(57)【要約】      （修正有）【課題】プロテアーゼに対する耐性を示すインスリンアナログ、該インスリンアナログの調製方法、該インスリンアナログを含有するインスリン製剤及びこれらのインスリンアナログを使用する真性糖尿病の治療方法を提供する。【解決手段】親インスリンに対し、少なくとも２の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換が、親インスリンの２以上のプロテアーゼ切断部位の内部又はこれに近接して存在しているインスリンアナログであって、一又は複数の付加的な変異をさらに含んでいてもよい、インスリンアナログ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親インスリンに対し、少なくとも２の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換が、親インスリンの２以上のプロテアーゼ切断部位の内部又はこれに近接して存在しているインスリンアナログであって、一又は複数の付加的な変異をさらに含んでいてもよいインスリンアナログ。
【請求項２】
インスリンアナログのＡ鎖が少なくとも一の変異を含み、インスリンアナログのＢ鎖が親インスリンに対して少なくとも一の変異を含んでいる請求項１に記載のインスリンアナログ。
【請求項３】
親タンパク質に対して、一又は複数のプロテアーゼ酵素への増加した安定性を示す請求項１又は２に記載のインスリンアナログ。
【請求項４】
式１：
ＸａａＡ(−２)-ＸａａＡ(−１)-ＸａａＡ０-Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-      Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-
ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１-ＸａａＡ２２
式(１)(配列番号１)
のＡ鎖アミノ酸配列、及び次の式２：
ＸａａＢ(−２)-ＸａａＢ(−１)-ＸａａＢ０-ＸａａＢ１-ＸａａＢ２-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-      Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-
ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-
ＸａａＢ２５-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０-ＸａａＢ３１-
ＸａａＢ３２
式(２)(配列番号２)
のＢ鎖アミノ酸配列を含み、該式中、
ＸａａＡ(−２)は存在しないか又はＧｌｙであり;
ＸａａＡ(−１)は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＡ０は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２２は存在しないか又はＬｙｓであり;
ＸａａＢ(−２)は存在しないか又はＧｌｙであり;
ＸａａＢ(−１)は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＢ０は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＢ１は存在しないか、又は独立してＰｈｅ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２は存在しないか又はＶａｌであり;
ＸａａＢ３は存在しないか、又は独立してＡｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２５は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり;
ＸａａＢ３１は存在しないか又はＬｅｕであり;
ＸａａＢ３２は存在しないか又はＧｌｕであり;
場合によってはＣ末端がアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列が、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインがジスルフィド架橋により結合しており；
場合によってはＡ鎖アミノ酸配列のＮ末端が、３-７のアミノ酸を含有するアミノ酸配列により、Ｂ鎖アミノ酸配列のＣ末端に結合して、単鎖インスリン分子を形成してよく、場合によってはＢ鎖のＮ末端が１-１０のアミノ酸で伸長しており；
ＸａａＡ８がＴｈｒであり、ＸａａＡ１２がＳｅｒであり、ＸａａＡ１３がＬｅｕであり、ＸａａＡ１４がＴｙｒであるならば、 ＸａａＡ１５はＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び
ＸａａＢ２４がＰｈｅであり、 ＸａａＢ２５がＰｈｅであり、 ＸａａＢ２６がＴｙｒであり、ＸａａＢ２７がＴｈｒであり、ＸａａＢ２８がＰｒｏであるならば、ＸａａＢ２９はＧｌｎである
請求項１から３のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項５】
生物活性量の請求項１から４のいずれか１項に記載のインスリンアナログと製薬的に許容可能な担体を含有する製薬用組成物。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載のインスリンアナログ、又は請求項５に記載の製薬用組成物を患者に投与することを含む、患者の高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、Ｘ症候群、又は脂質代謝異常を治療、予防又は緩和する方法。
【請求項７】
経口投与である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、Ｘ症候群、及び脂質代謝異常の治療又は予防における医薬として使用するための、請求項１から４のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項９】
２型糖尿病の疾患進行の遅延化又は予防における医薬として使用するための、請求項１から４のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１０】
食物摂取の低下、β細胞アポトーシスの低下、β細胞機能及びβ細胞量の増加、及び／又はβ細胞に対するグルコース感受性の回復における医薬として使用するための、請求項１から４のいずれか１項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか１項に記載のインスリンアナログをコードする核酸配列。
【請求項１２】
製薬的に許容可能な物質及び／又は賦形剤と、請求項１から４のいずれか１項に記載のインスリンアナログとを混合することを含む、請求項５に記載の製薬用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼに対する耐性を示す新規なインスリンアナログ、かかるインスリンアナログの調製方法、本発明のインスリンアナログを含有するインスリン製剤、及びこれらのインスリンアナログを使用する真性糖尿病の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
経口経路は、薬剤投与で最も幅広く使用されている経路であり、特に長期治療を受けている患者に、一般的には非常によく受け入れられている。しかしながら、治療用ペプチド又はタンパク質の投与は、胃腸(ＧＩ)管での酵素的分解、薬物排出ポンプ、腸粘膜からの不十分で変動する吸収、並びに肝臓での初回通過代謝等のいくつかの障壁のため、好ましい経口投与よりも非経口投与に限定されることが多い。ヒトインスリンは、胃(ペプシン)、腸内腔(キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ等)、ＧＩ管の粘膜表面(アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ等)に見出される種々の消化酵素により分解される。
多くのペプチド及び多くのタンパク質が臨床的に有効であることが証明されており、投与が簡単で、レシピエントにとって許容可能ならば、より広く使用されるであろうから、このことは残念なことである。
【０００３】
真性糖尿病は、グルコースを利用する能力が部分的に又は完全に喪失している代謝疾患である。全人口の約５％が糖尿病に罹患しており、該疾患は流行病の割合に近づいている。１９２０年代にインスリンが導入されて以来、真性糖尿病の治療を改善するため、絶え間ない努力がなされている。糖尿病に罹患している人々は、数十年以上の長期間にわたる治療を受けるために、安全で簡便であり、生活の質を改善するインスリン製剤に対する大きな必要性がある。
【０００４】
真性糖尿病の治療において、多くの様々なインスリン製剤、例えばレギュラーインスリン、イソフェンインスリン(ＮＰＨと称される)、インスリン亜鉛懸濁剤(例えばSemilente(登録商標)、Lente(登録商標)、及びUltralente(登録商標))、及び二相性イソフェンインスリンが示唆され使用されている。商業的に入手可能なインスリン製剤のいくつかは、作用発現が速いことで特徴付けられ、他の製剤は、作用発現は比較的遅いが、程度の差はあるが、持続作用を示す。速効性インスリン製剤は、通常インスリンの溶液であるが、遅効性インスリン製剤は、亜鉛塩を単独で添加するか、又はプロタミンを添加するか、又は双方を組合せることにより沈殿させられる結晶及び／又は非晶質形態のインスリンを含む懸濁剤でありうる。
【０００５】
ヒトインスリンは、それぞれ２１及び３０のアミノ酸残基を含むＡ鎖及びＢ鎖の２つのポリペプチドからなる。Ａ鎖及びＢ鎖は２つのジスルフィド結合により相互に結合している。殆どの他の種由来のインスリンも同様であるが、いくつかの位置にアミノ酸置換を含みうる。ここ１０年で、多くのヒトインスリンアナログが開発されている。それらは特定の作用プロファイル、すなわち速効型又は持続作用となるように設計される。このようなインスリンアナログを含有する商業的に入手可能な製品には、Levemir(登録商標)、NovoRapid(登録商標)、Humalog(登録商標)、Apidra(登録商標)及びLantus(登録商標)が含まれる。
【０００６】
通常、インスリン製剤は、皮下注射により投与される。
しかしながら、経口経路による投与は、患者のコンプライアンス、安全性及び簡便性にとって有利である。
【０００７】
インスリンのようなタンパク質薬剤の経口投与は、酵素的及び吸収障壁のために非常に低い生物学的利用能に帰する場合が多い。ペプチド及びタンパク質の送達のための一般的なアプローチは、侵襲的で不便な非経口投与である。よって、タンパク質ベースの医薬の経口送達等の非侵襲経路が益々研究されている。タンパク質／ペプチドの経口送達のための最近の製剤設計には、プロテアーゼインヒビター、浸透エンハンサー、ポリマーベース送達系及びインスリンコンジュゲートを含む共製剤が含まれる。後者には、ヘキシル-インスリン-モノコンジュゲート-２(ＨＩＭ２) (Nobex Cooperation及びGSK)、Ｂ２９に結合したＰＥＧ７-ヘキシル基を有するヒトインスリンアナログが含まれる。例えば、米国特許第7,030,082号、米国特許第6,867,183号、及び米国特許第6,770,625号には、インスリンと比較して、タンパク質分解安定性及び生物学的利用能が増加した経口ＨＩＭ２が報告されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一実施態様では、タンパク質分解安定性が高められ、生物学的なインスリン活性が保持されたインスリンアナログが提供される。
本発明のさらなる実施態様では、親インスリン分子に対して、少なくとも２のアミノ酸が置換及び／又は欠失しているインスリンアナログが提供される。
本発明のさらなる実施態様では、親インスリンに対して、少なくとも２の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換が、親インスリンの２以上のプロテアーゼ切断部位の内部又はこれに近接して存在しているインスリンアナログであって、場合によっては一又は複数の付加的な変異をさらに含むインスリンアナログが提供される。
【０００９】
また、インスリンアナログのＡ鎖が少なくとも一の変異を含み、インスリンアナログのＢ鎖が親インスリンに対して少なくとも一の変異を含んでいる本発明のインスリンアナログを提供することが本発明の目的である。
さらに本発明は、請求項記載のインスリンアナログのプレプロペプチドをコードする核酸配列に関する。さらなる実施態様では、本発明は、かかる核酸配列を有するベクター、及びかかる核酸配列又はベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明のインスリンアナログを得るための方法及び医薬としてのそれらの使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、３７℃での未変化インスリン(アナログ)に対するパーセンテージとして測定された、キモトリプシンに対するヒトインスリン(ＨＩ)及びインスリンアナログのタンパク質分解安定性を示す。
【図２】図２は、２５℃での未変化インスリン(アナログ)に対するパーセンテージとして測定された、ペプシンに対するヒトインスリン(ＨＩ)及びインスリンアナログのタンパク質分解安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のインスリンアナログは、親インスリン分子に対して、Ａ及び／又はＢアミノ酸鎖の２以上の変異を有するインスリン分子である。
インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位の内部又はこれに近接した２以上の疎水性アミノ酸を、親水性アミノ酸で置換することにより、親インスリンに対してタンパク質分解的に安定したインスリンアナログが得られることが見出された。
【００１２】
以下は、他の箇所でさらに記載される実施態様の非限定的列挙である：
実施態様１．  親インスリンに対して少なくとも２の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換が、親インスリンの２以上のプロテアーゼ切断部位の内部又はこれに近接して存在しているインスリンアナログであって、場合によっては一又は複数の付加的な変異をさらに含むインスリンアナログ。
実施態様２．  親インスリンに対して増加した溶解度が得られる実施態様１のインスリンアナログ。
実施態様３．  インスリンアナログのＡ鎖が少なくとも一の変異を含み、インスリンアナログのＢ鎖が親インスリンに対して少なくとも一の変異を含む実施態様１−２のいずれか一のインスリンアナログ。
実施態様４．  インスリンアナログが、第１の修飾インスリンアナログのプロテアーゼ部位に、少なくとも一のアミノ酸置換をさらに有し、該少なくとも一のアミノ酸置換が、少なくとも一の疎水性アミノ酸が少なくとも一の親水性アミノ酸で置換されているものである実施態様１−３のいずれか一のインスリンアナログ。
【００１３】
実施態様５．
・  Ａ１２位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり、及び／又はＡ１３位のアミノ酸がＨｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり、及び／又はＡ１４位のアミノ酸がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＨｉｓであり、及び／又はＡ１５位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び
・  Ｂ２４位のアミノ酸がＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、及び／又はＢ２６位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ又はＴｈｒであり、及び／又はＢ２７位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ又はＡｒｇであり、及び／又はＢ２８位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ又はＡｓｐであり;
場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含む実施態様１−４のいずれかのインスリンアナログ。
【００１４】
実施態様６．  Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含む実施態様１−５のいずれかのインスリンアナログ。 
実施態様７．  Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、Ｂ３０位のアミノ酸が欠失している実施態様１−６のいずれかのインスリンアナログ。
実施態様８．  Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓである実施態様１−６のいずれかのインスリンアナログ。
【００１５】
実施態様９．  一又は複数の付加的な変異が、Ａ(−３)Ｇｌｙ、Ａ(−２)Ｇｌｙ、Ａ(−１)Ｐｒｏ、Ａ(０)Ｐｒｏ、Ａ８Ｈｉｓ、Ａ１８Ｇｌｎ、Ａ１８Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｙ、Ｂ(−３)Ｇｌｙ、Ｂ(−２)Ｇｌｙ、Ｂ(−１)Ｐｒｏ、Ｂ(０)Ｐｒｏ、Ｂ１Ｇｌｕ、Ｂ１Ｇｌｎ、ｒｏ、Ｂ１Ｇｌｕ、Ｂ１Ｇｌｎ、Ｂ３Ｇｌｎ、Ｂ１０Ｐｒｏ、Ｂ１４Ｔｈｒ、Ｂ１６Ｇｌｕ、Ｂ１７Ｓｅｒ、Ｂ２６Ａｓｐ、ＤｅｓＢ２６、ＤｅｓＢ２７、Ｂ２７Ｇｌｕ、Ｂ２７Ｇｌｕ、Ｂ２８Ａｓｐ、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０、Ｂ３１Ｌｅｕ、Ｂ３２Ｇｌｕからなる群から選択される実施態様１−６のいずれかのインスリンアナログ。
実施態様１０．  付加的な変異がｄｅｓＢ３０である実施態様１−６又は９のいずれかのインスリンアナログ。
実施態様１１．  Ａ１４がＧｌｕである実施態様１−１０のいずれかのインスリンアナログ。
【００１６】
実施態様１２．  親タンパク質に対して、一又は複数のプロテアーゼ酵素への増加した安定性を示す実施態様１−１１のいずれかのインスリンアナログ。
実施態様１３．  親タンパク質に対して、２以上のプロテアーゼ酵素への増加した安定性を示す実施態様１−１２のいずれかのインスリンアナログ。
【００１７】
実施態様１４．  親インスリンが、
ヒトインスリン;
・  Ｂ２８位のアミノ酸残基がＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基がＬｙｓ又はＰｒｏであり、場合によってはＢ３０位のアミノ酸残基が欠失しているヒトインスリンのインスリンアナログ；
・  ｄｅｓ(Ｂ２６-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２８-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２９-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７)ヒトインスリン、又はｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン;
・  Ｂ３位のアミノ酸残基がＬｙｓであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基が Ｇｌｕ又はＡｓｐであるヒトインスリンのインスリンアナログ;
・  Ａ２１位のアミノ酸残基が Ｇｌｙであり、２つのＡｒｇ残基でＣ末端がさらに伸長しているヒトインスリンのインスリンアナログ；
・  Ｂ３０位のアミノ酸残基がスレオニンメチルエステルで置換されているインスリン誘導体；
・  ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンのＢ２９位にあるリジンのＮε位にテトラデカノイル鎖が結合したインスリン誘導体；
からなる群から選択される実施態様１−１３のいずれかのインスリンアナログ。
【００１８】
実施態様１５．  一又は複数の付加的な変異が、インスリンの化学的安定性を高めるように選択される実施態様１−６、９又は１１-１４のいずれかのインスリンアナログ。
