して腫瘍部の経時的な光音響イメージングを行った結果である。
【図２】本発明の実施例で調製したＩＣＧ−ＨＳＡ（７）をヌードマウス足底皮下へ投与して１日後の光音響イメージング結果である。
【図３】本発明の実施例で調製したＩＣＧ−ＨＳＡ（７）をヌードマウス足底皮下投与１日後の摘出センチネルリンパ節の光音響イメージング結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の実施形態に係る光音響イメージング（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ、以下ＰＡＩと略すことがある）用造影剤について説明する。
【００２４】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、アルブミンと、近赤外波長領域の光を吸収する有機色素（以下、近赤外有機色素と略すことがある）とが共有結合した複合体を有することを特徴とする。本明細書において近赤外波長領域の光とは６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長の光を意味する。
【００２５】
ここで、ＩＣＧなどの近赤外有機色素は、血中に投与した場合、血中のタンパク質と吸着した上で体外へと排出されやすい。また、近赤外有機色素は血中の水分子と反応して分解してしまう可能性がある。その結果、単独の近赤外有機色素を生体の血中に投与しても、血中滞留性が低く、腫瘍への集積性が低い。したがって、単独の近赤外有機色素を光音響イメージング用造影剤として用いた場合、腫瘍から発せられる光音響信号強度は小さい。
【００２６】
一方、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、近赤外有機色素がアルブミンと共有結合しているため、アルブミンが、近赤外有機色素への血中のタンパク質の吸着を抑制する。そのため、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を生体の血中に投与しても、血中のタンパク質と吸着しにくく、体外へと排出されにくい。また、近赤外有機色素とアルブミンが共有結合していることで、血中の水分子が近赤外有機色素に接近しにくく、近赤外有機色素は分解しにくい。さらにアルブミンは、半減期が２０日以内程度と生体内で安定性が高いため、近赤外有機色素を単独で投与した場合に比べて血中滞留性が向上することが期待できる。このような理由で、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は近赤外有機色素を単独で投与した場合に比べて血中滞留性や腫瘍集積性が高いため、腫瘍から発せられる光音響信号強度は大きくなる効果が期待される。
【００２７】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤において、複合体は、少なくとも１つのアルブミンと、少なくとも１つの近赤外有機色素とが共有結合していればよく、複数のアルブミンと複数の近赤外有機色素とが共有結合していてもよい。また、複合体が、アルブミンと複数の近赤外有機色素を有する場合、少なくとも１つの近赤外有機色素がアルブミンと共有結合していればよく、それ以外の近赤外有機色素は非共有結合していてもよい。同様に、近赤外有機色素と複数のアルブミンを有する場合、少なくとも１つのアルブミンが近赤外有機色素と共有結合していればよく、それ以外のアルブミンは非共有結合していてもよい。
【００２８】
なお、本発明及び本明細書でいう「アルブミンと近赤外有機色素が共有結合した」とは、厳密にいえば、アルブミンの一部（代表的にはＨまたはＯＨ）を除いた部位（これは基ということもできる）と、近赤外有機色素の一部（代表的にはＨまたはＯＨ）を除いた部位とが共有結合した、ということである。また、「複合体」は別の見方をすれば「分子」ということもできる。
【００２９】
（色素標識率）
本明細書においてアルブミン１つに対して共有結合している近赤外有機色素の数を、色素標識率とよぶ。本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤において、色素標識率は、０．９より大きいことが好ましく、３．１より小さいことが好ましい。また、本実施形態において色素標識率は、１．６乃至３．０であることがさらに好ましい。これは、色素標識率が上記範囲内にあるときに、腫瘍集積性が高いからである。なお、色素標識率はサンプル中の近赤外有機色素の濃度およびアルブミンの濃度をそれぞれ求め、それらの比（近赤外有機色素の濃度／アルブミンの濃度）から算出した。近赤外有機色素の濃度は、その色素の特異的な吸収波長における吸光度から算出した。特異的な吸収波長として例えば、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（下記式（２）で示される化合物）を用いた場合は８００ｎｍ下記式（５）で示される化合物を用いた場合は７５０ｎｍを採用することができるが、特異的な吸収波長は他の値を採用してもよい。アルブミンの濃度はＢＣＡ法等によって求めることができる。
【００３０】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、下記式（Ｉ）で示される複合体を有することが好ましい。
【００３１】
【化５】
2014129332.tif 000006
（Ｉ）
【００３２】
式（Ｉ）においてＡは、アルブミンのうち、１つのアミノ基を除いた部位を表す。Ａ’は下記式（ｉ）または式（ｉｉ）を表し、下記式（ｉ）、（ｉｉ）の＊は式（Ｉ）の窒素原子（Ｎ）に結合する。
【００３３】
なお、本明細書において、＊は構造式中の
【００３４】
【化６】
2014129332.tif 000007
【００３５】
と同義である。
【００３６】
【化７】
2014129332.tif 000008
（ｉ）
【００３７】
【化８】
2014129332.tif 000009
（ｉｉ）
【００３８】
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、Ｚは水素原子、スルホン酸基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホン酸基で置換されていてもよい。
【００３９】
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、Ｒ１は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）のいずれかである。Ｒ１がアルキル基である場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３−（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。
【００４０】
式（ｉ）および式（ｉｉ）において、ａは１乃至１０のいずれかの整数であり、ｎは２または３である。
【００４１】
式（ｉｉ）において、Ｒ４は炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ２）ｂ−ＳＯ３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。上記式（Ｉ）においては、Ａ−Ｎ−Ｈの部分が、前述した、アルブミンの一部を除いた部位に相当し、Ａ’が前述した近赤外有機色素の一部を除いた部位に相当する。
【００４２】
また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤において、式（ｉ）が、下記の式（ｉ−１）乃至（ｉ−６）のいずれかで表されることが好ましい。
【００４３】
【化９】
2014129332.tif 000010
（ｉ−１）
【００４４】
【化１０】
2014129332.tif 000011
（ｉ−２）
【００４５】
式（ｉ−２）において、Ｙ−は塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンのいずれかである。
【００４６】
【化１１】
2014129332.tif 000012
（ｉ−３）
【００４７】
【化１２】
2014129332.tif 000013
（ｉ−４）
【００４８】
【化１３】
2014129332.tif 000014
（ｉ−５）
【００４９】
【化１４】
2014129332.tif 000015
（ｉ−６）
【００５０】
上記式（ｉ−３）乃至（ｉ−６）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
【００５１】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤において、前記式（ｉｉ）が、下記の式（ｉｉ−１）または（ｉｉ−２）のいずれかで表されることが好ましい。
【００５２】
【化１５】
2014129332.tif 000016
