(57)【要約】【課題】レチノイン酸様剤の提供。【解決手段】ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするレチノイン酸様剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするレチノイン酸様剤。
【請求項２】
ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
【請求項３】
ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
【請求項４】
ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
【請求項５】
シナワスレナグサ又はその抽出物を含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイン酸様剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及びその類縁化合物であるレチノイド（ｒｅｔｉｎｏｉｄ）は、生体内で形態形成制御作用、細胞の分化増殖制御作用等を発揮することが知られている。レチノイン酸には、オールトランスレチノイン酸（トレチノイン）、９シスレチノイン酸（アリトレチノイン）、１３シスレチノイン酸（イソトレチノイン）等の立体異性体が存在する。
レチノイン酸は、核内受容体であるレチノイン酸受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＡＲ）及びレチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＸＲ）の天然リガンドである。レチノイン酸が生体内でＲＡＲ及びＲＸＲに結合すると、ＲＡＲとＲＸＲはヘテロ二量体を形成する。これがリガンド誘導性転写因子として、標的遺伝子群のプロモーターに結合することにより、標的遺伝子群の発現を転写レベルで制御する。
【０００３】
ＲＡＲ及びＲＸＲには３つのサブタイプ（α、β、γ）が存在し、皮膚では主としてＲＡＲγとＲＸＲαが発現している（非特許文献１、２）。ＲＡＲγは角化細胞の分化抑制に関わっており、ＲＡＲγ選択的アゴニストの一つであるアダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）は、ＲＡＲγに特異的に結合し、表皮角化細胞の分化を抑制することで、尋常性ざ瘡（ニキビ）の初発疹である面ぽうを治療できると云われている。
また、レチノイン酸及びレチノイドを外用すると、脂腺細胞の増殖・分化、ＩＬ−１やＴＮＦ−αの産生に関与するＰＰＡＲを制御することで、脂腺からの皮脂分泌を抑制できると云われている。
【０００４】
さらに、レチノイン酸を強力に外用すると、表皮のターンオーバーが速まり、激しい落屑が見られ、同時に表皮基底層周辺のメラニンの排出が促され、２週間程度の短期間で劇的な表皮メラニンの減少が認められること（非特許文献３、４）、レチノイン酸は、真皮線維芽細胞のコラーゲン産生促進、ＭＭＰ抑制等の作用により光老化による真皮菲薄化（肌老化）を抑制することが報告されている（非特許文献５、６、７）。
このようなことから、皮膚においてＲＡＲγを活性化し、レチノイン酸様作用を発揮できれば、皮脂分泌の抑制、ニキビ、皮膚の老化症状、表皮内色素沈着の予防・改善等に有用であると考えられる。
【０００５】
一方、ヤナギタデ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ）は、タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）に属する植物で、消炎、解毒、利尿、下痢止め、解熱、虫さされ、食あたり等の治療に、シナワスレナグサ（Ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｍ ａｍａｂｉｌｅ Ｓｔａｆ ｅｔ Ｄｒｕｍ．）は、ムラサキ科（Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ）に属する植物で、咳、吐血、痙攣の治療にそれぞれ有用なことが知られている。
しかしながら、これら植物とレチノイン酸様活性との関係については知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９２；９８（６  Ｓｕｐｐｌ）：３６Ｓ−４１Ｓ
【非特許文献２】Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９９２；６（３）：３２９−４４
【非特許文献３】Ｘｉａｏ，Ｊ．Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １８  １９９９：１５３９−１５４８
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  ２０００；１０５：１０９７−１１０８
【非特許文献５】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＣＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９３；６（ｓｕｐｐｌ  １）：７０−７７
【非特許文献６】Ｋｌｉｇｍａｎ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９３；６（Ｓｕｐｐｌ  １）：７８−８２
【非特許文献７】Ｋｌｉｇｍａｎ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８６；１５：８３６−８５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、レチノイン酸様剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ＲＡＲγの分子構造内にあるｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（ＬＢＤ）を利用し、ＲＡＲγのＬＢＤへ物質（リガンド）が結合した時にのみ、細胞からルシフェラーゼが発せられるような系を構築し、ＲＡＲγに結合することでその活性を高める、すなわちレチノイン酸様作用を発揮する物質について鋭意研究したところ、ヤナギタデ及びシナワスレナグサに優れたレチノイン酸様活性があることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（５）に係るものである。
