(57)【要約】【課題】テルペンの生物大量生産系を構築するために使用される、テルペン生産経路に関わる酵素群およびそれらの変異体の探索方法を提供すること。【解決手段】テルペン合成酵素の「基質消費能」に基づき、テルペン合成酵素をスクリーニングする方法を提供する。具体的には、酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体を導入した細胞に被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することにより、テルペン合成に関わる酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体をスクリーニングする方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子であって、酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【請求項２】
テルペン合成酵素変異体が、該変異体を発現した細胞の細胞死を引き起こすテルペン合成酵素変異体である、請求項１に記載のテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【請求項３】
細胞死が、テルペン合成酵素変異体により消費される基質または該基質の材料となる化合物が細胞の生存に関与する化合物であることにより生じる細胞死である、請求項２に記載のテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【請求項４】
テルペン合成酵素変異体が、ゲラニオール合成酵素変異体である、請求項１から３のいずれか１項に記載のテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞が、大腸菌である、請求項１から４のいずれか１項に記載のテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【請求項６】
酵素活性が増強されたゲラニオール合成酵変異体をコードする遺伝子であって、該変異体は酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されており、かつ、該変異体を発現した細胞において、該変異体により消費される基質または該基質の材料となる化合物が細胞の生存に関与する化合物であることにより生じる細胞死を引き起こす変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【請求項７】
酵素活性が増強されたゲラニオール合成酵変異体をコードする遺伝子が、配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチド配列で表される遺伝子である、請求項６に記載のテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【請求項８】
配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチド配列で表されるゲラニオール合成酵変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【請求項９】
配列番号５または配列番号６に記載のヌクレオチド配列で表されるプラスミドを形質転換した大腸菌に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テルペン合成酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、本発明は、テルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子であって、酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含み、ここで、該テルペン合成酵素変異体は、細胞の生存に関与する化合物をその基質や該基質の材料として消費することにより細胞死を引き起こすことを特徴とする、テルペン合成酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テルペンは、５５，０００種以上もの構造が知られている、植物や昆虫、菌類等によって生産される多様な天然化合物群である。分類によってはテルペン類のうち、カルボニル基やヒドロキシ基等の官能基を持つ誘導体をテルペノイドと呼ぶことがある。また、それらの総称としてイソプレノイドという呼称も使用される。
【０００３】
テルペンは最初、精油に含まれるＣ１０Ｈ１６の分子式をもつ炭化水素を指していたが、テルペンと呼ばれる対象が拡大し、現在では（Ｃ５Ｈ８）ｎの組成の炭化水素およびそれから導かれる含酸素／含窒素化合物並びに不飽和度を異にするものも意味するようになった。拡張された範囲のものをテルペノイドと称する場合も多い。上記分子式のｎの数２のものをモノテルペン、３をセスキテルペン、４をジテルペン、６をトリテルペン、８をテトラテルペン、および多数のものをポリテルペンと称する。自然界には既知／未知を含めて百万超のテルペンがあると言われている。これら全てのテルペン化合物はイソペンテニル二リン酸（以下、ＩＰＰ）という共通の前駆体からテルペン合成経路を介して合成される。ＩＰＰは、アセチルＣｏＡを出発物とするメバロン酸経路や、ピルビン酸を出発物とする非メバロン酸経路を経て合成される（非特許文献１−２）。ＩＰＰは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（以下、ＩＤＩ）による異性化反応で、その構造異性体であるジメチルアリル二リン酸（以下、ＤＭＡＰＰと略称する）に転換される。これら経路で合成されたＩＰＰおよびＤＭＡＰＰにプレニルトランフェラーゼが作用することにより、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸等の、テルペン合成の中間体である鎖状アルコール二リン酸エステルが生成される。これら鎖状アルコール二リン酸エステルを基質としてテルペン合成酵素の作用によりテルペンが合成されるが、これらの酵素は鎖状のテルペンを与えるほか、閉環、ヒドリドやアルキル基転位、水やアミンの付加、脱水素、酸素官能基導入、脱炭酸反応を行い、多種多様な骨格を持つテルペンを生成する。
【０００４】
テルペンは、医薬品、香料、および有機合成の合成原料として広く利用されている（非特許文献３）。また、このような工業価値を有するものに加え、抗菌作用、免疫賦活作用、精神安定作用、抗マラリア活性等の、様々な薬理活性を有するものがある。さらに近年では、ディーゼルやジェット燃料に適した物性を持つテルペンが、新たなバイオ燃料として注目されてもいる（非特許文献４）。
【０００５】
このようにテルペンにはさまざまな生理機能があることから、テルペンの効率的な微生物生産法の確立をめざした多くの研究がなされている。テルペン合成酵素をコードする遺伝子の多くは植物由来であるため、大腸菌や酵母等の宿主を利用した生産系では、その発現量が低く、また発現する酵素の安定性や活性も低い。つまり、コドン利用（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）の非最適化、翻訳後修飾の欠如、会合パートナーの不在等によって、本来の活性を発揮できない場合が多い。また、テルペン合成酵素は、酵素活性が高くないものが多い。これらの原因により、テルペンの効率的な微生物生産の構築が困難になっている。
【０００６】
一方、大腸菌、酵母、シアノバクテリア、コリネ菌、枯草菌、好熱性細菌等、産業生産の宿主に使われることが検討されているほとんど全ての細胞は、テルペン類の直接の前駆体を合成している。このため、必要なテルペン合成酵素の遺伝子を導入するだけで、微量ながら細胞にテルペン生産させることができる。ただし、それらのプレニル二リン酸の合成量は必ずしも高くないうえ、ｔＲＮＡ修飾やタンパク質のプレニル化、ドリコール／キノン側鎖等細胞の生育に必要な各種成分の生合成に使われるため、テルペン生産にまわる炭素原は必ずしも多くない。
【０００７】
テルペンの効率的生産をめざして、その生産経路の改良が各種試みられてきた。例えば、宿主由来のプレニル二リン酸合成経路遺伝子の過剰発現（非特許文献５）、異種のプレニル二リン酸合成経路遺伝子の導入（非特許文献６−７）、競合経路であるｔＲＮＡプレニル化酵素遺伝子の欠損（特許文献１、非特許文献６−７）、およびグローバルレギュレーターの過剰発現（非特許文献７）等による試みが報告されている。しかしテルペンの生産効率は、バイオアルコールや脂肪酸エステル、バイオプラスチック等の生産レベル（数十〜数百ｇ／Ｌ培地）と比べ、圧倒的に低レベル（せいぜい１ｇ／Ｌ培地）であり、その生産方法にはまだ改良の余地がある。テルペン生産能の向上に寄与する遺伝的因子の探索を目的として、宿主の持つ複雑で未解明な代謝制御ネットワークを探索し、ランダムな遺伝子ノックアウト（非特許文献８−１０）、σ因子やグローバル転写レギュレータのランダム改変（特許文献２−４、非特許文献７）、ゲノムシャッフリング（非特許文献１１）等が、今なお精力的に行われている。また、同じテルペン生産経路の上流に存在して生産を強化する遺伝子（群）でも、由来が違ったり、あるいはオペロンの構成が変わったりすると、宿主のテルペン生産能は高まる（非特許文献１２−１３および１４−１６）。
【０００８】
また、テルペンの効率的生産を目的として、その合成酵素遺伝子の探索が盛んに行われている。しかしながら、テルペン生合成に係わる合成酵素をコードする遺伝子の全てを網羅的に取得する方法は提案されていない。とくに未知のテルペン分子をつくる合成酵素の機能は、簡単に同定することはできない。現在のところ、既知のテルペン合成酵素遺伝子と有意な配列相同性をもつ遺伝子をゲノムデータベースから特定し、該遺伝子がコードするタンパク質の活性を液体クロマト質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）やガスクロマト質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ）を用いて測定し、その結果テルペン合成酵素活性が認められたタンパク質をコードする遺伝子をテルペン合成酵素遺伝子であると認定するという方法で、新規テルペン合成酵素遺伝子の取得が行われている（非特許文献１７）。しかし、既知のテルペン合成酵素遺伝子と配列相同性が低い遺伝子は、このような方法では取得することが困難であった。
【０００９】
テルペン生産経路の改良やその合成酵素遺伝子の探索には、プレニル二リン酸から合成されるカロテノイド色素合成経路を用いたスクリーニング（カロテノイドスクリーニング）が用いられている（非特許文献７および１８）。このスクリーニングでは、何らかの遺伝子の導入および発現によりテルペン前駆体量が高くなると、該テルペン前駆体から合成されるカロテノイド色素の蓄積量の増加がもたらされ、該増加した色素蓄積量がコロニー色の深化により可視化できる。
【００１０】
本発明者らも、テルペン合成酵素の基質消費能に基づき、テルペン合成酵素遺伝子をスクリーニングする方法を提供している（非特許文献５）。すなわち、テルペン合成酵素群と同じ基質を原料とする種々の色素の生合成経路を細胞内に構築し、これらの細胞にテルペン合成酵素の遺伝子を導入して色素合成経路から原料を奪うことにより、細胞当りの色素合成量が減少することを指標にしたテルペン合成酵素のスクリーニング方法を提供している。
【００１１】
しかし、色素の蓄積量の増加または減少を指標にしたテルペン合成酵素遺伝子のスクリーニングには、２つの問題点がある。１つの問題は、コロニーの色の測定等に手間がかかり、そのスクリーニングサイズが制限されることである。このようなスクリーニングにおいては多くの場合、ニトロセルロース膜を使って視認性を高める工夫が必要であり、そのコストとスループットに大きな制限がある（非特許文献１９）。また、メタゲノムソースや、複数の遺伝子にまたがるランダム変異ライブラリ等のようなスループット要求性のより高い探索には、これらの手法は現実的ではない。もう１つ問題は、カロテノイド色素の代謝経路そのものが持つ触媒活性、および細胞宿主の色素蓄積限界の存在である。テルペン生産経路の上流経路を強化できたとしても、これらの要素により、細胞への色素蓄積量はプラトーに達する。このため、強力な活性を有するテルペン合成酵素遺伝子の探索は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００５−３４８６４４号公報
【特許文献２】米国特許第７６９５９３２号明細書
