(57)【要約】【課題】ポストカラム誘導体化法を用いた液体クロマトグラフにおいて、カラム圧力の上限になるように流量を調整することにより、分析を高速化する。【解決手段】溶離液のグラジエント溶出プログラムに伴い変化する検出ベースライン変動を抑えるために、溶離液を送液する第１ポンプの流量と誘導体化試薬を送液する第２ポンプの流量をそのプログラムに連動して大なり小なり変化させる。ここでは、予め設定したプログラムによりカラム圧力の上限になるよう第１/第２ポンプの流量を変化させ、分析の高速化を図り分析注入サイクルごとに再現性よく反応環境条件を成立させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料のクロマトグラムを取得する分析装置であって、
溶離液を送液する第１のポンプと、
誘導体化試薬を送液する第２のポンプと、
前記第１のポンプから延設される第１の流路と、
前記第２のポンプから延設される第２の流路と、
前記第１の流路において、前記第１のポンプの後段に設けられ、分析対象の試料を導入するための試料導入部と、
前記第１の流路において、前記試料導入部の後段に設けられる前記試料の各成分を分離する分離機構と、
前記分離機構の後段に設けられ、前記第２の流路を前記第１の流路に接続し、前記試料と前記誘導化試薬を混合させるためのジョイント部と、
前記試料と前記誘導化試薬の反応を検出して検出信号を出力する検出器と、
前記分析装置の各構成部を制御し、前記検出信号に基づいてクロマトグラムを生成して出力するデータ処理装置と、を有し、
前記データ処理装置は、前記溶離液の流量を経時的に変動させて前記第１の流路に導入し、前記分離機構に掛かる液体の圧力を所定範囲に抑えるための、与えられた分析プログラムに基づいて、前記第１のポンプの送液動作を操作して前記溶離液の流量を制御し、前記検出信号から前記分離機構に掛かる圧力の経時変化を示す圧力プロファイルと、前記混合液のクロマトグラムを取得することを特徴とする分析装置。
【請求項２】
請求項１において、
前記与えられた分析プログラムは、前記誘導化試薬の流量が前記溶離液の流量の変動に対応して変動するように規定しており、
前記データ処理装置は、前記与えられた分析プログラムに基づいて、前記第２のポンプの送液動作を操作して前記誘導化試薬の流量を制御することを特徴とする分析装置。
【請求項３】
請求項１において、
前記データ処理装置は、前記溶離液及び前記誘導か試薬の流量を一定に保持して前記第１及び第２の流路のそれぞれに送出し、その結果前記分離機構に掛かる液体の圧力が変動することになる基準プログラムに基づいて、必要な基準圧力プロファイル及び基準クロマトグラムを取得し、前記基準圧力プロファイルで示される経時的な圧力値が前記所定範囲に収まるような流量を算出して、前記分析プログラムを生成することを特徴とする分析装置。
【請求項４】
請求項３において、
前記データ処理装置は、前記分離機構に掛けるべき上限圧力値を決定し、当該上限圧力値と前記基準圧力プロファイルで示される前記溶離液の各圧力値との比率を流量係数として求め、前記基準プログラムに示される一定の流量に前記流量係数を乗算することにより前記分析プログラムで規定される、前記溶離液の変動流量を決定することを特徴とする分析装置。
【請求項５】
請求項１において、
前記データ処理装置は、前記分析プログラムから得られる圧力プロファイルの変動の大きさが所定値以上の場合に、前記分析プログラムにおける前記溶離液の流量を変更し、前記分析プログラムを更新することを特徴とする分析装置。
【請求項６】
請求項５において、
前記データ処理装置は、前記分離機構に掛けるべき上限圧力値と前記分析プログラムから得られる圧力プロファイルで示される前記溶離液の各圧力値との比率を流量係数として求め、与えられた基準流量に前記流量係数を乗算することにより、前記分析プログラムにおける前記溶離液の変動流量を更新することを特徴とする分析装置。
【請求項７】
請求項１において、
前記分析プログラムは、前記溶離液の流量を段階的に変動させるか、或いは、前記溶離液の流量を傾斜変化させるプログラムであることを特徴とする分析装置。
【請求項８】
分析装置を用いて液体試料のクロマトグラムを取得する方法であって、
前記分析装置は、溶離液を送液する第１のポンプと、誘導体化試薬を送液する第２のポンプと、前記第１のポンプから延設される第１の流路と、前記第２のポンプから延設される第２の流路と、前記第１の流路において、前記第１のポンプの後段に設けられ、分析対象の試料を導入するための試料導入部と、前記第１の流路において、前記試料導入部の後段に設けられる前記試料の各成分を分離する分離機構と、前記分離機構の後段に設けられ、前記第２の流路を前記第１の流路に接続し、前記試料と前記誘導化試薬を混合させるためのジョイント部と、前記試料と前記誘導化試薬の反応を検出して検出信号を出力する検出器と、前記分析装置の各構成部を制御し、前記検出信号に基づいてクロマトグラムを生成して出力するデータ処理装置と、を有し、
