(57)【要約】【課題】優れたＴｉｅ２活性化作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有する安全性の高いＴｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物の提供。【解決手段】ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を有効成分として含有するＴｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＴｉｅ２活性化剤。
【請求項２】
ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする血管新生抑制剤。
【請求項３】
ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤。
【請求項４】
請求項１に記載のＴｉｅ２活性化剤、請求項２に記載の血管新生抑制剤、及び請求項３に記載の血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、血管内皮細胞と血管壁細胞（血管平滑筋細胞やペリサイト）とが、細胞外マトリックスを介して間接的に、又は直接的に接着する構造を有しており、酸素及び栄養素を生体組織に供給し、生体組織から老廃物を除去する機能を有している。
【０００３】
一般に、血管の形成は、新たに血管が形成される血管発生（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）と、形成された既存の血管が伸長し、分岐することにより、新たな血管のネットワークが形成される血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）との２段階に分けられる。前者は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が作用し、脈管形成とよばれる血管の初期発生からその後の血管新生に至るまで非常に広い範囲の血管形成に関与するものであり、後者は、アンジオポエチン（Ａｎｇ）が作用し、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着の制御、血管の構造的安定化に関与するものである。
【０００４】
血管は通常の酸素状況においては、血管内皮細胞とその周囲を裏打ちする血管壁細胞とが強固に接着しており、血管構造が安定に保たれているが、組織で低酸素が生じると血管壁細胞が血管内皮細胞から脱離し、無秩序な血管が増生することがある。このような現象（血管新生）は、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患において、しばしば観察されている。
【０００５】
これらの血管新生は、血管内皮細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼＴｉｅ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｉｇ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ２）を活性化させることにより、抑制されることが知られている（特許文献１参照）。血管狭小化あるいは血管拡大化の抑制が原因となって生じる虚血性疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管腔が拡大化されることが報告されている（非特許文献１参照）。また、Ｔｉｅ２の活性化により、血管内皮細胞の細胞死を抑制することも報告されている（非特許文献２参照）。
【０００６】
このように、Ｔｉｅ２の活性化により、血管新生が抑制されることが知られているだけでなく、血管を成熟化、正常化、及び安定化させることも知られている。
例えば、血管再生医療においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管における血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管を成熟化させることが知られている。
例えば、腫瘍や糖尿病性網膜症などで観察される血管壁細胞が血管内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管が増生するような疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管壁細胞を内皮細胞に接着させ、血管を正常化させることが知られている。
また、例えば、種々の細胞内外の血管構造を破たんさせる環境因子に対しては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管の不安定化を抑制し、血管を安定化させることが知られている。
【０００７】
このようなＴｉｅ２の活性化により血管新生を抑制する天然物としては、桂皮の抽出物などが提案されている（特許文献１参照）。しかしながら、これらの活性が不十分であるという問題がある。また、血管新生を抑制する物質としては、スラミン（ポリスルホン化ナフチルウレア化合物）が知られているが（特許文献２参照）、安全性に優れないという問題がある。
【０００８】
したがって、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有する安全性の高い物質について、速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−２６３３５８号公報
【特許文献２】特表平９−５０３４８８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｈｕｒｓｔｏｎ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，１９９９  Ｄｅｃ  ２４；２８６（５４４９）：２５１１−４．
【非特許文献２】Ｃｈｏ  Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００４  Ａｐｒ  １３；１０１（１５）：５５５３−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、かつ安全性の高いＴｉｅ２活性化剤を提供することを目的とする。
本発明は、優れた血管新生抑制作用を有し、かつ安全性の高い血管新生抑制剤を提供することを目的とする。
本発明は、優れた血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、かつ安全性の高い血管の成熟化剤、血管の正常化剤、又は血管の安定化剤を提供することを目的とする。
本発明は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用の少なくともいずれかの作用を有し、かつ安全性の高い医薬品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を行ったところ、ウルソール酸（Ｕｒｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、コロソリン酸（Ｃｏｒｏｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１（３−Ｏ−ｇａｌｌｏｙｌｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｂ−１）、リノレン酸（Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸（１３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−ｏｃｔａｄｅｃａｔｒｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、プロシアニジンＢ−２（Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｂ−２）、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン｛ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−（４β−６）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−（４β−８）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ｝、プロシアニジンＣ−１（Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｃ−１）、アストラガロシドＶＩＩＩ（Ａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅ  ＶＩＩＩ）、ソヤサポニンＩ（Ｓｏｙａｓａｐｏｎｉｎ  Ｉ）及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種が優れたＴｉｅ２活性化作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有することを知見し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＴｉｅ２活性化剤である。
＜２＞  ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする血管新生抑制剤である。
＜３＞  ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤である。