（１）ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするレチノイン酸様剤。
（２）ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
（３）ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
（４）ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
（５）シナワスレナグサ又はその抽出物を含有する皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のレチノイン酸様剤等は、ＲＡＲγを活性化し、皮脂腺からの皮脂分泌を抑制する作用を有することから、ニキビ、シワ、ハリの低下等の皮膚老化症状、くすみ、シミ等のメラニン色素性疾患等に対して予防又は改善効果を発揮し得る医薬品、医薬部外品又は化粧品として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】レチノイン酸又はＲＡＲγ選択的アゴニストによる皮脂分泌抑制作用を示す図。
【図２】本発明植物抽出物の皮脂分泌抑制作用を示す図。
【図３】本発明植物抽出物のＭＭＰｓ活性阻害作用を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「レチノイン酸様」或いは「レチノイン酸様活性」とは、ＲＡＲ及びＲＸＲ、特にＲＡＲγへの結合、これの活性化等、レチノイン酸と同様の生理活性を意味する。
【００１３】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００１４】
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【００１５】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００１６】
本明細書において、ヤナギタデとは、タデ科タデ属のＰｏｌｙｇｏｎｕｍ ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒを指し、シナワスレナグサとは、ムラサキ科オオルリソウ属のＣｙｎｏｇｌｏｓｓｕｍ ａｍａｂｉｌｅ Ｓｔａｆ ｅｔ Ｄｒｕｍ．を指す。ヤナギタデとして、ヤナギタデを基原植物として得られた生薬、スイリョウを用いてもよい。また、シナワスレナグサとして、シナワスレナグサを基原植物として得られた生薬、クシカを用いてもよい。
【００１７】
斯かる植物は、いずれも任意の部位、例えば全草、葉、茎、芽、花、蕾、根、根茎、仮球茎、球茎、塊茎、種子等、又はそれらの組み合わせを使用することができるが、葉や茎等の地上部を用いるのが好ましい。
斯かる植物は、そのまま又は乾燥・粉砕等して用いることができる。また、上記部位は、そのまま抽出工程に付されてもよく、又は粉砕、切断若しくは乾燥された後に抽出工程に付されてもよい。該抽出物は天然成分由来であり安全性も高い。
【００１８】
抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、１００〜４００ｒ／ｍｉｎで１〜３０分間の攪拌が挙げられる。
抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。
【００１９】
抽出のための溶剤には、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類、アルコール−水混合液、炭化水素類が挙げられ、アルコール−水混合液、炭化水素類がより好ましい。アルコール類としては炭素数１〜５のアルコール類が好ましく、エタノールがより好ましい。炭化水素類としてはヘキサンが好ましい。
【００２０】
抽出のための溶剤としてアルコール−水混合液を使用する場合には、アルコール濃度は、特に限定されないが、０．００１容量％以上が好ましく、より好ましくは５容量％以上、より好ましくは２０容量％以上、より好ましくは３０容量％以上、より好ましくは４０容量％以上であり、そして好ましくは９５容量％以下、より好ましくは８０容量％以下、より好ましくは７０容量％以下、より好ましくは６０容量％以下である。例えば、５〜９５容量％、２０〜８０容量％、３０〜７０容量％、４０〜６０容量％が挙げられる。
【００２１】
溶剤の使用量としては、それぞれの植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬ、更に８〜５０ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１分間〜１００日間が好ましく、１分間〜３日間がより好ましい。このときの抽出温度は、０℃〜溶媒沸点、より好ましくは２０〜１００℃、さらに好ましくは４０〜９０℃である。
【００２２】
斯くして得られる植物抽出物は、抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
また、植物の抽出物は市販品を使用することもできる。
【００２３】
本発明の植物の抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００２４】
後記実施例で示すとおり、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ＲＡＲγの分子構造内にあるＬＢＤを利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系において優れたレチノイン酸様活性を示した。
当該評価系は、リガンドのＬＢＤへの結合、すなわちＲＡＲγの活性化を、リガンドがＬＢＤに結合する際に発生するルシフェラーゼ活性で判別することにより、レチノイン酸様活性の評価を可能にしたものである。
また、本発明の植物又はそれらの抽出物は、皮脂腺細胞において皮脂の分泌を抑制する作用を示した。
