(57)【要約】【課題】迅速かつ簡便な方法であって、しかも特定菌を高い感度で検出することができる特定菌検出方法を提供すること。【解決手段】本発明は、特定菌に対する親和性を有する生体プローブと蛍光粒子とを結合した生体標識剤を用いて、試料中における特定菌を検出する方法に関する。この方法では、蛍光粒子として、特定菌を含む菌及び試料中の生物由来物質が自家蛍光しない近赤外領域にて蛍光を発するものを選択する。選択した前記蛍光粒子と生体プローブとを結合した生体標識剤を用いる。その生体標識剤を試料に作用させかつ励起光を照射して、近赤外領域の蛍光を誘起する。そして、その蛍光に基づいて特定菌を検出する。【選択図】図２
2014223033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定菌に対する親和性を有する生体プローブと蛍光粒子とを結合した生体標識剤を用いて、試料中における前記特定菌を検出する方法であって、
前記特定菌を含む菌及び前記試料中の生物由来物質が自家蛍光しない近赤外領域にて蛍光を発する蛍光粒子と前記生体プローブとを結合した生体標識剤を用い、その生体標識剤を前記試料に作用させかつ励起光を照射して前記近赤外領域の蛍光を誘起し、その蛍光に基づいて前記特定菌を検出することを特徴とする特定菌検出方法。
【請求項２】
前記試料に近赤外領域の励起光を照射したときに発する前記近赤外領域の蛍光を検出することを特徴とする請求項１に記載の特定菌検出方法。
【請求項３】
前記蛍光粒子は非晶質無機材料微粒子からなることを特徴とする請求項１または２に記載の特定菌検出方法。
【請求項４】
前記試料は農畜産物、食品、食品添加物、飲料、医薬品、医薬部外品及び化粧品の中から選択される少なくともいずれかであり、前記菌は病原性細菌であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の特定菌検出方法。
【請求項５】
前記特定菌を検出する場合、前記近赤外領域の蛍光の強度に関するしきい値をあらかじめ設定し、そのしきい値と実際に得られた蛍光の強度とを比較して前記特定菌の有無を判断することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の特定菌検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中における特定の菌を検出する方法に係り、特には特定の菌に対する親和性を有する生体プローブと蛍光粒子とを結合した生体標識剤を用いて当該特定の菌を迅速かつ簡便に検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
農畜産物、食品、食品添加物、飲料、医薬品、医薬部外品、化粧品などの製品または原料における菌学的安全性は、常に保証されている必要があり、そのために定量的な菌学的分析手法を利用した菌検査が日常的に行われている。このような分析手法では、対象となる試料中に存在する生きた菌（細菌、酵母やカビ等の真菌など）を培養し、塗抹標本やコロニーとして裸眼で目視できる程度まで菌を繁殖させることを行う。
【０００３】
一般的な培養法では、菌が含まれている可能性のある試料を栄養分媒体に植付け、通常これを特定の菌に適した温度で一週間以内の期間中培養する（例えば、培養器内で１日間培養）。そして、得られた培養物の成長度合い及び形状を調査し、その調査結果から試料中に含まれていた菌の種類や量を導き出すようにしている。
【０００４】
ところが、このような培養法では、菌の種類などに依存して数日以上の時間を検出に要することが最大の欠点となっている。
【０００５】
そこで、上記の一般的な培養法に代わるものとして、より短時間でかつ感度の高い菌検出方法（迅速検出法）が従来開発されてきた。迅速検出法においては、検出時間を数日から数時間ほど減らす試みがなされ、その中でも色素または蛍光による菌検出法が数多く提案されてきた。その例を挙げると、目的とする菌の細胞そのものを染色あるいは加水分解すると蛍光を発する基質を作用させ、目的菌の酵素反応により菌体に蛍光を保持させる方法などが従来知られている（例えば特許文献１，２を参照）。
【０００６】
このような迅速検出法では、菌の存在を迅速に検知することは可能であるが、その種類を特定することが困難である。その一方で、産業界においてはヒトに危害を加える例えば病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ菌といった菌の種類を迅速に特定することが望まれている。菌の同定のためには、このような特定の菌に特異的に存在するＤＮＡを増幅した後、ゲル電気泳動を行って当該特定のＤＮＡを検出するという分子生物学法が有効である。しかしながら、このような検出法の場合、増菌及びＤＮＡ増幅に時間がかかるほか、作業者の熟練を要することから、誰にでも操作可能な簡便かつ迅速な検出法であるとは言い難い。
【０００７】
そこで、迅速かつ菌の種類を推定可能な手法として、特定菌に親和性を有する物質（ここでは生体プローブという）の特異性を利用した特定菌の検出法が従来開発されてきた（例えば、特許文献３を参照）。この種の検出法では、生体プローブに量子ドットや蛍光タンパク質などの蛍光物質を標識したものを用い、これを試料に作用させる。そして、ある特定波長の励起光を照射して特定の波長域の蛍光を誘起させ、その蛍光を観測することにより特定菌の存在を検査するようにしている。さらに近年では、菌そのものの発する自家蛍光を検出し、種類を識別しようとする試みもなされている（例えば、特許文献４を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特願２００２−５４３０１６号公報