実施態様１６．  一又は複数の付加的な変異が、Ａ１８Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｙ及びＢ３Ｇｌｎからなる群から選択される実施態様１５のインスリンアナログ。
【００１９】
実施態様１７．  式１：
ＸａａＡ(−２)-ＸａａＡ(−１)-ＸａａＡ０-Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-      Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-
ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１-ＸａａＡ２２
式(１)(配列番号１)
のＡ鎖アミノ酸配列、及び次の式２：
ＸａａＢ(−２)-ＸａａＢ(−１)-ＸａａＢ０-ＸａａＢ１-ＸａａＢ２-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-      Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-
ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-
ＸａａＢ２５-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０-ＸａａＢ３１-
ＸａａＢ３２
式(２)(配列番号２)
のＢ鎖アミノ酸配列を含み、上記式中、
ＸａａＡ(−２)は存在しないか又はＧｌｙであり;
ＸａａＡ(−１)は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＡ０は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２２は存在しないか又はＬｙｓであり;
ＸａａＢ(−２)は存在しないか又はＧｌｙであり;
ＸａａＢ(−１)は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＢ０は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＢ１は存在しないか、又は独立してＰｈｅ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２は存在しないか又はＶａｌであり;
ＸａａＢ３は存在しないか、又は独立してＡｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２５は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり;
ＸａａＢ３１は存在しないか又はＬｅｕであり;
ＸａａＢ３２は存在しないか又はＧｌｕであり;
場合によってはＣ末端がアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列が、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインがジスルフィド架橋により結合しており；
場合によってはＡ鎖アミノ酸配列のＮ末端が、３−７のアミノ酸を含有するアミノ酸配列により、Ｂ鎖アミノ酸配列のＣ末端に結合して、単鎖インスリン分子を形成してよく、場合によってはＢ鎖のＮ末端が１−１０のアミノ酸で伸長しており；
ＸａａＡ８がＴｈｒで、ＸａａＡ１２がＳｅｒで、ＸａａＡ１３がＬｅｕで、ＸａａＡ１４がＴｙｒであるならば、ＸａａＡ１５はＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び
ＸａａＢ２４がＰｈｅで、ＸａａＢ２５がＰｈｅで、ＸａａＢ２６がＴｙｒで、ＸａａＢ２７がＴｈｒで、ＸａａＢ２８がＰｒｏであるならば、ＸａａＢ２９はＧｌｎである、
実施態様１−４又は１２-１４のいずれかのインスリンアナログ。
【００２０】
実施態様１８．  次の式３：
Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-
Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-
Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１
式(３)(配列番号３)
のＡ鎖アミノ酸配列、及び次の式(４)：
ＸａａＢ１-Ｖａｌ-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-ＧＬｙｓｅｒ-
ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-
Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-Ｈｉｓ-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-
ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０
式(４)(配列番号４)
のＢ鎖アミノ酸配列を含み、上記式中、
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ１は独立して、Ｐｈｅ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ３は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり;
場合によってはＣ末端がアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列が、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインがジスルフィド架橋により結合している、実施態様１−４又は１２-１４のいずれかのインスリンアナログ。
【００２１】
実施態様１９．  ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１４は独立して、Ａｓｐ、Ｈｉｓ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ１は独立して、Ｐｈｅ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ３は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２６は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２７は独立して、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２８は独立して、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２９は独立して、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０存在しないか又はＴｈｒであり;
場合によってはＣ末端がアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列が、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインがジスルフィド架橋により結合している、実施態様１８のインスリンアナログ。
【００２２】
実施態様２０．  Ｂ鎖のＣ末端が、３−１５のアミノ酸又は３−７のアミノ酸で、Ａ鎖のＮ末端に結合し、単鎖インスリン分子を形成しており、場合によってはＢ鎖のＮ末端が１−１０のアミノ酸で伸長している実施態様１−１６のいずれかのインスリンアナログ。
【００２３】
実施態様２１．  実施態様１−２０のいずれかに記載の生物活性量のインスリンアナログと製薬的に許容可能な担体を含有する製薬用組成物。
実施態様２２．  実施態様１−２０のいずれかに記載の２以上のインスリンアナログを含有し、各アナログが、他の変異体の少なくとも一つに存在しない少なくとも一の変異を有することによって定められた製薬用組成物。
実施態様２３．  製薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と、場合によってはアジュバントをさらに含有する実施態様１１−２０のいずれかの製薬用組成物。
【００２４】
実施態様２４．  実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログ、又は実施態様２１−２３のいずれかの製薬用組成物を患者に投与することを含む患者における真性糖尿病を治療する方法。
実施態様２５．  実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログ、又は実施態様２１−２３のいずれかの製薬用組成物の治療的活性量を、かかる治療を必要とする患者に投与することを含む、哺乳動物の血糖値を低下させる方法。
実施態様２６．  経口投与である実施態様２４又は２５の方法。
実施態様２７．  非経口投与である実施態様２４又は２５の方法。
実施態様２８．  気管内投与である実施態様２４又は２５の方法。
【００２５】
実施態様２９．  高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、Ｘ症候群、及び脂質代謝異常の治療又は予防における医薬として使用される実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログ。
実施態様３０．  ２型糖尿病の疾患進行の遅延化又は予防における医薬として使用される実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログ。
実施態様３１．  食物摂取の低下、β細胞アポトーシスの低下、β細胞機能及びβ細胞量の増加、及び／又はβ細胞に対するグルコース感受性の回復において医薬として使用される実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログ。
【００２６】
実施態様３２．  実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログをコードする核酸、その誘導体、その部分配列、その変性配列、又はストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列。
実施態様３３．  実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログの前駆体をコードする核酸、その誘導体、その部分配列、その変性配列、又はストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列。
【００２７】
実施態様３４．  実施態様３２又は３３の核酸配列を含む発現ベクター。
実施態様３５．  実施態様３４の発現ベクターを含む宿主細胞。
【００２８】
実施態様３６．  実施態様３５の宿主細胞を培養する工程を含む、インスリンアナログの製造方法。
実施態様３７．  アミノ酸の置換を、部位特異的突然変異誘発により実施する実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログの製造方法。
【００２９】
実施態様３８．  製薬的に許容可能な物質及び／又は賦形剤と実施態様１−２０のいずれかのインスリンアナログとを混合することを含む実施態様２１-２３のいずれかの製薬用組成物の製造方法。
実施態様３９．  実施態様３８の方法により得られうる製薬用組成物。
【００３０】
インスリンは膵臓のβ細胞から分泌されるポリペプチドホルモンである。インスリンは、２つの鎖間ジスルフィド架橋により連結した２つのポリペプチド鎖Ａ及びＢからなる。さらに、Ａ鎖は一つの鎖内ジスルフィド架橋により特徴付けられる。
該ホルモンは、プレペプチド-Ｂ-Ａｒｇ Ａｒｇ-Ｃ-Ｌｙｓ Ａｒｇ-Ａ（ここで、Ｃは、３１のアミノ酸の連結ペプチドである）の配置の、２４のアミノ酸のプレペプチドに８６のアミノ酸を含むプロインスリンが続いてなる単鎖前駆体プロインスリン(プレプロインスリン)として合成される。Ａｒｇ-Ａｒｇ及びＬｙｓ-Ａｒｇは、Ａ及びＢ鎖から連結ペプチドを切断するための切断部位である。
【００３１】
本発明のインスリンアナログは、さらなる変異を含みうる。インスリン分子中の変異は、自然に生じたインスリン分子のＡ及び／又はＢ鎖におけるアミノ酸残基の置換、欠失又は付加の形態でありうる。
「ｄｅｓＢ３０」又は「Ｂ(１-２９)」とは、Ｂ３０アミノ酸残基を欠く天然インスリンＢ鎖を意味し、「Ａ(１-２１)」は天然インスリンＡ鎖を意味する。ミニＣペプチド及びそのアミノ酸配列は３文字のアミノ酸コードで示される。
ここで、Ａ１、Ａ２、Ａ３等の用語は、それぞれ(Ｎ末端から数えた)インスリンのＡ鎖の位置１、２及び３を示す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３等の用語は、それぞれ(Ｎ末端から数えた)インスリンのＢ鎖の位置１、２及び３を示す。アミノ酸用の１文字コードを使用すると、Ａ２１Ａ、Ａ２１Ｇ及びＡ２１Ｑ等の用語は、Ａ２１位にあるアミノ酸が、それぞれＡ、Ｇ及びＱであることを示す。アミノ酸用の３文字コードを使用すると、対応する表現は、それぞれＡ２１Ａｌａ、Ａ２１Ｇｌｙ及びＡ２１Ｇｌｎとなる。
ここで、Ａ(０)又はＢ(０)なる用語は、それぞれＡ１又はＢ１のＮ末端よりに隣接した位置を示す。Ａ(−１)又はＢ(−１)なる用語は、それぞれＡ(０)又はＢ(０)に対してＮ末端よりの第１のアミノ酸の位置を示す。よって、Ａ(−２)及びＢ(−２)は、それぞれＡ(−１)及びＢ(−１)に対してＮ末端よりの位置を示し、Ａ(−３)及びＢ(−３)は、それぞれＡ(−２)及びＢ(−２)に対してＮ末端寄りの位置を示す。
【００３２】
連結ペプチドなる用語は、インスリンのＡ鎖のＮ末端アミノ酸残基とＢ鎖のＣ末端アミノ酸残基を結合可能なペプチド鎖を包含する。
プロペプチドなる用語は、その機能が、発現されたポリペプチドを小胞体からゴルジ体へ、さらには培養培地中への分泌のために分泌小胞へ向けること（すなわち、細胞壁又は少なくとも細胞膜を通しての酵母細胞のペリプラズム空間中へのポリペプチドの排出）を可能にすることであるポリペプチド配列を意味する。プロペプチドは酵母α-因子プロペプチドであってよく、米国特許第4,546,082号及び同4,870,008号が参照される。またプロペプチドは、合成プロペプチド、つまり天然には見出されないプロペプチドであってもよい。適切な合成プロペプチドは米国特許第5,395,922号；同5,795,746号；同5,162,498号及び国際公開第98/32867号に開示されているものである。好ましくは、プロペプチドは、Ｃ末端にエンドペプチダーゼプロセシング部位、例えばＬｙｓ-Ａｒｇ配列又はその任意の機能的類似体を含む。
【００３３】
「糖尿病」なる用語には、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症を引き起こす他の状態が含まれる。
疾患の「治療」なる用語には、疾患の治療、予防又は緩和が含まれる。
本発明の一実施態様では、インスリンアナログは特に経口投与に適している。
【００３４】
疎水性アミノ酸は、ここでは、自然に生じるアミノ酸(括弧内に三文字及び一文字略語を記載)トリプトファン(Ｔｒｐ、Ｗ)、フェニルアラニン(Ｐｈｅ、Ｆ)、バリン(Ｖａｌ、Ｖ)、イソロイシン(Ｉｌｅ、Ｉ)、ロイシン(Ｌｅｕ、Ｌ)及びチロシン(Ｔｙｒ、Ｙ)と理解される。
親水性アミノ酸は、ここでは、上述の疎水性アミノ酸ではない天然アミノ酸であると理解される。一実施態様では、本発明の親水性の酸は、グルタミン酸(Ｇｌｕ、Ｅ)、アスパラギン酸(Ａｓｐ、Ｄ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ、Ｈ)、グルタミン(Ｇｌｎ、Ｑ)、アスパラギン(Ａｓｎ、Ｎ)、セリン(Ｓｅｒ、Ｓ)、スレオニン(Ｔｈｒ、Ｔ)、プロリン(Ｐｒｏ、Ｐ)、グリシン(Ｇｌｙ、Ｇ)、リジン(Ｌｙｓ、Ｋ)及びアルギニン(Ａｒｇ、Ｒ)からなる群から選択される。さらなる実施態様では、本発明の親水性アミノ酸は、グルタミン酸(Ｇｌｕ、Ｅ)、アスパラギン酸(Ａｓｐ、Ｄ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ、Ｈ)、グルタミン(Ｇｌｎ、Ｑ)、アスパラギン(Ａｓｎ、Ｎ)、リジン(Ｌｙｓ、Ｋ)及びアルギニン(Ａｒｇ、Ｒ)からなる群から選択される。
【００３５】
ここで、本発明の「インスリン」は、ヒトインスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体と理解される。
ここで使用される「親インスリン」なる用語は、本発明のあらゆる変異がなされる前のインスリンを意味するものである。親インスリンの非限定的な例は、野生型インスリン、例えばヒトインスリン又はブタインスリン、ヒトインスリンのアナログ、又はヒトインスリン又はインスリンアナログの誘導体、例えばペグ化又はアシル化されたヒトインスリン又はインスリンアナログである。
【００３６】
一実施態様では、本発明の親インスリンは、
ヒトインスリン、
Ｂ２８位にあるアミノ酸残基がＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、Ｂ２９位にあるアミノ酸残基がＬｙｓ又はＰｒｏであり、場合によってはＢ３０位にあるアミノ酸残基が欠失しているヒトインスリンのインスリンアナログ、
ｄｅｓ(Ｂ２８-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７)ヒトインスリン、又はｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンであるインスリンアナログ、
Ｂ３位にあるアミノ酸残基がＬｙｓであり、Ｂ２９位にあるアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐである、ヒトインスリンのインスリンアナログ、
Ａ２１位にあるアミノ酸残基がＧｌｙであり、２つのアルギニン残基でＣ末端がさらに伸長している、ヒトインスリンのインスリンアナログ、
Ｂ３０位のアミノ酸残基がスレオニンメチルエステルで置換されているインスリン誘導体、
ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンのＢ２９位にあるリジンのＮε位にテトラデカノイル鎖が結合したインスリン誘導体、
からなる群から選択される。
【００３７】
一実施態様では、本発明の親インスリンは、
ヒトインスリン；
ＤｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
ＡｓｐＢ２８ ヒトインスリン;
ＡｓｐＢ２８、ＤｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９ ヒトインスリン;
ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９ ヒトインスリン;
ＧｌｙＡ２１、ＡｒｇＢ３１、ＡｒｇＢ３２ ヒトインスリン;及び
ＤｅｓＢ３０、ＡｒｇＢ３１、ＡｒｇＢ３２ ヒトインスリン
からなる群から選択される。
【００３８】
ここで使用される「インスリンアナログ」なる用語は、インスリンの一又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がインスリンから欠失しており、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がインスリンに付加されている、修飾されたインスリンを意味している。
一実施態様では、インスリンアナログは、親インスリンに対して８未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一実施態様では、インスリンアナログは、親インスリンに対して７未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一実施態様では、インスリンアナログは、親インスリンに対して６未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。他の実施態様では、インスリンアナログは、親インスリンに対して５未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。他の実施態様では、インスリンアナログは、親インスリンに対して４未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。他の実施態様では、インスリンアナログは、親インスリンに対して３未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。他の実施態様では、インスリンアナログは、親インスリンに対して２未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。
