(57)【要約】【課題】サンプルのサイズレンジに適した分離媒体を容易に調製することができるようにする。【解決手段】測定サンプルのサイズレンジが及んでいるサイズ区間の分離度マップを取り出す。取り出したサイズ区間の分離度マップから高分離度領域を抽出する。高分離度領域を抽出した後の各分離度マップを重ね合わせ、高分離度領域の重複する領域を高分離度重複領域とし、その高分離度重複領域内の点の組成を測定サンプルの分離に適した分離媒体の組成として決定する。決定した組成となるように各分離媒体Ａ，Ｂ，Ｃを混合し、測定サンプルの分離に使用する混合分離媒体を調製する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップをその順に実行することにより、測定サンプルの電気泳動分析に使用する分離媒体の組成を決定する電気泳動用分離媒体の組成決定方法。
複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップを、互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ準備する分離度マップ準備ステップ、
測定サンプルのサイズレンジが及んでいる前記サイズ区間の前記分離度マップから測定サンプルの分離に必要な分離度を有する高分離度領域を抽出する高分離度領域抽出ステップ、及び
前記高分離度領域内の点を高分離度点として選び出し、その高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定する混合分離媒体組成決定ステップ。
【請求項２】
測定サンプルのサイズレンジが複数の前記サイズ区間に及んでいる場合は、
前記高分離度領域抽出ステップでは、それらの前記サイズ区間の前記分離度マップそれぞれから前記高分離度領域を抽出し、さらに、それら全ての前記高分離度領域に含まれる領域を高分離度重複領域として抽出し、
前記混合分離媒体組成決定ステップでは、前記高分離度重複領域内の点を高分離度点として選び出し、その高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定する請求項１に記載の電気泳動用分離媒体の組成決定方法。
【請求項３】
複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップが互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ用意された分離度マップ情報を用い、以下のステップをその順に実行することにより測定サンプルの電気泳動分析に使用する分離媒体の組成を決定するように構成された電気泳動用分離媒体の組成決定プログラム。
測定サンプルのサイズレンジが及んでいる前記サイズ区間の前記分離度マップから測定サンプルの分離に必要な分離度を有する高分離度領域を抽出する高分離度領域抽出ステップ、及び
前記高分離度領域内の点を高分離度点として選び出し、その高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定する混合分離媒体組成決定ステップ。
【請求項４】
測定サンプルのサイズレンジが複数の前記サイズ区間に及んでいる場合は、
前記高分離度領域抽出ステップでは、それらの前記サイズ区間の前記分離度マップそれぞれから前記高分離度領域を抽出し、さらに、それら全ての前記高分離度領域に含まれる領域を高分離度重複領域として抽出し、
前記混合分離媒体組成決定ステップでは、前記高分離度重複領域内の点を高分離度点として選び出し、その高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定する請求項３に記載の電気泳動用分離媒体の組成決定プログラム。
【請求項５】
複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップが互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ用意された分離度マップ情報と、請求項３又は４に記載の組成決定プログラムとを格納してコンピュータで使用する記録媒体。
【請求項６】
複数種類の分離媒体をそれぞれ個別に送液する媒体送液機構と、
前記媒体送液機構により送液される分離媒体を混合するためのミキサと、
複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップが互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ用意された分離度マップ情報を保持する分離度マップ情報保持部と、
請求項３又は４に記載の電気泳動用分離媒体の組成決定プログラムを有するとともに、設定された測定サンプルのサイズレンジに基づいて、前記組成決定プログラムにより分離媒体の組成を決定する分離媒体組成決定手段及び決定した組成となるように前記媒体送液機構の動作を制御して混合分離媒体を調製する分離媒体調製手段を備えた制御部と、を備えた分離媒体調製装置。
【請求項７】
前記媒体送液機構は、各分離媒体を送液するためのシリンジポンプ、すべてのシリンジポンプが一端に接続され前記シリンジポンプにより送液される分離媒体を混合するスタティックミキサ及び前記スタティックミキサの他端に接続され前記スタティックミキサで混合されて調製された混合分離媒体を分注するためのプローブを備えている請求項６に記載の分離媒体調製装置。
【請求項８】
前記分離度マップ情報及び組成決定プログラムは請求項５に記載の記録媒体を通じて入力されたものである請求項６又は７に記載の分離媒体調製装置。
