(57)【要約】【課題】  基質原料に植物組織を用いるとともに抽出及び精製手段として、エタノール及び水とエタノールの混合溶媒と活性炭を用いることでさらに環境負荷が少なく温和な条件によるチューリッパリン類の製造方法の提供を目的とする。【解決手段】植物組織から水とエタノールの混合溶媒を用いて基質となるチューリッポシド類を抽出するステップと、前記抽出溶液とアニオン交換樹脂に固定化したチューリッポシド変換酵素（固定化チューリッポシド変換酵素）とを接触させることで酵素反応液中にチューリッパリン類を得るステップと、前記酵素反応液中から活性炭を用いてチューリッパリン類を吸着回収するステップとを有することを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織から水とエタノールの混合溶媒を用いて基質となるチューリッポシド類を抽出するステップと、
前記抽出溶液とアニオン交換樹脂に固定化したチューリッポシド変換酵素（固定化チューリッポシド変換酵素）とを接触させることで酵素反応液中にチューリッパリン類を得るステップと、
前記酵素反応液中から活性炭を用いてチューリッパリン類を吸着回収するステップとを有することを特徴とするチューリッパリン類の製造方法。
【請求項２】
前記チューリッポシド類の抽出溶液からエタノールを除去するステップの後に、
前記固定化チューリッポシド変換酵素と接触させることを特徴とする請求項１記載のチューリッパリン類の製造方法。
【請求項３】
前記酵素反応に用いた酵素反応液中からろ過操作により前記固定化チューリッポシド変換酵素を回収することで、当該固定化チューリッポシド変換酵素を繰り返し利用可能にしたことを特徴とする請求項１又は２記載のチューリッパリン類の製造方法。
【請求項４】
前記酵素反応液中から活性炭にてチューリッパリン類を吸着回収するステップの後に、
水洗及び水とエタノールとの混合溶媒に当該チューリッパリン類を再溶出させるステップと、
前記再溶出液から活性炭に再吸着させるステップにてチューリッパリン類の精製を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のチューリッパリン類の製造方法。
【請求項５】
前記基質原料となる植物組織がチューリップ由来の組織であり、
前記固定化チューリッポシド変換酵素がチューリップ由来の酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のチューリッパリン類の製造方法。
【請求項６】
前記基質原料がチューリッポシドＢの含有率の高いチューリップ花部であり、
前記固定化チューリッポシド変換酵素がチューリップ球根由来の酵素であり、得られるチューリッパリン類がチューリッパリンＢであることを特徴とする請求項５記載のチューリッパリン類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物組織を基質原料とし、酵素反応によりチューリッパリン類を得る製造方法に関し、特に環境負荷の低減を図るのに有効な製造方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
チューリッパリン類はα−メチレン−γ−ブチロラクトン類に相当し、耐熱性透明樹脂の原材料、各種生理活性物質の合成中間体、害虫忌避剤、抗変異原性剤、及び抗菌物質等多くの分野に利用されている。
本出願人は従来の化学合成法よりも温和であり、石油系資源に依存しない方法として植物組織を基質原料にして酵素反応によりチューリッパリン類を得る方法を先に提案している（特許文献１）。
本発明は先の発明をさらに改善したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２０７２１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は基質原料に植物組織を用いるとともに抽出及び精製手段として、エタノール及び水とエタノールの混合溶媒と活性炭を用いることでさらに環境負荷が少なく温和な条件によるチューリッパリン類の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係るチューリッパリン類の製造方法は、植物組織から水とエタノールの混合溶媒を用いて基質となるチューリッポシド類を抽出するステップと、前記抽出溶液とアニオン交換樹脂に固定化したチューリッポシド変換酵素（固定化チューリッポシド変換酵素）とを接触させることで酵素反応液中にチューリッパリン類を得るステップと、前記酵素反応液中から活性炭を用いてチューリッパリン類を吸着回収するステップとを有することを特徴とする。
