(57)【要約】【課題】食料としては利用されない燃料を利用することが可能であり、且つ、イミダゾール環を有する化合物のような緩衝能の高い物質の存在下でも安定に機能する酵素をバイオ燃料電池に利用すること。【解決手段】配列番号１又は２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、イミダゾール環を有する物質の存在下で安定であるアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含有する、バイオ燃料電池用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、イミダゾール環を有する物質の存在下でＤ−マンノース脱水素活性を有するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含む、バイオ燃料電池用組成物。
【請求項２】
アルドヘキソースデヒドロゲナーゼが、更に下記（Ａ）〜（Ｃ）から成る群より選択される１つ以上の特性を備える、請求項１に記載のバイオ燃料電池用組成物。
（Ａ）Ｄ−マンノースに対するＫｍ値が、Ｄ−グルコースに対するＫｍ値よりも小さい
（Ｂ）７０℃以下の温度で安定である
（Ｃ）少なくともｐＨ７〜１１の範囲で安定である
【請求項３】
バイオ燃料電池が、正極と負極との間に、イミダゾール環を有する化合物を０．５Ｍ以上の濃度で含む、項１又は２に記載のバイオ燃料電池用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のバイオ燃料電池用組成物を含む負極を有し、正極と負極との間にイミダゾール環を有する化合物を０．５Ｍ以上の濃度で含む、バイオ燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ燃料電池用酵素組成物等に関する。より具体的に、本発明は、バイオ燃料電池の電極への使用に適した酵素組成物、前記酵素組成物が使用された電極、及び前記電極を含むバイオ燃料電池等に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料電池は、電極において使用される触媒として生体触媒（即ち、酵素）を利用した燃料電池である。バイオ燃料電池は、通常、正極、負極、電解質、及びセパレーターを備える。典型的に、負極で燃料（例えば、糖）が分解され、水素イオン及び電子が発生する。水素イオンは、電解質に媒介され、セパレーターを通って、正極側へと移動する。電子は、電子伝達物質（メディエーター）を介して負極に到達し、電子回路を通って正極へと流れる。正極では、典型的に、負極からの水素及び電子と空気中の酸素とを反応させ、水が生成される。バイオ燃料電池では、このような一連の反応によって生じる電子の流れによって、電気エネルギーが創出され、上記の通り、正極及び負極における化学反応の触媒として酵素が用いられる点で、燃料電池と基本的に異なる。
【０００３】
上記のように、バイオ燃料電池は、燃料の持つ化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換するため、エネルギー変換効率が高い発電装置である。また、バイオ燃料電池は、石油等の化石燃料を必要としないため、それを必要とする他の発電技術と比較して環境への負荷が低いと考えられる。これらの観点から、バイオ燃料電池の更なる実用化及びその拡大に対する期待は大きい。
【０００４】
バイオ燃料電池の実用性を更に高めるために、より効率的にエネルギーを創出することが求められている。それを実現するために、種々の試みが成されている。例えば、高濃度の酵素が負極に使用される場合、負極周辺での緩衝能の低下が問題となり得るところ、十分な緩衝能を提供できる電解質として、イミダゾール環を含む化合物を使用することが提案されている（特許文献１）。しかしながら、バイオ燃料電池技術には、更なる改善の余地が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２４５９２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような現状の下、本発明者等は、バイオ燃料電池の更なる実用化に向けて鋭意検討を重ねたところ、特許文献１に開示されるような、イミダゾール環を含む化合物の使用は、優れた緩衝能を有するという点で優れているものの、そのような化合物の存在下において、酵素は必ずしも安定に機能しないことに気付いた。また、バイオ燃料電池の燃料には、主に、グルコースやエタノール等が用いられているところ、これらの物質は食料としても利用できるため、コスト削減の観点及び食糧危機への対応を考慮した場合に必ずしも望ましくない。これらの事情を踏まえ、本発明者等は、食料としては利用されない燃料を利用することが可能であり、且つ、イミダゾール環を有する化合物のような緩衝能の高い物質の存在下でも安定に機能する酵素をバイオ燃料電池に利用することを一つの目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記のような課題を解決すべく、本発明者等は、日夜研究を重ね、食料としての利用価値が低いＤ−マンノースに対する基質特異性がグルコースに対するよりも高く、且つ、イミダゾール環を有する化合物の存在下でも安定であるアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを見出し、それがバイオ燃料電池への使用に特に適していることを確認した。本発明者等は、斯かる知見に基づき、更なる検討と改良を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００８】
代表的な本発明は、以下の通りである。
項１．
配列番号１又は２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、イミダゾール環を有する物質の存在下でＤ−マンノース脱水素活性を有するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含む、バイオ燃料電池用組成物。
項２．
アルドヘキソースデヒドロゲナーゼが、更に下記（Ａ）〜（Ｃ）から成る群より選択される１つ以上の特性を備える、項１に記載のバイオ燃料電池用組成物。
（Ａ）Ｄ−マンノースに対するＫｍ値が、Ｄ−グルコースに対するＫｍ値よりも小さい
（Ｂ）７０℃以下の温度で安定である
（Ｃ）少なくともｐＨ７〜１１の範囲で安定である
項３．
バイオ燃料電池が、正極と負極との間に、イミダゾール環を有する化合物を０．５Ｍ以上の濃度で含む、項１又は２に記載のバイオ燃料電池用組成物。
項４．
項１又は２に記載のバイオ燃料電池用組成物を含む負極を有し、正極と負極との間にイミダゾール環を有する化合物を０．５Ｍ以上の濃度で含む、バイオ燃料電池。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、イミダゾール環を有する化合物の存在下でもＤ−マンノース脱水素活性を有するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含む組成物が提供される。この組成物を利用することにより、イミダゾール環を有する化合物による優れた緩衝能を利用しながら、効率的に、電気エネルギーを創出することが可能となる。また、前記組成物を利用することにより、Ｄ−マンノース等の食料価値の低い燃料から電気エネルギーを提供することが可能となるため、バイオ燃料電池の利用コストの低減を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．ＧＤＨ１株由来のＮＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ活性に対する塩の影響を測定した結果を示す（（Ａ）イミダゾール、（Ｂ）リン酸ナトリウム塩）。
