(57)【要約】      （修正有）【課題】感染を引き起こすことがある多くの可能性のある病原体の中で眼および中枢神経系の感染のひとつの原因病原体あるいはふたつ以上の原因病原体の同定のための診断法を提供する。【解決手段】マルチプレックスＰＣＲアッセイであって、病原体の検出でそれぞれ方向付けされる一連の検査に頼ることなく１回の検査で可能性のある病原体ひとそろいの中から、その病原体の検出と識別を行い、症候群ベースの診断を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
症候群を引き起こす病原体の検出と識別に有用なプライマーセット：
セット 1    FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3' (SEQ ID No.1)
RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' (SEQ ID No.2)    
セット 2    FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3' (SEQ ID No.3)
RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3' (SEQ ID No.4)
セット 3    FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3'(SEQ ID No.5)
RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3'(SEQ ID No.6)
セット 4    FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3'(SEQ ID No.7)
RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID No.8)
セット 5    FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID No.9)
RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.10)
セット 6    FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3'(SEQ ID No.11)
RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3’ (SEQ ID No.12)
セット 7    FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3'(SEQ ID No.13)
RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID No.14)
セット 8    FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15)
RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3'(SEQ ID No.16)
セット 9    FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 3'(SEQ ID No.17)
RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID No.18)
セット 10   FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' (SEQ ID No.19)    
RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'(SEQ ID No.20)
セット 11   FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3(SEQ ID No.21)
RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3(SEQ ID No.22)
セット 12   FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID No.23)
RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID No.24)
セット 13   FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25)
RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3’ (SEQ ID No.26)
セット 14   FP: 5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID No.27)
RP: 5’ggatgccaccccccaaaag 3'(SEQ ID No.28)
セット 15   FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'(SEQ ID No.29) 
RP: 5' gacgttttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30)
セット 16   FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3' (SEQ ID No.31)    
RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32)
セット 17   FP: 5’aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'(SEQ ID No.33)
RP: 5’tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' (SEQ ID No.34)
セット 18   FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3'(SEQ ID No.35)
RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36)
セット 19   FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' (SEQ ID No.37)
RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' (SEQ ID No.38)
セット 20   FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3' (SEQ ID No.39)       
RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3' (SEQ ID No.40)       
セット 21   FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3' (SEQ ID No.41)
RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3' (SEQ ID No.42)
セット 22   FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3' (SEQ ID No.43)         
RP: 5' gcgggttgttcggcatcag 3' (SEQ ID No.44)   
前記プライマーは、単独で、または組み合わせて使用できる。 
【請求項２】
臨床サンプルをマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応により病原体のターゲット遺伝子を増幅することによって、感染性眼球内炎または角膜炎またはブドウ膜炎または網膜炎または髄膜炎のような症候群を引き起こす病原体の検出および識別に有用な請求項1に記載のプライマーセット。
【請求項３】
58℃から65℃の範囲での一定のアニーリング温度および17から29の塩基鎖を有することで特徴づけられた請求項1に記載のプライマーセット。
【請求項４】
ユニプレックスまたはマルチプレックスPCR反応を用い、一般的なまたは臨床の標本から請求項1に記載のプライマーセットを使用して増幅される以下に示す病原体に特異的なDNAプローブ配列のセット：
1. プローブDNA配列  “cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”(SEQ ID No. 45) 
2. プローブDNA配列 “ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg”(SEQ ID No. 46) 
3. プローブDNA配列 “caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac”(SEQ ID No. 47) 
4. プローブDNA配列 “ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg”(SEQ ID No. 48) 
5. プローブDNA配列   “cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg”(SEQ ID No.49) 
6. プローブDNA配列  “gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg”(SEQ ID No.50) 
7. プローブDNA配列 “ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacggaggca”(SEQ ID No. 51)  
8. プローブDNA配列 “tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgctaccggaacgt”(SEQ ID No. 52) 
9. プローブDNA配列 “cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaac”(SEQ ID No. 53) 
10. プローブDNA配列 “tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg”(SEQ ID No. 54) 
11. プローブDNA配列 “ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc”(SEQ ID No. 55) 
12. プローブDNA配列 “acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca”(SEQ ID No. 56) 
13. プローブDNA配列 “gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg”(SEQ ID No. 57)
14. プローブDNA配列 “aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcatcc”(SEQ ID No. 58) 
15. プローブDNA配列 “tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc”(SEQ ID No. 59) 
16. プローブDNA配列 “cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc”(SEQ ID No. 60) 
17. プローブDNA配列 “aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttcctcga”(SEQ ID No. 61) 
18. プローブDNA配列 “gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa”(SEQ ID No. 62) 
19. プローブDNA配列 “tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaataccgg”(SEQ ID No. 63) 
20. プローブDNA配列 “cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg”(SEQ ID No. 64) 
21. プローブDNA配列  “ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg”(SEQ ID No. 65) 
22.  プローブDNA配列  “gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc”(SEQ ID No. 66) 
【請求項５】
58.9℃から83℃の範囲で一定の融点を持ち、固相基盤上で固定した後、検査中の特異的な病原体を更に検出および識別するためのハイブリダイゼーション中に使用される増幅した配列に相補的である下記リストのDNAターゲット配列のセットで、その配列は次からなる：
1.   5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3’ (SEQ ID No. 67)
2.   5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3’ (SEQ ID No. 68) 
3.   5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3’ (SEQ ID No. 69) 
4.   5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3’(SEQ ID No. 70)
5.   5’aatacaaagccgcagtgtcgtc 3’(SEQ ID No. 71) 
6.   5’gactccaggtacaccttgacgtactg 3’(SEQ ID No. 72) 
7.   5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3’(SEQ ID No. 73)
8.   5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3’(SEQ ID No. 74) 
9.   5’ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3’(SEQ ID No. 75) 
10.  5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3’(SEQ ID No. 76) 
11.  5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3’(SEQ ID No. 77) 
12.  5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’(SEQ ID No. 78) 
13.  5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3’(SEQ ID No. 79) 
14.  5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3’(SEQ ID No. 80) 
15.  5’tttataaatcctgtccaccccgt 3’(SEQ ID No. 81) 
16.  5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3’(SEQ ID No. 82) 
17.  5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3’(SEQ ID No. 83) 
18.  5’gtaagtcaaggatgctggcataatg 3’(SEQ ID No. 84) 
19.  5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3’(SEQ ID No. 85) 
