(57)【要約】      （修正有）【課題】多様な疾患に対して、抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を操作するための治療剤の提供。【解決手段】ニューリチンを含む治療剤、あるいはニューリチンをコードする核酸分子またはその機能的フラグメントによって形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む医薬組成物。ニューリチンを介する調節性Ｔ細胞及びＤＣの操作は、自己免疫疾患、癌及び感染性疾患の免疫治療を増強するためのみならず、ドナーのリンパ球インフュージョン、骨髄移植、並びに他の型の移植及び養子移植の設定において、リンパ球生着を増強するためにも用いることができる。ニューリチンは、ニューリチンを発現するＴ細胞の細胞集団を選択的に増強又は除去するために用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において自己免疫疾患を処置する方法であって：
ニューリチン陰性調節性Ｔ細胞を前記個体に投与し、
それにより前記個体において前記自己免疫疾患を処置することを含む、前記方法。
【請求項２】
個体において自己免疫疾患を処置する方法であって：
ニューリチンをコードする核酸分子またはその機能的フラグメントによって形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞を前記個体に投与し、それにより前記個体において前記自己免疫疾患を処置することを含む、前記方法。
【請求項３】
個体において自己免疫疾患を処置する方法であって：
ニューリチンのアンタゴニストを前記個体に投与し、
それにより前記個体において前記自己免疫疾患を処置することを含む、前記方法。
【請求項４】
個体に自己免疫疾患を処置する上で有効な少なくとも一つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
個体において癌を処置する方法であって：
前記個体にニューリチン陽性ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を含むリンパ球インフュージョンを投与し、
それにより前記個体において前記癌を処置することを包含する、前記方法。
【請求項６】
個体において癌を処置する方法であって：
ニューリチンを過剰発現する腫瘍特異的Ｔ細胞を投与し、それにより前記個体において前記癌を処置することを含む、前記方法。
【請求項７】
個体において癌を処置する方法であって、可溶性ニューリチンまたはその機能的フラグメントを投与し、それにより前記個体において前記癌を処置することを含む、前記方法。
【請求項８】
可溶性ニューリチンまたはその機能的フラグメントが、ヒトニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
個体に癌を処置する上で有効な少なくとも一つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
個体において感染症を処置する方法であって、可溶性ニューリチンまたはその機能的フラグメントを投与し、それにより前記個体において前記感染症を処置することを含む、前記方法。
【請求項１１】
可溶性ニューリチンまたはその機能的フラグメントが、ヒトニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
個体に感染症を処置する上で有効な少なくとも一つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
感染症が慢性ウイルス感染症である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
個体においてリンパ球生着を増強する方法であって、前記個体が、骨髄移植を受けたか、受けている過程にあるか、または受ける予定であり：
アンタゴニスト抗ニューリチン抗体を前記個体に投与し、それによりリンパ球生着を増強することを含む、前記方法。
【請求項１５】
個体において抗原特異的調節性Ｔ細胞の持続性を延長する方法であって、ニューリチンアンタゴニストを前記個体に投与することを含み、前記アンタゴニストがニューリチンの免疫調節効果を阻害する、前記方法。
【請求項１６】
アンタゴニストが抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ニューリチンに特異的に結合する抗体であって、インビボで抗原特異的Ｔ細胞の寿命を延長する、前記抗体。
【請求項１８】
個体が自己免疫疾患を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
個体が移植片対宿主病を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
個体において抗原特異的調節性Ｔ細胞の欠失を予防する方法であって：ニューリチンアンタゴニストを前記個体に投与することを含み、前記アンタゴニストがニューリチンの免疫調節効果を阻害する、前記方法。
【請求項２１】
アンタゴニストが、抗体、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子およびニューリチンのフラグメントからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ニューリチンに特異的に結合する抗体であって、個体においてインビボで抗原特異的調節性Ｔ細胞の欠失を予防する、前記抗体。
【請求項２３】
個体が自己免疫疾患を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
個体が移植片対宿主病を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
個体において抗原特異的調節性Ｔ細胞の量を減少させるための方法であって、可溶性ニューリチン融合タンパク質を前記個体に投与し、ここで前記抗原特異的調節性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞であり、それにより調節性Ｔ細胞の量を減少させることを含む、前記方法。
【請求項２６】
ニューリチン融合タンパク質がヒトニューリチンＩｇキメラ分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ニューリチン融合タンパク質がマウスニューリチンＩｇキメラ分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
個体においてアネルギー化されたＴ細胞の量を減少させるための方法であって、可溶性ニューリチン融合タンパク質を個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
ニューリチン融合タンパク質がヒトニューリチンＩｇキメラ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ニューリチン融合タンパク質がマウスニューリチンＩｇキメラ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
個体が癌を有する、請求項２５または２８に記載の方法。
【請求項３２】
抗原特異的調節性Ｔ細胞が腫瘍関連抗原に指向されている、請求項２５または２８に記載の方法。
【請求項３３】
癌を有する個体において癌を処置する方法であって、可溶性ニューリチン融合タンパク質を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
ニューリチン融合タンパク質がヒトニューリチンＩｇキメラ分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ワクチンの効力を増大させる方法であって、可溶性ニューリチンを個体に共投与することを含む、前記方法。
【請求項３６】
ワクチンが腫瘍ワクチンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ワクチンが、感染性疾患を予防するために設計されたワクチンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
個体において移植片対宿主病を処置する方法であって、ニューリチンアンタゴニストを前記個体に投与し、それにより前記個体を処置することを含む、前記方法。
【請求項３９】
骨髄移植の後のリンパ球生着を増強する方法であって、ニューリチンアンタゴニストを個体に投与し、それによりリンパ球生着を増強することを含む、前記方法。
【請求項４０】
個体において免疫応答を調節する方法であって、ニューリチンアンタゴニストを前記個体に投与し、それにより前記個体を処置することを含む、前記方法。
【請求項４１】
個体において免疫応答を調節する方法であって、ニューリチンアンタゴニストを前記個体に投与し、それによって前記個体において免疫応答を調節することを含む、前記方法。
【請求項４２】
ニューリチンに特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントであって、ヒト調節性Ｔ細胞に結合する、前記抗体。
【請求項４３】
アンタゴニスト抗体である、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
アゴニスト抗体である、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４５】
モノクローナル抗体である、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４６】
モノクローナル抗体が１Ｄ６および１Ａ９からなる群より選択される、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４７】
キメラ抗体である、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４８】
ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４９】
請求項４２に記載の抗体とキャリアとを含む組成物。
【請求項５０】
請求項４２に記載の抗体と薬学的に受容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項５１】
ヒトニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質。
【請求項５２】
マウスニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質。
【請求項５３】
ヒト調節性Ｔ細胞を阻害する、ヒトニューリチンのペプチドフラグメント。
【請求項５４】
ヒト調節性Ｔ細胞を活性化する、ヒトニューリチンのペプチドフラグメント。
【請求項５５】
ヒトニューリチンに指向されたＲＮＡアプタマー。
【請求項５６】
マウスニューリチンに指向されたＲＮＡアプタマー。
【請求項５７】
ヒト調節性Ｔ細胞の活性を特異的に阻害する、請求項５５に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項５８】
ヒト調節性Ｔ細胞の活性を特異的に増大させる、請求項５５に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項５９】
ニューリチンをコードする核酸分子に特異的に結合するｓｉＲＮＡ分子。
【請求項６０】
ニューリチンをコードする核酸分子と特異的に結合するｓｈＲＮＡ分子。
【請求項６１】
ニューリチンまたはその機能的フラグメントをコードする核酸分子を含むウイルスベクターであって、免疫細胞にトランスフェクションすることができる、前記ベクター。
【請求項６２】
レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項６１に記載のウイルスベクター。
【請求項６３】
免疫細胞がＴ細胞である、請求項６１に記載のウイルスベクター。
【請求項６４】
Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞が調節性Ｔ細胞である、請求項６４に記載のベクター。
【請求項６６】
請求項４２に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６７】
請求項６６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６８】
発現ベクターである、請求項６７に記載のベクター。
【請求項６９】
請求項６７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７０】
請求項５１に記載のニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７１】
請求項５２に記載のニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７２】
請求項７０に記載のポリペプチドを含むベクター。
【請求項７３】
請求項７１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７４】
発現ベクターである、請求項７２に記載のベクター。
【請求項７５】
発現ベクターである、請求項７３に記載のベクター。
【請求項７６】
請求項７４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７７】
請求項７５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７８】
請求項５３に記載のヒトニューリチンのペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７９】
請求項５４に記載のマウスニューリチンのペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８０】
請求項７８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８１】
請求項７９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８２】
発現ベクターである、請求項８０に記載のベクター。
【請求項８３】
発現ベクターである、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８４】
請求項８２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８５】
請求項８３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８６】
個体において炎症状態を処置する方法であって、ニューリチンアンタゴニストを前記個体に投与し、それによって前記炎症を処置することを含む、前記方法。
【請求項８７】
炎症状態が心臓に位置する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
個体において移植された器官の拒絶を予防する方法であって、ニューリチンアンタゴニストを前記個体に投与することを含み、前記アンタゴニストがニューリチンの免疫調節効果を阻害する、前記方法。
【請求項８９】
アンタゴニストが、抗体、ペプチド、または小分子である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ＣＤ４＋Ｔ細胞がニューリチンを発現しない、コンディショナルニューリチンノックアウトマウス。
【請求項９１】
ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞およびＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞がニューリチンを過剰発現する、トランスジェニックマウス。
【請求項９２】
ニューリチンの免疫調節活性をインビトロで調節する薬剤についてのスクリーニング方法であって：
ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養すること、ここで、該ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ニューリチンをコードするレトロウイルスベクターを含み、該細胞は、抗原でパルスされた骨髄由来樹状細胞にＧＦＰを有する；
産生されたＩＬ−２産生を測定すること；および
産生されたＩＬ−２の量をコントロールと比較すること
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項９３】
コントロールが、試験剤の不在下において培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
ＩＬ−２産生の増加が、試験剤がニューリチンの免疫調節活性を阻害することを示す、請求項９２または９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2005年9月9日に出願された米国仮特許出願第60/XXX,XXX号の優先権を主張し、該出願の全開示は、本明細書において参考として援用される。
発明の分野
本発明は、ニューリチン媒介性免疫応答の調節のための方法および製品に関する。この調節は、特定の免疫応答プロセスの阻害または刺激をもたらすことができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
調節性Ｔ細胞（Treg）は、現在、多数の系において記載されており、自己寛容および自己免疫疾患からの保護の維持のための主要な機構として明らかになってきた。Treg細胞は、殆どの系においてCD4+/CD25+として特徴付けられ、胸腺から出現する（いわゆる「ナチュラルＴ細胞」）か、または成熟Ｔ細胞から末梢耐性誘導の条件下において分化する（いわゆる「誘導性Ｔ細胞」）ことができる。調節性Ｔ細胞（Treg）は、自己免疫を制限するが、また、抗腫瘍免疫の強さを減弱する。Treg機能の増強は、自己免疫疾患を処置するために用いることができ、一方、Treg細胞の阻害または排除は、癌および感染性疾患の免疫治療を増強することができる。
したがって、Treg活性の調節のための方法および組成物は、Treg活性によって特徴付けられる疾患および障害、例えば、癌、感染性疾患および免疫応答の処置において有用である。
【発明の開示】
【０００３】
要旨
本発明者らは、ニューリチンが調節性Ｔ細胞の恒常性を抗原依存的な様式において制御することを実証した。この知見に基づき、ニューリチン、ニューリチンのフラグメント、ニューリチンアゴニスト、ニューリチンアンタゴニスト、ニューリチンに対する抗体、およびニューリチンの核酸分子またはその相補物は、多様な疾患の設定において抗原特異的調節性Ｔ細胞を操作するための治療剤として用いることができる。したがって、ニューリチンを介するTreg細胞およびＤＣの操作は、例えば、自己免疫疾患、癌および感染性疾患の免疫治療を増強するためのみならず、ドナーのリンパ球のインフュージョン、骨髄移植、ならびに他の型の移植および養子移植の設定において、リンパ球生着を増強するためにも用いることができる。さらに、ニューリチンは、ニューリチンを発現するＴ細胞の細胞集団を選択的に増強または除去するために用いることができる。
【０００４】
一態様において、Treg細胞機能を調節する免疫治療に基づくニューリチンの用途を記載する。本発明者らは、ニューリチンの発現が、ナチュラル調節性Ｔ細胞（Treg）およびアネルギー性Ｔ細胞において特有であるが、ナイーブＴ細胞または活性化Ｔ細胞においては存在しないことを示す。これらの知見は、ニューリチンを、アネルギー性Ｔ細胞についてのTreg特異的表面分子として同定する。さらに、本明細書において、ニューリチンが活性化樹状細胞に結合して樹状細胞（ＤＣ）の機能に影響を与えることができること、および、可溶化ニューリチン−Ｉｇ融合タンパク質はTreg細胞に対するその効果を調節することができることを示した。また、免疫治療モデル、特に自己免疫モデル、移植モデル、および癌免疫治療モデルにおけるインビボでのニューリチン調節剤のスクリーニングおよび評価を支援するために、CD4+細胞がニューリチンを発現しないニューリチンのコンディショナルノックアウトマウス、ならびに、CD4+CD8-Ｔ細胞およびCD4-CD8+Ｔ細胞がニューリチンを過剰発現するトランスジェニックマウスを提供する。
【０００５】
本明細書において記載される一態様は、ニューリチンに特異的に結合する単離された抗体であって、該抗体は、ヒト調節性Ｔ細胞に結合する。一局面において、抗体は、抗体の機能的フラグメントである。別の局面において、抗体はアンタゴニスト抗体であり、一方、別の局面においては、抗体はアゴニスト抗体である。別の局面において、抗体は、本明細書において記載されるニューリチン特異的１Ｄ６抗体および１Ａ９抗体などのモノクローナル抗体である。別の局面において、抗体はキメラ抗体であるか、またはさらに抗体はヒト化抗体であってもよい。本明細書において記載される抗体を含有する医薬組成物を含む組成物もまた、包含される。
【０００６】
別の態様において、ヒトおよびマウスのニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質を含む可溶性ニューリチンが本明細書において記載され、ヒトおよびマウスのニューリチンのフラグメント、特に少なくとも一つのニューリチンの特徴である免疫調節活性を保持するフラグメントも、同様に記載される。マウスおよびヒトのニューリチンに対するＲＮＡアプタマーを本明細書において記載し、これらは、ヒトおよび／またはマウスの調節Ｔ細胞を特異的に阻害するもの、ならびにヒトおよび／またはマウスの調節Ｔ細胞を特異的に活性化するものを含む。また、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ分子を本明細書において記載し、これらは本発明の方法において有用である。
【０００７】
別の態様において、ニューリチンまたはその機能的フラグメントをコードする核酸を含むウイルスベクターを記載する。これは、免疫細胞、すなわちCD4+Ｔ細胞およびCD4+調節Ｔ細胞を含むＴ細胞に形質移入することができる。別の態様において、ニューリチン特異的抗体およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびウイルスベクターを含むベクター、ならびに前記ポリヌクレオチドおよび前記ベクターを含む宿主細胞を記載する。別の態様において、可溶性ニューリチンをコードするポリヌクレオチド、ヒトおよび／もしくはマウスのニューリチンキメラ免疫グロブリン融合分子またはそのフラグメント、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびウイルスベクターを含むベクター、ならびに前記ポリヌクレオチドおよびベクターを含む宿主細胞を記載する。
