(57)【要約】【課題】開口数が小さなコンパクトな構成でありながらも、物体面に密度の高い格子状の照明光強度分布を形成することができる顕微鏡用照明光学系を実現する。【解決手段】、顕微鏡用照明光学系２００は、物体面２０７に配置された試料を観察する顕微鏡において該物体面を照明する。該照明光学系は、その瞳面２０３に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、該複数の光源領域のそれぞれの中心と該照明光学系の瞳の中心との距離のうち、少なくとも１つの距離が他の距離と異なっている。照明光学系が物体面よりも瞳面側に形成する格子状の第１の照明光強度分布に対してその格子周期の半分だけずれた第２の照明光強度分布を形成し、物体面に第１および第２の照明光強度分布を重ね合わせた第３の照明光強度分布を形成する構成２０６を有する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
物体面に配置された試料を観察する顕微鏡において前記物体面を照明する照明光学系であって、
該照明光学系の瞳面に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、
前記複数の光源領域のそれぞれの中心と該照明光学系の瞳の中心との距離のうち、少なくとも１つの距離が他の距離と異なっており、
該照明光学系が前記物体面よりも前記瞳面側に形成する格子状の第１の照明光強度分布に対してその格子周期の半分だけずれた第２の照明光強度分布を形成し、前記物体面に前記第１および第２の照明光強度分布を重ね合わせた第３の照明光強度分布を形成する構成を有すること特徴とする顕微鏡用照明光学系。
【請求項２】
前記試料が自家発光体であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡用照明光学系。
【請求項３】
前記自家発光体である試料の発光機構が蛍光または燐光であることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡用照明光学系。
【請求項４】
透過型顕微鏡または落射型顕微鏡に用いられることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡用照明光学系。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡用照明光学系と、
該顕微鏡用照明光学系により照明された物体面に配置された試料を観察するための対物光学系とを有することを特徴とする顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡において試料を照明する顕微鏡用照明光学系に関し、特に３次元蛍光顕微鏡に好適な顕微鏡用照明光学系に関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡、特に蛍光顕微鏡による生体試料の観察は、医学への応用を含む生物学的研究にとって不可欠である。ただし、通常の蛍光顕微鏡で厚みのある試料を観察すると、試料内部の光が透過した全ての高さ位置にある画像が重畳された画像が観察される。つまり、ピントが合っている高さ位置の平面（合焦平面）の画像以外に、ピントが外れた高さ位置にある平面（非合焦平面）のぼけ画像が重畳されて観察される。このように、通常の蛍光顕微鏡においては、所望の合焦平面の画像だけを選択的に分離して取り出すことができない。所望の合焦平面の画像だけを選択的に分離して取り出す効果は、「セクショニング効果」と呼ばれている。
【０００３】
種々の機構に基づいてセクショニング効果が得られるように構成された蛍光顕微鏡は、３次元蛍光顕微鏡と称され、通常の蛍光顕微鏡とは区別される。セクショニング効果があると、任意の合焦面の画像を計算機上で積層して立体的な３次元画像を作り出すことができる。すなわち、これまで経験豊富な病理医等が脳内で行っていた細胞配置の立体視が、デジタル処理によって誰にでも行えるようになる。
【０００４】
代表的な３次元蛍光顕微鏡として、共焦点顕微鏡がある。これは、合焦平面から来る光の集光点にピンホールを配置することにより、所望の合焦平面から来る光のみを通過させ、非合焦平面から来る収束度合いの緩い光を遮蔽する方式である。この方式は、高いセクショニング効果を持つが、一度に撮像できる領域が点状に狭いため、試料の全領域を観察するためには走査が必要である。
【０００５】
一方、計算機による画像処理を援用してセクショニング効果を実現する方法として、構造化照明法がある（非特許文献１参照）。この方式では、物体面において照明強度が、例えば正弦波上に変化するような状況を作り、その位相をずらすことによって正弦波構造が平行移動した複数枚の画像を取得する。その後、計算機上でその複数枚の画像を処理することによりセクショニング効果を得る。この方式は、高い精度で位相、すなわち位置を制御された正弦波構造を作り出すことが必要である。
【０００６】
さらにランダムに生成されたスペックルを照明として利用する方法も知られている（特許文献１および非特許文献２〜６参照）。この方法もまた計算機による画像処理を用いるが、物体面の照明強度がランダムなスペックルに依存するため、最終画像に不均一な強度むらが発生することが避けられないという欠点を持つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許公開２０１０／０２２４７９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】M. A. A. Neil and T. Wilson, “Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope,” Opt. Lett. 22, 1905 (1997).
