(57)【要約】【課題】血管硬化症の治療における使用のためのＢＭＰ−７の提供。【解決手段】本発明は、モルフォゲンを使用する、血管硬化症、血管石灰化（ＶＣ）、および新生内膜過形成の予防および治療に関する。本発明の一態様において、血管硬化症は、ＣＫＤを伴うまたはＣＫＤによって誘発される。本発明はまた、血管平滑筋細胞の分化を誘発するための組成物および方法にも関する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を治療するためのまたは予防するための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府基金
本発明は、主要な研究者としてのＫｅｉｔｈ  Ａ．Ｈｒｕｓｋａによって、ＮＩＨ助成金ＤＫ０５９６０２、ＤＫ０７０７９０およびＡＲ４１６７７により支援された。
【０００２】
発明の分野
本発明は、血管硬化症、新生内膜過形成、および血管石灰化（ＶＣ）の予防および治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、致命的な病気であり、心血管合併症（静脈新生内膜過形成（ＮＨ）病変による動静脈（ＡＶ）アクセス不全を含む）は、罹患および死亡の主な原因である（Ｇｏ，  Ａ．Ｓ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５１巻：１２９６〜１３０５頁、２００４年；Ｂｅｒｌ，  Ｔ．およびＨｅｎｒｉｃｈ，  Ｗ．、Ｃｌｉｎ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １巻：８〜１８頁、２００６年）１；２。心血管死亡と関連する標準的な危険因子の役割が、ＣＫＤにおける危険性の増加の理由を説明しないので、ＣＫＤと関連する過剰な心血管死亡の原因は、未知である（Ｂｅｒｌ、同書）。
【０００４】
本来の血管を用いて構築されるＡＶ瘻は、血管移植片または中心静脈カテーテルと比較して、狭窄症、血栓症、および感染症のより低い発生率のために、利用可能な最良の血管アクセスであるが、成熟の後でさえ、２年間での６６％の不全率は、なお容認できないままであり（Ｓｈｅｎｏｙ  Ｓ，ら、Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  ２００３年；３８巻（２号）：２２９〜２３５頁）５４、血液透析アクセス関連性の入院は、かなり費用がかかり続けており、アメリカ合衆国において１年当たり１０億ドルを超える（Ｌｅｅ  Ｈ，ら、Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．  ２００２年；４０巻（３号）：６１１〜６２２頁）５５。
【０００５】
ＡＶアクセス不全の原因は、インサイツ血栓症が続く、吻合および／または流出静脈での閉塞性新生内膜過形成性病変形成に主に付随する（Ｍａｔｔａｎａ  Ｊ，ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  １９９７年；５２巻（６号）：１４７８〜１４８５頁；Ｅｚｚａｈｉｒｉ  Ｒ，ら、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  １９９９年；１４巻（９号）：２１１０〜２１１５頁；Ｃｉｎａｔ  ＭＥ，ら、Ａｎｎ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １９９９年；１３巻（２号）：１９１〜１９８頁；Ｔｏｒｄｏｉｒ  ＪＨら、Ｅｕｒ
Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｅｎｄｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．  １９９５年；９巻（３号）：３０５〜３０９頁）５６〜５９。血管形成術およびステント術の後の、閉塞前のアテローム硬化性動脈で見られる再狭窄とは異なり、新生内膜（新内膜）過形成（ＮＨ）は、四肢において、動脈または人工移植片（たとえばｅＰＴＦＥ、Ｄａｃｒｏｎ）および静脈を含む吻合で見られる。これらの血管は、通常、アテローム斑がないが、それらは、石灰化、既存のＮＨ、および針刺し傷害を起こしやすい。そのため、静脈管腔表面への平滑筋細胞（ＳＭＣ）の指向性の移動は、吻合部周囲のＮＨ病変形成にとって重大である（Ｒｏｙ−Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ  Ｐら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００６年；１７巻（４号）：１１１２〜１１２７頁；Ｎｉｋｋａｒｉ  ＳＴら、Ａｎｎ  Ｍｅｄ．  １９９４年；２６巻（２号）：９５〜１００頁）６０，６１。
【０００６】
ＣＫＤは、血行力学的な力、炎症性メディエーター、血小板活性化、凝固カスケード、および代謝因子などのような多数の他の混乱した因子と共に、アテローム性動脈硬化症の発症に関係する。さらに、血清リンは、ＣＫＤにおける心血管事象および死亡に対して非依存性の危険因子であるという強い疫学的証拠がある（Ｋｅｓｔｅｎｂａｕｍ，  Ｂ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １６巻：５２０〜５２８頁、２００５年；Ｓｌｉｎｉｎ，  Ｙ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １６巻：１７８８〜１７９３頁、２００５年）３；４。血清リンは、ＣＫＤにおいて、他の心血管危険因子、血管硬直の重要な原因である血管石灰化（ＶＣ）に関連づけられてきた（Ｋｅｓｔｅｎｂａｕｍら  ２００５年；Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｇ．Ｍ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｄｉａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  １８巻：１７３１〜１７４０頁、２００３年；Ｒａｇｇｉ，  Ｐ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３９巻：６９５〜７０１頁、２００２年）３；５；６。ＣＫＤ、アテローム性動脈硬化症、代謝性疾患、および糖尿病を含む様々な原因に由来する血管硬直は、主な心血管危険因子であり、脈波伝播速度の増加、心仕事量の増加、左室肥大、および冠状動脈血流量の減少に至る（Ｒａｇｇｉ  ２００２年；Ｚｉｌｅ，  Ｍ．Ｒ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５０巻：１９５３〜１９５９頁、２００４年；Ｏｈｔａｋｅ，  Ｔ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １６巻：１１４１〜１１４８頁、２００５年）６〜８。リンは、それが、骨芽細胞機能−骨形成（Ｔｙｓｏｎ，  Ｋ．Ｌ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２３巻：４８９〜４９４頁、２００３年）９および刺激的なマトリックスミネラル化（Ｓｔｅｉｔｚ，  Ｓ．Ａ．ら、Ｃｉｒｃ．
Ｒｅｓ．  ８９巻：１１４７〜１１５４頁、２００１年；Ｊｏｎｏ，  Ｓ．ら、Ｃｉｒ．  Ｒｅｓ．  ８７巻：ｅ１０〜ｅ１７頁、２０００年；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １５巻：２８５７〜２８６７頁、２００４年）１０〜１２に関与するタンパク質の遺伝子転写を増加させることによって血管平滑筋細胞における表現型の変化を誘発することを実証したインビトロにおける研究を通して、ＶＣの原因としてさらに関連づけられている。尿毒症性の石灰化環境において、α−平滑筋アクチン、ＳＭ２２、および重鎖ミオシンなどのような、血管平滑筋細胞の収縮性タンパク質の発現は、抑制されるが（Ｔｒｉｏｎ，  Ａ．およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｒｓｅ，  Ａ．、Ａｍ．  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  １４７巻：８０８〜８１４頁、２００４年）１３、オステオカルシン、オステオポンチン、骨形成タンパク質２、および骨形成タンパク質４などのような骨芽細胞系統マーカーは、増加する（Ｔｙｓｏｎ  ２００３年；Ｍｏｅ，  Ｓ．Ｍ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ’ｌ  ６１巻：６３８〜６４７頁、２００２年；Ｂｏｓｔｒｏｍ，  Ｋ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９１巻：１８００〜１８０９頁、１９９３年；Ｄｈｏｒｅ，  Ｃ．Ｒ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２１巻：１９９８〜２００３頁、２００１年）９；１４〜１６。さらに、骨格の骨形成を指示する、骨芽細胞特異的な転写因子ＲＵＮＸ２（Ｄｕｃｙ，  Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ  ８９巻：７４７〜７５４頁、１９９７年）１７は、末期ＣＫＤ（ＥＳＫＤ）を有する対象の脈管構造において発現する（Ｔｙｓｏｎ  ２００３年；Ｍｏｅ，  Ｓ．Ｍ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ’ｌ  ６３巻：１００３〜１０１１頁、２００３年）９；１８。
【０００７】
高食餌性脂肪を摂食させた、アテローム硬化性低密度リポタンパク質受容体欠損マウスにおけるＣＫＤ刺激性ＶＣの動物モデルが、最近同定された（Ｄａｖｉｅｓ，  Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １４巻：１５５９〜１５６７頁、２００３年）１９。このモデルにおけるＣＫＤは、高リン酸血症と関連する。高リン酸血症は、ＣＫＤにおいてＶＣの直接的な原因であることが実証された（Ｄａｖｉｅｓ，  Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈ．  １６巻：９１７〜９２８頁、２００５年）２０。これは、高リン酸血症が、その疾患の心血管合併症の原因となるというインビボにおける最初の実証となった。さらに、ＣＫＤにおける骨格は、摂取されたリンの腸管吸収および腎排泄の減少と共に、高リン酸血症へのリンの重要な寄与体であることが実証された（Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年；Ｌｕｎｄ，  Ｒ，Ｊら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １５巻：３５９〜３６９頁、２００４年）２０；２１。これは、血清リンを通しての、ＣＫＤにおける骨格のリモデリングおよびＶＣの間の直接的な関連を確証する。脈管構造のレベルでのリン作用のメカニズムは、このイオンの直接的な作用を示唆する最近の進展にもかかわらず、まだ実証されていない（Ｊｏｎｏ  ２０００年；Ｌｉ，  Ｘ．ら、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ９８巻：９０５〜９１２頁、２００６年）１１；２２。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、血管硬化症を治療するまたは予防するための組成物および方法に関する。本発明の一態様において、血管硬化症は、ＣＫＤを伴うまたはＣＫＤによって誘発される。本発明はまた、血管平滑筋細胞の分化を誘発するための組成物および方法にも関する。
【０００９】
本発明の一態様は、血管硬化症を治療するためのまたは予防するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を治療するためのまたは予防するための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。他の実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を治療するためのまたは予防するための方法であって、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、血管硬化症は、慢性腎疾患によって誘発される。
【００１０】
本発明の他の態様は、新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるためのものである。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。他の実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための方法であって、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、吻合と関連する。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、慢性腎疾患によって誘発される。
【００１１】
本発明の他の態様は、血管平滑筋分化を誘発するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明は、血管平滑筋細胞分化を誘発するための方法であって、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンと接触させるステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。他の実施形態において、本発明は、血管平滑筋細胞分化を誘発するための方法であって、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法をも提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。
【００１２】
本発明は、血管の石灰化によって引き起こされる慢性の血管硬化症を予防し、減少させることにさらに関する。石灰化を減少させるための代表的な方法のメカニズムは、高リン酸血症および関連するリン代謝をコントロールすることによるものである。ＣＫＤは、部分的にアテローム硬化性石灰化を増加させることを通してＶＣを刺激する。第２に、アテローム硬化性石灰化は、脈管構造における骨芽細胞の分化および機能の異所的発現によるものである。第３に、高リン酸血症は、血管石灰化の刺激を通してＣＫＤにおける心血管危険因子となる。血管石灰化のリン媒介性の誘発のメカニズムは、ＣＫＤにおける血管新生内膜および血管中膜におけるｏｓｔｅｒｉｘのその刺激を通してのものである。ｏｓｔｅｒｉｘのリン刺激性の活性は、ＢＭＰ−２／ＭＳＸ２が指示するプログラムが完了し、ミネラル化が刺激されることを可能にした。
【００１３】
本発明の一態様は、ミネラル化骨形成タンパク質（ＢＭＰ）活性を阻害することによって、ミネラル化を予防するまたは血管のさらなるミネラル化および／もしくは石灰化を停止させるためのものである。本発明の一実施形態は、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニスト、つまりミネラル化対抗ＢＭＰと筋細胞を接触させ、それによってミネラル化ＢＭＰ活性を阻害することによって、リンの存在下における最初のまたはさらなる血管のミネラル化／石灰化を予防するための方法である。特定の実施形態において、筋細胞は、血管平滑筋細胞である。特定の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。さらなる特定の実施形態において、筋細胞は、大動脈細胞である。一実施形態において、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストは、ＢＭＰ−７などのような他のＢＭＰまたはその類似体である。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、ｏｓｔｅｒｉｘ活性を低下させることによって、リンの存在下における血管の最初のまたはさらなる石灰化を予防するための方法である。ある実施形態において、ｏｓｔｅｒｉｘ活性は、ｏｓｔｅｒｉｘの発現を低下させることによって低下する。特定の実施形態において、ｏｓｔｅｒｉｘの発現は、ｏｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡ転写を低下させることによって低下する。他の実施形態において、ｏｓｔｅｒｉｘの発現は、ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質翻訳を阻害することによって阻害される。他の特定の実施形態において、ｏｓｔｅｒｉｘ活性は、ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の活性を直接阻害することによって低下する。
【００１５】
本発明の他の態様は、ミネラル化骨形成タンパク質（ＢＭＰ）活性を阻害することによって血管の石灰化を治療するための方法である。本発明の一実施形態は、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを投与し、それによってミネラル化ＢＭＰ活性を阻害することによって、慢性の血管ミネラル化を治療するための方法である。本発明の好ましい実施形態は、ＣＫＤによって誘発される血管硬化症を治療するためのそのような方法であって、血清におけるリンレベルは、上昇している方法である。特定の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰ活性のアンタゴニストは、ＢＭＰ−７またはその類似体である。
【００１６】
本発明の他の態様は、対象における血管硬化症を治療するためのまたは予防するための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物である。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。本発明の他の態様は、対象における血管硬化症を治療するためのまたは予防するための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４である。いくつかの実施形態において、血管硬化症は、慢性腎疾患によって誘発される。
【００１７】
本発明の他の態様は、対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物である。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。本発明の他の態様は、対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４である。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、吻合と関連する。他の実施形態において、新生内膜過形成は、慢性腎疾患によって誘発される。
【００１８】
本発明の他の態様は、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞の分化を誘発するための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物である。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。本発明の他の態様は、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞の分化の誘発のための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４である。
【００１９】
本発明の他の態様は、高リン酸血症、したがって血管石灰化の治療のためのリン結合剤を含む医薬組成物である。本発明の他の態様は、血管石灰化の治療のための、ＢＭＰ阻害剤を含む医薬組成物である。本発明のさらなる他の態様は、血管石灰化の治療のための、ＢＭＰ−７を含む医薬組成物である。
【００２０】
本発明の、記載された態様および実施形態のいずれにおいても、指定されるＢＭＰの類似体は、高度に相同性の構造、つまり、ジスルフィド結合を通して、ポリペプチドのＣ末端部分で明確な構造を形成する６または７個のシステイン骨格を有する任意の類似するＢＭＰを表し、そのような６または７個のシステイン骨格のアミノ酸配列は、システインを保存しながら、７０、８０、９０、または９５％の類似性または同一性を共有し、それらの生物学的活性は、部分的にまたは全体的に、指定されるＢＭＰの代わりになってもよい。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
対象における血管硬化症を治療するための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびその変異体から成る群から選択されるモルフォゲンを前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目２）
対象における血管硬化症を予防するための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびその変異体から成る群から選択されるモルフォゲンを前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目３）
対象における血管硬化症を治療するための方法であって、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目４）
対象における血管硬化症を予防するための方法であって、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目５）
前記モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
前記ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である、項目３または４に記載の方法。
（項目７）
前記ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである、項目３または４に記載の方法。
（項目８）
前記血管硬化症は、慢性腎疾患によって誘発される、項目１から４に記載のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびその変異体から成る群から選択されるモルフォゲンを前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目１０）
対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための方法であって、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目１１）
