(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸増幅阻外剤の存在下での核酸増幅の効率及び感度を高める方法を提供する。【解決手段】体液及び／または組織であり、希釈、洗浄、溶解、保存及び／または凍結乾燥されたものである、生物学的試料に含まれる、または、胆汁酸、胆汁酸塩、多糖類、ビリルビン、ヘパリン、タンパク質加水分解酵素、フェノール化合物、ヌクレアーゼ、ポリアミン、ヘム、ヘミン、コラーゲン、メラニン、ユーメラニン、ミオグロビン、プロテイナーゼ、カルシウムイオン、尿素、ヘモグロビン、ラクトフェリン、兔疫グロブリンＧ、フミン酸、グローブパウダー、塩化カルシウム、ＥＤＴＡ及びＦｅＣｌ3からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上である核酸増幅の阻害剤を抑制する１−ブチル−３−メチルイミダゾリニウムテトラフルオロボライオン性液体の存在下で、特に、生物学的試料に含まれる核酸を増幅させるための方法、及び該方法を行うのに有用な組成物。【選択図】図２Ａ
2014027934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン性液体の存在下で核酸を増幅させる段階を含む核酸増幅方法。
【請求項２】
前記イオン性液体の陽イオンは、下記の化学式１ａ〜１ｄで表わされる陽イオンからなる群から選択される一つ以上であり
【化１】
2014027934.tif 000011
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基、またはＣ6〜Ｃ20アリール基である。）、
前記イオン性液体の陰イオンは、ハロゲン化物イオン、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-、ＣＨ3ＯＳＯ3-から選択される一つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオン性液体及び核酸増幅阻害剤の存在下で核酸を増幅させる段階を含み、
前記イオン性液体が、前記核酸増幅阻害剤の核酸増幅阻害作用を抑制する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸増幅阻害剤は、生物学的試料に含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸増幅阻害剤は、胆汁酸、胆汁酸塩、多糖類、ビリルビン、ヘパリン、タンパク質加水分解酵素、フェノール化合物、ヌクレアーゼ、ポリアミン、ヘム、ヘミン、コラーゲン、メラニン、ユーメラニン、ミオグロビン、プロテイナーゼ、カルシウムイオン、尿素、ヘモグロビン、ラクトフェリン、兔疫グロブリンＧ、フミン酸、グローブパウダー、塩化カルシウム、ＥＤＴＡ及びＦｅＣｌ3からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸は、生物学的試料に含まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
生物学的試料及び／または核酸増幅混合物にイオン性液体を添加する段階と、
前記生物学的試料及び前記核酸増幅混合物を混合して核酸増幅反応混合物を調製する段階をさらに含む、請求項４または６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料は、体液及び／または組織であり、希釈、洗浄、溶解、保存及び／または凍結乾燥されたものである、請求項４、６又は７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的試料は、大便、小便、血液、粘液、唾または汗を含む、請求項４または６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記イオン性液体の濃度が、０．００１％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅は、ＢＳＡ、アセトアミド、ベタイン、デキストラン、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＶＰ−１０、トゥイーン−２０、トリトン−Ｘ、ＳＤＳ、ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質及びプロテイナーゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、核酸配列−基礎増幅、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、逆転写または逆転写−ＰＣＲの一つ以上を使って行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸増幅阻害剤の存在下で核酸を増幅させるための核酸増幅組成物であって、イオン性液体及び核酸増幅混合物を含む、核酸増幅組成物。
【請求項１４】
前記イオン性液体の陽イオンは、下記の化学式１ａ〜１ｄで表わされる陽イオンからなる群から選択される一つ以上であり
【化２】
2014027934.tif 000012
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基、またはＣ6〜Ｃ20アリール基である。）、
前記イオン性液体の陰イオンは、ハロゲン化物イオン、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-、ＣＨ3ＯＳＯ3-から選択される一つ以上である、請求項１３に記載の核酸増幅組成物。
【請求項１５】
前記核酸増幅阻害剤は、生物学的試料に含まれる、請求項１３または１４のいずれかに記載の核酸増幅組成物。
【請求項１６】
