(57)【要約】【課題】  健康維持に役立つ消化管免疫調節乳酸菌組成物や消化管免疫調節乳酸発酵食品を提供する。【解決手段】  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc sp.）ＫＫ１０１、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＫＫ１０２、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）ＳＮ１−７のうちの少なくとも一方の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有する。これら乳酸菌は、消化管免疫調節機能を有する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc sp.）ＫＫ１０１、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）ＫＫ１０２、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）ＳＮ１−７のうちの少なくとも１種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有し、消化管免疫調節機能を有することを特徴とする消化管免疫調節乳酸菌組成物。
【請求項２】
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc sp.）ＫＫ１０１、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）ＫＫ１０２、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）ＳＮ１−７のうちの少なくとも１種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有し、消化管免疫調節機能を有する乳酸菌組成物を用い、食品原料を乳酸発酵させたことを特徴とする消化管免疫調節乳酸発酵食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管免疫調節機能を有する新規な乳酸菌組成物及び乳酸発酵食品に関し、特に、発酵食品から単離される特定の乳酸菌の菌体等を含有する乳酸菌組成物及び乳酸発酵食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管や呼吸器粘膜に分布する免疫システムは、免疫系全体の６０％以上を占め、その特徴的な免疫活動により、外来異物の認識・排除を行い、生命活動を維持するのに極めて重要な役割を担っている。
【０００３】
粘膜免疫装置の中でも消化管免疫は，食物からの栄養源の取り込みを監視する他、微生物や食物由来の成分、薬物などの影響を受け、腸内環境の保全や食物アレルギー応答の制御、免疫寛容、造血などの生体応答と密接に関連している。この特徴的な消化管免疫反応は、パイエル板という腸の特殊なリンパ組織によって担われ、このリンパの機能を制御するアジュバント活性様のメカニズムが経口可能なワクチンや抗アレルギー薬開発のための新規な薬理学的作用機序として注目されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００４】
一方で、石川県下で造られる発酵食品には、あじなれずし、かぶらずし、だいこんずし、いかこうじ漬け等、独自性のある発酵食品が多く、この発酵プロセスには、多くの乳酸菌が関与している。
【０００５】
前記なれずしの遊離アミノ酸には、γ−アミノ酪酸を多く含むものがあり、このγ−アミノ酪酸の人等の哺乳動物に対する代表的な生理作用として、脳機能改善、精神安定化、血圧上昇抑制等が知られている。また、なれずしの有機酸量の主成分である乳酸は、乳酸菌によって生成されるが、乳酸菌は、生菌、死菌であっても、その菌体成分が生体に吸収されるか、あるいは腸内細菌を介して、免疫機能の増強や肝機能の促進等に有利に働くとされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mowat et al. Nature Rev.Immunol., Vol.3, 332
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のなれずし等の乳酸発酵食品は、腸内環境を改善し、生体の健康維持や増進に役立つものと考えられるが、免疫に対する機能性等については、未だ十分に解明されていない。
【０００８】
本発明は、このような実情に鑑みて提案されたものであり、石川県下で造られる発酵食品の粘膜応答に及ぼす影響や作用機序を遺伝子レベルで解明し、腸管機能に優れた乳酸菌を見出すことにより、健康維持に役立つ乳酸菌組成物や乳酸発酵食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、石川県の特産の発酵食品について、発酵菌の菌叢解析を行うとともに、ＤＮＡマイクロアレイ法によって腸管の機能を評価することで、消化管免疫調節機能に優れた菌を見出すに至った。本発明は、見出された乳酸菌を用いて、消化管免疫調節機能に優れた乳酸菌組成物及び乳酸発酵食品を提供するものである。
【００１０】
すなわち、本発明の消化管免疫調節乳酸菌組成物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc sp.）ＫＫ１０１、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＫＫ１０２、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）ＳＮ１−７のうちの少なくとも１種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有し、消化管免疫制御活性を有することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の消化管免疫調節乳酸発酵食品は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc sp.）ＫＫ１０１、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＫＫ１０２、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）ＳＮ１−７のうちの少なくとも１種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有し、消化管免疫調節機能を有する乳酸菌組成物を用い、食品原料を乳酸発酵させたことを特徴とする
