(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリヌクレオチドを修復し、これにより、例えば増幅反応における改良された忠実度及び／又は収量で前記ポリヌクレオチドを複製することができる方法の提供。【解決手段】（ａ）少なくとも１つの脱プリン部位／脱ピリミジン部位（ＡＰ）エンドヌクレアーゼの有効量；ＤＮＡリガーゼ；及び補助因子としてのＮＡＤ＋若しくはＡＴＰの少なくとも１つを含む反応混合物中で、ポリヌクレオチドを温置すること；及び（ｂ）複製された若しくは増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させることを含む、複製された若しくは増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させるための、ポリヌクレオチドを修復する方法。【選択図】図１１
2014027939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの脱プリン部位／脱ピリミジン部位（ＡＰ）エンドヌクレアーゼの有効量；ＤＮＡリガーゼ；及び補助因子としてのＮＡＤ＋若しくはＡＴＰの少なくとも１つを含む反応混合物中で、ポリヌクレオチドを温置すること；及び
（ｂ）複製された若しくは増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させること
を含む、複製された若しくは増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させるための、ポリヌクレオチドを修復する方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リガーゼが、ＮＡＤ＋依存性リガーゼであり、及び反応混合物が、ＮＡＤ＋を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リガーゼが、ＴａｑＤＮＡリガーゼ又はイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
段階（ａ）が、反応混合物中でポリヌクレオチドを増幅することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）中のポリヌクレオチドが、反応混合物中の少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼを変性又は除去せずに増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅及び全ゲノム増幅からなる群から選択される手段によって増幅が生じる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
増幅のためのポリヌクレオチドが、５０ヌクレオチドから１００，０００ヌクレオチドの大きさの範囲にある、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが、天然源、保存された生物材料、法医学的証拠品、生物由来の古代材料、組織生検及び化学合成からなる群から選択される源から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
損傷を受けたポリヌクレオチドが、ＡＰ部位、変異誘発されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、ニック、ギャップ、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−タンパク質架橋結合、断片化及びＤＮＡ−ＲＮＡ架橋結合から選択される損傷の１つ又はそれ以上の種類によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼが、細菌、哺乳動物、古細菌又はウイルスから取得可能であるエンドヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼが、イー・コリ、ヒト細胞又はサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種から取得可能であるエンドヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
反応混合物が、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＡポリメラーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＢポリメラーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼのＹファミリーのメンバーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ及びファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡポリメラーゼが、イー・コリｐｏｌＩＶ、イー・コリｐｏｌＶ、ヒトｐｏｌκ、ヒトｐｏｌη、Ｓｓｏ  Ｄｐｏ４、Ｓａｃ  Ｄｂｈ、Ｓｃｅ  ｐｏｌζ、ファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ及びヒトｐｏｌιから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
反応混合物が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又はその変異体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
反応混合物が、Ｔ４ピリミジン二量体グリコシラーゼ（ＰＤＧ）をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
反応混合物が、ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）をさらに含む、請求項１又は１３に記載の方法。
【請求項２２】
反応混合物が、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ及びＵｖｒＣ並びに場合によってＵｖｒＤ又はＣｈｏの少なくとも１つをさらに含む、請求項１又は１３に記載の方法。
【請求項２３】
反応混合物が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩをさらに含む、請求項１又は１３に記載の方法。
【請求項２４】
反応混合物が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）又はアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ａａｇ）の少なくとも１つをさらに含む、請求項１又は１３に記載の方法。
【請求項２５】
反応混合物中でポリヌクレオチドを温置することが、実質的に単一の温度で達成され、それにより収量又は忠実度の少なくとも１つを増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
酵素の少なくとも１つがＤＮＡリガーゼであり、及び酵素の少なくとも１つが反応混合物中で０．０００１単位／μＬから１００単位／μＬの範囲の濃度のＡＰエンドヌクレアーゼであり、２つ又はそれ以上の酵素が、ポリヌクレオチドの修復を増大させるために、損傷を受けたポリヌクレオチド調製物への添加用に調合される、反応混合物を形成するための前記２つ又はそれ以上の酵素と及びその使用のための説明書とを含む、キット。
【請求項２７】
少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼの有効量、ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを含み、修復混合物が、ポリヌクレオチドに添加可能であり、及び前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド修復混合物を除去又は分解せずに増幅可能であり；並びに前記修復混合物が、複製されたポリヌクレオチドの収量及び忠実度の少なくとも１つを増大させる、ポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項２８】
ＤＮＡリガーゼが、イー・コリＤＮＡリガーゼ又はＴａｑＤＮＡリガーゼである、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項２９】
ＡＰエンドヌクレアーゼが、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶである、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３０】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼである、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３１】
Ｔ４  ＰＤＧをさらに含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３２】
イー・コリＦｐｇをさらに含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３３】
ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣの少なくとも１つと、場合によってＵｖｒＤ又はＣｈｏとをさらに含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３４】
エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩの少なくとも１つをさらに含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３５】
ＵＤＧ及びＡａｇの少なくとも１つをさらに含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３６】
ＰＤＧ、ＵＤＧ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及びＦｐｇをさらに含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３７】
ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＰＤＧ、ＵＤＧ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及びＦｐｇの１つ又はそれ以上が、イー・コリから得られる、請求項３６に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３８】
ＡＰエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＵＤＧ及びＦｐｇが、イー・コリから得られる、請求項３７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項３９】
ＰＤＧが、Ｔ４ＰＤＧであり、ＤＮＡリガーゼが、ＴａｑＤＮＡリガーゼであり、及びポリメラーゼが、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼである、請求項３７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４０】
Ｔ４  ＰＤＧの効果的な濃度が、０．０００１単位／μＬから４単位／μＬの範囲である、請求項３９に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４１】
ＴａｑＤＮＡリガーゼの効果的な濃度が、０．００００１単位／μＬから１００単位／μＬの範囲である、請求項３９に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４２】
ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの効果的な濃度が、０．００００１単位／μＬから２単位／μＬの範囲である、請求項３９に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４３】
イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶの効果的な濃度が、０．０００１単位／μＬから１００単位／μＬの範囲である、請求項２９に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４４】
エンドヌクレアーゼＶＩＩＩの効果的な濃度が、０．０００１単位／μＬから２０単位／μＬの範囲である、請求項３４に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４５】
ＵＤＧの効果的な濃度が、０．００００１単位／μＬから２０単位／μＬの範囲である、請求項３５に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４６】
Ｆｐｇの効果的な濃度が、０．０００００１単位／μＬから０．１単位／μＬの範囲である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４７】
ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼ、Ｆｐｇ、ＰＤＧ及びＵＤＧを含む、ポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４８】
Ｂｓｔポリメラーゼが、０．００００１単位／μＬから２単位／μＬの範囲の濃度を有し、ＡＰエンドヌクレアーゼが、０．０００１単位／μＬから１００単位／μＬの範囲の濃度を有し、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩが、０．００００１単位／μＬから２０単位／μＬの範囲の濃度を有し、リガーゼが、０．００００１単位／μＬから１００単位／μＬの範囲の濃度を有し、Ｆｐｇが、０．０００００１単位／μＬから０．１単位／μＬの範囲の濃度を有し、ＰＤＧが、０．０００１単位／μＬから４単位／μＬの範囲の濃度を有し、及びＵＤＧが、０．００００１単位／μＬから２０単位／μＬの範囲の濃度を有する、請求項４７に記載のポリヌクレオチド修復混合物。
【請求項４９】
請求項２７に記載のポリヌクレオチド修復混合物によって、ポリヌクレオチド断片中の配列エラーを修復すること；及び
前記ポリヌクレオチド断片をクローニング又は配列決定すること
を含む、ポリヌクレオチド断片をクローニング又は配列決定するための方法。
【請求項５０】
修復混合物が、ベクター中にクローニングするためのポリヌクレオチド断片を平滑末端化し得る、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）プライマーの少なくとも１つの第一対及びポリヌクレオチドとハイブリッド形成されたときプライマーの第一セット内に入れ子状態にされる第二対を得ること；
（ｂ）請求項２７に記載の組成物へポリヌクレオチドを供すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドをプライマーの前記第一セットで増幅すること；
（ｄ）（ｃ）の産物をプライマーの第二セットで増幅すること；並びに
（ｅ）増幅されたポリヌクレオチドの増大した収量を得ること
を含む、複製された又は増幅されたポリヌクレオチドの収量を増大させるための、方法。
【請求項５２】
ポリヌクレオチド修復混合物が、ＰＤＧ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｆｐｇと、場合によってＵＤＧとをさらに含み、及びＡＰエンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶである、請求項４９又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
リガーゼが、ＴａｑＤＮＡリガーゼであり、及びＰＤＧが、Ｔ４  ＰＤＧであり、及びＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｆｐｇ及び場合によってＵＤＧが、イー・コリから得られる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）ポリヌクレオチドを請求項２７のポリヌクレオチド修復混合物と接触させること；及び
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを配列決定すること
を含む、ポリヌクレオチドを配列決定するための方法。
【請求項５５】
（ａ）断片化されたＤＮＡを請求項２７に記載の修復混合物と接触させること；
（ｂ）組換え受容性タンパク質を場合によって添加すること；及び
（ｃ）前記断片化されたＤＮＡを増幅又は複製すること
を含む、断片化されたＤＮＡを複製又は増幅するための方法。
【請求項５６】
組換え受容性タンパク質が、イー・コリＲｅｃＡ又はファージλβタンパク質である、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ポリヌクレオチドの複製、より具体的には増幅は、例えば遺伝子の特性を研究するために、分子生物学において一般的に使用されている。ポリヌクレオチドが何らかの方法で損傷された場合に、複製上の問題が生じる。
【０００２】
例として、米国特許第５，０３５，９９６号は、修飾されたヌクレオチドｄＵＴＰを増幅反応において使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の汚染を抑制するための方法を記載している。この方法は、ウラシルを含有するＰＣＲ産物を除去し、その後のＰＣＲ反応物の汚染を防止するために、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を使用する。米国特許公報第２００４−００６７５５９Ａ１号も、増幅及び使用の前に、プライマーＤＮＡ中の修飾された塩基、例えば単位複製配列中へ組み込むためのｄＵＴＰに依存している。次いで、単位複製配列は、例えばＵＤＧ及びエンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏ）ＩＶを添加することによって断片化されることが可能である。
【０００３】
ホットスタート核酸増幅と呼ばれる１つの増幅方法は、ＰＣＲ中の誤プライミングを低下させるために使用されてきた。ホットスタート増幅の１つの種類において、ポリメラーゼによる伸長の防止は、ＰＣＲ反応中に、封鎖された３’末端を有するＰＣＲプライマーが存在することに依存している（例えば、米国公報第２００３−０１１９１５０号参照）。プライマーは、３７℃超の温度で活性のある耐熱性３’−５’エキソヌクレアーゼによって封鎖解除される。従って、エキソヌクレアーゼが３７℃超の温度で３’末端の封鎖を解除すると、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲプライマーを伸長するのみである。あるいは、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ；Ｔａｑ）ポリメラーゼは、封鎖された後、増幅温度で活性化される。
【０００４】
Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２２１６−２２２０（１９９４）は、増幅中のみにＴａｑポリメラーゼを使用することに対する改良として、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼを使用することを記載している。Ｇｈａｄｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．は、損傷された部位又は脱塩基部位によって停止されていない変異体Ｔａｑポリメラーゼを報告した（Ｇｈａｄｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（６）：７５５−９（２００４））。
【０００５】
ＤＮＡが実質的に損傷を受けている場合、従来の増幅技術が危ういことが報告されている（Ｄｉ  Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ１６（２００２））。ＤＮＡヌクレアーゼを含有する環境及び微生物への曝露から得られるＤＮＡの分解及び／又は断片化は、法医学、診断検査及び定型的な増幅においてしばしば問題となっており、増幅産物の忠実度及び収量に影響を及ぼす。さらに、保存され、絶滅した生物又は保存された生物から得られたＤＮＡを分析している研究者も、分解されたＤＮＡの問題に直面する。
【０００６】
Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１１）：ｅ５０（２０００）及び国際公報第ＷＯ０１／５１６５６は、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる処理が、長時間のＰＣＲの収量を改良することを報告した。しかしながら、Ｆｒｏｍｅｎｔｙは、エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用した場合に、５００塩基対未満のＤＮＡに関して、低下した単位複製配列の収量も報告した。エキソヌクレアーゼＩＩＩの使用と関連した問題の１つは、エキソヌクレアーゼＩＩＩがテンプレート及びプライマーを分解することである。ＡｃｃｕＴａｑＬＡ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＴＴ（参考文献の実施例２）からもなる酵素配合物中の、ＤＮＡ修復のためのエキソヌクレアーゼＩＩＩの使用は、米国公報第０５／００２６１４７号においてＷａｌｋｅｒらによっても記載されている。前記参考文献は、エキソヌクレアーゼＩＩＩを失活した後にオリゴヌクレオチドプライマーを添加するさらなる熱失活段階の必要性を記載する。調製物は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ及びＱｂｉｏｇｅｎｅ（現ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ），Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡによって市販されており、ＤＮＡ増幅の前にＤＮＡと共に使用するが、これらの調製物の内容物は、供給者によって指定されてはいない。これらの参考文献において記載されるアプローチに関する制限は、修復後及び増幅前の変性段階に関する報告された必要性である。単一の段階で修復を達成し、さらなる分離又は変性段階なしで増幅を達成するために試薬を単に添加することが望ましい。
【０００７】
Ｄｉ  Ｂｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（４）：ｅ１６（２００２）は、二本鎖ＤＮＡの架橋結合された領域間で一本鎖ＤＮＡの短い領域を増幅するための前処理としての、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４リガーゼ）及びイー・コリポリメラーゼの使用を記載した。
【０００８】
損傷を受けたＤＮＡの増幅に対する別のアプローチは、米国公報第２００３−００７７５８１号に記載されている。分解された核酸と相同な配列を有する分解されていない核酸に、分解された核酸がハイブリッド形成された。次いで、分解された核酸の領域をヌクレオチド前駆体で充填した。次に、重合酵素及び／又は連結酵素を使用して、断片化された鎖を共有結合させた。
【０００９】
イー・コリＤＮＡ  ｐｏｌＩと増幅前修復のためのＴ４  ＤＮＡリガーゼとの組み合わせの使用が他者により報告されている（Ｐｕｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：８５７（１９９８））。しかしながら、Ｐｕｓｃｈらによると、増幅前産物は、増幅の開始前に精製されなければならない。Ｅｓｃｈｏｏ（米国公報第２００６／００１４１５４号）も、増幅前の精製段階に関する必要性を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５０３５９９６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００６７５５９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１１９１５０号明細書
【特許文献４】国際公開第２００１／５１６５６号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／００２６１４７号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／００７７５８１号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／００１４１５４号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２２１６−２２２０（１９９４）
【非特許文献２】Ｇｈａｄｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（６）：７５５−９（２００４）
【非特許文献３】Ｄｉ  Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ１６（２００２）
【非特許文献４】Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１１）：ｅ５０（２０００）
【非特許文献５】Ｄｉ  Ｂｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（４）：ｅ１６（２００２）
【非特許文献６】Ｐｕｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：８５７（１９９８）
【発明の概要】
【００１２】
要旨
本発明の一実施形態において、ＤＮＡ等の（但し、ＤＮＡに限定されない。）損傷を受けたポリヌクレオチドを修復することによって、複製された又は増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させるための方法が提供される。この方法は、少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼの有効量、ＤＮＡリガーゼ及び共因子としてのＮＡＤ＋又はＡＴＰのうちの少なくとも１つとを含む反応混合物中で、ポリヌクレオチドを温置することが含まれる。ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼは、ＰＣＲ増幅又は全ゲノム増幅等の方法の特定の使用のために選択される。ＡＴＰが利用される場合、ＤＮＡのその後の増幅に及ぼす負の効果を最小化する５００μＭ未満のＡＴＰの濃度が使用され得る。
【００１３】
反応混合物中でのポリヌクレオチドの修復は、増幅又は複製前に、（標準的な恒温器の温度変動の限界内の）単一温度で達成され得る。例えば、等温性の温度は、１分間から１２時間の範囲の温置時間で、４℃から５２℃の範囲から選択され得る。