【０００８】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患を処置する方法を提供する。個体において自己免疫疾患を処置する一つの方法は、ニューリチン陰性調節性Ｔ細胞を個体に投与することによるものであり、前記投与が前記個体において前記自己免疫疾患を処置する。一態様において、方法は、ニューリチン陽性調節性Ｔ細胞を、例えばニューリチンに対して特異的な抗体を用いて、インビトロで単離することを含む。本明細書において記載される個体において自己免疫疾患を処置する別の方法は、個体において自己免疫疾患を処置するために、機能的に活性なフラグメントをコードするニューリチン遺伝子またはそのフラグメントを含むCD4+Ｔ細胞を個体に投与することを包含する。本明細書において記載される個体において自己免疫疾患を処置する別の方法は、個体における自己免疫疾患を処置するために、ニューリチンアンタゴニストを個体に投与することを含む。自己免疫疾患を処置するこれらの方法のいずれも、自己免疫疾患を処置する上で有効な他の薬剤の投与と組み合わせることができる。
【０００９】
別の局面において、本発明は、処置の方法を提供する。処置の一部として１以上のリンパ球インフュージョンを受けている個体において癌を処置する一つの方法は、癌を処置するために、前記個体にニューリチン陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むリンパ球インフュージョンを投与することを含む。本明細書において記載される癌を処置する別の方法は、腫瘍特異的Ｔ細胞のインフュージョンを受ける個体に適用され、除去（deplete）されたニューリチン陽性ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を投与し、それにより個体における癌を処置することを含む。本明細書において記載される個体において癌を処置する別の方法は、Treg細胞の数および／または活性を低下させるための、可溶性ニューリチンの投与を含む。癌を処置するこれらの方法のいずれも、癌を処置する上で有効な他の薬剤の投与と組み合わせてもよい。
【００１０】
また、個体において感染症を処置する方法も、本明細書において記載される。一局面において、ヒトニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質などの可溶性ニューリチンを投与して、個体に投与されたワクチンまたは他の治療剤を増強することによって、感染症を処置する。感染症は、例えば、急性であっても慢性であってもよく、ウイルス感染を含む。また、個体において移植物に対する寛容を増大する方法も本明細書において記載する。これは、個体における移植片の拒絶を低減するために、抗ニューリチンアンタゴニスト抗体などのニューリチンに対するアンタゴニストを投与することを含む。個体において移植片対宿主病を処置するためにニューリチンのアンタゴニストを投与する方法を、本明細書において記載する。骨髄移植を受けた個体においてリンパ球生着を増強する方法も記載し、これは、リンパ球生着を増強するためにニューリチンに対するアンタゴニストを投与することを含む。ニューリチンのアンタゴニストの投与はまた、心臓の炎症およびアテローム性動脈硬化などの炎症状態を処置するために用いてもよい。また、CD4+Ｔ細胞がニューリチンを発現しないコンディショナルニューリチンノックアウトマウス、ならびに、CD4+CD8-Ｔ細胞およびCD4-CD8+Ｔ細胞がニューリチンを過剰発現するトランスジェニックマウスを、本明細書において記載する。
【００１１】
また、インビトロでニューリチンの免疫調節活性を調節する薬剤についてのスクリーニングの方法を、本明細書において記載し、この方法は以下を含む：試験剤の存在下または不在下において、ニューリチンをコードするレトロウイルスベクターを含みＧＦＰを発現するCD4+Ｔ細胞を、例えば２４時間、骨髄（例えば第７日の骨髄）由来の樹状細胞であって抗体でパルスされたものと、共培養すること、および、試験剤の存在下または不在下において共培養の後で生じた上清からのIL-2産生の量を比較すること、ここで、IL-2産生の増大は、試験剤がニューリチンの免疫調節活性を阻害することを示す。
【００１２】
図面の簡単な説明
上記の本発明の特徴、利点および目的、ならびにこれより明らかになる他のことは、達成され、詳細に理解されることができ、上で簡単に要約された本発明のより具体的な記載は、添付の図面において説明される特定の態様への言及によって得ることができる。これらの図面は、明細書の一部を形成する。しかし、添付の図面は、本発明の好ましい態様を説明するものであり、したがってその範囲を限定するものとはみなされない。
【００１３】
図１．エフェクター／メモリー対アネルギー性表現型へのＴ細胞の分化の概念図。
図２．誘導されたTreg細胞は、致死性の間質性肺炎の発症を抑制する。
図３Ａ−Ｂ．アネルギー性6.5Ｔ細胞は、インビトロおよびインビボで調節活性を示す。Ａ．インビトロ抑制アッセイ。C3HA宿主細胞へ養子移植された6.5Ｔ細胞を、移植の４日後および７日後に単離した。ナイーブ6.5Ｔ細胞（レスポンダー（responder）細胞）を、インビボで発生させた異なる量のアネルギー性6.5細胞（サプレッサー）の存在下において、HAペプチドで刺激した。Ｂ．C3HA宿主中のアネルギー性6.5Ｔ細胞は、後に移植された6.5Ｔ細胞の増殖を阻害する。２×１０６個の6.5Ｔ細胞を移植して３つの異なる条件下において活性化した後で、Ｔ細胞増殖を比較した。メモリー条件：6.5Ｔ細胞をB10.D2宿主へ移植し、VacHAで活性化した。非抑制条件：6.5Ｔ細胞をナイーブC3HAマウスへ移植した。抑制条件：２週間前に１×１０５個の6.5Ｔ細胞を移植されたC3HAマウスに、6.5Ｔ細胞を移植した。致死用量の6.5Ｔ細胞の増殖を、移植の２日後、４日後および７日後に試験した。
【００１４】
図４．アネルギー性／Treg誘導とエフェクター／メモリー誘導との間のCD4+Ｔ細胞における遺伝子の発現差異をランク付けする。養子移植の後で多様な日数の後に精製されたナイーブ6.5クローン形質CD4+Ｔ細胞、アネルギー性／Tregおよびエフェクター／メモリー6.5クローン形質CD4+Ｔ細胞から調製されたmRNAを、Affymetrix gene chipにより分析した。アネルギー性／Treg誘導とエフェクター／メモリー誘導との間の遺伝子の発現差異を、距離によってランク付けした。距離（Ｄ）を、養子移植の後、第２日（｜d1｜）、第３日（｜d2｜）、および第４日（｜d3｜）における、アネルギー性Ｔ細胞とエフェクター／メモリーＴ細胞との間の発現の絶対的差異の合計として定義し、正規化のためにナイーブCD4+Ｔ細胞の値（ｎ）で除算した。
【００１５】
図５．インビボおよびインビトロで発生させたアネルギー性Ｔ細胞対活性化Ｔ細胞におけるニューリチン発現を比較するGenechipのデータ。インビボでは、6.5 TCRトランスジェニックＴ細胞をC3HA宿主に養子移植し、２日後、３日後、４日後にインビボのアネルギー条件において細胞をソートした；または、VacHA注入活性化条件と併せて6.5細胞をB10D2宿主に移植した。インビトロでは、AE7細胞を、抗CD3単独で、２時間、４時間、６時間刺激するか、または一晩刺激して５日間IL-2の不在下において静置させることによってアネルギー化した。これらの条件からのRNAサンプルを単離し、cDNA合成およびGenechip分析に供した。データは、Genechipデータからのニューリチンの相対的発現を示す。
【００１６】
図６．多様な細胞型におけるニューリチン発現の比較。CD4+CD441owCD25-、CD4+CD44hiCD25+、CD4+CD44hiCD25-、CD8+CD44hi、CD8+CD44L、B220+CD19+Ｂ細胞、DX5+CD3-ＮＫ細胞、CDllChiB220- bmDCおよびCDl1C1owB220+細胞を、リンパ節および脾臓からソートした。各々の細胞集団からRNAを抽出し、cDNAについてqRT-PCRを行った。CD4+CD44LナイーブＴ細胞における増幅のレベルは、負のコントロールに類似し、したがって、比較の基線として使用する。
【００１７】
図７Ａ−Ｂ．ニューリチンはCD4CD25+CD62Low細胞において高発現し、その発現は、CD4CD25+CD2hi細胞においてIL-2によって誘導することができる。ナチュラルTreg細胞のソートされた亜集団における、ナチュラルTregの異なる処置に際してのニューリチン発現のRT-PCR。Ａ．ニューリチン発現は、CD4CD25+CD2hi細胞においてよりも、フレッシュなソートされたCD4CD25+CD62Low細胞において高い。Ｂ．ソートされたCD4CD25+CD2hi細胞を、APC単独の存在下において、または以下の処置と併せて培養した：IL-2（100u/ml）、IL-2（100u/ml）＋抗CD3（lug/ml）、抗CD3（lug/ml）＋抗CD28（5ug/ml）または抗CD28（5ug/ml）単独。
【００１８】
図８Ａ−Ｄ．多様な条件下におけるニューリチンの発現プロフィール。qRT-PCRによる、アネルギー性条件対活性化条件下において活性化されたＴ細胞におけるニューリチン発現の比較。Ｂ．qRT-PCRによる、アネルギー性AE7細胞対活性化AE7細胞におけるニューリチン発現の確認。Ｃ．ニューリチンについてのウェスタンブロッティング。アネルギー性AE7細胞、活性化された細胞またはコントロールの静止細胞からの細胞ライセート。Ｄ．腫瘍アネルギー化Ｔ細胞対活性化細胞またはコントロールナイーブ細胞における、qRT-PCRアッセイ。
【００１９】
図９Ａ−Ｃ．CD2ニューリチントランスジェニックマウスの作製。Ａ．hCD2発現構築物。Ｂ．CD2+ニューリチン＋と陰性の同腹仔とから、リンパ節、胸腺および脾臓からRNAを抽出した。CD2誘導性ニューリチン発現について特異的であるプライマー対Ａを用いてRT-PCRを行った。cDNAの増幅は、75bpのイントロン配列がスプライスされることに起因してcDNA産物のサイズがより小さいことから、ゲノムDNAの増幅と区別することができる。Ｃ．内因性ニューリチン発現を検出することができるプライマー対Ｂを用いてのRt-PCRによる、CD2ニューリチン＋と陰性の同腹仔との間でのニューリチン発現レベルの比較。Ｄ．上記Ｂ．およびＣ．のRT-PCR反応において使用されたcDNAの量についてのコントロールのためのアクチンのRT-PCR。
【００２０】
図１０Ａ−Ｃ．CD2NトランスジェニックＴ細胞は、ADT CD2N+細胞の欠失に起因してインビボで抑制の低下を示す。CD2N+またはCD2N-の6.5 TCR+thy1.1+全脾細胞を、C3-HA thy1.2+HA発現宿主に養子移植した。１８日後、CFSE標識されたwt6.5Ｔ細胞を、ナイーブな（予め移植していない）C3-HA宿主に再度ADTした。二次移植されたＴ細胞の増殖および一次移植からの細胞の持続性を試験した。Ａ．CD2N+/-6.5細胞を予め移植された宿主におけるwt6.5T細胞のCFSE希釈。Ｂ．C3-HA宿主における移植されたCD2N+およびCD2N-細胞の持続性を経時的にモニタリングする。
【００２１】
図１１Ａ−Ｂ．可溶性ニューリチンは、自己Ａｇ発現宿主におけるＡｇ特異的Ｔ細胞の欠失を媒介することができる。Ａ．CD2N＋またはCD2N−の6.5+thy1.1+細胞を、wt6.5thy1.1+Ｔ細胞と混合し、C3-HA宿主に移植した。脾臓における移植された細胞のパーセンテージを、ADTの３日後および１４日後に試験した。Ｂ．WT Thy1.1+6.5+細胞を、C3-HA宿主に移植した。ADT宿主を、ADTの時、およびその後１日おきに、NhFcタンパク質またはhIgG 200ugで腹腔内で処置した。脾臓におけるADT細胞の持続性をADTの１３日後に試験した。
【００２２】
図１２．抗原との接触により誘導されたFoxp3＋Treg細胞の欠失。CD2N+またはCD2N-の6.5+thy1.1+脾細胞を、C3-HA宿主に移植した。foxp3＋細胞のパーセンテージを、ADTの３日後および１３日後に試験した。
図１３Ａ−Ｃ．CD2N+マウスにおいて増悪したEAE。CD2N+およびC57/BL6バックグラウンドにおける同腹仔を、Mog抗原媒介性EAE誘導に供した。EAE疾患の進行を、標準的なソーティングシステムを用いてモニタリングした（Ａ）。ドレーンしているリンパ節および脾臓を、疾患誘導の１０日後に採取し、MOGペプチドを用いてインビトロで再刺激した。刺激の２日後に上清を採取し、IL17分泌について測定した（Ｂ）。ドレーンしているリンパ球および脾臓細胞をまた、MOGペプチドを用いてGolgi-Stopの存在下において４時間再刺激し、IL2およびIFN-gについて染色した（Ｃ）。
【００２３】
図１４Ａ−Ｂ．Ａ．ＤＣのニューリチン−Ｆｃ染色。骨髄由来DCを、ザイモサンとともにまたはザイモサンなしで２４時間または４８時間培養した。細胞をその後N-Fcについて染色した。Ｂ．脾臓のDCを単離し、インビトロで２４時間多様な条件下において培養し、その後N-Fc染色した。
図１５．プレート被覆ニューリチン−Ｆｃ（N-Fc）またはコントロールヒトIgG1（hIgG1）で処置された骨髄由来DCからのIL12p40産生。
【００２４】
図１６Ａ−Ｃ．ニューリチンを発現するまたは発現しないＴ細胞で処置されたDCのサイトカイン産生および抗原提示。第７日の骨髄由来ＤＣをHAペプチドでパルスし、ニューリチンを発現するHA特異的Ｔ細胞およびベクターと共培養した。刺激の２４時間後、培養上清中のIL12p40およびIL12p70の分泌を試験した（ＡおよびＢ）。ＤＣを、HA特異的クローンである4 CD8 Ｔ細胞へのHAクラスＩ特異的ペプチドの提示のために、さらに使用した。CD8 Ｔ細胞の増殖を、刺激の３６時間後に決定した（Ｃ）。
【００２５】
図１７Ａ−Ｄ．ニューリチン特異的モノクローナル抗体の作製。Ａ．２つのハイブリドーマクローンは、ELISAによってプレート結合ニューリチン−hfc融合タンパク質を認識することができる抗体を分泌する。Ｂ．全長ニューリチン（HY10）またはGPIアンカーがない可溶性ニューリチン（HY18）を移植された293個の細胞の表面染色。Ｄ．CD2N+および陰性の同腹仔からのCD4+CD8-胸腺細胞に対する、1D6モノクローナル抗体を用いるニューリチン表面染色のオーバーレイ。
【００２６】
図１８Ａ−Ｂ．CD2N（＋）およびコントロールCD2N（−）マウスからのCD4細胞の亜集団におけるニューリチンの表面染色。Ａ．CD4細胞の亜集団におけるニューリチン（赤）とアイソタイプコントロール抗体（青）との表面染色のオーバーレイ。末梢リンパ節からの細胞を、ビオチン標識1D6抗体またはビオチン標識IgG2bアイソタイプコントロール抗体で染色し、その後、アビジン−PE、CD4、CD44およびCD25表面染色を行った。Ｂ．CD4CD25-CD441ow（赤）、CD4CD25+CD441ow（青）、CD4CD25+CD44hi(9)、およびCD4CD25-CD44hi（橙）の細胞に対するニューリチン表面染色のオーバーレイ。
【００２７】
図１９．可溶性ニューリチンおよび細胞結合ニューリチンを検出するサンドウィッチELISA。脳および腎臓の組織粉砕物上清ならびに脳腎臓細胞ライセートからの25ugの全タンパク質を、1A9抗体で被覆されたELISAプレートに適用した。ビオチン化1D6抗体によりニューリチンの量を検出した。
図２０は、マウスニューリチンの核酸配列を示す（配列番号１）
図２１は、ヒトおよびマウス由来のニューリチンのポリペプチド配列を示す（各々、配列番号２および配列番号３）。
【００２８】
詳細な説明
定義
用語「一つの（a）」または「一つの（an）」ものは、そのものの１または２以上を指すことに注意する；例えば、一つの（a）標的特異的化合物とは、１または２以上の標的特異的化合物を指す。このように、用語「一つの（a）」（または「一つの（an）」）、「１または２以上」、および「少なくとも一つ」は、本明細書において交換可能に用いることができる。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「アプタマー」とは、目的の特定の分子に高いアフィニティーおよび特異性で結合することができる核酸分子である（Tuerk and Gold，Science 249：505（1990）；Ellington and Szostak，Nature 346：818（1990)）。より最近のアプタマーおよびそれらのリガンドの概説に関しては、Eaton，Curr．Opin．Chem．Biol．1：10-16（1997)，Famulok，Curr．Opin．Struct．Biol．9：324-9(1999)，およびHermann and Patel，Science 287：820-5（2000)を参照のこと。したがって、本明細書において記載されるアプタマーは、ニューリチンを含む多様なタンパク質標的に結合し、これらのタンパク質と他のタンパク質との相互作用を分断し、および／またはタンパク質標的によるシグナリングを分断する。米国特許第5,756,291号は、トロンビンに結合して血液凝固を阻害するDNAアプタマーを開示する。治療剤としてのアプタマーの使用の成功の概説に関しては、Osborne et al.，Curr．Opin．Chem．Biol．1：5-9（1997)を参照のこと。アプタマーは、古典的なワトソン−クリック塩基対形成以外の相互作用を通じて、分子に対して特異的な結合アフィニティーを有する核酸分子である。抗体と異なり、ＤＮＡ分子は、それらの配列に依存して多様な三次元構造を想定することができる。本明細書において記載されるものは、ニューリチンに対して高いアフィニティーを示すアプタマーを包含するものである。
【００３０】
また、ニューリチンに特異的に結合する抗体も、本明細書において記載される。これらの抗体は、例えば、ニューリチンを単離するためや、ニューリチンの存在、すなわち、アネルギー性Ｔ細胞上のニューリチンの存在を同定するためなどに用いることができる。アンタゴニスト性である抗体、すなわち、ニューリチンの機能の１または２以上を阻害する（例えばニューリチンのＴ細胞調節活性を阻害または低下させる）抗体、ならびにアゴニスト抗体が挙げられる。抗体を作製するために、ニューリチンポリペプチドまたはペプチド（ニューリチンの抗原性フラグメント）を、別の分子に結合させるか、またはアジュバントとともに投与する。コード配列は、免疫原をインビボで発現することができる発現カセットまたはベクターの一部であってもよい（例えば、Katsumi（1994）Hum．Gene Ther．5：1335-9を参照のこと）。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成する方法は、当業者に公知であり、科学文献および特許文献において記載される。例えば、Coligan，Current Protocols in Immunology，Wiley/Greene，NY（1991)；Stites（eds.）Basic and Clinical Immunology（7th ed.）Lange Medical Publications，Los Altos，Calif；Goding，Monoclonal Antibodies：Principle and Practice（2d ed.）Academic Press，New York，N．Y.（1986)；Harlow（1988）Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照のこと。
【００３１】
ヒト抗体は、例えば、米国特許第5,877,397号；同第5,874,299号；同第5,789,650号；および同第5,939,598号によって記載されるように、ヒト抗体のみを産生するように操作されたマウスにおいて作製することができる。これらのマウス由来のＢ細胞は、モノクローナルヒト抗体産生細胞を産生するために、標準的な技術を用いて（例えば、ミエローマなどの不死化細胞株と融合させることによって、または、細胞株を永続化させる他の技術によってかかるＢ細胞を操作することによって）不死化することができる。例えば、米国特許第5,916,771号および同第5,985,615号を参照のこと。抗体はまた、伝統的な動物を用いるインビボ方法に加えて、インビトロで、例えば組み換え抗体結合部位を発現するファージディスプレイライブラリーを用いて、作製することもできる。例えば、Huse Science 246：1275（1989)；Ward Nature 341：544（1989)；Hoogenboom Trends Biotechnol．15：62-70（1997)；Katz Annu．Rev．Biophys．Biomol．Struct．26：27-45（1997)を参照のこと。
【００３２】
完全なモノクローナルおよびポリクローナル抗体に加えて、多様な遺伝子操作抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓＦｖフラグメント）、ならびに抗原結合機能および親抗体の特異性を保持する他のフラグメントを、標準的な方法を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体の短縮バージョンは、所望のモノクローナル抗体フラグメントを好適な宿主において発現するプラスミドを作製する組み換え方法によって生成することができる。Ladner（米国特許第4,946,778および同第4,704,692号)は、シグナルポリペプチド鎖抗体を生成するための方法を記載する。
【００３３】
Ward et．al.，Nature 341：544-546，1989は、高い抗原結合アフィニティーを有する重鎖可変ドメインの調製を記載する。McCafferty et al.，Nature 348：552-554，1990は、完全抗体Ｖドメインをバクテリオファージの表面にディスプレイすることができること、ファージが抗原に対して特異的に結合すること、およびアフィニティークロマトグラフィーの後で単離できるファージは稀（１００万個に１個）であることを示す。Boss et al.，米国特許第4,816,397号は、免疫グロブリン、および、それらの免疫学的に機能的なフラグメント（一つの宿主において重鎖および軽鎖の少なくとも可変ドメインを含む）を生成するための種々の方法を記載する。Cabilly et al.、米国特許第4,816,567号は、キメラ抗体を調製するための方法を記載する。さらに、用語「抗体」とはまた、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部がヒト免疫グロブリン配列から誘導されるヒト化抗体、および米国特許第4,946,778号において記載されるような単鎖抗体、およびＦａｂ、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖなどの抗体のフラグメントも指す。
【００３４】
