(57)【要約】【課題】トランスジェニック魚類及びトランスジェニック魚類を用いて検出対象物質を検出又は定量する方法を提供すること。【解決手段】トランスジェニック魚類は、リガンドが結合したＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体を転写開始に必要な転写因子とするプロモーターと、マーカータンパク質をコードするＤＮＡとをゲノムに有し、前記マーカータンパク質をコードするＤＮＡは前記プロモーターの制御下にあり、前記マーカータンパク質は視覚的に検出可能なシグナルを発する。検出対象物質を検出又は定量する方法は、トランスジェニック魚類を検出対象液中に配置し、前記シグナルを視覚的に検知し、その結果に基づいて行われる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドが結合したＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体を転写開始に必要な転写因子とするプロモーターと、マーカータンパク質をコードするＤＮＡとをゲノムに有し、前記マーカータンパク質をコードするＤＮＡは前記プロモーターの制御下にあり、前記マーカータンパク質は視覚的に検出可能なシグナルを発する、トランスジェニック魚類。
【請求項２】
前記魚類はメダカである請求項１記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３】
前記プロモーターは配列番号１を有する請求項１又は２に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項４】
前記トランスジェニック魚類はＴｇ２０系統のメダカである請求項３記載のトランスジェニック魚類。
【請求項５】
前記リガンドを分解又は阻害する内因性タンパク質をコードするＤＮＡの発現が下方制御された請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック魚類。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置し、前記シグナルを視覚的に検知し、その結果に基づいて検出対象物質を検出又は定量する方法。
【請求項７】
前記検出対象物質はＰＡＨを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記トランスジェニック魚類はメダカ卵であり、受精後５日以降の前記メダカ卵を用いて前記配置を行う請求項６又は７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック魚類及びトランスジェニック魚類を用いて検出対象物質を検出又は定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タバコの煙に含まれるベンゾピレンに代表される多環芳香族炭化水素（以下ＰＡＨ）や、塩素を含む物質の不完全燃焼で生じるダイオキシン類は、環境から直接、あるいは、生態系の生物を介して関節にヒトの体内に入ることが知られている。ＰＡＨやダイオキシン類の中の一部のものは、発がん性、変異原性、催奇性を持ち、また、ダイオキシン類は難分解性、蓄積性を持つ。そのため、環境中におけるこれらの物質のモニタリングは欠かせない。
【０００３】
また、ＰＡＨやダイオキシン類などの外来性の化学物質の体内における解毒は、第１相反応と第２相反応から成り立っていることが知られている。外来性の化学物質は、第１相反応で水酸化などの修飾を受け、第２相反応で捕酵素の抱合を受け、水溶性を増し、体外に排泄されやすくなる。その中でも、異物代謝酵素であるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は、第１相反応において特に重要な生態防御機構を担っており、一原子酵素添加反応を触媒する。これが酸化、水酸化、脱アルキル化、脱アミノ化、エポキシ化などさまざまな反応を引き起こし、化学物質が解毒される（非特許文献１）。
【０００４】
シトクロムＰ４５０の一つであるＣｙｐ１ＡはＰＡＨやダイオキシン類などの環境化学物質などにより発現誘導されるが、その機構にはダイオキシン類受容体として働くＡｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡｈＲ）が重要な役割を果たす。細胞質に存在するＡｈＲにＰＡＨやダイオキシン類などのリガンドが結合すると、ＡｈＲはＡＲＮＴとヘテロ２量体を形成して核内に移行する。ＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体は配列特異的に複数の遺伝子プロモーターに結合し、Ｃｙｐ１Ａなど異物代謝にかかわる遺伝子群が誘導される。
【０００５】
ベンゾピレンや３−メチルコラントレンのようなＰＡＨは、発がん性を有するものが多く、環境中のこれらの物質はさまざまな方法でモニターされる。例えば、環境化学物質をモニタリングする方法として、Ｃｙｐ１Ａのプロモーターに蛍光タンパク質を結合させたものを培養細胞に導入して、蛍光強度によってＰＡＨ濃度を測定する方法や、ＧＣ／ＭＳ（非特許文献２）やＨＰＬＣなどの化学分析を用いた方法がある。さらに、魚類の胚は大量に調整でき、使用にあたって倫理的な問題も少ないので環境化学物質モニタリングに適しているという観点から、魚類の発生中における心浮腫を用いた方法がある（非特許文献３、４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐ４５０の分子生物学  第２番（ＫＳ医学・薬学専門書）石村  巽,藤井  義明,大村常雄
