(57)【要約】      （修正有）【課題】増大した頭状花序直径、雄性不稔性、雌性不稔性、改善された耐熱性、四季咲き、新しい花色及びより明るい花色などの特徴の開発を援助することができる新しい属間ハイブリッド植物を創出するための手段の提供。【解決手段】新しい植物を、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種の群に由来する植物と、雄性親としてのアルギランセマム属に由来する植物との間の新しい効率的な属間ハイブリダイゼーション法から創出した。植物は、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種の群に由来する植物と、雄性親であるアルギランセマムとの他家受粉により得た胚を救出することによって創出した。また、ハイブリッド植物をウイルス及びウイロイドに感染させて、植物表現型を改変するための方法も記載する。かかる植物の作製方法により、属間ハイブリッド植物及び自家受粉植物を創出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
雄性親としての異四倍体のアルギランセマム植物と、イスメリア・ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群より選択される雌性親植物との交雑から生産される属間ハイブリッド植物。
【請求項２】
請求項１に記載の属間ハイブリッド植物の植物部分。
【請求項３】
プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌しべ、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、頭状花序、舌状花、管状花、苗条、組織、葉柄、細胞及び分裂組織細胞からなる群より選択される、請求項２に記載の植物部分。
【請求項４】
請求項１に記載の植物からクローン繁殖させる属間ハイブリッド植物又はその植物部分。
【請求項５】
ａ．雄性親としての異四倍体のアルギランセマム植物を、雌性親としてのイスメリア・ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群より選択される植物と交雑するステップと、
ｂ．前記交雑から胚を生産するステップと、
ｃ．前記胚に対して胚救出を使用するステップと、
ｄ．前記胚から生育した属間ハイブリッド植物を得るステップと
を含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法。
【請求項６】
交雑するステップが、前記雄性親から花粉を収集するサブステップと、この花粉を用いて前記雌性親上の花に受粉させるサブステップとを含み、前記受粉から生じた胚を組織培養において救出する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法により生産される属間ハイブリッド植物又はその部分。
【請求項８】
請求項６に記載の方法により生産される属間ハイブリッド植物又はその部分。
【請求項９】
ａ．雄性親としての異四倍体のアルギランセマム植物と、雌性親としてのイスメリア・ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群より選択される植物との交雑から生産された属間ハイブリッド植物の挿し木を得るステップと、
ｂ．前記挿し木を生育させて属間ハイブリッド植物を得るステップと
を含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法。
【請求項１０】
植物ホルモン組成物を前記挿し木の基部に適用して根の形成を誘発するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法により生産される属間ハイブリッド植物又はその部分。
【請求項１２】
ステップａの前にアルギランセマム植物の染色体数を増大させることにより異四倍体のアルギランセマム植物を生産するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
アルギランセマム植物の染色体数を増大させて異四倍体を生産するステップが、
ａ．アルギランセマム植物を生育させるサブステップと、
ｂ．前記植物に抗有糸分裂薬を適用するサブステップと、
ｃ．前記植物から苗条を出芽させるサブステップと、
ｄ．異四倍体の苗条を選抜するサブステップと、
ｅ．前記苗条の染色体組を評価するサブステップと、
ｆ．前記苗条を生育させて異四倍体のアルギランセマム植物を生産するサブステップと、
ｇ．前記異四倍体のアルギランセマム植物の染色体安定性を検査するサブステップと
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法により生産される異四倍体のアルギランセマム植物。
【請求項１５】
プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌しべ、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、頭状花序、舌状花、管状花、苗条、組織、葉柄、細胞及び分裂組織細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載の異四倍体のアルギランセマム植物の植物部分。
【請求項１６】
請求項１５に記載の植物部分からクローン繁殖させるアルギランセマム植物又はその部分。
【請求項１７】
３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８又は３９の染色体数を有する、請求項１４に記載の異四倍体植物。
【請求項１８】
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７の染色体数を有する、請求項１に記載の属間ハイブリッド植物。
【請求項１９】
ａ．雌性親としての異四倍体のアルギランセマム植物を、Ｉ．ベルシコロール及びグレビオニス種の群に由来する植物の異種交配から得られるハイブリッド雄性親と交雑させるステップと、
ｂ．前記交雑から胚を生産するステップと、
ｃ．前記胚に対して胚救出を使用するステップと、
ｄ．前記胚から生育した属間ハイブリッド植物を得るステップと
を含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法により生産される属間ハイブリッド植物又はその部分。
【請求項２１】
前記雄性親がイスメリア・ベルシコロールとグレビオニス・セゲタムとの属間交雑から得られるハイブリッドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記雄性親がイスメリア・ベルシコロールとグレビオニス・コロナリアとの属間交雑から得られるハイブリッドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記雄性親がグレビオニス・セゲタムとグレビオニス・コロナリアとの種間交雑から得られるハイブリッドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
キクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）及びキクＢウイルス（ＣＶＢ）に感染している、請求項１に記載の属間ハイブリッド植物。
【請求項２５】
キクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）及びキクＢウイルス（ＣＶＢ）に感染している、請求項２０に記載の属間ハイブリッド植物。
【請求項２６】
雄性親としての二倍体アルギランセマム植物と、イスメリア・ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群より選択される雌性親植物との交雑から生産される属間ハイブリッド植物。
【請求項２７】
ａ．雄性親としての二倍体アルギランセマム植物を、雌性親としてのイスメリア・ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群より選択される植物と交雑するステップと、
ｂ．前記交雑から胚を生産するステップと、
ｃ．前記胚に対して胚救出を使用するステップと、
ｄ．前記胚から生育した属間ハイブリッド植物を得るステップと
を含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法。
【請求項２８】
交雑するステップが、前記雄性親から花粉を収集するサブステップと、この花粉を用いて前記雌性親上の花を受粉させるサブステップとを含み、前記受粉から生じた胚を組織培養において救出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法により生産される属間ハイブリッド植物又はその部分。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法により生産される属間ハイブリッド植物又はその部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、アルギランセマム（Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ）属間ハイブリッド植物、及びハイブリッド植物の生産効率を増大させるための方法に関する。より具体的には、本発明は、四倍体及び異数性四倍体（ａｎｅｕ−ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ）のアルギランセマム植物の生産、並びに四倍体又は異数性四倍体植物であるアルギランセマムと、イスメリア・ベルシコロール（Ｉｓｍｅｌｉａｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びグレビオニス（シュンギク；Ｇｌｅｂｉｏｎｉｓ）種の群の植物との交雑から得られる属間ハイブリッド植物の生産に関する。引用したすべての刊行物は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]特定の植物の特徴は、種間ハイブリダイゼーションと呼ばれる、他の種と時折交雑する能力である。種間ハイブリダイゼーションは、アルギランセマムを含むいくつかの種において同定されている。例えば、アルギランセマムでは、受粉への地理的な障壁が除去されると、多くの種が自然に交雑することが報告されている（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ−Ｏｒｔｅｇａ，Ｊ．、Ｓａｎｔｏｓ−Ｇｕｅｒｒａ，Ａ．、Ｍｅｓａ−Ｃｏｅｌｌｏ，Ｒ．、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｆｅｒｉａ，Ｅ．及びＣｒａｗｆｏｒｄ，Ｄ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｅｍｉｃ ｇｅｎｕｓ Ａｒｇｙｒａｎｔｈａｍｕｍ Ｓｃｈ．Ｂｉｐ．（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ：Ａｎｔｈｉｍｉｄｅａｅ）ｉｎｔｈｅ Ｍａｃｒｏｎｅｓｉａｎ Ｉｓｌａｎｄｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｃｒｏｐ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、４３：３３〜３９頁（１９９６年））。アルギランセマムの商業的に育種された変種において利用可能な広範な花色で、アルギランセマムのいくつかの種が、Ｃｕｎｎｅｅｎ，Ｔ．Ｍ．、ＴｈｅＭａｒｇｕｅｒｉｔｅ Ｄａｉｓｙ（Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ ｓｐｐ）：ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｆｏｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｓｙｄｎｅｙ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（１９９６年）によって報告された現代の品種の発育に関与していたことが示唆されている。したがって、現代の品種は、アルギランセマム×ハイブリッドとして最も良く説明される。すべてのアルギランセマム種は、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｃ．Ｊ．、Ａ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆｔｈｅ Ｍａｃｒｏｎｅｓｉａｎ ｇｅｎｕｓ Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ Ｗｅｂｂ ｅｘ Ｓｃｈｕｌｔｓ Ｂｉｐ．（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ−Ａｎｔｈｉｍｉｄｅａｅ）、Ｂｕｌｌｅｔｉｎｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｕｓｅｕｍ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ）、Ｂｏｔａｎｙ、５：１４５〜２４３頁（１９７６年）及びＦｊｅｌｌｈｅｉｍ，Ｓ．、ＨｏｌｔｅｎＪｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｍ．、Ｋｊｏｓ，Ｍ．、Ｂｏｒｇｅｎ，Ｌ．、Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｍｏｐｌｏｉｄｈｙｂｒｉｄ ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）ｏｎ Ｔｅｎｅｒｉｆｅ、ｔｈｅ Ｃａｎａｒｙ Ｉｓｌａｎｄｓ、ＢｏｔａｎｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｎｎｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ １５９（１）：１９〜３１頁、２００９年に報告されている通り、２ｎ＝２ｘ＝１８の二倍体染色体数を有する。
【０００３】
