(57)【要約】【課題】生体細胞及び生体組織の正確な位相分布を取得する技術を提供する。【解決手段】位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡で形成される生体試料の光学像を像コントラストを変化させながら取り込み、像コントラストの異なる複数枚の画像を形成する（Ｓ１）。その複数枚の画像に基づいて算出した生体試料の位相分布に対応する成分を位相分布以外に対応する成分で割って規格化された位相成分画像を形成する（Ｓ３）。規格化された位相成分画像を画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解する（Ｓ５）。複数の周波数成分のうちの屈折成分と構造成分の各々に対して対応する光学的応答特性を用いてデコンボリューション処理を行い屈折成分と構造成分の位相分布を算出する（Ｓ７）。屈折成分と構造成分の位相分布を合成して生体試料の位相分布を算出する（Ｓ９）。【選択図】図１
2014209085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡によって形成される生体試料の光学像を像コントラストを変化させながら取り込み、像コントラストの異なる複数枚の画像を形成する像コントラスト画像形成工程と、
前記複数枚の画像に基づいて前記生体試料の位相分布に対応する成分と前記生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出して、前記位相分布に対応する成分を前記生体試料の位相分布以外に対応する成分で割り算することで規格化された位相成分画像を形成する位相成分画像形成工程と、
前記位相成分画像を、画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解する空間周波数分解工程と、
前記周波数成分の各々に対して各々に対応する光学的応答特性を用いてデコンボリューション処理を行い、前記生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分の位相分布と前記生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された構造成分の位相分布を算出する位相分布算出工程と、
前記屈折成分の位相分布と前記構造成分の位相分布を合成して前記生体試料の位相分布を算出する生体試料の位相分布合成工程と、を有する
ことを特徴とする生体試料の内部の位相分布計測方法。
【請求項２】
請求項１に記載の位相分布計測方法において、
前記空間周波数分解工程は、前記位相成分画像にカーネルサイズが異なるフィルターで画像の平均化処理を行い、画像の空間周波数により前記位相成分画像を、空間周波数が最も低い背景成分と、前記屈折成分と、空間周波数が最も高い前記構造成分と、に分解する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項３】
請求項１に記載の位相分布計測方法において、
前記顕微鏡は、観察物体の位相分布を像強度分布として撮像する微分干渉顕微鏡であり、さらに、
前記顕微鏡のシァー方向を切り替える工程と、
切り替え前後の２方向のシァー方向で算出された前記生体試料の２つの位相分布を合成する工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項４】
請求項３に記載の位相分布計測方法において、さらに、
前記２方向のシァー方向で算出された前記構造成分の２つの位相分布の相関からシァー方向を切り替える際に発生する画像の位置ずれ量を算出する工程と、
算出された前記位置ずれ量を用いて切り替え前後の前記２方向のシァー方向で算出した前記生体試料の２つの位相分布の位置ずれを補正する工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項５】
請求項１に記載の位相分布計測方法において、さらに、
観察面に対するデフォーカス状態での光学的応答特性を用いて前記構造成分にデコンボリューション処理を行って前記構造成分の第２の位相分布を算出する第２位相分布算出工程と、
前記構造成分の第２の位相分布と前記観察面に対する合焦状態での光学的応答特性を用いて算出された前記構造成分の位相分布とを比較する位相分布比較工程と、
位相分布の比較結果に基づいて、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布を取り除くボケ位相分布除去工程と、を有し、
前記生体試料の位相分布合成工程は、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布が取り除かれた位相分布と、前記屈折成分の位相分布とを合成する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項６】
請求項５に記載の位相分布計測方法において、
前記第２位相分布算出工程は、前記デフォーカスにより発生する位相伝達関数を考慮して算出される光学的応答特性を用いて、前記構造成分にデコンボリューション処理を行う
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項７】
請求項５に記載の位相分布計測方法において、
前記ボケ位相分布除去工程は、前記構造成分の位相分布と前記デフォーカス状態での光学的応答特性を用いて算出された位相分布との差画像を形成して、前記観察面から特定の焦点深度内にある前記構造成分の位相分布を分離する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項８】
請求項５に記載の位相分布計測方法において、
前記ボケ位相分布除去工程は、
前記構造成分の第２の位相分布から前記顕微鏡の焦点深度から外れた部分を抽出して、抽出した位相分布を前記デフォーカス状態での光学的応答特性でコンボリューションを行いボケが生じた位相分布を算出する工程と、
前記構造成分の位相分布から、算出されたボケが生じた位相分布を引き算する工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項９】
請求項１または請求項５に記載の位相分布計測方法において、さらに、
観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる焦点面変更工程と、
各焦点面で算出された前記構造成分の位相分布を比較して、前記観察面の上下に存在する前記生体試料の構造から前記観察面に漏れこむ位相分布を識別する漏れ位相分布識別工程と、
識別された位相分布を前記構造成分の位相分布から取り除く漏れ位相分布除去工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の位相分布計測方法において、
位相分布を比較する工程は、
各焦点面で前記焦点面での前記構造成分の位相量が前記焦点面の上下に隣接する焦点面での前記構造成分の位相量よりも大きくなる光軸と直交するＸＹ平面内の領域を抽出する工程と、
抽出した領域の前記構造成分の位相分布に、前記焦点面の上下に隣接する焦点面とのデフォーカスにより発生する位相伝達関数を考慮して算出される光学的応答特性を用いてコンボリューション処理を行う工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の位相分布計測方法において、さらに、
観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる工程と、
各焦点面で算出された前記構造成分の位相分布を比較して前記観察面の前後から連続的に存在する前記生体試料の構造の位相分布を識別する工程と、
識別された前記構造の位相分布を連続的に接続する工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。
【請求項１２】
生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、
像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、
請求項１に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【請求項１３】
生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、
像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、
請求項５に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【請求項１４】
生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、
観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる焦点位置制御ユニットと、
像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、
請求項９に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から、前記観察面の上下に存在する前記生体試料の構造から漏れこむ位相分布を取り除いた前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【請求項１５】
請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、前記生体試料である培養されているＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の内部構造を位相分布として計測する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【請求項１６】
請求項１５に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、前記ＥＳ細胞または前記ｉＰＳ細胞のコロニー内部で正常な細胞と変異している細胞を判別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【請求項１７】
請求項１５に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、前記ＥＳ細胞または前記ｉＰＳ細胞の未分化状態を識別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【請求項１８】
請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が分化することによって形成された組織内の変位細胞を識別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【請求項１９】
請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、幹細胞が分化することによって形成された組織内の構造及び変異細胞を識別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【請求項２０】