20.  5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3’(SEQ ID No. 86) 
21.  5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3’(SEQ ID No. 87) 
22.  5’atcagcctggccggccgttacctggtg 3’(SEQ ID No. 88) 
【請求項６】
請求項1に記載のフォワードおよびリバースプライマーのセットの独特なプールを使用して臨床サンプルのマルチプレックスPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）アッセイを実施することによって病原体の特異的な遺伝子を増幅し、その増幅産物（プローブ）を公知の方法でマルチプレックスフォーマットでの固相基盤上で固定された相補的なDNA配列（ターゲット）にハイブリダイズし、そのハイブリダイズされた産物を公知の方法で検出して検査中の症候群を引き起こす特異的病原体を検出し識別するという更なるステップを経る感染性眼球内炎または角膜炎またはブドウ膜炎または網膜炎または髄膜炎のような症候群を引き起こす病原体の検出と識別のための方法。
【請求項７】
全プライマーセットにおいて94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60−64℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応であるとして特徴づけられた一定の温度サイクル条件を用いて同時にシングルチューブで使用できるようにした請求項1に記載の全または幾つかのプライマーセットを使用するマルチプレックスPCRアッセイ。
【請求項８】
前記プライマーを発色産物の形成によって検出されるようにビオチン部位を用いて5’末端をラベルする請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマーを何らかの蛍光走査装置または顕微鏡で検出を可能にする、例えば、蛍光イソチオシアナートFITCのような有機蛍光ラベル、またはQuantum DotsTMまたはCy3またはCy5のような無機蛍光ナノ粒子のような蛍光ラベルによってラベルする請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
アッセイは病原体の検出のための即時PCRである請求項1に記載のプライマーのプール、請求項4に記載のプローブ、請求項5に記載のターゲットの用途。
【請求項１１】
アッセイが予後のモニタリングまたは病気の治療のための臨床サンプル中の病原体の定量のための即時PCRである請求項1に記載のプライマーのプール、請求項4に記載のプローブ、請求項5に記載のターゲットの用途。
【請求項１２】
マクロアレイまたはスロットブロットまたはラインプローブアッセイの形態である請求項4に記載の特異的なプローブを使用する請求項6に記載の増幅産物の検出。
【請求項１３】
ニトロセルロース、ナイロン、荷電したナイロン、ガラス、またはポリスチレンからなる固相に固定した請求項5に記載のターゲットからなる請求項12に記載のマクロアレイ。
【請求項１４】
検出される病原体は、単純ヘルペスウイルス1および2、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、ユーバクテリア、グラム陽性微生物、グラム陰性細菌、真菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌）、マイコバクテリウム・ケロネー、マイコバクテリウム・フォーチュイタム、トキソプラズマ・ゴンジイ、クラミジア・トラコマティスである請求項12に記載の検出方法。
【請求項１５】
類似の所見を有する眼または神経系疾患を引き起こす請求項14に記載の可能性のある病原体群の中から個々の病原体の検出を可能にする請求項6に記載の検出方法。
【請求項１６】
請求項14に記載の幾つかのまたは全ての微生物に起因する何らかの臨床症候群を臨床標本に存在する何かひとつの病原体または病原体群を検出して調べる場合の請求項1に記載の選択した幾つかまたは全プライマーを使用するマルチプレックスPCRアッセイ。
【請求項１７】
次のことからなる外眼部感染症、眼球内炎またはブドウ膜炎または網膜炎または髄膜脳炎を引き起こす全ての病原体の同時検出のための方法：
a) 感染で苦しんでいる患者からの臨床サンプルの採取 、 
b) ステップaで得られた一部または全サンプルからのDNAの抽出、 
c) ステップbで得られたテンプレートDNA上でビオチンまたは蛍光トレーサーでラベルされた請求項1に記載のプライマーのプールおよびPCRの標準試薬を使用したマルチプレックスPCRの実施、 
d) ステップcで得られたPCR産物の変性、 
e) 固体基盤上に固定された請求項5に記載のターゲットを用いたPCR産物のハイブリダイジング、 
f) 酵素または蛍光法により固体基盤上でステップeで得られたDNAハイブリッドの検出。
【請求項１８】
次のことからなる外眼部感染症、眼球内炎またはブドウ膜炎または網膜炎または髄膜脳炎を引き起こす全ての病原体の同時検出のためのキット：
a) 請求項1に記載のフォワードおよびリバースプライマーのプール、 
b) 適切な固相上に固定した請求項5に記載のDNA配列のマトリックス、 
c) ポリメラーゼ連鎖反応によるDNAの増幅に必要な標準試薬、
d) 適切な固相上に固定したDNA配列のマトリックスにPCR増幅産物をハイブリダイズするのに必要な標準試薬、 
e) ハイブリダイズした最終産物を検出し識別するのに必要な標準試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は感染を引き起こすことがある多くの可能性のある病原体の中で眼および中枢神経系の感染のひとつの原因病原体あるいはふたつ以上の原因病原体の同定のための診断法に関する。眼あるいは神経系の離散的な領域に影響する全ての病原体は一般に同じ臨床所見あるいは症候群を引き起こす。本発明はひとつの病原体の検出でそれぞれ方向付けされる一連の検査に頼ることなく1回の検査で可能性のある病原体ひとそろいの中からのその病原体の検出と識別に関する。本発明の目的は、個々の病原菌に基づく診断に代わる症候群ベースの診断を目的とするものである。
【背景技術】
【０００２】
眼感染症は臨床では、感染による結果として冒されている解剖学的区分に従って分類される。眼感染症を引き起こす微生物は数多くあり、“Principles and Practice of Infectious Diseases（感染疾患の基本と実際）”, 6th Edition, Gerald Mandellら（Eds）Elsevier Churchill Livingston, pp 1387-1418（2005）に詳しく述べられているがここでその内容を引用する。
【０００３】
眼感染症は以下のカテゴリーベースの臨床医の初期診断に分類できる：
1. 角膜炎や結膜炎のような外眼部感染症
2. 感染性眼球内炎
3. ブドウ膜炎
4. 網膜炎
【０００４】
幾つかの細菌や真菌に起因する数多くの外眼部感染症がある。結膜や角膜には周囲への暴露に起因して接触する多くの非病原性の細菌や真菌が宿っているという現実により、結膜や角膜から採取された切片または綿棒の中にいる特異的な病原体（細菌および真菌）の検出が妨げられている。膿形成または膿を有する潰瘍形成の存在下では、臨床医は細菌感染の暫定診断を行い、患者を局所に適用できる広域スペクトルの抗生物質で治療する。しかしながら、診断するのに困難であるが十分に治療可能である極めて重大な感染は：
単純ヘルペス（角膜炎を引き起こす）
・アデノウイルス角結膜炎（時折流行する）
・クラミジア・トラコマティス（トラコーマおよび成人封入体性結膜炎に繋がる濾胞性結膜炎を引き起こす）
・水痘結膜炎（帯状疱疹結膜炎とも呼ばれる）
・M.ケロネーや M.フォーチュイタムのような急速に生育するマイコバクテリア（屈折異常を減らすために実施される近視矯正手術（LASIK）後の感染を引き起こす）
【０００５】
感染性眼球内炎は一般的に次のものに起因する。
・グラム陽性細菌
・グラム陰性細菌
・嫌気性微生物、すなわちプロピオニバクテリウム・アクネス
・真菌
【０００６】
非常に一般的に感染は術後に起こり急速に広がり失明に至る。治療に必要な最も重要な情報は、原因病原体が細菌か真菌か、そしてもしそれが細菌なら好気性か嫌気性かである。血行性拡散に起因する内因感染はまれである。
【０００７】
ブドウ膜炎は一般的に以下に起因する。
・マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis；結核菌）
・マイコバクテリウム・ケロネー（Mycobacterium chelonae）
・マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacterium fortuitum）
・トキソプラズマ・ゴンジイ（Mycobacterium gondii）
【０００８】
網膜炎は一般的に免疫低下患者に観察され次のウイルスに起因する。
・サイトメガロウイルス
・単純ヘルペスウイルス
・水痘帯状疱疹ウイルス
【０００９】
視力の顕著な喪失はそのような全ての患者に起こり、早期にそして時を得たそれら微生物診断は眼球全体の失明の予防に重要な要素となっている。それら感染の実際の発症率は発展途上国で相対的に高い可能性がある。多くの診断技術は先行技術で詳細に述べられているように眼感染症の診断のためである。
【００１０】
一般的な中枢神経系の感染は次のカテゴリーに分類できる：
急性化膿性髄膜炎：一般的に子供にみられ、次に示すような微生物に起因する。
・ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）
・髄膜炎菌（Neisseria meningitides）および
・肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）
【００１１】
髄液（CSF）沈降物の細菌培養またはスミア顕微鏡では感度を欠いている。更に複雑にしている要素は、抗生物質による患者への前治療がCSFからのグラム染色と培養で偽陰性結果となることである。それらの理由のために医師は培養結果を信頼することにためらい、大部分の患者で不必要な抗生物質の静脈注射を10−14日のフルコースで完遂することを選ぶことになる。一度部分的に治療されると、その症例は以下のどれに起因した慢性髄膜炎か区別ができない。
・マイコバクテリウム・ツベルクローシス
・様々な真菌
・一連の治療で対応できるウイルスすなわちHSV、CMVやVZVに起因するウイルス性脳炎
【００１２】
脳炎は風土病でまた流行性であり一般的に多種のウイルスに起因する。しかしながら、単純ヘルペス、サイトメガロウイルスおよび水痘帯状疱疹は特異的な抗ウイルス治療が役に立つウイルスである。他の治療可能な脳炎の病原体はトキソプラズマ・ゴンジイである。
【００１３】
先行技術：
臨床サンプルから病原体（細菌、酵母および他の真菌、寄生虫およびウイルス）を検出する古典的な方法として、標準的な検査室試験で同定し数値化できるよう存在する病原体の数を観察可能なコロニー生育に増やすためのサンプルの培養が挙げられる。所望により培養物は薬剤治療への病原体の感度を測定するための追加検査に付される。感染種の正確な同定のために臨床医は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの場合は3日（急速に増殖するマイコバクテリアを含む大部分の細菌の場合）から8週までの日数を必要とする培養結果に頼らなくてはならない。細菌の種類を正確に同定するために、培養は日数を追加したり週単位を必要とすることさえある長期にわたる生化学検査によることになる。多くの場合、その疾患の重症度や即時薬剤介入の必要性のためにこの測定を迅速に実施することが重要である。ここで述べる培養技術は一般に細菌感染や真菌感染の診断において有用であり、特に臨床サンプルから培養してウイルスが単離される頻度は15％より少ないことからウイルス感染の診断目的のためには通常用いられない。
【００１４】
眼感染症や神経系の感染のような感染の診断のための適切なサンプルは、角結膜炎、眼球内炎、ブドウ膜炎、網膜炎、髄膜炎および脳炎のような症候群を潜在的に有している病因病原体の検出で診断を成功するための重要な点となる。それらの症例では、感染は非常に局所化していることから眼あるいはCNSに限定される。血液、血漿または血清のような体液は感染病原体を含まない。感染性眼球内炎ではハンクス液による硝子体洗浄液20mLが手術室で採取される時の眼科医のオフィスでの硝子体吸引物、または好ましくは硝子体切断サンプルを必要とする一方、外眼部感染症では角膜からそり落とした切片または結膜綿棒のような標本を必要とする。硝子体の単なる吸引物では塗抹標本検査と培養によって真菌および細菌の眼球内炎を診断するのは多くの場合で不適当である。ブドウ膜炎と網膜炎の症例での好まれるサンプルは、27ゲージ針で採取された0.2から0.3mLの硝子体液である。中枢神経系感染の診断に使われる最も良い生体液は髄液である。本発明の一つの実施形態として、眼球内炎の症例での眼房水または硝子体液が感染病原体を検出し識別するのに十分であるということを特徴とする。これは手術室で行われる硝子体切断のような手術の手続きの必要性を取り除くものである。
【００１５】
病原体の同定のためのDNAに基づいた方法は、長時間浪費し、特別に訓練され熟練を要する人材を必要とする古典的方法に対して、単純で、しっかりしており、誰でも扱える代替法を提供するものである。古典的な方法を実施していると時として病原体のあいまいな同定に繋がり、それゆえ間違った診断/治療に陥るという間違いをもたらす可能性がある。一方、DNAを基本とした病原体の同定は、病原体を非常に早い段階で、時として臨床症状が見られるよりも早く（無症状の段階で）同定できるという利点を提供する。一旦条件が標準化されると、病原体同定は誰でも扱えて半熟練者によっても実施できる。DNAに基づいた手法は、薬剤介入の結果を評価するためにも用いることができる（予後価値）。PCRのようなDNAに基づいた方法を用いたヒト病原体のための臨床サンプルのスクリーニングは感度が高く決定的な診断および効果的な治療の開始を、1サンプルあたり非常に僅かな病原微生物（およそ20から50）しか含んでいない、たとえ、少量の臨床サンプル（眼房水、硝子体液、涙、唾液、血液、髄液、角膜小片のような粘膜あるいは上皮の小片、結膜綿棒、組織標本など）からも提供するものである。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いたときの潜在的な利点は、相対的に短期間で特異的な細菌またはウイルス病原体を同定するというものである。PCRに基づく生菌分析は患者がまだ緊急治療室にいる間に如何に治療を開始するかという臨床医の決断に影響する可能性を有している。PCRに基づいた検出方法は生組織の存在でなく、その代わりに遺伝物質に頼るものであり、PCRに基づいた技術は、抗生物質が臨床標本採集に先立って投与されたとしても全ての患者症例で適用できるものである。しかしながら、幾つかの困難が、核酸の混入による偽陽性結果や複雑なサンプルによるPCR反応の阻害のようなことがPCRに基づいた方法で関わってくる。次のPCRアッセイは、眼およびCNS感染を引き起こす微生物に対して述べられている。
【００１６】
単純ヘルペス1&2： HSVのPCRに基づいたDNA検出は、ウイルス培養よりも4から5倍の感度で示され、Wald Aら“Polymerase chain reaction for detection of Herpes simplex virus（HSV）on mucosal surface: Comparison with HSV isolation in cell culture（粘膜表面の単純ヘルペスウイルス（HSV）検出のためのポリメラーゼ連鎖反応：細胞培養でのHSV単離との比較）”. J. Inf. Dis.188: 1345-1351（2003）が報告したように輸送状態では敏感ではない。PCRは、Madhavan HNら“Detection of herpes simplex virus（HSV）using polymerase chain reaction（PCR）in clinical samples: Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV（臨床サンプル中のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた単純ヘルペスウイルス（HSV）の検出：HSV検出のためのPCRと標準的な臨床検査室法との比較）”.J. Clin. Virol. 14:145-151（1999）から報告されたように、眼房水、角膜小片、水晶体吸引物、水晶体嚢物質および硝子体液のような眼標本、およびCSF、生殖器綿棒および子宮頸部綿棒のような他の臨床標本中のHSVを検出するために使用された。ここではPCRが臨床サンプルで1から3粒子のHSVを検出した。PCRはまた、Madhavan HNらの報告“Phenotypic and Genotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes（単純ヘルペスウイルス抗原型の検出のための表原型的および遺伝子型的方法）”. J. Virol. Methods, 108: 97-102（2003）を参照して取り入れられた刊行物で述べられているようにPCRと増幅産物の制限酵素長多形を結合させるヘルペスウイルスの抗原型を同定するために効果的に用いられた。