そして、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ＲＡＲγに結合し、これを活性化することが有用と考えられる各種症状の予防、改善又は治療に有効であると考えられる。例えば、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ニキビの予防又は改善、シワ、ハリの低下等の皮膚老化症状の予防又は改善、くすみ、シミ等のメラニン色素性疾患の予防又は改善に有効であると考えられる。なお、「シワ」とは、長期紫外線曝露、乾燥、加齢等により、皮膚に回復し難い深い溝が形成されたもの、すなわち「深いシワ」、保湿剤等を用いて改善できるような「小じわ」を含む概念である。
【００２５】
従って、本発明の植物又はその抽出物は、レチノイン酸様活性、皮脂の分泌抑制、或いはニキビの予防又は改善、シワ、ハリの低下等の皮膚老化症状の予防又は改善、くすみ、シミ等のメラニン色素性疾患の予防又は改善のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
【００２６】
すなわち、本発明の植物又はそれらの抽出物は、レチノイン酸様剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ予防又は改善剤、皮膚老化予防又は改善剤、皮膚外用剤（以下、レチノイン酸様剤等）として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該レチノイン酸様剤等には、本発明の植物及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００２７】
当該レチノイン酸様剤等は、それ自体、レチノイン酸様活性、皮脂の分泌抑制、ニキビの予防又は改善、シワ、ハリの低下等の皮膚の老化症状の予防又は改善、シミ等のメラニン色素性疾患の予防又は改善効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料又は食品であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品、化粧料等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
食品としては、レチノイン酸様活性、皮脂の分泌抑制、ニキビの予防又は改善、シワやハリの低下等の皮膚の老化症状の予防又は改善、くすみ、シミ等のメラニン色素性疾患の予防又は改善等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。
【００２８】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、パップ剤、軟膏、ローション、クリーム、口腔用製剤等の何れでもよく、投与形態も、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよい。
このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本発明の植物及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２９】
これらの投与形態のうち、好ましい形態は外用であり、製剤中の本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上であり、そして１０質量％以下、好ましくは１質量％以下である。例えば、０．００００１〜１０質量％、０．０００１〜１質量％が挙げられる。
【００３０】
上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の植物及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上であり、そして１００質量％以下、９０質量％以下、８０質量％以下である。例えば、０．０１〜１００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、更に好ましくは１〜１００質量％が挙げられる。
【００３１】
上記医薬品の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、本発明の植物又はそれらの抽出物（乾燥物換算）として、１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上であり、そして１００ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下である。例えば、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
【００３２】
上記化粧料（医薬部外品も含む）の形態は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧料は、本発明の植物及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種と、皮膚化粧料に配合され得る、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類、脂肪代謝促進作用又は脱共役蛋白質発現促進作用が知られている薬物或いは天然物）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
【００３３】
当該化粧料の全量中の、本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量は、抽出物の乾燥物換算で、通常０．０００１質量％、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、そして２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。例えば、０．０００１〜２０質量％、好ましくは０．００１〜１０質量％、より好ましくは０．０００１〜５質量％が挙げられる。
【００３４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の用途を開示する。
＜１＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするレチノイン酸様剤。
＜２＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
＜３＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
＜４＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
