(57)【要約】      （修正有）【課題】外因性ポリヌクレオチドを発現するためのインテグラーゼ欠損レンチウイルスドナーポリヌクレオチドの提供。【解決手段】インテグラーゼ欠損レンチウイルスドナーポリヌクレオチドであって、哺乳類細胞の内因性細胞クロマチン配列と同一であり、ｉ）第１及び第２の相同配列の間に配置された対象の遺伝子、及び前記第１及び第２の相同配列の外側の選択マーカーを含むドナーポリヌクレオチド、ｉｉ）前記第１及び第２の相同配列の間に配置された対象の遺伝子及び第１の選択マーカー、及び前記第１及び第２の相同配列の外側の第２の選択マーカーを含むドナーポリヌクレオチド、ｉｉｉ）対象の遺伝子、及び前記第１及び第２の相同配列の外側の第１の選択マーカーを含むドナーポリヌクレオチド、ならびにｉｖ）前記第１及び第２の相同配列の間に配置された対象の遺伝子及び選択マーカーを含むドナーポリヌクレオチドから成る群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチウイルスＬＴＲの間で、
（ｉ）細胞の細胞クロマチンの関心領域と相同配列である第１および第２のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）外因性配列と、
を含む、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ドナーポリヌクレオチド。
【請求項２】
第１の選択可能またはスクリーニングマーカをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記第１の選択可能またはスクリーニングマーカは、前記第１と第２のヌクレオチド配列との間にない、請求項２に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項４】
第２の選択可能またはスクリーニングマーカをコードする配列をさらに含む、請求項２または３に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記第２の選択可能またはスクリーニングマーカの両側に前記第１および第２のヌクレオチド配列が配置される、請求項４に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記第１および／または第２の選択可能なマーカは、陽性選択マーカである、請求項４に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記第１および／または第２の選択可能なマーカは、陰性選択マーカである、請求項４に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記第１および／または第２の選択可能なマーカは、陽性および陰性選択マーカである、請求項４に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記陽性／陰性選択マーカは、ｈｙｇ−ＴＫである、請求項８に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記細胞は、真核細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記細胞は、哺乳類細胞である、請求項１０に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項１１に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記第１および第２のヌクレオチドは、前記外因性配列の両側に配置される、請求項１〜１２のいずれかに記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項１４】
細胞への外因性核酸配列の単一コピーまたは複数コピーの制御された部位特異的組込みのための方法であって、
（ａ）前記細胞において第１の融合タンパク質を発現するステップであって、前記第１の融合タンパク質は、第１の亜鉛フィンガー結合ドメインおよび第１の開裂半分ドメインを含み、前記第１の亜鉛フィンガー結合ドメインは、前記細胞のゲノムにおける関心領域において第１の標的部位に結合するように操作された、ステップと、
（ｂ）前記細胞において第２の融合タンパク質を発現するステップであって、前記第２の融合タンパク質は、第２の亜鉛フィンガー結合ドメインおよび第２の開裂半分ドメインを含み、前記第２の亜鉛フィンガー結合ドメインは、前記細胞の前記ゲノムにおける前記関心領域において第２の標的部位に結合し、前記第２の標的部位は、前記第１の標的部位と異なる、ステップと、
（ｃ）前記細胞を、請求項１〜１３のいずれかに記載の任意の前記ＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドと接触させる、ステップと、を含み、
前記第１の標的部位への前記第１の融合タンパク質の結合、および前記第２の標的部位への前記第２の融合タンパク質の結合は、前記開裂半分ドメインを位置付け、それにより、前記細胞の前記ゲノムは、前記関心領域において開裂され、それによって、前記関心領域における前記細胞の前記ゲノムへの前記外因性配列の１つ以上のコピーの組込みがもたらされる。
【請求項１５】
前記外因性核酸配列は、ｃＤＮＡを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記関心領域は、生存能力に対して必須ではない前記ゲノムの領域にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記関心領域は、転写活性のある前記ゲノムの領域にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記外因性配列の単一コピーは、前記細胞の前記ゲノムへ組み込まれる、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記外因性配列の複数コピーは、前記細胞の前記ゲノムへ組み込まれる、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記融合タンパク質の少なくとも１つは、前記開裂半分ドメインの二量化境界面のアミノ酸配列における変化を含む、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞は、哺乳類細胞である、請求項１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府援助研究に基づく発明に対する権利の陳述
該当せず。
【０００２】
本開示は、ポリペプチドおよびゲノム工学ならびに相同組換えの分野におけるものである。
【背景技術】
【０００３】
安定した形質転換および標的遺伝子挿入は、遺伝子療法および細胞工学の両方において多くの潜在的用途を有する。しかしながら、現在の戦略は、しばしば不十分であり、導入遺伝子を原核または真核ゲノムＤＮＡへ非特異的に挿入する。ゲノム挿入の配置を制御することができないことは、ゲノム内の位置効果のため、集団全体にわたって導入遺伝子発現のかなりばらつきがあるレベルにつながり得る。加えて、導入遺伝子の安定した形質転換および増幅の現在の方法は、しばしば、導入遺伝子の物理的損失、経時的な導入遺伝子サイレンシング、内因性遺伝子の内部にあるか、または隣接する遺伝子および自主的プロモータの組込みによる挿入突然変異、染色体異常の作製および再構成された遺伝子産物（内因性遺伝子、挿入された導入遺伝子、または両方から成る）の発現、および／または安定した導入遺伝子発現を提供するためのベクターの長期持続の必要性により恒久的に発現されるベクター由来の遺伝子からの体内でのベクター関連毒性または免疫原性の作製をもたらす。
【０００４】
レンチウイルスおよびレトロウイルスベクターは、遺伝子組込みのために使用され、コードされた導入遺伝子とともにそれらのウイルスゲノムを、インテグラーゼを介して形質導入細胞の宿主ゲノムへ安定的に組み込むことができる。例えば、米国特許第５，９９４，１３６号、同第６，１６５，７８２号、および同第６，４２８，９５３号を参照されたい。しかしながら、導入遺伝子発現は、ウイルスが宿主ゲノムのどこに組み込まれるかによってかなり変化に富み得、導入遺伝子サイレンシングが経時的に生じ得、挿入突然変異が生じ得、組込みの部位は、制御することができない。また、ゲノムへ挿入される導入遺伝子コピーの数は、細胞に付加されるベクターの用量によって若干しか制御することができない。また、ウイルスベクターが追加的な非原生種遺伝子を発現する場合、これらは細胞にとって毒性であり得るか、または体内で形質導入細胞の破壊につながる免疫応答を引き起こし得る。
【０００５】
真核細胞において、安定した形質転換は、対象の導入遺伝子とともに選択マーカをコードする組み換えＤＮＡ配列を使用して得ることもできる。対象の導入遺伝子を安定的に発現する細胞は、選択マーカの安定した発現のために選択することによって単離され得る。導入遺伝子コピーの数および発現のレベルは、メトトレキサート（ＤＨＦＲ遺伝子）またはＰＡＬＡ（ＣＡＤ遺伝子）等の薬物を使用して、長期に及ぶ選択によって増幅され得る。しかしながら、この方法は、まだ位置効果に苦しみ、ゲノムにおいて遺伝子が挿入され得る場所の標的化を可能にすることができない（Ｃｏｑｕｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９：２１５−２２５）。加えて、増幅頻度は低く（典型的に＜１０Ｅ−４）、しばしば、薬物濃度を徐々に増加させながらの２０の細胞通過のために選択が生じることを必要とし、単一の選択ステップを使用する増幅は、極めて非効率的である（Ｔｌｉｓｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９４４１−９４４５；Ｋｅｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｃｅｌｌ９：５４１−５５０；Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７９２１−７９２６）。また、増幅は、腫瘍細胞のみで実行することができ、初代細胞では作用せず（Ｔｌｉｓｔｙ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３１３２−３１３９号；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１７９１−１７９５）、多くのヒトおよびラット細胞株において、増幅プロトコルは、選択マーカおよび対象の導入遺伝子をコードする染色体領域の均質反復の代わりに、不安定な染色体外二重微小の形成、ならびに腫瘍細胞における染色体不安定性および再構成のより多い発生につながり得る（Ｐａｕｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２９５５−２９５９；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１８１６−１８２１；Ｆｏｕｇｅｒｅ−Ｄｅｓｃｈａｔｒｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，ｐｐ．２９−３２；Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７９２１−７９２６）。安定した高い導入遺伝子発現は、しばしば、選択薬剤への継続的な露出も必要とする（Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７０５−７１３；Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８４），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３：４４７−５０３；Ｔｌｉｓｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９４４１−９４４５）。そのため、薬剤への長期に及ぶ露出の必要条件、染色体不安定性の増加、および初代細胞に対してこの方法を使用することができないことを踏まえると、マーカ選択は、細胞療法のための細胞工学において適用可能ではない。
【０００６】
導入遺伝子の単一または複数コピーは、人工染色体または安定したエピソームを介して細胞へ安定的に組み込むこともできる。これらのシステムは、哺乳類細胞において複製し、安定したままでいられ、ゲノム調節要素を含むことができるより大きい遺伝子ペイロードを含有することができ、一般的に、組み込まれ、挿入突然変異を引き起こさない（Ｃｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）ｖｏｌ．１１，ｐｐ．１７３５−１７４１）。しかしながら、それらの経時的な全体的安定性に問題があり、例えば、これらの人工染色体の損失および／または再構成、ならびに天然型染色体の不安定化（例えば、二動原体染色体の作製）を引き起こし得る、人工染色体またはエピソームの天然型染色体への組込みにおける経時的な増加を含む（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ（２００６），ＪＢＣ，ｖｏｌ．２８１，ｐｐ．２６６１５−２６６２３；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８，ｐｐ．７１３−７２５；Ｏｈｚｅｋｉ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．１５９，ｐｐ．７６５−７７５；Ｇｒｉｍｅｓ  ＢＲ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７９８−８０５；Ｎａｋａｎｏ  Ｍ，（２００３）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，ｖｏｌ．１１６，ｐｐ．４０２１−４０３４.）。また、人工染色体および安定したエピソームは、細胞株を分割するか、またはＤＮＡを用いた送達（例えば、エレクトロポレーションまたは陽イオン性脂質）が効果的に作用し（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ（２００６），ＪＢＣ，ｖｏｌ．２８１，ｐｐ．２６６１５−２６６２３）、不安定性および損失を経時的に引き起こす分離異常を生じる（Ｒｕｄｄ  ＭＫ，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ，Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．７６８９−７６９７）初代細胞を増殖する際にのみ機能する。加えて、これらの安定したエピソームまたは人工染色体を含有する細胞クローンの単離および維持は、選択を用いる方法を必要とするため、上記に詳述されるすべての問題を有する。最後に、安全性に対する懸念は、これらの安定したエピソームが、しばしば、哺乳類細胞において染色体外で持続することを示しているが、ＥＢＮＡ１等の癌性ウイルス由来の導入遺伝子の発現を必要とする自己複製ウイルス由来ベクター（例えば、ＥＢＶまたはウシパピローマウイルス）に由来するという事実によってもたらされる。
【０００７】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、相同駆動修復（ＨＤＲ）を介して新規の遺伝子配列を切断部位へ挿入するための相同ドナー鋳型を使用して、極めて高い効率で標的遺伝子挿入を効果的に駆動するために使用され得る。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、および同第２００６０１８８９８７号、ならびに国際公開第ＷＯ２００７／０１４２７５号を参照されたく、それらの開示は、すべての目的のためにそれらの全体として参照することにより組み込まれる。これは、送達ベクターの長期持続を必要としなく、挿入突然変異、及びベクター由来の遺伝子からの毒性及び免疫原性の問題を回避する。
【０００８】
しかしながら、細胞集団内でのより高いか、またはより低い、安定し、かつ均一の導入遺伝子発現を可能にするための、導入遺伝子の単一または複数コピーの制御された部位特異的組込みの必要性が残る。変化に富んだ導入遺伝子発現、位置効果によって引き起こされる挿入突然変異、または導入遺伝子増幅に関係する染色体不安定性をもたらさない標的遺伝子組込みの必要性も残る。