請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、生体組織内の変異細胞を標識化することなく識別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体細胞及び生体組織などの位相物体の位相分布を取得する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
無色透明な生体細胞及び生体組織を観察する方法としては、生体細胞をそのままの状態で位相差顕微鏡または微分干渉顕微鏡などを用いて観察する方法、生体組織から薄い切片サンプルを形成しそれらを染色して明視野顕微鏡で観察する方法、薄い切片サンプルを染色せずに位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡などを用いて観察する方法などが知られている。なお、微分干渉顕微鏡を用いて生体組織等を観察する方法は、例えば、特許文献１に開示されている。
【０００３】
この他に、生体細胞及び生体組織を蛍光色素で染色する、または、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）などの蛍光たんぱく質を遺伝子導入して生体細胞及び生体組織に蛍光たんぱく質を発現させた上で、蛍光共焦点顕微鏡を用いて観察する方法も知られている。蛍光共焦点顕微鏡は優れた３次元分解能を有することから、生体組織を観察する場合であっても切片サンプルを形成することなく３次元構造を観察することが可能である。このため、現時点において、生体細胞及び生体組織の微細な３次元構造を観察する場合に用いられる観察法としては、蛍光共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察法が最も一般的である。
【０００４】
ところで、分化誘導して臓器の組織や神経などを再生することが可能なｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）やＥＳ細胞（embryonic stem cells）といった万能幹細胞の出現により、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞が再生した臓器の組織や神経を生体に移植することで種々の疾患を治療する再生医療が可能になると期待されている。そして、その臨床応用に向けた研究も進められている。
【０００５】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞自体の変異、または、その細胞を分化誘導して再生した組織などに生じる腫瘍化などの変異は、特に再生医療の臨床応用において、望ましいものではなく、避けるべきものである。このため、臨床応用に向けた研究では、細胞レベルから再生される組織や臓器に至るそれぞれの過程での変異や変質を検査するといった取り組みが進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０９−０１５５０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞は、細胞分裂が進むにつれてコロニーと呼ばれる立体的な集合体を形成する特性を有しているため、培養細胞であっても生体組織と同様に３次元的な複雑な構造を形成する。このため、これらの細胞の各過程での変異や変質を検査するためには、３次元的な複雑な構造を観察する技術が必要である。
【０００８】
しかしながら、現在、生体細胞及び生体組織の３次元構造を観察するのに最も一般的に用いられている蛍光共焦点顕微鏡を用いる方法では、観察のために蛍光色素の付加や蛍光タンパクの発現が必要である。蛍光色素や蛍光タンパクが組み込まれて再生された組織や臓器の人体への移植は、組織の変異や変質と同様に、人体への影響が懸念される。このため、この方法を検査に用いることは困難である。
【０００９】
また、観察物体に強いレーザ光を照射したときに発生するＳＨＧ（second harmonic generation）などの非線形光学現象を利用して共焦点観察を行う観察法も考案されているが、これらの方法では、強いレーザ光の照射による細胞や組織へのダメージが変異や変質を発生させる可能性が低くない。このため、この方法も、各過程での変異や変質の検査には不向きである。
【００１０】
このような実情から、再生医療の臨床応用の分野では、蛍光色素等を付加することなく３次元的な構造を持つ生体細胞及び生体組織を検査することが可能な技術として、位相分布を取得して３次元構造を観察する技術のさらなる向上が望まれている。
【００１１】
以上のような実情を踏まえ、本発明は、生体細胞及び生体組織の正確な位相分布を取得する位相分布計測方法、及び、位相分布計測装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明の第１の態様は、位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡によって形成される生体試料の光学像を像コントラストを変化させながら取り込み、像コントラストの異なる複数枚の画像を形成する像コントラスト画像形成工程と、前記複数枚の画像に基づいて前記生体試料の位相分布に対応する成分と前記生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出して、前記位相分布に対応する成分を前記生体試料の位相分布以外に対応する成分で割り算することで規格化された位相成分画像を形成する位相成分画像形成工程と、前記位相成分画像を、画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解する空間周波数分解工程と、前記周波数成分の各々に対して各々に対応する光学的応答特性を用いてデコンボリューション処理を行い、前記生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分の位相分布と前記生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された構造成分の位相分布を算出する位相分布算出工程と、前記屈折成分の位相分布と前記構造成分の位相分布を合成して前記生体試料の位相分布を算出する生体試料の位相分布合成工程と、を有する生体試料の内部の位相分布計測方法を提供する。
【００１３】
本願発明の第２の態様は、第１の態様に記載の位相分布計測方法において、前記空間周波数分解工程は、前記位相成分画像にカーネルサイズが異なるフィルターで画像の平均化処理を行い、画像の空間周波数により前記位相成分画像を、空間周波数が最も低い背景成分と、前記屈折成分と、空間周波数が最も高い前記構造成分に分解する位相分布計測方法を提供する。
【００１４】
本願発明の第３の態様は、第１の態様に記載の位相分布計測方法において、前記顕微鏡は、観察物体の位相分布を像強度分布として撮像する微分干渉顕微鏡であり、さらに、前記顕微鏡のシァー方向を切り替える工程と、切り替え前後の２方向のシァー方向で算出された前記生体試料の２つの位相分布を合成する工程と、を有する位相分布計測方法を提供する。
【００１５】
本願発明の第４の態様は、第３の態様に記載の位相分布計測方法において、さらに、前記２方向のシァー方向で算出された前記構造成分の２つの位相分布の相関からシァー方向を切り替える際に発生する画像の位置ずれ量を算出する工程と、算出された前記位置ずれ量を用いて切り替え前後の前記２方向のシァー方向で算出した前記生体試料の２つの位相分布の位置ずれを補正する工程と、を有する位相分布計測方法を提供する。
【００１６】
本願発明の第５の態様は、第１の態様に記載の位相分布計測方法において、さらに、観察面に対するデフォーカス状態での光学的応答特性を用いて前記構造成分にデコンボリューション処理を行って前記構造成分の第２の位相分布を算出する第２位相分布算出工程と、前記構造成分の第２の位相分布と前記観察面に対する合焦状態での光学的応答特性を用いて算出された前記構造成分の位相分布とを比較する位相分布比較工程と、位相分布の比較結果に基づいて、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布を取り除くボケ位相分布除去工程と、を有し、  前記生体試料の位相分布合成工程は、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布が取り除かれた位相分布と、前記屈折成分の位相分布とを合成する位相分布計測方法を提供する。
【００１７】
本願発明の第６の態様は、第５の態様に記載の位相分布計測方法において、前記第２位相分布算出工程は、前記デフォーカスにより発生する位相伝達関数を考慮して算出される光学的応答特性を用いて、前記構造成分にデコンボリューション処理を行う位相分布計測方法を提供する。
【００１８】
本願発明の第７の態様は、第５の態様に記載の位相分布計測方法において、ボケ位相分布除去工程は、前記構造成分の位相分布と前記デフォーカス状態での光学的応答特性を用いて算出された位相分布との差画像を形成して、前記観察面から特定の焦点深度内にある前記構造成分の位相分布を分離する位相分布計測方法を提供する。
【００１９】
本願発明の第８の態様は、第５の態様に記載の位相分布計測方法において、ボケ位相分布除去工程は、前記構造成分の第２の位相分布から前記顕微鏡の焦点深度から外れた部分を抽出して、抽出した位相分布を前記デフォーカス状態での光学的応答特性でコンボリューションを行いボケが生じた位相分布を算出する工程と、前記構造成分の位相分布から、算出されたボケが生じた位相分布を引き算する工程と、を有する位相分布計測方法を提供する。
【００２０】
本願発明の第９の態様は、第１の態様または第５の態様に記載の位相分布計測方法において、さらに、観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる焦点面変更工程と、各焦点面で算出された前記構造成分の位相分布を比較して、前記観察面の上下に存在する前記生体試料の構造から前記観察面に漏れこむ位相分布を識別する漏れ位相分布識別工程と、識別された位相分布を前記構造成分の位相分布から取り除く漏れ位相分布除去工程と、を有する位相分布計測方法を提供する。
【００２１】
本願発明の第１０の態様は、第９の態様に記載の位相分布計測方法において、位相分布を比較する工程は、各焦点面で前記焦点面での前記構造成分の位相量が前記焦点面の上下に隣接する焦点面での前記構造成分の位相量よりも大きくなる光軸と直交するＸＹ平面内の領域を抽出する工程と、抽出した領域の前記構造成分の位相分布に、前記焦点面の上下に隣接する焦点面とのデフォーカスにより発生する位相伝達関数を考慮して算出される光学的応答特性を用いてコンボリューション処理を行う工程と、を有する位相分布計測方法を提供する。
【００２２】
