(57)【要約】【課題】落射顕微鏡を用いる場合には細胞の表面以外の内部からも蛍光が励起されてバックグラウンド光となり、Ｓ／Ｎ比が低いという課題がある。一方、共焦点レーザ顕微鏡および全反射顕微鏡は細胞の特定面に存在する蛍光を選択励起するため高Ｓ／Ｎ比の高解像画像が得られるが、光学系が複雑で、装置が大型かつ高価であるという課題がある。【解決手段】試料の表面を観察する観察用基材であって、予め定められた波長の光に対して透明な本体部を備え、本体部は、一方の面に予め定められたピッチで屈折率が変化する変化面領域を有し、ピッチは、自由空間での波長を変化面領域における有効屈折率で割った長さの整数倍±１０％の範囲内に含まれる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の表面を観察する観察用基材であって、
予め定められた波長の光に対して透明な本体部を備え、
前記本体部は、一方の面に予め定められたピッチで屈折率が変化する変化面領域を有し、前記ピッチは、自由空間での前記波長を前記変化面領域における有効屈折率で割った長さの整数倍±１０％の範囲内に含まれる観察用基材。
【請求項２】
前記整数は１から４のいずれかである請求項１に記載の観察用基材。
【請求項３】
前記変化面領域は、一方向に前記ピッチで凹凸が繰り返された形状を有する請求項１または２に記載の観察用基材。
【請求項４】
前記凹凸は正弦波形状である請求項３に記載の観察用基材。
【請求項５】
前記変化面領域は、二次元的に前記ピッチで配置された複数の柱状体および穴の少なくとも一方を有する請求項１または２に記載の観察用基材。
【請求項６】
前記複数の柱状体および穴の少なくとも一方は、格子状に配置されている請求項５に記載の観察用基材。
【請求項７】
前記複数の柱状体または穴の少なくとも一方は、ハニカム状に配置されている請求項５に記載の観察用基材。
【請求項８】
前記変化面領域は、前記屈折率が変化する領域の周囲に配された、前記長さの非整数倍のピッチで屈折率が変化する第二の領域をさらに有する請求項１から７のいずれか１項に記載の観察用基材。
【請求項９】
前記変化面領域は、直径が前記ピッチに等しい複数の微粒子を有し、前記複数の微粒子は互いに隣接して前記一方の面に配される請求項１に記載の観察用基材。
【請求項１０】
前記変化面領域は、第１の屈折率を有する低屈折率領域、および、第１の屈折率よりも高い第２の屈折率を有する高屈折率領域を有し、
前記高屈折率領域の体積分率が０．２から０．８である請求項１から９のいずれか１項に記載の観察用基材。
【請求項１１】
前記高屈折率領域の体積分率が０．３から０．６である請求項１０に記載の観察用基材。
【請求項１２】
前記高屈折率領域は、ＩＴＯ、ＴｉＯ２、ＺｎＯ、ダイアモンド、窒化ケイ素、炭化ケイ素、ＺｒＯ２、ＺｒＴｉＯ４、ＣｅＯ２、ＨｆＯ２、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、Ｙ２Ｏ３、およびＷＯ３等のうちの少なくともいずれかの薄膜を含む請求項１０または１１に記載の観察用基材。
【請求項１３】
前記高屈折率領域は、ＩＴＯ、ＴｉＯ２、ＺｎＯ、ダイアモンド、窒化ケイ素、炭化ケイ素、ＺｒＯ２、ＺｒＴｉＯ４、ＣｅＯ２、ＨｆＯ２、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、Ｙ２Ｏ３、およびＷＯ３等のうちの少なくともいずれかの、可視光波長以下の直径の粒子を含む請求項１０または１１に記載の観察用基材。
【請求項１４】
前記低屈折率領域の表面と前記高屈折率領域の表面とが平坦につながっている請求項１０から１３のいずれか１項に記載の観察用基材。
【請求項１５】
前記変化面領域に、疎水性処理および親水性処理の少なくとも一方が施されている請求項１から１４のいずれか１項に記載の観察用基材。
【請求項１６】
前記変化面領域に、プロタミン、ポリリジン、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンのうちの少なくともいずれかが吸着されている請求項１から１４のいずれか１項に記載の観察用基材。
【請求項１７】
前記変化面領域に、蛍光材料を含む前記試料が載置され、
前記波長は、前記蛍光材料を励起する励起光の波長である請求項１から１６のいずれか１項に記載の観察用基材。
【請求項１８】
前記変化面領域に、蛍光材料を含む前記試料が載置され、
前記波長は、前記蛍光の波長である請求項１から１６のいずれか１項に記載の観察用基材。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか１項に記載の観察用基材が、前記試料を収容する収容部の底面に配されたウェルプレート。
【請求項２０】
請求項１から１８のいずれか１項に記載の観察用基材と、
前記観察用基材に対向して配された対物光学系と、
前記対物光学系に前記波長の光を入射する入射光学系と、
