(57)【要約】【課題】本発明は、細胞の形質転換および異常細胞増殖における、CXCR-4の新規役割の同定に関する。【解決手段】特に本発明は、CXCR-4のリガンドの遺伝子発現の変化以外に、多くの原発性腫瘍および腫瘍由来の細胞株におけるCXCR-4の遺伝子発現の変化に関する。さらに本発明は、一部は、形質転換された細胞でのCXCR-4遺伝子発現またはCXCR-4活性の阻害は、形質転換された表現型を逆転させるという、本出願人の驚くべき発見に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CXCR-4遺伝子のRNA転写体の少なくとも一部分に相補的なアンチセンス核酸を、腫瘍細胞の高増殖性を阻害するのに有効な量で含む、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
腫瘍細胞の高増殖性を阻害するのに有効な量で、CXCR-4に対する抗体を含む、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
【請求項３】
CXCR-4機能を阻害する分子の治療上有効量を、治療または予防が望ましい被験体に投与することを特徴とする、対象における細胞過剰増殖が関与する疾患または障害の治療または予防方法。
【請求項４】
前記疾患または障害が悪性腫瘍である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患または障害が、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌、およびＢ細胞性リンパ腫よりなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記対象がヒトである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記脳腫瘍が、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経外胚葉癌、および神経芽腫よりなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記神経膠芽細胞腫が多形神経膠芽細胞腫である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患または障害が、前癌症状、良性腫瘍、高増殖性疾患、および良性異常増殖疾患よりなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記CXCR-4機能を阻害する分子が、抗CXCR-4抗体またはその断片、抗CXCR-4抗体により結合されることができるCXCR-4誘導体または類似体、CXCR-4アンチセンス核酸、およびCXCR-4遺伝子（異種配列がCXCR-4遺伝子の少なくとも一部分の生物活性を不活性化するように、異種ヌクレオチド配列が挿入されている）の少なくとも一部分を含む核酸よりなる群から選択され、ここで、ゲノムCXCR-4遺伝子との相同性組換えを促進するように、CXCR-4遺伝子が異種配列の両側に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記CXCR-4機能を阻害する分子が、（ａ）少なくとも６つのヌクレオチドからなり；（ｂ）CXCR-4遺伝子のRNA転写体の少なくとも一部分に相補的な配列を含み；そして（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下でRNA転写体にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
CXCR-4機能を促進する分子の治療上有効量を、治療の必要な対象に投与することを特徴とする、対象における細胞増殖が関与する疾患または障害の治療または予防方法。
【請求項１３】
前記疾患または障害は、変性疾患、増殖不全、高増殖性傷害、肉体的外傷、病変、および創傷よりなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
被験体から得られた試料中のCXCR-4 RNAまたはタンパク質のレベルを測定することを含んでなる、被験体におけるCXCR-4 RNAまたはタンパク質の異常レベルが特徴的な疾患または障害の診断方法であって、疾患または障害のない類似試料中に存在するCXCR-4 RNAまたはタンパク質のレベルに比較して、CXCR-4 RNAまたはタンパク質のレベルが増加または減少していることが、被験体中の疾患または障害の存在を示す、上記方法。
【請求項１５】
被験体から得られたCXCR-4 DNA、RNAまたはタンパク質を検出することを含んでなる、被験体の細胞の過剰増殖が関与する疾患または障害の存在、またはこれらの発症し易さの素因の、診断またはスクリーニング方法であって、該CXCR-4 DNA、RNAまたはタンパク質の存在が、疾患または障害の存在、またはこれらの発症し易さの素因を示す、上記方法。
【請求項１６】
抗CXCR-4抗体、CXCR-4 RNAにハイブリダイズすることができる核酸プローブ、またはCXCR-4核酸の少なくとも一部分の増幅をプライムすることができる一対の核酸プライマーよりなる群から選択される分子を、１つまたは複数の容器中に含むキット。
【請求項１７】
SDF-1遺伝子のRNA転写体の少なくとも一部分に相補的なアンチセンス核酸を、腫瘍細胞の高増殖性を阻害するのに有効な量で含む、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
【請求項１８】
SDF-1に対する抗体を、腫瘍細胞の高増殖性を阻害するのに有効な量で含む、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
【請求項１９】
治療または予防が望ましい対象に、SDF-1機能を阻害する分子の治療的有効量を投与することを特徴とする、対象の細胞過剰増殖が関与する疾患または障害の治療または予防方法。
【請求項２０】
被験体から得られた試料中のSDF-1 RNAまたはタンパク質のレベルを測定することを含んでなる、被験体におけるSDF-1 RNAまたはタンパク質の異常レベルが特徴的な疾患または障害の診断方法であって、疾患または障害のない類似試料中に存在するSDF-1 RNAまたはタンパク質のレベルに比較して、SDF-1 RNAまたはタンパク質のレベルが増加または減少していることが、被験体中の疾患または障害の存在を示す、上記方法。
【請求項２１】
被験体から得られたSDF-1 DNA、RNAまたはタンパク質を検出することを含んでなる、被験体の細胞の過剰増殖が関与する疾患または障害の存在、またはこれらの発症し易さの素因の、診断またはスクリーニング方法であって、該SDF-1 DNA、RNAまたはタンパク質の存在が、疾患または障害の存在、またはこれらの発症し易さの素因を示す、上記方法。
【請求項２２】
抗SDF-1抗体、SDF-1 RNAにハイブリダイズすることができる核酸プローブ、またはSDF-1核酸の少なくとも一部分の増幅をプライムすることができる一対の核酸プライマーよりなる群から選択される分子を、１つまたは複数の容器中に含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、腫瘍形成、特に１次脳腫瘍、乳癌および結腸癌形成におけるCXCR-4遺伝子の新規役割の同定に関する。本発明は、前癌症状または癌を証明するための診断手段としてのCXCR-4核酸およびポリペプチドの役割、および腫瘍形成を治療および／または予防する方法としてCXCR-4遺伝子発現および／または活性を阻害するための治療薬としての役割、に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
２．１．脳腫瘍
脳腫瘍は、小児と成人の主要な死因の１つである。アメリカ癌学会（American Cancer Society）による調査は、1995年に13,300人が脳腫瘍で死亡したと報告し、1996年には17,900人以上の死亡を予測している（Parkerら, 1996，CA Cancer J. Clin., 46:5-28）。脳腫瘍による死亡数は、毎年急速に増加している。平均して、25,000人のアメリカ人が、毎年脳腫瘍を有すると診断されている。脳腫瘍による小児の死亡は、白血病を除いて、どの癌よりも多い。
【０００３】
脳腫瘍の発病率の増加は、小児のみでなく成人でも明らかである。1982年と1996の間に成人１次悪性腫瘍の死亡率が大きく上昇したと報告されている（Parkerら, 1996, CA Cancer J. Clin., 46:5-28）。神経膠芽細胞腫,（glioblastoma）、星状細胞腫（astrocytoma)、および髄膜腫（meningioma）は、成人がかかる最も一般的な脳腫瘍である（ThaparとLaws, 1993, CA Cancer J. Clin., 46:263-271）。
【０００４】
正常人の脳細胞から神経膠腫（glioma）への形質転換は、一連の細胞変化と遺伝的変化の蓄積の結果として起きる（Sehgal, 1998 Cancer Surv., 25:233-275; vonDiemilingら, 1995 Glia 15:328-338; Furnariら, 1995, J. Surg. Oncol. 67:234）。これらの遺伝的変化には、異なる染色体の喪失、取得または増幅を含む。これらの遺伝的変化が、正常な細胞の増殖において重要な役割を果たすタンパク質の発現の変化を招く。染色体レベルのいくつかの共通の遺伝的変化（17p、13q、9p、19、10、22q、18qの喪失および７と１２ｑの増幅）が観察されている（Sehgalら, 1998, J. Surg. Oncol. 67:23; vonDiemilingら, 1995 Glia 15:328-338; Furnariら, 1995, Cancer Surv. 25:233-275）。
【０００５】
これらの変化は、ヒト神経膠腫の発生と進行（Sehgalら, 1998, J. Surg. Oncol. 67:234; vonDiemilingら, 1995 Glia 15:328-338）の間のいくつかの遺伝子（p53、RB、INFα/β、CDKN2、MMAC1、DCC、EGFR、PDGF、PDGFr、MDM2、GLI、CDK4およびSAS）の発現の変化を招く。
【０００６】
最近の研究は、いくつかの他の遺伝子（MET、MYC、TGFβ、CD44、VEGF、NCAML1、p21waf1/Cip1、trkA、MMRs、C4-2、D2-2）やタンパク質（カテプシン、テナシン、マトリックスメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼの組織インヒビター、一酸化窒素シンセターゼ、インテグリン、IL13受容体、コネクシン43、uPARの細胞外マトリックスタンパク質、および熱ショックタンパク質）の発現の変化は、ヒト神経膠腫の発生に関連していることを示唆している（Sehgalら, 1998, J. Surg. Oncol. 67:234）。これらの知見はまとめると、遺伝子発現の広範な変化と組合わされた複数の遺伝子突然変異の蓄積が、ヒト神経膠腫の病因に必須かも知れないという事実を指摘している。これらの遺伝的変化の同定にもかかわらず、ヒト神経膠腫の発生を引き起こす事象の正確な過程は不明である。
【０００７】
多形神経膠芽細胞腫（glioblastoma multiforme）は、非常に急速に増殖し、非常に悪性の細胞を含有する高い段階の星状細胞腫である（ThaparとLaws, 1993, CA Cancer J. Clin., 43:263-271）。多形神経膠芽細胞腫の発症の分子的基礎は、染色体レベルまたは遺伝子発現レベルの全身性事象が関与しているかも知れない。これらには、腫瘍サプレッサー遺伝子の不活性化、癌遺伝子または染色体レベルでの特異的転座の活性化がある。染色体レベルおよび遺伝子発現レベルの一部の遺伝的変化は、他の脳腫瘍について広く報告されている（Furnariら, 1995, Cancer Surv., 25:233-275）。
【０００８】
例えば、染色体10の腫瘍サプレッサー遺伝子の喪失、p53の突然変異、または表皮増殖因子受容体の過剰発現が、多形神経膠芽細胞腫を招く主要な事象であるかも知れないと報告されている。異なるタイプの脳腫瘍では、多くの他の遺伝子（例えば、EGFR、CD44、β4インテグリン、膜型メタロプロテイナーゼ（MT-MMP）、p21、p16、p15、mycおよびVEGF）が過剰発現されていることが証明されている（Faillotら, 1996, Neurosurgery, 39:478-483; Eiblら, 1995, J. of Neurooncol, 26:165-170; Previtaliら, 1996, Neuropathol. Exp. Neurol. 55:456-465; Yamamotoら, 1996, Cancer Res., 56:384-392; Jungら, 1995, Oncogene, 11:2021-2028; Tsuzukiら, 1996, Cancer, 78:287-293; Chenら, 1995, Nature Med., 1:638-643; Takanoら, 1996, Cancer Res., 56:2185-2190; Boglerら, 1995, Glia, 15:308-327）。
【０００９】
p53のような他の遺伝子は、多くの脳腫瘍で突然変異を示す（Boglerら, 前出）。１つまたはそれ以上のこれらの遺伝子の相互作用がどのように腫瘍形成に至るかは不明であるが、新生物形質転換にはおそらく複数の工程が必要なのであろう。神経膠芽細胞腫の開始または進行を招く正確な過程は現在不明であり、脳腫瘍の早期検出に有用なマーカーが欠如している。
【００１０】
2.2.  CXCR-4
ケモカイン受容体は、Ｔ細胞および食細胞の炎症領域への走化性において重要な役割を演じている。CXCR-4は、最初に、白血球走化性因子受容体（Ｎ−ホルミルペプチド、C5aとIL-8）に対して作成した縮重プライマーを使用して増幅したcDNAとして同定され、HM89と名付けられた（Endresら, 1996, Cell 87:745）。リガンド結合分析は、ＨＭ８９はＮ−ホルミルペプチド受容体ではないことを示したが、配列分析は、これがＧタンパク質結合受容体ファミリーのメンバーであることを明白に証明した。細胞遺伝学分析は、HM89はヒト染色体2q21に局在化していることを示している（Benlら, 1996, Nature 382:829）。
【００１１】
HM89は、後にヒト単核細胞ライブラリーのスクリーニング時に、ウサギIL-8受容体cDNAを使用して再クローン化され、LESTR（白血球由来の７つのトランスメンブランドメイン受容体（Nagasawaら, 1996, Nature 382:635））と名付けられ；そして再度クローン化され、CD4+細胞へのHIV-1の融合と侵入の補助因子として同定された（De Risiら, 1996, Nature , Genetics 14:457）。この補助因子は、すでにクローン化されていたHM89と同一であり、HIV-1ウイルスとCD4+細胞との融合タンパク質としての役割のために、「フシン（fusin）」と命名された。
【００１２】
フシンはCD4とともに、HIV-1を非許容性マウス3T3細胞に入らせるのに充分である（De Risiら, 1996, Nature , Genetics 14:457）。配列分析は、HM89、LESTRおよびフシンはすべて同じ遺伝子であることを証明し、化学誘引性のために、これらの遺伝子は現在CXCケモカイン受容体−４（CXCR-4）と呼ばれている。最近、HIV-1によるCD4非依存性感染は、CXCR-4受容体により仲介されることが証明された（Fengら, 1996, Science 172:872）。
【００１３】
CXCR-4のリガンドが最近クローン化され、PBSF/SDF-1（プレＢ細胞増殖刺激因子／間質細胞由来因子１）と名付けられた（Engelhardら, 1997, Neurosurgery 41:886）。PBSF/SDF-1が欠如したトランスジェニックマウスは早期に死亡し、そのＢ細胞と骨髄性前駆細胞の数が大幅に低下していた（Harihabuら, 1997 J. Biol. Chem. 272:28726）。この結果は、PBSF/SDF-1がＢ細胞リンパ球形成と骨髄発生の原因であることを、明白に証明している。
【００１４】
最近の研究は、HIVのＴ細胞指向性株が標的細胞に入るために、CD4とともに補助受容体としてCXCR-4が機能することを証明している（Nomuraら, 1993, Int. Immunol. 5:1239; Federsppielら, 1993, Genomics 16:707）。感染中にHIV-1が、CXCR-4ケモカイン受容体およびCD4分子と相互作用する機序は、不明である。また、CD4−細胞のHIV-2感染は、HIV-1補助因子CXCR-4受容体を利用することにより迅速に起きることが証明された（Loctscherら, 1994, J. Biol. Chem. 269:232）。
【００１５】
CD4-細胞へのHIV-2の侵入により引き起こされる相互作用と細胞変性作用は、CXCR-4タンパク質に対するモノクローナル抗体により阻害された（Doranzら, 1997, Immuno. Resh. 16:15）（Fengら，1996, Science 272:872）。HIV感染におけるCXCR-4の役割は、ヒトおよび非ヒトCD4-細胞への導入がHIV-2感染を可能にした時、さらに強化された（Doranzら, 1997, Immunol. Res. 16:15）（Fengら, 1996, Science 272:872）。
本明細書における文献の引用は、そのような文献が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【発明の概要】
【００１６】
３．発明の要約
本発明は、多くのタイプの細胞（多くの原発性腫瘍および誘導細胞株を含む）の異常増殖挙動におけるCXCR-4の新規役割の発見に関する。特に、本発明は、特に脳腫瘍、乳癌および結腸癌の、細胞の形質転換と腫瘍形成における、CXCR-4の役割の同定に関する。本発明は、腫瘍形成の治療または予防のための、CXCR-4タンパク質、核酸、およびアゴニストやアンタゴニストに基づく、治療的および診断的応用を包含する。
【００１７】
本発明はさらに、腫瘍形成の治療または予防のための、CXCR-4、SDF-1、およびSPF-1タンパク質、核酸、およびアゴニストやアンタゴニストに基づく、治療的および診断的応用を包含する。本発明はさらに、形質転換表現型または腫瘍形成の治療および／または予防のための、治療薬候補としての、CXCR-4活性および／または発現の調節物質を同定するための、スクリーニング測定法を包含する。
【００１８】
本発明は、一部は、CXCR-4ヌクレオチド配列およびコードされる遺伝子産物が、多形神経膠芽細胞腫ならびにいくつかの多型の腫瘍や癌で高レベルで発現されるという、本出願人の驚くべき発見に基づく。
ある実施態様において本発明は、CXCR-4のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列（例えば、前癌または形質転換細胞表現型の前兆としての組織または細胞培養試料中のCXCR-4発現のレベルを決定するために；または前癌または形質転換細胞表現型の治療または予防法としてCXCR-4発現を阻害するために使用される、プライマー、断片またはアンチセンスヌクレオチド）を包含する。具体的な実施態様において、CXCR-4遺伝子は、ヒト遺伝子であり、CXCR-4タンパク質はヒトタンパク質である。
【００１９】
本発明はまた、細胞の形質転換に関するCXCR-4活性のインヒビターを包含する。CXCR-4は、シグナル伝達に関与する公知のＧタンパク質結合受容体である。本発明は、CXCR-4に結合するリガンドを阻害するかまたはこれと競合し、従ってCXCR-4活性を阻害する、ペプチド断片もしくはアンタゴニスト、抗体、または小化合物を包含する。本発明はさらに、CXCR-4に結合するリガンドを妨害するのに使用される、CXCR-4タンパク質の１つまたはそれ以上のドメインを含むペプチド断片（およびその誘導体と類似体）を包含する。CXCR-4に対する抗体、およびCXCR-4誘導体と類似体が、さらに提供される。CXCR-4タンパク質、誘導体および類似体の製造方法（例えば、組換え法）も提供される。
【００２０】
本発明はさらに、腫瘍形成の治療および／または予防のための治療薬候補として、CXCR-4遺伝子発現または遺伝子産物活性を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング測定法を包含する。特に本発明は、腫瘍形成の治療と予防のための治療薬候補として、CXCR-4遺伝子発現または活性を阻害する物質を同定するためのスクリーニング測定法のための手段として有用な、高レベルでCXCR-4を発現する宿主細胞株またはトランスジェニック動物を包含する。
【００２１】
本発明はまた、CXCR-4タンパク質および核酸に基づく、治療法と診断法および組成物を包含する。本発明の治療用化合物には、特に限定されないが、CXCR-4タンパク質およびその類似体と誘導体（断片を含む）；これに対する抗体；CXCR-4タンパク質、類似体または誘導体をコードする核酸；およびCXCR-4アンチセンス核酸を含む。
本発明は、CXCR-4機能を低減させるかまたはアンタゴナイズ（阻害）する化合物（例えば、抗体、アンチセンス核酸、リボザイム）を投与することによる、過剰増殖の障害（例えば、腫瘍、癌および高増殖性障害）の治療を提供する。
【００２２】
本発明はまた、CXCR-4活性を促進する化合物（例えば、CXCR-4のアゴニスト；CXCR-4をコードする核酸）を投与することによる、細胞の増殖（成長）不全が関与するかまたは細胞増殖が本来は望ましい疾患（例えば、変性障害、増殖不全、病変、肉体的傷害）の治療法を提供する。
動物モデル、疾患に対する素因の診断法とスクリーニング法、およびCXCR-4アゴニストやアンタゴニストの同定法もまた、本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、CXCR-4遺伝子の同定を示す。パネルＡとＢは、それぞれ正常組織と腫瘍組織からのP32標識したcDNAとハイブリダイズした発現アレイを示す。CXCR-4遺伝子は、パネルＢで太い矢印で示す。正常組織と腫瘍組織の両方で同様のレベルで発現された２つの他の遺伝子は、小さい矢印で示す。パネルＣは、遺伝子特異的RT-PCRを使用した、正常組織と腫瘍組織（ＮとＴ）中のCXCR-4発現の分析を示す。ハウスキーピング遺伝子（D1-2）は、文字Ｈで示す。
【００２４】
【図２】図２Ａ〜Ｂは、in situ ハイブリダイゼーションの技術を使用したGMTTとNBT中のCXCR-4の発現分析を示す。パネルＡは、センスプローブとハイブリダイズしたGMTTを示す。パネルＢは、CXCR-4アンチセンスプローブとハイブリダイズしたGMTTを示す。CXCR-4発現は、矢印で示す。
【００２５】
【図３Ａ】図３Ａは、ヒト腫瘍細胞株と１次組織中のCXCR-4の発現を示す。遺伝子特異的RT-PCRは、CXCR-4とD1-2特異的プライマーを使用して行なった。NBT、FNHAおよび３つの神経膠芽細胞腫細胞株と組織中のCXCR-4発現を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒト腫瘍細胞株と１次組織中のCXCR-4の発現を示す。遺伝子特異的RT-PCRは、CXCR-4とD1-2特異的プライマーを使用して行なった。脳腫瘍細胞株と組織中のCXCR-4の発現を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ヒト腫瘍細胞株と１次組織中のCXCR-4の発現を示す。遺伝子特異的RT-PCRは、CXCR-4とD1-2特異的プライマーを使用して行なった。腫瘍組織中のCXCR-4の発現を示す。
【００２６】
【図４Ａ】図４Ａは、乳癌組織のCXCR-4の発現を示す。総RNAは、ギブコ／ビーアールエル（Gibco/BRL）（ゲーサーズバーグ、メリーランド州）からのRNAzolを使用して単離した。DNAse1処理後、RT-PCRとサザンブロッティングを行なった。次乳房組織（Ｎ＝正常、Ｔ＝腫瘍）のCXCR-4発現を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、細胞株のCXCR-4の発現を示す。総RNAは、ギブコ／ビーアールエル（Gibco/BRL）（ゲーサーズバーグ、メリーランド州）からのRNAzolを使用して単離した。DNAse1処理後、RT-PCRとサザンブロッティングを行なった。
【００２７】
【図５Ａ】図５Ａは、癌細胞株と正常組織中のCXCR-4の発現を示す。ヒト癌細胞株中のCXCR-4の発現を調べるために、癌細胞株と３つの複数の正常ヒト組織ブロット（MNHTB）をクロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。これらのブロットは、２μgの純粋なポリＡ＋mRNAを含有した。MNHTBは、発現ハイブリダイゼーション緩衝液（クロンテク（Clontech））中で３〜４時間プレハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、マルチプライム標識0.55Kb（1591〜1618位）CXCR-4プローブを用いて行なった。次にCXCR-4プローブを除去し、内部対照としてヒトβアクチン遺伝子を使用した。
【００２８】
【図５Ｂ】図５Ｂは、癌細胞株と正常組織中のCXCR-4の発現を示す。正常ヒト組織中のCXCR-4の発現を調べるために、癌細胞株と３つの複数の正常ヒト組織ブロット（MNHTB）をクロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。これらのブロットは、２μgの純粋なポリＡ＋mRNAを含有した。MNHTBは、発現ハイブリダイゼーション緩衝液（クロンテク（Clontech））中で３〜４時間プレハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、マルチプライム標識0.55Kb（1591〜1618位）CXCR-4プローブを用いて行なった。次にCXCR-4プローブを除去し、内部対照としてヒトβアクチン遺伝子を使用した。
【００２９】
【図６】図６は、正常ヒト脳の異なる領域でのCXCR-4の発現を示す。正常人のCXCR-4の発現を調べるために、正常ヒト脳ブロットをクロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。このブロットは、各レーンに２μgのポリＡ＋mRNAを含有した。ブロットのプレハイブリダイゼーションは、過剰の発現ハイブリダイゼーション緩衝液（クロンテク（Clontech））中で３〜４時間行なった。ハイブリダイゼーションは、マルチプライム標識0.55Kb（1591〜1618位）CXCR-4プローブを用いて行なった。次にＣＸＣＲ−４プローブを除去し、内部対照としてヒトβアクチン遺伝子を使用した。既に記載されている（Sehgalら, 1998, Int. J. Cancer 71:565）ように、CXCR-4の相対的発現を算出した。
【００３０】
【図７Ａ】図７Ａは、異なる動物でのCXCR-4配列保存の分析を示す。５μgの前消化（EcoRI）したゲノムDNAを含有するズー（Zoo）ブロット膜を、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。臭化エチジウム染色ゲルを示す。プローブとして標識するためのCXCR-4 0.55Kb断片を単離するために、125ngのcDNA（オリゴｄＴとヒト神経芽腫細胞株からのランダム６量体プライマーを使用して調製した）を鋳型として使用した。遺伝子特異的プライマー（5’CTCTCCAAAGGAAAGCGAGGTGCACAT3’(配列番号：５）と5’TGATTTCAGCACCTACAGTGTACAGTCT3’）(配列番号：６）を使用して、本明細書に記載の条件下で、CXCR-4断片のPCR増幅を行なった。
【００３１】