【発明の概要】
【０００９】
ゲノムへの制御された部位特異的組込みのための組成物および方法を本明細書において開示する。本明細書において記載される組成物および方法は、選択された導入遺伝子の単一または複数コピーの制御された組込みを可能にする。そのため、用途、および所望の導入遺伝子発現レベルによって、本開示は、標的ゲノムにおける特異的部位へ挿入される単一コピーまたは複数コピーを可能にする。
【００１０】
特に、本開示は、細胞において、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）によって保持される外因性ポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）を発現するための方法および組成物を提供する。導入遺伝子は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードまたは非コーディング配列を含むことができ、細胞へ導入され、それにより、所定の関心領域において細胞のゲノムへ組み込まれる。導入遺伝子の組込みは、関心領域におけるゲノムの標的二本鎖開裂によって促進される。開裂は、関心領域における最適な任意の配列を結合するために操作され得る亜鉛フィンガー結合ドメイン、および開裂ドメインまたは開裂半分ドメインを含む融合タンパク質の使用により、特定の部位へ標的される。そのような開裂は、開裂部位か、またはその付近で外因性ポリヌクレオチド配列の標的組込みを刺激する。
【００１１】
これらの組成物および方法を用いて使用され得る細胞として、培養細胞、有機体における細胞、および細胞および／またはそれらの古い型に由来しているものが治療後に有機体に戻される場合の、治療のための有機体から取り出された細胞が挙げられる。細胞クロマチンにおける関心領域は、例えば、ゲノム配列またはその一部分であり得る。細胞クロマチンは、原核および真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、霊長類細胞、およびヒト細胞を含むが、これらに限定されない任意の種類の細胞に存在し得る。
【００１２】
一態様において、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ドナーポリヌクレオチドが本明細書において開示される。ドナーポリヌクレオチドは、外因性核酸配列をさらに含むことができる。典型的に、ドナーポリヌクレオチドの両側にＩＤＬＶのＬＴＲが配置される。さらに、ＩＤＬＶのドナーポリヌクレオチドは、細胞における対象の配列と相同の第１および第２のポリヌクレオチド（相同アーム）を含む。相同アームは、導入遺伝子をコードする配列の両側に配置することができるか、または代替として、外因性配列が相同アームの外側にあり得る。相同アームの１つまたは両方は、関心領域における配列と同一であり得る。代替として、相同アームの１つまたは両方は、相同であるが、関心領域における配列と非同一であり得る。
【００１３】
本明細書において記載される任意のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドは、１つ以上の選択可能なマーカ、例えば１つ以上の陽性および／または陰性選択マーカをさらに含むことができる。ある実施形態において、単一の陽性および／または陰性選択マーカは、相同アームの外側にある。他の実施形態において、ＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドは、２つの選択可能なマーカを含み、１つの両側には相同アームが配置され、１つは相同アームの外側に配置される。任意の選択可能なマーカまたは選択可能なマーカの組み合わせ、例えば、単一の陽性選択マーカ、単一の陰性選択マーカ、２つの陽性選択マーカ、２つの陰性選択マーカ、および１つの陰性および１つの陽性選択マーカを使用することができる。任意の選択マーカは、陽性／陰性選択マーカ、例えばｈｙｇ−ＴＫ選択マーカでもあり得る。ある実施形態において、ＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドは、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄまたは図１Ｅに示されるベクターを含む。
【００１４】
任意のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドは、１つ以上のスクリーニングマーカ、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはベータガラクトシダーゼを代替として含むことができる。ある実施形態において、スクリーニングマーカは、相同アームの外側にあるが、他の実施形態において、スクリーニングマーカは、相同アームの内側にある。追加的な実施形態において、１つのスクリーニングマーカは、１つの両側に相同アームが配置され、他方は相同アームの外側にある１つの選択マーカと組み合わせて使用される。スクリーニングおよび選択可能なマーカの任意の組み合わせを使用することができ、例えば、相同アームの外側にある選択マーカと組み合わせて、相同アームの間に配置されるスクリーニングマーカを使用することができる。加えて、マーカの任意の組み合わせ、例えば、１つの陽性選択マーカと併用される１つのスクリーニングマーカ、および１つの陰性スクリーニングマーカと併用される１つのスクリーニングマーカを使用することができる。
【００１５】
他の態様において、細胞への外因性核酸配列の１つ以上のコピーの制御された組込みのための方法を本明細書において開示し、方法は、（ａ）細胞において第１の融合タンパク質を発現するステップであって、第１の融合タンパク質は、第１の亜鉛フィンガー結合ドメインおよび第１の開裂半分ドメインを含み、第１の亜鉛フィンガー結合ドメインは、細胞のゲノムにおける関心領域において第１の標的部位に結合するように操作された、ステップと、（ｂ）細胞において第２の融合タンパク質を発現するステップであって、第２の融合タンパク質は、第２の亜鉛フィンガー結合ドメインおよび第２の開裂半分ドメインを含み、第２の亜鉛フィンガー結合ドメインは、細胞のゲノムにおける関心領域において第２の標的部位に結合し、第２の標的部位は、第１の標的部位と異なる、ステップと、（ｃ）細胞を、本明細書において記載される任意のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドと接触させる、ステップと、を含み、第１の標的部位への第１の融合タンパク質の結合、および第２の標的部位への第２の融合タンパク質の結合は、開裂半分ドメインを位置付け、それにより、細胞のゲノムは、関心領域において開裂され、それによって、関心領域における細胞のゲノムへの外因性配列の１つ以上のコピーの組込み、および外因性配列の産物の発現がもたらされる。ある実施形態において、第１および第２の亜鉛フィンガータンパク質を含む融合タンパク質は、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、例えば、Ａｄ５／３５ベクター上に提供される。
【００１６】
本明細書において記載される任意の方法は、対象の領域へ挿入された外因性配列の単一コピー（導入遺伝子）を含有する細胞に対して選択するために使用することができる。ある実施形態において、導入遺伝子の単一コピーは、相同アームの外側にある陰性マーカを含むＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドを使用して組み込まれる（図２Ｂ）。他の実施形態において、導入遺伝子の単一コピーは、両側に相同アームが配置される陽性選択マーカを含むＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドを使用して組み込まれる（図３Ａ）。他の実施形態において、導入遺伝子の単一コピーは、両側に相同アームが配置される陽性選択マーカ、および相同アームの外側にある陰性択マーカを含むＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドを使用して組み込まれる（図３Ｃ）。さらに他の実施形態において、導入遺伝子の単一コピーは、導入遺伝子および選択マーカ（例えば、陽性選択マーカ）の両方が相同アームの外側にあるＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドを使用して組み込まれる（図４Ｃ）。さらに他の実施形態において、導入遺伝子の単一コピーは、図１Ｅおよび図５に示されるＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドを使用して組み込まれる。
【００１７】
加えて、本明細書において記載される任意の方法は、対象の領域への外因性配列の複数コピーの挿入に対して選択するために使用することができる。「複数コピー」は、標的の１つ以上の対立遺伝子へ組み込まれる導入遺伝子の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のコピーを有する細胞を指す。ある実施形態において、導入遺伝子の複数コピーは、相同アームの外側にある陽性マーカを含むＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドを使用して組み込まれる（図２Ｃおよび３Ｂ）。他の実施形態において、導入遺伝子の複数コピーは、相同アームの外側にある陽性選択マーカ、および両側に相同アームが配置される陰性選択マーカを含むＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドを使用して組み込まれる（図３Ｄ）。さらに他の実施形態において、導入遺伝子の単一コピーおよび複数コピーは、両側に相同アームが配置される陽性選択マーカ、および相同アームの外側にある陽性選択マーカを含むＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドを使用して組み込まれる（図３Ｅ）。
【００１８】
本明細書において記載される任意の方法において、関心領域は、生存能力に対して必須ではないゲノムの領域にあり得る。例えば、ヒト細胞におけるＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座は、標的組込み（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００５２８２号、米国特許出願第１２／１５０／１０３号を参照）のための「セーフハーバー」遺伝子座として使用することができる。他の実施形態において、関心領域は、転写活性のあるゲノムの領域にある。関心領域が、生存能力に対して必須であるゲノムの領域にある実施形態において、挿入は、「必須」遺伝子の発現を実質的に変更しない。
【００１９】
本明細書において記載される任意の方法において、第１および第２の開裂半分ドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩまたはＳｔｓＩからのものである。また、本明細書において記載される任意の方法において、融合タンパク質の少なくとも１つは、開裂半分ドメインの二量化境界面のアミノ酸配列における変更を含むことができる。
【００２０】
本明細書において記載される任意の方法において、細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞であり得る。また、細胞は、細胞周期のＧ２期で拘束され得る。
【００２１】
そのため、本主題は、以下の実施形態を含むが、それらに限定されない。
１．レンチウイルスＬＴＲの間で、
（ｉ）細胞の細胞クロマチンの関心領域と相同配列である第１および第２のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）外因性配列と、
を含む、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ドナーポリヌクレオチド。
２．第１の選択可能またはスクリーニングマーカをコードする配列をさらに含む、１に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
３．第１の選択可能またはスクリーニングマーカは、第１と第２のヌクレオチド配列との間にない、２に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
４．第２の選択可能またはスクリーニングマーカをコードする配列をさらに含む、２〜３のいずれかに記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
５．第２の選択可能またはスクリーニングマーカの両側に第１および第２のヌクレオチド配列が配置される、４に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
６．第１および／または第２の選択可能なマーカは、陽性選択マーカである、２〜５のいずれかに記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
７．第１および／または第２の選択可能なマーカは、陰性選択マーカである、２〜５のいずれかに記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
８．第１および／または第２の選択可能なマーカは、陽性および陰性選択マーカである、２〜５のいずれかに記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
９．陽性／陰性選択マーカは、ｈｙｇ−ＴＫである、８に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
１０．細胞は、真核細胞である、１〜９のいずれかに記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
１１．細胞は、哺乳類細胞である、１０に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
１２．細胞は、ヒト細胞である、１１に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
１３．第１および第２のヌクレオチドは、外因性配列の両側に配置される、１〜１２のいずれかに記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
１４．細胞への外因性核酸配列の単一コピーまたは複数コピーの制御された部位特異的組込みのための方法であって、
（ａ）細胞において第１の融合タンパク質を発現するステップであって、第１の融合タンパク質は、第１の亜鉛フィンガー結合ドメインおよび第１の開裂半分ドメインを含み、第１の亜鉛フィンガー結合ドメインは、細胞のゲノムにおける関心領域において第１の標的部位に結合するように操作された、ステップと、
（ｂ）細胞において第２の融合タンパク質を発現するステップであって、第２の融合タンパク質は、第２の亜鉛フィンガー結合ドメインおよび第２の開裂半分ドメインを含み、第２の亜鉛フィンガー結合ドメインは、細胞のゲノムにおける関心領域において第２の標的部位に結合し、第２の標的部位は、第１の標的部位と異なる、ステップと、
（ｃ）細胞を、１〜１３のいずれかに記載の任意のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドと接触させる、ステップと、を含み、
第１の標的部位への第１の融合タンパク質の結合、および第２の標的部位への第２の融合タンパク質の結合は、開裂半分ドメインを位置付け、それにより、細胞のゲノムは、関心領域において開裂され、それによって、関心領域における細胞のゲノムへの外因性配列の１つ以上のコピーの組込みがもたらされる。
１５．外因性核酸配列は、ｃＤＮＡを含む、１４に記載の方法。
１６．関心領域は、細胞クロマチンアクセス可能領域にある、１４または１５に記載の方法。
１７．関心領域は、生存能力に対して必須ではないゲノムの領域にある、１４、１５、または１６に記載の方法。
