(57)【要約】      （修正有）【課題】従来のキトサンと類似した構造を有するが、水等への溶解性が高く粘性も低く、取り扱いが容易で多様な用途を有する新規アミノ多糖を提供する。【解決手段】グルコサミンがβ１→３結合とβ１→４結合で交互に連なる構造で結合した構造を有するアミノ多糖を提供する。分子ペイロネラ  カロプレフェレンスＮＩＴＥ  Ｐ−０１５７５菌株或いはその自然的或いは人工的変異体の産生した分子量が３００,０００〜５００,０００であるアミノ多糖。凝集沈殿法により廃液の浄化を行う廃液浄化剤として、利用可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミンがβ１→３結合とβ１→４結合で交互に連なる構造で結合した構造を有するアミノ多糖。
【請求項２】
赤外吸収スペクトル：891±10 cm−1、3300±100cm−1、2900±50cm−1、3300±100cm−1、1550〜1650cm−1にピ−クを有する請求項１記載のアミノ多糖。
【請求項３】
元素分析値（重量％）が以下である、請求項２記載のアミノ多糖。
Ｃ：３８〜４０
Ｈ：６〜９
Ｎ：６〜９
Ｏ：３８〜４０  
【請求項４】
分子量が３００,０００〜５００,０００である請求項２又は３記載のアミノ多糖。
【請求項５】
ペイロネラ  カロプレフェレンス（Peyronellaea calorpreferens）NITE  Ｐ−０１５７５菌株或いはその自然的或いは人工的変異体の産生した請求項１〜４いずれか記載のアミノ多糖。
【請求項６】
請求項１から５いずれか記載のアミノ多糖を含む粘度が５cP以下の水溶液。
【請求項７】
請求項１から５いずれか記載のアミノ多糖を含む１５重量％以下の水溶液。
【請求項８】
請求項１〜５いずれか記載のアミノ多糖を含む廃液浄化剤。
【請求項９】
請求項８記載の廃液浄化剤を凝集沈殿法により廃液の浄化を行うことを特徴とする浄化方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか記載のアミノ多糖を含む食品。
【請求項１１】
請求項１〜５いずれか記載のアミノ多糖を含む飼料。
【請求項１２】
請求項１〜５いずれか記載のアミノ多糖を含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は粘度が低く、溶解し易い新規なアミノ多糖に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、キトサンは凝集剤としての用途が主であったが、その後医療分野、工業分野、農業分野、食品分野で多岐の用途開発が行われ、特に近年では抗コレステロ−ル、抗高血圧に着目した健康食品、またその構成糖であるグルコサミンの関節痛に対する健康食品としての用途からその供給源としての需要が増加しており、様々なキチン・キトサン様物質が報告されている（特許文献１、２，非特許文献１，２）。しかしながら、従来のキチン・キトサン様物質は、分子量分布が広く、粘性が高くかつ水に不溶であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３７９７８５１号公報
【特許文献２】特開２００４−０８１１０６公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of Bioscience and Bioengineering Vol89, No．1，40−46, 2000
【非特許文献２】Biotechnology Letters(2006)28：241−245
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は水へ溶かしても粘性が低く、溶解度が高い、より使いやすい新規アミノ多糖を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、以下に示す項目によって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］グルコサミンがβ１→３結合とβ１→４結合で交互に連なる構造で結合した構造を有するアミノ多糖。