【特許文献２】特開平１１−１３７２９３号公報
【特許文献３】特開２０１１−２２４０２０号公報
【特許文献４】特願２０１１−５４０７１２号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃ．２００７，１７，４５５−４５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献４や非特許文献１等において明らかなように、菌自体には芳香族アミノ酸や色素等が含まれており、それらが自家蛍光（ＩＦ）を発することが従来知られている。また、検査対象となる食品や飲料等は動植物などに由来する物質（生体由来物質）を材料としているため、可視光域で自家蛍光を発するクロロフィル、カロテノイド等の色素が少なからず含まれている。このことから、菌迅速検出法において用いられる生体プローブに標識した蛍光が可視光域の波長を放出するものの場合、上記のような夾雑物に由来する自家蛍光の影響を受けてしまい、検出感度の低下、偽陽性の頻出といった問題が生じる。従って、特定菌の検出感度を向上させるためには、対象試料中の夾雑物による自家蛍光の影響をできるだけ排除することが必要と考えられている。
【００１０】
また、産業界において食品や飲料等の検査を行う場合、現実的には、Ｏ１５７、サルモネラ菌といった病原性細菌の検査において、必ずしも定量性までは要求されず、むしろ特定の病原性細菌の有無の検出を迅速かつ簡便に行う定性的検査の実現が要求されている。
【００１１】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、迅速かつ簡便な方法であって、しかも特定菌を高い感度で検出することができる特定菌検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そして上記課題を解決するための手段１〜５を以下に列挙する。
【００１３】
［１］特定菌に対する親和性を有する生体プローブと蛍光粒子とを結合した生体標識剤を用いて、試料中における前記特定菌を検出する方法であって、前記特定菌を含む菌及び前記試料中の生物由来物質が自家蛍光しない近赤外領域にて蛍光を発する蛍光粒子と前記生体プローブとを結合した生体標識剤を用い、その生体標識剤を前記試料に作用させかつ励起光を照射して前記近赤外領域の蛍光を誘起し、その蛍光に基づいて前記特定菌を検出することを特徴とする特定菌検出方法。
【００１４】
［２］前記試料に近赤外領域の励起光を照射したときに発する前記近赤外領域の蛍光を検出することを特徴とする手段１に記載の特定菌検出方法。
【００１５】
［３］前記蛍光粒子は非晶質無機材料微粒子からなることを特徴とする手段１または２に記載の特定菌検出方法。
【００１６】
［４］前記試料は農畜産物、食品、食品添加物、飲料、医薬品、医薬部外品及び化粧品の中から選択される少なくともいずれかであり、前記菌は病原性細菌であることを特徴とする手段１乃至３のいずれか１項に記載の特定菌検出方法。
【００１７】
［５］前記特定菌を検出する場合、前記近赤外領域の蛍光の強度に関するしきい値をあらかじめ設定し、そのしきい値と実際に得られた蛍光の強度とを比較して前記特定菌の有無を判断することを特徴とする手段１乃至４のいずれか１項に記載の特定菌検出方法。
【発明の効果】
【００１８】
以上詳述したように、手段１乃至５に記載の発明によると、近赤外領域にて蛍光を発する蛍光粒子と生体プローブとを結合した生体標識剤を用いるとともに、近赤外領域の蛍光に基づいて特定菌を検出することにより、対象試料中の夾雑物による自家蛍光の影響を排除することが可能となる。よって、迅速かつ簡便な方法であるにもかかわらず、特定菌を高感度で検出することができ、偽陽性の出現率を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明を具体化した実施例の特定菌検出方法を実施するための近赤外光検出装置を示す概略図。
【図２】（ａ）は実施例の生体標識剤（蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体）を菌体に作用させたときの様子を示す写真、（ｂ）はコントロールの生体標識剤（蛍光ガラス−ＢＳＡ）を菌体に作用させたときの様子を示す写真、（ｃ）は（ａ）のものを、異なる視野かつより高倍率で観察した様子を示す写真。
【図３】Ｏ１５７抗体で蛍光ガラス微粒子を標識した実施例の生体標識剤を用いた場合と、抗体未標識の蛍光ガラス微粒子を用いた場合とでの差分画像を示す写真。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の特定菌検出方法について詳細に説明する。
【００２１】
本発明の特定菌検出方法は、特定菌に対する親和性を有する生体プローブと蛍光粒子とを結合した生体標識剤を用いて、試料中における特定の菌を検出するための方法である。
【００２２】
