(57)【要約】【課題】生細胞における状態の変化をＦＲＥＴの発生と解消の程度により効率よく短時間に行うことができるＦＲＥＴ計測プローブとＦＲＥＴ計測方法を提供する。【解決手段】ＦＲＥＴ計測に用いるＦＲＥＴ型バイオプローブは、ドナー蛍光を発する蛍光タンパク質と、アクセプタ吸光を行う吸光分子と、前記蛍光タンパク質と前記吸光分子との間に接続され、特定の生体分子と相互作用することにより、前記蛍光タンパク質と前記吸光分子との間でＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の発生／解消を生じさせる特異的生体分子認識領域と、を含む。前記蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記吸光分子の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れている。前記蛍光タンパク質の発色団と前記有機蛍光物質とは、フェルスタ距離Ｒ0が５〜４０ｎｍとなるように、前記吸光分子と接続する前記蛍光タンパク質の配列の改変がなされている。【選択図】  図２
2014055777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲＥＴ型バイオプローブであって、
ドナー蛍光を発する蛍光タンパク質と、
アクセプタ吸光を行う吸光分子と、
前記蛍光タンパク質と前記吸光分子との間に接続され、特定の生体分子と相互作用することにより、前記蛍光タンパク質と前記吸光分子との間でＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の発生／解消を生じさせる特異的生体分子認識領域と、を含み、
前記蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記吸光分子の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れており、
前記蛍光タンパク質の発色団と前記有機蛍光物質とは、フェルスタ距離Ｒ0が５〜４０ｎｍとなるように、前記吸光分子と接続する前記蛍光タンパク質の配列の改変がなされている、
ことを特長とするＦＲＥＴ型バイオプローブ。
【請求項２】
前記特異的生体分子認識領域は、前記蛍光タンパク質のＣ末端近傍またはＮ末端近傍に設けられる、請求項１に記載のＦＲＥＴ型バイオプローブ。
【請求項３】
前記蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記有機蛍光物質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れている、請求項１または２に記載のＦＲＥＴ型バイオプローブ。
【請求項４】
ドナー蛍光を発する第１の蛍光タンパク質と、
アクセプタ吸光を行う第１の吸光分子と、
前記第１の蛍光タンパク質と前記第１の吸光分子との間に接続され、特定の生体分子と相互作用することにより、前記蛍光タンパク質と前記吸光分子との間でＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の発生／非発生を生じさせる第１の特異的生体分子認識領域と、を含み、
前記第１の蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記第１の吸光分子の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れており、
前記第１の蛍光タンパク質の発色団と前記第１の吸光分子とは、フェルスタ距離Ｒ0が５〜４０ｎｍとなるように、前記第１の吸光分子と接続する前記第１の蛍光タンパク質の配列の改変がなされている、第１のＦＲＥＴ型バイオプローブを用いてＦＲＥＴを蛍光寿命によって計測するＦＲＥＴ計測方法であって、
（Ａ）前記第１のＦＲＥＴ型バイオプローブを取り込んだ生細胞を、変調周波数で強度変調されたレーザ光で照射するステップと、
（Ｂ）照射された前記第１のＦＲＥＴ型バイオプローブの前記第１の蛍光タンパク質が発する第１のドナー蛍光を受光するステップと、
（Ｃ）受光した前記第１のドナー蛍光と前記レーザ光の強度変調の情報から、前記第１のドナー蛍光の蛍光寿命を算出するステップと、
（Ｄ）前記第１の蛍光寿命と、ＦＲＥＴが解消したときの前記第１の蛍光タンパク質が発する蛍光の蛍光寿命とを比較することにより、第１のＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴの発生と解消の程度を求めるステップと、
を有することを特徴とするＦＲＥＴ計測方法。
【請求項５】
前記第１の吸光分子の蛍光の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は７００ｎｍ以上である、請求項４に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項６】
前記第１の蛍光タンパク質と異なる波長のドナー蛍光を発する第２の蛍光タンパク質と、
アクセプタ吸光を行う第２の吸光分子と、
前記第２の蛍光タンパク質と前記第２の吸光分子との間に接続され、特定の生体分子と相互作用することにより、前記第２の蛍光タンパク質と前記第２の吸光分子との間でＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の発生／解消を生じさせる第２の特異的生体分子認識領域と、を含み、
前記第２の蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記第２の吸光分子の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れており、
前記第２の蛍光タンパク質の発色団と前記第２の吸光分子とは、フェルスタ距離Ｒ0が５〜４０ｎｍとなるように、前記第２の吸光分子と接続する前記第２の蛍光タンパク質の配列の改変がなされている、第２のＦＲＥＴ型バイオプローブを、前記第１のＦＲＥＴ型バイオプローブとともに前記生細胞は取り込んでおり、
前記（Ａ）〜（Ｄ）のステップに加えて、
（Ｅ）前記第２のＦＲＥＴ型バイオプローブを取り込んだ前記生細胞を、変調周波数で強度変調されたレーザ光で照射するステップと、
（Ｆ）照射された前記第２のＦＲＥＴ型バイオプローブの前記第２の蛍光タンパク質が発する第２のドナー蛍光を受光するステップと、
（Ｇ）受光した前記第２のドナー蛍光と前記レーザ光の強度変調の情報から、前記第２の蛍光の蛍光寿命を算出するステップと、
（Ｈ）前記第２の蛍光寿命と、ＦＲＥＴが解消したときの前記第２の蛍光タンパク質が発する前記第２のドナー蛍光の蛍光寿命とを比較することにより、第２のＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴの発生と解消の程度を求めるステップと、
（Ｉ）前記第１の蛍光寿命の比較結果及び前記第２の蛍光寿命の比較結果に基づいて、前記生細胞の状態を判定するステップと、を有する、
請求項４または５に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項７】
前記第２の有機蛍光物質の蛍光の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は７００ｎｍ以上である、請求項６に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＲＥＴ型バイオプローブ及びＦＲＥＴ計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパクの機能解析が重要となっている。特に、生細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパクと、他のタンパクや低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
近年、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して、生細胞における生体物質であるタンパクと、他のタンパクや低分子化合物との間の相互作用の解析が盛んに行われている。ＦＲＥＴ現象により生じる蛍光を測定することにより、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を測定することができる。ＦＲＥＴは、生体物質に修飾されたドナー蛍光分子が照射されたレーザ光により励起したとき、接近しているアクセプタ蛍光分子に蛍光を発することなく励起エネルギーの一部が移動して、アクセプタ蛍光分子が蛍光を発する現象をいう。
【０００３】
また、近年、医療あるいは創薬の分野で、有機物からなるドナー蛍光分子と有機物からなるアクセプタ蛍光分子を、タンパクで構成された特定の酵素に反応する特定酵素認識部位を用いて結合したＦＲＥＴ型バイオプローブの開発が盛んに行われている。このＦＲＥＴ型バイオプローブが取り込まれた測定対象物である複数の生細胞について、ＦＲＥＴ計測装置を用いて短時間に計測してＦＲＥＴの変化の程度を短時間に判定できること、さらには、生細胞内の状態の時間変化（動態変化）を、ＦＲＥＴの判定結果を用いて定量的に知ることが求められている。
例えばＦＲＥＴ型バイオプローブの開発において下記非特許文献１が知られている。また、ＦＲＥＴ計測装置として下記特許文献１が知られている。また、ＦＬＩＭ（Fluorescence -Lifetime Imaging microscopy）を用いて、ＦＲＥＴを計測した研究も知られている（非特許文献２）。ＦＲＥＴ計測装置及びＦＬＩＭでは、ドナー蛍光分子が発するドナー蛍光のみを利用してドナー蛍光の蛍光寿命を計測することにより、ＦＲＥＴの変化の情報を得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２３２５５９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】“Protease-sensive signaling by chemically engineered intramolecular fluorescent resonance energy transfer mutants of green fluorescent protein”, Miho Suzuki et al., Biochimica et Biophysica Acta 1679(2004),pp.222-229
