(57)【要約】【課題】動物由来ＤＮＡを検出可能なプライマーを効率よく設計して取得するための方法を提供すること、ならびにこのような方法によって得られた特異的かつ高感度検出可能なプライマーを提供すること。【解決手段】所定の配列のプライマーの組み合わせであるブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対、ならびに、試料中の特定の動物種または群由来の成分を検出する方法であって、所定のプライマー対を用い、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含み、特定の動物種または群が、ブタである、方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号９の配列からなるプライマーと配列表の配列番号１０の配列からなるプライマーとの組み合わせ；配列表の配列番号１１の配列からなるプライマーと配列表の配列番号１２の配列からなるプライマーとの組み合わせ；配列表の配列番号１３の配列からなるプライマーと配列表の配列番号１４の配列からなるプライマーとの組み合わせ；または配列表の配列番号１５の配列からなるプライマーと配列表の配列番号１６の配列からなるプライマーとの組み合わせである、ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対。
【請求項２】
試料中の特定の動物種または群由来の成分を検出する方法であって、請求項１に記載のプライマー対を用い、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含み、特定の動物種または群が、ブタである、方法。
【請求項３】
前記試料が、生肉、生魚、肉加工食品、魚加工食品、肉加工品含有食品、魚加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、魚粉、フィッシュソリュブル、だし粕、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、ペットフード、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物由来ＤＮＡ検出用プライマー配列、ならびに該プライマー配列を効率よく設計して取得するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、牛海綿状脳症 (ＢＳＥ) の牛に由来する肉骨粉が飼料に添加され、その飼料を与えられた牛がＢＳＥに罹患し、問題となっている。そして、ＢＳＥと類似する病気が種々の家畜にも存在する可能性が指摘されている。そこで、ＢＳＥの発生以来、先端技術を用いた鋭敏な動物由来のＤＮＡの検出技術の開発が必要となっており、特に行政上の緊急対応事項となっている。さらに、昨今、肉の種類などの偽装も問題となっており、食肉加工品の表示などの真偽を容易確認するための手段も求められている。
【０００３】
動物由来のＤＮＡの検出については、従来、免疫学的手法、ならびに核遺伝子を用いる遺伝子検出手法が用いられてきた。免疫学的手法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法が挙げられる。核遺伝子を用いる遺伝子検出手法としては、例えば、ＰＣＲ法が挙げられる。しかし、検出対象試料は、加熱処理されているものが多いため、タンパク質の変性や核酸の断片化が生じている可能性が高いこと、および牛用飼料には植物由来成分が多いため、動物由来成分についての微量分析が必要であることなど、現在行われている動物由来ＤＮＡ検出方法には、多くの問題点がある。このように加熱処理後の試料についても実施可能な、感度が高くかつ有効な検出方法の開発が急務である。
【０００４】
これまでに、動物ミトコンドリアゲノムに存在するＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子（ａｔｐ８遺伝子）に由来する動物特異的ＤＮＡ配列をプライマー対として用いる動物種の検出方法が開発されている（特許文献１および２）。これらは、ａｔｐ８遺伝子の相同配列が植物（イネ）ミトコンドリアゲノムに存在しないことを利用し、植物系の飼料中より微量の動物遺伝子を効率的に検出することができる。また、他のグループも、肉種判別や肉骨粉の検出に使用できるプライマーを開発している（非特許文献１および２）。
【０００５】
これらのプライマーは、増幅すべきＤＮＡの位置、プライマーの長さや塩基などについての膨大な数の組み合わせについて個々に特異性や検出感度を確認するという、試行錯誤の末に開発されたものである。したがって、特定の範囲の動物種を検出対象とした特異的かつ高感度な新規なプライマーを得ることは容易なことではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１６４２８７号公報
【特許文献２】特開２００５−３２３５８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lahiff, S.ら、Mol. Cell Probes，15巻，27-35頁，2001年
【非特許文献２】Tartaglia, M.ら、J. Food Prot.，61巻，513-518頁，1998年
【非特許文献３】Rice, P.ら、Trends in Genetics，16巻，276-277頁，2000年
【非特許文献４】Imaizumiら、Int. J. Legal Med.，121巻，184-191頁，2007年
【非特許文献５】Dalmasso, A.ら、Mol. Cell Probes，18巻，81-87頁，2004年
【非特許文献６】Marco T.ら，J. Anim. Sci.，76巻，2207-2208頁，1998年
【非特許文献７】Jane M.ら，Environ. Sci. Technol.，41巻，3277-3283頁，2007年
【非特許文献８】Shinoda, N.ら、J. Food Prot.，71巻，2257-2262頁，2008年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、動物由来ＤＮＡを検出可能なプライマーを効率よく設計して取得するための方法を提供すること、ならびにこのような方法によって得られた特異的かつ高感度検出可能なプライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、特定の動物種または群由来のＤＮＡ検出用プライマー配列を取得するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）ＤＮＡ配列の検索対象領域を決定する工程；
（ｂ）該領域について該特定の動物種または群のＤＮＡ配列のリストを取得し、該特定の動物種または群のＤＮＡ配列をマルチプルアラインメントする工程；
（ｃ）該マルチプルアラインメントしたＤＮＡ配列から、コンセンサス配列を得る工程；
（ｄ）該領域について該特定の動物種または群とは異なる動植物種または群のＤＮＡ配列のリストを取得し、該異なる動植物種または群のＤＮＡ配列と該コンセンサス配列とをマルチプルアラインメントする工程；
（ｅ）該工程（ｄ）でマルチプルアラインメントしたＤＮＡ配列における任意の塩基長の範囲内で縦列間の塩基を比較して、該範囲のコンセンサス配列をスコアリングする工程であって、該スコアリングが、該コンセンサス配列と異なる塩基について、該範囲の５’または３’末端からの距離、ギャップの有無、および塩基の種類に応じて設定された重みを加算して行われる、工程；
（ｆ）該工程（ｅ）でスコアリングされたコンセンサス配列から、スコアが高いコンセンサス配列を選択する工程；
（ｇ）該工程（ｆ）で選択されたコンセンサス配列の塩基を修正する工程であって、該修正が、該範囲のコンセンサス配列のＴｍ値が任意の温度になるように塩基長を調節し、そして該調節されたコンセンサス配列でホモダイマーを形成しないように塩基を置換することである、工程；
（ｈ）該修正されたコンセンサス配列について、該領域における該コンセンサス配列間の距離が適切な塩基長になるように、対とすべきコンセンサス配列を選択する工程；および
（ｉ）該選択されたコンセンサス配列の対について、特異性および検出感度を確認する工程；
を含む。
【００１０】
１つの実施態様では、上記５’または３’末端からの距離に応じて設定された上記重みは、５’または３’末端側ほど重い。
【００１１】
他の実施態様では、上記ギャップの有無に応じて設定された上記重みは、ギャップ差の絶対値が大きいほど重い。
【００１２】
さらなる実施態様では、上記塩基の種類に応じて設定された上記重みは、該コンセンサス配列中の塩基とミスアニーリングを生じにくい塩基であるほど重い。
【００１３】
ある実施態様では、上記検索対象領域は、ミトコンドリアＤＮＡである。
【００１４】
特定の実施態様では、上記特定の動物種または群は、反芻動物、ブタ、クジラ・イルカ類、シカ、ヒツジまたはヤギである。
【００１５】
ある実施態様では、上記工程（ｂ）から（ｄ）は、配列解析プログラムＥＭＢＯＳＳ（The European Molecular Biology Open Software Suite）を用いて行われる。
【００１６】
ある実施態様では、上記工程（ｂ）から（ｇ）は、一連のプログラムとして自動的に行われ得る。
【００１７】
本発明はまた、配列表の配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列との組み合わせ；配列表の配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列との組み合わせ；配列表の配列番号５の配列と配列表の配列番号６の配列との組み合わせ；または配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号８の配列との組み合わせである、反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対を提供する。
