(57)【要約】      （修正有）【課題】食品中の微生物の高感度かつ特異的な検出のための方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列からなり、食品中の１又は複数の微生物の存在の検出のための微生物核酸とハイブリダイズし得る前記塩基配列からなる核酸集団、フォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ、または、１又は複数の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の１又は複数の微生物の特異的な検出のための前記核酸配列からなる、前記核酸集団を含むアッセイキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項２】
２つ以上の核酸を含む核酸集団であって、前記２つ以上の核酸は各々、配列番号１〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、集団。
【請求項３】
前記２つ以上の核酸は２つ以上の異なる核酸を含む、請求項２に記載の集団。
【請求項４】
核酸集団を含むアッセイキットであって、前記集団は、
（ａ）配列番号１〜３、
（ｂ）配列番号４〜６、
（ｃ）配列番号７〜９、
（ｄ）配列番号１０〜１２、
（ｅ）配列番号１３〜１５、
（ｆ）配列番号１６〜１８、
（ｇ）配列番号１９〜２１、
（ｈ）配列番号２２、２４及び２７、
（ｉ）配列番号２２、２５及び２７、
（ｊ）配列番号２３、２６及び２７、
（ｋ）配列番号２８〜３０、
（ｌ）配列番号３１〜３３、
（ｍ）配列番号３４〜３６、
（ｎ）配列番号３７〜３９、
（ｏ）配列番号４０〜４２、及び
（ｐ）配列番号４３〜４５
からなる群から選択される、キット。
【請求項５】
支持体上に固定化された請求項１に記載の核酸、請求項２又は３に記載の核酸集団又は請求項４に記載のアッセイキットの核酸集団を含む支持体。
【請求項６】
検出可能な標識をさらに含む、請求項５に記載の支持体。
【請求項７】
食品中の１又は複数の微生物の存在を検出するための方法であって、
（ａ）食品から単離された微生物核酸を含む少なくとも１つの試験サンプルを得るステップ、
（ｂ）請求項１に記載の核酸、請求項２又は３に記載の核酸集団、請求項４に記載のアッセイキットの核酸集団、又は請求項５又は６に記載の核酸を含む支持体を、該核酸と前記微生物核酸との間で複合体が形成されるのを可能にする条件下で前記少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記複合体を検出するステップ、及び、任意選択で、
（ｄ）前記少なくとも１つの試験サンプル中の複合体の量を、微生物核酸を欠くネガティブサンプルからの複合体の量と比較するステップ（該ステップにおいて、前記少なくとも１つの試験サンプルからの複合体の量の増加は１又は複数の微生物の存在を示す。）
を含む方法。
【請求項８】
食品の変敗を引き起こす１又は複数の微生物の存在を検出するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペクチナタス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）及びメガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）からなる群から選択される１又は複数の属の１又は複数の微生物の存在を検出するステップを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ペディオコッカス・ダムノサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｍｎｏｓｕｓ）、ペディオコッカス・イノピナタス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ）、ペディオコッカス・クラウセニ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・バッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ）、ラクトバチルス・パラブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・パラコリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・ペロレンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｒｏｌｅｎｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペクチナタス・セレビシフィラス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ）、ペクチナタス・フリシンゲンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ）、ペクチナタス・ハイカラエ（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｈａｉｋａｒａｅ）、ペクチナタス・ポルタレンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｐｏｒｔａｌｅｎｓｉｓ）、メガスフェラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びメガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）からなる群から選択される１又は複数の微生物の存在を検出するステップを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
