(57)【要約】【課題】拮抗微生物を利用した植物病害防除剤及びそれを用いた植物病害の防除方法を提供する。【解決手段】植物病原菌に対する拮抗能力を有するバチルス属(Bacillus)に属する細菌と農業系資材とを含有する植物病害防除剤。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病原菌に対する拮抗能力を有するバチルス属(Bacillus)に属する細菌と農業系資材とを含有する植物病害防除剤。
【請求項２】
バチルス属に属する細菌がバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)に属する細菌である、請求項１記載の植物病害防除剤。
【請求項３】
バチルス・アミロリクエファシエンスに属する細菌が受託番号NITE BP-1399で特定される細菌株である、請求項２記載の植物病害防除剤。
【請求項４】
農業系資材がそば殻又はそば殻堆肥である、請求項１〜３のいずれか１項記載の植物病害防除剤。
【請求項５】
植物病原菌がフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)に属する細菌である、請求項１〜４のいずれか１項記載の植物病害防除剤。
【請求項６】
植物病害がレタス根腐病である、請求項１〜５のいずれか１項記載の植物病害防除剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の植物病害防除剤を土壌に施用する工程と、
前記土壌において植物を生育する工程と、
を含む、植物病害防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば植物病害に対する生物防除剤及びそれを用いた植物病害の防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レタス栽培においては、レタス根腐病が問題となっている。レタス根腐病は糸状菌の一種であるフザリウム・オキシスポラムf.sp.ラクチュケ(Fusarium oxysporum f.sp. lactucae)が原因とされ、レタスの根から浸入して導管を詰まらせ、株の成長が阻害される。レタス根腐病による被害によれば、レタスの商品価値が低下することとなる。
【０００３】
また、レタス根腐病の被害にあった作物残渣や汚染した土壌が流出すると発生地域が広がるため、作業後の農機類等の殺菌等、伝染を防止するための対策が必要となる。
【０００４】
従来において、レタス根腐病への対策として、クロルピクリン剤等の土壌くん蒸剤を用いた土壌消毒が行われている。しかしながら、化学農薬を使用すると圃場中の有用微生物まで死滅させてしまうため、病原菌が優占化しやすくなる等の問題がある。
従って、環境への負荷が少なく、化学農薬に頼らないレタス根腐病の防除方法が必要とされる。
【０００５】
一方、特許文献１は、植物病原菌の生育の抑制能を有する、バチルス(Bacillus)属に属する微生物を使用して植物に対して有害な生物を防除する方法を開示する。また、特許文献２は、植物病原性の糸状菌、細菌又はウイルスの感染又は増殖を抑制する能力を有するバチルス属に属する細菌の栄養細胞を用いて、植物病害を防除する方法を開示する。しかしながら、特許文献１及び２は、バチルス属に属する細菌がレタス根腐病を防除したことを開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2004-215567号公報
【特許文献２】特開2007-55982号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、環境への負荷が少なく、化学農薬に頼らないレタス根腐病等の植物病害の防除方法が必要とされる。
そこで、本発明は、環境への負荷が少ない、拮抗微生物を利用した植物病害に対する生物防除剤及びそれを用いた植物病害の防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するため鋭意研究を行った結果、バチルス属に属する細菌を農業系資材と共に土壌に施用することで、レタス根腐病等の植物病害の原因である植物病原菌を防除できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、植物病原菌に対する拮抗能力を有するバチルス属に属する細菌と農業系資材とを含有する植物病害防除剤に関する。
【００１０】
バチルス属に属する細菌としては、受託番号NITE BP-1399で特定される細菌株等のバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)に属する細菌が挙げられる。
【００１１】
農業系資材としては、そば殻、そば殻堆肥等が挙げられる。
