(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物ＩｇＧと結合できる抗原結合タンパク質の提供。【解決手段】抗原結合タンパク質のフレームワーク領域は、ラクダ科動物において見ることができるような、天然に軽鎖を欠く抗体の領域に対応することが好ましい。さらに、このような抗原結合タンパク質をコードする核酸、このようなタンパク質を含む免疫吸着物質、哺乳動物ＩｇＧ抗体の精製のため、及び治療的アフェレーシスのためのこのような免疫吸着物質の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順で作動可能に連結している、４種のフレームワーク領域であるＦＲ１からＦＲ４と、３種の相補性決定領域であるＣＤＲ１からＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質であって、
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列か、又は配列番号１〜４９と１若しくは２個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
各フレームワーク領域が、配列番号１４８〜１９６のいずれか１種のフレームワークアミノ酸配列と少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有し、抗原結合タンパク質が、哺乳動物ＩｇＧ分子のＦｃドメインと特異的に結合する抗原結合タンパク質。
【請求項２】
ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも１０−７Ｍの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、
ｂ）抗原結合タンパク質が、少なくとも０．５ｇ／酵母培養物１Ｌの発現レベルでの酵母における発現によって得ることができること、
ｃ）抗原結合タンパク質が、ＮＨＳ樹脂１ｍｌあたり２０ｍｇ抗原結合タンパク質の密度で１５０ｃｍ／ｈの流速を用いてＮＨＳ活性化担体にカップリングされると、少なくとも２ｍｇのヒトＩｇＧ／樹脂１ｍｌの動的結合能を有すること、
ｄ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、ｃ）に定義されるようにＮＨＳ樹脂にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０を用いて、少なくとも９０％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、
ｅ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、ｃ）に定義されるようにＮＨＳ樹脂にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも７０％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、及び
ｆ）抗原結合タンパク質が、ｃ）に定義されるようにＮＨＳ樹脂にカップリングされると、２０回の定置洗浄サイクル後に少なくとも７０％の残存動的結合能を保持し、各定置洗浄サイクルにおいて、ＮＨＳ樹脂にカップリングされた抗原結合タンパク質が、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ及び０．５Ｍ  ＮａＣｌと１５０ｃｍ／ｈの流速で１５分間接触すること
からなる群から選択される１つ又は複数の特性を有する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
哺乳動物ＩｇＧが、ヒトＩｇＧ分子である、請求項１又は２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
ヒトＩｇＧのＦｃドメインと結合するが、ネズミ又はウシ起源のＩｇＧ分子とは結合しない、請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜１５、１７〜２５、３１〜３６、３８、４３及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１〜１５、１７〜２５、３１〜３６、３８、４３及び４４と４個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜６４、６６〜７４、８０〜８５、８７、９２及び９３からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号５０〜６４、６６〜７４、８０〜８５、８７、９２及び９３と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１１３、１１５〜１２３、１２９〜１３４、１３６、１４１及び１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号９９〜１１３、１１５〜１２３、１２９〜１３４、１３６、１４１及び１４２と、６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、
請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１４８〜１６２、１６４〜１７２、１７８〜１８３、１８５、１９０及び１９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
さらにヤギ起源のＩｇＧ分子と結合しない、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜１５、１７〜２５、３１〜３６、３８及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１〜１５、１７〜２５、３１〜３６、３８及び４４と４個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜６４、６６〜７４、８０〜８５、８７及び９３からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号５０〜６４、６６〜７４、８０〜８５、８７及び９３と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１１３、１１５〜１２３、１２９〜１３４、１３６及び１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号９９〜１１３、１１５〜１２３、１２９〜１３４、１３６及び１４２と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、
請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号１４８〜１６２、１６４〜１７２、１７８〜１８３、１８５及び１９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
さらにラット、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ネコ又はヒツジを起源とするＩｇＧ分子と結合しない、請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１〜１５と４個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜６４からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号５０〜６４と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号９９〜１１３と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、
請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１４８〜１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも５ｎＭの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、
ｂ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも９９％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、
ｃ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ４．０を用いて、少なくとも９５％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、
ｄ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１〜０．２Ｍアルギニン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも９９％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、
ｅ）１００回の定置洗浄サイクル後に少なくとも９０、９５又は１００％の残存動的結合能を保持し、各定置洗浄サイクルにおいて、参照ＮＨＳ担体にカップリングされている抗原結合タンパク質が、０．１Ｍ  ＮａＯＨと１５０ｃｍ／ｈの流速で１５分間接触すること、及び
ｆ）４０回の定置洗浄サイクル後に少なくとも８０％の残存動的結合能を保持し、各定置洗浄サイクルにおいて、参照ＮＨＳ担体にカップリングされている抗原結合タンパク質が、０．２Ｍ  ＮａＯＨと１５０ｃｍ／ｈの流速で１５分間接触すること
からなる群から選択される１つ又は複数の特性を有する、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１〜９と４個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号５０〜５８と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号９９〜１０７と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、
請求項１４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号１４８〜１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
ａ）ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも３ｎＭの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、及び
ｂ）少なくとも１．２ｇ／酵母培養物１Ｌの発現レベルでの酵母における発現によって得ることができること
からなる群から選択される１つ又は複数の特性を有する、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１０〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１０〜１５と４個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５９〜６４からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号５９〜６４と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１０８〜１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１０８〜１１３と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、
請求項１７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
配列番号１５７〜１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
ヒト、ネズミ及びウシからなる群から選択される少なくとも２つの異なる種に由来するＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合する、請求項１又は２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１６、２６〜３０、３７、４２及び４７〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１６、２６〜３０、３７、４２及び４７〜４９と４個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号６５、７５〜７９、８６、９１及び９６〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号６５、７５〜７９、８６、９１及び９６〜９８と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１１４、１２４〜１２８、１３５、１４０及び１４５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１１４、１２４〜１２８、１３５、１４０及び１４５〜１４７と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、
請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
配列番号１６３、１７３〜１７７、１８４、１８９及び１９４〜１９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
ヒト、ネズミ、ウシ、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、サル、ロバ及びウマ由来のＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合する、請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１６、２８〜３０、３７、４２及び４７〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１６、２８〜３０、３７、４２及び４７〜４９と４個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号６５、７７〜７９、８６、９１及び９６〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号６５、７７〜７９、８６、９１及び９６〜９８と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１１４、１２６〜１２８、１３５、１４０及び１４５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１１４、１２６〜１２８、１３５、１４０及び１４５〜１４７と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、
請求項２３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
配列番号１６３、１７５〜１７７、１８４、１８９及び１９４〜１９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
すべての哺乳動物種由来のＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合する、請求項２３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも２０ｎＭの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、