【００１７】
水痘帯状疱疹ウイルス： PCRは水痘感染を検出するために適用された（Burke DGら、“Polymerase chain reaction detection and clinical significance of varicella zoster in cerebrospinal fluid in human immunodeficiency virus infected patients（ヒト免疫不全ウイルス感染患者の髄液中のポリメラーゼ連鎖反応検出と水痘帯状疱疹の臨床上の意義）”. J.Inf. Dis, 176: 1080（1996））。中枢神経系中のHSVとVZVの両方の検出はまたPCR（Sauerbrei A および Wutzler P.“Laboratory diagnosis of central nervous system infection caused by herpes viruses（ヘルペスウイルスに起因する中枢神経系感染の検査室診断）”. J. Clin. Virol, 25 s45-s51,（2002））を用いることによって成し遂げられ、ここでは彼らはPCRはVZVの検出に良い基準となると結論を下していた。
【００１８】
サイトメガロウイルスA： COBAS Amplicor CMV Monitor（Roche Molecular diagnostics, Pleasanton, CA, USA）と呼ばれ市販されているPCR検査では増幅による検出のためCMVのDNAポリメラーゼ遺伝子の365塩基対領域を使用する。前初期抗原の遺伝子とDNAポリメラーゼを使用した多くのアッセイは、様々な体液中のCMVの存在を検出するためとして述べられている（Stanier Pら、“Detection of human cytomegalovirus in peripheral mononuclear cells and urine samples using PCR（PCRを用いた抹消の単核細胞および尿サンプル中のヒトサイトメガロウイルスの検出）”. Mol. Cell Probes, 6: 51-58（1992）およびGerna Gら、“Monitoring human cytomegalovirus infection and gancyclovir treatment in heart transplant recipients by determination of viraemia, antigenemia and DNAemia（ウイルス血症、抗原血症およびDNA血症の診断による心臓移植患者でのヒトサイトメガロウイルス感染およびガンシクロビル治療のモニタリング）”. J. Inf. Dis., 164, 488-498（1991））。患者のCMV感染はまた、血液、羊水、鼻吸引物、気管支肺胞洗浄液、尿、胎盤物質および気管支吸引物のような様々なサンプル中でネステッド PCRによって検出された。
【００１９】
HSV、VZVおよびCMVの全3種のウイルスに起因する眼感染症はPriya Kら“Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis: a polymerase chain reaction based study（患者の眼房水中のヘルペスウイルスと地図状脈絡膜炎との関連：ポリメラーゼ連鎖反応に基づいた研究”. Ocular Immunology and Inflammation 9: 1-9（2003）が報告していたのに準じて検出された。ネステッド PCRは必要な感度を得るためにこの研究ではVZVの検出で行われた。しかしながら、ネステッド PCRは、1回増幅したPCR産生物が1回目のPCRで増幅した遺伝子の小領域を増幅する2回目のプライマーセットを含んでいる2回目のPCRチューブに移されなくてはならないので検査室内での増幅産物の汚染持ち込みという付随した問題を有している。
【００２０】
PCRによるマイコバクテリウム・ツベルクローシスの検出にはふたつのFDAが承認した検査体系がある。それらは増幅したマイコバクテリウム・ツベルクローシスの直接検査（Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct test、Gen- Probe San Deigo、USA）およびアンプリコル マイコバクテリウム・ツベルクローシス検査（Amplicor M. tuberculosis test、Roche Diagnostic Systems、Basel, Swizerland）である。多くの他の検査も先行技術として知られている。しかしながら、PCRを使った眼のツベルクローシスはMadhavan HNら（“Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in epiretinal membrane in Eales’（イールズ（Eales）病での網膜上膜のマイコバクテリウム・ツベルクローシスの検出のためのポリメラーゼ連鎖反応）”. Disease. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41: 822-825（2000））によって検出された。
【００２１】
核酸増幅によるクラミジア・トラコマティスの検出は臨床の場で用いられており、Black CM“Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infection（クラミジア・トラコマティス感染の検査室診断の現在の方法）”. Clin. Microbiol. Rev.10: 160-184（1997）により詳しく報告されている。クラミジア結膜炎は結膜綿棒上のPCRを用いて検出され、Malathi. Jら“A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis（クラミジア・トラコマティスによる結膜炎の罹患率に関する病院に基づいた研究）”. Ind. J. Med. Res., 117: 71-75（2003）が詳細に述べているように僅か30の微生物が臨床サンプルで検出された。
【００２２】
アデノウイルス性結膜炎は既に述べられたように角膜綿棒の中からネステッドPCRによって診断されたDalapathy Sら、“Development and use of nested polymerase chain reaction（PCR）for the detection of Adenoviruses from conjunctivitis specimen（結膜炎標本からのアデノウイルスの検出のためのネステッドポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の展開と用途）”. J. Clin. Virol. 11:77-84（1998）。
【００２３】
トキソプラズマ・ゴンジイは免疫不全の患者の場合では重度の脳炎やブドウ膜炎を引き起こす。PCR検査のプロトコールの多くは様々な体液と組織を研究するために用いられてきており、それら全てのPCR検査はB1遺伝子の増幅に頼っている（Danise Aら、“Use of polymerase chain reaction assays of aqueous humor in diagnosis of in the differential diagnosis of retinitis in patients infected with human immunodeficiency virus（ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者の網膜炎の鑑別診断での眼房水のポリメラーゼ連鎖反応アッセイの用途）”. Clin. Infect. Dis 24: 1100-1106（1997）、Montoyo.ら、“Use of polymerase chain reaction in diagnosis of ocular  toxoplasmosis（眼トキソプラズマ症の診断でのポリメラーゼ連鎖反応の用途）”. Ophthalmology, 106: 1554-1563（1999））。
【００２４】
眼の術後感染で起きる感染性眼球内炎は、Anand ARら“Use of polymerase chain reaction（PCR）and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis（眼球内炎患者の眼球内液中で相互作用している細菌のグラム反応を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAプローブハイブリダイゼーションの用途）”. J.  Infection, 41:221-226（2000）によって詳しく述べられているように、ユーバクテリア遺伝子のPCR反応とグラム陽性および陰性へのプローブによる識別を用いて調べられる。この研究では臨床サンプルで六つの少ない細菌を検出することができた。プロピオニバクテリウム・アクネスのような嫌気性微生物に起因する眼感染症は、Therese KLら“Polymerase chain reaction in the diagnosis of bacterial endophthalmitis（細菌性眼球内炎の診断におけるポリメラーゼ連鎖反応）”, Brit. J. Opthal. 82:1078-1082（1998）が詳しく報告したようにPCRを用いて速やかに検出された。真菌性眼球内炎はまた、Anand ARら（“Polymerase chain reaction in the diagnosis of Asperigillus endophthalmitis（アスペルギルス性眼球内炎の診断でのポリメラーゼ連鎖反応）”. Ind. J. Med. Res. 114: 133-140（2001）およびAnand ARら“Use of polymerase chain reaction in fungal endophthalmitis（真菌性眼球内炎でのポリメラーゼ連鎖反応の用途）”. Ophthalmology 108: 326-330（2001）が詳しく述べているようにPCRを用いて速やかに診断することができた。これら両方の研究では〜0.4pgsの真菌のDNAを検出することができた。
【００２５】
ここに述べられている様々なPCRアッセイはプライマーセットとして異なった温度プロファイルを用いており、それぞれ個々のPCRで検出される遺伝子は異っている。さらにまた、上述のそれぞれのPCRの試薬濃度はここで述べられている一連の反応物に対して最も高い感度になるようにPCRを適正に調整されている。至適反応条件は、そのサイズを増幅したヌクレオチド鎖の配列および検出される微生物または病原体の全ターゲットDNAの複雑性に従って変化する。
【００２６】
しかしながら、眼と中枢神経系で細菌、真菌、寄生虫およびウイルス感染を引き起こす病原体の間で検出と識別を同時にでき、加えて速やかであり、汚染しにくく、他の方法に比べて感度および特異性を向上させたPCRに基づいたアッセイの必要性を残したままである。24から48時間で感染病原体を同定することは生命を救済する上で重要であることから、臨床の場で使用するときは簡便であるべきである。眼と脳の感染の正確な診断における重要な問題として次のことが挙げられる：
・眼と脳の感染は非常に局在化している。血液、血清、血漿、唾液または膿または外傷あるいは潰瘍からの膿状の分泌物のような容易に得られる生物学的液体中に原因となる病原体の痕跡がない。
・C反応性タンパク質のような何らかの急性感染での推定上のバイオマーカーは一般的であり、人体をひどく苦しめている全ての感染に共通性がある。すなわちこれは非特異的である。
・原因となる特異的な病原体を同定するために、眼またはCSFからのサンプルが必要である。手に入るサンプルは角膜感染では角膜小片、結膜炎では結膜綿棒、眼球内炎では眼房水、ブドウ膜炎と網膜炎では硝子体液である。脳感染の場合に好まれるサンプルは常にCSFである。これら全てのサンプルで1回の患者との対面で得られるサンプル量には限りがある。一般的に角膜小片あるいは綿棒のおそらく2から3mgのサンプルで数千の細胞が得られる。患者の眼からいつでも採取することができる眼房水は約100μLであり、硝子体切断手術サンプルで200μLまでである。5mlまでのCSFサンプルは採取できるが、PCRで必要とするCSFのサンプル量は0.5mlより少ない。
・サンプル量の限度に付随してサンプル中に存在する細菌/ウイルス/寄生虫の数が限られている。加えて感染病原体の量は血液のような多くの他の体の部位に観察される量の病原体よりも少ない。
・サンプル中に存在する感染性の粒子の総計は、検出の成功とまさに比例している。ある決定的な量以下では、感染性病原体である細菌や真菌は培養で増殖しなくなり診断が困難になる。眼標本中に存在するウイルス粒子の数は検出感度を25％未満にするウイルス培養と同様に一般的に蛍光抗体検出検査の検出限度以下である。トキソプラズマ・ゴンジイのような寄生虫に対しては容易な検出系はなく、また寄生虫の数は検出するには少なすぎる。HSV、CMV、VZV、アデノウイルス、クラミジアおよびトキソプラズマのためのIgMまたはIgG検出のような検査は非常に非特異的であり診断上の意義はない。
・診断におけるもう一つの大きな問題は、上述してきた眼の全ての問題が急性的な性格であり、適切な治療を開始するためにも即刻正確な診断を必要とすることである。48時間以上遅くなると感染性眼球内炎の場合では失明に至り、ウイルス感染に起因する壊死性網膜炎では最初の症状の発現から96時間以内に治療する必要がある。
【００２７】
マルチプレックスPCRはまた、ある与えられた臨床状況で幾つかの病原体に対して実施され、その増幅産物は、PCR産物の塩基組成のマススペクトルでの決定によって病原体の検出と同定に関して報告されたようにマススペクトルで分子量が決定されることにより同定されてきた。
（Ecker, David J.: Griffey Richard 11.: Sampath, Rangarajan; Hofstandler, Steven A.: Meneil, John; Crooke, Sstanley T.（USA）. U.S. Pat. Appl. Publ.（2004）, 168 pp. Cont.-in-part of U.S. Ser. No. 323,233. Application:US 2003-660122 20030911. Priority:US 2001-798007 20010302; US 2002-431319 20021206; US 2002-323233 20021218; US 2002-326051 20021218; US 2002-325526 20021218; US 2002-325527 20021218; US 2003-443443 20030129; US 2003-443788 20030130; US 2003-447529 20030214）。
【００２８】
マルチプレックスPCRアッセイ、引き続く同定のための生産物のゲル電気泳動は、Read, SJ.およびKurtz, JB.“Laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system by using a single multiplex PCR screening assay（シングルマルチプレックスPCRスクリーニングアッセイを用いることによる中枢神経系の一般のウイルス感染の検査室診断）”. J. Clin. Microbiol. 37: 1352-1355（1999）によって述べられたように中枢神経系の感染に対して行われた。
【００２９】
