(57)【要約】【課題】精度よく肝細胞がん再発リスクを判定できるバイオマーカーを用いた、肝細胞がん再発リスクを判定する方法や肝細胞がん再発リスクの判定用キットを提供すること。【解決手段】７種類の遺伝子（ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ、ＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１）をバイオマーカーとして用いることにより、精度よく肝細胞がん再発リスクを判定することができる。また、かかる７種類のバイオマーカー遺伝子のうち、３種類のバイオマーカー遺伝子（ＳＬＣ２２Ａ１、ＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１）を選択し、さらにＣＯＬ１５Ａ１及びＡＢＣＢ６遺伝子をバイオマーカーとして選択して判別分析を行うと、術後２年以内肝細胞がん再発症群の中で「術後２年以内肝細胞がん再発症あり」と判定されるのは８８％（感度）であるのに対して、術後２年を超えて肝細胞がん無再発症群の中で「術後２年を超えて肝細胞がん再発症なし」と判定されるのは１００％（特異度）であり、肝細胞がん再発症リスクを高精度に判定できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［Ａグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現減少、又はそれらがコードするタンパク質の発現減少、あるいは、［Ｂグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現増加を検出することを特徴とする、肝細胞がん発症リスクを判定する方法。
［Ａグループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ
［Ｂグループ］
ＴＳＰＡＮ８、ＮＱＯ１
【請求項２】
遺伝子が、［Ａグループ］に含まれる以下の［Ａ’グループ］、又は［Ｂグループ］に含まれる以下の［Ｂ’グループ］から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
［Ａ’グループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１
［Ｂ’グループ］
ＴＳＰＡＮ８
【請求項３】
遺伝子が、［Ａグループ］に含まれるＥＳＲ１、又は［Ｂグループ］に含まれるＮＱＯ１であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
［Ａグループ］及び／又は［Ｂグループ］における遺伝子から４以上を選択して判別分析を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８を選択することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８とを選択することを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
［Ａグループ］及び／又は［Ｂグループ］における遺伝子に加えて、さらに、以下の［Ｃグループ］における遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現増加、及び／又は［Ｄグループ］における遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現減少を検出し、判別分析を行うことを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
［Ｃグループ］
ＣＯＬ１５Ａ１
［Ｄグループ］
ＡＢＣＢ６
【請求項８】
［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ２２Ａ１と、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６とを選択することを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
以下の［Ａグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現、あるいは、［Ｂグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする、肝細胞がん発症リスクの判定用キット。
［Ａグループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ
［Ｂグループ］
ＴＳＰＡＮ８、ＮＱＯ１
【請求項１０】
遺伝子が、［Ａグループ］に含まれる以下の［Ａ’グループ］、又は［Ｂグループ］に含まれる以下の［Ｂ’グループ］から選択されることを特徴とする請求項９に記載のキット。
［Ａ’グループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１
［Ｂ’グループ］
ＴＳＰＡＮ８
【請求項１１】
遺伝子が、［Ａグループ］に含まれるＥＳＲ１、又は［Ｂグループ］に含まれるＮＱＯ１であることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
以下の［Ａグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、あるいは、［Ｂグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする、肝細胞がん発症リスクの判定用キット。
［Ａグループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ
［Ｂグループ］
ＴＳＰＡＮ８、ＮＱＯ１
【請求項１３】
遺伝子が、［Ａグループ］に含まれる以下の［Ａ’グループ］、又は［Ｂグループ］に含まれる以下の［Ｂ’グループ］から選択されることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
［Ａ’グループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１
［Ｂ’グループ］
ＴＳＰＡＮ８
【請求項１４】
遺伝子が、［Ａグループ］に含まれるＥＳＲ１、又は［Ｂグループ］に含まれるＮＱＯ１であることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞がん発症リスクの判定方法や判定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国では死亡原因の第一位はがんであり、その対策は国民の健康という観点から最重要課題となっている。肝細胞がん（hepatocellular carcinoma；ＨＣＣ、以下、「ＨＣＣ」ということもある）は、世界中で最も頻出の高い固形がんのひとつであり、２００９年の日本におけるＨＣＣによる死亡率は、がんの中でも３番目に高いことが報告されている。ＨＣＣは、その殆どがウイルス感染に起因する慢性肝炎や、慢性肝炎から進行した肝硬変を背景として発症することが知られており、ＨＣＣ患者の中で、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に陽性である人の割合は約７０％、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に陽性である人の割合は約２０％にのぼる（非特許文献１）。これらの肝炎ウイルスがＨＣＣを引き起こすメカニズムの詳細は明らかにされていないが、ウイルスの持続感染が慢性肝炎や肝硬変等を引き起こす過程で、肝細胞のがん化が起こると考えられている。
【０００３】
現在のところ、ＨＣＣ治療法としては外科的な摘除手術が有効であるとされているが、術後の再発率はきわめて高く、予後不良であることが知られている（非特許文献２）。術後早期（およそ１〜２年）の肝内再発については、門脈浸潤を原因とした肝内転移によると考えられている。また、肝細胞がん患者の多くはウイルス感染の素地を有していることから、術後後期においても多中心性発がんにより肝細胞がんが再発することも知られている（非特許文献３）。以上のように、ＨＣＣの治療には、高い再発の危険性が伴っており、外科手術後の再発を予測するためのバイオマーカーの開発は、ＨＣＣ患者のＱＯＬ（quality of life）の観点から非常に重要である。
