(57)【要約】【課題】ヒト細胞の高マンノース型糖鎖以外の糖鎖の検出や分析が簡便に行える糖鎖試料の調製方法及びその利用を提供する。【解決手段】一態様において、ヒト生体由来材料から得られうる糖鎖原料から、高マンノース型糖鎖を除去することを含む、糖鎖試料の調製方法に関する。その他の態様において、糖鎖試料中の糖鎖を検出又は分析する方法であって、前記糖鎖試料を本開示にかかる糖鎖試料の調製方法により調製することを含む、ヒトの糖鎖の検出又は分析方法に関する。さらにその他の態様において、ヒト生体由来材料から本開示にかかる糖鎖試料の調製方法により調製された糖鎖試料について糖鎖の検出を行うこと、及び、異なる２以上のヒト生体由来材料から得られた前記検出結果を比較することを含む、糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト生体由来材料から得られうる糖鎖原料から、高マンノース型糖鎖を除去することを含む、糖鎖試料の調製方法。
【請求項２】
前記糖鎖原料は、ヒト細胞の糖鎖群を回収した糖鎖原料である、請求項１記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項３】
前記ヒト細胞は、ヒト幹細胞を含む、請求項２記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項４】
ヒト細胞をタンパク質及び／又は脂質に結合している糖鎖を切り出す働きを有する酵素を含有する溶液と接触させて細胞の糖鎖を遊離させることを含む工程により前記糖鎖原料を得ることを含む、請求項１から３のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項５】
さらに、遊離された前記糖鎖を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体又は化合物に捕捉させることを含む工程により前記糖鎖原料を得ることを含む、請求項４記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項６】
さらに、糖鎖が結合した前記担体又は化合物から糖鎖を遊離させることを含む工程により前記糖鎖原料を得ることを含む、請求項５記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項７】
さらに、前記遊離と同時に、又は、前記遊離の後に、前記糖鎖を標識することを含む工程により前記糖鎖原料を得ることを含む、請求項６記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項８】
高マンノース型糖鎖の除去が、高マンノース型糖鎖を特異的に結合する分子を有する担体又は化合物を用いて行われる、請求項１から７のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項９】
さらに、高マンノース型糖鎖が除去された糖鎖群を標識化することを含む、請求項１から８のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項１０】
さらに、高マンノース型糖鎖が除去された糖鎖群を所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けて糖鎖ライブラリーとすることを含む、請求項１から９のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
【請求項１１】
糖鎖試料中の糖鎖を検出又は分析する方法であって、
前記糖鎖試料を請求項１から１０のいずれかに記載の方法により調製することを含む、ヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
【請求項１２】
前記糖鎖の検出又は分析が、ヒト細胞の糖鎖の検出又は分析である、請求項１１記載のヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
【請求項１３】
前記糖鎖試料を液体クロマトグラフィー及び／又は質量分析装置を用いて検出又は分析することを含む、請求項１１又は１２に記載のヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
【請求項１４】
さらに、異なる２以上のヒト生体由来材料から得られた糖鎖原料についての糖鎖の検出結果を比較することを含む、請求項１１から１３のいずれかに記載のヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
【請求項１５】
前記異なる２以上のヒト生体由来材料が、分化状態の異なる２以上のヒト幹細胞を含む、請求項１４に記載のヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
【請求項１６】
ヒト生体由来材料から請求項１から１０のいずれかに記載の方法により調製された糖鎖試料について糖鎖の検出を行うこと、及び、
異なる２以上のヒト生体由来材料から得られた前記検出結果を比較することを含む、糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記異なる２以上のヒト生体由来材料が、分化状態の異なる２以上のヒト幹細胞を含み、
前記比較結果から、ヒト幹細胞の分化状態の指標となる糖鎖バイオマーカー候補を選択することをさらに含む、請求項１６記載の糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法のためのキットであって、
糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する糖鎖捕捉のための担体又は化合物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、糖鎖試料の調製方法、糖鎖の検出又は分析方法、糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法、及びそれらに用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１及び２は、細胞の糖鎖をグリコシダーゼ等で遊離させ、ヒドラジド基を有する担体で遊離糖鎖を捕捉し、前記糖鎖を検出する方法を開示する。
【０００３】
また、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞のＮ型糖鎖のなかで、多フコシル化糖鎖、中性三本鎖糖鎖、バイセクティングＧｌｃＮＡｃやラックダイナック構造を有する糖鎖が、ヒトＥＳ、ヒトｉＰＳを規定できる可能性が報告された（非特許文献１）。一方で、非特許文献２では、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞のＮ型糖鎖は、高マンノース型糖鎖と呼ばれる糖鎖群が主要であることが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１４２２３８号公報
【特許文献２】特開２０１２−１８９４３９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fujitani N. et al., PNAS. 2013.
