(57)【要約】【課題】本発明は、細胞を１つずつ取り出して解析することとあわせて組織の２次元情報を保った形で種々の遺伝子の発現量を定量的にモニターするための方法及び／又は手段を提供する。【解決手段】本発明は、生体組織内の２次元細胞分布情報を保持した形でmRNAからcDNAライブラリを作製して任意の又は対象とする全ての場所の遺伝子発現量を１細胞レベルの位置分解能で得る方法を提供する。より具体的には、生体組織内の２次元細胞分布情報を保持した形でmRNAからシート状のcDNAライブラリを作製し、これを繰り返し遺伝子発現の検出ステップに用いることによって、多数の遺伝子について高精度に発現分布計測を可能とする。【選択図】図１
2014027955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸プローブが固定された支持体と、
液体を供給する液体供給部と、
前記液体供給部から供給された被検核酸抽出試薬によって、前記支持体上で位置が固定された細胞から抽出された被検核酸を、前記細胞の下方に位置する前記核酸プローブに捕捉する被検核酸捕捉部と、
前記被検核酸に関する解析を行う解析部と、を備える
ことを特徴とする解析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の解析装置であって、
前記解析部は、
前記支持体に捕捉された被検核酸の前記支持体での位置に関する情報を取得する、
ことを特徴とする解析装置。
【請求項３】
請求項２に記載の解析装置であって、
前記解析部は、
前記被検核酸の位置情報から前記細胞についての遺伝子発現分布を解析する、
ことを特徴とする解析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の解析装置であって、
前記解析部は、
複数の細胞ごとの遺伝子発現分布を解析し、細胞間での遺伝子発現分布を比較する、
ことを特徴とする解析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の解析装置であって、
前記解析部は、
前記支持体に捕捉された被検核酸の位置情報を光学的に解析する、
ことを特徴とする解析装置。
【請求項６】
請求項２に記載の解析装置であって、
前記解析部は、
前記細胞の顕微鏡像と、前記被検核酸の位置に関する情報、に基づいて、細胞形状と遺伝子発現との間の相関に関する解析を行う、
ことを特徴とする解析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の解析装置であって、
前記支持体は、
前記捕捉された被検核酸の逆転写により構成されたcDNAライブラリを有する、
ことを特徴とする解析装置。
【請求項８】
請求項１に記載の解析装置であって、
前記被検核酸は、メッセンジャーRNA（mRNA）である、ことを特徴とする解析装置。
【請求項９】
請求項８に記載の解析装置であって、
前記支持体は、
前記核酸プローブとして、ポリT配列を含むDNAプローブが固定されている、
ことを特徴とする解析装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の解析装置であって、
前記支持体は、
シート、メンブレン、ゲル薄膜、キャピラリープレート及びビーズの少なくともいずれかである、
ことを特徴とする解析装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の解析装置であって、
前記支持体は、
多孔質支持体であって、前記核酸プローブが細孔に固定されている、ことを特徴とする解析装置。
【請求項１２】
核酸プローブが固定された支持体と、
液体を供給する液体供給部と、
前記液体供給部から供給された被検核酸抽出試薬によって、前記支持体上で位置が固定された細胞から抽出された被検核酸を、前記細胞の下方に位置する前記核酸プローブに捕捉する被検核酸捕捉部と、を備える、
ことを特徴とするデバイス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のデバイスであって、
前記支持体は、
前記捕捉された被検核酸の逆転写により構成されたcDNAライブラリを有する、
ことを特徴とするデバイス。
【請求項１４】
請求項１２に記載のデバイスであって、
前記被検核酸は、メッセンジャーRNA（mRNA）である、ことを特徴とするデバイス。
【請求項１５】
請求項１４に記載のデバイスであって、
前記支持体は、
前記核酸プローブとして、ポリT配列を含むDNAプローブが固定されている、
ことを特徴とするデバイス。
【請求項１６】
請求項１２に記載のデバイスであって、
前記支持体は、
シート、メンブレン、ゲル薄膜、キャピラリープレート及びビーズの少なくともいずれかである、
ことを特徴とするデバイス。
【請求項１７】
請求項１２に記載のデバイスであって、
前記支持体は、
多孔質支持体であって、前記核酸プローブが細孔に固定されている、ことを特徴とするデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現解析方法に関する。具体的には、サンプルに含まれる核酸からcDNAライブラリを作製して、サンプルにおける遺伝子発現プロフィールを解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現解析では、細胞群の中からmRNAを取り出し、相補鎖であるcDNAを作製してこのコピー数をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などにより増幅した後、DNAプローブアレー（DNAチップ）を用いてターゲットを対応するプローブ位置に捕獲して蛍光検出する方法が用いられている。しかし、PCR増幅やDNAチップを用いる方法は定量分析精度が低く、精度の高い遺伝子発現プロフィール分析方法が望まれていた。ヒトゲノム解析の終了に伴い遺伝子発現を定量的に調べる要求は強まりつつあるが、最近では１つの細胞からmRNAを抽出して定量分析を行う方法が望まれている。定量性の良い分析方法として定量PCRがあるが、これはターゲットと同じDNA配列を有する標準試料を用意し、同じ条件下でPCR増幅して増幅の進行具合を蛍光プローブでモニターして比較することで定量分析を行う方法である。ターゲットが１細胞の場合には元々存在するmRNAの数が少なく、定量分析することが難しい。また、複数の遺伝子発現の定量分析を行うには試料を分割してそれぞれ独立に定量分析を行う必要がある。対象となる遺伝子の数が多く、発現量が少ない遺伝子が含まれる場合には試料分割により測定できない場合もある。
【０００３】
このような状況下で発明者らは全てのmRNAをcDNAに変換し、ビーズ上に保持したcDNAライブラリ（全てのcDNAを含んだcDNA集合体）を作製して定量分析に利用する方法を考案した（特許文献１）。そこではcDNAライブラリを繰り返し利用することで試料分割による微量発現遺伝子の計測ミスを取り除き、１細胞中に含まれる複数遺伝子の発現量を正確に計測できることを示した。しかし、生体組織については、多くの細胞からmRNAを取り出し、解析する技術しかないのが現状である。生体組織の２次元形状を保った形での遺伝子発現解析は、蛍光プローブを用いて１又は２つ程度のmRNAをモニターすることが行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−３１９０２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
再生医療、遺伝子を用いた診断、あるいは生命現象の基本的な理解には、組織の平均としての遺伝子の発現量ばかりでなく、組織を構成する１つ１つの細胞における遺伝子の発言を定量的に分析することが重要視されている。これには細胞を１つずつ取り出して解析することとあわせて組織の２次元情報を保った形で種々の遺伝子の発現量を定量的にモニターすることが望まれているが、良い方法が無いのが現状である。対象とする遺伝子が１又は２つの場合には蛍光プローブを用いた標識を利用して組織における遺伝子発現を観測することが可能であるが、多くの遺伝子の発現量を見ることは不可能であった。理想的には２次元又は３次元の構造体を形成する生体組織の中で活動する遺伝子（mRNA）を１細胞レベルで細胞の位置情報を保った形で計測することができれば生体内で起こっている種々の現象を細胞間の相互作用も含めて詳細に知ることができるようになり、生命科学分野、特に医療又は創薬分野に大きなインパクトを与えると考えられる。
【０００６】
このように多くの細胞の平均的な情報から１つの細胞の情報を得て生命活動を把握し、更に単に１つの細胞でなく、多くの細胞群を１細胞ごとに分析することが要求されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を克服するため鋭意検討を行った結果、生体組織内の２次元細胞分布情報を保持した形でmRNAからcDNAライブラリを作製して任意の又は対象とする全ての場所の遺伝子発現量を１細胞レベルの位置分解能で分析する方法を開発した。すなわち、２次元的に広がった組織内の各細胞又は細胞の部位に対応したcDNAライブラリシートを作製して遺伝子発現解析に用いることにより、上記課題を克服することができることを見出した。
具体的には、本発明は以下の（１）〜（２７）を包含する。
【０００８】
（１）遺伝子発現プロフィールの解析方法であって、
（a）サンプル中の被検核酸を、支持体に２次元的に分布しかつ固定された核酸プローブとハイブリダイズさせるステップ、
（b）被検核酸の配列に対し相補的な配列を有するcDNAを合成し、該支持体に２次元cDNAライブラリを作製するステップ、
（c）２次元cDNAライブラリを用いて、サンプルにおける遺伝子発現を検出するステップ
を含むことを特徴とする遺伝子発現プロフィールの解析方法。
【０００９】
（２）サンプルが複数の細胞を含み、遺伝子発現プロフィールを細胞ごとに解析するものである、（１）に記載の方法。
【００１０】
（３）サンプルが複数の細胞を含み、細胞ごとの遺伝子発現プロフィールを解析し、細胞間での遺伝子発現プロフィールを比較するものである、（１）又は（２）に記載の方法。
【００１１】
（４）サンプルが生体組織サンプルであり、生体組織サンプルを構成する細胞の２次元位置情報を保存した状態で２次元cDNAライブラリを作製する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
（５）サンプルが生体組織サンプルであり、生体組織サンプルを構成する細胞の内部の２次元位置情報を保存した状態で２次元cDNAライブラリを作製する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１３】
（６）生体組織サンプルが組織切片サンプルであり、その組織切片サンプル中の被検核酸を支持体に移動させることにより核酸プローブとハイブリダイズさせる、（４）又は（５）に記載の方法。
【００１４】
（７）被検核酸の支持体への移動が電気泳動により行われる、（６）に記載の方法。
【００１５】
（８）サンプルが、個々の細胞を２次元的に保持したアレーである、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００１６】
（９）被検核酸が、メッセンジャーRNA（mRNA）、非コードRNA（ncRNA）、及びDNA、並びにそれらの断片からなる群より選択される、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（10）被検核酸がmRNAであり、核酸プローブがポリT配列を含むDNAプローブである、（９）に記載の方法。
【００１８】
（11）支持体が、シート、メンブレン、ゲル薄膜、キャピラリープレート及びビーズからなる群より選択される少なくとも１種である、（１）〜（10）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（12）支持体が、２次元に区分された複数の微細な空間を有するものである、（１）〜（11）のいずれかに記載の方法。
（13）微細な空間の間隔が細胞のサイズより小さいものである、（12）に記載の方法。
（14）２次元cDNAライブラリが、支持体の２次元に区分された複数の微細な空間にcDNAが保持されているものである、（12）又は（13）に記載の方法。
【００２０】