【０００４】
これまでに、ＤＮＡマイクロアレイ法などの網羅的解析から、がん細胞での遺伝子発現プロファイルが構築され、がんと関わりのある遺伝子が多数同定されてきた。これを基に、がん特異的遺伝子のｍＲＮＡ発現をバイオマーカーとして、がんに対する早期検出・分類・予後予測などの診断法が開発されている。しかしながら、現在までに実用化されたものは、米国食品医薬品局に認可された、乳がんの再発リスクを７０の遺伝子の発現から予測するMammaPrint（Agendia社製）にとどまっているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kiyosawa K. et al., Gastroenterology 127, S17-26 (2004)
【非特許文献２】Makuuchi M. et al., Hepatogastroenterology 45, S1267-1274 (1998)
【非特許文献３】Poon RT. et al., Cancer 89, 500-507 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、精度よく肝細胞がんの発症リスクを判定できるバイオマーカーを用いた、肝細胞がんの発症リスクを判定する方法や肝細胞がん発症リスクの判定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けていく過程において、マイクロアレイ法とHigh Coverage Expression Profiling（ＨｉＣＥＰ）（登録商標）法の２つの異なる解析法を用いてバイオマーカー遺伝子の探索を行って、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と術後１年以内ＨＣＣ再発症群とで遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルが異なるものをスクリーニングしたところ、マイクロアレイ法及びＨｉＣＥＰ法によりそれぞれ１８０６種類及び６種類のバイオマーカー候補遺伝子を同定した。さらに、これらの中から有意差検定等による二次選別を行い、リアルタイムＰＣＲ法を用いた定量解析を行ったところ、マイクロアレイ法からの３種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、及びＳＬＣ２２Ａ１）及びＨｉＣＥＰ法からの３種類の遺伝子（ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴ）が精度よくＨＣＣ発症又は再発リスクを判定できるバイオマーカー（以下、「ＨＣＣバイオマーカー」ということもある。）となり得ることを見いだした。
【０００８】
また、ＨＣＣ組織と周辺非癌肝組織でのｍＲＮＡ発現比を指標としてバイオマーカーの選定を行ったところ、ＣＯＬ１５Ａ１遺伝子をＨＣＣバイオマーカーとして見いだした。さらに、上記７種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ１、ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ１、ＧＬＹＡＴ、及びＣＯＬ１５Ａ１）に加え、本発明者らが以前に肝細胞がんの発症リスクを予測できるバイオマーカーとして見いだしたＡＢＣＢ６遺伝子（国際公開第２０１１／１２２０２１号パンフレット）の上流配列に存在する転写因子結合部位に着目してバイオマーカーの選定を行ったところ、ＥＳＲ１遺伝子をＨＣＣバイオマーカーとして見いだした。
【０００９】
さらに、ある遺伝子の発現をバイオマーカーとした診断システムを構築する際、複数の遺伝子を組み合わせることで診断能力の向上が期待されるが、単一の手法から得られたバイオマーカーは、ある意味均質なものであるため、それらを組み合わせても診断システムの向上には限界があると本発明者らは考えた。そこで、多種類の方法によるアプローチで得られた上記８種類のＨＣＣバイオマーカー遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ１、ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ１、ＧＬＹＡＴ、ＥＳＲ１及びＣＯＬ１５Ａ１）に加え、ＡＢＣＢ６遺伝子を組合せて、ＨＣＣ再発予測の検討を行った。その結果、５つの遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＳＬＣ２２Ａ１、ＮＱＯ１、ＣＯＬ１５Ａ１、及びＡＢＣＢ６）のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を基に判別分析を行うと、術後２年以内ＨＣＣ再発症群の中で「術後２年以内ＨＣＣ再発症あり」と判定されるのは８８％（感度）であるのに対して、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群の中で「術後２年を超えてＨＣＣ再発症なし」と判定されるのは１００％（特異度）であり、ＨＣＣ発症又は再発リスクを高精度に判定できることが確認された。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）以下の［Ａグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現減少、又はそれらがコードするタンパク質の発現減少、あるいは、［Ｂグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現増加を検出することを特徴とする、肝細胞がん発症リスクを判定する方法に関する。
［Ａグループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ
［Ｂグループ］
ＴＳＰＡＮ８、ＮＱＯ１
【００１１】
また本発明は、（２）遺伝子が、［Ａグループ］に含まれる以下の［Ａ’グループ］、又は［Ｂグループ］に含まれる以下の［Ｂ’グループ］から選択されることを特徴とする上記（１）に記載の方法に関する。
［Ａ’グループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１
［Ｂ’グループ］
ＴＳＰＡＮ８
【００１２】
また本発明は、（３）遺伝子が、［Ａグループ］に含まれるＥＳＲ１、又は［Ｂグループ］に含まれるＮＱＯ１であることを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（４）［Ａグループ］及び／又は［Ｂグループ］における遺伝子から４以上を選択して判別分析を行うことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法や、（５）少なくとも［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８を選択することを特徴とする上記（４）に記載の方法や、（６）［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８とを選択することを特徴とする上記（４）又は（５）に記載の方法や、（７）［Ａグループ］及び／又は［Ｂグループ］における遺伝子に加えて、さらに、以下の［Ｃグループ］における遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現増加、及び／又は［Ｄグループ］における遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現減少を検出し、判別分析を行うことを特徴とする上記（４）〜（６）のいずれかに記載の方法に関する。
［Ｃグループ］
ＣＯＬ１５Ａ１
［Ｄグループ］
ＡＢＣＢ６
【００１３】
また本発明は、（８）［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ２２Ａ１と、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６とを選択することを特徴とする上記（４）〜（７）のいずれかに記載の方法に関する。
【００１４】
上記本発明の判定方法には医師による診断行為は含まれず、また上記判定方法のその他の態様としては、肝細胞がん発症又は再発リスクを判定（予測）するためのデータを収集する方法を挙げることができる。
