(57)【要約】【課題】  熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、およびその製造方法を提供すること。【解決の手段】  ＡＭＶ逆転写酵素を構成するアミノ酸のうち、特定の位置にあるアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、熱安定性が向上したＡＭＶ逆転写酵素を得ることができた。また前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで、前記逆転写酵素を製造することができた。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、以下の（１）から（１５）のうち少なくともいずれか一箇所が他のアミノ酸に置換している、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５８番目のセリン
（２）配列番号１の８１３番目のバリン
（３）配列番号１の１９２番目のアスパラギン酸
（４）配列番号１の７１５番目のトレオニン
（５）配列番号１の５８３番目のアラニン
（６）配列番号１の６５番目のセリン
（７）配列番号１の１１３番目のフェニルアラニン
（８）配列番号１の６８９番目のアラニン
（９）配列番号１の７１８番目のイソロイシン
（１０）配列番号１の１７４番目のセリン
（１１）配列番号１の６６０番目のイソロイシン
（１２）配列番号１の４０２番目のグリシン
（１３）配列番号１の７３２番目のアスパラギン
（１４）配列番号１の８５６番目のロイシン
（１５）配列番号１の６２６番目のグリシン
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、以下の（１）から（１５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５８番目のセリンがグリシンに置換
（２）配列番号１の８１３番目のバリンがアラニンに置換
（３）配列番号１の１９２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４）配列番号１の７１５番目のトレオニンがメチオニンに置換
（５）配列番号１の５８３番目のアラニンがトレオニンに置換
（６）配列番号１の６５番目のセリンがグリシンに置換
（７）配列番号１の１１３番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（８）配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換
（９）配列番号１の７１８番目のイソロイシンがトレオニンに置換
（１０）配列番号１の１７４番目のセリンがシステインに置換
（１１）配列番号１の６６０番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号１の４０２番目のグリシンがシステインに置換
（１３）配列番号１の７３２番目のアスパラギンがセリンに置換
（１４）配列番号１の８５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１５）配列番号１の６２６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換されており、かつ以下の（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の７１８番目のイソロイシンがトレオニンに置換
（２）配列番号１の１７４番目のセリンがシステインに置換
（３）配列番号１の６６０番目のイソロイシンがバリンに置換
（４）配列番号１の４０２番目のグリシンがシステインに置換
（５）配列番号１の７３２番目のアスパラギンがセリンに置換
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、少なくとも以下の（１）から（３）のアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５番目のセリンがグリシンに置換
（２）配列番号１の１１３番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（３）配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換
【請求項５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、少なくとも以下の（１）から（３）のアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５番目のセリンがグリシンに置換
（２）配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換
（３）配列番号１の８５６番目のロイシンがプロリンに置換
【請求項６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、少なくとも以下の（１）から（４）のアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５番目のセリンがグリシンに置換
（２）配列番号１の５８３番目のアラニンがトレオニンに置換
（３）配列番号１の６２６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（４）配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換
【請求項７】
配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４および配列番号７６のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素。
【請求項８】
野生型のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素と比較して、３７℃より高い温度で、より長い半減期を伴う酵素活性を有する、請求項１から７のいずれかに記載の逆転写酵素。
【請求項９】
野生型のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素と比較して、３７℃より高い温度で保持した場合に、より高い残存活性を有する、請求項１から７のいずれかに記載の逆転写酵素。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１３】
宿主が大腸菌である、請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の形質転換体を培養することで前記形質転換体からトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を発現させる工程と、前記形質転換体から当該逆転写酵素を単離する工程とを含む、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡからＤＮＡを複製するトリ骨髄芽細胞腫（ＡＭＶ）ウイルス逆転写酵素およびその製造方法に関するものである。より詳しくは、熱に対する安定性を向上させたＡＭＶ逆転写酵素に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスの増殖に必須の因子として発見された逆転写酵素は、一本鎖ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成（逆転写）する、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有しており、ｃＤＮＡ合成等に必須な遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬に利用されている。
【０００３】
逆転写酵素を利用した逆転写反応の効率に影響を及ぼす要因のひとつに、ＲＮＡの二次構造があげられる。例えば、ＲＮＡ分子の領域がハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、二本鎖ＲＮＡを形成する場合に、このような二次構造が形成されることがある。一般的に、ＲＮＡ分子を含む溶液の温度を上げることによって、ＲＮＡの二次構造の形成を減らすことができる。従って、多くの場合、３７℃を超える温度でＲＮＡを逆転写することが望ましい。しかしながら、当技術分野で既知の逆転写酵素は、３７℃よりかなり上の温度、例えば５０℃でインキュベートされると一般的に活性を失ってしまう。
【０００４】
逆転写酵素の一つである、トリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、分子量約６３ｋＤａのα鎖および分子量約９５ｋＤａのβ鎖からなるヘテロ複合体であり、ＡＳＬＶファミリーとして知られている。このうちα鎖は、タンパク質分解性プロセシングによりβ鎖から形成される（非特許文献１）。ＡＭＶ逆転写酵素のヘテロ複合体は、α鎖のみの場合またはβ鎖のみの場合と比較して安定であり、遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬に利用する逆転写酵素として有用であることが知られている（特許文献１）。また熱安定性が向上したＡＭＶ逆転写酵素としてα鎖の変異体が知られている（非特許文献２）。しかしながら熱安定性が向上したヘテロ複合体、およびβ鎖の変異体の報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−３３４０９５号公報
【特許文献２】特開２０１２−１２０５０６号公報
【特許文献３】特開２００６−０１４６３２号公報
【特許文献４】特開２０１２−０７５４１８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ  Ｓ．Ｆ．Ｊ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１６３（１９９３）
【非特許文献２】Ｋｏｎｉｓｈｉ  Ａ，Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｋ，Ｉｎｏｕｙｅ  Ｋ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  α−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．，Ｊｕｌ；３４（７）：１２０９−１２１５（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
逆転写酵素を用いた反応ではその増幅の効率と正確性の向上のため、より高い温度で逆転写反応が可能な酵素が望まれている。本発明の目的は、熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを一部改変したポリヌクレオチドを作製し、作製したポリヌクレオチドを含むベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を用いて発現させたＡＭＶ逆転写酵素変異体を選抜した結果、本願発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本願は以下の（Ａ）から（Ｎ）に記載の態様を包含する：
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、以下の（１）から（１５）のうち少なくともいずれか一箇所が他のアミノ酸に置換している、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５８番目のセリン
（２）配列番号１の８１３番目のバリン
（３）配列番号１の１９２番目のアスパラギン酸
（４）配列番号１の７１５番目のトレオニン
（５）配列番号１の５８３番目のアラニン
