(57)【要約】      （修正有）【課題】ケモカイン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）が介在する病態の治療に有用な新規な化合物およびその組成物の提供。【解決手段】ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素である、化合物。該化合物および医薬上許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。該化合物を投与することを含む、ケモカインまたはＩＬ−８が介在する病態、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患または成人性呼吸窮迫症候群の治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素である、化合物。
【請求項２】
ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素および医薬上許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項３】
哺乳類においてケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体と結合する、ケモカイン介在疾患を治療する方法であって、有効量のｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素を投与することを含む、方法。
【請求項４】
喘息、慢性閉塞性肺疾患または成人性呼吸窮迫症候群の治療方法であって、それを必要とする哺乳類に有効量のｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素を投与することを含む、方法。
【請求項５】
慢性閉塞性肺疾患の治療方法であって、それを必要とする哺乳類に有効量のｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素を投与することを含む、方法。
【請求項６】
ケモカイン介在疾患の治療に用いるための薬剤の製造における、ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素の使用。
【請求項７】
喘息、慢性閉塞性肺疾患または成人性呼吸窮迫症候群の治療に用いるための薬剤の製造における、ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素の使用。
【請求項８】
慢性閉塞性肺疾患の治療に用いるための薬剤の製造における、ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素の使用。
【請求項９】
ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素と１以上の付加的治療成分を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
前記付加的治療成分がＣＸＣＲ３受容体アンタゴニストまたはＣＣＲ５受容体アンタゴニストである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１１】
ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル）−フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素を製造する方法であって、
ａ）アセトニトリルとｐ−トルエンスルホン酸一水和物を合わせる工程；
ｂ）工程ａ）の生成物をテトラヒドロフランに溶解させた
【化１】
2014055145.tif 000005
に加える工程；および
ｃ）工程ｂ）で得られた生成物をアセトニトリルで処理する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素、この化合物を含有する医薬組成物、およびＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２およびＥＮＡ−７８介在疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）には、好中球誘引／活性化タンパク質−１（ＮＡＰ−１）、単球由来好中球走化因子（ＭＤＮＣＦ）、好中球活性化因子（ＮＡＦ）およびＴ細胞リンパ球走化因子などの多くの異なる名称が適用されてきた。インターロイキン−８は、好中球、好塩基球およびＴ細胞のサブセットの走化性因子である。これは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＬＰＳに曝されたマクロファージ、繊維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞を含めた有核細胞の大多数によって産生され、ＬＰＳ、またはＦＭＬＰなどの走化因子に曝される場合には、好中球それ自体によって産生される。
【０００３】
また、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、ケモカインファミリーにも属する。ＩＬ−８と同様に、これらのケモカインも種々の名称で呼ばれてきた。例えば、ＧＲＯα、β、γは、それぞれＭＧＳＡα、βおよびγ（メラノーマ増殖刺激活性）と呼ばれてきた。ＣＸＣモチーフの直前にＥＬＲモチーフを有するαファミリーの全てのケモカインは、ＩＬ−８Ｂ受容体（ＣＸＣＲ２）と結合する。
【０００４】
ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２およびＥＮＡ−７８は、in vitroでいくつかの機能を刺激する。それらは全て、好中球の走化特性を有することが示されており、ＩＬ−８およびＧＲＯαは、Ｔリンパ球および好塩基球の走化活性が実証されている。さらに、ＩＬ−８は、正常個体およびアトピー個体両方の好塩基球からのヒスタミン放出を誘発することができる。ＧＲＯ−αおよびＩＬ−８はさらに、好中球からのリソソーム酵素放出および呼吸バーストを誘発することができる。ＩＬ−８はまた、de novoタンパク質合成なしに好中球上でのＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）の表面発現を増大することが示されている。このことは、好中球の血管内皮細胞への接着の増大に寄与し得る。多くの既知の疾患は、著しい好中球浸潤を特徴とする。ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２が好中球の蓄積および活性化を促進することから、これらのケモカインは、乾癬および関節リウマチを含む幅広い急性および慢性炎症性障害に関連づけられている。さらに、ＥＬＲケモカイン（ＣＸＣモチーフの直前にアミノ酸ＥＬＲモチーフを含むもの）も、血管新生阻害(angiostasis)に関連づけられている。
【０００５】
in vitroにおいて、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、７回膜貫通型Ｇタンパク質結合ファミリーの受容体と結合し、それを活性化することによって、特にＩＬ−８受容体、とりわけＩＬ−８β受容体（ＣＸＣＲ２）と結合することによって、好中球の形状変化、走化性、顆粒放出および呼吸バーストを誘発する。この受容体ファミリーのメンバーに対する非ペプチド小分子アンタゴニストの開発には前例がある。従って、ＩＬ−８受容体は、新規な抗炎症薬を開発するための有望な標的となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３９７７５号
【特許文献２】米国特許第６１８０６７５号明細書
【特許文献３】米国特許第６５００８６３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
当技術分野では、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２受容体と結合することができる化合物に関する取り組みが依然として必要とされている。従って、ＩＬ−８産生（好中球およびＴ細胞サブセットの炎症部位への走化性を担う）の増大に関連する症状は、ＩＬ−８受容体結合の阻害剤である化合物によって利益が得られるであろう。このような化合物はＷＯ２００４／０３９７７５、米国特許第６，１８０，６７５号および米国特許第６，５００，８６３号に開示されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素（本化合物）および本化合物と医薬上許容される担体または希釈剤を含む組成物に関する。
【０００９】
本発明はまた、本化合物と１以上の付加的治療成分を含む組合せに関する。
【００１０】
本発明はさらに、ケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するものであるケモカイン介在疾患を治療する方法に関し、その方法は、有効量の本化合物を投与することを含む。
【００１１】
本発明はまた、それを必要とする哺乳類、特にヒトにおいて、ＩＬ−８の、その受容体への結合を阻害する方法に関し、その方法は有効量の本化合物を投与することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素および本化合物と医薬上許容される担体または希釈剤を含む組成物に関する。
【００１３】
本発明はまた、本化合物と１以上の付加的治療成分を含む組合せに関する。
【００１４】
本発明はさらに、ケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するものであるケモカイン介在疾患を治療する方法に関し、その方法は、有効量の本化合物を投与することを含む。
【００１５】
本発明はまた、それを必要とする哺乳類、特にヒトにおいて、ＩＬ−８の、その受容体への結合を阻害する方法に関し、その方法は有効量の本化合物を投与することを含む。
【００１６】
本発明はさらに、喘息、慢性閉塞性肺疾患および成人呼吸器系疾患を治療する方法に関する。特に、本発明は、本化合物を用いた閉塞性肺疾患の治療に関する。
【００１７】
製造方法
ｐ−トルエンスルホン酸Ｎ−［４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−Ｎ’−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素
【化１】
2014055145.tif 000002
【００１８】
化合物１の製造
