(57)【要約】      （修正有）【課題】相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供する。【解決手段】抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントであって、、特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメイン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項１に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項１又は２に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有することを特徴とするミリストイル化タンパク質検出キット。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子。
【請求項８】
（ｇ）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ）配列番号８に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ）配列番号８に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の遺伝子を発現ベクターに挿入してなることを特徴とする組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターに関する。  
【背景技術】
【０００２】
ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットの一次配列決定の際にＮ末端にミリスチン酸が結合していることが発見されてから（非特許文献１参照。）、現在までに１００ 以上のミリストイル化タンパク質が報告され、全タンパク質の数パーセントがミリストイル化を受けているとゲノム配列から推定されている（非特許文献２参照。）。
【０００３】
ミリストイル化とは、タンパク質のＮ末端に炭素数14 個の飽和脂肪酸であるミリスチン酸が付加される翻訳後修飾の一種であり、この修飾はすべての真核生物に普遍的に存在するＮ−ミリストイル転移酵素（ＮＭＴ：Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、非特許文献３参照。）によって翻訳と同時に行われる。
ミリストイル化は、翻訳時にペプチド鎖がリボソームに結合した状態で、メチオニンアミノペプチダーゼによるＮ末端のメチオニンの除去により露出したグリシンのαアミノ基に、ＮＭＴがミリスチン酸をアミド結合で付加することで生じる（非特許文献４参照。）。ミリストイル化にはコンセンサス配列は存在しないが、Ｎ末端から１番目がグリシンであることは必須であり、２番目は電荷を持たないアミノ酸（但し、プロリン、芳香族アミンを除く）、５番目は電荷を持たないアミノ酸、特にセリンが存在する場合が多く、６番目はプロリン以外のアミノ酸である、という傾向がある（非特許文献５参照。）。
【０００４】
細胞内シグナル伝達系に関与するタンパク質に多く見られるミリストイル化は、タンパク質と細胞膜との可逆的な相互作用のために機能している。例えば、ＨＩＶ遺伝子産物であるＮｅｆや、癌遺伝子産物であるＳｒｃ  ｋｉｎａｓｅはミリストイル化がタンパク質の機能発現に関与していることが報告されている（非特許文献６，７参照。）。また、Ｎ末端グリシンに変異をいれミリストイル化できないようにしたタンパク質では細胞膜に結合できず、その結果、がんの転移活性がなくなる場合もあることも示唆されている。
【０００５】
タンパク質−膜間、あるいはタンパク質−タンパク質間の特異的相互作用を介して、タンパク質の細胞内局在や活性の制御を行うことにより細胞内情報伝達に深く関与しているミリストイル化タンパク質の検出は、それぞれの細胞の動作メカニズムを理解するための重要な知見を与える（非特許文献８，９参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Carr, S. A., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1982) vol.79, pp.6128-6131.
【非特許文献２】Maurer-Stroh, S., et.al., J. Mol. Biol., (2002) vol. 317, pp. 541-557.
【非特許文献３】Towler,D.A., et.al., J.Biol.Chem., (1987) vol. 262, pp. 1030-1036.
【非特許文献４】Rudnick ,D.A., et.al., J.Biol.Chem., (1990) vol. 265, pp. 13370-13378.
【非特許文献５】Towler,D.A., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1987) vol. 84, pp. 2708-2712.
【非特許文献６】Wang,J.K., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (2000) vol. 97, pp. 394-399.
【非特許文献７】Cross,FR., et.al., Mol.Cell.Biol., (1984) vol. 4, pp. 1834-1842.
【非特許文献８】Spiegel,A.M., et.al., Trends Biochem.Sci., (1991) vol.16,338-341.
【非特許文献９】Magee,T., et.al., Curr.Opin.Cell Biol., (2005) vol. 17, pp. 190-196.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、未知のミリストイル化タンパク質の存在が推定されているものの、化学的に安定で反応性の低いミリストイル基を簡便に検出する方法はこれまで存在しなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、抗体と抗原の分子間相互作用だけで抗体をクローニングすることが出来る抗体ライブラリー技術を用いて、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供するものである。
【００１０】
（１）（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１１】
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を有する重鎖可変ドメインを含む前記（１）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（１）又は（２）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（４）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（５）前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有することを特徴とするミリストイル化タンパク質検出キット。
（６）前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
（７）前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子。
（８）（ｇ）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ）配列番号８に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ）配列番号８に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（９）前記（７）又は（８）に記載の遺伝子を発現ベクターに挿入してなることを特徴とする組換えベクター。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】抗体ライブラリーに用いられるファージの構造を示す図である。
【図２】抗体ライブラリーのスクリーニング方法（パニング）の概要を示す図である。