１８．関心領域は、転写活性のあるゲノムの領域にある、１４〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．外因性配列の単一コピーは、細胞のゲノムへ組み込まれる、１４〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．外因性配列の複数コピーは、細胞のゲノムへ組み込まれる、１４〜１８のいずれかに記載の方法。
２１．第１および第２の開裂半分ドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからである、１４〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩおよびＳｔｓＩからなる群より選択される、２１に記載の方法。
２３．関心領域は、染色体にある、１４〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．関心領域は、遺伝子を含む、１４〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．細胞は、細胞周期のＧ２期で拘束される、１４〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．融合タンパク質の少なくとも１つは、開裂半分ドメインの二量化境界面のアミノ酸配列における変更を含む、１４〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．細胞は、哺乳類細胞である、１４〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．細胞は、ヒト細胞である、２７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】パネルＡ〜Ｃは、制御および標的組込みのための例示的なインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ドナーコンストラクトを描写する概略図である。図１Ａは、１つの選択またはスクリーニングマーカを含み、「レンチウイルスコンストラクトＩ」と指定されるレンチウイルスコンストラクトの概略図である。図１Ｂは、２つの選択またはスクリーニングマーカを含み、「レンチウイルスコンストラクトＩＩ」と指定されるレンチウイルスコンストラクトの概略図である。図１Ｃは、選択可能またはスクリーニングマーカを有さないレンチウイルスドナーコンストラクトの概略図である。図１Ｄは、相同アームの外側にある１つの選択可能またはスクリーニングマーカを含み、「レンチウイルスコンストラクトＩＶ」と指定されるレンチウイルスドナーコンストラクトの概略図である。図１Ｅは、「レンチウイルスコンストラクトＶ」と指定されるレンチウイルスドナーコンストラクトの概略図である。
【００２３】
【図２】パネルＡ〜Ｃは、レンチウイルスコンストラクトＩの様々な例示的な実施形態を描写する。図２Ａは、一般的にコンストラクトを示す。図２Ｂは、選択またはスクリーニングマーカが陰性選択マーカであるコンストラクトを描写する。図のように、陰性選択は、非修正細胞、または単一コピーが、相同組換え標的組込み（ＨＲ−ＴＩ）を介して、および／または一端での相同組換えおよび他端の末端接合（ＨＲ−ＥＪ）によって、ゲノムへ組み込まれる細胞をもたらし得る。図２Ｃは、選択またはスクリーニングマーカが陽性選択マーカであり、典型的に頭尾配向で対象の細胞の複数コピーを導入するコンストラクトを描写する。図２Ｃに示されるコンストラクトは、無作為組込み、末端接合によるＬＴＲの組込み（ＬＴＲ−ＥＪ）、または一端での相同組換えおよび他端の末端接合を介する対象の細胞の単一コピーの組込み（ＨＲ−ＥＪ）をもたらすことができる。
【００２４】
【図３】レンチウイルスコンストラクトＩＩの様々な例示的な実施形態を描写する。一番上の行は、概して、コンストラクトを示す。図３Ａは、選択／スクリーニングマーカ１が陽性選択マーカの場合、対象の細胞の単一コピーが標的細胞へ組み込まれることを示す。このコンストラクトも、一端での相同組換えおよび他端の末端接合（ＨＲ−ＥＪ）のために、対象の細胞の単一コピーを含有する細胞の低いレベルをもたらす。図３Ｂは、選択／スクリーニングマーカ１が陽性選択マーカであり、典型的に頭尾配向で対象の細胞の複数コピーを導入するコンストラクトを描写する。図３Ｂに記載されるコンストラクトも、無作為組込み、末端接合によるＬＴＲの組込み（ＬＴＲ−ＥＪ）、または一端での相同組換えおよび他端の末端接合を介した対象の細胞の単一コピーの組込み（ＨＲ−ＥＪ）をもたらすことができる。図３Ｃは、選択／スクリーニングマーカ１が陽性選択マーカであり、選択／スクリーニングマーカ２が陰性選択マーカである場合に対象の細胞の単一コピーの相同組換え（ＨＲ−ＴＩ）を介する標的組込みを示す。図３Ｃのコンストラクトも、無作為に組み込まれるか、またはＬＴＲ末端接合（ＬＴＲ−ＥＪ）を介して組み込まれ得る。図３Ｄは、選択／スクリーニングマーカ１が陰性選択マーカであり、選択／スクリーニングマーカ２が陽性選択マーカである場合、対象の細胞の複数コピーが相同組換えによって標的細胞へ組み込まれることを示す。コンストラクトも、無作為組込み、ＬＴＲ−ＥＪ、およびＨＲ−ＥＪ（低効率で）をもたらすことができるが、ＨＲ−ＴＩを介する単一コピーの組込みを可能としない。図３Ｅは、選択／スクリーニングマーカ１が陽性選択マーカであり、選択／スクリーニングマーカ２が陽性選択マーカである場合、対象の細胞の単一および複数コピーがどのようにして標的細胞へ組み込まれるかを示す。
【００２５】
【図４】図１Ｄに示されるレンチウイルスコンストラクトＩＶの様々な例示的な実施形態を描写する。一番上の行は、概して、コンストラクトを示す。顕著に、外因性配列（導入遺伝子）は、相同アームの外側にある。図４Ａおよび４Ｂは、単一（図４Ａ）および複数の（図４Ｂ）ゲノム集団のプロウイルス構造を示す。示されるように、２−ＬＴＲ集団が細胞で形を成した後、相同アームは、導入遺伝子の両側に配置される。図４Ｃは、陽性選択マーカを含むコンストラクトの相同組換え後に、陽性選択がどのようにしてＨＲ−ＴＩを介して導入遺伝子の単一コピーを含有する細胞を生じさせるかを示す。稀に、複数コピーまたはＨＲ−ＥＪを有する細胞が選択されるが、このコンストラクトに対する陽性選択は、無作為に組み込まれたか、またはＬＴＲ−ＥＪで組み込まれた導入遺伝子を有する細胞を死滅させる。
【００２６】
【図５】図１Ｅに示されるレンチウイルスコンストラクトＶの様々な例示的な実施形態を描写する。一番上の行は、概して、コンストラクトを示す。図５Ａおよび５Ｂは、単一（図５Ａ）および複数の（図５Ｂ）ゲノム集団のプロウイルス構造を示す。図５Ｃは、陽性選択マーカを含むコンストラクトの相同組換え後に、陽性選択がどのようにしてＨＲ−ＴＩを介して導入遺伝子の単一コピーを含有する細胞を生じさせるかを示す。稀に、複数コピーまたはＨＲ−ＥＪを有する細胞が選択されるが、このコンストラクトに対する陽性選択は、無作為に組み込まれたか、またはＬＴＲ−ＥＪで組み込まれた導入遺伝子を有する細胞を死滅させる。
【００２７】
【図６】ＣＣＲ５に標的されるＺＦＮの存在下におけるＫ５６２細胞へのＩＤＬＶレンチウイルスドナーコンストラクトの組込みを示す。ＩＤＬＶドナーコンストラクトは、５’〜３’方向で、ＬＴＲ−左相同アーム−ＧＦＰ−コーディング配列−右相同アーム−ＬＴＲを含む。左および右相同アームは、ＣＣＲ５と相同であった。示されるＺＦＮは、Ａｄ５／３５ベクターを使用して、すべて送達された。Ａｄ５／３５ＣＣＲ５−ＺＦＮに関する詳細は、２００７年５月２３日出願の米国特許出願第１１／８０５，７９７号を参照されたい。「２２４ｎｆ」は、ＦＬＡＧタグを有さないＺＦＮ２２４を指す。「２２４」は、ＦＬＡＧタグを有するＺＦＮ２２４を指す。ＺＦＮ２２４は、ＦｏｋＩの操作された開裂ドメインを含む。「２１５」は、ＺＦＮ２１５を指し、野生型ＦｏｋＩ開裂ドメインを含む。「ＨＲヘテロ接合」は、１つの対立遺伝子に対する相同組換えを介する単一コピーの標的組込みを指す。「ＨＲホモ接合」は、両方の対立遺伝子に対する相同組換えを介する単一コピーの標的組込みを指す。「ＬＴＲ＿ＥＪ」は、コンストラクトがＬＴＲの末端接合によって組み込まれた細胞を指す。「複数コピーＨＲ」は、１つの対立遺伝子に対するＧＦＰコンストラクトの複数コピーの標的組込みを指す。「ヘテロＬＴＲ＿ＥＪ」は、１つの対立遺伝子に対するＨＤＲ、および他の対立遺伝子に対するＬＴＲ−ＥＪを介する単一コピーの標的組込みを指す。「ヘテロ複数」は、１つの対立遺伝子に対する相同組換えを介する単一コピー、および他の対立遺伝子に対するＨＤＲを介する複数コピーの標的組込みを指す。「複数を有するホモ」は、両方の対立遺伝子に対する相同組換えを介する複数コピーの標的組込みを指し、「複数のＥＪ」は、１つの対立遺伝子に対するＨＤＲを介するドナーコンストラクトの複数コピーの組込み、および他の対立遺伝子に対する末端接合を介する組込みを指す。
【００２８】
【図７】パネルＡおよびＢは、図４に示される選択された個々の細胞クローンのサザンブロット分析を示す。選択されたクローンの種類は、各レーンの上に示される。図７Ａは、ブロットがＰＧＫ−ＧＦＰプローブで精査された場合の結果を描写する。図７Ｂは、コンストラクトの左相同アームを対象としたプローブ（ＣＣＲ５左アームプローブ）を使用した結果を示す。
【００２９】
【図８】ｐｇｆ−ｅＧＦＰプローブを使用した、図６に示される細胞のプールのサザンブロット分析を示す。
【００３０】
【図９】パネルＡおよびＢは、図６に記載されるＧＦＰドナーコンストラクトおよびＡｄ５／３５ＺＦＮを含むＨｅｐ３Ｂ細胞（図９Ａ）およびヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ、図９Ｂ）のサザンブロット分析を示す。
【００３１】
【図１０】パネルＡ〜Ｅは、ＧＦＰ発現が、ＺＦＮおよびレンチウイルスＧＦＰドナーコンストラクトを含むｈＭＳＣにおける細胞通過中、安定していることを示す。図１０ＡおよびＢは、ＺＦＮおよびドナーコンストラクトを含む細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図１０ＣおよびＤは、ドナーコンストラクトのみを含む細胞における発現の欠如を示す。図１０Ｅは、ドナーコンストラクトの示された感染の多重度（ｍｏｉ）での８つの通過中のＧＦＰ発現を描写するグラフである。
【００３２】
【図１１】パネルＡ〜Ｆは、ＧＦＰコンストラクトが組み込まれたｈＭＳＣ細胞が、含脂肪細胞の分化後に、ＧＦＰを発現し続けることを示す。図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１１Ｄおよび１１Ｅは、含脂肪細胞へ分化した無染色ＧＦＰ発現細胞を示し、図１１Ｆは、含脂肪細胞へ分化したＧＦＰ発現細胞のオイルレッドＯ染色を示す。
【００３３】
【図１２】パネルＡ〜Ｄは、ＧＦＰコンストラクトが組み込まれたｈＭＳＣ細胞が、骨形成分化後に、ＧＦＰを発現し続けることを示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、ＧＦＰ発現を示す。図１２Ｃは、無染色ＧＦＰ発現細胞を示し、図１２Ｄは、ＧＦＰ発現骨形成分化細胞のＡＬＰ染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示は、標的ゲノム、特に哺乳類（例えば、ヒト）ゲノムへの標的組込み（ＴＩ）のための方法および組成物に関する。組成物および方法は、標的細胞への対象の細胞の単一または複数の（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の）コピーの部位特異的な制御された組込みを可能にする。
【００３５】
標的開裂および組換えに有用な組成物は、開裂ドメイン（または開裂半分ドメイン）および亜鉛フィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびポリペプチドおよびポリペプチドコーディングポリヌクレオチドの組み合わせを含む。亜鉛フィンガー結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上の亜鉛フィンガー）を含むことができ、任意の配列に結合するように操作され得る。細胞におけるそのような融合タンパク質（またはタンパク質）の存在は、融合タンパク質のその（それらの）結合部位への結合、および内因性標的遺伝子内での開裂をもたらす。
【００３６】
また、ＺＦＮおよび／またはドナー配列を含む複製欠損アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、およびこれらのＡｄベクターを含む細胞を本明細書において開示する。これらのＡｄベクターは、細胞クロマチンの標的開裂のための、および例えば、標的開裂、その後の非相同末端接合、または標的開裂、その後の外因性ポリヌクレオチド（細胞ヌクレオチド配列を有する相同の１つ以上の領域）とゲノム配列との間の相同組換えによる細胞ヌクレオチド配列の標的変更のための方法に有用である。
【００３７】
概要
本明細書において開示される、方法の実践、ならびに組成物の調製および使用は、他に指示のない限り、当該技術内にあるように、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ、および関連分野における従来の技術を使用する。これらの技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的更新；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３８】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同じ意味で使用され、線形または円形配座、および一本または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定として解釈されるものではない。用語は、天然ヌクレオチドの周知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修正されるヌクレオチドを包含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００３９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、同じ意味で使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修正誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用する。
【００４０】
「結合」は、巨大分子の間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）。そのような相互作用は、概して、１０-6Ｍ-1またはそれ以下の解離定数（Ｋd）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度、より低いＫdと相関されている高い結合親和性を指す。
【００４１】
「結合タンパク質」は、他の分子に非共有結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するために）、および／または異なるタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００４２】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内にあるアミノ酸配列の領域である１つ以上の亜鉛フィンガーにより、配列特異的方法でＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きいタンパク質内にあるドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００４３】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。亜鉛フィンガータンパク質を操作するための方法の非限定的例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、設計／組成物が主に合理的基準から生じる、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則、ならびに既存のＺＦＰ設計の情報および結合データを保存するデータベースにおける情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号、また国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６を参照されたい。
