(57)【要約】【課題】  宿主細胞内で発現した組換えタンパク質を効率的にペリプラズム領域へ移行可能なシグナルペプチド、および当該ペプチドを用いた前記タンパク質の製造方法を提供すること。【解決の手段】  天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうちＮ末端領域のいずれかに塩基性アミノ酸を挿入したシグナルペプチド、および前記ペプチドをペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドとして用いて前記タンパク質を製造することで、前記課題を解決する。【選択図】  図２
2014223064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、Ｎ末端領域のいずれかに塩基性アミノ酸を挿入した、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチド。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、２番目のリジンと３番目のチロシンとの間に塩基性アミノ酸を１残基挿入した、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチド。
【請求項３】
塩基性アミノ酸がリジンである、請求項１または２に記載のシグナルペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、前記タンパク質を発現させるためのプラスミド。
【請求項５】
タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、請求項４に記載のプラスミド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のプラスミドを用いて宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項７】
宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の形質転換体を培養することで前記形質転換体からタンパク質を発現させる工程と、前記形質転換体から当該タンパク質を単離する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なシグナルペプチドおよびそれを用いたタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は細胞内で合成された後、そのまま細胞内に留まるもの、細胞外へと分泌タンパク質として放出されるものが知られている。また大腸菌などを宿主として用いた組換えタンパク質生産では、細胞内膜と外膜の間のペリプラズム領域に前記タンパク質を分泌発現させる方法が知られている（特許文献１）。細胞内からペリプラズム領域へ組換えタンパク質が移送される際には、シグナルペプチドと呼ばれるオリゴペプチドの働きが重要である（特許文献１）。シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の特徴として、以下の３つがあげられる（特許文献１）。
（ｉ）Ｎ末端領域には、アルギニンやリジンといった塩基性アミノ酸が少なくとも１つ含まれており、当該塩基性アミノ酸の側鎖の正電荷と細胞膜表面の負電荷とのイオン結合によりシグナルペプチドが細胞膜内へと移行する。
（ｉｉ）中心領域では、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンといった疎水性アミノ酸が多く含まれ、細胞膜内への貫通に関与する。
（ｉｉｉ）Ｃ末端領域では、細胞膜貫通後にシグナルペプチダーゼにより切断される特定のアミノ酸が認識部位として存在しており、当該認識部位で切断されることで成熟体タンパク質がペリプラズム領域や細胞外へと放出される。
【０００３】
組換えタンパク質を宿主のペリプラズムに分泌発現させるには、前記タンパク質のＮ末端側に、ペリプラズムへの分泌発現を促進させるシグナルペプチドが付加された状態で発現させる必要がある。しかしながら、前記方法を用いた場合、活性型タンパク質としての生産性が低いという問題があった。またシグナルペプチドの改変により生産性を向上させた例も報告（特許文献１から３）されているが、工業的な生産には十分とはいえなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−１７５６８６号公報
【特許文献２】特開２００８−０７３０４４号公報
【特許文献３】ＷＯ２００８／０３２６５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、宿主細胞内で発現した組換えタンパク質を効率的にペリプラズム領域へ移行可能なシグナルペプチド、および当該ペプチドを用いた前記タンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、既知のシグナルペプチドの特定位置に塩基性アミノ酸を挿入したオリゴペプチドをシグナルペプチドとして用いることで、組換えタンパク質の生産量が向上できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、Ｎ末端領域のいずれかに塩基性アミノ酸を挿入した、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチド。
【０００８】
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、２番目のリジンと３番目のチロシンとの間に塩基性アミノ酸を１残基挿入した、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチド。
【０００９】
（Ｃ）塩基性アミノ酸がリジンである、（Ａ）または（Ｂ）に記載のシグナルペプチド。
【００１０】
（Ｄ）（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、前記タンパク質を発現させるためのプラスミド。
【００１１】
（Ｅ）タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、（Ｄ）に記載のプラスミド。
【００１２】
（Ｆ）（Ｄ）または（Ｅ）に記載のプラスミドを用いて宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【００１３】
（Ｇ）宿主が大腸菌である、（Ｆ）に記載の形質転換体。
【００１４】
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に記載の形質転換体を培養することで前記形質転換体からタンパク質を発現させる工程と、前記形質転換体から当該タンパク質を単離する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。
【００１５】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【００１６】
本発明のシグナルペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までの領域）のうち、Ｎ末端領域のいずれかに塩基性アミノ酸が挿入されていることを特徴としている。ここでＮ末端領域とは、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号２）のうちＮ末端側４アミノ酸残基（１番目のメチオニンから４番目のロイシンまでの領域）のことをいう。具体的には、１番目のメチオニンと２番目のリジンとの間、２番目のリジンと３番目のチロシンとの間、３番目のチロシンと４番目のロイシンとの間、のいずれかに塩基性アミノ酸を挿入することで、本発明のシグナルペプチドを得ることができる。塩基性アミノ酸の挿入数は、本発明のシグナルペプチドでペリプラズムに分泌させるタンパク質の性質を考慮の上、１から数アミノ酸残基の範囲で適宜決定すればよい。天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号２）のうち、２番目のリジンと３番目のチロシンとの間に塩基性アミノ酸を１残基挿入した本発明のシグナルペプチドの具体例として、前記天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち２番目のリジンと３番目のチロシンとの間にリジンが挿入されたオリゴペプチド（配列番号４）や、前記天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち２番目のリジンと３番目のチロシンとの間にアルギニンが挿入されたオリゴペプチドや、前記天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち２番目のリジンと３番目のチロシンとの間にヒスチジンが挿入されたオリゴペプチドがあげられる。
【００１７】