（15）２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAを第２の支持体に移動させ、第２の支持体に２次元的に分布しかつ固定された、該cDNA又はその断片に対し相補的な配列を有する核酸プローブとハイブリダイズさせることにより、第２の２次元cDNAライブラリを作製するステップをさらに含む、（１）〜（14）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（16）２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAに対応する核酸断片を生成し、２次元cDNAライブラリの２次元位置情報を保持した状態で、該核酸断片を第２の支持体に移動させることにより、第２の２次元cDNAライブラリを作製するステップをさらに含む、（１）〜（15）のいずれかに記載の方法。
（17）cDNAに対応する核酸断片がcDNAの相補配列を含む、（16）に記載の方法。
（18）cDNAに対応する核酸断片が、cDNAの相補配列及びcDNAの配列とは関連のない既知配列を含む、（16）に記載の方法。
【００２２】
（19）検出対象の遺伝子に特異的な標識核酸プローブを２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAとハイブリダイズさせ、その標識に基づいて遺伝子発現を検出する、（１）〜（18）のいずれかに記載の方法。
（20）標識が蛍光標識又は化学発光標識である、（19）に記載の方法。
【００２３】
（21）検出対象の遺伝子に特異的な核酸プローブを２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAとハイブリダイズさせ、該核酸プローブに含まれる核酸配列の増幅反応を行い、その増幅産物に基づいて遺伝子発現を検出する、（１）〜（18）のいずれかに記載の方法。
（22）増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である、（21）に記載の方法。
【００２４】
（23）検出対象の遺伝子に特異的な核酸パドロックプローブを２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたパドロックプローブをライゲーション反応によりリング状のプローブとし、該リング状プローブを鋳型としてローリングサークル増幅（RCA）反応を行い、その増幅産物に基づいて遺伝子発現を検出する、（１）〜（18）のいずれかに記載の方法。
【００２５】
（24）増幅産物を蛍光又は化学発光を利用して検出する、（21）〜（23）のいずれかに記載の方法。
【００２６】
（25）２次元cDNAライブラリを繰り返し使用して、遺伝子発現の検出ステップを行う、（１）〜（24）のいずれかに記載の方法。
【００２７】
（26）２次元cDNAライブラリにおける遺伝子発現の検出結果とサンプルの２次元位置情報とを比較し、サンプルにおける特定の位置と遺伝子発現との相関データを得るステップをさらに含む、（１）〜（25）のいずれかに記載の方法。
【００２８】
（27）サンプルに含まれる分子プロフィールの解析方法であって、
（a）サンプル中の被検分子を、支持体に２次元的に分布しかつ固定された抗体又はアプタマーと結合させるステップ、
（b）近接ライゲーション法を利用して、被検分子と抗体又はアプタマーとの結合に特異的なリングプローブを形成するステップ、
（c）上記リングプローブ又はリングプローブを鋳型として生成された核酸断片を用いて２次元cDNAライブラリを作製するステップ、
（d）２次元cDNAライブラリを用いて、サンプルにおける分子の存在を検出するステップ
を含むことを特徴とする分子プロフィールの解析方法。
（28）分子がタンパク質である、（27）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、遺伝子発現プロフィールの解析方法が提供される。本発明の方法は、サンプルにおける遺伝子の発現を、その２次元位置情報と共に解析することができる。また本発明の方法では、サンプルにおいて発現される遺伝子を全てcDNAに変換してcDNAライブラリとすることができるため、遺伝子発現の検出を簡便かつ効率的に行うことができる。従って、本発明は、細胞機能解析、生体組織の解析、病気の診断、創薬などの分野で有用である。特にこれまでに集積された病理切片などに本発明を適用することで、種々の病気の解明、診断方法の確立、又は医薬品の開発等を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】２次元cDNAライブラリを細孔アレーシートにおいて作製する方法の概略図である。
【図２】cDNAライブラリの作製に用いる反応セルの一例である。
【図３】ローリングサークル増幅（RCA）反応の概略である。
【図４】ターゲット配列（配列番号１）の一例を示す。
【図５】パドロックプローブの配列（配列番号２）の一例を示す。
【図６】共通DNAプローブIの配列（配列番号３）の一例を示す。
【図７】共通DNAプローブIIの配列（配列番号４）の一例を示す。
【図８】化学発光測定を行うために用いた反応セルの一例である。
【図９】化学発光測定を行うために用いた光学系の一例である。
【図１０】化学発光測定を行うために用いた共焦点光学系の一例である。
【図１１】組織切片サンプルからcDNAライブラリを作製する方法の一例である。
【図１２】蛍光測定を行うために用いた光学系の一例である。
【図１３】蛍光測定を行うために用いた光学系の別の例である。
【図１４】蛍光測定を行うために用いた反応セル及び光学系の一例である。
【図１５】リングプローブを別の検出用ゲル膜に移動させて、RCA反応を行う場合の、細孔アレーシートとゲル膜の断面を示す。
【図１６】蛍光測定を行う場合のローリングサークル増幅（RCA）反応の概略である。
【図１７】蛍光測定を行うために用いたエバネッセント励起に基づく光学系の一例である。
【図１８】cDNAライブラリをメンブレンにおいて作製する方法の一例である。
【図１９】cDNAライブラリをビーズ上に作製する方法の一例である。
【図２０】cDNAライブラリをビーズ上に作製する方法の別の例である。
【図２１】cDNAライブラリ中のターゲットcDNAを検出するために使用するプローブ設計の一例である。
【図２２】電位計測により遺伝子発現を測定するための方法の一例である。
【図２３】近接ライゲーション法を利用して検出対象の分子をcDNAライブラリに固定し、定量するための方法の一例である。
【図２４】遺伝子発現を蛍光検出する場合のフローチャートである。
【図２５】遺伝子発現を化学発光検出する場合のフローチャートである。
【図２６】蛍光測定を行った場合の蛍光像の例と得られるデータ例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に本発明について詳細に説明する。本願は、2009年12月4日に出願された日本国特許出願第2009-276883号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【００３２】
本発明に係る遺伝子発現プロフィールの解析方法は、以下のステップ：
（a）サンプル中の被検核酸を、支持体に２次元的に分布しかつ固定された核酸プローブとハイブリダイズさせるステップ、
（b）被検核酸の配列に対し相補的な配列を有するcDNAを合成し、該支持体に２次元cDNAライブラリを作製するステップ、
（c）２次元cDNAライブラリを用いて、サンプルにおける遺伝子発現を検出するステップ
を含む。
【００３３】
本発明において「遺伝子発現プロフィールの解析」とは、サンプル（細胞、組織切片など）における遺伝子の発現を定量的に分析すること、サンプルにおける遺伝子の発現分布を分析すること、サンプルにおける特定の位置と遺伝子発現量との相関データを得ることを意味する。
【００３４】
サンプルは、遺伝子発現プロフィールを解析しようとする生体由来サンプルであれば特に限定されるものではなく、細胞サンプル、組織サンプル、液体サンプルなどの任意のサンプルを用いることができる。具体的には、１細胞からなるサンプル、複数の細胞を含むサンプル、組織切片サンプル、複数の個々の細胞を２次元的に保持したアレーの形態のサンプルなどが挙げられる。
【００３５】
またサンプルの由来となる生体も特に限定されるものではなく、脊椎動物（例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類など）、無脊椎動物（例えば昆虫、線虫、甲殻類など）、原生生物、植物、真菌、細菌、ウイルスなどの任意の生体に由来するサンプルを用いることができる。
【００３６】
本発明の方法では、例えばサンプルが複数の細胞を含み、遺伝子発現プロフィールを細胞ごとに解析することができる。また例えばサンプルが複数の細胞を含み、細胞ごとの遺伝子発現プロフィールを解析し、細胞間での遺伝子発現プロフィールを比較することができる。
【００３７】
本発明の方法では、例えばサンプルが生体組織サンプルであり、生体組織サンプルを構成する細胞の２次元位置情報を保存した状態で２次元cDNAライブラリを作製することが好ましい。あるいは、サンプルが生体組織サンプルであり、生体組織サンプルを構成する細胞の内部の２次元位置情報を保存した状態で２次元cDNAライブラリを作製することが好ましい。生体組織サンプルとしては、組織切片サンプルを用いることができ、その組織切片サンプル中の被検核酸を支持体に移動させることにより核酸プローブとハイブリダイズさせることができる。この被検核酸の支持体への移動は、例えば電気泳動により行うことができる。
【００３８】
本発明の方法において、被検核酸としては、メッセンジャーRNA（mRNA）、非コードRNA（ncRNA）、及びDNA、並びにそれらの断片を用いることができる。例えば、当技術分野で公知の方法によりサンプルに含まれる核酸を抽出して、被検核酸を調製することができる。例えば、Proteinase Kのようなタンパク質分解酵素、チオシアン酸グアニジン・グアニジン塩酸といったカオトロピック塩、Tween及びSDSといった界面活性剤、あるいは市販の細胞溶解用試薬を用いて、細胞を溶解し、それに含まれる核酸、すなわちDNA及びRNAを溶出することができる。被検核酸としてmRNAを用いる場合には、上記の細胞溶解により溶出された核酸のうち、DNAをDNA分解酵素（DNase）により分解し、核酸としてRNAのみを含む試料が得られる。
【００３９】
また、使用する核酸プローブは、これらの被検核酸とハイブリダイズして捕捉することができるものであれば特に限定されるものではなく、当業者には公知である。例えば被検核酸がmRNAの場合には、核酸プローブとしてポリT配列を含むDNAプローブを用いることが好ましい。ポリT配列を含むDNAプローブ、すなわちオリゴ（dT）は、常法により合成することができ、オリゴ(dT)の重合度は、mRNAのポリA配列とハイブリダイズして、mRNAをオリゴ(dT)が固定された支持体に捕捉しうる重合度であればよい。
【００４０】
支持体は、cDNAライブラリの作製に当技術分野で一般的に使用されている材料で作製されたものであれば特に限定されるものではなく、例えばシート、メンブレン、ゲル薄膜、キャピラリープレート、ビーズ、フィルムなどである。その材料としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト及び感光性ガラス等のガラス材料；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等のプラスチック；アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンが挙げられる。例えば支持体としてシートを用いる場合には、例えばアルミナ、ガラスなどからシートを作製することができる。また支持体としてゲル薄膜を用いる場合には、例えばアクリルアミドゲル、ゼラチン、修飾ポリエチレングリコール、修飾ポリビニルピロリドン、ハイドロゲルなどを用いてゲル薄膜を作製することができる。支持体としてメンブレンを用いる場合には、例えばセルロースアセテート、ニトロセルロース又はこれらの混合メンブレン、ナイロンメンブレンなどを用いることができる。支持体としてビーズを用いる場合には、樹脂材料（ポリスチレンなど）、酸化物（ガラスなど）、金属（鉄など）、セファロース、及びこれらの組み合わせなどからビーズを作製することができる。
【００４１】
ここで、２次元cDNAライブラリにおいて２次元位置情報を保持した状態でcDNAを保持することができるように、支持体は２次元に区分された複数の微細な空間を有することが好ましい。例えば、シート、ゲル薄膜、キャピラリープレートに細孔を設けることにより、又は、セルなどのように区分された空間にビーズを敷き詰めることにより、このような複数の微細な空間を設定することができる。このような支持体における微細な空間の間隔は、細胞のサイズよりも小さいことがより好ましい。