前記波長の光が前記変化面領域の中に回折して定在した定在波により励起された、前記変化面領域に近い側の前記試料の表面に含まれる蛍光材料からの蛍光を前記対物光学系を介して観察する観察光学系と
を備える表面観察装置。
【請求項２１】
光源からの入射光のうち前記波長の光を透過する第１のフィルタ、および、前記波長の光から前記蛍光を分離して透過する第２のフィルタを有し、取り外し可能に取り付けられたフィルタユニットをさらに備える請求項２０に記載の表面観察装置。
【請求項２２】
前記第１のフィルタは、前記波長の±１０％の波長を含む波長帯を透過する請求項２１に記載の表面観察装置。
【請求項２３】
前記対物光学系は、前記波長の光をブリュースター角より小さい入射角で前記観察用基材に入射する請求項２０から２２のいずれか１項に記載の表面観察装置。
【請求項２４】
前記対物光学系は、前記観察用基材の前記変化面領域と反対の面から前記波長の光を入力する請求項２０から２３のいずれか１項に記載の表面観察装置。
【請求項２５】
前記対物光学系は、前記観察用基材の前記変化面領域と反対の面から前記蛍光を入力する請求項２０から２３のいずれか１項に記載の表面観察装置。
【請求項２６】
請求項１から１８のいずれか１項に記載の観察用基材の前記変化面領域上に前記試料を載置する段階と、
前記観察用基材に対向して配された対物光学系に前記波長の光を入射する段階と、
前記波長の光が前記変化面領域の中に回折して定在した定在波により励起された、前記変化面領域に近い側の前記試料の表面に含まれる蛍光材料からの蛍光を前記対物光学系を介して観察する段階と
を備える表面観察方法。
【請求項２７】
請求項１から１８のいずれか１項に記載の観察用基材の前記変化面領域上に前記試料を載置する段階と、
前記試料における前記変化面領域の側の表面で生じる発光が前記変化面領域の中に回折して定在した定在波により増強された増強発光を，前記観察用基材に対向して配された対物光学系を介して観察する段階と
を備える表面観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察用基材、ウェルプレート、表面観察装置および表面観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の表面は細胞機能の解析等において重要な観察対象である。細胞の表面の観察対象分子は、蛍光標識後、励起光照射によって生じる蛍光で観察される。一部、観察対象の目的分子を、ルシフェラーゼ標識とルシフェリン、または酵素標識抗体と化学発光基質を用いて検出する発光法も用いられる。しかし蛍光観察の方が、複数波長の蛍光を識別でき、得られる情報量が多いため、主に用いられる。蛍光観察装置としては、落射顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡および全反射照明顕微鏡が用いられている（例えば、特許文献１参照）。
［特許文献１］特表２０１１−５１４９６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、落射顕微鏡を用いる場合には細胞の表面以外の内部からも蛍光が励起されてバックグラウンド光となるので、Ｓ／Ｎ比が低いという課題がある。一方、共焦点レーザ顕微鏡および全反射顕微鏡は光学系が複雑で、装置が大型かつ高価であるという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様においては、試料の表面を観察する観察用基材であって、予め定められた波長の光に対して透明な本体部を備え、本体部は、一方の面に予め定められたピッチで屈折率が変化する変化面領域を有し、ピッチは、自由空間での波長を変化面領域における有効屈折率で割った長さの整数倍±１０％の範囲内に含まれる。
【０００５】
本発明の第２の態様においては、表面観察装置であって、上記観察用基材と、観察用基材に対向して配された対物光学系と、対物光学系に波長の光を入射する入射光学系と、波長の光が変化面領域の中に回折して定在した定在波により励起された、試料における変化面領域の側の表面に含まれる蛍光材料からの蛍光を対物光学系を介して観察する観察光学系とを備える。
【０００６】
本発明の第３の態様においては、表面観察方法であって、上記観察用基材の変化面領域上に試料を載置する段階と、観察用基材に対向して配された対物光学系に波長の光を入射する段階と、波長の光が変化面領域の中に回折して定在した定在波により励起された、試料における変化面領域の側の表面に含まれる蛍光材料からの蛍光を対物光学系を介して観察する段階とを備える。
【０００７】
本発明の第４の態様においては，表面観察方法であって、上記観察用基材上記観察用基材の変化面領域上に試料を載置する段階と、試料における変化面領域の側の表面で生じる発光が変化面領域の中に回折して定在した定在波により増強された増強発光を，観察用基材に対向して配された対物光学系を介して観察する段階とを備える。
