(57)【要約】【課題】  生体内でヌクレアーゼによる分解を受けにくく、標的のｍＲＮＡに対する高い結合親和性および特異性を有し、特定の遺伝子の発現を効率よく制御することのできるアンチセンス用の新規な分子を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明の新規人工ヌクレオシドは、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡの架橋構造にアミド結合が導入されている。この２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵する一本鎖ＲＮＡに対する結合親和性と、ＬＮＡを上回るヌクレアーゼ耐性とを有する。特に、一本鎖ＲＮＡに対して、Ｓ−オリゴよりも非常に強い結合親和性を有するため、核酸医薬への応用が期待される。【選択図】  図１
2014043462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉまたは式ＩＩで表される化合物またはその塩：
【化１】
2014043462.tif 000084
【化２】
2014043462.tif 000085
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表し；
ｍは、０から２の整数であり；そして
ｎは、０から１の整数である）。
【請求項２】
前記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、前記Ｂａｓｅが、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
前記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、前記Ｒ１が、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である、請求項１または２に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
前記式Ｉにおいて、前記ｍが０である、請求項１から３のいずれかの項に記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
前記式ＩＩにおいて、前記ｎが０である、請求項１から３のいずれかの項に記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
前記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、前記Ｂａｓｅが、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１から５のいずれかの項に記載の化合物またはその塩。
【請求項７】
以下の式ＩＩＩまたは式ＩＶで表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
【化３】
2014043462.tif 000086
【化４】
2014043462.tif 000087
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表し；
ｍは、０から２の整数であり；そして
ｎは、０から１の整数である）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチドに関する。より詳細には、一本鎖ＲＮＡに対する高い結合親和性およびヌクレアーゼに対する高い耐性を有する架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬による疾病の治療法として、アンチセンス法、アンチジーン法、アプタマー、ｓｉＲＮＡなどがある。このうち、アンチセンス法は、疾病に関わるｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）を外部から導入し、二重鎖を形成させることにより、病原ＲＮＡの翻訳過程を阻害し、疾病の治療や予防を行う手法である。ｓｉＲＮＡもこれに類似しており、生体に投与した二重鎖ＲＮＡによりｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する。一方、アンチジーン法は、病原ＲＮＡを転写するＤＮＡ部位に対応する三重鎖形成オリゴヌクレオチドを外部から導入することによりＤＮＡからＲＮＡへの転写を抑制する。また、アプタマーは、短い核酸分子（オリゴヌクレオチド）であるため、疾病の原因となるタンパク質などの生体成分と結合することにより機能を発揮する。
【０００３】
こうした核酸医薬の素材として、種々の人工核酸が開発されているが、未だ切札となるべき分子が存在しない。例えば、これまでに開発されてきた核酸医薬の素材として、Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）、２’，４’−ＢＮＡ（bridged nucleic acid）／ＬＮＡ（locked nucleic acid）（特許文献１〜３および非特許文献１〜４参照）などがある。Ｓ−オリゴは、サイトメガロウイルスに対するアンチセンス医薬品として、既に米国で上市されている。これは、高いヌクレアーゼ耐性を有するものの、標的核酸鎖への結合親和性が低いという難点を有しており、改善が必要である。これまでに開発されている２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡは、いずれも標的核酸鎖への結合親和性が高く、これからの核酸医薬の素材として最も期待される分子である。しかしながら、ヌクレアーゼへの耐性が十分ではなく、生体内での安定性という点で改良の余地を残している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９８／３９３５２号
【特許文献２】国際公開第２００５／０２１５７０号
【特許文献３】国際公開第２００３／０６８７９５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】C. Wahlestedtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000年，97巻，10号，5633-5638頁
【非特許文献２】Y. Hariら、Bioorg. Med. Chem.，2006年，14巻，1029-1038頁
【非特許文献３】K. Miyashitaら、Chem. Commun.，2007年，3765-3767頁
【非特許文献４】S.M.A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.，2008年，130巻，14号，4886-4896頁
【非特許文献５】M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁
【非特許文献６】S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.，2001年，9巻，1001-1011頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体内でヌクレアーゼによる分解を受けにくく、標的のｍＲＮＡに対する高い結合親和性および特異性を有し、特定の遺伝子の発現を効率よく制御することのできるアンチセンス用の新規な分子の創製が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡの架橋構造にアミド結合を導入することにより、優れた一本鎖ＲＮＡに対する結合親和性とヌクレアーゼ耐性とを同時に有する新規な架橋型人工核酸を提供できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下の式Ｉまたは式ＩＩで表される化合物およびその塩：
【０００９】
【化１】
2014043462.tif 000003
【００１０】
【化２】
2014043462.tif 000004
【００１１】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表し； 
ｍは、０から２の整数であり；そして
ｎは、０から１の整数である）を提供する。
【００１２】
１つの実施態様では、上記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、上記Ｂａｓｅは、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。
【００１３】
１つの実施態様では、上記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、上記Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である。
【００１４】
１つの実施態様では、上記式Ｉにおいて、上記ｍは０である。
【００１５】
１つの実施態様では、上記式ＩＩにおいて、上記ｎは０である。
【００１６】
１つの実施態様では、上記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、上記Ｂａｓｅは、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）である。
【００１７】
本発明はまた、以下の式ＩＩＩまたは式ＩＶで表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
【００１８】
【化３】
2014043462.tif 000005
【００１９】
【化４】
2014043462.tif 000006
【００２０】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表し； 
ｍは、０から２の整数であり；そして
ｎは、０から１の整数である）を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、新規な２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供される。この２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵する一本鎖ＲＮＡに対する結合親和性と、ＬＮＡを上回るヌクレアーゼ耐性とを有する。特に、一本鎖ＲＮＡに対して、Ｓ−オリゴよりも非常に強い結合親和性を有するため、核酸医薬への応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】種々のオリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼで分解した場合の、オリゴヌクレオチドの残存率の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
【００２４】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。
【００２５】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基などが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。
【００２７】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
【００２８】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
【００３０】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の任意の芳香族炭化水素および環構造にヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）を含む炭素数３〜１２の任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして環構造にヘテロ原子を含む炭素数３〜１２の任意の複素芳香族化合物としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
【００３１】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。
【００３２】
本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基；メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基；（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基；４−アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基；２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基；４−フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。
【００３３】
本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１〜２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。
【００３４】
本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
【００３５】
本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」などが挙げられる。
【００３６】
より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン−２−イル基、テトラヒドロチオフラン−２−イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、２−メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、１−エトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、２，２，２−トリクロロエチル基などが挙げられる。１〜３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、９−アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。
【００３７】
「核酸合成の水酸基の保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、またはシリル基であり、さらに好適には、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、または低級アルケニル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基または２−プロペニル基である。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、好適には、アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、好適には、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」または「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」であり、さらに好適には、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基である。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基または芳香族アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。
【００３８】
本明細書において、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ４がＯＲ４ａそしてＲ５がＮＲ５ａとして表すことができる基は、「ホスホロアミダイト基」という。ホスホロアミダイト基としては、好適には、式−Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基、または式−Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。
【００３９】
本明細書において、用語「人工ヌクレオシド」および「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものいう。
【００４０】
本明細書において、用語「人工オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合で２〜５０個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいう。そのような類縁体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
【００４１】
本明細書において、用語「その塩」とは、本発明の式ＩまたはＩＩで表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、好適には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
【００４２】
本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」としては、本発明の式ＩＩＩまたは式ＩＶで表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩をいう。そのような塩としては、好適には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
【００４３】
以下、本発明について詳述する。
【００４４】
本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチドまたはその塩は、以下の式Ｉまたは式ＩＩ：
【００４５】
【化５】
2014043462.tif 000007
【００４６】
【化６】
2014043462.tif 000008
【００４７】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表し； 
ｍは、０から２の整数であり；そして
ｎは、０から１の整数である）
で表される構造を有する。
【００４８】
上記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、Ｂａｓｅは、プリン塩基（すなわち、プリン−９−イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００４９】
上記の塩基（Ｂａｓｅ）の具体例としては、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、および４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられる。
【００５０】
中でも、Ｂａｓｅは、核酸医薬への導入という観点から、以下の構造式：
【００５１】
【化７】
2014043462.tif 000009
【００５２】
でそれぞれ表される、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）が好適であり、特に、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基が保護基により保護されていることが好ましい。
【００５３】
上記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基である。より好適には、Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、さらに好適には、Ｒ１は、水素原子またはメチル基である。
【００５４】
上記式Ｉまたは式ＩＩにおいて、ｍは、０から２の整数であり；そしてｎは、０から１の整数である。すなわち、２’位、３’位、４’位、および架橋部を含む環は、５員環〜７員環である。
【００５５】
上記式ＩＩにおいて、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基である。好適には、Ｘは、酸素原子またはアミノ基である。なお、Ｘがアミノ基またはメチレン基である場合、低級アルキル基で置換されていてもよい。
【００５６】
本発明の新規２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドは、従来の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡの架橋構造にアミド結合が導入されている。具体的には、糖部の２’位のアミノ基と４’位から伸長したカルボニル基との間にアミド結合が形成されている。このように、構造的に揺らぎが少なくかつ親水性に優れるアミド結合を有するため、ヌクレオシドの糖部の構造が、架橋により固定化されている。
【００５７】
本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドから、２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを容易に調製することができる。例えば、三リン酸化は、非特許文献５に記載の方法に従って容易に行われ得る。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、以下の式ＩＩＩまたは式ＩＶで表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有する：
【００５９】
【化８】
2014043462.tif 000010
【００６０】
【化９】
2014043462.tif 000011
【００６１】
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ１、Ｘ、ｍおよびｎは、上記式ＩおよびＩＩで定義されるものと同様である）。
【００６２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、上記ヌクレオシド構造を、任意の位置に少なくとも１つ有する。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。
【００６３】
このようなヌクレオシド構造を含むオリゴヌクレオチド類縁体（アンチセンス分子）は、上述のようにアミド結合により固定された構造を有するため、各種ヌクレアーゼに対して分解されにくく、生体への投与後、長時間生体内に存在することができる。例えば、ｍＲＮＡと安定な二重鎖を形成して病因となるタンパク質の生合成を阻害し、あるいはゲノム中の二重鎖ＤＮＡとの間で三重鎖を形成してｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を抑えることも可能となる。また、アミド結合を有することから、生体適合性が高いことも期待され、さらにタンパク質などの生体成分を認識するためのアプタマーとしての機能も期待できる。
【００６４】