【特許文献３】米国特許第７７４１０７０号明細書
【特許文献４】米国特許第８０６２８７８号明細書
【特許文献５】特開２０１１−１２５３３４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，４２５−４３０（１９９０）
【非特許文献２】Ｈｕｎｔｅｒ  Ｗ．Ｎ．，Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２，２１５７３−２１５７７（２００７）
【非特許文献３】Ａｊｉｋｕｍａｒ  Ｐ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｒｕｇｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ５，２，１６７−１９０（２００８）
【非特許文献４】Ｌｅｅ  Ｓ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｆｒｏｍ  ｂｕｇｓ  ｔｏ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｆｕｅｌｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９，５，５５６−５６３（２００８）
【非特許文献５】Ｋｉｎｋｅａｄ  Ｒｅｉｌｉｎｇ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏａｎｄ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８７，２，２００−２１２（２００４）
【非特許文献６】Ｍａｒｔｉｎ  Ｖ．Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，７，７９６−８０２（２００３）
【非特許文献７】Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉ−ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９，３３７−３４７（２００７）
【非特許文献８】Ｏｅｚａｙｄｉｎ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｃｒｅｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １５，１７４−１８３（２０１３）
【非特許文献９】Ａｌｐｅｒ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７，１５５−１６４（２００５）
【非特許文献１０】Ｔａｗｏｒｎｓａｍｒｅｔｋｉｔ  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｌｉｎａｌｏｏｌ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ−ｂａｓｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ．  Ｐｒｏｃｅｄｉａ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１，２４−３５（２０１２）
【非特許文献１１】Ｚｈａｎｇ  Ｙ．Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，６４４−６４６（２００２）
【非特許文献１２】Ｋａｊｉｗａｒａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２４，４２１−４２６（１９９７）
【非特許文献１３】Ｔｓｕｒｕｔａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｏｒｐｈａ−４，１１−ｄｉｅｎｅ，  ａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ  ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ，  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ４４８９（２００９）
【非特許文献１４】Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｊ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｍａｌａｒｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｍｏｒｐｈａ−４，１１−ｄｉｅｎｅ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１，１３−１９（２００９）
【非特許文献１５】Ｐｅｒａｌｔａ−Ｙａｈｙａ  Ｐ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｅｒｐｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｉｏｆｕｅｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２，４８３（２０１１）
【非特許文献１６】Ａｊｉｋｕｍａｒ  Ｐ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔａｘｏｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｖｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，７０−７４（２０１０）
【非特許文献１７】Ｍｉｊｔｓ  Ｂ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ａｃｙｃｌｉｃ  ｘａｎｔｈｏｈｙｌｌｓ：ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，４５３−４６０（２００５）
【非特許文献１８】Ｐｒａｔｈｅｒ  Ｋ．Ｊ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｉｅｎｃｅｓ  １０７，３２，１３６５４−１３６５９（２０１０）
【非特許文献１９】Ｆｕｒｕｂａｙａｓｈｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８９２，２４５−２５３（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
自然界の既知および未知のテルペンを生物生産できるようにするためには、まず、その合成酵素の遺伝子を取得する必要があり、そのような遺伝子の取得方法の開発が必要である。また、テルペンの生物大量生産系の構築のためには、テルペン生産経路の改良が必要であり、該経路に関わる酵素群およびそれらの変異体の探索方法の開発が必要である。
【００１５】
すなわち、本発明の課題は、テルペンの生物大量生産系を構築するために使用される、テルペン生産経路に関わる酵素群およびそれらの変異体の探索方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、テルペン生産量の向上したゲラニオール合成酵素（以下、ＧＥＳと略称する）変異体をコードする遺伝子を形質転換した大腸菌株では細胞死が引き起こされること、該細胞死はＧＥＳによる基質消費に起因する生育阻害によること、該細胞死はＧＥＳの基質の生合成を触媒する酵素をコードする遺伝子を導入して該基質を供給することにより防止できることを見出した。そして、これら知見を利用して、酵素活性および／またはその発現が増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することにより、テルペン合成酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体、例えばテルペン合成酵素の基質または該基質の材料となる化合物、すなわちテルペン前駆体、を合成する酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体をスクリーニングする方法を構築した。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下からなる。
１．テルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子であって、酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
２．テルペン合成酵素変異体が、該変異体を発現した細胞の細胞死を引き起こすテルペン合成酵素変異体である、前記１．のテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
３．細胞死が、テルペン合成酵素変異体により消費される基質または該基質の材料となる化合物が細胞の生存に関与する化合物であることにより生じる細胞死である、前記２．のテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
４．テルペン合成酵素変異体が、ゲラニオール合成酵素変異体である、前記１．から３．のいずれかのテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
５．細胞が、大腸菌である、前記１．から４．のいずれかのテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
６．酵素活性が増強されたゲラニオール合成酵変異体をコードする遺伝子であって、該変異体は酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されており、かつ、該変異体を発現した細胞において、該変異体により消費される基質または該基質の材料となる化合物が細胞の生存に関与する化合物であることにより生じる細胞死を引き起こす変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
７．酵素活性が増強されたゲラニオール合成酵変異体をコードする遺伝子が、配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチド配列で表される遺伝子である、前記６．のテルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
８．配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチド配列で表されるゲラニオール合成酵変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
９．配列番号５または配列番号６に記載のヌクレオチド配列で表されるプラスミドを形質転換した大腸菌に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、酵素活性および／またはその発現が増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法を提供することができ、その結果、選抜された遺伝子やその変異体を使用して、テルペンの生物大量生産系を構築することができる。
【００１９】
本発明に係る方法は、テルペン合成酵素の基質や該基質の材料となる化合物の枯渇による細胞死からのレスキューを原理とした選抜手法である。すなわち、本方法は、テルペンの前駆体、すなわちテルペン合成酵素の基質または該基質の材料となる化合物を合成する酵素をコードする遺伝子やその変異体を形質転換した細胞のみが生存するといういわゆるセレクションモードでの遺伝子探索法である。本方法は、従来報告されているテルペン生産向上に寄与する遺伝子のスクリーニング方法、例えば色素の蓄積量の増加または減少を指標にしたスクリーニング方法と比較して、スループットが極めて高く、その操作も迅速かつ簡便である（図１）。また本方法は、細胞増殖と結びついている（Ｇｒｏｗｔｈ−ｃｏｕｐｌｅｄ）ため、テルペン前駆体の合成増強活性がより強い酵素をコードする遺伝子やその変異体を形質転換した細胞ほど生存効率がより高いと考えることができる。すなわち、単に正の効果をもつ遺伝子を選び出すだけでなく、より好ましい遺伝子を濃縮するための手法としてさらなる使用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】テルペン合成に関わる酵素遺伝子のスクリーニング方法を説明する図である。パネルＡは、従前に報告されている方法であってカロテノイド色素を用いて色を指標に実施するスクリーニング方法を示す。パネルＢは、本願発明に係る方法であって、基質枯渇による細胞死の回避を指標に実施するスクリーニング方法を示す。