植物病原菌としては、フザリウム・オキシスポラムに属する細菌が挙げられる。
植物病害としては、レタス根腐病が挙げられる。
【００１２】
また、本発明は、上記植物病害防除剤を土壌に施用する工程と、当該土壌において植物を生育する工程とを含む植物病害防除方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、植物に大きな被害を与える植物病害に対して優れた防除効果を有する生物防除剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】K-No.3株の栄養細胞及び胞子の位相差顕微鏡写真である。
【図２】K-No.3株とその近縁種との系統樹である。
【図３】実施例１〜３におけるK-No.3株含有そば殻堆肥によるフザリウム菌防除の結果を示すグラフである。（A)のパネルは、各実験区においてフザリウム菌感染培養土で生育したレタスの地上部の長さを示すグラフである。(B)のパネルは、各実験区においてフザリウム菌感染培養土で生育したレタスの地下部の導管褐変の本数を示すグラフである。
【図４】比較例１における各実験区のイメージ図である。
【図５】実施例４における各実験区のイメージ図である。
【図６】実施例４におけるK-No.3株含有そば殻堆肥によるフザリウム菌防除の結果を示すグラフである。（A)のパネルは、各実験区においてフザリウム菌感染培養土で生育したレタスの地上部の長さを示すグラフである。(B)のパネルは、各実験区においてフザリウム菌感染培養土で生育したレタスの地下部の導管褐変の本数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る植物病害防除剤は、植物病原菌に対する拮抗能力を有するバチルス属に属する細菌(以下、「バチルス属細菌」と称する)と農業系資材とを含有するものである。本発明に係る植物病害防除剤を、植物を生育させる土壌に施用し、植物を生育させることで、当該バチルス属細菌が植物の地下部周囲に生息することで、植物を植物病原菌の着生及び植物病害の発病から防御することができる。
【００１６】
ここで、本発明において使用するバチルス属細菌としては、植物病原菌に対する拮抗能力(又は、植物病原菌の感染又は増殖を抑制する能力)を有するものであれば、いずれのものであってよく、例えば、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・サブチリス等の種に属する細菌が挙げられ、バチルス・アミロリクエファシエンスK-No.3株(以下、「K-No.3株」と称する)が好ましい。植物病原菌に対する拮抗能力(又は、植物病原菌の感染又は増殖を抑制する能力)は、例えば、植物病原菌を塗抹した寒天培地上に当該バチルス属細菌を画線して阻止円の有無によって評価することができる。
【００１７】
K-No.3株は、浄化槽活性汚泥から単離された。単離方法は、希釈した浄化槽活性汚泥を寒天培地上に塗抹して出現したコロニーから単離した。
【００１８】
以下に単離したK-No.3株の生物学的性質を説明する。
K-No.3株について形態観察及び生理的性状試験を行うことで、K-No.3株の生物学的性質を特定した。結果を以下の表１に示す。また、図１に、K-No.3株の栄養細胞及び胞子の位相差顕微鏡写真を示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
一方、K-No.3株のDNAを抽出し、PCR法により16S rRNA領域のDNAを増幅した。増幅したDNAについて塩基配列を解析した。得られた塩基配列(配列番号１)を、国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL/GenBank)に登録されている塩基配列及びMicroSeq ID Analysis Software Version 2.0(Applied Biosystems社)のデータベースと相同性検索を行い、近縁種との系統樹を近隣結合法(NJ法)により作成した。16S rDNAに基づくK-No.3株の相同性検索結果を以下の表２に示し、且つ作成した系統樹を図２に示す。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
表２及び図２に示すように、K-No.3株はバチルス・ベレゼンシス(Bacillus velezensis)に最も近縁であった。しかしながら、表１に示すように、K-No.3株はTween20の加水分解並びにラクトース、メリビオース及びD-ラフィノースからの酸の生成において全て陽性であり、Ruiz-Garcia, C., Bejar, V., Martinez-Checa, F., Llamas, I. and Quesada, E.: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 191-195(2005)に記載のバチルス・ベレゼンシスの性状とは異なるものであった。