【００１８】
本発明はまた、配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１０の配列との組み合わせ；配列表の配列番号１１の配列と配列表の配列番号１２の配列との組み合わせ；配列表の配列番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列との組み合わせ；または配列表の配列番号１５の配列と配列表の配列番号１６の配列との組み合わせである、ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対を提供する。
【００１９】
本発明はまた、配列表の配列番号５２の配列と配列表の配列番号５３の配列との組み合わせ；または配列表の配列番号５２の配列と配列表の配列番号５４の配列との組み合わせである、クジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマー対を提供する。
【００２０】
本発明はまた、配列表の配列番号５５の配列と配列表の配列番号５６の配列との組み合わせである、シカ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列表の配列番号５７の配列と配列表の配列番号５８の配列との組み合わせである、ヒツジ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対を提供する。
【００２２】
本発明はまた、配列表の配列番号５９の配列と配列表の配列番号６０の配列との組み合わせである、ヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、試料中の特定の動物種または群由来の成分を検出する方法を提供し、上記のいずれかのプライマー対を用い、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含み、特定の動物種または群が、反芻動物、ブタ、クジラ・イルカ類、シカ、ヒツジまたはヤギである。
【００２４】
ある実施態様では、上記試料は、生肉、生魚、肉加工食品、魚加工食品、肉加工品含有食品、魚加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、魚粉、フィッシュソリュブル、だし粕、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、ペットフード、および飼料添加物からなる群より選択される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の方法によれば、任意の範囲の動物種または群（グループ）に由来するＤＮＡを検出するためのプライマーを、より効率的に設計して取得することができる。本発明の方法によって、非常に高感度の反芻動物、ブタ、クジラ・イルカ類、シカ、ヒツジまたはヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対が提供される。例えば、本発明の方法により取得された反芻動物、ブタ、クジラ・イルカ類、シカ、ヒツジまたはヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対は、飼料中の微量の反芻動物、ブタ、クジラ・イルカ類、シカ、ヒツジまたはヤギ由来の肉骨粉を高感度で検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペア１：５Ｄ２（配列番号１）と３Ｄ５（配列番号２）との組み合わせ）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図２】反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペア２：５Ｋ４（配列番号３）と３Ｋ４（配列番号４）との組み合わせ）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図３】反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペア１：５Ｄ２（配列番号１）と３Ｄ５（配列番号２）との組み合わせ）を用いて、各種反芻動物由来のＤＮＡの濃度を変えてＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図４】反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペア１：５Ｄ２（配列番号１）と３Ｄ５（配列番号２）との組み合わせ）を用いて、種々の飼料についてＤＮＡ検出を行った結果を示す電気泳動写真である。
【図５】反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペア１：５Ｄ２（配列番号１）と３Ｄ５（配列番号２）との組み合わせ）を用いて、種々の濃度のウシ肉骨粉を含む配合飼料についてＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図６】ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペアＩ：PigATP6-5.3（配列番号９）とPigATP6-3.9（配列番号１０）との組み合わせ；およびペアＩＶ：PIG 5J（配列番号１５）とPIG 3J（配列番号１６）との組み合わせ）を用いて、各品種のブタ由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図７】ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペアＩ：PigATP6-5.3（配列番号９）とPigATP6-3.9（配列番号１０）との組み合わせ）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図８】ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペアＩ：PigATP6-5.3（配列番号９）とPigATP6-3.9（配列番号１０）との組み合わせ）を用いて、ブタ由来のＤＮＡの濃度を変えてＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図９】ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペアＩ：PigATP6-5.3（配列番号９）とPigATP6-3.9（配列番号１０）との組み合わせ）を用いて、種々の濃度のブタ肉骨粉を含む配合飼料についてＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図１０】クジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペアＩ：whale51（配列番号５２）とwhale31（配列番号５３）との組み合わせ；およびペアII：whale51（配列番号５２）とwhale32（配列番号５４）との組み合わせ）を用いて、各品種のクジラ・イルカ類由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図１１】クジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペアＩ：whale51（配列番号５２）とwhale31（配列番号５３）との組み合わせ；およびペアII：whale51（配列番号５２）とwhale32（配列番号５４）との組み合わせ）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図１２】シカ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（deer54（配列番号５５）とdeer33（配列番号５６）との組み合わせ）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図１３】ヒツジ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（sheep53（配列番号５７）とsheep33（配列番号５８）との組み合わせ）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【図１４】ヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（goat55（配列番号５９）とgoat35（配列番号６０）との組み合わせ）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
試料中の特定の動物種または群由来の成分を検出するために、それぞれの動物種または群に特異的なＤＮＡ配列を検出する方法が行われる。このような方法としては、サザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などが挙げられるが、微量のＤＮＡ試料でも検出が可能な点、および精度を向上させる点で、ＰＣＲ法が好ましく用いられている。ＰＣＲでは、目的の動物種に特異的なＤＮＡ配列を含む一対のプライマーを用いて行い、増幅されたＤＮＡ断片を検出する。本発明の方法は、このＰＣＲに用いるためのプライマーを効率よく設計して取得するための方法である。
【００２８】
本発明の特定の動物種または群由来のＤＮＡ検出用プライマー配列を取得するための方法は、以下の工程：
