(57)【要約】【課題】シミやソバカス等の色素沈着を効果的に予防、治療することができるチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤を提供する。さらに当該チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物を提供することを目的とする。【解決手段】タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ誘導抑制剤、及びメラニン合成抑制剤であり、これらチロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物である。【選択図】図３
2014097945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ誘導抑制剤。
【請求項２】
タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするメラニン合成抑制剤。
【請求項３】
還元剤を含有する請求項２に記載のメラニン合成抑制剤。
【請求項４】
請求項１に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは請求項２又は３に記載のメラニン合成抑制剤を含有する化粧料。
【請求項５】
請求項１に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは請求項２又は３に記載のメラニン合成抑制剤を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤に関する。さらに本発明は、チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シミ、ソバカス等の色素沈着は、太陽光等による紫外線の曝露、ホルモンバランスの異常等により、皮膚内に存在するメラニン細胞（メラノサイト）内において、メラニンが過剰生産されることにより生じることが知られている。メラニンは、チロシナーゼの作用により、必須アミノ酸であるチロシンからドーパキノンを合成し、このドーパキノンが酸化、重合して合成される。このメラニン合成経路をターゲットとしたメラニン合成抑制剤のスクリーニングが精力的に行われており、各種植物の抽出物にメラニン合成の抑制作用があることが報告されている。
【０００３】
例えば、トウセンダン、ソウカ、セネシオグラシリス、及びコクリロの抽出物は、チロシナーゼ活性の抑制作用を備えており、美白作用に有効であることが報告されている（特許文献１）。
【０００４】
カカオニブ、カカオマス、ココア、及びこれらの抽出物は、メラニンの合成抑制作用を備えており、シミ、ソバカス等の色素沈着の予防や治療に有効であることが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１９５７３２号公報
【特許文献２】特開２００７−０１５９４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１及び特許文献２に記載の植物には、メラニン合成を抑制する作用があることが開示され、一部の食品、化粧品、医薬品等の各種製品に配合されて実用化されているものもある。しかしながら、メラニン合成抑制効果、及びその安定性については、必ずしも満足のいくものではなかった。
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、チロシナーゼの誘導抑制作用と、メラニンの合成抑制作用とを備え、シミやソバカス等の色素沈着を効果的に予防、治療することができるチロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を提供することを目的とする。さらに当該チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料、及び医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明は以下の発明を含む。
［発明１］
タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ誘導抑制剤。
［発明２］
タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とするメラニン合成抑制剤。
［発明３］
還元剤を含有する発明２に記載のメラニン合成抑制剤。
［発明４］
発明１に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは発明２又は３に記載のメラニン合成抑制剤を含有する化粧料。
［発明５］
発明１に記載のチロシナーゼ誘導抑制剤、あるいは発明２又は３に記載のメラニン合成抑制剤を含有する医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本構成のチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤は、チロシナーゼの誘導抑制及びメラニンの合成抑制に優れた効力を発揮し、皮膚におけるメラニンの生成を効果的に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制を示す写真である。
【図２】図２は、タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制を示すグラフである。
【図３】図３は、タカクマムラサキ抽出物の添加量とメラニンの誘導量とを比較したグラフである。
【図４】図４は、タカクマムラサキ抽出物と還元剤とのメラニン合成抑制の相乗効果を示す写真である。