３，４−ジクロロアニリン（１００ｇ）をテトラブチルメチルアミン（ＴＢＭＥ）（６６０ｍＬ）に溶解させ、１０〜１５℃に冷却した。水酸化ナトリウム（３０％水溶液９４ｇ）を加え、この溶液を機械的攪拌機で激しく攪拌した。塩化トリメチルアセチル（８４ｍＬ）を、内部温度が３５℃までに維持されるような速度で加えた。添加が完了したところで（１０〜１５分）、この混合物を３０〜３５℃で約３０分維持した後、３０〜４０分かけて０〜５℃に冷却した。この反応混合物を０〜５℃で１時間維持した後、濾過し、まず９０：１０水／メタノール（４００ｍＬ）で、次に水（６００ｍＬ）ですすいだ。真空下、５０〜５５℃で乾燥させ、生成物を灰白色結晶として得た。収量１２７ｇを得た。
【００１９】
化合物２の製造
化合物１の溶液（３００ｍＬ）を窒素の不活性雰囲気下で−５０〜−４０℃に冷却した。Ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、１７９ｍＬ）を、溶液の内部温度が−４５〜−３０℃の間に維持されるような速度で加えた（およそ１５〜３０分の添加）。ＨＰＬＣが最初の反応が完了したことを示すまで、この溶液を約−３５〜−２５℃で保持した。次に、この溶液を再び−４５〜−４０℃に冷却し、この溶液に、内部温度をおよそ−１４℃までに維持しつつ、溶液が酸性となるまで、二酸化硫黄（〜１６．９ｇ）の泡を通じた。反応が完了したところで、この混合物を−１０〜０℃に温めた。次に、−２〜３℃で始め、塩化スルホニル（２５．２ｍＬ）をテトラヒドロフラン溶液に、温度をおよそ２２℃までに維持しつつ、５〜１５分かけて滴下した。５分後、ＨＰＬＣによって、反応が完了したことを確認し、この間、溶液は１０〜１５℃前後に維持した。この混合物の溶媒を減圧下でα，α，α−トリフルオロトルエンに交換し、濾過し、部分的に真空濃縮した（〜１００ｍＬ）後、ジクロロメタン（３５０ｍＬ）を加えた。この混合物に、溶液の内部温度を１５〜２７℃に維持しつつ、周囲温度でジクロロメタン（６２５ｍＬ）中ピペラジン（６１．２ｇ）の溶液を滴下した（２時間添加）。この反応を完了するまで２０〜２４℃で保持した。この混合物を脱イオン水（２００ｍＬ）で洗浄し、有機層を濃縮した後、ヘプタン（４５０ｍＬ）を加えた。生成物（７０．５ｇ）を濾過により単離し、ヘプタン（５０〜１００ｍＬ）で洗浄し、５０〜５５℃で真空乾燥させた。
【００２０】
化合物３の製造
化合物２（３０ｇ）を〜１６％（水中ｗ／ｗ）の硫酸（３００ｍＬ）に加えた。得られた混合物を９９〜１０３℃で〜６時間加熱還流した。反応が完了したところで、この溶液を４０〜５０℃に冷却し、その後、減圧下で〜６０ｍＬまで濃縮した。アセトニトリル（２２５ｍＬ）を加え、得られた懸濁液を２０〜２５℃で〜１時間攪拌した。生成物を濾過により単離し、アセトニトリル（１３５ｍＬ）で洗浄し、４５〜５０℃で真空乾燥させた。収量３３．３４ｇを得た。
【００２１】
化合物４の製造
化合物３（２０ｇ）を脱イオン水（２００ｍＬ）に加えた。得られた溶液のｐＨを、内部温度を２０〜３０℃の間に維持しつつ５０％水酸化ナトリウム水溶液（〜６．３５ｍＬ）を加えることで６．５〜７．０に調整した。次に、酢酸エチル（８０ｍＬ＋２０ｍＬすすぎ）中、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（８．９ｇ）の溶液を加えた。得られた混合物のｐＨを、内部温度を２０〜３０℃の間に維持しつつ５０％水酸化ナトリウム水溶液（２．４５ｍＬ）を加えることで６．８〜７．０に調整した。反応が完了したところで、反応溶液を濾過して少量の沈殿を除去した。濾液を二層に分け、水層を酢酸エチル（１４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を水（４０ｍＬ）で洗浄し、１００ｍＬまで濃縮した。ヘプタン（１００ｍＬ）を加え、得られた懸濁液を６０ｍＬまで濃縮した。このプロセスをもう一度繰り返した。その後、ヘプタン（１４０ｍＬ）を加え、得られた懸濁液を２０〜２５℃で〜１時間攪拌した。生成物を濾過により単離し、ヘプタン（８０ｍＬ）で洗浄し、４０〜４５℃で真空乾燥させた。収量１５．３ｇを得た。
【００２２】
化合物５の製造
化合物４（１０ｇ）をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）およびアセトニトリル（８０ｍＬ）に加えた。内部温度を２０〜３０℃の間に維持しつつ、イソシアン酸２−クロロ−３−フルオロフェニル（４．７７ｇ）を加えた後、１０ｍＬのアセトニトリルですすいだ。得られた混合物を２０〜２５℃で〜２時間攪拌した。反応が完了したところで、メタノール（５０ｍＬ）を加えた。得られた懸濁液を２０〜２５℃で〜１０分間攪拌した。脱イオン水（１５０ｍＬ）を加え、得られた懸濁液を２０〜２５℃で〜１時間攪拌した。生成物を濾過により単離し、脱イオン水（１００ｍＬ）およびメタノール（１５〜２０ｍＬ）で洗浄した後、４０〜４５℃で真空乾燥させた。収量１４．１５ｇを得た。
【００２３】
化合物６の製造−手法１
化合物５（５０ｇ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２００ｍＬ）に溶解させ、３３〜３７℃に加熱し、３３〜３７℃で保持した。別の反応で、アセトニトリル（２５０ｍＬ）、ＴＨＦ（５０ｍＬ）およびｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４３．９ｇ）の溶液を調製した。得られた溶液を３３〜３７℃に加熱し、３３〜３７℃で保持した。このｐ−トルエンスルホン酸溶液を濾過し、温度を３３〜３７℃に維持しつつ、化合物５とＴＨＦの入った反応槽に移した。出発材料が消費された後、生成物の微粉シード（０．５ｇ）を最少量のアセトニトリル（５ｍＬ）に入れた。次に、この反応混合物を〜４０分にわたって５３〜５７℃に加熱し、この温度で少なくとも４時間保持した。反応物を０〜５℃に冷却し、生成物を濾過により単離し、アセトニトリル（２５０ｍＬ）で洗浄し、５５〜６０℃で真空乾燥させた。収量５２．２４ｇを得た。
【００２４】
化合物６の製造−手法２
化合物５（５００ｇ）を反応槽１に入れた後、アセトニトリル（ＣＡＮ、３７５０ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１２５０ｍＬ）を入れた。次に、この溶液を６０〜６５℃に加熱し、透明な溶液が得られたところで、反応槽２へ明澄化濾過を行う。反応槽１に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ、４３９ｇ）、次いでＡＣＮ（７５０ｍＬ）およびＴＨＦ（２５０ｍＬ）を加える。この混合物を４０〜４５℃で加熱し、透明な溶液が得られたところで、明澄化濾過を行い、反応槽２の温度を５０〜６０℃に維持しつつ、この溶液を反応槽２（出発材料溶液を含む）に加えた。この混合物を加熱還流し、反応が完了するまで７０〜８０℃で保持した。〜３５００ｍＬの溶媒を常圧蒸留によって除去した。次に、この反応槽に２．５Ｌの水、次いで４ＬのＡＣＮを入れ、温度を７０〜８０℃に調節した。溶解が見られた後、得られた溶液を６４〜６８℃に冷却した。５〜１０分後、粉砕した生成物シード（５ｇ）を最少量のアセトニトリルに加え、６４〜６８℃で１時間保持した。この混合物を２時間かけて０〜５℃に冷却し、０〜５℃で〜３０分間保持した後、生成物を濾過により単離した。この固体生成物を２．５Ｌのアセトニトリルで洗浄し、５０〜６０℃で真空乾燥させた。収量４８０ｇを得た。
【００２５】
治療方法
本化合物は、限定されるものではないが、単球および／またはマクロファージなどの哺乳類細胞による過剰な、または調節を欠いたＩＬ−８サイトカイン、またはＩＬ−８αもしくはβ受容体（Ｉ型もしくはＩＩ型受容体とも呼ばれる）と結合する他のケモカインの産生によって悪化または発生するヒトまたは他の哺乳類の病態の予防的または治療的治療を目的とした薬剤の製造において有用である。
【００２６】
よって、本発明は、ケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するものである、ケモカイン介在疾患を治療する方法を提供し、その方法は有効量の本化合物を投与することを含む。特に、ケモカインはＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８である。
【００２７】
本化合物は、正常レベルの生理学的機能まで、または場合によっては病態を改善するために正常より低いレベルまで生物学的にダウンレギュレーションされるように、サイトカイン機能、特に、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８を阻害するのに十分な量で投与される。本発明において、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８の異常なレベルとは、例えば、（ｉ）遊離ＩＬ−８が１ピコグラム／ｍＬ以上のレベル；（ｉｉ）細胞関連ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８が正常な生理学的レベルを超える；または（ｉｉｉ）ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８のが産生される細胞および組織における、それぞれＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８の存在が基本レベルを超える、というものである。
【００２８】
過剰な、または調節を欠いたＩＬ−８産生が疾病の悪化および／または発生に関与している多くの病態が存在する。ケモカイン介在疾患としては、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨関節炎、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、成人性呼吸窮迫症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、脳卒中、敗血性ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、毒性ショック症候群、心臓および腎臓の再潅流傷害、糸球体腎炎、血栓症、移植片対宿主反応、アルツハイマー病、同種移植片拒絶、マラリア、再狭窄、脈管形成、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、歯肉炎、ライノウイルスなどのウイルス病または望ましくない造血幹細胞放出が挙げられる。
【００２９】
特に、本発明の化合物は、喘息、慢性閉塞性肺疾患および成人性呼吸窮迫症候群の治療に有用である。好ましくは、本化合物は慢性閉塞性肺疾患の治療に有用である。