【図３】ファージディスプレイ用の抗体発現ベクターを示す図である。
【図４】実施例における最適抗原量の検討結果である。
【図５】実施例におけるパニング回数とｏｕｔｐｕｔ／ｉｎｐｕｔ比の関係図である。
【図６】実施例における各パニング回数のポリクローナル抗体のＥＬＩＳＡの結果である。
【図７】実施例におけるモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡの結果である。
【図８】実施例において同定されたモノクローナル抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図９】実施例におけるモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡの結果である。
【図１０】実施例におけるモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果である。
【図１１】実施例におけるビアコアを用いた相互作用解析結果である。
【図１２】実施例におけるビアコアを用いた相互作用解析結果である。
【図１３】実施例におけるビアコアを用いた相互作用解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント＞
本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント（以下、本発明の抗体ともいう。）は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
尚、本発明において、ＣＤＲはｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎを意味する。
【００１５】
本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、ミリストイル化されたタンパク質のミリストイル基を特異的に認識するものである。従って、ミリストイル基特異的認識能を保持していれば、前記（ａ）〜（ｆ）の配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１ 〜５個が好ましく、１ 〜 ２個がより好ましい。
【００１６】
更に、発現精製が容易であることから、本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原を認識するために必要な最小単位である重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単可変ドメインフラグメントであることが好ましい。即ち、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましい。
具体的には、本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することが好ましく、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００１７】
本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法としては、特に限定されず、通常用いられる動物免疫法やハイブリドーマによる抗体作製法を用いてもよい。
しかしながら、動物細胞の増殖速度が遅く時間がかかる、動物に有害（致死性）な抗原は使用出来ない、エピトープ（抗体の抗原結合部位）や結合力が限られた特定の抗体しか得られない、抗体遺伝子を得るのが困難、等の問題があることから、抗体と抗原の分子間相互作用のみで抗体遺伝子をクローニングできる、ファージ抗体ライブラリーを用いたモノクローナル抗体の作製方法を用いることが好ましい。
抗体ライブラリーは、１固体の動物、あるいは、複数の固体の動物から全ての抗体遺伝子をクローニングし、その全ての可変ドメインを組み換え体の形（ｓｃＦｖ抗体）でそれぞれひとつの繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３）の外郭タンパク質に融合して発現させることで、全ての抗体を漏れなく提示したファージのセットを作製する技術である（図１参照。）。図２に示すように、かかる抗体ライブラリーを用いてファージ上に提示された抗体のセットを用いてパニングを行うことによって、目的の抗ミリストイル化タンパク質抗体が選択される。パニングのサイクルを数回繰り返すことによって抗体ライブラリーの中から、抗原であるミリストイル基との親和性の高い抗ミリストイル化タンパク質抗体を取得することができる。
パニングでは、標的タンパク質（抗原）であるミリストイル化タンパク質をプレートに固定化し、ファージ抗体を反応させ、結合しなかったファージは洗浄し、結合したファージ抗体を溶出し大腸菌（例えば、ＤＨ１２Ｓ）に感染させて増殖させる、という操作を繰り返す。これにより、抗原分子に発現した抗体が結合するかしないかだけで抗体を選択することが可能である。
【００１８】
抗体ライブラリーとしては、非免疫ライブラリー、免疫ライブラリー、合成ライブラリー等が挙げられる。非免疫ライブラリー及び免疫ライブラリーは、由来となる動物が体内で作製した抗体遺伝子を全てクローニングすることで作製する。このとき、非免疫ライブラリーでは免疫していない動物を、免疫ライブラリーでは目的の抗原で免疫した動物を使用する。後者では特異性が高く結合力が強い抗体が得られることが多いが、致死性の抗原は使用出来ない、得られる抗体のエピトープ（抗体の抗原結合部位）が限られるのに対して、前者ではどのような抗原も使用可能で、エピトープや結合力が異なる様々な抗体が得られる。合成ライブラリーは抗体の可変領域の中でも特に多様性を持つＣＤＲ領域の遺伝子をランダムなアミノ酸で置換をしたライブラリーである。この場合は多様性が得られるが、実際の生体内では機能する抗体だけが生み出されるのとは異なり、そこには不具合のある抗体が多数含まれている可能性があることが問題となる。
本発明においては、非免疫ライブラリー、免疫ライブラリーを用いることが好ましく、非免疫ライブラリーを用いることがより好ましい。
【００１９】
抗体ライブラリーは必ずしも免疫が必要ではなく、動物がもつ全ての抗体が候補となることから、毒物や本発明の抗体のような本来は生体内に大量に存在して免疫反応を惹起することが難しい分子に対する抗体も取得することが可能である。
また生体内では抗原による刺激が繰り返されることでより親和性の高い抗体を産出していくアフィニティーマチュレーション（抗体親和性成熟）がなされているが、遺伝子に変異を入れることやパニングを繰り返すことでこの現象をｉｎ  ｖｉｔｒｏ で再現できる。
また抗体分子とともに抗体の遺伝子も得ることができるため、継続的な抗体の生産が可能となることや、抗体分子の改変も出来ることもメリットのひとつである。
【００２０】
ファージディスプレイ用の抗体発現ベクターとしては、例えば図３に示すベクターが挙げられる（藤田保健衛生大学、黒澤研究室より供与）。図３に示すベクターにおいて、抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）として、最初はファージ外膜の一部であるｃｐ３と融合した形で発現される。次に、抗体を介して抗原に結合したファージからこのベクターを回収し、ＳａｌＩ処理を行うことでｃｐ３遺伝子を除去すると、ｐｒｏｔｅｉｎＡ が融合したｓｃＦｖ抗体が得られる。そのため、得られたｓｃＦｖ抗体は、ｐｒｏｔｅｉｎＡ が結合するＩｇＧを固相化したカラムで簡便に精製され得る。
【００２１】
＜遺伝子＞
本発明の遺伝子は、上述した本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなる。該遺伝子は、本発明の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含むものであれば、特に限定されず、重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含む遺伝子、及び、軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含む遺伝子の二つの遺伝子からなるものであってもよい。
ハンドリングしやすさの観点からは、上述したｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
【００２２】