（ａ）ＤＮＡ配列の検索対象領域を決定する工程；
（ｂ）該領域について該特定の動物種または群のＤＮＡ配列のリストを取得し、該特定の動物種または群のＤＮＡ配列をマルチプルアラインメントする工程；
（ｃ）該マルチプルアラインメントしたＤＮＡ配列から、コンセンサス配列を得る工程；
（ｄ）該領域について該特定の動物種または群とは異なる動植物種または群のＤＮＡ配列のリストを取得し、該異なる動植物種または群のＤＮＡ配列と該コンセンサス配列とをマルチプルアラインメントする工程；
（ｅ）該工程（ｄ）でマルチプルアラインメントしたＤＮＡ配列における任意の塩基長の範囲内で縦列間の塩基を比較して、該範囲のコンセンサス配列をスコアリングする工程であって、該スコアリングが、該コンセンサス配列と異なる塩基について、該範囲の５’または３’末端からの距離、ギャップの有無、および塩基の種類に応じて設定された重みを加算して行われる、工程；
（ｆ）該工程（ｅ）でスコアリングされたコンセンサス配列から、スコアが高いコンセンサス配列を選択する工程；
（ｇ）該工程（ｆ）で選択されたコンセンサス配列の塩基を修正する工程であって、該修正が、該範囲のコンセンサス配列のＴｍ値が任意の温度になるように塩基長を調節し、そして該調節されたコンセンサス配列でホモダイマーを形成しないように塩基を置換することである、工程；
（ｈ）該選択されたコンセンサス配列について、該領域における該コンセンサス配列間の距離が適切な塩基長になるように、対とすべきコンセンサス配列を選択する工程；および
（ｉ）該選択されたコンセンサス配列の対について、特異性および検出感度を確認する工程；
を含む。
【００２９】
本発明において、検出の対象となる動物種または群は特に限定されない。哺乳類、鳥類、魚類などの広範なグループ；反芻動物、げっ歯類、クジラ・イルカ類などの一定の範囲のクラスまたはグループ；ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、ブタ、ウマ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、クジラなどの特定の範囲の属、種、またはグループ；あるいは、黒毛和牛種、乳牛、アカウシ、中ヨークシャー（ブタ）、バークシャー（ブタ）、ミニブタなどの種または品種であってもよい。検出の目的に応じて、対象動物の範囲は適宜設定され得る。
【００３０】
本発明の方法は、種々の遺伝子解析ツールを用いて行われ得る。各工程において、適切な解析プログラムをそれぞれ選択して用いることができる。例えば、本発明においては、工程（ｂ）〜（ｄ）を配列解析プログラムＥＭＢＯＳＳ（The European Molecular Biology Open Software Suite）のコマンドを用いて行うことができる。あるいは、工程（ｂ）から（ｇ）までの一連の操作を自動的に連続して行い得る配列解析プログラムを独自に組んでもよい。
【００３１】
ここで、ＥＭＢＯＳＳとは、分子生物学のユーザ・コミュニティー（例えば、ＥＭＢｎｅｔ）のために開発された、全く新しいオープン・ソースな解析用ソフトウェア・パッケージである（非特許文献３）。このソフトウェア・パッケージの使用により、様々なフォーマットで書かれたデータの自動的な処理、ウェブからの透過的な配列データ検索などが可能である。ＥＭＢＯＳＳには、１５０以上のプログラム（アプリケーション）が含まれている。例えば、配列アラインメント；配列パターンによる、高速なデータベース検索；ドメイン解析を含む、タンパク質のモチーフ同定；ＥＳＴ解析；ＣｐＧアイランドの同定などの、核酸配列のパターン解析；単純で種特異的なリピートの同定；小さなゲノムにおけるコドン使用頻度解析；大規模な配列セットにおける、迅速な配列パターン同定などが挙げられる。また、ＥＭＢＯＳＳパッケージには拡張ライブラリーが含まれていること、様々な配列解析用パッケージやツールがシームレスに統合されているため、目的とする解析などを効率よく行うことが可能である。
【００３２】
以下、本発明の方法を工程の順に詳細に説明する。
【００３３】
工程（ａ）：
まず、工程（ａ）において、ＤＮＡ配列の検索対象領域を決定する。検索対象領域としては、目的の特定の動物種または群のＤＮＡ配列のどの領域を選択してもよい。以下の工程（ｂ）および（ｄ）において、種々の動物のＤＮＡ配列のリストを取得することを考慮すると、多くの動物種または群についてＤＮＡ配列が明らかになっているＤＮＡ領域が好ましい。本発明においては、核ゲノムＤＮＡよりもコピー数が多くかつ環状で変性に強い点で、ミトコンドリアＤＮＡが好適に用いられる。ミトコンドリアＤＮＡ上には、酸化的リン酸化（電子伝達系）に必要な酵素類の生合成に必須である、ＡＴＰ合成酵素、シトクロムｃオキシダーゼなどがコードされている。検索対象とするＤＮＡ配列の領域として、このミトコンドリアＤＮＡ全体（すなわち、全領域）を選択してもよく、あるいは一部のみを選択してもよい。
【００３４】
工程（ｂ）：
次いで、上記工程（ａ）で選択したＤＮＡ配列の領域について、目的の特定の動物種または群のＤＮＡ配列のリストを取得して、得られた特定の動物種または群のＤＮＡ配列をマルチプルアラインメントする。
【００３５】
ＤＮＡ配列は、当業者が利用可能な種々のデータベースから入手可能である。データベースとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬなどが挙げられる。データベースからできるだけ多くのＤＮＡ配列を取得し、ＤＮＡ配列リストとする。ＤＮＡ配列をデータベースのＩＤ番号として取得した場合は、ＥＭＢＯＳＳに設定されているコマンドにより、容易にＤＮＡ配列リストを取得することができる。
【００３６】
次いで、このＤＮＡ配列リストを、マルチプルアラインメントする。ここで、マルチプルアラインメントとは、複数の配列を相同性に基づいて整列させることをいう。マルチプルアライメントを行うためのプログラムとしては、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ）などがある。これらのプログラムも、ＥＭＢＯＳＳに含まれている。
【００３７】
工程（ｃ）：
次いで、工程（ｃ）では、マルチプルアラインメントしたＤＮＡ配列から、コンセンサス配列を得る。コンセンサス配列は、各ＤＮＡ配列間の相同性に基づいて、例えば、ＥＭＢＯＳＳ中のコマンド（例えば、ＣＯＮＳ）を用いて作成できる。
【００３８】
必要に応じて、プライマー設計の判断をより正確に行う目的で、コンセンサス配列を２種類作成する。１本は厳密なコンセンサス配列とし、そしてもう１本は緩いコンセンサス配列とする。この場合、以下で詳述する不一致度の指定には、厳密なコンセンサス配列を使用するが、実際のプライマーは、緩いコンセンサス配列に基づいて取得する。２種類のコンセンサス配列の取得について、以下の例示に従って説明する。
【００３９】
反芻動物についてのコンセンサス配列を作成する場合を例に挙げる。例えば、ウシ、ヒツジ、およびヤギのＤＮＡ配列を、それぞれ、
【００４０】
【数１】
2014000091.tif 000002
【００４１】
と仮定する。この場合、縦列で比較すると、
【００４２】
【数２】
2014000091.tif 000003
【００４３】
となる。なお、緩いコンセンサス配列は、縦列中で最も多い塩基で置き換えられる。一方、厳密なコンセンサス配列においては、縦列中で１つでも異なる塩基があれば、Ｎと表示する。
【００４４】
不一致度は、上記厳密なコンセンサス配列の任意の、例えば、１７塩基長の範囲において、上記Ｎの許容数に応じて指定される。例えば、３段階の不一致度を定義する場合、不一致度が高い方から順に、
不一致度１が「５’末端から１番目〜５番目の塩基中にＮが０であり、かつ５’末端から６番目〜１７番目の塩基中にＮが６個以内である場合」とし、
不一致度２が「５’末端から１番目〜７番目の塩基中にＮが０であり、かつ５’末端から８番目〜１７番目の塩基中にＮが３個以内である場合」とし、
不一致度３が「５’末端から１番目〜９番目の塩基中にＮが０であり、かつ５’末端から１０番目〜１７番目の塩基中にＮが６個以内である場合」と定義される。この場合は、５’末端から１８番目〜２５番目の塩基中のＮの数はいくつであっても許容される。通常は、不一致度２を指定する。
【００４５】
工程（ｄ）：
次に、上記工程（ａ）で選択したＤＮＡ配列の領域について、特定の動物種または群とは異なる動植物種または群のＤＮＡ配列のリストを取得し、該異なる動植物種または群のＤＮＡ配列と該コンセンサス配列とをマルチプルアラインメントする。
【００４６】
特定の動物種または群とは異なる動植物種または群は、特に限定されない。多種多様な範囲の動植物についてのＤＮＡ配列リストを取得することが好ましく、特定の動物種または群に比較的に近い動物種または群を含むことが好ましい。ＤＮＡ配列リストの取得、ならびにマルチプルアラインメントの手法は、上記工程（ｂ）と同様である。例えば、ＥＭＢＯＳＳ中のコマンドを用いて行うことができる。
【００４７】
工程（ｅ）：
工程（ｅ）では、上記工程（ｄ）でマルチプルアラインメントしたＤＮＡ配列における任意の塩基長の範囲内で縦列間の塩基を比較する。任意の塩基長は、プライマーとして適切な塩基長であり得る。通常、１５〜３０塩基長、好ましくは１７〜２５塩基長である。上記のコンセンサス配列をスコアリングする。上記コンセンサス配列の種々の位置の任意の塩基長の範囲において、このコンセンサス配列の塩基と、マルチプルアラインメントしたＤＮＡ配列の塩基とを縦列間で比較する。比較した場合、各塩基について、塩基の一致または不一致、ギャップなどの差異が見出される。
【００４８】