ここで、酵素反応の基質としてチューリッポシド類が得られるものであれば植物の種類に限定はない。
本発明者らの研究によれば、チューリップ植物の組織には主にチューリッポシドＡとチューリッポシドＢとが存在し、さらに品種や組織の部位によりチューリッポシドＡとチューリッポシドＢの含有量や、その存在比率が相異することも分かっている。
【０００６】
ここで、チューリッポシドＡは下記化学式（１）で示され、チューリッポシドＢは下記化学式（２）で示される。
なお、本発明に係るチューリッポシド類にはこれらの類縁物質も含まれる。
【化１】
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【化２】
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また、本発明に係るチューリッパリン類には、下記化学式（３）で示されるチューリッパリンＡ（α−メチレン−γ−ブチロラクトン）及び化学式（４）で示されるチューリッパリンＢ（α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン）が含まれる。
【化３】
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【化４】
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ここで、チューリッパリンＢの方がチューリッパリンＡよりもアレルギー性が低いことも知られている。
【０００７】
本発明において、植物組織からチューリッポシド類の抽出に水とエタノールの混合溶媒を用いた点に特徴がある。
チューリッポシド類は上記化学式（１），（２）に示したように糖エステルに属するから親水性が高いことが想定され、エタノールの含有率が比較的低濃度の水との混合溶媒でも抽出可能と思われる。
しかし、植物組織中、特にチューリップ植物組織中にはチューリッポシド類の他に、チューリッポシドをチューリッパリンに変換するチューリッポシド変換酵素が含まれていることが知られており、エタノールの濃度が低いと抽出過程中にチューリッパリンに変換される比率が高くなり、基質原料としては好ましくない場合もある。
一方、エタノールの含有率を高くすると疎水性の不純物も多く抽出されるので好ましくないが、抽出溶液中の疎水性夾雑物は一度活性炭で除去した後にエタノールを除去後、酵素反応に供することで解決できる。
【０００８】
本発明においては、アニオン交換樹脂にチューリッポシド変換酵素を固定化させた点にも特徴がある。
この場合に酵素反応をリン酸の添加により停止させると酵素が失活する恐れがあることから、酵素反応液をろ過操作し、チューリッポシド変換酵素の反応をろ過にて停止させるとともに固定化酵素を回収する。
回収した固定化酵素はＫＰＢ（リン酸カリウム緩衝液）等で洗浄調整するだけで繰り返し酵素反応に使用できる。
【０００９】
酵素反応液中には酵素反応にてチューリッパリンと等モル量のグルコースが生成していることや、植物組織から抽出した基質原料中にも糖類等の不純物が存在することから、酵素反応生成物を吸着させた活性炭にはチューリッパリン類の他に、これらの不純物も含まれる。
そこで、前記酵素反応液中から活性炭にてチューリッパリン類を吸着回収するステップの後に、水洗及び水とエタノールとの混合溶媒に当該チューリッパリン類を再溶出させるステップと、前再溶出液から活性炭に再吸着させるステップにてチューリッパリン類の精製を行うのが好ましい。
また、上記の混合溶媒による再溶出と活性炭による吸着回収を行うことで、それだけ、チューリッパリン類の精製度が向上し、最後にエタノールで溶出させると、その後の減圧濃縮が容易になる。
【００１０】
本発明において特にチューリッパリンＢの製造及び精製を目的とする場合には、前記基質原料がチューリッポシドＢの含有率の高いチューリップ花部であり、前記固定化チューリッポシド変換酵素がチューリップ球根由来の酵素であるのが好ましい。
チューリップ花部にはチューリッポシドＢの含有率の高いものが多く、チューリップ球根にはチューリッポシド変換活性の高い酵素が含まれているからである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るチューリッパリン類の製造方法は酵素反応を用い、反応における抽出及び精製に活性炭とエタノール（水との混合溶媒）を用い、他の有機溶媒を用いる必要がないので温和で環境にやさしい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】チューリップ組織から基質を抽出する際のエタノール濃度の影響を調査した結果を示す。