【図７Ｂ】図７Ｂは、異なる動物でのCXCR-4配列保存の分析を示す。５μgの前消化（EcoRI）したゲノムDNAを含有するズー（Zoo）ブロット膜を、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。オートラジオグラムである。プローブとして標識するためのCXCR-4 0.55Kb断片を単離するために、125ngのcDNA（オリゴｄＴとヒト神経芽腫細胞株からのランダム６量体プライマーを使用して調製した）を鋳型として使用した。遺伝子特異的プライマー（5’CTCTCCAAAGGAAAGCGAGGTGCACAT3’(配列番号：５）と5’TGATTTCAGCACCTACAGTGTACAGTCT3’）(配列番号：６）を使用して、本明細書に記載の条件下で、CXCR-4断片のPCR増幅を行なった。CXCR-4ゲノムバンドを矢印で示す。
【００３２】
【図８−１】図8-1は、マウス胚上のCXCR-4の in situ ハイブリダイゼーションを示す。パネルＡ〜Ｄ：Ａ＝８日目の全胚。Ｂ＝９日目の胚（頭部領域）、Ｃ＝９日目の胚（臓器領域）、Ｄ＝10日目の胚（臓器領域）、パネルＥ〜Ｆは、Ａ〜Ｄと同じであるが、CXCR-4センスプローブでハイブリダイズした。
【００３３】
【図８−２】図8-2は、マウス胚上のCXCR-4の in situ ハイブリダイゼーションを示す。パネルＩ〜Ｏ：Ｉ＝10日目の胚（頭部領域）、Ｊ＝11日目の胚（頭部領域）、Ｋ＝11日目の胚（額領域）、Ｌ＝13日目の胚（脊髄）、Ｍ＝15日目の胚（下垂体）、Ｍ＝15日目の胚（前脳）、Ｍ＝14日目の胚の肋骨（脊髄の近く）、およびＯ＝16日目の胚の前部肋骨。高レベルのCXCR-4発現を矢印で示す。
【００３４】
【図９】図９のパネルＡ〜Ｄは、5GB神経膠芽細胞腫細胞株でのCXCR-4過剰発現の影響を示す。パネルＡとＢは、pCMV-necCS（CXCR-4センス）でトランスフェクションした細胞を示す。パネルＣとＤは、pCMV-necCA（CXCR-4アンチセンス）でトランスフェクションした細胞を示す。pCMVneoCAトランスフェクション細胞における神経突起成長を、パネルＣにおいて矢印で示す。トランスフェクションの48時間後に、細胞をG418（1000μg/ml）で３週間選択した。倒立光学顕微鏡で５×拡大で細胞の形態を観察した。（パネルＡとＢ）それぞれpCMV-neoまたはpCMV-neoCA（CXCR-4アンチセンス）でトランスフェクションした神経膠芽細胞腫5GB細胞。（パネルＣとＤ）それぞれpCMV-neoまたはpCMV-neoCA（CXCR-4アンチセンス）でトランスフェクションした神経膠芽細胞腫GB1690細胞。神経突起成長を矢印で示す。アンチセンストランスフェクション細胞の免疫細胞化学は、CXCR-4発現の50%低下とGFAPの発現増加を示した。
【００３５】
【図１０】図10のパネルＡ〜Ｃは、GB1690神経膠芽細胞腫細胞株でのCXCR-4過剰発現の影響を示す。パネルＡ、ＢおよびＣは、それぞれpCMV-nec、pCMV-necCS（CXCR-4センス）およびpCMV-necCA（CXCR-4アンチセンス）でトランスフェクションした細胞を示す。pCMVneoCAトランスフェクション細胞における神経突起成長を、パネルＣにおいて矢印で示す。
【００３６】
【図１１Ａ】図11Aは、HTB-16神経膠芽細胞腫細胞株に及ぼすCXCR-4発現の影響を示す。簡単に説明すると、野生型と突然変異体発現細胞の1000細胞を、三重測定で96ウェルプレートに塗布した。細胞を37℃で24時間インキュベートし、80μlの色素を加える。４時間後、15μlの停止溶液を加え、１８時間インキュベートする。次にELISAプレートリーダーを使用して、570nmで吸光度を記録した。グラフの点は、三重測定試料で２回行なった実験の平均を示す。
【００３７】
【図１１Ｂ】図11Bは、GB1690神経膠芽細胞腫細胞株に及ぼすCXCR-4発現の影響を示す。簡単に説明すると、野生型と突然変異体発現細胞の1000細胞を、三重測定で96ウェルプレートに塗布した。細胞を37℃で24時間インキュベートし、80μlの色素を加える。４時間後、15μlの停止溶液を加え、１８時間インキュベートする。次にELISAプレートリーダーを使用して、570nmで吸光度を記録した。グラフの点は、三重測定試料で２回行なった実験の平均を示す。
【００３８】
【図１２−１】図12-1のパネルＡ〜Ｂは、神経膠芽細胞腫細胞株BG1690の軟寒天中のコロニー形成に及ぼすCXCR-4過剰発現の影響を示す。ベクター単独およびCXCR-4でセンス方でトランスフェクションしたBG1690細胞を、トリプシン処理した。約１×106 細胞を、0.26％寒天と混合した。次に細胞を60mmのシャーレ中の0.65％の寒天層の上に塗布し、37℃で２〜４週間インキュベートした。10日毎に、細胞に血清含有培地を加えた。コロニーは、倒立光学顕微鏡で計測した。パネルＡ〜Ｂ、pCMV-neoベクター単独；パネルＣ〜Ｄ、pMV-neoCS。
【００３９】
【図１２−２】図12-2は、神経膠芽細胞腫細胞株BG1690の軟寒天中のコロニー形成に及ぼすCXCR-4過剰発現の影響を示す。ベクター単独およびCXCR-4でセンス方でトランスフェクションしたBG1690細胞を、トリプシン処理した。約１×106 細胞を、0.26％寒天と混合した。次に細胞を60mmのシャーレ中の0.65％の寒天層の上に塗布し、37℃で２〜４週間インキュベートした。10日毎に、細胞に血清含有培地を加えた。コロニーは、倒立光学顕微鏡で計測した。コロニー数のヒストグラムである。
【００４０】
【図１３】図13は、腫瘍細胞増殖に及ぼすCXCR-4抗体処理の影響を示す。CXCR-4タンパク質の最初の38アミノ酸に対応する合成ペプチド（ＭＥＧＩＳＩＹＴＳＤＮＹＴＥＥＭＧＳＧＤＹＤＳＭＫＥＰＣＦＲＥＥＮＡＮＦＮＫ）(配列番号：７）に対して、CXCR-4ポリクローナル（ウサギ抗ヒト）抗体を作成した。約１×103 細胞（NIH3T3と神経膠芽細胞腫）を、60mmのシャーレに塗布した。塗布の48時間後、最終希釈１／50のCXCR-4ポリクローナル抗体または免疫前血清を、培地に加えた。192時間後に細胞を採取し、細胞カウンターで計測した。結果は、三重測定で行なった同じ実験の平均である。
【００４１】
【図１４Ａ】図14Aは、ヒトCXCR-4のヌクレオチド(配列番号：１）とアミノ酸配列(配列番号：２)を示す。
【図１４Ｂ】図14Bは、ヒトCXCR-4のヌクレオチド(配列番号：１）とアミノ酸配列(配列番号：２)を示す。
【００４２】
【図１５Ａ】図15Aは、ヒトSDF-1のヌクレオチド（配列番号：３）とアミノ酸配列(配列番号：４)を示す。
【図１５Ｂ】図15Bは、ヒトSDF-1のヌクレオチド（配列番号：３）とアミノ酸配列(配列番号：４)を示す。
【図１６】図16は、腫瘍細胞増殖に及ぼすSDF-1抗体処理の影響を示す。SDF-1に対するモノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄシステムズ（メネアポリス、ミネソタ州）から購入した。約１×103 細胞（NIH3T3と神経膠芽細胞腫）を、60mmのシャーレに塗布した。塗布の24時間後、最終濃度40μg/mlで抗SDFβ-1抗体または免疫前血清を培地に加えた。48時間毎に細胞を採取し、細胞カウンターで計測した。結果は、三重測定で行なった同じ実験の平均である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
3.1.  略語の定義
本明細書において、遺伝子の名前に下線を付したものは遺伝子を示す場合があり、これに対してコードされるタンパク質生成物は、下線を付さない遺伝子の名前で示す場合がある。例えば「CXCR-4」は、CXCR-4遺伝子を示し、「CXCR-4」はCXCR-4のタンパク質生成物を示す場合がある。
【００４４】
本明細書において以下の用語は、記載の意味を有する。
【００４５】
CXCR-4ヌクレオチドまたはコード配列：CXCR-4 mRNA転写体、CXCR-4のタンパク質、ペプチド、またはペプチド断片、およびCXCR-4融合タンパク質をコードするDNA配列、およびCXCR-4 mRNA転写体に対応するRNA配列、およびmRNA転写体に相補的なRNA配列、RNA、DNA（CXCR-4遺伝子のようなゲノムDNAやcDNAを含む）を包含するCXCR-4ヌクレオチド配列。
【００４６】
CXCR-4：遺伝子産物、例えば転写体およびCXCR-4タンパク質。本タンパク質のポリペプチドまたはペプチド断片は、CXCR-4ポリペプチドまたはCXCR-4ペプチドと呼ぶ。無関係のタンパク質に対するCXCR-4タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド断片の融合体は、CXCR-4融合タンパク質と呼ぶ。
【００４７】
本明細書において、以下の用語は記載の略語を有する。
CD：細胞質ドメイン
DD-PCR：分別表示（differentual display）−ポリメラーゼ連鎖反応
ECD：細胞外ドメイン
FNHA：胎児正常人星状細胞腫（fetal normal human astroyte)
GMTT：多形神経膠芽細胞腫腫瘍組織（glioblastemas multiforme tumor fissue)
MTB：複数の組織ブロット
MTT：髄膜腫腫瘍組織（meningioma fumor fissue)
【００４８】
NBT：正常脳組織
ORF：読みとり枠
RT-PCR：逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応
TM：トランスメンブランドメイン
UTR：非翻訳領域
【００４９】
脳腫瘍細胞株：
CCF-STTG1：星状細胞腫グレードIV
D283Med：多形髄芽細胞腫（medulloblastoma)
DBTRG-05MG：多形神経膠芽細胞腫（glioblastoma multiforme)
Hs683：神経膠腫（glioma)
IMR-32：神経芽腫（nenroblastoma)
PFSK-1：原始神経外胚葉腫瘍（primifine neuroectodermal fumor)
SW1783：星状細胞腫グレードIII
【００５０】
５．発明の詳細な説明
本発明は、細胞の形質転換および異常細胞増殖における、CXCR-4の新規役割の同定に関する。特に本発明は、CXCR-4のリガンドの遺伝子発現の変化以外に、多くの原発性腫瘍および腫瘍由来の細胞株におけるCXCR-4遺伝子の発現の変化に関する。さらに本発明は、一部は、腫瘍細胞の増殖に、リガンドSDFβ-1の存在下でCXCR-4が必要であり、形質転換された細胞でのCXCR-4遺伝子発現の阻害またはCXCR-4活性の阻害は、形質転換された表現型を逆転させるという、本出願人の驚くべき発見に関する。
【００５１】
本発明は、形質転換した前癌または癌細胞表現型の存在を証明するために、診断または予防手段として異常CXCR-4遺伝子発現または活性を検出するための化合物と方法を包含する。本発明はさらに、形質転換した前癌または癌細胞表現型の存在を証明するために、診断または予防手段として異常SDF-1遺伝子発現または活性を検出するための化合物と方法を包含する。本発明はまた、形質転換した前癌または癌細胞表現型を治療または予防する方法として、CXCR-4遺伝子の発現を調節するための化合物と方法を包含する。
【００５２】
この点で本発明は、CXCR-4遺伝子のヌクレオチド配列、およびこれにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を提供する。本発明はさらに、CXCR-4タンパク質の断片や他の誘導体、および類似体を提供する。そのような断片または誘導体をコードする核酸はまた、本発明の範囲内である。本発明は、他の種におけるCXCR-4遺伝子とヒトおよび関連遺伝子（同族体）のコードされるタンパク質を提供する。具体的な実施態様において、CXCR-4遺伝子とタンパク質は、脊椎動物またはさらに詳しくは哺乳動物由来である。本発明の好適な実施態様において、CXCR-4遺伝子とタンパク質はヒト由来である。前記核酸、タンパク質および誘導体（例えば、組換え法による）の産生が提供される。
【００５３】
CXCR-4は、本発明の方法により同定され、多形神経膠芽細胞腫組織ならびにいくつかの他の型の腫瘍および癌で、高レベルに発現される遺伝子である。
本発明はまた、機能的に活性がある本発明のCXCR-4誘導体および類似体を提供し、すなわちこれらは、完全長（野生型）CXCR-4タンパク質に関して本明細書に記載された１つまたはそれ以上の機能活性を示すことができる。そのような機能活性には、特に限定されないが、抗原性、すなわち抗CXCR-4抗体に結合（または、結合についてCXCR-4と競合）する能力、免疫原性、すなわちCXCR-4に結合する抗体を産生する能力、およびCXCR-4のリガンドに結合（または、結合についてCXCR-4と競合）する能力を含む。
【００５４】
本発明はさらに、CXCR-4タンパク質の１つまたはそれ以上のドメインを含むCXCR-4の断片（およびこれらの誘導体と類似体）を提供する。CXCR-4に対する抗体、その誘導体と類似体が、さらに提供される。
本発明はまた、CXCR-4タンパク質と核酸および抗CXCR-4抗体に基づく、治療法と診断法および組成物を提供する。本発明は、CXCR-4活性を低下させる化合物（例えば、抗体、CXCR-4アンチセンス核酸）を投与することによる、過剰増殖障害（例えば、癌および高増殖性障害）の治療を提供する。
【００５５】
本発明はまた、CXCR-4機能を促進する化合物を投与することによる、細胞増殖不全を有する障害、または細胞増殖（成長）が本来は好ましい障害（例えば、増殖不全、変性疾患、病変、肉体的傷害）の治療法を提供する。
本発明はさらに、CXCR-4遺伝子の発現またはCXCR-4タンパク質活性（リガンド、例えば、SDF-1との相互作用を含む）を標的とする新規物質、従って、細胞の形質転換、または前癌もしくは癌表現型（すなわち、腫瘍形成）の治療または予防のための治療薬候補である新規物質を同定するためのスクリーニング測定法を提供する。
【００５６】
本発明のスクリーニング測定法は、CXCR-4発現を阻害するか、またはCXCR-4とそのリガンド（例えば、SDF-1）との相互作用を阻害する、新規の外因性または内因性物質を同定するように機能する。CXCR-4遺伝子発現および／またはCXCR-4活性を阻害、そしてその結果異常な細胞増殖活性におけるCXCR-4参加を阻害する薬剤を同定するのに、種々のプロトコールと技術が使用される。そのような同定される物質は、細胞形質転換表現型または異常細胞増殖挙動を示す宿主の治療に有用であり、腫瘍形成の治療および／または予防に有効であろう。
【００５７】
本発明はさらに、本明細書に記載のスクリーニング測定法により同定される新規物質を含有する医薬組成物を包含する。本発明は、腫瘍形成の治療および形質転換表現型の予防のための、治療法と医薬組成物とを提供する。本発明の治療法はさらに、CXCR-4遺伝子発現および／または活性を阻害する物質と少なくとも１つの他の治療薬（例えば、化学療法剤）が、同時に（例えば、混合物として）、別々のものであるが同時に、または順に投与される併用療法を包含する。
【００５８】
本発明の新規の治療的併用は、抗形質転換または抗腫瘍形成に必要な薬剤の有効投与量を低減させて毒性を低減させるだけでなく、種々の機序で異常細胞増殖を攻撃する結果として、絶対的な治療作用を改善する、治療手段を提供する。
本発明は、特にCXCR-4単離と性状解析、およびいくつかの腫瘍でのCXCR-4の発現パターンを開示する、以下の例により説明される（セクション６を参照）。
開示内容を明瞭にするために、本発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分類するが、これらは限定するものではない。
【００５９】
5.1.  形質転換におけるCXCR-4の役割の同定
本発明は、細胞の形質転換と腫瘍形成の促進におけるCXCR-4の新規役割に関する。特に本発明は、（ａ）CXCR-4は、多形神経膠芽細胞腫の腫瘍組織や多くの他の原発性腫瘍で過剰発現される；（ｂ）神経膠芽細胞腫癌細胞の連続的増殖にCXCR-4遺伝子の発現が必要であり、その遺伝子機能をブロックすると増殖が停止する；および（ｃ）センス配向でCXCR-4を過剰発現すると、軟寒天での細胞増殖とコロニー形成が増強されそして速くなる、という本出願人の知見に関する。
【００６０】
本発明はさらに、CXCR-4はいくつかの脳腫瘍由来細胞株と１次脳腫瘍組織（神経芽腫および神経外胚葉ヒト腫瘍細胞株、髄芽細胞腫と星状細胞腫グレードIII細胞株、および原発性神経膠腫と髄膜腫を含む）で過剰発現されるという本出願人の知見に関する。さらに、CXCR-4は、乳癌組織、リンパ芽球性白血病細胞株、バーキットリンパ腫細胞株、結腸直腸副腎癌、肺癌、および黒色腫細胞株で、過剰発現されることがわかった。
【００６１】
本発明は、細胞の形質転換と腫瘍形成の促進におけるCXCR-4の役割に関し、形質転換した前癌および癌表現型の検出のための診断および予防手段として、CXCR-4核酸およびCXCR-4核酸にハイブリダイズするかまたは補足する核酸の使用を含む方法を提供する。本発明は、形質転換した前癌および癌表現型を治療または予防するための治療薬として、CXCR-4核酸およびCXCR-4をコードする核酸配列を補足するおよび／またはハイブリダイズする核酸の使用方法を提供する。特に本発明は、形質転換した前癌および癌表現型を治療または予防するための治療薬として、CXCR-4発現を阻害する核酸配列を含む組成物を提供する。
【００６２】
5.2.  診断薬、治療薬およびスクリーニング測定法の成分としてのCXCR-4核酸、ポリペプチドおよび抗体の産生
本発明は、形質転換した表現型、前癌または癌症状を検出するための診断または予防手段として、異常CXCR-4遺伝子発現の検出のための物質の使用を包含する。本発明で使用される診断または予防手段には、特に限定されないが、（ａ）CXCR-4ヌクレオチド配列とハイブリダイズするかまたはこれと相補的な核酸；（ｂ）CXCR-4リガンド結合ドメインに結合するポリペプチド、ペプチド断片または合成分子；および（ｃ）CXCR-4に結合する抗体がある。
【００６３】
本発明は、形質転換したか、または前癌表現型、または癌または腫瘍形成の治療および／または予防のための治療薬としての、CXCR-4遺伝子発現および／またはタンパク質活性を阻害する物質の使用に関する。本発明で使用される治療薬には、特に限定されないが、（ａ）CXCR-4遺伝子発現を阻害する核酸、例えばCXCR-4に相補的なアンチセンス分子、リボザイムまたは３重らせん分子；（ｂ）CXCR-4活性を阻害するかまたはCXCR-4がそのリガンドに結合するのを妨害するポリペプチド、ペプチド、抗体、小有機分子または合成分子；および（ｃ）CXCR-4活性のアンタゴニストとして作用するペプチド、ポリペプチド、抗体、小有機分子または合成分子がある。
【００６４】
本発明は、CXCR-4遺伝子発現および／または活性を阻害する物質の同定のためのスクリーニング測定法を提供する。本発明の１つの実施態様において、本発明のスクリーニング測定法の重要な成分は、CXCR-4タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドをコードするヌクレオチドコード配列である。本発明はさらに、（ａ）前記のCXCR-4コード配列および／またはそれらの相補体の任意のものを含有するDNAベクター；（ｂ）宿主細胞中でのコード配列の発現を指令する制御成分に機能的に結合した、任意の前記のCXCR-4コード配列を含有するDNA発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞中でのコード配列の発現を指令する制御成分に機能的に結合した任意の前記のCXCR-4コード配列を含有する、遺伝子操作で作成した宿主細胞を含む。
【００６５】
本発明は、形質転換した表現型、前癌または癌症状を検出するための診断または予防手段としての、異常SDF-1遺伝子を検出するための物質の使用を提供する。本発明は、形質転換したかまたは前癌表現型、または癌または腫瘍形成の治療および／または予防のための治療薬としての、SDF-1遺伝子発現および／またはタンパク質活性を阻害する物質の使用を包含する。本発明はさらに、SDF-1遺伝子発現および／または活性を阻害する物質の同定のためのスクリーニング測定法を包含する。
【００６６】
本発明は、例としてCXCR-4に関して説明するが、SDF-1を排除することを限定するものではない。本発明は、特に限定されないが、（ａ）SDF-1コード配列にハイブリダイズするかまたは相補的な核酸（図15を参照）；および（ｂ）SDF-1遺伝子発現または活性の検出または阻害のために使用されるポリペプチド、ペプチド、抗体、小有機分子または合成分子を含む。
【００６７】
5.2.1.  CXCR-4核酸
本発明は、CXCR-4核酸のヌクレオチド配列に関する。具体的な実施態様において、CXCR-4核酸は、配列番号  のcDNA配列、またはそのコード領域、またはCXCR-4タンパク質（例えば、配列番号  の配列を有するタンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸は、１本鎖でも２本鎖でもよい。本発明はまた、前記配列とハイブリダイズすることができるかまたはこれと相補的な核酸に関する。
【００６８】
具体的な面において、CXCR-4遺伝子の少なくとも10、25、50、100、200、または250の連続したヌクレオチドに相補的な配列を含む核酸が提供される。具体的な実施態様において、低ストリンジェンシー条件下で、CXCR-4核酸（例えば、配列番号  を有する）にハイブリダイズすることができるか、またはCXCR-4誘導体をコードする核酸にハイブリダイズすることができる核酸が提供される。
【００６９】
例えば、特に限定されないが、このような低ストリンジェンシー条件を使用する方法は以下のものがある（ShiloとWeinberg、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792 を参照）：DNAを含有するフィルターを、40℃で、35％ホルムアミド、5×SSC、50mMトリス−塩酸（pH7.5）、５mM EDTA、0.1％PVP、0.1％フィコール、１％BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAを含有する溶液で、６時間、前処理する。同じ溶液中で以下の変更を加えてハイブリダイゼーションを行う：0.02％PVP、0.02％フィコール、0.2％BSA、100μg/ml変性サケ精子DNA、10％（w/v）デキストラン硫酸、および５〜20×106 cpm 32Ｐ標識プローブを使用する。
【００７０】
フィルターは、ハイブリダイゼーション混合物中で40℃で18〜20時間インキュベートし、次に55℃で、２×SSC、25mMトリス−塩酸（pH7.4）、５mM EDTA、および0.1％SDSを含有する溶液中で1.5時間洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液で置換し、60℃でさらに1.5時間インキュベートする。フィルターをブロットして乾燥させ、オートラジオグラフィーに露光させる。必要であれば、フィルターを65〜68℃で３回目の洗浄を行い、再度フィルムに露光する。使用される低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で公知である（例えば、種間ハイブリダイゼーションについて使用されるように）。
【００７１】
別の具体的な実施態様において、高ストリンジェンシー条件下でCXCR-4核酸にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。例えば、特に限定されないが、このような高ストリンジェンシー条件を使用する方法は以下のものがある：DNAを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、65℃で、６×SSC、50mMトリス−塩酸（pH7.5）、１mM EDTA、0.02％PVP、0.02％フィコール、0.02％BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAからなる緩衝液中で行う。
【００７２】
フィルターは、100μg/ml変性サケ精子DNAと５〜20×106 cpm の32Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で、65℃で46時間ハイブリダイズする。フィルターの洗浄は、２×SSC、0.01％PVP、0.01％フィコール、および0.01％BSAを含有する溶液中で、37℃で１時間行う。次に、0.1×SSCで50℃で45分洗浄後、オートラジオグラフィーを行う。高ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で公知である。
別の実施態様において、中程度のストリンジェンシー条件下でCXCR-4核酸にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。
【００７３】
核酸ハイブリダイゼーションを促進する種々の他のストリンジェンシー条件が使用できる。例えば６×SSCで約45℃でハイブリダイゼーション後に、２×SSCで50℃で洗浄を使用してもよい。あるいは洗浄工程の塩濃度は、50℃で約５×SSCの低ストリンジェンシーから, 50℃で約２×SSCの中程度のストリンジェンシーまで、50℃で約0.2×SSCの高ストリンジェンシーまでの範囲でもよい。さらに洗浄工程の温度は、室温の低ストリンジェンシー条件から, 約42℃の中程度のストリンジェンシー条件まで、約65℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させてもよい。
【００７４】
他の条件には、特に限定されないが、68℃で、0.5M NaHPO4（pH7.2）／1mM EDTA／７％ SDSでハイブリダイゼーション、または、50％ホルムアミド／0.25M NaHPO4（pH7.2）／.25M NaCL／１mM EDTA／７％ SDSでハイブリダイゼーション；次に、42℃で40mM NaHPO4（pH7.2）／１mM EDTA／５％ SDSでハイブリダイゼーション、または50℃で40mM NaHPO4（pH7.2）／1mM EDTA／１％ SDSでハイブリダイゼーションがある。温度と塩の両方とも、変化させてもよく、またはいずれかの変数を一定に維持し、他方を変化させてもよい。
【００７５】
低、中程度、および高ストリンジェンシー条件は、当業者に公知であり、特定の核酸配列の塩基組成および核酸配列が得られる具体的な生物に依存して、予測可能に変化させられるであろう。そのような条件についての指針は、例えばサムブルーク（Sambrook）ら, 1989，モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク、9.47〜9.57頁；およびアウスベル（Ausubel）ら, 1989，分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、ニューヨーク、を参照されたい。
【００７６】
CXCR-4タンパク質の誘導体と類似体をコードする核酸（セクション5.2.2を参照）、およびCXCR-4アンチセンス核酸が、さらに提供される。容易に明らかなように、本明細書において「CXCR-4タンパク質の断片または部分をコードする核酸」は、CXCR-4タンパク質の記載の断片または部分のみをコードする核酸を意味し、連続配列としてCXCR-4タンパク質の他の連続的部分をコードする核酸を意味するものではない。
同じかまたは異なる種の他のCXCR-4核酸の間で保存されている領域を含むCXCR-4核酸の断片もまた、提供される。１つまたはそれ以上のCXCR-4ドメインをコードする核酸が提供される。
【００７７】
限定することなく特定の例として提示されるCXCR-4遺伝子のクローニングの具体的な実施態様には、以下がある：
発現クローニング（当該分野で公知で技術）のために、当該分野で公知の方法により発現ライブラリーを作製する。例えばmRNA（例えば、ヒト）を単離し、cDNAを作成し、そしてそれが導入される宿主細胞により発現されることができるように発現ベクター（例えば、バクテリオファージ誘導体）に連結する。次に種々のスクリーニング測定法を使用して、発現されたCXCR-4産物について選択する。ある実施態様において、抗CXCR-4抗体は、選択のために使用することができる。
【００７８】