前記モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記新生内膜過形成は、吻合と関連する、項目９または１０に記載の方法。
（項目１５）
前記新生内膜過形成は、慢性腎疾患によって誘発される、項目９または１０に記載の方法。
（項目１６）
血管平滑筋細胞分化を誘発するための方法であって、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）ならびにそれらの変異体から成る群から選択されるモルフォゲンと接触させるステップを含む方法。
（項目１７）
血管平滑筋細胞分化を誘発するための方法であって、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法。
（項目１８）
前記モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
筋細胞をミネラル化骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストと接触させ、それにより、ミネラル化を阻害することによって、リンの存在下においてミネラル化ＢＭＰ活性を阻害することにより、血管の最初のまたはさらなるミネラル化を予防するための方法。
（項目２２）
前記筋細胞は、血管平滑筋細胞である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記ミネラル化対抗ＢＭＰは、ＢＭＰ−７である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
ｏｓｔｅｒｉｘ活性を低下させ、それにより、ミネラル化を阻害することによって、リンの存在下において血管の最初のまたはさらなるミネラル化を予防するための方法。
（項目２８）
ｏｓｔｅｒｉｘ活性は、ｏｓｔｅｒｉｘの前記発現を低下させることによって低下する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
ｏｓｔｅｒｉｘの前記発現は、ｏｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡ転写を低下させることによって低下する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
ｏｓｔｅｒｉｘの前記発現は、ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質翻訳を低下させることによって低下する、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
ｏｓｔｅｒｉｘ活性は、ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の前記活性を直接阻害することによって低下する、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
治療の必要性がある対象に、ミネラル化骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストを投与することによって、前記ミネラル化ＢＭＰ活性を阻害することにより血管のミネラル化を治療するための、前記対象を治療するための方法。
（項目３３）
前記ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記ミネラル化対抗ＢＭＰは、ＢＭＰ−７である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
高リン酸血症の治療の必要性がある対象にＢＭＰ−７を投与するステップから成る、高リン酸血症を治療するための方法。
（項目３８）
対象における血管硬化症を治療するためのまたは予防するための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から成る群から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物。
（項目３９）
対象における血管硬化症を治療するまたは予防するための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物。
（項目４０）
前記血管硬化症は、慢性腎疾患によって誘発される、項目３８または３９に記載の医薬組成物。
（項目４１）
対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、および変異体から成る群から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物。
（項目４２）
対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物。
（項目４３）
前記新生内膜過形成は、吻合と関連する、項目４１または４２に記載の医薬組成物。
（項目４４）
前記新生内膜過形成は、慢性腎疾患によって誘発される、項目４１または４２に記載の医薬組成物。
（項目４５）
血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞の分化を誘発するための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、および変異体から成る群から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物。
（項目４６）
血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞の分化を誘発するための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物。
（項目３９）
前記モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である、項目３８、４１、または４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４１）
前記ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である、項目３９、４２、または４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４２）
前記ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである、項目３９、４２、または４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４３）
血管石灰化の治療のためのリン結合剤を含む医薬組成物。
（項目４４）
血管石灰化の治療のための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む、項目４３に記載の医薬組成物。
（項目４５）
ＢＭＰ−７を含む、血管石灰化の治療のための、項目４３に記載の医薬組成物。
（項目４６）
リン結合剤をさらに含む、項目４３に記載の医薬組成物。
（項目４７）
前記リン結合剤は、ＬａＣＯ３である、項目４６に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＣＫＤにおける血管石灰化に対するＢＭＰ−７の効果を示す図である。
【図２】図２は、ＣＫＤにおける血管石灰化に対する、食餌中に共に３％混合されたＣａＣＯ３およびＬａＣＯ３の効果を示す図である。
【図３】図３は、ＬＤＬＲ−／−高脂肪摂食マウスにおける大規模な石灰化されたアテローム斑を実証する近位大動脈の切片を示す図である。
【図４】図４は、マトリックスミネラル化が、アテローム硬化性ドナーから単離されたヒト血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）の培養物中で刺激されることを示す図である。
【図５】図５は、ｏｓｔｅｒｉｘの誘発を通しての、ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＨＰＯ４による、ＢＭＰ−２／ＭＳＸ２が指示する骨芽細胞の分化プログラムの刺激を示す図である。
【図６】図６は、ＶＳＭＣミネラル化および遺伝子発現に対する、骨形成タンパク質特異的阻害剤ｎｏｇｇｉｎの効果を示す図である。
【図７】図７は、骨芽細胞様細胞によるリン刺激性のミネラル化に対する、ｏｓｔｅｒｉｘノックダウンの効果を示す図である。ｏｓｔｅｒｉｘに対するｓｉＲＮＡを発現するＳＡＯＳ細胞系を、実施例１１において記載されるように発生させた。パネルＡ．ｏｓｔｅｒｉｘに対するｍＲＮＡのレベルは、２つの個別の細胞系（ｏｓｘｓｉＲＮＡ＃１およびｏｓｘｓｉＲＮＡ＃２）において５０％超減少した。パネルＢ．ｏｓｔｅｒｉｘのタンパク質レベルは、ｏｓｘｓｉＲＮＡ＃１およびｏｓｘｓｉＲＮＡ＃２におけるウエスタン分析によって非常に減少した。ヒストンＨ３レベルは、ウエスタンブロット上でローディングコントロールとして測定された。パネルＣ〜Ｇ．高リン条件によって刺激された培養物のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（パネルＣ〜Ｅ）およびアリザリンレッド（パネルＦ、Ｇ）染色。パネルＣ．高リンミネラル化条件における、７日目の、スクランブルｓｉＲＮＡを発現する細胞を含有するウェルの周囲におけるミネラル化結節。パネルＤ．高リンミネラル化条件における、７日目の、スクランブルｓｉＲＮＡを発現する細胞を含有するウェルの中心におけるミネラル化結節。パネルＥ．高リンミネラル化条件における、７日目の、ｏｓｘｓｉＲＮＡ＃１を発現するウェルの周囲における、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色によって検出されるミネラル化の不在。パネルＦ．高リンミネラル化条件における、７日目の、スクランブルｓｉＲＮＡを発現する細胞を含有するウェルの周囲におけるアリザリンレッド染色結節。パネルＧ．高リンミネラル化条件における、７日目の、ｏｓｘｓｉＲＮＡ＃１を発現するウェルの周囲におけるアリザリンレッド染色によって検出されるミネラル化の不在。オレンジは、アリザリンレッドネガティブ染色におけるバックグラウンド染色である。パネルＨ．ｏｓｔｅｒｉｘに対するｓｉＲＮＡを発現する細胞系の培養物のマトリックスにおけるカルシウムレベル。
【図８】図８は、ｈＶＳＭＣにおける収縮性ＶＳＭＣマーカーの発現を示す図である。
【図９】図９は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定される、ＬＤＬＲ−／−高脂肪摂食マウスの様々なグループの大動脈における様々な石灰化関連性の遺伝子の発現を示す図である。
【図１０】図１０は、様々な骨形成タンパク質の間の相同性を示す図である。
【図１１】図１１は、ＡＶ吻合の略図である。側面の左外頸静脈に対する末端の左総頸動脈の端側吻合によるＡＶ瘻造設のマウスモデルの実際の写真（Ｂ）および模式図（Ａ）。ＡＶ瘻造設の３週間後の静脈吻合の１００ミクロンの断面図（Ｃ〜Ｆ）。バー＝１００μｍ。
【図１２】図１２は、吻合ＮＨ病変形成のＣＫＤ誘発に対するＢＭＰ−７投与の効果を示す図である。
【図１３−１】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−４】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−５】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−６】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−７】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−８】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−９】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１０】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１１】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１２】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１３】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１４】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１５】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１６】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１７】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１８】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−１９】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２０】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２１】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２２】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２３】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２４】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２５】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２６】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２７】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２８】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−２９】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３０】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３１】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３２】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３３】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３４】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３５】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３６】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３７】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３８】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−３９】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−４０】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−４１】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−４２】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−４３】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−４４】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【図１３−４５】図１３は、様々なモルフォゲンの配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書において記載される本発明が、十分に理解されるために、以下の詳細な説明が、記載される。
【００２３】
Ｉ．定義
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価な方法および物質を使用することができるが、適した方法および物質は、下記に記載される。物質、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。本明細書において言及される刊行物、特許、および他の文書はすべて、それらの全体が参照によって組み込まれる。
【００２４】
本明細書の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような語尾変化は、任意の他の整数または整数のグループの排除ではなく、述べられる整数または整数のグループの包含を暗示するように理解されるであろう。
【００２５】
ＯＰ／ＢＭＰモルフォゲン．本明細書において使用されるように、用語「ＯＰ／ＢＭＰモルフォゲン」、「ＢＭＰ」、「ＯＰ」、「モルフォゲン」、「骨モルフォゲンタンパク質」、および「骨形成タンパク質」は、区別なく使用され、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、ＯＰ−３、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９、および「モルフォゲン類似体」から成る群から選択される哺乳動物タンパク質のＣ末端の６または７個のシステインドメインを少なくとも含むポリペプチドまたはポリペプチドの機能的変異体を意味する。「モルフォゲン類似体」は、Ｃ末端の６または７個のシステイン骨格（互いのおよび互いの間でのならびに他のアミノ酸残基との空間的関係を保存する足場を形成するシステインを有する）を含み、システインではない、この骨格におけるアミノ酸の間で、それがその類似体であるモルフォゲンの７システインドメインのアミノ酸配列と少なくとも６５％またはより好ましくは７０％、７５％  ８０％、８５％、９０％、もしくは９５％のアミノ酸配列相同性または少なくとも５０％、より好ましくは５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、もしくはそれ以上の同一性を示すタンパク質として本明細書において定義される。モルフォゲン類似体は、完全長モルフォゲンと比較して、Ｎ末端で切断されてもよいまたは異なる種に由来する、対応するタンパク質であってもよい。モルフォゲン類似体は、人工的に調製されてもよい。モルフォゲン類似体は、翻訳後修飾を有していてもよいまたは非アミノ酸を組み込んでいてもよいまたはＤ−アミノ酸などのような非天然アミノ酸またはそれらが交換されたアミノ酸残基と実質的に類似するコンホメーションを有する多糖を含んでいてもよい。モルフォゲン類似体は、それがその類似体であるタンパク質と類似する生物学的活性を有していてもよい。そのような活性は、（ａ）Ｒｅｄｄｉ−Ｓａｍｐａｔｈ異所性骨アッセイ（ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ  １９８１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ７８巻：７５９９〜７６０３頁）もしくは実質的に等価なアッセイにおいて軟骨形成を誘発することができる活性、（ｂ）慢性腎不全の標準的な動物モデルにおいて腎機能の進行性の損失を有意に予防する、阻害する、遅延させる、もしくは緩和することができる活性、または（ｃ）慢性腎不全のもしくは慢性腎不全の危険性がある哺乳動物に投与した場合に、腎機能の標準的なマーカーにおいて臨床的に有意な改善を引き起こすことができる活性である。
【００２６】
本明細書において使用されるように、「ミネラル化骨形成タンパク質」または「ミネラル化ＢＭＰ」は、組織の骨芽細胞分化および石灰化を促進する、ＯＰ／ＢＭＰモルフォゲン（上記に定義される）のサブセットを指す。ミネラル化ＢＭＰの例は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４ならびにＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４の類似体である。
【００２７】
本明細書において使用されるように、「ミネラル化対抗ＢＭＰ」は、ミネラル化ＢＭＰの活性に対抗し、そのため、組織のミネラル化を妨害する、ＢＭＰ−７などのようなある種のＢＭＰを意味する。
【００２８】
本明細書において使用されるように、「アミノ酸配列相同性」または２つのアミノ酸配列の間の「相同性」パーセントは、アミノ酸配列同一性および保存された置換の両方を含むように本明細書において理解される。したがって、本明細書において使用されるように、２つのアミノ酸配列の間の「相同性」パーセントは、配列の間で同一であるまたは保存された置換であるアミノ酸残基の割合を示す。アミノ酸の「保存的置換」は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８年）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５巻（補足３）、３５４〜３５２頁、Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．における「許容される点突然変異（ａｃｃｅｐｔｅｄ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」について定義される基準を満たす。したがって、「保存的置換」は、類似するサイズ、形状、電荷、および／または共有結合もしくは水素結合またはその他同種のものを形成するための能力などのような化学的特性を有する対応する参照残基に物理的にまたは機能的に類似する残基である。好ましい保存的置換の例は、類似する特徴を有する他のアミノ酸に対するあるアミノ酸の置換、たとえば以下のグループ内の置換：（ａ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ；（ｂ）Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；（ｃ）Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；（ｄ）Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ；（ｅ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐを含む。最も好ましい実施形態において、保存的置換は、以下のグループ内の他のアミノ酸に対するあるアミノ酸の置換を含む：（ａ）グリシン、アラニン；（ｂ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｃ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｄ）アスパラギン、グルタミン；（ｅ）セリン、トレオニン；（ｆ）リジン、アルギニン、ヒスチジン；および（ｇ）フェニルアラニン、チロシン。Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８年）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５巻（補足３）、３５４〜３５２頁、Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．の図８４を参照されたい。用語「保存的置換」または「保存的変化」はまた、所与のポリペプチド鎖における非置換親アミノ酸の代わりに、置換アミノ酸の使用をも含む、但し、結果として生じる置換ポリペプチド鎖もまた、本発明において治療的効能を有することを条件とする。