【図２】球根粗酵素中のチューリッポシド変換酵素活性の各種樹脂への吸着率を示す。
【図３】異なる塩濃度におけるＨＰＡ２５Ｌ樹脂からのチューリッポシドＡ変換酵素活性の溶出結果を示す。
【図４】固定化酵素の使用回数による酵素活性の変動の調査結果を示す。
【図５】酵素反応に及ぼす固定化酵素量の影響の調査結果を示す。
【図６】精製したチューリッパリンＢのＨＰＬＣクロマトグラムチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、本発明に係る各プロセスを実験で確認したので以下説明する。
これまでにいろいろな種類の植物組織にチューリッポシド類が存在することが分かっており、特にチューリップの各組織中に著量のチューリッポシド類が存在する。
本出願人はチューリップの花弁、球根、葯等、多くの組織にチューリッポシド類が存在することを先に確認している（特許文献１）。
今回はチューリップの花部組織中のチューリッポシドＢ含有率が高いことに着目し、１２３品種のチューリップ花部について、花弁、おしべ、めしべの組織別に全チューリッポシド／チューリッパリン含有量に対するチューリッポシドＢ／チューリッパリンＢの含有率を調査した。
調査方法を下記に示す。
凍結保存してあるチューリップ花部を花弁、おしべ、めしべの各組織に分離後、重量測定し、液体窒素存在下、乳鉢中で破砕し、５０％エタノールを加えてさらに破砕することで組織中に含まれるチューリッポシド／チューリッパリンを抽出した。
抽出液を遠心分離（２１，５００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）後、上清を蒸留水にて適宜希釈しＨＰＬＣ分析に供した。
ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｖ  ５μｍ（４．６  ｘ  １５０ｍｍ）、流速：０．６５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２０８ｎｍ、溶媒：５％メタノール／１０ｍＭリン酸）。
【００１４】
その結果を表１及び表２に示す。
【表１】
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【表２】
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【００１５】
表１に示す４３品種／７９組織では全チューリッポシド／チューリッパリン量に対するチューリッポシドＢ／チューリッパリンＢ量の比率が８０％以上であることが分かった。
さらにそのうちの２９品種／４８組織（表２）では、チューリッポシドＢ／チューリッパリンＢ量の比率が９０％以上に達し、チューリッポシドＢ／チューリッパリンＢをほぼ独占的に蓄積していることが分かった。  
【００１６】
次にチューリップ組織から基質を抽出する際の水とエタノールの混合溶媒におけるエタノール濃度の影響を調査した。
調査方法は次のとおりである。
チューリップ品種「紫水晶」の凍結乾燥花弁をミルサーにて破砕後、１５ｍｌチューブに０．１ｇずつ取り、１０〜１００％のエタノール水溶液５ｍｌを添加し、回転撹拌（２６ｒｐｍ、３ｈ、４℃）することで抽出を行った。
抽出液を遠心分離（２１，５００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）後、上清を蒸留水にて適宜希釈しＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析は表１，２の調査と同様に行った。
その結果を図１のグラフに示す。
エタノール濃度が１０％と２０％のものはチューリッパリンの割合が多くなっており、特にチューリッパリンＢの方が顕著であった。
これは、花弁内に存在するチューリッポシド変換酵素により変換されたためと推定される。
このことからチューリップ組織から基質の抽出にはエタノール濃度が３０％以上が好ましく、疎水性不純物の抽出を抑えるにはエタノールの濃度が低い方がよいことから、水との混合溶媒におけるエタノール濃度は３０〜５０％範囲がよいと思われる。
【００１７】
次に高いチューリッポシド変換酵素活性を含有するチューリップ球根由来の酵素を各種樹脂に固定化することを検討した。