【非特許文献２】“Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescence proteins”, Dmitry Shcherbo et al., BMC Biotechnology, 25 March 2009, Page 1-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した様にＦＲＥＴは、「生体物質に修飾されたドナー蛍光分子が照射されたレーザ光により励起したとき、接近しているアクセプタ蛍光分子に蛍光を発することなく励起エネルギーの一部が移動して、アクセプタ蛍光分子が蛍光を発する現象」である。しかし、上述のＦＲＥＴ計測装置においてＦＲＥＴ型バイオプローブを用いた場合、１つのレーザ光によって、ドナー蛍光分子の他にアクセプタ蛍光分子も直接励起されて（cross-excitation）、ドナーから移動したエネルギーによる発光のみでなくレーザ光によって直接励起されて発光するアクセプター分子が存在してしまう場合がある。この様な不都合は、ドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子の励起波長が近いことに起因しておこり、多くの場合両者の蛍光波長も近いためドナー蛍光分子にアクセプタ蛍光分子が漏れ込んでしまう(cross-talk)場合が多い。たとえ直接励起されたアクセプタ蛍光分子（cross-excitation）が存在せず、ドナー蛍光分子からのエネルギー移動のみで発光したアクセプタ蛍光分子が存在する場合であっても、このアクセプタ蛍光分子の蛍光波長がドナー蛍光分子の蛍光波長に近ければ計測するドナー蛍光分子の発するドナー蛍光にアクセプタ蛍光分子が発するアクセプタ蛍光が漏れ込み(cross-talk)易い。このため、従来より行われているＦＲＥＴの発生の有無の指標となるレシオメトリ（ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比）を正確に求めるために、補正を行う処理が必要になり、計測に要する時間が長くなる。
また、ドナー蛍光の蛍光寿命を計測する場合においても、計測するドナー蛍光分子の発するドナー蛍光にアクセプタ蛍光分子が発するアクセプタ蛍光が漏れ込み易く、ドナー蛍光の蛍光寿命を正しく計測することができない場合がある。また、漏れ込みを除去するために、ドナー蛍光を主に受光する光電変換器の蛍光信号及びアクセプタ蛍光を主に受光する光電変換器の蛍光信号を用いて補正処理をすることにより、アクセプタ蛍光の盛り込みを排除してドナー蛍光の蛍光信号を求めることができる。しかし、このような補正処理は、計測前に予備計測を行って補正式を確立しておく必要があり、短時間に計測を行うことは難しい。
特に、生細胞に取り込まれるＦＲＥＴ型バイオプローブには、蛍光タンパクや有機蛍光分子が用いられるので蛍光帯域及び励起帯域は広い。このため、生細胞内に複数種類のＦＦＲＥＴ型バイオプローブが取り込まれた場合、ドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子の励起帯域（吸収帯域ともいう）が重なって、前述の１つの励起光によって複数のドナー蛍光とアクセプタ蛍光が同時に発する場合（cross-excitation）の頻度がますます高まる。また、ドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子の蛍光帯域が重なり合う場合(cross-talk)の頻度も高まる。このため、ＦＲＥＴ計測装置やＦＬＩＭで生細胞から発する蛍光を正確に分離して受光をすることは難しく、ＦＲＥＴの変化の程度の計測を正確に行うことはますます難しくなる。今日、医療あるいは創薬の分野で、生細胞の動態変化を蛍光の計測により短時間で判定することが望まれるが、現在のＦＲＥＴ型バイオプローブでは、蛍光を計測して、複数種類のＦＲＥＴの変化の程度を同時に、かつ短時間に判定することは難しい。
【０００７】
そこで、本発明は、生細胞における状態の変化をＦＲＥＴの変化の程度の計測をより効率よく短時間に行うことができるＦＲＥＴ型バイオプローブと、このＦＲＥＴ型バイオプローブを用いたＦＲＥＴ計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、ＦＲＥＴ型バイオプローブである。当該ＦＲＥＴ型バイオプローブは、
ドナー蛍光を発する蛍光タンパク質と、
アクセプタ吸光を行う吸光分子と、
前記蛍光タンパク質と前記吸光分子との間に接続され、特定の生体分子と相互作用することにより、前記蛍光タンパク質と前記吸光分子との間でＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の発生／解消を生じさせる特異的生体分子認識領域と、を含む。
前記蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記吸光分子の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れている。
前記蛍光タンパク質の発色団と前記有機蛍光物質とは、フェルスタ距離Ｒ0、すなわち、ＦＲＥＴが５０％発生するためのドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子間の距離が５〜４０ｎｍとなるように、前記吸光分子と接続する前記蛍光タンパク質の配列の改変がなされている。
【０００９】
その際、前記特異的生体分子認識領域は、前記蛍光タンパク質のＣ末端近傍またはＮ末端近傍に設けられることが好ましい。
【００１０】
また、前記蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記有機蛍光物質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れていることが好ましい。
【００１１】
また、本発明の別の態様は、ＦＲＥＴ計測方法である。より具体的には、ＦＲＥＴ原理を応用した計測方法である。当該計測方法では、
ドナー蛍光を発する第１の蛍光タンパク質と、
アクセプタ吸光を行う第１の吸光分子と、
前記第１の蛍光タンパク質と前記第１の吸光分子との間に接続され、特定の生体分子と相互作用することにより、前記蛍光タンパク質と前記吸光分子との間でＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の発生／解消を生じさせる第１の特異的生体分子認識領域と、を含み、
前記第１の蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記第１の吸光分子の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れており、
前記第１の蛍光タンパク質の発色団と前記第１の吸光分子とは、フェルスタ距離Ｒ0、すなわち、ＦＲＥＴが５０％発生するためのドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子間の距離が５〜４０ｎｍとなるように、前記第１の吸光分子と接続する前記第１の蛍光タンパク質の配列の改変がなされている、第１のＦＲＥＴ型バイオプローブを用いる。
前記計測方法は、
（Ａ）前記第１のＦＲＥＴ型バイオプローブを取り込んだ生細胞を、変調周波数で強度変調されたレーザ光で照射するステップと、
（Ｂ）照射された前記第１のＦＲＥＴ型バイオプローブの前記第１の蛍光タンパク質が発する第１のドナー蛍光を受光するステップと、
（Ｃ）受光した前記第１のドナー蛍光と前記レーザ光の強度変調の情報から、前記第１のドナー蛍光の蛍光寿命を算出するステップと、
（Ｄ）前記第１の蛍光寿命と、ＦＲＥＴが生じていないときの前記第１の蛍光タンパク質が発する蛍光の蛍光寿命とを比較することにより、第１のＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴの発生と解消の程度を求めるステップと、
を有する。
【００１２】
その際、前記第１の吸光分子の蛍光の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は７００ｎｍ以上であってもよい。
【００１３】
さらに、前記生細胞は、以下に示す第２のＦＲＥＴ型バイオプローブを、前記第１のＦＲＥＴ型バイオプローブとともに取り込んでおり、
前記（Ａ）〜（Ｄ）のステップに加えて、
（Ｅ）前記第２のＦＲＥＴ型バイオプローブを取り込んだ前記生細胞を、変調周波数で強度変調されたレーザ光で照射するステップと、
（Ｆ）照射された前記第２のＦＲＥＴ型バイオプローブの前記第２の蛍光タンパク質が発する第２のドナー蛍光を受光するステップと、
（Ｇ）受光した前記第２のドナー蛍光と前記レーザ光の強度変調の情報から、前記第２のドナー蛍光の蛍光寿命を算出するステップと、
（Ｈ）前記第２の蛍光寿命と、ＦＲＥＴが生じていないときの前記第２の蛍光タンパク質が発する蛍光の蛍光寿命とを比較することにより、第２のＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴの発生と解消の程度を求めるステップと、
（Ｉ）前記第１の蛍光寿命の比較結果及び前記第２の蛍光寿命の比較結果に基づいて、前記生細胞の状態を判定するステップと、を有してもよい。
前記第２のＦＲＥＴ型バイオプローブは、
前記第１の蛍光タンパク質と異なる波長のドナー蛍光を発する第２の蛍光タンパク質と、
アクセプタ吸光を行う第２の吸光分子と、
前記第２の蛍光タンパク質と前記第２の吸光分子との間に接続され、特定の生体分子と相互作用することにより、前記第２の蛍光タンパク質と前記第２の吸光分子との間でＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の発生／解消を生じさせる第２の特異的生体分子認識領域と、を含み、
前記第２の蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、前記第２の吸光分子の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れており、