【００２９】
本明細書において使用されるように、本発明の治療剤（モルフォゲン）は、「治療的効能」を有すると表現され、治療剤の量は、治療剤のその量の投与が、血管硬化症のまたはその危険性がある哺乳動物対象（たとえばヒト患者）に投与された場合に、心血管健康状態の標準的なマーカーにおける臨床的に有意な改善を引き起こすのに十分である場合に、「治療的に有効である」と表現される。血管硬化症のそのようなマーカーは、医学文献において周知であり、限定されることなく、心拍数、心臓のリズム、ならびに血管造影法、ストレステスト、心電図、心エコー図、コンピュータ断層撮影法、心臓スコアリング（ｈｅａｒｔｓｃｏｒｉｎｇ）、心石灰化スコアリング（ｃａｒｄｉａｃ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｉｎｇ）、カルシウムスコアリング、および心臓スキャニングなどのような試験の結果を含む。
【００３０】
本明細書において使用される語句「治療有効量」は、動物における細胞の少なくとも１つのサブ集団においていくらかの望ましい治療効果をもたらすのに有効であり、それによって、任意の医療に適用可能である適切なベネフィット／リスク比で、治療細胞におけるその経路の生物学的転帰をブロックする、本発明の化合物を含む化合物、物質、または組成物の量を意味する。
【００３１】
語句「薬学的に許容可能な」は、安全な医学的判断（ｓｏｕｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｊｕｄｇｍｅｎｔ）の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織に接触する使用に適しており、適切なベネフィット／リスク比に相応しいそれらの化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すように本明細書において用いられる。
【００３２】
本明細書において使用される語句「薬学的に許容可能なキャリヤー」は、ある器官または身体の部分から他の器官または身体の部分に主題の化合物を運搬するまたは輸送するのに関与する、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶剤、またはカプセル化物質などのような、薬学的に許容可能な物質、組成物、または媒体を意味する。それぞれのキャリヤーは、製剤の他の成分と適合性であり、患者にとって傷害性でないという意味において、「許容可能で」なければならない。薬学的に許容可能なキャリヤーとして役立ち得る物質のいくつかの例は、（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどのような糖；（２）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのようなデンプン；（３）セルロースならびにカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのようなその誘導体；（４）粉末トラガント；（５）バクガ；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオバターおよび坐薬ワックスなどのような賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などのような油；（１０）プロピレングリコールなどのようなグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのようなポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのようなエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどのような緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；ならびに（２１）医薬製剤において用いられる他の無毒性の適合性物質を含む。
【００３３】
本明細書において使用されるように、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象における、記載される状態、疾患、または障害と関連する、１つまたは複数の症状の重症度を緩和するまたは和らげることを指す。しかしながら、治療するまたは治療することという用語は、対象の健康をその状態の前の状況（ｓｔａｔｅ）に回復させるのに１００％有効である完全な治癒または治療のプロセスを意味するものでも、その他の様式で必要とするものでもない。
【００３４】
本明細書において使用されるように、「予防する」または「予防」は、対象（細胞、組織、器官、もしくは生物など）において、ある状態を発病する可能性／危険性を低下させること、または対象において、ある状態の発症を遅延させること、または対象において発病し得る状態の１つもしくは複数の症状の重症度を和らげることまたはその任意の組合せを意味する。
【００３５】
本明細書において使用されるように、「対象」は、動物を指す。いくつかの実施形態において、動物は、ヒト、ウシ、およびげっ歯動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物である。好ましい実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００３６】
本明細書において使用されるように、一般に腎疾患に関して、より具体的に尿円柱、測定ＧＦＲ、または腎機能の他のマーカーなどのような臨床的指標に関して、これらのそれぞれは、下記に記載され、「慢性」は、少なくとも３か月、より好ましくは少なくとも６か月の期間の間、持続することを意味する。したがって、たとえば、慢性的に５０％未満のＧＦＲｅｘｐの測定ＧＦＲを有する対象は、ＧＦＲが、少なくとも３か月、より好ましくは少なくとも６か月隔てられた少なくとも２回の測定において、測定され、５０％未満のＧＦＲｅｘｐであることが分かり、ＧＦＲが、介入期間の間に実質的に（たとえば１０％）高くなったと考える、医学的に安全な理由がない対象である。
【００３７】
本明細書において使用されるように、対象は、診断試験が、治療する医師の見解に立って、承認される健康レベルを超える血管石灰化の存在を示す場合、血管硬化症を有すると表現される。対象は、対象が、腎臓病、肥満症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、および骨粗鬆症を含む、血管石灰化についての１つまたは複数の危険因子の存在により、血管硬化症を発病することが合理的に予想される場合、「血管硬化症を発病する危険性がある」と表現される。血管硬化症の存在または危険性は、関連する医学的または獣医学的技術における熟練者によってルーチン的になされてもよい決定である。対象は、彼または彼女が、慢性腎不全、末期腎臓病、慢性糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、遺伝性腎炎、および／または腎異形成の症状を示す場合；対象が、糸球体肥大、尿細管肥大、慢性糸球体硬化症、および／または慢性尿細管間質性硬化症を示す生検材料を有する場合；対象が、腎線維症を示す超音波、ＮＭＲ、ＣＡＴスキャン、または他の非侵襲性検査を有する場合；対象が、尿沈渣中に存在する、異常な数の大きな円柱を有する場合；対象が、慢性的に、対象についての約５０％未満、より特に約４０％、３０％、もしくは２０％未満の予想ＧＦＲの寒天を有する場合；ヒト男性対象が、少なくとも約５０ｋｇの体重であり、慢性的に、約５０ｍｌ／分未満、より特に約４０ｍｌ／分、３０ｍｌ／分、または２０ｍｌ／分未満のＧＦＲを有する場合；ヒト女性対象が、少なくとも約４０ｋｇの体重であり、慢性的に、約４０ｍｌ／分未満、より特に約３０ｍｌ／分、２０ｍｌ／分、または１０ｍｌ／分未満のＧＦＲを有する場合；対象が、健康な対象、そうでなければ類似する対象が有する機能的なネフロン単位の数の約５０％未満、より特に約４０％、３０％、または２０％未満の機能的なネフロン単位の数を有する場合；たった１つの腎臓を有する対象の場合；ならびに腎臓移植レシピエントである対象の場合、腎臓病に罹患していると見なされてもよい。
【００３８】
ＩＩ．概要
血管硬化症、すなわち血管の硬化は、複数の関連する心血管傷害および不全に至る。血管硬化症は、それ自体、慢性腎疾患（ＣＫＤ）などのような腎臓病、アテローム性動脈硬化症、代謝性疾患、メタボリックシンドローム、肥満症、骨粗鬆症、高血圧症、ＩＩ型糖尿病などを含む多くの疾患において発症する可能性がある。ＣＤＫは、複雑な多臓器機能不全である。それは、心血管事象による高い死亡率と関連する。
【００３９】
高リン酸血症および血管石灰化（ＶＣ）または血管ミネラル化（これらの２つの用語は、本明細書において区別なく使用される）は、ＣＫＤにおける心血管危険因子である。アテローム性動脈硬化症および２型糖尿病の動物モデルにおいて、ＣＫＤは、高リン酸血症およびＶＣを刺激することが実証された。さらに、高リン酸血症は、このモデルを使用して実証されるように、ＶＣに直接関連づけられることおよびＢＭＰ−７または腸管のリン結合は、このモデルにおいて、高リン酸血症を直し、慢性のＶＣを減少させたことが本明細書において開示される。
【００４０】
本発明は、血管硬化症を治療するためのまたは予防するための組成物および方法に関する。一態様において、本発明は、対象におけるＣＫＤが伴うまたはＣＫＤによって誘発される血管硬化症の予防治療および治療処置に関する。他の態様において、本発明は、ＣＫＤが伴うまたはＣＫＤによって誘発される、対象における血管硬化症を低下させるまたはコントロールすることに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を治療するための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を治療するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、またはＯＰ−２（ＢＭＰ−８）と接触させるステップを含む方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を治療するための方法であって、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、血管硬化症を治療するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を予防するための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から成る群から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を予防するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、またはＯＰ−２（ＢＭＰ−８）と接触させるステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。他の実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を予防するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を低下させるまたはコントロールするための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から成る群から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を低下させるまたはコントロールするための方法であって、血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、またはＯＰ−２（ＢＭＰ−８）と接触させるステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。他の実施形態において、本発明は、対象における血管硬化症を治療するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。他の実施形態において、血管硬化症は、ＣＫＤを伴うまたはＣＫＤによって誘発される。
【００４４】
本発明の他の態様は、対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるためのものである。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を治療するための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を治療するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）から選択されるモルフォゲンと接触させるステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。他の実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を治療するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、吻合と関連する。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、ＣＫＤを伴うまたはＣＫＤによって誘発される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を予防するための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を予防するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）から選択されるモルフォゲンと接触させるステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。他の実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を予防するための方法であって、血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、吻合と関連する。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、ＣＫＤを伴うまたはＣＫＤによって誘発される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を低下させるための方法であって、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、およびそれらの変異体から選択されるモルフォゲンを上述の対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を低下させるための方法であって、血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）から選択されるモルフォゲンと接触させるステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。他の実施形態において、本発明は、対象における新生内膜過形成を低下させるための方法であって、血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、吻合と関連する。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、慢性腎疾患によって誘発される。
【００４７】
本発明はまた、血管平滑筋細胞の分化を誘発するための組成物および方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、血管平滑筋細胞分化を誘発するための方法であって、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞を、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）から成る群から選択されるモルフォゲンと接触させるステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、モルフォゲンは、ＢＭＰ−７である。いくつかの実施形態において、本発明は、血管平滑筋細胞分化を誘発するための方法であって、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞を、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストと接触させるステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。いくつかの実施形態において、血管平滑筋細胞の脱分化は、ＣＫＤ伴うまたはＣＫＤによって誘発される。
【００４８】
本発明はまた、血管石灰化（ＶＣ）の予防および治療にも関する。一態様において、本発明は、ＣＫＤを伴うまたはＣＫＤによって誘発される血管石灰化の予防治療および治療処置に関する。上記に記載されるＣＫＤ刺激性ＶＣの動物モデルにおいて、マトリックスミネラル化は、培地のリンが、ＢＭＰ−２の存在下において増加し、ＲＵＮＸ２が、骨芽細胞の転写を指示した場合に観察された。インビトロにおけるこのリン刺激性のミネラル化は、第２の重大な骨芽細胞転写因子であるｏｓｔｅｒｉｘの阻害によっておよびＢＭＰ−２アンタゴニストであるｎｏｇｇｉｎによるＢＭＰ−２作用の阻害によって静められた。
【００４９】
したがって、本発明の一態様は、ミネラル化を促進するＢＭＰを阻害することによって、マトリックスミネラル化を低下させること、コントロールすること、および予防することに関する。本発明の他の態様は、ｏｓｔｅｒｉｘを阻害することによってマトリックスミネラル化を低下させること、コントロールすること、および予防することである。一実施形態において、本発明は、ＢＭＰアンタゴニストであるｎｏｇｇｉｎによってＢＭＰ−２作用を阻害することによってマトリックスミネラル化を低下させること、コントロールすること、および予防することに関する。他の実施形態において、ＢＭＰ−２作用は、他のＢＭＰ、たとえばＢＭＰ−７が対抗する。
【００５０】
インビボにおいて、ＣＫＤは、高リン酸血症をもたらし、大動脈ｏｓｔｅｒｉｘ発現を刺激した。ホスフェート結合剤またはＢＭＰ−７を用いた高リン酸血症のコントロールは、ｏｓｔｅｒｉｘ発現および大動脈ミネラル化を減少させた。
【００５１】
したがって、本発明の他の態様は、高リン酸血症をコントロールすることによって、血管ミネラル化を低下させること、コントロールすること、および予防することに関する。本発明の一実施形態は、その必要性のある対象において、高リン酸血症を低下させる、コントロールする、および予防するための方法であって、ホスフェート結合剤を投与し、それによって血清リン含有量を低下させるステップ含む方法を提供する。他の実施形態において、ＢＭＰ−７は、高リン酸血症を低下させる、コントロールする、または予防するために投与される。本発明の一実施形態は、高リン酸血症をコントロールすることによって、血管ミネラル化を低下させる、コントロールする、および予防するための方法である。本発明の他の実施形態は、ｏｓｔｅｒｉｘ発現を低下させるための方法であって、ホスフェート結合剤またはＢＭＰ−７を投与するステップを含む方法である。
【００５２】
アテローム硬化性大動脈から単離されたヒト大動脈平滑筋細胞培養物は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４が、骨芽細胞の遺伝子転写プログラムを活性化したことを実証した（Ｌｅｃａｎｄａ，  Ｆ．ら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７巻：３８６〜３９８頁、１９９７年）２３。リンは、インビトロにおいて、骨形成に類似した、これらの培養物の細胞外マトリックスのミネラル化を刺激した。ミネラル化は、高リンの存在下において、ＢＭＰアンタゴニストであるｎｏｇｇｉｎによってブロックされた。リンは、骨芽細胞特異的転写因子であるｏｓｔｅｒｉｘの発現の増加を通して、骨芽細胞ミネラル化プログラムの決定的な刺激を増加させた（Ｎａｋａｓｈｉｍａ，  Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ  １０８巻：１７〜２９頁、２００２年；Ｌｅｅ，  Ｍ．−Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ３０９巻：６８９〜６９４頁、２００３年）２４；２５。ミネラル化の阻害は、高培地ホスフェートの存在下において、ｏｓｔｅｒｉｘ発現を減少させることによってもたらされた。インビトロにおけるデータは、高リンシグナルを刺激することによって、部分的に、ＣＫＤによるインビボにおけるデータと完全に一致した。高脂肪摂食アテローム硬化性ＬＤＬＲ−／−マウスは、ＢＭＰ−４およびＲＵＮＸ２を発現し、いくらかの低レベルの大動脈ミネラル化を有した。ＣＫＤは、高リン酸血症、ｏｓｔｅｒｉｘ発現、および大動脈ミネラル化を刺激した。ミネラル化は、高リン酸血症の治療によってまたはｏｓｔｅｒｉｘ発現のサイレンシングと関連するＢＭＰ−７（これはまた高リン酸血症を直した）を用いると、部分的に可逆的なものとなった。
【００５３】
本発明は、対象における血管硬化症を治療するまたは予防するための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態において、血管硬化症を治療するまたは予防するための医薬組成物は、ＢＭＰ−７を含む。本発明はまた、対象における血管硬化症を治療するまたは予防するための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物に関する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。いくつかの実施形態において、血管硬化症は慢性腎疾患を伴うまたは慢性腎疾患によって誘発される。
