(57)【要約】【課題】カイコ抽出液を使用した無細胞タンパク質合成系において、太く容易に摘出可能な中部絹糸腺を材料とした抽出液の調製方法およびその抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法を提供する。【解決手段】中部絹糸腺は、繭成分のセリシンを生産する一方、後部絹糸腺で生産されたフィブロイン（絹糸主要タンパク質）の蓄積を伴うため、一般的なカイコ品種では、粘弾性に富み抽出液作製には不適である。そこで、フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統から作製した交雑種の中部絹糸腺を用いた。このカイコ幼虫の腹部第３節と第４節の複脚の間の節間膜にハサミで切れ込みを入れ、その切れ込みよりピンセットで中部絹糸腺を取り出すことで極めて簡便に摘出可能であることを見出した。この方法を用いることで１頭当たり平均２３秒と、従来の後部絹糸腺摘出の場合と比べ約１／６の所要時間で絹糸腺を摘出することが可能となり、細胞抽出液調製に要する時間を大幅に短縮することができた。また、５齢期２，３日目の中部絹糸腺抽出液において高いタンパク質合成能が確認され、それを用いることにより、簡便な抽出液調製が可能な無細胞タンパク質合成の提供が実現できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統の中部絹糸腺を用いることを特徴とした無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項２】
フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統から作製した交雑種の中部絹糸腺を用いることを特徴とした無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項３】
蚕系統が、セリシンホープである請求項１又は２に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項４】
５齢期１日目あるいは２日目のカイコ幼虫の中部絹糸線を用いた請求項１、２又は３に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項５】
カイコ幼虫の腹部第３節と第４節の複脚の間の節間膜又は腹部第２節と第３節の複脚の間の節間膜に切り込みを入れ、該切れ込みより中部絹糸腺を摘出することを特徴とする、請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の方法で製造した無細胞タンパク質合成用抽出液を含む無細胞タンパク質合成試薬キット。
【請求項７】
請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の方法で製造した無細胞タンパク質合成用抽出液を用いたタンパク質合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、無細胞タンパク質合成系に使用できる抽出液、およびその製造方法、ならびに当該抽出液を使用した無細胞系でのタンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、ヒトゲノムをはじめとし多くの生物の遺伝情報が解読されている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品開発研究などに利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡便に合成することが必要となってくる。【０００３】  現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって大腸菌、酵母、昆虫培養細胞、哺乳動物培養細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。【０００４】  一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系または遺伝情報転写／翻訳系を試験管内に取り揃え、反応鋳型として目的タンパク質をコードする構造遺伝子を有するＤＮＡ（転写鋳型）またはｍＲＮＡ（翻訳鋳型）を用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞タンパク質合成系（以下、「無細胞系」ということがある）が知られている。このような無細胞タンパク質合成系では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系に供する抽出液（無細胞タンパク質合成用抽出液）として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。【０００５】無細胞タンパク質合成用抽出液としては、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球の他、昆虫培養細胞など由来のものが従来から知られている。我々は、これまでカイコ組織由来の抽出液（カイコ抽出液）を使用した無細胞系タンパク質合成方法を提案してきている（たとえば、特許文献１、特許文献２、特許文献３を参照）。我々が提案するカイコ抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法では、従来の方法と比較して、カイコという安価な材料を用いて抽出液が作製でき、動物細胞由来の抽出液の中では高いタンパク質合成能力を有し、糖タンパク質の合成も可能であるという利点があり、非常に有用である。しかしながら、抽出液作製に適しているカイコ器官である後部絹糸腺や脂肪体は、細く脆弱であるため、ローラー状の物で蚕の頭部から尾部に向けて押し出す方法にて絹糸線を分離する方法や絹糸線を細かく切って絹糸線細胞を除去する等の従来方法では傷つけることなく、摘出することができない。その結果として抽出液の調製が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合があり、その改善方法を見出すことが重要な課題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４２４４６２５号
【特許文献２】特許第４２４４６２８号