別の実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーで所望の配列を増幅してから, 選択を行う。公知のCXCR-4配列を示すオリゴヌクレオチドプライマーを、PCRのプライマーとして使用することができる。好適な面において、オリゴヌクレオチドプライマーは、図に示すCXCR-4配列の少なくとも一部分である。合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、目的の配列（RNAまたはDNA）好ましくはcDNAライブラリーからPCR配列を増幅することができる。
【００７９】
PCRは、例えばパーキンエルマーシータス（Perkin Elmer Cetus）サーマルサイクラーとTaqポリメラーゼ（ジーンアンプ（Gene AmpTM））を使用して、行うことができる。増幅されるDNAは、任意の真核生物種のmRNA、cDNA、またはゲノムDNAを含むことができる。PCR反応で使用するために、いくつかの異なる縮重プライマーを合成することを選択することができる。また、PCR反応のプライミングに使用されるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させて、公知のCXCR-4ヌクレオチド配列と単離される核酸同族体の間のヌクレオチド配列類似性の程度を、より大きくまたはより小さくすることができる。異種間ハイブリダイゼーションのために、低ストリンジェンシー条件が好ましい。
【００８０】
同種間ハイブリダイゼーションのために、中程度のストリンジェンシー条件が好ましい。CXCR-4同族体のセグメントの増幅の成功のためには、セグメントを分子的にクローン化し配列決定し、プローブとして使用して、完全なcDNAまたはゲノムクローンを単離する。次にこれは、後述の遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および機能的分析のためのそのタンパク質産物の産生を可能にする（後述）。こうして、CXCR-4タンパク質をコードする追加の遺伝子およびCXCR-4類似体が同定される。
上記方法は、CXCR-4のクローンが得られる方法の以下の一般的な記載を限定するものではない。
【００８１】
真核細胞は、CXCR-4遺伝子の分子クローニングの核酸供給源として機能できる可能性がある。CXCR-4をコードする核酸配列は、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、イヌ、ヒトや他の霊長類）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などの脊椎動物、昆虫などの非脊椎動物、植物などから単離することができる。DNAは、当該分野で公知の標準的方法によりクローン化DNA（例えば、cDNA「ライブラリー」）から, または所望の細胞から精製されるゲノムDNAまたはその断片から, 化学合成、cDNAクローニング、またはゲノムDNAのクローニングにより得られる。
【００８２】
（例えば、サムブルーク（Sambrook）ら, 1989，モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；Glover D.M.（編）、1985、DNAクローニング：実際的アプローチ（DNA Cloning:A Practical Approach）、エムアールエルプレス（MRL Press, Ltd.）、オックスフォード、英国、第Ｉ、II巻を参照）。ゲノムDNAから得られるクローンは、コード領域以外に制御DNAおよびイントロンDNAを含有してもよい。cDNAから得られるクローンは、エキソン配列のみを含有するであろう。供給源が何であっても、遺伝子は、遺伝子を増殖するために適当なベクター中に分子クローン化される。
【００８３】
ゲノムDNAからの遺伝子の分子クローニングでは、DNA断片が生成し、その一部は所望の遺伝子をコードする。DNAは、種々の制限酵素を使用して、特定の部位で切断される。あるいは、マンガンの存在下でDNAseを使用してDNAを断片化するか、または例えば音波処理によりDNAを物理的に剪断してもよい。次に線状DNA断片は、標準的方法（アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびカラムクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない）により、サイズに従って分離することができる。
【００８４】
DNAがいったん生成されると、多くの方法により所望の遺伝子を含有する特異的DNA断片が同定される。ある量の（任意の種の）CXCR-4遺伝子の一部、またはその特異的RNAもしくはその断片（セクション5.6）が得られ、精製および標識されるなら, 生成したDNA断片は、標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングされる（BentonとDavis, 1977, Science 196:180; GrunsteinとHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961）。プローブへの実質的相同性を有するDNA断片がハイブリダイズするであろう。制限酵素消化および入手できるなら既知の制限地図に従って予測されるものと断片サイズを比較して、適当な断片を同定することができる。遺伝子の性質に基づき、さらなる選択を行うことができる。
【００８５】
あるいは遺伝子の存在は、その発現生成物の物理的、化学的、または免疫学的性質に基づく測定法により検出される。例えば、正しいmRNAをハイブリッド選択するcDNAクローンまたはDNAクローンを選択することができ、これは、CXCR-4と同様または同一の電気泳動度、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解性消化地図、細胞増殖活性の促進、基質結合活性、または抗原性を有するタンパク質を産生する。CXCR-4に対する抗体が利用できるなら, ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）型の方法で、推定のCXCR-4合成クローンへの標識抗体の結合により、CXCR-4タンパク質が同定される。
【００８６】
CXCR-4遺伝子はまた、核酸ハイブリダイゼーションと次のインビトロ翻訳を用いるmRNA選択により同定することができる。この方法では、ハイブリダイゼーションにより相補的ｍＲＮＡを単離するのに断片が使用される。このようなDNA断片は、別の種（例えば、ヒト、マウスなど）の利用可能な精製されたCXCR-4 DNAでもよい。単離したmRNAの単離した生成物のインビトロ翻訳生成物の免疫沈降分析または機能的分析（例えば、インビトロ凝集能；受容体への結合；下記参照）により、mRNAが同定され、従って所望の配列を含有する相補的なDNA断片が同定される。
【００８７】
さらに、細胞から単離したポリソームを、CXCR-4タンパク質に特異的な固定化抗体に吸着させて、特異的ｍＲＮＡが選択される。放射能標識CXCR-4 DNAは、選択したmRNA（吸着したポリソームから）を鋳型として使用して合成することができる。次に放射能標識したmRNAまたはcDNAをプローブとして使用して、他のゲノムDNA断片の中からCXCR-4 DNA断片が同定される。
【００８８】
CXCR-4ゲノムDNAを単離する代わりに、特に限定されないが、既知の配列から遺伝子配列自身を化学合成するかまたはCXCR-4タンパク質をコードするmRNAに対してcDNAを作成する。例えば、CXCR-4遺伝子のcDNAクローニングのためのRNAは、CXCR-4を発現する細胞から単離することができる。他の方法も可能であり、本発明の範囲内に含まれる。
【００８９】
同定し単離した遺伝子は、次に適当なクローニングベクター中に挿入することができる。当該分野で公知の多数のベクター−宿主系が使用される。可能なベクターには、特に限定されないが、プラスミドまたは修飾ウイルスがあるが、ベクター系は、使用される宿主細胞と適合性がなければならない。このようなベクターには、特に限定されないが、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはpBR322のようなプラスミド、またはpUC19プラスミド誘導体またはBluescriptベクター（ストラタジーン（Stratagene））がある。クローニングベクターへの挿入は、例えば相補的な粘着末端を有するクローニングベクターにDNA断片を連結することにより行われる。
【００９０】
しかしDNAを断片化するのに使用される相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しないなら、DNA分子の末端が酵素で修飾してもよい。あるいは、DNA末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することにより、任意の所望の部位を作成することができる；これらの連結したリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成したオリゴヌクレオチドを含んでもよい。別の方法において、切断ベクターとCXCR-4遺伝子は、ホモポリマーテイリングにより修飾される。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔法などにより宿主細胞中に導入することができ、その結果遺伝子配列の多くのコピーが生成する。
【００９１】
別の方法において、「散弾銃」（shot gum）アプローチにより適当なクローニングベクターに挿入後に、所望の遺伝子が同定され単離される。例えばサイズ細分化による所望の遺伝子の濃縮を、クローニングベクターへの挿入の前に行うことができる。
具体的な実施態様において、単離されたCXCR-4遺伝子、cDNA、または合成DNA配列を有する組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数のコピーの生成を可能にする。すなわち、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えDNA分子を単離し、かつ必要であれば単離した組換えDNAから挿入された遺伝子を回収することにより、遺伝子が大量に得られる。
【００９２】
本発明により提供されるCXCR-4配列には、未変性のCXCR-4タンパク質中にあるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするおの、および機能的に同等のアミノ酸を有するコードされたアミノ酸配列をコードするもの、ならびに他のCXCR-4誘導体または類似体をコードするものがある（CXCR-4誘導体と類似体については下記のセクション5.2.2.に記載されている）。
本発明により提供されるCXCR-4配列には、構成性に発現されるCXCR-4変異体をコードするものがある。
【００９３】
5.2.2.  CXCR-4遺伝子の発現
CXCR-4タンパク質またはその機能的に活性のある類似体もしくは断片もしくは他の誘導体をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写と翻訳のために必要な配列を含有するベクター）中に挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルはまた、未変性のCXCR-4遺伝子および／またはそのフランキング領域により供給される。タンパク質をコードする配列を発現するのに多くの宿主−ベクター系が利用できる。
【００９４】
これらには、特に限定されないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母、バクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換された細菌のような微生物がある。ベクターの発現成分は、その強度と特異性が異なる。使用される宿主−ベクター系に依存して、いくつかの適当な転写および翻訳成分の任意のものが使用される。具体的な実施態様において、ヒトCXCR-4遺伝子が発現されるか、またはヒトCXCR-4の機能活性部分をコードする配列が発現される。さらに別の実施態様において、CXCR-4タンパク質のドメインを含むCXCR-4の断片が発現される。
【００９５】
ベクターへのDNA断片の挿入について前記した方法の任意の方法を使用して、適切な転写／翻訳調節シグナルとタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターが作製される。これらの方法は、インビトロの組換えDNAと合成技術およびインビボ組み換え体（遺伝的組換え）を含む。CXCR-4タンパク質またはペプチド断片をコードする核酸配列の発現は、第２の核酸配列により制御され、その結果CXCR-4タンパク質またはペプチドは、組換えDNA分子で形質転換された宿主中で発現される。例えば、CXCR-4タンパク質の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー成分により調節される。
【００９６】
CXCR-4発現を調節するのに使用されるプロモーターには、特に限定されないが、SV40早期プロモーター領域（BernoistとChambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復配列中に含有されるプロモーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）；原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731）、またはtacプロモーター（DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25）がある；
【００９７】
また、Scientific American, 1980, 242:74-94中の「組換え細菌からの有用なタンパク質（Useful proteins from recombinant bacteria）」を参照されたい；ノパリンシンセターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター（Herrera-Estrellaら, 1983, Nature 303:209-213）またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（Gardnerら, 1981, Nucleic Acids Res. 9:2871）、および光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrellaら, 1983, Nature 310:115-120）；酵母または他の真菌からのプロモーター成分、例えばGal4プロモーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および以下の動物転写調節領域（これは、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で使用されている）；
【００９８】
膵臓腺房細胞中で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swiftら, 1984, Cell 38:639-646; Ornitzら, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞中で活性のあるインスリン遺伝子調節領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）、リンパ系細胞中で活性のある免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedlら, 1984, Cell 38:647-658; Adamesら, 1985, Nature 318:533-538; Alexanderら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）、睾丸、乳房、リンパ系および肥満細胞中で活性のあるマウス乳癌ウイルス調節領域（Lederら, 1986, Cell 45:485-495）、肝臓中で活性のあるアルブミン遺伝子調節領域（Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1:268-276）、肝臓中で活性のあるアルファフェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlaufら, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；
【００９９】
Hammerら, 1987, Science 235:53-58；肝臓中で活性のあるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelseyら, 1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄性細胞中で活性のあるベータグロビン遺伝子調節領域（Mogramら, 1985, Nature 315:338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94；脳の乏突起神経膠細胞中で活性のあるミエリン塩基性タンパク質（Readheadら, 1987, Cell 48:703-712）；骨格筋中で活性のあるミオシン軽鎖２遺伝子調節領域（Sani, 1985, nature 314:283-286）、および視床下部で活性のあるゴナドトロビン放出ホルモン遺伝子調節領域（Masonら, 1986, Science 234:1372-1378）。
【０１００】
具体的な実施態様において、CXCR-4コード核酸に機能的に連結したプロモーター、１つまたはそれ以上の複製開始点、および随時１つまたはそれ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが使用される。
具体的な実施態様において、CXCR-4コード配列を、３つのpGEXベクターのそれぞれのEcoRI制限部位にサブクローン化することにより、発現作製体が作成される（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ発現ベクター；SmithとJohnson, 1988, Gene 7:31-40）。これは、正しい読みとり枠でサブクローンからのCXCR-4タンパク質生成物の発現を可能にする。
【０１０１】
CXCR-4遺伝子挿入体を含有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチにより同定することができる：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無、および（ｃ）挿入された配列の発現。第１のアプローチでは、発現ベクター中に挿入されたCXCR-4遺伝子の存在は、挿入されたCXCR-4遺伝子に相補的な配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第２のアプローチでは、組換えベクター／宿主系が同定され、ベクター中のCXCR-4遺伝子の挿入により引き起こされる、いくつかの「マーカー」遺伝子機能の有無に基づき選択される（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中での封入体生成など）。
【０１０２】
例えば、CXCR-4遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入されるなら, CXCR-4異性体を有する組み換え体は、マーカー遺伝子機能の欠如により同定することができる。第３のアプローチでは、組み換え体により発現されるCXCR-4生成物を測定することにより、組換え発現ベクターを同定することができる。このような測定法は、例えばインビトロ測定系（例えば、抗CXCR-4抗体との結合、細胞増殖の促進）で、CXCR-4タンパク質の物理的または機能的性質に基づく。
【０１０３】
特定の組換えDNA分子がいったん同定され単離されると、当該分野で公知のいくつかの方法を用いて、これを増殖させることができる。適当な宿主系と増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターを大量に増殖させ調製することができる。前述したように、使用される発現ベクターには、特に限定されないが、以下のベクターまたはその誘導体がある：少し例を挙げると、ヒトまたは動物ウイルス、例えばワクシニアウイルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、そしてプラスミドおよびコスミドDNAベクターがある。
【０１０４】
さらに、挿入配列の発現を調節するかまたは所望の特異的な方法で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株が選択される。いくつかのインデューサーの存在下では、いくつかのプロモーターの発現は上昇している；すなわち、遺伝子操作したCXCR-4タンパク質の発現は、調節することができる。さらに異なる宿主細胞は、翻訳および翻訳後プロセシングと修飾の特徴的で特異的な機序（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）を有する。発現される外来タンパク質の所望の修飾とプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。
【０１０５】
例えば、細菌系での発現を使用して、非グリコシル化コアタンパク質産物を産生することができる。酵母での発現は、グリコシル化生成物を与える。哺乳動物細胞での発現は、異種タンパク質の「未変性の」グリコシル化を確実にするために使用することができる。さらに異なるベクター／宿主発現系は、プロセシング反応に異なる程度に作用する。
【０１０６】
他の具体的な実施態様において、CXCR-4タンパク質、断片、類似体、または誘導体は、融合またはキメラタンパク質生成物として発現されてよい（（異なるタンパク質の）異種タンパク質配列にペプチド結合で結合した、タンパク質、断片、類似体、または誘導体を含む）。このようなキメラ生成物は、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を、当該分野で公知の方法により互いに正しいコードフレームで連結し、当該分野で公知の方法によりキメラ生成物を発現することにより、作成することができる。あるいは、このようなキメラ生成物は、タンパク質合成法（例えば、ペプチド合成機を使用する）により作成してもよい。
cDNAとゲノム配列のいずれも、クローン化し発現することができる。
【０１０７】
5.2.3.  CXCR-4遺伝子産物の同定と精製
具体的な面において本発明は、CXCR-4（好ましくはヒトCXCR-4）のアミノ酸配列、および抗原決定基（すなわち、抗体により認識され得る）を含み本来は活性があるその断片および誘導体、ならびにこれらをコードする核酸配列を提供する。本明細書において「機能的活性がある」CXCR-4物質とは、完全長（野生型）CXCR-4タンパク質に関連した１つまたはそれ以上の機能活性（例えば、細胞増殖の促進、CXCR-4基質またはCXCR-4結合パートナーへの結合、抗原性（抗CXCR-4抗体への結合）、免疫原性など）を示す物質について言及する。
【０１０８】
他の具体的な実施態様において本発明は、少なくとも６アミノ酸、10アミノ酸、50アミノ酸、または少なくとも75アミノ酸からなるCXCR-4タンパク質の断片を提供する。他の実施態様において本発明は、CXCR-4タンパク質の配列番号  、配列番号  、配列番号  、または配列番号  、またはこれらの任意の組合と、100％同一のアミノ酸の配列を含む、これらを有する、または実質的にこれらからなるタンパク質を提供する。このような配列を含む断片またはタンパク質は、下記の免疫測定法に特に有利である。CXCR-4タンパク質の前記領域の一部またはすべてが欠如した断片、または断片を含むタンパク質もまた提供される。前記をコードする核酸が提供される。
【０１０９】
CXCR-4遺伝子配列を発現する組み換え体がいったん同定されると、遺伝子産物を分析することができる。これは、生成物の物理的または機能的性質に基づく測定法（生成物の放射能標識の後に、ゲル電気泳動、免疫測定法などで分析）により行われる。
CXCR-4タンパク質がいったん同定されると、これは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイズ区別カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度、またはタンパク質の精製のための他の標準的技術を含む標準的方法により、単離し精製される。機能的性質は、適当な測定法（セクション5.3を参照）により評価される。
【０１１０】
あるいは組み換え体により産生されるCXCR-4タンパク質がいったん同定されると、このタンパク質のアミノ酸配列は、組み換え体中に含有するキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から推定することができる。その結果、タンパク質は、当該分野で公知の標準的化学的方法により合成することができる（例えば、Hunkapiller, M.ら, 1984, Nature 310:105-111を参照）。
別の実施態様において、未変性のCXCR-4タンパク質は、前記した標準的方法（例えば、免疫親和性精製）により、天然の供給源から精製することができる。
【０１１１】
本発明の具体的な実施態様において、このようなCXCR-4タンパク質（組換えDNA法、化学合成法、または未変性のタンパク質の精製により産生されたものであっても）には、特に限定されないが、１次アミノ酸配列として、そのアミノ酸配列のすべてまたは一部を実質的に含有するもの、ならびに断片および他の誘導体、そして図14（配列番号  ）に示すその類似体（これに相同的なタンパク質を含む）がある。
【０１１２】
5.2.4.  CXCR-4に対する抗体と免疫細胞
5.2.4.1.  CXCR-4タンパク質およびその誘導体に対する抗体の作成
本発明においてCXCR-4タンパク質、その断片もしくは他の誘導体またはその類似体は、免疫特異的に免疫原に結合する抗体を生成するのに使用される。そのような抗体には、特に限定されないが、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーがある。具体的な実施態様において、ヒトCXCR-4タンパク質に対する抗体が産生される。
【０１１３】
別の実施態様において、CXCR-4タンパク質のドメインに対する抗体が産生される。具体的な実施態様において、親水性であるとして同定されるCXCR-4タンパク質の断片は、抗体産生の免疫原として使用される。本発明のさらに別の実施態様において、SDF-1タンパク質、その断片もしくは他の誘導体、または類似体を免疫原として使用して、そのような抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成してもよい。具体的な実施態様において、抗SDFβ-1抗体が産生される。
【０１１４】
別の具体的な実施態様において、ヒトCXCR-4タンパク質に対する抗体は、２特異性（bispecific）抗体である（一般的には、例えば、FangerとDrakeman, 1995, Drug News and Perspectives 8:133-137）。そのような２特異性抗体は、（１）ヒトCXCR-4エピトープおよび（２）細胞障害性Ｔ細胞に特定の標的の破壊を引き起こさせることができるとして同定されている、種々の「トリガー」分子（例えば、骨髄性細胞上のFc受容体、およびＴ細胞上のCD3やCD2）の１つ、の両方を認識するように、遺伝子操作で作成される。このような２特異的抗体は、当業者に公知の化学的結合、ハイブリドーマ、または組換え分子生物学的方法により調製することができる。
【０１１５】
当該分野で公知の種々の方法は、CXCR-4タンパク質または誘導体もしくは類似体に対するポリクローナル抗体を産生するのに使用される。特定の実施態様において、CXCR-4タンパク質のエピトープまたはそのサブ配列に対するウサギポリクローナル抗体が得られる。抗体の産生のために、種々の宿主動物（例えば、ウサギ、マウス、ラットなどがあるが、これらに限定されない）に、未変性のCXCR-4タンパク質、または合成したもの、またはその誘導体（例えば、断片）を注入することにより免疫することができる。
【０１１６】
