(57)【要約】      （修正有）【課題】表面を形成する組成自身が着色性を示し、ラテックス粒子の表面組成が維持されており濃い色調を示すことができるイムノクロマト用着色粒子と、該着色粒子を用いた診断用イムノクロマト試薬を提供する。【解決手段】表面を構成する成分としてπ共役化合物を含む高分子を含有することを特徴とするイムノクロマト用着色粒子、例えば、炭化水素系微粒子の表面にπ共役化合物を含む高分子を被覆させたことを特徴とするイムノクロマト用着色粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を構成する成分としてπ共役化合物を含む高分子を含有することを特徴とするイムノクロマト用着色粒子。
【請求項２】
前記着色粒子の平均粒径が５０〜１０００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のイムノクロマト用着色粒子。
【請求項３】
炭化水素系微粒子の表面にπ共役化合物を含む高分子を被覆させたことを特徴とする請求項１または２に記載のイムノクロマト用着色粒子。
【請求項４】
π共役化合物を含む高分子が、ポリアセチレン、ポリアニリン、ポリフラン、ポリピロール、ポリチオフェンからなる群から選ばれる少なくとも一種類以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノクロマト用着色粒子。
【請求項５】
炭化水素系微粒子が、
・フェニル基を有する重合性単量体
・メタクリロイル基を有する重合性単量体
・アクリロイル基を有する重合性単量体
からなる群から選ばれる一種類以上と、
・フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体
を共重合させたことを特徴とする請求項３または４に記載のイムノクロマト用着色粒子。
【請求項６】
炭化水素系微粒子の表面にπ共役化合物を含む高分子を被覆させる際に、スルホン酸塩を有する重合性単量体を存在させることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のイムノクロマト用着色粒子。
【請求項７】
前記着色粒子が黒色粒子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のイムノクロマト用着色粒子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のイムノクロマト用着色粒子を用いたことを特徴とする診断用イムノクロマト試薬。
【請求項９】
請求項８に記載のイムノクロマト試薬を用いたことを特徴とするイムノクロマト測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断用イムノクロマト試薬に好適に使用されるイムノクロマト用着色粒子と、該着色粒子を用いた診断用イムノクロマト試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、種々の疾患の診断を目的として、被検物質に免疫学的に結合する物質とクロマトグラフィーの原理を組み合わせて被検物質を目視判定で検出する診断用イムノクロマト試薬が広く用いられている。診断用イムノクロマト試薬は、被検物質である抗原（または抗体）に対する抗体（または抗原）をクロマトグラフ媒体に固定化して、免疫反応部位を作製したものを固定相とし、上記被検物質と結合可能な抗体（または抗原）によって感作された検出用担体と被検物質を含んだ検体とを接触させて抗原抗体複合体を形成させ、それらが含有された液体を移動相とした免疫クロマトグラフの測定方法に用いられる。
【０００３】
当該測定方法において、検出用担体と接触した被検物質を含んだ検体は、免疫反応を行い、検出用粒子−感作に用いられた抗体（または感作に用いられた抗原）−検体中の抗原（または抗体）とからなる複合体が生成する。この複合体がクロマトグラフ上の反応部位まで達すると、再度免疫反応を行い、前記複合体が前記固定化抗体（または固定化抗原）に結合されて、検出用担体が捕捉される為、その捕捉の有無を目視判定することにより検体中の被検物質の存在を判定することができる（当該測定方法をイムノクロマトグラフ法という。）。 
【０００４】
上記イムノクロマトグラフ法では、目視判定を容易にするために、検出用担体に着色された微粒子が広く利用されている。このような検出用担体としては、その粒径や調製条件によって自然呈色するコロイド状金属粒子もしくはコロイド状金属酸化物粒子などのコロイド状粒子や、合成高分子よりなるラテックス粒子を着色することによって得られる着色ラテックス粒子、着色剤とともに単量体を重合して得られる着色ラテックス粒子などが用いられている。しかしながら、上記コロイド状粒子は、その粒径及び調製条件によって色調が決定されてしまうため、所望の色に調製できない、また鮮明な濃い色調のものを得にくい等の問題点があった。一方、着色ラテックス粒子は、色調を自由に選択できる点で有利であるが、着色量を高める、つまりは濃い色調を得ることが難しく、イムノクロマトに用いた際に目視判定がしにくい等の問題点があった。