食品が飲料である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
食品がビールである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【電子的提出物の参照による組み入れ】
【０００１】
[0001]本明細書と同時に提出されたコンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表（２０１２年７月２０日付けの、「７１０６７５ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ」という名称の８，７８１バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル）は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]微生物（例えば細菌）は、製造中又は製造後に食品（例えばビール）の変敗を引き起こし得る。いくつかの微生物は、食品変敗、及びいくつかの望ましくない影響（例えば、不快臭、不快な味、あるいは食品を安全に摂取できないものにする）の１又は複数を引き起こし得る。食品変敗微生物の存在を正確かつ迅速に検出しないと、食品変敗の危険性が増加する可能性がある。食品の変敗を引き起こす微生物の迅速かつ正確な検出に対する障害としては、例えば、微生物の検出に使用される従来の微生物学的方法が長期にわたることが挙げられる。これらの従来の方法は、完了するのに平均７〜１４日を要する可能性がある。正確な検出に対する他の障害としては、例えば、いくつかの食品変敗微生物のゲノム配列が非食品変敗微生物のゲノム配列と類似していることが挙げられる。
【０００３】
[0003]したがって、食品の変敗を引き起こす微生物を検出するための改善された組成物及び方法が求められている。
【発明の概要】
【０００４】
[0004]本発明のある実施形態は、配列番号１〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる核酸を提供する。
【０００５】
[0005]本発明の他の実施形態は、２つ以上の核酸を含む核酸集団であって、２つ以上の核酸は各々、配列番号１〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、集団を提供する。
【０００６】
[0006]本発明の他の実施形態は、核酸集団を含むアッセイキットであって、集団は、（ａ）配列番号１〜３、（ｂ）配列番号４〜６、（ｃ）配列番号７〜９、（ｄ）配列番号１０〜１２、（ｅ）配列番号１３〜１５、（ｆ）配列番号１６〜１８、（ｇ）配列番号１９〜２１、（ｈ）配列番号２２、２４及び２７、（ｉ）配列番号２２、２５及び２７、（ｊ）配列番号２３、２６及び２７、（ｋ）配列番号２８〜３０、（ｌ）配列番号３１〜３３、（ｍ）配列番号３４〜３６、（ｎ）配列番号３７〜３９、（ｏ）配列番号４０〜４２、及び（ｐ）配列番号４３〜４５からなる群から選択される、キットを提供する。
【０００７】
[0007]本発明のさらに別の実施形態は、食品中の１又は複数の微生物の存在を検出するための方法であって、（ａ）食品から単離された微生物核酸を含む少なくとも１つの試験サンプルを得るステップ、（ｂ）本発明の核酸、核酸集団、又は少なくとも１つの本発明の核酸を含む支持体を、本発明の核酸と微生物核酸との間で複合体が形成されるのを可能にする条件下で少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップ、（ｃ）複合体を検出するステップ、及び、任意選択で、（ｄ）少なくとも１つの試験サンプル中の複合体の量を、微生物核酸を欠くネガティブサンプルからの複合体の量と比較するステップ（該ステップにおいて、少なくとも１つの試験サンプルからの複合体の量の増加は１又は複数の微生物の存在を示す。）を含む方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
[0008]本発明のある実施形態は、配列番号１〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる核酸を提供する。一実施形態において、核酸は単離又は精製される。本発明の核酸は、食品中の１又は複数の微生物の存在の検出のための微生物核酸と有利なことに特異的にハイブリダイズし得るフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブを提供する。いくつかの実施形態において、プライマー及びプローブは、特定の属（ｇｅｎｕｓ）の微生物の核酸と特異的にハイブリダイズする。特に好ましい実施形態において、プライマー及びプローブは、特定の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の微生物の核酸と特異的にハイブリダイズする。
【０００９】