ｂ）抗原結合タンパク質が、少なくとも２．５ｇ／酵母培養物１Ｌの発現レベルでの酵母における発現によって得ることができること、及び
ｃ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされていると、０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ３．０又は０．２Ｍ  アルギニン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも９９％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること
からなる群から選択される１つ又は複数の特性を有する、請求項２６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２８】
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１６、２８〜３０及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１６、２８〜３０及び４８と４個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号６５、７７〜７９及び９７からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号６５、７７〜７９及び９７と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１１４、１２６〜１２８及び１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１１４、１２６〜１２８及び１４６と６個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、
請求項２７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２９】
配列番号１６３、１７５〜１７７及び１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３０】
請求項１から２９までのいずれか一項に記載の少なくとも２種の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含む、多価抗原結合タンパク質。
【請求項３１】
治療タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列をさらに含む融合タンパク質の部分である、請求項１から３０までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３２】
請求項１から３１までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３３】
ヌクレオチド配列が、プロモーターと、場合により、その他の調節エレメントと作動可能に連結している、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
請求項３１又は３２に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項３５】
酵母、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエである、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
ａ）請求項３４又は３５に記載の宿主細胞を、抗原結合タンパク質の発現につながる条件下で培養するステップと、場合により、
ｂ）宿主細胞及び培養培地のうち少なくとも一方から抗原結合タンパク質を精製するステップと
を含む、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を製造する方法。
【請求項３７】
請求項１から３１までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含む組成物。
【請求項３８】
請求項１から３１までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含む免疫吸着物質。
【請求項３９】
抗原結合タンパク質が担体上に固定化され、好ましくは、抗原結合タンパク質が、共有結合によって担体上に固定化されている、請求項３８に記載の免疫吸着物質。
【請求項４０】
担体が、セファロースを含む、請求項３８又は３９に記載の免疫吸着物質。
【請求項４１】
哺乳動物ＩｇＧ分子の検出及び／又は精製のための、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
【請求項４２】
哺乳動物ＩｇＧ分子を精製する方法であって、
ａ）哺乳動物ＩｇＧ分子を含むサンプルを、請求項３８から４０までのいずれか一項に記載の免疫吸着物質と、哺乳動物ＩｇＧ分子と免疫吸着物質の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
ｂ）場合により、洗浄ステップを実施するステップと、
ｃ）結合している哺乳動物ＩｇＧ分子を、哺乳動物ＩｇＧ分子と免疫吸着物質との親和性を低下させる条件下で溶出するステップと、
ｄ）場合により、哺乳動物ＩｇＧ分子をさらに処理するステップと
を含む方法。
【請求項４３】
体液中の哺乳動物ＩｇＧを除去、枯渇又は不活化する方法であって、請求項３８から４０までのいずれか一項に記載の免疫吸着物質を、被験体、好ましくは、ヒト被験体の体液と体外接触させる方法。
【請求項４４】
被験体、好ましくは、ヒト被験体の体液中の哺乳動物ＩｇＧの体外除去又は枯渇のための、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学の分野、特に、免疫グロブリン精製及び抗体技術に関する。本発明は、哺乳動物ＩｇＧと結合できるアミノ酸配列、このようなアミノ酸配列を含む、又は本質的にこの配列からなるタンパク質及びポリペプチド、このようなアミノ酸配列、タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸、このようなタンパク質及びポリペプチドを含む免疫吸着物質、並びに哺乳動物ＩｇＧ抗体の精製のためのこのような免疫吸着物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物ＩｇＧ抗体、特に、ヒト及び／又はヒト化ＩｇＧ抗体の効率的、迅速、且つ節約及び費用効率の高い精製は、当技術分野でかなり研究された問題である。新たな抗体ベースの薬剤の出現で、ＩｇＧの精製は、抗体ベースの薬剤の製造において、ますます重大で、費用のかかる段階となり、高度の純度を必要とする。さらに、このような抗体は、結合親和性及びエフェクター機能のような生物活性を保持しなくてはならない。
【０００３】
哺乳動物ＩｇＧ抗体、特に、ヒトＩｇＧ又はヒト化ＩｇＧ抗体の精製に一般に用いられる精製法は、陰イオン／陽イオン交換、サイズ排除／ゲル濾過、沈殿などの従来の生化学的分離及び精製技術の使用並びに特異的親和性リガンドの使用を含む。一般に用いられるリガンドは、細菌由来のタンパク質、プロテインＡ及びプロテインＧである。或いは、プロテインＬを用いることもできるが、プロテインＬはλ軽鎖とは結合しないので、κ軽鎖を含む免疫グロブリンにしか用いることができない。
【０００４】
プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって発現される細菌表面タンパク質である。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体のＦｃ部分上のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの境界の共通部位（Ｆｃγ）を主に認識する。さらに、プロテインＡはまた、マウスＶＨドメインの１２％及びヒトＶＨドメインの５０％（ヒトＶＨ−ＩＩＩサブクラス）との結合を示す。これらの後者の相互作用は、低い親和性（例えば、ヒトＩｇＧ１の＜１ｎＭと比較して、ＶＨの±２００ｎＭ）を有するが、プロテインＡは、Ｆａｂ及び（ｓｃ）Ｆｖ断片（Ｉｇアイソタイプと無関係に）の精製のために使用できる。プロテインＡは、プロテインＬと同様に、おそらくは、そのＶＨ−ＩＩＩ反応性によって誘導される、ヒトＢリンパ球上のスーパー抗原として作用する。したがって、精製ＩｇＧ抗体が治療的利用に意図される場合には、主な安全上の懸念は、精製プロセスの間でのその支持材料からのプロテインＡの意図されない脱離の結果として、精製された治療薬中のプロテインＡの存在が考えられることである（プロテインＡ漏出）。多数の刊行物で、プロテインＡは、動物モデル及びヒトにおいて毒性及び分裂促進性と関連付けられている（例えば、Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄｉｆ．３、３４７、１９８４年；Ｍｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄｉｆ．３、３２５、１９８４年；Ｔｅｒｍａｎ及びＢｅｒｔｒａｍ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１、１１１５；１９８５年並びにＶｅｎｔｕｒａら、Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ．７１、４１１、１９８７年参照のこと）。
【０００５】
さらに、ヒトＶＨ−ＩＩＩドメインへのプロテインＡの同時結合が、いくつかのＩｇＧ抗体間でアフィニティークロマトグラフィーにおける溶出ｐＨの相違をもたらす主な理由である。このような相違は、様々なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）間で精製手順における一貫性の欠如を引き起こすので望ましいものではない。さらに、強固に結合したＩｇＧ  Ｍａｂは、ヒトＶＨ−ＩＩＩとプロテインＡの同時結合のために、効率的な回収を得るために低いｐＨ値の溶出剤を必要とすることが多い。
【０００６】
プロテインＧは、Ｃ及びＧ群連鎖球菌によって発現される細菌表面タンパク質である。プロテインＡと同様に、プロテインＧも、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗体のＦｃ部分上のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの境界の共通部位（Ｆｃγ）を認識する。プロテインＡと比較して、より広い範囲のＩｇＧ種を認識できる。さらに、プロテインＧは、ＩｇＧのＣＨ１ドメインとの結合による、ＩｇＧ抗体のＦａｂ部分との結合を示す。ＣＨ１に対する結合親和性（±２００ｎＭ）は、そのＦｃ部分上のエピトープと比較して、やはり大幅に低い。プロテインＧは、プロテインＡよりも広い反応性プロフィールを有するが、抗体とプロテインＧの結合は、より強力であることが多く、これが溶出及び完全な抗体の回収をより難しくする。
【０００７】
大規模工程適用のための、ヒト免疫グロブリン、特に、ＩｇＧのアフィニティー精製に最も一般に用いられるリガンドは、プロテインＡである。しかし、プロテインＡは、ＩｇＧ３サブクラスのヒト抗体と結合する能力を欠く。さらに、プロテインＡ及びＧは、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分上のＣＨ２−ＣＨ３境界と強力に結合する。実験データは、誘導適合が生じることを示し、これによって溶出に必要とされる厳格な条件を説明することができる。これらの厳格な条件は、結合部位のコンホメーションに影響を及ぼし、それによって、精製されたＩｇＧ抗体の免疫機能を変化させる可能性がある（Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ  ５８００Ｎによって出版されたＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｐ．Ｇａｇｎｏｎ、１９９６年）。Ｘ線結晶解析での測定結果は、ＣＨ２ドメインは、プロテインＡとの結合によって、ＣＨ３ドメインに向かって縦方向に移動され、これが最終的に、ＣＨ２ドメイン間の炭水化物領域の部分回転及び不安定化を引き起こし得ることを示している。ゆがみは、ＩｇＧがそのエフェクター機能を発揮するのに必要とされる、その後のタンパク質間相互作用に干渉する。抗原結合能に対する厳格な溶出条件（特に、プロテインＧについて）の影響の他に、これらの二次的作用が抗体エフェクター機能に干渉し又はそれを変化させ、タンパク質分解に対する免疫グロブリンの感受性を増大させることがある。精製ステップの間に生じる変性、フォールディングの変化及び化学修飾によって引き起こされるエフェクター機能の喪失は、ヒト又はヒト化抗体が治療目的で使用される予定である場合には非常に望ましくないものである。特に、分子内及び分子間硫黄架橋の減少が、精製及び保存の間に生じる問題であることが多い。
【０００８】
プロテインＡ及びＧのようなヒトＩｇＧ結合タンパク質に代わるものとして、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃドメインと結合できるいくつかのマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）が文献に記載されている。（Ｎｅｌｓｏｎ  ＰＮら、「エピトープマッピングによる抗ＩｇＧモノクローナル抗体Ａ５７Ｈの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＩｇＧ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａ５７Ｈ  ｂｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  １９９７年；２５：３７３）。
【０００９】
いくつかの共通Ｆｃエピトープが同定されており、いくつかの例を以下に列挙する：Ｍａｂ  Ｇ７Ｃ、ＪＤ３１２は、ＣＨ２上に結合エピトープを有する、アミノ酸２９０−ＫＰＲＥＥ−２９４。Ｍａｂ  ＰＮＦ６９Ｃ、ＰＮＦ１１０Ａ、ＰＮＦ２１１Ｃは、ＣＨ２−ＣＨ３上に結合エピトープを有する、ＡＡ：３３８−ＫＡＫＧＱＰＲ−３４４．Ｍａｂ  Ａ５７Ｈは、ＣＨ３上に結合エピトープ、ＡＡ  ３８０−ＥＷＥＳＮＧＱＰＥ−３８８を示す。マウスモノクローナル又はその他の非ヒト種由来のモノクローナルの使用と関連する問題として、除去することが困難である、精製された調製物の汚染を引き起こすマトリックスからのＭａｂの放出がある。さらに、モノクローナル抗体及びその機能的断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ２）は容易に変性され、分子の３Ｄ構造並びに重鎖及び軽鎖がアラインされるのを維持するＳ−Ｓ架橋は、特に、カラムと結合しているヒトＩｇＧの放出のために必要とされることが多い厳格な溶出条件下で容易に破壊される。親和性リガンドの脆弱性のために、カラムの能力が急速に低下し、カラムは、溶出後に極めて制限された再利用能しか有さず、連続操作に適さない。
【００１０】
ＥＰ−Ａ−４３４３１７に記載される（ｓｃ）Ｆｖ断片の代わりに、ＷＯ２００６／０５９９０４に記載される天然に軽鎖を欠く抗体に由来する抗体断片（ＶＨＨ）を用いて、ヒトＩｇＧ抗体の精製のための免疫吸着物質を作製してもよい。これらのＶＨＨ断片を使用する利点は、それらが単一ドメインペプチドであり、これらは高温でも極めて安定であることである。さらに、ＶＨＨは小さく、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの費用効率の高い宿主生物において容易に産生される。さらに、これらのＶＨＨ断片とヒトＶＨ−ＩＩＩドメインファミリー間の配列類似性のために、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）は、プロテインＡ及びＧのような細菌表面タンパク質と比較して極めて低いと予測される。これらの抗体は、ＥＰ−Ａ−６５６９４６に、より詳細に記載されている。