本願明細書において菌とは、細菌、真菌及び放線菌の総称として用いており、当該菌のうち特定の菌が本発明の方法による検出対象とされる。細菌としては、グラム陽性細菌やグラム陰性細菌がある。グラム陽性細菌の例としては、腸球菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス属、パエニバチルス属、乳酸桿菌属、リステリア属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ガードネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属などに属する細菌がある。グラム陰性細菌の例としては、シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ステノトロフォモナス属、ブレブンディモナス属、ラルストニア属、アクロモバクター属、フゾバクテリウム属、プレボテラ属、ブランハメラ亜属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属、アエロモナス属、モラクセラ属、ブルセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属、レジオネラ属などに属する細菌がある。真菌の例としては、酵母、カビ（糸状菌）、キノコを挙げることができ、具体的には、カンジダ属、クリプトコックス属、ノカルジア属、アオカビ属、アルタナリア属、ロドトルラ属、アスペルギルス属、フザリウム属、サッカロミセス属、トリコスポロン属などに属する菌がある。放線菌の例としては、ストレプトマイセス属、フランキア属、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アクチノマイセズ属などに属する菌がある。
【００２３】
本発明の方法では、そして先に列挙した特定の菌のなかでも、特定の細菌、とりわけ特定の病原性細菌を検出対象とすることが好適である。その具体例としては、サルモネラ菌(Salmonella enterica)、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、病原性大腸菌(EPEC: Enteropathogenic Escherichia coli)、Ｏ１５７等に代表される腸管出血性大腸菌（EHEC）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）、チフス菌（Salmonella typhi）、パラチフス菌（Salmonella paratyphi A）、コレラ菌（Vibrio colerae）、赤痢菌（Shigella dysenteriae）、セレウス菌（Bacillus cereus）、カンピロバクター菌（Campylobactor jejuni）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などが挙げられる。
【００２４】
本願明細書において試料とは、菌が混入している疑いのある試料のことを広く指し、例えば、農畜産物、食品、食品添加物、飲料、医薬品、医薬部外品及び化粧品の中から選択される少なくともいずれかのように、動植物などに由来する物質（生体由来物質）を材料としているものが好適である。なお、本発明における試料は、先に列挙したものに限定されず、例えば、水（例えば飲料水、非飲料水及び廃水）、海水バラスト、空気、土壌、汚水、血液製剤（例えば血小板、血清、血漿、白血球分画等）、動物の生体から採取した組織試料（例えば筋肉、皮、骨、臓器等）、植物の生体から採取した組織試料（例えば種、葉、茎、根、花、果実等）であってもよい。また、試料の形態は特に限定されず、固体、液体、気体、それらの２種以上の混合物のいずれであってもよい。
【００２５】
本発明の方法では、特定菌を検出するために、生体プローブと蛍光粒子とを結合した生体標識剤を用いる。
【００２６】
本発明の生体標識剤を構成する生体プローブは、上述した特定菌に対する親和性を有している必要がある。生体プローブとしては、検出すべき特定の菌に対して親和性を有するものであれば何ら制限されず、例えば、抗体、レクチン、核酸アプタマー、ペプチド・アプタマー、抗原及びその断片、抗生物質、ペプチド模倣体、ファージ由来の結合タンパク質、宿主防御ペプチド、バクテロシン、バクテリオファージ、色素、あるいはこれらのあらゆる組み合わせが使用可能である。ここに列挙したもののうち、例えば、検出すべき特定の菌のみに対して選択的かつ特異的に結合しうる生体プローブ（抗体、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ペプチド・アプタマーなど）を用いることが好ましい。
【００２７】
本発明の生体標識剤を構成する蛍光粒子は、近赤外領域にて蛍光を発する蛍光粒子である必要があり、とりわけ特定菌を含む菌全般及び試料中の生物由来物質が自家蛍光しない近赤外領域にて蛍光を発する蛍光粒子である必要がある。その理由は、特定菌を含む菌全般や生物由来物質の自家蛍光（即ち夾雑物の自家蛍光）がなくなることで、特定菌に付着した生体標識剤の蛍光のみを捉えることが可能となり、陽性及び陰性のときのＳ／Ｎ比が大きくなるからである。本発明における蛍光粒子が発する蛍光の波長は、具体的には、６５０ｎｍ〜１３００ｎｍ程度、好ましくは７００ｎｍ〜１３００ｎｍ程度、より好ましくは７５０ｎｍ〜１２５０ｎｍ程度の近赤外線の波長域である必要がある。このような波長域は一般に「生体の窓」と呼ばれている。ちなみに、６５０ｎｍ未満の波長域で蛍光を発する蛍光粒子を使用した場合には、夾雑物の自家蛍光を完全になくすことが困難になり、好適なＳ／Ｎ比が達成されにくくなる。逆に、１３００ｎｍ超の波長域で蛍光を発する蛍光粒子を使用した場合には、水の吸収が大きくなることにより光が透過されにくくなる結果、検出感度が低下するおそれがあるからである。
【００２８】
蛍光粒子の形成材料としては、上述した近赤外線の波長域の蛍光を発しうるものであれば特に制約されないことから、例えば、プラスチック等のような有機材料からなる微粒子、セラミック等のような結晶質無機材料からなる微粒子、ガラス等のような非晶質無機材料からなる微粒子を使用することが可能である。