＜５＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするＭＭＰｓ阻害剤。
＜６＞シナワスレナグサ又はその抽出物を含有する皮膚外用剤。
【００３５】
＜７＞レチノイン酸様剤を製造するための、ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜８＞皮脂分泌抑制剤を製造するための、ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜９＞ニキビ予防又は改善剤を製造するための、ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜１０＞皮膚老化予防又は改善剤を製造するための、ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜１１＞ＭＭＰｓ阻害剤を製造するための、ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜１２＞皮膚外用剤を製造するための、シナワスレナグサ又はその抽出物の使用。
＜１３＞レチノイン酸様物質として使用するためのヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１４＞皮脂分泌抑制に使用するためのヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１５＞ニキビ予防又は改善に使用するためのヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１６＞皮膚老化予防又は改善に使用するためのヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１７＞ＭＭＰｓ阻害に使用するためのヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１８＞皮膚外用のためのシナワスレナグサ又はその抽出物。
＜１９＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するレチノイン酸様活性の付与方法。
＜２０＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する皮脂分泌抑方法。
＜２１＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するニキビ予防又は改善方法。
＜２２＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する皮膚老化予防又は改善方法。
＜２３＞ヤナギタデ、シナワスレナグサ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するＭＭＰｓ阻害方法。
＜２４＞非治療的な方法である前記＜１９＞〜＜２３＞の方法。
＜２５＞前記＜１＞〜＜２４＞において、植物の使用部位は、好適には、葉や茎等の地上部である。
＜２６＞前記＜１＞〜＜２５＞において、植物抽出物を得るための抽出溶剤は、好適には、水、アルコール類、アルコール−水混合液、炭化水素類が挙げられ、アルコール−水混合液、炭化水素類がより好ましい。アルコール類としては炭素数１〜５のアルコール類が好ましく、エタノールがより好ましい。炭化水素類としてはヘキサンが好ましい。
＜２７＞前記＜１＞〜＜２６＞において、０．００１容量％以上が好ましく、より好ましくは５容量％以上、より好ましくは２０容量％以上、より好ましくは３０容量％以上、より好ましくは４０容量％以上であり、そして好ましくは９５容量％以下、より好ましくは８０容量％以下、より好ましくは７０容量％以下、より好ましくは６０容量％以下である。例えば、５〜９５容量％、２０〜８０容量％、３０〜７０容量％、４０〜６０容量％が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
実施例１  ＲＡＲγ結合活性作用
＜植物抽出物の調製＞
（製造例１）ヤナギタデ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ）抽出物の調製
ヤナギタデを基原植物とする生薬水蓼（スイリョウ）５０ｇを細切し、５０（ｖ／ｖ）％エタノール２０００ｍＬを加え、８５℃で２回抽出（１回目：２時間、２回目：１時間）した後、濾過し、溶媒を除き、固形分６．７ｇを得た。固形分を蒸発残分１．０（ｗ／ｖ）％となるよう希釈し、ヤナギタデ抽出物を調製した。
【００３７】
（製造例２）シナワスレナグサ（Ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｍ ａｍａｂｉｌｅ Ｓｔａｆ ｅｔ Ｄｒｕｍ．）抽出物の調製
シナワスレナグサを基原植物とする生薬狗屎花（クシカ）１００ｇを細切し、５０（ｖ／ｖ）％エタノール２０００ｍＬを加え、８５℃で２回抽出（１回目：２時間、２回目：１時間）した後、濾過し、溶媒を除き、固形分１６．１ｇを得た。固形分を蒸発残分１．０（ｗ／ｖ）％となるよう希釈し、シナワスレナグサ抽出物を調製した。
【００３８】
＜評価方法＞
ｐＢＩＮＤ−ＲＡＲγ及びｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］はＰｒｏｍｅｇａ社より購入した。
１）ｐＢＩＮＤ−ＲＡＲγの作成
先ず、ヒトの皮膚組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰｖｕＩとＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを含む、表１に示すプライマーを利用して、ＲＡＲγのＬＢＤを含む領域をＰＣＲにより増幅した。
【００３９】
【表１】
2014043423.tif 000002
【００４０】
表１のプライマーで増幅したＰＣＲ産物とＰｖｕＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＩＮＤ−ＲＡＲγを、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎした。その後、Ｐｒｏｍｅｇａ社の示すプロトコールに従い、ＪＭ１０９  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎし、目的のプラスミドが導入された大腸菌から、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドを抽出した。