次に、見出された差異をコンセンサス配列に対してスコアリングする。スコアリングは、コンセンサス配列と異なる塩基について、この範囲の５’または３’末端からの距離、ギャップの有無、および塩基の種類に応じて設定された重みを加算して行われる。本発明において「重み」とは、目的外のＤＮＡ（すなわち、検出目的の特定の動物種または群とは異なる動物種または群のＤＮＡ）とアニーリングしにくいものほど重いと設定される。例えば、プライマーの末端側の塩基が異なる場合、ギャップが末端側に存在する場合などは、アニーリングしにくくなる（言い換えれば、ミスアニーリングを生じにくくなる）。そのため、末端からの位置に応じて、適宜重みをスコアとして設定する。特に、末端の５塩基の影響が大きいため、末端５塩基についてのみスコアリングの対象とすることが好ましい。
【００４９】
塩基が異なる場合のスコアについては、例えば、末端からＸ番目の重みスコアを、末端からＸ＋１番目とＸ＋２番目の合計スコアと設定する。末端５塩基をスコアリングの対象とする場合、末端から５番目の塩基が異なる場合をスコア１とすると、末端から４番目は、５番目と６番目との合計なのでスコア２となる。末端から３番目の場合は、４番目と５番目との合計なので３、２番目の場合は５、そして１番目（末端）は８となる。
【００５０】
ギャップがある場合のスコアについては、例えば、末端５塩基についてのみスコアリングの対象とする場合、ギャップの差の絶対値（すなわち、ギャップの差）が１、２、３、４、および５に対して、スコアをそれぞれ３、５、７、９、および１１と設定する。
【００５１】
コンセンサス配列中の塩基とミスアニーリングを生じにくい塩基ＧまたはＣについては、その塩基のスコアを１．５倍にする。
【００５２】
以下に、具体例を挙げて説明する。ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの反芻動物のコンセンサス配列と、ブタおよびウマのＤＮＡ配列とを、以下のようなある一定の範囲（囲み内）について比較する。
【００５３】
【数３】
2014000091.tif 000004
【００５４】
まず、反芻動物コンセンサス配列とブタ配列とを縦列で比較する。例えば、３’末端側についてスコアリングすると、３’末端から１番目は異なっておりかつ塩基がＣであるので、スコアは８×１．５＝１２である。３’末端から４番目も異なっておりかつ塩基がＣであるのでスコアは２×１．５＝３である。したがって、スコア１２と３との合計で、ブタの配列に対してはスコア１５である。
【００５５】
一方、反芻動物コンセンサス配列とウマ配列との比較においては、３’末端からギャップも含めて２番目と５番目とが異なりかつ塩基がともにＣであるので、スコアの合計は９となる。ウマ配列には１塩基のギャップが存在するため、さらにスコア３を加算する。したがって、スコア９と３との合計で、ウマ配列との比較においては、このコンセンサス配列のスコアは１２である。
【００５６】
ブタ配列との比較ではスコア１５であるが、ウマ配列との比較ではスコア１２であるため、比較した中で最も低いスコア１２が、この範囲の反芻動物コンセンサス配列のスコアとなる。
【００５７】
このように、各配列と比較して得られた種々のスコアのうち、最も低いスコアが、該一定の範囲のコンセンサス配列のスコアになる。したがって、１つでも同一の配列が存在すれば、スコアは０となる。
【００５８】
なお、スコア０の場合であっても、数種のＤＮＡ配列のみが原因で、それらを除く配列との比較において高いスコアを有する場合がある。そのようなコンセンサス配列に基づくプライマーは、プライマー対の一方に高いスコアのプライマーを用いる場合に限って、その対のプライマーとして使用することができる。そのため、原因となるＤＮＡ配列以外の配列の比較に基づくスコアについても、条件付きで用いられる可能性があるため、注釈付きで記録することが好ましい。このようなスコアリングは、任意の適切なプログラムを組むことによって行われ得る。また、注釈付きの記録は、自動的に記録されるように設定され得る。
【００５９】
工程（ｆ）：
上記工程（ｅ）でスコアリングされたコンセンサス配列から、スコアが高いコンセンサス配列を選択する。例えば、末端５塩基について、上記のようなスコアを設定した場合、スコア１以上、好ましくはスコア５以上、より好ましくはスコア１０以上の配列が選択される。５’または３’側のいずれか一方のみのスコアが高い場合は、フォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかの候補となり得、両方とも高いスコアを有する場合は、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの両方の候補となり得る。また、上記のように、条件付きで用いられ得る配列も、同様に選択され得る。このような選択も、任意の適切なプログラムを組むことによって行われ得る。
【００６０】
工程（ｇ）：
次に、上記工程（ｆ）で選択されたコンセンサス配列の塩基を修正する。修正は、この範囲のコンセンサス配列のＴｍ値が任意の温度になるように塩基長を調節し、そしてこの調節されたコンセンサス配列でホモダイマーを形成しないように塩基を置換する。
【００６１】
選択されたコンセンサス配列のＴｍ値（プライマーの融解温度）は、一般的に、最近接塩基対法によって計算される。Ｔｍ値は、任意の値に設定できるが、ＰＣＲにおいて通常用いられるアニーリング温度付近に設定されることが好ましい。例えば、約５５℃に設定される。Ｔｍ値は、長い配列ほど上がり、そしてＧＣリッチな配列でも上がる。したがって、スコアリングの対象とは反対側の末端側の配列において、塩基を追加または削除して、Ｔｍ値を設定値に近づくように修正する。
【００６２】
さらに、塩基長が調節されたコンセンサス配列は、配列によってはホモダイマーを形成する場合がある。そこで、上記のスコアリングの対象になっていない位置の塩基を変更することにより、ホモダイマーを形成しないように修正する。上記の例の場合は、ホモダイマーとして対合する領域の５’末端側の領域の塩基を変更する。このようなコンセンサス配列の修正は、任意の適切なプログラムを組むことによって行われ得る。
【００６３】
工程（ｈ）：
工程（ｈ）では、修正されたコンセンサス配列について、該領域における該コンセンサス配列間の距離が適切な塩基長になるように、対とすべきコンセンサス配列を選択する。例えば、取得したプライマーを用いて検出する試料が、加熱処理後の肉由来製品である場合、ＤＮＡは切断されて比較的短い。そのため、プライマーによって増幅されるＤＮＡの塩基長は、好ましくは約５０〜５００ｂｐ、より好ましくは約６０〜３００ｂｐ、さらに好ましくは約７０〜２００ｂｐであり得る。したがって、候補として選択されたコンセンサス配列間の距離も、好ましくは約５０〜５００ｂｐ、より好ましくは約６０〜３００ｂｐ、さらに好ましくは約７０〜２００ｂｐ、特に好ましくは約７５〜１７０ｂｐであり得る。この場合、フォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれか一方のプライマーの特異性が高ければよいので、対として選択される配列は、必ずしも上記工程（ｆ）で選択されたコンセンサス配列である必要はない。
【００６４】
工程（ｉ）：
工程（ｉ）では、上記工程（ｈ）で選択されたコンセンサス配列の対について、特異性および検出感度を確認する。このコンセンサス配列は、プライマー候補である。
【００６５】
特異性の確認は、実際に抽出したＤＮＡに対してＰＣＲを行って確認することが好ましい。あるいは、プログラムによって、予備的に特異性を確認することが好ましい。このような特異性を確認するためのプログラムとしては、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどが挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡとは、いずれもバイオインフォマティクスでＤＮＡの塩基配列あるいはタンパク質のアミノ酸配列のシーケンスアラインメントを行うためのアルゴリズム、またそのアルゴリズムを実装したプログラムをいう。
【００６６】
予備的に特異性を確認したプライマー候補は、当業者が通常用いる方法によって（例えば、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて）目的の動物および他の動植物から抽出した種々のＤＮＡに対して、プライマー対としての特異性が確認される。プライマー候補のＤＮＡ配列は、通常用いられる方法によって合成される。一般的には、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断を行う。次いで、通常用いられる方法（例えば、カラムクロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライマーを得ることができる。
【００６７】
上記種々のＤＮＡについて、上記の選択したプライマー候補の組み合わせを用いてＰＣＲを行い、プライマーに挟まれた領域のＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲは、通常行われる条件で実施され、各プライマー対についてそれぞれ適切な条件を設定する。例えば、まず９５℃で９分熱変性した後、変性：９２℃、３０秒〜１分；アニーリング：４０〜６５℃、３０秒〜２分；伸長：７２℃、３０秒〜２分の反応を、３０〜５０サイクル、好ましくは３５〜４５サイクル繰り返し、最後に７２℃、５分反応させてＰＣＲを終了する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧＯＬＤポリメラーゼなどが用いられる。プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）のサイズは、選択されたプライマー対間の塩基数に応じて変動する。このＰＣＲ産物は、次いで、上記ＤＮＡ断片を分離できる条件下で、例えば、ＤＮＡ断片のサイズに応じてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを行う。