【００１２】
本発明で用いる特定の乳酸菌は、腸内での抗体産生等、免疫活性化等の機能を有する。したがって、これらを含む乳酸菌組成物や、これら乳酸菌を用いて乳酸発酵された乳酸発酵食品は、消化管の免疫調節機能に優れ、身体の健康維持に役立つ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、消化管免疫調節の機能を持ち健康維持に有用な乳酸菌組成物を提供することができ、また、これを用いて乳酸発酵させることで、同じく消化管免疫調節の機能を持ち健康維持に有用な乳酸発酵食品を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の乳酸菌のＩＦＮ−γ産生を示す図である。
【図２】本発明の乳酸菌のＩＬ−２産生を示す図である。
【図３】本発明の乳酸菌のＩｇＡ産生を示す図である。
【図４】本発明の乳酸菌のＩｇＧ産生を示す図である。
【図５】乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc sp.）ＫＫ１０１の遺伝子解析に用いたマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示す図である。
【図６】乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＫＫ１０２の遺伝子解析に用いたマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示す図である。
【図７】乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）ＳＮ１−７の遺伝子解析に用いたマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示す図である。
【発明の実施の形態】
【００１５】
以下、本発明を適用した乳酸菌組成物及び乳酸発酵食品の実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明の消化管免疫制御活性を有する乳酸菌組成物は、特定の乳酸菌、具体的には独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc sp.）ＫＫ１０１、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＫＫ１０２、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）ＳＮ１−７のうちの少なくとも１種を含むものである。
【００１７】
発酵プロセスには多くの乳酸菌が関与しているが、本発明者らは、乳酸菌の菌叢解析を行うとともに、ＤＮＡマイクロアレイ法によりその機能を評価した。その結果、前記各乳酸菌が、腸での抗体産生等、消化管免疫制御に関して、顕著な活性を有することを見出した。
【００１８】
前記各乳酸菌を組成物に使用する場合、菌体そのものを使用してもよいし、菌体成分や菌体由来成分、菌体処理物等を使用してもよい。例えば、前記菌体成分は、水やアルコールで抽出することにより得ることができる。
【００１９】
また、各乳酸菌は、それぞれ単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いることも可能であり、他の乳酸菌等を添加することも可能である。
【００２０】
さらに、前記各乳酸菌を含む乳酸菌組成物を薬剤等の形態で供する場合には、薬理上許容し得る担体、賦活剤、各種添加物等を加えることも可能である。
【００２１】
一方、本発明の乳酸発酵食品は、前記各乳酸菌を含む乳酸菌組成物を用い、各種食品原料を発酵させたものである。これら消化管免疫調節機能を有する乳酸菌を予め仕込んでおくことで、特定の乳酸菌（前記各乳酸菌）が増殖し、消化管免疫調節機能に優れた乳酸発酵食品を提供することが可能となる。
【００２２】
乳酸発酵させる食品原料は任意であり、あらゆる種類の発酵食品に適用することが可能である。例えば、あじなれずしにも適用することができるし、かぶらずし、だいこんずし、いかこうじ漬け等にも適用することができる。勿論、これらに限らず、世の中に知られている乳酸発酵食品の全てに適用することが可能である。発酵に際しては、例えば前記各乳酸菌を豊富に含む菌叢を利用して発酵食品を造り、製品とすればよい。
【００２３】
以上のように、本発明の乳酸菌組成物や乳酸発酵食品は、消化管免疫制御活性に優れた乳酸菌
を含有しているので、健康を維持する上で極めて有用なものである。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果を基に説明する。
【００２５】
実験方法
（１）サンプルの作製
菌体を濾過後に凍結乾燥に付し、乾燥粉末体を得た。これをサンプルとして以下の実験に用いた。なお、実験に使用した乳酸菌は、下記の３種である。
KK101：ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc
sp.）
KK102：ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）
SN1-7：ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）
【００２６】
