(57)【要約】      （修正有）【課題】ｓｉＲＮＡなどの機能的な核酸のための送達剤の提供。【解決手段】担体に含有される、および／または担体を含有する脂質組成物であって、少なくとも第１の脂質成分、少なくとも第１のヘルパー脂質、およびインビボ条件下において、任意で脂質組成物から除去することができる遮蔽化合物を含む組成物であり、担体を含有する脂質組成物のオスモル濃度が、約５０から６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ましくは、約２５０〜３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、およびより好ましくは、約２８０〜３２０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇであって、かつ／または、第１の脂質成分、および／または担体中のヘルパー脂質および遮蔽化合物の一方またはその両方よって形成されたリポソームの粒子サイズが、約２０から２００ｎｍ、好ましくは、約３０から１００ｎｍ、より好ましくは、約４０から８０ｎｍである組成物に関する。【選択図】図１ｂ
2014055167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に含有される、および／または担体を含有する脂質組成物であって、
少なくとも第１の脂質成分と、
少なくとも第１のヘルパー脂質と、
インビボ条件下において、脂質組成物から任意で除去することができる遮蔽化合物と
を含む組成物であって、
前記担体を含有する前記脂質組成物が、約５０から６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ま
しくは、約２５０〜３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、およびより好ましくは、約２８０〜３
２０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇのオスモル濃度を有し、かつ／または、
前記第１の脂質成分、および／または前記担体中の前記ヘルパー脂質および前記遮蔽化
合物の一方または両方よって形成されるリポソームの粒子径が約２０から２００ｎｍ、好
ましくは、約３０から１００ｎｍ、より好ましくは、約４０から８０ｎｍである脂質組成
物。
【請求項２】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、
およびポリプロピレンからなる群から選択される、請求項１に記載の脂質組成物。
【請求項３】
前記遮蔽化合物がＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である、請求項２に記載の脂質
組成物。
【請求項４】
さらなる構成成分および／または第２のヘルパー脂質を含む、請求項１から３のいずれ
か１項に記載の脂質組成物。
【請求項５】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートである、請求項１から４のいず
れか１項に記載の脂質組成物。
【請求項６】
前記セラミドが、６個から１０個の炭素原子、好ましくは、８個の炭素原子からなる、
少なくとも１つの短鎖炭素置換基を含む、請求項５に記載の脂質組成物。
【請求項７】
前記セラミドが前記第１のヘルパー脂質である、請求項５または６に記載の脂質組成物
。
【請求項８】
前記セラミドが前記第２のヘルパー脂質である、請求項５または６に記載の脂質組成物
。
【請求項９】
前記遮蔽化合物が、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分を含む、請求項１から８
のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項１０】
前記リンカーまたは部分がアニオン性リンカーまたはアニオン性部分である、請求項９
に記載の脂質組成物。
【請求項１１】
前記アニオン性リンカーまたはアニオン性部分が、酸性環境においてはアニオン性が低
いか中性であって、好ましくは、前記酸性環境がエンドソームである、請求項１０に記載
の脂質組成物。
【請求項１２】
前記ｐＨ感受性リンカーまたは前記ｐＨ感受性部分が、オリゴ（グルタミン酸）、オリ
ゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む群から選択される、請求項９
から１１のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項１３】
前記第１の脂質成分が、下記の化学式（Ｉ）に記載された化合物であって、
【化１】
2014055167.tif 000012
式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、アルキルを含む基から選択され、
ｎが１から４までの任意の整数であり、
Ｒ３が、下記の化学式（ＩＩ）に記載のリシル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリ
ル、ヒスチジル、およびアシル部分であって、
【化２】
2014055167.tif 000013
式中、ｍが１から３までの任意の整数であり、ＮＨ３＋が、任意では存在しなくてもよく
、また、
Ｙ−が薬学的に許容されるアニオンである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の
脂質組成物。
【請求項１４】
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレ
イルを含む群から選択される、請求項１３に記載の脂質組成物。
【請求項１５】
Ｒ１がラウリルおよびＲ２がミリスチルであり、または、
Ｒ１がパルミチルおよびＲ２がオレイルである、請求項１３または１４に記載の脂質組
成物。
【請求項１６】
ｍが１または２である、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項１７】
前記化合物がカチオン性脂質であり、好ましくは、アニオンＹ−と結合している、請求
項１３から１６のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項１８】
Ｙ−が、ハロゲン化合物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸を含む群から選択される、請
求項１３から１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項１９】
前記化合物が、以下の群、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−ア
ミド三塩酸、
【化３】
2014055167.tif 000014
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−ア
ミド三塩酸、および
【化４】
2014055167.tif 000015
ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸
【化５】
2014055167.tif 000016
から選択される、請求項１３から１８のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項２０】
前記オスモル濃度が、糖によってほとんど決定され、前記糖が、好ましくは、ショ糖、
トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、イヌ
リン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択され、より好ま
しくは、ショ糖、トレハロース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせた
ものを含む群から選択される、請求項１から１９のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項２１】
１種類または数種類の塩基性化合物を含有し、該塩基性化合物が、好ましくは、塩基性
アミノ酸および弱塩基を含む群から選択される、請求項１から２０のいずれか１項に記載
の脂質組成物。
【請求項２２】
前記アミノ酸が、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンを含む群から選択される、請
求項２１に記載の脂質組成物。
【請求項２３】
前記弱塩基が、ＴＲＩＳおよびエタノールアミンを含む群から選択される、請求項２１
に記載の脂質組成物。
【請求項２４】
前記塩基性化合物が、ｐＨ調整のために提供されている、請求項２１から２３のいずれ
か１項に記載の脂質組成物。
【請求項２５】
前記脂質組成物が核酸を含み、該核酸が、好ましくは、さらなる構成成分である、請求
項１から２４のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項２６】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプ
タマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される、請求項２５に記載の脂質組成物
。
【請求項２７】
前記遮蔽化合物が核酸に結合している、請求項１から２６のいずれか１項に記載の脂質
組成物。
【請求項２８】
前記遮蔽化合物が、リンカー部分によって核酸に結合している、好ましくは、リンカー
部分によって核酸に共有結合している、請求項２７に記載の脂質組成物。
【請求項２９】
前記リンカー部分が、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、
Ｓ−Ｓリンカー、およびｐＨ感受性リンカーを含む群から選択される、請求項２８に記載
の脂質組成物。
【請求項３０】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡを含む群から選択され、前記リン
カーが、センス鎖の３’末端に結合している、請求項２７から２９のいずれか１項に記載
の脂質組成物。
【請求項３１】
組成物が核酸を含み、前記核酸が、リポソームとともにリポプレックスを形成する、請
求項１から３０のいずれか１項に記載の脂質組成物。
【請求項３２】
前記担体中の脂質濃度が、リポプレックスによって提供される脂質の全体量に基づいて
、約０．０１から１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１から４０ｍｇ／ｍｌ、および
より好ましくは約０．０１から２５ｍｇ／ｍｌである、請求項１から３１のいずれか１項
に記載の脂質組成物。
【請求項３３】
前記核酸がｓｉＲＮＡであり、前記脂質組成物のｓｉＲＮＡの濃度が約０．２から０．
４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２８ｍｇ／ｍｌであり、総脂質濃度が約１．５から２．７
ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．１７ｍｇ／ｍｌである、請求項３１から３２のいずれかに記
載の脂質組成物。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれかに記載の組成物、および任意には薬学的活性化合物、およ
び好ましくは、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項３５】
前記薬学的活性化合物および／または更なる構成成分が、ペプチド、タンパク質、オリ
ゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群から選択される、請求項３４に
記載の組成物。
【請求項３６】
前記タンパク質が抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項３５に記
載の組成物。
【請求項３７】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬＮＡを含む群から選択される、請求項
３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記核酸が機能的核酸であって、好ましくは、前記機能的核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮ
Ａ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含
む群から選択される、請求項３５または３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第１のヘルパー脂質および／または前記第２のヘルパー脂質が、リン脂質およびス
テロイドを含む群から選択されるが、ただし、好ましくは、第１および／または第２のヘ
ルパー脂質がセラミドではない、請求項１から３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第１および／または第２のヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分が、１，２−ジフ
ィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ヘルパー脂質成分の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約２
０モル％から約８０モル％である、請求項３９から４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
前記ヘルパー脂質成分の含有量が約３５モル％から約６５モル％である、請求項４１に
記載の組成物。
【請求項４３】
前記脂質がβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オ
レイル−アミド三塩酸であり、前記ヘルパー脂質が１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリ
セロ−３−ホスホエタノールアミンである、請求項４０から４２のいずれか１項に記載の
組成物。
【請求項４４】
前記脂質が５０モル％であり、前記ヘルパー脂質が、組成物またはリポプレックスの総
脂質含有量の５０モル％である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
さらに第２のヘルパー脂質を含む、請求項１から４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記第１および／または第２のヘルパー脂質が、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロ
キシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）部分、およびポリプロピレン部分を含む群から選択さ
れる基を含み、前記成分が、好ましくは、約５００から１０００Ｄａ、より好ましくは、
約２０００から５０００Ｄａの分子量を提供する、請求項１から４５のいずれか１項に記
載の組成物。
【請求項４７】
前記ＰＥＧ部分を含む前記ヘルパー脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
エタノールアミンを含む群から選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ヘルパー脂質の前記ＰＥＧ部分が、約２，０００から５，０００Ｄａの分子量、好
ましくは２，０００Ｄａの分子量を有する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
組成物が、前記脂質成分としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−
パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸を、第１のヘルパー脂質として１，２−ジフィ
タノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを、および第２のヘルパー脂質
として１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ
２０００を含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記第２のヘルパー脂質の含有量が、前記組成物またはリポプレックスの総脂質含有量
の約０．０５モル％から４．９モル％、好ましくは、約１から２モル％である、請求項４
５から４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から１０モル％、より好ましく
は１から７．５モル％、および最も好ましくは１から５モル％のＰＥＧとセラミドとの複
合体を含む、請求項１から５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記セラミドがＣ８ｍであり、ＰＥＧがＰＥＧ２０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミ
ドの複合体の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から５モル％
である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記セラミドがＣ８ｍであり、ＰＥＧがＰＥＧ５０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミ
ドの前記複合体の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から５モ
ル％である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記第１の脂質成分の含有量が、約４２．５モル％から５０モル％、前記第１のヘルパ
ー脂質の含有量が、約４２．５モル％から５０モル％であって、前記第１の脂質成分、第
１のヘルパー脂質、およびＰＥＧとセラミドとの前記複合体の含有量の合計が１００モル
％である、請求項５０から５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
核酸、好ましくは、機能的な核酸、より好ましくは、二本鎖リボ核酸、および最も好ま
しくは、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む
群から選択される核酸であって、好ましくは、カチオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比
が、約０から０．０７５、好ましくは、約０．０２から０．０５、およびさらにより好ま
しくは０．０３７である核酸をさらに含む、請求項１から５４のいずれか１項に記載の組
成物。
【請求項５６】
前記担体が水性媒体であり、好ましくは、糖含有等張性水溶液であって、前記担体に含
有される脂質組成物が分散物として、好ましくは、リポソームおよび／またはリポプレッ
クスの分散物として存在している、請求項１から５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記脂質組成物が、約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−
Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、約４８から４９モル％の１，２−ジフィ
タノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、および約１から２モル％の１
，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−
グリコールを含み、前記担体が水溶液である、請求項１から５６のいずれか１項に記載の
、好ましくは請求項３１に記載の組成物。
【請求項５８】
好ましくは請求項１から５７のいずれか１項に記載の組成物であるか、または該組成物
に含有されるリポプレックスであって、
ｃ）以下のものからなる正に荷電したリポソーム、
ａａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミ
チル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、好ましくは、（β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−
Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸）
ａｂ）約４８から４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホス
ホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）
ａｃ）約１から２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエ
タノールアミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシ
ポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−
ホスホエタノールアミンナトリウム塩；および
ｄ）機能的核酸、好ましくはｓｉＲＮＡ
を含むリポプレックス。
【請求項５９】
前記リポプレックスのζ電位が約４０から５５ｍＶ、好ましくは約４５から５０ｍＶで
ある、請求項５８に記載のリポプレックス。
【請求項６０】
前記リポプレックスが、ＱＥＬＳによって測定すると、約８０から２００ｎｍ、好まし
くは約１００から１４０ｎｍ、より好ましくは約１１０ｎｍから１３０ｎｍのサイズであ
る、請求項５８または５９に記載のリポプレックス。
【請求項６１】
請求項５８から６０のいずれかに記載のリポプレックスを含む、請求項１から５７のい
ずれか１項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記薬剤を製造するための請求項１から５７および６１のいずれか１項に記載の組成物
、または請求項５８から６０のいずれか１項に記載のリポプレックスの使用。
【請求項６３】
前記薬剤が、核酸、好ましくは機能的核酸を、内皮、好ましくは血管内皮に送達するた
めのものである、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
前記薬剤が、血管形成依存性疾患を治療するためのものである、請求項６２または６３
に記載の使用。
【請求項６５】
前記疾患はがん疾患、より好ましくは固形腫瘍である、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
前記疾患が、腫瘍性疾患を含む群から選択されるが、より好ましくは、前記疾患が、骨
がん、乳がん、前立腺がん、消化器官系のがん、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、腎臓
がん、泌尿生殖器がん、膵臓がん、下垂体がん、精巣がん、眼窩がん（ｏｒｂｉｔａｌ  
ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、中枢神経系のがん、および呼吸器官系のがんを含む群から
選択される、請求項６３から６５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６７】