【非特許文献２】C. Ventalon and J. Mertz, “Quasi-confocal fluorescence sectioning with dynamic speckle illumination,” Opt. Lett. 30, 3350-3352 (2005).
【非特許文献３】C. Ventalon and J. Mertz, “Dynamic speckle illumination microscopy with translated versus randomized speckle patterns,” Opt. Express 14, 7198-7209 (2006).
【非特許文献４】C. Ventalon, R. Heintzmann, and J. Mertz, “Dynamic speckle illumination microscopy with wavelet prefiltering,” Opt. Lett. 32, 1417-1419 (2007).
【非特許文献５】Daryl Lim, Kengyeh K. Chu, and Jerome Mertz,“Wide-field fluorescence sectioning with hybrid speckle and uniform-illumination microscopy,” Opt. Lett. 33, 1819-1821 (2008).
【非特許文献６】Daryl Lim, N.Ford,Kengyeh K. Chu, and Jerome Mertz,“Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy”Journal of Biomedical Optics. 16, 016014 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者は、物体面の走査や照明系における高度な精度が不要でありながらも高品質なセクショニング効果を持つ顕微鏡用照明光学系として、その瞳面に複数のコヒーレント光源を非対称に配置した照明光学系を提案している。言い換えれば、瞳面に互いにコヒーレントな複数の光源領域を互いに離して配置し、該複数の光源領域のそれぞれの中心と該照明光学系の瞳の中心との距離のうち少なくとも１つの距離を他の距離と異ならせた照明光学系を提案している。この照明光学系によれば、物体面は格子状の照明光強度分布で照明されることになる。
【００１０】
非特許文献５，６の記載によると、格子状の照明の間隔（ピッチ）は狭い方が水平方向の分解能を高くすることができるので望ましいとされ、このことは、瞳面上で光源領域間の距離を大きくすることに相当する。
【００１１】
しかしながら、実際には、瞳の大きさ（半径）は照明光学系の開口数で決まる有限の大きさを持つため、光源領域間の距離にも上限がある。開口数を大きくすると、照明光学系が大型化するため、コンパクトな照明光学系を実現することが難しくなる。
【００１２】
本発明は、開口数が小さなコンパクトな構成でありながらも、物体面に密度の高い格子状の照明光強度分布を形成することができ、解像度の高い顕微鏡を実現できるようにした顕微鏡用照明光学系およびこれを用いた顕微鏡を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一側面としての顕微鏡用照明光学系は、物体面に配置された試料を観察する顕微鏡において該物体面を照明する。該照明光学系は、その瞳面に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、該複数の光源領域のそれぞれの中心と該照明光学系の瞳の中心との距離のうち、少なくとも１つの距離が他の距離と異なっている。そして、該照明光学系が物体面よりも瞳面側に形成する格子状の第１の照明光強度分布に対してその格子周期の半分だけずれた第２の照明光強度分布を形成し、物体面に第１および第２の照明光強度分布を重ね合わせた第３の照明光強度分布を形成する構成を有すること特徴とする。