【非特許文献２】An HJ. et al., Molecular & Cellular Proteomics. 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞表面に存在するほとんど全ての膜タンパク質は糖鎖修飾を受けている。細胞表面の糖鎖は細胞の分化、癌化において糖鎖構造や糖鎖プロファイルの変化が見られることから、糖鎖は「細胞の顔」にしばしば例えられ、発生段階や環境の変化によりその構造が著しく変化することが古くから知られている。そのため、さまざまな糖鎖バイオマーカーの探索や開発が行われている。
【０００７】
ヒト細胞には、例えば、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞のように、細胞糖鎖に占める高マンノース型糖鎖の割合が高い細胞がある。このような細胞の糖鎖を検出した場合、高マンノース型糖鎖以外の糖鎖を簡便に検出することが困難になる場合がある。そこで、本開示は、一態様において、高マンノース型糖鎖以外のヒト細胞の糖鎖の検出や分析が簡便に行える糖鎖試料の調製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一態様において、ヒト生体由来材料から得られうる糖鎖原料から、高マンノース型糖鎖を除去することを含む、糖鎖試料の調製方法に関する。
【０００９】
本開示は、その他の態様において、糖鎖試料中の糖鎖を検出又は分析する方法であって、前記糖鎖試料を本開示にかかる糖鎖試料の調製方法により調製することを含む、ヒトの糖鎖の検出又は分析方法に関する。
【００１０】
本開示は、その他の態様において、ヒト生体由来材料から本開示にかかる糖鎖試料の調製方法により調製された糖鎖試料について糖鎖の検出を行うこと、及び、異なる２以上のヒト生体由来材料から得られた前記検出結果を比較することを含む、糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法に関する。
【００１１】
本開示は、その他の態様において、本開示にかかる糖鎖試料の調製方法のためのキットであって、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する糖鎖捕捉のための担体又は化合物を含む、キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本開示によれば、一態様において、高マンノース型糖鎖以外のヒト細胞の糖鎖の検出や分析が簡便に行える糖鎖試料の調製方法することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＨｅＬａ細胞の糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラム及び高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】図２は、ＨｅＬａ細胞の糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムと高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムとを、高マンノース型糖鎖のピークに着目した比較を示す。
【図３】図３は、ＨｅＬａ細胞の糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムにおける高マンノース型糖鎖のピーク画分と、高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムにおける高マンノース型糖鎖のピークと重なる位置のピーク画分を質量分析した結果を示す。
【図４】図４は、ＨｅＬａ細胞の糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムと高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムを重ね合わせた図である。
【図５】図５は、ＥＳ細胞Ｋ１株の細胞糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】図６は、ＥＳ細胞Ｋ３株の細胞糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】図７は、ＥＳ細胞Ｋ４株の細胞糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】図８は、ＥＳ細胞Ｈ１株の細胞糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】図９は、ＥＳ細胞Ｋ１株の細胞糖鎖の高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、ＥＳ細胞Ｋ３株の細胞糖鎖の高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、ＥＳ細胞Ｋ４株の細胞糖鎖の高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、ＥＳ細胞Ｈ１株の細胞糖鎖の高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３】図１３は、ＥＳ細胞Ｋ１株、Ｋ３株、Ｋ４株、Ｈ１株の高マンノース型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムの各ピーク面積比を比較した図である。
【図１４】図１４は、ＥＳ細胞Ｋ１株、Ｋ３株の細胞糖鎖の高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムの各ピーク面積比を比較した図である。
【図１５】図１５は、ＥＳ細胞Ｋ４株、Ｈ１株の細胞糖鎖の高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムの各ピーク面積比を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、一態様において、ヒト細胞、とりわけ、高マンノース型糖鎖群が主要糖鎖であるヒト細胞において、高マンノース型糖鎖を除去することにより、液体クロマトグラフィー、質量分析装置等による検出が困難であった細胞糖鎖や細胞表面糖鎖の検出が容易になるという知見に基づく。また、本開示は、一態様において、高マンノース型糖鎖が除去されたヒト細胞糖鎖の糖鎖試料を調製できれば、新たな糖鎖バイオマーカーの探索及び開発、並びに、該糖鎖バイオマーカーの利用が可能になるという知見に関する。また、本開示は、一態様において、高マンノース型糖鎖が除去されたヒト細胞糖鎖の糖鎖試料を調製できれば、幹細胞の分化状態を判別できる糖鎖バイオマーカーの探索及び開発、並びに、該糖鎖バイオマーカーの利用が可能になるという知見に関する。
【００１５】