[0003]長い時間をかけて、植物は、分類学者によってより正確に説明及び調査され、それにより分類学者は属名及び種名に変更を加えている。グレビオニス属には、Ｍａｂｂｅｒｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．、Ｍａｂｂｅｒｌｅｙ’ｓ Ｐｌａｎｔ Ｂｏｏｋ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００８年）によれば、現在Ｇ．コロナリア（ｃｏｒｏｎａｒｉａ）及びＧ．セゲタム（ｓｅｇｅｔｕｍ）の２種がある。しかしこれらの種は、歴史的にクリサンセマム（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）及びキサントプタルマム（Ｘａｎｔｈｏｐｔｈａｌｍｕｍ）にも含まれている。イスメリア属には、現在Ｉ．ベルシコロール１種のみが存在する。歴史的に、この種は、クリサンセマム・カリナタム（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃａｒｉｎａｔｕｍ）、グレビオニス・カリナタム（Ｇｌｅｂｉｏｎｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｍ）及びイスメリア・ベルシコロールとして知られている。混乱を避けるために、本出願では、グレビオニス属にはＧ．コロナリア及びＧ．セゲタムの２種が含まれ、イスメリア属にはＩ．ベルシコロールの１種が含まれるという２００８年のＭａｂｂｅｒｌｅｙの慣例を適用する。
【０００４】
[0004]遺伝の複雑性は、育種法の選択に影響を及ぼす。遺伝性の高い形質にとって好適な１つ又はいくつかの遺伝子を望ましい品種に伝達するために、戻し交雑による育種が使用される。この手法は、病害に耐性のある品種の育種のために広く使用されているものである。数々の遺伝子によって制御される遺伝形質を定量的に改善するために、様々な循環選抜技術が使用される。自家受粉作物における循環選抜の使用は、受粉の容易性、それぞれの受粉からハイブリッドが成功する頻度、及び成功したそれぞれの交雑からのハイブリッド子孫の数に応じて決まる。
【０００５】
[0005]戻し交雑育種は、単純なメンデル遺伝に従う形質を、循環親である望ましいホモ接合性品種又は近交系に伝達するために使用されてきた。伝達される形質の供給源は、ドナー親と呼ばれる。生じた植物は、循環親（例えば、品種）の属性及びドナー親から伝達された望ましい形質を有すると期待される。最初の交雑の後、ドナー親の表現型を有する個体を選抜し、循環親に繰り返し交雑し戻す（戻し交雑する）。生じた植物は、循環親（例えば、品種）の属性及びドナー親から伝達された望ましい形質を有すると期待される。
【０００６】
[0006]系統育種は、一般に自家受粉作物の改善のために使用される。好適な相補的な形質を有する２つの親を交雑して、Ｆ１集団を生産する。Ｆ２集団は、１つ又は複数のＦ１植物を自家受粉させることによって生産される。最良の個体の選抜は、Ｆ２集団において開始することができる。次いで、最良の科（families）における最良の個体は、Ｆ３世代の開始において選抜される。科の複製試験をＦ４世代において開始して、低い遺伝力を有する形質の選抜の有効性を改善することができる。同系交配の進んだ段階（すなわち、Ｆ６及びＦ７世代）において、最良の系統又は表現型が類似している系統の混ざったものを、新しい品種としての潜在的な販売可能性について試験する。
【０００７】
[0007]育種集団から品種を発育させるために、系統育種法及び循環選抜育種法が使用される。育種プログラムによって、２つ以上の品種又は様々な幅広い供給源からの望ましい形質を育種プールに組み入れ、それから自家受粉及び所望の表現型の選抜によって品種を発育させる。どれが商業的に可能な潜在性を有するかを決定するために、新しい品種を評価する。
【０００８】
[0008]集団選抜及び循環選抜を使用して、自家受粉又は他家受粉作物のいずれかの集団を改善することができる。遺伝的に変わりやすいヘテロ接合性個体の集団は、いくつかの異なる親を交雑することによって同定、又は創出される。最良の植物は、個体の優位性、傑出した後代、又は優れた組合せ能力を基にして選抜される。選抜された植物を交雑して新しい集団を生産し、それからさらなる選抜サイクルを継続する。
【０００９】
[0009]異なる形質及び作物に一般に使用される他の育種法の説明は、いくつかの参考文献の１つに見出すことができる（例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｒ．Ｗ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９６０年）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｎ．Ｗ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ＣｒｏｐＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、Ｌｏｎｇｍａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ（１９８１年））。
【００１０】
[0010]各育種プログラムは、育種手順の効率の周期的な客観的評価を含むべきである。評価基準は、目的及び目標に応じて変わるが、適切な標準、改良された育種系統の全体的な価値、及び投入量単位当たり（例えば、１年当たり、支出額当たりなど）の生産品種の成功数の比較を基にした、選抜による１年当たりの利益を含むべきである。
【００１１】
[0011]有望な改良育種系統は、徹底的に試験され、商業上の標的地域（複数可）を代表する環境において３年以上、適切な標準と比較される。最良の系統は、新しい商業用品種の候補となる。それでもいくつかの形質を欠いているものは、さらなる選抜用に新しい集団を生産するための親として使用することができる。
【００１２】
[0012]マーケティング及び流通の最終段階に至るこれらの過程には、最初の交雑が行われる時からいくつかのステップが必要である。したがって、新しい品種の開発は、正確な将来計画、効率的な資金の使用、及び最小限の方向転換を必要とする時間のかかる過程である。
【００１３】
[0013]大部分の形質について、他の交絡植物（confoundingplant）の形質又は環境因子によってその遺伝子型の真の価値が覆い隠されるため、最も困難な課題は、遺伝的に優れた個体の同定である。優れた植物の１つの同定方法は、他の実験植物及び／又は一般的な品種と比較してその性能を観察することである。１回の観察で結論に到達しない場合、観察を繰り返すことによって、その遺伝的価値をより良好に見積もることができる。
【００１４】
[0014]種間ハイブリダイゼーションは、例えば野生種から関連の栽培種への遺伝子移入によって、植物の新しい形態の創出、及びある種から他の種への望ましい特徴の伝達を可能にしてきた。しかし、生存可能な種間ハイブリッド種子又は植物を創出するための任意の２種の能力は、予測不可能であり、また不可能であることがしばしば証明されている。
【００１５】
[0015]異なる属間の２つの植物の交雑である属間ハイブリダイゼーションは、相対的な遺伝的距離が種間よりも属間の方が大きいため、種間ハイブリダイゼーションよりも予測不可能であり可能性が低い。ほんのいくつか成功した属間ハイブリッドが報告されているが、それらは人間の介入及び胚救出の使用によってのみ可能であることが多い。胚救出の一形態は胚珠培養であり、これは種子から胚珠を無菌で取り出し、その胚珠を人工培地上に置いて胚を発芽させ、植物に生育させることができるものである。アルギランセマムでは、属間ハイブリッドは、雌性二倍体であるＡ．フルテッセンス（ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）と、雄性二倍体であるＧ．カリナタム（異名Ｉ．ベルシコロール）との間及び雌性二倍体であるＡ．フルテッセンスと雄性二倍体であるＧ．コロナリアとの間で報告されており、これらはすべて胚珠培養によって発育したものである（Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｈ．及びＩｎａｂａ，Ｚ．、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｇｕｅｒｉｔｅ（Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）ｗｉｔｈ ａｎｎｕａｌ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ（Ｇｌｅｂｉｏｎｉｓｃａｒｉｎａｔｕｍ）ａｎｄ ｃｒｏｗｎ ｄａｉｓｙ（Ｇ． ｃｏｒｏｎａｒｉａ）ｕｓｉｎｇ ｏｖｕｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５、５３５〜５３９頁（２００８年）；Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｈ．及びＩｎａｂａ，Ｚ．、Ｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆ Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ ｂｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．１．Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ ａｎｄ Ｉｓｍｅｒｉａ ｃａｒｉｎａｔａ（ｓｙｎ．Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃａｒｉｎａｔｕｍ）、Ｉ．ｃｏｒｏｎａｒｉａ（ｓｙｎ．Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｏｒｏｎａｒｉａ）ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｖｕｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ、７２（Ｓｕｐｐｌ．１）、２６４頁（２００３年）；Ｉｗａｚａｋｉ，Ｙ．、Ｕｅｄａ，Ｙ．及びＹａｍａｄａ，Ｈ．、Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ ａｎｄ Ｉｓｍｅｌｉａ ｂｙ ｏｖｕｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ、ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｊａｐａｎ）、６（Ｓｕｐｐｌ．１）、２１２頁（２００７年））。しかし、効率（実施した受粉の回数対生産された開花植物の数）及び生産された植物の質は非常に低い。
【００１６】
[0016]例えば、Ｏｈｔｓｕｋａ及びＩｎａｂａ（２００８年）は、Ａ．フルテッセンス×Ｇ．カリナタム（異名 Ｉ．ベルシコロール）の７０回の受粉から１６個の胚しか得られず、それを胚珠培養によって発芽させたが、そのうち５つの開花植物しか発育しなかったことを報告した。これらの５つの植物は、Ｇ．カリナタム（異名Ｉ．ベルシコロール）と類似の形態を有していた。しかし、開花後に２つが死滅し、残りの３つは淡緑色の葉を有し、脆弱な生育を示した。Ｏｈｔｓｕｋａ及びＩｎａｂａ（２００８年）は、Ａ．フルテッセンス×Ｇ．コロナリアの６１回の受粉から２６個の胚しか得られず、それを胚珠培養によって発芽させたが、そのうち１６個の開花植物しか発育しなかったことも報告した。これらの１６の植物は、一般に、ほとんど枝分れのない直立の活発な生育、及び白色又は白色／黄色の舌状花色と共に淡緑色の葉を特徴としていた。Ｏｈｔｓｕｋａ及びＩｎａｂａ（２００８年）はさらに、この交雑の組合せからは「花壇及び鉢植え植物の生産に有用となり得る新しい特徴を見出すことができなかった」と説明している。
【００１７】
[0017]本発明は、雄性アルギランセマム異四倍体植物と交雑させたイスメリア・ベルシコロール及びグレビオニス種の群より選択される雌性植物を用いて、交雑組合せから商業的に有用な後代を発育させることができるという驚くべき発見をもたらした。これらの交雑は、イスメリア・ベルシコロール、グレビオニス・コロナリア及びグレビオニス・セゲタムについて成功していることに加えて、驚くべきことに雌性親の自家受粉も引き起こす。これらの種が全て自家不和合性を示す（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｏ．、Ｌｉｅｄｌ，Ｂ．Ｅ．、Ａｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｄ．、Ｗｉｄｍｅｒ  Ｒ．Ｅ．、及びＤｅｓｂｏｒｏｕｇｈ，Ｓ．Ｌ．（１９８８年）、Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ，Ｓｅｘｕａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １：１７３〜１８１頁）ことを考慮すると、柱頭不和合性（ｉｎｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ）機構がアルギランセマム花粉の適用によって克服されたと考えられる。
【００１８】
[0018]属間ハイブリダイゼーションの条件下では、一側性不適合性（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｉｎｃｏｎｇｒｕｉｔｙ）を経験することが一般的であるため、本発明は予想外のものであった（Ｌｉｅｄｌ，Ｂ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ（１９９３年）。Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｂａｒｒｉｅｒｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１１：１１〜１５４頁）。換言すると、交雑は一方向で作用するが、逆方向では作用しない。この現象の理由としては、様々な種類の不和合性、及び内胚乳平衡数の相違が挙げられる。有用な属間ハイブリッド後代に加えて、雌性グレビオニス種及びＩ．ベルシコロールの花にアルギランセマム花粉を受粉させる行動により、多数の自殖後代が生産された。この現象は、本明細書に記載される属内では以前に報告されていなかった。
【００１９】