【００１４】
本明細書に記載される本発明の実施形態において、修復中又は修復後及び複製又は増幅前の温度又は他の変性段階は、必要とされない。Ｎｏｒは、修復と複製又は増幅との間に必要とされる精製段階である。従って、修復及び増幅又は複製は、単一段階で達成することが可能である。
【００１５】
増幅は、ＰＣＲ増幅、ヘリカーゼ依存的増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、全ゲノム増幅または本分野で公知の他の増幅プロトコールによって達成することが可能である。
【００１６】
本方法の実施形態において、ポリヌクレオチドは、天然源、保存された生物材料、法医学的証拠品、生物由来の古代材料、組織生検及び化学合成からなる群から選択される源から得られる。ポリヌクレオチドに対する損傷の種類は、脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基（ＡＰ）部位、変異誘発されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、ニック、ギャップ、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−タンパク質架橋結合及びＤＮＡ−ＲＮＡ架橋結合を含む。
【００１７】
反応混合物中のＤＮＡリガーゼは、耐熱性リガーゼであり得る。例えば、９°Ｎリガーゼ等のＡＴＰ依存的リガーゼ、又はＴａｑＤＮＡ等のＮＡＤ＋依存的リガーゼが使用され得る。あるいは、必要とされる共因子がＮＡＤ＋であるイー・コリＤＮＡリガーゼ等の中温性リガーゼが使用され得る。
【００１８】
特異的ＡＰエンドヌクレアーゼ活性の有効量を有する１つ又はそれ以上のＡＰエンドヌクレアーゼは、イー・コリ等の細菌、ヒト等の哺乳動物、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）等の古細菌、又はアフリカブタ熱ウイルス等のウイルスから得られ得る。
【００１９】
反応混合物はさらに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ又はファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ等のファミリーＡ、Ｂ又はＹ  ＤＮＡポリメラーゼ、イー・コリｐｏｌＩＶ、イー・コリｐｏｌＶ、ヒトｐｏｌκ、ヒトｐｏｌη、Ｓｓｏ  Ｄｐｏ４、Ｓａｃ  Ｄｂｈ、Ｓｃｅ  ｐｏｌζ、及びヒトｐｏｌιを含む。
【００２０】
Ｔ４ピリミジン二量体グリコシラーゼ（ＰＤＧ）及び／又はホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、及び／又はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ及びＵｖｒＣ及び場合によってはＵｖｒＤ又はＣｈｏのうちの少なくとも１つをさらに含む反応混合物が提供される。場合によっては、反応混合物はさらに、米国公報第２００７／００４２３７９号に記載されるものなどのＴ７エンドヌクレアーゼＩ又はその変異体を含み得る。
【００２１】
さらなる実施形態において、反応混合物はさらに、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＵＤＧ及びアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ａａｇ）のうちの少なくとも１つを含み得る。
【００２２】
本発明の一実施形態において、酵素の少なくとも１つがＤＮＡリガーゼであり、酵素の少なくとも１つが、反応混合物の０．０００１単位／μＬから１００単位／μＬの濃度を有するＡＰエンドヌクレアーゼであり、ポリヌクレオチドの修復を増大させるために、２つ又はそれ以上の酵素が、損傷を受けたポリヌクレオチド調製物への添加用に調合された、２つ又はそれ以上の酵素と、その使用のための説明書とを含むキットが提供される。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、（１）増幅混合物へ添加すること；及び（２）ポリヌクレオチド修復混合物の不在下で複製された又は増幅されたポリヌクレオチドと比較して、複製された又は増幅されたポリヌクレオチドの収量及び忠実度の少なくとも１つの増大が可能であることに適した緩衝液中で、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼの有効量を含むポリヌクレオチド修復混合物が提供される。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼであり得る。ポリヌクレオチド修復混合物はさらに、Ｔ４  ＰＤＧを含み得る。さらに、ポリヌクレオチド修復混合物は、イー・コリＦｐｇを含み得る。ポリヌクレオチド修復混合物はさらに、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ及び場合によってはＵｖｄ又はＣｈｏのうちの少なくとも１つを含み得る。ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ及びＣｈｏは、イー・コリ等の細菌から得られ得、又は真核生物の等価物が使用され得る。ポリヌクレオチド修復混合物はさらに、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩのうちの少なくとも１つを含み得る。ポリヌクレオチド修復混合物はさらに、ＵＤＧ及びＡａｇのうちの少なくとも１つを含み得る。組成物はさらに、ＰＤＧ、ＵＤＧ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及び／又はＦｐｇを含み得る。
【００２５】
本発明の実施形態において、ポリヌクレオチド修復混合物は、イー・コリから得られたＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＰＤＧ、ＵＤＧ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及びＦｐｇのうちの１つ又はそれ以上を含む。例えば、ポリヌクレオチド修復混合物中のＡＰエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＵＤＧ及びＦｐｇは全て、イー・コリから得ることが可能である。これらの実施形態において、ＰＤＧは、Ｔ４  ＰＤＧであり得、ＤＮＡリガーゼは、ＴａｑＤＮＡリガーゼであり得、ＤＮＡポリメラーゼは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【００２６】
本発明の実施形態において、ポリヌクレオチド修復混合物中の酵素濃度は、以下に記載される範囲にある：Ｔ４  ＰＤＧの濃度範囲は、０．０００１単位／μＬから４単位／μＬの濃度範囲である。ＴａｑＤＮＡリガーゼの濃度範囲は、０．００００１単位／μＬから１００単位／μＬであり、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの濃度範囲は、０．００００１単位／μＬから２単位／μＬであり、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶの範囲は、０．０００１単位／μＬから１００単位／μＬであり、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩの範囲は、０．００００１単位／μＬから２０単位／μＬであり、ＵＤＧの範囲は、０．００００１単位／μＬから２０単位／μＬであり、及びＦｐｇの範囲は、０．０００００１単位／μＬから０．１単位／μＬである。
【００２７】
本発明の一実施形態において、上述のポリヌクレオチド修復混合物によってポリヌクレオチド断片中の配列エラーを修復することと及びポリヌクレオチド断片をクローニング又は配列決定することとを含む、ポリヌクレオチド断片をクローニング又は配列決定するための方法が提供される。ポリヌクレオチド修復混合物は、ベクター中にクローニングするために、ポリヌクレオチドの平滑末端化を生じ得る。
【００２８】
本発明の一実施形態において、（ａ）少なくとも第一対と、ポリヌクレオチドにハイブリッド形成される場合、プライマーの第一セット内で入れ子状態にあるプライマーの第二対とを得ること；（ｂ）上述の修復混合物にポリヌクレオチドを供すること；（ｃ）プライマーの第一セットでポリヌクレオチドを増幅すること；（ｄ）（ｃ）の産物をプライマーの第二セットで増幅すること；及び（ｅ）増幅されたポリヌクレオチドの増大した収量を得ることを含む、複製された又は増幅されたポリヌクレオチドの収量を増大させるための方法が提供される。
【００２９】
クローニングの方法及び上述の複製された又は増幅されたポリヌクレオチドの収量を増大させるための方法において、組成物は、ＴａｑＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＰＤＧ等のＰＤＧ、及びエンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｆｐｇ及び場合によってはイー・コリ由来のものなどのＵＤＧを含有し得る。
【００３０】
本発明の一実施形態において、（ａ）ＤＮＡリガーゼの有効量、ＤＮＡポリメラーゼ及び配列決定反応に適合する緩衝液中で実質的に非特異的ＤＮＡ分解活性を欠失しているＡＰエンドヌクレアーゼのある濃度を含む組成物と、ポリヌクレオチドとを接触させること；及び（ｂ）ポリヌクレオチドを配列決定することを含む、ポリヌクレオチドを配列決定するための方法が提供される。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、（ａ）増幅反応又は複製反応に適合する緩衝液中で、ＤＮＡリガーゼの有効量、ＤＮＡポリメラーゼ及び、実質的なエキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＡＰエンドヌクレアーゼのある濃度を含有する組成物と、断片化されたＤＮＡとを接触させること；（ｂ）イー・コリｒｅｃＡ又はファージλβタンパク質等の組換え形質転換受容性タンパク質を場合によって添加すること；及び（ｃ）断片化されたＤＮＡを増幅又は複製することを含む、断片化されたＤＮＡを複製又は増幅するための方法が提供される。
【００３２】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｄは、特定の酵素との前温置後の、熱損傷を受けたλＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示す。
【００３３】
図１Ａは、熱による異なる程度に損傷を受けたＤＮＡテンプレート、及びλＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅に及ぼすこの損傷の効果を示す。ここにおいて、λＤＮＡを９９℃で０秒間、３０秒間、６０秒間、９０秒間、１２０秒間又は１８０秒間熱処理することによって前損傷後、熱処理されたλＤＮＡ５ｎｇ、２ｎｇ及び１ｎｇを増幅する。損傷を受けたＤＮＡは、増幅前の酵素処理に供されなかった。増幅量を電気泳動後に測定し、１２０秒間の熱処理によって実質的に減少することを発見した。ゲル上の第一のレーンは、２ログラダーのサイズ標準物質（ＮＥＢ＃Ｎ３２００、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇを含有している。
【００３４】
図１Ｂは、λＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅において、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリｐｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたλＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示す。ＤＮＡを図１Ａにおいて記載されるように熱損傷したが、増幅前に、損傷を受けたＤＮＡを酵素処理に供した。ＴａｑＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリｐｏｌＩによる１０分間の前処理反応後の増幅結果を示す。単位複製配列収量は全体的に増大したが、１２０秒間及び１８０秒間の熱損傷を受けたＤＮＡで特に顕著であった。ゲル上の最初と最後のレーンは、２ログラダーのサイズ標準物質（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇを含有している。
【００３５】
図１Ｃは、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）エンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリｐｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたλＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示す。増幅前の酵素処理は図１Ｂに従って増幅を実施したが、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶの代わりに、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶを含有していた。ＴａｑＤＮＡリガーゼ、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリｐｏｌＩによる１０分間の前処理反応後の増幅の結果を示す。単位複製配列収量は全体的に増大したが、１２０秒間及び１８０秒間の熱損傷を受けたＤＮＡで特に顕著であった。第一のレーンのみが、分子量マーカーラダーを含有している。
【００３６】
図１Ｄは、イー・コリＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリＤＮＡ  ｐｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたλＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示す。増幅前の酵素処理は図１Ｂに従って増幅を実施したが、ＴａｑＤＮＡリガーゼの代わりに、イー・コリＤＮＡリガーゼを含有していた。９９℃で１８０秒間に供したλＤＮＡをテンプレートとして使用した。使用されたテンプレートＤＮＡの量を、各レーンの上に示す。５ｋｂ単位複製配列の収量は、酵素前処理によって、テンプレートの各量に関して増大する。
【００３７】
図２Ａ及び図２Ｂは、単位複製配列収量に及ぼすテンプレートＤＮＡのクエン酸緩衝液（ｐＨ５）の処理の効果を示す。
【００３８】
図２Ａは、クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中で０、２０、４０、８０、１２０及び１６０分間、λＤＮＡを７０℃まで加熱した場合の、λＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅の結果を示す。クエン酸で処理された各試料５０ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇを増幅し、得られた産物をゲル上で可視化し、増幅の程度を決定した。ＤＮＡは、増幅前に、選択された酵素で処理されなかった。右側の最後のレーンは、２ログラダー１μｇを含有している。
【００３９】
図２Ｂは、ＤＮＡポリメラーゼを酵素混合物中で使用したにもかかわらず、λＤＮＡの５ｋｂ単位複製配列の収量が増大したことを示す。クエン酸で１２０分間損傷を受けたλＤＮＡを、増幅前に多様な酵素で処理した。
レーン１：２ログラダー（ＮＥＢ＃  Ｎ３２００、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）１μｇ。
レーン２：前処理無し。
レーン３：Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶによる前処理。
レーン４：Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、イー・コリｐｏｌＩ及びイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶによる前処理。
レーン５：Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ混合物及びイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶによる前処理。
【００４０】
図３は、オキアミのエタノール保存された試料から抽出され、多様なＤＮＡポリメラーゼのうちの１つ、ＤＮＡリガーゼ及び増幅収量を増大させるＡＰエンドヌクレアーゼを含有する酵素混合物で前処理されたオキアミゲノムの２００塩基対セグメントの増幅結果を示す。
レーン１：オキアミＤＮＡの酵素による前処理無し。
レーン２：オキアミＤＮＡの、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる前処理。
レーン３：オキアミＤＮＡの、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及びＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼによる前処理。
レーン４：オキアミＤＮＡのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及び５０：１のＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼによる前処理。
【００４１】
図４は、熱損傷を受けたＤＮＡからの１０ｋｂ単位複製配列の収量の増大を示す。１８０秒間の熱損傷を受けたＤＮＡを、酵素混合物で前処理した後、増幅した。
レーン１：２ログラダーサイズ標準（ＮＥＢ＃  Ｎ３２００、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）１μｇ。
レーン２：Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリｐｏｌＩによる前処理。
レーン３：Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ及びイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶによる前処理。
レーン４：Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼによる前処理。
レーン５：対照、処理されていないＤＮＡ。
【００４２】
図５は、ＤＮＡリガーゼ前処理によって、環境ＤＮＡ（土壌試料抽出物）からの単位複製配列収量が増大することを示す。
レーン１：２ログラダーサイズ標準（ＮＥＢ＃  Ｎ３２００、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。
レーン１：酵素前処理無し。
レーン２：Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる前処理。
レーン３：酵素前処理無し。
レーン４：Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼによる前処理。
【００４３】
図６Ａ−１から６Ａ―９及び６Ｂ−１から６Ｂ−２：イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【００４４】
図７は、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶのＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す。
【００４５】
図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、λＤＮＡを使用する単位複製配列収量に及ぼす紫外線の効果を示す。
【００４６】
図８Ａは、λＤＮＡを５０秒間まで紫外線照射に供し、生じた２ｋｂ単位複製配列の収量のわずかな減少を示す。
【００４７】
図８Ｂは、λＤＮＡを５０秒間まで紫外線照射に供し、５ｋｂ単位複製配列の収量の減少を示す。
【００４８】
図８Ｃは、紫外線照射後の５ｋｂ単位複製配列の収量に及ぼすλＤＮＡに添加された多様な反応混合物の効果を示す。
レーン２−７は、反応混合物が存在しない対照である。
レーン８−１３は、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼプラスＴ４  ｐｄｇ１０単位の添加による増加した有益な効果を示す。
レーン１４−１９は、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼプラスＴ４  ｐｄｇ８０単位の添加による増加した有益な効果を示す。
レーン１及び２０：２ログラダーサイズ標準（ＮＥＢ＃  Ｎ３２００、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。
【００４９】
図９Ａ及び９Ｂは、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩへＤＮＡリガーゼを添加すると、産物が分解されないＥｎｄｏＩ：ＤＮＡ比の有用な範囲が拡大することを示す。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ及びＴ７エンドヌクレアーゼＩが高次コイルＤＮＡに各レーンに示されている種々の量にて添加された。
【００５０】
図９Ａは、ＴａｑＤＮＡリガーゼは添加されていないが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩの増大する量が使用された対照である。高次コイルＤＮＡは、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩの１２．５から２５単位を有する多様なサイズの断片に主に切断された。
【００５１】
図９Ｂは、ＴａｑＤＮＡリガーゼの１００単位の添加が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩの存在下で、非特異的切断からＤＮＡをどのように保護するかを示す。Ｔ７エンドヌクレアーゼの２００単位でさえ、ＤＮＡリガーゼの不在下では存在しない直鎖ＤＮＡに相当する明確なバンドがあるよう保護される。
【００５２】
図１０Ａ及び１０Ｂは、酸化的損傷を受けたＤＮＡ又は損傷を受けていないテンプレートからの単位複製配列収量に及ぼす修復酵素処理の効果を示す。
【００５３】
図１０Ａは、損傷を受けていないテンプレートｐＷＢ４０７へ修復酵素を添加しても、単位複製配列収量に何ら効果がないことを示す。
【００５４】
図１０Ｂは、メチレンブルーの存在下であらかじめ温置された損傷を受けたテンプレートであるプラスミドｐＷＢ４０７にＦｐｇを添加すると、一貫しない収量への効果が付与されることを示す。Ｆｐｇの存在下又は不在下でのＴａｑＤＮＡリガーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ及びイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶの添加は、一貫して、単位複製配列の収量を増大させる。
【００５５】
図１１は、修復酵素による処理後の損傷を受けたＤＮＡからの増大したＰＣＲ反応忠実度を示す。ＰＣＲ前に損傷を受けていないテンプレートであるプラスミドｐＷＢ４０７の修復酵素処理は、忠実度に有意な効果を何ら及ぼさない。メチレンブルーと共に温置された損傷を受けたテンプレートであるプラスミドｐＷＢ４０７を、Ｆｐｇ単独又はＴａｑＤＮＡリガーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ及びイー・コリエンドヌクレアーゼでも処理すると、ＰＣＲの忠実度が増大する。忠実度の測定結果は、以下に論議されるｌａｃＺを含有する単位複製配列をクローニングした後の白色コロニー数対青色コロニー数である。白色コロニーの割合が高ければ高いほど、エラー率は大きい。
【００５６】
図１２は、損傷を受けたＤＮＡを処理するための又は忠実度若しくは収量のうちの少なくとも１つを増大させるための、流れ図を示す。
【００５７】
図１３Ａ及び１３Ｂは、単位複製配列の収量が、室温で１５分間又は４℃で一晩、多重酵素修復混合物と共に温置された、３０秒間紫外線損傷を受けたＤＮＡの５ｋｂ断片をどのように増大するかを示す。
図１３Ａ：室温での温置：
レーン１：２ログラダーのＤＮＡ分子量標準物質
レーン２及び３：多重酵素修復混合物なしで室温で１５分間温置した２つの反応物
レーン４及び５：室温で１５分間修復混合物と共に温置した反応物は、期待された５ｋｂの単位複製配列を有している。
図１３Ｂ：４℃での温置：
レーン１：２ログラダーのＤＮＡ分子量標準物質
レーン２及び３：多重酵素修復混合物なしで４℃で一晩温置した２つの反応物
レーン４及び５：修復混合物と共に４℃で一晩温置した反応物は、期待された５ｋｂの単位複製配列を有している。
【００５８】
図１４は、室温にて修復酵素混合物にて１５分間処理した後のウラシル含有プラスミドからの増大した単位複製配列収量及び、古細菌ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲ増幅を示す。レーン１及び２は、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用するｐＮＥＢ０．９２ＵのＰＣＲ増幅の産物を示す。９２０塩基対にかすかに見えるバンドがある。レーン３及び４は、修復酵素混合物で処理されたｐＮＥＢ０．９２ＵからのＰＣＲ増幅の産物を示す。
【００５９】
図１５は、６２０塩基対の増幅されたＤＮＡに相当するバンドが同定されたアガロースゲルを示す。４８ヌクレオチド又はそれより小さな２０個の重複する一本鎖オリゴヌクレオチドから、６２０塩基対の単位複製配列を得た。
レーン１：２ログラダー分子量標準（ＮＥＢ＃  Ｎ３２００、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）１μｇ。
レーン２：組立段階の間、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ４００単位、イー・コリｐｏｌＩ０．１単位、Ｔ４ｐｄｇ５単位及びイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ２０単位と共に２０のオリゴヌクレオチドを温置。
レーン３：組立段階の間、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ４００単位、イー・コリｐｏｌＩ０．１単位、Ｔ４ｐｄｇ５単位、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ２０単位及びλβタンパク質と共に２０のオリゴヌクレオチドを温置。
レーン４：組立段階の間、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ４００単位、イー・コリｐｏｌＩ０．１単位、Ｔ４ＰＤＧ５単位、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ２０単位及びイー・コリＲｅｃＡと共に２０のオリゴヌクレオチドを温置。