本願発明の第１１の態様は、第１の態様に記載の位相分布計測方法において、さらに、観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる工程と、各焦点面で算出された前記構造成分の位相分布を比較して前記観察面の前後から連続的に存在する前記生体試料の構造の位相分布を識別する工程と、識別された前記構造の位相分布を連続的に接続する工程と、を有する位相分布計測方法を提供する。
【００２３】
本願発明の第１２の態様は、生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、第１の態様に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する位相分布計測装置を提供する。
【００２４】
本願発明の第１３の態様は、生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、第５の態様に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する位相分布計測装置を提供する。
【００２５】
本願発明の第１４の態様は、生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる焦点位置制御ユニットと、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、第９の態様に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から、前記観察面の上下に存在する前記生体試料の構造から漏れこむ位相分布を取り除いた前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する位相分布計測装置を提供する。
【００２６】
本願発明の第１５の態様は、第１２の態様乃至第１４の態様のいずれか１つに記載の位相分布計測装置において、前記位相分布計測装置は、前記生体試料である培養されているＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の内部構造を位相分布として計測する位相分布計測装置を提供する。
【００２７】
本願発明の第１６の態様は、第１５の態様に記載の位相分布計測装置において、前記位相分布計測装置は、前記ＥＳ細胞または前記ｉＰＳ細胞のコロニー内部で正常な細胞と変異している細胞を判別する位相分布計測装置を提供する。
【００２８】
本願発明の第１７の態様は、第１５の態様に記載の位相分布計測装置において、前記位相分布計測装置は、前記ＥＳ細胞または前記ｉＰＳ細胞の未分化状態を識別する位相分布計測装置を提供する。
【００２９】
本願発明の第１８の態様は、第１２の態様乃至第１４の態様のいずれか１つに記載の位相分布計測装置において、前記位相分布計測装置は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が分化することによって形成された組織内の変位細胞を識別する位相分布計測装置を提供する。
【００３０】
本願発明の第１９の態様は、第１２の態様乃至第１４の態様のいずれか１つに記載の位相分布計測装置において、前記位相分布計測装置は、幹細胞が分化することによって形成された組織内の構造及び変異細胞を識別する位相分布計測装置を提供する。
【００３１】
本願発明の第２０の態様は、第１２の態様乃至第１４の態様のいずれか１つに記載の位相分布計測装置において、前記位相分布計測装置は、生体組織内の変異細胞を標識化することなく識別する位相分布計測装置を提供する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、生体細胞及び生体組織の正確な位相分布を取得する位相分布計測方法、及び、位相分布計測装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の一実施形態に係る位相分布計測方法のフローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態に係る位相分布計測方法の別のフローチャートである。
【図３】観察面に対する合焦状態での構造成分に対応する光学的応答特性を示す図である。
【図４】生体試料の３次元的な構造を説明するための図である。
【図５】合焦状態での光学的応答特性により得られる位相分布を模式的に示した図である。
【図６】デフォーカスによるボケが生じた位相分布を再生する方法の一例を説明するための図である。
【図７】観察面に対するデフォーカス状態での構造成分に対応する光学的応答特性を示した図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る位相分布計測方法のさらに別のフローチャートである。
【図９】デフォーカスによるボケが生じた位相分布を再生する方法の別の例を説明するための図である。
【図１０】本発明の実施例１に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【図１１】観察面に対する合焦状態での屈折成分に対応する光学的応答特性を示す図である。
【図１２Ａ】図１０に示す顕微鏡システムによって得られるｉＰＳ細胞の位相分布を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａから観察位置を光軸方向に３μｍ上方に変化させたときに、図１０に示す顕微鏡システムによって得られるｉＰＳ細胞の位相分布を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｂから観察位置を光軸方向に３μｍ上方に変化させたときに、図１０に示す顕微鏡システムによって得られるｉＰＳ細胞の位相分布を示す図である。
【図１３】本発明の実施例２に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【図１４】図１３に示す顕微鏡システムに含まれる偏光板の回転について説明するための図である。
【図１５】本発明の実施例３に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【図１６】図１５に示す顕微鏡システムによって得られる小腸のクリプトの位相分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
まず、本願発明が対象とする試料である生体細胞及び生体組織（以降、これらをまとめて生体試料と記す）について説明する。
【００３５】
３次元的な構造を有する生体試料は、無色透明ではあるが、その内部組成の違いなどにより透過する光の位相を変化させるという性質を有している。このことから、生体試料は３次元に連続的に変化する位相分布を有する位相物体であると看做すことができる。このため、生体試料の３次元的な位相分布を得ることができれば、その３次元構造を知ることができる。
【００３６】
本願発明は、生体試料（位相物体）のうちの光軸方向に特定の厚みのある観察領域の位相分布を検出する技術に関するものであり、生体試料の３次元的な位相分布は、光軸方向の位置が異なる複数の観察領域の位相分布を接続することにより得られる。これは、観察物体内の蛍光色素の３次元位置座標を検出して、検出した位置座標から３次元像を形成する蛍光共焦点顕微鏡とは全く異なる技術である。
【００３７】
次に、生体試料に限らない位相物体全般の位相分布の計測に関する本願発明者によるこれまでの研究成果と、本願発明者が新たに見出した生体試料の位相分布の計測に関する課題について概説する。
【００３８】
特開２００８−１０２２９４号公報には、位相物体は、明視野観察が行われると合焦位置では像は発生しないが焦点から外れた位置で像コントラストが発生するという特性を有することが開示されている。また、特開平９−１５５０４号公報（特許文献１）には、微分干渉顕微鏡で位相物体を観察したときの像強度分布には位相分布の微分を表す像強度分布以外に複数の像成分が含まれることが開示されている。
【００３９】
本願発明者は、特開平９−１５５０４号公報で示した複数の像成分には、特開２００８−１０２２９４号公報で示したデフォーカスによって発生した像成分が含まれること、及び、位相物体が３次元的に構造を有する場合にはデフォーカスによって発生した像成分（観察領域外の位相分布による像成分）が観察に与える影響も無視できないこと、を新たに見出した。
【００４０】
また、特開平９−１５５０４号公報には、微分干渉顕微鏡で生じる２つの偏光のリターデーション量を変化させることにより像コントラストを変化させた画像を複数枚取り込み、それらに対して差演算と和演算を行い、それによって得られた差演算画像を和演算画像で規格化することで、位相物体の位相分布に微分干渉顕微鏡の光学的応答特性（ＯＴＦ：Optical Transfer Function光学的伝達関数ともいう）をコンボリューションした像成分のみを抽出できることが開示されている。この技術は、観察位置を移動させることなく偏光のリターデーション量を変化させても特開２００８−１０２２９４号公報で示すデフォーカス量に対応した像成分が変化しないことを利用するものである。より詳細には、偏光のリターデーション量を対称（±θ）に変化させて取得した画像を差演算することでデフォーカス量に対応した像成分を取り除き、観察物体の位相分布と微分干渉顕微鏡の光学的応答特性とがコンボリューションされた像強度分布のみを求めるというものである。なお、特開平９−１５５０４号公報には、このようにして算出した像強度分布を微分干渉顕微鏡の光学的応答特性を用いてデコンボリューションすることで観察物体の位相分布が得られることについても、開示されている。
【００４１】
微分干渉顕微鏡の光学的応答特性の値は、空間周波数が０に近い低周波帯域とカットオフ周波数近傍の周波数帯域とで０に近づく。このため、デコンボリューション処理の際に０割が発生し得るが、この問題はウィナーフィルターを工夫することで改善できる。特開２００６−３００７１４号公報は、このような対応では緩やかな勾配を持つ物体の位相分布を求めるときには精度が低下するという課題を示し、部分的に積分処理することでこの課題を改善できることを開示している。
【００４２】
本願発明者は、特に生体試料の観察では、核などに位相分布が緩やかな勾配を持つ部分が多いためデコンボリューション処理を行う際に偽像が発生することがあること、顆粒状の組織などが多いため積分処理を行う際にノイズが連鎖することがあること、を新たに見出した。また、生体試料（生体組織や細胞コロニー）は光軸方向に構造が広がっているため、ノマルスキープリズムのローカライズ位置の微小なずれで視野ムラが発生し、観察領域内にうねりが発生することについても、新たに見出した。
以下では、このような新たな課題を改善して、生体試料の観察領域内の位相分布を精度良く求める方法について、図１を参照しながら説明する。
【００４３】
まず、微分干渉顕微鏡など位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡によって形成される生体試料の光学像を撮像素子における像コントラストを変化させながら取り込み、像コントラストの異なる複数枚の画像を形成する（図１のステップＳ１（像コントラスト画像形成工程））。
【００４４】