【図２】Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図３】Ｔｖ株由来ＡＨＤＨの基質特異性を示す。
【図４】Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨ（Ａ）及びＴａ株由来精製ＡＨＤＨ（Ｂ）について、至適ｐＨを測定した結果を示す。
【図５】Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨ（■）及びＴａ株由来精製ＡＨＤＨ（◆）について温度安定性を測定した結果を示す。
【図６】Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示す。
【図７】Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨの反応速度とＤ−マンノース濃度との関係を示す。
【図８】Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨの反応速度とＤ−グルコース濃度との関係を示す。
【図９】Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨの反応速度とＮＡＤ濃度との関係を示す。
【図１０】Ｔａ株由来の精製ＡＨＤＨの活性に対するリン酸ナトリウム塩濃度の影響を測定した結果を示す。（Ａ）Ｄ−グルコース基質（比活性）、（Ｂ）Ｄ−グルコース基質（相対活性）、（Ｃ）Ｄ−マンノース基質（比活性）、（Ｄ）Ｄ−マンノース基質（相対活性）、（Ｅ）Ｄ−キシロース基質（比活性）、（Ｆ）Ｄ−キシロース基質（相対活性）
【図１１】Ｔｖ株由来の精製ＡＨＤＨの活性に対するリン酸ナトリウム塩濃度の影響を測定した結果を示す。（Ａ）Ｄ−グルコース基質（比活性）、（Ｂ）Ｄ−グルコース基質（相対活性）、（Ｃ）Ｄ−マンノース基質（比活性）、（Ｄ）Ｄ−マンノース基質（相対活性）、（Ｅ）Ｄ−キシロース基質（比活性）、（Ｆ）Ｄ−キシロース基質（相対活性）
【図１２】Ｔａ株由来の精製ＡＨＤＨの活性に対するイミダゾール濃度の影響を測定した結果を示す。（Ａ）Ｄ−グルコース基質（比活性）、（Ｂ）Ｄ−グルコース基質（相対活性）、（Ｃ）Ｄ−マンノース基質（比活性）、（Ｄ）Ｄ−マンノース基質（相対活性）、（Ｅ）Ｄ−キシロース基質（比活性）、（Ｆ）Ｄ−キシロース基質（相対活性）
【図１３】Ｔｖ株由来の精製ＡＨＤＨの活性に対するイミダゾール濃度の影響を測定した結果を示す。（Ａ）Ｄ−グルコース基質（比活性）、（Ｂ）Ｄ−グルコース基質（相対活性）、（Ｃ）Ｄ−マンノース基質（比活性）、（Ｄ）Ｄ−マンノース基質（相対活性）、（Ｅ）Ｄ−キシロース基質（比活性）、（Ｆ）Ｄ−キシロース基質（相対活性）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．バイオ燃料電池用組成物
バイオ燃料電池用組成物は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、イミダゾール環を有する物質の存在下でＤ−マンノース脱水素活性を有するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含むことが好ましい。本書では、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼを「ＡＨＤＨ」と称する場合がある。
【００１２】
「イミダゾール環を有する化合物の存在下」とは、０．１Ｍ以上のイミダゾール環を有する化合物と接触する状態を意味し、例えば、ＡＨＤＨが、イミダゾール環を有する化合物を０．１Ｍ以上含む水溶液中に存在していることを意味する。ＡＨＤＨが存在する環境中のイミダゾール環を有する化合物の濃度は、０．１Ｍ以上である限り特に制限されないが、より高い緩衝能を得るという観点から、好ましくは０．５Ｍ以上、より好ましくは１Ｍ以上である。イミダゾール環を有する物質の濃度の上限は、ＡＨＤＨが有するＤ−マンノース脱水素活性が維持される限り、特に制限されないが、例えば、３Ｍ以下であり、好ましくは２．５Ｍ以下に設定することができる。これらの濃度でイミンゾール環を有する化合物が存在することにより、バイオ燃料電子の電極の表面、周囲、又は内部（電極が多孔質の場合）でプロトン濃度の増減が生じても、十分な緩衝作用を得ることができるため、電極上の酵素の周囲のｐＨが酵素の至適ｐＨからずれることを抑制し、酵素が本来持っている能力を十分に発揮することが可能となる。
【００１３】
イミダゾール環を有する化合物は、イミダゾール環を有し、水溶液中で緩衝能を示す限り特に制限されないが、例えば、イミダゾール、及びトリアゾール、並びにピリジン誘導体、ビピリジン誘導体、及びイミダゾール誘導体等の誘導体を挙げることができる。前記誘導体としては、例えば、ヒスチジン、１−メチルイミダゾール、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、２−エチルイミダゾール、イミダゾール−２−カルボン酸エチル、イミダゾール−２−カルボキシアルデヒド、イミダゾール−４−カルボン酸、イミダゾール−４，５−ジカルボン酸、イミダゾール−１−イル−酢酸、２−アセチルベンズイミダゾール、１−アセチルイミダゾール、Ｎ−アセチルイミダゾール、２−アミノベンズイミダゾール、Ｎ−（３−アミノプロピル) イミダゾール、５−アミノ−２−（トリフルオロメチル) ベンズイミダゾール、４−アザベンズイミダゾール、４−アザ−２−メルカプトベンズイミダゾール、ベンズイミダゾール、１−ベンジルイミダゾール、１−ブチルイミダゾール等を挙げることができる。好ましいイミダゾール環を有する化合物は、イミダゾールである。
【００１４】
Ｄ−マンノース脱水素活性は、下記の手順で測定することができる。
＜試薬＞
（１）１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
（２）８０ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＤ＋水溶液
（３）１．５Ｍ  Ｄ−マンノース水溶液
（４）酵素希釈溶液  ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸと０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
【００１５】
＜手順１＞
ＡＨＤＨ溶液を、予め氷冷した酵素希釈溶液（４）で０．８〜１．２Ｕ／ｍＬに希釈し、氷冷保存して酵素溶液を準備する。また、２．６ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１）、０．１ｍＬのＮＡＤ＋水溶液（２）、及び０．３ｍＬのＤ−マンノース水溶液（３）を混合し、３７℃にて５分間予備加温して、反応液を準備する。
【００１６】
＜手順２＞