＜４＞  前記＜１＞に記載のＴｉｅ２活性化剤、前記＜２＞に記載の血管新生抑制剤、及び前記＜３＞に記載の血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬品組成物である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＴｉｅ２活性化剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、かつ安全性の高いＴｉｅ２活性化剤を提供することができる。
本発明の血管新生抑制剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れた血管新生抑制作用を有し、かつ安全性の高い血管新生抑制剤を提供することができる。
本発明の血管の成熟化剤、血管の正常化剤、又は血管の安定化剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れた血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、かつ安全性の高い血管の成熟化剤、血管の正常化剤、又は血管の安定化剤を提供することができる。
本発明の医薬品組成物によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用の少なくともいずれかの作用を有し、かつ安全性の高い医薬品組成物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（Ｔｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤）
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤は、ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１６】
前記Ｔｉｅ２活性化剤は、Ｔｉｅ２をリン酸化することで、その活性体（リン酸化Ｔｉｅ２）に変換するＴｉｅ２活性化作用を有する。即ち、Ｔｉｅ２活性化剤はＴｉｅ２のホモ２量体の形成を促すことで、Ｔｉｅ２の細胞内チロシンキナーゼ活性により、Ｔｉｅ２の自己リン酸化が惹起される。Ｔｉｅ２の自己リン酸化により、アダプタータンパク質であるＧＲＢ２や、ＧＲＢ２結合性グアニンヌクレオチド交換因子であるＳＯＳを細胞膜付近にリクルートすることなどを介し、細胞内シグナル伝達系が活性化し、最終的に血管内皮細胞と血管壁細胞との接着が誘導される。血管狭小化あるいは血管拡大化の抑制が原因となって生じる虚血性疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管腔が拡大化される。また、Ｔｉｅ２の活性化により、血管内皮細胞の細胞死が抑制される。
【００１７】
前記血管新生抑制剤は、既存の血管から形成される新たな血管のネットワークを抑制する血管新生抑制作用を有する。低酸素状態では、Ｔｉｅ２の活性化が一時的に抑制され、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着が乖離し、接着が乖離された血管内皮細胞から新しい血管のネットワークが形成される。血管新生抑制剤は、このような血管壁細胞が内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管の増生を抑制することができる。
【００１８】
前記血管の成熟化剤は、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管内環境因子（細胞及び液性因子）が容易には血管外に漏出しないような血管内皮細胞間の接着斑を形成する成熟化作用を有する。また、血管再生医療においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管における血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管を成熟化させることが可能である。
【００１９】
前記血管の正常化剤は、血管内皮細胞同士の接着を高め、血管壁細胞の血管内皮細胞への裏打ちを促進することにより、血管透過性の破綻した血管や血管の無秩序な増生を招くような異常な血管を、正常な状態にする正常化作用を有する。また、腫瘍や糖尿病性網膜症などで観察される血管壁細胞が血管内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管が増生するような疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管壁細胞を内皮細胞に接着させ、血管を正常化させることが可能である。
【００２０】
前記血管の安定化剤は、既存の血管に対する障害、血管内皮細胞同士の乖離、及び血管内皮細胞と血管壁細胞の乖離を抑制する作用、及び血管内皮細胞の細胞死を抑制する安定化作用を有する。また、種々の細胞内外の血管構造を破たんさせる環境因子に対しては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管の不安定化を抑制し、血管を安定化させることが可能である。
【００２１】
＜ウルソール酸＞
前記ウルソール酸は、下記の構造式（１）で表される５環性トリテルペン酸である。
【化１】
2014097977.tif 000002
また、前記ウルソール酸は、筋肉の萎縮を軽減したり、筋肉の成長を刺激することや、ＳＴＡＴ３活性化を阻害することで、様々な種類の癌細胞の増殖を阻害したり、グルココルチコイド受容体を介して、マトリックスメタロプロテアーゼ−９の発現を減少させることによって、ヒト線維肉腫細胞の増殖を阻害することなどが知られている。
前記ウルソール酸は、リンゴ、バジル、ビルベリー、クランベリー、エルダーフラワー、ペパーミント、ローズマリー、ラベンダー、オレガノ、タイム、サンザシ、プルーンなど、多くの植物中に存在している。
【００２２】
前記ウルソール酸は、植物などの天然物から精製されたものであってもよいし、化学合成品であってもよい。前記ウルソール酸としては、市販品を用いることができ、該市販品としては、例えば、和光純薬工業株式会社が製造している市販品が挙げられる。前記ウルソール酸としては、ウルソール酸又は製薬上許容されるウルソール酸の塩を使用することができる。
【００２３】
＜コロソリン酸＞
前記コロソリン酸は、植物などに含まれる、下記の構造式（２）で表される５環性トリテルペン酸である。
【化２】
2014097977.tif 000003
【００２４】
前記コロソリン酸は、植物などの天然物から精製されたものであってもよいし、化学合成品であってもよい。前記コロソリン酸としては、市販品を用いることができ、該市販品としては、例えば、和光純薬工業株式会社が製造している市販品が挙げられる。前記コロソリン酸としては、コロソリン酸又は製薬上許容されるコロソリン酸の塩を使用することができる。
【００２５】
＜３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１＞
前記３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１は、植物などに含まれる、下記の構造式（３）で表されるポリフェノールである。
【化３】
2014097977.tif 000004
【００２６】
＜＜３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１の製造方法＞＞
前記３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物抽出物調製工程、植物抽出物溶出工程、及び溶出物精製工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００２７】
−植物抽出物調製工程−
前記植物抽出物調製工程は、植物の抽出物を調製する工程である。
前記植物としては、前記３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１を抽出できる植物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、グァバが好ましい。
【００２８】
前記植物抽出物の抽出原料であるグァバは、フトモモ科バンジロウ属の低木であり、学名は、Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ  Ｌ．である。前記グァバは、熱帯アメリカを原産としており、これらの地域から容易に入手可能である。前記グァバは、バンジロウとも呼ばれており、ポリフェノール化合物であるタンニン、葉緑素、葉酸、ビタミン類、ミネラル、たんぱく質、多糖類などを含み、健康食品として広く利用されている。
【００２９】
前記植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。なお、前記植物抽出物には、前記植物の抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００３０】
前記植物の抽出部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記植物がグァバの場合、葉部、枝部、幹部、樹皮部、花部、果実部、根部などが挙げられるが、これらの中でも、葉部が好ましい。
【００３１】
前記植物の抽出部位の調製方法としては、各部位を乾燥させた後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。前記乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。
【００３２】