本明細書において記載される場合、「抗原性フラグメント」とは、１または２以上のエピトープを含むポリペプチドの一部を指す。エピトープは、基本的に抗原からの直鎖配列を含む直線的なものであっても、他の配列によって遺伝子的に分離されているがポリペプチドリガンドに対する結合部位においては構造的に一体化する配列を含む立体構造的なものであってもよい。「抗原性フラグメント」は、５０００、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０または２５または２０または１０または５アミノ酸長までのいずれであってもよい。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、用語「フラグメント」とは、タンパク質性の因子の文脈において、ペプチドまたはポリペプチドであって、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも５個の近接するアミノ酸残基、少なくとも１０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも１５個の近接するアミノ酸残基、少なくとも２０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも２５個の近接するアミノ酸残基、少なくとも４０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも５０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも６０個の近接するアミノ残基、少なくとも７０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも近接する８０個のアミノ酸残基、少なくとも近接する９０個のアミノ酸残基、少なくとも近接する１００個のアミノ酸残基、少なくとも近接する１２５個のアミノ酸残基、少なくとも１５０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも近接する１７５個のアミノ酸残基、少なくとも近接する２００個のアミノ酸残基、または少なくとも近接する２５０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むものを指す。
【００３６】
特定の態様において、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一つの機能を保持する。別の態様において、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントの少なくとも一、二、三、四、または五つの機能を保持する。好ましくは、抗体のフラグメントは、抗原に対して特異的に結合する能力を保持する。
【００３７】
ニューリチンなどのタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであってもよい。ニューリチンに関しては、生物学的に活性な部分は、Ｔ細胞活性、または全長ニューリチンの他の活性を調節する因子として直接的に使用してもよい。ニューリチンのタンパク質およびその生物学的に活性なフラグメントはまた、ニューリチンによって媒介される活性（例えば本明細書において記載される活性）を調節する薬剤であって不十分なまたは過剰なＴ細胞活性と関連する障害を処置するための治療剤となり得るものを開発するための、標的として用いてもよい。例えば、Ｔ細胞調節活性を有するニューリチンポリペプチドとして、Ｔ細胞調節活性を有する部分配列（subsequence）バリアントおよび配列バリアント（例えば、ニューリチンに対して少なくとも約６５％の同一性を有するポリペプチド）、模倣薬などが挙げられる。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの活性を調節する薬剤（例えば、Ｔ細胞調節活性を有するニューリチンポリペプチド）を同定するための方法を提供し、例えば、薬剤は、細胞においてニューリチンのＴ細胞調節活性を低下させることができる。
【００３８】
本明細書において使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、第一のタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント、またはその機能的フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体のアミノ酸配列、および、非相同タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（すなわち、第一のタンパク質またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体と異なる、第二のタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一態様において、融合タンパク質は、ＩｇＧ分子に融合されたニューリチンを含む。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「組み合わせて」とは、治療について言及する場合、一つより多くの治療（例えば、一つより多くの予防薬および／または治療剤）の使用を指す。用語「組み合わせて」の使用は、治療（例えば、予防薬および／または治療剤）が被験体に施される順序を限定しない。第一の治療（例えば、第一の予防薬または治療剤）を、第二の治療（例えば、第二の予防薬または治療剤）が被験体に施される前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間前）に投与しても、同時に投与しても、または後（５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間後）に投与してもよい。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「選択的に結合する」または「特異的に結合する」とは、本発明によって包含されるタンパク質の文脈において、ペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよび抗体の任意の二つの特異的相互作用を指し、ここで、相互作用は、好ましくは任意の他のペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよび抗体と比較して、好ましくはペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよび抗体の任意の二つの間で起こる。例えば、二つの分子がタンパク質分子である場合、第一の分子上の構造は、他のタンパク質よりもむしろ第二の分子上の構造を認識して結合する。「選択的結合」とは、この用語が本明細書において使用される場合、分子が、その特異的結合パートナーに、非特異的分子に結合するよりも少なくとも２倍高いアフィニティー、好ましくは、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または１００倍より高いアフィニティーで、結合することを意味する。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「被験体」および「患者」および「個体」は、互いに交換可能に使用され、動物（例えば、哺乳動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類および昆虫）を指す。特定の態様において、被験体は哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物およびヒト）である。別の態様において、被験体は愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、サルおよびトリ）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギおよびニワトリ）または実験動物（例えば、マウスおよびラット）である。別の態様において、被験体は霊長類（例えば、チンパンジーおよびヒト）である。別の態様において、被験体はヒトである。
【００４２】
本明細書において、用語「治療剤（therapeutic agent）」および「治療剤（therapeutic agents）」とは、疾患もしくは状態またはその一つ以上の症状の処置、管理、または寛解において用いることができる任意の化合物を指す。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」とは、疾患もしくは状態またはその一つ以上の症状の寛解をもたらすか、疾患もしくは症状の進行を予防するか、疾患もしくは状態の退行を引き起こすか、または別の治療（例えば治療剤）の治療効果を増強もしくは改善するために十分な、治療（例えば治療剤）の量を指す。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」とは、本発明の方法によって同定される一つ以上の化合物、または本発明の方法によって同定される一つ以上の化合物と別の治療との組合せの投与に起因する、疾患もしくは状態またはその一つ以上の症状の進行、重篤度、および／または再発の低減または寛解を指す。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「癌」、「過剰増殖性」および「新生物性」とは、自己増殖の能力を有する細胞、すなわち、急速に増殖する細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態（state）または状態（condition）を指す。過剰増殖性および新生物性の疾患の状態は、病態的に、すなわち、疾患状態を特徴付けるかもしくは構成するものとして分類しても、または非病態的に、すなわち、正常から逸脱するが疾患状態と関連しないものとして分類してもよい。この用語は、病理組織学的な型または侵襲性の状態に関係なく、全ての型の癌性増殖または発癌過程、転移組織または悪性に形質転換された細胞、組織、もしくは器官を包含することを意図される。用語「癌」または「新生物」は、種々の器官系の悪性腫瘍、例えば肺、胸部、甲状腺、リンパ系、胃腸管および泌尿生殖管を冒すこと、ならびに腺癌を含み、腺癌は、殆どの結腸癌、腎細胞腺癌、前立腺癌、および／または精巣癌、肺の非小細胞腺癌、小腸の癌および食道の癌などの悪性腫瘍を含む。
【００４６】
造血性新生物性障害は、造血性の起源を有する（例えば、骨髄球、リンパ球、または赤血球の系統、またはそれらの前駆細胞から生じる）過形成性／新生物性細胞と関連する疾患を含む。代表的には、疾患は、殆ど分化していない急性白血病、例えば、血芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。さらなる例示的な骨髄球性障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：急性前骨髄球性白血病（ＡＭＰＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Vaickus，L.（1991）Crit Rev. in Oncol./Hemotol．11：267-97において概説される）；以下を非限定的に含むリンパ系悪性腫瘍:Ｂ系譜ＡＬＬおよびＴ系譜ＡＬＬを含む急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンストロームマクログロブリン血症（ＷＭ）。さらなる形態の悪性リンパ腫として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病とリード−シュテルンベルク疾患。
【００４７】
用語「自己免疫状態」または「自己免疫疾患」とは、自己抗原として知られる自己によってコードされるものに向けられる不適当な免疫応答によって引き起こされる疾患状態を意味する。自己免疫疾患として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、関節リウマチ、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性網膜ブドウ膜炎、糸球体腎炎、ギラン−バレー症候群、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性脳脊髄炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、腫瘍随伴性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合性結合組織疾患、悪性貧血、多発性筋炎、特発性アジソン病、自己免疫疾患関連不妊症、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、特発性粘液水腫、大腸炎、および神経保護。
【００４８】
特定の態様において、かかる本発明の方法の投薬レジメンは、皮下投与を含む。別の態様において、本発明の方法によって処置することが可能な疾患は、以下から選択される：アレルギー、喘息、湿疹、枯草熱、ＨＶＧＤまたはＧＶＨＤ、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）。特定の態様において、かかる方法の投薬レジメンは、皮下投与または経皮投与を含む。一つの特定の態様において、このような自己免疫疾患は、多発性硬化症である。なおさらなる特定の態様において、多発性硬化症は、再発寛解型多発性硬化症である。別の態様において、自己免疫状態は、臓器移植の後の臓器の拒絶である。
【００４９】
用語「障害」および「疾患」および「状態」は、包括的に用いられ、身体のあらゆる部分、器官または系（またはそれらのあらゆる組合せ）の正常な構造または機能からのあらゆる逸脱を指す。具体的な疾患は、生物学的、化学的、および生理学的変化を含む特徴的な症状および徴候によって示され、しばしば、以下を含むがこれらに限定されない多様な他の要因と関連する：人口学的要因、環境的要因、雇用要因、遺伝子的要因、および病歴的要因。特定の特徴的な徴候、症状、および関連する要因は、重要な診断情報を得るために、多様な方法によって定量することができる。
【００５０】
siRNAは、相同な二本鎖RNAであって、遺伝子の産物を特異的にターゲッティングし、ヌルまたは低形質の表現型をもたらす。例えばCD4+Ｔ細胞においてニューリチン発現を阻害するためのRNA干渉（RNAi）の使用を、本明細書において記載する。RNAiは、mRNAの酵素による切断および分解をもたらす細胞プロセスであり、配列特異的二本鎖低分子干渉RNA（siRNA）によって誘導される（Dykxhoorn，D．M．et al.；Nat Rev MoI Cell Biol 2003；4：457-467）。siRNAによる細胞のトランスフェクションは、RNA誘導サイレンシング複合体と称される、細胞質に位置するリボ核タンパク質複合体を生じる。siRNA鎖の１本を放出することによるこの複合体の活性化（Khvorova，A.，et al.；Cell 2003；115：209-216；Schwarz，D．S.，et al.；Cell 2003；115：199- 208）の際に、残りの鎖は、RISCを相補的RNA配列にターゲッティングして、RISCの構成要素であるAgo-2による標的RNAのヌクレオチド鎖切断をもたらす（Meister，G.，et al.；MoI Cell 2004；15：185-197；Rand，T．A.，et al.；Proc Natl Acad Sci USA 2004；101： 14385-14389；Song，J．J.，et al.；Science 2004；305：1434-1437）。
【００５１】
外因性に添加される合成siRNAは、遺伝子発現をサイレンシングするための非常に強力で配列特異的な因子として作用することが示され（Elbashir，S．M.，et al.；Nature 2001；411：494-498）、このことは、遺伝子機能の分析のためのみならず、遺伝子特異的治療のアプローチのためにも大きな可能性を示した（Cheng，J．C，Moore，T．B.およびSakamoto，K．M.；MoI Genet Metab 2003；80： 121-128；Heidenreich，O．Curr Pharm Biotechnol 2004；5：349-354）。本明細書において記載されるのは、CD4陽性Ｔ細胞などの免疫細胞においてニューリチン遺伝子発現を特異的に阻害するRNAiである。遺伝子発現はまた、自らを折り畳んで必要な二本鎖部分を生じる低分子ヘアピン型RNA（shRNA）分子の使用によっても制御することができる（例えば、Yu et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 99：6047（2002)を参照のこと）。
【００５２】
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、天然のソースから単離されても、合成であっても、または組み換え生成されたポリペプチドであってもよい。ペプチドおよびタンパク質を、インビトロおよびインビボで組み換え発現してもよい。本発明のペプチドおよびポリペプチドを、当該分野において公知のあらゆる方法を用いて生成して単離することができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、当該分野において周知の化学的方法を用いて、完全にまたは部分的に合成してもよい。例えば、Caruthers（1980）Nucleic Acids Res．Symp．Ser．215-223；Horn（1980）Nucleic Acids Res．Symp．Ser．225−232；Banga，A．K.，Therapeutic Peptides and Proteins，Formulation，Processing and Delivery Systems（1995）Technomic Publishing Co.，Lancaster，Pa.を参照のこと。例えば、ペプチド合成は、多様な固相技術（例えば、Roberge（1995）Science 269：202；Merrifield（1997）Methods Enzymol．289：3-13を参照のこと）を用いて行ってもよく、例えば、ABI 43 IA Peptide Synthesizer（Perkin Elmer）を用いて自動合成を達成してもよい。当業者は、個々の合成残基およびポリペプチド組み込み模倣薬（polypeptides incorporating mimetics）は、多様な手順および方法を用いて合成できることを理解する。かかる手順および方法は、科学文献および特許文献、例えば、Organic Syntheses Collective Volumes，Gilman，et al.（Eds）John Wiley＆Sons，Inc.，NYにおいてよく記載されている。
【００５３】
ポリペプチド組み込み模倣薬はまた、Di Marchi，et al．，米国特許第5,422,426号によって記載されるような固相合成法を用いて作製することができる。本発明のペプチドおよびペプチド模倣薬はまた、コンビナトリアル方法を用いて合成することができる。ペプチドおよびペプチド模倣薬のライブラリーの作製のための多様な技術は周知であり、例えば、マルチピン法、ティーバッグ法、スプリット−カップル−ミックス（split-couple-mix）法が挙げられる；例えば、al-Obeidi（1998）MoI．Biotechnol．9：205-223；Hruby（1997）Curr．Opin．Chem．Biol．1：114−119；Ostergaard（1997）MoI．Divers．3：17-27；Ostresh（1996）Methods Enzymol．267：220−234を参照のこと。本発明の修飾ペプチドはさらに、化学修飾法によって生成することができる。例えば、Belousov（1997）Nucleic Acids Res．25：3440-3444；Frenkel（1995）Free Radic．Biol．Med．19：373-380；Blommers（1994）Biochemistry 33：7886-7896を参照のこと。本明細書において使用される場合、「〜によってコードされるポリペプチド配列」とは、本明細書において定義されるように、遺伝子のタンパク質コード領域の翻訳の後で得られるアミノ酸配列を指す。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「核酸（単数または複数）」は、用語「ポリヌクレオチド（単数または複数）」と交換可能であり、一般に、任意のポリヌクレオチドまたはポリ−デオキシリボ核酸を指し、これは、非修飾RNAもしくはDNA、または修飾RNAもしくはDNA、またはこれらの任意の組合せであってよい。「核酸」として、限定することなく、一本鎖または二本鎖核酸が挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「核酸（単数または複数）」はまた、一つ以上の修飾された塩基を含む上記のDNAまたはRNAを包含する。したがって、安定性のためまたは他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAは、「核酸」である。用語「核酸」は、本明細書において使用される場合、化学によって、酵素によって、または代謝によって修飾された形態のかかる核酸、ならびに、ウイルスおよび例えば単純または複雑な細胞を含む細胞の特徴であるDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。「核酸」または「核酸配列」はまた、一本鎖もしくは二本鎖DNAもしくはRNAまたは任意のこれらの組合せの領域を包含する。
【００５５】
用語「配列同一性」または「配列相同性」のパーセントとは、２以上の核酸またはポリペプチドの配列の文脈において、比較ウィンドウにわたって最大の一致について比較されてアラインメントされた場合に、特定のパーセンテージの同じヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を有する配列またはその部分配列を指す。同一性のパーセントは、手動のアラインメントおよび目視検査によって、または本明細書において記載されるように配列比較アルゴリズムを用いて測定することができる。この定義はまた、配列の相補物（アンチセンス鎖）を指す。例えば、多様な態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号２に示す例示的配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、および少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有するものを含む。ポリペプチドの部分配列もまた包含される。さらなる態様において、部分配列は、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１２５、１５０または２００アミノ酸長、またはそれより多いアミノ酸長（例えば、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０など）である。したがって、配列番号２に対して必要な配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその部分配列もまた、本発明のポリペプチドである。多様なさらなる態様において、部分配列を含むポリペプチドは、ニューリチンのものなどの配列の一つ以上の活性を有する。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「核酸プローブ」は、相補的塩基対相互作用を含む数種の非共有結合的相互作用を介してアレイ上の核酸メンバーの相補配列に結合することができる核酸を含む。本明細書において使用される場合、核酸プローブは、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、もしくはＴ）または改変された塩基（７−デアザグアノシン（deazaguanosine）、イノシンなど）を含んでもよい。さらに、核酸プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない（すなわち、核酸プローブが、標準的なストリンジェント条件または選択的ハイブリダイゼーション条件下において、その相補配列になお特異的に結合する）限り、ホスホジエステル結合以外の架橋によって結合されていてもよい。したがって、核酸プローブは、構成する塩基がホスホジエステル架橋ではなくペプチド結合によって結合される、ペプチド核酸であってもよい。