前記第２の蛍光タンパク質の発色団と前記第２の吸光分子とは、フェルスタ距離Ｒ0、すなわち、ＦＲＥＴが５０％発生するためのドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子間の距離が５〜４０ｎｍとなるように、前記第２の吸光分子と接続する前記第２の蛍光タンパク質の配列の改変がなされている、ＦＲＥＴ型バイオプローブである。
【００１４】
その際、前記第２の有機蛍光物質の蛍光の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は７００ｎｍ以上であってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
上述のＦＲＥＴ型バイオプローブ及びＦＲＥＴ計測方法では、生細胞における状態の変化量の測定（あるいは状態変化の定量化）をＦＲＥＴの発生と解消の程度により効率よく短時間に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】本実施形態の一例のＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴ発生状態を説明する図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示すＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴ解消状態を説明する図である。
【図１Ｃ】本実施形態の別の例のＦＲＥＴ型バイオプローブのＮＯＮ−ＦＲＥＴ状態（ＦＲＥＴ解消状態）を説明する図である。
【図１Ｄ】図１Ｃに示すＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴ発生状態を説明する図である。
【図１Ｅ】本実施形態の別の例のＦＲＥＴ型バイオプローブのＮＯＮ−ＦＲＥＴ状態（ＦＲＥＴ解消状態）を説明する図である。
【図１Ｆ】図１Ｅに示すＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴ発生状態を説明する図である。
【図２】（ａ）は、ＧＦＰの構造を説明する図であり、（ｂ）はＧＦＰの６番目のグルタミン酸及び２２９番目のイソロイシンのいずれかをシステインに置換した場合を示す図である。
【図３】蛍光タンパク質の蛍光スペクトルＡと有機蛍光物質の吸収スペクトルＢの一例を示す模式図である。
【図４】本実施形態のＦＲＥＴ型バイオプローブの例を示す図である
【図５】（ａ）は、ＧＦＰの蛍光スペクトルＰ1と、ＧＦＰを有するＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴ発生時の蛍光スペクトルＰ2を示す図であり、（ｂ）は、ＲＦＰの蛍光スペクトルＰ3と、ＲＦＰを有するＦＲＥＴ型バイオプローブのＦＲＥＴ発生時の蛍光スペクトルＰ4を示す図である。
【図６】ＲＦＰを蛍光タンパク質とし、種々の有機蛍光物質を替えたときのＦＲＥＴ型バイオプローブのドナー蛍光の蛍光強度と蛍光寿命τを示す図である。
【図７】本実施形態のＦＲＥＴ型バイオプローブを用いてＦＲＥＴを計測するＦＲＥＴ計測装置の概略の構成を示す図である。
【図８】本実施形態の受光部の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【図９】本実施形態の制御・処理部の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【図１０】本実施形態の分析装置の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【図１１】（ａ）〜（ｃ）は、本実施形態の３種類のＦＲＥＴ型バイオプローブを示す図である。
【図１２】（ａ）〜（ｅ）は、本実施形態のあるＦＲＥＴ型バイオプローブ（ＧＦＰ−Ｃａｓ−Ｄ６８０とＧＦＰ−Ｃａｓ−Ａ７５０）を用いたときのドナー蛍光の蛍光寿命τのヒストグラムを示す図である（「薬剤非導入」と「薬剤導入」の２つの状態が示され、「薬剤導入」の場合、薬剤導入後図示した時間経過後のドナー蛍光の蛍光寿命τのヒストグラムを示す図である）。
【図１３】本実施形態の他のＦＲＥＴ型バイオプローブ（ＲＦＰ−Ｃａｓ３−Ａ６３３）を用いて計測された、「薬剤非導入」と「薬剤導入」（５時間経過後）のドナー蛍光の蛍光寿命τのヒストグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（ＦＲＥＴ型バイオプローブ）
図１Ａは、本実施形態のＦＲＥＴ型バイオプローブ（以下、単にＦＲＥＴプローブという）１０のＦＲＥＴ発生状態の説明図である。ＦＲＥＴプローブ１０は、ドナー蛍光を発する蛍光タンパク質（蛍光タンパク分子）１２と、アクセプタ蛍光を発する有機蛍光物質（吸光分子）１４と、蛍光タンパク質１２と有機蛍光物質１４との間に接続される特異的生体分子認識部位（特異的生体分子認識領域）１６と、を含む。特異的生体分子認識部位１６は、細胞内で発現するカスパーゼ等の特定の酵素（生体分子）がない状態では、蛍光タンパク１２と有機蛍光物質１４との間でＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を発生させる。しかし、細胞内で発現するカスパーゼ等の特定の酵素が存在する状態では、特異的生体分子認識部位１６が切断されて蛍光タンパク質１２と有機蛍光物質１４との間でＦＲＥＴが解消する。すなわち、特異的生体分子認識部位１６は、特定の酵素と反応することにより、蛍光タンパク質１２と有機蛍光物質１４との間でＦＲＥＴの発生／解消を生じさせる。以下で説明する特異的生体分子認識部位１６は、特定の酵素と反応することにより、蛍光タンパク質１２と有機蛍光物質１４との間でＦＲＥＴの解消を生じさせる例を説明するが、特異的生体分子認識部位１６は、特定の酵素と反応することにより、蛍光タンパク質１２と有機蛍光物質１４との間でＦＲＥＴの発生を生じさせるものであってもよい（図１Ｃ〜１Ｆ参照）。
蛍光タンパク質１２には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、あるいはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）等が用いられる。例えば、生細胞イメージングに用いられるＧＦＰは、波長４８８ｎｍの光で励起され、波長５０８ｎｍの蛍光を発するタンパク質である。
アクアセプタ蛍光分子として用いる有機蛍光物質は、例えば、Alexa Fluor（登録商標）シリーズが好適に用いられる。なお、有機蛍光物質はアクセプタ蛍光を発するが、この有機蛍光物質の代わりに、アクセプタ吸光を行うもの用いればよく、アクセプタ蛍光を発するものに特に限定されない。
特異的生体分子認識部位１６は、カスパーゼ３やカスパーゼ９等を含むプロテアーゼにより認識され切断されるか、あるいはキナーゼやトランスフェラーゼなどにより認識され修飾を受けるアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質）等である。図１Ｂは、ＦＲＥＴプローブ１０が特定のプロテアーゼにより切断されたときのＮＯＮ−ＦＲＥＴ状態（ＦＲＥＴ解消状態）を説明する図である。
【００１８】
図１Ａに示すように、特定のプロテアーゼが接近する前、有機蛍光物質１４は蛍光タンパク質１２とＦＲＥＴが発生するように蛍光タンパク質１２に、特異的生体分子認識部位１６を介して接続されている。このとき、特異的生体分子認識部位１６が特定のプロテアーゼにより認識され図１Ｂに示されるように切断されると、蛍光タンパク質１２と有機蛍光物質１４との離間距離は大きくなり、ＦＲＥＴは解消する。本実施形態では、後述するように、蛍光タンパク質１２が発するドナー蛍光の蛍光寿命の変化を計測することにより、ＦＲＥＴの発生と解消の程度の有無の情報を得ることができる。このＦＲＥＴの発生と解消の程度（発生効率）の定量化計測の情報から、特定酵素の細胞内における活性の情報を得ることができる。
【００１９】
また、特定生体分子認識部位１６は、図１Ａ、図１Ｂに示される形態の他に、図１Ｃ、図１Ｄに示される形態のものを用いることができる。図１Ｃ，図１Ｄは、ＦＲＥＴ型バイオプローブ１０のＮＯＮ−ＦＲＥＴ状態（ＦＲＥＴ解消状態）、ＦＲＥＴ発生状態を説明する一例の説明図である。図１Ｃ，図１Ｄに示すＦＲＥＴ型バイオプローブ１０は、標的分子（Target）１５ａが有機蛍光物質１４で標識化され、標的分子１５ａが、特定生体分子認識部位１６に結合することにより、ＧＦＰ１２と有機蛍光物質１４が近づいて、ＮＯＮ−ＦＲＥＴ状態（ＦＲＥＴ解消状態）からＦＲＥＴ発生状態に移行する。
図１Ｅ，図１Ｆは、ＦＲＥＴ型バイオプローブ１０のＮＯＮ−ＦＲＥＴ状態（ＦＲＥＴ解消状態）、ＦＲＥＴ発生状態を説明する別の例の説明図である。図１Ｅ，図１Ｆに示すＦＲＥＴ型バイオプローブでは、標的分子（Target）１５ａ（キナーゼやトランスエラーゼ等）により付加されたリン酸、糖、遊離脂肪酸などの付加物１５ｂを認識して結合する有機蛍光色素１４、あるいは上記付加物１５ｂに特異的に結合する有機蛍光色素１４が、特異的生体分子認識部位１６と付加物１５ｂが結合することにより、ＧＦＰ１２に近づいて、ＮＯＮ−ＦＲＥＴ状態（ＦＲＥＴ解消状態）からＦＲＥＴ発生状態に移行する。
このように、ＦＲＥＴ型バイオプローブ１０は種々の形態が存在するが、本明細書では、図１Ａ，図１Ｂに示す形態に基いて説明し、図１Ｃ，図１Ｄに示す形態のＦＲＥＴ型バイオプローブ１０及び図１Ｅ，図１Ｆに示す形態のＦＲＥＴ型バイオプローブ１０についての説明は省略する。
【００２０】
