(57)【要約】【課題】本発明は、簡易な手順で、高価な装置を用いることなく、低コストで、細胞をパターン状に培養するための細胞培養用基材を製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、細胞培養用基材の製造方法であって、酸または塩基によって加水分解可能な結合を有し、細胞の接着性を制御する機能性ポリマーの層を基材上に形成する工程、少なくとも片面が再剥離性を有する微粘着性面でありパターン成形された被覆材の微粘着性面と機能性ポリマーの層とを接着させて、機能性ポリマー層上に被覆材のパターンを形成する工程、被覆材に被覆されておらず露出した機能性ポリマーの層に、酸または塩基を接触させて加水分解反応を行う工程、および被覆材を剥離する工程を含む方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養用基材の製造方法であって、
酸または塩基によって加水分解可能な結合を有し、細胞の接着性を制御する機能性ポリマー層を基材上に形成する工程、
機能性ポリマー層と、パターン成形された被覆材とを密着させて、機能性ポリマー層上に被覆材のパターンを形成する工程、
被覆材のパターンにより露出した機能性ポリマー層に、酸または塩基を接触させることにより、機能性ポリマー層の一部に加水分解反応を行う工程、および
被覆材を機能性ポリマー層から剥離する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
機能性ポリマーが、酸または塩基によって加水分解可能な結合として、エステル結合を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被覆材の、機能性ポリマー層と密着させる面が再剥離性を有する微粘着性面である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
被覆材の微粘着性面がシリコーンゴムまたはシリコーン樹脂からなる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
機能性ポリマーがアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
機能性ポリマーが、ポリアルキレングリコール（メタ）アクリレートおよびポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミドから選択される、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞をパターン状に培養するための細胞培養用基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みや、生体外で細胞を培養する工程を経て患者に培養細胞や培養組織を移植する再生医療の研究が盛んに行われている。
【０００３】
一方、培養細胞を基材上に部分的に接着させ、配列させる技術が報告されている。このような技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面がパターンをなしているような基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。
【０００４】
例えば、特許文献１では、細胞非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性ポリマーをフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。さらに、特許文献２では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。
【０００５】
しかしながら、上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によるパターニングを行う場合は、高精細なパターンを得ることはできるが、細胞接着性材料が感光性を有する必要があり、例えば生体ポリマー等にこのような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く、細胞接着性材料の選択性の幅を極めて狭くするといった問題があった。また、半導体製品の製造において常用される、フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では、フォトレジストの現像に現像液等を用いる必要性があり、これらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。さらに、特許文献３に記載されるような、フォトマスクを用いたフォトリソグラフィ法によるパターニングでは、フォトマスクにゴミが付着するとパターニング不良が生じやすく、露光を行う前に洗浄工程が必要であること、洗浄工程により除去しきれないゴミがフォトマスクに付着していてもフォトマスクが高価であるため使い捨てできないこと、露光装置など高価な装置が必要であることなどの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平３−７５７６号公報
【特許文献２】特開平５−１７６７５３号公報