【００１５】
また本発明は、（９）以下の［Ａグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現、あるいは、［Ｂグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする、肝細胞がん発症リスクの判定用キットに関する。
［Ａグループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ
［Ｂグループ］
ＴＳＰＡＮ８、ＮＱＯ１
【００１６】
また本発明は、（１０）遺伝子が、［Ａグループ］に含まれる以下の［Ａ’グループ］、又は［Ｂグループ］に含まれる以下の［Ｂ’グループ］から選択されることを特徴とする上記（９）に記載のキットに関する。
［Ａ’グループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１
［Ｂ’グループ］
ＴＳＰＡＮ８
【００１７】
また本発明は、（１１）遺伝子が、［Ａグループ］に含まれるＥＳＲ１、又は［Ｂグループ］に含まれるＮＱＯ１であることを特徴とする上記（９）に記載のキットに関する。
【００１８】
また本発明は、（１２）以下の［Ａグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、あるいは、［Ｂグループ］における遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする、肝細胞がん発症リスクの判定用キットに関する。
［Ａグループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ
［Ｂグループ］
ＴＳＰＡＮ８、ＮＱＯ１
【００１９】
また本発明は、（１３）遺伝子が、［Ａグループ］に含まれる以下の［Ａ’グループ］、又は［Ｂグループ］に含まれる以下の［Ｂ’グループ］から選択されることを特徴とする上記（１２）に記載のキットに関する。
［Ａ’グループ］
ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１
［Ｂ’グループ］
ＴＳＰＡＮ８
【００２０】
さらに本発明は、（１４）遺伝子が、［Ａグループ］に含まれるＥＳＲ１、又は［Ｂグループ］に含まれるＮＱＯ１であることを特徴とする上記（１２）に記載のキットに関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によると、肝細胞がん治療における術後の肝細胞がん再発リスクを精度よく判定（予測）することが可能となり、肝細胞がん治療の術後の治療方針を決定することができる。また、本発明によると、肝細胞がんの予防及び早期発見のために有用な情報を提供することができる。さらに、本発明によると、本発明のＨＣＣバイオマーカー遺伝子におけるＤＮＡのメチル化と、肝細胞がん発症との関連性を示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】３種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、及びＳＬＣ２２Ａ１）のｍＲＮＡの発現レベルを、マイクロアレイ法（上段）及びリアルタイムＰＣＲ法（下段）により解析した結果を示す図である。図中、「無再発」、「１〜２年再発」、及び「１年以内再発」は、それぞれ術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群、術後１年を超えて且つ２年以内（１〜２年）ＨＣＣ再発症群、及び術後１年以内ＨＣＣ再発症群を示す（図２及び３も同様）。また、図中、「＊」は、Kruskal Wallis検定で統計的な有意差を示し、「＊＊」は、Steel検定で統計的に有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す（図２及び３も同様）。
【図２】３種類の遺伝子（ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ、及びＧＬＹＡＴ）のｍＲＮＡの発現レベルを、マイクロアレイ法（上段）及びリアルタイムＰＣＲ法（下段）により解析した結果を示す図である。
【図３】ＥＳＲ１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを、マイクロアレイ法（左図）及びリアルタイムＰＣＲ法（右図）により解析した結果を示す図である。
【図４】リアルタイムＰＣＲ法を用いて解析した、９種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ、ＧＬＹＡＴ、ＣＯＬ１５Ａ１、及びＡＢＣＢ６）のｍＲＮＡの発現レベルについて、その結果を基に統計解析ソフトウェアIBM SPSS Statics 17.0 （IBM社製）を用いてReceiver Operating Characteristic（ＲＯＣ）曲線解析を行い、ＲＯＣ曲線下面積（Area Under the Curve；ＡＵＣ）を指標として判別性能を評価した結果を示す図である。図中、「１年以内再発」は、術後１年以内ＨＣＣ無再発症群と術後１年以内ＨＣＣ再発症群の間での比較検討した結果を示し、また、「２年以内再発」は、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と術後２年以内ＨＣＣ再発症群の間での比較検討した結果を示す。また、図中、「IHR predictive value」は、５種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＳＬＣ２２Ａ１、ＮＱＯ１、ＣＯＬ１５Ａ１、及びＡＢＣＢ６）のｍＲＮＡの発現レベルを組み合わせたものを示す。
【図５】図４で得られた結果を基に、５種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＳＬＣ２２Ａ１、ＮＱＯ１、ＣＯＬ１５Ａ１、及びＡＢＣＢ６）の組合せによる判別分析を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の肝細胞がん発症リスクを判定する方法としては、例えば、肝細胞がんを発症しているかどうか不明な被験者や手術などの肝細胞がん治療が施された被験者（肝細胞がん患者）などから採取された判定用試料中の、上記［Ａグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子（群）のｍＲＮＡ若しくはその逆転写物（ｃＤＮＡ）の発現減少、又は該ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡがコードするタンパク質の発現減少、及び／又は上記［Ｂグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子（群）のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現増加、又は該ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡがコードするタンパク質の発現増加を検出する方法であれば特に制限されない。
また、本発明の肝細胞がん発症リスクの判定用キットとしては、上記［Ａグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現、及び／又は上記［Ｂグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件キット１」という）や、上記［Ａグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、及び／又は上記［Ｂグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件キット２」という）であれば特に制限されない。
本発明における「肝細胞がん発症」には、がん化していない肝細胞、若しくは前がん状態にある肝細胞ががん化したり、或いは肝臓以外の他の臓器におけるがん細胞が肝臓に転移することにより、肝臓組織で初めてがんが形成される、肝細胞がんの新規発症の他、治療のためにがん部を除去した後の非がん部肝臓組織において、再度がんが形成される、肝細胞がんの再発（再発症）も含まれる。
【００２４】
