(57)【要約】【課題】標的分子の標識用の染色及び対比染色が施された標本に対し、標的分子の発現情報を広視野且つ高精細に画像化する際に、標的分子の発現領域に対する合焦精度を向上させることができる顕微鏡システム等を提供する。【解決手段】顕微鏡システムは、顕微鏡装置により標本を低倍率の対物レンズで観察することにより低解像画像を取得する低解像画像作成部５５２と、低解像画像の色情報に基づいて、該低解像画像から標的分子の発現領域を抽出して注目領域として設定する注目領域設定部５５３と、注目領域に対する合焦平面を決定する合焦平面決定部５５４と、合焦平面決定部５５４により決定された合焦平面に基づいて、顕微鏡装置により注目領域に対応する標本の領域を、上記低倍率の対物レンズよりも高倍率の対物レンズで観察することにより高解像画像を取得する高解像画像作成部５５５とを備える。【選択図】図３
2014044360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子の標識用の染色及び対比染色が施された標本を、顕微鏡が備える対物レンズに対して該対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、
前記顕微鏡により前記標本を低倍率の対物レンズで観察することにより、低解像の顕微鏡画像を取得する低解像画像取得手段と、
前記低解像の顕微鏡画像の色情報に基づいて、前記低解像の顕微鏡画像から前記標的分子の発現領域を抽出して、注目領域として設定する標的分子発現領域抽出手段と、
前記注目領域に対する合焦平面を決定する合焦平面決定手段と、
前記合焦平面決定手段により決定された合焦平面に基づいて、前記顕微鏡により前記注目領域に対応する前記標本の領域を、前記低倍率の対物レンズよりも高倍率の対物レンズで観察することにより、高解像の顕微鏡画像を取得する高解像画像取得手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２】
前記合焦平面決定手段は、前記注目領域における色情報を用いて合焦評価演算を行うことにより、前記合焦平面を決定することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記注目領域に対し、前記対物レンズの光軸方向における互いに異なる複数箇所をそれぞれ焦点位置とする複数の高解像画像を取得する多焦点高解像画像取得制御手段と、
前記複数の高解像画像に基づいて、焦点深度が拡大された２次元の高解像画像を構築する焦点深度拡大手段と、
をさらに備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記標的分子の標識用の染色は、前記標的分子を茶褐色に標識するＤＡＢ色素を含み、
前記対比染色は、細胞核を青紫色に標識するヘマトキシリン染色を含み、
前記色情報は、前記顕微鏡画像を構成する各画素における色差である、
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
前記各画素は、Ｒ成分、Ｇ成分、及びＢ成分の各色成分を有し、
前記色差は、前記Ｒ成分の強さを表す値をＩ（Ｒ）、前記Ｇ成分の強さを表す値をＩ（Ｇ）、前記Ｂ成分の強さを表す値をＩ（Ｂ）とすると、Ｉ（Ｒ）−Ｉ（Ｇ）又はＩ（Ｒ）−Ｉ（Ｂ）によって与えられる、
ことを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡システム。
【請求項６】
標的分子の標識用の染色及び対比染色が施された標本を、顕微鏡が備える対物レンズに対して該対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムが実行する標本画像生成方法において、
前記顕微鏡により前記標本を低倍率の対物レンズで観察することにより、低解像の顕微鏡画像を取得する低解像画像取得ステップと、
前記低解像の顕微鏡画像の色情報に基づいて、前記低解像の顕微鏡画像から前記標的分子の発現領域を抽出して、注目領域として設定する標的分子発現領域抽出ステップと、
前記注目領域に対する合焦平面を決定する合焦平面決定ステップと、
前記合焦平面決定ステップにより決定された合焦平面に基づいて、前記顕微鏡により前記注目領域に対応する前記標本の領域を、前記低倍率の対物レンズよりも高倍率の対物レンズで観察することにより、高解像の顕微鏡画像を取得する高解像画像取得ステップと、
を含むことを特徴とする標本画像生成方法。
【請求項７】
標的分子の標識用の染色及び対比染色が施された標本を、顕微鏡が備える対物レンズに対して該対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムに実行させる標本画像生成プログラムにおいて、
前記顕微鏡により前記標本を低倍率の対物レンズで観察することにより、低解像の顕微鏡画像を取得する低解像画像取得ステップと、
前記低解像の顕微鏡画像の色情報に基づいて、前記低解像の顕微鏡画像から前記標的分子の発現領域を抽出して、注目領域として設定する標的分子発現領域抽出ステップと、
前記注目領域に対する合焦平面を決定する合焦平面決定ステップと、
前記合焦平面決定ステップにより決定された合焦平面に基づいて、前記顕微鏡により前記注目領域に対応する前記標本の領域を、前記低倍率の対物レンズよりも高倍率の対物レンズで観察することにより、高解像の顕微鏡画像を取得する高解像画像取得ステップと、
を含むことを特徴とする標本画像生成プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数枚の顕微鏡画像を繋ぎ合わせて広視野且つ高解像度の画像を生成する顕微鏡システム、標本画像生成方法、及び標本画像生成プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡によって標本を一度に観察できる範囲は、主に対物レンズの倍率によって決まる。例えば、対物レンズの倍率を高くすると、高精細な（高解像度の）画像が得られる反面、観察範囲が狭くなる。そのため、近年では、電動ステージ等を利用して視野を移動させながら複数枚の画像を撮像し、それらの画像を繋ぎ合わせることで、広視野かつ高精細な顕微鏡画像を作成するシステムが知られている。このようなシステムは、バーチャル顕微鏡システムと呼ばれており、病理診断等において活用されている。また、複数枚の画像を繋ぎ合わせた画像は、バーチャルスライド画像（以下、ＶＳ画像と略す）と呼ばれる。なお、ＶＳ画像は、ホール・スライド・イメージング（Whole  Slide  Imaging）とも呼ばれる。
【０００３】
例えば特許文献１及び２には、標本の範囲を複数の小区画に分割し、各小区画に対応する標本の部分を高倍率の対物レンズで撮像して得られた画像を繋ぎ合わせることにより、広視野且つ高解像度の顕微鏡画像を形成する顕微鏡システムが開示されている。