［２］赤外吸収スペクトル：891±10 cm−1、3300±100cm−1、2900±50cm−1、3300±100cm−1、1550〜1650cm−1にピ−クを有する［１］記載のアミノ多糖。
［３］元素分析値（重量％）が以下である、［２］記載のアミノ多糖。
Ｃ：３８〜４０
Ｈ：６〜９
Ｎ：６〜９
Ｏ：３８〜４０
［４］ 分子量が３００,０００〜５００,０００である［２］又は［３］記載のアミノ多糖。
［５］ペイロネラ  カロプレフェレンス（Peyronellaea calorpreferens）NITE  Ｐ−０１５７５菌株或いはその自然的或いは人工的変異体の産生した［１］〜［４］いずれか記載のアミノ多糖。
［６］［１］から［５］いずれか記載のアミノ多糖を含む粘度が５cP以下の水溶液。
［７］［１］から［５］いずれか記載のアミノ多糖を含む１５重量％以下の水溶液。
［８］［１］から［５］いずれか記載のアミノ多糖を含む廃液浄化剤。
［９］［８］記載の廃液浄化剤を凝集沈殿法により廃液の浄化を行うことを特徴とする浄化方法。
［１０］［１］から［５］のいずれか記載のアミノ多糖を含む食品。
［１１］［１］から［５］いずれか記載のアミノ多糖を含む飼料。
［１２］［１］から［５］いずれか記載のアミノ多糖を含む医薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は水に溶かしても粘度が低く、溶解度が高いユニ−クな物性と生理活性を有する新規アミノ多糖を提供可能とした。
【０００８】
本発明は、新規アミノ多糖を含む浄化剤を提供することを可能とし、凝集沈殿法を用いて容易に廃液を浄化することを可能とした。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ポテトデキストロースアガー寒天平板培地上でのコロニ−形成
【図２】菌糸
【図３】実施例１の経日変化
【図４】実施例２−１，２−２の経日変化
【図５】実施例３のGPCクロマト結果
【図６】実施例４のGPCクロマト結果
【図７】本発明の加水分解物に関する1H−NMRスペクトル
【図８】本発明の加水分解物に関する13C−NMRスペクトル
【図９】グルコサミン標品の1H−NMRスペクトル
【図１０】グルコサミン標品の13C−NMRスペクトル
【図１１】キトサン7B加水分解物に関する1H−ＮＭＲスペクトル
【図１２】キトサン7B加水分解物に関する13C−ＮＭＲスペクトル
【図１３】本発明品とキトサン標品の赤外吸収スペクトル
【図１４】本発明品の1H−NMRスペクトル
【図１５】キトサン標品の1H−NMRスペクトル
【図１６】本発明品の13C−NMRスペクトル
【図１７】本発明品の２次元NMRスペクトル
【図１８】本発明品と標準試料プルランMW344,000のGPCによるクロマト図
【図１９】本発明品とキトサン標品との各濃度における粘度変化
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のアミノ多糖は、一般式（１）に示す様に、グルコサミンがβ１→３結合とβ１→４結合で交互に連なって結合した構造を有する。
【化１】
2014223027.tif 000002
【００１１】
通常グルコ−スは一般式（２）に示す様に、環状構造であり、C−１位のOH基の向きにより２種類の化学構造をとることが可能である。OH基が環状面に対してC−６位の炭素原子と反対にある場合（アキシアル）をα−グルコ−ス、同じ側にある場合（エクトリアル）をβ−グルコ−スとして区別している。水溶液中では平衡状態にあり、存在比率はα約36％、β約64％である。
【化２】
2014223027.tif 000003
【００１２】
多糖の場合、単糖同士の結合様式にはα型とβ型の２種類がある。α−グルコ−ス同士が結合した多糖類をα−グルカン、βグルコ−ス同士が結合した多糖類をβ−グルカンと称している。グルコ−スのC−１位の炭素原子は、他のグルコ−スのC−５位を除く５種の炭素と結合が可能である。結合位置の組み合わせとして、（1→１）、(１→２)、(１→３)、（１→４）、（１→６）の５種類があり、自然界に多いのは、(１→３)、（１→４）、（１→６）の組み合わせである。キトサンはグルコサミンのβ（１→４）を有しており、本発明のアミノ多糖と良く似ている。
【００１３】
本発明のアミノ多糖の分子量は、高速液体クロマトグラフィ−によって求めたとき、３００,０００から５００,０００である。