【００３９】
ここで使用される「インスリン誘導体」なる用語は、少なくとも一の置換基が親タンパク質又はそのアナログに存在しない化学的に修飾された親インスリン又はそのアナログ、すなわち親タンパク質は共有的に修飾されているものを意味する。典型的な修飾は、アミド類、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化等である。本発明のヒトインスリン誘導体の例は、スレオニンメチルエステル-Ｂ３０ヒトインスリン、Ｎε-Ｂ２９-テトラデカノイルｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎε-Ｂ２９-テトラデカノイルＧｌｎＢ３ ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン)、Ｎε-Ｂ２９-トリデカノイルヒトインスリン、Ｎε-Ｂ２９-テトラデカノイルヒトインスリン、Ｎε-Ｂ２９-デカノイルヒトインスリン及びＮε-Ｂ２９-ドデカノイルヒトインスリンである。
【００４０】
ここで使用される「ヒトインスリン」なる用語は、その構造及び特性がよく知られているヒトホルモンを意味する。ヒトインスリンは、システイン残基の間のジスルフィド架橋により結合した２つのポリペプチド鎖、すなわちＡ鎖及びＢ鎖を有する。Ａ鎖は２１のアミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は３０のアミノ酸のペプチドであり、２つの鎖は３つのジスルフィド架橋で結合しており、第１の架橋はＡ鎖の６及び１１位にあるシステインの間、第２の架橋はＡ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、第３の架橋はＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインの間にある。
【００４１】
インスリン分子における変異は、鎖(Ａ又はＢ)、位置、天然アミノ酸を置換するアミノ酸の３文字コードを提示することで示される。「ｄｅｓＢ３０」とは、Ｂ３０アミノ酸を欠く、天然インスリンＢ鎖又はそのアナログを意味する。よって、Ａ２１Ｇｌｙ、Ｂ２８Ａｓｐ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは、Ａ鎖の２１位がグリシンに変異され、Ｂ鎖の２８位がアスパラギン酸に変異され、Ｂ鎖の３０位が欠失されているヒトインスリンのアナログである。
【００４２】
「プロテアーゼ」又は「プロテアーゼ酵素」は、タンパク質及びペプチドを分解し、ヒトの体の様々な組織、例えば胃(ペプシン)、腸内腔(キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ等)、又はＧＩ管の粘膜表面(アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ等)、肝臓(インスリン分解酵素、カテプシン等)、及び他の組織に見出される消化酵素である。
【００４３】
ここでタンパク質分解的に安定したインスリンアナログとは、ヒトインスリンよりも、一又は複数のプロテアーゼによる分解が遅いインスリンアナログであると理解される。一実施態様では、本発明のタンパク質分解的に安定したインスリンアナログは、親インスリンよりも、一又は複数のプロテアーゼによる分解が遅い。本発明のさらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ペプシン(例えば、イソ型のペプシンＡ、ペプシンＢ、ペプシンＣ及び／又はペプシンＦ)、キモトリプシン(例えば、イソ型のキモトリプシンＡ、キモトリプシンＢ及び／又はキモトリプシンＣ)、トリプシン、インスリン分解酵素(ＩＤＥ)、エラスターゼ(例えば、イソ型の膵エラスターゼＩ及び／又はＩＩ)、カルボキシペプチダーゼ(例えば、イソ型のカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＡ２、及び／又はカルボキシペプチダーゼＢ)、アミノペプチダーゼ、カテプシンＤ、及びラット、ブタ又はヒトから誘導される腸抽出物に存在する他の酵素からなる群から選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している。
【００４４】
一実施態様では、本発明のインスリンアナログは、キモトリプシン、トリプシン、インスリン分解酵素(ＩＤＥ)、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びカテプシンＤからなる群から選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ及びＩＤＥからなる群から選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼから選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している。
【００４５】
Ｔ1/2は、キモトリプシン、ペプシン及び／又はカルボキシペプチダーゼＡ等のプロテアーゼ酵素に対する、本発明のインスリンアナログのタンパク質分解安定性の尺度として実施例に記載されているようにして決定することができる。本発明の一実施態様では、Ｔ1/2はヒトインスリンに対して増加している。さらなる実施態様では、Ｔ1/2は親インスリンに対して増加している。さらなる実施態様では、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも２倍に増加している。さらなる実施態様では、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも３倍に増加している。さらなる実施態様では、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも４倍に増加している。さらなる実施態様では、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも５倍に増加している。さらなる実施態様では、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも１０倍に増加している。
【００４６】
プロテアーゼ切断部位(ここでは、プロテアーゼ部位とも記載する)は、プロテアーゼにより認識されるアミノ酸残基、及び／又はそのペプチド結合がプロテアーゼにより切断されるアミノ酸残基であると理解される。プロテアーゼ切断部位は、ＨＰＬＣ、ＭＳ又はＬＣ-ＭＳ分析により切断「ホットスポット」を決定するか、及び／又はプロテアーゼ切断部位が決定されるプロテアーゼ酵素の酵素特異性に基づいた予測により、決定することができる。当業者であれば、例えば、Handbook of Proteolytical Enzymes, 第2版, Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woesner, J.F編, Elsevier Academic Press 2004に記載されているように、酵素特異性に基いてプロテアーゼ切断部位を如何にして決定するかは分かるであろう。例えばキモトリプシンは、Ｐｒｏが続かない、芳香族残基(Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＬｅｕ)のＣ末端でペプチド結合を切断すると予測される。同様に、トリプシンは、Ｐｒｏが続かない塩基性残基Ｌｙｓ又はＡｒｇのＣ末端でペプチド結合を切断すると予想され、エラスターゼは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ又はＳｅｒのＣ末端で残基を切断すると予想され、カルボキシペプチダーゼＡは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＰｒｏではなく、任意のＣ末端アミノ酸を除去するであろう。インスリン分解酵素（ＩＤＥ）は、ヒトインスリンのＢ９−１０、Ｂ１０−１１、Ｂ１３−１４、Ｂ１４−１５、Ｂ２４−２５、Ｂ２５−２６、Ａ１３−１４及びＡ１４−１５位を切断すると予想される。
【００４７】
プロテアーゼ切断部位の「内部又はこれに近接した」アミノ酸を置換するなる用語は、プロテアーゼ切断部位であることが決定された親インスリンの位置の内部又はこれに近接したアミノ酸の置換を示すために使用される。一実施態様では、インスリン上の２以上のプロテアーゼ部位の内部又はこれに隣接した２以上の疎水性アミノ酸が置換され、ここで、該疎水性アミノ酸は親水性アミノ酸で置換される。さらなる実施態様では、インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位の内部の２以上の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換される。さらなる実施態様では、インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位の隣に位置する２以上の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換される。またさらなる実施態様では、インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位から２つのアミノ酸分離れて位置する２以上の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換される。さらなる実施態様では、インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位から３つのアミノ酸分離れて位置する２以上の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換される。さらなる実施態様では、インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位から４つのアミノ酸分離れて位置する２以上の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換される。さらなる実施態様では、インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位の内部又はこれから１、２又は３つのアミノ酸分離れて位置する２以上の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換される。さらなる実施態様では、インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位の内部又はこれから１又は２つのアミノ酸分離れて位置する２以上の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換される。さらなる実施態様では、インスリンにおける２以上のプロテアーゼ部位の内部又は隣に位置する２以上の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換される。
【００４８】
本発明のインスリンアナログは、親インスリンの正味電荷とは異なる正味電荷を有していてもよい。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの正味電荷は、親インスリンの正味電荷よりもさらに正である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの正味電荷は、親インスリンの正味電荷よりもさらに負である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の正の正味電荷は、水溶液で測定して０．５〜５である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の正の正味電荷は１〜５である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の正の正味電荷は１〜４である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の正の正味電荷は１〜３である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の正の正味電荷は２又は３である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の負の正味電荷は、水溶液で測定して−０．５〜−５である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の負の正味電荷は−１〜−５である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の負の正味電荷は−１〜−４である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の負の正味電荷は−１〜−３である。一実施態様では、本発明のインスリンアナログの平均の負の正味電荷は−２又は−３である。
【００４９】
一実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ３−９で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ４−８．５で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ４−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ４．５−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ５−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ５．５−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ６−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。
一実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ２−４で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。
【００５０】
一実施態様では、本発明のインスリンアナログは、親インスリンよりも増加した溶解度を有するものであってもよい。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ３−９で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ４−８．５で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ４−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ４．５−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ５−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ５．５−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ６−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。
一実施態様では、本発明のインスリンアナログは、ｐＨ２−４で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。
【００５１】
「与えられたｐＨで増加した溶解度」とは、ヒトインスリン又は親インスリン等の比較されるインスリンに対して、高濃度の本発明のインスリンアナログが、溶液のｐＨで水又はバッファー溶液に溶解していることを意味する。溶液に含まれるインスリンが溶解しているかどうかを測定する方法は当該分野で知られている。
一実施態様では、溶液を３００００ｇで２０分、遠心分離にかけ、ついで上清のインスリン濃度をＲＰ-ＨＰＬＣにより測定することができる。この濃度が、組成物を作製するために元々使用されるインスリン濃度に実験誤差の範囲内で等しいならば、インスリンは本発明の組成物に十分に可溶性である。
他の実施態様では、本発明の組成物におけるインスリンの溶解度は、組成物を収容する容器を、単に眼で観察することにより測定することができる。溶液が、目で見て透明であり、粒子状物質が懸濁していないか、又は容器の側面／底に沈殿していないならば、インスリンは可溶性である。
【００５２】
本発明のインスリンアナログは、測定時に比較して、親インスリンよりも増加した効能及び生物学的利用能を有している。
インスリンの効能又は生物学的利用能を測定するための標準的なアッセイは、当業者に知られており、とりわけ(１)インスリンの相対的効力が、ラットの肝臓細胞膜分画等の細胞膜に存在するインスリンレセプターに特異的に結合する１２５Ｉ-インスリンの５０％が置き換えられるのに必要なインスリンアナログに対するインスリンの比率として定義されるインスリンラジオレセプターアッセイ；(２)インスリンの相対的有効性が、有機抽出可能物(例えば脂質)への[３-３Ｈ]グルコースの最大転換率が５０％に達するのに必要なインスリンアナログに対するインスリンの比率として定義される、ラット脂肪細胞などを用いて実施される脂質生合成アッセイ；(３)インスリンアナログの相対的効力が、グルコース-１-[１４Ｃ]の[１４ＣＯ２]への最大転換率が５０％に達するためのインスリンアナログに対するインスリンの比率として定義される、単離脂肪細胞におけるグルコース酸化アッセイ；(４)特異的抗インスリン抗体への結合についてインスリン又はインスリンアナログが１２５Ｉ-インスリンと競合する効果を測定する、インスリンアナログの免疫原性を測定可能なインスリンラジオイムノアッセイ；及び(５)特異的インスリン抗体を有するＥＬＩＳＡアッセイ等の動物の血漿サンプルにおける抗体へのインスリン又はインスリンアナログの結合性を測定する他のアッセイが含まれる。
【００５３】
本発明のインスリンアナログは、場合によっては、一又は複数の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸でさらに置換されていてもよいさらなるプロテアーゼ部位について分析されてもよい。本発明のインスリンアナログは、親インスリン、第１の修飾されたインスリンと比較して、プロテアーゼ部位に少なくとも２の親水性酸を有し、少なくとも一の疎水性アミノ酸は少なくとも一の親水性アミノ酸で置換されている第１の修飾されたインスリンの新規プロテアーゼ部位に少なくとも一のアミノ酸置換を有するインスリンアナログであってよい。
【００５４】
一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端が３−１５のアミノ酸でＡ鎖のＮ末端に結合しているインスリンアナログが提供される。このようなインスリンアナログは、ここでは「単鎖インスリン」又は「ＳＣＩ」と称され、一般構造Ｂ-Ｃ-Ａを有するもので、ここでＢはヒトインスリンＢ鎖又はそのアナログ又は誘導体であり、ＡはヒトインスリンＡ鎖又はアナログ又は誘導体であり、Ｃは、通常Ａ１とＢ３０を結合させる３−１５のアミノ酸の連結ペプチド鎖である。Ｂ鎖がｄｅｓＢ３０鎖である場合、連結ペプチドはＡ１とＢ２９を結合させるであろう。該単鎖インスリンは、ヒトインスリンの場合におけるように、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７との間、及びＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９との間に存在する正確に位置するジスルフィド架橋(３)と、ＣｙｓＡ６及びＣｙｓＡ１１との間の内部ジスルフィド架橋を含むであろう。一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端が３−７のアミノ酸でＡ鎖のＮ末端に結合しているインスリンアナログが提供される。
【００５５】