【００５７】
用語「プライマー」は、本明細書において使用される場合、オリゴヌクレオチドを指し、制限酵素による消化物中のものとして天然に存在するものであっても、合成で生成されるものであってもよいが、プライマー伸長産物（これは核酸鎖に対して相補的である）の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導因子の存在下であって好適な温度およびｐＨにおかれた場合に、合成の開始点として作用することができる。プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよく、誘導因子の存在下において所望の伸長産物の合成をプライミングするために十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーのソース、および使用される方法を含む多くの要因に依存し得る。例えば、診断用途については、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、代表的には１５〜２５またはこれより多いヌクレオチドを含むが、より少しまたはより多くのヌクレオチドを含んでもよい。
【００５８】
プライマーの適当な長さを決定する上で関与する要因を、当業者は容易に知ることができる。一般に、本発明によって実施されるプライマーの設計および選択は、当該分野において標準的かつ周知の方法に従う。以下を参照のこと：Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.（1995）General Concepts for PCR Primer Design．In：PCR Primer，A Laboratory Manual（Eds．Dieffenbach，CW，and Dveksler，G.S.）Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，133-155；Innis，M.A.およびGelfand，D.H.（1990）Optimization of PCRs．In：PCR protocols，A Guide to Methods and Applications（Innis，M.A.、Gelfand，D.H.、Sninsky，J.J.、およびWhite，TJ.編）Academic Press，San Diego，3-12；Sharrocks，A.D.（1994）The design of primers for PCR．In：PCR Technology，Current Innovations（Griffin，H.G.およびGriffin，A.M，編）CRC Press，London，5-11。
【００５９】
調節性Ｔ細胞（Treg）は、今や、多数の系において記載され、自己寛容の維持および自己免疫疾患からの保護のための主要な機構として明らかとなってきている。殆どの系においてCD4+/CD25+として特徴付けられるTreg細胞は、胸腺から発生し得る（いわゆる「ナチュラルTreg」）か、または成熟Ｔ細胞から末梢耐性誘導の条件下において分化し得る（いわゆる「誘導Ｔ細胞」）。多数のケースにおいて、Treg細胞は、確立された癌に対する治療的腫瘍ワクチンの効力を制限することが示されている。Treg細胞は、樹状細胞（DC）などのプロフェッショナルな抗原提示細胞を介して、その機能を発揮することができる。樹状細胞（DC）は、抗原を処理してナイーブＴリンパ球に提示する、免疫系における少数の細胞であり、宿主免疫応答を開始する上で重要な役割を果たしている。DCはまた、耐性を維持する上で重要な役割を果たす。インビボでのTregの治療的操作は、Treg特異的受容体の同定を必要とする。
【００６０】
ニューリチン（配列番号１および２）は、元々1997年に神経系においてクローニングされた。免疫系における機能および発現は記載されていない。本発明者らは、ニューリチンの特有の調節された発現パターンを、ナチュラル調節性Ｔ細胞およびアネルギー性Ｔ細胞の両方において同定した。過剰発現動物モデルを用いて、本発明者らは、ニューリチンが調節性Ｔ細胞の恒常性を抗原依存的な様式において制御することを実証した。さらに、可溶性ニューリチン−Ｉｇ融合タンパク質は、Treg細胞に対するその効果を調節することができる。これらの知見から、本明細書において記載するように、多様な疾患の設定において、抗原特異的調節性Ｔ細胞を操作するための治療剤としてのニューリチンの適用が可能となる。
【００６１】
個体における自己免疫疾患は、ニューリチンの免疫調節活性のアンタゴニストを投与することによって処置することができる。理論に拘束されないが、ニューリチンのアンタゴニストは、抗原特異的Treg細胞の持続性を延長する。例示的なニューリチンアンタゴニストとして、ニューリチンに特異的に結合してニューリチンの免疫調節機能を阻害するアンタゴニスト抗体、ニューリチン遮断抗体、ＲＮＡアプタマー、ならびにアンタゴニストペプチド、薬物および分子が挙げられる。
【００６２】
個体における癌の処置は、可溶性ニューリチン融合タンパク質などの可溶性ニューリチンを投与することによって達成することができる。理論に拘束されないが、投与された可溶性ニューリチン融合タンパク質のは、腫瘍抗原特異的Treg細胞およびアネルギー化Ｔ細胞を排除する。可溶性ニューリチンと腫瘍ワクチンとの共投与を用いて、腫瘍抗原特異的調節性Ｔ細胞を排除することによって、腫瘍ワクチン免疫応答を追加免疫することができる。
【００６３】
個体における慢性ウイルス感染などの慢性感染は、感染性因子についてのワクチンを受けている患者に可溶性ニューリチンを投与することによって処置することができる。あるいは、慢性感染は、可溶性ニューリチン−Ｉｇ融合タンパク質を単に投与して抗原特異的Treg細胞を排除し、それによって病原に対する免疫応答を追加免疫することによって、処置することができる。
【００６４】
移植片対宿主病は、Treg細胞の損失を予防するためにニューリチンアンタゴニストを投与することによって処置することができる。ニューリチンアンタゴニストを投与することはまた、移植を受ける宿主における移植片の拒絶を低減するためにも用いることができる。ニューリチン遮断抗体を投与することによって、骨髄移植後のリンパ球生着を増強することができる。
アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞などの炎症状態は、ニューリチンアンタゴニストを投与することによって処置することができる。
【００６５】
免疫治療製品として、以下が挙げられる：ニューリチンに特異的に結合して抗原特異的Ｔ細胞をインビボで延長させる抗体、抗原特異的調節性Ｔ細胞を排除するマウスおよびヒトのニューリチン−Ｉｇキメラ分子、Treg細胞の恒常性に影響を及ぼすマウスおよびヒトのニューリチンに対するアゴニストペプチドおよびアンタゴニストペプチド、Treg細胞の恒常性に影響を及ぼすマウスおよびヒトのニューリチンに対するＲＮＡアプタマー、ならびに免疫応答に影響を及ぼすためにニューリチンをＴ細胞に導入するためのレトロウイルス、アデノウイルスまたは他のウイルスベクター。また、Treg細胞の恒常性に影響を及ぼすマウスおよびヒトのニューリチンシグナリングに影響を及ぼすアゴニストおよびアンタゴニスト薬物についてスクリーニングする方法、ならびに薬物自体も包含される。
【００６６】
したがって、本発明は、キメラまたは融合タンパク質を提供する。これらは、ニューリチンに対して実質的に相同でないアミノ酸配列を有する非相同ペプチドに作動的に結合したニューリチンペプチド配列を含む。「作動的に結合した」とは、ニューリチンペプチドと非相同ペプチドとがインフレーム（in-frame）で融合していることを示す。非相同ペプチドは、ニューリチンのＮ末端またはＣ末端に融合させても、内部に位置させてもよい。
【００６７】
一態様において、融合タンパク質は、ニューリチンの機能自体には影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質は、ニューリチン配列がGST配列のＣ末端に融合されるGST融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質の一つの型として、酵素性融合タンパク質、例えば、βガラクトシダーゼ融合、酵母ツーハイブリッドGALA融合物、ポリ−His融合物およびＩｇ融合物が挙げられるが、これらに限定されない。かかる融合タンパク質、特にポリ−His融合物は、組み換えニューリチンの精製を容易にすることができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、タンパク質の発現および／または分泌は、非相同シグナル配列を用いて増加させることができる。したがって、別の態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端に非相同シグナル配列を含む。
【００６８】
EP-A-O 464 533は、免疫グロブリン定常領域の多様な部分を含む融合タンパク質を開示する。Fcは、治療および診断において有用であり、したがって、例えば、薬物動態特性の改善をもたらす（EP-A 0232262）。薬物送達において、例えば、アンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイを目的として、ヒトタンパク質をFc部分と融合させた（Bennett et al.（1995）J．MoI．Recog．8：52-58（1995）およびJohanson et al．J．Biol．Chem．270：9459-9471）。したがって、本発明はまた、ニューリチンポリペプチドと多様なサブクラスの免疫グロブリン（IgG、IgM、IgA、IgE）の重鎖または軽鎖の定常領域の多様な部分とを含む、可溶性融合タンパク質を包含する。免疫グロブリンとして好ましいものは、ヒトIgGの重鎖の定常部位、特に、融合がヒンジ領域で行われるIgG１である。一部の用途について、例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として用いられる場合、融合タンパク質がその意図された目的のために用いられた後で、Fcを取り除くことが望ましい。特定の態様において、Fc部位を簡単な方法で、また組み込んだ開裂配列によって取り除くことができる。開裂配列は、因子Ｘａにより切断することができる。
【００６９】
キメラまたは融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって作製することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡフラグメントを、標準的な技術にしたがってインフレームでライゲーションする。別の態様において、自動ＤＮＡ合成機を含む標準的な技術によって、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、アンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行ってもよい。アンカープライマーは、二つの連続した遺伝子フラグメントの間で相補的な突出部を生じ、これらをその後アニーリングして再増幅し、キメラ遺伝子配列を作成することができる（Ausubel et al.（1992）Current Protocols in Molecular Biologyを参照のこと）。さらに、既に融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）をコードしている多数の発現ベクターが市販されている。ニューリチンをコードする核酸を、融合部分がインフレームでニューリチンに結合するように、かかる発現ベクターにクローニングすることができる。
【００７０】
単離されたニューリチンタンパク質は、それを天然に発現する細胞から、例えば本明細書において記載される細胞のいずれか、特に、それを発現するように改変された細胞（組み換え体）から精製しても、または公知のタンパク質合成方法を用いて合成してもよい。
【００７１】
一態様において、タンパク質は組み換えＤＮＡ技術によって生成される。例えば、ニューリチンポリペプチドをコードする核酸分子またはそのフラグメントを、発現ベクターにクローニングし、発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主においてタンパク質を発現させる。タンパク質は、次いで、標準的なタンパク質精製技術を用いる適当な精製スキームによって細胞から単離することができる。ポリペプチドは、しばしば、２０個の天然に存在するアミノ酸として一般に言及される２０アミノ酸以外のアミノ酸を含む。さらに、末端のアミノ酸を含む多数のアミノ酸は、プロセッシングまたは他の翻訳後修飾などの天然のプロセスによって、または、当該分野において周知の化学修飾技術によって修飾され得る。ポリペプチドにおいて天然に起こる一般的な修飾は、基礎的な教科書、詳細な研究論文、および研究文献において記載され、当業者に周知である。
【００７２】
したがって、ポリペプチドはまた、誘導体またはアナログを含み、これらにおいては、置換アミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされたものでないか、置換基が含まれているか、成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を延長するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物と融合しているか、あるいは、リーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製のための配列などの付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合している。
【００７３】
公知の修飾として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質分解によるプロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡ媒介性のタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化。
【００７４】
かかる修飾は、当業者に周知であり、科学文献において詳細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えば、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰ−リボシル化は、殆どの基礎的な教科書、例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties，2nd ed.，T.E．Creighton，W．H．Freeman and Company，New York（1993）において記載されている。この主題について多くの詳細な概説が入手可能であり、例えば、Wold，F.，Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B．C．Johnson，Ed.，Academic Press，New York 1-12（1983)；Seifter et al.（1990）Meth．Enzymol．182：626-646）およびRattan et al.（1992）Ann．N.Y Acad．Sci．663：48-62)によるものなどがある。
【００７５】
周知のことであるが、ポリペプチドは、常に完全に直鎖状であるわけではない。例えば、ポリペプチドは、翻訳後のイベントの結果として、環状であっても、分枝を有していても有していなくてもよい。かかるイベントとして、一般的に、天然のプロセッシングのイベント、および人為的操作によってもたらされた天然には起こらないイベントが挙げられる。環状、分枝状、および分枝環状のポリペプチドは、翻訳以外の天然のプロセッシングによって合成されても、合成方法によって合成されてもよい。
【００７６】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントのどこで起こってもよい。共有結合性修飾によるポリペプチドにおけるアミノ基もしくはカルボキシル基または両方の遮断は、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドにおいて一般的である。例えば、E.coliにおいて生成されるポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解プロセッシングの前に、殆ど常にＮ−ホルミルメチオニンとなる。
【００７７】
修飾は、タンパク質が生成される方法の関数であり得る。例えば、組み換えポリペプチドについては、修飾は、宿主細胞の翻訳後修飾能力、およびポリペプチドのアミノ酸配列における修飾シグナルによって決定される。したがって、グリコシル化が所望の場合、ポリペプチドは、グリコシル化宿主、一般的には真核細胞において発現されるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化を行う。このため、昆虫細胞発現系が、ネイティブのグリコシル化のパターンを有する哺乳動物のタンパク質を効率的に発現するように開発されてきた。同様の考察が他の修飾にも適用される。
同じ型の修飾が、所与のポリペプチドにおいて、いくつかの部位で同じまたは異なる程度で存在してもよい。また、所与のポリペプチドは、一つより多い型の修飾を含んでもよい。
【００７８】
ニューリチンポリペプチドは、ニューリチン、領域、またはフラグメントについて特異的な抗体を生成するために有用である。当業者は、通常の方法およびソフトウェアを用いて、高い抗原性インデックススコアを有する領域を決定することができる。
ニューリチンポリペプチドは、ニューリチンに関連する生物学的アッセイのために有用である。かかるアッセイは、本明細書において同定されるもののようなニューリチンに関連する状態の診断および処置のために有用な、任意の公知のニューリチンの機能または活性または特性に関与する。
【００７９】
ニューリチンポリペプチドはまた、細胞をベースとする系または細胞を用いない（cell-free）系における薬物スクリーニングアッセイにおいて有用である。細胞をベースとする系は、生検または細胞培養中で増殖させたものとして、ネイティブ、すなわちニューリチンを通常発現する細胞であってもよい。しかし、一態様においては、細胞をベースとするアッセイは、ニューリチンを発現する組み換え宿主細胞を要する。
【００８０】
試験化合物のニューリチンと相互作用する能力を決定することはまた、ポリペプチドに結合する公知の結合分子の能力と比較した場合に、試験化合物が優先的にポリペプチドに結合する能力を決定することを含んでもよい。
【００８１】
ポリペプチドは、ニューリチンの活性を調節する化合物を同定するために用いることができる。かかる化合物は、例えば、ペプチド基質への結合のアフィニティーまたは速度を増大または低下させるか、ニューリチンに結合することについてペプチド基質と競合するか、またはニューリチンに結合したペプチド基質を取り外すことができる。ニューリチンおよび適当なバリアントおよびフラグメントは、ニューリチンに結合する能力について候補化合物をアッセイするための、ハイスループットスクリーンにおいて用いることができる。これらの化合物を、化合物のニューリチン活性に対する効果を決定するために、機能的ニューリチンに対してさらにスクリーニングしてもよい。所望の程度までニューリチンを活性化する化合物（アゴニスト）または不活化する化合物（アンタゴニスト）を同定することができる。インビトロで（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによって）、または代替的にインビボで（例えば、被験体に薬剤を投与することによって）、調節的な方法を行ってもよい。
【００８２】
ニューリチンポリペプチドは、ニューリチンタンパク質と、通常ニューリチンタンパク質と相互作用する標的分子との間の、相互作用を刺激または阻害する能力について、化合物をスクリーニングするために用いてもよい。アッセイは、ニューリチンタンパク質またはフラグメントが標的分子と相互作用することができ、ニューリチンタンパク質と標的との間の複合体の形成を検出できるか、またはニューリチンと標的との相互作用の生化学的結果を検出できる条件下において、ニューリチンタンパク質と候補化合物とを組み合わせる工程を含む。
【００８３】
ニューリチンが標的分子に結合する能力を決定することはまた、リアルタイムBimolecular Interaction Analysis（BIA）などの技術を用いて達成することができる。Sjolander et al.（1991）Anal．Chem．63：2338-2345およびSzabo et al（1995）Curr．Opin．Struct．Biol．5：699-705。本明細書において使用される場合、「BIA」は、生物特異的相互作用を、相互作用体のいずれをも標識することなく、リアルタイムで研究するための技術である（例えば、BIAcore.TM.）。光学現象表面プラズモン共鳴（SPR）の変化を、生物学的分子間のリアルタイム相互作用の指標として用いてもよい。
【００８４】
本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれを用いて得てもよい。かかる方法として以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳積分を要する合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーのアプローチは、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ポリペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは低分子化合物のライブラリーに適用することができる（Lam，K．S.（1997）Anticancer Drug Des．12：145）。
【００８５】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば、DeWitt et al.（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：6909；Erb et al.（1994）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：11422；Zuckermann et al.（1994)．J．Med．Chem．37：2678；Cho et al.（1993）Science 261：1303；Carell et al.（1994）Angew．Chem．Int．Ed．Engl．33：2059；Carell et al.（1994）Angew．Chem．Int．Ed．Engl．33：2061；および Gallop et al.（1994）J．Med．Chem．37：1233において見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten（1992）Biotechniques 13：412-421)）か、ビーズ上(Lam（1991）Nature 354：82-84)、チップ(Fodor（1993）Nature 364：555-556)、細菌(Ladner、米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner、米国特許第'409号)、プラスミド(Cull et al.（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89：1865−1869)、またはファージ上(Scott and Smith（1990）Science 249：386-390)；(Devlin（1990）Science 249：404-406)；(Cwirla et al.（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．97：6378-6382)；(Felici（1991）J．MoI．Biol．222：301-310上に提示することができる。