【００２３】
一方、バチルス・ベレゼンシスとその近縁菌であるバチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・アトロファエウス(Bacillus atrophaeus)、バチルス・サブチリス亜種サブチリス(Bacillus subtilis subsp. subtilis)、バチルス・バリスモルティス(Bacillus vallismortis)及びバチルス・モジャベンシス(Bacillus mojavensis)について、Ruiz-Garcia, C., Bejar, V., Martinez-Checa, F., Llamas, I. and Quesada, E.: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 191-195(2005)の記載に基づいて、表１に記載の上記性状を比較した結果、全て陽性を示すものはバチルス・アミロリクエファシエンスのみであった。
以上の結果から、K-No.3株はバチルス・アミロリクエファシエンスに属する菌株と判断した。
【００２４】
K-No.3株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)(〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に平成24年(2012年)7月31日付でブダペスト条約に基づいて国際寄託されており、その受託番号はNITE BP-1399である。
【００２５】
また、K-No.3株において、自然的又は人工的手段によって変異させて得られ、且つ植物病原菌に対する拮抗能力(又は、植物病原菌の感染又は増殖を抑制する能力)を有する変異株も本発明におけるバチルス属細菌として使用することができる。あるいは、配列番号１に記載のK-No.3株の16S rDNAの塩基配列と例えば90％以上、95％以上(好ましくは96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)の相同性を有する16S rDNAを有し、且つ植物病原菌に対する拮抗能力(又は、植物病原菌の感染又は増殖を抑制する能力)を有するバチルス属細菌も本発明におけるバチルス属細菌として使用することができる。
【００２６】
本発明で使用するK-No.3株等のバチルス属細菌の培養方法は、当該細菌が増殖できるものであれば、いずれのものであってよく、例えば、標準寒天培地(培地組成(1L当たり)：D(+)-グルコース8g、Nutrient Broth(Difco)8g、塩化ナトリウム6g、寒天17g及び蒸留水1L)に当該細菌を接種し、培養することが挙げられる。
【００２７】
上記培養における温度条件は、当該細菌の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定する。例えば、設定温度は15〜50℃、好ましくは32℃である。また培地のpHは、5〜9、好ましくは6.5に設定すればよい。
培養時間は、栄養源の量や種類により異なるが、通常1日以上、好ましくは2日である。
【００２８】
一方、本発明で使用する農業系資材とは、ケイ酸成分を含む穀物の殻を意味し、例えばその上で及び/又はその中でバチルス属細菌が生育できるものであればいずれのものであってよく、例えばそば殻、そば殻堆肥、籾殻等が挙げられ、そば殻又はそば殻堆肥が好ましく、特にそば殻堆肥が好ましい。
【００２９】
ここで、そば殻堆肥とは、そば殻に水分を含ませ、定期的に撹拌し、発酵させたものを意味する。そば殻堆肥としては市販のものを使用することができる。
【００３０】
以上に説明した、バチルス属細菌と農業系資材とを用いて、本発明に係る植物病害防除剤を製造することができる。例えば農業系資材としてそば殻堆肥を使用する場合には、そば殻堆肥50g〜200g(好ましくは、100g〜150g)に対して、バチルス属細菌107cfu/ml〜1011cfu/ml(好ましくは108cfu/ml〜1010cfu/ml)の菌液を40ml接種し、温度15〜50℃下で2〜14日間(好ましくは5〜7日間)培養する。培養後、得られた混合物を本発明に係る植物病害防除剤として使用することができる。また、本発明に係る植物病害防除剤には、バチルス属細菌及び農業系資材以外に、例えば、化学肥料（窒素、リン酸、カリウムなど）を添加することができる。
【００３１】
また、本発明に係る植物病害防除剤を植物が生育する土壌に施用することで、植物を、植物病原菌の着生及び植物病害の発病から防御することができる。
