(57)【要約】【課題】悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルを提供する。【解決手段】細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを含む混合物を、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルとする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを含む混合物である、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデル。
【請求項２】
前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞は、株化された悪性リンパ腫の腫瘍細胞、悪性リンパ腫に罹患した動物由来の株化されていない悪性リンパ腫の腫瘍細胞である、請求項１に記載のインビトロ腫瘍細胞モデル。
【請求項３】
前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞は、悪性リンパ腫に罹患したヒト由来の株化されていない悪性リンパ腫の腫瘍細胞である、請求項１又は２に記載のインビトロ腫瘍細胞モデル。
【請求項４】
前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞は、悪性リンパ腫に罹患した特定のヒト個体から採取された株化されていない悪性リンパ腫の腫瘍細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載のインビトロ腫瘍細胞モデル。
【請求項５】
前記細網線維芽細胞は、株化された細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載のインビトロ腫瘍細胞モデル。
【請求項６】
前記細網線維芽細胞は、マウス由来の細網線維芽細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載のインビトロ腫瘍細胞モデル。
【請求項７】
前記細網線維芽細胞は株化された細網線維芽細胞であり、前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞は悪性リンパ腫に罹患したヒト由来の株化されていない悪性リンパ腫の腫瘍細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載のインビトロ腫瘍細胞モデル。
【請求項８】
動物から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞を前記腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して前記非ヒト動物内で培養し、前記非ヒト動物から分離して得られる悪性リンパ腫の腫瘍細胞を含む、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルのための培養剤。
【請求項９】
細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程、を備える、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの製造方法。
【請求項１０】
さらに、前記混合工程後に、前記細網線維芽細胞と前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを共培養する工程を備える、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
さらに、前記混合工程に先立って、前記細網線維芽細胞を培養する工程を備え、
前記混合工程は、予め培養された前記細網線維芽細胞と前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、前記混合工程に先立って、前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養する工程と、
前記非ヒト動物内から前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞を分離する工程と、を備え、
前記混合工程は、前記細網線維芽細胞と前記非ヒト動物内から分離した前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程である、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
さらに、前記混合工程に先立って、前記細網線維芽細胞を培養する工程と、
前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養する工程と、
前記非ヒト動物内から前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞を分離する工程と、
を備え、
前記混合工程は、予め培養された前記細網線維芽細胞と前記非ヒト動物内から分離した前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程である、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記細網線維芽細胞は株化された細網線維芽細胞である、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程と、
前記混合工程後に、前記細網線維芽細胞と前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを共培養する工程と、を備える、悪性リンパ腫の腫瘍細胞のインビトロ培養系の製造方法。
【請求項１６】
動物から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞を準備する工程と、
前記腫瘍細胞を前記腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して前記非ヒト動物内で培養する工程と、
を備える、インビトロ培養系に適した悪性リンパ腫の腫瘍細胞の製造方法。
【請求項１７】
細網線維芽細胞を含む、悪性リンパ腫の腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤。
【請求項１８】
悪性リンパ腫の腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤のスクリーニング方法であって、
１又は２以上の細網線維芽細胞を被験細胞とし、当該被験細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合し培養する工程と、
前記工程で得られた培養物と前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞の増殖抑制剤とを接触させる工程と、
前記増殖抑制剤と接触後の前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞の細胞活性を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれかに記載の悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルと１又は２以上の被験化合物とを接触させる工程と、
前記インビトロ腫瘍細胞モデルに対する前記１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、
を備える、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニング方法。
【請求項２０】
前記作用は、前記１又は２以上の被験化合物の前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞の対する増殖抑制、増殖促進及び耐性から選択されるいずれかである、請求項１９に記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの前記細網線維芽細胞に前記１又は２以上の被験化合物を接触させる工程と、