本発明の判定する方法や本件キット１や本件キット２における遺伝子としては、肝細胞がん治療後２年以内に再発する肝細胞がん発症リスクを判定する場合、上記［Ａグループ］に含まれる上記［Ａ’グループ］、及び／又は上記［Ｂグループ］に含まれる上記［Ｂ’グループ］から選択される遺伝子が好ましく、また、肝細胞がん治療後１年以内に再発する肝細胞がん発症リスクを判定する場合、上記［Ａグループ］に含まれるＥＳＲ１、及び／又は上記［Ｂグループ］に含まれるＮＱＯ１が好ましい。また、上記［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現増加を検出することにより、肝細胞がん治療後２年以内に再発する肝細胞がん発症リスクを判定することもできる。
【００２５】
上記判定用試料としては、肝臓組織由来の組織、細胞、器官等の非液性試料や、血液、血清、唾液等の液性試料を例示することができる。例えば、上記肝臓組織は、被験者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、かかる病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。
【００２６】
本発明の判定する方法において、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ａグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量、又は該ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡがコードするタンパク質の発現量が、対照試料における発現量と比較して減少している場合や、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ｂグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量、又は該ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡがコードするタンパク質の発現量が、対照試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の肝細胞がん発症（再発）リスクが高い、或いは被験者における肝細胞がん治療の予後が悪い（予後不良）と評価（予測）することができる。
また、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ａグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量、又は該ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡがコードするタンパク質の発現量が、対照試料における発現量と比較して減少していない場合や、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ｂグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量、又は該ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡがコードするタンパク質の発現量が、対照試料における発現量と比較して増加していない場合、被験者の肝細胞がん発症（再発）リスクが低い、或いは被験者における肝細胞がん治療の予後が良い（予後良好）と評価（予測）することができる。
なお、肝細胞がん治療の予後とは、肝細胞がん治療が施された、肝細胞がん発症患者、肝細胞がん再発患者、肝細胞がん転移患者などの肝細胞がん患者（被験者）の、治療後の生存期間や回復期間（肝細胞がん再発や肝臓以外の他の臓器への転移が認められない期間）を意味する。
【００２７】
上記対照試料としては、健常者由来の組織、細胞、血液、唾液などの試料の他、医師等当業者が通常用いる基準に照らして明らかにがん化していないと判断される組織、細胞、器官等の非液性試料や血液、唾液等の液性試料を例示することができる。また、これら対照試料は、採取された後に、判定用試料と同様の処理が施された対照試料であることが好ましい。
【００２８】
本発明の判定する方法において、遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現減少若しくは増加を検出する方法としては、上記［Ａグループ］及び［Ｂグループ］におけるＨＣＣバイオマーカー遺伝子（以下、これらを総称して「本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子」という）のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などでｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的にｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｃＤＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡを制限酵素（ＭｓｐＩ、ＭｓｅＩ等）によって切断し、アダプター配列を結合した後、これらを鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲを行い、それぞれのＰＣＲ産物をキャピラリー電気泳動により展開し、得られたＰＣＲ産物由来のピークを検証するＨｉＣＥＰ法などの方法を挙げることができる。なお、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡの配列情報は、例えば本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子名を基に、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースで検索することにより得ることができる。
【００２９】
本発明の判定する方法において、タンパク質の発現減少又は増加を検出する方法としては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡがコードするタンパク質（以下、「本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質」という）の一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法や、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法を挙げることができる。なお、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列情報は、例えば本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子名を基に、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースで検索することにより得ることができる。
【００３０】
上記免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。また、上記質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、ＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。また、液体クロマトグラフ（ＬＣ）やＨＰＬＣにより、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。なお、質量分析法を用いて本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を構成するペプチドを質量分析法で検出・定量する場合、かかるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる、濃度が既知の安定同位体で標識したペプチドを内部標準とすることができる。かかる安定同位体標識ペプチドとしては、検出する本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を構成するペプチドにおけるアミノ酸の１個以上が、１５Ｎ，１３Ｃ，１８Ｏ，及び２Ｈのいずれか１以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、数などは適宜選択することができ、かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてＦ−ｍｏｃ法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成することができるが、ｉＴＲＡＱ（登録商標）試薬、ＩＣＡＴ（登録商標）試薬、ＩＣＰＬ（登録商標）試薬、ＮＢＳ（登録商標）試薬などの標識試薬を用いて作製することもできる。