そして、形成した複数枚の画像に基づいて生体試料の位相分布に対応する成分と生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出する。この位相分布以外に対応する成分には、例えば、生体試料の吸収による成分や照明分布による成分などが含まれる。その後、算出した位相分布に対応する成分を位相分布以外に対応する成分で割り算することで、規格化された位相分布に対応する成分の画像（以下、規格化された位相成分画像）を形成する（図１のステップＳ３（位相成分画像形成工程））。なお、この手順は、例えば、特許文献１に開示されている。
【００４５】
次に、得られた規格化された位相成分画像を、空間周波数が最も低い背景成分と、生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分と、生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された空間周波数が最も高い構造成分と、に分解する。つまり規格化された位相成分画像を、画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解する（図１のステップＳ５（空間周波数分解工程））。
【００４６】
なお、上述した視野ムラは、空間周波数で考えると観察範囲内で高々４周期程度の周波数成分からなるため、その影響は背景成分に表れると考えられる。また、例えば核など、位相分布が緩やかな勾配を持つ生体試料の部分は、顕微鏡のカットオフ周波数の高々１０分の１程度の周波数帯域を有するため、屈折成分として検出される。また、例えば顆粒状の組織などの生体試料の微細構造は、これらよりも高い周波数帯域を有するため、構造成分として検出される。
【００４７】
さらに、像強度分布である屈折成分及び構造成分の各々と各々に対応する光学的応答特性とをデコンボリューション処理し、屈折成分の位相分布と構造成分の位相分布とを別々に算出する（図１のステップＳ７（位相分布算出工程））。そして、それらを合成することによって、生体試料の位相分布を算出する（図１のステップＳ９（生体試料の位相分布合成工程））。
【００４８】
以上のように、規格化された位相成分画像を３つの成分に分解し、さらに、デコンボリューション処理には、背景成分を除く屈折成分と構造成分の２つの成分を用いる。このため、背景成分に表れる視野ムラの影響を抑えることができる。また、屈折成分と構造成分は、それぞれに応じた別々の光学的応答特性でデコンボリューション処理される。このため、偽像の発生やノイズの連鎖を抑制することができる。従って、この方法によれば、より正確な生体試料の位相分布を取得することができる。
【００４９】
なお、規格化された位相成分画像をフーリエ変換して周波数だけに注目して３つの周波数成分に分解すると、分解することによってノイズが発生することがある。このため、上記の方法では、規格化された位相成分画像を３成分に分解する際に、画像を平均化処理するローパスフィルタリングを用いることが望ましい。例えば、規格化された位相成分画像に、比較的大きな平均化領域を持つ平均化フィルターでコンボリューション処理を複数回行うことにより、背景成分の画像を形成する。さらに、規格化された位相成分画像から背景成分の画像を引き算して得られる画像に、平均化領域を背景成分より小さくした平均化フィルターでコンボリューション処理を複数回行うことにより、屈折成分の画像を形成する。最後に、規格化された位相成分画像から背景成分の画像と屈折成分の画像を引き算して、構造成分の画像を形成する。このように、規格化された位相成分画像にカーネルサイズが異なるフィルターで画像の平均化処理を行って、規格化された位相成分画像を背景成分、屈折成分、構造成分に分解することが望ましい。
【００５０】
また、微分干渉顕微鏡を用いる場合であれば、シァー（shear）方向に対して垂直な方向の位相分布に対応する像コントラストは得られないため、画像の像強度分布からシァー方向の位相分布を算出することは困難である。このため、シァー方向を切り替えることで、図１に示す方法により直交する２つのシァー方向で位相分布を算出し、得られた位相分布を合成することが望ましい。なお、シァー方向を切り替えて得られた２つの位相分布を合成する技術は、特開平９−１５５０４号公報にも開示されている。
【００５１】
図１に示す方法により例えば、ステップＳ１で２つのシァー方向の微分干渉画像を得るためには、ノマルスキープリズムを切り替えることにより、または、単一のノマルスキープリズムを回転させることにより、シァー方向を切り替える必要がある。ノマルスキープリズムの平行度や取り付け角度などを調整した場合であっても、切り替え前後では数ピクセル程度の画像の移動が発生してしまうため、算出される位相分布に位置ずれが生じることを避けることは困難である。そして、この位置ずれを補正することなくこれらの位相分布を合成すると、合成した位相分布にブレが生じてしまう。このため、直交する２つのシァー方向で算出された位相分布を合成する場合には、シァー方向の切り替え時に発生する画像移動を検出して、これらの画像の合成前に、位置を補正することが望ましい。
【００５２】
なお、構造成分をデコンボリューション処理して算出した位相分布は、シァー方向にほぼ垂直な方向に広がっている構造以外の分布は物体構造に対応した分布となる。このため、シァー方向を切り替えて算出した構造成分の２つの位相分布の類似性は、他の成分（背景成分、屈折成分）の場合と比較して非常に高くなる。この特性を利用して、例えば、２方向のシァー方向で算出された構造成分の２つの位相分布の相関からシァー方向を切り替える際に発生する画像の位置ずれ量を算出し、算出された位置ずれ量を用いて切り替え前後の２方向のシァー方向で算出した生体試料の２つの位相分布の位置ずれを補正することが望ましい。これにより、合成後の位相分布のブレを抑制することができる。なお、相関は、例えば位相限定相関法によって得ることができる。また、このシァー方向の違いにより発生する位置ずれを補正し、合成することは図１では、ステップＳ７とステップＳ９の間に行なわれることが望ましい。
【００５３】
位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡は無染色で生体細胞や組織を観察することが可能な顕微鏡であるが、観察物体が３次元的に複雑な構造を持つと、観察位置の上下にある生体細胞や組織のボケ像が観察像に混入する。これにより、実際の観察位置の構造とは異なる像強度分布が発生するため、生体細胞や組織の構造の確認が難しくなり、変異や変質の確認が困難となる場合がある。以下では、このような課題を改善して、生体試料の観察領域内の位相分布をさらに精度良く求める方法について、図２から図７を参照しながら説明する。
【００５４】
一般に光学的応答特性ＯＴＦは、ＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）で表される。ここで、ＭＴＦは変調伝達関数（ＭＴＦ：Modulation Transfer Function）であり、ＰＴＦは位相伝達関数（ＰＴＦ：Phase Transfer Function）である。観察物体が光学系の合焦位置にあり、且つ、光学系が無収差であるときには、ＰＴＦ＝０となるため、ＯＴＦは、ＭＴＦとなり、ＭＴＦのみに依存する。ただし、観察物体が光学系の合焦位置から外れるときや収差が発生したときにはＰＴＦ≠０となるため、ＯＴＦとして、ＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）を用いる必要がある。上述した特開平９−１５５０４号公報では、説明を簡略化するために、観察物体が合焦位置にあり且つ光学系が無収差であると仮定して、デコンボリューション処理を行うときにＭＴＦのみに依存するＯＴＦを用いている。
【００５５】
なお、図３は、観察物体が光学系の合焦位置にあり、且つ、光学系が無収差であるときの顕微鏡のＯＴＦを示した図である。図３に示すＬ１とＬ２は、それぞれ、同じ対物レンズとコンデンサレンズを備えた明視野顕微鏡と微分干渉顕微鏡のＯＴＦを示している。なお、明視野顕微鏡のＭＴＦは、対物レンズの開口数（以降、ＮＡと記す）とコンデンサレンズのＮＡにより定まるのに対して、微分干渉顕微鏡のＭＴＦは、明視野顕微鏡のＭＴＦとｓｉｎ（πΔｆ）の積で定まる。なお、ここで、Δはシァー量であり、ｆは空間周波数である。このような明視野顕微鏡のＭＴＦと微分干渉顕微鏡のＭＴＦとの関係は、例えば、特開２００８−１０２２９４に記載されている。
【００５６】
３次元的な構造を有する生体試料には、観察光学系の合焦位置（図４のＺ）に位置する部分（構造Ｃ２）と合焦位置から外れた位置（図４の＋ΔＺ、−ΔＺ）に位置する部分（構造Ｃ１、Ｃ３）が存在する。なお、図４は、紙面左右方向がある光軸方向の位置での光軸に垂直な面内の観察物体の位置を、上下方向の楕円の厚みが位相量を、示すよう模式化した図である。特開平９−１５５０４号公報のように、ＭＴＦのみに依存するＯＴＦを用いてデコンボリューション処理を行うと、図５に示すように、合焦位置に位置する部分（構造Ｃ２）に対応した位相分布が再生されるとともに、合焦位置から外れた位置にある部分（構造Ｃ１、Ｃ３）の位相分布がＰＴＦの影響を受けてその位相分布より小さい位相量で再生される。これは、合焦位置から外れた位置にある部分はその位相分布とＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）のコンボリューションにより得られる像強度分布であり、本来はＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）を用いてデコンボリューション処理を行うべきところを、ＭＴＦを用いてデコンボリューション処理が行われたためである。
【００５７】
一方で、合焦位置から外れた位置に対応したＰＴＦを計算により算出してＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）を用いてデコンボリューション処理を行うと、この合焦位置から外れた部分に対応した位相分布が再生されるとともに、合焦位置に位置する部分の位相分布はＰＴＦの影響を受けてその位相分布より小さい位相量で再生される。これは、合焦位置に位置する部分はその位相分布とＭＴＦのコンボリューションにより得られる像強度分布であり、本来はＭＴＦを用いてデコンボリューション処理を行うべきところを、ＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）を用いてデコンボリューション処理が行われたためである。つまり、合焦位置に位置する部分の位相分布は、実際の位相分布をｅｘｐ（−２πｉ・ＰＴＦ）でコンボリューションしたものと等価となるので、小さい位相量で再生される。
【００５８】
この特徴を利用することで、観察物体の中で合焦位置にある部分（構造Ｃ２）の位相分布と合焦位置から外れた位置にある部分（構造Ｃ１、Ｃ３）の位相分布とを分離する。
【００５９】