【００６８】
電気泳動したゲル上のＤＮＡ断片は、当業者が通常用いるエチジウムブロマイド染色、蛍光検出、サザンハイブリダイゼーションなどの検出手段によって検出され、ＤＮＡ配列決定により確認し得る。
【００６９】
特異性が高いことが確認されたプライマー候補の組み合わせは、次いで、検出感度についての検討が行われる。検出感度は、目的の動物種（グループ）から抽出した種々の濃度のＤＮＡについて、上記のようにＰＣＲを行うことにより確認できる。こうして得られたプライマー対のＤＮＡの検出限界は、好ましくはＰＣＲチューブあたり１０ｐｇ、より好ましくは１ｐｇ、さらに好ましくは０．１ｐｇであり得る。
【００７０】
上記の方法に従って、ＧｅｎＢａｎｋから取得したミトコンドリアＤＮＡ配列リストについて、上記の工程を行うことにより、例えば、反芻動物由来ＤＮＡ検出用プライマー対、ならびにブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対が得られ得る。
【００７１】
具体例としては、本発明の反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対は、配列表の配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列との組み合わせ；配列表の配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列との組み合わせ；配列表の配列番号５の配列と配列表の配列番号６の配列との組み合わせ；または配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号８の配列との組み合わせである。これらのプライマー対は、ウシ、シカ、ヒツジ、およびヤギ由来のＤＮＡについては検出可能であるが、反芻動物以外の哺乳動物（ヒト、クジラ、ブタ、ウサギなど）、家禽類、および魚介類由来のＤＮＡについては検出しない。また、反芻動物由来の原料を含まない飼料についても、ＤＮＡを検出しない。
【００７２】
さらに別の具体例としては、本発明のブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対は、配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１０の配列との組み合わせ；配列表の配列番号１１の配列と配列表の配列番号１２の配列との組み合わせ；配列表の配列番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列との組み合わせ；または配列表の配列番号１５の配列と配列表の配列番号１６の配列との組み合わせである。これらのプライマー対はいずれも、ブタ由来のＤＮＡは、品種にかかわらず検出可能であり、ブタ由来の肉骨粉を試料とした場合は検出可能である。一方、ブタ以外の哺乳動物（ヒト、クジラ、ウシ、ウサギなど）、家禽類、および魚介類由来のＤＮＡについては検出しない。また、ブタ由来の原料を含まない飼料についても、ＤＮＡを検出しない。
【００７３】
別の具体例としては、本発明のクジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマー対は、配列表の配列番号５２の配列と配列表の配列番号５３の配列との組み合わせ；または配列表の配列番号５２の配列と配列表の配列番号５４の配列との組み合わせである。これらのプライマー対は、クジラおよびイルカ類由来のＤＮＡについては検出可能であるが、クジラおよびイルカ類以外の哺乳動物（ヒト、ウシ、ブタ、ウサギなど）、家禽類、および魚介類由来のＤＮＡについては検出しない。また、クジラおよびイルカ類由来の原料を含まない飼料についても、ＤＮＡを検出しない。
【００７４】
さらに別の具体例としては、本発明のシカ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対は、配列表の配列番号５５の配列と配列表の配列番号５６の配列との組み合わせである。このプライマー対はいずれも、シカ由来のＤＮＡは、品種にかかわらず検出可能であり、シカ由来の肉骨粉を試料とした場合は検出可能である。一方、シカ以外の哺乳動物（ヒト、クジラ、ウシ、ウサギなど）、家禽類、および魚介類由来のＤＮＡについては検出しない。また、シカ由来の原料を含まない飼料についても、ＤＮＡを検出しない。
【００７５】
別の具体例としては、本発明のヒツジ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対は、配列表の配列番号５７の配列と配列表の配列番号５８の配列との組み合わせである。このプライマー対はいずれも、ヒツジ由来のＤＮＡは、品種にかかわらず検出可能であり、ヒツジ由来の肉骨粉を試料とした場合は検出可能である。一方、ヒツジ以外の哺乳動物（ヒト、クジラ、ウシ、シカ、ヤギ、ウサギなど）、家禽類、および魚介類由来のＤＮＡについては検出しない。また、ヒツジ由来の原料を含まない飼料についても、ＤＮＡを検出しない。
【００７６】
さらに別の具体例としては、本発明のヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対は、配列表の配列番号５９の配列と配列表の配列番号６０の配列との組み合わせである。このプライマー対はいずれも、ヤギ由来のＤＮＡは、品種にかかわらず検出可能であり、ヤギ由来の肉骨粉を試料とした場合は検出可能である。一方、ヤギ以外の哺乳動物（ヒト、クジラ、ウシ、シカ、ヒツジ、ウサギなど）、家禽類、および魚介類由来のＤＮＡについては検出しない。また、ヤギ由来の原料を含まない飼料についても、ＤＮＡを検出しない。
【００７７】
このようにして得られたプライマー対は、種々の試料中の目的の動物種または群由来のＤＮＡの存在を検出し得る。すなわち、上記方法により得られたプライマー対を用いて、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、そして該増幅されたＤＮＡ断片を検出する。
【００７８】
検出の対象とされる試料としては、生肉、生魚、肉加工食品、魚加工食品、肉加工品含有食品、魚加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、魚粉、フィッシュソリュブル、だし粕、これらを含有する飼料、肥料、ペットフード、および飼料添加物などが挙げられる。試料からのＤＮＡの抽出は、用いられるプライマー対に応じて当業者が通常用いる方法によって行われる。例えば、ミトコンドリアＤＮＡから設計されたプライマー対を用いる場合は、ミトコンドリアＤＮＡを抽出する。試料からのミトコンドリアＤＮＡの抽出は、例えば、以下のように行う。約５０ｍｇ〜５００ｍｇの試料（例えば、生肉の場合５０ｍｇ、乾燥粉体試料の場合１００〜５００ｍｇ）を、約１０倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（例えば、和光純薬工業株式会社製）を用いて抽出する。このようなキットは、組織細胞中の核ゲノムＤＮＡの混入が少なく、より高純度のミトコンドリアＤＮＡを回収するものであり、遠心分離、沈殿採取などによるＤＮＡの抽出、濃縮操作などを行う。このようにして、試料中に存在する大量の核ゲノムＤＮＡの混入程度が低いミトコンドリアＤＮＡをより効率的に抽出できる。ＤＮＡの抽出法は、ここで記述した方法に限定されず、その他の方法も利用し得ることは、当業者に明らかである。
【００７９】
プライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に、約０．４μＭで使用することが好ましい。
【００８０】
このようにして、試料中に目的の動物種由来のＤＮＡが存在していれば、増幅されたＤＮＡ断片がゲル上で検出され得る。検出限界は、用いるプライマー対の種類および組み合わせ、試料の量、ＰＣＲ条件、検出方法などの種々のファクターによって異なり得る。適切な条件を選択すれば、微量の試料においても、高感度でＤＮＡの存在を検出することができる。例えば、適切な条件を選択すれば、試料がウシ由来の肉骨粉を含む配合飼料である場合、反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対を用いて、少なくとも０．０１質量％の牛肉骨粉の混入でさえも検出することが可能である。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマーの取得）
（実施例１−１：反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
検索対象とするＤＮＡ配列の領域をミトコンドリアＤＮＡとした。ＧｅｎＢａｎｋから、反芻動物のミトコンドリアＤＮＡ配列について２０種類のＩＤ番号のリストを取得した（Ｖ００６５４、ＡＹ５２６０８５、ＡＹ６７６８５９、ＡＹ６７６８７１、ＡＢ０７４９６４、ＡＦ４９２３５１、ＡＹ６７６８５７、ＡＹ１２６６９７、ＤＱ９８５０７６、ＥＦ０３５４４７、ＡＢ２４５４２７、ＡＢ２４５４２６、ＡＢ２１１４２９、ＡＢ２１８６８９、ＡＢ２１０２６７、ＡＹ７０２６１８、ＡＦ５３３４４１、ＡＹ２２５９８６、ＡＦ５２７５３７、およびＡＦ０１０４０６）。ＥＭＢＯＳＳをインストールしたコンピュータにおいて、この２０種のＩＤ番号のリストを入力してＤＮＡ配列を取得し、マルチプルアラインメントして、反芻動物についてのコンセンサス配列を作成した。ここでは、厳密と緩いものとの２種のコンセンサス配列を作成した。
【００８２】