すなわち、本開示は、一態様において、ヒト生体由来材料から得られうる糖鎖原料から、高マンノース型糖鎖を除去することを含む糖鎖試料の調製方法（以下、「本開示の糖鎖試料の調製方法」ともいう。）に関する。
【００１６】
［ヒト生体由来材料から得られうる糖鎖原料］
本開示において、ヒト生体由来材料は、ヒトの複合糖質を含む材料をいう。本開示において複合糖質とは、生体内に存在する糖鎖が結合したタンパク質や脂質などをいう。一又は複数の実施形態において、ヒト生体由来材料は、ヒト細胞、ヒト培養細胞、ヒトの細胞外マトリクス、ヒト組織、ヒト体液、及びこれらの２以上の組み合わせを含むものが挙げられる。なお、本開示において、糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖及びこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称をいう。
【００１７】
糖鎖原料は、一又は複数の実施形態において、ヒト生体由来材料から複合糖質及び／又は糖鎖が分離及び／又は精製された形態が挙げられる。糖鎖原料は、一又は複数の実施形態において、ヒトの細胞糖鎖を検出及び／又は分析する観点から、ヒト細胞の糖鎖群を含む糖鎖原料であることが挙げられ、また、ヒト細胞の糖鎖群を回収した糖鎖原料であることが挙げられる。糖鎖原料は、一又は複数の実施形態において、操作性の観点から、複合糖質から糖鎖が分離された遊離糖鎖群又はその溶液が挙げられる。したがって、糖鎖原料は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞の糖鎖の遊離糖鎖群又はその溶液が挙げられる。また、糖鎖原料は、一又は複数の実施形態において、糖鎖が、検出又は分析のための標識化された形態や、分解抑制のための修飾された形態、及び、これらの標識化や修飾が施されていない形態が挙げられる。さらにまた、糖鎖原料は、一又は複数の実施形態において、クロマトグラフィー等により分画された一部の画分の形態、及び、未分画の形態が挙げられる。
【００１８】
［糖鎖原料の調製方法］
前記糖鎖原料の調製方法としては、特に制限されないが、ヒト細胞の糖鎖及び遊離糖鎖群を含む糖鎖原料の調製方法として、一又は複数の実施形態において、細胞等のヒト生体由来材料より抽出した液にタンパク質及び／又は脂質に結合している糖鎖を切り出す働きを有する酵素を作用させて細胞糖鎖を遊離させることを含む方法が挙げられる。
【００１９】
前記ヒト細胞としては、一又は複数の実施形態において、ヒト培養細胞又はヒト組織より採取されたヒト細胞が挙げられる。前記ヒト細胞としては、一又は複数の実施形態において、細胞表面糖鎖中の高マンノース型糖鎖の割合が高い細胞が挙げられる。本開示において、細胞表面糖鎖中の高マンノース型糖鎖の割合が高い細胞としては、一又は複数の実施形態において、ヒト幹細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＫＬＭ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＬ６０細胞、ＮＥＣ細胞、ヒト神経幹細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト肝幹細胞、ヒト膵幹細胞、ヒト皮膚幹細胞、ヒト筋幹細胞、ヒト生殖幹細胞等が挙げられる。前記タンパク質及び／又は脂質に結合している糖鎖を切り出す働きを有する酵素としては、一又は複数の実施形態において、エンド型グリコシダーゼが挙げられる。前記エンド型グリコシダーゼとしては、一又は複数の実施形態において、ペプチド：Ｎ-グリカナーゼ、エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ、エンド-β-マンノシダーゼ、エンド-α-Ｎ-アセチルガラクトサミニダーゼ、エンド-β-キシロシダーゼ、エンド-β-ガラクトシダーゼ、エンド-β-グルクロニダーゼ、精巣性ヒアルロニダーゼ、エンド-β-Ｎ-アセチルヘキソサミニダーゼ、エンドグリコセラミダーゼ等が挙げられる。前記ヒト細胞と前記酵素を含有する溶液との接触は、一又は複数の実施形態において、前記ヒト細胞を超音波破砕装置やホモジナイザー等を用いて破砕し抽出した溶液に前記の各酵素を約３７℃で１〜１６時間作用させることが挙げられる。
【００２０】
ヒト細胞の遊離糖鎖群を含む糖鎖原料の調製方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、遊離された前記糖鎖を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体又は化合物に捕捉させることを含むことが挙げられる。
【００２１】
糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基としては、一又は複数の実施形態において、ヒドラジド基及びオキシルアミノ基が挙げられる。ヒドラジド基を有する捕捉担体は、特許文献１及び２に開示されるものを使用でき、或いは、市販のものを使用してもよい。ヒドラジド基を有する捕捉担体は、限定されない一又は複数の実施形態において、下記の一般式（Ｉ）で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。
【化１】
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［式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、Ｈ、ＣＨ3又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示し、ｍ、ｎはモノマーユニット数を示す。］
【００２２】
遊離された前記糖鎖とヒドラジド基を有する捕捉担体の結合は、ヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合であって、限定されない一又は複数の実施形態において、該反応は以下の条件で行うことができる。反応系のｐＨは、２〜９、２〜７、又は２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、４〜９０℃、４〜８５℃、３０〜８０℃、又は４０〜８０℃である。反応時間は、５分〜２４時間、又は、１０分〜５時間である。反応時は反応容器を静置してもよく、振とうしてもよい。反応終了後、反応容器に水あるいは緩衝液を加え遠心分離あるいはフィルター操作により捕捉担体と溶液を分離する。
【００２３】
ヒト細胞の遊離糖鎖群を含む糖鎖原料の調製方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、糖鎖が結合した前記担体又は化合物から糖鎖を遊離させることを含むことが挙げられる。
【００２４】