具体的には、まず、図２のステップＳ１１からステップ１７の手順により、図３に示す観察面に対する合焦状態（観察面に光学系の焦点面が位置する状態）でのＯＴＦを用いて屈折成分の位相分布及び構造成分の位相分布を算出する。なお、ステップＳ１１からステップＳ１７は、図１のステップＳ１からステップＳ７に対応する処理である。ステップＳ１７では、観察面に対する合焦状態でのＯＴＦ（つまり、ＭＴＦ）を用いて位相分布（図６の位相分布Ｂ１）を算出する。
【００６０】
次に、観察面に対するデフォーカス状態（光学系の焦点面が観察面からずれた位置にある状態）でのＯＴＦを用いて、ステップＳ１５で得られた構造成分にデコンボリューション処理を行って構造成分の第２の位相分布（図６の位相分布Ｂ２、Ｂ３）を算出する（図２のステップＳ１９（第２位相分布算出工程））。
【００６１】
ここで、デフォーカス状態でのＯＴＦとは、合焦位置でのＯＴＦ（つまり、ＭＴＦ）と、合焦位置から外れた位置でのＰＴＦ（つまり、デフォーカスにより発生するＰＴＦ）とから算出されるＯＴＦであり、ＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）である。図６の位相分布Ｂ２は合焦位置Ｚから＋ΔＺ外れた位置でのＯＴＦを用いて算出された構造成分の位相分布であり、図６の位相分布Ｂ３は合焦位置Ｚから−ΔＺ外れた位置でのＯＴＦを用いて算出された構造成分の位相分布である。また、図６の位相分布Ｂ１は、合焦位置ＺでのＯＴＦを用いてステップＳ１７で算出された構造成分の位相分布である。
【００６２】
さらに、ステップＳ１９で算出した第２の位相分布と、ステップＳ１７で既に算出されている観察面に対する合焦状態での位相分布である構造成分の位相分布と、を比較する（図２のステップＳ２１（位相分布比較工程））。
【００６３】
上述したように合焦状態でのＯＴＦでデコンボリューションして得られた位相分布では、生体試料の合焦位置にある部分の位相量が大きく算出され、デフォーカス状態でのＯＴＦでデコンボリューションして得られた位相分布では、生体試料の合焦位置からずれたその特定の位置にある部分の位相量が大きく算出される。この特徴を利用して、比較工程では、位相分布画像上で、合焦位置にある部分を１とし合焦位置からずれた位置にある部分を０とした２値画像を形成して、それによって、合焦位置から外れた領域（例えば、顕微鏡の焦点深度外の領域）を識別する。図６の例では、構造Ｃ２がある部分を１とし、構造Ｃ１、Ｃ３がある部分を０とした２値画像を形成する。
【００６４】
なお、ＰＴＦは合焦位置から外れる（デフォーカス）量に対応して変化するが、同じデフォーカス量であっても物体の空間周波数によってＰＴＦがＯＴＦに与える影響は異なる。図７は、合焦状態でのＯＴＦを実線で、デフォーカス状態でのＯＴＦを破線で示している。より詳細には、図７に示すＬ１ｄは、デフォーカス状態での明視野顕微鏡のＯＴＦを示している。また、図７に示すＬ２ｄｒ、Ｌ２ｄｉは、それぞれデフォーカス状態での微分干渉顕微鏡のＯＴＦの実部、虚部を示している。図７に示すＬ１とＬ２は、図３と同様に、合焦状態における明視野顕微鏡と微分干渉顕微鏡のＯＴＦである。
【００６５】
図７に示すように、物体の空間周波数が比較的高い領域でＰＴＦのＯＴＦへの影響（つまり、合焦状態のＯＴＦとデフォーカス状態のＯＴＦの差異）は大きくなることから、合焦位置にある部分と合焦位置から外れた位置にある部分とを分離して２値画像を形成する際には、上述したように、空間周波数の高い構造成分を用いることが望ましい。これにより、デフォーカス量に対する位相量の変化を他の成分を用いる場合に比べて大きくすることが可能となり、分離の感度を高くすることができる。
【００６６】
ステップＳ２１の比較工程が完了すると、その比較結果に基づいて、ステップＳ１７で算出された構造成分の位相分布からデフォーカスによるボケが生じた位相分布を取り除く（図２のステップＳ２３（ボケ位相分布除去工程））。
【００６７】
ここでは、まず、ステップＳ１９で算出された構造成分の第２の位相分布とステップＳ２１で形成された２値画像との積を取ることで、合焦位置から外れた位置にある構造成分の位相分布を抽出する。その後、抽出された位相分布をデフォーカス状態でのＯＴＦでコンボリューション処理を行うことで、合焦位置でデフォーカスによるボケが生じた構造成分の位相分布を算出する。さらに、ステップＳ１７で算出された構造成分の位相分布から、算出されたボケが生じた構造成分の位相分布を引き算する。これにより、合焦位置に位置する物体の構造成分の位相分布が分離されて抽出される。
【００６８】
最後に、ステップＳ２３で抽出された構造成分の位相分布とステップＳ１７で算出された屈折成分の位相分布を合成して、生体試料の位相分布を算出する（図２のステップＳ２５（生体試料の位相分布合成工程））。
【００６９】
以上のようにして、観察位置の上下に位置する構造のボケ像の混入を取り除くことで、観察位置の構造をより正確に認識することが可能となる。従って、図２に示す方法によれば、生体試料の観察領域内の位相分布をさらに精度良く求めることができるため、無染色で細胞や組織の３次元的な構造をさらに精度良く検査することができる。また、生体試料が３次元的に入り組んだ構造を有する場合であっても位相分布を精度良く再生することができる。
【００７０】
なお、図２では、説明の都合上、合焦位置と合焦位置から外れた位置という表現を用いている。ＰＴＦの変化に対して再生される位相分布の変化が小さいすぎるため合焦位置（観察面）から焦点深度内の位置の位相分布については分離することができない。このため、より厳密には、図２に示す方法によれば、焦点深度を越えるデフォーカス量に対応する位置のボケた位相分布を分離することが可能である。
【００７１】
図１及び図２に示す方法は、光軸方向の特定のＺ位置で生体試料の画像を複数取り込み、それらの画像から形成された規格化された位相成分画像を背景成分、屈折成分、構造成分に分解し、屈折成分と構造成分から生体試料の位相再生を行う方法である。特に図２に示す方法は、Ｚ位置を変化させることなくＯＴＦを変化させてデコンボリューション処理を行うことで、Ｚ位置から外れた位置にある物体部分からの影響を取り除いた位相分布を再生するものである。即ち、上述した図２に示す方法は、特定のＺ位置で取得した画像のみから特定のＺ位置を合焦位置とする生体試料の位相分布を再生する方法である。
【００７２】
一方、特開２００８−１１１７２６号には、各Ｚ位置での規格化された位相成分画像または位相成分画像から再生された位相分布を比較し、位相成分画像のコントラストが最大になるＺ位置または再生された位相分布の位相量の値が最大になるＺ位置をその物体に対する合焦位置とする技術が開示されている。特開２００８−１１１７２６号で示す手法は、金属やシリコンウェハー表面の構造を検出する方法として優れている。しかしながら、この手法では画素毎に一つのＺ位置の位相分布しか取得することができないため、この手法を生体細胞や組織のように３次元的に重なりを持つ物体に対してそのまま適用すると、３次元的な構造を有する生体試料の位相分布を取得することができない。
【００７３】
そこで、以下では、３次元的な構造を有する生体試料の位相分布を取得するために、複数のＺ位置で取得した画像から特定のＺ位置を合焦位置とする生体試料の位相分布を再生する方法について、図８を参照しながら説明する。
【００７４】
まず、Ｚ位置（つまり、焦点面）を注目するＺ位置（つまり、観察面）に設定して、図８のステップＳ３１からステップ３７の手順により屈折成分の位相分布と構造成分の位相分布を算出する。なお、ステップＳ３１からステップＳ３７は、図１のステップＳ１からステップＳ７に対応する処理である。なお、ステップＳ３７では、図３に示す観察面に対する合焦状態でのＯＴＦ（つまり、ＭＴＦ）を用いて位相分布を算出する。
【００７５】
次に、Ｚ位置を移動させる（図８のステップＳ３９（焦点面変更工程））。つまり、観察面に対して対物レンズの焦点面を光軸方向に移動させる。その後、再び、ステップＳ３１からステップＳ３７の処理を実行する。なお、ステップＳ３１からステップＳ３９までの処理は、少なくとも、注目しているＺ位置である位置Ｚ１、その位置Ｚ１からプラス方向に移動した位置Ｚ２、位置Ｚ１からマイナス方向に移動した位置Ｚ３に対して繰り返し行われる。即ち、少なくとも注目しているＺ位置とその上下に隣接するＺ位置で行われる。
【００７６】
その後、各Ｚ位置（焦点面）で算出された構造成分の位相分布を比較して、そのＺ位置の上下に存在する生体試料の構造からそのＺ位置に漏れこむ位相分布を識別する（図８のステップＳ４１（漏れ位相分布識別工程））。
【００７７】
ステップＳ４１では、まず、Ｚ位置毎に、そのＺ位置での構造成分の位相量が上下に隣接するＺ位置での構造成分の位相量よりも大きくなる光軸と直交するＸＹ平面内の領域を、そのＺ位置を合焦位置とする部分として抽出する。ここで構造成分の位相分布を用いる理由は、構造成分の位相分布が屈折成分の位相分布と比較してデフォーカス量に対して大きく変化する性質を有しているため、屈折成分の位相分布を含む合成後の位相分布や屈折成分の位相分布を用いた場合に比べて合焦位置となる部分をより正確に検出できるからである。なお、図９の位相分布Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３は、それぞれ位置Ｚ１、位置Ｚ２、位置Ｚ３でＭＴＦのみに依存するＯＴＦ（つまり、ＭＴＦ）を用いて算出された構造成分の位相分布である。
【００７８】
ステップＳ４１では、その後、Ｚ位置毎に、そのＺ位置の上下に隣接するＺ位置と間のデフォーカスにより発生するＰＴＦを考慮してＯＴＦを算出する。そして、Ｚ位置毎に、構造成分の位相成分から抽出された領域の位相分布に、ＰＴＦを考慮して算出したＯＴＦを用いてコンボリューション処理を行う。これにより、上下に隣接するＺ位置でボケ像として検出される位相成分、換言すると、各Ｚ位置の上下に存在する生体試料の構造から各Ｚ位置に漏れこむ位相分布、が識別される。
【００７９】
その後、ステップＳ４１で識別された各Ｚ位置に漏れこむ位相分布を各Ｚ位置の構造成分の位相分布から取り除く（図８のステップＳ４３（漏れ位相分布除去工程））。これは、各Ｚ位置の構造成分の位相分布から各Ｚ位置に漏れこむ位相分布を引き算することで実現される。
【００８０】
最後に、ステップＳ４３で算出されたＺ位置に漏れこむ位相分布が取り除かれた構造成分の位相分布と屈折成分の位相分布とを合成して、生体試料の位相分布を算出する（図８のステップＳ４５（生体試料の位相分布合成工程））。
【００８１】
以上のように、図８に示す方法では、特開２００８−１１１７２６に示す手法とは異なり、観察位置の上下に位置する構造のボケ像の混入を取り除くことができる。このため、観察位置の構造をより正確に認識することが可能となる。従って、図８に示す方法によれば、生体試料の観察領域内の位相分布を精度良く求めることができるため、無染色で細胞や組織の３次元的な構造をさらに精度良く検査することができる。また、生体試料が３次元的に入り組んだ構造を有する場合であっても位相分布を精度良く再生することができる。
【００８２】
