(57)【要約】      （修正有）【課題】JNKリン酸化反応を誘導することによりプログラム細胞死の誘発を可能にする癌の複合治療のための医薬組成物の提供。【解決手段】２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）と１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ）とからなる試薬、及び当該試薬の代替物とからなる群から選択される第１の薬剤と；核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）阻害剤（例えば、アピゲニン）、ｐＵＣＩ９、ｐＣＤＮＡ３、及び特定の配列番号からなる群から選択されるｓｉＲＮＡ又は特定の配列番号からなる群から選択される遺伝子の発現を標的にするｓｉＲＮＡからなる群から選択される第２の薬剤と；を含む医薬組成物。【選択図】図９
2014055135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療用の医薬品の組成物であって、前記組成物が：
ＷＳＴ−１ｒを含む第１の薬剤、又は当該第１の薬剤の有効な代替物と；
核内因子κＢ（ＮＦκＢ）、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）、又はカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）を阻害する阻害剤を含む第２の薬剤と；
任意に、薬学的に許容可能な担体と；
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記第１の薬剤の有効な代替物が水溶性のテトラゾリウム−３（ＷＳＴ−３）を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、前記第１の薬剤の有効な代替物が水溶性のテトラゾリウム（ＷＳＴ）と電子受容体の中間体（ＩＥＡ）とからなる試薬を更に含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物において、前記ＷＳＴが２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−３）、２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４）、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム，二ナトリウム塩（ＷＳＴ−５）、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム，１ナトリウム塩（ＷＳＴ−９）、２．５−ジ−（４−ニトロフェニル）−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１０）、２，２’−ジベンゾチアゾリルｌ−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム，二ナトリウム塩（ＷＳＴ−１１）、及び（２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の組成物において、前記ＩＥＡが１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ）及びコエンザイムＱ１を含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物において、前記第１の薬剤がＷＳＴ−１及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−３及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−４及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−５及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−９及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−１０及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ１１及びｍＰＭＳ、ＸＴＴ及びｍＰＭＳからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物において、前記ＮＦκＢの阻害剤がＩＫＫ阻害剤、フラボノイド、又はＣＫ２阻害剤からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物において、前記第２の薬剤がアピゲニンであることを特徴とする組成物。
【請求項９】
ＷＳＴ−３とアピゲニンとを含む組成物。
【請求項１０】
ＷＳＴ−３とＩＫＫ阻害剤とを含む組成物。
【請求項１１】
ＷＳＴ−１ｒとアピゲニンとを含む組成物。
【請求項１２】
ＷＳＴ−１ｒとＩＫＫ阻害剤とを含む組成物。
【請求項１３】
請求項７、１０、及び１２に記載の組成物において、前記ＩＫＫ阻害剤がアピゲニン、４−（２’−アミノエチル）アミノ−１，８−ジメチルイミダゾ［１，２−ａ］キノキサリン（ＢＭＳ−３４５５４１、ＩＫＫ阻害剤ＩＩＩ）、ＳＣ−５１４、ＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ、ウェデロラクトン（Ｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ：ＩＫＫ阻害剤ＩＩ）、Ｎ−（３，５−ビス−トリフルオロメチルフェニル）−５−クロロ−２−ヒドロキシベンズアミド（ＩＫＫ−２阻害剤Ｖ、ＩＭＤ−０３５４）、及び（５−フェニル−２−ウレイド）チオフェン−３−カルボアミド（ＩＫＫ−２阻害剤ＶＩ）からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項７に記載の組成物において、前記ＣＫ２阻害剤がアピゲニンを含む群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物において、前記第２の薬剤が、ｐＵＣＩ９（配列番号１）、ｐＣＤＮＡ３（配列番号１３）、又は配列番号１０ないし１２からなる群から選択されるｓｉＲＮＡ若しくは配列番号２ないし５及び１４からなる群から選択される遺伝子の発現を標的にするｓｉＲＮＡを更に含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
当該出願
本出願は、2007年7月2日に出願された米国仮出願第60/929,535の特権を主張するものであり、前記出願明細書の全文をここに引用し、援用する。
【０００２】
政府の利益
現出願における研究は国立衛生研究所（NIH）による部分支援を受けており、政府は本出願の発明において特定の権利を所有することができる。  
【０００３】
発明の内容
発明の技術分野
本発明は腫瘍学 および 化学療法の分野に関連している。特に本発明では、より効果的かつ細胞毒性がないか非常に低いがん治療をめざした、新規の方法や医薬組成物、および標的を提示する。
【０００４】
本発明の背景技術
現在のところ、化学療法 および放射能療法は依然として 癌治療の本流である。これらの治療は癌細胞のみではなく増殖細胞を標的として成り立っていた。それらの治療はすべて骨髄細胞および粘膜に細胞毒性を持ち、その治療副作用は致命的でありまた実際極端な例では大概死に至っている。投与量を減らすため薬効を相乗させることにより治療効果を高める努力、あるいは代替治療を開発する努力が活発になされてきた。細胞毒性の副作用を制限しつつ癌治療薬効を高める方法を改良する技能分野にはまだ改良の余地がある。本発明は非細胞毒性物質の組み合わせにより、その相乗的効果を利用してがん細胞を選択的に死滅させる癌療法の発明をめざすものである。
【０００５】
この標的療法は癌治療の新世代であり、癌特有に起こる分子上のまたはシグナル伝達系の変化を標的として、癌細胞死を誘導しつつも、正常細胞への影響を最低限にとどめることを目的としている。治療標的を探索すること、また細胞内標的をターゲットにした方法治療方法の開発に多大な努力が払われてきた。  しかしながら現時点ではこの新世代治療法の成功率は限られている。課題の一種として、細胞制御メカニズムの複雑性と、細胞内経路の重複があげられる。複合的癌治療 はこれらの重複する
経路と冗長な制御機構を克服する鍵となる。
【０００６】
核内因子カッパ（κ）B （Nuclear factor-kappa B, またはNF-κB） は、転写因子として機能するRelタンパクファミリーに属している。その活動はストレス誘導による 細胞応答や、感染や炎症、酸化ストレス、創傷 およびプログラム細胞死を含む複数の発病プロセスに関与している。異常な NF-κB の活性化 がさまざまな 腫瘍組織に検出されており、 癌細胞は化学療法や放射線療法に耐性を示すと同時に腫瘍形成、細胞増殖制御、アポトーシス制御、 血管新生、 腫瘍浸潤 、癌転移に相関していることが報告されている（Kim HJ, Hawke N, and Baldwin AS, NF-κB and IKK as therapeutic targets in cancer, Cell Death ad Differentiation, (2006) 13:738-47; Karin M, Nuclear factor-κB in cancer development and progression, (2006) Nature 441:431-6）。NF-κB活性を阻害することにより癌細胞死を促進し、癌細胞の化学療法に用いる薬剤や放射性療法への感度を上昇させる方法論の確立に向けて、様々な努力がなされてきた（Kim HJ, Hawke N, and Baldwin AS, NF-κB and IKK as therapeutic targets in cancer, Cell Death and Differentiation, (2006) 13:738-47; Karin M, Nuclear factor-kB in cancer development and progression, (2006) Nature 441:431-6; Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi, Nuclear Factor-κB Inhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs, NATURE REVIEWS CANCER (2005) 5:297-309）。 しかしながら、これらの努力は目覚しい結果とは言いがたいものであった。
【０００７】
通常、静止細胞中において NF-κBは、Inhibitor KB (IKB) に結合することにより不活性状態で細胞質に局在するが、シグナル伝達プロセスを解した外界の刺激によって活性化される。 IKB キナーゼ （IKK）はそのシグナル伝達系において直接上流の NF-κB 活性剤であり、IKBをリン酸化することによりNF-κBを解離し、解離したNF-κBは核内へ移行し細胞内での転写活性を制御する。IKKには2種類の類似しているが異なる IKK があり、どちらもNF-κBを活性化することができる。 おのおののIKKは異なるシグナル経路に反応して、異なったNF-κBファミリーの一員を活性化している可能性がある。さらに、NF-κB 活性化にはプロテインキナーゼ CK2（CK2）のような代替性経路も存在する。 ほとんどの癌細胞内では、NF-κBは 構造的に活性化している。IKK の古典的経路に加えて、これらの 代替性 NF-κB 活性化経路もまた癌細胞の異常な NF-κB 活性 に貢献している可能性がある（Ming Yu, Jason Yeh, and Carter Van Waes タンパク質 Kinase CK2 Mediates Inhibitor-Kappa B Kinase and Aberrant Nuclear Factor-κB Activation by Serum Factor(s) in Head and Neck Squamous Carcinoma Cells Cancer Research, 2006 July 1; 66(13): 6722-6731. and other for NFKB activation） 。これまで数十のIKK 阻害剤が生産され、非炎症性疾患の治療に試験的に用いられているが、癌治療としてはあまり効果をあげていない。これらの代替的 NF-κB 活性化 経路が存在することが、残念ながらがん治療においてIKK阻害剤効果が充分に発揮されない少なくとも一因になっている可能性がある（中西 史、戸井 雅和Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi, Nuclear Factor-κB Inhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs, NATURE REVIEWS CANCER (2005) 5:297-309）。  
【０００８】
NF-κBは、抗アポトーシス遺伝子の転写を誘導し、カスパーゼ 活性を干渉し、 c-JUN N末端キナーゼ （JNK）の持続的な活性化を阻害することにより、アポトーシスやネクローシスを含むプログラム細胞死を阻害することが知られている。 (Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi, Nuclear Factor-κB Inhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs, NATURE REVIEWS CANCER (2005) 5:297-309)。NF-κBや IKK の阻害は腫瘍細胞死や形成阻害を引き起こし、それと共に、あるいは癌細胞の化学療法治療 に対する感受性を上昇させることにつながる (Kim HJ, Hawke N, and Baldwin AS, NF-κB and IKK as therapeutic targets in cancer, Cell Death and Differentiation, (2006) 13:738-47; Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi, Nuclear Factor-κB Inhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs, NATURE REVIEWS CANCER (2005) 5:297-309)。IκBa の分解を阻害するプロテアソーム 阻害剤、 ボルテゾミブ/ベルケイド (PS341) は、NF-κB 活性化が病因に関与している多発性骨髄腫の治療に承認された。IKK はNF-κB上流域のレギュレータで、NF- κBの活性化と活性を調整する。NF-κB 活性化を阻害する目的で、これまでに十数以上のIKK2 阻害剤が開発されている (Michael Karin, Yumi Yamamoto and Q. May Wang, The IKK NF-KAPPAB System: A Treasure Stove for Drug Development, Nature ReviewslDrug Discovery 3:17-26, January, 2004) 。その大多数が炎症性疾患を標的にしている。いくつかのIKK 阻害剤は、血液学的悪性腫瘍に対して有効性を示している1。しかしその一方で、固形腫瘍の治療目的ではこれらの IKK 阻害剤の臨床的 有効性は示されていない。IKK阻害剤のうちのいくつかは、NF-κB活性の作用機作を部分的に阻害し、in vitro の細胞生存や細胞増殖でも阻害作用を示した。いくつかの研究では、IKK阻害剤が in vivo における腫瘍形成を阻害することが報告された（Hu MC, and Hung MC, Role of IkappaB kinase in tumorigenesis, (2005) Future Oncol. 1:67-78; Luo JL, Kamata H, and Karin M, IKK/NF-kappaB signaling: balancing life and death-a new approach to cancer therapy, (2005) J. Clin Invest 115:2625-32）。しかしながら、これらの成功例は非常に限定的である。抗腫瘍薬としてIKK阻害剤を用いた研究は、概して成功せずに終わっており、実用にはほど遠いのが現状である。これは、阻害剤の制御作用機序が複雑であり、阻害剤が別の作用をもつためと思われる。癌細胞死につながる重要な標的プロセスを同定し、またそのプロセスの複数のポイントを治療の複合的なターゲットにすることが、現状打破をもたらすために肝要である。
【０００９】
NF-κB活性化を誘導することで知られるTNFaは、 一定の状況下で細胞死を引き起こす（参照）と報告されている。近年の研究で、NF-κB活性とJNK活性とがバランスをとることにより、細胞死と細胞増殖を制御していることが示唆されている（レビュー）。この理論においては、NF-κB と JNK との間には活性酸素種（reactive oxygen species, またはROS）を介してクロストークが存在すると考えられている。TNFa はNF-κB とJNK両者の活性化を誘導する。JNK とNF-κB両者が活性化すると細胞増殖が起きる。しかしながら、 ROSはJNK の活性化を誘導し、長期にわたるJNK 活性化がプログラム細胞死を誘導する。逆に、活性化したNF-κB は ROS の抑制に働き、すなわち ROS は JNK の活性化を誘導する。したがって、JNK が活性化する一方でNF-κB が阻害されることで、プログラム細胞死を調節するバランスが保たれている。現段階では、そのような治療法は報告されていない。最も重要なことには、この特異的な関係理論が提唱されてきたにも関わらず、その効果を証明するのに成功した例が未だない。そこで私は、ここに証明するための手法を開示し、この一連の特異的な関係を証明することにする。
【００１０】
私はドミナント・ネガティブの手法を利用し、NF-κB で誘導される遺伝子の発現を相乗的に阻害するIKK1+2 DNA ベクターを用いてIKK1 とIKK 2 との組成での阻害を確認した。しかしながら、この組成では化学療法製剤に対する薬効を上昇させる効果はほとんどみられなかった。同時に、ヒト癌細胞において、WST-1 試薬で細胞生存度を測定しながら、ドミナント・ネガティブを起こす IKK1 DNA ベクターとIKK2阻害剤との複合的作用を観察すると、この組成で一晩処理の後、通常培地に交換したあとに劇的な細胞死を引き起こすことが確認された。DNA の導入を行わない同時並行のコントロール実験では、細胞死はみられなかった (図 1,2)  。この処理には、ドミナント・ネガティブを起こす IKK1 DNA の導入、IKK 阻害剤、そしてWST-1の3つの要素が必要である。この過程では JNK の活性化、ROSの誘発が見られ (図 5)、この結果は仮説として提唱したJNK-ROS-NF-NK-κB理論と一致している。
【００１１】
さらなる解析の結果、この効果はドミナント・ネガティブを起こすIKK1 DNA 配列とは関連がみられなかった。（図 3）。その代わり、同時遺伝子導入した Pucl9ベクターの骨格が3者の組成効果に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。この組成での Pucl9 ベクターの遺伝子導入は、初期の処理に限ってインターフェロン・ベータ 、 アルファ (interferon beta, alpha または IFN ) で部分的に代替できる（図 4）。Pucl9 DNA 配列は、この3種複合処理に重要な役割を果たすことが明らかとなった。Pucl9 の配列をヒト遺伝子およびヒトゲノムに対して ブラスト解析を行ったところ、数ヶ所の短い配列でヒト遺伝子産物に相同性があり、隣接領域では多数の遺伝子に相同性がみられた。これらの短い配列の siRNA や相同性のみられたいくつかの遺伝子の siRNA では、Pucl9 ベクターに代わって3者の組成効果を引き起こしており、他の遺伝子の干渉作用も3者の組成効果を引き起こすのに必要である可能性が示唆された。    
【００１２】
細胞増殖を促すWST-1 試薬 は、細胞内代謝を測定するのに用いられる研究用試薬であり、生細胞を同定する指示薬である。 細胞増殖を促す WST-1 は、WST-1、テトラゾリウム塩、電子結合試薬 1-mPMS で構成されている。WST-1 は細胞膜に非浸透性のテトラゾリウム塩であり、還元されると水溶性のホルマザンを生成する。WST-1 は細胞膜貫通型の電子伝達系において電子担体 1-methoxyPMAS (mPMS) を介して還元されるが、その場合の細胞内還元剤はNADH である (Berridge, Herst, and Tan, Biotechnology Annual Review Vol.2: 127-52) 。この過程には NOX が関与しており、ROS が発生する。
【００１３】
ROSは、通常の細胞内代謝の副産物であり有害にもなりうる物質であり、細胞の機能に直接影響する。ROSはあらゆる好気性生物で産生し、細胞増殖や酸化還元 (redox) 状態やシグナル伝達系において欠くことのできない重要な役割を持つ。しかし、これらの活性酸素代謝物が過剰生成されると、細胞の完全性や生存に重要な細胞構造を酸化・損傷する、致死的な連鎖反応を引き起こす。実際、ビンブラスチン、シスプラチン、ミトマイシン C、ドキソルビシン、 カンプトテシン、イノスタマイシン、ネオカルチノスタチン 他多くの抗癌剤が ROS 依存性のアポトーシス活性化を介して抗癌作用を発揮しており、このことから ROS の根本的な抗癌原理を利用してのROS の応用可能性が示唆される。癌治療の方法として「酸化治療」という独特な抗癌治療が開発されている。これは、固形腫瘍で直接、細胞毒性のある酸化ストレスとしてのROS の生成を促進する方法である。しかし実際には成功例がなく、これは腫瘍選択的に ROS を送り込むことが不可能で、従って重篤な副作用を誘発してしまうためと考えられる (Fang, Nakamura, and Iyer, J Drug Target Vol15: 475-86) 。  
【００１４】
大多数の癌細胞はミトコンドリアに欠損があり、そのためエネルギー生成は解糖系に依存しており、結果として細胞質に NADH が蓄積する。代謝をつかさどるミトコンドリアが不在の癌細胞では、細胞膜貫通型の電子伝達系により依存することになる (Herst et al. Biochim Biophys Acta 1656:79-87; Tan and Berridge Redox Rep 9:302-06) 。この癌細胞特有の特徴を利用して、癌細胞の代謝経路を標的とした複合的治療が可能になる。
【００１５】
WST-1とmPMSは、この目的達成のために利用する、化合物群の代表格となりえる。WST-1とmPMSとの組成では、ROS の直接毒性を誘導せずに癌細胞死を相乗的に誘発する作用を持つように、両者の割合を含めた調節、最適化が可能であろう。この複合処理プロトコルでの発見は、細胞内シグナル伝達系のメッセンジャーとして作用する、低レベル ROS産生を誘導させる手法を提示した。細胞死は複合的な処理により誘導されるが、WST-1 のみでは不可能である。この治療目的での特異的な所見により、甚大な細胞毒性を引き起こさずにシグナル伝達を活性化するROS の生成を促進することが可能であろう。
【００１６】
アピゲニンは、自然生成する植物フラボン (4’, 5, 7, - トリヒドロキシフラボン）であり、りんご、 パセリ、 たまねぎ、 オレンジ、 茶、 カモミール、発芽小麦などの日常的にみられる果物や野菜、諸種の調味料に豊富に含まれる。アピゲニンには優れた抗炎症作用、抗酸化作用、抗癌性作用があることが明らかになっており、活発な研究が進んでいる。細胞、分子レベルでのアピゲニンの生理作用の研究の結果、アピゲニンには HER2 タンパクの減少、Her2 / Her3- フォスファチジルノシチド 3-キナーゼ/AKT 経路の抑制(Way and Lin Future Oncol 1:841-49)、HIF, PKC, CDK, VEGF, NF-κB, CK2, AKT, MAPK, AR, ER 経路の阻害、野生型 p53 の活性化、細胞周期を調節し脱制御することでアポトーシスを誘導 (Induction of caspase- dependent, p53-mediated apoptosis by apigenin in human neuroブラストoma ? Torkin et al. 4 (1): 1 -- ..; Apigenin Inhibits Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Angiogenesis in Human Lung Cancer Cells: Implication of ..; Apigenin inhibits VEGF and HIF-I expression via PI3K/AKT/p70S6Kl and HDM2/p53 pathways - Fang et al. The FASEB 19 (3): 342 -- ..;Balasubramanian and Eckert Toxicol Appl Pharmacol 224:214-19;Birt et al. Carcinogenesis 7:959-63;Patel, Shukla, and Gupta lnt J Oncol 30:233-45;Sato et al. Biochem Biophys Res Commun 204:578-84) などの作用機作を含む、広域な分子やシグナル伝達、制御経路の阻害作用があることが解明されている。さらに、アピゲニンはミトコンドリア膜を崩壊する ROS を生成することが知られている。現段階の研究試験によると、アピゲニンはDNA の酸化的損傷を減少、ヒト白血病細胞の成育や分化を阻害、癌細胞のシグナル伝達を阻害してアポトーシスを誘発、抗炎症性作用、抗痙攣性、鎮痙作用があることが報告されている。アピゲニン関連で100 以上の特許申請が提出されており、その中でもアピゲニンの炎症性疾患や自己免疫疾患の治療目的での申請請求が目立っている。加えて、アピゲニンは癌の化学的予防薬としての利用や、10 μM 濃度の処方で癌の化学療法で相乗的効果を狙った申請要求も提出されている  (US Patent Application 20060189680)。アピゲニンを癌の化学的予防薬としての利用に関して、複数のグループで盛んな研究が進んでいる。しかしアピゲニンが化学療法の効果を増幅させる効果については、私の in vitro の実験で違う結果が示された。3種類のヒト癌培養細胞 （ヒト軟組織非上皮性悪性腫瘍細胞株である HT1080、ヒト頭部および頸部扁平上皮腫瘍細胞であるCal27とUM-SCC6）を用いたin vitro 実験では、30μM まで濃度を上昇させたアピゲニンと3種の化学療法製剤であるタキソール、シスプラチン、ドキソルビシンとの組み合わせを処理しても、複合的効果は見られなかった。さらに私のデータでは、アピゲニン単独を 100μM まで濃度を上昇させても、細胞死はほとんど見られなかった。癌治療目的の細胞毒性を持つ薬剤として、アピゲニンは他の処方と組みあわさねばならない。
【００１７】
私のデータでは、10-30μM 濃度のアピゲニン処理で pucl9 遺伝子の導入とIKK阻害剤の複合処理の代用となることができ、さらにWST-1 試薬を組み合わせると癌細胞死を相乗的に誘導することが示されている。この効果はアピゲニンとWST-1 試薬の投与量と処理時間に依存し、多数の異なるヒト癌細胞株で再現性が高い。
【００１８】
アピゲニンはCK2 を阻害し、それを介してIKK や NF-κB も阻害する。WST-1処理によりROS が産生する。この複合処理によりROS の生成や JNK の活性化が認められ、この結果はROS - JNK - NF-κB 理論を立証しておりJNK - NF-κB間のバランスで細胞生存または細胞死を決定することを検証している。一方、ほかのCK2 阻害剤の処理ではこの阻害効果が見られなかった。CK2 に対する siRNA の処理でも、弱い阻害効果しか見られなかった。さらにIKK 阻害剤を処理した場合、一種のヒト黒色腫細胞株を除いてこの阻害効果は見られなかった。上記で示したようにアピゲニンは、より重要な分子やシグナル伝達系の調節に関与している可能性がある。複合処理におけるアピゲニンの作用機序は独特である。アピゲニンの作用メカニズムは、我々が現在認識しているよりも複雑である可能性が高い。