前記担体又は化合物とヒドラゾン結合で結合している糖鎖は、一又は複数の実施形態において、酸性溶媒中、加熱反応を行うことで遊離させることができる。限定されない一又は複数の実施形態において、該反応は以下の条件で行うことができる。溶媒は、酸と水と有機溶媒の混合溶媒が挙げられ、水の含有率は０．１ｗｔ％〜９０ｗｔ％、０．１ｗｔ％〜８０ｗｔ％、又は０．１ｗｔ％〜５０ｗｔ％である。水の代わりに水性緩衝液（１ｍＭ〜１００ｍＭ）を含有してもよい。反応溶液のｐＨは、２〜９、２〜７、又は２〜６である。使用する酸は、例えば、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、クエン酸、リン酸、又は硫酸であり、反応性の観点から、好ましくは酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、より好ましくは酢酸、トリフルオロ酢酸である。反応温度は、４〜９０℃、２５〜９０℃、又は、５０〜９０℃である。反応時間は、５分間〜２４時間、１０分間〜８時間、又は１５分間〜１２０分間である。反応は、溶液濃度が無限濃縮されることにより十分な反応をおこさせる観点から、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させる。
【００２５】
ヒト細胞の遊離糖鎖群を含む糖鎖原料の調製方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、前記遊離と同時に、又は、前記遊離の後に、前記糖鎖を標識することを含むことが挙げられる。標識化は、高マンノース型糖鎖を除去した後に行ってもよい。糖鎖を捕捉担体から遊離させるのと同時に標識する方法としては、ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有する標識化合物を作用させて、ヒドラゾン−ヒドラゾン若しくはヒドラゾン−オキシム交換反応により酸性糖鎖を捕捉担体から切り離しをすると同時に前記標識化合物に結合させる方法が挙げられる。遊離した糖鎖を標識する方法としては、一又は複数の実施形態において、溶液中でアミノ基を有する標識化合物を作用させて、還元アミノ化反応により標識化合部と結合させる方法が挙げられる。
【００２６】
［高マンノース型糖鎖の除去］
本開示の糖鎖試料の調製方法における高マンノース型糖鎖の除去は、一又は複数の実施形態において、高マンノース型糖鎖を特異的に結合する分子を有する担体又は化合物を用いて行われうる。高マンノース型糖鎖を特異的に結合する分子としては、一又は複数の実施形態において、ＣｏｎＡ(Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ）、ＧＮＡ(Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ)、ＨＨＬ(Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ Ｈｙｂｒｉｄ  Ｌｅｃｔｉｎ)、Ｃａｌｓｅｐａ(Ｃａｌｙｓｔｅｇａ  Ｓｅｐｉｅｍ  Ｌｅｃｔｉｎ)、ＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ(Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ)が挙げられる。ＣｏｎＡは、Ｃ−３、Ｃ−４及びＣ−６位の水酸基が未置換であるａｌｐｈａ−Ｄ−マンノースを２残基以上含む構造に特異性を有する。本開示は、一態様において、ＣｏｎＡを有する担体又は化合物によればヒト細胞の糖鎖群から高マンノース型糖鎖を選択的に効率良く除去できるという知見に基づく。具体的な除去方法は特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、ＣｏｎＡのカラム、ビーズ、プレート等と前記糖鎖原料とを接触させることが挙げられる。なお、本開示において、「高マンノース型糖鎖が除去された」とは、一又は複数の実施形態において、除去処理前の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、又は１００％の高マンノース型糖鎖が除去されることをいう。
【００２７】
本開示の糖鎖試料の調製方法は、一又は複数の実施形態において、上述の高マンノース型糖鎖の除去を行った糖鎖群を調製された糖鎖試料として得てもよく、さらに高マンノース型糖鎖が除去された糖鎖群の標識化を行い、標識された糖鎖群を調製された糖鎖試料として得てもよい。標識としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ＨＰＬＣのための蛍光ラベルや、質量分析の感度を向上させるための標識が挙げられる。遊離した糖鎖を標識する方法としては、上述のとおり、一又は複数の実施形態において、溶液中でアミノ基を有する標識化合物を作用させて、還元アミノ化反応により標識化合部と結合させる方法が挙げられる。
【００２８】
アミノ基と蛍光物質又はＵＶ吸収基を有する標識化合物は、一又は複数の実施形態において、下記の化合物が挙げられる。
8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonate, 8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulphonate, 7-Amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid, 2-Amino9(10H)-acridone,5-Aminofluorescein,Dansylethylenediamie, 2-Aminopyridine, 7-Amino-4-methylcoumarine, 2-Aminobenzamide, 2-Aminobenzoic acid, 3-Aminobenzoic acid, 7-Amino-1-naphthol, 3-(Acethylamino)-6-aminoacridine, 2-Amino-6-cyanoethylpyridine,Ethyl p-aminobenzoate, p-Aminobenzonitrile, 及び7-aminonaphothalene-1,3-disulfonic acid
2-Aminobenzamideによる標識は、一又は複数の実施形態において、遊離糖鎖に1.4 M 2-Aminobenzamid, 1 M sodium cyanoborohydrideの濃度になるように３０％酢酸／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた溶液５０〜１００μＬを加え、３０〜７０℃で１〜１０時間反応する事で達成される。
【００２９】
［糖鎖ライブラリー］
本開示の糖鎖試料の調製方法は、一又は複数の実施形態において、高マンノース型糖鎖の除去を行った遊離又は標識化された糖鎖群を、所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けて糖鎖ライブラリーとすることを含み、前記糖鎖ライブラリー又はその一部を調製された糖鎖試料として得てもよい。前記「所定の特性」とは、一又は複数の実施形態において、糖鎖の分子量、糖鎖結合様式、特定糖鎖の有無糖鎖以外の結合分子などが挙げられる。これらの特性に応じた分離は、従来公知又は今後開発されるカラム等を用いて行うことができる。