【００４４】
「選択された」亜鉛フィンガータンパク質は、産出が主にファージ提示法、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験的過程から生じる、自然界に見られないタンパク質である。例えば、米国特許第ＵＳ５，７８９，５３８号、同第ＵＳ５，９２５，５２３号、同第ＵＳ６，００７，９８８号、同第ＵＳ６，０１３，４５３号、同第ＵＳ６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、および同第ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００４５】
「配列」という用語は、線形、円形、または分岐、および一本鎖または二本鎖のいずれかであり得るＤＮＡまたはＲＮＡであり得る任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば長さで２〜１０，０００ヌクレオチド（または、その間またはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは長さで約１００〜１，０００ヌクレオチド（またはその間の任意の整数）、より好ましくは長さで約２００〜５００ヌクレオチドであり得る。
【００４６】
「相同非同一配列」は、第２の配列と配列同一性の程度を共有する第１の配列を指し、配列は、第２の配列の配列と同一ではない。例えば、突然変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異遺伝子の配列と相同、かつ非同一である。ある実施形態において、２つの配列の間の相同の程度は、その間の相同組換えを可能にするために十分であり、通常の細胞機構を利用する。２つの相同非同一配列は、任意の長さであり得、それらの非相同の程度は、単一のヌクレオチドと同じくらい小さいか（例えば、標的相同組換えによるゲノム点突然変異の補正のために）、もしくは１０またはそれ以上のキロベースと同じくらい大きくてもよい（例えば、染色体における所定の異所での遺伝子の挿入のために）。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドの外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。
【００４７】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当技術分野で周知である。典型的に、そのような技術は、遺伝子に対してｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列も、この方法で決定され、比較され得る。概して、同一性は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸の一致をそれぞれ指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較され得る。核酸またはアミノ酸配列の２つの配列のパーセント同一性は、より短い配列の長さで除し、１００で乗じられる、２つの整合配列の間での正確な一致の数である。核酸配列に対する近似整合は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって標準化されたスコアマトリクスを使用することによってアミノ酸配列に適用され得る。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用的用途におけるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法に対するデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）において記載される。本開示との関連においてパーセント同一性を確立する好ましい方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋが著作権を有し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって流通されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一連のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは、デフォルトパラメータがスコア表に使用される場合に使用され得る（例えば、１２のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、および６のギャップ）。生成されるデータから、「一致」値は、配列同一性を反映する。配列の間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、概して当技術分野で周知であり、例えば、他の整合プログラムは、デフォルトパラメータを用いて使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝コード＝標準、フィルタ＝無し、鎖＝両方、カットオフ＝６０、予期＝１０、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記述＝５０配列、分別＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスにおいて見ることができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。本明細書において記載される配列に対して、配列同一性の所望の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％、およびその間の任意の整数値である。典型的に、配列の間のパーセント同一性は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％配列同一性である。
【００４８】
代替として、ポリヌクレオチドの間の配列類似性の程度は、相同領域の間での安定した二本鎖の形成を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化されたフラグメントの大きさの決定よって決定され得る。２つの核酸、または２つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を使用して決定される分子の確定した長さにわたって少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％配列同一性を提示する場合、互いに実質的に相同する。本明細書において使用されるように、実質的に相同は、特定されたＤＮＡまたはポリペプチド配列との完全同一性を示す配列も指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定のシステムに対して確定される厳しい条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を確定することは、当技術分野内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【００４９】
２つの核酸フラグメントの選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように決定され得る。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、そのような分子の間でのハイブリダイゼーションイベントの効率性および強度に影響を与える。部分的に同一の核酸配列は、標的分子への完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野で周知である（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション等、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）ハイブリダイゼーション検定を使用して評価され得る。そのような検定は、例えば、低い厳密性から高い厳密性まで様々な条件を使用して、様々な程度の選択性を使用して行われ得る。低い厳密性の条件が使用される場合、非特異的結合の非存在は、配列同一性の部分的な程度さえも欠く二次的プローブ（例えば、標的分子との約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価され得、それにより、非特異的結合イベントの非存在下において、二次的プローブは、標的にハイブリダイズしない。
【００５０】
ハイブリダイゼーションによる検出システムを利用する場合、参照核酸配列に相補的である核酸プローブが選択され、その後、適切な条件の選択によって、プローブおよび参照配列は、選択的に互いにハイブリダイズまたは結合し、二本鎖分子を形成する。中度に厳しいハイブリダイゼーション条件下において参照配列に選択的にハイブリダイズすることが可能な核酸分子は、典型的に、選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有する、長さで少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下においてハイブリダイズする。厳しいハイブリダイゼーション条件は、典型的に、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より大きい配列同一性を有する、長さで少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が特定の程度の配列同一性を有する場合のプローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で周知のように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【００５１】
ハイブリダイゼーションのための条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーション厳密性は、ハイブリダイゼーション条件が、不一致のヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を好まない程度を指し、より高い厳密性は、不一致のハイブリッドに対するより低い耐性と相関する。ハイブリダイゼーションの厳密性に影響を与える要因は、当業者に周知であり、例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の温度、ｐＨ、イオン強度、および濃度を含むが、これらに限定されない。当業者に周知のように、ハイブリダイゼーション厳密性は、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって増加する。
【００５２】
ハイブリダイゼーションのための厳密性条件に対して、非常に多くの同等の条件は、例えば以下の要因を変化させることによって特定の厳密性を確立するために使用され得るということが当技術分野で周知である：配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成物、塩および他のハイブリダイゼーション溶液構成要素の濃度、ハイブリダイゼーション溶液における遮断薬の有無（例えば、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータ、ならびに様々な洗浄条件。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術における標準方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。
【００５３】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチドの間での遺伝情報の交換の過程を指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復中に行われるそのような交換の特殊な形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列相同を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復を鋳型化するために「ドナー」分子を使用し、それは、ドナーから標的への遺伝情報の移転につながるため、「非クロスオーバー遺伝子変換」または「短経路遺伝子変換」として様々に周知である。特定の理論に拘束されることなく、そのような移動は、切断標的とドナーとの間に形を成すヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、および／またはドナーが、標的の一部になる遺伝子情報を再合成するために使用される「合成依存鎖アニール」、および／または関連過程を伴い得る。そのような特殊なＨＲは、しばしば、標的分子の配列の変更をもたらし、それにより、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドへ組み込まれる。
【００５４】
「開裂」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの異なる一本鎖開裂イベントの結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または互い違いの末端のいずれかの産出をもたらし得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、標的二本鎖ＤＮＡ開裂のために使用される。
【００５５】
「開裂半分ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるかのいずれか）と併用して、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の開裂半分ドメイン」、「＋および−開裂半分ドメイン」、および「右および左開裂半分ドメイン」という用語は、同じ意味で使用され、二量化する開裂半分ドメインの対を指す。
【００５６】
「操作された開裂半分ドメイン」は、他の開裂半分ドメイン（例えば、他の操作された開裂半分ドメイン）を有する必須のヘテロ二量体を形成するように修正された開裂半分ドメインである。また、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号、ならびに米国仮出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）を参照されたい。
【００５７】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含むヌクレオタンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの対部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、それぞれ２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と関連するおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（有機体によって可変の長さ）は、ヌクレオソームコアの間に伸展する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと関連する。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、原核および真核の両方のすべての種類の細胞ヌクレオタンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００５８】