【００８６】
候補化合物として、例えば、１）可溶性ペプチドなどのペプチド（Ｉｇのテールを有する融合ペプチド、およびランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Lam et al.（1991）Nature 354：82-84；Houghten et al.（1991）Nature 354：84-86を参照のこと）、ならびにコンビナトリアルケミストリーによって誘導される分子ライブラリーであってＤ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸から作られるものを含む）；２）リンペプチド（例えば、ランダムおよび部分的に分解、指向されたリンペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Songyang et al.（1993）Cell 72：767-778を参照）；３）抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および一本鎖抗体、ならびにFab、F(ab').sub.2、Fab発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合フラグメント）；ならびに４）低分子の有機および無機分子（例えば、コンビナトリアルおよび天然の生成物のライブラリーから得られる分子）。
【００８７】
一候補化合物は、ペプチド結合について競合する可溶性の全長ニューリチンまたはフラグメントである。他の候補化合物として、変異体ニューリチン、またはニューリチンの機能に影響を及ぼしペプチド基質について競合する変異体を含む適当なフラグメントが挙げられる。したがって、基質について競合するフラグメント、例えば、高いアフィニティーを有するもの、または基質に結合するがそれを分解しないフラグメントが、本発明によって包含される。
【００８８】
本発明は、ニューリチンの活性を調節（刺激または阻害）する化合物を同定するための他のエンドポイントを提供する。アッセイは、代表的には、ニューリチンの活性を示す細胞イベントのアッセイを含む。したがって、ニューリチンの活性に対する応答において上方調節または下方調節された遺伝子の発現をアッセイしてもよい。一態様において、かかる遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼなどの容易に検出可能なマーカーに作動的に結合されていてもよい。あるいは、ニューリチンの修飾を測定してもよい。
【００８９】
ニューリチンによって媒介される生物学的または生化学的機能のいずれをエンドポイントアッセイとして用いてもよい。これらは、本明細書において記載される、本明細書において参考文献として記載される、これらのエンドポイントアッセイ標的について参考として援用される、生化学的または生化学的／生物学的イベントの全て、および当業者に公知の他の機能を包含する。
【００９０】
結合および／または活性化する化合物もまた、一つ以上の領域、セグメント、部位などが本明細書において記載されるものであるキメラニューリチンタンパク質を用いて、スクリーニングすることができる。例えば、ネイティブのニューリチンと異なるペプチド配列特異性および／またはアフィニティーで相互作用する触媒領域を用いてもよい。したがって、異なるセットの成分が、活性化についてのエンドポイントアッセイとして利用可能である。さらなる代替として、エフェクタータンパク質による修飾、例えばリン酸化の部位を、異なるエフェクタータンパク質についての部位で置換することができる。活性化はまた、ニューリチンが関与するネイティブの経路の一部である転写調節配列に作動的に結合された、容易に検出可能なコード領域を含むレポーター遺伝子によって、検出することができる。
【００９１】
本発明はまた、ニューリチンならびにそのバリアントおよびフラグメントに選択的に結合する抗体を提供する。抗体は、ニューリチンと実質的に相同でない他のタンパク質にもまた結合する場合であっても、選択的に結合すると考えられる。これらの他のタンパク質は、ニューリチンのフラグメントまたはドメインと相同性を共有する。この特異的領域における保存は、相同配列の効果により、両方のタンパク質に結合する抗体を生じる。この場合、ニューリチンに結合する抗体はなお選択的であると理解する。
抗体を作製するために、単離されたニューリチンポリペプチドを免疫原として用い、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて抗体を作製する。全長タンパク質または抗原性ペプチドフラグメントのいずれを用いてもよい。
【００９２】
抗体は、好ましくは、これらの領域から、またはこれらの領域における分散したフラグメントから調製する。しかし、抗体は、本明細書において記載されるペプチドの任意の領域から調製することができる。好ましいフラグメントは、ペプチドの加水分解または結合を低下させるかまたは完全に妨げる抗体を生じる。抗体は、全ニューリチンに対して作製しても、本明細書において記載されるニューリチンのドメインに対して作製してもよい。抗原ペプチドは、少なくとも１２、１４、１５、または３０アミノ酸残基の近接する配列を含んでもよい。一態様において、フラグメントは、タンパク質の表面上に位置された領域、例えば、親水性領域に対応する。しかし、これらのフラグメントは、本発明の前に開示されている可能性があるいずれかのフラグメントを包含するものとして解釈されるべきではない。
抗体は、ポリペプチドであってもモノクローナルであってもよい。完全抗体を用いても、またはそのフラグメント（例えば、FabまたはF(ab')、sub.2）を用いてもよい。
【００９３】
検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に結合させる）ことによって容易にすることができる。検出可能な物質の例として、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が挙げられる。好適な酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジンビオチンが挙げられる；好適な蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアン酸、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが挙げられる；発光物質の例として、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。
適当な免疫原性調製物は、ネイティブのペプチド、組み換え発現ペプチド、または化学合成されたペプチドに由来してもよい。
【００９４】
抗体は、疾患の活性段階において、またはニューリチンの機能に関する疾病素因を有する個体においてなどの、疾患状態におけるニューリチン発現を評価するために用いてもよい。疾患が、不適当なニューリチンの組織分布、発達における発現、または発現のレベルによって引き起こされる場合、正常なニューリチンタンパク質に対して抗体を調製してもよい。疾患が、ニューリチンにおける特異的な変異によって特徴付けられる場合、この変異について特異的な抗体を使用して特異的な変異ニューリチンの存在についてアッセイすることができる。しかし、細胞内で作製された抗体（「細胞内抗体」）もまた包含され、これは、細胞内ニューリチンペプチド領域を認識する。
【００９５】
抗体はまた、生体中の多様な組織における細胞の正常および異常な細胞内分布を評価するために用いることもできる。全ニューリチンまたはニューリチンの部分に対して抗体を作製してもよい。
診断的用途は、遺伝子試験のみならず、処置のモダリティをモニタリングする上でも適用することができる。したがって、処置が最終的に、ニューリチン発現レベルまたは異常なニューリチンの存在および異常な組織分布もしくは発達上の発現を修正することを目的とする場合、ニューリチンまたは関連するフラグメントに対して指向された抗体を用いて治療効力をモニタリングすることができる。
したがって、抗体を診断的に用いて、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルをモニタリングし、例えば、所与の処置レジメンの効力を決定することができる。
【００９６】
抗体はまた、電気泳動による移動度、等電点、トリプシンペプチド消化物、および当該分野において公知の他の物理学的アッセイによって分析される、異常なニューリチンについての免疫学的マーカーとして、診断ツールとして有用である。
抗体はまた、組織のタイピングのために有用である。したがって、特定のニューリチンが特定の組織における発現と関連付けられた場合、このニューリチンに特異的な抗体を、組織の型を同定するために用いることができる。
抗体はまた、ニューリチン機能を阻害するために有用である。
これらの用途はまた、処置がニューリチンの機能を阻害することを要する治療の文脈においても適用することができる。抗体を、例えば、ペプチド結合を遮断するために用いることができる。抗体を、機能のために必要な部位を含む特定のフラグメントに対して、または細胞に関連する完全なニューリチンに対して調製してもよい。
【００９７】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Lonberg et al.（1995）Int．Rev．Immunol．13：65-93を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術ならびにかかる抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、米国特許第5,625,126号；米国特許第5,633,425号；米国特許第5,569,825号；米国特許第5,661,016号；および米国特許第5,545,806号を参照のこと。
【００９８】
本発明はまた、抗体を用いて生物学的サンプル中のニューリチンタンパク質の存在を検出するためのキットを包含する。キットは、標識されているかまたは標識可能な抗体などの抗体、および生物学的サンプル中のニューリチンを検出するための化合物または薬剤；サンプル中のニューリチンの量を検出するための手段；ならびにサンプル中のニューリチンの量を標準物質と比較するための手段を含む。化合物または薬剤は、好適な容器中にパッケージされていてもよい。キットは、ニューリチンを検出するためにキットを用いるための説明書をさらに含んでもよい。
【００９９】
本発明はまた、ニューリチンポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。用語「ベクター」は、ビヒクル、好ましくはニューリチンポリヌクレオチドを輸送することができる核酸分子を指す。ベクターが核酸分子である場合、ニューリチンポリヌクレオチドは、ベクターの核酸に共有結合されている。本発明のこの局面において、ベクターはプラスミド、一本鎖もしくは二本鎖ファージ、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、またはＤＮＡウイルスベクター、または、BAC、PAC、YACもしくはMACなどの人工染色体を含む。
【０１００】
ベクターは、宿主細胞中で染色体外エレメントとして維持されてもよく、ここで、ベクターが複製してニューリチンポリヌクレオチドのさらなるコピーを産生する。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主細胞が複製するときにニューリチンポリヌクレオチドのさらなるコピーを産生してもよい。
本発明は、ニューリチンポリヌクレオチドの維持のためのベクター（クローニングベクター）または発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核細胞または真核細胞において、または両方において（シャトルベクター）機能することができる。
【０１０１】
発現ベクターは、ポリヌクレオチドの転写が宿主において可能となるように、ベクター中でニューリチンポリヌクレオチドに作動性に結合された、シス作用性調節領域を含む。ポリヌクレオチドを、転写に影響を及ぼすことができる別のポリヌクレオチドと共に、宿主細胞に導入してもよい。したがって、第二のポリヌクレオチドは、シス調節性制御領域と相互作用してベクターからのニューリチンポリヌクレオチドの転写を可能にする、トランス作用性因子を提供してもよい。
【０１０２】
あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞によって供給されてもよい。最後に、トランス作用性因子は、ベクター自体から提供されてもよい。
しかし、一部の態様において、ニューリチンポリヌクレオチドの転写および／または翻訳は、細胞を用いない系において提供されてもよいことが理解される。
本明細書において記載されるポリヌクレオチドが作動的に結合されることができる調節配列として、mRNA転写を指揮するプロモーターが挙げられる。これらは、以下を含むがこれに限定されない：バクテリオファージＤ由来のレフトプロモーター（left promotor）、E.coli由来のlac、TRP、およびTACプロモーター、SV40由来の早期プロモーターおよび後期プロモーター、ＣＭＶ即時早期プロモーター、アデノウイルスの早期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスの末端反復配列。
【０１０３】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位およびエンハンサーなど、転写を調節する領域を含んでもよい。例として、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス即時早期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、およびレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
【０１０４】
転写の開始および制御のための部位を含有することに加えて、発現ベクターはまた、転写終止のために必要な配列を含んでもよく、および、転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでもよい。発現のための他の調節制御エレメントとして、開始コドンおよび終止コドン、ならびにポリアデニル化シグナルが挙げられる。当業者は、発現ベクターにおいて有用である多数の調節配列を知っているであろう。かかる調節配列は、例えば、Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning： A Laboratory Manual 2nd．ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.において記載される。
【０１０５】
ニューリチンポリヌクレオチドを発現するために多様な発現ベクターを用いることができる。かかるベクターとして、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクター、例えば、細菌のプラスミドに由来するベクター、バクテリオファージに由来するベクター、酵母エピソームに由来するベクター、酵母人工染色体を含む酵母染色体エレメントに由来するベクター、バキュウロウイルス、SV40などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクターが挙げられる。ベクターはまた、これらのソースの組合せに由来してもよく、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント、例えば、コスミドおよびファージミドに由来してもよい。原核生物宿主および真核生物宿主のための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning： A Laboratory Manual 2nd．ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y.において記載される。
【０１０６】
調節配列は、一つ以上の宿主細胞において構成的発現をもたらしても（すなわち、組織特異的である）、一つ以上の細胞型において、温度、栄養添加物、またはホルモンもしくは他のリガンドなどの外因性因子などによる誘導性発現をもたらしてもよい。原核生物および真核生物の宿主において構成的発現および誘導性発現をもたらす多様なベクターは、当業者に周知である。
【０１０７】
ニューリチンポリヌクレオチドは、周知の方法によりベクターの核酸に挿入することができる。一般的に、最終的に発現されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベクターを一つ以上の制限酵素で切断して、フラグメントをともにライゲーションすることによって、発現ベクターに結合される。制限酵素消化およびライゲーションのための手順は、当業者に周知である。
【０１０８】
適当なポリヌクレオチドを含むベクターを、周知の技術を用いて、増殖または発現のための適当な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞として、E.coli、ストレプトマイセス属、およびネズミチフス菌が挙げられるがこれらに限定されない。真核細胞として、酵母、ショウジョウバエ属などの昆虫細胞、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞などの動物細胞、ならびに植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０９】
本明細書において記載される場合、ポリペプチドを融合タンパク質として発現することが望ましい場合がある。したがって、本発明は、ニューリチンポリペプチドの産生を可能にする融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組み換えタンパク質の発現を増加し、組み換えタンパク質の可溶性を増加し、および例えばアフィニティー精製のためのリガンドとして作用することによってタンパク質の精製に役立つことができる。タンパク質分解による切断部位は、所望のポリペプチドを最終的に融合部分から分離することができるように、融合部分の接合部で導入することができる。タンパク質分解酵素として、因子Ｘａ、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。代表的な融合発現ベクターとして、pGEX（Smith et al.（1988）Gene 67：31-40）、pMAL（New England Biolabs，Beverly，Mass.）、およびpRIT5（Pharmacia，Piscataway，NJ.）が挙げられ、これらは各々、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、標的組み換えタンパク質に融合させる。好適な誘導性非融合E.coli発現ベクターの例として、pTrc（Amann et al.（1988）Gene 69：301-315）およびpET 1 Id（Studier et al.（1990）Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185：60-89）が挙げられる。
【０１１０】
組み換えタンパク質をタンパク質分解により切断する宿主細胞の能力が損なわれている遺伝子的背景を提供することによって、組み換えタンパク質発現を宿主細菌において最大化することができる（Gottesman，S.（1990）Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif．119-128）。あるいは、目的のポリヌクレオチドの配列を、特定の宿主細胞、例えばE.coliについての優先的コドンの使用をもたらすように変更してもよい。（Wada et al.（1992）Nucleic Acids Res．20：2111-2118）。
【０１１１】
ニューリチンポリヌクレオチドはまた、酵母において作動性の発現ベクターによって発現してもよい。酵母、例えばS.cerevisiaeにおける発現のためのベクターの例として、例えば、pYepSecl（Baldari et al.（1987）EMBO J．6：229-234 ）、pMFa（Kurjan et al.（1982）Cell 30：933-943）、pJRY88（Schultz et al.（1987）Gene 54： 113-123）、およびpYES2（Invitrogen Corporation，San Diego，Calif）が挙げられる。
【０１１２】
ニューリチンポリヌクレオチドはまた、例えば、バキュウロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において発現してもよい。培養昆虫細胞（例えば、Sf 9細胞）におけるタンパク質の発現のために利用可能なバキュウロウイルスベクターとして、pAcシリーズ（Smith et al.（1983）MoI．Cell Biol．3：2156-2165）およびpVLシリーズ（Lucklow et al.（1989）Virology 170：31-39）が挙げられる。
本発明の特定の態様において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例として、pCDM8（Seed，B.（1987）Nature 329：840）およびpMT2PC（Kaufman et al.（1987）EMBO J．6：187-195）が挙げられる。
【０１１３】
本明細書において列記される発現ベクターは、ニューリチンポリヌクレオチドを発現するために有用である、当業者に利用可能な周知のベクターの例としてのみ提供される。当業者は、本明細書において記載されるポリヌクレオチドの維持増殖または発現のために好適な他のベクターを知っているであろう。これらは、例えば、Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y.において見出される。
【０１１４】
本発明はまた、本明細書において記載されるヌクレオチド配列がベクターに逆方向においてクローニングされているがアンチセンスRNAの転写を可能にする調節配列に作動的に結合されているベクターも包含する。したがって、コード領域および非コード領域の両方を含む、本明細書において記載されるポリヌクレオチド配列の全てまたは一部に対するアンチセンス転写物を生成することができる。このアンチセンスRNAの発現は、センスRNAの発現に関する上記のパラメーターの各々（調節配列、構成的発現または誘導性発現、組織特異的発現）に供される。
