(57)【要約】      （修正有）【課題】植物からＤＮＡを取得するための非破壊的手法の提供。【解決手段】成長中の根から根境界細胞を収集し、当該根境界細胞からＤＮＡを抽出することを含む方法。根境界細胞は、水、組織培養培地または土壌などの培地中で成長している成長中の根の根浸出物に含有される。好ましくは、根は発芽中の種子の一部であるか、または苗の根であるか、または組織培養植物もしくは植物部分の不定根である。【選択図】図１２
2014000078.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物からＤＮＡを得る方法であって、
ａ）成長中の根から根境界細胞を集める工程と、
ｂ）前記根境界細胞からＤＮＡを抽出する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記根境界細胞が成長中の根の根浸出物に含まれている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記根が培地中で成長している請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が水である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が組織培養用の培地である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が土壌である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記根が発芽種子の一部である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記根が苗の根である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記根が組織培養した植物または植物の一部の不定根である請求項１〜６のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項１０】
前記種子を幼根または根端が出現するまで発芽させる請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
約１〜２ｃｍまで成長した根から前記根境界細胞を収集する請求項１〜１０のいずれか
一項に記載の方法。
【請求項１２】
交雑Ｍ２突然変異体植物集団から遺伝子変種を検出するための請求項１〜１１のいずれ
か一項に記載の方法の使用。
【請求項１３】
交雑自然植物集団から遺伝子変種を検出するための請求項１〜１１のいずれか一項に記
載の方法の使用。
【請求項１４】
育種集団中の遺伝子変種を検出するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法
の使用。
【請求項１５】
商業用種子のロット間の遺伝子変種を検出するための請求項１〜１１のいずれか一項に
記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物からＤＮＡを単離するための非破壊的手法および植物または植物集団の
遺伝学的解析におけるその手法の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物育種は、特定の環境内で植物の表現型を決定する、特定作物種の生殖質に内在する
遺伝的変異を、効率よく活用することに依存している。これは、伝統的には、表現型レベ
ルで観察される望ましい形質の組み合わせを選抜することによって行われるが、これを、
特定形質の発現に寄与する遺伝子の対立遺伝子型に遺伝的に密接に連鎖する分子マーカー
に基づく選抜によって行うことが、ますます可能になりつつある。
【０００３】
分子マーカーに基づく形質の選抜は、植物の発生段階に依存せず、環境にも依存しない
ので、選抜プロセスが著しく強化される。分子マーカーを使って選抜することができる形
質（多数の遺伝子によって制御される複合形質を含む）の数は著しく増加し、この発展は
さらにペースを上げて持続すると予想することができる。
【０００４】
植物育種分野におけるもう一つの趨勢は、逆遺伝学から生じる。逆遺伝学は、遺伝子を
単離し、その一次構造または発現を修飾することによって、その機能を決定するアプロー
チに関係する。遺伝子機能に関する知見は、特にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のようなモデル系において、現在増加しているので、作物系にお
ける逆遺伝学アプローチは、現在、効率が良くなっている。
【０００５】
候補遺伝子の対立遺伝子変異性を決定するために、極めて多くのＤＮＡ診断ツールを利
用することができ、それらは当業者に公知である。対立遺伝子変種の飽和したコレクショ
ンを獲得するには、自然対立遺伝子変異または誘発対立遺伝子変異を含有する植物の大き
な集団を、関心対象の座位におけるＤＮＡ多型について、スクリーニングする必要がある
。そのようにして見出された遺伝子の対立遺伝子型は、関連研究により、植物表現型に対
するそれらの寄与について評価することができる。
【０００６】
育種集団または突然変異体集団をスクリーニングするコストは、主として、研究対象で
ある集団の個々の植物を成長させ、試料採取するために要求される労力、およびそれらの
試料からＤＮＡを調製するために要求される労力によって決まる。研究対象である集団の
個々の植物に内在する遺伝的変異を表す種子試料として集団が供給される場合は、ファミ
リー内の近縁個体として植物ごとに種子を収穫するのに、かなりの労力が費やされる。さ
らにまた、特定の遺伝子座における対立遺伝子変種について作成され、評価される各追加
集団についても、この作業を反復する必要がある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、植物からＤＮＡを単離するための効率のよい手法を提供することであ
る。本発明のさらにもう一つの目的は、特定の遺伝子座における対立遺伝子変種の存在に
関する植物集団のスクリーニングを可能にする効率のよいＤＮＡ単離手法であって、組織
試料を手作業で切開する必要または研究対象である集団の個々の植物から種子を収穫する
必要を不要にするような手法を提供することである。
【０００８】
本発明によれば、そのような方法は、根（好ましくは、苗のような非常に若い植物の根
、または発芽中の種子から出現する根、または組織培養下で成長する植物の不定根）から
の浸出物を使って、そこからＤＮＡを単離することに基づき得ることが見出された。より
具体的には、本方法は、根端から脱落するいわゆる根境界細胞（ｒｏｏｔ  ｂｏｒｄｅｒ
ｃｅｌｌ）を、ＤＮＡの一次供給源として利用する。根境界細胞は、ほとんどの植物種
の根端を取り囲む生細胞である。植物は、土壌で成長する場合にも、液体培地または固体
培地中で成長する場合にも、根境界細胞を根から自然に脱落させる。従って本発明の方法
は非破壊的であるとみなされる。これらの細胞は既に植物から自然な形で脱落し、根を取
り囲んで根境界細胞を含む培地（通常は液体）を穏やかに撹拌して取り出すことによって
収穫することができる。成長中の根は根境界細胞を産生し続け、その根境界細胞は後続段
階で再び収穫することができる。
【０００９】
従って本発明は、植物からＤＮＡを単離するための方法であって、
ａ）成長中の根から根境界細胞を収集する工程と、
ｂ）根境界細胞からＤＮＡを抽出する工程と
を含む方法に関する。
【００１０】
原則として、ＤＮＡは全ての根境界細胞から得ることができる。しかし、発芽中の種子
の一部である根から根境界細胞を収集することが、非常に実用的である。種子は、水など