（６）配列番号１の６５番目のセリン
（７）配列番号１の１１３番目のフェニルアラニン
（８）配列番号１の６８９番目のアラニン
（９）配列番号１の７１８番目のイソロイシン
（１０）配列番号１の１７４番目のセリン
（１１）配列番号１の６６０番目のイソロイシン
（１２）配列番号１の４０２番目のグリシン
（１３）配列番号１の７３２番目のアスパラギン
（１４）配列番号１の８５６番目のロイシン
（１５）配列番号１の６２６番目のグリシン
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、以下の（１）から（１５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５８番目のセリンがグリシンに置換
（２）配列番号１の８１３番目のバリンがアラニンに置換
（３）配列番号１の１９２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４）配列番号１の７１５番目のトレオニンがメチオニンに置換
（５）配列番号１の５８３番目のアラニンがトレオニンに置換
（６）配列番号１の６５番目のセリンがグリシンに置換
（７）配列番号１の１１３番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（８）配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換
（９）配列番号１の７１８番目のイソロイシンがトレオニンに置換
（１０）配列番号１の１７４番目のセリンがシステインに置換
（１１）配列番号１の６６０番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号１の４０２番目のグリシンがシステインに置換
（１３）配列番号１の７３２番目のアスパラギンがセリンに置換
（１４）配列番号１の８５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１５）配列番号１の６２６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換されており、かつ以下の（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の７１８番目のイソロイシンがトレオニンに置換
（２）配列番号１の１７４番目のセリンがシステインに置換
（３）配列番号１の６６０番目のイソロイシンがバリンに置換
（４）配列番号１の４０２番目のグリシンがシステインに置換
（５）配列番号１の７３２番目のアスパラギンがセリンに置換
（Ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、少なくとも以下の（１）から（３）のアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５番目のセリンがグリシンに置換
（２）配列番号１の１１３番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（３）配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換
（Ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、少なくとも以下の（１）から（３）のアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５番目のセリンがグリシンに置換
（２）配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換
（３）配列番号１の８５６番目のロイシンがプロリンに置換
（Ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素において、少なくとも以下の（１）から（４）のアミノ酸置換が生じている、前記逆転写酵素。
（１）配列番号１の６５番目のセリンがグリシンに置換
（２）配列番号１の５８３番目のアラニンがトレオニンに置換
（３）配列番号１の６２６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（４）配列番号１の６８９番目のアラニンがバリンに置換
（Ｇ）配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、および配列番号７６のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素。
【００１０】
（Ｈ）野生型のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素と比較して、３７℃より高い温度で、より長い半減期を伴う酵素活性を有する、（Ａ）から（Ｇ）のいずれかに記載の逆転写酵素。
【００１１】
（Ｉ）野生型のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素と比較して、３７℃より高い温度で保持した場合に、より高い残存活性を有する、（Ａ）から（Ｇ）のいずれかに記載の逆転写酵素。
【００１２】
（Ｊ）（Ａ）から（Ｇ）のいずれかに記載のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
【００１３】
（Ｋ）（Ｊ）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【００１４】
（Ｌ）（Ｋ）に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【００１５】
（Ｍ）宿主が大腸菌である、（Ｌ）記載の形質転換体。
【００１６】
（Ｎ）（Ｌ）または（Ｍ）に記載の形質転換体を培養することで前記形質転換体からトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を発現させる工程と、前記形質転換体から当該逆転写酵素を単離する工程とを含む、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素の製造方法。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明において、野生型のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素とは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖、または配列番号２記載のアミノ酸配列からなるＡＭＶ逆転写酵素α鎖のことをいう。なお、野生型のＡＭＶ逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖単独でもよく、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖単独でもよく、さらには両者からなる任意の複合体やそれらの混合物であってもよい。
【００１９】
本発明にかかるトリ骨髄芽細胞種ウイルス逆転写酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列であって、６５８番目のセリン、８１３番目のバリン、１９２番目のアスパラギン酸、７１５番目のトレオニン、５８３番目のアラニン、６５番目のセリン、１１３番目のフェニルアラニン、６８９番目のアラニン、７１８番目のイソロイシン、１７４番目のセリン、６６０番目のイソロイシン、４０２番目のグリシン、７３２番目のアスパラギン、８５６番目のロイシン、および６２６番目のグリシンからなる群から選ばれる少なくとも１以上の位置にてアミノ酸置換を有する配列を含む。
【００２０】
本発明に係るアミノ酸置換は、各置換位置において、特定の性質を有するアミノ酸群から選ばれるアミノ酸に置換されてもよい。例えば、６５８番目および６５番目の位置は、小側鎖のアミノ酸、例えばグリシンに置換される。８１３番目の位置は、疎水性炭化水素鎖を有するアミノ酸、例えばアラニンに置換される。１９２番目の位置は、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸に置換される。７１５番目の位置は、含硫黄アミノ酸、例えばメチオニンに置換される。５８３番目および第７１８番目の位置は、水酸基又はチオール基を有するアミノ酸、例えばトレオニンに置換される。１１３番目および７３２番目の位置は、水酸基又はチオール基を有するアミノ酸、例えばセリンに置換される。６８９番目および６６０番目は、炭化水素基を有するアミノ酸、例えばバリンに置換される。１７４番目および４０２番目は、水酸基又はチオール基を有するアミノ酸、例えばシステインに置換される。８５６番目の位置は、疎水性アミノ酸、例えばプロリンに置換される。６２６番目の位置は、酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸に置換される。図１に本発明のＡＭＶ逆転写酵素におけるアミノ酸置換部位を示す。
【００２１】
本発明に係るトリ骨髄芽細胞種ウイルス逆転写酵素は、上記の１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは３以上の位置でアミノ酸置換を含んでいる。アミノ酸置換位置の組合せは、野生型のトリ骨髄芽細胞種ウイルス逆転写酵素に比較して、高温で残存活性又は半減期の点で優れていれば、任意の組合せを選択することができる。２の位置で置換が生じる場合、優れた残存活性又は半減期を有する逆転写酵素を取得する観点から、６８９番目の位置における置換と、その他の位置における置換の組合せが好ましく、例えば６８９番目の位置における置換と、７１８番目、１７４番目、６６０番目、４０２番目、又は７３２番目との組合せが選択されるが、これらの組合せに限定されることを意図するものではない。３の位置で置換が生じる場合、優れた残存活性又は半減期を有する逆転写酵素を取得する観点から、６８９番目の位置における置換と、その他の２の位置における置換の組合せが好ましく、例えば６８９番目の位置における置換と、６５番目と１１３番目との組合せや、６８９番目の位置における置換と、６５番目と８５６番目との組合せが選択されるが、この組合せに限定されることを意図するものではない。４の位置で置換が生じる場合、優れた残存活性又は半減期を有する逆転写酵素を取得する観点から、６５番目における置換と６８９番目の位置における置換と、その他の２の位置における置換の組合せが好ましく、例えば、６５番目における置換と６８９番目の位置における置換と、５８３番目と６２６番目との組み合わせが選択されるが、この組合せに限定されることを意図するものではない。
【００２２】
本発明に係るトリ骨髄芽細胞種ウイルス逆転写酵素は、特定されたアミノ酸配列のみからなってもよいし、その他活性に影響を与えない範囲で任意の配列を含んでもよい。そのような配列の例として、例えば精製を容易にするタグ配列や分泌シグナルなどのシグナルペプチド配列がＮ末端又はＣ末端、または両方の末端に付加されていてもよい。タグ配列は、数残基程度の特定のアミノ酸配列を含んでおり、特異的抗体や特異的結合担体を用いることによりにより発現したタンパク質の精製が容易になる。タグ配列の例として、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグなど、遺伝子工学の分野で用いられる配列であれば任意の配列を用いることができる。これらの配列は、精製後に、所定の制限酵素を用いることにより取り除かれてもよいし、そのまま転写酵素として用いられてもよい。また制限酵素を用いて付加配列を除去した場合も、数残基程度のアミノ酸配列がＮ末端又はＣ末端に存在してもよい。
【００２３】