【００２９】
ここで、蛍光粒子の形成材料としては、材料安定性等の観点から有機材料よりも無機材料を選択することが好適であり、さらに無機材料のうち結晶質無機材料よりも非晶質無機材料を選択することが好適である。その理由は次のとおりである。即ち、セラミック等に代表される結晶質無機材料は一般的に硬質であるため、焼結後に粉砕して粉末化することがそもそも困難であり、しかも均一な粒径でかつ球形度の高い粒子を得るためには煩雑な作業を要する。これに対し、ガラス等に代表される非晶質無機材料は、結晶質無機材料ほど硬質ではないことから、粉砕して粉末化することが比較的容易であり、かつその際に均一な粒径でかつ球形度の高い粒子を得ることが比較的容易だからである。ちなみに、均一な粒径でかつ球形度の高い粒子を用いることは、特定菌の検出精度向上にとってプラスに作用しうると考えられる。また、ガラス等に代表される非晶質無機材料は、結晶質無機材料に比べて安価であり、低コスト化に向くといった利点もあるからである。なお、非晶質無機材料のなかでもガラスは、汎用の材料でありコスト的に特に有利である。
【００３０】
有機材料からなる微粒子の具体例としては、蛍光物質を含有するＥＰ樹脂、ＰＰ樹脂、ＰＥ樹脂、ＰＳ樹脂、ＰＥＴ樹脂などのプラスチック微粒子や、組成中に発蛍光性官能基を有するプラスチック微粒子などが挙げられる。結晶質無機材料からなる微粒子の具体例としては、組成中に希土類イオンをドープした酸化物セラミックなどが挙げられる。
【００３１】
非晶質無機材料からなる微粒子の具体例としては、希土類元素やその他の元素の酸化物やハロゲン化物等を原料として製造されたガラス微粒子などが挙げられる。また、このようなガラス微粒子を製造するための原料として、具体的には、酸化ネオジム、塩化ネオジム、硝酸ネオジム、酸化イッテルビウム、塩化イッテルビウム、硝酸イッテルビウム、酸化ランタン、塩化ランタン、硝酸ランタン、酸化イットリウム、塩化イットリウム、硝酸イットリウム、酸化ビスマス、塩化ビスマス、硝酸ビスマス、酸化ホウ素、三塩化ホウ素、酸化アンチモン、塩化アンチモン、硝酸アンチモン、塩化プラジオセム、塩化テルビウム、オルトリン酸、リン酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム等を用いることができる。本発明にて使用するガラス微粒子の好適例としては、例えば、Ｂｉ２Ｏ３−Ｂ２Ｏ３系ガラスを母体とし、Ｙｂ３＋及びＮｄ３＋を発光中心とする蛍光ガラス微粒子を挙げることができる。このような組成の蛍光ガラス微粒子は、酸化ネオジム粉末、酸化イッテルビウム粉末、酸化ビスマス粉末、酸化ホウ素粉末及び酸化アンチモン粉末を原料とし、これらを混合、溶融した後、冷却することにより製造可能である。また、このような組成の蛍光ガラス微粒子は、励起光の照射により励起されると９００ｎｍ〜１１００ｎｍの赤外光を発する。
【００３２】
また、蛍光ガラス微粒子の母体は、上記のようなＢｉ２Ｏ３−Ｂ２Ｏ３系のホウ酸系ガラスのみに限定されず、リン酸系ガラスやフッ化物ガラスであってもよく、具体的には、Ｂｉ２Ｏ３−ＧｅＯ２系ガラス、ＺｎＯ−Ｂ２Ｏ３系ガラス、ＣａＯ−Ｂ２Ｏ３系ガラス、ＣａＯ−Ｐ２Ｏ５系ガラス等の低融点ガラスを例示することができる。蛍光ガラス微粒子の発光中心は、上記のようなＹｂイオン及びＮｄイオンに限定されず、Ｔｍイオン、Ｅｒイオン、Ｄｙイオン、Ｐｒイオン等の希土類イオンであってもよい。希土類イオンはそれぞれ発光波長が異なることから、用途に応じて希土類イオンの種類や配合を決定すればよい。
【００３３】
蛍光粒子の大きさや形状は、生体プローブの特定菌に対する親和能を妨害しない範囲であれば特に制限されることはなく、任意に設定することができる。例えば、特定菌が一般的サイズの細菌（最大径が例えば０．５μｍ〜５μｍ程度の細菌）であり、かつ、蛍光粒子がガラス等の非晶質無機材料微粒子からなるものの場合、平均粒径は１μｍ以下（１０００ｎｍ以下）であることが好ましく、さらには１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることがより好ましい。これは、蛍光強度と粒子重量とのバランスを考慮したためである。即ち、蛍光粒子の平均粒径が上記好適範囲よりも小さいと、十分な蛍光強度が得られず検出感度の向上を達成しにくくなるばかりでなく、均一な粒子を得るのにコスト等がかかる等のデメリットがある。一方、蛍光粒子の平均粒径が上記好適範囲よりも大きいと、十分な蛍光強度が得やすくなる反面、粒子重量が重くなり液体中での分散性が悪くなるおそれがある。ゆえに、特定菌に対する結合性が低下する可能性がある。以上のことを鑑みると、特定菌が一般的サイズの細菌であり、かつ、蛍光粒子がガラス等の非晶質無機材料微粒子からなるものの場合、平均粒径は１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることがさらに好ましく、平均粒径は５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下であることがいっそう好ましく、１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが最も好ましい。もっとも、数１０ｎｍ以下の平均粒径の蛍光粒子を積極的に排除するものではなく、検出が可能なものであれば選択することが勿論許容される。
【００３４】
また、蛍光粒子の形状は、作業者、検査試料、光検出機器、検出方法などに悪影響を与えないのであれば、特に制限されず任意のもの（例えば球状、楕円体状、立方体状、直方体状、塊状、鱗片状など）とすることができるが、強いて言えば球状あるいはそれに近い形状であることが好ましい。