図８に示す方法は図２に示す方法と併用されてもよく、これらの方法を併用することで、ボケ像の影響を更に小さくすることが可能である。また、上述したように、図２に示す方法と図８に示す方法によれば、いずれも注目するＺ位置以外から注目するＺ位置にボケ像として重畳される位相分布を除去して、焦点深度内の位相分布のみを抽出することができる。このため、焦点深度を計算または比較計測することで求めて、焦点深度内の位相分布を焦点深度で割り算することで、生体試料の各Ｚ位置での屈折率分布を求めることができる。更に、Ｚ位置毎に算出した屈折率分布を組み合わせて、生体試料の３次元的な屈折率分布を求めることも可能である。
【００８３】
なお、異なるＺ位置で合焦した部分のボケ像をＺ位置の画像から除去する方法としては、非特許文献１（Ｄａｖｉｄ  Ａ．  Ａｒｇａｒｄ，Ｙ．  Ｈｉｒａｏｋａ，Ｐｅｔｅｒ  Ｓｈａｗ，  Ｊｏｈｎ  Ｗ．Ｓｅｄａｔ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ  ３０（１９８９））に開示される方法がある。この方法は、蛍光顕微鏡を用いた場合に、注目する焦点位置以外のＺ位置から漏れこむ蛍光を除去する方法として知られている。また、この方法は蛍光顕微鏡以外の観察法とは親和性が良くないことも知られている。その理由は、蛍光像は焦点移動が発生すると焦点移動に対応して像にボケが発生するが、蛍光顕微鏡以外の観察法では、形成される像が複数の成分を持ち、各成分の焦点移動に伴う像強度の変化が異なるからである。このため、非特許文献１を微分干渉顕微鏡や位相差顕微鏡のような像強度分布を位相分布に変換する顕微鏡にそのまま適用することは困難である。
【００８４】
以下、図８に示す方法と非特許文献１の技術を比較し、それらの類似点と差異点について説明する。まず、図８に示す方法では、規格化された位相成分画像が形成される。規格化された位相成分画像は観察物体の位相分布に光学的応答特性がコンボリューションされた画像信号からなる画像であり、蛍光顕微鏡の像特性と同じ特性を有している。このため、図８に示す方法と非特許文献１の技術では像特性について類似している。一方、図８に示す方法では、規格化された位相成分画像を背景、屈折、構造の各成分に分解する。これは、図８に示す方法では、背景成分は焦点移動には関与しないこと、屈折成分は緩やかに変化する位相分布であり複数のＺ位置で共有され、焦点移動の影響を受け難いこと、構造成分は焦点移動の影響を受けて異なるＺ位置にボケ像が重畳されやすいこと、が考慮されているからである。この点については、図８に示す方法と非特許文献１は大きく異なっている。
以下、上述した位相計測方法の実施例について具体的に説明する。
【実施例１】
【００８５】
図１０を参照しながら、上述した位相計測方法を実施する位相計測装置の構成について説明する。
【００８６】
図１０に示される顕微鏡システム１００は、上述した位相計測方法を実施する位相計測装置であり、顕微鏡１と、顕微鏡１を制御するコンピュータ２０と、コンピュータ２０の指示に従って顕微鏡１を駆動する複数の駆動機構（駆動機構２１、駆動機構２２、駆動機構２３、駆動機構２４）と、生体試料Ｓの画像を表示するモニタ２５を含んでいる。
【００８７】
顕微鏡１は、培養細胞などの生体試料Ｓの構造を像強度分布として撮像素子の受光面に投影する微分干渉顕微鏡であり、倒立顕微鏡として構成されている。より詳細には、顕微鏡１は、照明系、ステージ８、結像系、及び、撮像素子を備えたＣＣＤカメラ１３を備えている。
【００８８】
ステージ８は、生体試料Ｓを配置する電動ステージであり、コンピュータ２０の指示に従って駆動機構２２によって光軸方向に移動するように構成されている。照明系には、光源２、レンズ３、視野絞り４、像コントラスト変化ユニット５、ノマルスキープリズム６、及びコンデンサレンズ７が含まれ、結像系には、対物レンズ９、ノマルスキープリズム１０、検光子１１、及び結像レンズ１２が含まれている。ここで、コンデンサレンズ７の開口数（ＮＡ）は、例えば０．５５である。対物レンズ９は水浸対物レンズであり、対物レンズ９の倍率は、例えば６０倍であり、開口数（ＮＡ）は１．２である。
【００８９】
光源２からの出射した光は、レンズ３及び視野絞り４を介して入射する像コントラスト変化ユニット５で直線偏光に変換され、ノマルスキープリズム６で常光と異常光とに分離されて、コンデンサレンズ７によりステージ８上に配置された生体試料Ｓに照射される。生体試料Ｓを透過した常光と異常光は、対物レンズ９を介して入射するノマルスキープリズム１０で合成され、検光子１１及び結像レンズ１２によってＣＣＤカメラ１３の受光面に結像する。このようにして微分干渉像が得られる。
【００９０】
ここで、像コントラスト変化ユニット５は、偏光板５ａとλ／４板５ｂを有し、コンピュータ２０の指示に従って駆動機構２４により偏光板５ａが回転制御されることで直線偏光の位相を変化させて楕円偏光に変換する、セナルモン法を採用した位相変調器である。顕微鏡システム１００では、コンピュータ２０が、駆動機構２４を通じて像コントラスト変化ユニット５を制御することで、顕微鏡１によってＣＣＤカメラ１３に投影される像強度分布の像コントラストを連続的に変化させることができる。また、ステッピングモータ等を用いて像コントラストを離散的に変化させてもよい。
【００９１】
また、ノマルスキープリズム６、ノマルスキープリズム１０は、それぞれ、コンデンサレンズ７、対物レンズ９の瞳位置またはその共役位置に配置されている。顕微鏡システム１００では、ノマルスキープリズム６及びノマルスキープリズム１０は、シァー方向を切り替えるために、コンピュータ２０の指示に従って駆動機構２１、駆動機構２３により回転制御される。
【００９２】
即ち、コンピュータ２０は、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、ＣＣＤカメラ１３及び像コントラスト変化ユニット５を制御するとともに、シァー方向を切り替えるように、ノマルスキープリズム６及びノマルスキープリズム１０を制御する制御ユニットとして機能する。また、コンピュータ２０は、駆動機構２３を通じてステージ８を光軸方向に移動させることができるため、焦点面を光軸方向に変化させる焦点位置制御ユニットとしても機能する。さらに、後述するように、コンピュータ２０は、コンピュータ２０による制御により取得された像コントラストの異なる複数枚の画像から生体試料の位相分布を算出する演算ユニットとしても機能する。
次に、以上のように構成された顕微鏡システム１００による位相計測方法について具体的に説明する。
【００９３】
まず、コンピュータ２０は、駆動機構２１、駆動機構２３にノマルスキープリズム６、ノマルスキープリズム１０を回転させて、シァー方向がＣＣＤカメラ１３の受光面上で基準方向に対して４５°方向になるように設定する。その後、コンピュータ２０は、駆動機構２３に偏光板５ａを回転させることによりリターデーションを±θ、０に順番に変化させて、ＣＣＤカメラ１３から像コントラストの異なる３枚の微分干渉画像I1(−θ)、I1(０)、I1(θ)を取り込む。
【００９４】
次に、コンピュータ２０は、駆動機構２１、駆動機構２３にノマルスキープリズム６、ノマルスキープリズム１０を９０°回転させて、シァー方向がＣＣＤカメラ１３の受光面上で基準方向に対して−４５°方向になるように設定する。その後、コンピュータ２０は、駆動機構２４に偏光板５ａを回転させることでリターデーションを±θ、０に順番に変化させて、ＣＣＤカメラ１３から像コントラストの異なる３枚の微分干渉画像I2(−θ)、I2(０)、I2(θ)を取り込む。
【００９５】
なお、ノマルスキープリズムの方向によらず位相変調器（像コントラスト変化ユニット５）で発生するリターデーションが±θ、０になるように、駆動機構２４による偏光板５ａの回転は、ノマルスキープリズムの回転に伴って発生するリターデーション量のずれを予め計測した値を用いてオフセット補正するように制御される。
【００９６】
次に、コンピュータ２０は、取得した微分干渉画像を用いて以下の演算を行うことで、規格化された位相成分画像をシァー方向毎に形成する。ここで、Def1、Def2は、規格化された位相成分画像である。
Def1=｛I1(θ)−I1(−θ)｝／｛I1(θ)＋I1(−θ)−I1(0)｝
Def2=｛I2(θ)−I2(−θ)｝／｛I2(θ)＋I2(−θ)−I2(0)｝
【００９７】
その後、コンピュータ２０は、規格化された位相成分画像Def1、Def2のそれぞれに対して、平均化領域（カーネルサイズ）が100x100の平均化フィルターで平均化処理を数回行い、背景成分の画像BG1、BG2を形成する。さらに、規格化された位相成分画像Def1、Def2のそれぞれから背景成分の画像BG1、BG2を引き算する。それによって得られる視野ムラなどの外乱が除去された画像(Def1−BG1)、(Def2−BG2)のそれぞれに対して、平均化領域（カーネルサイズ）が20x20の平均化フィルターで平均化処理を数回行い、屈折成分の画像GR1、GR2を形成する。さらに、規格化された位相成分画像Def1、Def2から背景成分の画像BG1、BG2と屈折成分の画像GR1、GR2を引き算して構造成分の画像ST1(=Def1−BG1−GR1)、ST2(=Def2−BG2−GR2)を形成する。
【００９８】
次に、コンピュータ２０は、構造成分の画像ST1、ST2に図３で示した微分干渉顕微鏡の合焦状態でのＯＴＦ（図３のＬ２）を用いてデコンボリューション処理を行い、物体の微細構造を表す、構造成分の位相分布PhS1、PhS2を算出する。
【００９９】
なお、図３に示す光学的応答特性は、周波数が０である帯域とカットオフ周波数である帯域の２つの帯域でその値が０に近づく。このため、デコンボリューション処理のときに０割りが生じてしまうため、ウィナー手法を採用して０割りを防止する。構造成分の画像ST1、ST2では、周波数が０に近い帯域の画像成分が小さいため、ウィナー手法を採用して計算誤差を小さくすることができる。
【０１００】
コンピュータ２０は、構造成分の位相分布PhS1、PhS2からノマルスキープリズムのシァー方向を切り替えることによって生じる画像間の相対的な位置ずれ量を算出する。構造成分の位相分布PhS1、PhS2は同じ物体（生体試料Ｓ）をノマルスキープリズムのシァー方向を変えて求めた構造成分の位相分布である。このため、それぞれのシァー方向に対して略垂直な構造に関する位相分布以外は類似した位相分布となる。従って、構造成分の位相分布PhS1、PhS2に位相限定相関法を適応することで２つの画像間の相対的な位置ずれ量（δx、δy）を算出することができる。
【０１０１】
さらに、コンピュータ２０は、屈折成分の画像GR1、GR2が生体試料の緩やかな位相の変化を有していることを考慮して、屈折成分の画像GR1、GR2に図３に示すＯＴＦの代わりに図１１で示すＯＴＦを用いてデコンボリューション処理を行う。これにより、緩やかな位相変化を表す、屈折成分の位相分布PhG1、PhG2を算出する。
【０１０２】
なお、合焦状態での屈折成分に対応するＯＴＦ（図１１のＬ３）は、微分干渉顕微鏡のＭＴＦが明視野顕微鏡のＭＴＦとｓｉｎ（πΔｆ）の積であること、及び、屈折成分が構造成分に比べて低い周波数成分でありその条件下では図３のＬ１で示すように明視野顕微鏡のＭＴＦは１とみなすことができること、からｓｉｎ（πΔｆ）として算出される。
【０１０３】
