(57)【要約】【課題】細胞培養用培地及び細胞の培養方法、特に角膜内皮細胞増殖用の培養用培地及び培養法を提供。より詳細には、本発明は、無血清条件下で角膜内皮細胞を増殖させることができる細胞培養用培地及び培養法を提供することを目的とする。【解決手段】p21ファミリーの作用を阻害する物質（例、bFGF）、活性酸素を除去する物質（例、アスコルビン酸２-リン酸）、p16INK4aの作用を阻害する物質（例、Bmi1-11R）、及びWntシグナル経路を活性化する物質（BIO）を含有する細胞培養用培地、該培地を用いて細胞を培養することを特徴とする細胞の培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
p21ファミリーの作用を阻害する物質、活性酸素を除去する物質、p16INK4aの作用を阻害する物質及びWntシグナル経路を活性化する物質を含有する細胞培養用培地。
【請求項２】
p21ファミリーの作用を阻害する物質がbFGFである、請求項１記載の培地。
【請求項３】
活性酸素を除去する物質がアスコルビン酸２-リン酸である、請求項１記載の培地。
【請求項４】
p16INK4aの作用を阻害する物質がBmi1-11Rである、請求項１記載の培地。
【請求項５】
Wntシグナル経路を活性化する物質がBIOである、請求項１記載の培地。
【請求項６】
ｂＦＧＦ、アスコルビン酸２-リン酸、Bmi1-11R及びBIOを含有する細胞培養用培地。
【請求項７】
無血清培地である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培地。
【請求項８】
細胞が、角膜内皮細胞、腎尿細管上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、涙腺上皮細胞、顎下腺上皮細胞、耳下腺上皮細胞、肺胞上皮細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培地。
【請求項９】
細胞が、角膜内皮細胞である、請求項８記載の培地。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
【請求項１１】
bFGF、アスコルビン酸２-リン酸、Bmi1-11R及びBIOを含有する細胞培養用培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
【請求項１２】
細胞が、角膜内皮細胞、腎尿細管上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、涙腺上皮細胞、顎下腺上皮細胞、耳下腺上皮細胞、肺胞上皮細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１０又は１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
細胞が、角膜内皮細胞である、請求項１２記載の培養方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の培養方法により培養した角膜内皮細胞を含有する医薬。
【請求項１５】
角膜内皮細胞の単層細胞シートである、請求項１４記載の医薬。
【請求項１６】
p16INK4aの作用を阻害する物質及び／又はWntシグナル経路を活性化する物質を含有する、角膜内皮細胞の減少を伴う疾患の治療薬。
【請求項１７】
Bmi1-11R及び／又はBIOを含有する、角膜内皮細胞の減少を伴う疾患の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用の培地及び細胞の培養方法に関する。特に本発明は、角膜内皮細胞培養用の培地及び角膜内皮細胞の培養方法に関し、より詳細には、無血清条件下で増殖可能な角膜内皮細胞培養用の培地及び無血清条件下で角膜内皮細胞を培養する方法、ならびに該方法により得られた角膜内皮細胞を含有する医薬等に関する。さらに、本発明は角膜内皮細胞の減少を伴う疾患の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜内皮は角膜の最後面に位置する一層の細胞層であり、ポンプ機能とバリア機能により角膜実質の含水率を制御し角膜の透明性の維持に寄与している。ヒト角膜内皮細胞は前房内の房水から栄養を受けており、房水内にはbFGFなどの成長因子（非特許文献１）や、さらに大量のアスコルビン酸が含まれている（非特許文献２）が、それらの因子の存在にもかかわらずヒト角膜内皮細胞は生後には再生能力がなく、その細胞数は加齢と共に低下し、ジストロフィ等の疾病や眼手術によっても低下することが知られている。
【０００３】
細胞数の減少がある段階に達すると内皮機能不全となり、角膜浮腫、水疱性角膜症により視力低下を来す。現在角膜内皮機能不全は角膜移植の最も主要な適応疾患となっている。一方で、本邦の角膜移植の待機患者が約６，０００名であるのに対し、提供眼球数は年間１，５００眼程度であり、手術までの長い待機期間があるのが問題となっている。そのため角膜内皮細胞を分裂増殖させる方法の開発が求められている。現在、培養増殖させたヒト角膜内皮細胞（非特許文献３〜８）や、体性幹細胞（非特許文献９）あるいはヒトiPS細胞から誘導した角膜内皮細胞を移植に用いることでドナー不足の問題を解消する試み
が研究されているが、いまだ臨床応用には至っていない。また、ROCK阻害剤により生体内でヒト角膜内皮細胞を増殖あるいはアポトーシスを抑制することで角膜浮腫を改善させる試みがなされているが、十分な効果をあげているとはいえない（非特許文献１０）。
【０００４】
これまで試みられてきたヒト角膜内皮細胞培養法では、少なくとも２％以上の濃度のウシ胎仔血清(FBS)等の動物由来血清や、動物細胞由来のconditioned mediumを培養液中に添加することが必須であり、さらにさまざまな増殖因子の添加が必須であった（非特許文献３〜８）。これらの要因が複雑に絡み合うため、なぜヒト角膜内皮細胞に増殖能がなく、ヒト角膜内皮細胞の増殖に必須な因子が何であるかが全く不明であった。また、培養ヒト角膜内皮細胞を用いた角膜内皮移植を臨床応用する際に、これらの動物由来製品の安全性に問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Schulz MW, et al., Development. 1993;118(1):117-126.