の液体培地に浸漬することができ、その後に発芽する。従って、植物発生の極めて初期段
階で、すなわち種子発芽中に、植物を解析することができる。葉が植物上で成長し終える
まで待つ必要はない。しかし、本方法は、苗の根から得られる根境界細胞を使って行うこ
ともできる。
【００１１】
さらにまた、組織培養下の植物材料上に成長した不定根が根境界細胞を産生することも
見出された。本発明によれば、これらの根境界細胞も、そこからＤＮＡを単離するために
使用することができる。
【００１２】
ＤＮＡの抽出には、例えばＣＴＡＢ（Ｄｏｙｌｅ  ＪＪ  ａｎｄ  Ｄｏｙｌｅ  ＪＬ  
（１９９０）Ｆｏｃｕｓ  １２，１３−１５）、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６（商標）（Ｔ
ｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）など、様々な方法を利用することができ、それらは
当業者に公知である。
【００１３】
そのようにして得られるＤＮＡは核および細胞質に由来することができ、様々な核酸解
析技術を使って解析することができる。そのような解析技術は当業者には周知であり、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サンガーシーケンシング、ミニシーケンシング、パイロ
シーケンシング、ＧＳ２０シーケンシング、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、制限断片長多
型（ＲＦＬＰ）、多型ＤＮＡのランダム増幅（ＲＡＰＤ）、インベーダー法、オリゴヌク
レオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、シングルフィーチャー多型（Ｓｉｎｇｌｅ
Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＦＰ）を含むが、これらに限るわけで
はない。
【００１４】
さらに本発明は、特定座位における遺伝的変異に関して大きな植物集団を極めて高い効
率でスクリーニングするための、上記新規非破壊的ＤＮＡ単離手法の使用に関する。この
遺伝的変異は自然のものであっても、人工的に誘発されたものであってもよい。
【００１５】
このようにして提供される植物からのＤＮＡ単離手法は、化学的または物理的突然変異
誘発によって生成させた植物集団中の特定遺伝子の遺伝子変種を検出するために使用する
ことができるＤＮＡを取得するための、効率のよいツールである。あるいは、その遺伝子
変種は自然集団内に存在してもよい。
【００１６】
本発明の方法を使用すれば、変異誘発したＭ１植物から派生するＭ２ファミリーを設定
する必要がなくなる。その代りに交雑（ｂｕｌｋｅｄ）Ｍ２集団を使用することができ、
これにより、特定遺伝子の異なる対立遺伝子型の存在について、より効率的かつ柔軟な方
法で、Ｍ２集団を解析することが可能になる。
【００１７】
植物からＤＮＡを単離するための本発明の手法は、遺伝的純度および遺伝的同一性を評
価するための商業用種子ロットの品質管理目的に役立つ、植物集団の遺伝子タイピングに
おける使用にも適する。
【００１８】
さらに本ＤＮＡ単離手法は、遺伝的に異なる植物の集団内に存在する植物を、ある表現
型形質の発現を決定する遺伝子の対立遺伝子型に連鎖する多型分子マーカーの対立遺伝子
型の検出に基づいて同定するためにも使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
大規模配列の努力により、シロイヌナズナのようなモデル植物種およびイネのような作
物種の全ゲノム配列が得られている。さらにまた、トマト、レタス、キュウリ、アブラナ
属、メロン、トウモロコシなどのような広範囲にわたる作物種から得られた様々な組織試
料に由来する多数のｃＤＮＡフラグメントまたはＥＳＴが配列決定されている。目下の課
題は、個々の遺伝子の機能、それらの発現の調節およびそれらの遺伝的相互作用を解明す
ることである。この課題を達成するには、個々の遺伝子が持つ数多くの一連の対立遺伝子
変種を整理することが重要になる。これは、ある遺伝子産物が細胞レベル、生物レベルま
たはより高次なレベルで、どの生化学的役割を果たすか、および遺伝子産物がどのように
相互作用し得るかの手掛かりになる。
【００２０】
遺伝子機能に関する情報を植物育種に活用するには、極めて効率がよくかつ費用効果が
高い逆遺伝学技術を利用できることが望ましい。逆遺伝学とは、対立遺伝子変種または発
現変種を作出しようとしている遺伝子配列情報から出発し、その作出後にそれらを機能的
に解析するアプローチを指す。この術語は、表現型変種を出発材料として使用し、その基
礎にある遺伝子の対立遺伝子型を同定する順遺伝学に対置される術語である。
【００２１】
逆遺伝学を植物育種に応用するには、遺伝子機能の知識が前提条件になる。現在、シロ
イヌナズナは、遺伝子機能に関して最も大規模に研究された植物系であり、アラビドプシ
ス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）研究で得られた結果は、この点で、豊富な情報源になって
いる。
【００２２】
アミノ酸配列レベルでのホモロジーに基づいて、作物種の相同タンパク質の機能を予測
することはできるが、その遺伝子の機能を証明するために、最終的には直接的な実験的証
拠が必要になる。従って、モデル種の遺伝子に対するホモロジーに基づいて同定された作
物種の遺伝子は、特定機能の候補遺伝子とみなすことしかできない。種間で類似する機能
または同一の機能を持つ遺伝子は、高レベルのホモロジーを示す場合があるが、必ずしも
そのようではなく、特定のモデル系に内在する遺伝子機能が、与えられた作物種に内在す
るものとは、部分的にしか重複しないこともあり得る。
【００２３】
逆遺伝学で活用することができる対立遺伝子変異性は、適応した集団内に自然に順応す
るか、またはそれぞれエチルメタンスルホン酸（ｅｍｓ）もしくはｘ線のような化学的も
しくは物理的突然変異誘発要因を使ったランダム突然変異誘発によって得ることができる
。植物の器官、細胞、花粉または種子をそのような突然変異誘発要因で処理することによ
り、ゲノムＤＮＡ中のランダムな位置で、遺伝子機能の変化につながりうる改変が誘発さ
れる。遺伝子機能に関する知識が急速に増加しつつあること、多くの植物種のゲノム配列
およびｃＤＮＡ配列を広く利用できること、ならびに自然の遺伝的変異および誘発された
遺伝的変異を有する集団を利用できることを考えると、逆遺伝学技術は、モデル種または
作物種における遺伝子機能を確立するための研究道具として、ますますその重要性を増し
ている。また、逆遺伝学は、特定の形質に機能的に関与することが公知である遺伝子の対
立遺伝子変種を効率よく同定することができる作物改良の強力な技術であるとみなすこと
もできる。
【００２４】
作物種において逆遺伝学を行うには、ターゲット遺伝子の他に、与えられた作物種の該
遺伝子座の遺伝子変種を含有する植物の集団が必要であることは明らかである。そのよう
な集団において、遺伝的変異は自発的に生じたものであってもよいし、ｅｍｓのような変
異原によって誘発することもできる。誘発突然変異を持つ集団を得るには、例えば、ｅｍ
ｓのような変異原を様々な濃度で含有する溶液中で、種子をインキュベートすることがで
きる。ｅｍｓは、主として、ＤＮＡ鎖のＧ残基をアルキル化し、それはＤＮＡ複製時に、
ＣではなくＴとの対形成を引き起こす。従ってＧＣ塩基対が、ｅｍｓの有効用量およびそ
の植物のミスマッチ修復系の活性によって決まる頻度で、ＡＴ塩基対に変化する。
【００２５】