（ｉｉ−１）
【００５３】
【化１６】
2014129332.tif 000017
（ｉｉ−２）
【００５４】
上記式（ｉｉ−１）乃至（ｉｉ−２）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
【００５５】
式（ｉ）及び式（ｉｉ）におけるａは２乃至６のいずれかの整数であることが好ましい。式（ｉ）及び式（ｉｉ）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３におけるｂは２乃至６のいずれかの整数であることが好ましい。
【００５６】
式（ｉ）及び式（ｉｉ）におけるａおよびｂが、６以下の場合、疎水性が高くならないため、生体中において非特異吸着しにくい。
【００５７】
本実施形態において、複合体は、下記式（Ｉ−１）で示されることが好ましい。
【００５８】
【化１７】
2014129332.tif 000018
（Ｉ−１）
【００５９】
上記式（Ｉ−１）において、Ａはアルブミンのうち、１つのアミノ基を除いた部位を表す。
【００６０】
また、本実施形態におけるＰＡＩ用造影剤は標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有していてもよい。
【００６１】
（アルブミン）
本実施形態に係るアルブミンは、血中に多量に存在（３５〜５０ｇ／Ｌ）し、分子サイズが６６．５ｋＤａ、全配列５８５アミノ酸からなるタンパク質である。アルブミンは生体内で局在することにより浸透圧制御などの多くの役割を果たしている。本実施形態に係るアルブミンとしては、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）が挙げられるが、ＨＳＡまたはＢＳＡの改変体であってもよい。また、これらの断片であってもよい。本実施形態に係るアルブミンとしては、人体での安全性が高いと考えられる、ＨＳＡ、ＨＳＡの改変体、ＨＳＡの断片、ＨＳＡの改変体の断片のいずれかであることが好ましい。また、本実施形態に係るアルブミンはヒト血液からの抽出物であってもよいし、大腸菌等からの生産物でもあっても構わない。本実施形態に係るアルブミンはＨＳＡの全配列あるいは全配列中から取り出してきた部分配列と比較して少なくとも９５％以上の相同性を有することを特徴とする。アルブミンは近赤外有機色素がアクセスできる位置に複数のリジン残基、あるいは遊離のシステイン残基を有している。アルブミンと近赤外有機色素との化学結合を形成する場合の一例として、アルブミンのリジン残基のアミノ基と近赤外有機色素のカルボキシル基とによるアミド結合が挙げられる。
【００６２】
（近赤外有機色素）
本実施形態において近赤外有機色素としては、近赤外波長領域の光を吸収して音響波を発する有機色素であれば特に限定されない。
【００６３】
本実施形態における近赤外有機色素としては、例えば、アジン系色素、アクリジン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ系色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、インジゴイド系色素を挙げることが出来る。
【００６４】
上記シアニン系色素としては、例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ａｌｅｘａ  ７５０などのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素（インビトロジェン社製）、Ｃｙ（登録商標）系色素（ＧＥ  ヘルスケア  バイオサイエンス社製）、ＩＲ−７８３、ＩＲ−８０６、ＩＲ−８２０（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社製）、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ（登録商標）（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ７９５ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、ＡＤＳ８３２ＷＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｙｅ  Ｓｏｕｒｃｅ社製）、Ｈｙｌｉｇｈｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）、ＤｙＬｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を挙げることが出来る。
【００６５】
本実施形態において、近赤外有機色素が下記式（ＩＩ）で表されることが好ましい。
Ｂ−Ｂ’      （ＩＩ）
【００６６】
式（ＩＩ）において、Ｂは上記式（ｉ）または上記式（ｉｉ）を表し、Ｂ’は下記式（ｉｉｉ）乃至（ｖｉ）のいずれかを表す。
【００６７】
式（ｉ）、（ｉｉ）の＊は式（ＩＩ）のＢ’と結合し、式（ｉｉｉ）乃至（ｖｉ）の＊は式（ＩＩ）のＢと結合する。
【００６８】
【化１８】
2014129332.tif 000019
（ｉｉｉ）
【００６９】
【化１９】
2014129332.tif 000020
（ｉｖ）
【００７０】
【化２０】
2014129332.tif 000021
（ｖ）
【００７１】
【化２１】
2014129332.tif 000022
（ｖｉ）
【００７２】
上記式（ＩＩ）の例として、下記式（２）で示される化合物（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、登録商標））、下記式（３）で示される化合物、下記式（４）示される化合物、下記式（５）で示される化合物、下記式（６）で示される化合物、下記式（７）で示される化合物のいずれかであることが好ましい。
【００７３】
【化２２】
2014129332.tif 000023
（２）
【００７４】
【化２３】
2014129332.tif 000024
（３）
【００７５】
【化２４】
2014129332.tif 000025
（４）
【００７６】
【化２５】
2014129332.tif 000026
（５）
【００７７】
【化２６】
2014129332.tif 000027
（６）
【００７８】
【化２７】
2014129332.tif 000028
（７）
【００７９】
（複合体の調製方法）
本実施形態において、アルブミンと近赤外有機色素は、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基を介して公知のカップリング反応によって共有結合させることができる。特に、アミノ基を介して結合させることが好ましい。アミノ基はアルブミン中に複数存在し、弱アルカリ性のｐＨ領域において効率的かつ選択的に反応する。前記反応によりアルブミンと結合した近赤外有機色素は、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法等の公知のタンパク質精製法により洗浄、精製することができる。アルブミンと近赤外有機色素の結合はアルブミン表面に存在する前記アミノ基、チオール基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基と近赤外有機色素の誘導体とで直接結合されていても良いし、種々の架橋材（クロスリンカー）を介してアルブミンと近赤外有機色素が結合されていても良い。
【００８０】
（流体力学的平均粒子径）
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤において、複合体は粒子であることが好ましい。なお粒子は、真球状、楕円状、平面状、一次元のひも状などのいずれの形状でもよい。粒子である場合の流体力学的平均粒子径（以下、単に粒径と略すことがある）は、動的光散乱法で測定して１０００ｎｍ未満であることが好ましい。粒径が１０００ｎｍ未満の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの粒子を集積させることができる。腫瘍部位に集積したＰＡＩ用造影剤は、光音響イメージング装置を用いることによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、上記粒子の粒径は動的光散乱法で測定して、２００ｎｍ以下であることがより好ましく、５０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。上記粒子の粒径が２００ｎｍ以下であると、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤が血中のマクロファージに取り込まれにくくなる結果、血中滞留性が高くなると考えられるからである。さらに粒径が５０ｎｍ以下であると、上記粒子の組織浸透性が高まることが期待され、目的部位に到達した粒子の集積性が高まると考えられるからである。