【００１１】
しかし、ＷＯ２００６／０５９９０４に記載されるアミノ酸配列は、κ又はλアイソタイプのいずれかのヒト抗体の軽鎖と結合するＶＨＨ断片に関し、したがって、ＩｇＧアイソタイプのみの抗体の選択的精製を可能にするものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、ヒトＩｇＧ抗体を含めた哺乳動物ＩｇＧ抗体を、このようなＩｇＧ抗体のＦｃドメイン中に存在するエピトープの結合によって選択的に精製するための、免疫吸着物質への組込み及び／又はそれとの付着に有用である新規クラスの抗原結合タンパク質を見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の態様では、本発明は、哺乳動物ＩｇＧと特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する。好ましくは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順で作動可能に連結している、４種のフレームワーク領域であるＦＲ１からＦＲ４と、３種の相補性決定領域であるＣＤＲ１からＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質であって、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列か、又は配列番号１〜４９と、１若しくは２個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、各フレームワーク領域が、配列番号１４８〜１９６のいずれか１種のフレームワークアミノ酸配列と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％のアミノ酸同一性を有する抗原結合タンパク質。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、抗体であり、このような抗体又はその断片は、天然に軽鎖を欠く抗体に由来することがより好ましい。天然に軽鎖を欠く抗体は、例えば、ラクダ科動物（例えば、ラマ）又はサメを免疫化することによって得ることができる（さらに以下を参照のこと）。これらの抗体は、重鎖のみを含み、軽鎖を欠いている。このような単一ドメイン重鎖抗体を使用する利点は、それらが高温でも極めて安定であり、小さく、サッカロミセス・セレビシエなどの宿主生物において容易に産生されることである。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、単一のポリペプチド鎖中に標的分子上のエピトープに対する完全な抗原結合部位を含む免疫グロブリン由来可変ドメインを含むことが好ましい。このような抗原結合タンパク質として、それだけには限らないが、
１）重鎖のみからなり、天然に軽鎖を欠く、ラクダ科動物及びサメから得ることができる抗体、
２）通常、ＶＨＨドメインと呼ばれる、１）で定義される抗体の可変ドメイン、
３）１）で定義される抗体又は２）中のドメインの遺伝子操作された形、例えば、ラクダ科動物（又はサメ）ＶＨＨドメインのフレームワーク配列がその他の供給源から得られたＣＤＲでグラフトされている「ラクダ科動物化（ｃａｍｅｌｉｄｉｓｅｄ）」抗体、
４）例えば、ＷＯ０４／１０８７４９に記載されるような、様々な免疫グロブリン様分子由来のフレームワーク配列が、所与の標的分子に特異的なＣＤＲと組み合わされている、免疫グロブリン様可変ドメインの遺伝子操作された形
を具体的に挙げられる。
【００１５】
本発明の好ましい抗原結合タンパク質では、完全な抗原結合能を含む可変ドメインの単一ポリペプチド鎖は、当技術分野において、また本明細書において、それぞれ、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる４種のフレームワーク領域又は「ＦＲ」を含み、これらのフレームワーク領域が、当技術分野では、それぞれ、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる３種の相補性決定領域又は「ＣＤＲ」によって割り込まれていると考えられ得るアミノ酸配列及び構造を有することが好ましい。これらのフレームワーク領域及び相補性決定領域は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順で（アミノ末端からカルボキシ末端へ）作動可能に連結していることが好ましい。
【００１６】
完全な抗原結合能を有する可変ドメイン中のアミノ酸残基の総数は、１１０〜１３５の域中であり得、１１５〜１２９の域中であることが好ましい。しかし、本発明に従う完全な抗原結合能を有する可変ドメインは、ドメインが、本明細書に概説されるさらなる機能的必要条件を満たす、及び／又は、本明細書に記載される目的上適しているので、その長さ及び／又は大きさに関して特に制限されない。完全な抗原結合能を有する可変ドメインのアミノ酸残基は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによって（１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：２５〜３８頁、例えば、前記参考文献の図２参照のこと）及びＨａｒｍｓｅｎらによって（２０００年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３７：５７９〜５９０頁、例えば、前記参考文献の図１参照のこと）ラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用されるように、Ｋａｂａｔらによって与えられるＶＨドメインの一般的な番号付けに従って番号付けされている（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、出版物番号９１）。
【００１７】
完全な抗原結合能を有する可変ドメインにおけるこの番号付けによれば、ＦＲ１は、位置１〜２５のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は、位置２６〜３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は、位置５０〜６４のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は、位置６５〜９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は、位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、最後に、ＦＲ４が、位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
【００１８】
この点において、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当技術分野で周知のとおり、各ＣＤＲ中のアミノ酸残基の総数は異なる場合があり、Ｋａｂａｔ番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数と対応しない場合があるということに留意されたい。しかし、当業者ならば、フレームワーク領域の保存されたアミノ酸に基づいて、１１３個のアミノ酸以外の長さを有する完全な抗原結合能を有する可変ドメインについて、Ｋａｂａｔ定義に従って、それぞれのフレームワーク及び相補性決定領域をアラインできるであろう。その例が、本明細書においてＩｇＧ−Ｆｃ  １〜４９のアミノ酸配列中の相補性決定領域の定義に示されている。ラクダ科動物由来のＶＨＨドメイン、及び完全な抗原結合能を有する可変ドメインに類似の形で適用することもできる、ＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付けるための代替法は、Ｃｈｏｔｈｉａらによって記載される方法（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２、８７７〜８８３頁（１９８９年））、いわゆる「ＡｂＭ定義」及びいわゆる「接触定義」又はＩＭＧＴ番号付けシステム（Ｌｅｆｒａｎｃら、１９９９年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９〜２１２頁）である。
【００１９】
本発明の好ましい抗原結合タンパク質では、完全な抗原結合能を有する可変ドメインのフレームワークアミノ酸配列は、配列番号１４８〜１９６のうちいずれか１種のフレームワークアミノ酸配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％のアミノ酸同一性を有することが好ましい。
【００２０】
より好ましくは、完全な抗原結合能を含む可変ドメインの単一ポリペプチド鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の各位置に存在する（Ｋａｂａｔの番号付けに従って）アミノ酸残基は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４について表１〜４に示されるとおりであることが好ましい。したがって、完全な抗原結合能を有する可変ドメインのフレームワークアミノ酸残基は、天然に存在するラクダ科動物ＶＨＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の各位置に存在し得る（Ｋａｂａｔの番号付けに従って）表１〜４中の限定されない残基から選択されることが好ましい（データは特許ＷＯ２００６／０４０１５３  ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１０１８から取り出した）。しかし、完全な抗原結合能を有する可変ドメインのフレームワークアミノ酸残基は、哺乳動物ＩｇＧと特異的に結合する抗原結合タンパク質の、配列番号１４８〜１９６のうちいずれか１種のアミノ酸配列のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の各位置に存在する（Ｋａｂａｔの番号付けに従って）表１〜４中のアミノ酸残基から選択されることがより好ましい。各位置について、各位置で最も頻繁に出現するアミノ酸残基が、表１〜４中太字で示されている。
【００２１】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、表１〜４中に記載される位置に存在するアミノ酸残基に基づいて、本発明の抗原結合タンパク質中の完全な抗原結合能を含む可変ドメインのアミノ酸配列は、以下の構造を有し得る：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
［式中、ＦＲ１は、
ａ）［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ［２５］（配列番号１９７）、
ｂ）ａ）中の配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び／又は
ｃ）表１中に定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を有するａ）のアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
ＦＲ２は、アミノ酸配列：
ｄ）［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ［４９］（配列番号１９８）、
ｅ）ｄ）中の配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び／又は
ｆ）表２に定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を有するｄ）のアミノ酸配列
からなる群から選択され、
ＦＲ３は、アミノ酸配列：
ｇ）［６５］ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＳＣＡＡ［９４］（配列番号１９９）、
ｈ）ｇ）中の配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び／又は
ｉ）表３に定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を有するｇ）のアミノ酸配列
からなる群から選択され、
ＦＲ４は、アミノ酸配列：
ｊ）［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］（配列番号２００）、
ｋ）ｊ）中の配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び／又は
ｌ）表４に定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を有するｊ）のアミノ酸配列
からなる群から選択される］。
【００２２】
別の好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、表５の行の１つにおいて示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含み、フレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）は、上記で定義されるフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）のいずれであってもよい。より好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、表５の行の１つにおいて示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含み、抗原結合タンパク質が、表５の対応する行の最後のセル中に提供される配列に対して少なくとも９０、９５、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２３】
本発明の抗原結合タンパク質は、所望の結合親和性（本明細書に定義される）で標的分子と特異的に結合する成分である。本発明の抗原結合タンパク質は、単一特異性抗原結合タンパク質であることが好ましい。単一特異性抗原結合タンパク質、例えば、本発明の免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂａｎｔ）物質を含む組成物は、抗原結合タンパク質の均一な集団を有する組成物を意味すると理解される。したがって、単一特異性抗原結合タンパク質は、単一のエピトープ又はリガンドに対して特異的であるということになる。しかし、免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂａｎｔ）物質は、各々、均一な集団からなる、２以上の種類の単一特異性抗原結合タンパク質を含み得るということが本発明に含まれることは明らかである。しかし、通常、本発明との関連で、免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂａｎｔ）物質は４、６、８、１０又は２０種を超える様々な単一特異性抗原結合タンパク質を含まない。抗原結合タンパク質は、通常、抗体又はその断片であり、したがって、その場合には、単一特異性抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体又はその断片であり、これは、クローニングされた細胞系（例えば、ハイブリドーマ）から得てもよく、クローニングされたコード配列から発現させてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、用語単一特異性抗原結合タンパク質は、ポリクローナル抗体及び抗血清を排除する。
【００２４】