前記生物学的試料は、大便、小便、血液、粘液、唾または汗を含む、請求項１５に記載の核酸増幅組成物。
【請求項１７】
前記イオン性液体の濃度が、０．００１％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の核酸増幅組成物。
【請求項１８】
前記核酸増幅組成物は、ＢＳＡ、アセトアミド、ベタイン、デキストラン、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＶＰ−１０、トゥイーン−２０、トリトン−Ｘ、ＳＤＳ、ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質及びプロテイナーゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記イオン性液体の陽イオンは、下記一般式（Ｉ）で表わされる陽イオンであり、
【化３】
2014027934.tif 000013
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、またはＣ2〜Ｃ6アルケニル基である。）
前記イオン性液体の陰イオンは、ハロゲン化物イオン、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-、ＣＨ3ＯＳＯ3-から選択される一つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記イオン性液体の陽イオンは、下記一般式（Ｉ）で表わされる陽イオンであり、
【化４】
2014027934.tif 000014
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、またはＣ2〜Ｃ6アルケニル基である。）
前記イオン性液体の陰イオンは、ハロゲン化物イオン、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-、ＣＨ3ＯＳＯ3-から選択される一つ以上である、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
核酸増幅のための方法及び組成物、特に、核酸増幅阻害剤の存在下での方法、及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的試料に含まれる核酸の増幅は、細胞溶解及び多様な核酸増幅阻害物質の存在によって影響される。したがって、生物学的試料から核酸増幅阻害剤を除去することは、より正確かつ精密な診断を支援するための核酸増幅分子診断法に期待されている。
【０００３】
生物学的試料は、例えば、鼻水、血液、大便、及び個体から由来する組織試料を含む。大便試料からの核酸の増幅は、試料の変動が大きく、核酸増幅阻害剤、特にヘム（ｈｅｍｅ）、ビリルビン、胆汁酸塩、及び複雑で多様な多糖も試料に存在するため、特に妨害されている。
【０００４】
核酸増幅阻害剤は、試料の前処理または後処理中に生物学的試料から除去される。試料の前処理（すなわち、核酸増幅のための試料の準備以前に）中の核酸増幅阻害剤の除去は複雑であり、前処理反応に使われる反応、結合及び溶出緩衝液に大きく影響され、そして標的細胞の目減りが起きる。試料の後処理（すなわち、核酸増幅のための試料の準備以後に）中に核酸増幅阻害剤の除去は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）マスターミックスに核酸増幅阻害剤除去物質の添加を含む。後処理には、標的細胞またはＤＮＡに致命的な目減りが発生しない。しかし、後処理段階は、核酸増幅阻害剤の除去にあまり効果がない。多様な化学物質（アセトアミド、ベタイン、デキストラン、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、グリセロール、ＰＧＥ、ＰＶＰ−１０など）、界面活性剤（トゥイーン、ＳＤＳなど）、及び生体分子（ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質、プロテイナーゼ阻害剤など）の使用が研究されたが、その効果は不十分である。ＢＳＡのみが、一部の試料で核酸増幅阻害剤の除去時に若干の効果を持つといえる。
したがって、生物学的試料から核酸を増幅させる向上した方法が要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ２００６／０１２１５１５
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｌａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４  （２００９）  ２１１−２１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
核酸を増幅させる方法として、特に核酸増幅阻害剤の存在下で、イオン性液体の存在下で核酸を増幅させる方法を提供することを課題とする。
【０００８】
また、核酸増幅阻害剤の存在下で、核酸増幅のための組成物としてイオン性液体及び核酸増幅混合物を含む組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、核酸増幅の効率及び感度を高めることができる。本発明は、以下の内容をその骨子とする。
【００１０】
（１）イオン性液体の存在下で核酸を増幅させる段階を含む核酸増幅方法。
【００１１】
（２）前記イオン性液体の陽イオンは、下記の化学式１ａ〜１ｄで表わされる陽イオンからなる群から選択される一つ以上であり
【００１２】
【化１】
2014027934.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基、またはＣ6〜Ｃ20アリール基である。）、