ＦＲＥＴプローブ１０における蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、有機蛍光物質１４の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上、好ましくは４５ｎｍ以上離れている。さらには、７０ｎｍ以上離れていてもよい。一層さらには、２００ｎｍ以上離れていてもよい。さらに、蛍光タンパク質１２の発色団と有機蛍光物質１４とは、フェルスタ距離Ｒ0が５〜４０ｎｍとなるように、特異的生体分子認識部位１６を通して（介して）有機蛍光物質１４と接続するために、蛍光タンパク質１２の配列が改変されている。特異的生体分子認識部位１６が、例えばアミノ酸配列（ペプチド或いはタンパク質ドメイン）、あるいは一部のアミノ酸が修飾された（リン酸化、アセチル化、糖化、ユビキチン化、ニトロ化、ヒドロキシル化など）アミノ酸配列（ペプチド或いはタンパク質ドメイン）の場合、特異的生体分子認識部位１６が蛍光タンパク質１２のアミノ酸配列に結合されるように、蛍光タンパク質１２の配列が改変されている。この場合、特異的生体分子認識部位１６が蛍光タンパク質１２に結合したものは、１つの融合タンパク質とみることもできる。また、特異的生体分子認識部位１６が、アミノ酸配列（ペプチド或いはタンパク質ドメイン）を含まない他の生体分子（糖鎖、核酸、脂質、補酵素など）の場合でも、特異的生体分子認識部位１６を結合させるためのアミノ酸を蛍光タンパク質１２のアミノ酸配列に一端結合させて融合タンパク質を形成させ、さらに、特異的生体分子認識部位１６が蛍光タンパク質１２とのとの結合により蛍光タンパク質１２の特性が変化しないよう、蛍光タンパク質１２は改変されている。この場合、特異的生体分子認識部位１６が蛍光タンパク質１２に結合したものは、人工的なタンパク質複合体とみることもできる。また、この場合も特異的生体分子認識部位１６を介して有機蛍光物質１４は、蛍光タンパク質１２と接続される。
このような接続は、蛍光タンパク質１２のＣ末端近傍またはＮ末端近傍に設けられることが好ましい。接続位置は、例えばＧＦＰの場合、ＧＦＰの６番目のグルタミン酸の位置あるいは２２９番目のイソロイシンの位置近傍である。上記特異的生体分子認識部位１６や特異的生体分子認識部位１６の結合のためのアミノ酸配列などが挿入されることで好ましい位置がずれないよう、蛍光タンパク質１２のアミノ酸配列は改変（欠損、置換、挿入など）されている。有機蛍光物質１４との接続は、ＧＦＰの６番目のグルタミン酸あるいは２２９番目のイソロイシンを通常の遺伝子操作などにより予めシステインなど化学結合に適したアミノ酸に置換させることにより、実現される。また、蛍光タンパク質１２の改変されたアミノ酸配列や特異的認識部位１６に非共有結合で上記接続が実現される場合もある。
ＦＲＥＴプローブ１０の作製方法については、後述する。
【００２１】
図２（ａ）は、ＧＦＰの構造を説明する図である。ＧＦＰは、１本のαヘリックスの中心に蛍光を発する発色団があり、その周りに１１本のβシートで覆われたβカンとよばれる構造を有する。図２（ｂ）はＧＦＰの６番目のグルタミン酸及び２２９番目のイソロイシンのいずれかをシステインに置換したＧＦＰを示す図である。
図３は、蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルＡと有機蛍光物質１４の吸収スペクトルＢの一例（重なり部分を含む）を示す模式図である。
本実施形態では、蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長λ1と有機蛍光物質１４の吸収スペクトルの最大ピーク波長λ2との差分Δλが３５ｎｍ以上、好ましくは４５ｎｍ以上離れていても（７０ｎｍ以上離れていても、さらには２００ｎｍ以上離れていても）、フェルスタ距離Ｒ0を、５〜４０ｎｍとすることができ、ＦＲＥＴを発生させることができる。なお、上記フェルスタ距離Ｒ0の値は、フェルスタ距離の計算式である式（２）、（３）の各パラメータを、蛍光タンパク質１２及び有機蛍光物質１４の立体構造や電子分布を考慮して分子動力学法により求めてフェルスタ距離Ｒ0を計算したものである。このことは、図３中の蛍光スペクトルＡと吸収スペクトルＢの重なり部分の面積が小さくても、蛍光タンパク質１２に、有機蛍光物質１４を接続させることにより、特異的生体分子認識部位１６などが挿入されても蛍光タンパク質１２と有機蛍光物質１４との間でＦＲＥＴを発生させることができることを意味する。これは、蛍光タンパク質１２の双極子モーメントの向きに対してＦＲＥＴが発生し易い向きに有機蛍光物質１４が配向できる制限と回転自由度を持って蛍光タンパク質１２に接続されるからであると考えられる。すなわち、有機蛍光物質１４は、有機蛍光物質１４がＦＲＥＴの発生に望ましい配向の制限と回転の自由度を持つように、蛍光タンパク質１２の部分に接続される。
【００２２】
図４には、特異的生体分子認識部位１６として、カスパーゼ３により認識されると、酵素カスパーゼ３により切断されるアミノ酸配列が挿入された蛍光タンパク質（ＧＦＰあるいはＲＦＰ）を用いて、この蛍光タンパク質と有機蛍光物質とを種々組み合わせて作製したＦＲＥＴプローブ１０の例を列挙して示している。
例えば、図４中の「ＧＦＰ−ｃａｓ３−Ａ５４６」は、ＧＦＰを蛍光タンパク質１２として用い、カスパーゼ３により認識されると切断される特異的生体分子認識部位（ｃａｓ３）を用い、吸収に関して最大ピーク波長５４６ｎｍを持つ有機蛍光物質１４、具体的には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｅ（登録商標）５４６を用いることを示す。図４からわかるように、いずれもフェルスタ距離Ｒ0は５〜４０ｎｍであり、蛍光タンパク質の発色団と有機蛍光物質の距離を鑑みるといずれの場合もＦＲＥＴが発生する。これらＧＦＰ、ＲＦＰの蛍光タンパク質の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、Ａ５４６〜Ａ７５０等の有機蛍光物質の吸収スペクトルの最大ピーク波長（およそ５４０ｎｍから７５０ｎｍ）と３５ｎｍ以上離れている。その際、蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、有機蛍光物質１４の蛍光スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れていることが、後述するＦＲＥＴの計測時、ＦＲＥＴ計測装置において定めたアクセプタ蛍光分子の直接励起やドナー蛍光の波長帯域にアクセプタ蛍光が漏れ込まない点で好ましい。
なお、フェルスタ距離Ｒ0は、通常、下記式（１）にしたがってＦＲＥＴ効率Ｅと関係する。式（１）からわかるように、フェルスタ距離Ｒ0が大きいほどＦＲＥＴ効率Ｅは高くなることを意味する。ｒ＝Ｒ0において、ＦＲＥＴ効率Ｅが０．５、すなわちＦＲＥＴが５０％の効率で発生する。なお、フェルスタ距離Ｒ0は下記式（２）によって表され従来のＦＲＥＴ型バイオプローブでは１〜１０ｎｍとなっている。フェルスタ距離Ｒ0中のＪは、ドナー蛍光分子である蛍光タンパク質の蛍光スペクトルとアクセプタ蛍光分子である有機蛍光物質のモル吸光係数のスペクトル（励起スペクトル、吸収スペクトル）とを乗算して積分した重なり積分値である。具体的には、重なり積分値Ｊは、下記式（３）によって表される。
このよう方法で求められる従来のＦＲＥＴ型バイオプローブのフェルスタ距離Ｒ0の値に対して、本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０のフェルスタ距離Ｒ0の値は大きい。
【００２３】
【数１】
2014055777.tif 000003
【００２４】
【数２】
2014055777.tif 000004
【００２５】
【数３】
2014055777.tif 000005
【００２６】
図５（ａ）は、ＧＦＰの蛍光スペクトルＰ1と、ＧＦＰ−ｃａｓ３−Ａ６３３のＦＲＥＴ発生時の蛍光スペクトルＰ2を示す図である。これらの蛍光スペクトルは、分光光度計を用いて計測された結果である。図５（ａ）に示すように、蛍光スペクトルＰ1は、ＧＦＰの発する波長５０８ｎｍが最大ピーク波長となっており、ＧＦＰの蛍光特性を表している。一方、蛍光スペクトルＰ2は、波長５０８ｎｍにおいて最大ピーク波長を有するとともに、波長６４７ｎｍにおいてピーク波長を有する。このピーク波長は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｅ（登録商標）６３３の発光の最大ピーク波長に対応する。しかも、ＧＦＰ−ｃａｓ３−Ａ６３３の波長５０８ｎｍにおける発光強度は、蛍光スペクトルＰ1の発光強度に対して大きく低下している。このことより、ＧＦＰとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｅ（登録商標）６３３との間でＦＲＥＴが発生しているといえる。
また、図５（ｂ）は、ＲＦＰの蛍光スペクトルＰ3と、ＲＦＰ−ｃａｓ３−Ａ６８０のＦＲＥＴ発生時の蛍光スペクトルＰ4を示す図である。これらの蛍光スペクトルは、分光光度形を用いて計測された結果である。図５（ｂ）に示すように、蛍光スペクトルＰ3は、ＲＦＰの発する波長５８５ｎｍが最大ピーク波長となっており、ＲＦＰの蛍光を表している。一方、蛍光スペクトルＰ4は、波長５８５ｎｍにおいて最大ピーク波長を有するとともに、波長７０２ｎｍにおいてピーク波長を有する。このピーク波長は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｅ（登録商標）６８０の発光の最大ピーク波長に対応する。しかも、ＲＦＰ−ｃａｓ３−Ａ６８０の波長５８５ｎｍにおける発光強度は、蛍光スペクトルＰ3に対して低下している。このことより、ＲＦＰとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｅ（登録商標）６８０との間でＦＲＥＴが発生しているといえる。
【００２７】
図６は、ＲＦＰを蛍光タンパク質１２とし、種々の有機蛍光物質１４を替えたときのＦＲＥＴプローブのアクセプタ蛍光の蛍光強度と蛍光寿命τ（ナノ秒）を示す図である。図６によると、概ねＦＲＥＴ発生時のアクセプタ蛍光の蛍光強度が高くなる程、ドナー蛍光の蛍光寿命が短くなっている。これより、ドナー蛍光分子で励起されたエネルギーがＦＲＥＴによりアクセプタ分子である有機蛍光物質１４に多く移動する程、ドナー蛍光の蛍光寿命は短くなっていることを意味する。したがって、図６に示す蛍光の挙動は、ＦＲＥＴの特徴をよく表している。
【００２８】
このようなＦＲＥＴプローブ１０は、以下の方法で作製される。
【００２９】
（ＦＲＥＴプローブの作製方法）