特異的標的分子（抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質）と結合でき、それに対して親和性を有し、及び／又はそれに対して特異性を有する本発明の抗原結合タンパク質は、前記標的分子「に対するものである」又は「を対象とする」と言われる場合もある。用語「特異性」とは、特定の抗原結合タンパク質分子が結合できる、様々な種類の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づいて決定できる。抗原と抗原結合タンパク質との解離についての平衡定数（ＫＤ）によって表される親和性は、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位間の結合強度の尺度である。或いは、親和性はまた、１／ＫＤである親和性定数（ＫＡ）として表される場合もある。親和性は、注目する抗原結合タンパク質及び抗原の特定の組合せに応じて、それ自体公知の方法で決定できる。本明細書において、結合活性は、標的分子と、結合作用物質の大きな複合体による複数の結合部位との結合の強度、即ち、多価結合の結合の強度を指すと理解される。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との親和性及び抗原結合分子上に存在する結合部位の数の両方と関連している。他方、親和性とは、簡単な一価受容体リガンド系を指す。
【００２５】
通常、本発明の抗原結合タンパク質は、約１０−５〜１０−１２Ｍ以下、好ましくは、１０−７〜１０−１２Ｍ以下、より好ましくは、１０−８〜１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、及び／又は少なくとも１０−７Ｍ、好ましくは、少なくとも１０−８Ｍ、より好ましくは、少なくとも１０−９Ｍ、例えば、少なくとも１０−１０、１０−１１、１０−１２Ｍ以上の結合親和性で標的分子と結合する。通常、１０−４Ｍを超える（即ち、１００μＭ未満）任意のＫＤ値が、非特異的結合を示すと考えられる。本発明のポリペプチドは、所望の抗原と、５００ｎＭ未満、好ましくは、２００ｎＭ未満、より好ましくは、１０ｎＭ未満、例えば、５００ｐＭ未満の親和性で結合することが好ましい。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的結合は、例えば、スキャッチャード解析法及び／又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイ及び当技術分野でそれ自体公知であるそれらの様々な変法をはじめとするそれ自体公知である任意の適した方法で決定できる。好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、所望の抗原と上記で定義される親和性で結合するが、この親和性は、穏やかな溶出条件下での抗原結合タンパク質からの抗原の効率的な放出と組み合わせる。
【００２６】
穏やかな溶出条件とは、本明細書において、その下で活性及び／又は完全性（例えば、二次／三次構造）がわずかしか影響を受けない（例えば、１０％未満の不活性又は変性）、好ましくは、抗原の活性及び／又は完全性において検出可能な低減がない条件であると理解される。このような穏やかな溶出条件の例として、例えば、本明細書において以下に明記される酸性条件、例えば、０．１Ｍ  グリシン  ｐＨ３．０又はｐＨ４．０、０．１Ｍ  アルギニン  ｐＨ４．０又はｐＨ５．０が挙げられる。（ほぼ）中性ｐＨの穏やかな溶出条件のその他の例として、例えば、２Ｍ  ＮａＣｌ（例えば、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中）に相当する条件などの高イオン強度又はエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのカオトロピック剤（例えば、２０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、４０〜６０％、好ましくは、約５０％（ｖ／ｖ））が挙げられる。上記の穏やかな溶出条件下で抗原を放出する本発明の抗原結合タンパク質の例として、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜９及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１〜９及び１６と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜５８及び６５からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号５０〜５８と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号９９〜１０７及び１１４と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有する抗原結合タンパク質が挙げられる。抗原結合タンパク質は、配列番号１４８〜１５６及び１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００２７】
エピトープは、抗原結合タンパク質によって結合される標的分子の部分として定義される。抗原結合タンパク質が抗体である場合には、エピトープは、個々の脊椎動物宿主をこの分子で免疫化する際に免疫学的反応を引き起こす標的分子の部分である。一般に、抗体との結合が起こる標的分子の部位である。エピトープは、標的分子中に天然に存在することが好ましい。場合により、エピトープ（単数又は複数）は、標的分子中に人為的に含められた配列である。場合により、多数の同一又は異なるエピトープが、標的分子中に、その精製及び検出を容易にするよう含まれている。
【００２８】
本明細書において、標的分子は、結合作用物質、好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質によって結合されるべき分子として定義される。標的分子は、精製を必要とするタンパク質又は検出若しくは同定されるべきタンパク質であり得る。本発明との関連で好ましい標的分子として、哺乳動物ＩｇＧがある。抗原結合タンパク質は、哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ（結晶化可能断片）ドメインと結合することが好ましい。抗原結合タンパク質は、哺乳動物ＩｇＧのＦｃ（結晶化可能断片）ドメインと結合し、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＥクラスの哺乳動物免疫グロブリンと結合しないことがより好ましい。本明細書において、第１の種類の標的分子と結合するが第２の種類の標的分子と結合しない抗原結合タンパク質は、第１及び第２の種類の標的分子それぞれに対して、少なくとも１００、１０００、１０，０００又は１００，０００の倍数の解離定数の相違を有すると理解される。抗原結合タンパク質は、哺乳動物免疫グロブリンのＦａｂ（抗原結合断片）ドメインと結合しないことが好ましい。抗原結合タンパク質と哺乳動物免疫グロブリンの結合及びその後の免疫グロブリンの溶出は、哺乳動物免疫グロブリンのエフェクター機能に影響を及ぼさないことが好ましい。また、抗原結合タンパク質と哺乳動物免疫グロブリンの結合及びその後の免疫グロブリンの溶出は、哺乳動物免疫グロブリン分子とその所定の抗原との結合を低減、阻害せず、又はその他の形でこれに影響を及ぼさないことも好ましい。
【００２９】
哺乳動物ＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合する本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも１０−７Ｍ、１０−８Ｍ又は１０−９Ｍの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、ｂ）抗原結合タンパク質が、少なくとも０．５、０．８、１．０ｇ／酵母培養物１Ｌの発現レベルでの酵母における発現によって得ることができること、ｃ）抗原結合タンパク質が、ＮＨＳ担体１ｍｌあたり２０ｍｇ抗原結合タンパク質の密度で１５０ｃｍ／ｈの流速を用いてＮＨＳ活性化担体（好ましくは、セファロース４Ｂファーストフロー）にカップリングされると、少なくとも２、５又は１０ｍｇのヒトＩｇＧ／担体１ｍｌの動的結合能を有すること、ｄ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、ｃ）に定義されるように参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０を用いて、少なくとも９０、９５又は９９％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、ｅ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、ｃ）に定義されるように参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも７０、７５又は８０％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、ｆ）ｃ）に定義されるように参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、抗原結合タンパク質が、２０回の定置洗浄サイクル後に少なくとも７０、７５又は８０％の残存動的結合能を保持し、各定置洗浄サイクルにおいて、参照ＮＨＳ担体とカップリングされる抗原結合タンパク質が、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ及び０．５Ｍ  ＮａＣｌと１５０ｃｍ／ｈの流速で１５分間接触すること、並びにｇ）抗原結合タンパク質が、担体上に、且つ／又は標準カップリング化学反応（例えば、ＮＨＳ又はＣＮＢｒ活性化担体）を介して担体上に固定化され得、ＩｇＧ結合の機能性を依然として保持し（即ち、ｃ）に定義される動的結合能を有する）、抗原結合タンパク質のＮ及び／又はＣ末端に遺伝的に組み込まれるさらなるタグ又はリンカーを必要としないことからなる群から選択される１つ又は複数の特性を有する抗原結合タンパク質である。抗原結合タンパク質は、前記特性のうち少なくとも４、５、６つ又はすべてを有することがより好ましい。便宜上、本明細書を通じて、「参照ＮＨＳ担体」への言及は、上記のｃ）で定義されるＮＨＳ担体１ｍｌあたり２０ｍｇの抗原結合タンパク質の密度のＮＨＳ活性化担体（好ましくは、セファロース４Ｂファーストフロー）を指す。
【００３０】
本発明の好ましい抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合するが、ネズミ又はウシ起源のＩｇＧ分子とは結合しない。好ましい抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４分子のうち１種又は複数と結合し、より好ましくは、抗原結合タンパク質は、４種のヒトＩｇＧサブクラスのすべてと結合する。ヒトＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合するが、ネズミ又はウシ起源のＩｇＧ分子とは結合しない抗原結合タンパク質は、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜１５、１７〜２５、３１〜３６、３８、４３及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１〜１５、１７〜２５、３１〜３６、３８、４３及び４４と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜６４、６６〜７４、８０〜８５、８７、９２及び９３からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号５０〜６４、６６〜７４、８０〜８５、８７、９２及び９３と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１１３、１１５〜１２３、１２９〜１３４、１３６、１４１及び１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号９９〜１１３、１１５〜１２３、１２９〜１３４、１３６、１４１及び１４２と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有する抗原結合タンパク質であることが好ましい。抗原結合タンパク質は、配列番号１４８〜１６２、１６４〜１７２、１７８〜１８３、１８５、１９０及び１９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３１】
本発明のより好ましい抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合するが、ネズミ、ウシ又はヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）（ヤギ（ｇｏａｔ））起源のＩｇＧ分子とは結合しない。抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４分子のうち１種又は複数と結合することが好ましく、抗原結合タンパク質は、４種のヒトＩｇＧサブクラスのすべてと結合することがより好ましい。ヒトＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合するが、ネズミ、ウシ又はヤギ起源のＩｇＧ分子とは結合しない抗原結合タンパク質は、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜１５、１７〜２５、３１〜３６、３８及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１〜１５、１７〜２５、３１〜３６、３８及び４４と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜６４、６６〜７４、８０〜８５、８７及び９３からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号５０〜６４、６６〜７４、８０〜８５、８７及び９３と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１１３、１１５〜１２３、１２９〜１３４、１３６及び１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号９９〜１１３、１１５〜１２３、１２９〜１３４、１３６及び１４２と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有する抗原結合タンパク質であることが好ましい。抗原結合タンパク質は、配列番号１４８〜１６２、１６４〜１７２、１７８〜１８３、１８５及び１９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３２】