【００３１】
本発明の判定する方法の精度を高めるために、上記［Ａグループ］や［Ｂグループ］における遺伝子から判別分析を行うことが好ましく、判別分析を行うために選択する遺伝子数としては、肝細胞がん発症リスクを判別できれば特に制限されず、例えば２以上、３以上、４以上などを挙げることができ、特に４以上を好適に例示することができる。また、上記［Ａグループ］や［Ｂグループ］における遺伝子に加えて、さらに、上記［Ｃグループ］における遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現増加や、上記［Ｄグループ］における遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はそれらがコードするタンパク質の発現減少を検出し、判別分析を行ってもよい。判別分析を行う場合、選択する遺伝子の数や種類については、感度（真の肝細胞がん発症又は再発群において、検査陽性［肝細胞がん発症又は再発あり］と判別できる確率）及び特異度（真の健常者又は肝細胞がん無再発群において、検査陰性［肝細胞がん発症又は再発なし］と判別できる確率）、及び／又は、陽性的中率（検査陽性［肝細胞がん発症又は再発ありと判別］群において、真の肝細胞がん発症患者又は再発患者である確率）及び陰性的中率（検査陰性［肝細胞がん発症又は再発なしと判別］群において、真の健常者又は肝細胞がん無再発者である確率）を考慮して適宜選択することができ、感度及び／又は特異度としては、少なくとも５０％であればよく、好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも８８％、さらに好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは１００％を挙げることができ、陽性的中率及び／又は陰性的中率は、少なくとも５０％であればよく、好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも８８％、さらに好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは１００％を挙げることができる。なお、感度（％）は、式「（［真の肝細胞がん発症又は再発群のうちで検査陽性者の数］／［真の肝細胞がん発症又は再発者数］）×１００」に入力することにより算出することができ、特異度（％）は、式「（［真の健常者又は無再発者群のうちで検査陰性者の数］／［真の健常者又は無再発者数］）×１００」に入力することにより算出することができ、陽性的中率（％）は、式「（［検査陽性者群のうちで真の肝細胞がん発症又は再発者の数］／［検査陽性者数］）×１００」に入力することにより算出することができ、陰性的中率（％）は、式「（［検査陰性者群のうちで真の健常者又は無再発者の数］／［検査陰性者数］）×１００」に入力することにより算出することができる。
【００３２】
本発明の判定する方法において、判別分析を行う場合、少なくとも［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８を選択することが好ましく、少なくとも［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８を選択する場合の遺伝子の組合せとしては、例えば、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＥＳＲ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＥＳＲ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ２２Ａ１と、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ１０Ａ１、及びＳＬＣ２２Ａ１と、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ２２Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＳＬＣ２２Ａ１と、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８、及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せなどを挙げることができ、これらの中でも、［Ａグループ］に含まれるＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴと、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８との組合せや、［Ａグループ］に含まれるＳＬＣ２２Ａ１と、［Ｂグループ］に含まれるＴＳＰＡＮ８及びＮＱＯ１と、［Ｃグループ］に含まれるＣＯＬ１５Ａ１と、［Ｄグループ］に含まれるＡＢＣＢ６との組合せが好ましい。
【００３３】
上記判別分析としては、予めどのサンプル（検出試料）がどの群（健常者若しくは肝細胞がん無再発群又は肝細胞がん発症若しくは肝細胞がん再発群）に属すのかというデータをもとに、どの群に属すのかわからないサンプルがどの群に属すのかを判別する関数（判別関数）を求める手法であれば制限されず、判別関数のうち、線形判別関数として、例えば超平面・直線による判別関数等を挙げることができ、非線形判別関数として、例えば超曲面・曲線によるマハラノビス氾距離による判別関数等を挙げることができる。
【００３４】
本件キット１におけるプライマー対としては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｃＤＮＡの上流及び下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマー対であれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、１５〜３０塩基を選択することができ、また、増幅するｃＤＮＡの長さとしては、５０〜３００塩基を選択することができる。
【００３５】
本件キット１におけるプローブとしては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの一部若しくは全部がハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、かかるスプライシングバリアントとハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。
【００３６】
本件キット２における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。また、本件キット２には、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質のアミノ酸残基に結合した本件キット２における抗体を検出するための、蛍光物質、酵素等の標識物質をコンジュゲートした２次抗体を含めることや、本件キット２における抗体とは異なるエピトープと反応する少なくとも１種類の抗体を含めることができる。また、本件キット２には、必要と目的に応じた緩衝液、ｐＨ調製剤、反応容器等をさらに備えたものであってもよい。
【００３７】
本件キット１におけるプライマー対やプローブや、本件キット２における抗体の標識物における標識物質としては、例えばビオチン、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase;ＨＲＰ)、３２Ｐなどを具体的に挙げることができる。
【００３８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