【０１１５】
本発明はまた、本明細書において記載されるベクターを含む組み換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、したがって、原核細胞、酵母などの下等真核細胞、昆虫などの他の真核細胞、および哺乳動物細胞などの高等真核細胞を含む。
組み換え宿主細胞は、本明細書において記載されるベクター構築物を当業者が容易に入手可能な技術により細胞に導入することによって調製する。これらとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、およびSambrook et al.（Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y.）において見出されるものなどの他の技術。
【０１１６】
宿主細胞は、一つより多くのベクターを含んでもよい。したがって、異なるヌクレオチド配列を、同じ細胞の異なるベクター上に導入してもよい。同様に、ニューリチンポリヌクレオチドを、単独で導入しても、発現ベクターのためのトランス作用性因子を提供するものなどの、ニューリチンポリヌクレオチドと関連しない他のポリヌクレオチドとともに導入してもよい。一つより多くのベクターを細胞に導入する場合、ベクターを独立して導入しても、共導入しても、またはニューリチンポリヌクレオチドベクターと結合させてもよい。
【０１１７】
バクテリオファージおよびウイルスベクターの場合、これらはパッケージされたウイルスまたはカプセル化されたウイルスとして、感染および形質導入のための標準的な方法により、細胞に導入することができる。ウイルスベクターは、複製コンピテントであっても、複製欠損であってもよい。ウイルス複製が欠損している場合、複製は、欠損を補完する機能を提供する宿主において起こる。
【０１１８】
ベクターは、一般的に、組み換えベクター構築物を含有する細胞の亜集団の選択を可能にする選択マーカーを含む。マーカーは、本明細書において記載されるポリヌクレオチドを含有するものと同じベクター中に含有されても、別のベクターにおいて含有されてもよい。マーカーとして、原核生物宿主細胞についてはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子、真核生物宿主細胞についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性が挙げられる。しかし、表現型的特色についての選択を提供するあらゆるマーカーが有効である。
【０１１９】
成熟タンパク質は、細菌、酵母、哺乳動物細胞、および他の細胞において、適切な調節配列の制御下において産生することができるが、一方、細胞を用いない転写系または翻訳系もまた、本明細書において記載されるDNA構築物に由来するRNAを用いて、これらのタンパク質を産生するために用いることができる。
【０１２０】
ポリペプチドの選択を所望する場合、適当な分泌シグナルをベクターに組み込む。シグナル配列は、ニューリチンポリペプチドに対して内因性であっても、これらのポリペプチドに対して異種性であってもよい。
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合、凍結融解、超音波破砕、機械的破壊、分解剤などの使用を含む標準的な破壊手順によって、タンパク質を宿主細胞から単離してもよい。次いで、ポリペプチドを回収して、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィーを含む周知の精製方法により精製してもよい。
【０１２１】
また、本明細書において記載されるポリペプチドの組み換え産生における宿主細胞に依存して、ポリペプチドが多様なグリコシル化のパターンを細胞に依存して有し得るか、または、細菌において産生される場合はグリコシル化されないこともあることが理解される。さらに、ポリペプチドは、一部の場合において宿主によって媒介されるプロセスの結果として開始修飾メチオニン（initial modified methionine）を含んでもよい。
「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」とは、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または子孫となり得るものをも指す。続く世代において変異または環境の影響に起因して特定の改変が起こり得るので、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、なお本明細書において使用される用語の範囲内に含める。
【０１２２】
本明細書において記載されるポリペプチドを発現する宿主細胞、および特に組み換え宿主細胞は、多様な用途を有する。第一に、細胞はニューリチンのタンパク質またはポリペプチドを産生するために有用であり、ニューリチンのタンパク質またはポリペプチドは、所望の量のニューリチンのタンパク質またはフラグメントを提供するためにさらに精製される。したがって、発現ベクターを含む宿主細胞は、ポリペプチド産生のために有用である。
【０１２３】
宿主細胞はまた、ニューリチンまたはニューリチンのフラグメントを必要とする、細胞をベースとするアッセイを行うために有用である。したがって、ネイティブのニューリチンを発現する組み換え宿主細胞は、ニューリチンの機能を刺激または阻害する化合物についてアッセイするために有用である。これは、亜鉛またはペプチド結合、転写または翻訳のレベルでの遺伝子発現、および他の細胞成分との相互作用を含む。
宿主細胞はまた、これらの機能が影響を及ぼされるニューリチン変異体を同定するために有用である。変異体が天然に存在して病態を生じる場合、変異を含む宿主細胞は、変異ニューリチンに対して、ネイティブのニューリチンに対してのそれらの効果によっては示され得ない所望の効果を有する（例えば、機能を刺激または阻害する）化合物をアッセイするために有用である。
組み換え宿主細胞はまた、本明細書において記載されるように、非相同ドメイン、セグメント、部位などにより活性化または活性を抑制する化合物を評価するための、本明細書において記載されるキメラポリペプチドを発現するために有用である。
【０１２４】
さらに、多様な機能の一つ以上が増大または低下するように操作された変異ニューリチンを設計し、個体におけるニューリチンタンパク質を増強または置換するために使用することができる。したがって、宿主細胞は、異常ニューリチンを置換するか、または治療的結果をもたらす異常ニューリチンを提供することによって、治療の利益を提供することができる。一態様において、細胞は、異常に活性なニューリチンを産生する。
【０１２５】
別の態様において、細胞は、異常に不活性なニューリチンを産生する。これらのニューリチンは、個体において、内因性のニューリチンと競合することができる。
別の態様において、活性化することができないニューリチンを発現する細胞を、内因性ニューリチンと亜鉛またはペプチドについて競合させるために個体に導入する。例えば、過剰な亜鉛が治療のモダリティの一部である場合、処置の特定の時点で亜鉛を効果的に不活化することが必要であり得る。分子について競合するが、ニューリチン活性化によって影響を及ぼされ得ない細胞を提供することが有利である。
【０１２６】
また、宿主細胞のゲノムにおける内因性ニューリチンポリヌクレオチド配列のインサイチュでの変更を可能にする、相同的に組み換えられた宿主細胞を提供してもよい。この技術は、WO 93/09222、WO 91/12650および米国特許第5,641,670号においてより完全に記載される。簡単に述べると、ニューリチンポリヌクレオチドに対応する特定のポリヌクレオチド配列、またはニューリチン遺伝子に対して近位もしくは遠位にある配列を、遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる相同的組み換えによって、宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。一態様において、内因性配列の発現を増加または低下させる調節配列を導入する。したがって、通常ニューリチンタンパク質を発現しない細胞においてニューリチンタンパク質を産生させても、または、通常特定のレベルでそのタンパク質を発現する細胞においてニューリチンタンパク質の発現の増加をもたらしてもよい。あるいは、遺伝子の全体を欠失させてもよい。なおさらに、特定の変異を遺伝子の任意の所望の領域に導入して、変異ニューリチンタンパク質を産生させてもよい。かかる変異は、例えば、本明細書において開示される特定の領域に導入することができる。
【０１２７】
一態様において、宿主細胞は、改変ニューリチン遺伝子を含むトランスジェニック動物を作製するために用いることができる、受精卵母細胞または胎性幹細胞であってもよい。あるいは、宿主細胞は、特定の細胞の亜集団を生じ、動物においてトランスジェニック組織を生じるために用いることができる、幹細胞または他の初期組織前駆体であってもよい。相同組み換えベクターの説明については、また、Thomas et al.，Cell 51：503（1987)を参照のこと。ベクターを胎性幹細胞株に導入し（例えば、エレクトロポレーションによって）、導入された遺伝子が内因性ニューリチン遺伝子と相同的に組み換えされている細胞を選択する（例えば、Li，E．et al.（1992）Cell 69：915を参照のこと）。選択された細胞を、次いで、動物（例えば、マウス）の胚盤胞にインジェクションし、集合キメラを形成させる（例えば、Bradley，A．、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells中：A Practical Approach，E．J．Robertson編（IRL，Oxford，1987）pp．113-152を参照のこと）。
【０１２８】
次いで、キメラ胚を、好適な偽妊娠の雌仮親（foster）動物に移植して、胚を出産させてもよい。生殖細胞において相同的に組み換えされたDNAを保有する子孫を用いて、導入遺伝子の生殖系列伝達により、全ての細胞が相同的に組み換えされたDNAを含む動物を育種してもよい。相同組み換えベクターおよび相同組み換え動物を構築するための方法は、Bradley，A.（1991）Current Opinion in Biotechnology 2：823-829およびPCT国際公開第WO 90/11354号；同第WO 91/01140号；および同第WO 93/04169号においてさらに記載される。
【０１２９】
遺伝子操作された宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために用いることができる。トランスジェニック動物は、好ましくは哺乳動物、例えばラットまたはマウスなどの齧歯類であり、動物の一つ以上の細胞が導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発達する細胞のゲノムに組み込まれた外因性ＤＮＡであり、トランスジェニック動物の一つ以上の細胞型または組織において、成熟動物のゲノム中に保持される。これらの動物は、ニューリチンタンパク質の機能を研究し、ニューリチンタンパク質活性のモジュレーターを同定して評価するために有用である。
【０１３０】
トランスジェニック動物の他の例として、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、および両生類が挙げられる。
一態様において、宿主細胞は、ニューリチンポリヌクレオチドが導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。
トランスジェニック動物は、核酸を、受精卵母細胞の雄性前核に、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルスインジェクションによって導入し、卵母細胞を偽妊娠の雌仮親動物において発生させることによって、作製することができる。ニューリチンポリヌクレオチド配列のいずれを導入遺伝子としてマウスなどの非ヒト動物のゲノムに導入してもよい。
【０１３１】
調節配列または発現ベクターにおいて有用な他の配列のいずれがトランスジェニック配列の部分を形成してもよい。これは、既に含んでいない場合は、イントロン性配列およびポリアデニル化シグナルを含む。特定の細胞にニューリチンタンパク質の発現を指向させるために、組織特異的調節配列を導入遺伝子に作動的に結合させてもよい。
【０１３２】
トランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を胚操作およびマイクロインジェクションを介して作製するための方法は、当該分野において定法のものとなっており、例えば、Lederらによる米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号、Wagnerらによる米国特許第4,873,191号、ならびに、Hogan，B.，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y.，1986）において記載される。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために用いられる。初代トランスジェニック動物は、そのゲノム中の導入遺伝子の存在、および／または動物の組織もしくは細胞におけるトランスジェニックmRNAの発現に基づいて、同定することができる。初代トランスジェニック動物は、次いで、導入遺伝子を有するさらなる動物を育種するために用いることができる。さらに、導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物と交配してもよい。トランスジェニック動物はまた、全動物または動物における全組織が本明細書において記載される相同組み換え宿主細胞を用いて産生された動物を含む。
【０１３３】
別の態様において、選択された系を含み、導入遺伝子の発現の調節が可能な、トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。かかる系の一例は、バクテリオファージＰ１のcre/loxPリコンビナーゼ系である。cre/loxPリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Lakso et al.（1992）PNAS 89：6232-6236を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、S.cerebisiaeのFLPリコンビナーゼ系である（O'Gorman et al.（1991）Science 251：1351-1355）。cre/loxPリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために用いられる場合、Creリコンビナーゼと選択されたタンパク質との両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要とされる。かかる動物は、「ダブル」トランスジェニック動物の構築を介して、例えば、一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む、２種類のトランスジェニック動物を交配することによって、作製することができる。
【０１３４】
本明細書において記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut et al.（1997）Nature 385：810-813ならびにPCT国際公開第WO 97/07668号および同第WO 97/07669号において記載される方法にしたがって作製してもよい。簡単に述べると、トランスジェニック動物由来の細胞、例えば体細胞を、単離して、増殖サイクルを出てG.sub.o期に入るように誘導することができる。次いで、静止細胞を、例えば電気パルスの使用によって、静止細胞が単離されたものと同じ種の動物由来の除核された卵母細胞に融合させる。次いで、再構成された卵母細胞を、桑実胚または胚盤胞に発達するように培養し、次いで、偽妊娠の雌の仮親動物に移植する。この雌の仮親動物から生まれる子孫は、細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンである。
【０１３５】
本明細書において記載されるポリペプチドを発現する組み換え細胞を含むトランスジェニック動物は、インビボの文脈において本明細書において記載されるアッセイを行うために有用である。したがって、インビボで存在し、結合または活性化に影響を及ぼし得る多様な生理学的要因は、インビトロの細胞フリーアッセイまたは細胞をベースとするアッセイからは明らかでないかもしれない。したがって、非ヒトトランスジェニック動物を提供することは、ペプチド相互作用、ニューリチンの機能およびペプチド相互作用に対する特定の変異ニューリチンの効果、ならびにキメラニューリチンの効果を含む、ニューリチンの機能を、インビボでアッセイするために有用である。また、一つ以上のニューリチンの機能を実質的にまたは完全に排除する変異体であるヌル変異体の効果を評価することも可能である。
【０１３６】
ニューリチンの核酸分子、タンパク質、タンパク質のモジュレーター、および抗体（本明細書において「活性化合物」としても言及される）を、被験体、例えばヒトに投与するのに適した医薬組成物に組み込んでもよい。さらに、本明細書において同定される細胞集団および改変細胞を、被験体に投与するのに適した医薬組成物に組み込んでもよい。かかる組成物は、代表的には、核酸分子、タンパク質、モジュレーター、または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１３７】
用語「投与する」とは、その最も広い意味において用いられ、本発明の組成物を被験体に導入するあらゆる方法を含む。これは、被験体に外因性に導入されたポリヌクレオチドのインビボでの転写または翻訳によって、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをインビボで生成することを含む。したがって、被験体において外因性組成物から生成されたポリペプチドまたは核酸は、用語「投与する」に包含される。
【０１３８】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、医薬投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含むことを意図される。医薬活性物質のためのかかる溶媒および剤の使用は、当該分野において周知である。従来の溶媒または剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、かかる溶媒は、本発明の組成物において用いることができる。また、補充の活性化合物も、組成物に組み込むことができる。本発明の医薬組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方される。
【０１３９】
投与の経路の例として、以下が挙げられる：非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与。非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁剤は、以下の成分を含んでもよい：注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、クエン酸、またはリン酸などの緩衝化剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアル中に封入することができる。
【０１４０】
注射用途のために適した医薬組成物として、滅菌の注射可能溶液または分散剤をその場で調製するための、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散剤および滅菌の散剤を含む。静脈内投与については、好適なキャリアとして、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（BASF、Parsippany，NJ.）またはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌であるべきであり、容易に注射可能である程度まで流体であるべきである。これは、製造および貯蔵の条件下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、溶媒または分散媒であってよく、例えば以下を含む：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの好適な混合物。
【０１４１】
例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散媒の場合は必要な粒子サイズの維持により、および表面活性剤の使用により、正しい流動性を保つことができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを、組成物中に含むことが好ましい。注射可能組成物の吸収の遅延は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
【０１４２】
滅菌注射可能溶液は、活性化合物（例えば、ニューリチンタンパク質または抗ニューリチン抗体）を、必要な量で適当な溶媒中に、必要に応じて上に列挙する成分の一つまたは組合せとともに組み込み、その後にろ過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散剤は、活性成分を、基本の分散剤と上に列挙するものからの必要な他の成分とを含む滅菌のビヒクル中に組み込むことによって、調製することができる。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌の散剤の場合、調製の好ましい方法は、予め滅菌ろ過された溶液から、活性材料と任意のさらなる所望の成分との散剤を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１４３】
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入されても、錠剤に打錠されてもよい。経口投与のために、薬剤は、胃を通過するために腸溶性の形態で含有されても、または、ＧＩ管の特定の領域において放出されるように、公知の方法によってさらにコーティングもしくは混合されてもよい。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と組合せて、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で用いてもよい。経口組成物はまた、洗口液としての使用のために、液体のキャリアを用いて調製してもよい。液体のキャリア中の化合物が経口で適用され、口中を漱ぎ（swish）、吐き出されるかまたは嚥下される。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバントの材料を、組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれを含んでもよい：微晶質セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、Primogelもしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotesなどの潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素などの流動促進剤；ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料などの香味剤。