【特許文献３】特許第４２４３７６２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、無細胞タンパク質合成に用いる抽出液を作製するための好適な材料となるカイコ幼虫組織であって、容易に摘出可能である組織を見出し、該組織を材料とした抽出液の調製方法およびその抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、カイコ幼虫の中部絹糸腺は絹の一成分であるセリシンを合成分泌する組織であり、該組織が高いタンパク質合成能を有することが示唆されていた。しかし、従来の一般品種（例えば錦秋×鐘和）のカイコ幼虫では、後部絹糸腺においてフィブロインが生産され、中部絹糸腺への移行・蓄積が生じ、それに伴い、中部絹糸腺が肥大するとともに高い粘弾性を有するようになるため抽出液調製のための材料としては適さないことから、中部絹糸腺を材料とした抽出液の調製は報告されていない。一方、フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統あるいはその系統から作製した交雑種の中部絹糸腺では、フィブロインの蓄積がほとんど生じないため高い粘弾性を有さないことが期待された。そこで、フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統あるいはその系統から作製した交雑種の中部絹糸腺を材料とした抽出液の調製法を検討した結果、該中部絹糸腺が容易に摘出することができることを見出し、また、前記中部絹糸腺を材料とすることにより、効率的な抽出液調製が実現できることを見出した。
発明は以下のとおりである。
〔１〕フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統の中部絹糸腺を用いることを特徴とした無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
〔２〕フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統から作製した交雑種の中部絹糸腺を用いることを特徴とした無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
〔３〕蚕系統が、セリシンホープである請求項１又は２に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
〔４〕５齢期１日目あるいは２日目のカイコ幼虫の中部絹糸線を用いた請求項１、２又は３に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
〔５〕上記１〜４に記載した方法で製造した合成用抽出液を含む無細胞タンパク質合成試薬キット。
〔６〕上記１〜４に記載した方法で製造した合成用抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法。【０００９】  なお本明細書において「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。【００１０】  カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期が終齢である。その後１週間程度でカイコの幼虫は、体が半透明になり絹糸を吐いて繭を形成し始め（この状態は「熟蚕」とも呼ばれる）、繭中で蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。【００１１】  本明細書における「絹糸腺」は、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。【００１２】  本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成（翻訳系）、ならびに、外来鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成（転写／翻訳系）のいずれであってもよい。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。
【発明の効果】
【００１３】  本発明によれば、従来と比べて簡便な無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、およびその抽出液を用いたカイコ無細胞タンパク質合成方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】  以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統あるいはその系統から作製した交雑種の中部絹糸腺を材料として用いることを特徴とする、無細胞タンパク質合成用抽出液の調製方法である。従来の一般品種（例えば錦秋×鐘和）のカイコ幼虫では、後部絹糸腺においてフィブロインが生産され、中部絹糸腺への移行・蓄積が生じ、それに伴い、中部絹糸腺が肥大するとともに高い粘弾性を有するようになるため抽出液調製のための材料としては不適であった。一方、フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統あるいはその系統から作製した交雑種の中部絹糸腺では、一般品種と同様に肥大するもののフィブロインの蓄積がほとんど生じないため粘弾性を有さず、その結果、材料として用いることが可能となり、効率的な抽出液調製が実現できた。
【００１５】  本発明に用いるフィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統としては、セリシンホープ（セリシンＣ）、セリシンＮ、Ｎｄ蚕、Ｎｄ‐ｓ蚕、Ｎｄ‐ｓＤ蚕などがあげられる。また、安定飼育の観点から、これらのフィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統から作製した交雑種が好ましく、特にセリシンホープから作製した交雑種がより好ましい。
【００１６】  セリシンホープは、中国蚕系統「ＣＳ８３」に「Ｎｄ系統」を交配し、さらに「ＣＳ８３」の戻し交雑等を行い作製された蚕系統である（特許第３３７４１７７号参照）。このセリシンホープは、フィブロイン合成能に異常をおこし、後部絹糸腺が退化していることを特徴としている。
【００１７】  本発明における抽出対象である中部絹糸腺は、カイコ幼虫のどの状態（１齢期〜５齢期）由来であってよい。また、単一の状態（たとえば、５齢期のカイコ幼虫）に限らず、複数の状態（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫）であってもよい。また、中部絹糸腺のみならず他の組織（たとえば、後部絹糸腺）を含んでいてもよいものとする。無論、複数の状態の中部絹糸腺と他の組織を含んでいてもよい。なお、中部絹糸腺は、その組織全体である必要はない。
【００１８】  中部絹糸腺抽出液調製に用いるカイコ幼虫は、１齢期〜５齢期のものであれば、特に制限なく本発明の方法にて調製できるが、特に、５齢期のカイコ幼虫であるのが好ましい。これは、５齢期のカイコ幼虫において、中部絹糸腺が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しており、これを用いることで他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質が合成可能な無細胞系タンパク質合成用抽出液が得られるためである。中でも特に、絹糸の成分であるセリシンを活発につくり、高いタンパク質合成能を有しているという観点から、５齢期のカイコ幼虫の中部絹糸腺、中でも５齢期の１日〜２日のカイコ幼虫の中部絹糸腺から抽出を行うことが好ましい。