また、例えば特許文献３及び４にも、広視野且つ高解像度の顕微鏡画像を作成する顕微鏡システムに関する技術が開示されている。
【０００４】
このように標本全体をＶＳ画像として高精細に画像化しておくことにより、例えばパソコンとネットワーク環境があれば、ＶＳ画像の閲覧により、場所や時間を問わずに当該標本を観察することが可能となる。そのため、バーチャル顕微鏡システムは、医学生の病理学実習や、病理医間の遠隔コンサルテーション等にも利用され始めている。
【０００５】
ところで、病理診断においては、観察対象や目的に応じて種々の染色手法や観察法が用いられる。例えば、組織や細胞の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリン及びエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色とも呼ばれる）が病理診断に一般的に用いられる。このような形態観察染色が施された標本に対しては、光学顕微鏡による明視野観察が行われる。
【０００６】
また、病理診断においては、形態情報に基づく形態診断を補完する目的で、標本に分子情報の発現を確認するための染色を施し、標的分子（特定の遺伝子やタンパク）の発現異常といった機能異常を診断する分子学的病理検査が行われることもある。例えば、ＩＨＣ（immunohistochemistry：免疫組織化学）法、ＩＳＨ（in  situ  hybridization）法等により標本に蛍光標識（染色）を施して蛍光観察を行ったり、酵素標識を施して明視野観察を行ったりする。以下、ＩＨＣ法及びＩＳＨ法による標的分子の染色を行うことを標的分子染色と記す。
【０００７】
近年では、癌等の治療として、特定の分子を標的として作用する治療薬を用いた治療（分子標的治療と呼ばれる）が行われており、治療効果の向上と副作用の軽減とが期待されている。分子標的治療においては、癌細胞に特異的に発現する分子（抗原タンパク）を標的とする治療薬が用いられる。このような分子標的治療を行う場合、治療に先立って、例えば、細胞の表面（即ち細胞膜）上に抗体治療薬の標的分子となる抗原が発現しているか否かをＩＨＣ法等で観察し、適応患者の選択を行う。
【０００８】
例えば、乳癌治療においては、標的分子の発現状況に応じたターゲット治療が進んでいる。ターゲット治療においては、腫瘍部における複数の標的分子の発現パターンに応じて病型（細胞亜型）が「Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ」、「Ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ」、「ＨＥＲ２  ｄｉｓｅａｓｅ」、「Ｂａｓａｌ  ｌｉｋｅ」と称す４つの型に分類され、この分類に基づいて治療法の基本的な選択がなされる。具体的には、ホルモン受容体であるエストロゲン受容体（以下、「ＥＲ」と略記する）やプロゲステロン受容体（以下、「ＰｇＲ」と略記する）の細胞核上での発現の有無によってホルモン依存性に増殖する癌か否かを判断し、内分泌療法（ホルモン療法）の適用可否を選択する。また、ＨＥＲ２受容体（以下、「ＨＥＲ２」と略記する）の細胞膜上での発現の有無に応じて抗ＨＥＲ２抗体製剤であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））の適用可否を選択する。そして、ＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２のいずれも発現していない所謂トリプルネガティブ乳癌（Triple  Negative  Breast  Cancer：ＴＮＢＣ）と呼ばれるタイプでは、化学療法を中心に治療を行う。また、最近ではＬｕｍｉｎａｌ型の乳癌において、細胞増殖能を示す核内タンパクであるＫｉ−６７の発現状況に応じてホルモン療法に化学療法を加えるか否かを判断することも行われている。
【０００９】
このように、病理診断における標的分子の発現解析は、治療法の選択において重要である。ところが、標的分子の発現解析のためには、標的分子の発現が陽性である細胞数をカウントする等、非常に手間のかかる作業を行わなくてはならない。このため、画像解析により細胞数を自動でカウントする技術も開発されている。
【００１０】
しかしながら、画像解析を行うためには、標的分子が標識された標本の広視野範囲を高精細に画像化する必要がある。ところが、標本を高精細に画像化したＶＳ画像を作成する際に、ＶＳ画像を構成する各区画（顕微鏡により１回の撮影で画像化される領域）に対し、合焦位置を毎回実測すると、ＶＳ画像の作成に多大な時間がかかってしまう。このため、合焦位置を実測する区画を限定し、実測しない区画に対しては、近傍の区画について実測された合焦位置の値から、補間演算により合焦位置を求めることが行われている（特許文献２及び３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００２−５１４３１９号公報
【特許文献２】特開２００６−３４３５７３号公報
【特許文献３】特表２０００−５０１１８４号公報
【特許文献４】特開平９−２８１４０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、従来、合焦位置を実測する区画は、標的分子の発現状態に無関係に選択されていた。このため、標的分子の発現領域に対する合焦精度が低下し、標的分子の発現解析に支障を来すという問題があった。
【００１３】
また、陽性細胞（標的分子が発現している細胞）を含む区画に対して合焦演算を行う場合、輝度情報に基づく通常の合焦評価演算では、陰性細胞（標的分子が未発現で、対比染色により細胞核が標識されている細胞）も含めた合焦位置が算出されてしまう。このため、陽性細胞と陰性細胞との合焦位置にズレがある場合に、陽性細胞の合焦精度が劣化するという問題もあった。
【００１４】
さらに、標的分子が標識された標本に厚みがある場合、１つの区画内の陽性細胞間においても合焦位置のズレが存在することがあり、発現解析の精度を劣化させるという問題もあった。
【００１５】
このような問題に対し、特許文献２には、Ｚ方向（対物レンズの光軸方向）における互いに異なる複数箇所においてそれぞれ合焦させた複数枚の高解像画像を取得することにより、標本全体を３次元的に高精細にＶＳ画像化し、ユーザにより注目領域を決定した後で非注目領域の情報を圧縮する技術が開示されている。しかしながら、標本全体を３次元的に高精細にＶＳ画像化することは、スキャン時間及び情報圧縮前のファイル容量が膨大になると共に、３次元のＶＳ画像を閲覧する際の操作レスポンス性が問題となることもある。