【０００８】
なお、上記の発明の概要は、本発明の必要な特徴の全てを列挙したものではない。また、これらの特徴群のサブコンビネーションもまた、発明となりうる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本実施形態に係る顕微鏡１０の概略図である。
【図２】観察用基材１００を上方から見た平面図である。
【図３】図２の観察用基材１００を矢印方向から見た断面図である。
【図４】観察用基材１００を用いて試料５０を観察する状態を模式的に示す。
【図５】他の変化面領域１０７を有する観察用基材１１０の断面図である。
【図６】さらに他の変化面領域１２１を有する観察用基材１２０を上方から見た平面図である。
【図７】図６の観察用基材１２０を矢印方向から見た断面図である。
【図８】さらに他の変化面領域１２７を有する観察用基材１２５の断面図である。
【図９】さらに他の変化面領域１４１を有する観察用基材１４０の平面図である。
【図１０】さらに他の変化面領域１５１を有する観察用基材１５０の斜視図である。
【図１１】さらに他の変化面領域１６１を有する観察用基材１６０の断面図である。
【図１２】さらに他の変化面領域１７２を有する観察用基材１７０の断面図である。
【図１３】さらに他の変化面領域１８１を有する観察用基材１８０の平面図である。
【図１４】本実施形態のウェルプレート１９０の斜視図である。
【図１５】実施例による撮像画像の一例を示す。
【図１６】比較例による撮像画像の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００１１】
図１は、本実施形態に係る顕微鏡１０の概略図である。顕微鏡１０は、倒立落射型の蛍光顕微鏡であって、試料５０の表面を観察する表面観察装置の一例である。顕微鏡１０は、光源１２と、入射光学系２２と、フィルタユニット３０と、対物光学系３２と、支持台３４と、観察光学系３６と、撮像素子３８とを有する。
【００１２】
光源１２は、波長λ１を含む波長帯λ０の光を出力する。波長λ１は、試料５０に付加された蛍光材料の蛍光を励起する励起光の波長である。光源１２は、複数種類の蛍光材料に対応した互いに異なる波長を含む波長帯の光を出力することができるものが好ましい。光源１２の例は、水銀ランプ、キセノンランプ、レーザー、ＬＥＤ等である。なお、特に断らない限り、波長は空気中での値を用いる。
【００１３】
入射光学系２２は、光源１２に近い側から順に、コレクタレンズ１４、開口絞り１６、視野絞り１８および視野レンズ２０を有する。コレクタレンズ１４は光源１２から入力された光を開口絞り１６の位置に結像する。開口絞り１６は、試料５０を照射する光の開口数ＮＡを決める。視野絞り１８は、試料５０を照射する光の範囲すなわち視野を決める。視野レンズ２０は、開口絞り１６および視野絞り１８を通過した光を集光してフィルタユニット３０へ出力する。
【００１４】
フィルタユニット３０は、第１のフィルタ２４、ダイクロイックミラー２６および第２のフィルタ２８を有する。
【００１５】
第１のフィルタ２４は、波長λ１の励起光を透過するバンドバスフィルタである。第１のフィルタは励起フィルタと呼ばれることもある。これにより第１のフィルタ２４は、視野レンズ２０から入力された光の波長帯λ０のうち、波長λ１の励起光を透過する。第１のフィルタ２４は、波長λ１を含んでそれよりも短波長側および長波長側の含む波長帯を透過して他を遮断してもよい。この場合に第１のフィルタ２４は蛍光材料の吸収スペクトルの半値全幅程度の波長帯を透過してもよい。吸収スペクトルの半値全幅が波長λ１に対して±１０％の範囲であるときは、第１のフィルタ２４は当該範囲内の波長帯を透過してもよい。
【００１６】
ダイクロイックミラー２６は、設計波長を境にして短波長側を反射しかつ長波長側を透過する。当該ダイクロイックミラー２６においては、励起光の波長λ１と蛍光の波長λ２との間に設計波長が設計されている。これによりダイクロイックミラー２６は励起光を反射するとともに、蛍光を透過する。
【００１７】
第２のフィルタ２８は、波長λ１の励起光を遮りかつ波長λ２の蛍光を透過するバンドバスフィルタであ。第２のフィルタ２８は吸収フィルタと呼ばれることもある。ダイクロイックミラー２６および第２のフィルタ２８により、励起光から蛍光がより確実に分離される。
【００１８】
フィルタユニット３０は、試料５０の蛍光の波長λ２および当該蛍光を励起する励起光の波長λ１の組み合わせに基づいて、第１のフィルタ２４、ダイクロイックミラー２６および第２のフィルタ２８が設計される。フィルタユニット３０は顕微鏡１０の本体に対して取り外し可能に取り付けられている。よって、ひとつの顕微鏡１０に対して、観察に用いる蛍光材料に応じて、適したフィルタユニット３０を交換して用いることができる。
【００１９】