本発明において言及されるＡＭＶ逆転写酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸の位置は、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖のアミノ酸配列を表す配列番号１を基準として表されるが、配列番号１のアミノ酸配列の所定の位置のみを指すことを意図するものではなく、配列番号１に対応するアミノ酸配列における対応する位置を指すこともある。配列番号１に対応するアミノ酸配列とは、配列番号１の配列の１又は複数の領域において欠失又は追加がされた結果、アミノ酸の位置にずれが生じている配列をいい、より具体的には、配列番号２などのアミノ酸配列をいう。配列番号２のアミノ酸配列は、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖がタンパク質分解性プロセシングを受けて生じたＡＭＶ逆転写酵素α鎖であり、配列番号１のアミノ酸配列の１から５７２番目に対応している。
【００２４】
したがって、配列番号１の１９２番目のアスパラギン酸、とは配列番号１に記載のＡＭＶ逆転写酵素β鎖のアミノ酸配列によって定義される１９２番目のアミノ酸であるアスパラギン酸を指すが、対応するアミノ酸配列である配列番号２における対応するアミノ酸を指すこともある。ここで、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖は、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖の５７３番目以降のアミノ酸がプロセシングを受けるため、配列番号１の５７３番目以降のアミノ酸については、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖に対応するアミノ酸は存在することはない。なお１から５７２番目の他のアミノ酸についても同様である。
【００２５】
本発明において、３７℃より高い温度で、より長い半減期を伴う、とは、ある態様において高い温度で、すなわち、３７℃より高い温度、好ましくは４５℃より高い温度、より好ましくは５０℃より高い温度、より好ましくは５５℃より高い温度において、野生型のＡＭＶ逆転写酵素よりも長い半減期、すなわちある態様において５分間よりも長く、好ましくは１０分間より長い半減期であり得る。
【００２６】
本発明において、酵素活性を有するとは、野生型のＡＭＶ逆転写酵素が有する酵素活性であって、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性、が例示できる。さらに、本発明における酵素活性は任意の１つ、または任意の組み合わせの複数の酵素活性であってもよく、より好ましくはＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性であり、さらに好ましくはＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性の組み合わせ、またはＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性とＲＮａｓｅＨ活性の組み合わせであり、より好ましくはＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性とＲＮａｓｅＨ活性の組み合わせである。
【００２７】
本発明において、３７℃より高い温度で保持した場合とは、ある態様において高い温度で、すなわち、３７℃より高い温度、好ましくは４５℃より高い温度、より好ましくは５０℃より高い温度、より好ましくは５５℃より高い温度において、ＡＭＶ逆転写酵素が働くために充分に長い時間保持した場合をいい、例えば、１分よりも長い時間、好ましくは５分より長い時間、より好ましくは１０分より長い時間、より好ましくは２０分より長い時間、より好ましくは３０分より長い時間保持される。
【００２８】
本発明において、残存活性は、加熱前の酵素が有する活性に対する加熱後の酵素が有する活性の割合を指す。野生型のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素と比較してより高い残存活性を有するとは、ＡＭＶ逆転写酵素が働くために充分に長い時間、所定の温度で保持した場合の酵素活性を、同時間４℃で保持した場合の酵素活性で除した残存活性が、野生型のＡＭＶ逆転写酵素について同条件で測定した残存活性と比較して高いことをいう。残存活性比が、野生型のＡＭＶ逆転写酵素の残存活性比よりも高いとは、すなわち、野生型ＡＭＶ逆転写酵素の残存活性と比較して３％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２５％以上高い残存活性が観察されることであり得る。
【００２９】
本発明において、ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドとは、ｍＲＮＡへの転写と転写されたｍＲＮＡの翻訳によって、本発明のＡＭＶ逆転写酵素を製造し得るポリヌクレオチドのことをいう。前記ポリヌクレオチドは、野生型のＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号３から６のいずれかに記載の配列からなるポリヌクレオチド）を改変または変異を導入することで作製することができる。所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤または放射線への露出といった公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。当業者はこのような任意の改変または変異を有する遺伝子を、従来公知の変異導入法を利用して作製することができ、例えばＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法が例示できる。このようにして作製したポリヌクレオチドとして配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３および配列番号７５に記載の配列を含むポリヌクレオチドが例示でき、さらにはこれらのポリヌクレオチドに、アミノ酸の変化をもたらさないサイレント変異が入ったポリヌクレオチドが例示できる。
【００３０】
本発明において発現ベクターとは、本発明のＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを挿入したベクターである。発現ベクターは、ＡＭＶ逆転写酵素を発現させる宿主を基にして適宜選択すればよく、大腸菌においてはｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＢＲ、ｐＢＲ３２２などを例示することができる。その中でもｔｒｃプロモータを有する点で、ｐＴｒｃ９９ａベクターが好ましいプラスミドベクターとして例示できる。ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチドのベクターへの挿入は、挿入するベクターの適切な位置に遺伝子工学的に挿入すればよい。ここでいう適切な位置とは、ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で自由に決定してよい。またベクターに挿入する場合、例えばプロモータ機能を有するオリゴヌクレオチドを付加してもよい。機能するプロモータの一例として、大腸菌で機能するｌａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータまたはＴ７プロモータが例示できる。その中でもｔｒｃプロモータは、転写活性の調節が容易なため好ましい。挿入するベクターは、形質転換する宿主内で充分な期間安定に存在し、複製することができるものであれば特に制限はない。
【００３１】
本発明における宿主としては、ＡＭＶ逆転写酵素を発現できる細胞であればよく、原核細胞においては大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌、真核細胞としては酵母のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する菌、キャンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する菌、ポンベ（Ｐｏｍｂｅ）属に属する菌、糸状菌のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌などを例示することができ、さらには、昆虫細胞や動物細胞を例示することができる。好ましい宿主の一例として培養や取り扱いが容易な大腸菌があげられる。さらに好ましくは大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌Ｗ３１１０株であり、より好ましくは大腸菌Ｗ３１１０株である。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した大腸菌変異株を使用してもよい。
【００３２】
発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換する方法については、本技術分野に知られている任意の方法を使用することができ、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，ｐ．４６９−６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，ｐ．３０５−６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載された方法により行なえばよい。
【００３３】
本発明の形質転換体を培養するには、前述した方法で得られた形質転換体を、例えば必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地により培養すればよい。なお、本発明の形質転換体を選択して培養することを目的に、前記ベクターの構成を基にした選抜剤を培地に添加するとよい。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターを使用する場合には、培地にアンピシリンやカルベニシリンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素、無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよい。さらにグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を添加しても良い。培養温度は、例えば約２０℃から４０℃までの範囲であればよく、好ましくは３５℃から３８℃までの範囲、より好ましくは３７℃付近である。ｐＨは５．９から８．１までの範囲であればよく、好ましくは５．９から７．１までの範囲である。
【００３４】
本発明の形質転換体を培養する際、当該形質転換体に含まれる発現ベクターにｔｒｃプロモータといった誘導性のプロモータが含まれている場合は、培養開始時に誘導剤を添加してＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導してもよいし、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度まで培養を行なった後に誘導剤を添加し、ＡＭＶ逆転写酵素を発現させてもよい。好ましくは、培養液の濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）が約０．５から２０．０を示す増殖期間、より好ましくは濁度が１．０から１０．０を示す増殖期間に、誘導剤を添加する誘導操作を行ない、引き続き培養する方法が例示できる。添加する誘導剤は、使用するプロモータに応じて適宜選択して使用すればよい。例えば、誘導性のプロモータがｔｒｃプロモータの場合、添加する誘導剤としてＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を例示することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は終濃度で約０．１から１０．０ｍＭまでの範囲の中から適宜選択すればよいが、好ましくは１．０ｍＭから１０．０ｍＭまでの範囲、より好ましくは５．０ｍＭ付近である。なお、誘導操作後に培養温度を大腸菌の至適培養温度よりも低い温度まで下げてもよく、好ましくは１０℃から３０℃までの範囲、より好ましくは１５℃から２５℃までの範囲、さらに好ましくは２５℃付近である。