【特許文献３】特開２００７−３１２７３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡易な手順で、高価な装置を用いることなく、低コストで、細胞をパターン状に培養するための細胞培養用基材を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酸または塩基によって加水分解可能な結合を有し、細胞の接着性を制御する機能性ポリマーの層を基材上に形成し、被覆材をパターン成形して、機能性ポリマーの層に密着させ、機能性ポリマーの層の露出部分にのみ酸または塩基を接触させて加水分解反応を行うことにより、基材上に機能性ポリマー層のパターンを簡易に形成できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）細胞培養用基材の製造方法であって、
酸または塩基によって加水分解可能な結合を有し、細胞の接着性を制御する機能性ポリマー層を基材上に形成する工程、
機能性ポリマー層と、パターン成形された被覆材とを密着させて、機能性ポリマー層上に被覆材のパターンを形成する工程、
被覆材のパターンにより露出した機能性ポリマー層に、酸または塩基を接触させることにより、機能性ポリマー層の一部に加水分解反応を行う工程、および
被覆材を機能性ポリマー層から剥離する工程
を含む、前記方法。
（２）機能性ポリマーが、酸または塩基によって加水分解可能な結合として、エステル結合を有する、（１）記載の方法。
（３）被覆材の、機能性ポリマー層と密着させる面が再剥離性を有する微粘着性面である、（１）又は（２）記載の方法。
（４）被覆材の微粘着性面がシリコーンゴムまたはシリコーン樹脂からなる、（３）記載の方法。
（５）機能性ポリマーがアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）機能性ポリマーが、ポリアルキレングリコール（メタ）アクリレートおよびポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミドから選択される、（５）記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、簡易な手順で、高価な装置を用いることなく、低コストで、細胞をパターン状に培養するための細胞培養用基材を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の細胞培養用基材の製造方法の一実施形態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の細胞培養用基材の製造方法は、例えば図１に示すように、
ａ）酸または塩基によって加水分解可能な結合を有し、細胞の接着性を制御する機能性ポリマーの層１を基材２上に形成する工程、
ｂ）機能性ポリマーの層１と、パターン成形された被覆材４を密着させて、機能性ポリマー層上に被覆材のパターンを形成する工程、
ｃ）被覆材４のパターンにより露出した機能性ポリマーの層５に、酸または塩基６を接触させることにより、機能性ポリマー層の一部に加水分解反応を行う工程、および
ｄ）被覆材４を機能性ポリマー層から剥離する工程
を含む。
【００１３】
本発明では、酸または塩基によって加水分解可能な結合を有する機能性ポリマーを用いることにより、酸または塩基を用いた加水分解処理で、基材上に機能性ポリマー層のパターンを簡便に形成することができる。酸または塩基によって加水分解可能な結合としては、例えば、エステル結合、アミド結合、チオエステル結合、アセタール結合、ヘミアセタール結合、ケタール結合、およびヘミケタール結合が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、エステル結合を有する機能性ポリマーを用いる。エステル結合の加水分解反応は低濃度の酸または塩基を用いて加熱処理などを加えることなく比較的温和な条件でも進むため、加水分解工程で基材に与えるダメージを抑えられるため好ましい。また、エステル結合を有する分子は多種類存在するため、実験系にあわせて表面性質を制御できるため好ましい。
【００１４】
細胞の接着性を制御する機能性ポリマーは、細胞に対して接着性および／または非接着性の表面を提供する機能性ポリマーであり、例えば、細胞に対して接着性の表面を提供するポリマーや、細胞に対して非接着性の表面を提供するポリマーや、細胞に対する接着性が変化する表面を提供するポリマーなどが挙げられる。
【００１５】
細胞接着性を判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。
【００１６】
細胞の播種は、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に懸濁させて測定対象物上に播種し、その後、細胞ができるだけ均一に分布するよう、細胞が播種された測定対象物をゆっくりと振とうすることにより行うものである。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定では、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いた箇所を測定箇所とする。
【００１７】
一方、細胞非接着性とは、細胞が接着しにくい性質をいう。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。
【００１８】
細胞に対して非接着性の表面を提供するポリマーとしては、親水性ポリマーが挙げられる。本発明において親水性ポリマーは、細胞の吸着、特に非特異的吸着を抑制する親水性ポリマーをさす。親水性ポリマーは、ポリマーの主鎖もしくは側鎖に親水性の官能基を含むポリマーのことを指す。
【００１９】
酸または塩基によって加水分解可能な結合を有する親水性ポリマーの具体例としては、ポリアルキレングリコール（特に、ポリエチレングリコール）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸、これらと他のモノマーとの共重合体や、グラフト重合体などの（メタ）アクリレート、好ましくはジ（メタ）アクリレートが挙げられる。中でもポリアルキレングリコール（メタ）アクリレートは様々な分子量のものが市販されており、かつ生体適合性に優れているので好適に用いることができる。