[0019]本発明は、新しい属間ハイブリッド植物を創出するための別の手段を提供し、増大した頭状花序直径、雄性不稔性、雌性不稔性、改善された耐熱性、四季咲き、新しい花色及びより明るい花色などの特徴の開発を援助することができる。本発明より前には、雄性親としてのアルギランセマム植物と交雑させた、雌性親として用いられるイスメリア・ベルシコロール及びグレビオニス種の群に由来する植物に関して、いかなる倍数レベルでもハイブリダイゼーションに成功したという以前の報告はなかった。
【００２０】
[0020]関連技術及びそれに関連する限定についての前述の例は、例示的なものであり、排他的なものではない。関連技術の他の限定は、本明細書を読む際に当業者に明らかとなろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
[0021]以下の実施形態及びその態様を、範囲を制限するものではない例示的な体系、手段及び方法と共に説明する。様々な実施形態において、前述の問題の１つ又は複数は、低減又は排除されており、他の実施形態は他の改善を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
[0022]本発明の一態様は、雌性親としてのグレビオニス種及びＩ．ベルシコロール植物との交雑において、雄性親としてアルギランセマム異四倍体植物を用いることにより、属間ハイブリッド植物の発育を促進する。本明細書で用いられる場合、異四倍体という用語は、四倍体及び異四倍体のアルギランセマム植物の両方を指す。本発明の方法から得られる後代の数は予想外に多く、この後代は２つの型、（１）自家受粉の結果であるもの及び（２）両方の親の形態学的特徴を有することに基づくハイブリッドであるものに形態学的に区別された。アルギランセマム花粉は、グレビオニス種及びＩ．ベルシコロール植物の柱頭での自家不和合性機構の破壊を容易にし、自家受粉を可能にして、柱頭に浸透し、受粉を行うと考えられた。多数の自家後代に加えて、少数のハイブリッド後代が見出された。さらなる改変を用いて、自家後代の数を減少させ、ハイブリッド後代の数を増加させることができた。いくつかの方法が当業界で周知であり、限定されるものではないが、雄性不稔雌性親の発育、除雄剤（ｇａｍｅｔｏｃｉｄｅ）の適用、雌性舌状花のみを残すための除雄、又は水で洗浄するか、若しくは空気を吹き付けることによる花粉の除去が挙げられる。本発明の技術は、新しい型の属間ハイブリッドを発育させるための手段並びにグレビオニス種及びＩ．ベルシコロールから自家後代を発育させるための手段を提供する。本発明より前には、雄性親としてのアルギランセマムと交雑させたグレビオニス種若しくはＩ．ベルシコロール雌性植物に関して、いかなる倍数レベルでもハイブリダイゼーションに成功したという以前の報告、又はグレビオニス種及びＩ．ベルシコロールからの自家後代の発育に関する以前の報告はなかった。本発明のさらなる態様は、雌性親としての異四倍体のアルギランセマム植物と、雄性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物との交雑から生産される属間ハイブリッド植物を提供することである。
【００２３】
[0023]本発明のさらなる一態様は、雌性親としての異数性四倍体のアルギランセマム植物と、雄性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群の植物との交雑から生産される属間ハイブリッド植物を提供することである。
【００２４】
[0024]本発明のさらなる態様は、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物と、雄性親としてのアルギランセマム植物との交雑から生産される属間ハイブリッド植物の植物部分を提供することである。本発明のさらなる態様は、属間交雑を提供してハイブリッド植物又はクローン繁殖させるその部分を生産することである。
【００２５】
[0025]本発明のさらなる態様は、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物と、雄性親としてのアルギランセマム植物とを交雑するステップと、交雑から生じた胚を救出するステップと、それから生育した属間ハイブリッド植物を得るステップとを含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法を提供することである。
【００２６】
[0026]本発明のさらなる態様は、（ａ）異四倍体のアルギランセマム植物である第１の植物と、Ｉ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物である第２の植物とを栽培するステップと、（ｂ）第１の植物から花粉を収集するステップと、（ｃ）この花粉を用いて第２の植物の頭状花序に受粉させるステップと、（ｄ）胚を単離し、適切な培地上でインビトロで発芽させるステップと、（ｅ）この胚の生育から生じた属間ハイブリッド植物を得るステップとを含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法を提供することである。
【００２７】
[0027]本発明のさらなる態様は、（ａ）雌性親としてのイスメリア・ベルシコロール、グレビオニス・コロナリア及びグレビオニス・セゲタムからなる群に由来する植物と、雄性親である異四倍体のアルギランセマムとの交雑から生産された属間ハイブリッドであるアルギランセマム植物の挿し木を得るステップと、（ｂ）この挿し木を栽培して属間ハイブリッドであるアルギランセマム植物を得るステップとを含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法を提供することである。
【００２８】
[0028]本発明のさらなる一態様は、挿し木の基部（ｂａｓｅ）に植物ホルモン組成物を適用し、根の形成を誘発して属間ハイブリッド植物を生産することによってさらに定義付けられる、属間ハイブリッド植物の生産方法を提供することである。
【００２９】
[0029]本発明のさらなる一態様は、（ａ）アルギランセマム植物を栽培するステップと、（ｂ）前記植物の成長点に抗有糸分裂薬を適用するステップと、（ｃ）処理した成長点から苗条（シュート、ｓｈｏｏｔ）を出芽させるステップと、（ｄ）こうして発育した推定上の異数性四倍体の苗条を選抜するステップと、（ｅ）細胞学的核型分析によって前記苗条の染色体組を評価するステップと、（ｆ）前記苗条を植物に生育させるステップと、（ｇ）染色体安定性を検査するステップとを含む、アルギランセマム植物の染色体数を変更し、二倍体２ｎ＝２ｘ＝１８から、異数性四倍体の２ｎ＝４ｘ＝３２、３３、３４、３５、３６、３７〜３８まで体細胞染色体数を増大させる方法を提供することである。
【００３０】
[0030]本発明のさらなる一態様は、アルギランセマム植物の染色体数を変更する方法を提供することであり、変更した染色体数は、異数性四倍体植物を生産するための異数性四倍体であると定義される。異数性四倍体のアルギランセマム植物の植物部分は、花、挿し木、種子、花粉、胚珠又は細胞である。次いで植物を、植物部分からクローン繁殖させる。
【００３１】
[0031]本発明のさらなる一態様は、アルギランセマム属の植物、好ましくは標的とする形質の育種にとって有用な適切な遺伝的特徴（例えば、雄性及び雌性の稔性、適切な習性、開花の早さ、頭状花序の大きさと色、開花期間、頭状花序の形状等）を有する植物を提供することである。
【００３２】
[0032]本発明のさらなる一態様は、アルギランセマム植物の異数性四倍体形態を、好ましくはコルヒチン又は他の倍数体誘発剤（複数可）を使用することによって発育させることである。
【００３３】
[0033]本発明のさらなる一態様は、好ましくは染色体数によって、並びに／或いは二倍体祖先と比較して、全体的な頭状花序の直径の増大、頭状花序の管状花部の直径の増大、花柄の幅の増大、より大きい葉の大きさ、及びより大きい花粉直径などの形態的変化を植物に与えることによって、異数性四倍体植物を安定化し、確認することである。
【００３４】
[0034]本発明のさらなる態様は、本発明の異四倍体植物が、３２、３３、３４、３５、３６、３７〜３８の範囲の染色体数を有することである。
【００３５】
[0035]本発明のさらなる態様は、本発明の属間ハイブリッド植物が、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７の染色体数を有することである。
【００３６】
[0036]本発明のさらなる態様は、異四倍体であるアルギランセマム植物を、Ｉ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物と交雑すること、Ｆ１ハイブリッドから花粉を収集すること、及びその花粉を異四倍体であるアルギランセマム植物に適用して、戻し交雑ハイブリッドＦ２植物を得ることにより、異三倍体Ｆ１ハイブリッド植物を発育させることである。
【００３７】
[0037]本発明のさらなる態様は、あらゆる可能な組合せでＩ．ベルシコロール、グレビオニス・セゲタム及びグレビオニス・コロナリアを交雑してＦ１ハイブリッド植物を生産し、ハイブリッド植物を選抜し、このハイブリッド植物に由来する花粉を使用して異四倍体であるアルギランセマム植物に受粉させて異三倍体ハイブリッド植物を生産することである。
【００３８】
[0038]本発明のさらなる態様は、異三倍体であるアルギランセマムハイブリッド植物を、キクＢウイルス（ＣＶＢ）及びキクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）に感染させることである。
【００３９】
[0039]先に記載の例示的な態様及び実施形態に加えて、以下の説明を研究することによって、さらなる態様及び実施形態が明らかになろう。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
[0040]以下の説明及び表では、いくつかの用語が使用される。かかる用語が与えられる範囲を含む、本明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解のために、以下の定義を提示する。
【００４１】
[00412]対立遺伝子。対立遺伝子は、ある形質又は特徴に関する、遺伝子の１つ又は複数の代替形態のいずれかである。二倍体の細胞又は生物では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子が、一対の相同な染色体上の対応する座を占める。
【００４２】
[0042]アミプロホス−メチル（ＡＰＭ）。本明細書で使用される場合、アミプロホス−メチル（ＡＰＭ）は、染色体の倍加を誘発するために植物育種において使用される化合物を指す。
【００４３】
[0043]雄ずい群。雄しべと総称される植物の花の雄性部分。
【００４４】
[0044]アネモネ。細長い花冠筒部を有する管状花を有する頭状花序。アネモネ型の頭状花序は、標準（一重）と重弁花の中間の形状の頭状花序に見える。アネモネの頭状花序は、重弁花の頭状花序とは異なっており、後者の花弁は、管状花における雄しべの代わりである。
【００４５】
[0045]異数性四倍体。本明細書で使用される場合、異数性四倍体は、四倍体植物、及び一倍体のおよそ４倍の染色体数を有する任意の植物を意味する。例えば、本発明の異数性四倍体のアルギランセマム植物は、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は３８個の染色体を有する。
【００４６】
[0046]異数性三倍体。本明細書で使用される場合、異数性三倍体は、三倍体植物、及び一倍体のおよそ３倍の染色体数を有する任意の植物を意味する。例えば、本発明の異数性三倍体植物は、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９個の染色体を有する。
【００４７】
[0047]抗有糸分裂（ａｎｔｉ−ｍｉｏｔｉｃ）剤。本明細書で使用される場合、抗有糸分裂は、染色体の倍加を誘発するために植物育種において使用される、有糸分裂（細胞分裂）を停止させることによって細胞の成長を妨害するために使用される化合物又は化学物質を指す。抗有糸分裂剤の例には、それに限定されるものではないが、コルヒチン、トリフルラリン、オリザリン及びアミプロホス−メチル（ＡＰＭ）が含まれる。
【００４８】
[0048]無配偶生殖。受精なしの無性生殖による、標準の有性生殖の代替。開花植物では、無配偶生殖という用語は、一般に、種子による無性生殖を特定するために使用される。
【００４９】
[0049]アルギランセマム。本明細書で使用される場合、アルギランセマムは、キク（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）科の植物の属を指す。アルギランセマム属には、それらに限定されるものではないが、Ａ．アダウクタム（ａｄａｕｃｔｕｍ）、Ａ．ブロウソネティ（ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉｉ）、Ａ．カリクリサム（ｃａｌｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）、Ａ．コロノピフォリウム（ｃｏｒｏｎｏｐｉｆｏｌｉｕｍ）、Ａ．ディセクタム（ｄｉｓｓｅｃｔｕｍ）、Ａ．エスカレイ（ｅｓｃａｒｒｅｉ）、Ａ．フィリフォリウム（ｆｉｌｉｆｏｌｉｕｍ）、Ａ．フォエニキュラセウム（ｆｏｅｎｉｃｕｌａｃｅｕｍ）、Ａ．フルテッセンス、Ａ．グラキレ（ｇｒａｃｉｌｅ）、Ａ．ハエモトマ（ｈａｅｍｏｔｏｍｍａ）、Ａ．ハオウアリテウム（ｈａｏｕａｒｙｔｈｅｕｍ）、Ａ．ヒエレンス（ｈｉｅｒｒｅｎｓｅ）、Ａ．レムシイ（ｌｅｍｓｉｉ）、Ａ．リディイ（ｌｉｄｉｉ）、Ａ．マダレンス（ｍａｄａｒｅｎｓｅ）、Ａ．ピンナティフィダム（ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄｕｍ）、Ａ．スヴェンテニイ（ｓｖｅｎｔｅｎｉｉ）、Ａ．スンディンギイ（ｓｕｎｄｉｎｇｉｉ）、Ａ．タラソフィラム（ｔｈａｌａｓｓｏｐｈｉｌｕｍ）、Ａ．テネリファエ（ｔｅｎｅｒｉｆａｅ）、Ａ．ビンセンティ（ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、Ａ．ウェッビイ（ｗｅｂｂｉｉ）及びＡ．ウィンテリ（ｗｉｎｔｅｒｉ）を含む約２４種が含まれる（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｃ．Ｊ．、Ａｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｃｒｏｎｅｓｉａｎ ｇｅｎｕｓ Ａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｕｍ Ｗｅｂｂ ｅｘ Ｓｃｈｕｌｔｓ Ｂｉｐ．（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ−Ａｎｔｈｉｍｉｄｅａｅ）、Ｂｕｌｌｅｔｉｎｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｕｓｅｕｍ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ）、Ｂｏｔａｎｙ、５：１４５〜２４３頁（１９７６年））。