前記方法は、
前記データ処理装置が、与えられた分析プログラムに基づいて、前記第１のポンプの送液動作を操作して前記溶離液の流量を制御するステップと、
前記データ処理装置が、前記検出信号から、前記分離機構に掛かる圧力の経時変化を示す圧力プロファイルと、前記混合液のクロマトグラムを取得するステップと、を有し、
前記分析プログラムは、前記溶離液の流量を経時的に変動させて前記第１の流路に導入し、前記分離機構に掛かる液体の圧力を所定範囲に抑えるためのプログラムであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８において、
前記与えられた分析プログラムは、前記誘導化試薬の流量が前記溶離液の流量の変動に対応して変動するように規定しており、
さらに、前記データ処理装置が、前記与えられた分析プログラムに基づいて、前記第２のポンプの送液動作を操作して前記誘導化試薬の流量を制御するステップを有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８において、
さらに、前記データ処理装置が、前記溶離液及び前記誘導か試薬の流量を一定に保持して前記第１及び第２の流路のそれぞれに送出し、その結果前記分離機構に掛かる液体の圧力が変動することになる基準プログラムに基づいて、必要な基準圧力プロファイル及び基準クロマトグラムを取得し、前記基準圧力プロファイルで示される経時的な圧力値が前記所定範囲に収まるような流量を算出して、前記分析プログラムを生成するステップを有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記分析プログラムを生成するステップにおいて、前記データ処理装置は、前記分離機構に掛けるべき上限圧力値を決定し、当該上限圧力値と前記基準圧力プロファイルで示される前記溶離液の各圧力値との比率を流量係数として求め、前記基準プログラムに示される一定の流量に前記流量係数を乗算することにより前記分析プログラムで規定される、前記溶離液の変動流量を決定することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項８において、
さらに、前記データ処理装置が、前記分析プログラムから得られる圧力プロファイルの変動の大きさが所定値以上の場合に、前記分析プログラムにおける前記溶離液の流量を変更し、前記分析プログラムを更新するステップを有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２において、
前記更新するステップにおいて、前記データ処理装置は、前記分離機構に掛けるべき上限圧力値と前記分析プログラムから得られる圧力プロファイルで示される前記溶離液の各圧力値との比率を流量係数として求め、与えられた基準流量に前記流量係数を乗算することにより、前記分析プログラムにおける前記溶離液の変動流量を更新することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項８において、
前記分析プログラムは、前記溶離液の流量を段階的に変動させるか、或いは、前記溶離液の流量を傾斜変化させるプログラムであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析装置、及びそれを用いて液体試料のクロマトグラムを取得する方法に関し、例えば、ポストカラム誘導体化法を用いた反応系を備えた液体クロマトグラム取得のための技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来からポストカラム誘導体化法を用いた液体クロマトグラフの代表的な装置としてアミノ酸分析計がある。例えば、特許文献１に述べられているように、従来のアミノ酸の検出方法によれば、緩衝液ポンプにより送液する分離カラムで分離したアミノ酸成分を含む緩衝液（溶離液）に、ニンヒドリン試薬を合流させ、その混合液を加熱した反応コイルまたは反応カラムを通すことによって反応させ、可視検出器で連続的に検出している。この反応コイルは、反応混合液を流す間、一定の反応時間を得るために、通常０.２５mmＩＤ ×７〜２０ｍの細くて長いテフロン（登録商標）チューブを使用する。反応カラムの場合は、１０から１００μｍのイナートなビーズを充填したカラム状の円筒を用いて反応時間を得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平４−１９４７５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ステップワイズ溶出法にせよ、リニアグラジエント溶出法にせよ、クロマトグラフィーの分離改善のため分離カラムに送り込む溶離液の液性，流量を変化させる場合が多々ある。液性は、ｐＨ，塩濃度，有機溶媒濃度、その他モディファイアの濃度などにより特徴付けられる。ポストカラム誘導体化法の場合、溶離液の液性、または流量が変化する場合、検出信号値が影響を受け、ベースラインが変動することが多い。これは、溶離液と誘導体化試薬の反応環境，反応時間などが変化することで、混合液の吸光度や蛍光強度などが影響を受けるため、吸光度検出や蛍光検出の信号値が変化するためである。