従って、本発明の遺伝子は、具体的には、以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ）配列番号８に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ）配列番号８に示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２３】
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよい塩基の数としては、１ 〜３０個が好ましく、１ 〜１５個がより好ましく、１ 〜１０個が特に好ましく、１ 〜 ５個が最も好ましい。
【００２４】
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム,０．３Ｍ クエン酸溶液,ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００２５】
＜抗ミリストイル化タンパク質抗体組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、上述した本発明の遺伝子を発現ベクターに挿入してなるものであり、具体的には、発現ベクターに、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを、制限酵素部位を介して挿入してなるものである。
本発明の組換えベクターに挿入されるＤＮＡとしては、配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡが好ましい。
【００２６】
本発明に用いられる発現ベクターとしては、宿主細胞に抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる細胞系ベクター；適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系において抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる無細胞系ベクターが挙げられる。
細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
遺伝子が組込まれた組換えベクターの宿主への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００２７】
無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
【００２８】
無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いて、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントのＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡを合成する。係る転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質から抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを精製して用いることができる。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、精製抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの純度を高めることができる。
【００２９】
＜ミリストイル化タンパク質検出キット＞
本発明のミリストイル化タンパク質検出キットは、上述した本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有するものであれば特に限定されない。
例えば、本発明のミリストイル化タンパク質検出キットとして、サンドイッチ法により比色定量するＥＬＩＳＡキットが挙げられる。具体的には、本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントでコートされた９６ウェルプレートと、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等の酵素で標識した２次抗体と、該酵素の色原性基質と、を含む。
本発明のミリストイル化タンパク質検出キットによれば、ウエスタンブロット等を行わなくとも簡便にかつ短時間で試料中のミリストイル化タンパク質の検出をすることができる。
【００３０】
＜医薬＞
本発明の医薬は、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する。上述したように、タンパク質のミリストイル化は、癌遺伝子産物であるＳｒｃ  ｋｉｎａｓｅ等細胞内シグナル伝達系に関与するタンパク質や、Ｎｅｆ等のＨＩＶ遺伝子産物において報告されている。本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントが中和抗体として機能する場合には、これを有効成分として含有する本発明の医薬は、種々の疾患に対する治療効果が期待される。
本発明の医薬の治療効果が期待される対象疾患としては、例えばヒトの固形がん等が挙げられる。ヒトの固形がんとしては、例えば、脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ−イング腫、軟部肉腫などが挙げられる。
また、アルツハイマー病やパーキンソン病といった神経変性疾患；糖尿病等も挙げられる。
【００３１】
本発明の医薬における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００３２】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００３３】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００３４】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００３５】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００３６】
本発明の医薬の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
【００３７】
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
【実施例】
【００３８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（マウス由来非免疫抗体ライブラリーの作成）
［ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出］
免疫をしていないマウス（６ヶ月、Ｃ−５７ＢＬ６Ｊ）から脾臓を抽出し、すぐにＲＮＡｌａｔｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により安定化した後、ハサミを用いて細かくした。抽出した脾臓の一部（５０ｍｇ）からＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。吸光度にて抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度を見積もった。
【００４０】
［ｃＤＮＡの合成］
抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ３０μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
表１に示す組成の溶液を混合し、６５℃５分、氷上２分インキュベートした。
【００４３】
【表２】
2014209891.tif 000003
【００４４】
表１に示す組成の溶液に、表２に示す組成の溶液をさらに混合し、４２℃２分インキュベートした。次いで、この溶液に逆転写酵素６μＬをさらに混合し、４２℃５０分、７０℃１５分、氷上５分インキュベートした。次いで、ＲＮＡを分解するために、この溶液にＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、３７℃２０分インキュベートした。次いで、合成したｃＤＮＡ溶液を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて精製した。