【００４２】
支持体への核酸プローブの固定は、当技術分野で公知の任意の方法により行うことができる。例えば支持体の表面、細孔内部、メンブレンの繊維などに、共有結合、イオン結合、物理吸着、生物学的結合（例えば、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンとの結合、抗原と抗体との結合など）を利用して核酸プローブを固定することができる。また、スペーサー配列を介して核酸プローブを支持体に固定することも可能である。
【００４３】
共有結合を介した核酸プローブの支持体への固定は、例えば、核酸プローブに官能基を導入しかつ該官能基と反応性の官能基を支持体表面に導入して両者を反応させることにより実施できる。例えば、核酸プローブにアミノ基を導入し、支持体に活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基又はイソシアネート基を導入することにより共有結合を形成できる。また、核酸プローブにメルカプト基を導入し、支持体に活性エステル基、マレイミド基又はジスルフィド基を導入してもよい。官能基を支持体の表面に導入する方法の一つとしては、所望の官能基を有するシランカップリング剤によって支持体を処理する方法が挙げられる。カップリング剤の例としては、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン、N-β-(アミノエチル)-γ-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-β-(アミノエチル)-β-アミノプロピルメチルジメトキシシラン等を用いることができる。結合部位となる官能基を支持体に導入する別の方法としては、プラズマ処理が挙げられる。また物理吸着によって核酸プローブを支持体に固定する方法としては、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した支持体に、核酸プローブの荷電を利用して静電結合させる方法などが挙げられる。
【００４４】
なお、支持体には、他の物質（核酸やタンパク質など）が吸着しないように、表面コーティングを行うことが好ましい。
【００４５】
サンプル中の被検核酸を、支持体に固定された核酸プローブとハイブリダイズさせるには、サンプル中の被検核酸を上述のように抽出し、支持体と接触させる。その際に、例えば、核酸の負電荷性質を利用して、被検核酸を含むサンプルと支持体に電界を印加し、電気泳動によって支持体に固定された核酸プローブの近傍へと被検核酸を移動させる方法を用いることもできる。
【００４６】
ハイブリダイゼーション反応は、核酸プローブを固定した支持体と被検核酸を含むサンプルとをサンプル中でインキュベーションすることにより実施できる。かかるハイブリダイゼーションのためのインキュベーションは、温度70℃で５分程度穏やかな攪拌下で行い、その後0.1℃/秒程度でゆっくりと室温にまで温度を低下させることが好ましい。また、ハイブリダイゼーション反応後に、支持体から非結合成分を洗浄・除去することが好ましい。
【００４７】
被検核酸と核酸プローブとをハイブリダイズさせた後、被検核酸又はその一部の配列に対して相補的な配列を有するcDNAを合成する。この相補鎖合成は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。例えば被検核酸がmRNA又はncRNAの場合には、例えば逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAを合成することができる。また被検核酸がDNAの場合には、例えばポリメラーゼを用いた複製反応によってcDNAを合成することができる。合成反応後は、被検核酸を、例えばRNaseを用いて分解除去する。この結果、支持体には、被検核酸に対応するcDNAから構成される２次元cDNAライブラリが構築される。作製された２次元cDNAライブラリは、好ましくは支持体の２次元に区分された複数の微細な空間にcDNAが保持されている。
【００４８】
cDNA合成後、２次元cDNAライブラリ（支持体）を洗浄して除去する操作を実施することにより、残留試薬、例えば、細胞溶解試薬及びDNA分解酵素を除去することができ、その後の遺伝子発現の検出ステップを阻害されることなく実施することができる。
【００４９】
また任意により、上述のように作製された２次元cDNAライブラリに含まれるcDNAを移動させることにより、又は２次元cDNAライブラリに含まれるcDNAに対応する核酸断片を生成することにより、元の２次元cDNAライブラリに含まれるcDNAの情報を別の２次元cDNAライブラリに移すことができる。
【００５０】
例えば、２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAを第２の支持体に移動させる方法としては、該cDNA又はその断片に対し相補的な配列を有する核酸プローブを第２の支持体に２次元的に分布させて固定し、その第２の支持体に固定された核酸プローブと、元の２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAをハイブリダイズさせることによって、第２の２次元cDNAライブラリを作製することができる。
【００５１】
また例えば、２次元cDNAライブラリに含まれるcDNAに対応する核酸断片を生成する場合には、該cDNAの相補配列を含む核酸断片を生成したり、あるいは該cDNAに特異的な核酸プローブをハイブリダイズさせてその核酸プローブを核酸断片として利用したり、あるいはcDNAの相補配列及びcDNAの配列とは関連のない既知配列を含む核酸断片を生成することができる。このように生成された核酸断片を、２次元cDNAライブラリの２次元位置情報を保持した状態で、第２の支持体に移動させ、第２の２次元cDNAライブラリを作製する。
【００５２】
上述のように作製した２次元cDNAライブラリ（第２の２次元cDNAライブラリも含む）は、各操作の後に洗浄を行うことによって繰り返し使用することができ、同じ２次元cDNAライブラリを用いて後述の遺伝子発現の検出ステップを複数回行うことが可能である。
【００５３】
続いて、上記のように作製された２次元cDNAライブラリ（第２の２次元cDNAライブラリも含む）を用いて、サンプルにおける遺伝子発現を検出する。本発明において「検出」とは、遺伝子の発現の有無の検出、及びその発現量の定量的な検出の両方を含む。
【００５４】
遺伝子発現を検出するための１つの方法としては、検出対象の遺伝子に特異的な標識核酸プローブを２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAとハイブリダイズさせ、その標識に基づいて遺伝子発現を検出する方法がある。そのような検出に使用する核酸プローブは、当業者であれば適宜設計することができる。使用する標識もまた当技術分野で公知の任意の標識を用いることができ、例えば蛍光標識（Cy3、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）など）、化学発光標識（ルシフェリンなど）、酵素標識（ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど）、放射性標識（トリチウム、ヨウ素125など）が挙げられる。
【００５５】
また別の方法としては、検出対象の遺伝子に特異的な核酸プローブを２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAとハイブリダイズさせ、該核酸プローブに含まれる核酸配列の増幅反応を行い、その増幅産物に基づいて遺伝子発現を検出する方法がある。このような増幅反応としては、当技術分野で公知の任意の方法を用いることができ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ローリングサークル増幅（RCA）反応、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification（NASBA）法及びLoop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法が挙げられる。また当業者であれば、採用する増幅反応に応じて、使用する核酸プローブを適宜設計することができる。例えば増幅反応としてローリングサークル増幅（RCA）反応を行う場合には、検出対象の遺伝子に特異的な核酸パドロックプローブを２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたパドロックプローブをライゲーション反応によりリング状のプローブとし、該リング状プローブを鋳型としてRCA反応を行い、その増幅産物に基づいて遺伝子発現を検出することができる。また上記の増幅反応は、cDNA末端に繰り返し配列を導入するプロセスを含んでもよい。
【００５６】
このような増幅産物は、当技術分野で公知の任意の方法により検出することができる。例えば、増幅反応に使用される基質（塩基）に標識を付し、その標識に基づいて増幅産物を検出することができる。あるいは得られる増幅産物と特異的に結合することができる標識核酸プローブを用いることによって、結合した核酸プローブの標識に基づいて増幅産物を検出することができる。使用する標識は上記と同様である。
【００５７】
標識に基づく検出は、当技術分野で公知の方法及び機器を使用して行うことができる。例えば蛍光標識及び化学発光標識は、適当な光レーザを用いて励起し、放出される蛍光をカウントする光学系、蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。また酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって検出及び定量することができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。本発明の方法においては、蛍光又は化学発光を利用して、得られる光信号が発する位置をカウントすることにより、遺伝子の発現を定量分析することができる。また、具体的な例としては、１つの被検核酸に由来するcDNAに基づき、上述のように増幅反応を行い、得られる増幅産物を１μ以下の微細な反応セルに導入又は固定し、蛍光又は化学発光の発光点をカウントすることにより、遺伝子の発現を定量分析することができる。
【００５８】
また別の遺伝子発現検出方法として、検出対象の遺伝子に特異的な核酸プローブを２次元cDNAライブラリに保持されているcDNAとハイブリダイズさせ、続いて該核酸プローブのみを、電極に固定された、該核酸プローブに特異的な第２の核酸プローブとハイブリダイズさせて、そのハイブリダイゼーションに基づく電極の電位変化を計測する方法も用いることができる。
【００５９】
本発明においては、上述のとおり得られた２次元cDNAライブラリにおける遺伝子発現の検出結果と、サンプルの２次元位置情報とを比較することにより、サンプルにおける特定の位置と遺伝子発現との相関データを得ることも可能である。そのようなサンプルの２次元位置情報は、例えば細胞サンプル又は組織切片サンプルの顕微鏡像、他の標識法により得られる蛍光像又は化学発光像などである。
【００６０】
また本発明に係るサンプルに含まれる分子プロフィールの解析方法は、以下のステップ：
（a）サンプル中の被検分子を、支持体に２次元的に分布しかつ固定された抗体又はアプタマーと結合させるステップ、
（b）近接ライゲーション法を利用して、被検分子と抗体又はアプタマーとの結合に特異的なリングプローブを形成するステップ、
（c）上記リングプローブ又はリングプローブを鋳型として生成された核酸断片を用いて２次元cDNAライブラリを作製するステップ、
（d）２次元cDNAライブラリを用いて、サンプルにおける分子の存在を検出するステップ
を含む。
【００６１】
この方法は、上述したサンプル中の被検核酸を核酸プローブとハイブリダイズさせる代わりに、サンプル中の被検分子を、該被検分子と特異的に結合することができるリガンド（抗体又はアプタマーなど）と結合させて、近接ライゲーション法によりリングプローブを形成させることによって２次元cDNAライブラリを作製するものである。本発明において、検出対象となる分子としては、タンパク質、ペプチド核酸、高分子（ポリマー）、低分子などの任意の分子が挙げられる。特異的な結合を利用して支持体に捕捉するため、特異的に結合するリガンドが存在する被検分子であることが好ましい。例えば、被検分子としてタンパク質を選択し、特異的に結合するリガンドとして抗体又はアプタマーを選択することができる。
【００６２】