【０００５】
この点、従来の液体クロマトグラフによるサンプル検出においては、各溶離液の流量を一定に保持しているため、各溶離液の粘性の相違から分離カラムに掛かる圧力が変動する。一方、分離カラムには耐圧基準（最大耐圧）が定められており、この耐圧基準を超えた圧力で使用し続けると分離カラムが故障してしまうという危険性がある。このため、従来の検出方法では、様々な粘性の溶離液に対応するため、分離カラムに掛かる圧力に変動があったとしても耐圧基準を絶対に超えないように、耐圧基準よりもはるかに低い圧力に抑えられるように流量を制御している。
【０００６】
しかしながら、このような流量一定制御による検出では分析に長い時間を要しており、サンプル分析のための効率が悪くなってしまうという課題が存在する。
【０００７】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、ポストカラム誘導体化法を用いた液体クロマトグラフにおける分析時間を短縮し、分析効率向上に資するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（i）上記課題を解決するために、本発明では、溶離液のグラジエント溶出プログラムに伴い変化する検出ベースライン変動を抑えるために、誘導体化試薬を送液する第２のポンプの流量をそのプログラムに連動して大なり小なり変化させる。ここでは、予め設定したプログラムにより第２のポンプの流量を変化させ、分析注入サイクルごとに再現性よく反応環境条件を成立させる。例えば、反応混合液の吸光度が若干大きくなる場合、第２のポンプの流量をやや下げる。逆の場合は、流量をやや上げることになる。
【０００９】
また、第２のポンプで反応試薬および反応最適条件を作る緩衝液を混合送液することがある。このときは第２のポンプを変化させる方法以外に、例えば反応混合液の吸光度が若干大きくなる場合、緩衝液の混合比を増すこともできる。また逆に吸光度等検出信号が若干小さく変化する場合は反応試薬のほうの混合比率を増すことになる。
【００１０】
（ii）即ち、本発明による分析装置は、溶離液を送液する第１のポンプと、誘導体化試薬を送液する第２のポンプと、第１のポンプから延設される第１の流路と、第２のポンプから延設される第２の流路と、第１の流路において、第１のポンプの後段に設けられ、分析対象の試料を導入するための試料導入部と、第１の流路において、試料導入部の後段に設けられる試料の各成分を分離する分離機構と、分離機構の後段に設けられ、第２の流路を第１の流路に接続し、試料と誘導化試薬を混合させるためのジョイント部と、試料と誘導化試薬の反応を検出して検出信号を出力する検出器と、分析装置の各構成部を制御し、検出信号に基づいてクロマトグラムを生成して出力するデータ処理装置と、を有している。ここで、データ処理装置は、溶離液の流量を経時的に変動させて第１の流路に導入し、分離機構に掛かる液体の圧力を所定範囲に抑えるための、与えられた分析プログラムに従って、分析装置を制御する。具体的には、データ処理装置は、当該分析プログラムに基づいて、第１のポンプの送液動作を操作して溶離液の流量（変動量）を制御し、検出信号から分離機構に掛かる圧力の経時変化を示す圧力プロファイルと、混合液のクロマトグラムを取得する。
【００１１】
（iii）本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本発明の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
【００１２】
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本発明の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ポストカラム誘導体化法を用いた液体クロマトグラフにおける分析時間を短縮し、分析効率向上に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態による分析装置の概略構成を示す図である。
【図２】本発明の実施形態の全体動作を説明するためのフローチャートである。
【図３】グラジエント溶出プログラムの例を示す図である。
【図４】図２のプログラムの実行よって得られたクロマトグラムの例を示す図である。
【図５】図２のプログラムの実行によって得られた圧力プロファイルの例を示す図である。
