(57)【要約】【課題】バイオフィルムを速やかにかつ穏やかに破砕・除去するバイオフィルム除去剤およびそれを用いるバイオフィルム除去方法を提供する。また、抗菌薬を使わないバイオフィルム形成を防止するバイオフィルム形成抑制剤およびそれを用いる方法を提供する。【解決手段】特定のイオン液体は、バイオフィルムの除去作用およびバイオフィルム形成抑制作用を有し、バイオフィルムの除去剤およびバイオフィルム形成抑制として有用である。【選択図】図１
2014043568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：Ｋ＋Ａ−
「式中、Ｋ＋は、ヒドロキシテトラアルキルアンモニウムカチオンまたはＮ−アルキルイミダゾリウムカチオンを、
Ａ−は、ヒドロキシカルボン酸アニオン、カルボン酸アニオン、オキソカルボン酸アニオン、テトラゾール化合物アニオン、トリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオンまたはアレーンスルホン酸アニオンのいずれか１つを、それぞれ意味する。」
で示されるイオン液体を含有するバイオフィルム除去剤
【請求項２】
Ｋ＋が、ヒドロキシテトラアルキルアンモニウムカチオンまたはＮ−アルキルイミダゾリウムカチオンであり、Ａ−が、ヒドロキシカルボン酸アニオン、カルボン酸アニオン、オキソカルボン酸アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオンのいずれか１つである請求項１記載のバイオフィルム除去剤
【請求項３】
一般式：Ｋ＋Ａ−
「式中、Ｋ＋は、ヒドロキシテトラアルキルアンモニウムカチオンまたはＮ−アルキルイミダゾリウムカチオンを、
Ａ−は、ヒドロキシカルボン酸アニオン、カルボン酸アニオン、オキソカルボン酸アニオン、テトラゾール化合物アニオン、トリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオンまたはアレーンスルホン酸アニオンのいずれか１つを、それぞれ意味する。」
で示されるイオン液体を含有するバイオフィルム形成抑制剤
【請求項４】
Ｋ＋が、ヒドロキシテトラアルキルアンモニウムカチオンまたはＮ−アルキルイミダゾリウムカチオンであり、Ａ−が、ヒドロキシカルボン酸アニオン、カルボン酸アニオン、オキソカルボン酸アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオンのいずれか１つである請求項３記載のバイオフィルム形成抑制剤
【請求項５】
請求項１または２に記載のバイオフィルム除去剤をバイオフィルムに作用させることを特徴とするバイオフィルムの除去方法。
【請求項６】
請求項３または４に記載のバイオフィルム形成抑制剤を、物質表面に作用させることを特徴とするバイオフィルム形成抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルム除去剤およびバイオフィルム形成抑制剤並びにバイオフィルム除去法およびバイオフィルム形成抑制法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌・真菌等は物体表面に付着しバイオフィルムを形成する。バイオフィルムは菌膜または生体膜とも言い、内部には嫌気性菌から好気性菌まで様々な種類の微生物が存在する。表面は、細菌や多糖体とその副産物の集合体であるマトリクスに覆われ、粘着性がある。
【０００３】
バイオフィルムは様々な環境で形成される。バイオフィルムが形成される場所の例として、口腔内などの生体内や、カテーテル内部、キッチンのぬめり、工場の配水管内部などである。形成されたバイオフィルムは汚染、金属の腐食の原因となったり、病原菌の感染源になったり虫歯・歯周病の原因になったりするため、臨床現場や日常生活でさまざまな問題を引き起こす。したがって、バイオフィルムを除去する技術の開発が必要であり、現在、特許文献１から３のような様々な薬剤・方法が開発されている。
【０００４】
一方、イオン液体は、イオンだけから構成される室温で液体の塩である。イオン液体は、イオン同士が静電的な相互作用で束縛されているため、液体であっても蒸気圧がほとんどゼロである。また、難燃性であり、低粘性で、導電性が高く、幅広い温度領域で液体である。
【０００５】
キノリウムまたはイソキノリウムをカチオン種とするイオン液体が抗菌剤として使用できることが知られている（特許文献４）。また、ペル酸アニオン由来のイオン液体が、バイオフィルム除去を目的とした製品に使用できることが知られている（特許文献５）。また、イオン液体は、電子顕微鏡で観察する標本の作製において、試料観察面のチャージアップを防止する液状媒体として使用されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−０９２３２０
【特許文献２】特開２０１２−１２６７５８
【特許文献３】特開２０１１−２５１９７７
【特許文献４】特表２０１１−５１７６８２
【特許文献５】特表２００８−５３１４９９