【００５０】
[0050]無性繁殖／無性生殖。無性繁殖又は生殖は、有性生産した種子を除く、すべての種類の植物繁殖を意味する。無性繁殖の例には、それらに限定されるものではないが、挿し木、接木（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、系統分け、無配偶生殖又は組織培養における再生が含まれる。
【００５１】
[0051]戻し交雑。戻し交雑は、育種家が、ハイブリッド後代を親の一方に繰り返し交雑し戻す過程である。例えば、第１世代ハイブリッドＦ１は、Ｆ１ハイブリッドの親の遺伝子型の１つを有する。
【００５２】
[0052]架橋交雑（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ）。中間交雑において、第３の遺伝子型又は種のそれぞれと部分的に適合する第３の遺伝子型又は種を用いることにより、２つの遺伝子型又は種の間の不和合性障壁を迂回する方法。
【００５３】
[0053]頭状花序。頭状花序は、管状花（ｄｉｓｃ ｆｌｏｒｅｔ）と呼ばれる無柄の花の中心の管状花（ｄｉｓｃ）及び舌状花と呼ばれる花弁のような構造の外輪の形態の花序を指す。管状花は一般に完全であり、舌状花は一般に不完全である。頭状花序（ｃａｐｉｔｕｌｕｍ）の複数形は、頭状花序（ｃａｐｉｔｕｌａ）である。
【００５４】
[0054]細胞。本明細書で使用される場合、細胞には、単離されているか、組織培養であるか、又は植物若しくは植物部分に組み込まれているかに関わらず、植物細胞が含まれる。
【００５５】
[0055]キメラ。キメラ又はキメラ植物は、２つ以上の遺伝的に異なる細胞の群からなる植物である。遺伝的差異は、通常、突然変異から生じる。
【００５６】
[0056]染色体数。植物細胞が有する染色体の数。
【００５７】
[0057]染色体安定性。本明細書で使用される場合、染色体安定性とは、急激な又は極度の変化又は変動を受けない染色体を指す。
【００５８】
[0058]キクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）。「キクわい化」病の原因因子であり、花の大きさの低下及び早期開花などの、感染した植物における生育の成長阻害を引き起こす。
【００５９】
[0059]キクＢウイルス（ＣＶＢ）。感染した植物において葉の斑点形成又は葉脈透化を引き起こすウイルス。
【００６０】
[0060]コルヒチン。コルヒチンは、イヌサフラン（ａｕｔｕｍｎｃｒｏｃｕｓ）から得られる薄黄色のアルカロイド、Ｃ２２Ｈ２５ＮＯ６であり、染色体の倍加を誘発するために植物育種において使用される。
【００６１】
[0061]挿し木。発根（ｒｏｏｔｉｎｇ）又は接木を介して、新しい植物を繁殖させるために植物から取り出した、茎、葉又は根などの植物から生じる部分。
【００６２】
[0062]二倍体。二倍体（体細胞の染色体数２ｎ＝２ｘによって示される）は、染色体の各種類の一対（相同の対）を有し、したがって基本（一倍体）の染色体数（記号ｘによって示される）が倍加している体細胞又は植物である。
【００６３】
[0063]管状花。キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）又はキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）植物の頭状花序の中心部を構成する小管状の放射相称小花の１つ。
【００６４】
[0064]優性遺伝。特定の特徴又は形質の表現型が優性対立遺伝子によって決定される遺伝方式を指す。
【００６５】
[0065]優性突然変異。優性突然変異の表現型は、ヘテロ接合体遺伝子型に見られる。
【００６６】
[0066]重弁花。１つ又は複数の花弁が雄しべを代替している管状花を有する頭状花序。
【００６７】
[0067]除雄。自家受粉を防止するための花の葯の除去。
【００６８】
[0068]胚。前胚が胚及び胚柄に分化したときの、受精又は単為生殖後の若い植物個体。
【００６９】
[0069]胚培養。単離した植物の胚の、適切な培地におけるインビトロでの生育。
【００７０】
[0070]胚救出。本明細書で使用される場合、胚救出とは、脆弱で未成熟であり、又はそうでなければ親植物上で成熟した生存可能な種子に成長しない胚を、植物育種家が出芽させるために使用する方法である。例えば、胚救出の一形態は胚珠培養であり、これは種子から胚珠を無菌で取り出し、その胚珠を人工培地上に置いて胚を発芽させ、植物に成長させることができるものである。
【００７１】
[0071]Ｆ２。記号「Ｆ２」は、Ｆ１世代の自家受粉から生じた世代を示す。「Ｆ」の数は、遺伝学で一般的に使用される用語であり、雑種世代を示す。「Ｆ２」世代は、第１世代、すなわちＦ１世代のメンバーの自家受粉又は自家交配（ｓｅｌｆｍａｔｉｎｇ）から生じた子孫を示す。
【００７２】
[0072]配偶子。有性融合に関与して接合子を形成することができる細胞又は核。
【００７３】
[0073]遺伝子。本明細書で使用される場合、遺伝子は核酸のセグメントを指す。遺伝子は、形質転換又は様々な育種法を使用して、異種からであろうと同種からであろうと、ある種のゲノムに導入することができる。
【００７４】
[0074]遺伝子環境相互作用／遺伝子型環境相互作用。遺伝子と環境との相互作用の表現型作用を指す。
【００７５】
[0075]遺伝的形質転換。外来遺伝物質の、取込み、ゲノムの導入、及び発現から生じた細胞の遺伝子変異を指す。
【００７６】
[0076]転換した遺伝子（転換）。遺伝子が転換された（転換）植物は、戻し交雑と呼ばれる植物育種技術によって生育される植物を指し、この場合、戻し交雑技術、遺伝子操作又は突然変異によって変種に導入された１つ又は複数の遺伝子に加えて、変種の所望の形態学的及び生理学的特徴の本質的にすべてが回復する。
【００７７】
[0077]遺伝子型。細胞又は生物の遺伝子構成を指す。
【００７８】
[0078]グレビオニス種。本明細書で使用される場合、グレビオニス種は、それらに限定されるものではないが、シュンギク（ＣｒｏｗｎＤａｉｓｙ）としても知られているグレビオニス・コロナリア及びアラゲシュンギク（Ｃｏｒｎ Ｍａｒｉｇｏｌｄ）（Ｍａｂｂｅｒｌｅｙ ２００８年）としても知られているグレビオニス・セゲタムを含むキク科の植物の属を指す。以前の属名には、キサントプタルマム及びクリサンセマムが含まれていた。
【００７９】
[0079]雌ずい群。植物の花の胚珠生産部。
【００８０】
[0080]半数体。半数体は、染色体組の各染色体のただ１つの代表を含有する細胞核であり、記号ｎで示される。半数体数（ｎ）は、半数体細胞核における染色体の数である。配偶子は半数体細胞である。
【００８１】
[0081]ヘテロ接合性。特定の遺伝子座の対応する対立遺伝子が異なっている遺伝子構成を指す。
【００８２】
[0082]より高い生育温度（Highergrowing temperatures）。本明細書で使用される場合、より高い生育温度とは、後代を生産するために使用される親が耐えることができた温度よりも高い温度で生育し、その温度に耐える後代植物の能力を指す。
【００８３】
[0083]ホモ接合性。特定の遺伝子座の対応する対立遺伝子が同一である遺伝子構成を指す。
【００８４】
[0084]同系交配。遺伝的に密接に関係した配偶子の融合による子孫の生産と定義される。
【００８５】
[0085]近交退化。近交退化は、近親育種の結果としての所与の集団における又は自家受粉からまた生じた植物における適応度の低下である。これは一般に、通常は異系交配する種において生じる。
【００８６】
[0086]花序。主枝又は枝分れの配置から構成される茎上に配置された花の群又は集団。
【００８７】
[0087]属間交雑。属間交雑は、それぞれ異なる属の２つの個体の有性ハイブリダイゼーションを意味する。例えば、イスメリア・ベルシコロール植物と交雑させたアルギランセマム植物。
【００８８】
[0088]属間ハイブリッド。属間ハイブリッドは、属間交雑から、又は２つの異なる属の間の交雑から生じたＦ１世代の植物を意味する。
【００８９】
[0089]種間交雑。種間交雑は、同属のそれぞれ異なる種の２つの個体の有性ハイブリダイゼーションを意味する。例えば、グレビオニス・セゲタム植物と交雑させたグレビオニス・コロナリア植物。
【００９０】
[0090]種間ハイブリッド。種間ハイブリッドは、種間交雑から、又は２つの異なる種の間の交雑から生じたＦ１世代の植物を意味する。
【００９１】
[0091]Ｉ．ベルシコロール。本明細書で使用される場合、Ｉ．ベルシコロールは、それに限定されるものではないが、ハナワギク（ＴｒｉｃｏｌｏｒＤａｉｓｙ）（Ｍａｂｂｅｒｌｅｙ ２００８年）としても知られているイスメリア・ベルシコロールを含むキク科の植物の属を指す。イスメリア・ベルシコロールに対して使用されていた以前の属名及び種名には、グレビオニス・カリナタ（ｃａｒｉｎａｔａ）、グレビオニス・カリナタム及びクリサンセマム・カリナタムが含まれる。
【００９２】
[0092]核型分析。本明細書で使用される場合、核型分析は、染色した分裂中期の染色体の光学顕微鏡分析による、染色体数及び構成の確認を意味する。細胞を収集し、分化を誘導し、次いで分裂中期（染色体が凝縮し、したがって目に見えるようになる細胞分裂の段階）において停止させる。染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）は、明暗バンドのパターンを示す特定の色素で染色される。染色体の大きな変化は、核型分析を使用して検出することができる。
【００９３】
[0093]遺伝子座。遺伝子座は、例えば、除草剤耐性、昆虫抵抗性、病害抵抗性、花色、花の形状、植物の高さなどの１つ又は複数の形質を付与する。形質は、例えば、戻し交雑、天然突然変異若しくは誘発突然変異によって変種のゲノムに導入される天然に生じる遺伝子、又は遺伝子転換技術により導入される導入遺伝子によって付与され得る。遺伝子座は、単一の染色体上の位置において統合された１つ又は複数の対立遺伝子を含むことができる。
【００９４】
[0094]Ｍ０。Ｍ０世代は、突然変異原で処理された世代である。後続の世代は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３等と示される。
【００９５】
[0095]一遺伝子性遺伝。特定の特徴又は形質の表現型が、単一遺伝子によって決定される遺伝方式を指す。
【００９６】
[0096]一倍体。一倍体の染色体数は、単一（非相同）の組の染色体の数（ｘ）であり、半数体（ｎ）の数と異なり得る。
【００９７】
[0097]突然変異。突然変異は、細胞のゲノムのＤＮＡ配列における変化であり、放射線又は化学物質などの突然変異原によって、並びにＤＮＡ複製中に生じるエラーによって生じる。
【００９８】
[0098]オリザリン。本明細書で使用される場合、オリザリンは、染色体の倍加を誘発するために植物育種において使用される化合物を指す。
【００９９】
[0099]異系交配。異系交雑としても知られており、遠縁の配偶子の融合による子孫の生産と説明される。異系交配は同系交配の反意語である。
【０１００】
[0100]胚珠培養。切除した胚珠の、適切な培地におけるインビトロでの培養。
【０１０１】
[0101]表現型。花色、植物の大きさなどの植物の観察可能な任意の特徴又は形質を指す。
【０１０２】
[0102]植物。本明細書で使用される場合、植物という用語には、種子又は葯が除去された植物を含む、未成熟の又は成熟したすべての植物への言及が含まれる。植物を生産する種子又は胚も、植物であるとみなされる。
【０１０３】
[0103]植物ホルモン組成物。本明細書で使用される場合、植物ホルモン組成物は、植物の生育を制御する化学物質を指す。例えば、インドール−３−酪酸、Ｎ６−ベンジルアデニン及びジベレリン酸。
【０１０４】
[0104]植物部分。本明細書で使用される場合、植物部分という用語には、それらに限定されるものではないが、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌しべ、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、頭状花序、舌状花弁／小花、管状花の花弁／小花、苗条、組織、葉柄、細胞、分裂組織細胞等が含まれる。
【０１０５】
[0105]受粉。受粉は、花粉が植物に移動することによって受精及び有性生殖することができる方法である。
【０１０６】
[0106]後代。本明細書で使用される場合、後代には、アルギランセマム植物と、Ｉ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群の植物との交雑から生産されたＦ１植物が含まれる。後代には、それらに限定されるものではないが、後続のＦ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９及びＦ１０世代の、親との交雑及び後代間の交雑がさらに含まれる。
【０１０７】
[0107]プロトプラスト融合／体細胞の融合。２つの異なる植物からのプロトプラスト（すなわち、細胞壁のない植物細胞）が一緒になって融合して、両方の特徴を有する新しいハイブリッド植物を形成する、植物の育種法を指す。
【０１０８】
[0108]量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）。量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）とは、通常は連続して分布する数値的に表し得る形質を、ある程度制御する遺伝子座を指す。
【０１０９】