これらのことから、本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチド類縁体は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品（アンチセンス分子）としての有用性が期待される。
【００６５】
特に、アンチセンス法では、相補センス鎖ＲＮＡに対する結合親和性および生体内ＤＮＡ分解酵素への耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、一本鎖状態では、糖部の構造が絶えずＤＮＡ二重鎖に近い形と、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖やＲＮＡ二重鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。一本鎖核酸が相補的なＲＮＡ鎖と二重鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。そこで、本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドでは、糖部を予め二重鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のＲＮＡ鎖と二重鎖を形成しやすく、安定に存在させることができる。また、核酸二重鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドでは、アミド結合を有するため、糖部架橋に親水性を付与し、より安定化され得る。さらに、糖部架橋のアミド結合の存在は、生体酵素に認識されにくくし、ヌクレアーゼ耐性に大きく寄与していると考えられる。
【００６６】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製できる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドおよびその類縁体の合成を、実施例に基づいてさらに詳しく説明する。
【００６８】
（実施例１）ヌクレオシド類縁体：２’−アミノ−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｎ，４’−Ｃ−オキソメチレンチミジン（化合物１６：ａｍｉｄｅＮＨ）の合成
【００６９】
【化１０】
2014043462.tif 000012
【００７０】
（１）化合物２の合成
【００７１】
【化１１】
2014043462.tif 000013
【００７２】
窒素気流下、化合物１（１４．７ｇ，３６．８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（８０ｍＬ）にトリエチルアミン（１５．１ｍＬ，１１０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下ジメチルアミノピリジン（０．９０ｇ，７．３６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（１５．１ｍＬ，５８．９ｍｍｏｌ）を加えて還流した。なお、化合物１は、Koshkin, A. A.ら、Tetrahedron，1998年，54巻，pp.3607-3630およびSingh, S. K.ら、Chem. Commun.，1998年，pp.455-456に従って調製し得る。２０時間後、水を加え、塩化メチレンで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１(v/v)）により精製し、化合物２（２０．４ｇ：収率８５．９％）を油状物質として得た。
【００７３】
得られた化合物２の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 ＋84.8 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr): 1457, 1372, 1105, 1025cm-1；1H-NMR (270MHz, CDCl3)：δ1.03 (9H, s), 1.29 (6H, s), 3.62, 3.73 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.03, 4.08 (2H, AB, J = 11.3 Hz), 4.20 (1H, d, J = 5.1 Hz), 4.45, 4.55 (2H, AB, J = 11.9 Hz), 4.49, 4.66 (2H, AB, J = 12.2 Hz), 4.58 (1H, dd, J = 5.1 Hz, 4.1 Hz), 5.76 (1H, d, J = 4.1 Hz), 7.21-7.70 (20H, m)；13C-NMR (75.45MHz, CDCl3)：δ19.9, 26.9, 27.2, 27.5, 65.3, 72.6, 73.0, 74.2, 78.8, 80.2, 88.2, 104.8, 113.8, 128.2, 128.2, 128.3, 128.3, 128.8, 128.9, 130.1, 133.9, 134.1, 135.4, 136.3, 136.4, 138.5, 138.7；MS(FAB)：m/z 661 (MNa+)：計算値 C39H46O6Si：C, 73.32; H, 7.26，実測値 C, 73.44; H, 7.32。
【００７４】
（２）化合物４の合成
【００７５】
【化１２】
2014043462.tif 000014
【００７６】
上記（１）で得た化合物２（１．００ｇ，１．５７ｍｍｏｌ）の０．１％(v/v)濃硫酸酢酸溶液（１．１１ｍＬ）に、無水硫酸（１．７８ｍＬ，１８．８ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。３．５時間後、飽和重曹水に反応液を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、化合物３の粗成績体（１．０７ｇ）を油状物質として得、続くチミン導入に用いた。
【００７７】
窒素気流下、化合物３の粗成績体のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）にチミン（２９７ｍｇ，２．３６ｍｍｏｌ）を加え、４０℃の油浴中で溶解させた後、室温にてＮ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（１．３４ｍＬ，５．５０ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．２８ｍＬ，１．５７ｍｍｏｌ）を加えて１時間還流撹拌した。飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１→１：１(v/v)）により精製し、化合物４（３６７ｍｇ：収率４９％（２工程））を白色アモルファスとして得た。
【００７８】
得られた化合物４の物性データは、以下のとおりであった：融点：55〜59℃； [α]D24 -11.7 (c 0.800, CHCl3)；IR (KBr)：1747, 1693, 1232, 1113 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.04 (9H, s), 1.52 (3H, s), 1.96 (3H, s), 3.71, 3.76 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.94, (2H, AB, J = 10.8 Hz), 4.41 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.54, 4.58 (2H, AB, J = 12.6 Hz), 4.54, 4.58 (2H, AB, J = 12.6 Hz), 5.38 (1H, t, J = 6.0 Hz), 6.16 (1H, d, J = 6.0 Hz), 7.18-7.63 (20H, m), 7.87 (1H,s)；13C-NMR (75.45MHz, CDCl3)：δ12.0, 19.2, 20.6, 26.9, 63.8, 72.2, 73.7, 74.6, 74.9, 77.7, 85.5, 87.9, 111.3, 127.6, 127.7, 127.7, 127.8, 128.1, 128.3, 128.6, 129.7, 129.9, 132.6, 132.9, 135.5, 135.7, 135.7, 137.2, 137.5, 150.4, 163.6, 170.2；MS(FAB)：m/z 749 (MH+), 計算値 C43H48N2O8Si: C, 68.96; H, 6.46; N, 3.74. 実測値 C, 68.92; H, 6.45; N, 3.74。
【００７９】
（３）化合物５の合成
【００８０】
【化１３】
2014043462.tif 000015
【００８１】
上記（２）で得た化合物４（３２６ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２．４ｍＬ）に４０％(v/v)メチルアミン溶液（１．１ｍＬ，１３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１(v/v)）により精製し、化合物５（３１２ｍｇ：収率１００％）を白色アモルファスとして得た。
【００８２】
得られた化合物５の物性データは、以下のとおりであった：融点：61〜63℃；[α]D25 -12.2 (c 0.750, CHCl3)；IR (KBr): 3403, 3175, 1688, 1468, 1272, 1113 cm-1；1H-NMR (270MHz, CDCl3)：δ1.06 (9H, s), 1.60 (3H, s), 3.54, 3.63 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.64 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.73, 3.83 (2H, AB, J =10.5 Hz), 4.31 (1H, d, J = 4.9 Hz,) 4.41 (1H, ddd, J = 4.9 Hz, 4.9 Hz, 10.8 Hz), 4.50 (2H,s), 4.67, 4.73 (2H, AB, J = 11.1 Hz), 5.95 (1H, d, J = 4.9 Hz), 7.21-7.66 (20H, m), 8.12 (1H,s)；13C-NMR (67.80MHz, CDCl3)：δ12.1, 19.1, 26.8, 64.2, 72.2, 73.8, 74.2, 74.5, 77.2, 78.5, 88.1, 90.9, 110.9, 127.7, 127.8, 127.9, 128.0, 128.1, 128.2, 128.6, 130.0, 132.2, 132.2, 135.6, 135.7, 136.5, 137.2, 150.3, 163.4；MS(FAB): m/z 707 (MH+). 計算値 C41H46N2O7Si: C, 69.66; H, 6.56; N, 3.96. 実測値 C, 69.59; H, 6.59; N, 3.93。
【００８３】
（４）化合物６の合成
【００８４】
【化１４】
2014043462.tif 000016
【００８５】
窒素気流下、上記（３）で得た化合物５（２６２ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７ｍＬ）に、ジメチルアミノピリジン（１８１ｍｇ，１．４８ｍｍｏｌ）を加えた。氷冷下、トリフルオロメタンスルホニルクロリド（０．１２ｍＬ，１．１１ｍｍｏｌ）を加え、緩やかに室温条件とした後、１時間撹拌した。飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、化合物６（２４８ｍｇ：収率９７％）を白色アモルファスとして得た。
【００８６】
得られた化合物６の物性データは、以下のとおりであった：融点：51〜54℃；[α]D26 -33.5 (c 1.000, CHCl3)；IR (KBr): 1667, 1650, 1563, 1482, 1112 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.03 (9H, s), 1.99 (3H, s), 3.29, 3.34 (2H, AB, J = 10.8 Hz), 3.68, 3.82 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.31 (1H, d, J =3.9 Hz), 4.32, 4.38 (2H, AB, J =12 Hz), 4.60, 4.81 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 5.50 (1H, dd, J =6.3, 3.9 Hz), 6.23 (1H, d, J = 6.3 Hz), 7.08-7.66 (21H, m)；13C-NMR (75.45MHz, CDCl3)：δ14.0, 18.9, 26.7, 64.0, 69.4, 73.4, 84.0, 87.1, 88.7, 89.9, 119.0, 127.4, 127.6, 127.7, 127.8, 128.1, 128.3, 128.4, 128.5, 129.8, 129.8, 130.1, 131.9, 132.3, 135.3, 135.5, 136.4, 137.0, 159.2, 172.3；MS(FAB): m/z 689 (MH+), 計算値 C41H44N2O6Si: C, 71.48; H, 6.44; N, 4.07. 実測値 C, 71.38; H, 6.49; N, 4.08。
【００８７】
（５）化合物７の合成
【００８８】
【化１５】
2014043462.tif 000017
【００８９】
上記（４）で得た化合物６（５１０ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１１ｍＬ）に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１．９０ｍＬ）を加え、室温にて１１．５時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液で中和後、溶媒留去ジクロロメタンで抽出し、飽和重曹水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１(v/v)）により精製し、化合物７（５２４ｍｇ：収率１００％）を白色アモルファスとして得た。
【００９０】
得られた化合物７の物性データは、以下のとおりであった：融点：67〜70℃；[α]D26 +24.5 (c 0.840, CHCl3)；IR (KBr): 3347, 3184, 1690, 1471 cm-1；1H-NMR (270MHz, CDCl3)：δ1.02 (9H, s), 1.65 (3H, s), 3.48, 3.70 (2H, AB, J = 10.3 Hz), 3.50 (1H, d, J = 7.0 Hz), 3.62, 3.76 (2H, AB, J =10.8 Hz), 4.22 (1H, d, J = 7.0 Hz,) 4.51, 4.78 (2H, AB, J = 7.6 Hz), 4.54 (1H, d, J =11.6 Hz), 4.69 (1H, ddd, J = 5.1, 7.0, 7.6 Hz), 6.15 (1H, d, J = 5.1 Hz), 7.29-7.64 (20H, m), 8.10 (1H,s)；13C-NMR (67.80MHz, CDCl3)：δ12.0, 18.8, 26.5, 63.9, 69.7, 72.6, 73.6, 75.3, 81.9, 85.3, 85.5, 109.5, 127.5, 127.6, 127.8, 128.0, 128.2, 128.5, 129.5, 129.6, 132.4, 135.4, 135.5, 136.8, 137.2, 137.9, 151.1, 164.3；MS(FAB): m/z 707 (MH+), 計算値 C41H46N2O7Si: C, 69.66; H, 6.56; N, 3.96. 実測値 C, 69.42; H, 6.54; N, 3.97。
【００９１】
（６）化合物９の合成
【００９２】
【化１６】
2014043462.tif 000018
【００９３】
窒素気流下、上記（５）で得た化合物７（２．８６ｇ，４．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）に、氷冷下、ピリジン（１．６５ｍＬ，２０．５ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．３７ｍＬ，８．２０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷条件で１時間撹拌した。水を加えて酸無水物を分解させた後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体を黄色油状物質として得、フラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→２：１(v/v)）により簡易精製し、化合物８の粗成績体を淡黄色アモルファスとして得た。
【００９４】
次いで、窒素気流下、化合物８（１．９６ｇ，２．３４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（８０ｍＬ）にアジ化ナトリウム（０．２３ｇ，３．６０ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。４８時間後、溶媒留去し、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により精製し、化合物９（１．７１ｇ：収率６６％（２工程））を白色アモルファスとして得た。
【００９５】
得られた化合物９の物性データは、以下のとおりであった：融点：53〜56℃；[α]D27 -32.7 (c 0.840, CHCl3)；IR (KBr): 3175, 2109, 1686, 1268, 1111 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ0.99 (9H, s), 1.58 (3H, s), 3.63, 3.69 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.91 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.91 (1H, dd, J = 7.2 Hz, 5.4 Hz), 4.23 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.47, 4.53 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.57, 4.75 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.03 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.23-7.60 (20H, m), 8.70 (1H,s)；13C-NMR (75.45MHz, CDCl3)：δ12.1, 19.1, 26.9, 64.0, 64.6, 72.4, 73.8, 74.6, 79.5, 85.2, 87.9, 111.3, 127.7, 127.7, 127.8, 128.0, 128.2, 128.4, 128.7, 129.7, 129.9, 132.5, 132.8, 135.1, 135.5, 135.7, 136.8, 136.9, 150.2, 163.4；MS(FAB): m/z 732 (MH+), 計算値 C41H45N5O6Si: C, 67.28; H, 6.20; N, 9.57. 実測値 C, 67.25; H, 6.27; N, 9.45。
【００９６】
（７）化合物１０の合成
【００９７】
【化１７】
2014043462.tif 000019
【００９８】
窒素気流下、上記（６）で得た化合物９（１．１０ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（３０ｍＬ）に１Ｎテトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液（２．２０ｍＬ，２．２０ｍｍｏｌ）を加え、１２．５時間撹拌した。溶媒留去後、水および酢酸エチルを順次加え、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１(v/v)→酢酸エチルのみ）により精製し、化合物１０（６８２．２ｍｇ：収率９２％）を白色アモルファスとして得た。
【００９９】
得られた化合物１０の物性データは、以下のとおりであった：融点：41〜45℃；[α]D25 +13.3 (c 0.950, CHCl3)；IR (KBr): 3435, 2113, 1694, 1459, 1268, 1097 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.63 (3H, s), 2.09 (1H, br), 3.73 (1H, s), 4.04 (1H, t, J = 6.3 Hz), 4.39 (1H, d, J = 6.3 Hz), 4.51, 4.55 (2H, AB, J = 10.2 Hz), 4.56, 4.91 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.18 (1H, d, J = 6.3 Hz), 7.26-7.44 (10H, m), 8.50 (1H,s)；13C-NMR (75.45Hz, CDCl3)：δ12.2, 63.4, 64.9, 71.8, 73.8, 74.8, 79.4, 86.4, 87.5, 111.5, 127.7, 128.2, 128.2, 128.6, 128.7, 128.8, 135.2, 136.5, 137.0, 150.3, 163.5；MS(FAB): m/z 494 (MH+), 高分解能MS(FAB): 計算値 C25H28N5O6 (MH+): 494.2040. 実測値 494.2045。
【０１００】
（８）化合物１１の合成
【０１０１】
【化１８】
2014043462.tif 000020
【０１０２】
窒素気流下、上記（７）で得た化合物１０（０．２０ｇ，０．４０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（３．１ｍＬ）に、粉末モレキュラーシーブス４Å（０．３１ｇ）および二クロム酸ピリジニウム（１．５０ｇ，４．００ｍｍｏｌ）を順次加え、室温条件で撹拌した。４．５時間後、水を加えて数分間撹拌した後、酢酸（２ｍＬ）を加え、さらに１時間撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、セライトでろ過し、酢酸エチルで抽出した。有機層を０．４Ｍシュウ酸水溶液（３０ｍＬ）および０．３Ｍシュウ酸アンモニウム水溶液（３０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去し、化合物１１（０．２０ｇ：収率１００％）を淡黄色固体として得た。
【０１０３】