免疫応答を上昇させるために、宿主の種に依存して、種々のアジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リソレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）やコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）のような有用である可能性のあるヒトアジュバントがあるが、これらに限定されない）を使用してもよい。
【０１１７】
CXCR-4タンパク質配列またはその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養物中の連続的細胞株により抗体分子を産生する任意の技術が使用される。例えば、元々 KohlerとMilstein（1975, Nature 256:495-497）により開発されたハイブリドーマ技術ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96中）。
【０１１８】
本発明のさらなる実施態様において、PCT/US90/02545に記載の技術を使用して、無菌動物でモノクローナル抗体を産生することができる。本発明において、ヒト抗体が使用され、ヒトハイブリドーマ（Coteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030）を使用するか、またはヒトＢ細胞をインビトロでＥＢＶウイルスを使用して形質転換（Coleら, 1985, モノクローナル抗体と癌の治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）、Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96中）して得ることができる。
【０１１９】
実際本発明において、CXCR-4に特異的なマウス抗体分子から、遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライスして、「キメラ抗体」の産生について開発された技術（Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608; Takedaら, 1985, Nature 314:452-454）を使用することができる；このような抗体は本発明の範囲内に含まれる。
【０１２０】
本発明において、１本鎖抗体の産生のための技術（米国特許第4,946,778号）を、CXCR-4特異的１本鎖抗体を産生するように適合させることができる。本発明のさらなる実施態様は、Ｆab発現ライブラリーの作製について記載された技術（Huseら, 1989, Science 246:1275-1281）を使用して、CXCR-4タンパク質、誘導体、または類似体に対して所望の特異性をモノクローナル有するFab断片を、迅速かつ容易に同定する。
【０１２１】
分子のイディオタイプを含有する抗体断片は、公知の技術により作成される。例えばそのような断片には、特に限定されないが、抗体断片のペプシン消化により産生することができるＦ(ab')2断片；Ｆ(ab')2断片のジスルフィド結合を還元することにより生成するＦab'断片、抗体分子をパパインと還元剤で処理して作成することができるＦab断片、およびＦｖ断片がある。
【０１２２】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当該分野で公知の技術、例えばELISA（酵素結合免疫吸着測定法）により行われる。例えばCXCR-4タンパク質の特異的ドメインを認識する抗体を選択するために、そのようなドメインを含有するCXCR-4断片に結合する生成物について、生成したハイブリドーマを測定してもよい。１つのCXCR-4同族体に特異的に結合するが、異なるCXCR-4同族体には特異的に結合しない抗体の選択のために、第１のCXCR-4同族体に対する陽性の結合と第２のCXCR-4同族体に対する結合の欠如に基づいて、選択をすることができる。
【０１２３】
CXCR-4タンパク質のドメインに特異的な抗体もまた提供される。
前記抗体は、本発明のCXCR-4タンパク質配列の局在化と活性に関して当該分野で公知の方法で使用することができる（例えば、診断法において、これらのタンパク質をイメージングし、適当な生理学的試料中でそのレベルを測定する）。
本発明の別の実施態様（下記）において、抗CXCR-4抗体および結合ドメインを含有するその断片は、治療薬である。
【０１２４】
抗体と抗原結合抗体断片もまた、化学的結合法または組換えDNA技術により、異種タンパク質またはペプチドに結合させてもよい。得られたキメラタンパク質は、抗体の抗原結合特異性と、異種タンパク質の機能を有する。例えば、CXCR-4の細胞外ドメインに特異的な抗体の抗原結合領域をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖のコード配列に遺伝子的に融合させることができる。この作製体をＴ細胞中で発現した後、このＴ細胞をエクスビボで拡張し、脳腫瘍患者に注入する。
【０１２５】
このキメラタンパク質を発現するＴ細胞は、抗体結合特異性の結果として、特異的にCXCR-4を発現する腫瘍に向かい、腫瘍細胞を死滅させる。あるいは抗体をタンパク質に融合すると、これは白血球の遊走を誘導し、腫瘍部位に他の化合物を引き寄せる親和性を有する。このタイプの特異的なタンパク質は、ストレプトアビジンである。腫瘍細胞へのストレプトアビジン結合抗体の結合後、ビオチン化薬剤、トキシンまたはラジオアイソトープを加えると、腫瘍の特異的な死滅を引き起こす。
【０１２６】
上記タイプの物質のいずれかに結合したモノクローナル抗体（またはその断片）を含有する、このようなインビトロの腫瘍局在化や治療法で使用するためのキットを、調製することができる。キットの成分は、水性媒体中でまたは凍結乾燥型で、包装することができる。モノクローナル抗体（またはその断片）を、標識物または治療的部分（Ｎ−例えば、放射性金属イオンまたは治療薬部分）が結合した結合体の形でキット中で使用する時、そのような結合体の成分は、完全に結合した形で、中間体の形で、またはキットの使用者が結合させるための別々の部分として、供給することができる。
【０１２７】
5.2.5.  CXCR-4タンパク質、誘導体および類似体
本発明はさらに、CXCR-4タンパク質、および誘導体（断片を含むが、これに限定されない）、およびCXCR-4タンパク質の類似体（特に、CXCR-4活性のアンタゴニストとして作用する誘導体）を含む組成物を包含する。CXCR-4タンパク質誘導体をコードする核酸およびタンパク質類似体もまた提供される。ある実施態様において、CXCR-4タンパク質は、セクション5.2.1.（前記）に記載のCXCR-4核酸によりコードされる。具体的な面において、タンパク質、誘導体、または類似体は、動物（例えば、ハエ、カエル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ、サル、ヒト）または植物のCXCR-4タンパク質のものである。
【０１２８】
CXCR-4に関連する誘導体と類似体の産生と使用は、本発明の範囲内にある。具体的な実施態様において、誘導体または類似体は機能的に活性がある（すなわち、完全長の野生型CXCR-4タンパク質に関連した１つまたはそれ以上の機能活性を示すことができる）。１つの例として、所望の免疫原性または抗原性を有する誘導体または類似体は、例えば免疫測定法、免疫、CXCR-4活性の阻害などで使用することができる。
【０１２９】
目的の所望のCXCR-4性（例えば、CXCR-4結合パートナーへの結合、細胞増殖の促進）を保持、または欠如または阻害する誘導体または類似体は、そのような性質のインデューサーまたはインヒビターとして、および生理学的関連物質として使用することができる。ある具体的な実施態様は、抗CXCR-4抗体により結合されることができるCXCR-4断片に関する。CXCR-4の誘導体または類似体は、当該分野で公知の方法（セクション5.3および5.5に記載の測定法を含むが、これらに限定されない）により、所望の活性について試験することができる。
【０１３０】
特に、機能的に同等の分子を与える置換、付加または欠失により、CXCR-4配列を改変することにより、CXCR-4誘導体を作成することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重性のために、CXCR-4遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を、本発明の実施に使用することができる。これらには、特に限定されないが、配列内に機能的に同等のアミノ酸残基をコードする（従って、サイレント変化を生成する）異なるコドンの置換により改変されているCXCR-4遺伝子のすべてまたは一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１３１】
同様に、本発明のCXCR-4誘導体には、特に限定されないが、１次アミノ酸配列として、改変配列（ここで、機能的に同等のアミノ酸残基は、配列内でサイレント変化を引き起こす残基で特にされる）を含むCXCR-4タンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含むものがある。例えば、配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、機能的同等物として作用する同様の極性のアミノ酸により置換して、サイレント変化を引き起こすことができる。配列内のアミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。
【０１３２】
例えば非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンがある。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンがある。陽性に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンがある。陰性に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸がある。
【０１３３】
本発明の具体的な実施態様において、CXCR-4タンパク質の少なくとも10個の（連続的）アミノ酸からなるCXCR-4タンパク質の断片からなるかまたはこれを含むタンパク質が、提供される。他の実施態様において、断片は、CXCR-4タンパク質の少なくとも20または50アミノ酸からなる。具体的な実施態様において、そのような断片は、35、100または200アミノ酸以下である。
【０１３４】
CXCR-4の誘導体または類似体には、特に限定されないが、CXCR-4またはその断片に実質的に相同的な領域（例えば、種々の実施態様において、同一のサイズのアミノ酸配列に対して、または当該分野で公知のコンピューター相同性プログラムで整列させた配列と比較して、少なくとも60％または70％または80%または90％または95％の同一性）、またはストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または非ストリンジェントな条件下で、そのコードする核酸が、CXCR-4配列にハイブリダイズするかまたはコードすることができる領域を含む分子がある。
【０１３５】
本発明のCXCR-4誘導体および類似体は、当該分野で公知の種々の方法により産生することができる。この産生のための操作は、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルでもよい。例えば、クローン化CXCR-4遺伝子配列は、当該分野で公知の多くの方法の任意の方法（サムブルーク（Sambrook）ら, 1989，モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク）を使用して修飾することができる。
【０１３６】
この配列は、制限エンドヌクレアーゼで適当な部位で切断し、次に所望であればさらに酵素で修飾し、単離し、インビトロで連結することができる。CXCR-4の誘導体または類似体をコードする遺伝子の産生では、修飾した遺伝子が、CXCR-4と同じ翻訳読みとり枠内にあり、所望のCXCR-4活性がコードされる遺伝子領域において翻訳停止シグナルにより妨害されていないことを確実にするように注意すべきである。
【０１３７】
さらに、CXCR-4コード核酸配列は、インビトロまたはインビボで突然変異させて、翻訳、開始、および／または停止配列を作成および／または破壊するか、またはコード配列中に変化を作成するか、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を生成するか、または既存の制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊して、インビトロ修飾をさらに促進することができる。当該分野で公知の任意の突然変異誘発技術が使用でき、例えば、特に限定されないが、化学的突然変異誘発、インビトロ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson, C.ら, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551）、TAB（登録商標）リンカー（ファルマシア（Pharmacia））の使用などがある。
【０１３８】
CXCR-4配列の操作もまた、タンパク質レベルで行うことができる。本発明の範囲内に含まれるものは、翻訳の間またはその後（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結などがある）に区別的に修飾されるCXCR-4タンパク質断片または他の誘導体もしくは類似体がある。無数の化学的修飾法の任意の方法が、公知の技術（例えば、特に限定されないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的化学切断；アセチル化、ホルミルか、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成など）により行われる。
【０１３９】
さらにCXCR-4の類似体および誘導体は、化学的に合成することができる。例えば、所望のドメインを含むかまたはインビトロで所望の活性を仲介するCXCR-4タンパク質の一部に対応するペプチドを、ペプチド合成機を使用して合成することができる。さらに所望であれば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、置換または付加として、CXCR-4配列中に導入することができる。
【０１４０】
非古典的アミノ酸には、特に限定されないが、ふつうのアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Abu、２−アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、６−アミノヘキサン酸、Aib、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Nα−メチルアミノ酸）、およびアミノ酸類似体全般がある。さらにアミノ酸は、Ｄ（右旋性）でもＬ（左旋性）でもよい。
【０１４１】
具体的な実施態様において、CXCR-4誘導体は、ペプチド結合を介して異なるタンパク質のアミノ酸配列に結合した、CXCR-4タンパク質またはその断片（好ましくは、CXCR-4タンパク質の少なくとも１つのドメインまたはモチーフ、またはCXCR-4タンパク質の少なくとも10アミノ酸からなる）を含むキメラまたは融合タンパク質である。ある実施態様において、そのようなキメラタンパク質は、タンパク質をコードする核酸（フレーム内で異なるタンパク質のコード配列に結合したCXCR-4コード配列を含む）の組換え発現により産生される。
【０１４２】
そのようなキメラ生成物は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を、当該分野で公知の方法により、互いに連結することにより作成することができる。あるいはそのようなキメラ生成物は、タンパク質合成技術、例えばペプチド合成機を使用して、作成することができる。異種タンパク質をコードする配列に融合したCXCR-4の部分を含むキメラ遺伝子を作製できる。１つの具体的な実施態様は、少なくとも６アミノ酸のCXCR-4の断片を含むキメラタンパク質に関する。
【０１４３】
別の具体的な実施態様において、CXCR-4誘導体は、CXCR-4タンパク質と相同性の領域を含む分子である。例えば種々の実施態様において、第１のタンパク質領域に含有される数と等しい数のアミノ酸を有する第２の領域中の任意の配列と比較して、または当該分野で公知のコンピューター相同性プログラムで整列させた第２の領域の整列配列と比較して、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％または95％同一である時、第１のタンパク質領域は、第２のタンパク質領域と「相同的」であると見なされる。例えば、分子は、CXCR-4ドメインまたはその一部に相同的な１つまたはそれ以上の領域を含むことができる。
誘導体と類似体の他の具体的な実施態様は、以下のサブセクションと後述の実施例のセクションで説明される。
【０１４４】
5.3.  CXCR-4タンパク質、誘導体および類似体の測定法
CXCR-4タンパク質、誘導体および類似体の機能活性を、種々の方法により測定することができる。
例えばある実施態様において、抗CXCR-4抗体に結合に結合するかまたは、この結合について野生型CXCR-4と競合する能力について測定する場合、当該分野で公知の種々の免疫測定法が使用でき、これらには、特に限定されないが、放射免疫定量法、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、イムノラジオメトリック測定法、ゲル分散沈降反応、免疫拡散測定法、 in situ 免疫測定法（例えば、コロイド性金、酵素またはラジオアイソトープ標識）、ウェスタンブロット、沈降反応、粘着測定法（例えば、ゲル粘着測定法、血球凝集測定法）、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテインＡ測定法、および免疫電気泳動などの技術を用いる競合または非競合測定法がある。
【０１４５】
ある実施態様において、１次抗体上の標識物を検出することにより、抗体結合が検出される。別の実施態様では、１次抗体への、２次抗体または試薬の結合を検出することにより、１次抗体が検出される。さらなる実施態様では、２次抗体が標識される。免疫測定法での結合を検出するための多くの手段が当該分野で公知であり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０１４６】
別の実施態様において、CXCR-4結合タンパク質を同定する場合、結合は、例えば当該分野で公知の手段により測定することができる。別の実施態様では、その基質へのCXCR-4結合の生理学的関連物（シグナル伝達）を測定することができる。
さらに、細胞増殖を阻害または促進する能力を検出または測定するために使用される測定法は、セクション5.4.に記載されている。
他の方法は当業者に公知であり、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４７】
5.4.  診断とスクリーニング
CXCR-4タンパク質、その類似体、誘導体、およびこれらのサブ配列、CXCR-4核酸（および、これらに相補的な配列）、抗CXCR-4抗体は、診断薬としての用途がある。このような分子は、測定法、例えば、CXCR-4発現に影響を与える種々の状態、疾患、および障害を、検出、予防、診断、または監視するために、またはその治療を監視するための免疫測定法に使用することができる。特にそのような免疫測定法は、免疫特異的結合が起きるような条件下で、抗CXCR-4抗体に患者由来の試料を接触させ、そして抗体による免疫特異的結合の量を検出または測定することを特徴とする方法により行われる。
【０１４８】
具体的な面において、組織切片での抗体のそのような結合は、異常なCXCR-4局在化またはCXCR-4の異常（例えば、高い、低い、または存在しない）レベルを検出するために使用することができる。具体的な実施態様において、CXCR-4に対する抗体は、CXCR-4の存在（CXCR-4の異常なレベルは疾患状態の指標である）を患者組織または血清試料で測定するために使用することができる。
【０１４９】
「異常なレベル」とは、体の一部からまたは疾患の無い被験体からの類似の試料中に存在するかまたは存在するレベルである標準的レベルに比較して、増加または低下したレベルを意味する。具体的な実施態様において、CXCR-4に対する抗体は、髄液および脳組織（しかし、特に限定されない）を含む組織または体液を、腫瘍を示すCXCR-4発現レベルの上昇について、測定およびスクリーニングするのに使用することができる。
【０１５０】
使用できる免疫測定法には、特に限定されないが、少し例を挙げればウェスタンブロット、放射免疫定量法、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降測定法、沈降反応、免疫拡散測定法、粘着測定法、補体結合測定法、イムノラジオメトリック測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ測定法がある。
【０１５１】
CXCR-4遺伝子と関連する核酸配列およびサブ配列（相補的な配列を含む）もまた、ハイブリダイゼーション測定法で使用することができる。CXCR-4核酸配列または少なくとも約８ヌクレオチドを含むそのサブ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーション測定法は、前記のCXCR-4発現および／または活性の異常変化に関連する状態、障害、または疾患を、検出、予防、診断、または監視するために、使用することができる。特にこのようなハイブリダイゼーション測定法は、ハイブリダイゼーションが起きるような条件下で、CXCR-4 DNAまたはRNAにハイブリダイズすることができる核酸プローブに、核酸を含有する試料を接触させ、そして生じるハイブリダイゼーションを検出または測定することを特徴とする方法により行われる。
【０１５２】
具体的な実施態様において、細胞の過剰増殖が関与する疾患および障害が診断できるか、またはその疑わしい存在がスクリーニングされるか、またはCXCR-4の発現または活性の上昇を引き起こすCXCR-4タンパク質、CXCR-4 RNA、またはCXCR-4機能的活性の増加レベルを検出するか、またはCXCR-4 RNA、DNAまたはタンパク質の突然変異（例えば、CXCR-4核酸中の転座、CXCR-4遺伝子またはタンパク質の末端切断、野生型CXCR-4に対してヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化）を検出することにより、そのような疾患をまたは疾患を発症する素因を検出することができる。
【０１５３】
そのような疾患および障害には、特に限定されないが、CXCR-4が過剰発現されているセクション６に言及した腫瘍または組織型がある。例えば、CXCR-4タンパク質のレベルは免疫測定法により検出され、CXCR-4 RNAのレベルはハイブリダイゼーション測定法（例えば、ノーザンブロット、ドットブロット）により検出され、CXCR-4核酸中の転座や点突然変異は、サザンブロッティング、FRLP分析、あるいは好ましくはCXCR-4遺伝子のほとんどを含む断片を生成するプライマーを使用するPCR、患者から得られたCXCR-4ゲノムDNAまたはcDNAの配列決定などにより検出することができる。
【０１５４】
好適な実施態様において、患者試料中のCXCR-4 mRNAまたはタンパク質のレベルが検出または測定され、この場合、レベルの上昇は、被験者が、悪性腫瘍または高増殖性疾患を有するかまたは発症しやすい素因を有することを示し、この場合、レベルの上昇は、体の一部からのまたはその場合に応じて悪性腫瘍または高増殖性疾患を持たない被験体からの類似の試料中に存在するレベルに比較したものである。
【０１５５】
別の具体的な実施態様において、CXCR-4タンパク質、CXCR-4 RNA、またはCXCR-4機能活性のレベルの低下を検出するか、またはCXCR-4の発現または活性の低下を引き起こすCXCR-4 RNA、DNAまたはタンパク質の突然変異（例えば、CXCR-4核酸中の転座、遺伝子またはタンパク質の末端切断、野生型CXCR-4に対してヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化）を検出することにより、細胞増殖が欠如したかまたは治療のために細胞増殖が好ましい疾患および障害が診断できるか、またはその疑われる存在がスクリーニングできるか、またはそのような疾患をまたは疾患への罹りやすさの素因を検出することができる。
【０１５６】
そのような疾患および障害には、特に限定されないが、CXCR-4が過剰発現されているセクション６やそのサブセクションで言及した腫瘍や組織タイプがある。例えば、CXCR-4タンパク質のレベル、CXCR-4 RNAのレベル、CXCR-4結合活性、および転座または点突然変異の存在は、前述のように決定することができる。
【０１５７】
具体的な実施態様において、患者試料中のCXCR-4 mRNAまたはタンパク質のレベルが、検出または測定され、この場合、レベルの低下は、被験者が、悪性腫瘍または高増殖性疾患を有するかまたはこれらを発症しやすい素因を有することを示し、この場合、レベルの低下は、体の一部からのまたはその場合に応じて悪性腫瘍または高増殖性疾患を持たない被験体からの類似の試料中に存在するレベルに比較したものである。
【０１５８】
１つまたはそれ以上の容器中に、抗CXCR-4抗体、および随時抗体に対する標識結合パートナーを含む、診断用途のキットも提供される。あるいは抗CXCR-4抗体は、（検出マーカー、例えば化学発光、酵素的蛍光、または放射性残基を用いて）標識することができる。また、１つまたはそれ以上の容器中に、CXCR-4 RNAにハイブリダイズすることができる核酸プローブを含むキットも提供される。
【０１５９】
具体的な実施態様において、キットは、１つまたはそれ以上の容器中に、CXCR-4核酸の少なくとも一部分の適切な条件下で、増幅［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、Innisら, 1990, PCRプロトコール（PCR Protocols）, アカデミックプレス社（Academic Press Inc.）、サンジエゴ、カリホルニア州、を参照）、リガーゼ連鎖反応（EP320,308を参照）、Qβレプリカーゼの使用、サイクリックプローブ反応、または当該分野で公知の他の方法］をプライムすることができる一対のプライマー（例えば、各６〜30ヌクレオチドの範囲のサイズ）を含むことができる。キットは、随時さらに、容器中に、例えば標準物質または対照として、あらかじめ決められた量の精製CXCR-4タンパク質または核酸を含むことができる。
【０１６０】
5.5.  治療用途
本発明は、治療用化合物（本明細書において「治療薬」と呼ぶ）の投与による、種々の疾患や障害の治療または予防を提供する。このような「治療薬」には、特に限定されないが：CXCR-4タンパク質およびその類似体および誘導体（断片を含む）（例えば、本明細書で前記したもの）；これに対する抗体（本明細書で前記したもの）；CXCR-4タンパク質、類似体、または誘導体をコードする核酸（例えば、前記したもの）；CXCR-4アンチセンス核酸、およびCXCR-4アゴニストとアンタゴニストがある。腫瘍形成または細胞過剰増殖が関与する障害は、CXCR-4機能に拮抗する治療薬の投与により、治療または予防される。細胞増殖が欠損しているかまたはこれが望ましい疾患は、CXCR-4機能を促進する治療薬の投与により、治療または予防される。詳細は、下記のサブセクションを参照されたい。
【０１６１】
一般に、受容体の起源または反応性（抗体の場合）と同じ種の起源と同じ種の反応性の生成物を投与することが好ましい。すなわち好適な実施態様において、ヒトCXCR-4タンパク質、誘導体、または類似体、または核酸、またはヒトCXCR-4タンパク質に対する抗体が、ヒト患者に治療的または予防的に投与される。
本発明に従って使用される治療薬のさらなる説明と供給源は、本明細書のセクション5.1〜5.7に記載されている。
【０１６２】