【００３０】
本発明の疾患は、主として著しい好中球浸潤、Ｔ細胞浸潤または血管新生成長を特徴とし、炎症部位への好中球の走化性または内皮細胞の方向性成長を担うＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８産生の増強に関連している。他の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦおよびＩＬ−６）とは対照的に、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８は、好中球の走化性、限定されるものではないがエラスターゼの放出などの酵素の放出、ならびにスーパーオキシドの産生および活性化を促進する独自の特性を有する。α−ケモカイン、特に、Ｉ型またはＩＩ型ＩＬ−８受容体を介して働くＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８は、内皮細胞の方向性成長を促進することによって腫瘍の新血管新生を促進し得る。従って、ＩＬ−８により誘発される走化性または活性化の阻害は、好中球浸潤の直接的減少をもたらす。
【００３１】
また、最近の証拠は、ＨＩＶ感染の治療におけるケモカインの役割を含意しているLittleman et al., Nature 381, pp. 661 (1996)およびKoup et al., Nature 381, pp. 667 (1996)。
【００３２】
最近の証拠はまた、アテローム性動脈硬化症の治療におけるＩＬ−８阻害剤の使用を示している。最初の参考文献Boisvert et al., J. Clin. Invest, 1998, 101:353-363は、骨髄移植を通じて、幹細胞上に（従って、単球／マクロファージ上に）ＩＬ−８受容体が存在しないと、ＬＤＬ受容体欠損マウスにおいてアテローム斑の発生が軽減されることを示す。
【００３３】
本発明はまた、ＣＮＳ損傷を治療する手段を提供する。このような治療は救急時に、また、損傷を受けるおそれのある個体において損傷を予防するために提供される。
【００３４】
本明細書で定義されるＣＮＳ損傷としては、外科術によるものなどの開放性または穿孔性双方の頭部外傷、または頭部領域への損傷によるものなどの閉鎖性頭部外傷を含む。また、特に脳領域に対する虚血性脳卒中もこの定義内に含まれる。
【００３５】
虚血性脳卒中は、通常は血栓、塞栓または血管のアテローム変性閉鎖の結果としての、特に脳領域への血液供給が不足することから起こる局部的な神経障害として定義することができる。この領域における炎症性サイトカインの役割は明らかになっており、本発明はこれらの損傷の可能性のある治療に向けた手段を提供する。
【００３６】
ＴＮＦ−αは、内皮細胞白血球接着分子の発現を含めた炎症性作用を有するサイトカインである。白血球は脳の虚血部位に浸潤し、従って、ＴＮＦを阻害するか、またはそのレベルを低下させる化合物が虚血性脳損傷の治療に有用となる。Liu et al., Stroke, Vol. 25., No. 7, pp. 1481-88 (1994)（この開示は出典明示により本明細書の一部とされる）参照。
【００３７】
閉鎖性頭部損傷および５−ＬＯ／ＣＯ混合薬による治療のモデルが、Shohami et al., J. of Vaisc & Clinical Physiology and Pharmacology, Vol. 3, No. 2, pp. 99-107 (1992)に述べられている。浮腫の形成を軽減する治療は、被治療動物における機能的転帰を改善することが分かった。
【００３８】
本化合物は、好中球の走化性および活性化の低下によって明らかなものなど、ＩＬ−８αまたはβ受容体に結合するＩＬ-８が、これらの受容体と結合するのを阻害するのに十分な量で投与される。本化合物はＩＬ−８結合の阻害剤であるという発見は、これらのアッセイにおける本化合物の作用に基づくものである。
【００３９】
本明細書において、「ＩＬ−８介在疾患または病態」とは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８が、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８自体の産生によるか、または限定されるものではないがＩＬ−１、ＩＬ−６もしくはＴＮＦなどの他のモノカインの放出を引き起こすＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８によって役割を果たす、いずれか、また全ての病態を指す。従って例えば、ＩＬ−１が主成分であり、その産生または作用がＩＬ−８に応答して激化または分泌される病態は、ＩＬ−８が介在する病態であると考えられる。
【００４０】
本明細書において「ケモカイン介在疾患または病態」とは、限定されるものではないがＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８など、ＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するケモカインが役割を果たす、いずれか、また全ての病態を指す。これには、ＩＬ−８が、ＩＬ−８自体の産生によるか、または限定されるものではないがＩＬ-１、ＩＬ−６もしくはＴＮＦなど他のモノカインの放出を引き起こすＩＬ−８によって役割を果たす病態が含まれる。従って例えば、ＩＬ−１が主成分であり、その産生または作用がＩＬ−８に応答して激化または分泌される病態は、ＩＬ−８が介在する病態であると考えられる。
【００４１】
本明細書において「サイトカイン」とは、細胞の機能に影響を与え、免疫応答、炎症応答または造血応答における細胞間の相互作用を変調する分子である、分泌型ポリペプチドを指す。サイトカインとしては、限定されるものではないが、モノカインおよびリンホカインが含まれ、どの細胞がそれらを産生するかにはよらない。例えばモノカインは、一般に、マクロファージおよび／または単球などの単核細胞によって産生および分泌されるとされている。しかし、ナチュラルキラー細胞、繊維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細胞、脳星状細胞、骨髄間質細胞、表皮ケラチノサイトおよびＢリンパ球などの他の多くの細胞もモノカインを産出する。リンホカインは一般に、リンパ球細胞によって産出されるとされている。サイトカインの例としては、限定されるものではないが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）が含まれる。
【００４２】
本明細書において「ケモカイン」とは、上記の「サイトカイン」という用語と同様に、細胞の機能に影響を与え、免疫応答、炎症応答または造血応答にける細胞間の相互作用を変調する分子である、分泌型ポリペプチドを指す。ケモカインは、主に細胞のトランスメンブランを介して分泌され、特定の白血細胞（white blood cell）および白血球（leukocyte）、好中球、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞および平滑筋細胞の走化性および活性化を生じる。ケモカインの例としては、限定されるものではないが、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＰＦ４、ならびにＭＣＰ１、２および３が含まれる。
【００４３】
本化合物を治療で使用するためには、通常、それを、標準的な製薬慣行に従って医薬組成物へと処方する。従って、本発明はまた、有効な非毒性量の本化合物と医薬上許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００４４】
本化合物およびそれを配合した医薬組成物は、薬剤投与、例えば、経口、局所、非経口または吸入による投与に通常使用される経路のいずれかによって好都合に投与することができる。本化合物は、通常の手順に従って本化合物を標準的な医薬担体と組み合わせることによって調製された通常の投与形として投与することができる。本化合物は、第２の既知の治療上有効な化合物と組み合わせて、通常の投与形で投与することもできる。これらの手順は、所望の製剤に適するように、成分の混合、造粒および圧縮または溶解を含み得る。医薬上許容される種類または希釈剤の形態および特徴は、それが組み合わされる有効成分の量、投与経路および他の周知の変数によって定められると考えられる。担体は、その処方物の他の成分と適合し、かつ、そのレシピエントに対して有害ではないという意味で「許容され」なければならない。
【００４５】
使用される医薬担体は、例えば、固体でも液体でもよい。固体担体の例としては、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などがある。液体担体の例としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、水などがある。同様に、担体または希釈剤としては、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなど当技術分野で周知の遅延材料を単独で、またはワックスとともに含み得る。
【００４６】
多様な医薬形を使用することができる。従って、固体担体が使用される場合には、この製剤は、粉末またはペレットの形態で打錠またはゼラチン硬カプセルに入れるか、あるいはトローチまたはロゼンジの形態とすることができる。固体担体の量は多様であるが、好ましくは、約２５ｍｇ〜約１ｇである。液体担体が使用される場合には、製剤は、シロップ、エマルション、ゼラチン軟カプセル、アンプルなどの無菌注入液体、または非水性液体懸濁剤の形態となる。
【００４７】
本化合物は、局所的に、すなわち非全身投与によって投与することができる。これには、本化合物の表皮または口腔への外用、このような化合物の、耳、目および鼻への滴注が含まれ、この場合には本化合物はあまり血流に入り込まない。これに対し、全身投与は、経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を指す。
【００４８】
局所投与に適した処方物としては、皮膚を介して炎症部位に浸透させるのに適したリニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏またはペースト剤などの液体または半液体製剤、ならびに目、耳または鼻への投与に適した滴剤が含まれる。有効成分は、局所投与については、処方物の０．００１％〜１０％ｗ／ｗ、例えば１重量％〜２重量％を含み得る。処方物の１０％ｗ／ｗも含むことができるが、好ましくは５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは０．１％〜１％ｗ／ｗを含む。