【００２０】
その他の親水性ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸、これらと他のモノマーとの共重合体や、グラフト重合体の1種または複数種をさらに混合して用いてもよい。
【００２１】
基材上に形成される親水性ポリマー層における親水性ポリマーの密度および親水性は、表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。例えば、親水性ポリマー固定化後の表面の水接触角が典型的には４８°以下、好ましくは４０°以下、より好ましくは３０°以下であれば、親水性ポリマーが十分な密度で存在し、親水性を有するとともに細胞の吸着や接着、特に非特異的吸着が抑制されていると考えられる。なお、本発明において水接触角とは、２３℃において測定される水接触角をさす。
【００２２】
機能性ポリマー層として親水性ポリマー層を形成するための塗工液は、親水性ポリマーを、好ましくは適当な溶媒に溶解することにより調製できる。親水性ポリマーは、一種類のみを用いてよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、２−ブタノール、ｎ−ブタノール、および水等が挙げられ、それらを１種以上使用してよい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、およびエチレン(もしくはジエチレン)グリコールまたはそのモノエチルエーテル、等も１種以上使用してよい。本発明においては、ｉ−プロパノールが好ましい。i-プロパノールは薄膜に塗布することで室温にて容易に揮発するため、特段の乾燥工程なしに、後述の乾燥によるメリットを得ることができるからである。また、基材として細胞培養に汎用されるポリスチレンを選択した場合においても表面を侵さないため好ましい。
【００２３】
溶媒に溶解させる親水性ポリマーの量は、ポリマーの分子量に応じて決定されるが、好ましくは濃度が１重量％以上、より好ましくは５重量％以上である。
【００２４】
機能性ポリマーとしての、細胞に対する接着性が変化する表面を提供するポリマーとして、温度応答性ポリマーが挙げられる。温度応答性ポリマーは細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した細胞シートの回収時の温度下において親水性を示すものである。なお、温度応答性ポリマーが、疎水性から親水性に変化する温度（水に対する臨界溶解温度（Ｔ））としては、特に限定されないが、培養後の細胞シートの回収の容易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場（細胞接着面）が充分に確保されるため細胞培養を効率よく行うことができる。その一方、培養後の細胞シートの回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、培養された細胞シートを細胞培養用基材から分離させることで、細胞シートの回収を一層容易にすることができる。特に所定の臨界溶解温度未満の温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎水性を示す温度応答性ポリマーが好ましい。このような温度応答性ポリマーにおける臨界溶解温度を特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。具体的には下限臨界溶解温度Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃である温度応答性ポリマーが好ましい。
【００２５】
酸または塩基によって加水分解可能な結合を有する温度応答性ポリマーの具体例としては、アクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適なポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、およびポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。その他のポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミドが挙げられる。
【００２６】
機能性ポリマー層として温度応答性ポリマー層を形成するための塗工液として、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ−(もしくはＮ,Ｎ−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導体などのモノマーを、好ましくは適当な溶媒に溶解したものを使用できる。塗工液に含まれるモノマーの量は、好ましくは５重量％以上、より好ましくは２０重量％以上であり、好ましくは７０重量％以下、より好ましくは５０重量％以下である。温度応答性ポリマー層を形成するための塗工液として、温度応答性ポリマーを、適当な架橋剤とともに、適当な溶媒に溶解したものを使用してもよい。
【００２７】