【００３５】
本発明の形質転換体の培養時間は、一般的な大腸菌の培養時間よりも長時間であり、好ましくは２４時間以上、より好ましくは５０時間以上、さらに好ましくは１００時間以上、さらに好ましくは１００時間から１７０時間、さらに好ましくは１００時間から１５０時間である。
【００３６】
本発明の形質転換体から逆転写酵素を単離するには、前述した方法で得られた形質転換体の培養液からＡＭＶ逆転写酵素を抽出すればよく、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。例えば、発現したＡＭＶ逆転写酵素が大腸菌内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出すればよい。なお前記抽出段階では種々の蛋白質が混在しているが、ストレプトマイシン塩酸塩やポリミンＰ（商品名）を添加することで核酸と共沈させることにより効率的にＡＭＶ逆転写酵素を沈澱回収することができる。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーを単独または組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素を高純度に精製することができる。クロマトグラフィーを用いたＡＭＶ逆転写酵素精製の一例として、ポリプロピレングリコール基を導入した疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてＡＭＶ逆転写酵素を精製後、ホスホセルロース担体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製することで、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖、およびＡＭＶ逆転写酵素α鎖β鎖ヘテロ複合体を、分離精製することができる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明は、野生型のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素と比較して、より高い温度で、より長い半減期を伴う酵素活性を有していることを特徴としている。このため、遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬で用いる酵素として有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】野生型のＡＭＶ逆転写酵素β鎖のアミノ酸配列（配列番号１、上段）と、本発明のＡＭＶ逆転写酵素におけるアミノ酸置換部位を示す図である。
【図２】プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢの構造を示す図である。
【図３】蛍光強度が初期値の１．２倍になる時間から逆転写酵素のユニット数を見積もる検量線を示す図である。
【図４】野生型のＡＭＶ逆転写酵素と本発明のＡＭＶ逆転写酵素とで耐熱性を評価した結果を示す図である。
【図５】Ａ６８９Ｖ変異体と当該変異体にさらにアミノ酸置換を導入したＡＭＶ逆転写酵素とで耐熱性を評価した結果を示す図である。
【図６】野生型のＡＭＶ逆転写酵素と、Ａ６８９Ｖ変異体と、（Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体とで耐熱性を評価した結果を示す図である。
【図７】野生型のＡＭＶ逆転写酵素と、（Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体と、（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体とで耐熱性を評価した結果を示す図である。
【図８】（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体のホスホセルロースカラム溶出パターンを示す図である。
【図９】（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体のホスホセルロースカラム溶出パターンを示す図である。
【図１０】ホスホセルロースカラムから溶出した（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体のヘテロ複合体を含む画分（ａ）とβ鎖を含む画分（ｂ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ＣＢＢで染色した電気泳動写真を示す図である。
【図１１】（Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体と、（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体とで耐熱性を評価した結果を示す図である。
【図１２】（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体と、（Ｓ６５Ｇ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体とで耐熱性を評価した結果を示す図である。
【図１３】野生型ＡＭＶ逆転写酵素のヘテロ複合体と、（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体のヘテロ複合体と、（Ｓ６５Ｇ、Ａ５２８Ｔ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）四重変異体のヘテロ複合体とで、耐熱性を評価した結果を示す図である。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００４０】
実施例１  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子の変異体ライブラリーの作製
特許文献２に記載の方法で大腸菌コドン型のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子（配列番号５）を持つプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢ（図２）を作製した。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢの塩基配列情報を配列番号７に示す。作製したプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢのＡＭＶ逆転写酵素遺伝子に以下の手順で変異を導入した。
（１）プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢを鋳型プラスミドとして、表１に示した反応液組成に基づいてエラープローンＰＣＲ反応を行なった。
【００４１】
【表１】
2014209898.tif 000003
ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用い、９５℃で２分加熱後、９５℃・３０秒、５５．７℃・３０秒、７２℃・３．５分の温度サイクルを４０回繰り返した。
（２）ＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）精製されたＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を含むＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化後、同酵素で消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＡＭＶ逆転写酵素遺伝子変異体ライブラリーとした。
（４）さらに作製したライブラリーを定法に従い大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換し、３７℃のＬＢ／Ｃｒｂ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  ポリペプトン、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ  精製寒天、０．１ｍｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム（ｐＨ７．４））で一晩培養し変異体候補株を得た。
【００４２】
実施例２  変異体候補株の培養
９６穴プレート（グライナー・ジャパン社製）に２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ  トリプトン、１０ｇ／Ｌ  酵母エキス、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ  第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ  第二リン酸ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム）２００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、実施例１で作製した変異体候補株を１コロニーずつ植菌し、３７℃・２０００ｒｐｍで一晩振とう培養を行なうことで前培養を行なった。前培養液の一部はグリセロールストックとし−８０℃で保存した。
【００４３】
次に９６穴ディープウェルプレート（グライナー・ジャパン社製）に２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ  トリプトン、１０ｇ／Ｌ  酵母エキス、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ  第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ  第二リン酸二ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム）５００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、前培養液を５０μＬずつ植菌し、３７℃・１５００ｒｐｍで３時間振とう培養を行なった。さらに各ウェルに５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、２５℃・２０００ｒｐｍで三晩振とう培養を行なうことでトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の発現を促した。
【００４４】
その後、培養菌体を４℃・２５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行ない、上清を捨てることで菌体を回収し、−３０℃で保存した。
【００４５】
実施例３  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素抽出液の酵素活性評価