【００１４】
なお、上記顕微鏡用照明光学系と、該顕微鏡用照明光学系により照明された試料を観察するための対物光学系とを有する顕微鏡も、本発明の他の一側面を構成する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、開口数が小さなコンパクトな構成でありながらも、物体面に密度の高い格子状の照明光強度分布を形成することができる顕微鏡用照明光学系を実現することができる。そして、この顕微鏡用照明光学系を用いることで、高い解像度を有する顕微鏡を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の前提技術における瞳関数Ｐと、該Ｐを用いたときの試料中のｚ＝０μｍの平面における照明光強度分布とを示す図。
【図２】図１の瞳に対して半分の大きさの開口数を持つ瞳に、図１の瞳関数を縮小投影したときの瞳関数と、それを用いたときの試料中のｚ＝０μｍの平面における照明光強度分布とを示す図。
【図３】ラインアンドスペースを表す図。
【図４】図１で示される照明を用いて図３のパターンを撮像したときのｙ＝０μｍの断面における強度分布をシミュレーションした図。
【図５】図２で示される照明を用いて図３のパターンを撮像したときのｙ＝０μｍの断面における強度分布をシミュレーションした図。
【図６】複屈折性結晶の作用を模式的に示す図。
【図７】本発明の実施例である照明光学系の透過型蛍光顕微鏡に対する適用例を示す図。
【図８】本発明の実施例１における瞳関数とその瞳関数を持った照明光学系によって形成される、試料中のｚ＝０μｍの平面における照明光強度分布を示す図。
【図９】複屈折結晶の作用によって生じる格子状照明の形状変化を模式的に表す図。
【図１０】図８（ｂ）に示される照明光強度分布に複屈折結晶の作用を加えた照明光強度分布を表す図。
【図１１】図８（ｂ）に示される照明光学強度分布で図３のパターンを撮像したときの試料中のｙ＝０μｍの断面における強度分布をシミュレーションした図。
【図１２】図８（ｂ）に示される照明光学強度分布に複屈折結晶の作用を加えて図３のパターンを撮像したときの試料中のｙ＝０μｍの断面における強度分布をシミュレーションした図。
【図１３】実施例の瞳関数を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施例について図面を参照しながら説明する。
【００１８】
本発明の実施例である顕微鏡用照明光学系は、例えば、発光機構が蛍光または燐光である自家発光体としての試料を観察する３次元顕微鏡に適用することができる。顕微鏡のタイプとしては、落射型顕微鏡および透過型顕微鏡のいずれでもよい。
【００１９】
具体例として、実施例の顕微鏡用照明光学系は、デジタルスライドスキャナーに使用する被検サンプルである蛍光染色された試料を観察する顕微鏡に適用することができる。デジタルスライドスキャナーは、生物学や病理学的検査等で使用するプレパラートを高速でスキャンし、高解像度なデジタルデータに変換する装置である。さらに、実施例の顕微鏡用照明光学系は、例えば、開口数（ＮＡ）の大きな投影光学系を備えるデジタルスライドスキャナーや通常の蛍光顕微鏡にセクショニング効果を付与する手段として使用し得る。
【００２０】
まず、本発明の前提技術となる、本発明者が提案している顕微鏡用照明光学系について説明する。この照明光学系では、該照明光学系の瞳面上での瞳関数（振幅分布）Ｐ（ｆ，ｇ）として、図１（ａ）に示すＰ（ｆ，ｇ）を用いる。Ｐ（ｆ，ｇ）は、照明光学系の半径１で規格化された瞳面での直交座標系において、以下の座標の式（１）で示す瞳内の３点または該３点が作る三角形と相似な三角形の３頂点に、互いにコヒーレントな点光源を配置することを特徴とする。
（−１／√２＋ａ，１／√２＋ｂ）