本発明のプラスミドは、宿主で発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＡ）の５’末端側に本発明のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）を付加したポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＣ）を、プラスミドの適切な位置に挿入することで得られる。なお、前記ポリヌクレオチドＡに前記ポリヌクレオチドＢを付加させる際、前記ポリヌクレオチドＡと前記ポリヌクレオチドＢとの間にリンカーとして１から数アミノ酸残基からなる任意のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入してもよい。またポリヌクレオチドＣを挿入するプラスミドとしては、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、宿主が大腸菌の場合は、ｐＥＴプラスミド、ｐＵＣプラスミド、ｐＴｒｃプラスミド、ｐＣＤＦプラスミド、ｐＢＢＲプラスミドを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。本発明のプラスミドを用いて宿主を形質転換させるには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。
【００１８】
本発明のプラスミドを用いて宿主を形質転換体して得られる形質転換体（以下、単に本発明の形質転換体とする）を用いて製造するタンパク質に特に限定はなく、一例として、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモンなどのヒト由来タンパク質、およびそれらの受容体タンパク質があげられる。なお、本発明の形質転換体を用いて製造するタンパク質は、完全体であってもよいし、当該タンパク質の機能に重要な部分のみから構成されるタンパク質であってもよいし、さらに当該タンパク質を構成するアミノ酸の一つ以上が欠失および／または挿入および／または置換されていてもよい。以降、本発明の形質転換体を用いて製造可能なタンパク質のうち、Ｆｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。
【００１９】
本明細書においてヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）（図１参照）を構成するタンパク質、またはヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号２２に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでの領域）（図４参照）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質や、
（ｉｉｉ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｖ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。
【００２０】
前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質や、配列番号２１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４２）のうち少なくともいずれか１つの置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特開２０１４−０２７９１６号）があげられる。
（１）配列番号２１の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号２１の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号２１の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号２１の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号２１の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号２１の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号２１の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号２１の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号２１の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号２１の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号２１の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号２１の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号２１の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号２１の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号２１の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号２１の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号２１の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号２１の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号２１の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号２１の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号２１の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号２１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号２１の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号２１の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号２１の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号２１の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号２１の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号２１の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号２１の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号２１の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号２１の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号２１の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号２１の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号２１の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
（３５）配列番号２１の３４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（３６）配列番号２１の４５番目のグルタミンがリジンに置換
（３７）配列番号２１の８２番目のグルタミンがプロリンに置換
（３８）配列番号２１の１７７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３９）配列番号２１の２１３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号２１の２４２番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４１）配列番号２１の２５３番目のスレオニンがセリンに置換
（４２）配列番号２１の２７１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
また前記（ｉｖ）の具体例としては、配列番号２２に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１３−２０２２４５号）があげられる。