【００１６】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、標的分子の標識用の染色及び対比染色が施された標本に対し、標的分子の発現情報を広視野且つ高精細に画像化する際に、標的分子の発現領域に対する合焦精度を向上させることができる顕微鏡システム、標本画像生成方法及びプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る顕微鏡システムは、標的分子の標識用の染色及び対比染色が施された標本を、顕微鏡が備える対物レンズに対して該対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、前記顕微鏡により前記標本を低倍率の対物レンズで観察することにより、低解像の顕微鏡画像を取得する低解像画像取得手段と、前記低解像の顕微鏡画像の色情報に基づいて、前記低解像の顕微鏡画像から前記標的分子の発現領域を抽出して、注目領域として設定する標的分子発現領域抽出手段と、前記注目領域に対する合焦平面を決定する合焦平面決定手段と、前記合焦平面決定手段により決定された合焦平面に基づいて、前記顕微鏡により前記注目領域に対応する前記標本の領域を、前記低倍率の対物レンズよりも高倍率の対物レンズで観察することにより、高解像の顕微鏡画像を取得する高解像画像取得手段と、を備えることを特徴とする。
【００１８】
上記顕微鏡システムにおいて、前記合焦平面決定手段は、前記注目領域における色情報を用いて合焦評価演算を行うことにより、前記合焦平面を決定することを特徴とする。
【００１９】
上記顕微鏡システムは、前記注目領域に対し、前記対物レンズの光軸方向における互いに異なる複数箇所をそれぞれ焦点位置とする複数の高解像画像を取得する多焦点高解像画像取得制御手段と、前記複数の高解像画像に基づいて、焦点深度が拡大された２次元の高解像画像を構築する焦点深度拡大手段と、をさらに備えることを特徴とする。
【００２０】
上記顕微鏡システムにおいて、前記標的分子の標識用の染色は、前記標的分子を茶褐色に標識するＤＡＢ色素を含み、前記対比染色は、細胞核を青紫色に標識するヘマトキシリン染色を含み、前記色情報は、前記顕微鏡画像を構成する各画素における色差である、
ことを特徴とする。
【００２１】
上記顕微鏡システムにおいて、前記各画素は、Ｒ成分、Ｇ成分、及びＢ成分の各色成分を有し、前記色差は、前記Ｒ成分の強さを表す値をＩ（Ｒ）、前記Ｇ成分の強さを表す値をＩ（Ｇ）、前記Ｂ成分の強さを表す値をＩ（Ｂ）とすると、Ｉ（Ｒ）−Ｉ（Ｇ）又はＩ（Ｒ）−Ｉ（Ｂ）によって与えられる、ことを特徴とする。
【００２２】
本発明に係る標本画像生成方法は、標的分子の標識用の染色及び対比染色が施された標本を、顕微鏡が備える対物レンズに対して該対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムが実行する標本画像生成方法において、前記顕微鏡により前記標本を低倍率の対物レンズで観察することにより、低解像の顕微鏡画像を取得する低解像画像取得ステップと、前記低解像の顕微鏡画像の色情報に基づいて、前記低解像の顕微鏡画像から前記標的分子の発現領域を抽出して、注目領域として設定する標的分子発現領域抽出ステップと、前記注目領域に対する合焦平面を決定する合焦平面決定ステップと、前記合焦平面決定ステップにより決定された合焦平面に基づいて、前記顕微鏡により前記注目領域に対応する前記標本の領域を、前記低倍率の対物レンズよりも高倍率の対物レンズで観察することにより、高解像の顕微鏡画像を取得する高解像画像取得ステップと、を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る標本画像生成プログラムは、標的分子の標識用の染色及び対比染色が施された標本を、顕微鏡が備える対物レンズに対して該対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムに実行させる標本画像生成プログラムにおいて、前記顕微鏡により前記標本を低倍率の対物レンズで観察することにより、低解像の顕微鏡画像を取得する低解像画像取得ステップと、前記低解像の顕微鏡画像の色情報に基づいて、前記低解像の顕微鏡画像から前記標的分子の発現領域を抽出して、注目領域として設定する標的分子発現領域抽出ステップと、前記注目領域に対する合焦平面を決定する合焦平面決定ステップと、前記合焦平面決定ステップにより決定された合焦平面に基づいて、前記顕微鏡により前記注目領域に対応する前記標本の領域を、前記低倍率の対物レンズよりも高倍率の対物レンズで観察することにより、高解像の顕微鏡画像を取得する高解像画像取得ステップと、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、低解像の顕微鏡画像の色情報を用いて標的分子の発現領域を自動認識し、該発現領域に対して合焦平面を決定するので、標的分子の発現情報を広視野且つ高精細に画像化する際に、標的分子の発現領域に対する合焦精度を向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの構成例を示す模式図である。
【図２】図２は、標本が固定されたスライドガラスの一例を示す模式図である。
【図３】図３は、図１に示すホストシステムの構成例を示すブロック図である。
【図４】図４は、図１に示す顕微鏡システムの動作を示すフローチャート図である。
【図５】図５は、図３に示す注目領域設定部が実行する処理を示すフローチャートである。
【図６Ａ】図６Ａは、標本サーチ範囲の全体画像を示す画像である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａに示す画像から色差をもとに作成された画像である。
【図７】図７は、図６Ｂに示す画像に対して設定された注目領域の拡大図である。
【図８】図８は、標本の断面を示す模式図である。
【図９】図９は、合焦位置の補間演算を説明するための概念図である。
【図１０】図１０は、フォーカスマップの一例を示す表である。
【図１１】図１１は、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡システムが備えるホストシステムの構成を示すブロック図である。
【図１２】図１２は、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡システムの動作を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明に係る実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、これらの実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一の符号を付して示している。
【００２７】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの構成例を示す図である。