[0109]舌状花。舌状花又は小舌状花は、いくつかのキク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）又はキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）植物の頭状花序における、外側の不規則な小花の１つである。いくつかのキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）又はキク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）植物では、舌状花の小舌は花弁と呼ばれる。
【０１１０】
[0110]劣性遺伝。特定の特徴又は形質の表現型が劣性対立遺伝子によって決定される遺伝方式を指す。
【０１１１】
[0111]劣性突然変異。劣性突然変異の表現型は、ホモ接合性遺伝子型のみに見られる。
【０１１２】
[0112]再生。再生とは、組織培養からの植物の発育を指す。
【０１１３】
[0113]有性繁殖／有性生殖。種子からの植物の繁殖を指す。
【０１１４】
[0114]体細胞。胞子、配偶子又はそれらの前駆体以外の植物の任意の細胞。
【０１１５】
[0115]四倍体。本明細書で使用される場合、四倍体とは、一倍体の染色体数の４倍の染色体数を有する細胞又は植物を指す。四倍体のアルギランセマムの染色体数は３６であり、体細胞において２ｎ＝４ｘで示される。
【０１１６】
[0116]トリフルラリン。本明細書で使用される場合、トリフルラリンは、染色体の倍加を誘発するために植物育種において使用される化合物を指す。
【０１１７】
[0117]三倍体。本明細書で使用される場合、三倍体とは、一倍体の染色体数の３倍の染色体数を有する細胞又は植物を指す。三倍体の染色体数は２７であり、体細胞において２ｎ＝３ｘで示される。
【０１１８】
[0118]以下の実施形態及びその態様を、範囲を制限するものではない例示的な体系、手段及び方法と共に説明する。様々な実施形態において、前述の問題の１つ又は複数は、低減又は排除されており、他の実施形態は他の改善を目的とする。
【０１１９】
[0119]本発明の一態様では、観賞植物としての使用に望ましい独特の特徴を有する新しい植物が生産された。本発明のこれらの新しい植物は、過去に知られていない属間ハイブリッドであり、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州のＹｅｌｌｏｗ  Ｒｏｃｋで創出された。この植物は、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種の群に由来する植物と、雄性親としてのアルギランセマム植物との交雑から、属間ハイブリッド植物を効率的に生産することができるという予想外の知見から生産された。
【０１２０】
[0120]本発明は、アルギランセマムを用いて新しい属間ハイブリッド植物を発育させるための別の手段を提供する。以前には、任意のアルギランセマムと交雑させたＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種に関して、いかなる倍数レベルでもハイブリダイゼーションに成功したという報告はなかった。
【０１２１】
[0121]本発明のさらなる態様は、雌性親としての、三色デイジー（Ｔｒｉｃｏｌｏｒ  Ｄａｉｓｙ）としても知られるイスメリア・ベルシコロール、シュンギクとしても知られるグレビオニス・コロナリア及びアラゲシュンギクとしても知られるグレビオニス・セゲタムからなる群に由来する植物と、雄性親としてのアルギランセマム植物との交雑から生産される属間ハイブリッド植物を提供することである。
【０１２２】
[0122]本発明のさらなる態様は、雄性親としての、三色デイジーとしても知られるイスメリア・ベルシコロール、シュンギクとしても知られるグレビオニス・コロナリア及びアラゲシュンギクとしても知られるグレビオニス・セゲタムからなる群に由来する植物と、雌性親としてのアルギランセマム植物との交雑から生産される属間ハイブリッド植物を提供することである。
【０１２３】
[0123]本発明のさらなる態様は、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物と、雄性親としてのアルギランセマム植物との交雑から生産される属間交雑ハイブリッド異三倍体植物の植物部分を提供することである。
【０１２４】
[0124]本発明の一態様は、属間交雑を提供してハイブリッド植物又はクローン繁殖させるその部分を生産することである。
【０１２５】
[0125]本発明のさらなる態様は、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物を、雄性親としてのアルギランセマム植物と交雑するステップと、その交雑から生じた胚を救出するステップと、それから生育した属間ハイブリッド植物を得るステップとを含む、属間交雑ハイブリッド異三倍体植物を生産する方法を提供することである。
【０１２６】
[0126]本発明のさらなる態様は、雄性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物を、雌性親としてのアルギランセマム植物と交雑するステップと、その交雑から生じた胚を救出するステップと、それから生育した属間ハイブリッド植物を得るステップとを含む、属間交雑ハイブリッド異三倍体植物を生産する方法を提供することである。
【０１２７】
[0127]本発明のさらなる態様は、（ａ）Ｉ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物である第１の植物と、アルギランセマム植物である第２の植物とを栽培するステップと、（ｂ）第２の植物から花粉を収集するステップと、（ｃ）この花粉を用いて第１の植物の頭状花序に受粉させるステップと、（ｄ）胚を単離し、適切な培地上でインビトロで発芽させるステップと、（ｅ）この胚の生育から生じた属間ハイブリッド植物を得るステップとを含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法を提供することである。
【０１２８】
[0128]本発明のさらなる態様は、（ａ）雌性親としてのイスメリア・ベルシコロール、グレビオニス・コロナリア及びグレビオニス・セゲタムからなる群に由来する植物と、雄性親であるアルギランセマムとの交雑から生産された属間ハイブリッド植物の挿し木を得るステップと、（ｂ）この挿し木を栽培して属間ハイブリッド植物を得るステップとを含む、属間ハイブリッド植物を生産する方法を提供することである。
【０１２９】
[0129]本発明のさらなる一態様は、挿し木の基部に植物ホルモン組成物を適用し、根の形成を誘発して属間ハイブリッド植物を生産することによってさらに定義付けられる、属間ハイブリッド植物の生産方法を提供することである。
【０１３０】
[0130]本発明のさらなる一態様は、（ａ）アルギランセマム植物を栽培するステップと、（ｂ）前記植物の成長点に抗有糸分裂薬を適用するステップと、（ｃ）処理した成長点から苗条を出芽させるステップと、（ｄ）こうして発育した推定上の異数性四倍体の苗条を選抜するステップと、（ｅ）細胞学的核型分析によって前記苗条の染色体組を評価するステップと、（ｆ）前記苗条を植物に生育させるステップと、（ｇ）染色体安定性を検査するステップとを含む、アルギランセマム植物の染色体数を変更して、二倍体２ｎ＝２ｘ＝１８から、異数性四倍体の２ｎ＝４ｘ＝３２、３３、３４、３５、３６、３７〜３８まで体細胞染色体数を増大させる方法を提供することである。
【０１３１】
[0131]本発明のさらなる一態様は、アルギランセマム植物の染色体数を変更する方法を提供することであり、変更した染色体数は、異数性四倍体植物を生産するための異数性四倍体と定義される。異数性四倍体のアルギランセマム植物の植物部分は、花、挿し木、種子、花粉、胚珠又は細胞である。次いで植物を、植物部分からクローン繁殖させる。
【０１３２】
[0132]本発明のさらなる一態様は、アルギランセマム属の植物、好ましくは標的とする形質の育種にとって有用な適切な遺伝的特徴（例えば、雄性及び雌性の稔性、適切な習性、開花の早さ、頭状花序の大きさと色、開花期間、花の形状等）を有する植物を提供することである。
【０１３３】
[0133]本発明のさらなる一態様は、アルギランセマム植物の異数性四倍体形態を、好ましくはコルヒチン又は他の倍数体誘発剤（複数可）を使用することによって発育させることである。
【０１３４】
[0134]本発明のさらなる一態様は、好ましくは染色体数によって、並びに／或いは二倍体祖先と比較して、全体的な頭状花序の直径の増大、頭状花序の管状花部の直径の増大、花柄の幅の増大、大きい葉の大きさ、及び大きい花粉直径などの形態的変化を植物に与えることによって、異数性四倍体植物を安定化し、確認することである。
【０１３５】
[0135]本発明のさらなる一態様は、本発明の異数性四倍体植物が、３２、３３、３４、３５、３６、３７〜３８の範囲の染色体数を有することである。
【０１３６】
[0136]本発明のさらなる態様は、本発明の属間ハイブリッド植物が、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７の染色体数を有することである。
【０１３７】
[0137]本発明のさらなる態様は、異四倍体であるアルギランセマムと、Ｉ．ベルシコロール及びグレビオニス種からなる群に由来する植物とを交雑すること、Ｆ１ハイブリッドから花粉を収集すること、及びその花粉を異四倍体であるアルギランセマム植物に適用して、戻し交雑ハイブリッドＦ２植物を得ることにより、異三倍体Ｆ１ハイブリッドを発育させることである。
【０１３８】
[0138]本発明のさらなる態様は、あらゆる可能な組合せでＩ．ベルシコロール、グレビオニス・セゲタム及びグレビオニス・コロナリアを交雑してＦ１ハイブリッド植物を生産し、ハイブリッド植物を選択し、このハイブリッド植物に由来する花粉を使用して異四倍体であるアルギランセマム植物に受粉させて異三倍体ハイブリッド植物を生産することである。
【０１３９】
[0139]本発明の別のさらなる態様は、ウイルス（キクＢウイルス、ＣＶＢ）及びウイロイド（キクわい化ウイロイド、ＣＳＶｄ）を、異三倍体であるアルギランセマムハイブリッド植物に導入して、この植物の表現型を変化させることによって、商業的に実行可能な製品としてのその可能性をおそらく改善することを含む。
【０１４０】
[0140]先に記載の例示的な態様及び実施形態に加えて、以下の説明を研究することによって、さらなる態様及び実施形態が明らかになろう。
Ｉ．異数性四倍体のアルギランセマム種の発育
【０１４１】
[0141]本発明は、３２、３３、３４、３５、３６、３７〜３８の範囲の染色体数を有すると本明細書において定義される異数性四倍体のアルギランセマム植物を生産する方法を提供する。
【０１４２】
[0142]アルギランセマム植物は、以下の種又は以下の種のハイブリッドのいずれか１つから派生する。Ａ．アダウクタム、Ａ．ブロウソネティ、Ａ．カリクリサム、Ａ．コロノピフォリウム、Ａ．ディセクタム、Ａ．エスカレイ、Ａ．フィリフォリウム、Ａ．フォエニキュラセウム、Ａ．フルテッセンス、Ａ．グラキレ、Ａ．ハエモトマ、Ａ．ハオウアリテウム、Ａ．ヒエレンス、Ａ．レムシイ、Ａ．リディイ、Ａ．マダレンス、Ａ．ピンナティフィダム、Ａ．スヴェンテニイ、Ａ．スンディンギイ、Ａ．タラソフィラム、Ａ．テネリファエ、Ａ．ビンセンティ、Ａ．ウェッビイ及びＡ．ウィンテリ。アルギランセマム植物の異数性四倍体形態を、好ましくは抗有糸分裂薬を使用することによって、発育させる。抗有糸分裂薬の例には、それらに限定されるものではないが、コルヒチン、トリフルラリン、オリザリン、アミプロホス−メチル及び他の倍数体誘発剤（複数可）が含まれる。四倍体は、自然発生することがあり、又はコルヒチンなどの紡錘糸阻害剤を使用して誘発することができる。コルヒチンを用いて誘発する倍数体化の技術は、１９３０年代から使用されている。コルヒチンは、紡錘糸へのチューブリン（ｔｕｂｌｉｎ）サブユニットの組込みを阻害し、その結果、染色体移動が生じることができなくなり、有糸分裂の分裂中期段階の細胞が蓄積する。染色分体が分離するが、紡錘体によって別個の細胞に分割されない場合、その染色体数は倍加して、同質倍数体を創出する。育種目的で倍数体を創出する場合、配偶体組織を生じさせる頂端分裂組織の層が倍加する必要がある。倍加の成功の可能性を最適化するために、活発に生育する多数の小さい分裂組織が処理される。通常、コルヒチンは、組織及び種に応じて０．１％〜２．０％の濃度で使用される。コルヒチン又は他の紡錘糸阻害剤を用いて種子及び植物部分を処理する方法は、Ｐｏｅｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｍ．、ＢｒｅｅｄｉｎｇＦｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ ａｎｄ Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｉｎｃ．（１９６６年）；Ｗａｔｔｓ，Ｌ．、Ｆｌｏｗｅｒａｎｄ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｇｒｏｗｅｒ Ｂｏｏｋｓ（１９８０年）；Ｃａｌｌａｗａｙ Ｄ．Ｊ．及びＣａｌｌａｗａｙ Ｍ．Ｂ．、ＢｒｅｅｄｉｎｇＯｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｎｔｓ、Ｔｉｍｂｅｒ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（２０００年）に論じられている通り当技術分野において周知である。
【０１４３】