【００５４】
本発明は、対象における新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態において、新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための医薬組成物は、ＢＭＰ−７を含む。本発明はまた、新生内膜過形成を治療する、予防する、または低下させるための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物にも関する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、吻合と関連する。いくつかの実施形態において、新生内膜過形成は、慢性腎疾患を伴うまたは慢性腎疾患によって誘発される。
【００５５】
本発明はまた、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞の分化を誘発するための、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）から選択されるモルフォゲンを含む医薬組成物にも関する。好ましい実施形態において、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞の分化を誘発するための医薬組成物は、ＢＭＰ−７を含む。本発明はまた、血管平滑筋前駆細胞または未分化もしくは脱分化血管平滑筋細胞の分化の誘発のための、ミネラル化ＢＭＰのアンタゴニストを含む医薬組成物にも関する。ある実施形態において、ミネラル化ＢＭＰは、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。いくつかの実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ｎｏｇｇｉｎである。他の実施形態において、ミネラル化ＢＭＰアンタゴニストは、ミネラル化対抗ＢＭＰである。ある実施形態において、血管平滑筋細胞の脱分化は、ＣＫＤを伴うまたはＣＫＤによって誘発される。
【００５６】
本発明は、高リン酸血症、したがって血管石灰化の治療のための、リン結合剤を含む医薬組成物に関する。本発明は、さらに、血管石灰化の治療のための、ＢＭＰ阻害剤を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、血管石灰化の治療のための、ＢＭＰ−７を含む医薬組成物にも関する。
【００５７】
ＩＩＩ．基本的な腎臓機能およびそれらの指標
ＢＵＮおよびクレアチニン．尿素として公知の血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒ）の血液中の濃度（血液レベル）は、日常検査室試験によって測定することができる。ＢＵＮおよびクレアチニンのレベルは、腎臓の全般的な機能を示す。ＢＵＮは、肉、鶏肉、およびある種の野菜などのようなタンパク質に富んだ食物の代謝副産物である。ＢＵＮは、腎臓によって血液から濾過され、尿中に排泄される。クレアチニンは、筋肉内の正常な細胞代謝によって絶えず生成される。クレアチニンもまた、腎臓によって血液から濾過され、尿中に排泄される。
【００５８】
血液中のＢＵＮおよびクレアチニンの量は、腎臓によって排泄される量に等しい。ＢＵＮおよびＣｒの血液レベルは、腎（つまり腎臓）機能の急激な悪化がなければ、変わらない。腎臓が、急激に、機能することができなくなると、ＢＵＮおよびＣｒは、日ごとに増加する。この状態は、急性腎不全として公知である。慢性腎不全は、長期間にわたるＢＵＮおよびＣｒの漸進的な増加によって区別される状態である。
【００５９】
腎臓機能の測定．腎機能が低下すると、腎臓が血液を効率的に浄化することができないので、ＣｒおよびＢＵＮの血液レベルは増加する。腎臓に関係しない因子もまた、ＢＵＮおよびＣｒのレベルに影響を与える。クレアチニンは、特に、年齢、性別、体重、および筋量が影響する。
【００６０】
腎機能は、両方の腎臓が血液を浄化することができる速度を評価するために測定される。腎機能を測定するために、２４時間の尿試料を収集しなければならない。２４時間の試料が完全である（つまり尿が欠けていない）ことが重要であり、その結果、真の腎機能は、過小評価されないであろう。
【００６１】
尿試料中のＣｒの量は、Ｃｒの血液レベルと比較される。この数値は、両方の腎臓が血液を浄化する速度であるクレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）として公知である。正常なＣｒＣｌは、毎分約９０〜１３０ミリリットル（ｍＬ／分）である。多くの人々は、年を取るとともに、漸進的に腎機能を失う。代替の腎機能測定は、年齢、体重、性別、および血液クレアチニンを考慮に入れる表または式に依存する。
【００６２】
アメリカ合衆国におけるいくつかの医療施設は、腎機能を評価するためにＧｌｏｆｉｌ−１２５アッセイを提案している。イオタラム酸ナトリウムＩ−１２５（放射性医薬品）は、皮膚に注射され、血液および尿の試料は、腎機能を測定するために得られる。この試験は、実行するのが容易であり、血液クレアチニン測定よりも感度がよく、２〜３時間以内に結果を提供する。腎機能の測定は、腎臓機能障害の重症度を決定する。治療を伴う悪化または改善の速度を立証するためにある期間にわたって腎機能をモニターすることは重要である。
【００６３】
糸球体濾過速度（ＧＦＲ）．「糸球体濾過速度」または「ＧＦＲ」は、血清タンパク質が結合せず、糸球体を横切って大量に濾過され、かつ腎尿細管によって分泌も再吸収もされない血漿媒介性の物質の尿へのクリアランスの速度に比例する。したがって、本明細書において使用されるように、ＧＦＲは、以下の等式によって好ましくは規定される。
【００６４】
ＧＦＲ＝Ｕｃｏｎｃ×Ｖ／Ｐｃｏｎｃ
ここで、Ｕｃｏｎｃは、マーカーの尿濃度であり、Ｐｃｏｎｃは、マーカーの血漿濃度であり、Ｖは、ｍｌ／分の尿の流速である。任意選択で、ＧＦＲは、体表面積について補正される。したがって、本明細書において使用されるＧＦＲ値は、ｍｌ／分／１．７３ｍ２の単位であると見なされてもよい。
【００６５】
ＧＦＲの好ましい尺度は、イヌリンのクリアランスであるが、この物質の濃度を測定するのが困難なために、クレアチニンのクリアランスが、臨床設定において典型的に使用される。たとえば、平均サイズ、健康なヒト男性（７０ｋｇ、２０〜４０歳）について、クレアチニンクリアランスによって測定される典型的なＧＦＲは、約１２５ｍｌ／分であることが予想され、クレアチニンの血漿濃度は、０．７〜１．５ｍｇ／ｄＬである。相当する平均的なサイズの女性について、クレアチニンクリアランスによって測定される典型的なＧＦＲは、約１１５ｍｌ／分であることが予想され、クレアチニンレベルは、０．５〜１．３ｍｇ／ｄＬである。良好な健康状態の場合、ヒトＧＦＲ値は、ＧＦＲが典型的に年齢と共に低下し始める約４０歳まで比較的安定している。８５〜９０歳まで生存する対象については、ＧＦＲは、４０歳時に相当する値の５０％まで低下する可能性がある。
【００６６】
予想糸球体濾過速度（ＧＦＲｅｘｐ）．「予想ＧＦＲ」または「ＧＦＲｅｘｐ」の推定は、対象の年齢、体重、性別、体表面積、および筋組織の程度ならびに血液試験によって測定されるいくつかのマーカー化合物（たとえばクレアチニン）の血漿濃度の考察に基づいて提供されてもよい。したがって、例として、予想ＧＦＲまたはＧＦＲｅｘｐは、以下のように推定されてもよい。
【００６７】
ＧＦＲｅｘｐ＝（１４０−年齢）×体重（ｋｇ）／［７２×Ｐｃｏｎｃ（ｍｇ／ｄｌ）］
この推定は、表面積、筋組織の程度、または体脂肪の割合のような因子を考慮に入れない。それにもかかわらず、マーカーとして血漿クレアチニンレベルを使用して、この式は、ＧＦＲを推定するための低費用の手段としてヒト男性に用いられてきた。クレアチニンが、横紋筋によって産生されるので、ヒト女性対象の予想ＧＦＲまたはＧＦＲｅｘｐは、筋量における予想される差異の理由を説明するために０．８５を掛けた同じ等式によって推定される。（Ｌｅｍａｎｎら（１９９０年）Ａｍ．  Ｊ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．  １６巻（３号）：２３６頁を参照されたい）。
【００６８】
大きな円柱．形成されたエレメントの存在についての尿沈渣の顕微鏡検査は、尿分析における標準的な手順である。尿中に存在する可能性がある、形成されたエレメントの中に、典型的に遠位曲尿細管または集合尿細管の管腔の鋳型または「円柱」に相当する凝集した物質の円柱状の塊がある。健康なヒト対象において、そのような円柱は、典型的に、１５〜２５μｍの直径を有する。しかしながら、慢性腎不全を有する対象において、尿細管の肥大は、正常な円柱の直径の２〜６倍であり、多くの場合、均一な滑らかな外観を有する「大きな円柱」または「腎不全円柱」の存在をもたらす可能性がある。したがって、本明細書において使用されるように、「大きな円柱」は、ヒト円柱について正常の２〜６倍または約３０〜１５０μｍの直径を有する尿沈渣円柱を意味する。
【００６９】
ＩＶ．血管硬化症および石灰化
高脂肪食を摂食させたＬＤＬＲ−／−マウスにおける血管石灰化（ＶＣ）は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満症、およびアテロームにおいて、ＶＣの臨床的に関連するモデルとなることが示され（Ｔｏｗｌｅｒ，  Ｄ．Ａ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３巻：３０４２７〜３０４３４頁、１９９８年；Ｓｈａｏ，  Ｊ．Ｓ．らＪ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５巻：１２１０〜１２２０頁、２００５年）２６；２７、これは、ＣＫＤによる血管石灰化の刺激のモデルとなる（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年）１９。先の研究は、ＢＭＰ−７が、骨格の沈着の増加による、高リン酸血症のコントロールに至る骨形成の刺激を部分的に通しての、高脂肪食を摂食させたＣＫＤを有するＬＤＬＲ−／−マウスにおける大動脈石灰化の発症を予防したことを実証した（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年；Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年）１９；２０。慢性のＶＣの治療に対するＢＭＰ−７および高リン酸血症コントロールの作用を検査するために、本発明の発明者らは、「治療研究」の実験計画に取りかかった、ここで、療法は、先の予防研究が終了した時に始め、発明者らは、６週間、それを継続した。
【００７０】
Ａ．治療剤
本発明のモルフォゲンは、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリー内の骨原性タンパク質／骨形成タンパク質（ＯＰ／ＢＭＰ）ファミリーにおける天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質の機能的変異体および類似体である。
【００７１】
（ｉ）モルフォゲンのＯＰ／ＢＭＰファミリー
タンパク質の「ＯＰ／ＢＭＰファミリー」は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーとして公知の配列関連性のタンパク質の緩い進化的なグルーピング内で特異なサブグループを形成する。このタンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的な特徴を共有し、プロタンパク質から同様に処理され、カルボキシ末端の成熟タンパク質を産出する分泌ポリペプチドを含む。タンパク質のこのファミリーはまた、モルフォゲンとも呼ばれる。上記に述べられるように、本明細書において定義されるように、タンパク質は、それが、新しい器官特異的組織の形成に達する、細胞および分子の事象の発達的なカスケードを誘発する場合、モルフォゲンタンパク質である。
【００７２】
本発明について、「ＯＰ／ＢＭＰファミリー」は、少なくとも２つのグループにさらに分類することができ、定義の部において上記に記載されるように、一方は、「ミネラル化ＢＭＰ」ファミリーであり、他方は、「ミネラル化対抗ＢＭＰ」ファミリーである。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の実施に有用なモルフォゲンは、二量体タンパク質であり、このそれぞれのポリペプチド成分は、少なくとも、ヒトＢＭＰタンパク質の保存されたＣ末端の６または７個のシステイン骨格に相当するまたは機能的に等価である配列を有する。ミネラル化対抗ＢＭＰについては、好ましい実施形態は、配列番号２に含まれるＢＭＰ−７（ＯＰ−１）および／またはこの領域においてＢＭＰ−７（ＯＰ−１）と７０％のアミノ酸配列相同性もしくは５０％の同一性を共有するその類似体を使用する。ミネラル化ＢＭＰの同定について、好ましい実施形態は、ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４またはその類似体である。モルフォゲンは、一般的に、モルフォゲンが許容的な環境において、以下を含む事象のカスケードを誘発する能力がある：前駆細胞の増殖の刺激；前駆細胞の分化の刺激；分化細胞の増殖の刺激；ならびに分化細胞の成長および維持の支持。適切な条件下で、モルフォゲンはまた、異常な分化を受けた細胞の再分化を誘発する能力もある。本発明において有用なモルフォゲンがどのように同定されたのかについての詳細およびモルフォゲン活性のためにそれらを作製し、使用し、かつ試験するための方法についての説明は、米国特許第５，０１１，６９１号および第５，２６６，６８３号ならびに国際特許出願公開ＷＯ  ９２／１５３２３；ＷＯ９３／０４６９２；およびＷＯ９４／０３２００を含む、多数の刊行物において開示されており、これらのそれぞれは、本明細書において参照によって組み込まれる。そこに開示されるように、モルフォゲンは、天然源の物質から精製することができるまたはそこに開示される遺伝子配列を使用して、原核生物または真核生物の宿主細胞から組換えで生産することができる。その代わりに、新規なモルフォゲン配列は、そこに開示される手順に従って同定することができる。
【００７４】
天然に存在するモルフォゲンは、それらのＣ末端配列において実質的なアミノ酸配列相同性を共有する（この領域における保存システインについての「６または７個のシステイン骨格」配列と呼ばれる領域）。典型的に、天然に存在するモルフォゲンは、切断されて、生物学的に活性なＣ末端骨格配列を含む成熟ポリペプチドを産出する「プロ」ドメインが続く、典型的に長さが約３５未満の残基のＮ末端シグナルペプチド配列を有する前駆体として翻訳される。シグナルペプチドは、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４巻：４６８３〜４６９１頁（１９８６年）の方法を使用して所与の配列において予測することができる切断部位で、翻訳に際して速やかに切断される。「プロ」ドメインは、配列および長さの両方においての不定であり、約２００〜４００超の残基まで及ぶ。プロドメインは、切断されて、約１１５〜１８０残基の「成熟」Ｃ末端ドメインを産出し、これは、９７〜１０６残基の保存された６または７個のシステインＣ末端ドメインを含む。プロポリペプチドは、典型的に、完全に処理された成熟Ｃ末端ポリペプチドよりも約３倍大きい。本来の条件下で、タンパク質は、成熟二量体として分泌され、切断されたプロポリペプチドは、それと結合したままであり、タンパク質複合体を形成し、おそらく、成熟二量体タンパク質の可溶性を改善すると考えられる。モルフォゲンの複合体形成形態は、生理的条件下で、成熟形態よりも可溶性であることが一般的に観察される。
【００７５】
本明細書において使用されるように、ＯＰ／ＢＭＰファミリーメンバーの「プロ形態」は、ポリペプチドのフォールドされたペアを含むタンパク質を指し、それぞれ、ＯＰ／ＢＭＰポリペプチドの成熟ドメインと共有結合または非共有結合したプロドメインを含む。プロ形態は、培養哺乳動物細胞から分泌される一次形態であるように思われる。タンパク質の「成熟形態」は、プロドメインと共有結合も非共有結合もしていない成熟Ｃ末端ドメインを指す。ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）の任意の調製物は、調製物におけるプロドメインの量が、「成熟」Ｃ末端ドメインの量のわずか５％である場合、成熟形態を含有すると考えられる。
【００７６】
その成熟した本来の形態の、自然源のモルフォゲンタンパク質は、典型的に、グリコシル化二量体であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように約３０〜３６ｋＤａの見かけ上の分子量を有する。還元されると、３０ｋＤａタンパク質は、約１６ｋＤａおよび約１８ｋＤａの範囲の見かけ上の分子量を有する２つのグリコシル化ポリペプチドサブユニットを生じる。非グリコシル化二量体タンパク質は、これもまたモルフォゲン活性を有するが、典型的に、約２７ｋＤａの範囲の見かけ上の分子量を有する。還元されると、２７ｋＤａタンパク質は、典型的に約１４ｋＤａ〜約１６ｋＤａの範囲の分子量を有する２つの非グリコシル化ポリペプチドを生じる。
【００７７】
本明細書において有用なＯＰ／ＢＭＰファミリーメンバーは、天然源のものであるまたは生合成的に生産されるかどうかにかかわらず、その対立遺伝子同等物、系統発生的同等物、および他の変異体を含む公知の天然に存在する本来のタンパク質（たとえば「ムテイン」または「突然変異タンパク質」を含む）ならびにタンパク質のＯＰ／ＢＭＰファミリーの新しい活性なメンバーのうちのいずれかを含む。特に有用な配列は、哺乳動物のＣ末端の７個のシステインドメインを含み、すべてのシステインが保存されているもの、好ましくはヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ−５を含む。本発明の実施において有用な他のタンパク質は、様々な生物に由来するＶｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１；ＢＭＰ１３、ＢＭＰ１５、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、またはＮＥＵＲＡＬおよびその類似体の活性形態を含む。これらのタンパク質およびＢＭＰ−７の生物学的活性を有するポリペプチドのいずれか１つは、ミネラル化対抗ＢＭＰとして使用されてもよい。
【００７８】
好ましい一実施形態において、本発明のモルフォゲンは、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）である。特に好ましい実施形態において、ＢＭＰ−７は、可溶性形態をしている。好ましい実施形態において、本明細書において定義される二量体モルフォゲンタンパク質のポリペプチドサブユニットのそれぞれは、参照モルフォゲンのアミノ酸配列と規定される関係を共有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、好ましいモルフォゲンポリペプチド鎖は、モルフォゲン活性完全長ヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、配列番号３中に存在する配列と規定される関係を共有する。しかしながら、任意の１つまたは複数の、本明細書において開示される天然に存在するモルフォゲンタンパク質または生合成モルフォゲンタンパク質は、同様に、参照配列として使用することができる。好ましいモルフォゲンポリペプチド鎖は、少なくとも、ヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）のＣ末端の６個のシステイン骨格、配列番号３の残基３３５〜４３１（または配列番号１の残基４３〜１３９）と規定される関係を共有する。好ましくは、モルフォゲンタンパク質は、少なくとも、ヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）のＣ末端の７個のシステイン骨格、配列番号３の残基３３０〜４３１（または配列番号１の残基３８〜１３９）と規定される関係を共有する。
【００７９】
機能的に等価な配列は、これらのシステインの一次配置を改変するが、モルフォゲンの活性に必要となる可能性がある、そのような鎖内または鎖間ジスルフィド結合を形成するそれらの能力を含む、二量体モルフォゲンタンパク質のフォールド構造におけるそれらの関係を実質的に損なわない、アミノ酸挿入または欠失を含む、参照配列内に配置される、システイン残基の機能的に等価な配置を含む。機能的に等価な配列は、さらに、１つまたは複数のアミノ酸残基が、参照配列の対応する残基、たとえばヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）のＣ末端の７個システイン骨格と異なるものを含む、但し、この差異は、組織モルフォゲン活性を破壊しないことを条件とする。したがって、参照配列における対応するアミノ酸の保存的置換は、好ましい。
【００８０】
下記の表Ｉは、現在までに同定されたＯＰ／ＢＭＰファミリーの様々な天然に存在するメンバーを概説するものであり、本明細書において使用されるそれらの命名法、それらの配列表の参照、および配列表において含まれていない、完全長タンパク質についてのアミノ酸配列についての公開源を含む。表Ｉにおいて記載される一般名称のそれぞれは、下記に言及されるまた配列表において記載される、同定された配列をコードする核酸から発現される、治療的に有効なタンパク質またはその活性断片もしくは前駆体または天然に存在する変異体もしくは生合成変異体などのようなその機能的等価物を包含するように意図されるまたはそのように理解されるべきである。天然に存在する変異体は、単一の生物種の他の個体から単離される対立遺伝子変異形態および系統発生的に別個の生物学的種から単離される種変異体（相同性）を含む。これらのモルフォゲンは、ミネラル化ＢＭＰまたはミネラル化対抗ＢＭＰであってもよい。
【００８１】
【表１−１】
2014043461.tif 000002
【００８２】
【表１−２】
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【００８３】
【表１−３】
2014043461.tif 000004
ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）タンパク質は、このファミリーにおける他のタンパク質と共通して、保存システイン骨格に加えて、この領域において「さらなる」システイン残基を有する（たとえば配列番号２１および２３の残基４１を参照されたい）。ＧＤＦ−１タンパク質は、保存された骨格内に４個のアミノ酸挿入を有するが（配列番号１９を配列番号１３と比較）、この挿入は、おそらく、フォールド構造におけるシステインの関係に干渉しない。そのうえ、ＣＢＭＰ２タンパク質は、システイン骨格内に、１つのアミノ酸残基を欠いている。