従来のキトサンを始め、高分子量体は通常水に溶解しても高粘性を示し、溶解度は溶液の濃度増加と共に高粘性を示すが、本発明のアミノ多糖は、高分子量であるが、水溶液濃度に関わらず５ｃP以下の極めて低い粘性を有し、かつ水、酸、アルカリによく溶解するという特徴を有する。室温では、水溶液に対して１５重量％以下、特に５重量％まで溶解させることが出来る。水溶液のなかでも、酸性水溶液の場合は１０重量％まで溶解させることができ、アルカリ性水溶液の場合は２重量％まで溶解させることが出来る。すなわち、本発明のアミノ多糖は、いかなる用途形態のものであっても水溶液中１５重量％濃度相当まで自由に添加でき、広い用途展開が可能である。
【００１４】
本発明のアミノ多糖の元素分析値（重量％）は以下の範囲である。
Ｃ：３８〜４０
Ｈ：６〜９
Ｎ：６〜９
Ｏ：３８〜４０
【００１５】
本発明のアミノ多糖は、微生物が産出するものであり、微生物の培養物、その処理物から単離される。好ましい微生物としては、ペイロネラカロプレフェレンス(Peyronellaea calorpreferens)があり、ＭＧＣ１３０Lとして独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センタ−に２０１３年３月１８日にNITE  P−０１５７５として寄託されている。
【００１６】
菌学的性質
ポテトデキストロ−ス（以下、ＰＤＡと略する）寒天培地上で胞子の形成がなく、本来（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，６５：３１−３２  ２０１０）の形質を失った新菌株であった。
すなわちｐＨ５．６に調整したＰＤＡ寒天平板培地、２５℃において生育は早く、１４日間培養により図１に示す様に白色〜緑褐色、羊毛状のコロニ−を形成した。顕微鏡を用いた観察を図２に示す。栄養菌糸は無色〜茶褐色で隔壁を持ち、菌糸の一部が膨らむなどの特徴を有していたが、分生子等は形成されていなかった。
【００１７】
培養条件
本発明のアミノ多糖を生産するための微生物の培養条件は、通常の好気的培養方法が適用でき、ｐHは３〜8、好ましくは４〜7、温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃、培養時間は７２〜１６８時間、好ましくは１２０〜１４４時間である。
【００１８】
栄養源には一般に使用される炭素源、窒素源、無機塩などを適当な割合で混合溶解させた天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。炭素源としてはグルコ−ス、シュクロ−ス、廃糖蜜等を利用でき、これらを２〜１０％の濃度で、好ましくは３〜５％の濃度で添加すると良い。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、コ−ンスティープリカー、肉エキス、硫酸アンモニウム等を利用できる。これらを0.1〜２％、単品で或いは組み合わせて使用しても良い。また、無機塩としてMgとＣａを添加する。Ｍｇとしては硫酸マグネシウム・７水塩、Caとしては炭酸カルシウムを用いて、それぞれ０．１〜1％、好ましくは０．３〜０．６％添加する。
【００１９】
合成培地として寒天培地を用いる場合、通常の寒天培地等で生育できる培地であれば特に限定されるものではなく、カビの生育培地としてよく使用されるPDA寒天培地が好適である。
【００２０】
分離方法
菌体が産生したアミノ多糖の分離方法は特に限定するものではなく、例えばごく一般的な方法であるエタノ−ル沈殿法を用いることが出来る。遠心分離後の培養上清液にこれの２〜３倍量のエタノ−ルを加え静置すると沈殿が沈降するので、上部を斜瀉により除いた後、沈殿部を１０００〜３０００回転程度で遠心分離すると灰白色ケ−キ状の物として得られる。
【００２１】
本発明の菌株の保存方法としては、凍結乾燥等の乾燥による保存では胞子を形成しないため好ましくなく、グリセリンストックによる−80℃或いは液体窒素中で安定に保存することができる。
【００２２】