【０００５】
この問題を解決する為に、特許文献１では、着色ラテックス粒子中の着色剤の含有率が１０重量％以上とする方法が示されており、目視判定性を向上させている。しかし、この方法でも、まだ十分な感度が確保されているとは言えず、更に着色量を高めると、色素等がラテックス粒子の表面を覆うようになり、粒子本来の表面状態が損なわれる結果、非特異反応や過凝集による目詰まりなどを引き起こすことが問題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２０２３４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、更なる目視判定性の向上を達成しつつ、非特異反応や過凝集による目詰まり等を生じない検出用担体、つまりは検出用担体の濃色化及びラテックス粒子の表面状態の維持が望まれていた。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、表面を形成する組成自身が着色性を示し、ラテックス粒子の表面組成が維持されており濃い色調を示すことができるイムノクロマト用着色粒子と、該着色粒子を用いた診断用イムノクロマト試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下に関する。
＜発明１＞
表面を構成する成分としてπ共役化合物を含む高分子を含有することを特徴とするイムノクロマト用着色粒子。
＜発明２＞
前記着色粒子の平均粒径が５０〜１０００ｎｍであることを特徴とする発明１に記載のイムノクロマト用着色粒子。
＜発明３＞
炭化水素系微粒子の表面にπ共役化合物を含む高分子を被覆させたことを特徴とする発明１または２に記載のイムノクロマト用着色粒子。
＜発明４＞
π共役化合物を含む高分子が、ポリアセチレン、ポリアニリン、ポリフラン、ポリピロール、ポリチオフェンからなる群から選ばれる少なくとも一種類以上であることを特徴とする発明１〜３のいずれか１項に記載のイムノクロマト用着色粒子。
＜発明５＞
炭化水素系微粒子が、
（１）フェニル基を有する重合性単量体、メタクリロイル基を有する重合性単量体、アクリロイル基を有する重合性単量体からなる群から選ばれる一種以上の重合性単量体と、
（２）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体を共重合させたことを特徴とする発明３または４に記載のイムノクロマト用着色粒子。
＜発明６＞
炭化水素系微粒子の表面にπ共役化合物を含む高分子を被覆させる際に、スルホン酸塩を有する重合性単量体を存在させることを特徴とする発明３〜５のいずれか１項に記載のイムノクロマト用着色粒子。
＜発明７＞
前記着色粒子が黒色粒子であることを特徴とする発明１〜６のいずれか１項に記載のイムノクロマト用着色粒子。
＜発明８＞
発明１〜７のいずれか１項に記載のイムノクロマト用着色粒子を用いたことを特徴とする診断用イムノクロマト試薬。
＜発明９＞
発明８に記載のイムノクロマト試薬を用いたことを特徴とするイムノクロマト測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、粒子表面を形成する組成自身が着色性を示すことで、ラテックス粒子の表面組成を維持し、濃い色調を示すことができるイムノクロマト用着色粒子が得られるため、従来より濃色化が図れる視認性の優れたイムノクロマト用着色粒子、及び該着色粒子を用いた診断用イムノクロマト試薬を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明のイムノクロマト用着色粒子について詳細に説明する。
本発明のイムノクロマト用着色粒子は、表面を構成する成分としてπ共役化合物を含む高分子を含有する着色粒子である。なかでも炭化水素系微粒子の表面にπ共役化合物を含む高分子を被覆させた着色粒子である。これらは、イムノクロマト用の検出用担体として好適に用いられる。
【００１１】
上記炭化水素系微粒子は、
（１）フェニル基を有する重合性単量体、メタクリロイル基を有する重合性単量体、アクリロイル基を有する重合性単量体からなる群から選ばれる一種類以上の重合性単量体と、
（２）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体
を共重合させた粒子であれば特に限定されず、従来より免疫測定分野で用いられてきた粒子を用いることができる。
【００１２】