近接ライゲーション法を用いた２次元cDNAライブラリの作製についての詳細は、実施例８で説明する。
【００６３】
上述した本発明の方法は、生態組織内の全ての細胞について発現している遺伝子又は分子をcDNAに変換して、細胞の組織内での位置情報を保持した状態で２次元的にcDNAライブラリを作製することができる。そのため、注目する任意の場所における遺伝子発現を、又は全ての場所における遺伝子発現を知ることができ、組織の中で遺伝子情報がどのように広がっていくかなどのこれまでに得られなかった種々の情報を可視化することが可能である。さらに、組織をスライス切片サンプルとして各切片について２次元cDNAライブラリを作製し、遺伝子発現を調べることで、遺伝子発現の３次元分布情報も得ることができる。これらは、従来のわずかな遺伝子についての蛍光検出法とは異なり、非常に多くの遺伝子についての情報を簡便かつ効率的に得ることができる。また、本発明によって得られる遺伝子発現プロフィールの解析結果に基づいて、さらに遺伝子情報の流れ、刺激が組織に与える影響など多くの新たな情報が得られると期待される。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
【００６５】
［実施例１］
本実施例は、シート状の細胞群から中に含まれるmRNAの位置情報を保持した形で２次元cDNAライブラリシートを細孔アレーシート中に構築して用いた例である。以下、細孔が２次元状に多数形成されたシートを細孔アレーシートと呼び、そこにcDNAライブラリが形成されたものをcDNAライブラリシートと呼ぶことにする。この方法の一例の概念図を図１に示した。
【００６６】
この方法は、細胞位置情報を保存した状態でのmRNAの抽出とシート内部のDNAプローブへの捕獲プロセス（図１(a)）、シート内部での逆転写によるcDNAライブラリの作製プロセス（図１(b)）、そしてこれに附随する遺伝子発現の計測方法の一例として、両端がターゲットcDNAにハイブリダイズする形のDNAプローブ（パドロックプローブ）をターゲットcDNAにハイブリダイズさせ、ライゲーション反応を用いてリング状のDNAプローブ（リングプローブと呼ぶ）を作製することでターゲットcDNAの存在を識別するプロセス（図１(c)）、リングプローブにハイブリダイズして相補鎖合成によりリングプローブと相補的な配列を増幅してタンデムに特定の配列が繋がったDNAを作製するDNA増幅プロセス（RCA（Rolling Circle Amplification）と呼ばれている）（図１(d)）、タンデムに繋がったDNAに相補的な部分配列を有する蛍光プローブをハイブリダイズさせて蛍光計測するプロセス、特に特に光を発するスポットの計測による遺伝子のカウント定量プロセス（図１(e)）から構成される。
【００６７】
まず、cDNAライブラリを作製するための細孔アレーシートとして、アルミナを陽極酸化して得た細孔アレーシートを用いた。ここでは孔径200nmで厚さが60μm、直径25mmのシート１を用いた例について説明するが、細孔アレーのシートの形状はこれに限定されるものではない。このようなシートは陽極酸化により自作することもできるが、孔径20nm〜200nmのものが市販品として入手可能である。なお、細孔アレーシートとしては、多孔質のガラスからなるモノリスシート、毛細管を束ねてスライスしたキャピラリープレート、ナイロンメンブレン、又はゲル薄膜などを用いることも可能である。シート１に形成された細孔２はシート１の厚さ方向に貫通しており、細孔同士は完全に独立である。この表面は親水性で、表面へのタンパク質の吸着が極めて少なく、酵素反応が効率よく進む。まず、細孔アレーシートの表面をシランカップリング処理し、DNAプローブ７を細孔表面に固定する。固定されたプローブは平均30〜100nm2に一個の割合で表面に固定されるので、4〜10×106個のDNAプローブが１つの孔に固定される。次いで表面吸着を防止するために表面コート剤で表面をコートする。この表面コートはプローブ固定と同時に行ってもよい。プローブとして25マー以上のポリT配列を含むDNAプローブを用いた。このプローブ密度はこの空間を通過するmRNAを100％捕獲できるDNAプローブ密度である。
【００６８】
次に、細胞群からmRNAを抽出し、cDNAライブラリを細孔アレーシートに作製する。細胞膜を破壊するためのライセート（たとえば表面活性剤）を含むゲルを、細孔アレーシートの上部に図１(a)に示すように設置する。ここで３はサンプルの細胞群（細胞シート）であり、４がライセートを含むゲルである。次いで、細胞シートの上部を電解質を含んだ溶液と接触させる。もちろん直接細胞が電解質に触れてもよいがゲルなどを通して接触させてもよい。一方、細胞シートの下部も細孔を通して電解質を含んだ溶液と接触させ、細胞シートの上下方向に電界がかかるようにする。負に帯電しているmRNA５は細孔６を通って下部に電気泳動するが細孔６の中でDNAプローブ７に捕獲される。図１(a)の８に示すようにmRNAを細孔６中に捕獲した後、サンプル（細胞シート）３及びゲルシート４は取り除くが、ゲル材料として温度により相変化するゲルである低融点アガロースゲルを用いて、温度上昇により洗い流すことでこの操作を行うと都合がよい。
【００６９】
続いて、細孔中のDNAプローブ７に捕獲されたmRNA８を鋳型にしてcDNA９を合成する。この操作は、逆転写酵素及び合成基質を含む溶液で細孔部６を満たし、50℃にゆっくり昇温して50分ほど相補鎖合成反応を行うことによって実施する。反応終了後、RNaseを細孔６を通して流してmRNA８を分解除去する。次いで、アルカリ変性剤を含む液及び洗浄液を細孔６に通して流して残存物及び分解物を除去する。ここまでのプロセスで細孔６内には組織サンプル中の細胞の位置を反映した図１(b)に示すようなcDNAライブラリが構築される。
【００７０】
なお、１細胞当りのmRNAの数はおおよそ106個であり、細胞のサイズを模式的に直径10μmの円形とすると１細胞当たりに用いる細孔の数は2500ほどとなる。すなわち１細胞中に発現しているmRNA数が1000コピー以下の場合には平均として１つの細孔内に１コピーのcDNAができることになる。それより多い場合には同一mRNA種について複数コピーのcDNAが１つの細孔に生成することになる。細孔のサイズを小さくすると１つの細孔あたり各種類のmRNAについて１コピー以下とすることもできる。（また、細胞を１つずつ処理して１細胞当たりのcDNAライブラリ作製領域を大きくすると１細胞あたり１コピー以下にすることもできる）。各細孔には平均として400個の種々のcDNAが生成することになる。もちろん、１細胞に対応する平均2500個の細孔のどの細孔にmRNAが固定され、cDNAに逆転写されたかを分解して計測することによって、細胞内のmRNA分布を計測することも可能である。
【００７１】
続いて、生成されたcDNA９を計測する。例えば、ローリングサークル増幅（RCA）を利用して、ターゲットとなるcDNAの種類ごとにプローブ10を作り、それらを順次細孔６に入れて、蛍光検出又は化学発光検出により計測することができる。本実施例ではローリングサークル増幅（RCA）と化学発光検出を用いる例を開示する。他の方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification（NASBA）法及びLoop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法などの増幅方法を用いることも可能である。RCAを用いる場合を図２４及び図２５にフローチャートとして示した。図２４が蛍光検出の場合、図２５が化学発光検出の場合である。
【００７２】
図２４に示すように、蛍光検出を行う場合では、cDNAライブラリシートを別の検出シートにリングプローブを移し取ってから、RCA増幅して検出・定量する方法と、RCA増幅せずに蛍光検出する方法、また、cDNAライブラリシートを用いて直接検出・定量する方法がある。この場合にもRCA増幅する方法としない方法がある。
【００７３】
一方、化学発光を検出する場合には、図２５に示すように、cDNAライブラリシートから検出シートにリングプローブを移し取ってからRCA増幅反応を行い、そのときに生成されるピロリン酸を化学発光によって検出する方法と、cDNAライブラリシート内部でRCA増幅反応を行って、発光計測する方法があり、この方法はパドロックプローブの特異的ライゲーションによってリングプローブを得てから、RCA増幅反応を行う方法と、リングプローブを直接cDNAに特異的にハイブリダイズさせてRCA増幅反応を行う方法がある。
【００７４】
各cDNA（ターゲット）に両端がハイブリダイズしてリングを形成するDNAプローブを用意する。本明細書において、このDNAプローブをパドロックプローブと呼び、リングの形成後はリングプローブと呼ぶ。このプローブは、本実施例においては、全長が110塩基であり、測定しようとする遺伝子（ターゲット）ごとにハイブリダイズする部分の配列は異なるが、内部に20塩基ほどの２つの共通配列（共通配列I及びII）を有するように設計する。まず、１番目のターゲット遺伝子に対応するDNAプローブ10を細孔６に入れ、ターゲットcDNAにハイブリダイズさせる。溶液中にはリガーゼ（ライゲース）が含まれており、ハイブリダイズしたプローブはリング状（リングプローブと呼ぶ）になる（図１(c)参照））。昇温してリガーゼを失活させると共に、リングプローブをターゲットcDNA９から遊離させる。遊離したリングプローブ10を、共通配列Iの部分にハイブリダイズする共通プローブIが細孔内に固定された別の細孔アレーシート（「検出用細孔アレーシート」ともいう）に電気泳動又は送液により移動させ、検出用細孔アレーシート内に固定された共通DNAプローブIとハイブリダイズさせることによってリングプローブ10をトラップする。
【００７５】
本実施例では、cDNAライブラリを作製後、測定しようとする遺伝子（ターゲット）に特異的なDNAプローブ（パドロックプローブ）を用いたが、cDNAライブラリシート中でRCA増幅を行う場合には、パドロックプローブではなく、初めからリング状のプローブを用いてライゲーションの過程を省略し、RCA増幅を行うことも可能である。
【００７６】
また本実施例では、検出用の細孔アレーシートとして、細孔に捕獲されたDNAに起因した信号を個別に化学発光計測するためにSiを陽極酸化して得られた可視光を吸収する材料でできた細孔アレーシートを使用した。
【００７７】
次に、共通配列IIと同じ配列を有する共通DNAプローブII、鎖置換型のDNAポリメラーゼ、DNA合成反応基質、及びピロリン酸をATPに変換する試薬とATPとルシフェリンを反応させて化学発光を得る試薬を含む反応液を、４℃にて細孔に流し込む。次に細孔の内部以外に存在する酵素を洗い流し、15℃以下で溶液、25℃以上で流動性のないゲルとなるメビールゲル（Mebiol Inc.）でシートの両面を覆う。これによって、シート以外の部分からのバックグラウンド発光を抑制するとともに細孔の外部への注入した酵素の流出を防ぐ。DNA相補鎖合成に最適の温度37℃に設定すると、ターゲットcDNAにハイブリダイズしたDNAプローブIはDNA相補鎖伸長を始める。リングを一回りしても鎖置換活性によって繰り返し配列を生成していく。図３(a)に、２つの共通配列I及びIIとcDNAとハイブリダイズする部分が繰り返し増幅される様子を示した。ここで図３中の3'末端の矢印で示した部分はリングプローブとハイブリダイズしている部分である。これがRCAの第１のステップである。最初、プローブIIはハイブリダイズすべきDNA鎖がなく、DNA相補鎖伸長反応はしないが、プローブIのDNA鎖伸長が進むと相補的な配列がこの相補鎖に作られるので、これにハイブリダイズして相補鎖伸長を開始する。図３(b)に示すように、プローブIIは最初に伸長したDNA相補鎖の複数の位置で伸長を開始し、相対的に5'末側でハイブリダイズしたプローブからの伸長鎖はより3'末端側にハイブリダイズし伸長を開始した相補鎖によって剥がされていく。完全にはがされ１本鎖となった相補鎖は近傍に固定されたプローブIに捕獲され、相補鎖伸長によって2本鎖が生成する。この結果、図３(c)に示すような状態となる。実際にはこのような過程が並行して繰り返し起きる。これがRCAの第２のステップである。なお、本実施例では、プローブIIを相補鎖合成の最初から入れたが、まず、プローブIを用いてRCAを行い、長いDNA合成鎖を作成した後に上記試薬を入れてプローブIIを用いて相補鎖合成を行い、続いて化学発光反応を行ってもよい。
【００７８】
