(57)【要約】      （修正有）【課題】前立腺を刺激することなく、脂肪細胞、骨、筋肉等に対してアンドロゲン作用を示す化合物の提供。【解決手段】式（ＩＩＩａ）で示される化合物を有効成分として含有する選択的アンドロゲン受容体調節剤。2014055155.tif 000029該選択的アンドロゲン受容体調節剤を含有することを特徴とする生活習慣病の予防又は治療のための組成物。さらには、上記式（ＩＩＩａ）で示される化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（ＩＩＩａ）
【化６】
2014055155.tif 000027
で示される化合物を有効成分として含有する選択的アンドロゲン受容体調節剤。
【請求項２】
請求項１に記載の選択的アンドロゲン受容体調節剤を含有することを特徴とする生活習慣病の予防又は治療のための組成物。
【請求項３】
生活習慣病が、肥満、インスリン抵抗性（２型）糖尿病、高脂血症（家族性を除く）、高血圧症、高尿酸血症、循環器疾患（先天性を除く）、大腸癌（家族性を除く）、肺扁平上皮癌、慢性気管支炎、肺気腫、アルコール性肝障害、骨粗鬆症及び歯周病からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患である請求項２に記載の生活習慣病の予防又は治療のための組成物。
【請求項４】
生活習慣病が、肥満、インスリン抵抗性（２型）糖尿病、高脂血症（家族性を除く）及び高血圧症からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患である請求項２に記載の生活習慣病の予防又は治療のための組成物。
【請求項５】
下記式
【化７】
2014055155.tif 000028
で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺を刺激することなく、脂肪細胞、骨、筋肉等に対してアンドロゲン作用を示す化合物を有効成分として含有する、選択的アンドロゲン受容体調節剤（Selective Androgen Receptor Modulator：SARM）に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンドロゲンは、性分化の促進及び雄性表現型の誘導において種々の機能を果たす。雄性において、これらの作用を仲介する高活性な内因性アンドロゲンは、テストステロン（testosterone：T）及び5α-ジヒドロテストステロン（dihydrotestosterone：DHT）である。
【０００３】
男性における血漿Tレベルは、20歳代初めから加齢と共にほぼ年1％の割合で直線的に徐々に減少していく（Metabolism, 46, 410-413、J. Clin. Endocrinol. Metab., 86, 724-731、J. Clin. Endocrinol. Metab., 87, 589-598）。バイオアベイラブルTの減少は、身体脂肪分布の変化、エネルギー消費の減少、筋力及び骨密度の減少、身体機能の低下、性機能の低下、憂うつな気分になることに関係していると考えられている（J. Gerontol., 57A, M76-M99、Endocrine Rev., 26, 833-876、Med. Hypoth., 60, 448-452、J. Alzheiners Dis., 5, 267-269、Cell Mol. Life Sci., 62, 281-292）。高齢男性におけるこのようなアンドロゲン不足状態は、しばしば男性更年期又は遅発型生殖機能不全（late-onset hypogonadism：LOH）と呼ばれる。注射薬、経口薬、そしてより最近では経皮製剤を用いたアンドロゲン治療が、長い間、様々な男性障害に用いられてきた。いくつかの臨床試験が、高齢男性に生理学的用量のTを補充すると、除脂肪体重の有意な増加、脂肪組織の減少、そして筋力及び骨密度の増加をもたらすことを示している（J. Clin. Endocrinol. Metab., 84, 2647-2653、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 282, E601-E607、J. Am. Med. Assoc., 288, 2282-2292、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 284, E120-E128、J. Clin. Endocrinol Metab., 90, 678-688、J. Clin. Endocrinol. Metab., 90, 1502-1510）。
【０００４】
しかしながら、高齢男性へのT補充療法（testosterone replacement therapy：TRT）は、潜在的な副作用、例えば、前立腺の過刺激、ヘマトクリットの上昇、肝機能不全および睡眠時無呼吸症候群等への危惧から、しばしば制限される（Am. J. Med., 110, 563-572、J. Am. Geriat. Soc., 51, 101-115、N. Engl. J. Med., 350, 482-492、J. Clin. Endocrinol. Metab., 89, 4789-4796、Ann. Rev. Med., 56, 117-137）。なかでも、前立腺の過剰刺激は、潜在性で無症状の良性前立腺過形成（benign prostate hypertrophy：BPH）或いは前立腺癌を誘導してしまうことが懸念される。そのため、疾患に応じた明確な組織特異性をもつ化合物を開発する事が極めて重要になる。そのような化合物は、選択的アンドロゲン受容体調節剤（selective androgen receptor modulator：SARM）と呼ばれ（J. Clin. Endocrinol. Metab., 84, 3459-3462）、ステロイド治療法の場合に一般的に付随して起こる前立腺、肝臓又は赤血球に対する有害作用を伴うことなく、特に高齢男性において、筋力及び筋肉の機能を維持又は改善し、骨密度を増加させて骨粗鬆症及び／又は骨折を予防し、抗肥満作用を示し、インスリン感受性を改善して抗糖尿病作用及び／又は抗高脂血症作用を示し、抗痴呆作用を示し、性欲及び性機能を改善する可能性を有している。
【０００５】
アンドロゲン受容体（Androgen Receptor：AR）は転写因子であり、かつ核内レセプターファミリーのメンバーである。ARは、前立腺及び精嚢、男女外部生殖器、精巣、卵巣、皮膚、心筋、骨格筋、肝臓、脳皮質及び脳皮質下領域等の、生殖組織及び非生殖組織に広く分布している。このようなARの広範囲にわたる分布にかかわらず、天然リガンドであるジヒドロテストステロンと合成ARリガンドとでは異なる作用を示す。これは、各組織や細胞のタイプによって、細胞核内に存在している共役因子（コアクチベーター、コレプレッサー）のタイプ及び濃度が異なるためであり、コアクチベーター又はコレプレッサーの結合による複合体形成に違いが生ずる結果、ARが特定組織において個々の遺伝子を選択的に制御することになる。最近では、リガンドが結合して形成されるリガンド−核内受容体とコアクチベーター又はコレプレッサーとの複合体による転写制御機構が詳細に解明されている。リガンドの構造が異なればリガンド−核内受容体の三次元構造が異なり、コアクチベーター又はコレプレッサーとの結合も異なることとなる。したがって、異なる組織や細胞において様々な転写制御を引き起こす特定の部分的アゴニスト活性を有するSARMは、独自の活性プロフィールをもつ新規治療薬としての開発が期待される。