前記薬剤が、１つまたはいくつかの他の治療法と併用して用いられる、請求項６２から
６６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６８】
前記治療法が、化学療法、寒冷療法、温熱療法、抗体療法、および放射線療法を含む群
から選択される、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
移動剤（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）としての請求項１から５７および６
１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５８から６０のいずれか１項に記載のリ
ポプレックスの使用。
【請求項７０】
前記移動剤が核酸を移動させ、前記核酸は、好ましくは、組成物に含有されている核酸
であるか、または前記核酸は、好ましくは、リポプレックスの核酸成分である、請求項６
９に記載の使用。
【請求項７１】
前記核酸が機能的核酸であり、好ましくはｓｉＲＮＡである、請求項７０に記載の使用
。
【請求項７２】
前記移動剤が、内皮、好ましくは血管内皮に特異的である、請求項６９から７１のいず
れか１項に記載の使用。
【請求項７３】
前記移動剤が、薬学的活性成分および／または更なる構成成分を細胞、好ましくは哺乳
動物細胞、より好ましくはヒト細胞の中に移動させる、請求項６９から７２のいずれか１
項に記載の使用。
【請求項７４】
薬学的活性化合物および／または更なる構成成分を、細胞に、または膜を通過して、好
ましくは細胞膜を通過して移動させる方法であって、
細胞または膜を提供するステップと、
請求項１から５７および６１のいずれかに記載の組成物、または請求項５８から６０の
いずれかに記載のリポプレックスであって、前記組成物が、任意で、薬学的活性化合物お
よび／または更なる構成成分を含むものを提供する工程ステップと、
細胞または膜を、請求項１から５７および６１のいずれかに記載の組成物、または請求
項５８から６０のいずれかに記載のリポプレックスに接触させるステップと
を含む方法。
【請求項７５】
細胞内および／または膜の向こう側で薬学的活性化合物および／または更なる構成成分
を検出するステップをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬学的活性化合物の送達は、過去に既にかなりの注意を引いて来たが、細胞の中で活性
であるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ分子など、新しい治療剤の出現
によって、細胞内への送達の必要性がより重要になり、これまでに様々な方策が追求され
ている。
【０００３】
ｓｉＲＮＡ治療剤の開発に向けた最初の段階において、ｓｉＲＮＡ分子の安定性は、こ
れらの分子をヌクレアーゼによる分解から防ぐ、様々な化学的骨格修飾を取り込むことに
よって強化された（Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，２００３；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ
ａｌ．，２００３；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｏｕｔｓｃｈｅ
ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。例えば、両鎖に交互の２’−Ｏ−メチル修飾パターンを
有する平滑末端のｓｉＲＮＡ分子を開発したが、それらは、非修飾のｓｉＲＮＡよりも血
漿由来ヌクレアーゼに対して有意に抵抗性が強く、形質転換後の哺乳動物細胞における遺
伝子発現のサイレンシングを行う能力を有する（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２
００３）。安定性の問題に加えて、インビボにおけるｓｉＲＮＡ分子の機能的な送達が、
依然としてｓｉＲＮＡ治療薬を開発する上での主な障害であり、必須の条件となっている
（Ｕｐｒｉｃｈａｒｄ，２００５）。ｓｉＲＮＡを利用した治療薬の有効で非毒性の全身
への投与法は、適当な非ウイルス性の送達技術が存在しないため、未だ臨床応用するため
には開発されていない。
【０００４】
特に、ｓｉＲＮＡなどの細胞内活性剤の場合における良好な送達技術は、強く負に荷電
したｓｉＲＮＡを機能的に細胞内に取り込むこと、インビボ送達に特異的な器官および細
胞型の薬力学的性質、および最後には、ｓｉＲＮＡを処方することによる有毒な副作用の
可能性を含む、いくつかの問題に対処する必要がある。これらの問題を克服するために、
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ送達について広範に調べられた方法は、核酸
の直接的化学変質法である。これらの化学的修飾法は、骨格の修飾（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ
ｅｔ  ａｌ．，２００５）か、または輸送ペプチド（Ｍｕｒａｔｏｖｓｋａ  ａｎｄ  
Ｅｃｃｌｅｓ、２００４；Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓｈａｄｉｄｉ  
ａｎｄ  Ｓｉｏｕｄ、２００３；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）または疎水性
残基（例えば、コレステロール（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４））のよ
うな、取り込みを仲介する実体とのコンジュゲートである。いくつかの試薬が、マウスに
おいて、ｓｉＲＮＡの共有結合修飾に代わるものとして、ｓｉＲＮＡの全身への静脈内投
与に使用されている。正に荷電した担体、例えば、プロタミン−抗体融合タンパク質、ナ
ノ粒子、シクロデキストリン含有ポリカチオン、ＰＥＩ、およびアテロコラーゲンなどが
、インビボにおいて適用するために、ｓｉＲＮＡとのコンジュゲート形成について調べら
れている（Ｃｈａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ
．，２００５；Ｌａｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ｅｔ
ａｌ．，２００４；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  ｅｔ  
ａｌ．，２００５；Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。より細胞型特
異的なｓｉＲＮＡ送達を行うために、いくつかのグループは、細胞標的化のための受容体
リガンド（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、または抗体の取り込
み、または結合を行った（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００５】
インビトロにおける哺乳動物細胞への核酸送達には、カチオン性脂質が日常的に使用さ
れ（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、リポプレックス（カチオン性脂質、中
性ヘルパー脂質、および核酸から構成されている）の全身静脈内投与が、インビボにおけ
る遺伝子およびｓｉＲＮＡの送達に利用されている（Ｂａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９
９９；Ｃｈａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｌｉ
ｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｎｏｇａ
ｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。しかし、これま
での研究のほとんどは、概念を実証するために設計され、利用されるｓｉＲＮＡ処方剤の
薬力学的挙動および毒性である可能性についての情報を提供するものではなかった。この
情報は、さらなる臨床開発をするために、具体的な送達技術を正しくリスク便益評価する
上で必要なものである。例えば、生体利用能、細胞型特異的送達、およびインビボにおけ
る薬物動態（投与経路に依存する。ｉ．ｖ．、皮下、経口）が、インビボにおける遺伝子
サイレンシング効果を明らかにすること以外にも評価すべき重要なパラメーターである。
これまでに多数の研究で、様々な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボでの性
質が報告されているが、非処方ｓｉＲＮＡまたは処方ｓｉＲＮＡおよびインビボにおいて
化学修飾されたそれらの類似体の薬力学的挙動についてはほとんど知られていない。化学
修飾されたｓｉＲＮＡを静脈内注射したところ、広範に組織分布したが、肝臓、空腸、お
よび腎臓に選択的に蓄積した（Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｏｕｔｓｃ
ｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。別の研究では、放射性標識されたｓｉＲＮＡは、Ｐ
ＥＩ複合体として腹腔内投与されると、異種移植されたマウスの筋肉組織および腫瘍組織
で主に検出され、肝臓および腎臓ではほとんど検出されない（Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎ  
ｅｔ  ａｌ．，２００５）。しかし、これらの研究は、各器官に存在する多様な細胞型へ
の送達を区別していなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の基礎にある課題は、限定されないが、ｓｉＲＮＡなどの機能的な核酸のための
送達剤を提供することである。さらに、本発明の基礎にある課題は、限定されないが、ｓ
ｉＲＮＡなどの機能的な核酸のための送達剤を提供することによって、その送達が内皮に
対して特異的、より具体的には血管内皮に対して特異的であることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらおよびその他の問題は、本発明の内容によって解決される。より好ましい実施形
態は、従属請求項から得ることができる。
【０００８】
本発明の基礎にある課題は、第１の態様において、担体に含有されるか、担体を含有す
る脂質組成物であって、
少なくとも第１の脂質成分、
少なくとも第１のヘルパー脂質、および
インビボ条件下において、脂質組成物から任意で除去することができる遮蔽化合物を含
む組成物であって、
前記担体を含有する脂質組成物が、約５０から６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ましく
は、約２５０〜３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、およびより好ましくは、約２８０〜３２０
ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇのオスモル濃度であり、かつ／または、
第１の脂質成分、および／または担体中のヘルパー脂質および遮蔽化合物の一方または
両方よって形成されるリポソームの粒子径が約２０から２００ｎｍ、好ましくは、約３０
から１００ｎｍ、より好ましくは、約４０から８０ｎｍである脂質組成物によって解決さ
れる。
【０００９】
本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロ
キシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロピレンからなる群から選択される。
【００１０】
本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物はＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５
０００である。
【００１１】
本発明の第１の態様の実施形態において、組成物は、さらなる構成成分および／または
第２のヘルパー脂質を含む。
【００１２】
本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、ＰＥＧとセラミドのコンジュ
ゲートである。
【００１３】
本発明の第１の態様の実施形態において、セラミドは、６個から１０個の炭素原子、好
ましくは、８個の炭素原子からなる、少なくとも１つの短鎖炭素置換基を含む。
【００１４】
本発明の第１の態様の実施形態において、セラミドが第１のヘルパー脂質である。
【００１５】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、セラミドは第２のヘルパー脂質である。
【００１６】
本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、ｐＨ感受性リンカーまたはｐ
Ｈ感受性成分を含む。
【００１７】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、このリンカーまたは部分はアニオン
性リンカーまたはアニオン性部分である。
【００１８】
本発明の第１の態様のより好ましい実施形態において、このアニオン性リンカーまたは
アニオン性部分は酸性環境においてアニオン性が低いか中性であるが、これにより、好ま
しくは、そのような酸性環境はエンドソームである。
【００１９】
本発明の第１の態様の実施形態において、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分は
、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を
含む群から選択される。
【００２０】
本発明の第１の態様の実施形態において、第１の脂質成分は、下記の化学式（Ｉ）に記
載された化合物であって、
【化１】
2014055167.tif 000003
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、アルキルを含む基から選択され、ｎは１から
４までの任意の整数であり、Ｒ３は、下記の化学式（ＩＩ）に記載のリシル、オルニチル
、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、およびアシル部分であって、
【化２】
2014055167.tif 000004
式中、ｍは１から３までの任意の整数であり、ＮＨ３＋は、任意で存在しなくてもよく、
Ｙ−は薬学的に許容されるアニオンである。
【００２１】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して
、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む基から選択される。
【００２２】
本発明の第１の態様の実施形態において、Ｒ１がラウリル、およびＲ２がミリスチル、
またはＲ１がパルミチル、およびＲ２がオレイルである。
【００２３】
本発明の第１の態様の実施形態において、ｍは１または２である。
【００２４】
本発明の第１の態様の実施形態において、化合物はカチオン性脂質であり、好ましくは
、アニオンＹ−と結合している。
【００２５】
本発明の第１の態様の実施形態において、Ｙ−は、ハロゲン化合物、酢酸、およびトリ
フルオロ酢酸を含む群から選択される。
【００２６】
本発明の第１の態様の実施形態において、化合物は、以下の群
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミ
ド三塩酸、
【化３】
2014055167.tif 000005
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミ
ド三塩酸、および
【化４】
2014055167.tif 000006
ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸
【化５】
2014055167.tif 000007
から選択される。
【００２７】
本発明の第１の態様の実施形態において、オスモル濃度は、糖によってほとんど決定さ
れるが、この糖は、好ましくは、ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マ
ンノース、マルトース、ラクトース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わ
せたものを含む群から選択され、より好ましくは、ショ糖、トレハロース、イヌリン、ラ
フィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択される。
【００２８】
本発明の第１の態様の実施形態において、組成物は、１種類または数種類の塩基性化合
物を含み、このような塩基性化合物は、好ましくは、塩基性アミノ酸、および弱塩基を含
む群から選択される。
【００２９】
本発明の第１の態様の実施形態において、このアミノ酸は、ヒスチジン、リジン、およ
びアルギニンを含む群から選択される。
【００３０】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、弱塩基は、ＴＲＩＳおよびエタノールア
ミンを含む群から選択される。
【００３１】
本発明の第１の態様の実施形態において、塩基性化合物は、ｐＨ調整のために提供され
ている。
【００３２】
本発明の第１の態様の実施形態において、脂質組成物は核酸を含み、このような核酸は
、好ましくは、さらなる構成成分である。
【００３３】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓ
ｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群か
ら選択される。
【００３４】
本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物は核酸に結合している。
【００３５】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、遮蔽化合物は、リンカー部分によっ
て核酸に結合、好ましくは、リンカー部分によって核酸に共有結合している。
【００３６】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、リンカー部分は、ｓｓＲＮＡ、ｓｓ
ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ−Ｓリンカー、およびｐＨ感受性リンカ
ーを含む群から選択される。
【００３７】
本発明の第１の態様の実施形態において、核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉ
ＮＡを含む群から選択され、リンカーは、センス鎖の３’末端に結合している。
【００３８】
本発明の第１の態様の実施形態において、組成物は核酸を含み、この核酸は、リポソー
ムとともにリポプレックスを形成する。
【００３９】
本発明の第１の態様の実施形態において、担体中の脂質濃度は、リポプレックスによっ
て提供される脂質の全体量に基づいて、約０．０１から１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約
０．０１から４０ｍｇ／ｍｌ、およびより好ましくは約０．０１から２５ｍｇ／ｍｌであ
る。
【００４０】
本発明の第１の態様の実施形態において、核酸はｓｉＲＮＡであり、脂質組成物のｓｉ
ＲＮＡの濃度が約０．２から０．４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２８ｍｇ／ｍｌであり、
総脂質濃度が約１．５から２．７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．１７ｍｇ／ｍｌである。
【００４１】
本発明の基礎にある課題は、第２の態様において、本発明の第１の態様に係る組成物、
および任意には薬学的活性化合物、および好ましくは、薬学的に許容される担体を含む薬
学的組成物によって解決される。
【００４２】
本発明の第２の態様の実施形態において、薬学的活性化合物および／または更なる構成
成分は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を
含む群から選択される。
【００４３】
本発明の第２の態様の実施形態において、タンパク質は抗体であり、好ましくはモノク
ローナル抗体である。
【００４４】
本発明の第２の態様の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬ
ＮＡを含む群から選択される。
【００４５】
本発明の第２の態様の実施形態において、核酸は機能的核酸であり、好ましくは、この
機能的核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプ
タマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される。
【００４６】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第１のヘルパー脂質および／また
は第２のヘルパー脂質は、リン脂質およびステロイドを含む群から選択されるが、ただし
、好ましくは、第１および／または第２のヘルパー脂質はセラミドではない。
【００４７】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第１および／または第２のヘルパ
ー脂質またはヘルパー脂質成分は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホス
ホエタノールアミンおよび１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される。
【００４８】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、ヘルパー脂質成分の含有量は、組
成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約２０モル％から約８０モル％である。
【００４９】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、ヘルパー脂質成分の含有量は、約
３５モル％から約６５モル％である。
【００５０】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、脂質はβ−アルギニル−２，３−
ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸であり、ヘルパー
脂質は１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである。
【００５１】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、脂質は５０モル％であり、ヘルパ
ー脂質は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の５０モル％である。
【００５２】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、組成物は、さらに第２のヘルパー
脂質を含む。
【００５３】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第１および／または第２のヘルパ