【００８１】
本実施形態において粒子の粒径は、動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，  ＤＬＳ）法によって流体力学的直径を測定することで求めることができる。
【００８２】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、上記複合体以外に分散媒を有していてもよい。なお、ＰＡＩは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本実施形態に係ＰＡＩ用造影剤は、必要に応じて薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。
【００８３】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。
【００８４】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、ＥＰＲ効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、粒子を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。したがって、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は腫瘍の造影に用いられることが好ましい。
【００８５】
また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤はリンパ節の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ、以下ＳＬＮと略すことがある）の造影剤に用いることが特に好ましい。ＩＣＧなどの近赤外有機色素をセンチネルリンパ節の造影剤として用いた場合、体内に投与した近赤外有機色素は速やかに血中へと移行して体外へ排出されてしまうために観察時間が制約されてしまうという欠点があった。本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は近赤外有機色素と比べて分子サイズが大きく、組織内の拡散スピードが低下する結果、センチネルリンパ節での滞留時間延長が期待されるからである。したがって、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤はリンパ節の造影、特にセンチネルリンパ節の造影に用いられることが好ましい。
【００８６】
（捕捉分子）
本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、ポリペプチド、ペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された複合体を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。本実施形態において、タンパク質とは、アミド結合によって天然または非天然アミノ酸が９０個以上連結されたものを言う。本実施形態においてポリペプチドとは、アミド結合によって天然または非天然アミノ酸が３０個以上９０個未満で連結されたものを言う。本実施形態において、ペプチドとは、アミド結合によって天然または非天然アミノ酸が３０個未満で連結されたものを言う。本実施形態において、タンパク質とポリペプチドとペプチドの分類は、アミノ酸の連結数によってなされるものであり、種々の修飾の有無を問わない。本実施形態において捕捉分子はタンパク質、または、ポリペプチド、または、ペプチドであることが好ましい。更に本実施形態における捕捉分子としてより好ましくは、タンパク質である抗体であり、特に一本鎖抗体であることが好ましい。
【００８７】
別の本実施形態における光音響イメージング用造影剤は、下記式（ＩＩＩ）で示される複合体を有する。
ＡＬＢ−Ｌ−Ｃ      （ＩＩＩ）
【００８８】
式（ＩＩＩ）において、ＡＬＢは前記有機色素が共有結合したアルブミンであり、Ｃは捕捉分子であり、ＡＬＢはリンカーＬに結合し、ＬはＣに結合する。
【００８９】
本実施形態において、捕捉分子は例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。タンパク質は一本鎖抗体であることが好ましい。
【００９０】
上記式（ＩＩＩ）におけるＬが、末端に１つ以上のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ基と、別の末端に１つ以上のｍａｌｅｉｍｉｄｏ基を有することが好ましい。
【００９１】
また、上記式（ＩＩＩ）におけるＬが、末端に１つ以上のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ基と、別の末端に１つ以上のｍａｌｅｉｍｉｄｏ基を有し、かつ１つ以上のエチレングリコール部位を有することが好ましい。
【００９２】
上記式（ＩＩＩ）におけるＬが、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］  ｅｓｔｅｒ、または、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＡ−１００ＴＳであることが好ましい。
【００９３】
上記式（ＩＩＩ）におけるＬが、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅであることが好ましい。
【００９４】
上記式（ＩＩＩ）におけるＬが、末端に２つ以上のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ基を有することが好ましい。
【００９５】
上記式（ＩＩＩ）におけるＬが、末端に２つ以上のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ基を有し、かつ１つ以上のエチレングリコール部位を有することが好ましい。
【００９６】
上記式（ＩＩＩ）におけるＬが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−（ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｅｓｔｅｒであることが好ましい。
【００９７】
（添加剤）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、凍結乾燥時に使用する添加剤を含んでいてもよい。添加剤の一例としてグルコース、ラクトース、マンニトール、ポリエチレングリコール、グリシン、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウムが挙げられる。添加剤は１種類のみを用いても、複数種類を併用してもよい。
【００９８】
（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程
【００９９】
また、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
【０１００】
上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を投与された検体を用いることができる。
【０１０１】
また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。
【０１０２】
上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４  ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
【０１０３】
音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
【０１０４】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍、リンパ節あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
【実施例】
【０１０５】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する色素修飾アルブミンが得られる範囲で自由に変えることができる。
【０１０６】
（光音響信号強度の計測方法）
本発明の実施例において光音響信号強度は以下のように計測した。
【０１０７】
市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ．Ｉｎｃ．製）を用いて行い、調製したＰＡＩ用造影剤を投与する前、投与後の任意のタイミングにおいて光音響信号を測定し、それぞれの３次元再構成データを得た。得られた３次元再構成データをソフトウェア（ＧＥＨＣ  ＭＩＣＲＯＶＩＥＷ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）などにより関心領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）中の光音響強度を計測した。