【００４９】
本発明のローション剤には、皮膚または目への適用に適したものが含まれる。目薬は、殺菌剤を所望により含有する滅菌水溶液を含むことができ、滴剤の調製方法と同じ方法によって調製することができる。皮膚に適用するためのローション剤またはリニメント剤は、アルコールまたはアセトンなど、乾燥を促進し皮膚を冷却するための薬剤、ならびに／あるいはグリセロールまたはヒマシ油もしくは落花生油といった油などの保湿剤を含むこともできる。
【００５０】
本発明のローション剤としては、皮膚または目への適用に適したものが含まれる。目薬は、所望により殺菌剤を含有する滅菌水溶液を含むことができ、滴剤の調製と同様の方法によって調製することができる。皮膚に適用するためのローション剤またはリニメント剤は、アルコールまたはアセトンなどの、乾燥を促進し皮膚を冷却するための薬剤、ならびに／あるいはグリセロールまたはヒマシ油もしくは落花生油といった油などの保湿剤を含むこともできる。
【００５１】
本発明のクリーム剤、軟膏またはペースト剤は、外用の、有効成分の半固体処方物である。それらは、適切な機械の助けで、油脂性基材または非油脂性基材を用いて、微細分割されたまたは粉末の形態の有効成分を単独で、あるいは水性または非水性流体中の溶液または懸濁液として混合することによって調製することができる。基材は、硬質、軟質または液体パラフィンなどの炭化水素、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸；漿剤；アーモンド油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然源の油；羊毛脂またはその誘導体、あるいはプロピレングリコールなどのアルコールを伴うステアリン酸またはオレイン酸などの脂肪酸；あるいはマクロゲルを含むことができる。この処方物は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤、例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの好適な界面活性剤を配合することができる。天然ゴム、セルロース誘導体または珪質シリカなどの無機材料などの懸濁化剤、およびラノリンなどの他の成分も含むことができる。
【００５２】
本発明の滴剤は、無菌の水性もしくは油性溶液または懸濁液を含むことができ、有効成分を、殺菌剤および／または殺真菌剤および／または他の好適な任意の保存剤（好ましくは界面活性剤を含む）の好適な水溶液に溶解させることによって調製することができる。次いで、得られた溶液を、濾過によって明澄化し、好適な容器に移した後、それを密閉し、高圧蒸気殺菌によって滅菌するか、または９８〜１００℃で３０分間維持する。あるいは、溶液を濾過除菌し、無菌法で容器に移してもよい。滴剤に入れるのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例としては、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）がある。油性溶液の調製に適した溶媒には、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。
【００５３】
本化合物は、非経口、すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内または腹腔内投与によって投与することができる。このような投与に適当な投与形は、通常の技術によって調製することができる。また、本化合物は、吸入によって、すなわち鼻腔内および経口吸入投与によって投与することもできる。エアゾール処方物または定量吸入器など、このような投与に適当な投与は、通常の技術によって調製することができる。
【００５４】
本化合物に関して本明細書で開示される全ての使用方法で、１日経口投与計画は、好ましくは約０．０１〜約８０ｍｇ／全体重ｋｇである。１日非経口投与計画は、約０．００１〜約８０ｍｇ／全体重ｋｇである。１日局所投与計画は、好ましくは０．１ｍｇ〜１５０ｍｇであり、１日に１〜４回、好ましくは２回または３回投与される。１日吸入投与計画は、好ましくは１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。当業者であれば、本化合物の個々の投与の最適な量および間隔は、治療される症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、治療される具体的な患者によって決定されること、ならびにこのような最適条件は通常の技術によって決定できることが分かるであろう。当業者であれば、最適な治療コース、すなわち規定の日数、１日当たり与えられる本化合物の投与回数は当業者が通常の治療決定試験コースを使用して確定可能であることも分かるであろう。
【００５５】
組合せ：
本化合物および本発明の医薬処方物は、例えば、抗炎症薬、抗コリン作用薬（特にＭ１／Ｍ２／Ｍ３受容体アンタゴニスト）、β２−アドレナリン受容体アゴニスト、抗生物質、抗ウイルス薬などの抗感染薬、または抗ヒスタミン薬から選択される１以上の他の治療薬と組み合わせて使用すること、またはこれらを含むことができる。よって、本発明は、さらなる態様において、本化合物または生理学上機能のある本化合物の誘導体を、例えば、コルチコステロイドもしくはＮＳＡＩＤなどの抗炎症薬、抗コリン作用薬、β２−アドレナリン受容体アゴニスト、抗生物質もしくは抗ウイルス薬などの抗感染薬、または抗ヒスタミン薬から選択される１以上の他の治療上有効な薬剤とともに含む組合せを提供する。本発明の一実施形態は、本化合物またはその生理学上機能のある誘導体をβ２−アドレナリン受容体アゴニスト、および／または抗コリン作動薬、および／またはＰＤＥ−４阻害剤、および／または抗ヒスタミン薬とともに含む組合せを包含する。
【００５６】
当業者には、適当であれば、治療成分の活性および／または安定性および／または溶解度などの物理的特性を最適化するために、他の治療成分を、塩（例えば、アルカリ金属塩もしくはアミン塩または酸付加塩）、またはプロドラッグ、またはエステル（例えば、低級アルキルエステル）、または溶媒和物（例えば、水和物）の形態で使用することができることが明らかである。また、適当であれば、治療成分を光学的に純粋な形態で使用することができることも明らかである。
【００５７】
一実施形態において、本発明は、本化合物をβ２−アドレナリン受容体アゴニストとともに含む組合せを包含する。β２−アドレナリン受容体アゴニストの例としては、サルメテロール(salmeterol)（ラセミ体またはＲ−鏡像異性体などの単一の鏡像異性体であり得る）、サルブタモール(salbutamol)（ラセミ体またはＲ−鏡像異性体などの単一の鏡像異性体であり得る）、フォルモテロール(formoterol)（ラセミ体またはＲ，Ｒ−ジアステレオマーなどの単一のジアステレオマーであり得る）、サルメファモール(salmefamol)、フェノテロール(fenoterol)、カルモテロール(carmoterol)、エタンテロール(etanterol)、ナミンテロール(naminterol)、クレンブテロール(clenbuterol)、ピルブテロール(pirbuterol)、フレルブテロール(flerbuterol)、レプロテロール(reproterol)、バムブテロール(bambuterol)、インダカテロール(indacaterol)、テルブタリン(terbutaline)およびその塩、例えば、サルメテロールのキシナホ酸（１−ヒドロキシ−２−ナフタレンカルボン酸）塩、サルブタモールの硫酸塩もしくは遊離塩基、またはフォルモテロールのギ酸塩が含まれる。一実施形態において、β２−アドレナリン受容体アゴニストは長時間作用性のβ２−アドレナリン受容体アゴニスト、例えば、約１２時間以上有効な気管支拡張をもたらす化合物である。他のβ２−アドレナリン受容体アゴニストとしては、ＷＯ２００２／０６６４２２、ＷＯ２００２／０７０４９０、ＷＯ２００２／０７６９３３、ＷＯ２００３／０２４４３９、ＷＯ２００３／０７２５３９、ＷＯ２００３／０９１２０４、ＷＯ２００４／０１６５７８、ＷＯ２００４／０２２５４７、ＷＯ２００４／０３７８０７、ＷＯ２００４／０３７７７３、ＷＯ２００４／０３７７６８、ＷＯ２００４／０３９７６２、ＷＯ２００４／０３９７６６、ＷＯ２００１／４２１９３およびＷＯ２００３／０４２１６０に記載されているものが含まれる。
【００５８】
β２−アドレナリン受容体アゴニストのさらなる例としては、
３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）ベンゼンスルホンアミド；
３−（３−｛［７−（｛（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチル）フェニル］エチル｝−アミノ）ヘプチル］オキシ｝プロピル）ベンゼンスルホンアミド；
４−｛（１Ｒ）−２−［（６−｛２−［（２，６−ジクロロベンジル）オキシ］エトキシ｝ヘキシル）アミノ］−１−ヒドロキシエチル｝−２−（ヒドロキシメチル）フェノール；
４−｛（１Ｒ）−２−［（６−｛４−［３−（シクロペンチルスルホニル）フェニル］ブトキシ｝ヘキシル）アミノ］−１−ヒドロキシエチル｝−２−（ヒドロキシメチル）フェノール；
Ｎ−［２−ヒドロキシル−５−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシ−２−［［２−４−［［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル］アミノ］フェニル］エチル］アミノ］エチル］フェニル］ホルムアミド；
Ｎ−２｛２−［４−（３−フェニル−４−メトキシフェニル）アミノフェニル］エチル｝−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−キノリノン−５−イル）エチルアミン；および  ５−［（Ｒ）−２−（２−｛４−［４−（２−アミノ−２−メチル−プロポキシ）−フェニルアミノ］−フェニル｝−エチルアミノ）−１−ヒドロキシ−エチル］−８−ヒドロキシ−１Ｈ−キノリン−２−オン
が挙げられる。
【００５９】
β２−アドレナリン受容体アゴニストは、硫酸、塩酸、フマル酸、ヒドロキシナフトン酸（例えば、１−または３−ヒドロキシ−２−ナフトン酸）、桂皮酸、置換桂皮酸、トリフェニル酢酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ナフタレンアクリル酸、安息香酸、４−メトキシ安息香酸、２−または４−ヒドロキシ安息香酸、４−クロロ安息香酸および４−フェニル安息香酸から選択される医薬上許容される酸とともに形成される塩の形態であり得る。