【図６】改良されたグラジェント溶出プログラム（改良分析プログラム）の例を示す図である。
【図７】改良分析プログラムに従って取得したクロマトグラムの例を示す図である。
【図８】改良分析プログラムに従って取得した圧力プロファイルの例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施形態と実装例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
【００１６】
本実施形態では、当業者が本発明を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能で、本発明の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。
【００１７】
更に、本発明の実施形態は、後述されるように、汎用コンピュータ上で稼動するソフトウェアで実装しても良いし専用ハードウェア又はソフトウェアとハードウェアの組み合わせで実装しても良い。
【００１８】
以下では「データ処理装置（コンピュータ、或いはプロセッサ）」を主語（動作主体）として本発明の実施形態における各処理について説明を行うが、図６に従った動作を規定する処理プログラムを主語とした説明としてもよい。また、プログラムを主語として開示された処理は管理サーバ等の計算機、情報処理装置が行う処理としてもよい。プログラムの一部または全ては専用ハードウェアで実現してもよく、また、モジュール化されていても良い。各種プログラムはプログラム配布サーバや記憶メディアによって各計算機にインストールされてもよい。
【００１９】
＜アミノ酸分析装置の構成＞
図１は、本発明の実施形態によるアミノ酸分析装置の概略構成を示す図である。本実施形態ではアミノ酸分析装置を例にその動作等を説明するが、その他の分析装置であっても良い。
【００２０】
図１によれば、アミノ酸分析装置１００は、溶離液送液機構１１と、試料導入部３と、分離機構１２と、反応液送液機構１３と、Ｔ字ジョイント７と、反応装置８と、可視検出器９と、これらをつなぐ流路１４及び１５と、データ処理装置１０と、を有している。
【００２１】
溶離液送液機構１１は、複数の溶離液槽と溶離液を送液するためのポンプ１を有し、更に、ポンプ１内あるいは溶離液槽とポンプ１の間に溶離液層を選択するための電磁弁を有しており、データ処理装置１０からの信号あるいはポンプ１への直接入力により電磁弁を切り替え、選択された溶離液をポンプ１により送液する。なお、ポンプ１は、分析プログラム（例えば、図３や図６で示されるプログラム）に従って、指定された割合で溶離液を流路１４に流す。
【００２２】
試料導入部３は、分析対象としての試料（サンプル）を注入するための部位である。注入されるサンプルは様々な成分を含み、各成分のプロファイルが後述の様にクロマトグラムによって取得される。
【００２３】
溶離液は、試料導入部３を経由して分離機構１２へと送られる。分離機構１２はガードカラム５と分離カラム６から構成されており、試料導入部３より導入された試料はガードカラム５を通過し、分離カラム６で分離される。ガードカラム５は、導入された試料に含まれる不純物を除去し、分離カラム６を保護する役割を有している。また、分離カラム６は、試料に含まれる各成分をそれらの分子量に応じて分離する。つまり、分子量が小さければ分離カラム６から時間的に早く排出され、分子量が大きければ分離カラム６から排出されるのに分子量が小さい成分よりも時間が掛かる。
【００２４】
反応液送液機構１３は、複数の反応液層及び洗浄液層と、反応液（誘導体化試薬）または洗浄液を送液するポンプ２と、流路１５と、を有する。ポンプ２内あるいは反応液・洗浄液槽とポンプ２の間には電磁弁が設けられている。また、反応液送液機構１３は、データ処理装置１０からの信号あるいはポンプ２への直接入力により電磁弁を切り替え、選択された液をポンプ２により流路１５へと送液する。なお、ポンプ２も、ポンプ１と同様に、分析プログラム（例えば、図２や図６で示されるプログラム）に従って、指定された割合で溶離液を流路１４に流す。
【００２５】
Ｔ字ジョイント７は、分離カラム６と反応液送液機構１３との間に設けられ、分離カラム６で分離された各アミノ酸が反応液送液機構１３より送液される反応液とＴ字ジョイント７の部分において混合される。この混合液は、反応装置８を通過する際に反応し呈色して、可視検出器９により検出される。
【００２６】
可視検出器９は、検出信号をデータ処理装置１０に出力する。データ処理装置１０は入力した信号を処理してクロマトグラムおよびデータとして出力，記録，保存する。
【００２７】
なお、図１において、データ処理装置１０は、可視検出器９にのみ接続されているように描かれているが、実際には、溶離液送液機構１１、反応液送液機構１３、試料導入部３、分離機構１２、反応装置８、及び可視検出器９のそれぞれに接続され、それぞれに対して所定の制御処理を実行する。