【００１９】  所望の量の上記抽出物を含有する抽出液を得るためには、通常、複数体のカイコより抽出する必要がある。抽出に供するカイコの数は、使用するカイコの状態や個体差によっても異なるが、カイコ幼虫については、繭の形成期に近づくにつれて組織の成熟に伴って、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済む。特に絹糸腺は、５齢期のカイコ幼虫において日を追うごとに著しく成熟するため、たとえば、５齢期の１日で３０匹程度のカイコ幼虫からと同程度の量を５齢期の７日では６匹〜７匹程度のカイコ幼虫から得ることができる。
【００２０】  本発明の無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法においては、従来の後部絹糸腺や脂肪体を抽出液作製に用いる場合と比べて、野性型カイコ系統の中部絹糸腺を摘出する方法として従来報告されている方法（特開２００７−２１０９０２参照）で摘出した場合であっても、フィブロインを特異的に産生しないカイコ系統の中部絹糸線を簡便に摘出可能であることを特徴としている。また、発明者らは、以下に述べるように、前記従来からの方法と比較してもより短時間にフィブロインを特異的に産生しないカイコ系統の中部絹糸腺を摘出する方法を開発した。具体的には、カイコ幼虫の腹部第３節と第４節の複脚の間の節間膜にハサミ、メスなどで切れ込みを入れ、その切れ込みよりピンセットなどで中部絹糸腺を取り出すことを特徴とする使用器官の摘出方法を用いることで実現できる。また、切れ込みを入れる位置は、他の場所でもよく、例えば、腹部第２節と第３節の複脚の間の節間膜でもよい。中部絹糸腺より抽出を行うならば、その他の手順には特に制限されるものではないが、たとえば、以下の手順により行うことができる。まず、カイコ幼虫を氷上に数分間置くことで動きを止める。次に、上述の方法にしたがって、たとえばハサミ、メスおよびピンセットなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。次に摘出した組織を、液体窒素で凍結させた後、予め液体窒素で冷却させた乳鉢を用いてすり潰し、抽出用液で抽出する。ここで使用する抽出用液は、従来公知の抽出に用いる緩衝液を特に制限なく使用することができるが、好ましくは、プロテアーゼインヒビター、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、グリセロールおよび緩衝剤を含有するものを使用する。特に好ましくは、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５−４０％（ｖ／ｖ）グリセロール、および、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有する抽出用液を使用する。このようにして、まず、カイコ中部絹糸腺からの抽出物を含有する液状物を得る。
【００２１】  次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。抽出液の調製方法としては、該遠心分離を１回行った後、得られた上清を抽出液とする。また、タンパク質合成に不要な不溶成分を除去するという観点より、該上清に上記の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清を抽出液としてもよい。
【００２２】  さらに、本発明の抽出液の調製方法としては、上記１回あるいは２回の遠心分離で得られた抽出液をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する処理を行うことで抽出液を調製してもよい。具体的には以下の手順にて行う。まず、遠心分離後の上清についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。次に、ゲル慮過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＤＵ８００（ベックマンコールター社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が１０以上の画分を分取する。このようにして得られる画分を抽出液としてもよい。
【００２３】  上記のように本発明の方法にて得られた抽出液を用いてタンパク質合成反応を行うことによって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて合成することが可能となる。また、真核生物であるカイコの中部絹糸腺由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。なお上記タンパク質合成反応は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成反応（翻訳系合成反応）、外来鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）のいずれであってもよい。さらに、このような抽出液は、後述するように従来のカイコ後部絹糸腺からの抽出液の調製と比較して、無細胞系タンパク質合成に供することのできる抽出液を、格段に容易に調製することができ、効率的な無細胞系タンパク質合成を実現できる。
【００２４】  本発明の方法で得られた抽出液中におけるカイコ中部絹糸腺由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを超えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
【００２５】  なお上記範囲の量のカイコ中部絹糸腺由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００２６】  本発明の方法で得られる抽出液を用いて、上記翻訳系合成反応、転写／翻訳系合成反応を行うために調製する反応液（それぞれ、「翻訳系用反応液」、「転写／翻訳系用反応液」と呼ぶ。）の組成に特に制限はなく、それぞれ従来公知の組成を適宜選択すればよい。翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液のいずれの場合であっても、本発明の方法で得られた抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するように調製されたものであるのが好ましい。すなわち、反応液の全体において、カイコ中部絹糸腺由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