ー脂質は、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）部分
、およびポリプロピレン部分を含む群から選択される基を含み、その部分が、好ましくは
、約５００から１００００Ｄａ、より好ましくは、約２０００から５０００Ｄａの分子量
を提供する。
【００５４】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、ＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質が
、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２
−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される。
【００５５】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、ヘルパー脂質のＰＥＧ部分が、約
２，０００から５，０００Ｄａの分子量、好ましくは２，０００Ｄａの分子量を有する。
【００５６】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、組成物は、脂質成分としてβ−ア
ルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩
酸を、第１のヘルパー脂質として１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
エタノールアミンを、また第２のヘルパー脂質として１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グ
リセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む。
【００５７】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第２のヘルパー脂質の含有量は、
組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約０．０５モル％から４．９モル％、好ま
しくは、約１から２モル％である。
【００５８】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、組成物は、組成物またはリポプレ
ックスの総脂質含有量の約１から１０モル％、より好ましくは１から７．５モル％、およ
び最も好ましくは１から５モル％のＰＥＧとセラミドとのコンジュゲートを含有する。
【００５９】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、セラミドはＣ８ｍであり、ＰＥＧ
はＰＥＧ２０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートの含有量は、組成物
またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から５モル％である。
【００６０】
本発明の第１および第２の態様の別の好ましい実施形態において、セラミドはＣ８ｍで
あり、ＰＥＧはＰＥＧ５０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートの含有
量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から５モル％である。
【００６１】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第１の脂質成分の含有量は、約４
２．５モル％から５０モル％、第１のヘルパー脂質の含有量は、約４２．５モル％から５
０モル％であって、第１の脂質成分、第１のヘルパー脂質、およびＰＥＧとセラミドのコ
ンジュゲートの含有量の合計が１００モル％である。
【００６２】
本発明の第１および第２の態様のいずれかの実施形態において、組成物は、核酸、好ま
しくは、機能的な核酸、より好ましくは、二本鎖リボ核酸、および最も好ましくは、ＲＮ
Ａｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群から選択さ
れる核酸であって、好ましくは、カチオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比は、約０から
０．０７５、好ましくは、約０．０２から０．０５、およびさらにより好ましくは０．０
３７である核酸をさらに含む。
【００６３】
本発明の第１および第２の態様のいずれかの実施形態において、担体は水性媒体であり
、好ましくは、糖含有等張性水溶液であって、この担体に含有される脂質組成物が分散物
として、好ましくは、リポソームおよび／またはリポプレックスの分散物として存在して
いる。
【００６４】
本発明の第１および第２の態様のいずれかの実施形態において、脂質組成物は、約５０
モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイ
ル−アミド三塩酸、約４８から４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホエタノールアミン、および約１から２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコールを含み、この担体
は水溶液である。
【００６５】
本発明の基礎にある課題は、第３の態様において、リポプレックスによって解決される
が、リポプレックスは、好ましくは、本発明の第１および第２の態様のいずれかに係る組
成物であるか、またはその組成物に含有され、以下を含む。
ａ）以下のものからなる正に荷電したリポソーム、
ａａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチ
ル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、好ましくは、（β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ
−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸）
ａｂ）約４８から４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
エタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）
ａｃ）約１から２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタ
ノールアミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシポ
リエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホエタノールアミンナトリウム塩；および
ｂ）機能的核酸、好ましくはｓｉＲＮＡ。
【００６６】
本発明の第３の態様の実施形態において、リポプレックスのζ電位は約４０から５５ｍ
Ｖ、好ましくは約４５から５０ｍＶである。
【００６７】
本発明の第３の態様の実施形態において、リポプレックスは、ＱＥＬＳによって測定す
ると、約８０から２００ｎｍ、好ましくは、約１００から１４０ｎｍ、より好ましくは、
約１１０ｎｍから１３０ｎｍのサイズを有する。
【００６８】
別の実施形態において、リポプレックスは、好ましくはＱＥＬＳによって測定すると、
約６０ｎｍのサイズを有する。
【００６９】
本発明の第１および第２の態様の実施形態において、組成物は、本発明の第３の態様に
係るリポプレックスを含む。
【００７０】
本発明の基礎にある課題は、第４の態様において、第１および第２の態様のいずれかに
記載された組成物、または本発明の第３の態様に記載されたリポプレックスを薬剤の製造
のために使用することによって解決される。
【００７１】
本発明の第４の態様の実施形態において、薬剤は、核酸、好ましくは機能的核酸を、内
皮、好ましくは血管内皮に送達するためのものである。
【００７２】
本発明の第４の態様の実施形態において、薬剤は、血管形成依存性疾患を治療するため
のものである。
【００７３】
本発明の第４の態様の実施形態において、疾患は、癌疾患、より好ましくは固形腫瘍で
ある。
【００７４】
本発明の第４の態様の実施形態において、疾患は、腫瘍性疾患を含む群から選択され、
より好ましくは、疾患は、骨癌、乳癌、前立腺癌、消化器官系の癌、結腸直腸癌、肝臓癌
、肺癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、膵臓癌、下垂体癌、精巣癌、眼窩癌（ｏｒｂｉｔａｌ  
ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、中枢神経系の癌、および呼吸器官系の癌を含む群から選択さ
れる。
【００７５】
本発明の第４の態様の実施形態において、薬剤は、１つまたはいくつかの他の治療法と
併用して用いられる。
【００７６】
本発明の第４の態様の実施形態において、治療法は、化学療法、寒冷療法、温熱療法、
抗体療法、および放射線療法を含む群から選択される。
【００７７】
本発明の基礎にある課題は、第５の態様において、第１および第２の態様のいずれかに
記載された組成物、または本発明の第３の態様に記載されたリポプレックスを移動剤（ｔ
ｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として使用することによって解決される。
【００７８】
本発明の第５の態様の実施形態において、移動剤は核酸を移動させ、この核酸は、好ま
しくは、組成物に含有される核酸であるか、この核酸は、好ましくは、リポプレックスの
核酸成分である。
【００７９】
本発明の第５の態様の実施形態において、核酸は機能的核酸であり、好ましくはｓｉＲ
ＮＡである。
【００８０】
本発明の第５の態様の実施形態において、移動剤は、内皮、好ましくは血管内皮に特異
的である。
【００８１】
本発明の第５の態様の実施形態において、移動剤は、薬学的活性成分および／または更
なる構成成分を細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞の中に移動させ
る。
【００８２】
本発明の基礎にある課題は、第６の態様において、薬学的活性化合物および／または更
なる構成成分を、細胞内へ、または膜、好ましくは細胞膜を通過して移動させる方法であ
って、以下の工程を含む方法によって解決される。
細胞または膜を提供するステップと、
本発明の第１および第２の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第３の
態様に記載されたリポプレックスであって、組成物が、任意で、薬学的活性化合物および
／または更なる構成成分を含むものを提供する工程ステップと、
細胞または膜を、本発明の第１および第２の態様のいずれかに記載された組成物、また
は本発明の第３の態様に記載されたリポプレックスに接触させるステップ。
【００８３】
本発明の第６の態様の実施形態において、本方法は、さらに以下のステップを含む。
細胞内および／または膜の向こう側で薬学的活性化合物および／または更なる構成成分
を検出するステップ。
【００８４】
本発明者らは、意外にも、未修飾のｓｉＲＮＡ分子または非処方ｓｉＲＮＡ分子とは対
照的に、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスが血管内皮によって強力に取り込まれたことを見出
した。この観察されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスのインビボにおける取り込みは、ノッ
クダウン解析によると、ＲＮＡｉの有効性と相関があった。標的特異的なｓｉＲＮＡ−リ
ポプレックスを反復して全身に静脈内投与すると、内皮特異的に発現される標的遺伝子の
ｍＲＮＡおよびタンパク質が明確にノックダウンされ、機能的取り込みおよびＲＮＡｉに
よるサイレンシング活性を示した。従って、本明細書に記載の脂質組成物は、特異的な送
達、または内皮／内皮細胞、より特異的には、血管内皮を標的とするのに特に有用である
。
【００８５】
更に、本発明者らは、第１の脂質成分に関して、本発明の脂質組成物があると、先行技
術の脂質組成物と比較して少量の脂質により、ｓｉＲＮＡ分子との複合体を形成できるこ
とに気づいた。また、意外なことに、本発明の脂質組成物を用いると、ＨｅＬａ細胞にお
いてインターフェロン応答性のＯＡＳ−１遺伝子およびＯＡＳ−２遺伝子の発現が増加す
ることによって示される、非特異的なインターフェロン応答性も、サイトカインであるＩ
ＦＮ−γおよびＩＬ−１２の誘導も、本発明に従って脂質組成物を用いると観察されなか
った。
【００８６】
最後に、本発明者らは、意外にも、本発明の脂質組成物を用いると、そのような組成物
およびそれから形成されるリポプレックスの比較的特異的な取り込みだけでなく、より重
要なことには、血管内皮細胞によるエンドサイトーシス取り込みの後に、エンドソームか
ら細胞特異的な機能的送達および放出がみられることを見出した。機能的核酸（具体的に
はｓｉＲＮＡ）などの機能的な活性因子が放出されただけで、細胞レベルでその作用を発
揮できる限りにおいて、後者は非常に重要である。
【００８７】
この点から見て、本明細書に開示されている脂質組成物およびリポプレックスは、特に
、限定ではないが、ｓｉＲＮＡなどの機能的な核酸を送達するための薬学的処方剤として
使用されると、様々な疾患のそれぞれの治療および予防に用いることができる。様々な疾
患は、限定ではないが、白血病および血管形成依存性固形癌などであり、これらは、癌腫
、肉腫ならびにリンパ腫のカテゴリ、ならびに、その他の新生物、例えば、骨、乳房、前
立腺、消化器系、直腸結腸、肝臓、肺、腎臓、泌尿生殖器、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、
頭頸部、中枢神経系、呼吸器などのそれぞれのがんおよび腫瘍などを含むが、これらに限
定されない。そのような薬剤および薬学的処方剤を用いることができる更なる疾患は、脳
卒中、潰瘍、アテローム性動脈硬化症、および関節リウマチであり、これらは全部、血管
形成の過剰または不足を特徴としている。言い換えれば、本発明の脂質組成物およびリポ
プレックスはそれぞれ、血管新生を促進および抑制する療法、従って血管新生を改善また
は強化する薬物、または血管新生を低下させる薬物の製造に用いることができる。
【００８８】
さらに、この種の薬剤および薬学的処方剤はそれぞれ、他の治療法、例えば、化学療法
、凍結療法、温熱療法、モノクローナル抗体療法、特にＶＥＧＦ−モノクローナル抗体療
法などの抗体療法、放射線療法などと併用することが可能であろう。
【００８９】
このような種類の薬学的処方剤、およびこのような脂質組成物およびリポプレックスを
それぞれ含む薬剤を使用して原理上治療可能な、更なる具体的な疾患は、以下のリストか
ら選ばれることが可能である：（成人）急性リンパ芽球性白血病、（小児）急性リンパ芽
球性白血病、（成人）急性骨髄性白血病、（小児）急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、（小
児）副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、（小児）星状細胞腫
、（小児）小脳星状細胞腫、（小児）大脳星状細胞腫、胆管癌、肝外胆管癌、膀胱癌、（
小児）膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、（小児）脳幹グリオーマ、（成人）
脳腫瘍、（小児）脳幹グリオーマ脳腫瘍、（小児）小脳星状細胞腫脳腫瘍、（小児）大脳
星状細胞腫／悪性グリオーマ脳腫瘍、（小児）上衣細胞腫脳腫瘍、（小児）髄芽腫脳腫瘍
、（小児）テント上原始神経外胚葉腫脳腫瘍、（小児）視経路および視床下部膠腫、（小
児）脳腫瘍、乳癌、（小児）乳癌、男性乳癌、（小児）気管支腺腫／カルチノイド、バー
キットリンパ腫、（小児）カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、消化器カルチノイド腫
瘍、原発不明癌腫、中枢神経権リンパ腫、原発性中枢神経権リンパ腫、（小児）小脳星状
細胞腫、（小児）大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、
慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、（小児）直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リン
パ腫、子宮体癌、（小児）上衣細胞腫、食道癌、（小児）食道癌、ユーイング腫瘍、（小
児）頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫、眼癌、網膜
芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、（小児）胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外
胚細胞腫瘍、（小児）頭蓋外胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫
瘍、妊娠性絨毛腫瘍、（成人）脳幹グリオーマ、（小児）脳幹グリオーマ、（小児）大脳
星状細胞腫グリオーマ、（小児）視経路および視床下部グリオーマ、有毛細胞白血病、頭
頸部癌、（成人）（原発性）肝細胞癌（肝癌）、（小児）（原発性）肝細胞癌（肝癌）、
（成人）ホジキンリンパ腫、（小児）ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、（小児）視床下部お
よび視経路グリオーマ、眼内黒色腫、（膵臓内分泌部）島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓（腎
細胞）癌、（小児）腎臓癌、喉頭癌、（小児）喉頭癌、（成人）急性リンパ性白血病、（
小児）急性リンパ性白血病、（成人）急性骨髄性白血病、（小児）急性骨髄性白血病、慢
性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、口唇・口蓋癌、（原発性）（成
人）肝臓癌、（原発性）（小児）肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ＡＩＤＳ関連性リ
ンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、（成人）ホジキンリンパ腫、（小児
）ホジキンリンパ腫、（成人）非ホジキンリンパ腫、（小児）非ホジキンリンパ腫、中枢
神経系原発リンパ腫、マクログロブリン血症、ワンデルシュレーム骨悪性線維性組織球腫
／骨肉腫、（小児）髄芽腫、（眼球）眼内黒色腫、メルケル細胞腫、悪性（成人）中皮腫
、（小児）中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、（小児）多発性内分泌腫瘍症候群
、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性
疾患、慢性骨髄性白血病、急性（成人）骨髄性白血病、急性（小児）骨髄性白血病、多発
性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、口蓋および副鼻腔の癌、上咽頭癌、（小児）上咽頭癌、
神経芽細胞腫、（成人）非ホジキンリンパ腫、（小児）非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺
癌、（小児）口腔癌、口蓋癌、口唇および中咽頭癌、骨髄腫／悪性骨繊維性組織球腫、（
小児）卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、（小児）
膵臓癌、膵島細胞癌、副鼻腔・口蓋癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、（小児）松果
体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、脳下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨
髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳癌、妊娠期ホジキンリンパ腫、妊娠期非ホジキンリンパ腫、
原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、（小児）腎細胞（腎
臓）癌、腎盂および尿菅の移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、（小児）横紋筋肉腫
、唾液腺癌、（小児）唾液腺癌、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、（成人）軟部組織肉腫、
（小児）軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、（非メラノーマ）皮膚癌、
（小児）皮膚癌、（メラノーマ）皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、（
成人）軟部組織肉腫、（小児）軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明の頸部扁平上皮癌、
転移性胃癌、（小児）胃癌、（小児）テント上原始神経外胚葉性腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ
腫、精巣癌、（小児）胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、（小児）甲状腺癌、腎盂
および尿管の移行細胞癌、妊娠性絨毛性腫瘍、腎盂および尿管の絨毛性腫瘍、尿道癌移行
細胞癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視路および視床下部膠腫、（小児）視路およ
び視床下部膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍
。
【００９０】
このような特異性を示す脂質組成物およびリポプレックスの特徴を以下に述べる。
【００９１】
本発明者らは、驚くべきことに、核酸、特に、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡ
など、小型の核酸のインビボでの用途における非常に効率のよい送達を、少なくとも第１
の脂質成分、少なくとも第１のヘルパー脂質、および遮蔽化合物を含む脂質組成物を利用
することによって達成できることを見出した。好ましくは、第１のヘルパー脂質は、中性
、すなわち電荷中性または無電荷のヘルパー脂質である。このような脂質組成物は、典型
的には、担体に含有されるが、凍結乾燥状態で存在することも可能である。担体に含有さ
れる脂質組成物は、通常、分散体を形成している。より好ましくは、担体は、本明細書に
おいても更に詳しく特徴が述べられている水性溶媒または水溶液である。脂質組成物は、
一般的には、担体内でリポソームを形成するが、そのようなリポソームも、好ましくは、
内部に担体を含有する。
【００９２】
担体内に含有される脂質組成物、および担体は、それぞれ、オスモル濃度が、好ましく
は約５０〜６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ましくは約２５０〜３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／
ｋｇ、およびより好ましくは約２８０〜３２０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇである。