フェニル基を有する重合性単量体としては、例えば、スチレン、クロルスチレン、α−メチルスチレン、ビニルトルエンなどの重合性不飽和芳香族類が挙げられる。また、ジビニルベンゼン等の架橋性単量体も含まれ、適量を存在させても構わない。メタクリロイル基またはアクリロイル基を有する重合性単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸エチルn-プロピル、（メタ）アクリル酸−２ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル等の重合性不飽和カルボン酸エステル類、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの重合性不飽和カルボン酸類、またこれらの塩類、例えば、（メタ）アクリル酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸カリウム、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリレート等の重合性不飽和カルボン酸アミド類が挙げられる。また、エチレングリコール（メタ）アクリレートやプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メチレンビス（メタ）アクリルアミド等の架橋性単量体も含まれ、適量を存在させても構わない。これらの単量体は、１種または２種以上を混合して使用することができる。
【００１３】
フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体としては、例えば、スチレンスルホン酸ナトリウム、スチレンスルホン酸カリウム、スチレンスルホン酸リチウム等が挙げられる。
【００１４】
これらのうち、特にスチレンとスチレンスルホン酸ナトリウムからなる共重合体、及びスチレンとメタクリル酸メチル及びスチレンスルホン酸ナトリウムからなる共重合体が好ましい。
【００１５】
上記共重合体の重合方法としては、従来より公知の重合方法を用いることができ、分散重合法、懸濁重合法、乳化重合法、ソープフリー乳化重合法が挙げられるが、ソープフリー乳化重合法が好ましい。ソープフリー乳化重合法としては、例えば、特開２００３−５１０９５６号公報等に記載の方法を用いることができる。
【００１６】
本発明は、表面を構成する成分としてπ共役化合物を含む高分子が含有されていることを特徴としている。尚、π共役化合物を含む高分子によって被覆される炭化水素系微粒子について前述したが、この炭化水素系微粒子が存在しない、すなわち、π共役化合物を含む高分子微粒子をπ共役化合物を含む高分子で被覆したイムノクロマト用着色粒子も本発明に含まれるのは言うまでもない。
【００１７】
また、π共役化合物を含む高分子は、着色粒子の表面を構成する成分中に主成分として存在していればよい。表面にπ共役化合物を主成分として含む場合には、該着色粒子は黒色を呈し、黒色着色粒子として好適に用いられる。ここで主成分とは全体の７０質量％以上である成分を意味する。主成分（π共役系化合物）以外の成分としては、チタンブラック、酸化鉄等の黒色無機材料が挙げられ、例えば本発明のイムノクロマト用着色粒子の表面は、π共役系化合物とともにこれらの黒色無機材料を３０質量％以下の範囲で含有する組成物から形成されていてもよい。その場合、重合または重縮合によりπ共役化合物を含む高分子を合成する際などに、これらの黒色無機材料を共存させればよい。また、上記組成物には、主成分であるπ共役系化合物の他に、黒色粒子の黒色に影響を与えない範囲で、π共役系化合物以外のポリマーなどが含まれてもよい。
【００１８】
π共役化合物を含む高分子とは、π共役化合物を含む高分子を形成し得る単量体を用いて製造された重合体であり、このような単量体（以下、π共役形成性単量体という場合がある。）としては、アセチレン、アニリン、フラン、ピロール、チオフェン及びこれらの誘導体が挙げられ、これらのうち１種以上を使用できる。
【００１９】
π共役化合物を含む高分子の具体例としては、アセチレン及びその誘導体を重合して得られるポリアセチレン、アニリン及びその誘導体を重合して得られるポリアニリン、フラン及びその誘導体を重合して得られるポリフラン、ピロール及びその誘導体を重合して得られるポリピロール、チオフェン及びその誘導体を重合して得られるポリチオフェンが挙げられ、これらのなかではポリピロールが好ましい。
【００２０】
π共役化合物を含む高分子は、原料単量体の酸化重合、電解重合、ラジカル重合、カップリング反応等、公知の製造方法により製造できる。また、該高分子の製造時には、公知の開始剤、重合時の安定性を高めるための添加剤、例えば、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどの分散安定剤やドデシル硫酸ナトリウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどの界面活性剤等を適宜使用できる。これらを使用することで、π共役系化合物を主成分として形成された表面のさらに外側に、これらの分散安定剤、界面活性剤等からなる極薄い膜が形成される場合がある。このような製造工程に由来する薄膜は、実質的には、粒子の表面を形成しているものとは言えない。よって、本発明のイムノクロマト用着色粒子には、このような製造工程に由来する薄膜が結果的に最外表に形成されているものも含まれる。