[0009]本発明の核酸は、食品のサンプル中で食品変敗を引き起こす１又は複数の微生物の存在を検出するために使用されてもよい。本発明のある実施形態において、本発明の核酸は、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペクチナタス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）及びメガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）からなる群から選択される１又は複数の属（ｇｅｎｕｓ）の１又は複数の微生物を特異的に検出してもよい。本発明の核酸により特異的に検出可能な微生物の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の例を表１に記載する。
【００１０】
【表１−１】
2014027933.tif 000002
【表１−２】
2014027933.tif 000003
【００１１】
[0010]本発明の核酸は、任意のタイプの微生物核酸を特異的に検出することができる。本発明のある実施形態において、微生物核酸はＤＮＡである。さらに別の実施形態において、本発明の核酸は、配列番号１〜４５のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列からなる核酸である。配列番号１〜４５のいずれかに対して相補的な核酸は微生物ＲＮＡを検出してもよい。
【００１２】
[0011]一実施形態において、本発明の核酸は検出可能な標識をさらに含む。標識は、本発明の核酸と微生物核酸とのハイブリダイゼーション（例えば複合体）を検出するのに適した任意の標識であり得る。検出可能な標識としては、例えば、放射性標識、非放射性標識、蛍光標識及び化学発光標識のいずれか１又は複数が挙げられる。
【００１３】
[0012]本発明の他の実施形態は、２つ以上の核酸を含む核酸集団であって、２つ以上の核酸は各々、配列番号１〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、集団を提供する。本発明のある実施形態において、集団は、配列番号１〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでもよい又はさらに含んでもよい。集団は、任意の適当な数の本発明の核酸を含んでもよい。例えば、集団は、約２〜約４５以上の核酸、約１０以下〜約４０以上の核酸、又は約２０以下〜約３０以上の核酸を含んでもよい。この点、集団は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上又は４５以上の核酸を含んでもよい。集団の２つ以上の核酸は相互に同一であってもよいが、好ましい実施形態において、２つ以上の核酸は相互に異なる。２つ以上の異なる核酸は、有利なことに２つ以上の異なる微生物核酸とハイブリダイズすることができ、そのため、食品中の２つ以上の異なる微生物の存在を検出することができる。
【００１４】
[0013]本発明のある実施形態は、１又は複数の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の１又は複数の微生物の特異的な検出のための核酸集団を含むアッセイキットを提供する。アッセイキットの核酸集団は、少なくとも１つのプライマー及びプローブ、好ましくは、少なくとも１つのフォワードプライマー、少なくとも１つのリバースプライマー及び少なくとも１つのプローブを含んでもよい。一実施形態において、アッセイキットは、表１のアッセイキット番号１〜１４からなる群から選択される。好ましくは、アッセイキットの核酸集団は、（ａ）配列番号１〜３、（ｂ）配列番号４〜６、（ｃ）配列番号７〜９、（ｄ）配列番号１０〜１２、（ｅ）配列番号１３〜１５、（ｆ）配列番号１６〜１８、（ｇ）配列番号１９〜２１、（ｈ）配列番号２２、２４及び２７、（ｉ）配列番号２２、２５及び２７、（ｊ）配列番号２３、２６及び２７、（ｋ）配列番号２８〜３０、（ｌ）配列番号３１〜３３、（ｍ）配列番号３４〜３６、（ｎ）配列番号３７〜３９、（ｏ）配列番号４０〜４２、及び（ｐ）配列番号４３〜４５からなる群から選択される。一実施形態において、アッセイキットは、配列番号１〜４５のいずれか１又は複数に相補的な配列を含んでもよい。
【００１５】
[0014]本明細書において、「ヌクレオチド配列」又は「核酸」は「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を包含し、一般的にはＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味する。ここで、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、また、合成されたものであっても天然の供給源から得られた（例えば単離及び／又は精製された）ものであってもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーは、天然、非天然又は改変ヌクレオチドを含んでもよく、また、未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然又は改変ヌクレオチド間結合（例えばホスホロアミデート又はホスホロチオエート結合）を含んでもよい。一般的には、本発明の核酸は、挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含まないのが好ましい。しかし、本明細書に記載のように、場合により、核酸は１又は複数の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含むのが好ましい。
【００１６】