【図２】ゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子の発現コンストラクトの模式図およびそのプラスミドマップを示す図である。パネルＡは、ゲラニオール合成酵素（ＧＥＳ）のＮ末端５２アミノ酸を欠失させ、さらにＣ末端に６×ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）を付加した変異体（ＧＥＳＭ５３）をコードする遺伝子の発現コンストラクトｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３の模式図である。パネルＣは、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３のプラスミドマップを示す。パネルＢは、ＧＥＳＭ５３遺伝子の翻訳効率を高めるためにＧＥＳＭ５３のアミノ酸配列においてＧＥＳの第５４番目に相当するアミノ酸であるグリシンをバリンに置換し、さらにＣ末端に６×Ｈｉｓを付加した変異体（ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖ）をコードする遺伝子の発現コンストラクトｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖの模式図である。パネルＤは、ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖのプラスミドマップを示す。（実施例１）
【図３】ゲラニオール合成酵素遺伝子の変異体を導入した大腸菌株ＸＬ−１  ｂｌｕｅでのゲラニオール生産をガスクロマト／水素イオン検出器により測定した結果を示す図である。Ａ．はｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３を形質転換したＸＬ−１  ｂｌｕｅ、Ｂ．はｐＬａｃ−ｇｅｓＤ３２３Ａを形質転換したＸＬ−１  ｂｌｕｅにおけるゲラニオール（Ｇｅｒａｎｉｏｌ）の分析結果を示す。Ｃ．はゲラニオール標品の分析結果を示す。横軸は保持時間（ＲＴ［ｍｉｎ］）を示す。（実施例１）
【図４】カロテノイド色素合成酵素遺伝子であるジアポフィトエン合成酵素（ＣｒｔＭ）遺伝子およびデヒドロスクアレン不飽和化酵素（ＣｒｔＮ）遺伝子を発現させた大腸菌では、ゲラニオール合成酵素遺伝子を共発現させると、色素合成酵素の基質がゲラニオール合成酵素に奪われるために、カロテノイド色素量の蓄積量の減少が認められたことを説明する図である。パネルＡは、ＣｒｔＭ遺伝子およびＣｒｔＮ遺伝子を発現させた大腸菌では、ピルビン酸を原料として幾つかの経路を経てゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）が合成され、ＧＰＰからさらにゲラニオール合成酵素（ＧＥＳ）よりゲラニオール（Ｇｅｒａｎｉｏｌ）が生産される一方、ＧＰＰからファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を中継してカロテノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）の１種である黄色色素（ｙｅｌｌｏｗ  ｐｉｇｍｅｎｔ）が合成されることを説明する。パネルＢは、ＣｒｔＭ遺伝子およびＣｒｔＮ遺伝子を発現させた大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅでは、野生型ＧＥＳ（図中、ＷＴと表示）またはＧＥＳＭ５３（図中、Ｍ５３と表示）を共発現させると、空ベクター（図中、Ｖｏｉｄと表示）を形質転換したとき、またはＧＥＳ不活性化変異体（図中、ＷＴＤ３２３Ａと表示）を発現させたときと比較して、カロテノイド合成量が著しく減少したことを示す。カロテノイド合成量は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）１ｇ当たりの合成量（μｇ／ｇＤＣＭ）として示す。結果はＮ＝３の平均値で示し、エラーバーはＮ＝３の標準偏差を示す。（実施例１）
【図５】野生型ＧＥＳを発現させた大腸菌およびＧＥＳ不活性化変異体（図中、Ｄ３２３Ａと表示）を発現させた大腸菌ＪＷ３６８６株ではコロニー形成が観察されたが、ＧＥＳＭ５３を発現させた大腸菌ＪＷ３６８６株ではコロニー形成がほとんど観察されなかったことを説明する図である。図中、野生型ＧＥＳはＷＴ、ＧＥＳ不活性化変異体はＤ３２３Ａ、ＧＥＳＭ５３はＭ５３と表示する。図の縦軸は、形質転換あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ＴＦ）を示す。（実施例３）
【図６】ＧＥＳＭ５３のみを発現させた大腸菌ではコロニーが形成されなかったが、該大腸菌にイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を共発現させるとコロニー形成が観察されたことを説明する図である。大腸菌ＪＷ３６８６株に、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３と空ベクターであるｐＡＣ−ｖｏｉｄまたは色素合成酵素遺伝子発現ベクターであるｐＡＣ−ｃｒｔＭＮとを共形質転換したときにはコロニーが形成されなかったが、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３とｐＡＣ−ｉｄｉとを共形質転換することによりコロニーが形成された。図の左縦軸は、形質転換あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ＴＦ）を示す。図中、○はｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３と、ｐＡＣ−ｖｏｉｄ、ｐＡＣ−ｉｄｉ、またはｐＡＣ−ｃｒｔＭＮとの共形質転換によるコロニー形成単位（ＣＦＵＧＥＳ（＋））を示す。●は、ｐＬａｃプラスミドと、ｐＡＣ−ｖｏｉｄ、ｐＡＣ−ｉｄｉ、またはｐＡＣ−ｃｒｔＭＮとの共形質転換によるコロニー形成単位（ＣＦＵＧＥＳ（ー））を示す。図の右縦軸は生存率を示し、該生存率はＣＦＵＧＥＳ（＋）のＣＦＵＧＥＳ（ー）に対する比である。結果はＮ＝３の平均値で示し、エラーバーはＮ＝３の標準偏差を示す。（実施例３）
【図７】各種ＧＥＳ変異体発現プラスミドと緑色蛍光タンパク質発現プラスミドとを３種類の大腸菌株に形質転換し、宿主の種類がＧＥＳ変異体発現による細胞死に影響するか否かを検討した結果を示す図である。大腸菌は、ＪＷ３６８６株（図中、ＪＷ／Δｔｎａと記載する）、ＢＷ２５１１３株、およびＸＬ−１  Ｂｌｕｅの３種類を用いた。図中、Ｄ３２３ＡおよびＧ２８５ＳはＧＥＳ不活性化変異体を、ｗｔは野生型ＧＥＳを、Ｍ５３はＧＥＳＭ５３を示す。縦軸は、プレートあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｐｌａｔｅ）に対する蛍光性コロニーおよび非蛍光性コロニーのそれぞれの数比を示し、図中の数字は実際に計数したコロニーの数を示す。（実施例４）
【図８】ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３と、ｐＡＣ−ｉｄｉおよびｐＡＣ−ｇｆｐの等濃度混合液（ｐＡＣ−ｇｆｐ／ｐＡＣ−ｉｄｉ混合液）とを、大腸菌に共形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、ＩＤＩ遺伝子を、ＧＦＰ遺伝子との混合系から選択的に濃縮することができたことを示す図である。左パネルは、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３またはｐＬａｃ−ｇｅｓＤ３２３Ａと、ｐＡＣ−ｇｆｐ／ｐＡＣ−ｉｄｉ混合液とをＪＷ３６８６株に共形質転換して培養し、形成されたコロニーを計数した結果を示す。棒グラフの濃灰色は緑色蛍光コロニー（蛍光（＋））、薄灰色は無蛍光コロニー（蛍光（−））を示す。図中の数字は、実際に観察されたコロニー数を示す。右パネルは、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３とｐＡＣ−ｇｆｐ／ｐＡＣ−ｉｄｉ混合液との共形質転換によって生じた３個の蛍光コロニーおよび３０個の無蛍光コロニーのうち３個（左パネル参照）のプラスミド部分をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅してアガロースゲル電気泳動により分析した結果を示す。図中、Ｍは分子量マーカである。（実施例５）
【図９】ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖのアラビノース誘導系を利用し、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖ発現とそれによる細胞死のアラビノースによるスイッチング、およびＩＤＩによる該細胞死のレスキュー効果を検討した結果を示す図である。左縦軸は、アラビノースを含有する寒天培地でのコロニー形成数（○  ＣＦＵ／ＴＦ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ（＋））、およびアラビノースを含まない寒天培地（●  ＣＦＵ／ＴＦ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ（−））でのコロニー形成数を示す。コロニー形成数は形質転換あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ＴＦ）で示した。右縦軸は、生菌率を示す（棒グラフ）。生菌率は、アラビノースを含有する寒天培地上のコロニー数とアラビノースを含有しない寒天培地上のコロニー数の比として算出した。（実施例６）
【図１０】ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖのアラビノース誘導系を導入した大腸菌（ＪＷ３６８６／ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖ）に、ｐＡＣ−ｉｄｉおよびｐＡＣ−ｇｆｐの等濃度混合液（ｐＡＣ−ｇｆｐ／ｐＡＣ−ｉｄｉ混合液）を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、ＩＤＩ遺伝子を、ＧＦＰ遺伝子との混合系から選択的に濃縮することができたことを説明する図である。左パネル（Ａ）は、ＪＷ３６８６／ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖを、ｐＡＣ−ｇｆｐ／ｐＡＣ−ｉｄｉ混合液によって形質転換し、０．２％  アラビノースを含有する寒天培地（上段）およびアラビノースを含有しない寒天培地（下段）に播種して形成させたコロニーの状態を示す。白く見えるのが蛍光を示すコロニー、つまりｐＡＣ−ｇｆｐの形質転換物である。右パネル（Ｂ）は、形成された非蛍光コロニーの数および蛍光コロニーの数から求めた形質転換あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ＴＦ）を示す。図中の数字は実際に計数したコロニーの数を示す。（実施例７）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、テルペン合成酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、本発明は、テルペンの前駆体を合成する酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法に関する。
【００２２】
本発明に係るスクリーニング方法は、酵素活性が増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を形質転換した細胞で、該酵素による基質消費に起因する生育阻害により細胞死が引き起こされることを見出したことに基づいて達成したものであり、酵素活性および／またはその発現が増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子うち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを特徴とする。
【００２３】