本発明のさらにより好ましい抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合するが、ネズミ、ウシ、ヤギ、ラット、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ネコ又はヒツジを起源とするＩｇＧ分子とは結合しない。抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４分子のうち１種又は複数と結合することが好ましく、抗原結合タンパク質は、４種のヒトＩｇＧサブクラスのすべてと結合することがより好ましい。抗原結合タンパク質は、ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも５ｎＭの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、ｂ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０を用いて、少なくとも９９％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、ｃ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも８０％の収率で抗原結合タンパク質から回収されることからなる群から選択される１つ又は複数の特性を有することがさらに好ましい。より好ましくは、抗原結合タンパク質は、前記特性のうち少なくとも２又は３を有することが好ましい。このような抗原結合タンパク質は、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１〜１５と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜６４からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号５０〜６４と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号９９〜１１３と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有することがさらに好ましい。抗原結合タンパク質は、配列番号１４８〜１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３３】
本発明の最も好ましい抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合するが、ネズミ、ウシ、ヤギ、ラット、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ネコ又はヒツジを起源とするＩｇＧ分子とは結合しない。抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４分子のうち１種又は複数と結合することが好ましく、抗原結合タンパク質は、４種のヒトＩｇＧサブクラスのすべてと結合することがより好ましい。抗原結合タンパク質は、ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも５ｎＭの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、ｂ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも９９％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、ｃ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍグリシン、ｐＨ４．０を用いて、少なくとも９５％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、ｄ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１〜０．２Ｍアルギニン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも９９％の収率で抗原結合タンパク質から回収されること、ｅ）１００回の定置洗浄サイクル後に少なくとも９０、９５又は１００％の残存動的結合能を保持し、各定置洗浄サイクルにおいて、参照ＮＨＳ担体にカップリングされている抗原結合タンパク質が、０．１Ｍ  ＮａＯＨと１５０ｃｍ／ｈの流速で１５分間接触すること、及びｆ）４０回の定置洗浄サイクル後に少なくとも８０％の残存動的結合能を保持し、各定置洗浄サイクルにおいて、参照ＮＨＳ担体にカップリングされている抗原結合タンパク質が、０．２Ｍ  ＮａＯＨと１５０ｃｍ／ｈの流速で１５分間接触することからなる群から選択される１つ又は複数の特性を有することがさらに好ましい。より好ましくは、抗原結合タンパク質は、前記特性のうち少なくとも２、３、４、５又は６を有することが好ましい。このような抗原結合タンパク質は、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１〜９と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号５０〜５８と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９〜１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号９９〜１０７と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有することがさらに好ましい。抗原結合タンパク質は、配列番号１４８〜１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３４】
本発明の別のより好ましい抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合するが、ネズミ、ウシ、ヤギ、ラット、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ネコ又はヒツジを起源とするＩｇＧ分子とは結合しない。抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４分子のうち１種又は複数と結合することが好ましく、抗原結合タンパク質は、４種のヒトＩｇＧサブクラスのすべてと結合することがより好ましい。抗原結合タンパク質は、ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも３ｎＭの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、及びｂ）抗原結合タンパク質が、少なくとも１．２ｇ／酵母培養物１Ｌの発現レベルでの酵母における発現によって得ることができることからなる群から選択される１つ又は複数の特性を有することがさらに好ましい。より好ましくは、抗原結合タンパク質は、前記特性の両方を有することが好ましい。このような抗原結合タンパク質は、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１０〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１０〜１５と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５９〜６４からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号５９〜６４と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１０８〜１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１０８〜１１３と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有することがさらに好ましい。抗原結合タンパク質は、配列番号１５７〜１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３５】
本発明の好ましい別の抗原結合タンパク質は、ヒト、ネズミ及びウシからなる群から選択される少なくとも２つの異なる種に由来するＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合する。このような好ましい別の抗原結合タンパク質は、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１６、２６〜３０、３７、４２及び４７〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１６、２６〜３０、３７、４２及び４７〜４９と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号６５、７５〜７９、８６、９１及び９６〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号６５、７５〜７９、８６、９１及び９６〜９８と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１１４、１２４〜１２８、１３５、１４０及び１４５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１１４、１２４〜１２８、１３５、１４０及び１４５〜１４７と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有することが好ましい。抗原結合タンパク質は、配列番号１６３、１７３〜１７７、１８４、１８９及び１９４〜１９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３６】
本発明のより好ましい別の抗原結合タンパク質は、ヒト、ネズミ、ウシ、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、霊長類（そのうち、少なくともチンパンジー及びアカゲザル）、ロバ及びウマ由来のＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合する。このような好ましい別の抗原結合タンパク質は、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１６、２８〜３０、３７、４２及び４７〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１６、２８〜３０、３７、４２及び４７〜４９と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号６５、７７〜７９、８６、９１及び９６〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号６５、７７〜７９、８６、９１及び９６〜９８と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１１４、１２６〜１２８、１３５、１４０及び１４５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１１４、１２６〜１２８、１３５、１４０及び１４５〜１４７と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有することが好ましい。抗原結合タンパク質は、配列番号１６３、１７５〜１７７、１８４、１８９及び１９４〜１９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３７】
本発明の最も好ましい別の抗原結合タンパク質は、ヒト、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、霊長類（チンパンジー、アカゲザル）、ロバ、ウマ、ヤギ、シリアンハムスター、モルモット由来のＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合する「多種抗原結合タンパク質」である。この抗原結合タンパク質は、肉食動物目、偶蹄目及び奇蹄目、霊長類、げっ歯類及びウサギ目（ウサギを含む）内の種のうち少なくともいくつか、好ましくはすべてに由来するＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合することがより好ましく、この抗原結合タンパク質は、すべての哺乳動物種に由来するＩｇＧ分子のＦｃドメインと結合することが最も好ましい。抗原結合タンパク質は、ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも２０ｎＭの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、ｂ）抗原結合タンパク質が、少なくとも２．５ｇ／酵母培養物１Ｌの発現レベルでの酵母における発現によって得ることができること、及びｃ）抗原結合タンパク質と結合しているヒトＩｇＧが、参照ＮＨＳ担体にカップリングされると、０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ３．０又は０．２Ｍ  アルギニン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも９９％の収率で抗原結合タンパク質から回収されることからなる群から選択される１つ又は複数の特性を有することがさらに好ましい。抗原結合タンパク質は、前記特性のうち少なくとも２又は３を好ましくは有することがより好ましい。最も好ましい別の抗原結合タンパク質は、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１６、２８〜３０及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１６、２８〜３０及び４８と４、３、２若しくは１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号６５、７７〜７９及び９７からなる群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号６５、７７〜７９及び９７と６、５、４、３、２若しくは１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１１４、１２６〜１２８及び１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１１４、１２６〜１２８及び１４６と６、５、４、３、２若しくは１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有することが好ましい。抗原結合タンパク質は、配列番号１６３、１７５〜１７７及び１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、特定の形の本発明の抗原結合タンパク質：多価抗原結合タンパク質に関する。多価抗原結合タンパク質は、本明細書において上記で定義される少なくとも２種の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含む。少なくとも２種の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、各々異なっていてもよく、同一、例えば、１種のアミノ酸配列のコピー又は反復であってもよい。少なくとも２種の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は通常、ｈｅａｄ−ｔｏ  ｔａｉｌ、即ち、最もＮ末端にある配列のＣ末端が第２の配列のＮ末端と融合する状態などで融合する。少なくとも２種の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、融合して直接連結していてもよく、リンカー又はスペーサーを介して連結していてもよい。本発明の多価抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の２種以上のコード配列が、同一リーディングフレーム中に一緒に作動可能に連結している、多価タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現によって産生され得る。当業者ならば、タンパク質をコードする配列を作動可能に融合する方法を承知しているであろう。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義される抗原結合タンパク質のアミノ酸配列が、治療タンパク質のアミノ酸配列と融合している融合タンパク質に関する。２種のアミノ酸配列は、遺伝子融合によって一緒になって連結されることが好ましく、これでは、それぞれのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野においてそれ自体公知の手段によってインフレームで一緒に作動可能に連結される。アミノ酸配列は直接連結していてもよく、場合により、スペーサー又はリンカーアミノ酸配列を介していてもよい。治療タンパク質と融合された、本発明の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質は、タンパク質の血清半減期を増大するのに有用である。注射される生物治療薬は、投与後、血液循環から迅速に除去され、有効な治療レベルを維持するために高用量又は頻繁な投与を必要とする場合がある。これらの問題を克服するために、生物学的治療用タンパク質又はペプチドを、ＩｇＧなどの循環血清タンパク質と結合し、そのバイオアベイラビリティを増強することができる。本発明では、生物学的治療用タンパク質又はペプチドは、生物学的治療用タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を、本発明の抗原結合タンパク質のものと融合することによって、循環ＩｇＧと結合される。これによって融合された生物学的治療用タンパク質又はペプチドのバイオアベイラビリティが増強される。本発明の抗原結合タンパク質と生物学的治療薬との遺伝子融合は、ＩｇＧのＦｃドメインに向けられた結合部分を提供し、血清における生物学的治療薬の半減期の増大をもたらし得る。Ｈａｒｍｓｅｎら、（２００５年、Ｖａｃｃｉｎｅ２３（４１）、４９２６〜４２頁）によって、ブタＩｇＧと結合するＶＨＨとの融合物による、治療の可能性を有するモデルＶＨＨとブタＩｇＧとの結合が、ブタＩｇＧと結合しなかった対照融合物ＶＨＨと比較した、モデルＶＨＨのｉｎ  ｖｉｖｏ滞留の増大をもたらしたと実際に報告されている。血清半減期を改善するこの方法は、原則として、例えば、抗原（ワクチン接種のため）、酵素（酵素補充療法のため）、ホルモン、キモカイン（ｃｈｙｍｏｋｉｎｅｓ）、インターロイキン、（ヒト化）モノクローナル抗体などをはじめとする任意の生物学的治療用タンパク質に適用できる。