図１に示すように、実施の形態１に係る顕微鏡システム１は、顕微鏡装置１０と、顕微鏡装置１０の各部を制御する顕微鏡コントローラ２０と、顕微鏡装置１０に取り付けられたテレビ（ＴＶ）カメラ３０と、ＴＶカメラ３０の動作を制御するテレビ（ＴＶ）カメラコントローラ４０と、これらの各部とデータ送受可能に接続され、顕微鏡システム１全体の動作を統括的に制御するホストシステム５０−１とを備える。この顕微鏡システム１は、顕微鏡装置１０が備える対物レンズに対して標本を対物レンズの光軸と直交する方向に移動させて、撮像視野をずらしながら標本を部分ごとに撮像し、それによって取得した複数の画像を互いに繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像（以下、ＶＳ画像と略す）の生成が可能な顕微鏡システムである。
【００２８】
図２は、スライドガラス標本２の一例を示す模式図である。図２に示すように、スライドガラス標本２は、スライドガラスＳと、スライドガラスＳ上に固定された標本ＳＰとを含む。また、スライドガラスＳ上には、標本ＳＰに関する標本情報が記載されたラベルＬＢが貼付されている。
【００２９】
標本ＳＰは、生体から採取されたブロック状の標本（包埋ブロックとも呼ばれる）を薄切した切片に対して所定の染色を施したものである。標本ＳＰは、スライドガラス標本２上の予め設定された領域である標本サーチ範囲Ａ１内に固定される。標本サーチ範囲Ａ１は、例えば、縦：２５ｍｍ×横：５０ｍｍ程度の大きさである。
【００３０】
顕微鏡装置１０は、透過観察用光学系１１として、透過照明用光源１１０と、透過照明用光源１１０の照明光を集光するコレクタレンズ１１１と、透過用フィルタユニット１１２と、透過シャッタ１１３と、透過視野絞り１１４と、透過開口絞り１１５と、照明光の光路を折り曲げる反射ミラー１１６と、コンデンサ光学素子ユニット１１７と、トップレンズユニット１１８とを有する。また、顕微鏡装置１０は、落射観察用光学系１２として、落射照明用光源１２０と、コレクタレンズ１２１と、落射用フィルタユニット１２２と、落射シャッタ１２３と、落射視野絞り１２４と、落射開口絞り１２５とを有する。
【００３１】
これらの透過観察用光学系１１の光路Ｌ１と落射観察用光学系１２の光路Ｌ２との双方と重なる観察光路Ｌ上には、スライドガラス標本２が載置される電動ステージ１３が設けられている。この電動ステージ１３は、観察光路Ｌに挿入された対物レンズ１４ａの光軸と直交する面（ＸＹ面）内、及び該光軸と平行な方向（Ｚ方向）に沿って移動可能に設けられている。電動ステージ１３の移動制御は、顕微鏡コントローラ２０の制御の下で動作するステージＸ−Ｙ駆動制御部２１及びステージＺ駆動制御部２２により、モータ１３１、１３２をそれぞれ介して行われる。また、電動ステージ１３は、原点センサによる原点位置検出機能（図示せず）を有しており、電動ステージ１３に載置されるスライドガラス標本２上の各位置に対して座標を設定することができる。
【００３２】
電動ステージ１３の上方には、互いに倍率が異なる複数（図１においては２つ）の対物レンズ１４ａ、１４ｂを保持可能なレボルバ１４が設けられている。対物レンズ１４ａ、１４ｂとしては、少なくとも、倍率が比較的低い低倍率（例えば２倍、４倍）の対物レンズ（以下、低倍対物レンズという）と、倍率が低倍対物レンズよりも高い高倍率（例えば、１０倍、２０倍、４０倍）の対物レンズ（以下、高倍対物レンズという）とがあれば良い。なお、低倍及び高倍とした倍率は一例であり、少なくとも一方の倍率が他方の倍率に対して高ければ良い。レボルバ１４は、そのときの観察に使用される対物レンズを回転動作により観察光路Ｌに選択的に挿入する。図１においては、対物レンズ１４ａが観察光路Ｌに挿入された状態を示している。
【００３３】
観察光路Ｌ上には、複数（図１においては２つ）の光学キューブ１５ａ、１５ｂと、これらの光学キューブ１５ａ、１５ｂを保持する光学キューブユニット１５とが設けられている。光学キューブユニット１５は、そのときの検鏡法に応じた光学キューブを観察光路Ｌに選択的に挿入する。図１は、光学キューブ１５ａが観察光路Ｌに挿入された状態を示している。
【００３４】
これらのレボルバ１４及び光学キューブユニット１５は電動化されており、その動作は顕微鏡コントローラ２０によって制御される。
【００３５】
さらに、観察光路Ｌ上には、対物レンズ１４ａを通過した観察光を接眼レンズ１７側とＴＶカメラ３０側とに分岐するビームスプリッタ１６とが備えられている。
【００３６】
顕微鏡コントローラ２０は、顕微鏡装置１０全体の動作を制御する機能を有し、ホストシステム５０−１からの制御信号に応じて、検鏡法の変更や、透過照明用光源１１０及び落射照明用光源１２０の調光といった各ユニットの制御を行うと共に、各ユニットの現在の状態を検出して、検出信号をホストシステム５０−１に送出する。また、顕微鏡コントローラ２０は、ホストシステム５０−１からの制御信号に応じて、ステージＸ−Ｙ駆動制御部２１及びステージＺ駆動制御部２２を介して、電動ステージ１３の移動制御を行う。
【００３７】
ＴＶカメラ３０は、各画素位置においてＲ（赤）、Ｇ（緑）、Ｂ（青）の各色成分（波長成分）に対して、例えば２５６階調の画素レベル（画素値）を持つカラー画像の生成が可能な撮像装置である。ＴＶカメラ３０には、受光した観察光を電気信号に変換して画像データを生成するＣＣＤ等の撮像素子が設けられている。ＴＶカメラ３０において生成された画像データは、後述するビデオボード５１によりホストシステム５０−１に取り込まれる。また、ＴＶカメラ３０に対する自動ゲイン制御のＯＮ／ＯＦＦ、ゲイン設定、自動露出制御のＯＮ／ＯＦＦ、及び露光時間の設定といった各種設定は、ＴＶカメラコントローラ４０を介してホストシステム５０−１の制御の下で行われる。
【００３８】
ホストシステム５０−１は、ＣＰＵやビデオボード、メインメモリ等の主記憶装置、ハードディスクや各種記憶媒体等の外部記憶装置、通信装置、表示装置や印刷装置等の出力装置、入力装置、各部を接続し、あるいは外部入力を接続するインタフェース装置等を備えた公知のハードウェア構成（例えば、ワークステーションやパソコン等の汎用コンピュータ）によって実現される。
【００３９】
図３は、ホストシステム５０−１の構成を示すブロック図である。図３に示すように、ホストシステム５０−１は、ＴＶカメラ３０から入力されるビデオ信号を処理するビデオボード５１と、入力部５２と、モニタ５３と、記録部５４と、これらの各部及び顕微鏡システム１全体の動作を制御する制御部５５とを備える。この他、ホストシステム５０−１は、制御部５５がワークメモリとして使用するメインメモリや、図１に示す顕微鏡システムを構成する各部との間で各種データの授受を管理するインタフェースユニット等（いずれも図示せず）を備える。
【００４０】
入力部５２は、ユーザが各種情報や命令を当該ホストシステム５０−１に入力する際に用いられるマウスやキーボード等の入力デバイスを含み、これらの入力デバイスを介して入力された入力信号を制御部５５に入力する。
【００４１】
モニタ５３は、ＬＣＤやＥＬディスプレイ等の表示装置によって実現され、顕微鏡装置１０を操作するための操作画面や、顕微鏡装置１０によって撮像された顕微鏡画像や、複数の顕微鏡画像を繋ぎ合わせたＶＳ画像や、これらの画像の関連情報等を表示する。