ｅｍｓの有効用量は、使用する濃度、種子のサイズおよび他の物理的性質、ならびにｅ
ｍｓ溶液中で種子をインキュベートする時間に依存する。ｅｍｓで処理された種子は、典
型的に、Ｍ１種子と呼ばれる。処理の結果として、Ｍ１種子の組織はその細胞のゲノムに
ランダム点突然変異を含有し、生殖系組織を形成することになる細胞の部分集団中に存在
するものは、Ｍ２と呼ばれる次世代に伝達されることになる。ハプロ不全であるために不
稔性を引き起こす突然変異もしくはその組み合わせ、または胚致死性を誘発する突然変異
もしくはその組み合わせは、Ｍ２世代には伝達されない。
【００２６】
ｅｍｓの使用について上述した類似する手法を、他の突然変異誘発要因にも適用するこ
とができる。
【００２７】
突然変異体Ｍ２集団を特定遺伝子座の望ましい対立遺伝子変種の存在について逆遺伝学
を使って評価するには、Ｍ２種子集団を収穫および保存するために選択される方法に基づ
いて識別することが可能な異なるアプローチを取ることができる。一方では、Ｍ２種子を
単一の混合試料（ｂｕｌｋ  ｓａｍｐｌｅ）として収穫し保存することができるのに対し
て、他方では、Ｍ２種子をファミリーとして収穫し保存することができ、これは、Ｍ２種
子を植物ごとに収穫し、別々に保存することを意味する。
【００２８】
Ｍ２種子をまとめて収穫するのに要求される労力投入量は、Ｍ２種子がファミリーとし
て別々に収穫される状況と比較すると、はるかに少ない。その一方で、Ｍ２種子をファミ
リーとして収穫すると、その集団の各ファミリーのＭ２種子のサブセットのＤＮＡ抽出物
を調製することが可能になり、それを診断的に使って、その集団を解析することができる
。ひとたび突然変異が同定されたら、突然変異体を得るために温室または圃場で成長させ
る必要があるのは、陽性と診断された試料に対応するファミリーの種子だけである。
【００２９】
交雑Ｍ２集団が利用可能である場合は、ＤＮＡの抽出および解析用に、Ｍ２植物を別々
に成長させて試料採取する必要があり、これには、実行される各スクリーンごとに、比較
的大きな資源投入量が要求される。従ってどちらのアプローチも、それぞれに特有の欠点
を持ち、両アプローチの欠点を取り除くことができる解決策を提供することが、当分野で
は、明らかに必要とされている。
【００３０】
Ｍ２種子がまとめて収穫された場合、特定遺伝子の所望の対立遺伝子変種を含有する植
物個体を同定するには、非破壊的試料採取が要求される。通常、これは、Ｍ２集団の幼植
物（ｙｏｕｎｇ  ｐｌａｎｔ）を成長させ、葉試料を採取することによってこれらの植物
を個別に試料採取し、解析に使用するＤＮＡをそこから調製することによって行われる。
これらの葉試料は、ＤＮＡ抽出前に、使用する突然変異検出プラットフォームのダイナミ
ックレンジによって決定される程度まで、プールすることができる。適当なラベリングに
より、所望の突然変異を含有する部分集団、そして最終的には対応する植物個体まで、遡
ることができる。
【００３１】
スクリーニングする必要があるＭ２植物の数は、Ｍ１植物における突然変異の頻度およ
び研究対象である植物種において生殖系列に寄与する独立細胞の数に依存する。典型的な
実験において、１植物につき独立生殖胚芽細胞が２個であるとすると、誘発された遺伝的
変異を捕捉するには、Ｍ１植物５０００個の集団から出発した場合、約１０，０００個の
Ｍ２植物をスクリーニングすべきである。
【００３２】
Ｍ２種子が植物ごとに収穫される場合、種子の収穫が行われるＭ１植物の生殖系列に寄
与する細胞に内在する誘発突然変異は、Ｍ２ファミリーでは分離している。Ｍ２ファミリ
ーのいくつかの個体からＤＮＡ試料を調製することにより、毎回集団の試料を再採取しな
くても、ターゲット遺伝子における突然変異の存在について診断することができる。言い
換えると、単一のＤＮＡ試料を、それが代表するＭ２ファミリーのために、診断的に使用
することができる。特定遺伝子の所望の対立遺伝子変種を含有する植物個体は、所望の突
然変異に関して陽性と診断されたＭ２ファミリーだけについて個体を栽培することによっ
て得ることができる。
【００３３】
一度Ｍ２ファミリーが樹立されたら、このアプローチは比較的効率がよいものの、その
ようなファミリーに基づく系の設定はＭ１植物上で成長した種子を個別に収穫し処理する
必要があるので労働集約的であるし、集団の遺伝的変異の代表的反映としてＤＮＡライブ
ラリーを設定することも同様である。５０００個のＭ２ファミリーを処理するには、少な
くとも２５０人時の投入が必要であると見積られる。重要なことに、所望の突然変異がそ
の集団内に存在しない場合には、その作業全体を繰り返す必要がある。
【００３４】
（プールされた）植物試料から単離されたＤＮＡ中の突然変異を検出するために、当業
者はいくつかの確立された技術を持っている。ティリング（ｔｉｌｌｉｎｇ：ゲノム中の
局所病変を誘発するターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｏｃａｌ
ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ））は、ミスマッチの位置にＰＣＲによって生成
させた標識ヘテロ二重鎖ＤＮＡフラグメントのＣｅｌＩによる特異的切断に基づく。消化
した試料は（例えばＬｉｃｏｒシステムでの）変性ゲル電気泳動によって解析され、消化
されたＰＣＲフラグメントの存在は、元のＤＮＡプールにおけるＤＮＡ多型の存在を示す
（Ｃｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
１２６，４８０−４８４）。
【００３５】
変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）も同様にプールＤＮＡ試料に応用する
ことができる。ティリング手法と同様に、突然変異の存在は、ｄＨＰＬＣカラムをホモ二
重鎖分子と比較すると、速く流れるヘテロ二重鎖分子の形成をもたらして、プール試料中
の突然変異の検出を可能にする（ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｎ
ａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，４５５−４５７）。
【００３６】
高速中性子を突然変異誘発要因として使用する場合は、ゲノム中のランダムな位置に小
さな欠失が生じている。これは、欠失の結果としてサイズが減少している突然変異座位を
、ＰＣＲによって増幅することを可能にする。このＰＣＲ反応は突然変異座位に特異的で
あるため、極めて高レベルの試料プーリングが可能になる。一方、本方法は、例えば欠失
を含有する座位用に、特異的なＰＣＲ反応を設計することができる突然変異にだけ応用さ
れる（Ｓｏｎｇ，Ｘ．ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ
２７，２３５−２４２）。
【００３７】
ＤＮＡ試料間の多型を検出するために基本的に任意の利用可能な核酸解析技術を応用で
きることは、当業者には明らかである。個々の試料のダイレクト配列でさえ応用すること
ができる。産業的背景がある場合は、最適なプラットフォームが、主として、そのロバス
トネス（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）およびデータポイントあたりのコストによって決定され
る。
【００３８】
様々な誘発突然変異検出技術を利用できることと、自動化および小型化の進歩とにより
、データポイントあたりのコストは、Ｍ２集団および代表的ＤＮＡテンプレートの調製に
関わるコストと比較すると、比較的低いレベルまで下げられる。
【００３９】