反応液３．０ｍＬに、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、緩やかに混和した後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計（光路長１．０ｃｍ）で、３４０ｎｍの吸光度を２〜３分間測定する。時間（分）をＸ軸、吸光度をＹ軸として吸光度の変化をプロットし、変化が直線に達した時点（即ち、反応速度が一定になった時点）から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈溶液を０．０５ｍＬ加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から下記の式に従ってＡＨＤＨ活性を求める。ここでＡＨＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、上記の測定条件で１分間にＮＡＤＨを生成する酵素量である。
【００１７】
（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０５×希釈倍率］
／（６．２２×１．０×０．０５）
上記の式において各数値は、以下を意味する。
３．０５：ＡＨＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
６．２２：ＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０：光路長（ｃｍ）
０．０５：添加するＡＨＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
【００１８】
ＡＨＤＨのタンパク質量（質量）当たりの活性（Ｕ／ｍｇ：比活性）は、上記の式におけるｍｌ溶液中に存在するＡＨＤＨのタンパク質量を測定することにより求めることができる。タンパク質量は、任意の手法で測定することができるが、例えば、Ａ２８０ｎｍの吸光度又はバイオラッド社のタンパク質定量試薬（商品名：バイオラッドプロテインアッセイ濃縮色素試薬）等を用いて測定することができる。ＡＨＤＨが固体でＡＨＤＨ以外の成分を含むと思われる場合は、適当な溶液に溶解してタンパク質量を求め、比活性を求めることが出来る。
【００１９】
イミダゾール環を有する化合物の存在下でのＤ−マンノース脱水素活性の測定は、上記の測定方法において、試薬（１）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを、イミダゾール環を有する化合物に置き換えて行うことが出来る。イミダゾール環を有する化合物以外の他の緩衝物質の存在による影響を調べる場合も同様に行うことができる。Ｄ−マンノース以外の糖（例えば、Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、及びＤ−キシロース）に対する脱水素活性の測定は、Ｄ−マンノースを他の糖に置き換えることにより行うことができる。
【００２０】
イミダゾール環を有する物質の存在下でＡＨＤＨが有するＤ−マンノース脱水素活性は、特に制限されないが、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を用いた場合に、好ましくは５Ｕ／ｍｇ以上であり、より好ましくは１０Ｕ／ｍｇ以上、更に好ましくは１２Ｕ／ｍｇ以上である。Ｄ−マンノース脱水素活性の上限は、特に制限されないが、例えば、５０Ｕ／ｍｇ以下、４０Ｕ／ｍｇ、又は３０Ｕ／ｍｇと設定することができる。イミダゾール環を有する化合物の存在下で、この範囲の活性を有することにより、ＡＨＤＨは、バイオ燃料電池における負極用の酵素として好適で用いられる。
【００２１】
ＡＨＤＨのＤ−マンノース脱水素活性についてのＫｍ値は、ＮＡＤを補酵素とした場合に、好ましくは１００ｍＭ以下であり、より好ましくは５０ｍＭ以下である。上記Ｋｍ値の下限は、特に制限されないが、例えば、２０ｍＭ以上、好ましくは３０ｍＭ以上、より好ましくは４０ｍＭ以上に設定することができる。Ｄ−グルコースよりも積極的にＤ−マンノースを基質として利用させるという観点から、Ｄ−マンノースを基質とした場合のＫｍ値は、Ｄ−グルコースを基質とした場合のＫｍ値よりも低いことが好ましい。
【００２２】
ＡＨＤＨは、少なくとも７０℃以下（０〜７０℃）の温度範囲において安定であることが好ましい。ここで、特定の温度条件の下で安定であるとは、特定の温度に設定した適当な緩衝液（例えば、リン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．０）中に１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を１５分間維持した後の残存活性が、処理前の活性と比較して８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上であることを意味する。ここで、活性とは、Ｄ−マンノース脱水素活性を意味する。
【００２３】
ＡＨＤＨは、少なくともｐＨ７〜１１の範囲で安定であることが好ましい。本書において、特定のｐＨ条件の下で安定であるとは、０．５ｍｇ／ｍＬの酵素を２５℃で１９時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは実質的に１００％維持されていることを意味する。
【００２４】
ＡＨＤＨは、Ｄ−マンノース以外に、２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び／又はキシロース等の食料としての価値の低い糖に対する基質特異性が、Ｄ−グルコースに対する基質特異性よりも高いことが好ましい。このような性質を備えることにより、食料価値の低い燃料から電気エネルギーを供給することが可能になるためである。
【００２５】
配列番号１のアミノ酸配列は、サーモプラズマ アシッドフィラム（以下「Ｔａ」と称する場合もある）由来のＡＨＤＨのアミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸配列は、サーモプラズマ  ボルカニウム（以下、「Ｔｖ」と称する場合もある）由来のＡＨＤＨのアミノ酸配列である。これらのＡＨＤＨは、いずれもイミダゾール環を有する化合物の存在下でＤ−マンノース脱水素活性を有し、上記のＤ−マンノースに対する好ましいＫｍ値、好ましい熱安定性、好ましいｐＨ安定性、及び好ましい基質特異性といった特性を満たす。
【００２６】
ＡＨＤＨは、配列番号１又は２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つ、イミダゾール環を有する物質の存在下でＤ−マンノース脱水素活性を有することが好ましい。配列番号１又は２のアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上である。
【００２７】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて、算出することができる。
【００２８】
配列番号１又は２のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、任意の手法で得ることが出来る。例えば、配列番号１及び２のアミノ酸配列と同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を設計し、化学合成法によってその配列を有するポリペプチドを合成することができる。また、配列番号１又２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから公知の遺伝子工学的手法を利用して得ることもできる。配列番号１及び２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を各々配列番号３及び４に示す。
【００２９】
配列番号１又は２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドには、イミダゾール環を有する物質の存在下でＤ−マンノース脱水素活性を有さないものも含まれ得るが、そのようなポリペプチドは、上述する活性測定方法に従って確認することにより、容易に排除することができる。