前記細網線維芽細胞に対する前記１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、
を、さらに備える、請求項１９又は２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記細網線維芽細胞に対する前記１又は２以上の被験化合物の作用と前記インビトロ腫瘍細胞モデルに対する作用とに基づいて前記１又は２以上の被験化合物を評価する工程を、さらに備える請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項１〜７のいずれかに記載の悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルと１又は２以上の被験化合物とを接触させる工程と、
前記インビトロ腫瘍細胞モデルに対する前記１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、
を備える、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する化合物の評価方法。
【請求項２４】
前記悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの前記細網線維芽細胞に前記１又は２以上の被験化合物を接触させる工程と、
前記細網線維芽細胞に対する前記１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、
を、さらに備える、請求項２３に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデル及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗がん剤のスクリーニング方法としては、既存のがん細胞株を培養し、その増殖を抑制する化合物を探索することが行われてきている(非特許文献１）。さらに、特定のがん活性化分子を標的とするスクリーニングも行われてきている。
【０００３】
一方、抗がん剤分野における臨床開発の成功率は約５％に留まっているのが現状である（非特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nature Reviews Clinical Oncology 8, 200-209(April, 2011)
【非特許文献２】Nature Reviews Drug Discovery 10, 87(February, 2011)
【非特許文献３】Nature Reviews Drug Discovery 3, 711-716(August, 2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
通常、株化されたがん細胞は、in vivo（インビボ）の臨床環境に由来してはいるものの、in vitro（インビトロ）の環境で選択された一部の細胞に過ぎず、この細胞株を培養しても実際の臨床病態のごく一面のみを具現化したものが得られるに過ぎない。すなわち、この種のスクリーニング系は、実際のがんの複雑性を再現できているわけではない。したがって、こうしたスクリーニング系では、効果的な抗がん剤を見出すことが困難である。
【０００６】
また、動物モデルを用いることで有効な薬剤のスクリーニングが期待される一方、煩雑さやコストの問題もあり、効率的なスクリーニングが困難である。さらに、例えば、リンパ腫のように多数の分子変異が蓄積して発症するがんの場合には、特定の分子を標的にスクリーニングを行ってもその有効性は限定的である。
【０００７】
そこで、本明細書は、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルを提供する。また、本明細書は、当該モデルを用いたスクリーニング方法等の当該モデルの利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒトの臨床検体から得られた悪性リンパ腫の腫瘍細胞を免疫不全マウスに移植することにより、マウス内でヒト由来リンパ腫腫瘍細胞をヒトにおける臨床病態を模倣した状態で維持できるという知見を得た。通常、動物内で増殖した悪性リンパ腫の腫瘍細胞などの株化されていない腫瘍細胞は、インビトロで培養できない。本発明者らは、こうした悪性リンパ腫の腫瘍細胞のインビトロ培養系の確立について検討したところ、細網線維芽細胞（Fibroblastic Reticular Cells：ＦＲＣ）を共存させることで、この種の腫瘍細胞でもインビトロ培養系を確立できるという知見を得た。さらに、本発明者らは、こうしたインビトロ培養系を用いることで悪性リンパ腫の腫瘍細胞に作用する薬剤などを効率的にスクリーニングできるという知見を得た。本明細書によれば、これらの知見に基づき以下の手段が提供される。
【０００９】
本明細書によれば、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルが提供される。このモデルは、細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを含む混合物とすることができる。
【００１０】
前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞は、株化された悪性リンパ腫の腫瘍細胞、悪性リンパ腫に罹患した動物由来の株化されていない悪性リンパ腫の腫瘍細胞であってもよい。前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞は、悪性リンパ腫に罹患したヒト由来の株化されていない悪性リンパ腫の腫瘍細胞であってもよい。また、前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞は、悪性リンパ腫に罹患した特定のヒト個体から採取された株化されていない悪性リンパ腫の腫瘍細胞であってもよい。
【００１１】
前記細網線維芽細胞は、株化された細胞であってもよく、マウス由来の細網線維芽細胞であってもよい。さらに、前記細網線維芽細胞は株化された細網線維芽細胞であり、前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞は悪性リンパ腫に罹患したヒト由来の株化されていない悪性リンパ腫の腫瘍細胞であってもよい。
【００１２】
本明細書によれば、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルのための培養剤が提供される。この培養剤は、動物から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞を前記腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して前記非ヒト動物内で培養し、前記非ヒト動物から分離して得られる悪性リンパ腫の腫瘍細胞を含むことができる。
【００１３】
本明細書によれば、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの製造方法が提供される。この方法は、細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程、を備えることができる。
【００１４】
さらに、前記混合工程後に、前記細網線維芽細胞と前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを共培養する工程を備えていてもよい。また、さらに、前記混合工程に先立って、前記細網線維芽細胞を培養する工程を備え、前記混合工程は、予め培養された前記細網線維芽細胞と前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程であってもよい。
【００１５】
さらに、前記混合工程に先立って、前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養する工程と、前記非ヒト動物内から前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞を分離する工程と、を備え、前記混合工程は、前記細網線維芽細胞と前記非ヒト動物内から分離した前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程であってもよい。