従って植物の逆遺伝学の改良は、誘発された多型の検出よりも、突然変異体集団および
その代表的ＤＮＡ試料を調製する分野で実現された方がよい。このような改善は本発明に
よって得られる。
【００４０】
いずれにせよ、すなわち、Ｍ２交雑集団（ｂｕｌｋ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に基づい
て逆遺伝学を応用するにせよ、Ｍ２ファミリーに基づいて逆遺伝学を応用するにせよ、ス
クリーニング時に、または事前準備（ｕｐｆｒｏｎｔ）時に、それぞれかなりの労力投入
量が要求される。これは作物種における逆遺伝学的アプローチの費用効果的な利用可能性
を著しく制限する。
【００４１】
本発明のＤＮＡ単離方法は、植物育種中の植物の選抜にも使用することができる。植物
育種における前進は、交配および後代集団からの植物の選抜によって達成される。伝統的
には、選抜は特定の成長条件下で発現する植物表現型のレベルで行われる。例えば、植物
は、その果実および葉の色もしくは形状、病原体に対するそれらの抵抗性、それらの生産
性もしくは他の形質またはそれらの組み合わせに基づいて選抜される。
【００４２】
分子マーカー技術の登場により、特定形質の選抜は、ＤＮＡのレベルで行うことができ
るようになった。ある表現型の発現を引き起こしている遺伝子の対立遺伝子型に遺伝的に
強く連鎖するマーカー対立遺伝子の同定および検出を可能にする技術が開発されている。
理想的状況では、マーカー対立遺伝子およびある形質の原因になる遺伝子の対立遺伝子型
が同一である。そのような場合は、マーカー対立遺伝子および形質対立遺伝子が遺伝的組
換えによって切り離されることは起こり得ない。
【００４３】
形質の間接選抜を目的とするマーカー対立遺伝子の使用には、選抜プロセスの効率を改
善させる明確な利点がいくつかある。マーカーに基づく選抜は、植物の発生段階および環
境には依存しない。これは、例えば、果実特徴に関する選抜を実生段階で行うこと、また
は耐寒性に関する選抜を室温で行うことを可能にする。現在、マーカー対立遺伝子を使っ
た間接選抜は、現代の植物育種において広く応用されている。最も進歩しているのは、質
的形質（すなわち、生殖質内の表現型変異が単一遺伝子の対立遺伝子型によって決定され
るような形質）を検出するためのマーカーの応用である。
【００４４】
例えば、特定の病原体株に対する抵抗性は、しばしば、その病原体のビルレンス因子の
存在または活性を検出する受容体をコードするドミナントＲ遺伝子の存在によって決定さ
れる。抵抗性表現型の発現には多くの座位が関与するが、生殖質に内在して表現型値の説
明になる遺伝的変異は、通常は、単一のＲ遺伝子座によって決定される。
【００４５】
しかし、多くの形質は定量的または連続的であり、これは、環境条件による影響をしば
しば受ける形質の表現型値には、多くの遺伝子が寄与し得ることを意味する。そのような
形質は、例えば草高、開花期間または生産力である。さらにまた、複合形質の基礎にある
個々の遺伝子はエピスタティックに相互作用する場合があり、それがそれらの遺伝解析を
複雑にする。
【００４６】
高密度遺伝子マップおよび強力な統計学的ツールとを利用することができるので、これ
らの量的形質の発現に関与する座位（ＱＴＬ）の検出が、現在では可能になっている。従
って、分子マーカーを使って検出することができる（複合）形質の数は、近い将来、著し
く増加すると予想することができる。
【００４７】
現在、間接選抜を応用するには、選抜されるべき個々の植物を含む集団の種子を、ＤＮ
Ａ抽出用に組織試料を採取することができる段階まで、温室で発芽させる必要がある。組
織試料の採取は、作物種に依存して、実生段階または幼植物段階で行うことができる。Ｄ
ＮＡ解析を行った後に、植物の選抜を行うことができる。そのような手法が時間、空間お
よび労力を要し、それが分子マーカーに基づく間接選抜を行うために必要とされる資源全
体の比較的大きな部分を消費することは、明らかである。
【００４８】
ＤＮＡ解析を行うのに十分な質および量のＤＮＡ抽出物を取得するための手法の効率を
増大させる技術は、分子マーカーに基づく間接選抜に関わるコストを著しく低下させるこ
とができる。そのような技術を本発明は提供する。
【００４９】
本発明は、著しく効率のよい非破壊的な方法で植物からＤＮＡを単離するための新規方
法を提供する。本方法は、例えば、逆遺伝学ならびに間接選抜技術の総合効率を著しく改
善させるために応用することができる。
【００５０】
ＤＮＡ単離方法は、植物発生の極初期段階で、すなわち浸漬した種子から幼根が出現し
た段階で効果的に適用することができ、重要なことに、打抜きまたは切断などによる組織
試料採取を一切必要としない。
【００５１】
種子を適当な水分、光および温度条件下に置くと、水が吸い上げられ、発芽が開始され
る。通常、最初の目に見える発芽の兆候は、幼根または根端の出現である。成長と同時に
、根端の後ろのゾーンは、根境界細胞と呼ばれる生細胞を、環境中に捨てる（Ｈａｗｅｓ
，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．３６，
３１１−３２７）。
【００５２】
根境界細胞の機能は完全に明らかになっているわけではないが、これらの細胞は、植物
体とそれが成長している土壌との間に拡散境界（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｂｏｕｎｄａｒｙ）を
形成することによって、植物をアルミニウムなどの毒性元素または病原性微生物から保護
するというのが、現在の仮説である。また、根境界細胞は、有益な微生物の誘引または菌
根の樹立にも、役割を果たし得る。従って根境界細胞は根系の微細環境の制御に極めて重
要であり得る。
【００５３】
種子をインビトロで（例えば水中で）発芽させた場合も、根境界細胞は同様に産生され
、根表面に弱く付着した状態を保つ。穏やかに撹拌すると、根境界細胞は根表面から放出
され、液体中に分散し、収穫することができる。驚いたことに、本発明によれば、これら
の根境界細胞は、診断目的用のＤＮＡの供給源として役立ち得ることが見出された。全て
ではないとしても大半の作物種は根境界細胞を産生することが公知であるので、本発明の
普遍的な利用可能性が示唆される。
【００５４】
根が約１〜２ｃｍ出現している段階まで種子を水中で発芽させた場合、その水は、標準
的なＤＮＡ抽出手法を行って、ＰＣＲまたは他のＤＮＡ解析技術によるさらなる解析に十
分なＤＮＡを得るのに、十分な細胞材料を含有する。
【００５５】
本発明によれば、インビトロ植物の根が根境界細胞を産生することも見出された。従っ
て、発芽中の種子または苗の根端から派生するのではなく組織培養材料上の不定根から派
生するそのような根境界細胞も、そこからＤＮＡを単離するために使用することができる
。
【００５６】
根境界細胞懸濁液を１時間にわたって有効濃度のＤＮアーゼで処理しても、ＤＮアーゼ
の不活化とそれに続くＤＮＡの抽出後に、依然としてシグナルを得ることができる（図１
５）。これは、根浸出物から得られるＤＮＡが確かに根境界細胞などのＤＮアーゼ耐性構
造に由来しているという認識を裏付けている。
【００５７】
取得することができるＤＮＡの量は、多くの解析を行うのに十分であり、特にＩｎｖａ
ｄｅｒ（商標）またはＩｎｖａｄｅｒ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような蛍光に基づく検出技術を使用する場合である。
【００５８】
全てではないとしても大半の種子において、十分な物理的品質を有する作物種は、水中
で数日以内に発芽する。根境界細胞はこの極初期段階において形成されることを観察した