マルチプレックスPCR、引き続く病原体を検出するマイクロアレイは、呼吸疾患を引き起こす病原体の検出で（Wang Dら“Microarray based detection and genotyping of viral pathogens（ウイルス病原体のマイクロアレイに基づいた検出と遺伝子型決定）”. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 1568-15692（2002））により報告された。増幅産物の検出はまた、比色微量定量プレートアッセイ系を用いて行われ、増幅産物はジゴキシゲニン11-dUTPでラベルし、ビオチン化されたプローブは微量定量プレート上で増幅産物を補足するために使用された。その産物は酵素標識化抗ジゴキシゲニンを用いて示された（Smalling TW ら、“Molecular approaches to detecting herpes simplex virus and enteroviruses in the central nervous system（中枢神経系の単純ヘルペスウイルスおよびエンテロウイルスを検出する分子アプローチ）”. J. Clin. Microbiol. 40:2317-2322（2002））。
【００３０】
同じ微生物すなわち、サイトメガロウイルスの形態学的形質転換領域II、UL 83および糖蛋白O遺伝子の三つの異なった遺伝子のマルチプレックスPCRアッセイは、Madhavan HN ら“Development and application of a novel multiplex polymerase chain reaction for semiquantitation of human cytomegalovirus in clinical specimen（臨床標本中のヒトサイトメガロウイルスの半定量のための新規なマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応の展開と応用）”J Virol Methods. 141:166-72（2007）で詳しく報告されたように臨床サンプル中のウイルスを定量するために首尾よく行われた。
【００３１】
ラインプローブアッセイはまた、全19のハイリスクな遺伝子型のL1領域を増幅するマルチプレックスPCRアッセイ後の女性の子宮頸部サンプル中のパピローマウイルスの遺伝子型を検出し識別するために用いられた（Bauer HMら、“Detection of human papilloma viruses by polymerase chain reaction（ポリメラーゼ連鎖反応によるヒトパピローマウイルスの検出）”US Patent No 5639871）。
【００３２】
マススペクトルのような方法は、進歩的な第三次医療施設でさえも実際的ではなく、高価なスキャナーに基づいたマイクロアレイ検出は臨床の場では賄いきれない。ラインプローブアッセイは増幅汚染しやすい。
【００３３】
I. 定義
“ヌクレオチド”は、ひとつの窒素塩基、ひとつのフォスフェート分子、およびひとつの糖分子からなるDNAまたはRNAのビルディングブロックを意味する（DNA中のデオキシリボース、RNA中のリボース）。
【００３４】
“オリゴヌクレオチド”は、ヌクレオチド鎖の短いものを意味する。オリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAのマッチング配列を探すためのプローブとしてしばしば用いられ、ラジオアイソトープおよび蛍光および化学発光部位のような多種のラベルを用いてラベルできる。
【００３５】
“プライマー”は、DNAのプライマー合成を行うために使用されるDNAの特異的なターゲット配列に相補的なオリゴヌクレオチド鎖の短いものを意味する。
【００３６】
“ユニプレックス”は、ひとつの病原体の特異的なDNA配列を増幅するそれぞれの反応でプライマーのシングルセットを利用するPCRに基づいたアッセイを意味する。
【００３７】
“マルチプレックス”は、それぞれのプライマーがひとつの病原体の特異的なDNA配列を増幅でき、1回の反応で多数のプライマーセットを利用するPCRに基づいたアッセイを意味する。
【００３８】
“プローブ”という言葉は、ターゲットDNAのPCRに基づいた増幅から生じるDNA産物（増幅産物）のことを指す。
【００３９】
“ターゲット”という言葉は、ナイロンのような不活性な基盤上に固定される個々の病原体に特異的なDNA配列を指す。
【００４０】
“ハイブリダイゼーション”は、2本鎖分子を形成するためのDNAのふたつの相補的な鎖を結合する工程を指す；ここで更に明確に言及すれば、‘プローブ’および‘ターゲット’DNAの配列の間のことである。
【００４１】
ここで使用される“検出系”と言う言葉は、PCRで増幅したDNA産物の視覚化を可能にする方法を指す。適切な検出系の例として、色、放射活性、蛍光または化学発光の検出による系が挙げられる。
【００４２】
“パン フンガル”は、クリプトコッカス、カンジダ、ムコマイコーシス、アスペルギルスおよびクモノスカビなどのような全ての病原真菌に見られ、いずれかの/全ての真菌種の同定に使用される一般的な遺伝子配列を意味する。
【発明の概要】
【００４３】
本発明は、95℃で変性温度、58℃から65℃のアニーリング温度および72℃での伸長でマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応で病原体からターゲット配列を特異的に増幅するために独特にデザインされた化学的にタグを付けた病原体に特異的なフォワードおよびリバースプライマーのセットを提供するものである。本発明はまた、不活性な支持体上で固定され、病原体に特異的なフォワードおよびリバースPCRプライマーを用いて得られるPCR増幅産物に特異的にハイブリダイズする病原体に特異的な遺伝子由来のターゲットDNA配列のセットを提供するものである。
【００４４】
本発明は、免疫学的パラメーターが、活動的感染を示さず病原体へさらされている事を示し、細菌および真菌培養のような古典的な微生物学的アッセイは、病原体を検出するのに十分な感度を有さず、48時間以内に病原体を同定するのに十分な迅速さもないのに対し、眼と中枢神経系の感染原因となる複数の病原体の同時検出の迅速なアッセイを提供するものである。
【００４５】
本発明は、PCRアッセイの高感度と発色検出法によるハイブリダイゼーションの検出を有するマクロアレイ上でのハイブリダイゼーションによる同定の高い特異性を組み合わせ、その最終結果が視覚的にモニターできるようにしたものである。しかしながら、Quantum Dots、Cy3、Cy5、FITCのような蛍光ラベルも使用でき、その産物は蛍光顕微鏡によって視覚化できた。
【００４６】
本発明は、眼とCNS感染を引き起こす病原体の検出と識別を同時に行うためのマルチプレックスアッセイで次のことからなることを特徴とする：
i） 一般的な方法によってDNAを単離するため、眼またはCNS感染で苦しんでいると疑われる患者の角膜小片または結膜綿棒または眼房水または硝子体液または採取された硝子体切断洗浄液または髄液吸引液または脳膿瘍材料から採取された膿または網膜上膜のような臨床サンプルのプロセッシング。
【００４７】
ii） CNSおよび眼の感染を引き起こすことで知られている病原体それぞれに対してラベルした増幅プライマーを使用するシングルチューブPCR技術によって病原体それぞれに特異的である遺伝子からDNAの特異的な領域の増幅。
【００４８】
iii） 病原体それぞれに特異的な固定されたターゲット配列はそのPCR反応から生成した増幅DNAプローブと反応するDNAハイブリダイゼーションを使用し特異的な試薬セットを使用した発色によりハイブリダイゼーションをモニタリングする病原体の検出および識別。［発明の詳細な説明］
【００４９】
眼感染に苦しんでいる患者の臨床サンプルから単数および複数の病原体DNAのマルチプレックスPCRに適した独特なPCRプライマーのデザイン。
【００５０】
眼感染を引き起こす多種の公知の病原体から次に示す遺伝子が文献から利用できる公知の情報に基づいて選ばれた。
【００５１】
1. 単純ヘルペスウイルス 1 & 2 糖蛋白 D 
2. 単純ヘルペスウイルス 1 & 2 UL 44 遺伝子
3. 単純ヘルペスウイルス 1 & 2 DNA ポリメラーゼ遺伝子 
4. サイトメガロウイルス糖蛋白 O 遺伝子 
5. サイトメガロウイルス形態学的形質転換遺伝子
6. サイトメガロウイルス UL 88 遺伝子 
7. 水痘帯状疱疹 ORF 29 
8. 水痘帯状疱疹 DNA ポリメラーゼ遺伝子 
9. アデノウイルスヘキソン遺伝子 
10. ユーバクテリア16s リボソーマル RNA 遺伝子 I 
11. ユーバクテリア16s リボソーマル RNA 遺伝子領域 II 
12. 16s リボソーマル RNA 遺伝子のグラム陽性細菌特異的領域
13. マイコバクテリウム・ツベルクローシス MPB 64 遺伝子 
14. マイコバクテリウム・フォーチュイタム16s-23s RNA 遺伝子 
15. マイコバクテリウム・ケロネー16s-23s RNA 遺伝子 
16. トキソプラズマ・ゴンジイ B 1 遺伝子
17. クラミジア・トラコマティス  多形蛋白 II 
18. 28s リボソーマル RNA 遺伝子の真菌特異的領域 
19. 16s-23s リボソーマル RNA 遺伝子のプロピオネバクテリウム  アクネ特異的領域   20. gyr B 遺伝子のグラム陰性細菌特異的領域      
21. グラム陰性細菌のアコニテートヒドラターゼ遺伝子 
22. グラム陰性リボヌクレアーゼ 1 遺伝子  
【００５２】
単純ヘルペス1および2、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹およびグラム陰性細菌のような幾つかの微生物の検出の確実性をより向上させるために、それぞれの微生物のふたつ以上の遺伝子が増幅目的に選ばれた。水痘帯状疱疹ではふたつの遺伝子が選ばれた一方、単純ヘルペス1および2、およびサイトメガロウイルスの場合では、それぞれの微生物の三つの異なった遺伝子が選ばれた。
【００５３】
ヘルペスウイルスのDNAポリメラーゼ遺伝子はPCRへの感度に影響するひとつの遺伝子であり、異なった研究で使用された。その最初の研究では、179bp産物は、95℃で45秒の変性、64℃で45秒のアニーリングおよび72℃で45秒の伸長温度の温度サイクル条件を用いて増幅された。Madhavan HNら、Detection of herpes simplex virus（HSV）using polymerase chain reaction（PCR）in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV（臨床サンプル中のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた単純ヘルペスウイルス（HSV）の検出。HSV検出のためのPCRと標準検査室法との比較）, J. Clin. Virol. 14:145-151（1999）。一方、もうひとつの研究では、その同じ遺伝子の469および391 bp領域が異なったプライマーセットおよび95℃で45秒の変性温度、60℃で45秒のアニーリングおよび72℃で45秒の伸長温度の温度サイクル条件を用いて増幅された。Madhavan HNら、Phenotypic and Genotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes（単純ヘルペスウイルス抗原型の検出のための表原型的および遺伝子型的方法）. J. Virol. Methods, 108: 97-102.（2003）。何らかの方法でウイルスをそれぞれ検出する際、眼感染同定のためのHSV、CMVおよびVZVのためのPCRの場合のように異なる温度条件が使用される。Priya Kら、Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis: a polymerase chain reaction based study（患者の眼房水中のヘルペスウイルスと地図状脈絡膜炎との関連：ポリメラーゼ連鎖反応に基づいた研究）, Ocular Immunology and Inflammation 9:1-9（2003）。この研究では反応条件およびプライマーの濃度は異なったウイルスで異なった。それゆえ与えられた臨床サンプル中のひとつまたはそれ以上の病原体の迅速な検出と識別を可能にするシングルチューブマルチプレックスPCR反応を可能にするために公知の病原体のセットのためのプライマーおよび特異的なターゲット配列をデザインすることは難しいということは明らかである。
それ故、公知の生化学的に有用な情報を取り入れた方法（bioinformatic methods）を用いてPCR増幅産物に相補的である適切なPCRプライマーおよびターゲットDNA配列をデザインする可能性を探求する必要が考えられた。
【００５４】
この目的を達成するために、発明者らはまず、好ましくはHSV、CMVおよびVZVの検出のためのマルチプレックスPCR反応、すなわち、95℃での変性、引き続く58℃−65℃でのアニーリング、そして72℃での伸長を行うという条件に固定した。固相基盤上に固定されたそれぞれの病原体のための特異的なターゲットDNA配列にもたらされるPCR増幅産物のハイブリダイゼーションの最適の温度は48℃から55℃に固定された。それ故、特異的なPCR増幅産物がDNA配列の非特異的結合を起こすことなく一定の温度でその相補的なターゲットDNA配列にハイブリダイズするというように、原因となるそれぞれの病原体のためのターゲットDNA配列のセットをデザインする必要が考えられた。
【００５５】
マルチプレックスPCR反応のためのプライマーをデザインする場合での最も難しい要素は、全てのプライマーが同じ温度サイクル条件下で全ての遺伝子の増幅を可能にするために同じ融点を持っているという方法でプライマーをデザインすることである。
【００５６】
増幅のためのプライマーセットは、全てのプライマーが58−65℃の範囲でアニーリング温度を有していることから、同じチューブでPCRを使用して増幅される23遺伝子全てが問題となる特異的な病原体の全ての株または抗原型において変化なく存在するということで、上述の遺伝子配列から選ばれた。
【００５７】
異なったサイズの増幅産物はPCR法によるマトリックス増幅の効率性を妨害する。それ故、プライマーを選ぶ2番目の基準を、66−90のヌクレオチドの範囲内である均一なサイズの増幅産物とした。前節で述べた全ての遺伝子として66−90bp長（プライマー配列を含んで）を含んだ領域が選ばれた。
【００５８】
一定の融点を保つために、プライマー長は17から29の塩基対の間で変化した。
【００５９】
更にマルチプレックス反応において、相補的な領域の存在のためにプライマー内のループ形成またはクロスハイブリダイゼーションがPCR増幅それ自身を妨害する。全てのそのような複雑化を避けるために全てのプライマーはそれらプライマー自身間でのループ形成、またはクロスハイブリダイゼーションを完全に除去するよう注意深くデザインされた。他の微生物の遺伝子/反応混合物中の遺伝子と反応すべきではないプライマーセット、すなわち微生物のプライマー/遺伝子による非特異的（クロス）増幅を避けるための注意がとられた。
【００６０】
全てのプライマーは、一般的に病原体遺伝子の全てのヌクレオチド塩基にマッチするようにデザインされる。しかしながら、もし、グラム陽性、グラム陰性細菌および真菌を増幅するためにデザインされたプライマーの場合で幾つかの株または種でミスマッチがある場合は、そのミスマッチはプライマーの中間でふたつのヌクレオチドの最大側に限られる。それぞれのプライマーの3’末端は常に診断される種の全ての株で完全にマッチしていたということが保障された。
【００６１】
上記基準は、またここで参考として詳しく述べられたプライマー配列を選択する技術の中で述べられた一般的な基準に追加するものである。分子クローニング：A laboratory manual（検査室マニュアル）, Vol 2, Sambrook. J, Russell DW（Eds）Cold Spring Harbor Laboratory Press NY（2001）。それらの基準は縦列GC反復を避け、一般にTなどを有するプライマーで終わらせないGまたはCである3’末端である。
【００６２】