【００１６】
さらに、前記混合工程に先立って、前記細網線維芽細胞を培養する工程と、前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養する工程と、前記非ヒト動物内から前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞を分離する工程と、を備え、前記混合工程は、予め培養された前記細網線維芽細胞と前記非ヒト動物内から分離した前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程であってもよい。
【００１７】
前記細網線維芽細胞は株化された細網線維芽細胞であってもよい。
【００１８】
本明細書によれば、悪性リンパ腫の腫瘍細胞のインビトロ培養系の製造方法が提供される。この方法は、細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合する工程と、前記混合工程後に、前記細網線維芽細胞と前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを共培養する工程と、を備えることができる。
【００１９】
本明細書によれば、インビトロ培養系に適した悪性リンパ腫の腫瘍細胞の製造方法が提供される。この方法は、動物から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞を準備する工程と、前記腫瘍細胞を前記腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して前記非ヒト動物内で培養する工程と、を備えることができる。
【００２０】
本明細書によれば、細網線維芽細胞を含む、悪性リンパ腫の腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤が提供される。
【００２１】
本明細書によれば、悪性リンパ腫の腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法は、１又は２以上の細網線維芽細胞を被験細胞とし、当該被験細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを混合し培養する工程と、前記工程で得られた培養物と前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞の増殖抑制剤とを接触させる工程と、前記増殖抑制剤と接触後の前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞の細胞活性を評価する工程と、を備えることができる。
【００２２】
本明細書によれば、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法は、前記悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルと１又は２以上の被験化合物とを接触させる工程と、前記インビトロ腫瘍細胞モデルに対する前記１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、を備えることができる。
【００２３】
前記作用は、前記１又は２以上の被験化合物の前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞の対する増殖抑制、増殖促進及び耐性から選択されるいずれかとすることができる。前記悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの前記細網線維芽細胞に前記１又は２以上の被験化合物を接触させる工程と、前記細網線維芽細胞に対する前記１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、
を、さらに備えることもできる。前記細網線維芽細胞に対する前記１又は２以上の被験化合物の作用と前記インビトロ腫瘍細胞モデルに対する作用とに基づいて前記１又は２以上の被験化合物を評価する工程を、さらに備えることもできる。
【００２４】
本明細書によれば、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する化合物の作用の評価方法が提供される。この評価方法は、前記悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルと１又は２以上の被験化合物とを接触させる工程と、前記インビトロ腫瘍細胞モデルに対する前記１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、を備えることができる。
【００２５】
前記悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの前記細網線維芽細胞に前記１又は２以上の被験化合物を接触させる工程と、前記細網線維芽細胞に対する前記１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、を、さらに備えることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＦＡＣＳによるキメリズム解析結果を示す図である。
【図２】リンパ腫マウスモデルから採取した脾臓についての免疫染色結果を示す図である。
【図３】シクロホスファミド１水和物を投与したリンパ種モデルマウスの脾臓重量及びその免疫染色結果を示す図である。
【図４】ＤＬＢＣＬ患者由来の細胞（ＯＮＯ）を移植したＮＯＧマウスから採取した脾臓のEVG染色、アザン染色、渡辺鍍銀染色を行った結果を示す図である。
【図５】ＤＬＢＣＬ患者由来の細胞（ＯＮＯ）を移植したＮＯＧマウスから採取した脾臓の細網線維芽細胞（Rat-FR-TR7）及びヒト由来細胞の染色結果を示す図である。
【図６】試験管内でのヒト由来リンパ腫細胞と細網線維芽細胞との微小環境を示す図である。
【図７】ＢＬＳ４との共培養を介してヒト由来リンパ腫細胞にＣＰＡに対する抵抗性が付与されたことを示す図である。
【図８】ヒト由来リンパ腫細胞を、ＢＬＳ４とともに培養すると、その増殖活性は継続的に維持されることを示す図である。
【図９】臨床検体から採取したリンパ腫細胞は、ＢＬＳ４の併存下においては細胞死が減少することを示す図である。
【図１０】ＢＬＳ４と臨床検体由来のＴＫリンパ腫細胞との共培養による２６１３化合物のスクリーニング結果を示す図である。
【図１１】２６１３種の化合物のうち、ＢＬＳ４細胞の処理群／コントロール（Ｔ／Ｃ）が上位１０位で、かつＴＫリンパ腫細胞の処理群／コントロール（Ｔ／Ｃ）が２．０の以上の化合物の表を示す図である。
【図１２】Pyruvinium Pamoateの濃度とリンパ腫ＴＫ細胞の細胞死との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書は、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルとその利用に関する。本明細書に開示される悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルによれば、動物内における悪性リンパ腫の腫瘍細胞の微小環境に類似した環境をインビトロに供給することができる。このため、動物等を利用せずにインビボでも有効なスクリーニングや評価等などのための利用が可能となる。さらに、インビトロでのモデルであるため、操作の煩雑さやコストを低減できる。さらに、悪性リンパ腫の腫瘍細胞と細網線維芽細胞とを含むため、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対して高い特異性で作用する作用剤を選択することが可能となる。
【００２８】
本明細書によれば、上記した悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルのほか、当該モデルのための培養剤、当該モデルの製造方法、悪性リンパ腫の腫瘍細胞のインビトロ培養系の製造方法、悪性リンパ腫の腫瘍細胞を培養するための培養剤及びそのスクリーニング方法、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニング方法、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する化合物の作用の評価方法等が提供される。以下、これらの実施形態について詳細に説明する。