前記イオン性液体の陰イオンは、ハロゲン化物イオン、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-、ＣＨ3ＯＳＯ3-から選択される一つ以上である、（１）に記載の方法。
【００１４】
（３）前記イオン性液体及び核酸増幅阻害剤の存在下で核酸を増幅させる段階を含み、
前記イオン性液体が、前記核酸増幅阻害剤の核酸増幅阻害作用を抑制する、（１）または（２）に記載の方法。
【００１５】
（４）前記核酸増幅阻害剤は、生物学的試料に含まれる、（３）に記載の方法。
【００１６】
（５）前記核酸増幅阻害剤は、胆汁酸、胆汁酸塩、多糖類、ビリルビン、ヘパリン、タンパク質加水分解酵素、フェノール化合物、ヌクレアーゼ、ポリアミン、ヘム、ヘミン、コラーゲン、メラニン、ユーメラニン、ミオグロビン、プロテイナーゼ、カルシウムイオン、尿素、ヘモグロビン、ラクトフェリン、兔疫グロブリンＧ、フミン酸、グローブパウダー、塩化カルシウム、ＥＤＴＡ及びＦｅＣｌ3からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上である、（３）または（４）に記載の方法。
【００１７】
（６）前記核酸は、生物学的試料に含まれる、（１）〜（５）のいずれか一つに記載の方法。
【００１８】
（７）生物学的試料及び／または核酸増幅混合物にイオン性液体を添加する段階と、
前記生物学的試料及び前記核酸増幅混合物を混合して核酸増幅反応混合物を調製する段階をさらに含む、（４）または（６）に記載の方法。
【００１９】
（８）前記生物学的試料は、体液及び／または組織であり、希釈、洗浄、溶解、保存及び／または凍結乾燥されたものである、（４）、（６）又は（７）のいずれか一つに記載の方法。
【００２０】
（９）前記生物学的試料は、大便、小便、血液、粘液、唾または汗を含む、（４）または（６）〜（８）のいずれか一つに記載の方法。
【００２１】
（１０）前記イオン性液体の濃度が、０．００１％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）である、（１）〜（９）のいずれか一つに記載の方法。
【００２２】
（１１）前記増幅は、ＢＳＡ、アセトアミド、ベタイン、デキストラン、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＶＰ−１０、トゥイーン−２０、トリトン−Ｘ、ＳＤＳ、ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質及びプロテイナーゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、（１）〜（１０）のいずれか一つに記載の方法。
【００２３】
（１２）前記増幅は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、核酸配列−基礎増幅、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、逆転写または逆転写−ＰＣＲの一つ以上を使って行われる、（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の方法。
【００２４】
（１３）核酸増幅阻害剤の存在下で核酸を増幅させるための核酸増幅組成物であって、イオン性液体及び核酸増幅混合物を含む、核酸増幅組成物。
【００２５】
（１４）前記イオン性液体の陽イオンは、下記の化学式１ａ〜１ｄで表わされる陽イオンからなる群から選択される一つ以上であり
【００２６】
【化２】
2014027934.tif 000004
【００２７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基、またはＣ6〜Ｃ20アリール基である。）、
前記イオン性液体の陰イオンは、ハロゲン化物イオン、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-、ＣＨ3ＯＳＯ3-から選択される一つ以上である、（１３）に記載の核酸増幅組成物。
【００２８】
（１５）前記核酸増幅阻害剤は、生物学的試料に含まれる、（１３）または（１４）のいずれかに記載の核酸増幅組成物。
【００２９】
（１６）前記生物学的試料は、大便、小便、血液、粘液、唾または汗を含む、（１５）に記載の核酸増幅組成物。
【００３０】
（１７）前記イオン性液体の濃度が、０．００１％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）である、（１３）〜（１６）のいずれか一つに記載の核酸増幅組成物。
【００３１】
（１８）ＢＳＡ、アセトアミド、ベタイン、デキストラン、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、グリセロール、ＰＥＧ、ＰＶＰ−１０、トゥイーン−２０、トリトン−Ｘ、ＳＤＳ、ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質及びプロテイナーゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、（１３）〜（１７）のいずれか一つに記載の組成物。
【００３２】
（１９）前記イオン性液体の陽イオンは、下記一般式（Ｉ）で表わされる陽イオンであり、
【００３３】
【化３】
2014027934.tif 000005
【００３４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、またはＣ2〜Ｃ6アルケニル基である。）
前記イオン性液体の陰イオンは、ハロゲン化物、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-、ＣＨ3ＯＳＯ3-から選択される一つ以上である、（１）に記載の方法。