【非特許文献２】Taylor A, et al., Curr Eye Res. 1997;16(9):857-64.
【非特許文献３】Koizumi N, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48(10):4519-26.
【非特許文献４】Peh GS, et al., Transplantation. 2011;91:811-819.
【非特許文献５】Ishino Y, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:800-806.
【非特許文献６】Zhu C, and Joyce NC. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:1743-1751.
【非特許文献７】Li W, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48:614-620.
【非特許文献８】Engelmann K, and Friedl P. In Vitro Cell Dev Biol. 1989;25:1065-1072.
【非特許文献９】Hatou S, et al., Stem Cells Dev. 2013;22:828-39.
【非特許文献１０】奥村直毅， 水疱性角膜症に対する新しい治療法の開発， 角膜カンファランス2012，  東京， 2012年2月23日.
【非特許文献１１】Wang Y, et al., Mol Vis. 2012;18:803-815.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、細胞培養用培地及び細胞の培養方法、特に角膜内皮細胞増殖用の培養用培地及び培養法を提供することであり、より好ましくは無血清条件下で角膜内皮細胞を増殖させることができる細胞培養用培地及び培養法を提供することである。さらに本発明は、本発明の方法により得られた角膜内皮細胞を用いた医薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、無血清培地に特定の因子を加えることで、無血清条件下で角膜内皮細胞を増殖させることができることを見出して本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］p21ファミリーの作用を阻害する物質、活性酸素を除去する物質、p16INK4aの作用を阻害する物質及びWntシグナル経路を活性化する物質を含有する細胞培養用培地。
［２］p21ファミリーの作用を阻害する物質がbFGFである、上記［１］記載の培地。
［３］活性酸素を除去する物質がアスコルビン酸２-リン酸である、上記［１］記載の培地。
［４］p16INK4aの作用を阻害する物質がBmi1-11Rである、上記［１］記載の培地。
［５］Wntシグナル経路を活性化する物質がBIOである、上記［１］記載の培地。
［６］ｂＦＧＦ、アスコルビン酸２-リン酸、Bmi1-11R及びBIOを含有する細胞培養用培地。
［７］無血清培地である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の培地。
［８］細胞が、角膜内皮細胞、腎尿細管上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、涙腺上皮細胞、顎下腺上皮細胞、耳下腺上皮細胞、肺胞上皮細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の培地。
［９］細胞が、角膜内皮細胞である、上記［８］記載の培地。
［１０］上記［１］〜［９］のいずれかに記載の培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
［１１］ｂＦＧＦ、アスコルビン酸２-リン酸、Bmi1-11R及びBIOを含有する細胞培養用培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
［１２］細胞が、角膜内皮細胞、腎尿細管上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、涙腺上皮細胞、顎下腺上皮細胞、耳下腺上皮細胞、肺胞上皮細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１０］又は［１１］に記載の培養方法。
［１３］細胞が、角膜内皮細胞である、上記［１２］記載の培養方法。
［１４］上記［１３］に記載の培養方法により培養した角膜内皮細胞を含有する医薬。
［１５］角膜内皮細胞の単層細胞シートである、上記［１４］記載の医薬。
［１６］p16INK4aの作用を阻害する物質及び／又はWntシグナル経路を活性化する物質を含有する、角膜内皮細胞の減少を伴う疾患の治療薬。