１．マイクロアレイ法を用いたＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子のスクリーニング
１−１  ｃＤＮＡの単離法
術後１年以内ＨＣＣ再発症群由来の５検体の肝細胞がん組織試料を用いて、TRIzol Reagent（Life Technologies社製）とPureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit（Life Technologies社製）により全ＲＮＡの精製を行った後、PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa Bio社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。なお、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群由来の５検体の肝組織試料から合成したｃＤＮＡをコントロールとして用いた。
【００４０】
１−２  マイクロアレイ法
上記実施例１の「１−１  ｃＤＮＡの単離法」の項目に記載の方法で合成したｃＤＮＡを、DNA Labeling Kits（Roche Applied Science社製）を用いてＣｙ３で蛍光標識した後、蛍光標識したｃＤＮＡをHuman Gene Expression 4x72K Arrays（Roche社製）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、Hybridization Kits（Roche Applied Science社製）及びNimbleGen Hybridization Systems（Roche Applied Science社製）を用いて４２℃にて１６時間の条件下で行った。蛍光シグナルのスキャニングは、GenePix 4000B（Molecular Devices社製）を用いて行い、取得した蛍光シグナルの画像解析は、NimbleScan Software（Roche Applied Science社製）を用いて行った。その後の統計学的解析は、GeneSpring GX（アジレント・テクノロジー社製)を用いて行った。選択基準（Fold-change＞２．０、Ｐ値＜０．０５）を基に、ＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子を同定した。Ｐ値は、漸近計算した対応のないｔ−検定（unpaired t-test）とBenjamini-Hochberg FDR多重検定（multiple-testing correction）により算出した。
【００４１】
１−３  結果
術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、術後１年以内ＨＣＣ再発症群で蛍光シグナルの増減、すなわちｍＲＮＡの発現量の増減が認められた遺伝子は１８０６種類（８３０種類；発現量増加、９７６種類；発現量減少）あることが確認された。このうち、上記選択基準を満たす遺伝子として、４５種類（２４種類；発現量増加、２１種類；発現量減少）の遺伝子を同定することができ、かかる遺伝子をＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子とした。
【実施例２】
【００４２】
２．ＨｉＣＥＰ法を用いたＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子の同定
２−１  ＨｉＣＥＰ法
上記実施例１の「１−１−１  ｃＤＮＡの単離法」の項目に記載の方法で単離したｃＤＮＡを用いたＨｉＣＥＰ法は、文献（Fukumura R et al., Nucleic Acids Res. 2003. 31: e94.）に記載の方法にしたがって行った。すなわち、ｃＤＮＡを２種類の制限酵素（ＭｓｐＩ及びＭｓｅＩ）によって切断した後に、アダプター配列を結合した。これらを鋳型ＤＮＡとして「256 primer sets」を用いたＰＣＲを行い、それぞれのＰＣＲ産物をキャピラリー電気泳動により展開し、得られたＰＣＲ産物由来のピークを検証した。選択基準（Fold-change＞５．０、Higher peak height＞１５００）を基にピークのスクリーニングを行った後、ピーク由来のＰＣＲ産物のシーケンスを行い、ＰＣＲ産物がｍＲＮＡであることが明らかになったものを、ＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子として同定した。
【００４３】
２−２  結果
術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、術後１年以内ＨＣＣ再発症群で蛍光シグナルの増減、すなわち発現量の増減（Fold-change＞２．０、Higher peak height＞１００）が認められたＰＣＲ産物は、２８５８種類（１３９０種類；発現量増加、１４６８種類；発現量減少）あることが確認された。このうち、さらに上記選択基準（Fold-change＞５．０、Higher peak height＞１５００）を満たすＰＣＲ産物として、２８種類（１５種類；発現量増加、１３種類；発現量減少）のＰＣＲ産物が示された。このうち、１５種類のＰＣＲ産物についてシーケンスを行ったところ、６種類がｍＲＮＡ由来のものであることが明らかとなり、かかる６種類のＰＣＲ産物由来の遺伝子をＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子とした。
【実施例３】
【００４４】
３．リアルタイムＰＣＲ法を用いたＨＣＣ再発症に関わる遺伝子の同定
３−１  リアルタイムＰＣＲ法
上記実施例１の方法で同定した４５種類のＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子について、また、上記実施例２の方法でスクリーニングした６種類のＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子について、ｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＰＣＲ法を用いた解析により定量した。具体的には、「１−１−１  ｃＤＮＡの単離法」の項目に記載の方法で単離したｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、Universal ProbeLibrary Set, Human（Roche Applied Science社製）、LightCycler 480 Probe Master（Roche Applied Science社製)、及びLightCycler480 System II（Roche Applied Science社製）を用いてリアルタイムＰＣＲ法を行い、ＰＣＲ産物が一定量になるＰＣＲのサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を測定した。コントロールとして非がん部由来のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲ法を行って得られたＣｔ値を基準として、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）によりＰＣＲ産物の相対量、すなわちｍＲＮＡの相対量を算出した。
【００４５】
３−２  結果