【００３０】
よって、本開示は、その他の態様において、本開示の糖鎖試料の調製方法によって調製された糖鎖試料又は糖鎖ライブラリーに関する。一又は複数の実施形態において、本開示は、本開示の糖鎖試料の調製方法により、高マンノース型糖鎖の割合が高い細胞から調製された、高マンノース型糖鎖が除去された糖鎖試料又は糖鎖ライブラリーに関する。
【００３１】
［ヒトの糖鎖を検出／分析する方法］
本開示の糖鎖試料の調製方法によって調製される糖鎖試料は、一又は複数の実施形態において、ヒトの糖鎖を検出又は分析するため、又は、ヒト細胞の糖鎖を検出又は分析するために使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、糖鎖試料中の糖鎖を検出又は分析する方法（以下、「本開示の検出／分析方法」ともいう）であって、前記糖鎖試料を本開示の糖鎖試料の調製方法により調製することを含むヒトの糖鎖の検出又は分析方法に関する。そして、本開示の検出／分析方法は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞の糖鎖を検出又は分析する方法である。糖鎖の検出又は分析を行う手段としては、特に限定されず、一又は複数の実施形態において、ＨＰＬＣ等の液体クロマトグラフィー及び／又は質量分析装置、糖鎖を認識する分子を用いた系が挙げられる。
【００３２】
一又は複数の実施形態において、本開示の検出／分析方法を、分化状態の異なる２以上のヒト幹細胞に用いて比較すれば、異なる分化状態の指標となる糖鎖又は糖鎖の組み合わせが検出できる。本開示において、分化状態とは、限定されない一又は複数の実施形態において、継代回数、分化段階、又は、これらの組み合わせが挙げられる。異なる分化状態のヒト幹細胞の比較としては、限定されない一又は複数の実施形態において、未分化状態において継代回数が少ないものと継代回数が多いものとの比較、未分化状態のものと分化が方向付けられたものとの比較、分化段階が初期の段階のものと後期の段階のものとの比較、異なる分化段階に分化したもの同士の比較、又は、これらを組み合わせての比較が挙げられる。限定されない一又は複数の実施形態において、継代回数及び／又は分化段階がヒト幹細胞の品質に影響を及ぼす場合には、検出される糖鎖又は糖鎖の組み合わせは、ヒト幹細胞の品質評価に使用できる。
【００３３】
［糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法］
本開示の検出／分析方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、異なる２以上のヒト生体由来材料から得られた糖鎖原料についての糖鎖の検出結果を比較することを含む。前記比較を行うことにより、所定のヒト生体由来材料に特異的な糖鎖を同定することができる。したがって、本開示は、その他の態様において、ヒト生体由来材料から本開示の糖鎖試料の調製方法により調製された糖鎖試料について糖鎖の検出を行うこと、及び、異なる２以上のヒト生体由来材料から得られた前記検出結果を比較することを含む、糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法に関する。前記糖鎖バイオマーカーは、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞、とりわけ、高マンノース型糖鎖群が主要な糖鎖であるヒト細胞の種類、状態、性質等を示す指標として使用されうる。
【００３４】
一又は複数の実施形態において、分化状態の異なる２以上のヒト幹細胞に用いて、本開示の糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法を行えば、分化状態の指標となる糖鎖バイオマーカー又は糖鎖バイオマーカー候補が得られうる。したがって、本開示は、その他の実施形態において、分化状態の異なる２以上のヒト幹細胞から得られた糖鎖原料についての糖鎖の検出結果を比較し、該比較結果から、ヒト幹細胞の分化状態の指標となる糖鎖バイオマーカー候補を選択することをさらに含む、糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法に関する。本開示において、分化状態とは、上述のとおり、限定されない一又は複数の実施形態において、継代回数、分化段階、又は、これらの組み合わせが挙げられる。使用される分化状態の異なるヒト幹細胞としては、限定されない一又は複数の実施形態において、未分化状態において継代回数が少ないもの、継代回数が多いもの、未分化状態のもの、分化が方向付けられたもの、分化段階が初期の段階のもの、分化段階が後期の段階のもの、又は、これらを組み合わせが挙げられる。限定されない一又は複数の実施形態において、継代回数及び／又は分化段階がヒト幹細胞の品質に影響を及ぼす場合には、得られる糖鎖バイオマーカーは、ヒト幹細胞の品質評価に使用できる。
【００３５】
［キット］
本開示は、その他の態様において、本開示の糖鎖試料の調製方法のためのキットであって、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する糖鎖捕捉のための担体又は化合物を含むキットに関する。本開示のキットは、さらに、ヒト細胞の細胞糖鎖を遊離させるためのタンパク質及び／又は脂質に結合している糖鎖を切り出す働きを有する酵素、高マンノース型糖鎖を特異的に結合する分子を有する担体又は化合物、糖鎖を標識するための標識化合物、反応に用いる反応試薬又は反応溶液、並びに／或いは、反応容器からなる群から選択される１又は２以上を含んでいてもよい。前記糖鎖捕捉のための担体又は化合物は、上述のとおりであって、一又は複数の実施形態において、ヒドラジド基を有する糖鎖捕捉担体が挙げられる。前記酵素は、上述のとおりであって、一又は複数の実施形態において、エンド型グリコシダーゼが挙げられる。前記酵素は粉末若しくは固形であってもよく、溶液であってもよい。糖鎖を標識するための標識化合物については上述のとおりであって、限定されない一又は複数の実施形態において、2-Aminobenzamide等が挙げられる。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、本開示の検出／分析方法、及び／又は、本開示の糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法に使用できる。
【００３６】
本開示は、さらに以下の一又は複数の実施形態に関する。
［１］  ヒト生体由来材料から得られうる糖鎖原料から、高マンノース型糖鎖を除去することを含む、糖鎖試料の調製方法。
［２］  ヒト生体由来材料が、複合糖質を含む試料である、［１］記載の糖鎖試料の調製方法。