約45分間反応させると約110塩基からなるターゲット配列は約1000倍に増える。一方、プローブIを起点として生成したDNA鎖には約1000個のプローブIIがハイブリダイズし、相補鎖合成を行うが、これらの反応によるDNAコピー数は約500000コピー程度である。この状態のシートの断面図を図１(d)に示した。この反応で生成するピロリン酸分子の数は108個以上である。これらピロリン酸を用いたATP生成反応及び発光反応では基質が充分にあるときには毎秒108個の発光を得ることができる。受光効率及び検出の量子効率などを考慮しても冷却CCDカメラなどで充分に検出できる量である。
【００７９】
一方、蛍光計測を行うためには、細孔内に固定されたプローブIを用いてRCA相補鎖伸長を行った後、蛍光標識付きのプローブII（蛍光プローブ）を細孔内に導入して、RCA産物にハイブリダイズさせて蛍光計測を行う。蛍光プローブがつけられた状態を図１(e)で示す。
【００８０】
また、ここではRCAを行う検出用細孔アレーシートと細孔内にcDNAを作製するcDNAライブラリシートとして別のシートを使用し、cDNAライブラリシートを用いて作製したリングプローブを検出用の細孔アレーシート（検出用細孔アレーシート）に転写してからRCAを行ったが、これはcDNAライブラリシートを繰り返し使用したときに前の測定に使用した試薬、プローブ類が計測の障害とならないようにするためである。もちろんcDNAライブラリを形成したシートの細孔内部ですべての反応及び計測を行うことも可能である。
【００８１】
次に、cDNAライブラリシートの細孔内部へのDNAプローブの固定化方法について詳細に説明する。シート内部の細孔の表面は、高密度でポリT DNAプローブが固定化されると同時に、mRNAやリングプローブなどの核酸、そしてリガーゼやポリメラーゼなどのタンパク質を吸着しない表面である必要がある。本実施例では、DNAを固定化するためのシランカップリング剤と吸着を防止するシラン化されたMPCポリマー（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー）を適切な割合で同時に細孔表面に共有結合にて固定してDNAの高密度固定と核酸やタンパク質の安定した吸着抑制を実現した。実際には、まずアルミナ製のポーラスシート１をエタノール溶液に３分浸漬後、UVO3処理を５分行い、超純水で３回洗浄する。次に平均分子量9700（重合度40）のシラン化MPCポリマーであるMPC0.8-MPTMSi0.2（MPC: 2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine/MPTMSi: 3-Methacryloxypropyl trimethoxysilane）（参考文献１：Biomaterials 2009, 30,  4930-4938，参考文献２：Lab Chip 2007, 7, 199-206）3mg/mlと0.3mg/mlのシランカップリング剤GTMSi（GTMSi：3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane、信越化学）、及び酸触媒である0.02％酢酸を含む80％エタノール溶液に２時間浸漬した。エタノールで洗浄後、窒素雰囲気で乾燥し、オーブンにて120℃で30分間加熱処理した。次にDNAを固定化するために、1μMのポリT DNAプローブ（Oligo(dT)30VN）と7.5％グリセロールと0.15M NaClを含む0.05Mホウ酸バッファー（pH 8.5）をシート上に500μL滴下して、加湿チャンバ内において25℃で２時間反応させた。最後に未反応グリシド基をブロックし、過剰なDNAプローブを除去するために、十分量の10mM Lysと0.01％SDSと0.15M NaClを含むホウ酸バッファー（pH 8.5）で５分間洗浄し、この洗浄液を除去した後、0.01％SDSと0.3M NaClを含む30mMクエン酸ナトリウムバッファー（2xSSC, pH 7.0）を用いて60℃にて洗浄し、過剰DNAを除去した。これによって、DNAプローブの固定と表面処理を完了した。
【００８２】
以下、細胞アレーを例に説明するが、組織切片サンプルを用いた場合も同様である。実際に測定したハウスキーピング遺伝子GAPDH（GenBankアクセッション番号NM_002046）を例に説明する。100万個程度以下の細胞サンプルをチューブに入れ、１×PBSを500μL加え、細胞を傷つけないように溶液を吸引・吐出して、洗浄後、できる限りPBSが残らないように溶液を捨て、４℃に冷却された1×PBSを50μL加えた。このサンプルをシート１上にアレイ状に配列させる。具体的には0.1μmの細孔を持つ60μmの厚みのシート上に30ミクロン間隔で正に帯電した20μm直径の領域を表面処理により設ける。細胞は表面が負に帯電しているので細胞をこの表面に流すと25μm間隔で表面に捕獲される。捕獲に利用するシート面積は直径25mmの円形としたので約100万個の細胞が捕獲可能である。実際に細胞を流して捕獲した場合には60％程度の位置に細胞を一個ずつ捕獲することができた。
【００８３】
図２は細胞を捕獲するのに用いた反応セルの一例である。反応セルを用いることによって直径25mmのシート１の上に細胞３を１つ１つ固定し、細孔６の内部を溶液で満たすことができる。シートの周囲が溶液で満たされるようにシート１の周辺部分にポリプロピレン製の保護リング212を設けて、その上下に厚さ1mmのスペーサ209を設けて、上下の内側に電極がスパッタリングによって形成された上蓋201及び下蓋202によってこれらを挟んで、反応溶液で満たすための上部反応領域203及び下部反応領域204を形成する。スペーサ209と上下の蓋201及び202を固定するために、固定治具210とねじ211を用いた。インレット205からバッファー液を注入し、上部アウトレット206及び下部アウトレット207から排出して内部を溶液で満たした。次に細胞流路（インレット205）から反応セルを振とうしながら細胞群を反応セル内に流入させた。細胞は正に帯電した部分に捕獲されるが、もちろん細胞が１個入るような容器を用いて細胞を捕獲してもよい。次いで温度によりゲル状態と液体状態に相変換する低融点アガロースゲル（SeaPrep Agarose；２％のときにゲル化温度19℃、融点45℃）にライセート試薬を混和した溶液を用いてシート上での細胞の位置を固定した状態で細胞膜及び細胞組織を破壊してmRNAを抽出する。
【００８４】
４％SeaPrep Agarose（Cambrex Bio Science Rockland, Inc.）溶液250μLとLysis Solution 495μL（TaqMan MicroRNA Cell-to-CT Kit; Applied Biosystems Inc.）とDNase I 5μLを40℃にてよく混和した。次にシート１の温度を４℃に設定し、反応領域203及び204の溶液を抜いてから、インレット205から上記ライセート溶液を注入する。シート上の溶液がゲル化したことを確認し、シート温度を20℃まで上げて、８分間反応させた後、Stopping Solution（DNaseを失活させる溶液）50μLをゲルの上に添加し、５分間反応させ、４℃に冷却した。次に、分子量60万、0.03％のPEO（ポリエチレンオキシド）と分子量100万、0.03％のPVP（ポリビニルピロリドン）、0.1％Tween 20を含む10mMのTrisバッファー（pH 8.0）0.5mLを加えた。このとき上部電極201と下部電極202間の距離は２mmとし、シート上部及び下部の空隙（反応領域203,204）は前記Trisバッファーで完全に満たされている。シート及び溶液温度を４℃に維持したまま、上部電極201を陰極（GND）、下部電極202を陽極として、＋0.8Vを２分間印加し、負電荷を持つmRNAを細胞内部から204の方向へ電気泳動させる。
【００８５】
この過程で大分部のmRNAはシート中の細孔に固定されたOligo dT DNAプローブにトラップされる。しかし、一部のmRNAは２次構造によってトラップされずにシート下部のバッファー中（204）に移動してしまう。mRNAを完全にOligo dT DNAプローブにトラップするために、シート１及び溶液の温度を70℃まで上げて５分保持した後、１分毎に下部電極202に印加する電圧の極性を反転させながら−0.1℃/secで４℃まで冷却した（最初は−0.8Vを１分間印加し、その後＋0.8V→−0.8Vで１分ずつ10回繰り返し印加）。次にインレット205から上記trisバッファーを導入し、アウトレット206から排出することによって、シート１上部の領域203中の溶液を交換しながら、溶液及びシート１の温度を35℃まで上げてアガロースゲルを溶解させて、必要のない細胞組織とアガロースを洗浄し、除去した。さらに、0.1％Tween20を含む10mMのTrisバッファー（pH=8.0）585μLと10mM dNTP 40μLと5xRTバッファー（SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA Synthesis System）225μLと0.1M DTT 40μLとRNaseOUT（SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA Synthesis System）40μLとSuperscript III（逆転写酵素：SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA Synthesis System）40μLを混和し、シート１を満たしている溶液をアウトレット206及び207から排出し、直ちに逆転写酵素を含む上記溶液をインレット205から注入した。その後、溶液とシート１を50℃に昇温して、50分間保つことによって逆転写反応を完了させた。その後、85℃にて1.5分保ち逆転写酵素を失活させ、４℃に冷却後、RNaseを含む0.1％Tween20を含む10mM Trisバッファー（pH = 8.0）10mLをインレット205から注入し、アウトレット206及び207から排出することによって、RNAを分解し、同量のアルカリ変性剤を同様に流して細孔内の残存物及び分解物を除去・洗浄し、cDNAライブラリを構築した。
【００８６】
ここでは１つの細胞あたり約１万個の細孔を用いてcDNAライブラリを作製している。細孔の１細胞当たりの全表面積は約0.7mm2である。100nm2当たり１個以上のDNAプローブが固定されているので、プローブ総数は約７×109個であり、１細胞中のmRNA（総数106程度）を捕獲するには充分な量である。細孔内では核酸は表面に吸着しやすいので、上述のように表面コート剤としてMCPポリマーを用い、細孔表面を覆って吸着を防いでいる。
【００８７】
以上の操作から、１細胞に由来するcDNAが多くの細孔の表面に固定されたcDNAライブラリを得た。これはいわば１細胞cDNAライブラリシートというべきものであり、これまでの多くの細胞から得られる平均化されたcDNAライブラリとは根本的に異なるものである。
【００８８】
このように得られたcDNAライブラリシートから種々遺伝子について遺伝子ごとの発現量を定量的に計測する。１つの細胞当たり１万個の細孔があるので、１つの細孔当たりのcDNAの個数は平均で100個である。１種類のcDNAについて、１細胞当たりのcDNAコピー数が１万個以下の場合には、１つの細孔当たり平均として１個以下となる。これを検出するにはcDNAの種類ごとに特異的にハイブリダイズするプローブを用いる。
【００８９】
検出方法は化学発光又は蛍光を利用する方法があるが、ここでは化学発光を利用する方法について説明する。ターゲットとするcDNAの標的配列部分を増幅する方法として、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）又はローリングサークル増幅（RCA）反応がある。ここでは増幅率が安定しているローリングサークル増幅を用いた。ターゲット配列の１例を図４（配列番号１）に示した。このターゲット部分にハイブリダイズするDNAプローブ（パドロックプローブ）を図５（配列番号２）に示した。このパドロックプローブはターゲットにハイブリダイズする特異配列部分と約22塩基からなる２つの共通配列部分からなる。本実施例では全長110塩基とした。DNAプローブは両端がターゲットにハイブリダイズし、修復酵素リガーゼにより末端同士が結合してリング状のDNA（リングプローブ）を生成するような形をしている。DNAプローブを細孔に流し込んでDNAプローブ（パドロックプローブ）をターゲットにハイブリダイズさせ、ライゲーションによりリング状のDNA（リングプローブ）を得る。
【００９０】