これまでに、既知ARアンタゴニストであるビカルタミドおよびフルタミドから出発して、前立腺には作用しないが、筋肉又は骨に作用する化合物が報告されている（J. Med. Chem., 49, 7596-7599）。その他に、SARMとしての化合物も種々知られている（例えば、特開2007-211024号公報、特表2007-526336号公報、特表2008-501800号公報等）。SARMの作用目的は様々であるが、例えば、骨減少症又は骨粗鬆症である高齢男性に対しては、標的部位がその男性の骨であり、且つ骨および筋肉に明瞭な作用をもちつつ前立腺や他の性付属器官に対する活性が低い、より同化作用的なSARMが望ましい。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、前立腺を刺激することなく前立腺以外の組織に対してアンドロゲン作用を示す化合物を見出すためのスクリーニング方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、前立腺を刺激することなく前立腺以外の組織に対してアンドロゲン作用を示す化合物を有効成分として含有するSARMを提供することである。更に、本発明の別の目的は、このSARMを含有することを特徴とする生活習慣病の予防又は治療のための組成物を提供することである。
【０００７】
本発明者らは、多くの合成ARリガンドおよびデヒドロエピアンドロステロン（dehydroepiandrosterone：DHEA）誘導体の中から、SARM活性をもつ化合物を探索すべく、まず、前立腺癌細胞の前立腺特異抗原（prostate specific antigen：PSA）発現レベルを刺激しない化合物をスクリーニングした。次に、第二スクリーニングマーカーとして、エネルギー消費や脂質代謝に関連する脱共役タンパク質-1（uncoupling protein-1：UCP-1）を選択した。UCP-1は、エネルギー基質酸化をミトコンドリアATP産生から脱共役化させ、その結果、熱的エネルギー消費をもたらし、体重を減少させると考えられる（J. Appl. Physiol., 92, 2187-2198）。本発明者らは、先に、アンドロゲン受容体ノックアウト（androgen receptor knockout：ARKO）雄性マウスではUCP-1のmRNAの発現が著しく低下しており、エネルギー消費抑制による遅発型肥満を示すこと、また、DHT-ARがUCP-1発現に対する直接刺激作用を有することを見出している（Diabetes, 54, 1000-1008）。この知見に基づき、第二スクリーニングとして、被験化合物についてのUCP-1発現作用を試験した。その結果、脂質代謝に有益な作用を有する化合物をいくつか見出すことが出来た。
【０００８】
さらに、これらの化合物について、前立腺重量の変化、前立腺における前立腺特異抗原のmRNAの発現レベル又は前立腺特異抗原の産生レベル、肛門挙筋重量の変化、大腿骨骨密度の変化、椎骨骨密度の変化、血漿中ゴナドトロピンの量の変化、血漿中アジポネクチンの量の変化、血漿中インスリンの量の変化、血漿中トリグリセリドの量の変化、血漿中コレステロールの量の変化、肝臓及び内臓脂肪におけるステロール制御要素結合蛋白質−１ｃのmRNAの発現レベル、内臓脂肪におけるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１のmRNAの発現レベル、肝臓及び内臓脂肪における脂肪酸合成酵素のmRNAの発現レベル、並びに高脂肪食を与えたときの体重、骨塩量、脂肪分布、運動量、血清中グルコース濃度及び血清中インスリン濃度の変化を測定し、化合物が有する更なる作用を検討した。
【０００９】
かくして、本発明によれば、下記の工程を含むことを特徴とする、選択的アンドロゲン受容体調節作用を有する化合物のスクリーニング方法：
（１）培養前立腺癌細胞に被験物質を添加して、当該培養前立腺癌細胞における前立腺特異抗原（PSA）のmRNAの発現レベル又は前立腺特異抗原（PSA）の産生レベルを測定する工程、及び
（２）培養脂肪細胞に被験物質を添加して、当該培養脂肪細胞における脱共役蛋白質−１（UCP-1）のmRNAの発現レベル又は脱共役蛋白質−１（UCP-1）の産生レベルを測定する工程。
が提供され、さらには、上記（１）及び（２）に加えて下記の工程：
（ａ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の前立腺の重量の変化を測定する工程、
（ｂ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の前立腺における前立腺特異抗原のmRNAの発現レベル又は前立腺特異抗原の産生レベルを測定する工程、
（ｃ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の肛門挙筋の重量の変化を測定する工程、
（ｄ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の大腿骨の骨密度の変化を測定する工程、
（ｅ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の椎骨の骨密度の変化を測定する工程、
（ｆ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の血漿中のゴナドトロピンの量の変化を測定する工程、
（ｇ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の血漿中のアジポネクチンの量の変化を測定する工程、
（ｈ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の血漿中のインスリンの量の変化を測定する工程、
（ｉ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の血漿中のトリグリセリドの量の変化を測定する工程、
（ｊ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の血漿中のコレステロールの量の変化を測定する工程、
（ｋ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の肝臓及び内臓脂肪におけるステロール制御要素結合蛋白質−１ｃのmRNAの発現レベルを測定する工程、
（ｌ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の肝臓及び内臓脂肪におけるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１のmRNAの発現レベルを測定する工程、
（ｍ）睾丸摘出動物に被験物質を投与して、当該動物の肝臓及び内臓脂肪における脂肪酸合成酵素のmRNAの発現レベルを測定する工程、
（ｎ）被験動物に被験物質及び高脂肪食を投与して、当該動物の体重、骨塩量、脂肪分布、運動量、血清中グルコース濃度及び血清中インスリン濃度から選ばれる少なくとも一つの変化を測定する工程、