なお、酵素活性はチューリッポシドＡ変換酵素活性をチューリッパンＡの生成量にて測定したが、球根由来のチューリッポシドＡ変換酵素はチューリッポシドＢに対しても活性を有することが分かっている。
試験方法は次のとおりである。
球根２００ｇに１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ  ７．０）２００ｍｌを加え、ミキサーにて破砕抽出したものをガーゼでろ過した後、遠心分離（２１，５００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）し、得られた上清を粗酵素液とした。
このもの５ｍｌに、１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄後蒸留水にて平衡化した各樹脂を０．５ｇ添加し、穏やかに回転撹拌（２６ｒｐｍ、１ｈ、４℃）した。
遠心分離（７，６００ｇ、２ｍｉｎ、４℃）にて樹脂を除いた上清に残存するチューリッポシドＡ変換酵素活性を測定し、樹脂への酵素活性の吸着率を算出した。
用いた樹脂は以下のとおりである。
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（以上、東ソー）、ＤＩＡＩＯＮ−ＲＣＰ１６０Ｍ、−ＳＫ１Ｂ、−ＷＫ４０、−ＷＡ１０、−ＷＡ２０、−ＷＡ３０、−ＷＡ２１Ｊ、−ＰＡ３１２、−ＰＡ４１２、−ＨＰＡ２５Ｌ、−ＳＡ１０Ａ、−ＨＰ２０、−ＨＰ２０ＳＳ、−ＨＰ２ＭＧ、−ＳＰ７０、−ＳＰ２０７、−ＳＰ８５０（以上、三菱化学）、ＤＥ５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、Ｄｕｏｌｉｔｅ−Ａ７、−Ａ５６１、−Ａ５６８、−ＸＡＤ７６１（以上、住化ケムテックス）、Ｔｏｙｏｎｉｔｅ−２００Ｍ（東洋電化工業）。
酵素活性は以下のように測定した。
０．５Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）５μｌ、蒸留水３０μｌ、酵素液１０μｌ、４０ｍＭチューリッポシドＡ  ５μｌを加え、全量を５０μｌとし、室温にて１０分間静置することで反応を行った。
０．５Ｍリン酸５０μｌを加えて反応を停止し、蒸留水４００μｌを添加して希釈したものをＨＰＬＣ分析に供した。
ただし、溶媒には１０％メタノール／１０ｍＭリン酸を用いた。
それによって酵素反応生成物であるチューリッパリンＡの生成量を測定し、酵素活性（Ｕ）を求めた（１Ｕは１分間に１μｍｏｌのチューリッパリンＡを生成する酵素量）。
球根粗酵素中のチューリッポシド変換酵素活性の各種樹脂への吸着率を図２に示す。
この結果、弱アニオン交換樹脂であるＤＥＡＥ−ＴｏｙｏｐｅａｒｌやＤＥ５２（ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、強アニオン交換樹脂であるＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌにおいては９０％以上の高い吸着率が得られた。
これら以外では、ハイポーラス型強アニオン交換樹脂であるＨＰＡ２５Ｌで７５％の高い吸着率が得られたが、その他の樹脂では５０％の吸着率を超えるものはなかった。
ＨＰＡ２５Ｌを用いて樹脂量および固定化時間を検討した結果、球根粗酵素液１０ｍｌあたりに添加する樹脂量は０．４〜０．６ｇ程度、固定化時間は２時間以上とすることで、再現性よく固定化を行うことができることが分かった。
【００１８】
次に、アニオン交換樹脂ＨＰＡ２５Ｌを用いて固定化酵素の安定性を評価した。
評価方法は次のとおりである。
前記方法にて球根チューリッポシド変換酵素をＨＰＡ２５Ｌに固定化した後、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）にて洗浄した固定化酵素０．３ｇに、０、１００、２００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ  ７．０）をそれぞれ５ｍｌずつ添加し、穏やかに回転撹拌（２６ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃）した。
その後、樹脂を除いた上清に含まれるチューリッポシドＡ変換酵素活性を測定することで、樹脂に固定化したチューリッポシド変換酵素活性の樹脂からの溶出率（回収率）を求めた。
酵素活性の測定は前述に従い行った。
結果を図３に示す。