【００３５】
（２０）前記イオン性液体の陽イオンは、下記一般式（Ｉ）で表わされる陽イオンであり、
【００３６】
【化４】
2014027934.tif 000006
【００３７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、またはＣ2〜Ｃ6アルケニル基である。）
前記イオン性液体の陰イオンは、ハロゲン化物イオン、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-、ＣＨ3ＯＳＯ3-から選択される一つ以上である、（１３）に記載の組成物。
【発明の効果】
【００３８】
核酸を増幅させる方法として、特に核酸増幅阻害剤の存在下で、イオン性液体の存在下で核酸を増幅させる方法が提供される。
【００３９】
また、核酸増幅阻害剤の存在下で、核酸増幅のための組成物としてイオン性液体及び核酸増幅混合物を含む組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】反応単位（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ；Ｒｎ）対サイクル数のグラフであり、イオン性液体自体がＰＣＲを阻害しないことを示す。
【図２Ａ】反応単位（Ｒｎ）対サイクル数のグラフであり、大便試料でＰＣＲに対するイオン性液体の効果に関する増幅プロファイル曲線を示す。
【図２Ｂ】多様な反応条件での反応単位（Ｒｎ）のグラフであり、大便試料でＰＣＲに対するイオン性液体の効果に関する増幅プロファイル曲線から計算された最大Ｒｎ値を示す。
【図２Ｃ】大便試料でＰＣＲに対するイオン性液体に関する、増幅されたＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す電気泳動写真である（Ａ：イオン性液体＋大便試料、Ｂ：イオン性液体の不存在＋大便試料、Ｃ：イオン性液体＋緩衝液中のゲノムＤＮＡ、Ｄ：イオン性液体の不存在＋緩衝液中のゲノムＤＮＡ）。
【図２Ｄ】電気泳動結果から増幅した産物の計算された濃度を示すグラフである（Ａ：イオン性液体＋大便試料、Ｂ：イオン性液体の不存在＋大便試料、Ｃ：イオン性液体＋緩衝液中のゲノムＤＮＡ、Ｄ：イオン性液体の不存在＋緩衝液中のゲノムＤＮＡ）。
【図３Ａ】大便試料でＰＣＲに対するイオン性液体の効果を示す、反応単位（Ｒｎ）対サイクル数のグラフであり、１０2コピーのゲノムＤＮＡに対する増幅プロファイル曲線を示す。
【図３Ｂ】大便試料でＰＣＲに対するイオン性液体の効果を示す、反応単位（Ｒｎ）対サイクル数のグラフであり、１０1コピーのゲノムＤＮＡに対する増幅プロファイル曲線を示す。
【図３Ｃ】大便試料でＰＣＲに対するイオン性液体の効果を示す、多様な反応条件で反応単位（Ｒｎ）のグラフであり、図３Ａ及び図３Ｂで計算された最大Ｒｎ値を示す。
【図４Ａ】大便試料でＰＣＲに対するイオン性液体またはＢＳＡの効果を示す、反応単位（Ｒｎ）対サイクル数のグラフであり、１０3コピーのゲノムＤＮＡに対する増幅プロファイル曲線を示す。
【図４Ｂ】大便試料でＰＣＲに対するイオン性液体またはＢＳＡの効果を示す、反応条件で反応単位（Ｒｎ）のグラフであり、図４Ａで計算された最大Ｒｎ値を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、実施例を通じて見て詳細に説明する。しかし、これら実施例は例示的に説明するためのことで本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
イオン性液体の存在下で核酸を増幅させる段階を含む、特に、核酸増幅阻害剤の存在下で核酸を増幅させる方法が提供される。核酸増幅阻害剤は生物学的試料に存在し、増幅標的である核酸を含む試料を汚染させる。イオン性液体は、核酸増幅阻害剤の活性を直接または間接的に抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）し、イオン性液体のない場合に比べれば核酸増幅の反応効率が向上する。
【００４３】
用語'’増幅効率（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）'’は、与えられた条件下でのＰＣＲ等の各サイクル当り標的核酸の平均増幅回数（ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ／ｃｙｃｌｅ）を意味する。核酸増幅反応の効率は、試料の純度、標的物質の量、反応条件、反応阻害剤の存否などによって影響される。核酸増幅反応は、一般的に鋳型を一本鎖に分離させる変性、プライマーと鋳型とを結合させるアーニリング、及びポリメラーゼ酵素による伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の段階で構成されるサイクルを、産物の検出に好適な回数ほど繰り返すことで行われる。増幅効率が高いほど、検出可能なレベルまでの増幅が短時間内に行われる。例えば、核酸増幅の効率は、全体サイクル、すなわち、標的核酸を検出できるレベルまで増幅させるために必要なサイクルを繰り返して行って反応を完了するのにかかる時間であると解釈される。
【００４４】