【００９３】
第１の脂質成分によって、また、任意には、第１のヘルパー脂質によって、好ましくは
第１の脂質成分との組み合わせによって形成されるリポソームの粒子径は、約２０〜２０
０ｎｍ、好ましくは約３０〜１００ｎｍ、およびより好ましくは約４０〜８０ｎｍである
。
【００９４】
更に、粒子のサイズが一定の分布に従うものと理解される。あくまで代表的な粒子サイ
ズの分布が図１ｃに示されているのであって、これは、原則として、他の平均サイズの粒
子にも、すなわち、リポソームおよびリポプレックスのそれぞれにも適用可能である。
【００９５】
本発明に係る脂質組成物の更なる選択的な特徴は、担体のｐＨ値が、好ましくは約４．
０〜６．０であることである。しかし、他のｐＨ範囲、例えば、４．５〜８．０、好まし
くは約５．５〜７．５、およびより好ましくは約６．０〜７．０なども本発明の範囲に含
まれる。
【００９６】
これらの具体的な特徴を実現するために、当分野において周知されているような、様々
な手段をとることができる。例えば、オスモル濃度の調節するについては、糖または糖類
の配合物が特に有用である。その限りにおいて、本発明の脂質組成物は、以下の糖類のう
ちの１つまたはいくつかを含むことができる。ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラ
クトース、マンノース、マルトース、ラクツロース、イヌリン、およびラフィトース、た
だし、ショ糖、トレハロース、イヌリン、およびラフィトースが特に好ましい。特に好ま
しい実施形態において、主に糖の添加によって調節されるオスモル濃度は約３００ｍｏｓ
ｍｏｌｅ／ｋｇであり、これは２７０ｍＭのショ糖溶液または２８０ｍＭのグルコース溶
液に相当する。好ましくは、担体は、そのような脂質組成物が投与されることになる体液
と等張である。本明細書において、主に糖の添加によって調節されるオスモル濃度という
用語は、オスモル濃度の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％が、前記糖
または前記糖類配合物によってもたらされることを意味する。
【００９７】
本発明の脂質組成物のｐＨを調節する場合、基本的には当業者に知られているような緩
衝物質を用いて、これを行う。好ましくは、カチオン性脂質、より具体的には、カチオン
性頭部基のアンモニウム基の塩基性の性質を補うのに適した塩基性物質を用いる。塩基性
アミノ酸および弱塩基などの塩基性物質をそれぞれ添加するときは、上記のオスモル濃度
を考慮すべきである。そのような脂質組成物およびそのような脂質組成物によって形成さ
れるリポソームの粒子サイズは、好ましくは、動的光散乱（ＱＥＬＳ）によって、例えば
、製造業者の指示に従って、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒのＮ５サブミクロン粒子サ
イズ解析装置を使用することによって決定される。
【００９８】
脂質組成物が１個または数個の核酸を含有していれば、そのような脂質組成物は、通常
、リポプレックス複合体、すなわち、リポソームおよび核酸からなる複合体を形成する。
好ましくは等張性の２７０ｍＭショ糖または２８０ｍＭグルコース中のリポプレックスに
おける総脂質含有量の、より好ましい濃度は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましく
は０．０１〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇ／ｍｌである。この濃
度は、適当な保存液を調製するために、一般的には、２〜３倍まで上げることができると
理解されるべきである。このことに基づいて、オスモル濃度が上記で規定された範囲内に
なるように希釈液を調製することも、本発明の範囲に含まれる。より好ましくは、この希
釈液は、脂質組成物に関して使用された担体、またはその中に脂質組成物が含まれている
担体と同一であるか、または機能の点から見て、より具体的には、オスモル濃度の点から
見て類似している担体中で調製される。脂質が核酸、より好ましくは、限定ではないが、
ｓｉＲＮＡなどの機能的核酸を含む、本発明の脂質組成物の実施形態において、脂質組成
物中のｓｉＲＮＡの濃度は、約０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２８ｍｇ／ｍ
ｌであり、総脂質濃度は約１．５〜２．７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．１７ｍｇ／ｍｌで
ある。核酸画分と脂質画分の間のこの質量比が、それによって実現される電荷比に関して
も、特に好ましいと理解されるべきである。本発明の脂質組成物の更なる濃度もしくは希
釈度に関しては、そのような濃度もしくは希釈度にかかわらず、この具体的な実施形態に
おいて実現される質量比および電荷比のそれぞれが、維持されることが好ましい。
【００９９】
例えば、薬学的組成物において用いられる、このような濃度は、適量の媒体、好ましく
は生理学的に許容される緩衝液、または本明細書に記載されているいずれかの担体中に脂
質を分散させることによってか、あるいは、適当な手段で濃縮することによって得ること
ができる。そのような適当な手段は、例えば、クロスフロー限外濾過法などの限外濾過法
である。濾過膜の細孔幅は、約１，０００〜３００，０００Ｄａの分画分子量（ＭＷＣＯ
）または５ｎｍ〜１μｍである。特に好ましいのは、約１０，０００〜１００，０００Ｄ
ａＭＷＣＯの細孔幅である。脂質組成物、より具体的には、本発明に係るリポプレックス
が、凍結乾燥状態で存在し得ることを、当業者は理解する。このような凍結乾燥状態は、
典型的には、リポプレックスの保存期間を延ばすのに適している。特に、適当なオスモル
濃度をもたらすために添加された糖が、それに関しては、抗凍結剤として用いられる。そ
れに関して、前記したオスモル濃度、ｐＨ、およびリポプレックス濃度の特徴は、担体中
で溶解、懸濁または分散している脂質組成物の状態を指すが、そのような担体は、原則と
して、本明細書に記載されている担体のいずれかであって、典型的には、水または生理学
的に許容される緩衝液、好ましくは等張性緩衝液もしくは等張液などの水性担体である。
【０１００】
遮蔽化合物によって、インビボにおける循環時間が延長され、その結果、核酸を含有す
る脂質組成物の生体内分布が改善される。このような機序によって、静脈内投与を行う場
合、脂質組成物は、通常は脈菅系の内壁である、注射部位の周りの組織によって直ちに分
解されないため、そのような脂質組成物の投与部位から比較的離れている、ヒトまたは動
物の体内の部位、より具体的には、哺乳動物の体内の部位を標的化することが可能である
。本明細書で用いられるとき、遮蔽化合物とは、好ましくは、脂質組成物が、血清化合物
、または他の体液の化合物、または、好ましくは、脂質組成物が好ましく投与される血菅
系内壁の細胞質膜の化合物と直ちに相互作用するのを防止する化合物である。遮蔽という
用語は、そのような脂質組成物が投与された身体の免疫系またはその他の防御機構もしく
は除去機構の要素が、脂質組成物と直ちに相互作用せずに、生体内における循環時間を再
度延長することを意味する。この限りにおいて、遮蔽化合物は、抗オプソニン化化合物と
して作用する。いかなる機構または理論に拘泥しようとするものではないが、遮蔽化合物
は、外部環境との相互作用に利用可能な、脂質組成物の表面積を減少させる被覆または被
膜を形成し、それを形成しなければ、そのような相互作用が起こるのには早すぎる時期に
他の脂質と融合したり、人体もしくは動物の体のそれぞれの因子が結合してきたりする脂
質組成物にしてしまうと思われる。ただし、より後期（すなわち、脂質組成物を投与して
から長時間経過後）には、リポソームおよびリポプレックスのペイロードが送達されるた
めには、このような相互作用は、少なくとも一定の程度までは好ましい、または望ましい
と理解しなければならない。遮蔽化合物の観察された有効性に依拠していると考えられる
別の機序は、脂質化合物、特に、核酸、好ましくは、本明細書に規定されているような機
能的核酸、より好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、およびＲＮＡｉを含有する脂質化合
物の総電荷の遮蔽である。ここでも、脂質化合物の相互作用が影響を受けるが、この効果
は、脂質成分の遮断ではなく、電荷の遮断から生じると思われる。本開示に関しては、組
成物は、１種類の脂質しか含むことができないと理解されるべきである。
【０１０１】
遮蔽化合物は、好ましくは、生物学的に不活性な化合物である。より好ましくは、遮蔽
化合物は、その表面上、またはその分子自体にも電荷をもたない。従って、特に好ましい
遮蔽化合物は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルグルコースベースのポリマー
、ポリヒドロキシエチルスターチ（ｐｏｌｙＨＥＳ）、およびポリプロピレンであるが、
該化合物のいずれも、好ましくは約５００〜１００００Ｄａ、より好ましくは約２０００
〜５０００Ｄａの分子量を有する。
【０１０２】
インビボ条件下で、好ましくは、遮蔽化合物を脂質組成物から除去できるということは
、本発明の重要な特徴である。このような除去は、一つの実施形態では、遮蔽化合物自体
を除去することを含むことができるが、異なった実施形態では、遮蔽化合物が、好ましく
は共有結合している化合物とともに遮蔽化合物を除去することも含むことができる。この
ような除去によって、脂質組成物のその他の成分、またはそれらの一部が、動物の体また
は人体などの環境に曝露され、最終的には、脂質組成物に含まれた核酸などの化合物の放
出および送達がそれぞれ可能となる。インビボ条件という用語は、好ましくは、動物、よ
り好ましくは哺乳動物の体、または人体の中、好ましくは、血液、溶液、間質、および細
胞内液などの体液中に存在する状況、ならびに／またはエンドソームおよび／もしくはリ
ソソーム中に存在する状況を意味する。遮蔽化合物の設計に応じて、以下でより詳しく説
明されるような様々な方法で、除去が影響を受けることがあるかもしれない。
【０１０３】
遮蔽剤が失われることから生じる更なる効果は、特に、遮蔽剤がＰＥＧである場合には
、ＰＥＧを有する脂質処方剤を提供する (ＰＥＧ化とも呼ばれる) ことで、そのような脂
質処方剤によって細胞質に送達されるべき核酸分子の機能的な送達がしばしば損なわれる
結果になるという事実によるものである。脂質処方剤にＰＥＧが大量に存在すると、典型
的には脂質処方剤によって形成されるリポソームのエンドソームへの取り込みが損なわれ
るか、または、脂質化合物に含有されているか、それに結合している核酸が、必要なエン
ドソーム脱出を妨害する。
【０１０４】
一つの実施形態において、遮蔽化合物は、セラミドに結合、好ましくは、共有結合して
いる、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロ
ピレンからなる群から選択される。セラミドは、脂質化合物と相互作用し、存在すれば、
ヘルパー脂質と相互作用する。その限りにおいて、セラミドは、第１のヘルパー脂質であ
っても、第２のヘルパー脂質であってもよい。ＰＥＧに結合したセラミドは、第１のヘル
パー脂質とは異なっていることが好ましい。セラミドは、一般的に、好ましくは、第１の
脂質成分および第１のヘルパー脂質によって形成された脂質組成物の脂質画分に埋め込ま
れ、比較的短い炭化水素鎖によって、一定の速度で放出される。セラミドが脂質組成物か
らこのように放出されると、遮蔽剤も同様に放出される。従って、この実施形態では、イ
ンビトロ条件によって脂質処方剤の分解が可能になり、それによって、脂質組成物のイン
ビボにおける寿命または循環時間が延長される。
【０１０５】
更なる実施形態において、遮蔽剤は、脂質組成物に含有されるか、それに結合している
核酸に結合している。好ましくは、遮蔽剤は、核酸に共有結合し、最も好ましくはリンカ
ーを介して共有結合している。より好ましい実施形態において、リンカーは、生理学的条
件下、すなわち、動物またはヒトの体内に広く存在する状況下で切断されるように設計さ
れている。好ましい実施形態において、一定の割合の核酸のみが、リンカーを介して、そ
のような多量体を実際に備える。いかなる理論にも拘泥するものではないが、該脂質組成
物に遮蔽効果をもたらすためには、脂質組成物の一部を形成する一定の数の核酸分子だけ
がそのような巨大成分を持てば十分である。好ましくは、核酸分子の部分は約０〜２０％
、より好ましくは３〜１０％、さらに好ましくは６〜１０％の範囲内にある。遮蔽剤を有
する核酸（本明細書において遮蔽化合物とも呼ばれている）の好ましい含有量は、約０〜
３％、３〜６％、６〜１０％および１０〜２０％であるが、本段落において、および本出
願全体を通して使用されている％は、特に明記しない限り、モル％である。
【０１０６】
このようなリンカーは一本鎖ＲＮＡリンカーであってもよく、より好ましくは、インビ
ボの状態において、もしくはインビボ条件下で存在するＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性に
よって切断される１〜２０個のヌクレオチドを含む一本鎖ＲＮＡリンカーであってもよい
。更なる実施形態において、このリンカーは、インビボ状態において、もしくはインビボ
条件下でも存在するＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断される一本鎖ＤＮＡリンカー
によって形成されている。更なる実施形態において、このリンカーは、二本鎖ＲＮＡまた
は二本鎖ＤＮＡによって形成させることができる。核酸からなるリンカーの安定性は、一
般的には以下の通りである。ｓｓＲＮＡ＜ｄｓＲＮＡ＜ｓｓＤＮＡ＜＜ｄｓＤＮＡ。この
ように安定性が多様であるため、それぞれが、前記リンカーを含む、そのようにして改変
された核酸および脂質組成物の残留時間を特異的に設計すること可能になる。
【０１０７】
更なる実施形態において、リンカーは、インビボの状態もしくはインビボ条件下で存在
するプロテアーゼによって切断されるオリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質
によって形成されることができる。更なる実施形態によって、酸化還元状態に感受性が高
いＳ−Ｓ結合を含むリンカーが提供される。
【０１０８】
更なる実施形態において、リンカーはｐＨ感受性リンカーである。ｐＨ感受性リンカー
という概念は、脂質組成物（原則としてリポプレックスまたはリポソームのいずれかであ
り得る）の取り込みにおいて、遮蔽剤（取り込まれる前の脂質組成物の保護に取りかかる
場合には明らかに有益である）が、細胞内に輸送された化合物の更なる使用に制限を加え
るという観察結果によるものである。本明細書において、遮蔽剤は、好ましい実施形態に
おいてアニオン性部分であるか、またはこれを含む、ｐＨ感受性リンカーと結合している
。エンドソームなどの酸性環境においては、このようなアニオン性部分の電荷が変化する
。それによって、静電学に基づいた、脂質処方剤に含まれたカチオン性脂質とのｐＨ感受
性リンカーの相互作用も変化するが、通常は低下し、その結果、ｐＨ感受性リンカーが、
程度の差はあるが、脂質処方剤を含むカチオン性脂質から徐々に放出される。その結果、
リポソームまたはリポプレックスは遮蔽剤を失って、その影響を細胞の外および／または
中に及ぼすことができる。この種のリンカーは、当分野において知られているようなリン
カー、およびこの種の新規のリンカー、すなわち、この種の特徴を有する新規のリンカー
を含む。好ましくは、そのようなリンカーは、リンカーが上述のように反応することを可
能にする電荷特性を有するリンカーである。そのようなｐＨ感受性リンカーの代表的なも
のは、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢
酸などを含む。そのようなリンカーを遮蔽剤に結合させること、およびそのようなリンカ
ーを、一般に遮蔽剤の部分と言われている遮蔽剤に取り込ませることは、両方とも当業者
に知られている。
【０１０９】
本明細書において本発明に係る化合物とも称される、本発明に係る脂質組成物の第１の
脂質成分として用いられる化合物は、図１に示されているように、Ｒ１−Ｎ−Ｒ２部分に
よって形成された親油基、Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＮＨ３＋）（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ成分によって
形成されたリンカー基、およびＲ３成分によって形成された頭部基を含むものと見なすこ
とができる。本発明者らは、驚いたことに、リンカー基において正電荷を示す、この種の
化合物が、細胞膜全面に、より好ましくは細胞内に、より好ましくは動物細胞内に生物活
性化合物を移動させるのに特に適していることを見出した。また、本発明者らは、驚いた
ことに、生物活性化合物が、核酸、好ましくはｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡである場合には
、本発明に係る化合物によって仲介される移動が特に効率的であることを見出した。
【０１１０】
本明細書において好ましく使用されている、アルキルという用語は、８〜２０個の炭素
原子、好ましくは、１２〜１８個の炭素原子を含有する飽和型脂肪族置換基、または８〜
３０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの二重結合または三重結合をそれぞれ含む、
一価もしくは多価の不飽和型脂肪族置換基を意味する。従って、好ましい実施形態におい
て、アルキルという用語はアルケニルまたはアルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）も含む。アル
キルは、分岐型および非分岐型、すなわち、非線形型または直鎖型のアルキル基を意味す
る。好ましい直鎖型アルキル基は、８〜３０個の炭素原子を含む。より好ましいアルキル
基は、１２〜１８個の炭素原子を含む。好ましい分岐型アルキル基は、８〜３０個の炭素
原子を含むが、８〜３０個の炭素原子という数は、そのような分岐型アルキル基の骨格を
形成している炭素原子の数を意味する。分岐型アルキル基の骨格は、骨格から分岐してい
る、少なくとも１つのアルキル基を含むが、このアルキル基は、本明細書において定義さ
れているアルキル基であり、より好ましくは、短鎖アルキル基を含むアルキル基であり、
より好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜３個、および最も好ましくは１個の炭素原
子を含む。より好ましいのは、骨格に１２〜１８個の炭素原子を含む分岐型アルキル基で
、その分岐アルキル基が上記で定義されているものである。特に好ましいアルキル基はフ
ィタニル基である。
【０１１１】
別の実施形態において、アルキルは、上記に定義されている不飽和型の分岐型アルキル
基または非分岐型アルキル基である。より好ましくは、そのような不飽和型脂肪族炭化水
素置換基が１つ、２つ、または３つ、または４つの二重結合を含むが、二重結合を１つ有
する遊離基が特に好ましい。最も好ましいものは、Ｃ１８：Ｉｄｅｌｔａ９、すなわち、
１８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素であって、９位に、９番炭素原子を１０番炭素
原子に結びつける一重結合ではなく、ｃｉｓ型二重結合が示されているオレイル基である
。
【０１１２】
本明細書において、ｎは１から４の間の任意の整数であって、ｎが１、２、３、および
４であり得ることを意味する。本明細書において、ｍは１から３の間の任意の整数であっ
て、ｍが１、２、および３であり得ることを意味する。
【０１１３】
本発明に係る化合物は、好ましくはカチオン性脂質であると理解されるべきである。よ
り好ましくは、本発明に係る化合物に存在するＮＨ基またはＮＨ２基はどちらも、プロト
ン化型として存在する。典型的には、本発明に係る化合物の正電荷は、アニオンの存在に
よって相殺される。そのようなアニオンは、一価アニオンまたは多価アニオンであっても
よい。好ましいアニオンは、ハロゲン化物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸である。本明
細書におけるハロゲン化物は、好ましくはフッ化物、塩化物、ヨウ化物、および臭化物で
ある。塩化物が最も好ましい。カチオン性脂質が、細胞内に移動する前の生物活性化合物
に結合すると、ハロゲン化物のアニオンが、１個または数個の負電荷を好ましくは示す生
物活性化合物によって置換される。ただし、生物活性化合物の全電荷は負であるとは限ら
ないと認識されるべきである。
【０１１４】
化学式（Ｉ）に記載された任意の化合物は、少なくとも２つの不斉炭素原子を含むと認
認されるべきである。本明細書に記載された、そのような化合物のあらゆる可能な鏡像異
性体、すなわち、特にＲ−Ｒ；Ｓ−Ｓ；Ｒ−ＳおよびＳ−Ｒという鏡像異性体が本明細書
に開示されていることも、本発明の範囲に含まれる。
【０１１５】
本発明に係る化合物は、組成物を形成したり、組成物の一部となったりすることができ
、そのような組成物は担体を含む。本明細書において脂質組成物とも言われる、そのよう
な組成物において、本発明に係る化合物も脂質成分を指す。そのような担体は、好ましく
は液体担体である。好ましい液体担体は、水性担体または非水性担体である。好ましい水
性担体は、水、水性緩衝系、より好ましくは、生理学的緩衝強度および生理食塩濃度を有
する緩衝系である。好ましい非水性担体は、溶媒、好ましくは、エタノール、およびｔｅ
ｒｔ−ブタノールなどの有機溶媒である。いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、原
則として、任意の水混和性有機溶媒も利用することができる。従って、組成物、より具体
的には脂質組成物は、このようにリポソームとして存在したり、リポソームを形成したり
することができるものと認識されるべきである。本発明の脂質組成物に関して規定されて
いるオスモル濃度およびｐＨ、ならびにリポプレックス濃度は、それぞれ、脂質組成物お
よびリポプレックス、ならびに前記担体を含む系を意味することも、本発明の範囲に含ま
れる。
【０１１６】
本発明に係る組成物は、本明細書においてヘルパー脂質成分とも呼ばれているヘルパー
脂質を１つ以上含むことができる。ヘルパー脂質成分は、好ましくは、リン脂質およびス
テロイドからなる群から選択される。リン脂質は、好ましくは、リン酸ジエステルおよび
リン酸モノエステルである。リン脂質の好ましいメンバーはホスホグリセリドおよびスフ
ィンゴ脂質である。本明細書において、ステロイドは、部分的に水素化したシクロペンタ
［ａ］フェナントレンに基づく天然化合物および合成化合物である。好ましくは、ステロ
イドは２１〜３０個の炭素原子を含有する。特に好ましいステロイドはコレステロールで
ある。
【０１１７】
特に好ましいヘルパー脂質は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
エタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−
ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【０１１８】
本発明に係る特に好ましい組成物は、ＤＰｈｙＰＥと一緒に、β−アルギニル−２，３
−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸［♯６］、β−
アルギニル−２，３−ジアモノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三