デザイン後、プライマーはリスト化した全ての病原体の標準的なDNA配列（遺伝子）を使用して感度および特異性を確認するために個々に、またマルチプレックスフォーマット中で使用された。感度が先行技術、すなわち、幾つかの微生物またはウイルス粒子を認識するMadhavan HNら、Detection of herpes simplex virus（HSV）using polymerase chain reaction（PCR）in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV（臨床サンプル中のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた単純ヘルペスウイルス（HSV）の検出。HSV検出のためのPCRと標準検査室法との比較）J. Clin. Virol. 14:145-151（1999）; Malathi. Jら、A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis（クラミジア・トラコマティスによる結膜炎の罹患率に関する病院に基づいた研究）Ind. J. Medical research, 117:71-75（2003）; Anand ARら、Use of polymerase chain reaction（PCR）and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis（眼球内炎患者の眼球内液中で相互作用している細菌のグラム反応を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAプローブハイブリダイゼーションの用途）Journal of Infection, 41:221-226（2000）; Anand ARら、Use of polymerase Chain reaction in fungal endophthalmitis（真菌性眼球内炎でのポリメラーゼ連鎖反応の用途）Ophthalmology 108: 326-330（2001）によって報告されたものに満たない場合は、異なったプライマーセットが同じ基準を用いて選択された。たとえ幾つかのプライマーが58℃でアニーリングしても、全てのプライマーは60℃で良好に増幅するということが実験的に保障された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】アデノウイルスのヘキソン遺伝子およびC.トラコマティスゲノムのためのユニプレックスおよびマルチプレックスPCRの増幅産物を示している6％アガロースゲル電気泳動図である。
【図２】単純ヘルペスウイルス（HSV）の糖蛋白D、DNAポリメラーゼ、UL-44領域の増幅産物を示している4％アガロースゲル電気泳動図である。
【図３】外眼部感染症のためのマルチプレックスPCRの増幅産物を示している6％アガロースゲル電気泳動図である。
【図４】HSV、C. ラコマティス、アデノウイルスのゲノムを特異的に同定する外眼部感染症の同定のためのマルチプレックスPCRからの増幅産物とハイブリダイズされたナイロン膜上にスポットされたマクロアレイの写真である。
【図５】T.ゴンジイ、M.ツベルクローシス、M.フォーチュイタムおよびM.ケロネーのゲノムを特異的に同定するブドウ膜炎および他の疑われるマイコバクテリア感染の検出のためのマルチプレックスPCRの増幅産物でハイブリダイズされたナイロン膜にスポットされたマクロアレイの写真である。
【図６】HSV、CMV、およびVZVのゲノムを特異的に同定するウイルス性網膜炎の同定のためのマルチプレックスPCRからの増幅産物とハイブリダイズされたナイロン膜上にスポットされたマクロアレイの写真である。
【図７】ユーバクテリア、グラム陽性、グラム陰性、P.アクネスおよび真菌のゲノムを特に同定する感染性眼球内炎の同定のためのマルチプレックスPCRからの増幅産物とハイブリダイズされたナイロン膜上にスポットされたマクロアレイの写真である。
【００６４】
本発明の実施形態によると、注意深い評価後、次の独特なプライマーが病原体の検出と識別のために選出され使用された。それらの配列は独特であり先行技術としてこれまでに知られていない。
【００６５】
1. SEQ ID No 1 and 2 FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3'（SEQ ID No.1）& RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3'（SEQ ID No.2）からなるプライマーセット1により増幅された単純ヘルペスウイルス 1 & 2 糖蛋白D遺伝子
2. SEQ ID No 3 and 4 FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3'（SEQ ID No.3）& RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3'（SEQ ID No.4）からなるプライマーセット2により増幅された単純ヘルペスウイルス 1 & 2 UL 44遺伝子
3. SEQ ID No 5 and 6 FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3'SEQ ID No.5）& RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3'（SEQ ID No.6）からなるプライマーセット3により増幅された単純ヘルペスウイルス 1 & 2 DNAポリメラーゼ遺伝子
4. SEQ ID No 7 and 8 FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3'（SEQ ID No.7）& RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'（SEQ ID No.8）からなるプライマーセット4により増幅されたサイトメガロウイルス糖蛋白O遺伝子
5. SEQ ID No 9 and 10 FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3'（SEQ ID No.9）& RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'（SEQ ID No.10）からなるプライマーセット5により増幅されたサイトメガロウイルスの形態学的形質転換遺伝子
6. SEQ ID No 11 and 12 FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3'（SEQ ID No.11）& RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3'（SEQ ID No.12）からなるプライマーセット6により増幅されたサイトメガロウイルスUL 88 遺伝子
7. SEQ ID No 13 and 14 FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3'（SEQ ID No.13）& RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'（SEQ ID No.14）からなるプライマーセット7により増幅された水痘帯状疱疹ORF 29
8. SEQ ID No 15 and 16 FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'（SEQ ID No.15）& RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3'（SEQ ID No.16）からなるプライマーセット8により増幅された水痘帯状疱疹DNAポリメラーゼ遺伝子
9. SEQ ID No 17 and 18 FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 3'（SEQ ID No.17）& RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3'（SEQ ID No.18）からなるプライマーセット9により増幅されたアデノウイルスヘキソン遺伝子
10. SEQ ID No 19 and 20 FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3'（SEQ ID No.19）& RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'（SEQ ID No.20）からなるプライマーセット10により増幅されたユーバクテリア 16s リボソーマルRNA遺伝子領域 I
11. SEQ ID No 21 and 22 FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3（SEQ ID No.21）& RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3（SEQ ID No.22）からなるプライマーセット11により増幅されたユーバクテリア 16s リボソーマルRNA遺伝子領域 II
12. SEQ ID No 23 and 24 FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'（SEQ ID No.23）& RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'（SEQ ID No.24）からなるプライマーセット12により増幅された16s リボソーマルRNA遺伝子のグラム陽性細菌特異的領域
13. SEQ ID No 25 and 26 FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3'（SEQ ID No.25）& RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3'（SEQ ID No.26）からなるプライマーセット13により増幅されたマイコバクテリウム・ツベルクローシス MPB 64 遺伝子
14. SEQ ID No 27 and 28 FP: 5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'（SEQ ID No.27）& RP: 5' ggatgccaccccccaaaag 3'（SEQ ID No.28）からなるプライマーセット14により増幅されたマイコバクテリウム・フォーチュイタム16s-23s RNA遺伝子
15. SEQ ID No 29 and 30 FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'（SEQ ID No.29）& RP: 5' gacgttttgccgactacctatcc 3（SEQ ID No.30）からなるプライマーセット15により増幅されたマイコバクテリウム・ケロネー 16s−23s RNA遺伝子
16. SEQ ID No 31 and 32 FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3'（SEQ ID No.31）& RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'（SEQ ID No.32）からなるプライマーセット17により増幅されたトキソプラズマ・ゴンジイ B 1 遺伝子
17. SEQ ID No 33 and 34 FP: 5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'（SEQ ID No.33）& RP:5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' （SEQ ID No.34）からなるプライマーセット18により増幅されたクラミジア・トラコマティス多型蛋白II
18. SEQ ID No 35 and 36 FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3'（SEQ ID No.35）& RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3（SEQ ID No.36）からなるプライマーセット19により増幅された28sリボソーマルRNA遺伝子の真菌特異的領域
19. SEQ ID No 37 and 38 FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3'（SEQ ID No.37）& RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3'（SEQ ID No.38）からなるプライマーセット20により増幅された16s−23sリボソーマルRNA遺伝子のプロピオニバクテリウム・アクネス特異的領域
20. SEQ ID No 39 and 40 FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3'（SEQ ID No.39）& RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3'（SEQ ID No.40）からなるプライマーセット21により増幅されたgyr B 遺伝子のグラム陰性細菌特異的部分
21. SEQ ID No 41 and 42 FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3'（SEQ ID No.41）& RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3'（SEQ ID No.42）からなるプライマーセット22により増幅されたグラム陰性細菌アコニテートヒドラターゼ遺伝子
22. SEQ ID No 43 and 44 FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3'（SEQ ID No.43）& RP: 5' gcgggttgttcggcatcag 3'（SEQ ID No.44）からなるプライマーセット23により増幅されたグラム陰性リボヌクレアーゼ 1 遺伝子
【００６６】
更なる本発明の実施形態として、SEQ ID 45−67を持ったプローブ配列は前記病原体に独特な特異的遺伝子部分の同定のためのプライマーをデザインするために用いられるコンピュータプログラムによって得られた。本プローブ配列は66−90ヌクレオチド長の中で変化する。本プローブはそれ自身でヘアピンループを形成しない。それらは他のいずれの増幅産物と相同性を有していない。本プローブは、病原体DNA鎖のいずれかから増幅できる。
【００６７】
本プローブ配列は以下に示す通りである：
1. （FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3'（SEQ ID No.1）& RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' （SEQ ID No.2）からなるプライマーセット1により増幅された）単純ヘルペスウイルス 1 & 2 糖蛋白D遺伝子のプローブ DNA 配列である “cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”（SEQ ID No. 45）  2. （FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3'（SEQ ID No.3）& RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3'（SEQ ID No.4）からなるプライマーセット2により増幅された）単純ヘルペスウイルス 1 & 2 UL 44遺伝子のプローブ DNA 配列である “ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg”（SEQ ID No. 46）
3. （FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3'（SEQ ID No.5）& RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3'（SEQ ID No.6）からなるプライマーセット3により増幅された）単純ヘルペスウイルス 1 & 2 DNAポリメラーゼ遺伝子のプローブ DNA 配列である “caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac”（SEQ ID No. 47）