【００４５】
［ＰＣＲ法の最適サイクル数の検討］
合成したｃＤＮＡを鋳型として用い、各抗体遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ法にて、各抗体遺伝子を増幅した。その際に最適なサイクル数を見積もった。各特異的プライマーはそれぞれ可変領域の両端にあるＶ遺伝子群（Ｖ  ｐｒｉｍｅｒ）、Ｊ遺伝子群（Ｊ  ｐｒｉｍｅｒ）に共通する配列をミックスしたものである。
各遺伝子の増幅におけるサイクル数を２４サイクルから３６サイクルに振り分けてＰＣＲ反応を行い、増幅産物をそれぞれアガロース電気泳動で確認した。ＰＣＲ反応における反応液の組成を表３に示し、ＰＣＲ反応の反応条件を表４に示す。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
【表４】
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【００４８】
［コントロールによるレパートリーチェック］
逆転写したｃＤＮＡが十分なレパートリーを保有しているかを予測するためにレパートリーチェックを行った。各鎖に特異的なプライマーを用いて、最適サイクル数でそれぞれ抗体遺伝子を増幅した。
各ＰＣＲ反応溶液を１／５等量の６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ（ＴａＫａＲａ社製）と混ぜ、２％アガロースゲルで電気泳動し、コントロールとＤＮＡ量を比較することでレパートリーを見積もった。
【００４９】
［ＰＣＲ法による抗体遺伝子の増幅］
十分なレパートリーを含んでいることを確認した上で検討した最適サイクル数により抗体遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応における反応液の組成を表５に示し、ＰＣＲ反応の反応条件を表６に示す。
【表５】
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【００５０】
【表６】
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【００５１】
各ＰＣＲ反応液をフェノールクロロホルム処理し、エタノール沈殿をした後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。各反応溶液を１／５等量の６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ（ＴａＫａＲａ社製）と混ぜ、２％アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンドがあることを確認した。
【００５２】
［軽鎖ライブラリーの作製］
精製した抗体遺伝子の軽鎖（ｋ鎖、λ鎖）、及び図３に記載のファージディスプレイ用の抗体発現ベクターをＮｃｏＩ、ＡｓｃＩで制限酵素処理をした。各抗体遺伝子４μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを各１．２μＬ加え３７℃で２時間インキュベートした。ｖｅｃｔｏｒ３０μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを１８μＬ、ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを各９μＬ加え３７℃で２時間インキュベートした。
制限酵素処理後の抗体遺伝子をＱＩＡ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、制限酵素処理後のベクターをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、アガロース電気泳動にて切断を確認した。
制限酵素処理済みのサンプルを、以下の反応組成で１５℃、３ 時間、ライゲーションを行った。
【００５３】
【表７】
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【００５４】
ｋ鎖、λ鎖のライゲーション産物をアガロース電気泳動にて確認をし、エタノール沈殿を行った。そのサンプル各５μＬとＤＨ１２Ｓ  １００μＬを混合し、エレクトロポレーション法にて（２５μＦ、２．５ｋＶ、２００Ω）形質転換し、２×ＹＴ培地１０ｍＬで３７℃１時間培養し、その一部（１００μＬ、１０μＬ、１μＬ）をＬＢＧＡプレートにまき、３７℃一晩インキュベートした。また、１０ｍＬ培養液に２×ＹＴＧＡ１９０ｍＬを加え３０℃一晩培養した。
用いた培地の組成を以下に示す。
２×ＹＴ：ｔｒｉｐｔｏｎｅ  １６ｇ，ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ，ＮａＣｌ １０ｇ（１Ｌ)
２×ＹＴＧＡ：２×ＹＴ＋Ａｍｐ  ｆｉｎａｌ  ２０μｇ／ｍＬ，Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｆｉｎａｌ  １％
ＬＢプレート：ｔｒｉｐｔｏｎｅ  １０ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ，ＮａＣｌ  １０ｇ，ａｇａｒ  １５ｇ（１Ｌ)
ＬＢＧＡプレート：ＬＢプレート＋Ａｍｐ  ｆｉｎａｌ  ２０μｇ／ｍＬ，Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｆｉｎａｌ  １％
【００５５】
各培養液２００ｍＬからＭａｘｉ  ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出し、アガロース電気泳動で目的のバンドを確認し、これをそれぞれマウス非免疫ｋ鎖、λ鎖ライブラリープラスミドとした。プレートのコロニー数からレパートリーを見積もり、コロニーを１０個ピックアップして、選択したコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析した。シークエンス反応に用いた溶液の組成を表８に示し、シークエンス反応の条件を表９に示す。
【００５６】
【表８】
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【００５７】
【表９】
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【００５８】
［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］
精製した重鎖遺伝子（Ｈ 鎖）と軽鎖（ｋ鎖、λ鎖）ライブラリーをＳｆｉＩで５０℃、
２時間制限酵素処理をした。具体的には、４μｇ重鎖遺伝子に、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＳｆｉＩを６μＬ加え、５０℃で２時間インキュベートしアガロース電気泳動にて切断を確認した。また、軽鎖ｋ鎖遺伝子と軽鎖λ鎖遺伝子を９：１に混合した軽鎖ライブラリー５μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを２０μＬ、ＳｆｉＩを１０μＬ加え、５０℃で２時間インキュベートしアガロース電気泳動にて切断を確認した。
さらに重鎖遺伝子、軽鎖ライブラリーにＸｈｏＩを５μＬ加え３７℃２時間インキュベートし、アガロース電気泳動にて切断を確認した。軽鎖ライブラリーについては、制限酵素処理後、エタノール沈殿をし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。軽鎖ライブラリーに重鎖遺伝子を組み込むために、以下の反応組成で１５℃、３ 時間、ライゲーションを行った。
【００５９】
【表１０】
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【００６０】
重鎖のライゲーション産物を電気泳動にて確認をし、エタノール沈殿を行った。そのサンプル１９μＬとＤＨ１２Ｓ  １００μＬを混合し、エレクトロポレーション法にて形質転換し、２×ＹＴ培地１０００ｍＬに加え、３７℃１時間培養し、その一部（１００μＬ、１０μＬ、１μＬ）をＬＢＧＡプレートにまき、３７℃一晩インキュベートした。また培養液にＧｌｕｃｏｓｅ ｆｉｎａｌ  １％、Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ  ｆｉｎａｌ  ２０μｇ／ｍｌになるように加え、３０℃一晩培養した。プレートのコロニー数からレパートリー数を見積もり、コロニーを１０個ピックアップして、選択したコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析した。シークエンス反応に用いた溶液の組成は、表８と同様であり、シークエンス反応の条件は、表９と同様である。