【００２９】
（悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデル）
本明細書に開示される悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルは、細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞（以下、単に腫瘍細胞という。）とを含むことができる。
【００３０】
細網線維芽細胞とは、動物のリンパ節の間葉系ストローマ細胞であり、線維芽細胞状の形態を示し、リンパ節組織を支持するネットワーク構造を形成すると考えられている。典型的には、ＥＲ−ＴＲ７抗原を提示する。細網線維芽細胞は、株化された細胞であってもよいし、動物のリンパ節から採取しただけの株化されていない細胞であってもよいが、好ましくは株化された細胞である。細網線維芽細胞は、マウスなどの実験動物やヒトのリンパ節から採取できるほか、必要に応じて株化されたものを入手あるいは取得できる。例えば、ＢＬＳ４、ＢＬＳ１２等が挙げられる。また、当業者であれば、J Exp Med. 2004 Sep 20;200(6):783-95の記載(BLS4の樹立に関する）に基づいて、必要に応じて細網線維芽細胞株を樹立し、また適宜後述するスクリーニング方法により選択して用いることができる。また、本モデルに用いる細網線維芽細胞は、後述するスクリーニング方法により、腫瘍細胞と組み合わせてモデルを構築するのに好適な細胞を、ヒトやマウスなどに由来する細網線維芽細胞から取得することもできる。
【００３１】
腫瘍細胞は、悪性リンパ腫の腫瘍細胞である。悪性リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とかあるが、非ホジキンリンパ腫には、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、小細胞性リンパ腫及び形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫。リンパ芽球性リンパ腫などのＢ細胞性リンパ腫、菌状息肉腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球型リンパ腫、鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫などのＴ細胞性又はＮＫ細胞性リンパ腫が挙げられる。なかでも、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫が挙げられる。
【００３２】
腫瘍細胞は、株化されていてもよいし、株化されていなくてもよい。悪性リンパ腫に罹患したヒトまたは非ヒト動物のリンパ節等から採取された株化されてないものであってもよい。また、特定の個体に適した薬剤のスクリーニング等を用途とする場合には、当該個体から採取された腫瘍細胞とすることが好ましい場合もある。株化された腫瘍細胞は、マウスやヒトなど各種動物由来で商業的に入手が可能であり、株化されていない腫瘍細胞は、悪性リンパ腫の腫瘍細胞は悪性リンパ腫に罹患した臨床検体から採取可能である。
【００３３】
さらに、腫瘍細胞としては、ヒトなどの動物のリンパ節等から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞をこの腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して非ヒト動物内で培養し、非ヒト動物から分離して得られる悪性リンパ腫の腫瘍細胞であってもよい。こうした腫瘍細胞は、非ヒト動物内で増殖されており、取り扱いが容易であるほか、インビトロ培養系の構築に好適であることがわかっている。
【００３４】
腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物とは、人工的にあるいは本来的な免疫不全非ヒト動物である。免疫不全非ヒト動物は、商業的に入手が可能であるほか、マウス実験の基礎知識（小出 剛著、オーム社発行、(2009/03) ISBN-10: 4274502171）等に基づいて取得可能である。典型的には、免疫不全非ヒト動物としては、マウス等が挙げられる。好ましくはマウスである。また、ヒト由来の腫瘍細胞を培養するのに適したものとしては、Cellular & Molecular Immunology (2012) 9, 208-214; doi:10.1038/cmi.2012.2; published online 13 February 2012に開示されるＮＯＧ、ＮＯＤ、ＮＳＧマウスが好適である。また、Blood November 1, 2002 vol. 100 no. 9 3175-3182に開示されるＮＯＧマウスも好適である。この種腫瘍細胞の取得については後段で詳述する。
【００３５】
細網線維芽細胞と腫瘍細胞とは、同種細胞に由来していてもよいし、異種細胞に由来していてもよい。また、他家細胞に由来していてもよいし、自家細胞に由来していてもよい。例えば、マウス由来の細網線維芽細胞とヒト由来の腫瘍細胞との組み合わせであってもよいし、いずれもヒトであってもよい。薬剤等のスクリーニングなどの用途を考慮すると、腫瘍細胞はヒトあるいは家畜あるいはペットなどの非ヒト動物由来であることが好ましい。家畜としては、ウシ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ブタ等が挙げられる。ペットとしては、イヌ、ネコ、サル、ウサギ等が挙げられる。
【００３６】
このモデルは、これらの細胞を含んでいる限り、その形態を特に限定されない。例えば、これらの細胞の混合物であってもよいし、共培養物であってもよい。混合物自体であっても、スクリーニングなどの用途に供するのに適した状態の腫瘍細胞を維持できるし、混合された直後から実質的にこれらの細胞間の相互作用が生じるためである。共培養物であれば、通常、よりこれらの細胞間の相互作用が強固された状態が得られている。なお、混合物と共培養物とは必ずしも明確に区別できないが、通常、これらの細胞の間に細胞外マトリックス繊維等によるネットワーク構造を有している。
【００３７】
本モデルにおける細網線維芽細胞と腫瘍細胞の分布状態も特に限定されない。細網線維芽細胞と腫瘍細胞とがほぼ均等に分散している形態であってもよい。また、例えば、腫瘍細胞が細網線維芽細胞マトリックスに分散されている状態など、一方の細胞が他方の細胞を主体とするマトリックスに分散されている状態であってもよい。さらに細網線維芽細胞を主体とする足場に腫瘍細胞が保持されている形態であってもよい。さらに、細網線維芽細胞を主体とする３次元ネットワークに腫瘍細胞が保持されている形態であってもよい。この構造は、動物のリンパ節等で観察される細網ネットワークに類似したネットワーク構造体である。
【００３８】
このモデルは、培養容器等の容器内に収容された形態を採ることもできるし、それ自体３次元形状を有していてもよい。細網線維芽細胞は接着性細胞であり、培養容器の内表面に応じた形態を取りうるからである。こうした３次元形状を有する細網線維芽細胞に腫瘍細胞を混合し、あるいはこうした細網線維芽細胞を足場として腫瘍細胞を培養すること等により任意の３次元形状を有するモデルを得ることができる。
【００３９】
このモデルは、細網線維芽細胞と腫瘍細胞とのみから構成されていてもよいが、必要に応じ、これらの細胞を維持しあるいは増殖に適した状態を維持するための他の成分を含むことができる。例えば、細胞外マトリックス成分（細胞外マトリックス繊維も含む）、各種ケモカイン等が挙げられる。例えば、細胞外マトリックス成分としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリノーゲン 、プロテオグリカン 、ポリ-L- オルニチン、ポリ-D-リジン、ビトロネクチン、ニドジェン、テネイシン、トロンボスポンジン等が挙げられ、ケモカインとしては、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ１６、ＩＰ−１０、ＭＣＰ１、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ｒａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ１、ＴＲＥＭ１等が挙げられる。