【図５】図５は、タカクマムラサキ抽出物と還元剤とのメラニン合成抑制の相乗効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明に係るチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤、並びに、当該チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物に関する実施形態を説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施形態に記載される構成に限定されることを意図しない。
【００１２】
クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）に属するタカクマムラサキ（Ｃａｌｌｉｃａｒｐａ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ  （Ｈｅｍｓｌ.）  Ｍｅｒｒ.）は、中国南部や台湾で広く分布する植物であり、民間薬で消腫（腫れを抑えること）や、止血等に用いられている。しかし、この植物が、チロシナーゼの誘導を抑制したり、メラニンの合成を抑制したりすることは知られていない。
【００１３】
本発明者らは、タカクマムラサキについて鋭意検討を重ねた結果、タカクマムラサキ又はその抽出物が、チロシナーゼの誘導抑制作用と、メラニンの合成抑制作用とを備えていることを見出し、本研究を完成させた。
【００１４】
本発明のタカクマムラサキ又はその抽出物を含有するチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤は、色素沈着の疾患の予防や治療に用いることが可能であり、具体的には、シミ、ソバカス、老人性色素斑等の予防や治療に用いることができる。
【００１５】
タカクマムラサキの使用される部位は、特に限定されるものではなく、その植物全体を使用してもよいし、花、果実、葉、茎、芽、根、種子等のいずれの部位を使用してもよいが、好ましくは、葉が使用される。
【００１６】
タカクマムラサキの抽出法としては、特に限定されず、タカクマムラサキをそのまま、含浸法、圧搾法、超音波法、水蒸気蒸留法、溶媒抽出法等で抽出してもよいし、タカクマムラサキを切断、粉砕、破砕したもの、又は乾燥、粉末化したものを上記方法で抽出してもよい。この中でも、好ましい抽出法としては、タカクマムラサキを乾燥、粉末化したものを、溶媒抽出法で抽出することである。
【００１７】
タカクマムラサキの抽出物を、溶媒抽出法で使用する場合、使用する溶媒としては、有機溶媒が好ましく、極性有機溶媒、非極性有機溶媒の何れでもよい。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ブチルアルコール等の低級アルコール類；ポリエチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；エチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；トルエン、キシレン、ヘキサン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；アセトニトリル等が挙げられるが、好ましくは低級アルコール類、多価アルコール類であり、さらに好ましくはエタノールである。有機溶媒は、一種単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
上記有機溶媒には、水を加水して含水有機溶媒としてもよい。含水有機溶媒に使用される有機溶媒としては、特に限定されないが、好ましくは低級アルコール類及び多価アルコール類であり、さらに好ましくは低級アルコール類であり、特に好ましくはエタノールである。含水有機溶媒中の有機溶剤の割合としては、好ましくは３０重量％以上であり、さらに好ましくは５０〜９９重量％であり、特に好ましくは７０〜９９重量％である。
【００１９】
タカクマムラサキ抽出物を溶媒抽出法で抽出する方法としては、特に限定されないが、例えば、タカクマムラサキの乾燥粉末１重量部に対して、上記有機溶媒又は含水有機溶媒を１〜５０重量部、好ましくは５〜２０重量部添加し、抽出温度を５〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃で、抽出時間を５〜１２０時間、好ましくは８〜４８時間で、静置又は撹拌しながらタカクマムラサキのエキス分を抽出した後、遠心分離機等で固形分を除去する方法等が挙げられる。また、抽出の際に、窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、非酸素条件下で行ってもよい。
【００２０】
得られたタカクマムラサキ抽出物は、そのまま用いてもよいが、希釈、濃縮、凍結乾燥等の処理を行って、液状、ペースト状、又は粉末状の形態に調製して用いることも可能である。また、必要に応じて、タカクマムラサキ抽出物を、活性炭、液体クロマトグラフィー、精留等によりさらに精製してもよいが、好ましい精製法としては、タカクマムラサキの乾燥粉末１〜１／５０重量部のエタノール抽出物を活性炭に素通りさせることである。
【００２１】
タカクマムラサキ抽出物に還元剤や還元作用を有する分子を添加することが好ましい。タカクマムラサキ抽出物に還元剤を添加すると、メラニンの合成を相乗的に抑制することが可能となる。使用可能な還元剤としては、例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、グルタチオン、細胞内でグルタチオンに代謝されるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）等が挙げられるが、好ましくは、ＮＡＣである。
【００２２】
タカクマムラサキ又はその抽出物は、チロシナーゼの誘導抑制作用及びメラニンの合成抑制作用を有しているため、シミ、ソバカス等の皮膚への色素沈着を予防、改善、治療する組成物として、化粧料、医薬組成物、及び食品等に配合して使用することができる。