不一致度を３段階に設定し、「５’末端から１番目〜７番目の塩基中にＮが０であり、かつ５’末端から８番目〜１７番目の塩基中にＮが３個以内である場合」とした不一致度２を指定して、これに該当しないものについては、以下のスコアリングを行わなかった。
【００８３】
次いで、反芻動物以外のミトコンドリアＤＮＡ配列について、ＧｅｎＢａｎｋから１４種類のＩＤ番号のリストを取得した（ＡＦ０３４２５３（ブタ）、Ｘ７９５４７（ウマ）、ＡＦ３４７０１５（ヒト）、Ｊ０１４１５（ヒト）、ＡＢ０３２５５４（イワシ）、ＡＢ２０１２５８（クジラ）、Ｕ２０７５３（ネコ）、Ｕ９６６３９（イヌ）、ＡＹ１７２３３５（マウス）、ＡＰ００２９３２（サンマ）、Ｘ１４８４８（ラット）、ＡＰ００３３２２（ニワトリ）、ＥＦ１２６３６９（サケ）、およびＡＢ１８５０２２（マグロ））。この１４種のＩＤ番号を入力してＤＮＡ配列を取得し、先に作成したコンセンサス配列とマルチプルアラインメントした。
【００８４】
次に、マルチプルアラインメントしたＤＮＡ配列において縦列間の塩基を比較した。末端５塩基をスコアリングの対象とし、スコアリングの重みを次のように設定した。末端から５番目の塩基が異なる場合をスコア１とし、４番目をスコア２とし、３番目をスコア３とし、２番目をスコア５とし、そして１番目（末端）をスコア８とした。ギャップについては、ギャップの差の絶対値が１、２、３、４、および５に対して、スコアをそれぞれ３、５、７、９、および１１と設定した。アニーリングの安定性により、ＧまたはＣの塩基についてはスコアを１．５倍にした。このような設定でスコアリングして、各コンセンサス配列のスコアを決定した。なお、スコア０のコンセンサス配列のうち、数種のＤＮＡ配列のみが原因となるものについては、原因となるＤＮＡ配列以外の配列の比較に基づくスコアを、括弧内に注釈付きで記録した。
【００８５】
次に、コンセンサス配列の塩基について、Ｔｍ値を５５℃に設定して塩基長を調節し、そしてホモダイマーの形成を自動修正した。
【００８６】
得られた配列の中から、スコアが１２以上のコンセンサス配列（フォワードプライマーの候補として５種、およびリバースプライマーの候補として６種）を以下の表１に例示する。なお、表１において、リバースプライマーについて、上段にコンセンサス配列および下段の括弧内にプライマーとしての配列を示す。
【００８７】
【表１】
2014000091.tif 000005
【００８８】
（実施例１−２：反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマーの特異性の確認）
上記実施例１−１で得られたコンセンサス配列（スコア８以上）について、ＢＬＡＳＴによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、クジラ、トリ、サケ、カレイ、アジ、タラ、サバ、サンマ、ニジマス、カツオ、イワシ、マグロ、カニ、アサリ、エビ、およびイカの各肉試料から、ミトコンドリアＤＮＡを以下のように調製した。各肉試料を１０倍量の緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キットであるｍｔＤＮＡエキストラクターＣＴキット（和光純薬工業製）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００８９】
それぞれのＤＮＡ試料を鋳型とし、種々のプライマー対についてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである：反応緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）；９５℃で９分熱変性した後、変性：９２℃、３０秒；アニーリング：５５℃、３０秒；伸長：７２℃、３０秒の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃、５分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）を検出した。その結果、以下の表２に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
【００９０】
【表２】
2014000091.tif 000006
【００９１】
表２には、これらのプライマー対によって増幅される部位について、ＧｅｎＢａｎｋのＡＹ５２６０８５のウシミトコンドリアＤＮＡ配列を参照に記載した。ペア１（５Ｄ２と３Ｄ５との組み合わせ）によって増幅される部分は、非特許文献４および５に記載されている増幅領域の近傍であるかまたは一部重複する領域であるが、増幅断片およびプライマー配列ともに異なっている。このように、本発明の方法に従って設計することにより、増幅のターゲットとすべき領域を予め特定していなかったにもかかわらず、同様の目的で増幅されることが公知であった領域の近辺で、より高感度なプライマー対を新たに取得することができた。なお、その他のプライマー対によって増幅される部分は、これまでに種特異的に増幅される領域としての報告はない。
【００９２】
次に、これらのプライマー対を用いた場合の各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。代表的な電気泳動写真を図１（ペア１：５Ｄ２と３Ｄ５との組み合わせ）および図２（ペア２：５Ｋ４と３Ｋ４との組み合わせ）に示し、これらの結果を表３にまとめる。図１および２ならびに表３からわかるように、これらのプライマー対は、反芻動物のみを検出可能であることがわかった。
【００９３】
【表３】
2014000091.tif 000007
【００９４】
（実施例１−３：反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対の検出感度の確認）
ウシ、シカ、およびヒツジのミトコンドリアＤＮＡについて、予め抽出ＤＮＡの濃度を測定した。次いで、ＰＣＲチューブあたり１．０ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇ、０．００１ｎｇ（１．０ｐｇ）、０．０００１ｎｇ（０．１ｐｇ）、および０．００００１ｎｇ（０．０１ｐｇ）のＤＮＡを加えて、ペア１のプライマー対（５Ｄ２と３Ｄ５との組み合わせ）を用いてＰＣＲを行った。電気泳動写真を図３に示す。その結果、０．１ｐｇのＤＮＡを含む場合でも、電気泳動のバンドはシグナル強度が強く、非常に高感度で検出可能であった。
【００９５】
（実施例２：各種飼料中の反芻動物特異的ＤＮＡの検出）
種々の魚粉、チキンミール、フェザーミール、ポークチキンミール、および家畜用配合飼料について、反芻動物特異的ＤＮＡの検出を検討した。１００ｍｇとり、上記実施例１−２と同様に１０倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（和光純薬工業製）を用いてミトコンドリアＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として、反芻動物特異的ＤＮＡ検出用プライマー対（ペア１：５Ｄ２と３Ｄ５との組み合わせ）を用いて、実施例１−２と同じ条件でＰＣＲを行った。結果を図４に示す。反芻動物由来成分を含まない飼料（レーン１〜１２および１４〜１８）では２０１ｂｐのバンドは検出されなかったが、ウシ由来成分を含むレーン１３の配合飼料については、２０１ｂｐバンドを検出できた。また、配合飼料にウシ肉骨粉を添加して、種々の濃度のウシ肉骨粉を含む試料を調製した。上記実施例１−２と同様の手順でこれらの試料からミトコンドリアＤＮＡを抽出し、ペア１のプライマー対（５Ｄ２と３Ｄ５との組み合わせ）を用いて検出感度を確認した。その結果、０．０１％（ｗ／ｗ）添加まで検出可能であることがわかった（図５）。
【００９６】
（実施例３：ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの取得）
（実施例３−１：ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
検索対象とするＤＮＡ配列の領域をミトコンドリアＤＮＡとし、上記実施例１−１と同様の手順で、ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。ＧｅｎＢａｎｋから、ブタのミトコンドリアＤＮＡ配列について４０種類のＩＤ番号のリストを取得した。また、ブタ以外の動物種のミトコンドリアＤＮＡについても３３種類のＩＤ番号のリストを取得した。ＩＤ番号のリストを以下の表４に示す。
【００９７】
【表４】
2014000091.tif 000008
【００９８】
これらのＩＤ番号のリストをもとに、上記実施例１−１と同様にブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。得られた配列の中から、スコアが１５以上のコンセンサス配列（フォワードプライマーの候補として１２種、およびリバースプライマーの候補として５種）を以下の表５に例示する。なお、表５において、リバースプライマーについて、上段にコンセンサス配列および下段の括弧内にプライマーとしての配列を示す。
【００９９】
【表５】
2014000091.tif 000009
【０１００】
（実施例３−２：ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの特異性の確認）
上記実施例３−１で得られたコンセンサス配列（スコア８以上）について、ＢＬＡＳＴによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。６種類のブタの肉試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製した。これらの抽出ＤＮＡおよび市販のブタミトコンドリアＤＮＡ（テキサスジェノミクスジャパン製）を鋳型として、上記実施例１−２と同様にＰＣＲを行った。その結果、以下の表６に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた（図６を参照）。