4. （FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3'（SEQ ID No.7）& RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'（SEQ ID No.8））からなるプライマーセット4により増幅された）サイトメガロウイルス糖蛋白O遺伝子のプローブDNA 配列である “ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg”（SEQ ID No. 48）
5. （FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3'（SEQ ID No.9）& RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'（SEQ ID No.10）からなるプライマーセット5により増幅された）サイトメガロウイルス形態学的形質転換領域II遺伝子のプローブDNA配列である “cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg”（SEQ ID No.49）
6. （FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3'（SEQ ID No.11）& RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3’（SEQ ID No.12）からなるプライマーセット6により増幅された）サイトメガロウイルス UL 88 遺伝子のプローブDNA配列である “gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg”（SEQ ID No.50）
7. （FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3'（SEQ ID No.13）& RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'（SEQ ID No.14）からなるプライマーセット7により増幅された）水痘帯状疱疹ORF29 のプローブDNA配列である “ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacggaggca”（SEQ ID No. 51）
8. （FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'（SEQ ID No.15）& RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3'（SEQ ID No.16）からなるプライマーセット8により増幅された）水痘帯状疱疹DNAポリメラーゼ遺伝子のプローブDNA配列である “tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgctaccggaacgt”（SEQ ID No. 52）
9. （FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 3'（SEQ ID No.17）& RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3'（SEQ ID No.18）からなるプライマーセット9により増幅された）アデノウイルスヘキソン遺伝子のプローブDNA配列である “cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaac”（SEQ ID No. 53）
10. （FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3'（SEQ ID No.19）& RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'（SEQ ID No.20）からなるプライマーセット10により増幅された）ユーバクテリア 16s リボソーマルRNA遺伝子領域IのプローブDNA配列である “tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg”（SEQ ID No. 54）
11. （FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3（SEQ ID No.21）& RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3（SEQ ID No.22）からなるプライマーセット11により増幅された）ユーバクテリア 16s リボソーマルRNA遺伝子領域IIのプローブDNA配列である“ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc”（SEQ ID No. 55）
12. （FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'（SEQ ID No.23）& RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'（SEQ ID No.24）からなるプライマーセット12により増幅された）16s リボソーマルRNA遺伝子のグラム陽性細菌特異的領域のプローブDNA配列である“acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca”（SEQ ID No. 56）  13. （FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3'（SEQ ID No.25）& RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3’（SEQ ID No.26）からなるプライマーセット13により増幅された）マイコバクテリウム・ツベルクローシス MPB64 遺伝子のプローブDNA配列である “gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg”（SEQ ID No. 57）
14. （FP: 5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'（SEQ ID No.27）& RP: 5’ ggatgccaccccccaaaag 3'（SEQ ID No.28）からなるプライマーセット14により増幅された）マイコバクテリウム・フォーチュイタム 16s−23s RNA遺伝子のプローブDNA配列である“aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcatcc”（SEQ ID No. 58）
15. （FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'（SEQ ID No.29）& RP: 5' gacgttttgccgactacctatcc 3（SEQ ID No.30）からなるプライマーセット15により増幅された）マイコバクテリウム・ケロネー 16s−23s RNA遺伝子のプローブDNA配列である“tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc”（SEQ ID No. 59）
16. （FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3'（SEQ ID No.31）& RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'（SEQ ID No.32）からなるプライマーセット16により増幅された）トキソプラズマ・ゴンジイ B 1遺伝子のプローブDNA配列である “cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc”（SEQ ID No. 60）
17. （FP:5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'（SEQ ID No.33） & RP:5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3'（SEQ ID No.34）からなるプライマーセット17により増幅された）クラミジア・トラコマティス多型蛋白IIのプローブDNA配列である “aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttcctcga”（SEQ ID No. 61）
18. （FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3'（SEQ ID No.35）& RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3（SEQ ID No.36）からなるプライマーセット18により増幅された）28s リボソーマルRNA遺伝子の真菌特異的領域のプローブDNA配列である “gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa”（SEQ ID No. 62）
19. （FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3'（SEQ ID No.37）& RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' （SEQ ID No.38）からなるプライマーセット19により増幅された）16s−23s リボソーマルRNA遺伝子のプロピオニバクテリウム・アクネス特異的領域のプローブDNA配列である “tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaataccgg”（SEQ ID No. 63） 
20. （FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3'（SEQ ID No.39）& RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3'（SEQ ID No.40）からなるプライマーセット20により増幅された）gyr B 遺伝子のグラム陰性細菌特異的部分のプローブDNA配列である “cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg”（SEQ ID No. 64）
21. （FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3'（SEQ ID No.41）& RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3'  （SEQ ID No.42）からなるプライマーセット21により増幅された）グラム陰性細菌アコニテートヒドラターゼ遺伝子のプローブDNA配列である “ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg”（SEQ ID No. 65）
22. （FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3'（SEQ ID No.43）& RP: 5' gcgggttgttcggcatcag 3' （SEQ ID No.44）からなるプライマーセット22により増幅された）グラム陰性リボヌクレアーゼ1 遺伝子のプローブDNA配列である “gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc”（SEQ ID No. 66）
【００６８】
繰り返しのようである。
本発明の他の実施形態によると、SEQ ID Nos 67−88を有するターゲット配列は、コンピュータプログラムを使用してプローブ配列から作られた。それらのターゲットはナイロンのような不活性基盤上で固定のために使用され、紫外線放射または化学的固定でクロスリンクされる。本ターゲットは次の基準に従って選ばれた：
1. 全てのターゲット配列は病原体に特異的であり、他の病原体のどの配列とも重複しない。
2. 全てのターゲット配列は23から38の塩基長の範囲のサイズの中にある。
3. 全てのターゲットは58.9℃から88℃の範囲で一定の融点を有している。
4. 本ターゲット配列は増幅産物領域に存在し、フォワードまたはリバースプライマー配列を含まないことから（SEQ ID No 67−91を有する）ラベルされたプローブはそれらターゲットに非特異的には結合しない。
5. 全てのターゲットは一般的に全てのヌクレオチド塩基とマッチするというやり方でデザインされる。しかしながら、もし幾つかのプローブでミスマッチがあれば、そのミスマッチはプローブの間でふたつのヌクレオチドの最大側に限られることになりハイブリダイゼーションは保障される。
【００６９】
本ターゲット配列を以下詳細に述べる：
1. プライマーセット1により増幅されたHSV糖蛋白D のための5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3’（SEQ ID No. 67）ターゲット
2. プライマーセット2により増幅されたHSV UL 44のための 5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3’（SEQ ID No. 68）ターゲット
3. プライマーセット3により増幅されたHSVポリメラーゼ遺伝子のための 5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3’（SEQ ID No. 69）ターゲット
4. プライマーセット4により増幅されたCMVの糖蛋白Oのための 5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3’（SEQ ID No. 70）ターゲット
5. プライマーセット5により増幅されたサイトメガロウイルスの形態学的形質転換遺伝子IIのための 5’aatacaaagccgcagtgtcgtc 3’（SEQ ID No. 71）ターゲット
6. プライマーセット6により増幅されたサイトメガロウイルスの UL 88 遺伝子のための 5’gactccaggtacaccttgacgtactg 3’（SEQ ID No. 72）ターゲット
7. プライマーセット7により増幅された水痘帯状疱疹ウイルスの ORF 29 遺伝子のための 5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3’（SEQ ID No. 73）ターゲット
8. プライマーセット8により増幅された水痘帯状疱疹ウイルスのDNAポリメラーゼ遺伝子のための 5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3’（SEQ ID No. 74）ターゲット 
9. プライマーセット9により増幅されたアデノウイルスのヘキソン遺伝子のための 5’ ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3’（SEQ ID No. 75）ターゲット
10. プライマーセット10により増幅されたユーバクテリア 16 s リボソーマル遺伝子領域Iのための 5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3’（SEQ ID No. 76）ターゲット
11. プライマーセット11により増幅されたユーバクテリア 16 s リボソーマル遺伝子領域IIのための 5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3’（SEQ ID No. 77）ターゲット
12. プライマーセット12により増幅されたグラム陽性微生物の 16s リボソーマル遺伝子のための 5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’（SEQ ID No. 78）ターゲット
13. プライマーセット13により増幅されたマイコバクテリウム・ツベルクローシスの MPB 64 遺伝子のための 5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3’（SEQ ID No. 79）ターゲット 
14. プライマーセット14により増幅されたマイコバクテリウム・フォーチュイタムの 16s−23s RNA遺伝子のための 5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3’（SEQ ID No. 80） ターゲット