【０１０８】
（色素標識率の算出）
本発明の実施例においてアルブミンに対する色素標識率はサンプルの吸光度測定により算出した。サンプル中の色素濃度は用いた色素に特異的な吸収波長における吸光度から算出した。具体的には、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（上記式（２）で示される化合物）を用いた場合は８００ｎｍ、上記式（５）で示される化合物を用いた場合は７５０ｎｍにおける吸光度を計測した。ＩＣＧの濃度はサンプルを５％ＳＤＳで希釈して吸光度を測定し、予め作成しておいたＳＤＳ中での色素の検量線から算出した。ＨＳＡ濃度はＢＣＡ法から算出した。
【０１０９】
（腫瘍塊への移行量評価例）
本発明の実施例において腫瘍塊へのＰＡＩ用造影剤の移行量の評価は腫瘍移植マウスを用いて行った。腫瘍移植マウスは、ヒト胃癌細胞株（Ｎ８７）、ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）をそれぞれヌードマウス皮下に移植し作製したものを用いた。腫瘍移植マウスへ造影剤を色素量で１３０ｎｍｏｌ投与し、投与５分後、投与１日後での光音響イメージングを行った。さらに、比較例として投与１日後における腫瘍移植マウス蛍光イメージングも実施した。蛍光イメージングはＩＶＩＳ（登録商標）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行い、腫瘍部分の関心領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）の蛍光強度を計測した。
【０１１０】
（センチネルリンパ節への集積評価例）
本発明の実施例においてセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）へのＰＡＩ用造影剤の移行はマウス膝窩リンパ節を用いて評価した。ヌードマウス後肢の足底皮下に造影剤１０マイクロリットルを投与して、１日後にマウス膝窩リンパ節の光音響イメージングを実施した。
【０１１１】
さらに比較例として、種々の造影剤投与１日後のマウス膝窩リンパ節を摘出し破砕抽出液の吸光度測定を行った。
【０１１２】
集積率は、以下の式に基づいて算出した。
集積率＝｛（摘出マウス膝窩リンパ節の吸光度）／（投与サンプル相当量の吸光度）｝×１００
【０１１３】
集積量を算出した後に、ＩＣＧを投与して１日後の集積を１とした場合における蓄積量比を各種材料に関して算出した。
【０１１４】
（実施例）
本実施例における化合物はＨＳＡ表面のアミノ基に対して近赤外有機色素を共有結合させたものである。ＩＣＧ−ＨＳＡの代表的な構造は式（Ｉ）、ＩＣＧ’−ＨＳＡの代表的な構造は式（ＩＩ）でそれぞれ示す。
【０１１５】
【化２８】
2014129332.tif 000029
【０１１６】
【化２９】
2014129332.tif 000030
【０１１７】
（近赤外有機色素が結合したアルブミンの調製）
ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ：ＨＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製、以下単にＨＳＡと略す）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解してＨＳＡ溶液とした。１ｍｇの上記式（２）で示される化合物（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、登録商標）と、上記式（５）で示される化合物をそれぞれ、０．１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記のＨＳＡ溶液に混合して３７度で３時間静置した。得られた反応混合溶液をそれぞれ、ゲルろ過（ＰＤ−１０）および限外濾過（５０ｋＤａ）によりＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）への置換、および未反応体の分離を行った。最終的に、近赤外有機色素とＨＳＡが共有結合した化合物を作製した。表１、２に反応時の仕込モル濃度を変化させて得られた化合物の色素標識率を示す。本実施例の化合物の具体的な化学構造は式（Ｉ）に示す通りである。一方、表２中で上記式（５）で示される化合物とＨＳＡとが結合して得られた化合物はＩＣＧ‘−ＨＳＡと表記した。ＩＣＧ‘−ＨＳＡの具体的な化学構造は式（ＩＩ）に示す通りである。
【０１１８】
表１、２よりＨＳＡに対する色素誘導体の仕込モル比を変化させることで任意の範囲で色素標識率を変化させることが出来る。ＨＳＡに対する色素モル比を８０：１および１００：１としたサンプルに関しては滅菌フィルターろ液に吸光度が確認できなかったため、色素標識率の算出が出来なかった。
【０１１９】
【表１】
2014129332.tif 000031
【０１２０】
【表２】
2014129332.tif 000032
【０１２１】
（粒子径の測定）
上記の方法で得られたＩＣＧ−ＨＳＡ（７）について動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いてで流体力学的平均粒子径の計測を行った結果を表３に示す。なお、比較例としてＩＣＧ（（財）日本公定書協会製）、ＨＳＡ、ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）を内包するリポソーム粒子、およびＩＣＧを内包するミセル粒子の平均粒子径の結果を示す。ちなみにＩＣＧ−ＨＳＡ（７）内包リポソーム粒子とは、上記の方法で得られたＩＣＧ−ＨＳＡ（７）を公知の方法でリン脂質リポソームに内包したものである。さらにＩＣＧを内包するミセル粒子とは、従来公知の乳化手法によって界面活性剤ミセル中にＩＣＧを含有させたミセル粒子である。
【０１２２】
【表３】
2014129332.tif 000033
【０１２３】
（腫瘍の光音響イメージング）
ＨｅＬａ細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対してＩＣＧ−ＨＳＡ（７）を色素量１３０ｎｍｏｌで投与し、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ．Ｉｎｃ．製）を用いて、計測は投与前、投与５分後、投与１日後でそれぞれ実施した。計測波長は８００ｎｍとした。ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）を投与する前に測定した光音響強度を１とした場合の腫瘍部での相対光音響信号強度を表４に示す。表４から、腫瘍部での光音響信号強度はＩＣＧ−ＨＳＡ（７）を投与した直後（５分後）に大きく上昇し、投与１日後においても投与直後の光音響信号強度が保持されていることが示された。
【０１２４】
【表４】
2014129332.tif 000034
【０１２５】
（腫瘍塊への移行量評価）
ＩＣＧ−ＨＳＡの腫瘍集積性を確認するために、Ｎ８７細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して造影剤を投与した。ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）および種々の造影剤を腫瘍移植マウス血中に投与し、１日後の腫瘍集積性を蛍光により評価した。さらに、腫瘍部ＲＯＩにおける集積量を算出し、ＩＣＧのＲＯＩ値を基準とした相対腫瘍集積量をまとめた結果を表５に示す。比較例としてＩＣＧ、ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）を内包するリポソーム粒子、およびＩＣＧを内包するミセル粒子の相対腫瘍集積量の結果を示す。これより、ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）は他の比較材料に比べて高い腫瘍集積性を示していることが明らかとなった。
【０１２６】
【表５】
2014129332.tif 000035
【０１２７】
（センチネルリンパ節の光音響イメージング）
光音響イメージングを用いてセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）への集積を評価した。表６および図２にＩＣＧ−ＨＳＡ（７）をヌードマウスの足底皮下に色素量でそれぞれ１３０ｎｍｏｌ投与して１日後の光音響イメージングの可否を評価した結果を示す。ＩＣＧおよびＩＣＧ含有ナノミセルは投与１日後ではＳＬＮでの光音響信号はほとんど確認できず、描出を認めることができなった。一方ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）はＳＬＮを明瞭に確認することができ（図２）、ＩＣＧ−ＨＳＡ内包リポソームとほぼ同等の描出性を示した。さらに、測定後のＳＬＮを摘出して、造影剤未投与のＳＬＮと並べて光音響イメージングを実施した結果を図３に示す。未投与のＳＬＮとの比較においてもＩＣＧ−ＨＳＡ（７）投与１日後のＳＬＮにおいて有意な光音響信号を確認した。