ＦＲＥＴプローブ１０の作製では、まず、蛍光タンパク質をコードする遺伝子からシステイン残基を別のアミノ酸に置換する遺伝子操作が行われる。次に、上記蛍光タンパク質をコードする遺伝子に検出を行う標的分子と相互作用する特異的認識アミノ酸配列１６をコードする遺伝子をＮまたはＣ末端近傍に挿入する遺伝子操作が行われる。この蛍光タンパク質に導入された特異的認識領域前後に新たなシステイン残基を挿入する様な遺伝子操作が行われる。これにより改変された蛍光タンパク質の遺伝子をプラスミドに組み込み大腸菌を形質転換する。上記形質転換された大腸菌に蛍光タンパク質変異体を発現誘導させて精製する。精製された蛍光タンパク質変異体のシステイン残基に有機蛍光物質が化学修飾される（図１Ａ及び１Ｂ）。あるいは、有機蛍光物質の化学修飾を行う代わりに、上記精製された蛍光タンパク質変異体と相互作用する標的分子が蛍光色素で化学修飾される場合もある(図１Ｃ及び１Ｄ)。
以上の過程により得られた蛍光タンパク質変異体が蛍光タンパク質１２として用いられ、化学修飾に用いた蛍光色素が有機蛍光物質１４として用いられる。
【００３０】
（ＦＲＥＴ計測装置）
このようなＦＲＥＴプローブ１０を用いて以下説明するフローサイトメータがＦＲＥＴの計測に用いられる。
図７は、ＦＲＥＴプローブ１０を用いてＦＲＥＴを計測するＦＲＥＴ計測装置１００の概略の構成を示す図である。
【００３１】
ＦＲＥＴ計測装置１００は、信号処理装置１２０と、分析装置（コンピュータ）１８０と、を有する。
信号処理装置１２０は、ＦＲＥＴプローブ１０が取り込まれた測定対象物である生細胞にレーザ光を照射し、このＦＲＥＴプローブ１０から発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする。分析装置１８０は、信号処理装置１２０で得られた処理結果からＦＲＥＴプローブ１０の蛍光を計測して生細胞の状態の分析を行なう。
【００３２】
ＦＲＥＴ計測装置１００は、溶液中に混濁された状態で用意された複数の生細胞のそれぞれに含まれるＦＲＥＴプローブ１０が、レーザの照射を受けた際に発するドナー蛍光の蛍光寿命を計測することにより、ＦＲＥＴの発生の有無を調べる。さらに、ＦＲＥＴ計測装置１００は、ＦＲＥＴの発生によって生細胞の状態を分析する。ＦＲＥＴプローブ１０は、キメラ型のバイオプローブであり、生細胞内に発現誘導させるのではなく、タンパク質導入剤により複数種類のＦＲＥＴプローブ１０を取り込むことができる。例えば、１つの生細胞内に、後述するようにＧＦＰ−ｃａｓ９−Ｄ６８０及びＲＦＰ−ｃａｓ３−Ａ６３３を取り込むことができる。また、取り込ませるＦＲＥＴプローブ１０の濃度比などもおよそ制御できる。
【００３３】
信号処理装置１２０は、レーザ光源部１２２と、受光部１２４，１２６と、制御・処理部１２８と、管路１３０と、を有する。制御・処理部１２８は、レーザ光源部１２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び生細胞中のＦＲＥＴプローブ１０が発する蛍光の蛍光信号を処理する処理部を有する。管路１３０は、高速流を形成するシース液に生細胞を流す。この生細胞は、管路１３０中を１つずつ１列に流れる。
管路１３０の出口には、回収容器１３２が設けられている。ＦＲＥＴ計測装置１００には、レーザ光の照射により短時間内に生細胞を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
【００３４】
レーザ光源部１２２は、ドナー蛍光分子である蛍光タンパク質１２を励起するためのレーザ光を出射する光源である。例えば、ＧＦＰを蛍光タンパク質１２として用いる場合、波長３９５ｎｍのレーザ光が用いられる。ＣＦＰが蛍光タンパク質１２として用いられる場合、波長４０５〜４４０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光源部１２２は、このような、蛍光タンパク質１２を励起するための波長のレーザ光を、所定の周波数で強度変調して出射する部分である。
【００３５】
一般に、ＦＲＥＴでは、ドナー蛍光分子がレーザ光により励起され、その一部分が蛍光を放射し、一部のエネルギーはクーロン相互作用（双極子モーメントの作用）によりアクセプタ蛍光分子へ流れる。このクーロン相互作用によるエネルギー移動は、ドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子との間の距離が数ｎｍの（およそ１ｎｍ〜１０ｎｍ）極めて至近距離によって生じるものである。したがって、エネルギー移動が起きることで、アクセプタ蛍光分子が励起されてアクセプタ蛍光分子から蛍光が放射される。
【００３６】
本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０では、上述したように、蛍光タンパク１２の蛍光スペクトルのピーク波長は、有機蛍光物質１４の吸収スペクトルのピーク波長と３５ｎｍ以上離れており、有機蛍光物質１４が発するアクセプタ蛍光は、概ねＦＲＥＴによって発する蛍光である。また、蛍光タンパク１２の発色団と有機蛍光物質１４とは、分子動力学的計算よりおよそ３nｍ程度離れていると見積もられ、フェルスタ距離Ｒ0、すなわちＦＲＥＴが５０％発生するためのドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子間の距離が５〜４０ｎｍとなるように、有機蛍光物質１４特異的生体分子認識部位１６の蛍光タンパク質１２への接続位置が定められている。このため、本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０においては極めて効率の良いＦＲＥＴが発生する。
さらに、蛍光タンパク１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、有機蛍光物質１４の蛍光スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上離れていてもよい。蛍光タンパク１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長と、有機蛍光物質１４の蛍光スペクトルの最大ピーク波長路の差分は、さらには、１００ｎｍ以上であってもよく、さらには２００ｎｍ以上であってもよい。また、上記差分の上限は好ましくは、３００ｎｍ以下である。
この場合、受光部１２６で受光した蛍光について、ドナー蛍光を主に受光するチャンネルとアクセプタ蛍光を主に受光するチャンネルとの間で蛍光の漏れ込みを抑制することができる。さらに後述するようなフィルタを用いるのでドナー蛍光とアクセプタ蛍光との間で生じる漏れ込みをより十分に防止することができる。
【００３７】
受光部１２４は、管路１３０を挟んでレーザ光源部１２２と対向するように配置されている。レーザ光源部１２２からのレーザ光は、管路１３０中の一点で収束する。このレーザ光の収束した点を、生細胞が１つずつ通過する。したがってこのレーザ光の収束した点は、ＦＲＥＴを計測する測定点となる。この測定点を通過する生細胞によってレーザ光が前方散乱することにより、生細胞が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を受光部１２４は備える。この受光部１２４から出力される信号は、制御・処理部１２８に供給され、制御・処理部１２８において生細胞が管路１３０中の測定点を通過するタイミングを知らせ、信号の処理を開始するトリガ信号として用いられる。
【００３８】
一方、受光部１２６は、レーザ光源部１２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交方向であって、かつ管路１３０中の生細胞の移動方向に対して直交方向に配置されている。測定点にてレーザ光の照射を受けた生細胞が発する蛍光を受光するフォトマルチプライヤ（光電子倍増管）やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を備える。
【００３９】
図８は、受光部１２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。図８に示す受光部１２６は、図８に示す測定点を通過する生細胞１１２が発する蛍光の蛍光信号を集束させるレンズ系１２６ａと、ダイクロイックミラー１２６ｂ1，１２６ｂ2と、バンドパスフィルタ１２６ｃ1、１２６ｃ2と、光電子倍増管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器１２７ａ、１２７ｂと、を有する。レンズ系１２６ａは、受光部１２６に入射した蛍光を光電変換器１２７ａおよび１２７ｂの受光面に集束させるように構成されている。
【００４０】
ダイクロイックミラー１２６ｂ1，１２６ｂ2は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ１２６ｃ1，１２６ｃ2は、光電変換器１２７ａ，１２７ｂの各受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光の波長帯域に対応して設定されており、互いに異なる波長帯域となっている。
すなわち、光電変換器１２７ａおよび１２７ｂで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー１２６ｂ1，１２６ｂ2の反射波長帯域および透過波長帯域、及びバンドパスフィルタ１２６ｃ1，１２６ｃ2の透過する蛍光の波長帯域が設定されている。具体的には、光電変換器１２７ａには、蛍光タンパク質１１２の発するドナー蛍光を受光するように、ドナー蛍光の波長帯域に対応した光を反射するダイクロイックミラー１２６ｂ1が設けられ、ドナー蛍光の波長帯域に対応した光を透過するバンドパスフィルタ１２６ｃ1が設けられている。また、光電変換器１２７ｂには、有機蛍光物質１４の発するアクセプタ蛍光を受光するように、アクセプタ蛍光の波長帯域に対応した光を反射するダイクロイックミラー１２６ｂ2が設けられ、アクセプタ蛍光の波長帯域に対応した光を透過するバンドパスフィルタ１２６ｃ2が設けられている。
上述したように、生細胞１１２に取り込まれ、ドナー蛍光及びアクセプタ蛍光を発するＦＲＥＴプローブ１０において、蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長が、有機蛍光物質１４の蛍光スペクトルの最大ピーク波長と４５ｎｍ以上離れている場合、ダイクロイックミラー１２６ｂ2、バンドパスフィルタ１２６ｃ1、１２６ｃ2を設けなくてもよい。ドナー蛍光とアクセプタ蛍光の波長は十分に離れているので、光電変換器１２７ａにアクセプタ蛍光が漏れ込むことは殆ど生じない。また、光電変換器１２７ｂにドナー蛍光が漏れ込むことは殆ど生じない。