【００６０】
好適な抗炎症薬としては、コルチコステロイドが含まれる。本発明の化合物との組合せ使用が可能なコルチコステロイドの例としては、経口および吸入コルチコステロイド、ならびに抗炎症活性を有するそれらのプロドラッグが含まれる。
【００６１】
例としては、メチルプレドニゾロン(methyl prednisolone)、プレドニゾロン、デキサメタゾン(dexamethasone)、プロピオン酸フルチカゾン(fluticasone propionate)、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル（フロ酸フルチカゾン）、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−（２−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３Ｓ−イル）エステル、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−（２，２，３，３−テトラメチシクロプロピルカルボニル）オキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−シアノメチルエステルおよび６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−（１−メチシクロプロピルカルボニル）オキシ−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、ベクロメタゾン(beclomethasone)エステル（例えば、１７−プロピオン酸エステルまたは１７，２１−二プロピオン酸エステル）、ブデソニド(budesonide)、フルニソリド(flunisolide)、モメタゾン(mometasone)エステル（例えば、フロ酸モメタゾン）、トリアムシノロンアセトニド(triamcinolone acetonide)、ロフレポニド(rofleponide)、シクレソニド(ciclesonide)（１６α，１７−［［（Ｒ）−シクロヘキシルメチレン］ビス（オキシ）］−１１β，２１−ジヒドロキシ−プレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン）、プロピオン酸ブチキソコルト(butixocort propionate)、ＲＰＲ-−１０６５４１およびＳＴ−１２６が挙げられる。一実施形態において、コルチコステロイドとしては、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−（２，２，３，３−テトラメチシクロプロピルカルボニル）オキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−シアノメチルエステルおよび６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−（１−メチシクロプロピルカルボニル）オキシ−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルが挙げられる。一実施形態において、コルチコステロイドは６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルである。
【００６２】
コルチコステロイドの例としてはまた、ＷＯ２００２／０８８１６７、ＷＯ２００２／１００８７９、ＷＯ２００２／１２２６５、ＷＯ２００２／１２２６６、ＷＯ２００５／００５４５１、ＷＯ２００５／００５４５２、ＷＯ２００６／０７２５９９およびＷＯ２００６／０７２６００に記載されているものが含まれる。
【００６３】
トランス抑制に対してトランス活性化を超える選択性を持ち得、併用療法に有用であり得るグルココルチコイド増強作用を有する非ステロイド系化合物としては、次の公開特許出願および特許にわたるものが含まれる：ＷＯ２００３／０８２８２７、ＷＯ１９９８／５４１５９、ＷＯ２００４／００５２２９、ＷＯ２００４／００９０１７、ＷＯ２００４／０１８４２９、ＷＯ２００３／１０４１９５、ＷＯ２００３／０８２７８７、ＷＯ２００３／０８２２８０、ＷＯ２００３／０５９８９９、ＷＯ２００３／１０１９３２、ＷＯ２００２／０２５６５、ＷＯ２００１／１６１２８、ＷＯ２０００／６６５９０、ＷＯ２００３／０８６２９４、ＷＯ２００４／０２６２４８、ＷＯ２００３／０６１６５１、ＷＯ２００３／０８２７７、ＷＯ２００６／０００４０１、ＷＯ２００６／０００３９８およびＷＯ２００６／０１５８７０。
【００６４】
トランス抑制に対してトランス活性化を超える選択性を持ち得、併用療法に有用であり得るグルココルチコイド増強作用を有する非ステロイド系化合物としては、次の特許にわたるものが含まれる：ＷＯ２００３／０８２８２７、ＷＯ１９９８／５４１５９、ＷＯ２００４／００５２２９、ＷＯ２００４／００９０１７、ＷＯ２００４／０１８４２９、ＷＯ２００３／１０４１９５、ＷＯ２００３／０８２７８７、ＷＯ２００３／０８２２８０、ＷＯ２００３／０５９８９９、ＷＯ２００３／１０１９３２、ＷＯ２００２／０２５６５、ＷＯ２００１／１６１２８、ＷＯ２０００／６６５９０、ＷＯ２００３／０８６２９４、ＷＯ２００４／０２６２４８、ＷＯ２００３／０６１６５１およびＷＯ２００３／０８２７７。
【００６５】
抗炎症薬の例としては、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれる。
【００６６】
ＮＳＡＩＤの例としては、クロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤（例えば、テオフィリン、ＰＤＥ４阻害剤またはＰＤＥ３／ＰＤＥ４混合阻害剤）、ロイコトリエンアンタゴニスト、ロイコトリエン合成阻害剤（例えば、モンテルカスト）、ｉＮＯＳ阻害剤、トリプターゼおよびエラスターゼ阻害剤、β−２インテグリンアンタゴニストおよびアデノシン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、アデノシン２ａアゴニスト）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ＣＣＲ３アンタゴニストなどのケモカインアンタゴニスト）またはサイトカイン合成阻害剤、または５−リポキシゲナーゼ阻害剤が含まれる。一実施形態において、本発明は、経口投与用のｉＮＯＳ（一酸化硝酸シンターゼを含む）阻害剤を包含する。ｉＮＯＳ阻害剤の例としては、ＷＯ１９９３／１３０５５、ＷＯ１９９８／３０５３７、ＷＯ２００２／５００２１、ＷＯ１９９５／３４５３４およびＷＯ１９９９／６２８７５に開示されているものが含まれる。ＣＣＲ３阻害剤の例としては、ＷＯ２００２／２６７２２に開示されているものが含まれる。
【００６７】
一実施形態において、本発明は、例えば吸入に適した処方物の場合、本化合物とホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤との併用を提供する。本発明のこの態様に有用なＰＤＥ４阻害剤は、例えば、ＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄの阻害剤など、ＰＤＥ４阻害剤として知られている、またはＰＤＥ４阻害剤として働くことが発見されている化合物であり得る。
【００６８】
ＰＤＥ４阻害化合物としては、
シス−４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、
２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オンおよび
シス−［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オール］
が含まれる。また、シス−４−シアノ−４−［３−（シクロペンチルオキシ）−４−メトキシフェニル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（シロミラスト(cilomilast)としても知られる）およびその塩、エステル、プロドラッグまたは米国特許第５，５５２，４３８号に記載されている物理形態が含まれる。
【００６９】
他のＰＤＥ４阻害化合物としては、Elbion (Hofgen, N. et al. 15th EFMC Int Symp Med Chem (Sept 6-10, Edinburgh) 1998, Abst P.98; CAS reference No. 247584020-9)からのＡＷＤ−１２−２８１（Ｎ−（３，５−ジクロロ−４−ピリジニル）−１−［４−フルオロフェニル）メチル］−５−ヒドロキシ−α−オキソ−１Ｈ−インドール−３−アセトアミド）；ＮＣＳ−６１３と命名された９−ベンジルアデニン誘導体（ＩＮＳＥＲＭ）；Chiroscience and Schering-PloughからのＤ−４４１８；ＣＩ−１０１８（ＰＤ−１６８７８７）として識別され、Ｐｆｉｚｅｒに属すベンゾジアゼピンＰＤＥ４阻害剤；Kyowa HakkoがＷＯ９９／１６７６６で開示しているベンゾジオキソール誘導体；Kyowa HakkoからのＫ−３４；Napp (Landells, L.J. et al. Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (Sept 19-23, Geneva) 1998] 1998, 12 (Suppl. 28): Abst P2393)からのＶ−１１２９４Ａ；ロフルミラスト(roflumilast)（３−（シクロプロピルメトキシ）−Ｎ−（３，５−ジクロロ−４−ピリジニル）−４−（ジフルオロメトキシ）ベンズアミド）（Byk Gulden LombergのＥＰ０７０６５１３Ｂ１、例えば、その実施例５参照）；Byk-Guldenからのフタラジノン(phthalazinone)（ＷＯ１９９９／４７５０５）；Byk-Gulden、現在のAltanaにより製造され、公開されているＰＤＥ３／ＰＤＥ４混合阻害剤である、プマフェントリン(Pumafentrine)、（−）−ｐ−［（４ａＲ＊，１０ｂＳ＊）−９−エトキシ−１，２，３，４，４ａ，１０ｂ−ヘキサヒドロ−８−メトキシ−２−メチルベンゾ［ｃ］［１，６］ナフチリジン−６−イル］−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルベンズアミド；Almirall-Prodesfarmaが開発中のアロフィリン(arofylline)；VernalisからのＶＭ５５４／ＵＭ５６５；またはＴ−４４０(Tanabe Seiyaku; Fuji, K. et al. J Pharmacol Exp Ther,1998, 284(1): 162)およびＴ２５８５が含まれる。