5.5.1.  細胞の過剰増殖が関与する障害の治療と予防
細胞の過剰増殖が関与する疾患と障害は、CXCR-4機能に拮抗（すなわち阻害）する治療薬の投与により、治療または予防される。このような治療薬の例としては、特に限定されないが、CXCR-4抗体、CXCR-4アンチセンス核酸、誘導体、または機能的に活性のある特に細胞増殖の阻害に活性がある類似体（例えば、インビトロ測定法または動物モデルまたはキイロショウジョウバエ（Drosophila）中で証明されるように）がある。使用可能な他の治療薬（例えば、CXCR-4アンタゴニスト）は、インビトロ測定法を使用して同定することができ、その例は後述される。
【０１６３】
具体的な実施態様において、（１）CXCR-4タンパク質または機能のレベルの上昇（正常または所望ののレベルと比較して）が関与する疾患または障害において、例えばCXCR-4タンパク質が過剰発現している、遺伝的に欠陥のある、または生理学的高活性の患者において、；または（２）インビトロ（またはインビボ）の測定法（後述）がCXCR-4アンタゴニスト投与の有用性を示す疾患または障害において、CXCR-4機能を阻害する治療薬が、治療的（予防的を含む）に投与される。CXCR-4タンパク質または機能のレベルの上昇は、例えば患者組織試料（例えば、生検組織から）を得て、RNAまたはタンパク質レベル、発現されたCXCR-4 RNAまたはタンパク質の構造および／または活性について、インビトロで測定することにより、容易に検出することができる。
【０１６４】
当該分野で標準的な多くの方法を使用することができ、これらには、特に限定されないが、CXCR-4タンパク質を検出および／または視覚化するための免疫測定法（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降の次にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学など）、および／またはCXCR-4 mRNAを検出および／または視覚化（例えば、ノーザン測定法、ドットブロット、 in situ ハイブリダイゼーションなど）することによりCXCR-4発現を検出するためのハイブリダイゼーション測定法などがある。
【０１６５】
治療または予防が可能な、細胞過剰増殖が関与する疾患と障害には、特に限定されないが、悪性腫瘍、前悪性腫瘍症状（例えば、肥厚、変質形成、形成異常）、良性腫瘍、高増殖性障害、良性異増殖障害などがある。これらの例を以下に詳述する。
【０１６６】
5.5.1.1.  悪性腫瘍
CXCR-4機能を阻害する治療薬の投与により治療または予防することができる悪性腫瘍や関連障害には、特に限定されないが、表１に記載のものがある（このような障害の総説については、Fishmanら, 1985, Medicine, 第２版、J.B. Lippincott Co., フィラデルフィアを参照されたい）。
【０１６７】
第１表
悪性腫瘍および関連障害
白血病
急性白血病
急性リンパ球性白血病
急性リンパ芽球性白血病
急性骨髄球性白血病
骨髄芽球性
骨髄性
前骨髄球性
骨髄性単球性白血病
単球性
赤白血病
【０１６８】
慢性白血病
慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病
慢性骨髄性白血病
慢性リンパ球性白血病
真性多血症
ホジキン病
非ホジキン病
多発性骨髄腫
ワルデンストレーム大グロブリン血症
重鎖病
【０１６９】
固形腫瘍
肉腫および癌
腺癌
線維肉腫
粘液肉腫
脂肪肉腫
軟骨肉腫
骨原性肉腫
脊索腫
血管肉腫
内皮肉腫
リンパ管腫
リンパ管内皮肉腫
滑膜腫
【０１７０】
中皮腫
ユーイング腫瘍
平滑筋肉腫
横紋筋肉腫
結腸癌
結腸直腸腺癌
脳に転移性の結腸腫瘍
肺癌
膵臓癌
乳癌
卵巣癌
前立腺癌
扁平上皮癌
基底細胞癌
腺癌
【０１７１】
汗腺癌
脂腺癌
乳頭状癌
乳頭状腺癌
嚢胞腺癌
髄様癌
気管支原生癌
腎細胞癌
肝癌
胆管癌
絨毛癌
精上皮腫
胎生癌
ウィルムス腫瘍
子宮頚癌
【０１７２】
子宮癌
睾丸癌
肺癌
小細胞肺癌
膀胱癌
上皮癌
神経膠芽細胞腫
神経膠腫
星状細胞腫
髄芽細胞腫
頭蓋咽頭腫
【０１７３】
上衣細胞腫
松果体腫
血管腫
聴神経腫
乏突起細胞腫
髄膜腫
黒色腫
神経芽腫
網膜芽細胞腫
【０１７４】
具体的な実施態様において、脳、乳房、結腸、前立腺、肺、または皮膚で、悪性腫瘍または異常増殖性変化（例えば、変質形成および異形成）が治療または予防される。他の具体的な実施態様において、癌、黒色腫、または白血病が、治療または予防される。
【０１７５】
5.5.1.2.  前悪性症状
CXCR-4活性に拮抗する本発明の治療薬はまた、前癌症状を治療したり、新生物または悪性腫瘍状態への進行を防止するために投与することができ、例としては、特に限定されないが、表１に示すのもがある。このような予防的または治療的使用は、新生物または癌への進行に先行することが公知のまたは疑われる症状、特に肥厚、変質形成、または特に形成異常からなる非新生物細胞増殖が起きた場合に、有効であるとされている（このような異常増殖症状の総説については、RobbinsとAngell, 1976, 基礎病理学（Basic Pathology）、 第２版、W.B. Saunders Co., フィラデルフィア、６８−７９頁を参照）。
【０１７６】
肥厚は、構造または機能の大きな異常無しに、組織または臓器中の細胞数の増加を伴う制御された型の細胞増殖である。ほんの一例として、子宮内膜増殖症はしばしば子宮内膜癌に先行する。変質形成は、１つの型の成体細胞または完全に分化した細胞がが別の型の成体細胞を置換する、制御された型の細胞増殖である。変質形成は、上皮または結合組織細胞に発生する。異型性の変質形成は、やや無秩序な変質形成性上皮を伴う。
【０１７７】
形成異常はしばしば、癌の前兆であり、主に上皮中に見られる；これは、非新生物細胞増殖の最も無秩序な型であり、個々の細胞の均一性と細胞の構造的配向がなくなる。形成異常細胞はしばしば、異常に大きく、濃く染色される核を有し、多態性を示す。形成異常は、慢性の刺激または炎症がある場合に特徴的に発生し、子宮頸部、呼吸気道、口腔、および胆嚢にしばしば見られる。
【０１７８】
あるいは、肥厚、変質形成、もしくは形成異常以外に、形質転換表現型の１つまたはそれ以上の特徴の存在、またはインビボで見られるかもしくは患者の細胞試料からインビトロで見られる悪性腫瘍表現型の存在は、CXCR-4機能を阻害する治療薬の予防的／治療的投与の好適性を示し得る。前述のように、形質転換表現型のそのような特徴には、形態変化、ルーザー下層接着（looser substratum attachment）、接触阻害の喪失、足場依存性の喪失、プロテアーゼ放出、糖輸送の増加、血清要求性の低下、胎児抗原の発現、250,000ダルトン細胞表面タンパク質の消失などがある（形質転換または悪性腫瘍表現型に関連する特徴については、前記文献の84〜90頁を参照）。
【０１７９】
具体的な実施態様において、白斑症（上皮の良性に見える肥厚または変質形成病変）またはボウエン病（in situ の癌）は、予防的介入の好適性を示す前新生物病変である。
別の実施態様において、繊維嚢胞性疾患（繊維嚢胞性肥厚、乳房変質形成、特に腺症（良性の上皮肥厚））は、予防的介入の好適性を示す。
【０１８０】
他の実施態様において、悪性腫瘍について１つまたはそれ以上の以下の素因因子を示す患者は、有効量の治療薬の投与により治療される：悪性腫瘍に関連する染色体転座（例えば、慢性骨髄性白血病のフィラデルフィア染色体、ろ胞性リンパ腫についてのｔ（14；18）など）、家族性ポリープ症またはガードナー症候群（結腸癌の前兆の可能性）、良性モノクローナル免疫グロブリン異常症（多発性骨髄腫の前兆の可能性）、およびメンデル（遺伝子的）遺伝パターンを示す癌または前癌疾患を有するヒトの第１親等（例えば、結腸の家族性ポリープ症、ガードナー症候群、遺伝外骨腫、ポリエンドクリン（polyendocrine）腺症、アミロイド産生とクロム親和性細胞腫を有する甲状腺髄様癌、ポイツ−ジェガーズ症候群、フォンレックリングハウゼンの神経繊維腫、網膜芽細胞腫、頸動脈体腫瘍、皮膚黒色癌、眼内黒色癌、色素性乾皮症、血管拡張性失調症、チェディアック−東症候群、色素欠乏症、ファンコニ悪性貧血、およびブルーム症候群；RobbinsとAngell, 1976, 基礎病理学（Basic Pathology）, 第２版、W.B. Saunders Co.、フィラデルフィア、112−113頁）など）。
【０１８１】
別の実施態様において、本発明の治療薬は、脳、乳房、結腸、前立腺、肺、または皮膚への進行を防ぐためにヒト患者に投与される。他の具体的な実施態様において、癌、黒色腫、または白血病が治療または予防される。
【０１８２】
5.5.1.3.  遺伝子治療
具体的な実施態様において、CXCR-4機能を阻害するために、遺伝子治療により、CXCR-4タンパク質またはその機能性誘導体をコードする配列に相補的なアンチセンス核酸が投与される。遺伝子治療とは、被験体への核酸の投与により行われる治療を意味する。本発明のこの実施態様において、アンチセンス核酸は、CXCR-4転写と翻訳を阻害することにより、治療作用を仲介する。
本発明に従って、当該分野で利用できる任意の遺伝子治療法が使用できる。その方法の例を以下に示す。
【０１８３】
遺伝子治療の方法の総説については、以下を参照されたい。Godlspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；WuとWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; およびMorganとAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215）。使用可能な組換えDNA技術の分野で公知の方法は、アウスベル（Ausubel）ら, 1989，分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、John Wiley and Sons、ニューヨーク；.およびKriegler、1990，遺伝子輸送と発現、実験室マニュアル（Gene Transfer and Expression, A laboratory Manual）、Stockton Press, ニューヨークを参照されたい。
【０１８４】
ある実施態様において、治療薬は、適当な宿主中でCXCR-4タンパク質またはその断片もしくはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの一部である、CXCR-4センスまたはアンチセンス核酸を含む。特に、そのような核酸は、CXCR-4コード配列に機能的に連結したプロモーターを有し、該プロモーターは、誘導性または構成性であり、随時組織特異的である。別の好適な実施態様において、核酸分子が使用され、ここでCXCR-4コード配列と任意の他の所望の配列は、ゲノムの所望の部位での相同的組換えを促進する領域が両側に位置し、こうしてCXCR-4核酸の染色体内発現を提供する（KollerとSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０１８５】
患者への核酸の供給は、直接（この場合、患者は、核酸または核酸を有するベクターに直接暴露される）かまたは間接（この場合、細胞をまずインビトロで核酸で形質転換してから, 次に患者に移植される）でもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボまたはエクスビボ遺伝子治療として公知である。
具体的な実施態様において、核酸は、インビボで直接投与され、そこで発現されてコードされる生成物を産生する。
【０１８６】
これは、当該分野で公知の多くの任意の方法で行われ、例えば、適当な核酸発現ベクターの一部として作製し、これが細胞内にあるように、例えば欠陥性または弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第4,980,286号を参照）を使用する感染により、または裸のDNAを直接注入して、または微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）を使用して、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション物質で被覆して、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセルにカプセル化して投与するか、または核に入ることが知られているペプチドに連結して投与するか、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、WuとWu、 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）（これは、受容体を特異的に発現するタイプの細胞をターゲティングするのに使用できる）を受けるリガンドに連結して投与して、行われる。別の実施態様において、別の実施態様において、核酸−リガンド複合体が形成され、リガンドは、エンドソームを破壊するためのフソゲニック（fusogenic）ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を避けることを可能にする。
【０１８７】
さらに別の実施態様において、核酸は、特異的受容体をターゲティングすることにより、細胞特異的取り込みと発現について、インビボでターゲティングされる（例えば、PCT公報WO92/06180号、1992年４月16日（Wuら）；WO92/22635号、1992年12月23日（Wilsonら）；WO/20316号、1992年11月26日（Findeisら）；WO93/14188号、1993年7月22日（Clarkeら）、WO93/20221号、1993年10月14日（Young）を参照）。あるいは、核酸は相同的組換えにより、細胞内に導入され、発現のために宿主細胞DNA内に取り込まれる（KollerとSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０１８８】
具体的な実施態様において、CXCR-4核酸を含有するウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599）。これらのレトロウイルスベクターは修飾して、ウイルスゲノムのパッケージや宿主細胞DNAへの組み込みに必要ではないレトロウイルス配列は削除されている。遺伝子治療で使用されるCXCR-4核酸は、ベクター内にクローン化され、これは患者への遺伝子の供給を促進する。
【０１８９】
レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Boesenら, 1994, Biotherapy 6:291-302に記載されており、これは、化学療法に対して幹細胞を耐性にするために、ｍｄｒｌ遺伝子を造血幹細胞胞に供給するのにレトロウイルスベクターの使用を記載している。遺伝子治療においてレトロウイルスベクターの使用を例示する他の文献には、以下がある：Clowesら, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Kiemら, 1994, Blood 83:1467-1473；SalmonsとGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；およびGenetics and Devel. 3:110-114中のGrossmandとWilson, 1993, Curr. Opin.。
【０１９０】
アデノウイルスは、遺伝子治療で使用できる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、基本的に気道上皮に遺伝子を供給するのに魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、天然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの供給システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。
【０１９１】
KozarskyとWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の総説を提示している。Boutら, 1994, Human Gene Therapy 5:3-10は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を輸送するのにアデノウイルスベクターの使用を証明した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldら, 1991, Science 252:431-434；Rosenfeldら, 1992, Cell 68:143-155；およびMastrangeliら, 1993, J. .clin. Invest. 91:225-234に記載されている。
【０１９２】
アデノ関連ウイルス（AAV）はまた、遺伝子治療での使用も提唱されている（Walshら, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300）。
遺伝子治療への他のアプローチでは、電気穿孔法、リポフェクチン、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を輸送する。通常、輸送の方法は、選択マーカーを細胞に移送する。次に細胞を選択条件下で広げて、取り上げて輸送した遺伝子を発現している細胞を単離する。次にこれらの細胞を、患者に与える。
【０１９３】
この実施態様では、核酸を細胞に導入してから, 生じる組換え細胞をインビボ投与する。このような導入は、当該分野で公知の任意の方法、例えば、特に限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターで感染、細胞融合、染色体介在遺伝子輸送、ミクロセル介在遺伝子輸送、スフェロプラスト融合などがある。
【０１９４】
細胞への外来遺伝子の導入については、当該分野で多くの技術が知られており（例えば、LoefflerとBehr、1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohenら, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92）、本発明に従って使用できるが、ただし、受容細胞の必要な成長および生理学的機能は破壊されてはならない。この技術は、細胞への核酸の安定な輸送を提供し、その結果、核酸が細胞により発現可能であり、好ましくは遺伝可能であり、その細胞子孫により発現可能である。
【０１９５】
得られる組換え細胞は、当該分野で公知の種々の方法により患者に供給することができる。好適な実施態様において、上皮細胞が、例えば皮下に注入される。別の実施態様において、組換え皮膚細胞が、皮膚移植片として患者に適用される。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは静脈内に投与される。使用が企図される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者は決定することができる。
【０１９６】
遺伝子治療を目的として核酸が導入される細胞は、任意の所望の入手できるタイプの細胞であり、特に限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単核細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝から得られるものがある。
好適な実施態様において、遺伝子治療に使用される細胞は患者自己のものである。
【０１９７】
遺伝子治療で組換え細胞が使用される実施態様では、CXCR-4核酸が細胞に導入され、その結果これは、細胞またはその子孫により発現可能であり、組換え細胞は次に、治療効果のためにインビボ投与される。具体的な実施態様において、幹細胞または前駆細胞が使用される。本発明の実施態様に従って、単離できインビトロで維持できる任意の幹細胞および／または前駆細胞は、使用できる可能性がある。このような幹細胞には、特に限定されないが、造血幹細胞（HSC）、例えば、皮膚や腸管の裏層のような上皮組織の細胞、胚心筋細胞、肝幹細胞（PCT公報WO94/08598号、1994年８月28日）、および神経幹細胞（StempleとAnderson、1992, Cell 71:973-985）がある。
【０１９８】
上皮幹細胞（ESC）またはケラチン細胞は、皮膚や腸管の裏層のような組織から公知の方法により得られる（Rheinwald、1980, Meth. Cell Bio. 21A:229）。層状の上皮組織（例えば、皮膚）では、基底板に最も近い層である基底層内の幹細胞の有糸分裂により、再生が起きる。腸管の裏層内の幹細胞は、この組織の急速な再生速度を有する。患者またはドナーの皮膚または腸管の裏層から得られるＥＳＣまたはケラチン細胞は、組織培養で増殖させることができる（Rheinwald、1980, Meth. Cell Bio. 21A:229；PttelkowとScott、1986, Mayo Clinic Proc. 61:771）。ドナーによりESCが提供されるなら, 宿主対移植片反応性の抑制方法（例えば、穏やかな免疫抑制を促進するための照射、薬剤または抗体投与）を使用することもできる。
【０１９９】
造血幹細胞（HSC）に関して、HSCの単離、増殖およびインビトロの維持を提供する任意の方法が、本発明の実施態様で使用できる。これを行う方法には、（ａ）将来の宿主またはドナーから単離した骨髄細胞からのHSC培養物の単離と樹立、または（ｂ）あらかじめ樹立した長期HSC培養物の使用（これは同種でも異種でもよい）がある。非自己HSCは好ましくは、将来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法とともに使用される。本発明の特定の実施態様において、ヒト骨髄細胞は、針吸引法により後腸骨稜から得られる（例えば、Kodoら, 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384）。
【０２００】
本発明の好適な実施態様において、HSCは、実質的に純粋な型で高度に濃縮することができる。この濃縮は、長期培養前、その最中、または後に行うことができ、当該分野で公知の任意の方法によって行われる。骨髄細胞の長期培養物は、例えば修飾Dexter細胞培養法（Dexterら, 1977, J. Cell Physiol. 91:335）またはWitlock-Witte培養法（WitlockとWitte、1982、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612）を使用して、樹立かつ維持できる。
【０２０１】
具体的な実施態様において、遺伝子治療目的に導入される核酸は、コード領域に機能的に連結した誘導性プロモーターを含有し、その結果核酸の発現は、適切な転写のインデューサーの有無を調節することにより調節可能である。
CXCR-4タンパク質またはその機能性誘導体をコードするヌクレオチドを供給するのに使用するように適合させることができる追加の方法を、セクション5.8.2.2.2に記載する。
【０２０２】
5.5.2.  高増殖性および増殖不全性障害の治療と予防
細胞増殖（成長）の増加が関与するかまたは細胞増殖が本来は好ましくない疾患と障害は、CXCR-4機能に拮抗（阻害）する治療薬の投与により治療または予防される。使用可能な治療薬には、特に限定されないが、抗CXCR-4抗体（およびその結合領域を含有するその断片と誘導体）、CXCR-4アンチセンス核酸、および相同的組換え（例えば、Capecchi、1989, Science 244:1288-1292）により内因性CXCR-4機能を「ノックアウト」するために使用される機能不全性（例えば、CXCR-4コード配列内の異種（非CXCR-4配列）挿入のために）であるCXCR-4核酸がある。
【０２０３】
本発明の具体的な実施態様において、CXCR-4配列が異なる遺伝子配列の両側に（５’と３’の両方に）位置するCXCR-4遺伝子の一部を含有する核酸が、CXCR-4アンタゴニストとして、相同的組換えによりCXCR-4不活性化を促進するのに使用される（また、KollerとSmithies、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstraら, 1989, Nature 342:435-438を参照）。
【０２０４】
CXCR-4機能を阻害する他の治療薬は、既知の便利なインビトロ測定法（例えば、他のタンパク質へおCXCR-4の結合を阻害、または任意の既知のCXCR-4機能を阻害する能力に基づく（好ましくはインビトロまたは細胞培養で測定される））を使用して同定することができるが、キイロショウジョウバエ（Drosophilap）または他の種の遺伝的測定法を使用してもよい。好ましくは、特定の治療薬の効果を測定するために、およびその投与が患部組織の治療に有効かどうかを決定するために、適当なインビトロまたはインビボ測定法が使用される。
【０２０５】
具体的な実施態様において、CXCR-4機能を偽する治療薬は：（１）CXCR-4タンパク質または機能のレベル上昇（正常または所望のレベルに対して）が関与する疾患または障害（例えばCXCR-4タンパク質が過剰な活性を有するかまたは過剰に発現される患者）；または（２）インビトロ（またはインビボ）測定法（後述）がCXCR-4アンタゴニスト投与の有用性を示す、疾患または障害に、治療的（予防的を含む）に投与される。CXCR-4タンパク質または機能のレベルの上昇は、例えばタンパク質および／またはRNAを定量して、患者の組織試料を得て（例えば、生検組織から）、そしてインビトロでRNAまたはタンパク質レベル、発現されたCXCR-4 RNAまたはタンパク質の構造および／または活性を測定することにより、容易に検出することができる。
【０２０６】
当該分野で標準的な多くの方法が使用でき、例えば、特に限定されないが、CXCR-4タンパク質を検出および／または視覚化するための免疫測定法（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降の次にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学など）、および／またはCXCR-4 mRNAを検出および／または視覚化（例えば、ノーザン測定法、ドットブロット、 in situ ハイブリダイゼーションなど）することによりCXCR-4発現を検出するためのハイブリダイゼーション測定法などがある。
【０２０７】
他の実施態様において、化学的突然変異誘発、または挿入的に不活性化したCXCR-4遺伝子との相同的組換え（Capecchi、1989, Science 244:1288-1292および後述のセクション5.14を参照）を実施して、細胞増殖を低下させるために、内因性CXCR-4機能を低下または破壊することができる。CXCR-4機能を阻害するのに使用できる適当な方法、投与方法および組成物は、前記セクション5.8.2〜5.8.2.1.2に記載されている。
【０２０８】
本発明の実施態様において、CXCR-4活性を阻害する治療薬は、高増殖性または良性増殖不全性障害を治療または予防するのに使用される。具体的な実施態様は、肝硬変（損傷が肝臓の再生プロセスを超えた状態）の治療または予防、ケロイド（過形成性瘢痕）形成（瘢痕性が正常な再生を妨害する皮膚の変形）、乾癬（皮膚の過剰増殖と正しい細胞運命の決定の遅れを特徴とする、一般的な皮膚の症状）、良性腫瘍、繊維芽細胞症状、および組織肥厚（例えば、前立腺肥大）の治療に関する。
【０２０９】
5.5.2.1.  CXCR-4発現のアンチセンス制御
具体的な実施態様において、CXCR-4機能は、CXCR-4アンチセンス核酸の使用により阻害される。本発明は、CXCR-4またはその一部をコードする遺伝子またはcDNAに対してアンチセンスである少なくとも６つのヌクレオチドの、治療的または予防的使用を提供する。本明細書においてCXCR-4「アンチセンス」核酸とは、一部の配列相補性により、CXCR-4 RNAの一部（好ましくはmRNA）にハイブリダイズすることができる核酸を意味する。
【０２１０】