レーン５：組立段階の間、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ４００単位、イー・コリｐｏｌＩ０．１単位、Ｔ４ＰＤＧ５単位、エンドヌクレアーゼＩＶ２０単位、λβタンパク質及びＲｅｃＡと共に２０のオリゴヌクレオチドを温置。
レーン６：組立段階の間、修復酵素が添加されなかった２０のオリゴヌクレオチド、対照。
【００６０】
図１６は、選択マーカーを含有するＤＮＡを使用して細胞を形質転換する場合に得られるコロニー数によって決定される、非照射ＤＮＡ及び照射ＤＮＡに及ぼすＤＮＡ修復処理の効果を示す。
【００６１】
図１７は、入れ子状態の異なるプライマー対を使用する２セットの増幅反応の古代ホラアナグマＤＮＡからの単位複製配列の改良された収量を示す。遺伝子マップは、プライマー対Ｆ１−Ｒ１、Ｆ１−Ｒ２及びＦ１−Ｒ４の位置を示す。ゲルの上に、各試料中のミトコンドリアＤＮＡの概算量を表す数のセットが提供される（８８、７９、１０、１１、１８６８及び１３１４）。レーン３Ａ及び３Ｂは、最多のＤＮＡを含有している。＋／−は、Ｆ１−Ｒ１を使用する第一の増幅前に、修復混合物を使用したかどうかを示す。レーン３Ｂにおいて、修復の不在下で存在しない修復されたホラアナグマＤＮＡに相当する鋭いバンドを観察した。
【００６２】
図１８は、プラスミドｐＮＥＢ０．９２ＵのＤＮＡ配列（配列番号４２）を示す。
【００６３】
図１９は、対照と比較した、修復されたＤＮＡから得られる増幅産物を示す。
レーン１及び２は、対照ＤＮＡ及びＵＶ損傷されたλＤＮＡを示す。
レーン３及び４は、対照ＤＮＡ及び熱損傷されたλＤＮＡを示す。
レーン５及び６は、対照ＤＮＡ及び酸化されたプラスミドＤＮＡを示す。
レーン７及び８は、対照ＤＮＡ及びＵＶ損傷されたヒトゲノムＤＮＡを示す。
レーン９及び１０は、対照ＤＮＡ及びＵＶ損傷された及びＡＰ損傷されたλＤＮＡを示す。
レーン１１及び１２は、対照ＤＮＡ及びＡＰ損傷されたλＤＮＡを示す。
【００６４】
図２０Ａ―２０Ｂは、λＤＮＡテンプレートから５ｋｂ単位複製配列を増幅する能力に及ぼすＡＴＰの増大する濃度の効果を示す。検査される８個のＡＴＰ濃度の各々について３重で反応を実施した。図２０Ａは、０、１５、３０及び６０μＭＡＴＰを含有した反応を示す。図２０Ｂは、力価の持続であり、１２０、２４０、４８０及び９６０μＭでのＡＴＰの効果を示す。９６０μＭＡＴＰの存在によって、ＰＣＲ反応において９６０μＭのＡＴＰ濃度にて検出可能な単位複製配列が何ら生じなかった。１％アガロースゲル上での電気泳動に反応物を供し、臭化エチジウム染色によって可視化した。図２０Ａ及び２０Ｂの左側のレーンは、広範な範囲の分子量ＤＮＡマーカーである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】熱による異なる程度に損傷を受けたＤＮＡテンプレート、及びλＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅に及ぼすこの損傷の効果を示す。
【図１Ｂ】λＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅において、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリｐｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたλＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示す。
【図１Ｃ】ＴａｑＤＮＡリガーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）エンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリｐｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたλＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示す。
【図１Ｄ】イー・コリＤＮＡリガーゼ、イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ及びイー・コリＤＮＡ  ｐｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたλＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示す。
【図２Ａ】クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中で０、２０、４０、８０、１２０及び１６０分間、λＤＮＡを７０℃まで加熱した場合の、λＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅の結果を示す。
【図２Ｂ】ＤＮＡポリメラーゼを酵素混合物中で使用したにもかかわらず、λＤＮＡの５ｋｂ単位複製配列の収量が増大したことを示す。
【図３】オキアミのエタノール保存された試料から抽出され、多様なＤＮＡポリメラーゼのうちの１つ、ＤＮＡリガーゼ及び増幅収量を増大させるＡＰエンドヌクレアーゼを含有する酵素混合物で前処理されたオキアミゲノムの２００塩基対セグメントの増幅結果を示す。
【図４】熱損傷を受けたＤＮＡからの１０ｋｂ単位複製配列の収量の増大を示す。
【図５】ＤＮＡリガーゼ前処理によって、環境ＤＮＡ（土壌試料抽出物）からの単位複製配列収量が増大することを示す。
【図６Ａ−１】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−２】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−３】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−４】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−５】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−６】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−７】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−８】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−９】イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ｂ−１】Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ｂ−２】Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用するＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図７】ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶのＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す。
【図８−１】Ａは、λＤＮＡを５０秒間まで紫外線照射に供し、生じた２ｋｂ単位複製配列の収量のわずかな減少を示す。Ｂは、λＤＮＡを５０秒間まで紫外線照射に供し、５ｋｂ単位複製配列の収量の減少を示す。
【図８−２】Ｃは、紫外線照射後の５ｋｂ単位複製配列の収量に及ぼすλＤＮＡに添加された多様な反応混合物の効果を示す。
【図９】Ｔ７エンドヌクレアーゼＩへＤＮＡリガーゼを添加すると、産物が分解されないＥｎｄｏＩ：ＤＮＡ比の有用な範囲が拡大することを示す。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ及びＴ７エンドヌクレアーゼＩが高次コイルＤＮＡに各レーンに示されている種々の量にて添加された。Ａは、ＴａｑＤＮＡリガーゼは添加されていないが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩの増大する量が使用された対照である。Ｂは、ＴａｑＤＮＡリガーゼの１００単位の添加が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩの存在下で、非特異的切断からＤＮＡをどのように保護するかを示す。
【図１０】酸化的損傷を受けたＤＮＡ又は損傷を受けていないテンプレートからの単位複製配列収量に及ぼす修復酵素処理の効果を示す。Ａは、損傷を受けていないテンプレートｐＷＢ４０７へ修復酵素を添加しても、単位複製配列収量に何ら効果がないことを示す。Ｂは、メチレンブルーの存在下であらかじめ温置された損傷を受けたテンプレートであるプラスミドｐＷＢ４０７にＦｐｇを添加すると、一貫しない収量への効果が付与されることを示す。Ｆｐｇの存在下又は不在下でのＴａｑＤＮＡリガーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ及びイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶの添加は、一貫して、単位複製配列の収量を増大させる。
【図１１】修復酵素による処理後の損傷を受けたＤＮＡからの増大したＰＣＲ反応忠実度を示す。
【図１２】損傷を受けたＤＮＡを処理するための又は忠実度若しくは収量のうちの少なくとも１つを増大させるための、流れ図を示す。
【図１３Ａ】単位複製配列の収量が、室温で１５分間、多重酵素修復混合物と共に温置された、３０秒間紫外線損傷を受けたＤＮＡの５ｋｂ断片をどのように増大するかを示す。
【図１３Ｂ】単位複製配列の収量が、４℃で一晩、多重酵素修復混合物と共に温置された、３０秒間紫外線損傷を受けたＤＮＡの５ｋｂ断片をどのように増大するかを示す。
【図１４】室温にて修復酵素混合物にて１５分間処理した後のウラシル含有プラスミドからの増大した単位複製配列収量及び、古細菌ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲ増幅を示す。
【図１５】６２０塩基対の増幅されたＤＮＡに相当するバンドが同定されたアガロースゲルを示す。４８ヌクレオチド又はそれより小さな２０個の重複する一本鎖オリゴヌクレオチドから、６２０塩基対の単位複製配列を得た。
【図１６】選択マーカーを含有するＤＮＡを使用して細胞を形質転換する場合に得られるコロニー数によって決定される、非照射ＤＮＡ及び照射ＤＮＡに及ぼすＤＮＡ修復処理の効果を示す。
【図１７】入れ子状態の異なるプライマー対を使用する２セットの増幅反応後の古代ホラアナグマＤＮＡからの単位複製配列の改良された収量を示す。
【図１８−１】プラスミドｐＮＥＢ０．９２ＵのＤＮＡ配列（配列番号４２）を示す。
【図１８−２】プラスミドｐＮＥＢ０．９２ＵのＤＮＡ配列（配列番号４２）を示す。
【図１９】対照と比較した、修復されたＤＮＡから得られる増幅産物を示す。
【図２０】λＤＮＡテンプレートから５ｋｂ単位複製配列を増幅する能力に及ぼすＡＴＰの増大する濃度の効果を示す。Ａは、０、１５、３０及び６０μＭＡＴＰを含有した反応を示す。Ｂは、力価の持続であり、１２０、２４０、４８０及び９６０μＭでのＡＴＰの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
実施形態の詳細な説明
本方法の実施形態は、分子生物学研究において、例えば法医学的分析にて見出されるような断片化された及び損傷を受けたＤＮＡを分析することを含む応用生物学における問題を解決する上において、古代源由来のＤＮＡを分析することが望ましい生物考古学において、生物事業のバーコード（Ｂａｒｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）に必要とされるような環境試料由来のＤＮＡを分析することが望ましい分類学のために、並びに疾病への感受性又は状態を決定するための組織生検などの診断アッセイのために、広範な用途を有する。他の使用には、高い忠実度の配列決定、遺伝子組立、断片分析及び複製、クローニングのための連結並びに一段階修復及び平滑末端化が含まれる。
【００６７】
単離された多くのポリヌクレオチド又はインビトロで複製された多くのポリヌクレオチドは、ある程度損傷を受けている。ポリヌクレオチドの損傷は、個々のヌクレオチドの化学的修飾又はポリヌクレオチド骨格の破壊から生じ得る。ポリヌクレオチドは、ホルムアルデヒド及びメチルメタンスルホナートなどの化学物質、環境因子、極端な温度、酸化、乾燥及び紫外線（ＵＶ）光等の多岐にわたる源からの損傷を受ける。損傷の多様な種類には、（ａ）例えば熱、及びＨ２Ｏ若しくはｐＨの極限等の環境中の因子への曝露によって生じた脱プリン部位又は脱ピリミジン部位損傷、（ｂ）例えば脱アミノ化、アルキル化及び酸化によって生じた個々のヌクレオチドの修飾、（ｃ）例えば熱、及びＨ２Ｏ若しくはｐＨの極限等の環境中の因子への曝露によって生じたニック及びギャップ、（ｄ）例えばホルムアルデヒド、光又は環境因子によって生じた架橋結合、（ｅ）例えばＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの誤取り込みによって生じた誤って組み合わさったＤＮＡ、並びに、（ｆ）ＤＮＡの断片化が含まれる。
【００６８】
損傷は、保存された組織、乾燥した標本又は環境へ曝露されたポリヌクレオチドにおいてより著しい。損傷は、試料又はその源又はその調製物の保存の結果として生じ得る。さらに、損傷は、高温段階を包含するＰＣＲ増幅中に生じるなど、ポリヌクレオチド合成のための方法の適用中に生じ得る。それゆえ、ほとんどのポリヌクレオチドは、ある程度の損傷を受けている。増幅中に損傷を受ける見込みが増すので、より長い単位複製配列を分析する場合に、この損傷の有する影響はより大きい。
【００６９】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で損傷を持続することが可能である。異なるポリヌクレオチド調製物は、例えばインビトロでのポリヌクレオチド調製物の保存又は取り扱い、ポリヌクレオチドを含有する原核細胞、古細菌又は真核細胞がどのように保存されているか、及びポリヌクレオチドが抽出される細胞の特徴に依存して、損傷の異なる種類を受ける。合成ポリヌクレオチドは、化学合成の間に損傷を持続し得る。
【００７０】
本発明の実施形態は、損傷を受けたポリヌクレオチドを複製又は増幅するための方法における改良を提供する。これらの改良は、損傷を受けたポリヌクレオチドが、複製段階又は増幅段階の前及び／又は間に反応混合物と混合される場合に達成され、複製された又は増幅されたＤＮＡの収量及び／又は忠実度を増大することが可能である。これは、修復酵素と共因子との混合物を含有する反応混合物に該ポリヌクレオチドを添加することによって容易に達成される。増大した収量及び／又は忠実度は、複製された又は増幅された産物の特徴付けに依存する検査の感度及び特異性を改良することが可能である（「増大した」とは、修復混合物の不在下で観察される割合と比較して、収量及び／又は忠実度に関して、出発材料に対する複製された又は増幅された産物の改良された比を得ることを指す。）。
【００７１】
本発明の一実施形態において、本方法は、ポリヌクレオチドにおいて共通して生じる損傷の異なる複数の種類を修復することが可能である酵素の１セットをポリヌクレオチドに添加するために提供する。この酵素のセットは本明細書では、普遍的混合物と呼ぶ。しかしながら、損傷の特定の種類が標的とされる場合、普遍的混合物のサブセットが使用可能であるが、ただし、サブセットは最小でも、ＤＮＡリガーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ及び共因子を含む。一般的に、１つの段階で複数の酵素をポリヌクレオチドに添加することは、１つ又はそれ以上の酵素を連続して添加することを除外するものではない。図１２は、ポリヌクレオチドによって持続される損傷の種類が知られているか又は知られていないかに従って、適切な修復混合物が、どのように選択され得るのかを示す。
【００７２】
実例となる多様な実施形態において、普遍的酵素混合物は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ又はＴａｑポリメラーゼ、及び中温性エンドヌクレアーゼＩＶ、例えばイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ又は好熱性エンドヌクレアーゼＩＶ、例えばＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ等のＡＰエンドヌクレアーゼ、及びイー・コリＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ又は９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼ等の古細菌ＤＮＡリガーゼから選択されるＤＮＡリガーゼを含有する。普遍的混合物はさらに、以下のうちの１つ又はそれ以上を含有し得る：Ｔ４  ＰＤＧ、イー・コリＦｐｇ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ及び場合によってはＵｖｒＤ又はＣｈｏのうちの少なくとも１つ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＵＤＧ及び／又はＡａｇ。
【００７３】
「ポリヌクレオチド」という用語は特に、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを指す。
【００７４】
「修復酵素」とは、特に、ポリヌクレオチドの修復の過程に関与する好冷性、中温性又は好熱性の酵素を指す。例えば、修復酵素は、結合においてポリヌクレオチドの破損を誘導し、これによりポリヌクレオチドの損傷を受けた領域の除去又は単一ヌクレオチドの除去を促進し得る。ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ等の合成上の役割を有する酵素も修復酵素である。しかしながら、本発明の一実施形態において、本明細書で使用される修復酵素は、キナーゼを含むことは意図されない。損傷を受けたＤＮＡは、ＤＮＡの複製及び／又は増幅を増大させるために、反応混合物へ供される。修復反応は、「単一」温度が、水槽又は冷蔵庫又は反応温度を設定するのに使用される他の装置と関連する温度の微小な変動を含む単一温度で実施することが可能である。
【００７５】
ＤＮＡ修復酵素は、科学文献に記載されており、例えば、Ｗｏｏｄ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５７７（１−２）：２７５−８３（２００５）及びＥｉｓｅｎ，Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｈａｎａｗａｌｔ，Ｐ．Ｃ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４３５（３）：１７１−２１３（１９９９）を参照されたい。ヒト修復酵素のリストは、以下の表１に提供されている。表１には記載されていないが、列挙されている酵素の相同体及び機能的に関連した他の酵素が、修復酵素の記述に含まれる。上述の酵素のいずれも、天然、組換え又は合成であり得る。これらの酵素のいずれも、幾つもの活性を有する天然の又はインビトロで作製されたキメラタンパク質であり得る。保存された配列モチーフを共有し、類似の酵素活性を有する関連酵素を同定するためのデータベースを検索する方法は、当業者に知られている。例えば、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｃｏｍ）は、保存されたドメインデータベースを提供する。例えば、データベースがエンドヌクレアーゼＩＶの相同体に関して検索される場合、７４個の配列の一致が得られる（ＤＮＡリガーゼに関しては、図６Ａ−１から６Ａ−９及び６Ｂ−１から６Ｂ−２も参照されたい。）。
【００７６】
損傷を受けたＤＮＡを修復するための酵素混合物中で使用される「ポリヌクレオチド切断酵素」とは、特に、修復酵素の１クラスを指し、ＡＰエンドヌクレアーゼ、グリコシラーゼ及び塩基除去修復に必要とされるリアーゼを含む。
【００７７】
ＡＰエンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドを分解せずに修復に寄与する有効量によって特徴付けられる。ＡＰエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼと付随するエキソヌクレアーゼを有し得る。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩは、ＤＮＡに対して有意な分解活性を及ぼすことが発見された（Ｆｒｏｍｅｎｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１１）：ｅ５０（２０００）及び米国公報出願第２００５−００２６１４７号参照）。本明細書において、有効量とは、例えばオリゴヌクレオチド上のＡＰ部位で特異的に切断するが、標準的なゲル電気泳動によって測定された場合にオリゴヌクレオチドの非特異的分解の検出可能な量を示さない酵素の量として定義される。本明細書において特定されるＡＰエンドヌクレアーゼの有効量は、０．０００１から１００単位／μＬの範囲である。この範囲の上限を超えると、非特異的分解が、エンドヌクレアーゼＶＩに対して測定されるように問題となる。以前は、エンドヌクレアーゼＶＩの活性はエキソヌクレアーゼ活性の単位で測定された。エキソヌクレアーゼ活性の量は、本明細書に記載されているエンドヌクレアーゼ濃度の上限を超過した。
【００７８】
損傷を受けた塩基は、デオキシリボース糖部分と塩基との間のＮ−グリコシル結合を加水分解するＤＮＡグリコシラーゼ酵素によって除去することができる。例えば、イー・コリのグリコシラーゼ及びＵＤＧエンドヌクレアーゼは、脱アミノ化されたシトシンに作用するのに対して、イー・コリ由来の２つの３−ｍＡｄｅグリコシラーゼ（ＴａｇＩ及びＴａｇＩＩ）は、アルキル化剤による損傷に作用する。
【００７９】
損傷を受けた塩基のグリコシラーゼによる除去の産物は、正しく置換されなければならないＡＰ部位である。これは、ＡＰ部位に隣接する糖ホスファート骨格に切れ目を入れるエンドヌクレアーゼによって達成することができる。脱塩基糖は除去され、ＤＮＡポリメラーゼ／ＤＮＡリガーゼ活性によって、新たなヌクレオチドが挿入される。これらの修復酵素は、原核細胞及び真核細胞中に見出される。一実施形態において、本普遍的混合物中で使用するためのＡＰエンドヌクレアーゼは、指定された活性範囲で及び個の活性範囲内で使用されるべきであり、増幅前に不活化段階を必要とするべきではない。ＡＰエンドヌクレアーゼは、実施例２０に記載されているアッセイを使用して、本方法及び組成物におけるその使用に関して検査されることができる。
【００８０】
本明細書において適用可能な幾つかの酵素は、１分子中にグリコシラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する。脱塩基部位は、ＡＰエンドヌクレアーゼ及び／又はＡＰリアーゼによって認識及び切断されることが可能である。クラスＩＩのＡＰエンドヌクレアーゼは、ＡＰ部位で切断して、ポリヌクレオチドの重合化に使用することが可能な３’ＯＨを残す。さらに、ＡＰエンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドの重合化を阻害する３’ＯＨへ付着される部分を除去することができる。例えば、３’ホスファートは、イー・コリのエンドヌクレアーゼＩＶによって３’ＯＨへ変換されることができるンドヌクレアーゼは、グリコシラーゼとともに作用することができる。
【００８１】
グリコシラーゼ基質の例には、ウラシル、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン（３−ｍＡｄｅ）、ホルムアミドピリミジン（ＦＡＰＹ）、７，８−ジヒドロ−８−オキシグアニン及びヒドロキシメチルウラシルが含まれる。ＤＮＡ中のウラシルの存在は、重硫酸塩、亜硝酸、又は自発性脱アミノ化によるシトシンの誤組み込み又は脱アミノ化により生じ得る。ヒポキサンチンは、一般に、亜硝酸又は自発性脱アミノ化によるアデニンの脱アミノ化により生じる。これに関連して、３−ｍＡｄｅは、アルキル化剤の産物である。ＦＡＰＹ（７−ｍＧｕａ）は、ＤＮＡのメチル化剤の共通産物である。７，８−ジヒドロ−８オキソグアニンは、グアニンの変異原性酸化産物である。γ照射は、４，６−ジアミノ−５−ＦＡＰＹを生じる。ヒドロキシメチルウラシルは、チミジンに対するイオン化照射又は酸化的損傷によって作られる。
【００８２】
損傷のこれらの異なる種類は、上述の及び表１中の種類のグリコシラーゼを使用して修復され得る。
【００８３】
修復酵素の別の種類はリアーゼである。この酵素は、ポリヌクレオチド中のホスホジエステル結合を破壊することができる。
【００８４】
協調された様式で又は順次に組み合わされたＡＰエンドヌクレアーゼ又はリアーゼ及びグリコシラーゼ活性を有すると思われる幾つもの酵素が単離されている。
【００８５】
複製又は増幅反応において収量又は忠実度の少なくとも１つを増大させる上での使用に適していることがここに明らかとなったポリヌクレオチド切断酵素の例には、あらゆる生物又はウイルスに由来する酵素の以下の種類が含まれるが、これらに限定されるものではない。１）イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ（図７）及びヒトＡＰエンドヌクレアーゼ等のＡＰエンドヌクレアーゼ、２）ＵＤＧ、イー・コリ３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡｌｋＡ）及びヒトＡａｇ等のグリコシラーゼ、３）イー・コリエンドヌクレアーゼＩＩＩ、イー・コリエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、イー・コリＦｐｇ、ヒトＯＧＧ１及びＴ４  ＰＤＧ等のグリコシラーゼ／リアーゼ並びに４）リアーゼである。
【００８６】
既に記載されているよりも低濃度で、すなわち前記範囲でこの酵素を使用することによって、従来技術において記載されているエンドヌクレアーゼＶＩ種の分解が回避されるので、本方法の本実施形態は、修復後及び増幅前に修復酵素を不活化する必要がない。
【００８７】
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を指すが、他の活性を有していてよい。修復及び複製反応を通じて、単一のＤＮＡポリメラーゼ又は複数のＤＮＡポリメラーゼを使用し得る。同一のＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼのセットは、本方法の異なる段階で使用され得、又はＤＮＡポリメラーゼは変動し得、又はその後の操作のために修復後にさらなるポリメラーゼが添加され得る。ポリメラーゼには、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の超好熱性酵素、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ等の好熱性酵素及び中温性ポリメラーゼが含まれる。酵素のこれら３群の何れかに由来するポリメラーゼが、本明細書で使用され得る。好ましくは、これらの群のうち、ギャップ充填ポリメラーゼ又はニック翻訳ポリメラーゼが、本実施形態において使用される。ＤＮＡポリメラーゼの有効量は、実施例において記載されているような公知のＤＮＡを使用して、ＤＮＡリガーゼとＡＰエンドヌクレアーゼとの一定濃度でＤＮＡポリメラーゼを力価測定することによって容易に確認することが可能である。