（１）配列番号２２の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号２２の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号２２の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号２２の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号２２の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号２２の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号２２の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号２２の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号２２の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号２２の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号２２の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号２２の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号２２の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号２２の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号２２の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号２２の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号２２の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号２２の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号２２の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号２２の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号２２の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号２２の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号２２の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号２２の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号２２の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号２２の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号２２の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号２２の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号２２の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号２２の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号２２の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号２２の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号２２の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号２２の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号２２の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号２２の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号２２の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号２２の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号２２の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号２２の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
本発明の形質転換体を作製する際に用いる宿主としては、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞に代表される動物細胞、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌等が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。なお宿主が大腸菌でタンパク質がＦｃ結合性タンパク質の場合は、特開２０１２−０３４５９１号に開示した方法等により本発明の形質転換体を培養することで前記タンパク質を発現させればよい。
【００２１】
本発明の形質転換体の培養液から、発現したタンパク質を回収するには、発現の形態によって適宜選択すればよい。例えば、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズムに発現する場合は、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後、遠心分離により破砕残渣を除去することで、発現したタンパク質を含む無細胞抽出液を得ればよく、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズムから培養上清に漏出する場合は、培養液を遠心分離して得られる培養上清から発現したタンパク質を回収すればよい。なお薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと６ｍＭ  ＭｇＳＯ４と２５０Ｕ／Ｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）と０．３ｇ／Ｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅと０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）と０．５％  ＣＴＡＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）と５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（特開２０１３−２５２０９９号）や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕するとよい。
【００２２】
回収したタンパク質を含む溶液は、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等により当該タンパク質を精製単離することができる。陽イオン交換クロマトグラフィー用担体は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基といった陽イオン交換基を担体に結合したものであり、一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０、（以上、東ソー社製）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）があげられる。疎水クロマトグラフィー用担体は、エーテル基、フェニル基、ブチル基といった疎水性官能基を担体に結合させたものであり、一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｅｔｈｅｒ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０（以上、東ソー社製）があげられる。各種クロマトグラフィー用担体を用いて精製を行なう際は、アプライ液の導入量や前記担体のタンパク吸着性能などによって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を導入する前に、あらかじめ適切な緩衝液（トリス／トリス塩酸塩緩衝液、グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸塩緩衝液等）により平衡化しておく。前述の方法で回収したタンパク質を含む溶液を、平衡化したクロマトグラフィー用担体に導入することで前記タンパク質を担体に吸着させ、平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄する。その後、溶出用緩衝液を用いて吸着した前記タンパク質を溶出させることにより精製された前記タンパク質を含む溶液を得ることができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のシグナルペプチドは、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち、Ｎ末端領域（１番目のメチオニンから４番目のロイシンまでの領域）のいずれかに塩基性アミノ酸が挿入されたオリゴペプチドであり、本発明のオリゴペプチドをペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドとして用いることで、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドを用いた時と比較し、組換えタンパク質生産量を大幅に向上させることが可能となり、産業上有用な組換えタンパク質の製造効率を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】天然型ヒトＦｃγＲＩの構造を示す図。