【００７０】
さらなるＰＤＥ４阻害化合物は、公開国際特許出願ＷＯ２００４／０２４７２８、ＷＯ２００４／０５６８２３、ＷＯ２００４／１０３９９８（例えば、そこに開示されている実施例３９９または５４４）、ＷＯ２００５／０５８８９２、ＷＯ２００５／０９０３４８、ＷＯ２００５／０９０３５３およびＷＯ２００５／０９０３５４（全て、Glaxo Group Limitedの名称）に開示されている。
【００７１】
抗コリン作用薬の例としては、ムスカリン性受容体においてアンタゴニストとして作用する化合物、特に、Ｍ１またはＭ３受容体のアンタゴニスト、Ｍ１／Ｍ３またはＭ２／Ｍ３受容体の二重アンタゴニスト、あるいはＭ１／Ｍ２／Ｍ３受容体の汎アンタゴニストである化合物がある。吸入を介する投与のための化合物例としては、イプラトロピウム(ipratropium)（例えば、Ａｔｒｏｖｅｎｔの名称で販売されている臭化物ＣＡＳ  ２２２５４−２４−６として）、オキシトロピウム(oxitropium)（例えば、臭化物ＣＡＳ  ３０２８６−７５−０として）およびチオトロピウム(tiotropium)（例えば、Ｓｐｉｒｉｖａの名称で販売されている臭化物ＣＡＳ  １３６３１０−９３−５として）が挙げられる。また、レバトロパン酸（例えば、ＣＡＳ  ２６２５８６−７９−８臭化水素酸塩として）およびＷＯ２００１／０４１１８に開示されているＬＡＳ−３４２７３が注目される。経口投与用の化合物例としては、ピレンゼピン(pirenzepine)（ＣＡＳ  ２８７９７−６１−７）、ダリフェナシン(darifenacin)（Ｅｎａｂｌｅｘの名称で販売されている臭化水素酸としてのＣＡＳ  １３３０９９−０４−４またはＣＡＳ  １３３０９９−０７−７）、オキシブチニン(oxybutynin)（Ｄｉｔｒｏｐａｎの名称で販売されているＣＡＳ  ５６３３−２０−５）、テロジリン(terodiline)（ＣＡＳ  １５７９３−４０−５）、トルテロジン(tolterodine)（Ｄｅｔｒｏｌの名称で販売されている酒石酸塩としてのＣＡＳ  １２４９３７−５１−５またはＣＡＳ  １２４９３７−５２−６）、オチロニウム(otilonium)（例えば、Ｓｐａｎｓｍｏｍｅｎの名称で販売されている臭化物としてのＣＡＳ  ２６０９５−５９−０）、塩酸トロスピウム(trospium chloride)（ＣＡＳ  １０４０５−０２−４）およびソリフェナシン(solifenacin)（ＹＭ−９０５としても知られ、Ｖｅｓｉｃａｒｅの名称で販売されているコハク酸塩としてのＣＡＳ  ２４２４７８−３７−１またはＣＡＳ  ２４２４７８−３８−２）が含まれる。
【００７２】
さらなる化合物はＷＯ２００５／０３７２８０、ＷＯ２００５／０４６５８６およびＷＯ２００５／１０４７４５に開示されている。本組合せとしては、限定されるものではないが、
（３−エンド）−３−（２，２−ジ−２−チエニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（３−エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニルエチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；
４−［ヒドロキシ（ジフェニル）メチル］−１−｛２−［（フェニルメチル）オキシ］エチル｝−１−アゾニアビシクロ［２．２．２］オクタンブロミド；および
（１Ｒ，５Ｓ）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニルエチル）−８−メチル−８−｛２−［（フェニルメチル）オキシ］エチル｝−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド
が含まれる。
【００７３】
他の抗コリン作用薬としては、米国特許出願６０／４８７９８１（出典明示により本発明を実施するのに必要な程度まで本明細書の一部とされる）に開示されている化合物が含まれる。これらには例えば、
（エンド）−３−（２−メトキシ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオニトリル；
（エンド）−８−メチル−３−（２，２，２−トリフェニル−エチル）−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクタン；
３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオンアミド；
３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオン酸；
（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；
３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロパン−１−オール；
Ｎ−ベンジル−３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオンアミド；
（エンド）−３−（２−カルバモイル−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
１−ベンジル−３−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；
１−エチル−３−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；
Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−アセトアミド；
Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−ベンズアミド；
３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−プロピオニトリル；
（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−ベンゼンスルホンアミド；
［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；
Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−メタンスルホンアミド；および／または
（エンド）−３−｛２，２−ジフェニル−３−［（１−フェニル−メタノイル）−アミノ］−プロピル｝−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド
が含まれる。
【００７４】
さらなる化合物としては、
（エンド）−３−（２−メトキシ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；
（エンド）−３−（２−カルバモイル−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；および／または
（エンド）−３−｛２，２−ジフェニル−３−［（１−フェニル−メタノイル）−アミノ］−プロピル｝−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド
が含まれる。
【００７５】
一実施形態において、本発明は、本化合物をＨ１アンタゴニストとともに含む組合せを提供する。Ｈ１アンタゴニストの例としては、限定されるものではないが、アメレキサノックス(amelexanox)、アステミゾール(astemizole)、アザタジン(azatadine)、アゼラスチン(azelastine)、アクリバスチン(acrivastine)、ブロムフェニラミン(brompheniramine)、セチリジン(cetirizine)、レボセチリジン(levocetirizine)、エフレチリジン(efletirizine)、クロルフェニラミン(chlorpheniramine)、クレマスチン(clemastine)、サイクリジン(cyclizine)、カレバスチン(carebastine)、シプロヘプタジン(cyproheptadine)、カルビノキサミン(carbinoxamine)、デスカルボエトキシロラタジン(descarboethoxyloratadine)、ドキシラミン(doxylamine)、ジメチンデン(dimethindene)、エバスチン(ebastine)、エピナスチン(epinastine)、エフレチリジン(efletirizine)、フェキソフェナジン(fexofenadine)、ヒドロキシジン(hydroxyzine)、ケトチフェン(ketotifen)、ロラタジン(loratadine)、レボカバスチン(levocabastine)、ミゾラスチン(mizolastine)、メキタジン(mequitazine)、ミアンセリン(mianserin)、ノベラスチン(noberastine)、メクリジン(meclizine)、ノルアステミゾール(norastemizole)、オロパタジン(olopatadine)、ピクマスト(picumast)、ピリラミン(pyrilamine)、プロメタジン(promethazine)、テルフェナジン(terfenadine)、トリペレナミン(tripelennamine)、テメラスチン(temelastine)、トリメプラジン(trimeprazine)およびトリプロリジン(triprolidine)、特に、セチリジン、レボセチリジン、エフレチリジンおよびフェキソフェナジンが含まれる。さらなる実施形態において、本発明は、本化合物をＨ３アンタゴニスト（および／または逆アゴニスト）とともに含む組合せを提供する。Ｈ３アンタゴニストの例としては、例えば、ＷＯ２００４／０３５５５６およびＷＯ２００６／０４５４１６に開示されている化合物が含まれる。本発明の化合物と組み合わせて使用することができる他のヒスタミン受容体アンタゴニストとしては、Ｈ４受容体のアンタゴニスト（および／または逆アゴニスト）、例えば、Jablonowski et al., J. Med. Chem. 46:3957-3960 (2003)に開示されている化合物が含まれる。
【００７６】
一実施形態において、本発明は、本化合物を、４，４−ジフルオロ−Ｎ−（（１Ｓ）−３−｛３−［３−メチル−５−（１−メチルエチル）−４Ｈ−１，２，４−トリアゾｌ−４−イル］−８−アザビシクロ［３．２．１］オクト−８−イル｝−１−フェニルプロピル）シクロヘキサンカルボキサミド：
【化２】