の少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする、選択的アンドロゲン受容体調節作用を有する化合物のスクリーニング方法が提供される。
【００１０】
さらに、本発明には、上記（１）及び（２）のスクリーニング方法、又は上記（１）及び（２）にさらに上記（ａ）〜（ｎ）の少なくとも１つを加えたスクリーニング方法によって得られる選択的アンドロゲン受容体調節作用を有する化合物を有効成分として含有する選択的アンドロゲン受容体調節剤も包含される。
【００１１】
また、本発明によれば、下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）
【化１】
2014055155.tif 000002
【００１２】
（各式中、Ｒ１〜Ｒ９はそれぞれ独立に水素原子又はＣ１−４アルキル基を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表す。）
のいずれかで示される化合物を有効成分として含有する選択的アンドロゲン受容体調節剤が提供され、さらに、下記式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）
【化２】
2014055155.tif 000003
のいずれかで示される化合物を有効成分として含有する選択的アンドロゲン受容体調節剤が提供される。
【００１３】
本発明によれば、本発明のスクリーニング方法によって得られる選択的アンドロゲン受容体調節作用を有する化合物、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物又は上記式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）のいずれかで示される化合物を有効成分として含有する選択的アンドロゲン受容体調節剤を含有することを特徴とする生活習慣病の予防又は治療のための組成物、更には、当該生活習慣病が、肥満、インスリン抵抗性（２型）糖尿病、高脂血症及び高血圧症からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患である生活習慣病の予防又は治療のための組成物が提供される。
【００１４】
さらに、本発明によれば、本発明のスクリーニング方法によって得られる選択的アンドロゲン受容体調節作用を有する化合物、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で示される化合物又は上記式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）で示される化合物を有効成分として含有する選択的アンドロゲン受容体調節剤をヒトに投与して生活習慣病を予防又は治療する方法が提供される。特に、本発明の予防又は治療方法の好ましい実施態様においては、前立腺が作用を受けない。
【００１５】
さらにまた、本発明によれば、下記式
【化３】
2014055155.tif 000004
で示される化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、AR-GFPをトランスフェンクションしたLNCaP細胞を10-7Mのジヒドロテストステロンで処理し、これをレーザー共焦点蛍光顕微鏡で観察した画像である。
【図２】図２は、AR-GFPをトランスフェンクションしたLNCaP細胞を10-5Mの式（Ｉ）の化合物で処理し、これをレーザー共焦点蛍光顕微鏡で観察した画像である。
【図３】図３は、AR-GFPをトランスフェンクションしたNIH-3T3-L1細胞を10-7Mのジヒドロテストステロンで処理し、これをレーザー共焦点蛍光顕微鏡で観察した画像である。
【図４】図４は、AR-GFPをトランスフェンクションしたNIH-3T3-L1細胞を10-5Mの式（Ｉ）の化合物で処理し、これをレーザー共焦点蛍光顕微鏡で観察した画像である。
【図５】図５は、9週齢のB6マウスに高脂肪食又は高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物を16週間にわたり投与したときの、対照群、高脂肪食群及び高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群それぞれの外観の写真であり、左が対照群、中央が高脂肪食群、右が高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群である。
【図６】図６は、9週齢のB6マウスに高脂肪食又は高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物を16週間にわたり投与したときの、対照群、高脂肪食群及び高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群それぞれの内臓脂肪の写真であり、左が対照群、中央が高脂肪食群、右が高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、「選択的アンドロゲン受容体調節剤」における「選択的」とは、生体内アンドロゲンが有する作用のうちのいくつかの好ましい作用を有し且ついくつかの好ましくない作用を有さないことを言う。しかして、本発明の選択的アンドロゲン受容体調節剤において、好ましい作用としては、例えば、脂肪細胞における脱共役蛋白質−１のmRNAの発現レベル又は脱共役蛋白質−１の産生レベルを高める作用、筋肉の重量を増加させる作用、骨密度を増加させる作用、インスリン感受性状態を高める作用、血漿中トリグリセリドレベルを低下させる作用、肝臓及び／又は内臓脂肪におけるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１のmRNAの発現レベルを上昇させる作用、前立腺の重量を減少させる作用等が挙げられ、好ましい作用を複数有することもできる。また、本発明の選択的アンドロゲン受容体調節剤における好ましくない作用としては、例えば、前立腺癌細胞における前立腺特異抗原のmRNAの発現レベル又は前立腺特異抗原の産生レベルを高める作用、前立腺組織における前立腺特異抗原のmRNAの発現レベル又は前立腺特異抗原の産生レベルを高める作用、前立腺の重量を増加させる作用、血漿中ゴナドトロピンレベルを増加させる作用、血漿中及び／又は血清中インスリンレベルを増加させる作用、肝臓及び／又は内臓脂肪におけるステロール制御要素結合タンパク質−１ｃのmRNAの発現レベルを上昇させる作用、肝臓及び／又は内臓脂肪における脂肪酸合成酵素のmRNAの発現レベルを上昇させる作用、体重を増加させる作用、内臓脂肪を増加させる作用、血清中グルコース濃度を上昇させる作用等が挙げられる。ここで、本発明の選択的アンドロゲン受容体調節剤において、好ましくない作用をいくつか有していてもかまわないが、少なくとも前立腺癌細胞における前立腺特異抗原のmRNAの発現レベル又は前立腺特異抗原の産生レベルを高める作用を有さないことが好ましい。さらに、「選択的アンドロゲン受容体調節剤」における「調節」とは、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用に加えて、何ら作用を及ぼさない場合をも包含する。
【００１８】