【請求項９】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成決定方法により決定された組成の分離媒体を電気泳動チップの分離流路に充填するステップと、
前記分離流路の一端に設けられたサンプルリザーバにサンプルを分注するステップと、
前記分離流路の両端の間に電圧を印加することによりサンプルを前記分離流路中で泳動させ、前記分離流路の所定の位置において泳動する前記サンプルの成分を検出するステップと、を備えた電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、板状部材の内部に分離流路を含む分離流路を有するマイクロ流体デバイスを使用し、その分離流路の一端側に導入されたＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質などのサンプルをその分離流路の両端間に印加した電圧によりその分離流路の他端方向に電気泳動させることにより分離させて分析するマイクロチップ電気泳動分析に関し、具体的には、電気泳動分析の際に分離流路内に充填する分離媒体の組成決定方法、分離媒体の組成決定プログラム、そのプログラムを格納した記録媒体、分離媒体の組成を自動的に決定して調整する分離媒体調製装置及び調製した分離媒体を用いた電気泳動方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流体デバイスによるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の分離分析は、その微細流路内に分子の大きさに応じて移動度を変化させるための分離媒体を充填する必要がある。分離媒体としては、流路内への充填及び置換の容易さから水溶性ポリマー溶液が使用されることが一般的である。そして、分析するサンプルの分子量に応じて水溶性ポリマー溶液の分子量（重合度）と濃度を最適化することが一般に行なわれている。例えば、サンプルが鎖長（以下、サイズともいう）の短いＤＮＡの場合には水溶性ポリマー溶液の分子量を下げて高濃度にし、サンプルが鎖長の長いＤＮＡの場合には水溶性ポリマー溶液の分子量を上げて低濃度にする。
【０００３】
このように、分析するサンプルの分子量によって分離媒体の最適条件が異なるため、アプリケーションに応じた水溶性ポリマーを複数種類用意し、分析するサンプルに適した水溶性ポリマーをユーザが正しく選択する必要があった。例えば、ｄｓＤＮＡのフラグメント解析において２５ｂｐ〜１２０００ｂｐの広い鎖長レンジ（サイズレンジともいう）に渡る分離を実現するためには、少なくとも３種類の水溶性ポリマーを用意しなければならなかった。１種類の水溶性ポリマーだけでは高い分離度が得られるサイズレンジが限られているため、サイズレンジの異なるサンプルの分離を１種類の水溶性ポリマーで高精度に実現することは困難であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のように、１種類の分離媒体のみで広いサイズレンジをもつサンプルの分離やサイズレンジの異なる複数種類のサンプルの分離を行なうことは困難である。そのため、サイズレンジの異なる複数のサンプルの分離を行なう場合には、その都度、ユーザがサンプルのサイズレンジに適した分離媒体に変更する必要があり、作業が煩雑になったり分離媒体の選択を誤ってしまったりするなど問題がある。
【０００５】
ところで、１９９０年代初頭よりセルロース誘導体をＤＮＡフラグメントの分離媒体として用いる例が多数報告されている。セルロース誘導体としては、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。これらはいずれも、分子量や濃度、ｐＨを調整してポリマーネットワークのメッシュサイズを変更することにより、ＤＮＡフラグメントの分離のサイズ特性を調整することがある程度可能である。
【０００６】
そこで、本発明は、サンプルのサイズレンジに適した分離媒体を容易に調製することができるようにすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明にかかる電気泳動用分離媒体の組成決定方法は、以下のステップをその順に実行することにより、測定サンプルの電気泳動分析に使用する分離媒体を調製するものである。
複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップを、互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ準備する分離度マップ準備ステップ、
測定サンプルのサイズレンジが及んでいるサイズ区間の分離度マップから測定サンプルの分離に必要な分離度を有する高分離度領域を抽出する高分離度領域抽出ステップ、及び
高分離度領域内の点を高分離度点として選び出し、その高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定する混合分離媒体組成決定ステップ。
【０００８】
本発明にかかる電気泳動用分離媒体の組成決定プログラムは、複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップが互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ用意された分離度マップ情報を用い、以下のステップをその順に実行することにより測定サンプルの電気泳動分析に使用する分離媒体の組成を決定するように構成されたものである。