【００２１】
上記分散安定剤、界面活性剤の有無に関わらず、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体を存在させて、炭化水素系微粒子の表面をπ共役化合物を含む高分子で被覆させたイムノクロマト用着色粒子も本発明の１つである。
【００２２】
π共役化合物を含む高分子がポリピロールである場合、イムノクロマト用着色粒子の表面は一定の正荷電を有するが、該表面にフェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体を存在させることで、負荷電を有する着色粒子とすることができ、正荷電では不都合な抗原や抗体を結合させる際に好適に用いられる。また、フェニル基を有する成分が表面に一定割合で存在することになる為、適度な疎水性が与えられ、抗原や抗体の物理吸着に好都合な環境を付与できることも本発明の特徴の１つである。
【００２３】
本発明のイムノクロマト用着色粒子は、平均粒径が５０〜１０００ｎｍ、好ましくは、１００〜５００ｎｍの粒子が用いられる。ＣＶ値（粒径の変動係数）は１０％以下であることが好ましい。尚、ＣＶ値は、「粒径分布の標準偏差÷平均粒径×１００」により算出される。着色粒子の平均粒径が５０ｎｍ未満であると、視認性が劣り、１０００ｎｍを超えると、メンブレン中で目詰まりを起こす可能性が高まる。尚、本明細書における平均粒径とは、透過型電子顕微鏡により得られた任意の３視野における１００個以上の粒子画像を画像解析装置を用いて解析して求めた値の平均値を示す。
【００２４】
本発明のイムノクロマト用着色粒子の平均粒径は、例えば、粒径が一定の炭化水素系微粒子を用いる方法による制御、着色粒子合成時における分散安定剤による制御、乳化剤による制御、粒子電荷による制御、マイクロチャネル径による制御、撹拌操作による制御など、公知の方法により制御できるが、粒径が一定の炭化水素系微粒子を用いる方法が簡便で好ましい。尚、炭化水素系微粒子の粒径制御は、特開２００３−５１０９５６号公報等に記載の方法で制御すればよく、例えば、重合開始剤の量を調整したり、重合温度を変化させるなどして、調整する方法が挙げられる。
【００２５】
本発明のイムノクロマト用着色粒子を検出用担体として用いた診断用イムノクロマト試薬も本発明の１つである。診断用イムノクロマト試薬として用いられる項目は、例えば、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス等が挙げられる。これらの項目に対応する抗体を本発明のイムノクロマト用着色粒子に結合させることで抗体感作粒子を作製し、イムノクロマト試薬とすることができる。結合の方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、抗原（または抗体）を含む緩衝液中にイムノクロマト用着色粒子を浸漬させ、一定温度で一定時間インキュベートするなどで物理吸着させる方法などが挙げられる。
【００２６】
また、本発明の診断用イムノクロマト試薬を用いれば、例えばイムノクロマトグラフ法の原理を用いた診断用テストストリップにおいて、移動層の液体中に抗体感作粒子を含浸させることによってコンジュゲートパッドに含有させ、メンブレン上に免疫反応部位として固定化した被検物質である抗原（または抗体）に対する抗体（または抗原）と結合、凝集させることによって、検体中の被検物質の存在を判定することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明する。
【００２８】
［炭化水素系微粒子１の作製］
４ツ口セパラブルカバー、攪拌翼、還流用冷却管、温度検出器、窒素導入管を取り付けた２０００ｍＬ容のセパラブルフラスコに、脱イオン水１１００ｇ、スチレン（和光純薬製）１７０ｇ、パラスチレンスルホン酸ナトリウム（東京化成製）０．０８ｇ、重合開始剤として過硫酸カリウム０．３６ｇ（和光純薬製）を秤量した後、２１０ｒ．ｐ．ｍ．で攪拌しながら、容器内を窒素置換し、７０℃で１８時間重合を行った。
得られた白色溶液をペーパーろ紙でろ過、セルロースチューブにて透析精製（透析液：水、精製回数５回以上）し、目的の炭化水素系微粒子を得た（微粒子１とする）。得られた微粒子の粒径を透過型電子顕微鏡により粒径を測定したところ、３０１ｎｍ（ＣＶ６．０％）であった。
【００２９】
［炭化水素系微粒子２の作製］