【００６１】
[プラスミド抽出]
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、３０℃一晩培養した培養液２００ｍＬから、Ｍａｘｉ  ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを１本使用してプラスミドを抽出し、これをマウス非免疫抗体ライブラリープラスミドとした。
【００６２】
[グリセロールストックの作製１]
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］の培養液のうち４０ｍＬを８０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し菌体を回収した。上清を捨て４０％グリセロールを５００μＬ加えて懸濁し−８０℃で保存した。同じものを計４本作り、これをマウスナイーブ抗体ライブラリーグリセロールストックとした。
【００６３】
[ｃｐ３  ｆｏｒｍの作製１]
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、一晩培養した培養液０．５ｍＬを２×ＹＴＡＩ  １０ｍＬに加え３０℃一晩培養した。この培養液を１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を回収し、飽和硫安を同量加え、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を完全に捨てきり硫安沈殿を行った。沈殿をＮａＮ３（ｆｉｎａｌ０．０５％）入りＰＢＳ  １ｍＬで懸濁、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を回収した。これをマウスナイーブ抗体ライブラリーｃｐ３  ｆｏｒｍ溶液とした。
用いた培地及び試薬の組成を以下に示す。
培地組成
２×ＹＴＡＩ：２×ＹＴ＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ  ｆｉｎａｌ  ２０μｇ／ｍｌ、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）ｆｉｎａｌ  ０．５ｍＭ
試薬組成
ＰＢＳ：ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ  １３７ｍＭ），ＫＣｌ（ｆｉｎａｌ ２．７ｍＭ)， ＮａＨＰＯ４ （ｆｉｎａｌ  １０ｍＭ) ，ＫＨ２ＰＯ４ （ｆｉｎａｌ １．７６ｍＭ)ｐＨ ７．４
【００６４】
[ファージ抗体の作製１]
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、一晩培養した培養液１０ｍｌを２×ＹＴＡ培地９０ｍＬに加えＯＤ＝０．５になるまで３７℃にて振盪培養し、ヘルパーファージＫＯ７を１ｍＬ加え１．５時間感染させた。２×ＹＴＡＫ 培地９００ｍＬに、感染させた培養液を全て加え３０℃一晩振盪培養した。この培養液を８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収した。次いで、この上清に１／５ 量のＰＥＧ を加え撹拌し８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し上清を捨て、再度遠心をして上清を完全に捨てた。沈殿をＮａＮ３ （ｆｉｎａｌ  ０．０５％）入りＰＢＳ  ４０ｍＬで懸濁した。この懸濁液０．４５μｍフィルターに通し、４℃保存、これをマウスナイーブ抗体ライブラリーファージ抗体とした。
用いた培地及び試薬の組成を以下に示す。
培地組成
２×ＹＴＡＫ：２×ＹＴ＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ  ｆｉｎａｌ  ２０μｇ／ｍＬ，Ｋａｎａｍｉｃｉｎｅ  ｆｉｎａｌ  ５０μｇ／ｍＬ
ＬＢＡＫ：ＬＢ培地＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ  ｆｉｎａｌ  ２０μｇ／ｍＬ，Ｋａｎａｍｉｃｉｎｅ  ｆｉｎａｌ  ５０μｇ／ｍＬ
試薬組成
ＰＥＧ：ＰＥＧ６０００  ２０％，ＮａＣｌ  ２．５Ｍ
【００６５】
（抗Ｎ−ミリストイル化タンパク質抗体のクローニング）
[パニング（抗体のスクリーニング）１]
ミリストイル基は、分子量が小さく、かつ生体内に含まれるものであるため、ミリストイル基をそのまま免疫しても、抗原性を示さない。そこでＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、４５０ｋＤａ−１３０００ｋＤａ）にミリストイル基をコンジュゲートさせた。ミリストイル基は結合するタンパク質のＮ末端がグリシンでないと結合しない、またＫＬＨも非結合分子がペプチド又はタンパク質でないと結合しないことから、条件を満たすようにリンカー用のペプチドを挟んで両者をマレイミド法で結合させた。リンカーペプチドにはミリストイル化タンパク質の中で天然には存在しない配列を設計した。具体的には、ミリストイル化タンパク質のＮ末端の配列傾向、ＫＬＨ結合用にＣ末端はシステインにする必要があることを踏まえて下記のように設計した。
ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ＧＫＲＫＣ−ＫＬＨ（ｍｙｒ−ＫＬＨ）
【００６６】
[抗原量検討]
パニングの抗原として、上記ｍｙｒ−ＫＬＨを用いて、Ｎｕｎｃ  Ｐｌａｔｅ  Ｆ８ＷＥＬＬＭＯＤ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ に結合する最適な抗原量をＥＬＩＳＡ法で求めた。反応条件を以下に示す。
抗原：ｍｙｒ−ＫＬＨ
固定化条件：２，１，０．５，０．２５，０．１２５，０．０７５μｇ抗原／ｗｅｌｌ及び１００μＬ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ＮａＮ３  ０．０５％ ／ｗｅｌｌを４℃、一晩、インキュベーションした。
ブロッキング剤：３００μＬ  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ＮａＮ３  ０．０５％を３７℃、１ 時間、インキュベーションした。
１次抗体：１００μＬ  ａｎｔｉ−ＫＬＨ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／２０００)を室温、１ 時間インキュベーションした。
２次抗体：１００μＬ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＨＰＲ  （Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ) （１／４０００)を室温、１ 時間インキュベーションした。
発色：２００μＬ  ＯＰＤ （ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ) を室温、５分間インキュベーションした。
停止液 ：７５μＬ  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて発色反応を停止した。
ＢｉｏＲａｄ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅｒを用いて各ｗｅｌｌの吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
結果を図４に示す。
【００６７】
図４に示すように、２μｇ以上の抗原量でパニングを行うことが最適であることが確認された。
【００６８】
[ファージのタイターチェック]
タイターチェックをするためにパニングに使用するファージ抗体を１０−８、１０−９希釈したものを大腸菌ＤＨ１２Ｓ株ＯＤ＝０．５の２×ＹＴＧＡ培養液５００μＬにそれぞれ１０μＬ加え１時間感染させ、そのうちの５０μＬをＬＢＧＡ プレートにまき、３７℃一晩インキュベートした。プレート上に出現したコロニー数を数え、１ｍＬに含まれるファージの数を算出した。
結果を表１１に示す。表１１に示されるように、１ｓｔ  ｉｎｐｕｔ  ｐｈａｇｅのタイターを約３．０ｘ１０−１２／ｍＬと見積もった。