【００３０】
配列番号１又は２のアミノ酸配列を９０％以上の同一性を有するポリペプチドからなるＡＨＤＨは、配列番号１と２とに共通する配列部分について保存されていることが好ましい。例えば、配列番号１のアミノ酸配列における次の位置のアミノ酸が保存されていることが好ましい：６位〜８位、１０位〜１３位、１５位、１７位〜１９位、２１位、２７位、３０位、３２位、３３位、３７位、４８位、４９位、５３位〜５６位、６０位、６１位、６９位、７１位、７２位、７４位、７７位〜８４位、８６位、９７位〜１０４位、１０７位、１０９位、１１３位、１１６位、１１７位、１１９位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３２位〜１３４位、１３９位〜１４２位、１４４位〜１５１位、１５４位〜１５６位、１５８位、１６０位、１６２位〜１６５位、１６８位〜１７４位、１７６位、１７７位、１７９位、１８０位、１８２位、１８４位〜１８６位、１８９位、２００位、２０１位、２０３位〜２０５位、２０８位〜２１０位、２１２位〜２１４位、２１６位、２１８位〜２２０位、２２３位〜２２８位、２３１位〜２３６位、２３８位、２３９位、２４１位〜２４５位、及び２５０位〜２５４位。
【００３１】
ＡＨＤＨは、任意の微生物から単離して取得することも可能である。そのような微生物としては、例えば、超好熱性始原菌を挙げることができる。好ましい超好熱性始原菌としては、例えば、パイロディクティム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｍ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、サーモフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、及びサーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属などが挙げることができる。より好ましい微生物は、サーモプラズマ属に分類される微生物であり、具体的には、サーモプラズマ アシッドフィラム及びサーモプラズマ  ボルカニウムを挙げることができる。
【００３２】
微生物からのＡＨＤＨの単離は、公知の技術を適宜組み合わせて実施することが出来る。例えば、微生物を適当な培養条件で培養し、培養上清を濾過及び／又は遠心することによって、不溶物を除去し、限外ろ過膜を用いた濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、及び／又は各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて実施することができる。
【００３３】
バイオ燃料電池用組成物は、ＡＨＤＨのみを含んでいても良いが、ＡＨＤＨのＤ−マンノース脱水素活性を阻害しない限り、任意の他の物質を含み得る。例えば、当該組成物は、ＡＨＤＨの保存に適した任意の保存溶液（例えば、緩衝液）中にＡＨＤＨを含んでいても良い。また、当該組成物は、ＮＡＤやＮＡＤＰ等の補酵素を含んでいても良い。更に、当該組成物は電子伝達物質を含み得る。電子伝達物質としては、特に制限されないが、例えば、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、２，３−ジアミノ−１，４−ナフトキノン、４−アミノ−１，２−ナフトキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−メチル−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、ビタミンＫ１（２−メチル−３−フィチル−１，４−ナフトキノン）、ビタミンＫ２（２−ファルネシル−３−メチル−１，４−ナフトキノン）、ビタミンＫ３（２−メチル，１，４−ナフトヒドロキノン）等を挙げることができる。また、アントラキノン−１−スルホネート、アントラキノン−２−スルホネート等のアントラキノン骨格を有する化合物やその誘導体を用いることもできる。
【００３４】
バイオ燃料電池用組成物は、種々の形態をとり得る。例えば、バイオ燃料電池用組成物は、凍結乾燥粉末形態や液状形態であり得る。バイオ燃料電池用組成物が液体組成物である場合、当該組成物に含まれるＡＨＤＨの量は特に制限されないが、例えば、１〜１００ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍｌである。
【００３５】
２．バイオ燃料電池
バイオ燃料電池は、典型的に、正極、負極、及びこれらの間の電解液、及びセパレーターを備える。バイオ燃料電池は、負極に上述のＡＨＤＨを有する限りに任意の構成を取り得るが、更に０．１Ｍ以上のイミダゾール環を有する化合物を含む電解液を備えることが好ましい。
【００３６】
正極及び負極は、電極に適した任意の素材によって構成され得る。例えば、電極は、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンペーパー、カーボンフェルト、導電性カーボンブラック（例えば、ケッチェンブラック（Ketjen Black））、炭素繊維又は炭素微粒子の積層体等のカーボン系材料、並びに、金及び白金等の金属から構成され得る。酵素を積載するという観点から、好ましくは多孔質カーボンである。
【００３７】
負極には、上述するＡＨＤＨが存在することが好ましい。負極には、ＡＨＤＨに加えて任意の他の酵素が存在しても良い。他の酵素は、燃料に選択する物質に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシパルベートレダクターゼ、グリセレートデヒドロゲナーゼ、フォルメートデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒドー３リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、スクロースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルボースデヒドロゲナーゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼ、イソシレートデヒドロゲナーゼ、２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ、スクシネートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アシルーＣｏＡデヒドロゲナーゼ、L−３−ヒドロキシアシルーＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ等から成る群より１種以上を選択することができる。
【００３８】
負極には、ＡＨＤＨ等の酵素に加えて、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ等の補酵素が存在することが好ましい。ＡＨＤＨの好ましい補酵素はＮＡＤである。ＮＡＤ及びＮＡＤＨは、２０〜４０ｍＭの濃度で存在することが好ましい。また、ＡＨＤＨに加えて、他の酵素が負極に存在する場合は、他の酵素の性質に応じて、ＦＡＤ及びＰＱＱ等の他の補酵素が存在しても良い。
【００３９】
負極には、ＡＨＤＨ等の酵素に加えて、任意の電子伝達物質も存在し得る。ＡＨＤＨの電子伝達物質としては、上記１において、バイオ燃料電池用組成物に含まれ得る電子伝達物質として記載したものを使用することができる。