【００８４】
モルフォゲンは、還元された場合、不活性であるが、本発明の他のモルフォゲンと組み合わせて酸化された場合、酸化ホモ二量体として活性となる（たとえばヘテロ二量体として）。したがって、本明細書において規定されるように、モルフォゲンは、ポリペプチド鎖のペアを含む二量体タンパク質であり、それぞれのポリペプチド鎖は、これらのシステインの機能的に等価な配置（たとえばフォールド構造において、配列におけるシステインの一次配置を改変するが、それらの関係を改変しないアミノ酸挿入または欠失）を含む、配列番号１の残基４３〜１３９によって規定されるＣ末端の６個のシステイン骨格を少なくとも含み、その結果、ポリペプチド鎖が、フォールドされる場合、ポリペプチド鎖のペアを含む二量体タンパク質種は、タンパク質が、本明細書において規定されるようにモルフォゲンとして作用することができるように適切な鎖内または鎖間ジスルフィド結合を含む、適切な３次元構造を有する。特に、モルフォゲンは、一般的に、モルフォゲンが許容的な環境において以下のすべての生物学的機能が可能である：前駆細胞の増殖の刺激；前駆細胞の分化の刺激；分化細胞の増殖の刺激；および形質転換細胞の「再分化」を含む、分化細胞の成長および維持の支持。そのうえ、これらのモルフォゲンは、適切な環境条件下で、コミット細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｃｅｌｌ）の再分化を誘発することができることもまた予期される。
【００８５】
以下の刊行物は、天然に存在するモルフォゲンおよび／または合成モルフォゲンの公開されたモルフォゲンポリペプチド配列ならびに関連する化学的特性および物理的特性を開示する：ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）：米国特許第５，０１１，６９１号および米国特許第５，２６６，６８３号、Ｏｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９巻：２０８５〜２０９３頁（１９９０年）；ＯＰ−３：ＷＯ９４／１０２０３（ＰＣＴ  ＵＳ９３／１０５２０）；ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、およびＢＭＰ−４：ＷＯ８８／００２０５、Ｗｏｚｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：１５２８〜１５３４頁（１９８８年）；ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６：Ｃｅｌｅｓｔｅら、ＰＮＡＳ  ８７巻：９８４３〜９８４７頁（１９９１年）；Ｖｇｒ１：Ｌｙｏｎｓら、ＰＮＡＳ  ８６巻：４５５４〜４５５８頁（１９８９年）；ＤＰＰ：Ｐａｄｇｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２５巻：８１〜８４頁（１９８７年）；Ｖｇ−１：Ｗｅｅｋｓ  Ｃｅｌｌ  ５１巻：８６１〜８６７頁（１９８７年）；ＢＭＰ−９：ＷＯ９５／３３８３０（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７０８４）；ＢＭＰ−１０：ＷＯ９４／２６８９３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９０）；ＢＭＰ−１１：ＷＯ９４／２６８９２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２８８）；ＢＭＰ−１２：ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＢＭＰ−１３：ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＧＤＦ−１：ＷＯ９２／００３８２（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０９６）およびＬｅｅら、ＰＮＡＳ  ８８巻：４２５０〜４２５４頁（１９９１年）；ＧＤＦ−８：ＷＯ９４／２１６８１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３０１９）；ＧＤＦ−９：ＷＯ９４／１５９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６８５）；ＧＤＦ−１０：ＷＯ９５／１０５３９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４４０）；ＧＤＦ−１１：ＷＯ９６／０１８４５（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５４３）；ＢＭＰ−１５：ＷＯ９６／３６７１０（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６５４０）；ＭＰ１２１：ＷＯ９６／０１３１６（ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２５５２）；ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１、ＭＰ５２）：ＷＯ９４／１５９４９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６５７）およびＷＯ９６／１４３３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２８１４）およびＷＯ９３／１６０９９（ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０）；ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２、ＢＭＰ−１３）：ＷＯ９５／０１８０１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７６２）およびＷＯ９６／１４３３５およびＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２）：ＷＯ９５／１０８０２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７９９）およびＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）。他の実施形態において、有用なタンパク質は、新規な生合成モルフォゲンタンパク質および２つまたはそれ以上の公知のモルフォゲンに由来する配列を使用して設計されるキメラタンパク質を含む、生物学的に活性な生合成構築物を含む。米国特許第５，０１１，６９１号において開示される生合成構築物もまた参照されたい（たとえばＣＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、およびＣＢＭＰ−７（ＯＰ−１）６）。モルフォゲ���および他の関連するタンパク質を記載する、すべての引用される参考文献の開示は、参考文献によって本明細書において組み込まれる。
【００８６】
ある好ましい実施形態において、有用なモルフォゲンタンパク質は、アミノ酸配列が、少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性（同一性または保存置換）、好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を、本明細書において挙げられる例示的な天然に存在するモルフォゲンタンパク質から選択される参照モルフォゲンタンパク質と共有する配列を含むものを含む。好ましくは、ミネラル化対抗ＢＭＰについての参照タンパク質は、ヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）であり、その参照配列は、ヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、配列番号３の残基３３０〜４３１（または配列番号１の残基３８〜１３９）の骨原性活性形態中に存在するＣ末端の７個のシステイン骨格である。有用なモルフォゲンタンパク質は、したがって、天然に存在するまたは生合成的に生産されるかどうかにかかわらず、好ましい参照配列の対立遺伝子同等物、系統発生的同等物、および他の変異体（たとえば「ムテイン」または「突然変異タンパク質」を含む）ならびに上記に記載され、同定されるものを含む、タンパク質の一般的なモルフォゲンのファミリーの新規なメンバーを含む。ある種の特に好ましいモルフォゲンポリペプチドは、ヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）の好ましい参照配列または上記に記載される他のモルフォゲンのうちのいずれかと、少なくとも５０％のアミノ酸同一性を共有する。より好ましくは、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上のアミノ酸同一性をそれと共有する。
【００８７】
図１０は、参照配列としてＢＭＰ−７（ＯＰ−１）を使用する、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの様々な代表的なメンバーのＣ末端の７個のシステイン骨格内のアミノ酸配列相同性パーセントおよび同一性パーセントを記載する。図において記載される相同性パーセントは、ＭｅｇａＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して配列をアライメントすることによって決定される。参照モルフォゲン配列（ｈＢＭＰ−７（ＯＰ−１）のＣ末端の生物学的に活性な７個のシステイン骨格）からの挿入および欠失は、計算の目的のために無視される（詳細は下記を参照されたい）。
【００８８】
他の好ましい実施形態において、本発明において有用なモルフォゲンポリペプチドのファミリーおよびそのメンバーは、上位のアミノ酸配列によって規定される。
【００８９】
ミネラル化を抑制するための本発明におけるモルフォゲンとしての使用のための特に有用な配列は、Ｃ末端ドメイン、たとえばＶｇｌ、Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−５のＣ末端９６〜１０２アミノ酸残基（下記の表ＩＩおよび配列番号１〜１３を参照されたい）ならびに６０Ａ、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ６のＣ末端ドメインを含むタンパク質（配列番号１２、１４〜１６を参照されたい）を含み、これらのすべては、保存された６または７個のシステイン骨格を少なくとも含む。そのうえ、米国特許第５，０１１，６９１号において開示されるＣＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、３〜５、７、１６などのような上位の配列から設計される生合成構築物もまた有用である。他の配列は、インヒビン／アクチビンタンパク質を含む（たとえば米国特許第４，９６８，５９０号および第５，０１１，６９１号を参照されたい）。したがって、他の有用な配列は、上記の配列のうちのいずれかと少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性または５０％の同一性、好ましくは８０％の相同性または７０％の同一性を共有するものである。これらは、対立遺伝子変異体および種変異体および突然変異体ならびに生合成ムテインならびにタンパク質のこのモルフォゲンファミリーの新規なメンバーを含むことが予期される。特に、関連するタンパク質のファミリーにおいて、モルフォゲン活性を呈するタンパク質が想定され、好ましい配列からのアミノ酸変化は、保存的変化を含む。保存アミノ酸変化に関する情報は、当技術分野において周知である。たとえば、Ｄａｙｈｏｆｆらは、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；５巻、補足３、３４５〜３６２頁（Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ編、Ｎａｔ’ｌ
ＢｉｏＭｅｄ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｄｎ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  １９７８年）において、進化的保存タンパク質の間のある種のアミノ酸置換が、偶然が可能にするよりも、予想頻度よりも高い頻度で生じることを記載した。したがって、保存アミノ酸置換は、図８４に従って決定することができる（前掲）。本明細書において使用されるように、可能性として有用な配列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（（１９７０年）  Ｊ．
Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３〜４５３頁）の方法を使用して、公知のモルフォゲン配列とアライメントされ、同一性は、ＭｅｇａＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）によって計算される。
【００９０】
下記に記載される表ＩＩは、ヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）（ｈＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、配列番号１〜３）、マウスＢＭＰ−７（ＯＰ−１）（ｍＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、配列番号４および１９）、ヒトおよびマウスＯＰ−２（ＢＭＰ−８）（配列番号５、６、２１、および２３）、ＣＢＭＰ２Ａ（配列番号１０）、ＣＢＭＰ２Ｂ（配列番号１１）、ＢＭＰ３（配列番号１２）、ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａに由来、配列番号７）、Ｖｇｌ（Ｘｅｎｏｐｕｓ、配列番号８に由来）、Ｖｇｒ−１（マウスに由来、配列番号９）、ＧＤＦ−１（マウスに由来、配列番号１３）、６０Ａタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａに由来、配列番号１４）、ＢＭＰ５（配列番号１５）、ならびにＢＭＰ６（配列番号１６）を含む、モルフォゲンとして同定された本来のタンパク質の活性領域のアミノ酸配列を比較する。配列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３〜４５３頁の方法に従って本質的にアライメントされ、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して計算される。表において、３個のドットは、その位置におけるアミノ酸が、ｈＢＭＰ−７（ＯＰ−１）におけるアミノ酸と同じであることを示す。３個のダッシュは、アミノ酸が、その位置に存在せず、相同性を説明する目的のために含まれることを示す。たとえば、ＣＢＭＰ−２ＡおよびＣＢＭＰ−２Ｂのアミノ酸残基６０は、「欠けている」。
【００９１】
【表２−１】
2014043461.tif 000005
【００９２】
【表２−２】
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【００９３】
【表２−３】
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【００９４】
【表２−４】
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【００９５】
【表２−５】
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先のアミノ酸配列比較から明白なように、いくつかのアミノ酸変化は、モルフォゲン活性を保持しながら、上位の配列内でなされ得る。配列についての観察は、サブファミリーがこのファミリー内にあることを容易に明らかにする：ヒトおよびマウスＢＭＰ−７は、密接に関連づけられ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＶｇｒ−１と共に、１つのサブファミリーを形成する。ＣＢＭＰ−２ＡおよびＣＢＭＰ−２Ｂは、ＤＰＰと共に、他のサブファミリーを形成する。変化したアミノ酸残基は、生物学的活性にとって重大ではなく、アミノ酸残基は、交換可能であることが予想される。そのため、サブファミリーのすべてのメンバーを包含する配列を有する上位の配列は、それぞれのサブファミリーに対して容易に理解され得る、また上位の配列の範囲内の任意の配列は、同じまたは類似する活性を有することが予想される。
【００９６】
たとえば、ミネラル化対抗ＢＭＰ（マウスおよびヒトＢＭＰ−７）ならびに関連づけられる配列（ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＶＧＲ−１）を包含する上位の配列Ｎｏ．１（配列番号２４）は、以下のように記載することができる。
【００９７】
【化１】
2014043461.tif 000010
それぞれのＸａａは、以下のように規定される、１つまたは複数の指定されるアミノ酸の群から独立して選択される：「Ｒｅｓ．」は、「残基」を意味し；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１８のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＭｅｔ）；ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．６６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＴｒｐ）；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ）；およびｒｅｓ．９３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）。そのような上位の配列は、ＢＭＰ−７の活性を保存するすべての予想されるモルフォゲンを示す。他の上位の配列は、サブファミリー配列を使用し、交換可能なアミノ酸残基を考慮に入れて構築することができる。
【００９８】
上記に述べられるように、本発明において有用な、ある種の好ましいモルフォゲンポリペプチド配列は、５０％以上の同一性、好ましくは５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらに９９％以上の同一性を、ｈＢＭＰ−７（ＯＰ−１）の好ましい参照配列を規定するアミノ酸配列（とりわけ、ｈＢＭＰ−７（ＯＰ−１）の６〜７個の保存されたシステイン骨格、たとえば配列番号１の残基３８〜１３９）または本出願において記載される他のモルフォゲンに由来する等価な領域を有する。これらの特に好ましい配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ６０Ａタンパク質を含む、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）タンパク質およびＯＰ−２タンパク質の対立遺伝子同等物変異体および系統発生的同等物変異体ならびに密接に関連づけられるタンパク質ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、およびＶｇｒ−１を含む。したがって、ある特に好ましい実施形態において、有用なモルフォゲンタンパク質は、７個のシステイン骨格を規定し、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＯＰ−２（ＢＭＰ−８）のいくつかの同定された変異体の間の相同性を組み込む本明細書において「ＯＰＸ」（配列番号２５）と呼ばれる上位のアミノ酸配列内のポリペプチド鎖のペアを含む活性タンパク質を含む。したがって、ＯＰＸにおける所与の位置のそれぞれの「Ｘａａ」は、マウスまたはヒトＢＭＰ−７（ＯＰ−１）またはＯＰ−２（ＢＭＰ−８）のＣ末端配列において対応する位置に生じる残基から独立して選択される。特に、それぞれの「Ｘａａ」は、下記に規定される、１つまたは複数の指定されるアミノ酸の群から独立して選択される（配列番号２５）。
【００９９】
【化２】
2014043461.tif 000011
ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ．＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＣｙｓ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＡｓｎ）；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７３のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．９１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；およびｒｅｓ．９６のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＬｙｓ）。
【０１００】
以下の特許または刊行物または特許出願は、モルフォゲンまたは有用な／活性なモルフォゲンの式を開示し、これらの全内容は、本明細書において参照によって組み込まれる：欧州特許第６０１１０６号およびＵＳＳＮ０８／９３７，７５５（１９９７年９月２５日に提出）。
【０１０１】
本発明の方法、組成物、およびデバイスにおいて有用なモルフォゲンは、天然に存在する源から単離されるまたは組換えＤＮＡ技術もしくは他の合成技術によって生産されるかどうかにかかわらず、適切なサブファミリーにある、上記に記載されるポリペプチド鎖のうちのいずれかを含むタンパク質を含み、これらのタンパク質の対立遺伝子変異体および種変異体、その天然に存在する突然変異体または生合成突然変異体、ならびに様々な切断構築物および融合構築物を含む。欠失突然変異体または追加突然変異体もまた、活性であることが想定され、保存されたＣ末端のシステイン骨格を改変する可能性があるものを含む、但し、改変が、フォールド構造におけるこれらのシステインの関係を機能的に破壊しないことを条件とする。したがって、そのような活性形態は、本明細書において開示される、特に記載される構築物の等価物と考えられる。
【０１０２】
タンパク質は、多様なグリコシル化パターン、多様なＮ末端、アミノ酸配列相同性の領域を有する、関連づけられるタンパク質のファミリー、および宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって生産される、本来のタンパク質または生合成タンパク質の活性切断形態または活性突然変異形態を有する形態を含んでいてもよい。
【０１０３】