【００３２】
本発明において、防除対象の植物病原菌としては、フザリウム・オキシスポラム(フザリウム・オキシスポラムf.sp.ラクチュケ等)が挙げられる。
【００３３】
また、防除対象の植物病害としては、フザリウム・オキシスポラムf.sp.ラクチュケのレタスへの感染により引き起こされるレタス根腐病が挙げられる。レタス根腐病は、例えばレタスの根（地下部）の導管の褐変を指標として判断することができる。
【００３４】
特に、本発明においては、本発明に係る植物病害防除剤をフザリウム・オキシスポラムf.sp.ラクチュケの感染により引き起こされるレタス根腐病の防除のために使用することができる。
【００３５】
本発明に係る植物病害防除方法では、先ず、本発明に係る植物病害防除剤を、植物を生育させる土壌へ混和する。土壌への本発明に係る植物病害防除剤の混和量は、例えば土壌重量比10〜40％とする。
【００３６】
次いで、本発明に係る植物病害防除剤を混和した土壌に植物の幼苗等を植え付け、植物を生育させる。このようにして、植物病害から植物を防御する一方、植物を生育させることができる。
【００３７】
以上に説明する本発明に係る植物病害防除剤によれば、植物病害の防除を達成できる。同時に、本発明に係る植物病害防除剤によれば、そば殻堆肥等の農業系資材中に含まれる有機物等の成分により植物をより生育させることができる。また、そば殻堆肥は、バチルス属細菌及びその他の細菌を含有し、これら細菌と添加するバチルス属細菌(例えばK-No.3株)との相乗効果により、植物病害から植物を有意に防御することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
〔実施例で使用する材料の準備〕
(1) 標準寒天培地の作製
D(+)-グルコースを8g、ニュートリエントブイヨンを8g、塩化ナトリウムを6g、及び培地用寒天BA-10を17g量り取り、2Lビーカーに移して純水1Lを加え、約30分間加温溶解した。
【００４０】
溶解後、培地を50枚のシャーレにフィンガーディスペンサーにて20mlずつ分注し、サクラ小型高圧蒸気滅菌器内の滅菌カゴに分注済みのシャーレを設置し、121℃(1.2気圧)下で15分間、高圧蒸気滅菌を行った。
【００４１】
滅菌後、滅菌器の圧力計が0になっていることを確認して、滅菌カゴを取り出し、クリーンベンチ内にシャーレを移して、シャーレの蓋を僅かに開けて20分間静置した。
【００４２】
静置後、シャーレの蓋についている水分をJKワイパーで拭き取り、蓋を閉じて保管用のクリーンベンチへ培地含有シャーレを収納した。
【００４３】
(2) PDA培地の作製
PDA培地を39g量り取り、2Lビーカーに移して純水1Lを加え、約30分間加温溶解した。
溶解後、滅菌から収納までの操作を、上記の(1)標準寒天培地の作製と同様に行った。
【００４４】
(3) 滅菌水の作製
塩化ナトリウムを6g量り取り、1Lビーカーに移して純水1Lを加えて溶解した。
溶解後、100個の10ml三角フラスコにフィンガーディスペンサーにて塩化ナトリウム水溶液を10mlずつ分注し、適当な大きさに切ったアルミホイルで蓋をして、サクラ小型高圧蒸気滅菌器内の滅菌カゴに設置して121℃(1.2気圧)下で15分間、高圧蒸気滅菌を行った。
滅菌後、滅菌器の圧力計が0になっていることを確認して、滅菌カゴを取り出し、保管用のクリーンベンチへ塩化ナトリウム水溶液含有三角フラスコを収納した。
【００４５】
(4) PD培地の作製
PD培地を3.6g量り取り、200mlビーカーに移して純水150mlを加え、約10分間加温溶解した。
溶解後、培地を200ml三角フラスコ1個にメスシリンダーにて150ml分注して、バイオシリコで蓋をし、アルミホイルでバイオシリコを包んで高圧蒸気滅菌器内の滅菌カゴに設置して121℃(1.2気圧)下で15分間、高圧蒸気滅菌を行った。
滅菌後、滅菌器の圧力計が0になっていることを確認して、培地含有三角フラスコを滅菌カゴから取り出し、クリーンベンチ内で放冷した。
【００４６】
(5) 植菌用コーンラージ棒の滅菌
1Lビーカーにコーンラージ棒を適当な本数入れて、アルミホイルで蓋をした。
滅菌から収納までの操作を、上記の(3)滅菌水の作製と同様に行った。
【００４７】
(6) 植菌用シリンジの滅菌
1Lビーカーにシリンジを適当な本数入れて、アルミホイルで蓋をした。
滅菌から収納までの操作を、上記の(3)滅菌水の作製と同様に行った。
【００４８】
(7) フザリウム菌液(フザリウム・オキシスポラムf.sp.ラクチュケSB1-1株の菌液)の作製
予めPDA培地で培養しておいたフザリウム菌(フザリウム・オキシスポラムf.sp.ラクチュケSB1-1株)のコロニーをコルクボーラーで打ち抜き、その1片を10ml滅菌水に懸濁させて菌液とした。
【００４９】