以下、（１）翻訳系用反応液、（２）転写／翻訳系用反応液について、それぞれ説明する。
【００２７】  （１）翻訳系用反応液
翻訳系用反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来ｍＲＮＡ、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる翻訳系用反応液を使用して翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００２８】  上記翻訳系用反応液に用いる外来ｍＲＮＡとは、カイコ中部絹糸腺に由来しないｍＲＮＡを指し、カイコ中部絹糸腺に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。なお、翻訳系用反応液に含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるかカイコ中部絹糸腺に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、翻訳系用反応液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００２９】  なお翻訳系用反応液に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
【００３０】  翻訳系用反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００３１】  翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００３２】  翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００３３】  翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００３４】  翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００３５】  翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００３６】  翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００３７】  翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００３８】  翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
【００３９】  本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４０】  翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するカイコ中部絹糸腺由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００４１】  翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００４２】  翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００４３】  また翻訳系用反応液は、さらにグルセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。また、グリセロールの代わりに、同様の効果を有する種々の多価アルコールを好適に添加してもよい。
【００４４】  さらに、翻訳系用反応液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、本発明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを超えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００４５】  すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００４６】  上記翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（翻訳系合成反応）は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を超えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００４７】  （２）転写／翻訳系用反応液
転写／翻訳系用反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５’−三リン酸、ウリジン５’−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも含有するのが好ましい。かかる転写／翻訳系用反応液を使用して転写／翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００４８】  上記転写／翻訳系用反応液に用いる外来鋳型ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどの環状ＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ産物などの直鎖状ＤＮＡであってもよい。上記外来鋳型ＤＮＡは、カイコ組織に由来しない鋳型ＤＮＡを指し、目的タンパク質をコードする塩基配列と、その５’上流側に位置するプロモーター配列とを少なくとも有する。本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、カイコ中部絹糸腺に由来しない鋳型ＤＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。また本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡにおけるプロモーター配列としては、特に制限されるものではないが、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
【００４９】  なお本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば鋳型ＤＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来鋳型ＤＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。なお、抽出液において、含有される鋳型ＤＮＡが外来鋳型ＤＮＡであるかカイコ中部絹糸腺に由来する鋳型ＤＮＡであるかは、抽出液中より、フェノール−クロロホルム抽出を行ってその鋳型ＤＮＡを抽出し、その塩基配列を解析することによって判別することができる。