本明細書において企図されるモルフォゲンは、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において、完全もしくは切断ゲノムもしくはｃＤＮＡからまたは合成ＤＮＡから発現し、精製し、切断し、リフォールドし、二量体化して、モルフォゲン活性組成物を形成することができる。二量体タンパク質は、インビトロにおいて、培地から単離しかつ／またはリフォールドしかつ二量体化して、生物学的に活性な組成物を形成することができる。ヘテロ二量体は、個別の別個のポリペプチド鎖を組み合わせることによってインビトロにおいて形成することができる。その代わりに、ヘテロ二量体は、個別の別個のポリペプチド鎖をコードする核酸を同時発現することによって、単一の細胞において形成することができる。いくつかの例示的な組換えヘテロ二量体タンパク質生産プロトコールについて、たとえばＷＯ９３／０９２２９または米国特許第５，４１１，９４１号を参照されたい。現在、好ましい宿主細胞は、限定を伴うことなく、Ｅ．  ｃｏｌｉを含む原核生物もしくは酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）を含む真核生物、昆虫細胞、またはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、もしくはＢＳＣ細胞などのような任意の適した哺乳動物宿主細胞を含む。当業者は、他の宿主細胞を有利に使用することができることを十分に理解するであろう。それらを作製し、使用し、かつ軟骨形成活性について試験する方法を含む、本発明の方法、組成物、およびデバイスにおいて有用なモルフォゲンの詳細な説明は、米国特許第５，２６６，６８３号および第５，０１１，６９１号を含む、多数の刊行物において開示され、これらの明細書は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１０４】
他の好ましい実施形態において、有用なモルフォゲン活性タンパク質は、参照モルフォゲン配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズする核酸によってコードされる配列、たとえば、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＯＰ−２（ＢＭＰ−８）、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、Ｖｇｒ−１、６０Ａ、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、およびその他同種のものの保存された７個のシステイン骨格を規定するＣ末端配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を有する。本明細書において使用されるように、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、一晩、３７℃での４０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、および０．１％ＳＤＳにおける、公知の技術によるハイブリダイゼーションならびに５０℃での、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄として規定される。標準的なストリンジェンシー条件は、標準的な分子生物学クローニングテキストにおいて十分に特徴づけられている。たとえばＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）；ＤＮＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４年）；ならびにＢ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ
ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４年）を参照されたい。
【０１０５】
他の実施形態において、モルフォゲンタンパク質の投与の代替として、哺乳動物において内因性モルフォゲン発現の増加を刺激するまたは誘発する能力がある、有効な量の作用物質は、本明細書において記載されるルートのうちのいずれかによって投与されてもよい。そのようなモルフォゲン誘発剤は、たとえば哺乳動物への全身投与によってまたは血管への直接的な投与によって哺乳動物に提供されてもよい。所与の組織において内因性モルフォゲンのレベルを調節する能力がある誘発剤（刺激剤）を同定しかつ試験するための方法は、公開出願ＷＯ９３／０５１７２およびＷＯ９３／０５７５１において記載され、これらのそれぞれは、本明細書において参照によって組み込まれる。手短に言えば、候補化合物は、この化合物が生産に影響するのに、つまり、その組織の細胞によって生産されるモルフォゲンの発現および／または分泌を引き起こすのに十分な時間の、試験組織もしくは試験細胞またはそれに由来する培養細胞系とのインビトロにおけるインキュベーションによって、同定され、かつ試験される。適した組織または適した組織の培養細胞は、腎上皮、卵巣組織、線維芽細胞、および骨芽細胞から好ましくは選択される。
【０１０６】
他の実施形態において、モルフォゲン受容体のアゴニストとして作用する作用物質は、モルフォゲンそれ自体の代わりに投与されてもよい。そのような作用物質はまた、モルフォゲン「模倣物」、モルフォゲン「ミメティック」、またはモルフォゲン「類似体」と呼ばれてもよい。したがって、たとえば、モルフォゲンの受容体に結合し、かつそれを活性化する際のモルフォゲンの活性を模倣することができる小さなペプチドまたは他の分子は、モルフォゲンの等価物として用いられてもよい。好ましくは、アゴニストは、完全なアゴニストであるが、部分的なモルフォゲン受容体アゴニストもまた、有利に用いられてもよい。そのようなアゴニストを同定するための方法は、当技術分野において公知であり、モルフォゲン媒介性の応答を誘発する化合物についてのアッセイを含む（たとえば後腎間充織の分化の誘発、軟骨内骨形成の誘発）。たとえば、モルフォゲン誘発剤またはモルフォゲン受容体のアゴニストを同定するための方法は、１９９５年６月７日に提出されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４７８，０９７；２００１年２月２２日に提出されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／７９１９４６；米国特許第５，８３４，１８８号；米国特許第６，２７３，５９８号；ＷＯ９７／２６２７７；欧州特許第０８７６４０１号；１９９８年３月３０日に提出された米国仮出願第６０／０８００３２号；２００１年６月１０日に提出された米国仮出願第６０／２９６２９１号；２００２年２月５日に提出された米国仮出願第６０／３５４８２０号；および２００２年４月１０日に提出された米国仮出願（第１の指定された発明者Ｐｅｔｅｒ  Ｋｅｃｋ、発明の名称：「ＭＯＲＰＨＯＧＥＮ  ＡＮＡＬＯＧＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＴＨＥＭ」）において見つけられてもよく、これらの開示は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１０７】
本発明のモルフォゲンのＯＰ／ＢＭＰファミリーはまた、当業者らによって容易に確認されてもよい生物学的活性によっても特徴づけられる。特に、本発明のモルフォゲンは、（ａ）Ｒｅｄｄｉ−Ｓａｍｐａｔｈ異所性骨アッセイ（ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ（１９８１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８巻：７５９９〜７６０３頁）もしくは実質的に等価なアッセイにおいて軟骨形成を誘発することができる、（ｂ）慢性腎不全の標準的な動物モデルにおいて腎機能の進行性の損失を有意に予防する、阻害する、遅延させる、もしくは緩和することができる、または（ｃ）慢性腎不全であるもしくは慢性腎不全の危険性がある哺乳動物に投与した場合に、腎機能の標準的なマーカーにおいて臨床的に有意な改善を引き起こすことができる。
【０１０８】
Ｒｅｄｄｉ−Ｓａｍｐａｔｈ異所性骨アッセイは、軟骨形成活性のアッセイとして当技術分野において周知である。このアッセイは、容易に実行することができるが、たとえばＳａｒｎｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ（１９８１年）において、慢性腎不全を特徴づける機能が記載され、論じられる。
【０１０９】
最終的に、本発明のモルフォゲンは、慢性腎不全であるまたはその危険性がある哺乳動物対象（たとえばヒト患者）に投与された場合に、腎機能の標準的なマーカーにおける臨床的に有意な改善を引き起こす際のそれらの治療的効能について評価されてもよい。腎機能のそのようなマーカーは、医学文献において周知であり、限定されることなく、ＢＵＮレベルの増加の速度、血清クレアチニンの増加の速度、ＢＵＮの静的測定、血清クレアチニンの静的測定、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）、ＢＵＮ／クレアチニンの比、ナトリウム（Ｎａ＋）の血清濃度、クレアチニンについての尿／血漿比、尿素についての尿／血漿比、尿重量オスモル濃度、毎日の尿量、およびその他同種のものを含む（たとえばＢｒｅｎｎｅｒおよびＬａｚａｒｕｓ（１９９４年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１３版、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｔｅｘｔ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＬｕｋｅおよびＳｔｒｏｍ（１９９４年）、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第４版、Ｊ．Ｈ．  Ｓｔｅｉｎ編、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，  Ｉｎｃ．  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓを参照されたい）。
【０１１０】
医薬組成物
本発明において有用な医薬組成物は、様々な形態をしていてもよい。これらは、たとえば、液体の溶液、注入可能な溶液、乳剤、ゲル、懸濁剤、錠剤、および丸剤などのような液体、固体、または半固体の剤形を含む。好ましい形態は、投与の意図したモードおよび治療適用に依存し、当業者によって選択されてもよい。投与のモードは、静脈内、経口、非経口、筋肉内、腹腔内、皮下、病巣内、外科的移植、または局所的投与を含んでいてもよい。組成物は、投与のそれぞれのルートに適切な剤形で製剤されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、血管組織に投与されるであろう。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、標的血管組織の近傍に投与されるであろう。他の実施形態において、医薬品は、標的組織から遠位の部位に投与される。たとえば、いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、全身に投与されてもよい。
【０１１１】
組成物はまた、好ましくは、当技術分野において周知の従来の薬学的に許容可能なキャリヤーをも含むであろう（たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０年）を参照されたい）。そのような薬学的に許容可能なキャリヤーは、ヒト血清アルブミンまたは血漿の調製物などのような、他の薬剤、キャリヤー、遺伝的キャリヤー、アジュバント、賦形剤などを含んでいてもよい。好ましくは、キャリヤーは、等張性である。そのようなキャリヤー媒体の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、緩衝水溶液、ヒアルロナン、ヒアルロン酸、およびブドウ糖溶液を含む。不揮発性油およびオレイン酸エチルなどのような非水性の媒体もまた本明細書において有用である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、徐放性製剤、スローデリバリー製剤、またはモルフォゲンのクリアランスを遅延させる製剤である。マイクロスフェア（たとえばポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマー）、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ゼラチン、および他の微粒子デリバリー系、または徐放性製剤を含むが、これらに限定されない、これらの組成物の調製に利用可能な多数のデリバリー物質がある。いくつかの実施形態において、モルフォゲンは、デリバリー物質に共有結合される。
【０１１３】
様々な成長因子、サイトカイン、ホルモン、栄養剤、ならびに抗生物質および化学療法剤、酵素、酵素阻害剤、ならびに他の生理活性作用物質を含む治療剤もまた、医薬組成物において含まれてもよい。
【０１１４】
１日当たり約１μｇおよび約１０００μｇの間の、好ましくは１日当たり３μｇおよび５０μｇの間のモルフォゲンの投薬レベルは、有用である。当業者は、十分に理解するであろうが、記載される用量よりも低いまたはより高い用量が必要とされてもよい。組成物は、好ましくは、単位用量の形態をしており、通常、特定の組織治療に依存する用量レジメンとして投与されるであろう。組成物は、組織治癒または回復を最適化する、当技術分野において公知の投与頻度で、１回または複数回投与されてもよい。組成物は、たとえば、毎日、毎週、毎月、半月毎に、隔月に、四半期毎に、二年毎に、または毎年投与することができる。任意の特定の患者についての特定の投薬量および治療レジメンは、用いられるモルフォゲンの活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与の時間、排泄の速度、薬剤の組合せ、組織損傷の重症度、および治療する医師の判断を含む、様々な因子に依存するであろう。
【０１１５】
一般的な問題として、本発明のモルフォゲンは、対象においてＣＫＤ、血管硬化症、新生内膜過形成、および／または血管石灰化の危険性があるまたはそれに罹患している任意の哺乳動物対象の治療のための医薬の調製において使用されてもよい。さらに、本発明の方法は、ＣＫＤ、血管硬化症、新生内膜過形成、および／または血管石灰化の危険性があるまたはそれに罹患している、任意の哺乳動物対象の治療に適用されてもよい。本発明は、任意の霊長動物、好ましくは、ヒトなどのようなより高等な霊長動物の治療に適している。そのうえ、しかしながら、本発明は、ヒトのコンパニオンとして管理される（たとえばイヌ、ネコ、ウマ）、重要な商品価値を有する（たとえばヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、狩猟動物、または役畜）、重要な科学的価値を有する（たとえば絶滅危惧種の捕えられている標本もしくは自由な標本または同系動物もしくは遺伝子操作動物）、またはその他に価値を有する飼い慣らされた哺乳動物の治療において用いられてもよい。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１）
動物および食餌：Ｃ５７Ｂｌ／６ＪバックグラウンドのＬＤＬ受容体ヌル（ＬＤＬＲ−／−）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から購入し、病原体がいない環境において飼育した。動物は、３週目に離乳させ、固形飼料にした［Ｐｉｃｏ  Ｌａｂげっ歯動物固形飼料２０およびマウス固形飼料２０の１：１混合物、脂肪として６．７５％カロリー］。１０週目で、動物は、この固形飼料を継続したまたは脂肪として４２％カロリーを含有する高コレステロール（０．１５％）食餌を始めた［Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、製品Ｎｏ．ＴＤ８８１３７］。何匹かの動物については、食餌に、１％または３％のＣａＣＯ３を補足した。ＣａＣＯ３を補足した動物食餌は、先に報告されている２０。動物は、自由に、水を摂取した。ＢＭＰ−７は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）によって提供された。Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ
Ｃａｒｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、研究プロトコールを承認した。動物実験は、ＮＩＨ
Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って実行し、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０１１７】
（実施例２）
ＣＫＤの誘発：先に記載されるように、２段階の手順を利用して、尿毒症を引き起こした（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年；Ｌｕｎｄ、２００４年）１９；２１。伏在静脈血液試料は、手術後の腎機能のベースラインを評価するために、第２の外科手術の１週間後に採取した。動物は、出生の２８週間後に、麻酔下で犠牲死させた。犠牲死の時に、血液を、心臓内穿刺によって採取し、心臓および大動脈を、ひとまとめにして解剖した。ＢＭＰ−７治療グループは、１００μｌ媒体［マンニトール（５％ｗ／ｖ）、酢酸Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ４．０〜４．５）、滅菌水］中の毎週１回のＢＭＰ−７  １０μｇ／ｋｇ乾重量の腹腔内注射を受けた。これは、発明者らの先の研究において使用されるのと同じ用量である（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年；Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年）１９；２０。
【０１１８】
動物は、第２の外科手術の後に、７つのＣＫＤ高脂肪摂食グループのうちの１つに割り当てた：他のコントロールグループは、固形飼料のＬＤＬＲ−／−偽手術マウスおよび固形飼料の、ＣＫＤを有するＬＤＬＲ−／−マウスを含んだ。固形飼料を摂食したＣ５７Ｂ１６  ＷＴマウスは、正常なベンチマーク源となった。これらのコントロールグループに由来するデータは、示さない。グループ１は、２２週目に犠牲死させた高脂肪食のＬＤＬＲ−／−マウスとした。グループ２は、高脂肪食を摂食させ、媒体ＩＰを用いて２２〜２８週目に毎週治療した、ＣＫＤを有するＬＤＬＲ−／−マウスとした。このグループは、高血清リンおよびＶＣを発病することが予想された。グループ３は、第１の治療グループとした。これらは、ＢＭＰ−７治療（毎週１０μｇ／ｋｇ  ＩＰ）を受けた、高脂肪食の、ＣＫＤを有するＬＤＬＲ−／−マウスとした。グループ４は、セベラマーＣＯ３１％を用いて治療した、高脂肪食の、ＣＫＤを有するＬＤＬＲ−／−マウスとした。グループ５は、セベラマーＣＯ３３％を用いて治療した、高脂肪食の、ＣＫＤを有するＬＤＬＲ−／−マウスとした。グループ６は、ＣａＣＯ３３％を用いて治療した、高脂肪食の、ＣＫＤを有するＬＤＬＲ−／−マウスとした。グループ７は、ＣａＣＯ３３％を用いて治療した、高脂肪食の、ＣＫＤを有するＬＤＬＲ−／−マウスとした。一度、マウスを無作為化して、グループにしたら、それらに、出生後の１４週目〜２２週目まで石灰化を発病させた。療法は、出生後の２３週目に始め、マウスを検査する出生後の２８週目まで継続した。
【０１１９】
（実施例３）
血液試験：血清は、標準的な検査法によって、血液尿素窒素［ＢＵＮ］、コレステロール、カルシウム、およびホスフェートについて血液採取の日に分析した。療法の開始の前に、血液は、伏在静脈を通して得た。犠牲死の時に、血液は、心臓内穿刺を通して得た。
【０１２０】
（実施例４）
組織調製：切除した標本は、液体窒素中で急速冷凍し、次いで、以下のように分類した：心臓、上行大動脈、および大動脈弓は、下行大動脈から分離し、大動脈流出路を通して矢状方向に二分した。下行大動脈は、その長さに沿って冠状におよそ中間で二分した。組織切片における石灰化を視覚化するために、組織薄片（５μｍ厚）をカットし、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色およびＴｒａｐ染色を用いて染色した。
【０１２１】
（実施例５）
化学的石灰化定量：発明者らの先の実験計画に類似する（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年；Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年）１９；２０。大動脈および心臓は、犠牲死時に解剖し、すべての付着組織は、解剖顕微鏡下でブラントジセクションによって除去した。組織は、６０℃で２０〜２４時間乾燥させ、計量し、粉砕して、乳棒および乳鉢を用いて粉末にした。カルシウムを、４℃、２４時間、１Ｎ  ＨＣＬ中で溶出した。溶出液のカルシウム含有量は、メーカーの指示に従って、クレゾールフタレインコンプレキソン法（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）を使用してアッセイし、結果は、心臓および大動脈についての乾燥組織体重に対して補正した。
【０１２２】
（実施例６）
細胞培養：ヒト成人大動脈は、アテローム性動脈硬化症のためにＭｉｄ−Ａｍｅｒｉｃａ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）によって拒絶された７人の死体器官ドナーから得、ヒト平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）を得るために酵素で消化した。内側組織を、外膜および内膜から分離し、１時間、Ｉ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）２ｍｇ／ｍｌを用いて消化し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を用いて洗浄した。それに続けて、さらなる消化を、４時間、ＩＩ型コラゲナーゼ１ｍｇ／ｍｌ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）およびエラスターゼ．２５ｍｇ／ｍｌ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を用いて行った。細胞浮遊液を、ＨＢＳＳを用いて２回洗浄し、３７℃で、９５％／５％大気／ＣＯ２加湿環境において３週間、Ｔ−７５フラスコ中で培養した。使用した成長培地は、４．５％グルコース（高グルコース）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｓ、Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ユニット／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を含有するＤＭＥＭとした。細胞純度は、α−平滑筋アクチンおよびカルポニンについてのポジティブ免疫染色によっておよびフォン  ウィレブランド因子の不在について評価した。すべての実験プロトコールにおいて、細胞は、６ウェルプレート中に１×１０５細胞／ウェルで接種した。培地は、最初の日に交換し、その後、３日毎に交換した。すべての症例において、使用した細胞は、継代２および５の間であった（表３）。