［１７］Bmi1-11R及び／又はBIOを含有する、角膜内皮細胞の減少を伴う疾患の治療薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、（１）培養ヒト角膜内皮細胞を用いた角膜内皮移植を臨床応用する際の、動物由来製品の安全性の問題を解消でき、さらに（２）ヒト生体内で角膜内皮細胞を増殖させる、角膜移植に頼らない新たな治療法が開発できる可能性があり、（１）、（２）とも本邦のドナー不足の問題の解決につながる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の細胞培養用培地、及び本発明の細胞培養方法により、角膜内皮細胞の増殖が促進されることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
１．細胞培養用培地（以下、本発明の培地とも称する）及び培養方法
本発明の培地及び培養方法は、（１）p21ファミリーの作用を阻害する物質、（２）活性酸素を除去する物質、（３）p16INK4aの作用を阻害する物質、及び（４）Wntシグナル経路を活性化する物質の４つの成分を必須的に使用することを特徴とする。
（１）p21ファミリーの作用を阻害する物質
p21ファミリーにはp21、p27、p57が含まれる。p21は、Waf1あるいはCip1とも称され、細胞の核に局在する分子量２１ｋＤａのタンパク質であり、１６４個のアミノ酸からなる。p27はKip1とも称され、細胞の核に局在する分子量２７ｋＤａのタンパク質であり、１９７個のアミノ酸からなる。p57はKip2とも称され、細胞の核に局在する分子量５７ｋＤａのタンパク質であり、３１６個のアミノ酸からなる。細胞内で合成されたこれらのp21ファミリーは核へと移行し、サイクリン（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅのいずれか）とCdk（Cdk2、Cdk4、Cdc2のいずれか）さらにはＳ期の核内においてはPCNAと結合し、ヘテロ四量体を形成する。p21ファミリーが結合したサイクリン／Cdk複合体は、そのキナーゼ活性が強く阻害されるため、それ以降の増殖シグナルであるRBタンパクのリン酸化、E2Fの活性化、さらにはＤＮＡポリメラーゼやチミジンキナーゼ、DHFR、Myc、Cdc2、サイクリンＡ等の合成を誘導しない。結果として、細胞のp21ファミリーを過剰発現させると、その細胞の分裂は停止し、細胞増殖が抑制される。
本発明において使用する「p21ファミリーの作用を抑制する物質」は、p21、p27及びp57のいずれか１つ、２つ、あるいは３つ全ての作用を阻害するものであり得る。具体的には、bFGF、VEGF、sonic hedgehog、EGF等が挙げられるがこれらに限定されない。これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
本発明では、好ましくは、bFGFが用いられる。p21ファミリーの作用を阻害する物質の培地中の濃度は、用いる物質の種類によって適宜設定されるが、bFGFの場合、通常０．５〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ程度である。１種又は２種以上の物質を組み合わせて用いても良い。
【００１２】
（２）活性酸素を除去する物質
活性酸素は細胞に対して有毒であることが知られている。本発明において使用する活性酸素を除去する物質としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジスムターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステル（例、アスコルビン酸２−リン酸）、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物（例、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Se-メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、アデノシン−５’−ホスホセレン酸、Se−アデノシルセレノメチオニン）、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ジブチルリルｃＡＭＰなどを例示することができる。これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
本発明では、好ましくは、アスコルビン酸２−リン酸が用いられる。活性酸素を除去する物質の培地中の濃度は、用いる物質の種類によって適宜設定されるが、アスコルビン酸２−リン酸の場合、通常０．１〜１ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ程度である。１種又は２種以上の物質を組み合わせて用いても良い。
【００１３】
房水内にはbFGF等の成長因子（非特許文献１）や大量のアスコルビン酸が含まれており（非特許文献２）、それらの因子の存在にもかかわらずヒト角膜内皮細胞は生後には再生能力がなく、その細胞数は加齢と共に低下することが知られている。また、bFGFとアスコルビン酸２−リン酸の添加によるヒト角膜内皮細胞培養の報告は種々あるが、いずれもウシ胎仔血清等の動物由来血清の添加が必要であった。本発明では上記２成分に加え以下の２成分を用いることで動物由来血清を添加する必要がなくなった。