生活習慣病は、「食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣が、その発症・進行に関与する疾患群」と定義され、その中には、例えば、肥満、インスリン抵抗性（２型）糖尿病、高脂血症（家族性を除く）、高血圧症、高尿酸血症、循環器疾患（先天性を除く）、大腸癌（家族性を除く）、肺扁平上皮癌、慢性気管支炎、肺気腫、アルコール性肝障害、骨粗鬆症、歯周病等の疾患が含まれる。これらの疾患のうち、本発明の選択的アンドロゲン受容体調節剤は、肥満、インスリン抵抗性（２型）糖尿病、高脂血症、高血圧症の予防又は治療に対して特に有効である。
【００１９】
前記式（Ｉａ）の化合物は、例えば、Journal of Chemical Research, 7, 417-419(2006)等に記載されており、当該文献に記載されている製造方法等に従い、前記式（Ｉ）の化合物を容易に製造することが出来る。また、前記式（ＩＩａ）の化合物は、例えば、Journal of Medicinal Chemistry, 28, 233-239(1985)等に記載されており、当該文献に記載されている製造方法等に従い、前記式（ＩＩ）の化合物を容易に製造することが出来る。前記式（ＩＩＩａ）の化合物は新規な化合物であるが、例えば、以下の方法（ａ）に述べるような方法、すなわち、下記式（ＩＩＩｂ）の化合物における水酸基をメチル化することにより容易に製造することができる。反応条件等の詳細については、後記実施例１を参照されたい。なお、下記方法（ａ）における出発物質である式（ＩＩＩｂ）の化合物は、例えば、国際公開WO 92/17489号公報の製造例29等に記載されており、当該文献に記載されている製造方法等に従い、前記式（ＩＩＩ）の化合物を容易に製造することが出来る。
【００２０】
方法（ａ）：
【化４】
2014055155.tif 000005
【００２１】
本発明のスクリーニング方法によって得られる選択的アンドロゲン受容体調節作用を有する化合物、特に前記式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）の化合物が有する、LNCaP細胞に対する作用及びNIH-3T3-L1細胞に対する作用、並びに種々の組織に対する作用は、以下に述べる実験によって示すことができる。
【００２２】
（１）転写活性の測定：
１）プラスミドの構築
プラスミドpCMV-hARを、本発明者らが先に報告した方法（J. Biol. Chem., 282, 7329-7338）に基づき構築した。また、レポータープラスミドであるPGL3-PSA（ヒト）及びPGL3-UCP-1（マウス）も、本発明者らが先に報告した方法（Diabetes, 54, 1000-1008）に基づき構築した。なお、pRL-SV40は商業的に入手した。
【００２３】
２）細胞の培養
NIH-3T3-L1マウス前駆脂肪細胞を、10%ウシ胎児血清を加えたDulbeccoの改良型Eagle培地（Sera Laboratories社製）で培養した。また、ヒト前立腺癌細胞株LNCapを、10％ウシ胎児血清を加えたRPMI 1640培地（Sigma社製）で培養した。なお、この二種類の細胞株は、American Type Culture Collection（Manassas社）から得た。
【００２４】
３）トランスフェクション
Effecteneトランスフェクションキット（Qiagen社製）及びFugene HDキット（Roche Diagnostics社製）を用いて、上記２）のNIH-3T3-L1細胞に対し、24ウェルプレート中でpCMV-hAR、pRL-SV40及びPGL3-UCP-1（マウス）を共トランスフェクションした。また、上記２）のLNCaP細胞に対し、同様にpCMV-hAR、pRL-SV40及びPGL3-PSA（ヒト）を共トランスフェクションした。
【００２５】
４）LNCaP細胞におけるPSAプロモーター−ルシフェラーゼ活性に対する作用の測定
上記３）で共トランスフェクションしたLNCaP細胞を、トランスフェクションの24時間後、さらに、デキストランチャーコールで処理した10％ウシ胎児血清及び被験化合物（少量のDMSOに溶解したもの）を含むDMEM又はRPMI 1640中で24時間培養した。その後、ホタルルシフェラーゼ及びRenillaルシフェラーゼの活性を、Dual-Luciferaseレポーターアッセイシステム（Promega社製）を用いて、Minilumat LB9507（Berthold Technologies社）の手順書に従って24ウェルプレートにおいてアッセイした。各被験化合物についてのPSAプロモーター−ルシフェラーゼ活性に対する値を下記表１に示す。なお、ホタルルシフェラーゼ活性の値はRenillaの内部標準に沿って標準化し、相対ルシフェラーゼ活性として示した。
【表１】
2014055155.tif 000006
上記表１に示すように、PSAプロモーター活性は、10-7M又は10-8Mのジヒドロテストステロンによってほぼ9倍刺激されるが、式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）の化合物はPSAプロモーター活性をほとんど上昇させなかった。
【００２６】
（２）細胞内ｍＲＮＡ発現レベルの測定：
１）トータルRNAの抽出
上記（１）−３）で共トランスフェクションしたLNCaP細胞及びNIH-3T3-L1細胞をそれぞれ6ウェルプレートで培養した後、デキストランチャーコールで処理した10％ウシ胎児血清及び被験化合物（少量のDMSOに溶解したもの）を含むEMEM又はRPMI 1640中で24時間培養した。その後、ISOGEN（和光純薬製）を使ってそれぞれトータルRNAを抽出した。
【００２７】
２）リアルタイムPCR
上記１）で得たそれぞれのトータルRNAについて、各5μgを、SuperScript IIIキット（Invitrogen社製）を用いて第1鎖cDNAに逆転写し、最終容積を20μLとした。LNCaP細胞におけるPSA mRNA及びNIH-3T3-L1細胞におけるUCP-1 mRNAの発現を定量化するために、LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I（Roche Diagnostic社製）を用いてリアルタイムPCRを実施した。PCRは、20μLの反応混合液中で、次の条件で実施した：95℃、3秒間の変性、60℃、10秒間のアニーリング、そして72℃、25秒間の延伸を50サイクル。同時に内部標準として、β-アクチンのmRNAも増幅した。各標的転写物のためのフォワード／リバースプライマーの配列を、下記表２に示す。各転写物に関するリアルタイムPCRの値は、β-アクチンに対する相対比として計算した。
【表２】
2014055155.tif 000007
【００２８】
３）各ｍRNAの発現レベル
LNCaP細胞におけるPSA mRNA及びNIH-3T3-L1細胞におけるUCP-1 mRNAの発現レベルを、下記表３に示す。
【表３】
2014055155.tif 000008
上記表３より、式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）の化合物は、PSA mRNAレベルに影響を与えることなく、エネルギー消費に関係するUCP-1 mRNAレベルを上昇させることがわかる。
【００２９】