対物光学系３２は、観察用基材１００に対向して配される。対物光学系３２は、フィルタユニット３０から入力された励起光を集光して試料５０を照明する。さらに対物光学系３２は試料５０からの蛍光による像を拡大してフィルタユニット３０へ出力する。この場合に、本実施形態の観察用基材１００を用いない落射観察と共用する場合には、励起光の主光線の入射角は０度であることが好ましいが、傾いていてもよい。励起光の主光線の入射角を傾ける場合であっても、本実施形態において特に全反射は用いなくてよいのでブリュースター角または全反射の臨界角よりも小さくてよい。
【００２０】
支持台３４は、対物光学系３２の上方に近接して配される。支持台３４は、観察用基材１００を支持する。支持台３４において、対物光学系３２に対向する部分は開口部３５が設けられ、対物光学系３２と試料５０との間の光を透過する。
【００２１】
観察光学系３６は、フィルタユニット３０から入力された蛍光の像を撮像素子３８に結像する。撮像素子３８は結像された蛍光を電気信号に変換して撮像画像を生成する。撮像素子３８の一例は、蛍光の波長λ２を含む波長帯に感度を有する画素が二次元的に配列されたＣＣＤもしくはＣＭＯＳである。なお、図１には倒立型の顕微鏡１０を示したが、正立型であってもよい。
図２は観察用基材１００を上方から見た平面図である。図３は図２の観察用基材１００を矢印方向から見た断面図である。
【００２２】
観察用基材１００は、基材１０４と、基材１０４の一面に設けられた本体部１０２とを有する。基材１０４は、励起光に対して透明な材料で形成される。基材１０４の一例は、プレパラートに用いられるカバーガラスと同一の材料および形状である。
【００２３】
本体部１０２は、励起光に対して透明であって基材１０４とバックグラウンドよりも屈折率が高い、例えば水より屈折率が高い材料で形成される。本体部１０２の材料の一例はインジウム錫酸化物（ＩＴＯ）である。
【００２４】
基材１０４とは反対の側における本体部１０２の一面には、周期的に屈折率が変化する変化面領域１０３が設けられる。図２および図３に示す例において、変化面領域１０３は一方向に凸部１０６と凹部１０８とが交互に繰り返された形状を有する。凹部１０８には空気または水が充填されるので、凹部１０８が低屈折率領域をなし、凸部１０６が高屈折率領域をなす。凹部１０８は、例えば、平坦なＩＴＯ膜に対してマスクを介してドライエッチングによりＩＴＯを除去することにより形成される。
【００２５】
屈折率の変化のピッチＤは、励起光の波長λ１を変化面領域における有効屈折率ｎｅｆｆで割った長さλ１／ｎｅｆｆと等しい。なお、有効屈折率ｎｅｆｆは下記により求められる。
ｎｅｆｆ２＝ｎｈ２（Ｄ−ｄ）／Ｄ＋ｎｌ２ｄ／Ｄ
ここで、ｎｈは高屈折率領域の屈折率であり、ｎｌは低屈折率領域の屈折率であり、ｄは高屈折率領域の上記一方向に沿った長さである。
【００２６】
変化面領域１０３において、高屈折率領域の体積分率が０．２から０．８であることが好ましく、特に０．３から０．６であることが好ましい。なお、観察用基材１００のよう一方向にしか屈折率が変化していない場合には、体積分率は図３に示す断面における面積分率と等価となる。凹部１０８と凸部１０６との段差ｈは、励起光の波長λ１と上記有効屈折率ｎｅｆｆと高屈折率領域の体積分率とを設定することにより決定される。
【００２７】
図４は、観察用基材１００を用いて試料５０を観察する状態を模式的に示す。試料５０には波長λ１の励起光に対して波長λ２の蛍光を発する蛍光材料５４、５６が付加されている。試料５０の例は、抗体、酵素、レセプター、糖鎖、リガンド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー等である。試料５０の他の例は、組み換え蛍光タンパクを発現させた細胞、蛍光染色細胞、蛍光標識細胞、酵素標識抗体に浸漬した細胞、酵素反応により蛍光を呈する溶液に浸漬した細胞、細胞の生化学反応等により蛍光を示す溶液に浸漬した細胞等である。
【００２８】
倒立型の顕微鏡１０において、観察用基材１００の変化面領域１０３が上向きに配される。試料５０は、観察用基材１００の変化面領域１０３の上に載置される。試料５０は培養液、生理食塩水等とともに観察用基材１００上に配されてもよい。この場合には、凹部１０８に培養液が入り込むので、低屈折率ｎｌは当該培養液等の屈折率となる。なお、培養液等の屈折率は水の屈折率で近似してもよい。
【００２９】
観察用基材１００の基材１０４の側から、すなわち、変化面領域１０３とは反対側から波長λ１の励起光が入力される。この場合に、励起光は試料５０を一度に照射できる大きさの光束であることが好ましい。変化面領域１０３が図２から図４に示すように一方向に屈折率が変化している場合には、当該一方向に平行に電場が振動する直線偏光、すなわち図中の左右方向に電場が振動する直線偏光を入力することが好ましい。
【００３０】