【００１４】
（３）p16INK4aの作用を阻害する物質
p16INK4a蛋白質は、増殖中の正常細胞ではその発現レベルがきわめて低いが、細胞が分裂を繰り返し、分裂寿命に達すると発現レベルが著しく上昇し、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を不活性化し、細胞周期をＧ１期で停止させることにより細胞老化に至らせることが知られている。即ちp16INK4aの作用を阻害することは細胞の若返り、増殖促進に繋がる。本発明において使用する「p16INK4aの作用を阻害する物質」としては、Bmi1、DNMT1等の蛋白質成分やCyclic Pifithrin-α等の低分子化合物が挙げられ、これらは間接的にp53を阻害する。これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
Cyclic Pifithrin-αとしては、以下式：
【００１５】
【化１】
2014209904.tif 000002
【００１６】
で表されるCyclic Pifithrin-α hydrobromide (CAS登録番号：511296-88-1)が挙げられる。
また、Bmi1としては組換え体であるBmi1-11Rが商業的に入手可能である。
本発明では、好ましくは、Bmi1-11R又はCyclic Pifithrin-αが用いられる。p16INK4aの作用を阻害する物質の培地中の濃度は、用いる物質の種類によって適宜設定されるが、Bmi1-11Rの場合、通常０．５〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌ程度であり、Cyclic Pifithrin-αの場合、通常、フリー体の濃度で１〜２０μＭ、好ましくは１０μＭ程度である。１種又は２種以上の物質を組み合わせて用いても良い。
【００１７】
（４）Wntシグナル経路を活性化する物質
Wntシグナルは、細胞増殖活性のあるWnt/β−カテニン経路と、細胞形態や移動を制御するWnt経路に大別される。本発明において使用される「Wntシグナル経路を活性化する物質」は、Wnt/β−カテニン経路を活性化する物質であり、具体的には、CHIR98014、CHIR99021、ケンパウロン（Kenpaullone）、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119、SB415286、およびRo3303544等のＧＳＫ３β阻害剤が例示される。ＧＳＫ３βを阻害することによりWntシグナルが活性化される。
各ＧＳＫ３β阻害剤の構造とCAS登録番号を表１に示す。
【００１８】
【表１−１】
2014209904.tif 000003
【００１９】
【表１−２】
2014209904.tif 000004
【００２０】
これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
本発明では、好ましくは、BIO（6-Bromoindirubin-3'-oxime）が用いられる。Wntシグナル経路を活性化する物質の培地中の濃度は、用いる物質の種類によって適宜設定されるが、BIOの場合、通常０．５〜５μＭ、好ましくは１μＭ程度である。１種又は２種以上の物質を組み合わせて用いても良い。
【００２１】
本発明で用いる培地は、上記４成分を含有している限り特に限定されず、通常、細胞を培養するのに用いられる培地（以下、便宜上、基礎培地とも称する）に上記した４成分を添加してなるものである。基礎培地としては、例えば、MEM培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの培地は、商業的に入手可能である。さらに本発明で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得る。本工程で用いられる培地が血清含有培地である場合には、ウシ血清（Bovine Serum）、ウシ胎仔血清（Fetal Bovine Serum）などの哺乳動物の血清が使用でき、該血清の培地中の濃度は０．１〜２０％、好ましくは１〜１０％である。
本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、無血清で、組成が化学的に明らかな培地である。無血清培地としては、例えば、MEM、DMEM/F12、HuMEC Basal SFM、Defined Keratinocyte−SFM、Human Endothelial-SFM等が挙げられ、いずれも商業的に入手可能かあるいは既知文献に従って適宜調製することができる。その一例として実施例ではHuman Endothelial-SFMを使用する。
【００２２】
本発明の培養方法は、使用する細胞の培養に適した培養温度、通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で、増殖するのに十分な期間、１〜１０％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーター内にて培養することによって実施される。
【００２３】