測定サンプルのサイズレンジが及んでいるサイズ区間の分離度マップから測定サンプルの分離に必要な分離度を有する高分離度領域を抽出する高分離度領域抽出ステップ、及び
高分離度領域内の点を高分離度点として選び出し、その高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定する混合分離媒体組成決定ステップ。
【０００９】
本発明にかかる記録媒体は、複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップが、互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ用意された分離度マップ情報と、本発明に記載の組成決定プログラムとを格納してコンピュータで使用するものである。
【００１０】
本発明にかかる分離媒体調製装置は、複数種類の分離媒体をそれぞれ個別に送液する媒体送液機構と、媒体送液機構により送液される分離媒体を混合するためのミキサと、複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップが互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ用意された分離度マップ情報を保持する分離度マップ情報保持部と、本発明の電気泳動用分離媒体の組成決定プログラムを有するとともに、設定された測定サンプルのサイズレンジに基づいて、組成決定プログラムにより分離媒体の組成を決定する分離媒体組成決定手段及び決定した組成となるように媒体送液機構の動作を制御して混合分離媒体を調製する分離媒体調製手段を備えた制御部と、を備えたものである。
【００１１】
本発明にかかる電気泳動方法は、本発明の組成決定方法により決定された組成の分離媒体を電気泳動チップの分離流路に充填するステップと、分離流路の一端に設けられたサンプルリザーバにサンプルを分注するステップと、分離流路の両端の間に電圧を印加することによりサンプルを分離流路中で泳動させ、分離流路の所定の位置において泳動するサンプルの成分を検出するステップと、を備えたものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の電気泳動用分離媒体の組成決定方法によれば、複数種類の分離媒体を混合して調製される混合分離媒体の組成とその組成の分離媒体を使用して分析したときに得られる分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップを、互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ準備しておき、測定サンプルのサイズレンジが及んでいるサイズ区間の分離度マップから測定サンプルの分離に必要な分離度を有する高分離度領域を抽出し、その高分離度領域内の高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定するので、測定サンプルの分離に適した分離特性をもつ混合分離媒体を容易に得ることができる。
【００１３】
本発明の組成決定プログラムは、分離媒体の組成と分離度との関係をその平面上の位置によって示す分離度マップが互いに連続する複数のサイズ区間についてそれぞれ用意された分離度マップ情報を用い、測定サンプルのサイズレンジが及んでいるサイズ区間の分離度マップから測定サンプルの分離に必要な分離度を有する高分離度領域を抽出し、高分離度領域内の高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定するように構成されているので、測定サンプルの分離に適した混合分離媒体の組成を迅速に決定することができる。
【００１４】
本発明の記録媒体は、分離度マップ情報と、本発明に記載の組成決定プログラムとを格納しているので、電気泳動分析に使用するコンピュータに組成決定プログラムをインストールすることができる。これにより、組成決定プログラムがインストールされたコンピュータにおいて、測定サンプルの電気泳動分析に適した分離媒体の組成が自動的に決定されるようになる。
【００１５】
本発明の分離媒体調製装置は、媒体送液機構、ミキサ、分離度マップ情報を保持する分離度マップ情報保持部、本発明の組成決定プログラム及び制御部を備え、制御部は、設定された測定サンプルのサイズレンジに基づいて、組成決定プログラムにより分離媒体の組成を決定する分離媒体組成決定手段及び決定した組成となるように媒体送液機構の動作を制御して混合分離媒体を調製する分離媒体調製手段を備えているので、ユーザが測定サンプルのサイズレンジを装置に設定するだけで、そのサイズレンジに適した分離媒体の組成の決定とその組成の分離媒体の調製を自動的に実行することができる。
【００１６】
本発明の電気泳動方法では、本発明の組成決定方法により決定された組成に調製された分離媒体を用いてサンプルの電気泳動を実行するので、サンプルのサイズレンジに適した分離媒体の分離特性により高い分離が得られ、精度の高い分析を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】分離媒体の調製方法の一実施例における分離度マップの作成手順を示すフローチャートである。
【図２】分離媒体の調製方法の一実施例における混合分離媒体の調製手順を示すフローチャートである。
【図３】３種類の分離媒体を使用する場合の組成マトリクスの一例を示す図である。
【図４】同実施例で使用する各分離媒体の分離特性を示すグラフである。
【図５】同実施例の組成マトリクスの各基準位置におけるサイズ区間ごとの分離度を示す表である。
【図６】同実施例のサイズ区間２７１−２８１における分離度マップである。