。従って、驚いたことに、乾燥種子から出発して数日以内に、ＤＮＡの抽出および解析を
完了することができる。発芽させた種子は少なくとも２週間はインビトロで生き続けるの
で、温室で植物を成長させるのに通常要求される時間および場所、ならびに組織試料を収
穫するのに要求される労力を、大幅に省略することができる。
【００５９】
同じことが組織培養根にも言える。根境界細胞を培地から単離することができ、インビ
トロ植物は成長を続けることができる。解析は植物発生の極初期段階において行うことが
できる。
【００６０】
さらに本発明によれば、交雑Ｍ２集団からの種子を種子２〜５個の小さなプールに分け
て発芽させ、そこからプールＤＮＡ試料を取得し、その試料を、野生型対立遺伝子の量の
３〜９倍を含有するプール中の１突然変異対立遺伝子を検出するダイナミックレンジを持
つ検出プラットフォームで解析することが可能であることも示される。
【００６１】
プーリングは、根境界細胞収穫、ＤＮＡ抽出物またはＰＣＲ産物のレベルで行うことも
できる。実際に採用されるプーリング戦略は、作物種ごとに異なり得る液体中での種子の
発芽挙動および根境界細胞産生、ならびに植物あたりのコストという観点から見て最適条
件を見出すことができる検出プラットフォームのダイナミックレンジなどといった、様々
なプロセスの専門的事項に依存する。
【００６２】
交雑Ｍ２種子もしくはＭ２ファミリーまたは育種集団いずれかを用いる逆遺伝学アプロ
ーチまたは間接選抜アプローチの資源投入量からみた効率に関して、本発明の方法はいく
つかの重要な意味を持っている。根境界細胞を用いる非破壊的ＤＮＡ抽出手法は、インビ
トロでの種子の発芽後、極めて早期に行うことができるので、苗がインビトロで少なくと
も数週間は生き続けるという事実を考えると、交雑Ｍ２集団を用いる逆遺伝学アプローチ
または間接選抜アプローチは、温室期間および場所ならびにリーフディスク（ｌｅａｆ  
ｄｉｓｃ）のような植物試料の労働集約的調製を、もはや必要としない。これは、Ｍ２交
雑集団を用いる作業の代替選択肢、すなわち資源の著しい事前投入が要求されるＭ２ファ
ミリーによる作業が、もう必要でないことを意味する。
【００６３】
また、育種中の間接選抜手法は、選抜が行われない温室における植物材料の成長を必要
としない。従って本発明では、特定座位における対立遺伝子変異性に関して評価する必要
がある手元の任意の集団を、当分野において現在公知である逆遺伝学または間接選抜手法
と比較して、かつてない効率および柔軟性をもってスクリーニングすることができる。
【００６４】
本発明の、植物のためのＤＮＡ単離方法は、最も広い意味で、応用することができる。
本出願では、効率のよい非破壊的ＤＮＡ単離方法が有利であるようないくつかの状況に言
及する。これらの例は限定を意図しない。本方法は任意のＤＮＡ単離に使用することがで
き、本明細書で言及しない他の状況においても、等しく応用できることは、当業者には明
らかである。
【００６５】
以下の限定でない実施例では、本発明をさらに詳しく示す。これらの実施例では後述の
図面に言及する。
〔実施例〕
【実施例１】
【００６６】
（キュウリの根境界細胞からのＤＮＡの抽出および解析）
キュウリ種子を１００μｌの水（ｍｉｌｌｉＱ）中、２６℃で発芽させる。さらなる処
理のために９６穴マイクロタイタープレートに試料を容易に移すことができる１２×８  
Ｍｉｃｒｏｎｉｃ（商標）マイクロチューブフォーマットなど、目的に応じて、様々なフ
ォーマットを使用することができる。出現する根が長さ約１．５ｃｍになった段階（これ
は、品種および種子の質に依存して、約１８時間後に起こる）で、根境界細胞を根から放
出させるために、発芽した種子を含有するチューブを１５秒間ボルテックスすることによ
って穏やかに振とうする。光学顕微鏡法で検査したところ、図１に示すように、キュウリ
の根境界細胞が培地中に存在することが明確に示された。
【００６７】
主根および根毛は本手法によって損傷されない。根境界細胞を含有する液体を使用し、
１００μｌの溶解緩衝液（Ａｇｏｗａ）を加えることによって、ＤＮＡ抽出（Ｐｌａｎｔ
ＤＮＡ単離キット（Ａｇｏｗａ  ＧｍｂＨ）とＫｉｎｇ  Ｆｉｓｈｅｒ（商標）ロボテ
ィクス、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓの組み合わせ）を行う。その混合物を５５
℃で１０分間インキュベートする。次に、３００μｌのＤＮＡ結合緩衝液（Ａｇｏｗａ）
を加え、その混合物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、１５μｌのＫｉｎｇ
Ｆｉｓｈｅｒ粒子懸濁液（Ａｇｏｗａ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｓｕ
ｓｐｅｎｓｉｏｎ  ＢＬＭ））を上清に加える。
【００６８】
１２０μｌの溶出緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ＝７．６）を使って、結
合したＤＮＡを粒子から溶出させた後は、ＤＮＡをすぐに解析に使用することができる。
キュウリの場合は、根境界細胞に基づくＤＮＡ抽出物から得たＤＮＡを解析するために、
ゲノムに内在する「ｋｏｍ２０」と呼ばれるランダム分子マーカーを選択した。
【００６９】
本実施例で使用した集団は、ｋｏｍ２０マーカーの対立遺伝子の一つに関してヘテロ接
合またはホモ接合に分離する。得られたＤＮＡ抽出物の全量の５μｌを使ってＰＣＲを行
った。このＰＣＲ反応は、アガロースゲルで解析した場合、３７２ｂｐのフラグメントを
もたらすと予想される。制限酵素ＭｓｐＩを使ってｋｏｍ２０  ＰＣＲフラグメントを消
化すると、本実施例で記載する実験に使用した集団中のこのマーカー座位の二つの対立遺
伝子が区別される。上記制限酵素の認識部位がＰＣＲ産物中に存在する場合、ＭｓｐＩに
よる消化は、２７９ｂｐおよび９３ｂｐのフラグメントをもたらす。その解析の結果を図
２に示す。
【００７０】
この結果を確認するために、ｋｏｍ２０対立遺伝子のそれぞれについて特異的蛍光シグ
ナル（正味のフォールドオーバーゼロ（Ｆｏｌｄ  Ｏｖｅｒ  Ｚｅｒｏ）、すなわちＦＯ
Ｚとして表される）を生成するｋｏｍ２０特異的蛍光プローブセット（Ｉｎｖａｄｅｒ（
商標））を使って、ＤＮＡ調製物を解析した。従って、この分離集団の個体から本発明に
従って得られたＤＮＡ調製物は、ｋｏｍ２０プローブを使って解析すると、マーカー対立
遺伝子のヘテロ接合性を示す蛍光シグナル診断（対角線上にプロットされる、ＲＥＤ＋Ｆ
ＡＭシグナル）またはマーカー対立遺伝子の一方のホモ接合性を示す蛍光シグナル診断（
この具体例ではＲＥＤで標識され、Ｘ軸にプロットされる）が生成される。この解析の結
果を図３に示し、解析の結果はこの予想を裏付けている。
【００７１】
集団のＰＣＲ／ＭｓｐＩ解析または蛍光に基づく解析を使って得られたｋｏｍ２０遺伝
子型スコアは、解析した各植物について合致することがわかった。従って、これらの結果
は、本発明の主題である手法に従って単離されるＤＮＡの量が、検出プラットフォームと
してＰＣＲとアガロースゲル電気泳動との組み合わせまたは蛍光に基づくプローブ系を使
用するＤＮＡマーカー解析を実行するのに十分であることを実証している。さらに、マー
カーコール（ｍａｒｋｅｒ  ｃａｌｌ）は、母体組織由来ではなく種子に内在する雑種組
織由来のＤＮＡから得られたものであると、結論することができる。というのも、使用し
たマーカーは分離し、この解析に使用した雑種種子を作出するために用いた母系ではその
ようではないからである。
【００７２】
本発明のＤＮＡ単離手法を使って得られたデータを確認するために、発芽した種子を温