これら乳酸菌のうち、乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ（Leuconostoc sp.）ＫＫ１０１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託申請し、以下の受託番号で受託されている。
KK101：（受託番号：NITEP1239）
【００２７】
また、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＫＫ１０２は、市販のカブラ寿しより分離した好塩性乳酸菌であり、多糖を生産するという性質を有する。乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）ＳＮ１−７は、能登地方の市販サバの馴れずしから分離した乳酸菌である。
【００２８】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（雄，５ｗ，日本チャールズリバー）を実験時に適宜購入し、金沢大学自然研動物飼育施設で１週間以上飼育、馴化させてから実験に使用した。
【００２９】
（３）サンプルの調製と投与
（１）の方法で得られたサンプルについて、最終投与量が３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙになるよう、用時、精製水に懸濁して投与サンプルを調製した。この投与サンプルを（２）の条件で飼育したマウスに０．１ｍＬ／１０ｇで１日１回（午前１０時）、連続的に５日間、経口投与した。
【００３０】
（４）パイエル板構成細胞の採取
初回のサンプル投与開始から７日後に、マウスを過剰のエーテルにより致死せしめ、無菌条件下に小腸を摘出して、散布するパイエル板を実体顕微鏡下に摘出した。得られたパイエル板を冷えたリン酸緩衝液に入れて洗浄後、７５０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（ｔｙｐｅＩ：シグマ・アルドリッチ社製）完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０）に投入し、１時間インキュベートした。インキュベート終了後、分離したパイエル板構成リンパ球を２００μｍのナイロンメッシュを通してシングルセル懸濁液として細胞数を計測した。
【００３１】
パイエル板構成細胞を３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるように５％ＦＣＳ化ＲＰＭＩ−１６４０培地に再浮遊して調製し、２４ウエル培養プレートに１ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間の安定培養を行った後に、最終濃度が５μｇ／ｍＬのConcanavalin A（ＣｏｎＡ），あるいは１μｇ／ｍＬのlipopolysaccharide（ＬＰＳ）を各ウエルに添加し、４８〜１４４時間、静置培養した。
【００３２】
（５）培養液上清中のＴｈ１およびＴｈ２関連サイトカインの測定
ＣｏｎＡによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるＴヘルパー細胞による免疫調節因子であるＩＬ−２とＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）、ＩＬ−４とＩＬ−５（Ｔｈ２）を市販のＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて測定した。測定方法は、ｋｉｔの添付文書に従い、形成する発色色素の吸光度を測定し、標準物質による検量線からそれぞれのサイトカイン産生量を算定した。
【００３３】
（６）培養液上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡおよびＩｇＧ１）の測定
ＬＰＳによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるＢ細胞が産生したＩｇＡおよびＩｇＧ１の抗体（免疫グロブリン）量をＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Bethyl Laboratories, Inc社製）を用いて測定した。測定方法はＫｉｔの添付文書にしたがって操作し、形成する発色色素の吸光度を測定した。標準物質による検量線から、培養液上清中の抗体産生量を算定した。
【００３４】
（７）パイエル板構成細胞からのＲＮＡ抽出
上記のパイエル板構成細胞の培養とは別に、（４）の操作で得られたパイエル板について、市販のＲＮＡ抽出ｋｉｔを使用して、パイエル板から直接ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取した。すなわち、ｋｉｔに付属する組織融解用試薬をパイエル板組織に直接添加し、以降はマニュアルに従って操作してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。ＲＮＡ量は２６０および２８０ｎｍの吸光度差を測定することにより計測し、その後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ１μｇを１．２％アガロースゲルで電気泳動した後、ＥＢ（エチジウムブロマイド）染色し、１８Ｓおよび２８Ｓのバンドの明瞭さからＲＮＡのクオリティーを確認した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、以下のＤＮＡマイクロアレイによる発現遺伝子網羅解析を実施するまで−８０℃で保存した。
【００３５】
（８）ＤＮＡマイクロアレイ
パイエル板構成細胞から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡについて発現遺伝子の網羅的解析を実施した。すなわち、（７）の方法で得たＲＮＡ（７００  ｎｇ）を市販の商品名MessageAmp II-Biotin Enhanced kit（Ａｍｂｉｏｎ社製）でｃＤＮＡを作製し、遺伝子標的ハイブリダイゼーションをマウスＧｅｎｅＣｈｉｐ（商品名）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）で測定した。すなわち、ｃＤＮＡから作製した２重鎖ＤＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐに滴下し、４５℃、１６時間作用させた。作用終了後にチップをFluidic