（１）実施例２で回収した菌体に抽出液（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名）（メルク社製）溶液、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．２ｍｇ／ｍＬ  卵白リゾチーム、２５Ｕ／ｍＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）（メルク社製）、１０ｍＭ  ＤＴＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、２５℃・１５００ｒｐｍで一時間振とうし、続いて４℃・２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行ない、上清を回収し抽出液とした。
（２）酵素活性の測定を、特許文献３記載の核酸増幅法をもとに行なった。表２に記載した組成の反応液（ミックス試薬とする）１５μＬをＰＣＲ用９６穴プレート（ＡＢＩ社製）に分注し、前記抽出液を１０ｍＭ  ＤＴＴ水溶液で１０倍に希釈しものを５μＬ加えた。
【００４６】
【表２】
2014209898.tif 000004
続いて各ウェルに開始溶液（１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３．８％（ｗ／ｖ）  グリセロール、１０．４％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ）を１０μＬ混合し、ＡＢＩ７３００ＲｅａｌＴｉｍｅ−ＰＣＲ装置（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、４６℃・１５秒、４７℃・３０秒、４６℃・１５秒の温度サイクルを３０回繰り返し、サイクルごとに蛍光強度を測定した。
（３）野生型のＡＭＶ逆転写酵素と比較し蛍光強度の増加が早いサイクルで観察される変異体を耐熱性変異株として取得した。
【００４７】
実施例４  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の調製（その１）
実施例３で選択した耐熱性変異株について耐熱性の評価を行なうために、耐熱性変異株の培養と精製を行なった。
（１）試験管に２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ  トリプトン、１０ｇ／Ｌ  酵母エキス、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ  第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ  第二リン酸ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム）２ｍＬ分注し、実施例２で作製したグリセロールストックを２０μＬ植菌し、３７℃・１６０ｒｐｍで一晩振とう培養を行なうことで前培養を行なった。
（２）１００ｍＬフラスコに２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ  トリプトン、１０ｇ／Ｌ  酵母エキス、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ  第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ  第二リン酸ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム）２０ｍＬ分注し、前培養液を２００μＬ植菌し、３７℃・１６０ｒｐｍで３時間振とう培養を行なった。さらに培養液に５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、２５℃・１６０ｒｐｍで三晩振とう培養を行なうことでトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の発現を促した。その後、培養液を４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで菌体を回収し、−３０℃で凍結保存した。
（３）凍結菌体を５ｍＬ／湿菌体質量のバッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、４ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、ソニケーター（Ｉｎｓｏｎａｔｏｒ  ２０１Ｍ、久保田製作所社製）を使用して１５０Ｗ、４℃の条件で超音波破砕を行なった後、４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで未破砕の菌体を取り除き抽出液を得た。
（４）得られた抽出液に０．８３％（ｗ／ｖ）になるようにストレプトマイシン塩酸塩（和光純薬社製）を溶解し、４℃で３０分間撹拌した。その後、４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することでＡＭＶ逆転写酵素を沈澱として回収し、取り除いた上清と等量のバッファーＡへ再度懸濁した。この再懸濁液をさらに４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した上清を回収した。この上清５００μＬとバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、４ｍＭ  ＤＴＴ、１７０ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム）５００μＬを混和した後、バッファーＣ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、４ｍＭ  ＤＴＴ、８５ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＰＰＧ−６００Ｍ（東ソー社製）の５０％スラリー５００μＬと混和し、４℃で１０分間転倒撹拌することで吸着を行なった。４℃・５０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで、未吸着分を取り除いた。
（５）吸着させたゲルへ１．７ｍＬのバッファーＤ（バッファーＡとバッファーＣを２：８で混和したバッファー）を加え、数回転倒撹拌した後４℃・５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ない、上清を取り除くことでゲルを洗浄した。さらにこの洗浄をさらにもう一度繰り返し、洗浄したゲルにバッファーＡを２５０μＬ加え、４℃で１０分間転倒撹拌しゲルから溶出させた後、４℃・５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ない、ゲルを取り除いた上清を各耐熱性変異株のＡＭＶ逆転写酵素液として回収し４℃で保存した。
【００４８】
実施例５  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の耐熱性評価（その１）
実施例４で調製した各耐熱性変異株由来のＡＭＶ逆転写酵素の耐熱性評価を行なった。
（１）ＡＭＶ逆転写酵素液３．２μＬに対し４０．３μＬの滅菌水を加え、さらに５．２μＬのＤＭＳＯ（終濃度１０．４％（ｖ／ｖ））を加え混和することで非加熱酵素反応液を調製し、４℃に保持した。
（２）（１）の非加熱酵素反応液の一部をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、４６℃で１０分加熱後、４℃で３分冷却することで加熱酵素反応液を調製した。
（３）実施例３に記載した組成でミックス試薬を調製し１５μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、前記非加熱酵素反応液もしくは前記加熱酵素反応液を５μＬ加え、４６℃で２分保温した。
（４）各ＰＣＲチューブに開始溶液（１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３．８％（ｗ／ｖ）  グリセロール、１０．４％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ）を１０μＬ混合し、ＴＲＣＲリアルタイムモニターＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー社製）を用いて蛍光強度の変化を測定した。
（５）適宜バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、４ｍＭ  ＤＴＴ）で希釈したＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて同様の方法で蛍光強度の変化を測定し、蛍光強度が初期蛍光強度の１．２倍になる時間から逆転写酵素のユニット数を見積もる検量線を作成した（図３）。
（６）（５）で作成した検量線を用いて非加熱酵素反応液と加熱酵素反応液それぞれのＡＭＶ逆転写酵素の活性を見積もり、加熱酵素反応液の活性を、非加熱酵素反応液の活性で除することで残存活性を算出した。
【００４９】
残存活性を野生型由来と各耐熱性変異株由来のＡＭＶ逆転写酵素反応液とで比較した結果、各耐熱性変異株由来の酵素は野生型由来と比較して耐熱性が向上していることが判った（図４）。
【００５０】
実施例６  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子の塩基配列決定
実施例４で培養した菌体の一部から、定法によりプラスミドを抽出し、抽出したプラスミドに含まれるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の塩基配列決定を以下の方法で行なった。
（１）Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付のバッファー２．０μＬ、プレミックス４．０μＬ、合成ＤＮＡプライマー３．２ｐｍｏｌ、鋳型プラスミド５００ｎｇを滅菌水にて２０μＬに調製し、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用い、９６℃で１分加熱後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）（１）で調製した塩基配列決定用サンプルをＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、以下に示す方法で精製した。
（２−１）Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラムに滅菌水を８００μＬ加え、ボルテックスにより乾燥したゲルを十分に水和させた。
（２−２）カラムに気泡がないことを確認後、室温にて２時間以上放置した。
（２−３）上のキャップ、下のストッパーを順に外しカラム内の滅菌水をゲル表面まで自然落下させた後、７３０×ｇで２分間遠心分離を行なった。
（２−４）（２−１）から（２−３）により作製したスピンカラムの中央に塩基配列決定用サンプルをアプライし、７３０×ｇで２分間遠心分離によりサンプルをチューブに回収した。
（２−５）回収したサンプルについて減圧乾燥を行なった後、ホルムアミドに溶解した。
（３）（２）で調製した塩基配列決定用サンプルを９５℃で２分間処理し、氷上で急冷後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０−ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析することで、塩基配列を決定した。塩基配列決定に使用した合成ＤＮＡプライマーは、配列番号１５から２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを必要に応じて選択し使用した。
（４）決定した塩基配列はＧＥＮＥＴＹＸ  ｖｅｒ．１１．０．１（商品名）（ゼネティクス製）を使用して解析を行なった。
【００５１】
解析の結果、耐熱性変異株から以下に示す７株の変異体がそれぞれ同定された。