【００２３】
化粧料は、タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とし、化粧料として許容される基材や担体と組み合わせて提供される。化粧料には、必要に応じて、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、分散剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保湿剤、着色剤、香料、増粘剤、殺菌剤、細胞賦活剤、抗炎症剤等の添加剤を適宜配合することもできる。
【００２４】
化粧料におけるタカクマムラサキ又はその抽出物の配合割合は、その有効量や、化粧料の形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、化粧料の総量に対して、乾燥重量当たり、０．０１〜９９重量％であり、好ましくは０．０１〜２０重量％であり、さらに好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２５】
化粧料として、具体的には、乳液、クリーム、クレンジング、パック、オイルリキッド、マッサージ料、美容液、洗浄剤、脱臭剤、ハンドクリーム、リップクリーム等のスキンケア化粧料；メイクアップ下地、白粉、リキッドファンデーション、油性ファンデーション、頬紅、アイシャドウ、マスカラ、アイライナー、アイブロウ、口紅等のメイクアップ化粧料；シャンプ−、リンス、トリートメント、セット剤等の毛髪化粧料；制汗剤、日焼け止め乳液や日焼け止めクリーム等の紫外線防御化粧料、皮膚外用剤等が挙げられ、医薬部外品として使用されるものも含まれる。
【００２６】
医薬組成物は、タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とし、薬学的に許容される基材や担体と組み合わせて提供される。医薬組成物には、薬学的に許容される限度において、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、分散剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保湿剤、着色剤、香料、増粘剤、殺菌剤、細胞賦活剤、抗炎症剤等の添加剤を適宜配合することもできる。
【００２７】
医薬組成物としては、医薬品又は医薬部外品を含み、タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分として含有する。当該医薬組成物は、経口又は非経口のいずれで適用される剤型であってもよい。経口投与で投与される医薬組成物の剤型としては、例えば、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤等が挙げられる。非経口で投与される医薬組成物の剤型としては、例えば、外用剤、経皮剤、経鼻剤、液剤、貼付剤、皮膚外用剤等が挙げられる。
【００２８】
医薬組成物におけるタカクマムラサキ又はその抽出物の配合割合は、その有効量や、医薬組成物の剤形や、投与形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、医薬組成物の総量に対して、乾燥重量当たり、０．０１〜９９重量％であり、好ましくは０．１〜５０重量％であり、さらに好ましくは０．１〜１０重量％である。
【００２９】
食品としては、タカクマムラサキ又はその抽出物を有効成分とし、食品素材として、各種食品に配合されて提供される。特に、タカクマムラサキ又はその抽出物を含有する食品は、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品として提供され得る。
【００３０】
食品の形態としては、固形、半固形、液状等のいずれの形態であってもよく、錠剤形態、丸剤形態、タブレット、カプセル形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。食品として、具体的には、パン類、麺類、スナック類、ケーキ類、冷菓類、飲料類、冷凍食品、インスタント食品等が挙げられる。
【００３１】
食品におけるタカクマムラサキ又はその抽出物の配合割合は、その有効量や、食品の形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、食品の総量に対して、乾燥重量当たり、０．１〜９９重量％であり、好ましくは０．１〜５０重量％であり、さらに好ましくは０．１〜１０重量％である。
【実施例】
【００３２】
本発明のチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤について、チロシナーゼの誘導抑制作用及びメラニンの合成抑制作用を評価する試験を実施した。試験結果を以下に示す。
【００３３】
＜チロシナーゼの誘導抑制作用の評価＞
タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制作用について、チロシナーゼの転写因子であるＭＩＴＦ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）及びチロシナーゼの発現量を、タカクマムラサキ抽出物の添加の有無により評価した。試験方法を以下に示す。
【００３４】
（タカクマムラサキ抽出物）