【０１２３】
【表３】
2014043461.tif 000012
（実施例７）
石灰化の誘発：コンフルエンスの時に、細胞は、１または２ｍＭ  Ｐｉを補足したＤＭＥＭから成るミネラル化培地に切り換えた。ＢＭＰ−７治療に曝露した細胞に対して、媒体（マンニトール、酢酸、アセテート）または媒体中のＢＭＰ−７のいずれかを含有する新鮮なミネラル化培地を、０．１、１．０、１０、または１００ｎｇ／ｍｌで追加した。培地を、２日または３日毎に交換した。ｎｏｇｇｉｎ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度でミネラル化培地に追加した。カルシウム含有量を定量し、記載されるように細胞タンパク質に対して標準化した（Ｊｏｎｏ  ２０００年；Ｍｏｅ  Ｓ．Ｍ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ６７巻：２２９５〜２３０４頁、２００５年）１１；５２。
【０１２４】
（実施例８）
ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、細胞培養物から抽出した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、２段階の方法を使用して、メーカーの指示に従って、Ｒｏｃｈｅ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）からのＰＣＲキットを使用して行った。１μｇの全ＲＮＡは、逆転写し、ランダムプライマーは、ＰＣＲ前に４２℃で６０分間追加した。フォワードプライマーおよびリバースプライマー（表４）を追加し、反応を、２０〜３５サイクルのＰＣＲにかけた。ｃＤＮＡを増幅するが、指数関数的増幅範囲内にとどまるのに必要であるサイクルの数は、それぞれのプライマーセットに対して決定した。ＧＡＰＤＨを、ローディングを評価するために内部標準として使用した。ゲノムコンタミネーションは、ＲＴ−ＰＣＲ前に逆転写酵素の熱不活化によって評価した。プライマーは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して設計し、それぞれのプライマーペアの最適条件を、決定した（表４）。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＤＮＡサーマルサイクラーを、反応を実行するために使用した。産物は、２％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）上で分離し、臭化エチジウムを用いて視覚化した。バンド強度は、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０ゲルイメージャー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、ゲルをスキャニングすることによって最初に分析し、ＴｏｔａｌＬａｂソフトウェアｖ２００３．０３（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を使用することによって定量し、ＧＡＰＧＨに対する比較によってローディングに対して標準化した。ネガティブコントロールは、ゲノムＤＮＡが増幅されなかったことを保証するために、ＲＴ−ＰＣＲ前に５分間、煮沸することによって逆転写酵素を不活性化することによって実行した。
【０１２５】
【表４】
2014043461.tif 000013
（実施例９）
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ：上記のように実行した逆転写後に、リアルタイムを、ＭＸ  ４０００（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）からのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰＣＲキットを使用して実行した。それぞれの反応を、９５℃、４５秒間および６０℃、３０秒間および７２℃で６０秒間、４０サイクルを３回実行した。これに、７２℃〜９９℃の温度の段階的な増加から成る融解サイクルを続けた。単一の優勢なピークが、それぞれの遺伝子の解離曲線において観察され、ＰＣＲ産物の特異性を支持した。Ｃｔ値（閾値）を、ＰＣＲの対数期の範囲内に設定し、所望の遺伝子の発現レベルを計算するために使用した。ＧＡＰＤＨは、内部標準として使用し、値を標準化するために使用した。ＣＴ対ログｃＤＮＡ希釈液（ログコピー数に相当する）から成る標準曲線を、未知の量のアンプリコンに対応するｃＤＮＡの段階希釈液の増幅によって生成した。
【０１２６】
（実施例１０）
ｏｓｔｅｒｉｘ  ｓｉＲＮＡ構築物：ヒトｏｓｔｅｒｉｘ（ｏｓｘ）ｓｉＲＮＡ標的配列は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｉＤｉｒｅｃｔ（ＲＮＡｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）（表４）によって設計した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの６３塩基長センス鎖およびアンチセンス鎖を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成した。ｓｉＲＮＡのデリバリーのためのレトロウイルスベクターの構築は、メーカーの指示に従ってｐＳｉｌｅｎｃｅｒ５．１−Ｈレトロウイルス系（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して実行した。スクランブルｓｉＲＮＡネガティブコントロールレトロウイルスベクターは、Ａｍｂｉｏｎから購入した。
【０１２７】
（実施例１１）
安定感染細胞の確立：Ｄｒ．Ｇａｒｒｙ  Ｎｏｌａｎ（スタンフォード大学医科大学院、カリフォルニア州スタンフォード）からの寄贈であるサブコンフルエントＰｈｏｅｎｉｘ−Ａのパッケージング細胞を、ＦｕＧｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｓｉＲＮＡレトロウイルスベクター（８μｇ  ＤＮＡ／１００ｍｍ皿）を用いてトランスフェクトした。４８時間後、上清を収集し、０．４５μｍシリンジフィルターで濾過し、標的細胞を形質導入するために使用した。それぞれの上清（５ｍｌ）を、８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ）と混合した。この感染カクテル（１０ｍｌ）を、６時間、ＳａＯｓ細胞（２×１０５細胞／１００ｍｍ皿）に感染させるために使用した。感染細胞を、３日間、４μｇ／ｍｌプロマイシン（Ｓｉｇｍａ）の存在下において選択し、感染細胞をアッセイした。
【０１２８】
（実施例１２）
免疫ブロット法：ｓｉＲＮＡによるノックダウンの効果を評価するために、細胞の核溶解物は、ｏｓｔｅｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）およびヒストンＨ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する特異的な抗体を使用して、免疫ブロット法によってアッセイした。ヒストンＨ３抗体を、ローディングコントロールとして使用した。免疫ブロット法の方法論は、当技術分野において周知である。
【０１２９】
（実施例１３）
ミネラル化アッセイ：インビトロにおいてミネラル化を誘発するために、感染細胞を、７日間、５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）を有する無血清ＨＬ−１培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。７日間の培養の後、感染細胞を、ミネラル化を検出するために、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａまたはアリザリンレッドによって染色した（１、２）。カルシウム定量化のために、カルシウムを、超音波処理の後に１６時間、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および４Ｎ  ＨＣＬを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）中で溶解した。溶解カルシウムの含有量は、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃ−Ｔｅｓｔ（Ｗａｋｏ）によって測定した。
【０１３０】
（実施例１４）
統計分析：データは、ＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性（Ｐ＜．０５）について分析した。２２週目に犠牲死させた動物（コントロールグループ）およびＢＭＰ−７またはＣａＣＯ３を用いて治療した、２８週目に犠牲死させたものの間で比較した。細胞培養物について、系のデータを、ＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性（Ｐ＜．０５）について分析した。これらの分析を、Ｓｙｓｔａｔ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ（Ｐｏｉｎｔ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて実行した。
【０１３１】
（実施例１５）
大動脈Ｃａの定量．出生の１４週後に誘発し、２２週後に安楽死させた、ＣＫＤを有する脂肪摂食マウスにおける大動脈Ｃａの定量は、ＣＫＤが石灰化を刺激したことを実証した（図１Ａ）。マウスを、毎週１回腹腔内注射した１０ｍｃｇ／ｋｇ  ＢＭＰ−７を用いて治療した。パネルＡは、血管石灰化の程度の変化が、媒体治療動物において２２週目から２８週目まで増加したが、大動脈カルシウムは、ＢＭＰ−７を用いて治療した動物において減少したことを示す。パネルＢは、コントロール動物およびＢＭＰ−７治療動物の血清におけるリンのレベルを示す。治療されなければ、それは、２２週目および２８週目の間で不変であったが、ＢＭＰ−７を用いる治療によって正常なレベルまで低下した。データは、グループ平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４〜７）として表現する。出生後２２週目で始めて出生後２８週目までの６週間の、媒体を用いる療法は、血管カルシウムのさらなる蓄積をもたらす（図１Ａ）。２２〜２８週の期間、先の予防試験（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年；Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年）１９；２０において使用されるのと同じ用量である、毎週１０μｇ／ｋｇ  ＩＰのＢＭＰ−７を用いる療法は、２２週目の開始時点と比較して、大動脈石灰化の有意な低下をもたらし（図１Ａ）、高リン酸血症の改善をもたらした（図１Ｂ）。
【０１３２】
（実施例１６）
石灰化に対する高リン酸血症の直接的な効果．ＢＭＰ−７が、高リン酸血症を低下させることに加えて、直接脈管構造に対する作用を有するので（Ｄｏｒａｉ  Ｈら、Ｊ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １８４巻：３７〜４５頁、２０００年；Ｄｏｒａｉ
ＨおよびＳａｍｐａｔｈ  ＴＫ、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  ８３巻：Ｓ７０〜Ｓ７８頁、２００１年）２８；２９、本発明の発明者は、高リン酸血症のみのコントロールの効果を分析した。本発明の発明者らは、最初に、高リン酸血症を改善するために、腸管腔ホスフェートおよび胆汁酸塩の非吸収性結合剤であるセベラマーＣＯ３を選んだが、この結合剤は、有効であるが（表５）、多面的な作用を有した（Ｍａｔｈｅｗ  Ｓら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １８巻：１２２〜１３０頁、２００７年）３０。
【０１３３】
【表５】
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したがって、本発明の発明者らは、食糧において十分に混合された場合および血清Ｃａに影響しない場合、作用がホスフェート結合に限られる可能性があるＣａＣＯ３を選んだ。臨床的に使用される他の非カルシウム含有ホスフェート結合剤であるＬａＣＯ３も研究した。血管石灰化が、媒体治療動物において２２週目〜２８週目まで有意に増加したが、大動脈カルシウムは、３％ＣａＣＯ３を用いて治療した動物において２２週目のレベルより下に低下した。３％ＬａＣＯ３治療動物における２２週目からの有意な変化はなかった。データは、グループ平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４〜５）として表現する。食餌に追加したＣａＣＯ３は、ＢＭＰ−７効果に類似して、２２週目の開始時点の動物と比較して、血管石灰化を有意に低下させた（図２）。ＣａＣＯ３の治療作用は、高リン酸血症がＣａＣＯ３によって予防された場合にＶＣの予防を実証する、発明者らの公開研究に類似した（Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年）２０。ＣａＣＯ３は、血清Ｃａに影響しなかった（表５）。ＬａＣＯ３はまた、ＣａＣＯ３に類似して、２２〜２８週目まで血管石灰化の増加を予防したが、２２週目に観察されたレベルより下に血管カルシウムレベルを低下させなかった。セベラマーＣＯ３療法は、血清コレステロールを低下させたが、他の治療のどれも、ＬＤＬＲ−／−マウスの高コレステロール血症に影響しなかった。
【０１３４】
実験動物の大動脈が、大動脈カルシウム含有量を定量するための技術によって破壊されたので、治療の効果を定量するために、さらなるマウスを、大動脈の定性分析のための研究に登録した。血管石灰化は、大部分は、大動脈アテローム斑関連性のものであり（図３）、中膜における点状の石灰化が、観察された。パネルＡ：偽手術高脂肪摂食ＬＤＬＲ−／−マウスの近位大動脈における大きな、脂質を含んだ斑（矢印の間）。太い矢印は、斑の基部の限局的な石灰化を同定する。パネルＢ：ＣＫＤ高脂肪摂食ＬＤＬＲ−／−マウスの近位大動脈における大きな石灰化斑（矢印の間）。パネルＣ：ＢＭＰ−７治療ＣＫＤ高脂肪摂食ＬＤＬＲ−／−マウスの近位大動脈における大きな、脂質を含んだ斑（矢印の間）。染色は、アリザリンレッドとする。倍率は、Ａ〜Ｃにおいて４００×とする。ＢＭＰ−７、ＣａＣＯ３、またはＬａＣＯ３を用いる治療は、斑関連性のカルシウム沈着を減少させたが、それらは、アテローム硬化性病変のサイズを減少させなかった（図３）。
【０１３５】
（実施例１７）
インビトロマトリックスミネラル化．リン刺激性の血管石灰化のメカニズムを分析するために、本発明の発明者らは、このアテローム硬化性マウスモデルを模倣するためにインビトロにおいてアテローム硬化性ドナーから単離したヒト血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）（表３）によってマトリックスミネラル化を検査した。本発明の発明者らは、ＣＫＤの高リン酸血症を模倣するために培地リンを増加させた。モデルの概念は、ヒト組織に適した、先に確立された石灰化血管平滑筋細胞培養系１０〜１２に従う。本明細書において使用されるｈＶＳＭＣは、基本条件において細胞外マトリックスをミネラル化しなかったが、培地中に既に存在する１ｍＭ以上のリンの増加に曝露した場合（最終Ｐｉ  ２ｍＭ）、ｈＶＳＭＣは、ある期間にわたってそれらのマトリックスをミネラル化した（図４）。７人のドナーに由来するｈＶＳＭＣは、実施例６において記載されるようなＤＭＥＭ（グループＡ）または１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．４を補足したＤＭＥＭ（グループＢ）において成長させた。グループＣ、Ｄ、およびＥにおいて、ＢＭＰ−７の０．１、１、および１０ｎｇ／ｍｌは、それぞれ、ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＨＰＯ４補足培地に追加した。培養は、１４日目（Ａ）および２１日目（Ｂ）に終了した。データは、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝７ドナーとする。１４日間（図４Ａ）または２１日間（図４Ｂ）のＢＭＰ−７曝露は、高リン培地におけるＥＣＭのミネラル化を減少させた。
【０１３６】
（実施例１８）
ｏｓｔｅｒｉｘ誘発を通しての骨芽細胞の分化の刺激．ＲＴ−ＰＣＲは、ｈＶＳＭＣ初代培養物が、分化骨芽細胞のマーカーであるオステオカルシンを発現したことを実証するために使用した（Ａｕｂｉｎ  ＪＥ、Ｌｉｕ  Ｆ：Ｔｈｅ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｌｉｎｅａｇｅ。実施例６において記載されるようにＤＭＥＭにおいて培養し、ＲＴ−ＰＣＲ（挿入図）によって検出した、ｈＶＳＭＣにおける遺伝子発現の基本レベルを、１の基準値として設定した（白棒、グループＡ）。高リン（２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／（Ｎａ）２ＨＰＯ４）培地（黒棒、グループＢ）および２ｍＭリン＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−７（斜線棒、グループＣ）による誘発倍数を決定した。ＢＭＰ−２／ＭＳＸ２によって指示された骨芽細胞の転写プログラムは、オステオカルシン（Ａ）、ＢＭＰ−２（Ｂ）、ＭＳＸ２（Ｃ）、およびＲＵＮＸ２（Ｄ）遺伝子転写の存在によって実証されるように、ｈＶＳＭＣ培養物中に存在した。ｏｓｔｅｒｉｘ（Ｅ）は、基本の培養条件において弱く発現しただけであった。ｏｓｔｅｒｉｘ（Ｅ）のリン刺激性の転写。ＢＭＰ−７は、ｏｓｔｅｒｉｘおよびオステオカルシンの発現を阻害した。Ａ〜Ｅにおけるデータは、基本の培養条件における発現レベルに対して標準化し、誘発倍数、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３として表現した。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ
ＪＰら編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年、５１〜６７頁；Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ＨＭら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：１２８８７〜１２８９１頁、１９９４年）３１；３２（図５Ａ）において、発明者らおよび同僚らによるインビボにおける先の免疫組織的研究（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年）１９と一致して、骨芽細胞の分化が、異所的ミネラル化のメカニズムであることを示唆する。骨芽細胞の分化の誘発剤であるＢＭＰ−２およびＭＳＸ２の転写（Ｃｈｅｎｇ  ＳＬら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８巻：４５９６９〜４５９７７頁、２００３年；Ｈａｒｒｉｓ  ＳＥら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ３巻：１３７〜１５５頁、１９９５年）３３；３４は、この可能性と一致して、初代培養物中に存在したが（図５Ｂ、Ｃ）、それらのレベルは、高リン条件によって誘発されなかった。同様に、骨芽細胞組織特異的転写因子であるＲＵＮＸ２／Ｃｂｆａ１（Ｄｕｃｙ  １９９７ら；Ｋｏｍｏｒｉ  Ｔら、Ｃｅｌｌ  ８９巻：７５５〜７６４頁、１９９７年）１７；３５は、未治療ｈＶＳＭＣ細胞において発現し（図５Ｄ）、培地リンによって刺激されなかった。しかしながら、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４の下流の、第２の骨芽細胞組織特異的転写因子、ｏｓｔｅｒｉｘ２４；２５は、それが高リン培地によって誘発されるまで、低レベルで発現した（図５Ｅ）。ＲＵＮＸ２およびｏｓｔｅｒｉｘは、骨芽細胞のモルフォゲンＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４によって指示される骨芽細胞のプログラムを通して間葉系統細胞を誘導することができる骨芽細胞の転写因子である（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ２００２年；Ｌｅｅ  ２００３年；Ｋｏｍｏｒｉ  １９９７年）２４；２５；３５。（Ｈａｒｒｉｓ  １９９５年）３４ＢＭＰ−７は、ｏｓｔｅｒｉｘの上流のＢＭＰ−２経路（ＢＭＰ−２およびＲＵＮＸ２）の発現に影響しなかったが（図５Ｂ、Ｃ、Ｄ）、それは、ｏｓｔｅｒｉｘ発現（図５Ｅ）および骨芽細胞の表現型マーカーであるタンパク質の発現（図５Ａ）を強く阻害した。
【０１３７】
（実施例１９）
ＢＭＰ−２阻害剤によるミネラル化の阻害．骨芽細胞の分化およびミネラル化の誘発におけるＢＭＰ−２の決定的に重要な役割は、ＢＭＰ−２の阻害剤、ｎｏｇｇｉｎを追加した場合の、高リン培地におけるミネラル化の消失によって実証された（図６Ａ）。パネルＡは、高リン培地に追加したｎｏｇｇｉｎの効果、（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、斜線棒により、リンによって刺激されるマトリックスミネラル化が阻害されたことを示す。パネルＢは、ｎｏｇｇｉｎ、１００ｎｇ／ｍｌが、リン誘発性ｏｓｔｅｒｉｘ発現をブロックしたことを示す。ｎｏｇｇｉｎの追加（図６Ｂ）はまた、高リン培地刺激性ｏｓｔｅｒｉｘ発現をも阻害し、高リンの作用が、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４刺激骨芽細胞分化と協調的であることを示唆する。高ホスフェートによる、発達後期の第２の骨芽細胞特異的転写因子、ｏｓｔｅｒｉｘの刺激は、ｏｓｔｅｒｉｘがＢＭＰ−７治療によって阻害された場合のミネラル化の転換によって示されるように、細胞外マトリックスにおけるミネラル沈着をもたらす骨芽細胞分化の最終ステップとなった（図６Ｂ、図１）。
【０１３８】
（実施例２０）