（Ａ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６５８番目のセリンがグリシンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＳ６５８Ｇ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号２３に、アミノ酸配列を配列番号２４にそれぞれ示す。
（Ｂ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の８１３番目のバリンがアラニンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＶ８１３Ａ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号２５に、アミノ酸配列を配列番号２６にそれぞれ示す。
（Ｃ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の１９２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換された変異と、７１５番目のトレオニンがメチオニンに置換された変異を持つ変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素を（Ｄ１９２Ｅ、Ｔ７１５Ｍ）変異体とし、その遺伝子配列を配列番号２７に、アミノ酸配列を配列番号２８にそれぞれ示す。また、１９２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換された変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＤ１９２Ｅ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０にそれぞれ示し、７１５番目のトレオニンがメチオニンに置換された変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＴ７１５Ｍ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３１に、アミノ酸配列を配列番号３２にそれぞれ示す。
（Ｄ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の５８３番目のアラニンがトレオニンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＡ５８３Ｔ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３３に、アミノ酸配列を配列番号３４にそれぞれ示す。
（Ｅ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６５番目のセリンがグリシンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＳ６５Ｇ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３５に、アミノ酸配列を配列番号３６にそれぞれ示す。
（Ｆ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の１１３番目のフェニルアラニンがセリンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＦ１１３Ｓ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３７に、アミノ酸配列を配列番号３８にそれぞれ示す。
（Ｇ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６８９番目のアラニンがバリンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＡ６８９Ｖ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３９に、アミノ酸配列を配列番号４０にそれぞれ示す。
【００５２】
実施例７  Ａ６８９Ｖ変異体への変異導入とスクリーニング
実施例１に記載した方法でＡ６８９Ｖ変異体プラスミドを鋳型プラスミドとして、エラープローンＰＣＲ反応により変異体ライブラリーを作製し、実施例２および３に記載した方法で変異体候補株の培養と評価を行ない、実施例４および５に記載した方法で耐熱性評価を行なった。さらに実施例６に記載した方法で塩基配列を決定し、Ａ６８９Ｖ変異体を鋳型とした耐熱性変異株から以下に示す４株の変異体がそれぞれ同定された。
【００５３】
それぞれの残存活性をＡ６８９Ｖ変異体由来のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素反応液と比較した結果、耐熱性が向上していることが判った（図５）。
（Ａ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６８９番目のアラニンがバリンに、７１８番目のイソロイシンがトレオニンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素を（Ａ６８９Ｖ、Ｉ７１８Ｔ）変異体とし、その遺伝子配列を配列番号４１に、アミノ酸配列を配列番号４２にそれぞれ示す。また、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の７１８番目のイソロイシンがトレオニンに置換された変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＩ７１８Ｔ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号４３に、アミノ酸配列を配列番号４４にそれぞれ示す。
（Ｂ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６８９番目のアラニンがバリンに、１７４番目のセリンがシステインに、６６０番目のイソロイシンがバリンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素を（Ａ６８９Ｖ、Ｓ１７４Ｃ、Ｉ６６０Ｖ）変異体とし、その遺伝子配列を配列番号４５に、アミノ酸配列を配列番号４６にそれぞれ示す。また、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の１７４番目のセリンがシステインに置換された変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＳ１７４Ｃ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号４７に、アミノ酸配列を配列番号４８にそれぞれ示し、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６６０番目のイソロイシンがバリンに置換された変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＩ６６０Ｖ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号４９に、アミノ酸配列を配列番号５０にそれぞれ示す。
（Ｃ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６８９番目のアラニンがバリンに、４０２番目のグリシンがシステインに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素を（Ａ６８９Ｖ、Ｇ４０２Ｃ）変異体とし、その遺伝子配列を配列番号５１に、アミノ酸配列を配列番号５２にそれぞれ示す。また、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の４０２番目のグリシンがシステインに置換された変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＧ４０２Ｃ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号５３に、アミノ酸配列を配列番号５４にそれぞれ示す。
（Ｄ）配列番号１に記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６８９番目のアラニンがバリンに、７３２番目のアスパラギンがセリンに置換されている変異体。この変異を有するＡＭＶ逆転写酵素を（Ａ６８９Ｖ、Ｎ７３２Ｓ）変異体とし、その遺伝子配列を配列番号５５に、アミノ酸配列を配列番号５６にそれぞれ示す。また、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の７３２番目のアスパラギンがセリンに置換された変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＮ７３２Ｓ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号５７に、アミノ酸配列を配列番号５８にそれぞれ示す。
【００５４】
実施例８  （Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体の作製と評価
Ｓ６５Ｇ変異体、Ｆ１１３Ｓ変異体、Ａ６８９Ｖ変異体を基に、Ｓ６５ＧとＦ１１３ＳとＡ６８９Ｖの三つの変異を持った三重変異体を作製した。
（１）Ｓ６５Ｇ変異体、Ｆ１１３Ｓ変異体、Ａ６８９Ｖ変異体、それぞれからミニプレップ法を用いてプラスミドを調製した。
（２）Ｓ６５Ｇ変異体から調製したプラスミドを鋳型として、表３の試薬組成および下記の反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。
【００５５】
【表３】
2014209898.tif 000005
反応条件はサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・２分４０秒の温度サイクルを２５回繰り返した。
（３）反応液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（４）Ｆ１１３Ｓ変異体から調製したプラスミドを鋳型に、合成プライマーとしてＦプライマー（配列番号６０）とＲプライマー（配列番号６１）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件でＰＣＲ反応と精製を行なった。
（５）Ａ６８９Ｖ変異体から調製したプラスミドを鋳型に、合成プライマーとしてＦプライマー（配列番号６２）とＲプライマー（配列番号９）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件で、ＰＣＲ反応と精製を行なった。
（６）（３）から（５）で得られた、３種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、三重変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、および精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてＦプライマー（配列番号８）とＲプライマー（配列番号９）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件で行なった。
（７）（６）で得られた、精製二重変異体遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化後、同酵素で消化したｐＴｒｃ９９ａベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（８）（７）の反応液を大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換させ、ＬＢ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを三重変異体とした。さらに三重変異体は実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認し、（Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体とした。その遺伝子配列を配列番号６３に、アミノ酸配列を配列番号６４に示す。