【０１２８】
【表６】
2014129332.tif 000036
【０１２９】
（センチネルリンパ節への集積評価）
センチネルリンパ節への集積評価例に従って、センチネルリンパ節への集積量の評価を行った。本実施例でマウスへの造影剤は色素量で１０ｎｍｏｌをそれぞれ投与した。表７に各造影剤における集積量比をまとめた結果を示す。比較例としてＩＣＧ、ＩＣＧとＨＳＡの混合溶液（ＩＣＧ＋ＨＳＡ）、ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）を内包するリポソーム粒子、およびＩＣＧを内包するミセル粒子の相対集積量の結果を示す。この結果、ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）は比較例と比べてＳＬＮへの高い集積性を示すことが明らかとなった。
【０１３０】
【表７】
2014129332.tif 000037
【０１３１】
（造影剤の腫瘍集積性評価）
実施例に記載の方法でＩＣＧ−ＨＳＡ（２）、ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）、ＩＣＧ−ＨＳＡ（２１）、ＩＣＧ−ＨＳＡ（５０）の水溶液を作製した。ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウスにＣｏｌｏｎ２６細胞を皮下に移植した腫瘍マウスモデルに対して各種ＩＣＧ−ＨＳＡ水溶液１００μＬ（ＩＣＧとして１３ｎｍｏｌ）をマウス尾静脈から注射することにより腫瘍への集積性を評価した。本実施例ではさらにＩＣＧ（（財）日本公定書協会製）の水溶液を対照サンプルとして用いた。
【０１３２】
腫瘍集積性の評価は次のように行った。投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、癌組織をそれぞれ摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートした。次いで、癌組織重量の２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて、腫瘍組織中の色素抽出液を調製した。次いで、既知濃度のＩＣＧ−ＨＳＡ溶液およびＩＣＧ水溶液を、前記癌組織のＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液で種々の濃度へ希釈し、この希釈溶液に対し、２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて検量用標準液を調製した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、腫瘍組織中の色素抽出液および検量用標準液の蛍光強度を測定することで癌組織中の色素量（％ＩＤ／ｇ）を定量した。
【０１３３】
各種ＩＣＧ−ＨＳＡ水溶液と対照の投与２４時間後におけるＣｏｌｏｎ２６細胞塊への集積性を表８に示す。対照試料であるＩＣＧ水溶液を投与したものに比べて、色素をＨＳＡに共有結合させることで腫瘍集積性が向上していることが示唆された。さらに、投与２４時間後での腫瘍集積量と血液集積量との集積量比をとると、ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）とＩＣＧ−ＨＳＡ（１５）が高い値を示したことから血液に比べて腫瘍に特異的に集積していることが示唆された。さらに、ＩＣＧ−ＨＳＡ（７）では１日後の腫瘍部の光音響信号も高かったことから今回のサンプルの中ではＩＣＧ−ＨＳＡ（７）が最も腫瘍描出に有効であった。
【０１３４】
【表８】
2014129332.tif 000038
【０１３５】
（一本鎖抗体  ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖの作製）
始めに、ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）部をコードする遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子のＣ末端にはタンパク精製のためのヒスチジンが６残基連続した６  ｘ  Ｈｉｓタグ、またそのさらに下流にスペーサーとしてグリシンを２残基挟み信号発信分子を導入するためのシステインを配置した（配列番号１）。上記遺伝子断片をＴ７プロモーターの下流に挿入したプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０ｍｌの２  ｘ  ＹＴ培地に添加し、２８度、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭでＩＰＴＧを添加し、２８度で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００ｘｇ、３０分、４度で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４度で静置後、８０００ｘｇ、３０ｍｉｎ、４度で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／５００ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１Ｌの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）  Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１３６】
ＭＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ  （配列番号１）
【０１３７】
（一本鎖抗体ｓｃＦｖを固定化したＩＣＧ−ＨＳＡの作製）
ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ，  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ：ＨＳＡ、ＳＩＧＭＡ）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解してＨＳＡ溶液とした。１ｍｇのＩＣＧ誘導体（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−Ｏｓｕ、ＤＯＪＩＮＤＯ）を０．１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記のＨＳＡ溶液に対してＨＳＡの７倍モル量添加して３７度で２時間静置した。この反応混合溶液を限外濾過（３０ｋＤａ）により、未反応体の分離を行い、ＩＣＧ−ＨＳＡの水溶液を得た。
【０１３８】
得られたＩＣＧ−ＨＳＡに対して、６０倍モル量のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、ＰＩＥＲＣＥ）を添加して４度で１時間静置した。この反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０）することで、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）への置換、および未反応体の除去を行い、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ導入ＩＣＧ−ＨＳＡの水溶液を得た。
【０１３９】
一本鎖抗体ｓｃＦｖに対して、Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ塩酸塩（ＴＣＥＰ）を１４倍モル量、室温で２時間反応させた後に、上記で得られたＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ導入ＩＣＧ−ＨＳＡに対して、ｓｃＦｖを１倍、もしくは２倍モル混合して、室温で５時間反応させた。その後、限外濾過（５０ｋＤａ）により、未反応体の除去を行い、ｓｃＦｖを修飾したＩＣＧ−ＨＳＡ（ｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ）を得た。ｓｃＦｖを１倍モル反応させたものをｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ−１、２倍モル反応させたものをｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ−２とする。
【０１４０】
（ｓｃＦｖを固定化したＨＳＡ（ｓｃＦｖ−ＨＳＡ）の作製、およびＩＣＧを標識したｓｃＦｖ−ＨＳＡ（ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ）の作製）