【００８８】
ポリメラーゼの例には、ＴａｑＤＮＡ及びＴｔｈポリメラーゼ等の耐熱性細菌ポリメラーゼ並びにＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）及びＰｆｕ等の古細菌ポリメラーゼ；Ｂｓｔポリメラーゼ等のより耐熱性が低い酵素、テルモミクロビウム・ロゼウム（ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ等の）幾つかのファージＤＮＡポリメラーゼ、イー・コリｐｏｌＩＶ、イー・コリｐｏｌＶ等のイー・コリｐｏｌＩ及びイー・コリｐｏｌＩＩ  ＹファミリーＤＮＡポリメラーゼ、ヒトｐｏｌκ、ヒトｐｏｌη、Ｓｓｏ  Ｄｐｏ４、Ｓａｃ  Ｄｂｈ、Ｓｃｅ  ｐｏｌζ、ヒトｐｏｌι（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：１１０２−１１１１（２００６）；Ｖａｌｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ５：２１０（２００６）；Ｏｈｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：７−８（２００１）；Ｇｏｏｄｍａｎ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：１７−５０（２００２））又はこれら由来の変異体、誘導体若しくは修飾物が含まれる。誘導体の例には、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）酵素（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）及び、二本鎖結合タンパク質を１つ又は数個の源から得られるポリメラーゼ配列と組み合わせる他のＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００８９】
本明細書に記載されている酵素混合物中で使用される「ＤＮＡリガーゼ」とは、ポリヌクレオチドの一本鎖の５’末端をポリヌクレオチドの別の一本鎖の３’末端へ連結する酵素を指す。リガーゼの有効量は、生化学的適用において一般的に使用される量である。修復反応においてＤＮＡリガーゼの過剰を使用する際の有害な結果は限定されており、又は存在しない。このようなＤＮＡリガーゼは、実質的に全ての真核細胞、原核細胞及び古細菌細胞中で見出され、幾つかのバクテリオファージ及びウイルス中でも見出され得る。適切なＤＮＡリガーゼの例には、９°Ｎリガーゼ（ＰＣＴ／ＵＳ０６／３５９１９）、イー・コリＤＮＡリガーゼ及びＴａｑＤＮＡリガーゼが含まれる。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼも、限定された状況下で使用され得る。このＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡを効率的に平滑末端化して、その後の増幅段階又は複製段階中に望ましくないキメラを生じる。
【００９０】
本発明において有用性を有し得る他のＤＮＡリガーゼ又はリガーゼ様タンパク質は、これらの公知のＤＮＡリガーゼと少なくとも６個の連続したアミノ酸を共有する何れかの酵素が、本発明の実施形態に従って、修復混合物中に含まれ得るデータベース（図６Ａ−１から６Ａ−９並びに図６Ｂ−１及び６Ｂ−２を参照）を検索するために、例えば、イー・コリＤＮＡリガーゼを使用するＢｌａｓｔ検索によって明らかにされる。
【００９１】
いずれもの共因子の不存在下における、エキソヌクレアーゼＩＩＩと組み合わせたＤＮＡリガーゼの公表された使用（米国公報第２００５−００２６１４７号）とは異なり、リガーゼを含む酵素混合物中には、ＮＡＤ＋又はＡＴＰが必要とされることが本発明において見い出された。より具体的には、ＴａｑＤＮＡリガーゼ及びイー・コリＤＮＡリガーゼはＮＡＤ＋を必要とするのに対し、９°ＮＤＮＡリガーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼはＡＴＰを必要とする。図２０Ａ及び２０Ｂは、５００μＭ超の濃度のＡＴＰが、増幅をどのように妨害するかを示している。
【００９２】
ある種のＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼは、ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されており（２００５から２００６年のカタログの１０７から１１７ページが、参照により組み入れられ（ＤＮＡリガーゼに関しては１０２から１０８ページ）。）、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／３５９１９号及び国際公報第ＷＯ２００５／０５２１２４号に記載されている。さらに、耐熱性修復酵素は、増幅前混合物中の耐熱性修復酵素と互換的に使用されることが可能である。耐熱性酵素は、４０℃超又はより具体的には、６５℃若しくはそれ以上で活性を保持する。
【００９３】
普遍的混合物中で例示される酵素の単位の定義は、以下のとおりである：
（ａ）好熱性ＵＤＧ
１単位は、二本鎖のウラシル含有ＤＮＡから１分間あたりウラシル６０ｐｍｏｌの放出を触媒する酵素の量として定義される。活性は、０．２μｇのＤＮＡを含有する５０μＬの反応物中での［３Ｈ］−ウラシルの６５℃で３０分間の放出（１０４から１０５ｃｐｍ／μｇ）によって測定される。（反応緩衝液：１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、２５℃でｐＨ８．８。）
（ｂ）中温性ＵＤＧ
１単位は、二本鎖のウラシル含有ＤＮＡから１分間あたりウラシル６０ｐｍｏｌの放出を触媒する酵素の量として定義される。活性は、０．２μｇＤＮＡを含有する５０μＬ反応物中での［３Ｈ］−ウラシルの３７℃で３０分間の放出（１０４から１０５ｃｐｍ／μｇ）によって測定される。（反応緩衝液：２０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ８．０。）
（ｃ）中温性又は好熱性エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ
１単位は、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド二本鎖１０ｐｍｏｌを含有する１×エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ反応緩衝液中において、３７℃で１時間、１０μＬの総反応容積で、単一のＡＰ部位を含有する３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖１ｐｍｏｌを切断するために必要とされる酵素の量として定義される。（ＡＰ部位は、単一ウラシル残基を含有する３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖１０ｐｍｏｌを、ＵＤＧ１単位で、３７℃で２分間処理することによって作製される；反応緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ８．０。）
（ｄ）中温性又は好熱性エンドヌクレアーゼＩＩＩ
１単位は、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド二本鎖１０ｐｍｏｌを含有する１×エンドヌクレアーゼＩＩＩ反応緩衝液中において、３７℃で１時間、１０μＬの総反応容積で、単一ＡＰ部位を含有する３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖１ｐｍｏｌを切断するために必要とされる酵素の量として定義される。（反応緩衝液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ８．０。）
（ｅ）中温性又は好熱性Ｆｐｇ
１単位は、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド二本鎖１０ｐｍｏｌを含有する１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ１（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中において、３７℃で１時間、１０μＬの総反応容積で、シトシンと対形成された単一８−オキソグアニン塩基を含有する３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖１ｐｍｏｌを切断するために必要とされる酵素の量として定義される。（反応緩衝液：１０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、２５℃でｐＨ７．０及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ。）
（ｆ）中温性又は好熱性８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ
１単位は、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド二本鎖１０ｐｍｏｌを含有する１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中において、３７℃で１時間、１０μＬの総反応容積で、シトシンと対形成された単一８−オキソグアニン塩基を含有する３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖１ｐｍｏｌを切断するのに必要とされる酵素の量として定義される。（反応緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、２５℃でｐＨ７．９及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ。）
（ｇ）中温性又は好熱性ＰＤＧ
１単位は、２０μＬの総反応容積で、３７℃で３０分間、紫外線照射された高次コイルｐＵＣ１９ＤＮＡを、切れ目を入れられた９５％超のプラスミドに変換するのを触媒する酵素の量として定義される。切れ目の入り具合は、アガロースゲル電気泳動によって評価される。照射されたプラスミドは、平均３から５個のピリミジン二量体を含有する。（反応緩衝液：１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２５℃でｐＨ７．２及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ。）
（ｈ）イー・コリエンドヌクレアーゼＶ
１単位は、１０μＬの総容積で、単一デオキシイノシン部位を含有する３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖１ｐｍｏｌを、３７℃で１時間切断するのに必要とされる酵素の量として定義される。（デオキシイノシン部位は、３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖の片側の鎖の中間において、デオキシイノシンを用いた合成的に調製される；反応緩衝液：２０ｍＭトリス−酢酸、５０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール、２５℃でｐＨ７．９。）
（ｉ）好熱性ＤＮＡリガーゼ
１単位は、４５℃で１５分間、５０μＬの総反応容積で、ＢｓｔＥＩＩによって消化されたλＤＮＡ１μｇの５０％連結を付与するのに必要とされる酵素の量として定義される。ＴａｑＤＮＡリガーゼは、ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されている。（反応緩衝液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭジチオトレイトール、０．１％トリトンＸ−１００、２５℃でｐＨ７．６。リガーゼの共因子の必要性に応じて、１ｍＭのＡＴＰ又は０．５ｍＭのＮＡＤ＋の何れかが反応中に含まれる。）
（ｊ）中温性ＤＮＡリガーゼ
１単位は、１６℃で３０分間、２０μＬの総反応容積で、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたλＤＮＡ（０．１２μＭの５’ＤＮＡ終端濃度、３００μｇ／ｍＬ）の５０％連結を付与するのに必要とされる酵素の量として定義される。イー・コリＤＮＡリガーゼは、ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されている。（反応緩衝液：３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、５０μｇ／ｍＬＢＳＡ、２５℃でｐＨ８．リガーゼの共因子の必要性に応じて、０。１ｍＭのＡＴＰ又は０．５ｍＭのＮＡＤ＋の何れかが反応中に含まれる。）
（ｋ）ＡＰエンドヌクレアーゼ
１単位は、３７℃で１時間、１０μＬの総反応容積で、単一のＡＰ部位を含有する３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖１ｐｍｏｌを切断するために必要とされる酵素の量として定義される。（反応緩衝液：５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、２５℃でｐＨ７．９。）
（ｉ）中温性ＤＮＡポリメラーゼ
１単位は、５０μＬの総反応容積で、［３Ｈ］−ｄＴＴＰを含む３３μＭのｄＮＴＰ及び７０μｇ／ｍＬの変性したヘリンボーン状の精子ＤＮＡと共に、酸不溶性材料中にｄＮＴＰ１０ｎｍｏｌを組み込む酵素の量として定義される。（反応緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、２５℃でｐＨ７．９。）
（ｊ）好熱性ＤＮＡポリメラーゼ
１単位は、［３Ｈ］−ｄＴＴＰを含む２００μＭｄＮＴＰ及び２００μｇ／ｍＬ活性化されたウシ胸腺ＤＮＡを用いて、７５℃で３０分間、５０μＬの総反応容積で、酸不溶性材料中にｄＡＴＰ１０ｎｍｏｌを組み込む酵素の量として定義される。好熱性ＤＮＡポリメラーゼ−Ｔａｑポリメラーゼ及び古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されている。
【００９４】
好熱性ＵＤＧ、Ｆｐｇ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩに関する単位の定義は、列挙されている中温性の等価物（ＮＥＢカタログ、ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に関する単位の定義と同一である。（反応緩衝液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、２５℃でｐＨ８．８。）
【００９５】
【表１】
2014027939.tif 000003
2014027939.tif 000004
【００９６】
酵素の普遍的混合物中の酵素の濃度の例は、０．００１単位／μLから４単位／μLの濃度範囲のＴ４ＰＤＧ、０．００００１単位／μＬから１００単位／μＬの濃度範囲のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．００００１単位／μＬから２単位／μＬの濃度範囲のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、０．０００１単位／μＬから１００単位／μＬの範囲のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ、０．００００１単位／μＬから２０単位／μＬの範囲のエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、０．００００１単位／μＬから２０単位／μＬの範囲のＵＤＧ、及び０．０００００１単位／μＬから０．１単位／μＬの範囲のＦｐｇである。
【００９７】
普遍的混合物中に指定されているもの以外のエンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼに関する濃度範囲は、使用される酵素及び反応温度と共に変動し得る。しかしながら、この濃度範囲は、実施例に記載されているアッセイを使用して容易に確認することができる。例えば、λＤＮＡの標準物質調製物は、実施例１に従って加熱処理することができる。次に、ＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼ及び共因子を含有する一連の酵素混合物に供することができる。混合物中の前記酵素に関する好ましい濃度を決定するために、さらなる酵素が力価測定される。このようにして、ＤＮＡ修復は最適化することができる。各試料の増幅後、増幅されたＤＮＡの量は、検査酵素に対する好ましい濃度範囲を明らかにするゲル電気泳動によって決定することが可能である。
【００９８】
実施例において説明されているように、損傷の種類に応じて、ＤＮＡ損傷の性質に応じたさらなる修復酵素を普遍的酵素混合物に補充することが望ましい場合があり得る。あるポリヌクレオチドを修復するための個々の修復酵素又は修復酵素の混合物の適切性を決定するために、前記修復酵素又は修復酵素の混合物の有用性は、実施例及び図面に記載されているアッセイを使用して決定することができる。
【００９９】
ポリヌクレオチドに対する一般的な損傷又は特異的な損傷の修復
（ａ）一般的な損傷
ポリヌクレオチド中の損傷の性質を決定することには、時間がかかる。ポリヌクレオチドに対する損傷の何らかの形態が疑われる場合、例えば、ポリヌクレオチドがほとんど増幅されない場合に、障害を同定する必要性がないことが好ましい。これらの状況では、改良された増幅が得られるかどうかを決定するために、上述のような酵素の普遍的混合物を利用し得る。普遍的混合物を使用すれば、改善が十分である場合には、さらなる作用は必要ではない。改善が十分ではない場合、好ましい結果が得られるまで、本明細書に記載されている混合物へさらなる酵素を添加することができる。アッセイ全体は、９６ウェル皿等の単一反応容器中で達成され得る。皿中の各微小ウェルは、普遍的混合物に加えて、以下に概略されている損傷の各クラスに対処するように選択された酵素を含む異なる酵素混合物に対して利用可能である。
【０１００】
ＤＮＡの一般的な損傷又は未知の損傷の修復のために酵素を選択するためのプロトコールが、図１２（流れ図）及び実施例に記載されているアッセイ中に提供されている。
【０１０１】
（ｂ）特異的な損傷
（ｉ）ＡＰ部位
塩基の喪失は、生理学的条件下での自発性ＤＮＡ損傷の最も一般的な形態である。ＤＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼをベースとした技術は、これらの脱塩基部位の存在によって不利な影響を受ける。プライマー伸長反応の有効性は、ポリヌクレオチド中に見出される全ての脱塩基部位を修復することによって増強される。これは、一実施形態において、脱塩基部位でホスファート骨格を切断するエンドヌクレアーゼＩＶ活性によって達成される。これは、切断された脱塩基部位に対して５’のＤＮＡ断片上に伸長可能な３’ＯＨを残す。これは、切断された脱塩基部位に対して３’のＤＮＡ断片上にデオキシリボース−５’−ホスファート（ｄＲ５Ｐ）も残す。ＤＮＡポリメラーゼは、遊離３’ＯＨから伸長して、切断された脱塩基部位を正しいヌクレオチドと置換することができる。ｄＲ５Ｐは、哺乳動物ｐｏｌβ又は哺乳動物ｐｏｌβの８ＫｄのＮ末端部分等のｄＲ５Ｐを特異的に標的化する酵素によって（Ｄｅｔｅｒｄｉｎｇ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１０４６３−７１（２０００））、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ等のある種のＤＮＡポリメラーゼ中に存在するフラップエンドヌクレアーゼ活性によって又はＦＥＮＩ等の別個のフラップエンドヌクレアーゼによって除去され得る。ｄＲ５Ｐの除去は、フラップエンドヌクレアーゼ活性によるこの群の下流の切断によっても生じ得る。ｄＲ５Ｐの除去及び３’ＯＨに隣接する５’ホスファートの生成の後、ＤＮＡリガーゼは、このニックを封着し、修復を終了し得る（実施例１から３参照）。
【０１０２】
（ｉｉ）修飾されたヌクレオチド
（ａ）チミジン二量体
光は、ピリミジン二量体の形成を誘導することによってＤＮＡを損傷することができる。ピリミジン二量体は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ伸長反応を遮断して、ＤＮＡ増幅を阻害する（Ｗｅｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（８）：１５７８−７９（１９９６））。その結果、増幅前又は増幅中にピリミジン二量体を修復することが望ましい。これは、ピリミジン二量体グリコシラーゼ／リアーゼ（Ｖａｎｄｅ  Ｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３２）：２０２７６−２０２８４（１９９８））を普遍的酵素混合物へ添加することによって達成することができる。ＤＮＡ骨格は、ピリミジン二量体に対して５’で切断され、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能な３’ヒドロキシル部分を残す。ある実施形態において、３’ヒドロキシルでの伸長並びにＤＮＡ伸長の間に生成される障害含有フラップのその後の形成及び切断は、ニックを封着できる酵素によって封着されるニックをもたらす。フラップの切断は、伸長ＤＮＡポリメラーゼ、例えばイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩによって、又はフラップエンドヌクレアーゼの作用によって達成することが可能である（Ｘｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２７）：２０９４９−２０９５５（２０００）、Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：５８９−６１５（２００４））。
【０１０３】
（ｂ）酸化的損傷、アルキル化及び脱アミノ化
損傷を受けた塩基の反対側への望ましくないヌクレオチドの組み込みのために、ＤＮＡ増幅産物中に誤りが導入され得る（Ｇｉｌｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．７２：４８−６１（２００３）、Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：４７９３−９（２００１））。これらの誤りは、同一試料を何度も増幅し、クローニングし及び配列決定した後に発見され得る。塩基損傷による誤りは、ＵＤＧ等の、変異原性ＤＮＡ障害の一般的種類の１つを除去する酵素による試料処理の前及び後に配列データを比較することによっても同定することが可能である（Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：４７９３−９（２００１））。しかしながら、ＵＤＧによる処理は、プライマー伸長によるＤＮＡ増幅を阻害する脱塩基部位をＤＮＡ内に作出する。これによって、ＤＮＡ試料が、ＵＤＧ処理の後の増幅を受けなくなる場合があり得る。次いで、このＡＰ部位は、ＤＮＡリガーゼ並びに好ましくはＡＰエンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼも含有する反応混合物によって修復され得る。ウラシルの除去により、増幅反応において本来この部位で停止されるＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡを増幅し続けることが可能となる。例えば、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ウラシルを含有するＤＮＡテンプレート上で阻害される。ウラシルを除去する能力によって、ＤＮＡポリメラーゼは増強された有効性を有することが可能となる。
【０１０４】
これに対して、ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを含む酵素混合物とともにＵＤＧを含めることは、ポリヌクレオチドの複製又は増幅の産物の収量及び忠実度を増大させるために首尾よく使用され得ることが本明細書で示されている。実施例１１から１３は、ＵＤＧを含む多様な有益な酵素混合物の記述を提供する。
【０１０５】
酸化的損傷の産物である修飾されたヌクレオチドは、Ｆｐｇ又はｈＯＧＧによってポリヌクレオチドから除去されて、エンドヌクレアーゼＩＶ等のＡＰエンドヌクレアーゼによって修復可能な封鎖されたポリヌクレオチドを残すこともできる。
【０１０６】
複製又は増幅の前に、ポリヌクレオチドに対する酸化的損傷を修復するための酵素前処理の有効性は、複製されたポリヌクレオチド産物の改良された忠実度が、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼＩＶ及びＦｐｇを含有する酵素混合物を使用して示されている実施例９において説明されている。
【０１０７】
シトシンがウラシルへ、グアニンがキサンチンへ又はアデニンがヒポキサンチンへ変換されているアルキル化された塩基又は脱アミノ化された塩基等の修飾された他のヌクレオチドは、ミスコードを生じる。修飾されたこれらのヌクレオチドの除去が望ましい。修飾されたこれらの塩基は、上に論述されているＵＤＧによって、又は実施例１０に記載されているＡｌｋＡ若しくはＡａｇによって除去され得る。
【０１０８】
（ｉｉｉ）架橋
ホルムアルデヒド及び巨大な付加物から生じる損傷並びにＤＮＡ−タンパク質架橋結合を形成する化学的に修飾された塩基をもたらす損傷を修復するために、さらなるヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）タンパク質（Ｍｉｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：３０００−３００９（２００５）、Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８５（１１）：１０８３−１０９９（２００３）、Ｓａｎｃａｒ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６５：４３−８１（１９９６））を使用することができる。５’末端において、及び場合によって、損傷を受けた部位の周囲の３’末端において切り込みを作るために、イー・コリＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、変異体ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ又はＣｈｏのうちの少なくとも１つ（Ｍｏｏｌｅｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４６７−７２（２００２））を使用することが可能である。これらの酵素の特性及び精製プロトコールについての詳細は、Ｚｏｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４１９６−４２０５（２００４）から取得することができる。修復過程は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼを用いることによって、及び場合によりフラップエンドヌクレアーゼを用いることによって完了され得る。