【図７】同実施例のサイズ区間２８１−３１０における分離度マップである。
【図８】同実施例のサイズ区間２８２−１０７８における分離度マップである。
【図９】同実施例のサイズ区間１０７８−１３５３における分離度マップである。
【図１０】図６〜図９の分離度マップを重ね合わせた図である。
【図１１】同実施例の調製方法により調製した混合分離媒体と分離媒体Ｂ単体の分離特性を示すグラフである。
【図１２】同実施例の調製方法により調製した混合分離媒体を使用したときのフラグメント解析データである。
【図１３】分離媒体調製及び充填装置を備えた電気泳動分析装置の構成の一例を概略的に示すブロック図である。
【図１４】同実施例の電気泳動分析装置を使用して分離度マップを作成する手順の一例を示すフローチャートである。
【図１５】同実施例の電気泳動分析装置によるサンプルの分析手順の一例を示すフローチャートである。
【図１６】分離媒体調製及び充填装置を備えた電気泳動分析装置の構成の他の例を概略的に示すブロック図である。
【図１７】分離媒体調製及び充填装置の一実施例を概略的に示す図である。
【図１８】分離媒体調製及び充填装置の他の実施例を概略的に示す図である。
【図１９】マイクロチップ電気泳動装置の一実施例を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の分離媒体の組成決定方法及び組成決定プログラムにおいて、測定サンプルのサイズレンジが複数のサイズ区間に及んでいる場合は、高分離度領域抽出ステップでは、それらのサイズ区間の分離度マップそれぞれから高分離度領域を抽出し、さらに、それら全ての高分離度領域に含まれる領域を高分離度重複領域として抽出し、混合分離媒体組成決定ステップでは、高分離度重複領域内の点を高分離度点として選び出し、その高分離度点の組成を測定サンプルの電気泳動分析に使用する混合分離媒体の組成として決定するようになっていることが好ましい。これにより、測定サンプルのサイズレンジが広い場合でも、その広いサイズレンジのすべての領域において高い分離特性を示す分離媒体の組成を決定することができる。
【００１９】
本発明の分離媒体調製装置において、媒体送液機構は、各分離媒体を送液するためのシリンジポンプ、すべてのシリンジポンプが一端に接続されシリンジポンプにより送液される分離媒体を混合するスタティックミキサ及びスタティックミキサの他端に接続されスタティックミキサで混合されて調製された混合分離媒体を分注するためのプローブを備えていてもよい。そうすれば、測定サンプルのサイズレンジに適した組成の混合分離媒体をスタティックミキサで調製すると同時に、調製した混合分離媒体をプローブの先端から電気泳動チップの分離流路に充填することができ、分離媒体充填装置としての機能ももたせることができる。
【００２０】
本発明の分離媒体調製装置が有する分離度マップ情報及び組成決定プログラムは、それらが格納された本発明の記録媒体を通じて装置に入力されたものであってもよい。
【００２１】
電気泳動分析に使用する分離媒体の調製方法の一実施例について説明する。
この実施例の調製方法では３種類の水溶性ポリマー（分離媒体）Ａ，Ｂ，Ｃを使用し、測定サンプルのサイズレンジに応じてそれらの分離媒体の混合比率を調整することにより、測定サンプルの分離に適した所望の分離特性をもつ分離媒体を調製する。分離媒体の混合比率は、各分離媒体Ａ，Ｂ，Ｃの分離特性に基づいて作成された分離度マップを使用して決定する。
【００２２】
なお、この実施例では３種類の分離媒体を使用するが、本発明の調製方法はこれに限定されるものではなく、２種類又は４種類以上の分離媒体の混合により所望の分離特性をもつ混合分離媒体を調製するものであってもよい。なお、以下において、複数種類の水溶性ポリマーの混合により調製された分離媒体を「混合分離媒体」と呼ぶ。
【００２３】
まず、混合分離媒体の調製時に使用する分離度マップの作成方法について図１のフローチャートとともに図２〜図５の各図を用いて説明する。
この実施例では、分離媒体Ａ，Ｂ，Ｃとして３種類のヒドロキシルエチルセルロース（以下、ＨＥＣ）を使用する。分離媒体ＡはＨＥＣ（Sigma-Aldrich社の製品、Ｍｗ（重量平均分子量）＝２５００００）の２％溶液であり、分離媒体ＢはＨＥＣ（Sigma-Aldrich社の製品、Ｍｖ（粘度平均分子量）＝７２００００）の０．４％溶液であり、分離媒体ＣはＨＥＣ（Sigma-Aldrich社の製品、Ｍｖ＝１３０００００）の０．２％溶液である。
【００２４】
分離媒体Ａ，Ｂ，Ｃの分離特性を図４に示す。図４は各分離媒体Ａ，Ｂ，Ｃを使用して標準サンプル（ΦＸ１７４−Ｈａｅ３消化物）を電気泳動分離して得られたフラグメント解析データを用いて、各フラグメントサイズにおける分離特性を計算により求めたものをグラフ化したものである。この計算においては、式（１）により近接した２つのピーク（フラグメント）の幅及び高さが同じと仮定したときの分離度（Ｒｓ）を定義し、Ｒｓ≧１が分離が行なわれているか否かの基準とした。また、各サイズ区間のサイズ分解能（％）は、
（サイズ分離能[ｂｐ]／１ピークのサイズ[ｂｐ]）
＝（近接した２ピークのサイズ差[ｂｐ]）／Ｒｓ／（１ピークのサイズ[ｂｐ]）（％）
により求めた。このグラフのサイズ差とは、Ｒｓ＝１となるために必要な２つのピークが現れているフラグメントサイズ（鎖長の大きさ）の差を意味する。
【００２５】
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ここで、ｔは泳動時間、Ｗbはベースラインピーク幅、Ｗhは１／２ピーク高さにおけるピーク幅である。