また本発明は、請求項記載のインスリンアナログをコードする核酸配列にも関する。さらなる実施態様では、本発明は、かかる核酸配列を含むベクター、及びかかる核酸配列又はベクターを含む宿主細胞に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、(ｉ)インスリン前駆体をコードする核酸配列を含む宿主細胞を培養し；(ｉｉ)培養培地からインスリン前駆体を単離し、及び(ｉｉｉ)インビトロ酵素的転換により、インスリン前駆体を本発明のインスリンアナログに転換させることを含む、インスリンアナログの製造方法に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、(ｉ)インスリン前駆体をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養し；(ｉｉ)培養培地からインスリン前駆体を単離し、及び(ｉｉｉ)インスリン前駆体を本発明のインスリンアナログに転換させることを含む、インスリンアナログの製造方法に関する。
本発明の一実施態様では、宿主細胞は酵母宿主細胞であり、さらなる実施態様では、酵母宿主細胞はサッカロミセス属から選択される。さらなる実施態様では、酵母宿主細胞は出芽酵母から選択される。
【００５６】
ここで使用される「インスリンアナログ」とは、天然に生じるインスリン中に生じる少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失及び／又は置換することにより、及び／又は少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリンの一次構造から誘導されるポリペプチドを意味する。付加された及び／又は置換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じるアミノ酸残基の何れかとすることができる。
本発明のインスリンアナログは、一又は複数の位置で変異したヒトインスリン又はそのアナログであってよい。一実施態様では、インスリンアナログは、同定されたプロテアーゼ切断部位をベースにしたプロテアーゼに対する安定性が高められるように設計されている。
【００５７】
一実施態様では、変異を受ける少なくとも一の切断部位は、ヒトインスリンのＢ２-３、Ｂ６-７、Ｂ９-１０、Ｂ１０-１１、Ｂ１３-１４、Ｂ１４-１５、Ｂ１６-１７、Ｂ２２-２３、Ｂ２４-２５、Ｂ２５-２６、Ａ１３-１４、Ａ１４-１５及びＡ１９-２０からなる群から選択される位置に存在する。
一実施態様では、変異を受ける少なくとも一の切断部位は、ヒトインスリンのＢ２-３、Ｂ６-７、Ｂ１６-１７、Ｂ２２-２３、Ｂ２４-２５及び／又はＡ１９-２０からなる群から選択される位置に存在する。
一実施態様では、変異を受ける少なくとも一の切断部位は、Ｂ２２-２３の位置に存在する。
一実施態様では、変異を受ける少なくとも一の切断部位は、Ｂ９-１０、Ｂ１０-１１、Ｂ１３-１４、Ｂ１４-１５、Ｂ２４-２５、Ｂ２５-２６、Ａ１３-１４、Ａ１４-１５からなる群から選択される位置に存在する。
【００５８】
一実施態様では、変異を受ける切断部位は、ヒトインスリンのＢ２-３、Ｂ６-７、Ｂ９-１０、Ｂ１０-１１、Ｂ１３-１４、Ｂ１４-１５、Ｂ１６-１７、Ｂ２２-２３、Ｂ２４-２５、Ｂ２５-２６、Ａ１３-１４、Ａ１４-１５及びＡ１９-２０からなる群から選択される２以上の位置に存在する。
一実施態様では、変異を受ける切断部位は、ヒトインスリンのＢ２-３、Ｂ６-７、Ｂ１６-１７、Ｂ２２-２３、Ｂ２４-２５及び／又はＡ１９-２０からなる群から選択される２以上の位置に存在する。
一実施態様では、変異を受ける切断部位は、Ｂ９-１０、Ｂ１０-１１、Ｂ１３-１４、Ｂ１４-１５、Ｂ２４-２５、Ｂ２５-２６、Ａ１３-１４、Ａ１４-１５からなる群から選択される２以上の位置に存在する。
【００５９】
一実施態様では、親インスリンに対して、インスリンアナログのＡ鎖が少なくとも一の変異を含み、インスリンアナログのＢ鎖が少なくとも一の変異を有し、Ａ鎖における少なくとも一の変異が、Ａ１３-１４、Ａ１４-１５及びＡ１９-２０からなる群から選択される一又は複数の切断部位に存在し、Ｂ鎖における少なくとも一の変異が、Ｂ２-３、Ｂ６-７、Ｂ９-１０、Ｂ１０-１１、Ｂ１３-１４、Ｂ１４-１５、Ｂ１６-１７、Ｂ２２-２３、Ｂ２４-２５及びＢ２５-２６からなる群から選択される一又は複数の切断部位に存在する、本発明のインスリンアナログが得られる。
【００６０】
一実施態様では、親インスリンに対して、インスリンアナログのＡ鎖が一の変異を含み、インスリンアナログのＢ鎖が少なくとも一の変異を有し、Ａ鎖における一の変異が切断部位Ａ１９-２０に存在し、Ｂ鎖における少なくとも一の変異が、Ｂ２-３、Ｂ６-７、Ｂ１６-１７、Ｂ２２-２３及びＢ２４-２５からなる群から選択される一又は複数の切断部位に存在する、本発明のインスリンアナログが得られる。
【００６１】
一実施態様では、親インスリンに対して、インスリンアナログのＡ鎖が少なくとも一の変異を含み、インスリンアナログのＢ鎖が少なくとも一の変異を有し、Ａ鎖における少なくとも一の変異が、Ａ１３-１４及びＡ１４-１５からなる群から選択される一又は複数の切断部位に存在し、Ｂ鎖における少なくとも一の変異が、Ｂ９-１０、Ｂ１０-１１、Ｂ１３-１４、Ｂ１４-１５、Ｂ２４-２５及びＢ２５-２６からなる群から選択される一又は複数の切断部位に存在する、本発明のインスリンアナログが得られる。
【００６２】
置換に適したアミノ酸残基は、切断部位を除去する目的で選択される。一実施態様では、アミノ酸は、溶解度を増加させるさらなる目的で選択される。さらなる実施態様では、溶解度の増加は３-９の範囲のｐＨに存在する。さらなる実施態様では、溶解度の増加は４-８の範囲のｐＨに存在する。インスリン又はインスリンアナログは、任意の天然アミノ酸により、一又は複数の位置で置換されてよく、又は任意の天然アミノ酸が親インスリン又は親インスリンアナログに付加されてもよい。便宜上、以下、丸括弧中の通常の３文字コード及び１文字コードを有するコード可能な天然のアミノ酸の名称である：グリシン(Ｇｌｙ及びＧ)、プロリン(Ｐｒｏ及びＰ)、アラニン(Ａｌａ及びＡ)、バリン(Ｖａｌ及びＶ)、ロイシン(Ｌｅｕ及びＬ)、イソロイシン(Ｉｌｅ及びＩ)、メチオニン(Ｍｅｔ及びＭ)、システイン(Ｃｙｓ及びＣ)、フェニルアラニン(Ｐｈｅ及びＦ)、チロシン(Ｔｙｒ及びＹ)、トリプトファン(Ｔｒｐ及びＷ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ及びＨ)、リジン(Ｌｙｓ及びＫ)、アルギニン(Ａｒｇ及びＲ)、グルタミン(Ｇｌｎ及びＱ)、アスパラギン(Ａｓｎ及びＮ)、グルタミン酸(Ｇｌｕ及びＥ)、アスパラギン酸(Ａｓｐ及びＤ)、セリン(Ｓｅｒ及びＳ)及びスレオニン(Ｔｈｒ及びＴ)。もし、入力ミスが原因であるならば、通常使用されているコードから派生しており、通常使用されるコードが適用される。この発明のインスリンに存在するアミノ酸は、好ましくは核酸によりコード可能なアミノ酸である。一実施態様では、インスリン又はインスリン誘導体は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及び／又はＰｒｏで置換されており、及び／又はＧｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及び／又はＰｒｏが、インスリン又はインスリンアナログに付加されている。一実施態様では、インスリン又はインスリンアナログは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及び／又はＡｒｇで置換されており、及び／又はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及び／又はＡｒｇが、インスリン又はインスリンアナログに付加されている。
【００６３】
インスリンアナログは、Ａ１４位にある天然Ｔｙｒの、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓへの置換と組合せて、Ｂ鎖の２５位が天然Ｐｈｅ残基からＨｉｓへ修飾されていてもよい。一又は複数の付加的な変異にはｄｅｓＢ３０が含まれてよく、インスリンアナログはＡ鎖及び／又はＢ鎖のＮ末端伸長又はＣ末端伸長、例えばＧＧＰ、ＧＧＰＰ、ＧＰ又はＧＰＰを用いたインスリンアナログのＡ鎖及び／又はＢ鎖のＮ末端伸長により、さらに修飾することができる。さらなる具体例には、限定されるものではないが、付加的な変異が含まれ、ここで１又は２のＰｒｏ残基はＡ０及び／又はＢ０位に付加されてよく、ＬｅｕはＢ３１に付加されてよく、及び／又はＧｌｕはＢ３２位に付加されてよい。一又は複数の付加的な変異は、Ａ８位のＨｉｓへ、Ａ２１位のＧｌｙへ、Ｂ１位のＧｌｕ又はＧｌｎへ、Ｂ１６位のＧｌｕへ、Ｂ２６位のＡｓｐへ、Ｂ２７位のＧｌｕへ、及び／又はＢ２８位のＡｓｐへの修飾から選択されうる。
【００６４】
一実施態様では、本発明のインスリンアナログは、
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２８Ｄ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２６Ｄ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２８Ｄ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｄ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ(−１)Ｐ、Ａ(０)Ｐ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ(−１)Ｐ、Ｂ(０)Ｐ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ(−１)Ｐ、Ａ(０)Ｐ、Ａ１４Ｅ、Ｂ(−１)Ｐ、Ｂ(０)Ｐ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ３０T, Ｂ３１L, Ｂ３２E ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１０Ｐ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１０Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｈ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｈ、Ｂ１０Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１０Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ａ１８Ｑ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２４Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１０Ｄ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１０Ｄ、Ｂ２５Ｈ-アミド、ｄｅｓＢ２６、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２６、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ-アミド、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２７Ｇ、Ｂ２８Ｇ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２６、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ａ１８Ｑ、Ａ２１Ｑ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ａ１８Ｑ、Ａ２１Ｑ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ａ１８Ｑ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｎ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｎ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ(−２)Ｇ、Ａ(−１)Ｐ、Ａ(０)Ｐ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ(−２)Ｇ、Ｂ(−１)Ｐ、Ｂ(０)Ｐ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ(−２)Ｇ、Ａ(−１)Ｐ、Ａ(０)Ｐ、Ａ１４Ｅ、Ｂ(−２)Ｇ、Ｂ(−１)Ｐ、Ｂ(０)Ｐ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｄ、Ｂ２９Ｋ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｄ、Ｂ２９Ｋ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２６Ｔ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｄ、Ｂ２９Ｋ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ａ１８Ｋ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、ｄｅｓＢ１、ｄｅｓＢ２、ｄｅｓＢ３, Ｂ２５Ｈ-アミド、ｄｅｓＢ２６、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、ｄｅｓＢ１、ｄｅｓＢ２、ｄｅｓＢ３, Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、ｄｅｓＢ１、ｄｅｓＢ２、ｄｅｓＢ３, Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｒ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｒ、ｄｅｓＢ２８-Ｂ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｈ、ｄｅｓＢ２８-Ｂ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ２８-Ｂ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｋ、ｄｅｓＢ２８-Ｂ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２７Ｋ、ｄｅｓＢ２８-Ｂ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ａ１８Ｑ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｅ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１２Ｅ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１５Ｅ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１２Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１５Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２７、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２６Ｄ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
ＥＥＡＥＡＥＡＰＫ-Ｂ(１-２９)-Ｂ２５Ｈ-ＡＡＫ-Ａ(１-２１)-Ａ１４Ｅ ヒトインスリン;
ＥＥＡＥＰＫ-Ｂ(１-２９)-Ｂ２５Ｈ-ＤＧＫ-Ａ(１-２１)-Ａ１４Ｅ ヒトインスリン;
Ｂ(１-２９)-Ｂ２５Ｈ-ＡＡＫ-Ａ(１-２１)-Ａ１４Ｅ ヒトインスリン;
Ｂ(１-２９)-Ｂ１Ｅ、Ｂ２５Ｈ-ＡＡＫ-Ａ(１-２１)-Ａ１４Ｅ ヒトインスリン;
Ｂ(１-２９)-Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７E-ＡＡＫ-Ａ(１-２１)-Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ ヒトインスリン;
Ｂ(１-２９)-Ｂ１Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７E-ＡＡＫ-Ａ(１-２１).Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ ヒトインスリン;
ＥＥＡＥＡＥＡＰＫ-Ｂ(１-２９)-Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ-ＡＡＫ-Ａ(１-２１)-Ａ８H. Ａ１４Ｅ ヒトインスリン;
Ｂ(１-２９)-Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＧＧＱ-Ａ(１-２１)-Ａ１４Ｅ ヒトインスリン
Ｂ(１-２９)-Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＧＧＱ-Ａ(１-２１)-Ａ１４Ｅ ヒトインスリン
Ｂ(１-２９)-Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＧＧＱ-Ａ(１-２１)-Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ ヒトインスリン
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｒ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｎ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｄ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｑ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｇ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｋ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｐ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｓ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｔ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｒ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｎ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｄ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｑ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｅ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｇ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｋ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｐ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｓ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１３Ｔ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｄ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｑ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｒ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｎ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｄ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｑ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｇ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ１４Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン;