本発明品のアミノ多糖は、先に述べた様に、キトサンと同様にグルコサミンのβ−１，４結合を有しており、構造が類似している。一方、βーグルカンで総称される多糖類もβー１，４結合を有することが知られている。βーグルカンは分岐の有無、分子量、構成する糖の種類などの違いにより、様々な分子種が存在することが報告されている。この様にキトサン、本発明品及びβーグルカンは全てβー結合を有しており、基本構造が類似している。
βーグルカンを含む成分は、免疫活性を増強する作用、免疫機能活性化作用、抗腫瘍活性、腸内細菌増殖作用、保湿作用、重金属の排泄作用等種々の生理活性が報告されている。同様の生理活性はキトサンについても多数報告されており、当該生理活性がβー結合を有する基本構造によるものであることは容易に推測される。
更に、本発明品と類似の結合様式をとるものとして大麦由来のβーグルカンが報告されている。（埼玉大学著：大麦βーグルカンの健康維持増進機能に着目した大麦食品の開発）大麦βーグルカンは分岐のない直鎖構造であり、β１→3結合とβ1→4結合の２種類からなり、β−D−グルコースを構成糖とし、連続するβ1→4の２〜３個に１つの割合でβ１→3結合が存在し、β１→3結合は連続して存在しないことが示されている。このものの生理機能はコレステロール低下作用、血糖値の改善、免疫機能促進などが報告されており、米国食品医薬品局（FDA）は、血清コレステロール値を低下させる作用があることを認め健康強調表示物質として認可している。
このようにβーグルカンやキトサンの生理活性に関する知見の積み重ねから、本発明品がキトサンと同様の効果を有することは容易に想定できる。
【００２３】
すなわち、本発明のアミノ多糖は、キトサンと同様に健康食品、食品添加物等の食品、飼料、医薬品、化粧品、排水浄化・汚泥凝集剤等の多岐用途に用いることが出来る。
健康食品としては、例えば、コレステロ−ル低下・血圧降下・脂肪吸収抑制・腸内細菌活性化又は膝関節痛改善のためのグルコサミン原料等が、医薬品としては、例えば免疫細胞の活性化、がん細胞の増殖抑制用途が、化粧品としては、例えば化粧水等の保湿剤が、食品添加物としては、抗菌・抗カビ用途等が挙げられる。
【００２４】
排水浄化・汚泥凝集剤に関しては、廃液中の放射性物質や重金属等を容易に浄化させることができる。浄化方法としては、水溶液或いは粉末形態で散布して、吸着沈殿させる凝集沈殿法を用いることが可能である。水溶液で散布する場合は、廃液の規模にもよるが、高濃度で添加したほうが効率は良い。例えば酸性水溶液の場合、１０重量％溶液又はこれ以上の濃度で、添加するのが好ましい。重金属の具体例としては、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ等が挙げられる。従来、特開平8−68893公報等の様に、キトサンをカラムに充填して廃液を通過させて吸着除去することが知られていたが、本発明のアミノ多糖は水溶性ゆえカラムに充填して廃液を通過させる工程を行うことなく、容易に廃液の浄化が可能である。
【実施例】
【００２５】
次に、本発明を実施例および比較例をもってより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの例にのみ制限されるものではない。
【００２６】
実施例1
三角フラスコにグルコース３重量％、ペプトン1.5重量％、酵母エキス0.1重量％、硫酸アンモニウム0.5重量％、塩化ナトリウム0.1重量％、硫酸マグネシウム0.3重量％、炭酸カルシウム0.4重量％の割合でイオン交換蒸留水に溶解した培地４００ｍｌをpH７に調整しオートクレーブ滅菌後、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１５７５株を接種し、培養温度25℃、回転数180rpmで７日間培養した。
【００２７】
培養開始後1日毎に培養液の２〜３ｍｌを抜き出し、遠心分離後その上清についてキチンキトサン実験マニュアル  キチンキトサン研究会編(技報堂出版)を参考にインドールー塩酸法によるアミノ糖の定性的な比色分析を以下の手順で行い、生産量の目安とした。
アミノ糖の定性的な比色分析
１）亜硝酸分解
遠心分離後の培養上清液1ｍｌを試験管にとり、酢酸10μｌを加えた。これに10％亜硝酸ナトリウム水溶液1ｍｌと5％硫酸水素カリウム水溶液1ｍｌを加え、室温で一晩放置し反応させた。翌日12.5％スルファミン酸アンモニウム水溶液２mlを加え、１０分間振盪させた。