【０１０９】
ＮＥＲ酵素がＤＮＡを切断するが、プライマー伸長を阻害するＤＮＡ上の封鎖された３’末端を残す場合には、５’切り込み部位に３’ヒドロキシルが生成することが有用であり得る。一例は、ＮＥＲ酵素がＤＮＡを切断し、３’ホスファートを残した場合である。これは、３’ホスファートが、例えばイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶによって除去されなければ、公知のＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない。
【０１１０】
ＮＥＲ酵素がＤＮＡ障害に対して５’及び３’を切断する場合には、新たに放出されるオリゴヌクレオチドがＤＮＡから解離するときに、損傷が除去される。ＤＮＡポリメラーゼは、ニックを残すＤＮＡの切り出された領域を単に充填することができ、次に、修復を完了するようにリガーゼが封着する。ある種の事例では、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡを充填した後に、残りのＤＮＡ鎖を置換し続け得る。これらの状況では、フラップ分解酵素活性を有する酵素によって、ＤＮＡリガーゼが封着することができるニックが形成可能となる。ＮＥＲ酵素が損傷に対して５’のみを切断する場合には、ＤＮＡポリメラーゼは好ましくは、損傷を過ぎるまで元のＤＮＡ鎖を置換し、その地点でフラップ分解酵素は、ＤＮＡフラップを切断して連結可能なニックを作出する。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ及びフラップ分解酵素活性は、連結可能なニックを残すＤＮＡ障害を最終的に置換及び除去して、ＤＮＡテンプレートを修復するように作用する。上述のアプローチの有効性の一例は、実施例７に提供されている。
【０１１１】
（ｉｖ）ニック、ギャップ及び誤対合されたポリヌクレオチド
ＤＮＡ骨格中のニック及びギャップは、末端切断されたプライマー伸長産物及び一本鎖領域の望ましくないハイブリッド形成によるキメラの形成をもたらし得る。ヘテロ二本鎖ＤＮＡは、多重テンプレートＰＣＲにおいて及び均一テンプレートＰＣＲにおいて問題となり得る（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．＆  Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：６７６−６８１（２０００）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（９）：２０８３−２０８８（２００２）、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．＆  Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６８４７−６８５０（１９９７））。例えば、キメラは、誤対合部位に形成され得る。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ等のＡＴＰ依存性リガーゼは、ＤＮＡを効率的に平滑末端化して、増幅中にキメラが形成する可能性を高める。
【０１１２】
場合によって、普遍的酵素混合物内に含有されるヘテロ二本鎖部位（Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ及びその変異体）において認識及び切断する酵素と一緒にされた、ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの複合的効果は、ＤＮＡ中のニック、ギャップ、ヘテロ二本鎖及びキメラの修復をもたらすことにより、ポリヌクレオチドの複製及び増幅反応の収量及び忠実度を増大させる。実施例８及び図９は、上に例示されているＴ７エンドヌクレアーゼＩ及びＤＮＡリガーゼを使用する有益な効果を示している。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又は変異体にＤＮＡリガーゼを添加することによって、ＤＮＡの非特異的分解を生じずに、エンドヌクレアーゼの増大した濃度を使用することができる。このアプローチは、ＤＮＡの定量化を必要とせず、Ｌｏｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：６７６−６８１（２０００）、及びＳｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６８４７−６８５０（１９９７）によって必要とされるＰＣＲ反応後の余分な段階を回避する。
【０１１３】
幾つかのポリヌクレオチドに関して、損傷の性質は公知であり得る。実例として、酵素の混合物は、特異的な損傷を修復するために、上述の（ｂ）章に従って選択されることが可能である。損傷が未知である場合、又は源が混合されている場合、実施例を含む本明細書中に記載されている普遍的混合物を使用し得る。
【０１１４】
ＤＮＡマイクロアレイ
ＤＮＡマイクロアレイは、ＤＮＡ試料を分析するために使用される強力な方法である（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：３７６−３８０（１９９４）、Ｋｏｚａｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２（７）：７５３−９（１９９６））。まず、損傷を受けたＤＮＡを修復することが、損傷を受けたＤＮＡのマイクロアレイ分析から得られる情報の量及び質に対して有益である。
【０１１５】
増幅
ポリヌクレオチドの複製によってＤＮＡポリメラーゼ依存性増幅が生じる場合、長さ約５００塩基対未満（１００塩基対と同程度に短い）の短い単位複製配列又は５００塩基超の若しくは約１００ｋｂと等しい大きさの長い単位複製配列が、（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＰＣＲ増幅のために）増幅され得る。増幅の他の種類は、広範な範囲の大きさの単位複製配列を生じ得る。例えば、１００塩基と同程度に小さな、又は全ゲノムと同程度に大きな（ヒトに関しては３０億塩基の）サイズを有するポリヌクレオチドが増幅可能である。単位複製配列のサイズの制限は、増幅プロトコールによって決定される。
【０１１６】
本明細書に記載されている方法を使用して試料のポリヌクレオチドを事前温置することで、増幅された産物の再現性及び正確性が改良される。上述の事前温置によって利益を受ける増幅プロトコールには、ＰＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，４５５，１６６号及び第５，４７０，７２３号）；ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）（米国公報第２００４−００５８３７８−Ａ１号）；転写仲介性増幅（ＴＭＡ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０））；インビボのローリングサークルＤＮＡ複製から応用したインビトロでのＤＮＡ増幅において使用するために配列の複数の複製を生じるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４６４１−４６１５（１９９５）；Ｌｕｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４（１９９６）；ＬＩＺＡＲＤＩ，ＥＴ  ＡＬ．，ＮＡＴＵＲＥ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２２５−２３２（１９９８））；及び全ゲノム増幅法（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：６５−６７（２００２））がある。ポリヌクレオチド合成の他の種類には、配列決定反応等のプライマー伸長反応がある。
【０１１７】
本発明の実施形態は、実施例１から２０で説明される。これらの実施例は、以下のことを示す。
【０１１８】
（Ｉ）ポリヌクレオチド修復は、単位複製配列の収量を増大させる（実施例１、２、３、４、５、６、７、９、１３、１４、１７、１８及び１９参照）。これらの実施例と関連して、図１Ｂから１Ｄ及び４は、修復混合物と共に事前温置した後の熱損傷を受けたλＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示している。図２Ｂは、ｐＨ損傷を受けたＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示している。図８Ｃは、多様な修復混合物による処理後の紫外線損傷を受けたＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示している。図１４は、修復混合物と共に事前温置した後のウラシル含有プラスミドからの増大した単位複製配列収量を示している。図１５は、短いオリゴヌクレオチドを修復し、修復されたＤＮＡを増幅することによって、６２０塩基対のＤＮＡの増大した収量を示す。図３は、修復混合物と共に事前温置した後のエタノール試料から抽出したオキアミＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示している。図５は、修復混合物と共に事前温置した後の環境ＤＮＡからの増大した単位複製配列収量を示している。図１７は、ホラアナグマＤＮＡの増大した単位複製配列収量を示す。図１９は、紫外線照射、熱、酸化及びｐＨによって損傷を受けたＤＮＡ試料に及ぼす修復混合物の事前温置の効果を示している。
【０１１９】
（ＩＩ）ポリヌクレオチド修復は、ポリヌクレオチドテンプレートからの複製の忠実度を増大させる（実施例８、９、１０及び１１）。これは、図１１でも図示されている。図１１は、損傷を受けたテンプレートがＰＣＲ前に修復される場合、ｌａｃＺ遺伝子の単位複製配列をクローニングすることによって、白色コロニーの非常により低い割合が生じることを示す。白色コロニーの割合が低ければ低いほど、正しい配列を有する単位複製配列の数はより多い。
【０１２０】
（ＩＩＩ）ポリヌクレオチド修復は、例えば、形質転換のための（実施例１５参照）、クローニングのための（実施例１６参照）及び配列決定のための（実施例１１参照）下流加工を容易にする。これは、図１６にも図示されている。図１６は、ＤＮＡ修復混合物で最初に処理する場合、より多くのイー・コリ形質転換体が、紫外線損傷を受けたプラスミドから回収されることを示している。
【０１２１】
（ＩＶ）単一温度での温置（実施例１２参照）、単一混合物からの修復の広範な範囲（実施例１９参照）、共因子阻害の調節（実施例２０参照）及び望ましくないエキソヌクレアーゼが影響を及ぼすのを最小化すること（実施例２１参照）など、修復のためにパラメータが改良される。これは、図１３、１９及び２０にも図示されている。図１３は、室温（１３Ａ）又は４℃（１３Ｂ）の何れかの単一温度での温置が、紫外線損傷を受けたＤＮＡからの増幅を助けることができることを示している。図１９は、単一の酵素混合物が損傷の広範な範囲を修復することが可能であることを示す。図２０は、最適なＡＴＰ濃度が、ＡＴＰによるＰＣＲ阻害を最小化することが見出され得ることを示している。
【０１２２】
本明細書で引用される全ての参考文献、並びに２００５年１０月２０日に出願された米国出願第１１／２５５，２９０号及び２００４年１０月２１日に出願された米国仮出願第６０／６２０，８９６号、２００５年１月２４日に出願された第６０／６４６，７２８号、２００５年４月２１日に出願された第６０／６７３，９２５号及び２００６年４月１１日に出願された第６０／７９１，０５６号は、参照により組み入れられる。
【０１２３】
実施例
【実施例１】
【０１２４】
熱処理によって損傷を受けたＤＮＡ由来の単位複製配列収量の増大
増幅前にＤＮＡを修復するための選択された試薬の使用を最適化するためのアッセイを開発した。
【０１２５】
熱損傷の多様な程度の生成
ＤＮＡ損傷の多様な量を熱処理により誘導した。これは、次のとおり達成した。ＰＥ２７００サーマルサイクラー中にて、それぞれ９９℃で３０秒間、６０秒間、９０秒間、１２０秒間及び１８０秒間熱処理するために、０．５ｍｇ／ｍＬのλＤＮＡ１００μＬ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を個々のチューブ中へ分注した。前処理なしで増幅するためのテンプレートとして、試料を使用した。
【０１２６】
損傷を受けた残りのＤＮＡを、次のとおり、酵素の混合物によって前処理した。次の混合物中において、室温で１０分間、損傷を受けたＤＮＡテンプレートを温置した。
【０１２７】
ＤＮＡ（５ｎｇ、２ｎｇ及び１ｎｇ）；
１００μＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ＃Ｍ０４４７、ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ＃Ｎ−７００４，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；
８０単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０８，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又はイー・コリＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０５Ｓ）４０から１００単位；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（イー・コリｐｏｌＩ）（ＮＥＢ＃Ｍ０２０９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ（ＮＥＢ＃Ｍ０３０４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又はＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ１０単位；
９６μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ＃Ｂ９００４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。
【０１２８】
反応の終了時に、試料を氷へ移した後、増幅した。
【０１２９】
ＤＮＡ増幅反応
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１１９７−１２０７（２００４）の方法に従って、次のプライマー：ＣＧＡＡＣＧＴＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧ（Ｌ７２−５Ｒ）（配列番号１）及びＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣ（Ｌ３０３５０Ｆ）（配列番号２）を使用して、λのＤＮＡ増幅を実施した。
【０１３０】
増幅混合物４μＬを上述の修復混合物９６μＬへ添加した。増幅混合物は、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液中の１００μＭ  ｄＮＴＰ、５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．１単位のＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ、５×１０−１１ＭのプライマーＬ７２−５Ｒ及び５×１０−１１ＭのプライマーＬ３０３５０Ｆを含有した。
【０１３１】
いずれもの酵素保存緩衝液効果を補正するために、修復酵素が反応から除外された場合には、その保存緩衝液の適切な容積を反応物へ添加した。全ての事例で、増幅反応は、次のパラメータ、すなわち９５℃で２０秒間を１周期の後、９４℃で５秒間、次に、７２℃で５分間の２５周期を使用するサーマルサイクラー中で実施した。増幅される単位複製配列の大きさは、５ｋｂであった。
【０１３２】
１％アガロースゲル電気泳動によって、ＤＮＡ（５ｋｂ）の増幅の結果を決定した。６×添加染色剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１，ｐｐ．５．４−５．１７）を１００μＬの増幅反応物へ添加した。次に、この溶液２０μＬをアガロースゲルへ、サイズ標準物質としての２ログラダー（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇとともに添加した。
【０１３３】
各試料に対して増幅されたＤＮＡ量を、ゲル電気泳動によって比較し、結果を図１ＡからＤに示した。熱処理後であるが、増幅の前に、酵素の混合物で試料を処理した場合に、増幅収量の有意な増大が達成された（図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ）。
【実施例２】
【０１３４】
酵素混合物での前処理後の低ｐＨによって誘導された脱塩基部位を有するＤＮＡから得られる増大した単位複製配列収量
脱塩基部位から生じる損傷の多様な程度の発生
損傷を受けたＤＮＡの修復の程度をアッセイするために、まずＤＮＡ損傷の多様な量を酸性ｐＨによって誘導した。これは、以下のように達成した。
【０１３５】
Ｉｄｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（３２）：８２７６−８３（１９９３）によって記載されているとおり、ＤＮＡを脱プリン化し、エタノール沈殿した。０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、脱プリン化緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．０）中にＤＮＡを再懸濁し、７０℃で０、２０、４０、８０、１２０、及び１６０分間温置した。次に、試料をエタノール沈殿し、０．０１Ｍトリス、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に再懸濁した。緩衝液対照で較正した後、ＤＮＡを含有する溶液のＡ２６０を測定することによって、ＤＮＡ濃度を決定した。
【０１３６】
酵素混合物によるＤＮＡの前処理
次の混合物中で、室温で１０分間、損傷を受けたＤＮＡを温置した。
【０１３７】
ＤＮＡ（低ｐＨ処理の１２０分後の損傷を受けたＤＮＡ２．５ｎｇ）；
１００μＭ  ＮＴＰ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
８０単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ又は０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又は０．１単位のＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）Ｐｏｌ（ＮＥＢ＃Ｍ０２５４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）０．００２単位；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
９６μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１３８】
室温で１０分間、上述の混合物を温置した後、増幅前に氷へ移した。
【０１３９】
ＤＮＡ増幅反応
実施例１に記載されているように増幅を実施し、５ｋｂの単位複製配列を得た。脱塩基部位を含有するλＤＮＡを酵素の混合物で処理することによって、陰性対照（図２Ａ）と比較して、単位複製配列収量が増大した。異なる酵素混合物を使用する一連の前処理に関する結果を図２Ｂに示す。酵素混合物は、ＴａｑＤＮＡリガーゼの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ（イー・コリＰｏｌＩ又はＴａｑ  Ｖｅｎｔ（登録商標）ｐｏｌＩ、Ｔａｑ  ｐｏｌ）に関して変動した。
【実施例３】
【０１４０】
保存料中での保存後の未変性生物から抽出されたＤＮＡの増大した単位複製配列収量
Ｂｕｃｋｌｉｎ，Ａ．＆  Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｄ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．３０（３）：８７９−８８２（２００４）に記載されているとおり、メガニクチファネス・ノルベギカ（Ｍｅｇａｎｙｃｔｉｐｈａｎｅｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃａ）（オキアミ）からゲノムＤＮＡを単離した。オキアミをエタノール中で約５年間保存した。
【０１４１】
酵素の混合物によるオキアミＤＮＡの前処理は、次のとおり実施した。
【０１４２】
Ｍ．ノルベギカゲノムＤＮＡ５０ｎｇ；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
ＴａｑＤＮＡリガーゼ４０単位；
０．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．２単位のＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ、又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．０５単位及びＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）０．００１単位を含有するＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）混合物；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
９６μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１４３】
増幅段階に進行する前に、室温で１５分間、本反応物を温置した。
【０１４４】
ＤＮＡ増幅反応
Ｂｕｃｋｌｉｎ，Ａ．＆  Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｄ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．３０（３）：８７９−８２（２００４）に記載されているとおり、増幅プライマーは５２Ｆ及び２３３Ｒに相当し、２００ｂｐの単位複製配列を生成した。
５２Ｆ：ＴＴＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡ（配列番号３）
２３３Ｒ：ＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＣＧ（配列番号４）
【０１４５】
プライマーを０．５μＭの最終濃度になるように、各ｄＮＴＰを２００μＭの最終濃度になるように添加した。次に、５０：１のＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）混合物（反応物へ添加された５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び０．１単位のＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ）１μＬを各反応物へ添加し、１００μＬの最終容積にした。
【０１４６】
対照反応物（レーン１）については、エンドヌクレアーゼＩＶ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ又は前処理ＤＮＡポリメラーゼを添加しなかった。容積を適宜調整した。修復酵素が省略された反応では、緩衝液効果を調節するために、酵素保存緩衝液の適切な容積を対照へ添加した。
【０１４７】
サイクリング条件は次のとおり、すなわち９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間及び７２℃で１分４０秒間を４０周期であった。上述のとおり、２５μＬ（反応物の１／４）を調製し、１％アガロースゲルに添加し、電気泳動し、可視化した。
【０１４８】
上述の酵素混合物を使用する試料の事前温置後に、オキアミゲノムＤＮＡ由来の増大した単位複製配列収量を観察した（図３）。
【実施例４】
【０１４９】
熱によって損傷を受けたＤＮＡ由来の大きな（１０ｋｂの）単位複製配列の増大した収量
熱によって損傷を受けたＤＮＡを、実施例１に記載されているとおりに調製した。λＤＮＡを９９℃まで１８０秒間加熱した。
【０１５０】
酵素の混合物による損傷を受けたＤＮＡの前処理は、次のとおり実施した。
【０１５１】
λＤＮＡ（１８０秒間熱処理したＤＮＡ１μｇ）；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
ＴａｑＤＮＡリガーゼ８０単位；
イー・コリＰｏｌＩ０．１単位
イー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ１００単位；
９６μＬの容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１５２】
増幅前に混合物を１０分間温置した。
【０１５３】
以下に明記される場合を除き、ＤＮＡ増幅は、実施例１に記載のとおり実施した。上述の事前温置混合物９６μＬへプライマーを添加した。実施例１におけるＬ７２−５ＲをプライマーＬ７１−１０Ｒ（配列ＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＧ）（配列番号５）に置き換えた。ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラープログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）は、９５℃で２０秒間を１周期、９５℃で５秒間、７２℃で１０分間を２５周期、次いで７２℃で１０分間を１周期であった。単位複製配列の大きさは、１０ｋｂであった。
【０１５４】
以下の例外を除き、実施例１に記載されているとおりにＤＮＡを可視化した。６×添加緩衝液２０μＬを１００μＬの増幅反応物へ添加した。この溶液１０μＬを、Ｈ２Ｏ及び１×添加緩衝液で１００μＬになるように希釈した。これを、２０μＬずつ各レーンへ添加した。ゲルは０．８％アガロースゲルであった。結果は、図４に示されている。
【実施例５】
【０１５５】
（土壌試料から抽出された）環境ＤＮＡ由来のＤＮＡの改良された増幅収量
ＭｏＢｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡキット（カタログ番号１２８００−５０）を使用して、環境ＤＮＡを土壌から単離した。
【０１５６】
ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの前処理