Ａ８Ｈ、Ｂ１０Ｄ、Ｂ２５Ｈ ヒトインスリン; 及び
Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１０Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン
からなる群から選択される。
【００６５】
インスリンは膵臓のβ細胞から分泌されるポリペプチドホルモンであり、２つの鎖間ジスルフィド架橋により結合している２つのポリペプチド鎖Ａ及びＢからなる。さらに、Ａ鎖は一つのジスルフィド架橋により特徴付けられる。
ホルモンは、プレペプチド-Ｂ-Ａｒｇ Ａｒｇ-Ｃ-Ｌｙｓ Ａｒｇ-Ａ（ここで、Ｃは、３１のアミノ酸の連結ペプチドである）なる配置で、２４のアミノ酸のプレペプチドに８６のアミノ酸を含むプロインスリンが続いてなる単鎖前駆体プロインスリン(プレプロインスリン)として合成される。Ａｒｇ-Ａｒｇ及びＬｙｓ-Ａｒｇは、Ａ及びＢ鎖から連結ペプチドを切断するための切断部位である。
【００６６】
微生物中でのヒトインスリンの生産には３つの主要な方法が使用される。２つは、細胞質における大きな融合タンパク質の発現(Frankら (1981) Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross編), Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. pp 729-739)、又は細胞膜周辺腔へ分泌させるためのシグナルペプチドの使用(Chanら (1981) PNAS 78:5401-5404)を伴う大腸菌に関与する。第３の方法は、培地中にインスリン前駆体を分泌させるために出芽酵母を利用するものである(Thimら (1986) PNAS 83:6766-6770)。従来技術には、大腸菌又は出芽酵母のいずれかかで発現する多くのインスリン前駆体が開示されている。米国特許第5,962,267号、国際公開第95/16708号、欧州特許第0055945号、欧州特許第0163529号、欧州特許第0347845号、及び欧州特許第0741188号を参照のこと。
【００６７】
インスリンアナログは、例えば米国特許第6500645号に開示されているようなよく知られている技術により、適切な宿主細胞中で、当該インスリンアナログをコードするＤＮＡ配列を発現させることにより生成される。インスリンアナログは、直接、又はＢ鎖にＮ末端伸長を有する前駆分子として発現される。このＮ末端伸長は、直接発現される産物の収率を増加させる機能を有している場合があり、１５アミノ酸残基長までのものであってもよい。Ｎ末端伸長は培養ブロスからの単離後にインビトロで切断されることになり、よってＢ１の隣に切断部位を有する。本発明に適したタイプのＮ末端伸長は、米国特許第5,395,922号及び欧州特許第765,395A号に開示されている。
【００６８】
単離されたインスリンアナログは、よく知られているアシル化法により、所望の位置でアシル化でき、かかるインスリンアナログの例は、例えば公開番号EP214826、EP375437及びEP383472を有する欧州特許出願に記載されている。
【００６９】
各インスリンアナログポリペプチドをコードする核酸配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucageら (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869により記載されているホスホアミダイト法、又はMatthesら (1984) EMBO Journal 3:801-805により記載されている方法により、合成的に調製することができる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、二本鎖にされ、ライゲーションされて、合成ＤＮＡコンストラクトが形成される。ＤＮＡコンストラクトを調製する現在の好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)による。
【００７０】
また、核酸配列は、混合ゲノム、ｃＤＮＡ、及び合成由来のものであってよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列を、Ａ鎖及びＢ鎖をコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列に結合させた後、よく知られた手順に従って相同組換えのために所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入し、又は好ましくは適当なオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって所望の配列を生産することによって、ＤＮＡ配列を修飾してもよい。
【００７１】
選択された微生物又は宿主細胞中で複製可能であり、当該インスリンアナログポリペプチドをコードする核酸配列を担持する組換えベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクターで、その複製が染色体複製とは独立しているもの、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でありうる。ベクターは自己複製を保証する任意の手段を含みうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。さらに、単一のベクター又はプラスミド、又は宿主細胞のゲノムに導入されることになる全ＤＮＡを併せて含む２つ又はそれ以上のベクター又はプラスミド、あるいはトランスポゾンが使用されてもよい。ベクターは直鎖又は閉環状プラスミドであってよく、宿主細胞のゲノム中へのベクターの安定した組込み、又はゲノムとは独立した細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメント(群)を好ましくは含む。
一実施態様では、組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。ベクターを酵母中で複製させることができる配列の例は、酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製起点である。
【００７２】
ベクターは、形質転換細胞の選択を容易にする一又は複数の選択可能マーカーを含みうる。選択可能マーカーは、その産物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属、原栄養体、独立栄養体等に対する耐性を提供する遺伝子である。細菌性選択可能マーカーの例は、枯草菌又はバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のｄａｌ遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を付与するマーカーである。糸状菌宿主細胞における使用に適切なマーカーには、ａｍｄＳ(アセタミダーゼ)、ａｒｇＢ(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、ｐｙｒＧ(オロチジン-５'-ホスファートデカルボキシラーゼ)及びｔｒｐＣ(アントラニル酸シンターゼ)が含まれる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。酵母によく適した選択可能マーカーは分裂酵母ＴＰＩ遺伝子(Russell (1985) Gene 40:125-130)である。
【００７３】
ベクター中において、核酸配列は適切なプロモーター配列に作用可能に結合している。プロモーターは、変異、切断、及びハイブリッドプロモーターを含む選択宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞に相同か又は異種性である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００７４】
細菌宿主細胞において転写を行わせるのに適切なプロモーターの例は、大腸菌ｌａｃオペロン、ストレプトマイセス・セリカラーアガラーゼ(agarase)遺伝子(ｄａｇＡ)、枯草菌レバンスクラーゼ(levansucrase)遺伝子(ｓａｃＢ)、バチルス・リケニホルミスアルファ-アミラーゼ遺伝子(ａｍｙＬ)、バチルス・ステアロサーモフィル(Bacillus stearothermophilus)スマルトゲンアミラーゼ遺伝子(ａｍｙＭ)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)アルファ-アミラーゼ遺伝子(ａｍｙＱ)、バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子(ｐｅｎＰ)から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞において転写を行わせるのに適切なプロモーターの例は、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロコウジカビ天然アルファ-アミラーゼ、及びクロコウジカビ酸安定性アルファ-アミラーゼから得られるプロモーターである。酵母宿主では、有用なプロモーターは、出芽酵母Ｍａ１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
核酸コンストラクトは典型的には適切なターミネーターに作用可能に連結される。酵母において、適切なターミネーターはＴＰＩターミネーター(Alberら(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)である。
【００７５】
所望のインスリンアナログポリペプチドをコードするＤＮＡ、プロモーター及びターミネーター等、発現ベクターに含有される個々の核酸配列をそれぞれライゲーションし、選択宿主での複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている。ベクターは、まず本発明のインスリンアナログポリペプチドをコードする全ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを調製し、続いて適切な発現ベクターにこの断片を挿入するか、又は個々のエレメント(例えば、シグナル、プロ-ペプチド、連結ペプチド、Ａ及びＢ鎖)についての遺伝的情報を含むＤＮＡ断片を挿入し、続いてライゲーションすることにより構築されうることが理解されるであろう。
【００７６】
このような核酸配列を含むベクターを、先に記載したようにして、ベクターが染色体組込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入する。「宿主細胞」なる用語は、複製中に生じる変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞は、単細胞生物、例えば原核生物、又は非単細胞生物、例えば真核生物であってよい。有用な単細胞は細菌細胞、例えば限定されるものではないが、バチルス細胞、ストレプトマイセス細胞を含むグラム陽性菌、又はグラム陰性菌、例えば大腸菌及びシュードモナス属である。真核細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞であってよい。好ましい実施態様では、宿主細胞は酵母細胞である。本発明の方法に使用される酵母生物は、培養で多量の本発明の単鎖インスリンを生産する任意の適切な酵母生物でありうる。適切な酵母生物の例は、酵母種出芽酵母、サッカロマイセス・クルイベリ(kluyveri)、分裂酵母、サッカロマイセス・ウバルム(uvarum)、クルイベロマイセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・クルイベリ、ヤロウイア・リポリティカ(lipolytica)、カンジダ種、トルラ酵母、カンジダ・カカオイ(cacaoi)、ゲオトリクム種、及びゲオトリクム・フェルメンタンス(fermentans)から選択される株である。
【００７７】
酵母細胞の形質転換は、例えば原形質形成と続く形質転換によりそれ自体知られている方式でなされうる。細胞を培養するのに使用される培地は酵母生物を増殖させるのに適した任意の一般的な培地であり得る。分泌されるインスリンアナログポリペプチドは、その有意な割合が正しくプロセシングされた形態で培地中に存在するが、遠心分離、濾過による培地からの酵母細胞の分離、又はイオン交換マトリックス又は逆相吸収マトリックスによるインスリン前駆体の捕捉、例えば硫酸アンモニウムのような塩による上清又は濾液のタンパク質性成分の沈殿と、続く例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のような様々なクロマトグラフィー法による精製を含む、一般的な手順により培地から回収されうる。
【００７８】
製薬用組成物
本発明の他の目的は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する本発明のインスリンアナログを含有する製薬用製剤を提供することにあり、ここで該製剤は、２．０〜１０．０のｐＨを有する。製剤は、プロテアーゼインヒビター(類)、バッファー系、保存料(類)、等張化剤(類)、キレート剤(類)、安定剤及び界面活性剤をさらに含有してよい。本発明の一実施態様では、製薬用製剤は水性製剤で、すなわち水を含有する製剤である。このような製剤は、典型的には溶液又は懸濁剤である。本発明のさらなる実施態様では、製薬用製剤は水溶液である。「水性製剤」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有する製剤と定義される。同様に「水溶液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有する溶液と定義され、「水性懸濁剤」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有する懸濁剤と定義される。
【００７９】
他の実施態様では、製薬用製剤は凍結乾燥製剤であり、医師又は患者は、使用前に溶媒及び／又は希釈液を添加する。
他の実施態様では、製薬用製剤は、何ら事前に溶解することなく使用準備が整った乾燥した製剤(例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥)である。
【００８０】
さらなる実施態様では、本発明は、本発明のインスリンアナログの水溶液及びバッファーを含有する製薬用製剤に関し、該インスリンアナログは０．１ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在し、該製剤は約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
【００８１】
経口使用を意図した製剤は、任意の既知の方法に従って調製することができ、かかる製剤は、製薬的に上品で口に合う製剤を提供するために、甘味料、香料、着色剤、及び保存料からなる群から選択される一又は複数の薬剤を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適する非毒性で製薬的に許容可能な賦形剤と混合されて、活性成分を含んでもよい。これらの賦形剤は、例えば不活性な希釈剤、例えばマンニトール、マルトデキストリン、カオリン、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、ポリマー又はアカシア；及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであってよい。錠剤はコートされていなくてもよく、又は崩壊もしくは治療的に活性なポリペプチドの放出を遅延化するために既知の技術によりコートされていてもよい。
【００８２】
本発明の経口的に投与可能な製剤は、薬化学でよく知られている方法に従って、調製され投与され得、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版. (A. osol編, 1985)が参照される。
【００８３】
本発明の一実施態様では、本発明の製薬用組成物は、錠剤及びカプセル等、固形投与形態で投与されうる。錠剤は湿式造粒、乾式造粒、直接圧縮、又は溶融造粒により調製されうる。
【００８４】
この発明の錠剤は、常套的な錠剤化技術を使用して調製されうる。一般的な製造方法は、インスリンアナログ、水溶性希釈剤、親水性バインダー、及び場合によっては崩壊剤の一部を混合することを含む。ついで、この混合物を、親水性バインバーの水溶液又は親水性バインダーと界面活性剤との水溶液を用いて造粒し、必要ならば粉砕する。顆粒を乾燥させ、適した大きさまで小さくする。例えば潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム)や更なる崩壊剤のような任意の他の成分を顆粒に添加し、混合する。ついで、この混合物を適切な大きさに圧縮し、常套的な錠剤化機械、例えばロータリー式錠剤プレスを使用して成形する。錠剤は、当該分野でよく知られている技術によってフィルムコーティングされてもよい。
【００８５】
経口使用のための製剤は、硬質又は軟質ゼラチンカプセルとしても提供され得、ここで活性成分は、不活性な固形希釈剤、例えばマンニトール、マルトデキストリン、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、カオリン、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムと混合され、又は軟質ゼラチンカプセルの場合は、活性成分は水又は油性媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、又はオリブ油と混合される。
【００８６】
この発明のカプセルは、一般的な方法を使用して調製することができる。一般的な製造方法は、治療的に活性なペプチド、アルギン酸塩、水溶性希釈剤、親水性バインダー、場合によっては崩壊剤の一部を混合することを含む。ついで、この混合物を、親水性バインバー水溶液又は親水性バインダーと界面活性剤の水溶液を用いて造粒し、必要ならば粉砕する。顆粒を乾燥させ、適切な大きさまで小さくする。例えば潤滑剤のような任意の他の成分を顆粒に添加し、混合する。ついで、常套的なカプセル充填機を使用し、得られた混合物を適切なサイズの殻の固いゼラチンカプセルに充填する。
【００８７】
本発明のさらなる実施態様では、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シタラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーの各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【００８８】
本発明のさらなる実施態様では、製剤は製薬的に許容可能な保存料をさらに含有する。保存料は、保存効果(防腐効果)を得るのに十分な量で存在している。製薬用製剤における保存料の量は、当業者によく知られており、例えば当該分野の文献及び／又は市販品等における保存料の既知の量から決定することができる。これらの特定の保存料の各一が、本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００８９】
本発明のさらなる実施態様では、製剤はキレート剤をさらに含有する。製薬用組成物にキレート剤を使用することは当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science及びPractice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