15. プライマーセット15により増幅されたマイコバクテリウム・ケロネーの 16s−23s RNA遺伝子のための 5’tttataaatcctgtccaccccgt 3’（SEQ ID No. 81）ターゲット
16. プライマーセット16により増幅されたトキソプラズマ・ゴンジイのB1遺伝子のための 5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3’（SEQ ID No. 82）ターゲット
17. プライマーセット17により増幅されたクラミジア・トラコマティスの多型蛋白IIのための 5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3’（SEQ ID No. 83）ターゲット
18. プライマーセット18により増幅された全ての真菌の 28s リボソーマルRNA遺伝子のための 5’gtaagtcaaggatgctggcataatg 3’（SEQ ID No. 84）ターゲット
19. プライマーセット19により増幅されたプロピオニバクテリウム・アクネスの16s リボソーマルRNA遺伝子のための 5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3’（SEQ ID No. 85）ターゲット
20. プライマーセット20により増幅されたグラム陰性微生物のジャイレース遺伝子のための 5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3’（SEQ ID No. 86）ターゲット
21. プライマーセット21により増幅されたグラム陰性微生物のアコニテートヒドラターゼ遺伝子のための 5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3’（SEQ ID No. 87）ターゲット
22. プライマーセット22により増幅されたグラム陰性微生物のリボヌクレアーゼ遺伝子のための 5’atcagcctggccggccgttacctggtg 3’（SEQ ID No. 88）ターゲット
【００７０】
上述した不活性基盤上の固定で使用したこれらオリゴヌクレオチドは、臨床サンプルと同様に一般的なDNAから生じた産物を使用して（配列分析によって）確かめられた。それらの配列は独特であり、マルチプレックスまたはユニプレックスPCRのどちらにも知られておらず報告もされていない。
【００７１】
本発明の他の実施形態によると、マルチプレックスPCRアッセイは、全てのプライマーにおいて、94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60℃−64℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、引き続いて72℃で10分間の伸長反応からなる一定の温度サイクル条件を用いて同時にシングルチューブで使用できるようにした前述の全てのまたは幾つかのプライマーセットを使用して提供されるものである。
【００７２】
更なる実施形態によると、発色産物の検出を可能にするビオチン部分を用いて5’端末をラベル化したプライマーセットである。
【００７３】
更に他の実施形態によると、前記プライマーは、何らかの蛍光走査装置または顕微鏡によって検出を可能にする。例えば蛍光イソチオシアナートFITCのような有機蛍光ラベルのような蛍光ラベルまたはQuantum DotsTM またはCy3またはCy5のような無機蛍光ナノ粒子によってラベルされる。
【００７４】
更に他の実施形態によると、本発明はアッセイが病原体の検出のための即時PCRである前記プライマーのプールとプローブの用途を提供するものである。
【００７５】
更に他の実施形態によると、本発明はアッセイが予後のモニタリングまたは病気の治療のために臨床サンプル中の病原体の定量のための即時PCRである前記プライマーのプールとプローブの用途を提供するものである。
【００７６】
更に他の実施形態によると、本発明は増幅産物の検出がマクロアレイまたはスロットブロットまたはラインプローブアッセイの形態である前記プライマーのプールの用途を提供するものである。
【００７７】
更に他の実施形態によると、本発明はニトロセルロース、ナイロン、電荷したナイロン、ガラス、またはポリスチレンからなる固相に固定した前記プローブからなるマクロアレイを提供するものである。
【００７８】
更に他の実施形態によると、本発明は検出される病原体が単純ヘルペスウイルス1および2、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、ユーバクテリア、グラム陽性微生物、グラム陰性細菌、真菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ケロネー、マイコバクテリウム・フォーチュイタム、トキソプラズマ・ゴンジイ、クラミジア・トラコマティスである感染性眼球内炎または角膜炎またはブドウ膜炎または網膜炎または髄膜炎のような症候群を引き起こす病原体の検出と識別のための方法を提供するものである。
【００７９】
更に他の実施形態によると、本発明は類似の所見を有する眼または神経系疾患を引き起こす可能性のある病原体群から個々の病原体の検出のための方法を提供するものである。
【００８０】
更に他の実施形態によると、本発明は幾つかのまたは全ての前記微生物に起因する何らかの臨床症候群を臨床標本に存在する何かひとつの病原体または病原体群を検出して調べる場合の前述の選択した幾つかまたは全てのプライマーを使用するマルチプレックスPCRアッセイを提供するものである。
【００８１】
更に他の実施形態によると、本発明は外眼部感染症、眼球内炎またはブドウ膜炎または網膜炎または髄膜脳炎を引き起こす全ての病原体の同時検出のための方法を提供するものであり、次のことからなることを特徴とする：
a）  前記感染に苦しんでいる患者からの臨床サンプルの採取、
b）  ステップaで得られた一部または全サンプルからのDNAの抽出、
c）  ビオチンまたは蛍光トレーサーでラベルされた請求項1に記載のプライマーのプールおよびPCRの標準試薬を用いてステップbで得られたDNAのためのマルチプレックスPCRの実施、
d）  ステップcで得られたPCR産物の変性、
e）  固体基盤上に固定されたターゲットを用いたステップdで得られたPCR産物のハイブリダイジング、
f）  酵素または蛍光法により固体基盤上でステップeで得られたDNAハイブリッドの検出。
【００８２】
更に他の実施形態によると、本発明は外眼部感染症、眼球内炎またはブドウ膜炎または網膜炎または髄膜脳炎を引き起こす全ての病原体の同時検出のためのキットを提供するものであり、次のことからなることを特徴とする：
a）  前述のフォワードおよびリバースプライマーのプール、
b）  適切な固体支持体上に固定した前述のDNAターゲットのマトリックス、
c）  ポリメラーゼ連鎖反応によるDNAの増幅に必要な標準試薬、
d）  DNAプローブの固定されたマトリックスにPCR増幅産物をハイブリダイズするのに必要な標準試薬、
e）  特異的原因病原体の検出と識別のためのハイブリダイズされた最終産物を検出するために必要な標準試薬。
【００８３】
更に他の実施形態によると、本発明は外眼部感染症、眼球内炎またはブドウ膜炎または網膜炎または髄膜脳炎を引き起こす全ての病原体を同時検出するための方法を提供するものであり、次のことからなることを特徴とする：
a）  前記感染に苦しんでいる患者からの臨床サンプルの採取、
b）  ステップaで得られた一部または全サンプルからのDNAの抽出、
c）  ビオチンまたは蛍光トレーサーでラベルされた前述のプライマーのプールおよびPCRの標準試薬を用いてステップbで得られたDNAのためのマルチプレックスPCRの実施、    d）  ステップcで得られたPCR産物の変性、
e）  固体基盤上に固定された前述のターゲットを用いたステップdで得られたPCR産物のハイブリダイジング、
f）  酵素または蛍光法により固体基盤上でステップeで得られたDNAハイブリッドの検出。
【実施例】
【００８４】
次に本発明の例証を示すが、これによって本発明の範囲を制限すると解釈するものではない。
【実施例１】
【００８５】
アデノウイルスのヘキソン遺伝子およびクラミジア・トラコマティスの多型蛋白II遺伝子それぞれを増幅するプライマーセット9および18を用いたマルチプレックスPCRを実施した。本PCR混合物に、増幅産物の汚染を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ10から20pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTPおよび d-GTPをそれぞれ200μM、10mMのTris-HCl（pH 9.0）中のTaq ポリメラーゼ2ユニット、1.5mM のMgCl2、5 mMのKCl、0.01% 寒天、1mMのEDTAおよび1ユニットのUDP グリコシラーゼを含有させた。サイクリング条件は、何らかの増幅産物汚染物の完全な消化のために37℃で30分間培養し、50℃で2分間、94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。生産物を6％アガロースゲルで分析した。図1に示したように、両遺伝子が増幅された。1pgのアデノウイルスの標準DNAおよび10fgのクラミジアDNAを増幅に使用した。
【実施例２】
【００８６】
糖蛋白D、UL 44およびDNAポリメラーゼ遺伝子それぞれを増幅するプライマーセット1、2および3を用いたマルチプレックスPCRを実施した。本PCR混合物に、増幅産物の汚染を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ10pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP および d-GTP をそれぞれ200 μM、10 mMのTris-HCl（pH 7.5）中のTaq ポリメラーゼ2 ユニット、1.5mM のMgCl2、5mM のKCl、0.01% 寒天、1mMのEDTAおよび1ユニットの UDP グリコシラーゼを含有させた。サイクリング条件は、何らかの増幅産物汚染物の完全な消化のために37℃で30分間培養し、50℃で2分間、94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。生産物を6％アガロースゲルで分析した。図2に示したように、全3遺伝子が増幅された。
【実施例３】
【００８７】
HSVの糖蛋白D遺伝子、UL 44 遺伝子およびDNAポリメラーゼ遺伝子、アデノウイルスのヘキソン遺伝子およびクラミジア・トラコマティスの多型蛋白II遺伝子のそれぞれを増幅するプライマーセット1、2、3、9および17を用いたマルチプレックスPCRを実施した。本PCR混合物に、増幅産物の汚染を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ10pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTPおよびd-GTPをそれぞれ200μM、10mMのTris-HCl（pH 9.0）中のTaq ポリメラーゼ2ユニット、1.5mMのMgCl2、5mM のKCl、0.01% 寒天、1mMのEDTAおよび1ユニットのUDP グリコシラーゼを含有させた。サイクリング条件は、何らかの増幅産物汚染物の完全な消化のために37℃で30分間培養し、50℃で2分間および94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。上述のPCR混合物の五つのチューブを、次のDNA調製法で、すなわちDNAを入れていないチューブNC、1ピコグラムのHSV DNAを入れたチューブ1、4フェムトグラムのC.トラコマティスを入れたチューブ2、10ピコグラムのアデノウイルスDNAを入れたチューブ3および全3つのDNAを上述した量入れたチューブ4で培養した。生産物を6％アガロースゲルで分析した。図3に示したように全遺伝子が増幅された。
【００８８】
MW-0.26 N NaOH 中SEQ ID No. 67, 68, 69, 75および83 を有するターゲット100pmoleでそれぞれスポットしたφX 174 DNAナイロン膜のHinf I消化（図 4）。そして膜を37℃で1時間、0.1% SDSおよび1% BSAを含んだ2X SSPEを用いてブロックした。増幅産物を95℃で10分間加熱し、0.1% SDSを含む2X SSPEに混ぜ、52℃で2時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、膜を0.1% SDSを含む1X SSPEで3分間洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。膜を1% BSA、150mM のNaClおよび0.3% tween-20を含んだ0.1MのTris-HCl（pH 7.4）中ストレプトアビジンパーオキシダーゼ複合体（Streptavidin peroxidase conjugate）とともに培養した。37℃で30分後、膜を同じバッファで3分洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。発色のため、膜を37℃で10分間、ホスフェートでバッファされた生理食塩水1mlあたり0.5mgのジアミノベンジジン塩酸塩を用いて培養した。茶色のスポットが出現すると特異的な病原体の存在を示したことになる。
【実施例４】
【００８９】
マイコバクテリウム・ツベルクローシスの MPB 64 遺伝子、マイコバクテリウム・フォーチュイタムの16s-23s RNA 遺伝子、マイコバクテリア・ケロネーの 16s-23s RNA 遺伝子およびトキソプラズマ・ゴンジイの B1 遺伝子を増幅するプライマーセット13、14、15および16を用いたマルチプレックスPCRを実施した。本PCR混合物に、増幅産物の汚染を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ10 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP および d-GTP をそれぞれ200μM、50 mMのTris-HCl（pH 9.0）中のTaq ポリメラーゼ2 ユニット、1.5mM のMgCl2、5mMのKCl、0.01% 寒天、1mMのEDTAおよび1ユニットのUDP グリコシラーゼを含有させた。サイクリング条件は、何らかの増幅産物汚染物の完全な消化のために37℃で30分間培養し、50℃で2分間および94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。上記PCR混合物の五つのチューブは次のDNA調製法、すなわちDNAを入れていないチューブNC、1フェムトグラムのM.ツベルクローシスDNAを入れたチューブ1、100フェムトグラムのM.フォーチュイタムDNAを入れたチューブ2、100フェムトグラムのM.ケロネーDNAを入れたチューブ3、1 fgsのトキソプラズマ・ゴンジイDNAを入れたチューブ4で培養した。図5は0.26 N NaOH中、SEQ ID No 79, 80, 81 および82 を有する100 pmoleのターゲットでそれぞれスポットされた五つのナイロン膜を示す。本膜は37℃で1時間、0.1% SDSおよび1% BSAを含んだ2X SSPEを使用してブロックした。増幅産物を95℃で10分間加熱し、0.1% SDSを含む2X SSPE 1mlに混ぜ、52℃で2時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、膜を0.1% SDSを含む1X SSPEで3分間洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。膜を1% BSA、150mMのNaClおよび0.3% tween-20を含んだ0.1 MのTris-HCl（pH 7.4）中ストレプトアビジンパーオキシダーゼ複合体（Streptavidin peroxidase conjugate）とともに培養した。37℃で30分後、膜を同じバッファで3分間洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。発色のため、膜を37℃で10分間、ホスフェートでバッファされた生理食塩水1mlあたり0.5mgのジアミノベンジジン塩酸塩を用いて培養した。茶色のスポットが出現すると特異的な病原体の存在を示したことになる。
【実施例５】
【００９０】