［３］  ヒト生体由来材料が、ヒト細胞、ヒト培養細胞、ヒトの細胞外マトリクス、ヒト組織、ヒト体液、及びこれらの２以上の組み合わせからなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の糖鎖試料の調製方法。
［４］  前記ヒト細胞及び前記ヒト培養細胞は、ヒト幹細胞を含む、［３］に記載の糖鎖試料の調製方法。
［５］  前記糖鎖原料は、ヒト細胞表面の糖鎖を含む糖鎖原料である、［１］から［４］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
［６］  前記糖鎖原料は、ヒト細胞表面の糖鎖群を回収した糖鎖原料である、［１］から［５］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
［７］  ヒト細胞をタンパク質及び／又は脂質に結合している糖鎖を切り出す働きを有する酵素を含有する溶液と接触させて細胞の糖鎖を遊離させることを含む工程により前記糖鎖原料を得ることを含む、［１］から［６］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
［８］  さらに、遊離された前記糖鎖を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体又は化合物に捕捉させることを含む工程により前記糖鎖原料を得ることを含む、［７］記載の糖鎖試料の調製方法。
［９］  さらに、糖鎖が結合した前記担体又は化合物から糖鎖を遊離させることを含む工程により前記糖鎖原料を得ることを含む、［８］記載の糖鎖試料の調製方法。
［１０］  さらに、前記遊離と同時に、又は、前記遊離の後に、前記糖鎖を標識することを含む工程により前記糖鎖原料を得ることを含む、［９］記載の糖鎖試料の調製方法。
［１１］  高マンノース型糖鎖の除去が、高マンノース型糖鎖を特異的に結合する分子を有する担体又は化合物を用いて行われる、［１］から［１０］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
［１２］  さらに、高マンノース型糖鎖が除去された糖鎖群を標識化することを含む、［１］から［１１］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
［１３］  さらに、高マンノース型糖鎖が除去された糖鎖群を所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けて糖鎖ライブラリーとすることを含む、［１］から［１２］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
［１４］  前記糖鎖試料が、ヒトの糖鎖を検出又は分析するための試料である、［１］から［１３］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
［１５］  前記糖鎖試料が、ヒト細胞の細胞表面糖鎖を検出又は分析するための試料である、［１］から［１４］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法。
［１６］  糖鎖試料中の糖鎖を検出又は分析する方法であって、
前記糖鎖試料を［１］から［１５］のいずれかに記載の方法により調製することを含む、ヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
［１７］  前記糖鎖の検出又は分析が、ヒト細胞の細胞表面糖鎖の検出又は分析である、［１６］記載のヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
［１８］  前記糖鎖試料を液体クロマトグラフィー及び／又は質量分析装置を用いて検出又は分析することを含む、［１６］又は［１７］に記載のヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
［１９］  さらに、異なる２以上のヒト生体由来材料から得られた糖鎖原料についての糖鎖の検出結果を比較することを含む、［１６］から［１８］のいずれかに記載のヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
［２０］前記異なる２以上のヒト生体由来材料が、分化状態の異なる２以上のヒト幹細胞を含む、［１９］に記載のヒトの糖鎖の検出又は分析方法。
［２１］  ヒト生体由来材料から［１６］から［２０］のいずれかに記載の方法により調製された糖鎖試料について糖鎖の検出を行うこと、及び、異なる２以上のヒト生体由来材料から得られた前記検出結果を比較することを含む、糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法。
［２２］  前記異なる２以上のヒト生体由来材料は、分化状態の異なる２以上のヒト幹細胞を含み、前記比較結果から、ヒト幹細胞の分化状態の指標となる糖鎖バイオマーカー候補を選択することをさらに含む、［２１］記載の糖鎖バイオマーカーのスクリーニング方法。
［２３］  ［１］から［１５］のいずれかに記載の糖鎖試料の調製方法のためのキットであって、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する糖鎖捕捉のための担体又は化合物を含むキット。
［２４］  さらに、糖鎖を遊離させるためのタンパク質及び／又は脂質に結合している糖鎖を切り出す働きを有する酵素、高マンノース型糖鎖を特異的に結合する分子を有する担体又は化合物、糖鎖を標識するための標識化合物、及び、反応溶液からなる群から選択される１つ又は２以上を含む、［２３］記載のキット。
【００３７】
以下、本発明を以下の実施例及び比較例に基づいて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）［細胞表面糖鎖の全糖鎖成分の調製］
＜細胞表面糖鎖遊離溶液の調製＞
ＨｅＬａ細胞（１×１０7個）を１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（和光純薬、０１７−０２８７５）５００μＬに溶解させた後、６００ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール、ＳＩＧＭＡ、Ｄ９７７９）を１０μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、４９２ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド、和光純薬、０９３−０２１５２）２５μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４０００Ｕのトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ０３０３）によってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５０ＵのグリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、１−３６５−１９３）による処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、遊離糖鎖溶液を得た。