「テルペン」は、イソプレンを構成単位とする炭化水素で、植物や昆虫、菌類等によって作り出される生体物質である。もともと精油の中から大量に見つかった一群の炭素１０個の化合物に与えられた名称であり、そのため炭素１０個を基準として体系化されている。分類によってはテルペン類のうち、カルボニル基やヒドロキシ基等の官能基を持つ誘導体をテルペノイドと呼ぶことがある。また、それらの総称としてイソプレノイドという呼称も使用される。
【００２４】
テルペンは生体内でメバロン酸またはピルビン酸から、数段階の反応を経て、生合成される。なお、テルペンの生合成経路は生物種により異なっている。
【００２５】
テルペン生合成の第一段階はイソプレン単位の生成であり、メバロン酸経路または非メバロン酸経路（ＮＥＰ／ＤＯＸＰ経路ともいう）から、イソプレン単位の起源であるＣ５分子（Ｃ５ＰＰ）、すなわちイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が合成される。さらに、ＩＰＰからその異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が生成される。
【００２６】
ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの異性化反応は、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）により触媒される。
【００２７】
テルペン生合成の第二段階は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に次々にイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が付加していくイソプレン単位の結合過程が挙げられる。これにより炭素数が５つずつ増えてゆき、様々な鎖状アルコール二リン酸エステル、例えば炭素数１０のもの（Ｃ１０ＰＰ）、炭素数１５のもの（Ｃ１５ＰＰ）、炭素数２０のもの（Ｃ２０ＰＰ）が合成される。これら鎖状アルコール二リン酸エステルは、テルペノイド前駆体として、テルペノイド生合成経路の最終段階で使用される。
【００２８】
Ｃ１０ＰＰ、例えばゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰの間で起こる頭−尾結合（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）型の縮合反応により合成される。この反応は、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．５．１．１）により触媒される。Ｃ１０ＰＰは、ゲラニオールやリナロールといったモノテルペンの前駆体となる。
【００２９】
Ｃ１５ＰＰは、ＩＰＰとＣ１０ＰＰの縮合反応により合成される。例えば、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）は、ＩＰＰとＧＰＰの縮合反応により合成される。この反応は、ファルネシル二リン酸合成酵素（ファルネシル二リン酸シンターゼ）により触媒される。これはファルネソールといったセスキテルペンの前駆体となる。また、スクアレン合成酵素の触媒作用により、２分子のＣ１５ＰＰが結合するとスクアレンが生成し、コレステロールやフィトステロールといったトリテルペンの前駆体となる。
【００３０】
Ｃ２０ＰＰは、ＩＰＰとＣ１５ＰＰの縮合反応により合成される。例えば、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）は、ＩＰＰとＦＰＰの縮合反応により合成される。この反応は、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素により触媒される。Ｃ２０ＰＰは、ゲラニルゲラニオール、フィトール、タキソールといったジテルペンの基本骨格となる。ジテルペンの中には生理活性をもつものが数多くあるため、その大量生産方法の開発は極めて重要である。さらに、２分子のＣ２０ＰＰが結合するとフィトエンが生成し、カロテノイドといったテトラテルペンの前駆体となる。
【００３１】
テルペン生合成の第三段階は、鎖状アルコール二リン酸エステルから種々の骨格を持つテルペンへの転換工程である。この生合成経路にも種々の酵素が関与している。
【００３２】
Ｃ１０ＰＰを基質とする酵素としては、ゲラニオール合成酵素、リモネン合成酵素、メントール合成酵素、ピネン合成酵素等を挙げることができる。
【００３３】
Ｃ１５ＰＰを基質とする酵素としては、γ−フムレン合成酵素、ファルネソール合成酵素、アリストロケン合成酵素、β−ファルネセン合成酵素、ノートカトン合成酵素−スクアレン合成酵素等を挙げることができる。スクアレン合成酵素は２分子のＣ１５ＰＰを頭−尾結合で縮合させ、Ｃ３０骨格をもつ炭化水素スクアレンを合成する反応を触媒する。
【００３４】
Ｃ２０ＰＰを基質とする酵素としては、タキサジエン合成酵素、コパリル二リン酸合成酵素、カスベン合成酵素等を挙げることができる。
【００３５】
「テルペンの前駆体」とは、テルペン生合成経路において、ある生産物よりも前の段階にあって、１ないし数段階の反応によって当該生産物に変わり得る化合物をいう。テルペンの前駆体は、言い換えれば、テルペン生合成経路において、ある生産物を合成する酵素の基質または該基質の材料となる化合物を意味する。テルペンの前駆体には、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ等のＣ５ＰＰ、並びにＧＰＰ等のＣ１０ＰＰ、ＦＰＰ等のＣ１５ＰＰ、およびＧＧＰＰ等のＣ２０ＰＰにより例示される鎖状アルコール二リン酸エステルが含まれる。
【００３６】
「テルペン合成酵素」とは、テルペンの生合成を触媒する酵素を意味する。本発明において「テルペン合成酵素」の範囲には、テルペン生合成の各過程に係わる酵素のいずれも含まれる。また、酵素は、酵素活性等のその基本的な性質が阻害されない限りにおいて、そのアミノ酸配列のＮ末端側やＣ末端側に別のタンパク質等、例えばヒスチジンタグ等のタグペプチドが付加されたものであってもよい。酵素は、各種生物内に有している天然の酵素であってもよいし、変異体であってもよい。「テルペン合成酵素変異体」とは、テルペン合成酵素がそのタンパク質の一部のアミノ酸残基の置換、欠失、付加等により変異したタンパク質の概念である。変異体には、かかる変異によりその酵素活性、基質特異性、および安定性等の性質に変化が生じるものがある。これに対し、変異させていない酵素を野生型酵素と称する。
【００３７】
本発明において、テルペン合成酵素をコードする遺伝子を「テルペン合成酵素遺伝子」という。「その変異体」とは、テルペン合成酵素遺伝子のＤＮＡがその一部のヌクレオチドの置換、欠失、付加等により変異した遺伝子の概念である。自然界で生じた変異でもよいし、人工的になされた変異でもよい。また、テルペン合成酵素遺伝子は、その機能、例えばコードするタンパク質の発現や、発現されたタンパク質の機能が阻害されない限りにおいて、そのＤＮＡの５´末端側や３´末端側に、別のタンパク質をコードする遺伝子、例えばヒスチジンタグ等のタグペプチドをコードする遺伝子が付加されたものであってもよい。
【００３８】
変異体は、変異体のライブラリを作成し、そのライブラリから、宿主において酵素活性、発現量または安定性が高い変異体を選択することにより取得できる。このような選択は、従来報告されている色素の蓄積量の増加または減少を指標にしたテルペン合成酵素遺伝子のスクリーニング方法や、本発明に係るスクリーニング方法により実施できる。また、変異体、およびそのライブラリの作成は、公知の遺伝子工学的手法を用いて実施することができる。
【００３９】
細胞に導入するテルペン合成酵素遺伝子またはその変異体によりコードされるテルペン合成酵素およびその変異体は、十分な基質消費能力をもつものである限りにおいて、いずれのものであってもよい。好ましくは、酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体、より好ましくは酵素活性が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体である。「酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強された」とは、細胞あたりの酵素活性および／またはその発現量が、野生型酵素のものよりも高いことを意味する。酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体は、基質消費能力が高く、その結果、基質や該基質の材料となる化合物の枯渇を生じる。そのため、基質や該基質の材料となる化合物が細胞の生存に関与する化合物であることにより、テルペン合成酵素またはその変異体を発現した細胞において生育阻害や細胞死が引き起こされる。テルペン合成酵素変異体の酵素活性および／またはその発現の増強の程度は、基質や該基質の材料となる化合物の消費が亢進することにより細胞死が誘導される程度の増強であればよい。
【００４０】
細胞に導入するテルペン合成酵素遺伝子またはその変異体によりコードされるテルペン合成酵素およびその変異体は、好ましくは、その基質や該基質の材料となる化合物が細胞の生存に関与する化合物であることを特徴とするテルペン合成酵素またはその変異体である。より好ましくは、テルペン合成酵素またはその変異体を発現した細胞の細胞死を引き起こすことを特徴とするテルペン合成酵素またはその変異体である。さらに好ましくは、テルペン合成酵素またはその変異体を発現した細胞において、該酵素またはその変異体がコードする酵素の基質や該基質の材料となる化合物の枯渇により細胞死を引き起こすことを特徴とするテルペン合成酵素またはその変異体である。さらにより好ましくは、酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されており、かつ、テルペン合成酵素またはその変異体を発現した細胞において、該酵素またはその変異体により消費される基質または該基質の材料となる化合物が細胞の生存に関与する化合物であることにより生じる細胞死を引き起こすことを特徴とするテルペン合成酵素変異体である。テルペン合成酵素またはその変異体として、具体的には、鎖状アルコール二リン酸エステル、例えばＧＰＰやＦＰＰを高効率で消費するテルペン合成酵素またはその変異体を挙げることができる。
【００４１】
細胞に導入するテルペン合成酵素遺伝子またはその変異体によりコードされるテルペン合成酵素およびその変異体として、例えば、ゲラニオール合成酵素（ｇｅｒａｎｉｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＧＥＳ）の変異体を好ましく例示できる。具体的には、ＧＥＳの変異体として、スイートバジル由来のＧＥＳの変異体であって、全長ＧＥＳ（５６７アミノ酸）のアミノ酸配列から、Ｎ末端の５２アミノ酸を切除して作製した変異体（ＧＥＳＭ５３と呼称する）を挙げることができる。ＧＥＳＭ５３は、野生型のものと比較して酵素活性が増強されており、ＧＥＳＭ５３を発現した細胞において、該細胞の細胞死を引き起こした。また、別の具体例として、ＧＥＳＭ５３のアミノ酸配列において、ＧＥＳの第５４番目に相当するアミノ酸であるグリシンをバリンに置換した変異体（ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖと呼称する）を挙げることができる。ＧＥＳＭ５３Ｇ５４は、ＧＥＳＭ５３と比較して、その遺伝子の翻訳効率が高いため、より高い活性を期待できる。ＧＥＳＭ５３をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１に、ＧＥＳＭ５３のアミノ酸配列を配列番号２に、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号３に、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００４２】
本発明に係る方法で細胞に導入する遺伝子として、テルペン合成酵素遺伝子またはその変異体の代わりに、テルペン合成酵素の基質や該基質の材料となる化合物を消費する能力を有する酵素をコードする遺伝子またはその変異体を使用することができる。例えば、テルペン合成酵素の基質の材料となる化合物であるＩＰＰを消費する活性を有する酵素、好ましくはＩＰＰを消費する活性が高い酵素をコードする遺伝子を細胞に導入することにより、細胞内でＩＰＰの枯渇が引き起こされ、それにより細胞死が生じる。かかる酵素として、ピロリン酸を加水分解除去するピロフォスファターゼを例示できる。
【００４３】