用語'’反応感度（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）'’または'’検出限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＬＯＤ）は、与えられた核酸増幅条件下でＰＣＲ等によって信頼性のあるように検出かつ定量される最小標的核酸の量またはコピー数を意味する。リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ−ＰＣＲ）では、最大Ｒｎ（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ：ＭａｘＲｎ）またはしきいサイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ：Ｃｔ）値によって検出限界を表現する。また、Ｃｔ値は、ＰＣＲの各サイクルから出る蛍光シグナルを分析し、各試料に対して試料中の標的核酸のコピー数とＣｔ値とのグラフを作成してベースライン（背景信号）を測定し、これより明らかに蛍光シグナルが増加し始める地点のサイクル数を意味する。
【００４５】
増幅される核酸は、生物学的試料に含まれる。用語'’生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）'’は、生物から得られるあらゆる試料を意味する。よって、生物学的試料は、特に人間を始めとする哺乳動物、または微生物から来由する組織、体液及びその成分である。例えば、生物学的試料は、大便、小便、血液、粘液、鼻水、唾、汗、またはその成分（例えば、一つ以上の部分的にまたは完全に分離された細胞または核酸抽出物）である。試料は、希釈、洗浄、溶解、保存または凍結乾燥を含む部分的にまたは完全に脱水されたものでありうる。生物学的試料は、追加的な核酸の分離工程を伴わずに、水圏や人体から得られた試料として使われることもできる。一部の例で、特に試料の量が少ない場合、核酸の分離工程の間に試料の量が目減りすることを回避し、かつ手間を低減させるために無傷な試料（ｉｎｔａｃｔ  ｓａｍｐｌｅ）を使うことが望ましい。
【００４６】
イオン性液体は、核酸との増幅を行うための核酸増幅混合物を混合する前に核酸若しくは生物学的試料、若しくは核酸増幅混合物に添加されるか、または組み合わせられた反応混合物に（すなわち、核酸または生物学的試料が核酸増幅混合物と混合された後で）添加される。用語'’核酸増幅混合物'’は、核酸増幅を行うために必要な鋳型以外の成分をいずれも含む混合物を意味し、'’マスターミックス（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）'’または'’プリミックス（ｐｒｅ ｍｉｘ）'’と指称されることもある。核酸増幅混合物は、標的核酸の増幅に要求される周知の物質をさらに含む。例えば、核酸増幅混合物は、核酸ポリメラーゼ、その活性に必要な緩衝液、補助因子、及び／または基質をさらに含む。前記核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）及びこれらの組み合わせである。逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＲＴ）とは、ＲＮＡを鋳型としてＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成することである。前記核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を持つものである。例えば、レトロウイルスから由来する一つ以上の逆転写酵素、例えば、ＨＩＶ、ＭＭＬＶ、ＡＭＶである。前記核酸ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持っていない。核酸増幅混合物は、逆転写またはＰＣＲ増幅に必要な物質を含むものである。例えば、核酸増幅混合物は、それぞれ１μＭ〜５０ｍＭの順方向及び逆方向プライマー、ｐＨ８．０〜９．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌのようなポリメラーゼ酵素反応用緩衝溶液、約４０ｍＭ ＫＣｌ、約１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、それぞれ約２５０μＭである４種類のｄＮＴＰ、及び約０．５〜１ＵのＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む。核酸増幅混合物は、所望の反応総量と速度次第で、×２〜×１０のような高倍数の濃度で用いられる。
【００４７】
用語''イオン性液体（ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ）''は、常温（例えば、２５℃）でイ
オンの結合で構成されたにもかかわらず液状に存在する物性を持つ物質を意味する。化学的には塩と類似しているが、塩とは異なって常温で液状であり、物質をよく溶解させる性質を持つ。また、常温で容易に蒸発されなくて揮発性有害物質が排出されないだけではなく、有機溶媒に比べて回収が容易であるため再使用でき、環境にやさしい溶媒として評価されている。特に、触媒や電池産業で電解質として応用されている。いかなるイオン性液体でも使用できる。例えば、イオン性液体は下記の陽イオンを含む。
【００４８】
【化５】
2014027934.tif 000007
【００４９】
前記式で、Ｒ1は、Ｈ、フェニル基、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基またはＣ6〜Ｃ20アリール基であり、Ｒ2は、Ｈ、フェニル基、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基またはＣ6〜Ｃ20アリール基であり、Ｒ3は、Ｈ、フェニル基、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基またはＣ6〜Ｃ20アリール基であり、Ｒ4は、Ｈ、フェニル基、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基またはＣ6〜Ｃ20アリール基である。前述した炭素数の範囲は、具体的に任意及びその上下位範囲いずれも含む。