（９）作製した（Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体を用いて実施例４および実施例５で示した方法で培養と精製を行ない、耐熱性を評価した。
【００５６】
その結果、（Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体由来の酵素は野生型由来およびＡ６８９Ｖ変異体由来と比較して耐熱性が向上していることが判った（図６）。
【００５７】
実施例９  （Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体の作製
ｐＴｒｃＡＭＶＢを鋳型とし、合成プライマーとしてＦプライマー（配列番号６０）とＲプライマー（配列番号６１）の組み合わせを使用した他は、実施例８に記載した方法で（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体を作製した。詳細を以下に示す。
（１）Ｓ６５Ｇ変異体、Ａ６８９Ｖ変異体、それぞれからミニプレップ法を用いてプラスミドを調製した。
（２）Ｓ６５Ｇ変異体から調製したプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。なお、試薬組成は表３に示す組成であり、ＰＣＲ反応はサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて９４℃で２分加熱後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・２分４０秒の温度サイクルを２５回繰り返す条件で行なった。
（３）反応液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（４）プラスミドｐＴｒｃＡＭＶＢを鋳型とし、合成プライマーとしてＦプライマー（配列番号６０）とＲプライマー（配列番号６１）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件で、ＰＣＲ反応と精製を行なった。
（５）Ａ６８９Ｖ変異体を発現可能なプラスミドを鋳型とし、合成プライマーとしてＦプライマー（配列番号６２）とＲプライマー（配列番号９）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件で、ＰＣＲ反応と精製を行なった。
（６）（３）から（５）で得られた、３種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、二重変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、および精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてＦプライマー（配列番号８）とＲプライマー（配列番号９）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件で行なった。
（７）（６）で得られた、精製二重変異体遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化後、同酵素で消化したｐＴｒｃ９９ａベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（８）（７）の反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、ＬＢ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを二重変異体とした。
（９）得られた二重変異体を実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認した。得られた（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体の遺伝子配列を配列番号６５に、アミノ酸配列を配列番号６６に示す。
（１０）作製した（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体を用いて実施例４および実施例５で示した方法で培養と精製を行ない、耐熱性を評価した。
【００５８】
その結果、（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体由来の酵素は、実施例８で作製した（Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体由来の酵素と比較して耐熱性が向上していることが判った（図１１）。
【００５９】
実施例１０  （Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体に対する変異導入およびスクリーニング（その１）
実施例９で得られた（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体を発現可能なプラスミドを鋳型プラスミドとして、実施例１に記載した方法でエラープローンＰＣＲ反応を行なうことで、変異体ライブラリーを作製し、実施例２および３に記載した方法で変異体候補株の培養と評価を行ない、実施例４および５に記載した方法で耐熱性評価を行なった。さらに実施例６に記載した方法で塩基配列を決定した。
【００６０】
（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体を鋳型とした耐熱性変異株から（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体を取得した。なお（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体は、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６５番目のセリンがグリシンに、６８９番目のアラニンがバリンに、８５６番目のロイシンがプロリンに置換されている変異体であり、その遺伝子配列を配列番号６７に、アミノ酸配列を配列番号６８にそれぞれ示す。また、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の８５６番目のロイシンがプロリンに置換された変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＬ８５６Ｐ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号６９に、アミノ酸配列を配列番号７０にそれぞれ示す。
【００６１】
（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体の残存活性を野生型および（Ｓ６５Ｇ、Ｆ１１３Ｓ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体由来のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素反応液と比較した結果、耐熱性が向上していることが判った（図７）。
【００６２】
実施例１１  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の調製（その２）
実施例９で得られた（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体を発現可能なプラスミド、および実施例１０で得られた（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体を発現可能なプラスミドを用いて、大腸菌Ｗ３１１０株を、それぞれヒートショック法にて形質転換することで形質転換体を得た後、以下の方法でＡＭＶ逆転写酵素を発現させ、精製を行なった。
（１）２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬカルベニシリンナトリウム）１００ｍＬに、形質転換体を植菌し、５００ｍＬバッフル付三角フラスコ中、３０℃・１３０ｒｐｍで一晩振とう培養を行なうことで前培養を行なった。
（２）表４に示す組成からなる培地２．１Ｌを全容３．０Ｌ発酵槽（サクラ精機社、ＴＦＬＣ−３）に入れ、１２１℃で２０分間で滅菌後、（１）で得られた前培養液を２１ｍＬ植菌し、本培養を開始した。発酵槽の培養温度は３７℃に、撹拌速度は５００ｒｐｍに、ｐＨは６．９から７．1に、それぞれ設定し、５０％のリン酸水溶液を用いてｐＨの調整を行なった。
【００６３】
【表４】
2014209898.tif 000006
（３）培養開始から３時間後に発酵槽の培養温度を２５℃に下げ、０．５ＭのＩＰＴＧ水溶液を２１ｍＬ添加した。
（４）約１４０時間培養後、培養液を４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで、菌体を回収し−３０℃で凍結保存した。
（５）凍結菌体を５ｍＬ／湿菌体質量のバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、超音波破砕後、４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで未破砕菌体を除き抽出液を得た。
（６）抽出液に０．８３％のストレプトマイシン（和光純薬社製）を添加し、４℃で３０分間撹拌後、４℃・１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで沈澱を回収した。
（７）等量のバッファーＢに沈殿を再溶解し、粗精製溶液とした。
（８）粗精製溶液２００ｍＬに硫酸アンモニウム（和光純薬社）を１５％飽和になるになるまで少量ずつ添加した。さらに当該粗精製溶液を、あらかじめバッファーＣ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５％飽和硫酸アンモニウム）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＰＰＧ−６００Ｍ（東ソー社）ゲルを充填したカラム（１０ｍｍＩ．Ｄ．×２０ｃｍ）に添加した。
（９）十分量のバッファーＣをカラムに通液することで、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、１０カラムボリューム（ＣＶ）でバッファーＢが１００％となるようなリニアグラジエント溶出法により、ＡＭＶ逆転写酵素を溶出させた（流速５ｍＬ／分）。
（１０）カラムからの溶出液を、１０ｍＬ毎に試験管に分注し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色によりＡＭＶ逆転写酵素の画分を決定した。
（１１）（１０）で決定したＡＭＶ逆転写酵素の活性フラクションをバッファーＡで透析後、あらかじめバッファーＡで平衡化したホスホセルロース（Ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｐ１１、Ｗｈａｔｍａｎ社製）ゲルを充填したカラム（１０ｍｍＩ．Ｄ．×５ｃｍ）に添加した。
（１２）十分量のバッファーＡをカラムに通液することで、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、１０ＣＶでバッファーＤ（１Ｍ  ＫＣｌを含むバッファーＡ）が１００％となるようなリニアグラジエント溶出法により、ＡＭＶ逆転写酵素を溶出させた（流速０．５ｍＬ／分）。
（１３）カラムからの溶出液を、１ｍＬ毎に試験管に分注し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色によりＡＭＶ逆転写酵素の画分を決定した。