【０１４４】
吸入による投与のために、組成物は、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからの、アエロゾルスプレーの形態において送達される。
全身投与はまた、経粘膜または経皮の手段によるものであってよい。経粘膜または経皮投与のために、浸透すべきバリアに対して適当な浸透剤を処方において用いる。かかる浸透剤は、当該分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻用スプレーまたは坐剤の使用を介して達成することができる。経皮投与については、活性化合物は、当該分野において一般に公知であるように、軟膏（salve）および軟膏（ointment）、ゲルまたはクリームに処方される。
【０１４５】
化合物はまた、直腸投与のために、坐剤の形態において（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤用基剤とともに）調製しても、残留浣腸の形態において調製してもよい。
一態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル送達系などを含む、徐放処方物など、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するキャリアを用いて調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生物適合性ポリマーを用いてもよい。かかる処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。材料は、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals，Inc.から市販でも入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞にターゲッティングされたリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして用いることができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載されるような当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
【０１４６】
経口または非経口組成物を、投与単位形態において処方することは、投与の簡易さおよび投与量の均一さのために、特に有益である。「投与単位形態」とは、本明細書において使用される場合、処置される被験体にとって単位の投与量として適している物理的に分離した単位を指す；各単位は、必要な薬学的キャリアと組み合わせて所望の治療効果をもたらすように計算された、予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形態のための規格は、活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのかかる活性化合物を調剤する分野において固有の制限によって決定され、これらに直接的に依存する。
【０１４７】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して遺伝子治療ベクターとして使用してもよい。遺伝子治療ベクターは、被験体に、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号）、または定位注入（例えば、Chen et al.（1994）PNAS 91：3054-3057を参照のこと）によって送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含んでもよく、または遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放マトリックスを含んでもよい。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組み換え細胞から完全な状態で生成される、例えばレトロウイルスベクターの場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を提供する一つ以上の細胞を含む。
【０１４８】
医薬組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサー中に含めてもよい。
本発明は、多数の異なる形態において実施することができ、本明細書において記載された態様に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、これらの態様は、開示が、本発明を当業者に完全に通達するように提供される。本発明が関連する分野の当業者は、前述の記載において示される教示の利益を有することにより、本発明の多くの改変および他の態様を想起する。具体的な用語が用いられるが、これらは、他に指示されない限り、当該分野において用いられるものである。
【０１４９】
例
本発明は、ここに記載される例に限定されるものとして解釈されるべきではないことが理解されるべきであり；むしろ、本発明は、本明細書において提供される任意のおよび全ての適用、ならびに当業者の技術の範囲内である全ての同等の改変を含むものとして解釈されるべきである。
【０１５０】
C3-HAトランスジェニックマウスにおけるアネルギー誘導
本発明者らは、自己抗原および腫瘍抗原に対するＴ細胞の耐性の誘導の機構を、ウイルス抗原、自己抗原または腫瘍抗原のいずれかとして発現されるモデル抗原、ヘマグルチニン（HA）に対して特異的なTCRトランスジェニックCD4 T細胞の養子移植のアプローチを用いて研究してきた。組み換えワクシニア−HA（Vac-HA、５×１０６pfu、腹腔内）によるマウスの免疫の後で、養子移植されたHA特異的6.5 CD4 Ｔ細胞は、増殖／収縮期およびメモリーマーカーの発生によって特徴付けられる典型的なエフェクター／メモリー応答を受ける。養子移植された動物から取り出された場合、エフェクター／メモリー細胞は、ナイーブ6.5Ｔ細胞と比較して、インビトロでHAに対して過剰応答性である。
【０１５１】
インビボでの耐性機構を理解するために、本発明者らは、C3プロモーターの制御下においてHAを導入遺伝子として発現することにより、HAトランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスは、多くの上皮系コンパートメントにおいてHAを発現し、肺の上皮細胞において発現のレベルが最も高い（Adler、1998）。6.5Ｔ細胞のC3HAマウス系統への移植は、Vac-HAの応答と類似の増殖／収縮期をもたらすが、生じるＴ細胞はアネルギー性となる。このアネルギー性表現型は、IL-2もしくはIFN−γを産生することができないか、またはインビトロで同族の抗原に応答して増殖することができないことにより、特徴付けられる。
【０１５２】
アネルギー誘導は、Ｔ細胞移植の４〜５日後に観察される。しかし、第１日と第４日との間の初期活性化段階は、IFN−γ産生などのエフェクター機能の獲得により特徴付けられ、これは、組み換えワクシニア−HAによる感染に応答して活性化されたＴ細胞に非常に類似する（Huang、2003）。これらの活性化された細胞は、高いレベルの抗原を発現する組織において自己免疫応答を引き起こすことができる。したがって、＜０．５×１０６個の6.5 Ｔ細胞をC3-HAマウスに静脈内で移植した場合、マウスは生存し、6.5細胞はアネルギー性となる（図２）。しかし、２．５×１０６個の6.5 CD4 Ｔ細胞のC3-HAマウスへの静脈内移植は、6.5Ｔ細胞自体はアネルギー性となるにもかかわらず、４〜７日間までの死亡率を有する重篤な肺血管炎の成分により特徴付けられる、重篤な間質性肺炎を誘導する。この肺血管炎は、肺における、マクロファージおよびCD8 Ｔ細胞（これはまた、致死性間質性肺炎の原因となる）を伴う大量の6.5Ｔ細胞の集積によって特徴付けられる。より少数の6.5 CD4細胞の移植は、C3-HAマウスにおいて一過性間質性肺炎を誘導するが、致死性ではない（図２）。
【０１５３】
C3-HA自己抗原アネルギーモデルと同様に、HAを発現する腫瘍（A20-HAリンパ腫またはRENCA-HA腎細胞癌のいずれか）を有するマウスに6.5 Ｔ細胞を移植した場合、これらは類似のアネルギー状態に分化する（Staveley-O'Carroll，1998;Sotomayor，2001）。これらの比較研究は、確立された腫瘍が、骨髄由来APCによる抗原の再提示を伴う交差耐性機構を介して、抗原特異的Ｔ細胞耐性を誘導する能力を強調する。
【０１５４】
アネルギー性6.5Ｔ細胞はTreg機能を示す
Lechlerのグループは、1994年に、インビトロで作製されたアネルギー性Ｔ細胞がナイーブＴ細胞活性化に対する抑制作用を示すことができることを実証した（Lombardi，1994）。このことは、本発明者らを、インビボで産生されたアネルギー性6.5Ｔ細胞はインビトロおよびインビボで何らかの活性を有しているか否かとの問いへと促した。インビボでアネルギー化された6.5Treg細胞を再単離した場合、これらは、インビトロ抑制アッセイにおいて、ナイーブＴ細胞の活性化を抑制した（図３Ａ）。「アネルギー性」6.5 CD4細胞がTreg機能をインビボで示すという証拠は、致死量以下の用量の6.5細胞で予め処置した動物を、次いで、致死量の6.5Ｔ細胞で攻撃（challenge）したときに得られた。本発明者らは、たった8,000個の最初に移植された6.5 CD4 Ｔ細胞が、その後の致死量の２．５×１０６個の6.5 CD4 Ｔ細胞による攻撃から動物を保護することができることを見出した（図２）。保護された動物において、その後の移植されたＴ細胞の間で、細胞増殖の低下が観察された（図３Ｂ）。
【０１５５】
養子移植の前のCD25+Ｔ細胞の除去は、第一の移植からの細胞がその後の致死性の6.5細胞の攻撃から動物を保護する能力を除去しなかったので、保護は、（養子移植された集団の間で天然に存在するTreg細胞の存在と対照的に）養子移植された細胞の第一のバッチにより獲得されたTreg表現型に起因する可能性が最も高い。アネルギー性細胞がTreg機能を示すというさらなる証拠は、それらがVac-HAによる感染の後でHA特異的CD8細胞の細胞毒性に対する活性化を阻害するという知見からもたらされる（インビトロおよびインビボのCTLアッセイからのデータは示さず）。これらの知見は、6.5 CD4細胞が、Ｂ細胞コンパートメントにおいてHAを発現するマウスへの移植の後でアネルギー性となり、実際にTreg機能を示したことを実証した、Von Boehmerらの公開された知見と適合性が高い（Jooss、2001）。
【０１５６】
アネルギー性／Treg細胞の遺伝子発現プロファイリング
本発明者らのインビボ系においてアネルギー性／Treg表現型と関連する遺伝子を同定するために、本発明者らは、ナイーブなレシピエントへの養子移植とその後のVac-HA免疫によるエフェクター／メモリーＴ細胞の生成の後、または、C3-HAマウスへの移植の後のいずれかにおいて、Affimetrix chip分析を精製6.5細胞について行った。ドナー6.5細胞を、養子移植の後の二段階の単離および精製の手順を可能にするThy1.1バックグラウンド上に交差させた。次いで、6.5細胞を、CD4＋Thy1.1＋細胞についてのソーティングにより、およそ９５％の純度まで濃縮した。このプロトコルは、抗体単離の手順に基づくTCR依存的遺伝子発現パターンを変える可能性がある、TCR特異的抗体の使用を回避する。養子移植後０〜４日後にchip分析のために細胞からRNAを単離した。エフェクター／メモリー集団と比較してアネルギー性／Treg集団において選択的に発現する遺伝子を、第１〜４日でのそれらの平均発現差異にしたがって順位付けした（図４）。
【０１５７】
驚くほど多数の遺伝子が、養子移植後の早い時点においてですら、エフェクター／メモリー集団と比較して、アネルギー性／Treg集団において選択的に活性化された。これらの遺伝子の多くは、既知の機能を有さないＥＳＴを表した。先に同定されている遺伝子の中で、エフェクター／メモリー集団と比較してアネルギー性／Treg集団の間で最も発現の差異が大きかった遺伝子は、ニューリチンであった。図５は、養子移植の後０日目と２、３、４日後とを比較する、Affymetrix chip分析に基づくニューリチンの相対的発現を示す。
【０１５８】
遺伝子発現プロファイリングアプローチはまた、インビトロＴ細胞アネルギーモデルに基づいて作製されたアネルギー性Ｔ細胞を分析するために有用である。１型ヘルパーＴ細胞のクローンAE7を、Schwartzのグループによって最初に記載されたインビトロでのアネルギーモデル（Jenkins、1987）において用いた。したがって、AE7細胞をTCRシグナルのみ（抗CD3）で共刺激の不在下において刺激する場合、これらの細胞は延長された期間、アネルギー性となる。IL2の不在下において１０日間の静止の後ですら、細胞は再刺激の際になお非応答性であり、IL2を全く産生することができない。一方、細胞にTCRと共刺激シグナルとの両方（抗CD3＋抗CD28）を供給した場合、AE7細胞は、再刺激の際に好ましい増殖およびIL2産生を示す。興味深いことに、アネルギー性AE7細胞はまた、ナイーブＴ細胞活性化を抑制することができる（データは示さず）。アネルギー条件下で多様な回数にわたって活性化されたAE7細胞について、遺伝子発現プロファイル分析を行った。アネルギー誘導の２時間、４時間、および６時間後に、RNAを細胞から単離し、Affymetrix chipアッセイに供した。インビボで産生されたアネルギー性Treg細胞からのデータと一致して、ニューリチンはまた、アネルギー条件からの細胞において、静止AE7細胞（図５）および活性化AE7細胞と比較して、５倍より多い発現の増加を示した。
【０１５９】
調節性Ｔ細胞は免疫系において最も高いレベルのニューリチンを発現する
ニューリチンは、元来、神経活動によって誘導される海馬遺伝子のスクリーニングの間に同定された（Naeve、1997）。脳における高い発現レベルの他に、本発明者らはまた、ウェスタンブロットにより、腎臓においてニューリチンの発現を検出した（データは示さず）。ニューリチン発現は、神経活動により、ならびに活動によって調節される神経栄養因子BDNFおよびNT-3によって誘導される。配列分析は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）架橋によって膜にアンカーされた細胞外分子を予測し、他のタンパク質との有意な配列またはモチーフの相同性は全く見出されていない（Naeve、1997）。ヒト、ラット、およびマウスからのニューリチンのタンパク質配列は、細胞外領域において１００％保存されている。神経系において、ニューロンにおけるニューリチンの異所性発現は、GPI架橋を必要とする細胞間シグナリング機構を通して、隣接する細胞の樹状の分枝的成長を促進する（Nedivi，1998；Naeve，1997）。最近、可溶性形態のニューリチンが脳において同定され、アポトーシスからニューロンを保護することが示された（Putz、2005）。
【０１６０】
ニューリチンは、免疫学の分野においては新たな分子である。免疫応答におけるニューリチンの機能を理解するために、本発明者らはまず、ニューリチンの発現を異なる細胞型の間で調査した。本発明者らは、CD4+CD441owナイーブＴ細胞、CD4+CD44hiCD25+細胞、CD4+CD44hiCD25-細胞、CD8+CD441ow細胞、CD8+CD44hi細胞、B220+CD19+細胞、ＮＫ細胞、CDl 1 CMB220- bmDC、およびCDl1ClowB220+形質細胞様ＤＣにおけるニューリチンの発現を比較した。図６のqRT-PCR分析において示すように、ニューリチンは、CD4+CD25+調節Ｔ細胞において最も高く発現した。CD4+CD44hiCD25-抗原およびCD8CD44hi抗原を経験したＴ細胞もまた、比較的高いレベルのニューリチンmRNAを発現した。低レベルの発現は、CD8+CD44lowＴ細胞、Ｂ細胞およびbmDCにおいて検出された。qRT-PCR反応において、ナイーブＴ細胞における増幅は、負のコントロールと同じであることが指摘されるべきである；したがって、ニューリチンはナイーブＴ細胞においては発現しない。ＮＫおよびｐＤＣにおける発現もまた、基線に近い。本発明者らは、qRT-PCRは新たにソーティングしたCDllChiB220- bmDCについて行ったのみであるが、本発明者らのDNAマイクロアレイデータバンクにおいて、８つの異なる条件下および４つの異なる時点において活性化されたbmDCにおけるニューリチンの発現を試験し、有意な変化は全くみられず、シグナルは全て非常に低かった。
【０１６１】
ニューリチンはTreg細胞において特異的に発現し、その発現はIL2およびTCRシグナルによって調節される
天然のCD4+CD25+ Treg細胞は、非相同的集団を表す。これらは二つの亜集団に分けることができる：静止状態の細胞と考えられるCD4CD25+CD62hi-、および多様な活性化マーカーを有するCD4CD25+CD62low細胞（Fisson、2003）。両方の集団が、インビトロでのポリクローナルの刺激に際して同等にアネルギー性であり抑制性であることが示されている（Kuniyasu、2000；Thornton、2000；Szanya、2002）が、CD4CD25+CD62hi細胞は、インビボで、より長い寿命およびサプレッサー活性を示す（Fisson、2003；Taylor、2004）。CD4CD25+CD621ow細胞が活性化されたエフェクターTreg細胞であることが提案されている（Fisson、2003；Huehn、2004）。
【０１６２】
本発明者らは、ソートした天然のTreg亜集団におけるニューリチンの発現パターンをさらに試験した。CD4CD25+CD62hi細胞およびCD621ow細胞の両方がニューリチンを発現するが、一方、CD4CD25+CD621ow細胞は遙かにより高いニューリチン発現を有する（図７Ａ）。静止状態のCD4CD25+CD62hi細胞においてニューリチンの発現を誘導することができるか否かを試験するために、本発明者らは、これらの細胞を、ナイーブBalb/Cマウスからソートし、IL2、IL2＋抗CD3、CD3、CD3+CD28およびCD28により、単独または何らの処置もなし（静止状態）で、処置した。一晩（２０時間）の処置の後で、ニューリチンの発現を、IL2およびIL2＋抗CD3の添加により誘導した（図７Ｂ）。IL-2は、インビボでのTreg細胞の生存、増殖および機能に不可欠である（Malek TR、2004）。結果は、ニューリチンがTreg細胞におけるIL-2媒介性の機能のためのエフェクター遺伝子である可能性があることを示唆する。
【０１６３】
ニューリチンはアネルギー化Ｔ細胞において高く発現される
Genechip分析は、ニューリチンがアネルギー化Ｔ細胞において発現されることを示す（図５）。この結果を、6.5 CD4細胞のC3HA宿主への養子移植後１ヶ月間の期間にわたって異なる時点で単離された、インビボでアネルギー化された細胞からのサンプルについての定量RT-PCR（qRT-PCR）によって、さらに確認した（図８Ａ）。これらのデータは、インビボで延長された期間にわたって、アネルギー化Ｔ細胞においてニューリチン発現が増加することを再確認する。対照的に、メモリー誘導条件下において活性化された細胞（非トランスジェニックB10.D2宿主に移植され、HA抗原をコードするワクシニアウイルスにより活性化された、6.5 CD4細胞）は、ニューリチンの発現の増加を示さなかった。このことは、ニューリチンの発現の増加は、アネルギー化されたＴ細胞に特異的であることを示唆する。AE7アネルギー系におけるニューリチンの過剰発現を、RNAおよびタンパク質の両方のレベルでさらに確認した（図８ＢおよびＣ）。
【０１６４】
ニューリチンが腫瘍アネルギー化細胞において類似の発現パターンを示すか否かをさらに調査するために、A20腫瘍アネルギー化系を用いた（Staveley-O'Carroll，1998）。A20は、BALB/c Ｂ細胞リンパ腫であり、ヒトＢ細胞リンパ腫の多くの形態とインビボで同様に振る舞う。BALB/cマウスに注入される場合、この腫瘍は、腸間膜リンパ節、脾臓および肝臓に浸潤し、骨髄および末梢血においても見出すことができる。HA抗原を構成的に発現するA20細胞を、腫瘍アネルギー化実験において使用した。A20HA細胞のBALB/cマウスへの移植の１０日後、HA抗原特異的6.5Ｔ細胞を、腫瘍を有する宿主へ養子移植した。養子移植の２１日後、6.5Ｔ細胞を宿主から単離し、RNAサンプルを調製した。ニューリチンの発現レベルを、アネルギー化条件（すなわち、A20HA宿主へ養子移植された6.5Ｔ細胞）、ナイーブ条件（すなわち、A20野生型宿主へHA抗原なしで移植された6.5Ｔ細胞）、および活性化条件（すなわち、Vac HAによって活性化された6.5Ｔ細胞）の間で比較した（図８Ｄ）。ニューリチンは、腫瘍アネルギー化条件下において発現の増加を示すのみであった。
【０１６５】
Ｔ細胞特異的ニューリチン過剰発現トランスジェニックマウスの作製
Ｔ細胞の発達におけるニューリチンの役割およびインビボ応答をさらに理解するために、本発明者らは、Ｔ細胞特異的ニューリチントランスジェニックマウスを作製した。このマウスは、機能獲得マウスと機能喪失マウスとにおいて免疫応答を平行して比較するための、ニューリチンノックアウトマウス（以下に記載する）の強力な補助である。改善されたヒトCD2プロモーターは、トランスジェニックマウスにおける実質的に全てのシグナル陽性のCD4+CD8-およびCD4-CD8+の成熟Ｔリンパ球において遺伝子発現を誘導することができ、発現は、導入遺伝子のコピー数に直線的に比例する（Zhumabekov、1955）。ニューリチンを、hCD2プロモーターの下に直接位置させた（図９Ａ）。hCD2ニューリチン発現カセットを、トランスジェニックマウスを作製するための標準的な手順にしたがって精製して注入した。例示的な導入遺伝子陽性系統を、（図９Ｂ）に示す。導入遺伝子陽性と陰性との同腹仔の間でのニューリチン発現の比較は、導入遺伝子陽性マウスからのＴ細胞においてニューリチンが過剰発現されることを、明らかに示す（図９ＣおよびＤ）。
【０１６６】
トランスジェニック系統の分析は、正常な胸腺の発達、および比較可能なパーセンテージのCD4+、CD8+およびCD4+CD8+細胞を示す（データは示さず）。末梢リンパ系器官の染色は、比較可能なCD4+、CD8+、B220+、Gr-1+、DX5+およびCDllc+の細胞集団を示す。Ｔ細胞の活性化を試験するために、CD4およびCD8細胞を精製し、プレートに結合した抗CD3+CD28で刺激した。本発明者らは、比較可能なＴ細胞の増殖を観察した（データは示さず）。本発明者らはまた、類似の数のCD4+CD25+天然Treg細胞、およびインビトロでの比較可能な抑制作用を観察した（データは示さず）。
【０１６７】