【００６９】
【表１１】
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【００７０】
[パニング２]
最適抗原量をプレート８ｗｅｌｌ分にコーティングし４℃、一晩インキュベートした。ブロッキング剤には下記表１２に示すｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ｗｅｌｌに３００μＬ加え、室温で１時間インキュベートし、同時に別途下記表１３に示すｐｈａｇｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを室温で１時間インキュベートした。ｐｈａｇｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに予めＫＬＨを加えて反応させることによって、目的の部位以外の抗原（今回の場合はＫＬＨ）に結合するファージ抗体がスクリーニングに用いるプレート上の抗原に結合しないように前処理を施した。この処理によって、目的とするミリストイル基に結合するファージ抗体のみが得られることが期待できる。
【００７１】
【表１２】
2014209891.tif 000013
【００７２】
【表１３】
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【００７３】
各ｗｅｌｌから２００μＬのｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを抜き、１５０μＬのｐｈａｇｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、ピペッティングをし、室温で２時間インキュベートした。上清を捨て、ＰＢＳＴ０．１％ １０回、ＰＢＳ  ５回、ＭｉｌｌｉＱ  ｗａｔｅｒ  １ 回の順でｗｅｌｌを洗浄した。溶出のために各ｗｅｌｌに２００μＬの０．２Ｍグリシンを加え２分後からピペッティングを始め、３分後に回収をして１．５Ｍ  Ｔｒｉｓで中和をした。再度同様に溶出を行い、溶出液をあらかじめＯＤ＝０．５（２ｘＹＴ  ２０ｍＬ）に培養しておいたＤＨ１２Ｓに３７℃、１時間感染させた。２×ＹＴＧＡ  ３８０ｍＬに感染させた培養液を加え、一部（５００μＬ、５０μＬ、０．５μＬ）をＬＢＧＡプレートにまき３７℃一晩インキュベートし、コロニーの数からｏｕｔｐｕｔ  ｐｈａｇｅの数を算出した。培養液は３０℃一晩培養した。また後述の［ポリクローナル抗体のＥＬＩＳＡによる評価］ではこれらのｏｕｔｐｕｔプレートからコロニーをピックアップしモノクローナル抗体を得た。
用いた試薬の組成を以下に示す。
ＰＢＳＴ０．１％：ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０  ｆｉｎａｌ  ０．１％
グリシン：０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ: １．５Ｍ
【００７４】
[グリセロールストックの作製２]
上記[グリセロールストックの作製１]で述べた方法に従って、上記[パニング２]で述べた培養液からグリセロールストックを作製した。これを１ｓｔグリセロールストックとした。
【００７５】
[ｃｐ３  ｆｏｒｍの作製２]
上記[ｃｐ３  ｆｏｒｍの作製１] で述べた方法に従って、上記[パニング２]で述べた培養液からｃｐ３  ｆｏｒｍを発現させた。これを１ｓｔポリクローナルｃｐ３  ｆｏｒｍ溶液とした。
【００７６】
[ファージ抗体の作製２]
２ｎｄスクリーニングに用いるファージ抗体を作製した。上記[パニング２]の培養液２ｍＬに２ｘＹＴＡ  １８ｍＬを加えてＯＤ＝０．５になるまで３０分、３７℃で培養した。ヘルパーファージＫＯ７を２００μＬ加え３７℃、１．５時間感染させ、２×ＹＴＡＫ １８０ｍＬに加え３０℃一晩培養した。
培養液を８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収した。４０ｍＬのＰＥＧを加え撹拌し８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し上清を捨て、再度遠心し上清を完全に捨てた。沈殿をＮａＮ３（ｆｉｎａｌ  ０．０５％）入りＰＢＳ  ４ｍｌで懸濁した。溶けきらなかった分は１００００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を０．４５μｍフィルターに通し、４℃保存し、これを２ｎｄ  ｉｎｐｕｔファージ抗体とし、この２ｎｄ  ｉｎｐｕｔファージ抗体のタイターチェックを行った。タイターチェックの手順は上記[ファージのタイターチェック]に従った。
同様にパニングを、マウス非免疫ライブラリーを用いて５回行った。
【００７７】
ｍｙｒ−ＫＬＨを用いて行った５回のパニングにおいて、各回の算出されたｉｎｐｕｔ  ｐｈａｇｅ、ｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅのファージ数を表１４に示す。
なおｉｎｐｕｔ  ｐｈａｇｅ は上記[ファージのタイターチェック]の通りに確認したパニングに使用したファージの数であり、ｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅはパニング後、上記[パニング２]のステップで得られたプレートからコロニー数を数えて見積もったファージの数である。ｒａｔｉｏはｏｕｔｐｕｔをｉｎｐｕｔで割った値である。この値が大きいほど、目的の抗体が濃縮されていることになる。
【００７８】
【表１４】
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【００７９】
更に、表１４に基づき、縦軸にｒａｔｉｏを、横軸にパニングの回数をとったグラフを図５に示す。
図５に示すように、５回目のパニングを行うと、１回目と比較して目的の抗体が約５０倍に濃縮されていることが確認された。
マウス非免疫ライブラリー由来の抗体はｍｙｒ−ＫＬＨを認識している抗体がほとんどであったため、陽性クローンについて全て遺伝子配列を確認した。
【００８０】
［ポリクローナル抗体のＥＬＩＳＡによる評価］
上記[ｃｐ３  ｆｏｒｍの作製２]で得られたポリクローナルｃｐ３  ｆｏｒｍについて、ｍｙｒ−ＫＬＨ、ＫＬＨに対してＥＬＩＳＡを行った。反応条件は以下に示す。
抗原：ｍｙｒ−ＫＬＨ、ＫＬＨ
固定化条件：０．２５μｇ抗原／ｗｅｌｌ及び１００μＬ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ＮａＮ３  ０．０５％ ／ｗｅｌｌを４℃、一晩、インキュベーションした。
ブロッキング剤：３００μＬ  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ＮａＮ３  ０．０５％を３７℃、１ 時間、インキュベーションした。
１次抗体：各ポリクローナル抗体ｃｐ３  ｆｏｒｍ
２次抗体：１００μＬ  ａｎｔｉ−ｃｐ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／２０００) を室温、１時間インキュベーションした。
３次抗体：１００μＬ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＨＰＲ  （Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ) （１／４０００)を室温、１ 時間インキュベーションした。
発色：２００μＬ  ＯＰＤ （ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ) を室温、５分間インキュベーションした。
停止液：７５μＬ  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて発色反応を停止した。
ＢｉｏＲａｄ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅｒを用いて各ｗｅｌｌの吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
結果を図６に示す。パニング４回目、５回目で濃縮されたポリクローナル抗体は、ｍｙｒ−ＫＬＨを特異的に認識していることが確かめられた。
【００８１】
［モノクローナル抗体のｃｐ３  ｆｏｒｍ発現とプラスミド抽出］