タカクマムラサキ（独立行政法人医薬基盤研究所  薬用植物資源研究センター種子島研究部にて栽培）は、収穫した葉を５０℃で２日間温風乾燥した（株式会社いすゞ製作所製、型番ＥＰＦＨ−３４３−２Ｔ）。乾燥した葉は、卓上粉砕機（株式会社東京ユニコム、型番Ｔ−３５１）を用いて粉末化した。タカクマムラサキの粉末０．５ｇに、５ｍｌのエタノールを加え、１２時間、１ｒｐｍで撹拌し、８００ｇ、５分間で遠心後、エタノールを回収した。沈殿物に再度５ｍｌのエタノールを加え、５分間、１ｒｐｍで撹拌し、８００ｇ、５分間で遠心後、エタノールを回収した。次に、０．０５ｇの乾燥クロマト用活性炭（和光純薬工業株式会社製）を詰めたポリプロピレン製の使い捨てカラム（ＢｉｏＲａｄ社）に、先に回収したエタノール溶液及び２回目に回収したエタノール溶液を素通りさせて混合し、精製したエタノール溶液の抽出物を得た。得られた抽出物を減圧乾燥し、秤量後、１０ｍｇ／ｍｌになるように１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶液を添加し、タカクマムラサキ抽出物として以下の試験に供した。
【００３５】
（Ｂ１６メラノーマ細胞の培養）
チロシナーゼの発現量の評価を行うために、メラニン産生細胞であるＢ１６メラノーマ細胞の培養を行った。以下にＢ１６メラノーマ細胞の培養方法を示す。
（１）６穴−ディッシュに、メラニン産成細胞であるＢ１６メラノーマ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、細胞番号：ＪＣＲＢ０２０２）を５×１０３細胞（１ｍｌ／ウェル）となるように播種し、１ｍｌの前培養培地を添加後、３７℃、５％二酸化炭素気流下で１日間培養した。
前培養培地：１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（抗生物質ＭＩＸ（和光純薬工業株式会社）終濃度が１×になるように添加）。
（２）（１）で培養したＢ１６メラノーマ細胞の前培養培地を除去した後、２ｍｌのＢ１６メラノーマ細胞の処理用培地を添加して２日間培養し、同じ処理用培地で培地を交換してさらに２日間培養した。
処理用培地：前培養培地に、タカクマムラサキ抽出物を、乾燥重量当たり０〜１０μｇ／ｍｌ、ホルスコリン（ＦＳＫ）を１０μＭ、ＤＭＳＯを０．２％となるように添加した。ＦＳＫは、Ｂ１６メラノーマ細胞のαメラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）と同様にシグナル誘導をおこさせ、メラニン合成を促進させる物質である。
コントロール用処理用培地：上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物を無添加。
ブランク用処理用培地：上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物及びＦＳＫを無添加。
（３）（２）で培養したＢ１６メラノーマ細胞の処理用培地を除去し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）１ｍｌにて２回洗浄した後、ＰＢＳを再度１ｍｌ添加して、６穴−ディッシュに付着した細胞をピペッティングで完全にはがし取り、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに細胞を回収して試験サンプルとした。各試験サンプルは、プロテインアッセイ（バイオラッド社製）を使用して、タンパク質の定量を行った。
ＭＩＴＦは、Ｂ１６メラノーマ細胞に処理用培地を添加して培養すると、培養の初期段階で発現するため、ＭＩＴＦの発現量の評価には、処理用培地で３時間培養したＢ１６メラノーマ細胞を使用した。
【００３６】
（ウエスタンブロッティング）
（１）ＳＤＳサンプルバッファ(０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー、０．６％２−メルカプトエタノール)に各試験サンプルのＢ１６メラノーマ細胞を溶解して、タンパク質量が同量となるようにポリアクリルアミドゲルに分注し、電気泳動を行った。
（２）ポリアクリルアミドゲルで分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した後、ＰＶＤＦメンブレンを１％ＢＳＡでブロッキングした。
（３ａ）チロシナーゼの発現量を評価するために、抗チロシナーゼ抗体（Ｓａｎｔａｃｕｒｚ社製）で、４℃１６時間１次抗体反応を行った。洗浄後、抗ヤギ−ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ社製）で２次抗体反応を行った。
（３ｂ）ＭＩＴＦの発現量を評価するために、抗ＭＩＴＦ抗体(ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ社製）で、４℃１６時間１次抗体反応を行った。洗浄後、抗マウス−ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ社製）で２次抗体反応を行った。
（４）ＰＶＤＦメンブレン上の抗原を、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア社製)を使用して、化学発光によりＭＩＴＦ（約６０ｋＤａ）及びチロシナーゼ（約８２．５ｋＤａ）のシグナル強度を検出した。
試験は、全てｎ＝３で実施した。
【００３７】
図１は、タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制を示す写真であり、図２は、タカクマムラサキ抽出物のチロシナーゼの誘導抑制を示すグラフである。図２の縦軸は、タンパク質のシグナル強度を示しており、ＭＩＴＦ及びチロシナーゼの相対的な量を表している。図１及び図２に示されるように、コントロールと比較して、タカクマムラサキ抽出物は、チロシナーゼの転写因子であるＭＩＴＦ及びチロシナーゼの誘導を明確に抑制することが確認された。
【００３８】
＜メラニンの合成抑制作用を評価＞
タカクマムラサキ抽出物の異なる量を添加したＢ１６メラノーマ細胞について、メラニン合成量を分析し、タカクマムラサキ抽出物の添加量に対するメラニン合成抑制効果について評価した。試験方法を以下に示す。
【００３９】
（Ｂ１６メラノーマ細胞の培養）