【００３９】
＜糖鎖の精製及び標識＞
ＢｌｏｔＧｌｙｃｏビーズ分散液５０μＬをピペットで取り、キット付属の反応用チューブの底部に注入した。反応用チューブを卓上遠心機（チビタン、日本ミリポア社製）で数秒間遠心し，水を除去し、ビーズ上に遊離糖鎖溶液（２０μＬ）を添加し、さらに２％酢酸／アセトニトリル（１８０μＬ）を添加した。反応チューブを８０℃のヒートブロックに挿入し、１時間加熱し、溶媒が完全に蒸発し、ビーズが完全に乾燥していることを確認した。反応終了後、反応用チューブを２ｍＬエッペンドルフチューブに挿入し、反応用チューブに２Ｍグアニジン溶液（２００μＬ）を加え、卓上遠心機で数秒間遠心した。この作業を３回繰り返したのち、エッペンドルフチューブに溜まった溶液を除去した。反応用チューブを純水（２００μＬ）で３回洗浄し、続けて１％トリエチルアミン／メタノール（２００μＬ）で３回洗浄し、最後にメタノール（２００μＬ）で３回洗浄した。反応用チューブのビーズに１００μＬの１０％無水酢酸／メタノール溶液を加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、反応用チューブを再度２ｍＬエッペンドルフチューブに挿入し、遠心して無水酢酸溶液を除去した。さらにビーズをメタノール（２００μＬ）で３回洗浄、続けて１０ｍＭ塩酸（２００μＬ）で３回洗浄、最後に純水（２００μＬ）で３回洗浄した。洗浄後、ビーズから糖鎖の切り出し反応を行った。純水２０μＬ及び２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、８０℃で１時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。その後２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ、和光純薬、５７４−９２４４１）による標識を行った。粒子の入ったディスポカラムに、２−ＡＢおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．７Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ジメチルスルホシキド（ＤＭＳＯ）混合溶媒に溶解させて調製した溶液５０μＬを添加し、６０℃で２時間反応させた。反応溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、シリカカラム（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット付属品）に添加してシリカゲルに標識糖鎖を吸着させた。アセトニトリルにてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖（全糖鎖成分）を回収した。
【００４０】
＜高マンノース型糖鎖の除去＞
はじめに、ＣｏｎＡ緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４）で１００μＬのＣｏｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を平衡化した。次に、前記標識糖鎖２５μＬを５００μＬのＣｏｎＡ緩衝液に溶解し、平衡化したＣｏｎ Ａゲルに添加し、１．５ｍＬのＣｏｎＡ緩衝液を流した。Ｃｏｎ Ａゲルを素通りした画分（約２ｍＬ）を回収し、Ｃ１８の樹脂が詰まった固相抽出のカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  １ｃｃ；Ｗａｔｅｒｓ社）に流した。Ｃ１８の固相抽出のカラムを２ｍＬの純水で洗浄した後、１ｍＬのアセトニトリルで溶出を行い、溶出画分をすべて回収し、遠心濃縮機を用いて乾固させた。乾固させた高マンノース型糖鎖除去後成分は、５μＬの純水に溶解した。
【００４１】
＜ＬＣ−ＭＳによる検出＞
得られた全糖鎖成分と高マンノース型糖鎖除去後成分をＬＣ−ＭＳで検出した。ＬＣの条件を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2014209084.tif 000004
【００４３】
なお、表１のＡ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整するようになっている。また、表１において、「Ｂ：ａ％（Ｔ1分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ2分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、（Ｔ2−Ｔ1）分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ1，Ｔ2，ａ，ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表１において％は体積を基準とした百分率を表わす。
得られた細胞糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラム及び高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。
【００４４】
＜クロマトグラムの分析＞
図１のＨＰＬＣクロマトグラムが示すとおり、全糖鎖成分から少なくとも５つの高マンノース型糖鎖が検出された。これらの高マンノース型糖鎖のリテンションタイムに着目して全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムと高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムを比較した図を図２に示す。図２に示すとおり、高マンノース型糖鎖除去後成分のクロマトグラムにおいて、全糖鎖成分における高マンノース型糖鎖のピークと重なる位置に、ピークが観察された。これらのピークに該当する糖鎖を質量分析装置により分析した。その結果を図３に示す。
【００４５】
＜質量分析装置による分析＞