本体部１０２に入力された励起光は、変化面領域１０３で回折される。回折は、０次方向のみならず、変化面領域１０３内にも生じる。ここで、０次方向の回折光は、入射角θが０度である場合には入射角と同じ方向に直進する進行波である。これに対し、変化面領域１０３内への回折光は、変化面領域１０３の上面に平行、すなわち、観察用基材１００の主平面に沿った方向に定在する定在波である。
【００３１】
変化面領域１０３のピッチＤが波長λ１を有効屈折率ｎｅｆｆで割った値λ´の整数倍（本実施形態においては１倍）に等しい場合には、当該定在波が変化面領域１０３のピッチＤの屈折率構造によって共振する。これにより、定在波の電場は局所的に増強される。さらに、当該定在波は、変化面領域１０３の上面から数十ｎｍだけ面外に染み出している。
【００３２】
よって、変化面領域１０３から数十ｎｍの範囲Ａに試料５０の蛍光材料５４が存在する場合に、定在波が蛍光材料５４と相互作用して蛍光を励起する。これにより、蛍光材料５４から波長λ２の蛍光が発せられて、観察用基材１００の基材１０４の側から、すなわち、変化面領域１０３とは反対側から観察光学系３６を介して観察される。これにより、試料５０の表面５２の近傍における蛍光を撮像素子３８で撮像して、二次元画像を生成することができる。
【００３３】
当該観察において、進行波も試料５０の蛍光材料５４、５６の蛍光を励起する。しかしながら観察系の焦点深度Ｂは浅く、十μｍ程度なので、表面５２から離れた蛍光材料５６からの蛍光は集光されずバックグラウンド光となる。ただし、本実施形態においては、表面５２の近傍の蛍光材料５４は、電場が増強された励起光により励起されているので蛍光の強度も増強される。従って、バックグラウンド光に対する表面５２での蛍光の強さであるＳ／Ｎ比が向上する。さらに、共焦点レーザ顕微鏡や全反射照明顕微鏡のように、高価で複雑な光学系を用いることなく、安価で簡便に試料５０の表面５２の二次元画像を生成することができる。
【００３４】
図２から図４の変化面領域１０３において、ピッチＤは、励起光の波長λ１を変化面領域１０３における有効屈折率ｎｅｆｆで割った長さλ´と等しい。これに限られず、ピッチＤは、励起光の波長λ１を変化面領域における有効屈折率ｎｅｆｆで割った長さλ´の整数倍であってもよい。上記整数は、小さいほど定在波の強度が大きいので、１から４であることが好ましい。ただし、ピッチ当該長さの整数倍±１０％の範囲内であってもよく、好ましくは±５％の範囲内であってもよい。この範囲は蛍光材料の吸収スペクトルの幅が広い場合にはより広くてもよい。また、言い換えると、励起光として用いる波長λ１が上記条件を満たすように、ピッチＤおよび有効屈折率ｎｅｆｆが設計される。
【００３５】
図５は、他の変化面領域１０７を有する観察用基材１１０の断面図である。図５において、図２から図４と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【００３６】
変化面領域１０７において、凹部１０９は基材１０４まで達している。すなわち、基材１０４は低屈折率領域側に露出している。この場合に、基材１０４は変化面領域１０７を保持する本体部を兼ねる。
【００３７】
図６は、さらに他の変化面領域１２１を有する観察用基材１２０を上方から見た平面図である。図７は、図６の観察用基材１２０を矢印方向から見た断面図である。図６および図７において、図２から図５と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【００３８】
図６および図７の変化面領域１２１において、屈折率の変化が二次元的に周期的に繰り返されている。変化面領域１２１は、高屈折率領域１２２に対して二次元的に周期的に配置された複数の穴１２４を有する。複数の穴１２４は低屈折率領域をなす。複数の穴１２４は、上記ピッチＤで格子状に配置されている。
【００３９】
上記観察用基材１２０によれば、縦方向および横方向に定在して増強された励起光を用いて、試料５０の表面を二次元的にイメージングして観察することができる。さらに、偏光を用いなくても、励起光のうち電場の振動方向が穴１２４の並び方向に一致する成分が当該方向に沿って定在する。よって、入射光学系２２を簡素化することができる。なお、図６において複数の穴１２４のそれぞれは丸穴であるが、これに限られず四角の穴等の他の形状であってもよい。また、複数の穴１２４は高屈折率領域１２２を貫通していてもよいし、貫通していなくてもよい。
【００４０】
図８は、さらに他の変化面領域１２７を有する観察用基材１２５の断面図である。図８において、図２から図７と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【００４１】
変化面領域１２７は、図７の変化面領域１２１とは凹凸の関係が逆になっている。すなわち、変化面領域１２７は、二次元的に周期的に配置された複数の柱状体１２８を有する。複数の柱状体１２８は高屈折率領域をなし、その周囲が低屈折率領域をなす。複数の柱状体１２８は、上記ピッチＤで格子状に配置されている。
【００４２】