[0015]本発明の核酸は、当技術分野で知られている手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチドを用いて、あるいは分子の生物学的安定性を増加させるように又はハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された多様に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体、アクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学的に合成することができる。核酸を生成させるために使用可能な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、本発明の核酸の１又は複数は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）などの会社から購入できる。
【００１７】
[0016]本発明のある実施形態は、支持体上に固定化された本発明の核酸、核酸集団又はアッセイキットの核酸集団を含む支持体を提供する。本発明の他の実施形態は、支持体上に固定化された試験サンプルを含む支持体を提供し、本発明の核酸は支持体に適用される。支持体は、本発明の核酸を固定化するのに適した任意の支持体であり得る。支持体の例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第６，８２１，７７１号に記載されている。他の支持体としては、例えば、ＧＥＮＥＤＩＳＣプレート（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。
【００１８】
[0017]支持体は、検出可能な標識をさらに含んでもよい。標識は、本発明の核酸と微生物核酸との複合体を検出するのに適した任意の標識であり得る。検出可能な標識としては、例えば、放射性標識、非放射性標識、蛍光標識及び化学発光標識のいずれか１又は複数が挙げられる。
【００１９】
[0018]本発明のさらに別の実施形態は、食品中の１又は複数の微生物の存在を検出するための方法であって、（ａ）食品から単離された微生物核酸を含む少なくとも１つの試験サンプルを得るステップ、（ｂ）本発明の核酸、核酸集団、アッセイキットの核酸集団、又は少なくとも１つの核酸を含む支持体を、本発明の核酸と微生物核酸との間で複合体が形成されるのを可能にする条件下で少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップ、（ｃ）複合体を検出するステップ、及び（ｄ）少なくとも１つの試験サンプル中の複合体の量を、微生物核酸を欠くネガティブサンプルからの複合体の量と比較するステップ（該ステップにおいて、少なくとも１つの試験サンプルからの複合体の量の増加は１又は複数の微生物の存在を示す。）を含む方法を提供する。
【００２０】
[0019]上記方法は、試験される食品のサンプルを得るステップ及び任意の適当な方法でサンプル中の微生物を培養するステップを含んでもよい。例えば、食品がビールである場合、サンプルは、澄んだビール、未濾過ビール、プロセスビール、発酵ビール又は他の濁りビールのいずれか１又は複数であり得る。
【００２１】
[0020]上記方法は、当技術分野で知られているように任意の適当な培養培地中で微生物を培養するステップを含んでもよい。培養培地は、試験される食品及び微生物の性質に応じて選択されてもよい。培養培地としては、例えば、ＭＲＳエンリッチメントブロス（ＡＥＳ  ＣＨＥＭＵＮＥＸ，  Ｉｎｃ．，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手可能）、ＮＢＢ−Ｃエンリッチメントブロス（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡから入手可能）などのエンリッチメントブロスが挙げられる。
【００２２】
[0021]微生物は、当技術分野で知られているように任意の適当な温度で任意の適当な期間、培養されてもよい。培養温度及び期間は、試験される食品及び微生物の性質に応じて選択されてもよい。例えば、微生物は、約２０℃〜約４０℃、好ましくは約２２℃〜約２８℃の温度で培養されてもよい。微生物は、約１日〜約１４日間、好ましくは約２日〜約７日間培養されてもよい。
【００２３】
[0022]上記方法は、当技術分野で知られているように任意の適当な方法で微生物から核酸を抽出するステップを含んでもよい。核酸はＲＮＡ及び／又はＤＮＡであってもよい。核酸を抽出するためのプロトコールは、当技術分野で知られているように、試験される食品、微生物及び核酸の性質に応じて選択されてもよい。好ましくは、核酸は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌を溶解し、試験可能な量のＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）阻害剤なしで回収するような方法で抽出される。核酸抽出は、市販の核酸抽出キットのいずれかをメーカーの使用説明書に従って用いて実施されてもよい。ＤＮＡ抽出キットとしては、例えば、ＰＥＦＯＯＤキット（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。
【００２４】
[0023]上記方法は、本発明の核酸、核酸集団、アッセイキットの核酸集団、又は支持体を、本発明の核酸と微生物核酸との間で複合体が形成されるのを可能にする条件下で少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップを含む。この点、上記方法は、本発明の核酸を、当技術分野で知られているように、本発明の核酸が微生物核酸と特異的にハイブリダイズするのを可能にする条件下で、抽出された核酸のサンプルと接触させるステップを含む。上記方法は、当技術分野で知られているように任意の適当なタイプのＰＣＲを用いて本発明の核酸及び微生物核酸を増幅するステップを含んでもよい。