室で成長させ、葉試料を採取し、ＰＣＲ／ＭｓｐＩを使ってｋｏｍ２０マーカーについて
解析した。葉ＤＮＡを使って得られたデータは、根境界細胞ＤＮＡ抽出物から得たＤＮＡ
を使って得られたデータと合致することが明らかになった。これは、根境界細胞ＤＮＡ抽
出物によって生成されるマーカーデータが、出現する苗から成長させた苗立ちした植物を
表現することを実証している。
【００７３】
ＤＮＡ抽出物１個あたりに行うことができるアッセイの量を決定するために、ＤＮＡ抽
出物の希釈系列を、様々な５種類のランダムマーカー座位を検出する五つの蛍光型アッセ
イを、２回ずつ使ってアッセイした。各ＤＮＡ抽出物は、少なくとも２０倍は希釈しても
、上記様々なアッセイのシグナルはいずれも失われないことがわかった。各抽出物は体積
１００μｌとして産出され、１回のアッセイにつき５μｌを使用するので、１回の単離で
ＤＮＡ抽出物１個につき合計４００回のアッセイを行うことができる。また、キュウリの
場合は、１個の苗につき、少なくとも２ラウンドの根境界細胞収穫およびＤＮＡ単離を行
うことができ、これは、根境界細胞ＤＮＡ抽出物を使って１個の苗につき合計８００回の
アッセイを行い得ることを意味する。
【００７４】
根境界細胞ＤＮＡの供給源として使用した発芽種子を４℃で保存すると、キュウリ苗は
少なくとも３週間は生存可能な状態を保つ。これは、ＤＮＡ解析が完了した後で温室に移
すことができるほど十分なレベルの生存力を、苗が持つことを含意している。
【００７５】
従って、所望する分子マーカースコアを持つ植物だけを温室に移せばよく、所望する分
子マーカースコアを持たない植物は、極初期のインビトロ相で廃棄することができる。こ
れはかなりのコスト削減をもたらし得る。
【実施例２】
【００７６】
（メロンの根境界細胞からのＤＮＡの抽出および解析）
ダヌビオ（Ｄａｎｕｂｉｏ）と呼ばれる雑種品種の自殖後代のメロン種子を、１００μ
ｌの水（ｍｉｌｌｉＱ）中、２６℃で発芽させる。メロンからＤＮＡを単離するために使
用する手法は、本出願の実施例１にキュウリについて説明した手法と同様である。図４は
、メロン苗を含有する液体培地における根境界細胞の存在を示している。
【００７７】
ＰＣＲを使ってマーカー対立遺伝子を検出するのに十分なＤＮＡをこの手法がもたらす
かどうかを調べるために、５μｌのＤＮＡ抽出物を使って、マーカー対立遺伝子ｍｌ１１
ｋ１９に特異的なプライマーの組み合わせを用いるＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応
は、３４２ｂｐのフラグメントをもたらすと予想される。この解析の結果を図５に示す。
【００７８】
図５に示す結果は、予想されるＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって生成させるのに十
分なＤＮＡが得られたことを実証している。フラグメントが実際に胚に由来することを実
証するために、元の雑種中に存在しこの解析で使用した種子では分離すると予想される両
対立遺伝子を検出する蛍光型ｍｌ１１ｋ１９アッセイを行った。この実験の結果を図６に
示す。
【００７９】
この結果は、マーカー対立遺伝子ｍｌ１１ｋ１９が、ホモ接合Ａ（ＦＡＭシグナル）、
ホモ接合Ｂ（ＲＥＤシグナル）およびヘテロ接合という、三種類に分離することを明確に
実証し、これはＤＮＡが胚由来であることを示している。
【実施例３】
【００８０】
（トマトの根境界細胞からのＤＮＡの抽出および解析）
トマト種子を、５０μｌの水（ｍｉｌｌｉＱ）中、２６℃で発芽させ、出現する根が平
均１．０ｃｍの長さになった時に、本出願の実施例１に従ってＤＮＡを抽出した。光学顕
微鏡法による解析は、図７に示すように、培地中にトマトの根境界細胞が存在することを
、明確に示した。
【００８１】
３６０ｂｐのバンドを生成させると予想されるラテラルサプレッサー（ｌａｔｅｒａｌ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）と呼ばれるトマトの公知遺伝子に特異的なプライマーの組み合
わせを使って、ＤＮＡの全量の５μｌを使って、ＰＣＲを行った。この実験の結果を図８
に示す。
【００８２】
この結果は、本手法によって単離されるＤＮＡの量が、アガロースゲル上で検出するこ
とのできる予想サイズのＰＣＲフラグメントを生成させるのに十分であることを、明確に
実証している。バンドが観察されない場合（図８においてアスタリスクで印を付けたレー
ン）では、種子が発芽していなかったことに注意すべきである。これは、本手法を使って
行われるＰＣＲフラグメントの検出が種子の発芽に依存することを示している。
【実施例４】
【００８３】
（キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）の根境界細胞からのＤＮＡの抽出お
よび解析）
キャベツの発芽種子を使って実験を行った。採用した手法は、実施例１で記載した手法
と同様である。発芽温度は２１℃とした。キャベツの苗の根端にある根境界細胞を図９に
示す。
【００８４】
根境界細胞から得たＤＮＡ抽出物を使って、核に内在する核酸を検出できることを実証
するために、ＢｏＡＣＯ２と呼ばれるエチレンの生合成に関与する遺伝子のフラグメント
を増幅することができるプライマーの組み合わせを設計した。このＰＣＲ反応は３４４ｂ
ｐのフラグメントをもたらすと予想される。この解析の結果を図１０に示す。
【００８５】
図１０に示す結果は、ＰＣＲによって予想される核ＤＮＡフラグメントを生成させるの
に十分なＤＮＡが得られたことを実証している。
【００８６】
核配列の他に、細胞質ゲノムに内在する配列も、根境界細胞由来のＤＮＡ中に検出でき
ることを実証するために、他の実験を行った。ミトコンドリアゲノム中に位置するＯＲＦ
Ｂ遺伝子領域を増幅するＰＣＲ反応を行った。このＯＲＦ  Ｂ領域のフラグメントは１
１８０ｂｐの予想サイズを有する。本実験の結果を図１１に示す。
【００８７】
この結果はＯＲＦ  Ｂ遺伝子領域に特異的バンドの生成を示し、本明細書に記載するＤ
ＮＡ単離手法を使って細胞質ＤＮＡ配列を検出できるということを実証している。
【実施例５】
【００８８】
（レタスの根境界細胞からのＤＮＡの抽出および解析）
レタス種子を５０μＬの水（ｍｉｌｌｉＱ）中、２１℃で発芽させた。根の出現は２日
以内に起こり、穏やかな振とうにより、根から根境界細胞を引き離した。顕微鏡法で可視
化したレタスの根境界細胞を図１２に示す。
【００８９】
ＤＮＡ抽出は、根が約１．５ｃｍの平均長になった段階で行った。適用したＤＮＡ抽出
手法は、実施例１でキュウリについて記載した手法と同様である。十分なＤＮＡが得られ
たかどうかを評価するために、アブラムシ（Ｎａｓｏｎｏｖｉａ）抵抗性遺伝子に連鎖す
るＮＡＳ２と呼ばれるゲノムマーカーを使って、ＰＣＲ反応を行った。その結果を図１３
に示す。
【００９０】
この結果は、得られたＤＮＡ抽出物の５μｌをＰＣＲ反応に使用した場合に、応用した
分子マーカーに予想されるサイズを持つ特異的バンドが生成することを示している。本発
明によるＤＮＡ単離手法は、ＰＣＲのようなＤＮＡ解析を行うための要件を満たしている
と結論される。
【００９１】
図１３に示す結果は、予想されるＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって生成させるのに
十分なＤＮＡが得られたことを実証している。フラグメントが実際に胚由来であることを
実証するために、元の雑種中に存在し、この解析で使用した種子において分離すると予想
されるＮＡＳ２の両対立遺伝子を検出する蛍光型ＮＡＳ２アッセイを行った。この実験の
結果を図１４に示す。
【００９２】
この結果は、マーカー対立遺伝子ＮＡＳ２が、ホモ接合Ａ（ＦＡＭシグナル）、ホモ接