２）インドール−HCL法
振盪終了後得られた亜硝酸分解物を３０分間放置後に1％インドール−エタノール溶液0.1mlを加え、沸騰湯浴中5分間反応させた。氷水中で充分冷却後、エタノールを1ml加えた。この発色液についてＯＤ（λ＝４９２ｎｍ）を測定した。
【００２８】
図３は横軸を培養日数、縦軸をODλ=492nmとしてその経日変化を示したものである。グラフが示すように培養開始後から生産が始まり、日の経過と供に増大し7日経過時点でほぼ最大に達した。培養開始後の７日目に培養を停止し遠心分離後培養上清３００ｍｌを取得した。これにエタノール３倍量を加え静置すると徐々に沈殿が進行し、上清部を傾瀉により除いたあとの沈殿部を３０００回転で遠心分離しエタノールで二回洗浄し真空乾燥した。粗製品として０．２８ｇであった。
これにより、本発明品がアミノ多糖であることが確認出来た。
【００２９】
実施例２−１、２−２
培養温度を30℃とし、培地組成は炭素源をグルコース（実施例２−１）又はシュクロース（実施例２−２）とした他は実施例１と同様の方法を用いて培養し、生産性を比較した。図４に経日変化を示した。実施例１と比較するとやや増殖が早く、培養日数が4〜５日で生産量上限に達した。炭素源の違いによる生産量に差は認められず、どちらも良好に資化することできた。
【００３０】
ミリポア攪拌式セル８４００に分画分子量が５００００（アミコン社製のダイアフローメンブレンXM50）の濾過用フィルターを用いた限外濾過で濃縮しながら適時イオン交換蒸留水を補充→濃縮→イオン交換蒸留水の補充を繰返し、濃縮時毎に実施例３のＨＰＬＣによるＧＰＣ分析により濃縮液をモニターして低分子画分のピークが認められなくなったときを限外濃縮終了の目安として抽出・精製を行った。本発明品は粘性が極めて低いため濃縮の進行による濾過速度の低下が生じず、極めてスムーズに濃縮脱塩が同時進行した。限外濾過器(ミリポア攪拌式セル8400)使用により３００ml程度の液量であれば１両日(夜間はしない)で濃縮脱塩が同時進行し、短時間で精製濃縮液となった。適当な量まで濃縮した後、凍結乾燥して本発明品を取得した。収量はそれぞれ０．２９ｇ（実施例２−１）と０．２５ｇ（実施例２−２）であった。
【００３１】
実施例３
実施例１と同様の培地組成・培養条件で約1週間の培養し、400mlの培養液から上清液350mlを得た。上清液はミリポア攪拌式セル8400により限外濃縮した。この時用いた濾過用フィルターは分画分子量が50000(アミコン社製のダイアフローメンブレンXM50)のものを用いた。
【００３２】
以下のステップで濃縮脱塩を行った。上清液３５０ｍｌを限外濾過により７０mlに濃縮した後、イオン交換蒸留水２５０ｍｌを追加し、再度７０ｍｌまで濃縮・脱塩の操作を計６回繰返し、６回目は５０mlまで濃縮しこれを凍結乾燥した。収量０．３６g、培養上清液の０．１%であった。
【００３３】
５０ml濃縮精製液の一部をマイクロシリンジに取り以下の条件にてHPLCによるGPCカラムで分析したクロマト結果を図５に示す。後半１４分のピークは溶離液に由来するピークであることは確認した。図が示すとおり本発明品以外のピークは検出されず、９０%以上の純度まで精製された。
カラム：Shodex Asahipack GF510HQ7.6×３００ｍｍ（排除限界分子量300,000）
温度：３５℃
溶媒：１%酢酸
流速：１ｍｌ／ｍ
検出：RI
注入量：２０μｌ
【００３４】
実施例4−１  溶解性試験
シュクロースを炭素源にした他は実施例１と同様の条件で培養した。このときの培養上清液は２５０mlであった。培養後、実施例３と同様に限外濃縮し凍結乾燥した。収量０．２８g、培養上清液の０．１１％であった。
更に、凍結乾燥品２０ｍｇを小試験管に採り、水０．２mlを加え、１０％相当の水縣濁液として、超音波洗浄器の水浴中で溶解状態を目視で観察した。全体が溶解しきれない時はこれに逐次水を加えていき、溶解の状態を観察した。５％相当になるまで水を加えた時点で全体が溶解し、淡褐色の溶液となった。
【００３５】
凍結乾燥品の０．２３％／１％酢酸溶液を調製し実施例３と同様の条件にてＨＰＬＣによるGPCカラムにより分析した時のクロマト結果を図６に示す。本発明のアミノ多糖のみのピークであり面積比による割合は９５%となり、かつ図１８のピークと同保持時間に溶出された。