構造成分の位相分布PhS1、PhS2と屈折成分の位相分布PhG1、PhG2を算出すると、コンピュータ２０は、これらを合成して観察物体（生体試料Ｓ）の位相分布Ph1、Ph2を算出する。なお、観察物体の位相分布Ph1、Ph2は、視野ムラなどの外乱を取り除いた像強度分布の画像(Def1−BG1)、(Def2−BG2)に対応する位相分布であるので、以下の式により算出される。
Ph1＝PhS1＋PhG1
Ph2＝PhS2＋PhG2
【０１０４】
最後に、シァー方向の影響を排除するために、直交するシァー方向で得られた観察物体の位相分布Ph1、Ph2を合成する。この際、画像間の相対的な位置ずれ量（δx、δy）を用いて位相分布Ph1、Ph2を補正してから合成する。これにより、シァー方向の影響が排除された生体試料の位相分布Phを得ることができる。
【０１０５】
上記の方法により得られた生体試料の位相分布Phには、対物レンズ９の合焦位置近傍（焦点深度内）に存在する部分の位相分布に、合焦位置から若干外れた位置（例えば±２μm程度外れた位置）に存在する部分のボケた位相分布が混入していると想定される。このようなボケた位相分布を取り除くためには、コンピュータ２０は、さらに、以下のような演算を行う。
【０１０６】
まず、コンピュータ２０は、構造成分の画像ST1、ST2に、図７で示すような、焦点面から２μｍ程度デフォーカスした状態でのＯＴＦを用いてデコンボリューション処理を行い、構造成分の位相分布PhSd1、PhSd2を算出する。
【０１０７】
次に、コンピュータ２０は、デフォーカス状態でのＯＴＦを用いて算出した構造成分の位相分布PhSd1、PhSd2と合焦状態でのＯＴＦを用いて算出した構造成分の位相分布PhS1、PhS2とを比較する。２μm程度のデフォーカス状態でのＯＴＦを用いて算出した構造成分の位相分布PhSd1、PhSd2では、デフォーカスした位置に存在する物体の位相分布のボケが低減されていて、デフォーカスした位置に存在する物体の位相分布が構造成分の位相分布PhS1、PhS2内よりも、大きな値で算出される。これを考慮して、合焦位置近傍にある部分と２μｍ程度合焦位置から外れた位置にある部分とを識別して、構造成分の位相分布PhSd1、PhSd2から２μｍ程度合焦位置から外れた位置にある部分の位相分布PhSP1、PhSP2を抽出する。
【０１０８】
さらに、コンピュータ２０は、抽出された位相分布PhSP1、PhSP2に、デフォーカス状態でのＯＴＦを用いてコンボリューション処理を行って、合焦位置におけるボケが再生された位相分布PhSR1、PhSR2を算出する。
【０１０９】
最後に、コンピュータ２０は、ボケが再生された位相分布PhSR1、PhSR2を構造成分の位相分布PhS1、PhS2から引き算する。これにより、合焦位置近傍に存在する構造成分の位相分布がより正確に算出される。
【０１１０】
図１２Ａ、図１２Ｂ、及び図１２Ｃは、顕微鏡システム１００により観察位置を光軸方向に０．５μｍステップで変化させ、培養液中のマウスのｉＰＳ細胞の位相分布を計測することで得られた複数の位相分布画像の一部である。より詳細には、ＮＡ＝０．５５のコンデンサレンズで照明した培養液中のマウスのｉＰＳ細胞の位相分布を、６０ｘ、ＮＡ＝１．２の水浸対物レンズを用いて計測したものである。なお、図１２Ａは最も深い観察位置で計測した位相分布画像、図１２Ｂは図１２Ａの観察位置から３μｍ上方に位置する観察位置で計測した位相分布画像、図１２Ｃは図１２Ｂの観察位置から３μｍさらに上方に位置する観察位置で計測した位相分布画像である。また、図１２Ｃには、光軸方向から見た画像Ｍ１に加えて、画像Ｍ１に示すＡ−Ａ’断面及びＢ−Ｂ’断面における断面図の画像Ｍ２及び画像Ｍ３が示されている。画像Ｍ２及び画像Ｍ３は、図１２Ａから図１２Ｃに示す画像を含む光軸方向に０．５μｍステップで変化させて取得された複数の位相分布画像から生成された画像である。
なお、図１２Ａから図１２Ｃの観察波長は５５０±３０ｎｍである。光源２の中にはハロゲンランプと干渉フィルターが配置され、干渉フィルターにより照明光を５５０±３０ｎｍの波長範囲に準単色化している。
【０１１１】
図１２Ａでは、画像の中央部分にｉＰＳ細胞のコロニーを、周辺部に分化した別の細胞を観察することができる。さらに、ｉＰＳ細胞のコロニーには、コロニーを構成する細胞の間隔が密になっている部分と細胞の間隔が比較的広がっている部分とが存在することも観察することができる。
【０１１２】
さらに、図１２Ａと比較して観察位置が３μｍ上方にある図１２Ｂでは、中央に位置するｉＰＳ細胞のコロニーの存在を確認することはできるが、図１２Ａでは周辺部に位置していた分化した細胞の存在は確認できない。この違いにより細胞の厚みの違いを認識することができる。また、図１２Ｂでは、中央部分に位置するｉＰＳ細胞のコロニーに分化した細胞が重なっている様子が見て取れるため、ｉＰＳ細胞の一部が分化してコロニー上部に横たわっていることを認識することができる。さらに、図１２Ａと図１２Ｂを比較するとｉＰＳ細胞のコロニーを形成する細胞の形状が異なっている。このことから、図１２Ａと図１２Ｂでは、コロニーを形成している細胞群のうちの光軸方向の異なる位置にある細胞が観察されていると認識することができる。
【０１１３】
図１２Ｂと比較して観察位置が３μｍ上方にある（つまり、図１２Ａと比較すると観察位置が６ｍ上方にある）図１２Ｃでも、ｉＰＳ細胞のコロニーとコロニー上部に横たわれる分化した細胞を観察することができる。図１２Ｃには、ｉＰＳ細胞のコロニーを形成する、図１２Ａや図１２Ｂで観察された細胞とは別の細胞の存在を確認することができる。
【０１１４】
このように顕微鏡システム１００により得られる位相分布画像からは、コロニーの高さやコロニーを形成する各細胞の厚みに関する情報を得ることが可能であり、光軸方向それぞれの位置にある細胞の状態も確認することができる。具体的には、図１２Ａから図１２Ｃを参照すると、ｉＰＳ細胞だけではなく分化した細胞についても、細胞１個当たりの高さ（厚み）は、数μｍ以上になることがわかる。
【０１１５】
また、細胞内の小器官についてもμｍオーダの大きさを有していることが想定され、且つ、細胞や細胞小器官は連続的に変化していることから、観察位置を変化させて位相分布を計測すると、複数の観察位置に連続的に重複して検出されることになる。特定の観察位置で計測された位相分布と前後の観察位置で計測された位相分布との相関（類似性）を求めることにより、各観察位置で計測された位相分布の連続性を判断することができる。この連続性を利用して、複数の観察位置で計測された位相分布を連続的につなぎ合わせることで、細胞や細胞小器官の位相分布を正確に求めることができる。また、位相分布を観察位置の間隔で割り算することで各観察位置での細胞や細胞小器官の相対的な屈折率分布を求めることもできる。
【０１１６】
以上のように、本実施例に係る顕微鏡システム１００によれば、ｉＰＳ細胞の正確な位相分布を取得することができるため、ｉＰＳ細胞の位相再生結果から、培養されているｉＰＳ細胞の内部構造を位相分布として計測することができる。また、コロニー内部で正常な細胞と変異している細胞を判別することもできる。さらに、ｉＰＳ細胞の未分化状態を識別することもできる。つまり、コロニー内の細胞状態（細胞の形態変化、コロニーの変化、死細胞の分布、細胞間の接着性）、分化による細胞の変性を評価することが可能である。なお、ｉＰＳ細胞に限られずＥＳ細胞であっても同様である。
【実施例２】
【０１１７】
図１３に示される顕微鏡システム１０１は、顕微鏡１ａを備える顕微鏡システムであり、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に、上述した位相計測方法を実施する位相計測装置である。顕微鏡システム１０１は、光源２の代わりにＬＥＤ光源３１及びＬＥＤ光源３２を備える点、像コントラスト変化ユニット５の代わりに位相変調手段３０を備える点、及び、駆動機構２４の代わりに駆動機構２６を備える点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。その他の構成は、顕微鏡システム１００と同様である。
【０１１８】
ＬＥＤ光源３１及びＬＥＤ光源３２は、例えば、単色ＬＥＤ光源である。顕微鏡システム１０１では、コンピュータ２０が、駆動機構２６を通じてＬＥＤ光源３１及びＬＥＤ光源３２の発光を制御する。
なお、白色ＬＥＤ光源を用いることも可能である。その際は実施例１と同様にさらに干渉フィルターを配置することにより準単色化して用いる。
【０１１９】
位相変調手段３０は、光軸に対して回転可能な２つの偏光板（偏光板３３、偏光板３４）と、ＬＥＤ光源３１からの光とＬＥＤ光源３２からの光を合成してレンズ３の光軸の方向に出射する光合成手段であるビームスプリッタ３５と、光学軸を所定の方向に向けて配置されたλ／４板３６とを備えている。ビームスプリッタ３５は、例えば、ハーフミラーを備えている。
【０１２０】
偏光板３３、偏光板３４は、それぞれＬＥＤ光源３１とビームスプリッタ３５の間、ＬＥＤ光源３２とビームスプリッタ３５の間に配置されている。偏光板３３及び偏光板３４は、駆動機構（ここでは駆動機構２６）を通じてコンピュータ２０によって回転制御され、λ／４板（ここでは、λ／４板３６）とともにそれぞれセナルモン法を採用した位相変調器として機能する点は、図１０の偏光板５ａと同様である。
【０１２１】
偏光板３３と偏光板３４には、偏光板３３と偏光板３４を連動して回転させる図示しない構造が設けられていて、その構造により、図１４に示すように、偏光板３３の振動方向３３ａと偏光板３４の振動方向３４ａがλ／４板３６の光学軸（Ｓ軸、Ｆ軸）に対して同じ角度で逆方向に回転するように構成されている点が、図１０の偏光板５ａとは異なっている。
【０１２２】
さらに、偏光板３３と偏光板３４には、偏光板３３と偏光板３４の一方の回転角をオフセットする機構が設けられている。この機構により、ビームスプリッタ３５のハーフミラーなどで生じるリターデーション量を補償するように、偏光板３３と偏光板３４の一方の回転角をオフセットする。
【０１２３】
以上のように構成された顕微鏡システム１０１によっても、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様の効果を得ることができる。さらに、顕微鏡システム１０１では、偏光板３３及び偏光板３４が任意の対称な回転角に設定された状態で、コンピュータ２０がＬＥＤ光源３１及びＬＥＤ光源３２を順番に発光させることで、リターデーション量の異なる設定で標本Ｓが撮像された像コントラストの異なる２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）を取得することができる。なお、ＬＥＤ光源の発光制御は、実施例１に係る顕微鏡システム１００における偏光板５ａの回転制御に比べて高速な切替えが可能であるため、本実施例に係る顕微鏡システム１０１によれば、２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）を素早く取得することができる。従って、実施例１に係る顕微鏡システム１００よりも高速な位相分布の計測が可能となる。
【０１２４】
