(57)【要約】【課題】  簡易な構成でありながら迅速に生菌数を正確に計測することができ、取り扱いや操作が容易な生菌数測定方法及び生菌数測定キットを提供する。【解決手段】  検査対象液をメンブランで濾過した後、濾過に使用したメンブランを酸素透過性のない袋状容器内に収容する。そして、印刷電極をメンブランに接触するように袋状容器内に挿入し、袋状容器内の酸素減少量を電気化学的に測定し生菌数を計測する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象液を細菌捕集可能なメンブランで濾過し、
前記濾過に使用したメンブランを酸素透過性のない袋状容器内に収容するとともに、印刷電極をメンブランに接触するように袋状容器内に挿入し、
袋状容器内の酸素減少量を電気化学的に測定し生菌数を計測することを特徴とする生菌数測定方法。
【請求項２】
検査対象液は、検査対象サンプルを洗浄した液体、サンプル表面をぬぐった綿棒等を洗浄した液体、液体サンプル、あるいはこれらを前処理カラムで濾過した液体であることを特徴とする請求項１記載の生菌数測定方法。
【請求項３】
測定に際して、袋状容器内に培養液を入れることを特徴とする請求項１または２記載の生菌数測定方法。
【請求項４】
検査対象液を濾過する細菌捕集可能なメンブランと、
前記濾過に使用したメンブランを収容する酸素透過性のない袋状容器と、
前記メンブランに接触するように袋状容器内に挿入される印刷電極とを備え、
袋状容器内の酸素減少量を電気化学的に測定することにより生菌数を計測することを特徴とする生菌数測定キット。
【請求項５】
前記酸素透過性のない袋状容器は、２枚重ねにしたプラスチックフィルムの２辺をヒートシールした袋状容器であることを特徴とする請求項４記載の生菌数測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生菌数を電気化学的に計測し得る生菌数計測方法及び生菌数計測キットに関するものであり、特に、極めて簡易な構成でありながら迅速に生菌数を計測し得る生菌数計測方法及び生菌数計測キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば食品分野においては、大腸菌等、各種細菌による汚染の防止が大きな課題となっている。細菌による汚染は、食中毒等の原因にもなることから、これを極力排除する必要がある。そのためには、細菌による汚染度合い（食品等に付着している生菌の数）を正確に把握する必要があり、できる限り簡易に、且つ短時間に生菌の数を計測し得ることが望まれる。
【０００３】
このような状況から、各方面で生菌数の計測方法に関する検討が進められ、様々な方式の生菌数計測方法、生菌数計測装置が提案されている（特許文献１〜３等を参照）。
【０００４】
例えば特許文献１には、酵素電極の先端部に被検菌体を固定したメンブランフィルターを装着し、メンブランフィルターを酵素電極の先端部と共に透析膜で被覆して生菌数の計測を行う生菌数計測用センサが開示されている。
【０００５】
特許文献２には、微生物を含有する試料溶液中の溶存酸素の減少量を酸素電極を用いて測定することにより試料中の生菌数を測定する方法が開示されており、溶存酸素の減少量の測定を試料溶液を容器内に密閉した状態で行うことが記載されている。
【０００６】
特許文献３には、濾過膜に試料液を通水することによって試料液中の細菌を濾過膜上に捕集し、該濾過膜を溶菌剤及び酵素反応基質に接触させ、ターゲット細菌中酵素の酵素反応基質に対する酵素活性値を求めることによって、試料液中の細菌数を定量する細菌の検出方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６４−９１０５０号公報
【特許文献２】特開昭６３−１５１５０号公報
【特許文献３】特開２００７−３７５３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１記載の生菌数計測センサの場合、酵素電極とメンブランフィルターの間にテフロン（登録商標）膜を挟み、透析膜で外側を包み、２種類の溶液に浸して電流値を測定し、その差から生菌数を計測しており、輪ゴムで留める等、メンブランフィルターの酵素電極への装着が煩雑である。また、計測自体も、２種類の溶液（リン酸緩衝液と培養液）についてそれぞれ計測を行う必要があり、煩雑である。
【０００９】
一方、特許文献２記載の方法の場合、メンブランによる濃縮を行っていないため、感度が不十分である他、酸素電極を用いて溶存酸素の減少量を計測しているため、装置構成が煩雑で、現場での簡易検査等には向いていない。また、特許文献３記載の方法は、酵素反応を利用したものであるので、試薬の数も多く、やはり簡易検査には向いていない。