【特許文献６】ＷＯ２００７／０８３７５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
バイオフィルムは、物体表面に強固に付着するため、物理的方法で掻き取って除去することも困難である。また、表面が三次元構造のマトリクスで覆われているため、内部の微生物に薬剤などが直接接触することができず、容易に除去することができない。歯垢のような生体に形成されたバイオフィルムの場合は、穏やかなブラッシングや副作用の少ない薬剤を使う必要があるため、除去はさらに困難である。
【０００８】
医療臨床現場においては、カテーテル内になどに黄色ブドウ球菌や緑膿菌がバイオフィルムを形成することがある。バイオフィルムができあがると、除去が困難なため持続感染の感染源となる。そこで、医療器具等に付着した微生物がバイオフィルムを形成することを防止する方法が求められている。抗菌薬は細菌の増殖を阻止しあるいは細菌を死滅させるためバイオフィルム形成を阻止できる。しかし、抗菌薬には耐性菌が出現するため、抗菌薬に依存したバイオフィルム形成防止は短期的な効果しか得られず、耐性菌の出現により事態がより悪化する場合がある。
【０００９】
また、バイオフィルム形成過程を分子生物学的、微生物学的、生化学的、構造生物学的に解析する場合、バイオフィルムを速やかにかつ穏やかに破砕する必要があるが、現在のところそれに適した方法や試薬はない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討の結果、特定のイオン液体がバイオフィルムの除去及びバイオフィルムの形成阻害する効果があることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、一般式：Ｋ＋Ａ−  （１）
「式中、Ｋ＋は、ヒドロキシテトラアルキルアンモニウムカチオンまたはＮ−アルキルイミダゾリウムカチオンを、
Ａ−は、ヒドロキシカルボン酸アニオン、カルボン酸アニオン、オキソカルボン酸アニオン、テトラゾール化合物アニオン、トリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオンまたはアレーンスルホン酸アニオンのいずれか１つを、それぞれ意味する。」
で示されるイオン液体を含有するバイオフィルム除去剤およびバイオフィルム形成抑制剤である。
また、本発明は、上記、一般式（１）のイオン液体を利用したバイオフィルム除去法およびバイオフィルム形成抑制法である。
【発明の効果】
【００１１】
バイオフィルムは本発明のイオン液体が接触することで速やかに除去することができる。また、細菌が物体表面に付着する過程または／およびバイオフィルムが形成する過程において本発明のイオン液体が接触することでバイオフィルムの形成を阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ガラス棒に付着した大腸菌のバイオフィルムをＣｈｏｌｉｎｅ  Ｌ−（＋）−ｌａｃｔａｔｅ溶液に浸潤させた際のＳＥＭ画像である。
【図２】ガラス棒に付着した大腸菌のバイオフィルムをＣｈｏｌｉｎｅ  Ｌ−（＋）−ｌａｃｔａｔｅ溶液で浸潤させた後、ミキサで撹拌した際の、ガラス棒のＳＥＭ画像である。
【図３】ガラス棒に付着した大腸菌のバイオフィルムをＣｈｏｌｉｎｅ  Ｌ−（＋）−ｌａｃｔａｔｅ溶液で浸潤させた後、ミキサで撹拌した際の、溶液のＳＥＭ画像である。
【図４】ガラス棒に付着した大腸菌のバイオフィルムをＣｈｏｌｉｎｅ  Ｌ−（＋）−ｌａｃｔａｔｅ溶液で浸潤させた溶液から回収したＤＮＡ量をリアルタイムＰＣＲで測定したグラフである。
【図５】ガラス棒をＣｈｏｌｉｎｅ  Ｌ−（＋）−ｌａｃｔａｔｅを含む大腸菌溶液に浸潤させた後、２７℃，６０ｈ静置した際のＳＥＭ画像である。
【図６】大腸菌のバイオフィルムを各種イオン液体に１時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図７】大腸菌のバイオフィルムを各種イオン液体に２４時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図８】緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのバイオフィルムを各種イオン液体に１時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図９】緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのバイオフィルムを各種イオン液体に２４時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図１０】緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｙｈａｂｉｔａｎｓのバイオフィルムを各種イオン液体に１時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図１１】緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｙｈａｂｉｔａｎｓのバイオフィルムを各種イオン液体に２４時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図１２】緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓのバイオフィルムを各種イオン液体に２４時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図１３】緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのバイオフィルムを各種イオン液体に２４時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図１４】黄色ブドウ球菌近縁種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのバイオフィルムを各種イオン液体に２４時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図１５】黄色ブドウ球菌近縁種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓのバイオフィルムを各種イオン液体に２４時間浸潤させた際の電子顕微鏡画像である。
【図１６】様々な濃度の各種イオン液体中で大腸菌を培養した際の増殖曲線である。
【図１７】様々な濃度の各種イオン液体中で大腸菌を培養した際の電子顕微鏡画像である。
【図１８】様々な濃度の各種イオン液体を含有したＬＢ培養液で大腸菌がバイオフィルムを形成するか観察した際の電子顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のバイオフィルム除去剤およびバイオフィルム形成抑制剤に用いられるイオン液体は、以下の一般式（１）で表されるイオン液体である。
Ｋ＋Ａ−  （１）
「式中、Ｋ＋は、ヒドロキシテトラアルキルアンモニウムカチオンまたはＮ−アルキルイミダゾリウムカチオンを、Ａ−は、ヒドロキシカルボン酸アニオン、カルボン酸アニオン、オキソカルボン酸アニオン、テトラゾール化合物アニオン、トリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオンまたはアレーンスルホン酸アニオンのいずれか１つを、それぞれ意味する。」
【００１４】
ヒドロキシテトラアルキルアンモニウムカチオンとしては、例えば、２−ヒドロキシエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（コリン）、３−ヒドロキシプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなどが挙げられる。
Ｎ−アルキルイミダゾリウムカチオンとしては、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムなどのＷＯ２００７／０８３７５６に記載のカチオンが挙げられる。
【００１５】
ヒドロキシカルボン酸アニオンとしては、乳酸アニオン、ヒドロキシ酪酸アニオンなどが挙げられる。
カルボン酸アニオンとしては、メタン酸アニオン、エタン酸アニオン、ペンタン酸アニオン、ヘキサン酸アニオンなどが挙げられる。
オキソカルボン酸アニオンとしては、レブリン酸アニオンなどが挙げられる。
【００１６】
テトラゾール化合物アニオン、トリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオンまたはアレーンスルホン酸アニオンとしては、例えば、ＷＯ２００７／０８３７５６に記載のアニオンが挙げられる。
【００１７】
一般式（１）において、好ましいものとしては、Ｋ＋がコリンカチオンでＡ−が乳酸アニオン、Ｋ＋が１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンでＡ−がテトラフルオロホウ酸アニオン、Ｋ＋が１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンでＡ−がテトラフルオロホウ酸アニオン、Ｋ＋が１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンでＡ−がビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドアニオン、Ｋ＋が１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンでＡ−がビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドアニオン、Ｋ＋が１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンでＡ−がヘキサフルオロリン酸アニオン、Ｋ＋が１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンでＡ−が乳酸アニオン、Ｋ＋がコリンカチオンでＡ−がヘキサン酸アニオン、Ｋ＋がコリンカチオンでＡ−がレブリン酸アニオン、Ｋ＋がコリンカチオンでＡ−がペンタン酸アニオン、Ｋ＋が１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンでＡ−がメタン酸アニオン、Ｋ＋が１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンでＡ−がエタン酸アニオンであるものが挙げられる。