【００４０】
また、モデルには、動物細胞の細胞培養に用いられる公知の培地又は当該培地を構成する１又は２以上の成分をさらに含んでいてもよい。また、このモデルは、動物細胞の細胞培養に用いられる公知の培地添加剤又は当該培地添加剤に含まれる１又は２以上の成分を含んでいてもよい。例えば、ＴＩＭＰ−１、ＫＣ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１等が挙げられる。
【００４１】
（悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルのための培養剤）
本明細書によれば、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルのための培養剤が提供される。この培養剤は、動物から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞を前記腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して前記非ヒト動物内で培養し、前記非ヒト動物から分離して得られる悪性リンパ腫の腫瘍細胞を含むことができる。
【００４２】
（悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの製造）
本明細書に開示される悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの製造方法は、細網線維芽細胞と腫瘍細胞とを混合する工程を備えることができる。本製造方法によれば、インビトロでも、簡易な方法で動物内における腫瘍細胞を含む微小環境を模倣した培養系を構築できる。
【００４３】
混合工程における細網線維芽細胞と腫瘍細胞との混合方法は特に限定しない。細網線維芽細胞と腫瘍細胞とを単に混合してもよいし、予め細網線維芽細胞を培養しておき、この細胞集団に対して腫瘍細胞を混合してもよい。腫瘍細胞も予め培養しておいてもよい。好ましくは、予め細網線維芽細胞を培養しておき、それに対して腫瘍細胞を添加する。こうすることで、両者の相互作用によってより好ましいインビトロ培養系を構築できると考えられる。
【００４４】
混合工程に供される腫瘍細胞は、その腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養し、非ヒト動物内から分離した腫瘍細胞としてもよい。すなわち、混合工程に先立って、腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養する工程と、非ヒト動物内から前記悪性リンパ腫の腫瘍細胞を分離する工程と、を備えていてもよい。腫瘍細胞は、免疫的に許容される非ヒト動物内で培養し、継代が可能であるため、こうした非ヒト動物内で培養した腫瘍細胞は、株化されていない、ヒト臨床検体を含む動物個体から採取された腫瘍細胞であっても、有効な増殖活性を有しており、インビトロ培養系の構築に適している。
【００４５】
非ヒト動物に移植するための腫瘍細胞は、悪性リンパ腫に罹患した動物から悪性リンパ腫の腫瘍細胞を採取して準備する。動物個体から腫瘍細胞の採取は、常法に従い当業者であれば実施できる。また、腫瘍細胞は、マウスなどの免疫不全非ヒト動物の腹腔内に移植して増殖させることが好ましい。非ヒト動物内において腫瘍細胞を培養するには、こうした非ヒト動物を通常の飼育条件下で飼育することで通常実現できる。非ヒト動物内で所定期間腫瘍細胞を培養後、当該動物の腹腔内の腫瘍、そのほか腫瘍細胞が蓄積される脾臓やリンパ節などの組織や器官を採取し、常法に従い単セル化して用いる。必要に応じて凍結保存し、その後用いることもできる。
【００４６】
なお、こうした非ヒト動物内培養腫瘍細胞を混合工程に供する場合、本製造方法は、細網線維芽細胞を培養する工程を伴い、予め培養された細網線維芽細胞とこの腫瘍細胞とを混合することが好ましい。
【００４７】
本製造方法は、さらに、混合工程後に、細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞とを共培養する工程を備えることができる。混合工程後に、インビトロ培養系として用途に供するに先立って、適宜これらの細胞を共培養する工程を備えることが好ましい。こうすることで、両者の相互作用がより強まってより動物内での腫瘍細胞を含む微小環境を模倣できる。
【００４８】
細網線維芽細胞、腫瘍細胞のそれぞれの培養、及びこれらの共培養については、それぞれに適した培地、温度等の培養条件は、動物の細胞培養（特に線維芽細胞及び腫瘍細胞）に関する公知技術に基づき当業者であれば適宜設定することができる。例えば、これらの共培養にあたっては、３７℃、５％ ＣＯ2の条件のほか、低酸素培養（＜５％Ｏ2）培養、低栄養（Glucose Free）培養等も適宜採用できる。
【００４９】
なお、本製造方法は、同時に、腫瘍細胞のインビトロ培養系の製造方法でもある。腫瘍細胞モデルは、それ自体、腫瘍細胞のインビトロ培養系でもあるからである。
【００５０】
（インビトロ培養系に適した腫瘍細胞の製造）
本明細書の開示される、インビトロ培養系に適した悪性リンパ腫の腫瘍細胞の製造方法は、動物から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞を準備する工程と、腫瘍細胞を当該腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して前記非ヒト動物内で培養する工程と、を備えることができる。本製造方法によれば、インビトロでも増殖活性に優れる腫瘍細胞を効率的に準備できる。また、こうして得られる非ヒト動物内で培養された腫瘍細胞は、インビトロ培養系や腫瘍細胞モデルの構築に適しておりそれ自体有用である。本製造方法における、腫瘍細胞の準備、非ヒト動物への移植、培養については、既に説明したインビトロ腫瘍細胞モデルの製造における各種実施態様を適用できる。
【００５１】
（腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤）
本明細書に開示される、腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤は、細網線維芽細胞を含むことができる。腫瘍細胞の培養に細網線維芽細胞を用いることで、腫瘍細胞を含む動物内の微小環境をより近似した状態をインビトロでも再現し、より増殖活性に優れる状態を形成できる。こうした細網線維芽細胞としては、既に悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの製造に関して説明した各種実施態様を適用できる。
【００５２】
（腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤のスクリーニング方法）
本明細書に開示される、腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤のスクリーニング方法は、１又は２以上の細網線維芽細胞を被験細胞とし、当該被験細胞と腫瘍細胞とを混合し培養する工程と、培養工程で得られた培養物と腫瘍細胞の増殖抑制剤とを接触させる工程と、増殖抑制剤と接触後の腫瘍細胞の細胞活性を評価する工程と、を備えることができる。この方法によれば、腫瘍細胞にインビトロで培養するのに適した培養剤となる細網線維芽細胞を取得できる。また、この方法によれば、用いる腫瘍細胞に対応してより適した細網線維芽細胞を取得することができる。
【００５３】
被験細胞とする細網線維芽細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。また、用いる腫瘍細胞に対して異種であってもよいし、同種であってもよいし、他家であってもよいし自家であってもよい。また、公知の株化された細網線維芽細胞を被験細胞とすることもできる。
【００５４】
（腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニング方法）