【００４２】
記録部５４は、画像データ記録部５４１、発現量記録部５４２、撮像座標記録部５４３、及びプログラム記録部５４４を備え、例えば、更新記録可能なフラッシュメモリ等のＲＯＭやＲＡＭといった各種ＩＣメモリ、内蔵若しくは外付けハードディスク、又は、ＣＤ−ＲＯＭ等の情報記録媒体及びその読取装置によって実現される。
【００４３】
画像データ記録部５４１は、ビデオボード５１を介して入力された画像データを記録する。画像データ記録部５４１に記録された画像データは、例えば、任意のときに（例えばユーザによる入力部５２への操作に応じて）制御部５５によって読み出され、モニタ５３に出力される。それにより、当該画像データによって表される顕微鏡画像がモニタ５３に表示される。なお、画像データ記録部５４１は、ハードディスクや大容量メモリ等によって実現することが好ましい。
【００４４】
発現量記録部５４２は、観察対象である標本ＳＰの各位置における標的分子の発現量を記録する。
撮像座標記録部５４３は、スライドガラス標本２上の標本サーチ範囲Ａ１を撮像する際のＸＹＺ座標（合焦位置座標）を記録する。
プログラム記録部５４４は、顕微鏡システム１の動作を制御するための各種制御プログラムや、これらの制御プログラムの実行中に用いられるデータ等を記録する。
【００４５】
制御部５５は、例えばＣＰＵ等のハードウェアによって実現され、プログラム記録部５４４に記録されている制御プログラムを読み込むことにより、顕微鏡システム１の制御や顕微鏡画像の画像処理をはじめとする各種機能を実行する。制御部５５は、合焦位置算出部５５１と、低解像画像作成部（低解像画像取得手段）５５２と、注目領域設定部（標的分子発現領域抽出手段）５５３と、合焦平面決定部（合焦平面決定手段）５５４と、高解像画像作成部（高解像画像取得手段）５５５とを有する。
【００４６】
合焦位置算出部５５１は、スライドガラス標本２上の標本サーチ範囲Ａ１を撮像する際に、ＴＶカメラ３０を介して入力される画像のコントラストに基づき、顕微鏡装置１０に合焦動作（所謂、ビデオＡＦ機能）を実行させて、合焦位置座標（Ｚ座標）を算出する。
【００４７】
低解像画像作成部５５２は、合焦位置算出部５５１による合焦位置座標の算出結果に基づいて顕微鏡装置１０に撮像を実行させることにより、標本ＳＰの全体を含む標本サーチ範囲Ａ１を低倍率の対物レンズで観察した標本全体像（低解像ＶＳ画像）を取得する。
【００４８】
注目領域設定部５５３は、標的分子の染色情報に基づき、低解像画像作成部５５２により取得された標本全体像の色情報を用いて標的分子が発現する領域を抽出し、抽出した領域を注目領域として設定する。
【００４９】
合焦平面決定部５５４は、注目領域設定部５５３により設定された注目領域に対して顕微鏡装置１０に合焦動作を実行させることにより、合焦位置座標を算出し、合焦平面を決定する。合焦平面決定部５５４が算出した合焦位置座標は、撮像座標記録部５４３に格納されたフォーカスマップ（後述）に記録される。
【００５０】
高解像画像作成部５５５は、合焦平面決定部５５４により注目領域に対して決定された合焦平面に基づいて顕微鏡装置１０に撮像を実行させることにより、注目領域を高倍率の対物レンズで観察した高解像画像を取得する。さらに、取得した高解像画像を用いて、高解像のＶＳ画像を作成する。
【００５１】
この他、制御部５５は、スライドガラス標本２の画像を取得する際に、顕微鏡コントローラ２０に制御信号を送信して、顕微鏡装置１０の各部に対する制御（電動ステージ１３の移動制御、検鏡法の変更等）を行う。また、制御部５５は、顕微鏡コントローラ２０を介して顕微鏡装置１０の各部の状態検出等を行う。なお、以下の説明においては、この様な制御や状態検出については逐一説明しないものとする。
【００５２】
次に、顕微鏡システム１の動作について説明する。図４は、顕微鏡システム１の動作を示すフローチャートである。
本実施の形態１においては、一例として、標本ＳＰに対し、標的分子を標識する標的分子染色として、標識酵素にペルオキシダーゼを、発色基質にジアミノベンジジン（以下、ＤＡＢ色素と記す）を用いたＤＡＢ法により免疫染色を施すと共に、ヘマトキリシン（以下、Ｈ色素と記す）による対比染色を施す。この場合、Ｈ色素により細胞核が青紫色に染色され、ＤＡＢ色素により標的分子の存在領域が茶褐色で表色される。
【００５３】
まず、ステップＳ１１０において、顕微鏡システム１は、例えば２倍といった低倍対物レンズを観察光路Ｌに挿入する。
【００５４】
続くステップＳ１２０において、顕微鏡システム１は、スライド全体の低解像画像を取得する。即ち、スライドガラス標本２（図２参照）上の標本サーチ範囲Ａ１全体を低倍率で撮像したＶＳ画像（低解像ＶＳ画像）を作成する。
【００５５】
より詳細には、顕微鏡システム１はまず、ＴＶカメラ３０に投影される撮像領域の幅に応じて、標本サーチ範囲Ａ１を複数の区画に分割する。言い換えると、ステップＳ１１０において観察光路Ｌに挿入された対物レンズ１４ａの倍率に応じて、区画の分割を行う。そして、電動ステージ１３をＸＹ方向移動させることにより、分割された各区画を順次対物レンズ１４ａの撮像視野に入れ、ＴＶカメラ３０により顕微鏡画像の撮像を繰り返し行う。このようにして取得された複数の顕微鏡画像（即ち、低倍率の各区画の画像）はホストシステム５０−１に順次入力される。ホストシステム５０−１において、低解像画像作成部５５２は、入力された複数の顕微鏡画像を相互に結合することで、標本サーチ範囲Ａ１全体の画像を生成し、標本サーチ範囲画像データとして画像データ記録部５４１に記録する。
【００５６】
続くステップＳ１３０において、顕微鏡システム１は、例えば２０倍等、予め決定された高倍対物レンズを観察光路Ｌに挿入する。
【００５７】
ステップＳ１４０において、注目領域設定部５５３は、標的分子の染色情報に基づき、標本サーチ範囲Ａ１全体が写った低解像ＶＳ画像から標的分子の発現領域を抽出し、該発現領域を注目領域に設定する。
【００５８】
ここで、標本ＳＰにおいて、標的分子はＤＡＢ色素により茶褐色に染色されている。この茶褐色に染色された領域における各色成分の強さの関係は、一般的に、Ｒ成分が突出して強く、その他は、Ｇ成分がＢ成分よりも強いという関係となる。即ち、Ｒ成分の強さを表す値（例えば画素値）をＩ（Ｒ）、Ｇ成分の強さを表す値（同上）をＩ（Ｇ）、Ｂ成分の強さを表す値（同上）をＩ（Ｂ）とすると、Ｉ（Ｒ）≫Ｉ（Ｇ）＞Ｉ（Ｂ）という関係になる。一方、標本ＳＰにおいては、Ｈ色素を用いた対比染色により、主に細胞核が青紫色に染色されている。そして、青紫色に染色された領域においては、一般的に、Ｂ成分が突出して強く、その他は、Ｇ成分がＲ成分よりも強いという関係になる。即ち、Ｉ（Ｂ）≫Ｉ（Ｇ）＞Ｉ（Ｒ）という関係になる。本実施の形態１においては、このような標的分子染色及び対比染色の染色情報に基づき、標本ＳＰを撮像した画像における色情報（色差、色比、色相等）を用いることにより、特異的にＤＡＢ色素で染められている領域を抽出する。