【００１９】
通常、電子伝達はミトコンドリア膜上で起こる。WST-1 試薬は、細胞膜間での電子伝達系で細胞質中のNADH を NAD+ に変換することによってROSの生成を促進した。大多数の癌細胞ではミトコンドリアによるエネルギー代謝が欠損しており細胞質中で起こる解糖系により依存するため細胞質中にNADH が生成されていることから、この複合処理は癌特異的に標的とした、新規の方法となりえる。
【００２０】
WST-1 試薬はWST-1 と mPMS から構成されており、これはそれぞれテトラゾリウム塩の化合物群の代表格と電子結合試薬としての化合物群の代表格となりえる。この試薬は細胞膜貫通型電子伝達系を促進する作用があり、この過程で ROS が発生する。この処理で見られる極立った特徴として、処理過程で生成したROS の量は、2種類の処理の割合や濃度を最適化することによって調節可能であることがあげられる。このことは、細胞内で特定のシグナルを誘導するシグナル分子として作用し、細胞を直接死滅させるのではなくプログラム細胞死を誘導する役割をもったROS の産生量を制御する方法の可能性を示している。
高レベルのROS量は細胞内のあらゆる高分子を破壊し、正常細胞に対しても破滅へと誘導する。以前ほかの研究者によって、ROS 生成を誘導する試薬を癌治療へ応用する試みがなされているが、失敗に終わっているのはROSの高い毒性のためである。一方、低レベルのROS 量にはシグナル伝達のメッセンジャーとしての作用機作がある。治療に選択的に利用する観点から、甚大な細胞毒性を起こさずにROS 生成の誘導を調整することが可能かもしれない。WST-1 試薬はWST-1 と mPMS 間の割合や濃度を調節・最適化することによりROSの直接毒性を避けながら癌細胞死を誘発する試みがなされてきた。細胞死は複合的な処理により誘導されるが、WST-1 のみでは不可能である。
さらに、本治療はパルス療法としても応用でき、長期治療において毒性を最低限に抑えるために用いることのできる可能性がある。
本発明の意義は以下を含む:  
・本治療は癌細胞が主に依存する代謝経路を標的にした手法の代表格である。  
・ 本治療は、癌細胞において特定したROSを誘導する制御方法を示し、シグナル伝達を必須条件とした治療方法を生み出すことができる。
・ 本治療はJNKのリン酸化と活性化を長期に亘って誘導し、また細胞壊死の活性化と誘導を引き起こす誘導剤である。
・ 本複合治療に用いる阻害剤や、WST-1といった試薬用の化学薬品は、各処理に用いる成分候補として代表格の化学薬品分類を示す。これらの分類に属する他のメンバーも本治療に採用できるかどうかを調べる検査を行っている。この包括的療法は新しく、癌細胞死率において高い結果を出しており、選定的に癌細胞を標的とすることができる可能性が高く、各進展段階や生成物は 新しい「癌」の 標的手段となる。 一例として、 以前は試薬であったWST-1 は、今や公認の癌治療剤として認められるであろう。本発見の発表以前には、WST-1 を癌処理剤とした研究は皆無であった。    
・ 本発明は抗腫瘍薬開発の新しい道を開拓する。
本発明において、IKK1 と IKK2 両者を阻害することによる複合的癌治療が、腫瘍細胞内でNF-κB活性を構築する活動の相乗的阻害に結びつくこと、またNF-κB 活性阻害の後にテトラゾリウム塩WST-1を用いて癌細胞を処理すれば、癌細胞死を相乗的に促進できることを証明する。この二つの発見を複合した治療とWST-1の持つ可能性により、新規の効果的ながん療法をもたらす医薬品開発へ導く偉大な効果が期待できる。  
アピゲニンとstattic(Stattic)の複合処理によるCal27細胞生存の相乗阻害および細胞死の誘導
NF-κBに加えて、シグナル変換器と転写アクティベーター (Signal transducer and activator of transcription、スタットまたはStat) も転写因子ファミリーの一種である。それら（転写因子）はサイトカインと成長因子によって刺激された細胞外シグナルを媒介し、細胞核内に転移し、そこで転写アクチベーターとして作用する。細胞刺戟に感応したこれらのタンパク質はさまざまな遺伝子の発現を仲介し、細胞形成やアポトーシスなど多くの細胞変化プロセスに重要な役割を果たす。STAT3などスタットが、癌細胞生存と増殖に大きな役割を持つが、スタット阻害剤やIKK阻害剤だけでは癌細胞生存にはほとんど阻害効力を示さなかった。これら2種の転写因子は相互作用し、機能的に相補性をもつことが証明された。さらに、NF-kBとSTATは結合部位で結合しプロモーターモジュールを形成する。IKK 阻害剤かアピゲニンいずれかを用いるスタット阻害剤であるstatticの合成物は、結果的に細胞死の相乗誘導を引き起こす。この合成による癌の処理方法を提供する。
【００２１】
特定DNAとsiRNA配列の発見、およびがん治療の標的となりうる相合性遺伝子群 上記のように、Puc19 DNAベクター 遺伝子導入はこの三種組成で最高の有効性を達成するために必須である。化学療法薬とPuc19 遺伝子導入との組みあわせにより、検査した4種全ての化学療法薬のIC50を3〜30倍低下することが可能になった(paclictaxel, Doxourubicin, Cis-platinum, 5-FU)。これらの短い配列の一致に由来する配列をもつsiRNAと、これらの一致配列のうちいくつかに対応する遺伝子に対するsiRNAは、化学療法薬と組み合わせればPuc19 DNA ベクターの代替となる。このように同定された配列は、今までめったに研究されていなかった遺伝子の最たるものだ。それらのいくつかはまだ仮定的、すなわち今まで研究されていない遺伝子である。これらの遺伝子を発見することにより 抗癌薬開発に新しい標的をもたらすことができる可能性がある。
【００２２】
本発見の基礎となる発見には、がん治療においてWST-1rの利用、そして
Puc19のDNA配列にコードされる生物学的作用が、化学療法薬の薬効を高めることができるような癌治療の標的遺伝子の同定につながること、があげられる。これらの発見に基づき、他の化学物質、生物学的分子、化学療法薬を複合した、数種の癌治療方法を本出願中に記した。出願の本題は、テトラゾリウム塩の組成物、電受容体中間体、そしてその両者を組成して癌の複合治療薬にする手法、またこの薬を他の化合物、抽出物、 阻害剤、生物学的分子との組成で（組み合わせで）癌治療に用いるし手法である。これらの発見における関係図表は、本出願の題目をよりわかりやすくするため、Supplement  Fig.（補足図）に表している。
【００２３】
本発明のまとめ  
本発明は、細胞毒性副作用のない、あるいはほとんどない、相乗的に有効ながん治療において癌を処理することを目標に、製薬調合、 組成成分、癌の複合的治療の手法、細胞標的の解析をする。
【００２４】
本発明の実施例のひとつとして、細胞膜貫通型の電子伝達を行うことにより ROSを誘導することができる癌の複合処理を発明し、それに用いるWST-1r と、その有効代替組成を提示した。WST-1rとその有効代替は、テトラゾリウム塩と電子結合試薬(IEA)、または一種以上の最適化した濃度のテトロゾリウム塩か一種以上のIEAとの混合剤である。同化合物は製薬的に受容できる担体媒体で投与することが可能である。
【００２５】
本発明の一側面として、 遺伝子、 分子、ポリヌクレオチド配列、ポリペプチド 配列を、当該がん患者の癌処理に設計された薬の標的として選定した。これらの標的は、ヒト転写産物、そしてそれらに対応するタンパク質/ペプチド 分子および・またはゲノム配列であり、それらはpUC19 DNA ベクターのDNA 配列をヒトゲノムおよび転写産物に対するBLAST解析で選定した配列であり、ヒトゲノムおよび転写産物に対して短い断片でマッピングされたDNA配列である。その転写産物とその対応するコード分子は該癌治療の有効性を増幅する標的となりうる。従ってヒトゲノム配列とマッピングした他の配列が標的として利用できると同時に、これらが一致する遺伝子のターゲティングに利用できる可能性がある。これらの標的選定を設計できる候補薬は、siRNA、 小分子阻害剤、 ペプチド阻害剤、 アンチセンス RNA、 アンチセンスオリゴ、 抗体、 抗体断片、 タンパク質、 ドミナントネガティブDNA ベクター、インタフェロン （IFN）を含むがそれに限らない。特定の実施例で用いた標的は、TRPC6 (SEQ ID #: 2)、 MAGI-3(SEQ ID #: 4)、 TMEM182(SEQ ID #: 5)、 SH3PXD2B(SEQ ID #: 3)、 c60rf108 (SEQ ID #: 14)、TRPC6のポリペプチド 配列(SEQ ID #: 6)、 MAGI-3(SEQ ID #: 8)、 TMEM182 (SEQ ID #: 9)、 SH3PXD2B(SEQ ID #: 7)のポリヌクレオチド 配列群、  またはc60rf108 (SEQ ID #: 15)を含むが、それに限らない。ヒトゲノム配列および・または転写産物を標的とする配列は、puc19 DNA ベクター (SEQ ID #: 1)、 siRNA2 (SEQ ID #: 10、 SEQ ID #: 11、 SEQ ID #: 12)を含むが、それに限らない。これらの遺伝子が癌の複合 治療 の標的として利用できることを証明するため、その標的遺伝子(SEQ ID #: 2~ 5 およびSEQ ID #: 14)に対する複合 siRNAを選定した。  
【００２６】
ある特定の実施例では、当該がん治療での癌処理を必要とする患者に、 同時にまたは連続的に、医薬的投与が可能な量で（1） すくなくとも一種のpuc19 DNA ベクター遺伝子を導入 または一種以上の導入したpuc19 DNA 遺伝子代替薬（2） 少なくとも一種のIKK 阻害剤（3）製薬上受容できる担体媒体にいれた第三の追加薬剤、 WST-1r または一種以上のWST-1rの有効代替を投与するそれぞれの方法を提示する。上記の組成薬は癌細胞死の誘導を促進する一方、個別に使われた場合は無害であると論証されている。
【００２７】
Puc19 DNAトランスフェクション（遺伝子導入）の有効代替の選択群は以下を含む：（1）タイプ１IFN、 （2）pUC19 DNA ベクターのDNA 配列および ヒトの転写産物 ・ゲノム DNA 配列両者に播かれたヌクレオチド SEQ ID #10-12 Synthetic small inbterfering RNAs (siRNA) 、 （3）生物学的および非生物学的、無機・有機複合物からなるグループより選定された生物製剤。この複合物のスクリーニング選定方法では、 上記の生物製剤化学薬品はさらにポリペプチド、 タンパク質、 ペプチド、 抗体、 抗体断片群、 核酸、また上記選定標的と相互作用し干渉するTRPC6 (SEQ ID #: 2)、 MAGI-3(SEQ ID #: 4)、 TMEM182 (SEQ ID #: 5)、 H3PXD2B(SEQ ID #: 3)、c60rf108 (SEQ ID #: 14)のポリヌクレオチド配列群や、TRPC6 (SEQ ID #: 6)、 MAGI-3(SEQ ID #: 8)、 TMEM182 (SEQ ID #9)、 SH3PXD2B(SEQ ID #: 7)、 c60rf108 (SEQ ID #: 15) などのポリペプチド 配列群グループから選定される。これらの標的遺伝子群 (SEQ ID #: 2 〜 5 および SEQ ID #: 14）に対する合成siRNAは、複合的癌治療の標的遺伝子としての利用の可能性を論証するために選定された。
【００２８】
本発明の一種の側面は、悪性細胞集団内のがん細胞のプログラム細胞死 を誘導することにより、 複合治療を用いてがん患者を治療する方法を提示する。 本発明の複合治療は、WST-1r またはその有効代替を有効量投与することで、細胞膜貫通型の電子伝達が可能となり、細胞中のROSと、NF-κB 活性と他の分子やシグナル伝達経路を阻害する多機能 阻害剤アピゲニン、または一種以上の IKK阻害剤を誘導する。 この複合治療 はアピゲニンの 抗腫瘍効果を高め癌細胞死の誘導を相乗的に進める。
【００２９】
さらにもう一種の特定実施例では、継続的もしくは連続的に、製薬上効果のある量の、少なくとも一種のGSK3b NF とタンパク質 キナーゼ CK2 (CK2) 阻害剤と3分の一の薬剤WST-1rを投与し治療する必要のある患者に対する癌処理方法を提示する。 本発明の特徴的結論から言えば、理想的にはGSK3bを阻害する少なくとも一種の薬剤は LiCl であり、またタンパク質 キナーゼ CK2 （CK2）の阻害剤はアピゲニンであるのが好ましい。化合物は製薬上許容されうる媒体内で（媒体を用いて）投与されることができる。上記の組成薬はがん細胞死の導入を促進する一方、その薬剤を個別に用いた場合は無害という結果が出ている。  
【００３０】
また本発明の他の実施例において、がん治療の必要な患者に、同時、または連続的に、製薬上効果的な成分の選定的Puc19 DNA遺伝子導入の複合物一種、または、上記のリストにあるpuc19 遺伝子導入の有効代替一種以上をすくなくとも一種の公認科学治療剤と合成して投与する癌治療方法が提示された。上記Puc19 DNA遺伝子導入もしくは一種以上の有効なpuc19遺伝子導入代替物を投与することにより、上記認定化学治療剤を大幅に増幅することができ、 また大幅に上記化学治療薬剤の、 またはそれらの組成薬の有害副作用を減らすため、 上記のPuc19 DNAトランスフェクションもしくは一種以上の有効代替が化学治療薬に甚大な活性効果を持つ。  
【００３１】
さらにもう一種の実施例において、この治療薬投与を必要とするがん細胞またはがん患者に、製薬上効果的な量を同時にまたは継続的に、効果的な薬量を少なくとも一種のDominant negative kinase dead IKK1 DNA ベクター (IKK1-KA) 及び少なくとも一種のDominant negative kinase dead IKK2 DNA ベクター (IKK2-KA）を投与し相乗的に癌細胞内のNF-κBNF-KAPPAB 活性を阻害する方法が採られた。少なくとも一種のIKK1-KA もしくは IKK2-KAベクターは、IKK阻害剤リストから選ばれたIKK阻害剤で代替してもよく、組成薬は製薬上受容できる運搬体媒体に投与することができる。 この組成による阻害効果は第三の薬剤、WST-1r またはその有効代替を加えることでさらに増幅する可能性が高く、さらなる癌細胞死の誘導が期待できる。  
【００３２】
本発明におけるもう一種の側面は、癌細胞死を誘導することにより、複合治療を用いて患者を治療する方法を提示する。この本発明における複合治療には、好ましい実施例でNF-kB 活性を阻害する少なくとも一種の化合物と、また少なくとも一種のSTAT3を阻害する複合剤を有効量投与するが、NF-κB 活性を阻害する複合剤はアピゲニンかもしくはIKK阻害剤またはCK2阻害剤であり、STATを阻害する複合剤はstatticを用いる。この複合剤は製薬上受容できる運搬体に投与することが望ましい。
【００３３】
本発明では 癌処理として複合治療を用いてIKK 阻害剤もしくはアピゲニンおよびSTAT3 阻害剤であるstatticを投与することについて考察する。好ましい実施例において、頭部および頚部の扁平上皮癌の様々なサブタイプ群から癌を選定した。  
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、内因性 NF-kappaB 下流遺伝子 発現量。図が示すとおりUM-SCC-6 細胞群にpCDNA コントロール ベクター、IKK1-KA、IKKb-KAとIKK1-KA 、 IKKb-KA ベクター群を遺伝子導入した。18sRNAに対する割合としてp100 （A）およびCK2b （B）でのIkBaのmRNA 量が示されている。データによるとIKKだけを阻害してもNF-KAPPAB活性に対してはほとんど何の効果も見られなかった。両方のIKKを阻害すると相乗的にNF-KAPPAB 活性を阻害できる。
【図２】図２は、WST-1を用いた、あるいは用いていない複合治療においてIKK-KA 遺伝子導入をした結果の細胞生存。細胞群は図１に示したとおりに処理し、さらにWST-1r 処理を4 時間付け加える。  細胞生存率をCCK8 kitを用いたWST-1r 治療の24時間後に測定した。A: CCK8による大量の細胞生存率、 B: IKK1-KA+IKK2-KA を同時遺伝子導入した細胞群とWST-1治療を施した細胞群における細胞死の細胞画像。
【図３−１】図３は、IKK阻害剤、IKK1-KAトランスフェクションとWST-1rを組成した複合治療からの細胞生存率。A: 阻害剤 III、B: 阻害剤 II、C: 第一実験中のSC-514 ; D: 細胞画像、E: IKK 阻害剤III を用いたCCK8 kit による細胞生存率、 F: IKK阻害剤VIIを用いた第二実験よりCCK8 kitによる細胞生存率。
【図３−２】図３は、IKK阻害剤、IKK1-KAトランスフェクションとWST-1rを組成した複合治療からの細胞生存率。A: 阻害剤 III、B: 阻害剤 II、C: 第一実験中のSC-514 ; D: 細胞画像、E: IKK 阻害剤III を用いたCCK8 kit による細胞生存率、 F: IKK阻害剤VIIを用いた第二実験よりCCK8 kitによる細胞生存率。
【図４】図４は、示すとおりHT1080 細胞群にpUC19, pCDNA3, IKK1-KA, IKK-1KA+PUC19, またはpCDNA3+pUC19 DNAベクター、続けてIKK阻害剤III 処理の3,10, 30iMを遺伝子導入し、その後WST-1r 処理を行った。細胞生存率はWST-1 治療の24時間後、48時間後 、96 時間後に測定した。 上位パネルはIKK阻害剤III 濃度の均等メモリを示し、下位パネルはIKK阻害剤III濃度の対数メモリを示す。P3: pCDNA3、 p9: pUC19、IKK1-KA: pCDNA3 ベクター内のIKK1-K44A キナーゼ dead IKK1、 GS: WST-1r、 I-3: IKK阻害剤III。  30mM IKK阻害剤IIIで処理し、DNA ベクター群のいずれかを遺伝子導入してWST-1で処理した細胞群は、WST-1r 処理の96時間後に完全に死滅したが、一方トランスフェクションをしない細胞群は完全に回復し、WST-1r 処理をせずに遺伝子導入した細胞群は部分的に回復した。
【図５】図５は、WST-1r はROSの産生を誘導する。 HT1080 細胞群は示すとおり処理した。   A: 細胞はCM-H2-DCFDA（アセチルエステル）で色素標識されWST-1r で 30分間処理した。 B: 細胞群はWST-1r で4 時間処理し、CM-H2-DCFDAの色素標識をした。WST-1r処理をした細胞群はすべてA、Bどちらも強い蛍光色標識が現れ、WST-1が ROS産生を誘導することを示唆している。驚くことに、 遺伝子導入 とIKK 阻害剤もまたROSを誘導する。IKK阻害剤 III だけを投与するとＡでは量依存的なＲＯＳ発生の増加がみられたが、Bにおいては増加しなかった。これによりこれらそれぞれの薬剤には異なるROS産生の経時変化があるものと推定される。DNA 遺伝子導入 は IKK 阻害剤IIIによるROS誘導を可能にする (A)。同三因子は複合してはじめて合同で細胞死を促進する。各薬剤と異なる組成が 異なる 調整 作用メカニズムに関与していると考えられるが、細胞死を導くのは３因子を複合したときだけであった。（I-3 = IKK阻害剤 III、 P9 = pUC19 DNA遺伝子導入、 GS = WST-1r）
【図６】図６は、UM-SCC-6 細胞群は、示すとおりLiCl とアピゲニンのさまざまな組み合わせで処理され、WST-1r 治療で継続した（左側パネル）とWST-1r 治療で継続しなかった（右側パネル）を示す。相乗的 効果アピゲニンを用いたLiCl組成による相乗効果のいくつかを提唱するデータがある。
【図７】図７は、DNA 遺伝子導入 は化学療法薬 の有効性効果を増幅する。UM-SCC-6 細胞群はpUC19、pCDNA3、pCDNA3+pUC19、pIKK1-KA+pUC19、pIKK2-A+pUC19DNA、 pIKK1-KA+pIKK2-KA+pUC19、pIKK1-KA、 pIKK2-KA、pIKK1-KA+pIKK2-KA、 DNA ベクターで遺伝子導入し、トランスフェクションをしていないものをネガティブコントロールとし、DMSO（ジメチル・スルホキシド）をビークルコントロールとした。細胞生存率はCCK8で測定し、450nm で吸収、訂正背景は 690nmであった。A: 5-FUで処理されたUM-SCC-6 細胞群、 B: Cis-Platinumで処理したUM-SCC細胞群。  DNA遺伝子導入は化学療法薬の有効性 効果を相乗し癌細胞死を促進する。   HT1080 細胞群は、示すように、異なる量の化学治療薬を投与する前にpUC19、 pCDNA3、 pCDNA3+pUC19、 pIKK1-KA+pUC19、 pIKK2-KA+pUC19DNA、 pIKK1-KA+pIKK2-KA+pUC19、 pIKK1-KA+pCDNA3、pIKK2-KA+p CDNA3、 pIKK1-KA+pIKK2-KA+p CDNA3、 DNA ベクターで遺伝子導入される。   A: Cis-Platinum を72時間投与し及び、96 時間薬剤を除去して24時間投与、 B: パクリタキセル を72時間投与し、96時間薬を除去して24時間投与  C: 96 時間 治療後に5-FUを投与    D: 72 時間治療後にドキソルビシン投与。データによると遺伝子導入は化学療法薬による細胞形成 阻害効果を阻害するという結果が出た。遺伝子導入をしなかった細胞群は化学療法 薬処置を除去した後に回復したが、一方DNA 遺伝子導入をした細胞群は回復なく死亡し(A and B) 、DNA 遺伝子導入 が促進する細胞死は回復できないことが示された。pUC19 は細胞形成 阻害に最強の効果を示し、他のIKK-KAドミナントネガティブベクター群よりも細胞死を促進することがわかった。
【図８】図８は、HT1080 細胞群はIKK1-KA、 IKK2-KA 、 IKK1-KA+IKK2-KAの遺伝子をpUC19 かpCDNA3と複合処理して導入した。pUC19 とpCDNA3のみをコントロールとした。   IkBaとIL-8 Mrna量はNF-KAPPAB 転写活性の指示薬として測定された。データは対応する18sRNA 量により正常化された。
【図９】図９は、F1A 図表はアピゲニンとWST-1r を用いた複合治療は癌細胞死の誘導を相乗することを示している。  F1Bテスト33  細胞生存率におけるアピゲニン効果およびWST-1r 治療 順序
【図１０】図１０は、細胞生存率におけるアピゲニン効果及びWST-1r 処理 順序を示す図表
【図１１】図１１は、アピゲニンを用いたWST-1rの複合治療に関与したWST-1r の経時変化と用量反応およびアピゲニンの用量反応を示す図表。
【図１２】図１２は、黒色腫細胞株におけるIKK阻害剤とWST-1r を用いた組成 治療の効果を示す図表。
【図１３】図１３は、 誘導した細胞死におけるWST-1r とIKK阻害剤 III の治療順序効果
【図１４】図１４は、Teat39 WST-1r とアピゲニンを用いた組成 治療で 誘導した JNKリン酸化反応を示す図表
【図１５】図１５は、WST-1r、CCK8、アピゲニンIKK阻害剤 III を用いた複合治療後のROS産生の経時変化
【図１６】図１６は、CCK8とXTTの細胞死を誘導する能力を、アピゲニンと組成したWST-1rとCCK8-XTT-GSによって比較した図表
【図１７】図１７は、細胞死を導入する細胞能力を、WST-1による 他のテトラゾリウム塩と比較した図表
【図１８】図１８は、細胞死におけるHT1080: mPMSの用量反応
【図１９】図１９は、mPMS 治療に対する異なる細胞の反応
【図２０−１】図２０は、アピゲニンとの組成 治療 における細胞死誘導に関して、WST-1rをWST-3で代替する効果および、WST-1rをWST-3+mPMS で代替する効果の比較
【図２０−２】図２０は、アピゲニンとの組成 治療 における細胞死誘導に関して、WST-1rをWST-3で代替する効果および、WST-1rをWST-3+mPMS で代替する効果の比較
【図２１】図２１は、タキセルとのsiRNAから派生したPuc19 DNA 配列組成によるタキセル有効性の相乗効果
【図２２】図２２は、TMEM182 とMAGI3 をPuc19-IKK阻害剤-WST-1r の三種複合治療に代替することに対し、Puc19 をsiRNAで代替する比較対象 。
【図２３】図２３は、WST-1r、CCK8 とアピゲニン、IKK阻害剤 III 三種を複合した複合治療後に産生するROSの用量反応
【図２４】図２４は、図 6において示したように、DNA 遺伝子導入は有効性効果を示しIFN 効果は通常遺伝子導入がもたらした効果に関与していることはよく知られているが、本実験はこれらの効果がINFで代替できるかどうかを調べるものである。HT1080細胞群が上の図 6 に示したように処理されたが、ただしDNA遺伝子導入の代わりにこれらの 細胞群は変異的用量でインタフェロン（IFN）を用いて処置した。何も処置されていないネガティブコントロールとpUC19DNAを遺伝子導入したポジティブコントロールは並列してIKK阻害剤III濃度により線・棒グラフ両形式で図式化されている、またIFNの濃度によっても棒グラフでWST-1 処置後24時間後と48 時間後の結果を並列して図表化している。総数14のINF因子群、 IFNaA, IFNaB, IFNaC, IFNaD, IFNaF, IFNaG, IFNaH, IFNaI, IFNaJ, IFNaK, IFNa4b, IFNaWA, IFNb, IFNg,  IL-6 がすべて検査できた。検査されたINFa分子は全て、遺伝子導入されたpUC19のポジティブコントロールに比較して部分的（50-80%）に増幅する効果がみられた(図 24)。
【００３５】
本発明の明細
1． 総合的明細
本発明は以下二つの発見に基づくものである: （1）細胞増殖試薬 WST-1 (WST-1r)は、Puc19 DNA 遺伝子導入とIKK阻害剤の組成で相乗的に癌細胞の細胞死を誘導する（2）細胞死誘導におけるpuc19の効果はDNA配列に具現する。
【００３６】
第一の発見は、化学薬品の分類同定、またこれらの化学複合剤を癌の複合治療薬として用いる方法へ導いた。第二の発見ではさらに癌治療における標的として可能性のある数種の遺伝子発見が導かれた。これらは今までほとんど研究されていない遺伝子であり、現在でもまだ遺伝子ステータスとしては仮定的である。これらの発見を合成して癌治療における数種の複合治療手法を確立するに至った。  
【００３７】
本発明の一種の実施例では、WST-1rの製薬調合はがんの複合治療薬として解説されている。
【００３８】
また本発明の他の実施例では、癌治療におけるWST-1rとその有効代替の調剤製法に導くことのできる化合物の分類とそれらの組成を説明している。
【００３９】
本発明の一実施例では、Puc19 DNA ベクターは哺乳類またヒトの癌細胞に生物学的効果をもつことが明らかにされ、複合治療剤としてIKK阻害剤とWST-1r試薬とともに用いられた。  
【００４０】
また他の本発明実施例では、 Puc19 DNAベクターはそれらがん治療に用いる化学治療薬の治癒効果を増幅するため、化学治療薬と複合する薬として用いられた。
【００４１】
それら本発明の実施例により、Puc19 DNA ベクターから派生したヌクレオチド配列であるsmall interfering RNAs (siRNA1、siRNA2、siRM|NA3)を癌複合治療に用いることができるように詳述した。
【００４２】
さらに本発明の数々の実施例により、癌治療の薬剤開発の標的として用いる可能性のある対応siRNAsを選定し、その生物学的作用機作とPuc19のDNA配列解析に基づいて選定されたヒト遺伝子(TRPC6 (SEQ ID#: 2), MAGI-3(SEQ ID #: 4), TMEM182 (SEQ ID #: 5), SH3PXD2B(SEQ ID #: 3), or c60rf108 (SEQ ID #: 14), and the polypeptide sequences of TRPC6(SEQ ID #: 6), MAGI-3(SEQ ID #: 8), TMEM182 (SEQ ID #: 9), SH3PXD2B(SEQ ID #: 7), or c60rf108 (SEQ ID #: 15)) の明細について説明し、対応するこれらの遺伝子群に対するsiRNAsで検査した。  