架橋剤としては、好ましくは放射線反応性官能基を２以上有する架橋剤を用いる。温度応答性ポリマーとともに放射線反応性官能基を有する架橋剤を含む塗工液を基材上に供給した後、放射線（例えば電子線）を照射することにより、温度応答性ポリマーを、架橋剤を介して基材上に共有結合で結合させることができ、温度応答性ポリマーの強固な固定化が達成できる。放射線反応性官能基、例えば電子線反応性官能基は、放射線（例えば電子線）を照射することにより、基材に共有結合で結合することができるものであれば特に制限されない。放射線反応性官能基は、高エネルギー照射下でラジカルを形成することができる部分であり、放射線源にさらされるとフリーラジカルを発生し、架橋およびグラフトを達成する。
【００２８】
放射線反応性官能基は、用いる温度応答性ポリマーにより適宜選択されるが、例えば、アクリロイル基、メタクリロイル基、アジド基、一級、二級または三級の脂肪族基、脂環式基、ベンジル基などの芳香族基などが挙げられる。架橋剤は、これらの放射線反応性官能基を１種類のみ有するものでもよいし、複数種有するものでもよい。放射線反応性官能基として、アクリロイル基またはメタクリロイル基を有する架橋剤を用いることが好ましい。アクリロイル基またはメタクリロイル基を有する架橋剤は入手しやすく、アジド基などと比較すると取り扱いが比較的容易である。
【００２９】
架橋剤の具体例としては、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリプロピレングリコールジアクリレート、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、ならびにエトキシ化グリセリン（メタ）アクリレート、例えば、エトキシ化グリセリンジアクリレート、エトキシ化グリセリントリアクリレート、エトキシ化グリセリンジメタクリレート、およびエトキシ化グリセリントリメタクリレートなどが挙げられる。
【００３０】
温度応答性ポリマー層を形成するための塗工液の調製に使用する溶媒としては、特に限定されないが、常圧下に於いて沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、２−ブタノール、ｎ−ブタノール、および水等が挙げられ、それらの１種以上使用してよい。中でも上記と同様の理由により、ｉ−プロパノールが好ましい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、およびエチレン(もしくはジエチレン)グリコールまたはそのモノエチルエーテル、等も１種以上使用してよい。
【００３１】
上記機能性ポリマー層を形成する基材は、公知または市販のものを適用できる。機能性ポリマー層として、細胞に対して接着性の表面を提供するポリマーの層を形成する場合は、細胞非接着性の表面を有する基材を用いることにより、細胞接着性の表面と細胞非接着性の表面がパターン形成された細胞培養用基材を得ることができる。一方、細胞に対して非接着性の表面を提供するポリマーの層を形成する場合は、細胞接着性の表面を有する基材を用いることにより、細胞接着性の表面と細胞非接着性の表面がパターン形成された細胞培養用基材を得ることができる。
【００３２】
基材の具体例としては、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチックで代表される有機材料を挙げることができる。プラスチックとしては、例えば、ポリエステル、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ウレタンアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリアミド(ナイロン)、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリオレフィンおよびポリ乳酸などが挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。また、基材は、オゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施すことができる。
【００３３】
基材の形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。
【００３４】
温度応答性ポリマー層の形成のために基材上に塗布する塗工液の塗布量は温度応答性ポリマーが機能（例えば温度応答性）を発揮するのに必要な塗布量であり、５０ｍｇ／ｍ２以上あればよい。塗布量の上限は特にないが、４０ｇ／ｍ２未満が好ましく、１０ｇ／ｍ２以下がより好ましい。親水性ポリマー層の形成のために基材上に塗布する塗工液の塗布量は、親水性ポリマーが機能（例えば細胞非接着性または非特異的吸着の抑制）を発揮するのに必要な塗布量であり、５０ｍｇ／ｍ２以上あればよい。塗布量の上限は特にないが、４０ｇ／ｍ２未満が好ましく、１０ｇ／ｍ２以下がより好ましい。
【００３５】
塗布量が多すぎると、厚みが増して塗膜厚が安定しないこと、厚みが増して放射線の貫通・照射量が安定しないこと、ならびに照射エネルギーに由来する膜内の対流により被覆量にムラが生じる場合がある。また、遊離のポリマーや分子を洗浄するための洗浄時間を短くするためには塗膜量は１０ｇ／ｍ２以下が望ましい。
【００３６】
機能性ポリマーを形成するための塗工液の基材への塗布方法としては公知のいずれの方法を使用してもよく、例えばスピンコーター、バーコーター等による塗布法、噴霧塗布法、ブレードコーティング法、グラビアコーティング法、ロッドコーティング法、ナイフコーディング法、リバースロールコーティング法、オフセットグラビアコーティング法等が使用できる。これらは例示に過ぎず、当業者であれば適用可能なものを使用することができる。
【００３７】