PD培地100ml(比較例１及び実施例４では150ml)に菌液0.2mlをシリンジにて添加して、20℃に設定したインキュベーター内の振盪機にて130回/分で振盪培養を6〜7日間行った。  なお、PD培地は100ml×1本(実施例１以外では150ml×1本)とした。
【００５０】
培養後、培養液を、テーブルトップ遠心機に設置してある4本の沈殿管に移して、3000rpmで30分間遠心分離を行った。遠心分離後、上澄みを除去し、純水を加えて再度遠心分離を行った。
【００５１】
再度の遠心分離後、上澄みを除去して、沈殿物を200ml三角フラスコに移して、純水を加えて100ml(実施例１以外では150ml)としてフザリウム菌液とした。なお、菌液は1本作製した。
【００５２】
(8) 実施例１〜３で使用する資材の作製
(i) K-No.3株培養籾殻
保存してあるK-No.3株を白金耳にて少量かきとり、10ml滅菌水に懸濁させて懸濁液とした。
【００５３】
標準寒天培地のシャーレ5枚にシリンジにてK-No.3株懸濁液を0.1mlずつ分注して、コーンラージ棒で塗抹し、32℃に設定したインキュベーター内で2日間培養を行った。
培養後、培地に出現したコロニーをコーンラージ棒でかきとり、150ml滅菌水に懸濁させて菌液とした。
【００５４】
一方、深型シャーレ2本に籾殻50gを量り取った。
また、D(+)-グルコースを0.16g、ニュートリエントブイヨンを0.16g、及び塩化ナトリウムを0.12g量り取り、300mlビーカーに移して純水200mlを加え、約30分間加温溶解した。
【００５５】
加温溶解後、得られた培地を籾殻含有深型シャーレに100mlずつ移して、クリーンベンチ内でK-No.3株菌液10mlを滅菌済みピペットで添加し、32℃に設定したインキュベーター内で5〜7日間培養を行った。培養後、得られた培養物をK-No.3株培養籾殻とした。
【００５６】
(ii) K-No.3株含有そば殻堆肥
深型シャーレ2本にそば殻堆肥100g及び純水20mlを量り取った。
次いで、上記(i)で作製したK-No.3株菌液を、クリーンベンチ内でそば殻堆肥含有深型シャーレに20ml添加し、32℃に設定したインキュベーター内で5〜7日間静置した。得られた培養物をK-No.3株含有そば殻堆肥とした。
【００５７】
(iii) そば殻堆肥
そば殻堆肥は、そば殻に水分を含ませ、定期的に撹拌して発酵させたものである。
【００５８】
(9) 恒温槽
恒温槽として、恒温恒湿器(株式会社いすゞ製作所製)及び恒温恒湿器内ＬＥＤ照明ユニット（ＫＯＡ株式会社製）を使用した。
【００５９】
〔実施例１〕
1. 材料及び方法
1-1. フザリウム菌感染培養土の作製
培養土(太平園芸培土)約4kgを10Lステンレス容器に投入し、高圧蒸気滅菌器にて121℃下で60分間高圧蒸気滅菌を行った。
滅菌後、培養土を滅菌器内で放冷し、プラスチック容器に移し、フザリウム菌液20mlを混合した。得られた混合物をフザリウム菌感染培養土とした。
【００６０】
1-2. 定植用幼苗栽培
セルポットに未滅菌培養土(太平園芸培土)を充填し、そこにレタス種子(栽培品種：パトリオット(コーティング種子))を約50粒播種して、恒温槽内で14日間栽培した。得られた幼苗を定植用幼苗とした。
【００６１】
1-3. 各実験区の作製
本実施例における実験区を以下の表３に示す。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
(1) No.1(対照区)
フザリウム菌感染培養土1kgを10区画のポットへ充填した。
(2) No.2(K-No.3株培養籾殻区)
フザリウム菌感染培養土1kgにK-No.3株培養籾殻100gを混合し、10区画のポットへ充填した。
(3) No.3(そば殻堆肥区)
フザリウム菌感染培養土1kgにそば殻堆肥100gを混合し、10区画のポットへ充填した。
(4) No.4(K-No.3株含有そば殻堆肥区)
フザリウム菌感染培養土1kgにK-No.3株含有そば殻堆肥100gを混合し、10区画のポットへ充填した。
【００６４】
1-4. 定植
播種後14日間栽培した幼苗の地下部を水洗いした後、当該幼苗を各実験区のポットへ定植し、恒温槽内で21日間栽培した。恒温槽の設定は、温度：25℃、湿度：80％、CO2濃度：500ppm、LED光量子密度：89.9μmol/m2/S及び照明時間：14時間とした。
【００６５】
1-5. 判定
定植後21日目の各実験区の感染培養土よりレタスを薬さじで感染培養土ごと抜き取り、水道水で地下部を水洗いした。
水洗いしたレタスの地上部と地下部を切断して、地上部は長さを測定し、地下部は導管が茶色になっているか否かを確認した。
【００６６】
2. 結果                    