細胞は、テルペン合成酵素遺伝子またはその変異体を導入することにより、細胞の生存に関与する化合物が消費され、その結果、細胞死が引き起こされるものである限りにおいて、いずれのものであってもよい。好ましくは、テルペン類の前駆体、例えばＩＰＰやＤＭＡＰＰを合成している細胞や、テルペン生合成経路を有する細胞を使用する。細胞は、増殖速度、クローニングの容易性、遺伝子操作の容易性、およびテルペンの生物大量生産系の構築への利用の容易性を考慮すると、大腸菌、シアノバクテリア、コリネ菌、枯草菌、好熱性細菌等の細菌類や酵母類が好ましい。また、人為的にテルペン生合成経路やその制御系の一部を損傷した細胞を使用することもできる。好適な細胞として、大腸菌、例えばＪＷ３６８６株やＢＷ２５１１３株を例示できる。ＪＷ３６８６株は、ＢＷ２５１１３株にΔｔｎａＡ：：ｋａｎＲの遺伝子改変を加えた株であり（Ｂａｂａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｉｎ−ｆｒａｍｅ，ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｏ．０００８（２００６））、インドール合成に必要となるトリプトファン代謝酵素ＴｎａＡが欠損しているため、インドール合成をしない。そのため、ガスクロマトグラムにおいて、インドールピークに悩まされることなくテルペン生産物の分析ができるという利点がある。ＢＷ２５１１３株は、大腸菌Ｋ−１２株に由来する大腸菌株で、様々な遺伝子改変大腸菌を作成するときの親株として汎用されている。
【００４４】
遺伝子またはその変異体の細胞への導入は、公知の遺伝子工学的手法を用いて実施することができる。例えば、テルペン合成酵素遺伝子またはその変異体を適当なベクターＤＮＡに挿入して、該遺伝子またはその変異体を含む組換えベクターを作成し、得られた該組換えベクターを細胞に形質転換することにより、遺伝子またはその変異体の細胞への導入を実施できる。テルペン合成酵素遺伝子またはその変異体を挿入したベクターＤＮＡとして、配列番号２記載のアミノ酸配列で示されるＧＥＳＭ５３のＣ末端に６×ヒスチジンタグを付加したタンパク質をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクター（図２のパネルＡおよびＣ参照）を例示できる。このプラスミドベクターのヌクレオチド配列を配列番号５に示す。また別の例として、配列番号４記載のアミノ酸配列で示されるＧＥＳＭ５３Ｇ５４ＶのＣ末端に６×ヒスチジンタグを付加したタンパク質をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクター（図２のパネルＢおよびＤ参照）を例示できる。このプラスミドベクターのヌクレオチド配列を配列番号６に示す。
【００４５】
ベクターは、好ましくは発現ベクターを使用する。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。具体的には、大腸菌では、ｐＵＣ１８およびｐＡＣＹＣ１８４等を、枯草菌ではｐＹＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４、ｐＨＹ３００ＰＬＫ  ＤＮＡ等を、酵母では、ｐＲＳ３０３、ＹＥｐ２１３、ＴＯｐ２６０９等を挙げることができる。ベクターには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を例示できる。ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【００４６】
ベクターの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。
【００４７】
細菌を宿主として用いる場合、プロモーターとして、大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが例示できる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を例示できる。
【００４８】
酵母を宿主とする場合、プロモーターとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が例示できる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を例示できる。
【００４９】
動物細胞を宿主とする場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等を用いることができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を例示できる。
【００５０】
原核生物を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５１】
発現ベクターは、所望の遺伝子の発現を制御可能な発現誘導システム（遺伝子発現誘導システム）を使用することが好ましい。遺伝子発現誘導システムは、該システムを導入した細胞で、特定の薬剤等の存在下で所望の遺伝子の発現が誘導または抑制されるものである。本発明に係るスクリーニング方法で用いるテルペン合成酵素をコードする遺伝子またはその変異体を形質転換した細胞は、発現した該酵素による基質消費に起因する生育阻害により細胞死が引き起こされるため、かかる細胞を維持培養しようとするときには、該遺伝子の発現が抑制されていることが必要である。遺伝子の発現を制御可能な発現誘導システムを使用することにより、通常の維持培養では遺伝子の発現を抑制して細胞を生存させ、使用時に薬剤を添加することにより遺伝子の発現を誘導して細胞死を誘発することができる。遺伝子発現誘導システムは、テルペン合成酵素をコードする遺伝子またはその変異体の発現を制御可能なものであれば、いずれを使用することもできる。好ましくは、発現誘導前の漏出のレベルが低いもの、より好ましくは、発現誘導前の漏出が殆どないものを使用する。遺伝子発現誘導システムとして、種々のシステムが報告されており、また、市販されているものもあるため、これらの中から適当なものを選択して使用することができる。好ましい遺伝子発現誘導システムとして、ｐＢＡＤタンパク質発現システムを例示できる。ｐＢＡＤタンパク質発現システムは、ｐＢＡＤプロモーターを組み込んだプラスミドベクターであり、Ｌ−アラビノースの用量依存的に、目的タンパク質の発現量をコントロールすることができる。ｐＢＡＤタンパク質発現システムを利用したテルペン合成酵素変異体遺伝子の発現ベクターとして、配列番号６に記載のヌクレオチド配列で表されるプラスミド（図２のパネルＢおよびＤ参照）を例示できる。このプラスミドは、配列番号４記載のアミノ酸配列で示されるＧＥＳＭ５３Ｇ５４ＶのＣ末端に６×ヒスチジンタグを付加したタンパク質をコードする遺伝子をＣｏｌＥＩ型ベクターのｐＢＡＤ下に導入した発現コンストラクトである。
【００５２】
「被検遺伝子」は、本発明に係るスクリーニング方法で試験される遺伝子を意味する。被検遺伝子は、特に限定されず、天然に存在するものであってもよいし、人為的に作成された変異体であってもよい。例えば、メタゲノム、テルペン生合成経路に関与する既知テルペン合成酵素の変異体、テルペン生産が認められる細胞や生物から調製した遺伝子群、公知のゲノムライブラリやｃＤＮＡライブラリ、人工のテルペン生合成経路のオペロンのライブラリ、テルペン生合成経路の上流の経路の向上に資する酵素遺伝子のランダム化によって得られたライブラリを挙げることができる。メタゲノムとは、土壌等の環境試料から、微生物の培養および分離を介さずに、抽出した微生物ゲノム群を意味する。
【００５３】
被検遺伝子の細胞への導入は、遺伝子組み換え技術で用いられている常法によって実施できる。例えば、被検遺伝子を組込んだベクターを用いた形質転換方法を挙げることができる。ベクターおよびベクターの宿主細胞への導入方法は、上記のベクターおよびベクターの宿主細胞への導入方法を使用することができる。
【００５４】
テルペン合成酵素遺伝子またはその変異体と被検遺伝子の細胞への導入は、同時に行っても良いし、また前者を細胞に導入しておいて、後に後者を細胞に導入しても良い。
【００５５】
テルペン合成酵素遺伝子またはその変異体を導入した細胞に被検遺伝子を導入した後、細胞を、該細胞に適した公知の培地や条件下で培養する。例えば、大腸菌等の細菌であれば、コロニーを形成する条件下で培養を行う。
【００５６】
被検遺伝子がテルペン合成酵素遺伝子および／またはその変異体であるという判定は、被検遺伝子を導入した細胞の生存を指標に行う。すなわち、細胞に導入した被検遺伝子のうち、培養後に生存した細胞に導入した被検遺伝子を、テルペン合成酵素遺伝子および／またはその変異体として選択する。前述のように、テルペン合成酵素をコードする遺伝子またはその変異体を形質転換した細胞では、発現した酵素による基質消費に起因する生育阻害により細胞死が引き起こされる。被検遺伝子の中に、テルペン合成酵素の基質または該基質の材料となる化合物、すなわちテルペン前駆体、の合成量を増加し得る酵素をコードする遺伝子またはその変異体が存在する場合、該被検遺伝子を導入した細胞のみが、基質消費に起因する生育阻害を回避することができ、細胞死を免れて生存し、増殖することができる。したがって、被検遺伝子の導入により生存できた細胞では、被検遺伝子の導入によりテルペン前駆体の合成量が増加し、その結果、生存が可能になったと判断できる。すなわち、被検遺伝子を導入した細胞のうち生存できた細胞に導入した被検遺伝子はテルペン前駆体を合成する酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体であると判定できる。生存した細胞から、被検遺伝子を回収し、被検遺伝子の同定を公知の方法により行う。
【００５７】
本発明に係る方法を用いれば、細胞を破壊することなく、テルペン合成酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体を取得することができる。具体的には、大腸菌等の細菌であれば、コロニーをプレート上に形成させ、形成されたコロニーをピックアップすればよい。コロニーピッカーを用いてスクリーニング全般を半自動化することもできる。本発明に係る方法により、テルペン生産における原料供給経路を向上させる遺伝子群を効率的に、そしてハイスループットに選抜することができる。
【００５８】
好適な実施態様は、酵素活性が増強されたゲラニオール合成酵変異体をコードする遺伝子であって、該変異体は酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されており、かつ、該変異体を発現した細胞において、該変異体により消費される基質または該基質の材料となる化合物が細胞の生存に関与する化合物であることにより生じる細胞死を引き起こすことを特徴とする変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法である。
【００５９】
別の好適な実施態様は、配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチド配列で表されるゲラニオール合成酵素遺伝子変異体を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法である。
【００６０】
別の好適な実施態様は、配列番号５または配列番号６に記載のヌクレオチド配列で表されるプラスミドを形質転換した大腸菌に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子および／またはその変異体のスクリーニング方法である。
【００６１】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６２】
［テルペン生産量の向上したゲラニオール合成酵素変異体の作製］
テルペン生産量を向上させる方法の開発にあたって、まず、テルペン生産量の向上したゲラニオール合成酵素変異体の作製を行った。
【００６３】
テルペン合成酵素の触媒活性は一般的に極めて低く、ｋｃａｔ値にして０．０１−０．１／ｓｅｃ程度である。そのなかでは、ゲラニオール合成酵素（ＧＥＳ）等のモノテルペン合成酵素は最速の触媒活性を示す。そこで、スイートバジル由来のゲラニオール合成酵素を検討対象として選択し、大腸菌におけるテルペン生産活性が増強されたその変異体の作製を試みた。ゲラニオール合成酵素として、具体的には、スイートバジル由来のゲラニオール合成酵素を使用し（Ｉｉｊｉｍａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｒａｎｉｏｌ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐｅｌｔａｔｅ  Ｇｌａｎｄｓ  ｏｆ  Ｓｗｅｅｔ  Ｂａｓｉｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３４，３７０−３７９（２００４））、下記方法により、ゲラニオール合成酵素変異体の作製を行った。