ＨＳＡに対して、６０倍モル量のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、ＰＩＥＲＣＥ）を添加して４度で１時間静置した。この反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０）することで、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）への置換、および未反応体の除去を行い、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ導入ＨＳＡの水溶液を得た。
【０１４１】
一本鎖抗体ｓｃＦｖに対して、Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ塩酸塩（ＴＣＥＰ）を１４倍モル量、室温で２時間反応させた後に、上記で得られたＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ導入ＨＳＡに対して、ｓｃＦｖを３倍モル混合して、室温で５時間反応させた。その後、限外濾過（５０ｋＤａ）により、未反応体の除去を行い、ｓｃＦｖを固定化したＨＳＡ（ｓｃＦｖ−ＨＳＡ）を得た。
【０１４２】
上記で得られたｓｃＦｖ−ＨＳＡに対して、ＩＣＧを７倍、もしくは、２１倍、もしくは、７０倍モル量添加して２時間反応後に、限外濾過（３０ｋＤａ）により、未反応体の除去を行い、ＩＣＧを標識したｓｃＦｖ−ＨＳＡ（ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ）を得た。ＩＣＧを７倍、２１倍、７０倍モル反応させたものをそれぞれ、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−７、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−２１、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−７０とする。
【０１４３】
（色素標識率の算出）
上記の方法で得られたＩＣＧ−ＨＳＡ、ｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧについて、ＨＳＡに対する色素標識率を算出した。色素標識率の算出はＢＣＡアッセイによるタンパク定量およびＩＣＧの吸光度からそれぞれの濃度を測定することによって算出した。結果を表９に示す。
【０１４４】
（一本鎖抗体ｓｃＦｖ固定化数の算出）
上記で得られたｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ、ｓｃＦｖ−ＨＳＡについて、ＨＳＡに対するｓｃＦｖ固定化数を算出した。結果を表９に示す。ｓｃＦｖ固定化数の算出は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、クマシー染色を行うことで、バンドの染色強度を測定することによって算出した。
【０１４５】
（ｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ、およびｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧのＨＥＲ２への結合能力の評価）
上記で作製した種々のｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧと抗原であるＨＥＲ２との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いて測定することにより、ＨＥＲ２結合能力を測定した。抗原としては、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、メーカーの推奨に従って、ＣＭ５チップ表面のカルボキシメチルデキストラン鎖へのアミンカップリングにより固定した。固定化量は、約５０００ＲＵ程度であった。ランニングバッファーとしてはＰＢＳ−Ｔ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）を用いて、１００ｎＭ〜８００ｎＭに調製したサンプルを流速２０マイクロリットル／ｍｉｎの条件下でインジェクトし、ＨＥＲ２に対する結合能力（解離定数ＫＤ［Ｍ］）を評価した。結果を表９に示す。ｓｃＦｖ固定化数が多いほど、ＨＥＲ２に結合能力が高くなることを確認した。また、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−７、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−２１、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−７０を比較したところ、色素標識率が２１になるとＨＥＲ２結合能力が大きく低下することを確認した。
【０１４６】
（ＨＥＲ２特異的な腫瘍集積性の評価）
上記で作製した分子プローブ（ＩＣＧ−ＨＳＡ、ｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ）のＨＥＲ２特異的な腫瘍集積性を確認するために、以下の実験を行った。ＨＥＲ２陽性のＮ８７細胞株、ＨＥＲ２陰性のＳＵＩＴ−２細胞株を移植した腫瘍移植モデルマウスに対して、分子プローブを投与後１日後に、腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加して破砕し、その破砕液に対してジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を９倍量添加し混合した溶液を調製した。それらの溶液の蛍光強度を測定することにより、マウスに投与した分子プローブの腫瘍重量当たりの腫瘍集積量［％ＩＤ／ｇ］を算出した。また、Ｎ８７への腫瘍集積量をＳＵＩＴ−２への腫瘍集積量で割った値（Ｎ８７／ＳＵＩＴ−２）をＨＥＲ２特異性を示す値として算出した。その結果を表９に示す。ｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ−１、ｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ−２、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−７でＨＥＲ２特異的な集積を示すことを確認した。ｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ−１、ｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ−２を比較したところ、ｓｃＦｖ固定化数が多いｓｃＦｖ−ＩＣＧ−ＨＳＡ−２の方がＨＥＲ２特異性が高く、ｓｃＦｖ固定化数が多い方がＨＥＲ２特異性が高いことが示唆された。また、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−７、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−２１、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−７０を比較したところ、色素標識率が６．６以上になるとＨＥＲ２特異的な集積が見られなくなることを確認した。この原因として、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−７とｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ＩＣＧ−２１では、ＨＥＲ２に対する結合能力は変わらないことより、ＩＣＧを多数標識することにより、ＩＣＧを介した肝臓排泄が促進されてしまったことなどが考えられる。
【０１４７】
つまり、ｓｃＦｖを固定化したＩＣＧ−ＨＳＡに関しては、色素標識率１．９において、ｓｃＦｖ固定化数は０．６９以上でＨＥＲ２特異的な集積を示し、ｓｃＦｖ固定化数が１．７でより高いＨＥＲ２特異性を示すことを確認した。また、ＩＣＧを標識したｓｃＦｖ−ＨＳＡに関しては、ｓｃＦｖ固定化数２．９において、色素標識率は少なくとも６．６より少ない必要があることを確認した。以上より、ｓｃＦｖ固定化数は０．６９以上、より好ましくは１．７程度以上、色素標識率は６．６より少ないことが、ＨＥＲ２特異的な腫瘍集積に必要であることが示唆された。
【０１４８】
【表９】
2014129332.tif 000039
【０１４９】
（ＨＥＲ２捕捉分子とＩＣＧ−ＨＳＡとの固定化方法の比較）