各実験区の判定時に採取したレタス地上部の長さ(cm)の平均及びレタス地下部の導管褐変の本数を以下の表４及び図３に示す。
【００６７】
【表４】
2014043421.tif 000006
【００６８】
3. 考察
No.1区(対照区)で全て（10本）の枯れが確認され、No.2区(K-No.3株培養籾殻区)では枯れが2本、No.3区(そば殻堆肥区)及びNo.4区(K-No.3株含有そば殻堆肥区)では枯れが0本であったため、資材はフザリウム菌に対する防除効果を有すると考えられた。
【００６９】
導管の色については、対照区では全てが褐色に変色し、K-No.3株培養籾殻区では6本、そば殻堆肥区及びK-No.3株含有そば殻堆肥区では1本が褐色に変色した。このことからも資材はフザリウム菌に対する防除効果を有すると考えられた。
【００７０】
レタスの生育については、地上部の長さからそば殻堆肥区が最も良く、次いで、K-No.3株含有そば殻堆肥区、K-No.3株培養籾殻区となり、最も生育が悪かったのは対照区であった。これは、そば殻堆肥に含まれている成分によりレタスの生育が良かったと考えられた。
【００７１】
〔実施例２〕
1. 材料及び方法
フザリウム菌感染培養土の作製の際に、培養土へのフザリウム菌液の添加量を実施例１に対して2倍量(40ml)とし、且つ定植後の栽培を20日間とした以外は、実施例１と同様の方法で実験を行った。
本実施例における実験区を以下の表５に示す。
【００７２】
【表５】
2014043421.tif 000007
【００７３】
2. 結果            
各実験区の判定時に採取したレタス地上部の長さ(cm)の平均及びレタス地下部の導管褐変の本数を以下の表６及び図３に示す。
【００７４】
【表６】
2014043421.tif 000008
【００７５】
3. 考察
No.1区(対照区)で全て(10本)の枯れが確認され、No.2〜No.4区(それぞれ、K-No.3株培養籾殻区、そば殻堆肥区及びK-No.3株含有そば殻堆肥区)については枯れが確認されなかった。
【００７６】
導管の変色についてはNo.1区で10本、No.2区で0本、No.3区及びNo.4区で2本となり、資材を混合した区において導管の変色が少なかった。従って、資材は、フザリウム菌に対する防除効果を有すると考えられた。
【００７７】
〔実施例３〕
1. 材料及び方法
フザリウム菌感染培養土の作製の際に、培養土へのフザリウム菌液の添加量を実施例１に対して10倍量(200ml)とし、幼苗栽培の期間を12日間とした以外は、実施例１と同様の方法で実験を行った。
本実施例における実験区を以下の表７に示す。
【００７８】
【表７】
2014043421.tif 000009
【００７９】
2. 結果         
各実験区の判定時に採取したレタス地上部の長さ(cm)の平均及びレタス地下部の導管褐変の本数を以下の表８及び図３に示す。
【００８０】
【表８】
2014043421.tif 000010
【００８１】
3. 考察
レタスの枯れについて、No.1区(対照区)及びNo.2区(K-No.3株培養籾殻区)は10本、No.3区(そば殻堆肥区)及びNo.4区(K-No.3株含有そば殻堆肥区)は9本確認された。
【００８２】
各資材を混合した区においてもレタスの生育が悪くなり、導管の変色も増加した。これは、フザリウム菌液の添加量を50mlにした場合、防除しきれていないと考えられた。
【００８３】
しかし、No.3区のそば殻堆肥を混合した区、No.4区のK-No.3株含有そば殻堆肥を混合した区において、地上部の長さから他の区よりもレタスの生育が良くなる傾向にあった。
【００８４】
〔比較例１〕
1. 材料及び方法
1-1. 定植用幼苗栽培
セルポットに未滅菌培養土(太平園芸培土)を充填し、レタス種子(栽培品種：パトリオット(コーティング種子))を約60粒播種して、恒温槽内で13日間栽培した。得られた幼苗を定植用幼苗とした。
【００８５】
1-2. 各資材の作製
(1) 滅菌そば殻堆肥
そば殻堆肥110gを深型シャーレに量り取り、高圧蒸気滅菌器にて121℃(1.2気圧)下で60分間高圧蒸気滅菌を行い、堆肥中の菌体を死滅させた。
滅菌後、滅菌器の圧力が0になったことを確認した後、クリーンベンチ内で堆肥を放冷し、滅菌そば殻堆肥とした。
【００８６】
(2) 熱処理そば殻堆肥
そば殻堆肥110gを深型シャーレに量り取り、乾燥機にて85℃下で60分間熱処理を行い、堆肥中のバチルス菌以外の菌体を死滅させた。
熱処理後、クリーンベンチ内で堆肥を放冷し、熱処理そば殻堆肥とした。
【００８７】
1-3. フザリウム菌感染培養土の作製
培養土(太平園芸培土)約4kgをステンレス容器に投入し、高圧蒸気滅菌器にて121℃（1.2気圧)下で60分間高圧蒸気滅菌を行った。
【００８８】