【００３６】
実施例4−２
実施例４−１と同様にして得られた凍結乾燥品５ｍｇを小試験管に採り、これに１%酢酸０．２ｍｌを加え、溶解状態を目視で観察した。溶解したため、更に５ｍｇを追加した。溶解したため５ｍｇずつ追加を更に２回行ったところ溶解し、１%酢酸に少なくとも１０%相当は溶解することを確認した。更にこれ以上の溶解が可能と推測できた。
【００３７】
実施例4−３
実施例４−１と同様にして得られた凍結乾燥品１０ｍｇを小試験管に採り、これに２％水酸化ナトリウム０．５mlを加え、溶解状態を目視で観察した。溶解したため、２％相当が溶解することを確認した。
【００３８】
実施例５  成分分析
実施例１で得たアミノ多糖と参考例１としてキトサン標品（キトサン７B Lot No．TB25−M：フナコシ(株)）について元素分析を行った。結果を表１に示す。元素分析値はキトサン７Bとよく類似した成分含量を示した。
【表１】
2014223027.tif 000004
また、蛋白や脂質は含まれず、フェノール硫酸法「還元糖の定量法 福井作蔵著(東京大学出版会)」による糖の比色分析においてもキトサンと同程度、即ち対照(水)と同程度のＯＤ（λ=490nm）を示し、ヘキソース類は含まれていないことが確認された。
【００３９】
実施例６  構成糖の確認
次に、本発明のアミノ多糖の構成糖について、エルソン−モルガン法「還元糖の定量法  福井作蔵著(東京大学出版会)」を用いて比色分析を行い確認した。エルソン−モルガン法は単糖類を対象とした比色分析であり、本発明のアミノ多糖のような高分子量の場合はあらかじめ加水分解する必要がある為、非特許文献（Biotechnology  Letters  2005 Vol．27. 13−18）に記載されたキトサンの加水分解条件を参考に、6N塩酸に対する1％溶液を調整し、１１５℃ ３時間の加水分解を行った。
【００４０】
得られた強酸性の加水分解液を発色を妨害しない程度まで水で希釈して塩酸濃度が最終的に０．１２N（加水分解物量60μg／0.12N塩酸１ｍｌ）となるように希釈調製し、エルソンーモルガン法による比色分析を行った。比較のため対照としてキトサン標品の加水分解物、グルコサミン標品についても同様の濃度に調製して分析した。結果を表２に示す。
【表２】
2014223027.tif 000005
OD（λ=530nm）の値が示すとおり、キトサン加水分解物のＯＤはグルコサミン標品のODと誤差範囲でほぼ近似の値であるが、実施例６のアミノ多糖はグルコサミン標品の約86%の値となった。この違いは本発明のアミノ多糖に対する加水分解条件が必ずしも最適の条件ではないため一部切れ残りがあった或いは若干の不純物(元素分析値)のため純度がキトサン標品に劣ったためであろうと推測しており、本発明品がアミノ糖を構成糖とするホモポリマ−であろうということが推測できた。
【００４１】
実施例７  構成糖の同定
次に構成糖がいかなるアミノ糖であるか確認した。1H−NMR、13C−NMRの測定を実施例６で得られた加水分解物、グルコサミン標品、キトサン加水分解物について行った。
ＮＭＲは日本電子製ＪＥＯＬ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ ＥＣＡ−５００を用い、溶媒は重水に化学シフトの基準物質として３−（トリメチルシリル）−２，２，’３,３’−テトラジュウテロプロピオン酸（ＴＳＰ−ｄ４）を０．１％添加したものを用いた。
これに表３に示す様に各試料を０．３〜０．５ｗｔ％溶解して室温で測定した。結果を図７〜１２に示す。各試料のスペクトルは一致し、構成糖がグルコサミンであることが分かった。
【表３】
2014223027.tif 000006
【００４２】
実施例８  酵素反応
キトサンと同等の構造であるとすると、キトサナーゼにより分解しグルコサミンが遊離するはずであり、このことを実証するためキトサナーゼを用いた酵素反応させ、その後反応液についてエルソンーモルガン法による比色分析を行った。この場合は定量が目的ではなく、定性的にエルソンーモルガン法に応答して発色(ピンク色)の有無によりキトサンとの異同を検証した。
【００４３】