最初に、ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ，  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ：ＨＳＡ、ＳＩＧＭＡ）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解してＨＳＡ溶液とした。１ｍｇのＩＣＧ誘導体（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−Ｏｓｕ、ＤＯＪＩＮＤＯ）を０．１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記のＨＳＡ溶液に対してＨＳＡの７倍モル量添加して３７度で２時間静置した。この反応混合溶液を限外濾過（３０ｋＤａ）により、未反応体の分離を行い、ＩＣＧ−ＨＳＡの水溶液を得た。
【０１５０】
得られたＩＣＧ−ＨＳＡに対して、１０倍モル量、または１００倍モル量のＳＭ（ＰＥＧ）２（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］  ｅｓｔｅｒ、ＰＩＥＲＣＥ）、またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＡ−１００ＴＳ（日油）を添加して４度で１時間静置した。この反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０）することで、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）への置換、および未反応体の除去を行い、２種類のリンカーを異なる割合で導入したＩＣＧ−ＨＳＡの水溶液を得た。ＩＣＧ−ＨＳＡに対するそれぞれのリンカー導入数は、リンカー導入前後のＩＣＧ−ＨＳＡのアミノ基数の変化から算出した。アミノ基数の定量方法は、２，４，６−Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄを用いた呈色反応により行った。
【０１５１】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標、Ａｆｆｉｂｏｄｙ）は、ＨＥＲ２捕捉分子ポリペプチドである。Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）を溶解させたリン酸緩衝液に対して、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ナカライテスク）を終濃度２０ｍＭとなるように添加して２５度で２時間混和した。この反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０）することで、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌの除去を行い、還元処理されたＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）の水溶液を得た。これと、前記２種類のリンカーを異なる割合で導入したＩＣＧ−ＨＳＡの水溶液をそれぞれ混合させ、２５度で２時間以上混和した。その後、限外濾過（３０ｋＤａ）により、未反応のＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）の除去を行い、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）を固定化したＩＣＧ−ＨＳＡを得た。固定化されたＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）の数は、限外濾過により溶出されるろ液中に含まれる未固定化体を定量することで算出した。ここで、上記リンカーとして１０倍モル量のＳＭ（ＰＥＧ）２を使用したＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）固定化ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ１−ＩＣＧ−ＨＳＡ、１００倍モル量のＳＭ（ＰＥＧ）２を使用したＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）固定化ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ２−ＩＣＧ−ＨＳＡと表記する。同様に、上記リンカーとして１０倍モル量のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＡ−１００ＴＳを使用したＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）固定化ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ３−ＩＣＧ−ＨＳＡ、１００倍モル量のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＡ−１００ＴＳを使用したＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）固定化ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ４−ＩＣＧ−ＨＳＡと表記する。上記のＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）固定化ＩＣＧ−ＨＳＡについて、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって、標的分子であるＨＥＲ２に対する結合性を評価した。ＳＰＲはＰｒｏｔｅｏｎ（登録商標）ＸＰＲ３６（バイオラッドラボラトリーズ）を用いて測定した。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を酢酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解させ、ＧＬＭセンサーチップ表面のカルボキシル基へのアミンカップリングにより固定化した。固定化量は、約３０００ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）であった。次に、各Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）固定化ＩＣＧ−ＨＳＡを０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で種々の濃度へ希釈した後、流速５０μＬ／分でフローセルへ注入した。測定時間は、注入時間（結合）１２０秒、注入停止後経過時間（解離）１２０秒であった。結合速度論解析実験においては、１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いてセンサーグラムを分析した。算出された結合解離定数（ＫＤ）を表１０にまとめた。いずれのサンプルでもＨＥＲ２に対する結合性が確認され、特にＳＭ（ＰＥＧ）２を１００倍量用いて多くのＨＥＲ２捕捉分子を固定化した方が、ＨＥＲ２に対する結合力は高いことが示唆された。
【０１５２】
【表１０】
2014129332.tif 000040
【０１５３】
（ＨＥＲ２結合性分子種とリンカー種の組み合わせにおける比較）
最初に、ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ，  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ：ＨＳＡ、ＳＩＧＭＡ）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解してＨＳＡ溶液とした。１ｍｇのＩＣＧ誘導体（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−Ｏｓｕ、ＤＯＪＩＮＤＯ）を０．１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、上記のＨＳＡ溶液に対してＨＳＡの７倍モル量添加して３７度で２時間静置した。この反応混合溶液を限外濾過（３０ｋＤａ）により、未反応体の分離を行い、ＩＣＧ−ＨＳＡの水溶液を得た。
【０１５４】
得られたＩＣＧ−ＨＳＡに対して、１００倍モル量のＳＭ（ＰＥＧ）２、または、１００倍モル量のＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、ＰＩＥＲＣＥ）、または、１００倍モル量のＢＳ（ＰＥＧ）５（Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−（ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｅｓｔｅｒ、ＰＩＥＲＣＥ）をそれぞれ添加して４度で１時間静置した。この反応混合溶液をゲルろ過（ＰＤ−１０）することで、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）への置換、および未反応体の除去を行い、３種類のリンカーを導入したＩＣＧ−ＨＳＡの水溶液を得た。ＩＣＧ−ＨＳＡに対するそれぞれのリンカー導入数は、リンカー導入前後のＩＣＧ−ＨＳＡのアミノ基数の変化から算出した。アミノ基数の定量方法は、２，４，６−Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄを用いた呈色反応により行った。ＳＭ（ＰＥＧ）２を導入したＩＣＧ−ＨＳＡ（以下、ＳＭ−ＩＣＧ−ＨＳＡと略す）へのリンカー導入数は、１３であった。また、ＳＭＣＣを導入したＩＣＧ−ＨＳＡ（以下、ＣＣ−ＩＣＧ−ＨＳＡと略す）へのリンカー導入数は、９であった。また、ＢＳ（ＰＥＧ）５を導入したＩＣＧ−ＨＳＡ（以下、ＢＳ−ＩＣＧ−ＨＳＡと略す）へのリンカー導入数は、１５であった。