前記植物抽出物を抽出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出する方法などが挙げられ、具体例としては、抽出溶媒を満たした処理槽内に、抽出原料としてのグァバを投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出する方法などが挙げられる。
【００３３】
前記植物から前記植物抽出物を抽出するのに用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒などが挙げられる。
【００３４】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００３５】
前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。
【００３６】
前記植物抽出物の抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出溶媒量としては、抽出原料の５倍量〜１５倍量（質量比）が好ましく、抽出溶媒として水を用いた場合には、５０℃〜９５℃で１時間〜４時間程度で抽出することが好ましく、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、４０℃〜９０℃で３０分間〜４時間程度で抽出することが好ましい。
【００３７】
前記植物抽出物の精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離などの精製方法が挙げられる。
【００３８】
−植物抽出物溶出工程−
前記植物抽出物溶出工程は、前記植物抽出物調製工程により得られた前記植物抽出物から３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１を含有する成分を溶出する工程である。
【００３９】
前記植物抽出物から３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１を含有する成分を溶出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記グァバの抽出物を極性溶媒により溶出する方法が好ましく、具体的には、前記グァバの抽出物をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０に付して、水、６０質量％メタノール、８０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出する方法がより好ましい。
【００４０】
−溶出物精製工程−
前記溶出物精製工程は、前記植物抽出物溶出工程により得られた溶出物から３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１を精製する工程である。
【００４１】
前記溶出物から３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記極性溶媒により得られた溶出物を粗精製して分取ＨＰＬＣを用いて３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１を分離精製する方法が好ましく、具体的には、得られた水溶出物、６０質量％メタノール溶出物、８０質量％メタノール溶出物、メタノール溶出物、及びアセトン溶出物のうち、６０質量％メタノール溶出物をＯＤＳカラムにより粗精製し、前記粗精製することにより得られた粗精製物から分取ＨＰＬＣを用いて３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１を単離して精製する方法が好ましい。
【００４２】
＜＜３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１が製造されたことを確認する方法＞＞
前記３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１が製造されたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単離された目的物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析することにより確認する方法が好ましい。
なお、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、以下に示す通りである。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＣＯ＋Ｄ２Ｏ）δＣ：
３４．１、６７．４、７４．５、７５．３、８１．９、９５．３、９５．８、９６．８、１００．９、１０１．４、１０６．７、１０９．９、１１４．７、１１４．７、１１５．４、１１５．６、１１８．９、１１９．５、１２１．３、１３１．３、１３１．６、１３８．８、１４５．０、１４５．１、１４５．１、１４５．２、１４５．７、１５４．３、１５５．６、１５５．６、１５７．１、１５７．１、１５７．４、１６６．６
【００４３】
＜リノレン酸＞
前記リノレン酸は、多くの植物油に含まれる、下記の構造式（４）で表される脂肪酸である。
【化４】
2014097977.tif 000005
【００４４】
前記リノレン酸は、植物などの天然物から精製されたものであってもよいし、化学合成品であってもよい。前記リノレン酸としては、市販品を用いることができ、該市販品としては、例えば、和光純薬工業株式会社が製造している市販品が挙げられる。前記リノレン酸としては、リノレン酸又は製薬上許容されるリノレン酸の塩を使用することができる。
【００４５】
＜１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸＞
前記１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸は、植物などに含まれる、下記の構造式（５）で表される脂肪酸である。
【化５】
2014097977.tif 000006
【００４６】
＜＜１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸の製造方法＞＞
前記１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物抽出物調製工程、植物抽出物溶出工程、及び溶出物精製工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００４７】
−植物抽出物調製工程−
前記植物抽出物調製工程は、植物の抽出物を調製する工程である。
前記植物としては、前記１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸を抽出できる植物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、スターフルーツが好ましい。
【００４８】
前記植物抽出物の抽出原料であるスターフルーツはカタバミ科ゴレンシ属の常緑の木本であり、学名は、Ａｖｅｒｒｈｏａ ｃａｒａｍｂｏｌａ（和名：ゴレンシ）である。前記スターフルーツの原産地は、東南アジア全域の他、中国南部、台湾、ブラジル、ガイアナ、トリニダード・トバゴ、フロリダ、ハワイ等の熱帯から亜熱帯地域であり、これらの地域から容易に入手可能である。前記スターフルーツは、甘い実のなる甘味種と、酸味のある実のなる酸味種とがあり、生食の他、ジャムやゼリー、漬物などに利用されている。前記スターフルーツの葉は、風熱感冒、急性胃腸炎、小便不利、産後浮腫等の予防乃至治療剤として利用されている。
【００４９】
前記植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。なお、前記植物抽出物には、前記植物の抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００５０】
前記植物の抽出部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記植物がスターフルーツの場合、葉部、枝部、幹部、樹皮部、花部、果実部、根部などが挙げられるが、これらの中でも、葉部が好ましい。
【００５１】
前記植物の抽出部位の調製方法としては、各部位を乾燥させた後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。前記乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。
【００５２】
前記植物抽出物を抽出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出する方法などが挙げられ、具体例としては、抽出溶媒を満たした処理槽内に、抽出原料としてのスターフルーツを投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出する方法などが挙げられる。
【００５３】
前記植物から前記植物抽出物を抽出するのに用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒などが挙げられる。
【００５４】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００５５】
前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。
【００５６】
前記植物抽出物の抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出溶媒量としては、抽出原料の５倍量〜１５倍量（質量比）が好ましく、抽出溶媒として水を用いた場合には、５０℃〜９５℃で１時間〜４時間程度で抽出することが好ましく、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、４０℃〜９０℃で３０分間〜４時間程度で抽出することが好ましい。