リアルタイムＰＣＲ法による解析の結果、上記実施例１に記載のマイクロアレイ法でスクリーニングした４５種類のＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子のうち、３種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、及びＳＬＣ２２Ａ１）がリアルタイムＰＣＲ法による解析においても検出レベルが特に高く、また術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べてその発現量に統計学的有意差のあることが明らかとなった。また、術後１年以内ＨＣＣ再発症群及び術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群から上記実施例１で用いた検体とは異なるもの（それぞれ６検体及び７検体）を選択し、ｃＤＮＡを単離した後、マイクロアレイ法（図１上段）及びリアルタイムＰＣＲ法（図１下段）を行ったところ、同様に、術後１年以内ＨＣＣ再発症群におけるＴＳＰＡＮ８遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、増加しており（図１の左図）、また、術後１年以内ＨＣＣ再発症群におけるＣＹＰ２Ａ６及びＳＬＣ２２Ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、減少しており（それぞれ図１の中央図及び右図）、両群間で統計学的有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。さらに、術後１〜２年ＨＣＣ再発症群由来の１１検体を用いて検討したところ、上記３つの遺伝子の発現量は、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、術後１〜２年再発症群で増加（ＴＳＰＡＮ８）、又は減少（ＣＹＰ２Ａ６及びＳＬＣ２２Ａ１）しており、両群間の上記３つの遺伝子の発現量に統計学的有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）（図１）。これらの結果から、ＨＣＣ再発症に関わる遺伝子として３種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、及びＳＬＣ２２Ａ１）を同定することができた。
【００４６】
また、リアルタイムＰＣＲ法による解析の結果、上記実施例２に記載のＨｉＣＥＰ法でスクリーニングした６種類のＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子のうち、３種類の遺伝子（ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴ）がリアルタイムＰＣＲ法による解析においても検出レベルが特に高く、また術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べてその発現量に統計学的有意差のあることが明らかとなった。また、術後１年以内ＨＣＣ再発症群及び術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群から上記実施例１で用いた検体とは異なるもの（それぞれ６検体及び７検体）を選択し、ｃＤＮＡを単離した後、マイクロアレイ法及びリアルタイムＰＣＲ法を行ったところ、同様に、術後１年以内ＨＣＣ再発症群におけるＮＱＯ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、増加しており（図２の左図）、また、術後１年以内ＨＣＣ再発症群におけるＳＬＣ１０Ａ１及びＧＬＹＡＴ遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、減少しており（それぞれ図２の中央図及び右図）、両群間におけるこれらの発現量は、統計学的有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。さらに、術後１〜２年再発症群を用いて比較検討したところ、上記３種類の遺伝子の発現量は、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、術後１〜２年再発症群で増加（ＮＱＯ１）、又は減少（ＳＬＣ１０Ａ１及びＧＬＹＡＴ）しており、両群間のＳＬＣ１０Ａ１遺伝子の発現量に統計学的有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）（図２）。これらの結果から、ＨＣＣ再発症に関わる遺伝子として３種類の遺伝子（ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＧＬＹＡＴ）を同定することができた。
【実施例４】
【００４７】
４．ＨＣＣ組織特異的な発現を示す遺伝子に着目したＨＣＣ再発症に関わる遺伝子の同定
上記実施例１〜３では、ＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子を、ＨＣＣ再発症検体の中からスクリーニングし、同定したが、本実施例では、ＨＣＣ発症に関わる候補遺伝子を、ＨＣＣ組織特異的な発現を示す遺伝子の中から同定し、その中からＨＣＣ再発症にも関わる遺伝子を同定することを試みた。まず、ＨＣＣ発症５検体由来の肝細胞がん組織試料を用いて、上記実施例の「１−１−１  ｃＤＮＡの単離法」の項目に記載の方法でｃＤＮＡを合成した。なお、上記ＨＣＣ発症５検体由来の周辺非がん肝組織試料から合成したｃＤＮＡをコントロールとして用いた。ｃＤＮＡを用いて、上記実施例１の「１−２  マイクロアレイ法」の項目に記載の方法でマイクロアレイ解析を行い、ＨＣＣ発症に関わる候補遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、ＨＣＣ発症に関わる候補遺伝子として、４１種類の遺伝子をスクリーニングすることができた。かかる４１種類の遺伝子のうち、５種類を、上記実施例３に記載の方法でリアルタイムＰＣＲ法によってＨＣＣ発症に関わる遺伝子として同定し、そのうちの１つであるＣＯＬ１５Ａ１遺伝子のＨＣＣ組織における発現量は、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群では周辺非がん肝組織における発現量と比較した場合１０．４倍であったのに対して、術後１年以内ＨＣＣ再発症群では周辺非がん肝組織における発現量と比較した場合は３．２倍であったことが明らかとなった。すなわち、ＨＣＣ組織におけるＣＯＬ１５Ａ１遺伝子の発現上昇レベルは、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比較して術後１年以内ＨＣＣ再発症群の方が有意に減少していることが示された。この結果から、ＨＣＣ再発症に関わる遺伝子としてＣＯＬ１５Ａ１を同定することができた。
【実施例５】
【００４８】
５．転写制御因子に着目したＨＣＣ再発症に関わる遺伝子の同定
上記実施例１及び２では、マイクロアレイ法やＨｉＣＥＰ法による網羅的解析によりＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子をスクリーニングしたが、本実施例では、別の手法、すなわち、上記実施例１〜４のマイクロアレイ法及びＨｉＣＥＰ法により、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、術後１年以内ＨＣＣ再発症群で発現レベルの増減が認められた７種類の遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ１、ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ１、ＧＬＹＡＴ、及びＣＯＬ１５Ａ１）に加え、本発明者らが以前に肝細胞がんの発症リスクを予測できるバイオマーカーとして見いだしたＡＢＣＢ６遺伝子の上流配列（翻訳開始点より５ｋｂ上流〜翻訳開始点より０．５ｋｂ下流の領域を含む配列）に存在する転写因子結合部位に着目して、ＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子をスクリーニングすることを試みた。まず、転写因子結合部位が存在するかどうかを、ＭＡＴＣＨ及びｐ−ＭＡＴＣＨプログラムを用いて解析したところ、４０の転写因子結合部位が明らかとなった。かかる転写因子結合部位に結合とする転写因子について、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、術後１年以内ＨＣＣ再発症群でｍＲＮＡの発現量の増減が認められるかどうかを、マイクロアレイ法及びリアルタイムＰＣＲ法により検証した。マイクロアレイ法は、選択基準（Fold-change＞１．２）を基に、上記実施例１の「１−２  マイクロアレイ法」の項目に記載の方法を用いて行い、リアルタイムＰＣＲ法は、上記実施例３の「３−１  リアルタイムＰＣＲ法」の項目に記載の方法を用いて行った。
【００４９】