具体的には、2μMパドロックプローブ10μLと10x Ampligaseバッファー（Ampligase DNA Ligase Kits; EPICENTRE Biotechnologies）100μLとAmpligase（Ampligase DNA Ligase Kits; EPICENTRE Biotechnologies）100μLとBSA（10mg/mL）250μLと純水（DW）540μLを混和し、この溶液をインレットから注入し、50℃に保って、12時間反応させた。その後80℃に昇温し20分間保持することによってリガーゼを失活させた。
【００９１】
次にリングプローブを検出用細孔アレーシートに移して計測を行うが、この細孔内にはリングプローブ中の共通部分Iの配列とハイブリダイズする共通DNAプローブI（図６；配列番号３）が固定されており、リングプローブを細孔内にトラップする。続いて、リングプローブ中のもうひとつの共通部分IIと同じ22塩基の配列を持つ共通DNAプローブII（図７；配列番号４）と鎖置換活性を持つポリメラーゼを細孔内に導入し、RCA反応を37℃45分間行った。
【００９２】
RCA及び化学発光による計測を行うために、不透明なSiを陽極酸化することによって得られたシートの内部にポリTプローブを固定し、MPCポリマーによるコーティングを前記と同様に行った。アルミナのシートと同様に細孔の直径は0.1μmで直径25mm厚さ100μmとした。次に、図８に示すようにリングプローブが形成されたシート１の下に、プローブIが固定されたシート801を重ねて配置し、反応セルを組み立てた。下蓋202の内側の電極に＋0.4Vを印加した状態で95℃にて１分間加熱後、１℃/secのレートで65℃まで冷却し、10分間維持した。電圧をオフにして、温度を室温まで冷却し、アルミナ製のcDNAライブラリシートを除去し、プローブIにリングプローブがハイブリダイズしたシート801のみを残して再び、反応セルを組み立てた。
【００９３】
10xφ29発光試薬バッファー（0.5M Tricine, 0.1M MgAc, 0.1M (NH4)2SO4, 4mM DTT, 4mM D-Luciferin, 0.02mM APS）100μLと遊離DNAプローブII（0.1μM）10μLと10mM dNTP 50μLと10mg/mL BSA 25μLと10U/μL φ29ポリメラーゼ（New England BioLabs）50μLを、耐熱性ルシフェラーゼ（4258.1 GLU/mL; Kikkoman）100μLとATP Sulfurylase（30U/mL; NewEngland BioLabs）50μLを625μLの純水(D.W.)に混和し、インレット205から注入した。注入後ただちにシートの上下で圧力差が生じないようにしながらアウトレット206及び207から余分の試薬を取り除く。次に４℃に冷却された10xφ29発光試薬バッファーとメビールゲルの1：9混合溶液を同じくアウトレット220、221から圧力差が生じないように静かに注入する。反応セルは37℃に保ってあるのでメビオールゲルはただちにゲル化する。その後20分間RCA反応させた。
【００９４】
次に図９に示した光学系にて化学発光の計測を続けて行う。ここではNA0.8、作動距離3.3mmの対物レンズ901と結像レンズ902と冷却CCDカメラ903（1000×1000ピクセル、画素サイズ13×13μm,量子効率0.9）を用いた。光学系の倍率は50倍に設定し、シート下側（下蓋202に近いシート801の）表面に焦点を合わせて発光像を得た。ここでCMOSイメージセンサなどの他の撮像素子を用いてもよい。このとき分解能は0.5μmでありほぼ限界の分解能を得た。１フレームの大きさは0.26mm角で、露光時間は３秒とし、直径25mmの計測領域を7500の領域に分けて計測した。得られた7500枚の化学発光画像から化学発光スポットを抽出し、計測領域を上でマッピングする。シート上での細胞の位置を明視野像から得ておき、化学発光スポットと位置を対応させることによって、各細胞ごとに何分子のGAPDHが発現しているかを確認することができた。ここで作製したシートは繰り返し利用可能であり、発現量を知る必要がある遺伝子（ターゲット）に特異的なパドロックプローブを作製し、上記と同様にライゲーション反応以降のプロセスを実行することによってそのターゲット遺伝子の細胞ごとの遺伝子の発現量をカウントによって高精度に決定することが可能である。RCA反応の増幅効率が変わったり、計測のタイミングがRCA反応開始から変わったとしても、化学発光スポットの有無は同一画面上で決定するので問題とはならない。化学発光スポットはmRNAの分子数に直接対応し、その定量誤差はほぼポアソン分布に従う測定誤差に抑制することが可能である。
【００９５】
本実施例では、GAPDH（GenBankアクセッション番号NM_002046）に特異的にハイブリダイズするパドロックプローブ（配列番号２）を用いて、配列特異的なRCA増幅反応後、化学発光スポットのカウントによる定量を行ったが、cDNAは元の状態に保存されているので、GAPDHの定量評価の後、他の遺伝子特異的なプローブを導入し、同様に処理することによって遺伝子発現分布を測定し、遺伝子発現プロフィールを解析することが可能である。すなわち、cDNAライブラリを繰り返し利用することによって、高精度な発現分布測定を必要な種類の遺伝子すべてについて行うことが可能である。
【００９６】
本実施例では、シート内以外の領域からのバックグラウンド発光を抑制するためにメビオールゲルを用いて、シート内部以外の部分の領域の酵素を排除することによって抑圧したが、細胞の数が少なく、計測エリアが狭い場合はメビオールゲルを用いずに図１０に示すような共焦点光学系を用いてバックグラウンドの影響を抑制してもよい。図１０において、1001はスリットであり、z方向の被写界深度を0.01μm以下に抑圧することが可能である。1002はアバランシェフォトダイオード（APD）又は光電子増倍管(PMT)のいずれかを用いればよい。
【００９７】
また、光学系は図８と同様のままでシート表面に化学発光に必要な酵素（ルシフェラーゼとATPスルフリラーゼ）を固定して、メビオールゲルを使用しないことも可能である。酵素を固定する方法は多く存在するが、ここでは、プローブIを固定する方法においてプローブIと同時にストレプトアビジンを混ぜて反応させる。ストレプトアビジン表面のアミノ基とシランカップリング剤が反応することによってストレプトアビジンが固定化される。この状態で、ビオチン化ルシフェラーゼとビオチン化ATPスルフリラーゼを混ぜ、30分室温にて反応させると表面へのルシフェラーゼとATPスルフリラーゼの固定化が完了する。このあと、メビオールゲルの注入の工程を省いてRCA反応及び化学発光計測を行えば前記と同様に化学発光計測が可能である。計測は蛍光を用いてもよいが、その詳細は実施例２に記載する。
【００９８】
また、アルミやシリコンの陽極酸化によって得られたシートの代わりに、毛細管を束ねて引き伸ばし、スライスしたキャピラリープレートを用いてもまったく同様の方法を適用することが可能である。しかし、市販のキャピラリープレートは細孔の直径が最小で１μmであるため、分解能が1/10となりmRNA分子をカウントする場合には一細胞あたりの計測可能な最大分子数が100個となる。このような場合には、化学発光量の強度を段階的に変更することで定量分析範囲を拡大することができる。キャピラリープレートを用いた場合の最適な計測方法を以下に示す。使用したキャピラリープレートは細孔径が６μmで細孔が形成された領域の直径が20mm、外径が25mm、厚さが1.0mmの浜松ホトニクス製のものを用いた。細孔の内壁は前記と同様にシランカップリング処理と同時に吸着防止の表面処理を行い、polyT配列を含むオリゴDNAを細孔の内壁に固定し、メンブレンの場合と同様にcDNAライブラリシートを作製した。このとき、キャピラリープレートに形成された細孔の直径が大きいため、分解能が低下するのを緩和するため、キャピラリープレートの内部に直径１μmのストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ上にpolyT配列を含むオリゴDNAを固定し、このビーズをキャピラリープレート上の細孔内部に詰めて、cDNAをトラップして、同様にcDNAライブラリを作製することもできた。
【００９９】
［実施例２］
本実施例の概要を図１１に示す。これは、組織切片サンプル1101から２次元cDNAライブラリシートを細孔アレーシート中に構築して用いた例である。凍結させた組織切片を５〜20μm程度の厚さにミクロトームにて膜状のサンプルにして、図１１に示すようにアルミナ製の細孔アレーシート１上に組織切片サンプル1101を載せ、ただちにライセートを含む低融点アガロースで組織切片サンプルを覆う。アガロース溶液は35℃で溶液の状態を保っており、シート１を４℃に冷却してただちにゲル化させ、その後、図２に示す反応セルにセットして、mRNAを実施例１と同様に抽出する。
【０１００】
低融点アガロースゲル（SeaPrep Agarose；２％のときのゲル化温度19℃、融点45℃）にライセート試薬を混和した溶液を用いて、シート状の細胞切片サンプルにおける細胞の位置を固定した状態で細胞膜及び細胞組織を破壊してmRNAを抽出する。この場合にも化学発光計測を行うことが可能であるが、本実施例では蛍光計測について詳しく説明する。
【０１０１】
mRNAをシート内に固定後、実施例１と同様に繰り返し利用可能なcDNAライブラリシートを作製する。その後、このシート中のcDNAを遺伝子（ターゲット）特異的蛍光プローブで標識し、洗浄後に直接蛍光計測を行ってもよいし、RCAやPCRなどの化学増幅法を用いて得られる増幅産物に蛍光プローブをハイブリダイズさせた後に蛍光計測を行ってもよい。また、実施例１に示したように別のシートに移動（転写）させてから蛍光計測を行ってもよいし、さらに化学増幅を行ってから測定してもよい。ここではcDNAライブラリから遺伝子特異的なパドロックプローブを導入し、リングプローブを別のシートに移動させてからRCA増幅し、蛍光計測する例を詳細に記述する。
【０１０２】
すなわち、cDNAライブラリシート内部で遺伝子特異的にライゲーションを行い、パドロックプローブからリングプローブを作製する。次にこのリングプローブを別のシートに電気泳動にて移動させる。ここで蛍光計測のための第２の細孔アレーシートはアルミナ製の透明のものを用いた。蛍光計測では一般に感度が高いので、RCA反応時にはプローブIIを用いずにRCAを行った後に蛍光標識したプローブIIと同様の配列を細孔内に導入することによって蛍光プローブを導入して、図１２に示すような光学系で蛍光像を得る。この像を用いて蛍光スポットをカウントすることによってmRNAの分子数をカウントする。ここで、1201はレーザであり、蛍光体をCy3としたため、レーザの励起波長は532nm、出力レベルは20mWとした。
【０１０３】
また、蛍光体付きのプローブIIを用いる変わりに２本鎖DNAを結合して蛍光を発するインターカレータ(SYTOX GreenやPOPO 3）を用いても同様にmRNAの分子カウントを実行することができた。
【０１０４】
レーザ出力はビーム径１mmのコリメート光であり、これをレーザービームエキスパンダ1202によって、５倍に拡大した。1203はNA0.8、動作距離3.6mm、焦点距離3.6mmの対物レンズであり、焦点をシート最下面に合わせて倍率50倍で冷却CCDカメラ1206にて蛍光像を得た。ここで、1204はダイクロイックミラーで、1205は結像レンズ、1207は励起光カットのためのバンドパスフィルタである。１フレームの画像サイズは0.26mm角で露光時間は10msec、70秒でシート最下面全体をスキャンした。次にz方向に１μmだけ移動し、シート内部に焦点が合うようにして同様にスキャンし、シート全体の画像を得るために、80分を要した。面内の分解能は0.5μmであったので、直径10μmの１細胞あたりのカウントが可能なmRNAの最大数は約20000であった。また、細胞内のmRNAの分布も分解能0.5μmで得ることができた。
【０１０５】
アルミナ製の屈折率は1.76と大きく、多結晶性による光散乱が比較的大きい。そのため、RCA反応が十分効率よくおきず、RCA産物１分子あたりの蛍光体の数が少ない分子を蛍光計測する場合には、蛍光スポットとして計測できないこともあった。そのため、対物レンズの焦点位置をz方向に移動させるのではなく、蛍光体つきRCA産物をシート下面に移動させてから、焦点をシート最下面に合わせて撮像し、xy方向のみにステージをスキャンしてシート全体の蛍光像を得ることも可能である。RCA産物の移動には温度を80℃程度に上げて、下蓋側の電極に＋0.4V程度の電圧をかけてもよいが、ここでは同じ電極に−0.4Vを印加し、上から下に毎秒10μmの圧力流ができるようにすることによって、シート最下面付近にRCA産物が移動することを利用して、蛍光像を取得した。
【０１０６】