（３）GFP-ARの核内局在化の検討：
本発明者らによるこれまでの研究から、リガンドが誘導する核内（subnuclear）のフォーサイ（ドット）形成は、核内レセプターの転写活性化機能と密接に関連していることがわかっている（Diabetes, 54, 1000-1008、J. Med. Chem., 49, 7596-7599、J. Biol. Chem., 276, 28395-28401、Mol. Endocrinol., 16, 694-706、Mol. Endocrinol., 18, 127-141）。ジヒドロテストステロンは250〜400個の微細で明瞭に分離している核内ARフォーサイ（ドット）形成を誘導し、このプロセスに伴ってステロイドレセプターコアクチベータ-1（SRC-1）、TIF-2及びCBP（CREB-結合タンパク質）のようなコアクチベーターが動員される。ARはヒドロキシフルタミドのような抗アンドロゲンと結合するが、これらとはフォーサイ（ドット）を形成しないことから、核内における、アゴニストが結合したステロイドホルモン受容体の明瞭なフォーサイ（ドット）形成が、転写活性状態の指標となる。式（Ｉａ）の化合物について、GFP（green fluorescence protein：緑色蛍光タンパク質）−ARの核内局在化を検討した。
【００３０】
NIH-3T3-L1細胞およびLNCaP細胞を35-mmのガラス皿に培養し（2×105細胞／皿；旭テクノグラス社製）、Fugene HDキット（Roche Diagnostics社製）を用いて、hAR-GFPプラスミドを2μg/皿の割合でトランスフェクションした。24時間培養した後、細胞をジヒドロテストステロン又は式（Ｉａ）の化合物で処理し、3時間後にLSM 510 META顕微鏡（Carl Zeiss社製）を使って観察した。
【００３１】
LNCaP細胞内にGFP-ARをトランスフェクションすると、GFP−ARは細胞質内に拡散して分布していたが、ジヒドロテストステロン（10-7M）で処理すると、急速に核内に移行し、フォーサイ（ドット）を形成した（図１）。一方、これを式（Ｉａ）の化合物（10-5M）で処理すると、この場合もGFP-ARは核内に移行したが、明瞭なフォーサイ（ドット）を形成することはなく、核内で拡散した分布パターンを示した（図２）。
【００３２】
さらに、同じ実験をGFP-ARをトランスフェクションしたNIH-3T3-L1細胞についても行った。この場合、ジヒドロテストステロン（10-7M）も式（Ｉａ）の化合物（10-5M）も共にGFP-ARを核へ移行させ、核内でフォーサイ（ドット）を形成させた（図３及び４）。
【００３３】
この実験より、ジヒドロテストステロンと式（Ｉａ）の化合物はともにARにリガンド結合し、LNCaP細胞では異なる働きをするが、NIH-3T3-L1前駆脂肪細胞では同様に働いており、PSAまたはUCP-1の発現に対するこれらARリガンドの作用が同じでないことがわかる。
【００３４】
なお、シングル蛍光タンパク質イメージングを行うために、空冷ファイバーカップル・アルゴンレーザーからの波長488nmのレーザーを使って、GFP蛍光を励起した。論理的な細胞内相互作用を観察するためには、トランスフェクションしたタンパク質の発現レベルをマッチングさせる必要があるところ、共トランスフェクションを行うと、各AR-GFPプラスミドの量はモルベースで等しかった。目的タンパク質の発現レベルが適切である細胞を顕微鏡下で選択した。LSM画像をTIFファイルとしてエクスポートし、Adobe Illustrator及びAdobe Photoshop（Adobe Systems社製）を用いて最終画像を作成した。
【００３５】
（４）化合物の男性化作用の検討：
ORXラットへの化合物投与における前立腺重量の変化を指標として、化合物の男性化作用を検討した。
【００３６】
１）ラットの処理
11週齢の雄性SD（Sprague-Dawley）ラット（320〜340g、Charles River Japan社より購入）を、12時間の明暗周期が維持され、温度および湿度が管理された状態の室内で、市販の標準的な齧歯類用飼料及び水を自由に摂取させて1週間飼育した。
飼育後、エーテル麻酔をかけて、両側の睾丸を摘出（orchiectomized：ORX）又はシャム処理した。麻酔から覚めた後、動物をそれぞれ3-5匹の実験群に割り付けた。手術翌日から被験化合物注射液（被験化合物を少量のDMSOに溶解し、動物実験用のオリーブオイルで希釈して（オリーブオイル95％及びDMSO5％）被験化合物注射液としたもの）を1日1回、0.1ml /100g体重の割合で皮下注射した。21日後、ラットを腹部動脈から全採血して安楽死させ、腹側の前立腺および肛門挙筋を切り出し、重量測定後、RNA抽出のためにRNAlater（ナカライテスク社製）に浸した。また、右大腿骨から柔組織を取り除き、75％エタノールに浸してから骨塩密度測定向けに保存した。さらに、肝臓および内臓脂肪組織も集め、RNA抽出に備えてRNAlaterに浸した。
【００３７】
２）前立腺重量の変化
上記で測定した前立腺重量を、下記表４に示す。
【表４】
2014055155.tif 000009
シャム処理群に比べると、精巣除去により前立腺の重量は劇的に減少したが、ジヒドロテストステロンの投与で用量に依存して増加した。しかし、式（Ｉａ）の化合物を投与したラットの前立腺重量は1〜10mg/kg体重の用量では増加せず、式（Ｉａ）の化合物がジヒドロテストステロンのような男性化作用を有していないことを示している。
さらに、以下のように、化合物投与におけるORXラット前立腺中のPSA mRNA発現レベルも測定した。
【００３８】
３）組織mRNA測定のためのリアルタイムPCR
ORXラットの各組織内のトータルRNAを、RNeasy Mini KitまたはRNeasy Fiberous Tissue Mini Kit（Qiagen社製）を用いて単離した。このうち、1μgのトータルRNAをQuantiaTect Reverse Transcription Kit（Qiagen社製）を用いて逆転写にかけた。次にcDNAを、LightCycler（Roche Diagnostics社製）を用いてリアルタイムPCR分析にかけ、各種転写物を定量化した。なお、PCRは、SYBR Premix Ex Taq（タカラバイオテクノロジー社製）を用い、次の条件で、20μlの反応混合液中で行った：95℃、5秒間の変性、60℃、20秒間のアニーリング、そして72℃25秒間の延伸を50サイクル。また、内部標準として、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAも同時に増幅し、各転写物のリアルタイムPCRの値をGAPDHに対する相対比として計算した。各標的転写物についてのフォワード／リバースプライマーの配列を、下記表５に示す。
【表５】
2014055155.tif 000010
【００３９】
４）ORXラット前立腺中のPSA mRNA発現レベル
前記（４）−１）で得たORXラット前立腺中のPSA mRNA発現レベルを、上記（４）−３）の方法により測定した。その結果を、下記表６に示す。
【表６】
2014055155.tif 000011
PSA mRNAレベルは、精巣除去によってシャム処理群に比べ劇的に減少したが、ジヒドロテストステロンの投与によってシャム処理ラットに比べて約1.8倍増加した。一方、式（Ｉａ）の化合物で処理した群では、PSA mRNAレベルに変化は見られなかった。