【００２８】
＜分析処理の内容＞
図２は、本発明の実施形態による分析処理の全体動作を説明するためのフローチャートである。
（１）ステップＳ１
（i）データ処理装置１０は、入力された分析プログラム（図３参照：基準プログラムともいう）に従って、分析処理を開始する。ステップＳ１で入力される分析プログラムは、従来方法、つまり溶離液の流量が一定で、カラム圧力が変動する検出方法による処理を規定するプログラムである。本発明の実施形態では、まず溶離液の流量一定及びカラム圧力変動の状態で圧力プロファイル及びクロマトグラムを取得し、取得した情報に基づいて、溶離液の流量変動及びカラム圧力一定の状態でクロマトグラム及び圧力プロファイルを改めて取得する。一旦溶離液の流量設定値を決定し、カラム圧力が一定の状態（改良分析プログラム（図６参照）で分析ができる状態）に設定できると、時間の経過に伴ってカラム圧力の変動が発生し、カラムの耐圧基準に近づいた状態になるまで、当該改良プログラムで分析を続行することができる。カラムに対する圧力の経時変動が発生した場合には、改良分析プログラムを調整すれば良い。
【００２９】
（ii）分析プログラム（図３：グラジエントプログラム）について
図３のアミノ酸分析計のグラジエントプログラムにおいて、「％Ｂ１」〜「％Ｂ６」は、ポンプ１が送液する各溶離液の比率、「流量１」はポンプ１が送液する流量を示す。また、「％Ｒ１」〜「％Ｒ３」は、ポンプ２が送液する各反応液の比率、「流量２」はポンプ２が送液する流量を示す。そして、各時間に対応した数値（つまり、１００）は、対応する溶離液を供給する割合を示している。つまり、０．０分から３．０分までは溶離液Ｂ１のみが供給され、３．１分から６．９分までは溶離液Ｂ２のみが供給される。その他の溶離液Ｂ３乃至Ｂ６も同様に図３のスケジュールに従って供給される。そして、各溶離液を供給する際の流量は、流量１に示されるように、０．４００ｍｌ／ｍｉｎで一定であり、そのときの温度は５７℃に保たれている。なお、分析プログラム中、空白部分は同じ量を供給することを意味している。
【００３０】
また、図３において、Ｒ１乃至Ｒ３は用意された反応液或いは洗浄液に対応する。そして、反応液Ｒ１とＲ２の割合を５０：５０にして、０．０分から３２．０分まで供給する。３２．１分から３７．０分までは、反応液Ｒ３のみが供給され、３７．１分から５３．０分までは再度Ｒ１とＲ２の割合を５０：５０にして供給する。なお、反応液の流量は、流量２に示されているように、０．３５０で一定であり、溶離液と同様に、反応液の温度は５７℃に保たれている。
【００３１】
（２）ステップＳ２
データ処理装置１０は、入力された分析プログラム（図３）に従って、クロマトグラム（Ｓ２)を取得する。取得されるクロマトグラムは図４に示されるようなものである。また、データ処理装置１０は、ステップＳ２において、取得したクロマトグラムから、各成分のピークの出現順序を特定し、その情報を図示しないメモリに一時的に格納しておく。
【００３２】
（３）ステップＳ３
データ処理装置１０は、さらに、圧力プロファイル（Ｓ３)を取得する。取得される圧力プロファイルは図５に示されるようなものである。
【００３３】
図５からも分かるように、アミノ酸分析計の分析で使用する各溶離液(Ｂ１〜Ｂ６)の粘度の影響により、溶離液を送出するポンプ１の圧力は、送出する溶離液の種類によって変動している（グラジエントプログラム時間帯で圧力値が変動）。ただし、前述の様に、各溶離液の流量は一定である。一方、反応液を送出するポンプ２の圧力は一定に保たれている（流量も一定）。
【００３４】
なお、図２では、ステップＳ２が先に実行され、その後ステップＳ３が実行されているが、それらを実行する順番は逆であっても良い。
【００３５】
（４）ステップＳ４
データ処理装置１０は、ステップＳ３で取得した圧力プロファイル（図５）と分離カラム６の耐圧基準（最大値）とを比較分析し、上限圧力設定値を決定する。つまり、図５に示される、取得した圧力プロファイルの最大圧力値が、分離カラム６の耐圧基準の例えば８０％程度になるように、上限圧力設定値が決定される。
【００３６】
（５）ステップＳ５
データ処理装置１０は、圧力値と流量は比例関係にあるということに基づき、ステップＳ３で取得した圧力プロファイルを観察し、各時間における圧力値とステップＳ４で設定した上限圧力値との差を求め、ステップＳ１で入力した分析プログラムの各時間帯における流量係数値を算出する。この算出された流量係数値は、改良分析プログラムを生成するために用いられる。流量係数値は、例えば、ｆ＝Ｐlimit／Ｐobservedによって求められる。ここで、ｆは流量係数を表し、Ｐlimitは圧力上限値を、Ｐobservedは圧力プロファイルによって与えられる実測値を示していている。
【００３７】