この結果、１００ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ  ７．０）中、１００ｍＭ以上のＮａＣｌの存在下では樹脂からの酵素の溶出がみられたが、ＮａＣｌを含まない１００ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）中では溶出はほとんどみられなかった。
このことから、塩を含まない１００ｍＭ以下のＫＰＢ中で酵素反応を行うことで、酵素の溶出を伴うことなく安定的に固定化酵素を使用することが可能であることが分かった。
【００１９】
次に、固定化酵素の再使用の検討を行った。
１回目の反応停止をリン酸で行ったものは、２回目の反応ではほとんど活性がみられなかったことから、固定化した状態であってもリン酸の添加によって酵素は失活することが分かった。
一方、リン酸の添加を行わなかったものは２回目の反応においても高い活性を維持していたことから、固定化酵素を用いた酵素反応では、樹脂をろ過等によって除去することで反応を終了する方法が適しており、それによって固定化酵素の再使用が可能であることが分かった。
そこで、反応に使用した固定化酵素を回収後、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で洗浄し、次の反応に用いることを繰り返し、何回まで高い活性を維持した状態で再使用が可能であるかを調べた。
その結果、図４に示すように計５回の使用後もほぼ１００％のチューリッポシドＡ変換酵素活性が維持されていることが確認され、本固定化酵素は目立った活性の減衰なく再使用が可能であることが分かった。
【００２０】
先に、チューリップ組織からの基質であるチューリッポシドの抽出にエタノール濃度３０〜５０％の水との混合溶媒が好ましいことが明らかになったので、そのまま上記抽出溶液を酵素反応基質として用いることができるか検討すべく、４０％エタノールを用いて抽出した溶液にてＨＰＡ２５Ｌ樹脂に固定化した固定化チューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応を実施した。
その結果、ある程度の酵素活性を示すもののエタノール非存在下の酵素活性値の２０％〜３０％まで低下した。
従って、酵素反応を行う際にはチューリップ組織の抽出液からエタノールを除去する方が好ましいことが分かった。
そこで、次のような系で実験を行うこととした。
４０％エタノールの花部抽出液をロータリーエバポレーターにて減圧留去後、最終液量が当初液量の１／１０となるように蒸留水に再溶解することで、１０倍濃縮花部抽出液を調製し、酵素反応基質として用いるものである。
この方法によって調製した品種「アペルドーン」の濃縮花部抽出液を基質とし、異なる固定化酵素量における酵素反応の経時変化を調べた。
０．５Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）１００μｌ、１０倍濃縮花部抽出液２００μｌを含む１ｍｌの反応液中に固定化酵素を５、１０、２０、５０ｍｇ添加し、室温にて１５〜１２０分反応させ、基質中の主要チューリッポシドであるチューリッポシドＢの残存量を定量した。
その結果を図５に示す。
チューリッポシドＢ消費量は添加する固定化酵素量の増加に伴って高くなっており、５０ｍｇの固定化酵素を加えて１５分反応させた時点で９３％のチューリッポシドＢがチューリッパリンＢへと変換され、６０分反応時ではほぼ完全に変換反応が完了した。
以上の結果から、固定化酵素を用いた酵素反応は、反応液１ｍｌあたり１０倍濃縮花部抽出液２００μｌ、０．５Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）１００μｌ、蒸留水７００μｌ、固定化酵素５０ｍｇを含む反応液を１時間以上反応させると、チューリッポシドＢが完全に変換されることが分かる。
【００２１】
次に酵素反応液からチューリッパリンを精製する条件を検討した。
品種「デザインインプレッション」の花弁抽出物由来酵素反応液５ｍｌに、蒸留水で洗浄した石炭由来活性炭（商品名：ブロコール，太平化学産業）を１／５倍量（１ｍｌ）添加し室温にて回転撹拌することでチューリッパリンＢを吸着させたところ、１時間経過時のチューリッパリンＢの吸着率は９７％であった。
ブロコールに吸着させたチューリッパリンＢの溶出の際に用いるエタノール濃度は、低すぎると溶出効率が悪くなり、高すぎると不純物が溶出されやすくなってしまうことから、２０％エタノールによって溶出することとした。
ブロコールの２０倍量および１００倍量の２０％エタノールにて溶出したところ、チューリッパリンＢ回収率はそれぞれ５９％、７２％となった。
１００倍量もの溶媒で溶出しても回収率がさほど向上しないことや、スケールアップ時に大量の溶媒を必要とすることから、２０％エタノールによる溶出はブロコール体積の２０倍量とすることとした。
この２０％エタノールによる溶出液中の主成分はチューリッパリンＢであるが、この段階で無視できないレベルのチューリッパリンＡが共存している場合には、溶液体積の１／１００倍量のブロコールを添加し、室温で１時間程度撹拌することで、チューリッパリンＡを５０％程度吸着・除去することができた。
その際のチューリッパリンＢの溶液中への回収率は約８０％であった。
チューリッパリンＢの２０％エタノール溶液を直接濃縮すると、濃縮に長時間を要してしまうことから、溶液中のチューリッパリンＢを再度ブロコールに吸着させ、エタノールにて溶出した後に濃縮することとした。
チューリッパリンＢの２０％エタノール溶液に１／５倍量のブロコールを添加し、室温で１時間撹拌することで、チューリッパリンＢを吸着させた（吸着率は約８０％）。
ブロコール体積の５０倍量の蒸留水にて洗浄後、同１０倍量のエタノールを添加することでチューリッパリンＢを溶出し、精製チューリッパリンＢエタノール溶液を得た。
これによって、ブロコールに吸着したチューリッパリンＢの約８０％を溶出することができた。
このものを減圧下濃縮することで精製チューリッパリンＢを得る方法を確立した。
【００２２】
次にチューリップ花部組織を用いて、スケールアップしたチューリッパリンＢの製造を行った。
＜固定化チューリッポシド変換酵素の調製＞
３ｋｇの冷凍保存球根（複数品種混合物）をハンマーで大まかに破砕した後、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）６Ｌを少量ずつ加えながらワーリングブレンダーを用いて破砕した。
このものを２０Ｌバケツ中、メカニカルスターラーを用いて４℃にて２時間撹拌（１７０ｒｐｍ）することで粗酵素を抽出した。
抽出残渣をガーゼによるろ過で除き、ろ液に１Ｍ  ＮａＣｌ  ５００ｍｌで洗浄し蒸留水１Ｌで平衡化したＨＰＡ２５Ｌ樹脂３００ｇを添加し、メカニカルスターラーを用いて４℃にて６時間撹拌（１７０ｒｐｍ）して、粗酵素中のチューリッポシド変換酵素を固定化した。
固定化酵素をガーゼでろ別し、蒸留水１Ｌにて混入しているデンプンを洗浄した後、１Ｌビーカー中、蒸留水の添加、撹拌、デカントによってさらにデンプンの除去を行った。
洗浄液が透明になるまでこの操作を繰り返した。
調製した固定化酵素は防腐剤として０．１％（ｖ／ｖ）Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＰＰＭ）（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５００ｍｌ中にて４℃で保存した。
本条件下で少なくとも２年以上は顕著な失活無く保存することが可能である。
固定化酵素の活性は以下のように測定した。０．５Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）１００μｌ、蒸留水８７５μｌ、４０ｍＭチューリッポシドＡまたはチューリッポシドＢ  ２５μｌ、固定化酵素１ｍｇを含む１ｍｌの反応液を室温にて回転撹拌（２７ｒｐｍ）することで反応を行った。
チューリッポシドＡ、チューリッポシドＢを基質とした時の反応時間はそれぞれ１分間および４分間とした。
反応液と等量の０．５Ｍリン酸を加えて反応を停止し、蒸留水にて適宜希釈したものをＨＰＬＣ分析に供し、チューリッパリンＡまたはチューリッパリンＢの生成量を測定し、酵素活性（Ｕ）を求めた（１Ｕは１分間に１μｍｏｌのチューリッパリンを生成する酵素量）。
その結果、１ｍＭの基質存在下における固定化酵素のチューリッポシドＡ変換酵素活性は０．２３Ｕ／ｍｇ  ｒｅｓｉｎ、チューリッポシドＢ変換酵素活性は０．０２２Ｕ／ｍｇ  ｒｅｓｉｎであった。
＜花弁１ｋｇからのチューリッパリンＢの調製＞
花弁中の全チューリッポシド／チューリッパリン量に対するチューリッポシドＢ／チューリッパリンＢ含有率が９７％であった「立山の春」の花弁を原料として、チューリッパリンＢの調製を行った。
凍結保存花弁１ｋｇ（花部１６３個分）を４０％エタノール５Ｌに４℃で４日間浸漬し、抽出を行った。