（１）６穴−ディッシュに、メラニン産成細胞であるＢ１６メラノーマ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、細胞番号：ＪＣＲＢ０２０２）を５×１０３細胞（１ｍｌ／ウェル）となるように播種し、１ｍｌの前培養培地を添加後、３７℃、５％二酸化炭素気流下で１日間培養した。
前培養培地：１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（抗生物質ＭＩＸ（和光純薬工業株式会社）終濃度が１×になるように添加）。
（２）（１）で培養したＢ１６メラノーマ細胞の前培養培地を除去した後、２ｍｌのＢ１６メラノーマ細胞の処理用培地を添加して２日間培養し、同じ処理用培地で培地を交換してさらに１日間培養した。
処理用培地：上記１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地に、タカクマムラサキ抽出物を、其々乾燥重量当たり０．１μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（ＦＳＫ：１０μＭ、ＤＭＳＯ：０．１％）。
コントロール用処理用培地：上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物を無添加。
ブランク用処理用培地：上記処理用培地のタカクマムラサキ抽出物及びＦＳＫを無添加。
各試験サンプルの調製は、上記方法と同方法で行った。
【００４０】
（メラニンの定量）
回収した各Ｂ１６メラノーマ細胞からメラニンを抽出した。メラニンの抽出方法を以下に示す。
（１）タンパク質量を合わせた各試験サンプルからＰＢＳを除去し、３００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加え、細胞の破片が見えなくなるまでホモジナイズした。
（２）各試験サンプルを４５℃、２時間でインキュベートした。
（３）各試験サンプルにメタノール：クロロホルム（１：２）混合溶液を１００μｌ加え、撹拌し、メラニンを抽出した。
（４）１２００ｒｐｍ、１０分で遠心分離し、上清を回収し、メラニン抽出液を得た。
（５）メラニン抽出液１００μｌを、９６穴プレートに分注し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
（６）メラニン標準溶液の吸光度から検量線を作成し、各試験サンプルのメラニン量の濃度を算出した。
メラニン標準溶液は、メラニンの濃度が０μｇ／ｍｌ，６．２５μｇ／ｍｌ，１２．５μｇ／ｍｌ，２５μｇ／ｍｌ，５０μｇ／ｍｌ，１００μｇ／ｍｌとなるように、メラニンを、１Ｎ  ＮａＯＨ溶液に溶解して調製した。メラニン標準溶液の３００μｌ（ｎ＝３）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに加え、上記（３）〜（５）と同じ方法でメラニンを測定し、検量線を作成した。
【００４１】
図３は、タカクマムラサキ抽出物の添加量とメラニンの誘導量とを比較したグラフである。グラフは、コントロールのメラニンの誘導量を１００とした場合の各試験サンプルのメラニンの誘導量（％）を表している。図３の結果に示されるように、コントロールと比較して、タカクマムラサキ抽出物を添加した試験サンプルは、その濃度に依存して、メラニン合成を抑制することが明確に示された。
【００４２】
＜タカクマムラサキ抽出物と還元剤とのメラニン合成抑制の相乗効果＞
タカクマムラサキ抽出物と、還元剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）とのメラニンの合成抑制に関する相乗効果を、ＮＡＣの添加の有無による各Ｂ１６メラノーマ細胞のメラニンの合成量により評価した。ＮＡＣの添加量は、１００μＭとした。評価は、培養後の各Ｂ１６メラノーマ細胞の目視観察、及びメラニンの定量により評価した。各Ｂ１６メラノーマ細胞の培養及びメラニンの定量法は、ＮＡＣの添加の有無以外、＜メラニンの合成抑制作用を評価＞の項で述べた方法と同じ方法で実施した。メラニンの目視観察は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに各試験サンプルのＢ１６メラノーマ細胞を回収した際に行った。メラニンが過剰に生産されると、Ｂ１６メラノーマ細胞は、黒色に着色するため、容易に判別可能である。
【００４３】
図４は、タカクマムラサキ抽出物とＮＡＣとのメラニン合成抑制の相乗効果を示す写真である。上段は、ＮＡＣを添加せずに培養したＢ１６メラノーマ細胞の写真であり、タカクマムラサキ抽出物の濃度にしたがって、Ｂ１６メラノーマ細胞の色は薄くなったが、１０μｇ／ｍｌの添加量でも若干の着色が見受けられた。これに対して、ＮＡＣを添加した下段の写真では、３μｇ／ｍｌのタカクマムラサキ抽出物の添加量で、着色が殆ど見られず、ブランクと略同じ結果となった。また、図５は、タカクマムラサキ抽出物とＮＡＣとのメラニン合成抑制の相乗効果を示すグラフである。グラフは、コントロール（ＮＡＣ（−））のメラニンの誘導量を１００とした場合の各試験サンプルのメラニンの誘導量（％）を表している。図５の結果から、目視観察の評価と同様に、メラニンの合成量もＮＡＣを添加することにより抑制されていることが明確に示された。上記結果から、タカクマムラサキ抽出物に還元剤であるＮＡＣを添加すると、メラニンの合成が相乗的に抑制されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明に係るチロシナーゼ誘導抑制剤及びメラニン合成抑制剤、並びに、当該チロシナーゼ誘導抑制剤又はメラニン合成抑制剤を用いた化粧料及び医薬組成物は、例えば、食品分野、化粧品分野、及び医薬品分野に利用することができる。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図４】
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