本発明において培養の対象となる細胞は、本発明の培地及び培養方法によって好適に増殖し得る細胞であれば特に限定されないが、角膜内皮細胞、腎尿細管上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、涙腺上皮細胞、顎下腺上皮細胞、耳下腺上皮細胞、肺胞上皮細胞等が挙げられる。好ましくは角膜内皮細胞である。
角膜内皮細胞はどのように調製されたものであってもよい。例えばドナー角膜から角膜内皮細胞が付着したデスメ膜を剥離・回収し、酵素処理等によりそこから遊離した細胞を角膜内皮細胞として得ることができる。あるいは角膜内皮細胞、特に角膜実質またはｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞から分化誘導することによって製造された角膜内皮細胞であってもよい。
【００２４】
本発明において細胞が好適に増殖し、且つその機能が維持されているか否かの判断・評価は、増殖させる細胞の種類によって異なるが、例えば角膜内皮細胞の場合、増殖した角膜内皮細胞が、角膜内皮細胞としての機能を維持しているか否かは、角膜内皮細胞に特異的に発現しているタンパク質やそれをコードする遺伝子（角膜内皮細胞マーカー）の発現の有無を評価することによって行うことができる。タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって、遺伝子の発現はRT-PCRを利用した方法等によって評価することができる。該マーカーとしては、N-cadherin、Na+,K+-ATPase、Na+,HCO3-co-transporter、collagen typeIV、collagen typeVIII、carbonic anhydrase等が挙げられる。
【００２５】
また、細胞のＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ機能を測定することによっても評価することができる。細胞のＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ機能は、例えばUssing chamberを用いてInvestigative Ophthlmology & Visual Science, 2010 vol. 51, No. 8, 3935-3942やCurrent Eye Research, 2009 vol. 34, 347-354に記載の方法に従って測定することができる。
【００２６】
簡便には、細胞形態を評価することによっても確認することができる。角膜内皮細胞はモザイク状の増殖形態を示す。
【００２７】
本発明の培養方法により、角膜内皮細胞を大量に得ることができ、得られた角膜内皮細胞は、角膜移植用の角膜内皮細胞シート、好ましくは単層の角膜内皮細胞シート等の医薬として利用することができる。
【００２８】
２．細胞を含む医薬
本発明は、上記した本発明の培養方法により製造された角膜内皮細胞を含む医薬（本明細書中、本発明の医薬と略記する場合がある）を提供する。
角膜内皮細胞を含む医薬を、角膜内皮細胞シートとして製する場合には、角膜内皮細胞を培養基材上に播種し、本発明の培地で培養することによって、該培養基材上で角膜内皮細胞を増殖させる。本発明において用いられる培養基材としては、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ラミニン等の天然物由来の高分子材料、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の合成高分子材料、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の生分解性高分子材料、ハイドロキシアパタイト、羊膜等が挙げられる。好ましくは、移植の際に拒絶反応を引き起こさないようなものが、移植対象によって適宜設定される。
【００２９】
移植には、コンフルエントな状態になった角膜内皮細胞が用いられる。その為には、通常、角膜内皮細胞の細胞数を、細胞シートを形成させることができる細胞密度となるよう設定して播種する。通常、播種される細胞密度は、１．０×１０４〜５．０×１０６細胞数／ｃｍ２、より好ましくは、１．０×１０５〜１．０×１０６細胞数／ｃｍ２である。
【００３０】
本発明によって得られる角膜内皮細胞シートは、角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑等の治療における移植片として用いることができる。
【００３１】
また、シート以外の別の態様としては、本発明の医薬は、得られた角膜内皮細胞をそのまま、もしくはフィルター濾過などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などとして用いられる。さらに、該医薬は、グリセロール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、プロピレングリコール、アセトアミドなどの保護剤を加え、凍結保存することもできる。該医薬は、医薬として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理など、角膜内皮細胞としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下での処理に付してもよい。