土壌から単離された環境ＤＮＡ０．６μｇ並びに以下の（ａ）及び（ｂ）に記載されている２つのＤＮＡリガーゼのうちの１つを含有する１００μＬの最終容積によって、反応混合物が形成された。次に、室温で１５分間、この反応混合物を温置した。
【０１５７】
（ａ）１×ＴａｑＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及びＴａｑＤＮＡリガーゼ８０単位
（ｂ）１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０２，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）８００単位。
【０１５８】
以下に記載されている増幅反応において、反応混合物１μＬを使用した。
【０１５９】
ＤＮＡ増幅反応
ＤＮＡ増幅は、プライマーＧＧＧＧＧＸＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡ（配列番号６）及びＧＧＧＧＧＸＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（配列番号７）（Ｍ＝Ｃ若しくはＡ、Ｙ＝Ｃ若しくはＴ、Ｘ＝８−オキソ−グアニン）を使用して実施した。これらのプライマーは、１．６Ｋｂの単位複製配列の大きさを有する１６ＳｒＤＮＡを標的とする。
【０１６０】
５０μＬの反応物は、各プライマー１０ｐｍｏｌ、修復された環境ＤＮＡ１μＬ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液及び１．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有した。次のサイクリングパラメータを使用して、増幅を実施した。９４℃で５分間を１周期、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分４０秒間を３２周期、次いで７２℃で５分間を１周期。
【０１６１】
実施例１に記載されているように、ゲル電気泳動を実施した。結果は、図５に示されている。
【実施例６】
【０１６２】
紫外線光により損傷を受けたＤＮＡの増大した単位複製配列収量
ＤＮＡ修復の有効性をアッセイするための条件を決定するために、５０μｇのλＤＮＡ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に、５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、３６Ｊ／ｍ２の紫外線光で０、１０、２０、３０、４０及び５０秒間照射した。
【０１６３】
酵素の混合物による損傷を受けたＤＮＡの前処理は、次のとおり実施した。
【０１６４】
次の混合物中において、室温で１５分間、損傷を受けたＤＮＡを温置した。
【０１６５】
ＤＮＡ（０、１０、２０、３０、４０又は５０秒間損傷を受けたλＤＮＡ５０ｎｇ）；
２００μＭ  ｄＮＴＰ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
８０単位又は１０単位の（Ｔ４エンドヌクレアーゼＶとも呼ばれる。）Ｔ４  ＰＤＧ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液
５０μＬになるように、容積を水で調整。
【０１６６】
１５分間の温置の後、５０μＬの反応混合物を増幅溶液５０μＬへ添加した。増幅溶液は、各プライマー（実施例１に記載のＬ７２−５Ｒ及びＬ３０３５０Ｆ又はＬ７２−２Ｒ（ＤＮＡ配列は、ＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧであった。）（配列番号８））４０ｐｍｏｌ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２００μＭ  ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２６７，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、及び５０μＬの最終容積にするためのＨ２Ｏからなった。５０μＬの修復反応物を５０μＬの増幅溶液と組み合わせることによって、１００μＬの最終容積が得られた。
【０１６７】
１００μＬの溶液をサーマルサイクラー中へと配置した。Ｌ７２−５Ｒ及びＬ３０３５０Ｆのプライマーの組み合わせに関しては、９４℃で５分間を１周期、９４℃で３０秒間、５８℃で６０秒間、及び７２℃で４分間を３０周期、７２℃で５分間を１周期であった。
【０１６８】
Ｌ７２−２Ｒ及びＬ３０３５０Ｆのプライマーの組み合わせに関しては、９４℃で５分間を１周期、９４℃で３０秒間、５８℃で６０秒間、及び７２℃で２分間を３０周期、７２℃で５分間を１周期であった。
【０１６９】
臭化エチジウムを使用して、１．８％アガロースゲル上で、増幅産物の存在を可視化した。２ログラダー（ＮＥＢ＃Ｎ３２００Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のサイズ標準物質を含有するレーンに対して、全てのバンドの大きさを比較した。結果は、図８に示されている。
【実施例７】
【０１７０】
ヌクレオチド切除修復タンパク質ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ及びＵｖｒＣを使用するＤＮＡの増大した単位複製配列収量
ヌクレオチド切除修復に関与するタンパク質を含有する酵素混合物を使用して、試料の事前温置後に、オキアミゲノムＤＮＡ由来の増大した単位複製配列収量を決定した。
【０１７１】
酵素の混合物による保存されたＤＮＡの前処理は、次のとおり実施する。
【０１７２】
保存されたＤＮＡを次の混合物中で４から３７℃で１から１８０分間温置する。
【０１７３】
ＤＮＡ：Ｍ．ノルベギカゲノムＤＮＡ５０ｎｇ；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１ｍＭ  ＡＴＰ；
ＴａｑＤＮＡリガーゼ４００単位；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０ｎＭイー・コリＵｖｒＡ、２５０ｎＭイー・コリＵｖｒＢ（又は変異体ＵｖｒＢ＊）、＋又は−５０ｎＭイー・コリＵｖｒＣ；
９６μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１７４】
＊変異体ＵｖｒＢに関しては、Ｚｏｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４１９６−４２０５（２００４）を参照されたい。
【０１７５】
ＤＮＡ増幅反応は、実施例３に記載されているとおりに実施される。
【実施例８】
【０１７６】
ヘテロ二本鎖の酵素切断によって少なくとも１つの鎖において誤ったヌクレオチドを除去した後のＤＮＡの増大した配列正確性
【０１７７】
Ａ．ＴａｑＤＮＡリガーゼをＴ７エンドヌクレアーゼＩへ添加することが、ＤＮＡを無作為に分解せずに、ＤＮＡ調製物中でＴ７エンドヌクレアーゼＩの増大した濃度の使用が可能となった。
【０１７８】
本アッセイは、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩの増大する量とともに十字型構造を含有する高次コイルＤＮＡを処理することに依存する。
【０１７９】
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ＃Ｍ０３０２，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）０、１．６、３．１、６．２、１２．５、２５、５０、１００、２００又は４００単位を、ｐＵＣ（ＡＴ）（Ｇｕａｎ，Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４３１３−４３２２（２００４））１μｇ及び１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ＃Ｂ７００２Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からなる５０μＬの反応物へ添加した。プラスミドｐＡＴ２５ｔｅｔＡをｐＵＣ（ＡＴ）の代わりに使用することが可能である（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：１６９−１７８（１９９７）及びＢｏｗａｔｅｒ，Ｒ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：９２６６−９２７５（１９９４））。反応の別のセットを同時に準備し、１ｍＭ  ＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｎ−７００４，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び（ＮＥＢ＃Ｍ０２０８（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）の原液を１００μ／μＬの濃度で使用する）ＴａｑＤＮＡリガーゼ１００単位の添加とともに、上述の同一構成成分を使用した。全ての反応物を３７℃で６０分間温置した。
【０１８０】
０．９％ＴＢＥアガロースゲル上で反応物を泳動することによって結果を分析し、臭化エチジウムで染色し、紫外線光を使用して可視化した（図９Ａ及び９Ｂ参照）。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを有さないｐＵＣ（ＡＴ）プラスミドは、高次コイル型（下部バンド）及び弛緩した環状型（上部バンド）に相当する２つのバンドをゲル上で生じた。
【０１８１】
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、高次コイル型ｐＵＣ（ＡＴ）を弛緩した環状型及び直鎖型へ分解し、直鎖型は、高次コイル型及び弛緩した環状型に対して中間に泳動した。あるＴ７エンドヌクレアーゼＩ：ＤＮＡの比で、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩが非特異的酵素活性によってＤＮＡを分解したことを示すスメアが生じた。ＴａｑＤＮＡリガーゼの存在は、使用可能なＴ７エンドヌクレアーゼＩ：ＤＮＡ比を有意に増大させた。この比は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを国際公報第ＷＯ２００５／０５２１２４号に記載されているＴ７エンドヌクレアーゼＩ変異体と置換することによってさらに改良される。
【０１８２】
Ｂ．ＰＣＲ反応からヘテロ二本鎖を除去するための方法Ａの使用
土壌からのＤＮＡの単離及び精製されたＤＮＡの増幅は、５単位のＴ７エンドヌクレアーゼＩ又はその変異体を場合によって添加しながら、実施例５に記載されているとおりに実施する。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又はその変異体を添加する場合には、さらなる増幅周期（３７℃で１５分間を１周期）を付加する。最後の段階は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩに、形成された全てのヘテロ二本鎖を切断させることである。
【０１８３】
ゲル電気泳動は、実施例１に記載されているとおり実施する。Ｌｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．＆  Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：６７６−６８１（２０００）に記載されているとおり、ヘテロ二本鎖ＤＮＡをゲル上で可視化する。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又はその変異体の存在下でヘテロ二本鎖ＤＮＡが存在しないことは、ＤＮＡリガーゼとともにＴ７エンドヌクレアーゼＩ又はその変異体の有効性を示す。
【０１８４】
単位の定義は、本明細書中に引用されているＮＥＢカタログ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中の各酵素に関する産物の記述とともに記載されている。例えば、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又はその変異体に関する単位の定義は、高次コイルプラスミド１μｇの９０％超を、５０μＬの反応容積中の９０％超の直鎖ＤＮＡへと３７℃で１時間変換するために必要な酵素の量である。
【０１８５】
ＤＮＡリガーゼの存在下で、ＤＮＡの非特異的な切断を増大させずに、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ：ＤＮＡを増大させることが可能である。
【実施例９】
【０１８６】
酸化的損傷後のＤＮＡ増幅反応の配列の正確性の増大
酸化的損傷を伴うＤＮＡの作製
ｐＷＢ４０７  ＤＮＡ（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３））が、酸化的損傷へ供された。既に記載されているとおりに（Ｓａｔｔｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７６（１）：２６−３（２０００））、メチレンブルー（ＭＢ）と可視光との組み合わせを使用して、損傷を誘発した。プラスミドＤＮＡ（蒸留水中の２００μｇ／ｍＬ）を、パラフィルム伸縮性材料上に滴下した（５０μＬ滴）。０から５０（０、３、６、１２．５、２５及び５０）μｇ／ｍＬの範囲に及ぶ最終濃度になるように、ＭＢを滴へ添加した（１００μＬ最終容積）。これらのパラフィルム伸縮性材料を有するプレートを氷上に配置し、１×１００Ｗの電球で８分間照明を当てた。ＭＢ光で処理されたＤＮＡを沈殿させ、乾燥させた後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）５０μＬ中に再懸濁した。２６０ｎｍでの光の吸光度によって、最終的なＤＮＡ濃度を測定した。
【０１８７】
ＤＮＡ増幅条件
プライマー３１６−１３８（ＴＧＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣ（配列番号９））及び３１６−１３７（ＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡ（配列番号１０））を使用して、ｌａｃＺを含有するｐＷＢ４０７の一部を増幅した。プライマー３１６−１３８及び３１６−１３７はそれぞれ、既に記載されているプライマーＫｆｄ−２９及びＨ３Ｂｌａ３４（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３））をベースにした。１００μＬのＰＣＲ反応物は、テンプレートＤＮＡ１０ｎｇ又は５０ｎｇの何れかを含有し、及び各プライマー４０ｐｍｏｌを場合によって含有した。利用されるサイクリング条件は、増幅に使用されるＤＮＡポリメラーゼの耐熱性によって変動した。
【０１８８】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６７Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用するときのサイクリング条件は、９４℃で５分間を１周期の初期変性段階、次いで９４℃で３０秒間、５８℃で６０秒間、及び７２℃で３分３０秒間を３０周期、並びに最後に７２℃で５分間であった。
【０１８９】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｆ−５３０Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用するときのサイクリング条件は、９８℃で３０秒間を１周期、次いで９８℃で１０秒間、６２℃で３０秒間、及び７２℃で１分３０秒間を３０周期、並びに最後に７２℃で５分間を有した。
【０１９０】
１．６％アガロースゲルに反応物２５μＬを添加することによって反応産物を分析し、調製し、電気泳動し、上述のとおり可視化した（図１０）。使用されるマーカーは、２ログＤＮＡラダー（ＮＥＢカタログ番号Ｎ３２００Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）であった。
【０１９１】
増幅の正確性の測定
ｐＷＢ４０７テンプレートからのＤＮＡ増幅の正確性を、Ｂａｒｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）及びＫｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３）によって記載されるとおりに測定した。酸化的損傷の異なる量へ供したプラスミドｐＷＢ４０７から、ｌａｃＺ遺伝子を含有する単位複製配列を作製した。上述のとおり、メチレンブルーを使用して、酸化的損傷を実施した。上述のとおりテンプレート５０ｎｇを使用して、ＰＣＲ反応を実施した。サイクリング後、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１０単位を各１００μＬのＰＣＲ反応物へ添加し、３７℃で２時間温置した。この段階は、元のテンプレートプラスミドを排除した。次に、得られた増幅産物をフェノール／クロロホルムで抽出し、イソプロパノールを使用して沈殿させた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１，ｐｐ．６．２５，Ａ８．１２−Ａ８．２４）。沈殿した産物をＨ２Ｏ中に再懸濁し、製造元（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって推奨される条件を使用して、制限エンドヌクレアーゼＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断した。６５℃に２０分間加熱することによって、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｔｙＩ酵素を失活させることによって、ＤＮＡ消化反応を停止した。短いＤＮＡ断片を除去するために、ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、制限消化産物を精製した。
【０１９２】
合計５０μＬの修復反応混合物は、ｐＷＢ４０７単位複製配列１０又は５０ｎｇ±メチレンブルー温置物を含有した。修復反応物は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２００μＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）及び多様な修復酵素混合物を含有した。
【０１９３】
５０μＬの合計容積中で個別に又は多様な組み合わせで使用される修復酵素混合物は、次のとおりであった。
【０１９４】
０．４単位のＦｐｇ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２４０Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１９５】
反応物を２５℃で１５分間温置した。温置後、ＰＣＲ混合物（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２００μＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）及び２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６７Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又はＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ１単位の何れか）５０μＬを５０μＬの修復反応物へ添加し、この新たな溶液をＰＣＲ用の温熱サイクリング条件へ供した。これらの反応物由来の単位複製配列を精製し、上述の他の単位複製配列に関して記載されているとおり、制限酵素で消化した。
【０１９６】
単位複製配列をｐＷＢ４０７プラスミド中へクローニングした。制限エンドヌクレアーゼＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、南極ホスファターゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８９Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１単位／ＤＮＡμｇとともに３７℃で３０分間温置することによって、プラスミドｐＷＢ４０７を調製した。脱リン酸化したｐＷＢ４０７ベクター骨格をアガロースゲル電気泳動により精製した。ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してゲル抽出を実施した。
【０１９７】
消化された単位複製配列を、３０μＬの反応物中の調製されたｐＷＢ４０７プラスミド中へ、約０．１μｇのベクターＤＮＡ及び約０．５μｇの単位複製配列を使用して連結した。製造元（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって推奨される条件に従い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結を実施した。連結産物をイー・コリ系ＷＢ４４１中へと電気穿孔した（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｇｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２））。使用される選択された指示薬プレートは、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び８０μｇ／ｍＬのＸｇａｌを含有するＬＢプレートであった。播種の前に、栄養分の豊かなブロス中で細菌を３７℃で１時間温置し、アンピシリン耐性を発現させた。リガーゼ処理を欠失する対照形質転換物は、コロニーをまったく生成しなかった。３７℃で１日後、及び２５℃で１又は２日後、青色に関してコロニーをスコア化した。結果は、図１０Ａから１０Ｂ及び１１に示されている。
【実施例１０】
【０１９８】
脱アミノ化損傷後のＤＮＡ増幅反応の配列の正確性の増大
脱アミノ化されたＤＮＡの発生
脱アミノ化へ供されたＤＮＡは、ｐＷＢ４０７（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：６１３９−６１４７（２００３））である。Ｙａｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７（４）：２６４０−５０（２００３）に記載されているとおり、亜硝酸による無作為な変異原性を使用して、損傷を発生させる。亜硝酸は、ＤＮＡ中のグアニンをキサンチンへ、シトシンをウラシルへ、及びアデニンをヒポキサンチンへ脱アミノ化することが可能である。
【０１９９】
プラスミドＤＮＡ（２μｇ）を１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）中の０．７Ｍ  ＮａＮＯ２で処理する。氷冷１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）４容積の添加によって、様々な時点で反応を終結させる。プラスミドＤＮＡをアルコール沈殿させ、乾燥させた後、ＴＥ緩衝液１００μＬ中に再懸濁する。
【０２００】
脱アミノ化された塩基を修復するための前処理反応
５０μＬの合計容積中で個別に又は多様な組み合わせで使用される修復酵素混合物は、次のとおりである。
【０２０１】
（ａ）
１単位のヒトＡａｇ；
２単位のエンドヌクレアーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６８Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＵＤＧ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８０Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０２０２】
（ｂ）
２単位のエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＵＤＧ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８０Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０２０３】
（ｃ）
２単位のエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０２０４】
（ｄ）
１単位のヒトＡａｇ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のエンドヌクレアーゼＩＩＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６８Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０２０５】
（ｅ）
１単位のヒトＡａｇ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＵＤＧ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８０Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０２０６】
（ｆ）
１単位のヒトＡａｇ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０２０７】
実施例９に記載されているとおり、増幅反応条件及び増幅正確性測定を実施する。
【実施例１１】
【０２０８】
配列決定反応の感度を増大させるためにＤＮＡ配列決定反応において使用する前のＤＮＡの修復
配列決定反応の感度とは、配列決定前に正確な配列を有するテンプレートＤＮＡの量が、低下した背景ノイズ及び増大したシグナルを生じることを意味するものとする。これによって、より長い及び／又はより完全な配列の読み取りが可能となる。配列読み取りの改良された忠実度は、さらなる利点である。以下に記載されているような修復混合物の有益な使用が、配列決定方法に関して一般的に観察され得る。例えば、配列決定法には、４５４配列決定、単一分子配列決定、サンガー配列決定及びマクサム−ギルバート配列決定がある。
【０２０９】
ＤＮＡ修復の前及び後に、２つのＤＮＡ試料をＤＮＡ配列決定に供する。２つのＤＮＡ試料を４０秒間紫外線処理し（実施例６参照）、２５μｇ／ｍＬメチレンブルーの存在下でλＤＮＡを光へ曝露する。
【０２１０】