図２６にこのとき得られる蛍光像の例と得られるデータ例を示す。2601は一回の撮像CCDカメラから得られる画像を示している。この中の白い点2602がRCA反応後のDNAに蛍光プローブが結合した分子からの蛍光スポットに対応する。この点１つ１つが細胞中のmRNA一分子に対応し、この蛍光スポットをカウントすることによって特定の遺伝子に対応するmRNAの分子数をカウントするこができる。このような画像をXYZ方向（2604）にスキャンして複数取得する（2603)。このXYZ方向は図１２の1210に示したXYZ方向と一致している。計測された蛍光スポットはそれぞれ、XYZ座標が対応し、Z方向は電気泳動によって移動した方向であるから、cDNAライブラリシート上の細胞位置と対応するためにZ座標を無視して、どの細胞中のmRNAであるかを事前に取得した顕微鏡像と対応させることによって決定する。このようなデータの対応付けによって、表2605のようなデータセットを得ることができる。
【０１０７】
次に、蛍光スポットの分解能を向上して、細胞内の発現分布を計測する必要がある場合には、図１３に示すような光学系を用いればよい。レーザから放射された光をレーザービームエキスパンダ1202にて１mmから５mmまで拡大し、NA0.9、動作距離１mm、焦点距離3.6mmの対物レンズ1203にてレーザスポットをシート内部で１μm程度まで絞った。シートの細孔内部にある蛍光体（Cy3）から発する蛍光を同じ対物レンズ1203にて集光し、ダイクロイックミラー1204を通して、励起光をカットした後、結像レンズ1205にて結像させ、結像面にて直径50μmのピンホール1301を通して、共焦点光学系を構成した。光検出器1302は光電子増倍管を用いたがAPDを利用することも可能である。この場合、方向の光学系の分解能５nmが得られたが、10nmピッチのz方向駆動機構を利用したため、計測全体の分解能は10nmであった。XY方向の光学系の分解能は0.4μmであったから、厚さ60μmを用いた場合、細胞中最大発現量を10000と仮定すると、ほぼ光学系の分解能で遺伝子発現量を定量できた。この場合も細胞内で核内外のmRNA分布を得ることができた。
【０１０８】
ここまでの記載では細孔アレーシート中に作製したcDNAライブラリから同じシート中でRCA増幅して、シート内部で蛍光プローブをハイブリダイズさせて蛍光計測するか、あるいは検出シートにリングプローブを電気泳動によって移動させてから、RCA増幅し、蛍光プローブをハイブリダイズさせて蛍光計測した。リングプローブを検出シートに移動させる代わりに、ゲル膜に移動させて蛍光計測することも可能である。次にこの場合について説明する。
【０１０９】
細孔アレーシート中でcDNAライブラリを作製しcDNAライブラリシートを完成後、図１４に示すような下蓋202の上に膜状のゲル1401を形成し、その上に細孔が付いたcDNAライブラリシート１を密着させた反応セルを作製する。次にcDNAライブラリシート内で配列特異的にパドロックプローブからリングプローブを形成し、リングプローブをゲル膜に電気泳動にて移動させる。移動したリングプローブは共通プローブIでトラップし、リングプローブにハイブリダイズする配列を持つ蛍光プローブを注入後、電気泳動にてゲル膜まで誘導させることによって、蛍光計測の準備を完成させてもよいし、RCA反応後同様に蛍光プローブをつけてもよい。下記にこの場合について詳述する。ここで使用するゲルには任意のゲル材料を用いることができ、例えばアクリルアミドゲル、ゼラチン、修飾ポリエチレングリコール、修飾ポリビニルピロリドン、修飾ポリエチレングリコールを用いてもよいし、その他のハイドロゲルを用いてもよい。ただし、ゲルの材料はリングプローブをcDNAから分離して電気泳動する条件でゲルの状態が保たれている材料である必要がある。たとえば実施例１の条件では95℃でゲル状態を保っていなければならない。
【０１１０】
ここでは、2％AWP（東洋合成）と10mg/mLのストレプトアビジンを含む50mMトリシンバッファー（pH7.5）を下蓋202上に0.5mL滴下し、1500rpmで回転塗布後、波長302nmを含む紫外光（2mW/cm2）を２分間照射することによってゲル化させた。これによって10μm程度の厚さのストレプトアビジンによる固定化サイトを含むゲル膜1401を形成した。さらに、5'末端をビオチン修飾したプローブIの1μM溶液500μLをゲル膜1401上に膜を覆うように滴下し、乾燥を防ぎながら、２時間室温にて反応させた後、十分量のバッファーでゲル膜を洗浄することによってリングプローブとハイブリダイズするプローブのゲル膜1401への固定を完了した。
【０１１１】
ゲル膜1401つきの下蓋202を反応セルに取り付けてその上にcDNAライブラリシート１を密着させ、上蓋201を取り付けた後、インレット205から1mLの50mMトリシンバッファー（pH7.5）を反応セル内に注入し、脱気した。
【０１１２】
次にこのシート内で前記と同様にリングプローブを作製するために、パドロックプローブとリガーゼを含む試薬をインレット205から注入し、実施例１に記載の条件で反応させた。リングプローブを電気泳動にてゲル膜中に移動させるために、下蓋202の内側の電極に＋0.4Vを印加した状態で95℃にて１分間加熱後、１℃/secのレートで65℃まで冷却し、10分間維持した。その結果得られるゲル膜とシート断面の状態を図１５に模式的に示した。1501は、プローブI（1502）をビオチンアビジン結合によって固定するためのストレプトアビジンであり、これとAWPポリマーとはストレプトアビジン上の１級アミンとAWPポリマー上のアジ基が紫外線の照射によって反応することによって共有結合している。電気泳動によって移動してきたリングプローブ1503は高密度に固定化したプローブI（1502）とハイブリダイズすることによって固定化される。
【０１１３】
ここで、cDNAライブラリシートを取り外し、10xφ29発光試薬バッファー（0.5M Tricine, 0.1M MgAc, 0.1M (NH4)2SO4, 4mM DTT）100μLと5'末端がリン酸化された遊離DNAプローブII（0.1μM）10μLと10mM dNTP 50μLと10mg/mL BSA 25μLと10U/μL φ29ポリメラーゼ（New England BioLabs）50μLを10mM DTT 775μLのD.W.に混和し、インレット205から注入した。その後、反応セルを37℃に保って60分間RCA反応させた。このときにRCA反応は実施例１の場合と同様であるが、リン酸化したプローブIIによって開始される相補鎖合成反応時にφ29ポリメラーゼの鎖置換活性によって複数の相補鎖がプローブIから伸長するDNAから分離するが、この鎖はもともとリングプローブがプローブIにハイブリダイズした位置のすぐ近傍で再びプローブIにトラップされることになり、相補鎖合成反応が開始される。このため、１分子のリングプローブから１本の鎖に多数の蛍光プローブのためのハイブリダイゼーションサイトを持つ多数の鎖から構成される蛍光スポットがゲル中に形成されることになる。この蛍光スポットサイズはRCA反応が長いほど、プローブIIの濃度が高いほど、また、プローブIの濃度が低いほど大きくなる。上記反応条件ではスポット直径は0.1〜0.3μmであった。また、かなりの割合のDNA鎖が２本鎖となっているため、この後プローブIIと同じ配列でCy3蛍光体が固定された蛍光プローブを導入してもハイブリダイズする位置（サイト）が少なくなってしまう。これによる蛍光強度の低下を防ぐため、ラムダエクソヌクレアーゼによってリン酸化した鎖を選択的消化することによって２本鎖を１本鎖にしてもよい。すなわち、図１６(a)に示すように5'末端にリン酸基が導入されているため、このリン酸化されている鎖がラムダエクソヌクレアーゼによって消化され、１本鎖化されることによって、図１６(b)のようにほぼすべてのサイトに蛍光プローブを結合させることができる。
【０１１４】
次に蛍光プローブを付加するためにプローブIIと同じ配列で5'末端に蛍光体（Cy3）を結合したプローブ１μMを反応セルに注入し、下蓋202に＋0.4Vを５分間印加後１分ごとに−0.4Vと＋0.4Vの印加を３回繰り返した。その後、溶液をプローブが含まれない50mMトリシンバッファーに交換し、下蓋に−0.4Vを10分間印加しながら、１mL/minの流速でバッファーをインレット205からアウトレット207に流し続けた。
【０１１５】
蛍光計測は図１４に示す共焦点光学系を用いて行った。光学系の構成は図１３と同じである。ゲル中をz及びxy方向にスキャンすることのよって得ているが、ゲルを用いることによって、細孔アレーシートに比べて屈折率分布が小さく、蛍光計測時に散乱光の影響を受けにくい。
【０１１６】
また、蛍光計測は図１７に示すエバネッセント励起を用いてもよい。エバネッセント励起を実現するため、厚さ2mmの石英板で作製した下蓋202の中心付近に直角三角柱の形状の凹み1703を２箇所形成した。波長532nmの励起光はレーザービームエキスパンダ1202にて３倍に拡大された後、集光レンズ1702でゲル膜1401と下蓋202の上面の境界付近に集光されるようにする。このとき、凹み1703によって屈折し、上記界面の臨界角よりも小さい角度でレーザ光が入射することになり、全反射する。全反射によって上記界面付近数百nmのみが励起されることになり、この界面付近にある蛍光体のみが計測されることになる。
【０１１７】
対物レンズ1203は前記と同様にNA0.8、作動距離3.3mmのものを用い、励起光の散乱光を除去するバンドパスフィルタ1207及び結像レンズ1205を通して撮像素子として冷却CCDカメラ1206を用いて蛍光像を得た。
【０１１８】
ここまでの例では蛍光像中の蛍光スポットをカウントすることによってmRNAの定量を行ってきたが、もちろん、蛍光強度と分子数を対応させて定量を行うことも可能である。しかし、スポットをカウントすることによる定量は検量線の必要がない絶対定量であるだけでなく、分子の有無を判定する１つの閾値しか設定しないため、最も精度の高い定量が可能な方法である。一方、この方法では空間分解能が犠牲となる。定量性を犠牲にしても空間分解能が必要な場合には強度と分子数の対応付けによる定量を行ってもよい。なおこのようなカウントによる定量を選択するか、又は一部で強度計測を用いるかは、実施例１の化学発光の場合にも同様である。
【０１１９】
また、エバネッセント励起による蛍光像を得るためにTotal Internal Reflection Fluorescence専用の対物レンズ（たとえばAPON 60×OTIRFM（オリンパス））を用いてもよい。
【０１２０】
本実施例の場合にもcDNAライブラリシートは繰り返し利用可能であることはいうまでもない。また、全実施例でも同じことが可能であるが、本法で得られた蛍光像又は化学発光像及びそれから得られる遺伝子発現プロフィール（遺伝子発現分布）と、事前に取得した細胞の顕微鏡像とを重ね合わせることによって、細胞の形状と遺伝子発現の間の相関に関するデータを得ることができる。さらに、蛍光in situハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization; FISH）法で得られた画像と本法で得られた像を重ねあわせることによって、同じ遺伝子を測定した場合には本法の高精度定量を生かしてFISH法の定量性の評価も可能である。
【０１２１】
重ね合わせることが可能な像は他の標識法で得られた蛍光や化学発光像でもかまわないことはいうまでもない。
【０１２２】
また、蛍光標識の替わりにアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼなどの化学発光酵素を固定したDNAプローブを用い、あとから化学発光基質を加えることによって発光計測を行ってもよい。
【０１２３】
［実施例３］
本実施例は、実施例１又は２のように細孔付きシートをcDNAライブラリシートとして利用するのではなく、他のメンブレンを支持体として利用してcDNAライブラリを作製した例である。
【０１２４】
メンブレンとしては、タンパク質吸着の少ないセルロースアセテートメンブレンやニトロセルロースメンブレン又はこれらの混合メンブレン及びナイロンメンブレン等が利用可能である。ここでは厚さ115μmでポアサイズ0.2μm、直径25mmのセルロースアセテート製メンブレン（Whatman）を用いた例を示す。
【０１２５】
図１８に示すように、メンブレン1801内部のメンブレン繊維1802の表面にポリTプローブ1803を実施例１と同様にシランカップリング処理によって固定化する。また、同時にMPC処理も同様に行う。次にメンブレンを実施例１又は２と同様の反応セルに設置し、組織切片サンプル1101を載せ、前記と同様の処理を行うと、メンブレン内に細胞位置情報を保存した状態で、mRNAをメンブレン内のポリTプローブに捕獲することができる。その後、同様に逆転写反応することによってcDNAライブラリメンブレンを作製することが可能である。