全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムにおける高マンノース型糖鎖のピーク画分と、高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムにおける高マンノース型糖鎖のピークと重なる位置のピーク画分に含まれる成分の質量分析は、全糖鎖成分のＬＣクロマトグラムにおける５つのピークのＬＣ−ＭＳスペクトルより、左から順にＭ５（m/z=６９７．１６）、Ｍ６（m/z=７５７．１８）、Ｍ７（m/z=８３８．１９）、Ｍ８（m/z=９１９．２２）、Ｍ９（m/z=１０００．２３）のシグナルが検出された。また、高マンノース型糖鎖除去後成分ではＬＣクロマトグラムにおける４つのピークのＬＣ−ＭＳスペクトルより、左から順にm/z値  ８５０．７０、９９６．２４、１１３４．７７、１２８０．８１のシグナルが検出された。これらの質量電荷比（ｍ／ｚ）の値は、表２に示すようにウシのフェツインに存在することが報告されているシアロ糖鎖を２ＡＢ標識したものに由来する値とほぼ一致する。
【００４６】
【表２】
2014209084.tif 000005
Man:マンノース
GlcNAc:Ｎアセチルグルコサミン
Hex:ヘキソース
HexNAc:ヘキソサミン
Fuc:フコース
NeuAc:Ｎアセチルノイラミン酸
【００４７】
図３に示す通り、高マンノース型糖鎖除去後成分のクロマトグラムでは、高マンノース型糖鎖はほとんど検出されず、９０％以上の高マンノース型糖鎖が除去できている。全糖鎖成分のクロマトグラムと高マンノース型糖鎖除去後成分のクロマトグラムを重ね合わせた図を図４に示す。
【００４８】
（実施例２）［ヒトＥＳ細胞の全糖鎖成分の調製］
＜糖鎖遊離溶液の調製＞
４株のヒトＥＳ細胞Ｋ１株、Ｋ３株、Ｋ４株、Ｈ１株のＥａｒｌｙ  ｐａｓｓａｇｅ、Ｌａｔｅ  ｐａｓｓａｇｅ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄの三段階の培養細胞サンプル（京都大学より提供、それぞれ２×１０6個）をそれぞれ１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（和光純薬、０１７−０２８７５）５００μＬに溶解させた後、６００ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール、ＳＩＧＭＡ、Ｄ９７７９）を１０μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、４９２ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド、和光純薬、０９３−０２１５２）２５μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４０００Ｕのトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ０３０３）によってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５０ＵのグリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、１−３６５−１９３）による処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、遠心濃縮機にて乾固させた後に２０μＬの超純水を添加し、遊離糖鎖溶液を得た。
【００４９】
本実施例において、Ｅａｒｌｙ  ｐａｓｓａｇｅとは、未分化培養の継代回数が１０〜３９回の段階を示し、以下単に「Ｅａｒｌｙ」ともいう。Ｌａｔｅ  ｐａｓｓａｇｅとは、未分化培養の継代回数が９４〜１８８回の段階を示し、以下単に「Ｌａｔｅ」ともいう。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄとは、神経細胞に分化させた後の段階を示し、以下単に「Ｄｉｆｆ」ともいう。
【００５０】
＜糖鎖の精製及び標識＞
調製した遊離糖鎖溶液を用いて、実施例１と同様にして、糖鎖の精製及び標識を行った。
【００５１】
＜高マンノース型糖鎖の除去＞
はじめに、ＣｏｎＡ緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４）で１００μＬのＣｏｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を平衡化した。次に、前記標識糖鎖３８μＬを５００μＬのＣｏｎＡ緩衝液に溶解し、平衡化したＣｏｎ Ａゲルに添加し、１．５ｍＬのＣｏｎＡ緩衝液を流した。Ｃｏｎ Ａゲルを素通りした画分（約２ｍＬ）を回収し、Ｃ１８の樹脂が詰まった固相抽出のカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  １ｃｃ；Ｗａｔｅｒｓ社）に流した。Ｃ１８の固相抽出のカラムを２ｍＬの純水で洗浄した後、１ｍＬのアセトニトリルで溶出を行い、溶出画分をすべて回収し、遠心濃縮機を用いて乾固させた。乾固させた高マンノース型糖鎖除去後成分は、４μＬの純水に溶解した。
【００５２】
＜ＬＣ−ＭＳによる検出＞
得られた全糖鎖成分と高マンノース型糖鎖除去後成分をＬＣ−ＭＳで検出した。ＬＣの分析条件は実施例１と同じである。
【００５３】
＜クロマトグラムの分析＞
４株のＥＳ細胞の各三段階（Ｅａｒｌｙ、Ｌａｔｅ、Ｄｉｆｆ）の細胞糖鎖の全糖鎖成分のＨＰＬＣクロマトグラムを図５〜８に、高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムを図９〜１２に示す。図５及び図９はＫ１株、図６及び図１０はＫ３株、図７及び図１１はＫ４株、図８及び図１２はＨ１株のクロマトグラムである。また、図５〜１２において、縦軸は強度（ｍＶ）を示し、横軸は保持時間（ｍｉｎ）を示す。
【００５４】
図５〜図８に示すように、全糖鎖成分では、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の５つのピークが検出された。図９〜１２に示すように、高マンノース型糖鎖除去後成分では、ｐ１〜ｐ９の９つのピークが検出された。
【００５５】
次に、４株のＥＳ細胞の各三段階（Ｅａｒｌｙ、Ｌａｔｅ、Ｄｉｆｆ）の高マンノース型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムの各ピークＭ５〜Ｍ９のピーク面積比を比較した図を図１３に示した。図１３において、（ａ）はＫ１株、（ｂ）はＫ３株、（ｃ）はＫ４株、（ｄ）はＨ１株のピーク面積比を示す。また、４株のＥＳ細胞の高マンノース型糖鎖除去後成分のＨＰＬＣクロマトグラムの各ピークｐ１〜ｐ９のピーク面積比を比較した図を図１４及び１５に示した。図１４において、（ａ）はＫ１株、（ｂ）はＫ３株のピーク面積比を示し、図１５において、（ａ）はＫ４株、（ｂ）はＨ１株のピーク面積比を示す。ここで、ピーク面積比とは、検出されたピークの総面積を１００％としたときの各ピーク面積の比率を示す。
【００５６】
図１３〜図１５から、神経細胞の分化前後、継代回数の違い、及び、細胞株間において糖鎖プロファイルに差がみられることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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