ＤＮＡ配列決定反応における使用の前に、修復酵素の活性を可能にする条件下で、配列決定されるべきＤＮＡを１つ又はそれ以上の修復酵素と接触させる。例えば、配列決定用の０．５μｇのテンプレートＤＮＡを、１×濃度になるようにＮＥＢ  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と混合し（Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液の１×濃度は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００を含有する。）、室温で１５分間ＤＮＡ修復酵素（２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、１単位のＴ４  ＰＤＧ、１５単位のエンドヌクレアーゼＩＶ、２．５単位のエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、０．１単位のＦｐｇ、及び必要に応じて０．５単位のイー・コリＵＤＧ）とともに温置する。修復されたＤＮＡを、配列決定のために即時使用するか、又はＤＮＡ配列決定前に、市販のキット（例えばＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡキット）を使用して精製及び濃縮する。配列決定反応は、古典的なサンガー配列決定反応によって、又は米国公報第２００５／０１００９３２号、米国特許第６，８９７，０２３号、又はＭａｒｇｕｌｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３７（７０５７）：３７６−８０（２００５）に記載の方法によって実施され得る。
【０２１１】
修復混合物による事前温置の結果、配列決定反応の感度及び結果の忠実度が改善される。
【実施例１２】
【０２１２】
損傷を受けたＤＮＡを修復するための多重酵素修復混合物は単一の温度において効果的である
紫外線で３０秒間照射することによって、λＤＮＡを処理した（実施例６参照）。事前修復を行い又は行わずに、紫外線処理されたλＤＮＡから５キロベースの単位複製配列を増幅するために、Ｌ７２−５Ｒ（配列番号１）及びＬ３０３５０Ｆ（配列番号２）プライマーを選択した。ＤＮＡ修復混合物は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０％グリセロール中の、２００単位／μＬのＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位／μＬのイー・コリＰｏｌＩ、１単位／μＬのＴ４  ＰＤＧ、１５単位／μＬのエンドヌクレアーゼＩＶ、０．５単位／μＬのイー・コリＵＤＧ、２．５単位／μＬのエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及び０．１単位／μＬのＦｐｇを含有した。１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、１００μＭ  ｄＮＴＰ及び０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋を各々含有するサーモサイクラーチューブへ、３０秒間紫外線処理されたλＤＮＡ５０ｎｇを添加した。修復酵素混合物１μＬを、８本のチューブのうちの４本へ添加し、全てをＨ２Ｏで４７μＬの最終容積にした。修復酵素を含有する２本のチューブと、酵素を欠失する２本のチューブとを、室温で１５分間温置した。残りの溶液を４℃で一晩温置した。表記定温時間の後、プライマー（１μＭ）、ｄＮＴＰ（１００μＭ）及び２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを各サーモサイクラーチューブへ添加し、９５℃で２分間を１周期、９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で５分間を２５周期、７２℃で５分間を１周期、及び４℃で保持するプログラムを実行するＭｙＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中に溶液を配置した。各反応物２５μＬを１％アガロースゲルで分析した。
【０２１３】
修復を達成するために複数の異なる温度を使用することを必要とした他者の知見（米国公報第２００６／００１４１５４号）とは対照的に、紫外線による損傷を受けたＤＮＡを上述の修復混合物とともに、室温で１５分間又は４℃で一晩温置すると、正確な大きさの増幅産物が生じた（図１３Ａ及び１３Ｂ）。
【実施例１３】
【０２１４】
複数のウラシルを含有するプラスミドＤＮＡの修復、及びＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用する増幅
イー・コリＣＪ２３６からプラスミドｐＮＥＢ０．９２Ｕを精製した（ＮＥＢ＃Ｅ４１４１Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。配列を図１８に示す。イー・コリＣＪ２３６は、ｄＵＴＰａｓｅ及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを欠失しているので、本プラスミドは、その配列を通じて無作為に分布されたウラシルを含有する。古細菌ポリメラーゼＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼは、ウラシル含有テンプレートによって阻害される。事前修復を行い又は行わずに、プライマーＳ１２２４Ｓ（ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）（配列番号１２）及びＳ１２３３Ｓ（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ）（配列番号１３）を使用して、ｐＮＥＢ０．９２ＵＤＮＡ由来の９２０塩基の単位複製配列の増幅を実施した。ＤＮＡ修復混合物は、２００単位／μＬのＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位／μＬのイー・コリＰｏｌＩ、１単位／μＬのＴ４  ＰＤＧ、１５単位／μＬのエンドヌクレアーゼＩＶ、０．５単位／μＬのイー・コリＵＤＧ、２．５単位／μＬのエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及び０．１単位／μＬのＦｐｇを含有し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０％グリセロール中に保存した。０．５ｎｇ  ｐＮＥＢ０．９２Ｕ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、１００μＭ  ｄＮＴＰ及び０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋を各々含有する４本のサーモサイクラーチューブのうちの２本へ、修復酵素混合物１μＬを添加した。全てＨ２Ｏで４５μＬの最終容積にした。反応溶液を、室温で１５分間温置した後、プライマー（最終濃度：０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（最終濃度：１００μＭ）及び１単位のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを各チューブへ添加した。９５℃で２分間を１周期、９５℃で１０秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５周期、７２℃で５分間を１周期、次いで４℃で保持というプログラムを実行するＭｃＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー中へ溶液を配置した。各反応物２５μＬを１％アガロースゲルで電気泳動することによって検討した。
【０２１５】
ウラシルを除去せずにＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用してｐＮＥＢ０．９２Ｕから増幅すると、わずかに検出可能な望ましい大きさの産物が生じた。ｐＮＥＢ０．９２Ｕを修復混合物で処理すると、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して本プラスミドから生じた単位複製配列の量が有意に増大した（図１４）。
【実施例１４】
【０２１６】
ＤＮＡ断片由来の増大した単位複製配列収量
本反応におけるテンプレートは、平均的な大きさが約４５ヌクレオチドの２０の重複する合成一本鎖オリゴヌクレオチドのセットであった。オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。
【０２１７】
【化１】
2014027939.tif 000005
2014027939.tif 000006
2014027939.tif 000007
2014027939.tif 000008
2014027939.tif 000009
【０２１８】
組立反応は、組立段階及び増幅段階という２つの部分からなる。組立段階については、標準的な反応物は５０μＬであり、各オリゴ７０ｎＭ、１００μＭ  ｄＮＴＰ、０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有した。対照反応物には、酵素は添加されなかった。第一の実験反応物は、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４  ＰＤＧ、及び２０単位のエンドヌクレアーゼＩＶも含有した。反応物の第二のセットは、第一の反応物中で使用される酵素及び、１：１のβタンパク質：ヌクレオチドモル比で添加されるλβタンパク質（Ｋｍｉｅｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１２６３６−１２６３９（１９８１）、Ｒｙｂａｌｃｈｅｎｋｏ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１７０５６−１７０６０（２００４））を含有した。第三の反応物セットは、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４  ＰＤＧ、２０単位のエンドヌクレアーゼＩＶ、０．３ｍＭ  ＡＴＰ、及び３：１のモル比のヌクレオチド：ＲｅｃＡを含有した。ＲｅｃＡは、イー・コリ由来であった（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２４９Ｌ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。第四の反応物セットは、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４  ＰＤＧ、２０単位のエンドヌクレアーゼＩＶ、０．３ｍＭ  ＡＴＰ、３：１のモル比のヌクレオチド：ＲｅｃＡ、及び１：１のモル比のβタンパク質：ヌクレオチドを含有した。各反応物中のグリセロール含有量を調節した。反応混合物を、室温で３０分間温置した。
【０２１９】
室温で温置した後、２００μＭ  ｄＮＴＰ、５００ｎＭのオリゴヌクレオチド３１６−２１９及び３１６−２６６、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ１単位、及び１００μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液を使用して、組立反応物５μＬを増幅した。反応物を混合し、ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中に配置し、次の温熱サイクラータッチダウンプログラム、すなわち９４℃で２分間（１周期）、９４℃で３０秒間、７２℃ないし６２℃（１周期当たり１℃低下）で３０秒間、７２℃で４５秒間（１０周期）、９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で４５秒間（２０周期）、７２℃で５分間（１周期）、及び４℃で保持を使用した。各反応を二つ組で実施した。１０×試料緩衝液１１μＬを各試料へ添加し、電気泳動用の１％アガロースゲルへ、２５μＬを添加した。
【０２２０】
結果を図１５に示す。組立反応物が修復タンパク質の添加を含有しない場合には、増幅段階後に増幅産物は検出されなかった。しかしながら、修復タンパク質が組立反応物中に添加された場合には、増幅段階から正確な６２０ｂｐの単位複製配列を得た。λβタンパク質及び／又はイー・コリＲｅｃＡを含めることによって、単位複製配列収量はさらに増大した。ＤＮＡテンプレートが断片から構成されるシステムにおいて、ＤＮＡ修復タンパク質を含めることによって、単位複製配列を生じる能力を促進することが結論付けられた。さらに、前記ＤＮＡ修復タンパク質の幾らかが、ＤＮＡ組換えに関与することが知られている場合には、この効果は増大される。
【実施例１５】
【０２２１】
イー・コリへの損傷を受けたプラスミドＤＮＡによる増大した形質転換効率性
プラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０９１３７）を１％アガロースゲルへ適用し、臭化エチジウムの存在下で、プラスミドがゲル中へ移動するまで電気泳動を行った。ゲル中のＤＮＡを２５４ｎｍの紫外線光へ６０秒間供した。紫外線曝露の間、ｐＵＣ１９プラスミドを含有するゲルプラグを切り出した。Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ゲルプラグからプラスミドを抽出した。それぞれ０．５ｍＭ及び１００μＭまでＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ製品＃Ｎ−７００４，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びｄＮＴＰ（ＮＥＢ＃Ｎ０４４７Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）が添加された１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ＃Ｂ９００４Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中の、５０単位のイー・コリＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢＭ０２０５Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４  ＰＤＧ及び２０単位のエンドヌクレアーゼＩＶで、２５μＬの最終容積中の紫外線照射されたＤＮＡ又は照射されていないＤＮＡ３０ｎｇを処理した。室温で１５分間、反応物を温置した後、ＤＮＡを使用してイー・コリＤＨ−５α（ＮＥＢ＃Ｃ２９９１Ｈ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を形質転換した。対照として、紫外線照射されたＤＮＡ及び照射されていないＤＮＡを両者とも、添加された酵素のない状態で上述のとおり処理した。修復酵素で処理され又は処理されなかった紫外線照射されたプラスミドＤＮＡ及び照射されていないプラスミドＤＮＡにより、ＤＨ５α細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡの存在下で、イー・コリに熱ショックを与えることによって、形質転換を実施した。イー・コリ及びプラスミド５０μＬを氷上で３０分間温置した後、４２℃で３０秒間温置した。次に、形質転換反応物を氷上で２分間放置した後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上に細胞を播種した。各形質転換物の異なる希釈を有するＬＢアガープレートを３７℃恒温器中に一晩放置し、プラスミドの形質転換効率性を決定した。
【０２２２】
紫外線照射に供され修復されていなかったプラスミドｐＵＣ１９は、修復酵素混合物で処理された損傷を受けていないｐＵＣ１９プラスミドと比較して、形質転換効率性が有意に低下した（図１６参照）。
【実施例１６】
【０２２３】
ＰＣＲ、クローニング又は固定に必要なその後の連結のためのＤＮＡの同時修復及び平滑末端化
ＤＮＡライブラリは、環境、組織、又は細胞培養物から共通して作製される（Ｂｒａｄｙ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７０（１１）：６８６５−６８７０（２００４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｂｏｋｅｎ，ＮＪ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５：“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”（２００４）、Ｃｏｕｔｏｉｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（６９（１）：４９−５５（２００３）、米国特許第６，４４４，４２６号）。これらのライブラリは、超音波処理、酵素処理又は噴霧によって望ましい源からＤＮＡを剪断し、ＤＮＡ末端を調製し、混合物をオリゴヌクレオチド又はプラスミドＤＮＡと連結することによって、定型的に作製される（Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ａ．Ｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１（２０）：６８２０−６８３２（２００１））。オリゴヌクレオチドへの連結によって、連結されたオリゴと相補的なＤＮＡ配列を含有するアレイ上で、その後のＰＣＲ又は固定を行うことが可能である。プラスミドへの連結によって、異種性の宿主中での伝播が可能となる。最近ライブラリが使用されているのは、染色質の免疫沈降においてである（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２（２４）：８６０３−８６０８（２００５）、Ｒｅｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２４５−２５６（２００２）、及びＯｄｏｍ，Ｄ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１３７８−１３８１（２００４））。平滑末端の連結のためのＤＮＡ末端を調製することの一環として、研究者は、しばしば、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼを使用する。しかしながら、本実施例では、精製、調製及び保存の間にＤＮＡが獲得し得る損傷を修復することが可能であるのみならず、平滑末端も作製することが可能な酵素混合物が提供される。本酵素混合物は、ＤＮＡリガーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼの有効量、校正ＤＮＡポリメラーゼ及び酵素活性を可能にするために必要な全ての共因子を含む。好ましくは、混合物は、ＤＮＡリガーゼ、校正ＤＮＡポリメラーゼ、脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ、ＵＤＧ、ＦＰＧ、及びＴ４  ＰＤＧからなる。
【０２２４】
一例として、染色質免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、既に記載されているとおり、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５又はＥ２Ｆ６に対する抗体を使用して、ＨｅＬａ細胞ＤＮＡにおいて実施される（Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ａ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（２０）：６８２０−６８３２（２００１））。ＣｈＩＰで濃縮されたＤＮＡのクローニングは、既に記載されているとおりである（Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ａ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（２０）：６８２０−６８３２（２００１））。ＤＮＡを平滑末端化するためのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ単独の使用は、少なくともＤＮＡリガーゼと校正ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせを含有する酵素混合物によって置換される。例えば、０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋及び１００μＭ  ｄＮＴＰの補充された１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液中で、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ、２０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ、５単位のＴ４  ＰＤＧとともに、室温で１５分間、ＤＮＡを温置する。連結段階の前に、平滑末端化され及び修復されたＤＮＡを７５℃で２０分間温置することによって、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩを不活性化することが可能である。
【０２２５】
反応混合物中の校正ＤＮＡポリメラーゼの混合物は、プライマー若しくはプラスミドの何れかへのその後の連結のために、ＤＮＡ末端を平滑末端化することが可能である。
【実施例１７】
【０２２６】
ＤＮＡ断片由来の増大した単位複製配列収量。増幅、ＤＮＡ配列決定、マイクロアレイ分析及びハイブリッド形成分析等の下流段階のための、断片化されたＤＮＡ由来のより大きなＤＮＡ片の生成
５から１０００μＬの最終容積中の標準反応緩衝液及び必要な全ての共因子中のイー・コリＲｅｃＡ（ＮＥＢ＃Ｍ０２４９Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、Ｗｅｓｔ，Ｓ．Ｃ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，  ６０３−６４０（１９９２））及び／又はλβタンパク質（Ｒｙｂａｌｃｈｅｎｋｏ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（４９）：１７０５６−１７０６０（２００４）、Ｋｍｅｉｃ，Ｅ．，＆  Ｈｏｌｌｏｍａｎ，Ｗ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（２４）：１２６３６−１２６３９（１９８１））等の組換え／ＤＮＡアニーリング能の高いタンパク質とともに、０．１から１０００ｎｇの断片化されたＤＮＡを温置する。標準的な反応緩衝液の一例は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び５０ｍＭ  ＮａＣｌである。ＲｅｃＡを使用する場合には、１ｍＭ  ＡＴＰが標準的な反応に含まれる。ＲｅｃＡ及び／又はβタンパク質との温置と同時に又は温置の後に、少なくともＤＮＡリガーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性及び必要な全ての共因子、すなわちＡＴＰ、ＮＡＤ＋及びｄＮＴＰからなる修復混合物とも、ＤＮＡを接触させる。修復混合物は、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ及び０．１単位のイー・コリＰｏｌＩを含有し、さらに、５単位のＴ４  ＰＤＧ、２０単位のエンドヌクレアーゼＩＶ、０．５単位のイー・コリＵＤＧ、２．５単位のエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及び／又は０．１単位のＦｐｇが添加される。修復タンパク質との温置の前に、ＤＮＡ断片は熱変性され得、温度は３９℃未満まで低下され得る。例えば、反応緩衝液中のＤＮＡを、９８℃に５分間加熱した後、３９℃未満に冷却し得る。標準的な反応容積は、５から１０００μＬであり、温置時間は、４から３７℃で１から６０分である。典型的には、０．５：１から５：１のヌクレオチド：タンパク質モル比で、ＲｅｃＡ又はβタンパク質を使用する。
【０２２７】
上述の方法に対する改変には、ＲｅｃＡ及び／又はβタンパク質を耐熱性の等価物と置換することが含まれる。これらのタンパク質の幾つかの例は、ｔｔＲｅｃＡ（Ｋａｔｏ  Ｒ，＆  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ  Ｓ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９（３）：５９２−６０１（１９９９））、Ｔａｑ  ＲｅｃＡ、Ｔｍａ  ＲｅｃＡ及びＡｐｙ  ＲｅｃＡ（Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９（４１）：２５９２８−３５（１９９４））である。耐熱性タンパク質の使用は、耐熱性ＲｅｃＡ又はβ様タンパク質が、変性段階中にＤＮＡと混合されることが可能であることを意味する。タンパク質活性に必要な全ての共因子も含まれる。さらに、上記修復酵素は、変性の前又は後に添加される。耐熱性組換えタンパク質（ＲｅｃＡ又はβ様タンパク質）に関して、前記タンパク質を反応混合物へ４５から７５℃で１から６０分間添加して、非耐熱性修復タンパク質の添加前に３９℃未満の温度で最適な活性にすることが可能であることに留意されたい。
【０２２８】
次に、修復されたＤＮＡは、その後の段階、例えばＰＣＲにおいて使用されることが可能である。例えば、検査系として、超音波を使用してヒトゲノムＤＮＡを断片化し、大きさを分画して、約２００ｂｐにクラスター化される平均的な断片の大きさを付与する。大きさで分画された材料５００ｎｇを上述のとおり処理する。損傷を受けていないヒトゲノムＤＮＡから１、２及び４ｋｂの単位複製配列を確実に発生させるプライマーを使用するＰＣＲ反応において、この修復された材料５から１００ｎｇの用量設定を使用する。プライマーセットの例は、
ＤＮＭＴ−Ｒ：
ＧＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴＡＣＴ（配列番号３４）、
ＤＮＭＴ−１Ｆｂ：
ｃｃｔｃａｔｔｔｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｔａｔｃｔ（配列番号３５）、
ＤＮＭＴ−２Ｆｃ：
ｃｃｔｇａａａｃａａｇｇｔｔｇｔｇｇｃａｔａｇｃ（配列番号３６）、及び
ＤＮＭＴ−４Ｆｂ：
ｇａｇｔｇａｇｔｔｇａａａｇｔｇｃｔｃｃａｔａｃａ（配列番号３７）
である。
【０２２９】
断片化されたＤＮＡを用いて、同じテンプレートの用量設定を実施する。修復されていないＤＮＡ及び修復されたＤＮＡを比較すると、修復されたテンプレートは、紫外線光及び臭化エチジウムで可視化されるアガロースゲル上で可視的単位複製配列をテンプレートＤＮＡの少なくとも２倍低い量で生じさせた。
【０２３０】
少なくともＤＮＡリガーゼ活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性とともにＲｅｃＡ及び／又はβタンパク質様活性を使用することによって、修復されていないＤＮＡと比べて、より低いテンプレート量で、ＰＣＲ単位複製配列が検出される。
【実施例１８】
【０２３１】
ＤＮＡ損傷の修復後の保存されたホラアナグマ組織試料からのＤＮＡの増幅
現代の材料とは異なり、古代の骨から抽出されるＤＮＡは、様々な損傷の種類を示す。損傷の最も普遍的種類は、一本鎖の破損によって生じる断片化であり、これは、照射及び活性酸素種等の非酵素的攻撃に加えて、抽出されたＤＮＡの平均分子長を低下させる（Ｈｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（７）：１３０４−７（１９９６））。古代のＤＮＡ（ａＤＮＡ）の損傷を修復することは、抽出されたＤＮＡの有用性を向上させるのに重要である。