滅菌後、滅菌器の圧力計が0になっていることを確認して、滅菌器内で培養土を放冷し、プラスチック容器に移し、フザリウム菌液40mlを混合した。得られた混合物をフザリウム菌感染培養土とした。
【００８９】
1-4. 各実験区の作製
本比較例における各実験区を以下の表９に示す。また、各実験区のイメージ図を図４に示す。
【００９０】
【表９】
2014043421.tif 000011
【００９１】
(1) No.1区
フザリウム菌感染培養土1kgを10区画のポット1枚へ充填した。
(2) No.2区
フザリウム菌感染培養土1kgに滅菌そば殻堆肥100gを混合し、10区画のポット1枚へ充填した。
(3) No.3区
フザリウム菌感染培養土1kgに熱処理そば殻堆肥100gを混合し、10区画のポット1枚へ充填した。
(4) No.4区
フザリウム菌感染培養土1kgに未処理そば殻堆肥100gを混合し、10区画のポット1枚へ充填した。
【００９２】
1-5. 定植
播種後13日間栽培した幼苗の地下部を水洗いした後、各実験区のポットへ定植し、恒温槽内で21日間栽培した。恒温槽の設定は、温度：25℃、湿度：80％、CO2濃度：500ppm、LED光量子密度：89.9μmol/m2/S及び照明時間：14時間とした。
【００９３】
1-6. 判定
定植後21日目の各実験区の感染培養土よりレタスを薬さじで感染培養土ごと抜き取り、水道水で地下部を水洗いした。
水洗いしたレタスの地上部と地下部を切断して、地上部は長さを測定し、地下部は導管が茶色になっているか否かを確認した。
【００９４】
2. 結果      
各実験区の判定時に採取したレタス地上部の長さ(cm)の平均及びレタス地下部の導管褐変の本数を以下の表１０及び図６に示す。
【００９５】
【表１０】
2014043421.tif 000012
【００９６】
レタス地上部長さについては、No.4区が7.4cmで最も長く、次いでNo.2区及びNo.3区が2.8cmであり、最も短かった区はNo.1区で1.8cmであった。
【００９７】
導管の色については、No.1区、No.2区及びNo.3区は10本全てで褐色が確認され、一方、No.4区は8本となり、他の区よりも少ない結果となった。
【００９８】
3. 考察
滅菌を行ったそば殻堆肥区及び熱処理を行ったそば殻堆肥区では、レタスの枯れが多く、生育も悪かったが、未処理のそば殻堆肥区では、レタスの枯れが少なく、最も生育が良かった。これは、そば殻堆肥において無菌でもバチルス菌だけでもフザリウム菌に対する防除が困難であり、バチルス菌を含む多種の菌体がそば殻堆肥中に存在することで生育が良かったと考えられた。
【００９９】
〔実施例４〕
1. 材料及び方法
1-1. 定植用幼苗栽培
セルポットに未滅菌培養土(太平園芸培土)を充填し、レタス種子(栽培品種：パトリオット(コーティング種子))を約60粒播種して、恒温槽内で13〜14日間栽培した。得られた幼苗を定植用幼苗とした。
【０１００】
1-2. 各資材の作製
(1) K-No.3株含有滅菌そば殻堆肥
そば殻堆肥110gを深型シャーレに量り取り、高圧蒸気滅菌器にて121℃(1.2気圧)下で60分間高圧蒸気滅菌を行い、堆肥中の菌体を死滅させた。
【０１０１】
滅菌後、滅菌器の圧力が0になったことを確認した後、クリーンベンチ内で堆肥を放冷し、K-No.3株菌液10ml及び滅菌水(塩化ナトリウム無し）30mlを添加し、混合した後、32℃のインキュベーター内で14日間静置した。得られた培養物をK-No.3株含有滅菌そば殻堆肥とした。
【０１０２】
(2) K-No.3株含有熱処理そば殻堆肥
そば殻堆肥110gを深型シャーレに量り取り、乾燥機にて85℃下で60分間熱処理を行い、堆肥中のバチルス菌以外の菌体を死滅させた。
【０１０３】
熱処理後、クリーンベンチ内で堆肥を放冷して、K-No.3株菌液10ml及び滅菌水(塩化ナトリウム無し)30mlを添加し、混合した後、32℃のインキュベーター内で14日間静置した。得られた培養物をK-No.3株含有熱処理そば殻堆肥とした。
【０１０４】
(3) K-No.3株含有未処理そば殻堆肥
そば殻堆肥110gを深型シャーレに量り取り、K-No.3株菌液10ml及び滅菌水(塩化ナトリウム無し)30mlを添加し、混合した後、32℃のインキュベーター内で14日間静置した。得られた培養物をK-No.3株含有未処理そば殻堆肥とした。
【０１０５】
1-3. フザリウム菌感染培養土の作製
培養土(太平園芸培土)約4kgをステンレス容器に投入し、高圧蒸気滅菌器にて121℃（1.2気圧)下で60分間高圧蒸気滅菌を行った。
【０１０６】
滅菌後、滅菌器の圧力計が0になっていることを確認して、滅菌器内で培養土を放冷し、プラスチック容器に移し、フザリウム菌液(SB1-1株菌液）40mlを混合した。得られた混合物をフザリウム菌感染培養土とした。
【０１０７】