[0143]倍数性の変化は、交雑可能性（ｃｒｏｓｓａｂｉｌｉｔｙ）、稔性、細胞の大きさ及びヘテロ接合性に影響を及ぼす。これらの因子は、植物育種において潜在的な利益と同時に制限をもたらす。倍数性の操作は、異なる倍数性の分類群間の生殖質の遺伝子移入のために使用されていた。例えば、種間ユリ属のハイブリッドのＦ１不稔性を克服するために、コルヒチンを使用して四倍体が誘発された。４つのユリ属種の複合ハイブリッド間で、四倍体レベルの種間交雑が行われた。ＶａｎＴｕｙｌ，Ｊ．及びｖａｎ Ｈｏｌｓｔｅｉｊｎ，Ｈ．Ｌｉｌｙ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、４１４：３５〜４５頁（１９９６年）を参照されたい。天然では二倍体のブッデレヤ・グロボサ（Ｂｕｄｄｌｅｊａｇｌｏｂｏｓａ）の四倍体植物を、コルヒチン処理を使用して生産し、ブッデレヤ・ダビディイ（Ｂｕｄｄｌｅｊａ ｄａｖｉｄｉｉ）に黄色の花色を導入するために、ブッデレヤ・グロボサを天然の四倍体のブッデレヤ・ダビディイと交雑させている。Ｒｏｓｅ，Ｊ．、Ｋｕｂｂａ，Ｊ．及びＴｏｂｕｔｔ，Ｋ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆ ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓ ｆｏｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｈａｒｄｙ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌｓ、Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、５６０：１０９〜１１２頁（２００１年）を参照されたい。すべて黄色花のシクラメン・ペルシカム（Ｃｙｃｌａｍｅｎｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種は二倍体であり、花弁上に「目」を有していない。コルヒチン処理を使用して、四倍体の黄色花のシクラメンが誘導された。四倍体の「目付き」品種と交雑させた後、黄色花の「目付き」選抜が種子によって維持されないように分離が行われた。Ｔａｋａｍｕｒａ，Ｔ．、Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．、Ｔａｎａｋａ，Ｍ．及びＫａｇｅ，Ｔ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆ ｔｈｅ ｙｅｌｌｏｗ−ｆｌｏｗｅｒｅｄ ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ ｃｙｃｌａｍｅｎ ｗｉｔｈ“ｅｙｅ”、Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、４５４：１１９〜１２６頁（１９９８年）を参照されたい。
【０１４４】
[0144]本発明は、（ａ）アルギランセマム植物を栽培するステップと、（ｂ）その植物の成長点に抗有糸分裂薬を適用するステップと、（ｃ）植物の処理した成長点から苗条を出芽させるステップと、（ｄ）植物からこうして発育した推定上の異数性四倍体の苗条を選抜するステップと、（ｅ）細胞学的核型分析によって異数性四倍体の苗条の染色体組を評価するステップと、（ｆ）異数性四倍体の苗条を植物に生育させるステップと、（ｇ）染色体安定性を検査するステップとを含む、アルギランセマム植物の染色体数を変更して、３２、３３、３４、３５、３６、３７〜３８の範囲の染色体数を有する異数性四倍体植物を発育させる方法を提供する。当業者は、四倍性の誘発によって、予想した四倍体数よりも多い又は少ない染色体数の植物を生じさせることができ、かかる異数体植物は、本明細書では異数性四倍体と定義され、これには３２、３３、３４、３５、３６、３７〜３８の範囲の染色体数の植物が含まれることを理解されよう。
ＩＩ．属間ハイブリッド植物の生産
【０１４５】
[0145]花き産業は、開花植物の新しく異なる変種の開発に懸命である。かかる新しい変種を創出するための有効な一方法は、花色の操作による方法である。花色は主に、フラボノイド及びカロテノイドの２種類の色素に起因する。フラボノイドは、黄色から赤色、さらに青色までの範囲の色に寄与する。カロテノイドは、赤みがかった色−橙色又は黄色の色合いを付与し、一般に黄色又は橙色の花の唯一の色素である。花色に大きく寄与するフラボノイド分子はアントシアニンであり、これはシアニジン、デルフィニジン、ペツニジン、ペオニジン、マルビジン及びペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であり、液胞に局在している。様々なアントシアニンによって、際立った色の差が得られる。花色はまた、無色のフラボノイドとの共色素沈着（ｃｏ−ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、金属錯化、グリコシル化、アシル化、メチル化及び液胞のｐＨによって影響を受ける。Ｆｏｒｋｍａｎ，Ｇ．Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｓ ｆｌｏｗｅｒ ｐｉｇｍｅｎｔｓ：ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ １０６：１〜２６頁（１９９１年）を参照されたい。
【０１４６】
[0146]本発明は、新しい花色、及び改善された耐熱性、より大きい頭状花序などの他の有用な属性を有する属間ハイブリッド植物を予想外に生じさせた。本発明の方法は、雄性親としてのアルギランセマム植物との属間交雑において、雌性親としてイスメリア・ベルシコロール、グレビオニス・コロナリア又はグレビオニス・セゲタムに由来する植物を使用し、前記交雑は、以下の（ａ）アルギランセマム植物から花粉を収集するステップと、（ｂ）この花粉を用いてＩ．ベルシコロール又はグレビオニス種の雌性植物の頭状花序に受粉させるステップと、（ｃ）受粉から生じた胚を胚救出によって単離するステップと、（ｄ）寒天の栄養培地上で胚をインビトロで培養するステップと、（ｅ）この胚の生育から生じた属間ハイブリッド小植物を得るステップと、（ｆ）温室の生育培地に小植物を移植し、そこで成熟した属間ハイブリッド植物に発育させるステップとを含んでいた。異四倍体雄性アルギランセマムを用いることにより、親ハイブリッド後代が生産されたが、大多数の後代は、より少数の真のハイブリッドによる自家受粉の結果であった。
【０１４７】
[0147]本発明のさらなる態様は、（ａ）イスメリア・ベルシコロール、グレビオニス・コロナリア又はグレビオニス・セゲタムからなる群の植物を、あらゆる組合せで異種交配し、前記交雑から胚を生産するステップと、（ｂ）前記胚に対して胚救出を使用するステップと、（ｃ）次いで雄性親であるアルギランセマムとの交雑において雌性親として使用できる種間ハイブリッド植物を得るステップとを含む方法を提供することである。
【０１４８】
[0148]本発明のさらなる態様は、本発明の属間ハイブリッド植物が、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７の染色体数を有する、本明細書に定義された異二倍体から異三倍体であることである。
【０１４９】
[0149]本発明のさらなる態様は、（ａ）雌性親としてのイスメリア・ベルシコロール、グレビオニス・コロナリア及びグレビオニス・セゲタムからなる群に由来する植物と、雄性親としてのアルギランセマム植物との交雑から生産された属間ハイブリッド植物の挿し木を得るステップと、（ｂ）この挿し木を栽培して属間ハイブリッド植物を得るステップとを含む、属間ハイブリッド植物を繁殖させることである。
【０１５０】
[0150]本発明のさらなる一態様は、挿し木の基部に植物ホルモン組成物を適用し、根の形成を誘発して属間ハイブリッド植物を生産することによってさらに定義付けられる、属間ハイブリッド植物の生産方法を提供することである。
ＩＩＩ．架橋交雑における雄性親としてグレビオニス種ｘＩ．ベルシコロールハイブリッドを用いる属間ハイブリッド植物の生産
【０１５１】
[0151]ある植物は交雑し、他の植物は交雑しないということは植物育種においてはよく見られることである。例えば、植物Ａは植物Ｂと非常によく交雑するが、植物Ｃとは稀にしか交雑しない。しかしながら、植物ＢとＣとは容易に交雑する。植物Ｃに由来する遺伝子を、植物Ａとのハイブリッドに導入するために、架橋交雑を実施することができる。そのような環境下では、植物Ｂ及びＣを異種交配し、Ｆ１ハイブリッド植物を発育させ、花粉をＦ１ハイブリッド植物から収集し、植物Ａの柱頭に適用し、新しいハイブリッド植物を発育させる。その結果、交雑種はＡｘ（ＢｘＣ）である。この方法を用いて、以下の組合せ：異四倍体であるアルギランセマムｘ（あらゆる可能な組合せのグレビオニス種ｘＩ．ベルシコロール）の異三倍体属間ハイブリッドを発育させた。
【０１５２】
[0152]本発明は驚くべきことに、１つの種がアルギランセマムであり、他の２つの種がＧ．セゲタム、Ｇ．コロナリア及びＩ．ベルシコロールの群から選択される、少なくとも３つの別々の種に由来する特徴を有する異三倍体属間ハイブリッド植物の発育を可能にした。
ＩＶ．異三倍体属間ハイブリッドの戻し交雑
【０１５３】
[0153]観賞植物の育種は、新しい特徴を有する新しい種類の植物の発育を含む。いくつかの環境下では、不適合、様々な不和合性、均一でない染色体数及び他の未知の因子などの支障のため、発育した新しい植物をさらなる育種作業に用いることができない。この問題の一例は、異四倍体であるアルギランセマムとイスメリア・ベルシコロールとを交雑することにより発育させた異三倍体属間ハイブリッドについて見出された。発育したほぼ全ての植物が雄性不稔性であった（花粉を有さない）。驚くべきことに、いくらかの花粉を有するいくつかの植物が生産された。ハイブリダイゼーションは、異三倍体Ｆ１ハイブリッド植物から収集された花粉を使用し、その花粉を異四倍体であるアルギランセマムの頭状花序に適用して戻し交雑後代を発育させる、以前に記載された標準的な手順に従って実施した。
Ｖ．ハイブリッド植物のキクＢウイルス（ＣＶＢ）及びキクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）による感染
【０１５４】
[0154]本発明のさらなる態様は、異三倍体であるアルギランセマムハイブリッド植物をキクＢウイルス（ＣＶＢ）及びキクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）に感染させることである。これは、感染した植物を未感染の植物に接ぎ木し、接ぎ木を治癒させた後、新しく感染した植物を生育させ、それをＰＣＲ及び／又はＥＬＩＳＡに基づく方法により試験して、感染状態を確認することにより達成することができる。
【０１５５】
[0155]上記の例示的な態様及び実施形態に加えて、以下の実施例を研究することによって、さらなる態様及び実施形態は明らかになろう。
【実施例】
【０１５６】
[0156]本発明をさらに例示するために以下の実施例を提示する。これらの実施例は、いかなる方法によっても、添付の特許請求の範囲に記載の制限を超えて本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。本発明の精神及び範囲内であれば多くの変更及び改変を行うことができる。
実施例１−異数性四倍体のアルギランセマム種の発育
【０１５７】
[0157]本発明は、アルギランセマム植物の染色体数を変更して、体細胞染色体数を二倍体から異数性四倍体に倍加する新しい方法を提供する。本発明の染色体数の変更方法を、まずアルギランセマム植物の栽培から開始し、次いでコルヒチン、トリフルラリン、オリザリン又はアミプロホス−メチル（ＡＰＭ）などの抗有糸分裂薬を、アルギランセマム植物の成長点に適用した。次いでアルギランセマム植物の処理した成長点から異数性四倍体の苗条を出芽させ、アルギランセマム植物の成長点から発育した推定上の異数性四倍体の苗条を選抜した。次いで、異数性四倍体の苗条の染色体組を細胞学的核型分析によって評価し、次いで分析した異数性四倍体の苗条を植物に生育させた。新しいアルギランセマム植物の染色体安定性を検査し、新しい異数性四倍体のアルギランセマム植物を選抜し、維持した。アルギランセマム異数性四倍体植物の頭状花序から花粉を収集し、次いで受容性のグレビオニス種植物又はＩ．ベルシコロール植物の頭状花序に適用した。次いで、交雑から胚を救出し、次いで救出した胚を、組織培養において胚救出によって単離し、属間ハイブリッド植物を救出した胚の組織から生産した。
【０１５８】
[0158]本発明の一態様は、それらに限定されるものではないが、雄性及び雌性の稔性、適切な習性、開花の早さ、頭状花序の大きさ及び色、開花時期、並びに頭状花序の形状を含む、標的とする形質の育種にとって有用な適切な遺伝的特徴を有するアルギランセマム属の植物を得るステップを含んでいた。アルギランセマム植物が得られた後、以下の方法を使用して異数性四倍体のアルギランセマム植物を発育させた。１００本の挿し木を、栄養増殖ストックプラント（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｌｙｇｒｏｗｉｎｇ ｓｔｏｃｋｐｌａｎｔ）から収集し、カットした基部を２０００ｐｐｍのインドール−酪酸粉末に浸漬し、次いで繁殖用くさび型の商標オアシス（Ｏａｓｉｓ）（登録商標）に植えた。次いで挿し木を、約２０℃に維持した繁殖用ハウス内の間欠的噴霧の下に置いた。３週間後、挿し木を温室条件に順化させ、次いで標準の苗床である鉢植え用の（ｐｏｔｔｉｎｇ）ミックスを充填した１０ｃｍ直径の鉢１００個のそれぞれに、１つの植物を植えた。鉢に植えた植物を、最低温度１５℃の温室に置いた。約２週間後、植物はコルヒチン適用の準備ができた。コルヒチンは、水溶性ゲルを用いて０．１％〜２．０％重量／体積のペーストとして調製した。植物を処理するために、ある範囲のコルヒチン濃度を使用することによって、処理される各系統についてどの濃度によって最適な結果が得られるかを決定することができた。
【０１５９】
[0159]ペーストを芽に対して十分に適用し、２４時間後に細かい水の噴霧を使用して洗い流した。適用中に植物の数及び塗布した芽を計数することによって、終了時に生産効率の測定を行うことができた。
【０１６０】
[0160]その後の数週間、最良の実践及び生育手順に従って（例えば、Ｈａｍｒｉｃｋ，Ｄ．（Ｅｄ）、ＢａｌｌＲｅｄ Ｂｏｏｋ、Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ２、Ｂａｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００３年））、植物を観察し、維持した。新しい苗条を、異四倍性の徴候について評価した。これらの徴候には以下の、通常の葉よりも大きい葉を有する苗条及び広い葉柄の直径、大きい柱頭の小花、大きい中心管状花部を有する頭状花序、長い花柄の長さ及び幅の頭状花序、並びに大きい花粉直径の小花が含まれていた。二倍体に見える苗条を、その植物から刈り落とした。選抜した推定上の異数性四倍体の苗条に標識を付し、さらなる生育を促進するために刈り落とした。
【０１６１】
[0161]新しい推定上の異数性四倍体の苗条を生産したら、挿し木を採取し、繁殖させた。これらの第２世代植物を、表現型を基にして異四倍性の安定性及び均一性について継続的に評価した。次いで、核型分析を実施することによって推定上の異数性四倍体を確認し、又は廃棄した。確認後、植物を少なくともさらに２回繁殖させて、安定な異数性四倍体になるようにした。植物を、定期的に四倍性の形態学的特徴について視覚的に調査した。植物の形態的変化には、二倍体祖先と比較して、それらに限定されるものではないが全体的な頭状花序の直径の増大、頭状花序の管状花部の直径の増大、花柄の幅の増大、大きい葉の大きさ、大きい柱頭の大きさ、及び大きい花粉直径が含まれていた。アルギランセマム、イスメリア種及びグレビオニス種の選抜系統、並びに属間ハイブリッドについて染色体を計数した。