（−１／√２＋ａ，−１／√２＋ｂ）
（１／√２＋ｂ，−１／√２＋ａ）    ．．．（１）
これら座標中のａ，ｂは実数である。
【００２１】
言い換えれば、瞳関数Ｐ（ｆ，ｇ）では、図１３に示すように、照明光学系の瞳面に互いにコヒーレントな複数の光源領域Ａ，Ｂ，Ｃが互いに離れて配置されている。そして、該複数の光源領域Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれの中心ｃＡ，ｃＢ，ｃＣと該照明光学系の瞳の中心ｃＰとの距離ｄＡ，ｄＢ，ｄＣのうち、少なくとも１つの距離が他の距離と異なる。ここにいう光源領域は、微小な領域を有するとみなせる点光源も含む。また、光源領域は、瞳の半径に対する大きさの割合が０．３未満の領域であることが好ましい。少なくとも１つの距離が他の距離と異なるとは、すべての距離が異なっていてもよいし、１つの距離のみが他の２以上の同じ距離と異なっていてもよいという意味である。このような複数のコヒーレント光源の原点（瞳の中心）に対する非対称な配置は、３次元顕微鏡におけるｚ方向での分解能を獲得するために意図的になされたものである。
【００２２】
瞳関数（振幅分布）Ｐ（ｆ，ｇ）を用いて実際にできる物体面上での格子状の照明光強度分布を図１（ｂ）に示す。
【００２３】
前述したようにこのような格子状照明における格子間隔（ピッチ）はできるだけ狭いほうが望ましい。しかし、実際には機械的な配置スペース上の制約等によって大きな開口数を有する大型の照明光学系を用意できないことも考えられる。その場合でも水平方向の解像度を低下させないようにする必要がある。
【００２４】
図２（ａ）には、図１（ａ）に示した点光源配置をその半分の開口数の瞳内に縮小したときの点光源配置を示す。外側の円は半径１に規格化された瞳の範囲を、内側の円はその半分の大きさ（径）に縮小された瞳の範囲を示す。また、図２（ａ）の点光源配置に対応する物体面での格子状の照明光強度分布を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）を図１（ｂ）と比較すると、明らかに、１つ１つの輝点が大きくなっており、その周期も二倍に拡大されている。
【００２５】
このように格子状照明のピッチが変化したときに水平方向の解像度がどのくらい変化するかを評価するために、図３に示すようなラインアンドスペースパターンの蛍光物体を考える。線幅ないしハーフピッチは１μｍである。
【００２６】
図１（ｂ）に示した照明と図２（ｂ）に示した照明を用いて、図３に示したパターンを撮像したときのコントラスト（ここでは、ｙ＝０μｍの断面で見たときの強度分布）をシミュレーションする。図４には図１（ｂ）に示した照明を用いたときのコントラストを、図５には図２（ｂ）に示した照明を用いたときのコントラストを示す。両者のコントラストの差は明らかであり、図４の方が圧倒的に高コントラストであり、水平方向解像力が高い。したがって、格子状照明のピッチが図２（ｂ）の照明より狭い図１（ｂ）の照明を用いた方が良い。
【００２７】
しかし、実際には前述のように配置スペース上の都合等によって図１（ａ）に代表されるような大きな瞳を持った照明光学系を実現できないことも多い。
【００２８】
そこで、本実施例では、図２（ａ）に示すように小さな径の瞳内に複数のコヒーレント光源を配置しつつ、複屈折結晶等の簡易な構成を用いて、密度の高い格子状照明を物体面に形成する。複屈折結晶を用いる場合は、それが有する複屈折現象によって発生した異常光線により、元の正常光線が形成する格子状照明（第１の照明光強度分布）に対してその格子周期の半分だけずれた格子状照明（第２の照明光強度分布）を別に形成する。そして、これら正常光線および異常光線がそれぞれ形成した格子状照明を格子周期が互いに半周期だけずれたまま重ね合わせることによって、より密度の高い二重格子状照明（第３の照明光強度分布：以下、二重格子状の照明光強度分布ともいう）を物体面に形成する。