【００１８】
一般式（１）のイオン液体は組成物としてもよく、例えば、バイオフィルムの除去・形成抑制作用を増強する成分として知られているポリオキシアルキレン−アルキルエーテル、アルキルポリグリコシド、トリアルキルアミンオキサイド、多価アルコールが添加されていてもよい。さらに、一般式（１）のイオン液体の組成物は、溶剤、界面活性剤、殺菌剤、抗菌剤、洗浄剤、アルカリ剤、アルカリビルダー、金属捕捉剤、分散剤等を含有していてもよく、さらには、例えば、芳香成分や消臭成分等の機能性成分、再付着防止剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、粘度調整剤、懸濁剤、防腐剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、酵素、顔料や染料等の色素、蛍光剤、賦形剤、ソイルリリース剤、漂白剤、漂白活性化剤、粉末化剤、造粒剤、コーティング剤などを含有していてもよい。
【００１９】
一般式（１）のイオン液体またはその組成物の剤型は、特に限定されず、用途、目的等に応じて適宜選択すればよく、例えば、溶剤に溶かした溶液、固体、ゲル状、乳化・分散状、粉末状、エアゾールなどが挙げられる。
また、バイオフィルム除去剤／バイオフィルム形成抑制剤の濃度を高めた濃縮状態で、保管、搬送し、使用時に適宜希釈することとしてもよい。
【００２０】
上記バイオフィルム除去剤およびその組成物並びにバイオフィルム形成抑制剤およびその組成物の使用対象は、バイオフィルムが形成される場所であれば特に限定されず、
口腔内（歯）、台所、厨房、浴室など水回り用具、トイレの便器・排水溝、排水管、食品製造または飲料製造プラント、産業用の冷却タワーなどの冷却水系、脱塩装置、プール、人工池などなどの循環水系路、内視鏡、カテーテル、人工透析機などの医療機器などが挙げられる。
【００２１】
上記バイオフィルム除去剤およびその組成物並びにバイオフィルム形成抑制剤およびその組成物を作用させる対象となるバイオフィルムは、微生物が形成したものであれば、特に限定されないが、微生物として、大腸菌、緑膿菌などのグラム陰性菌や黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌を含む真性細菌、古細菌、原生生物、真菌類などが挙げられる。
【００２２】
本発明のバイオフィルム除去剤を、バイオフィルムを除去するために用いるには、一般式（１）のイオン液体を、バイオフィルムに作用させればよい。作用方法として、バイオフィルムが形成された物体を、イオン液体またはそれを含有する組成物に浸潤・浸漬する、イオン液体またはそれを含有する組成物で洗浄する、イオン液体またはその組成物を塗布・散布するなどの手段を用いればよい。好ましい作用方法としては、バイオフィルムが形成された物体を、イオン液体またはそれを含有する組成物に浸潤・浸漬および／または洗浄することが挙げられる。
また、上記バイオフィルム除去剤またはその組成物を作用させた後は、必要に応じて、水などを用いてバイオフィルム剤またはその組成物を除去されたバイオフィルムとともに洗い流すことが好ましい。
【００２３】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤をバイオフィルムの形成を抑制するために用いるには、一般式（１）のイオン液体をまたはその組成物を、対象とする物体の表面、に、一定時間（例えば、１分〜１０分）に作用させればよい。作用方法として、対象とする物体を、イオン液体またはそれを含有する組成物に浸潤・浸漬する、イオン液体またはそれを含有する組成物で洗浄する、イオン液体またはその組成物を塗布するなどの手段を用いればよい。好ましい接触方法としては、対象とする物体を、イオン液体またはそれを含有する組成物に浸潤および／または塗布することが挙げられる。
【００２４】
以下に実施例で本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
＜バイオフィルム除去効果＞
ガラス棒を４本用意し大腸菌液につけ，２７℃，６０ｈ静置し，バイオフィルムがガラス棒に形成したのを確認した。次いで，バイオフィルムが形成したそれらのガラス棒を，イオン液体Ｃｈｏｌｉｎｅ  Ｌ−（＋）−ｌａｃｔａｔｅ（以下，ＣＬまたはＣｈＬａｃ）の０．１％溶液，１％溶液，１０％溶液に５秒浸潤した。それらと，比較のために用意した未処理のバイオフィルム付きガラス棒を，固定・脱水した。その後，ＴＩブルーにより導電処理してから低真空ＳＥＭで観察した。図１が得られた画像である。１％ＣＬ溶液で処理した際に最も明瞭なバイオフィルム内部の菌体の画像を得ることができた。すなわち，菌体を覆っていたバイオフィルム表面のマトリクスが除去できたことを確認した。