【０１２６】
遺伝子特異的な蛍光プローブを導入し、それを図１３又は図１４のような単分子計測が可能な光学系でカウントすることによって遺伝子発現分布を測定してもよいし、RCAやPCRなどの化学増幅後に前記と同様に蛍光計測を行ってもよい。
【０１２７】
また、実施例１及び２と同様にcDNAライブラリシートから検出シート（これには細孔つきシートを用いてもよいし、メンブレンやゲル膜を用いてもよい）に移し取ってからRCAやPCRなどの化学増幅を行わずに蛍光計測や化学発光計測を行ってもよい。また、増幅後同様に計測を行ってもよい。
【０１２８】
また、メンブレンではなく、シート状のゲル膜や多孔質の他の材料を用いても同様の操作が可能である。
【０１２９】
［実施例４］
本実施例は、ビーズを支持体として利用してcDNAライブラリを作製した例である。
この例では、細胞より小さなビーズを面上に敷き詰めておき、ビーズ表面にポリTプローブを固定化し、その上に組織切片を載せて、前記実施例と同様の処理を行う。この場合のcDNAライブラリシートの断面図を図１９に示す。石英製のプレート1903及びその上面に透明電極1902を形成し、その上にポリTプローブを固定した直径１μmのダイナビーズ1901を敷き詰めた。ダイナビーズ1901が移動しないように一定の間隔でストッパー1904を設けた。この上に組織切片サンプル1101を載せて、前記と同様に細胞を破砕すると同時に電気泳動によってビーズ表面にmRNAをトラップし、逆転写することによってcDNAライブラリシートを得た。測定に関しても石英プレート1903と透明電極1902が下蓋202に対応するため、石英プレートを通して蛍光計測が可能である。また、この石英プレートの代わりにナイロンメッシュなど多孔質製の材料に置き換えることによって、他のシートやメンブレンにmRNAの位置情報を移し取ることも可能である。また、この例ではビーズは１層であるが、多層にビーズを敷き詰めてもよい。また、ビーズ材料はポリスチレンなどの樹脂材料、ガラスなどの（金属）酸化物、金属、セファロースなどの有機物でもよいし、これらの混合物でもよい。たとえば、ここではポリスチレンと鉄を組み合わせた磁気ビーズを用いた。
【０１３０】
次に、図２０に示すような細胞が収容されるセルの底面に多数のビーズを敷き詰めて同様の処理を行ってもよい。この例では、2001が反応セルであり、その底面にポリTプローブを固定した直径１μmの磁気ビーズ1901を用いた。1903は石英プレートであり、1902は透明電極である。これらの役割は前記と同じである。
【０１３１】
［実施例５］
実施例１〜４では、遺伝子特異的なパドロックプローブをcDNAにハイブリダイズさせ、遺伝子特異的に形成されるリングプローブを別のシートやメンブレンやゲルに転写した。遺伝子の発現分布を他のメンブレンに移しとる方法はこの方法だけではない。
【０１３２】
たとえば、逆転写酵素にM-MLVリバーストランスクリプターゼ（たとえばSUPERSCRIPT II）を使うことによって、mRNAからcDNAを合成する際にcDNAのすべての末端にCCC配列を付加し、続いてこの配列を識別するプローブをシート内部でハイブリダイズさせ、伸長反応後の適切な長さの相補鎖を別のシートに移しとることによって全cDNAの分布情報を別のシートに移しとることが可能である。
【０１３３】
すべての遺伝子発現の情報を配列解析によって分布を得ることも可能である。このときパイロシークエンス法を利用してホモポリマーを除いた配列に変換することも可能である。
【０１３４】
また、リングを形成しない遺伝子特異的プローブをハイブリダイズさせ、図２１に示すように5'末端側に遺伝子情報に対応する配列を付加することによって、ターゲットの配列そのものではない配列で情報を保持することが可能である。図２１の2101はシートの細孔内壁やメンブレンの繊維を示している。この表面にcDNAライブラリが固定されており、2102は１本鎖cDNAを示している。この一部の配列特異的にDNAプローブ2103がハイブリダイズしているが、配列特異性は2104の配列がcDNAの一部の配列と相補的であることに依拠している。この配列に対応する既知の配列をたとえば2105に配置することによって元のcDNAの配列ではない配列を識別して、蛍光や化学発光計測が可能となる。また、このようなプローブに共通配列部分を導入することによって、その共通配列部分にプライマーをハイブリダイズさせて増幅させることが可能となるため、増幅バイアスが低減できることは以前の実施例と同様である。さらに、2104の配列識別部分にユニバーサル塩基を用いることによってあるグループの配列をひとつの配列で代表させて、そのグループの遺伝子群に１つのプローブを反応させることも可能である。
【０１３５】
［実施例６］
上記実施例では、蛍光や化学発光計測を用いたが、電極表面にDNAが近づいたときに生じる電極の電位変化を計測することによってもmRNA分布を定量することができる。特にFETのゲート電極電位変化を利用することによって、cDNAライブラリシートから転写されたDNAプローブを定量することが可能である。ゲート電極容量をfF程度まで小さくすることによって１素電荷のゲート電極付近の移動を計測することも可能であるため、DNA１分子のゲート電極上でのハイブリダイゼーションを計測することが可能である。
【０１３６】
図２２に電位計測による計測機器の構成例を示す。１は細孔アレーシートであり、cDNAライブラリが形成済であるとする。このシートの直下にほぼ密着させる形で多数のFETを配置した半導体チップ2201を配置する。FETチップ2201とシート１の間及びシート１内部は電解質溶液で満たされており、また、この溶液の電位は参照電極によってコントロールされているものとする。チップ上には多数のFETセル2202が形成され、セル内部には１つずつソース2203、ドレイン2204、及びゲート2205が形成されている。セルサイズは１μmとした。セル間にワード線及びリード線が形成され、スイッチ用FETによって特定のセルのソースドレイン間の電流を順次計測することが可能となっている。ゲート電極は幅50nmのポリシリコン配線からなり、ゲート−ドレイン、及びゲート−グランド容量が十分小さく設計されている。ゲート電極上にはリング状プローブ2207と特異的にハイブリダイズするプローブ2206がシランカップリング剤によって固定されており、ハイブリダイズによる負イオンによって、ゲート電極電位が下がって、ソースドレイン間の電流を有効に変化させることができる。
【０１３７】
［実施例７］
上記実施例では、mRNAの分布を定量する方法について詳述してきたが、mRNA以外の非コードRNA（ncRNA）やゲノムDNAについても同様の方法を適用することが可能である。異なる点はポリTプローブではなく、解析対象となる配列（ncRNAやDNAなど）を固定化できるユニバーサルプローブをシートの細孔内壁やメンブレンの繊維に固定化すればよい。
【０１３８】
［実施例８］
本実施例では、核酸以外の分子（例えばタンパク質又は他の低分子物質）の細胞中の存在を解析する。細胞内の定量しようとする分子と特異的に結合する抗体やアプタマーを細孔内に固定することによって、定量しようとする分子に特異的なリングプローブを形成し、上記実施例と同様にして細胞内の存在分布を定量することが可能である。この方法は近接ライゲーション法（Proximity Ligation Method）という（参考文献：Malin Jarvius et al. Molecular & Cellular Proteomics 6 (9) p.1500, 2007）。
【０１３９】
図２３にシートの細孔内部の模式図を示した。2101は細孔の内壁又はメンブレンの繊維を示し、細胞内の定量しようとする分子2301と結合する抗体2302を、この抗体を抗原として認識する２次抗体2303を細孔壁面2101に固定することによって固定し、その結果、定量しようとする分子2301を固定する。また、定量しようとする分子2301をサンドイッチして結合するもうひとつの抗体2304にも抗体を認識する２次抗体2305を結合させる。２次抗体にはそれぞれDNA（2306及び2307）が固定されており、定量しようとする分子2301が抗体2302及び2304に結合することによって、これら２本の一本鎖DNAが近づく。このとき、２本のDNAプローブ2308と2309を細孔内に注入し、2306及び2307とハイブリダイズさせると、ライゲーション反応によりリングプローブが形成される。リングプローブが形成された後の計測法は上記実施例と同様である。
【０１４０】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明により、遺伝子発現プロフィールの解析方法が提供される。本発明の方法は、サンプルにおける遺伝子の発現を、その２次元位置情報と共に検出することができる。また本発明の方法では、サンプルにおいて発現される遺伝子を全てcDNAに変換してcDNAライブラリとすることができるため、遺伝子発現の検出を簡便かつ効率的に行うことができる。従って、本発明は、細胞機能解析、生体組織の解析、病気の診断、創薬などの分野で有用である。
【符号の説明】
【０１４２】
１  シート
２  細孔
３  細胞
４  ライセートを含むゲル
５  mRNA
６  細孔
７  DNAプローブ
８  細孔に捕獲されたmRNA
９  cDMA
10  プローブ
201  上蓋、上部電極
202  下蓋、下部電極
203  上部反応領域
204  下部反応領域
205  インレット
206  上部アウトレット
207  下部アウトレット
209  スペーサ
210  固定治具
211  ねじ
212  保護リング
220  上部アウトレット
221  下部アウトレット
801  シート
901  対物レンズ
902  結像レンズ
903  冷却CCDカメラ
1001  スリット
1002  アバランシェフォトダイオード（APD）又は光電子増倍管(PMT)
1101  組織切片サンプル
1201  レーザ
1202  レーザービームエキスパンダ
1203  対物レンズ
1204  ダイクロイックミラー  
1205  結像レンズ
1206  冷却CCDカメラ
1207  バンドパスフィルタ
1210  xyz方向
1301  ピンポール
1302  光検出器
1401  ゲル膜
1501  ストレプトアビジン
1502  プローブI
1503  リングプローブ
1701  ミラー
1702  集光レンズ
1703  凹み
1801  メンブレン
1802  メンブレン繊維
1803  プローブ
1901  ダイナビーズ
1902  透明電極
1903  プレート
1904  ストッパー
2001  反応セル
2101  シートの細孔内壁又はメンブレンの繊維
2102  cDNA
2103  DNAプローブ
2104  cDNAの一部の配列に対し相補的な配列
2105  cDNAの配列とは異なる既知配列
2201  半導体チップ
2202  FETセル
2203  ソース
2204  ドレイン
2205  ゲート
2206  プローブ
2207  リングプローブ
2301  計測対象の分子
2302  抗体
2303  ２次抗体
2304  抗体
2305  ２次抗体
2306  DNA
2307  DNA
2308  DNAプローブ
2309  DNAプローブ
2601  一回の撮像CCDカメラからで得られる画像
2602  蛍光スポット
2603  複数の画像
2604  xyz方向
2605  データセット
【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列番号１〜４：Artificial（合成DNA）
【図１】
2014027955.tif 000003
【図２】
2014027955.tif 000004
【図３】
2014027955.tif 000005
【図４】
2014027955.tif 000006
【図５】
2014027955.tif 000007
【図６】
2014027955.tif 000008
【図７】
2014027955.tif 000009
【図８】
2014027955.tif 000010
【図９】
2014027955.tif 000011
【図１０】
2014027955.tif 000012
【図１１】
2014027955.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
2014027955000001.app