実施例２−アルギランセマム、イスメリア及びグレビオニス系統の染色体数
【０１６２】
[0162]以下の表１は、アルギランセマム、イスメリア及びグレビオニス系統の染色体数を示す。１列目は、植物の識別番号を示し、２列目は属及び系統を示し、３列目は染色体数の範囲を示し、４列目は確認された倍数性レベルを示す。
【表１】
2014027923.tif 000002
実施例３−発育したアルギランセマム異四倍体株の起源及び説明
【０１６３】
[0163]以下の表２は、生産し、次いで表４〜１０に示す育種交雑で使用したアルギランセマム異四倍体植物の起源及び説明を提示するものである。二倍体親株（１列目に示す、２列目には表現型を示す）を、染色体の倍加を引き起こすことができる化学的突然変異原である様々な量のコルヒチンで処理した。さらなる育種及び分析のために選抜した異四倍体植物（それらの識別番号によって示す）を３列目に示す。異四倍体株の表現型を４列目に示す。
【表２】
2014027923.tif 000003
実施例４−表４〜１０に示した育種交雑で使用したグレビオニス種及びＩ．ベルシコロール変種及びハイブリッド
【０１６４】
[0164]以下の表３は、表４〜１０に示した育種交雑で使用したグレビオニス種及びＩ．ベルシコロール変種及びハイブリッドの植物名及び説明を提示するものである。植物名を１列目に示し、植物の識別番号を２列目に示し、頭状花序の形状及び色を３列目に示す。
【表３】
2014027923.tif 000004
実施例５−同じ遺伝子型から得られた二倍体アルギランセマム雌性親及び異四倍体アルギランセマム雌性親ｘグレビオニス種及びＩ．ベルシコロールを用いる属間ハイブリッド植物の生産効率の比較
【０１６５】
[0165]比較交雑を行って、用いる二倍体及び異四倍体であるアルギランセマム雌性親の間の生産効率を決定した。４つの二倍体アルギランセマム雌性親を用いた。異四倍体型のこれらの同じアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）を同様に発育させ、使用した。雌性親として二倍体及び異四倍体のアルギランセマム植物と、雄性親としてグレビオニス種及びＩ．ベルシコロールの植物とを用いて、交雑を実施した。その結果を比較した。表４Ａはそれぞれの交雑組合せのために受粉させた頭状花序の数を示し、表４Ｂは救出された胚の数を示し、表４Ｃは発育した植物の数を示す。
【表４】
2014027923.tif 000005
【表５】
2014027923.tif 000006
【表６】
2014027923.tif 000007
【０１６６】
[0166]表４Ａ、Ｂ及びＣは、雄性親としてＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種を用いる交雑組合せにおいて雌性親として異四倍体のアルギランセマム植物を用いた場合に得ることができる改善された生産効率を示すものである。
実施例６−種間交雑−グレビオニス種及びＩ．ベルシコロールのハイブリダイゼーションのための方法
【０１６７】
[0167]本発明のさらなる態様においては、グレビオニス・コロナリア、グレビオニス・セゲタム及びイスメリア・ベルシコロール種を、実施された他の交雑について以前に記載されたものと同じ手順に従って、あらゆる可能な対の組合せで異種交配させた。それぞれの対の組合せは、いくつかの生存できる後代を生産し、開花植物に生育した。
【０１６８】
[0168]開花Ｆ１植物を評価し、望ましい特徴（高い花粉稔性、特定の花色又は花色パターン、密集習性など）を有したものを、異四倍体アルギランセマム雌性親と交雑させるための雄性親として用いた。目的は、異三倍体後代の多様性をさらに増大させ、新しい遺伝子及び遺伝子組合せを前記後代に組込むことであった。例えば、グレビオニス・セゲタムは、異四倍体アルギランセマム雌性親と交雑した場合、多くの後代を生産しない。グレビオニス・セゲタムをイスメリア・ベルシコロールと交雑し、Ｆ１ハイブリッド植物を発育させ、異四倍体アルギランセマム雌性親との交雑において雄性親としてそのＦ１ハイブリッド植物を用いることにより、グレビオニス・セゲタムに由来する遺伝子を異三倍体後代中に組込んだ。この種類のハイブリダイゼーションは、架橋交雑と呼ばれる。
【０１６９】
[0169]イスメリア・ベルシコロールｘグレビオニス・コロナリアと、グレビオニス・コロナリアｘイスメリア・ベルシコロールとの間のＦ１ハイブリッドは、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  Ｂ．Ｋ．、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  Ｓ．Ｋ．Ｂａｓａｋ、Ｓ．Ｌ．及びＤａｎａ，Ｓ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｃｒｏｓｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｎｕａｌ  Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ、Ｃｙｔｏｌｏｇｉａ  ４１：１１１〜１２１頁（１９７６年）により以前に報告された。これらの著者らはまた、Ｆ１ハイブリッドを異種交配することによるＦ２ハイブリッドの発育も報告した。Ｂｏａｓｅ，Ｍ、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ及びＤｅｒｏｌｅｓ，Ｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ、ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｎｏ．１４、３２１〜３６１頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ（１９９７年）は、Ｉ．ベルシコロール及びＧ．コロナリアがハイブリダイズすることができると記載する。Ｄｏｗｒｉｃｋ，Ｇ．及びＥｌ−Ｂａｙｏｕｍｉ，Ａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  １３：２４１〜２５０頁（１９６９年）は、Ｇ．セゲタムとＧ．コロナリアとのハイブリッドのＤＮＡ含量を調査した。以下の表５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州のＹｅｌｌｏｗ  Ｒｏｃｋで２０００年〜２０１２年に行われた種間交雑の結果を示す。雌性親株を１列目に示し、各表の一番上の行に雄性親株をその植物識別番号により列挙する。胚を、受粉後１４〜２１日に救出した。表５Ａは、それぞれの交雑のために受粉させた頭状花序の数を示す。表５Ｂは、救出された胚の数を示す。表５Ｃは、発芽し、温室の鉢に植えた胚の数を示す。ＤＵは、データが利用可能でないことを示す。
【表７】
2014027923.tif 000008
【０１７０】
[0170]上記の表５Ａに示された通り、例えば、雌性グレビオニス・セゲタム植物０８−８９と、雄性イスメリア・ベルシコロール植物０８−８０との交雑において、２個の頭状花序を受粉させた（１６行目、６列目）。
【表８】
2014027923.tif 000009
【０１７１】
[0171]上記の表５Ｂに示された通り、雌性グレビオニス・セゲタム植物０８−８９と雄性イスメリア・ベルシコロール植物０８−８０の２回の受粉から、１４個の胚を救出した（１６行目、６列目）。
【表９】
2014027923.tif 000010
【０１７２】
[0172]上記の表５Ｃに示された通り、雌性グレビオニス・セゲタム植物０８−８９と雄性イスメリア・ベルシコロール植物０８−８０の２回の受粉から救出された１４個の胚（表５Ｂ）のうち、１０個の胚が発芽し、温室で植物に生育した（１６行目、６列目）。
実施例７−雌性親としての異四倍体アルギランセマムと、雄性親としての様々な雄性グレビオニス種ｘＩ．ベルシコロールハイブリッドとを用いる架橋交雑
【０１７３】
[0173]Ｉ．ベルシコロールとグレビオニス種との交雑に由来する種間ハイブリッド後代の発育に続いて、雌性親としての異四倍体アルギランセマムと、様々なグレビオニス種ｘＩ．ベルシコロールハイブリッド雄性親との間で交雑を実施した。異四倍体雌性親を、それらが得られる二倍体親に基づいて分類し、列挙されたそれぞれの雄性親について各群内で５個の頭状花序を受粉させた。それぞれの雄性親交雑組合せのために２つの雄性親を選抜した。以下の表６Ａ、Ｂ及びＣにおいて、左側の列は異四倍体アルギランセマム雌性親を表し、残りの８列は様々な組合せの様々なＩ．ベルシコロールｘグレビオニス種ハイブリッド雄性親を表す。表６Ａは受粉した頭状花序の数を示し、表６Ｂは他家受粉から救出された胚の数を示し、表６Ｃは発育したハイブリッド架橋交雑植物の数を示す。
【表１０】
2014027923.tif 000011
【表１１】
2014027923.tif 000012
【０１７４】
[0174]表６Ｂに示された通り、実施された他家受粉から救出された胚の総数は２２１個であった。
【表１２】
2014027923.tif 000013
【０１７５】
[0175]表６Ｃに示された通り、発育したハイブリッド架橋交雑植物の総数は１３２個であった。
【０１７６】
[0176]表６Ａ、Ｂ及びＣで実施された作業から得られた植物は、アルギランセマム、グレビオニス種及びＩ．ベルシコロールに由来するいくつかの組合せた特徴の組み込みを可能にした。当業者であれば、交雑のさらなる繰り返し及び親の組合せの微調整が、あらゆる交雑組合せにおいて後代及び植物の数を増大させ得ることを理解できる。
実施例８−イスメリア・ベルシコロール植物と、アルギランセマム異四倍体植物とのハイブリダイゼーション法
【０１７７】
[0177]本発明の別の態様は、イスメリア・ベルシコロールからなる群に由来する植物と、アルギランセマム属の異四倍体植物とを交雑させるステップを含んでいた。Ｉ．ベルシコロール雌性植物を、花色、花の縞模様、生育及び繁殖の容易性、枝分かれの多さ、開花の早さ並びに雄性及び雌性稔性などの所望の形質について選抜した。次いで、雄性親として使用する選抜した異四倍体のアルギランセマム植物から、花粉を取り出した。その花粉を、Ｉ．ベルシコロールの頭状花序が受容性である場合には、小筆を使用して、Ｉ．ベルシコロール雌性植物の頭状花序の上に適用した。Ｉ．ベルシコロールの頭状花序の除雄は実施しなかった。次いで、異四倍体のアルギランセマム植物に由来する花粉を受粉させたＩ．ベルシコロール植物に由来する頭状花序を、２〜３週間後に収穫し、小花を取り出した。次いで、各小花に無菌技術を適用した。好ましくは、材料を被覆するための１％次亜塩素酸ナトリウムを添加した容器に小花をそのまま入れ、その後１滴のＴｗｅｅｎ２０界面活性剤を添加した。容器を蓋で閉鎖し、毎分１回、５分間振とうした。次いで容器を空にし、オートクレーブした蒸留水で小花を３回すすいだ。次いで小花を取り出し、個々に精査した。次いで、任意の発育中の種皮及び子房壁組織を取り出して、胚珠を露出させた。次いで、胚珠から胚を取り出し、ペトリ皿内の適切な胚救出培地上に置いた。培地は、好ましくは推奨比率の半分（すなわち２．２１ｇ／Ｌ）のＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２年）塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．及びＳｋｏｏｇ，Ｆ、Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、１５：４７３〜４９７頁（１９６２年））、１％活性炭、２０ｇ／Ｌスクロース及び０．７％寒天を含有していた。培地をｐＨ５．８に調整した後、１２１℃で１７分間、１ｋｇ／ｍ２でオートクレーブにかけた。精査した胚を含むペトリ皿をパラフィンで封止し、２５℃の継続的な温度で１日１６時間、蛍光灯の下で維持した生育チャンバー内に置いた。２〜４週間後、発芽した胚を温室環境に移し、そこでアルギランセマム植物の生育に適した従来の苗床の実践に従って（例えば、Ｈａｍｒｉｃｋ，Ｄ．（Ｅｄ）、（２００３年））、胚の発育を促進して成熟した植物にした。例えば、発芽した胚を、肥料を含む種子育成混合物に移し、湿潤に保ち、日陰に置いた。その後、発芽した胚を、従来の鉢植え用の培地及び高光度を伴うより大きい鉢に移し、生育させ、開花させた。次いで、望ましい推定上のＦ１ハイブリッド植物を選抜し、挿し木を採取した。
実施例９−グレビオニス・コロナリア植物と、異四倍体のアルギランセマム植物とのハイブリダイゼーション法
【０１７８】
[0178]本発明の別の態様は、グレビオニス・コロナリアからなる群に由来する植物を、アルギランセマム属の異四倍体植物と交雑させるステップを含む。Ｇ．コロナリア雌性植物を、花色、花の縞模様、生育及び繁殖の容易性、枝分かれの多さ、開花の早さ並びに雄性及び雌性稔性などの所望の形質について選抜した。雄性親として使用する選抜した異四倍体のアルギランセマム植物から、花粉を取り出した。その花粉を、Ｇ．コロナリアの頭状花序が受容性である場合には、小筆を使用して、Ｇ．コロナリア雌性植物の頭状花序の上に適用した。Ｇ．コロナリアの頭状花序の除雄を実施した。次いで、異四倍体のアルギランセマム植物に由来する花粉を受粉させたＧ．コロナリア植物に由来する頭状花序を、２〜３週間後に収穫し、小花を取り出した。次いで、各小花に無菌技術を適用した。好ましくは、材料を被覆するための１％次亜塩素酸ナトリウムを添加した容器に小花をそのまま入れ、その後１滴のＴｗｅｅｎ２０界面活性剤を添加した。容器を蓋で閉鎖し、毎分１回、５分間振とうした。次いで容器を空にし、オートクレーブした蒸留水で小花を３回すすいだ。次いで小花を取り出し、個々に精査した。次いで、任意の発育中の種皮及び子房壁組織を取り出して、胚珠を露出させた。次いで、胚珠から胚を取り出し、ペトリ皿内の適切な胚救出培地上に置いた。培地は、好ましくは推奨比率の半分（すなわち２．２１ｇ／Ｌ）のＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２年）塩、１％活性炭、２０ｇ／Ｌスクロース及び０．７％寒天を含有していた。培地をｐＨ５．８に調整した後、１２１℃で１７分間、１ｋｇ／ｍ２でオートクレーブにかけた。精査した胚を含むペトリ皿をパラフィンで封止し、２５℃の継続的な温度で１日１６時間、蛍光灯の下で維持した生育チャンバー内に置いた。２〜４週間後、発芽した胚を温室環境に移し、そこでアルギランセマム植物の生育に適した従来の苗床の実践に従って（例えば、Ｈａｍｒｉｃｋ，Ｄ．（Ｅｄ）、（２００３年））、胚の発育を促進して成熟した植物にした。例えば、発芽した胚を、肥料を含む種子育成混合物に移し、湿潤に保ち、日陰に置いた。その後、発芽した胚を、従来の鉢植え用の培地及び高光度を伴うより大きい鉢に移し、生育させ、開花させた。次いで、望ましい推定上のＦ１ハイブリッド植物を選抜し、挿し木を採取した。