【非特許文献２】Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔｓ  ａｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＭＣ２５２−Ｓｐｉｌｌ  Ｌｅａｄ  ｔｏ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｉｌ−Ｃｏｎｔａｍｉｎａｅｄ  Ｇｕｌｆ  Ｍｅｘｉｃｏ  Ｓａｎｄ．  Ａｌｉｓｓａ  Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｍａｒｋｕｓ  Ｈｕｅｔｔｅｌ，  ＰＬＵＳ  ＯＮＥ，ｗｗｗ．ｐｌｏｓｏｎｅ．ｏｒｇ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１２，Ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ｉｓｓｕｅ  １１，ｅ５０５４９
【非特許文献３】Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｅｄａｋａ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ．  Ｐａｄｉｌｌａ  Ｓ，Ｃｏｗｄｅｎ  Ｊ，Ｈｉｎｔｏｎ  ＤＥ，Ｙｕｅｎ  Ｂ，Ｌａｗ  Ｓ，Ｋｕｌｌｍａｎ  ＳＷ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｒ，Ｈａｒｄｍａｎ  ＲＣ，Ｆｌｙｎｎ  Ｋ，Ａｕ  ＤＥ．Ｄｕｒｒ  Ｐｒｏｏｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００９Ｆｅｂ；Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｕｎｉｔ１．１０．
【非特許文献４】ＴＣＤＤ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  ｅｄｅｍａ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＣＯＸ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｄａｋａ  （Ｏｌｙｚｉａｓ  Ｌａｔｉｐｅｓ）ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｄｏｎｇ  Ｗ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｆ，Ｋｕｌｌｍａｎ  ＳＷ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｓｃｉ．２０１０  Ｎｏｖ；１１８（１）：２１３−２３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、培養細胞によるバイオモニタリング系は、培養装置などの特殊な装置を要するという問題があった。また、ＧＣ／ＭＳやＨＰＬＣなどの化学分析は、時間がかかる上、環境化学物質の複数の分子種を網羅しなくてはならず解析が煩雑であり、しかも、複数の環境化学物質を混合したときの効果が不明であるため、環境化学物質が個体レベルでどのような影響を与えるかわからないという問題があった。
【０００８】
また、従来の魚卵を用いたアッセイ系では、形態形成を待たなくてはならないので、結果を得るまで数日から一週間以上かかる上、定量が難しいという問題があった。
【０００９】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、迅速かつ簡便に検出対象物質を検出又は定量できる、新規なトランスジェニック魚類及び検出対象物質の検出又は定量を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、所定のＤＮＡをゲノムに有するトランスジェニック魚類を用いることで、迅速かつ簡便に検出対象物質を検出又は定量することができることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は、以下のようなものを提供する。
【００１１】
（１）リガンドが結合したＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体を転写開始に必要な転写因子とするプロモーターと、マーカータンパク質をコードするＤＮＡとをゲノムに有し、前記マーカータンパク質をコードするＤＮＡは前記プロモーターの制御下にあり、前記マーカータンパク質は視覚的に検出可能なシグナルを発する、トランスジェニック魚類。
【００１２】
（２）前記魚類はメダカである（１）記載のトランスジェニック魚類。
【００１３】
（３）前記プロモーターは配列番号１を有する（１）又は（２）に記載のトランスジェニック魚類。
（４）前記トランスジェニック魚類はＴｇ２０系統のメダカである（３）記載のトランスジェニック魚類。
【００１４】
（５）前記リガンドを分解又は阻害する内因性タンパク質をコードするＤＮＡの発現が下方制御された（１）から（４）のいずれかに記載のトランスジェニック魚類。