【００５７】
前記植物抽出物の精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離などの精製方法が挙げられる。
【００５８】
−植物抽出物溶出工程−
前記植物抽出物溶出工程は、前記植物抽出物調製工程により得られた前記植物抽出物から１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸を含有する成分を溶出する工程である。
【００５９】
前記植物抽出物から１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸を含有する成分を溶出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記スターフルーツの抽出物を極性溶媒により溶出する方法が好ましく、具体的には、前記スターフルーツの抽出物をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０に付して、水、６０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出する方法がより好ましい。
【００６０】
−溶出物精製工程−
前記溶出物精製工程は、前記植物抽出物溶出工程により得られた溶出物から１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸を精製する工程である。
【００６１】
前記溶出物から１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記極性溶媒により得られた溶出物を粗精製して分取ＨＰＬＣを用いて１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸を分離精製する方法が好ましく、具体的には、得られた水溶出物、６０質量％メタノール溶出物、メタノール溶出物、及びアセトン溶出物のうち、メタノール溶出物をＳｉＯ２カラムにより粗精製し、前記粗精製することにより得られた粗精製物から分取ＨＰＬＣを用いて１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸を単離して精製する方法が好ましい。
【００６２】
＜＜１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸が製造されたことを確認する方法＞＞
前記１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸が製造されたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単離された目的物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析することにより確認する方法が好ましい。
なお、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、以下に示す通りである。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ：
１４．２、２０．７、２４．６、２７．６、２８．８、２８．９、２９．４、３５．２、７２．２、１２３．７、１２５．９、１２７．８、１３２．９、１３４．９、１３５．２、１７８．８．
【００６３】
＜プロシアニジンＢ−２＞
前記プロシアニジンＢ−２は、植物などに含まれる、下記の構造式（６）で表されるポリフェノールである。
【化６】
2014097977.tif 000007
【００６４】
前記プロシアニジンＢ−２は、植物などの天然物から精製されたものであってもよいし、化学合成品であってもよい。前記プロシアニジンＢ−２としては、市販品を用いることができ、該市販品としては、例えば、和光純薬工業株式会社が製造している市販品が挙げられる。前記プロシアニジンＢ−２としては、プロシアニジンＢ−２又は製薬上許容されるプロシアニジンＢ−２の塩を使用することができる。
【００６５】
＜エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン＞
前記エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンは、植物などに含まれる、下記の構造式（７）で表されるポリフェノールである。
【化７】
2014097977.tif 000008
【００６６】
＜＜エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンの製造方法＞＞
前記エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物抽出物調製工程、植物抽出物溶出工程、及び溶出物精製工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００６７】
−植物抽出物調製工程−
前記植物抽出物調製工程は、植物の抽出物を調製する工程である。
前記植物としては、前記エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンを抽出できる植物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、カリンが好ましい。
【００６８】
前記植物抽出物の抽出原料であるカリンは、バラ科ボケ属の落葉高木植物であり、学名はＣｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓである。前記カリンは、木瓜（モッカ）とも呼ばれており、中国東部原産で、耐寒性もあり、日本を始め、中国や朝鮮、アメリカ、フランスなどで栽培されており、これらの地域から容易に入手可能である。前記カリンの果実は、生薬名を和木瓜（ワモッカ）といい、古くからのどの炎症を抑える咳き止めとして広く利用されている。
【００６９】
前記植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。なお、前記植物抽出物には、前記植物の抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００７０】
前記植物の抽出部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記植物がカリンの場合、葉部、枝部、幹部、樹皮部、花部、果実部、根部などが挙げられるが、これらの中でも、果実部が好ましい。
【００７１】
前記植物の抽出部位の調製方法としては、各部位を乾燥させた後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。前記乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。
【００７２】
前記植物抽出物を抽出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出する方法などが挙げられ、具体例としては、抽出溶媒を満たした処理槽内に、抽出原料としてのカリンを投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出する方法などが挙げられる。
【００７３】
前記植物から前記植物抽出物を抽出するのに用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒などが挙げられる。
【００７４】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００７５】
前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。
【００７６】
前記植物抽出物の抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出溶媒量としては、抽出原料の５倍量〜１５倍量（質量比）が好ましく、抽出溶媒として水を用いた場合には、５０℃〜９５℃で１時間〜４時間程度で抽出することが好ましく、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、４０℃〜９０℃で３０分間〜４時間程度で抽出することが好ましい。
【００７７】
前記植物抽出物の精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離などの精製方法が挙げられる。
【００７８】
−植物抽出物溶出工程−
前記植物抽出物溶出工程は、前記植物抽出物調製工程により得られた前記植物抽出物からエピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンを含有する成分を溶出する工程である。
【００７９】
前記植物抽出物からエピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンを含有する成分を溶出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記カリンの抽出物を極性溶媒により溶出する方法が好ましく、具体的には、前記カリンの抽出物をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０に付して、水、６０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出する方法がより好ましい。
【００８０】
−溶出物精製工程−
前記溶出物精製工程は、前記植物抽出物溶出工程により得られた溶出物からエピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンを精製する工程である。