【００４１】
ここで、蛍光の漏れ込みが生じ、光電変換器１２７ａにアクセプタ蛍光の一部分が含まれる場合、後述するようにドナー蛍光の蛍光寿命の変化を正確に求めることができない。このため、蛍光の漏れ込みは、ＦＲＥＴの発生と解消の程度を正確に計測、評価する上での不確定因子となり、計測・評価の精度を低下させる。したがって、ＦＲＥＴプローブ１０は、蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、有機蛍光物質１４の蛍光スペクトルの最大ピーク波長とおよそ４５ｎｍ以上離れていること、漏れ込みを抑制し、さらに、ＦＲＥＴの発生と解消の程度を正確に計測、評価する上で好ましい。
【００４２】
光電変換器１２７ａ，１２７ｂは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。受光部１２６では、光電変換器１２７ａがドナー波長帯域の光を受光し、光電変換器２７ｂが、アクセプタ波長帯域の光を受光するよう構成されている。
【００４３】
図９は、本実施形態の制御・処理部１２８の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
制御・処理部１２８は、図９に示されるように、信号生成部１４０と、信号処理部１４２と、コントローラ１４４と、を有して構成される。信号生成部１４０及びコントローラ１４４は、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。
信号生成部１４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部１４０は、発振器１４６、パワースプリッタ１４８及びアンプ１５０，１５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２に供給するとともに、信号処理部１４２に供給する部分である。信号処理部１４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換器１２７ａ，１２７ｂから出力される蛍光信号の位相差検出のための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜１００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
【００４４】
信号処理部１４２は、光電変換器１２７ａ，１２７ｂから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により生細胞１１２が発する蛍光の位相遅れに関する情報（位相差）を抽出する部分である。信号処理部１４２は、光電変換器１２７ａ，１２７ｂから出力される蛍光信号を増幅するアンプ１５４ａ，１５４ｂと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部１４０から供給された正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ（不図示）、及び増幅された蛍光信号を上記変調信号に合成するＩＱミキサ（不図示）を有する位相差検出器１５６を有して構成される。
【００４５】
位相差検出器１５６に設けられる図示されないＩＱミキサは、光電変換器１２７ａ，１２７ｂから供給される蛍光信号を、信号生成部１４０から供給される変調信号を参照信号として合成するために、光電変換器１２７ａ，１２７ｂの別に設けられている。具体的には、ＩＱミキサのそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算（ミキシング）して、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算（ミキシング）して、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ１４４に供給される。
【００４６】
コントローラ１４４は、信号生成部１４０に所定の周波数の正弦波信号を生成させるように制御するとともに、信号処理部１４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を求める部分である。具体的には、コントローラ１４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、ＦＲＥＴ計測装置１００の全動作を管理するシステム制御器１６０と、信号処理部１４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ１６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ１６４と、を有する。
【００４７】
分析装置１８０は、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の処理信号から、各蛍光の成分の蛍光強度情報や位相情報、蛍光寿命（蛍光緩和時定数）、レシオメトリなどを算出する装置である。例えば、光電変換器２７ａによる蛍光信号から得られた処理信号を用いて、ドナー蛍光の蛍光寿命を計測し、蛍光寿命の変化からＦＲＥＴの発生の有無を判定するとともに、この判定結果に基づいて生細胞１１２の状態を判定する。
【００４８】
図１０は、分析装置１８０の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
分析装置１８０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置であり、ＣＰＵ１８４、メモリ１８６、入出力部１８８の他に、ソフトウェアを起動することによって形成される蛍光情報算出ユニット１８９、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０と、細胞状態判定ユニット１９２と、を有する。また、分析装置１８０には、入出力部１８８を通してディスプレイ、プリンタ等の出力装置１９４が接続されている。また、分析装置１８０は、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の入力を受けて、ＡＤ変換して、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の検出値を出力するＡＤ変換ボード１８２を備える。
【００４９】
ＣＰＵ１８４は、コンピュータに設けられた演算プロセサであり、蛍光情報算出ユニット１８９、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０、及び細胞状態判定ユニット１９２の各種計算を実質的に実行する。
メモリ１８６は、コンピュータ上で実行することにより、蛍光情報算出ユニット１８９、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０、及び細胞状態判定ユニット１９２を形成するプログラムを格納したＲＯＭと、これらのユニットにより算出された処理結果や入出力部１８８から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備えている。
入出力部１８８は、コントローラ１４４から供給され、ＡＤ変換ボード１８２でＡＤ変換された蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の検出値の入力を受け入れるとともに、各ユニットで作成された処理結果の値やスキャッタグラムやヒストグラム等の情報を出力装置１９４に出力するために用いられる。出力装置１９４は、各ユニットで求められた情報を表示する。
【００５０】
蛍光情報算出ユニット１８９は、コントローラ１４４から供給されてＡＤ変換されたｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の検出値から、光電変換器１２７ａおよび１２７ｂそれぞれで受光した蛍光（ドナー蛍光、アクセプタ蛍光）の蛍光強度情報および位相情報（位相差の情報）を求める。
具体的には、蛍光情報算出ユニット１８９は、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）の検出値及びｓｉｎ成分（虚数部）の検出値の２乗加算和の平方根の値を算出し、この値を蛍光強度情報とする。さらに、蛍光情報算出ユニット１８９は、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）の検出値を、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）の検出値で除算して得られた値を求め、この値をさらに２πｆ（ｆはレーザ光の変調周波数）で除算することにより、蛍光寿命を求める。すなわち、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）の検出値を、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）の検出値で除算して得られた値をｔａｎθとしたとき、蛍光寿命τ＝ｔａｎθ／（２πｆ）に従って求められる。このような式によって蛍光寿命を求めることができるのは、ドナー蛍光及びアクセプタ蛍光の発光過程がいずれも１次遅れ応答に沿って進むためである。
特に、ＦＲＥＴが発生する場合、蛍光の挙動を１次緩和応答で表し、ドナー蛍光分子の発光遷移速度定数をｋfとし、共鳴エネルギー移動を除く無輻射繊維速度定数をｋnrとし、共鳴エネルギー移動の速度定数をｋtとしたとき、ＦＲＥＴの解消状態における蛍光寿命τは、１／（ｋf＋ｋnr）となり、ＦＲＥＴが発生した状態における蛍光寿命τは、１／（ｋf＋ｋnr＋ｋt）となる。したがって、ＦＲＥＴが発生したときのドナー蛍光の蛍光寿命τは短い。測定点でレーザ光により照射されて同時に発する蛍光タンパク１２は複数あるので、蛍光情報算出ユニット１８９は、複数のＦＲＥＴプローブ１０の発するドナー蛍光の平均的な蛍光寿命τを算出することになる。このような平均的な蛍光寿命τは、生細胞１１２が測定点を通過する間、順次算出される。