【００１５】
（６）（１）から（５）のいずれかに記載のトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置し、前記シグナルを視覚的に検知し、その結果に基づいて検出対象物質を検出又は定量する方法。
【００１６】
（７）前記検出対象物質はＰＡＨを含む（６）記載の方法。
【００１７】
（８）前記トランスジェニック魚類はメダカ卵であり、受精後５日以降の前記メダカ卵を用いて前記配置を行う（６）又は（７）の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、トランスジェニック魚類が所定のＤＮＡをゲノムに有することで、迅速かつ簡便に、検出対象物質を検出又は定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施例に係る、孵化後のトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置することで、トランスジェニック魚類においてマーカータンパク質が発現し、蛍光を発することを示す図である。
【図２】本発明の一実施例に係る、魚卵であるトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置することで、トランスジェニック魚類においてマーカータンパク質が発現し、蛍光を発することを示す図である。
【図３】本発明の一実施例に係る、魚卵であるトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置することで、トランスジェニック魚類においてマーカータンパク質が発現し、主に肝臓において蛍光を発することを示す図である。
【図４】本発明の一実施例に係る、魚卵であるトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置することで、トランスジェニック魚類においてマーカータンパク質が発現し、蛍光を発することを示す図である。
【図５】本発明の一実施例に係る、魚卵であるトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置することで、トランスジェニック魚類においてマーカータンパク質が発現し、主に肝臓において蛍光を発することを示す図である。
【図６】本発明の一実施例に係る、魚卵であるトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置することで、トランスジェニック魚類においてマーカータンパク質が発現し、卵黄において蛍光を発することを示す図である。
【図７】本発明の一実施例に係るトランスジェニック魚類を検出対象液中に配置することで、トランスジェニック魚類においてマーカータンパク質が発現し、それによって発せられた蛍光の蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに特に限定されるものではない。
【００２１】
＜トランスジェニック魚類＞
本発明のトランスジェニック魚類は、リガンドが結合したＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体を転写開始に必要な転写因子とするプロモーターと、マーカータンパク質をコードするＤＮＡとをゲノムに有し、前記マーカータンパク質をコードするＤＮＡは前記プロモーターの制御下にあることを特徴とする。これにより、トランスジェニック魚類は、視覚的に検出可能なシグナルを発する。
【００２２】
トランスジェニック魚類とは、上記特徴を有するものであれば特に種類は限定されないが、その種類としては、例えば、メダカ、ゼブラフィッシュ、キンギョ、サケ、ヒラメ、ドジョウ、コイ、アフリカナマズ、テラピア、タイセイヨウサケ、ニジマスなどが挙げられる。トランスジェニック魚類としては、メダカは、飼育が容易である、安価に飼育が可能である、淡水及び海水の双方に対する適応性が高い、ライフライクルが短くて繁殖が容易であるといった点において研究や実験の用途に適しているので、メダカを用いることが好ましい。
【００２３】
リガンドは、ＡｈＲに結合し、ＡｈＲをＡＲＮＴとヘテロ２量体を形成させて核内に移行させ、ＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体を配列特異的に複数の遺伝子プロモーターに結合させ、Ｃｙｐ１Ａなどの異物代謝にかかわる遺伝子群が誘導させるものであれば特に限定されない。リガンドとしては、ＰＡＨやダイオキシン類が例として挙げられる。
【００２４】
ＰＡＨとは、例えば、ベンゾピレン、３−メチルコラントレン、β―ナフトフラボン、ナフタレン、テンタレン、インデン、アズレン、インデノピレン、ジベンゾアントラセン、ジベンゾピレン、フルオレン、フェナレン、フェナンスレン、アントラセン、トリフェニレン、ピレン、ペリレンなどを指す。ダイオキシン類とは、ポリ塩化ジベンゾパラジオキシン（ＰＣＤＤ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、コプラナーＰＣＢ（Ｃｏ−ＰＣＢｓ）の総称をいう。
【００２５】