【０１０１】
【表６】
2014000091.tif 000010
【０１０２】
表６には、これらのプライマー対によって増幅される部位について、ＧｅｎＢａｎｋのＡＦ０３４２５３のブタミトコンドリアＤＮＡ配列を参照に記載した。ペアＩ（PigATP6-5.3とPigATP6-3.9との組み合わせ）によって増幅される部分、ならびにペアIII（PIG 5HとPIG 3Hとの組み合わせ）によって増幅される部分は、非特許文献１および６に記載されている増幅領域の近傍であるかまたは一部重複する領域であるが、増幅断片およびプライマー配列ともに異なっている。また、ペアＩＶ（PIG 5JとPIG 3Jとの組み合わせ）によって増幅される部分は、非特許文献７に記載されている増幅領域の近傍であるが、増幅断片およびプライマー配列ともに全く異なっている。なお、ペアII（PIG 5GとPIG 3Gとの組み合わせ）によって増幅される部分は、これまでに種特異的に増幅される領域としての報告はない。
【０１０３】
次に、これらのプライマー対を用いて、種々のブタの品種由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。代表的な電気泳動写真を図６に示す。いずれのプライマー対においても、品種にかかわらずブタＤＮＡを検出できた。
【０１０４】
次いで、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、クジラ、ブタ、ニワトリ、ウズラ、アイガモ、イワシ、アジ、マグロ、カツオ、サンマ、サケ、タラ、カレイ、ニジマス、カニ、エビ、イカ、アサリ、トウモロコシ、および配合飼料の各試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製し、種々のブタ特異的プライマー対を用いてＰＣＲを行った。４種類のプライマー対のいずれも、ポジティブコントロールであるブタＤＮＡのみが検出され、その他の試料については不検出であった。図７に、ペアＩ（PigATP6-5.3とPigATP6-3.9との組み合わせ）を用いた場合の電気泳動写真を例示する。
【０１０５】
（実施例３−３：ブタ特異的ＤＮＡ検出用プライマー対の検出感度の確認）
ブタミトコンドリアＤＮＡ（株式会社テキサスジェノミクスジャパン製：濃度１０ｎｇ／μＬ）を用いて、ＰＣＲチューブあたり１．０ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇ、０．００１ｎｇ、および０．０００１ｎｇのＤＮＡを加え、上記と同様にＰＣＲを行って、種々のプライマー対について検出感度を検討した。その結果、ペアＩ（PigATP6-5.3とPigATP6-3.9との組み合わせ）を用いた場合は、０．０００１ｎｇのＤＮＡを含む場合でも、電気泳動のバンドはシグナル強度が強く、非常に高感度で検出可能であった（図８）。また、ペアIII（PIG 5HとPIG 3Hとの組み合わせ）の場合も、同様に０．０００１ｎｇのＤＮＡを含む場合でも検出可能であった。さらに、ペアＩＶ（PIG 5JとPIG 3Jとの組み合わせ）の場合は、０．１ｎｇのＤＮＡを含む場合まで検出可能であった。
【０１０６】
（実施例４：飼料中のブタ特異的ＤＮＡの検出）
配合飼料中に、種々の量のブタ肉骨粉を添加して、種々の濃度のブタ肉骨粉を含む試料を調製した。上記実施例と同様の手順で、これらの試料からミトコンドリアＤＮＡを抽出し、上記のプライマー対を用いて検出した。その結果、ペアＩ（PigATP6-5.3とPigATP6-3.9との組み合わせ）を用いた場合は、０．０１％（ｗ／ｗ）のブタ肉骨粉を含む場合でさえも検出可能であった（図９）。また、ペアIII（PIG 5HとPIG 3Hとの組み合わせ）の場合は、０．１％（ｗ／ｗ）添加まで検出可能であり、そしてペアＩＶ（PIG 5JとPIG 3Jとの組み合わせ）の場合は、１．０％（ｗ／ｗ）添加まで検出可能であった。
【０１０７】
（実施例５：クジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマーの取得）
（実施例５−１：クジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
検索対象とするＤＮＡ配列の領域をミトコンドリアＤＮＡとし、上記実施例１−１と同様の手順で、クジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。ＧｅｎＢａｎｋから、クジラ・イルカ類のミトコンドリアＤＮＡ配列について９種類のＩＤ番号のリストを取得した。また、クジラ・イルカ類以外の動物種のミトコンドリアＤＮＡについても１８種類のＩＤ番号のリストを取得した。ＩＤ番号のリストを以下の表７に示す。
【０１０８】
【表７】
2014000091.tif 000011
【０１０９】
これらのＩＤ番号のリストをもとに、上記実施例１−１と同様にクジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。得られた配列の中から、スコアが１０以上のコンセンサス配列（フォワードプライマーの候補として１３種、およびリバースプライマーの候補として８種）を以下の表８に例示する。なお、表８において、リバースプライマーについて、上段にコンセンサス配列および下段の括弧内にプライマーとしての配列を示す。
【０１１０】
【表８】
2014000091.tif 000012
【０１１１】
（実施例５−２：クジラ・イルカ類特異的ＤＮＡ検出用プライマーの特異性の確認）
上記実施例５−１で得られたコンセンサス配列について、ＢＬＡＳＴによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。５種類のクジラ・イルカ類の肉試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製した。これらの抽出ＤＮＡを鋳型として、上記実施例１−２と同様にＰＣＲを行った。その結果、以下の表９に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
【０１１２】
【表９】
2014000091.tif 000013
【０１１３】
表９には、これらのプライマー対によって増幅される部位について、ＧｅｎＢａｎｋのＡＪ５５４０５４のミンククジラ（Balaenoptera acutorostrata）のミトコンドリアＤＮＡ配列を参照に記載した。ペアＩ（whale51（配列番号５２）とwhale31（配列番号５３）との組み合わせ）によって増幅される部分、ならびにペアII（whale51（配列番号５２）とwhale32（配列番号５４）との組み合わせ）によって増幅される部分は、従来のいずれの文献に記載されているものとは、増幅断片およびプライマー配列ともに異なっている。
【０１１４】
次に、これらのプライマー対を用いて、種々のクジラ・イルカ類の種由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。代表的な電気泳動写真を図１０に示す。いずれのプライマー対においても、種にかかわらずクジラ・イルカ類ＤＮＡを検出できた。
【０１１５】
次いで、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ、アジ、タラ、サバ、サンマ、カツオ、イワシ、マグロ、毛ガニ、エビ、イカ、およびヒトの各試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製し、２種のクジラ・イルカ類特異的プライマー対を用いてＰＣＲを行った。２種類のプライマー対のいずれも、ポジティブコントロールであるクジラＤＮＡのみが検出され（レーンＰ）、その他の試料については不検出であった。図１１に、ペアＩ（whale51（配列番号５２）とwhale31（配列番号５３）との組み合わせ）およびペアII（whale51（配列番号５２）とwhale32（配列番号５４）との組み合わせ）を用いた場合の電気泳動写真を例示する。
【０１１６】
（実施例６：シカ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの取得）
（実施例６−１：シカ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
検索対象とするＤＮＡ配列の領域をミトコンドリアＤＮＡとし、上記実施例１−１と同様の手順で、シカ特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。ＧｅｎＢａｎｋから、シカのミトコンドリアＤＮＡ配列について１０種類のＩＤ番号のリストを取得した。また、シカ以外の動物種のミトコンドリアＤＮＡについても２１種類のＩＤ番号のリストを取得した。ＩＤ番号のリストを以下の表１０に示す。
【０１１７】
【表１０】
2014000091.tif 000014
【０１１８】
これらのＩＤ番号のリストをもとに、上記実施例１−１と同様にシカ特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。得られた配列の中から、スコアが１０以上のコンセンサス配列（フォワードプライマーの候補として８種、およびリバースプライマーの候補として３種）を以下の表１１に例示する。なお、表１１において、リバースプライマーについて、上段にコンセンサス配列および下段の括弧内にプライマーとしての配列を示す。
【０１１９】
【表１１】
2014000091.tif 000015
【０１２０】
（実施例６−２：シカ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの特異性の確認）