【００２６】
図４に示されているように、Ａ，Ｂ，Ｃの３種類の分離媒体とも標準サンプル（ΦＸ１７４−Ｈａｅ３消化物）の各フラグメント間の分離が最も良い濃度に最適化されている。しかし、分離能の基準をサイズ差１０％以下と規定すると、分離媒体Ａは長鎖側領域（フラグメントサイズが１０００ｂｐ以上の領域）、分離媒体Ｂは長鎖側領域（フラグメントサイズが８００ｂｐ以上の領域）、分離媒体Ｃは短鎖側領域（フラグメントサイズが２００ｂｐ以下の領域）においてそれぞれ分離能が不足しており、これらの分離媒体Ａ，Ｂ，Ｃ単体では、広いサイズレンジの分離に対応することができない。そこで、３種類の分離媒体Ａ，Ｂ，Ｃを混合することにより、測定サンプルのサイズレンジに適した混合分離媒体を調製する。
【００２７】
まず、図３に示されているように、３種類の分離媒体Ａ，Ｂ，Ｃの混合比率（組成）に応じて基準点１〜１０が略均等に分布した組成マトリクスを作成する。組成マトリクス上の各基準点１〜１０はそれぞれその位置に応じた組成をもっている。
【００２８】
各基準点１〜１０の組成（混合比）は、基準点１が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（１／０／０）、基準点２が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０／１／０）、基準点３が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０／０／１)、基準点４が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０．５／０．５／０）、基準点５が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０／０．５／０．５）、基準点６が（Ａ／Ｂ／Ｃ)＝（０．５／０／０．５）、基準点７が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０．３３／０．３３／０．３３）、基準点８が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０．６７／０．１７／０．１７）、基準点９が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０．１７／０．６７／０．１７）、基準点１０が（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０．１７／０．１７／０．６７）である。
【００２９】
次に、各基準点１〜１０の組成をもつ混合分離媒体をそれぞれ使用して標準サンプル（ΦＸ１７４−Ｈａｅ３消化物）の電気泳動分離を実行し、そのフラグメント解析データに現れる近接フラグメントにより複数のサイズ区間に分割し、それらのサイズ区間ごとの分離度Ｒｓを上記式（１）を用いて求める。図５はフラグメント解析データにおいて各フラグメントにより仕切られた区間（サイズ区間）ごとの分離度Ｒｓを一覧として表示したものである。
【００３０】
図５のデータに基づき、各サイズ区間における各基準位置１〜１０の分離度Ｒｓを組成マトリクス上にマッピングし、図６〜図９に示されているようなサイズ区間ごとの分離度マップを作成する。この分離度マップから一定の分離度以上の領域を抽出することで、そのサイズ区間において一定以上の分離度を有する分離媒体の組成を求めることができる。すべてのサイズ区間についてこのような分離度マップを作成しておき、装置内に設けられた記憶部又は装置に接続されたパーソナルコンピュータの記憶部に保存しておき、混合分離媒体の組成の決定時にその分離度マップを取り出して使用する。
【００３１】
混合分離媒体の調製方法について図２のフローチャートとともに図６〜図１２の各図を用いて説明する。
測定サンプルのサイズレンジが及んでいるサイズ区間の分離度マップを取り出す。この例では、すべてのサイズレンジ（７２ｂｐ〜１３５３ｂｐ（図５参照））において高い分離度をもつ混合分離媒体の調製について説明する。すべてのサイズ区間の分離度マップに対してそれぞれ測定サンプルの分離に必要なしきい値（例えば、Ｒｓ＞１など）を設定し、各分離度マップからそのしきい値を超える高分離度領域を抽出する。
【００３２】
７２ｂｐ〜１１８ｂｐ、１１８ｂｐ〜１９４ｂｐ、１９４ｂｐ〜２３４ｂｐ、２３４ｂｐ〜２７１ｂｐ、３１０ｂｐ〜６０３ｂｐ及び６０３ｂｐ〜８７２ｂｐのサイズ区間については、すべての基準点１〜１０で高い分離度が示されているため、これらの領域についてはマップ全体を高分離度領域として抽出する。
【００３３】
２７１ｂｐ〜２８１ｂｐのサイズ区間では、図６に示されているように、しきい値を０．９としてＲｓ＞０．９の領域を高分離度領域として抽出する。
【００３４】
２８１ｂｐ〜３１０ｂｐのサイズ区間では、図７に示されているように、しきい値を１．５としてＲｓ＞１．５の領域を高分離度領域として抽出する。なお、Ｒｓ≧１であれば十分な分離能を有するため、Ｒｓ＞１としてすべての領域を高分離度領域として抽出してもよい。
【００３５】
８７２ｂｐ〜１０７８ｂｐのサイズ区間では、図８に示されているように、しきい値を１．５としてＲｓ＞１．５の領域を高分離度領域として抽出する。なお、Ｒｓ≧１であれば十分な分離能を有するため、高分離度領域の条件をＲｓ＞１としてもよい。
【００３６】
１０７８ｂｐ〜１３５３ｂｐのサイズ区間では、図９に示されているように、しきい値を１としてＲｓ＞１の領域を高分離度領域として抽出する。
【００３７】