【００３５】
本発明の生体標識剤は、生体プローブと蛍光粒子とを何らかの手段により結合させることで製造される。ここで「結合」とは、化学的な結合を指すばかりでなく、物理的な結合なども含む。また、生体プローブと蛍光粒子とは直接結合していてもよいほか、何らかの介在物を介して間接的に結合していてもよい。さらに、生体プローブは１つの蛍光粒子に対して１個だけ結合していてもよいほか、複数個結合していてもよい。また、異なる特定菌につき個別に親和性を有する複数種の生体プローブを、１つの共通の蛍光粒子に対して結合してもよい。
【００３６】
例えば、蛍光粒子としてガラス等の非晶質無機材料微粒子を選択した場合、本発明の生体標識剤は次のようにして製造することが可能である。一般に蛍光ガラス微粒子の表面には水酸基が存在しているため、当該表面に対して生体プローブの標示に適した任意の官能基を修飾することができる。例えば、シランクロスカップリング剤を用いて表面にＮ−ヒドロキシスクシニイミドエステル（ＮＨＳ）基、イミドエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、ヒドロキシメチルフォスフィン基、マレイミド基、ハロアセチル基、ピリジルスルフィド基、チオスルフォネート基、ビニルスルフォネート基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン基、ジアジリン基、アリルアジド基及び／またはイソシアネート基を修飾し、これら反応性の官能基を介して、蛍光ガラス微粒子表面に生体プローブを結合すればよい。また、蛍光ガラス及び生体プローブを結合可能な方法であってかつ生体プローブの機能を失活させない方法（例えば、ビオチン−アビジン（ストレプトアビジン）、核酸ハイブリダイゼーション、抗原抗体反応等）であれば、何ら制限はなく本発明の生体標識剤の製造にあたり採用することができる。
【００３７】
本発明の方法を実施する際には、まず、菌が混入している疑いのある試料を準備し、それに生体標識剤を作用させる。具体的にいうと、例えば試料が固体である場合には、例えばその表面に生体標識剤をそのまま塗布、散布等する。あるいは固体試料を細かく刻む等の処理を行ったり、搾汁する等の処理を行ってから生体標識剤を添加、混合等する。試料が液体である場合には、生体標識剤を添加、混合等する。
【００３８】
続いて、生体標識剤を作用させた試料に励起光を照射して、近赤外領域の蛍光を誘起する。このとき誘起される近赤外領域の蛍光は、３００ｎｍ〜６５０ｎｍ程度の可視光領域の励起光の照射によるものであっても、それよりも長波長側である近赤外領域の励起光の照射によるものであってもよい。この場合、試料に近赤外領域の励起光、例えば７００ｎｍ〜８５０ｎｍ程度の励起光を照射したときに発する近赤外領域の蛍光を検出することが好ましい。その理由は、このような波長域の励起光によれば、試料の表面ばかりでなくある程度内部にまで到達し得るため、検出に必要かつ十分な強度の蛍光を得ることができるからである。なお、このような励起光の照射は、例えば、８００ｎｍ前後の光を発生しうるレーザーダイオード等からなる光源を備えた市販の半導体レーザ装置を用いて実現することができる。なお、励起光の波長（ピーク波長）と蛍光の波長（ピーク波長）との差は１００ｎｍ以上であることがよく、１５０ｎｍ以上であることがよりよく、２００ｎｍ以上であることが特によい。その理由は、両者の波長の差が小さいと、励起光と蛍光との分離が困難となり、光量ロスの増大につながるからである。例えば、好適例として挙げた上記蛍光ガラス微粒子（母体：Ｂｉ２Ｏ３−Ｂ２Ｏ３系ガラス、発光中心：Ｙｂ３＋及びＮｄ３＋）の場合、約８００ｎｍの励起光の照射により１０００ｎｍを超えるピーク波長の赤外光を発する
【００３９】
また、光源の発した励起光は試料に直接照射してもよいが、例えば光ファイバー等からなる光ガイドを介在させて間接的に照射してもよい。前者の場合には光源をある程度試料に近づけて配置する必要があるが、後者の場合には遠ざけて配置することが可能となる点で装置を構成する上で有利となる。
【００４０】
励起光により誘起された近赤外領域の蛍光は、肉眼での直接観察には不向きであることから、近赤外光を検知可能なフォトダイオードやＣＣＤ素子等の受光素子を備えた光検出機器を用いて検出される。近赤外領域の蛍光を検出する場合、試料と光検出機器との間に、特定波長域の光を選択的に通過させる分光フィルタを介在させることが好ましい。このような分光フィルタを使用すると、例えば、励起光の波長と蛍光の波長とが近い場合であっても、蛍光のみを分離することが可能となり、光量ロスを低減することができる。
【００４１】
本発明の方法において特定菌を検出する場合、近赤外領域の蛍光の強度に関するしきい値をあらかじめ設定し、そのしきい値と実際に得られた蛍光の強度とを比較して前記特定菌の有無を判断することがよい。つまり、本発明の方法では特定菌の有無を定性的に調査することを目的としており、定量性は特に要求していない。具体的にいうと、しきい値は、例えば、蛍光粒子の平均粒径、蛍光粒子の励起発光効率、検出対象である特定菌の表面積から決定することが好適である。
【００４２】