【００４０】
別の態様では、本発明は、本明細書において上記で定義される抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。本発明の好ましい核酸は、抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、プロモーターと、場合により、例えば、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、分泌のためのシグナル配列などといったその他の調節エレメントと作動可能に連結している核酸構築物である。このような核酸構築物は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）に、またＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載される、注目する抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が適した宿主細胞において発現される組換え技術を用いる本発明の抗原結合タンパク質の産生にとって特に有用である。本明細書において、用語「作動可能に連結している」とは、機能的な関係でのポリヌクレオチド成分の連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係におかれている場合に「作動可能に連結している」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列と作動可能に連結している。作動可能に連結しているとは、連結されているＤＮＡ配列が、通常、隣接しており、必要に応じて、２種のタンパク質をコードする領域を接続しており、隣接し、リーディングフレームにあることを意味する。
【００４１】
さらなる態様では、本発明は、上記で定義される核酸を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、本発明の抗原結合タンパク質を製造するための宿主細胞であることが好ましい。宿主細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物の宿主細胞又は例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞系（ＨｅＬａ、ＣＯＳ及びＰＥＲ．Ｃ６を含む）、Ｓｆ９細胞及びＳｆ＋細胞をはじめとする、（培養された）哺乳動物、植物、昆虫、真菌若しくは酵母宿主細胞を含めた、本発明の抗原結合タンパク質を産生できる任意の宿主細胞であり得る。しかし、本発明の抗原結合タンパク質の製造にとって好ましい宿主細胞は、酵母及び糸状菌などの真核微生物の細胞である。例えば、好ましい酵母宿主細胞として、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）及びクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。本発明の抗原結合タンパク質を製造するための好ましい株、構築物及び発酵条件は、ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａａｒら（２００７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９６巻、第３号：４８３〜４９４頁）に記載されている。例えば、抗原結合タンパク質の製造は、１０から１０，０００リットルの間の可動範囲の標準的バイオリアクターにおいて実施できる。溶存酸素は、羽根車速度の自動調整によって制御できる。ｐＨは、リン酸及びアンモニアガス又はアンモニア溶液を用いて制御でき、温度は、例えば、冷却用ジャケット及び加熱用ジャケットによって制御する。オフガスを、エタノール濃度、ｒＯ２及びｒＣＯ２に関して分析する。バッチ相は、３％〜８％の十分に増殖した接種菌液を添加することによって開始する（例えば、３０℃、０．３〜０．４ＶＶＭ空気、ＤＯ２最小３０％、ｐＨ５．０）。バッチ相においてオフガス中のエタノール濃度が低下している場合には、エタノール発酵を開始してよい。パルス化供給プロフィールに従って供給を適用し、要求される限界内にエタノールレベルを維持できる。供給相は、２１℃、０．７〜１．１ＶＶＭ空気で実施できる。エタノール発酵の間に、ＤＯ２が０％に低下し、蓄積されたエタノールをパルス化供給プロフィールによってさらに制御できる。供給相は、エタノール供給が枯渇した時点で停止する。ブロスは、バイオマス回収などのようなさらなる処理まで５〜１０℃の間の温度に冷却できる（ＶＶＭ＝バッチの容積あたり、１分あたりの空気の容積）。これに関連して、本明細書において、本発明者らが、本発明の抗原結合タンパク質が特定の最小発現レベルでの酵母における発現によって得ることができるとする場合にはいつでも、このレベルは、本明細書の例１．１に記載される方法を用いて得られることも理解され、それによれば、抗原結合タンパク質（発酵の最後での）の（最大）濃度「ｇ／Ｌ」は、１リットルの細胞不含（即ち、例えば、濾過によってバイオマスを除去した後の）ブロスあたりの分泌された抗原結合タンパク質の量（グラム単位）を指す。
【００４２】
少なくとも１．２ｇ／酵母培養物１Ｌの発現レベルでの酵母における発現によって得ることができる本発明の抗原結合タンパク質の例として、ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１０〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１０〜１６と４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５９〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号５９〜６５と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号１０８〜１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号１０８〜１１４と６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する、本明細書において上記で定義される構造を有する抗原結合タンパク質が挙げられる。抗原結合タンパク質は、配列番号１５７〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００４３】
したがって、さらにもう１つの態様では、本発明は、ａ）抗原結合タンパク質の発現につながる条件下で、上記で定義される宿主細胞を培養するステップと、場合により、ｂ）少なくとも１種の宿主細胞及び培養培地から抗原結合タンパク質を精製するステップとを含むことが好ましい、本発明の抗原結合タンパク質を製造する方法に関する。適した条件として、適した培地の使用、餌の適した供給源及び／又は適した栄養分の存在、適した温度及び場合により、適した誘導因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導プロモーターの制御下にある場合）を挙げることができ、そのすべてが当業者によって選択され得る。このような条件下で、本発明のアミノ酸配列は、構成的に、一時的に発現されるか、又は適宜誘導される場合にのみ発現され得る。次いで、本発明の抗原結合タンパク質は、（分取）クロマトグラフィー及び／又は電気泳動技術、差次的沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）技術、親和性技術（例えば、本発明のアミノ酸配列と融合している、特異的、切断可能アミノ酸配列を用いる）及び／又は分取免疫学的技術（即ち、単離されるべき抗原結合タンパク質に対する抗体を用いる）などのそれ自体公知であるタンパク質単離及び／又は精製技術を用いて宿主細胞／宿主生物から、及び／又は前記宿主細胞又は宿主生物が培養された培地から単離できる。
【００４４】
一態様では、本発明はまた、本明細書に定義される抗原結合タンパク質を含む組成物に関する。その好ましい実施形態として、抗原結合タンパク質を含む免疫吸着物質がある。本明細書において、免疫吸着物質は、担体と担体上に固定化されている抗原結合タンパク質の組合せを意味すると理解される。免疫吸着物質では、抗原結合タンパク質は担体上に固定化されていることが好ましく、抗原結合タンパク質は、共有結合によって担体上に固定化されていることがより好ましい。担体は、抗原結合タンパク質の固定化に使用され得る任意の物質であり得る。適した例として、結合作用物質を捕捉するためのマトリックス物質、結合作用物質が提示されている細胞表面及び共有結合によって結合作用物質と連結され得るポリマーがある。アフィニティークロマトグラフィーの当業者ならば、例えば、多孔質固相担体物質、例えば、アガロース、ポリスチレン、細孔制御ガラス、セルロース、デキストラン、キーゼルグール、セファロース（商標）などの合成ポリマー、多孔質非結晶性シリカなどの適した担体を十分に承知している。担体物質は、粒子、粉末、シート、ビーズ、フィルターなどといった任意の適した形式であり得る。適した担体物質のさらなる詳述は、例えば、ＥＰ−Ａ−４３４３１７に開示されている。選択された官能基によってリガンドを迅速に、容易に、安全に固定化する方法が利用可能である。カップリング法の正しい選択は、固定化される物質に応じて変わる。例えば、以下のセファロース（商標）の商業的に知られている誘導体によって、その上にタンパク質を都合よく固定化することが可能となる：ＣＮＢｒ活性化セファロース（商標）４Ｂは、第一アミノ基を含有するリガンドが自発的な反応によって迅速に固定化されるのを可能にする。ＡＨ−セファロース（商標）４Ｂ及びＣＨ−セファロース（商標）４Ｂは両方とも、６個の炭素の長さのスペーサーアームを有し、それぞれ、カルボキシル基及びアミノ基を介したカップリングを可能にする。柔軟なスペーサーは、標的分子の柔軟性が限定されている状況又は標的の３次元構造が、最適結合を可能にするために結合作用物質のいくらかの柔軟性を必要とする状況で使用するのに適している。活性化ＣＨ−セファロース（商標）４Ｂは、６炭素スペーサーアーム及びアミノ基による自発的カップリングのための活性エステルを提供する。これらは、適した固定化経路のほんの数例である。場合により、免疫吸着物質をカラムに入れて、容易なクロマトグラフィーによる分離を促進してもよい。
【００４５】
なおさらなる態様では、本発明は、哺乳動物ＩｇＧ分子を精製する方法に関する。この方法は、ａ）標的分子、例えば、哺乳動物ＩｇＧ分子を含む組成物を、本発明の抗原結合タンパク質を含む免疫吸着物質と、好ましくは標的分子と免疫吸着物質の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、ｂ）場合により、１又は複数の洗浄ステップを実施するステップと、ｃ）標的分子と免疫吸着物質との親和性を低減する条件下で、結合している標的分子を溶出するステップと、ｄ）場合により、標的分子をさらに処理するステップとを含むことが好ましい。
【００４６】
標的分子を含む組成物は、精製されるべき標的の他に多数のその他のタンパク質を含む水性組成物であることが多い。接触ステップの条件は、結合作用物質と標的分子の結合が生じるようなものであることが好ましい。このステップでは、６．５〜８辺りのｐＨを有するローディングバッファーが用いられることが好ましい。適したバッファーとは、例えば、ＰＢＳバッファー又は類似のバッファー、生理学的イオン強度及びｐＨである。ロードされる物質は、非特異的結合物質が溶出されるまで洗浄されることが好ましい。これは、通常、ローディングバッファーと同一であってもよい、適したバッファーですすぐことによって実施される。標的分子の脱離又は溶出が、次のステップである。これは、抗体又は断片が、標的分子ともはや結合しないような条件に変更することによって行われることが好ましい。溶出は、ｐＨ、塩、温度又は任意のその他の適した尺度に関して条件を変更することによって達成され得る。脱離のための好ましい溶出法は、４、３又は２を下回るｐＨを有するバッファーで溶出することである。適した溶出バッファーは本明細書において上記に記載されている。
【００４７】
さらに詳しくは、本発明は、ａ）標的分子と結合する抗原結合タンパク質又はその断片を選択するステップと、ｂ）抗原結合タンパク質又はその断片を、免疫吸着物質（ｉｍｍｕｎｏｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）と結合するステップと、ｃ）好ましくは、抗原結合タンパク質と標的分子の結合が生じる条件下で、免疫吸着物質に標的分子を含む組成物とともにロードするステップと、ｄ）ロードされた免疫吸着物質を洗浄して非特異的結合物質を除去するステップと、ｅ）溶出条件を適用することによって標的分子を溶出するステップとを含む、免疫親和性によって標的分子を精製する方法に関する。抗原結合タンパク質の断片は、本発明に関連して上記で定義される結合親和性を保持することが好ましい。
【００４８】
なおさらなる態様では、本発明は、哺乳動物ＩｇＧ分子の検出及び／又は精製のための、本明細書に定義される抗原結合タンパク質の使用に関する。
【００４９】