ｏｓｔｅｒｉｘノックダウン細胞のミネラル化．ホスフェート応答性ミネラル化細胞系、ＳＡＯＳにおいて、ｏｓｔｅｒｉｘ  ｓｉＲＮＡのレトロウイルス誘発性発現は、実施例１１において記載されるように、予想されるように、高培地ホスフェート刺激マトリックスミネラル化をブロックしたが、ｏｓｔｅｒｉｘ配列に由来するレトロウイルス誘発性スクランブルｓｉＲＮＡは、高ホスフェートＨＬ−１培地に応答した（図７）。
【０１３９】
（実施例２１）
ヒト細胞における収縮性ＶＳＭＣマーカーの発現．ＢＭＰ−７は、収縮性ｈＶＳＭＣ表現型の刺激などのような作用をｏｓｔｅｒｉｘの阻害に加えて呈したが、リンは、これらのバイオマーカーの転写に影響せず（図８）、したがって、それらは、おそらく、リン作用のＢＭＰ−７阻害のメカニズムとならないであろう。図８において示されるＶＳＭＣバイオマーカーの発現は、アテローム硬化性大動脈に由来する培養物において低下し、アテローム斑と関連する新生内膜におけるＶＳＭＣの異常な表現型をおそらく反映する。ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるカルポニン（パネルＡ）、アルファ平滑筋アクチン（アルファＳＭＡ）（パネルＢ）、重鎖ミオシン（ＭＨＳＣＭ）（パネルＣ）、およびＳＭ２２アルファ（パネルＤ）のメッセージレベルは、基本条件におけるｈＶＳＭＣにおいて（白棒、グループＡ）および高リン培地の存在下において（黒棒、グループＢ）低かった。ＢＭＰ−７（斜線棒、グループＣ）は、マーカータンパク質のそれぞれの発現を誘発した。パネルＡ〜Ｄにおけるデータは、基本の培養条件における発現レベルに対して標準化し、誘発倍数、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３として表現した。低い基本レベルは、他の研究者によって示されるようにそれらの発現を低下させるための高培地リン効果がない状態についてのベースであった可能性がある（Ｊｏｎｏ  ２０００年；Ｌｉ，  Ｘら、２００７年、非公開研究）１１；３６。ｏｓｔｅｒｉｘに対するｓｉＲＮＡを発現するＳＡＯＳ細胞系は、実施例１１において記載されるように開発した。パネルＡ．ｏｓｔｅｒｉｘに対するｍＲＮＡのレベルは、２つの個別の細胞系（ｏｓｘｓｉＲＮＡ＃１およびｏｓｘｓｉＲＮＡ＃２）において５０％以上減少した。パネルＢ．ｏｓｔｅｒｉｘのタンパク質レベルは、ｏｓｘｓｉＲＮＡ＃１およびｏｓｘｓｉＲＮＡ＃２におけるウエスタン分析によって非常に減少した。ヒストンＨ３レベルは、ウエスタンブロット上でローディングコントロールとして測定した。高リン条件によって刺激された培養物のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（パネルＣ〜Ｅ）およびアリザリンレッド（パネルＦ、Ｇ）染色。パネルＣ．高リンミネラル化条件における、７日目の、スクランブルｓｉＲＮＡを発現する細胞を含有するウェルの周囲におけるミネラル化結節。パネルＤ．高リンミネラル化条件における、７日目の、スクランブルｓｉＲＮＡを発現する細胞を含有するウェルの中心におけるミネラル化結節。パネルＥ．高リンミネラル化条件における、７日目の、ｏｓｘｓｉＲＮＡ＃１を発現するウェルの周囲における、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色によって検出されるミネラル化の不在。パネルＦ．高リンミネラル化条件における、７日目の、スクランブルｓｉＲＮＡを発現する細胞を含有するウェルの周囲におけるアリザリンレッド染色結節。パネルＧ．高リンミネラル化条件における、７日目の、ｏｓｘｓｉＲＮＡ＃１を発現するウェルの周囲におけるアリザリンレッド染色によって検出されるミネラル化の不在。オレンジは、アリザリンレッドネガティブ染色におけるバックグラウンド染色である。パネルＨ．ｏｓｔｅｒｉｘに対するｓｉＲＮＡを発現する細胞系の培養物のマトリックスにおけるカルシウムレベル。
【０１４０】
ＢＭＰ−２／４指示プログラムは、一般的に、しかし常にではないが（Ａｓａｈｉｎａ
Ｉ．ら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２２２巻：３８〜４７頁、１９９６年）３７、骨芽細胞機能において相補的である、密接に関連づけられるＢＭＰであるＢＭＰ−７によってアンタゴナイズされる。これは、ＢＭＰ−２が、ＢＭＰ−７刺激分枝形態形成を阻害する腎臓発達を含むいくつかの生物学的状況において観察される現象と一致している（Ｐｉｓｃｉｏｎｅ  Ｔ．Ｄ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓ  （Ｒｅｎａｌ）  ２７３巻：Ｆ９６１〜Ｆ９７５頁、１９９７年）３８。一貫した現象は、ＢＭＰ−２が増殖を阻害し、アポトーシスを誘発したが、低用量ＢＭＰ−７が増殖を刺激した集合管機能において報告されている（Ｐｉｓｃｉｏｎｅ  Ｔ．Ｄ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８０巻：Ｆ１９〜Ｆ３３頁、２００１年）３９。理論によって束縛されるものではないが、関連づけられるＢＭＰのそのような別個の活性は、おそらく、異なる受容体（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａ  Ｍ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３巻：２５６２８〜２５６３６頁、１９９８年）４０およびＳｍａｄ非依存性のシグナル伝達の利用による。
【０１４１】
（実施例２２）
石灰化関連性の遺伝子の発現．インビトロにおいて検出されたリン作用のメカニズムを、インビボにおけるＣＫＤ誘発性の血管石灰化および高リン酸血症のこのモデルに関連づけるために、本発明の発明者は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、ｏｓｔｅｒｉｘメッセージレベルを含む骨芽細胞系統遺伝子の大動脈発現を分析した。マウスの様々なグループは、Ａ、偽手術；Ｂ、媒体治療ＣＫＤ；Ｃ、ＢＭＰ−７治療ＣＫＤ；Ｄ、３％ＣａＣＯ３治療ＣＫＤ；Ｅ、３％ＬａＣＯ３治療ＣＫＤとした。ＭＳＸ２発現（Ａ）は低く、ＣＫＤによって誘発されず、３回の治療のそれぞれで抑制された。挿入図は、０．０〜０．５の間の比の目盛りについてのデータを示す。ＣＢＦＡ１発現（Ｂ）は、ＣＫＤによって刺激されなかったが、それは、ＢＭＰ−７、３％ＣａＣＯ３、および３％ＬａＣＯ３治療によって阻害された。ｏｓｔｅｒｉｘ発現（Ｃ）は、ＣＫＤによって刺激され、それは、ＢＭＰ−７、ＣａＣＯ３、またはＬａＣＯ３治療によって阻害された。オステオカルシン発現（Ｄ）は、ＣＫＤによって強く誘発され（Ｙ軸目盛りが異なることに注意されたい）、ＢＭＰ−７、ＣａＣＯ３、またはＬａＣＯ３によって阻害された。それぞれのグループにおける大動脈／動物の数は、４個とした。データは、それぞれの大動脈におけるＧＡＰＤＨ発現と比較した転写物レベルの平均値±ＳＥＭ、Ｎ＝３として表現する。高脂肪摂食偽手術マウスにおいて、本発明の発明者らは、ＢＭＰ−２（示さず）、ＭＳＸ２（図９Ａ）、およびＲＵＮＸ２（図９Ｂ）の発現が、Ｓｈａｏら  ２００５年、２７に由来する最近のデータと一致していることを見つけたが、ｏｓｔｅｒｉｘは、弱く発現しただけであった（図９Ｃ）。ｏｓｔｅｒｉｘは、ＣＫＤによって強く誘発され（図９Ｃ）、血管石灰化を部分的に逆行させるための、上記に示されるＢＭＰ−７またはＣａＣＯ３を用いる治療（図１および２）は、ｏｓｔｅｒｉｘおよびＲＵＮＸ２の発現を低下させた（図９ＢおよびＣ）。オステオカルシンの大動脈発現は、ｏｓｔｅｒｉｘ活性および骨芽細胞の転写プログラムの阻害と適合性のＢＭＰ−７、ＣａＣＯ３、またはＬａＣＯ３療法によって減少した（図９Ｄ）（Ｈｏｆｆｍａｎ  １９９４年；Ｄｕｃｙ  Ｐ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ  １５巻：１８５８〜１８６９頁、１９９５年）３２；４１。
【０１４２】
本明細書において開示される本発明は、ＣＫＤが、血管ミネラル化を刺激することを実証する先の研究を伸展するものである（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年；Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年；Ｐｈａｎ  Ｏ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２巻：２８７５〜２８８２頁、２００５年；Ｔａｍａｇａｋｉ  Ｋ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２１巻：６５１〜６５９頁、２００６年）１９；２０；４２；４３。高脂肪食を摂食した、低密度リポタンパク質受容体欠損マウスである、記載される動物モデルは、高脂血症、肥満症、インスリン抵抗性、およびメタボリックシンドロームによるアテローム性動脈硬化症の動物モデルである。この動物モデルにおいて、ＶＣは、骨芽細胞転写因子ＲＵＮＸ２の転写効果と共に、ＢＭＰ−２およびＭＳＸ２によって指示される骨芽細胞の分化プログラムの発現と関連する大動脈アテローム硬化性新生内膜において発病する（Ｄａｖｉｅｓ  １００３年；Ｓｈａｏ  ２００６年）１９；２６（Ｓｈａｏ  ２００５年）２７；３３。得られたデータは、骨芽細胞の血管石灰化におけるその役割を実証するためにＭＳＸ２の過剰発現を進行したＣｈｅｎｇら（２００３年）３３と一致して、ＭＳＸ２が、脂肪摂食アテローム硬化性大動脈において低レベルで発現することを実証する。Ｓｈａｏら（Ｓｈａｏ，  Ｊ．Ｓ．ら  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５巻：１２１０〜１２２０頁、２００５年）２７はまた、ＬＤＬＲ−／−脂肪摂食モデルにおける外膜のＷｎｔ活性の活性化を実証するが、本発明の発明者らは、ＣＫＤが血管周囲のＷｎｔ阻害剤を誘発し（Ｓｕｒｅｎｄｒａｎ  Ｋ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈ．  １６巻：２３７３〜２３８４頁、２００５年）４４、ＣＫＤ誘発性のＶＣにおけるＷｎｔ活性の役割が、さらなる研究を必要とすることを示した。本研究ならびに発明者らおよび同僚らによる先の研究は、このモデルにおける、ＣＫＤによって誘発された新生内膜石灰化の大幅な増大を実証する（Ｄａｖｉｅｓ  ２００３年；Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年）１９；２０。結果はまた、ＣＫＤの誘発が、高リン酸血症の発症と関連し、ＢＭＰ−７を用いるその治療が、高リン酸血症を改善したという点においても、発明者らおよび彼らの同僚による先の研究に一致している（Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年）２０。高リン酸血症を改善するためのＢＭＰ−７の効果は、骨形成の刺激によることが示され（Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年）２０、高リン酸血症の改善は、ＣＫＤ刺激ＶＣの発症の予防となった（Ｄａｖｉｅｓ  ２００５年；Ｍａｔｈｅｗ  ２００７年）２０；３０。
【０１４３】
本明細書における予想外の新しい発明は、慢性の血管ミネラル化レベルを、ＢＭＰ−７および高リン酸血症コントロールによって減少することができるという実証である。薬理的治療を用いる既存の血管ミネラル沈着物の低下は、アテローム性動脈硬化症療法における、進歩的な有意なステップである。これは、アテローム硬化性ミネラル化プロセスのメカニズムについての強い症例を、活性な生物学的リモデリングメカニズムにする。あるそのようなメカニズムは、ミネラル沈着（骨形成）がミネラル再吸収に関連づけられる骨格のリモデリングに類似しているであろう。新しい沈着物を増加させるまたは生成する形成よりも速い速度での既存の沈着物の再吸収は、これらの結果のうちで最も適切な説明となる。ＴＲＡＰポジティブ多核破骨細胞様細胞が、新生内膜において実証されたので（Ｍｏｅ  ２００２年；Ｃｈｅｎ  Ｎ．Ｘ．ら、Ｓｅｍ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ２４巻：６１〜６８頁、２００４年；Ｄｏｈｅｒｔｙ  Ｔ．Ｍ．ら  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １６巻：５７７〜５８２頁、２００２年）１４；４５；４６、本発明の発明者らは、ＣａＣＯ３およびＢＭＰ−７治療動物における血管ミネラル化における減少が、血管ミネラル沈着物の形成の減少および継続的な再吸収と適合性であると解釈した。
【０１４４】
記載される動物モデルにおけるＣＫＤ誘発性の血管石灰化の低下は、高リン酸血症のコントロールと共に、リン刺激性の効果の転換の証拠となる。インビトロにおける研究において、ＢＭＰ−２の活性化を通してのリン刺激性のミネラル化は、骨芽細胞特異的転写因子の作用を通して血管骨芽細胞のプログラムを指示した。骨芽細胞のプログラムは、ＢＭＰ−２およびＭＳＸ２発現の存在、ＲＵＮＸ２の存在、ならびにオステオカルシンなどのようなＲＵＮＸ２転写活性標的によって実証されるこれらの細胞培養物において存在した（Ｄｕｃｙ  １９９７年；Ｄｕｃｙ  １９９５年）１７；４１。アテローム硬化性大動脈に由来するｈＶＳＭＣにおけるＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４ならびにＲＵＮＸ２発現の結果は、アテローム性動脈硬化症を有していない正常な大動脈の初代培養物の結果と異なる。しかしながら、ミネラル化は、培地リンの追加によって刺激され、必ずしもＲＵＮＸ２ではないが、ＢＭＰ−２の下流にある決定的に重要な骨芽細胞組織特異的転写因子であるｏｓｔｅｒｉｘの不十分な発現により存在しなかった（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ２００２年；Ｋｏｇａ  Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１巻：８８０〜８８５頁、２００５年）２４；４７。（Ｌｅｅ  ２００３年）２５高培地リン誘発性のミネラル化が、実際に骨原性プログラムの活性によるものであったということは、ＢＭＰアンタゴニスト、ｎｏｇｇｉｎを用いるその阻害によって実証された。ＢＭＰ−７治療を用いてまたはｏｓｔｅｒｉｘに対するｓｉＲＮＡによる、転写因子であるｏｓｔｅｒｉｘの阻害を通してのプログラムの妨害は、ミネラル化を取り除くために高培地リンの存在下において十分であった。したがって、リンは、インビトロにおける他の研究と一致した単なる物理化学的なミネラル化の動力ではなく、ｏｓｔｅｒｉｘ発現の増加に至る活性なシグナル伝達分子であった（Ｓｔｅｉｚ  ２００１年；Ｊｏｎｏ  ２０００年；Ｌｉ  ２００６年）１０；１１；２２。これらの研究（Ｊｏｎｏ  ２０００年；Ｌｉ  ２００６年）１１；２２は、リンの作用が、骨芽細胞において示唆されるように、ＶＳＭＣにおけるＰｉｔ１ナトリウム依存性輸送体の活性に関連づけられることを確立した（Ｂｅｃｋ  Ｇ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９７巻：８３５２〜８３５７頁、２０００年）４８。シグナル分子としてのその役割は、近位尿細管および破骨細胞のナトリウム依存性輸送タンパク質、ＮａＰｉ２ａと結合することが公知であるものに類似する、膜結合性シグナル伝達複合体のＰｉｔ１誘発性の活性化を通してのものである可能性がある（Ｂｉｂｅｒ  Ｊ．ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｎａｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２８７巻：８７１〜５頁、２００４年）４９。
【０１４５】
インビボにおける記載されるデータは、インビトロモデルに直接関連づけられる。先の研究（Ｓｈａｏ  ２００５年）２７と一致して、ＢＭＰ−２／ＭＳＸ２プログラムは、アテローム硬化性ドナーに由来する基本条件のｈＶＳＭＣ培養物に類似して、高脂肪摂食によって大動脈において誘発された。しかしながら、ＣＫＤは、インビトロにおけるリンの効果に類似して、このモデルにおけるＶＣに対する主な刺激となった。大動脈におけるｏｓｔｅｒｉｘのＣＫＤ誘発性の発現は、インビトロにおけるリンの効果に類似する。２つの個別の治療戦略による高リン酸血症のコントロールは、ＶＣを逆行させ、大動脈のｏｓｔｅｒｉｘおよびＲＵＮＸ２の発現を、偽手術高脂肪摂食マウスの大動脈における発現より下のレベルに戻した。したがって、本明細書におけるデータは、他の研究者に由来するデータと一致して、ＣＫＤ刺激性のアテローム硬化性石灰化の病因として、脈管構造における骨芽細胞のプログラムの活性化を実証する（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ２００４年；Ｍｏｅ
２００３年）１２；１８。
【０１４６】
リンの役割に関して、翻訳のデータは、インビボにおけるＣｈｅｒｔｏｗら（Ｃｈｅｒｔｏｗ  Ｇ．Ｍ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ６２巻：２４５〜２５２頁、２００２年）５０およびＢｌｏｃｋ（Ｂｌｏｃｋ  Ｇ．Ａ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ６８巻：１８１５〜１８２４頁、２００５年）５１ならびにインビトロにおけるいくつかの研究所のヒト臨床観察に一致している（Ｔｙｓｏｎ  ２００３年；Ｓｔｅｉｔｚ  ２００１年；Ｊｏｎｏ  ２０００年）９〜１１。本明細書は、リンが、インビボにおいてＶＣを引き起こし、リン作用のメカニズムが、異所的骨芽細胞の分化プログラムの刺激を通してのものであることを明らかに実証することを初めて記載する。これらのデータは、高リン酸血症をＣＫＤにおける心血管死亡に関連づけるヒト疫学的研究に一致しており（Ｋｅｓｔｅｎｂａｕｍ  ２００６年；Ｓｌｉｎｉｎ  ２００５年）３；４、それらは、高リン酸血症作用のメカニズムを示唆する。ここで報告された研究は、ＣＫＤにおける、高リン酸血症誘発性のアテローム硬化性血管石灰化のメカニズムを提供する。それらは、ＣＫＤにおいても刺激される、動脈中膜の弾性板の石灰化に関連づけられない可能性がある。このプロセスは、マトリックスミネラル化基質が１型コラーゲンである、骨芽細胞のミネラル化とは異なる。
【０１４７】
（実施例２３）
新生内膜過形成に対するＣＫＤの効果に対するＢＭＰ−７治療の効果
Ａ．動静脈（ＡＶ）瘻の生成
上記に記載されるようなＣＫＤマウスおよび偽マウスの生成の６週間後に、動物は、端側様式において頸静脈に左総頸動脈を吻合することによって、ＡＶ瘻生成を受けた。滅菌状態下で、垂直方向の切開を左の首にし、左総頸動脈および隣接した外頸静脈を注意深く別々にした。総頸動脈クランプを、１１〜０ナイロン縫合糸を用いて近位の部分に配置し、総頸動脈は、直近位から分岐に分類した。次に、頸静脈を、近位でおよび末梢部でクランプし、２７Ｇ注射器を用いて中央部分で穿刺した。ヘパリン化生理食塩水を用いてこの静脈セグメントを満たした後に、長さが０．７ｍｍの静脈切開を実行した。端側吻合（頸静脈側面に対する総頸動脈末端）を、次いで、１１〜０ナイロンの、下端から先端の（ｈｅｅｌ  ｔｏ  ｔｏｅ）連続的な縫合を使用して生成した。血管は、クランプを外し、開通性についてチェックした（図１１Ａ、Ｂ）。
【０１４８】
ＡＶ瘻生成の３週間後に、動物を安楽死させ、ＡＶ吻合は、先に記載されるように１００ｍｍ  Ｈｇの圧力で左心室を介して灌流固定した（Ｌｅｉｄｅｎｆｒｏｓｔ  ＪＥら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００３年；１６３巻（２号）：７７３〜７７８頁）５３。灌流固定の前に、血液を、生化学分析のために左心室から採取した。血液尿素窒素（ＢＵＮ）、リン、およびカルシウムは、ミズーリ州セントルイスのワシントン大学動物施設臨床検査室におけるオートアナライザー技術によって測定した。
【０１４９】
Ｂ．ＣＫＤ誘発性のＮＨ病変に対するＢＭＰ治療の効果
ＣＫＤが、より速い速度の移動を可能にするＶＳＭＣ脱分化を誘発するという可能性を研究するために、全身に投与されたＶＳＭＣ分化因子（たとえば、インビトロにおいてＶＳＣＭ収縮性表現型のマーカーの発現を刺激することが先に示されたＢＭＰ−７）（Ｍａｔｈｅｗ，  Ｓら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２００５年  １６巻：５２ａ頁（要約））６２の、新生内膜過形成（ＮＨ）病変発症に対する効果を検査した。マウスは、ＣＫＤ生成を受け、３週間後に動静脈（ＡＶ）瘻生成を受けた。ＡＶ瘻生成の１週間前およびＡＶ吻合摘出まで継続して、ＢＭＰ−７（１００μｇ／ｋｇ）またはその媒体（生理食塩水）を、１週間に２回、腹腔内投与した。偽手術動物において、ＮＨ病変発症に対するＢＭＰ−７の効果はなかった（１８匹のＢＭＰ−７動物対１６匹の媒体動物）。しかしながら、ＢＭＰ−７投与は、ＣＫＤによって誘発されるＮＨ病変形成の刺激を取り除いた（１６匹のＢＭＰ−７動物対１９匹の媒体動物）。＊Ｐ＜０．０１．図１２．これらの結果は、ＮＨ病変へのＣＫＤ刺激性のＶＳＭＣ移動が、移動細胞のＶＳＣＭ分化を減少させるためのＣＫＤの効果を通して可能にされたことを示唆する。
【０１５０】
【数１】
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【０１５１】
【数２】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
【数５】
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【０１５５】
【数６】
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【０１５６】
【数７】
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【０１５７】
【数８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−３５】
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【図１３−３６】
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【図１３−４１】
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【図１３−４３】
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【図１３−４４】
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【図１３−４５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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