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である、その核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
【００５９】
「エピソーム」は、複製核酸、ヌクレオタンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。
【００６０】
「アクセス可能領域」は、核酸に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る細胞クロマチンにおける部位である。特定の理論に拘束されることなく、アクセス可能領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージされない領域であると考えられる。アクセス可能領域の異なる構造は、しばしば、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感度によって検出され得る。
【００６１】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合する核酸の一部分を画定する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。
【００６２】
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝的、生化学的、または他の方法によって細胞へ導入され得る分子である。「細胞における通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に対して決定される。そのため、例えば、成人筋細胞に対して、筋肉の胚発生の間のみに存在する分子は、外因性分子である。同様に、熱ショックを与えられていない細胞に対して、熱ショックによって誘導される分子は、外因性分子である。外因性分子は、例えば、異常機能している内因性分子の機能している型、または正常に機能している内因性分子の異常機能している型を含み得る。
【００６３】
とりわけ、外因性分子は、組み合わせ化学過程によって生成される等の小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修正誘導体、もしくは上記の分子の１つ以上を含む任意の複合体等の巨大分子であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本または二本鎖であり得、線形、分岐、または円形であり得、任意の長さであり得る。核酸は、二本鎖を形成することが可能である核酸、および三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ、およびヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。
【００６４】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞へ導入される感染ウイルスゲノム、プラスミド、もしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含み得る。細胞への外因性分子の導入のための方法は、当業者に周知であり、脂質媒介移動（すなわち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移動、およびウイルスベクター媒介移動を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、他の種に由来する遺伝子、例えば、ハムスターゲノムへ組み込まれるヒト遺伝子配列でもあり得る。
【００６５】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下において特定の発生段階で特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体もしくは他のオルガネラ、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追加的な内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子、および酵素を挙げることができる。
【００６６】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合で結び付けられる分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の種類の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと開裂ドメインとの間の融合）および融合核酸（例えば、上述される融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、および小溝結合剤と核酸との間の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達からか、または融合タンパク質を生成するためにポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳される、細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じえる。トランススプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチド結紮も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の他の部分で提示する。
【００６８】
本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下参照）、およびそのような調節配列がコーディングおよび／または転写配列に隣接しているか、していないかにかかわらず、遺伝子産物の産出を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、プロモータ配列、ターミネータ、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサ、サイレンサ、インスレータ、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定される必要はない。
【００６９】
「遺伝子発現」は、遺伝子産物への遺伝子に含有される情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質の直接転写産物であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等の過程によって修正されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチレーション、およびグリコシル化によって修正されるタンパク質も含む。
【００７０】
遺伝子発現の「修正」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の修正は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。
【００７１】
「真核」細胞としては、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
「関心領域」は、例えば、遺伝子、または遺伝子内にあるか、またはそれに隣接する非コーディング配列等の細胞クロマチンの任意の領域であり、外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的ＤＮＡ開裂および／または標的組換えの目的のためであり得る。関心領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。関心領域は、遺伝子のコーディング領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等の転写非コーディング領域内、またはコーディング領域の上流もしくは下流のいずれかにある非転写領域内にあり得る。関心領域は、長さで単一のヌクレオチド対と同じくらい小さいか、または２，０００ヌクレオチド対までか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。
【００７３】
「動作可能な結合」および「動作可能に連結される」（または「動作可能なように連結される」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列に関して同じ意味で使用され、構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つの後に発揮される機能を仲介することができるという可能性を持たせるように配置される。例として、プロモータ等の転写調節配列は、転写調節配列が、１つ以上の転写調節因子の有無に応じてコーディング配列の転写のレベルを制御する場合、コーディング配列に動作可能に連結される。転写調節配列は、概して、コーディング配列を有するシスにおいて動作可能に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサは、それらが接触していなくても、コーディング配列に動作可能に連結される転写調節配列である。
【００７４】
融合ポリペプチドに対して、「動作可能に連結される」という用語は、構成要素のそれぞれは、あまり結び付けられていない場合のように、他の構成要素に結び付いて同じ機能を行うという事実を指す。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合される融合ポリペプチドに対して、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、開裂ドメインが標的部位の近辺でＤＮＡを開裂することができる場合、動作可能な結合にある。
【００７５】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的フラグメント」は、配列が完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的フラグメントは、対応する天然の分子より多いか、より少ないか、または同じ数の残基を所有し得、および／または１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コーディング機能、他の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルタ結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降検定によって決定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によって試験され得る。上記のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。他のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、遺伝的および生化学的の両方の、免疫共沈降、２つのハイブリッド検定、または相補性によって決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００７６】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
記載されるＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドは、好ましくは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して部位特異的な方法（標的組込み）で組み込まれる。ＺＦＮは、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）およびヌクレアーゼ（開裂）ドメインを含む。
【００７７】
Ａ．亜鉛フィンガータンパク質
亜鉛フィンガー結合ドメインは、最適な配列に結合するように操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。操作された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法としては、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合する亜鉛フィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連する、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含む。例えば、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる、共同所有される米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【００７８】
ファージ提示法および２つのハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、ならびにＧＢ２，３３８，２３７号に開示される。
【００７９】
亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、共同所有される国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。
【００８０】
標的部位、ＺＦＰの選択、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構成のための方法は、当業者に周知であり、米国公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５０６４４７４号、同第２００５００２６１５７号、同第２００６０１８８９８７号、国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号、米国特許出願第１０／５８７，７２３号（２００６年７月２７日出願）、同第１１／４９３，４２３号（２００６年７月２６日出願）に関連して詳述され、それらの開示は、すべての目的のためにそれらの全体として参照することにより組み込まれる。
【００８１】
ある実施形態において、本明細書において記載されるＺＦＮは、アデノウイルスベクター、例えば、キメラＡｄ５／３５ベクター上に有される。本明細書において述べられるように、ＺＦＮは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはさらにそれ以上の亜鉛フィンガードメインを含んでもよい。
【００８２】
ＺＦＰ結合ドメインは、ヌクレアーゼの開裂ドメインまたは開裂半分ドメインに融合される。ある実施形態において、ＺＦＰは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩの開裂半分ドメインに融合される。開裂半分ドメインに融合される場合、一対のそのような亜鉛フィンガー／ヌクレアーゼ半分ドメイン融合が、例えば、米国特許出願第２００５００６４４７４号に開示されるように標的開裂のために使用される。
【００８３】
標的開裂のために、結合部位の近端は、５つまたはそれ以上のヌクレオチド対によって分離され得、融合タンパク質のそれぞれは、ＤＮＡ標的の逆鎖に結合し得る。
【００８４】
Ｂ．開裂ドメイン
上で述べたように、ＺＦＮは、ヌクレアーゼ（開裂ドメイン、開裂半分ドメイン）も含む。本明細書において開示される融合タンパク質の開裂ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。開裂ドメインが得ることができる、例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを開裂する追加的な酵素が周知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓｅ  Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、また、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）を参照されたい）。これらの酵素（またはその機能的フラグメント）の１つ以上を、開裂ドメインおよび開裂半分ドメインの源として使用することができる。