【００５０】  また、本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、上記目的タンパク質をコードする塩基配列の３’下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列、および／または、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点からポリＡ配列を有しているのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
【００５１】  外来鋳型ＤＮＡは、転写／翻訳系用反応液中において、０．１μｇ／ｍＬ〜８０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来鋳型ＤＮＡが０．１μｇ／ｍＬ未満または８０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５２】  転写／翻訳系用反応液に用いるＲＮＡポリメラーゼは、外来鋳型ＤＮＡが有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、外来鋳型ＤＮＡがＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また、外来鋳型ＤＮＡが、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００５３】  ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度およびタンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中に０．０１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．０１Ｕ／μＬ未満であると、ｍＲＮＡの合成量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであり、またＲＮＡポリメラーゼが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００５４】  転写／翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５５】  転写／翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５６】  転写／翻訳系用反応液中におけるシチジン５’−三リン酸（以下、「ＣＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＣＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５７】  転写／翻訳系用反応液中におけるウリジン５’−三リン酸（以下、「ＵＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＵＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５８】  転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５９】  転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーセは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６０】  転写／翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
【００６１】  タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６２】  転写／翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。ｔＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６３】  転写／翻訳系用反応液は、さらに、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビター、スペルミジンおよび緩衝剤を含有するのが好ましい。
【００６４】  転写／翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６５】  転写／翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６６】  転写／翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１００ｍＭを超えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００６７】  転写／翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するカイコ由来のＲＮａｓｅによって、転写／翻訳系合成反応の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で添加されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６８】  上記スペルミジンは、転写における伸張反応を促進する目的で添加されるものであり、転写／翻訳系用反応液中において０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ末満であると、ｍＲＮＡの合成速度が低下し生成するｍＲＮＡの量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下するというような傾向にあるためであり、またスペルミジンが１００ｍＭを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６９】  転写／翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００７０】  また転写／翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、転写／翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。また、グリセロールの代わりに、同様の効果を有する種々の多価アルコールを好適に添加してもよい。