【００２５】
なお、１０％ＣＬ溶液で処理した画像において、内部の菌体が不鮮明になるのは、ＣＬ溶液が内部菌体にまで効果を及ぼすためである。したがって、内部菌体の破壊を望む場合は、濃度の高いＣＬ溶液を使用すればよい。
【００２６】
実施例２
＜バイオフィルムの崩壊＞
ガラス棒を２本用意し大腸菌液につけ，２７℃，６０ｈ静置し，バイオフィルムがガラス棒に形成したのを確認した。次いで，バイオフィルムが形成したガラス棒の１本を，ＣＬの１％溶液に１０分間浸潤した後、ボルテックスミキサで１秒間撹拌した。比較のために、もう１本のバイオフィルム付きガラス棒を生理食塩水に１０分間浸潤した後、ボルテックスミキサで１秒間撹拌した。これらを固定・脱水した後、ＴＩブルーにより導電処理してからガラス棒表面を低真空ＳＥＭで観察した。得られた画像が図２である。上段がガラス棒の画像であり、下段がガラス棒表面のバイオフィルムを観察した画像である。生理食塩水で処理したものと比較すると、１％ＣＬ処理によりバイオフィルムがガラス棒から脱落していることが確認できた。
【００２７】
また、バイオフィルム付きガラス棒を浸潤した後の液体中の固形物をＴＩブルーにより導電処理してから低真空ＳＥＭで観察した。得られた画像が図３である。生理食塩水中にはバイオフィルムの破片が確認できたが、１％ＣＬ溶液中には分散した大腸菌が確認できた。すなわち，バイオフィルムが崩壊し個々の菌体に分散した。従って、ＣＬ溶液によって、バイオフィルムのマトリクスは、表面のみならず内部まで崩壊させ剥がすことができる。
【００２８】
実施例３
＜バイオフィルム内の菌体からのＤＮＡ回収＞
実施例２と同じように、ガラス棒を複数本用意し大腸菌液につけ，２７℃，６０ｈ静置し，バイオフィルムがガラス棒に形成したのを確認した。次いで，バイオフィルムが形成しガラス棒を，ＣＬの１％溶液に１０分間浸潤した後、ボルテックスミキサで１秒間撹拌した。比較のために、別のバイオフィルム付きガラス棒を生理食塩水に１０分間浸潤した後、ボルテックスミキサで１秒間撹拌した。
浸潤した後の液体中の固形物を遠心分離装置にて沈殿させ、フェノール試薬を用いて沈殿物からＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ量はリアルタイムＰＣＲ装置を用いて解析した。増幅の対象は大腸菌がコードするｒＤＮＡ領域とした。図４は、ＤＮＡ量のグラフである。これによると、多くの場合、生理食塩水の沈殿物から回収したＤＮＡよりも１％ＣＬ溶液の沈殿物から回収したＤＮＡの方が多い。すなわち，１％ＣＬによりバイオフィルムが崩壊され、菌体が分散し、菌体からのＤＮＡ回収効率が上昇した。
【００２９】
実施例４
＜バイオフィルムの形成阻害効果＞
ガラス棒を４本用意し、０．１％，１％，１０％のＣＬを含む大腸菌液、およびＣＬを含まない大腸菌液につけ，２７℃，６０ｈ静置した。次いで，それらのガラス棒を，固定・脱水した後，ＴＩブルーにより導電処理してから低真空ＳＥＭで観察した。得られた画像が図５である。１％ＣＬを含む大腸菌液に浸潤したガラス棒上では成熟したバイオフィルムは確認できなかった。また、１０％ＣＬを含む大腸菌液に浸潤したガラス棒上では菌自体の付着がほぼ認められず、バイオフィルムの形成が阻害できた。
【００３０】
実施例５
＜各種イオン液体による大腸菌のバイオフィルム崩壊効果＞
大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３を釣菌しルリア−ベルターニ（ＬＢ）培養液０．５ｍｌに植菌し３７℃で６時間振盪培養した。分光光度計で培養した菌液の６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６５０）を測定し、ＯＤ６５０が０．１になるようにＬＢ培養液を加え調整した。調整した菌液６００μｌを２４ウェルプレートに分注し、２７℃で６０時間静置培養しウェウプレートにバイオフィルムを形成させた。
バイオフィルム形成後、ウェルプレートに分注した菌液を緩やかにピペットマンで吸い上げ除去し、１．０ｍｌ滅菌水を分注した。中で激しくピペッティングし、ウェル側面に形成されているバイオフィルムを剥がし、バイオフィルム片懸濁液を作った。バイオフィルム片懸濁液を３００μlずつマイクロチューブに入れ回転数９ｋｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を除去した。
その後それぞれのマイクロチューブに、１−ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（以下，ＢＭＩｍＢＦ４），１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（以下，ＥＭＩｍＢＦ４），１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ（以下，ＥＭＩｍＬａｃ），Ｃｈｏｌｉｎｅ  ｈｅｘａｎｏａｔｅ（以下，ＣｈＨｅｘ），ＣｈＬａｃ，Ｃｈｏｌｉｎｅ  ｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ（以下，ＣｈＬｅｖ），Ｃｈｏｌｉｎｅ  ｖａｌｅｒａｔｅ（以下，ＣｈＶａｌ）の各イオン液体の原液を２００μｌ加え，１時間または２４時間静置してバイオフィルムをイオン液体に浸潤させた。比較のために、遠心分離後に上清を除去したバイオフィルム片懸濁液に蒸留水（ｄＨ２Ｏ）を２００μｌ加えた物も用意し，１時間または２４時間静置した。