一態様では、本発明は、治療的アフェレーシスのための方法に関する。治療的アフェレーシスとは、血液から病原性化合物を排除するための体外血液治療である（Ｂｏｓｃｈ、２００３年、Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ６（１）：１〜８頁）。ＴＡの一例は、様々な抗体媒介性免疫疾患における抗体の吸着に関する。ＴＡにおいて抗体の吸着に一般に用いられるマトリックスとして、プロテインＡセファロースがある。このマトリックスは、様々な自己免疫疾患及び抗体媒介性移植拒絶の治療のために用いられる。しかし、ヒトＩｇＧサブクラスの３種の抗体に対する低い親和性のために、プロテインＡマトリックスは、ＩｇＧ３抗体の除去において効率的ではない。哺乳動物又はヒトＩｇＧに特異的である本発明の抗原結合タンパク質はまた、抗体媒介性疾患を患っている患者におけるＩｇＧ３を含めたＩｇＧの枯渇のために使用できることが有利である。治療的アフェレーシスのための方法は、体液中の（から）哺乳動物ＩｇＧを除去、枯渇及び不活化することのうち少なくとも１つを含むことが好ましい。体液中の（から）哺乳動物ＩｇＧを除去、枯渇及び不活化することは、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施することが好ましい。体液は、血液、血液画分、例えば、血漿若しくは血液血清など、又は別の体液であることが好ましい。本方法では、本明細書において上記で定義される本発明の抗原結合タンパク質又は上記で定義される抗原結合タンパク質を含む免疫吸着物質を、被験体、好ましくは、ヒト被験体の体液と体外接触させる。免疫吸着アフェレーシス物質は、粒子又はビーズの形であり得、それを通って被験体又は患者の体液が体外的に通過する、フローチャンバー又はカラム中に詰めることができることが有利である。ＩｇＧが枯渇する処理の前又は後に、体液のための１種又は複数のさらなる処理段階を実施してもよい。体液のいくつかの処理は、連続ユニットにおいて実施でき、ここで、ＩｇＧが吸着によって枯渇し、ＩｇＧの所望の最終濃度を達成する。ＩｇＧ枯渇の前及び後の体液のサンプルを、例えば、ＩｇＧレベルについて（例えば、本発明の抗原結合タンパク質を用いて）ＥＬＩＳＡを用いて試験してもよい。次いで、体液を被験体又はヒト患者に再注入してもよいが、後者のステップは、本方法の好ましい体外実施形態からは明確に排除され得る。好ましい実施形態では、治療的アフェレーシスのための本発明の方法は、抗体媒介性成分を含む、抗体媒介性自己免疫疾患、抗体媒介性移植拒絶又は自己免疫疾患を患う患者又は被験体から得た体液に適用される。このような疾患の例として、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び拡張型心筋症（ＤＣＭ）が挙げられる。本発明のアフェレティック（ａｐｈｅｒｅｔｉｃ）法は、例えば、ＳＬＥ及びＤＣＭのようなサブクラス３の自己抗体が関与している自己免疫疾患にとって特に有用であるが、これはプロテインＡを用いてＩｇＧ３が効率的に枯渇しないからである（Ｓｔａｕｄｔら、２００２年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：２４４８〜２４５３頁）。
【００５０】
したがって、一態様では、本発明はまた、被験体、好ましくは、ヒト被験体の体液中の哺乳動物ＩｇＧの体外除去又は枯渇のための、哺乳動物ＩｇＧ分子と結合する本発明の抗原結合タンパク質の使用に関する。
【００５１】
この文書及び特許請求の範囲では、動詞「含むこと（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用は、語句に続く項目が含まれるが、具体的に言及されない項目が排除されないことを意味するよう、限定されない意味で用いられる。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈が明確に、１種の、１種のみの要素があることを必要としない限り、２以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１種」を意味する。
【００５２】
本明細書に引用されるすべての特許及び参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５３】
以下の例は、例示目的でのみ提示されるものであって、決して、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００５４】
【表１】
2014223079.tif 000002
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】０．１Ｍ  ＮａＯＨ（白抜きのひし形）及び０．２Ｍ  ＮａＯＨ（白抜きの四角）を用いたサイクル後の残存する動的結合能（ＤＢＣ）が示されている図である。
【実施例】
【００５６】
（例１）
ＶＨＨ断片と結合するＩｇＧ−Ｆｃドメインの同定
ＶＨＨ断片と結合するＩｇＧ−Ｆｃドメインを、哺乳動物ＩｇＧ抗体及び／又はそのＦｃ断片で免疫化したラマから同定した。個々のＶＨＨ断片のスクリーニングは、様々な哺乳動物種由来のＩｇＧ並びに／又はそのＦｃ断片及びＦａｂ断片、例えば、ＩｇＭ及びＩｇＡのような非ＩｇＧ抗体を用いるＥＬＩＳＡによって実施し、これから、哺乳動物ＩｇＧ及び特にヒトＩｇＧのＦｃドメインと結合するＶＨＨ断片のパネルが得られた。表５は、ＶＨＨ断片の各々に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３アミノ酸配列、並びにフレームワーク領域を含むＶＨＨ断片の各々のアミノ酸配列も示す。
【表５−１】
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【表５−２】
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【００５７】
（例１．１）
ＶＨＨ断片と結合するＩｇＧ−Ｆｃドメインの製造
本発明のＩｇＧ結合タンパク質を、ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａａｒら、（２００７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９６巻、第３号：４８３〜４９４年）によって記載されるように、株及び発現構築物を用いて酵母において製造した。ＩｇＧ結合タンパク質の製造は、１０から１０，０００リットルの間の可動範囲の標準的バイオリアクターで実施した。溶存酸素（Ｉｎｇｏｌｄ  ＤＯ２電極、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）は、羽根車速度の自動調整によって制御した。ｐＨ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  Ｉｎｐｒｏ３１００ゲル電極又はＢｒｏａｄｌｅｙ  Ｊａｍｅｓ  Ｆ６３５ゲル電極）は、リン酸及びアンモニアガス又はアンモニア溶液を用いて制御した。発泡は、泡レベルセンサー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｒｕｓｓｅｌｌ）によって検出し、５〜１０％のＳｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６７３の添加によって制御した。温度（ＰＴ１００電極）は、冷却用ジャケット及び加熱用ジャケットによって制御した。オフガス（Ｐｒｉｍａ  ６００質量分光光度計、ＶＧガス分析システム）によって、エタノール濃度、ｒＯ２及びｒＣＯ２を分析した。３％〜８％の十分に増殖した接種菌液を添加することによって、バッチ相を開始した（３０℃、０．３〜０．４ＶＶＭ空気、ＤＯ２最小３０％、ｐＨ５．０）。バッチ相においてオフガス中のエタノール濃度が低下している場合には、エタノール発酵は自動的に開始された。パルス化供給プロフィールに従って供給を適用し、要求される限界内にエタノールレベルを維持した。供給相は、２１℃、０．７〜１．１ＶＶＭ空気で実施した。エタノール発酵の間に、ＤＯ２が０％に低下し、蓄積されたエタノールをパルス化供給プロフィールによってさらに制御した。供給相は、エタノール供給が枯渇した時点で停止した。ブロスは、使用済みバイオマス回収の回収を含むさらなる処理まで５〜１０℃の間の温度に冷却した。
【００５８】
通常の発酵パラメータとして、２０〜３１℃の温度、４．７〜５．８のｐＨ、形成された生成物：１０００〜１５００ｍｇ／無細胞ブロス１ｌ、１１５〜１２０時間の発酵時間及び細胞乾重（発酵の最後での）：９５〜１１５ｇ／ｋｇが含まれる。
【００５９】
（例１．２）
発酵におけるＶＨＨ断片と結合するＩｇＧ−Ｆｃドメインの発現レベル
例１．１に記載されるエタノールを供給された発酵における、ＶＨＨ断片と結合するＩｇＧ−Ｆｃの発現レベルを、アフィニティークロマトグラフィーカラムに基づく定量ＨＰＬＣアッセイを用いて調べた。サンプルを、ＩｇＧがカップリングされたアフィニティーカラムにロードした。結合していないサンプルを洗い出した後、結合しているＩｇＧ−Ｆｃ  ＶＨＨ断片を低ｐＨで溶出した。溶出ピークの面積を、ピーク積分によって求めた。このピーク面積に基づいて、サンプル中のＶＨＨ断片濃度を標準曲線を用いて算出した。
【００６０】
ＶＨＨ断片発現に関して、様々な発酵容積で発酵の最後（ＥｏＦ）のサンプルを分析した。様々な発酵容積でのＶＨＨ断片発現レベルの全体像が、表６に示されている。
【表６】
2014223079.tif 000008
＊濃度は、ＥｏＦでの上清１リットルあたりのＶＨＨ断片のｇである。
【００６１】
（例２．１）
ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅ分析
ＥＬＩＳＡでの結合分析のために、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ結合プレートを、様々な種の抗体抗原でコーティングし、続いて、ＰＢＳ中、２％（ｗ／ｖ）ゼラチンでブロッキングした。結合しているＶＨＨ断片を、ポリクローナルヤギ抗マウス−ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１７２−１０１１）と組み合わせたマウス抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ又はポリクローナルブタ抗ウサギＩｇＧ−ＨＰＯコンジュゲート（Ｄａｋｏ、Ｐ２１７）と組み合わせたポリクローナルウサギ抗ラマＶＨＨ血清のいずれかによって検出した。
【００６２】
表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）を用いる結合分析を、ＢｉａＣｏｒｅ３０００で実施した。この目的で、抗体抗原は、ＣＭ５センサーチップの表面上に固定化し、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；３ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中、抗ＩｇＧ−Ｆｃ  ＶＨＨ断片とともにインキュベートした。５μｌ／分で１分間結合させ、５μｌ／分で２．５分間の解離ステップを続けた。結合シグナル（レゾナンスユニット）を、ＨＢＳ−ＥＰバッファーのみを用いて測定されたバックグラウンドシグナルと比較した。
【００６３】
ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅ測定値間に相違は見られなかった。試験された抗ＩｇＧ−Ｆｃ  ＶＨＨ断片の特異性の全体像は、表７に示されている。比較のために、様々なＩｇＧ種に対するプロテインＡ及びＧの相対的な反応性が表８に示されている。
【表７】
2014223079.tif 000009
抗ＩｇＧ−Ｆｃ  ＶＨＨ断片３６、３８〜４１、４３〜４６は、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＩｇＧ−Ｆｃドメインに対して結合を示すが、その他のＩｇＧ種に対するさらなる分析は実施しなかった。
【００６４】
（例２．２）
ＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１６と結合するＩｇＧ−ＦｃドメインのＢｉａｃｏｒｅ分析
ＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１６の広い結合反応性を、ＢｉａＣｏｒｅ３０００での表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）を用いて調べた。この目的で、精製されたＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１６を、ＣＭ５センサーチップの表面上に固定化し、続いて、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中で様々な種に由来する精製されたＩｇＧ抗体（５０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。５μｌ／分で１分間結合させ、５μｌ／分で２．５分間の解離ステップを続けた。結合シグナル（レゾナンスユニット）を、ＨＢＳ−ＥＰバッファーのみを用いて測定されたバックグラウンドシグナルと比較した。結果は、表８に要約されている。比較のために、様々なＩｇＧ種に対するプロテインＡ及びＧの相対的な反応性も示されている。
【表８】
2014223079.tif 000010
それぞれ、＋＋＋、＋＋、＋、−：強力な結合、中程度の結合、弱い結合、結合なし
【００６５】
プロテインＡとヒトＩｇＧ  Ｆａｂ断片の結合について表８に示される「＋」値は、ヒトＶＨ−ＩＩＩファミリーに属するＶＨドメインを含むヒトＦａｂ断片にのみ関するということは注記する。ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ断片に対するプロテインＧの観察された結合反応性は、ヒトＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメイン上に存在するエピトープとの結合によって生じる。しかし、プロテインＡ及びＧの両方について、これらのＦａｂ関連エピトープに対する結合強度は、ＩｇＧ抗体のＦｃドメイン上に存在するエピトープと比較して低い。表８に示されるように、ＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１６は、ＩｇＧ  Ｆａｂ断片上に存在する任意のエピトープと同時には結合しない。
【００６６】
（例２．３）
Ｂｉａｃｏｒｅでの結合親和性測定値
抗ＩｇＧ−Ｆｃ  ＶＨＨ断片の結合親和性定数を、ＢｉａＣｏｒｅ３０００での表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）を用いて求めた。この目的で、精製されたＶＨＨ断片をＣＭ５センサーチップの表面上に固定化し、続いて、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中、様々な濃度の精製されたＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。３０μｌ／分で３分間結合させ、３０μｌ／分で１５分間の解離ステップを続けた。Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアを用い１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに従って結合曲線を適合させた。算出された親和性データの全体像が表９に示されている。
【表９】
2014223079.tif 000011
【００６７】
（例３．１）
クロマトグラフィー試験
ＷＯ２００６／０５９９０４に記載されるとおり、供給業者のプロトコール（ＧＥＨＣ）に従って、精製された抗ＩｇＧ−Ｆｃ  ＶＨＨ断片を、ＮＨＳカップリングバッファーに対して透析し、ＮＨＳ活性化セファロース４Ｂファーストフローにカップリングした。カラムは、ＨＲ５／５カラム（ＧＥＨＣ）を用い、カップリングされた抗体マトリックスで作製された。４００μｌのカラム容量を用いた。すべてのクロマトグラフィー実験は、Ａｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００で実施した。ＩｇＧサンプルは、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中でロードし、例えば、ｐＨ２．１となるよう８ＭのＨＣｌを添加したＰＢＳ又はｐＨ２又は３の０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌを用いて溶出した。タンパク質検出は、ＯＤ２１４及びＯＤ２８０のシグナルをモニタリングすることによってオンラインで実施した。クロマトグラフィーにおいて試験された抗ＩｇＧ−Ｆｃセファロース担体の結合分析の全体像が、表１０に示されている。
【表１０】
2014223079.tif 000012
【００６８】
（例３．１）
ＶＨＨ断片と結合するＩｇＧ−Ｆｃドメインの動的結合能