【００６４】
ホスホセルロースカラムからの溶出パターンを図８（（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体）および９（（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体）にそれぞれ示す。また、ホスホセルロースカラムから溶出した（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体のヘテロ複合体を含む画分とβ鎖を含む画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１０に、それぞれ示す。（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体のホスホセルロースカラムからの溶出パターン（図８）ではグラジエント５０％付近にα鎖とβ鎖とのヘテロ複合体のピーク（図８中のαβ）が確認できた。一方、（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体の溶出パターン（図９）ではグラジエント５０％付近のヘテロ複合体のピーク（図９中のαβ）が少なくなり、グラジエント８０％付近のβ鎖のピーク（図９中のβ）が大きくなることが判った。これは８５６番目のアミノ酸が置換（Ｌ８５６Ｐの置換）されることにより、ＡＭＶ逆転写酵素のβ鎖が大腸菌内でのタンパク質分解性プロセシングに抵抗性を示し、α鎖へ分解され難くなったためと考えられる。
【００６５】
実施例１２  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の耐熱性評価（その２）
実施例１１で得られた（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体のヘテロ複合体とβ鎖をそれぞれ以下に示す方法で耐熱性を評価した。
（１）（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体のヘテロ複合体を含む画分とβ鎖を含む画分を滅菌水で適宜希釈しＤＭＳＯ（終濃度５．２％（ｖ／ｖ））を加え混和することで非加熱酵素反応液を調製し、４℃に保持した。
（２）（１）の非加熱酵素反応液の一部をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、４６℃で１０分加熱した（プレヒート）。
（３）表３に記載した組成からなる反応液を調製し、その１５μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注した。
（４）（２）のプレヒートを行なった酵素反応液と非加熱酵素反応液をそれぞれ、４６℃で２分保温した。
（５）（４）の酵素液５μＬと、開始溶液（１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３．８％（ｗ／ｖ）  グリセロール、５．２％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ）１０μＬをそれぞれＰＣＲチューブに混合し、ＴＲＣＲリアルタイムモニターＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー社製）を用いて蛍光強度の変化を測定した。
【００６６】
酵素反応液のプレヒートを行なった場合と行なわなかった場合とで検出時間（蛍光強度が初期蛍光値の１．２倍になった時間）を比較した結果を表５に示す。
【００６７】
【表５】
2014209898.tif 000007
表５の結果より、（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ、Ｌ８５６Ｐ）三重変異体のヘテロ複合体はプレヒートにより検出時間の延長すなわち酵素の活性の低下が確認できる一方、β鎖はプレヒートの前後で活性の低下がほとんどなく耐熱性が高いことが判る。この結果からＬ８５６Ｐは主にβ鎖の量を相対的に増加させることで耐熱性を向上させていることが明らかとなった。
【００６８】
実施例１３  （Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体に対する変異導入およびスクリーニング（その２）
実施例９で得られた（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体を発現可能なプラスミドを鋳型プラスミドとして、実施例１に記載した方法でエラープローンＰＣＲ反応を行なうことで、変異体ライブラリーを作製し、実施例２および３に記載した方法で変異体候補株の培養と評価を行ない、実施例４および５に記載した方法で耐熱性評価を行なった。さらに実施例６に記載した方法で塩基配列を決定した。
【００６９】
（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体を鋳型とした耐熱性変異株から（Ｓ６５Ｇ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体を取得した。なお（Ｓ６５Ｇ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体は、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６５番目のセリンがグリシンに、６２６番目のグリシンがアスパラギン酸に、６８９番目のアラニンがバリンにそれぞれ置換されている変異体であり、その遺伝子配列を配列番号７１に、アミノ酸配列を配列番号７２にそれぞれ示す。また、配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６２６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換された変異を有するＡＭＶ逆転写酵素をＧ６２６Ｄ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号７３に、アミノ酸配列を配列番号７４にそれぞれ示す。
【００７０】
（Ｓ６５Ｇ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体由来の酵素の酵素の残存活性を（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体由来のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素反応液と比較した結果、耐熱性が向上していることが判った（図１２）。
【００７１】
実施例１４  （Ｓ６５Ｇ、Ａ５８３Ｔ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）四重変異体の作製と評価
（Ｓ６５Ｇ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体とＡ５８３Ｔ変異体を基に、Ｓ６５ＧとＡ５８３ＴとＧ６２６ＤとＡ６８９Ｖの四つの変異を持った四重変異体を作製した。詳細を以下に示す。
（１）（Ｓ６５Ｇ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体とＡ５８３Ｔ変異体、それぞれからミニプレップ法を用いてプラスミドを調製した。
（２）（Ｓ６５Ｇ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体を発現可能なプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。なお、試薬組成は表３に示す組成であり、合成プライマーとしてＦプライマー（配列番号８）とＲプライマー（配列番号７７）の組合せを使用した他は、実施例８（２）と同じ条件で行なった。
（３）反応液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（４）（Ｓ６５Ｇ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）三重変異体を発現可能なプラスミドを鋳型とし、合成プライマーとしてＦプライマー（配列番号７８）とＲプライマー（配列番号７９）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件で、ＰＣＲ反応と精製を行なった。
（５）Ａ５８３Ｔ変異体から調製したプラスミドを鋳型とし、合成プライマーとしてＦプライマー（配列番号８０）とＲプライマー（配列番号９）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件で、ＰＣＲ反応と精製を行なった。
（６）（３）から（５）で得られた、３種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、四重変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、および精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてＦプライマー（配列番号８）とＲプライマー（配列番号９）の組み合わせを使用した他は（２）から（３）と同じ条件で行なった。
（７）（６）で得られた精製四重変異体遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化後、同酵素で消化したｐＴｒｃ９９ａベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（８）（７）の反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、ＬＢ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを四重変異体とした。
（９）得られた四重変異体を実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認した。得られた（Ｓ６５Ｇ、Ａ５８３Ｔ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）変異体の遺伝子配列を配列番号７５に、アミノ酸配列を配列番号７６に示す。
【００７２】
実施例１５  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素ヘテロ複合体の耐熱性評価
（１）実施例１１に示した方法に従い、野生型のヘテロ複合体および（Ｓ６５Ｇ、Ａ５８３Ｔ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）四重変異体のヘテロ複合体を精製した。
（２）（１）で得られたヘテロ複合体と、実施例１１で得られた（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体のヘテロ複合体をそれぞれ実施例１２に示す方法で耐熱性を評価した。
（３）酵素反応液のプレヒートを行なった場合と行なわなかった場合とで検出時間（蛍光強度が初期蛍光値の１．２倍になった時間）から、図３に示した検量線を用いて非加熱酵素反応液と加熱酵素反応液それぞれのＡＭＶ逆転写酵素の活性を見積もり、加熱酵素反応液の活性を、非加熱酵素反応液の活性で除することで残存活性を算出した。
【００７３】
各酵素の残存活性を比較した結果を図１３に示す。野生型のヘテロ複合体と比較して（Ｓ６５Ｇ、Ａ６８９Ｖ）二重変異体のヘテロ複合体は耐熱性が高く、（Ｓ６５Ｇ、Ａ５８３Ｔ、Ｇ６２６Ｄ、Ａ６８９Ｖ）四重変異体のヘテロ複合体の耐熱性はさらに高いことが判った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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