【図２】Ｆｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩ由来）のＮ末端側に、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドを付加させたときと、本発明のシグナルペプチドを付加させたときで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を比較した図。
【図３】Ｆｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ由来）のＮ末端側に、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドを付加させたときと、本発明のシグナルペプチドを付加させたときで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を比較した図。
【図４】天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造を示す図。
【実施例】
【００２５】
以下、タンパク質としてＦｃ結合性タンパク質を用いたときの実施例および比較例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１  発現ベクターの作製
以下に示す方法にて天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ、配列番号２）をコードするポリヌクレオチドをプラスミドｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥヘルスケア社製）に挿入することで、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを作製した。
（１）配列番号６（５’−ＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣ−３’）および配列番号７（５’−ＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを等量混合し、９５℃で５分間加熱後、１５℃になるまで１分間で１℃毎に温度を下げることで、二本鎖オリゴヌクレオチドＰｅｌＢｐ１を調製した。なお、ＰｅｌＢｐ１は使用時まで１５℃で保持した。
（２）（１）で調製したＰｅｌＢｐ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ａに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、このライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを抽出した。
（４）（３）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌのうち、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジー社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号８（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号９（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００２７】
解析の結果設計通りであることを確認した。本実施例で合成した天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３に示す。
【００２８】
実施例２  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６８）発現ベクターの作製（その１）
配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側にシステインタグ（アミノ酸配列：ＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−ＣＧ）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、前記タンパク質発現ベクターを作製した。なおＦｃＲｍ６８は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列中、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃ（特開２０１１−２０６０４６号公報）のうち、
配列番号１０の３７番目のスレオニンがイソロイシンに、
配列番号１０の６３番目のバリンがグルタミン酸に、
配列番号１０の６９番目のアラニンがバリンに、
配列番号１０の７１番目のセリンがロイシンに、
配列番号１０の８４番目のセリンがスレオニンに、
配列番号１０の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、
配列番号１０の２９２番目のプロリンがリジンに、
配列番号１０の２９３番目のグルタミン酸がリジンに、
配列番号１０の２９７番目のグルタミンがリジンに、
配列番号１０の３０１番目のヒスチジンがリジンに、
配列番号１０の３０４番目のプロリンがリジンに、
それぞれ置換したＦｃ結合性タンパク質である。またＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列において１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、当該領域において６０箇所置換が生じている（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドである、配列番号１２に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号１３（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣ−３’）および配列番号１４（５’−ＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを得た。
【００２９】
【表１】
2014223064.tif 000003
（２）得られたＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌにライゲーションし、このライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧを抽出した。
（４）（３）で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧのうち、ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、実施例１（４）と同様の方法でヌクレオチド配列を解析した。
【００３０】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６に、それぞれ示す。なお配列番号１５において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（配列番号１１）、２９９番目のシステインから３００番目のグリシンまでがシステインタグのアミノ酸配列である。なお配列番号１５において、ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までの領域）は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。
【００３１】
実施例３  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６８）発現ベクターの作製（その２）
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち、２番目のリジンと３番目のチロシンとの間にリジンを挿入した本発明のシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ、配列番号４）を、実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧのＮ末端側に付加したポリペプチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１を、以下に示す方法で作製した。
（２）実施例２で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧを鋳型とし、配列番号１７（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧ−３’、３’末端側２８ヌクレオチドは配列番号５（配列番号４に記載の配列からなる本発明のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列）の１番目から２８番目までの領域に相当）および配列番号１８（５’−ＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、以下の反応を実施した。表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を１６サイクル繰り返すことで実施した。得られた産物を制限酵素ＤｐｎＩで消化することで鋳型プラスミドを分解し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを得た。
（２）得られたＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１を抽出した。