【００４３】
また本発明において、生物学的および非生物学的化合物から、上記Puc19DNAの有効代替をIKK阻害剤とWST-1rまたはWST-1rの有効代替物質との組成における効果を基準に選定した他の実施例も説明している。上記Puc19DNAの有効代替として用いる生物学的複合物にはインターフェロンの様々な因子、また上に述べたあらゆるsiRNAsが含まれる。
【００４４】
さらに本発明の他の実施例では、アピゲニンまたは少なくとも一種のIKK阻害剤とWST-1rからなる、がんの複合治療手法が詳述されている。
【００４５】
また他の本発明実施例では、少なくとも一種のタンパク質 キナーゼ II (CK2)阻害剤、アピゲニン、少なくとも一種のGSK3b阻害剤、塩化リチウム、WST-1rを治療効果を挙げるために用いるがんの複合治療手法を述べている。
【００４６】
また別の実施例では、ドミナント・ネガティブの手法を利用しがん細胞群にIKK1とIKK2 DNAを同時遺伝子導入することによりNF-kB活性を相乗的に阻害する手法を説明する。
【００４７】
さらにまた他の本発明実施例では、がん治療に一種以上のIKK阻害剤または少なくとも一種のCK2阻害剤とSTAT3阻害剤Statticからなる複合治療が説明されている。
【００４８】
I．  定義  
“pUC19 DNA”とは、原核細胞内で増幅するDNAクローニングベクター (SEQ ID1) である。本ベクターのDNA 配列は初め1986年3月3日J. Messing, Waksman Institute, NJにより遺伝子発現バンクに提出され、F. Pfeifferによって16-DEC-1986年12月16日に再検討された。本発明において、pUC19はヒトの癌細胞群に化学物質またはリポソーム性のDNA 遺伝子導入試薬によって導入された。
【００４９】
私のデータより、このDNAベクターを構成するDNA配列は、他の治療薬と融合して培養したヒトの癌細胞群に生物学的効果を現し、相乗的細胞死へ導くことが示唆されたため本発明で解説している。pUC19のDNA配列をヒトゲノムと転写産物に対してブラスト解析を行なったところ多くの短い配列が様々な配置でヒトゲノムと転写産物に現れている（ブラスト解析結果は本出願に添付している）。本発見において、pUC19は低分子DNA配列、ヒト転写物および、あるいはヒトゲノム配列、とマッピングされる、通常15-100塩基の代表格であり、そしてこれら低分子DNA配列に対応する遺伝子産物（このベクターのDNA配列に直接由来するsiRNA、miRNA、 shRNA、 ペプチド、そしてこれらの配列の直接の遺伝子産物としての対応する分子の作用や活性を干渉するおよび、あるいは阻害する低分子、を含む（がこれに限らない））の代表格であり、対応する遺伝子のDNA配列には、pUC19DNA配列と部分的に一致するDNA配列が含まれる。符合したDNA配列はかならずしも完全一致である必要はない。DNA配列のマッチングは10%、20%、または30〜40%に至るほどの差異があっても可能である。
【００５０】
“pcDNA3m DNA”とは哺乳類の発現ベクターversion 3.1の変形である（SEQ ID #13）。このベクターのDNA 配列は、現在このベクターの生産販売を中止しているInvitrogen社から仕入れた。この変形においてはBeglII部位破壊をヌクレオチド13で、またSp6部位をヌクレオチド 999-1016で、HindIIとEcoRIの間にHAtagを挿入した。pcDNA3はヒトの癌細胞に化学物質もしくはリポソーム 基のDNA遺伝子導入試薬で遺伝子導入した。われわれのデータの提唱により、本DNA ベクターを構成するDNA配列は、これらの細胞を他の治療薬と融合すると生物学的製剤効果 があり、培養したヒトの癌に相乗的細胞死を導く可能性があることは、この発明に述べている通りである。ヒトゲノムと転写産物に対してpcDNA3のDNA 配列をブラスト解析したところ、多型の短い配列がさまざまなヒトゲノムと転写産物に配置している（ブラスト結果は本出願に添付）が、それぞれ探査する予定である。本発明において、pcDNA3は、通常ヒトの転写産物および・またはヒトゲノム DNA 配列に配置した15〜100塩基の短いDNA配列、またsiRNA、 miRNA、 shRNA、 ペプチドを含むがその限りでない、この直接の遺伝子配列の産物としてこれら対応する分子の作用と活性に介入したり阻害したりできるベクターと小分子のDNA配列から直接派生した、それぞれ対応する遺伝子産物を代表するものであり、対応する遺伝子のDNA 配列pcDNA3のDNA 配列からきたマッチングの短いDNA配列を含む。このマッチングしたDNA配列は完全一致である必要はなく、30〜40% までの変異が認められる。  
【００５１】
“siRNA1” とは、pUC19 (SEQ ID#10)の DNA 配列から派生し、それを基に設計したsiRNAである。本 siRNA 配列 はヒトの遺伝子転写産物の一過性受容可能カチオンチャネル，サブファミリー C、メンバー 6（Homo sapiens transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 6）(TRPC6, 遺伝子ID: 7225)、 mRNA   (gi|19923256|NM_004621.3) 同義語: TRP6, FSGS2, FLJ11098に一致する。本発明では、siRNA1 はがん治療においてTRPC6を標的とするために用いられた。TRPC6は、いかなるsiRNA配列でもTRPC6配列の転写産物に配置でき、その発現量とTRPC6の作用機作に阻害効果があるものであれば標的にすることができる。概してsiRNA配列はすこし変異し、10%、20%さらに完全転写産物の配列から30〜40%さえも変異が認められる。TRPC6はまたペプチド、アンチセンスRNA、 アンチセンスDNA オリゴ、 ドミナント・ネガティブのDNAベクター、 抗体、小さい分子阻害剤により標的にすることができる。上の段落において述べたsiRNA配列は、好ましい配列であるが、 だからといって、上記段落内に述べたTRPC6を標的とする上で他のsiRNAや他の手法を制限するものではない。TRPC6の作用機作は以前から癌治療の標的として考えられていたが、TRPC6をIKK 阻害剤もしくは化学療法薬とともに癌細胞形成を相乗的に阻害し癌細胞死の促進へ導く癌の複合治療として用いる報告はこれまでなされていなかった。
【００５２】
“siRNA3” とはpUC19 (SEQ ID #12) のDNA 配列から派生し、それを基に設計したsiRNAである。このsiRNAの配列はHomo sapiens membrane associated グアニル酸キナーゼ, WW および PDZ ドメイン3を含む (MAGI3, Gene ID: 260425), 転写産物 variant 2, mRNA (gi|23097339|NM_152900.1) 同義語: MAGI-3, MGC163281 およびHomo sapiens 膜貫通型タンパク182 (TMEM182, 遺伝子ID: 130827), mRNA (gi|40255064|NM_144632.2)のヒト転写産物に一致する。 本発明において、 siRNA3はMAGI3やTMEM182 をがん治療の標的とするために用いられた。MAGI3やTMEM182は、MAGI3やTMEM182の各配列の転写産物に播くことのでき、またMAGIKKやMEM182の発現量と機能に阻害効果を持つあらゆるsiRNA配列で標的にすることができる。概してsiRNA配列は、転写産物の完全配列の10%、20% または30〜40%まで変異することができることができる。MAGI3やTMEM182はまたhsRNA、ペプチド、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA オリゴ、ドミナント・ネガティブのDNAベクター、抗体および小分子阻害剤で標的とすることができる。この段落の中で上に述べたsiRNA配列は好ましい配列だが、本発明からMAGIKKとTMEM182を標的とするためにこの段落のすぐ上に述べた他のsiRNAや他の手段を制限するものではない。MAGI3の作用機作は以前にも癌に関与していたが、複合癌治療の標的としてMAGI3をIKK阻害剤または化学療法薬とともに用いることにより癌細胞形成の相乗的阻害に導き癌細胞死を促進することに関した報告はされていない。TMEM182は以前研究されたことがあるが、癌には関連付けられてはいなかった。
【００５３】
“siRNA2” とは、pUC19 (SEQ ID#2) のDNA配列を基に設計され派生したsiRNAである。このsiRNA 配列の3分の2がヒトのSH3 and PX ドメインs 2B (SH3PXD2B), mRNA(SH3PXD2B、遺伝子ID: 285590), mRNA (NM_001017995) 同義語: HOFI; FLJ20831; KIAA1295の転写産物と合致する。加えて、本配列 はまたヒトゲノム内で45を越える部位に配置している。本発明においてsiRNA2 は、SH3PXD2B および他にがん処置に可能性のあるヒトのゲノム内のDNA 配列すべてを標的とするために用いられた。SH3PXD2Bは、SH3PXD2B 配列の転写産物 に配置でき、SH3PXD2Bの発現量と機能および 他の遺伝子 発現に阻害効果をもつあらゆるsiRNAによって標的とされる。 概してsiRNA配列 は、配列転写産物の完全転写の 30％〜40% も変異することができる。 SH3PXD2BはまたshRNA、 ペプチド、 アンチセンスRNA、 アンチセンスDNA オリゴ、ドミナント・ネガティブの手法を利用したDNAベクター、 抗体 、小さい分子 阻害剤によって標的とすることができる。上の段落において述べたsiRNA配列は、好ましい配列であるが、上記段落内に述べたように、この発明からsiRNA 配列によって変異できるSH3PXD2Bと他の遺伝子の発現量と作用機作を標的とする上で、この段落のすぐ上に述べた他のsiRNAや他の手法を制限するものではない。SH3PXD2Bはこれまでまったく癌に関連付けて研究されていなかった。
【００５４】
“TRPC6” は、ヒト一過性受容体カチオンチャネルサブファミリーC、メンバー6、 (遺伝子ID: 7225), mRNA (gi|19923256|NM_004621.3) 同義語: TRPC6、 FSGS2、 FLJ11098))の転写産物の代表格である。本発明において、TRPC6は癌を治療する標的としての可能性を持つ。 TRPC6 はsiRNA、 shRNA、 ペプチド、 アンチセンスRNA、 アンチセンスDNA オリゴ、小さい分子 阻害剤によって標的とされる。TRPC6 は、TRPC6配列の転写産物に配置でき、TRPC6の発現量と作用機能を阻害効果効果を持つあらゆるsiRNA 配列によって標的とされる。概してsiRNA 配列 は少し変異し、転写産物の完全配列の10%、20% から30〜40%さえも変異がみとめられる。TRPC6は、またペプチド、 アンチセンスRNA、 アンチセンスDNA オリゴ、 ドミナント・ネガティブの手法を利用したDNA ベクター、 抗体 、小 分子 阻害剤によって標的にすることができる。上記のsiRNA1 配列 は好ましい 配列だが、他のsiRNAやTRPC6を標的とするためにこの段落中のすぐ上に述べた手段以外の手法を制限するものではない。TRPC6 はこれまで癌治療の標的として報告されているが、複合癌治療の標的としてTRPC6をIKK阻害剤または化学療法薬とともに用いることにより癌細胞形成の相乗的阻害に導き癌細胞死を促進することに関した報告はされていない。
【００５５】
“MAGI3” は、 ヒト皮膜の転写産物関連のグアニル酸キナーゼであり、 WW および PDZ ドメイン3を含む （MAGIKK、 遺伝子ID: 260425） 転写産物 variant 2、 mRNA （gi|23097339|NM_152900.1）である。同義語: MAGI-3、 MGC163281。MAGI-3 はZO-1 および上皮細胞内で密着結合したcingulinで位置の同定ができるが、またMAGI-3 は上皮型カドヘリンに基づいた細胞間接触であり、第一培養を施した星状膠細胞群の接着斑部位に発現している（Adamsky K, Arnold K, Sabanay H, Peles E., Junctional Protein MAGIKK interacts with receptor tyrosine phosphatase beta (RPTP beta) and tyrosine-phosphorylated proteins. J Cell Sci. 2003 Apr 1;116(Pt 7):1279-89. PMID: 12615970）。 MAGI-3 は直接LPA（2）に干渉しLPAの能力（2）を調整することによりErkとRhoA を活性化する一方、MAGIKK は LPAの誘導したErkとRhoAの活性化を調整する（Zhang H, Wang D, Sun H, Hall RA, Yun CC, Cell Signal. 2007 Feb;19（2）:261-8. Epub 2006 Aug 9. PMID: 16904289）。MAGI3の作用機作はこれまで癌に関連付けられてきたが、IKK 阻害剤または化学療法薬を用いるMAGI3を標的とした組成的癌治療で癌細胞形成を相乗的に阻害し癌細胞死を誘導することに関しては何もレポートがなかった。本発明においては、 MAGIKK はがんの複合治療の標的となる可能性を持つ。 MAGIKK はsiRNA、shRNA、 ペプチド、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA オリゴ、ドミナントネガティブDNAベクター、抗体 、小さい 分子阻害剤によって標的となることができる。上記のsiRNA3 配列は好ましい配列であるが、この段落中に述べた他の手法を制限するものではない。概してsiRNA 配列はすこし変異することができ、10%、20% または30-40% も転写産物の完全配列から変異している。    
【００５６】
“TMEM182” とは、ヒトの トランス皮膜 タンパク質 182 (TMEM182、遺伝子ID: 130827) 、mRNA (gi|40255064|NM_144632.2) の代表格である。本発明において、
SH3PXD2Bは癌治療の標的となる可能性をもつ。TMEM182 は、siRNA、shRNA、 ペプチド、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA オリゴ、ドミナント・ネガティブの手法を利用したDNA ベクター、 抗体、小さい分子 阻害剤により標的とすることができる。上記のsiRNA3 配列 は好ましい配列であるが、他のsiRNAを標的とするために他のsiRNA配列やこの段落中に述べた手法を制限するものではない。 概してsiRNA 配列 はすこし変異することができ、転写産物の完全配列から10%、 20% 、また30〜40% の変異が可能である。TMEM182 はこれまで癌治療の標的として研究されておらず、癌に関連付けられていなかった。
【００５７】
“SH3PXD2B” は SH3とPX のドメイン2B アダプター タンパク質 HOFI （遺伝子ID: 285590）でありSH3 とPX のドメインを含む。SH3; Src 相同性3ドメイン; SH3ドメインは中程度のアフィニティと選択性でプロリンに富むリガンド群に、優先的にPxxP motifsに結合する; 分子内相互作用により酵素制御の役割をもち、PXの細胞内 部位を変更する; PhoX 相同的ドメインは、p47phox および p40phoxに発現する。  
未知の機能を持つ真核性ドメイン はphox タンパク質群に発現、 PLD イソ型複数、 およびPI3K イソ型一種。SHPXD2B はこれまで研究されておらず癌に関連付けもされていなかった。SH3PXD2B もこれまで研究されておらず癌に関連付けもされていなかった。本発明において、 SH3PXD2B は癌治療の標的となる可能性を持つ。   SH3PXD2B はsiRNA、 shRNA、 ペプチド、 アンチセンスRNA、アンチセンスDNA オリゴ、小さい分子 阻害剤により標的とすることができる。上記のsiRNA2 配列は好ましい 配列であるが、この段落に述べた他のsiRNA 配列や他の手法を制限するものではない。概してsiRNA 配列 は10%、20% さらに30〜40% ほども転写産物のexact 配列から変異することができる。
【００５８】
"C6orf 108" とは、ヒトC6orf 108 染色体 6 の読み枠 (ORF) 108 (Homo sapiens ) 遺伝子lD: 10591、公認シンボルはC6orfl08 である。この遺伝子はc-Myc タンパクによる刺激実験で同定された。この遺伝子の作用機作は不明であるが、ラットによる研究で細胞増殖やc-Myc が関与するトランスフォーメーションを誘引する役割が示唆されている。
【００５９】
"インターフェロン" (Interferon, またはIFN) とは、白血球や線維芽細胞内で産生するサイトカイン群である。この発明報告書で述べているIFN とは、タイプI、タイプII を含めたすべての IFN をさしており、IFNα A, IFNα B, IFNα C, IFNα D, IFNα F, IFNα G, IFNα H, IFNα I, IFNaJ, IFNα K, IFNα 4b, IFNα WA, IFNβ, IFNγ やIL-6に限らず、すべてのIFNのサブタイプを含む。
【００６０】
"WST-1c" とはテトラゾリウム塩WST-1{4-(3-(4-ヨードフェニル)-2-(4- ニトロフェニル)-2H-5-テトラゾリオ)-l,3-ベンゼンスルホン酸} であり、1996年に石山巳喜夫の論文で最初に報告された(Ishiyam M, et al Biol Pharm Bull 1996, 19:1515-20)。
【００６１】
"WST-1r" とはWST-1c と mPMSを複合処理の濃度条件を最適化した混合試薬を指す。
【００６２】
"IEA" とは電子受容体の中間体である。
【００６３】
"mPMS" (l-メトキシ-5-メチル-フェナジウムメチルスルファート) とは、テトラゾリウム塩と複合処理した際に、電子結合試薬かつ電子受容体の中間体として作用する化合物である。
【００６４】
"Ql" とはIEAの化合物である。
【００６５】
"WST-1r の有効な代替" とは、WST-1cの代替となり、相乗的に癌細胞死を誘発するあらゆる化合物、または単独、WST-1cの構成要素と共に、あるいは本発明に説明したようにテトラゾリウム塩の構成要素とWST-1r を含みWST-1r として作用するIEAとの組み合わせで複合的に作用する、電子結合試薬またはその他のあらゆる要素を指す。この用語 " WST-1rの有効な代替" には、現在入手が可能なすべてのテトラゾリウム塩を構成物質としたWST 群 (WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-9, WST -10, WST-11, MTS やXTT, mPMS とQl を含む IEA, そしてテトラゾリウム塩とこれらのIEA との組み合わせ (WST-1+mPMS, WST-3+mPMS, WST-4+mPMS, WST-5+mPMS, WST-9+mPMS, WST-10+mPMS, WST-11+mPMS, XTT+mPMS, MTS+mPMS,, WST-3+Q1, WST-4+Q1, WST-5+ Ql, WST-9+ Ql, WST-10+ Ql, WST-11+ Ql, XTT+ Ql MTS+ Ql) など含むが、これに限定されない)が挙げられる。
【００６６】
"IKK 阻害剤" とは阻害剤kappaB キナーゼ (Inhibitor kappaB Kinase, またはIKK) のことである。本発明に適したIKK 阻害剤とは、IKK 阻害剤 II、 IKK 阻害剤 III 、IKK 阻害剤 VI、 IKK 阻害剤 VII、sc-514を含むがこれに限定されない。より広域のグループとして含まれるのは（ただしこれに限定されない）、SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)、アニリノピリミジン誘導体 (Signal Pharmaceutical Inc.)、PS 1145 Millennium Pharmaceutical Inc.)、BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, IKK 阻害剤 III)、 SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.)、アミノ- イミダゾールカルボキシミド誘導体  (Smithkilne Beecham Corp.)、 ウレウド- チオフェネカルボキサミド誘導体 (AstraZeneca )、 ジアリルピリジン誘導体 (Bayer )、 ピリドオキサジノン誘導体 (Bayer )、 インドールカルボキサミド誘導体 (Aventis Pharma)、 ベンゾイミダゾールカルボキサミド誘導体(Aventis Pharma)、 ピラゾーロ(4,3-c) キノリン誘導体 (Pharmacia Corporation)、 イミダゾールキノリン ? カルバルデヒド  セミカルバジド誘導体 (Tulark Inc.)、ピリジルシアノグアニジン誘導体 (Leo Pharma), IkB キナーゼ 阻害剤ペプチド (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 IV (5-(p-フルオロフェニル)-2-ウレイド)チオフェン-3- カルボキサミド(CalBiochem)、 IKK阻害剤II、ウエデロアセトン (CalBiochem)、 IKK 阻害剤 VII (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 V N-(3,5-ビス-トリフロロメチルフェニル)-5-クロロ-2- ヒドロキシベンズアミドIMD-0354 (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VI (5-フェニル-2-ウレイド)チオフェン- 3-カルボキサミド (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VIII ACHP 2-アミノ-6-(2-(シクロプロピルメトキシ)- 6-ヒドロキシフェニル)-4-(4-ピペリジル)-3-ピリジンカルボニトリル (CalBiochem)などである。
【００６７】
"CK2 阻害剤" とは、本発明においてすべてのプロテインキナーゼ・カゼインキナーゼ2 阻害剤を示す。本発明に適したIKK 阻害剤はアピゲニンであるが、これに限定されない。
【００６８】
"アピゲニン" とは、広範にわたる果物や野菜（りんごやセロリなど）に含まれるフラボノイドを指す。CAS 登録番号: 520-36-5, 化学Abstracts Service Name: 4H-1- ベンゾピラン-4-オン,5,7-ジヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシ-フェニル)- (9CI)。アピゲニンは非変異原性のバイオフラボノイドであり、観葉植物や野菜（例：パセリ、西洋アザミ、バジル、セロリなど）に検出され、UV 照射に対して著しい化学予防活性がある。現段階の研究試験では、アピゲニンの作用としてDNA 酸化的損傷の低下、ヒト白血病細胞の成育を抑制、癌細胞のシグナル伝達を阻害してアポトーシスを誘導、抗炎症作用、抗痙攣性、鎮痙作用、などの所見が報告されている。アピゲニンはCK2、 MPK、 HIF、 VEGF、その他の分子や細胞分裂、血管新生、p53の活性化誘導などの制御経路を阻害する。アピゲニンは酸化を引き起こすUV照射に対抗する作用が知られ、癌に対する化学予防薬となる。
【００６９】
"LiCl" とは無機塩の塩化リチウム (塩化リチウム またはLiCl ) を指し、GSK3βの阻害剤として利用される。本発見で、LiCl はGSK3βを阻害する阻害剤群の代表格である。
【００７０】
"IKK" とは阻害剤kappaB キナーゼ (Inhibitory kappaB Kinase) であり、IKBをリン酸化してNF-KAPPAB の活性化を促進する。IKK にはIKKl (IKKα) と IKK2 (IKKβ) の2 種のアイソフォームが同定されている。同じアイソフォームのIKK同士、または2 分子はIKKlと IKK2との組み合わせとNEMO (IKKγ) との結合で IKK複合体を形成している。IKKはNF-kappaBシグナルの上流における重要なレギュレーターの一種である。"IKK阻害剤" とは、阻害剤kappaB キナーゼ (IKK) の活性を阻害する作用を持つ物質であり、すなわちIKKのリン酸化活性を阻害してNF-κB を活性化する。IKK 阻害剤にはは拮抗型、非拮抗型、不可逆型の阻害機構がある。"拮抗型IKK 阻害剤"とは、化合物やペプチドが酵素活性部位に可逆的に結合して阻害するものを指す (例：制限なし、例を探す必要あり)。"非拮抗型IKK 阻害剤"とは、化合物やペプチドが酵素活性部位以外の部位に結合して可逆的に阻害するものを指す (例：制限なし、例を探す必要あり) 。"不可逆的IKK 阻害剤"とは、化合物やペプチドがIKK に共有結合して不可逆的に酵素活性を阻害するものを指す (例：制限なし、例を探す必要あり)。現発明における"IKK阻害剤" とは、i) IKK阻害作用を示すことが解明された化合物群で、次のものを含む（ただし限定されない）: SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)、アニリノ- ピリミジン誘導体 (Signal Pharmaceutical Inc.)、PSl 145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)、 BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, IKK inhibitor III)、 SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.)、アミノ- イミダゾールカルボキシミド誘導体  (Smifhkilne Beecham Corp.), ウレウド- チオフェネカルボキサミド誘導体 (AstraZeneca )、 ジアリルピリジン誘導体 (Bayer )、 ピリドオキサジノン誘導体 (Bayer )、 インドールカルボキサミド誘導体 (Aventis Pharma)、 ベンゾイミダゾールカルボキサミド誘導体(Aventis Pharma)、 ピラゾーロ(4,3-c) キノリン誘導体 (Pharmacia Corporation)、 イミダゾールキノリン-カルバルデヒド  セミカルバジド誘導体 (Tulark Inc.)、ピリジルシアノグアニジン誘導体 (Leo Pharma), IkB キナーゼ 阻害剤ペプチド (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 IV (5-(p-フルオロフェニル)-2-ウレイド)チオフェン-3- カルボキサミド(CalBiochem)、 IKK阻害剤II、ウエデロアセトン (CalBiochem)、 IKK 阻害剤 VII (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 V N-(3,5-ビス-トリフロロメチルフェニル)-5-クロロ-2- ヒドロキシベンズアミドIMD-0354 (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VI (5-フェニル-2-ウレイド)チオフェン- 3-カルボキサミド (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VIII ACHP 2-アミノ-6-(2-(シクロプロピルメトキシ)- 6-ヒドロキシフェニル)-4-(4-ピペリジル)-3-ピリジンカルボニトリル (CalBiochem)、 ii) ある特定の実施例では、IKK 阻害剤群として、本発明でも以前の研究でも一致した抗腫瘍活性が認められ、IKKの阻害活性が確認された次の化合物群も含む（ただし限定されない）：PSl 145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)、BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。