塗工液を基材上に供給して塗布した後、放射線照射することにより基材表面と機能性ポリマーとの結合反応を進行させることが好ましい。ここでいう結合反応は、放射線照射によって、基材と機能性ポリマーの間の共有結合が形成される反応をさす。使用する放射線としては、α線、β線、γ線、電子線、紫外線等がある。本発明においては、γ線と電子線がエネルギー効率がよく、特に生産性の面から電子線が好ましい。紫外線に関しては適当な重合開始剤や基材とのアンカー剤を組合せることで使用できる。放射線の線量の範囲は、電子線であれば５０ｋＧｙ〜４００ｋＧｙが好ましく、γ線であれば５ｋＧｙ〜５０ｋＧｙが好ましい。通常、線量範囲は、放射線による温度上昇および樹脂のＴｇに基づき、適宜決定することができる。
【００３８】
上述の工程を経て形成された機能性ポリマー層は、遊離のポリマー分子や、未反応物等が存在している。そこでこれらの遊離ポリマーや未反応物を除去するために洗浄を行う洗浄工程を更に含むことが好ましい。洗浄方法としては特に限定されないが、典型的には浸漬洗浄、遥動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄等が挙げられる。また洗浄液としては典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。洗浄方法と洗浄液の組み合わせは適宜選択すればよい。
【００３９】
続いて、得られた機能性ポリマー層に、パターン成形された被覆材を密着させて、機能性ポリマー層上に被覆材のパターンを形成する。好ましくは、少なくとも片面が再剥離性を有する微粘着性面でありパターン成形された被覆材の微粘着性面（図１の３）を密着させて、機能性ポリマー層上に被覆材のパターンを形成する。このような被覆材は、機能性ポリマー層に一時的に接着して安定に被覆することができ、したがって酸または塩基による加水分解から機能性ポリマー層を保護できるとともに、加水分解反応後は容易に剥離することができる。
【００４０】
ここで再剥離性とは、一度粘着または密着させた後で、基材を破壊せず、かつ基材表面に粘着材を残さないで容易に剥離できる性質をさす。本発明における被覆材の微粘着性面は、軽度の粘着性を有することから、機能性ポリマー層と接触させるとこれに密着して、酸または塩基による加水分解処理の間、一時的に固定することができるが、加水分解処理が完了した後は、機能性ポリマー層と被覆材を容易に剥離することができる。微粘着性は、被覆材を機能性ポリマー層上に一時的に固定できるが、容易に剥離することが可能な程度の粘着性をさす。
【００４１】
上記のような特性を有する材料としては、エラストマー材料が挙げられる。エラストマー材料には、ゴム材料、熱硬化性樹脂系エラストマー材料、および熱可塑性樹脂系エラストマー材料が包含されるが、耐熱性の観点から熱硬化性樹脂系エラストマー材料が好ましい。ゴム材料には、天然ゴムおよび合成ゴム（ポリブタジエン系ゴム、ニトリル系ゴム、クロロプレン系ゴム）が包含される。エラストマー材料の具体例としては、ウレタンゴム、ニトリルゴム、シリコーンゴム、シリコーン樹脂（例えば、ポリジメチルシロキサン）、フッ素ゴム、アクリルゴム、イソプレンゴム、エチレンプロピレンゴム、クロロスルホン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴム、クロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブタジエンゴム、およびポリイソブチレンゴムなどが挙げられる。シリコーンゴムおよびシリコーン樹脂は、耐熱性に優れ、酸または塩基による変性がなく、固体として安定しているため、特に好ましい。また、シリコーンゴムおよびシリコーン樹脂は、弾性を硬化剤の量で調整できるとともに、粘着剤によることなく適度な自己粘着性を有する点でも細胞培養基材に用いるのに好適である。
【００４２】
被覆材の形状は、機能性ポリマー層を部分的に被覆できるパターン成形されたものであれば特に制限されない。好ましくは、シート状またはフィルム状である。全体が上記のような再剥離性と微粘着性を有する材料からなる被覆材であってもよいし、機能性ポリマー層と接触させる面のみが再剥離性と微粘着性を有する材料からなる被覆材であってもよい。
【００４３】
全体がエラストマー材料からなる被覆材を用いる場合、その厚みは、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは５０μｍ以上であり、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下である。上記範囲の厚みを有する被覆材はハンドリングがしやすく、また所望のパターンに容易に切断可能なため好ましい。
【００４４】
被覆材のパターンは、二次元のパターンであれば特に制限されず、細胞の種類、形成させる組織等によって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形および四角形等の図形の形状の被覆材、あるいは上記図形が切り抜かれた形状（開口を有する形状）の被覆材などが挙げられる。
【００４５】
被覆材の微粘着性面と機能性ポリマーの層とを密着させて、機能性ポリマー層上に被覆材のパターンを形成し、被覆材に被覆されておらず露出した機能性ポリマーの層に、酸または塩基を接触させて加水分解反応を行うことにより、機能性ポリマー中の酸または塩基によって加水分解可能な結合が分解され、機能性ポリマーを基材上から取り除くことができる。機能性ポリマー層のうち、被覆材に被覆されている領域は保護されているため、加水分解反応を受けない。したがって、加水分解処理後に被覆材を剥離すると、被覆材に被覆されていた領域は機能性ポリマー層が残り、露出していた領域は機能性ポリマー層が取り除かれて基材表面が露出した状態となる。結果として、基材上に、被覆材と同じパターンで機能性ポリマー層のパターンが形成された細胞培養用基材が得られる。