【００４１】
２）細胞培養
ヒト腎臓由来細胞株であるＨＥＫ２９３は、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で培養を行った（３７℃、５％  ＣＯ2）。
【００４２】
３）ＨＥＫ２９３へのプラスミドの導入とＲＡＲγアゴニストの添加
ＨＥＫ２９３を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３．０×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度になるよう播種した。その１２時間後に培養液（５％チャコール処理ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ）を交換し、ｐＢＩＮＤ−ＲＡＲγとｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製品添付のプロトコールに従い細胞に導入した。導入から２４時間後に、コントロール溶媒（０．１％  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを含む培養液）、陽性対照であるａｄａｐａｌｅｎｅ（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）（終濃度１０ｎＭ）、上記製造例１〜２で調製した植物抽出物（終濃度０．１、０．５又は１（ｖ／ｖ）％）をそれぞれ含む培養液と置換し、さらに２４時間培養を行った（ｎ＝６）。
【００４３】
４）ルシフェラーゼ活性測定
ホタルルシフェラーゼ（ＲＡＲγのＬＢＤ結合活性の指標）及びウミシイタケルシフェラーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ導入効率の指標）の活性測定には、Ｄｕａｌ  ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、添付のプロトコールに従い実施した。ホタルルシフェラーゼの活性を、ウミシイタケルシフェラーゼの活性で除し、補正した値を相対的発光強度（ＲＬＵ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）とした。
それぞれの活性値は陽性対照におけるＲＬＵを１００とした場合の相対値として示した。結合活性作用の評価は陰性対照であるコントロール溶媒を添加した際の結合活性値と比較して行った。
【００４４】
＜結果＞
結果を表２に示す。ＨＥＫ２９３細胞からの蛍光強度を測定したところ、上記植物抽出物を培養液に添加した細胞群では、その蛍光強度がコントロール溶媒を添加した群に比べ増加していた。実施例にて測定した蛍光は、ＲＡＲγのＬＢＤへの結合能を反映していることから、上記２抽出物にレチノイン酸様の活性があることが確認された。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
参考例１  レチノイン酸及びＲＡＲγ選択的アゴニストの皮脂分泌抑制作用
＜評価方法＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞（クラボウ社）を２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３日間Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ（クラボウ社）で培養した後、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（コントロール）、オールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ、和光純薬工業社）、アダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）、ＢＭＳ９６１（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をそれぞれ、０．１％、１００μＭ、１０ｎＭ、１０ｎＭとなるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤ（クラボウ社）中で更に３日間培養した（ｎ＝６）。培養後、それぞれのｗｅｌｌをＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍｌ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色液を滴下し３０分３７℃、ＣＯ2  ５％の条件下で染色した。染色終了後にＰＢＳで２回洗浄し、４８５ｎｍの励起波長を当て、５６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。
【００４７】
＜結果＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞からの蛍光強度を測定したところ、コントロール群と比較して、ａｔＲＡ、ａｄａｐａｌｅｎｅ、又はＢＭＳ９６１を添加した群では、その蛍光強度は有意に減少していた。統計学的有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した（＊＊＊：ｐ＜０．００１）。結果を図１に示す。
図１から、レチノイン酸及びＲＡＲγ選択的アゴニストは皮脂の分泌抑制に有効であることが確認された。なお、これまでにアダパレンによる皮脂分泌抑制作用は明らかにされていないが、レチノイン酸及び他のＲＡＲγ選択的アゴニストと同様、有意に皮脂腺からの皮脂分泌を抑制することが確認された。
【００４８】
実施例２  植物抽出物の皮脂分泌抑制作用