CD2NトランスジェニックＴ細胞は、養子移植（ADT）CD2N+細胞の欠失に起因するインビボでの抑制の低下を示す
CD2N+マウスを、B10.D2バックグラウンドおよび6.5 TCRトランスジェニックマウスに戻し交配した。アネルギー誘導におけるニューリチンの役割、および抑制におけるその機能の可能性を研究するために、本発明者らは、6.5 TCR+thy1.1+CD2N+またはCD2N-全脾細胞を、C3-HA thy1.2+HA発現宿主に養子移植（ADT）した。ADTの１８日後、CFSE標識wt6.5Ｔ細胞を、それらおよびナイーブなC3-HA宿主（前に移植していない）へ再度ADTした。先に移植されたCD2N+/- 6.5細胞によるwt6.5Ｔ細胞の増殖の抑制を第二のADTの３日後に分析した。本発明者らが驚いたことに、CD2N- 6.5Ｔ細胞は、ナイーブな宿主へのADTと比較してwt6.5Ｔ細胞の増殖を抑制したが、一方、CD2N+ 6.5Ｔ細胞による抑制は失われた（図１０Ａ）。平均時間において、C3-HA宿主におけるCD2N+ 6.5細胞の数は、CD2N- 6.5細胞と比較して大きく低下した（図１０Ｂ）。
【０１６８】
C3-HA宿主へのADTの際の抑制および細胞の欠失は、CD2N+ 6.5細胞における不完全な増殖および／または不完全なアネルギーの誘導に起因し得る。CD2N+ 6.5細胞の増殖を、HAペプチドによる刺激の際のCFSE希釈を観察することによりインビトロで試験し、C3-HA宿主へADTしてADTの３日後にCFSE希釈を試験することによりインビボで試験した。比較可能なCFSE希釈を、CD2N+/- 6.5細胞の間で、インビトロおよびインビボで観察した（データは示さず）。類似のパーセンテージのIL2およびIFNγ陽性細胞もまた、CD2N+/-活性化細胞の間で、インビトロおよびインビボで観察された（データは示さず）。さらに、C3-HA宿主へADTされたCD2N+/- 6.5細胞をADTの３日後、６日後および１４日後に分析した場合、CD2N+ 6.5細胞の有意な減少は後の時点でのみ観察されたが、一方、細胞の数は、ADTの３日後で比較可能であった（図１０Ｃ）。総合すると、これらの結果は、インビボで、CD4 Ｔ細胞におけるニューリチンの過剰発現が、自己Ａｇ特異的細胞の持続性の低下をもたらすことを示す。C3-HA宿主における経時的なCD2N+細胞の欠失は、ニューリチン発現細胞の不完全な活性化および増殖に起因しない。
【０１６９】
可溶性ニューリチンは、自己抗原発現宿主における抗原特異的Ｔ細胞の欠失促進を媒介する
先のセクションは、6.5 Ｔ細胞におけるニューリチンの過剰発現が、自己抗原発現C3-HA 宿主における細胞の欠失をもたらすことを示す。この効果が、ニューリチン発現細胞に固有のものか否か、またはニューリチンがトランス機構を通してこれを媒介することができるか否かは、明らかでない。これを調査するために、本発明者らは、wt thyl.l+thyl.2- 6.5Ｔ細胞とCD2N+/- thyl.l+thyl.2+6.5Ｔ細胞とをC3-HA宿主へ共移植し、wt6.5細胞を経時的に観察した。ADTの３日後にCD2N+/-thy 1.1+thyl.2+6.5と共移植した場合、類似の数のwt6.5細胞が観察されたが、CD2N+細胞と共移植した場合、ADTの１４日後にwt6.5細胞の数は大きく減少した（図１１Ａ）。この結果は、本発明者らがCD2N+自己Ａｇ特異的Ｔ細胞において観察した細胞の欠失が、ニューリチンの過剰発現によって引き起こされた発生学的欠損に起因しないことを示唆する。ニューリチンは可溶性形態において機能することができ、Ｔ細胞の持続性に影響を及ぼす。
【０１７０】
本発明者らは、可溶性ニューリチンが、インビボで細胞の欠失に対するトランス作用を媒介することができるか否かをさらに調査した。Wt6.5Ｔ細胞を、C3-HA宿主に移植した。マウスに、細胞移植の時、およびADTの後隔日で、200ugの可溶性ニューリチンヒト−Fc融合タンパク質（NhFc）またはヒトIgG（hIgG）コントロールのいずれかを腹腔内注入した。C3-HA宿主における6.5細胞の持続性を、ADTの１３日後に試験した。NhFcの処置は、自己抗原特異的wt細胞の欠失の促進をもたらした（図１１Ｂ）。したがって、可溶性形態のニューリチンは、自己抗原発現宿主において、抗原特異的なＴ細胞の欠失に対する作用を媒介することができる。
【０１７１】
抗原との接触による誘発（precipitated）Foxp3+ Treg 細胞の欠失
wt6.5TCRトランスジェニック マウスにおいて、約５％の6.5+CD4+CD25+foxp3+ HA抗原特異的ナチュラルTreg細胞が存在する。抗原性CD4+CD25+ Treg細胞は、Treg抑制性機能を有する細胞の特異的マーカーであるFoxp3転写因子を発現する。CD2N+とCD2N-のマウスとの間で類似のパーセンテージの6.5+CD4+CD25+foxp3+ナチュラルTreg細胞が観察された。6.5+Ｔ細胞をC3HA宿主に移植すると、CD4+CD25-ナイーブ細胞およびCD4+CD25+ Treg細胞の両方が増殖する（データは示さず）。ニューリチンは神経の生存および樹状突起の成長を支持することが報告されている。活性化によって誘導されるニューリチンの過剰発現がfoxp3+ Treg細胞の増殖または活性の増強を媒介する可能性がある。Treg細胞の数および／または活性の増大は、次いでfoxp3-細胞の増殖および生存を抑制し、ADT細胞の間で誘発細胞（precipitated cell）の欠失をもたらす。
【０１７２】
この可能性を探索するために、本発明者らは、C3-HA宿主へのADTの後で、CD2N+/-マウスからの全6.5+Ｔ細胞中のfoxp3+細胞の比をモニタリングした。ニューリチンがナチュラルTreg細胞の増殖の増強を媒介するのであれば、CD2N+マウスからの細胞は、foxp3+細胞対foxp3-細胞の比の増加を示すであろう。対照的に、CD2N+マウスからのfoxp3+細胞は、同腹仔コントロールより速やかに消失した（図１２）。CD2N+／-マウスにおいて類似のパーセンテージのTreg細胞を見出したので、Treg細胞の欠失は、調節性Ｔ細胞の活性化および増殖の条件に特異的であると考えられる。この結果は、Treg活性化により増強されたニューリチンの増殖は、Treg細胞の過剰増殖を抑えるために働くことを示唆する。
【０１７３】
CD2N+マウスにおいてEAE誘導により増悪した疾患
抗原特異的Treg細胞とエフェクター細胞との比を乱す（disrupt）ことは、病的状態をもたらし得る（Kohm、2002）。本発明者らは、ミエリン−オリゴデンドロサイト−糖タンパク質MOG（35-55）ペプチドにより媒介されるEAE自己免疫疾患モデルを、自己免疫疾患の発症におけるニューリチン過剰発現の影響を試験するために使用することを選択した。CD2N+マウスを、C57/BL6バックグラウンドに戻し交配し、MOG媒介性EAE誘導に供した。EAEの誘導により、CD2N+マウスは、CD2N−マウスと比較して、より早くより重篤な疾患を示した（図１３Ａ）。リンパ節および脾臓のドレーンからの細胞のMOGペプチドによる再刺激により、IL17分泌の増加をELISAにより検出し、より多くのIFNγ細胞を細胞内サイトカイン染色により検出した（図１３ＢおよびＣ）。さらに、より多数のCD4+細胞が、CNSにおいて回収された。したがって、ニューリチンの過剰発現は、EAEにおいてより重篤な疾患をもたらす。
【０１７４】
ニューリチン−Ｆｃは活性化されたＤＣに結合することができる
ニューリチンはGPIアンカーされた細胞表面タンパク質である。したがって、これは、他の細胞上の受容体を通してその機能を発揮する可能性がある。ニューリチンの結合パートナーを調査するために、ニューリチン−Fc（N-Fc）融合タンパク質を作製した。ニューリチンのGPIアンカーを、ヒトIgG1のFc部分で置換し、組み換えタンパク質をプロテインＧカラムを用いて精製した。精製されたN-Fcを、製造者のプロトコルにしたがってFITCと結合させ、リンパ系組織からの細胞を染色するために用いた。リンパ節および胸腺において有意な染色は観察されなかった。骨髄由来の樹状細胞（ＤＣ）において、N-Fc染色のレベルは非常に低い。しかし、酵母の膜由来のトール様受容体２リガンドであるザイモサンによる活性化の際に、N-Fcの劇的な増加が存在する（図１４Ａ）。同様に、フレッシュな脾臓ＤＣは、N-Fcでは染色されない。２４時間のインビトロ培養の後で、染色は増加する（図１４Ｂ）。したがって、ニューリチンは、活性化ＤＣによって発現される受容体と相互作用することができる。
【０１７５】
ニューリチンはＤＣ活性化に影響を及ぼす
Treg細胞は、抗原提示細胞を介してＴ細胞応答を能動的に抑制することができる（Taams，1998；Vendetti，2000；Frasca，2002；Cederbom，2000；Misra，2004;Min，2003）。TCRシグナル単独の存在下における刺激によってアネルギー化されたＴ細胞クローンを用いて、Frascaらは、アネルギー性Ｔ細胞によって引き起こされる抑制が、ＤＣなどの抗原提示細胞の存在を必要とすることを実証した。アネルギー化細胞は、ＤＣ上の共刺激分子を接触依存的な様式において下方調節することができる（Frasca、2002）。CD4+CD25+細胞における研究もまた、ナチュラルTreg細胞が、ＤＣの共刺激分子および抗原提示機能を、接触依存的な様式において下方調節できることを示す（Cederbom，2000；Misra，2004）。これらの観察についての分子機構は明らかでない。ＤＣに結合できるTreg発現細胞表面分子として、本発明者らは、ニューリチンがＤＣの成熟および抗原提示機能において何らかの役割を果たすか否かを問題とした。可溶性ニューリチン−Ｆｃを用いて骨髄由来ＤＣを処置した。ニューリチン−Ｆｃ処置細胞からの上清を、サイトカイン分泌について測定した。図１５に示すように、ニューリチン−Ｆｃ処置細胞においてIL12p40の分泌の低下を観察した。
【０１７６】
Ｔ細胞上に提示された場合のＤＣ上のニューリチン会合の機能を理解するために、ニューリチンを運搬するレトロウイルスベクターを用いて、活性化された6.5 CD4 Ｔ細胞を感染させた。GFPで標識された感染細胞を、ソートして、HAペプチド抗原でパルスした第７日骨髄由来ＤＣとの共培養に用いた。共培養の２４時間後に上清を収集して、IL12産生について試験した。ニューリチン−Ｆｃ処置ＤＣからの観察と一致して、ニューリチン発現Ｔ細胞と共培養されたＤＣにおいて、IL12分泌が著しく低下する（図１６ＡおよびＢ）。共培養物からのＤＣを、さらに、HAクラスＩ抗原をHA特異的クローン４ TCRトランスジェニックCD8マウスに提示するために用いた。ニューリチン発現Ｔ細胞とともに前培養されたＤＣによって抗原提示されたものにおいて、CD8細胞増殖の低下を観察した（図１６Ｃ）。
【０１７７】
ＮＯＤマウスにおいて糖尿病を首尾よく処置するために用いられるＤＣは、IL12産生において不完全であることが報告されている（図ｌ６Ｃ）。ＤＣによるIL12産生の阻害は、IL10産生の増加と関連し、混合リンパ球反応において弱いアロスティミュレーター（allostimulator）となった（Hill、2003）。他の研究もまた、MHCおよび共刺激分子のレベルは高いがIL12などの炎症性サイトカインは低いことによって特徴付けられる、半成熟（semimature）な表現型を有する保護的ＤＣの可能性を示唆する（Lutz、2002）。ニューリチン処置されたＤＣは、半成熟ＤＣと類似の表現型を示す。
【０１７８】
ニューリチン特異的モノクローナル抗体は可溶性ニューリチンおよび細胞結合ニューリチンを同定する
本発明者らは、ニューリチンの発現がTreg活性を有するＴ細胞に対して特異性が高いことを示した。マウスとヒトとのニューリチンの間での１００％の相同性に起因して、ニューリチンに対するモノクローナル抗体は、マウスおよびヒトにおいてTreg細胞を標識して研究するために非常に有用である。さらに、抗体はまた、ニューリチン活性をインビボで調節するために有用である。ニューリチン特異的抗体を作製するために、３個体のマウスをニューリチンのマウスＦｃ融合タンパク質（ニューリチン−mFc）を用いて免疫した。２回の追加免疫の後で、血清でのニューリチンに対する力価を試験した。ニューリチンに対して最も高い血清力価を有するマウスからの脾細胞を用いてハイブリドーマを作製した。１５０個のハイブリドーマのクローンからの上清を、初めにニューリチン−hFcタンパク質に対するELISAによって試験した。ELISAによる試験の結果、１６個のクローンが陽性であり、さらに細胞表面染色について試験した（図１７Ａ）。２９３個の細胞を、移入細胞をgfpで標識する事ができるレトロウイルスのニューリチン発現ベクターで形質移入した。１６個のうち２個のクローンが、ニューリチンを移入された２９３細胞において陽性の染色を示した（図１７Ｂ）。
【０１７９】
また、1D6抗体を用いて、全長または可溶性のニューリチンを移入した２９３個の細胞のライセートからニューリチンを免疫沈降できるか否かを試験した。図１７ｃに示すように、1D6は、実際に細胞ライセートならびに形質移入体の上清からニューリチンを免疫沈降した。初代Ｔ細胞におけるニューリチン染色をさらに試験するために、二つの陽性クローンからの上清を用いて、CD2N+トランスジェニックマウスおよび同腹仔コントロールからの胸腺細胞を染色した。２００ｕｌの上清を１×１０６個の胸腺細胞とともにインキュベートした後で、抗マウスIgG-PEで染色した。CD4+CD8-シングルポジティブＴ細胞は、実際に、同腹仔コントロールと比較して、CD2N+トランスジェニックマウスにおいて、1D6クローンの上清で陽性に染色された（図１７Ｄ）。クローン1A9は、初代Ｔ細胞上に発現するニューリチンを認識しない。
【０１８０】
内因性ニューリチンの表面発現を試験するために、本発明者らは、1D6抗体をビオチンで標識し、CD2N+マウスおよびCD2N-マウスの両方からのリンパ節細胞および脾細胞におけるニューリチンについて染色した。本発明者らは、CD2N-マウスにおけるCD4+CD44hiCD25-細胞およびCD4+CD44hiCD25+細胞において、弱い染色を観察した（図１８Ａ）が、一方、CD4+CD25+CD441ow細胞における変化は非常に小さく、検出することが困難であった。CD2N+マウスからのCD4細胞のサブセットにおける表面染色と比較して、本発明者らは、CD4+CD25+細胞およびCD4+CD44hiCD25-細胞におけるニューリチンの表面染色が、CD4+CD25-CD441owナイーブ細胞をより低いことを一貫して観察した（図１８Ｂ）。CD4細胞のTCR刺激により、本発明者らはまた、活性化トランスジェニックＴ細胞の間で、表面ニューリチン染色の低下を観察したが、ナイーブトランスジェニックＴ細胞では観察しなかった（データは示さず）。これらの観察は、Treg細胞の細胞表面からの、または活性化Ｔ細胞における、ニューリチン放出の可能性を強く示唆する。この結果はまた、上記の可溶性ニューリチンのインビボでの機能的役割と一致する。
【０１８１】
本発明者らはさらに、ニューリチンに対する二つの抗体クローンを用いて、内因性の可溶性ニューリチンおよび膜結合ニューリチンの発現を試験した。これらの二つの抗体クローンを、サンドウィッチELISAアッセイにおいて用いた。C57/BL6マウスの脳および腎臓（ウェスタンブロッティングによりニューリチンタンパク質を発現することを同定された二つの器官）を用いて、可溶性ニューリチン対細胞結合ニューリチンの存在を試験した。脳および腎臓の組織を細胞懸濁液に粉砕した。組織粉砕物からの上清および細胞ペレットからのタンパク質ライセートを、1A9および1D6クローンを用いるサンドウィッチELISAによって、ニューリチンタンパク質について試験した。図１９に示すように、脳サンプルにおいて可溶性ニューリチンおよび細胞結合ニューリチンの両方を検出し、一方、腎臓においては細胞結合ニューリチンのみを検出した。したがって、このアッセイにより、可溶性ニューリチンの存在をインビボで確認した。このアッセイは、異なるニューリチンの形態を免疫系においてアッセイするために用いられる。
【０１８２】
参考としての援用
本願を通して引用される全ての参考文献、特許、継続中の特許出願および公開された特許の内容は、本明細書により参考として明確に援用される。
【０１８３】
均等物
当業者は、本明細書において記載される本発明の具体的な態様の多くの均等物を理解するか、または通常の実験のみを用いて確認することができる。かかる均等物は、添付の特許請求の範囲により包含されることを意図される。
【０１８４】
【表１】
2014097985.tif 000002
【０１８５】
【表２】
2014097985.tif 000003
【０１８６】
【表３】
2014097985.tif 000004
【０１８７】
【表４】
2014097985.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】エフェクター／メモリー対アネルギー性表現型へのＴ細胞の分化の概念図である。
【図２】誘導されたTreg細胞は、致死性の間質性肺炎の発症を抑制する。
【図３】アネルギー性6.5Ｔ細胞は、インビトロおよびインビボで調節活性を示す。
【図４】アネルギー性／Treg誘導とエフェクター／メモリー誘導との間のCD4+Ｔ細胞における遺伝子の発現差異をランク付けする。
【図５】インビボおよびインビトロで発生させたアネルギー性Ｔ細胞対活性化Ｔ細胞におけるニューリチン発現を比較するGenechipのデータを示す。
【図６】多様な細胞型におけるニューリチン発現の比較を示す。
【０１８９】
【図７】ニューリチンはCD4CD25+CD62Low細胞において高発現し、その発現は、CD4CD25+CD2hi細胞においてIL-2によって誘導することができる。
【図８】多様な条件下におけるニューリチンの発現プロフィールを示す。
【図９】CD2ニューリチントランスジェニックマウスの作製を示す。
【図１０Ａ−Ｂ】CD2NトランスジェニックＴ細胞は、ADT CD2N+細胞の欠失に起因してインビボで抑制の低下を示す。
【図１０Ｃ】CD2NトランスジェニックＴ細胞は、ADT CD2N+細胞の欠失に起因してインビボで抑制の低下を示す。
【図１１】可溶性ニューリチンは、自己Ａｇ発現宿主におけるＡｇ特異的Ｔ細胞の欠失を媒介することができる。
【図１２】抗原と接触した後で沈殿したFoxp3＋Treg細胞の欠失を示す。
【０１９０】
【図１３】CD2N＋マウスにおいて増悪したEAEを示す。
【図１４】ＤＣのニューリチン−Ｆｃ染色を示す。
【図１５】プレート被覆ニューリチン−Ｆｃ（N-Fc）またはコントロールヒトIgG1（hIgG1）で処置された骨髄由来ＤＣからのIL12p40産生を示す。
【図１６】ニューリチン発現を有するＴ細胞またはニューリチン発現を有しないＴ細胞で処置されたＤＣのサイトカイン産生および抗原提示を示す。
【図１７】ニューリチン特異的モノクローナル抗体の産生を示す。
【図１８】CD2N（＋）およびコントロールCD2N（−）マウスからのCD4細胞の亜集団におけるニューリチンの表面染色を示す。
【図１９】可溶性ニューリチンおよび細胞結合ニューリチンを検出するサンドウィッチELISA。
【図２０】マウスのニューリチンの核酸配列を示す。
【図２１】ヒトおよびマウスのニューリチンのアミノ酸アラインメントを示す。
【図１】
2014097985.tif 000006
【図２】
2014097985.tif 000007
【図３】
2014097985.tif 000008
【図４】
2014097985.tif 000009
【図５】
2014097985.tif 000010
【図６】
2014097985.tif 000011
【図７】
2014097985.tif 000012
【図８】
2014097985.tif 000013
【図９】
2014097985.tif 000014
【図１０Ａ−Ｂ】
2014097985.tif 000015
【図１０Ｃ】
2014097985.tif 000016
【図１１】
2014097985.tif 000017
【図１２】
2014097985.tif 000018
【図１３】
2014097985.tif 000019
【図１４】
2014097985.tif 000020
【図１５】
2014097985.tif 000021
【図１６】
2014097985.tif 000022
【図１７】
2014097985.tif 000023
【図１８】
2014097985.tif 000024
【図１９】
2014097985.tif 000025
【図２０】
2014097985.tif 000026
【図２１】
2014097985.tif 000027
【配列表】
2014097985000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月20日(2013.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューリチンをコードする核酸分子またはその機能的フラグメントによって形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、自己免疫疾患を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも一つのさらなる治療剤をさらに含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ニューリチンアンタゴニストまたはその機能的フラグメントを含む、癌を処置するための医薬組成物。
【請求項４】
ニューリチンアンタゴニストが、ニューリチン特異的抗体またはニューリチンをコードする核酸分子に特異的に結合するｓｉＲＮＡ分子である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
少なくとも一つのさらなる治療剤をさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
可溶性ニューリチンまたはその機能的フラグメントを含む、抗原特異的調節性Ｔ細胞を増殖させるための医薬組成物。
【請求項７】
可溶性ニューリチンまたはその機能的フラグメントが、組み換えマウスニューリチンまたは組み換えヒトニューリチンを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
可溶性ニューリチンまたはその機能的フラグメントが、ヒトニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質またはマウスニューリチン／Ｉｇキメラ融合タンパク質を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
自己免疫疾患の処置に使用する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ニューリチンアンタゴニストを含む、ワクチンの効力を増大させるための医薬組成物。
【請求項１１】
ワクチンが腫瘍ワクチンである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ワクチンが、感染性疾患を予防するために設計されたワクチンである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ニューリチンアンタゴニストが、ニューリチン特異的抗体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2014097985000001.pdf