よって、Ｃ1〜Ｃ20は、例えば、１以上の炭素数（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上の炭素など）及び２０以下の炭素（例えば、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、５以下の炭素など）の範囲を含む。特定具体例で、低級アルキル置換基を持つ化合物が使われる。よって、例えば、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4の一つ以上（２以上、３以上またはすべて）は独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基（例えば、Ｃ1〜Ｃ6アルキルまたはＣ1〜Ｃ4アルキル）、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル（Ｃ2〜Ｃ6アルケニルまたはＣ2〜Ｃ4アルケニル）、またはＣ6アリール（例えば、フェニル）である。
【００５０】
また、イオン性液体の陰イオンは、例えば、ハロゲン化物イオン、ＳＣＮ-、ＢＨ4-、ＰＦ6-、ＣＦ3ＣＯＯ-、Ｃ6Ｈ5ＣＯＯ-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＨ3ＯＳＯ3-、（ＣＮ）2Ｎ-、ＮＯ3-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＳＯＯ-、（ＣＨ3Ｏ）2ＰＯ2-またはＣＨ3ＯＳＯ3-でありうる。
【００５１】
他の例示として、イオン性液体は、例えば、下記イオン性結合対を持つ種類を含む。
【００５２】
【化６】
2014027934.tif 000008
【００５３】
イオン性液体のさらなる具体例は、テトラ−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ホスホニウム化合物（例えば、テトラブチルホスホニウムメタンスルホネート、テトラブチルホスホニウムテトラフルオロボラート；テトラブチルホスホニウムｐ−トルエンスルホネート；トリブチルメチルホスホニウムジブチルフォスフェート；トリブチルメチルホスホニウムメチルカーボネート；トリブチルメチルホスホニウムメチルサルフェート；トリエチルメチルホスホニウムジブチルフォスフェートのようなテトラブチルホスホニウム、トリブチルメチルホスホニウム、及びトリエチルメチルホスホニウム化合物）、及び３−（トリフェニルホスホニオ）プロパン−１−スルホネート化合物（例えば、３−（トリフェニルホスホニオ）プロパン−１−スルホネート及び３−（トリフェニルホスホニオ）プロパン−１−スルホン酸トシラート）を含む。
【００５４】
本方法の一態様によれば、増幅される核酸を含む生物学的試料及び核酸増幅混合物が用意され、イオン性液体が生物学的試料、核酸増幅混合物、または生物学的試料と核酸増幅反応混合物とを含む反応混合物に添加される。
【００５５】
増幅を行うために反応混合物は、生物学的試料のうちの選択的に増幅される核酸及び核酸増幅混合物を混合して用意する。用語''核酸増幅反応混合物''とは、鋳型まで添加され
て核酸増幅を行うために必要なあらゆる成分が含まれた反応混合物をいう。
【００５６】
核酸増幅反応混合物中またはイオン性液体が含まれた反応混合物（例えば、核酸増幅混合物または生物学的試料）中のそれぞれのイオン性液体の濃度は、０．００１％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）である。例えば、０．００１％〜３０％であり、０．００１％〜１０％であり、０．００１％〜５％でありうる。
【００５７】
核酸増幅反応混合物は、ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、アセトアミド、ベタイン、デキストラン、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＶＰ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）−１０、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０、トリトン（Ｔｉｒｔｏｎ）−Ｘ、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ：ＳＤＳ）、ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質及びプロテイナーゼ阻害剤を含む群から選択されるいずれか一つ以上を含んでも良い。これらは反応混合物を用意する前に核酸成分（例えば、生物学的試料）または核酸増幅混合物（例えば、ＰＣＲマスターミックス）に添加されるか、または反応混合物自体に添加される。
【００５８】
核酸増幅は、任意の適切な方法によって行われる。用語''核酸増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ 
ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）''は、特定核酸配列を短時間内に数万〜数十万
倍に増幅できる技法をいう。核酸増幅は、例えば、ＤＮＡ増幅またはＲＮＡ増幅である。核酸増幅は、熱循環を使うか、または等温で行われる。増幅は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、核酸配列−基礎増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＣＡ）などを含む。増幅方法はまた、ＲＮＡ増幅方法を含む。増幅方法は、逆転写または逆転写−ＰＣＲのようなＲＮＡ増幅でありうる。''ＰＣＲ''は、ポリメラーゼを用いて標的核酸に特異的に結合するプライ