【００５９】
例えば、標本ＳＰを撮像した画像内の各画素に対し、色差Ｉ（Ｒ）−Ｉ（Ｇ）を算出すると、Ｈ色素により染色された領域は負の値となる。また、標本が存在しない背景部（即ち、無彩色の領域）において、各色成分の強さはＩ（Ｒ）≒Ｉ（Ｇ）≒Ｉ（Ｂ）≒０となる。そこで、適切な閾値を定めることにより、ＤＡＢ色素により彩色された領域のみを抽出することができる。
【００６０】
図５は、ステップＳ１４０において注目領域設定部５５３が実行する処理の詳細を示すフローチャートである。また、図６Ａは、標本サーチ範囲Ａ１全体が写った標本全体像（低解像ＶＳ画像）を表す画像の例である。なお、図６Ａに示す画像Ｍ１は、実際にはＲ、Ｇ、Ｂの各成分からなるカラー画像である。
【００６１】
図５のステップＳ１４１において、注目領域設定部５５３は、図６Ａに示す画像Ｍ１を、ステップＳ１３０において観察光路Ｌに挿入された高倍対物レンズの倍率により規定されるサイズの複数の区画ｃi（ｉ＝１〜ｎ、ｎは、対物レンズ１４ａの倍率に応じて決まる定数）に分割する。
【００６２】
続くステップＳ１４２において、注目領域設定部５５３は、区画ｃiの識別符号ｉを「１」に設定する。そして、各区画ｃiに対してステップＳ１４３〜Ｓ１４５の処理を順次行う。
【００６３】
即ち、ステップＳ１４３において、注目領域設定部５５３は、区画ｃi内の各画素の色差Ｉ（Ｒ）−Ｉ（Ｇ）を求める。この際、色差の算出結果が負となる画素については、一律に、色差を０に設定し、標的分子の未発現領域とする。
【００６４】
ステップＳ１４４において、注目領域設定部５５３は、区画ｃi内の各画素に対する色差の演算結果に対し、メディアンフィルタ等の孤立点除去フィルタ処理を施すことにより、孤立点（微細なノイズ等）を除去する。
【００６５】
ステップＳ１４５において、注目領域設定部５５３は、区画ｃi内において、各画素の色差の合計値（ＳＵＭ値）を算出する。注目領域設定部５５３は、このようにして区画ｃiごとに算出した色差のＳＵＭ値を、標的分子の発現量として、区画ｃiの座標と関連付けたテーブルの形式で発現量記録部５４２に記録する。以下において、区画ｃiごとの標的分子の発現量が記録されたテーブルのことを、標的分子発現マップという。
【００６６】
ステップＳ１４６において、注目領域設定部５５３は、当該区画ｃiにおける標的分子の発現の有無を判定する。即ち、標的分子発現マップに記録した標的分子の発現量が所定の閾値以上である場合、当該区画ｃiは標的分子の発現区画であると判定する。一方、標的分子の発現量が閾値未満である場合、当該区画ｃiは標的分子の未発現区画であると判定する。注目領域設定部５５３は、この判定結果を、上述した標的分子発現マップに記録する。
【００６７】
ステップＳ１４７において、注目領域設定部５５３は、画像Ｍ１内の全区画ｃiに対して標的分子の発現の判定処理が終了したか否か（即ち、ｉ＝ｎか否か）を判定する。全区画に対する判定処理が終了していない場合（ステップＳ１４７：Ｎｏ）、区画ｃiの識別符号ｉをインクリメントし（ステップＳ１４８）、その後、処理はステップＳ１４３に以降する。一方、全区画に対する判定処理が終了した場合（ステップＳ１４７：Ｙｅｓ）、処理はメインルーチンに戻る。
【００６８】
注目領域設定部５５３は、標的分子発現マップに基づき、標的分子の発現区画と判定された区画ｃiを注目領域に設定する。
【００６９】
図６Ｂは、図６Ａに示す画像Ｍ１の各画素の画素値から算出された色差をもとに作成された画像である。なお、図６Ｂに示す画像Ｍ２は、色差Ｉ（Ｒ）−Ｉ（Ｇ）に基づくモノクロ画像となる。図６Ｂに示すように、画像Ｍ１から色差Ｉ（Ｒ）−Ｉ（Ｇ）を算出することにより、茶褐色に染色された標的分子の発現領域ｍ１が抽出される。この標的分子の発現領域ｍ１を含む領域が注目領域Ａ２に設定される。
【００７０】
図４のステップＳ１５０において、合焦平面決定部５５４は、画像Ｍ２内の区画ｃiのうち、注目領域Ａ２に含まれる各区画ｃaを高解像画像の取得対象区画とし、高解像画像の取得対象区画の内から、合焦位置を実測するポイント（フォーカス位置実測ポイント）を決定する。図７は、図６Ｂに示す注目領域Ａ２の拡大図である。図７においては、注目領域Ａ２内の区画ｃaのうち、フォーカス位置実測ポイントとして決定された区画ｃpを斜線で示している。
【００７１】
ここで、注目領域Ａ２内の区画ｃaの数が多い場合、全ての区画ｃaに対して実測により合焦位置を求めようとすると、非常に時間がかかってしまう。そこで、本実施の形態１においては、注目領域Ａ２内の区画ｃaの中から、サンプリング（実測）する区画（フォーカス位置実測ポイント）ｃpを自動抽出する。この自動抽出は、ランダムに行っても良いし、規則的に（例えば、予め設定された所定数おきに）行っても良い。また、抽出されるフォーカス位置実測ポイントｃpの数は、注目領域Ａ２内の区画ｃaの数に応じて、所定の数以下となるように設定しても良い。つまり、フォーカス位置実測ポイントｃpの自動抽出処理の内容は任意に定めても良い。
【００７２】
続くステップＳ１６０において、顕微鏡システム１は、注目領域Ａ２内の各区画ｃaにおける合焦位置（Ｚ座標）を記録したフォーカスマップを作成する。
そのために、まず、顕微鏡システム１は、ＸＹ方向において電動ステージ１３の移動制御を行い、ステップＳ１５０において抽出した各フォーカス位置実測ポイントｃpを対物レンズ１４ａの光軸に順次合わせる。次に、Ｚ軸上で電動ステージ１３の移動制御を行いながら、ＴＶカメラ３０を介して標本像をホストシステム５０−１に入力し、合焦平面決定部５５４が合焦評価演算を行うことにより、合焦位置（Ｚ座標）を実測する。
【００７３】
この際、合焦平面決定部５５４は、注目領域Ａ２の中でも、陽性細胞（標的分子が発現している細胞）のみを合焦評価演算の対象とするために、通常の合焦評価演算で用いられる輝度情報ではなく、色差、色比、色相等の色情報を利用して合焦評価演算を行う。
【００７４】
ここで、図８は、ある区画ｃaに対応する標本ＳＰのＺ軸を含む断面を示す模式図である。図８に示すように、標的分子染色及び対比染色が施された標本ＳＰにおいては、標的分子の発現部位ｍ２と、対比染色による染色部位（例えば細胞核）ｍ３とが異なる合焦位置に存在する場合がある。このため、区画ｃaに対する合焦評価演算において輝度情報を用いると、画像解析対象である発現部位ｍ２の他に、対比染色による染色部位ｍ３も含めて合焦位置が評価されてしまい、発現部位ｍ２の合焦精度が低下してしまうおそれがある。
【００７５】
そこで、本実施の形態１においては、輝度情報の代わりに色情報を用いて合焦評価演算を行い、その演算結果（合焦評価値）が最大となるＺ座標を合焦位置として決定する。それにより、合焦評価演算の対象が発現部位ｍ２に限定され、合焦精度を向上させることができる。色情報としては、色差Ｉ（Ｒ）−Ｉ（Ｇ）の他、Ｉ（Ｒ）−Ｉ（Ｂ）等を用いても良い。