塩酸［♯１１］またはε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド
三塩酸［♯１５］のいずれかを含み、ＤＰｈｙＰＥの含有量が、約９０〜２０モル％、好
ましくは、８０モル％、６５モル％、５０モル％、および３５モル％である。ただし、モ
ル％という用語は、組成物の総脂質含有量、すなわち、本発明に係るカチオン性脂質、お
よび任意のヘルパー脂質など、別の任意の脂質を含むがこれらに限定されない、組成物の
脂質含有量の百分率を意味する。
【０１１９】
本発明に係る組成物が、好ましくは、本発明に係る化合物および／または本明細書に開
示されているヘルパー脂質のうちの１つもしくはいくつかを含み、本発明に係る化合物、
すなわち、カチオン性脂質、および／またはヘルパー脂質成分が、水性媒体中に分散物と
して存在していることは、本発明の範囲に含まれる。あるいは、本発明に係る化合物、す
なわち、カチオン性脂質、および／またはヘルパー脂質成分は、水混和性溶媒中で溶液と
して存在している。水性媒体として、好ましくは、本明細書に開示されている水性担体の
いずれかを使用する。好ましい水混和性溶媒は、任意の比率で水と均質相を形成する任意
の溶媒である。好ましい溶媒はエタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールである。組成物、
より具体的には、脂質組成物は、このように、リポソームとして存在しているか、リポソ
ームを形成することができると認識されるべきである。
【０１２０】
本発明に係る組成物は、その様々な実施形態において、薬学的組成物として用い、かつ用
いることができると認められるべきである。後者の場合、薬学的組成物は、薬学的活性化
合物、および任意で、薬学的に許容される担体を含む。このような薬学的に許容される担
体は、好ましくは、本発明に係る組成物に関して本明細書において定義されている担体の
群から選択することができる。本明細書に記載されている組成物はいずれも、その成分お
よびその任意の組み合わせが薬学的に許容されれば、原則として、薬学的組成物としても
使用することができることが当業者によって理解される。薬学的組成物は薬学的活性化合
物を含む。そのような薬学的活性化合物は、好ましくは、任意の生物学的活性化合物、よ
り好ましくは、本明細書に開示されている任意の生物活性化合物である、本発明に係る組
成物の更なる構成成分と同じものであり得る。更なる構成成分、薬学的活性化合物、およ
び／または生物活性化合物は、好ましくは、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド
、ポリヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択される。
【０１２１】
好ましくは、そのような生物活性化合物はいずれも、負に荷電した分子である。本発明
者らは、いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、負に荷電した分子という用語は、本
発明に係るカチオン性脂質の正荷電を有する基とイオン対合することができる、少なくと
も１つの負に電荷した基を有する分子を含むことを意味する。原則として、リンカー部分
における正電荷も、リンカーそれ自体、またはカチオン性脂質と負に荷電した分子、すな
わち、生物活性化合物との間で形成される複合体のいずれかの全体的な構造にいくらかの
影響を与えるかもしれない。その一方で、Ｘｕ  Ｙ，Ｓｚｏｋａ  ＦＣ  Ｊｒ．；Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９９６  Ｍａｙ  ０７，３５（１８）：５６１６−２３によって
教示されているように、本発明に係る脂質に導入された更なる正荷電は、米国特許第６，
３９５，７１３号に開示されているカチオン性脂質と比較して、この脂質の毒性を強める
のに寄与するはずである。当業者がこの先行技術文書から期待したものとは対照的に、本
発明に係る化合物は、本明細書において開示されている様々な目的に特に適し、特に、毒
性を欠いているか、または毒性を増加させない。
【０１２２】
本明細書において好ましく使用されるペプチドは、好ましくは、ペプチド結合を介して
、相互に共有結合している、少なくとも２個のアミノ酸からなる任意のポリマーである。
より好ましくは、ペプチドは２個から１０個のアミノ酸からなる。このペプチドの特に好
ましい実施形態は、更に一層好ましくは、約１０個〜約１００個のアミノ酸を含むオリゴ
ペプチドである。本明細書において、好ましく使用されるタンパク質は、相互に共有結合
している複数のアミノ酸からなるポリマーである。好ましくは、そのようなタンパク質は
、少なくとも約１００個のアミノ酸またはアミノ酸残基を含む。
【０１２３】
本発明に係るカチオン性脂質および組成物に関して使用することができる好ましいタン
パク質は、任意の抗体、好ましくは任意のモノクローナル抗体である。
【０１２４】
特に好ましい生物活性化合物、すなわち、薬学的活性化合物、および本発明に係る組成
物に関連して使用される更なる構成成分は核酸である。そのような核酸は、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ＰＮＡ、またはそれらの任意の混合物であってもよい。より好ましくは、核酸は機能
的な核酸である。本明細書において好ましく用いられているような機能的核酸は、ペプチ
ドおよびタンパク質をコードしていない核酸である。好ましい機能的核酸は、ｓｉＲＮＡ
、ｓｉＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびスピーゲルマ
ーであり、これらはすべて当分野において公知である。
【０１２５】
ｓｉＲＮＡは、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８６６６号に記載されて
いる低分子の干渉ＲＮＡである。典型的には、これらの分子は、相互に塩基対形成してい
る、すなわち、典型的にはワトソン−クリック塩基対によって、本質的に相互に相補的で
ある１５〜２５個、好ましくは、１８〜２３個の間のヌクレオチド対を含む二本鎖ＲＮＡ
構造物からなる。この二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡと
本質的に相補的であるのに対し、該二本鎖ＲＮＡ分子のもう一方の鎖は該標的核酸の鎖と
本質的に同一である。ｓｉＲＮＡ分子は、両側および両鎖のそれぞれに、必ずしも塩基対
合する必要のない、いくつかの付加的なオリゴヌクレオチドが配置されていてもよい。
【０１２６】
ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡと本質的に同じ設計を有するが、これらの分子はｓｉＲＮＡと
比較して有意に長い。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、５０個以上のヌクレオチドおよび塩基
対をそれぞれ含む。
【０１２７】
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉと同じ作用様式に基づいて活性である、更なる種類の機能的
核酸がｓｉＮＡである。ｓｉＮＡは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７４６
５４に記載されている。より具体的には、ｓｉＮＡはｓｉＲＮＡに対応しているが、ｓｉ
ＮＡは、リボヌクレオチドを全く含まない。
【０１２８】
本明細書において好ましく使用されているアンチセンス核酸は、標的ＲＮＡ、好ましく
はｍＲＮＡとの塩基相補性に基づいてハイブリダイズして、ＲＮａｓｅＨを活性化させる
オリゴヌクレオチドである。ＲＮａｓｅＨは、リン酸ジエステルおよびリン酸チオエート
に結合したＤＮＡによって活性化される。しかし、リン酸ジエステルに結合したＤＮＡで
、リン酸チオエートに結合したＤＮＡ以外のものは、細胞内ヌクレアーゼによって急速に
分解される。このように、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッ
ド複合体としてのみ効果的である。アンチセンス核酸の好ましい長さは、１６〜２３ヌク
レオチドの範囲である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、特に、米国特
許第５，８４９，９０２号および第５，９８９，９１２号に記載されている。
【０１２９】
機能的核酸の更なる群が、基本的に２つの成分を含むＲＮＡからなる、好ましくは、触
媒活性を有する核酸であるリボザイムである。第１の成分は触媒活性を示すが、第２の成
分は標的核酸との特異性相互作用に関与する。典型的には、ハイブリダイズする２本の鎖
上にある本質的に相補的な塩基鎖のハイブリダイゼーションおよびワトソン−クリック塩
基対形成によって、標的核酸とリボザイムの第２の成分が相互作用すると、触媒活性を有
する成分が活性化する可能性があるが、これは、リボザイムの触媒活性がホスホジエルテ
ル活性であるならば、そのような成分が標的核酸を分子内または分子間で切断することを
意味する。リボザイム、その使用法および設計原理は当業者に公知であり、例えば、Ｄｏ
ｈｅｒｔｙおよびＤｏｕｄｎａ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌｓｔ
ｒｕｃｔ．２０００；３０：４５７−７５）に記載されている。
【０１３０】
機能的核酸の更なる群がアプタマーである。アプタマーは、一本鎖型または二本鎖型い
ずれかのＤ型核酸であって、標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの製造または
選択は、例えば、欧州特許ＥＰ０５３３８３８号に記載されている。ＲＮＡｉ，ｓｉＲＮ
Ａ、ｓｉＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、およびリボザイムとは対照的に、アプタマー
は、標的ｍＲＮＡを全く分解しないが、タンパク質などの標的化合物の二次構造物または
三次構造物と特異的に相互作用する。標的と相互作用すると、標的は、典型的には、その
生物活性に変化を示す。アプタマーの長さは、典型的には、わずか１５ヌクレオチドから
８０ヌクレオチドにも及び、好ましくは、約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの
範囲にある。
【０１３１】
機能的核酸の別のグループが、例えば、国際特許出願第ＷＯ９８／０８８５６号に記載
されているスピーゲルマーである。スピーゲルマーは、アプタマーに類似した分子である
。しかし、スピーゲルマーはアプタマーとは対照的に、全部または大部分が、Ｄ型ヌクレ
オチドではなくＬ型ヌクレオチドからなる。それ以外では、特にスピーゲルマーの可能な
長さについては、アプタマーに関して概説したことがスピーゲルマーに適用される。
【０１３２】
前述したように、本発明者らは、驚くべきことに、本発明に係る化合物、および該化合
物を含む各々の組成物が、ＲＮＡｉ、より具体的には、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡを血管
内皮細胞の中に移動させるのに特に有効となり得ることを見出した。いかなる理論にも拘
泥するつもりはないが、ヘルパー脂質が、ＰＥＧ非含有ヘルパー脂質であっても、あるい
は、特定の実施形態においては、ＰＥＧ含有ヘルパー脂質であってもよいが、本発明に係
る脂質組成物に含有されるヘルパー脂質の特定のモル百分率のために、より具体的には、
この種のヘルパー脂質のいずれかの含有量が、本明細書に規定されている濃度範囲内に含
有されれば、驚くべき効果を実現することができることに注目すべきである。このことに
関して、本発明に係る脂質組成物が、ＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質を含有する場合には
、そのようなＰＥＧ由来ヘルパー脂質含有組成物を用いた送達もしくは形質転換の作用が
、核酸、具体的にはＲＮＡｉ分子、最も具体的には、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセン
スヌクレオチドおよびリボザイムを送達する上で有効であることが特に注目される。
【０１３３】
この理由は、本発明者らが、驚くべきことに、少なくとも第１の脂質成分、および少な
くとも第１のヘルパー脂質によって形成され、約４％以上のＰＥＧ含有ヘルパー脂質を含
有するリポソームは活性がないが、４％未満（好ましくは０％以上３％未満）を含むリポ
ソームは機能的な送達を媒介するが、ただし、ある程度の送達は、原理上、このような限
界を超えても観察されることを見出した。基本的には、本発明者らによって、本発明に係
る脂質組成物中の特定量のＰＥＧが、内皮細胞の効率的な形質転換および内皮細胞への送
達を行うのに適していることが発見された。
【０１３４】
更なる態様において、本発明者らは、驚くべきことに、好ましくはリポプレックスまた
はリポソームとして存在する、本発明に係る脂質組成物が、好ましくは、全体的にカチオ
ン性電荷を示し、少なくとも１つの余分な正電荷を示すことを見出した。より好ましくは
、脂質組成物では、負：正の形の電荷比が約１：１．３〜１：５であることを示す。従っ
て、本発明は、更なる態様において、負：正の形の電荷比が約１：１．３〜１：５である
、少なくとも１つのカチオン性脂質および１つの核酸、また、好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉ
ＲＮＡ、またはｓｉＮＡ、もしくは本明細書に定義されているその他の機能的核酸のいず
れかを含む任意の脂質組成物に関係している。カチオン性脂質は、好ましくは、本明細書
に記載されているカチオン性脂質である。脂質組成物は、好ましい実施形態においては、
本明細書に記載されているヘルパー脂質またはヘルパー脂質を組み合わせたものを含む。
【０１３５】
また、本発明者らは、特に、核酸含有脂質処方剤の全体的なカチオン性電荷に関連して
上記した内容に鑑みて、特に、ｓｉＲＮＡおよびカチオン性脂質のモル比が、本発明に係
る脂質組成物の適用の成功に不可欠であるかもしれないことも見出した。いかなる理論に
も拘泥するつもりはないが、１モルのカチオン性脂質で、特に、本明細書に開示されてい
るものは、１分子あたり最大３つの正の電荷を生じさせることができるが、一方で、核酸
、より具体的には、本明細書に開示されているｓｉＲＮＡ分子は、１分子あたり最大４０
個の負の電荷を生じる。本発明に係るｓｉＲＮＡ含有脂質処方剤を全体的に正に荷電させ
るためには、モル比が、好ましくは、０から最大０．０７５の範囲にわたることができる
。好ましいモル比の範囲は約０．０２〜０．０５であり、さらに好ましくは、約０．０３
７である。本発明の組成物およびリポプレックスのそれぞれの更なる実施形態において、
ｓｉＲＮＡの重量に対する全脂質の重量比は、典型的には、２：１〜１０００：１（ｍ／
ｍ）であるが、ただし、５：１〜１５：１（ｍ／ｍ）の比が好ましく、６：１〜９：１（
ｍ／ｍ）の比が更に好ましい。
【０１３６】
組成物、より具体的には、本発明に係る組成物が、薬学的活性化合物として、および更
なる構成成分としてそれぞれ、本発明に係る組成物に含まれ得る前記の生物活性化合物の
１つ以上を含有し得るということは、本発明の範囲内にあることである。これらの化合物
の任意のものを、原則として、薬学的化合物として使用できることが、当業者には理解で
きる。このような薬学的化合物は、典型的には、疾患の病理学的機序に関与する標的分子
に向けられたものである。様々な生物活性化合物、従って、本発明の態様に関連して使用
される薬学的活性化合物の基礎にある一般的な設計原理および作用様式のために、事実上
いかなる標的も対象とすることができる。従って、本発明に係る化合物およびこれを含有
するそれぞれの組成物は、この種の生物活性化合物を用いて処置、予防および／または治
療することができる疾患または病態を治療または予防するために使用することができる。
これらの生物活性化合物以外に、その他の生物活性化合物も、本発明の任意の実施形態に
係る組成物の一部となり得る。好ましくは、そのような他の生物学的活性化合物は、好ま
しくは、そのような他の生物活性化合物が、本発明に係る化合物、より好ましくは、カチ
オン性脂質として存在する本発明に係る化合物と相互作用するか、複合体を形成する条件
下で、少なくとも１つの負荷電を含む。
【０１３７】
本明細書において、生物活性化合物は、好ましくは、生物学的に活性があり、好ましく
は、何らかの生物学的、化学的、および／または物理的な効果を生体系に対して示す任意
の化合物である。このような生体系は、好ましくは、任意の生化学反応、任意の細胞、好
ましくは、任意の動物細胞、より好ましくは、任意の脊椎動物細胞、最も好ましくは、任
意の哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない、任意のヒト細胞、任意の組織、任意の
器官、および任意の生物などである。このような任意の生物、好ましくは、マウス、ラッ
ト、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、家禽、サル、
およびヒトからなる群から選択される。
【０１３８】
本発明に係る組成物のいずれか、より具体的には、本発明に係る薬学的組成物のいずれ
かは、さらに何らかの薬学的活性化合物を含むことができるということも、本発明の範囲
内にある。
【０１３９】
組成物、具体的には、本発明に係る薬学的組成物は、様々な形の投与法に使用すること
ができるが、局所投与および全身投与が特に好ましい。さらに好ましいのは、筋肉内、経
皮、皮下、静脈内および肺内投与からなる群から選択される投与経路である。本明細書に
おいて好ましく使用される、局所投与とは、組成物および生物活性化合物のそれぞれを投
与すべき細胞、組織、および器官のそれぞれと空間的に近接した関係で、それぞれの組成
物を投与することを意味する。本明細書において、全身投与とは、局所投与とは異なった
投与法であって、より好ましくは、血液および溶液など、それぞれの体液の中に投与し、
それによって、体液が、その組成物および生物活性化合物がそれぞれ送達されるべき細胞
、組織、および器官に組成物を輸送する。しかし、器官移植の場合のようなエクスビボ投
与も、本発明に含まれる。
【０１４０】
本明細書において、本発明に係る化合物および組成物のそれぞれによって生物活性化合
物が移動して行く細胞膜に沿った細胞は、好ましくは、真核生物細胞、より好ましくは、
脊椎動物細胞、さらに好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましい細胞はヒト細胞で
ある。いずれの場合も、当該細胞は内皮細胞である。
【０１４１】
本発明に係る化合物および組成物をそれぞれ用いて製造することができる任意の薬剤は
、それぞれ、患者における疾患を治療および予防するためのものである。好ましくは、そ
のような患者は脊椎動物であり、より好ましくは、哺乳動物であり、さらに好ましくは、
そのような哺乳動物はマウス、ラット、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ
、ヤギ、ウシ、ウマ、家禽、サル、およびヒトである。さらなる態様において、本発明に
係る化合物および組成物は、移動剤として使用することができ、より好ましくは、形質転
換剤として使用することができる。
【０１４２】
本明細書において好ましく使用される移動剤は、本明細書において前述されているよう
に、膜、好ましくは、細胞膜を通して化合物、より好ましくは、薬学的活性化合物のよう
な生物学的活性化合物を移動させる、より好ましく、細胞内にそのような化合物を移動さ
せるのに適した任意の薬である。更に好ましくは、そのような移動は、エンドソームおよ
び／またはリソソームからの放出も含む。好ましい実施形態において、細胞膜という用語
は、小胞膜、エンドソームおよびリソソームの膜など、細胞内部にある膜も含む。
【０１４３】
更なる態様において、本発明は、生物活性化合物によって細胞を移動させる、より具体
的には、形質転換する方法に関係している。工程の順序は必ずしも限定されず、具体的に
は、以下に概説する工程順序に限定されないが、第１のステップにおいて、細胞および細
胞膜がそれぞれ提供される。第２のステップにおいて、本発明に係る化合物もしくは組成
物、および薬学的活性化合物などの生物活性化合物が提供される。この反応は、細胞およ
び膜をそれぞれ接触させることができ、本発明に係る化合物および組成物の生物物理学的
特性のために、生物学的活性化合物は、膜の片側から反対側に、あるいは膜が細胞を形成
する場合は、細胞の外側から内側に移動する。細胞および膜をそれぞれ接触させる前に、
生物活性化合物、および本発明に係る化合物もしくは組成物を接触させると、好ましくは
、複合体が形成され、そのような複合体を細胞および膜のそれぞれと接触させることは、
本発明の範囲に含まれる。
【０１４４】
本発明の更なる態様において、生物活性化合物および薬学的活性化合物それぞれを移動
させる方法は、細胞および膜のそれぞれを提供するステップ、本発明に係る組成物を提供
するステップ、および組成物および細胞ならびに膜をそれぞれ接触させるステップを含む
。細胞および膜のそれぞれを接触させる前またはその過程で、組成物を形成させることが
できることは、本発明の範囲に含まれる。
【０１４５】
本明細書に開示されている生物活性化合物を移動させる任意の方法の実施形態において
、この方法は、さらなるステップ、好ましくは、生物活性化合物が移動したか否かを検出
するステップを含むことができる。そのような検出反応は、本方法に従って移動させられ
る生物活性化合物の種類に強く依存し、当業者には容易に明白である。本明細書に記載さ
れている細胞、組織、器官、および生物に、そのような方法を実施することは、本発明の
範囲に含まれる。
【０１４６】
更なる実施形態において、遮蔽剤は、本明細書に記載した通り、本発明に係る脂質組成
物の脂質成分に、より好ましくは、カチオン性脂質に結合していると認識されよう。
【０１４７】
本明細書において、疾患の治療という用語は、そのような疾患を予防することも含む。
【０１４８】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるが、それらから、更なる
特徴、実施形態および長所を理解することができる。
【実施例】
【０１４９】
実施例１：材料および方法
＜ｓｉＲＮＡ＞
本研究で使用されるｓｉＲＮＡ分子（ＡｔｕＲＮＡｉ）は、両鎖に対する交互２’−Ｏ
−メチル修飾によって安定化された、平滑で１９重合体の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドであり（詳細については、（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）参照）、
ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ社（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａ．Ｍ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成
されたものである。本研究において使用されたｓｉＲＮＡの配列を表１に列挙した。
【表１】
2014055167.tif 000008
【０１５０】
＜ｓｉＲＮＡ−リポプレックスの調製および特徴＞
脂質膜を、ＲＮａｓｅフリーの３００ｍＭ滅菌ショ糖溶液で、総脂質濃度４．３４，ｇ
／ｍｌの３００ｍＭショ糖、ｐＨ＝４．５〜６．０に再水和することによって、β−Ｌ−
アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミ
ド三塩酸である新規のカチオン性脂質ＡｔｕＦＥＣＴ０１（Ａｔｕｇｅｎ  ＡＧ（Ｂｅｒ