【００１０】
本発明は、以上のような従来技術の抱える課題を解消することを目的とするものであり、簡易な構成でありながら迅速に生菌数を正確に計測することができ、取り扱いや操作が容易で、あらゆる状況において、生菌数の計測を行うことが可能な生菌数測定方法及び生菌数測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前述の目的を達成するために、本発明の生菌数測定方法は、検査対象液を細菌捕集可能なメンブランで濾過し、前記濾過に使用したメンブランを酸素透過性のない袋状容器内に収容するとともに、印刷電極をメンブランに接触するように袋状容器内に挿入し、袋状容器内の酸素減少量を電気化学的に測定し生菌数を計測することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の生菌数測定キットは、検査対象液を濾過する細菌捕集可能なメンブランと、前記濾過に使用したメンブランを収容する酸素透過性のない袋状容器と、前記メンブランに接触するように袋状容器内に挿入される印刷電極とを備え、袋状容器内の酸素減少量を電気化学的に測定することにより生菌数を計測することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、メンブランによる濃縮を採用しているので、生菌数を感度良く短時間に測定することが可能である。また、酵素電極や酸素電極は必要なく、極めて簡易な印刷電極を用いており、他に必要なのは袋状容器のみであり、非常に簡便な測定方法、測定キットを実現することが可能である。さらに、本発明によれば、輪ゴムによるメンブランの装着や、電極移動等も不要であり、測定操作や取り扱いも容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明による生菌数の測定の様子を示す図である。
【図２】浸漬法による測定開始時及び３０分後のピーク高さと菌濃度の関係を示す特性図である。
【図３】本発明を適用した測定方法における測定結果の一例を示す図である。
【図４】本発明の測定方法により作成した検量線の一例を示す図である。
【図５】本発明の測定方法により作成した検量線の他の例を示す図である。
【図６】メンブレン上の生菌数とピーク電流値の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を適用した生菌数測定方法及び生菌数測定キットの実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１６】
本発明の生菌数測定方法及び生菌数測定キットは、例えば食品等に存在する生菌数を測定するものである。その測定原理は、生菌による酸素消費量を指標とするもので、検査対象サンプルを洗浄した液体をメンブランで濾過した後、前記濾過に使用したメンブランを酸素透過性のない袋状容器内に収容するとともに、印刷電極をメンブランに接触するように袋状容器内に挿入し、袋状容器内の酸素減少量を電気化学的に測定するという、極めて簡便なものである。
【００１７】
図１は、本発明による生菌数の測定の様子を示すものである。測定に際しては、先ず、検査対象液を細菌捕集可能なメンブランで濾過する。これにより、検査対象液に含まれる生菌がメンブランに濃縮され固定される。検査対象液としては、被検対象サンプル（例えば食品等）が液体でない場合には、その表面を細菌を含まない液体（水や培地等）で洗浄した洗浄液を用いるか、あるいは綿棒で表面をぬぐい、その綿棒を洗浄した洗浄液を用いる。検査対象サンプルが液体である場合には、液体サンプルをそのままの状態で検査対象液として用いる。いずれの場合にも、これらを前処理カラムで濾過して用いることも可能である。
【００１８】
次いで、図１に示すように、濾過後のメンブラン１を酸素透過性のない袋状容器２に入れる。袋状容器２は、例えば、２枚重ねにしたプラスチックフィルムの２辺をヒートシールしたものであり、市販のものを使用することも可能である。
【００１９】
袋状容器２に菌を固定したメンブラン１を入れた後、メンブラン１に接触するように平板な印刷電極３を袋状容器２内に挿入する。印刷電極３は、例えばカーボン印刷電極等、所定の電極パターン（例えば、作用極、参照極、及び対極）が印刷された簡単な構造のものを使用することができる。
【００２０】