上記転写因子のうち、上記選択基準（Fold-change＞１．２）を満たすＨＣＣ再発症に関わる候補遺伝子として、２１種類を同定することができた。かかる２１種類の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＰＣＲ法により確認したところ、ＥＳＲ１遺伝子の検出レベルが特に高く、また術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べてその発現量に統計学的有意差のあることが明らかとなった。また、術後１年以内ＨＣＣ再発症群及び術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群から上記実施例１で用いた検体とは異なるもの（それぞれ６検体及び７検体）を選択し、ｃＤＮＡを単離した後、マイクロアレイ法（図３の左図）及びリアルタイムＰＣＲ法（図３の右図）を行ったところ、同様に、術後１年以内ＨＣＣ再発症群におけるＥＳＲ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、減少しており、両群間で統計学的有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。（図３）。さらに、術後１〜２年再発症群を用いて比較検討したところ、ＥＳＲ１遺伝子の発現量は、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と比べ、術後１〜２年再発症群で減少していることが明らかとなった（図３）。これらの結果から、ＨＣＣ再発症に関わる遺伝子としてＥＳＲ１を同定することができた。
【実施例６】
【００５０】
６．同定した８つの遺伝子を用いたＨＣＣ再発予測の検討
６−１  術後１年を超えてＨＣＣ無再発症群と術後１年以内ＨＣＣ再発症群の間での比較検討、及び、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と術後２年以内ＨＣＣ発症群の間での比較検討
上記実施例１〜５では、ＨＣＣ再発症予測できる８つの遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＮＱＯ１、ＳＬＣ１０Ａ１、ＧＬＹＡＴ、及びＣＯＬ１５Ａ１）のｍＲＮＡの発現量について、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と術後１年以内ＨＣＣ再発症群の間での比較検討、あるいは、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と術後１〜２年再発症群の間での比較検討を行ったが、本実施例では、術後１年を超えてＨＣＣ無再発症群（術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群＋術後１〜２年再発症群）と術後１年以内ＨＣＣ再発症群の間での比較検討、及び、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と術後２年以内ＨＣＣ再発症群（術後１年以内ＨＣＣ再発症群＋術後１〜２年再発症群）の間での比較検討を行った（図４）。なお、コントロールとして以前発明者が同定した肝細胞がんの再発予測用バイオマーカーであるＡＢＣＢ６遺伝子（国際公開第２０１１／１２２０２１号パンフレット）を用いた。上記実施例３のリアルタイムＰＣＲ法により得られた結果を基に比較検討を行ったところ、上記８つの遺伝子とコントロールのＡＢＣＢ６遺伝子のうち、１年を超えてＨＣＣ無再発症群と術後１年以内ＨＣＣ再発症群の間で発現量（発現量比［ＨＣＣにおけるｍＲＮＡ発現量／周辺非がん肝組織における発現量］）の違いに統計学的有意差があったものは、３つ（ＥＳＲ１［Ｐ値＝０．０２３、ＡＵＣ値＝０．８１５］、ＮＱＯ１［Ｐ値＝０．０３３、ＡＵＣ値＝０．７９６］、及びＡＢＣＢ６［Ｐ値＝０．００９、ＡＵＣ値＝０．８６１］）あり、また、術後２年を超えてＨＣＣ無再発症群と２年以内ＨＣＣ発症群の間で発現量の違いに統計学的有意差があったものは、６つ（ＴＳＰＡＮ８［Ｐ値＝０．０３３、ＡＵＣ値＝０．７８２］、ＣＹＰ２Ａ６［Ｐ値＝０．００１、ＡＵＣ値＝０．９３３］、ＳＬＣ２２Ａ１［Ｐ値＝０．００８、ＡＵＣ値＝０．８４９］、ＥＳＲ１［Ｐ値＝０．００８、ＡＵＣ値＝０．８４９］、ＳＬＣ１０Ａ１［Ｐ値＝０．００７、ＡＵＣ値＝０．８５７］、及びＣＯＬ１５Ａ１［Ｐ値＝０．０１７、ＡＵＣ値＝０．８１５］）あることが明らかとなった（図４）。この結果は、３つの遺伝子（ＥＳＲ１、ＮＱＯ１、及びＡＢＣＢ６）は、術後１年以内のＨＣＣ再発症予測するためのバイオマーカーとして有用であり、また、６つの遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＳＬＣ１０Ａ１、及びＣＯＬ１５Ａ１）は、術後２年以内のＨＣＣ再発症予測するためのバイオマーカーとして有用であることを示している。特に、ＥＳＲ１遺伝子は、術後１年以内と術後２年以内の両方でＨＣＣ再発症予測するためのバイオマーカーとして有用であることを示している。
【００５１】
６−２  判別分析
図４で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝−０．２８８×［ＴＳＰＡＮ８のｍＲＮＡ発現量］＋０．２６６×［ＳＬＣ２２Ａ１のｍＲＮＡ発現量］＋（−０．１２５）×［ＮＱＯ１のｍＲＮＡ発現量］＋０．５１１×［ＣＯＬ１５Ａ１のｍＲＮＡ発現量］＋０．３７９×［ＡＢＣＢ６のｍＲＮＡ発現量］＋０．０５９）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を、術後２年を超えてＨＣＣ再発症なしとし、判別得点０未満を、術後２年以内ＨＣＣ再発症ありとした場合、真の術後２年以内ＨＣＣ再発症１７検体中でこの判別式により「術後２年以内ＨＣＣ再発症」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１５検体（感度：８８％）であるのに対し、真の術後２年を超えてＨＣＣ無再発症７検体中で「術後２年を超えてＨＣＣ再発症なし」と判定（判別得点が０点以上）されたのは７検体（特異度：１００％）であった（図５）。また、陽性的中率（検査陽性者［術後２年以内ＨＣＣ再発症ありと判別］群において、真の術後２年以内ＨＣＣ再発症である確率）は、１００％であるのに対して、陰性的中率（検査陰性［術後２年を超えてＨＣＣ再発症なしと判別］群において、真のである確率）は、７８％であった（図５）。以上の結果から、ＨＣＣ再発症予測できる上記８つの遺伝子の中から５つの遺伝子（ＴＳＰＡＮ８、ＳＬＣ２２Ａ１、ＮＱＯ１、ＣＯＬ１５Ａ１、及びＡＢＣＢ６）のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を基に判別分析を行うと、感度及び特異度が共に高く、術後２年以内のＨＣＣ再発症を精度よく予測できることが明らかとなった。かかる５つの遺伝子は、術後２年以内でＨＣＣ再発症予測するためのバイオマーカーとして有用であることも明らかとなった。（図４の「IHR predictive value」参照）（Ｐ値＜０．００１、ＡＵＣ値＝０．９８３）。
【００５２】
さらに、術後２年以内でＨＣＣ再発症を精度よく予測できる遺伝子の組合せバターンの検証を行ったところ、上述の図４及び５で示した組合せ以外にもＨＣＣ再発症を精度よく予測できる組合せがあることが明らかとなった（表１及び２）。例えば、４つの遺伝子（ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＧＬＹＡＴ、及びＴＳＰＡＮ８）のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を基に判別分析を行うと、感度（８２％）及び特異度（１００％）が共に高く、術後２年以内のＨＣＣ再発症を精度よく予測できることが明らかとなった（ＡＵＣ値≒０．９９）。さらに、術後２年以内でＨＣＣ再発症を精度よく予測するためには、少なくともＴＳＰＡＮ８遺伝子を選択して判別分析を行うことが必要であることも確認された。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、肝細胞がん再発リスクを予測することができるため、術後の治療方針を決定することができる。また、術後の生存期間や回復期間を延ばすことが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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