1-4. 各実験区の作製
本実施例における各実験区を以下の表１１に示す。また、各実験区のイメージ図を図５に示す。
【０１０８】
【表１１】
2014043421.tif 000013
【０１０９】
(1) No.1(対照区)
フザリウム菌感染培養土を10区画のポット1枚へ充填した。
(2) No.2(K-No.3株含有滅菌そば殻堆肥区)
フザリウム菌感染培養土1kgにK-No.3株含有滅菌そば殻堆肥100gを混合し、10区画のポット1枚へ充填した。
(3) No.3(K-No.3株含有熱処理そば殻堆肥区)
フザリウム菌感染培養土1kgにK-No.3株含有熱処理そば殻堆肥100gを混合し、10区画のポット1枚へ充填した。
(4) No.4(K-No.3株含有未処理そば殻堆肥区)
フザリウム菌感染培養土1kgにK-No.3株含有未処理そば殻堆肥100gを混合し、10区画のポット1枚へ充填した。
【０１１０】
1-5. 定植
播種後13〜14日間栽培した幼苗の地下部を水洗いした後、各実験区のポットへ定植し、恒温槽内で20〜21日間栽培した。
【０１１１】
1-6. 判定
定植後22日目の各実験区の感染培養土よりレタスを薬さじで感染培養土ごと抜き取り、水道水で地下部を水洗いした。
水洗いしたレタスの地上部と地下部を切断して、地上部は長さを測定し、地下部は導管が茶色になっているか否かを確認した。
【０１１２】
2. 結果     
各実験区の判定時に採取したレタス地上部の長さ(cm)の平均及びレタス地下部の導管褐変の本数を以下の表１２及び図６に示す。
【０１１３】
【表１２】
2014043421.tif 000014
【０１１４】
レタスの枯れについては、No.1区(対照区)及びNo.2区(K-No.3株含有滅菌そば殻堆肥区)は10本中10本全てで枯れが確認され、No.3区(K-No.3株含有熱処理そば殻堆肥区)は3本、No.4区(K-No.3株含有未処理そば殻堆肥区)は5本の枯れとなった。
【０１１５】
レタス地上部長さについては、No.3区が12.0cmで最も長く、次いでNo.4区が8.7cmであり、No.2区が6.1cmであり、最も短かった区はNo.1区で2.3cmであった。
【０１１６】
また、比較例１の実験結果と本実施例の実験結果との比較を下記の表１３に示す。表１３において、「K-No.3株無し」が比較例１の実験結果であり、「K-No.3株有り」が本実施例の実験結果である。
【０１１７】
【表１３】
2014043421.tif 000015
【０１１８】
比較例１のK-No.3株無しの各そば殻堆肥区との比較では、熱処理そば殻堆肥にK-No.3株を培養させたことによって枯れが少なくなることが確認できた。また、各そば殻堆肥ともK-No.3株を培養させることによって、生育(地上部の長さ(cm)の平均)が良くなることが確認できた。
【０１１９】
3. 考察
比較例１との比較において、滅菌処理したそば殻堆肥にK-No.3株を培養させたものは、枯れ数に変化は無かったが、生育は良かった。これは、K-No.3株を培養させたことにより、フザリウム菌の感染が遅れたことで枯れ数に変化が無くても生育が良かったと考えられた。しかしながら、レタスが枯れてしまったことから、K-No.3株単一菌体では防除は困難であると考えられた。
【０１２０】
また、比較例１との比較において、熱処理したそば殻堆肥にK-No.3株を培養させたものは、枯れ数が少なくなり、生育も良かった。これは、そば殻堆肥中のバチルス菌とK-No.3株の相乗効果により、枯れ数が少なくレタスの生育も良かったと考えられた。従って、K-No.3株を含む複数のバチルス菌が存在することによりフザリウム菌に対する防除効果が高くなると考えられた。
【０１２１】
さらに、比較例１との比較において、未処理のそば殻堆肥にK-No.3株を培養させたものは、枯れ数に変化は無かったが、生育が良かった。これは、そば殻堆肥中のバチルス菌を含む多種の菌体とK-No.3株によりフザリウム菌の感染が遅れ、枯れ数に変化が無くても生育が良かったと考えられた。なお、熱処理したそば殻堆肥よりも枯れ数が多く、生育が悪かったことから、そば殻堆肥中のバチルス菌以外の菌体が存在しているとフザリウム菌に対する防除効果は、若干低くなると考えられた。
【受託番号】
【０１２２】
NITE BP-1399
【図１】
2014043421.tif 000016
【図２】
2014043421.tif 000017
【図３】
2014043421.tif 000018
【図４】
2014043421.tif 000019
【図５】
2014043421.tif 000020
【図６】
2014043421.tif 000021
【配列表】
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