アンチセンス核酸は、CXCR-4 mRNAのコード配列および／または非コード配列に対して相補的でもよい。そのようなアンチセンス核酸は、CXCR-4機能を阻害する治療薬として有用であり、セクション5.5.2およびそのサブセクションで前述した障害の治療または予防に使用することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、２本鎖または１本鎖のオリゴヌクレオチド、RNAまたはDNAまたはこれらの修飾物もしくは誘導体でもよく、これは細胞に直接投与されるか、または外因性の導入された配列の転写により細胞内で産生することができる。
【０２１１】
具体的な実施態様において、本発明により提供されるCXCR-4アンチセンス核酸は、腫瘍または他の型の異常な細胞増殖を予防するのに使用することができる。
本発明はさらに、有効量の本発明のCXCR-4アンチセンス核酸を、後述の薬剤学的に許容される担体中に含む医薬組成物を提供する。
別の実施態様において、本発明は、本発明のCXCR-4アンチセンス核酸を含む有効量の組成物を細胞に提供することを特徴とする、原核生物または真核生物細胞中のCXCR-4アンチセンス核酸の発現を阻害する方法に関する。
CXCR-4アンチセンス核酸およびその使用を、以下に詳細に記載する。
【０２１２】
5.5.2.1.1.  CXCR-4アンチセンス核酸
CXCR-4アンチセンス核酸は、少なくとも６つの核酸であり、好ましくはオリゴヌクレオチドである（６〜約50の範囲のオリゴヌクレオチド）。具体的な面において、このオリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、または少なくとも200ヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNA、またはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾物でもよく、１本鎖または２本鎖でもよい。このオリゴヌクレオチドは、塩基残基、糖残基、またはリン酸骨格で修飾することができる。
【０２１３】
このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、または細胞膜（例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6553-6556；Lemaitreら, 1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652；PCT公報番号WO88/09810、1988年12月15日公表）または血液脳関門（例えば、PCT公報番号WO89/10134、1988年４月25日公表）の通過を促進する物質、ハイブリダイゼーション誘発性切断物質（例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6:958-976）または介在（intercalating）物質（例えば、Zon、1988, Pharm. Res. 5:539-549）などの他の付属基を含有してもよい。
本発明の好適な面において、CXCR-4アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは１本鎖DNAで提供される。このオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の置換基を有する構造上の任意の位置で修飾してもよい。
【０２１４】
CXCR-4アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下から選択される少なくとも１つの修飾塩基残基（特に限定されない）を含有してもよい：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、N6−アデニン、
【０２１５】
７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシルー５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−ウラシル、２−ウラシル、４−ウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3)w、および2,6−ジアミノプリン。
【０２１６】
別の実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソースよりなる群から選択される（しかし、特に限定されない）少なくとも１つの修飾糖残基を含む。
さらに別の実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホアミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホジエステル、およびホルムアセアール、またはこれらの類似体よりなる群から選択される、少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む。
【０２１７】
さらに別の実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、α−アノマー性オリゴヌクレオチドである。α−アノマー性オリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと特異的２本鎖ハイブリッドを形成し、ここで通常β単位とは反対に、鎖は互いに反対に平行に進む（Gautierら, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。
このオリゴヌクレオチドは、他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送物質、ハイブリダイゼーション誘発切断物質など、に結合してもよい。
【０２１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的方法、例えば自動ＤＮＡ合成機（例えば、Biosearch、Applied Biosystemsなどから市販されているもの）を使用して、合成してもよい。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（1988, Nucl. Acids Res. 16:3209）により、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、調節多孔性ガラスポリマー支持体（Sarinら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448-7451）などにより調製することができる。
【０２１９】
具体的な実施態様において、CXCR-4アンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒性RNA、またはリボザイムを含む（例えば、PCT国際公法WO90/11364号、1990年10月４日公表；Sarverら, 1990, Science 247:1222-1225）。別の実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルリボヌクレオチド（Inoueら, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148）、またはキメラRNA-DNA類似体（Inoueら, 1987, FEBS Lett. 215:327-330）である。
【０２２０】
別の実施態様において、本発明のCXCR-4アンチセンス核酸は、外因性配列から転写により細胞内で産生される。例えばベクターがインビトロで導入され、その結果細胞に摂取され、その細胞内でベクターまたはその一部は転写され、本発明のアンチセンス核酸（RNA）を産生する。このようなベクターは、CXCR-4アンチセンス核酸をコードする配列を含有するであろう。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAを産生することができる限り、エピトープでもまたは染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野の標準的な組換えDNA技術により作製される。
【０２２１】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、または哺乳動物細胞での複製と発現に使用される当該分野で公知の他のものでもよい。CXCR-4アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞で作用することが当該分野で公知である任意のプロモーターにより行われてよい。そのようなプロモーターは、誘導性でも構成性でもよい。そのようなプロモーターは、以下を含むが、特に限定されない：SV40早期プロモーター領域（BernoistとChambon, 1991, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復配列中に含有されるプロモーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）など。
【０２２２】
本発明のアンチセンス核酸は、CXCR-4遺伝子、好ましくはヒトCXCR-4遺伝子のRNA転写体の少なくとも一部分に相補的な配列を含む。しかし、絶対的な相補性は（好適ではあるが）必要ではない。本明細書において「RNAの少なくとも一部分に相補的な」配列とは、RNAとハイブリダイズして安定な２本鎖を形成することができる充分な相補性を有する配列を意味し、２本鎖CXCR-4アンチセンス核酸の場合は、２本鎖DNAの１本鎖を試験するか、または３本鎖形成を試験してもよい。
【０２２３】
ハイブリダイズする能力は、相補性の程度とアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、含有するCXCR-4 RNAとの塩基のミスマッチが多くなるが、安定な２本鎖（または、場合により３本鎖）を形成する。当業者は、標準的方法を使用して、ハイブリダイズした複合体の融点を測定することにより、ミスマッチの許容程度を確認することができる。
【０２２４】
5.5.2.1.2.  CXCR-4アンチセンス核酸の治療的使用
CXCR-4アンチセンス核酸は、CXCR-4を発現（好ましくは過剰発現）するタイプの細胞の障害を治療（または予防）するのに使用することができる。具体的な実施態様において、そのような障害は高増殖性障害（例えば、腫瘍形成）である。好適な実施態様において、１本鎖DNAアンチセンスCXCR-4オリゴヌクレオチドが使用される。
【０２２５】
CXCR-4 RNAを発現または過剰発現するタイプの細胞は、当該分野で公知の種々の方法により同定することができる。そのような方法には、特に限定されないが、CXCR-4特異的核酸とのハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、 in situ ハイブリダイゼーション）、細胞のRNAがインビトロでCXCR-4に翻訳される能力を観察、免疫測定法などがある。好適な面において、患者からの１次組織は、処理前に、例えば免疫細胞化学または in situ ハイブリダイゼーションでCXCR-4発現について測定することができる。
【０２２６】
有効量のCXCR-4アンチセンス核酸を薬剤学的に許容される担体中に含有する本発明の医薬組成物（セクション5.10を参照）は、CXCR-4 RNAまたはタンパク質を発現または過剰発現するタイプである、疾患または障害を有する患者に投与することができる。
特定の障害または症状の治療に有効なCXCR-4アンチセンス核酸の量は、その障害または症状の性質に依存し、標準の臨床的方法により決定することができる。可能な場合は、インビトロで処理し次に有用な動物モデル系で腫瘍タイプのアンチセンス細胞障害性を測定してから, ヒトで試験および使用をすることが好ましい。
【０２２７】
具体的な実施態様において、CXCR-4アンチセンス核酸を含む医薬組成物は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを介して投与される。本発明の種々の実施態様において、CXCR-4アンチセンス核酸の持続放出を達成するために、そのような組成物を使用することが有用であろう。具体的な実施態様において、特異的な同定可能な腫瘍抗原に対する抗体を介して、標的とされたリポソームを使用することが好ましいかも知れない（Leionetteら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2448-2451；Renneisenら, 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342）。
CXCR-4アンチセンス核酸の供給に使用できるように適合できる追加の方法は、セクション5.9.1.4に記載されている。
【０２２８】
5.6.  治療的または予防的有用性の証明
本発明の治療薬は、治療的または予防的有用性について好ましくはインビトロで試験され、次にインビボで試験されてから, ヒトで使用される。
例えば、特定の治療薬の投与が有効であるかどうかを決定するために使用されるインビトロ測定法には、インビトロ細胞培養測定法があり、ここでは、患者組織試料を培養して増殖させ、治療薬に暴露または投与し、組織試料に対するそのような治療薬の効果を観察する。ある実施態様において、患者が悪性腫瘍を有する場合、そのような悪性腫瘍の細胞の試料をプレートに塗布し、培養して増殖させ、次に細胞を治療薬に暴露する。
【０２２９】
悪性腫瘍細胞の生存または増殖を阻害する治療薬は、インビボでの治療的使用のために選択される。当該分野で標準的な多くの測定法を使用して、そのような生存および／または増殖を評価することができる；例えば、細胞増殖は、3Ｈチミジン取り込みの測定、直接細胞数計測、プロト癌遺伝子（例えば、fos、myc）のような既知の遺伝子または細胞サイクルマイクロカプセルの転写活性の変化の検出により測定することができ；細胞生存活性は、トリパンブルー染色により評価することができ、分化は、形態変化などを視覚的に評価することができる。
【０２３０】
別の実施態様において、高増殖性または低増殖性障害を有するかまたは有することが疑われる患者の組織からの細胞試料に対して、所望の効果、それぞれ細胞増殖の阻害または促進を示す治療薬は、使用に適するとされる。そのような高増殖性または低増殖性障害には、特に限定されないが、本明細書に記載のものを含む。
別の具体的な実施態様において、患者の細胞の増殖をインビトロで促進する治療薬は、細胞傷害または変性障害の治療に使用できるとされる。
種々の具体的な実施態様において、患者の障害に関与するタイプの細胞の代表的な細胞でインビトロ測定法を行って、治療薬がそのようなタイプの細胞に所望の効果を有するかどうかを決定することができる。
【０２３１】
別の実施態様において、前新生物状態であることが疑われる患者の組織試料の細胞を、同様に塗布してインビトロで増殖させ、治療薬に暴露する。より正常な細胞表現型（すなわち、前新生物状態、新生物状態、悪性腫瘍状態、または形質転換表現型をあまり示さない）を引き起こす治療薬を、治療用途に選択する。当該分野で標準的な多くの測定法を使用して、前新生物状態、新生物状態、または形質転換もしくは悪性腫瘍表現型が存在するかどうかを評価することができる。
【０２３２】
例えば、形質転換表現型に関連した特徴（インビボの腫瘍形成能に関連するインビトロの特徴のセット）には、より丸い細胞形態、ルーザー下層接着（looser substratum attachment）、接触阻害の喪失、足場依存性の喪失、プラスミノゲンアクチベーターのようなプロテアーゼ放出、糖輸送の増加、血清要求性の低下、胎児抗原の発現、250,000ダルトン細胞表面タンパク質の消失などがある（Luriaら, 1978, 一般ウイルス学（General Virology）、 第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley & Sons）、 ニューヨーク、436-446頁）。
【０２３３】
他の具体的な実施態様において、治療すべき特定の患者からの細胞試料ではなく細胞株を使用して、前述のインビトロ測定法を実施することができ、ここで細胞株は、治療または予防が望ましい悪性腫瘍、新生物または前新生物障害から得られかまたはこれに関連する特徴を示すか、または本発明に従って、効果が望ましいタイプの細胞から得られる。
治療に使用される化合物は、適当な動物モデル系（特に限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど）で試験した後、ヒトで試験することができる。インビボ試験については、ヒトに投与する前に、当該分野で公知の任意の動物モデル系が使用される。
【０２３４】
5.7.  治療的／予防的投与および組成物
本発明は、有効量の本発明の治療薬を被験体に投与することによる治療（および予防）法を提供する。好適な面において、治療薬は実質的に精製されている。被験体は好ましくは動物であり、特に限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含み、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。具体的な実施態様において、非ヒト哺乳動物が被験体である。
治療薬が核酸を含む時使用される投与処方と方法は、前述した。投与の追加の適当な処方と経路は、下記から選択される。
【０２３５】
種々の供給システムが公知であり、本発明の治療薬を投与するのに使用され、例えば、リポソーム中にカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、治療薬を発現することができる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、WuとWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療薬核酸の作製などがある。導入法には、特に限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路がある。化合物は、任意の便利な経路で投与され、例えば、注入またはボラス注射、上皮または皮膚粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および小腸粘膜など）があり、他の生物活性物質とともに投与される。投与は全身性でも局所的でもよい。
【０２３６】
さらに、適当な経路（例えば、特に限定されないが、脳室内注入と髄腔内注入）により、本発明の治療薬を中枢神経系中に導入することが好ましい。リザバー（例えば、オマヤレザバー）に取り付けた脳室内カテーテルにより、脳室内注入が促進される。中枢神経系の腫瘍に治療薬を供給することが目的の場合、脳腫瘍への化学療法剤の供給を増強する物質（例えば、透過性を制御する内皮細胞上の特異的受容体を活性化するアゴニスト、例えばブラジキニンアゴニスト（例えば、Elliottら, 1996, Cancer Research 56:3998-4005 を参照）、腫瘍血管形成因子（CserrとKnopf, 1992, Immunol Today 112:507-512）など）を、投与の処方や方法で使用することができる。
【０２３７】
具体的な実施態様において、腫瘍の免疫療法のために、髄液への注入、および／またはオマヤレザバーを使用する方法を使用して、本発明の治療薬（例えば、抗CXCR-4抗体、例えば２特異的抗CXCR-4抗体）を直接中枢神経系に導入することができる。
さらに別の具体的な実施態様において、非脳腫瘍の免疫療法において、治療薬として抗CXCR-4抗体（２特異的抗CXCR-4抗体）を使用し、受容者の静脈内に注入することができる。
【０２３８】
免疫細胞（例えば、樹状細胞または細胞障害性Ｔ細胞）は、血液脳関門を越えることができ、特に腫瘍血管形成因子（CserrとKnopf, 1992, Immunol. Today 112:507-512）の存在下で、脳組織に近づくことができる。好適な実施態様において、CXCR-4タンパク質、その類似体または誘導体に接触させた活性化樹状細胞（受容者とHLAが一致している）（総説については、Tjoaら, 1996, Prostate 28:65-69 を参照）が、血液脳関門を越えることを可能にする条件下（例えば腫瘍血管形成因子（CserrとKnopf, 1992, Immunol. Today 112:507-512）の存在下）で、受容者に注入される。
【０２３９】
別の好適な実施態様において、CXCR-4タンパク質、その類似体または誘導体にエクスビボ（すなわち、インビトロ）で接触させた活性化細胞障害性Ｔ細胞（受容者とＨＬＡが一致している）（総説については、Tjoaら, 1996, Prostate 28:65-69）が、血液脳関門を越えることを可能にする条件下で、受容者に注入される。
【０２４０】
さらに別の具体的な実施態様において、本発明の治療薬（例えば、CXCR-4タンパク質、その類似体または誘導体に接触させた活性化樹状細胞、またはCXCR-4タンパク質、その類似体または誘導体に接触させた活性化樹状細胞にエクスビボで接触させた活性化細胞障害性Ｔ細胞）が、非脳腫瘍の治療のために投与される。
治療薬の肺投与もまた使用することができる（例えば、吸入器またはネブライザーと、エアゾル化物質との製剤を使用して）。
【０２４１】
具体的な実施態様において、本発明の治療薬を、治療の必要な部位に局所的に投与することが好ましい；これは例えば、特に限定されないが、手術中の局所的注入、局所的適用、例えば、手術後の創傷の包帯とともに、注射で、カテーテルで、坐剤で、またはインプラント（該インプラントは、多孔性または非多孔性で、ゼラチン性物質、例えば、シアラスティック（sialastic）膜、または繊維である）を用いて行われる。ある実施態様において、投与は、悪性腫瘍、または新生物もしくは前新生物組織の部位（または以前の部位）に直接注射される。
【０２４２】
別の実施態様において、治療薬は、小胞特にリポソームで供給することができる（Langer, 1990 Science 249:1527-1533；Treatら, 感染症と癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer）中、Lopez-BeresteinとFidler（編）、Liss、ニューヨーク、353-365頁（1989）；Lopez-BeresteinとFidler、同上、317-327頁；総説については、同上を参照）。
【０２４３】
さらに別の実施態様において、治療薬は、制御放出システムで供給することができる。ある実施態様では、ポンプが使用される（Langer、前述；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)；Buchwaldら, Surgery 88:507 (1980)；Saudekら, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)を参照）。別の実施態様において、ポリマー物質を使用することができる（制御放出の医学的応用（Medical Applications of Controlled Release）、LangerとWise（編）、CRC Pres., Boca Raton, フロリダ（1974）；制御薬剤バイオアベイラビリティ、ドラッグプロダクトデザインと性能（Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）、SmolenとBall（編），Wiley, ニューヨーク（1984）；RangerとPeppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；またLevyら, 1985 Science 228:190；Duringら, 1989 Ann. Neurol. 25:351；Howardら, 1989 J. Neurosurg. 71:105を参照）。
【０２４４】
さらに別の実施態様において、制御放出システムが、治療標的（すなわち、脳）の近くに置かれ、従って全身性投与のほんの一部の量が必要なだけである（例えば、Goodson, 制御放出の医学的応用（Medical Applications of Controlled Release）、前述、第２巻、115-138頁（1984）を参照）。
他の制御放出システムは、Langerにより総説中で説明されている（Science 249:1527-1533 (1990)）。
【０２４５】
治療薬がタンパク質治療薬をコードする核酸である具体的な実施態様において、核酸は、レトロウイルスベクター（米国特許第4,980,286号を参照）を使用して、または直接注入して、または微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）を使用して、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション物質で被覆して投与するか、または核に入る（例えば、Joliotら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:184-1868）ことが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して投与して、核酸が細胞内にあるようにするために、適当な核酸発現ベクターの一部として作製し、これを投与することにより、この核酸はインビボで投与して、そのコードしたタンパク質の発現を促進することができる。あるいは、相同的組換えにより、核酸治療薬を細胞内に導入し、発現のために宿主細胞内に取り込むことができる。
【０２４６】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、治療上有効量の治療薬と、薬剤学的に許容される担体とを含んでなる。具体的な実施態様において、用語「薬剤学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関により認可されていること、または米国薬局方、または動物（特に、ヒト）で使用について他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。用語「担体」とは、治療薬が一緒に投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は、無菌の液体、例えば、水や油（石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など）でもよい。
【０２４７】
医薬組成物が静脈内投与される時は、水が好適な担体である。食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体、特に注射溶液として使用することができる。適当な薬剤学的賦形剤には、デンプン、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。所望であれば、組成物はまた、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含有してもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、除放性製剤などの型でもよい。
【０２４８】
組成物は、伝統的な結合剤および担体（例えば、トリグリリド）とともに坐剤として処方することができる。経口製剤は、標準的担体、例えば薬剤学的グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含有してもよい。適当な薬剤学的担体は、E.W. Martinの「レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に記載されている。そのような組成物は、患者に正しく投与するために、治療上有効量の治療薬を、好ましくは純粋な型で、適当量の担体とともに含有するであろう。この製剤は、投与の方式に適するべきである。
【０２４９】
好適な実施態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として、ルーチンの方法に従って、処方される。典型的には、静脈内投与の組成物は、無菌等張水性緩衝液中の液剤である。必要であれば、組成物はまた、可溶化剤および局所的麻酔剤（例えば、注射部位での疼痛を緩和するためのリドカイン）を含有してもよい。一般に、成分は、別々にまたは一緒に、単位投与型で、例えば凍結乾燥粉末としてまたは無水の濃縮物として、密封容器（例えば、アンプルまたはサッシェ）に活性成分の量を記載して、供給される。組成物が注入により投与される時、これは無菌薬剤学的グレードの水または食塩水を含有する注入瓶で与えられる。組成物が注射により投与される時、注射用無菌水または食塩水は、投与前に成分が混合されるように、提供される。