【００２５】
[0024]上記方法は、複合体を検出するステップを含む。複合体は、例えば、当技術分野で知られているように放射性標識又は色素を用いて検出されてもよい。好ましい実施形態において、上記方法は、例えばレーザーを用いて、蛍光色素から放射された光を測定するステップを含む。複合体の検出は、形成された複合体の量を測定するステップをさらに含んでもよい。
【００２６】
[0025]ある実施形態において、上記方法は、少なくとも１つの試験サンプル中の複合体の量を、微生物核酸を欠くネガティブサンプルからの複合体の量と比較するステップを任意選択で含む。該ステップにおいて、少なくとも１つの試験サンプルからの複合体の量の増加は１又は複数の微生物の存在を示す。この点、サンプル中で検出される複合体の量が、微生物核酸を欠くことが分かっているネガティブサンプル中で検出される複合体の量を超えない場合、サンプルは食品変敗微生物について陰性となる。サンプル中で検出される複合体の量が、微生物核酸を欠くことが知られているネガティブサンプル中で検出される複合体の量を超える場合、サンプルは食品変敗微生物について陽性となる。
【００２７】
[0026]上記方法は、有利なことに、１つを超える異なる食品サンプル中の微生物の存在について同時に試験するステップを含んでもよい。この点、少なくとも１つの試験サンプルは、連続的又は同時に試験される２つ以上の異なるサンプルであってもよい。すなわち、連続的又は同時に試験される３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上又は２０以上のサンプルであってもよい。
【００２８】
[0027]上記方法は、食品の変敗を引き起こす任意の１又は複数の微生物の存在を検出するステップを含んでもよい。本発明のある実施形態において、上記方法は、ペディオコッカス、ラクトバチルス、ペクチナタス及びメガスフェラからなる群から選択される１又は複数の属（ｇｅｎｕｓ）の１又は複数の微生物の存在を検出するステップを含む。好ましい実施形態において、上記方法は、ペディオコッカス・ダムノサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｍｎｏｓｕｓ）、ペディオコッカス・イノピナタス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ）、ペディオコッカス・クラウセニ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・バッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ）、ラクトバチルス・パラブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・パラコリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・ペロレンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｒｏｌｅｎｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペクチナタス・セレビシフィラス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ）、ペクチナタス・フリシンゲンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ）、ペクチナタス・ハイカラエ（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｈａｉｋａｒａｅ）、ペクチナタス・ポルタレンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｐｏｒｔａｌｅｎｓｉｓ）、メガスフェラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びメガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）からなる群から選択される１又は複数の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の微生物の存在を検出するステップを含む。
【００２９】
[0028]上記方法は、任意の食品中の微生物を検出するステップを含んでもよい。食品は、例えば、乳製品；脂肪、油、及び脂肪エマルション；食用の氷（例えば、シャーベット及びソルベを含む）；果物及び野菜（例えば、キノコ及び菌類、根及び塊茎、豆類及びマメ科植物、及びアロエ・ベラを含む）；海草；木の実及び種子；菓子；シリアル及びシリアル製品；焼いた食品（例えばパン）；食肉及び肉製品（例えば、家禽及び狩猟動物を含む）；魚介及び魚介製品（軟体動物、甲殻類及び棘皮動物を含む）；卵及び卵製品；甘味料（例えばハチミツを含む）；塩、香辛料、スープ、ソース、サラダ、タンパク質製品；特定の栄養上の用途を意図した食品；及び飲料（例えば、ビール、ワイン）のいずれか１又は複数であり得る。好ましい実施形態において、食品はビールである。
【００３０】