【００２９】
方解石等に代表される複屈折材料は、光の偏光方向に応じて光の進路を２つに分離する。この様子を図６に示す。紙面に垂直な面を複屈折性結晶のへき開面とすると、紙面に平行に振動している光と垂直に振動している光はそれぞれ、図中に示す正常光線と異常光線となって２つに分かれ、結晶平板を通過した後、再び結晶平板に垂直な方向に進行する。この両方の光の強度を揃えるためには、例えば、紙面に平行な方向と紙面に垂直な方向の両方の成分を等しい強度で持つような斜めの直線偏光を用意しておけばよい。また、結晶平板の厚さは、格子状照明のずれ量が格子状照明の格子周期の半分になるように設定する。このような結晶平板を、試料が配置される物体面よりも瞳面側に配置する。
【００３０】
また、上記のように複屈折結晶を用いる構成以外の構成として、瞳面上の点光源を２組の互いにインコヒーレントな点光源の組とする構成によって、上述した第１および第２の照明光強度分布を形成し、これらを重ね合わせた第３の照明光強度分布を実現してもよい。さらに、時間差をあけて２回の露光を行い、それぞれの回ごとの照明光強度分布（第１および第２の照明光強度分布）が格子状照明の格子周期の半分だけ横ずれしている状況（つまりは第３の照明光強度分布）を実現する構成を採用してもよい。
【００３１】
以上説明したように、本実施例による顕微鏡用照明光学系によれば、非特許文献５，６６に記載の方法と合わせて用いることで、コンパクトな照明光学系により高い水平方向解像力を持った画像を得ることが可能になる。
【００３２】
次に、３次元蛍光顕微鏡における本実施例の照明光学系の好適な配置例を図７を用いて説明する。ここでは、二重格子状の照明光強度分布を形成するための構成として、複屈折結晶を用いた場合について説明する。図７において、１００は透過型３次元蛍光顕微鏡である。
【００３３】
２００は照明光学系であり、対物レンズ１０２およびイメージセンサ１０３により構成される顕微鏡本体に対して付加することができる構成を有する。２０７は物体面に配置された物体（試料）である。
【００３４】
照明光学系２００において、２０１はコヒーレントな光源であり、蛍光試料を励起できる波長のレーザー等を用いることができる。２０２は回折格子、プリズムまたは光ファイバ等の光学素子であり、光源２０１から発せられた１本のビームを複数本（例えば、３本）に分ける作用を有する。光学素子２０２は、上記回折格子やプリズム等に限られず、照明光学系２００の瞳面２０３に対して本実施例が特徴とする瞳関数形状を実現できるものであればどのようなものでもよい。本実施例における瞳関数形状の形成方法は、顕微鏡または半導体露光装置に関する技術者にとっては容易な方法により実現可能であり、例えば、計算機生成ホログラム（ＣＧＨ）を利用することができる。
【００３５】
分けられたビームはミラー２０４を介してレンズ２０５および複屈折結晶２０６を通過して、物体２０７を二重格子状の照明光強度分布によって照明する。物体２０７から出た蛍光は、対物レンズ（対物光学系）１０２を通過してイメージセンサ１０３上に結像する。イメージセンサ１０３による撮像によって得られ、不図示のモニタに表示された画像が観察者によって観察される。
【００３６】
このように、本実施例の照明光学系は、簡易な構成によって物体面を格子間隔が狭い二重格子状の照明光強度分布で照明することができる。また、本実施例の照明光学系は、通常の３次元蛍光顕微鏡に付加（後付け）することができる。さらに、本実施例の照明光学系を用いれば、格子状の照明光強度分布が若干位置ずれしても、それを含む領域で積算されるため、最終の画質に影響を及ぼさない。
【００３７】
以下、上述した複屈折結晶を含む顕微鏡用照明光学系のより具体的な実施例について説明する。
【実施例１】
【００３８】