得られた化合物１１の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.64 (3H, s), 3.83 (1H, dd, J = 8.4, 5.4 Hz), 3.84, 4.12 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.45 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.59, 4.65 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.75, 4.82 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 5.89 (1H, br), 6.54 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.28-7.44 (10H, m), 7.99 (1H, s), 9.31 (1H, br)；MS(FAB): m/z 508 (MH+),高分解能MS(FAB): 計算値 C25H25N5O7 (MH+): 508.1832. 実測値 508.1825。
【０１０４】
（９）化合物１３の合成
【０１０５】
【化１９】
2014043462.tif 000021
【０１０６】
上記（８）で得た化合物１１（３８９．７ｍｇ，０．７７ｍｍｏｌ）を水：テトラヒドロフラン＝１：３の混合溶液（５ｍＬ）に溶解し、トリブチルホスフィン（０．９６ｍＬ，３．８５ｍｍｏｌ）を加えて室温下撹拌した。３．５時間後、溶媒留去したものをメタノールに溶解し、ヘキサンで洗浄した。溶媒留去後、化合物１２の粗成績体（３８０ｍｇ）を油状物質として得、続く閉環反応に用いた。
【０１０７】
窒素気流下、化合物１２のＤＭＦ溶液（１１ｍＬ）に、氷冷下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２２１ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）を加え、２１．５時間室温下撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１(v/v)→酢酸エチルのみ）により精製し、化合物１３（１９１．３ｍｇ：収率５４％（２工程））を油状物質として得た。
【０１０８】
得られた化合物１３の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 +62.1 (c 0.400, CHCl3)；IR (KBr): 3186, 1692, 1469, 1455, 1272, 1112 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.61 (3H, s), 3.96, 4.11 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.13 (1H, s), 4.22 (1H, s), 4.56 (2H, s), 4.60, 4.67 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 5.45 (1H, s), 6.58 (1H, br), 7.21-7.56 (10H, m), 7.57 (1H, s), 9.24 (1H, br)；13C-NMR (67.80Hz, CDCl3): 12.3, 58.4, 63.0, 72.4, 74.0, 78.3, 86.2, 86.6, 110.9, 127.8, 127.8, 128.1, 128.3, 128.5, 128.6, 135.1, 136.2, 137.4, 142.0, 150.5, 163.8, 174.3；MS(FAB): m/z 464 (MH+)。
【０１０９】
（１０）化合物１４の合成
【０１１０】
【化２０】
2014043462.tif 000022
【０１１１】
窒素気流下、上記（９）で得た化合物１３（１０１ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２．２ｍＬ）に２０％(v/v)水酸化パラジウムカーボン（１００ｍｇ）を加え、水素気流下、３時間撹拌した。熱時ろ過を行い、温メタノール（１５０ｍＬ）で洗浄後、溶媒留去し、粗成績体を得た。メタノールで再結晶を行い、化合物１４（５７．２ｍｇ：収率９３％）を白色固体として得た。
【０１１２】
得られた化合物１４の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 +31.6 (c 0.700, CH3OH)；IR (KBr): 3255, 2925, 2852, 1692, 1466, 1231, 1065 cm-1；1H-NMR (300MHz, CD3OD)：δ1.89 (3H, s), 3.88, 4.04 (2H, AB, J = 12.9 Hz), 4.12 (1H, s), 4.30 (1H, s), 5.38 (1H, s), 7.86 (1H, s)。
【０１１３】
（１１）化合物１５の合成
【０１１４】
【化２１】
2014043462.tif 000023
【０１１５】
窒素気流下、上記（１０）で得た化合物１４（２７．３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（０．８ｍＬ）に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４８．８ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を加え、３時間撹拌した。飽和重曹水を加えて数分間撹拌し、溶媒留去した後、飽和重曹水／酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１(v/v)→酢酸エチルのみ）により精製し、化合物１５（４７．６ｍｇ：収率８５％）を白色泡状物質として得た。
【０１１６】
得られた化合物１５の物性データは、以下のとおりであった：融点：79〜81℃；IR (KBr): 3342, 3063, 2928, 1690, 1509, 1270, 1253,1177, 1035 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.66 (3H, s), 3.61, 3.92 (2H, AB, J = 12.8 Hz), 3.78 (6H, s), 4.26 (1H, s), 4.46 (1H, s), 5.42 (1H, s), 6.86-7.45 (13H, m), 7.78 (1H,s)；MS(FAB): m/z 586 (MH+)。
【０１１７】
（１２）化合物１６の合成
【０１１８】
【化２２】
2014043462.tif 000024
【０１１９】
窒素気流下、上記（１１）で得た化合物１５（１００ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル−テトラヒドロフラン溶液（３：１(v/v)）（２．０ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２２．２ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５４．０μＬ，０．１７ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。１．５時間後、飽和重曹水を加えて数分間撹拌した後、水／酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール：トリエチルアミン＝５０：１：１(v/v/v)）により精製し、粗成績体を得た。得られた粗成績体をジクロロメタンに溶解し、ｎ−ヘキサンへの添加により再沈殿を行い、化合物１６（２９．４ｍｇ，２２％）を白色粉体として得た。
【０１２０】
得られた化合物１６の物性データは、以下のとおりであった：融点：110〜112℃ (CH2Cl2)；31P-NMR (202.35MHz, CDCl3)：δ149.74, 150.12；MS(FAB): m/z 786 (MH+), 高分解能MS(FAB): 計算値 C41H49N5O9 (MH+): 786.3268. 実測値 786.3266。
【０１２１】
（実施例２）オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
上記実施例１で得た化合物１６を含有する１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物１７〜２０：以下の表１に示す）を、ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ ８９０９（ＡＢＩ社製）により０．２μｍｏｌスケールで合成した。ただし、標準的なホスホロアミダイトプロトコルにおけるキャッピングの工程を省いた。また、化合物１６（アミダイトユニット）は、テトラヒドロフランに溶解して用いた。なお、表１において、化合物１６はＸと表記する。アミダイトユニット（化合物１６）と５’−末端の水酸基とのカップリング時間は、１．５分（標準条件）から２０分に延長した。５’−末端がＤＭＴｒ基により保護されかつ固相支持されたオリゴヌクレオチド類縁体を、０．０５Ｍ炭酸カリウムのメタノール溶液で処理し、５％(w/v)塩酸で中和処理した後、溶媒を留去した。得られた粗成績体をゲルろ過カラムＮＡＰＴＭ １０Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社製）により粗精製した後、逆相ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣ−１０ＡＴＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＳＰＤ−１０ＡＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＴＯ−１０ＶＰ、分取カラムとしてＷａｔｅｒｓＸＴｅｒｒａ（登録商標）（１０ｍｍ×５０ｍｍ））により精製した。
【０１２２】
合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物１７〜２０）の純度は、逆相ＨＰＬＣ（ＷａｔｅｒｓＸＴｅｒｒａ（登録商標）ＭＳ Ｃ１８ ２．５μｍ，４．６ｍｍ×５０ｍｍ））により確認した（条件：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー（ｐＨ７．０）中、１ｍＬ／分で３０分の７→１３％(v/v)アセトニトリルのグラジエント）。また、分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ測定により決定した。結果を表１に示す。
【０１２３】
【表１】
2014043462.tif 000025
【０１２４】
また、比較のために、天然型のオリゴヌクレオチド（化合物２１）を含有するオリゴヌクレオチド（以下の表２に示す）、および公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ（５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンウリジン：非特許文献６に従って合成）を含有するオリゴヌクレオチド類縁体（化合物２２〜２４：以下の表２に示す）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し精製した。なお、表２において、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡはＹと表記する。
【０１２５】
（実施例３）融解温度（Ｔｍ）の測定
上記実施例２で合成したオリゴヌクレオチド鎖である化合物１７〜１９および２１〜２４（アンチセンス鎖）とセンス鎖（３’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−５’）とをアニーリング処理した後、Ｔｍ値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。Ｔｍ値とは、二重鎖核酸の５０％解離温度であり、この値が高いほど、核酸二重鎖が高い結合力を有する。
【０１２６】
ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、アンチセンス鎖４μＭ、およびセンス鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ−１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間１０℃に保った後、測定を開始した。温度は８５℃まで毎分０．５℃ずつ上昇させ、０．１℃間隔で２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果を表２に示す。
【０１２７】
【表２】
2014043462.tif 000026
【０１２８】
表２から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖ＤＮＡに対する親和性に比較して一本鎖ＲＮＡに対する親和性が高く、その親和性は、公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡと同等であった。また、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Ｔｍ値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡと同様に、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
【０１２９】
（実施例４）ヌクレオシド類縁体：２’−アミノ−２’−デオキシ−２’−Ｎ，４’−Ｃ−オキソメチレンアデノシン（化合物３４）の合成
【０１３０】
【化２３】
2014043462.tif 000027
【０１３１】
（１）化合物２８の合成
【０１３２】
【化２４】
2014043462.tif 000028
【０１３３】
窒素気流下、化合物２６（５００ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）を水：テトラヒドロフラン＝１：３(v/v)の溶液（４．５ｍＬ）に溶解し、トリブチルホスフィン（０．８５ｍＬ，３．４２ｍｍｏｌ）を加えて室温にて８時間撹拌した。溶媒留去後、残渣をメタノールに溶解し、ヘキサンで洗浄した。溶媒留去後、粗成績体２７を油状物質として得、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→２：１(v/v)）により簡易精製した後、次の反応に用いた。
【０１３４】
窒素気流下、粗成績体２７のジクロロメタン溶液（６ｍＬ）に、ピリジン（０．１６ｍＬ，２．０５ｍｍｏｌ）を加えた。氷冷後、トリフルオロ酢酸無水物（０．１０ｍＬ，０．７５ｍＬ）を加え、０．５時間撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→２：１(v/v)）により精製し、化合物２８（３４１．４ｍｇ：収率６２％（２工程））を白色泡状物質として得た。
【０１３５】
得られた化合物２８の物性データは、以下のとおりであった：IR (KBr): 3185, 2961, 1713, 1211, 1158, 1094 cm-1；1H-NMR (300MHz, CDCl3)：δ1.04 (9H, s), 1.59 (3H, s), 3.54, 3.78 (2H, AB, J = 10 Hz), 3.65, 4.02 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.28 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.55, 4.71 (2H, AB, J = 11 Hz), 4.58, 4.63 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.94 (1H, dd, J = 5.5 Hz, 8 Hz), 6.22 (1H, d, J = 8 Hz), 7.19-7.84 (20H, m), 8.68 (1H, s)；13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3)：δ12.1, 19.1, 27.0, 55.9, 63.7, 73.0, 75.4, 79.6, 85.0, 88.2, 112.1, 115.4, 127.7, 127.8, 128.1, 128.1, 128.2, 128.5, 128.7, 129.8, 151.1, 157.8, 163.9；MS(FAB): m/z 802 (MH+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C43H47F3N3O7Si (MH): 802.3135. 実測値 802.3143。
【０１３６】
（２）化合物２９の合成
【０１３７】
【化２５】
2014043462.tif 000029
【０１３８】
窒素気流下、上記（１）で得た化合物２８（１０３ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）のジクロロエタン溶液（２．５ｍＬ）にＮ６−ベンゾイルアデニン（８０．４ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（２４６μＬ，１．０１ｍｍｏｌ）を加え、透明になるまで加熱撹拌した。反応液を常温まで戻し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（１６．３μＬ，０．０９ｍｍｏｌ）を加えて３．５時間還流撹拌した。次いで、飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水、次いで重曹水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→３：１(v/v)）により精製し、化合物２９（９０．３ｍｇ：収率７７％）を白色泡状物質として得た。
【０１３９】
得られた化合物２９の物性データは、以下のとおりであった：IR (KBr): 3402, 3246, 3068, 2931, 2858, 1722, 1638, 1218, 1105 cm-1；1H-NMR (300 MHz, CDCl3) ：δ1.06 (9H, s), 3.54, 3.83 (2H, AB, J = 10 Hz), 3.78, 4.10 (2H, AB, J = 11 Hz), 4.44 (1H, d, J = 6 Hz), 4.51, 4.66 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.54, 4.76 (2H, AB, J = 11 Hz), 5.29 (1H, dd, J = 6 Hz, 7.5 Hz), 6.11 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.16-8.02 (25H, m), 8.26 (1H, s), 8.70 (1H, s)；13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3)：δ19.1, 26.9, 56.4, 63.4, 72.0, 73.8, 75.5, 79.7, 86.1, 89.1, 122.9, 127.8, 128.0, 128.2, 128.3, 128.6, 128.7, 128.8, 129.9, 130.0, 132.3, 132.6, 132.6, 133.6, 135.5, 135.7, 136.3, 136.9, 141.1, 149.5, 151.7, 152.6, 157.1, 164.6；MS(FAB): m/z 915 (MH+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C50H50F3N6O6Si (MH):915.3513. 実測値 915.3537。
【０１４０】
（３）化合物３０の合成
【０１４１】
【化２６】
2014043462.tif 000030
【０１４２】
窒素気流下、上記（２）で得た化合物２９（４０ｍｇ，０．０４４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１．０ｍＬ）にフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，４９μＬ，０．０４９ｍｍｏｌ）を加えて室温にて１５分間撹拌した。溶媒留去後、水を加えて酢酸エチルで３回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（２ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→２：３）により精製し、化合物３０（２５．５ｍｇ：収率８６％）を白色泡状物質として得た。
【０１４３】
得られた化合物３０の物性データは、以下のとおりであった：[α] D26 -15.9 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr): 3395, 2928, 3271, 1722, 1613, 1216, 1184 cm-1；1H-NMR (300 MHz, CDCl3)：δ1.60 (1H, s), 3.24 (1H, s), 3.40, 3.47 (2H, AB, J = 10 Hz), 3.78, 3.91 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.33 (2H, s), 4.52, 4.62 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.89 (1H, d, J = 6.0 Hz), 5.41 (1H, d, J = 6.0 Hz), 6.33 (1H, s), 7.12-7.71 (13H, m), 8.02 (2H, d, J = 7.5 Hz), 8.25 (1H, s), 8.68 (1H, s), 9.44 (1H, s)；MS(FAB): m/z 677 (MH+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C34H32F3N6O6 (MH): 677.2335. 実測値 677.2349。
【０１４４】
（４）化合物３１の合成
【０１４５】
【化２７】
2014043462.tif 000031
【０１４６】
窒素気流下、上記（３）で得た化合物３０（２１３ｍｇ，０．３１５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解し、ピリジニウムジクロマート（８７２ｍｇ，３．１５ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Åを３００ｍｇ加えて、室温にて１７時間撹拌した。水を加え、さらに酢酸（１．５ｍＬ）を加えて撹拌した後、酢酸エチルで希釈し、セライトろ過を行った。酢酸エチルで抽出し、有機層をシュウ酸緩衝液で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成績体３１を白色固体として得た（１６９ｍｇ：収率７８％）。
【０１４７】