本明細書に開示される、腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニング方法は、インビトロ腫瘍細胞モデルと１又は２以上の被験化合物とを接触させる工程と、インビトロ腫瘍細胞モデルに対する１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、を備えることができる。この方法によれば、従来とは異なり、より動物内での状態に近い増殖活性を有する腫瘍細胞に対して被験化合物を提供できるため、腫瘍細胞に対してより現実的な、あるいはより有効な作用剤のスクリーニングを実施できる。また、後述するように、インビトロ腫瘍細胞モデルには、腫瘍細胞でない細網線維芽細胞を含んでいるために、この細胞を比較対象とすることで、腫瘍細胞により高い特異性で有効な作用剤をスクリーニングできる。
【００５５】
本スクリーニング方法でスクリーニングする作用剤の作用は、１又は２以上の被験化合物の腫瘍細胞の対する作用であれば特に限定されない。目的に応じて選択することができる。例えば、作用は、腫瘍細胞の増殖抑制（細胞死を含む）、増殖促進、耐性（増殖に対する反応性がないこと）等、腫瘍細胞の増殖活性に関する作用とすることができる。作用が増殖抑制であれば、抗腫瘍細胞剤をスクリーニングできるし、作用が増殖促進であれば、抗腫瘍細胞剤のターゲット化合物をスクリーニングできる。作用が耐性であれば、その腫瘍細胞には有効でない（薬剤非適応）薬剤をスクリーニングできる。
【００５６】
また、本スクリーニング方法では、特定の臨床検体からその検体に応じた腫瘍細胞モデルを使用するため、当該検体により有効な作用剤をスクリーニングできる。
【００５７】
インビトロ腫瘍細胞モデルの細網線維芽細胞に１又は２以上の被験化合物を接触させる工程と、前記細網線維芽細胞に対する１又は２以上の被験化合物の作用を評価する工程と、を、さらに備えることもできる。細網線維芽細胞に対する被験化合物の作用も評価することで、腫瘍細胞に対する被験化合物の作用をより選択的に評価でき、被験化合物についての作用についてより確度の高い評価（スクリーニング）が可能となる。
【００５８】
細網線維芽細胞についても評価を行う場合、細網線維芽細胞に対する１又は２以上の被験化合物の作用とインビトロ腫瘍細胞モデルに対する作用とに基づいて１又は２以上の被験化合物を評価する工程を、さらに備えることもできる。両者に対する作用を比較することで、腫瘍細胞でない正常細胞には作用しない（安全である）一方、腫瘍細胞に選択的に作用する（有効な）化合物をスクリーニングできる。
【００５９】
例えば、評価にあたっては、被験化合物が添加されていない細網線維芽細胞の作用（例えば細胞死）に対する被験化合物が添加された細網線維芽細胞の作用（細胞死）と、被験化合物が添加されていない腫瘍細胞の作用（例えば細胞死）に対する被験化合物が添加された腫瘍細胞の作用（細胞死）と、を用いることができる。これらの数値の積を、例えば、評価に用いた作用に関連づけたインデックス（この場合には細胞死インデックス）として、評価に用いることができる。
【００６０】
本明細書によれば、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する化合物の作用の評価方法も同時に提供される。本スクリーニング方法は、化合物のスクリーニングのみならず、単なる評価方法にも有効であるからである。本評価方法においても、本スクリーニング方法における接触工程及び評価工程に関する各種態様をそのまま適用できる。
【００６１】
（悪性リンパ腫に対して有効な増殖抑制剤）
本明細書に開示される増殖抑制剤は、パモ酸ピルビニウムを有効成分とする。パモ酸ピルビニウムは、悪性リンパ腫、特にびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に有効な薬剤である。この化合物は、リンパ細胞の支持細胞であり正常細胞である細網線維芽細胞には作用が弱く、かつ腫瘍細胞に作用が強い薬剤である。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を具現化した実施例について説明するが、以下の実施例は、本発明の具体例に過ぎず本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６３】
（リンパ腫マウスモデルの作製）
インフォームドコンセントを取得したリンパ腫患者から、末梢血、骨髄またはリンパ節検体を採取し、常法に従いフィコール法（GE Healthcare#17-1440-03)で単核球分離を行った。細胞をＲＰＭＩ培地（シグマ＃R5886）で2回洗浄し細胞数を計数した。１ｘ１０6〜１０7 cells/bodyでＮＯＧマウス(重度免疫不全マウス）（公益財団法人実験動物研究所）の腹腔内移植を行った。腫瘍細胞を移植する際にGVHDに備え、OKT-3（１００μｇ／ｂｏｄｙ）を腹腔内投与した。なお、２代目以降の継代に関しては行わなかった。
【００６４】
ＮＯＧマウスの状態が悪くなってきたら、解剖し腫瘍細胞及び脾臓を採取した。脾臓、腫瘍は４０μｍのCell Strainer（BD＃1083411）を通してシングルセルにし、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。なお、赤血球を除去するためにErythrocyte Lysis Buffer （Qiagen ＃79217 ）を脾臓細胞に５倍量加え、ボルテックス後に氷上で１０〜１５分静置しボルテックスし遠心し、ＰＢＳに懸濁した。細胞は新たなＮＯＧマウスに移植して継代し、リンパ腫マウスモデルを作製した。なお、腫瘍細胞は、遠心し上清を捨て、細胞をセルバンカーI（十慈フィールド）に１ｘ１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下になるように懸濁し−８０℃で凍結した。なお、凍結後２４時間以降に液体窒素に保存した。
【実施例２】
【００６５】
（抗がん剤評価  −リンパ腫マウスモデルによる薬効評価−）
（１）キメリズム解析
リンパ腫マウスモデルの腹腔内から採取し、シングルセル化し、赤血球を除去した脾臓細胞及び腫瘍細胞をそれぞれＰＢＳに５ｘ１０5／１００μＬに調整した。マウスＣＤ４５（biolegend、 mouseＣＤ４５-PerCP #103130、ヒトＣＤ４５ (BD、 humanＣＤ４５-PE、 #555483)、もしくはヒトCD19（BD、humanCD19-PE、#555413)を１μＬ添加し３０分間４℃で静置した。さらに、ＰＢＳ２ｍＬを加え３００ｘｇで１０分間遠心し、上清を取除いた。細胞を、０．１μｇ／ｍＬに調整したＤＡＰＩ（invitrogen #D1306）溶液300μＬに再懸濁し、ＦＡＣＳにてキメリズム解析を行った。結果を図１に示す。図１に示すように、脾臓及び腹腔内から採取した腫瘍に関しては、マウス由来細胞とヒト由来の腫瘍細胞とのキメリズムが形成されていることがわかった。
【００６６】
（２）免疫染色
リンパ腫マウスモデルから脾臓を採取し、自動染色装置（VENTANA BENCHMARK XTシステム）で処理し免疫染色を行った。抗体はヒトＣＤ４５ (Roche#760-4279)を使いＤＡＢ法により免疫染色を行った。結果を図２に示す。図２に示すように、腹腔内から採取した腫瘍細胞においてマウス由来細胞とヒト由来の腫瘍細胞とのキメリズムが形成されていることがわかった。
【００６７】
（３）ＤＬＢＣＬ ＴＡＫ 薬効試験
薬効試験には、７週から８週齢のＮＯＧマウスに他のＮＯＧマウス内で継代可能となったＤＬＢＣＬ患者由来の細胞（ＴＡＫ）を１ｘ１０6細胞を腹腔内に移植したリンパ腫マウスモデルを使用した。抗腫瘍剤であるシクロホスファミド１水和物（ＣＰＡ、図中薬剤Ａで示す。）（Sigma #C7397）をＲＰＭＩ（ＦＢＳフリー）で７５ｍｇ／１０ｍＬに調整し、移植後２２日目から７５ｍｇ／ｋｇの用量で連日腹腔内投与を行う。２９日目に脾臓を摘出し、重量測定を行った。測定後１０％中性ホルマリンで固定し、免疫染色は自動染色装置（VENTANA BENCHMARK XTシステム）で処理し、抗体はヒトＣＤ４５(Roche#760-4279)を使いＤＡＢ法により免疫染色を行った。結果を図３に示す。
【００６８】
図３に示すように、ＣＰＡを投与したマウスにおいては、腫瘍細胞の減少が観察される一方、コントロールのマウスにおいては、腫瘍細胞の増殖が観察された。