【０２５０】
本発明の治療薬は、中性または塩の型で処方されてもよい。薬剤学的に許容される塩には、遊離のアミノ基とで形成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから得られるもの、および遊離のカルボキシル基とで形成されるもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、第２鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから得られるものがある。
【０２５１】
特定の障害または症状の治療に有効な本発明の治療薬の量は、その障害または症状の性質に依存し、標準の臨床的方法により決定される。さらに、最適投与範囲を決定するのを助けるために、インビトロ測定法が随時実施される。製剤で使用される正確な投与量はまた、投与経路と疾患または障害の重症度に依存し、医師の判断と患者の状況に従って決定すべきである。しかし静脈内投与の適当な投与範囲は、通常約20〜500μgの活性成分／kg体重である。鼻内投与の適当な投与範囲は、一般に約0.01pg/kg体重〜１mg/kg体重の範囲である。有効投与量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから得られた用量応答曲線から外挿される。
【０２５２】
坐剤は一般に活性成分を0.5重量％〜10重量％の範囲で含有し、経口製剤は好ましくは10重量％〜95重量％の範囲で含有する。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つまたはそれ以上の成分が充填された１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。そのような容器と随時一緒に、医薬品または生物製剤の製造、使用または販売を監督する政府機関により処方された形の通知（この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売を監督する政府機関による認可を反映する）を含んでもよい。
【０２５３】
5.7.1.  低増殖性障害の治療と予防
細胞増殖の低下が関与するかまたは治療または予防のために細胞増殖が好ましい疾患と障害、およびCXCR-4機能を促進することにより治療または予防することができる疾患と障害には、特に限定されないが、変性障害、増殖不全、低増殖性疾患、肉体的障害、病変および創傷がある（例えば、創傷治癒を促進するために、または変性、病変または障害組織の再生を促進するために）。具体的な実施態様において、神経系障害が治療される。別の具体的な実施態様において、神経系ではない障害が治療される。
【０２５４】
本発明に従って治療される病変には、特に限定されないが以下の病変を含む：
（ｉ）外傷性病変、例えば、肉体的障害または手術に引き起こされた病変；
（ii）虚血性病変（ここでは、酸素の欠如が、細胞傷害または死滅を招く）、例えば、心筋もしくは脳梗塞または虚血、脊髄梗塞または虚血；
（iii）悪性腫瘍病変（ここでは細胞は、悪性腫瘍組織により破壊または傷害される）；
（iv）感染性病変（ここでは、感染の結果として組織は破壊または傷害され、例えば、膿瘍により、ヒト免疫不全症ウイルス、ヘルペスゾスター、または単純ヘルペスウイルス、またはライム病、結核、梅毒による感染に関連して）；
【０２５５】
（ｖ）変性病変（ここでは、組織は、例えば特に限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、または筋萎縮性側策硬化症に関連した神経系変性を含む変性プロセスの結果として、破壊または傷害される）；
（vi）栄養疾患または障害に関連した病変（ここでは組織は、例えば、特に限定されないが、ビタミンB2欠損、葉酸欠損、ヴェルニッケ病、タバコアルコール弱視、マルキアファーバ−ビニャーミ病（脳梁の１次変性）、およびアルコール性小脳変性を含む、栄養障害または代謝の障害により、組織は破壊または傷害される）；
【０２５６】
（vii）特に限定されないが、糖尿病または全身性エリテマトーデスを含む全身性疾患に関連した病変；
（viii）アルコール、鉛、または他の毒素を含む毒性物質により引き起こされる病変；および
（ix）神経系の脱髄病変（ここでは、例えば、特に限定されないが多発性硬化症、ヒト免疫不全症ウイルス関連ミエロパシー、種々の病因の脊髄横断障害、進行性多病巣性白質脳症、および中枢脳橋ミエリン溶解を含む脱髄疾患により、神経系の一部が破壊または傷害される）。
【０２５７】
本発明により患者（ヒトおよび非ヒト哺乳動物患者を含む）で治療される神経系病変には、特に限定されないが、中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系の病変を含む。
疾患の治療のための本発明のこの実施態様で有用な治療薬は、細胞の生存または分化を促進する生物活性について試験することにより、選択される（セクション5.9も参照）。
【０２５８】
例えば、神経系の治療に関する具体的な実施態様において、以下の作用の１つを誘発する治療薬は、本発明で有用となり得る：
（ｉ）培養またはインビボでのニューロンの新芽形成の増加；
（ii）培養またはインビボでのニューロン関連分子（例えば、運動ニューロンに関して、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリントランスフェラーゼ）の産生の増加；
（iii）インビボでのニューロン機能不全の症状の低下。
【０２５９】
このような作用は、当該分野で公知の任意の方法により測定される。好適な非限定例において、新芽形成の増加は、Pestronkら（1980, Exp. Neurol. 70:65-82）またはBrownら（1981, Ann. Rev. Neurosci. 4:17-42）中に記載の方法により検出され；ニューロン関連分子の産生増加は、測定される分子に依存して、バイオアッセイ、酵素的測定法、抗体結合、ノーザンブロット測定法などにより測定される。
【０２６０】
5.8.  増殖の上昇を促進するCXCR-4機能の追加の使用
CXCR-4機能の促進（例えば、前述のようにCXCR-4機能を促進する化合物の投与による）は、治療的または予防的応用有用性を有する（ただし、これらに限定されない）。例えば、CXCR-4機能は、動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、シカ、ニワトリ）および植物（特に食用植物、例えばトマト、メロン、レタス、ニジン、ジャガイモ、および他の野菜）、特に食物または材料になるものの成長を上昇させるために促進することができる。CXCR-4核酸が組織特異的プロモーターの制御下にある実施態様において、本発明は、所望の場合（例えば、フルーツまたは筋肉）、成長を上昇させるために植物または動物で使用することができる。
【０２６１】
例えば、温度感受性プロモーターの制御下にあるCXCR-4核酸を、植物または動物に投与して、植物または動物の所望の部分（または全体）に熱をかけてCXCR-4核酸産生を誘導し、CXCR-4発現を増加させ、細胞増殖を増加させることができる。植物を組み換え体にする方法は、当該分野で公知であり、使用可能である。植物形質転換法（例えば、CXCR-4アンチセンス核酸を用いる形質転換）については、Valvekensら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5536-5540 を参照されたい。植物中の標的遺伝子不活性化の方法（例えば、CXCR-4の不活性化）については、MiaoとLam, 1995, the Plant J. 7:359-365を参照されたい。
【０２６２】
CXCR-4機能の形成は、インビトロでの用途、例えばインビトロで細胞を拡張（特に限定されないが、幹細胞、前駆細胞、筋肉細胞、繊維芽細胞、肝細胞など）、例えばインビトロで細胞／組織を増殖させた後、患者（好ましくは、細胞が得られた患者）に投与するなどの用途を有する。
【０２６３】
5.9.  CXCR-4アゴニストとアンタゴニストのスクリーニング
CXCR-4核酸、タンパク質、および誘導体はまた、CXCR-4核酸、タンパク質、および誘導体に特異的に結合する分子を検出するスクリーニング測定法に有用であり、CXCR-4のアゴニストまたはアンタゴニストとして、特に細胞増殖に影響を与える分子としての可能性を有する。好適な実施態様において、そのような測定法は、抗癌剤または薬剤開発のリード化合物として有用な可能性のある分子をスクリーニングするために行われる。従って本発明は、CXCR-4核酸、タンパク質、および誘導体に特異的に結合する分子を検出するための測定法を提供する。
【０２６４】
例えば、CXCR-4核酸を発現する組換え細胞を使用して、これらの測定法中でCXCR-4タンパク質を組換え産生させ、CXCR-4タンパク質に結合する分子についてスクリーニングすることができる。分子（例えば、CXCR-4の推定結合パートナー）は、結合を起こしやすい条件下でCXCR-4タンパク質（またはその断片）と接触させ、次にCXCR-4タンパク質に特異的に結合する分子を同定する。同様の方法を使用して、CXCR-4誘導体または核酸に結合する分子をスクリーニングことができる。前記を実施するのに使用できる方法は、当該分野で公知である。
【０２６５】
例えば、CXCR-4に特異的に結合する分子について、多様性ライブラリー（例えばランダムまたは組合せペプチドまたは非ペプチドライブラリー）をスクリーニングすることができる。当該分野で公知の多くのライブラリーが使用可能であり、例えば化学合成したライブラリー、組み換え体（例えば、ファージ表示ライブラリー）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリーがある。
【０２６６】
化学合成ライブラリーの例は、Fodorら, 1991, Science 251:767-773；Houghtenら, 1991, Nature 354:84-86；Lamら., 1991, Nature 354:82-84；Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710；Gallopら, 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251；Ohlmeyerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:0922-10926；Erbら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426；Houghtenら, 1992, Biotechniques 13:412；Jayawickremeら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618；Salmonら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712；PCT公報番号WO93/20242；およびBrennerとLerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 に記載されている。
【０２６７】
ファージ表示ライブラリーの例は、ScottとSmith, 1990, Science 249:386-390；Devlinら, 1990, Science 249:404-406；Christian, R.B.ら, 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718；Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157；Kayら, 1993, Gene 128:59-65；およびPCT公報番号WO94/18318（1994年８月18日）に記載されている。
インビトロ翻訳ベースのライブラリーには、特に限定されないが、PCT公報WO91/05058（1991年４月18日）およびMattheakesら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 に記載のものがある。
【０２６８】
非ペプチドライブラリーの例には、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Buninら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712）は使用に適合させることができる。ペプトイドライブラリー（Simonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371）もまた使用できる。化学的に形質転換した組合せライブラリーを作成するためにペプチド中のアミド官能基がパーメチル化されている、使用可能なライブラリーの別の例は、Ostreshら（1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142)に記載されている。
【０２６９】
ライブラリーのスクリーニングは、種々の公知の任意の方法により行われる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の文献に記載されている：ParmleyとSmith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218；ScottとSmith, 1990, Science 249:386-390；Fowlkesら, 1992；BioTechniques 13:422-427；Oldenburgら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397；Yuら, 1994, Cell 76:933-945；Staudtら, 1988, Science 241:577-580；Bockら, 1992, Nature 355:564-566；Tuerkら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992；Ellingtonら, 1992, Nature 355:850-852；米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号、および米国特許第5,198,346号（すべてLadnerら）；RebarとPabo, 1993, Science 263:671-673；およびPCT公報番号WO94/18318。
【０２７０】
具体的な実施態様において、スクリーニングは、ライブラリーメンバーを、固相に固定化するとCXCR-4タンパク質（または核酸または誘導体）と接触させ、タンパク質（または核酸または誘導体）に結合するライブラリーメンバーを採取することにより、行われる。このようなスクリーニング法の例は、「パニング」と呼ばれる技術はが ParmleyとSmith, 1988, Gene 73:305-318；Fowlkesら, 1992, BioTechniques 13:422-427；PCT公報番号WO94/18318；および前記文献に記載されている。
【０２７１】
別の実施態様において、酵母中で相互作用するタンパク質を選択するための２ハイブリッド系（FieldsとSong, 1989, Nature 340:245-246；Chienら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582）を使用して、CXCR-4タンパク質または誘導体に特異的に結合する分子を同定することができる。
【０２７２】
5.10.  動物モデル
本発明はまた、動物モデルを提供する。ある実施態様において、細胞の低増殖性が関与する疾患と障害（例えば、セクション5.8.1に記載のように）のための動物モデルが提供される。そのような動物はまず、その染色体中のCXCR-4遺伝子と、生物学的に不活性化（好ましくは、異種配列、例えば抗生物質耐性遺伝子の挿入により）した外因性「CXCR-4遺伝子との間の相同的組換えを促進して、作成することができる。
【０２７３】
好適な面において、この相同的組換えは、胚由来の幹（ES）細胞を、相同的組換えが起きるように、挿入的に不活性化したCXCR-4遺伝子を含有するベクターで形質転換し、次にＥＳ細胞を胞胚に注入し、胞胚を養母動物に移植し、次にCXCR-4遺伝子が不活性化（Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292）されているキメラ動物（「ノックアウト動物」）を出産させて行われる。キメラ動物を飼育して、追加のノックアウト動物を産生することができる。このような動物は、マウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシなどでもよく、好ましくは非ヒト哺乳動物である。具体的な実施態様において、ノックアウトマウスが産生される。
【０２７４】
このようなノックアウト動物は、細胞の低増殖性が関与する疾患または障害を発症するかまたは発症しやすい素因があると予測される。このような動物を使用して、増殖を促進し従ってこのような疾患と障害を治療または予防する能力について分子をスクリーニングまたは試験することができる。
【０２７５】
本発明の異なる実施態様において、機能性CXCR-4遺伝子を取り込んだかまたは発現するトランスジェニック動物は、細胞高増殖性または悪性腫瘍が関与する疾患と障害の動物モデルとしての用途がある。そのような動物は、細胞高増殖性（例えば、悪性腫瘍）が関与する疾患または障害を発症するかまたは発症しやすい素因を有すると予測され、従って過剰増殖性（例えば、腫瘍形成）を阻害し、従ってこのような疾患または障害を治療または予防する能力について分子（例えば、可能な抗癌治療薬）をスクリーニングまたは試験するための、そのような疾患と障害の動物モデルとしての用途がある。
【０２７６】
６．実施例：ヒト多形神経膠芽細胞腫の腫瘍組織からのCXCR-4遺伝子発現の単離と性状解析
この試験では、脳腫瘍形成においてCXCR-4、Ｇタンパク質結合受容体の役割を解析した。
6.1.  材料と方法
ヒトAtlas（登録商標）発現アレイの示差的ハイブリダイゼーション
ヒト神経膠芽細胞腫の発生の間に変化を受ける遺伝子を同定するために、ヒトcDNA発現アレイの示差表示PCR（Different Display-PCR）（DD-PCR）と示差的ハイブリダイゼーションを使用した（DD-PCRのプロトコールの例は、Sehgalら, 1997, J. Surg. Oncol. 64:102-108；Sehgalら, 1997, J. Surg. Oncol. 65:249-257；Sehgalら, 1997, Int. J. Cancer 71:565-572；Sehgalら, 1996, Exp. Lung. Res. 22:419-434に記載されている）。
【０２７７】
Atlas（登録商標）ヒトcDNA発現アレイの示差的ハイブリダイゼーションの技術は、クロンテク（Clontech）により推奨されたプロトコールを使用して行なった。簡単に説明すると、10μgの総RNAをヒトGMTTから単離した。NBT（正常脳組織）の総RNAは、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入し、各組織試料から10μgの総RNAを、５μlの２単位／μlのDNaseIで37℃で30分処理した。
【０２７８】
第１の鎖のcDNAの合成は、オリゴ（ｄＴ）とランダムヘキサマープライマーを使用して、Advantage cDNA synthesis for PCR キットをクロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）の推奨する条件下で使用して、行なった。次に、等量のGMTTまたはNBT cDNA（１×106 cpm/ml）を、クロンテク（Clontech）の発現ハイブリダイゼーション溶液中で別々のバッグ中で２つのAtlas（登録商標）ヒトcDNA発現アレイに65℃で18時間ハイブリダイズした。次に膜を洗浄し、−80℃で48時間Ｘ線フィルムに暴露した。
【０２７９】
遺伝子特異的RT-PCR
遺伝子特異的RT-PCR法を、既に記載されているように行なった（Sehgalら, 1997 J. Surg. Oncol. 64:102-108）。PCRを実施するためにCXCR-4プライマー（5’CTCTCCAAAGGAAAGCGAGGTGGACAT3’（配列番号：８）、5’AGACTGTACACTGTAGGTGCTGAAATCA3’（配列番号：９））を使用した。D1-2（ミトコンドリアチトクロムＣオキシダーゼサブユニット１遺伝子、受け入れ番号D38112）、ハウスキーピング遺伝子のPCRは、特異的プライマー（5’CGGAGCAATATGAAATGATCT3’（配列番号：10）、5’GCAAATACAGCTCCTATTG3’（配列番号：11））を使用して行なった。
【０２８０】
PCRは、すでに詳細に記載（Sehgalら, 1997 J. Surg. Oncol. 64:102-108）されている条件を使用して行なった。次にPCR産物を1.2％アガロースゲルにかけた。DNAを、既に記載（サムブルーク（Sambrook）ら、1989コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、コールドスプリングラボラトリー（Cold Spring Laboratory））されている標準的サザンブロッティング条件を使用して、Hybond N+ magnacharge 膜（アマシャム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）に移した。ハイブリダイゼーションは、１×106 cpm/ml遺伝子特異的プローブを使用して、42℃で18時間行なった。
【０２８１】
遺伝子特異的プローブは、アマシャム（Amersham）（アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）のメガプライム（megaprime）標識キットを使用して、マルチプライム標識内部プライマー（CXCR-4、5’ATCTGTTTCCACTGAGTCTGATCTTCAAGT TTTCACCCAGCTAACACA3’（配列番号：12）とハウスキーピング遺伝子D1-2、5’TAGGCCTGACTGGCATTGTATTAGCAAACTCATCACTAGA3’（配列番号：13））により調製した。D1-2遺伝子は、RT-PCR応用（Sehgalら, 1997 J. Surg. Oncol. 64:102-105）でハウスキーピング遺伝子として、すでに使用されている。
【０２８２】
RT-PCRから得られたサザンブロットの定量は、Molecular Dyamics Phosphor ImagerからのImageQuant（登録商標）容量定量プログラムを使用して、行なった。容量定量は、画素位置と画素値の3-Dプロットにより作成された表面下の容量を算出する。サザンブロット中のCXCR-4バンドの容量（スポット中のすべての画素の積分強度からバックグランドを引いた）を定量した。次にこれらの画素値を、ハウスキーピング遺伝子（文字Ｈで示すD1-2）のバンド中の画素値を用いて標準化し、図１に相対的表示で示す。本文中の「低い」、「中程度」および「高い」という主観的な用語は、NBT中で「低い」、そしてHTB16とGB1690中で「高い」CXCR-4発現に基づく。
【０２８３】
in situ ハイブリダイゼーション
in situ ハイブリダイゼーション法は、既に記載されているように（Wilkinson, 1992  in situ ハイブリダイゼーション、実際的アプローチ（In Situ hybridization, A practical approach）、ニューヨーク：オックフォードユニバーシティプレス）行なった。簡単に説明すると、６μgのホルマリンで固定しパラフィン包埋したヒト脳腫瘍切片を、キシレンで２回洗浄して脱パラフィンし、次に100％から70％に段階的に変化させた濃度のエタノールで再度水和した。次にこれらをPBSで洗浄し、プロテイナーゼＫ（25mg/mlで10分）で処理し、次に４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０２８４】
0.25％無水酢酸／0.1M TEA（トリエチル酢酸）中でインキュベート後、溶液を70%から100％に段階的に変化させた濃度のエタノールで脱水し、50％ホルムアミド、５×SSC、pH4.5、50μg/ml tRNA、50μg/mlヘパリン、および１％SDS中で55℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行なった。切片を、１μg/mlのDIG（ジゴキシゲニン）標識アンチセンスまたはセンスプローブと、55℃で18時間ハイブリダイズさせた。プローブは、Genius 4 キット（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）、インディアナポリス、インディアナ州）で、塩基1061〜1618に対応するヒトCXCR-4 cDNAから得られたPCR鋳型のT3およびT7プロモーターを使用して、合成した。
【０２８５】
PCR鋳型は、それぞれT3プロモーターとT7プロモーターを含有する、プライマー5’CAAGCTCGAAATTAAAACCCTCACTAAAGGGCTCTCCAAAGGAAAGCGAGGTGGACAT3’（配列番号：14）と5’CACTTAACTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTACACTGTAGGTGCGAAATCA3’（配列番号：15）を使用して増幅し、塩基1061〜1087と1591〜1618に対応するヒトCXCR-4配列に加えた。ハイブリダイゼーション後、スライドを、50％ホルムアミド、２×SSC、pH4.5、１％SDS中で50℃において洗浄し、５μg/ml RNaseAにより37℃で30分処理し、50％ホルムアミド、２×SSC、pH4.5中で50℃にて洗浄した。
【０２８６】
切片を10％正常ヒツジ血清（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）でプレブロックし、１:2000希釈のアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニンＦab断片（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））で、４℃で18時間インキュベートした。検出のために、スライドをNBT/BCIP（５−ブロモ−４−クロロ−３−インジリル−ホスフェート、４−トルイジン塩）と共に暗所中で46時間インキュベートした。エオシンＹでカウンター染色後、スライドをPermountでマウントし、Axioskop（カールツァイス（Carl Zeiss）、ソーンウッド（Thornwood）、ニューヨーク）普通顕微鏡を使用して、観察した。
【０２８７】
複数組織ノーザンブロット分析
複数の正常ヒト組織ブロット（HMHTB）を、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。これらのブロットは、２μgの純粋なポリＡ＋ｍＲＮＡを含有した。MNHTBを、過剰のハイブリダイゼーション緩衝液（クロンテク（Clontech））中で３〜４時間プレハイブリダイズした。マルチプライム標識した0.55Kb（位置1591〜1618）CXCR-4プローブで、ハイブリダイゼーションを行なった。ブロットを0.1×SSCと0.1％SDS溶液中で、50℃で60分洗浄した。オートラジオグラフィー用に暴露後、CXCR-4プローブを除去し、ヒトβアクチン遺伝子を内部標準として使用した。CXCR-4の相対的発現は、前述のように算出した。
【０２８８】
ズーブロット（Zoo blot）分析