【００８１】
前記溶出物からエピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンを精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記極性溶媒により得られた溶出物を粗精製して分取ＨＰＬＣを用いてエピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンを分離精製する方法が好ましく、具体的には、得られた水溶出物、６０質量％メタノール溶出物、メタノール溶出物、及びアセトン溶出物のうち、６０質量％メタノール溶出物をＯＤＳカラムにより粗精製し、前記粗精製することにより得られた粗精製物から分取ＨＰＬＣを用いてエピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンを単離して精製する方法が好ましい。
【００８２】
＜＜エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンが製造されたことを確認する方法＞＞
前記エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンが製造されたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単離された目的物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析することにより確認する方法が好ましい。
なお、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、以下に示す通りである。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δＣ：
２９．７、３７．５、３７．５、６６．９、７３．１、７３．４、７７．１、７７．４、７９．６、９６．２、９６．６、９６．６、９７．４、１００．５、１００．５、１０１．４、１０６．６、１０８．６、１１５．２−１１５．９、１１８．８、１１９．２、１１９．６、１３２．１、１３２．４、１３２．６、１４５．６−１４５．９、１５４．４−１５９．３
【００８３】
＜プロシアニジンＣ−１＞
前記プロシアニジンＣ−１は、植物などに含まれる、下記の構造式（８）で表されるポリフェノールである。
【化８】
2014097977.tif 000009
【００８４】
前記プロシアニジンＣ−１は、植物などの天然物から精製されたものであってもよいし、化学合成品であってもよい。前記プロシアニジンＣ−１としては、市販品を用いることができ、該市販品としては、例えば、和光純薬工業株式会社が製造している市販品が挙げられる。前記プロシアニジンＣ−１としては、プロシアニジンＣ−１又は製薬上許容されるプロシアニジンＣ−１の塩を使用することができる。
【００８５】
＜アストラガロシドＶＩＩＩ＞
前記アストラガロシドＶＩＩＩ（ウイスタリアサポニンＣ）は、植物などに含まれる、下記の構造式（９）で表されるサポニン化合物である。
【化９】
2014097977.tif 000010
【００８６】
＜＜アストラガロシドＶＩＩＩの製造方法＞＞
前記アストラガロシドＶＩＩＩの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物抽出物調製工程、植物抽出物溶出工程、及び溶出物精製工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００８７】
−植物抽出物調製工程−
前記植物抽出物調製工程は、植物の抽出物を調製する工程である。
前記植物としては、前記アストラガロシドＶＩＩＩを抽出できる植物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ツルレンゲが好ましい。
【００８８】
前記植物抽出物の抽出原料であるツルレンゲ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｃｏｍｐｌａｎａｔｕｓ  Ｒ．Ｂｒ．）は、マメ科ゲンゲ属の多年草の植物であり、ツルゲンゲとも呼ばれる。前記ツルレンゲは、中国の遼寧、吉林、河北、陜西、甘粛、山西、内モンゴル等の山野に生え、これらの地域から容易に入手可能である。前記ツルレンゲは、草丈が１ｍ以上あり、全体が短い剛毛に覆われ、茎がやや扁平で地上をはうように生える。前記ツルレンゲの種子は、円みのある腎臓形で、沙苑子（シャエンシ）とも呼ばれ、肝機能や腎機能を補うなどの薬効があるとされている。
【００８９】
前記植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。なお、前記植物抽出物には、前記植物の抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００９０】
前記植物の抽出部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記植物がツルレンゲの場合、葉部、枝部、幹部、樹皮部、花部、果実部、種子部、種皮部、根部などが挙げられるが、これらの中でも、種子部が好ましい。
【００９１】
前記植物の抽出部位の調製方法としては、各部位を乾燥させた後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。前記乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。
【００９２】
前記植物抽出物を抽出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出する方法などが挙げられ、具体例としては、抽出溶媒を満たした処理槽内に、抽出原料としてのツルレンゲを投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出する方法などが挙げられる。
【００９３】
前記植物から前記植物抽出物を抽出するのに用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒などが挙げられる。
【００９４】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００９５】
前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。
【００９６】
前記植物抽出物の抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出溶媒量としては、抽出原料の５倍量〜１５倍量（質量比）が好ましく、抽出溶媒として水を用いた場合には、５０℃〜９５℃で１時間〜４時間程度で抽出することが好ましく、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、４０℃〜９０℃で３０分間〜４時間程度で抽出することが好ましい。
【００９７】
前記植物抽出物の精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離などの精製方法が挙げられる。
【００９８】
−植物抽出物溶出工程−
前記植物抽出物溶出工程は、前記植物抽出物調製工程により得られた前記植物抽出物からアストラガロシドＶＩＩＩを含有する成分を溶出する工程である。
【００９９】
前記植物抽出物からアストラガロシドＶＩＩＩを含有する成分を溶出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ツルレンゲの抽出物を極性溶媒により溶出する方法が好ましく、具体的には、前記ツルレンゲの抽出物をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０に付して、水、６０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出する方法がより好ましい。
【０１００】
−溶出物精製工程−
前記溶出物精製工程は、前記植物抽出物溶出工程により得られた溶出物からアストラガロシドＶＩＩＩを精製する工程である。
【０１０１】
前記溶出物からアストラガロシドＶＩＩＩを精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記極性溶媒により得られた溶出物を粗精製して分取ＨＰＬＣを用いてアストラガロシドＶＩＩＩを分離精製する方法が好ましく、具体的には、得られた水溶出物、６０質量％メタノール溶出物、メタノール溶出物、及びアセトン溶出物のうち、メタノール溶出物をＳｉＯ２カラムにより粗精製し、前記粗精製することにより得られた粗精製物から分取ＨＰＬＣを用いてアストラガロシドＶＩＩＩを単離して精製する方法が好ましい。
【０１０２】
＜＜アストラガロシドＶＩＩＩが製造されたことを確認する方法＞＞
前記アストラガロシドＶＩＩＩが製造されたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単離された目的物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析することにより確認する方法が好ましい。
なお、アストラガロシドＶＩＩＩの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、以下に示す通りである。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，Ｃ５Ｄ５Ｎ）δＣ：
１５．６、１７．０、１８．７、１８．９、２１．２、２３．０、２４．０、２５．７、２６．４、２６．７、２８．６、２８．６、３０．９、３３．３、３３．３、３６．６、３８．０、３８．９、４０．０、４２．３、４２．４、４４．４、４５．４、４６．８、４７．８、５６．４、６２．９、６６．９、６９．５、７０．９、７２．４、７２．８、７３．９、７４．４、７５．６、７７．５、７７．８、７８．５、７８．７、７９．５、９１．１、１０２．４、１０２．６、１０５．５、１２２．５、１４４．８、１７２．４