本発明のプロモーターは、リガンドが結合したＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体を転写開始に必要な転写因子とするものであれば、特に限定されない。本発明のプロモーターとは、具体的には、Ｃｙｐ１Ａプロモーター、Ｃｙｐ１Ｂ１、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、キノンレダクターゼ、ＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＡｈＲＲなどを指す。また、ＸＲＥ（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）をタンデムにつないだ人工的なプロモーターであってもよい。本発明のプロモーターは、転写因子であるＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体に対して高い発現性を有するという点において、配列番号１（Ｃｙｐ１Ａプロモーター）を有するのが好ましい。
【００２６】
マーカータンパク質とは、視覚的に検出可能なものであれば特に限定されないが、具体的には、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）などの蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、エクオリンなどの発光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼなどの呈色反応を触媒するタンパク質などを指す。
【００２７】
発現するｍＲＮＡの安定性が高くなるので、マーカータンパク質をコードするＤＮＡの下流にｐｏｌｙＡを接続させてもよい。ｐｏｌｙＡは、特に限定されないが、発現するｍＲＮＡの安定性がより高くなるという点において、メダカＣｙｐ１ａ由来のもの、ＳＶ４０由来のもの又はメダカβ―アクチン遺伝子由来のものなどが好ましい。
【００２８】
本発明のトランスジェニック魚類の具体例として、プロモーターとして配列番号１を、マーカータンパク質をコードするＤＮＡとしてＥＧＦＰを、ｐｏｌｙＡとしてＳＶ４０由来のものをそのゲノムに有するトランスジェニックメダカが挙げられる。そのようなトランスジェニックメダカの系統としては、Ｔｇ５、Ｔｇ９、Ｔｇ１１、Ｔｇ１３、Ｔｇ１５、Ｔｇ２０がある。Ｔｇ２０は、ＥＧＦＰが卵黄を覆う細胞において発現し、その全体が光るため、検出対象物質を検出又は定量する際に安定した蛍光強度を得ることができるという点において好ましい。
【００２９】
Ｔｇ５、Ｔｇ９、Ｔｇ１１、Ｔｇ１３、Ｔｇ１５、Ｔｇ２０の各系統は、慶應義塾大学医学部衛生学公衆衛生学教室にて保存にされており、こちらで入手可能である。本教室は、東京都新宿区信濃町３５番地の慶應義塾大学医学部内にある。また、本教室の連絡先の電話番号は、０３−５３６３−３７５８である。
【００３０】
本発明のトランスジェニック魚類は、リガンドを分解又は阻害する内因性タンパク質をコードするＤＮＡの発現が下方制御されたものである方が好ましい。この下方制御により、内因性タンパク質によってリガンドが分解又は阻害されないので、ＡｈＲに結合できるリガンドが増加する。ＡｈＲに結合できるリガンドが増加すると、ＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体による転写開始が促進され、マーカータンパク質の発現が増加する。その結果、マーカータンパク質による視覚的に検出可能なシグナルが増加し、検出対象物質の検出又は定量するための感度が高くなる。
【００３１】
内因性タンパク質は、リガンドを分解又は阻害する内因性タンパク質であれば特に限定されないが、具体的には、Ｃｙｐ１Ａ、Ｃｙｐ１Ｂ１、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、キノンレダクターゼ、ＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼなどを指す。
【００３２】
上記下方制御は、代表的なものとして、対象とする内因性タンパク質の遺伝子のノックアウトがあげられる。また、ノックアウト以外には、ＲＮＡｉ技術などによる、内因性タンパク質の発現を抑制する方法（ノックダウン）が挙げられる。
【００３３】
＜トランスジェニック魚類の作製＞
本発明のトランスジェニック魚類は、以下の方法で作製することができるが、これに特に限定されるものではない。
【００３４】
本発明のトランスジェニック魚類は、例えば、本発明のプロモーターの下流にマーカータンパク質のＤＮＡを有するプラスミドを、魚卵にマイクロインジェクションすることにより、作成することができる。
【００３５】
上記プラスミドは、従来の公知の方法のいずれによっても作成することができる。例えば、プロモーターやマーカータンパク質をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、それらとベクターとを同じ制限酵素などで処理し、ＤＮＡリガーゼによりライゲーションすることで作製することができる。この際、上記ｐｏｌｙＡをさらにその下流に接続させてもよい。
【００３６】
ＤＮＡの精製、確認、濃度の測定は、従来の公知のいずれの方法によってもすることができる。例えば、ＤＮＡの精製は、Ｑｉａｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いることですることができる。さらに、精製したＤＮＡはＭｕｐｉｄによるミニゲル電気泳動によって、そのサイズと質を確認することができる。また、ＤＮＡ濃度は分光光度計ナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定することができる。