スチレン１７０ｇをスチレン１００ｇ、メタクリル酸メチル７０ｇの混合物としたこと、及びパラスチレンスルホン酸ナトリウムを０．０５ｇとしたこと以外は、炭化水素系微粒子１の方法と同様にして、目的の炭化水素系微粒子を得た（微粒子２とする）。上記と同様に粒径を測定したところ、得られた微粒子の粒径は、２３５ｎｍ（ＣＶ５．３％）であった。
【００３０】
＜実施例１＞
４ツ口セパラブルカバー、攪拌翼、還流用冷却管、温度検出器、窒素導入管を取り付けた２０００ｍＬ容のセパラブルフラスコに、脱イオン水７００ｇ、上述の微粒子１を１０ｇ、パラスチレンスルホン酸ナトリウム（東京化成製）２０ｇ、ピロール（和光純薬製）１０ｇを秤量した後、２１０ｒ．ｐ．ｍ．で攪拌しながら、容器内を窒素置換し、６０℃に昇温した。
ついで、重合開始剤として過硫酸アンモニウム（和光純薬製）３４．０ｇを脱イオン３００ｇにて溶解させ、上記混合液中へ滴下した。滴下終了後更に８時間加熱攪拌させた後、冷却して反応を停止した。
遠心分離を行い、適度な脱イオン水を添加し、超音波洗浄機にて再分散させた。この操作を３回繰り返し、黒色着色粒子１を得た（ポリピロールによる着色粒子１）。透過型電子顕微鏡にて得られた粒子の粒径を測定したところ、３６８ｎｍ（ＣＶ６．４％）であった。
【００３１】
＜実施例２＞
使用したパラスチレンスルホン酸ナトリウムの量を１０ｇに、ピロールの量を５ｇに変更し、過硫酸アンモニウムの量を１７．０ｇに変更した以外は、ポリピロールによる着色粒子１の作製方法と同様にして黒色着色粒子を得た（ポリピロールによる着色粒子２）。上記と同様に得られた粒子の粒径を測定したところ、３４２ｎｍ（ＣＶ６．３％）であった。
【００３２】
＜実施例３＞
微粒子１を微粒子２に変更した以外は、ポリピロールによる着色粒子１の作製方法と同様にして黒色着色粒子を得た（ポリピロールによる着色粒子３）。上記と同様に得られた粒子の粒径を測定したところ、２９５ｎｍ（ＣＶ５．６％）であった。
【００３３】
＜実施例４＞
４ツ口セパラブルカバー、攪拌翼、還流用冷却管、温度検出器、窒素導入管を取り付けた２０００ｍＬ容のセパラブルフラスコに、脱イオン水７００ｇ、上述の微粒子１を１０ｇ、ポリビニルピロリドン（Ｋ３０、和光純薬製）１０ｇ、ピロール（和光純薬製）１０ｇを秤量した後、２１０ｒ．ｐ．ｍ．で攪拌しながら、容器内を窒素置換し、６０℃に昇温した。
ついで、重合開始剤として過硫酸アンモニウム（和光純薬製）３４．０ｇを脱イオン３００ｇにて溶解させ、上記混合液中へ滴下した。滴下終了後更に８時間加熱攪拌させた後、冷却して反応を停止した。
遠心分離を行い、適度な脱イオン水を添加し、超音波洗浄機にて再分散させた。この操作を３回繰り返し、黒色着色粒子４を得た（ポリピロールによる着色粒子４）。透過型電子顕微鏡にて得られた粒子の粒径を測定したところ、３３５ｎｍ（ＣＶ６．３％）であった。
【００３４】
＜実施例５＞
使用したピロールの量を５ｇに変更し、過硫酸アンモニウムの量を１７．０ｇに変更した以外は、ポリピロールによる着色粒子４の作製方法と同様にして黒色着色粒子を得た（ポリピロールによる着色粒子５）。上記と同様に得られた粒子の粒径を測定したところ、３２３ｎｍ（ＣＶ６．２％）であった。
【００３５】
＜実施例６＞
微粒子１を微粒子２に変更した以外は、ポリピロールによる着色粒子４の作製方法と同様にして黒色着色粒子を得た（ポリピロールによる着色粒子６）。上記と同様に得られた粒子の粒径を測定したところ、２６５ｎｍ（ＣＶ５．５％）であった。
【００３６】
＜比較例１＞
［市販色素による着色粒子の作製１］
特開２００３−２０２３４４号公報に記載の実施例１に従い、次のようにして着色粒子を作製した。
油溶性色素オイルブルー（オリエント化学工業製）２．４ｇをメタノール（和光純薬製）２０００ｍＬに溶解させた色素溶液を、固形量で６ｇとなるように採取した微粒子１の白色溶液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ）にて上清を廃棄したものの中に添加し、４５℃で３日間過熱攪拌処理を行った（この際メタノールを徐々に蒸発させた）。次いで遠心分離を行い、メタノールを廃棄後、適度な脱イオン水を添加し、超音波洗浄機にて再分散させた。この操作を３回繰り返し、メタノールを完全に脱イオン水に置換した青色着色粒子を得た（市販色素による着色粒子１）。透過型電子顕微鏡にて粒径を測定したところ、３２５ｎｍ（ＣＶ６．８％）であった。
【００３７】
＜比較例２＞
［市販色素による着色粒子の作製２］
微粒子１を微粒子２に変更した以外は、市販色素による着色粒子１の作製方法と同様にして青色着色粒子を得た（市販色素による着色粒子２）。同様に粒径を測定したところ、２５４ｎｍ（ＣＶ５．９％）であった。
【００３８】
[適用例]
＜インフルエンザウィルス測定用イムノクロマト試薬の作製＞
１．着色粒子標識抗Ａ型インフルエンザウィルス抗体の調製