【００７１】
"NF-kappaB" とは核内因子kappaB (Nuclear factor kappaB、またはNF-κB) を指し、rel タンパクファミリーの一種で、転写因子として遺伝子発現を調節する。通常、NF-KAPPAB タンパクは細胞質内で二量体で存在しており、さらに阻害剤kappa B (inhibitory kappa B 、またはIKB) と共に複合体を形成して不活性化した状態にある。シグナルが活性化されると、IKBはIKK によってリン酸化され、NF-kappaB の二量体が解離し、これが核内に移行してNF-kappaB が制御する特異な遺伝子群の転写活性を上昇させる。解離したIKB はプロテオソーム分解を受ける。NF-kappaB が活性化されると、細胞は細胞増殖と細胞生存に傾く。NF-kappaBの 活性化は、発癌過程や腫瘍形成、癌細胞の化学療法や放射線療法に対する耐性獲得と相関しているか、関与していることが知られている。
【００７２】
"C-Jun N-末端キナーゼ" (C-Jun N-terminal kinases、またはJNKs) は、c-Jun の転写活性ドメイン内のSer63 およびSer73アミノ酸配列に結合してリン酸化するキナーゼとして同定された。JNKs は分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(mitogen-activated タンパク質 kinases、またはMAPK) であり、ストレス刺激に対する応答、例えばサイトカイン、紫外線照射、熱ショック、浸透圧ショック、T cell 分化やアポトーシスなどに関与している。
【００７３】
"活性酸素種"  (Reactive Oxygen Species、またはROS) には酸素イオン、フリーラジカル、無機および有機の過酸化物が含まれる。ROS は概して非常に低分子であり、最外殻不対電子を有するために高い反応性を持つ。ROS は通常の酸素代謝自発的に形成する副生成物であり、細胞内のシグナルに重要な役割を果たしている。細胞内代謝におけるROS の役割は様々な種でよく研究されている。これにはプログラム細胞死やアポトーシスだけでなく、宿主防御遺伝子の発現やイオン輸送の可動化などの正の効果もある。これらは酸化還元経路や酸化的経路に関連した役割として報告されていることが多い。
【００７４】
"癌細胞" とは、接触阻止能の欠失などの悪性様態を示すヒトの癌または癌組織に由来する培養中の細胞を示す。
【００７５】
"癌" とは、発癌性物質や正常細胞に癌化を誘発する物質が隣接する組織に浸潤し局部的リンパ節や遠隔部位への悪性細胞のリンパ性あるいは血液性拡散（すなわち転移）する病状のことである。
【００７６】
"効果的濃度" とは、ここでは薬や調合薬が細胞、組織、システム、動物や人の固体に対して生物的、医学的応答を引き起こす薬の量であり、これらの量は研究者や臨床医によってもとめられている。さらに、"治療効果のある量" とは何も投与されていない対象と比較して、症状の改善、回復、予防、病気・疾患・副作用の改善、病気や疾患の進行速度の低下などの所見が認められる薬の量である。この用語には、正常な生理作用を促進するのに効果的な範囲の量、という意味も含まれる。
【００７７】
"癌治療" とは、薬や試薬が哺乳類の個体か細胞内に導入され、処置の継続期間、これらの薬の投薬、または治療の順番や時間間隔のことである。
【００７８】
"相乗的効果・相乗する" とは、2種かそれ以上の処置の組み合わせることにより、それら単独で得られた効果を加えた効果よりも高い有効性を生みだすことである。
【００７９】
"5-フルオロウラシル" (5-フルオロ-2,4-(lH,3H) ピリミジンジオン(5-FU)) とは、市販のフルオロウラシルを指す。
【００８０】
"シスプラチンの" (Cis-Platinum、またはcis-diamminedichloroplatinum) とは、注射溶液として市販されているPLATINOL.RTM.である。
【００８１】
"パクリタキセル" (パクリタキセル)とは強力な抗腫瘍薬である。β-チューブリン のN 末端領域と結合することにより非常に安定な微小管を形成し、この微小管は脱重合化に耐性があるため、正常な細胞分裂を妨害し、細胞周期をG2/M期で停止する。
【００８２】
"ドキソルビシン" (doxorubicin, (8S,10S)-10-((3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ- α- L-lyxo- ヘキソピラノシル)オキシ)-8? グリコシル, 7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,l l-トリヒドロキシ-l-メトキシ-5,12 ナフタセンジオンヒドロクロリド) は、注射形式の市販薬RUBEX.RTM. または ADRIAMYCIN RDF.RTM. である。
【００８３】
化合物や医薬組成物の"治療上効果量"とは、培養中の癌細胞を制御し、腫瘍形成や動物や特にヒト個体での転移を誘引するのに十分な量であり、個体レベルで無限の腫瘍の生育やサイズを抑制するか、腫瘍形成を予防する量を示すこともある。この用語は癌細胞死を誘発したり、正常細胞に副作用を与えずに選択的に癌細胞死を引き起こすのに必要な量と意味することもある。
【００８４】
"製薬学的に許容される"とは、連邦政府や州政府、米国薬局方やその他の広く認知されている薬局方のリストに入っている規制機関が出した、動物や多くはヒトへの利用許可を指す。
【００８５】
"担体"とは、本発見を実施した際に活性試薬と共に用いた、希釈剤、アジュバント、賦形剤、補助剤や媒体などのことである。製薬的担体とは水や石油など無菌の液体であり、例としては動植物または合成由来の油、ピーナッツ油・大豆油・鉱物油・ごま油などが含まれる。水または生理食塩水、デキストロース溶液、グリセロール溶液は、特に注射溶液として担体に適している。適当な製薬的担体に関しては、E. W. Martin 著 "Remington's Pharmaceutical Sciences" に記述がある。この著書には、DNA および、また RNAを細胞内に導入する際に使用するトランスフェクション試薬の利用法についても記されている。
【００８６】
"同時に"とは、(1) 時間的に同じ時点で、あるいは(2) 通常の処置スケジュールの中で、別の時点で、を意味する。
【００８７】
"連続で"とは、ある活性試薬を投与した後に別の活性試薬を投与することを言う。ある活性試薬を投入したあと、実質上はじめの活性試薬の投入からただちに次の活性試薬を投入するか、または次の活性試薬をはじめの活性試薬が薬効を発揮する期間を経てから投入することができる。すなわち、効果的な期間とは初めの活性試薬の効能が頂点に達するまでの時間である。
【００８８】
II 癌治療のための標的、および治療標的のターゲティング療法  
本発見では、癌治療の治療標的としての利用に有効な遺伝子上の核酸配列、これらの配列をコードするポリペプチド、抗体、ポリペプチド同様に活性のある化合物群、癌関連遺伝子の活性抑制に有効な試薬が、癌治療標的となりえる可能性を示唆しており、その結果、これまで抗腫瘍効果を確立していなかった癌性症状を治療することができる。
【００８９】
ここに公表した核酸配列はDNA クローニングベクターpUC19に関連、pUC19から由来したものである(SEQ ID #1)。このベクターを導入した癌細胞に、IKK 阻害剤、続いてWST-1rかその代替となる試薬を複合的に投与した場合、あるいは化学療法製剤と複合投与した場合、IKK 阻害活性が相乗的に高まり、癌細胞の成育、増殖が抑制され、癌細胞死が促進される。このpUC19 の役割に関しては、以前に報告したとおりである。ほかの候補となるDNA 配列としては、改変したpcDNA3 version 3.1 (SEQ ID 13) があげられ、題名"NCBI ブラスト pcDNA3 ヌクレオチド配列(5448 letters)"の添付書類にブラスト相同性解析の結果を示している。
【００９０】
従って、本発明において、このpUC19ベクター(SEQ ID #1)における抗癌作用は、第一にDNA配列に存在しており、その配列を転写産物とマッピングした結果、ヒトゲノムや遺伝子中に隣接する短い配列 (15 bp から100 bp) に相同性を示すことを明らかにした。pUC19 の遺伝子をマッピングしたデータベースは、1) Homo sapiens 一過性受容体電位カチオンチャネル, サブファミリー C, メンバー 6 (TRPC6, 遺伝子lD: 7225, mRNA: NM_004621.3, SEQ ID #2, #6), (2) Homo sapiens SH3 およびPX ドメイン 2B (SH3PXD2B, 遺伝子lD: 285590, mRNA:NM_001017995, SeQ ID #3, #7), (3) Homo sapiens 膜結合型グアニル酸キナーゼ, WW および PDZ ドメイン 3 を含む (MAGIKK, 遺伝子lD: 260425, 転写産物 variant 2, mRNA:NM_l 52900, SeQ ID #4, #8), (4) the Homo sapiens 膜貫通型タンパク182 (TMEM182, 遺伝子lD: 130827, mRNA: NM_144632, SeQ ID #5, #9) and (5) Homo sapiens クロモソーム 6 open reading frame 108 C6orfl08, 遺伝子lD: 10591 SeQID #14, #15) であった。pUC19 DNA配列とマッピングしたヒトゲノム配列は、題名"NCBI ブラスト-pUC19-Human-Transcripts and genome(2686 letters)"、"NCBI ブラスト_siRNA2 ヌクレオチド配列(24 letters)"、"NCBI ブラスト_pcDNA3 ヌクレオチド配列(5448 letters)"の添付書類のリストに記されている。
【００９１】
開示したポリペプチドには、多様なポリヌクレオチドの転写産物を含むことがここに明らかになり(SEQ ID #2, 3, 4, 5 and 14)、従ってその遺伝子産物から得られたのアミノ酸配列 (SEQ ID #6, 7, 8, 9 and 15) は癌治療の標的に利用することができる。特に、抗ポリペプチド抗体、ペプチド阻害剤、低分子阻害剤、二重鎖siRNA 、shRNA、アンチセンスRNA, アンチセンスオリゴ、および上記のポリペプチドを抑制するドミナントネガティブDNA ベクター抗体を含む（ただしそれらに限らない）抗癌剤は癌治療に応用が可能である。特定の実施例で用いた二重鎖siRNAは、siRNAl (SEQ ID #10), siRNA2 (SEQ ID #11), siRNA3 (SEQ ID #12)などを含んでいた。
【００９２】
本発見の過程で用いた、遺伝子産物としてのポリヌクレオチドとポリペプチドには、リコンビナントのポリヌクレオチドとポリペプチド、自然の（野生型の）ポリヌクレオチドまたは合成ポリヌクレオチドとポリペプチド、化学修飾したポリヌクレオチドとポリペプチドを含有している可能性がある。
【００９３】
このpUC19ベクターのポリヌクレオチドとポリペプチドはヒトゲノム、本発見の過程で用いたリコンビナントのポリヌクレオチドとポリペプチドを含むヒトゲノムの隣接遺伝子、とのマッピングの結果、自然のポリヌクレオチドとポリペプチド、または合成ポリヌクレオチドとポリペプチドとのマッピング解析に供されている。
【００９４】
ここに開示するポリヌクレオチドとポリペプチドの断片には、本発見の過程の実用化に有用である可能性がある。例示すると、ポリペプチドの誘導体やその類似体 の断片(SEQ ID# 2, 3, 4, 5 and 14) は、(i)これらの配列のいかなる部分および、または全体の配列のうち上限40 % までのミスマッチのある配列、(ii) DNAベクターか他の担体に融合するか、(iii) 核酸配列や修飾配列、で代替が可能かもしれない。
【００９５】
ここに開示するポリヌクレオチドとポリペプチドの断片には、本発見の過程の実用化に有用である可能性がある。例示すると、ポリペプチドの誘導体やその類似体 の断片(SEQ ID #6, 7, 8, 9 and 15) は、(i) 1か1以上のアミノ酸残基が、保存された、または保存されていないアミノ酸残基で置換したもの （保存されたアミノ酸残基が望ましい）で、そのような置換アミノ酸残基はゲノム配列をコードしているか、していないもの、または (ii) 1か1以上のアミノ酸残基自体が、置換器を持つもの、もしくは (iii) 成熟ポリペプチドが他の化合物と結合したもの、例としてはポリペプチドの半減期を高めるような化合物（ポリエチレンやグリセロールなど）、あるいは (iv) 成熟ポリペプチドにさらに多くのアミノ酸残基を付加融合したもの、例としてはリーダー配列や分泌配列、タンパク精製の補助的役割を果たすポリペプチドを付加した配列（ヒスチジン  ヘキサペプチドなど）、プロプロテイン配列などがあげられる。このような断片、その誘導体や類似体は、原理から導きだした工学技術であると考えれば、実現可能な技術であると判断できる。
【００９６】
上記で開示したこれらのsiRNA (SEQ ID 10, 11, 12)の置換は、本発明を実現するにあたって有用である可能性がある。例として挙げられるのは（しかしこれらに限定しない）、(i) ある遺伝子をコードする配列の別部位の配列をマッピングしたsiRNA、(ii) 同じ遺伝子を標的にできるが、発現量を低減した、変異型siRNA配列、(iii) 各三部分か全体のsiRNA に対する修飾、(iv) siRNA配列 をあらゆるタイプの担体に入れたもの、例として配列の作用発現を目的としたベクターや化学修飾など、である。
【００９７】
上記のとおり全mRNAの核酸配列、転写の読み枠 (open reading frame, ORF) 、アミノ酸配列は、上で紹介した遺伝子 ID かアクセス番号NCBI GenBankによって データベース検索できる。
【００９８】
本発見は、少なくとも部分的に、癌細胞におけるpUC19 ベクターが、IKK阻害剤WST-1rと共に複合処理されるか、化学療法製剤との複合処理をされた際に、癌細胞の生育・増殖を阻害し、癌細胞死を促進する効果を発見したことに基づいている。このpUC19 DNAを導入することによって誘発する阻害機構は、siRNA 、化合物または低分子阻害剤、ペプチド阻害剤、抗体、shRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴ、および上記のポリペプチドを抑制するドミナントネガティブDNA ベクター抗体、上記で述べた一致する遺伝子産物および、あるいはタンパク、そして少なくともIFNの一部、などで置き換えることができる可能性がある。
【００９９】
前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、子宮内膜、脳、肝臓、膀胱、卵巣、精巣、頭部、頸部、皮膚（悪性黒色腫と基底細胞癌を含む）、中皮、食道、乳、筋肉、結合組織、肺（小細胞肺癌と非小細胞癌を含む）、副腎、甲状腺、腎臓、骨の癌；膠芽細胞腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、肉腫、絨毛癌、皮膚基底細胞癌、精巣上皮腫を含む（ただしそれらに限定しない）癌は、本研究の手法を用いた処置で治療される可能性がある。
【０１００】
III. 癌治療のための処置
本発見では、以前には抗腫瘍活性が認められなかったWST-1r とその有効な代替（となる物質または処理）を含有する製薬組成について提示する。WST-1rの有する抗腫瘍活性は当初、細胞増殖を検出する試薬として発見された。これが (1) アピゲニン、またはその有効な代替、 (2) INN 阻害剤、 (3) Pucl9ベクターの遺伝子導入またはその代替、のいずれかと、すくなくとも１種のIKK 阻害剤を複合処理した場合、WST -Ir は癌細胞死を相乗的に誘導する。そのような製薬組成は、製薬的に効果的な量を、リン酸化緩衝食塩水ほか製薬的に許容される媒体を用いて、最適濃度で、癌治療の目的で患者に投与される。
【０１０１】
細胞増殖試薬WST-1はテトラゾリウム塩、WST-1、4-(3-(4- ヨードフェニル)-2-(4-ニトロフェニルl)-2H-5-テトラゾリオ)-l,3-ベンゼンスルホン酸 (WST-1, Ishiyam M, et al Biol Pharm Bull 1996, 19:1515-20; Berridge MV, et al Biotechnology Annual Review, Vol. 11:127-152, 2005)、電子受容体中間体 (IEA)、l-メトキシ-5-メチル- フェナジニウムメチルスルファート (mPMS, Berridge MV, et al Biotechnology Annual Review, Vol. 11:127-152, 2005) から構成されており、リン酸化緩衝食塩水に溶解している。
【０１０２】
本発見に従うと、本発見におけるWST-1rの含有する癌治療のための活性物質とは、最適の濃度または割合で処方されたWST-1または  mPMS単独、あるいは両者の組み合わせの処置である。本発明で解説するWST-1rとは、化合物群ないしは、テトラゾリウム塩とIEA との複合処理のことを示しており、これには、活性酸素種 (ROS) の発生を促す細胞膜貫通型電子伝達を含む（ただしそれに限らない）という共通した作用機作がある。
【０１０３】
有効なWST-1代替には、製薬的に許容される媒体中で最適濃度条件のWST-3, WST-4, WST-5, XTTなど他のテトラゾリウム塩などの例が挙げられる。
【０１０４】
有効なmPMS代替には、製薬的に許容される媒体中で最適濃度条件のQl (Berridge MV, et al Biotechnology Annual Review, Vol. 11:127-152, 2005) などの、他のIEAが挙げられる。
【０１０５】
WST-1rの構成要素として、少なくとも1 種のテトラゾリウム塩、WST-1、そして少なくとも1 種のIEA、mPMSが製薬的に許容される媒体中で最適濃度条件で含まれている。
【０１０６】
有効なWST-1r代替には、(1) 少なくとも1 種のテトラゾリウム塩と少なくとも1 種のIEAの組成、例を挙げるとWST-1+mPMS, WST-3+mPMS, WST-4+mPMS, XTT+mPMSなど（これに限らない）、(2) 少なくとも1 種のテトラゾリウム塩、例を挙げるとWST-3（これに限らない）、(3) 少なくとも1 種のIEA、例を挙げるとmPMS など（これに限らない）、があり、これらの構成要素は製薬的に許容される媒体中で最適濃度条件で含まれている。
【０１０７】
しかし本発明において、癌細胞をWST-1r とアピゲニンまたはその他全ての有効な代替と共に同時に、そして連続で上述した各々の処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１０８】
しかし本発明において、癌細胞をWST-1r 、少なくとも1 種のIKK阻害剤と、その他全ての有効な代替とで同時に、そして連続で上述した各々の処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１０９】
ただし本発明において、(1) DNAの遺伝子導入、IFN、siRNAの遺伝子導入、またはその他すべての有効な代替で処理し、続けて(2) １種のIKK、CK2、またはGSK3β 阻害剤で処理し、その後連続で上述した各々のWST- 1rで処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１１０】
ただし本発明において、(1) DNAの遺伝子導入、IFN、siRNAの遺伝子導入、またはその他すべての有効な代替で処理し、続けて(2) １種のIKK、CK2、またはGSK3β 阻害剤で処理し、その後連続で上述した各々のWST- 1rの電子結合試薬で処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１１１】
ただし本発明において、(1) DNAの遺伝子導入、IFN、siRNAの遺伝子導入、またはその他すべての有効な代替で処理し、続けて(2) １種のIKK、CK2、またはGSK3β 阻害剤で処理し、その後連続で上述した各々の、その他全てのWST- 1rの副要素で処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１１２】
ただし本発明において、(1) DNAの遺伝子導入、IFN、siRNAの遺伝子導入、またはその他すべての有効な代替で処理し、続けて(2) １種のIKK、CK2、またはGSK3β 阻害剤で処理し、その後連続で上述した各々の、あらゆる有効なWST-1r代替で処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１１３】
ただし本発明において、(1) DNAの遺伝子導入、IFN、siRNAの遺伝子導入、またはその他すべての有効な代替で処理し、続けて(2) １種のIKK、CK2、またはGSK3β阻害剤で処理し、その後連続で上述した各々の、あらゆる有効なWST-1c代替で処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１１４】
ただし本発明において、(1) DNAの遺伝子導入、IFN、siRNAの遺伝子導入、またはその他すべての有効な代替で処理し、続けて(2) １種のIKK、CK2、またはGSK3β阻害剤で処理し、その後連続で上述した各々の、あらゆる有効なWST-1rの電子結合試薬の代替で処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１１５】
ただし本発明において、(1) DNAの遺伝子導入、IFN、siRNAの遺伝子導入、またはその他すべての有効な代替で処理し、続けて(2) １種のIKK、CK2、またはGSK3β阻害剤で処理し、その後連続で上述した各々の、あらゆる有効なWST-1rの副要素の代替で処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１１６】
ただし本発明において、(1) DNAの遺伝子導入、IFN、siRNAの遺伝子導入、またはその他すべての有効な代替で処理し、続けて(2) １種のIKK、CK2、またはGSK3β阻害剤で処理し、その後連続で上述した各々の、あらゆる有効な代替（あらゆる有効な代替とWST-1rの副要素の代替間の、あらゆるタイプの組成で処理を行うことと、それに後続する実施例がより望ましい実施様態を呈するかは別の課題である。
【０１１７】
さらに、本発明は、治療を要するする患者に投薬することによる癌治療の手法、すなわち製薬的に有効な量の少なくとも１種のWST-1r 構成要素、または直前に述べたその代替を、提示するものである。
【０１１８】
最適濃度は、細胞増殖試薬WST-1のそれと同濃度であるか、異なっていることがあり、各要素や有効な代替によって、またin vitro とin vivo間の使用で異なることがある。製薬的に許容される媒体中に溶解した、mPMS のin vitro 投与に望ましい最適濃度の範囲は20-60 μM、WST-1のin vitro 投与に望ましい最適濃度の範囲は0.1 ?1 mM、WST-3のin vitro 投与に望ましい最適濃度の範囲は0.1 ?1 mM である。
【０１１９】
WST-1r、 WST-3+mPMS そしてWST-3 は、最も有効性の高いデータが測定されたため、最も望ましい実施様態である。
【０１２０】
さらに、本発明は、治療を要するする患者に投薬することによる癌治療の手法、すなわち製薬的に有効な量の少なくとも１種のWST-1r 構成要素、または直前に述べたその代替を、提示するものである。
【０１２１】
特定の実施例で、望ましいWST-1r処理条件とは、細胞に接触する時間が15 分から8 時間の場合である。より適したWST-1r処理条件とは、細胞に接触する時間が30 分から4 時間の場合である。さらに最適なWST-1r処理条件とは、処理時間がが 2 時間から4 時間の場合である。
【０１２２】
本プロトコルを用いて治療できる可能性のある癌には、次のものが挙げられる：前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、子宮内膜、脳、肝臓、膀胱、卵巣、精巣、頭部、頸部、皮膚（悪性黒色腫と基底細胞癌を含む）、中皮、食道、乳、筋肉、結合組織、肺（小細胞肺癌と非小細胞癌を含む）、副腎、甲状腺、腎臓、骨の癌；膠芽細胞腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、肉腫、絨毛癌、皮膚基底細胞癌、精巣上皮腫を含む（ただしそれらに限定しない）。
【０１２３】
IV. 癌治療を目的とした阻害剤とWST-1rとの複合治療
本発見では、癌細胞死や腫瘍抑制を誘導するさらなる手法を提示する。本発見に従えば、pUC19 DNA の導入および、あるいはIKK 阻害剤の有効な代替との複合処理で、相乗的な癌細胞生育や腫瘍生育の抑制効果、癌細胞死の促進効果を生み出す。従って本発見では患者の癌を治療するための製薬組成とプロトコルを提示しており、これには少なくても1種のpUC19 DNA 導入かその有効な代替、少なくとも1種のIKK 阻害剤、WST-1rか少なくとも1種の代替、を含んでいる。また、IFNと共に、少なくとも1種のIKK 阻害剤とWST-1r か少なくとも1種の有効なWST-1rの代替を有効量の投与することによる、患者の有する癌治療の方法を提示した。また、siRNAの導入と共に、少なくとも1種のIKK 阻害剤とWST-1r か少なくとも1種の有効なWST-1rの代替を有効量の投与することによる、患者の有する癌治療の方法を提示した。
【０１２４】
DNA の導入は、(i) 少なくとも1種のIFNを適切量投与、または (ii) 少なくとも1つの目的の転写（本発見に記述）をターゲットにした、少なくとも1種のsiRNA の導入、または (iii) 少なくとも1つの目的遺伝子と、あるいはその遺伝子産物（本発見に記述）をターゲットにした化合物または低分子阻害剤、または (iv) 少なくとも1つの目的遺伝子産物（本発見に記述）をターゲットにした抗体、(v) 少なくとも1つの目的の転写本発見に記述）の転写をターゲットにしたアンチセンスRNA、, (vi) 少なくとも1つの目的の転写（本発見に記述）の転写をターゲットにしたshRNA、(vii) 少なくとも1つの目的の転写（本発見に記述）の転写をターゲットにしたアンチセンスオリゴ、(viii) 少なくとも1つの目的遺伝子（本発見に記述）をターゲットにしたドミナント・ネガティブDNA ベクター、(ix) 少なくとも1つの目的遺伝子産物（本発見に記述）をターゲットにしたペプチド、で代替できる可能性がある。
【０１２５】
目的遺伝子とは、次のものを含む（ただしそれに限らない）、(1) Homo sapiens一過性受容体電位カチオンチャネル, サブファミリー C, メンバー 6 (TRPC6, 遺伝子ID: 7225), mRNA (gi|19923256|NM_004621.3) 同意語: TRP6, FSGS2, FLJ11098 (SEQ ID #2, #6), (2) Homo sapiens SH3 および PX ドメイン2B (SH3PXD2B), mRNA (.  (SH3PXD2B, 遺伝子ID: 285590), mRNA (NM_001017995) 同意語: HOFI; FLJ20831; KIAA1295 (SEQ ID #3, #7), (3) Homo sapiens膜結合型グアニル酸キナーゼ, WW およびPDZ ドメイン3を含む (MAGIKK, 遺伝子ID: 260425), 転写産物 variant 2, mRNA (gi|23097339|NM_152900.1) 同意語: MAGI-3, MGC163281 (SEQ ID #4, #8), および (4) the Homo sapiens膜貫通型タンパク182 (TMEM182, 遺伝子ID: 130827), mRNA (gi|40255064|NM_144632.2) (SEQ ID #5, #9).