実施例１０−グレビオニス・セゲタム植物と、異四倍体のアルギランセマム植物とのハイブリダイゼーション法
【０１７９】
[0179]本発明の別の態様は、グレビオニス・セゲタムからなる群に由来する植物と、アルギランセマム属の異四倍体植物とを交雑させるステップを含んでいた。Ｇ．セゲタム雌性植物を、花色、生育及び繁殖の容易性、枝分かれの多さ、開花の早さ並びに雄性及び雌性稔性などの所望の形質について選抜した。雄性親として使用する選抜した異四倍体のアルギランセマム植物から、花粉を取り出した。その花粉を、Ｇ．セゲタムの頭状花序が受容性である場合には、小筆を使用して、Ｇ．セゲタム雌性植物の頭状花序の上に適用した。Ｇ．セゲタムの頭状花序の除雄は実施しなかった。次いで、異四倍体のアルギランセマム植物に由来する花粉を受粉させたＧ．セゲタム植物に由来する頭状花序を、２〜３週間後に収穫し、小花を取り出した。次いで、各小花に無菌技術を適用した。好ましくは、材料を被覆するための１％次亜塩素酸ナトリウムを添加した容器に小花をそのまま入れ、その後１滴のＴｗｅｅｎ２０界面活性剤を添加した。容器を蓋で閉鎖し、毎分１回、５分間振とうした。次いで容器を空にし、オートクレーブした蒸留水で小花を３回すすいだ。次いで小花を取り出し、個々に精査した。次いで、任意の発育中の種皮及び子房壁組織を取り出して、胚珠を露出させた。次いで、胚珠から胚を取り出し、ペトリ皿内の適切な胚救出培地上に置いた。培地は、好ましくは推奨比率の半分（すなわち２．２１ｇ／Ｌ）のＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２年）塩、１％活性炭、２０ｇ／Ｌスクロース及び０．７％寒天を含有していた。培地をｐＨ５．８に調整した後、１２１℃で１７分間、１ｋｇ／ｍ２でオートクレーブにかけた。精査した胚を含むペトリ皿をパラフィンで封止し、２５℃の継続的な温度で１日１６時間、蛍光灯の下で維持した生育チャンバー内に置いた。２〜４週間後、発芽した胚を温室環境に移し、そこでアルギランセマム植物の生育に適した従来の苗床の実践に従って（例えば、Ｈａｍｒｉｃｋ，Ｄ．（Ｅｄ）、（２００３年））、胚の発育を促進して成熟した植物にした。例えば、発芽した胚を、肥料を含む種子育成混合物に移し、湿潤に保ち、日陰に置いた。その後、発芽した胚を、従来の鉢植え用の培地及び高光度を伴うより大きい鉢に移し、生育させ、開花させた。次いで、望ましい推定上のＦ１ハイブリッド植物を選抜し、挿し木を採取した。
実施例１１−雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム異四倍体とを用いる属間交雑
【０１８０】
[0180]以前に記載された方法に従って、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム異四倍体とを用いて交雑を実施した。表７Ａは、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム異四倍体とを用いて受粉させた頭状花序の数を示す。
【表１３】
2014027923.tif 000014
【０１８１】
[0181]表７Ａに示された通り、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム異四倍体とを用いて、合計６１個の頭状花序を受粉させた。
【０１８２】
[0182]表７Ｂは、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム異四倍体とを用いて受粉させた受粉から救出された胚の数を示す。
【表１４】
2014027923.tif 000015
【０１８３】
[0183]図７Ｂに示された通り、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム異四倍体とを用いて受粉させた受粉から、合計３４１個の胚を救出した。
【０１８４】
[0184]表７Ｃは、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム異四倍体とを用いた受粉から発育したハイブリッド及び自家受粉植物の数を示す。
【表１５】
2014027923.tif 000016
【０１８５】
[0185]表７Ｃに示された通り、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム異四倍体とを用いる受粉から、合計３７個のハイブリッド及び１６６個の自殖個体を発育させた。
【０１８６】
[0186]表７Ａ、Ｂ及びＣで実施された作業は、雄性異四倍体のアルギランセマム植物と交雑した雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種の群に由来する植物の使用により、ハイブリッド後代並びに自家受粉後代が得られることを示していた。
【０１８７】
[0187]表７Ｄは、表７Ｃに示された選抜した属間ハイブリッド植物の染色体計数を示す。
【表１６】
2014027923.tif 000017
【０１８８】
[0188]表７Ｄに示された通り、発育した全てのハイブリッド植物について、染色体計数はおよそ２ｎ＝２７であると予想されたが、驚くべきことに、観察された数には幅広い変動があった。
実施例１２−雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム二倍体とを用いる属間交雑
【０１８９】
[0189]実施例１１に示された交雑の結果は有望であったため、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、雄性親としてのアルギランセマム二倍体とを用いて、同様の交雑を試みることに決めた。表８Ａは、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、３つのアルギランセマム二倍体親とを用いて受粉させた頭状花序の数を示す。
【表１７】
2014027923.tif 000018
【０１９０】
[0190]表８Ａに示された通り、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、３つのアルギランセマム二倍体親とを用いて、合計２６個の頭状花序を受粉させた。
【０１９１】
[0191]表８Ｂは、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、３つのアルギランセマム二倍体親とを用いる交雑から救出された胚の数を示す。
【表１８】
2014027923.tif 000019
【０１９２】
[0192]表８Ｂに示された通り、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、３つのアルギランセマム二倍体親とを用いる交雑から、合計６０４個の胚を救出した。
【０１９３】
[0193]表８Ｃは、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、３つのアルギランセマム二倍体親とを用いる交雑から発育した自家受粉植物及び属間ハイブリッド植物の数を示す。
【表１９】
2014027923.tif 000020
【０１９４】
[0194]表８Ｃに示された通り、雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種と、３つのアルギランセマム二倍体親とを用いる交雑から、合計１９６個の自家受粉植物及び１３個の属間ハイブリッド植物を発育させた。
【０１９５】
[0195]表８Ａ、Ｂ及びＣで実施された作業は、雄性二倍体アルギランセマム植物と交雑した雌性親としてのＩ．ベルシコロール及びグレビオニス種の群に由来する植物の使用により、ハイブリッド後代並びに自家受粉後代が得られたことを示していた。
実施例１３−戻し交雑のための異三倍体ハイブリッドの使用
【０１９６】
[0196]異四倍体アルギランセマムｘイスメリア・ベルシコロール交雑から発育したほぼ全ての異三倍体ハイブリッドが、雄性不稔性であった（花粉を有さない）。しかしながら、時折、いくらかの花粉を有する植物が生産された。以前に記載された標準的な手順に従ってハイブリダイゼーションを実施し、表９に示された通り、１８個の受粉した頭状花序から、２個のハイブリッド植物を発育させた。この結果は、いくつかの異三倍体属間ハイブリッド植物が、新しい変種のさらなる発育にとって重要であるさらなる育種作業に寄与するための雄性親としての能力を有することを示唆するため、この結果は驚くべきことであった。
【表２０】
2014027923.tif 000021

実施例１４−植物表現型を改変するためのウイルス及びウイロイドの導入
【０１９７】
[0197]キクＢウイルス（ＣＶＢ）及びキクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）は、アルギランセマム及び多くのキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の他の種に感染することが報告された。Ｒａｈｍａｎ，Ｍ．、Ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｏｉｄ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｒｇｕｅｒｉｔｅ  ｄａｉｓｙ、ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ、２００７年により報告されたように、アルギランセマムにおいては、ＣＶＢ及びＣＳＶｄの両方による感染は、単独で、又は組合せで、感染した植物に対する形態学的変化をもたらした。これらの感染因子により誘発された形態学的変化は、花色、開花の早さの変化から植物習性の変化にまで及んだ。以前に記載された方法により発育させたいくつかの異三倍体ハイブリッド植物（系統：異四倍体アルギランセマムｘイスメリア・ベルシコロール及び異四倍体アルギランセマムｘグレビオニス・コロナリア）を、ＣＳＶｄ及びＣＶＢに感染したアルギランセマム植物に接ぎ木するために選抜した。これらの２つの生物に感染したアルギランセマム植物を２回試験し（６カ月の間隔後）、両時点で標準的なＥＬＩＳＡ及びＰＣＲに基づく技術に基づいてＣＳＶｄ及びＣＶＢに感染していることを確認した。異三倍体植物の根付いた挿し木を、ＣＳＶｄ／ＣＶＢ陽性アルギランセマム植物の根付いた挿し木に寄せ接ぎした後、標準的な鉢植え用培地及び栽培実践（例えば、Ｈａｍｒｉｃｋ，Ｄ．、２００３年）を用いて１０ｃｍ直径の鉢に植えた。１カ月後、接ぎ木された植物をより大きい鉢に植え、外科用メス（ｓｃａｌｐａｌ）を用いて異三倍体ハイブリッドからアルギランセマム植物を切り出した。さらに２カ月後、接ぎ木された植物をＣＳＶｄ及びＣＶＢ感染について試験した。試験した全ての接ぎ木された植物は、ＣＳＶｄ及びＣＶＢの両方について陽性であった。
【０１９８】
[0198]感染した、及び未感染の異三倍体ハイブリッドの形態を比較するために、標準的な生育手順を用いていくつかのアクセッションを繁殖及び生育させることにより、実験を実施した。生育試験の間及びその完了（ｃｏｍｐｌａｔｉｏｎ）時に、観察を行った。その結果を表１０に示す。
【表２１】
2014027923.tif 000022
【０１９９】
[0199]表１０に示された通り、結果は、ＣＳＶｄ及びＣＶＢに感染した異三倍体属間ハイブリッドが、花色、習性及び開花の早さなどの特徴における形態の変化を示すことができ、これらの変化の多くが商業生産にとって有益であることを示している。
【０２００】
[0200]いくつかの例示的態様及び実施形態を先に論じてきたが、当業者は、それらの特定の改変、置換、付加及び下位の組合せを認識されよう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲及び今後導入される特許請求の範囲は、かかるすべての改変、置換、付加及び下位の組合せを、それらの真の精神及び範囲内に含まれるものとして包含すると解釈されることを企図する。
【０２０１】
[0201]本発明を説明する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに類似の指示対象の使用は、本明細書に別段示されず、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「包含する(including)」及び「含有する(containing)」という用語は、別段指定されない限り制限のない用語（すなわち「それに限定されるものではないが、含む」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、その範囲に含まれるそれぞれ別個の値を個々に参照する省略法として働くことを単に企図し、それぞれ別個の値は、それがあたかも本明細書に個々に記載されるように本明細書に組み込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示される場合、１１、１２、１３及び１４も開示されている。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段指定されず、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に提示の任意のすべての例又は例示的用語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより明らかにするためのものであり、別段特許請求されない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書では、特許請求されていない任意の要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべき用語はない。
【外国語明細書】
2014027923000001.pdf