【０１０３】
＜ソヤサポニンＩ＞
前記ソヤサポニンＩは、植物などに含まれる、下記の構造式（１０）で表されるサポニン化合物である。
【化１０】
2014097977.tif 000011
【０１０４】
前記ソヤサポニンＩは、植物などの天然物から精製されたものであってもよいし、化学合成品であってもよい。前記ソヤサポニンＩとしては、市販品を用いることができ、該市販品としては、例えば、和光純薬工業株式会社が製造している市販品が挙げられる。前記ソヤサポニンＩとしては、ソヤサポニンＩ又は製薬上許容されるソヤサポニンＩの塩を使用することができる。
【０１０５】
＜３’−Ｏ−メチルガロカテキン＞
前記３’−Ｏ−メチルガロカテキンは、植物などに含まれる、下記の構造式（１１）で表される化合物（カテキン類、タンニン）である。
【化１１】
2014097977.tif 000012
【０１０６】
＜＜３’−Ｏ−メチルガロカテキンの製造方法＞＞
前記３’−Ｏ−メチルガロカテキンの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物抽出物調製工程、植物抽出物溶出工程、及び溶出物精製工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【０１０７】
−植物抽出物調製工程−
前記植物抽出物調製工程は、植物の抽出物を調製する工程である。
前記植物としては、前記３’−Ｏ−メチルガロカテキンを抽出できる植物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ツルレンゲが好ましい。
前記植物抽出物調製工程は、前記アストラガロシドＶＩＩＩの植物抽出物調製工程と同様であるため、その説明を省略する。
【０１０８】
−植物抽出物溶出工程−
前記植物抽出物溶出工程は、前記植物抽出物調製工程により得られた前記植物抽出物から３’−Ｏ−メチルガロカテキンを含有する成分を溶出する工程である。
【０１０９】
前記植物抽出物から３’−Ｏ−メチルガロカテキンを含有する成分を溶出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ツルレンゲの抽出物を極性溶媒により溶出する方法が好ましく、具体的には、前記ツルレンゲの抽出物をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０に付して、水、６０質量％メタノール、メタノール及びアセトンにより順次溶出する方法がより好ましい。
【０１１０】
−溶出物精製工程−
前記溶出物精製工程は、前記植物抽出物溶出工程により得られた溶出物から３’−Ｏ−メチルガロカテキンを精製する工程である。
【０１１１】
前記溶出物から３’−Ｏ−メチルガロカテキンを精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記極性溶媒により得られた溶出物を粗精製して分取ＨＰＬＣを用いて３’−Ｏ−メチルガロカテキンを分離精製する方法が好ましく、具体的には、得られた水溶出物、６０質量％メタノール溶出物、メタノール溶出物及びアセトン溶出物のうち、６０質量％メタノール溶出物をＯＤＳカラムにより粗精製し、前記粗精製することにより得られた粗精製物から分取ＨＰＬＣを用いて３’−Ｏ−メチルガロカテキンを単離して精製する方法が好ましい。
【０１１２】
＜＜３’−Ｏ−メチルガロカテキンが製造されたことを確認する方法＞＞
前記３’−Ｏ−メチルガロカテキンが製造されたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単離された目的物の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析することにより確認する方法が好ましい。
なお、３’−Ｏ−メチルガロカテキンの１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、以下に示す通りである。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，(ＣＤ３)２ＣＯ）δＨ（帰属水素、カップリング様式、Ｊ値）：
２．５０（Ｈ−４、ｄｄ、Ｊ＝８．８、１６．１Ｈｚ）、２．９０（Ｈ−４、ｄｄ、Ｊ＝５．８、１６．１Ｈｚ）、３．７８（３’−ＯＣＨ３、ｓ）、３．９８（Ｈ−３、ｄｄｄ−ｌｉｋｅ）、４．５０（Ｈ−２、ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ）、５．８６（Ｈ−８、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．０１（Ｈ−６、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．５６（Ｈ−２’、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．５７（Ｈ−６’、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，(ＣＤ３)２ＣＯ）δＣ（帰属炭素）：
２８．８（Ｃ−４）、５６．４（３’−ＯＣＨ３）、６８．２（Ｃ−３）、８２．８（Ｃ−２）、９５．２（Ｃ−８）、９６．１（Ｃ−６）、１００．５（Ｃ−１０）、１０３．８（Ｃ−２’）、１０９．０（Ｃ−６’）、１３１．０（Ｃ−１’）、１３４．５（Ｃ−４’）、１４５．８（Ｃ−５’）、１４８．７（Ｃ−３’）、１５６．７（Ｃ−９）、１５７．１（Ｃ−５）、１５７．６（Ｃ−７）
【０１１３】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、皮膚栄養剤などが挙げられる。  また、前記その他の成分の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸加水分解物、コラーゲン、コラーゲン加水分解物、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、アスコルビン酸配糖体、コエンザイムＱ１０、プロポリス、ローヤルゼリー、ローヤルゼリー蛋白分解物、フコイダン、アロエ粉末、アロエ抽出物、ブルーベリー粉末、ブルーベリー抽出物、イソフラボン、ノニ粉末、ノニ抽出物、ニンニク粉末、ニンニク抽出物、ウコン粉末、ウコン抽出物、キトサン、グルコサミン、クロレラ粉末、クロレラ抽出物、カルニチン、マカ粉末、マカ抽出物、カシス粉末、カシス抽出物、ハナビラタケ粉末、ハナビラタケ抽出物、その他美容に有効であるとされる植物の粉末及び／又は抽出物などが挙げられる。
【０１１４】
＜用途＞
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤及び血管の安定化剤は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有するため、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患、アトピー性皮膚炎、及び花粉症などのアレルギー性疾患に関する医薬品、並びにこれらの疾患に関する安全な予防薬として好適に用いることができ、その配合量、用法、及び剤型としては、その使用目的に応じて適宜選択することができる。また、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤は、消化管で消化されるようなものではないことが確認されているので、美容用飲食品、健康用飲食品などの飲食品として好適に用いることができ、その配合量、用法、及び剤型としては、その使用目的に応じて適宜選択することができる。
【０１１５】
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤における前記ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種を本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤として用いてもよいが、Ｔｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤１ｍＬあたり、０．０１μｇ以上が好ましく、０．１μｇ以上１，０００μｇ以下がより好ましく、１μｇ以上５００μｇ以下が更に好ましく、３μｇ以上４００μｇ以下が特に好ましい。
【０１１６】
前記用法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口、非経口、外用などの用法が挙げられる。
【０１１７】
前記剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、及びシロップ剤等の経口投与剤、注射剤、点滴剤、及び坐剤等の非経口投与剤、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、及び浴用剤、頭髪化粧料等の外用剤などが挙げられる。
【０１１８】
（医薬品組成物）
本発明の医薬品組成物は、上述した本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤の少なくともいずれかを含有し、更に必要に応じて医薬品に通常使用される添加剤を含有してもよい。
【０１１９】
本発明の医薬品組成物は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用の少なくともいずれかの作用を有するため、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧等の血管病変を主体とした疾患、アトピー性皮膚炎、及び花粉症などのアレルギー性疾患に関する医薬品、並びにこれらの疾患に関する安全な予防薬として好適に用いることができる。