【００３２】
３．角膜内皮細胞の減少を伴う疾患の治療薬
前述のとおり角膜内皮細胞は房水内のbFGFなどの成長因子やアスコルビン酸の影響を受けているが、それにも関らず生体内では増殖しない。
しかしながら、実施例で示されるように、Bmi1-11R等のp16INK4aの作用を阻害する物質やBIO等のWntシグナル経路を活性化する物質を添加することにより角膜内皮細胞の増殖が促進された。従って、p16INK4aの作用を阻害する物質及びWntシグナル経路を活性化する物質、この2つのうちどちらかあるいは両方を角膜内皮細胞減少を伴う疾患に対する治療として用いることができる。
角膜内皮細胞減少を伴う疾患としては、Fuchs角膜内皮変性症、内眼手術後水疱性角膜症、偽落屑性角膜内皮症、ヘルペス性角膜内皮炎、サイトメガロウイルス性角膜内皮炎、特発性角膜内皮炎、角膜移植後内皮型拒絶反応、角膜移植後移植片機能不全等が挙げられる。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。
本明細書中で用いた主な略語はそれぞれ以下の通り。
（略語一覧）
ＧＳＫ３：Glycogen synthase kinase 3
ｂＦＧＦ：Basic fibroblast growth factor
【００３４】
実施例１
患者への角膜移植後に残った海外ドナー角膜から角膜内皮細胞とその基底膜であるデスメ膜（約200mm2）一塊に剥離し、回収した。これをゼラチン(0.1%)/ラミニン(10μg/ml)/フィブロネクチン(5μg/ml)でコートした35mm培養皿（表面積9616mm2）に静置し、以下の組成の培地を800μl添加した：
Human Endothelial-SFM (life technologies, definedな成分を含む無血清培地)、
Bmi1-11R 2μg/ml (LD Biopharma)、
6-bromoindirubin-3'-oxime (BIO; glycogen synthase kinase (GSK) 3β inhibitor) 1μM (Calbiochem)、
bFGF 10ng/ml (PeproTech)、
アスコルビン酸２−リン酸0.5mM (Wako)。
培養開始後は２〜３日毎に、１００〜２００μｌの培地を追加した。３週間後にデスメ膜から遊離した角膜内皮細胞が培養皿底面に接着し増殖を開始するので、それが確認できたら以後は２〜３日毎に培地を交換した。
培養開始後７０〜８０日目でほぼ培養皿全面にsemi-confluentな状態にまで増殖した（表面積にして約19倍に増殖したことになる）（図１；１代目：P0）。
Semi-confluentになったら、Accutase (STEMCELL technologies)で8分間処理して細胞を回収し、同様にコーティングした培養皿に播種することで再び細胞が増殖し継代が可能となった（図１；２代目：P1）。
この方法の作用機序は、培養液にアスコルビン酸とbFGFを添加し房水と同様の環境を整えることに加えて、p16INK4aの作用を阻害し、Wntシグナル経路を活性化させることによるものである。
【００３５】
実施例２
実施例１と同様にしてこれまで３眼のドナー角膜から角膜内皮細胞の単離・増殖を試み、３眼とも培養増殖に成功した。
さらに別のドナー角膜内皮細胞に、（１）p21ファミリーの作用を阻害する物質、（２）活性酸素を除去する物質、（３）p16INK4aの作用を阻害する物質、及び（４）Wntシグナル経路を活性化する物質の４つの成分の1つずつを抜いて培養を試みた。
実施例１と同様にして、慶應義塾大学病院において、角膜移植手術用に輸入されたドナー角膜の残余部分を用いた。１検体より得られた角膜を８等分し、培地成分が異なる８つの条件での増殖能を検討した。基礎培地にはHuman Endothelial-SFM（Gibco）を用いた。培養に先立ち、培養皿は24 well cell culture cluster (costar)にゼラチン、ラミニン、フィブロネクチンでコートし２時間以上インキュベートしたものを用いた。
Bmi1-11R（又はcyclic Pifithrin α）、BIO、bFGF及びアスコルビン酸２−リン酸（Asc-2ｐ）の組合せのうち、どれか１つずつ因子を除いた培地（下記表２参照）を用意し、角膜内皮細胞を培養した。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
結果、どの因子が欠けても内皮細胞は増殖できない、あるいは著しく増殖能が劣ることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の培地及び培養方法によれば、大量の角膜内皮細胞の取得が可能となり、得られた角膜内皮細胞は、角膜移植用の角膜シート等の角膜内皮細胞の機能不全により生じる疾患の治療用の医薬、そのような疾患を治療するための細胞医療に用いることができる。
【図１】
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