なお、本実施例に係る顕微鏡システム１０１では、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なり、微分干渉画像I1(０)を取得することなく、２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）のみを取得している。上述した位相計測方法では、微分干渉画像I1(０)も使用されているが、微分干渉画像I1(０)は位相量の大きな物質で生じる誤差を補償するために用いられるものであるので、２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）のみからでも位相分布を計測することができる。
【実施例３】
【０１２５】
図１５に示される顕微鏡システム１０２は、レーザ走査型の微分干渉顕微鏡である顕微鏡１ｂを備えている顕微鏡システムであり、実施例１及び実施例２に係る顕微鏡システムと同様に、上述した位相計測方法を実施する位相計測装置である。
【０１２６】
顕微鏡システム１０２は、顕微鏡１の代わりに顕微鏡１ｂを備える点、駆動機構２４の代わりに駆動機構２７を備える点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００とは異なっている。さらに、顕微鏡１ｂは、光源２、視野絞り４及び像コントラスト変化ユニット５の代わりに検出手段４０を備える点、検光子１１、結像レンズ１２及びＣＣＤカメラ１３の代わりに照明手段５０を備える点が、実施例１に係る顕微鏡１とは異なっている。即ち、顕微鏡１ｂは、ステージ８の下方から生体試料Ｓにレーザ光を照射して生体試料Ｓを透過したレーザ光を検出するように構成されている。
【０１２７】
照明手段５０は、レーザ光源５１と、ビーム走査装置５２と、リレーレンズ５３と、ミラー５４と、を備えている。レーザ光源５１は、可視域のレーザ光を出射するレーザであってもよく、また、可視光に比べて波長が長く散乱が生じにくい近赤外域のレーザ光を出射するレーザであってもよい。標本Ｓが厚い場合には、波長が８００ｎｍ以上の近赤外域のレーザ光を出射するレーザが望ましい。ビーム走査装置５２は、レーザ光源５１から出射したレーザ光で標本Ｓを走査するための装置であり、例えば、対物レンズ９の瞳共役位置でレーザ光を偏向させるガルバノミラーなどを備えている。
【０１２８】
検出手段４０は、２つの光検出器である光電子増倍管（ＰＭＴ４１、ＰＭＴ４２）と、位相変調手段３０と、を備える差動検出手段である。位相変調手段３０は、実施例２に係る顕微鏡１ａの位相変調手段３０と同様の構成を有していて、具体的には、光軸に対して回転可能な２つの偏光板（偏光板３３、偏光板３４）と、ハーフミラーを備えるビームスプリッタ３５と、光学軸を所定の方向に向けて配置されたλ／４板３６とを備えている。なお、ここでは、ビームスプリッタ３５は、標本Ｓからのレーザ光を２つに分けてＰＭＴ４１とＰＭＴ４２に導く光分離手段として機能する。
【０１２９】
通常の差動検出手段では、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）によって光が分離されるためリターデーションの設定に制約がある。これに対して、顕微鏡システム１０２の差動検出手段（検出手段４０）は、標本に応じたリターデーションの設定を可能とするために、振動方向（振動方向３３ａ、振動方向３４ａ）がλ／４板３６の光学軸（Ｓ軸、Ｆ軸）に対して同じ角度で逆方向に回転するように構成された偏光板３３と偏光板３４を備えている点が、通常の差動検出手段とは異なっている。
【０１３０】
以上のように構成された顕微鏡システム１０２によっても、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様の効果を得ることができる。さらに、顕微鏡システム１０２では、光源として、バンド幅が狭く高い単色性を有するレーザ光を出射するレーザ光源５１が用いられることから、Ｓ／Ｎが大きくコントラストが高い微分干渉画像を取得することができる。また、レーザ光の狭いバンド幅はデコンボリューション処理の高精度化にも寄与する。このため、微分干渉画像からより正確な位相分布を算出することができる。従って、顕微鏡システム１０２によれば、実施例１に係る顕微鏡システム１００よりも正確な位相分布を算出することができる。
【０１３１】
なお、通常の顕微鏡（ワイドフィールド型の顕微鏡）で光源としてレーザ光源を採用した場合、コヒーレント照明に起因して解像力の低下やスペックルの発生といった望ましくない現象が生じるが、顕微鏡システム１０２のような走査型の顕微鏡では、このような現象は生じない。このため、走査型の顕微鏡はレーザ光の使用に好適である。
【０１３２】
その一方で、走査型の顕微鏡はワイドフィールド型の顕微鏡に比べて画像の取得に時間がかかるため、位相分布の算出に要する時間も長くなりやすい。この点について、顕微鏡システム１０２では、作動検出手段（検出手段４０）を用いて像コントラストの異なる複数の画像を同時に取得することで、位相分布の算出の高速化を図っている。具体的には、レーザ光源５１から出射して差動検出手段（検出手段４０）に入射したレーザ光は、ビームスプリッタ３５でＰＭＴ４１へ向かうレーザ光とＰＭＴ４２へ向かうレーザ光とに分離され、その後、それぞれ、対称な回転角度に設定された偏光板３３、偏光板３４を介してＰＭＴ４１、ＰＭＴ４２に入射する。これにより、顕微鏡システム１０２では、ビーム走査装置５２による１回の標本走査で、リターデーション量の異なる設定で標本Ｓが撮像された像コントラストの異なる２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）を同時に取得することができる。
【０１３３】
図１６は、顕微鏡システム１０２によって得られた小腸のクリプトの位相分布を示す図である。図１６に示す小腸のクリプトの画像には、クリプトの３次元構造が良好に表わされている。従って、図１６から、顕微鏡システム１０２を用いることで生体組織の３次元構造を観察することが可能であり、例えば、組織内に変位細胞が存在する場合であれば、この変位細胞を標識化することなく識別して観察し得る、ことが確認できる。
なお、このクリプトの画像は波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いたものである。レーザは単色性に優れているので、像コントラストの高い観察が可能となる。
【０１３４】
上述した実施例は、発明の理解を容易にするために本発明の具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。例えば、上述した実施例では、微分干渉顕微鏡を備えた顕微鏡システムを用いているが、必ずしも顕微鏡システムに含まれる顕微鏡は微分干渉顕微鏡に限定されるものではなく、像強度分布を位相分布に変換する顕微鏡であればよい。特開平７−２２５３４１号公報には、位相差顕微鏡の位相膜の位相量を変化せることで像コントラストを変化させ規格化された位相成分画像を形成する技術が開示されている。この技術を採用することで位相差顕微鏡を備えた顕微鏡システムでも、顕微鏡システム１００と同様の効果を得ることが可能である。
【０１３５】
また、上述した実施例に示すように、位相分布計測装置である顕微鏡システムは、ワイドフィールド型の顕微鏡システムであっても、走査型の顕微鏡システムであってもよい。また、光源も任意の光源を使用する可能であり、顕微鏡システムには、コヒーレント照明とインコヒーレント照明のいずれが採用されても良い。
【０１３６】
また、上述した実施例では、位相分布計測装置である顕微鏡システムは、図１及び図２に示す方法を実行する例を示したが、図８に示す方法を実行してもよい。また、特開２０１２−７３５９１号公報には、偏斜照明を使った顕微鏡が開示されており、照明の方向を変化せることで像コントラストを変化させることができる。これを使っても同様の効果を得ることができる。
【０１３７】
また、上述した実施例では、顕微鏡システムが位相分布計測装置として記載されているが、算出された生体試料の位相分布を用いて正常な細胞と変異している細胞（変位細胞）との判別を画像処理により行なう判別処理部を備えた観察装置として構成されてもよい。この場合、観察装置は、部位ごとの屈折率分布や生体試料の位相分布画像をモニタ２５等に表示する際に、変位細胞を他の細胞と識別して表示してもよい。また、判別処理部では、例えば、細胞の形状（他の細胞とは形状が異なるなど）、大きさ（細胞の外形に突起部が存在するなど）、明るさ（他の細胞よりも明るいまたは暗いなど）等に基づいて、変位細胞を判別してもよい。
【０１３８】
本発明の位相分布計測方法、位相分布計測装置は、特許請求の範囲に規定された本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。図１２Ａから図１２Ｃ及び図１６に示す画像から明らかなように、本願発明によれば、蛍光観察のように標本を染色することなく、細胞レベルから組織レベル（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、または幹細胞が分化することによって形成された組織も含む）までの任意の生体試料の３次元構造を無染色で観察して、生体組織内の構造や変異細胞を識別することができる。つまり、細胞の各過程における変異や変質の検査を無染色で行うことができる。
【符号の説明】
【０１３９】
１、１ａ、１ｂ  顕微鏡
２              光源
３              レンズ
４              視野絞り
５              像コントラスト変化ユニット
５ａ、３３、３４  偏光板
５ｂ、３６      λ／４板
６、１０        ノマルスキープリズム
７              コンデンサレンズ
８              ステージ
９              対物レンズ
１１            検光子
１２            結像レンズ
１３            ＣＣＤカメラ
２０            コンピュータ
２１、２２、２３、２４、２６、２７  駆動機構
３０            位相変調手段
３１、３２      ＬＥＤ光源
３３ａ、３４ａ  振動方向
４０            検出手段
４１、４２      ＰＭＴ
５０            照明手段
５１            レーザ光源
５２            ビーム走査装置
５３            リレーレンズ
５４            ミラー
１００、１０１、１０２  顕微鏡システム
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３  位相分布
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３  構造
Ｓ                生体試料
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３  画像
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１６】
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