Station 450で洗浄して染色し、ハイブリッド染色された遺伝子をGeneChip Operating
software（商品名）を搭載したワークステーションでイメージ化し、そのイメージのヒートマップを計算機上で数値化した。ミスマッチする発現遺伝子と完全にマッチした遺伝子との差を計算機上で演算し、その後、対照となるマウスから得た遺伝子との相対的な変動をチェックし、１．５倍以上の変動する遺伝子群を抽出した。抽出された遺伝子群で変化が認められたものについては、適宜、Ingenuity Pathway Analysis（ＩＰＡ）解析（データベースアクセスは米国）に付し、そのメカニズム解析を実施した。
【００３６】
実験結果
（１）乳酸菌のThサイトカイン産生に及ぼす結果
図１に示すように、乳酸菌ＫＫ１０１、ＫＫ１０２を３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で５日間、マウスに経口投与した結果、パイエル板構成細胞におけるＩＦＮ−γ産生を有意に活性化したが、乳酸菌ＳＮ１−７を経口投与した場合、ＩＦＮ−γ産生は有意的に抑制された。一方、図２に示すように、ＩＬ−２の産生は以上３種乳酸菌の処理で顕著的に下降した。
【００３７】
（２）乳酸菌の抗体産生（ＩｇＡ、ＩｇＧ）に及ぼす結果
パイエル板は小腸のリンパ組織であり、腸内において抗体を産生するＢ細胞も多数存在する。これらの細胞が産生する抗体の免疫グロブリン（ＩｇＡやＩｇＧ）は、腸粘膜において直接的な生体防御に与る因子であることから、本発明で使用する乳酸菌がこの産生にどのような影響を及ぼすかを検討した。
【００３８】
図３及び図４に示す通り、乳酸菌ＫＫ１０１の３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量を経口投与することにより、パイエル板構成細胞における２種の免疫グロブリンの産生（ＩｇＡとＩｇＧ１）を、ＬＰＳ刺激時において有意に増加させる活性があった。逆に、ＩｇＡとＩｇＧ１の産生は乳酸菌ＳＮ１−７で処理した後下降した。乳酸菌ＫＫ１０２を経口投与することによるマウスのＩｇＡとＩｇＧ１産生については、有意的な変化が見られなかった。
【００３９】
（３）ＤＮＡマイクロアレイを用いたパイエル板構成細胞における発現遺伝子の網羅的解析
３−１：乳酸菌ＫＫ１０１について
図５は、何も処置しないマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動であり、色が濃くなるほど頻繁に発現している遺伝子を表す。中線を軸に上下の閾線を設け、上に発現するドットは遺伝子中で上方調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される遺伝子群、閾線の下側は、下方調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）される遺伝子群をそれぞれ表す。定常状態にある場合には、発現方向に向かう遺伝子はなく、中線を境に１．８倍以上の変動を示す遺伝子は１０個から１００個程度に収まる。
【００４０】
表１に、乳酸菌ＫＫ１０１の投与により変動する遺伝子を示す。本菌を投与した場合のマウスでは、何も処置しないマウスに比べて１７個の重複しない遺伝子に変動が認められた。そのうち１６個はｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされ、残り１個はｄｏｗ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされることがわかった。
【００４１】
【表１】
2014000026.tif 000003
【００４２】
３−２：乳酸菌ＫＫ１０２について
図６に、何も処置しないマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示し、表２−１〜２−４に、乳酸菌ＫＫ１０２の投与により変動する遺伝子を示す。本菌を投与した場合のマウスでは、何も処置しないマウスに比べ８５個の重複しない遺伝子に変動が認められた。そのうち２３個はｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされ、残り６２個はｄｏｗ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされることがわかった。
【００４３】
【表２−１】
2014000026.tif 000004
【００４４】
【表２−２】
2014000026.tif 000005
【００４５】
【表２−３】
2014000026.tif 000006
【００４６】
【表２−４】
2014000026.tif 000007
【００４７】
３−３：乳酸菌ＳＮ１−７について
図７に、何も処置しないマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示し、表３に、乳酸菌ＳＮ１−７の投与により変動する遺伝子を示す。本菌を投与した場合のマウスでは、何も処置しないマウスに比べ２１個の重複しない遺伝子に変動が認められた。そのうち１０個はｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされ、残り１１個はｄｏｗ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされることがわかった。
【００４８】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2014000026.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
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