【０１２６】
遺伝子産物には、上記の転写産物とたんぱく質を含むが、これに限らない。
【０１２７】
siRNA配列とsiRNA配列のターゲットには、添付書類: “NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts and genome (2686 letters)”, “NCBI Blast_siRNA2 Nucreotide sequence (24 letters)” and ”NCBI Blast_pcDNA3 Nucreotide sequence (5448 letters)” に記述した、隣接遺伝子のヒトゲノム配列を含むことができるが、これに限らない。  
【０１２８】
少なくとも1種のIFN はタイプI のIFN サブファミリーから選択し、これには  IFNa A、 IFNa B、 IFNa C、 IFNa D、 IFNa F、 IFNa G、 IFNa H、 IFNa I、 IFNa J、 IFNa K、 IFNa 4b、 IFNa WA、 およびIFNa が含まれるがこれに限らない。
【０１２９】
癌細胞処理に用いるIFNの有効濃度は、使用した各々のIFN について10 unit/ml、 あるいはこれより低濃度である。
【０１３０】
適したIKK 阻害剤とは、IKK の阻害作用を持つあらゆる化合物を含む。
【０１３１】
少なくとも1種のIKK 阻害剤は、以下のものを含む化合物類から選択されることがあるが、これに限定されない；i) IKK 阻害作用を発揮することが既知の化合物（を含むがこれに限定されない）；SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)、アニリノ- ピリミジン誘導体 (Signal Pharmaceutical Inc.)、PSl 145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)、 BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, IKK inhibitor III)、 SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.)、アミノ- イミダゾールカルボキシミド誘導体  (Smifhkilne Beecham Corp.), ウレウド- チオフェネカルボキサミド誘導体 (AstraZeneca )、 ジアリルピリジン誘導体 (Bayer )、 ピリドオキサジノン誘導体 (Bayer )、 インドールカルボキサミド誘導体 (Aventis Pharma)、 ベンゾイミダゾールカルボキサミド誘導体(Aventis Pharma)、 ピラゾーロ(4,3-c) キノリン誘導体 (Pharmacia Corporation)、 イミダゾリルキノリン ? カルボキシアルデヒドセミカルバジド誘導体 (Tulark Inc.)、ピリジルシアノグアニジン誘導体 (Leo Pharma), IkB キナーゼ 阻害剤ペプチド (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 IV (5-(p-フルオロフェニル)-2-ウレイド)チオフェン-3- カルボキサミド(CalBiochem)、 IKK阻害剤II、ウエデロラクトン (CalBiochem)、 IKK 阻害剤 VII (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 V N-(3,5-ビス-トリフロロメチルフェニル)-5-クロロ-2- ヒドロキシベンズアミドIMD-0354 (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VI (5-フェニル-2-ウレイド)チオフェン- 3-カルボキサミド (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VIII ACHP 2-アミノ-6-(2-(シクロプロピルメトキシ)- 6-ヒドロキシフェニル)-4-(4-ピペリジル)-3-ピリジンカルボニトリル (CalBiochem)、ii) ある特定の実施例では、IKK 阻害剤類として、本発明でも以前の研究でも一致した抗腫瘍活性が認められ、IKKの阻害活性が確認された次の化合物類も含む（ただし限定されない）：PSl 145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)、BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。
【０１３２】
上記で示したように、適したWST-1r と少なくとも1つのWST-1r の代替とは、WST-1rとWST-1rとおのおのの構成要素（WST-1r、テトラゾリウム塩の有効な代替、WST-1r のIEAの有効な代替）、これらのWST-1r やmPMSの有効な代替の間での全ての可能な組み合わせ、またはこれらの有効な代替とWST-1rの構成要素の組み合わせ、テトラゾリウム塩およびIEAを、製薬的に許容される担体中で最適濃度条件で含む（がこれに限らない）。
【０１３３】
本発見の特定の実施例において、本発見で示す望ましい処置順序とはpUC19 DNA 導入またはその有効な代替、少なくても１種のIKK阻害剤とWST-1rまたはWST-1rの少なくても１種の有効な代替を、連続的に順序を問わず投与できる。しかし、pUC19 DNA 導入またはIFN の処置、またはsiRNA導入または他の有効代替（少なくても1種のIKK 阻害剤と、WST-1rまたは少なくても1種のWST-1r有効代替）は、同時に、または連続的に細胞や患者への投与が可能である。一方、pUC19 DNA導入は最初に投与でき、少なくても1種のIKK 阻害剤は最初に投与でき、WST-1rまたは少なくても1種のWST-1r有効代替は最初に投与でき、またはpUC19 DNA導入、少なくても1種のIKK 阻害剤、そして少なくても1種のWST-1r有効代替は同時に投与することもできる。加えて、pUC19 DNA導入はsiRNA導入で代替された際には、IFN 投与、または上記で示した標的遺伝子をターゲットとした低分子、あるいは少なくとも1種のIKK 阻害剤と少なくても1種のWST-1r有効代替との組み合わせが利用され、化合物はいかなる順番で投与してもよい。
【０１３４】
本複合プロトコルを用いて処置される癌は、ここに示した癌を含むがこれに限定しない上皮性悪性腫瘍および非上皮性悪性腫瘍である。しかし、本処理に対してより感度が高く望ましい癌細胞と腫瘍とは、以上なNF-kB 活性を持つものである。
【０１３５】
本発見はまた、癌患者の癌細胞死を誘発して腫瘍を抑制するためのさらなる方法を提示する。本発見に一致して、フラボノイドであるアピゲニン、またはその有効代替、またはIKK 阻害剤が、有効な濃度のWST-1rまたはその有効代替と共に複合処置された場合に、相乗的に癌細胞死を誘導する作用を持つことを明らかにしてきている。従って、本発見は、治療を要する患者の癌治療を目的とした、製薬的に許容できる担体中にある有効量の、少なくても1種のフラボノイド、特にアピゲニン、またはその有効代替、またはIKK 阻害剤と、WST-1rまたは少なくても1種のWST-1rの有効代替を含む医薬組成物と方法を提示する。
【０１３６】
上記の全てについて、そして本方法で処理した細胞のプログラム細胞死を誘発するための後続する実施例において、処理物の除去が必要である。
【０１３７】
望ましいフラボノイドには、製薬的に有効な担体中のアピゲニンとアピゲニンの有効代替が含まれるが、これに限らない。
【０１３８】
アピゲニンの有効代替として、スピゲニンとしての阻害活性を発揮する化合物が含まれる。
【０１３９】
適したIKK 阻害剤には、上記に示したとおり、以下の実施例には製薬的に許容できる担体中のIKK 阻害活性を発揮するあらゆる化合物を含む。少なくても1種のIKK 阻害剤は次のものからなる化合物類から選択される（がこれらに限らない）；i) IKK 阻害作用を発揮することが既知の化合物（を含むがこれに限定されない）；SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)、アニリノ- ピリミジン誘導体 (Signal Pharmaceutical Inc.)、PSl 145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)、 BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, IKK inhibitor III)、 SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.)、アミノ- イミダゾールカルボキシミド誘導体  (Smifhkilne Beecham Corp.), ウレウド- チオフェネカルボキサミド誘導体 (AstraZeneca )、 ジアリルピリジン誘導体 (Bayer )、 ピリドオキサジノン誘導体 (Bayer )、 インドールカルボキサミド誘導体 (Aventis Pharma)、 ベンゾイミダゾールカルボキサミド誘導体(Aventis Pharma)、 ピラゾーロ(4,3-c) キノリン誘導体 (Pharmacia Corporation)、 イミダゾリルキノリン ? カルボキシアルデヒドセミカルバジド誘導体 (Tulark Inc.)、ピリジルシアノグアニジン誘導体 (Leo Pharma), IkB キナーゼ 阻害剤ペプチド (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 IV (5-(p-フルオロフェニル)-2-ウレイド)チオフェン-3- カルボキサミド(CalBiochem)、 IKK阻害剤II、ウエデロラクトン (CalBiochem)、 IKK 阻害剤 VII (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 V N-(3,5-ビス-トリフロロメチルフェニル)-5-クロロ-2- ヒドロキシベンズアミドIMD-0354 (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VI (5-フェニル-2-ウレイド)チオフェン- 3-カルボキサミド (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VIII ACHP 2-アミノ-6-(2-(シクロプロピルメトキシ)- 6-ヒドロキシフェニル)-4-(4-ピペリジル)-3-ピリジンカルボニトリル (CalBiochem)、ii) ある特定の実施例では、IKK 阻害剤類として、本発明でも以前の研究でも一致した抗腫瘍活性が認められ、IKKの阻害活性が確認された次の化合物類も含む（ただし限定されない）：PSl 145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)、BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。
【０１４０】
上記で示したように、適したWST-1rと少なくても1種のWST-1rの有効代替には、ここに示すように、WST-1r、テトラゾリウム塩の構成要素、WST-1r のIEAの有効な代替、これらのWST-1r やmPMSの有効な代替の間での全ての可能な組み合わせ、またはこれらの有効な代替とWST-1rの構成要素の組み合わせ、テトラゾリウム塩およびIEAを、製薬的に許容される担体中で最適濃度条件で含む（がこれに限らない）。
【０１４１】
有効濃度のアピゲニンは細胞株の種類によって変化する可能性がある。望ましい濃度はin vitro で10-100mMの範囲である。
【０１４２】
上記の全て、および下記の実施例において、WST-1rおよびその有効代替の有効濃度は、個々の構成要素によって変化する可能性がある。個々の構成要素の有効濃度は、細胞増殖WST-1試薬の有効濃度と同濃度であるか、異なる可能性があり、またそれぞれの構成要素やそれらの有効代替によって、そしてin vitroかin vivo利用かによって変化する可能性がある。In vitroでの細胞増殖WST-1試薬の望ましい濃度範囲は、製薬的に許容できる担体中で3-10%である。In vitroでのmPMSの望ましい濃度範囲は、製薬的に許容できる担体中で20-60mMである。mPMS と複合処理される場合、In vitroでのWST-1の望ましい濃度範囲は、製薬的に許容できる担体中で0.1-1mMである。In vitroでのWST-3の望ましい濃度範囲は、製薬的に許容できる担体中で0.1-1mMである。
【０１４３】
本発見の特定の実施例において、WST-1rまたは少なくても1種のWST-1r有効代替、アピゲニンまたは少なくても1種のアピゲニン有効代替または少なくても1種のIKK 阻害剤の投与は、順序を問わない。特に、WST-1rまたは少なくても1種のWST-1r有効代替や、アピゲニンまたは少なくても1種のアピゲニン有効代替または少なくても1種のIKK 阻害剤は、細胞や患者に対して同時に、または連続での投与が可能である。言い換えると、アピゲニンまたは少なくても1種のアピゲニン有効代替または少なくても1種のIKK 阻害剤は最初に投与でき、WST-1rまたは少なくても1種のWST-1r有効代替は最初に投与でき、WST-1rまたは少なくても1種のWST-1r有効代替、アピゲニンまたは少なくても1種のアピゲニン有効代替または少なくても1種のIKK 阻害剤は同時に投与できる。本発見における望ましい処理順序とは、WST-1rまたは少なくても1種のWST-1r有効代替と、アピゲニンまたは少なくても1種のアピゲニン有効代替または少なくても1種のIKK 阻害剤を同時に処理し、それからWST-1rを除去した後にアピゲニンかIKK 阻害剤を再度加え、細胞に24時間直接処理する条件である。
【０１４４】
ある特定の実施例において、WST-1rを細胞に直接処理する条件は15分から8時間である。望ましい処理時間の範囲は30分から4時間である。さらに適した時間は2-4時間の範囲である。上記のものや後続する実施例において、この方法を用いてプログラム細胞死を誘発するには、処理したWST-1rとその有効代替を除去する必要がある。
【０１４５】
さらに本発見は、治療を要する患者に対して、上記で述べた製薬的に許容されうる担体中の少なくても1種のWST-1rかその有効代替、またはアピゲニンか少なくても1種の有効代替を、製薬的に有効な量を投与することによる、癌治療の方法を提供する。
【０１４６】
また、本発明は、治療を要するする患者に投薬することによる癌治療の手法、上記で述べた製薬的に許容されうる担体中のすなわち製薬的に有効な量の少なくとも１種のWST-1r とその有効代替と、少なくとも1種のIKK阻害剤を、製薬的に有効な量を投与することによる提示するものである。
【０１４７】
WST-1r とその有効代替とアピゲニンとの本複合プロトコルを用いて治療できる可能性のある癌には、次の上皮性悪性腫瘍と非上皮性悪性腫瘍を含む（がこれに限定されない）：前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、子宮内膜、脳、肝臓、膀胱、卵巣、精巣、頭部、頸部、皮膚（悪性黒色腫と基底細胞癌を含む）、中皮、食道、乳、筋肉、結合組織、肺（小細胞肺癌と非小細胞癌を含む）、副腎、甲状腺、腎臓、骨の癌；膠芽細胞腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、肉腫、絨毛癌、皮膚基底細胞癌、精巣上皮腫、軟部腫瘍を含む（ただしそれらに限定しない）。
【０１４８】
WST-1r またはその有効代替と少なくとも1種のIKK阻害剤との本複合プロトコルを用いて治療できる可能性のある癌には、次の上皮性悪性腫瘍と非上皮性悪性腫瘍を含む（がこれに限定されない）；SK-Mel-5, T294黒色腫細胞株、黒色腫癌細胞、黒色腫癌。
【０１４９】
本発見は、癌細胞に対する相乗的なNF-kB阻害の別な方法を提示する。本発見に一致して、pUC19 DNA導入は  IKK1-KA および IKK2-KA キナーゼ-dead のドミナントネガティブベクターが同時に利用されたときに、 NF-kB活性の阻害を相乗化することが明らかとなった。この阻害機構はWST-1r または少なくとも1種のWST-1r有効代替を加えた複合処理でさらに促進する。
【０１５０】
従って、pUC19 DNA導入は細胞や哺乳類を以下のもので処置することにより代替できる可能性がある；(i) 適量の少なくとも1種のIFN投与、または (ii) 本発見の上記で述べた目的転写をターゲットとした、少なくとも1種のsiRNA または shRNAの導入、または (iii) 本発見の上記で述べた目的遺伝子をターゲットとした低分子阻害剤、または (iv) 本発見の上記で述べた目的遺伝子産物をターゲットとした抗体、(v) 本発見の上記で述べた目的転写をターゲットとしたアンチセンスRNA 、(vi) 本発見の上記で述べた目的遺伝子の転写物をターゲットとしたアンチセンスオリゴ、がIKK1 および IKK2キナーゼ両方の活性を阻害するような、少なくとも1種のIKK阻害剤と複合投与された場合。
【０１５１】
少なくとも1種のIFNは次のIFNのサブファミリー；IFNa A、 IFNa B、 IFNa C、 IFNa D、 IFNa F、 IFNa G、 IFNa H、 IFNa I、 IFNa J、 IFNa K、 IFNa 4b、 IFNa WA、 IFNb, IFNg または IL-6から選択できる可能性があるがこれに限らない。
【０１５２】
siRNA、 shRNAのターゲットとなる転写物やタンパク、低分子阻害剤、ペプチド阻害剤、抗体、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴ、および抗体には次のものを含む（がこれに限定されない）；(1) ヒト一過性受容体電位カチオンチャネル、 サブファミリー C、 メンバー 6 (TRPC6, SEQ ID 2, 6)、 (2) ヒトSH3 とPX ドメイン2B (SH3PXD2B, SeQ ID #3, #7)、(3) 膜結合型グアニル酸キナーゼ、WW および PDZドメイン3を含む (MAGIKK, SeQ ID #4, #8)、 (4) ヒト膜貫型タンパク 182 (TMEM182, SeQ ID #5, #9) および(5) the C6orf108 (Seq ID #14, #15)。
【０１５３】
適したWST-1rと少なくとも1種のWST-1r有効代替には、上記で述べたようにWST-1rとその構成要素であるテトラゾリウム塩（WST-1r、WST-1r構成要素の有効代替、これら上記の有効代替の間での全ての可能な組み合わせ、またはこれらの有効代替と、各々のWST-1とmPMSの構成要素間での全ての可能な組み合わせを含む）が、これに限定されない。
【０１５４】
少なくとも1種のIKK阻害剤は次の化合物類から選択されることが可能である。i) IKK阻害作用を示すことが解明された化合物類で、次のものを含む（ただし限定されない）SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)、アニリノ- ピリミジン誘導体 (Signal Pharmaceutical Inc.)、PSl 145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)、 BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, IKK inhibitor III)、 SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.)、アミノ- イミダゾールカルボキシミド誘導体  (Smifhkilne Beecham Corp.), ウレウド- チオフェネカルボキサミド誘導体 (AstraZeneca )、 ジアリルピリジン誘導体 (Bayer )、 ピリドオキサジノン誘導体 (Bayer )、 インドールカルボキサミド誘導体 (Aventis Pharma)、 ベンゾイミダゾールカルボキサミド誘導体(Aventis Pharma)、 ピラゾーロ(4,3-c) キノリン誘導体 (Pharmacia Corporation)、 イミダゾリルキノリン-カルボキシアルデヒドセミカルバジド誘導体 (Tulark Inc.)、ピリジルシアノグアニジン誘導体 (Leo Pharma)、 IkB キナーゼ 阻害剤ペプチド (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 IV (5-(p-フルオロフェニル)-2-ウレイド)チオフェン-3- カルボキサミド(CalBiochem)、 IKK阻害剤II、ウエデロラクトン (CalBiochem)、 IKK 阻害剤 VII (CalBiochem)、 IKK-2 阻害剤 V N-(3,5-ビス-トリフロロメチルフェニル)-5-クロロ-2- ヒドロキシベンズアミドIMD-0354 (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VI (5-フェニル-2-ウレイド)チオフェン- 3-カルボキサミド (CalBiochem)、 IKK-2阻害剤VIII ACHP 2-アミノ-6-(2-(シクロプロピルメトキシ)- 6-ヒドロキシフェニル)-4-(4-ピペリジル)-3-ピリジンカルボニトリル (CalBiochem)。ある特定の実施例では、IKK 阻害剤類として、本発明でも以前の研究でも一致した抗腫瘍活性が認められ、IKKの阻害活性が確認された次の化合物類も含む（ただし限定されない）：PSl 145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)、BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。望ましいIKK阻害剤とはIKK1 およびIKK2キナーゼ両方の活性を阻害する阻害剤である。