即ち、蛍光粒子の蛍光の強度は、二次元においては面積に依存する。従って、検出において蛍光量及び位置情報を正確に把握するためには、検査対象物の表面積に対する蛍光粒子の「被覆率」が高いことが好ましいことになる。例えば、球状の蛍光粒子が最密に対象物（例えば大腸菌１細胞；表面積約１０μｍ２）に付着すると仮定すると、蛍光粒子の平均粒径を５００ｎｍ〜１０００ｎｍとしたときには大腸菌の表面積に対して被覆率が７８．５％となる。また、蛍光粒子の平均粒径を２５０ｎｍ、２００ｎｍ及び１００ｎｍ以下としたときには、それぞれの被覆率は、８６．４％、８８．３％及び９０％以上となる。この計算結果から、高い被覆率（例えば８５％以上）を確保する上では、蛍光粒子の平均粒径を２５０ｎｍ以下にすることがよいことがわかる。ただし、蛍光粒子の励起発光効率は個々の蛍光粒子の体積に依存するため、蛍光粒子の平均粒径が小さくなると、励起発光効率が低下し、三次元における蛍光強度も低下してしまう。従って、以上のことを考慮すると、蛍光粒子の平均粒径は１５０ｎｍ〜２５０ｎｍ程度が最適であると考えられる。
【００４３】
ここで、本発明の特定菌検出方法の一例として、食品中における特定細菌を検出する方法を採り上げ、その具体的な手法をいくつか説明する。
【００４４】
Ａ）試料及び特定細菌をフィルタ上に捕集する手法（第１の手法）
【００４５】
検査対象が食品（食肉）の場合、食品検査において一般に行われる方法にて検査試料を調製する。例えば、細菌が混入している疑いのある食肉サンプル２５ｇを測り取り、ストマッカー処理する。これに緩衝ペプトン水２２５ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて１〜２分間撹拌混合した懸濁物を試料とする。この試料のうち例えば１ｍＬを採取し、孔サイズ０．４５μｍのフィルタでろ過し、そのフィルタ上に食肉残渣及び細菌を捕集する。生体プローブの非特異的な吸着を抑えるためにブロッキング処理を施した後、例えば腸管出血性大腸菌であるＯ１５７に特異的に付着する生体標識剤を適量振り掛ける。そして、付着せずに残った余剰の生体標識剤を除去すべく、適当な緩衝液で洗浄ろ過する。次に、上記フィルタに対して、蛍光粒子を励起しうる波長の光（ここでは近赤外光）を照射し、蛍光粒子における近赤外の蛍光の強度を測定し、上述したしきい値との比較を行うことで、Ｏ１５７の有無を検出することができる。さらに、蛍光粒子における近赤外の蛍光の位置を特定することにより、Ｏ１５７が存在する位置を特定することもできる。この手法では、励起光として近赤外領域の波長を使用することが可能であるため、短波長励起において一般的に起こる強い散乱を低減することができるとともに、観察深度を上げることができる。よって、対象試料中に特定細菌以外のもの（食肉残渣等の夾雑物）が含まれていたとしても、その自家蛍光の影響を受けにくくなり、特定細菌の蛍光のみを高感度で確実に検出することができる。
【００４６】
Ｂ）抗体等を用いて特定細菌のみを捕集する手法（第２の手法）
上記第1の手法における検査試料は、残渣のサイズが大きい（０．４５μｍ以上の）物理的性状であることから、懸濁物及び目的の特定細菌を併せて分離収集する手法であった。このような手法のほか、例えば、抗体とマイクロ磁気ビーズとの複合体（例えば日本ハム製、「ＮＨビーズシリーズ」）等を用いて、上記検査試料に含まれる目的の特定細菌のみを選択的に捕集し、これを検査試料として上記生体標識剤を作用させてもよい。この後、上記検査試料に対する励起光の照射、蛍光粒子における近赤外蛍光強度の測定、しきい値との比較を順次行うことで、Ｏ１５７の有無を検出することができる。なお、目的の特定細菌を捕集した複合体に対する励起光の照射、近赤外蛍光強度の測定は、例えば複合体をフィルタ上や基板上に固定した状態で行ってもよいが、必ずしも複合体を固定する作業は必須ではない。よって、懸濁された複合体に生体標識剤を作用させて、複合体に生体標識剤を凝集させた状態で、照射及び測定を行うこともできる。そして上記第２の手法によれば、夾雑物である食肉残渣の影響をいっそう軽減することが可能となり、Ｏ１５７の有無の検出について、より信頼性の高い判定結果を得ることができる。ここで、第２の手法による特定細菌の検出は単独で行ってもよいが、上記第１の手法による検査と併せて行うことで、より信頼性の高い「二重検査」とすることができる。
【００４７】
Ｃ）全細菌を捕集する手法（第３の手法）
この手法では、レクチンや交差性の高い抗体のような、一般生菌に幅広く親和性を有する生体プローブが標示された支持体（例えば、磁気ビーズ、シリコン基盤、フィルタ等）上に食品中の全細菌を捕集する。そして、その支持体に特定の細菌（例えばＯ１５７、サルモネラ菌、リステリア菌等）に親和性を有する生体プローブと蛍光ガラス微粒子とを結合させてなる上記生体標識剤を作用させる。この後、励起光の照射、近赤外蛍光強度の測定、しきい値との比較を順次行うことで、目的の特定細菌の有無を検出することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明の特定菌検出方法をより具体化した実施例について詳細に説明する。
【００４９】
＜蛍光ガラス微粒子の調製＞
本実施例では、Ｂｉ２Ｏ３−Ｂ２Ｏ３系ガラスを母体とし、Ｙｂ３＋及びＮｄ３＋を発光中心とする、平均粒径が約２００ｎｍの蛍光ガラス微粒子を用いた。この蛍光ガラス微粒子は、Ｙｂ２Ｏ３を１．０ｍｏｌ％、ＮｄＯ３を４．０ｍｏｌ％、Ｂｉ２Ｏ３を４７．０ｍｏｌ％、Ｂ２Ｏ３を４７ｍｏｌ％、Ｓｄ２Ｏ３を１．０ｍｏｌ％含む組成となっている。このような組成の蛍光ガラス微粒子は、これらの原料粉末を混合、溶融、冷却した後、従来公知の粉砕装置により物理的に粉砕して所定粒径とすることにより製造した。当該蛍光ガラス微粒子は、８０８ｎｍの励起光の照射により、１０１４ｎｍに波長ピークを持つ赤外光を発するものとなっていた。
【００５０】
＜生体標識剤の作製＞