実施例３で得られたアミノ多糖を0.1M酢酸緩衝液(pH5.6)の0.5％溶液としたものとキトサナ−ゼ（Bacillus pumilus BN−262：和光純薬工業（株））粉末を0.1M酢酸緩衝液(pH5.6)に溶解し、0.04mg／1mlの割合に調製したものを40℃で反応させ、経時的に一定量をサンプリングし、エルソンーモルガン法により比色分析した。
【００４４】
対照としてキトサン標品を1％酢酸に0.1％溶液とした後pH5.6に調整したものを反応液として40℃でキトサナーゼと反応させ、経時的に一定量をサンプリングし、エルソンーモルガン法により比色分析した。
【００４５】
キトサン標品は反応時間の経過と共にエルソンーモルガン法による発色(ピンク色)の程度が強くなり、キトサナーゼに反応しグルコサミンを時間の経過とともに遊離させていることが明らかとなった。即ちキトサナーゼはβ−１,４−ポリグルコサミン（キトサン）のβ−１,４−結合をendo型に加水分解するという当然の結果を示した。一方本発明品はエルソン−モルガン法にまったく応答せずいかなる時間経過後の反応液も無色透明であった。即ち、本発明のアミノ多糖の構成糖はグルコサミンであるが、結合様式はキトサンと異なるということを示唆する結果となった。
【００４６】
実施例９  結合様式
酵素分析から本発明のアミノ多糖のグルコサミン結合様式が従来のキトサンとは異なるということが明らかとなりこの結合様式を明らかにすべく、次なる構造解析を行った。
【００４７】
赤外吸収スペクトルの測定
本発明品、キトサン標品についてフーリエ変換赤外分光分析を行った。結果を図１３に示す。共に類似した吸収スペクトルを示し、キチン・キトサンに特有の吸収スペクトルであるOH伸縮振動3300±100cm−1、CH伸縮振動2900±50cm−1、NH伸縮振動3300±100cm−1、アミド基に由来する吸収が1550〜1650cm−1にみられた。
【００４８】
糖の吸収特性としてα型は844±10ｃｍ−1、、β型は891±10ｃｍ−1にＣ1−H変角振動が見られることが知られている。キトサン標品は896ｃｍ−1付近に吸収が見られ、本発明品も同程度の位置に吸収が見られたことからβ型と判断出来た。
【００４９】
実施例１０  結合位置
NMR測定  
結合様式はβ型であることが明らかとなったが、キトサンと異なることから、炭素の結合位置が異なることが推測できた。そこでこれを明らかにすべく、実施例３で得られた本発明品、キトサン標品それぞれについて、1H−NMRによる結合位置の解析を行った。1H−NMRの測定には日本電子製ＪＥＯＬ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ ＥＣＡ−５００を用い、溶媒は重水に重酢酸を１％、化学シフトの基準物質としてＴＳＰ−ｄ４を０．１％添加したものを用いた。これに各試料を１ｗｔ％溶解して測定した。測定温度は５０℃で行った。
【００５０】
本発明品、キトサン標品それぞれの1H−NMRスペクトルの結果を図１４，１５に示す。キトサンはβ−1→4結合に由来するC−１位のHのシグナルが1本4.85ppmに検出され、本発明品ではC−１位のHと考えられるシグナルが5.1ppmと4.8ｐｐｍに2本検出された。結合様式が2種類存在し、かつ1H積分比が1：1であることから2種類の結合が同数存在することが明らかとなった。
【００５１】
本発明品の重水＋1％重酢酸溶液の13C−NMRによるスペクトルの結果を図１６に示す。Cサイトは全１２であり、C−1に帰属するシグナルが１００ppm付近に２本検出されていることから、糖の結合様式が２種類あることを示している。
【００５２】
本発明について二次元測定（ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣ，ＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ）行った結果を図１７に示す。HMBCでは、2〜3結合離れたCとHの相関を観測できる。Oをまたいだ3JCHの相関を確認した。C−3位のHとC−1’位のC（1H：4.1ppmと13C：99.4ppm)、C−1’位のHとC−3位のC（1H：5.1ppmと13C：80.6ppm)の相関はβ1→3結合を示す。C−4’位のHとC−1位のC（1H：4.0ppmと13C：100.5ppm)、C−1位のHとC−4’位のC（1H：4.8pmと13C：78.8ppm)の相関はβ1→4結合を示す。これより、2種類の結合様式はβ1→3結合とβ1→4結合であり、Cのサイトが全12であることから、β1→3結合とβ1→4結合が交互に連なる構造であると結論した。