合Ｂ（ＲＥＤシグナル）およびヘテロ接合という、三種類に分離することを明確に実証し
、これはＤＮＡが胚由来であることを示している。
【実施例６】
【００９３】
（根浸出物からのＤＮＡはＤＮアーゼ耐性画分に存在する）
本発明が記載する手法に従って根浸出物から得られるＤＮＡが根境界細胞に由来するこ
とを実証するために、ＤＮアーゼ感受性実験を行った。
【００９４】
実施例１で記載したようにキュウリ苗から根境界細胞を産生させ、単離されたＤＮＡを
、マーカー座位ｋｏｍ２４に特異的なプライマーの組み合わせを用いるＰＣＲで解析した
。ＤＮＡ抽出を行う前に、根浸出物をＤＮアーゼで処理した。ＤＮＡが根浸出物中にその
まま存在するのであれば、それはＤＮアーゼによって分解される。ＤＮＡが根境界細胞内
に存在するのであれば、ＤＮアーゼ処理は、ＤＮＡ抽出後のＰＣＲシグナルの生成には影
響しない。
【００９５】
本実験の結果を図１５に示す。これらの結果は、キュウリ根浸出物に加えた場合にレタ
ス由来のＤＮＡはＤＮアーゼ処理に対して感受性であるが、キュウリＤＮＡのＰＣＲシグ
ナルはＤＮアーゼ処理の結果として失われなかったことを示している。これは、キュウリ
根浸出物はキュウリＤＮＡを含有し、そのキュウリＤＮＡが、添加されたＤＮアーゼから
保護され、従って浸出物中に存在する根境界細胞に由来することを実証している。
【実施例７】
【００９６】
（インビトロで成長させた植物からの根浸出物を使ったＤＮＡ抽出）
インビトロで根付かせたキュウリの苗条を、インビトロ培養培地から水を含有するマイ
クロウェルプレートへと小植物を移すことによって解析用に採取し、それに根境界細胞を
生成させた。２６℃で２４時間のインキュベーション後は、図１６に示すように、光学顕
微鏡法で根境界細胞の形成を明確に視認することができた。
【００９７】
この段階で、根境界細胞を収集し、ＤＮＡを抽出し、マーカー座位ｋｏｍ２４に特異的
なＰＣＲによって解析した。図１７に示すように、根境界細胞からのＤＮＡ抽出物を使っ
て、キュウリゲノムＤＮＡの存在を示す明確なバンドが得られた。
【００９８】
図１７に示す結果は、予想されるＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって生成させるのに
十分なＤＮＡが得られたことを実証し、従って根境界細胞に基づくＤＮＡ単離技術はイン
ビトロで成長させた小植物からの不定根に由来する根浸出物にも応用できると結論するこ
とができる。
【実施例８】
【００９９】
（コショウの根境界細胞からのＤＮＡの抽出および解析）
コショウの種子を４０μｌの水（ｍｉｌｌｉＱ）中、２６℃で発芽させ、出現する根が
平均１．０ｃｍの長さになった時に、本出願の実施例１に従ってＤＮＡを抽出した。光学
顕微鏡法で検査したところ、図１８に示すように、培地におけるペッパーの根境界細胞の
存在が、明確に示された。
【０１００】
ＧＭＳ対立遺伝子のそれぞれについて特異的蛍光シグナル（正味のフォールドオーバー
ゼロ、すなわちＦＯＺとして表される）を生成するＧＭＳ特異的な蛍光プローブセット（
Ｉｎｖａｄｅｒ（商標））（ＦＡＭまたはＲＥＤ）を使って、ＤＮＡ調製物を解析した。
本実施例では、ＧＭＳマーカー対立遺伝子に関して一様にヘテロ接合であることが公知で
あるＦ１雑種種子を解析した。従って、Ｆ１雑種集団の個体から本発明に従って取得され
るＤＮＡ調製物を、ＧＭＳプローブを使って解析すれば、マーカー対立遺伝子のヘテロ接
合性を示す蛍光シグナル分析（対角線上にプロットされる、ＲＥＤ＋ＦＡＭシグナル）が
生成することが期待される。この解析の結果を図１９に示す。
【０１０１】
蛍光に基づく集団の解析を使って得られたＧＭＳ遺伝子型スコアは、解析した各植物に
ついて、このマーカー座位に関する公知表現型値と合致することが見出された。従って、
これらの結果は、本発明の手法に従って単離されるＤＮＡの量が、蛍光に基づくプローブ
系を検出プラットフォームとして使用してＤＮＡマーカー解析を行うのに十分であること
を実証している。
【実施例９】
【０１０２】
（トウモロコシの根境界細胞の形成）
トウモロコシ種子を５００μｌの水（ｍｉｌｌｉＱ）中、２１℃で発芽させ、出現する
根が平均２．０ｃｍの長さになった時に、光学顕微鏡法で検査したところ、図２０に示す
ように、培地におけるトウモロコシの根境界細胞の存在が、明確に示された。
【０１０３】
この段階で根境界細胞を収集し、ＤＮＡを抽出し、細胞壁インベルターゼ（Ｉｎｃｗ１
、アクセッション番号ＡＦ０５０１２９）に特異的なＰＣＲによって解析した。トウモロ
コシゲノムＤＮＡの存在を示す６２０ｂｐの明確なバンドが、図２１に示すように、根境
界細胞からのＤＮＡ抽出物を使って得られた。
【実施例１０】
【０１０４】
（エンダイブの根境界細胞の形成）
エンダイブ種子を４０μｌの水（ｍｉｌｌｉＱ）中、２１℃で発芽させ、出現する根が
平均１．０ｃｍの長さになった時に、光学顕微鏡法で検査したところ、図２２に示すよう
に、培地におけるエンダイブの根境界細胞の存在が、明確に示された。
【実施例１１】
【０１０５】
（ニンジンの根境界細胞の形成）
ニンジン種子を４０μｌの水（ｍｉｌｌｉＱ）中、２１℃で発芽させ、出現する根が平
均１．０ｃｍの長さになった時に、光学顕微鏡法で検査したところ、図２３に示すように
、培地におけるニンジンの根境界細胞の存在が、明確に示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】液体培地中に根境界細胞を脱落させているキュウリの根端である。左パネルは白色光下の像を示し、右パネルはＤＡＰＩ染色後の蛍光照明下での根境界細胞の核を示す。
【図２】本発明のＤＮＡ抽出手法によって生成されたキュウリの様々なＤＮＡ試料のｋｏｍ２０マーカー座位のＰＣＲ解析と、それに続くＭｓｐＩ消化とによって得られたバンドを示す、臭化エチジウム染色アガロースゲルである。  レーン１：サイズマーカー、  レーン２〜１１：１０個の個別キュウリ根境界細胞調製物、  レーン１２：陰性対照：レタス根境界細胞調製物、  レーン１３：陰性対照：水、  レーン１４：陽性対照：キュウリリーフディスク。
【図３】ｋｏｍ２０プローブセットを使ってキュウリ根境界細胞ＤＮＡ抽出物の解析後に得られる正味のフォールドオーバーゼロ（ＦＯＺ）として表したＦＡＭおよびＲＥＤスコアである。各ＤＮＡ試料について、ＲＥＤシグナルをＸ軸にプロットし、ＦＡＭシグナルをＹ軸にプロットする。
【図４】左パネルは、発芽させたメロン種子を、液体培地中のその根端と共に示している。右パネルは、根から生じる脱落した根境界細胞を示す。
【図５】本発明のＤＮＡ抽出手法によって生成されたメロンの様々なＤＮＡ試料のｍｌ１１ｋ１９マーカー座位のＰＣＲ解析によって得られたバンドを示す、臭化エチジウム染色アガロースゲルである。  レーン１：サイズマーカー、  レーン２〜１１：１０個の個別メロン根境界細胞調製物、  レーン１２：メロンリーフディスクから得たＤＮＡ、  レーン１３：陰性対照、レタス根境界細胞調製物、  レーン１４：陰性対照、水。
【図６】ｍｌ１１ｋ１９プローブセットを使ってメロン根境界細胞ＤＮＡ抽出物の解析後に得られる正味のフォールドオーバーゼロ（ＦＯＺ）として表したＦＡＭおよびＲＥＤスコアである。各ＤＮＡ試料について、ＲＥＤシグナルをＸ軸にプロットし、ＦＡＭシグナルをＹ軸にプロットする。
【図７】液体培地中に根境界細胞を脱落させているトマトの根端である。
【図８】本発明のＤＮＡ抽出手法によって生成されたトマトの様々なＤＮＡ試料のラテラルサプレッサー遺伝子のＰＣＲ解析によって得られたバンドを示す、臭化エチジウム染色アガロースゲルである。  レーン１：サイズマーカー、  レーン２〜１１：１０個の個別トマト根境界細胞調製物、レーン１２：トマトリーフディスクから得たＤＮＡ、  レーン１３：陰性対照、水。