ｌｉｎ））、中性／ヘルパー脂質リン脂質である１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐ
ｉｄｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、およびＰＥＧ化脂質であるＮ−（カル
ボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）（Ｌｉｐｏ
ｉｄ  ＧｍｂＨ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を５０／４９／１という
モル比で含むカチオン性リポソームを調製した。そして、この多重膜分散液を、Ｅｍｕｌ
ｓｉＦｌｅｘ  Ｃ３装置（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）を
用いた高圧ホモジナイズ法（７５０バールにて２２サイクル、そして１０００バールにて
５サイクル）によってさらに処理した。ｓｉＲＮＡ−リポプレックス（ＡｔｕＰＬＥＸ）
を生成させるために、得られたリポソーム分散液を、等量の３００ｍＭショ糖液中０．５
６２５ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ溶液と混合したところ、核酸のリン酸骨格対カチオン性脂
質の窒素原子の計算電荷比が約１：４となった。リポソームとリポプレックス分散物のサ
イズを、準弾性光散乱法（Ｎ５  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａ
ｎａｌｙｚｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）によ
って決定し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いてζ電位を測定した。
【０１５１】
ｓｉＲＮＡ−リポプレックスを二重標識するには、蛍光標識されたトレーサー脂質であ
るＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−
ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム塩（ＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）−Ｄ
ＨＰＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を以下の比率で加えて、蛍光標識されたリ
ポソームを生成させた。５０モル％カチオン性脂質（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）／４４モル％
ヘルパー脂質ＤＰｈｙＰＥ／１モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／５モル％ＴｅｘａｓＲｅｄ（登
録商標）ＤＨＰＥ。このリポソームは、混合する前に４００ｎｍポリカーボネート膜に通
す射出サイクルを５１回行って処理し、脂質については全部で最終濃度２．１７ｍｇ／ｍ
ｌ、また０．２８ｍｇ／ｍｌ  ｓｉＲＮＡが得られた（２００μｌを３０ｇのマウスに注
射するのは、１．８８  ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡおよび１４．５ｍｇ／ｋｇ脂質に相当す
る）。
【０１５２】
＜インビトロにおける形質転換およびイムノブロッティング＞
ヒトＨｅＬａ細胞株およびマウスＥＯＭＡ細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手して、ＡＴＣＣの推奨するところに従って培
養した。上記したカチオン性リポソームを用いて、細胞株をｓｉＲＮＡにより形質転換し
た。簡潔に説明すると、細胞を播種してから約１２時間後に、１０％血清含有培地に希釈
した様々な量のｓｉＲＮＡ−リポプレックス溶液を細胞に加えて、形質転換濃度が１〜５
０ｎＭのｓｉＲＮＡの範囲になるようにした。形質転換（４８時間）後の細胞を溶解し、
（Ｋｌｉｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）に記載されているようにしてイムノブロッ
ティングを行った。全タンパク質を抽出するには、組織を切り出して、直ちに液体窒素内
で急冷凍結した。２０ｍｇの組織を、Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ  ３０１（Ｒｅｔｓｃ
ｈ  ＧｍｂＨ，Ｈａａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、タングステンカーバイドビーズ（Ｑｉ
ａｇｅｎ）を用いてホモジナイズし、タンパク質をＮＰ４０−溶解バッファー内で抽出し
た。ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてタンパク質濃度を決定し、以下の
抗体を用いてイムノブロッティング解析を行うために等量をロードした。ウサギ抗ＰＴＥ
Ｎ（Ａｂ−２，Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）、モノクローナルｐ１１０α（Ｋｌｉｐｐｅｌ  
ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ウサギ抗ＰＫＮ３（Ｌｅｅｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０
０４）、ヤギ抗ＣＤ３１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサ
ギ抗Ｔｉｅ−２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１５３】
＜細胞培養およびマウスにおけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の取り込み実験＞
細胞内における非処方ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３分子の取り込み研究では、細胞を、血清含有
培地内で所定量のｓｉＲＮＡ溶液とともに一晩インキュベートした。リポプレックス化ｓ
ｉＲＮＡ−Ｃｙ３の取り込みは、上記のとおり、一晩形質転換して行った。処理した細胞
を氷冷ＰＢＳで洗浄し、顕微鏡観察する前に１５分間、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶
液で固定した。蛍光標識されたｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を用いたインビボにおける送達実験は
、処方されたｓｉＲＮＡおよび未修飾のｓｉＲＮＡを静脈内に投与して行った。最終用量
が１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３および１４．５ｍｇ／ｋｇの脂質となるよう
に２００μｌの単回静脈注射によってマウスを処理し、所定の時点で殺処分して、ホルマ
リン固定パラフィン包埋組織切片またはＯＣＴ固定凍結組織切片のいずれかに対し、蛍光
の取り込みを顕微鏡によって調べた。
【０１５４】
＜組織学的解析および顕微鏡観察＞
マウスを殺処分した後、組織を直ちに４．５％緩衝ホルマリンで１６時間固定し、それ
によって、パラフィン包埋のための処理をした。４μｍの切片を切り出し、スライドガラ
スに載せた。組織切片を、ヤギポリクローナル抗ＣＤ３１抗体／ＰＥＣＡＭ−Ｉ（Ｓａｎ
ｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（あるいは、凍結切片にはラットＣＤ３
１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色して、パラフィン切片内の内皮細胞を可視化した。標
準的なプロトコールに従って、パラフィン組織切片に対する免疫組織化学的検査およびヘ
マトキシリン／エオシン（Ｈ＋Ｅ）染色法を行った。蛍光標識されたｓｉＲＮＡのインビ
ボでの取り込みを研究するために、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を用いた落射蛍
光顕微鏡検査法によってパラフィン切片を直接調べた。画像を記録し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳ
Ｍ５画像化ソフトウェアを用いて処理した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  Ｍｅｔａ共焦点
顕微鏡を用いてｓｉＲＮＡ取り込みの精密顕微鏡分析を行った。そのために、切片をキシ
レンで脱パラフィン化し、エタノールで段階的に洗浄して再水和化し、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒ
ｅｅｎ  ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １００ｎＭ）で対比染色して洗浄
し、最後に、顕微鏡検査するためにＦｌｕｏｒＳａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に載せ
た。
【０１５５】
＜ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によるｍＲＮＡの定量＞
組織を切り出して、直ちに液体窒素内で急冷凍結した。約２０ｍｇの組織を、Ｍｉｘｅ
ｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ  ３０１（Ｒｅｔｓｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｈａａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内
で、タングステンカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてホモジナイズし、全ＲＮＡ
を、Ｉｎｖｉｓｏｒｂ  Ｓｐｉｎ組織ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｅｋ，Ｂｅｒｌｉｎ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製した。以下の単位複製配列セット（ＢｉｏＴｅｚ  Ｇｍ
ＢＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた定量的ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲには
、組織に応じて２５〜１００ｎｇの全ＲＮＡを用いた（ＵＰＲ：上流側プライマー、ＬＷ
Ｒ：顆粒側プライマー、ＰＲＢ：プローブ）：マウスｍＲＮＡに対しＣＤ３１特異的、Ｕ
ＰＲ  ５’ＧＧＧＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣ３’、ＬＷＲ  ５’ＣＡＴＴＡ
ＡＧＧＧＡＧＣＣＴＴＣＣＧＴＴＣ３’、ＰＲＢ  ＦＡＭ−５’ＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＡ
ＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡ３’−ＴＡＭＲＡ；両マウススプライスバリアント
に対しＣＤ３４特異的、ＵＰＲ  ５’ＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＧＴ３’
；ＬＷＲ  ５’ＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＡＣＣ３’；ＰＲＢ  ＦＡＭ−
５’ＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡ３’−ＴＡＭＲＡ；マウ
スｍＲＮＡに対しＴｉｅ２特異的、ＵＰＲ  ５’ＡＴＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧ
ＡＴＧ３’；ＬＷＲ  ５’ＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＴＣＴＧＴＧ３’；ＰＲＢ
ＦＡＭ−５’ＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴ３’−ＢＨ
Ｑｌ。ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ反応は、プライマーを濃度３００ｎＭ、またはプロー
ブを１００ｎＭとし、ＲＴ−ＰＣＲ用の標準的プロトコール（４８℃３０分間、９５℃  
ｌ０分間、４０×（９５℃１５秒間、６０℃１分間）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７
７００配列検出装置（Ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙ
ｓｔｅｍ  ｖｌ．６．３（ＡＢＩ））で行った。ＴａｑＭａｎデータは、比較ＣＴ法を用
いて計算した。ここで、標的ｍＲＮＡ（ＣＤ３１またはＴｉｅ２）の量は、内部参照（Ｃ
Ｄ３４）に対して標準化され、キャリブレーター（ショ糖群）に対して相対的なものであ
るが、式２−ΔΔＣＴによって与えられる。個々のマウスに関するデータは、ＣＤ３１の
ｍＲＮＡ、ＣＤ３４のｍＲＮＡ、またはＴｉｅ２のｍＲＮＡのＣＴとして示され、３回反
復の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。処理群に関するデータは、内部参照に対して標
準化された、ショ糖に対して相対的なΔΔＣＴとして示され、群当たり６〜８匹のマウス
の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。
【０１５６】
＜ＥＬＩＳＡによる可溶型Ｔｉｅ２の定量＞
血清解析には、０日目と５日目に、麻酔をかけたマウスから眼窩静脈叢出血により採血
した。製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡにより可溶型Ｔｉｅ２を測定した（Ｒ＆Ｄ  Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）。
【０１５７】
＜ＥＬＩＳＡによるインターロイキン−１２の定量＞
オスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅ
ｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはｓｉＲＮＡ−リポプレックス溶液（最終用量が１．８８  ｍ
ｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡまたはＰｏＩｙ（Ｉ：Ｃ）、および１４．５  ｍｇ／ｋｇのｌｉｐ
ｉｄ）を２００μｌ尾静脈に単回注射した。注射後２時間目と２４時間目に、麻酔をかけ
たマウスから眼窩静脈叢出血により採血し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）により血清ＩＬ−１２（ｐ４０）
およびインターフェロン−αのレベルを測定した。
【０１５８】
＜マウス研究＞
免疫不全のオスＨｓｄ：ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（９週齢）を、インビボに
おけるｓｉＲＮＡ−リポプレックスの毒性を評価するため、ならびにＲＮＡｉ（インビボ
におけるノックダウン解析）およびＴｉｅ２のＥＬＩＳＡを検出するために用いた。蛍光
標識されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスの器官分布および細胞型分布の顕微鏡による解析
、ならびにＩＬ−１２のＥＬＩＳＡ解析は、免疫適格オスＣ５７ＢＬ／６マウス（８〜１
０週齢）を用いて行った。動物の維持管理および実験は、認可されたプロトコールに従い
、労働保護・健康保護ならびに技術的安全性に関する州庁、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ（Ｎｏ．Ｇ０２６４／９９）のガイドラインに則って行われた。
【０１５９】
＜統計学的解析＞
データは、平均値±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表示されている。差異の統計
的有意性は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定によって決定した。Ｐ値＜０．０５を統
計的に有意であると見なした。
【０１６０】
実施例２：インビトロにおけるｓｉＲＮＡ−リポプレックスの特性
本発明者らは、３’突出を持たない１９重合体のｓｉＲＮＡ二重鎖であって、両鎖上を
交互に２’−Ｏ−メチル糖修飾し、実施例１の表１に図示されているように、修飾されて
いないヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドと反対鎖同士で向き合うようにすることに
よって化学的に安定化されている（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）ｓｉ
ＲＮＡ二重鎖を用いた。
【０１６１】
これら特別に修飾された分子が、ＲＮＡｉ活性を保持しつつ、血清ヌクレアーゼに対す
る抵抗性を促進することが、これまでに細胞培養（エクスビボ）（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  
ｅｔ  ａｌ．，２００３）において明らかにされている。まず、本発明者らは、これらの
分子が、カチオン性リポソームと複合体を形成するか、あるいは非処方（「未修飾」）で
、細胞培養においてＲＮＡｉをもたらすか否かを解析した。本目的のため、本発明者らは
、新規に設計され、ＡｔｕＦＥＣＴ０１と名付けられたカチオン性脂質を、市販されてい
るヘルパー脂質であって、その構造を図１ａに示した脂質と組み合わせて合成した。この
新規の脂質は、高電荷の頭部基に特徴があり、他の市販されているカチオン性脂質、例え
ば、ＤＯＴＡＰやＤＯＴＭＡに比べて効率のよいｓｉＲＮＡ結合ができるようになってい
る。以下の研究では、本発明者らは、正に荷電したリポソーム（５０モル％カチオン性脂
質ＡｔｕＦＥＣＴ０１、４９モル％中性／ヘルパー脂質ＤＰｈｙＰＥ、および１モル％Ｄ
ＳＰＥ−ＰＥＧ）からなるｓｉＲＮＡ−リポプレックスを、様々な標的特異的ｓｉＲＮＡ
分子と組み合わせて用いた。ＱＥＬＳ（９０°の角度における単一モード解析）およびζ
電位測定によって、サイズと電荷について、リポソームおよびｓｉＲＮＡ−リポプレック
スの特徴を調べた。その結果を図１ｃおよび１ｄに示す。代表的なカチオン性脂質処方剤
のζ電位は＋６３ｍＶであったが、本発明に係るリポプレックス処方剤は、＋４６ｍＶと
いうζ電位を示した。
【０１６２】
インビトロ送達について行ったイムノブロット解析によって、図２ａから分かるように
、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスではナノモル濃度が使用されているのに対し、未修飾のｓ
ｉＲＮＡは、マイクロモル濃度でも遺伝子のサイレンシングが起こらなかったことが実証
された。遺伝子サイレンシングが起こらなかったことが、アニオン性ｓｉＲＮＡと負に帯
電した細胞膜との間に反発作用があるために細胞内取り込みが不効率になった結果である
か否かを解析するために、本発明者らは、３’蛍光（Ｃｙ３）標識したｓｉＲＮＡを用い
て、共焦点顕微鏡により、それらの取り込みを調べた。本発明者らは、それ以前に、アン
チセンス分子の３’末端を蛍光標識しても、送達媒体で形質転換すれば、ＲＮＡのサイレ
ンシング活性を損なうことはないことを明らかにしていた。（Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎ
ａ，２００２；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。驚いたことに、本発明
者らは、図２ｂに示したように、高濃度の（１０μＭ）のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３分子を適用
すると、形質転換用試薬がなくても、蛍光標識されたｓｉＲＮＡの有意な取り込みが行わ
れることを観察した。これに対し、１０００倍低いｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３濃度（１０ｎＭ）
にてＡｔｕＦＥＣＴ０１により形質転換させると、同等のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３取り込みが
生じた。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスによって、ｓｉＲＮＡの機能的な
送達にとって以下の２つの有益な効果がもたらされることを示している。細胞内取り込み
の向上、さらに重要なのは、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡ分解が起きる、細胞質の中へのエン
ドサイトーシス／エンドソーム経路から免れることができる（Ｚｅｌｐｈａｔｉ  ａｎｄ
Ｓｚｏｋａ，１９９６）点である。
【０１６３】
実施例３：ＰＥＧ化されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスはインビトロで機能するととも
に、インビボでの適用にも適している。
カチオン性リポソーム粒子が、負に荷電した血清タンパク質と相互作用するか、または
他の血清成分に結合することができるということが示唆されている。これらの非特異的相
互作用は、インビボにおけるリポソーム処方剤の分配・送達特性に消極的な影響を与える
恐れがある。この問題を克服するために、多くのリポソーム担体は、ポリマーであるポリ
（エチレングリコール）、すなわちＰＥＧで被覆され、血清タンパク質または補体系によ
って担体がクリアランスされるのを防止して循環時間を向上させている。また、ＰＥＧの
取り込みは、マクロファージクリアランスを遮蔽および低減させることによってリポソー
ムを安定化するのにも役立ち得る（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｆｅｌｇｎｅ
ｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【０１６４】
ｓｉＲＮＡ−リポプレックスの場合におけるＰＥＧ化の利点を明らかにするため、本発
明者らは、ＰＥＧ化脂質を用いた実験と用いない実験を行った。以下の実験において、本
発明者らは、正に荷電したリポソーム（カチオン性脂質Ａｔｕｆｅｃｔ０１、中性／ヘル
パー脂質ＤＰｈｙＰＥ、および様々な量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）を含んでなるｓ
ｉＲＮＡ−リポプレックスを、様々な標的特異的ｓｉＲＮＡ分子と組み合わせて用いた。
まず、本発明者らは、インビトロにおいて、ＲＮＡ干渉活性に対する様々な量のＰＥＧ化
の効果を測定した。ｓｉＲＮＡＰＴＥＮによる遺伝子サイレンシングは、５モル％のＤＳ
ＰＥ−ＰＥＧ−２０００が存在すると完全に無効になったが、処方剤中に１〜２モル％存
在する場合には維持された。これらの結果は、ＨｅＬａ細胞の形質転換による、様々なモ
ル％のＰＥＧを含むｓｉＲＮＡリポソーム処方剤のウエスタンブロット解析検査を示す図
３ａに示されている（２０ｎＭ（左図）または５ｎＭ（右図）のｓｉＲＮＡ濃度；ｕｔ：
非処理）が、ここでは、抗抗ＰＴＥＮおよび抗ｐ１１０αをプローブにしてタンパク質抽
出物が調べられた。図３ｂに示されているように、１〜２％ＰＥＧ化を、大型の核周辺小