【００３７】
精製したプラスミドは、緩衝液によって希釈し、又はインジェクションを容易にするためにプラスミド溶液を着色してもよい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液を用いてもよく、ＤＮＡ濃度は、例えば１０〜１０００ｎｇ／μｌとなるように希釈してもよい。プラスミド溶液の着色は、例えば、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）によって、赤色に着色してもよい。
【００３８】
インジェクションを行うために、精製したプラスミド溶液は、Ｍｉｃｒｏｌｏａｄｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）などを用いて、インジェクションニードルへ充填することができる。
【００３９】
魚卵へのプラスミドのインジェクションは、そのゲノムに本発明の目的とするＤＮＡを組み込むことができる方法であれば特に限定されないが、例えば以下のような方法でインジェクションをすることができる。
【００４０】
受精直後の魚卵を保持するために、アガロースゲルによってエッグホルダーを作製し、そのエッグホルダーの溝に魚卵を整列させる。ＤＮＡ溶液を入れたインジェクションニードルを、マイクロマニピュレータ（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）に装着し固定する。実体顕微鏡下でピンセットを用いて魚卵を回転させ、針先に細胞（胚）が来るように位置を調節する。マイクロマニピュレータのねじを回して卵の表面を針で触り、針の先端に穴を開けたのち細胞の中に挿入する。また、胚へのＤＮＡ溶液の注入にはコンプレッサー内臓型のＦｅｍｔｏＪｅｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いてすることができる。その際、保持圧力と噴射圧力を適宜調節する。インジェクションする際は、液を胚の細胞に入れる。
【００４１】
アガロースゲルは、例えば、アガロース粉末にセディメントフィルタと活性炭で処理した脱塩素水を加え、電子レンジで加熱して溶解することにより作製することができる。溶解後のアガロースゲルは、ディッシュに移し、魚卵を保持するためのエッグホルダーの溝を、アクリル製の型などで作ってもよい。ディッシュの幅と、エッグホルダーの溝の幅は、インジェクションする魚卵の数や魚卵のサイズにより適宜調整することができるが、メダカの魚卵の場合、例えば１０ｃｍのディッシュを用い、約１ｍｍの幅としてもよい。
【００４２】
インジェクション用の針は、例えば、プラーを（ＰＣ−１０、ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ社）用いて、ガラスキャピラリー（ＧＤ１、ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ社）を加熱し引き伸ばすことにより作製することができる。
【００４３】
インジェクションニードルの太さは、太すぎれば卵膜を貫通することができず、細すぎれば針はすぐに破損する。また、インジェクションする際の温度を上げれば針先は細く長くなり、温度を下げれば針先は太く短くなる。インジェクションをするための針が卵膜を貫通し、破損させない太さにするための温度は、好ましくは４０〜８０℃であり、より好ましくは５０〜７０℃であり、最も好ましくは６０〜６５℃である。
【００４４】
インジェクションする際に常にかかる保持圧力は、高すぎると液が常に漏れ続けてしまいインジェクションに適さない。一方、保持圧力が低すぎると、細胞内に挿入した際に細胞液が逆流し、細胞構造を破壊してしまう。また、注入する際にかかる噴射圧力は、高すぎると液が入りすぎてしまい細胞が生存できないが、低すぎると細胞内圧の方が高圧となって注入することができない。保持圧力は、液の漏れが少なく、細胞構造を破壊しないという点において、好ましくは７０〜１３０ｈＰａであり、より好ましくは８０〜１２０ｈＰａであり、最も好ましくは９０〜１１０ｈＰａである。噴射圧力は、細胞が生存させ、注入しやすくなるという点において、好ましくは３００〜５００ｈＰａであり、より好ましくは３５０〜４５０Ｐａであり、最も好ましくは３８０〜４２０Ｐａである。
【００４５】
インジェクション後の胚の一部は、細胞構造の機械的な破壊のために死亡する。また、注入したＤＮＡ自体の毒性によっても胚は死亡する。インジェクションした個体のうち生存する割合は特に限定されない。ただし、生存率を上げるために注入量を少なくすれば、トランスジェニック系統が作られる確率が減少するので、インジェクションした個体の半数が生存するレベルにＤＮＡ量をコントロールするのがよい。インジェクションした個体のうち生存するレベルがより半数に近くなるＤＮＡ濃度は、好ましくは、１００〜９００ｎｇ／μｌであり、より好ましくは２００〜８００ｎｇ／μｌであり、さらに好ましくは３００〜７００ｎｇ／μｌであり、最も好ましくは４００〜６００ｎｇ／μｌである。また、インジェクションした個体のうち生存するレベルがより半数に近くなるＤＮＡ溶液の液量は、好ましくは、１０ｎｌ〜４．０μｌであり、より好ましくは１００ｎｌ〜３．０μｌであり、最も好ましくは５００ｎｌ．０〜２．０μｌである。
【００４６】