上記実施例６−１で得られたコンセンサス配列について、ＢＬＡＳＴによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。２種類のシカの肉試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製した。これらの抽出ＤＮＡを鋳型として、上記実施例１−２と同様にＰＣＲを行った。その結果、以下の表１２に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
【０１２１】
【表１２】
2014000091.tif 000016
【０１２２】
表１２には、このプライマー対によって増幅される部位について、ＧｅｎＢａｎｋのＤＱ９８５０７６のタイワンジカ（ハナジカ）（Cervus nippon taiouanus）のミトコンドリアＤＮＡ配列を参照に記載した。deer54（配列番号５５）とdeer33（配列番号５６）との組み合わせによって増幅される部分は、従来のいずれの文献に記載されているものとは、増幅断片およびプライマー配列ともに異なっている。
【０１２３】
次いで、種々の動植物由来試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製し、シカ特異的プライマー対を用いてＰＣＲを行った。代表的な電気泳動写真を図１２に示す。このプライマー対を用いると、ポジティブコントロールであるシカＤＮＡとともに、品種にかかわらずシカＤＮＡが検出され（レーン５および６）、その他の試料については不検出であった。
【０１２４】
（実施例７：ヒツジ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの取得）
（実施例７−１：ヒツジ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
検索対象とするＤＮＡ配列の領域をミトコンドリアＤＮＡとし、上記実施例１−１と同様の手順で、ヒツジ特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。ＧｅｎＢａｎｋから、ヒツジのミトコンドリアＤＮＡ配列について２種類のＩＤ番号のリストを取得した。また、ヒツジ以外の動物種のミトコンドリアＤＮＡについても２９種類のＩＤ番号のリストを取得した。ＩＤ番号のリストを以下の表１３に示す。
【０１２５】
【表１３】
2014000091.tif 000017
【０１２６】
これらのＩＤ番号のリストをもとに、上記実施例１−１と同様にヒツジ特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。得られた配列の中から、スコアが１０以上のコンセンサス配列（フォワードプライマーの候補として６種、およびリバースプライマーの候補として２種）を以下の表１４に例示する。なお、表１４において、リバースプライマーについて、上段にコンセンサス配列および下段の括弧内にプライマーとしての配列を示す。
【０１２７】
【表１４】
2014000091.tif 000018
【０１２８】
（実施例７−２：ヒツジ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの特異性の確認）
上記実施例７−１で得られたコンセンサス配列について、ＢＬＡＳＴによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。１種類のヒツジの肉試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製した。この抽出ＤＮＡを鋳型として、上記実施例１−２と同様にＰＣＲを行った。その結果、以下の表１５に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
【０１２９】
【表１５】
2014000091.tif 000019
【０１３０】
表１５には、このプライマー対によって増幅される部位について、ＧｅｎＢａｎｋのＡＦ０１０４０６のヒツジ（Ovis aries）のミトコンドリアＤＮＡ配列を参照に記載した。sheep53（配列番号５７）とsheep33（配列番号５８）との組み合わせによって増幅される部分は、従来のいずれの文献に記載されているものとは、増幅断片およびプライマー配列ともに異なっている。
【０１３１】
次いで、種々の動植物由来試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製し、ヒツジ特異的プライマー対を用いてＰＣＲを行った。代表的な電気泳動写真を図１３に示す。このプライマー対を用いると、ヒツジのみが検出され（レーン７およびＰ）、その他の試料については不検出であった。
【０１３２】
（実施例８：ヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの取得）
（実施例８−１：ヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
検索対象とするＤＮＡ配列の領域をミトコンドリアＤＮＡとし、上記実施例１−１と同様の手順で、ヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。ＧｅｎＢａｎｋから、ヤギのミトコンドリアＤＮＡ配列について１種類のＩＤ番号のリストを取得した。また、ヤギ以外の動物種のミトコンドリアＤＮＡについても３０種類のＩＤ番号のリストを取得した。ＩＤ番号のリストを以下の表１６に示す。
【０１３３】
【表１６】
2014000091.tif 000020
【０１３４】
これらのＩＤ番号のリストをもとに、上記実施例１−１と同様にヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマーを設計した。得られた配列の中から、スコアが１５以上のコンセンサス配列（フォワードプライマーの候補として１３種、およびリバースプライマーの候補として１５種）を以下の表１７に例示する。なお、表１７において、リバースプライマーについて、上段にコンセンサス配列および下段の括弧内にプライマーとしての配列を示す。
【０１３５】
【表１７】
2014000091.tif 000021
【０１３６】
（実施例８−２：ヤギ特異的ＤＮＡ検出用プライマーの特異性の確認）
上記実施例８−１で得られたコンセンサス配列について、ＢＬＡＳＴによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。１種類のヤギの肉試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製した。この抽出ＤＮＡを鋳型として、上記実施例１−２と同様にＰＣＲを行った。その結果、以下の表１８に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
【０１３７】
【表１８】
2014000091.tif 000022
【０１３８】
表１８には、このプライマー対によって増幅される部位について、ＧｅｎＢａｎｋのＡＦ５３３４４１のヤギ（Capra hircus）のミトコンドリアＤＮＡ配列を参照に記載した。goat55（配列番号５９）とgoat35（配列番号６０）との組み合わせによって増幅される部分は、従来のいずれの文献に記載されているものとは、増幅断片およびプライマー配列ともに異なっている。
【０１３９】
次いで、種々の動植物由来試料から、上記実施例１−２と同様の手順でミトコンドリアＤＮＡを調製し、ヤギ特異的プライマー対を用いてＰＣＲを行った。代表的な電気泳動写真を図１４に示す。このプライマー対を用いると、ヤギのみが検出され（レーン８およびＰ）、その他の試料については不検出であった。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明によれば、任意の範囲の動物種または群（グループ）に由来するＤＮＡを検出するためのプライマーを、より効率的に設計して取得することができる。例えば、反芻動物を検出対象として設計されたプライマーは、飼料中の微量の反芻動物由来の肉骨粉を高感度で検出できる。また、ブタ、シカ、ヒツジまたはヤギを検出対象として設計されたプライマーは、微量のこれらの動物由来肉骨粉を高感度で検出できる。そのため、ＢＳＥ発生および不適原料の混入の防止のために有用である。さらに、クジラ・イルカ類を検出対象として設計されたプライマーは、微量のクジラ・イルカ類由来肉骨粉を高感度で検出できる。また、本発明のこれらのプライマーは、肉骨粉中の動物由来ＤＮＡの検査時に、陽性コントロールプライマーとして利用することにより、検査結果の信頼性を確保することができる。また、本発明のこれらのプライマーは、食肉加工品の表示などの真偽の確認にも用いることができる。
【図１】
2014000091.tif 000023
【図２】
2014000091.tif 000024
【図３】
2014000091.tif 000025
【図４】
2014000091.tif 000026
【図５】
2014000091.tif 000027
【図６】
2014000091.tif 000028
【図７】
2014000091.tif 000029
【図８】
2014000091.tif 000030
【図９】
2014000091.tif 000031
【図１０】
2014000091.tif 000032
【図１１】
2014000091.tif 000033
【図１２】
2014000091.tif 000034
【図１３】
2014000091.tif 000035
【図１４】
2014000091.tif 000036
【配列表】
2014000091000001.app