[0029]本明細書において、「単離」とは、それが自然に存在する環境から取り出されていることを意味する。本明細書において、「精製」とは、純度が高められていることを意味する。「純度」は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度として解釈されるべきではない。例えば、純度は、少なくとも約５０％とすることができ、６０％超、７０％超、８０％超又は９０％超とすることができ、あるいは１００％とすることができる。
【実施例】
【００３１】
[0030]以下の実施例は本発明をさらに説明するものであるが、当然のことながら、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００３２】
実施例１：
[0031]本実施例では、本発明の核酸を使用するＬ．カゼイ（ｃａｓｅｉ）の定量的検出を行う。
【００３３】
[0032]ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ抽出キット（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能）を用いてＬ．カゼイ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）  菌株番号（ｓｔｒａｉｎ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）  Ｅ−０１１８０８）から単離する。細菌ＤＮＡは、８３ｐｇ／μＬの濃度まで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｐＨ８．３により希釈する。Ｔｒｉｓ−ｐＨ８．３緩衝液（１０ｍＭ）を標的なしのコントロール（ＮＴＣ）として使用する。
【００３４】
[0033]Ｌ．カゼイアッセイキット（フォワードプライマー（配列番号２８）、リバースプライマー（配列番号２９）及びプローブ（配列番号３０）を含む。）を用いて、ＰＣＲウェル当たり０（ＮＴＣ）、１０、１０００又は１０００００コピーのＬ．カゼイからのＤＮＡを試験する。プローブは、５’の６−ＦＡＭ蛍光色素及び３’のＢＨＱ１クエンチャー又は５’のＲＯＸ蛍光色素及び３’のＢＨＱ２クエンチャーで標識する。
【００３５】
[0034]ＧＥＮＥＤＩＳＣプレート（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能）をメーカーの使用説明書に従って用意する。
【００３６】
[0035]配列番号２８〜３０を含む定量的（ｑ）ＰＣＲミックスキット（「マスターミックス」）（ＧＥＮＥＤＩＳＣ検出キット（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能）に含まれる。）を調製する。ＧＥＮＥＤＩＳＣプレート上にあるバーコード及びマスターミックスバッグに含まれる識別カード上のバーコードを、ＧＥＮＥＤＩＳＣサイクラー（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能）に適合したバーコードリーダーを用いてスキャンする。サンプル名を、メーカーの使用説明書に従ってＧＥＮＥＤＩＳＣサイクラーに入力する。ＧＥＮＥＤＩＳＣプレートセクターの各々に対応する６つの１．５ｍＬマイクロチューブを標識する。マスターミックスを２秒間ボルテックスし、その後、２秒間簡単に遠心分離する。マスターミックス（３７μＬ）を各マイクロチューブに加える。マイクロチューブを閉める。ＤＮＡサンプルを、１５秒間、卓上遠心分離機で遠心分離する。
【００３７】
[0036]ＤＮＡサンプル（３７μＬ）を、ピペットを用いて、マスターミックスが入った対応するマイクロチューブに移す。チューブを、クロスコンタミネーションを防止するために閉める。チューブを２秒間穏やかに混合し、その後、ミニ遠心分離機を用いて２秒間遠心分離する。これらのステップを、他の５つのサンプルの各々について繰り返す。各マイクロチューブからの７２μＬを適切なＧＥＮＥＤＩＳＣプレートセクターに加える。
【００３８】
[0037]ＧＥＮＥＤＩＳＣプレートに装填する。充填キャップをＧＥＮＥＤＩＳＣプレートの上部に取り付け、キャップを穏やかに押さえて漏れがないようにし、吸引を始める。真空化が９０％完了していることをＧＥＮＥＤＩＳＣサイクラーが示したら、ＧＥＮＥＤＩＳＣプレートを軽く叩いて残留気泡を除去する。真空を解除した後、キャップを取り外す。ミネラルオイル（４滴）を各ＧＥＮＥＤＩＳＣプレートセクターに装填する。充填キャップをＧＥＮＥＤＩＳＣプレートの上部に取り付けて吸引を始める。キャップを真空サイクルの終了時に取り外し、７０％のエタノールで拭くことによって清浄にする。ウェルを検査して、アッセイキットの中止を引き起こし得る部分的又は不均等に充填されたウェルが存在しないようにする。
【００３９】
[0038]充填キャップを所定の位置に戻す。ＧＥＮＥＤＩＳＣプレートをＧＥＮＥＤＩＳＣサイクラーに注意深く挿入し、ＧＥＮＥＤＩＳＣサイクラーの蓋を閉める。ＰＣＲを、熱サイクル条件を用いて実施する。熱サイクル条件は、４つの温度：１１３℃、１０７℃、５７℃及び６３℃を含む。サイクル時間は、４５サイクルについて１サイクル当たり７０秒間とする。ＰＣＲの終了時に、ＧＥＮＥＤＩＳＣプレートを取り外して廃棄する。
【００４０】
[0039]データを分析する。Ｌ．カゼイアッセイ（配列番号２８〜３０）は、ＰＣＲウェル当たり１０、１０００及び１０００００コピーのＬ．カゼイ標的ＤＮＡを定量的に検出する。標的の非存在下又は「鋳型なしの」コントロール（ＮＴＣ）ではシグナルはない。ＮＴＣは、標的分子の非存在下での非特異的シグナルを測定する。阻害コントロール（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ポジティブＰＣＲシグナルをもたらし、サンプル又はサンプル中の混入物の存在下でのＰＣＲ阻害の程度を測定する。