【０２３２】
Ｐａａｂｏ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６（６）：１９３９−４３（１９８９）に記載されているとおり、古代のＤＮＡを抽出した。事前修復を行い又は行わずに、プライマーＣＢＦ１（ＣＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＡＣ）（配列番号３８）及びＣＢＲ１（ＧＧＡＧＣＧＡＧＡＧＧＴＡＣＡＣＧＴ）（配列番号３９）を使用して、３３０ｂｐのホラアナグマＤＮＡ（約４４，０００年経たもの）の増幅を実施した。ＤＮＡ修復混合物は、２００単位／μＬのＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位／μＬのイー・コリＰｏｌＩ、１単位／μＬのＴ４  ＰＤＧ、１５単位／μＬのエンドヌクレアーゼＩＶ、０．５単位／μＬのイー・コリＵＤＧ、２．５単位／μＬのエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及び０．１単位／μＬのＦｐｇを含有し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０％グリセロール中で保存した。２μＬのａＤＮＡ、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、１００μＭ  ｄＮＴＰ及び０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋を各々含有する４本のサーモサイクラーチューブのうちの２本へ、修復酵素混合物１μＬを添加した。全てをＨ２Ｏで４５μＬの最終容積にした。反応溶液を室温で１５分間温置した後、プライマー（最終濃度０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（最終１００μＭ）及び１単位のＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを各々へ添加した。９８℃で３０秒間を１周期、９８℃で１０秒間、５８℃で２０秒間及び７２℃で２０秒間を３０周期、７２℃で５分間を１周期、次いで４℃で保持というプログラムを実行するＭｃＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中へ溶液を配置した。修復されたＰＣＲ増幅されたＤＮＡ及び対照のＰＣＲ増幅されたＤＮＡ（修復なし）を、入れ子状態のプライマーを使用する第二のＰＣＲ増幅において直ちに使用した。入れ子状態のプライマーとの増幅反応は、１×Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（カタログ番号Ｍ０２７０Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、先行段階の増幅物２μＬ並びに０．２μＭの最終濃度のプライマーＣＢ  Ｆ１（ＣＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＡＣ）（配列番号４０）及びＣＢ  Ｆ３（ＧＣＣＣＣＡＴＧＣＡＴＡＴＡＡＧＣＡＴＧ）（配列番号４１）を使用した。反応容積全体は５０μＬであった。１％アガロースゲルへ各反応物５μＬを適用することによって反応物を分析し、調製し、電気泳動し及び上述のとおり可視化した。
【０２３３】
プライマー５’−ＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＡＡＡ−３’（配列番号４３）及び５’−ＡＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＧ−３’（配列番号４４）を使用するＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、ホラアナグマ骨試料中のミトコンドリアＤＮＡの量を概算した。
【０２３４】
増幅されたＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定法において即時使用し、又はＤＮＡ精製及び濃縮へ供した。精製後、ＤＮＡをＤＮＡ配列決定へ供する（実施例１１参照）。
【０２３５】
入れ子状態のＰＣＲにおいて、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用するホラアナグマＤＮＡからの増幅は、１試料（ＣＢ３Ａ）中で望ましい単位複製配列の大きさの検出可能な産物を生じた。修復混合物による処理は、試料ＣＢ３Ｂから別の単位複製配列を生じた。処理された及び処理されていないホラアナグマＤＮＡ（ＣＢ３Ｂ試料）からの単位複製配列の配列分析は、Ｈｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（７）：１３０４−７（１９９６）に記載されているＤＮＡ修飾と関連したＰＣＲ増幅誤差を除去するために、修復混合物による処理が有意に役立ったかどうかを明らかにする。
【０２３６】
修復酵素混合物によるホラアナグマＤＮＡテンプレートの処理によって、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼは、望ましい単位複製配列をより効果的に生じ、ＰＣＲ増幅誤差を除去することが可能となった（図１７）。
【実施例１９】
【０２３７】
単一修復混合物によるＤＮＡ損傷の多様な種類の修復
紫外線照射、熱又は酸性ｐＨによって、ＤＮＡに対する損傷を誘導した。７種酵素混合物が、損傷を受けたＤＮＡを効果的に修復することを発見した。
【０２３８】
（ａ）紫外線損傷を受けたＤＮＡの生成
（ｉ）実施例６に記載されるように、紫外線への曝露によって、λＤＮＡ尾を損傷したが、例外は、紫外線温置時間が５分であることであった。紫外線ランプの出力は、１４．６ｍＷ／ｃｍ２であった。ＵＶＰ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｇａｂｒｉｅｌ，ＣＡによって製造されたＵＶＸ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒを使用して、紫外線光の強度を測定した。ＤＮＡの濃度は、５０ｎｇ／μＬであった。
【０２３９】
（ｉｉ）実施例６において記載されるように、ヒトゲノムＤＮＡ（カタログ番号７０５７２−３、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を２０秒間紫外線損傷した。ＤＮＡの濃度は、５０ｎｇ／μＬであった。
【０２４０】
（ｂ）酸性ｐＨ及び紫外線により損傷を受けたλＤＮＡの生成
実施例２に記載されるように、低ｐＨ中でＤＮＡをまず処理することによって、酸及び紫外線により損傷を受けたλＤＮＡを生成した。ＤＮＡを７０℃で１２０分間温置した。損傷を受けたＤＮＡを５０ｎｇ／μＬに希釈し、実施例６に記載されるように、紫外線光へ３０秒間曝露した。
【０２４１】
（ｃ）酸性ｐＨにより損傷を受けたλＤＮＡの生成
（ｉ）実施例２に記載されるように、λＤＮＡ（５００ｎｇ／μＬ）の調製物を処理し、酸損傷を生じた。酸損傷を受けたＤＮＡの最終濃度は、２３２ｎｇ／μＬであった。
【０２４２】
（ｄ）熱損傷を受けたλＤＮＡの生成
実施例１に記載されるように、熱処理によってλＤＮＡを損傷した。本実施例では、１８０秒間の時点のみを使用した。
【０２４３】
（ｅ）酸化されたプラスミドＤＮＡの生成
実施例９に記載されるように、プラスミドｐＷＢ４０７を酸化した。反応物中のメチレンブルーの量は、１２ｎｇ／μＬであった（これをチェックすること）。ＤＮＡの濃度は、５０ｎｇ／μＬであった。
【０２４４】
ＤＮＡ修復
上述のように損傷を受けたＤＮＡを、ＰＣＲ前にＤＮＡ修復混合物で処理した。
【０２４５】
酵素カクテルから、修復混合物を形成し、混合物１μＬは以下を含有した：
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ
０．０１単位から２００単位のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ＊
０．０１単位から５０００単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ
０．０１単位から２００単位のＴ４  ＰＤＧ
０．００１単位から１０００単位のイー・コリＵＤＧ
０．００１から１０００単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ
０．００１から５単位のイー・コリＦｐｇ
＊Ｂｓｔ単位アッセイの定義は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（全長）に関してＮＥＢカタログに記載されている。Ａｌｉｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１２：１８５−９５も参照されたい。
【０２４６】
修復酵素カクテルに関する保存緩衝液は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０％グリセロールを含有する２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）であった。本実施例において、修復反応物あたり、修復カクテル１μＬを使用した。１００μＭ  ｄＮＴＰ及び０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋をカクテルに添加した。
【０２４７】
修復反応において使用される緩衝液は、ＰＣＲ用にどのＤＮＡポリメラーゼが使用されるかに従って変動した。例えば、ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに対して好ましく使用され、従って、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液が、紫外線損傷を受けたλＤＮＡ、熱損傷を受けたλＤＮＡ、酸及び紫外線により損傷を受けたλＤＮＡ並びに低ｐＨにより損傷を受けたλＤＮＡのための修復混合物用に選択された。ＧＣ緩衝液は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ用に好ましく使用され、従って、１×ＧＣ緩衝液（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）は、メチレンブルーにより損傷を受けたｐＷＢ４０７、及びＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡによる増幅前の紫外線損傷を受けたヒトゲノムＤＮＡを含む修復混合物のために選択された。上述の温度及び時間での温置の後、反応物を氷上に配置した。
【０２４８】
紫外線照射されたλＤＮＡ及び酸化されたｐＷＢ４０７を、ＤＮＡ修復混合物と共に何れかの３７℃で５分間温置した。熱損傷を受けたλＤＮＡ、紫外線損傷を受けたヒトＤＮＡ、酸及び紫外線により損傷を受けたλＤＮＡ並びに低ｐＨにより損傷を受けたλＤＮＡを室温で１０から１５分間交互に温置した。反応容積は、４８．５μＬであった。
【０２４９】
各修復反応におけるＤＮＡの量は以下のとおりであった。紫外線損傷を受けたλＤＮＡ、熱損傷を受けたλＤＮＡ並びに酸及び紫外線損傷を受けたλＤＮＡに関しては１ｎｇ；又は酸化されたλＤＮＡ１０ｎｇ；又は紫外線損傷を受けたヒトゲノムＤＮＡ及び低ｐＨにより損傷を受けたλＤＮＡ５０ｎｇ。
【０２５０】
修復が生じない負の対照反応物を上述のとおり処理したが、例外は、修復酵素を添加しなかったことである。しかしながら、酵素保存緩衝液の適切な容積を使用した。
【０２５１】
以下に記載される増幅反応全てに関して、温熱サイクリングを次のように実施した。
【０２５２】
以下のプログラム、すなわち、９５℃で２分間を１周期、次に、９５℃で１０秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５周期、及び最後に７２℃で５分間を１周期及び４℃で保持を実行するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用した。
【０２５３】
臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルで、増幅産物を可視化した（図１９参照）。
【０２５４】
ＤＮＡ増幅反応
（ａ）紫外線損傷を受けたλＤＮＡからの増幅。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１１９７−１２０７（２００４）の方法に従って、プライマーＬ３０３５０Ｆ（配列番号２）及びＧＡＴＧＡＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＣＧＡＴＡＡＴＡＴＣＣＧＧ（Ｌ７１−１Ｒ）（配列番号４７）を使用して、ＤＮＡ増幅を実施した。
【０２５５】
紫外線損傷を受けたλＤＮＡ又は負の対照を含有する修復混合物に、プライマー（最終濃度０．４μＭ）を添加した。１００μＭ  ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５単位も添加した。反応混合物の容積は、５０μＬであった。
【０２５６】
以下のプログラム、すなわち９５℃で２分間を１周期、次に、９５℃で１０秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５周期、及び最後に７２℃で５分間を１周期及び４℃で保持を実行するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用した。
【０２５７】
（ｂ）熱損傷を受けたλＤＮＡからの増幅
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１１９７−１２０７（２００４）の方法に従って、プライマーＬ３０３５０Ｆ（配列番号２）及びＬ７７−２Ｒ（配列番号８）を使用して、ＤＮＡ増幅を実施した。
【０２５８】
熱損傷を受けたλＤＮＡ又は負の対照を含有する修復混合物へ、プライマー（最終濃度０．４μＭ）を添加した。１００μＭ  ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５単位も添加した。反応混合物の容積は、５０μＬであった。
【０２５９】
以下のプログラム、すなわち９５℃で２分間を１周期、次に９５℃で１０秒間、６５℃で３９秒間及び７２℃で２分間を２５周期、及び最後に４℃で保持を実行するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に反応物を転移した。
【０２６０】
（ｃ）酸化されたｐＷＢ４０７プラスミドＤＮＡからの増幅
プライマー３１６−１３８（配列番号９）及び３１６−１３７（配列番号１０）を使用して、ＤＮＡ増幅を実施した。
【０２６１】
酸化されたｐＷＢ４０７ＤＮＡ又は負の対照を含有する修復混合物へ、プライマー（最終濃度０．４μＭ）を添加した。１００μＭ  ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）及びＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ１単位も添加した。反応混合物の容積は、５０μＬであった。
【０２６２】
以下のプログラム、すなわち、９８℃で３０秒間を１周期、次に９８℃で１０秒間、６８℃で２０秒間及び７２℃で１５秒間を３０周期、及び最後に７２℃で５分間を１周期及び４℃で保持を実行するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に反応物を移した。
【０２６３】
（ｄ）紫外線損傷を受けたヒトゲノムＤＮＡからの増幅
プライマーＤＮＭＴ−４Ｆｂ（配列番号３７）及びＤＮＭＴ−Ｒ（配列番号３４）を使用して、ＤＮＡ増幅を実施した。
【０２６４】
紫外線損傷を受けたヒトＤＮＡ又は負の対照を含有する修復混合物へ、プライマー（最終濃度０．４μＭ）を添加した。１００μＭ  ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５単位も添加した。反応混合物の容積は、５０μＬであった。
【０２６５】
以下のプログラム、すなわち、９８℃で３０秒間を１周期、次に９８℃で１０秒間、６８．５℃で３０秒間及び７２℃で２分間を３０周期、及び最後に７２℃で５分間を１周期及び４℃で保持を実行するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に反応物を転移した。
【０２６６】
（ｅ）酸及び紫外線損傷を受けたλＤＮＡからの増幅
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１１９７−１２０７（２００４）の方法に従って、プライマーＬ３０３５０Ｆ（配列番号２）及びＬ７２−５Ｒ（配列番号１）を使用して、ＤＮＡ増幅を実施した。
【０２６７】
酸及び紫外線により損傷を受けたλＤＮＡ又は負の対照を含有する修復混合物へ、プライマー（最終濃度０．４μＭ）を添加した。１００μＭ  ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５単位及びＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．０５単位も添加した。反応混合物の容積は、５０μＬであった。
【０２６８】
以下のプログラム、すなわち、９５℃で２分間を１周期、次に９４℃で３０秒間、６３℃で３０秒間及び７２℃で５分間を２５周期、及び最後に７２℃で５分間を１周期及び４℃で保持を実行するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に反応物を転移した。
【０２６９】
（ｆ）低ｐＨにより損傷を受けたλＤＮＡからの増幅
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１１９７−１２０７（２００４）の方法に従って、プライマーＬ３０３５０Ｆ（配列番号２）及びＬ７１−１０Ｒ（配列番号５）を使用して、ＤＮＡ増幅を実施した。
【０２７０】
低ｐＨにより損傷を受けたλＤＮＡ修復反応物及び負の対照へ、プライマーを各０．４μＭになるよう添加し、１００μＭ  ｄＮＴＰ、Ｔａｑ２．５単位及びＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．０５単位を添加した。最終的なＰＣＲ容積は、５０μＬであった。
【０２７１】
以下のプログラム、すなわち、９５℃で２０秒間を１周期、次に９５℃で５秒間及び７２℃で１０分間を３０周期、及び最後に７２℃で５分間を１周期及び４℃で保持を実行するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に反応物を転移した。
【実施例２０】
【０２７２】
ＰＣＲ増幅に及ぼすＡＴＰの有害な効果
アデノシントリホスファート（ＡＴＰ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号Ａ−２３８３）の異なる濃度の存在下で、λファージＤＮＡから５ｋｂの単位複製配列を増幅するために、プライマーＬ３０３５０Ｆ（配列番号２）及びＬ７２−５Ｒ（配列番号１）をＰＣＲにおいて使用した。５０μＬのＰＣＲ反応物は、５０ｐｇのλＤＮＡ、１×ＨＦ緩衝液（ＮＥＢ  ＃Ｆ−５１８、ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、２００μＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ  ＃Ｆ５６０ＰＬ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．５μＭプライマーＬ３０３５０Ｆ、０．５μＭ  Ｌ７２−５Ｒ、１単位のＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  ＃Ｆ５３０ＰＬ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、図２０中のレーンに示される最終濃度のＡＴＰ及び容積を５０μＬにするためのＨ２Ｏを含有した。
【０２７３】
以下のプログラム、すなわち、９８℃で３０秒間を１周期、次に９８℃で５秒間及び、７２℃で１５秒間を２５周期、及び最後に７２℃で５分間を１周期及び４℃で保持を実行するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、温熱サイクリングを実施した。
【０２７４】
臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルで、増幅産物を可視化した（図２０参照）。広範な範囲の分子量マーカー（ＮＥＢ  ＃Ｎ３２００Ｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を各ゲルに置いて最も左側のレーンに適用した。
【実施例２１】
【０２７５】
ＡＰエンドヌクレアーゼ活性の有効量の決定
修復反応において使用するためのＡＰエンドヌクレアーゼの効果的な濃度は、ＡＰ部位で特異的な円ドンクレアーゼ活性を生じる一方で、エキソヌクレアーゼ活性から得られる非特異的分解を回避する濃度である。効果的な濃度の範囲は、以下の実験プロトコールを使用して決定した。
【０２７６】
配列の中間近くにウラシル塩基の挿入された合成オリゴヌクレオチドは、相補的ＤＮＡと塩基対形成し、二本鎖テンプレートを生成した。反応物中のＵＤＧによってウラシル塩基を除去し、次に、検査されるべきＡＰエンドヌクレアーゼによって作用され得るＡＰ部位を作製した。ウラシル基を有するオリゴヌクレオチドを５’末端及び３’末端の両方において標識することによって、前記オリゴヌクレオチドは、ゲル電気泳動によってモニターすることが可能であった。効果的なＡＰエンドヌクレアーゼ濃度は、生成したＡＰ部位でオリゴヌクレオチドを検出可能に切断するが、オリゴヌクレオチドを非特異的に検出可能に分解しない濃度である。
【０２７７】
使用される典型的な反応物、例えば、オリゴヌクレオチド２８７：ＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＵＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＴＡＴＡＴＴＧＴ（配列番号４５）及びオリゴヌクレオチド２８８：ＣＡＡＴＡＴＡＡＧＴＡＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＣ（配列番号４６）。オリゴヌクレオチド２８７を５’末端及び３’末端の両方において標識した。二本鎖ＤＮＡを形成するために、オリゴヌクレオチドをアニールした。検査反応物は、０．５ｐｍｏｌ／μＬのアニールされたＤＮＡ基質、０．０５単位／μＬのＵＤＧ及び１×検査緩衝液を含有した。検査緩衝液は、例えば、ＮＥＢｕｆｆｅｒ３（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）であり得た。１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９からなった（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。これらの反応条件において、ＡＰエンドヌクレアーゼ活性物を連続的に希釈した。最終反応容積をＨ２Ｏで１０μＬにした。選択された温度、典型的にはＡＰエンドヌクレアーゼの最適活性温度で、反応物を１時間温置した。停止染色剤を１×に添加することによって、反応を停止した。典型的な５×停止染色剤は、１２％フィコール、０．０１％ブロモフェノールブルー、０．０２％キシレンシアノール、７Ｍ尿素、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、８９ｍＭトリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び８９ｍＭホウ酸塩、ｐＨ８．３からなった。変性ゲル電気泳動によって、反応物を分析した。
【図１Ａ】
2014027939.tif 000010
【図１Ｂ】
2014027939.tif 000011
【図１Ｃ】
2014027939.tif 000012
【図１Ｄ】
2014027939.tif 000013
【図２Ａ】
2014027939.tif 000014
【図２Ｂ】
2014027939.tif 000015
【図３】
2014027939.tif 000016
【図４】
2014027939.tif 000017
【図５】
2014027939.tif 000018
【図６Ａ−１】
2014027939.tif 000019
【図６Ａ−２】
2014027939.tif 000020
【図６Ａ−３】
2014027939.tif 000021
【図６Ａ−４】
2014027939.tif 000022
【図６Ａ−５】
2014027939.tif 000023
【図６Ａ−６】
2014027939.tif 000024
【図６Ａ−７】
2014027939.tif 000025
【図６Ａ−８】
2014027939.tif 000026
【図６Ａ−９】
2014027939.tif 000027
【図６Ｂ−１】
2014027939.tif 000028
【図６Ｂ−２】
2014027939.tif 000029
【図７】
2014027939.tif 000030
【図８−１】
2014027939.tif 000031
【図８−２】
2014027939.tif 000032
【図９】
2014027939.tif 000033
【図１０】
2014027939.tif 000034
【図１１】
2014027939.tif 000035
【図１２】
2014027939.tif 000036
【図１３Ａ】
2014027939.tif 000037
【図１３Ｂ】
2014027939.tif 000038
【図１４】
2014027939.tif 000039
【図１５】
2014027939.tif 000040
【図１６】
2014027939.tif 000041
【図１７】
2014027939.tif 000042
【図１８−１】
2014027939.tif 000043
【図１８−２】
2014027939.tif 000044
【図１９】
2014027939.tif 000045
【図２０】
2014027939.tif 000046
【配列表】
2014027939000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月7日(2013.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの脱プリン部位／脱ピリミジン部位（ＡＰ）エンドヌクレアーゼの有効量；ＤＮＡリガーゼ；及び補助因子としてのＮＡＤ＋若しくはＡＴＰの少なくとも１つを含む反応混合物中で、ポリヌクレオチドを温置すること；及び
（ｂ）複製された若しくは増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させること
を含む、複製された若しくは増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させるための、ポリヌクレオチドを修復する方法。
【外国語明細書】
2014027939000001.pdf