また、本発明の医薬品組成物は、消化管で消化されるようなものでないことが確認されているため、美容用飲食品、健康用飲食品等の飲食品として、幅広く用いることができる。
【０１２０】
本発明の医薬品組成物における前記ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンから選択される少なくとも１種そのものを本発明の医薬品組成物として用いてもよいが、医薬品組成物１ｍＬあたり、０．０１μｇ以上が好ましく、０．１μｇ以上１，０００μｇ以下がより好ましく、１μｇ以上５００μｇ以下が更に好ましく、３μｇ以上４００μｇ以下が特に好ましい。
【０１２１】
本発明の医薬品組成物の投与形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口、非経口、外用などが挙げられる。
【０１２２】
本発明の医薬品組成物の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、坐剤等の非経口投与剤；軟膏等の外用剤などが挙げられる。
【実施例】
【０１２３】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【０１２４】
（製造例１：３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１の製造）
グァバ抽出物（メタノール抽出物、丸善製薬株式会社製）（２２６．６ｇ）をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）カラムに付して、水、６０質量％メタノール、８０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出し、水溶出物（７７．４ｇ）、６０質量％メタノール溶出物（９５．８ｇ）、８０質量％メタノール溶出物（３．２ｇ）、メタノール溶出物（１９．９ｇ）、及びアセトン溶出物（１７．３ｇ）を得た。得られた６０質量％メタノール溶出物を、ＯＤＳカラム（メタノール：水（３０：７０））により粗精製した後、これを分取ＨＰＬＣ（ＯＤＳ，メタノール：水（２５：７５））により分離精製して、化合物（３４ｍｇ）を単離した。単離した化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析したところ、下記の構造式（３）で表される３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１が単離されたことがわかった。結果を下記に示す。
【０１２５】
【化１２】
2014097977.tif 000013
【０１２６】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＣＯ＋Ｄ２Ｏ）δＣ：
３４．１、６７．４、７４．５、７５．３、８１．９、９５．３、９５．８、９６．８、１００．９、１０１．４、１０６．７、１０９．９、１１４．７、１１４．７、１１５．４、１１５．６、１１８．９、１１９．５、１２１．３、１３１．３、１３１．６、１３８．８、１４５．０、１４５．１、１４５．１、１４５．２、１４５．７、１５４．３、１５５．６、１５５．６、１５７．１、１５７．１、１５７．４、１６６．６
【０１２７】
（製造例２：１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｚ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸の製造）
スターフルーツ抽出物（メタノール抽出物、丸善製薬株式会社製）（５０．０ｇ）を水、６０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出し、水溶出物（２１．０ｇ）、６０質量％メタノール溶出物（６．７ｇ）、メタノール溶出物（１２．７ｇ）、及びアセトン溶出物（７．８ｇ）を得た。得られたメタノール溶出物を、ＳｉＯ２カラム（クロロホルム：メタノール（２０：１））により粗精製した後、これを分取ＨＰＬＣ（ＯＤＳ，メタノール：水（６０：４０））により分離精製して、化合物（１７ｍｇ）を単離した。単離した化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析したところ、下記構造式（５）で表される１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸が単離されたことがわかった。結果を下記に示す。
【０１２８】
【化１３】
2014097977.tif 000014
【０１２９】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ：
１４．２、２０．７、２４．６、２７．６、２８．８、２８．９、２９．４、３５．２、７２．２、１２３．７、１２５．９、１２７．８、１３２．９、１３４．９、１３５．２、１７８．８．
【０１３０】
（製造例３：エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンの製造）
カリン抽出物（メタノール抽出物、丸善製薬株式会社製）（１７４．９ｇ）をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０カラム（三菱化学株式会社製）に付して、水、６０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出し、水溶出物（１４１．０ｇ）、６０質量％メタノール溶出物（２３．２ｇ）、メタノール溶出物（７．２ｇ）、及びアセトン溶出物（２．３ｇ）を得た。得られた６０質量％メタノール溶出物を、ＯＤＳカラム（メタノール：水（２０：８０））により粗精製した後、これを分取ＨＰＬＣ（ＯＤＳ，メタノール：水（２０：８０））により分離精製して、化合物（２９ｍｇ）を単離した。単離した化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析したところ、下記構造式（７）で表されるエピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンが単離されたことがわかった。結果を下記に示す。
【０１３１】
【化１４】
2014097977.tif 000015
【０１３２】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δＣ：
２９．７、３７．５、３７．５、６６．９、７３．１、７３．４、７７．１、７７．４、７９．６、９６．２、９６．６、９６．６、９７．４、１００．５、１００．５、１０１．４、１０６．６、１０８．６、１１５．２−１１５．９、１１８．８、１１９．２、１１９．６、１３２．１、１３２．４、１３２．６、１４５．６−１４５．９、１５４．４−１５９．３
【０１３３】
（製造例４：アストラガロシドＶＩＩＩの製造）
ツルレンゲ抽出物（３０質量％エタノール抽出物、丸善製薬株式会社製）（９６．４ｇ）をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０カラム（三菱化学株式会社製）に付して、水、６０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出し、水溶出物（７５．３ｇ）、６０質量％メタノール溶出物（１６．８ｇ）、メタノール溶出物（２．６１ｇ）、及びアセトン溶出物（０．１６ｇ）を得た。得られたメタノール溶出物を、ＳｉＯ２カラム（クロロホルム：メタノール：水（７０：３０：５））により粗精製した後、これを分取ＨＰＬＣ（ナカライテスクπＮＡＰ，メタノール：水：トリフルオロ酢酸（８０：２０：０．０５））により分離精製して、化合物（３８ｍｇ）を単離した。単離した化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析したところ、下記構造式（９）で表されるアストラガロシドＶＩＩＩが単離されたことがわかった。結果を下記に示す。
【０１３４】
【化１５】
2014097977.tif 000016
【０１３５】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，Ｃ５Ｄ５Ｎ）δＣ：
１５．６、１７．０、１８．７、１８．９、２１．２、２３．０、２４．０、２５．７、２６．４、２６．７、２８．６、２８．６、３０．９、３３．３、３３．３、３６．６、３８．０、３８．９、４０．０、４２．３、４２．４、４４．４、４５．４、４６．８、４７．８、５６．４、６２．９、６６．９、６９．５、７０．９、７２．４、７２．８、７３．９、７４．４、７５．６、７７．５、７７．８、７８．５、７８．７、７９．５、９１．１、１０２．４、１０２．６、１０５．５、１２２．５、１４４．８、１７２．４
【０１３６】
（製造例５：３’−Ｏ−メチルガロカテキンの製造）
ツルレンゲ抽出物（３０質量％エタノール抽出物、丸善製薬株式会社製）（９６．４ｇ）をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０カラム（三菱化学株式会社製）に付して、水、６０質量％メタノール、メタノール、及びアセトンにより順次溶出し、水溶出物（７５．３ｇ）、６０質量％メタノール溶出物（１６．８ｇ）、メタノール溶出物（２．６１ｇ）、及びアセトン溶出物（０．１６ｇ）を得た。得られた６０質量％メタノール溶出物を、ＯＤＳカラム（商品名：クロマトレックスＯＤＳ  ＤＭ１０２０Ｔ、富士シリシア化学株式会社製、メタノール：水＝１：９）、並びにＤｉｏｌシリカゲルカラム（商品名：クロマトレックスＤＩＯＬ、富士シリシア化学株式会社製、クロロホルム：メタノール＝３：１）により粗精製した後、これを分取ＨＰＬＣ（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８，メタノール：水＝３：７）により分離精製して、化合物（５１ｍｇ）を単離した。単離した化合物の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、超伝導多核種核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−４００、日本電子株式会社製）を用いて解析したところ、下記構造式（１１）で表される新規物質３’−Ｏ−メチルガロカテキンが単離されたことがわかった。結果を下記に示す。