【００４１】
実施例２：
[0040]本実施例では本発明の核酸の特異性を明らかにする。
【００４２】
[0041]ゲノムＤＮＡを、実施例１で記載のように、１３のビール変敗細菌（表２）から単離し、希釈する。Ｔｒｉｓ−ｐＨ８．３緩衝液（１０ｍＭ）を標的なしのコントロール（ＮＴＣ）として使用する。細菌株はすべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得る。
【００４３】
【表２】
2014027933.tif 000004
【００４４】
[0042]実施例１の手順に従って、Ｌ．カゼイアッセイキット（フォワードプライマー（配列番号２８）、リバースプライマー（配列番号２９）及びプローブ（配列番号３０）を含む。）を用いて、表２の１３の異なる細菌の各々からのＤＮＡのサンプルを試験する。プローブはすべて、５’の６−ＦＡＭ蛍光色素及び３’のＢＨＱ１クエンチャー又は５’のＲＯＸ蛍光色素及び３’のＢＨＱ２クエンチャーで標識する。
【００４５】
[0043]Ｌ．カゼイアッセイ（配列番号２８〜３０）は、ＰＣＲウェル当たり１０、１０００及び１０００００コピーのＬ．カゼイ標的ＤＮＡを定量的に検出する。しかし、表２の他の１２の細菌の各々の１０００００コピーの存在下ではポジティブシグナルはない。したがって、Ｌ．カゼイアッセイ（配列番号２８〜３０）はＬ．カゼイに対して極めて特異的である。
【００４６】
[0044]本明細書で引用される刊行物、特許出願及び特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み入れられることが個々に具体的に示され、かつその全体が本明細書に記載されるのと同程度に、参照により組み入れられる。
【００４７】
[0045]本発明の記載との関連における（特に特許請求の範囲との関連における）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」及び同様の指示語の使用は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈に反することが明らかでない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。１又は複数の項目のリストを伴う「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」の使用（例えば「Ａ及びＢの少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」）は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈に反することが明らかでない限り、リストされた項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又はリストされた項目のうちの２つ以上の項目の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味するものと解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断らない限り、オープンエンドの（すなわち「…を含むが、それに限定されない」を意味する）用語として解釈されるべきである。本明細書における数値範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、該範囲内にある各々の独立の値を個別に指すための簡略表現とすることを意図したものにすぎず、各々の独立の値は、あたかもそれが本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み入れられる。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈に反することが明らかでない限り任意の適当な順で実施できる。本明細書で提供される例又は例示表現（例えば「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用はいずれも、本発明をよりよく説明することを意図したものにすぎず、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、請求項に記載されていない何らかの要素を本発明の実施に必須なものとして示すものと解釈されるべきではない。
【００４８】
[0046]本明細書には、本発明者に知られている本発明を実施するための最良の形態を含めて、本発明の好ましい実施形態が記載されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、以上の説明を読めば当業者には明らかになるであろう。本発明者は、そのような変形形態を当業者が適宜採用することを予想しており、本発明者は、本明細書に具体的に記載された以外の形態で本発明が実施されることを想定している。したがって、本発明は、適用法令により許容される範囲で、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載される発明のすべての改変形態及び均等物を包含する。また、そのすべての可能な変形形態における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈に反することが明らかでない限り本発明に包含される。
【配列表】
2014027933000001.app
【外国語明細書】
2014027933000001.pdf