ガーゼを用いてろ過することで植物残渣を除いた抽出液（５Ｌ）に蒸留水洗浄済みのヤシガラ活性炭（商品名：ヤシコール，太平化学産業）１Ｌを加え、メカニカルスターラーを用いて４℃で１時間撹拌（２００ｒｐｍ）することで、抽出液中の疎水性夾雑物を吸着させ、吸引ろ過によってヤシコールを除いた。
吸引ろ過は予め２号ろ紙表面にろ過助剤としてラヂオライト１００（昭和化学工業）の層を１ｃｍ以上になるように形成し、抽出液にもラヂオライト１００を１００ｇ添加して行った。
得られたろ液を減圧濃縮し、最終液量が５００ｍｌとなるように蒸留水に再溶解することで、１０倍濃縮花弁抽出液（＝酵素反応基質）を調製した。
次に、０．５Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）２５０ｍｌ、１０倍濃縮花弁抽出液５００ｍｌ、蒸留水１７５０ｍｌおよび上記固定化酵素１２５ｇを含む反応液を室温にて２．５時間撹拌（１１０ｒｐｍ）することで酵素反応を行った。
吸引ろ過によって固定化酵素を除くことで酵素反応を終了し、酵素反応液２５００ｍｌを得た。
なお、ろ別した固定化酵素は、蒸留水にて洗浄後、上記の固定化酵素保存液中に懸濁し４℃にて保存することで再使用することが可能である。
２５００ｍｌの酵素反応液に蒸留水洗浄済みのブロコール５００ｍｌを添加して、メカニカルスターラーを用いて室温にて１時間撹拌（２００ｒｐｍ）することでチューリッパリンＢを吸着させた。
吸引ろ過によって未吸着画分を除き、ブロコールを２５Ｌの蒸留水にて洗浄した（ブロコールを入れた２０Ｌバケツに蒸留水を２．５Ｌ加えてメカニカルスターラーで５分間撹拌後吸引ろ過する操作を１０回繰り返した）。
洗浄後のブロコールに２０％エタノール１０Ｌを加えてチューリッパリンＢを溶出した（１Ｌ加えてメカニカルスターラーで５分間撹拌後吸引ろ過する操作を１０回繰り返した）。
合一した２０％エタノール溶出液１０Ｌに対して蒸留水洗浄済みのブロコール２Ｌを添加して、室温にて３時間撹拌することで溶液中に含まれるチューリッパリンＢを再び吸着させた。
吸引ろ過によって未吸着画分を除き、ブロコールを１００Ｌの蒸留水にて洗浄した（ブロコールを入れた２０Ｌバケツに蒸留水を１０Ｌ加えてメカニカルスターラーで５分間撹拌後吸引ろ過する操作を１０回繰り返した）。
洗浄後のブロコールにエタノール２０Ｌを加えてチューリッパリンＢを溶出した（２  Ｌ加えてメカニカルスターラーで５分間撹拌後吸引ろ過する操作を１０回繰り返した）。
合一した溶出液にラヂオライト１００を４００ｇ加え、２号ろ紙上に厚さ１ｃｍ程度に形成したラヂオライト１００層を用いて吸引ろ過を行うことで、ブロコール微粉末を除去した清澄なチューリッパリンＢエタノール溶液を得た。
このものを減圧濃縮し、精製チューリッパリンＢを得た（エタノール溶液、３０ｍｌ）。
以上のプロセスにより、「立山の春」花弁１ｋｇから２．３２ｍｍｏｌ（２６４ｍｇ）のチューリッパリンＢが得られた。
精製過程における回収率および純度を表３に、精製物のＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。
ＨＰＬＣ分析は表１，２のときと同様の条件にて行った。
＜花部１ｋｇからのチューリッパリンＢの調製＞
花部（花弁、おしべ、めしべを含む）を構成するいずれの組織においても全チューリッポシド／チューリッパリン量に対するチューリッポシドＢ／チューリッパリンＢ含有率が９０％以上であった「立山の春」の花部を原料として、チューリッパリンＢの調製を行った。
凍結保存花部１ｋｇ（花部１２２個）から、上記と同様の方法で２．６８ｍｍｏｌ（３０６ｍｇ）のチューリッパリンＢが得られた。
精製過程における回収率および純度を表４に、精製物のＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。
花弁のみおよび花部全体を原料として得られたものを比較すると、花弁のみを原料とした場合にはチューリッパリンＡの混入は痕跡量であり、ほぼ純粋なチューリッパリンＢが得られた。
花部全体を原料としたものは、花弁のみを原料としたものよりも、わずかながら純度は低下するものの、最終的には純度約９９％のチューリッパリンＢを得ることができた。
【表３】
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【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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