【化１６】
2014097977.tif 000017
【０１３７】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，(ＣＤ３)２ＣＯ）δＨ（帰属水素、カップリング様式、Ｊ値）：
２．５０（Ｈ−４、ｄｄ、Ｊ＝８．８、１６．１Ｈｚ）、２．９０（Ｈ−４、ｄｄ、Ｊ＝５．８、１６．１Ｈｚ）、３．７８（３’−ＯＣＨ３、ｓ）、３．９８（Ｈ−３、ｄｄｄ−ｌｉｋｅ）、４．５０（Ｈ−２、ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ）、５．８６（Ｈ−８、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．０１（Ｈ−６、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．５６（Ｈ−２’、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．５７（Ｈ−６’、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）
【０１３８】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，(ＣＤ３)２ＣＯ）δＣ（帰属炭素）：
２８．８（Ｃ−４）、５６．４（３’−ＯＣＨ３）、６８．２（Ｃ−３）、８２．８（Ｃ−２）、９５．２（Ｃ−８）、９６．１（Ｃ−６）、１００．５（Ｃ−１０）、１０３．８（Ｃ−２’）、１０９．０（Ｃ−６’）、１３１．０（Ｃ−１’）、１３４．５（Ｃ−４’）、１４５．８（Ｃ−５’）、１４８．７（Ｃ−３’）、１５６．７（Ｃ−９）、１５７．１（Ｃ−５）、１５７．６（Ｃ−７）
【０１３９】
［試験例１：Ｔｉｅ２活性化作用（イムノアッセイ）試験］
（実施例１：ウルソール酸）
コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェルプレートへ２．０×１０４細胞／０．１ｍＬ／ウェルとなるように播種し、低血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２）を用いて一晩培養した。次に、一晩培養後の前記ＨＵＶＥＣを、細胞刺激（被験試料添加）の３時間前に０．１ｍＬの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２）に置換し、再度培養を行った。その後、前記ウェル内に、被験試料として前記Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２で各濃度に調製したウルソール酸（和光純薬工業株式会社製）を添加し（試料濃度：１２．５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬ）、１０分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２（Ｙ９９２）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型Ｔｉｅ２量を測定し、下記式（１）に従いＴｉｅ２リン酸化作用を評価した。
また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたＤＭＳＯについても同様に評価した。結果を表１に示す。
【数１】
2014097977.tif 000018
【０１４０】
（実施例２：コロソリン酸）
実施例１において、前記ウルソール酸を、コロソリン酸（和光純薬工業株式会社製）に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４１】
（実施例３：３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１）
実施例１において、前記ウルソール酸を、製造例１で調製した３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４２】
（実施例４：リノレン酸）
実施例１において、前記ウルソール酸を、リノレン酸（和光純薬工業株式会社製）に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４３】
（実施例５：１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸）
実施例１において、前記ウルソール酸を、製造例２で調製した１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４４】
（実施例６：プロシアニジンＢ−２）
実施例１において、前記ウルソール酸を、プロシアニジンＢ−２（和光純薬工業株式会社製）に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４５】
（実施例７：エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン）
実施例１において、前記ウルソール酸を、製造例３で調製したエピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキンに変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４６】
（実施例８：プロシアニジンＣ−１）
実施例１において、前記ウルソール酸を、プロシアニジンＣ−１（和光純薬工業株式会社製）に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４７】
（実施例９：アストラガロシドＶＩＩＩ）
実施例１において、前記ウルソール酸を、製造例４で調製したアストラガロシドＶＩＩＩに変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４８】
（実施例１０：ソヤサポニンＩ）
実施例１において、前記ウルソール酸を、ソヤサポニンＩ（和光純薬工業株式会社製）に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１４９】
（実施例１１：３’−Ｏ−メチルガロカテキン）
実施例１において、前記ウルソール酸を、製造例５で調製した３’−Ｏ−メチルガロカテキンに変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１５０】
（陽性コントロール）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例１において、前記ウルソール酸を、陽性コントロールとしてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社製）に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｉｅ２リン酸化作用を評価した。結果を表１に示す。
【０１５１】
【表１】
2014097977.tif 000019
【０１５２】
実施例１〜１１におけるＴｉｅ２リン酸化作用の結果について説明する。
前記イムノアッセイキットによりＴｉｅ２リン酸化作用の評価を実施したところ、実施例１〜１１の結果から、ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ、及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンは、いずれもＴｉｅ２のリン酸化、即ち、Ｔｉｅ２の活性化を誘導することが認められた。具体的なデータを示していないが、陰性コントロールであるＤＭＳＯを添加した系では、Ｔｉｅ２の顕著なリン酸化は認められなかった。陽性コントロールであるＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１を添加した系では、Ｔｉｅ２がリン酸化されることが認められた。したがって、実施例１〜１１で用いた化合物によりＴｉｅ２がリン酸化して活性化され、血管成熟化、血管正常化、血管安定化がもたらされ、血管新生が抑制されることが示唆された。
【０１５３】
以上より、ウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ、及び３’−Ｏ−メチルガロカテキンが、いずれもＴｉｅ２リン酸化効果を有することにより、血管新生の抑制が起こり、血管の成熟化、血管の正常化、及び血管の安定化を誘導できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有するため、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患に関する医薬品及びこれらの疾患に関する安全な予防薬として、幅広く用いることができる。
また、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤は、消化管で消化されるようなものではないことが確認されているので、美容用飲食品、健康用飲食品などの飲食品として、幅広く用いることができる。