各試料を静置後、滅菌水を４００μｌ加え緩やかに２０回転倒混和したうえで、回転数９ｋｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を除去した。次に滅菌水を２００μｌ加えスライドガラスに滴下した。作成した各試料をグルタルアルデヒドで固定し、エタノールで脱水し、ＴＩブルーで２０分間染色した後、日立製卓上低真空走査型電子顕微鏡  Ｍｉｎｉｓｃｏｐｅ  ＴＭ１０００で観察し、バイオフィルムの崩壊効果を評価した。
図６が大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３によるバイオフィルムを各イオン液体原液または蒸留水に１時間浸潤した際に得られた画像，図７が２４時間浸潤した際に得られた画像である。
【００３１】
蒸留水に浸潤した場合と比べ、各イオン液体に浸潤した画像では、広い領域でバイオフィルム内部の菌体の画像を得ることができた。すなわち，菌体を覆っていたバイオフィルム表面のマトリクスが除去できたことを確認した。特に、ＣｈＬａｃ及びＣｈＶａｌに１時間浸潤した物は、バイオフィルムが崩壊し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果が認められた。各イオン液体へ２４時間浸潤すると、ＣｈＬａｃ，ＣｈＶａｌに加えＢＭＩｍＢＦ４やＥＭＩｍＢＦ４でもバイオフィルムの崩壊が進行し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果が確認できた。また、ＣｈＬｅｖに２４時間浸潤した物については、菌体が凝縮・硬化した。
【００３２】
実施例６
＜各種イオン液体による緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのバイオフィルム崩壊効果＞
実施例５と同様の実験を，緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓについて行った。図８が緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓによるバイオフィルムを各イオン液体または蒸留水に１時間浸潤した際に得られた画像，図９が２４時間浸潤した際に得られた画像である。
【００３３】
蒸留水に浸潤した場合と比べ、各イオン液体に浸潤した画像では、広い領域でバイオフィルム内部の菌体の画像を得ることができた。すなわち，菌体を覆っていたバイオフィルム表面のマトリクスが除去できたことを確認した。特に、ＣｈＬａｃ及びＣｈＶａｌに１時間浸潤した物は、バイオフィルムが崩壊し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果があった。各イオン液体へ２４時間浸潤したものでは、ＣｈＬａｃ、ＣｈＶａｌに加えＥＭＩｍＢＦ４やＣｈＬｅｖでもバイオフィルムの崩壊が進行し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果が確認できた。
【００３４】
実施例７
＜各種イオン液体による緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｙｈａｂｉｔａｎｓのバイオフィルム崩壊効果＞
実施例５と同様の実験を，緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｙｈａｂｉｔａｎｓについて行った。図１０が緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｙｈａｂｉｔａｎｓによるバイオフィルムを各イオン液体または蒸留水に１時間浸潤した際に得られた画像，図１１が２４時間浸潤した際に得られた画像である。
【００３５】
蒸留水に浸潤した場合と比べ、各イオン液体に浸潤した画像では、広い領域でバイオフィルム内部の菌体の画像を得ることができた。すなわち，菌体を覆っていたバイオフィルム表面のマトリクスが除去できたことを確認した。特に、ＣｈＬａｃ及びＣｈＶａｌに１時間浸潤した物は、バイオフィルムが崩壊し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果があった。各イオン液体へ２４時間浸潤したものでは、ＣｈＬａｃ及びＣｈＶａｌに加え、ＥＭＩｍＢＦ４やＣｈＨｅｘでもバイオフィルムの崩壊が進行し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果が確認できた。また、ＣｈＬｅｖに１時間または２４時間浸潤した物については、菌体が凝縮・硬化した。