得られた化合物３１の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 -43.8 (c 1.000, CHCl3)；IR (KBr): 3256, 3061, 2923, 2871, 1725, 1613, 1584, 1218, 1173 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ3.76, 3.97 (2H, AB, J = 10.6 Hz), 4.41, 4.60 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.44, 4.54 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.63 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.19 (1H, dd, J = 6.5 Hz, 8.7 Hz), 6.40 (1H, d, J = 6.5 Hz), 7.17-7.58 (13H, m), 7.99 (2H, d, J = 7.8 Hz), 8.37 (1H, s), 8.56 (1H, s), 9.57 (1H, s)；13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3)：δ55.8, 70.4, 73.8, 75.3, 78.7, 87.7, 90.4, 116.7, 122.6, 127.9, 128.2, 128.4, 128.6, 128.7, 133.0, 135.8, 136.6, 141.9, 149.5, 151.8, 157.4, 165.2。
【０１４８】
（５）化合物３３の合成
【０１４９】
【化２８】
2014043462.tif 000032
【０１５０】
窒素気流下、上記（４）で得た化合物３１（１．０９ｇ，１．５８ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、２８％(v/v)アンモニア水（１０ｍＬ）を加えて室温にて１９時間撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチル／水で抽出し、水層を回収して溶媒留去した。得られた粉末状の組成績体３２をアセトニトリルと共沸後、次の反応に用いた。
【０１５１】
粗成績体３２（７６６ｍｇ，１．５６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２９９ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１(v/v)）により精製し、白色固体３３（１８５ｍｇ：収率２５％（２工程））を得た。
【０１５２】
得られた化合物３３の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ3.94, 4.07 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.31 (1H, s), 4.43, 4.54 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.48 (1H, s), 4.63, 4.72 (2H, AB, J = 12 Hz), 5.61 (2H, s), 5.85 (1H, s), 6.01 (1H, s), 7.00-7.52 (10H, m), 8.15 (1H, s), 8.32 (1H, s)。
【０１５３】
（６）化合物３４の合成
【０１５４】
【化２９】
2014043462.tif 000033
【０１５５】
窒素気流下、上記（５）で得た化合物３３（３３．６ｍｇ，０．０７１ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解し、２０％水酸化パラジウムカーボン（３３ｍｇ）、シクロへキセン（１ｍＬ）を加え、窒素気流下、４時間加熱還流した。反応液を自然ろ過し、温メタノールで洗浄後、溶媒留去した。得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）により精製し、白色固体３４（１８．７ｍｇ：収率９０％）を得た。
【０１５６】
得られた化合物３４の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (400 MHz, CD3OD)：δ3.82, 3.98 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.34 (1H, s), 4.40 (1H, s), 5.76 (1H, s), 8.12 (1H, s), 8.26 (1H, s)。
【０１５７】
（実施例５）ヌクレオシド類縁体：２’−アミノ−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｎ，４’−Ｃ−オキソエチレンチミジン（化合物５１：ａｍｉｄｅ６ＮＨ）の合成
【０１５８】
【化３０】
2014043462.tif 000034
【０１５９】
（１）化合物３５の合成
【０１６０】
【化３１】
2014043462.tif 000035
【０１６１】
窒素気流下、化合物１（６．０３ｇ，１５．１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１５０ｍＬ）に、ジメチルスルホキシド（１３．０ｍＬ，１８１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（８．５０ｍＬ，６０．２ｍｍｏｌ）、および三酸化硫黄ピリジン錯体（９．６０ｇ，６０．２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４時間撹拌した。反応液に水を加えてクエンチし、ジエチルエーテルで希釈して３回抽出した。有機層を回収し、水で３回、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、化合物３５の粗成績体（４．２９ｇ）を得た。
【０１６２】
（２）化合物３６の合成
【０１６３】
【化３２】
2014043462.tif 000036
【０１６４】
窒素気流下、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（１１．５ｇ，３２．３ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン懸濁液（３０ｍＬ）に、０℃にてｎ−ブチルリチウム（１．６Ｍのｎ−ヘキサン溶液，２７．０ｍＬ，４３．１ｍｍｏｌ）を滴下し、室温にて１時間撹拌した。反応液に、上記（１）で得た化合物３５の粗成績体の無水テトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）を滴下し、室温にて１２時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液を加えてクエンチし、ジエチルエーテルで３回抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（８．９１ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５０ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１(v/v)）により精製し、化合物３６（３．２２ｇ：収率５４％（２工程））を無色油状物質として得た。
【０１６５】
得られた化合物３６の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.27 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 3.30, 3.32 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 4.24 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.50, 4.39 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 4.55-4.59 (m, 2H), 4.75 (AB, J = 12.5 Hz, 1H), 5.23 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 17.5 Hz, 1H), 5.75 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.18 (dd, J = 11.0, 17.5 Hz, 1H), 7.20-7.38 (m, 10H)。
【０１６６】
（３）化合物３７の合成
【０１６７】
【化３３】
2014043462.tif 000037
【０１６８】
窒素気流下、上記（２）で得た化合物３６（４．３６ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（１５０ｍＬ）にボラビシクロノナン（０．５Ｍテトラヒドロフラン溶液，６６ｍＬ，３３．０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温にて１９時間撹拌した。反応液に水を加えてクエンチし、水酸化ナトリウム水溶液（３Ｍ，２３．０ｍＬ，７０．４ｍｍｏｌ）、３５％(v/v)過酸化水素水（６．０ｍＬ，７０．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて０．５時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチルで３回抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（７．４３ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１(v/v)）により精製し、化合物３７（３．９６ｇ：収率８７％）を無色油状物質として得た。
【０１６９】
得られた化合物３７の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.32 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 1.77 (ddd, J = 4.0, 6.5, 15.5 Hz, 1H), 2.50 (ddd, J = 4.0, 8.5, 15.5 Hz, 1H), 2.85 (s, 1H), 3.29, 3.53 (AB, J = 10.0 Hz, 2H), 3.72-3.85 (m, 2H), 4.11 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.42, 4.50 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 4.53, 4.76 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.64 (dd, J = 4.0, 5.5 Hz, 1H), 5.76 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.23-7.33 (m, 10H)。
【０１７０】
（４）化合物３８の合成
【０１７１】
【化３４】
2014043462.tif 000038
【０１７２】
窒素気流下、上記（３）で得られた化合物３７（３．９６ｇ，９．５６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（３５０ｍｇ，２．８７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．０ｍＬ，２８．７ｍｍｏｌ）を加え、０℃にてｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（４．０ｍＬ，１５．３ｍｍｏｌ）を滴下し、反応液を室温にて１６時間撹拌した。反応液に水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで３回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（８．８２ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２００ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１(v/v)）により精製し、化合物３８（６．２８ｇ：定量的）を無色油状物質として得た。
【０１７３】
得られた化合物３８の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 +16.3 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr)：3068, 3031, 2932, 2857, 1454, 1428, 1382, 1209 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.99 (s, 9H), 1.28 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.85 (ddd, J = 7.0, 8.0, 14.5 Hz, 1H), 2.43 (ddd, J = 5.0, 6.5, 14.5 Hz, 1H), 3.28, 3.69 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.83-3.94 (AB, m, 2H), 4.20 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 4.33, 4.46 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 4.58 (dd, J = 3.5, 5.5 Hz, 1H), 4.52, 4.73 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 5.74 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 7.17-7.68 (m, 20H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ19.2, 26.3, 26.7, 26.9, 35.0, 59.9, 68.1, 72.5, 73.5, 78.0, 79.4, 86.8, 104.3, 113.1, 127.7, 127.7, 127.7, 127.9, 127.9, 128.4, 128.4, 129.6, 134.0, 134.0, 135.7, 138.2, 138.3；MS (FAB): m/z 675 (M+Na+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C40H48O6SiNa (M+Na+)：675.3118. 実測値：675.3115。
【０１７４】
（５）化合物３９の合成
【０１７５】
【化３５】
2014043462.tif 000039
【０１７６】
窒素気流下、上記（４）で得た化合物３８（５．８６ｇ，８．９８ｍｍｏｌ）の酢酸溶液（３０ｍＬ）に無水酢酸（１０ｍＬ，１０８ｍｍｏｌ）、０．１％(w/v)硫酸（４．０ｍＬ，酢酸溶液）を滴下し、室温にて２時間撹拌した。反応液に０℃にて飽和重曹水を加えてクエンチし、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を飽和重曹水で１回、水で１回、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（６．１８ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２００ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１(v/v)）により精製し、化合物３９（５．６７ｇ：収率９１％）を無色油状物質として得た。
【０１７７】
得られた化合物３９の物性データは、以下のとおりであった：[α]D24 -16.3 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr)：3069, 3031, 2931, 2857, 1748, 1428, 1369, 1219 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.01 (s, 9H), 1.82 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.96-2.13 (m, 2H), 3.37, 3.49 (AB, J = 10.0 Hz, 2H), 3.79-3.92 (m, 2H), 4.34-4.42 (m, 3H), 4.45, 4.56 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 5.27 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 6.01 (s, 1H), 7.20-7.67 (m, 20H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ19.2, 20.7, 21.1, 26.9, 35.9, 59.9, 73.3, 73.6, 74.8, 78.2, 86.8, 97.8, 127.5, 127.6, 127.7, 127.8, 127.9, 128.4, 128.5, 129.6, 134.0, 134.0, 135.7, 138.0, 138.3, 169.5, 169.8；MS (FAB): m/z 719 (M+Na+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C41H48O8SiNa (M+Na+)：719.3016. 実測値：719.2999。
【０１７８】
（６）化合物４０の合成
【０１７９】
【化３６】
2014043462.tif 000040
【０１８０】
窒素気流下、上記（５）で得た化合物３９（５．５７ｇ，８．００ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（２０ｍＬ）にチミン（１．４１ｇ，１１．２ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（６．８ｍＬ，２８．０ｍｍｏｌ）を滴下し、１．５時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却し、０℃にてトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（１．９ｍＬ，１０．４ｍｍｏｌ）を滴下し、３．５時間加熱還流した。反応液に０℃にて飽和重曹水を加えてクエンチし、酢酸エチルで希釈して３回抽出した。有機層を水で１回、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（５．７１ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５０ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：２(v/v)）により精製し、化合物４０（５．１４ｇ：収率８４％）を白色泡状物質として得た。
【０１８１】
得られた化合物４０の物性データは、以下のとおりであった：融点 45-48℃；[α]D25 +10.2 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr)：3172, 3068, 2930, 2857, 1747, 1693, 1470, 1372, 1234 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.01 (s, 9H), 1.48 (s, 3H), 1.76-1.83 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 2.03-2.11 (m, 1H), 3.41, 3.89 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.71-3.83 (m, 2H), 4.35 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.39, 4.44 (AB, J = 9.5 Hz, 2H), 4.38, 4.57 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 5.35 (dd, J = 5.0, 6.5 Hz, 1H), 6.08 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.20-7.41 (m, 16H), 7.49 (s, 1H), 7.60-7.65 (m, 4H), 7.83 (s, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.1, 19.2, 20.9, 27.0, 35.2, 59.4, 73.2, 73.5, 74.4, 75.4, 77.6, 86.2, 87.5, 111.3, 127.7, 127.8, 128.0, 128.1, 128.6, 128.7, 129.8, 133.6, 133.6, 135.6, 135.8, 137.5, 137.6, 150.4, 163.7, 170.2。
【０１８２】
（７）化合物４１の合成
【０１８３】
【化３７】
2014043462.tif 000041
【０１８４】
上記（６）で得た化合物４０（５．０４ｇ，６．６１ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１０ｍＬ）に、炭酸カリウム（４５０ｍｇ，３．３０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、水を加えて酢酸エチルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（４．７６ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：３(v/v)）により精製し、化合物４１（４．５４ｇ：収率９５％）を白色泡状物質として得た。
【０１８５】