【０１５５】
本発明はがん細胞死と腫瘍抑制を誘導するためのもう一種の手法を提示する。本発明により、GSK3b阻害剤 と WST-1rまたは少なくとも一種のWST-1rの有効な代替と組み合わせたCK2 阻害剤との組成は、腫瘍形成抑制に相乗的に作用することが発見された。従って、本発明では癌細胞小集団中の、および・または患者体内の癌の処置として、製薬学的に許容される担体に少なくとも一種の GSK3b阻害剤、少なくとも一種の CK2 阻害剤、WST-1r もしくは少なくとも一種のWST-1の有効な代替からなる医薬的組成を示す。また、患者の癌の処置法として少なくとも一種の GSK3b阻害剤と少なくとも一種の CK2 阻害剤の化合物を効果量投与する方法も示した。 適したGSK3b阻害剤には、塩化リチウムなどGSK3bを阻害活性を明示する全ての化合物を含む。 適した CK2 阻害剤には、アピゲニンがあるが、それに限定されない。  
【０１５６】
少なくとも一種の CK2 阻害剤は、TBB, TBBz, emodin, CK2 阻害剤 III (sigma)類の（ただし限定されない）化合物から選ぶことができる。
【０１５７】
適した WST-1rおよび 少なくとも一種のWST-1rの有効な代替は、上記したようにWST-1r 、その各構成要素、WST-1r構成する各要素、WST-1rの構成要素の有効な代替かその組成、またはこれらの構成要素間での全ての可能な組み合わせを含むが、それに限定されない。
【０１５８】
本発明の特定の実施例では、少なくとも一種の GSK3b阻害剤と 少なくとも一種の CK2 阻害剤を癌細胞または患者に同時にまたは連続で投与することができる。すなわち、少なくとも一種の GSK3b阻害剤を最初に投与するか、少なくとも一種の CK2 阻害剤を最初に投与するか、または少なくとも一種の GSK3b阻害剤 と 少なくとも一種の CK2 阻害剤 を同時に投与する。さらに加えて、二種以上のGSK3b阻害剤 および・またはCK2 阻害剤 を用いるときは、その複合物はどの順序で投与してもよい。
【０１５９】
これら複合プロトコルを用いて処理できる癌細胞はUM-SCC-6 細胞を含むが、その限りではない。ここに明示した組成プロトコルを用いて処理できる癌は、ここに述べた癌を含むが、その限りではない。
【０１６０】
本発明 は薬癌治療における化学治療の有効効果を増幅または相乗する補足的手法を提供する。また本発明によれば、Puc19 DNA遺伝子導入はまた腫瘍形成抑制を相乗し、 癌細胞死を促進することが判明された。従って、本発明では患者にpuc19 DNA遺伝子導入か一種以上のその有効代替に、一種以上の化学療法試薬を合成する癌治療の医薬的構成を提示する。このがん細胞死の導入効果は、製薬学的に許容される担体にWST-1rを追加するか、少なくとも一種のWST-1rの有効な代替を複合することでさらに増幅する可能性がある。 さらにまた、患者体内の癌細胞もしくは癌の処置方法として、少なくとも一種の DNA遺伝子導入か、少なくとも一種のDNA遺伝子導入の有効代替と少なくとも一種の化学療法試薬を組み合わせて、 効果的用量で投与する方法を提示する。  好ましい実施例では、本出願の中で前述したように遺伝子導に好ましいDNA は pUC19 DNA クローニングベクターである (Sequence #1)。  
【０１６１】
pUC19 DNA遺伝子導入の少なくとも一種の 有効な代替は、(i)適した 量の少なくとも一種の IFNを投与、 (ii)少なくとも一種の本発明で前述した標的とする転写産物をターゲットとして、少なくとも一種の ある特定の siRNAを投与、 (iii) 少なくとも一種の標的遺伝子および・または本発明で前述した遺伝子産物をターゲットとする少なくとも一種の 化学化合物か小分子阻害剤、(iv) 本発明で前述した、少なくとも一種の標的遺伝子産物を標的にした少なくとも一種の抗体、 (v) 本発明で前述した、少なくとも一種の標的転写産物をターゲットとしたアンチセンスRNA,  (vi) 本発明で前述した、少なくとも一種の標的転写産物をターゲットとしたshRNA、 (vii)本発明で前述した、少なくとも一種の標的転写産物をターゲットとするアンチセンスオリゴ、 (viii)本発明で前述した、少なくとも一種の標的遺伝子をターゲットにしたドミナントネガティブを利用したDNA ベクター、(ix) 本発明で前述した、少なくとも一種の標的遺伝子産物を標的にしたペプチドを含むが、ただしそれに限定されない。
【０１６２】
適した IFN は、IFNa  A、IFNa  B、IFNa  C、IFNa  D、IFNa F、IFNa G、IFNa H、IFNa I、IFNa J、IFNa K、IFNa 4b、WA、IFNa、IFNa および Interlukine-6 (IL-6)を含む（ただしその限りではない）あらゆるIFNサブファミリーメンバーから選ぶことができる。 本発明の好ましい実施例で好ましいIFNは、IFNaと IFNb各々のサブファミリーである。効果的なIFN濃度は各IFNに対して10 unit/ml 以下である。
【０１６３】
少なくとも一種の 化学化合物もしくは小分子阻害剤、 少なくとも一種の ある特定の siRNA、shRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴ、  ドミナントネガティブDNA ベクター、 少なくとも一種の ペプチド、 少なくとも一種の抗体、少なくとも一種の 阻害剤によってターゲット視される標的遺伝子は、以下：(1) TRPC6 (SEQ ID #2, #6)、 (2) SH3PXD2B (SEQ ID #3, #7)、 (3) MAGIKK (SEQ ID #4, #8)、 (4) TMEM182 (SEQ ID #5, #9)、 (5) C6orf108 (Seq ID #14, #15) であるが、それに限定しない。
【０１６４】
遺伝子産物は、遺伝子転写産物のヌクレオチド配列と これら遺伝子から派生したタンパク質のアミノ酸配列であるが、これに限定しない。
【０１６５】
siRNA および・もしくはshRNA 配列 とsiRNA配列の標的はまた、添付ファイル“NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts and genome(2686 letters)” and “NCBI Blast_siRNA2 Nucleotide sequence (24 letters)”に挙げたとおりヒトゲノム配列や 遺伝子に隣接するヌクレオチド配列も含む。
【０１６６】
従って、適した siRNAは、本出願の中で前述したように siRNA1 (SEQ ID #10)、siRNA 2(SEQ ID #11)、 siRNA 3(SEQ ID #12)、またヒトゲノム および・または 遺伝子転写産物に播かれた短片(10-100 bp 以上)の pUC19 DNA配列から派生した可能性のあるsiRNA を含む。これらのヌクレオチド配列とその対応する遺伝子は添付ファイル“NCBI Blast-pUC19-Human- Transcripts and genome(2686 letters)” および “NCBI Blast_siRNA2 Nucleotide sequence (24 letters)”に挙げた。 概論の通り、これらのsiRNA 配列は、遺伝子の完全一致配列から40% まで変異が可能である。  さらに加えて、これらsiRNAの作用機作は、対応するターゲットの遺伝子のほかの部位の配列にマッピングしたあらゆるsiRNA および・またはshRNA で代替できる。この段落に上述したように、遺伝子産物を効果的に標的として捉えることができsiRNAの標的でもある小分子阻害剤、 ペプチド 阻害剤、抗体、 アンチセンスRNA、 アンチセンスオリゴ、またドミナントネガティブDNA ベクターは、(1) TRPC6 (SEQ ID #2, #6)、 (2) SH3PXD2B (SEQ ID #3, #7)、 (3) MAGIKK (SEQ ID #4, #8)、 (4) TMEM182 (SEQ ID #5, #9)、(5) C6orf108 (Seq ID #14, #15)を含むが、ただしそれに限定しない。
【０１６７】
少なくとも一種のWST-1r 、または WST-1rの有効な代替は、上記したようにWST-1r 、 各々のWST-1rの有効代替 、WST-1r の各々の構成要素の有効代替、また全ての構成要素間での可能な組み合わせを含むが、その限りではない。
【０１６８】
適した化学治療試薬は、パリタキセル (Taxol.RTM.)、 シスプラチン、ドセタキセル, カルボプラチン、ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 メトトレキサート、 シクロホスファミド、 CPT-11、 5-フルオロウラシル (5-FU)、ゲミシタビン, エストラムスチン、カルムスチン、アドリアマイシン (ドキソルビシン)、 エトポシド、 亜ヒ酸、 イリノテカン、エポチロン 誘導体を含むが、その限りでない。  好ましい化学治療試薬は パリタキセル (Taxol.RTM.)シスプラチン、5-フルオロウラシル (5-FU)  その他である。
【０１６９】
本発明の特定の実施例における好ましい順序では、最初にpUC19 DNAをまたは少なくとも一種の有効な代替を遺伝子移動し、 そのpUC19DNA遺伝子導入後に化学治療薬を投与する。 しかし、 pUC19 DNAか少なくとも一種のその有効な代替を遺伝子導入し、癌細胞にもしくは患者に 同時に もしくは続いて化学治療薬を投与してもよい。すなわち、 pUC19 DNA遺伝子導入は最初に行ってもよいし、化学治療薬を最初に行ってもよい。  
【０１７０】
現在の組成プロトコルを用いて治療できる癌は上記の上皮性悪性腫瘍または非上皮性悪性腫瘍を含むが、その限りではない。
【０１７１】
上に述べてきたこと全てに加えて、本発明によりNF-kB活性と腫瘍抑制を阻害する新規の手法が開拓された。本発明において、IKK1 と IKK2 両者のキナーゼ活性をノックアウトするkinase dead IKK1とIKK2 (KKI-KA及び IKK2-KA) を同時に遺伝子導入すると、NF-KAPPAB活性および腫瘍形成を相乗的に抑制することが発見されている。このダブルノックアウトがWST-1r と少なくとも一種のWST-1rの有効な代替の複合治療と複合されると、癌細胞形はさらに抑制された。従って、本発明  患者の製薬学的に許容される担体に、少なくとも一種の IKK1-KA と 少なくとも一種の IKK2-KAを、WST-1r と少なくとも一種のWST-1r の有効代替で組み合わせた複合治療によるNF-KAPPAB活性阻害および・または癌治療の医薬的組成を提供する。さらにまた効果的にIKK1とIKK2 キナーゼ活性を阻害することによりNF-KAPPAB 活性阻害および・または患者のがん治療をする手法を提供する。IKK1 とIKK2のノックアウト効果は、IKK1 やIKK2 を個々にまたは全体でまたはあらゆる組み合わせで標的にする (1) siRNA、 (2) アンチセンスRNA、 (3) アンチセンスオリゴ、 (4) 小分子阻害剤、 (5) ペプチド 阻害剤、 (6) 抗体、で代替することが可能である。ある特定の実施例では、WST-1rと少なくとも一種のそのWST-1rの有効な代替はWST-1rとなる。
【０１７２】
特定の実施例で、本発明に沿ったIKK 阻害剤類はSPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)、 アニリノピリミジン誘導体(Signal Pharmaceutical Inc.)、PS1145(Millennium Pharmaceutical Inc.)、 BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)、SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.)、アミノイミダゾールカルボキシミド 誘導体(Smithkilne Beecham Corp.)、ウレイドチオフェンカルボキサアミド誘導体 (AstraZeneca)、ジアリールピリジン誘導体(Bayer)、ピリドオキサジノン誘導体(Bayer)、 インドールカルボキサアミド誘導体(Aventis Pharma)、ベンゾイミダゾール カルボキサアミド誘導体(Aventis Pharma), ピアゾーロ[4,3-c] キノリン誘導体(Pharmacia Corporation)、 イミダゾリルキノリン-カルボキシアルデヒドセミカルバジド誘導体(Tulark Inc.)、ピリジルシアノグアニジン(Leo Pharma)、IkB キナーゼ阻害剤ペプチド(CalBiochem)、IKK-2 阻害剤 IV [5-(p-フルオロフェニル)-2-ウレイド] チオフェン-3-カルボキサミド(CalBiochem)、IKK 阻害剤 II、ウェデロラクトン(CalBiochem)、IKK阻害剤 VII K 阻害剤 VII(CalBiochem)、IKK-2 阻害剤 V N-(3,5-ビス-トリフルオロメチフェニル)-5-chloro-2-ヒドロキシフェニルIMD-0354(CalBiochem)、IKK-2 阻害剤 VI (5-フェニル-2-ウレイド) チオフェン-3-カルボキサミド(CalBiochem)、IKK-2 阻害剤 VIII ACHP 2-Amino-6-(2-(シクロプロピルメトキシ)-6-ヒドロキシフェニル)-4-(4-ピペリジニル)-3-ピリジンカルボニトリル(CalBiochem)などを含むがそれに限定しない。
【０１７３】
本発明の特定の実施例では, IKK1-KA およびIKK2-KAノックアウト または上記のあらゆる手法またWST-1r と少なくとも一種のWST-1rの有効代替によるIKK 阻害は、患者s 同時にまたは連続で細胞にまたは患者に投与することが可能である。すなわち、IKK-KA遺伝子導入または他のIKK 阻害治療を最初に投与しても、NOX 基質・活性剤を最初に投与してもよく、または両者同時に投与してもよい。さらに、二種以上のIKK 阻害剤を用いる場合は、どの順序で処置してもよい。
現在の複合プロトコルを使って処理できる癌は、上記を含むが、その限りではない。
【０１７４】
本発明はがん細胞死と腫瘍抑制を誘導する追加手法を提供する。本発明によれば、IKK 阻害剤の組成もしくはStat阻害剤statticと組み合わせたCK2 阻害剤、または少なくとも一種のstatticの有効な代替は、がん細胞死誘導と抑制と腫瘍形成に相乗的に作用することが解明されている。  従って、本発明により癌細胞の小集団もしくは患者体内の癌処置として、少なくとも一種の IKK 阻害剤 または少なくとも一種のCK2 阻害剤 とstatticまたは少なくとも一種のstatticの有効代替の複合剤を製薬学的に許容される担体に投与するというの医薬的構成を提示する。また患者体内の癌処置として効果的な用量を少なくとも一種のIKK 阻害剤、または少なくとも一種の CK2 阻害剤 をstatticかその有効な代替と組み合わせて投与する手法も提示する。適したIKK 阻害剤は上記のリストしている。適した CK2 阻害剤は、アピゲニンを含むが、その限りではない。適したStat阻害剤は、statのリン酸化反応、活性化、核転移を阻害する阻害剤statticを含むが、その限りではない。 IKK 阻害剤またはCK2 阻害剤またはstatticはどの順序でとうよしてもよい。好ましい順序は該阻害剤を同時に投与することである。  
【０１７５】
V. 医薬組成物と化合物の投与
本発見の医薬組成品は、注射、経口、経肺、経鼻などのあらゆる適した経路で投与することができる。概して、本発見の医薬組成物は、中でも製薬的に許容されうる希釈液、可溶化剤、保存剤、入荷剤、アジュバンド、および、あるいは担体を含んでいる。そのような組成物には様々な希釈緩衝液内物質（例；Tris-HCl、酢酸、リン酸）、pHおよびイオン強度；界面活性剤や可溶化剤添加物（例；Tween80、ポリソルベー80）; 抗酸化剤（例；アスコルビン酸、二亜硫酸二ナトリウム）; 保存剤（例；チメラゾール、ベンジルアルコール）; 充填剤（例；ラクトース、マンニトール）を含むことが可能である。組成物は、ポリ酢酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の粒子やリポソームに取り込むことができる。そのような組成は、本発見において医薬組成物の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、in vivoでの排出速度に影響を及ぼす可能性がある（レミントンズファーマセティカルサイエンス第18版（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) 1435-1712頁を参照のこと。参考文献として添付）。本発見の医薬組成物は  例として液状で、または乾燥粉末として（例：凍結乾燥）調製されることが可能である。医薬組成物の投与に関する特定の方法は、上記に記したとおりである。
しかし他の実施例において、本発見の医薬組成物は、静脈点滴、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮貼布、リポソームその他の投与法を利用した放出制御システムによって送達されることが可能である。特定の実施例では、ポンプが用いられることもある( Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. (1987) 14:201; Buchwald et al., Surgery (1980) 88:507; Saudek et al., N. Engl. J. Med. (1989) 321:574  を参照)。また別の実施例では、高分子物質が使用される（ Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug 産物 Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. (1983) 23:61; see also Levy et al., Science (1985) 228:190; During et al., Ann. Neurol. (1989) 25:351; Howard et al., J. Neurosurg. (1989) 71:105) を参照）。また別の実施例では、放出制御システムは動物の標的組織に近接して設置され、すなわち全身性の投与量の一部しか要求されない (Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, (1984) vol. 2, pp. 115-138などを参照)。特定の実施例では、放出制御装置は、動物の不適切な免疫活性部位または腫瘍部位に近接して導入することが可能である。その他の放出システムについては、Langerのレビューで議論されている (Science (1990) 249:1527-1533).