また、蛍光情報算出ユニット１８９は、アクセプタ蛍光の蛍光強度情報をドナー蛍光の蛍光強度情報で除算したレシオメトリも算出する。
【００５１】
ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、蛍光情報算出ユニット１８９で算出されたドナー蛍光の蛍光寿命τを用いてＦＲＥＴの発生と解消の程度を算出する。具体的には、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、算出されたドナー蛍光の蛍光寿命τのヒストグラムを算出し、予めメモリ１８６に記録していた蛍光タンパク質１２のドナー蛍光の蛍光寿命のヒストグラムと比較することにより、ＦＲＥＴの発生の有無を判定する。より具体的には、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、判定しようとする蛍光寿命τのヒストグラムの最大頻度蛍光寿命（最大頻度蛍光寿命をτmaxという）と、ＦＲＥＴが解消したときの蛍光寿命のヒストグラムの最大頻度蛍光寿命τmaxをそれぞれ求める。この２つの最大頻度蛍光寿命τmaxから、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、ＦＲＥＴの発生と解消の程度を判定する。さらには、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、上記比較する２つのヒストグラムを規格化した後、規格化したヒストグラムの分布の一致度によってＦＲＥＴの発生と解消の程度を判定することもできる。例えば、ヒストグラム同士を差し引くことにより得られるヒストグラムの差分の情報を用いる。例えば、ヒストグラムの差分の絶対値を蛍光寿命τの全範囲において加算して、この加算値が所定の値より大きい場合、ＦＲＥＴは解消したと判定し、加算値が所定の値以下の場合、ＦＲＥＴは発生していると判定する。
【００５２】
さらに、蛍光情報算出ユニット１８９で算出したレシオメトリを用いてＦＲＥＴの判定を補強するように用いてもよい。例えば、ＦＲＥＴが発生する場合、ドナー蛍光の蛍光強度は低下しアクセプタ蛍光の蛍光強度は増大するので、レシオメトリは増大する。したがって、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、上述したドナー蛍光の蛍光寿命τに基く判定結果に加えて、レシオメトリの変化によって、ＦＲＥＴの発生の有無を判定することができる。なお、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、ＦＲＥＴの発生の有無を２値的に判定してもよいが、ＦＲＥＴの発生を蛍光寿命τの変化に応じて定まる連続的な値によって定量的に判定することもできる。例えば、ＦＲＥＴが全く発生していない状態、すなわち予めメモリ１８６に記録していた蛍光タンパク質１２のドナー蛍光の蛍光寿命のヒストグラムをレベル１０とする。ＦＲＥＴ計測装置１００は、ＦＲＥＴがすべて発生しているときのドナー蛍光の蛍光寿命τのヒストグラムを予め測定して、予めメモリ１８６に記録し、このときのドナー蛍光の蛍光寿命のヒストグラムをレベル１とする。そして、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、レベル１とレベル１０の間で、ヒストグラムのレベル２〜９の範囲を定める。ＦＲＥＴ判定ユニット１９０は、ＦＲＥＴの発生と解消の程度を判定するためにＦＲＥＴ計測をした生細胞１１２におけるドナー蛍光の蛍光寿命のヒストグラムが、レベル１とレベル１０のヒストグラムとの間のどのレベルに位置するかを、上述した最大頻度蛍光寿命τmaxあるいは一致度によって定量的に定めることができる。
【００５３】
細胞状態判定ユニット１９２は、ＦＲＥＴ判定ユニット１９０の判定結果にしたがって、測定対象物である生細胞１１２の内部の状態を判定する。例えば、特異的生体分子認識部位１６が、カスパーゼ３で認識されたときカスパーゼ３により切断されるタンパク質である場合、ＦＲＥＴが解消されたことにより、生細胞１１２は、カスパーゼ３が生細胞１１２内で発現した後活性を有した状態にあると判定することができる。
ＦＲＥＴ判定ユニット１９０で生成されたヒストグラム及びＦＲＥＴの発生と解消の程度あるいはＦＲＥＴの発生のレベルの情報、さらには、細胞状態判定ユニット１９２の判定結果は、出力装置１９４に出力され、画面表示されあるいはプリントされる。
【００５４】
上述したように、ＦＲＥＴプローブ１０は、キメラ型のバイオ型プローブであり、生細胞内に発現誘導させるのではなく、タンパク質導入剤により複数種類のＦＲＥＴプローブ１０を取り込むことができるので、複数種類のＦＲＥＴプローブ１０を用いて、生細胞１１２の状態を並列的に同時に判定することができる。例えば、特異的生体分子認識部位１６に、カスパーゼ３により認識されたときカスパーゼ３により切断されるアミノ酸配列を用いたＦＲＥＴプローブ１０と、特異的生体分子認識部位１６にカスパーゼ9で認識されたときカスパーゼ９により切断されるアミノ酸配列を用いたＦＲＥＴプローブ１０の２種類を用いる。この場合、ＦＲＥＴプローブ１０の蛍光タンパク質１２の種類を異ならせることにより、分析装置１８０は、異なるドナー蛍光を同時に計測し、ＦＲＥＴの発生と解消の程度及び生細胞１１２の状態を判定することができる。この場合、図８に示す光電変換器１２７ａで、例えば一方の種類の蛍光タンパク１２の発するドナー蛍光を受光するようにダイクロイックミラー１２６ｂ1と、バンドパスフィルタ１２６ｃ1を構成し、光電変換器１２７ｂで、他方の種類の蛍光タンパク質１２の発するドナー蛍光を受光するようにダイクロイックミラー１２６ｂ2と、バンドパスフィルタ１２６ｃ2を構成することもできる。この場合において、用いる２種類の蛍光タンパク質１２の発する蛍光の最大ピーク波長同士は４５ｎｍ以上離れていることが、光電変換器１２７ａ，１２７ｂに蛍光が漏れ込むことを防止する点で好ましい。
勿論、光電変換器１２７ａ，１２７ｂの他にさらに別の光電変換器を設けて、アクセプタ蛍光を受光してもよい。
【００５５】
（ＦＲＥＴ計測方法）
本実施形態のＦＲＥＴ計測方法では、上述したＦＲＥＴプローブ１０が用いられる。
まず、
（Ａ）ＦＲＥＴプローブ１０を取り込んだ生細胞１１２を、ＦＲＥＴ計測装置１００は、フローセル１３０内に１つずつ流す。ＦＲＥＴ計測装置１００は、管路１３０の測定点を通過する生細胞１１２に対して変調周波数で強度変調されたレーザ光で照射する。
（Ｂ）次に、照射された生細胞１１２内のＦＲＥＴプローブ１０の蛍光タンパク質１２が発するドナー蛍光を光電変換器１２７ａが受光する。
（Ｃ）受光したドナー蛍光とレーザ光の強度変調の情報から、分析装置１８０はドナー蛍光の蛍光寿命τを算出する。
（Ｄ）さらに、分析装置１８０は、蛍光寿命τと、ＦＲＥＴが解消したときの蛍光タンパク質１２が発する蛍光の蛍光寿命τとを比較することにより、ＦＲＥＴプローブ１０のＦＲＥＴの発生と解消の程度を判定する。
【００５６】
その際、有機蛍光物質１４の発するアクセプタ蛍光の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は７００ｎｍ以上であってもよい。有機蛍光物質１４は、蛍光タンパク質１２との間でＦＲＥＴが発生すればよく、本実施形態では、ドナー蛍光が正確に計測できればよく、アクセプタ蛍光を計測する必要性がない。このため、アクセプタ蛍光の波長は、ドナー蛍光の最大ピーク波長に対して長波長方向に大きくシフトした波長であってもよく、大きく波長がシフトするほど、蛍光の漏れ込みが少なくなるので好ましい。アクセプタ蛍光分子に対応する有機蛍光物質１４が吸光のみを行う場合は漏れ込みが完全になくなるためさらに望ましい。
【００５７】
また、ＦＲＥＴ蛍光計測方法は、以下の方法を用いることもできる。すなわち、少なくとも２種類のＦＲＥＴ蛍光プローブ１０が１つの生細胞１１２に取り込まれる。その際、いずれの種類のＦＲＥＴ蛍光プローブ１０においても、蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長は、有機蛍光物質１４の吸収スペクトルの最大ピーク波長と３５ｎｍ以上、好ましくは４５ｎｍ以上離れており、蛍光タンパク質１２の発色団と有機蛍光物質１４とは、フェルスタ距離Ｒ0、すなわちＦＲＥＴが５０％発生するためのドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子間の距離が５〜４０ｎｍとなるように、有機蛍光物質１４と特異的生体分子認識部位１６の蛍光タンパク１２への接続位置が定められている。このため、本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０においては極めて計測に効率の良いＦＲＥＴが発生する。
このような少なくとも２種類のＦＲＥＴ蛍光プローブ１０のそれぞれについて、上記（Ａ）〜（Ｄ）のステップを同時に並行して行うことにより、それぞれのＦＲＥＴ蛍光プローブ１０の蛍光タンパク質１２の発するドナー蛍光の蛍光寿命τを算出し、それぞれのＦＲＥＴプローブ１０のＦＲＥＴの発生と解消の程度を判定することができる。
その際、さらに、２種類のＦＲＥＴプローブ１０の発するドナー蛍光の蛍光寿命のそれぞれの比較結果に基づいて、生細胞１１２の状態を判定する。生細胞１１２の状態とは、生細胞１１２に特異的生体分子認識部位１６が認識する酵素が活性を有した状態で存在するか否かをいう。
したがって、ＦＲＥＴプローブ１０の特異的生体分子認識部位１６を互いに異ならせることにより、生細胞１１２の内部の状態を異なる種類の酵素が活性を有した状態で存在するか否かを同時に判定することができる。
【００５８】
［実験例］
図１１（ａ）〜（ｃ）は、３種類のＦＲＥＴプローブ１０Ａ〜１０Ｃを示している。
ＦＲＥＴプローブ１０Ａは、蛍光タンパク質１２としてＧＦＰを用い、特異的生体分子認識部位１６としてカスパーゼ９（Ｃａｓ９）で認識されるとカスパーゼ９により切断されるタンパク質を用い、有機蛍光物質１４としてＤ６８０（Thermo Fisher Scientific Ｉｎｃ．製）を用いた。