（４）実施例１（４）に記載の配列解析により所望の配列であることを確認した。
【００３２】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１９に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２０に、それぞれ示す。なお配列番号１９において、１番目のメチオニンから２３番目のアラニンまでが本発明のシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）、２６番目のグルタミンから２９９番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（配列番号１１）、３００番目のシステインから３０１番目のグリシンまでがシステインタグである。
【００３３】
実施例４  Ｆｃ結合性タンパク質の発現（その１）
（１）実施例３で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを含む２ＹＴ（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：５ｇ／Ｌ）液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを含む２ＹＴ液体培地２０ｍＬに前培養液を６００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始３時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０５ｍＭとなるようＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃ結合性タンパク質の濃度を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて抗体結合活性を測定し、既知濃度のＦｃ結合性タンパク質における値と比較して測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、調製したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−ＦｃγＲＩ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＨｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。
（５−５）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１Ｍのリン酸水溶液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し発色反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３４】
ＥＬＩＳＡ法によって濃度既知の精製Ｆｃ結合性タンパク質を用いた検量線から、培養後のＦｃ結合性タンパク質の濃度測定を行なった。また、培養終了時の菌体量として測定した６００ｎｍの吸光度で培養後のＦｃ結合性タンパク質の濃度を除することで、菌体あたりのＦｃ結合性タンパク質の生産性を算出した。結果を図２に示す。
【００３５】
比較例１  Ｆｃ結合性タンパク質の発現（その２）
実施例２で作製した天然型のＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号２）を含むＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧを用いて、大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を算出した。結果を図２に示す。
【００３６】
実施例５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ５ａ）発現ベクターの作製
実施例３で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１のうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの領域を配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドに置き換えた発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａ−Ｖ１を以下に示す方法で作製した。なおＦｃＲ５ａは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列中、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでの領域からなるＦｃ結合性タンパク質のうち、
配列番号２２の２７番目のバリンをグルタミン酸に、
配列番号２２の３５番目のチロシンをアスパラギンに、
配列番号２２の７５番目のフェニルアラニンをロイシンに
配列番号２２の９２番目のアスパラギンをセリンに、
配列番号２２の１２１番目のグルタミン酸をグリシンに、
それぞれ置換したＦｃ結合性タンパク質である（特願２０１３−２０２２４５号）。
（１）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドである、配列番号２４に記載の配列からなるポリヌクレオチドを発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）に導入することで、発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ５ａ（特願２０１３−２０２２４５号）を得た。
（２）得られた発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、ベクター部分を除くことで消化産物を得た。
（３）実施例３で得たｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｖ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、ベクター部分を精製したものと、（２）で作製した消化産物とをライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、配列番号４に記載の配列からなる本発明のシグナルペプチドをＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ５ａのＮ末端側に付加したポリペプチドＦｃＲ５ａ−Ｖ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａ−Ｖ１を抽出した。
【００３７】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａ−Ｖ１に対し、実施例１（４）に記載の配列解析を行なった結果、所望の配列であることを確認した。
【００３８】
実施例６  Ｆｃ結合性タンパク質の発現（その３）
実施例５で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａ−Ｖ１を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、得られた形質転換体を実施例４（１）から（３）と同様な方法で培養した後、実施例４（４）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製し、実施例４（５）と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質の濃度を測定することで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を算出した（ただし、実施例４（５−３）におけるＡｎｔｉ−ＦｃγＲＩ抗体はＡｎｔｉ−ＦｃγＲＩＩＩ抗体を使用した）。結果を図３に示す。
【００３９】
比較例２  Ｆｃ結合性タンパク質の発現（その４）
実施例２で作製した天然型のＰｅｌＢシグナルペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの領域を配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）に置き換えた発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａを実施例５と同様な方法で作製し、実施例６と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質の生産性を算出した。結果を図３に示す。
【００４０】
図２および３より、組換えタンパク質をペリプラズムに分泌させるシグナルペプチドとして、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドの２番目と３番目の間に塩基性アミノ酸を挿入した本発明のシグナルペプチドを用いる（実施例４および６）ことで、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドを用いたとき（比較例１および２）と比較し、前記タンパク質の生産性が向上していることがわかる。
【図１】
2014223064.tif 000004
【図２】
2014223064.tif 000005
【図３】
2014223064.tif 000006
【図４】
2014223064.tif 000007
【配列表】
2014223064000001.app