【００３６】
実施例８
＜各種イオン液体による緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓのバイオフィルム崩壊効果＞
実施例５と同様の実験を，緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓについて行った。図１２が緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓによるバイオフィルムを各イオン液体または蒸留水に２４時間浸潤した際に得られた画像である。
【００３７】
蒸留水に浸潤した場合と比べ、各イオン液体に浸潤した画像では、広い領域でバイオフィルム内部の菌体の画像を得ることができた。すなわち，菌体を覆っていたバイオフィルム表面のマトリクスが除去できたことを確認した。特に、ＢＭＩｍＢＦ４、ＥＭＩｍＢＦ４、ＣｈＨｅｘ、ＣｈＬａｃ及びＣｈＬｅｖに浸潤した物は、バイオフィルムが崩壊し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果があった。
【００３８】
実施例９
＜各種イオン液体による緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのバイオフィルム崩壊効果＞
イオン液体ＣｈＨｅｘ、ＣｈＬａｃ、ＣｈＬｅｖ、ＣｈＶａｌを準備し、実施例５と同様の実験を、緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａについて行った。図１３が緑膿菌近縁種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａによるバイオフィルムを各イオン液体または蒸留水に２４時間浸潤した際に得られた画像である。
【００３９】
蒸留水に浸潤した場合と比べ、各イオン液体に浸潤した画像では、広い領域でバイオフィルム内部の菌体の画像を得ることができた。すなわち，菌体を覆っていたバイオフィルム表面のマトリクスが除去できたことを確認した。特に、ＣｈＨｅｘ、ＣｈＬａｃ及びＣｈＶａｌに浸潤した物は、バイオフィルムが崩壊し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果があった。また、ＣｈＬｅｖに浸潤した物については、菌体が凝縮・硬化した。
【００４０】
実施例１０
＜各種イオン液体による黄色ブドウ球菌近縁種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのバイオフィルム崩壊効果＞
実施例５と同様の実験を、黄色ブドウ球菌近縁種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについて行った。図１４が黄色ブドウ球菌近縁種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによるバイオフィルムを各イオン液体または蒸留水に２４時間浸潤した際に得られた画像である。
【００４１】
蒸留水に浸潤した場合と比べ、各イオン液体に浸潤した画像では、広い領域でバイオフィルム内部の菌体の画像を得ることができた。すなわち，菌体を覆っていたバイオフィルム表面のマトリクスが除去できたことを確認した。特に、ＥＭＩｍＬａｃ、ＣｈＨｅｘ、ＣｈＬａｃ、ＣｈＬｅｖ、ＣｈＶａｌに浸潤した物は、バイオフィルムが崩壊し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果があった。
【００４２】
実施例１１
＜各種イオン液体による黄色ブドウ球菌近縁種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓのバイオフィルム崩壊効果＞
実施例５と同様の実験を、黄色ブドウ球菌近縁種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓについて行った。図１５が黄色ブドウ球菌近縁種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓによるバイオフィルムを各イオン液体または蒸留水に２４時間浸潤した際に得られた画像である。
【００４３】
蒸留水に浸潤した場合と比べ、各イオン液体に浸潤した画像では、広い領域でバイオフィルム内部の菌体の画像を得ることができた。すなわち，菌体を覆っていたバイオフィルム表面のマトリクスが除去できたことを確認した。特に、ＢＭＩｍＢＦ４、ＣｈＨｅｘ、ＣｈＬａｃ、ＣｈＶａｌに浸潤した物は、バイオフィルムが崩壊し、蒸留水に浸潤させていた物と比べて菌体もばらばらになったり、バイオフィルム片が明らかに小さくなったりしており、顕著な効果があった。また、ＣｈＬｅｖに浸潤した物については、菌体が凝縮・硬化した。
【００４４】
実施例１２
＜各種イオン液体による大腸菌のバイオフィルム形成抑制効果＞