この状態で酸素減少量をサイクリックボルタンメトリー（cyclic voltammetry）を用いて電気化学的に測定する。例えば、培養液を少量入れた状態で、電圧を変化させ、酸素濃度を反映する０．８Ｖ付近のピークの減少を測定する。電圧変化は、例えば５０ｍＶ／秒で行う。この減少の度合いを、予め作成しておいた検量線と照らし合わせることで、生菌数を計測することができる。なお、電気化学的測定としては、前記のようにピーク電流値を指標とするのが良いが、ピークの現れる範囲を積分して指標とすることも可能である。
【００２１】
一般的な生菌数測定方法では、２４時間以上かけて培養を行い、それから測定を行うため、測定に長時間を要することになる。本発明の測定方法では、メンブラン１に濃縮された菌がごく少量の培地中の酸素を消費するので、酸素減少量が検出し易く、２０分〜６０分程度で測定を完了することが可能である。生菌数が少ない場合、従来法では測定が難しいが、本発明方法を採用した場合、例えば１０３個／ｍｌ程度の生菌数であっても、１時間〜２時間程度で測定が可能である。
【００２２】
前述の通り、本発明方法を採用することで、簡単な操作で、迅速且つ高感度に被検対象サンプルの生菌数を計測することが可能である。また、係る測定を行うための生菌数測定キットについても、メンブランと袋状容器、印刷電極、さらには必要に応じてシリンジやメンブランホルダ等をセットにして提供すればよく、極めて簡易な構成でありながら、高性能な生菌数測定キットを提供することが可能である。
【００２３】
以上、本発明を適用した実施形態についてを説明してきたが、本発明が前述の実施形態に限られるものでないことは言うまでもなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、多様な変更または改良を加えることが可能である。
【実施例】
【００２４】
次に、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果を基に説明する。
【００２５】
浸漬法による測定（比較例）
生菌（Ｎ−３株）を１×１０３個／ｍＬ〜１×１０８個／ｍＬ含む液体をエッペンチューブに入れ、印刷電極を挿入し、電圧を変化させながら電流値の変化を測定した。測定開始時及び３０分後のピーク高をプロットしたものを図２に示す。
【００２６】
図２から明らかなように、いずれの濃度のサンプルにおいても、測定開始時に比べて３０分後のピーク高は減少していた。平均値では、菌濃度が高くなるにしたがってピークの大きさは小さくなっているが、例えば１×１０５個／ｍＬのサンプルと１×１０６個／ｍＬのサンプルでは、有意な差は認められなかった。
【００２７】
メンブランを用いた濃縮法（実施例）
１×１０４個／ｍＬ〜１×１０６個／ｍＬの生菌（Ｎ−３株）を含む培養液５０ｍＬをメンブランで濾過して生菌をメンブランに固定し、この生菌を固定したメンブランをビニールパウチに入れた。さらに、ビニールパウチ（袋状容器）内に１００μＬの培養液を入れ、印刷電極をメンブランに密着するようにビニールパウチ内に挿入した。
【００２８】
この状態で、比較例と同様、印刷電極により電圧を変化させながら電流値の変化を測定した。１×１０４個／ｍＬの生菌（Ｎ−３株）を含む培養液５０ｍＬを濾過したメンブランについての測定結果を図３に示す。いずれの濃度においても、浸漬法（比較例）と同様、時間とともに減少する酸素ピークが確認された。
【００２９】
１×１０６個／ｍＬの生菌（Ｎ−３株）を含む培養液５０ｍＬを濾過したメンブランについては、測定開始から１０分でもピークはほとんど認められないくらいに減少しており、浸漬法では測定できない範囲においても、本発明方法であれば測定が可能であると考えられる。
【００３０】
図４は、測定開始３０分後のピーク電流値を指標とした検量線である。１×１０４個／ｍＬ、１×１０５個／ｍＬ、１×１０６個／ｍＬで、それぞれ有意な差が認められた。培養液の量を１００ｍＬとすると、１×１０４個／ｍＬと１×１０３個／ｍＬでも差が認められた。図５は、培養液を５００ｍｌに増やした場合の検量線である。１×１０３個／ｍＬと１×１０４個／ｍＬの差は、さらに顕著なものとなった。
【００３１】
図３や図４に示す検量線は、生菌の培養液中の濃度に対して作成したものである。そこで、メンブレン上の生菌数とピーク電流値の関係を検討したところ、図６に示す関係となった。図６から明らかなように、濾過した液量に関わらず、シグモイド曲線上に載っていることから、例えば生菌数センサにプリセットする検量線として使用できるものと考えられる。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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