【００４０】
上記の結果及び前記（４）−２）の結果より、天然のARリガンドであるジヒドロテストステロンとは対照的に、式（Ｉａ）の化合物は、前立腺重量およびPSA発現の刺激に関して男性化の作用をほとんど有していないことがわかる。なお、各化合物処理群の間に体重に違いは見られなかった。また、全てのラットで、体重は3週間の試験期間中に徐々に増加した。
【００４１】
（５）化合物の同化作用の検討：
前記（４）−１）で処理したORXラットにおける肛門挙筋の重量並びに大腿骨及び椎骨の骨密度（bone mineral density：BMD）の変化を指標として、化合物の同化作用を検討した。
【００４２】
１）肛門挙筋重量の変化
肛門挙筋は、ラットの直腸を囲んで局在している典型的な骨格筋であり、男性ステロイドホルモンに感受性であると考えられている。肛門挙筋は、正常雄ラットに比べ精巣除去ラットで相当小型化するが、アンドロゲンを投与することによって正常重量まで回復させることができることは、よく知られている（J. Pharmacol. Exp. Ther., 91, 38-44）。前記（４）−１）で得たORXラットの肛門挙筋重量の測定結果を下記表７に示す。
また、肛門挙筋におけるペルオキシゾーム増殖（peroxisome proliferator）活性化因子レセプター−デルタ（PPARδ）mRNAの発現レベルの測定も行った。これは、この核レセプターが骨格筋での脂肪酸のβ−酸化およびエネルギー消費に関係していることが示されているからである（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 15924-15929）。この結果も併せて下記表７に示す。なお、測定は前記と同様の方法により行った。
【表７】
2014055155.tif 000012
予想どおり、精巣除去により、シャム処理群に比べて肛門挙筋の重量は減少した。この減少は1及び10mg/kgのジヒドロテストステロンの投与によって回復し、さらにシャム処理ラットの場合の重量を超えて増加した。一方、式（Ｉａ）の化合物では、10mg/kgの用量において、シャム処理群で観察されたものと同程度まで肛門挙筋の重量を有意に増加させた。この結果は、式（Ｉａ）の化合物が、ORXラットではジヒドロテストステロンと同様に、筋肉に対して同化活性を有していることを示している。
また、精巣除去によって肛門挙筋中のPPARδmRNAの発現は増加したが、ジヒドロテストステロンはこの発現を用量に依存して抑制した。しかし、興味深いことに、式（Ｉａ）の化合物は、10mg/kgの用量でこの発現を高めた。
【００４３】
２）大腿骨及び椎骨の骨密度
前記（４）−１）で処理したORXラットの大腿骨及び椎骨の骨端海綿骨のBMDを、Scan Xmate-A100S（コムスキャンテクノ社製）を用いて測定した。その結果を下記表８に示す。
【表８】
2014055155.tif 000013
局所での精巣テストステロンからエストロゲンへの変換が骨量の維持に寄与することはよく知られている。しかし、ジヒドロテストステロン−アンドロゲン受容体系の骨に対する直接作用もまた、ARKOマウスでは骨吸収が増加して骨消失を示すものの雌はこれを示さないという事実からも、明らかにされている（Proc. Natl. Acad. Sci., 100, 9416-9421）。
【００４４】
大腿骨BMDは、精巣除去により517.1mg/cm3（シャム）から465.3mg/cm3へと若干減少した。ジヒドロテストステロンは、精巣除去によって低下したこの値を、10mg/kgの用量で473.6mg/cm3にまで増加させたが、シャム群のレベルまで回復させるには至らなかった。式（Ｉａ）の化合物もまた、BMDの値を用量に依存して上昇させ、30mg/kgの用量で475.9mg/cm3まで増加させた。ただし、この数値は統計的に有意ではなかった。
【００４５】
椎骨BMDは、精巣除去によって770.8mg/cm3（シャム）から762.7mg/cm3まで僅かに減少した。ジヒドロテストステロンは椎骨BMDには影響を及ぼさなかったが、式（Ｉａ）の化合物はBMDを用量に依存して増加させる傾向を示し、30mg/kgの用量でBMDは775.1mg/cm3まで増加した。ただし、この値も統計的に有意なものではなかった。
【００４６】
上記の結果及び前記（５）−１）の結果より、式（Ｉａ）の化合物は、ORXラットにおいて、ジヒドロテストステロンと同様に、いくつかの同化活性傾向を有することが示された。
【００４７】
（６）血漿中ゴナドトロピンレベルの測定：
前記（４）−１）で処理したORXラットの血漿中のLH及びFSHの濃度を測定して、脳下垂体に対する化合物の作用の特徴を調べた。測定結果を下記表９に示す。
【表９】
2014055155.tif 000014
【００４８】
精巣除去は、シャム処理群に比べ、LHおよびFSHのレベルを大きく上昇させた。ジヒドロテストステロンは、視床下部−脳下垂体−生殖腺について十分に解明されているフィードバックメカニズムによって、脳下垂体からのゴナドトロピン分泌を抑制し、LHレベルを抑制したが、これに対し、式（Ｉａ）の化合物は抑制せず、むしろLHレベルを用量に依存して増加させた。
【００４９】
更に、ジヒドロテストステロンの1又は10mg/kg投与により、FSHレベルは非処理のコントロールに観察されるレベルにまで抑制されたが、式（Ｉａ）の化合物は、1又は10mg/kg用量では、FSHに何の影響も及ぼさなかった。
【００５０】
（７）血漿中アジポネクチンレベルの測定：
血漿テストステロンのレベルは、ORXラットでは低く（≦0.1ng/ml）、シャム処理群では正常（1.275ng/ml）であり、ラットの精巣除去が成功したこと及び今回の研究結果が信頼できることを示している。
【００５１】
脂肪細胞に由来する血漿タンパク質であるアジポネクチンは、血漿中に豊富に存在しており、最近そのインスリン感受性作用および抗アテローム発生作用から、大きな注目を集めている（Natl. Med., 8, 731-737、J. Biol. Chem., 278, 2461-2468、Biochem. Biophys. Res. Commun., 257, 79-83）。テストステロンは、ヒトおよびラットにおいて、脂肪細胞からのアジポネクチンの分泌を阻害すること、及び精巣除去が、マウスでは血漿中アジポネクチン濃度を上昇させること、特に高分子量（HMW）型のアジポネクチンの濃度を上昇させることが報告されている（J. Biol. Chem., 280(18), 18073-18080、J. Androl., 26, 85-92）。
【００５２】
本発明者らは、前記（４）−１）で処理したORXラットについてトータル血漿中アジポネクチンレベルを測定した。また同時に、血漿中インスリンレベルも測定した。これらの結果を下記表１０に示す。
【表１０】
2014055155.tif 000015
【００５３】
精巣除去は血漿アジポネクチンのレベルを有意に上昇させたが、この上昇は1又は10mg/kg用量のジヒドロテストステロンの投与によって、シャム処理ラットのレベルにまで抑制された。これに対し、式（Ｉａ）の化合物はアジポネクチンレベルにこのような抑制作用を示さなかった。
【００５４】