大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３のシングルコロニーを釣菌しＬＢ培養液０．５ｍｌに植菌し３７℃で終夜、振盪培養した。イオン液体を含有していないＬＢ培養液および，ＢＭＩｍＢＦ４、ＥＭＩｍＢＦ４、１−ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｆｏｒｍａｔｅ（以下、ＢＭＩｍＦｏｒ）、１−ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（以下ＥＭＩｍＡｃｅ）、ＣｈＬａｃの各イオン液体を０．００１％，０．０１％，０．１％，１．０％の濃度で含有したＬＢ培養液をそれぞれ５．０ｍｌずつ準備し、培養した大腸菌液を５０μｌ加えて植菌し、２７℃で振盪培養した。培養開始時に菌液８００μｌを、培養開始から２時間後，４時間後，６時間後，８時間後，１０時間後，１２時間後，２４時間後にそれぞれ菌液８０μlとＬＢ培養液７２０μlをキュベットに分注し、日立製分光光度計Ｕ−２００１を用いてＯＤ６００を測定し、増殖曲線を作製した（図１６）。また、各試料で２４時間培養した際の大腸菌液をそれぞれ１０μｌスライドガラスに滴下し、塗り広げた。各試料をグルタルアルデヒドで固定し、エタノールで脱水してＴＩブルーで２０分染色した後、日立製卓上低真空走査型電子顕微鏡  Ｍｉｎｉｓｃｏｐｅ  ＴＭ１０００でで観察し、イオン液体が大腸菌の形態に与える影響を評価した（図１７）。
【００４５】
図１６および図１７によれば、イオン液体が加えられていないＬＢ培養液で大腸菌を培養した場合と比べて、イオン液体を０．００１％から０．１％の濃度で含むＬＢ培養液中で培養した場合は、菌の生育は阻害されず、菌の形態にも異常が見られない。また、イオン液体濃度が１．０％の場合は生育が阻害されるものの、形態には異常が見られなかった。すなわち、低濃度のイオン液体の使用は細菌を生育する面から見た場合には安全であると言える。
【００４６】
次に、低濃度のイオン液体で、菌がバイオフィルムを形成することを抑制できるか実験した。
大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３のシングルコロニーを釣菌しＬＢ培養液０．５ｍｌに植菌し３７℃で６時間振盪培養した。分光光度計で菌液のＯＤ６５０を測定し、ＯＤ６５０が０．１かつイオン液体濃度がそれぞれ０．００１％、０．０１％、０．１％、１．０％になるように菌液を調製した。また、ＯＤ６５０が０．１でイオン液体を含まない菌液を比較のために用意した（ＩＬ  ｆｒｅｅ）。調整した各菌液を２００μｌずつマイクロチューブに分注し、その中にガラス棒を入れて２７℃で６０時間静置培養し、ガラス棒にバイオフィルムが形成するか調べた。各菌液に挿入して６０時間静置した後のガラス棒を、滅菌水１．０ｍｌで２回洗い流した。その後ガラス棒をグルタルアルデヒドで固定、エタノールで脱水しＴＩブルーで２０分染色した後、日立製卓上低真空走査型電子顕微鏡  Ｍｉｎｉｓｃｏｐｅ  ＴＭ１０００で観察し、イオン液体が与えるバイオフィルム形成抑制効果を評価した（図１８）。
図１８によると、イオン液体を加えていない菌液中に入れていたガラス棒上では、５つの結果いずれの場合もバイオフィルムが形成され、バイオフィルム表面のマトリクスのせいで個々の菌体を観察することができない。また、バイオフィルム形成量も多く、盛り上がっている部分もある。一方、各種イオン液体を含んだ菌液中に入れていたガラス棒では、イオン液体の濃度が０．００１％から０．１％の全ての場合において、イオン液体を加えない菌液での結果ほどバイオフィルムが形成されていない。また、個々の菌体を観察することができるものもある。大腸菌の生育や形態に異常が見られなかった０．００１％から０．１％の濃度のイオン液体でも大腸菌がバイオフィルムを形成することを抑制できるということは、安全性が重視されるような場合、例えば口腔内（歯）などの生体内、台所、浴室等、カテーテル、人工透析機などの医療機器に利用する場合でも、濃度を薄めたイオン液体を使用することで安全性を確保しつつ、バイオフィルムの形成を抑制することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、イオン液体にバイオフィルムを浸潤させることでバイオフィルムを除去することができる。この方法により、例えば歯垢の除去、細管内部のバイオフィルム除去、カテーテルの洗浄、入れ歯洗浄、キッチンのぬめり除去等を行うことができる。
また、イオン液体に物体を浸潤させることでバイオフィルムの形成を阻害することができるので、歯垢形成予防のためのうがい洗浄液、歯磨きペースト、食器洗浄剤に利用できる。
また、イオン液体濃度を調整することで、バイオフィルムを迅速簡便かつ穏やかな条件でバイオフィルムを破壊することができるので、研究のために内部の細菌および細菌内のＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質等の生体分子を抽出することに利用できる。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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