胞から小型で均一の小胞に変えたところ、蛍光標識されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスの
細胞内分布が変化した。これに対し、５モル％のＰＥＧ化では、図３ｂの左図から分かる
ように、リポプレックス化ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３が主に細胞表面に結合してしまうため、Ｒ
ＮＡｉは観察されず（図３ａ）、取り込みが遮断されていると考えられる。ＰＴＥＮ遺伝
子またはＰＫＮ３遺伝子の標的配列に相補的なｓｉＲＮＡを、１モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ
−２０００の存在下または不在下で処方すると、図３ｃから分かるように、ＰＥＧ化され
ているにも関わらず、特異的なｓｉＲＮＡによるタンパク質ノックダウンが観察された。
しかし、ＰＥＧ化された変異体と比較すると（図３ｃ、１ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を比較）
、非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスの方が、より低い濃度で僅かに効率よくタンパ
ク質ノックダウンを生じさせたものの、高い用量（２０ｎＭ、図３ｃ）で適用すると、非
特異的なノックダウン効果も見られた（ｓｉＲＮＡＰＫＮ３−リポプレックスに関するＰ
ＴＥＮローディング用対照参照）。このような非標的タンパク質レベルの非特異的阻害は
、おそらく、インビトロにおける非ＰＥＧ化リポプレックスのより強い毒性作用によるも
のである。
【０１６５】
ｓｉＲＮＡ−リポプレックスのＰＥＧ化が、インビボでも毒性を低下させることができ
るか否かを解析するために、本発明者らは、同一用量のＰＥＧ化（１モル％ＤＳＰＥ−Ｐ
ＥＧ−２０００）および非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスを尾静脈注射によってマ
ウスに適用した。非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックス（以下の４種類のｓｉＲＮＡ配
列を用いた。ｓｉＲＮＡＬｕｃ、ｓｉＲＮＡＰＫＮ３、ｓｉＲＮＡＣＤ３１、およびｓｉ
ＲＮＡＰＴＥＮ）を、全身投与（ｉ．ｖ．）によって毎日連続して（１〜５日目）処理す
ると、時間とともに体重が減少した。一方、図３ｄから分かるように、同じ日用量のＰＥ
Ｇ化変異体（１モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）で処理されたマウスには変化が見ら
れなかった。
【０１６６】
ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスおよび非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスに
よる処理後の体重減少の差異を解明するために、リポプレックス処理に対する免疫反応の
可能性を検討した。そのために、非複合体化ポリ（Ｉ：Ｃ）（陽性対照）、またはＰＥＧ
化ｓｉＲＮＡ−リポプレックス、または非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックス（ｓｉＲ
ＮＡＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡＬｕｃ）の静脈内ボーラス単回注入後、免疫適格マウスにおけ
るインターロイキン−１２（ＩＬ−２）の量を測定した（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ
ａｌ．，２００１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＥＬＩＳＡ解析によって、図
３ｅから分かるように、ＰＥＧ化したにも関わらず、ｓｉＲＮＡ−リポプレックス処理に
よってＩＬ−１２の増加は起きなかったことが明らかになった。従って、非ＰＥＧ化ｓｉ
ＲＮＡ−リポプレックスで処理した時に、非特異的なサイトカイン反応によって、観察さ
れた体重減少が起きたとは考えにくい。まとめると、これらのデータは、ｓｉＲＮＡ−リ
ポプレックス処方剤中１モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００で、充分にインビトロにお
けるＲＮＡｉ効果の顕著な消失を起こすことなく、インビボにおける非特異的副作用を抑
制できることを示している。従って、一定のＰＥＧ化度が、本明細書において特徴づけら
れているｓｉＲＮＡ−リポプレックスの安全で効率的なインビボ適用を行うための重要な
必要条件であると考えられる。
【０１６７】
実施例４：血管内皮へのリポプレックス化ｓｉＲＮＡの特異的取り込みおよび未修飾の
ｓｉＲＮＡの腎排泄
次の工程で、本発明者らは、マウスの全身処理後の非処方ｓｉＲＮＡとの比較したｓｉ
ＲＮＡ−リポプレックスの生体内分布および動態を調べることにした。本目的で、本発明
者らは、Ｃｙ３蛍光標識されたｓｉＲＮＡの単回用量を、脂質と複合体を形成させて（２
００μｌを１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、および１４．５ｍｇ／ｋｇの脂質
という最終用量で静脈内注射）、あるいは非処方で（１５μＭに等しいｓｉＲＮＡ−Ｃｙ
３：０．１８８ｍｇ／ｍｌ）、免疫適格マウスに注射し、落射蛍光顕微鏡法および共焦点
顕微鏡法で調べるために、９つの時点（５分から４８時間）で６種類の異なる器官を切り
出した。最初の顕微鏡解析によって、図４ａの下側の図に示したように、ｓｉＲＮＡ−Ｃ
ｙ３−リポプレックスによる処理後２０分の動物から解析した組織のすべてで蛍光が検出
された。Ｃｙ３−蛍光は、各器官について異なる染色パターンとなって現れた。この器官
特異的Ｃｙ３−染色パターンは、組織内皮の分布に似ている。これに対し、未修飾のｓｉ
ＲＮＡは、注射後２０分には、主に腎臓で見られたが、他の器官では検出できるシグナル
はなかった。これは、非処方ｓｉＲＮＡ分子が速やかに腎排泄されることを示唆している
（図４ａ、上列）。また、適用された未修飾のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３は、注射後５分で近位
尿細管の極および管腔の中、および尿中に蓄積するが、これは、リポプレックス化ｓｉＲ
ＮＡ−Ｃｙ３では見られなかった。結論として、非処方ｓｉＲＮＡは、全身投与後のイン
ビボで解析された組織のいかなる細胞型にも標的とされなかったが、これは、即座に腎排
泄されるためである可能性が最も高い。しかし、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスで
は、顕微鏡による蛍光データによって、ｓｉＲＮＡ分子が、様々な器官の血管系内皮によ
って、顕著に遅いクリアランス速度で取り込まれたことが示唆されている。ｓｉＲＮＡ−
Ｃｙ３−リポプレックスの薬理動態をより詳しく解析するために、本発明者らは、様々な
時点におけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの取り込みをより詳細に比較した。こ
の解析のため、注射（２００μｌを１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、および１
４．５ｍｇ／ｋｇの脂質という最終用量で静脈内注射）して２０分後に最も高いＣｙ３蛍
光量もつ４種類の器官（肺、心臓、肝臓、および脾臓）を選択した。同じ記録用パラメー
ターを用いた顕微鏡検査によってＣｙ３−蛍光を比較した。図４ｂから分かるように、こ
れらの器官すべてにおいて相当量のリポプレックス化ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３が、注射後５分
から蓄積していた。この蛍光量は、心臓と肺の組織では、その後２時間内に次第に減少し
て行った。それに対し、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックス投与後２０分では、ほとん
どの蛍光が脾臓で検出され、この組織では２０時間後までそれが続いた。肝臓では、長時
間にわたってｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスが蓄積し、注射後２時間でＣｙ３蛍光
が最も高量になり、その後４〜２０時間をかけて次第に減少して行った。驚いたことには
、各組織におけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの異なった蛍光染色パターンは、
時間がたっても変化せず、ｓｉＲＮＡ分子が組織全体にわたって拡散しないことを示唆し
ていた。この顕微鏡アッセイ法によって解析した試料のいずれにおいても、ｓｉＲＮＡ−
Ｃｙ３−リポプレックスの単回投与後４８時間目にはＣｙ３蛍光は観察されなかった。こ
れらの結果は、リポプレックスに処方されたｓｉＲＮＡ分子は、未修飾のｓｉＲＮＡとし
て投与されたｓｉＲＮＡ分子と比較して、より良好な器官取り込みを達成することを示し
ている。
【０１６８】
しかし、器官によるｓｉＲＮＡ取り込みが向上したことは、送達されたｓｉＲＮＡが機
能するための必要条件ではあるが、これらの分子の細胞内または細胞型に特異的な取り込
みを必ずしも示すものではない。処方されたｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の心臓および肺への取り
込みを共焦点顕微鏡検査によってさらに詳しく解析したところ、細胞レベルでは、蛍光染
色が、主に血管の内壁に存在することが明らかになり、内皮細胞に送達されることを示唆
した。抗ＣＤ３１抗体を用いた免疫組織化学検査によって、心臓の血管内皮を可視化した
。結果を図４ｃに示す。ＣＤ３１を発現する内皮細胞を染色すると、心筋細胞に沿って多
数の毛細血管が存在することが示される（図４ｃ；矢印：毛細血管の横断面と縦断面）。
これらの毛細管構造は、共焦点顕微鏡検査によって明らかになったように、ｓｉＲＮＡ−
Ｃｙ３−リポプレックスの単回静脈内注射によって処理したマウスの心臓内で標識されて
いた（図４ｃ、右図）。
【０１６９】
ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスで処理したマウスの肺切片の共焦点顕微鏡検査に
よって、図４ｄから分かるように、肺胞壁が強調して染色されるが、細気管支内皮は強調
して染色されないことが明らかになった。抗ＣＤ３１による染色によって可視化された通
り、肺胞壁には、肺胞の毛細管が縦横に行き交っている（図４Ｄ、左図）。そのため、本
発明者らは、本明細書記載のリポソームを用いてリポプレックス化されたｓｉＲＮＡは、
肺の毛細血管内皮に送達されるようになると結論する。同じような内皮細胞特異的ｓｉＲ
ＮＡ取り込みが、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、胃など、他の器官でも観察された。まとめる
と、これらデータは、カチオン性脂質に基づいたｓｉＲＮＡの処方剤が、ｓｉＲＮＡの生
体内分布特性を改善して、身体全体の内皮細胞へのｓｉＲＮＡの主な取り込みを可能にす
ることを明らかにしている。
【０１７０】
実施例５：肺、心臓、および肝臓の血管系における、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスに仲
介されるＲＮＡｉ
ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスで全身処理したマウスは、様々な器官の内皮区画
へのｓｉＲＮＡの送達を示唆している。この観察を行った後、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ
の取り込みと分布を、具体的な器官におけるＲＮＡ干渉の有効性と関連づけようとした。
本目的のため、本発明者らは、以下のインビボ実験を設計した。ヌードマウス（１コホー
ト当たり６〜８匹）を、３種類の標的特異的ｓｉＲＮＡ−リポプレックスで４日間続けて
静脈内注射（日用量：１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、および１４．５ｍｇ／
ｋｇの脂質）によって処理した。２種類の内在遺伝子標的であるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−
Ｉ）およびＴｉｅ２に特異的な強力なｓｉＲＮＡをインビトロで同定し、選択された器官
の血管系におけるＲＮＡｉサイレンシングを明らかにするために適用した。重要なことに
、これら２種類の遺伝子の発現は、内皮細胞に強く限定されている。別のマウス群を、非
特異的作用に対する対照として、並行してショ糖液、またはマウスＰＴＥＮのコード配列
に特異的なｓｉＲＮＡ−リポプレックスによって処理した。ＣＤ３１およびＴｉｅ２とは
対照的に、ＰＴＥＮは、マウスのすべての細胞型において普遍的に発現している。最後に
ｓｉＲＮＡ−リポプレックス処理してから２４時間後に、ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡ
量の変化を測定し、イムノブロット法およびＥＬＩＳＡ法によってタンパク質量の変化を
測定して、遺伝子発現を評価した。これらの結果を図５に示す。全ＲＮＡを、対応する処
理群（ショ糖、ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡＴｉｅ２、ｓｉＲＮＡＣＤ３１）の肺、
心臓、および肝臓から調製し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によって、２種類の
標的遺伝子の内皮におけるｍＲＮＡのノックダウンを解析した。血管内皮細胞に発現が限
定されているもう一つの遺伝子であるＣＤ３４のｍＲＮＡ量を測定し、内皮細胞のＲＮＡ
の同等量に対して標準化した。ＣＤ３４のｍＲＮＡ量に対する標準化したＣＤ３１または
Ｔｉｅ２のｍＲＮＡ量の平均割合を図５ａに示す。それぞれのｍＲＮＡ定量データで明ら
かになったように、ｓｉＲＮＡＴｉｅ２−およびｓｉＲＮＡＣＤ３１−リポプレックスで
処理された動物に由来する試料においてのみ、ＣＤ３１またはＴｉｅ２のｍＲＮＡ量が有
意に減少した。ｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレックス処理群におけるＴｉｅ２のｍＲＮＡ
量の減少、またはｓｉＲＮＡＣＤ３１−リポプレックス群におけるＣＤ３１のｍＲＮＡの
減少は、ｓｉＲＮＡ処理が標的特異的であることを実証している。肝臓において、ｍＲＮ
Ａ量のノックダウンは、Ｔｉｅ２よりも顕著であった（図５ａ、下側の図）が、一方、肺
および心臓では、どちらの標的遺伝子の発現も同じように阻害された。両方の標的遺伝子
のｓｉＲＮＡによる阻害を確認するために、本発明者らは、イムノブロットによりＴｉｅ
２タンパク質の発現の阻害の確認に着手した（図５ｂ）。ｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレ
ックス処理群またはｓｉＲＮＡＣＤ３１−リポプレックス処理群の６〜７匹の個々の動物
から器官のタンパク質ライセートを調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によ
って分離し、対応するイムノブロットを、抗Ｔｉｅ２および抗ＰＴＥＮ（ローディング対
照）をプローブとして調べた。ｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレックス処理された動物の３
種類の器官すべてにおいてＴｉｅ２タンパク質の有意な減少が見られた。肝臓からのタン
パク質ライセートでは、本発明者らは、イムノブロットによって、有意な量のＣＤ３１を
検出することができなかった。しかし、肺および心臓では、有意なｓｉＲＮＡＣＤ３１−
リポプレックス特異的ＣＤ３１タンパク質量の減少が明らかになった。まとめると、これ
らのデータは、マウスの血管内皮において、ｍＲＮＡ量およびタンパク質量に対するｓｉ
ＲＮＡによる「遺伝子サイレンシング」があることを実証している。
【０１７１】
解析した３種類の器官すべてのタンパク質ライセートにおいて、Ｔｉｅ−２タンパク質
の量が有意に減少したため、本発明者らは、ｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレックス処理さ
れた動物の血液において、Ｔｉｅ２の可溶型の量が減少していることを検出することがで
きるか否かを検討した。Ｔｉｅ２タンパク質は、そのリガンドであるアンギオポエチンと
協調して、専ら内皮細胞の中で受容体型チロシンキナーゼとして働き、血管の再構築と完
全性に寄与している（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，２００
３）。Ｔｉｅ２の可溶型であるｓ−Ｔｉｅ２は、受容体の細胞外ドメインをタンパク質切
断した産物であり、ＥＬＩＳＡアッセイによって血液中から簡単に検出することができる
。本発明者らは、ｓ−Ｔｉｅ２  ＥＬＩＳＡの読み取り結果を用いて、ｓｉＲＮＡ−リポ
プレックス処理の前後における血清中のｓ−Ｔｉｅ２の変化を観察した。検査した４つの
マウス群のすべてが、処理前には、同じようなｓ−Ｔｉｅ２量を示していた（０日目；図
５ｃ、左図）。ｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレックス処理されたマウスは、対照コホート
の処理マウス（ショ糖、ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡＣＤ３１）と比較すると、処理
日程の５日目で、有意なｓ−Ｔｉｅ２量の減少を示した（５日目；図５ｃ、右図）。この
結果は、ｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレックスの全身投与によって、おそらく、身体の血
管系内皮においてＴｉｅ２タンパク質の発現が抑制されることによって、インビボにおけ
る全体的なＴｉｅ２遺伝子発現が影響を受けたことを意味している。結論として、Ａｔｕ
ＦＥＣＴ０１に基づくｓｉＲＮＡ−リポプレックスは、静脈内注射後、多くの組織の血管
内皮に標的される。ｓｉＲＮＡ−リポプレックスを繰り返し投与したところ、肺、心臓、
および肝臓などの組織において標的特異的にＲＮＡおよび内皮遺伝子発現のタンパク質の
ノックダウンが生じた。
【０１７２】
実施例６：ｓｉＲＮＡリポプレックスの調製法
＜平均粒子サイズが約１２０ｎｍであるｓｉＲＮＡリポプレックス＞
本出願のリポプレックスをクロロホルム内（ｃ＝２０ｍｇ／ｍｌ）で形成する脂質の溶
液を、混合液内におけるカチオン性脂質のβ−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミ
ノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）
：ヘルパー脂質の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミ
ン（ＤＰｈｙＰＥ）：ＰＥＧ脂質のＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール
−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ナトリウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の比率が５０モル％：４９モル％：１モル％になるよ
うに、１００ｍｌの丸底フラスコに分注した。その後、真空下で溶媒を除去し、得られた
脂質膜を高真空下で４時間乾燥させる。乾燥した脂質に、２７０ｍＭの滅菌ショ糖液を加
え、４．３３５ｍｇ／ｍｌの総脂質濃度にする。超音波洗浄機の中で５分間、短い超音波
処理を行った後、脂質を分散させ、その後、高圧ホモジナイズ処理によってホモジナイズ
する（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｃ３）。リポソームのこのようなホモジナイズは、それらを７５
０バールで２１サイクル、１２５０バールで５２サイクル処理することによって行われる
。このようにして得られたリポソームは、図６に示されているように、ＱＥＬＳ（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎ５およびＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮＳ）に
よって決定すると約８５ｎｍの平均粒子径を有する。
【０１７３】
これらのリポソームを、無菌条件下でさらに処理する。本目的では、それらを、同量の
２７０ｍＭショ糖内ｓｉＲＮＡ溶液（ｃ＝０．５６２５ｍｇ／ｍｌ）と混合する。１５０
０ｒｐｍで振とうしながら、シリンジを用いて、ｓｉＲＮＡ溶液をリポソームに加える。
この結果、平均粒子径が約１２０ｎｍのリポプレックスが形成される。
【０１７４】
このようにして得られたリポプレックスのサイズ分布を図７に示す。粒子径は、ＱＥＬ
Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎ５およびＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ
ＮＳ）によって決定された。
【０１７５】
＜平均粒子サイズが約６０ｎｍであるｓｉＲＮＡリポプレックス＞
平均粒子径が約１２０ｎｍであるｓｉＲＮＡ−リポプレックスの調製物（上記の比率５
０：４９：１で、ｃ＝８６．５ｍｇ／ｍｌの総脂質）に関して上記で特定した脂質を、含
む３０％のｔｅｒｔ−ブタノール中に含む溶液の１ｍｌを、無菌条件下、１５００ｒｐｍ
で振とうしながら、シリンジを用いて、滅菌した２７０ｍＭショ糖溶液１９ｍｌに１分間
以内に加える。このようにすることによって、約３０ｎｍの平均粒子径を有するリポソー
ムを得ることができる。図８は、それぞれのサイズ分布を示している。粒子のサイズは、
ＱＥＬＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎ５およびＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉ
ｚｅｒ  ＮＳ）によって決定した。
【０１７６】
このようにして得られたリポソーム溶液を１．６ｍｌの等量液を、５ｍｌの凍結乾燥用
バイアルに入れた後、−８０℃に急速凍結してから凍結乾燥した。
【０１７７】
リポプレックスを調製するために、１３５ｍｌの滅菌ショ糖溶液中０．２８ｍｇ／ｍｌ
のｓｉＲＮＡ溶液３．２ｍｌを、凍結乾燥物とも呼ばれる凍結乾燥リポソームを含有する
バイアルに注入する。その後、凍結乾燥物と溶液を含有するバイアルを振とうして、凍結
乾燥によって形成された固形物が完全に溶解させた。このようにして得られたリポプレッ
クスは、図９に示すように、約６０ｎｍの平均粒子径を有する。粒子のサイズは、ＱＥＬ
Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎ５およびＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ
ＮＳ）によって決定した。
【０１７８】
参考文献
本明細書において、様々な先行技術文書に言及される限り、当該文書は、その完全な書
誌データは以下の通りであり、それらの全体が参照することにより本明細書に組み込まれ
る。
【表２Ａ】
2014055167.tif 000009
【表２Ｂ】
2014055167.tif 000010
【表２Ｃ】
2014055167.tif 000011
【０１７９】
本明細書、特許請求の範囲、および／または図面において開示されている本発明の特徴