2014055145.tif 000003
などのＣＣＲ５受容体アンタゴニストとともに含む組合せを提供する。
【００７７】
一実施形態において、本発明は、本化合物を、Ｎ−（（１Ｒ）−１−｛３−［４−（エチルオキシ）フェニル］−４−オキソ−３，４−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル｝エチル）−Ｎ−（３−ピリジニルメチル）−２−｛４−［（トリフルオロメチル）オキシ］フェニル｝アセトアミド：
【化３】
2014055145.tif 000004
などのＣＸＣＲ３受容体アンタゴニストとともに含む組合せを提供する。
【００７８】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物をＰＤＥ４阻害剤とともに含む組合せを提供する。
【００７９】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物をβ２−アドレナリン受容体アゴニストとともに含む組合せを提供する。
【００８０】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物をコルチコステロイドとともに含む組合せを提供する。
【００８１】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物を非ステロイド系ＧＲアゴニストとともに含む組合せを提供する。
【００８２】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物を抗コリン作用薬とともに含む組合せを提供する。
【００８３】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物を抗ヒスタミン薬とともに含む組合せを提供する。
【００８４】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物をＰＤＥ４阻害剤およびβ２−アドレナリン受容体アゴニストとともに含む組合せを提供する。
【００８５】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物を抗コリン作動薬およびＰＤＥ−４阻害剤とともに含む組合せを提供する。
【００８６】
上記に述べた組合せは、医薬処方物の形態で使用するために便宜に提供することができ、よって、上記で定義された組合せを医薬上許容される希釈剤または担体とともに含む医薬処方物は本発明のさらなる態様を表す。
【００８７】
このような組合せの個々の化合物は順次、または別個の、または組み合わせられた医薬処方物として同時に投与することができる。一実施形態において、個々の化合物は組み合わせられた医薬処方物として同時に投与される。当業者であれば、既知の治療薬の適当な用量が容易に分かるであろう。
【００８８】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物と別の治療上有効な薬剤との組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００８９】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物とＰＤＥ４阻害剤との組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００９０】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物とβ２−アドレナリン受容体アゴニストとの組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００９１】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物とコルチコステロイドとの組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００９２】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物と非ステロイド系ＧＲアゴニストとの組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００９３】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物と抗コリン作動薬との組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００９４】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物と抗ヒスタミン薬との組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００９５】
よって本発明は、さらなる態様において、本化合物とＣＸＣＲ３受容体アンタゴニストとの組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００９６】
よって本発明は、さらなる態様において、本発明とＣＣＲ５受容体アンタゴニストとの医薬組合せを提供する。
【００９７】
以下、本発明を書きの生物学的実施例により説明するが、これらは単に例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００９８】
生物学的実施例
本発明の化合物のＩＬ−８およびＧＲＯ−αケモカイン阻害作用は、以下のin vitroアッセイによって測定される。
【００９９】
受容体結合アッセイ：
比活性が２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの［１２５Ｉ］ＩＬ−８（ヒト組換え体）は、GE Healthcareから入手する。他の化学物質は全て分析級のものである。高レベルの組換えヒトＣＸＣＲ１（ＩＬ−８α型）およびＣＸＣＲ２（ＩＬ−８β型）受容体を、これまでに記載されているように(Holmes, et al., Science, 1991, 253, 1278)、非接着チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で個々に発現させる。ホモジナイゼーションバッファーを４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレン−グリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フッ化α−トルエンスルホニル）、２．５ｍｇ／Ｌロイペプチンおよび０．１ｍｇ／ｍｌアプロチニンに変更すること以外は、これまでに記載されているプロトコール(Haour, et al., J. Biol. Chem., 249 pp 2195-2205 (1974)（出典明示により本膜の調製に必要な程度まで本明細書の一部とされる）)に従って膜を調製する。細胞をホモジナイズし、２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離する。上清を１００，０００ｘｇで１時間遠心分離する。上清を廃棄し、膜を−８０℃で保存する。膜タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標品として用い、製造者のプロトコールに従ってＢｉｏＲａｄ試薬を用いて測定する。
【０１００】
ＩＬ−８の結合は全て、９６ウェルプレート形式で、麦芽凝集素ビーズを用いるシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を用いて行う。膜ＣＨＯ−ＣＸＣＲ１またはＣＨＯ−ＣＸＣＲ２を結合バッファー中、４℃で３０分間、ビーズとともにプレインキュベートする。バッファーは、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２５ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭのビス−トリスプロパンバッファーｐＨ８．０を含む。化合物をＤＭＳＯで最終希釈溶液（最終化合物濃度１ｎＭ〜３０μＭの間、最終ＤＭＳＯ濃度５％）の２０倍に希釈する。アッセイは、９６ウェルプレート（ｏｐｔｉｐｌａｔｅ  ９６、Packard）にて、室温、膜と０．０４％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、０．００２５％ＢＳＡおよび０．２３ｎＭ［１２５Ｉ］ＩＬ−８を含む０．１ｍｌ結合バッファー中で行う。プレートをプラットフォーム上で１時間振盪させ、インキュベーションが終了したところで、これらのプレートを２，０００ｒｐｍで５分回転させ、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔカウンターで計数する。組換えＩＬ−８Ｒα、ＣＸＣＲ１またはＩ型受容体は本明細書では非許容型受容体、組換えＩＬ−８Ｒβ、ＣＸＣＲ２またはＩＩ型受容体は許容型受容体とも呼ばれる。
【０１０１】
化合物は、本アッセイにおいて３０μＭ未満のＩＣ５０値を示す場合に活性があるとみなされる。本化合物は本アッセイにおいてＩＣ５０値が約１３ｎＭで有効であると判定されると思われる。
【０１０２】
走化性アッセイ：
好中球走化性アッセイを行う。ヒト一次好中球を、パーコール不連続勾配遠心分離、デキストラン沈降および低張溶解を用い、抹消全血から単離する。走化因子ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）またはＧＲＯ−α（ＣＸＣＬ１）を９６マルチウェルチャンバー(ChemoTx System, Neuro Probe, Gaithersburg, MD)の下方のチャンバーに入れる。用いるアゴニスト濃度はＥＣ８０濃度である。この２つのチャンバーを５μＭポリカーボネート膜で分離する。供試化合物を、フィルターの上部に置く前に細胞とともにプレイキュベートする。走化因子を５％ＣＯ２で加湿したインキュベーター中、３７℃で４５分間進行させる。このインキュベーションの終了時に、膜を取り外し、下方のチャンバーに移動した細胞を９６ウェルプレートに移す。これらの細胞を、発光細胞生存アッセイ(ChemoTx System, Neuro Probe, Gaithersburg, MD)を用いて測定する。各サンプルを２回試験し、各化合物は少なくとも３回繰り返す。陽性対照細胞は化合物を添加しない細胞であり、最大走化性応答に相当する。陰性対照（無刺激）は下方のチャンバーにケモカインを添加しないものである。陽性対照と陰性対照の間の差は、細胞の走化活性を表す。
【０１０３】