【図９】根境界細胞が付着しているキャベツの根端である（左）。キャベツの根境界細胞の詳細図である（右）。
【図１０】本発明のＤＮＡ抽出手法によって生成されたキャベツの様々なＤＮＡ試料のＢｏＡＣＯ２遺伝子フラグメントのＰＣＲ解析によって得られたバンドを示す、臭化エチジウム染色アガロースゲルである。  レーン１：サイズマーカー、  レーン２〜１２：１１個の個別キャベツ根境界細胞調製物、  レーン１３：陰性対照、水。
【図１１】キャベツのミトコンドリアゲノムのミトコンドリアＯＲＦ  Ｂ領域のＰＣＲ解析によって得られたバンドを示す、臭化エチジウム染色アガロースゲルである。  レーン１：サイズマーカー、  レーン２〜７：６個の個別キャベツ根境界細胞調製物、  レーン８：キャベツ植物の葉から得たＤＮＡ、  レーン９：陰性対照：水。
【図１２】トルイジンブルー染色後のレタス根から脱落した根境界細胞の光学顕微鏡観察である。
【図１３】本発明のＤＮＡ抽出手法によって生成されたレタスの様々なＤＮＡ試料のアブラムシ抵抗性遺伝子に連鎖するＮＡＳ２と呼ばれる分子マーカーのＰＣＲ解析によって得られたバンドを示す、臭化エチジウム染色アガロースゲルである。  レーン１：サイズマーカー、  レーン２〜１３：１２個の個別レタス根境界細胞調製物、  レーン１４：サイズマーカー、  レーン１５：陰性対照：水、  レーン１６：陽性対照：レタスのリーフディスクから得たＤＮＡ（「ｐｏｎｓ  ｓｌａ」）、  レーン１７：陰性対照、キュウリから得たＤＮＡ。
【図１４】ＮＡＳ２プローブセットを使ってレタス根境界細胞ＤＮＡ抽出物の解析後に得られる生の値として表したＦＡＭおよびＲＥＤスコアである。各ＤＮＡ試料について、ＲＥＤシグナルをＸ軸にプロットし、ＦＡＭシグナルをＹ軸にプロットする。
【図１５】ＤＮアーゼで処理したキュウリ根浸出物のＤＮＡ抽出物のＰＣＲ解析を示す、臭化エチジウム染色アガロースである。  パネルＡ：キュウリｋｏｍ２４特異的なプライマーの組み合わせを使ったＰＣＲ解析。  パネルＢ：レタス特異的なＲＣＰプライマーの組み合わせを使ったＰＣＲ解析。レーン１〜１８は、以下の処理に付したキュウリ根浸出物から単離されたＤＮＡを含有する。レーン１〜３、７〜９および１３〜１５で解析された根抽出物には、レタスゲノムＤＮＡを加えた。レーン１〜６の試料には、ＤＮアーゼを加えなかった。レーン７〜１２の試料には、ＤＮアーゼを加え、６５℃で５分間インキュベートすることによって直ちに失活させた。レーン１３〜１８には、ＤＮアーゼを加えた後、３７℃で３０分間インキュベートし、次に失活させた。パネルＡでは対照として、水（レーン１９）、レタスＤＮＡ（レーン２０）およびキュウリＤＮＡ（レーン２１）を使用した。パネルＢでは対照として、水（レーン１９）レタスＤＮＡ（レーン２０および２１）およびキュウリＤＮＡ（レーン２２）を使用した。
【図１６】２６℃の水中で２４時間インキュベートした後のインビトロ再生キュウリ植物の不定根の根端である。根境界細胞の脱落はこの段階で明確に視認することができる。
【図１７】本発明のＤＮＡ抽出手法によって生成されたキュウリの様々なＤＮＡ試料のｋｏｍ２４マーカー座位のＰＣＲ解析によって得られたバンドを示す、臭化エチジウム染色アガロースゲルである。  レーン１：不定根から得たキュウリ根境界細胞調製物（ＢＣ）、  レーン２：キュウリリーフディスクから得たＤＮＡ、レーン３：陰性対照、水。
【図１８】液体培地中に根境界細胞を脱落させているペッパーの根端である。
【図１９】ＧＭＳプローブセットを使ってペッパー根境界細胞ＤＮＡ抽出物の解析後に得られる正味のフォールドオーバーゼロ（Ｆｏｌｄ  Ｏｖｅｒ  Ｚｅｒｏ：ＦＯＺ）として表したＦＡＭおよびＲＥＤスコアである。各ＤＮＡ試料について、ＲＥＤシグナルをＸ軸にプロットし、ＦＡＭシグナルをＹ軸にプロットする。このグラフでは、ヘテロ接合シグナルを青色でプロットし、対照のホモ接合シグナルを赤色および緑色のシグナルでプロットする。
【図２０】液体培地中に根境界細胞を脱落させているトウモロコシの根端である。
【図２１】本発明のＤＮＡ抽出手法によって生成されたトウモロコシの様々なＤＮＡ試料の細胞壁インベルターゼ遺伝子Ｉｎｃｗ１のＰＣＲ解析によって得られたバンドを示す、臭化エチジウム染色アガロースゲルである。  レーン１：サイズマーカー。  レーン２〜７：トウモロコシ根境界細胞調製物から得たＤＮＡ。  レーン８：陰性対照、水。  レーン９〜１０：陽性対照、トウモロコシリーフディスクから抽出されたＤＮＡ。
【図２２】液体培地中に根境界細胞を脱落させているエンダイブの根端である。
【図２３】液体培地中に根境界細胞を脱落させているニンジンの根端である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年8月14日(2013.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
苗のような非常に若い植物の根、または発芽中の種子から出現する根、またはインビトロの植物の不定根から、水または組織培養培地などの液体培地中に収穫された根境界細胞から単離されたＤＮＡの解析を含む、遺伝的変異に関して大きな植物集団を極めて高い効率でスクリーニングするための方法。
【請求項２】
前記種子を幼根または根端が出現するまで発芽させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約１〜２ｃｍまで成長した根から前記根境界細胞を収集する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
スクリーニングされるための前記植物集団が、交雑Ｍ２突然変異体植物集団である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
スクリーニングされるための前記植物集団が、交雑自然植物集団である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
スクリーニングされるための前記植物集団が、育種集団である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
スクリーニングされるための前記植物集団が、商業用種子のロットである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝的変異が、化学的または物理的突然変異誘発によって生成させた植物集団中の特定遺伝子の遺伝子変種を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記スクリーニングが、品質管理のための植物集団の遺伝子タイピングのためのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記スクリーニングが、遺伝的に異なる植物の集団内に存在する植物を、ある表現型形質の発現を決定する遺伝子の対立遺伝子型に連鎖する多型分子マーカーの対立遺伝子型の検出に基づいて同定するためのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記スクリーニングが、植物育種中の植物の選抜のためのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
スクリーニングされるための前記植物集団が、キュウリ、レタス、メロン、トマト、キャベツ、コショウ、トウモロコシ、エンダイブおよびニンジンからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。