【００７１】  すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した転写／翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、さらに０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＣＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜５００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含有するのが好ましい。さらには、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜２０ｍＭのＤＴＴ、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭのスペルミジン、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有するように実現されるのが好ましい。
【００７２】  上記転写／翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）についても、上記翻訳系合成反応の場合と同様、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃末満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
【００７３】  転写／翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００７４】  上記翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００７５】  以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００７６】  実施例１：カイコ幼虫中部絹糸腺の摘出
５齢期２日目に達したフィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統から作製した交雑種７種類を用いて、カイコ幼虫中部絹糸腺の摘出を行った。先ず、各交雑種２０−４０頭を氷上で冷やし仮死状態にして動きを止めた。そのカイコ幼虫を氷上で冷やしておいたステンレス製バットに移し、腹部第３節と第４節の腹脚の間の節間膜にハサミで切れ込みを入れ、その切れ込みより中部絹糸腺を傷つけないようにピンセットを用いて摘出した。各交雑種２０−４０頭のカイコ幼虫より摘出した場合の所要時間を表１に示す。【００７７】
【表１】
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全体の平均は、中部絹糸腺の摘出には１頭あたり、約２３秒を要することがわかった。なお、日６０３号、日６０４号、中６０４号、中６０５号は、人工飼料育に適する広食性蚕品種「はばたき」の原種であり、いずれも、人工飼料を良く摂食する多糸量系統である。また、ｌｅｍは、独立行政法人農業生物資源研究所に保存されているｌｅｍ遺伝子を持つ系統を改良した系統である。これら全ての系統は、独立行政法人農業生物資源研究所から入手可能である。【００７８】  比較例１：カイコ幼虫後部絹糸腺の摘出
実施例１の比較として、５齢期４日目に達した普通蚕品種（錦秋×鐘和）を用いて、カイコ幼虫後部絹糸腺の摘出を行った。まず、カイコ幼虫を氷上で冷やし仮死状態にして動きを止めた。次に、ステンレス製バットの上においたダンボールに虫ピンで固定し、ハサミやメスを用いて腹部全体に縦に切り込みを入れ、絹糸腺に分布する気管を腺細胞を傷つけないようにしてピンセットで取り除き、中部絹糸腺と後部絹糸腺の境界付近の後部絹糸腺をピンセットでつまみ、前方に向かって絹糸腺を持ち上げて取り出す方法にて、後部絹糸腺を摘出した。結果として、後部絹糸腺の摘出には、２０頭あたり５０分（１頭あたり約１５０秒）を要することがわかった。この所要時間は、実施例１の６．５倍である。【００７９】  実施例２：カイコ幼虫中部絹糸腺抽出液の調製
５齢期に達したフィブロインを特異的に
産生しない突然変異蚕系統から作製した交雑種であるセリシンホープ×ｌｅｍを用いて、カイコ幼虫を１日目から８日目まで１日ごとにサンプリングした。サンプリングしたカイコ幼虫から、実施例１の方法にて中部絹糸腺を傷つけないように摘出した。摘出した中部絹糸腺は、滅菌済み０．７５％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、濾紙にて水分を取り除き、あらかじめ−８０℃に冷却しておいた乳鉢に移し、その後、抽出液作製時まで−８０℃で冷却保存した。【００８０】  抽出液の調製は以下のように行った。まず、−８０℃で一時保存した乳鉢に入った中部絹糸腺に液体窒素を加え冷却しながら乳棒を用いて粉状になるまですり潰した。サンプリングしたカイコ幼虫の日数別の頭数と、摘出および破砕に要した時間を表２に示す。【００８１】
【表２】
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【００８２】  次に、粉状となった中部絹糸腺を遠沈管に移し、電子天秤を用いてその重量を計測した。これに２／３量の下記組成の抽出用液を加え、スパーテルで良く攪拌することで抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ        ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ      酢酸カリウム
・２ｍＭ          酢酸マグネシウム
・１ｍＭ          ＤＴＴ
・０．５ｍＭ      ＰＭＳＦ
・１０％          グリセロール【００８３】  抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２２ＧＩＩ（日立工機社製））にて、３０，０００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離し、再び３０，０００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離し、これを中部絹糸腺抽出液とした。この間、材料や試薬は氷上で冷やしながら操作を行い、不純物が混入しないように手袋を着用した。また、器具や試薬は滅菌したものを使用した。【００８４】  参考例１：鋳型ｍＲＮＡの調製