本実施例では、抗大腸菌Ｏ１５７のウサギポリクローナル抗体を生体プローブとし、市販のシランカップリング剤（ＮＡＮＯＣＳ製、「Ｓｉｌａｎｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ」）を介して、この生体プローブと平均径２００ｎｍの蛍光ガラス微細粒子とを結合させることで、生体標識剤を作製した。このようにして作製された本実施例の生体標識剤のことを、便宜上「蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体」と記すことにする。その一方、Ｏ１５７抗体の代わりにＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ，和光純薬製）を用い、同様の手法により蛍光ガラス微細粒子と結合させることで、コントロールの生体標識剤を作製した。コントロールの生体標識剤のことを便宜上「蛍光ガラス−ＢＳＡ」と記すことにする。即ち、本実施例の生体標識剤はＯ１５７に対して高い親和性を有するが、コントロールの生体標識剤はそのような親和性を有していない点で相違する。
【００５１】
＜近赤外光検出装置の構成＞
図１には、本実施例の検査において使用する近赤外光検出装置１１が概略的に示されている。この近赤外光検出装置１１は、試料中に特定細菌が存在するか否かを検査するための装置であって、光ガイド１２、サンプル台１３、対眼フィルタ１４、レンズ１５、カメラ本体１６、図示しない光源、図示しない制御手段等により構成されている。サンプル台１３上には検査対象となるサンプル１７が載置可能となっている。サンプル台１３の直上位置には、レンズ１５とカメラ本体１６とを有するカメラ（光検出機器）が当該レンズ１５を下向きにして配置されている。本実施例において具体的には、近赤外領域の撮像に適したインジウムガリウムヒ素カメラが使用されている。また、サンプル１７とレンズ１５との距離は３５ｍｍに設定されている。対眼フィルタ１４は、サンプル台１３とレンズ１５との間に介在して配置されている。この対眼フィルタ１４（本実施例ではＩＲ８５フィルタを使用）は、可視光をカットする反面、それよりも長波長域の蛍光を選択的に通過させる性質を持っている。図示しない光源は、細菌が混入している疑いのある試料に照射する励起光を発生させる。本実施例において具体的には、光源として、８０８ｎｍの赤外光を発生するレーザーダイオード（出力：５００ｍＡ）を使用している。光源はサンプル台１３から若干離れた位置に設置されている。光源の発した励起光は、光ガイド１２によってガイドされ、サンプル台１３のすぐ近くまで導かれる。本実施例において具体的には、光ガイド１２として、直径６ｍｍのバンドルファイバが使用されている。また、光ガイド１２とサンプル１７との距離は１３ｍｍに設定され、励起光の入射角度はサンプル台１３の主面に対して４５°をなすように設定されている。
【００５２】
このように構成された近赤外光検出装置１１では、光源に電力を供給して励起光を発生させると、その励起光が光ガイド１２を介してサンプル１７に照射される。サンプル１７にて発生した蛍光は、対眼フィルタ１４を通過した後、カメラのレンズ１５に到り、カメラ本体１６内の図示しない光検出素子により検出され、強度に応じた所定の電気信号に変換される。カメラにはコンピュータ等の制御手段が電気的に接続されており、その制御手段が所定の信号処理を行うことで、撮像された画像が図示しないディスプレイに表示されるようになっている。
【００５３】
＜生体標識剤を用いたＯ１５７の検出＞
Ｏ１５７をＬＢ培地（１％トリプトン，１％塩化ナトリウム，０．５％酵母抽出物）にて一晩３７℃にて振とう培養し、細胞懸濁液とした。そして、細胞懸濁液１μＬと、本実施例の生体標識剤である「蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体」とをガラス重湿量にて１５μｇずつ混合した。なお、細胞懸濁液１μＬとコントロールである「蛍光ガラス−ＢＳＡ」についてもガラス重湿量にて１５μｇずつ混合した。混合後のものについて、それぞれ位相差顕微鏡を用いて１０００倍の倍率にて観察した結果を図２に示す。図２（ａ）の写真に示すように、蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体は、Ｏ１５７の菌体と結合する能力を有していた。図２（ｃ）は、異なる視野かつより高倍率で観察した様子を示す写真であるが、これによると菌体に蛍光ガラス微粒子が付着していることがわかる。ちなみに、各写真中の実線矢印は蛍光ガラスを指し、破線矢印は菌体を指している。その一方で、蛍光ガラス−ＢＳＡは菌体に結合せず、非特異的吸着は起きていないことが確認された（図２（ｂ）を参照）。以上のことから、蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体は、Ｏ１５７の検出に使用可能であることがわかった。
【００５４】
このような結果に基づいて、次に、ＬＢ寒天培地上に形成された直径２ｍｍのＯ１５７コロニーをスライドガラスに転写し、２．５％グルタルアルデヒド水溶液により固定した。そこに、本実施例の生体標識剤である「蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体」の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７）懸濁液をガラス重湿量５０μｇ分滴下した。滴下後、１分間静置した後、同緩衝液にて洗浄して、観察用のサンプルとした。これと同様の操作を、抗体未標識の蛍光ガラス微粒子についても行い、観察用のサンプルとした。これら２種のサンプルを、図１に示した近赤外光検出装置１１で観察し、差分画像を求めたところ、「蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体」を作用させたものについて有意な蛍光強度の増加が認められた（図３の写真を参照）。このことから、本実施例の生体標識剤である「蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体」が特異的にＯ１５７に結合し、その蛍光を観察することによりＯ１５７を検出可能であることがわかった。