【００６４】
（１）ゲラニオール合成酵素変異体の作製
まず、スイートバジル由来のゲラニオール合成酵素（５６７アミノ酸）のアミノ酸配列から、色素体への輸送配列を除去するためにＮ末端の５２アミノ酸を切除した。また、アフィニティ精製をするために、その終止コドンの直前に６×ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）を導入した。このように作製した変異体を、以降、ＧＥＳＭ５３と呼称する。また、対照として、ゲラニオール合成酵素の全長アミノ酸配列において、その酵素活性に必須とされる第３２３番目のアスパラギン酸（Ｄ３２３と称する）をアラニンに置換した不活性化変異体（ＧＥＳＤ３２３Ａと称する）を作製した。
【００６５】
ＧＥＳＭ５３をコードする遺伝子（ｇｅｓＭ５３と称する）をＣｏｌＥＩ型ベクターのｐＬａｃ下に導入し、ＧＥＳＭ５３の発現コンストラクト（ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３と称する）を作製した（図２のパネルＡ）。そのプラスミドマップを図２のパネルＣに示す。また、プラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３のヌクレオチド配列を配列番号５に示す。
【００６６】
また、ｇｅｓＭ５３をＣｏｌＥＩ型ベクターのｐＢＡＤ下に導入し、さらに翻訳効率を高めるため、ＧＥＳＭ５３のアミノ酸配列において、ゲラニオール合成酵素の第５４番目に相当するアミノ酸であるグリシンをバリンに置換する変異を該遺伝子に導入して発現コンストラクト（ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖと称する）を作製した（図２のパネルＢ）。そのプラスミドマップを図２のパネルＤに示す。また、プラスミドｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖのヌクレオチド配列を配列番号６に示す。
【００６７】
ＧＥＳＤ３２３Ａをコードする遺伝子（ｇｅｓＤ３２３Ａと称する）をＣｏｌＥＩ型ベクターのｐＬａｃ下に導入し、ＧＥＳＤ３２３Ａの発現コンストラクト（ｐＬａｃ−ｇｅｓＤ３２３Ａと称する）を作製した。
【００６８】
（２）ゲラニオール合成酵素およびその変異体によるゲラニオール生産
上記ゲラニオール合成酵素およびその変異体によるゲラニオール生産の確認を行った。具体的には、宿主としてＸＬ−１  Ｂｌｕｅを用い、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３を導入した。対照として、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３Ｄ３２３ＡをＸＬ−１  Ｂｌｕｅに導入した。ＸＬ−１  Ｂｌｕｅは、テルペン生産量を高めるためにｐＢＢＲＳＯＥ６（非特許文献５）で形質転換した大腸菌株である。また、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３Ｄ３２３Ａは、ＧＥＳＭ５３において、ゲラニオール合成酵素の酵素活性に必要な第３２３番目に相当するアミノ酸であるアスパラギン酸をアラニンに置換した不活性化変異体（ＧＥＳＭ５３Ｄ３２３Ａ）をコードする遺伝子の発現コンストラクトである。
【００６９】
遺伝子導入後、１ｍＭ  イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および０．０２％  アラビノースを添加して、３０℃、２００ｒｐｍで８時間、振とう培養することにより遺伝子の発現誘導を行った。その培養液を酢酸エチル（リモネン内部標準を含む）で抽出した。抽出物は、ガスクロマトグラフ／水素イオン検出器（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いて、次に示す条件で分析した。カラム：ＤＢ−５ｍｓ、注入口温度：２５０℃、カラム温度：６０℃（３ｍｉｎ）、６０−１５０℃（６℃／ｍｉｎ）、１５０−２３０℃（１５℃／ｍｉｎ）、検出器温度：２５０℃。キャリアガス：Ｎ２。
【００７０】
その結果、図３に示すように、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３を形質転換したＸＬ−１  Ｂｌｕｅではゲラニオールの生産が認められたが、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３Ｄ３２３Ａ形質転換したＸＬ−１  Ｂｌｕｅではゲラニオールの生産は認められなかった。
【００７１】
（３）ゲラニオール合成酵素およびその変異体を導入した細胞の細胞内ゲラニオール合成酵素活性
上記ゲラニオール合成酵素またはその変異体を導入した細胞の細胞内ゲラニオール合成酵素活性を測定した。細胞内のゲラニオール合成酵素活性の測定は、テルペン酵素群と同じ基質を原料とする種々の色素の生合成経路を細胞内に構築し、これらの細胞にテルペン合成酵素遺伝子を導入して色素合成経路から原料を奪うことにより、細胞あたりの色素合成量が減少することを指標にしてテルペン酵素活性を測定する方法（特許文献５）により行った。図４のパネルＡに示すように、スタフィロコッカス  アウレウス由来のジアポフィトエン合成酵素（ＣｒｔＭ）遺伝子およびデヒドロスクアレン不飽和化酵素（ＣｒｔＮ）遺伝子を発現させた大腸菌では、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）からファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を中継してカロテノイドの１種である黄色色素４，４’−ジアポニューロスポレンが合成される。ゲラニオール合成酵素（ＧＥＳ）は、その中間体であるＧＰＰをゲラニオールに転化する酵素であるため、ＣｒｔＭおよびＣｒｔＮを発現させた大腸菌で共発現させると、色素合成系から基質を奪う。その結果、カロテノイド色素量の蓄積量は減少する。すなわち、カロテノイド色素量の蓄積量の減少が認められた場合、細胞内のゲラニオール合成酵素が高いと判定できる。
【００７２】
具体的には、大腸菌にスタフィロコッカス  アウレウス由来のＣｒｔＭ遺伝子およびＣｒｔＮ遺伝子を導入し、得られた大腸菌に上記ゲラニオール合成酵素またはその変異体を導入して培養した後、該大腸菌で合成された色素量を指標に、細胞内のゲラニオール合成酵素活性を測定した。
【００７３】
図４のパネルＢに示すように、ＣｒｔＭ−ＣｒｔＮ遺伝子の発現コンストラクトｐＡＣ−ＣｒｔＭ−ＣｒｔＮを形質転換した大腸菌に空ベクターを導入したもの（Ｖｏｉｄ）は、黄色色素４，４’−ジアポニューロスポレンを蓄積し、細胞色が黄色くなった。これに対し、ｐＡＣ−ＣｒｔＭ−ＣｒｔＮを形質転換した大腸菌を、野生型ＧＥＳ遺伝子の発現コンストラクトｐＬａｃ−ｇｅｓ、またはＧＥＳＭ５３遺伝子の発現コンストラクトｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３でさらに形質転換すると、黄色色素の蓄積量は著しく減少し、細胞は白くなった。また、ＧＥＳＭ５３による基質消費量は野生型に比べ、明らかに高い。これは、Ｎ末端アミノ酸の欠失変異および翻訳効率を向上させる変異の導入により、細胞内におけるその酵素活性が十分向上しているためである。このような細胞の白色化、すなわち色素生産の減少は、ｐＡＣ−ＣｒｔＭ−ＣｒｔＮおよび不活性化ＧＥＳ変異体遺伝子の発現コンストラクトｐＬａｃ−ｇｅｓＤ３２３Ａを形質転換した大腸菌では認められなかった。
【００７４】
上記結果は、ＧＥＳが細胞内で高い基質消費活性を示し、カロテノイド色素生産に必要なその前駆体であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の量が有意に減少したことを反映するものである。
【実施例２】
【００７５】
［ゲラニオール合成酵素変異体によるテルペン生産向上の確認］
実施例１で作製したテルペン生産量の向上したゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子を使用して大腸菌株に導入し、テルペン生産の向上の確認を行った。
【００７６】
具体的には、大腸菌株ＪＷ３６８６（ＢＷ２５１１３ΔｔｎａＡ）株にｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３を形質転換して培養を行った。コントロールとして不活性化ＧＥＳ変異体（ＧＥＳＤ３２３Ａ）発現プラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＤ３２３Ａおよび空ベクターｐＬａｃ−ｖｏｉｄを用い、同様に形質転換して培養を行った。
【００７７】
その結果、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３を形質転換したＪＷ３６８６株ではコロニーが全く形成されず、形質転換効率はゼロとなった。一方、ＪＷ３６８６株にｐＬａｃ−ｇｅｓＤ３２３ＡまたはｐＬａｃ−ｖｏｉｄを形質転換した場合は、コロニーが形成された。この結果は、ＧＥＳ遺伝子の強制発現が細胞にとって致死性であることを意味している。
【実施例３】
【００７８】
［ゲラニオール合成酵素変異体の強制発現による細胞死のメカニズムの検討］
ゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子の強制発現が細胞にとって致死性であるメカニズムについて検討を行った。ＧＥＳ変異体遺伝子の強制発現が細胞にとって致死性であるメカニズムとしては次に示す２つの可能性がある：（１）ＧＥＳあるいはその生産物が宿主毒性を持つ；（２）ゲラニオール合成のために細胞生育に必須なキノンやドリコール、ｔＲＮＡ修飾源が枯渇し、その結果として細胞が死滅する。
【００７９】
（１）ＧＥＳあるいはその生産物が宿主毒性を持つ可能性の検討
ゲラニオール合成酵素による生産物ゲラニオールはモノテルペンであり、モノテルペンは抗菌活性を示すことが知られている。そのため、大腸菌に対して毒性を示した可能性がある。しかしながら、大腸菌のゲラニオールに対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は８００ｍｇ／Ｌ程度という報告がある（Ｄｕｎｌｏｐ  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｆｕｅｌＴｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｘｐｏｒｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｆｆｌｕｘ  Ｐｕｍｐｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｏ．４８７（２０１１））。本実施例で培地に蓄積したゲラニオール量は１０−２０ｍｇ／Ｌ程度であり、報告されたＭＩＣよりも十分低いものである。このことから、ゲラニオール合成酵素による生産物毒性は、本実施例で認められたＧＥＳ遺伝子強制発現による致死性の理由ではないと考えられる。
【００８０】
（２）ゲラニオール合成により、細胞生育に必須な物質が枯渇し、細胞死に至る可能性の検討
ＧＥＳ変異体によるゲラニオール合成によりＧＥＳの基質であるＧＰＰが消費される。このＧＰＰの消費が細胞死の原因である可能性について検討を行った。すなわち、ゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子と共に、ＧＰＰの合成に関わる酵素をコードする遺伝子を細胞に導入し、ＧＥＳ変異体によるＧＰＰの消費を補うことにより、細胞死を防止し得るか否かを検討した。ＧＰＰの合成に関わる酵素として、大腸菌由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ；ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：９４９０２０）を使用した。ＩＤＩは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とその異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の間の異性化反応を触媒する酵素である。生成したＤＭＡＰＰとＩＰＰとの間で頭−尾結合（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）型の縮合反応が起こりＧＰＰが生成する。ＩＤＩをコードする遺伝子を発現するプラスミドｐＡＣ−ｉｄｉは、該遺伝子をｐＡＣプラスミドに挿入することにより作製した。