【００５３】
実施例１１  分子量測定
実施例1と同様の培養条件で得られた培養上清液３００ｍｌを濾過用フィルター（アミコン社製のダイアフローメンブランXM50）により通過させた限外濃縮液を２％水酸化ナトリウム溶液でpH8〜10に調整しながら硫酸アンモニアで塩析することにより沈殿濃縮後、これを水に溶解させ流水透析後凍結乾燥し、１%酢酸液に0.2％溶解液とし、この２０μｌを実施例３と同様の条件にてＨＰＬＣを測定した。また、分子量検定用標準試料として分子量の異なる５種類のキット品からなるアミノ糖類プルラン（Shodex  STANDARD  P−82）についても同様に測定し、保持時間を比較することにより分子量を推測した。この時キトサン標品についても測定し、同様に推測した。
【００５４】
結果を図１８に示す。流水透析液はこの後これ以上の分画操作を行わず凍結乾燥したものであるが、本発明品以外の高分子量物は検出されず、本発明品のみが選択的に生産されていることが確認でき、その分子量は標準試料プルランの344,000相当と推測できた。キトサン標品もこれとほぼ同程度の保持時間で溶出された。
【００５５】
実施例１２  粘度  
実施例３で得られたアミノ多糖の0.05，0.1，0.25，0.5％水溶液を調製し、キトサン標品（キトサン７Ｂ Ｌｏｔ．ＮｏTB25−M：フナコシ(株)製）は１％酢酸に対して0.05，0.1，0.25，0.5％濃度のものを調製し、それぞれの濃度における粘度を２５℃でエー・アンド・ディ(株)のＳＶ型粘度計（ＳＶ−１０）を用いて測定した。図１９に結果を示す。
【００５６】
従来のキトサン標品を用いた溶液は濃度の増加と共に高粘性を示していくのに対して本発明品の粘度上昇は極めて緩やかなものであった。ほとんど粘性を有しないと言っても過言ではなかった。
【００５７】
実施例１３−１〜１３−１０、比較例１３−１〜１３−１０  廃液の浄化
表５に示す各金属の1％水溶液1mlを調製し、これに実施例４で取得したキトサン様物の2％水溶液を50μl、或いは比較例として従来のキトサン（キトサン7B）の1％溶液(1%酢酸)を100μl加えたときの沈殿生成の有無を定性的に観察した。結果を表４に示した。
【表４】
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−：沈殿生成なし +：極少量の沈殿生成  ++：徐々に沈殿生成  +++：瞬時に沈殿生成
比較例のキトサン７Bの場合、硫酸第一鉄に対してのみ沈殿形成作用が認められたのに対して、本発明のキトサン様物は実施例１３−１〜１３−５において+〜+++の範囲で沈殿生成作用を示し、従来のキトサン７Bに比べて高い沈殿形成能力と浄化作用を有することが示された。
【００５８】
実施例１４  硫酸亜鉛7水和物を用いた精製
炭素源はシュクロ−スとした他は、実施例１と同様の条件で５日間本菌株を培養した。培養終了後遠心分離して、上清液65ｍｌ(pH7.2)を得た。これに硫酸亜鉛7水和物の1％水溶液を3〜4mlを加えて攪拌した。攪拌と同時に沈殿が生成し徐々に沈降した。遠心分離により沈殿を取得したら水10ｍｌを加えて攪拌洗浄した。これを2回繰り返したあと、再度水10mlに縣濁した。これに強酸性イオン交換樹脂Dowex50 [Ｈ]型を5ｍｌ加えて、振盪攪拌した。静置し、上清部をピペットで吸い取り別の容器に移し取った。樹脂部は水を加えて洗浄し、静置後上清部をピペットで吸い取り、同容器に移し取り合わせて一つとした。凍結乾燥し0.083gを得た。収量0.13％。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は食品、健康食品、サプリメント、食品添加剤、化粧品、トイレタリ−製品、化成品、医薬品、廃液処理等への広範な応用が期待できる。
【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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