本発明のさらなる実施態様では、製剤は安定剤をさらに含有する。ここで使用される「安定剤」なる用語は、ペプチドを安定にするために、すなわちこのような製剤の保存期間及び／又は使用期間を長くするために、ポリペプチド含有製薬用製剤に添加される化学物質を意味する。製薬用組成物に安定剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００９０】
本発明のさらなる実施態様では、製剤は界面活性剤をさらに含有する。ここで使用される場合「界面活性剤」なる用語は、水溶性(親水性)の部分、頭部、脂溶性(親油性)のセグメントを含む任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、好ましくは、界面に蓄積され、親水性部分が水(親水性相)に対して配向し、親油性部分が油又は疎水性相(すなわち、ガラス、空気、油等)に配向している。界面活性剤がミセルを形成し始める濃度は、臨界ミセル濃度、すなわちＣＭＣとして知られている。さらに、界面活性剤は液体の表面張力を低下させる。界面活性剤は両親媒性化合物としてもまた知られている。「洗浄剤」なる用語は、一般的に界面活性剤に使われる同義語である。製薬用組成物に界面活性剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
本発明のさらなる実施態様では、製剤は、プロテアーゼインヒビターをさらに含有する。
【００９１】
他の成分が本発明のインスリンアナログ製薬用製剤に存在することは可能である。このような付加的な成分は、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、張力修正剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質)及び双性イオン(例えばアミノ酸、特にベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジン)を含んでよい。もちろん、このような付加的な成分は、本発明の製薬用製剤の全体的な安定性に悪影響を及ぼしてはならない。
【００９２】
本発明のインスリンアナログを含有する製薬用組成物は、いくつかの部位、例えば局所的部位、特に皮膚及び粘膜部位、動脈、静脈、心臓への投与等、バイパス吸収がなされる部位、例えば皮膚、皮下、粘膜又は腹部への投与等、吸収に関する部位において、このような治療が必要とされる患者に投与されうる。
【００９３】
本発明の製薬用組成物は、いくつかの投与経路、例えば舌、舌下、頬、口、経口、胃、及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞及び／又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼球を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、このような治療を必要としている患者に投与されうる。
【００９４】
本発明の組成物は、任意の投与形態、例えば溶液、懸濁剤、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、被覆錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼球用軟膏、眼球用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注入溶液、インシトゥー形質転換溶液、例えばインシトゥーゲル化、インシトゥーセット用、インシトゥー沈殿化、インシトゥー結晶化のもの、注入液、及び移植片として投与されうる。
【００９５】
本発明の組成物は、インスリンアナログ化合物の安定性をさらに高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、悪影響を低減させ、当業者によく知られている時間治療を達成し、患者のコンプライアンスを高める、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有結合的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤送達系、及び先端の薬剤送達系に、配合し又はこれらに付随させてもよい。
【００９６】
本発明の組成物は、全て当業者によく知られた装置である定量吸入器、乾燥パウダー吸入器、及び噴霧器等を使用し、インスリンアナログを肺に投与するための、固形状、半固体状、パウダー状及び液状の製剤に有用である。
【００９７】
本発明の組成物は、制御、徐放性、持続性、遅延性及び低速放出性の薬剤送達系の製剤に特に有用である。特に限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出性及び徐放性系(双方の系では、投与の数が数倍低下する)製剤に有用である。さらに好ましいのは、皮下投与される制御放出性及び徐放性系のものである。本発明の範囲を制限するものではないが、有用な制御放出性及び組成物の有用な例は、ハイドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマー性ミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
【００９８】
本発明の組成物に有用な制御放出系の作製方法は、限定されるものではないが、結晶化、縮合、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界流体プロセスを含む。一般的には、Handbook of Pharmaceutical controlled Release(Wise, D.L.編. Marcel Dekker, New York, 2000)及びDrug及びthe Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Formulation and Delivery(MacNally, E.J.編. Marcel Dekker, New York, 2000)を参照。
【００９９】
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射で実施されてよい。また非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。さらなる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態でインスリンアナログ化合物を投与するための溶液又は懸濁剤であってよい組成物にある。さらなる選択肢としては、本発明のインスリンアナログ化合物を含有する製薬用組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与用、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
【０１００】
本発明のインスリンアナログは、肺薬剤送達に適した任意の公知の種類の装置を使用し、ビヒクル、例えば溶液、懸濁剤又は乾燥パウダーとして、肺経路を介して投与することができる。これらの例には、限定されるものではないが、肺薬剤送達用に作製された一般的には３種類のエアゾールが含まれ、ジェット又は超音波噴霧器、定量吸入器、又は乾燥パウダー吸入器も含まれ得る(Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453を参照)。
【０１０１】
さらなる実施態様では、製剤は、１０μｍ、好ましくは１−５μｍ、最も好ましくは１−３μｍ未満のエアゾール粒子のＭＭＡＤを達成するために、任意の既知のエアゾール化技術、例えば噴霧化によりエアゾール化することができる。好ましい粒子径は、肺の奥深くに薬剤を送達せしめるのに最も効果的なサイズに基づき、タンパク質が最適に吸収されるようになされる (例えば、Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。
インスリンアナログ化合物を含有する肺用製剤を肺の奥深くに蓄積させることは、吸入技術、例えば限定されるものではないが、低吸入速度(例えば３０Ｌ／分)、呼吸停止、及び作動のタイミングを修正して最適化されうる。
【０１０２】
「安定化された製剤」なる用語は、物理的安定性が増した、化学的安定性が増した、又は物理的及び化学的安定性が増した製剤を意味する。
ここで使用されるタンパク質製剤の「物理的安定性」なる用語は、タンパク質が熱-機械的ストレスに暴露され、及び／又は不安定な表面及び界面、例えば疎水性表面及び界面と相互作用する結果として、タンパク質が生物学的に不活性になり及び／又は不溶性の凝集体が形成されるというタンパク質の傾向を意味する。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)に充填された製剤を、様々な時間、異なる温度で機械的／物理的ストレス(例えば攪拌)に暴露した後に、視覚検査及び／又は濁度測定することで評価される。製剤の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライト下において実施される。製剤の濁度は、例えば０から３のスケールで、濁りの程度をランク付けする視覚スコア(濁りのない製剤は視覚スコア０に相当し、日光下で視覚的に濁りのある製剤は視覚スコア３に相当する)により特徴付ける。製剤は、日光下で視覚的濁りを示す場合に、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。また製剤の濁度は、当業者によく知られている簡単な濁度測定法により評価することもできる。また水性タンパク質製剤の物理的安定性は、タンパク質の構造状態のプローブ又は分光剤を使用して評価することもできる。プローブは、好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴは、アミロイド原繊維の検出に広範囲に使用されている蛍光染料である。原繊維、おそらく他のタンパク質立体配置が存在すると、チオフラビンＴが約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、原繊維タンパク質形態に結合した時に、約４８２ｎｍで増強発光する。未結合のチオフラビンＴは、本質的にはその波長で非蛍光性である。
【０１０３】
天然から非天然状態までのタンパク質構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の暴露された疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、その天然状態にあるタンパク質の３次構造内に一般的に埋められているが、タンパク質の展開及び変性が始まると、暴露されるようになる。これらの小分子の例、分光プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光プローブは金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン等のコバルト金属錯体である。
【０１０４】
ここで使用されるタンパク質製剤の「化学的安定性」なる用語は、天然のタンパク質構造と比較して、免疫原性の潜在的増加及び／又は生物学的有効性の潜在的低下を伴う、化学的な分解産物の形成に至るタンパク質構造における化学的共有変化を意味する。種々の化学的な分解産物は、天然タンパク質の性質及び種類、及びタンパク質が暴露される環境に応じて形成されうる。化学的分解の排除は、多くの場合、完全に回避することはできず、当業者によく知られているように、タンパク質製剤の保存及び使用中に、化学的な分解産物の量の増加が見られる。殆どのタンパク質は、脱アミド化する傾向にあり、グルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を形成する。他の分解経路は高分子量の形質転換産物の形成に関与しており、２又はそれ以上のタンパク質分子は、アミド転移及び／又はジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及びポリマーの分解産物の形成に至る(Stability of Protein Phramaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。(例えばメチオニン残基の)酸化も、化学的分解の他の変形例として挙げることができる。タンパク質製剤の化学的安定性は、異なる環境条件に暴露させた後、種々の時点での化学的な分解産物の量を測定することにより評価することができる(分解産物の形成は、多くの場合、例えば温度上昇により促進される)。個々の分解産物の各々の量は、多くの場合、様々なクロマトグラフィー技術(例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ)を使用し、分子サイズ及び／又は電荷に応じて、分解産物を分離することにより測定される。
【０１０５】
よって、上に概要を述べたように、「安定化された製剤」とは、物理的安定性が増加、化学的安定性が増加、又は物理的及び化学的安定性が増加した製剤を意味する。一般的に、製剤は、有効期限に到達するまで、使用及び保存中に(推奨される用途及び保存条件で)安定していなければならない。
【０１０６】
本発明の一実施態様では、インスリンアナログ化合物を含有する製薬用製剤は、６週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の他の実施態様では、インスリンアナログ化合物を含有する製薬用製剤は、４週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、インスリンアナログ化合物を含有する製薬用製剤は、４週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、インスリンアナログ化合物を含有する製薬用製剤は、２週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
【０１０７】
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合して、活性成分を含みうる。
油性懸濁剤は、植物性油、例えばラッカセイ油、オリブ油、ゴマ油又はココナツ油、又は鉱物性油、例えば流動パラフィンに活性成分を懸濁させることにより製剤化されうる。油性懸濁剤は、増粘剤、例えばミツロウ、固形パラフィン、又はセチルアルコールを含みうる。甘味料、例えば上述したもの、及び香料を添加し、口に合う経口製剤が提供される。これらの製剤は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸を添加することにより保存されうる。
【０１０８】
水の添加による水性懸濁剤の調製に適した分散パウダー及び顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤、及び一又は複数の保存料と活性化合物を混合することにより提供される。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は、既に上述したものにより例証される。付加的な賦形剤、例えば甘味料、香料及び着色剤もまた存在しうる。
【０１０９】
本発明で使用される化合物を含有する製薬用製剤はまた水中油型エマルションの形態であってもよい。油相は、植物性油、例えばオリブ油又はラッカセイ油、又は鉱物性油、例えば流動パラフィン、又はそれらの混合物でありうる。適切な乳化剤は、天然に生じたガム、例えばアカシアガム又はトラガントガム、天然に生じたリン脂質、例えば大豆、レシチン、及び脂肪酸と無水ヘキシトールから誘導されたエステル又は部分エステル、例えばソルビタンモノオレアート、及び該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってよい。またエマルションは、甘味料及び香料を含んでいてもよい。
【０１１０】
シロップ及びエリキシル剤は、甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースと共に製剤化されうる。かかる製剤はまた粘滑剤、保存料及び香料及び着色剤をさらに含有していてもよい。
【０１１１】
本発明のさらなる実施態様では、製剤は浸透促進剤をさらに含有する。胆汁塩及び脂肪酸は、多くの場合、ＧＩ管の内側を覆う上皮細胞の脂質２重膜の経口透過性を増加させると考えられている。一般的に、浸透促進剤は、膜インテグリティを可逆的に変化させることにより、高分子の傍細胞及び経細胞輸送を増加させる。胆汁塩は、コール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、グリココール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、ウルソデオキシコール酸塩、タウロウルソデオキシコール酸塩、及びケノデオキシコール酸塩からなる群から選択される。脂肪酸は、短鎖、中鎖及び長鎖の脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等からなる群から選択される。他の促進剤は界面活性剤、例えばモノグリセリド、ポリオキシエチレンエステル、ソルビタン界面活性剤(非イオン性)及びスルファート(アニオン性)でありうる。
【０１１２】
本発明のさらなる実施態様では、製剤は、粘膜接着ポリマーをさらに含有する。胃腸管の粘膜への薬剤送達系の密接した接触は、粘膜接着ポリマーの使用により得ることができる。膜への投与形態の密着した接触は、送達系と吸着膜との間の経路で、治療的に活性ナトリウムポリペプチドの酵素的分解が回避可能なため、有利であるように思われる。さらに、受動的な薬剤の取込のための駆動力を表す吸着膜における段階的濃度勾配を提供することができる。
【０１１３】
本発明のさらなる実施態様では、製剤は、酵素障壁をさらに回避し、治療的に活性なポリペプチドの送達を達成するために、タンパク質分解酵素(群)のインヒビター、例えばアミノペプチダーゼインヒビター、アマスタチン(amastatin)、ベスタチン、ボロロイシン、及びピューロマイシンをさらに含有する。プロテアーゼインヒビターの例は、グリコール酸ナトリウム、メシル酸カモスタット、バシトラシン、ダイズトリプシンインヒビター及びアプロチニンである。
【０１１４】
封入及びカプセル化は、酵素分解に対して、保護を含む送達特性を最適にするために、治療的に活性なポリペプチドの薬剤送達系に使用される技術である。封入又はカプセル化はポリマー薬剤送達系の形態、例えばハイドロゲル及びナノカプセル／ミクロスフィア、脂質薬剤送達系、例えばリポソーム及びマイクロエマルションとすることもできる。
【０１１５】
本発明の製剤は、溶液、懸濁剤、ミクロ-及びナノ懸濁剤、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、軟膏、錠剤、被覆錠剤、リンス、発泡錠剤、舌下錠剤、口腔錠剤、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、パウダー、顆粒、インシトゥー形質転換溶液、例えばインシトゥーゲル化、インシトゥーセット用、インシトゥー沈殿化、インシトゥー結晶化のもの、胃部フローティング製剤、例えばフローティング懸濁剤、フローティング錠剤等で投与されてもよい。
【０１１６】
他の実施態様では、本発明は、医薬として使用される本発明のインスリンアナログに関する。
一実施態様では、本発明のインスリンアナログは、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、高血圧、Ｘ症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、冠動脈心疾患、及び他の心血管障害、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防のための医薬の調製に使用される。
【０１１７】
他の実施態様では、本発明のインスリンアナログは、２型糖尿病の疾患進行の遅延化又は予防のための医薬として使用される。
他の実施態様では、本発明のインスリンアナログは、食物摂取を低下させ、β細胞アポトーシスを低下させ、β細胞機能及びβ細胞量を増加させ、及び／又はβ細胞に対するグルコース感受性を回復させるための医薬として使用される。
【０１１８】