これにより、縦方向および横方向に定在して増強された励起光を用いて、試料５０の表面を二次元的にイメージングして観察することができる。なお、複数の柱状体１２８のそれぞれは丸柱であるが、これに限られず四柱等の他の形状であってもよい。また、複数の柱状体１２８と基材１０４との間に平板状の高屈折率領域１２６があってもよいし、複数の柱状体１２８が基材１０４に直接設けられてもよい。
【００４３】
図９は、さらに他の変化面領域１４１を有する観察用基材１４０の平面図である。図９において、図２から図８と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【００４４】
変化面領域１４１において、高屈折率領域１４２に複数の穴１４４がハニカム状に配置されている。近接する穴１４４同士はピッチＤで配されている。これにより、近接する１４４が並ぶ３方向に定在して増強された励起光を用いて、試料５０の表面を二次元的にイメージングして観察することができる。なお、図７と図８の関係のように、凹凸が逆であってもよい。また、丸穴または丸柱に代えて、四角の穴、柱等であってもよいことも図７および図８と同様である。
【００４５】
図１０は、さらに他の変化面領域１５１を有する観察用基材１５０の斜視図である。図１０の変化面領域１５１は、ピットＤで同心円状に交互に配された高屈折率領域１５２と低屈折率領域１５４とを有する。
【００４６】
図１１は、さらに他の変化面領域１６１を有する観察用基材１６０の断面図である。図１１において、図２から図１０と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。変化面領域１６１における高屈折率領域１６２と低屈折率領域１６６の境界の形状は、図２から図１０のいずれであってもよい。
【００４７】
変化面領域１６１において、低屈折率領域１６６は、高屈折率領域１６２よりも屈折率の小さい材料の固体で充填されている。これにより、低屈折率領域１６６の表面と高屈折率領域１６２の表面とが平坦につながっている。低屈折率領域１６６に充填される材料の一例は、透明な樹脂である。これにより、試料５０を安定して載置することができる。
【００４８】
図２から図１１に記載の変化面領域１０３等はいずれも、高屈折率領域と低屈折率領域の境界が断面図で見て直線状であるが、境界の形状はこれに限られない。境界は曲線であってもよく、例えば断面図で見て正弦波形状であってもよい。
【００４９】
試料５０が細胞である場合に、図２から図１１に記載の高屈折率領域は、観察波長である可視光から近赤外域において透過性と屈折率が高く、細胞毒性が低く、細胞接着性が高いことが好ましく、さらに、自家発光が低いことが好ましい。当該高屈折率領域として、ＩＴＯの他、二酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、ダイアモンド、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、チタン酸ジルコニウム（ＺｒＴｉＯ４）、二酸化セリウム（ＣｅＯ２）、二酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）、五酸化ニオブ（Ｎｂ２Ｏ５）、酸化イットリウム（Ｙ２Ｏ３）、および酸化タングステン（ＷＯ３）、等の薄膜が用いられてもよい。
【００５０】
図２から図１１に記載の変化面領域１０３等は、電子線描画やフォトリソグラフィで高屈折率材料上にマスクパターンを描画したのち、ドライエッチングで高屈折率領域を除去し、低屈折率領域を形成する。この他に、ナノインプリント等の方法により、変化面領域１０３等を形成してもよい。
【００５１】
図１２は、さらに他の変化面領域１７２を有する観察用基材１７０の断面図である。変化面領域１７２は、基材１０４の一方の面に堆積され、互いに隣接した複数の微粒子１７４を有する。微粒子１７４は、酸化インジウムスズ、酸化チタン、酸化亜鉛、ダイアモンド、窒化ケイ素、炭化ケイ素、二酸化ジルコニウム，炭化ケイ素、チタン酸ジルコニウム、二酸化セリウム、二酸化ハフニウム、五酸化タンタル、五酸化ニオブ、酸化イットリウム、酸化タングステン、うちの少なくともいずれかの、可視光波長以下の直径の粒子である。特に、微粒子１７４の直径は、上記ピッチＤであることが好ましい。
【００５２】
変化面領域１７２においても、複数の微粒子１７４が配列されていることにより、励起光のうち、変化面領域１７２の上面に平行に回折した回折光が定在する。これにより、変化面領域１７２においても、増強された励起光を用いて、試料５０の表面を二次元的にイメージングして観察することができる。
【００５３】
図１３は、さらに他の変化面領域１８１を有する観察用基材１８０の平面図である。変化面領域１８１は等ピッチで屈折率が変化する領域の中に、離散的に、異なるピッチの屈折率の領域が存在する。
【００５４】