【００８５】
同様に、開裂半分ドメインは、開裂活性のために二量化を必要とする、上記の任意のヌクレアーゼまたはその一部分に由来し得る。概して、２つの融合タンパク質は、融合タンパク質が開裂半分ドメインを含む場合、開裂のために必要とされる。代替として、２つの開裂半分ドメインを含む単一タンパク質を使用することができる。２つの開裂半分ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得るか、または各開裂半分ドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは、互いに対して配置され、それにより、それらのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば、二量体化によって、開裂半分ドメインが機能的開裂ドメインを形成することを可能にする、互いへの空間的配向に開裂半分ドメインを配置する。そのため、ある実施形態において、標的部位の近端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドによって分離される。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位の間に介入し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ以上）。概して、開裂の部位は、標的部位の間にある。
【００８６】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡへの配列特異的結合（認識部位で）および結合の部位か、またはその付近でＤＮＡを開裂することが可能である。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去される部位でＤＮＡを開裂し、分離可能な結合および開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、ＤＮＡの二本鎖開裂を、１つの鎖上にあるその認識部位から９ヌクレオチド、および他方上にあるその認識部位から１３ヌクレオチドで触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。そのため、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの開裂ドメイン（または開裂半分ドメイン）、および１つ以上の亜鉛フィンガー結合ドメインを含み、それらは、操作され得るか、またはされ得ない。
【００８７】
開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である、例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、開裂半分ドメインと見なされる。そのため、亜鉛フィンガーＦｏｋＩ融合を使用する細胞配列の標的二本鎖開裂および／または標的交換は、それぞれＦｏｋＩ開裂半分ドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性の開裂ドメインを再構成することができる。代替として、亜鉛フィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂半分ドメインを含有する単一ポリペプチド分子を使用することもできる。亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合を使用する標的開裂および標的配列変更のためのパラメータは、本開示の他の部分で提示する。
【００８８】
開裂ドメインまたは開裂半分ドメインは、開裂活性を保持するか、または機能的開裂ドメインを形成するために多量体化する（例えば、二量体化する）能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【００８９】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載され、この内容は、その全体として本明細書に組み込まれる。追加的な制限酵素も、分離可能な結合および開裂ドメインを含有し、これらは、本開示によって意図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【００９０】
ある実施形態において、開裂ドメインは、例えば、すべての開示の内容は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号（それぞれ出願第１０／９１２，９３２号および同第１１／３０４，９８１号）、ならびに米国暫定特許出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）に記載される、ホモ二量化を最小にするか、または妨げる１つ以上の操作された開裂半分ドメイン（二量化ドメイン突然変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８にあるアミノ酸残基は、すべて、ＦｏｋＩ開裂半分ドメインの二量化を影響するための標的である。
【００９１】
必須のヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された開裂半分ドメインは、第１の開裂半分ドメインがＦｏｋＩの位置４９０および５３８にあるアミノ酸残基で変異を含み、第２の開裂半分ドメインがアミノ酸残基４８６および４９９で変異を含む一対を含む。図２、３および４を参照されたい。
【００９２】
そのため、一実施形態において、図３および４に示されるように、４９０での変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で交換し、５３８での変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で交換し、４８６での変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で交換し、位置４９９での変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で交換する。具体的に、本明細書において記載される操作された開裂半分ドメインは、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」に指定される操作された開裂半分ドメインを産出するために、１つの開裂半分ドメインにおいて位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）を変異させることによって、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」に指定される操作された開裂半分ドメインを産出するために、他の開裂半分ドメインにおいて位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）を変異させることによって調製された。本明細書において記載される操作された開裂半分ドメインは、異常開裂が最小にされるか、または消失される必須のヘテロ二量体突然変異体である。例えば、米国仮出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）の実施例１を参照されたく、それらの開示は、すべての目的のためにそれらの全体として参照することにより組み込まれる。
【００９３】
本明細書において記載される操作された開裂半分ドメインは、例えば、米国特許出願第２００５００６４４７４号（第１０／９１２，９３２号、実施例５）および米国特許仮出願第６０／７２１，０５４号（実施例３８）に記載される野生型開裂半分ドメイン（ＦｏｋＩ）の部位を標的とした突然変異による任意の好適な方法を使用して調製され得る。
【００９４】
Ｃ．標的組込みのための追加的な方法
標的遺伝子における標的部位を有する任意のヌクレアーゼは、本明細書において開示される方法で使用され得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有し、中には、統計的基礎にしたがって、人間大のゲノムに一度存在する可能性が高いものもある。標的遺伝子において独特の標的部位を有する任意のそのようなヌクレアーゼは、標的遺伝子における標的開裂のために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの代わりにか、またはそれに加えて使用され得る。
【００９５】
例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ，Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ，Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は、周知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。
【００９６】
ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼの開裂特異性は、それらの認識部位に対して絶対的ではないが、部位は、哺乳類大のゲノム１つ当たりの単一の開裂イベントが、その認識部位の単一コピーを含有する細胞においてホーミングエンドヌクレアーゼを発現することによって得ることができる十分な長さである。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作され得ることも報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６を参照されたい。
【００９７】
ドナーポリヌクレオチド
本明細書において記載されるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）は、二本鎖ＤＮＡを開裂することによって配列の標的組込みを刺激する。開裂部位か、またはその付近のゲノムへ組み込まれる配列は、ドナーポリヌクレオチドまたはドナー配列と称される。ドナー配列は、典型的に、ゲノム配列との十分な相同を含有し、それと、それが相同を持つゲノム配列との間の相同組換えを支持する。およそ２５、５０、１００、または２００ヌクレオチドまたはそれ以上の、ドナーとゲノム配列との間の配列相同（または１０〜２００ヌクレオチドまたはそれ以上の任意の整数値）は、その間の相同組換えを支持する。ドナー配列は、長さで１０〜５，０００ヌクレオチド（またはその間のヌクレオチドの任意の整数値）またはそれ以上の範囲であり得る。ドナー配列は、典型的に、それが交換するゲノム配列と同一ではないことが容易に理解される。例えば、ドナーポリヌクレオチドの配列は、十分な相同が、相同組換えを支持するように存在する限り、ゲノム配列に対する１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、または再構成を含有し得る。
【００９８】
代替として、ドナー配列は、相同の２つの領域が両側に配置される非相同配列を含有し得る。加えて、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける関心領域と相同ではない配列を含有するベクター分子を含み得る。概して、ドナー配列の相同領域は、組み換えが所望であるゲノム配列との少なくとも５０％配列同一性を有する。ある実施形態において、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％配列同一性が存在する。１％〜１００％配列同一性の任意の値は、ドナーポリヌクレオチドの長さによって存在し得る。
【００９９】
ドナー分子は、細胞クロマチンとの相同のいくつかの不連続領域を含有し得る。例えば、関心領域に通常は存在しない配列の標的挿入のために、該配列は、ドナー核酸分子に存在し、関心領域において配列との相同の領域が両側に配置され得る。
【０１００】
ドナー配列の挿入の成功を判定するための検定（例えば、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、制限酵素消化）を簡素化するために、ゲノム配列と比較して、ある配列の差がドナー配列に存在する場合がある。好ましくは、コーディング領域に配置される場合、そのようなヌクレオチド配列の差は、アミノ酸配列を変化させないか、または寡黙なアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響を与えない変化）を引き起こす。ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによって細胞クロマチンへ導入されたドナー配列の開裂を妨げるために、関心領域における亜鉛フィンガードメイン結合部位に対応する配列における変化を任意で含有し得る。
【０１０１】
ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線形または円形の形態で細胞へ導入され得る。線形の形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に周知の方法によって保護（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、線形分子の３’末端に付加され、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドは、一端または両端に結紮される。例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。分子から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法は、末端アミノ基の付加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の修正された内部ヌクレオチド結合の使用を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモータ、および抗生物質耐性をコードする遺伝子等の追加的な配列を有するベクター分子の一部として細胞へ導入され得る。また、ドナーポリヌクレオチドは、リポソームまたはポロキサマー等の薬剤と複合される核酸である裸の核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ（例えば、連結されるＡＡＶベクター）、レンチウイルス）によって送達され得る。加えて、ドナーポリヌクレオチドにおける配列は、最適な発現を可能にするコドン最適化を受ける場合があり、１つの種において見られるドナーヌクレオチドコドンは、受容ゲノムにおいて好ましいヌクレオチドコドンへ核酸レベルで変更される場合がある。
【０１０２】
ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、レンチウイルスドナーポリヌクレオチドである。レンチウイルス移動ベクターは、当技術分野で周知の方法によって、概して、産出され得る。例えば、米国特許第５，９９４，１３６号、同第６，１６５，７８２号、および同第６，４２８，９５３号を参照されたい。好ましくは、レンチウイルスドナーコンストラクトは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）である。ＩＤＬＶは、例えば、Ｌｅａｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（２）：７２１−７２８；Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３（４７）：１７６８４−１７６８９；および国際公開第ＷＯ０６／０１０８３４号に開示される、例えば、天然のレンチウイルスインテグラーゼ遺伝子における１つ以上の変異を含むレンチウイルスベクターを使用して記載されるように産出され得る。ある実施形態において、ＩＤＬＶは、Ｌｅａｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（２）：７２１−７２８に記載されるように、インテグラーゼタンパク質（Ｄ６４Ｖ）の位置６４での変異を含むＨＩＶレンチウイルスベクターである。
【０１０３】