【００６９】
以上のことから、実施例１で作製したリンパ腫マウスモデルにおいては、動物内においてマウス由来細胞とヒト由来腫瘍細胞とがキメリズムを形成しており、また、マウスに対して薬剤を投与することで、マウス体内においてヒト由来腫瘍細胞に対する効果を確認できることがわかった。
【実施例３】
【００７０】
（病態検証  − リンパ腫微小環境解析−）
７週から８週齢のＮＯＧマウスに他のＮＯＧマウス内で継代可能となったＤＬＢＣＬ患者由来の細胞（ＯＮＯ）を１ｘ１０6細胞を腹腔内に移植した。移植後１４日目、２１日目及び２８日目に解剖し脾臓を摘出した。ヒトＣＤ２０抗体（DAKO L26）で免疫染色を行い、移植後２８日目の脾臓は連続切片を作製しEVG染色、アザン染色、渡辺鍍銀染色を行った。結果を図４に示す。図４上段に示すように、移植からの時間経過に伴い、マウス内でヒト由来の腫瘍細胞が増殖していることがわかった。また、図４下段に示すように、移植後２８日目の染色結果からは、ヒト由来の腫瘍細胞が細網線維芽細胞とともにマトリックスを形成していることがわかった。
【実施例４】
【００７１】
７週から８週齢のＮＯＧマウスに他のＮＯＧマウス内で継代可能となったＤＬＢＣＬ患者由来の細胞（ＯＮＯ）を１ｘ１０6細胞を腹腔内に移植する。移植後５週目に解剖し脾臓を摘出し、未固定のまま凍結する。凍結ブロックを１０μｍに薄切し、４％ paraformaldehuyde で１０分間室温にて固定する。ＰＢＳで２回洗浄後にＰＢＳに薄めた０．１％ｔｒｉｔｏｎ溶液で１０分間室温で静置しPermeabilizeを行う。ＰＢＳで洗浄後に２０分間風乾する。ＰＢＳで薄めたHorce Serumで６０分間室温でブロッキングを行う。１％ＢＳＡの入ったＰＢＳでRat-FR-TR7 を５０倍希釈、mouse-ＣＤ２０を３００倍希釈し、４℃でオーバーナイトで反応させる。ＰＢＳで３回洗浄後に１％ＢＳＡ ＰＢＳで５００倍に希釈したMouse-488、Rat-649で６０分間反応させる。ＰＢＳで２回洗浄後に１μｇ／ｍＬの Hochest 33342で３分間核染色を行いＰＢＳで１回洗浄する。封入剤（Diagnostic Biosystem#K024）で封入後に撮像を行う。なお、ヒト由来細胞は、抗ヒトＣＤ−２０抗体で染色した。結果を図５に示す。
【００７２】
図５に示すように、マウスの細網線維芽細胞がヒト由来の腫瘍細胞の周囲にネットワーク状に配置されており、マウス内においてヒト由来腫瘍細胞が、マウス細網線維芽細胞とともに微小環境を形成していることがわかった。
【実施例５】
【００７３】
培養は３７℃、５％ＣＯ2の条件で行った。Ｄａｙ０にＢＬＳ４細胞をＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）（シグマ＃R5886）を用いて３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整し、２５０μＬのＢＬＳ４細胞を８well Chamber Slideに播種した。Ｄａｙ１に培地を捨てＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）に懸濁したヒト由来リンパ腫細胞SU-DHL4を１ｘ１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬで２５０μＬ共培養する。コントロールウエルは培地を捨て２５０μＬのＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）培地を入れた。Ｄａｙ７にLyse/Fix buffer (BD#558049)で固定し、ＰＢＳで薄めた０．１％Tritonで１０分間室温で静置しPermeabilizeを行う。ＰＢＳで洗浄後に２０分間風乾する。ＰＢＳで薄めた１％ＢＳＡで６０分間室温でブロッキングを行った。１％ＢＳＡの入ったＰＢＳでRat-ER-TR7(Abcam #51824) を５０倍希釈、４℃でオーバーナイトで反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後に１％ＢＳＡ ＰＢＳで５００倍に希釈したAnti-RatIgG-Alexa488(Invitrogen #A11006)で６０分間反応させた。ＰＢＳで２回洗浄後に１μｇ／ｍＬの Hochest 33342(Invitrogen #H3570)で３分間核染色を行いＰＢＳで１回洗浄した。結果を図６に示す。
【００７４】
図６に示すように、インビトロにおいても、マウス生体内において確認されたように、ヒト由来腫瘍細胞の周囲にマウスの細網線維芽細胞がネットワークを形成していることがわかた。
【実施例６】
【００７５】
SU-DHL6細胞にレンチウイルスでGFP-Luciferase発現ベクターをトランスフェクションし、ＦＡＣＳ ＡｒｉａでＧＦＰ発現細胞のソーティングを行った。Ｄａｙ０に１０％ＦＢＳの入ったＲＰＭＩ培地 (１０％ＦＢＳ)（シグマ＃R5886）で３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＢＬＳ４を１００μＬずつ９６well プレートに播種した。Ｄａｙ１に培養上清を捨て、Luciferase発現SU-DHL6細胞株を１０％ＦＢＳの入ったＲＰＭＩ培地（シグマ＃R5886）で１ｘ１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整し１００μＬずつ播種した。共培養を開始して８時間後に抗腫瘍剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ）を最終濃度３ｍｇ／ｍＬ、最終容量１５０μＬになるように添加した。培養は３７℃、５％ＣＯ2で行った。Ｄａｙ４にLuciferin（Promega #P1041）を１５０μｇ／ｍＬになるように加え１分間攪拌したあと、５分間室温で静置し、プレートリーダーでLuciferaseの発光を測定しSU-DHL6の生細胞を求めた。結果を図７に示す。
【００７６】
図７に示すように、ＢＬＳ４と共培養したヒト由来リンパ腫細胞は、ＣＰＡに対して高い抵抗性を示し、その増殖活性が高まっていることがわかった。この結果から、リンパ腫細胞をＢＬＳ４などの細網線維芽細胞と併存させることにより、リンパ腫細胞の増殖活性が高まることがわかった。
【実施例７】
【００７７】
Ｄａｙ０にＲＰＭＩ培地 （１０％ＦＢＳ）（シグマ＃R5886）で３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＢＬＳ４を１０ｍＬずつ１０ｃｍプレートに播種した。Ｄａｙ１に液体窒素に保存していたシングルセル化したリンパ腫検体移植ＮＯＧマウスモデルから採取した腹腔内腫瘍細胞を３７℃で融解し、ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ）（シグマ＃R5886）で洗浄後生細胞数のカウントを行い１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。調整したリンパ腫細胞を前日に播種しておいたＢＬＳ４と共培養した。またリンパ腫細胞のみの培養も１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地（シグマ＃R5886）で行った。
【００７８】
なお、腹腔内腫瘍細胞は、インフォームドコンセントを取得したリンパ腫患者（ＴＫ）から、末梢血、骨髄検体を採取し単核球分離を行ったあと、ＮＯＧマウスの腹腔内に移植し脾臓から継代可能となった腫瘍細胞を摘出し、シングルセルにしたあと、セルバンカーI（十慈フィールド）に懸濁し−８０℃、もしくは液体窒素に保存しておいたものを用いた。
【００７９】
。
全ての培養は３７℃、５％ＣＯ2の条件で行った。経時的にTrypan Blueで生細胞のカウントを行った。３〜４日毎にＢＬＳ４の継代を行い、リンパ腫細胞は全量継代した。結果を図８に示す。
【００８０】
図８に示すように、ヒト由来リンパ腫細胞を、ＢＬＳ４とともに培養すると、その増殖活性は継続的に維持されることがわかった。
【実施例８】
【００８１】