図１０に示されているように、取り出した各サイズ区間において高分離度領域を抽出した後の各サイズ区間の分離度マップを重ね合わせ、高分離度領域の重複している領域を高分離度重複領域とする。ハッチングのなされていない領域が高分離度重複領域である。この高分離度重複領域内において、例えば最も分離度の高い点を高分離度点として選び出し、その高分離度点の組成を混合分離媒体の組成として決定する。そして、高分離度点の組成に基づいてＡ，Ｂ，Ｃを混合し、混合分離媒体を調製する。この混合分離媒体を使用することにより、フラグメントサイズが７２ｂｐ〜１３５３ｂｐの範囲においてＲｓ＞０．９を達成することができる。
【００３８】
上記の高分離度領域内の点に相当する混合比率として（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０．４／０．２／０．４）が挙げられる。この混合比率で調製された混合分離媒体を使用して標準サンプル（ΦＸ１７４−Ｈａｅ３消化物）を電気泳動分析したときのサイズ分離能（Ｒｓ＝１）を図１１に示す。分離媒体Ｂのみを使用した場合には、サイズ差が１０％以下となるフラグメントサイズの範囲が８０ｂｐ〜８００ｂｐであるのに対し、混合比率（Ａ／Ｂ／Ｃ）＝（０．４／０．２／０．４）で調製した混合分離媒体を使用した場合には、サイズ差が１０％以下となるフラグメントサイズの範囲が５０ｂｐ〜１２００ｂｐに拡大している。
【００３９】
上記の分離媒体の調製方法を使用して、２５ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜１０００ｂｐ、１００ｂｐ〜２５００ｂｐ及び１００ｂｐ〜１２０００ｂｐのそれぞれのサイズレンジに最適化した３種類の分離媒体Ｄ，Ｅ，Ｆによる混合分離媒体の混合比を以下に示す。なお、分離媒体ＤはＨＥＣ（Sigma-Aldrich社の製品、Ｍｗ（重量平均分子量）＝２５００００）の２％溶液であり、分離媒体ＥはＨＥＣ（Polysciences社の製品、Ｍｗ＝７２００００（Ｍｎ（数平均分子量）＝１０５０００））の０．３６％溶液であり、分離媒体ＦはＨＥＣ（Polysciences社の製品、Ｍｗ＝１００００００（Ｍｎ＝１６００００））の０．１８％溶液である。
【００４０】
２５ｂｐ〜５００ｂｐ：（Ｄ／Ｅ／Ｆ）＝（１／０／０）
１００ｂｐ〜１０００ｂｐ：（Ｄ／Ｅ／Ｆ）＝（０．２／０．４／０．４）
１００ｂｐ〜２５００ｂｐ：（Ｄ／Ｅ／Ｆ）＝（０／０．５／０．５）
１００ｂｐ〜１２０００ｂｐ：（Ｄ／Ｅ／Ｆ）＝（０／０／１）
【００４１】
図１２は上記の混合比率により調製された混合分離媒体を使用し、それぞれについて２−Ｌｏｇ  ＤＮＡ  ラダー（New England BioLabs社製、１０ｎｇ／μＬ）を電気泳動したときのフラグメント解析データである。各サイズレンジにおける高分子量内部標準マーカ（それぞれ、６８０ｂｐ、２７２０ｂｐ、６１００ｂｐ、２００００ｂｐ）及び各レンジ共通の低分子量内部標準マーカで移動時間を規格化して表示している（２本の縦線）。この図に示されているように、４種類のサイズレンジに応じて分離能が最適化されたため、２５ｂｐ〜５００ｂｐのレンジでは５００ｂｐ−５１７ｂｐ間の分離が達成されている一方で、それより長鎖側の分離能が不十分である。１００ｂｐ〜１０００ｂｐのレンジでは１０００ｂｐまでの分離能が改善され、１００ｂｐ〜１２０００ｂｐレンジにかけて長鎖側の分離能が改善されていることがわかる。
【００４２】
なお、サンプルの分離の基準となる分離度としては、Ｒｓに加えて許容分離時間を含むＲＥＦ値を次式（２）のように定義し、このＲＥＦ値を分離度として分離度マップを作成し、混合分離媒体の組成の決定に使用してもよい。
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ここで、Ｒｉはｉ番目のフラグメントの組のＲｓ、Ｒｉｄは目標とするＲｓ、Ａｉは重み付け係数（すべてのピークが均等であると過程した場合のＲｓ：Ａｉ＝１）、ｔmは最大許容分析時間、ｔLは分析時間の実験値である。
【００４３】
次に、上記の方法により混合分離媒体の調製を自動的に実行する分離媒体調製装置を備えた電気泳動装置の一実施例について図１３を用いて説明する。
この電気泳動装置は、分離媒体を調製する機能とともに所定位置に設置された電気泳動チップ２の分離流路に調製した分離媒体を充填する機能を有する分離媒体調製及び充填機構４と、電気泳動チップ２の分離流路の両端に電気泳動用の電圧を印加する機能とともにサンプルから発せられる蛍光を測定する機能を有する電気泳動分析部６を備えている。この電気泳動装置においては、分離媒体調製及び充填機構４、制御部８及び演算処理部１０が分離媒体調製装置２０を構成している。
【００４４】
分離媒体調製及び充填機構４と電気泳動分析部６は制御部８によりその動作が制御される。制御部８は例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）により実現される演算処理部１０から受け取る分析条件の情報に基づいて分離媒体調製及び充填機構４と電気泳動分析部６の動作を制御する。電気泳動分析部６で得られた測定データは制御部８を介して演算処理部１０に取り込まれる。演算処理部１０は取り込んだ測定データに基づいて種々の処理を実行するデータ処理手段１２のほか、分離媒体組成決定手段１４、分離媒体調製手段１６及び情報記憶部１８を備えている。
【００４５】