得られた化合物４１の物性データは、以下のとおりであった：融点 62-64℃；[α]D26 -10.3 (c 1.00, CHCl3); IR (KBr)：3423, 3179, 3066, 2928, 2856, 1695, 1471, 1428, 1270 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.06 (s, 9H), 1.56 (s, 3H), 1.77 (ddd, J = 6.5, 8.0, 14.5 Hz, 1H), 2.14 (dt, J = 5.0, 14.5 Hz, 1H), 2.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.45, 3.85 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.73-3.88 (AB, m, 2H), 3.85 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.30 (m, 1H), 4.46, 4.49 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.56, 4.63 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 5.82 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.22-7.65 (m, 21H), 8.12 (s, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.2, 19.2, 27.0, 35.5, 59.5, 73.6, 74.2, 74.7, 75.2, 79.5, 87.2, 88.6, 111.1, 127.6, 127.8, 127.8, 128.1, 128.2, 128.4, 128.7, 128.7, 129.8, 129.8, 133.6, 135.6, 136.0, 137.2, 137.5, 150.9, 163.8。
【０１８６】
（８）化合物４２の合成
【０１８７】
【化３８】
2014043462.tif 000042
【０１８８】
窒素気流下、上記（７）で得た化合物４１（３．２６ｇ，４．５２ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）にトリエチルアミン（６．３ｍＬ，４５．２ｍｍｏｌ）および塩化メタンスルホニル（０．７０ｍＬ，９．０４ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて１．５時間撹拌した。０℃にて飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を水で１回、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（３．８０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：３(v/v)）により精製し、化合物４２（３．２９ｇ：収率９１％）を白色泡状物質として得た。
【０１８９】
得られた化合物４２の物性データは、以下のとおりであった：融点 57-62℃；[α]D22 +214.8 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr): 3168, 3068, 3031, 2932, 2857, 1694, 1471, 1361, 1178 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.02 (s, 9H), 1.44 (s, 3H), 1.85 (ddd, J = 6.5, 8.0, 14.5 Hz, 1H), 2.10 (dt, J = 5.0, 14.5 Hz, 1H), 3.07 (s, 3H), 3.44, 3.95 (AB, J = 6.5 Hz, 2H), 3.70-3.86 (m, 2H), 4.33 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 4.37, 4.42 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.45, 4.83 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 5.26 (dd, J = 3.0, 5.0 Hz, 1H), 6.01 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.18-7.63 (m, 21H), 8.29 (s, 1H)；13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3)：δ11.9, 19.1, 26.8, 35.1, 38.8, 59.1, 72.6, 73.4, 73.8, 75.7, 80.3, 86.7, 87.8, 111.2, 127.6, 127.6, 127.7, 128.1, 128.3, 128.4, 128.6, 129.7, 129.7, 133.3, 133.4, 135.3, 135.5, 137.1, 137.2, 150.5, 163.5。
【０１９０】
（９）化合物４３の合成
【０１９１】
【化３９】
2014043462.tif 000043
【０１９２】
上記（８）で得た化合物４２（３．１６ｇ，３．９５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（４０ｍＬ）に水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ，１２ｍＬ，１２．０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温にて１２時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液を加えてクエンチし、酢酸エチルで３回抽出した。水で１回、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（２．７２ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１(v/v)）で精製し、化合物４３（２．５５ｇ：収率８９％）を白色泡状物質として得た。
【０１９３】
得られた化合物４３の物性データは、以下のとおりであった：融点 56-58℃；[α]D26 +43.5 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr)：3357, 3181, 3068, 3031, 2929, 2856, 1695, 1472, 1428, 1281 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.02 (s, 9H), 1.71 (d, J = 1.5 Hz, 3H), 1.83-1.98 (m, 2H), 3.55, 3.94 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.70-3.86 (m, 2H), 3.96 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.06 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.28 (ddd, J = 3.0, 4.0, 9.0 Hz, 1H), 4.45, 4.70 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.49, 4.53 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 5.93 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.22-7.63 (m, 20H), 7.48 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.4, 19.2, 27.0, 35.3, 59.7, 72.8, 73.1, 73.8, 74.8, 83.9, 84.8, 85.2, 109.4, 127.8, 128.0, 128.1, 128.5, 128.8, 129.9, 133.6, 135.6, 136.8, 137.5, 137.7, 150.8, 164.1。
【０１９４】
（１０）化合物４４の合成
【０１９５】
【化４０】
2014043462.tif 000044
【０１９６】
窒素気流下、上記（９）で得た化合物４３（２．０７ｇ，２．８７ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に無水ピリジン（１．９ｍＬ，１７．２ｍｍｏｌ）を加え、０℃にてトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．４ｍＬ，８．６０ｍｍｏｌ）を滴下し、０．５時間撹拌した。０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を水で１回、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（２．５６ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）により精製し、化合物４４（２．０３ｇ：収率８３％）を白色泡状物質として得た。
【０１９７】
得られた化合物４４の物性データは、以下のとおりであった：融点 37-40℃；[α]D25 +37.1 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr)：3190, 3069, 2930, 2858, 1695, 1455, 1426, 1245, 1215, 1143 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.02 (s, 9H), 1.68 (s, 3H), 1.81-1.94 (m, 2H), 3.36, 3.69 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.72-3.86 (m, 2H), 4.38, 4.43 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.48, 4.72 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 4.57 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 5.35 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 6.20 (d, J =4.5 Hz, 1H), 7.19-7.63 (m, 21H), 8.81 (s, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.4, 19.2, 26.9, 34.2, 59.2, 71.4, 73.5, 73.7, 80.7, 81.7, 84.6, 87.7, 111.1, 127.8, 128.1, 128.2, 128.5, 128.7, 129.9, 129.9, 133.5, 135.6, 136.7, 137.3, 150.1, 163.4；MS (FAB): m/z 853 (M+H+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C43H48N2O9F3SiS (M+H+)：853.2802. 実測値：853.2813。
【０１９８】
（１１）化合物４５の合成
【０１９９】
【化４１】
2014043462.tif 000045
【０２００】
窒素気流下、上記（１０）で得た化合物４４（２．０３ｇ，２．３８ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）にアジ化ナトリウム（４６４ｍｇ，７．１４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１３時間撹拌した。反応液に水を加えてジエチルエーテルで３回抽出し、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（２．２０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５０ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１(v/v)）により精製し、化合物４５（１．８０ｇ：定量的）を白色泡状物質として得た。
【０２０１】
得られた化合物４５の物性データは、以下のとおりであった：融点 46-49℃；[α]D25 -5.1 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr): 3179, 3068, 2929, 2857, 2109, 1694, 1470, 1428, 1268 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.02 (s, 9H), 1.56 (s, 3H), 1.77 (ddd, J = 6.5, 8.0, 14.5 Hz, 1H), 2.15 (dt, J = 5.0, 14.5 Hz, 1H), 3.44, 3.91 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 3.70-3.85 (m, 2H), 3.97 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.28 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.42, 4.48 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 4.48, 4.78 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 5.99 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.20-7.63 (m, 20H), 7.49 (s, 1H), 8.66 (s, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.2, 19.2, 27.0, 35.4, 59.4, 65.3, 73.6, 73.6, 74.4, 79.2, 86.1, 87.7, 111.2, 127.7, 127.8, 128.2, 128.3, 128.4, 128.6, 128.8, 129.8, 128.9, 133.6, 135.4, 135.7, 137.0, 137.3, 150.3, 163.6；MS (FAB): m/z 746 (M+H+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C42H48N5O6Si (M+H+)：746.3374. 実測値：746.3404。
【０２０２】
（１２）化合物４６の合成
【０２０３】
【化４２】
2014043462.tif 000046
【０２０４】
窒素気流下、上記（１１）で得た化合物４５（１．７８ｇ，２．３９ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（２０ｍＬ）にフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，２．６ｍＬ，２．６０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温にて１７時間撹拌した。反応液に水を加えて酢酸エチルで３回抽出し、有機層を飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（２．２０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７５ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１(v/v)）により精製し、化合物４６（１．２２ｇ：定量的）を白色泡状物質として得た。
【０２０５】
得られた化合物４６の物性データは、以下のとおりであった：融点 45-50℃；[α]D25 +10.2 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr)：3441, 3181, 3063, 2927, 2108, 1693, 1469, 1455, 1267 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.56 (s, 3H), 1.66 (br, 1H), 1.76 (dt, J = 6.0, 15.0 Hz, 1H), 2.21 (dt, J = 6.0, 15.0 Hz, 1H), 3.44, 3.82 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.75 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.47, 4.53 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 4.55, 4.83 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 6.10 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.22-7.38 (m, 10H), 7.44 (s, 1H), 8.34 (s, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.2, 34.9, 58.3, 65.0, 73.4, 73.8, 74.6, 79.6, 86.4, 87.9, 111.5, 127.8, 128.2, 128.4, 128.5, 128.7, 128.8, 135.4, 136.9, 137.1, 150.5, 163.8；MS (FAB): m/z 508 (M+H+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C26H30N5O6 (M+H+)：508.2196. 実測値：508.2204。
【０２０６】
（１３）化合物４７の合成
【０２０７】
【化４３】
2014043462.tif 000047
【０２０８】
窒素気流下、上記（１２）で得た化合物４６（１．２２ｇ，２．４０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）に粉末状のモレキュラーシーブス４Å（３．０ｇ）および二クロム酸ピリジニウム（１０．９ｇ，２８．８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１２時間撹拌した。反応液に酢酸（５．０ｍＬ）および水を加え、酢酸エチルで希釈してセライトろ過した。ろ液を酢酸エチルで３回抽出し、有機層をシュウ酸水溶液（０．４Ｍ，２００ｍＬ）で１回、シュウ酸アンモニウム水溶液（０．２Ｍ，２００ｍＬ）で１回、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（３．２０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７５ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝５０：５０：１(v/v/v)）により精製し、化合物４７（１．１８ｇ：収率９４％）を白色泡状物質として得た。
【０２０９】
得られた化合物４７の物性データは、以下のとおりであった：融点 78-81℃；[α]D25 -29.4 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr)：3510, 3179, 3033, 2929, 2108, 1705, 1470, 1455, 1269, 1213 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.56 (s, 3H), 2.71, 2.88 (AB, J = 16.5 Hz, 2H), 3.77, 3.94 (AB, J = 10.0 Hz, 2H), 3.99 (dd, J = 5.5, 7.0 Hz, 2H), 4.37 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.53, 4.61 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 4.49, 4.88 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 6.22 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.20-7.48 (m, 11H), 9.65 (s, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.1, 38.0, 65.0, 73.8, 74.0, 75.3, 80.3, 85.3, 86.4, 111.7, 127.8, 128.1, 128.2, 128.5, 128.5, 128.9, 135.6, 136.8, 137.0, 150.1, 164.4, 175.1；MS (FAB): m/z 522 (M+H+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C26H28N5O7 (M+H+)：522.1989. 実測値：522.1979。
【０２１０】
（１４）化合物４８の合成
【０２１１】
【化４４】
2014043462.tif 000048
【０２１２】
上記（１３）で得た化合物４７（２４１ｍｇ，０．４６２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン／水（５：１(v/v)）溶液（２４１ｍｇ，０．４６２ｍｍｏｌ，６ｍＬ）にトリメチルホスフィン（１Ｍトルエン溶液，０．５５ｍＬ，０．５５０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温にて２４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（２９３ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｇ，クロロホルム：メタノール＝３０：１(v/v)）により精製し、化合物４８（１０６ｍｇ：収率４３％）を白色粉末として得た。
【０２１３】
得られた化合物４８の物性データは、以下のとおりであった：融点 112-114℃；[α]D21 +78.9 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr): 3500, 3169, 3063, 2927, 1684, 1454, 1367, 1273, 1211 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.36 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.40, 2.57 (AB, J = 18.0 Hz, 2H), 3.58, 3.72 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 4.05 (dd, J = 3.5, 5.5 Hz, 2H), 4.24 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.54, 4.58 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 4.51, 4.65 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 5.76 (s, 1H), 6.86 (br, 1H), 7.24-7.35 (m, 10H), 7.92 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 9.40 (br, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ11.9, 38.6, 55.7, 68.7, 70.6, 71.9, 73.6, 83.8, 90.1, 109.6, 127.5, 127.9, 128.0, 128.2, 128.4, 128.7, 135.5, 137.0, 137.1, 150.7, 164.2, 169.6；MS (FAB)：m/z 478(M+H+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C26H28N3O6 (M+H+)：478.1978. 実測値：478.1983。