本発明の一実施態様では、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、高血圧、Ｘ症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患、及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防、又は２型糖尿病の疾患進行の遅延化又は予防、又は食物摂取の低下、β細胞アポトーシスの低下、β細胞機能及びβ細胞量の増加、及び／又はβ細胞に対するグルコース感受性の回復のための医薬として使用される本発明の誘導体が提供される。
【０１１９】
本発明のさらなる実施態様では、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、高血圧、Ｘ症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患、及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍を治療又は予防、又は２型糖尿病の疾患進行を遅延化又は予防、又は食物摂取を低下、β細胞アポトーシスを低下、β細胞機能及びβ細胞量を増加、及び／又はβ細胞に対するグルコース感受性を回復させるための方法であって、このような治療を必要とする患者に、本発明のインスリンアナログを、このような治療に有効な量投与することを含む方法が提供される。
【０１２０】
また、本発明のインスリンアナログを用いた治療は、例えば抗糖尿病剤、抗肥満剤、食欲調節剤、血圧降下剤、糖尿病に起因する又は関連する合併症を治療及び／又は予防する薬剤、及び肥満に起因する又は関連する合併症及び疾患を治療及び／又は予防する薬剤から選択される、第２の又はそれ以上の薬理学的活性物質と併用してもよい。これら薬理学的活性物質の例は次の通りである：ＧＬＰ-１及びＧＬＰ-１の誘導体及びアナログ、ＧＬＰ-２及びＧＬＰ-２の誘導体及びアナログ、エキセンディン-４及びエキセンディン-４の誘導体及びアナログ、アミリン及びアミリンの誘導体及びアナログ、スルホニル尿素、ビグアニド類、メグリチニド類(meglitinides)、グルコシダーゼインヒビター、グルカゴンアンタゴニスト、ＤＰＰ-ＩＶ(ジペプチジルペプチダーゼ-ＩＶ)インヒビター、グルコース新生及び／又はグリコーゲン分解の刺激に係る肝酵素のインヒビター、グルコース取込調節剤、脂質代謝を調節する化合物、例えば抗高脂血剤(antihyperlipidemic agents)、例えばＨＭＧ ＣｏＡインヒビター(スタチン類)、食糧摂取量を低下させる化合物、ＲＸＲアゴニスト、及びβ細胞のＡＴＰ-依存性カリウムチャンネルに作用する薬剤：コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲンフィブロジル(gemfibrozil)、ロバスタチン、プラバスタチン、シムバスタチン、プロブコール、デキストロサイロキシン、ネテグリニド(neteglinide)、レパグリニド；β-ブロッカー、例えばアルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロール及びメトプロロール、ＡＣＥ(アンジオテンシン変換酵素)インヒビター、例えばベナゼプリル(benazepril)、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル(fosinopril)、リシノプリル、アラトリオプリル(alatriopril)、キナプリル及びラミプリル、カルシウムチャンネルブロッカー、例えばニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼム及びベパラミル、及びα-ブロッカー、例えばドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシン及びテラゾシン；ＣＡＲＴ(コカインアンフェタミン調節転写)アゴニスト、ＮＰＹ(神経ペプチドＹ)アンタゴニスト、ＭＣ４(メラノコルチン４)アゴニスト、オレキシン(orexin)アンタゴニスト、ＴＮＦ(腫瘍壊死因子)アゴニスト、ＣＲＦ(コルチコトロピン放出因子)アゴニスト、ＣＲＦ ＢＰ(コルチコトロピン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β３アゴニスト、ＭＳＨ(メラノサイト刺激ホルモン)アゴニスト、ＭＣＨ(メラノサイト集中ホルモン)アンタゴニスト、ＣＣＫ(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再摂取インヒビター、セロトニン及びノルアドレナリン再摂取インヒビター、混合セロトニン及びノルアドレナリン性化合物、５ＨＴ(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、ＴＲＨ(チレオトロピン(thyreotropin)放出ホルモン)アゴニスト、ＵＣＰ２又は３(脱共役タンパク質２又は３)モジュレーター、レプチンアゴニスト、ＤＡアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン(doprexin))、リパーゼ／アミラーゼインヒビター、ＲＸＲ(レチノイドＸレセプター)モジュレーター、ＴＲβアゴニスト；ヒスタミンＨ３アンタゴニス��、ガストリン及びガストリンのアナログ及び誘導体。
【０１２１】
本発明の誘導体と、一又は複数の上述した化合物、場合によっては一又は複数のさらなる薬理学的活性物質との任意の適切な組合せは、本発明の範囲内であると考えられると理解されるべきである。
【０１２２】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解してはならない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語（例えば「等」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
この発明は、適用される法律に容認される、ここに添付した特許請求の範囲に記載された主題事項の全ての修正物及び均等物を含む。
【実施例】
【０１２３】
実施例１
ペプシン、キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼＡに対する、Ｂ２５Ｈ、Ａ１４Ｅ、Ａ１４Ｅ＿Ｂ２５Ｈ及びヒトインスリンのタンパク質分解安定性(半減期)の比較
キモトリプシン又はペプシン(０．３４-３．４μｇ)に対するヒトインスリン及びインスリンアナログ(０．０６ｍＭ、１０μＬ)のタンパク質分解安定性を、それぞれ１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．１又は１０ｍＭのＨＣｌ、ｐＨ２．０において、２５℃、最終容量１００μＬでインキュベートした後に測定した。種々の時間(０、５、１５、３０及び６０分)、サンプルを、同量の０．５％ＴＦＡ又は０．１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０(最終的にｐＨ７．７)でクエンチし、５℃に移した。ヒトインスリン及びインスリンアナログをＲＰ-ＨＰＬＣにより、２１４ｎｍで直ちに分析し、無傷タンパク質に相当するピーク下の面積を測定した。
【０１２４】
カルボキシペプチダーゼＡ(６．８μＬの希釈標準溶液、２０ｍｇ／ｍｌ、５３単位／ｍｇ、Sigma c-9268)に対するヒトインスリン及びインスリンアナログ(０．０６ｍＭ、１３．９μｇ)の安定性を、最終容量４００μＬで、５ｍＭのＮａＰ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、７０ｐｐｍのトゥイーン２０、ｐＨ  ７．４において、及び３７℃にてインキュベートした後に測定した。種々の時間(５、１５、３０、６０分)、サンプルを、同量の０．２％ＴＦＡでクエンチし、５℃に移した。酵素を添加することなく、参照サンプル(０分)を調製した。ヒトインスリン及びアナログをＲＰ-ＨＰＬＣにより、中性のバッファー系において、２１４ｎｍで直ちに分析し、無傷タンパク質に相当するピーク下の面積を測定した。同一の反応時間、ヒトインスリン及びｄｅｓＢ３０についても観察した。曲線から半減期(Ｔ１／２)を得、ヒトインスリンに対する増加倍数／減少倍数を算出した(安定性の相対的倍数)。同様の半減期を測定したところ、ヒトインスリンではＴ１／２＝６．９分、及びｄｅｓＢ３０ヒトインスリンではＴ１／２＝６．７であった。
2014129355.tif 000002
【０１２５】
実施例２
ＭＳ分析によるインスリン内のプロテアーゼ切断部位及び酵素特異性の同定
プロテアーゼ切断部位の同定を、ＬＣ-ＭＳにて、種々の酵素(ペプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＡ)による、インスリン及びインスリンアナログの制限タンパク質分解の経時的分析により実施した。生成したペプチド断片をＭＳ及び／又はＭＳ／ＭＳで同定し、大小の切断部位(ホットスポット)を同定するために、２１４ｎｍで定量した。ヒトインスリン内部のペプシン(Ｂ２４-２５、Ｂ２５-２６、Ｂ２６-２7)及びキモトリプシン(Ｂ１６-１７、Ｂ２４-２５、Ｂ２５-２６、Ｂ２６-２７、Ａ１４-１５及びＡ１９-２０)のホットスポットを同定した。興味あることに、ホットスポットはインスリン分解酵素(ＩＤＥ)（以下参照）、及びカテプシンＤ(Hanne Refsgaard, Novo Nordisk 個人的情報やりとり)と重複している。
【０１２６】
また、インスリン配列内の切断部位を、実施例３に示すように、キモトリプシン、トリプシン及びインスリ分解酵素(ＩＤＥ)の酵素特異性に基づいて予測した。トリプシン(塩基性残基、Ｃ末端からＬｙｓ、Ａｒｇ)、エラスターゼ(脂肪族残基、Ｃ末端からＡｌａ、Ｖａｌ、ＧＬｙ、Ｓｅｒ)、カルボキシペプチダーゼＡ(広範囲に特異性、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＰｒｏを除く)、ペプシンＡ(芳香族残基、Ｎ末端からＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＬｅｕ及び種々の他の残基)、及びキモトリプシン(芳香族残基、Ｃ末端からＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＬｅｕ、Ｘｘｘ-Ｐｒｏを除く)について予測された切断部位は、生化学のいくつかのハンドブックに記載されている。インスリン内のＩＤＥに対する切断部位は： Ｂ９-１０、Ｂ１０-１１、Ｂ１３-１４、Ｂ１４-１５、Ｂ２４-２５、Ｂ２５-２６、Ａ１３-１４、Ａ１４-１５ (Duckworthら, 2006)であると近年公開されており、次の置換基は、インスリンのＩＤＥ分解を阻害することが示されている：Ｂ１０Ｄ及びＢ４Ｅ_Ｂ１６Ｑ_Ｂ１７Ｆ(Bennettら, 2003)。
【０１２７】
実施例３
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン内のホットスポット同定の繰り返しサイクル
キモトリプシン切断についての大きなホットスポット(Ｂ１６-１７、Ｂ２４-２５、Ａ１９-２０)及び小さな切断部位(Ｂ１-２、Ｂ６-７)を、実施例２に記載の方法に従い、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンにおいて同定した。酵素特異性から同定切断部位及び予測切断部位に基づき、インスリンアナログを設計した。切断部位を除去し、溶解度が増すよう、置換のためのアミノ酸残基を選択した。
【０１２８】
キモトリプシン、アナログＤ、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリンの消化物のＬＣ-ＭＳにより同定されたホットスポットに基づく設計：
Ａ１４Ｘ１  Ｂ２５Ｈ  ｄｅｓＢ３０Ｘ１２  ＨＩ  Ｂ１Ｘ２  Ｂ６Ｘ３  Ｂ１６Ｘ６  Ｂ２４Ｘ８  Ａ１９Ｘ１１
Ｘ１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ
Ｘ２＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ３＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ６＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ８＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１２＝ｄｅｓＢ３０／天然ａａ
記：ヒトインスリンにおけるＢ２４及び／又はＡ１９の置換は、レセプター親和性を有意に低下させるように思われる。
【０１２９】
Ａ１４Ｘ１  Ｂ２５Ｐ  ｄｅｓＢ３０Ｘ１２  ＨＩ  Ｂ１Ｘ２  Ｂ６Ｘ３  Ｂ１６Ｘ６  Ｂ２４Ｘ８  Ａ１９Ｘ１１
Ｘ１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ
Ｘ２＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ３＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ６＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ８＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１２＝ｄｅｓＢ３０／天然ａａ
記：ＰｒｏによるＢ２５の置換は、Ｂ２４-２５におけるキモトリプシン切断を有意に低下させるように思われる。
【０１３０】
キモトリプシン、同定された及び予測されたホットスポットに基づく設計：
Ａ１４Ｘ１  Ｂ２５Ｈ  ｄｅｓＢ３０Ｘ１２  ＨＩ  Ｂ１Ｘ２  Ｂ６Ｘ３  Ｂ１１Ｘ４  Ｂ１５Ｘ５  Ｂ１６Ｘ６  Ｂ１７Ｘ７  Ｂ２４Ｘ８  Ａ１３Ｘ９  Ａ１６Ｘ１０  Ａ１９Ｘ１１
Ｘ１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ
Ｘ２＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ３＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ４＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ５＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ６＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ７＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ８＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ９＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１０＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１２＝ｄｅｓＢ３０／天然ａａ
記：インスリンにおけるＢ１１、Ｂ１５、Ｂ２４、Ａ１３、Ａ１６、及び／又はＡ１９の置換は、レセプター親和性を有意に低下させるように思われる。
【０１３１】
キモトリプシン＋トリプシン、同定された及び予測されたホットスポットに基づく設計：
Ａ１４Ｘ１  Ｂ２５Ｈ  ｄｅｓＢ３０Ｘ１２  ＨＩ  Ｂ１Ｘ２  Ｂ６Ｘ３  Ｂ１１Ｘ４  Ｂ１５Ｘ５  Ｂ１６Ｘ６  Ｂ１７Ｘ７  Ｂ２４Ｘ８  Ａ１３Ｘ９  Ａ１６Ｘ１０  Ａ１９Ｘ１１  Ｂ２２Ｘ１３
Ｘ１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ
Ｘ２＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ３＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ４＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ５＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ６＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ７＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ８＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ９＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１０＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１２＝ｄｅｓＢ３０／天然ａａ
Ｘ１３＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
【０１３２】
キモトリプシン＋トリプシン＋インスリン分解酵素(ＩＤＥ)、同定された及び予測されたホットスポットに基づく設計：
Ａ１４Ｘ１  Ｂ２５Ｈ  ｄｅｓＢ３０Ｘ１２  ＨＩ  Ｂ１Ｘ２  Ｂ６Ｘ３  Ｂ１１Ｘ４  Ｂ１５Ｘ５  Ｂ１６Ｘ６  Ｂ１７Ｘ７  Ｂ２４Ｘ８  Ａ１３Ｘ９  Ａ１６Ｘ１０  Ａ１９Ｘ１１  Ｂ２２Ｘ１３  Ｂ４Ｘ１４  Ｂ９Ｘ１５  Ｂ１０Ｘ１６  Ｂ１３Ｘ１７  Ｂ１４Ｘ１８
Ｘ１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ
Ｘ２＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ３＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ４＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ５＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ６＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ７＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ８＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ９＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１０＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１１＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１２＝ｄｅｓＢ３０／天然ａａ
Ｘ１３＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１４＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１５＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１６＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１７＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
Ｘ１８＝Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｐ／天然ａａ
【０１３３】
実施例４
キモトリプシンに対するインスリンアナログのタンパク質分解安定性(半減期)
インスリンアナログを安定性アッセイで試験し、タンパク質分解的消化に対し、耐性の向上を示すアナログを、実施例１に記載した方法に従い、増加した半減期によって同定した。結果には、タンパク質分解に対する耐性を高め、溶解度を増加させるために、生物学的利用能を増加させるための、さらに改善されたインスリンアナログの可能性が示されている。
キモトリプシンに対する次のインスリンアナログの安定性を、ヒトインスリンに対して試験した。
2014129355.tif 000003
【０１３４】
実施例５
ラットの腸(十二指腸の内腔)からの抽出物に対するインスリンアナログのタンパク質分解安定性
腸の抽出物におけるタンパク質分解に対する安定性について、インスリンアナログをテストした。絶食動物の内腔含有物を洗浄することにより、抽出物を調製した。３７℃、ｐＨ＝７．４にて、希釈した抽出物と共に、インスリンアナログをインキュベートし、インキュベートし２０分後、ＲＰ-ＨＰＬＣにより、未変化化合物の濃度を測定した。未変化インスリンアナログと未変化ヒトインスリンの相対量を比較した。ヒトインスリンとアナログＡ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリンとの間には、約５−１０倍の差異があることが見出された。