等ピッチの領域において、高屈折率領域１８２の中に格子状に低屈折率の複数の穴１８４が配される。穴１８４が配されるピッチは、励起光の波長λ１を変化面領域における有効屈折率ｎｅｆｆで割った長さλ´の整数倍から意図的にずらされた、非整数倍である。例えば、上記長さλ´の１．５倍である。図１３において、当該ピッチを１．５Ｋと表した。
【００５５】
上記等ピッチの領域の中に、穴１８４を設けない欠陥領域１８６がさらに配される。複数の穴１８４の並び方向における当該欠陥領域１８６の長さは、上記λ´の整数倍である。図１３の例においては、欠陥領域１８６の長さは等ピッチ１．５Ｋの２倍となるので３Ｋ、すなわち上記λ´の３倍となる。
【００５６】
上記変化面領域１８１によれば、等ピッチの領域はピッチが１．５Ｋなので、変化面領域１８１の面方向に沿った定在波は存在できない。これに対し、欠陥領域１８６の長さは３Ｋなので、定在波が存在することができる。よって、変化面領域１８１に入射した励起光のうち、変化面領域１８１の面方向に回折した回折光は欠陥領域１８６に局在し、電場が増強される。
【００５７】
欠陥領域１８６は、穴１８４を設けないことに代えて、特定の穴の径を大きくしたり、形状を変えた構造であってもよい。欠陥領域１８６は、隣接する複数の穴の径を大きくしたり、形状を変えた構造であってもよい。欠陥領域１８６は、隣接する複数の穴の位置を等ピッチからずらした構造であってもよい。
【００５８】
欠陥領域１８６に励起光を局在するには、欠陥領域１８６の周囲の等ピッチ領域が上記長さλ´の１０倍程度にわたって設けられていることが好ましい。言い換えると、隣接する欠陥領域１８６は、長さλ´の１０倍程度離れて設けられていることが好ましい。なお、複数の欠陥領域１８６は規則正しく配列していなくてもよい。
【００５９】
さらに、図２から図１３の観察用基材１００等における変化面領域１０３等の表面には、疎水性処理または親水性処理が施されてもよい。これにより試料５０が細胞等である場合の細胞の接着性を向上することができる。
【００６０】
さらに、図２から図１３の観察用基材１００等における変化面領域１０３等の表面には、プロタミン、ポリリジン、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンのうちの少なくともいずれかが吸着されていてもよい。プロタミンは細胞の接着性を静電的に阻害し、一方、ポリリジンには細胞の接着性を促進する機能があるので、これらを吸着させることにより、試料５０の一例である細胞を予め定められた位置に留まらせておくことができる。コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンもそれぞれ、これらのタンパクの特異的配列を認識して接着する細胞の接着性を促進することができる。
【００６１】
図２から図１３の観察用基材１００等のピッチＤ、有効屈折率ｎｅｆｆ等は、波長λ１の励起光を変化面領域１０３で増強するように選択される。これに代えて、ピッチＤ、有効屈折率ｎｅｆｆ等が、波長λ２の蛍光を変化面領域１０３で増強するように選択されてもよい。
【００６２】
また、図１から図１３において、試料５０の観察対象分子が蛍光標識からの蛍光で観察される。これに代えて、図１から図１３の実施形態を、観察対象分子をルシフェラーゼ標識とルシフェリン、または酵素標識抗体と化学発光基質を用いて検出する発光法に用いてもよい。この場合に、試料５０は、組み換えルシフェラーゼを発現させ、ルシフェリンに浸漬した細胞、酵素標識抗体で染色後、酵素化学発光基質溶液に浸漬した細胞等である。観察用基材１００等のピッチＤ、有効屈折率ｎｅｆｆ等は、発光の波長を上記λ１として、当該発光を変化面領域１０３等で増強するように選択される。これにより、試料５０における変化面領域１０３等の側の表面で生じる発光が変化面領域１０３等の中に回折して定在した定在波により増強された増強発光を、対物光学系３２を介して観察する。
【００６３】
発光法に図１から図１３の実施形態を用いることにより、変化面領域１０３から数十ｎｍの範囲Ａにおいて生じた試料５０の発光を、撮像素子３８で撮像して、二次元画像を生成することができる。当該発光が変化面領域１０３等で増強されるので、蛍光を用いる場合と同様にバックグラウンド発光に対する発光のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらに、発光法においては、励起光を用いなくてよいので、顕微鏡１０において光源１２、入射光学系２２およびフィルタユニット３０を省略することができる。
【００６４】
図１４は、本実施形態のウェルプレート１９０の斜視図である。ウェルプレート１９０は、矩形のフレーム１９２と、当該フレーム１９２内に配され、細胞等の試料５０を収容する複数の収容部１９４とを有する。図１４の例において収容部１９４は６つ配されるが、数はこれに限られない。
【００６５】