５μgのプレ消化した（EcoRI）ゲノムDNAを含有するズーブロット膜を、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。ズーブロットは、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）が推奨する方法に従って、プレハイブリダイズした。アンビオン（Ambion）（オースチン、テキサス州）のデカマープライマー標識キットを使用してdCTP32で0.55Kb（1061〜1618）CXCR-4断片を標識し、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。ブロットの洗浄は、クロンテク（Clontech）が推奨するように行なった。
【０２８９】
プローブとして標識するためのCXCR-4 0.557Kb断片を単離するために、125ngのcDNA（オリゴdTとヒト神経芽腫細胞株からのランダムヘキサマープライマーを使用して調製した）を、鋳型として使用した。CXCR-4断片のPCR増幅は、遺伝子特異的プライマー（5’CTCTCCAAAGGAAAGCGAGGTGGACAT3’（配列番号：16）と5’TGATTTCAGCACCTACAGTGTACAGTCT3’（配列番号：17））を使用し、既に記載されているPCR条件（Sehgalら, 1997, J. Surg. Oncol. 65:249-257, Sehgalら, 1997, J. Surg. Oncol. 64:102-108）を使用して、行なった。
【０２９０】
CXCR-4遺伝子の完全長クローンのクローニング
ヒト胎児脳ライブラリー（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリホルニア州）を、CXCR-4特異的0.55Kb PCR産物（CXCR-4特異的PCRプライマーを使用して神経芽腫細胞株から単離した）でスクリーニングした。これらの陽性クローンを同定し、ライブラリーの二次スクリーニング後に単一のプラークを単離した。これらのクローンの挿入体のサイズを評価するために、pfu TaqDNAポリメラーゼ（ストラタジーン（Stratagene））を使用してPCRを行なった。PCR産物を1.2％アガロースゲルにかけた。配列分析は、クローン＃３が2.0Kb挿入体を含有することを示し、これはあらかじめ単離した完全長CXCR-4クローンと同一である。
【０２９１】
完全長CXCR-4遺伝子をpCMV-neo中にサブクローン化するために、そのコード領域を、Sac11とSpe1（下線部）を含有する特異的プライマー（5’AGATAGATCCGCGGACCATGGAGGGGATCAGTATATA3’（配列番号：18）、5’TAGATACAACTAGTGTGTTAGCTGGAGTGAAAACTTGA3’（配列番号：19））を使用してPCR増幅した。次にpCMV-neoベクターをSac11とSpe1で消化し、Sac11とSpe1でプレ消化したCXCR-4 PCR産物に連結した。
【０２９２】
CXCR-4をアンチセンス方向でクローン化するために、CXCR-4特異的プライマー（5’AGATAGATCCGCGGGTGTTAGCTGGAGTGAAAACTTGA3’（配列番号：20）と5’TAGATACAACTAGTACCATGGAGGGGATCAGTATATA3’（配列番号：21））を、PCRを実施するために使用し、プレ消化したpCMV-neoベクターにセンス方向とアンチセンス方向にクローン化した。CXCR-4遺伝子の配向を、配列決定により確認した。
【０２９３】
増殖測定法
既に記載されているように（Huangら, 1995 Cancer Research 55:5054-5062)、プロメガ（Promega）の細胞増殖キットを使用して、CXCR-4トランスフェクション細胞の増殖測定を行なった。簡単に説明すると、1000の野生型細胞と変異体発現細胞を、三重測定で96ウェルプレートに塗布した。細胞を37℃で24時間インキュベートし、80μlの色素を加える。４時間後、15μlの停止溶液を加え、18時間インキュベートする。次にELISAプレートリーダーを使用して570nmで吸光度を記録する。
【０２９４】
軟寒天測定法
既に記載されているように（Huangら, 1995 Cancer Research 55:5054-5062)、軟寒天測定法を行なった。簡単に説明すると、ベクター単独およびCXCR-4でセンス方向でトランスフェクションしたGB1690細胞を、トリプシン処理した。約５×106 または１×106 細胞を、0.25％寒天と混合した。次に細胞を、60mmシャーレ中の0.65％アガロースの層の上に塗布し、37℃で２〜４週間インキュベートした。10日毎に細胞に、血清含有培地を加えた。倒立光学顕微鏡下でコロニーを計測した。
【０２９５】
免疫細胞化学
約１×104細胞を、Lab Tekチャンバースライド（ヌンク（Nunc）、ナパービル（Naperville）、イリノイ州）に塗布した。２４時間後細胞をPBSで洗浄した。次に細胞を４％パラホルムアルデヒド（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）で覆い、４℃で２〜４時間インキュベートした。細胞を再度PBSで洗浄後、200μlの希釈（１：20）ウサギ抗ヒトCXCR-4抗体とスライドに加えた。CXCR-4ポリクローナル抗体を、ゲノメドシンセシス社（Genomed Synthesis, Inc.）（サンフランシスコ、カリホルニア州）が調製した。
【０２９６】
この抗体は、CXCR-4タンパク質の最初の38アミノ酸（ＭＥＧＩＳＩＹＴＳＤＮＹＴＥＥＭＧＳＧＤＹＤＳＭＫＥＰＣＦＲＥＥＮＡＮＦＮＫ（配列番号：７）に対して作成した。スライドを加湿チャンバー中で４℃で18時間インキュベートした。PBSで洗浄後、FITC結合抗ウサギ免疫グロブリン（１：20）（ダコ（DAKO）、A/S、デンマーク）を適用し、スライドを加湿チャンバー中で24℃で30分インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、次にヘマトキシリン（リチャードアレンサイエンティフィック（Richard Allen Scientific）、リチャード、ミシガン州）で30秒間染色した。
【０２９７】
次にスライドを清澄化剤（リチャードアレンサイエンティフィック（Richard Allen Scientific）、リチャード、ミシガン州）で２秒間処理し、次に青味剤（リチャードアレンサイエンティフィック（Richard Allen Scientific）、リチャード、ミシガン州）で処理した。水で洗浄後、スライドを、50％グリセロール／PBS中の２％DABCO（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）でカバーグラスをのせ、Zeiss Axioskop 紫外線顕微鏡を使用して、観察した。
【０２９８】
6.2.  結果
6.2.1.  Atlas（登録商標）ヒトcDNA発現アレイの示差的ハイブリダイゼーションの技術を用いるCXCR-4の同定
ヒトcDNAアレイ技術の大きな利点は、多数の既知または未知の遺伝子を、異なる生物学的条件下で、その発現の変化について分析できることである。NBTとGMTTの間の遺伝子発現の差を研究するために、Atlas（登録商標）ヒトcDNA発現アレイの示差的ハイブリダイゼーションの技術を使用した。２つのAtlas（登録商標）ヒトcDNA発現アレイ膜（クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州））を使用し、各膜は、588の既知の遺伝子と９つのハウスキーピング遺伝子からのcDNAを含有した。
【０２９９】
dCTP32で標識したNBTとGMTTの等量のcDNAを、２つの同じAtlas（登録商標）ヒトcDNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。これらの１つは、NBTと比較してGMTTで過剰発現されたCXCR-4遺伝子である（図１のパネルＡとＢ）。GMTT中のCXCR-4の示差的発現を確認するために、遺伝子特異的RT-PCRの技術を使用した。図３Ｃと図３Ｄに示すように、CXCR-4はGMTT中で高レベルで発現され、NBT中では低レベルで発現されるかまたは全く発現されない。異なる量の鋳型を使用してPCRサイクルの数を変動させて、RT-PCRの条件を決定した。
【０３００】
6.2.2.  GMTT中のCXCR-4の発現
GMTT中のCXCR-4の示差的発現をさらに確認するために、 in situ ハイブリダイゼーションの技術を使用して、８つの異なるヒトGMTT中のCXCR-4の発現を調べた。分析した８つの試料のうちの４つは、高レベルのCXCR-4発現を示した。そのような試料の１つを図２に示す。CXCR-4の同定後、次の工程はその機能の理解であった。これを行うために、種々の組織および種々のタイプの細胞中での発現を調べた。
【０３０１】
6.2.3.  神経膠芽細胞腫および他の脳腫瘍細胞株と組織中のCXCR-4の発現
CXCR-4は多形神経膠芽細胞腫の腫瘍組織中で過剰に発現されるため、次に、いくつかの脳腫瘍由来の細胞株と１次脳腫瘍組織中のその発現を調べた。図3Aに示すように、いくつかの脳腫瘍由来の細胞株と１次脳腫瘍組織中で高レベルのCXCR-4発現が観察される（下記の表２を参照）。図3Aに示すように、ATCC（ロックビル（Rockville）、メリーランド州）から購入した３つの神経膠芽細胞腫細胞株（5GB、HTB-16およびGB1690）で高レベルのCXCR-4発現が観察される。
【０３０２】
これらの３つの細胞株は、元々個々の患者の神経膠芽細胞腫から得られ、現在異なる継代数で増殖している（5GB=15、HTB-16=とGB1690=425）。RT-PCR分析は、FNHA（胎児正常ヒト星状細胞）およびNBTと比較して，これらの細胞株の３つすべてで、CXCR-4が過剰発現されていることを示した。神経膠芽細胞腫細胞株HTB-16とGB1690は、5GB細胞株よりはるかに高レベルで、CXCR-4発現を示した。他の細胞株でのCXCR-4の分析は、これが、神経芽腫および神経外胚葉ヒト腫瘍細胞株中で高レベルに発現されることを証明した。髄芽細胞腫と星状細胞腫グレードIII細胞株では、中程度のCXCR-4の発現が観察される（図3B）。
【０３０３】
１次組織では、神経膠腫と髄膜腫に高レベルのCXCR-4発現が観察される（図3C）。これらの結果に基づき、NBTに比較してヒト神経膠腫中で、CXCR-4が過剰発現されると結論された。CXCR-4のリガンドであるSDF-1が、最近単離されクローン化された。従って、このリガンドも、脳腫瘍組織および細胞株中で過剰発現されているかどうか測定した。5GB細胞中ではSDF-1は非常に低レベルで検出されたが、他の細胞株のほとんどで観察されなかった。高レベルのSDF-1発現は、NBTと比較して、髄膜腫、悪性神経膠腫、神経芽腫組織中で観察された。
【０３０４】
6.2.4.  乳癌１次組織と細胞株中のCXCR-4発現
CXCR-4遺伝子は脳腫瘍組織と細胞株中で過剰発現されるため、他のタイプの腫瘍や細胞株中の発現パターンを試験した。CXCR-4の発現を、11の１次乳房組織（５つの腫瘍と６つの正常組織）中で試験した。図4Aに示すように、試験した５つの乳癌組織中の３つで、CXCR-4は高レベルで発現され、６つの正常乳房組織では低レベルで発現された（下記の表２を参照）。CXCR-4遺伝子を過剰発現する３つの乳癌組織のうちの２つは、エストロゲン受容体とプロゲステロン受容体が陽性であり、１つは両方の受容体が陰性であった。
【０３０５】
発現分析は、SDF-1もまた、CXCR-4を過剰発現する同じ乳房組織中で過剰発現されることを示した。これは、CXCR-4の役割がリガンド依存性である可能性を示している。次に１つの正常乳房組織と７つの乳癌細胞株中のCXCR-4遺伝子の発現を調べた。図4Bに示すように、１つの細胞株（T-47D）でのみ高レベルのCXCR-4発現が観察された。この実験の結果は、CXCR-4遺伝子が、正常乳房組織の新生物形質転換で役割を果たしている可能性を示唆している。
【０３０６】
6.2.5.  癌細胞株中のCXCR-4の発現
上記結果は、脳および乳房組織中でCXCR-4が過剰発現されていることを証明している。CXCR-4遺伝子は他のタイプの腫瘍でも過剰発現されているのであろうか。CXCR-4遺伝子は他のタイプの腫瘍で過剰発現されているかどうかの問題を検討するために、ノーザンブロット分析の技術を使用して、種々の癌細胞株中でその発現を試験した。
【０３０７】
図5Aに示すように、前骨髄球性白血病HL-60、HeLa細胞S3、リンパ芽球性白血病MOLT-4、バーキットリンパ腫Rajiで高レベルのCXCR-4発現が観察され、結腸直腸腺癌SW480中で低レベルの発現が観察された（図5A）。肺癌A549、黒色腫G361、および慢性骨髄性白血病K-562中では、CXCR-4の低レベルの発現が観察されたかまたは全く発現が観察されなかった。上記のデータは、リンパ球起源の多くの腫瘍細胞株中でもCXCR-4は過剰発現されていることを、明白に示唆している。
【０３０８】
6.2.6.  正常ヒト組織中のCXCR-4の発現
正常細胞機能中のCXCR-4遺伝子の役割を理解し始めるために、ノーザンブロット分析の技術を使用して、いくつかの正常ヒト組織中のCXCR-4遺伝子の発現を試験した。図5Bに示すように、CXCR-4は、４つの臓器（脾臓、胸腺、結腸およびPBL）でのみ高レベルに発現される。心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、前立腺、睾丸、卵巣および小腸では、低レベルの発現が観察されたかまたは全く発現が観察されなかった。
【０３０９】
6.2.7.  ヒト脳の異なる領域でのCXCR-4の発現
CXCR-4遺伝子は、NBTに比較してGMTT中で高レベルに発現されるという特徴により、同定した。CXCR-4遺伝子の役割を理解し始めるために、脳の異なる領域でのCXCR-4の発現を試験した。図６に示すように、前頭葉、側頭葉および脊髄はCXCR-4を発現する。脳のこれらの３つの領域でのそのような選択的発現の機能的意味は、現在不明である。脳のこれらの領域でのCXCR-4の発現レベルは、リンパ球起源の組織中より低い（図５と図６中の相対的発現単位を比較されたい）。
【０３１０】
6.2.8.  発生中のCXCR-4の発現
腫瘍形成のプロセス中にアップレギュレーションされることが知られている遺伝子はまた、発生の初期段階で時々過剰発現される。CXCR-4が発生の途中で何らかの役割を果たすかどうかの問題に答えるための第１工程として、マウス発生の初期段階のその発現を試験した。
マウス胚の in situ ハイブリダイゼーションを行う前に、我々は、ズーブロット分析を行って、CXCR-4の配列がヒトとマウスで保存されていることを証明した。図７に示すように、CXCR-4は、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、およびニワトリで保存されている。
【０３１１】
マウス胚の８つの発生段階（８日〜16日）を、 in situ ハイブリダイゼーションの技術を使用して、CXCR-4発現について分析した。８日から12日までのすべて組織で、CXCR-4発現が観察された。14日までに、ほとんどの組織、および脳と骨髄のすべて領域で、高レベルの発現が観察された。15日までに、前脳と中脳および下垂体中で発現は非常に強い。低レベルの発現は、骨髄、腸管および卵巣に見られた。16日までに、CXCR-4発現は主に脳と骨髄に限局されていた。これらの結果は、CXCR-4が、発生の初期段階で何らかの重要な役割を果たしている可能性があることを、示している。
【０３１２】
上記データに基づき、CXCR-4遺伝子は、いくつかの１次腫瘍組織や細胞株のみでなく、胚発生中でも示差的発現があることに反映される、何らかのユニークな性質を有すると、結論することができる。
【０３１３】
７．実施例：神経膠芽細胞腫細胞株中のCXCR-4発現を制御する作用
脳腫瘍形成におけるCXCR-4の機能的役割を評価するために、CXCR-4の過剰発現およびCXCR-4の活性と発現を阻害する作用を、神経膠芽細胞腫細胞株中で調べた。
7.1  材料と方法
セクション6.1を参照されたい。
7.2  結果
7.2.1.  5GB細胞株中のCXCR-4過剰発現の発現
【０３１４】
細胞の形質転換におけるCXCR-4遺伝子の役割を試験するために、CXCR-4を5GB中で、センスおよびアンチセンス方向で過剰発現させた。約10μgの純粋なDNAを、10,000細胞を含有する直径60mmのシャーレに、リポフェクタミン（ギブコビーアールエル（Gibco/BRL））を使用してトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、G418（1000μg/ml）中で２週間選択した。３週間後、細胞を400μg/mlのG418中で維持した。細胞形態を倒立光学顕微鏡で観察し、トランスフェクションした細胞の細胞増殖性を、プロメガ（Promega）（マジソン、ウィスコンシン州）の非放射性細胞増殖キットを使用して分析した。
【０３１５】
pCMV-neoベクターまたはCXCR-4でセンス方向（pCMV-neoCS）でトランスフェクションした神経膠芽細胞腫細胞中では、細胞増殖と形態の変化は観察されなかったが、CXCR-4でアンチセンス方向（pCVM-neoCA）でトランスフェクションした細胞は、最初の２週間、広範な神経突起成長を示し（図９）、５週以後は細胞が死滅した。神経突起の成長は、分化を受けている細胞のユニークな特徴である。レチノイン酸（RA）とホルスコリン処理に応答した神経芽腫細胞（LA-N-5HP）の神経突起成長と細胞分化が、観察されている（Mooreら, 1996 Clin Exp. Metastasis 14:239-245）。
【０３１６】
最近、神経膠芽細胞腫細胞株（5GB）を酪酸ナトリウムで処理すると、細胞分化が起きることが証明された（Englehardら, 1997 Neurosurgery 41:886-897）。我々の結果は、アンチセンス方向のCXCR-4過剰発現は、5GBやGB1690神経膠芽細胞腫細胞株でもCXCR-4遺伝子をブロックすることを示している。この結果は、CXCR-4発現が5GB細胞の連続的増殖に必要であることを、強く示唆している。
【０３１７】
7.2.2.  HTB16とGB1690細胞株中のCXCR-4過剰発現の発現
神経膠芽細胞腫細胞株HTB16とGB1690は、NBTおよび5GB細胞株と比較して、高レベルのCXCR-4を発現する。これらの細胞株を、ベクター単独でセンス方向（pCMV-neo、pCMV-neoCS）でトランスフェクションした。細胞形態に変化は観察されなかったが、細胞増殖の速度は異なっていた。CXCR-4でセンス方向でトランスフェクションしたGB1690細胞は、ベクター単独でトランスフェクションした細胞と比較して、細胞増殖が急速に上昇した。
【０３１８】
この結果は、CXCR-4でセンス方向でトランスフェクションした細胞が、ベクター単独でトランスフェクションした細胞よりはるかに速くコンフルエントになったとき、繰り返された。これらの結果は、GB1690中のCXCR-4の過剰発現が、細胞の急速な増殖を引き起こすことを証明している。HB16細胞をCXCR-4遺伝子でトランスフェクションすると、同様の結果が得られた。全体に、CXCR-4でセンス方向にトランスフェクションした細胞は、ベクター単独でトランスフェクションした細胞より40％速い速度で増殖した。
【０３１９】
7.2.3.  CXCR-4過剰発現GB1690細胞の軟寒天コロニー形成
前記で証明したように、HTB16とGB1690細胞でのCXCR-4の過剰発現は、インビトロで急速な細胞増殖を引き起こした。これは、ある表現型をインビトロで変化させるであろうか。CXCR-4の過剰発現が急速な細胞増殖を引き起こすかどうかの問題を検討するために、CXCR-4をセンス方向で過剰発現しているGB1690細胞について、軟寒天コロニー形成測定法を行なった。図12Eに示すように、センスCXCR-4遺伝子を過剰発現しているGB1690細胞では、pCMV-neoベクター単独でトランスフェクションした同じ細胞と比較して、約81％多くコロニーが形成された。
【０３２０】
CXCR-4過剰発現GB1690細胞により生成されるコロニーは、ベクター単独でトランスフェクションしたものより、有意に多かった。この結果に基づき、GB1690細胞中のCXCR-4過剰発現は、インビトロでの細胞の形質転換の可能性を上昇させると結論される。
【０３２１】
7.2.4.  CXCR-4とSDFβ-1を阻害する作用
細胞増殖におけるCXCR-4の役割は、まず完全長CXCR-4 cDNAを３つの異なる神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞株へ、トランスフェクションおよび過剰発現させて調べた。３つのすべての細胞株で増殖活性の上昇が見られ、軟寒天中でGB1690細胞株がコロニーを形成する能力が、大幅に上昇した。次に、CXCR-4とそのリガンドSDFβ-1の必要性を確認するために、これらの細胞株の増殖の調節に及ぼす特異的抗体の作用を調べた（図13と図16）。塗布後２４時間の培養物に特異的CXCR-4ポリクローナル抗体または免疫前血清を加えると、２つの細胞株（GB1690と5GB）で細胞増殖が90％阻害され、第３の細胞株HTB-16では、細胞増殖は90％阻害された（図13）。
【０３２２】
次に神経膠芽細胞腫細胞株の増殖に及ぼすSDFβ-1モノクローナル抗体の作用を調べた（図16）。SDFβ-1抗体は、３つの神経膠芽細胞腫細胞株（5GB、HTB16、およびGB1690）の細胞増殖の約90％阻害を引き起こした。逆に、NIH3T3細胞をSDFβ-1抗体で処理しても、細胞増殖は影響を受けなかった。最後に、CXCR-4をpCMV-neoベクター中に、センス方向およびアンチセンス方向で挿入し、5GBとGB1690神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞株中にトランスフェクションした。最初の２週間以内に、アンチセンスCXCR-4でトランスフェクションした両方の細胞株は、広範な神経突起成長と細胞分化を示し、一方センスCXCR-4またはベクターのみでトランスフェクションした細胞は、形態の変化を示さなかった（図９）。
【０３２３】
免疫細胞化学分析は、アンチセンスでトランスフェクションした細胞では、CXCR-4受容体タンパク質発現のダウンレギュレーションと同時に、グリア細胞分化細胞マーカーであるグリア線維関連タンパク質（GFAP）が強く誘発されることを示した。神経突起成長は、酪酸ナトリウムに応答した神経膠芽細胞腫細胞、レチノイン酸（RA）やフォルスコリン処理に応答した神経芽腫細胞のような分化細胞の典型的な特徴である。トランスフェクションとG418での選択の３週間後、アンチセンスCXCR-4でトランスフェクションしたすべての細胞は、分化を受け次に細胞が死滅した。
【０３２４】
さらにアンチセンスCXCR-4でトランスフェクションされた細胞は、軟寒天中でコロニーを形成することができなかった（図12）。すなわち、タンパク質発現を阻止することによるCXCR-4の細胞機能の阻害は、これらの神経膠芽細胞腫および他のタイプの腫瘍（例えば乳腺癌）の増殖活性を制御する機序における役割を、明白に証明している。これらの結果はまた、CXCR-4とそのリガンドSDF-1の両方が、神経膠芽細胞腫の細胞増殖に必要であることを、示している。
【０３２５】
神経膠芽細胞腫および乳腺癌におけるCXCR-4の過剰発現は、CD4+細胞へのHIVの侵入におけるCXCR-4の明らかな役割を考慮すると、驚くべき知見である。これらの観察結果は、本明細書に報告した追加の知見（CXCR-4受容体発現のアンチセンス阻害は、細胞の分化を誘発する）と一緒に、新生物表現型の維持におけるCXCR-4受容体の機能性役割を支持している。さらに、これらの癌によるCXCR-4リガンドSDF-1の同時発現は、これらの癌の異常増殖挙動の発生におけるオートクリン／パラクリン役割を示唆している。
【０３２６】
【表１】
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第２表は、１次腫瘍組織と正常組織および細胞株中のCXCR-4の過剰発現を示す。脳と乳房１次組織および細胞株における発現を試験するために、CXCR-4とD1-2特異的プライマーを使用して、遺伝子特異的RT-PCRとサザンブロッティングを行なった。RT-PCRとサザンブロッティングは、前述の方法を使用して行なった。ヒト癌細胞株中のCXCR-4の発現を試験するために、癌細胞株と３つの複数の正常ヒト組織ブロット（NMHTB）を、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。これらのブロットは、２μgの純粋なポリＡ＋mRNAを含有した。
【０３２７】
ハイブリダイゼーションは、マルチプライム標識0.55Kb（1591〜1618位）CXCR-4プローブを用いて行なった。次にCXCR-4プローブを除去し、内部対照としてヒトβアクチン遺伝子を使用した。サザンブロットとノーザンブロットの定量は、Molecular Dyamics Phosphor ImagerからのImageQuant（登録商標）容量定量プログラムを使用して、行なった。容量定量は、画素位置と画素値の3-Dプロットにより作成された表面下の容量を算出する。
【０３２８】
サザンブロット中のCXCR-4バンドの容量（スポット中のすべての画素の積分強度からバックグランドを引いた）を定量した。次にこれらの画素値を、ハウスキーピング遺伝子（D1-2またはβアクチン）のバンド中の画素値を用いて標準化し、相対的表示で示す。実験は２回行い、NBTに比較して２倍またはそれ以上のCXCR-4発現を過剰発現と見なした。１９のヒト脳神経膠芽細胞腫手術組織のうちの８つを、 in situ ハイブリダイゼーションの技術を使用して分析した。
【０３２９】
８．実施例：CXCR-4発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明において、CXCR-4の発現を阻害するために、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開発することができる。簡単に説明すると、翻訳開始部位に対する６つのホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）と３つのランダムODNを、市販品、例えば Oliogos Etc. Inc. （ウィルソンスビル（Wilsonville）、オレゴン州）から購入した。CXCR-4発現阻害に及ぼすODNの作用は、既に記載されている（Broaddusら, 1997, Neurosurgery 42:908-915）方法を使用して行なった。簡単に説明すると、1000のHTB16とGB1690細胞を、ODNの内培地で96ウェルプレートの各ウェルに塗布した。
【０３３０】
24時間後、培地を交換して、最終濃度の１mmol/L、３mmol/L、または10mmol/L ODNを含有させた。対照培養物には、ODNを添加しない新鮮な培地を与えた。４〜５日後、プロメガ（Promega）（マジソン、ウィスコンシン州）の細胞増殖測定キットを使用して、細胞増殖を分析した。CXCR-4発現に及ぼすODNの作用を試験するために、HTB16とGB1690細胞を、ガラスチャンバースライドに塗布した。前述の免疫細胞化学法を使用して、発現を分析した。CXCR-4の発現を阻害するのに必要なODNの濃度がいったん決定されたら、ODNで処理した細胞について、RT-PCR、ノーザンブロットおよびウェスタンブロット分析を行なった。増殖曲線と軟寒天コロニー形成を、CXCR-4遺伝子を過剰発現および過少発現する細胞について分析する。
【化１】
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【０３３１】
本発明は、寄託された微生物または本明細書に記載の具体的な実施態様に、その範囲が限定されるものではない。前述の説明と添付の図面から、本明細書に記載のもの以外に本発明の種々の修飾が可能であることは、当業者には明らかであろう。そのような修飾は、請求の範囲内に含まれると考えられる。
本明細書において多くの文献が引用されているが、これらの開示内容は、参考のためその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月9日(2013.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書の記載されている発明。
【外国語明細書】
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