（１）2wt%着色粒子を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液5mLに2.5mg/mL抗Ａ型インフルエンザウィルスモノクロナール抗体を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液を5mL添加し、室温で2時間攪拌した。その後、13,000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去後、10%スクロース含有2%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を10mL添加し、さらに2時間攪拌後、13,000rpmで10分間遠心分離し、抗体感作着色粒子を得た。その後、更に10%スクロース含有2%BSA水溶液を10mL添加し約1.0wt%着色粒子標識抗Ａ型インフルエンザウィルス抗体（コンジュゲート）を得た。
【００３９】
２．コンジュゲート塗布パッドの作製
上記１で調製したコンジュゲートを6.4 OD（λ650nm）/mLとなるように、0.5%カゼイン及び10%スクロース含有トリス緩衝液(pH8.5)と混合してコンジュゲート溶液を作製した。次に、グラスファイバー製パッド(Lydall社製)にイムノクロマトグラフ法用のディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社製)を用いて該コンジュゲート溶液を10μl/cmで滲みこませた。その後、ドライオーブン内で70℃、30分間加温して乾燥させ、コンジュゲート塗布パッドとした。
【００４０】
３．抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜の作製
ニトロセルロース膜(Sartorius社製)に、0.75mg/mLに調製した前記着色粒子標識抗A型インフルエンザウィルス抗体とはエピトープを異にする抗A型インフルエンザウィルス抗体及び2.5%スクロースを含む10mMリン酸緩衝液(pH 7.2)を、幅約1mmのライン状に塗布した。塗布は、イムノクロマトグラフ法用のディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社製)を用い、吐出量を1uL/cmとなるように設定した。ライン塗布後のニトロセルロース膜をドライオーブン内で70℃、45分間乾燥させ、抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜とした。
【００４１】
４．テストストリップの作製
プラスチック製粘着シートに上記抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜を貼り、上記２．で作製したコンジュゲート塗布パッドを配置装着し、反対側の端には吸収パッド(Whatman社製、740-E)を配置装着した。最後に、抗体固定化膜および吸収パッドを被覆するよ
うに上面にポリエステルフィルムを配置装着し、ラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を4mm幅に切断し、テストストリップを作成した。該テストストリ
ップの寸法は、4mm×98mm（幅×長さ）であり、イムノクロマトテストストリップの形態
にした。
【００４２】
５．検体抽出液及び感度確認用サンプルの調製
200mM 塩化カリウム、150mM L-アルギニン、0.5% Brij35、0.25% BSA、及び0.05% プロクリン（登録商標）950を含む50mM トリス緩衝液(pH8.5)を検体抽出液とした。また、A型インフルエンザウィルス標準液を検体抽出液で段階希釈し、感度確認用サンプルとした。
【００４３】
６．発色強度測定
感度確認用サンプルに上記４.で作製したテストストリップを浸し、10分後にラインの
発色強度を測定した（表１）。発色強度測定には、青の発色見本から0.25単位で数値をつけたカラーチャート（0.25〜4.0）を用い、n=3の平均値をその感度確認用サンプルにおける発色強度とした。尚、黒色粒子の場合は、青の発色見本と同程度の濃さとなる発色見本を別途作製し、同様の評価を行った。発色強度はその数値が高いほど感度が高く、0.5以上が目視による検出が可能である。
【００４４】
【表１】
2014209117.tif 000002
【００４５】
表１の評価によれば、炭化水素系微粒子の表面にπ共役化合物を含む高分子を被覆させることで、同じ炭化水素系微粒子の表面にπ共役化合物を含まない着色粒子と比較して、より濃色化され視認性に優れた着色粒子が得られることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、粒子表面を形成する組成自身が着色性を示すことで、ラテックス粒子の表面組成を維持し、濃い色調を示すことができるイムノクロマト用着色粒子が得られることから、従来より濃色化が図れる視認性の優れたイムノクロマト用着色粒子、及び該粒子を用いたイムノクロマト試薬を提供できる。