尚、注入ごとに流量係数を乗じていたのでは保持時間がばらついてしまうので一連の分析シーケンスでは一定の流量係数を用いることが望ましい。この場合、常に圧力上限値を超えないようにするために、圧力上限値の８０％（９０％であっても良い。割合は適宜設定変更可能である）になる流量係数を用いても良い。
【００３８】
（６）ステップＳ６
（i）処理内容
データ処理装置１０は、ステップＳ５で算出した流量係数値を流量値に換算する。換算式として、例えば、ＦNEW＝ｆ×Ｆoriginalを用いることができる。ここで、ＦNEW＝は改良分析プログラムで用いられる新しい流量値を示し、ｆは上記流量係数を示し、Ｆoriginalは分析プログラム（図３）で用いた流量値を示している。
また、ポンプ２側の反応液についての流量もステップＳ５で算出した流量係数値を用いて変更される。
【００３９】
（ii）改良分析プログラムについて
ステップ６を実行することにより、改良分析プログラムが生成される（図６参照）。なお、改良分析プログラム中、空白部分は同じ量を供給することを意味している。
【００４０】
図６において、Ｂ１乃至Ｂ６は用意された溶離液に対応する。そして、各時間に対応した数値（つまり、１００）は、対応する溶離液を供給する割合を示している。つまり、０．０分から３．０分までは溶離液Ｂ１のみが供給され、３．１分から６．９分までは溶離液Ｂ２のみが供給される。その他の溶離液Ｂ３乃至Ｂ６も同様に図６のスケジュールに従って供給される。そして、各溶離液を供給する際の流量は、流量１に示されるように、０．０分から６．９分までは０．４５０ｍｌ／ｍｉｎに設定され、７．０分から１４．９分までは０．５７０ｍｌ／ｍｉｎに設定される。さらに、２７．０分以降は０．６４０ｍｌ／ｍｉｎに設定される。このときの温度は５７℃に保たれている。
【００４１】
また、図６において、Ｒ１乃至Ｒ３は用意された反応液或いは洗浄液に対応する。そして、反応液Ｒ１とＲ２の割合を５０：５０にして、０．０分から３２．０分まで供給する。３２．１分から３７．０分までは、反応液Ｒ３のみが供給され、３７．１分から５３．０分までは再度Ｒ１とＲ２の割合を５０：５０にして供給する。なお、反応液の流量は、流量２に示されているように、０．０分から６．９分までは０．４００ｍｌ／ｍｉｎに設定され、７．０分から１４．９分までは０．５００ｍｌ／ｍｉｎに設定され、１５．０分以降は０．５６０ｍｌ／ｍｉｎに設定される。また、溶離液と同様に、反応液の温度は５７℃に保たれている。
【００４２】
図６では、一番左端の時刻において、各流量、各混合比がプロットされている。そして、それらのデータ点を折線グラフとして接続し、設定タイムプログラム（改良分析プログラム）としても良い。また、流量値の設定は階段状に設定しても良いし、所定の時間を過ぎた時点（例えば、３．１分を過ぎた時点）から徐々に次の設定値（例えば、０．５７０ｍｌ／ｍｉｎ）に向けて線形的に変化させても良い。どの時点から変化させるかについては、圧力プロファイル（図３）の領域１乃至３におけるプロファイルの変化時点に基づいて決定することができる。また、どの程度の変化率にするかは、領域１乃至３における変化量（傾き）に基づいて決定しても良い。但し、この場合でも温度だけは折線グラフ化せず変化する時刻において階段状に急激に立上げ（ないしは急激に立下げ）ることとする。図６では、温度を一定に保つ標準分析法を想定しているが、アミノ酸分析のその他の方法（生体液分析法、加水分解物分析法など）や、温度を所定時間ごとに（検出する成分に合わせて）変化させる場合に対応させるためである。
【００４３】
（７）ステップＳ７
データ処理装置１０は、ステップ６で求めた改良分析プログラムに従って、分析を開始する。ステップＳ７では、クロマトグラムが取得される。
【００４４】
図７は、新たに取得されるクロマトグラムを示している。図７からも分かるように、得られるグラフの形状は図４で示されるグラフの形状と時間スケール以外は同じであるが、各成分のピークが出現する時間が図４とは異なっている。つまり、分析時間が短縮されている。なお、各成分のピークの出現順序は図４のクロマトグラムと同一であるので、一時的に保持している各成分のピーク情報に基づいて、各ピークに対応する成分を特定することができる。
【００４５】
図７において、ピーク（頂点）の出現時刻（保持時間という）は、各注入毎に数秒程度はばらつく。この変動を吸収する為に数十秒程度の時間幅（タイムウィンドウ）を設定することが一般的である。本発明の実施形態では、圧力を上昇近傍にするように流量設定を切換える。なお、たまたまこの流量切換点にピークが出現すると保持時間が著しく変化することがある。これを防止するために、ピークが出現する時間帯を避けて流量切換することが肝要である。
【００４６】
（８）ステップＳ８
データ処理装置１０は、圧力プロファイル（図８）を取得する。