マー対から標的核酸を増幅させる方法である。例えば、核酸増幅は、変性、アーニリング及び伸長の段階を繰り返す。用語''アーニリング''は、用語''混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ）''と混用される。また増幅は、例えば、ＤＮＡ増幅またはＲＮＡ増幅である
。核酸増幅は、例えば、リアルタイムＰＣＲである。用語''リアルタイムＰＣＲ''は、Ｐ
ＣＲ産物の増加をＰＣＲの毎サイクルごとにリアルタイムで観察する方法である。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ産物と反応性のある蛍光物質（例えば、蛍光プローブ）の検出及び定量により試料を分析する。
【００５９】
前記方法に使われたイオン性液体は、反応混合物に存在できる一つ以上の核酸増幅阻害剤（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の作用を抑制するとされている。用語''核酸増幅阻害剤''とは、核酸増幅を阻害するか、ま
たは増幅された核酸の検出を阻害する（例えば、標的の増幅が起きたにもかかわらず増幅信号が表れないか、信号の強度が減少する）作用のある物質をいう。核酸増幅阻害剤は、生物学的試料に存在する物質であり、例えば、胆汁酸、胆汁酸塩、多糖類、ビリルビン、ヘパリン、タンパク質加水分解酵素、フェノール化合物、ヌクレアーゼ、ポリアミン、ヘム、ヘミン、コラーゲン、メラニン、ユーメラニン、ミオグロビン、プロテイナーゼ、カルシウムイオン、尿素、ヘモグロビン、ラクトフェリン、兔疫グロブリンＧ、フミン酸、グローブパウダー、塩化カルシウム、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び／またはＦｅＣｌ3である。
【００６０】
前記用語''抑制''とは、核酸増幅反応から部分的にまたは完全に及び直接的にまたは間
接的に核酸増幅阻害剤の作用を低減させることを意味する。
【００６１】
また、核酸増幅組成物が提供され、これは、核酸が生物学的試料に存在する場合のように、核酸増幅阻害剤の存在下で核酸を増幅させるのに特に有用である。核酸増幅組成物は、イオン性液体及び核酸増幅混合物を含む。イオン性液体及び核酸増幅混合物、及び核酸増幅組成物のあらゆる他の態様は、核酸増幅方法に関して本明細書で記載される。よって、核酸増幅混合物は、核酸増幅方法に使われた核酸増幅混合物に関して記載された成分を含む。さらに、核酸増幅組成物は、反応混合物に使われた成分を含む、核酸増幅方法に使うために本明細書に記載の他の成分を含む。また、核酸増幅方法を例示する目的のために本明細書に記載の核酸増幅組成物は、本発明のさらなる態様と考慮される。
【００６２】
核酸増幅組成物は、所望のレベルの効果を奏するのに十分なイオン液体の量を含む。例えば、核酸増幅組成物のうちイオン性液体の濃度は、０．００１％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）、０．００１％〜３０％、０．００１％〜１０％であり、または０．００１％〜５％である。
【００６３】
望ましい具体例によれば、本明細書に記載の核酸増幅方法及び核酸増幅組成物は、標的微生物、細胞、または遺伝子を速くて正確に、そして高い効率及び敏感度で検出するのに使われる。例えば、ＰＣＲ効率及び感度は、本明細書に記載の方法及び組成物の使用によって向上し、生物学的試料に存在する多様な核酸増幅阻害剤を低減または抑制することで正確な分子診断ができる。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）
イオン性液体のＰＣＲ阻害試験
ＰＣＲを使ってイオン性液体の存在の核酸増幅を調べた。
【００６５】
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボラート（ＢＭＩＴＦ）をイオン性液体として使い、使われたＰＣＲ用反応液の最終反応濃度は、下記の通りである。生物学的試料としては、ＡＴＣＣより購入したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＢＡＡ−１７１７）のゲノムＤＮＡを用いた。
【００６６】
１０3コピーのゲノムＤＮＡ
１ＸＰＣＲマスターミックス
０．５％（ｖ／ｖ）イオン性液体または精製水
前記ＰＣＲマスターミックスは、プライマー／プローブ、ｚ−ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、ｄＮＴＰ、ｚ−ｔａｑ緩衝液を含む。
【００６７】
順方向プライマー：５’−ＣＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＴＴＧＡＡＣ−３’（配列番
号１）
逆方向プライマー：５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＡ−３’（配
列番号２）
プローブ：５’−ａｇａＧｃａＴｔｔＡａｇＡｔｔＡｔｇｃｇ−３’（配列番号３）
ＰＣＲは、ＴＭＣ１０００（三星社製）を使って温度感度９５℃で１秒、６０℃で５秒を一サイクルにして総４５サイクルのＰＣＲを行った。
【００６８】
ＰＣＲサイクル数に対する反応単位（Ｒｎ）で表示される増幅プロファイル曲線を、図１に示した（太実線：０．５％（ｖ／ｖ）のイオン性液体を含む、点線：イオン性液体を含まない）。
【００６９】
図１に示したように、イオン性液体自体はＰＣＲ阻害効果がないということが分かった。
（実施例２）
大便試料でイオン性液体のＰＣＲに対する効果
核酸増幅阻害剤を含む大便試料と、生物学的試料としてゲノムＤＮＡを用いて、核酸のＰＣＲの増幅効率または感度に関するイオン性液体の効果を調べた。大便試料は、健常なヒトから得た大便を精製水で希釈し、終濃度１０ｍｇ／ｍｌとした。
【００７０】