が、別々にでも、それらを組み合わせてでも、様々な形態で本発明を実施するための材料
となる。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１ａ】本発明に係る脂質組成物の構成成分の構造を示す。
【図１ｂ】本発明に係る脂質組成物によって形成されるリポソーム、および脂質組成物とｓｉＲＮＡ分子によって形成される本発明に係るｓｉＲＮＡリポプレックスの略図が示され、ｓｉＲＮＡ分子は、リポソームに含有されるのではなく、リポソームの外面に主に複合体を形成し、これにより負に荷電したｓｉＲＮＡはカチオン性脂質の正の荷電との静電相互作用によって複合される。
【図１ｃ】本発明に係る脂質組成物および本発明に係るｓｉＲＮＡリポプレックスによって形成されるリポソームのサイズを示した図表である。
【図１ｄ】本発明に係る脂質組成物および本発明に係るｓｉＲＮＡリポプレックスによって形成されるリポソームのζ電位を示す図表である。
【図２ａ】ＨｅＬａ細胞における、リポプレックス化ｓｉＲＮＡおよび未修飾のｓｉＲＮＡのそれぞれによる、ＰＫＮ３タンパク質発現の濃度依存的阻害をウエスタンブロット解析した結果を示す。ただし、ＰＴＥＮがローディング対照として用いられている。
【図２ｂ】Ｃｙ３で標識された、未修飾の、または本発明に係るリポプレックスとして投与されたｓｉＲＮＡで処理されたＨｅＬａ細胞を共焦点顕微鏡で撮影した写真を示す。
【図３】図３ａは、様々なモル％のＰＥＧを含むリポソーム製剤を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。
【図３】図３ｂは、０、１、２、および５モル％のＰＥＧを含むｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの細胞内取り込みの共焦点顕微鏡写真を示す。蛍光標識されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスでＥＯＭＡ細胞を形質転換した。注記：５モル％ＰＥＧで、最も多くのリポプレックスが細胞表面を修飾している（矢印）。
【図３】図３ｃは、ウエスタンブロット解析、より具体的には、様々な量のＰＥＧ（１モル％）化されているか、ＰＥＧ化されていないｓｉＲＮＡＰＫＮ３−リポプレックス（上図）またはｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックス（下図）によって形質転換されたＨＵＶＥＣ細胞の抽出物を用いたイムノブロットの結果を示す。ｓｉＲＮＡの最終濃度が示されている（１〜２０ｎＭ；ｕｔ：非処理）。イムノブロットを抗ＰＴＥＮおよび抗ＰＫＮ３をプローブとして調べた。
【図３】図３ｄは、様々な処方剤で５日間にわたって処理されたヌードマウスの体重の変化を示す多様な図表を示す。ここで、マウスは、５日間にわたってｓｉＲＮＡＬｕｃ、ｓｉＲＮＡＰＫＮ３、ｓｉＲＮＡＣＤ３１、およびｓｉＲＮＡＰＴＥＮのＰＥＧ化されたリポプレックス（三角形）またはＰＥＧ化されていないリポプレックス（四角形）で処理された（１〜５日目に単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射）。体重の相対的変化が、各処理群当たり７匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍで示されている。
【図３】図３ｅは、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（各群につきマウス２匹）をポリ（Ｉ：Ｃ）、または図に表示されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスで２時間（暗灰色）または２４時間（明灰色）単回処理したものから採取した血液試料のＩＬ−１２についてのＥＬＩＳＡの結果を示した図表である。
【図４ａ】尾静脈注射から２０分後の様々な組織における、未修飾の（中段）またはリポプレックス化された（下段）ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（１．８８ｍｇ／ｋｇ）の分布を可視化した、パラフィン包埋切片の落射蛍光顕微鏡写真を示す。
【図４ｂ】ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの単回全身静脈内注射後の様々な時点において解析された、心臓、肺、脾臓、および肝臓の落射蛍光顕微鏡写真を示す。組織試料は、（各器官につき）同一の顕微鏡設定で記録した。サイズバー：１００μｍ、ただし、肝臓および脾臓については２００μｍ。
【図４ｃ】毛細血管の横断面と縦断面をラベルする抗ＣＤ３１抗体（矢印）を用いたＩＨＣによって明らかにされた（左側の写真）、心臓における内皮細胞の分布の共焦点顕微鏡写真である。血管系内の内皮細胞がＣｙ３染色されている（右側の写真、矢印）。
【図４ｄ】肺の中の肺毛細血管をラベルする抗ＣＤ３１抗体を用いたＩＨＣによって明らかにされた（左側の写真）、肺における内皮細胞の分布の共焦点顕微鏡写真である（矢印、血管；２倍の矢印、肺胞マクロファージ）。血管系内の内皮細胞がＣｙ３染色されている（右側の写真、矢印）。肺胞マクロファージも強い蛍光を示している（右側の写真、小さな矢印）。
【図５ａ】ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲによって定量すると、ショ糖、ｓｉＲＮＡＣＤ３１−リポプレックス、ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ−リポプレックス、またはｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレックスで４連続日毎日処理された動物の肺、心臓、および肝臓の組織におけるＴｉｅ２（右側の図表）またはＣＤ３１（左側の図表）のｍＲＮＡ量がノックダウンしていることを示す図表である。表示されているｍＲＮＡ量は、ショ糖群と比較した割合であり、ＣＤ３４のｍＲＮＡ量に対して標準化されている。数値は、各群のすべての動物から得られた割合の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図５ｂ】ｓｉＲＮＡＣＤ３１−リポプレックスまたはｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレックスのいずれかによって処理された６〜７個体のマウスからの肺、心臓、肝臓のタンパク質抽出物を抗Ｔｉｅ２、または抗ＣＤ３１および抗ＰＴＥＮ（ローディング対照）でプローブしたイムノブロットを示す。注記：タンパク質の発現量は、Ｔｉｅ−２またはＣＤ３１においてのみ、適用されたリポプレックスに比例して変化しているが、ＰＴＥＮの発現量は変化しなかった。
【図５ｃ】ｓ−Ｔｉｅ２を様々な処方剤の関数として示す、すなわち、ｓｉＲＮＡＴｉｅ２−リポプレックスで４日間毎日処理すると可溶型Ｔｉｅ２（ｓ−Ｔｉｅ２）は減少するが（５日目、左側図表）、対照であるリポプレックス（ｓｉＲＮＡＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡＣＤ３１）およびショ糖では減少していないことを示す図表である。処理群毎に各マウスで測定されたｓ−Ｔｉｅ２量がひし形で示され、処理前（０日目）のマウスの可溶型Ｔｉｅ２量が左側の図表に、処理後のものが右側の図表に示されている。各群についてのｓ−Ｔｉｅ２の平均値を線で示す。
【図６】約１２０ｎｍの平均粒子サイズを有するリポプレックスの調製に適した、平均粒子サイズが約８５ｎｍであるリポソームのサイズ分布を示す図表である。
【図７】約１２０ｎｍの平均粒子サイズを有するリポプレックスのサイズ分布を示す図表である。
【図８】約６０ｎｍの平均粒子サイズを有するリポプレックスの調製に適した、平均粒子サイズが約３０ｎｍであるいくつかのバッチのサイズ分布を示す図表である。
【図９】平均粒子サイズが約６０ｎｍであるリポプレックスのサイズ分布を示す図表である。
【図１ａ】
2014055167.tif 000017
【図１ｂ】
2014055167.tif 000018
【図１ｃ】
2014055167.tif 000019
【図１ｄ】
2014055167.tif 000020
【図２ａ】
2014055167.tif 000021
【図２ｂ】
2014055167.tif 000022
【図３】
2014055167.tif 000023
【図４ａ】
2014055167.tif 000024
【図４ｂ】
2014055167.tif 000025
【図４ｃ．４ｄ】
2014055167.tif 000026
【図５】
2014055167.tif 000027
【図６】
2014055167.tif 000028
【図７】
2014055167.tif 000029
【図８】
2014055167.tif 000030
【図９】
2014055167.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月13日(2013.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に含有される、および／または担体を含有する脂質組成物であって、
少なくとも第１の脂質成分と、ここで、前記第１の脂質成分が、下記の化学式（Ｉ）に記載された化合物であって、
【化１】
2014055167.tif 000032
式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、アルキルを含む基から選択され、
ｎが１から４までの任意の整数であり、
Ｒ３が、下記の化学式（ＩＩ）に記載のリシル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、およびアシル部分であって、
【化２】
2014055167.tif 000033
式中、ｍが１から３までの任意の整数であり、ＮＨ３＋が、任意では存在しなくてもよく、また、
Ｙ−が薬学的に許容されるアニオンであり、
少なくとも第１のヘルパー脂質と、ここで、前記第１のヘルパー脂質が、リン脂質およびステロイドからなる群から選択され、
インビボ条件下において、脂質組成物から任意で除去することができる遮蔽化合物と、ここで、前記遮蔽化合物が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロピレンからなる群から選択される、
を含む組成物であって、
前記担体を含有する前記脂質組成物が、５０から６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇのオスモル濃度を有し、かつ／または、
前記第１の脂質成分、および／または前記担体中の前記ヘルパー脂質および前記遮蔽化合物の一方または両方よって形成されるリポソームの粒子径が３０から１００ｎｍである脂質組成物の、医薬の製造のための使用であって、前記医薬が核酸を含み、肺、心臓、膵臓、小腸、胃、腎臓および脾臓から選択される組織の内皮に前記核酸を送達するためのものである、使用。
【請求項２】
前記リポソームの粒子径が４０から８０ｎｍである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記第１のヘルパー脂質が、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記遮蔽化合物がＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
さらなる構成成分および／または第２のヘルパー脂質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記セラミドが、６個から１０個の炭素原子からなる、少なくとも１つの短鎖炭素置換基を含む、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記セラミドが前記第２のヘルパー脂質である、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
前記遮蔽化合物が、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記リンカーまたは部分がアニオン性リンカーまたはアニオン性部分である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記アニオン性リンカーまたはアニオン性部分が、酸性環境においてはアニオン性が低いか中性であって、好ましくは、前記酸性環境がエンドソームである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ｐＨ感受性リンカーまたは前記ｐＨ感受性部分が、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む群から選択される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
Ｒ１がラウリルおよびＲ２がミリスチルであり、または、
Ｒ１がパルミチルおよびＲ２がオレイルである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
ｍが１または２である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記化合物がカチオン性脂質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
Ｙ−が、ハロゲン化合物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸を含む群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記化合物が、以下の群、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、
【化３】
2014055167.tif 000034
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸、および
【化４】
2014055167.tif 000035
ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸
【化５】
2014055167.tif 000036
から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記オスモル濃度が、糖によってほとんど決定され、前記糖が、ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
１種類または数種類の塩基性化合物を含有し、該塩基性化合物が、塩基性アミノ酸および弱塩基を含む群から選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記アミノ酸が、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンを含む群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記弱塩基が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびエタノールアミンを含む群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記塩基性化合物が、ｐＨ調整のために提供されている、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項２５】
前記遮蔽化合物が核酸に結合している、請求項１〜５および８〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記遮蔽化合物が、リンカー部分によって核酸に結合している、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記リンカー部分が、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ−Ｓリンカー、およびｐＨ感受性リンカーを含む群から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡを含む群から選択され、前記リンカーが、センス鎖の３’末端に結合している、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
組成物が核酸を含み、前記核酸が、リポソームとともにリポプレックスを形成する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記担体中の脂質濃度が、リポプレックスによって提供される脂質の全体量に基づいて、０．０１から１００ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記核酸がｓｉＲＮＡであり、前記脂質組成物のｓｉＲＮＡの濃度が０．２から０．４ｍｇ／ｍｌであり、総脂質濃度が１．５から２．７ｍｇ／ｍｌである、請求項２９または３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記第２のヘルパー脂質が、リン脂質およびステロイドを含む群から選択される、請求項１から３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
前記第１および／または第２のヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分が、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記ヘルパー脂質成分の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の２０モル％から８０モル％である、請求項３２または３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記ヘルパー脂質成分の含有量が３５モル％から６５モル％である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記脂質がβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸であり、前記ヘルパー脂質が１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
前記脂質が５０モル％であり、前記ヘルパー脂質が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の５０モル％である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
さらに第２のヘルパー脂質を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
前記第１および／または第２のヘルパー脂質が、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）部分、およびポリプロピレン部分を含む群から選択される基を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
前記ＰＥＧ部分を含む前記ヘルパー脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ヘルパー脂質の前記ＰＥＧ部分が、２，０００から５，０００Ｄａの分子量を有する、請求項３９に記載の使用。
【請求項４２】
組成物が、前記脂質成分としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸を、第１のヘルパー脂質として１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを、および第２のヘルパー脂質として１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記第２のヘルパー脂質の含有量が、前記組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の０．０５モル％から４．９モル％である、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
前記組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の１から１０モル％のＰＥＧとセラミドとの複合体を含む、請求項６または７に記載の使用。
【請求項４５】
前記セラミドがＣ８ｍであり、ＰＥＧがＰＥＧ２０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミドの複合体の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の１から５モル％である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記セラミドがＣ８ｍであり、ＰＥＧがＰＥＧ５０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミドの前記複合体の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の１から５モル％である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
前記第１の脂質成分の含有量が、４２．５モル％から５０モル％、前記第１のヘルパー脂質の含有量が、４２．５モル％から５０モル％であって、前記第１の脂質成分、第１のヘルパー脂質、およびＰＥＧとセラミドとの前記複合体の含有量の合計が１００モル％である、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群から選択され、ここで、カチオン性脂質に対する核酸のモル比が、０から０．０７５である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
前記担体が水性媒体であり、前記担体に含有される脂質組成物が、リポソームおよび／またはリポプレックスの分散物として存在している、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
前記脂質組成物が、５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、４８から４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、および１から２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコールを含み、前記担体が水溶液である、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
前記内皮が血管内皮である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５２】
前記薬剤が、１つまたはいくつかの他の治療法と併用して用いられる、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
前記治療法が、化学療法、寒冷療法、温熱療法、抗体療法、および放射線療法を含む群から選択される、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
請求項１〜５３のいずれか１項に定義された組成物を含有する、肺、心臓、膵臓、小腸、胃、腎臓および脾臓から選択される組織の内皮に核酸を送達するための医薬組成物。
【請求項５５】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項５４に記載の医薬組成物。