インジェクションする受精卵のステージは、受精卵の硬さがインジェクションニードルを挿入しやすい硬さであり、受精直後の卵の胚の位置を見極めやすいという点において、第一卵割の終了した二細胞期の受精後一時間胚にインジェクションを行うのが好ましい。
【００４７】
インジェクション後の胚は、従来の公知の方法により培養することができる。例えば、Ｅｍｂｒｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍを用いて、２８℃で培養することができる。また、インジェクション後、死卵を取り除いてもよい。生存した胚は、目的に応じて適宜培養してもよい。
【００４８】
内因性タンパク質の遺伝子のノックアウトされたトランスジェニック魚類は、逆遺伝学的手法により変異体を得る方法である、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）法により作製することができる。ＴＩＬＬＩＮＧ法は、具体的には、まずアルキル化剤であるＥＮＵ（ｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）処理によって突然変異を誘発された雄から得られたＦ１の精子を凍結保存する。それと同時に魚体からゲノムＤＮＡを抽出してライブラリーを作製し、そのゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型にして、標的遺伝子に変異を持つものをスクリーニングする方法をいう。
【００４９】
＜検出又は定量する方法＞
【００５０】
本発明のトランスジェニック魚類を用いて、検出対象物質を検出又は定量することができる。具体的には、検出対象液中にトランスジェニック魚類を配置すると、トランスジェニック魚類においてマーカータンパク質が発現されるので、そのマーカータンパク質が発するシグナルを視覚的に検知可能となり、その結果に基づいて検出対象物質を検出又は定量することができる。
【００５１】
検出対象物質は、ＡｈＲに結合し、ＡｈＲをＡＲＮＴとヘテロ２量体を形成させて核内に移行させ、ＡｈＲ／ＡＲＮＴの複合体を配列特異的に複数の遺伝子プロモーターに結合させ、Ｃｙｐ１Ａなどの異物代謝にかかわる遺伝子群が誘導させるものであれば特に限定されない。例えば、ＰＡＨやダイオキシン類が例として挙げられる。
【００５２】
検出対象液は、検出対象物質を含む液体でれば特に限定されない。また、検出対象物質の検出又は定量が可能であれば、他の公知の成分を含んでもよい。
【００５３】
本発明は魚類を用いるので、魚胚が透明、多検体での検出又は定量が可能、個体レベルで簡便に検出又は定量が可能であるといった点において有用である。特に、ＰＡＨを検出対象物質とした場合、従来の心浮腫による方法と比較し、迅速かつ簡単に検出又は定量をすることができる。
【００５４】
検出又は定量するために用いられるトランスジェニック魚類は、視覚的に検出可能なシグナルを発し、そのシグナルを視覚的に検知できるものであれば特に限定されず、魚卵であっても孵化したものであってもよい。魚卵は発生の早い段階で検出又は定量が可能であり、透明度が高いので、検出又は定量の感度が高く、安定した検出又は定量が可能である点において好ましい。
【００５５】
トランスジェニック魚類を検出又は定量する場合、目的に応じて適宜飼育することができる。例えば、魚卵を用いた場合、０．５ｍＬの滅菌飼育水の入った２４穴プレートにいれて飼育することができる。その後、さまざまな発生ステージにおける魚卵を検出対象液中に配置してもよい。魚卵としてメダカ卵を用いた場合、受精後０から４日目までの間に配置すると胚は死亡しやすい。メダカ卵の胚が死亡しにくいという点において、受精後５日以降に配置するのが好ましい。
【００５６】
配置直後に検出又は定量を行ってもよく、また、配置後に再び培養して検出又は定量を行ってもよい。魚卵の培養は、魚卵としてメダカ卵を用いた場合、例えば２８℃で培養することができる。メダカ卵は２８℃で培養した場合、受精後８日前後で孵化する。培養前に滅菌飼育水などで適宜洗浄してもよい。
【００５７】
検出対象物質の検出対象液に対する量は特に限定されないが、魚類が死ににくいという点において、好ましくは５ｐｐｍ以下であり、より好ましく３ｐｐｍ以下であり、さらに好ましくは１ｐｐｍ以下であり、最も好ましくは０．１ｐｐｍ以下である。また、安定した定量又は検出が可能であるという点において、好ましくは０．１ｐｐｍ以上であり、より好ましくは１ｐｐｍ以上であり、最も好ましくは３ｐｐｍ以上である。
【００５８】
検出対象物質の検出又は定量は、従来の公知の方法のいずれによっても行うことができる。例えば、マーカータンパク質が発する視覚的に検知可能なシグナルは、蛍光顕微鏡を用いて検出することができる。また、その視覚的に検知可能なシグナルの定量は、例えば、ＡＲＶＯ  Ｘ１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）などのプレートリーダーによりすることができる。蛍光顕微鏡を用いる際の露光時間は、シグナルの強度に応じて適宜調整してもよいが、例えば、１５０〜３０００ｍｓｅｃの露光時間としてもよい。
【００５９】
トランスジェニック魚類を検出対象液中に配置する時間は、検出又は定量が可能であれば特に限定されない。例えば、３０分〜２４時間、検出対象液中に配置することができるが、より早く検出又は定量ができるという点において、３０分〜６時間が好ましく、より安定して検出又は定量ができるという点において、９〜１２時間が好ましい。また、トランスジェニック魚類を検出対象液中に長時間配置したままにおくと、トランスジェニック魚類が死んでしまう。トランスジェニック魚類が死なないという点において、３０分〜１２時間、検出対象液中に配置するのが好ましい。