【００５５】
そこで本実施例では、Ｏ１５７を少量混入させた食肉を検査対象として用い、上記実施形態にて紹介した第１の手法に従い、食肉サンプルの懸濁物を作製してこれを試料とした。次いで、この試料をフィルタ上に捕集してブロッキング処理を施し、本実施例の生体標識剤である「蛍光ガラス−Ｏ１５７抗体」を適量振り掛けた後、緩衝液で洗浄ろ過した。そして、この状態の上記フィルタをサンプル１７として用い、これを近赤外光検出装置１１のサンプル台１３上に載置して、励起光である近赤外光の照射を行うとともに、蛍光ガラス微粒子における近赤外の蛍光をカメラで撮像した。ここで、近赤外光検出装置１１を構成する制御手段には、あらかじめ定めた所定のしきい値に関するデータと、そのしきい値データと実測の蛍光強度とを比較させる演算処理のプログラムとを格納しておいた。このように構成した場合、カメラから制御手段に所定の信号が入力されると、制御手段が前記プログラムを実行し、上述したしきい値と実測の蛍光強度との比較が行われる。その結果、しきい値よりも高い蛍光強度であると判断され、試料中に確かに特定細菌であるＯ１５７が有ることが検出された。
【００５６】
従って、本実施例の特定細菌検出方法によれば以下の効果を得ることができる。
【００５７】
（１）本実施例の方法では、近赤外領域にて蛍光を発する蛍光粒子と生体プローブとを結合した生体標識剤を用いるとともに、近赤外領域の蛍光に基づいて特定細菌を検出することを特徴としている。ゆえに、対象試料中の夾雑物による自家蛍光の影響を排除することが可能となり、偽陽性の出現率を確実に低減することができる。
【００５８】
（２）本実施例の方法は、例えば、特定細菌に特異的に存在するＤＮＡを増幅した後、ゲル電気泳動を行って当該特定のＤＮＡを検出するという分子生物学法とは異なり、時間がかかる工程（増菌やＤＮＡ増幅等）を必要としない。また、方法の実施にあたって、作業者の熟練を要するといったこともない。それゆえ、誰にでも操作可能な簡便かつ迅速な検出法であると言うことができる。しかも、本実施例の方法は、基本的に定量的な検査ではなく定性的な検査を目的とするものであることから、工程数が少なくて全体的にシンプルな手法となっている。従って、例えば特定細菌の量を求めるために検量線をあらかじめ算出しておく手間もなく、また、特定細菌に対して過不足なく生体標識剤を結合させるための余剰分選別処理等を行う手間も省くことができる。この点からみても、本実施例の方法は簡便かつ迅速な検出法であるとことが理解できる。ちなみに、ＰＥＴ、ＣＴ、ＭＲＩのような検査方法と比較した場合でも、特殊な設備や環境が不要である点で非常に有利である。
【００５９】
次に、前述した実施の形態によって把握される技術的思想を以下に列挙する。
【００６０】
（１）上記手段２において、前記試料に近赤外領域の励起光を照射したときに発する前記近赤外領域の蛍光は、前記励起光の波長よりも１００ｎｍ以上長い（好ましくは２００ｎｍ以上長い）波長を有すること。
（２）上記手段１または２において、前記蛍光粒子は平均粒径が１μｍ以下の非晶質無機材料微粒子からなること。
（３）上記手段１または２において、前記蛍光粒子は平均粒径が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下（好ましくは１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下）の蛍光ガラス微粒子からなること。
（４）上記手段１または２において、前記特定菌が最大径０．５μｍ以上５μｍ以下の細菌であり、かつ、前記蛍光粒子は平均粒径が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下（好ましくは１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下）の蛍光ガラス微粒子からなること。
（５）上記手段５において、前記しきい値は、蛍光粒子の平均粒径、蛍光粒子の励起発光効率、検出対象である特定菌の表面積から決定されること。
（６）上記手段５において、前記しきい値は、蛍光粒子の平均粒径、蛍光粒子の励起発光効率、検出対象である特定菌の表面積から決定されるとともに、前記蛍光粒子の平均粒径は、前記特定菌の表面積に対する蛍光粒子の被覆率が８５％以上となるように設定されること。
（７）上記手段１乃至５のいずれか１項において、励起光を発する光源と、試料を支持する試料支持台と、励起光を発する光源と、前記励起光を前記光源から前記サンプルに導く光ガイドと、前記試料支持台から離間した位置にて対眼フィルタを介して配置された光検出機器とを備えた近赤外光検出装置を用いて、前記試料中における前記特定菌の有無を判断すること。
【符号の説明】
【００６１】
１１…近赤外光検出装置
１２…光ガイド
１３…サンプル台
１４…対眼フィルタ
１５…レンズ
１６…カメラ本体
１７…サンプル
【図１】
2014223033.tif 000003
【図２】
2014223033.tif 000004
【図３】
2014223033.tif 000005