【０１７６】
このプログラム細胞死は、正常細胞が細胞毒性応答を示さず、さらに100%の割合で死滅することが観察により確認され、この重要な発見の実質上の証拠となるという結論に達した。その点で、本発見は  既に触れられていないか、代替の、すなわち既知の経路を先行の発明と重複しない方法癌細胞のプログラム細胞死経路について触れているため、本発見におけるまさしく一連の現象は癌細胞のプログラム細胞死を活性化し、将来研究への有効なモデルを定義する。言い換えると、これらの手法として知られる過程を経ることによって、我々の有効なモデルシステムを用いて、100%の割合で死滅を誘導するまさしく中心的な分子を開発することが可能である。その点で、本発見はまた、将来研究や調査、経路の発見・開発への重要なモデルとして主張される。
【０１７７】
上記および下記に特定の実験やデータを示したが、癌の前臨床および臨床プロトコル構造、遂行、分析に長けた技術の一種は、この書類を読むにあたり、指定の要素の投与量の変化、利用される順番や時間枠、指定要素の有効代替を通して認識し、無数の変化可能な応用があり、同様または類似の結果が得られる可能性がある。これらの応用変化法があらゆる癌や動物に応用できる範囲は、発明者は、発明者によって作成された本書類またはあらゆる後続の書類に含まれる事項に関して制限の意図はないことを注記する。発明者は、本発明が単独で使用され、化学療法や放射線療法など既存の癌治療における細胞毒性を低減することを意図する、しかしながら、本発見を  本発見と複合的に利用される化学療法や放射線療法の範囲で本発見の利用を制限する意図はないことを注記する。さらに、本発見と共同した化学療法や放射線療法との複合利用は、本発見との複合処理により化学療法や放射線療法の処置量を低減することが可能であるため、化学療法や放射線療法の細胞毒性を低減する可能性がある。そして最後に、指定した発見は、後続する化学療法や放射線療法、化学・放射線複合療法の適用がより効果的であり、また化学療法や放射線療法、化学・放射線複合療法の処置量を低減するなど、正常細胞に対して癌細胞特異的にさらなる感作を促す可能性がある。
【０１７８】
本発見における前述の記述で例証、解説を提示したが、本発見を開示したものに忠実に包括しまたは限定する意図はない。本発見の実用には上記の原理と一致した修飾や変化が要求される可能性がある。
従って、本発見の領域は、請求とその同等のものと注記される。
【０１７９】
本発見は、下記の例に詳細に明示される。これらの例示は特定の実施例の解説に限り役立つものであるが、請求範囲を制限するものではないと理解するべきである。さらに、この実施で提示された特異的な配列データが技術の一種であることを注記する。癌治療の新規標的を代表する新規の配列データの範囲について、ここに制限の意図はない。指定の標的とは、技術として既知の上記の手法やその他の手法の利用したこの実用の下で、さらなる開発へ向けた推定の標的である、と注記する。本明細書のどこにも記述がなくとも、癌治療法に用いられる、癌治療技術として知られる特異段階での放射線の使用、またはその他の低分子薬、DNA、RNA、siRNAやその他全てのものは、本プロトコルの補助となることを注記する。
【０１８０】
例示
例1
NF-KAPPAB活性の相乗的阻害
概論：通常、NF-κB活性はレポーターアッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイと、最近ではDNA 結合 ELISAを用いて測定される。しかしこれら全ての方法には、特異的なNF-κB DNA結合や転写活性を測定するためにNF-κB応答エレメントのコンセンサス配列を有する、外来DNAオリゴまたはコンストラクトを用いている。加えて、NF-κBコンセンサス応答エレメントは、複数の分子間での複合的相互作用に必要な実際のプローモーター配列とは異なっており、副次的効果が起こる可能性がある。
【０１８１】
方法：UM-SCC-6細胞はエフェクタン(Qiagen) を用いて以下の遺伝子が導入された。i) 20% ドミナントネガティブ IKK1-KA (K44A) および 80% pUC19、 ii) 20% ドミナントネガティブIKK2-KA (K44A) および 80% pUC19、 iii) 20% ドミナントネガティブIKK1-KA (K44A)、20% ドミナントネガティブIKK2-KA (K44A) および 60% pUC19、 iv) ネガティブコントロールとして20% pCDNA3および80%pUC19。72時間の遺伝子導入が終了後、細胞は遺伝子Spectra kit (Panomics) の溶解溶液で溶解された。IkBa, p100, CSNK2B のmRNA量を遺伝子Spectra kitで測定した。異なる遺伝子導入による各々の転写物の発現量は、同時に測定した各々の18sRNA量で正規化した。
【０１８２】
結果：以前、我々はキナーゼ- dead K44A-IKK1 もしくは K44A-IKK2をUM-SCC-6 細胞かその他の扁平上皮癌細胞に対して同時遺伝子導入することにより、NF-KAPPABレポーター活性が50% まで部分的阻害することを確認した。内因性NF-KAPPAB活性の指標としてNF-KAPPAB下流域遺伝子、IkBa, p100 およびCK2bの発現量を測定したところ、K44A-IKK1 遺伝子導入の細胞ではNF-KAPPAB活性の阻害作用はほぼ見られず (~20%) 、K44A-IKK2遺伝子導入の細胞では阻害作用が見られなかった。一方、ドミナントネガティブK44A-IKK1 および K44A-IKK2を同時に遺伝子導入することにより IKK1 および IKK2両分子を阻害した場合、測定した3種全ての標的遺伝子において~90%の阻害が認められた(図 1 A and B)。この結果は、各々のIKK分子を阻害することでNF-κB活性を部分的阻害することを示したNF-KAPPABレポーターアッセイのデータと異なっており、この相違はレポーターアッセイの副次的効果によって起きているものと思われる。さらに、我々のデータは、IKK1 および IKK2 が独立して別の経路でNF-KAPPABを活性化しているという現行の概念と矛盾している。そのかわり、我々のデータは、K44A-IKK1およびK44A-IKK2の組み合わせで、これらの癌細胞中の構造的NF-KAPPAB活性を相乗的に阻害することを示しており、これは2つのIKK間で作用に互換性がある可能性を示唆している。
【０１８３】
例2  
IKK1 および IKK2の同時阻害はさらに癌細胞死を誘引する
NF-KAPPAB活性の阻害に加えて、我々はK44A-IKK1 および K44A-IKK 2の同時遺伝子導入に従って、UM-SCC-6 細胞の細胞死を確認した (図 2)。48時間の遺伝子導入の後、K44A-IKK1 およびK44A-IKK2が同時遺伝子導入した細胞では、85%の細胞数の減少がみられ (図 2 WST-1 no no)、劇的な細胞死が見られた (図 2B)。このデータは二重サンプルの7セットの平均値を表示している。この結果はNF-KAPPAB活性阻害が癌細胞死を誘引し、これはIKK1 および IKK2を同時阻害なしでは達成できないことを示している。さらに、我々はK44A-IKK1およびK44A-IKK2の同時遺伝子導入がUM-SCC-6細胞のシスプラチンと5-FUに対して10 から 100倍の感作を促すことを確認した（データ非表示）。  
【０１８４】
例３
テトラゾリウム染色WST-1はIKK二重阻害による癌細胞死滅を促進する
この研究の間、我々はミトコンドリア電位の測定による、通常のWST-1アッセイを用いた細胞生存と細胞増殖との測定において困難に直面していた。IKKキナーゼ活性およびNF-KAPPAB活性の阻害は、本測定を干渉することが明らかとなった。さらに我々はWST-1r処理に続くIKK1 および IKK2阻害が細胞死を促進することを発見した (図 2)。図 2Aに、K44A-IKK1およびK44A-IKK2が同時遺伝子導入された細胞で細胞数が~80%減少し、K44A-IKK1およびK44A-IKK2が同時遺伝子導入されると共にWST-1処理された細胞では95%の減少が見られた。データは二重サンプルの7セットの平均値を表示している。図 4Bには、同時遺伝子導入された細胞の細胞死、K44A-IKK1 または K44A-IKK2が単独で遺伝子導入された細胞の部分的細胞死を示している。
【０１８５】
例４
UM-SCC-6細胞においてテトラゾリウム染色WST-1は、DNA導入とIKKとの複合で誘引される相乗的な癌細胞死を助長する
概要：我々はさらにIKK阻害剤がK44A-IKK1 および K44A-IKK2の同時遺伝子導入で得られた癌細胞死効果と同様の効果を持つかどうか調べた。我々はNF-KAPPAB 活性を阻害するため、K44A-IKK1遺伝子導入 と IKK2阻害剤とを組み合わせた。阻害剤IIIでは10mMで、阻害剤IV、VI、VIIでは20mMで、阻害剤IIおよび sc-514では30mMで、MLN120bでは60 mMで有意な細胞死が確認された。K44A-IKK1 およびIKK2阻害剤の組み合わせで処理した細胞の細胞数は概して低かったが、それらの違いは限定的であった。しかし、細胞がK44A-IKK1 遺伝子導入とIKK阻害剤に続いて WST-1で処理された場合、相乗的な細胞死が確認された。WST-1はIKK阻害剤と組み合わせることで、これらの癌細胞に対してIKK2阻害剤の処理濃度で1000倍以下に感作する。この相乗作用は試した7種のIKK2阻害剤のうち6種に当てはまった。  図 3にはK44A-IKK1遺伝子導入と阻害剤III およびVIIの組み合わせによって起こる相乗的な細胞死を示している。同様の効果が、阻害剤II、VI、sc-514 および MLN120bで処理した細胞で確認された。これらのデータは、IKK阻害剤が癌細胞を弱らせているだけで、WST-1の第3の攻撃が癌細胞死の誘因となっている可能性が示唆される。それゆえに、我々のデータはIKK1, IKK2の阻害およびそれに後続するWST-1処理、の3種の組み合わせが癌細胞死を相乗的に助長し、癌治療に関わるであろう。
【０１８６】
しかし一方で、データは  コントロールベクターとIKK1-KAベクター (IKK1-KA + pUC19)との差は非常に限定されていることをを示した。さらなる分析の結果、この複合的効果は、IKK 阻害剤、WST-1と組み合わせたpUC19 DNA遺伝子導入によることが明らかとなった。
【０１８７】
例５
WST-1は3種複合処置でHT1080ヒト肉腫細胞死を促進する
方法：HT1080細胞を96穴プレートに培養し、pUC19, pCDNA3, IKK1-KA, IKK1-KA+PUC19, および pCDNA3+pUC19 DNA ベクター各々のDNA導入、そしてIKK 阻害剤 III およびWST-1 処理を連続で行った。各々のセットの細胞は、前段落で述べたとおりの方法で1種のDNAベクターを遺伝子導入され、ただし遺伝子導入しないコントロールは24時間の後、3-30mM 濃度のIKK 阻害剤IIIでさらに24時間処理し、その後WST-1で4時間処理の後、一晩培養してから測定した。同様に処理した細胞は、WST-1処理後の24・48・96時間で測定された。細胞生存率はCell Count Kit 8 (CCK8) kitで測定した。
【０１８８】
データは、次のことを示した；(1) WST-1処理後24・48・96時間時点であらゆるDNA導入を行った細胞では、遺伝子導入を行わないコントロール細胞に比べて有意なIKK 阻害剤 III量依存的な細胞生育阻害および細胞生存低下がみられたが、pUC19ベクターは唯一IKK1-KAベクターとの有意差だけはみられなかった。(2)  WST-1を24・48・96時間処理した細胞では、処理しなかった細胞に比較してさらなる細胞死誘導と細胞生存の低下がみられた。(3) 96時間WST-1処理の後、全ての遺伝子導入をしない細胞で、処理なしのコントロールと同程度の細胞生育を示し、WST-1処理したが遺伝子導入していない細胞では部分的な回復がみられた。(4) 全ての処理後96時間経過した時、遺伝子導入でのみ、そしてまたWST-1で処理された細胞は回復なく死滅したままであり、これはIKK阻害剤の処理および、またはDNA導入が細胞を弱らせ、3種複合のWST-1がさらに弱った細胞の100％死滅を促したことを意味する。24時間WST-1処理をした後での吸収の違いは、部分的にはWST-1処理細胞でのCCK8検出反応の低下のためでった。この効果はWST-1 処理の除去から48時間後に減少し、96時間後に低下した。細胞の形態を観察したところ、24時間のWST-1 処理で大多数の30 mM IIKK 阻害剤 III処理した細胞は死滅した。しかし、WST-1処理していない生存細胞は再び成育を始めた。逆に、DNAベクター導入され、同じIKK 阻害剤III処理、およびWST-1処理された、全ての細胞の死滅率は100％であった。このデータはWST-1効果がこれらの細胞でIKK阻害剤 IIIの誘導する癌細胞死効果および細胞死を促進し、pUC19ベクターはこの細胞増殖阻害の複合効果に関与している可能性があることを明らかにしている。
【０１８９】
例６
IFNは、IKK 阻害剤III およびWST-1効果を増長させるpUC19遺伝子導入の代替となる
概要：我々の以前のデータは、DNA導入が3種複合処理により相乗的な癌細胞死で役割を果たしていることを示唆する。さらに、インターフェロン(IFN) 応答は遺伝子導入効果に関与することが知られている。我々はin vivo 処理においてIFNがDNA導入効果の代替になるかどうかについて調査した。
【０１９０】
方法：HT1080細胞を96穴プレートで培養し、IFN, IKK 阻害剤IIIおよびWST-1を連続で処理した。各々のセットの細胞は2-1000units/ml 濃度範囲の少なくとも1種のIFNメンバーで24 時間処理され、3-30mM のIKK 阻害剤IIIでさらに24時間、つぎにWST-1で4時間処理され、一晩培養の後に検出した。
細胞生存率はWST-1 処理後24および48時間にCCK8 kitで測定した。総数15 種のIFNが試験された。これらはIFNaA, IFNaB, IFNaC, IFNaD, IFNaF, IFNaG, IFNaH, IFNaI IFNaJ, IFNaK, IFNa4b, and IFNaWA, IFNb, IFNg および IL-6である。
【０１９１】
(図 4) のデータでは、IFN 処理をしなかった細胞に比較して、IFN量依存的、IKK 阻害剤 III依存的な細胞増殖の低下と細胞死の促進を示した。WST-1 処理後30mM I-3 およびWST-1 処理を 48 時間の処理と組み合わせた場合、細胞増殖の阻害と細胞死促進を相乗化するpUC19 DNA導入に比べ、IFNの阻害効果はpUC19 DNA導入の80-90%に達した。
【０１９２】
例７
WST-1 は ROS 発生を誘導する
概要：WST-1は当初ishiyamaの論文で報告された (Ishiyam M, et al Biol Pharm Bull 1996, 19:1515-20)。これは細胞増殖を検出する試薬でRocheにより製造されている。WST-1はテトラゾリウム塩WST-1 {4-[3-(4-ヨードフェニル)-2-(4-ニトロフェニル)-2H-5-テトラゾリオ]-1, 3-ベンゼンジスルホン酸}および電子結合試薬から構成され、リン酸希釈緩衝液に溶解している。WST-1は  ミトコンドリアのコハク酸- テトラゾリウム塩- リダクターゼ系で開裂される。この開裂に基づいて生細胞を検出する。しかしWST-1は細胞膜に非透過性であり、この還元反応が細胞表面で起きるか、細胞膜上のトランス- プラズマメンブラン電子伝達で起きることが分かってきた(Berridge, MV et al, Biotechnol Annu Rev, 2005; 11:127052)。そのかわり、WST-1は細胞表面のNAD(P)H-オキシダーゼで還元される可能性がある (Berridge, MV, et al, Antioxid Redox Signal, 2000, 2:231-42, Scalett, DJ, et al, Biofactors, 2004, 20:199-206)  。本発見では、少なくとも1種のDNA導入、またはIFN、または siRNA導入及び1種のIKK、またはCK2 および GSK3b 阻害剤の複合処理と共に使用された場合に、WST-1は細胞生育阻害および癌細胞死の促進を相乗化することが解明された。理論的には、JNK活性化とNF-KAPPAB活性間のバランスで細胞の運命を死滅か生存か決定することが提唱されている。長期化したJNK活性化はプログラム細胞死を誘引する。ROS発生はJNK活性化を誘導し、一方NF-KAPPAB活性はROS量の抑制を引き起こす(Luo, JL, et al, J. Clin. Invest, (2005) 115:2625-32, Shen, HM, et al, Free Radical Biology & Medicine 2006, 40:928-939)。本研究では、癌細胞においてWST-1がROS発生を誘導して細胞死を促進することを解明した。
【０１９３】
方法：HT1080細胞をカバーガラス上で培養し、pUC19遺伝子導入、IKK阻害剤III処理を連続的に行った。これらの処理に続き、処理細胞は、細胞中のROSを標識する蛍光染色であるCM-H2-DCFDAを用いて標識し、WST-1で30分処理するか (図 10-A)、WST-1 で 2時間処理の後CM-H2-DCFDAで標識した (図 5-B)。
結果はデジタルカメラで記録しSpotlight ソフトウェアを用いた。同じレベルの露光量を維持するため手動の露光量を用いた。
【０１９４】
結果：両方の実験において、有意な量のWST-1の誘導するROS発生が証明された(図 5 A and B)。図 8-Aでは、pUC19遺伝子導入、およびIKK処理をしたがWST-1処理しなかった細胞ではIKK 阻害剤 III量依存的なROS標識がみられた。これはIKK阻害剤IIIもまたROSを誘導することを示唆するかもしれない。
【０１９５】
例８
LiCl + アピゲニンはSCC-6, WST-1阻害促進をさらに相乗化した
概要：塩化リチウム（LiCl）はGSK3b活性を阻害することが知られ、アピゲニンはCK2阻害剤である。GSK3b およびCK2両者の活性はNF-KAPPAB活性に影響することが知られている。我々は塩化リチウムおよびアピゲニンの組み合わせが相乗的阻害効果を起こすDNA誘導の代替となるかどうか調査した。
【０１９６】
方法：UM?SCC-6細胞を96穴プレートで培養し、LiCl (1, 3, 10, 30, 100mM) およびアピゲニン(1, 3, 10, 30, and 100mM) 各濃度の組み合わせで24時間処理した後、WST-1処理を行った。細胞生存率はCCK8 kitで測定した。
データは、非処理のコントロール細胞と比較して、LiCl およびアピゲニンの組み合わせが量依存的に細胞生育を低下させ、細胞死を促進させることを示した。10mM AP および 30mM LiClでは細胞死が相乗的に増加している (図 6A)。後続するWST-1処理は さらにこの阻害効果を促進した(図 6B)。
【０１９７】
例９
UM-SCC-6 細胞でpUC19 DNA導入は化学療法製剤の効果を相乗化する
UM-SCC-6細胞にpUC19 DNA, pCDNA3, pUC19+pCDNA3, IKK1-KA+pUC19, IKK2-KA+pUC19, および IKK1-KA+ IKK2-KA+pUC19, IKK1-KA+pCDNA3, IKK2-KA+pCDNA3, または IKK1-KA+ IKK2-KA+pCDNA3遺伝子を導入し、48時間後、様々な量の5-FU (図 7A)またはシスプラチン(図 7B) 各々を 96 または72 時間処理した。細胞生存率を、試薬の処理から96または72時間後に測定した。データは、pUC19遺伝子導入された細胞で最大の阻害活性を示したことを示した。
【０１９８】
例１０
HT1080 細胞でpUC19 DNA導入は化学療法製薬の効果を相乗化する
HT1080 細胞に様々な量の化学療法製剤を処理する48時間前に、pUC19 DNA, pCDNA3, pUC19+pCDNA3, IKK1-KA+pUC19, IKK2-KA+pUC19, および IKK1-KA+ IKK2-KA+pUC19, IKK1-KA+pCDNA3, IKK2-KA+pCDNA3, または IKK1-KA+ IKK2-KA+pCDNA3の各遺伝子を導入した。72 および 96 時間の製剤処理後、細胞生存率を測定した。
【０１９９】
製剤処理：シスプラチン30ng/ml ? 3mg/ml (図 7D), パクリタキセル 1nM ? 10mM (図7C), 5-FU 50nM- 500mM (データ非表示), ドキソルビシン 30nM ? 3.3 mM (データ非表示)。
【０２００】
これらDNAベクターの遺伝子導入で、様々な促進および相乗効果が示された。調査したその他のDNAベクターに比較して、pUC19 DNA単独の遺伝子導入で、この化学療法製剤を処理に対する最も高い相乗効果を示した。pUC19 DNA導入との組み合わせでは、導入されない細胞に比較して、処理した製剤のIC50がおよそ10倍低下した。さらに、シスプラチンまたはパクリタキセルを96時間処理後、遺伝子導入しなかった細胞では成長回復したが、他方、遺伝子導入した細胞、特にpUC19ベクター単独の導入した細胞では非可逆的であり、すなわち細胞は100%死滅した。これらのデータは、これらの化学療法製剤が癌細胞成育を阻害するが、これらの細胞を死滅させないことを示唆している。pUC19 DNA遺伝子導入との組み合わせが細胞死を促進する。
【０２０１】
例１１
pUC19遺伝子導入は、NF-KAPPAB活性のドミナントネガティブIKK-KA阻害を相乗化する
図 1に両IKK1 および IKK2キナーゼ活性を阻害することにより相乗的にNF-KAPPAB活性を阻害することを示した。pUC19は同時遺伝子導入のためのcarrier DNAとして使用した。PUC19がNF-KAPPAB活性の相乗的阻害に関与するかどうかを調べるため、HT1080細胞へ同時遺伝子導入する際にpUC19 と平行してpCDNA3を用い、i) 20% ドミナントネガティブ IKK1-KA (K44A) および 80% pUC19, ii) 20% ドミナントネガティブIKK2-KA (K44A) および 80% pUC19, iii) 20% ドミナントネガティブIKK1-KA (K44A), 20% ドミナントネガティブIKK2-KA (K44A)および60% pUC19, iv) ネガティブコントロールとして20% pCDNA3 および 80%pUC19, v) 別のネガティブコントロールとして、また別実験セットの100% pUC19, vi) 20% dominant negative IKK1-KA (K44A) and 80% pCDNA3, vii) 20% ドミナントネガティブIKK2-KA (K44A)および80% pCDNA3, viii) 20% ドミナントネガティブIKK1-KA (K44A), 20% ドミナントネガティブ IKK2-KA (K44A)および60% pCDNA3、 の組み合わせの遺伝子を72時間遺伝子導入した。遺伝子導入の終了後、細胞は遺伝子Spectra kit (Panomics)溶解液で溶解した。pUC19 およびpCDNA3単独はネガティブコントロールである。NF-KAPPAB 転写活性の指標としてkBa (図 17A), CSNK2B (図 8B) そしてp100 (図 8C)のmRNA量を遺伝子Spectra kitで測定した。異なる遺伝子導入から得られた各々の転写物の発現量は、同時に測定したそれらの18sRNA量で正規化した。データはpCDNA3に比較して pUC19を同時遺伝子導入した場合に、IkBa (図  8A), CSNK2B (図 8B) および p100 (図 8C) mRNAの発現量に対してより高い阻害活性を持つことを明らかにした。
【０２０２】
例12
アピゲニンとWST-1r複合処理は癌細胞死誘導を相乗化する
方法： UM-SCC6, MDA-MB-231, Cal27, HT1080, B6-5 およびA431細胞は、3% のWST-1r または 100mM アピゲニン または3% WST-1r と100mM アピゲニン複合を4時間処理し、非処理またはDMSO処理細胞を同時並行のコントロールとした。その後、細胞から処理剤を除去し、すなわち通常の培地に置き換えて24時間培養した。DMSOは溶媒コントロールとして使用した。細胞生存率はCCK8 Kitで測定し、非処理コントロール細胞のそれとの割合%で正規化した。
結果： データが示すところによるとWST-1r およびアピゲニンの組成は、無処理のコントロールに比較して75% から 95% の細胞死をあらゆる癌細胞株に誘導した(Fig 9 ).