マウス非免疫抗体ライブラリーによるパニングで得られた４、５回目のコロニーを各４８個ずつ計９６個拾い、２×ＹＴＧＡ  ４ｍＬで３７℃一晩培養した。培養液のうち１００μＬを２×ＹＴＡＩ  ２ｍＬで３０℃一晩培養し、各モノクローナルｃｐ３ ｆｏｒｍを発現させた。残りの培養液からＭｉｎｉｐｒｅｐ（ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出した。
【００８２】
［モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡによる評価］
各モノクローナルｃｐ３  ｆｏｒｍ抗体について、ｍｙｒ−ＫＬＨ、ＫＬＨに対してＥＬＩＳＡを行った。反応条件を以下に示す。
抗原：ｍｙｒ−ＫＬＨ、ＫＬＨ
固定化条件：０．２５μｇ抗原／ｗｅｌｌ（マウス抗体ライブラリー）及び１００μＬ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ＮａＮ３  ０．０５％ ／ｗｅｌｌを４℃、一晩、インキュベーションした。
ブロッキング剤：３００μＬ  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ＮａＮ３  ０．０５％を３７℃、１ 時間、インキュベーションした。
１次抗体：各モノクローナル抗体ｃｐ３  ｆｏｒｍ 
２次抗体：１００μＬ  ａｎｔｉ−ｃｐ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／２０００) を室温、１時間インキュベーションした。
３次抗体：１００μＬ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＨＰＲ  （Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ) （１／４０００)を室温、１ 時間インキュベーションした。
発色：２００μＬ  ＯＰＤ （ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ) を室温、５分間インキュベーションした。
停止液：７５μＬ  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて発色反応を停止した。
ＢｉｏＲａｄ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅｒを用いて各ｗｅｌｌの吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
結果を図７に示す。
各クローンはｍｙｒ−ＫＬＨに特異的に結合しているので、ミリストイル基、ミリストイル化ペプチドのペプチド部分、あるいはその両方を認識していると考えられる。陽性クローンについて全ての遺伝子配列を解析したところ、同じ配列のものが含まれており、全体としては図８に示される以下の２種類のクローンが得られたことが確認された。図８中、ＣＤＲ 領域の決定はＩｇＧ  ＢＬＡＳＴを参考にした。
【００８３】
（モノクローナル抗体の特異性の評価）
［モノクローナル抗体（ｃｐ３  ｆｏｒｍ）のＥＬＩＳＡによる評価］
上記［モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡによる評価］でｍｙｒ−ＫＬＨに特異的に反応した２種類のクローン（ｃｌｏｎｅ４１，ｃｌｏｎｅ７８）について再度ＥＬＩＳＡを行った。反応条件を下記に示す。ＥＬＩＳＡはｍｙｒ−ＫＬＨ、ＫＬＨ、ｍｙｒ−ＮＡＰ２２（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｘｏｎａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２２ｋＤａ:
脳に特異的に発現しているミリストイル化蛋白質）について行った。
抗原 ：ｍｙｒ−ＫＬＨ、ＫＬＨ、ｍｙｒ−ＮＡＰ２２
固定化条件：０．２５μｇ抗原／ｗｅｌｌ（ｍｙｒ−ＫＬＨ、ＫＬＨ）又は２０μｇ抗原／ｗｅｌｌ（ｍｙｒ−ＮＡＰ２２）及び１００μＬ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ＮａＮ３  ０．０５％ ／ｗｅｌｌを４℃、一晩、インキュベーションした。
ブロッキング剤：３００μＬ  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ＮａＮ３  ０．０５％を３７℃、１ 時間、インキュベーションした。
１次抗体：各モノクローナル抗体ｃｐ３  ｆｏｒｍ
２次抗体：１００μＬ  ａｎｔｉ−ｃｐ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／２０００) を室温、１時間インキュベーションした。
３次抗体：１００μＬ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＨＰＲ  （Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ) （１／４０００)を室温、１ 時間インキュベーションした。
発色：２００μＬ  ＯＰＤ （ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ) を室温、５分間インキュベーションした。
停止液：７５μＬ  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて発色反応を停止した。
ＢｉｏＲａｄ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅｒを用いて各ｗｅｌｌの吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。
結果を図９に示す。２種類のクローン（ｃｌｏｎｅ４１，ｃｌｏｎｅ７８）はｍｙｒ−ＫＬＨに特異的に反応し、またｍｙｒ−ＮＡＰにも特異性を示したことから、これら２種類のクローンはミリストイル基を認識していることが確認された。
【００８４】
［モノクローナル抗体ＰＡ  ｆｏｒｍ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ融合型）発現ベクターの作製］
得られたクローンを精製するためにＰＡ  ｆｏｒｍで発現するようにプラスミドを組み換えた。各プラスミドを２μｇ使用し、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＳａｌＩを１μＬ、ＭｉｌｌｉＱ  ｗａｔｅｒをｆｉｎａｌ  １００μＬになるように加え、３７℃で２時間インキュベートし、制限酵素処理をした。次いで、この制限酵素処理した反応液をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製をし１００μＬで溶出をした。
１／５量のプラスミドにＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ０．５μＬ、１０×ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、ＭｉｌｌｉＱ  ｗａｔｅｒをｔｏｔａｌ  ４０μＬになるように加え、１５℃、３時間ライゲーション反応をした。ライゲーション反応させたプラスミドをエタノール沈殿により精製した。精製後ＤＮＡ１μＬを大腸菌ＤＨ１２Ｓ  ２０μＬ にエレクトロポレーション法にて形質転換をし、２×ＹＴ培地１ｍＬで３７℃、１ 時間インキュベートした。培養液１００μＬをＬＢＧＡプレートにまき、３７℃、一晩インキュベートした。生えてきたコロニーをそれぞれ３つピックアップし、２×ＴＹＧＡ培地５ｍＬで３７℃、一晩振盪培養した。
培養液のうち２００μＬに４０％グリセロール２００μＬを加えグリセロールストックとした。同時に、培養液３ｍＬからＭｉｎｉｐｅｐ（ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出し、遺伝子配列を解析したところ、抗体遺伝子の次にＰＡの配列があることが確認された。シークエンス反応の条件は上記［軽鎖ライブラリーの作製］に従った。
【００８５】
［モノクローナル抗体ＰＡ  ｆｏｒｍの発現と精製］