【００７６】
また、合焦評価演算においては、色差の総和を合焦評価値として用いても良い。或いは、焦点が合っている場合にエッジ部の立ち上がりが急峻に立ち上がることを利用して、ｓｏｂｅｌフィルタ等の一次微分フィルタ処理によるエッジ検出データの総和を合焦評価値として用いても良い。
【００７７】
続いて、合焦平面決定部５５４は、注目領域Ａ２のうち、フォーカス位置実測ポイントｃpとして抽出されなかった区画ｃaに対し、近傍のフォーカス位置実測ポイントｃpにおける合焦位置の実測値に基づき、補間演算により合焦位置（Ｚ座標）を算出する。
【００７８】
図９は、補間演算を説明するための概念図である。図９に示すように、演算対象である区画ｃaの近傍のフォーカス位置実測ポイントｃpj（ｊ＝１〜ｍ、図９においてはｍ＝５）における合焦位置をＺj、区画ｃaからの距離をＬjとすると、区画ｃaの合焦位置Ｚは、次式（１）により与えられる。
Ｚ＝Σ（Ｚj／Ｌj）／Σ（１／Ｌj）  …（１）
【００７９】
合焦平面決定部５５４は、このように実測又は補間演算により取得した各区画ｃaにおける合焦位置（Ｚ座標）を、上述した標的分子発現マップに対応付けることによりフォーカスマップを作成し、撮像座標記録部５４３に記録する。
【００８０】
図１０は、フォーカスマップの一例を示す表である。図１０に示すように、フォーカスマップＭ３は、各区画ｃaに割り当てられた座標番号（００１，００１）、（００２，００１）、…と、各区画ｃaにおける標的分子の発現量と、電動ステージ１３の座標情報（ステージ座標）と、合焦評価値とを含む。座標情報は、光路Ｌに挿入された高倍対物レンズの撮像視野に各区画ｃaを合わせたときの電動ステージ１３のＸ軸及びＹ軸方向の座標、並びに、合焦位置であるＺ軸の座標とを含む。このようなフォーカスマップＭ３は、撮像座標記録部５４３に格納される。
【００８１】
続くステップＳ１７０において、顕微鏡システム１は、フォーカスマップＭ３に登録された情報をもとに、標的分子の発現領域ｍ１が写った高解像のＶＳ画像を作成する。より詳細には、制御部５５は、顕微鏡コントローラ２０及びＴＶカメラコントローラ４０を介して、電動ステージ１３をフォーカスマップＭ３に登録されたステージ座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に順次移動させ、電動ステージ１３が移動するごとに、各区画ｃaに対応する標本ＳＰの領域を、高倍対物レンズを介してＴＶカメラ３０に撮像させる。それによって生成された画像データは、ホストシステム５０−１に入力される。
【００８２】
ホストシステム５０−１において、高解像画像作成部５５５は、入力された画像データに基づき、互いに隣接する区画ｃa同士の顕微鏡画像を繋ぎ合わせる連結処理を行う。このような電動ステージ１３の移動、画像データの入力、及び顕微鏡画像の連結処理という一連の動作を、フォーカスマップＭ３に登録された全ての区画ｃa（標的分子の発現区画）に対して繰返すことで、標的分子の発現領域ｍ１全体が写った広視野で高精細の顕微鏡画像（高解像ＶＳ画像）が作成される。このように作成された高解像ＶＳ画像の画像データを含む画像ファイルは、画像データ記録部５４１に格納される。
【００８３】
なお、上記画像ファイルには、高解像ＶＳ画像の画像データの他、標本サーチ範囲Ａ１（図２参照）全体が写った低解像ＶＳ画像、及び標的分子発現マップの情報も併せて記録される。従って、高解像ＶＳ画像の閲覧時に、標的分子の非発現区画が表示領域に含まれる場合には、制御部５５は、標本サーチ範囲Ａ１の低解像ＶＳ画像から当該非発現区画に対応する領域の画像を流用し、倍率を補正して補間表示することとしても良い。
【００８４】
また、制御部５５は、標的分子の発現領域の高解像ＶＳ画像を画面表示する際に、標的分子発現マップ情報をもとに、標的分子の発現量の高い領域を画面の中央に寄せて配置する、所謂リコール表示を行っても良い。或いは、高解像ＶＳ画像が表示された画面に対し、例えば、標的分子の発現量の高い領域を囲むマーカーや、標的分子の発現量の高い領域を指す矢印等を重ねて表示しても良い。このような表示を行うことで、ユーザが発現解析を行う際の効率を向上させることが可能となる。
【００８５】
以上、説明したように、本実施の形態１によれば、標本ＳＰを染色した染色情報に基づき、低解像ＶＳ画像における色情報を用いて標的分子の発現領域を自動抽出し、抽出された領域に対して合焦評価演算を行うので、病理標本上で標的分子が発現している領域に対し、精度よく合焦位置を決定することができる。この際、本実施の形態１においては、色情報を用いて合焦評価演算を行うので、対比染色の影響を受けることがなくなり、標的分子の発現領域に対する合焦精度をさらに向上させることができる。従って、本実施の形態１によれば、標的分子の発現情報を高精細に画像化することが可能となる。それにより、合焦不良に起因する解析エラーを低減させ、標的分子の発現解析の精度を向上させることが可能となる。
【００８６】
具体的には、標的分子の標識用の染色としてＤＡＢ染色、対比染色としてＨ染色が施されている場合、ＤＡＢにより茶褐色に染色された標的分子の発現領域を、ヘマトキシリンにより青紫色に染色された細胞核等から識別し、標的分子の発現領域に対して高精度に合焦された高精細な画像を取得することが可能となる。
【００８７】
また、本実施の形態１によれば、注目領域から合焦位置を実測するポイントを抽出すると共に、それ以外のポイントについては合焦位置の実測値に基づく補間演算により合焦位置を算出するので、高精細な画像を短時間に効率良く生成することが可能となる。さらに、必要以上の高解像画像を保持することがなくなるので、ファイル容量を抑制することが可能となる。
【００８８】
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。
図１１は、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡システムが備えるホストシステムの構成を示すブロック図である。本発明の実施の形態２に係る顕微鏡システムの構成は、全体として図１に示すものと同様であり、図１に示すホストシステム５０−１の代わりに、図１１に示すホストシステム５０−２を備える。
【００８９】
図１１に示すように、ホストシステム５０−２は、図３に示すホストシステム５０−１に対し、多焦点画像取得制御部（多焦点高解像画像取得制御手段）５６１及び焦点深度拡大部（焦点深度拡大手段）５６２をさらに有する制御部５６を備える。ホストシステム５０−２のその他の構成については、図３と同様である。
【００９０】
多焦点画像取得制御部５６１は、注目領域設定部５５３により設定された注目領域Ａ２（図７参照）内の各区画ｃaに対し、対物レンズ１４ａの光軸方向における互いに異なる複数箇所をそれぞれ焦点位置として、複数の高解像画像を取得する制御を行う。
【００９１】