一方、ジヒドロテストステロンも式（Ｉａ）の化合物もインスリンレベルを上昇させたが、この作用は式（Ｉａ）の化合物による処理群では軽度であった。この結果より、式（Ｉａ）の化合物はジヒドロテストステロンに比べて、よりインスリン高感受性状態にする作用を有することが示唆される。
【００５５】
（８）血漿中トリグリセリド及びコレステロールレベルの測定：
前記（４）−１）で処理したORXラットの代謝プロフィールを特徴付けるために、血漿中トリグリセリド及びコレステロールレベルを測定した。その結果を下記表１１に示す。
【表１１】
2014055155.tif 000016
【００５６】
血漿トリグリセリドレベルは、通常は、肝臓でのVLDL-トリグリセリドを含むトリグリセリドに富むリポタンパク質の合成と分泌のバランス、ならびにインスリン依存的な形でトリグリセリドを加水分解する末梢リポタンパク質リパーゼ（LPL）活性による血管からのクリアランスによって決定される。そのため、インスリン耐性およびその続発症であるインスリン過剰症は、高トリグリセリド血症を伴うことが多いが、これは、この疾患状態が、肝臓において主にSREBP-1cの活性化を介してVLDL-トリグリセリドの合成を促進すること（Prog. Lipid. Res., 40, 439）、及び末梢LPL活性の低下によりトリグリセリドに富むリポタンパク質を血中に蓄積させるためである。
【００５７】
今回の試験において、ジヒドロテストステロンはトリグリセリドレベルを上げ、コレステロールのレベルを下げた。一方、式（Ｉａ）の化合物は、驚くべきことにトリグリセリドレベルを大幅に下げたが、コレステロールについては、ジヒドロテストステロンの作用とは対照的に、何らの作用も有していなかった。これは、インスリン感受性に対する式（Ｉａ）の化合物の全体的便益作用によって部分的に説明することができる。
【００５８】
（９）肝臓及び内臓脂肪におけるSREBP-1c、FAS及びCPT-1のmRNAレベルの測定：
肝臓および脂肪細胞での脂質形成遺伝子の発現は、動物の脂質ホメオスタシス制御に必須な役割を果たしているステロール制御要素結合タンパク質-1c（SREBP-1c）を含む複数の転写因子によって制御されることが知られている。SREBP-1cは、コレステロール、脂肪酸、トリグリセリド、およびリン脂質の生合成に関わる30を超える遺伝子の発現を直接活性化することが示されている（J. Clin. Invest., 109, 1125-1131）。カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ-1（CPT-1）は、ミトコンドリア内膜を横切るカルニチン依存的輸送の重要な酵素であり、その欠損は、脂肪酸のβ-酸化の速度低下をもたらす。また、脂肪酸合成酵素（FAS）はSREBP-1cが標的とする脂肪酸合成酵素である。
【００５９】
被験化合物が有するトリグリセリド低下作用のメカニズムを調べるため、前記（４）−１）で処理したORXラットの肝臓及び内臓脂肪におけるSREBP-1c、FAS及びCPT-1のmRNAレベルを測定した。これに加えて、肝臓におけるインスリンレセプター基質-2（IRS-2）のmRNAレベルも測定した。これらの結果を下記表１２〜１５に示す。
【００６０】
【表１２】
2014055155.tif 000017
【００６１】
【表１３】
2014055155.tif 000018
【００６２】
【表１４】
2014055155.tif 000019
【００６３】
【表１５】
2014055155.tif 000020
【００６４】
上記表１２〜１４に見られるように、肝臓と内臓脂肪の両方について似た結果が得られた。SREBP-1cのmRNAレベルは、両組織とも式（Ｉａ）の化合物で処理した群の方が低かった。FASのmRNAレベルもまた、式（Ｉａ）の化合物処理によって低下した（表１２及び１３）。これによって脂肪形成が抑制されたが、その一方で、CPT-1のmRNAレベルは、ジヒドロテストステロンと比べて式（Ｉａ）の化合物の方が高く（表１４）、脂肪分解をより活性化した。このように、SREBP-1cおよびFASの発現減少およびCPT-1の発現増加が、式（Ｉａ）の化合物処理による血漿トリグリセリドレベル低下の一因である可能性がある。
【００６５】
インスリンレセプター基質は、活性化されたインスリンレセプターによってリン酸化される一群のタンパク質であり、IRS-2は、9つあるこの群のメンバーの一つである（Nature, 377, 173-177）。マウス視床下部およびβ-細胞におけるIRS-2欠損が、2型糖尿病様症状を引き起こすことが最近示された（J. Clin. Invest., 114, 917-927）。IRS-2はまた、β-細胞の増殖／生存を促進することも知られている（Nature, 391, 900-904）。
【００６６】
上記表１５に示すように、肝臓でのSREBP-1c下流遺伝子の発現、すなわちIRS-2のmRNAレベルが式（Ｉａ）の化合物処理によって増加したが、ジヒドロテストステロン処理では減少した。式（Ｉａ）の化合物が誘導したSREBP-1c発現の抑制は、肝臓でのIRS-2 ｍRNAの増加と密接に関連していると考えられる。また、式（Ｉａ）の化合物は、このIRS-2のアップレギュレーションメカニズムを通して、肝臓でのインスリン感受性作用も発揮している可能性がある。
【００６７】
式（Ｉａ）の化合物による血清トリグリセリドレベルの低下は、骨格筋におけるPPARδのアップレギュレーションの点からも説明できる。PPARδの活性化は、骨格筋の脂肪酸酸化に関連する遺伝子のアップレギュレーションと、ミトコンドリアの脱共役をもたらす。選択的PPARδアゴニストは、トリグリセリドレベルを下げ、HDLコレステロールレベル及びインスリン感受性を上げ、食事誘導肥満を防止することが示されている（Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 293, E1256-E1264）。
【００６８】
ところで、前記表３において、ジヒドロテストステロン及び式（Ｉａ）の化合物はNIH-3T3-L1細胞におけるUCP-1の転写レベルを上げることを示した。したがって、ラット内蔵脂肪におけるUCP-1 mRNAレベルも確認のために測定した。測定結果を下記表１６に示す。
【表１６】
2014055155.tif 000021
【００６９】
式（Ｉａ）の化合物には、UCP-1 mRNAレベルを上げる傾向が僅かに見られたが、それは有意ではなかった。また、ジヒドロテストステロンはUCP-1のｍRNAレベルにはほとんど影響しなかった。
【００７０】
（１０）内臓脂肪の蓄積に対する化合物の影響：
9週齢のB6マウスを10匹ずつ、対照群、高脂肪食群及び高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群に振り分け、16週間にわたり飼育、観察した。この間、式（Ｉａ）の化合物を1日おきに10mg/Kg皮下注射し、また、体重を週に1回測定し、さらに、食事摂取量を4週間に1回測定した。
【００７１】
16週後、マウスの体重、骨塩量、脂肪分布及び運動量を測定した後、採血し、最後に屠殺して各臓器を採取した。16週後の各群における体重、血清中グルコース濃度及び血清中インスリン濃度の平均値を下記表１７に示す。
【表１７】