本明細書において記載されるドナーポリヌクレオチドは、１つ以上の陽性および／または陰性選択またはスクリーニングマーカも含んでもよい。陽性選択マーカは、遺伝子を有し、発現する細胞のみが、ある条件で生存および／または成長することを可能にする産物をコードするそれらのポリヌクレオチドである。例えば、ネオマイシン耐性（ＮｅｏR）遺伝子を発現する細胞は、化合物Ｇ４１８に耐性を示すが、ＮｅｏRを発現しない細胞は、Ｇ４１８によって死滅する。ハイグロマイシン耐性、ＺｅｏｃｉｎTM（登録商標）耐性等を含む陽性選択マーカの他の例は、当業者に周知である。陰性選択マーカは、遺伝子を有し、発現する細胞のみが、ある条件で死滅することを可能にする産物をコードするそれらのポリヌクレオチドである。例えば、チミジンキナーゼ（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ＨＳＶ−ＴＫ）を発現する細胞は、ガンシクロビルが付加される場合、死滅する。他の陰性選択マーカは、当業者に周知である。使用することができるスクリーニングマーカは、例えば、ＧＦＰまたはベータガラクトシダーゼであり得る。他のスクリーニングマーカは、細胞表面上に発現されるポリペプチドをコードし、その表面発現ポリペプチドとの、特定の抗体または他のリガンドにより同定を可能にする配列を含むことができる。これらの検定における抗体またはリガンドは、迅速な細胞スクリーニングを可能にするために、例えばフルオロフォアによる、いくつかの方法で標識され得る。
【０１０４】
本明細書において記載されるように、細胞がＡｄ５／３５ＺＦＮコンストラクトおよびＩＤＬＶドナーコンストラクトにより形質導入される場合、２つの主要な相同組換え（ＨＲ）による標的組込み（ＴＩ）イベント、単一遺伝子標的挿入およびレンチウイルス２−ＬＴＲサークルによる複数コピー遺伝子挿入、が生じる。レンチウイルスＬＴＲによる末端接合（ＬＴＲ−ＥＪ）およびレンチウイルスゲノム無作為組込みも、非常に低い効率性で生じる。単一遺伝子標的挿入は、遺伝子補正、遺伝子破壊、および遺伝子ノックインに有用である。指定されたゲノム遺伝子座への複数コピー遺伝子挿入は、遺伝子療法の状況における有益な遺伝子の過剰発現、および生物工学的応用（例えば、タンパク質産出の強化）のために細胞株を操作することに対して重要である。
【０１０５】
レンチウイルスコンストラクトＩ（図１Ａ）は、単一の陽性／陰性選択またはスクリーニングマーカを介して単一遺伝子標的挿入または複数コピー遺伝子挿入のいずれかの質を選択的に高めるように設計される。図２Ａを参照されたい。上で述べたように、任意の選択またはスクリーニングマーカを使用することができる。ある実施形態において、選択マーカは、例えば、陽性および陰性選択の両方のために使用され得るｈｙｇ−ＴＫ融合遺伝子の、陽性および陰性選択マーカの両方であり得る。
【０１０６】
単一選択マーカが陰性選択マーカ（図２Ｂ）である場合、単一コピーを有する細胞は、２−ＬＴＲを受けた細胞を死滅させることによって選択され得る。また、陰性選択マーカの使用は、レンチウイルスベクターの無作為組込みを受けたか、またはＮＨＥＪを解して組み込まれるベクターを有する細胞を選び出し得る。そのため、陰性選択後の生存集団は、主に、一方または両方の対立遺伝子でヌクレアーゼによって誘導される二本鎖切断へのＨＤＲ駆動単一コピー挿入物を有する細胞であり得る。陽性選択（ハイグロマイシン）細胞の場合、２−ＬＴＲサークルの挿入を受けた細胞は、選択過程を生き残る（図２Ｃ）。
【０１０７】
ドナーコンストラクトへの陽性または陰性選択マーカの封入は、標的組込みイベントの制御された選択を可能にする。陰性選択マーカは、対象の細胞の単一コピーの制御された標的組込み（一方または両方の対立遺伝子上で）を可能にし、複数コピー、無作為成分、またはＮＨＥＪを介する組込みの除去を可能にする。陽性選択マーカの使用は、ドナーコンストラクトの複数コピーの標的組込みの選択を可能にする。上で述べたように、選択マーカは、単一ベクターコンストラクトを使用するいずれかの結果の選択を可能にする二重マーカ（例えば、ｈｙｇ−ＴＫ融合）であり得る。
【０１０８】
１つ以上のスクリーニングマーカの封入は、同様に、標的組込みイベントの制御された同定を可能にする。加えて、１つ以上のスクリーニングマーカは、複数の組込みイベント、無作為組込み、またはＮＨＥＪを介する組込みの除去を可能にするために、陰性または陽性選択マーカと組み合わせ使用され得る。
【０１０９】
レンチウイルスコンストラクトＩＩ（図１Ｂ）は、２つの選択またはスクリーニングマーカを含む他の例示的なドナーレンチウイルスベクターを示す。典型的に、相同アームの内側にある選択またはスクリーニングマーカ（選択／スクリーニングマーカ１）は、プロモータを持たず、それにより、それは、標的部位でゲノムに組み込まれる場合のみに発現される。下流活性遺伝子も含まれ、好ましくは、方向融合および／またはスプライスアクセプタ（ＳＡ）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または２Ａ自己開裂ペプチドのいずれかを使用して発現される。したがって、緻密な部位特異的挿入は、選択マーカ１の発現のために必要とされ、したがって、このマーカを使用して、ＮＨＥＪを介するレンチウイルスコンストラクトの挿入を有する無作為成分および細胞を選択的に除去することができる。
【０１１０】
第２の選択またはスクリーニングマーカ（選択／スクリーニングマーカ２）は、典型的に、相同アームの外側にあり、好ましくは、その発現を駆動する制御要素（例えば、プロモータ）に動作可能なように連結される。選択マーカ１および２のための選択を組み合わせることは、一方または両方の対立遺伝子で選択される両方のマーカにより単一のステップにおいて選択され得る標的部位で相同直接修復を介して挿入されるドナーの複数コピーを有する細胞集団の選択を可能にする。例えば、陽性選択マーカ１および陰性選択マーカ２を含むコンストラクトは、対象の細胞の部位特異的に組み込まれた単一コピーを主に有する細胞の選択を可能にする（図３Ｃ）。陰性選択マーカ１および陽性選択マーカ２を含むコンストラクトは、対象の細胞の部位特異的に組み込まれた複数コピーを主に有する細胞の選択を可能にする（図３Ｄ）。選択マーカ１および選択マーカ２の両方が陽性選択マーカであるコンストラクトは、対象の細胞の部位特異的に組み込まれた単一または複数コピーを有する細胞の選択を可能にする。
【０１１１】
レンチウイルスコンストラクトＩＶおよびＶ（図４および図５）は、ＨＲ−ＴＩを介して標的ゲノムに部位特異的に挿入された対象の導入遺伝子の単一コピーを含有する細胞の質を高めることを可能にする。稀に、これらのコンストラクトの組込みのための選択またはスクリーニングは、導入遺伝子の複数コピーを含有する細胞をもたらす。しかしながら、これらの設計を使用して選択される細胞は、無作為に組み込まれたコンストラクトおよび／またはＬＴＲ−ＥＪを介して組み込まれるコンストラクトを含有しない。「レンチウイルスコンストラクトＶ」に指定される設計は、最小レンチウイルス配列をゲノムに組み込む。
【０１１２】
送達
本明細書において記載されるＺＦＮは、任意の好適な手段によって標的細胞へ送達され得る。亜鉛フィンガーを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載され、このすべての開示は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
本明細書において記載されるＺＦＮは、１つ以上のＺＦＮをコードする配列を含有するベクターを使用しても送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクターシステムが使用され得る。また、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号を参照されたい。
【０１１４】
ある実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクターである。そのため、異種配列（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ））を細胞に導入するためのアデノウイルス（Ａｄ）ベクターを本明細書において記載する。
【０１１５】
本出願で使用され得るＡｄベクターの非限定的例としては、ヒトまたは非ヒト血清型に由来する、組換え（Ｅ１欠失等）、条件的複製可能（腫瘍崩壊等）、および／または複製可能Ａｄベクター（例えば、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ３５、または豚アデノウイルス−３）、および／またはキメラＡｄベクター（Ａｄ５／３５等）または操作された繊維（例えば、ノブまたはシャフト）タンパク質（ノブタンパク質のＨＩループ内でのペプチド挿入）を有する、指向性で変更させたＡｄベクター。また、免疫原性を低下させ、ＤＮＡペイロードの大きさを増加させる、「弱い」Ａｄベクター、例えば、すべてのアデノウイルス遺伝子が除去されたＡｄベクターが有用である。これは、例えば、ＺＦＮをコードする配列およびドナー配列の同時送達を可能にする。そのような弱いベクターは、ドナー配列が、標的組込みを介して組み込まれるより大きい導入遺伝子を含む場合、特に有用である。
【０１１６】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産出され得、それらは、多数の異なる細胞種類を容易に感染させる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を交換するように操作され、続いて、複製欠損ベクターは、トランスで欠失遺伝子機能のうちの１つ以上を提供する細胞において増殖する。例えば、ヒト２９３細胞は、Ｅ１機能を供給する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見られる細胞等の非分裂の分化した細胞を含む、複数の種類の組織を体内で形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉注射による抗癌免疫付与のためのポリヌクレオチド療法を含む（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８））。
【０１１７】
臨床試験における遺伝子移動のためのアデノウイルスベクターの使用の追加的な例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）；Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）が挙げられる。
【０１１８】
ある実施形態において、Ａｄベクターは、キメラアデノウイルスベクターであり、２つ以上の異なるアデノウイルスゲノムからの配列を含有する。例えば、Ａｄベクターは、Ａｄ５／３５ベクターであり得る。Ａｄ５／３５は、Ａｄ５の繊維タンパク質遺伝子（ノブ、シャフト、テール、ペントン）のうちの１つ以上を、例えば、Ａｄ３５等のＢ群アデノウイルスからの対応する繊維タンパク質遺伝子で交換することによってもたらされる。Ａｄ５／３５ベクター、およびこのベクターの特徴は、例えば、Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｆｉｂｅｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｂａｂｏｏｎｓ」，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：６６４−６７７；Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｏｒ  ３５  ｔｒｏｐｉｓｍ」，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：３７７−３８８；Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５  ｔｒｏｐｉｓｍ；ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ６：６３１−６４１；Ｓｃｈｒｏｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）「Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ａｄ５／Ｆ３５  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ」，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３２：５３６−５４６；Ｓｅｓｈｉｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１１：３８４−３９３；Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（＋）ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ」，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：２５６７−２５８３；およびＳｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），「Ａ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＴＲＡＩＬ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：４９６−５０９に記載される。
【０１１９】
上で述べたように、ＺＦＮおよび、これらのＺＦＮをコードするポリヌクレオチドは、任意の標的細胞へ送達され得る。
【０１２０】
用途
開示された方法および組成物は、所望の導入遺伝子発現レベルによって、ゲノムにおける特異的部位へ組み込まれる単一または複数の導入遺伝子を有する細胞の迅速、かつ制御された生成を可能にする。導入遺伝子の数の制御された組込みは、治療的および非治療的（例えば、基礎科学研究、生物工学的応用、細胞工学）用途の両方を有する。単一遺伝子標的挿入は、遺伝子補正、遺伝子破壊、および遺伝子ノックインに有用である。指定されたゲノム遺伝子座への複数コピー遺伝子挿入は、遺伝子療法の状況における有益な遺伝子の過剰発現、および生物工学的応用（例えば、タンパク質産出の強化）のために細胞株を操作することに対して重要である。
【０１２１】
ゲノムへ部位特異的に組み込まれる導入遺伝子の数を制御する能力は、位置効果によって引き起こされる挿入突然変異または変化に富んだ導入遺伝子発現に関連する問題を克服する。加えて、選択過程は、標準増幅手順に必要とされるものより迅速であり、染色体異常を引き起こし難い。
【０１２２】
そのため、本明細書において記載される組成物および方法が、制御された標的組込み、遺伝子修正、遺伝子補正、および遺伝子破壊のために使用され得る。本明細書において記載される組成物（例えば、レンチウイルス−ＺＦＮベクター）および方法は、タンパク質の産出のため、および／または様々な遺伝病および／または感染病の治療においても使用され得る。
【０１２３】
本明細書に記載されるすべての特許、特許出願、および出版物は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
開示は、明確性および理解のために例として多少詳細に提供されるが、様々な変化および修正が開示の精神または範囲から逸脱せずに行われ得ることは、当業者に理解される。したがって、先述の開示および以下の実施例は、限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：ベクター構成、および単一または複数の組み込まれた導入遺伝子を有する細胞の選択