【０１５５】
次に、上述の３種類のリンカーを導入したＩＣＧ−ＨＳＡに対して、ｓｃＦｖ、または、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、または、ＨＥＲ２結合性のペプチドを固定化した。使用したＨＥＲ２結合性ペプチドの配列は以下の通りである。
【０１５６】
ＹＣＤＧＦＹＡＣＹＭＤＶＧＧＫＧＳＫ（配列番号２）
ＭＡＲＳＧＬＧＧＫＧＳＣ（配列番号３）
【０１５７】
リンカーを導入したＩＣＧ−ＨＳＡへの固定化に際し、事前に、前述の方法と同様にｓｃＦｖに関してはＴＣＥＰにて還元処理し、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）に関してはＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌにて還元処理した。ＨＥＲ２結合性ペプチド、または、還元処理したＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、または、還元処理したｓｃＦｖと、各リンカーを導入したＩＣＧ−ＨＳＡとを２５度で２時間以上混和した。その後、限外濾過（３０ｋＤａ）により、未反応のＨＥＲ２結合性分子の除去を行い、ＨＥＲ２結合性分子を固定化したＩＣＧ−ＨＳＡを得た。固定化されたＨＥＲ２結合性分子の数は、限外濾過により溶出されるろ液中に含まれる未固定化体を定量することで算出した。ここで、配列番号２のペプチドを固定化したＢＳ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ５−ＩＣＧ−ＨＳＡ、配列番号３のペプチドを固定化したＳＭ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ６−ＩＣＧ−ＨＳＡ、配列番号３のペプチドを固定化したＣＣ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ７−ＩＣＧ−ＨＳＡ、列番号３のペプチドを固定化したＢＳ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ８−ＩＣＧ−ＨＳＡと表記する。また、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）を固定化したＳＭ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ９−ＩＣＧ−ＨＳＡ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）を固定化したＣＣ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ１０−ＩＣＧ−ＨＳＡ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）を固定化したＢＳ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ１１−ＩＣＧ−ＨＳＡと表記する。また、ｓｃＦｖを固定化したＳＭ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ１２−ＩＣＧ−ＨＳＡ、ｓｃＦｖを固定化したＣＣ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ１３−ＩＣＧ−ＨＳＡ、ｓｃＦｖを固定化したＢＳ−ＩＣＧ−ＨＳＡをＬ１４−ＩＣＧ−ＨＳＡと表記する。これらＨＥＲ２結合性分子固定化ＩＣＧ−ＨＳＡについて、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって、標的分子であるＨＥＲ２に対する結合性を評価した。ＳＰＲは前述の通りＰｒｏｔｅｏｎ（登録商標）ＸＰＲ３６（バイオラッドラボラトリーズ）を用いて測定した。
【０１５８】
腫瘍集積性の評価においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約１週間前に１Ｘ１０６個のＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞（理化学研究所）を、マウスの右肩および右腿に、１Ｘ１０６個のＨＥＲ２遺伝子を人工的に導入したＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞をマウスの左肩および左腿にそれぞれ皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全て定着しており、マウスの体重は１７〜２２ｇであった。担癌させたマウスにＨＥＲ２結合性分子固定化ＩＣＧ−ＨＳＡまたは、何も固定化していないＩＣＧ−ＨＳＡを、２００μＬ（ＩＣＧとして１３ｎｍｏｌ）を静脈注射した。投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、癌組織をそれぞれ摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートした。次いで、癌組織重量の２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて、腫瘍組織中の色素抽出液を調製した。一方で、ＨＥＲ２結合性分子固定化ＩＣＧ−ＨＳＡを投与していない担癌させたマウスから癌組織を摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートすることで、癌組織のＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を調製した。次いで、既知濃度のＨＥＲ２結合性分子固定化ＩＣＧ−ＨＳＡ溶液を、前記癌組織のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液で種々の濃度へ希釈し、この希釈溶液に対し、２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて検量用標準液を調製した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、腫瘍組織中の色素抽出液および検量用標準液の蛍光強度を測定することで癌組織中の色素量を定量した。各ＨＥＲ２結合性分子固定化ＩＣＧ−ＨＳＡのリンカー導入数、および、ＨＥＲ２結合性分子数、および、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＥＲ２に対する結合性、および、ＨＥＲ２遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍への集積量と、野生型Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍への集積量に対するＨＥＲ２遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍への集積量の割合を表１１にまとめた。何も固定化していないＩＣＧ−ＨＳＡに比較して、Ｌ１１−ＩＣＧ−ＨＳＡを除く全てのＨＥＲ２結合性分子固定化ＩＣＧ−ＨＳＡにおいて、集積量は減少したものの、野生型Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍に対して、ＨＥＲ２遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍へ選択的な集積が確認された。Ｌ１１−ＩＣＧ−ＨＳＡは、分子量の増加とＨＥＲ２結合力の低下の影響でＨＥＲ２選択性が得られなかったと考えられる。また、ＨＥＲ２結合性分子毎に比較した場合、ｓｃＦｖがもっともＨＥＲ２選択性が高いことが確認できた。更に、ＩＣＧ−ＨＳＡへ導入したリンカー毎に比較した場合、ＳＭ（ＰＥＧ）２、または、ＳＭＣＣにおいてＨＥＲ２選択性が高い傾向があった。
【０１５９】
【表１１】
2014129332.tif 000041
【図１】
2014129332.tif 000066
【図２】
2014129332.tif 000067
【図３】
2014129332.tif 000068
【配列表】
2014129332000001.app