情報記憶部１８はユーザにより入力された測定サンプルに関する情報、分析条件等の情報及び情報制御部８を介して取り込まれた測定データを保持するとともに、予め作成された分離度マップを保持している。分離媒体組成決定手段１４は情報記憶部１８に保持されている分離度マップを使用して測定サンプルに適した分離媒体の組成を決定するように構成されている。分離媒体調製手段１６は分離媒体の組成が分離媒体組成決定手段１４により決定されたものとなるように分離媒体調製及び充填機構４の動作条件を設定し、その動作条件に基づいた制御情報を制御部８に発するように構成されている。
【００４６】
分離媒体調製及び充填機構４の具体的な構成の例を図１７及び図１８に示す。
まず、図１７の例は、ダイナミックミキサ３４を備えてダイナミックミキサ３４において分離媒体の調製を行なうものでおり、互いに異なる種類の分離媒体であるポリマー材料Ａ，Ｂ，Ｃをそれぞれダイナミックミキサ３４に送液する送液ポンプ３２ａ，３２ｂ，３２ｃが設けられている。送液ポンプ３２ａ，３２ｂ，３２ｃはダイナミックミキサ３４で混合される混合分離媒体が分離媒体組成決定手段１４（図１３参照）により決定された組成となるように制御部８によってその送液流量が制御される。
【００４７】
ダイナミックミキサ３４で混合され調製された混合分離媒体は液体分注機構３５により電気泳動チップの分離流路に充填される。液体分注機構３５は、水平面内方向と上下方向に移動可能に構成されたプローブ３６及びプローブ３６を介して液の吸入と吐出を行なうシリンジポンプ３８を備えている。プローブ３６の移動動作やシリンジポンプ３８の吸入吐出動作も制御部８により制御される。ダイナミックミキサ３４で調製された混合分離媒体はプローブ３６を介してシリンジポンプ３８により吸入され、その後、プローブ３６が電気泳動チップの所定のリザーバの位置へ移動してプローブ３６の先端から吐出されることにより分離流路内に充填される。
【００４８】
なお、図１７の例では、シリンジポンプ３８は電磁弁４０の切替えによってプローブ３６と洗浄液を貯留した容器４２のいずれか一方に接続されるようになっており、分離流路への分離媒体の充填動作の後、シリンジポンプ３８で洗浄液を吸入しプローブ３６からその洗浄液を所定の廃液ポートに吐出することによりプローブ３６の内面の洗浄を実行できるようになっている。
【００４９】
図１８の例は、ポリマー材料Ａ，Ｂ，Ｃをそれぞれ吸入した状態のシリンジポンプ４４ａ，４４ｂ，４４ｃが設けられており、これらのシリンジポンプ４４ａ，４４ｂ，４４ｃは共通のスタティックミキサ４６の一端に接続され、スタティックミキサ４６の他端がプローブ４８の基端に接続されたものである。シリンジポンプ４４ａ，４４ｂ，４４ｃはスタティックミキサ４６において混合されて調製された混合分離媒体の組成が分離媒体組成決定手段１４（図１３参照）により決定された組成となるように、それぞれ制御部８によってその吐出流量が制御される。プローブ４８は水平面内方向や上下方向への移動が可能であり、その動作は制御部８によって制御される。
【００５０】
混合分離媒体の組成の決定に使用する分離度マップを図１３の電気泳動装置を用いて作成する方法の一例を図１４のフローチャートを用いて説明する。
まず、電気泳動チップ２と３種類のポリマー材料Ａ，Ｂ，Ｃを収容した容器を装置に設置する。図３に示されているような組成マトリクスを作成し、その組成マトリクス上に基準点を設定する。なお、組成マトリクスの作成や基準点の設定は、ユーザが入力するポリマー材料（分離媒体）の種類数に応じて演算処理部１０が自動的に作成するようになっていてもよい。また、組成マトリクスや基準点の情報が情報記憶部１８に予め用意されていてもよい。
【００５１】
組成マトリクス上のすべての基準点について以下の動作を順次実行する。
その基準点に応じた組成の混合分離媒体を調製し、調製した混合分離媒体で標準サンプルについての電気泳動分析を実行する。この電気泳動分析により得られたフラグメントデータを情報記憶部１８に保存する。データ処理手段１２はフラグメントデータにおいて各フラグメントにより区切られたサイズ区間ごとの分離度を算出し、その分離度データを情報記憶部１８に保存する。
【００５２】
すべての基準点について上記の動作を実行することで図５に示されたようなデータが得られ、このデータに基づいて、各サイズ区間の各基準点の分離度を組成マトリクス上にマッピングすることにより図６〜図９に示されるような分離度マップを作成する。作成した分離度マップは情報記憶部１８に保存しておく。
【００５３】
なお、上記の分離度マップの作成と保存の動作は、必ずしも当該電気泳動装置のユーザが実行する必要はない。図１６に示されているように、分離度マップを使用して分離媒体の組成を決定しその組成の分離媒体を調製するための分離媒体調製プログラム２２ａ及び分離度マップなどの分離度情報２２ｂを格納したＣＤ（コンパクトディスク）などからなる記録媒体２２を予め用意しておくことで、これらの機能や情報を記録媒体２２から演算処理部１０にインストールすることができ、それによって演算処理部１０に分離媒体組成決定手段１４や分離媒体調製手段１６、分離情報記憶部１９ａを備えさせることが可能となる。
【００５４】
情報記憶部１８に分離度マップが保存された状態の電気泳動装置を用いたサンプルの分析方法の一例について図１５を用いて説明する。
電気泳動チップ２とポリマー材料Ａ，Ｂ，Ｃを収容した容器を装置に設置した後、ユーザがサンプルのサイズレンジを演算処理部１０に設定すると、分離媒体組成決定手段１４が設定されたサイズレンジに対応する分離度マップを情報記憶部１８から取り出し、それらの分離度マップに分離度のしきい値（例えばＲｓ＞１）を設定して高分離度領域を抽出することにより、そのサイズレンジに適した混合分離媒体の組成を求める。
【００５５】