【００６０】
トランスジェニック魚類が死ななければ、生殖系系列の細胞のゲノムに本発明の目的とするＤＮＡを安定に組み込まれることで、次世代に伝わった個体を取得することができる。この次世代の個体は、より鋭敏かつ簡便なバイオモニター系に応用することが可能である。また、Ｃｙｐ１Ａなどの内因性タンパク質をコードするＤＮＡがノックアウトされたトランスジェニック魚類と交配することで、さらに安定したバイオモニター系に応用することが可能である。
【実施例】
【００６１】
＜実施例１＞
以下の方法で、プラスミドの精製、魚卵へのプラスミドのインジェクションを行い、トランスジェニック魚類を作製した。
【００６２】
＜プラスミドの精製＞
マーカータンパク質をコードするＤＮＡとして、ＥＧＦＰのｃＤＮＡを使用し、ＥＧＦＰをコードするＤＮＡを転写させるプロモーターとして、メダカ由来のＣｙｐ１Ａプロモーター（配列番号１）を使用した。メダカＣｙｐ１ＡプロモーターをＰＣＲにより増幅し、ＥＧＦＰ遺伝子に接続した。ｐｏｌｙＡは、ｍＲＮＡの安定性を考慮し、メダカＣｙｐ１ａ由来のもの（例１）、ＳＶ４０由来のもの（例２）、メダカβ―アクチン遺伝子由来のもの（例３）の３種類のコンストラクトを作製し、インジェクションに使用した。
【００６３】
ＤＮＡの精製は、Ｑｉａｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。また、精製したＤＮＡはＭｕｐｉｄによるミニゲル電気泳動によって、そのサイズと質を確認した。ＤＮＡ濃度は分光光度計ナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。さらに、それぞれのコンストラクトのＤＮＡ濃度は、例１が５１０．８ｎｇ／μｌ、例２が４６４．５ｎｇ／μｌ、例３が５３９．６ｎｇ／μｌであった。
【００６４】
リン酸緩衝液を用いてＤＮＡ濃度を５０ｎｇ／μｌに希釈し、さらにインジェクションを容易にするためにＰｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を加え、溶液を赤色に着色した。
【００６５】
＜マイクロインジェクション＞
注入液（ＤＮＡ１μｌ、リン酸緩衝液１５μｌ、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３μｌの混合溶液）１．５μｌを、Ｍｉｃｒｏｌｏａｄｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて、インジェクションニードルに充填した。インジェクションされる魚卵の保持は、１％（ｗ／ｖ）アガルースゲルにより行った。アガロースゲルは、アガロース粉末（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）にセディメントフィルタと活性炭で処理した脱塩素水を加え、それを電子レンジで加熱し溶解することにより作製した。溶解後のアガロースゲルを１０ｃｍディッシュに移し、アクリル製の型で約１ｍｍ幅の溝を作った。
【００６６】
ガラスキャピラリー（ＧＤ−１、ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ社）を６３．５℃で加熱し引き伸ばしてインジェクション用の針とした。ＤＮＡ溶液を１．５μｌ入れたインジェクションニードルは、マイクロマニピュレータ（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）に装着し固定した。受精直後の卵をアガロースゲルで作ったエッグホルダーの溝に整列させ、実体顕微鏡（ＳＺＸ１６、オリンパス社）下でピンセットを用いて卵を回転させて、針先に細胞（胚）が来るように位置を調節した。マイクロマニピュレータのねじを回すことで卵の表面を針で触り、針の先端に穴を開けたのち細胞の中に挿入した。胚へのＤＮＡ溶液の注入にはコンプレッサー内臓型のＦｅｍｔｏＪｅｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用い、空気圧は保持圧力を１００ｈＰａ、噴射圧力を４００ｈＰａに調節した。このとき、液を胚の細胞に入れるように行った。
【００６７】
インジェクションする受精卵のステージは、第一卵割の終了した二細胞期の受精後一時間胚にインジェクションを行った。このステージでインジェクションを行うことにより、受精卵の硬さがインジェクションニードルを挿入しやすく、受精直後の卵の胚の位置を見極めやすいことがわかった。
【００６８】
＜インジェクションした胚の生存率＞
インジェクションしたメダカ卵の個数と生存率を表１に示す。上記のＤＮＡ量、液量、手法によりインジェクションすることで、４割程度の胚が生存することがわかった。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
＜実施例２＞
実施例１で作製したトランスジェニック魚類を用い、以下の方法で、ＡｈＲリガンドであるβ―ナフトフラボン（ＢＮＦ）に曝露した。
【００７１】
＜ＡｈＲリガンドへの曝露と蛍光の測定＞