図１Ｃに示されるレンチウイルスベクターは、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ，Ａ．＆Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４６：４５４−４６５に記載されると同じくらい基本的に産出した。相同アーム（左および右）は、ＣＣＲ５と相同であり、ＧＦＰをコードする配列の両側に配置される。ＣＣＲ５−ＧＦＰコンストラクトは、ＣＣＲ−ＬＶＧＦＰに指定した。簡潔に述べると、２９３Ｔ細胞は、必要な移動ベクタープラスミド、ｐＭＤ．Ｌｇ／ｐＲＲＥ．Ｄ６４ＶＩｎｔパッケージプラスミド、ｐＭＤ２．ＶＳＶ−Ｇエンベロープコーディングプラスミド、およびｐＲＳＶ−Ｒｅｖを使用して、リン酸カルシウム沈殿によって同時遺伝子導入した。ベクター粒子は、ＤＥＡＥ−セファロースカラム上で精製し、その後、超遠心分離法によって濃縮した。感染力価は、定量的ＰＣＲ方法を使用して決定した。図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、および１Ｅに示されるレンチウイルスベクターも構築される。
【０１２６】
図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、および１Ｅに示されるベクターは、以下のように、単一または複数の組み込まれた導入遺伝子を選択するためにＺＦＮと食い合わせて使用した。標的細胞が、Ａｄ５／３５ＺＦＮウイルスおよび非組込みレンチウイルスドナーウイルス（図１Ａ〜Ｃ）により形質導入される場合、２つの主要な相同組換え（ＨＲ）による標的組込み（ＴＩ）イベント、単一遺伝子標的挿入およびレンチウイルス２−ＬＴＲサークルによる複数コピー遺伝子挿入、が生じる。レンチウイルスＬＴＲによる末端接合（ＬＴＲ−ＥＪ）およびレンチウイルスゲノム無作為組込みも、非常に低い効率性で生じる。
【０１２７】
レンチウイルスコンストラクトＩ（図１Ａ）は、陽性または陰性選択マーカを介して単一遺伝子標的挿入または複数コピー遺伝子挿入のいずれかの質を選択的に高める。このレンチウイルスドナーコンストラクトを使用して選択され得る結果は、図２ＡおよびＢに概説する。簡潔に述べると、使用される選択マーカは、陽性および陰性選択の両方に対して使用され得るｈｙｇ−ＴＫ融合遺伝子であり得る。陽性選択（例えば、ハイグロマイシン）の場合、これは、２−ＬＴＲサークルの挿入を受けた細胞、かなり低い頻度で、無作為に組み込まれたベクターを有する細胞、相同組換えを介して一端で、非相同末端接合（ＨＲ−ＥＪ）を介して他端で組み込まれるベクターを有する細胞、およびＬＴＲ（ＬＴＲ−ＥＪ）の末端接合を有する細胞を選択する。コンストラクト１は、挿入イベントをスクリーニングするためにスクリーニングマーカとともにも使用され得る。
【０１２８】
このコンストラクトにおける陰性選択マーカ（例えば、ＴＫ）は、２−ＬＴＲサークルを受け、単一のＴＩイベントを完全に残すそれらの細胞を選び出す。しかしながら、未修正細胞も選択される。また、陰性選択マーカは、レンチウイルスベクターの無作為組込みを受けたか、またはＮＨＥＪもしくはＨＲ／ＮＨＥＪの両方を介して組み込まれるベクターを有する細胞を選び出し得る。
【０１２９】
陽性または陰性選択マーカの使用は、単一のステップにおいて、単一遺伝子挿入物としての標的遺伝子付加の制御を可能にし、複数コピー、無作為成分、ＮＨＥＪまたはＨＲ／ＮＨＥＪを介する組込みの除去を可能にする。代替として、複数コピー挿入は、陽性選択マーカを使用して選択され得る。本明細書において述べられるように、選択マーカは、単一ベクターコンストラクトを使用するいずれかの結果の選択を可能にする二重マーカ（例えば、ｈｙｇ−ＴＫ融合）であり得る。
【０１３０】
しかしながら、レンチウイルスコンストラクトＩは、陽性選択によって、無作為成分、またはＮＨＥＪもしくはＨＥ／ＮＨＥＪを介する組込みを選び出さない。これらの成分の排除が所望である場合、レンチウイルスコンストラクトＩＩを使用することができる。レンチウイルスコンストラクトＩＩは、プロモータを有さない第２の陽性選択マーカを含み、発現され、典型的に相同アームの内側にある活性遺伝子の下流でこのマーカの緻密な挿入を必要とする。内因性プロモータからのこのプロモータを有さない選択マーカの発現は、スプライスアクセプタ（ＳＡ）の使用およびイントロンへのその挿入によるか、または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）もしくは２Ａペプチドによって、インフレームでそれを切断部位で天然の遺伝子にインフレームで直接融合することによって得られる。これは、発現されるこの陽性選択マーカのために緻密な部位特異的挿入を必要とするため、このマーカは、無作為成分、およびＮＨＥＪまたはＨＲ／ＮＨＥＪを介したレンチウイルスコンストラクトの挿入を有する細胞を選択的に除去し得る。コンストラクトＩＩは、プロモータを有さないスクリーニングマーカとともにも使用され得、スクリーニングマーカの発現は、天然の遺伝子への直接インフレーム融合に続く内因性プロモータに依存する。
【０１３１】
レンチウイルスコンストラクトＩＩは、導入遺伝子の単一コピーまたは導入遺伝子の複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはさらにそれ以上）コピーを有する細胞の選択を可能にする。例えば、選択マーカ１が陽性選択マーカである場合、ＺＦＮおよびレンチウイルスコンストラクトＩＩにより形質導入される細胞の選択は、ＨＲ−ＴＩによるか、または非常に低い効率性でＨＲ−ＥＪを介してかのいずれかで導入遺伝子の単一コピーを有する細胞を産出する（図３Ａ）。選択マーカ２が陽性選択マーカ（レンチウイルスコンストラクトＩと同様）である場合、選択された細胞は、ＨＲ−ＴＩを介して挿入される導入遺伝子の複数コピー、および導入遺伝子がＬＴＲ−ＥＪまたは無作為に組み込まれるか、またはＨＲ−ＥＪを介して組み込まれる細胞を含む（図３Ｂ）。選択マーカ１が陽性選択マーカであり、選択マーカ２が陰性選択マーカである場合、陽性および陰性選択は、複数コピーＨＲ−ＴＩ、無作為組込み、および／またはＬＴＲ−ＥＪを伴わずに、導入遺伝子の単一ＨＲ−ＴＩコピーを含有する細胞を生じさせる。選択マーカ２に対する陽性選択マーカ、および選択マーカ１に対する陰性選択マーカの使用は、導入遺伝子の複数ＨＲ−ＴＩコピーを含有し、導入遺伝子の単一ＨＲ−ＴＩコピーを伴わない細胞の選択を可能にする。選択マーカ１および２の両方に対する陽性選択マーカの使用は、複数コピーＨＲ−ＴＩ（頭尾）および単一コピーＨＲ−ＴＩの両方を有する細胞の選択を可能にする。
【０１３２】
レンチウイルスコンストラクトＩＶおよびＶにおける陽性選択マーカの使用は、導入遺伝子の単一コピーを含有し、標的部位へ相同組換えを介して組み込まれる（ＨＲ−ＴＩ）細胞において高度に質が高められる細胞の選択を可能にする。図４および図５を参照されたい。選択された細胞集団は、導入遺伝子の複数コピーを有する細胞を含有することができるが、選択された細胞集団は、無作為に組み込まれた導入遺伝子またはＬＴＲ末端接合（ＬＴＲ−ＥＪ）によって組み込まれる導入細胞を含有せず、スクリーニングマーカとともにも使用される。
【０１３３】
したがって、これらの異なる選択戦略を使用して、ある種類の組込みイベントのために質が高められる細胞集団が迅速に選択される。加えて、集団は、スクリーニング技術を使用してスクリーニングもされ得る。
【０１３４】
実施例２：導入遺伝子の単一コピーまたは複数コピーの標的組込み
実施例１に記載される、ＣＣＲ−ＬＶＧＦＰに指定されたレンチウイルスドナーコンストラクトは、ＣＣＲ５を標的としたＡｄ５／３５ＺＦＮの存在下においてＫ５６２、Ｈｅｐ３Ｂ、およびヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ）へ形質導入した。ＣＣＲ５Ａｄ５／３５ＺＦＮの完全な記載に関して、２００７年５月２３日出願の米国特許出願第１１／８０５，７９７号を参照されたい。
【０１３５】
図６に示されるように、Ｋ５６２細胞における同時形質導入は、１つ（ヘテロ接合）または両方の（ホモ接合）対立遺伝子上のＧＦＰの単一コピーを有する細胞、ならびにＧＦＰの複数コピーを有するヘテロ接合およびホモ接合細胞をもたらした。加えて、コンストラクトの１つ以上のコピーがＬＴＲの末端接合によって組み込まれた細胞も生成した。
【０１３６】
各種の組込みイベントからの選択されたクローン、および図６に示されるＫ５６２細胞のプールも、サザンブロット分析によって分析した。特に、選択されたクローンの細胞ＤＮＡは、ＰＧＫ−ＧＦＰ（図７Ａ）またはＣＣＲ５左相同アームプローブ（図７Ｂ）のいずれかにより精査した。ｐｇｆ−ｅＧＦＰプローブを使用した細胞のプールに対するサザンブロット分析の結果を図８に示す。
【０１３７】
同様に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（図９Ａ）およびヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ、図９Ｂ）のサザンブロット分析は、単一および複数のＨＲ−ＴＩイベントを示す。
【０１３８】
経時的なＧＦＰの発現（細胞通過）も、ｈＭＳＣ細胞において評価した。細胞は、ＣＣＲ−ＬＶＧＦＰ単独または０、３、１５、および２１でＡｄ５／３５ＣＣＲ５−ＺＦＮおよびＣＣＲ−ＬＶＧＦＰにより形質導入した。図１０、パネルＡ〜Ｅは、ＧＦＰ発現が、ＺＦＮおよびレンチウイルスＧＦＰドナーコンストラクトを含むｈＭＳＣにおける細胞通過中、安定していることを示す。
【０１３９】
組み込まれたＧＦＰを含む細胞も、脂質生成および骨形成に対して評価した。簡潔に述べると、ｈＭＳＣは、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングした２４ウェルプレート（骨細胞分化に対して２百万／プレート、含脂肪細胞分化に対して４百万／プレート）において播種した。第２日目、細胞は、分化基本培地（１０％ＥＳ−ＦＢＳ、ＤＭＥＭ中１％ＰＳＧ）および細胞に添加した誘導培地で完全に洗浄した。骨形成誘導培地は、基本培地、および０．０５ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸、０．１ｕＭデキサメタゾン、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸を含んだ。脂質生成誘導培地は、基本培地、ならびに１ｕＭ  Ｄｅｘ、１００ｕｇ／ｍｌ  ＩＢＭＸ、１０ｕｇ／ｍｌインスリン、および５ｕＭトログリタゾンを含んだ。細胞は、培地を２〜３日おきに新しい培地に交換しながら、約１０〜１４日間、誘導培地でインキュベートした。
【０１４０】
染色のために、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１０％ホルマリンに２０分間漬け、ＰＢＳ洗浄により２回洗浄した。骨細胞染色のために、細胞をシグマアルカリホスファターゼ染色キットで染色した。含脂肪細胞染色のために、細胞をプロピレングリコールで５分間さらに洗浄し、その後、プロピレングリコール中のオイルレッドＯで２時間染色した。染色後、細胞を８５％プロピレングリコールで５分間洗浄し、水で３回濯ぎ、５０％グリセロールで保存した。
【０１４１】
図１１および１２に示されるように、ＧＦＰコンストラクトが組み込まれるｈＭＳＣ細胞は、脂質生成および骨形成後にＧＦＰを発現し続ける。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月4日(2014.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチウイルスＬＴＲの間に、哺乳類細胞の内因性細胞クロマチンの関心領域に対する相同配列である第１及び第２のヌクレオチド配列を含むインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ドナーポリヌクレオチドであって、前記相同配列は、哺乳類細胞の内因性細胞クロマチン配列と同一であり、そしてさらに、前記ドナーポリヌクレオチドは：
（ｉ）前記第１及び第２の相同配列の間に配置された対象の遺伝子、及び前記第１及び第２の相同配列の外側の選択マーカーを含むドナーポリヌクレオチド；
（ｉｉ）前記第１及び第２の相同配列の間に配置された対象の遺伝子及び第１の選択マーカー、及び前記第１及び第２の相同配列の外側の第２の選択マーカーを含むドナーポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）対象の遺伝子、及び前記第１及び第２の相同配列の外側の第１の選択マーカーを含むドナーポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｖ）前記第１及び第２の相同配列の間に配置された対象の遺伝子及び選択マーカーを含むドナーポリヌクレオチド
から成る群から選択されることを特徴とする、ＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記第１及び／又は第２の選択マーカーは、陽性選択マーカーである、請求項１に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記第１及び／又は第２の選択マーカーは、陰性選択マーカーである、請求項１に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項４】
陽性−陰性選択マーカーを含む請求項１に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドであって、前記第１の選択マーカーが陽性選択マーカーであり、そして前記第２の選択マーカーが陰性選択マーカーである、ＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記陽性−陰性選択マーカーは、ｈｙｇ−ＴＫである、請求項４に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＩＤＬＶドナーポリヌクレオチド。
【請求項７】
単離細胞への外因性核酸配列の単一コピー又は複数コピーの制御された部位特異的組込みのための方法であって、
（ａ）前記細胞において第１の融合タンパク質を発現するステップであって、前記第１の融合タンパク質は、第１の亜鉛フィンガー結合ドメイン及び第１の開裂ハーフドメインを含み、前記第１の亜鉛フィンガー結合ドメインは、前記細胞のゲノムにおける関心領域において第１の標的部位に結合するように操作された、ステップと、
（ｂ）前記細胞において第２の融合タンパク質を発現するステップであって、前記第２の融合タンパク質は、第２の亜鉛フィンガー結合ドメイン及び第２の開裂ハーフドメインを含み、前記第２の亜鉛フィンガー結合ドメインは、前記細胞の前記ゲノムにおける前記関心領域において第２の標的部位に結合し、前記第２の標的部位は、前記第１の標的部位と異なる、ステップと、
（ｃ）前記細胞を、請求項１〜６のいずれか１項に記載の任意の前記ＩＤＬＶドナーポリヌクレオチドと接触させる、ステップと、を含み、
前記第１の標的部位への前記第１の融合タンパク質の結合、及び前記第２の標的部位への前記第２の融合タンパク質の結合は、前記開裂ハーフドメインを位置付け、それにより、前記細胞の前記ゲノムは、前記関心領域において開裂され、それによって、前記関心領域における前記細胞の前記ゲノムへの前記外因性配列の１つ以上のコピーの組込みがもたらされることを特徴とする、方法。
【請求項８】
前記外因性核酸配列はｃＤＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記関心領域は、生存能力に対して必須ではない前記ゲノムの領域にある、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記関心領域は、転写活性のある前記ゲノムの領域にある、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記外因性配列の単一コピーは、前記細胞の前記ゲノムへ組み込まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記外因性配列の複数コピーは、前記細胞の前記ゲノムへ組み込まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記融合タンパク質の少なくとも１つは、前記開裂ハーフドメインの二量化境界面のアミノ酸配列における変化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離細胞は、哺乳類細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離哺乳類細胞は、ヒト細胞である、請求項１４に記載の方法。
【外国語明細書】
2014223076000001.pdf