【００８１】
まず、大腸菌ＪＷ３６８６株に次のプラスミドのいずれかを導入して１時間培養し、ＬＢ寒天培地に散布してコロニー形成させた：全長型のＧＥＳにＤ３２３Ａ変異を導入した不活性化変異体を発現するプラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＤ３２３Ａ、ＧＥＳのＮ末端側の５２アミノ酸残基を削除し、Ｃ末端に６×Ｈｉｓを付加した変異体ＧＥＳＭ５３を発現するプラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３、および全長の野生型ＧＥＳを発現するプラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓ。
【００８２】
図５に示すように、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３のみを形質転換してＧＥＳＭ５３を発現させた大腸菌ＪＷ３６８６株では、コロニーが全く形成されなかった。一方、全長の野生型ＧＥＳを発現させた大腸菌株およびＧＥＳ不活性化変異体を発現させたＪＷ３６８６株では、コロニーの形成が観察された。
【００８３】
次に、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３を、ｐＡＣ−ｉｄｉ、ＣｒｔＭ遺伝子とＣｒｔＮ遺伝子とを含む大腸菌発現用プラスミドｐＡＣ−ｃｒｔＭＮ、およびｐＡＣ−ｖｏｉｄのいずれかと共に、ＪＷ３６８６株に共形質転換した。具体的には、ＪＷ３６８６株にｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３と共に、ｐＡＣ−ｉｄｉ、ｐＡＣ−ｃｒｔＭＮ、およびｐＡＣ−ｖｏｉｄのいずれかを導入して１時間培養し、ＬＢ寒天培地に散布してコロニー形成させた。形成したコロニーの数を数え、下記数式１を用いて生菌率を求めた。下記式において、ＣＦＵＧＥＳ（＋）はｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３を共発現させた大腸菌株のコロニー形成数を意味し、ＣＦＵＧＥＳ（−）はｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３を共発現させなかった大腸菌株のコロニー形成数を意味する。ここで、コロニー形成数はコロニー形成単位（ＣＦＵまたはｃｆｕと略称する。）で表している。
【００８４】
（数１）
【００８５】
ＣＦＵＧＥＳ（＋）
生菌率  ＝───────────
ＣＦＵＧＥＳ（−）
【００８６】
図６に示すように、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３と空ベクターであるｐＡＣ−ｖｏｉｄを共導入した場合、コロニーは全く形成されず、その形質転換効率はほぼゼロであった。ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３とｐＡＣ−ｃｒｔＭＮを共導入した場合も、コロニー形成は認められなかった。Ｃｒｔ−Ｍおよび／またはＣｒｔＮを発現させるとＧＥＳと競合して、ＧＥＳの基質を消費し、カロテノイド色素合成をする。その結果、ゲラニオール生産量は、ＧＥＳのみを発現する場合と比較して低減すると考えることができる。ＧＥＳ生産物であるゲラニオールの毒性が細胞致死性を示すのであれば、Ｃｒｔ−Ｍおよび／またはＣｒｔＮを発現させることにより細胞死を防止できる可能性があるが、全く形質転換効率の回復は認められなかったことから、ＧＥＳ生産物の毒性が細胞致死性に関連するという仮定は否定できる。
【００８７】
一方、大腸菌由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）遺伝子をｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３と共形質転換することにより、コロニーが形成され、形質転換効率が著しく回復した（図６）。この結果から、ＧＥＳＭ５３遺伝子強制発現による細胞死は、ＧＥＳＭ５３生産物のゲラニオールの毒性ではなく、その高い酵素活性により、細胞増殖に必須なイソプレニル二リン酸が消費されて枯渇したことが原因であることが強く示唆された。ＩＤＩを過剰発現させることにより、カロテノイドやテルペン等の生産量が増加することは従来報告されている（非特許文献１２）。ＩＤＩの過剰発現により宿主中のテルペン原料、すなわちイソプレニル二リン酸が増加し、その結果、ＧＥＳ発現下においても細胞の増殖が可能となったと考えることができる。
【００８８】
以上の結果から、ゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子の強制発現が細胞死を引き起こす原因は、ゲラニオール合成酵素変異体によるその基質の消費にあり、基質の供給、すなわち基質の生産に関わる酵素の発現により、該細胞死を防止できることが明らかになった。
【００８９】
上記現象を利用し、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素をコードする遺伝子と、該酵素の基質の生産に関わる酵素をコードする遺伝子とを共発現させることにより、これら遺伝子を形質転換した細胞の生存を維持することができ、また、かかる細胞を使用することにより、テルペン生産量を向上させることができる。
【００９０】
さらに、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素をコードする遺伝子を形質転換した細胞を用い、被検遺伝子を導入して細胞を培養し、生存細胞に導入した遺伝子を選択することにより、該酵素の基質や該基質の材料の生産に関わる酵素をコードする遺伝子の選抜を行うことができる。
【実施例４】
【００９１】
［ゲラニオール合成酵素変異体の強制発現による細胞死を利用した遺伝子選抜方法に用いる宿主の検討］
ゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子の強制発現による細胞死、および該酵素の基質の供給による該細胞死の防止が、ＪＷ３６８６株に特有の現象であるのか、それとも大腸菌株の種類によらずいずれの大腸菌株でも観察されるのかを検討した。
【００９２】
検討した大腸菌株は、ＢＷ２５１１３株、ＪＷ３６８６株、およびＸＬ−１  Ｂｌｕｅである。ＢＷ２５１１３株は、遺伝子改変株の作製に汎用されている大腸菌株である。ＪＷ３６８６株は、ＢＷ２５１１３株にΔｔｎａＡ：：ｋａｎＲの遺伝子改変を加えた株である。ＸＬ−１  Ｂｌｕｅは、クローニングに頻用される株である。
【００９３】
この３株のそれぞれに、２種類のプラスミドＤＮＡ、すなわち緑色蛍光タンパク質発現プラスミドｐＬａｃ−ｓｆｇｆｐと各種ＧＥＳ変異体の発現プラスミドとを１：５の濃度比で含む混合液を形質転換した。ｐＬａｃ−ｓｆｇｆｐはスーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（Ｓｕｐｅｒ  Ｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ）を定常発現するプラスミドである。ＧＥＳ変異体発現プラスミドは次のものを用いた：全長型のＧＥＳにＤ３２３Ａ変異を導入した不活性化変異体を発現するプラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＤ３２３Ａ、全長型のＧＥＳにＧ２８５Ｓ変異を導入した不活性化変異体を発現するプラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＧ２８５Ｓ、ＧＥＳのＮ末端側の５２アミノ酸残基を削除し、Ｃ末端に６×Ｈｉｓを付加した変異体ＧＥＳＭ５３を発現するプラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３。また、ＧＥＳ発現プラスミドとして、全長の野生型ＧＥＳを発現するプラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓを用いた。
【００９４】
発現プラスミドを大腸菌に形質転換した後、それぞれの形質転換体を寒天培地上に播き、コロニーを形成させた。ｐＬａｃ−ｓｆｇｆｐによる形質転換体は緑色蛍光を持つコロニーを与え、各種ＧＥＳ発現プラスミドによる形質転換体は無蛍光のコロニーを与える。
【００９５】
図７に示すように、ＧＥＳ不活性化変異体（ＧＥＳＤ３２３ＡおよびＧＥＳＧ２８５Ｓ）は当然のこと、野生型ＧＥＳを形質転換したものも、宿主に依らず、蛍光コロニー／無蛍光コロニーの数比は、形質転換操作時に用いた混合液のｐＬａｃ−ｓｆｇｆｐとｐＬａｃ−ｇｅｓの濃度比、すなわち１：５とほぼ変わらなかった。このことから、ＧＥＳ不活性化変異体や野生型ＧＥＳは、いずれの大腸菌株に対しても細胞毒性を示さないことは明らかである。
【００９６】
一方、ＧＥＳＭ５３をＪＷ３６８６株およびＢＷ２５１１３株に導入した場合は、生じたコロニーのすべてが蛍光性のものであり、無蛍光性コロニーは認められなかった。この結果は、ＧＥＳＭ５３がこの２つの細胞にとって致死性であることを示す。興味深いことに、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅを宿主とした場合は、この致死性は観察されなかった。すなわち、無蛍光コロニー／蛍光コロニーの数比は、ＧＥＳ不活性型変異体と変わらないものであった。ＧＥＳＭ５３の発現は、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅにおいては致死となるほどの基質枯渇をもたらさないと考えられる。
【実施例５】
【００９７】
［ゲラニオール合成酵素変異体の強制発現による細胞死を利用した遺伝子選抜］
実施例４に示したように、ゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子の強制発現による細胞死は、該酵素の基質の供給、すなわち基質の生産に関わる酵素を発現させることにより防止できる。この原理を利用して、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を形質転換した細胞を用い、被検遺伝子を導入して細胞を培養し、生存細胞に導入した遺伝子を選択することにより、該酵素の基質の生産に関わる酵素をコードする遺伝子の選抜を行うことができる。かかる選抜方法を実際に検討した。
【００９８】
具体的には、テルペン生産経路の増強効果を有する遺伝子と該効果を持たない遺伝子との混合系から、前者を選抜することを試みた。テルペン生産経路の増強効果を有する遺伝子の発現プラスミドはｐＡＣ−ｉｄｉを用い、該効果を持たない遺伝子の発現プラスミドは緑色蛍光タンパク質発現プラスミドｐＡＣ−ｇｆｐを用いた。
【００９９】
まず、ｐＡＣ−ｉｄｉとｐＡＣ−ｇｆｐをそれぞれ等量（５ｎｇ／μＬ）ずつ含むプラスミド溶液を調製した。このプラスミド溶液１μＬとＧＥＳ変異体発現プラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３またはＧＥＳ不活性化変異体発現プラスミドｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３Ｄ３２３Ａ  １μＬとをＪＷ３６８６株に形質転換した。ＳＯＣ培養液（２％  トリプトン、０．５％  酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ  グルコース）を添加して１時間培養した後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む寒天培地に散布してコロニーを形成させた。プレートあたりの蛍光コロニーおよび非蛍光コロニーの数をそれぞれ数えた。
【０１００】
図８の左パネルに示すように、プラスミド溶液とｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３Ｄ３２３Ａとを共形質転換する実験においては、１０１個のコロニーが形成され、蛍光コロニーおよび無蛍光コロニーの数はそれぞれ４１個および６０個であった。蛍光コロニーと無蛍光コロニーの数比は、形質転換前のプラスミド溶液のｐＡＣ−ｉｄｉとｐＡＣ−ｇｆｐの混合比１：１とほぼ変わらなかった。すなわち、ＩＤＩ遺伝子とＧＦＰ遺伝子の間で選択はほとんど起こっていないと言える。