無細胞タンパク質合成に用いる鋳型ＤＮＡとしては、昆虫無細胞タンパク質合成用発現ベクターｐＴＤ１（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ１９４７４２）の翻訳促進配列の直下とＢａｍＨＩサイトの間に，β‐ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入されたｐＴＤ１‐βｇａｌを用いた。この発現プラスミドを鋳型として、配列表配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー（ｐＴＤ１＿１６１‐１７９）、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー（ｐＴＤ１＿８４５‐８２７）と、ＫＡＰＡ  Ｔａｑ  Ｅｘｔｒａ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡバイオサイエンス社製）を用いて、９４℃で１５秒間、アニーリングを５０℃で１５秒間、伸長を７２℃で４分間の３段階の反応を３０回繰り返すことでＰＣＲを行い、直鎖状ＤＮＡ断片を増幅した。反応液からＨｉＹｉｅｌｄ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＲＢＣバイオサイエンス社製）を用いて直鎖状ＤＮＡを精製し、フェノール／クロロホルム抽出処理を行った後、エタノール沈澱で濃縮し、滅菌蒸留水に再溶解することで鋳型ＤＮＡを調製した。次に直鎖状ＤＮＡを鋳型とし、Ｔ７  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、３７℃で２時間インキュベートすることでｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。反応液をゲル濾過カラム（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＩＣＫ  Ｃｏｌｕｍｎｈｓ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐５０  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ、ＧＥヘルスケア社製）に供して未反応の核酸を取り除いたのち、エタノール沈殿を行い、滅菌蒸留水に再溶解して精製ｍＲＮＡ溶液を得た。【００８５】  実験例１：実施例２の抽出液を用いた無細胞タンパク質合成
実施例２で調製した各中部絹糸腺抽出液と、昆虫培養細胞無細胞タンパク質合成試薬キット  Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ（島津製作所社製）の反応用試薬（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、４ｍＭ  メチオニン）、β‐ガラクトシダーゼをコードしたｍＲＮＡを用いて、以下の組成となるように各試薬を混合し無細胞タンパク質（β‐ガラクトシダーゼ）合成反応を行った。反応装置としては、アルミブロック恒温槽（ＣＴＵ−Ｍｉｎｉ（タイテック社製））を用いた。反応液量は、１２．５μｌとした。反応温度は２５℃とし、５時間インキュベートした。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  中部絹糸腺抽出液
・３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・１．５ｍＭ        酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            ＤＴＴ
・５（ｖ／ｖ）％    グリセロール
・０．２５ｍＭ      ＡＴＰ
・０．１ｍＭ        ＧＴＰ
・２０ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・８０μＭ          アミノ酸（２０種）
・０．１ｍＭ        ＥＧＴＡ
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
・３２０μｇ／ｍＬ  ｍＲＮＡ【００８６】  合成されたβ‐ガラクトシダーゼは、β‐Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて定量した。具体的な測定方法は、合成液を希釈し、希釈液１０μｌとβ‐Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍの基質溶液１０μｌに加えよく混合した。混合液を発光測定用９６穴マイクロプレート（ｈａｌｆ‐ａｒｅａ９６ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅ，グライナー社製）に移し，低温アルミブロック恒温槽ＣＴＵ‐Ｍｉｎｉを用い、２５℃、３０分間インキュベートしたのち、フレキシブルマイクロプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００，テカン社製）で発光強度を測定した。合成量は、精製β‐ガラクトシダーゼ標準品を用いて作成した検量線をもとに、その発光強度より算出した。
表３に日数別に調製した抽出液のβ‐ガラクトシダーゼ合成量を示す。５齢期１、２日目の抽出液において合成が確認できた。【００８７】
【表３】
2014097056.tif 000004
【００８８】実験例２：抽出液凍結の影響
実験例１では、−８０℃で凍結保存後の抽出液を用いた。低いβ‐ガラクトシダーゼ合成量であったため、抽出液凍結による影響を調べた。本実験例では、表１にある交雑種「セリシンホープ×日６０４」を用いて、表３において交雑種「セリシンホープ×ｌｅｍ」における最も高い合成量が確認できた５齢２日目のカイコ幼虫を用いて実施例２に従って抽出液を調製した。得られた抽出液を、そのまま（凍結保存なし）、あるいは−８０℃に一晩凍結保存した後、実験例１に従って無細胞タンパク質合成および合成量の算出を行った。表４に−８０℃で凍結、非凍結した抽出液のβ−ガラクトシダーゼ合成量を示す。非凍結の抽出液で１．０μｇ／ｍｌと高い合成量が得られた。【００８９】
【表４】
2014097056.tif 000005
【００９０】実験例３：抽出液作製に適する飼育日数
実験例２において、非凍結の抽出液において高い合成量が得られたので、次に、非凍結抽出液を用いて抽出液作製に適する飼育日数を調べた。交雑種であるセリシンホープ×日６０４の５齢１日目から５日目のカイコ幼虫を用いて実施例２に従って抽出液を調製した。得られた抽出液を、凍結保存しない状態で用いて、実験例１に従い無細胞タンパク質合成および合成量の算出を行った。表５に日数別に調製した抽出液のβ−ガラクトシダーゼ合成量を示す。５齢期２，３日目の抽出液において、それぞれ、０．７２、０．７３μｇ／ｍＬと高い合成量が得られた。【００９１】
【表５】
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【配列表フリーテキスト】
【００９２】配列番号１：
ｐＴＤ１＿１６１‐１７９プライマーの塩基配列
配列番号２：
ｐＴＤ１＿８４５‐８２７プライマーの塩基配列
【配列表】
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