【０２１４】
（１５）化合物４９の合成
【０２１５】
【化４５】
2014043462.tif 000049
【０２１６】
窒素気流下、上記（１４）で得た化合物４８（５０ｍｇ，０．１０５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２ｍＬ）に２０％(v/v)水酸化パラジウムカーボン（５０ｍｇ）を加え、水素気流下、室温にて２６時間撹拌した。ひだ折りろ紙によりろ過後、メタノールで洗浄後、溶媒留去した。メタノール（２ｍＬ）および２０％(v/v)水酸化パラジウムカーボン（５０ｍｇ）を加え、さらに水素気流下、２４時間撹拌した。ひだ折りろ紙によりろ過後、メタノールで洗浄後、溶媒留去した。メタノールで再結晶を行い、化合物４９（１９．１ｍｇ：収率６１％）を白色固体として得た。
【０２１７】
得られた化合物４９の物性データは、以下のとおりであった：[α]D23 +36.5 (c 0.200, CH3OH)；IR (KBr): 3449, 3318, 3175, 3060, 2926, 2819, 1707, 1651, 1469, 1386, 1272, 1215 cm-1；1H-NMR (300 MHz, CD3OD)：δ1.86 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.29, 2.46 (AB, J = 18.0 Hz, 2H), 3.69, 3.75 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 3.83 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.69 (s, 1H), 8.36 (d, J = 1.0 Hz, 1H)；13C-NMR (100.53 MHz, CD3OD)：δ12.5, 38.8, 60.0, 61.8, 64.4, 86.0, 91.0, 110.1, 137.8, 152.1, 166.6, 173.3；MS (FAB)：m/z 298(M+H+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C26H28N3O6 (M+H+)：298.1039. 実測値：298.1044。
【０２１８】
（１６）化合物５０の合成
【０２１９】
【化４６】
2014043462.tif 000050
【０２２０】
窒素気流下、上記（１５）で得た化合物４９（２８ｍｇ，０．０９４ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２ｍＬ）に、０℃にて４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（９５．７ｍｇ，０．２８３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（１５９ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５．０ｇ，クロロホルム：メタノール＝２０：１）により精製し、化合物５０（４５．９ｍｇ：収率８１％）を白色泡状固体として得た。
【０２２１】
得られた化合物５０の物性データは、以下のとおりであった：[α]D23 +80.7 (c 1.00, CHCl3)；IR (KBr): 3562, 3341, 3062, 2933, 2838, 1704, 1657, 1608, 1509, 1465, 1253 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)：δ1.21 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.42 (s, 2H), 3.36 (s, 2H), 3.77 (s, 6H), 3.93 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.67 (s, 1H), 6.86-7.48 (m, 13H), 7.90 (d, J = 1.0 Hz, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 12.26, 39.34, 55.72, 59.80, 64.27, 65.71, 79.46, 85.55, 88.07, 91.72, 110.64, 114.27, 128.20, 129.02, 129.46, 131.46, 136.40, 136.61, 136.90, 145.76, 152.01, 160.36, 166.56, 173.01；MS (FAB): m/z 600 (M+H+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C26H28N3O6 (M+H+)：600.2346. 実測値：600.2347。
【０２２２】
（１７）化合物５１の合成
【０２２３】
【化４７】
2014043462.tif 000051
【０２２４】
窒素気流下、上記（１６）で得た化合物５０（７２ｍｇ，０．１２０ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン／アセトニトリル（３：１(v/v)）溶液（２．０ｍＬ）に１Ｈ−テトラゾール（１０．１ｍｇ，０．１４４ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミジド（４６μＬ，０．１４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１２時間撹拌した。０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を飽和重曹水で１回、飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（９９ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｇ，クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、粗成績体（７０．２ｍｇ，７３％）を得た。得られた粗成績体をジクロロメタンに溶解し、ｎ−ヘキサンへの添加により再沈殿を行い、化合物５１（４０．１ｍｇ，４２％）を白色固体として得た。
【０２２５】
得られた化合物５１の物性データは、以下のとおりであった：31P-NMR (161.83 MHz, CHCl3)：δ149.13, 150.91；MS (FAB): m/z 800 (M+H+), 高分解能MS(FAB)：計算値 C26H28N3O6 (M+H+)：800.3424. 実測値：800.3406。
【０２２６】
（実施例６）オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
上記実施例５で得た化合物５１を含有する１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物５２〜５５：以下の表３に示す）を、ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ ８９０９（ＡＢＩ社製）により０．２μｍｏｌスケールで合成した。ただし、標準的なホスホロアミダイトプロトコルにおけるキャッピングの工程を省いた。また、化合物５１（アミダイトユニット）は、テトラヒドロフランに溶解して用いた。なお、表３において、化合物５１はＸと表記する。アミダイトユニット（化合物５１）と５’−末端の水酸基とのカップリング時間は、１．５分（標準条件）から３０分に延長した。５’−末端がＤＭＴｒ基により保護されかつ固相支持されたオリゴヌクレオチド類縁体を、０．０５Ｍ炭酸カリウムのメタノール溶液で処理し、５％(w/v)塩酸で中和処理した後、溶媒を留去した。得られた粗成績体をゲルろ過カラムＮＡＰＴＭ １０Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社製）により粗精製した後、逆相ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣ−１０ＡＴＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＳＰＤ−１０ＡＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＴＯ−１０ＶＰ、分取カラムとしてＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ ＯＳＴ  Ｃ１８ ２．５μｍ（１０ｍｍ×５０ｍｍ））により精製した。
【０２２７】
合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物５２〜５５）の純度は、逆相ＨＰＬＣ（ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８ ２．５μｍ，４．６ｍｍ×５０ｍｍ））により確認した（条件：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー（ｐＨ７．０）中、１ｍＬ／分で３０分の７→１３％(v/v)アセトニトリルのグラジエント）。また、分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ測定により決定した。結果を表３に示す。
【０２２８】
【表３】
2014043462.tif 000052
【０２２９】
（実施例７）融解温度（Ｔｍ）の測定
上記実施例５で合成したオリゴヌクレオチド鎖である化合物５２〜５４（アンチセンス鎖）とセンス鎖（３’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−５’）とをアニーリング処理した後、Ｔｍ値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
【０２３０】
ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、アンチセンス鎖４μＭ、およびセンス鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ−１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間１０℃に保った後、測定を開始した。温度は８５℃まで毎分０．５℃ずつ上昇させ、０．１℃間隔で２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果を表４に示す。
【０２３１】
【表４】
2014043462.tif 000053
【０２３２】
表４から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖ＤＮＡに対する親和性に比較して一本鎖ＲＮＡに対する親和性が高く、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Ｔｍ値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
【０２３３】
（実施例８）ヌクレオシド類縁体：Ｎ２’−メチル−２’−アミノ−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｎ，４’−Ｃ−オキソエチレンチミジン（化合物６０：ａｍｉｄｅ６ＮＭｅ）の合成
【０２３４】
【化４８】
2014043462.tif 000054
【０２３５】
（１）化合物５６の合成
【０２３６】
【化４９】
2014043462.tif 000055
【０２３７】
窒素気流下、化合物４８（９４ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２．０ｍＬ）に、０℃にて１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（０．１２ｍＬ，０．７９ｍｍｏｌ）およびベンジルクロロメチルエーテル（５５μＬ，０．３９ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間撹拌した。０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を水で１回、飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（１１２ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５．０ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、化合物５６（１０１ｍｇ：収率８６％）を白色泡状固体として得た。
【０２３８】
得られた化合物５６の物性データは、以下のとおりであった： 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.43 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.45, 2.60 (AB, J = 17.5 Hz, 2H), 3.59, 3.76 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.96 (dd, J = 4.0, 5.5 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.51, 4.63 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 4.55, 4.60 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 4.69 (s, 2H), 5.43, 5.46 (AB, J = 9.5 Hz, 2H), 5.74 (s, 1H), 6.15 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.25-7.38 (m, 15H), 7.92 (d, J = 1.0 Hz, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.53, 38.68, 56.09, 70.27, 70.57, 72.27, 72.37, 73.69, 83.76, 90.53, 109.48, 127.55, 127.64, 127.71, 127.91, 128.30, 128.34, 128.58, 128.73, 133.97, 136.59, 136.88, 137.82, 150.79, 163.29, 169.26。
【０２３９】
（２）化合物５７の合成
【０２４０】
【化５０】
2014043462.tif 000056
【０２４１】
窒素気流下、上記（１）で得た化合物５６（１３０ｍｇ，０．２１８ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２．０ｍＬ）に０℃にて水素化ナトリウム（１０．４ｍｇ，０．２６０ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間撹拌した後、０℃にてヨウ化メチル（６８μＬ，１．１ｍｍｏｌ）を加えて２時間撹拌した。０℃にて反応液に水を加えてクエンチし、ジエチルエーテルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（１３９ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５．０ｇ，ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）で精製し、化合物５７（７９．６ｍｇ，６０％）を白色泡状固体として得た。
【０２４２】
得られた化合物５７の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.45 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.42, 2.60 (AB, J = 17.0 Hz, 2H), 3.07 (s, 3H), 3.68, 3.74 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 3.82 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.55, 4.60 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 4.70 (s, 2H), 5.43, 5.47 (AB, J = 9.5 Hz, 2H), 4.56 (s, 2H), 5.66 (s, 1H), 7.23-7.39 (m, 15H), 7.91 (d, J = 1.0 Hz, 1H); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ12.55, 34.17, 38.77, 63.11, 68.51, 70.20, 71.19, 72.27, 72.72, 73.64, 84.24, 88.87, 109.38, 127.52, 127.66, 127.70, 127.89, 128.27, 128.30, 128.32, 128.62, 128.69, 133.93, 136.69, 136.92, 137.81,150.68, 163.35, 167.29。
【０２４３】
（３）化合物５８の合成
【０２４４】
【化５１】
2014043462.tif 000057
【０２４５】
２０％水酸化パラジウムカーボン（９１．０ｍｇ）のエタノール懸濁液（２．０ｍＬ）に上記（２）で得た化合物５７（７９．６ｍｇ，０．１３０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（８．０ｍＬ）とシクロヘキセン（１．３ｍＬ，１３ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。水酸化パラジウムカーボンをひだ折りろ紙によりろ過後、溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２．０ｇ，クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、化合物５８（４０．８ｍｇ：ｑｕａｎｔ．）を白色粉末として得た。
【０２４６】
得られた化合物５８の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (400 MHz, CD3OD)：δ1.77 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.21, 2.39 (AB, J = 18.0 Hz, 2H), 3.02 (s, 3H), 3.57, 3.64 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 3.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.60 (s, 1H), 8.18 (d, J = 1.0 Hz, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)：δ12.54, 34.92, 39.01, 61.62, 64.88, 67.70, 86.54, 89.34, 110.21, 137.46, 152.07, 166.63, 170.82。
【０２４７】
（４）化合物５９の合成
【０２４８】
【化５２】
2014043462.tif 000058
【０２４９】
窒素気流下、上記（３）で得た化合物５８（２６．８ｍｇ，０．０８６１ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２．０ｍＬ）に０℃にて４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１７５ｍｇ，０．５６７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１７時間撹拌した。０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体（３２０ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５．０ｇ，クロロホルム：メタノール＝２５：１）で精製し、化合物５９（３６．６ｍｇ：収率６９％）を白色泡状固体として得た。
【０２５０】
得られた化合物５９の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.29 (s, 3H), 2.44, 2.53 (AB, J = 17.5 Hz, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.33, 3.37 (AB, J = 12.0 Hz, 6H), 3.75 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.94 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.61 (s, 1H), 6.80-7.41 (m, 14H), 7.90 (s, 1H)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)：δ11.91, 34.51, 38.54, 55.20, 62.87, 65.43, 65.98, 84.96, 86.88, 88.60, 110.39, 111.34, 127.20, 128.07, 130.10, 134.92, 135.08, 144.05, 152.35, 158.69, 164.37, 168.32。
【０２５１】
（５）化合物６０の合成
【０２５２】
【化５３】
2014043462.tif 000059
【０２５３】