【０１０１】
一方、プラスミド溶液とｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３とを共形質転換する実験においては、３３個のコロニーが形成され、蛍光コロニーおよび無蛍光コロニーの数はそれぞれ３個および３０個であった。すなわち、ＩＤＩが発現した無蛍光コロニーのほうが、ＧＦＰが発現した蛍光コロニーに比べ、濃縮された。
【０１０２】
蛍光コロニーと無蛍光コロニーの比は、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３Ｄ３２３Ａを用いた実験系では０．６８であり、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３では０．１である。すなわち、「ＩＤＩをコードする遺伝子の選抜」のみかけの効率はわずか６．８倍ということになる。
【０１０３】
一方、ｐＡＣ−ｉｄｉとｐＡＣ−ｇｆｐの形質転換効率比は、図６から見てほぼ１０００倍程度であることを考えると、この選抜効率は決して高いものではない。そこで、ｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３とプラスミド混合液の形質転換によって生じた３個の蛍光コロニーからプラスミドをポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、ゲル電気泳動分析を行った。また、３０個の無蛍光コロニーから無作為に３個を選択して同様の分析を行った。
【０１０４】
図８の右パネルに示すように、３個の蛍光コロニーにはｐＡＣ−ｇｆｐと共にｐＡＣ−ｉｄｉも形質転換されていた。この結果は、これら３個の蛍光コロニーは、導入されたＩＤＩ遺伝子がコードする酵素の効果によって、ＧＥＳ変異体発現下での細胞死が防止されて増殖し、かつ共に導入されたＧＦＰ遺伝子がコードするタンパク質によって蛍光を発していたことを示す。すなわち、プラスミド溶液とｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３とを共形質転換した大腸菌の培養により形成された３３個のコロニーの全てがｐＡＣ−ｉｄｉによる形質転換体であることが明らかになった。
【０１０５】
このように、ｐＡＣ−ｉｄｉを含む混合プラスミド溶液とｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３とを形質転換した細胞を培養することにより、ＩＤＩをコードする遺伝子を、テルペン生産経路の増強効果を持たない遺伝子との混合系から選択的に濃縮することができた。
【０１０６】
したがって、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素をコードする遺伝子を形質転換した細胞を用い、被検遺伝子を導入して細胞を培養し、生存細胞に導入した遺伝子を選択することにより、該酵素の基質の生産に関わる酵素をコードする遺伝子の選抜を行うことができる。
【実施例６】
【０１０７】
［ゲラニオール合成酵素変異体の強制発現による細胞死を利用した遺伝子選抜方法の効率向上のための、アラビノース誘導系の構築］
高い酵素活性を有するテルペン合成酵素をコードする遺伝子を形質転換した細胞を用い、被検遺伝子を導入して細胞を培養し、生存細胞に導入した遺伝子を選択することにより、該酵素の基質の生産に関わる酵素をコードする遺伝子の選抜を行うことができる。しかし、２つのプラスミドで大腸菌を共形質転換する場合、形質転換効率は決して高くない。このような選抜方法を効率よく行うためには、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素をコードする遺伝子を予め大腸菌ＪＷ３６８６株等の宿主に形質転換し、得られた形質転換体をコンピテントセル化し、これに対して被検遺伝子、例えば遺伝子ライブラリを形質転換することが好ましい。しかし、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素は細胞内でその基質を枯渇させることにより細胞死を引き起こすため、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素遺伝子の形質転換は、細胞内で該酵素の基質の供給に係わるＩＤＩのようなテルペン生産増強効果を有する酵素をコードする遺伝子がないかぎり実施することが困難である。そこで、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素をコードする遺伝子をＰＢＡＤ下流に挿入したコンストラクトを作製した。かかる形式のコンストラクトでは、アラビノースによって発現誘導される前はテルペン合成酵素遺伝子が発現抑制状態にあるため、該遺伝子を大腸菌に形質転換しても細胞死は引き起こされず、形質転換が可能となるはずである。
【０１０８】
まず、高い酵素活性を有するテルペン合成酵素としてＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖを用い、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖ遺伝子を含むｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖ（図２のパネルＢおよびパネルＤ、並びに配列番号６）をＪＷ３６８６株に導入した。ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４ＶはｐＬａｃ−ｇｅｓＭ５３とは異なり、大腸菌に形質転換しても、アラビノース不在下では毒性は認められなかった（図９）。また、ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４ＶをＪＷ３６８６株に形質転換して得られた形質転換体（以下、ＪＷ３６８６／ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖと称する）からコンピテントセルを問題なく作製できた。
【０１０９】
調製したＪＷ３６８６／ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖに、ｐＡＣ−ｉｄｉ、ｐＡＣ−ｇｆｐ、およびｐＡＣ−ｖｏｉｄの３種の発現プラスミドのいずれかを導入し、０．２％  アラビノースを含有する寒天培地または含有しない寒天培地に植菌してコロニーを形成させた。アラビノースを含有する寒天培地上のコロニー数とアラビノースを含有しない寒天培地上のコロニー数の比を算出し、ゲラニオール合成酵素変異体を発現する細胞の生菌率と定義した。
【０１１０】
図９に示すように、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖのみを発現させた大腸菌の生菌率は１０−４−１０−５程度であった。ＧＥＳＭ５３Ｇ５４ＶとＧＦＰを共発現させた大腸菌の生菌率は１０−３−１０−４程度まで減少した。一方、ＧＥＳＭ５３とＩＤＩを共発現させた大腸菌の生菌率はおよそ１であった。また、不活性型であるＧＥＳＭ５３Ｄ３２３Ａを発現するプラスミドｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｄ３２３Ａを用いて同様の実験を行った。大腸菌の生菌率は、ＧＥＳＭ５３Ｄ３２３Ａのみを発現させた場合も、ＧＦＰまたはＩＤＩと共発現させた場合も、いずれもほぼ１であった。つまり、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖの発現が誘導されなければ、このような生存率の差は生じない。
【０１１１】
これらの結果は、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖの発現によるその基質の枯渇により細胞が増殖阻害を受けること、およびＩＤＩによりＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖの基質の前駆体供給量を増加させることで細胞の増殖を回復させ得ることを示す。すなわち、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖ遺伝子を細胞に導入しても、アラビノースを添加しないことで該遺伝子を発現抑制状態に保つことができ、形質転換体を生存した状態で維持できる。
【０１１２】
このように、アラビノース誘導性プロモータを含む発現ベクタを利用することにより、予め高い酵素活性を有するテルペン合成酵素をコードする遺伝子を宿主に形質転換し、得られた形質転換体をコンピテントセル化することができる。得られたコンピテントセルを使用して、ゲラニオール合成酵素変異体の強制発現による細胞死を利用した遺伝子選抜方法を効率よく実施することができる。
【実施例７】
【０１１３】
［アラビノース誘導系におけるモックセレクションの検討］
実施例６で構築したアラビノース誘導系を用いて、ｐＡＣ−ｇｆｐとｐＡＣ−ｉｄｉとを含むプラスミド混合液から、ｐＡＣ−ｉｄｉだけを選別する実験を試みた。
【０１１４】
具体的には、実施例６で調製したＪＷ３６８６／ｐＢＡＤ−ｇｅｓＭ５３Ｇ５４Ｖに、ｐＡＣ−ｉｄｉおよびｐＡＣ−ｇｆｐの等濃度プラスミド混合液（ｐＡＣ−ｇｆｐ／ｐＡＣ−ｉｄｉ混合液）を形質転換し、０．２％  アラビノースを含有する寒天培地およびアラビノースを含有しない寒天培地に播種した。プラスミド混合液の作製および形質転換は、実施例５に記載の方法と同様の方法で行った。形成された蛍光コロニーおよび無蛍光コロニーをそれぞれ計数し、形質転換あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ＴＦ）を算出した。
【０１１５】
アラビノースを含有しない寒天培地では、蛍光コロニーおよび無蛍光コロニーの両方が観察された（図１０）。一方、アラビノースを含有する培地では、無蛍光コロニー、すなわちｐＡＣ−ｉｄｉの形質転換体の数は無誘導の時と変わらなかったが、蛍光コロニー、すなわちｐＡＣ−ｇｆｐの形質転換体は全く観察されなかった（図１０）。これは、アラビノースを含有する培地ではＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖの発現が誘導されるため、ｐＡＣ−ｉｄｉが導入されていない大腸菌ではＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖの基質が枯渇し細胞死が起きることに原因する。
【０１１６】
このように、ＧＥＳＭ５３Ｇ５４Ｖ遺伝子のアラビノース誘導系を用いて、テルペン合成経路の前駆体供給能を持つ遺伝子を選抜できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明は、テルペン生産量を向上させる方法に用いるテルペン合成酵素遺伝子の効率的探索法を提供することができる。テルペンはバイオ燃料、医薬品、農薬、香料、および有機合成の合成原料として有用な化合物である。そのため、本発明は、効率的なテルペンの製造に有用であり、産業上の利用可能性が極めて高いものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１：第１番目〜第５２番目のアミノ酸残基を欠失したスイートバジルゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子。
配列番号３：第１番目〜第５２番目のアミノ酸残基を欠失し、第５３番目のグリシンがバリンに置換されたスイートバジルゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子。
配列番号５：第１番目〜第５２番目のアミノ酸残基を欠失し、そのＣ末端に６×ヒスチジンタグが付加されたスイートバジルゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子の発現プラスミド。
配列番号６：第１番目〜第５２番目のアミノ酸残基を欠失し、第５３番目のグリシンがバリンに置換され、そのＣ末端に６×ヒスチジンタグが付加されたスイートバジルゲラニオール合成酵素変異体をコードする遺伝子の発現プラスミド。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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