図８に示されるように、改良分析プログラムによって得られる圧力プロファイルは、ポンプ１及び２共にほぼ一定となっている。なお、ポンプ２の圧力は、ポンプの直後（液体吐出側）に位置するセンサにより検出している。また、ポンプ２の流量を変えているのに圧力が変動しない理由は、ポンプ２では、流路上の流体の量に対する割合はごくわずかな量である反応液を供給しているため、この流量を変化させても流路内の圧力に大きな変化は生じないためである。
【００４７】
（９）ステップＳ９
上述のように、理想的には、圧力上限８０％近傍に分析圧力がなるようにグラジェント溶出プログラムを調節する。また、ポンプ２の流量はポンプ１の流量にほぼ比例するように設定することで移動相と反応液の混合比率を一定にすることが出来る。ただし、分析中の圧力プロファイルは、流量、移動相粘度、カラム温度などの要因変化によって変動することがある。この変動に適応するために、ステップＳ９及びＳ１０が実行される。
【００４８】
データ処理装置１０は、ステップＳ８で取得した圧力プロファイルで与えられる圧力値が、ステップＳ４で決定した圧力上限値の９０％以上になっているか判定する。圧力プロファイルで与えられる圧力値が圧力上限値の９０％以内に収まっていれば、処理はステップＳ７に移行し、同様の条件（同じ改良分析プログラム）を用いて分析が継続される。一方、圧力プロファイルで与えられる圧力値が圧力上限値の９０％以上となっている場合には、処理はステップＳ１０に移行する。
【００４９】
（１０）ステップＳ１０
データ処理装置１０は、ステップＳ８で得られた圧力プロファイルから与えられる現在の圧力値を用いて、改めて流量係数値を計算する。
【００５０】
そして、処理は、再度ステップＳ６に移行し、流量設定値が更新され、新たな改良分析プログラムが生成される。処理内容はステップＳ６と同様なので省略する。
【００５１】
（１１）その他
同じ条件（同じ溶離液及び反応液を用いる）、及び同じ改良プログラムを用いて分析する場合には、ステップＳ１において入力する分析プログラムを改良分析プログラムにし、ステップＳ２乃至Ｓ６の処理を省略することができる。なお、この場合には、ステップＳ１０の処理にステップＳ６の処理を含めるようにする必要がある。
【００５２】
＜その他＞
（i）本実施形態では、改良分析プログラムが分析装置に与えられる。この改良分析プログラムは、基準プログラムに基づいて作成されるが、分析処理の一連の流れの中で作成しても良いし、事前に作成しておいて実際の分析時に与えるようにしても良い。この改良分析プログラムは、溶離液の流量を経時的に変動（ステップワイズ或いは暫時的に変動）させて第１の流路に導入し、分離機構に掛かる液体の圧力を所定範囲に抑える処理を実現するプログラムである。分析装置におけるデータ処理装置（コンピュータ、プロセッサ等ともいう）は、この改良分析プログラムに基づいて、第１のポンプの送液動作を操作して溶離液の流量を制御し、反応装置からの検出信号を用いて、分離機構に掛かる圧力の経時変化を示す圧力プロファイルと、混合液のクロマトグラムを取得する。このようにすることにより、圧力プロファイルをほぼ一定に制御し、分析結果を従来（流量一定、圧力変動の場合）よりも短時間で取得することができるようになる。
【００５３】
また、改良分析プログラムでは、反応液（誘導化試薬）の流量が、溶離液の流量の変動に対応して変動するように規定されている。従って、改良分析プログラムに従って、第２のポンプの送液動作が操作され反応液（誘導化試薬）の流量も制御される。このようにすることにより、反応液と溶離液との混合比率を一定に保つことができるようになり、ベースラインの安定化を図ることができる。ここで、ベースラインとは、クロマトグラムのベースラインのことを意味する（図４及び図７におけるピーク以外のＹ軸がゼロのラインのことを示している）。また、「安定化」とは、ベースライン上のノイズを抑えてフラットな状態を示すことを意味している。
【００５４】
なお、改良分析プログラムは、次のように生成される。つまり、溶離液及び誘導か試薬の流量を一定に保持して第１及び第２の流路のそれぞれに送出し、その結果、分離機構に掛かる液体の圧力が変動することになる基準プログラムに基づいて、必要な基準圧力プロファイル及び基準クロマトグラムを取得する。そして、基準圧力プロファイルで示される経時的な圧力値が所定範囲に収まるような（圧力プロファイルが図８に示されるようにほぼ一定となるように）流量を算出して、改良分析プログラムとする。さらに、具体的には、まず、分離機構に掛けるべき上限圧力値を決定し、当該上限圧力値と基準圧力プロファイルで示される溶離液の各圧力値との比率を流量係数として求める。また、基準プログラムに示される一定の流量に流量係数を乗算することにより改良分析プログラムで規定される、溶離液の変動流量を決定する。このようにすることにより、分離機構（カラム）へのダメージの低減を保証した改良分析プログラムを生成することができる。
【００５５】