＜評価方法＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞（クラボウ社）を２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３日間Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ（クラボウ社）で培養した後、陰性対照であるＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（コントロール）、陽性対照であるアダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）、又は上記製造例１〜２で調製した植物抽出物をそれぞれ１（ｖ／ｖ）％となるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤ（クラボウ社）中で更に３日間培養した（ｎ＝３）。培養後、それぞれのｗｅｌｌをＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍｌ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色液を滴下し３０分３７℃、ＣＯ2  ５％の条件下で染色した。染色終了後にＰＢＳで２回洗浄し、４８５ｎｍの励起波長を当て、５６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。
【００４９】
＜結果＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞からの蛍光強度を測定したところ、コントロール群と比較して、製造例１〜２で調製した植物抽出物を添加した群では、その蛍光強度は統計的に有意に減少していた。統計学的有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。結果を図２に示す。
上記で測定した蛍光は、中性脂質に結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄから発せられるものであり、皮脂を構成する脂質の大半が中性脂質であることから、皮脂腺細胞中の皮脂量を反映していると考えられる。よって、上記植物抽出物は皮脂分泌抑制作用を有していることが確認された。
【００５０】
実施例３  マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）活性阻害作用
（１）細胞培養
ヒト真皮線維芽細胞は、５％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で培養した（３７℃、５％ＣＯ2）。
【００５１】
（２）培養上清の回収
ヒト真皮線維芽細胞を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３．０×１０5  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度になるよう播種した。その２４時間後に、培養液（ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ）を交換し、さらに２４時間培養した。培養後、コントロール溶媒である５０％  エタノール、もしくは製造例１〜２で調製した植物抽出物（終濃度１（ｖ／ｖ）％）をそれぞれ含む培養液と置換し、２４時間培養を続け、その後培養上清を回収した（ｎ＝２）。
【００５２】
（３）ＭＭＰｓ活性測定
９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＭＭＰｓの酵素源として、タンパク質濃度を調製した各培養上清、もしくは陽性対照としてＭＭＰｓの阻害剤であるＧＭ６００１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加した培養液（終濃度１０ｎＭ）を５０μｌ添加し（タンパク質濃度は１００ｎｇ／ｗｅｌｌとした）、複数のＭＭＰｓに切断される基質として、５０μｌのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ＩＸ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：終濃度１０ｎＭ）を加え、混合した。なお、培養上清の希釈にはＴＣＮＢバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５：ｐＨ７．５）を用いた。混合物を３７℃で３０分インキュベートした後、蛍光プレートリーダーにて蛍光強度を測定した（Ｅｘ：３５５ｎｍ、Ｅｍ：４３０ｎｍ）。Ｃｏｎｔｒｏｌの基質切断活性を１００％としたときの各培養上清の基質切断活性をＣｏｎｔｒｏｌに対する相対値で表した。
【００５３】
（４）結果
結果を表３に示す。培養上清中のＭＭＰｓの基質切断活性を蛍光強度にて測定したところ、ヤナギタデ抽出物、又はシナワスレナグサ抽出物を含む培養液で培養した各群において、コントロール溶媒を添加した群に比べ、有意にその蛍光強度が減少していた。（統計学的有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した（＊＊：ｐ＜０．０１）。従って、上記植物抽出物を添加した細胞群においてＭＭＰｓの基質切断活性の低下、すなわちＭＭＰｓの活性が阻害されたことが明らかになった。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
細胞外マトリックスタンパク質を主要な基質とする一群のプロテアーゼであるＭＭＰｓは、紫外線の照射により大きく上昇して細胞外マトリックスの減少や変性を引き起こし、強いてはこれが光老化の大きな要因の１つになっていると考えられている（Gary J. Fisher et al., Nature, Vol.379, No.6563, 335-339(1996)、Gary J. Fisher et al., ARCH DERMATOL, Vol.138, No.11, 1462-1470(2002)）。また、ＭＭＰ−２、−９の阻害物質をヘアレスマウスの背部へ塗布し、ＵＶＢ照射した場合には、シワ形成が予防できることも報告されている（Inomata et al, THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, Vol.120, No.1, 128-134 (2003))。したがって、ＭＭＰｓ活性阻害物質は、皮膚のタルミ、シワ等の皮膚老化を予防・改善できると考えられており、上記の結果より、本発明の植物抽出物には当該効果があるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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