【００４０】
負極に存在する酵素、補酵素及び／又は電子伝達物質等は、負極の表面に付着していることが好ましく、固定化されていることがより好ましい。固定化は、任意の手法で行うことができ、例えば、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、並びに、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー等により固定化膜を形成する方法を挙げることが出来る。典型的には、ＡＨＤＨ等を、グルタルアルデヒドを用いてカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする手法が取ら得る。
【００４１】
正極の表面には、酸素の還元反応を触媒する酵素が存在することが好ましい。そのような酵素としては、例えば、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、及びアスコルビン酸オキシダーゼ等を挙げることが出来る。また、正極には、負極と同様に、必用に応じて補酵素及び電子伝達物質が存在し得る。正極に存在する電子伝達物質は、負極に使用する電子伝達物質と比較して酸化還元電子が高いことが好ましい。
【００４２】
正極と負極との間に存在する電解液は、０．５Ｍ以上のイミダゾール環を有する化合物を含むことが好ましい。イミダゾール環を有する化合物としては、上記１．において記載するものを使用することができる。電解液中のイミダゾール環を有する化合物の濃度は、好ましくは１．０Ｍ以上である。イミダゾール環を有する物質の濃度の上限は、ＡＨＤＨが有するＤ−マンノース脱水素活性が維持される限り、特に制限されないが、例えば、３Ｍ以下であり、好ましくは２．５Ｍ以下に設定することができる。
【００４３】
電解液には、イミダゾール環を有する化合物以外の他の緩衝物質を含んでいても良い。他の緩衝物質としては、例えば、リン酸二水素イオン、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジル酸、炭酸、クエン酸水素イオン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、グリシルグリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン等から成る群より１種以上を選択することができる。
【００４４】
正極と負極との間のセパレーターは、電解液中の成分が透過可能な材料によって形成されていれば、その構成は特に制限されず、公知のセパレーターを適宜選択して使用することができる。例えば、セルロース系不織布又はセロファン等を使用することが出来る。
【００４５】
バイオ燃料電池の燃料は、ＡＨＤＨの基質となり得る物質を含む限り特に制限されず、任意の物質を使用することが出来る。好ましい燃料は、ＡＨＤＨの基質特性が高いＤ−マンノースを比較的高い割合で含む物質である。例えば、Ｄ−マンノース及びＤ−キシロースは、ヘミセルロースを構成する単糖であるため、ヘミセルロース及びそれを含む木質材料等を挙げることができる。ヘミセルロースは、非可食物質であり、比較的低廉であるという観点からも好ましい。
【００４６】
バイオ燃料電池は、電力の供給を必用とする任意の用途に用いることができる。例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船等）、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステム等に用いることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例参照して説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 
【００４８】
比較例１  ＮＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼに対するイミダゾール等の影響
特許文献１には、負極に使用する酵素としてＮＡＤ依存型のグルコースデヒドロゲナーゼが開示されている。そこで、ＷＯ２０１０／１３７４８９開示されるＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．  ＧＤＨ１株由来のＮＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを用いて、イミダゾール濃度による活性への影響を調べた。また、リン酸ナトリウム塩濃度による活性への影響も併せて測定した。Ｄ−グルコースを基質として用い、各種濃度のイミダゾール緩衝液中での酵素活性（０．１Ｍでの活性を１００％とした時の相対値）を図１Ａに示す。Ｄ−グルコースを基質として用い、各種濃度のリン酸ナトリウム緩衝液中での酵素活性（０．１Ｍでの活性を１００％とした時の相対値）を図１Ｂに示す。
【００４９】
図１Ａに示されるように、極限環境微生物であるサーモプロテウス由来のＮＡＤ依存型ＧＤＨの活性は、０．５Ｍのイミダゾールによって顕著に阻害され、１Ｍ以上のイミダゾールが存在する場合は、殆ど活性が見られないことが判明した。一方、図１Ｂに示されるように、０．１〜１．５ＭのＮａＰＢでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、１．５ＭのＮａＰＢでも相対活性が５７％以上保持されていた。
【００５０】
実施例１  Ｔｖ由来ＡＨＤＨのクローニング
Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＧＳＳ1株を、酵母エキス（ディフコ社製）１ｇ／Ｌ、グルコース  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．３２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３７２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２４７ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０７４ｇ／Ｌ、１０ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １．９３ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１８ｇ／Ｌ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ  ０．４５ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ  ４・２Ｈ２Ｏ  ３ｍｇ／Ｌ、ＶＯＳＯ  ４・２Ｈ２Ｏ  ３ｍｇ／Ｌ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／Ｌ）を加え、硫酸でｐＨを１．３に調節した培地で５８℃、二晩振とう培養した。その後、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１５分間）により集菌した。Ｔｖ株は、(独)製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターより入手可能である（ＮＢＲＣ番号１５４３８）。
【００５１】