インフォームドコンセントを取得したリンパ腫患者（びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫（ＴＫ、ＯＮＯ）、血管内リンパ腫（ＩＣＨＩ）、濾胞性リンパ腫（ＮＡＧ）、マントルセルリンパ腫（ＭＩＹ））から、末梢血、骨髄検体を採取し単核球分離を行ったあと、ＮＯＧマウスの腹腔内に移植し継代可能となった腫瘍細胞を摘出し、シングルセルにしたあと、セルバンカーI（十慈フィールド）に懸濁し−８０℃、もしくは液体窒素に保存しておいた。３７℃、５％ＣＯ2で培養し複数回継代したＢＬＳ４細胞を、Ｄａｙ０に１０％のＦＢＳが入ったＲＰＭＩ培地（シグマ＃R5886）中に３ｘ１０4 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整し１００μＬずつ９６ｗell プレートに播種した。Ｄａｙ１に、保存していたリンパ腫検体をＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ）で１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。ＢＬＳ４のプレートへの生着を確認した後、培地を捨て１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したリンパ腫細胞を１００μＬ加え、ＢＬＳ４とリンパ腫細胞の共培養を行った。またコントロールとしてリンパ腫検体を１０％ＦＢＳの入ったＲＰＭＩ培地でのみの培養を行った。Ｄａｙ４に死細胞の染色を行うために、０．６μｇ／ｍＬに調整したＤＡＰＩ（invitrogen #D1306）を２０μＬずつ共培養プレートに添加し軽く揺すった後、３００ｘｇ、４℃で１０分間遠心した。Thermo社のArrayScan VTI HCS Readerを使い、５ＸＮＡ０．２５レンズで各wellにつき９視野の撮像を行い、ＤＡＰＩ陽性の死細胞のカウントを行った。結果を図９に示す。
【００８２】
図９に示すように、特定の臨床検体から採取したリンパ腫細胞は、いずれもＢＬＳ４の併存下においては細胞死が減少していることがわかった。この結果から、ＢＬＳ４併存下においては、インビトロにおけるリンパ腫細胞の耐性が向上していることがわかった。
【実施例９】
【００８３】
創薬オープンイノベーションライブラリーより提供を受けたPrestwick Chemical LibraryとLOPAC Chemical Libraryの２６１３化合物について共培養スクリーニングを行った。共培養スクリーニングの方法は以下のとおりとした。
【００８４】
インフォームドコンセントを取得したリンパ腫患者（ＴＫ）から、末梢血、骨髄検体を採取し単核球分離を行ったあと、ＮＯＧマウスの腹腔内に移植し継代可能となった腫瘍細胞を摘出し、シングルセルにしたあとセルバンカーI（十慈フィールド）に懸濁し−８０℃もしくは液体窒素に保存した。３７℃、５％ＣＯ2で複数回継代したＢＬＳ４細胞をＤａｙ０に１０％のＦＢＳが入ったＲＰＭＩ培地（シグマ＃R5886）中に３ｘ１０4 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整し１００μＬずつ９６wellプレートに播種した。Ｄａｙ１に保存していたリンパ腫検体ＴＫをＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ）で１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。ＢＬＳ４のプレートへの生着を確認した後、培地を捨て１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＴＫ細胞を１００μＬ加え、ＢＬＳ４とＴＫの共培養を行った。またＢＬＳ４のみのプレートも同様に培地を捨て、新たに１００μＬのＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ）を加えた。
【００８５】
Ｄａｙ２に最終濃度を２μＭになるように化合物ライブラリーを４μＬずつ、ＢＬＳ４とＴＫ細胞の共培養プレート、ＢＬＳ４のみの培養プレートにそれぞれ添加した。細胞培養は３７℃、５％ＣＯ２で行った。Ｄａｙ５に死細胞の染色を行うために、０．６μｇ／ｍＬに調整したＤＡＰＩ（invitrogen #D1306）を２０μＬずつ共培養プレートに添加し軽く揺すった後、３００ｘｇ、４℃で１０分間遠心した。Thermo社のArrayScan VTI HCS Readerを使い、５ＸＮＡ０．２５レンズで各ｗｅｌＩにつき９視野の撮像を行い、ＤＡＰＩ陽性の死細胞のカウントを行った。またＢＬＳ４のみの培養プレートにはCell Counting Kit-8 (同仁化学研究所、#347-07621)を１０μＬずつ添加し、２時間後に吸光度測定を行い、化合物のＢＬＳ４への影響を調べた。結果を図１０に示す。
【００８６】
図１０は、Ｘ軸はＢＬＳ４のＭＴＴアッセイの結果を処理群／コントロール（Ｔ／Ｃ）で示し、Ｙ軸はリンパ腫細胞ＴＫの死細胞のカウント結果を処理群／コントロール（Ｔ／Ｃ）で示した。第１象限には、にはＢＬＳ４への影響が少なく、リンパ腫ＴＫ細胞への殺細胞効果のある化合物がプロットされている。
【００８７】
図１０に示すように、ＢＬＳ４の細胞死を抑制する一方リンパ腫細胞の細胞死を促進できる化合物が見出された。
【００８８】
共培養スクリーニングの結果の定量化のために、ＢＬＳ４のＭＴＴアッセイの結果、（処理群／コントロール（Ｔ／Ｃ））とリンパ腫細胞ＴＫの死細胞のカウント結果（処理群／コントロール（Ｔ／Ｃ））の積を細胞死インデックス（ＣＤＩ）として求めた。２６１３化合物の内ＢＬＳ４細胞の処理群／コントロール（Ｔ／Ｃ）が上位１０位で、かつＴＫリンパ腫細胞の処理群／コントロール（Ｔ／Ｃ）が２．０の以上のものを、図１１に示す。
【００８９】
図１０及び図１１に示すように、今回の２６１３化合物のスクリーニングによりＣＤＩの一番高かった化合物がPyruvinium Pamoateであった。
【実施例１０】
【００９０】
Ｄａｙ０に１０％のＦＢＳが入ったＲＰＭＩ培地（シグマ＃Ｒ５８８６）中に３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整し１００μＬずつ９６ｗellプレートに播種した。Ｄａｙ０に保存していたリンパ腫検体ＴＫをＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ）で１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。ＢＬＳ４のプレートへの生着を確認した後、培地を捨て１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＴＫ細胞を１００μＬ加え、ＢＬＳ４とＴＫの共培養を行った。またＢＬＳ４のみのプレートも同様に培地を捨て、新たに１００μＬのＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ）を加えた。Ｄａｙ２に容量を振ったPyruvinium Pamoate（Sigma P0027）を添加した。Ｄａｙ５に死細胞の染色を行うために、０．６μｇ／ｍＬに調整したＤＡＰＩ（invitrogen #D1306）を２０μＬずつ共培養プレートに添加し軽く揺すった後、３００ｘｇ、４℃で１０分間遠心した。Thermo社のArrayScan VTI HCS Readerを使い、５ＸＮＡ０．２５レンズで各ｗｅｌにつき９視野の撮像を行い、ＤＡＰＩ陽性ｌの死細胞のカウントを行った。結果を図１２に示す。
【００９１】
図１２に示すように、Pyruvinium Pamoateは容量依存的にリンパ腫ＴＫ細胞に殺細胞効果を示した。
【００９２】
以上、本発明の実施形態および実施例について詳細に説明したが、これらは例示に過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
【００９３】
本明細書または図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組合せによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組合せに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数目的を同時に達成し得るものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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