【０２０３】
例13
細胞死を誘導するアピゲニンとWST-1r処理順序の効果
方法： UM-SCC6 (Fig 10 A) および HT1080 (Fig 10 B)細胞に、記述したとおりの異なった順序の組み合わせの10%のWST-1r および 100mM アピゲニン処理をした。細胞生存率をCCK8 Kitで測定し、その値は非処理細胞のものと比較した割合%で正規化した。
コントロール： アピゲニンを記述した濃度のみで24時間処理し、次に正常培地でさらに24時間培養して細胞生存率を測定した細胞。Ap→WST：アピゲニンを記述した濃度のみで24時間処理し、次に終濃度10%のWST-1rで4時間、それから処理物質を除き正常培地でさらに24時間培養して細胞生存率を測定した細胞。WST+Ap: 10% WST-1rおよび記述した濃度のアピゲニンで4時間処理し、それから処理物質を除き正常培地でさらに24時間培養して細胞生存率を測定した細胞。WST+Ap→Ap: 10% WST-1rおよび記述した濃度のアピゲニンで4時間処理し、それから処理物質を除き記述した濃度のアピゲニンを含む培地でさらに24時間培養して細胞生存率を測定した細胞。WST→Ap: 10% WST-1rで4時間処理し、それから処理物質を除き記述した濃度のアピゲニンを含む培地でさらに24時間培養して細胞生存率を測定した細胞。データは、4種全ての組み合わせ順序で細胞死が起きたことを示すが(Fig 10 A, B)、最も効果的な処理順序は細胞株の種類によって異なる可能性がある。2種の細胞株ではWST+Ap→Apの順序が最も高い効果を示した。
【０２０４】
例14
アピゲニンとWST-1r の複合処理に関わるWST-1rの時間経過および用量反応、アピゲニンの用量反応
方法： Cal27 (C1), HT1080 (C2) and UM-SCC6 (C3)細胞に、記述のとおり様々な濃度(1%,  3% および 10%)のWST-1rを0.5, 1, 2, および 4時間、記述のとおり異なる濃度(3, 10, 30 および100mM) のアピゲニンと複合処理し、それから同濃度のアピゲニンでさらに24時間処理した。細胞生存率はCCK8 Kitで測定し、非処理細胞に対する割合%で正規化した。
結果： データは、試験した3種全ての細胞株でWST-1r時間、用量依存的な、およびアピゲニン用量依存的な細胞死が見られたことを示した(Fig 11-C1-3)。相乗的な細胞死の誘導(80%以上)が10% WST-1rを100mMアピゲニンと複合して0.5時間処理した際のCal27 および UM-SCC6 細胞株で起こり(Fig 11-C1, 3)、3% WST-1rを100mMアピゲニンと複合して1時間処理した際のHT1080 細胞で起こった(Fig 11-C2)。WST-1r処理時間を延長すると、4時間処理の10% WST-1r と共に30mM のアピゲニン処理をしたHT1080 および UM-SCC6細胞で(Fig11-C2-3)、および1時間処理の10% WST-1r と共に30mM のアピゲニン処理をしたCal 27 細胞で(Fig11-C1)、80-90%細胞死に到達した。
【０２０５】
例14
黒色腫細胞株におけるIKK阻害剤とWST-1rの複合処理効果
方法： SK-Mel-5 およびT294ヒト黒色腫細胞株に、1%および3% 終濃度の WST-1rを処理し、次に正常培地に交換することでWST-1rを除き、IKK 阻害剤 IIIを加えてさらに24時間培養した。記述したように3mM および10mM のIKK 阻害剤 III で24時間処理した後、正常培地に交換してさらに48時間培養してから細胞生存率をCCK8 Kitで測定した。
結果： データは、3% WST-1rと10mM IKK阻害剤IIIとの複合処理で細胞死の相乗的な誘導が起きたことを示す(Fig12-A1-2)。
【０２０６】
例16
細胞死におけるIKK阻害剤とWST-1rの処理順序の影響
方法： T294細胞は、3 または10mM IKK 阻害剤 III 各々と複合して3% WST-1rで、記述したとおり異なった順序で処理した。細胞生存率はCCK8 Kitで測定し、非処理コントロールの値に比較した割合%で正規化した。コントロール：細胞に非処理かIKK 阻害剤 IIIのみで記述した用量を24時間処理し、次に正常培地に交換してさらに24時間培養した後に細胞生存率を測定した。I3→WST： IKK 阻害剤 IIIのみで記述したとおりの用量を24時間処理し、次に終濃度3%のWST-1r を加えて4時間、そして処理物質を除き正常培地でさらに24時間培養して細胞生存率を測定した細胞。WST+I3: 3% WST-1r および記述した用量のIKK 阻害剤IIIを4時間処理し、そして処理物質を除き正常培地でさらに24時間培養して細胞生存率を測定した細胞。WST+I3→I3: 3% WST-1r および記述した用量のIKK 阻害剤IIIを4時間処理し、そして処理物質を除き、記述した用量のIKK 阻害剤IIIを正常培地に加えてさらに24時間培養してから細胞生存率を測定した細胞。
WST→I3: 細胞は3% WST-1rで4時間処理し、そして処理物質を除き、記述した用量のIKK 阻害剤IIIを正常培地に加えてさらに24時間培養してから細胞生存率を測定した細胞。
結果：データはWST+I3p およびWST+I3→I3処理順序で細胞死誘導を相乗化したことを示す(Fig13 F2-B)。
【０２０７】
例17
WST-1rおよびアピゲニン複合処理はJNKリン酸化を誘導した
方法： UM-SCC6細胞は、記述した用量のWST-1r およびアピゲニンで4時間処理し、リン酸化JNK量と総JNK量をFACE Kit (Qiogen)を用いて平行して測定した。得られたデータはクリスタル・バイオレット染色で測定した総細胞数で正規化した。各々の測定でのリン酸化JNK量は、総JNK量に対するリン酸化JNK量の割合で正規化した。
結果： データは、UM-SCC6 細胞でWST-1r用量依存的に、そしてアピゲニン用量依存的にJNKのリン酸化誘導を起こすことを示した (Fig 14) 。WST-1rとアピゲニンの組み合わせはさらにJNKリン酸化を上昇させた。UM-SCC6 細胞においてJNKリン酸化の最も有意な上昇は100mMアピゲニンを3%および10% WST-1rと複合した場合に起きた。例外的に10mM アピゲニンではJNKリン酸化の阻害効果を示した。この結果はWST-1rおよびアピゲニン複合処理がJNKリン酸化を誘導するとの仮説の証明となっている。
【０２０８】
例18
WST-1r 、 アピゲニンおよびIKK 阻害剤III 複合処理後に起きるROS発生の用量反応
方法： UM-SCC6細胞は10mM のCM-H2-DCFDAで15分間標識し、その後記述した量のWST-1r または CCK8を、様々な用量のアピゲニンと(A)、もしくはIKK 阻害剤 IIIと (B)4 時間、複合処理した。ROS 発生の検出には、ROSに標識されたCM-H2-DCFDAの Ex485/Em535の蛍光を測定した。
結果： データはWST-1r用量依存的なROS発生誘導を示す(Fig23A and B)。他方で、CCK8はその用量に関わらず、4時間の処理で、低量で非常に限定的なROS発生を誘導する。アピゲニン単独ではROS発生効果は見られなかった。しかしながら、WST-1r単独で一致する用量を処理したものに比較すると、アピゲニンと1% および 3% WST-1rの複合では用量依存性がみられ、処理した細胞からは限定的であるが着実なROS発生量の上昇がみられた (Fig23-A)  。
逆に、10% of WST-1rとアピゲニンとの複合ではROS量が低下した(Fig23-B) 。さらに、CCK8が複合した場合、アピゲニンはまたROS発生を上昇させる(Fig23-A)。この効果はアピゲニン用量依存的である。同様に、IKK 阻害剤 III単独とWST-1r とIKK阻害剤IIIの複合では (Fig23-B)、アピゲニンと同様の効果が見られ、ここで5mM IKK阻害剤がROS量を上昇させる一方で10mM IKK阻害剤はこれを減少させた(Fig23-B)。しかしながら、IKK阻害剤IIIには、ROS 量に関してCCK8との複合効果がなかった。
【０２０９】
例19
WST-1r 、アピゲニン、IKK 阻害剤 III複合処理後に起きるROS発生の経時変化
方法： UM-SCC6細胞を10mM CM-H2-DCFDA で 15 分間標識し、さらに様々な用量のアピゲニンまたはIKK 阻害剤 IIIとの複合処理で、指定した量のWST-1r またはCCK8を15 分から4 時間までの範囲で処理した。各々の時点でROS発生を検出するため、CM-H2-DCFDA標識したROSの蛍光Ex485/Em535を測定した。
結果： データは、WST-1r の誘導する ROS発生が上昇し続け、4時間以上続くことを示した(Fig15-B and D)。その一方、CCK8は低量かつ一時的なROSの上昇を促すことが明らかとなった(Fig15-A and C)。
【０２１０】
例20
CCK8-XTT-WST-1比較
アピゲニンと の複合処理時でのWST-1rとCCK8 およびXTTの持つ細胞死誘導能の比較
方法： HT1080 およびUM-SCC6細胞に10% のWST-1r, CCK8 またはXTTを、様々な用量のアピゲニンと組み合わせて4時間処理し、その後正常培地に交換してさらに24時間培養した。細胞生存率はCCK8 kitで測定した。
結果： 結果は、UM-SCC6 および HT1080細胞において、WST-1r に比べ、CCK8が細胞死に何の効果も持たないのに比して、XTTは中度の細胞死誘導能を持つことを明らかにした(Fig16).。
【０２１１】
例21
WST-1に比較したその他のテトラゾリウム塩の細胞死誘導能
方法： HT1080 およびUM-SCC細胞に1mM WST-1, 0.4mM WST-3, 0.5mM WST-4, 0.5mM WST-5 または0.12mM mPMS 単独、もしくは 単独の場合と同濃度の各WST-3, WST-4, およびWST-5を0.12mM mPMS (0.4mM WST-3+0.12mM mPMS, 0.5mM WST-4+0.12mM mPMS, 0.5mM WST-5+0.12mM mPMS) との複合で、アピゲニンを加えて4 時間処理し、そして正常培地に交換してさらに24 時間培養した。
細胞生存率はCCK8 Kitで測定した。
結果： データは、WST-3単独、WST-3+mPMS そして WST-4+mPMSがアピゲニンと複合した場合、同様の細胞死誘導能を示し、その効果はWST-1r のものと同等であった(Fig17 A-B)。WST-1, WST-4, そしてWST-5単独では、そのような効果は見られなかった(Fig17 A,B)。WST-3+mPMSはWST-1rに比べ、細胞死誘導の効能がより高かった。
【０２１２】
例22
HT1080: 細胞死に関する mPMSの量依存性
方法： HT1080細胞を、1mM WST-1と10, 30 または100 mM アピゲニンと複合して記述のように様々な濃度のmPMSで4時間処理し、その後正常培地に交換してさらに24時間培養した。細胞生存率はCCK8 Kitで測定した。1 mM WST-1 のみ, 0.12mM mPMS のみ 、そして10% WST-1r を平行コントロールとして用いた。
結果： その結果、mPMS および アピゲニン量依存的な細胞死が確認された(Fig 18)。Fig 19には、全てのコントロールと共に、アピゲニン量に応答した同じ細胞生存データを描写している。データ標識：Ctrl: 非処理コントロール, GS: WST-1r, mPMS: 1.2mM mPMS のみ, WST-1: WST-1のみ, 1: 1mM WST-1rプラス0.12 mM mPMS, 2: 1mM WST-1rプラス0.1 mM mPMS, 3: 1mM WST-1rプラス0.08 mM mPMS, 4: 1mM WST-1r plus 0.06 mM mPMS, 5: 1mM WST-1r plus 0.04 mM mPMS, 6: 1mM WST-1r プラス 0.02 mM mPMS。
その結果、mPMS量依存的な細胞死が認められた。0.12mMのmPMSは非常に細胞毒性が高く、WST-1との組成はこの毒性を収束させた。mPMSがWST-1と複合した場合、結果はmPMS およびアピゲニン量依存的な細胞死を示した。0.08mM WST-1 プラス 0.12mM mPMSでは、WST-1rと同様の細胞死効果があった。WST-1 1mM および mPMS 0.06mM Ap100は100%の細胞死を引き起こした。
【０２１３】
例23
アピゲニン複合処理の誘導する細胞死に関するWST-1rのWST-3置換効果  
方法： UM-SCC6, HT1080, Cal27, SK-Mel-5, そして HEK細胞は、10または30mM アピゲニンとの組成でWST-3 のみ、4時間処理し、その後正常培地に交換してさらに24時間、そのまま培養を続けた。24時間の培養後、細胞生存率をCCK8 Kitで測定した。データは非処理細胞の％で正規化した。
結果： その結果、30mMアピゲニンと50mM WST-3との複合処理したCal27, UM-SCC6, HT1080そしてSK-Mel-5細胞株で80%以上の細胞死を観察した(Fig 20)。他方で、この処理条件下において、初代培養細胞のヒト角化細胞HEKaはこの処理に抵抗性を示した。
この複合処理に対する感度の違いは、差別的な癌細胞のターゲティングのための手段を提供し、正常細胞への毒性を制限することが期待される。
【０２１４】
例24
アピゲニン複合処理の誘導する細胞死に関するWST-1rのWST-3+mPMS置換効果  
方法： UM-SCC6, HT1080, Cal27, SK-Mel-5, および HEKa細胞は0.1mM WST-3 プラス 30mM mPMS、またはWST-3のみ、または非処理コントロールで、10 または30mM アピゲニンと複合で4時間処理し、その後正常培地に交換し、そのままさらに24時間培養を続けた。24時間の培養あと、細胞生存はCCK8 Kitで測定した。データは非処理細胞の％で正規化した。
結果： その結果、処理したCal27, UM-SCC6, およびSK-Mel-5細胞で90%以上の細胞死が確認され、その時の処理組成は0.1mM WST-3, 30mM mPMS および30mM アピゲニンであった(F3-F2)。その一方で、この処理条件下で、初代培養細胞のヒト角化細胞HEKaはこの処理に比較的抵抗性を示した。この複合処理に対する感度の違いは、差別的な癌細胞のターゲティングのための手段を提供し、正常細胞への毒性を制限することが期待される。
【０２１５】
例25
タキセルおよびPuc19 DNA配列由来のsiRNAの複合によるタキセルの有効性効果の増大
方法： HT1080細胞にPuc19 DNA配列から由来したsiRNA（これに（その配列に）一致する遺伝子を標的にしており、その遺伝子がPuc19由来のsiRNAの標的となる）を24時間導入し、その後3, 10, 30, および100nMのタキセルで48時間処理した。48時間のタキセル処理後、正常培地に換えて24から72時間細胞を培養した。細胞生存率は、CCK8 Kitを用いて24時間毎に測定した。データは非処理細胞に対する%で正規化した。この研究に用いられたsiRNAは、siRNA#1, siRNA#2, siRHA#3, TRPC6, SH3PXD2B, C6orf108, TTBK1, MAGI3, およびTMEM182を標的としたsiRNAのそれぞれ、それからsiRNA＃2+#3, およびsiRNA#1+#2+#3+#4+#5 (siRNAΣ1-5)の組み合わせである。
結果： 結果は処理後72時間の測定値を表した。細胞生存率の結果、Puc19遺伝子導入および大多数のsiRNA導入によってタキセル量依存的な細胞死促進が見られた(Fig 21)。タキセルのIC50はPuc19 DNA導入やTRPC6, SH3PXD2B, C6orf108, TTBK1, MAGI3,およびTMEM182を標的としたsiRNA導入、siRNA#2+#3およびsiRNA#1+#2+#3+#4+#5の複合の導入によって三分の一倍以上に低下した。siRNA#2, siRHA#3、およびSH3PXD2B, C6orf108を標的にしたsiRNAでは、タキセルのIC50に2.5倍以上の低下が認められた。
これらの結果は、Puc19 DNA ベクターのDAN配列が、ある短い機能的配列をコードしており、これに対応する遺伝子の発現量そして細胞機能を標的として干渉するという仮説を立証している。少なくとも検証したこれらの遺伝子(TRPC6, SH3PXD2B, C6orf108, MAGI3,およびTMEM182)は化学療法製剤の効能を増大するような抗癌剤設計の標的として利用できることが期待される。今回同定されたこれらの一致する配列を標的とするsiRNAは、この目的を達成するための手段になりえる。加えて、これらの複合処理は単なる細胞増殖の阻害だけでなく癌細胞死を誘引する。
処理から72時間経過後、処理細胞は再び成育することはなかった。この特質は処理効果に永続性を与えている。
【０２１６】
例26
Puc19-IKK 阻害剤-WST-1r 3種複合処理を目的としたPuc19 と、TMEM182 およびMAGI3に対応するsiRNAとの置換による
方法： T1080細胞に対して、この配列と一致する遺伝子を標的にしており、この遺伝子がPuc19由来のsiRNAの標的となる、siRNA#3またはMAGI3,およびTMEM182を標的としたsiRNAを24時間遺伝子導入し、その後IKK阻害剤IIIの24時間処理に続いてWST-1rをさらに4時間加えた。4時間のWST-1r処理の後、正常培地に換えて24から72時間細胞を培養した。細胞生存率は、CCK8 Kitを用いて24時間毎に測定した。データは非処理細胞に対する%で正規化した。 siRNA遺伝子導入のネガティブコントロールとして AllStar siRNAを用いた。Puc19 DNAベクター導入は＝をポジティブコントロールとした。
結果： の結果、IKK 阻害剤 III量依存的に細胞死を引き起こし、MAGI3 および TMEM182を標的としたsiRNAはこの細胞死を相乗化した (Fig 22)。また、これらの結果はTMEM182 およびMAGI3のターゲティングが癌治療における
【０２１７】
配列リスト
Seq ID
#1 pUC19核酸配列
#2 TRPC6核酸配列
>gi|19923256|ref|NM_004621.3| Homo sapiens transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 6 (TRPC6), mRNA（ヒト一過性受容体電位カチオンチャネル, サブファミリー C, メンバー 6、mRNA)
#3 SH3PXD2B核酸配列
>gi|63055058|ref|NM_001017995.1| Homo sapiens SH3 and PX domains 2B (SH3PXD2B), mRNA（ヒトSH3 とPX ドメイン2B (SH3PXD2B), mRNA）
#4 MAGI3核酸配列
>gi|23097339|ref|NM_152900.1| Homo sapiens membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 3 (MAGIKK), transcript variant 2, mRNA (ヒトグアニル酸キナーゼ, WWとPDZ ドメイン、3を含む (MAGIKK), transcript variant 2, mRNA)
#5 TMEM182核酸配列
>gi|40255064|ref|NM_144632.2| Homo sapiens transmembrane protein 182 (TMEM182), mRNA（ヒト膜貫型タンパク 182 (TMEM182), mRNA）
#6 TRPC6 ペプチド配列
>gi|5730102|ref|NP_004612.2| transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 6 [Homo sapiens]（一過性受容体電位カチオンチャネル, サブファミリー C, メンバー 6、[ヒト])
#7 SH3PXD2B ポリペプチド
>gi|63055059|ref|NP_001017995.1| SH3 and PX domains 2B [Homo sapiens]（SH3 および PX ドメイン 2B [ヒト]）
#8 MAGI-3 membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 3 Polypeptide sequence（膜結合型グアニル酸キナーゼ、WW および PDZドメイン3を含む）
>gi|23097340|ref|NP_690864.1| membrane-associated guanylate kinase-related  3 isoform 2 [Homo sapiens]
#9 TMEM182 ペプチド配列
>gi|40255065|ref|NP_653233.2| hypothetical protein LOC130827 [Homo sapiens] （推定タンパクLOC130827 [ヒト]）
#10 siRNA1
Sense: UGA AUU CGA GCU CGG UAC CCG GGG A  
Antisense: UCC CCG GGU ACC GAG CUC GAA UUC A
#11 siRNA 2
Sense: CAG GAA AGA ACA UGU GAG CAA AAG
Antisense: CUU UUG CUC ACA UGU UCU UUC CUG
#12 siRNA3
Sense: CUU UUA AAU UAA AAA UGA AGU UUU A
Antisense: UAA AAC UUC AUU UUU AAU UUA AAA G
#13 pcDNA3m
SEQ ID NO#14 C6orf108
>gi|40354200|ref|NM_199184.1| Homo sapiens chromosome 6 open reading frame 108 (C6orf108), transcript variant 2, mRNA（ヒトクロモソーム 6 open reading frame 108 (C6orf108), transcript variant 2, mRNA）
SEQ ID NO#15 C6orf108
>gi|40354201|ref|NP_954653.1| putative c-Myc-responsive isoform 2 [Homo sapiens]（推定c-Myc応答アイソフォーム2 [ヒト]）
配列リスト
Seq ID
#1 pUC19核酸配列
#2 TRPC6核酸配列
>gi|19923256|ref|NM_004621.3| Homo sapiens transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 6 (TRPC6), mRNA（ヒト一過性受容体電位カチオンチャネル, サブファミリー C, メンバー 6、mRNA)
#3 SH3PXD2B核酸配列
>gi|63055058|ref|NM_001017995.1| Homo sapiens SH3 and PX domains 2B (SH3PXD2B), mRNA（ヒトSH3 とPX ドメイン2B (SH3PXD2B), mRNA）
#4 MAGI3核酸配列
>gi|23097339|ref|NM_152900.1| Homo sapiens membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 3 (MAGIKK), transcript variant 2, mRNA (ヒトグアニル酸キナーゼ, WWとPDZ ドメイン、3を含む (MAGIKK), transcript variant 2, mRNA)
#5 TMEM182核酸配列
>gi|40255064|ref|NM_144632.2| Homo sapiens transmembrane タンパク質 182 (TMEM182), mRNA（ヒト膜貫型タンパク 182 (TMEM182), mRNA）
#6 TRPC6 ペプチド配列
>gi|5730102|ref|NP_004612.2| transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 6 [Homo sapiens]（一過性受容体電位カチオンチャネル, サブファミリー C, メンバー 6、[ヒト])
#7 SH3PXD2B ポリペプチド
>gi|63055059|ref|NP_001017995.1| SH3 and PX domains 2B [Homo sapiens]（SH3 および PX ドメイン 2B [ヒト]）
#8 MAGI-3 membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 3 Polyペプチド sequence（膜結合型グアニル酸キナーゼ、WW および PDZドメイン3を含む）
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#9 TMEM182 ペプチド配列
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#10 siRNA1
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Antisense: UCC CCG GGU ACC GAG CUC GAA UUC A
#11 siRNA 2
Sense: CAG GAA AGA ACA UGU GAG CAA AAG
Antisense: CUU UUG CUC ACA UGU UCU UUC CUG
#12 siRNA3
Sense: CUU UUA AAU UAA AAA UGA AGU UUU A
Antisense: UAA AAC UUC AUU UUU AAU UUA AAA G
#13 pcDNA3m
SEQ ID NO#14 C6orf108
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SEQ ID NO#15 C6orf108
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【図１】
2014055135.tif 000003
【図２】
2014055135.tif 000004
【図３−１】
2014055135.tif 000005
【図３−２】
2014055135.tif 000006
【図４】
2014055135.tif 000007
【図５】
2014055135.tif 000008
【図６】
2014055135.tif 000009
【図７】
2014055135.tif 000010
【図８】
2014055135.tif 000011
【図９】
2014055135.tif 000012
【図１０】
2014055135.tif 000013
【図１１】
2014055135.tif 000014
【図１２】
2014055135.tif 000015
【図１３】
2014055135.tif 000016
【図１４】
2014055135.tif 000017
【図１５】
2014055135.tif 000018
【図１６】
2014055135.tif 000019
【図１７】
2014055135.tif 000020
【図１８】
2014055135.tif 000021
【図１９】
2014055135.tif 000022
【図２０−１】
2014055135.tif 000023
【図２０−２】
2014055135.tif 000024
【図２１】
2014055135.tif 000025
【図２２】
2014055135.tif 000026
【図２３】
2014055135.tif 000027
【図２４】
2014055135.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月5日(2013.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療用の医薬組成物であって、前記組成物が：
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）と１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ）とからなる試薬、及び当該試薬の代替物とからなる群から選択される第１の薬剤と；
核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）阻害剤、ｐＵＣＩ９（配列番号１）、ｐＣＤＮＡ３（配列番号１３）、及び配列番号１０ないし１２からなる群から選択されるｓｉＲＮＡ又は配列番号２ないし５及び１４からなる群から選択される遺伝子の発現を標的にするｓｉＲＮＡからなる群から選択される第２の薬剤と；
を含み；
前記代替物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−３）、及び水溶性のテトラゾリウム（ＷＳＴ）と電子受容体の中間体（ＩＥＡ）とからなる試薬からなる群から更に選択され；
前記ＷＳＴが２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム塩（ＷＳＴ−３）、２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４）、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム，二ナトリウム塩（ＷＳＴ−５）、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム，１ナトリウム塩（ＷＳＴ−９）、２．５−ジ−（４−ニトロフェニル）−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１０）、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム，二ナトリウム塩（ＷＳＴ−１１）、及び（２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）からなる群から更に選択され；
前記ＩＥＡがｍＰＭＳ、及びコエンザイムＱ１からなる群から更に選択され；
前記ＮＦ−κＢ阻害剤がＩＫＫ阻害剤、フラボノイド、及びＣＫ２阻害剤からなる群から選択され；
前記ＩＫＫ阻害剤がアピゲニン、４−（２’−アミノエチル）アミノ−１，８−ジメチルイミダゾ［１，２−ａ］キノキサリン（ＢＭＳ−３４５５４１、ＩＫＫ阻害剤ＩＩＩ）、ＳＣ−５１４、ＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ、ウェデロラクトン（Ｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ：ＩＫＫ阻害剤ＩＩ）、Ｎ−（３，５−ビス−トリフルオロメチルフェニル）−５−クロロ−２−ヒドロキシベンズアミド（ＩＫＫ−２阻害剤Ｖ、ＩＭＤ−０３５４）、及び（５−フェニル−２−ウレイド）チオフェン−３−カルボアミド（ＩＫＫ−２阻害剤ＶＩ）からなる群から選択され；
前記ＣＫ２阻害剤がアピゲニンである；
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物が、薬学的に許容可能な担体を更に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記第１の薬剤がＷＳＴ−１及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−３及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−４及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−５及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−９及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ−１０及びｍＰＭＳ、ＷＳＴ１１及びｍＰＭＳ、ならびにＸＴＴ及びｍＰＭＳからなる試薬の群から更に選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記第２の薬剤がアピゲニンであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
ＷＳＴ−３とアピゲニンとを含む医薬組成物。
【請求項６】
ＷＳＴ−３とＩＫＫ阻害剤とを含む医薬組成物であって、前記ＩＫＫ阻害剤がアピゲニン、４−（２’−アミノエチル）アミノ−１，８−ジメチルイミダゾ［１，２−ａ］キノキサリン（ＢＭＳ−３４５５４１、ＩＫＫ阻害剤ＩＩＩ）、ＳＣ−５１４、ＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ、ウェデロラクトン（Ｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ：ＩＫＫ阻害剤ＩＩ）、Ｎ−（３，５−ビス−トリフルオロメチルフェニル）−５−クロロ−２−ヒドロキシベンズアミド（ＩＫＫ−２阻害剤Ｖ、ＩＭＤ−０３５４）、及び（５−フェニル−２−ウレイド）チオフェン−３−カルボアミド（ＩＫＫ−２阻害剤ＶＩ）からなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
ＷＳＴ−１及びｍＰＭＳからなる試薬とアピゲニンとを含む医薬組成物。
【請求項８】
ＷＳＴ−１及びｍＰＭＳからなる試薬とＩＫＫ阻害剤とを含む医薬組成物であって、前記ＩＫＫ阻害剤がアピゲニン、４−（２’−アミノエチル）アミノ−１，８−ジメチルイミダゾ［１，２−ａ］キノキサリン（ＢＭＳ−３４５５４１、ＩＫＫ阻害剤ＩＩＩ）、ＳＣ−５１４、ＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ、ウェデロラクトン（Ｗｅｄｅｌｏｌａｃｔｏｎｅ：ＩＫＫ阻害剤ＩＩ）、Ｎ−（３，５−ビス−トリフルオロメチルフェニル）−５−クロロ−２−ヒドロキシベンズアミド（ＩＫＫ−２阻害剤Ｖ、ＩＭＤ−０３５４）、及び（５−フェニル−２−ウレイド）チオフェン−３−カルボアミド（ＩＫＫ−２阻害剤ＶＩ）からなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【外国語明細書】
2014055135000001.pdf
2014055135000002.pdf
2014055135000003.pdf
2014055135000004.pdf