上記［モノクローナル抗体ＰＡ  ｆｏｒｍ発現ベクターの作製］で作製したグリセロールストックを起こし、２×ＹＴＧＡ培地２０ｍＬに加え、３０℃で一晩培養した。培養液全量を４８０ｍＬの２×ＹＴＡＩ培地に加え、３０℃で一晩培養をした。上清を回収、硫酸アンモニウム（粉）を１５７ｇ加え、室温で３０分以上撹拌し、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心してペレットをＮａＮ３（ｆｉｎａｌ  ０．０５％）入りＰＢＳ２０ｍＬで懸濁し、再度１００００ｒｐｍ、４℃、１０分で遠心し、上清を０．４５μｍフィルターに通した。次いで、ＰＡ  ｆｏｒｍ溶液をカラムで精製した。精製条件を以下に示す。
カラム：ＩｇＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製） ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  １．５ｍＬ
平衡化：ＰＢＳ  ５０ｍＬ
洗浄：ＰＢＳＴ０．１％  ６０ｍｌ、ＰＢＳ２０ｍｌ、１０倍希釈したＰＢＳ  ５ｍｌ
溶出：５０ｍＭ  クエン酸（ｐＨ２．５）２０ｍＬ
【００８６】
溶出液を１．５Ｍ  Ｔｒｉｓで中和し、ＰＢＳ  ８００ｍＬで透析を２回行い、ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ−１５１０Ｋ にて限外濾過をし、５ｍＬに濃縮した。ＮａＮ３を終濃度０．０５％になるように加え、これを各クローンＰＡ  ｆｏｒｍ抗体精製溶液とした。
【００８７】
以上のことを２種類のクローン（ｃｌｏｎｅ４１，ｃｌｏｎｅ７８）について行った。ＰＡ  ｆｏｒｍが精製できているかをウェスタンブロッティングで確認し、濃度既知のサンプルと比較しＩｍａｇｅＪを使用し濃度を見積もった。撮影にはｉｍａｇｅ  ｓｃａｎｎｅｒ  ＡＴＴＯを用いた。測定条件を以下に示す。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル：１２．５％アクリルアミドゲル
電圧：３０ｍＡ
泳動時間：1 時間
ウェスタンブロッティング条件
メンブレン：ＰＶＤＦ膜 （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ：２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３）、１９．２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ，１５％メタノール，０．０３％ＳＤＳ
転写条件：１００ｍＡ、２５Ｖ、１時間半
ブロッキング：２％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｉｎ  ＰＢＳ
洗浄：ＰＢＳＴ０．１％
１次抗体：２ｍＬ  ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＨＲＰ （ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）（１／１０００  ｉｎ  ＰＢＳＴ０．０５％）を室温で、１ 時間インキュベートした。
発色：６００μＬ  Ｉｍｍｏｖｉｒｏｎ  ｗｅｓｔｅｒｎ化学発光ＨＲＰ 基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた。
ウェスタンブロッティングの結果を図１０に示す。図１０に示すように、各クローンにおいてシグナルが認められ、ＰＡ  ｆｏｒｍが精製できていることが確認された。画像解析により見積もった２種類のクローン（ｃｌｏｎｅ４１，ｃｌｏｎｅ７８）の濃度を表１５に示す。
【００８８】
【表１５】
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【００８９】
［抗体の結合力の決定］
精製した抗体の結合力を決定するためにＳＰＲ法を行った。解析にはＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘを使用した。リガンドとしてｍｙｒ−ＫＬＨ、ＫＬＨ、ｍｙｒ−ＮＡＰ２２をセンサーチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に結合させた。ランニングバッファー（ＨＢＳ）でシステムを置換し、リガンド希釈用緩衝液の最適ｐＨ を検討した。検討した緩衝液でリガンド溶液を希釈し、アミンカップリング法にてセンサーチップに抗原を結合させた。活性化にはＮＨＳ／ＥＤＣ（１：１）混合液を５μＬ／ｍｉｎで１４分７０μＬ流し、リガンドを各濃度で５μＬ／ｍｉｎ、７分、３５μＬ流し結合させた。リガンドが結合していることを確認してからエタノールアミンを５μＬ／ｍｉｎ、７分、３５μＬ 流し、ブロッキングをした。
用いた試薬の詳細を以下に示す。
ランニングバッファー：ＨＢＳ （１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５)
リガンド希釈液：Ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ４．０
リガンド濃度：ＫＬＨ（１００μｇ／ｍＬ），ｍｙｒ− ＫＬＨ（１００μｇ／ｍＬ），ｍｙｒ−ＮＡＰ２２（１０μｇ／ｍＬ）
【００９０】
ｃｌｏｎｅ４１を用いた場合の結果を図１１に示す。
尚、リガンドの固定化量は下記の値であった。
ｍｙｒ−ＫＬＨ：１１２３０ＲＵ（１１３３４ｐｇ／ｍｍ２，０．０２３ｐｍｏｌ）
ＫＬＨ：１６９２０ＲＵ（１６９２０ｐｇ／ｍｍ２，０．０３４ｐｍｏｌ）
【００９１】
次いで、アナライトに各濃度のＰＡ  ｆｏｒｍ抗体溶液（６７０ｎＭ、５３６ｎＭ、４０２ｎＭ）を用いて結合定数を求めた。
結合条件を以下に示す。アナライトの希釈にはＨＢＳを用いた。
速度：５μＬ／ｍｉｎ
時間：結合３分、解離３分
また、再生溶液にはグリシン（ｐＨ２．０）を用いた。
速度：３０μＬ／ｍｉｎ
時間：１分
【００９２】
ｃｌｏｎｅ４１におけるＫＤ（ｍｙｒ−ＫＬＨ）値は、１．１×１０−８（Ｍ−１) 〜１．４×１０−８（Ｍ−１)であった。しかしながら、ｃｌｏｎｅ４１はｍｙｒ−ＮＡＰ２２をリガンドとした場合は結合を示さなかった。
ＥＬＩＳＡの結果より、ｃｌｏｎｅ４１はｍｙｒ−ＫＬＨに対してより特異性を示し、結合力はＥＬＩＳＡ 及びＢＩＡＣＯＲＥの結果からｍｙｒ−ＫＬＨに対してのほうがＫＬＨに対してよりも１オーダー強いと言える。従ってこの抗体は、ｍｙｒ−ＫＬＨにのみ存在するペプチドリンカーを含むＫＬＨ部分を認識している可能性があることが確認された。
【００９３】
ｃｌｏｎｅ７８を用いた場合の結果を図１２に示す。
尚、リガンドの固定化量は下記の値であった。
ｍｙｒ−ＫＬＨ：１１３３４ＲＵ（１１３３４ｐｇ／ｍｍ２，０．０２３ｐｍｏｌ）
ＫＬＨ：１６４１３ＲＵ（１６４１３ｐｇ／ｍｍ２，０．０３３ｐｍｏｌ）
【００９４】
次いで、アナライトに各濃度のＰＡ  ｆｏｒｍ抗体溶液（３６ｎＭ、２８．８ｎＭ、２１．６ｎＭ）を用いて結合定数を求めた。
結合条件を以下に示す。アナライトの希釈にはＨＢＳを用いた。
速度：５μＬ／ｍｉｎ
時間：結合３分、解離３分
また、再生溶液にはグリシン（ｐＨ２．０）を用いた。
速度：３０μＬ／ｍｉｎ
時間：１分
【００９５】
ｃｌｏｎｅ７８におけるＫＤ（ｍｙｒ−ＫＬＨ）値は、１．４５×１０−８（Ｍ−１) 〜７．４３×１０−８（Ｍ−１)であった。次いで、ｃｌｏｎｅ７８において、ｍｙｒ−ＮＡＰ２２をリガンドとした場合の結合力を求めた。結果を図１３に示す。
尚、リガンドの固定化量は下記の値であった。
ｍｙｒ−ＮＡＰ２２：９５５２ＲＵ（９５５２ｐｇ／ｍｍ２，０．４３ｐｍｏｌ）
【００９６】
次いで、アナライトに各濃度のＰＡ  ｆｏｒｍ抗体溶液（３６ｎＭ、２８．８ｎＭ、２１．６ｎＭ）を用いて結合定数を求めた。
結合条件を以下に示す。アナライトの希釈にはＨＢＳを用いた。
速度：５μＬ／ｍｉｎ
時間：結合３分、解離３分
また、再生溶液にはグリシン（ｐＨ２．０）を用いた。
速度：３０μＬ／ｍｉｎ
時間：１分
【００９７】
ｃｌｏｎｅ７８におけるＫＤ（ｍｙｒ−ＮＡＰ２２）値は、３．６４×１０−６（Ｍ−１) 〜６．９８×１０−６（Ｍ−１)であった。ｍｙｒ−ＫＬＨ、ｍｙｒ−ＮＡＰ２２に共通する部分がミリストイル基であるから、ｃｌｏｎｅ７８はミリストイル基部分を認識していることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１０】
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【配列表】
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