実施例１は、図７で示されるような構成を有する顕微鏡用照明光学系であって、光学パラメタとして、波長λ＝５００ｎｍ、ＮＡ＝０．７を有する。物体としては、図３に示したラインアンドスペースパターンを採用する。該照明光学系の瞳関数は、図１（ａ）に示すように、瞳内に以下の座標の式（２）で示される３点または該３点が作る三角形と相似な三角形の３頂点に互いにコヒーレントな点光源を配置したものとして表される。式（２）中のａ，ｂは、ａ＝０．２、ｂ＝０．１である。これは、図８（ａ）に示されるように、図１（ａ）の約半分の半径の瞳内に収まる点光源配置を示す。
（−１／２√２＋ａ，１／２√２＋ｂ）
（−１／２√２＋ａ，−１／２√２＋ｂ）
（１／２√２＋ｂ，−１／２√２＋ａ）    ．．．（２）
図８（ｂ）には、この照明光学系（複屈折結晶の挿入前）によって物体面に形成される格子状照明（第１の照明光強度分布）を示している。
【００３９】
図９には、照明光学系における物体面よりも瞳面側の位置に複屈折結晶を挿入する前と挿入した後の照明形状の変化を示している。複屈折結晶の挿入前後を示す図において、黒く塗りつぶした楕円が複屈折結晶を通過した正常光線により形成された格子状照明（第１の照明光強度分布）を示す。また、複屈折結晶の挿入後を示す図において、ハッチングにより示した楕円が複屈折結晶で発生した異常光線により形成された格子状照明（第２の照明光強度分布）を示す。そして、これら黒く塗りつぶした楕円とハッチングした楕円との重なり合いにより形成される密度の高い、つまりは格子間隔が小さい二重格子状照明（第３の照明光強度分布）となる。複屈折結晶の挿入によって格子状照明の密度が増加したために、図中に正方形で表される単位格子の面積が小さく（約１／√２倍に）なっている。
【００４０】
また、図１０には、複屈折結晶の挿入によって形成されることが期待される二重格子状照明のシミュレーション結果を示している。図８（ａ）から分かるように格子状照明における各照明点は楕円形状を有するために、照明光強度分布は各楕円が長径方向にて重なり、この結果、全体としては複数の斜線状の照明のように見える。
【００４１】
複屈折性結晶の効果を図１１と図１２を用いて説明する。図１１には、複屈折結晶を照明光学系に挿入せずに図３に示すラインアンドスペースパターンを撮像したときのｙ＝０μｍでの断面における照明光強度分布のシミュレーション結果を示している。一方、図１２には、図８（ｂ）に示した照明光強度分布に複屈折結晶の作用を加えて、図３のパターンを撮像したときのｙ＝０μｍでの断面における照明光強度分布のシミュレーション結果を示している。これらを比較すると、明らかに図１２に示す複屈折結晶を挿入した方が高コントラストを持ち、均一性にも優れていることが分かる。これは複屈折結晶の挿入による二重格子状照明によって、格子状照明の照明点間の間隔を小さくすることができたことによるものである。
【００４２】
実施例１の照明光学系を用いた３次元顕微鏡により２５６×２５６×２５６の画素数で撮像を行った場合に処理に要した時間は３．３３ＧＨｚのＣＰＵを搭載したワークステーションで１分以内である。専用のプログラムを作成し、並列分散環境やグラフィックアクセラレータ等のハード機器を最適化して用いれば、共焦点顕微鏡が走査に要する時間よりも短い時間で画像を得ることが十分可能である。
【００４３】
以上説明した各実施例は代表的な例にすぎず、本発明の実施に際しては、各実施例に対して種々の変形や変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
蛍光顕微鏡やデジタルスライドスキャナー等の顕微鏡に使用可能な照明光学系を提供できる。
【符号の説明】
【００４５】
２００  照明光学系
２０１  コヒーレント光源
２０３  照明光学系の瞳（レンズ）
２０６  複屈折結晶
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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