遠心チューブ内に残存する培養液をキムワイプで拭き取った後、細胞１ｇあたり２０％シュークロース、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳを含んだ溶液１５ｍＬに懸濁し、１５０μＬのプロテアーゼK溶液(１０ｍｇ／ｍＬ)と１５０μＬのＲＮＡｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）とを加え、３７℃で１２時間維持した。これを等量のクロロホルム／フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取する操作を３回繰り返した。 
【００５２】
得られた水層に６００μＬの５ＭＮａＣｌを加え混合した後、０．８倍量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後に出現するＤＮＡを硝子棒に巻き付け精製ＤＮＡ標品とした。この精製ＤＮＡを５ｍＬの１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）溶液（以下、ＴＥと略記する）に再溶解し、２００μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを加え混合した後０．８倍量のイソプロピルアルコールを加え再抽出したＤＮＡを７０％エタノール溶液で洗浄後、風乾の後１ｍＬのＴＥ（トリス塩酸−ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。 
【００５３】
配列番号５に示す３７塩基からなるセンスプライマーと配列番号６に示す３４塩基からなるアンチセンスプライマーを合成し、このプライマーセットとＰｆｕｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼとを用い、実施例１で得られたＤＮＡを鋳型として、以下のサイクルでＰＣＲを行った。 
ステップ１：９４℃、１分間 
ステップ２：５０℃、１分間 
ステップ３：７２℃、２．５分間（３０サイクル） 
得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて泳動すると、０．７８ｋｂの大きさの特異的バンドが認められた。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、このＤＮＡ断片を同じくＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化することにより得られたベクターｐＥＴ２８の開環物とライゲーションした。このようにして、組み換えベクターｐＥＴ／Ｔｖを得た。この組み換えベクターによりエシェリヒア・コリＸＬ１／Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換した。 
【００５４】
ｐＥＴ／Ｔｖの約０．８ｋｂｐの挿入ＤＮＡについて、ＢｉｇＤｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙ ＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）及びＡＢＩ３１００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列のオープンリーディングフレーム及びこれに対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３及び配列番号１に示した。アミノ酸配列から求められるタンパク質の分子量は２７０００〜３３０００であった。 
【００５５】
実施例２  形質転換体の作製
エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のコンピテントセルをｐＥＴ／Ｔｖで形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔｖ）を得た。 
【００５６】
実施例３  形質転換体からのＴｖ株由来精製ＡＨＤＨの製造 
ＬＢ培地１００ｍＬを５００ｍＬフラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した２０ｍｇ／ｍＬカナマイシン、３４ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ナカライテスク社）０．１ｍＬを添加した。この培地にＬＢ培地で予め３７℃、１５時間振とう培養したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔｖ）の培養液１ｍＬを接種し、３７℃で８時間通気攪拌培養した。 
【００５７】
ＬＢ培地９００ｍＬを３Ｌフラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した２０ｍｇ／ｍＬカナマイシン及び３４ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ナカライテスク社製）０．９ｍＬを添加した。この培地に８時間培養したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔｖ）の培養液１００ｍＬを接種し、３０℃で１５時間通気攪拌培養した。培養終了時の培養液１ｍＬ中に含まれる菌体中のＡＨＤＨ活性は約４Ｕ／ｍＬであった。 
【００５８】
培養液中の菌体を遠心分離により集菌し、３００ ｍＭ ＮａＣｌ, 1 ｍｇ/ｍｌＬｙｓｏｚｙｍｅを含む５０ｍＭ  Ｎａ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波で破砕し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を６０℃で６０分間熱処理し、遠心分離を行い、上清液を得た。 
【００５９】
上清液をＨＩＳ−ＳＥＬＥＣＴ (ｓｉｇｍａ) に吸着させ、５０ ｍＭＮａ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ ６．０, ３００ ｍＭＮａＣｌ, １０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むバッファーで洗浄後、０〜４００ ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔにて分離、精製を行った。次に、ＡＨＤＨが多く含まれる画分を回収し、透析（２５ ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．５, ２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を行い、精製酵素標品を得た。本方法により得られたＡＨＤＨ標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりほぼ単一なバンドを示した。この際、タンパク質分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼｂ（９７，０００ダルトン）、アルブミン（６６，０００ダルトン）、オバルブミン（４５，０００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）、α−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）を用いた。Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図２に示す。
【００６０】
実施例４  Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨの基質特異性