ＦＲＥＴプローブ１０Ｂは、蛍光タンパク質１２としてＧＦＰを用い、特異的生体分子認識部位１６としてカスパーゼ３（Ｃａｓ３）で認識されるとカスパーゼ３により切断されるタンパク質を用い、有機蛍光物質１４としてＡｌｅｘａ（登録商標）７５０（Life Technologies Corporation製）を用いた。
ＦＲＥＴプローブ１０Ｃは、蛍光タンパク質１２としてＲＦＰを用い、特異的生体分子認識部位１６としてカスパーゼ３（Ｃａｓ３）で認識されるとカスパーゼ３により切断されるタンパク質を用い、有機蛍光物質１４としてＡｌｅｘａ（登録商標）６３３（Life Technologies Corporation製）を用いた。
ＦＲＥＴプローブ１０は、上述したＦＲＥＴプローブの作製方法により作製した。
【００５９】
生細胞１１２にある薬剤を導入して、カスパーゼ３、カスパーゼ９の活性状態を生細胞１１２の状態として判定することを行った。
生細胞１１２を含む溶液は、３つのサンプルに分けられ、それぞれのサンプル中の生細胞１１２にＦＲＥＴプローブ１０Ａ〜１０Ｃを別々に取り込ませ、さらに、カスパーゼ３，９の発現と活性化を誘発する薬剤を導入した。細胞１１２への薬剤の導入後の生細胞１１２の状態を判定するために、ＦＲＥＴ計測装置１００を用いて所定の時間毎にＦＲＥＴ計測を行い、蛍光寿命τを算出した。
【００６０】
図１２（ａ），（ｂ）は、ＦＲＥＴプローブ１０Ａを用いたときのトナー蛍光の蛍光寿命τのヒストグラム（薬剤導入１．５時間後、３．０時間後）を示す図である。図１２（ａ）に示すヒストグラムからわかるように、薬剤投入１．５時間後における蛍光寿命τは、薬剤非導入（ＦＲＥＴが発生）の場合に比べて、長くなっていることがわかる。これより、薬剤投入１．５時間後においてすでに特異的生体分子認識部位１６はカスパーゼ９により切断されて、ＦＲＥＴが解消したといえる。図１２（ｂ）に示すヒストグラムからもわかるように、薬剤投入３．０時間後における蛍光寿命τも、薬剤非導入（ＦＲＥＴが発生）の場合に比べて、長くなっている。しかも、蛍光寿命τの増大は、図１２（ａ）の場合に比べて大きいことがわかる。これより、生細胞１１２内では、薬剤導入１．５時間後において、カスパーゼ９が活性状態にあり、薬剤導入３時間後において、カスパーゼ９の活性状態がより進んだといえる。
【００６１】
図１２（ｃ）〜（ｅ）は、ＦＲＥＴプローブ１０Ｂを用いたときのトナー蛍光の蛍光寿命τのヒストグラム（薬剤導入１．５時間後、３．０時間後、５．０時間後）を示す図である。図１２（ｃ），（ｄ）に示すヒストグラムからわかるように、薬剤投入１．５時間後、３．０時間後における蛍光寿命τは、薬剤非導入（ＦＲＥＴが発生）の場合の蛍光寿命τと略同じである。これより、薬剤投入３．０時間後においてもＦＲＥＴの発生が維持され、生細胞１１２内でカスパーゼ３が活性状態にないことがわかる。しかし、図１２（ｅ）に示すヒストグラムからわかるように、薬剤投入５．０時間後における蛍光寿命τは、薬剤非導入（ＦＲＥＴが発生）の場合の蛍光寿命τに比べて長くなっており、ＦＲＥＴが一部解消していることがわかる。これより、薬剤導入５．０時間後において、生細胞１１２内でカスパーゼ３が発現して活性状態にあることがわかる。図１３は、ＦＲＥＴプローブ１０Ｃを用いて計測された、薬剤投入５．０時間後における蛍光寿命τのヒストグラムを示す図である。図１３に示されるように、図１２（ｅ）と同様に、薬剤投入５．０時間後における蛍光寿命τは、薬剤非導入（ＦＲＥＴが発生）の場合の蛍光寿命τに比べて長くなっており、ＦＲＥＴが一部解消していることがわかる。これより、薬剤導入５．０時間後において、生細胞１１２内でカスパーゼ３が活性状態にあることがわかる。このように、ＦＲＥＴプローブ１０の蛍光タンパク質１２及び有機蛍光物質１４の種類を代えても同じ結果を得ることができる。したがって、本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０は、生細胞１１２内の状態を効率よく計測することができる。特に、ＦＲＥＴプローブ１０は、キメラ型のバイオ型プローブであり、生細胞１１２内で発現誘導させるのではなく、タンパク質導入剤によりに複数種類のＦＲＥＴプローブ１０を取り込むことができるので、１回のＦＲＥＴ計測により、カスパーゼ３、カスパーゼ９のような複数の酵素の活性状態を判定することができる。
【００６２】
なお、カスパーゼは生細胞１１２の機能を調整するプロテアーゼとして知られ、現在カスパーゼ１〜１４まで確認されている。これらのカスパーザの多くは生細胞のアポートシス（細胞死）に関わっている。生細胞１１２がアポートシスに到るシグナルパスは、カスパーゼ９が活性化された後、カスパーゼ３が活性化されて、最終的にアポートシスに到ることが知られている。上述の実験例は、このような生細胞１１２のアポートシスに到る過程を示している。したがって、ＦＲＥＴプローブ１０は、アポートシス（細胞死）を利用した抗がん剤の開発に有効に用いられ得る。
【００６３】
（本実施形態の効果）
本実施形態に用いるＦＲＥＴプローブ１０では、蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルのピーク波長は、有機蛍光物質１４の吸収スペクトルのピーク波長と３５ｎｍ以上離れており、蛍光タンパク質１２の発色団と有機蛍光物質１４では、フェルスタ距離Ｒ0、すなわちＦＲＥＴが５０％発生するためのドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子間の距離が５〜４０ｎｍとなるように、特異的生体分子認識部位１６の蛍光タンパク質１２への接続位置が定められている。このため、本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０においては極めて計測に効率の良いＦＲＥＴが発生する。また、蛍光タンパク質１２の発する蛍光の最大ピーク波長と有機蛍光物質１４の発する蛍光の最大ピーク波長との差も従来よりも広がる。このため、蛍光の漏れ込みやアクセプタ蛍光分子の直接励起は少なくなるので、従来行っていた複数の補正は不要となる。このため、生細胞１１２における状態の変化をＦＲＥＴの発生と解消の程度により効率よく短時間に判定することができる。また、従来からＦＲＥＴの発生と解消の程度を判定するために用いられて来たレシオメトリ（ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比）を用いて生細胞における状態の変化をＦＲＥＴの発生と解消の程度により効率よく短時間に判定することができる。従来のように、レーザ光により励起されて発するアクセプタ蛍光が抑えられるので、正確なレシオメトリを求めることができる。
さらに、ＦＲＥＴプローブ１０は、ドナー蛍光の蛍光寿命の変化によってＦＲＥＴの発生と解消の程度を判定するＦＲＥＴ計測方法に有効に用いることができる。特に、アクセプタ蛍光を受光する必要がないので、ＦＲＥＴが発生する範囲内でアクセプタ蛍光の波長を長波長側に大きくシフトさせることができる。アクセプタ蛍光の波長を長波長側にシフトさせることにより空白となった波長帯域に、他の種類のＦＲＥＴプローブ１０のドナー蛍光の波長を設定することができる。すなわち、複数種類のＦＲＥＴプローブ１０を生細胞１１２内に取り込ませて複数のＦＲＥＴ計測を同時に行うことができる。
また、蛍光タンパク質１２の蛍光スペクトルの最大ピーク波長を、有機蛍光物質１４の蛍光スペクトルの最大ピーク波長と４５ｎｍ以上離れるように、ＦＲＥＴプローブ１０を構成することにより、ドナー蛍光を主に受光する光電変換器１２７ａにアクセプタ蛍光が漏れ込む程度を一層抑制することができる。
また、生細胞１１２内に発現誘導させるのではなく、タンパク質導入剤により複数種類のＦＲＥＴプローブ１０を取り込むことができるので、ＦＲＥＴを短時間に効率よく測定することで、生細胞内の状態を短時間に効率よく判定することができる。
【００６４】
以上、本発明のＦＲＥＴプローブおよびＦＲＥＴ計測方法について詳細に説明したが、本発明のＦＲＥＴプローブおよびＦＲＥＴ計測方法は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００６５】
１０  ＦＲＥＴプローブ
１２  蛍光タンパク質
１４  有機蛍光物質
１６  特異的生体分子認識部位
１００  ＦＲＥＴ計測装置
１２０  信号処理装置
１２２  レーザ光源部
１２４，１２６  受光部
１２６ａ  レンズ系
１２６ｂ1，１２６ｂ2  ダイクロイックミラー
１２６ｃ1、１２６ｃ2  バンドパスフィルタ
１２７ａ、１２７ｂ  光電変換器
１２８  制御・処理部
１３０  管路
１３２  回収容器
１４０  信号生成部
１４２  信号処理部
１４４  コントローラ
１４６  発振器
１４８  パワースプリッタ
１５０，１５２，１５４ａ，１５４ｂ，１６４  アンプ
１５６  位相差検出器
１６０  システム制御器
１６２  ローパスフィルタ
１８０  分析装置（コンピュータ）
１８２  ＡＤ変換ボード
１８４  ＣＰＵ
１８６  メモリ
１８８  入出力部
１８９  蛍光情報算出ユニット
１９０  ＦＲＥＴ判定ユニット
１９２  細胞状態判定ユニット
１９４  出力装置
【図１Ａ】
2014055777.tif 000006
【図１Ｂ】
2014055777.tif 000007
【図１Ｃ】
2014055777.tif 000008
【図１Ｄ】
2014055777.tif 000009
【図１Ｅ】
2014055777.tif 000010
【図１Ｆ】
2014055777.tif 000011
【図２】
2014055777.tif 000012
【図３】
2014055777.tif 000013
【図４】
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【図５】
2014055777.tif 000015
【図６】
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【図７】
2014055777.tif 000017
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2014055777.tif 000022
【図１３】
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