さらに、本実施形態では、一旦改良分析プログラムを用いて分析を開始しても、処理中に圧力プロファイルが変動する場合（ほぼ一定の状態を保てなくなった場合）、改良分析プログラムにおける溶離液の流量を変更し、当該改良分析プログラムを更新する。より具体的には、分離機構に掛けるべき上限圧力値と改良分析プログラムから得られる圧力プロファイルで示される溶離液の各圧力値との比率を流量係数として求める。そして、与えられた基準流量に流量係数を乗算することにより、改良分析プログラムにおける溶離液の変動流量を更新する。このようにすることにより、分析を重ねたことによって生じた微小な変動を修正することができるので、より正確な分析結果を出すことを保証することができる。
【００５６】
（ii）本発明は、実施形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードによっても実現できる。この場合、プログラムコードを記録した記憶媒体をシステム或は装置に提供し、そのシステム或は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出す。この場合、記憶媒体から読み出されたプログラムコード自体が前述した実施形態の機能を実現することになり、そのプログラムコード自体、及びそれを記憶した記憶媒体は本発明を構成することになる。このようなプログラムコードを供給するための記憶媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−Ｒ、磁気テープ、不揮発性のメモリカード、ＲＯＭなどが用いられる。
【００５７】
また、プログラムコードの指示に基づき、コンピュータ上で稼動しているＯＳ（オペレーティングシステム）などが実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によって前述した実施の形態の機能が実現されるようにしてもよい。さらに、記憶媒体から読み出されたプログラムコードが、コンピュータ上のメモリに書きこまれた後、そのプログラムコードの指示に基づき、コンピュータのＣＰＵなどが実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によって前述した実施の形態の機能が実現されるようにしてもよい。
【００５８】
さらに、実施の形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードを、ネットワークを介して配信することにより、それをシステム又は装置のハードディスクやメモリ等の記憶手段又はＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−Ｒ等の記憶媒体に格納し、使用時にそのシステム又は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が当該記憶手段や当該記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出して実行するようにしても良い。
【００５９】
最後に、ここで述べたプロセス及び技術は本質的に如何なる特定の装置に関連することはなく、コンポーネントの如何なる相応しい組み合わせによってでも実装できることを理解する必要がある。更に、汎用目的の多様なタイプのデバイスがここで記述した教授に従って使用可能である。ここで述べた方法のステップを実行するのに、専用の装置を構築するのが有益であることが判るかもしれない。また、実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。本発明は、具体例に関連して記述したが、これらは、すべての観点に於いて限定の為ではなく説明の為である。本分野にスキルのある者には、本発明を実施するのに相応しいハードウェア、ソフトウェア、及びファームウエアの多数の組み合わせがあることが解るであろう。例えば、記述したソフトウェアは、アセンブラ、Ｃ／Ｃ＋＋、ｐｅｒｌ、Ｓｈｅｌｌ、ＰＨＰ、Ｊａｖａ（登録商標）等の広範囲のプログラム又はスクリプト言語で実装できる。
【００６０】
さらに、上述の実施形態において、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。全ての構成が相互に接続されていても良い。
なお、明細書と具体例は典型的なものに過ぎず、本発明の範囲と思想は後続する請求範囲で示される。
【符号の説明】
【００６１】
１，２…ポンプ、３…試料導入部、５…ガードカラム、６…分離カラム、７…Ｔ字ジョイント、８…反応装置、９…可視検出器、１０…データ処理装置、１００…アミノ酸分析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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