実施例３で得られた精製ＡＨＤＨを用いて、種々の糖に対する活性を、補酵素としてＮＡＤを用いて測定した。結果を図３及び下記の表１に示す。その結果、本酵素は、Ｄ−マンノース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、及びキシロースに対して高い活性を有することが判明した。尚、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ株由来のＡＨＤＨの基質特異性については、特開２００４−３３０７７号公報に開示されており、Ｔｖ株由来のＡＨＤＨと同様に、Ｄ−マンノース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、及びキシロースに対して高い活性を有する。
【００６１】
【表１】
2014182887.tif 000002
【００６２】
実施例５  Ｔｖ株及びＴａ株由来の精製ＡＨＤＨの至適ｐＨ
実施例３で得られたＴｖ株由来の精製ＡＨＤＨ（２Ｕ／ｍＬ）及び特開２００４−３３０７７号公報に開示される内容に従って取得したＴａ株由来の精製ＡＨＤＨ（２Ｕ／ｍｌ）について、至適ｐＨを調べた。１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜６．０、図中◆印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０、図中■印でプロット）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０−８．０、図中▲印でプロット）、１００ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０−１１．０、図中●でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて、２５℃で酵素反応を行い、相対活性を調べた。結果を図４Ａ（Ｔｖ株）と図４Ｂ（Ｔａ株）に示す。Ｔｖ株由来のＡＨＤＨが残存活性８０％以上を示すｐＨ範囲はｐＨ６．９５−ｐＨ９．６９であった。Ｔａ株由来のＡＨＤＨが残存活性８０％以上を示すｐＨ範囲は、ｐＨ８．４−ｐＨ９．６９であった。
【００６３】
実施例６
Ｔｖ株及びＴａ株由来の精製ＡＨＤＨの熱安定性
Ｔｖ株由来のＡＨＤＨ酵素液（１ｍｇ／ｍＬ）及びＴａ株由来のＡＨＤＨ酵素液（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、温度安定性を調べた。２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、種々の温度（２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃）で１５分間処理した後、残存活性率を測定した。結果を図５に示す。活性が実質的に低下しない上限温度は、７０℃以下であることが確認された。
【００６４】
実施例７  Ｔｖ株及びＴａ株由来の精製ＡＨＤＨのｐＨ安定性
Ｔｖ株由来のＡＨＤＨ酵素液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜６．０、図中◆印でプロット）、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−ｐＨ８．０：図中■印でプロット）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０−ｐＨ９．０：図中▲印でプロット）、１００ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０−１１．０、図中●でプロット）を用い、２５℃で１９時間処理した後の活性の残存率を測定した。結果を図６に示す。その結果、ｐＨ４．５〜１０．１で酵素活性を９０％以上維持した。Ｔａ株由来のＡＨＤＨのｐＨ安定性については、特開２００４−３３０７７号公報に開示されており、ｐＨ７〜１１の範囲で安定であることが示されている。
【００６５】
実施例８  Ｄ−マンノースに対するＫｍ値の測定
Ｔｖ株由来のＡＨＤＨについて、Ｄ−マンノースの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ（図７）からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔを作成し、Ｋｍ値を算出した。補酵素には、ＮＡＤを用いた。その結果、Ｔｖ株由来ＡＨＤＨのＤ−マンノースに対するＫｍ値は、４４ｍＭであることが判明した。Ｔａ株由来のＡＨＤＨのＤ−マンノースに対するＫｍ値は、特開２００４−３３０７７号公報に開示される通り、２５ｍＭである。
【００６６】
実施例９  Ｄ−グルコースに対するＫｍ値の測定
Ｔｖ株由来のＡＨＤＨについて、Ｄ−グルコースの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ（図８）からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔを作成し、Ｋｍ値を算出した。その結果、Ｔｖ株由来ＡＨＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は、８９５ｍＭであることが判明した。Ｔａ株由来のＡＨＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は、特開２００４−３３０７７号公報に開示される通り、２０８ｍＭである。
【００６７】
実施例１０  ＮＡＤに対するＫｍ値の測定
Ｔｖ株由来のＡＨＤＨについて、ＮＡＤの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ（図９）からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔを作成し、Ｋｍ値を算出した。その結果、Ｔｖ株由来ＡＨＤＨのＮＡＤに対するＫｍ値は、０．１５ｍＭであることが判明した。尚、Ｔａ株由来のＡＨＤＨのＮＡＤに対するＫｍ値は、０．０８ｍＭ以下であり、ＮＡＤに対する親和性が非常に高い。
【００６８】
実施例１１  リン酸ナトリウム塩がＴａ株由来ＡＨＤＨの活性に与える影響
０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＰＢ）、０．５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＰＢ）、１．０Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（１．０Ｍ  ＮａＰＢ）、１．５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（１．５Ｍ  ＮａＰＢ）でのＴａ株由来ＡＨＤＨの活性を調べた。Ｄ−グルコースを基質とした時の結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに、Ｄ−マンノースを基質とした時の結果を図１０Ｃ及び図１０Ｄに、Ｄ−キシロースを基質とした時の結果を図１０Ｅ及び図１０Ｆに示す。
【００６９】
図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるように、０．１〜１．５ＭのＮａＰＢでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、０．１〜０．５ＭＮａＰＢでは活性低下が起こらなかった。１．０Ｍ以上から酵素活性の低下が起こるが、１．５Ｍ  ＮａＰＢでも相対活性が７０％以上保持されていた。
【００７０】