使われたＰＣＲ用反応液の最終反応濃度は、下記の通りである。
【００７１】
大便溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）試料
１０3コピーのゲノムＤＮＡ
１ＸＰＣＲマスターミックス、
０．５％（ｖ／ｖ）イオン性液体または精製水
前記ＰＣＲマスターミックスの組成及びＰＣＲ条件は、実施例１に記載した通りである。
【００７２】
ＰＣＲサイクル数に対する反応単位（Ｒｎ）で表示される増幅プロファイル曲線を獲得し、これから算出された最大Ｒｎ値をそれぞれ図２Ａ及び２Ｂに示した（太実線：０．５％（ｖ／ｖ）のイオン性液体を含む、点線：イオン性液体を含まない）。
【００７３】
なお、前記ＰＣＲによる増幅産物を、アガロースゲルを用いた電気泳動方法でサイズを分離させ、ターゲット増幅産物の量を比較した（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ）。図２Ｃは、増幅産物を電気泳動した結果を示し、これから算出された増幅産物の量を図２Ｄに示した（Ａ：イオン性液体＋大便試料、Ｂ：イオン性液体の無添加＋大便試料、Ｃ：イオン性液体＋緩衝液中のゲノムＤＮＡ、Ｄ：イオン性液体の無添加＋緩衝液中のゲノムＤＮＡ）。
【００７４】
図２Ａ〜図２Ｄに示したように、イオン性液体を使った実験の場合、ＰＣＲ増幅プロファイル曲線の最大Ｒｎ値が増加するということが分かった。Ｒｎ値の増加は単純な信号の増加ではなくＰＣＲ阻害剤の除去または抑制によるＰＣＲ増幅効率の増加によるものであるため、イオン性液体を使った場合にＰＣＲ増幅産物の濃度が高くなることが電気泳動実験により確かめることができる。
（実施例３）
少量の標的ＤＮＡを含む大便試料のＰＣＲに対するイオン性液体の効果
少量の標的ＤＮＡを含む大便試料でのイオン性液体の存在がＰＣＲの増幅効率及び敏感度を高めるかどうかを調べた。
【００７５】
使われたＰＣＲ用反応液の最終反応濃度は、下記の通りである。
大便溶出試料、
１０2または１０1コピーのゲノムＤＮＡ
１ＸＰＣＲマスターミックス
０．５％（ｖ／ｖ）イオン性液体または精製水
前記ＰＣＲマスターミックスの組成及びＰＣＲ条件は、実施例１に記載した通りである。
【００７６】
ＰＣＲサイクル数に対する反応単位（Ｒｎ）で表示される増幅プロファイル曲線を獲得して、図３Ａ（１０2コピーのゲノムＤＮＡに対する増幅プロファイル曲線）及び図３Ｂ（１０１コピーのゲノムＤＮＡに対する増幅プロファイル曲線）に示した（太実線：０．５％（ｖ／ｖ）のイオン性液体を含む、点線：イオン性液体を含まない）。そして、図３Ａ及び図３Ｂから算出された最大Ｒｎ値を図３Ｃに示した。
【００７７】
図３Ａ〜図３Ｃに示したように、低濃度標的ＤＮＡ実験の場合、イオン性液体を使わない場合には正常のＣｔ値が検出できない一方、イオン性液体を使った場合にはＣｔ値が測定できた。これは、大便試料中のＰＣＲ阻害剤の影響によってＰＣＲの増幅効率及び敏感度が低いが、イオン性液体の使用によってＰＣＲの増幅効率及び感度に優れ、検出限界の向上を示す。
（実施例４）
大便試料のＰＣＲの増幅効率及び感度に対するイオン性液体とＢＳＡの比較
ＰＣＲ試薬の最終反応濃度は、下記の通りである。
【００７８】
大便溶出試料、
１０3コピーのゲノムＤＮＡ
１ＸＰＣＲマスターミックス
０．５％（ｖ／ｖ）イオン性液体、０．１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡまたは精製水
前記ＰＣＲマスターミックスの組成及びポリメラーゼ酵素連鎖反応条件は、実施例１に記載した通りである。
【００７９】
ＰＣＲサイクル数に対する反応単位（Ｒｎ）で表示される増幅プロファイル曲線を獲得して図４Ａに示し、図４Ａから算出された最大Ｒｎ値を図４Ｂに示した（太実線：０．５％（ｖ／ｖ）のイオン性液体を含む、点線：０．１％（ｖ／ｖ）のＢＳＡを含む、細実線：イオン性液体及びＢＳＡを含まない）。
【００８０】
図４Ａ〜図４Ｂに示したように、大便試料のＰＣＲ阻害剤を除去または抑制するために多く使われるＢＳＡのみを使った場合が比較された。イオン性液体を使った実験で、Ｒｎ値が１以上増加した。よって、ＢＳＡだけでは除去できないＰＣＲ阻害剤がイオン性液体によって除去されることが分かった。
（実施例５）
ＰＣＲ阻害剤を除去または抑制する効果があるイオン性液体のスクリーニング
イオン性液体を変えつつＰＣＲを行った。使われたＰＣＲ反応混合物及びＰＣＲ条件は、実施例１及び２に記載した通りである。
【００８１】
【表１】
2014027934.tif 000009
【００８２】
【表２】
2014027934.tif 000010
【００８３】
表１または２でデルタＲｎ（△Ｒｎ）は、イオン性液体を添加した場合の最大Ｒｎ値からイオン性液体を添加しない場合の最大Ｒｎ値を引いた値である。
【００８４】
表１及び２から、ＢＭＩＴＦ＞ＥＭＩＤＣ＞ＢＭＰＤＣ＞ＭＰＰＤＣ＞ＢＭＩＤＣの順に核酸増幅阻害剤除去または抑制作用があるということが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、核酸増幅関連の技術分野に好適に用いられる。
【図１】
2014027934.tif 000015
【図２Ａ】
2014027934.tif 000016
【図２Ｂ】
2014027934.tif 000017
【図２Ｃ】
2014027934.tif 000018
【図２Ｄ】
2014027934.tif 000019
【図３Ａ】
2014027934.tif 000020
【図３Ｂ】
2014027934.tif 000021
【図３Ｃ】
2014027934.tif 000022
【図４Ａ】
2014027934.tif 000023
【図４Ｂ】
2014027934.tif 000024
【配列表】
2014027934000001.app