HSVの糖蛋白D遺伝子、UL 44 遺伝子およびDNAポリメラーゼ遺伝子、CMVの糖蛋白O遺伝子、形態学的形質転換およびUL 88 遺伝子およびVZVのORF29 遺伝子およびDNAポリメラーゼ遺伝子それぞれを増幅するプライマーセット1、2、3、4、5、6、7および8を用いたマルチプレックスPCRを実施した。本PCR混合物に、増幅産物の汚染を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ10pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP および d-GTP をそれぞれ200μM、10mMのTris-HCl（pH 9.0）中のTaq ポリメラーゼ2ユニット、1.5 mM のMgCl2、5mMのKCl、0.01% 寒天、1mMのEDTAおよび1ユニットのUDP グリコシラーゼを含有させた。サイクリング条件は、何らかの増幅産物汚染物の完全な消化のために37℃で30分間培養し、50℃で2分間および94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。
【００９１】
上述のPCR混合物の四つのチューブを次のDNA調製法、すなわちDNAを入れていないチューブNC、1ピコグラムのHSV DNAを入れたチューブ1、10ピコグラムのCMV DNAを入れたチューブ2および1pgのVZV DNAを入れたチューブ3で培養した。図6は0.26 N NaOH中SEQ ID No. 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73および 74を有する100pmoleのターゲットでそれぞれスポットした四つのナイロン膜を示す。本膜を37℃で1時間、0.1% SDSおよび1% BSAを含んだ2X SSPEでブロックした。増幅産物を95℃で10分間加熱し、0.1% SDSを含む2X SSPEに混ぜ、52℃で2時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、膜を0.1% SDSを含む 1X SSPEで3分間洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。膜を1% BSA、150mMのNaClおよび 0.3% tween-20を含んだ0.1MのTris-HCl（pH 7.4）中ストレプトアビジンパーオキシダーゼ複合体（Streptavidin peroxidase conjugate）とともに培養した。37℃で30分後、膜を同じバッファで3分洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。発色のため、膜を37℃で10分間、ホスフェートでバッファされた生理食塩水1mlあたり0.5mgのジアミノベンジジン塩酸塩を用いて培養した。茶色のスポットが出現すると特異的な病原体の存在を示したことになる。
【実施例６】
【００９２】
ユーバクテリアゲノムの16s リボソーマル RNA 遺伝子セット I および II、グラム陽性の 16s リボソーマル RNA 遺伝子、全ての真菌からの28s RNA 遺伝子、プロピオニバクテリウム・アクネスの16s リボソーマル RNA 遺伝子、グラム陰性細菌のgyr B 遺伝子、アコニテートヒドラターゼ遺伝子およびリボヌクレアーゼ遺伝子を増幅するプライマーセット10、11、12、18、19、 20、21および22を用いたマルチプレックスPCRを実施した。本PCR混合物に、増幅産物の汚染を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ10から20 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTPおよびd-GTPをそれぞれ200μM、50mMのTris-HCl（pH 7.5）中のTaq ポリメラーゼ2ユニット、5mMのMgCl2、5 mM のKCl、1％牛血清アルブミン、1mMのEDTAおよび1ユニットのUDP グリコシラーゼを含有させた。サイクリング条件は、何らかの増幅産物汚染物の完全な消化のために37℃で30分間培養し、94℃で5分
間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。上述のPCR混合物の五つのチューブを次のDNA調製法、すなわちDNAを入れていないチューブNC、5 fgのE.coli由来DNAを入れたチューブ1、10 fgの黄色ブドウ球菌（S.aureus）DNAを入れたチューブ2、10 fg のP.アクネスDNAを入れたチューブ3および10 fgのC.アルビカンスDNAを入れたチューブ4で培養した。図7は0.26 N NaOH中SEQ ID No. 76、77、78、84、85、86、87および88を有する100pmoleのターゲットでそれぞれスポットした五つのナイロン膜を示す。本膜を37℃で1時間、0.1% SDSおよび1% BSAを含んだ2X SSPEでブロックした。増幅産物を95℃で10分間加熱し、0.1% SDSを含む2X SSPEに混ぜ、52℃で2時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、膜を0.1% SDSを含む 1X SSPEで3分間洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。膜を1% BSA、150mMのNaClおよび0.3% tween-20を含んだ0.1 MのTris-HCl（pH 7.4）中ストレプトアビジンパーオキシダーゼ複合体（Streptavidin peroxidase conjugate）とともに培養した。37℃で30分後、膜を同じバッファで3分洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。発色のため、膜を37℃で10分間、ホスフェートでバッファされた生理食塩水1ml あたり0.5mgのジアミノベンジジン塩酸塩を用いて培養した。茶色のスポットが出現すると特異的な病原体の存在を示したことになる。
【実施例７】
【００９３】
生存時ブドウ膜炎/網膜炎を呈していた11人のAIDS患者の剖検で採取された硝子体液をマルチプレックスPCR、続いてマクロアレイ上の増幅産物の同定検査に付した。DNAをそれぞれの硝子体サンプル100μlからQIAGEN DNA精製キットを使用して抽出した。本DNAを溶出バッファ50μlにもどした。単純ヘルペスウイルス1 & 2 糖蛋白 D、単純ヘルペスウイルス1 & 2 UL 44 遺伝子、単純ヘルペスウイルス 1 & 2 DNA ポリメラーゼ遺伝子、サイトメガロウイルス糖蛋白O遺伝子、サイトメガロウイルス形態学的形質転換遺伝子、サイトメガロウイルス UL 88 遺伝子、水痘帯状疱疹 ORF 29、水痘帯状疱疹 DNA ポリメラーゼ遺伝子、アデノウイルス ヘキソン遺伝子、ユーバクテリア 16s リボソーマル RNA 遺伝子 I、ユーバクテリア 16s リボソーマル RNA 遺伝子領域 II、16s リボソーマル RNA 遺伝子のグラム陽性細菌特異的部分、マイコバクテリウム・ツベルクローシスMPB 64 遺伝子、マイコバクテリウム・フォーチュイタム16s-23s RNA 遺伝子、マイコバクテリウム・ケロネー16s-23s RNA 遺伝子、トキソプラズマ・ゴンジイ B 1 遺伝子、クラミジア・トラコマティス多型蛋白II、28s リボソーマルRNA遺伝子の真菌特異的部分、16s-23s リボソーマル RNA 遺伝子のプロピオニバクテリウム・アクネス特異的部分、gyr B 遺伝子のグラム陰性細菌特異的部分、グラム陰性細菌アコニテートヒドラターゼ遺伝子、グラム陰性リボヌクレアーゼ 1 遺伝子の全23遺伝子を増幅するプライマーセット1から23を用いたマルチプレックスPCRを実施した。
【００９４】
本PCR混合物に、増幅産物の汚染を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ10から20pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTPおよびd-GTPをそれぞれ200μM、10mMのTris-HCl（pH 9.0）中のTaq ポリメラーゼ2ユニット、1.5 mMのMgCl2、5 mMのKCl、0.01％寒天、1mMのEDTAおよび1 ユニットのUDP グリコシラーゼおよびサンプルから抽出した10μlのDNAを含有させた。サイクリング条件は、何らかの増幅産物汚染物の完全な消化のために37℃で30分間培養し、50℃で2分間、および94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。
【００９５】
50μlの反応混合物中10-20 pmoleの濃度で、配列ID No.1-46 からなるプライマー23セットを用いて上述したようにPCRを実施した。全サンプルのPCR産物はSEQ ID No. 47-71 のプローブでスポットされた膜ナイロン上でのハイブリダイゼーションに付した。ナイロン膜を0.26 N NaOH中SEQ ID No. 67-88 を有するターゲット100 pmpleでそれぞれスポットした。膜を37℃で1時間、0.1% SDSおよび1% BSAを含む 2X SSPEを使用してブロックした。増幅産物を95℃で10分間加熱し、0.1% SDSを含む2X SSPEに混ぜ、52℃で2時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、膜を0.1% SDSを含む 1X SSPEで3分間洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。膜を1% BSA、150mMのNaClおよび0.3% tween-20 を含んだ 0.1 MのTris-HCl（pH 7.4）中ストレプトアビジンパーオキシダーゼ複合体（Streptavidin peroxidase conjugate）とともに培養した。37℃で30分後、膜を同じバッファで3分洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。発色のため、膜を37℃で10分間、ホスフェートでバッファされた生理食塩水1mlあたり0.5mgのジアミノベンジジン塩酸塩を用いて培養した。茶色のスポットが出現すると特異的な病原体の存在を示したことになる。
【００９６】
得られた結果を表1に示した。全11サンプルは、HSV網膜炎およびマイコバクテリウム・ツベルクローシスによるブドウ膜炎として、加えてその10サンプルでは硝子体にトキソプラズマ・ゴンジイが同定された。マルチプレックスPCRおよびDNAマクロアレイにより正確に全検体が同定された。
【００９７】
【表１】
2014223077.tif 000002
【実施例８】
【００９８】
AIDS患者の剖検で採取された六つのCSFサンプルをマルチプレックスPCR、続いてマクロアレイで検査した。死因は中枢神経系感染として確認された。市販されているQIAGEN DNA抽出キットを使用して200μlのサンプルからDNAを抽出し、そのDNAを50μlの溶出バッファにもどした。単純ヘルペスウイルス 1 & 2 糖蛋白 D、単純ヘルペスウイルス 1 & 2 UL 44 遺伝子、単純ヘルペスウイルス 1 & 2 DNA ポリメラーゼ遺伝子、サイトメガロウイルス糖蛋白O遺伝子、サイトメガロウイルス形態学的形質転換遺伝子、サイトメガロウイルス UL 88 遺伝子、水痘帯状疱疹 ORF 29、水痘帯状疱疹 DNA ポリメラーゼ遺伝子、アデノウイルス ヘキソン遺伝子、ユーバクテリア 16s リボソーマル RNA 遺伝子 I、ユーバクテリア 16s リボソーマル RNA 遺伝子領域 II、16s リボソーマル RNA 遺伝子のグラム陽性細菌特異的部分、マイコバクテリウム・ツベルクローシスMPB 64 遺伝子、マイコバクテリウム・フォーチュイタム16s-23s RNA 遺伝子、マイコバクテリウム・ケロネー16s-23s RNA 遺伝子、トキソプラズマ・ゴンジイ B 1 遺伝子、クラミジア・トラコマティス多型蛋白II、28s リボソーマルRNA遺伝子の真菌特異的部分、16s-23s リボソーマル RNA 遺伝子のプロピオニバクテリウム・アクネス特異的部分、gyr B 遺伝子のグラム陰性細菌特異的部分、グラム陰性細菌アコニテートヒドラターゼ遺伝子、グラム陰性リボヌクレアーゼ 1 遺伝子の全23遺伝子を増幅するプライマーセット1から23を用いたマルチプレックスPCRを実施した。
【００９９】
本PCR混合物に、増幅産物の汚染を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ10から20 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP および d-GTP をそれぞれ200 μM、10 mMのTris-HCl（pH 9.0）中のTaq ポリメラーゼ 2 ユニット、1.5mMのMgCl2、5mMのKCl、0.01％寒天、1mMのEDTAおよび1ユニットのUDP グリコシラーゼおよびサンプルから抽出した10μlのDNAを含有させた。サイクリング条件は、何らかの増幅産物汚染物の完全な消化のために37℃で30分間培養し、50℃で2分間および94℃で5分間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。50μlの反応混合物中10-20pmoleの濃度で、配列ID No 1-46 からなるプライマー23セットを用いて前述のようにPCRを実施した。全サンプルのPCR産物は0.26N NaOH中100pmoleのターゲットSEQ ID No. 67-88でスポットされたナイロン膜上でのハイブリダイゼーションに付した。本膜を37℃で1時間、0.1% SDSおよび1% BSAを含んだ2X SSPEでブロックした。増幅産物を95℃で10分間加熱し、0.1% SDSを含む2X SSPEに混ぜ、52℃で2時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、膜を0.1% SDSを含む 1X SSPEで3分間洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。膜を1% BSA、150mMのNaClおよび0.3% tween-20を含んだ0.1MのTris-HCl（pH 7.4）中ストレプトアビジンパーオキシダーゼ複合体（Streptavidin peroxidase conjugate）とともに培養した。37℃で30分後、膜を同じバッファで3分洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。発色のため、膜を37℃で10分間、ホスフェートでバッファされた生理食塩水1mlあたり0.5mgのジアミノベンジジン塩酸塩を用いて培養した。茶色のスポットが出現すると特異的な病原体の存在を示したことになる。
【０１００】
【表２】
2014223077.tif 000003
【実施例９】
【０１０１】
眼房水または硝子体液の19の眼標本群は様々な臨床診断の時に採取された。約50-100 μlのサンプルからDNAを市販DNA抽出キットを使用して抽出し、そのDNAを50μlの水にもどし、10μlをSEQ ID No.1-46 からなるプライマーセット1-23をそれぞれ10-20 pmole含んだマルチプレックスPCRに使用した。PCR試薬構成および温度サイクル条件は前記実施例 6および7 で述べたのと同じである。増幅産物を前記実施例で述べたように SEQ ID No. 67-88 を有するターゲットとハイブリダイズした。プライマーセットおよびプローブの臨床有用性を示す結果を以下に示す。
【０１０２】
【表３】
2014223077.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
1. 効率性が高く時間を節約できるキットである。
2. 感染の非常に早期の段階で特異的な病原体の同定により臨床医がその病気の進展と治癒に対して適切な治療法を選択するのを助けるものである。
3. 同じサンプルでの複合感染の同定も同様に効果的な治療のための薬剤併用療法を有用なものとさせるものである。
【図１】
2014223077.tif 000005
【図２】
2014223077.tif 000006
【図３】
2014223077.tif 000007
【図４】
2014223077.tif 000008
【図５】
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【図６】
2014223077.tif 000010
【図７】
2014223077.tif 000011