焦点深度拡大部５６２は、多焦点画像取得制御部５６１の制御により取得された複数の高解像画像を用いて、焦点深度が拡大された２次元の高解像画像を構築する。
【００９２】
次に、本実施の形態２に係る顕微鏡システムの動作について説明する。本実施の形態２に係る顕微鏡システムの動作は、全体として実施の形態１（図４参照）と同様であり、標本分子の発現領域の高解像画像を取得する動作（ステップＳ１７０）の詳細が実施の形態１とは異なる。図１２は、ステップＳ１７０における顕微鏡システムの動作を説明するための模式図である。
【００９３】
ステップＳ１６０に続くステップＳ１７０において、顕微鏡システムは、フォーカスマップＭ３（図１０参照）に登録された情報をもとに、標的分子の発現領域ｍ１が写った高解像画像を取得する。より詳細には、多焦点画像取得制御部５６１は、顕微鏡コントローラ２０及びＴＶカメラコントローラ４０を介して、電動ステージ１３をフォーカスマップＭ３に登録されたステージ座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に移動させ、高倍対物レンズを用いて、区画ｃaに対応する標本ＳＰの領域をＴＶカメラ３０に撮像させると共に、登録されたＺ座標を中心とし、Ｚ軸方向の上下の所定距離に電動ステージ１３を移動させ、当該区画ｃaをさらに撮像させる。
【００９４】
例えば、図１２に示すように、ある区画ｃaに対応するステージ座標（Ｘ，Ｙ）に対し、合焦位置としてＺ＝Ｚ0がフォーカスマップＭ３に記録されている場合、図１２に示すように、当該区画ｃaに対し、Ｚ座標がＺ0、Ｚ0からΔｚだけプラスＺ軸方向に移動したＺ+1、Ｚ0から２ΔｚだけプラスＺ軸方向に移動したＺ+2、Ｚ0からΔｚだけマイナスＺ軸方向に移動したＺ-1、及び、Ｚ0から２ΔｚだけマイナスＺ軸方向に移動したＺ+2、の計５平面における焦点を合わせて撮像が行われる。それによって生成された高解像画像の画像データは、ホストシステム５０−２に入力される。
【００９５】
ホストシステム５０−２において、焦点深度拡大部５６２は、各区画ｃaに対して取得された焦点位置が互いに異なる複数の高解像画像を用いて、焦点深度が拡大された１つの画像を作成する。具体的には、例えば特開平１−３０９４７８号公報に開示されているように、画像加算及び空間周波数フィルタリングによる公知の回復フィルタ処理を施す。これにより、光軸方向の互いに異なる複数の位置に存在する標的分子に対して合焦された画像が作成される。
【００９６】
高解像画像作成部５５５は、焦点深度拡大部５６２によって各区画ｃaについて作成された画像を、互いに隣接する区画ｃa同士で繋ぎ合わせることにより、広視野で高精細の顕微鏡画像（ＶＳ画像）を作成する。
【００９７】
以上説明したように、本実施の形態２によれば、病理標本に厚みがある場合であっても、互いに異なる深さ（Ｚ方向の位置）に存在する標的分子の各々に対して精度良く合焦された高解像画像を取得することができる。従って、標的分子の発現の認識率を向上させることが可能となる。
【００９８】
（変形例１）
上述した焦点深度の拡大処理、即ち、多焦点画像取得制御部５６１の制御による合焦位置が互いに異なる複数の高解像画像の取得、及び、焦点深度拡大部５６２による画像処理は、標的分子発現マップに登録されている標的分子の発現量に応じて、実行するか否かを決定することとしても良い。具体的には、標的分子の発現量が所定の閾値以上である区画ｃaに対してのみ、焦点深度の拡大処理を実行する。この場合、標的分子の発現解析に必要な高精細な画像を、早く、且つ効率的に取得することが可能となる。
【００９９】
また、標的分子の発現区画が多数存在する場合、上述した焦点深度の拡大処理を、発現量の高い区画から順に、所定の区画数（例えば、上位１００区画）に対してのみ実行することとしても良い。或いは、連続する発現区画の個数（即ち、発現領域の面積）に応じて、焦点深度の拡大処理を行うか否かを決定しても良い。例えば、所定数以上が連続する区画に対してのみ、当該処理を行うこととしても良い。
【０１００】
（変形例２）
上述した多焦点画像取得制御部５６１の制御により、１つの区画ｃaに対して合焦位置を変えて取得した複数の高解像画像の別の利用方法として、例えば、合焦位置（Ｚ座標）ごとにＶＳ画像を作成して順次表示することとしても良い。或いは、これらの複数の高解像画像を用いて、３次元的な画像を構築しても良い。
【０１０１】
以上説明した本発明は、上述した実施の形態１及び２並びに変形例そのままに限定されるものではなく、各実施の形態１及び２並びに変形例に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることによって、種々の発明を形成することができる。例えば、実施の形態に示される全構成要素からいくつかの構成要素を除外して形成してもよい。あるいは、異なる実施の形態に示した構成要素を適宜組み合わせて形成してもよい。
【符号の説明】
【０１０２】
１  顕微鏡システム
２  スライドガラス標本
１０  顕微鏡装置
１１  透過観察用光学系
１１０  透過照明用光源
１１１  コレクタレンズ
１１２  透過用フィルタユニット
１１３  透過シャッタ
１１６  反射ミラー
１１７  コンデンサ光学素子ユニット
１１８  トップレンズユニット
１２  落射観察用光学系
１２０  落射照明用光源
１２１  コレクタレンズ
１２２  落射用フィルタユニット
１２３  落射シャッタ
１３  電動ステージ
１３１、１３２  モータ
１４  レボルバ
１４ａ、１４ｂ  対物レンズ
１５  光学キューブユニット
１５ａ、１５ｂ  光学キューブ
１６  ビームスプリッタ
１７  接眼レンズ
２０  顕微鏡コントローラ
２１  ステージＸ−Ｙ駆動制御部
２２  ステージＺ駆動制御部
３０  テレビ（ＴＶ）カメラ
４０  テレビ（ＴＶ）カメラコントローラ
５０−１、５０−２  ホストシステム
５１  ビデオボード
５２  入力部
５３  モニタ
５４  記録部
５４１  画像データ記録部
５４２  発現量記録部
５４３  撮像座標記録部
５４４  プログラム記録部
５５、５６  制御部
５５１  合焦位置算出部
５５２  低解像画像作成部
５５３  注目領域設定部
５５４  合焦平面決定部
５５５  高解像画像作成部
５６１  多焦点画像取得制御部
５６２  焦点深度拡大部
【図１】
2014044360.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
2014044360.tif 000009
【図１０】
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【図１１】
2014044360.tif 000011
【図１２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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