化合物は、５μＭ未満のＩＣ５０を示す場合に活性があるとみなされる。
【０１０４】
ＣＤ１１ｂヒト全血アッセイ：
ヒト全血において、化合物の好中球に対する、ＧＲＯαに誘発されるインテグリンＣＤ１１ｂの発現を阻害する能力を試験する。
【０１０５】
バタフライラインと有効ナトリウムヘパリン０．２ｍｌの入った１０ｍｌシリンジを用い、血液を抜き取る（９ｍｌ）。血液を以下の工程５で氷上に置くまで、３７℃で維持する。次に、化合物保存溶液を最大終濃度１２０μＭの１２倍に希釈する。その後、ビヒクルで半対数連続希釈を行う。そして、１０μＬの化合物希釈液またはビヒクルを適当な１２×７５ポリプロピレン試験管に加える。試験管１本当たり１００μＬの全血を加え、３７℃の水浴中でまず振盪させながら（穏やかに）１０分、そして再び５分インキュベートする。ＧＲＯα保存液を１２０ｎＭの「１２倍」濃度まで、０．１％ＢＳＡ−ＤＰＢＳ中で１：１６６．６６希釈し、このＧＲＯα希釈溶液または０．１％ＢＳＡ−ＤＰＢＳ  １０μｌを、最終ＧＲＯα濃度が１０ｎＭとなるように、適当な試験管に加える。これらの試験管を３７℃にて、手で穏やかに振盪させながら１０分、そして再び５分インキュベートする。次に、サンプルを氷上に置き、２５０μｌの氷冷ＣｅｌｌＦｉｘ実施希釈溶液を加えた後、氷上で１分インキュベートする。１．５ｍｌのエッペンドルフ管を、適当な抗体を加えることにより、ＧＲＯαインキュベーション中に準備する。各管には、ＣＤ１１ｂの代わりに１０μｌのＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣを入れたイソ型対照以外は、１０μｌのＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣと５μｌのＣＤ１６−ＰＥを入れる。各管からさらに５０μｌの固定血液を適当なエッペンドルフ管に加える。次に、サンプルを暗所にて４℃で２０分間インキュベートする。この血液／抗体混合物を５００μｌの冷ＤＰＢＳに加えたものを、適宜ラベルを付けた１２×７５ポリスチレン管に加える。得られた混合物を氷上で維持する。ＬＤＳ保存液（１０μｌ）を加え、この混合物を４℃で１０分インキュベートした後、フロー分析を行う。サンプルを遮光環境で維持する。全てのサンプルがＬＤＳ添加後１０〜２０分に流れるように、ＬＤＳの添加とフローサイトメーターでのサンプルの回収とを交互に行う。
【０１０６】
フロー回収には中程度の流速を用い、ＬＤＳシグナルを用いた分析から赤血球を排除するためにＦＬ３閾値を高める。色調補正は、ＰＥへ流出したＬＤＳ、およびＦＩＴＣへ流出したＰＥ、およびＰＥへ流出したＦＩＴＣを差し引くために非標識サンプルと１色サンプルを用いて適宜設定する。ＢＤ  ＬＳＲサイトメーターでは、ＬＤＳ＝ＦＬ３、ＰＥ＝ＦＬ２、ＦＩＴＣ＝ＦＬ１。ＳＳＣ対ＦＳＣによる顆粒球ゲートを満たし、かつ、ＦＬ２シグナルによりＣＤ１６陽性である最低２０００〜３０００事象を採集する。
【０１０７】
化合物は、本明細書において５μＭ未満のＩＣ５０値を示す場合に活性があるとみなされる。
【０１０８】
ＣＸＣＲ２およびＧα１６を安定発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるカルシウムの可動化合物：
ＣＸＣＲ２およびＧα１６を安定発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃に維持しつつ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＨＡＭの）１：１、ｗ／１０％ＦＣＳ（熱不活化）、ｗ／２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ｗ／０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中で集密度８０％まで増殖させる。アッセイ２４時間前に、細胞を採取し、９６ウェル黒壁、透明底プレート(Packard View)内に４０，０００細胞／ウェルで平板培養し、ＣＯ２インキュベーターに戻す。アッセイ当日、化合物を所望のアッセイ濃度の３００倍まで、１００％ＤＭＳＯで連続希釈する。培地を細胞から吸引し、１００μｌのロード培地（Ｅａｒｌの塩とともにｗ／Ｌ−グルタミン、０．１％ＢＳＡ(Bovuminar Cohen Fraction V from Seriologicals Corp.)、４μＭフロ−４−アセトキシメチルエステル蛍光指示色素（Ｆｌｕｏ−４  ＡＭ、Molecular Probes製）および２．５ｍＭプロベネシドを含むＥＭＥＭ）に置き換え、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で１時間インキュベートする。ロード培地を吸引し、Ｅａｒｌの塩とともにｗ／Ｌ−グルタミン、０．１％ゼラチンおよび２．５ｍＭプロベネシドを含む１００μＬのＥＭＥＭに置き換え、さらに１０分インキュベートする。ＤＭＳＯで３００倍に連続希釈した化合物（３μｌ）を、２９７μｌのＫＲＨ（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、１．０３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１ｍＭグルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））、ｗ／２．５ｍＭプロベネシドおよび０．１％ゼラチン（化合物はこの時点で３倍）の入った９６ウェルプレートに移す。細胞から培地を吸引し、細胞をＫＲＨ  ｗ／２．５ｍＭプロベネシド、ｗ／０．１％ゼラチンで３回洗浄する。ＫＲＨ（１００μｌ）  ｗ／２．５ｍＭプロベネシド、０．１％ゼラチンをウェルに加えた後、５０μｌのＫＲＨ  ｗ／２．５ｍＭプロベネシドおよび０．１％ゼラチン中３倍の化合物をウェルに加え（化合物はこの時点で１倍）、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で１０分インキュベートする。これまでに記載されたように分析するため(Sarau et al., 1999)、プレートをＦＬＩＰＲ(Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale CA)上に置く。ＣＸＣＲ２に関しては、１．０ｎＭ  ＩＬ−８によって誘発される最大ヒトＩＬ−８誘発Ｃａ２＋可動化％、すなわちＥＣ８０濃度を各化合物濃度で求め、ＩＣ５０を、１．０ｎＭ  ＩＬ−８によって誘発される最大応答の５０％を阻害する試験化合物の濃度として算出する。化合物は、本アッセイにおいて１０μＭ未満のＩＣ５０値を示す場合に活性があるとみなされる。
【０１０９】
ラットへの経口投与後の好中球ＣＤ１１ｂ刺激
Ｌｅｗｉｓラット（２５０〜３００ｇｍ）に本化合物またはビヒクルを経口投与し、１時間後にそれらをＣＯ２窒息により安楽死させた。ラット全血３ｍｌを心臓穿刺により、１００μｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ(GIBCO, Grand Island, NY)の入ったシリンジに抜き取った。ラットＣＸＣＬ２(PeproTech, Rocky Hill, NJ)保存液を、Ｋｒｅｂ’ｓ／０．１％ＢＳＡ（ＫＢＳＡ）中に１０μＭで再構成することにより作製した。この保存液をＤＰＢＳ(GIBCO)で最大使用濃度の「１１倍」まで希釈し、ＫＢＳＡ／ＤＰＢＳビヒクルで連続希釈した。適当な濃度（１．２〜１００ｎＭ）の本化合物またはビヒクル１０μｌを１２×７５ｍｍのポリプロピレン試験管に加えた後、１００μｌの全血を加えた。これらの試験管を３７℃浴で３０分、１０分ごとに手で穏やかに振盪させつつインキュベートした。次に、これらのサンプルを氷上に１０分置いた後、１０μｌの抗ラットＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣまたはＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ２ａイソ型対照（双方ともAntigenix America, Huntington Station, NY）を加え、氷上で３０分インキュベートした。ＦＡＣＳ溶解溶液(Becton Dickinson, San Jose, CA)（１ｍｌ、１倍）を加え、すぐに激しくボルテックスにかけ、その後、最後のサンプルに溶液を加えた後にさらにボルテックスにかけた。サンプルを室温で１０分インキュベートし、白血球を〜３００ｘｇでペレット化し、ＤＰＢＳで洗浄した。細胞を６５０μｌの１％パラホルムアルデヒドに再懸濁させた。このＦＡＣＳ溶解溶液はラット赤血球を完全には溶解させない。従って、フローサイトメトリー分析に関しては、残っている赤血球をゲートアウトするために、フロー分析の１〜２分以内に各サンプルにＬＤＳ−７５１(Exciton, Dayton, OH)の１．６７ｍｇ／ｍｌエタノール溶液（過飽和；遠心分離により明澄化）３．５μｌを加えた。サンプルデータは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアおよびＬＳＲフローサイトメーター(Becton-Dickinson)を低流速設定で用い、ＬＤＳ−７５１陰性赤血球を排除した後、前方散乱に対する側方散乱のプロットで好中球集団に対してゲーティングを行う。次に、この集団のＦＬ１（緑色ＦＩＴＣ蛍光、ＣＤ１１ｂ含量に直接関連）を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いた分析により、平均チャネル蛍光として測定した。
【０１１０】
本アッセイでは、本化合物は、Ｌｅｗｉｓラットに１０ｍｇ／ｋｇを経口投与した後、全血好中球ＣＤ１１ｂ発現の阻害に有効であると判定された。本化合物は、ＣＸＣＬ２濃度応答曲線のＥＣ５０を、ビヒクル治療ラットにおける４．７ｎＭ（１．９〜７．４；９５％Ｃ．Ｉ．）から１２．３ｎＭ（１０．０〜１４．７）へと有意にシフトさせた（ｐ＜０．００１、各群ｎ＝６）。
【０１１１】
上記で本発明をその好ましい実施形態を含めて十分開示した。本明細書に具体的に開示される実施形態の変更および改変は特許請求の範囲の範囲内にある。当業者であれば、さらに詳述しなくとも、前記の記載を用いて、本発明を完全に利用することができると考えられる。従って、本明細書の実施例は、単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。独占的権利または特権が特許請求される本発明の実施形態は、特許請求の範囲に定義されている。
【外国語明細書】
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