インジェクション後の胚はＥｍｂｒｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍの中で、２８℃で培養した。インジェクションの翌日に死卵を取り除き、残りの生存した胚を孵化するまで培養した。孵化した稚魚にＢＮＦを１ｐｐｍの濃度となるように加え、蛍光を経時的に実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）で観察した。その結果を図１に示す。色素胞から発せられる点状の自家蛍光に加え、インジェクションしていない個体では観察されない蛍光が観察された。この結果により、発せられた蛍光がＢＮＦへの曝露によって誘導されたＥＧＦＰによるものであることが明らかになった。すなわち、本発明のトランスジェニック魚類をＰＡＨに曝露することにより、ＥＧＦＰの発現が速やかに誘導することが可能であり、蛍光顕微鏡を用いて観察できることが明らかになった。
【００７２】
＜実施例３＞
プロモーターとしてメダカ由来のＣｙｐ１Ａプロモーター（配列番号１）を、マーカータンパク質をコードするＤＮＡとしてＥＧＦＰのｃＤＮＡを、ＰｏｌｙＡとしてＳＶ４０由来のものを用い、実施例１と同様の方法でトランスジェニック魚類を作製した。
【００７３】
０．５ｍＬの滅菌メダカ飼育水の入った２４穴プレートに上記６系統のメダカ胚を入れた。その後、さまざまな発生ステージのメダカ胚をＡｈＲリガンドであるＢＮＦ（５ｐｐｍ）に曝露した。その１時間後、滅菌メダカ飼育水で胚を３回洗浄した。洗浄後、２８℃で受精８日後まで飼育した。受精８日後、メダカ胚を実体顕微鏡で観察した。
【００７４】
受精後０から４日目までのＢＮＦに曝露した胚において心毒性が出現し、全ての胚が孵化することなく死亡した。心毒性を示した胚では心臓がルーピングせず伸展した状態で、その周囲に水腫が起こることがわかった。受精後５日以降にＢＮＦに曝露した胚では心毒性が出現せず、個体を生きたまま回収することが可能であることが明らかになった。
【００７５】
＜実施例４＞
実施例３と同様の方法で、トランスジェニック魚類を作製した。このとき、Ｔｇ５（例４）、Ｔｇ９（例５）、Ｔｇ１１（例６）、Ｔｇ１３（例７）、Ｔｇ１５（例８）、Ｔｇ２０（例９）の６系統を作製した。
【００７６】
例４を実施例３と同様の方法で、ＢＮＦで受精６日後の胚を曝露した。曝露を開始してから６時間後、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を観察した。露光時間は１６００ｍｓｅｃとした。その結果を図２に示す。曝露前に観察した場合と比較して、曝露後の例４はより強い蛍光を発していることが観察された。
【００７７】
例５を実施例３と同様の方法で、ＢＮＦで受精６日後の胚を曝露した。曝露を開始してから６時間後、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を観察した。露光時間は２０００ｍｓｅｃとした。その結果を図３に示す。曝露前に観察した場合と比較して、曝露後の例５はより強い蛍光を発していることが観察された。また、Ｔｇ９（例５）は曝露中に孵化したこと、及び主に肝臓が光る系統であることがわかった。
【００７８】
例６を実施例３と同様の方法で、ＢＮＦで受精６日後の胚を曝露した。曝露を開始してから６時間後、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を観察した。露光時間は３００ｍｓｅｃとした。その結果を図４に示す。曝露前に観察した場合と比較して、曝露後の例６は明らかにより強い蛍光を発していることが観察された。
【００７９】
例８を実施例３と同様の方法で、ＢＮＦで受精後６日後の胚を曝露した。曝露を開始してから３時間後、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を観察した。露光時間は２０００ｍｓｅｃとした。その結果を図５に示す。曝露前に観察した場合と比較して、曝露後の例６はより強い蛍光を発していることが観察された。また、Ｔｇ９（例５）と同様、Ｔｇ１５（例８）は曝露中に孵化したこと、及び主に肝臓（図５中の矢印）が光る系統であることがわかった。  
【００８０】
例９を実施例３と同様の方法で、ＢＮＦで受精６日後の胚を曝露した。曝露を開始してから６時間後、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を観察した。露光時間は１５０ｍｓｅｃとした。その結果を図６に示す。曝露前に観察した場合と比較して、曝露後の例９は明らかにより強い蛍光を発していることが観察された。また、例６と比較して曝露後の例９は卵黄を覆っている細胞が光ることが観察された。
【００８１】
ＢＮＦに曝露を開始した後、３、６、９、１２、２４時間後の例４〜９と、非トランスジェニックメダカ（比較１）の胚の蛍光を、それぞれＡＲＶＯ  Ｘ１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて定量した。その結果を図７に示す。例９は３、６、９、１２、２４時間後の全てにおいて、蛍光強度が高いことが示された。また、通常は、測定する際の胚の向きにより誤差が生じるところ、例９はその全体が光るため、より安定した蛍光の検出又は定量をすることができることが示唆された。
【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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