上記（４）で得た化合物５９（１１６ｍｇ，０．１８９ｍｍｏｌ）を、ピリジン、トルエンで共沸した後、窒素気流下、無水ジクロロメタン溶液（１．９ｍＬ）とし、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（０．２０ｍＬ，１．１３ｍｍｏｌ）を加えた。その後、０℃にて２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（８５μＬ，０．３７８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて６時間撹拌した。飽和重曹水を加えてしばらく撹拌した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝３０：１：０．０５）により精製し、白色泡状固体を得た。得られた白色泡状固体をジクロロメタンに溶解し、ｎ−ヘキサンへの添加により再沈殿を行い、化合物６０（７０ｍｇ：収率４５％）を白色粉体として得た。
【０２５４】
得られた化合物６０の物性データは、以下のとおりであった：131P-NMR (161.83 MHz, CDCl3)：δ148.84, 149.97。
【０２５５】
（実施例９）ヌクレオシド類縁体：Ｎ２’−メチル−２’−アミノ−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｎ，４’−Ｃ−オキソメチレンチミジン（化合物６５：ａｍｉｄｅＮＭｅ）の合成
【０２５６】
【化５４】
2014043462.tif 000060
【０２５７】
（１）化合物６１の合成
【０２５８】
【化５５】
2014043462.tif 000061
【０２５９】
窒素気流下、化合物１３（３０ｍｇ，０．０６５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．７ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（３８．６μＬ，０．２５９ｍｍｏｌ）を加え、１５分間撹拌した後、ベンジルクロロメチルエーテル（１７．７μＬ，０．１２９ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、３０分間撹拌した。メタノールを加え、撹拌した後、溶媒留去し、酢酸エチルで希釈した。水を加え、酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→１：１）により精製し、化合物６１（３１ｍｇ：収率８２％）を白色泡状固体として得た。
【０２６０】
得られた化合物６１の物性データは、以下のとおりであった：[α]D + 61.6 (c 0.700, CHCl3, 26℃). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.62 (3H, s), 3.95, 4.10 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.11 (1H, s), 4.22 (1H, s), 4.52, 4.56 (2H, AB, J = 13.5 Hz), 4.59, 4.64 (2H, AB, J = 11 Hz), 4.72, 4.69 (2H, AB, J = 13 Hz), 5.43 (1H, s), 5.43, 5.48 (2H, AB, J = 9.5 Hz), 7.54-7.20 (15H, m), 7.54 (1H, s). 13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3)：δ12.92, 58.47, 63.06, 70.26, 72.31, 72.42, 73.98, 78.72, 86.37, 86.58, 109.99, 127.68, 127.72, 127.75, 128.09, 128.29, 128.31, 128.52, 128.54, 133.93, 136.27, 137.40,137.76, 150.63, 163.15, 172.57。
【０２６１】
（２）化合物６２の合成
【０２６２】
【化５６】
2014043462.tif 000062
【０２６３】
窒素気流下、上記（１）で得た化合物６１（３０ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）に溶かし、氷冷下、水素化ナトリウムを加え、３０分間撹拌した。氷冷下、ヨウ化メチル（１５．９μＬ，０．２５５ｍｍｏｌ）を加え、撹拌しながら緩やかに室温まで上昇させた。３０分後、水を加え１０分間撹拌した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→１：１）により精製し、化合物６２（２６．１ｍｇ：収率８６％）を白色泡状固体として得た。
【０２６４】
得られた化合物６２の物性データは、以下のとおりであった：[α]D + 39.0 (c 0.350, CHCl3, 23℃). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.65 (3H, s), 2.96 (3H, s), 3.95, 4.10 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.01 (1H, s), 4.06 (1H, s), 4.50, 4.59 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.59, 4.63 (2H, AB, J = 11 Hz), 4.70 (2H, s), 5.40 (1H, s), 5.44, 5.48 (2H, AB, J = 9.5 Hz),  7.19-7.39 (15H, m), 7.52 (1H, s). 13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3)：δ 12.92, 28.39, 63.23, 64.52, 70.24, 72.26, 72.54, 73.84, 78.06, 84.42, 87.09, 109.94, 127.58, 127.62, 127.65, 127.70, 127.99, 128.24, 128.27, 128.48, 128.50, 133.78, 136.39, 137.41, 137.72, 150.52, 163.09, 170.93。
【０２６５】
（３）化合物６３の合成
【０２６６】
【化５７】
2014043462.tif 000063
【０２６７】
窒素気流下、上記（２）で得た化合物６２（１３０ｍｇ，０．２１８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２ｍＬ）に溶解し、２０％水酸化パラジウムカーボン（１３０ｍｇ）を加え、水素気流下、室温にて１時間撹拌した。反応液を自然ろ過し、温メタノールで洗浄した後、溶媒留去した。得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）により精製し、化合物６３（６１．７ｍｇ：収率９５％）を白色固体として得た。
【０２６８】
得られた化合物６３の物性データは、以下のとおりであった：[α]D + 63.7 (c 0.900, CHCl3, 26℃). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6)：δ1.77 (3H, s), 2.88 (3H, s), 3.67, 3.84 (2H, AB, J = 12.5 Hz), 4.03 (1H, s), 4.12 (1H, s), 5.28 (1H, s), 5.38 (1H, s), 5.90 (1H, s), 7.73 (1H, s), 11.44 (1H, s). 13C-NMR (100.53 MHz, CD3OD)：δ12.64, 28.65, 55.75, 68.53, 72.85, 85.48, 89.99, 110.93, 137.24, 151.96, 166.45, 174.14。
【０２６９】
（４）化合物６４の合成
【０２７０】
【化５８】
2014043462.tif 000064
【０２７１】
窒素気流下、ピリジンで共沸した上記（３）で得た化合物６３（６１．７ｍｇ，０．２０８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２ｍＬ）に溶かし、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１０６ｍｇ，０．３１１ｍｍｏｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。飽和重曹水を加えてしばらく撹拌した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝２０：１：０．０５）により精製し、化合物６４（１１３ｍｇ：収率９０％）を白色泡状固体として得た。
【０２７２】
得られた化合物６３の物性データは、以下のとおりであった：[α]D + 2.0 (c 0.300, CHCl3, 25℃). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.66 (3H, s), 2.97 (3H, s), 3.62, 3.90 (2H, AB, J = 12.5 Hz), 3.77 (6H, s), 4.13 (1H, s), 4.42 (1H, s), 5.40 (1H, s), 6.82-6.85 (4H, m), 7.21-7.34 (7H, m), 7.43 (2H, d, J = 8 Hz), 7.77 (1H, s), 9.45 (1H, s)。
【０２７３】
（５）化合物６５の合成
【０２７４】
【化５９】
2014043462.tif 000065
【０２７５】
窒素気流下、ピリジン、トルエンで共沸した上記（４）で得た化合物６４（１．１８ｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル／テトラヒドロフラン（３：１）（２３ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２５３ｍｇ，１．４８ｍｍｏｌ）、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（７５２μＬ，２．３７ｍｍｏｌ）を加え、室温下５時間撹拌した。飽和重曹水を加えてしばらく撹拌した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝３０：１：０．０５）により精製し、白色泡状固体を得た。得られた白色泡状固体をジクロロメタンに溶解し、ｎ−ヘキサンへの添加により再沈殿を行い、化合物６５（１．５３ｇ：収率９７％）を白色粉体として得た。
【０２７６】
得られた化合物６５の物性データは、以下のとおりであった：31P-NMR (161.83 MHz, CDCl3)：δ150.43, 150.59。
【０２７７】
（実施例１０）オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
上記実施例９で得た化合物６５を含有する１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物６６〜６９：以下の表５に示す）を、ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ ８９０９（ＡＢＩ社製）により０．２μｍｏｌスケールで合成した。また、化合物６５（アミダイトユニット）は、アセトニトリルに溶解して用いた。なお、表５において、化合物６５はＸと表記する。アミダイトユニット（化合物６５）と５’−末端の水酸基とのカップリング時間は、１．５分（標準条件）から５分に延長した。５’−末端がＤＭＴｒ基により保護されかつ固相支持されたオリゴヌクレオチド類縁体を、飽和アンモニア水で処理し、５％(w/v)塩酸で中和処理した後、溶媒を留去した。得られた粗成績体をゲルろ過カラムＮＡＰＴＭ １０Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社製）により粗精製した後、逆相ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣ−１０ＡＴＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＳＰＤ−１０ＡＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＴＯ−１０ＶＰ、分取カラムとしてＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ ＯＳＴ  Ｃ１８ ２．５μｍ（１０ｍｍ×５０ｍｍ））により精製した。
【０２７８】
合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物６６〜６９）の純度は、逆相ＨＰＬＣ（ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８ ２．５μｍ，４．６ｍｍ×５０ｍｍ））確認した（条件：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー（ｐＨ７．０）中、１ｍＬ／分で３０分の７→１３％(v/v)アセトニトリルのグラジエント）。また、分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ測定により決定した。結果を表５に示す。
【０２７９】
【表５】
2014043462.tif 000066
【０２８０】
（実施例１１）融解温度（Ｔｍ）の測定
上記実施例１０で合成したオリゴヌクレオチド鎖である化合物６６〜６８（アンチセンス鎖）とセンス鎖（３’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−５’）とをアニーリング処理した後、Ｔｍ値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
【０２８１】
ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、アンチセンス鎖４μＭ、およびセンス鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ−１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間１０℃に保った後、測定を開始した。温度は８５℃まで毎分０．５℃ずつ上昇させ、０．１℃間隔で２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果を表６に示す。
【０２８２】
【表６】
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【０２８３】
表６から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖ＤＮＡに対する親和性に比較して一本鎖ＲＮＡに対する親和性が高く、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Ｔｍ値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡと同様に、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
【０２８４】
（実施例１２）ヌクレアーゼ耐性の評価
上記実施例２で合成した化合物２０（ａｍｉｄｅＮＨ）、実施例６で合成した化合物５５（ａｍｉｄｅ６ＮＨ）および実施例１０で合成した化合物６９（ａｍｉｄｅＮＭｅ）の各オリゴヌクレオチドについて、オリゴヌクレオチドを３’側から分解するエキソヌクレアーゼに対する耐性を検討した。従来の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡおよびＮＣ（ＮＨ）（２’，４’−ＢＮＡＮＣ（ＮＨ）：架橋構造に窒素原子が含まれ得るがアミドではない構造）をコントロールとした。
【０２８５】
７５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを含むバッファー溶液（６５μＬ）を３７℃にて５分間保持した後、０．１７５ｍｇ／ｍＬの蛇毒ホスホジエステラーゼ（Crotalus admanteus venom phosphodiesterase (CAVP)：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を含むバッファー溶液（３５μＬ）を混合した。オリゴヌクレオチドの分解をＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣ−２０ＡＤ，ＳＰＤ−２０Ａ，ＣＴＯ−２０Ａ，ＳＩＬ−２０ＡＣ、分析カラムとしてＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８ ２．５μｍ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ））によって経時的に測定した。用いたバッファーの組成（終濃度）は、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭであり、測定前に十分に脱気した。ＨＰＬＣによる定量条件は、以下に示すとおりである。
【０２８６】
［ＨＰＬＣ定量条件］
移動相：Ａ液  ０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー，ｐＨ７．０
Ｂ液  ０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー：アセトニトリル＝１：１(v/v)，ｐＨ７．０
グラジエント：５→１１．４％(v/v)Ｂ液（１６分）
使用カラム：ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８ ２．５μｍ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ）
流速：０．８ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ（２６８ｎｍ）
【０２８７】
結果を図１に示す。図１中、「残存オリゴヌクレオチド（％）」とは、０時点における未分解オリゴヌクレオチド（１０ｍｅｒ）に対する、測定時点における未分解オリゴヌクレオチド（１０ｍｅｒ）の残存率を示す。
【０２８８】
図１から、化合物２０（ａｍｉｄｅＮＨ）、化合物５５（ａｍｉｄｅ６ＮＨ）および化合物６９（ａｍｉｄｅＮＭｅ）は、従来の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドを大きく上回る酵素耐性を有することがわかった。
【０２８９】
（実施例１３）オリゴヌクレオチドの血清（ＦＢＳ）中における安定性の評価
１ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチド（５’−（ＸＴＸＴＸＴＸＴＸＴ）−３’、実施例９で得た化合物６５を実施例１０の方法に従い配列中のＸの箇所に導入したもの）を１０μＬの２５％ＦＢＳに混合し、さらに滅菌水を加えて全量を２５μＬに調製した。この溶液を３７℃にて所定時間インキュベートした後、所定時間ごとに５μＬずつ計りとり、９０℃に熱した後、氷冷し、ＦＢＳ中の核酸分解酵素を失活させた。このサンプルは、ＨＰＬＣによる解析まで−８０℃にて保存した。ＨＰＬＣ解析のために、滅菌水を加えて全量を２００μＬに調整し、オリゴヌクレオチドの分解をＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣ−２０ＡＤ，ＳＰＤ−２０Ａ，ＣＴＯ−２０Ａ，ＳＩＬ−２０ＡＣ）によって経時的に測定した。用いたバッファーの組成（終濃度）は、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭであり、測定前に十分に脱気した。なお、比較検討のためにＸが天然のＤＮＡ−Ｔの配列およびＸがＬＮＡ−Ｔの配列についても同様の操作で実験を行なった。
【０２９０】
［ＨＰＬＣ定量条件］
移動相：Ａ液  ０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー，ｐＨ７．０
Ｂ液  ０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー：アセトニトリル＝１：１，ｐＨ７．０
グラジエント：１０→２６％(v/v)Ｂ液（１６分）
使用カラム：ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８ ２．５μｍ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ）
流速：０．８ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ（２６８ｎｍ）
【０２９１】
結果を表７に示す。表７中、「残存オリゴヌクレオチド（％）」とは、０時点における未分解オリゴヌクレオチド（１０ｍｅｒ）に対する、測定時点における未分解オリゴヌクレオチド（１０ｍｅｒ）の残存率を示す。
【０２９２】
【表７】
2014043462.tif 000068
【０２９３】
表７から明らかなように、本発明の化合物６５を導入したオリゴヌクレオチドは、天然ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドやＬＮＡ修飾したオリゴヌクレオチドに比べて、血清中での安定性がはるかに高く、ｉｎ  ｖｉｖｏでの優れた効果が期待できる。
【０２９４】
（実施例１４）ヌクレオシド類縁体：Ｎ２’−メチル−２’−アミノ−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｎ，４’−Ｃ−オキソメチレン−４−（１，２，４，−トリアゾール−１−イル）チミジン（化合物７０：チミジンアナログのトリアゾリル体、５-メチルシトシンアナログ等価体）の合成
【０２９５】
【化６０】
2014043462.tif 000069
【０２９６】
窒素気流下、ピリジン、トルエンで共沸した１，２，４−トリアゾール（３０６ｍｇ，４．４３ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、塩化ホスホリル（９４μＬ，１．０１ｍｍｏｌ）を加え、１０分間激しく撹拌した。続いてトリエチルアミン（７００μＬ，５．０４ｍｍｏｌ）を加え、１時間激しく撹拌した。氷冷下、化合物６５（１００ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２ｍＬ）に溶解し、反応液に加え、室温にて２時間激しく撹拌した。飽和重曹水を加えて撹拌した後酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物７０（９０．４ｍｇ：収率８５％）を白色泡状固体として得た。
【０２９７】
得られた化合物７０の物性データは、以下のとおりであった：31P-NMR (161.83 MHz, CDCl3)：δ150.9, 149.6。
【０２９８】
（実施例１５）ヌクレオシド類縁体：Ｎ−メチル−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−アミノオキソメチレン−５−メチルウリジン（化合物８１：ａｍｉｄｅＮＣ−ＮＭｅ）の合成
【０２９９】
【化６１】
2014043462.tif 000070
【０３００】
（１）化合物７１の合成
【０３０１】
【化６２】
2014043462.tif 000071
【０３０２】