分離媒体調製手段１６は、求められた組成にするために必要な分離媒体調製及び充填機構４の動作条件を設定しその情報を制御部８へ発することで、分離媒体調製及び充填機構４がそのような混合比率でポリマー材料Ａ，Ｂ，Ｃを混合して混合分離媒体を調製し、分電気泳動チップ２の分離流路に充填する。その後、電気泳動チップのサンプルリザーバにサンプルが入れられ、電気泳動分析部６により分離流路の両端に電圧が印加されることにより、サンプルの電気泳動分析が実行される。
【００５６】
そのサンプルの電気泳動分析が終了した後、次にサイズレンジの同じサンプルの分析を実行する場合には、そのまま同じ分離媒体を使用して次のサンプルについての電気泳動分析が実行される。一方、次にサイズレンジの異なるサンプルを実行する場合には、分離流路の洗浄が行なわれた後、ユーザにより設定された次のサンプルのサイズレンジに適した分離媒体の組成の決定、混合分離媒体の調製及び調製した分離媒体の充填が順次実行された後、電気泳動分析が実行される。
【００５７】
図１９にマイクロチップ電気泳動装置の要部を概略的に示す。この電気泳動装置は、図１７の構成を有する分離媒体調製装置を備え、サンプルのサイズレンジに適した分離特性を有する分離媒体を調製してマイクロチップの分離流路に充填するものである。なお、この例では、分離媒体を調製する機構として図１７のダイナミックミキサを用いたものを使用しているが、図１８のスタティックミキサを用いたものを使用してもよい。
【００５８】
電気泳動チップとしてのマイクロチップ１０５−１〜１０５−４は保持部（図示略）に４個が保持される。マイクロチップ１０５−１〜１０５−４はそれぞれ１サンプルを処理するための１つの分離流路が形成されたものである。
【００５９】
マイクロチップ１０５−１〜１０５−４に分離媒体とサンプルを分注するための分注部３５は、吸引と吐出を行なうシリンジポンプ３８と、分注ノズルを備えたプローブ３６と、洗浄水用の容器４２とを備えており、プローブ３６と洗浄水用の容器４２は三方電磁弁４０を介してシリンジポンプ３８に接続されている。サンプルはマイクロタイタプレート１１２上の穴に収容されて、分注部３５によりマイクロチップ１０５−１〜１０５−４に分注される。分離媒体はダイナミックミキサ３４においてサンプルのサイズレンジに応じて調製され、プローブ３６により吸入されてマイクロチップマイクロチップ１０５−１〜１０５−４のいずれかの分離流路の一端のリザーバに分注される。１１４はプローブ３６を洗浄するための洗浄部であり、洗浄水が溢れている。
【００６０】
分注部３５は、三方電磁弁４０をプローブ３６とシリンジポンプ３８が接続される方向に接続して分離媒体又は試料をプローブ３６に吸引し、シリンジポンプ３８によりマイクロチップ１０５−１〜１０５−４のいずれかの分離流路に吐出する。プローブ３６を洗浄する際は三方電磁弁４０をシリンジポンプ３８と洗浄水用の容器４２を接続する方向に切り替え、シリンジポンプ３８に水を吸引した後、プローブ３６を洗浄部１１４の水に浸し、三方電磁弁４０をシリンジポンプ３８とプローブ３６を接続する側に切り替えてプローブ３６の内部から洗浄水を吐出することにより洗浄を行なう。
【００６１】
マイクロチップ１０５−１〜１０５−４の分離流路の一端のリザーバに分注された分離媒体を流路内に充填するために、４つのマイクロチップ１０５−１〜１０５−４についてバッファ充填・排出ユニット１１６が共通に備えられている。バッファ充填・排出ユニット１１６はマイクロチップ１０５−１〜１０５−４のいずれかの分離流路の一端のリザーバ上に空気吐出口１１８を気密を保って押し付け、他のリザーバに吸引ノズル１２２を挿入し、空気吐出口１１８から空気を吹き込んで分離媒体を分離流路に押し込むとともに、他のリザーバから溢れた分離媒体をノズル１２２から吸引ポンプ１２３により外部へ排出する。
【００６２】
各マイクロチップ１０５−１〜１０５−４の分離流路に独立して泳動用の電圧を印加するために、マイクロチップ１０５−１〜１０５−４ごとに独立した電気泳動用高圧電源１２６（１２６−１〜１２６−４）が設けられている。
【００６３】
マイクロチップ１０５−１〜１０５−４の分離流路１５５で電気泳動分離されたサンプル成分を検出するための蛍光測定部１３１は、マイクロチップ１０５−１〜１０５−４ごとに設けられてそれぞれの分離流路の一部に励起光を照射するＬＥＤ（発光ダイオード）１３０−１〜１３０−４と、分離流路を移動するサンプル成分がＬＥＤ１３０−１〜１３０−４からの励起光により励起されて発生した蛍光を受光する光ファイバ１３２−１〜１３２−４と、それらの光ファイバ１３２−１〜１３２−４からの蛍光から励起光成分を除去し、蛍光成分のみを透過させるフィルタ１３４を介して蛍光を受光する光電子増倍管１３６とを備えている。ＬＥＤ１３０−１〜１３０−４を互いに時間をずらして発光させることにより、１つの光電子増倍管１３６で４つの蛍光を識別して検出することができる。
【符号の説明】
【００６４】
２      電気泳動チップ
４      分離媒体調製及び充填機構
６      電気泳動分析部
８      制御部
１０      演算処理部
１２      データ処理手段
１４      分離媒体組成決定手段
１６      分離媒体調製手段
１８，１９      情報記憶部
１９ａ      分離度情報記憶部
２０      分離媒体充填装置
２２      記録媒体
２２ａ      分離媒体調製プログラム
２２ｂ      分離度情報
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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