【図１】
2014129355.tif 000004
【図２】
2014129355.tif 000005
【配列表】
2014129355000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月7日(2014.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親インスリンに対し、少なくとも２の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換が、親インスリンの２以上のプロテアーゼ切断部位の内部又はこれに近接して存在しているインスリンアナログであって、一又は複数の付加的な変異をさらに含んでいてもよいインスリンアナログ。
【請求項２】
親タンパク質に対して、増加した溶解性の得られた請求項１に記載のインスリンアナログ。
【請求項３】
インスリンアナログのＡ鎖が少なくとも一の変異を含み、インスリンアナログのＢ鎖が親インスリンに対して少なくとも一の変異を含んでいる請求項１又は２に記載のインスリンアナログ。
【請求項４】
インスリンアナログが、最初に修飾されたインスリンアナログのプロテアーゼ部位において少なくとも一つのアミノ酸置換をさらに含み、前記少なくとも一つのアミノ酸置換が少なくとも一つの疎水性アミノ酸が少なくとも一つの親水性アミノ酸により置換されているものである、請求項１ないし３の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項５】
・Ａ１２位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり、及び／又はＡ１３位のアミノ酸がＨｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり、及び／又はＡ１４位のアミノ酸がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＨｉｓであり、及び／又はＡ１５位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び
・Ｂ２４位のアミノ酸がＨｉｓであり、及び／又はＢ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、及び／又はＢ２６位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ又はＴｈｒであり、及び／又はＢ２７位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ又はＡｒｇであり、及び／又はＢ２８位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ又はＡｓｐであり;
場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含む請求項１ないし４の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項６】
Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含む請求項１ないし５の何れか一項に記載のインスリンアナログ。 
【請求項７】
Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、Ｂ３０位のアミノ酸が欠失している請求項１ないし６の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項８】
Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓである請求項１ないし６の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項９】
一又は複数の付加的な変異が、Ａ(−３)Ｇｌｙ、Ａ(−２)Ｇｌｙ、Ａ(−１)Ｐｒｏ、Ａ(０)Ｐｒｏ、Ａ８Ｈｉｓ、Ａ１８Ｇｌｎ、Ａ１８Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｙ、Ｂ(−３)Ｇｌｙ、Ｂ(−２)Ｇｌｙ、Ｂ(−１)Ｐｒｏ、Ｂ(０)Ｐｒｏ、Ｂ１Ｇｌｕ、Ｂ１Ｇｌｎ、ｒｏ、Ｂ１Ｇｌｕ、Ｂ１Ｇｌｎ、Ｂ３Ｇｌｎ、Ｂ１０Ｐｒｏ、Ｂ１４Ｔｈｒ、Ｂ１６Ｇｌｕ、Ｂ１７Ｓｅｒ、Ｂ２６Ａｓｐ、ＤｅｓＢ２６、ＤｅｓＢ２７、Ｂ２７Ｇｌｕ、Ｂ２７Ｇｌｕ、Ｂ２８Ａｓｐ、ｄｅｓＢ２８、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０、Ｂ３１Ｌｅｕ、Ｂ３２Ｇｌｕからなる群から選択される請求項１ないし６の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１０】
付加的な変異がｄｅｓＢ３０である請求項１ないし６又は９の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１１】
Ａ１４がＧｌｕである請求項１ないし１０の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１２】
親タンパク質に対して、一又は複数のプロテアーゼ酵素への増加した安定性を示す請求項１ないし１１の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１３】
親タンパク質に対して、２以上のプロテアーゼ酵素への増加した安定性を示す請求項１ないし１２の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１４】
親インスリンが、
ヒトインスリン;
・Ｂ２８位のアミノ酸残基がＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基がＬｙｓ又はＰｒｏであり、場合によってはＢ３０位のアミノ酸残基が欠失しているヒトインスリンのインスリンアナログ；
・ｄｅｓ(Ｂ２６-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２８-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２９-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７)ヒトインスリン、又はｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン;
・Ｂ３位のアミノ酸残基がＬｙｓであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基が Ｇｌｕ又はＡｓｐであるヒトインスリンのインスリンアナログ;
・Ａ２１位のアミノ酸残基が Ｇｌｙであり、２つのＡｒｇ残基でＣ末端がさらに伸長しているヒトインスリンのインスリンアナログ；
・Ｂ３０位のアミノ酸残基がスレオニンメチルエステルで置換されているインスリン誘導体；
・ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンのＢ２９位にあるリジンのＮε位にテトラデカノイル鎖が結合したインスリン誘導体；
からなる群から選択される請求項１ないし１３の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１５】
一又は複数の付加的な変異が、インスリンの化学的安定性を高めるように選択される請求項１ないし６、９又は１１−１４の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１６】
一又は複数の付加的な変異が、Ａ１８Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｙ及びＢ３Ｇｌｎからなる群から選択される請求項１５に記載のインスリンアナログ。
【請求項１７】
式１：
ＸａａＡ(−２)-ＸａａＡ(−１)-ＸａａＡ０-Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１-ＸａａＡ２２
式(１)(配列番号１)
のＡ鎖アミノ酸配列、及び次の式２：
ＸａａＢ(−２)-ＸａａＢ(−１)-ＸａａＢ０-ＸａａＢ１-ＸａａＢ２-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-ＸａａＢ２５-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０-ＸａａＢ３１-ＸａａＢ３２
式(２)(配列番号２)
のＢ鎖アミノ酸配列を含み、上記式中、
ＸａａＡ(−２)は存在しないか又はＧｌｙであり;
ＸａａＡ(−１)は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＡ０は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２２は存在しないか又はＬｙｓであり;
ＸａａＢ(−２)は存在しないか又はＧｌｙであり;
ＸａａＢ(−１)は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＢ０は存在しないか又はＰｒｏであり;
ＸａａＢ１は存在しないか、又は独立してＰｈｅ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２は存在しないか又はＶａｌであり;
ＸａａＢ３は存在しないか、又は独立してＡｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２５は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり;
ＸａａＢ３１は存在しないか又はＬｅｕであり;
ＸａａＢ３２は存在しないか又はＧｌｕであり;
場合によってはＣ末端がアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列が、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインがジスルフィド架橋により結合しており；
場合によってはＡ鎖アミノ酸配列のＮ末端が、３−７のアミノ酸を含有するアミノ酸配列により、Ｂ鎖アミノ酸配列のＣ末端に結合して、単鎖インスリン分子を形成してよく、場合によってはＢ鎖のＮ末端が１−１０のアミノ酸で伸長しており；
ＸａａＡ８がＴｈｒで、ＸａａＡ１２がＳｅｒで、ＸａａＡ１３がＬｅｕで、ＸａａＡ１４がＴｙｒであるならば、ＸａａＡ１５はＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び
ＸａａＢ２４がＰｈｅで、ＸａａＢ２５がＰｈｅで、ＸａａＢ２６がＴｙｒで、ＸａａＢ２７がＴｈｒで、ＸａａＢ２８がＰｒｏであるならば、ＸａａＢ２９はＧｌｎである、
請求項１ないし４又は１２−１４の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１８】
次の式３：
Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１
式(３)(配列番号３)
のＡ鎖アミノ酸配列、及び次の式(４)：
ＸａａＢ１-Ｖａｌ-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-Ｈｉｓ-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０
式(４)(配列番号４)
のＢ鎖アミノ酸配列を含み、上記式中、
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ１は独立して、Ｐｈｅ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ３は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり;
場合によってはＣ末端がアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列が、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインがジスルフィド架橋により結合している、請求項１ないし４又は１２−１４の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１９】
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１４は独立して、Ａｓｐ、Ｈｉｓ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ１は独立して、Ｐｈｅ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ３は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２６は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２７は独立して、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２８は独立して、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２９は独立して、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０存在しないか又はＴｈｒであり;
場合によってはＣ末端がアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列が、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインがジスルフィド架橋により結合している、請求項１８に記載のインスリンアナログ。
【請求項２０】
Ｂ鎖のＣ末端が、３−１５のアミノ酸又は３−７のアミノ酸で、Ａ鎖のＮ末端に結合し、単鎖インスリン分子を形成しており、場合によってはＢ鎖のＮ末端が１−１０のアミノ酸で伸長している請求項１ないし１６の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項２１】
請求項１ないし２０の何れか一項に記載の生物活性量のインスリンアナログと製薬的に許容可能な担体を含有する製薬用組成物。
【請求項２２】
請求項１ないし２０の何れか一項に記載の２以上のインスリンアナログを含有し、各アナログが、他の変異体の少なくとも一つに存在しない少なくとも一の変異を有することによって定められた製薬用組成物。
【請求項２３】
製薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と、場合によってはアジュバントをさらに含有する請求項１１ないし２０の何れか一項に記載の製薬用組成物。
【請求項２４】
請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログ、又は請求項２１ないし２３の何れか一項に記載の製薬用組成物を患者に投与することを含む患者における真性糖尿病を治療する方法。
【請求項２５】
請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログ、又は請求項２１ないし２３の何れか一項に記載の製薬用組成物の治療的活性量を、かかる治療を必要とする患者に投与することを含む、哺乳動物の血糖値を低下させる方法。
【請求項２６】
経口投与である請求項２４又は２５の方法。
【請求項２７】
非経口投与である請求項２４又は２５の方法。
【請求項２８】
気管内投与である請求項２４又は２５の方法。
【請求項２９】
高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、Ｘ症候群、及び脂質代謝異常の治療又は予防における医薬として使用される請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項３０】
２型糖尿病の疾患進行の遅延化又は予防における医薬として使用される請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項３１】
食物摂取の低下、β細胞アポトーシスの低下、β細胞機能及びβ細胞量の増加、及び／又はβ細胞に対するグルコース感受性の回復において医薬として使用される請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項３２】
請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログをコードする核酸配列、その誘導体、その部分配列、その変性配列、又はストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列。
【請求項３３】
請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログの前駆体をコードする核酸配列、その誘導体、その部分配列、その変性配列、又はストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列。
【請求項３４】
請求項３２又は３３の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３４の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３５の宿主細胞を培養する工程を含む、インスリンアナログの製造方法。
【請求項３７】
アミノ酸の置換を、部位特異的突然変異誘発により実施する請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログの製造方法。
【請求項３８】
製薬的に許容可能な物質及び／又は賦形剤と請求項１ないし２０の何れか一項に記載のインスリンアナログとを混合することを含む請求項２１ないし２３の何れか一項に記載の製薬用組成物の製造方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法により得られうる製薬用組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
以下は、他の箇所でさらに記載される実施態様の非限定的列挙である：
実施態様１．  親インスリンに対して少なくとも２の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換が、親インスリンの２以上のプロテアーゼ切断部位の内部又はこれに近接して存在しているインスリンアナログであって、場合によっては一又は複数の付加的な変異をさらに含むインスリンアナログ。
実施態様２．  親インスリンに対して増加した溶解度が得られる実施態様１のインスリンアナログ。
実施態様３．  インスリンアナログのＡ鎖が少なくとも一の変異を含み、インスリンアナログのＢ鎖が親インスリンに対して少なくとも一の変異を含む実施態様１−２のいずれか一のインスリンアナログ。
実施態様４．  インスリンアナログが、最初に修飾されたインスリンアナログのプロテアーゼ部位に、少なくとも一のアミノ酸置換をさらに有し、該少なくとも一のアミノ酸置換が、少なくとも一の疎水性アミノ酸が少なくとも一の親水性アミノ酸で置換されているものである実施態様１−３のいずれか一のインスリンアナログ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
本発明のインスリンアナログは、場合によっては、一又は複数の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸でさらに置換されていてもよいさらなるプロテアーゼ部位について分析されてもよい。本発明のインスリンアナログは、親インスリン、最初に修飾されたインスリンと比較して、プロテアーゼ部位に少なくとも２の親水性酸を有し、少なくとも一の疎水性アミノ酸は少なくとも一の親水性アミノ酸で置換されている最初に修飾されたインスリンの新規プロテアーゼ部位に少なくとも一のアミノ酸置換を有するインスリンアナログであってよい。
【外国語明細書】
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