【００４６】
加水分解反応に用いる酸としては、特に制限されないが、例えば、塩酸、硝酸、硫酸などの無機酸、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸が挙げられる。加水分解反応に用いる塩基としては、特に制限されないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、および水酸化カルシウムなどが挙げられる。好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を用いる。このような水酸化ナトリウム水溶液は、加水分解後の洗浄工程が容易なため好ましい。
【００４７】
加水分解反応の条件は特に制限されず、処理する機能性ポリマーの種類や機能性ポリマー層の厚み、用いる酸または塩基の種類等に応じて適宜決定される。例えば、塩基として０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を用いる場合は、２０〜５０℃の温度で、５〜３０分間処理する条件が挙げられる。
【００４８】
加水分解処理後の基材は、被覆材を剥離した後、残留している酸や塩基、および分解されたポリマー等を除去するために洗浄を行うことが好ましい。洗浄方法としては、上記と同様の方法を使用できる。
【００４９】
本発明の方法で製造される細胞培養用基材は、細胞培養に適した形状（例えばディッシュ形状）に加工することができる。また、ディッシュ形状の容器の細胞培養面に接着剤などにより貼り付けてもよい。
【００５０】
本発明の方法で製造される細胞培養用基材を用いて、種々の細胞、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞等を培養することができる。
【００５１】
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）（アルドリッチ社製）が５重量％、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）（関東化学社製）が４０重量％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させて塗工液を作製した。市販のポリスチレンフィルム（サンディック社より入手）にコロナ処理を施して親水化した面に、ワイヤーバーを用いて上記塗工液をフィルム上に塗布した（１．４ｇ／ｍ２）。このフィルムに電子線照射（照射線量２００ｋＧｙ）を行って親水性ポリマーを固定化したフィルム試料を作製した。
【００５３】
作製したフィルム試料を培養シャーレ底面に固定化し、表面を０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液で５分間処理した。このとき、表面の一部分をポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のシートで被覆して水酸化ナトリウム水溶液との接触を防いだ。
【００５４】
上記培養シャーレを１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で満たしたところにマウス繊維芽細胞（ＣＣＬ１６３）を播種し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件で２晩培養した。インキュベーターから取り出して光学顕微鏡により細胞の状態を観察したところ、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のシートで被覆した領域は細胞非接着性を保っていたが、水酸化ナトリウム水溶液で処理された領域には細胞が接着していた。
【００５５】
（実施例２）
ポリ-Ｎ-イソプロピルアクリルアミド（分子量３５万）が３重量％、ＰＥＧＤＡが０．１０重量％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させて塗工液を作製した。市販のポリスチレンフィルム（サンディック社より入手）にコロナ処理を施して親水化した面に、ワイヤーバーを用いて上記塗工液をフィルム上に塗布した（１．４ｇ／ｍ２）。このフィルムに電子線照射（照射線量１２０ｋＧｙ）を行って温度応答性ポリマーを固定化したフィルム試料を作製した。
【００５６】
作製したフィルム試料を培養シャーレ底面に固定化し、表面を０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液で５分間処理した。このとき、表面の一部分を微粘着性フィルムであるゲルポリ（パナック社）で被覆して水酸化ナトリウム水溶液との接触を防いだ。
【００５７】
上記培養シャーレを１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で満たしたところにウシ血管内皮細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件で１日培養した。その後、２０℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに入庫した。３０分後に光学顕微鏡により細胞の状態を観察したところ、ゲルポリで被覆した領域は温度応答性能を保持しているため細胞が剥離したが、水酸化ナトリウム水溶液で処理された領域は細胞が剥離しなかった。
【符号の説明】
【００５８】
１：機能性ポリマーの層
２：基材
３：微粘着性面
４：被覆材
５：露出した機能性ポリマーの層
６：酸または塩基
【図１】
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