ＮＨＳセファロース上に固定化されているＶＨＨ断片と結合するＩｇＧ−Ｆｃドメインの動的結合能（ＤＢＣ）を試験した。ＰＢＳ  ｐＨ７．４中の１．０ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１０ｍｌを、１５０ｃｍ／時間の直線流を用いて４００μｌカラムにロードした。１０カラム容積のＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄した後、０．１Ｍ  グリシンバッファーｐＨ３．０でカラムを溶出した。フロースルー及び溶出ピークのＯＤ２８０シグナルの統合に基づいて、カラムの動的結合能を算出した（表１１）。
【表１１】
2014223079.tif 000013
【００６９】
（例３．２）
クロマトグラフィーにおいてＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１と結合するＩｇＧ−Ｆｃドメインの溶出プロフィール
ＷＯ２００６／０５９９０４に記載されるとおり、供給業者のプロトコール（ＧＥＨＣ）に従って、精製されたＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１を、ＮＨＳカップリングバッファーに対して透析し、ＮＨＳ活性化セファロース４Ｂファーストフローにカップリングした。カラムは、ＨＲ５／５カラム（ＧＥＨＣ）を用い、カップリングされた抗体マトリックスで作製された。４００μｌのカラム容量を用いた。比較のために、プロテインＡ  ＨｉＴｒａｐカラム（１ｍｌ）を用いた。すべてのクロマトグラフィー実験は、Ａｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００で実施した。ＩｇＧサンプル（１ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＢＳ  ｐＨ７中でロードし（ＩｇＧ−Ｆｃ−１セファロースに１０ｍｌ、プロテインＡ  ＨｉＴｒａｐに２０ｍｌ）、以下の種類の第１の溶出バッファーを用いて溶出した：
−  様々なｐＨ値を含むミリＱ中、０．２Ｍグリシン
−  様々なｐＨ値を含むミリＱ中、０．１Ｍ酢酸
−  様々なｐＨ値を含むミリＱ中、０．１Ｍクエン酸。
第２の溶出バッファー（再生）としてＰＢＳ、ｐＨ２を使用した。
【００７０】
サンプルをロードし（直線流：１５０ｃｍ／時間）、結合していないサンプルを洗い出した（直線流：１５０ｃｍ／時間、容積：１０ｃｖ）後、第１の溶出（直線流：３００ｃｍ／時間、容積：３０ｃｖ）を、指定のｐＨの（表１２参照のこと）第１の溶出バッファーのうち１種を用いて実施する。結合バッファーでカラムを再平衡化した後（直線流：３００ｃｍ／時間、容積３０ｃｖ）、第２の溶出（再生）を、第２の溶出バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ２．０、直線流：３００ｃｍ／時間、容積２０ｃｖ）を用いて実施する。
【００７１】
クロマトグラフから、２種の溶出ピークを統合し、２種間の関係を算出した。データが表１２に示されている。
【表１２】
2014223079.tif 000014
＊第１及び第２の溶出ピークの総ピーク面積と比較した第１の溶出ピークのパーセンテージ
【００７２】
（例３．３）
クロマトグラフィーにおけるＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１６と結合するＩｇＧ−Ｆｃドメインの溶出プロフィール
ＷＯ２００６／０５９９０４に記載されるとおり、供給業者のプロトコール（ＧＥＨＣ）に従って、精製されたＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１６を、ＮＨＳカップリングバッファーに対して透析し、ＮＨＳ活性化セファロース４Ｂファーストフローにカップリングした。カラムは、ＨＲ５／５カラム（ＧＥＨＣ）を用い、カップリングされた抗体マトリックスで作製された。４００μｌのカラム容量を用いた。すべてのクロマトグラフィー実験は、Ａｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００で実施した。ＩｇＧサンプル（１ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＢＳ  ｐＨ７中でロードし（ＶＨＨセファロースに１０ｍｌ）、以下の種類の第１の溶出バッファーを用いて溶出した：
−  様々なｐＨ値を含むミリＱ中、０．１Ｍグリシン
−  様々なｐＨ値を含むミリＱ中、０．１Ｍアルギニン
第２の溶出バッファー（再生）としてＰＢＳ、ｐＨ２を使用した。
【００７３】
サンプルをロードし（直線流：１５０ｃｍ／時間）、結合していないサンプルを洗い出した（直線流：１５０ｃｍ／時間、容積：１０ｃｖ）後、第１の溶出（直線流：３００ｃｍ／時間、容積：３０ｃｖ）を、指定のｐＨの（表１３参照のこと）第１の溶出バッファーのうち１種を用いて実施する。結合バッファーでカラムを再平衡化した後（直線流：３００ｃｍ／時間、容積３０ｃｖ）、第２の溶出（再生）を、第２の溶出バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ２．０、直線流：３００ｃｍ／時間、容積２０ｃｖ）を用いて実施する。
【００７４】
クロマトグラフから、２種の溶出ピークを統合し、２種間の関係を算出した。データが表１３に示されている。
【表１３】
2014223079.tif 000015
＊第１及び第２の溶出ピークの総ピーク面積と比較した第１の溶出ピークのパーセンテージ
【００７５】
（例３．４）
クロマトグラフィーにおけるＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１の腐食安定性
供給業者のプロトコールに従って、精製されたＶＨＨ断片ＩｇＧ−Ｆｃ−１を、ＮＨＳカップリングバッファーに対して透析し、ＮＨＳ活性化アガロースにカップリングした。カラムは、ＨＲ５／５カラム（ＧＥＨＣ）を用い、カップリングされた抗体マトリックスで作製された。ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１．０ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧ１０ｍｌを、１５０ｃｍ／時間の直線流を用いて４００μｌカラムにロードした。１０カラム容積のＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄した後、８Ｍ  ＨＣｌでｐＨ２．１に調整したＰＢＳでカラムを溶出した。フロースルー及び溶出ピークのＯＤ２８０シグナルの統合に基づいて、カラムの動的結合能（ＤＢＣ）を算出した。次いで、カラムを０．１Ｍ又は０．２Ｍ  ＮａＯＨとともに、１５０ｃｍ／時間の直線流で１５分間インキュベートし、続いて、１０カラム容積のＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡化した。各サイクルの後、動的結合能を上記のとおりに調べた。０．１Ｍ及び０．２Ｍ  ＮａＯＨを用いたサイクル後に残存するＤＢＣが図１に示されている。
【００７６】
０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いる１００を超えるサイクル後にもＤＢＣの喪失は見られなかった。０．２Ｍ  ＮａＯＨとともにインキュベートした場合には、４０サイクル後に９０％を超える残存するＤＢＣが見られた。
【図１】
2014223079.tif 000016
【配列表】
2014223079000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月25日(2014.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順で作動可能に連結している、４種のフレームワーク領域であるＦＲ１からＦＲ４と、３種の相補性決定領域であるＣＤＲ１からＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質であって、
ａ）ＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸配列か、又は配列番号１と１若しくは２個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｂ）ＣＤＲ２が、配列番号５０のアミノ酸配列か、又は配列番号５０と２個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
ｃ）ＣＤＲ３が、配列番号９９のアミノ酸配列か、又は配列番号９９と２個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有し、
各フレームワーク領域が、配列番号１４８のフレームワークアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、及びここで：
Ｉ）抗原結合タンパク質が、ヒトＩｇＧ分子のＦｃドメインと特異的に結合するが、ネズミ起源又はウシ起源のＩｇＧ分子に結合しないものであり；
ＩＩ）抗原結合タンパク質が、ＮＨＳ樹脂１ｍｌあたり２０ｍｇ抗原結合タンパク質の密度でＮＨＳ活性化担体にカップリングされると、２０回の定置洗浄サイクル後に少なくとも７０％の残存動的結合能を保持するものであり、（ここでこの各定置洗浄サイクルにおいては、ＮＨＳ樹脂にカップリングされた可変ドメインが、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ及び０．５Ｍ  ＮａＣｌと１５０ｃｍ／ｈの流速で１５分間接触するものである）；及び、
ＩＩＩ）ＩＩ）に定義されるようにＮＨＳ樹脂にカップリングされると、抗原結合タンパク質に結合しているヒトＩｇＧ分子が、
ｉ）０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０を用いて、少なくとも９０％の収率で；及び／又は
ｉｉ）０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いて、少なくとも７０％の収率で、
抗原結合タンパク質から回収されるものである、
上記抗原結合タンパク質。
【請求項２】
ａ）抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも１０−７Ｍの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合すること、
ｃ）抗原結合タンパク質が、ＮＨＳ樹脂１ｍｌあたり２０ｍｇ抗原結合タンパク質の密度で１５０ｃｍ／ｈの流速を用いてＮＨＳ活性化担体にカップリングされると、少なくとも２ｍｇのヒトＩｇＧ／樹脂１ｍｌの動的結合能を有すること、
からなる群から選択される１つ又は複数の特性を有する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子である、請求項１又は２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
さらにヤギ起源のＩｇＧ分子と結合しない、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
さらにラット、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ネコ又はヒツジを起源とするＩｇＧ分子と結合しない、請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
抗原結合タンパク質が、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いてＢｉａＣｏｒｅにより分析される少なくとも５ｎＭの結合親和性でヒトＩｇＧ分子と結合する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１４８のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の少なくとも２種の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含む、多価抗原結合タンパク質。
【請求項９】
治療タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列をさらに含む融合タンパク質の部分である、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列が、プロモーターと作動可能に連結している、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
ヌクレオチド配列が、さらにその他の調節エレメントと作動可能に連結している、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１４】
酵母である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記酵母がサッカロミセス・セレビシエである、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
ａ）請求項１３から１５のいずれか一項に記載の宿主細胞を、抗原結合タンパク質の発現につながる条件下で培養するステップ
を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を製造する方法。
【請求項１７】
ｂ）宿主細胞及び培養培地のうち少なくとも一方から抗原結合タンパク質を精製するステップ
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含む組成物。
【請求項１９】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含む免疫吸着物質。
【請求項２０】
抗原結合タンパク質が担体上に固定化されている、請求項１９に記載の免疫吸着物質。
【請求項２１】
抗原結合タンパク質が、共有結合によって担体上に固定化されている、請求項２０に記載の免疫吸着物質。
【請求項２２】
担体が、セファロースを含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の免疫吸着物質。
【請求項２３】
哺乳動物ＩｇＧ分子の検出及び／又は精製のための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
【請求項２４】
哺乳動物ＩｇＧ分子を精製する方法であって、
ａ）哺乳動物ＩｇＧ分子を含むサンプルを、請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の免疫吸着物質と、哺乳動物ＩｇＧ分子と免疫吸着物質の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
ｂ）結合している哺乳動物ＩｇＧ分子を、哺乳動物ＩｇＧ分子と免疫吸着物質との親和性を低下させる条件下で溶出するステップと、
を含む方法。
【請求項２５】
洗浄ステップを実施するステップをａ）とｂ）のステップの間にさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物ＩｇＧ分子をさらに処理するステップをｂ）のステップの後にさらに含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
体液中の哺乳動物ＩｇＧを除去、枯渇又は不活化する方法であって、請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の免疫吸着物質を、被験体の体液と体外接触させる方法。
【請求項２８】
前記被験体がヒト被験体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験体の体液中の哺乳動物ＩｇＧの体外除去又は枯渇のための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含む薬剤。
【請求項３０】
前記被験体がヒト被験体である、請求項２９に記載の薬剤。
【外国語明細書】
2014223079000001.pdf