各収容部１９４の底面１９６には、図２から図１３の観察用基材１００等のいずれかが配される。この場合に、各収容部１９４に対して同一の波長λ１の励起光が増強される観察用基材１００等が配されてもよいし、互いに異なる波長の励起光が増強される観察用基材１００等が配されてもよい。また、底面１９６の全体に渡って観察用基材１００等が設けられてもよいし、底面１９６の一部、例えば中央部分に設けられてもよい。
【００６６】
実施例として、図５の観察用基材１００を、励起光の波長λ１を５４５ｎｍとして下記の通りに設計した。基材１０４の大きさは１８ｍｍ×１８ｍｍ×０．１５ｍｍ、材料はガラスを用いた。変化面領域１０７の奥行きは３００μｍとし、凸部１０６は厚さ４５ｎｍのＩＴＯ薄膜とした。凹部１０９は幅４５ｎｍ、深さ４５ｎｍの直線溝（すなわち、低屈折率領域は高屈折率領域を貫通）とした。さらにピッチＤは２８０ｎｍとし、変化領域１０７をピッチＤの周期で１５００回ほど繰り返し、全長４００μｍ程度の構造を得た。
【００６７】
上記直線溝に直交する方向に電場が振動する、波長４８０ｎｍの直線偏光を入力するシミュレーションをしたところ、変化面領域１０７において局所的に励起光の電場が約２倍に増強された結果が得られた。
【００６８】
さらに、図５の観察用基材１００を用いて、下記の通り観察を行った。観察の対象は細胞膜上のビンキュリンである。ビンキュリンは細胞膜直下５０ｎｍに存在し、細胞の運動や細胞による外部環境の力学特性のセンシングに重要な役割を果たすタンパク質である。
【００６９】
観察用基材１００を、３０分間紫外線で滅菌した後に、細胞の接着性を上げるため、フィブロネクチン（ベクトン・ディキンスン）をコートした。これにＳｗｉｓｓ３Ｔ３繊維芽細胞を播種し、一晩培養した後に、４％パラホルムアルデヒドで固定化した。さらに０．１％ＴｒｉｎｔｏｎＸ−１００で細胞膜を処理し、０．２％ゼラチンでブロッキングした後、マウス由来抗ビンキュリン抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５標識抗マウス抗体を順次反応させた。
【００７０】
これを、顕微鏡１０の支持台３４に載置し、波長５３５ｎｍから５５５ｎｍの励起光で蛍光を励起して、撮像素子３８の一例としての冷却ＣＣＤ（ビットランＢＬ−５１ＬＮ）で撮像した。撮像画像を図１５に示す。図１５におけるスケールバーの長さは２０μｍである。
【００７１】
比較例として、同じ観察の対象を共焦点レーザ顕微鏡（オリンパスＦＶ−１０００Ｄ）により撮影した。条件をあわせるため、一枚当たり０．８秒でスキャンした。撮像画像を図１６に示す。図１６におけるスケールバーの長さは１０μｍである。
【００７２】
図１５および図１６に示す通り、観察用基材１００を用いた落射蛍光の顕微鏡１０により、共焦点レーザ顕微鏡に比べて、同じ撮影時間でコントラストがより高い画像を得ることができた。
【００７３】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【００７４】
特許請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。特許請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。
【符号の説明】
【００７５】
１０  顕微鏡、１２  光源、１４  コレクタレンズ、１６  開口絞り、１８  視野絞り、２０  視野レンズ、２２  入射光学系、２４  第１のフィルタ、２６  ダイクロイックミラー、２８  第２のフィルタ、３０  フィルタユニット、３２  対物光学系、３４  支持台、３５  開口部、３６  観察光学系、３８  撮像素子、５０  試料、５２  表面、５４  蛍光材料、５６  蛍光材料、１００  観察用基材、１０２  本体部、１０３  変化面領域、１０４  基材、１０６  凸部、１０７  変化面領域、１０８  凹部、１０９  凹部、１１０  観察用基材、１２０  観察用基材、１２１  変化面領域、１２２  高屈折率領域、１２４  穴、１２５  観察用基材、１２６  高屈折率領域、１２７  変化面領域、１２８  柱状体、１４０  観察用基材、１４１  変化面領域、１４２  高屈折率領域、１４４  穴、１５０  観察用基材、１５１  変化面領域、１５２  高屈折率領域、１５４  低屈折率領域、１６０  観察用基材、１６１  変化面領域、１６２  高屈折率領域、１６６  低屈折率領域、１７０  観察用基材、１７２  変化面領域、１７４  微粒子、１８０  観察用基材、１８１  変化面領域、１８２  高屈折率領域、１８４  穴、１８６  欠陥領域、１９０  ウェルプレート、１９２  フレーム、１９４  収容部、１９６  底面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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