化合物８（３ｇｍ，４．２４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１５ｍＬ）にピリジン（１．５ｍＬ，８．４８ｍｍｏｌ）とトリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．７ｍＬ，２．８２８ｍｍｏｌ）を０℃にて混合し、氷冷下４０分間撹拌した。氷冷水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた化合物７１（４．６４ｇ）を続く反応に用いた。
【０３０３】
（２）化合物７２の合成
【０３０４】
【化６３】
2014043462.tif 000072
【０３０５】
上記（１）で得た化合物７１のアセトニトリル溶液（２０ｍＬ）に、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（４．５ｍｇ，２７．６６ｍｍｏｌ）と１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（４．２ｍＬ，２７．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２４時間撹拌した。ジクロロメタンで希釈し、水を加えた後、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、化合物７２（２．８８ｇ:収率７９％（２工程））を白色泡状固体として得た。
【０３０６】
得られた化合物７２の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 = + 43.0 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：3188, 3067, 2934, 2862, 1791, 1730, 1692, 1465, 1427, 1421, 1366, 1267, 1189, 1106, 973 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：dH 1.08 (9H, s), 1.38 (3H, s), 3.65 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.02 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.09 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.22 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.48 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.52 (1H, d, J = 5.2 Hz), 4.55 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.73 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.85 (1H, dd, J = 3.2 Hz, 2.8 Hz), 5.13 (1H, d, J = 11.2 Hz), 6.40 (1H, d, J = 3.2 Hz), 7.16-7.86 (26H, m)。
【０３０７】
（３）化合物７３の合成
【０３０８】
【化６４】
2014043462.tif 000073
【０３０９】
上記（２）で得た化合物７２（２．８８ｇ，３．３８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１５ｍＬ）にトリエチルアミントリヒドロフルオリド（５．６ｍＬ，３３．８ｍｍｏｌ）を加え、７０℃にて１８時間還流した。氷冷下、反応液に氷冷水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和重曹水と飽和食塩水とで洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、化合物７３（１．８９ｇ：収率９１％）を白色泡状固体として得た。
【０３１０】
得られた化合物７３の物性データは、以下のとおりであった：[α]D25 = + 39.1 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：3504, 3181, 3062, 2881, 1789, 1733, 1689, 1466, 1375, 1272, 1187, 1105, 1057, 974 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：dH 1.36 (3H, s), 3.84 (1H, d, J = 10.4 Hz), 3.92 (1H, d, J = 7.2 Hz), 3.96 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.12 (1H, d, J = 7.2 Hz), 4.49 ( 1H, d, J = 11.2 Hz), 4.54 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.63 (1H, d, J = 6 Hz), 4.74 (1H, d, J = 12 Hz), 4.93 (1H, dd, J = 6 Hz, 1.6 Hz), 5.16 (1H, d, J = 11.6 Hz), 6.35 (1H, d, J = 1.2 Hz), 7.15-7.87 (15H, m), 7.92 (1H, br s)。
【０３１１】
（４）化合物７４の合成
【０３１２】
【化６５】
2014043462.tif 000074
【０３１３】
上記（３）で得た化合物７３のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）にモレキュラーシーブス４Å（２ｇ）を加え、１０分間撹拌した。反応液に重クロム酸ピリジニウム（１１．６ｇ，３０．８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液に氷冷水、酢酸（２ｍＬ）を加えて撹拌した。生成物を酢酸エチルで抽出し、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチル：メタノール＝１０：１）で精製し、化合物７４（１．４４ｇ：収率７５％）を白色泡状固体として得た。
【０３１４】
得られた化合物７４の物性データは、以下のとおりであった：[α]D26 = + 23.9 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：3178, 3066, 3032, 2873, 1790, 1736, 1468, 1376, 1275, 1187, 1125, 967 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：dH 1.59 (3H, s), 3.90 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.11 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.59 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.63 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.68 (1H, d, J = 4.4 Hz), 4.91 (1H, d, J = 11.2 Hz), 5.05 (1H, t, J = 5.6 Hz) 5.27 (1H, d, J = 11.2 Hz), 6.70 (1H, d, J = 6.4 Hz), 7.32- 7.86 (16 H, m), 8.75 (1H, br s)。
【０３１５】
（５）化合物７５の合成
【０３１６】
【化６６】
2014043462.tif 000075
【０３１７】
上記（４）で得た化合物７４（４００ｍｇ，０．６３６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２ｍＬ）に、ヒドラジン一水和物（０．０４ｍＬ，１．０２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間撹拌した。反応液を溶媒留去し、酢酸エチルを加えた。残査をろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した後、溶媒を留去し、得られた化合物７５（３８０ｍｇ）を続く反応に用いた。
【０３１８】
（６）化合物７６の合成
【０３１９】
【化６７】
2014043462.tif 000076
【０３２０】
上記（５）で得た化合物７５（３８０ｍｇ，０．７６３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（５ｍＬ）にホルマリン（３７ｗｔ％ｉｎＨ２Ｏ，０．０８ｍＬ，０．８４０ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温にて２時間撹拌した後、溶媒留去した。水を加え、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィーで（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→１：２）で精製し、得られた化合物７６（２５０ｍｇ：収率６５％（２工程））を白色固体として得た。
【０３２１】
得られた化合物７６の物性データは、以下のとおりであった：[α]D26 = - 29.3 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：3172, 3064, 2944, 2872, 1699, 1469, 1366, 1274, 1127, 1070, 916 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：dH 1.56 (3H, s), 3.84 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.14 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.64-4.79 (6H, m), 5.11 (1H, dd, J = 4.6 Hz, 3.2 Hz), 6.59 (1H, d, J = 6.8 Hz), 7.28-7.64 (11H, m)。
【０３２２】
（７）化合物７７の合成
【０３２３】
【化６８】
2014043462.tif 000077
【０３２４】
上記（６）で得た化合物７６（２５０ｍｇ，０．４９１ｍｍｏｌ）のメタノール溶液にｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（１Ｍ，４．９ｍＬ，４．９１ｍｍｏｌ），シアノ水素化ほう素ナトリウム（６２ｍｇ，０．９８２ｍｍｏｌ）を加え、０ｏＣにて１０分間撹拌した。反応液を室温に昇温し、さらに２時間撹拌した。溶媒を留去し、得られた生成物を酢酸エチルで希釈し、水と飽和食塩水とで洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた化合物７７（２３５ｍｇ）を続く反応に用いた。
【０３２５】
（８）化合物７８の合成
【０３２６】
【化６９】
2014043462.tif 000078
【０３２７】
上記（７）で得た化合物７７（２３５ｍｇ，０．４５９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０５．５ｍｇ，０．５５１ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７４．５ｍｇ，０．５５１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１日撹拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィーで（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１）で精製し、化合物７８（１９０ｍｇ：収率８０％（２工程））を白色固体として得た。
【０３２８】
得られた化合物７８の物性データは、以下のとおりであった：[α]D26 = + 62.3 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：3164, 3029, 2926, 2878, 1698, 1456, 1392, 1362, 1274, 1215, 1155, 1094, 1065, 983 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：dH 1.42 (3H, s), 3.25 (3H, s), 3.95 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.25 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.34 (1H, d, J = 3.2 Hz), 4.56 (1H, d, J = 10.8 Hz), 4.59-4.64 (3H, m), 4.73 (1H, d, J = 10.8 Hz), 6.08 (1H, s), 7.23-7.37 (10 H, m), 7.62 (1H, d, J = 1.6 Hz)。
【０３２９】
（９）化合物７９の合成
【０３３０】
【化７０】
2014043462.tif 000079
【０３３１】
上記（８）で得た化合物７８（１９０ｍｇ，０．３８５ｍｍｏｌ）のエタノール：クロロホルム＝５：１（５ｍＬ）溶液に水酸化パラジウムカーボン（１９０ｍｇ）を加え、撹拌した。反応容器内を水素ガスで数回置換し、水素気流下、室温にて一晩撹拌した。溶液をろ過後、溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→酢酸エチルのみ）で精製し、化合物７９（１０５ｍｇ：収率９０％）を白色固体として得た。
【０３３２】
得られた化合物７９の物性データは、以下のとおりであった：[α]D26 = + 14.9 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：3444, 3226, 3070, 2941, 1678, 1469, 1412, 1281, 1199, 1078,988 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)：dH 1.88 (3H, s), 3.25 (3H, s), 3.90 (1H, d, J = 12.8 Hz), 4.22 (1H, d, J = 12.8 Hz), 4.55 (1H, J = 3.6 Hz), 4.73 (1H, J = 3.6 Hz), 6.08 (1H, s), 7.98 (1H, d, J = 1.2 Hz)。
【０３３３】
（１０）化合物８０の合成
【０３３４】
【化７１】
2014043462.tif 000080
【０３３５】
上記（９）で得た化合物７９（５０ｍｇ，０．１５９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（３ｍＬ）に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（６５ｍｇ，０．１９１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．１ｍＬ，０．７９５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて８時間撹拌した。氷冷下、飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた組成績体をカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン添加ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→酢酸エチルのみ）で精製し、化合物８０（５８ｍｇ：収率６０％）を淡黄色固体として得た。
【０３３６】
得られた化合物８０の物性データは、以下のとおりであった：[α]D28 = - 21.1 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：3339, 3189, 3062, 2926, 2850, 1693, 1608, 1509, 1464, 1395, 1253, 1177, 1080, 1033, 978 cm-1；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：dH 1.41 (3H, s), 3.22 (3H, s), 3.72 (1H, d, J = 12 Hz), 3.78 (6H, s), 3.97 (1H, d, J = 12 Hz), 4.69 (1H, d, J = 3.6 Hz), 4.72 (1H, d, J = 3.6 Hz), 6.05 (1H, s), 6.82-6.85 (4H, m), 7.25 - 7.42 (9H, m), 7.67 (1H, s)。
【０３３７】
（１１）化合物８１の合成
【０３３８】
【化７２】
2014043462.tif 000081
【０３３９】
上記（３６）で得た化合物８０（５０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（０．０４ｍＬ，０．１３８ｍｍｏｌ）と４，５−ジシアノイミダゾール（９．５ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて７時間撹拌した。反応後、飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン添加ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１）で精製し、化合物８１（４６ｍｇ，７０％）を白色固体として得た。
【０３４０】
得られた化合物８１の物性データは、以下のとおりであった：31P-NMR (100 MHz, CDCl3)：dP 151.23, 151.82。
【０３４１】
（実施例１６）オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
上記実施例１５で得た化合物８１（アミダイト体）を含有する１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物８２〜８５：以下の表８に示す）を、ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ ８９０９（ＡＢＩ社製）により０．２μｍｏｌスケールで合成した。合成は、標準的なホスホロアミダイトプロトコルにより行い、アミダイト体８１はアセトニトリルに溶解して用いた。なお、表８において、化合物８１はＸと表記する。アミダイトユニット（化合物８１）と５’−末端の水酸基とのカップリング時間は、１．５分（標準条件）から３０分に延長した。５’−末端がＤＭＴｒ基により保護されかつ固相支持されたオリゴヌクレオチド類縁体を、０．０５Ｍ炭酸カリウムのメタノール溶液で処理し、１．０Ｍ ＴＥＡＡ（トリエチルアミン−酢酸）で中和処理した後、溶媒を留去した。得られた粗成績体を、ゲルろ過カラムＮＡＰＴＭ １０Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社製）により粗精製した後、逆相ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣ−１０ＡＴＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＳＰＤ−１０ＡＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＴＯ−１０ＶＰ，分取カラムとしてＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ ＯＳＴ  Ｃ１８ ２．５μｍ（１０ｍｍ×５０ｍｍ））により精製した。
【０３４２】
合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物８２〜８５）の純度は、逆相ＨＰＬＣ（ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＴＭ Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８ ２．５μｍ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ）により確認した（条件：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー（ｐＨ７．０）中、１ｍＬ／分で３０分の５→１４％(v/v)アセトニトリルのグラジエント）。また、分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ測定により決定した。結果を表８に示す。
【０３４３】
【表８】
2014043462.tif 000082
【０３４４】
（実施例１７）融解温度（Ｔｍ）の測定
上記実施例１６で合成したオリゴヌクレオチド鎖である化合物８２〜８４（アンチセンス鎖）とセンス鎖（３’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−５’）とをアニーリング処理した後、Ｔｍ値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
【０３４５】
ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、アンチセンス鎖４μＭ、およびセンス鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ−１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間１０℃に保った後、測定を開始した。温度は８５℃まで毎分０．５℃ずつ上昇させ、０．１℃間隔で２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果を表９に示す。
【０３４６】
【表９】
2014043462.tif 000083
【０３４７】
表９から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖ＤＮＡに対する親和性に比較して一本鎖ＲＮＡに対する親和性が高く、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Ｔｍ値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０３４８】
本発明によれば、アミド結合を含む架橋を有する新規な２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供される。この２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵する一本鎖ＲＮＡに対する結合親和性と、ＬＮＡを上回るヌクレアーゼ耐性とを有する。特に、一本鎖ＲＮＡに対して、Ｓ−オリゴよりも非常に強い結合親和性を有するため、核酸医薬への応用が期待される。
【図１】
2014043462.tif 000088