2014055155.tif 000022
【００７２】
まず、体重については、高脂肪食群に対して高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群の体重が有意に少なかった。この結果より、式（Ｉａ）の化合物には体重増加抑制効果があることが示唆される。なお、各群における食事摂取量の平均値の推移を下記表１８に示す。食事摂取量は、各群において有意差はなかった。
【表１８】
2014055155.tif 000023
【００７３】
次に、血清中グルコース濃度及び血清中インスリン濃度についても、高脂肪食による増加を式（Ｉａ）の化合物は有意に抑制している。これらの値の上昇を抑制することは、糖尿病などの生活習慣病の予防及び／又は治療に効果的である。
【００７４】
また、16週間飼育後のマウスに対する血糖負荷試験も行った。マウスを5匹／群に分け、1g/Kgを注入し、経時的に血糖値を測定した。その結果を下記表１９に示す。
【表１９】
2014055155.tif 000024
【００７５】
ところで、上記の体重増加抑制効果は、16週後の各群のマウスの外観において典型的に現れている。図５は16週後の各群のマウスを並べて撮影したものであるが、高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群のマウス（写真右）は、高脂肪食群（中央）よりも通常食群（写真左）に近い外観を呈している。
【００７６】
しかし驚くべきは、図６に示すように、高脂肪食群と高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群との間で内臓脂肪の蓄積に顕著な差が見られたことである。すなわち、高脂肪食群（中央）では内臓脂肪が著名に増加するが、高脂肪食＋式（Ｉａ）の化合物群（写真右）における内臓脂肪は通常食群（写真左）とほぼ同じであった。これにより、式（Ｉａ）の化合物が持つ著名な内臓脂肪増加抑制効果が明らかとなった。
【００７７】
上記のように、本発明のSARMは、前立腺を刺激することも、また視床下部−脳下垂体−生殖腺を抑制することもなく、筋肉の発達を促し、内臓脂肪の蓄積を抑制し、肝臓、脂肪組織及び筋肉におけるインスリン感受性を高める作用を有する。糖尿病及びアテローム性動脈硬化の治療又は予防にとってインスリン感受性の向上やトリグリセリドの低下が必須の標的である（Circulation, 100, 475-482）ことから、本発明のSARMは、有望な生活習慣病の予防・治療薬として期待される。
本発明のSARMは、無毒性の添加剤と共に、固体形態（例えば、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ錠など）、半固体形態（例えば、坐剤、軟膏など）又は液体形態（例えば、注射剤、乳剤、懸濁液、ローション、スプレーなど）のいずれかの製剤形態に調製して用いることができる。上記製剤に使用しうる無毒性の添加物としては、例えば、でん粉、ゼラチン、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル、シロップ、エタノール、プロピレングリコール、ワセリン、カーボワックス、グリセリン、塩化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。該製剤は、また、治療学的に有用な他の薬剤を含有することもできる。
【００７８】
該製剤中における選択的アンドロゲン受容体調節作用を有する化合物の含有量は、その剤形、投与形態等に応じて異なるが、一般に、固体及び半固体形態の場合には０．１〜５０重量％の含有率で、そして液体形態の場合には０．０５〜１０重量％の濃度で含有することができる。
【００７９】
また、本発明における選択的アンドロゲン受容体調節作用を有する化合物の投与量は、対象とするヒトをはじめとする温血動物の種類、対象とする疾患の種類、投与経路、症状の軽重、医師の診断等により広範に変えることができるが、一般には、１日あたり０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、好適には０．０２〜２ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。しかし、上記の如く患者の症状の軽重、医師の診断等に応じて、上記範囲の下限よりも少ない量又は上限よりも多い量を投与することはもちろん可能である。上記投与量は１日１回又は数回に分けて投与することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例及び製剤例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００８１】
実施例１
１６ａ−ホモ−１６ａ−オキサエストラ−５−エン−３β−メトキサイド（式（ＩＩＩａ）の化合物）の合成：
【化５】
2014055155.tif 000025
40%水素化ナトリウム50mgをベンゼン3mlで2回洗い、DMSO 0.5mlを加え室温で30分撹拌した。これに3-OH体50mgのDMSO 0.5ml溶液を滴下し、30分攪拌した。ヨウ化メチルを0.2ml加え15分攪拌後、氷水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水及び水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、酢酸エチルを減圧下にて留去した。残渣を薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）で精製し、表題化合物38.9mgを得た。
1H-NMR(CDCl3, δ):0.94-1.09(4H, m), 0.998(3H, s), 1.001(3H, s), 1.27(1H, dt, J=12.7, 3.4Hz), 1.32-1.62(7H, m), 1.85-1.97(2H, m), 2.03-2.20(2H, m), 2.40(1H, ddd, J=2.3, 4.6, 13.1Hz), 2.98(1H, d, J=10.8Hz), 3.01-3.12(1H, m), 3.33-3.42(2H, m), 3.36(3H, s), 4.02-4.08(1H, m), 5.34-5.39(1H, m).
MS(m/z): 304(M+).
【００８２】
実施例２
【表２０】
2014055155.tif 000026
活性成分を７０μｍ以下の粒度に粉砕し、それにでん粉、乳糖及びカルボキシメチルセルロースカルシウムを加えてよく混合する。１０％のでん粉のりを上記混合粉体に加えて攪拌混合し、顆粒を製造する。乾燥後粒径を１０００μｍ前後に整粒し、これにタルク及びステアリン酸マグネシウムを混合し、打錠する。
【図１】
2014055155.tif 000030
【図２】
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【図３】
2014055155.tif 000032
【図４】
2014055155.tif 000033
【図５】
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【図６】
2014055155.tif 000035
【配列表】
2014055155000001.app