図１０Ｃ及び図１０Ｄに示されるように、０．１〜１．５ＭのＮａＰＢでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、０．１〜０．５ＭＮａＰＢでは活性低下が起こらなかった。１．０Ｍ以上から酵素活性の低下が起こるが、１．５ＭのＮａＰＢでも相対活性が５０％以上保持されていた。
【００７１】
図１０Ｅ及び図１０Ｆに示されるように、０．１〜１．５ＭのＮａＰＢでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、０．１〜０．５ＭのＮａＰＢでは活性低下が起こらなかった。１．０Ｍ以上から酵素活性の低下が起こるが、１．５ＭのＮａＰＢでも相対活性が６０％以上保持されていた。
【００７２】
実施例１２  リン酸ナトリウム塩がＴｖ株由来ＡＨＤＨの活性に与える影響
０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＰＢ）、０．５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＰＢ）、１．０Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（１．０Ｍ  ＮａＰＢ）、１．５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（１．５Ｍ  ＮａＰＢ）でのＴｖ株由来ＡＨＤＨの活性を調べた。Ｄ−グルコースを基質とした時の結果を図１１Ａ及び図１１Ｂに、Ｄ−マンノースを基質とした時の結果を図１１Ｃ及び図１１Ｄに、Ｄ−キシロースを基質とした時の結果を図１１Ｅ及び図１１Ｆに示す。
【００７３】
図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、０．１〜１．５ＭのＮａＰＢでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、１．５Ｍ  ＮａＰＢでも相対活性が９０％以上保持されていた。
【００７４】
図１１Ｃ及び図１１Ｄに示されるように、０．１〜１．５ＭのＮａＰＢでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、０．１〜０．５ＭのＮａＰＢでは活性低下が起こらなかった。１．０Ｍ以上から酵素活性の低下が起こるが、１．５ＭのＮａＰＢでも相対活性が７０％以上保持されていた。
【００７５】
図１１Ｅ及び図１１Ｆに示されるように、０．１〜１．５ＭのＮａＰＢでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、０．１〜０．５ＭのＮａＰＢでは活性低下が起こらなかった。１．０Ｍ以上から酵素活性の低下が起こるが、１．５ＭのＮａＰＢでも相対活性が８０％以上保持されていた。
【００７６】
実施例１３  イミダゾール塩がＴａ株由来ＡＨＤＨの活性に与える影響
０．１Ｍ  イミダゾール緩衝液（０．１Ｍ  イミダゾール）、０．５Ｍ  イミダゾール緩衝液（０．５Ｍ  イミダゾール）、１．０Ｍ  イミダゾール緩衝液（１．０Ｍ  イミダゾール）、１．５Ｍ  イミダゾール緩衝液（１．５Ｍ  イミダゾール）、２．０Ｍ  イミダゾール緩衝液（２．０Ｍ  イミダゾール）でのＴａ株由来ＡＨＤＨの活性を調べた。Ｄ−グルコースを基質とした時の結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに、Ｄ−マンノースを基質とした時の結果を図１２Ｃ及び図１２Ｄに、Ｄ−キシロースを基質とした時の結果を図１２Ｅ及び図１２Ｆに示す。
【００７７】
図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、Ｄ−グルコースを基質とした場合、０．１〜２．０Ｍのイミダゾールでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、２．０Ｍのイミダゾール緩衝液でも相対活性が８％以上保持されていた。
【００７８】
図１２Ｃ及び図１２Ｄに示されるように、Ｄ−マンノースを基質とした場合、０．１〜２．０Ｍのイミダゾールでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が０．５〜１．５Ｍのイミダゾールになると酵素の比活性が上昇した。このような、比活性向上の効果はリン酸ナトリウム緩衝液では見られなかった現象である（図１１Ｃ、図１１Ｄ）。２．０Ｍのイミダゾール緩衝液でも相対活性が５５％以上保持されていた。
【００７９】
図１２Ｅ及び図１２Ｆに示されるように、Ｄ−キシロースを基質とした場合、０．１〜２．０Ｍイミダゾールでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が０．５Ｍイミダゾールになると酵素の比活性が上昇した。このような、比活性向上の効果はリン酸ナトリウム緩衝液では見られなかった現象である（図１１Ｅ、図１１Ｆ）。２．０Ｍのイミダゾール緩衝液でも相対活性が１６％以上保持されていた。
【００８０】
実施例１４  イミダゾール塩がＴｖ株由来精製ＡＨＤＨの活性に与える影響
０．１Ｍ  イミダゾール緩衝液（０．１Ｍ  イミダゾール）、０．５Ｍ  イミダゾール緩衝液（０．５Ｍ  イミダゾール）、１．０Ｍ  イミダゾール緩衝液（１．０Ｍ  イミダゾール）、１．５Ｍ  イミダゾール緩衝液（１．５Ｍ  イミダゾール）、２．０Ｍ  イミダゾール緩衝液（２．０Ｍ  イミダゾール）でＴｖ株由来精製ＡＨＤＨの活性を調べた。Ｄ−グルコースを基質とした時の結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに、Ｄ−マンノースを基質とした時の結果を図１３Ｃ及び図１３Ｄに、Ｄ−キシロースを基質とした時の結果を図１３Ｅ及び図１３Ｆに示す。
【００８１】
図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるように、Ｄ−グルコースを基質とした場合、０．１〜２．０Ｍのイミダゾールでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、２．０Ｍのイミダゾール緩衝液でも相対活性が９％以上保持されていた。
【００８２】
図１３Ｃ及び図１３Ｄに示されるように、Ｄ−マンノースを基質とした場合、０．１〜２．０Ｍのイミダゾールでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、０．１〜０．５Ｍイミダゾールでは活性低下が起こらなかった。１．０Ｍ以上から酵素活性の低下が起こるが、２．０Ｍのイミダゾール緩衝液でも相対活性が４０％以上保持されていた。
【００８３】
図１３Ｅ及び図１３Ｆに示されるように、Ｄ−キシロースを基質とした場合、０．１〜２．０Ｍのイミダゾールでも酵素反応が進行することが分かった。塩濃度が濃くなるほど、酵素の比活性が下がる傾向があるが、０．１〜０．５Ｍのイミダゾールでは活性低下が起こらなかった。１．０Ｍ以上から酵素活性の低下が起こるが、２．０Ｍのイミダゾール緩衝液でも相対活性が１２％以上保持されていた。
【００８４】
上記実施例１３及び１４から、サーモプラズマ由来のＮＡＤ依存型ＡＨＤＨは、サーモプロプロテウス由来のＮＡＤ依存型ＧＤＨとは異なり、イミダゾールの存在下でも安定であることが判明した。
【図１】
2014182887.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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