(57)【要約】      （修正有）【課題】胚性幹（ＥＳ）細胞等の分化可能細胞の培養に有用な血清代替物を含む組成物及び方法を提供する。【解決手段】多能性幹細胞と、基礎塩栄養液と、ＥｒｂＢ３リガンドとを含む組成物であって、実質的に無血清であり、多能性幹細胞は３つの胚葉のすべてを生じ得るものであり、ＥｒｂＢ３リガンドはＥｒｂＢ３受容体に結合し、これがＥｒｂＢ２受容体と共に二量体化してＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体を形成し得るものであり、これにより、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体においてＥｒｂＢ２受容体のチロシンキナーゼ活性が活性化される、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ３リガンドを含む組成物であって、実質的に無血清である、組成物。
【請求項２】
外因性インスリン及びインスリン代用物を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
インスリン様成長因子又はその機能断片をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＥｒｂＢ３リガンドが、ニューレグリン１、ヘレグリンβ（ＨＲＧ−β）、ヘレグリンα（ＨＲＧ−α）、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）、グリア成長因子２（ＧＧＦ２）、運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）、ニューレグリン２、ニューレグリン２β（ＮＲＧ２−β）、エピレギュリン、ビレギュリン及びこれらの機能断片からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＥｒｂＢ３リガンドがＨＲＧ−β又はその機能断片である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−βファミリーメンバー又はこれらの機能断片をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＴＧＦ−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、及びこれらの機能断片からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
アクチビンＡを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
インスリン様成長因子又はその機能断片をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
外因性線維芽細胞成長因子を含まない、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２及びこれらの機能断片からなる群から選択される少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＦＧＦが、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−２２である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
血清アルブミン（ＳＡ）をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＳＡがウシＳＡ（ＢＳＡ）又はヒトＳＡ（ＨＳＡ）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＳＡの濃度が容量対容量（ｖ／ｖ）で約０．２％より高い、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＳＡの濃度が約５ｖ／ｖ％未満である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つの不溶性基質をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの不溶性基質が、コラーゲン、フィブロネクチン及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
基礎塩栄養液と、分化可能細胞におけるＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段とを含む組成物。
【請求項２０】
前記ＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段が、前記分化可能細胞中のＥｒｂＢ３を特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記分化可能細胞が霊長類胚性幹細胞である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
分化可能細胞の培養方法であって、
ａ）前記分化可能細胞を細胞培養表面にプレーティングする工程と、
ｂ）前記分化可能細胞に基礎塩栄養液を与える工程と、
ｃ）ＥｒｂＢ３と特異的に結合するリガンドを与える工程と、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記分化可能細胞が霊長類胚性幹細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記胚性幹細胞にインスリン及びインスリン代用物のどちらも与えない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
インスリン様成長因子又はその機能断片を前記胚性幹細胞に与える工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＥｒｂＢ３を特異的に結合する前記リガンドが、ニューレグリン１、ヘレグリンβ（ＨＲＧ−β）、ヘレグリンα（ＨＲＧ−α）、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）、グリア成長因子２（ＧＧＦ２）、運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）、ニューレグリン２、ニューレグリン２β（ＮＲＧ２−β）、エピレギュリン、ビレギュリン及びこれらの機能断片からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記リガンドがＨＲＧ−β又はその機能断片である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞に形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−βファミリーメンバー又はこれらの機能断片を与える工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＧＦ−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、及びこれらの機能断片からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
インスリン様成長因子又はその機能断片を前記胚性幹細胞に与える工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２及びこれらの機能断片からなる群から選択される少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を前記胚性幹細胞に与える工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのＦＧＦが、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−２２である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
血清アルブミン（ＳＡ）を前記胚性幹細胞に与える工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＳＡがウシＳＡ（ＢＳＡ）又はヒトＳＡ（ＨＳＡ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＳＡの濃度が容量対容量（ｖ／ｖ）で約０．２％より高い、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＳＡの濃度が約５ｖ／ｖ％未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの不溶性基質を前記胚性幹細胞に与える工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの不溶性基質が、コラーゲン、フィブロネクチン及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
分化可能細胞の培養方法であって、
ａ）前記分化可能細胞を細胞培養表面にプレーティングする工程と、
ｂ）基礎塩栄養液を前記分化可能細胞に与える工程と、
ｃ）前記分化可能細胞におけるＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段を提供する工程と、
を含む、方法。
【請求項４０】
前記分化可能細胞が霊長類幹細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段を提供する工程が、ＥｒｂＢ３を特異的に結合するリガンドを提供する工程を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
分化可能細胞の培養方法であって、
ａ）細胞溶解試薬を前記分化可能細胞の層に与えて前記細胞を単一細胞に分解する工程であって、前記分化可能細胞の層が消化に先立ち培養チャンバに入れられる工程と、
ｂ）前記単一細胞を組織培養チャンバ内に置く工程と、
ｃ）細胞培養液を与える工程であって、前記幹細胞培養液が基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ３リガンドを含む工程と、
ｄ）前記培養された単一細胞を、前記単一細胞の成長及び分裂が可能な条件下に置く工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年２月２３日出願の米国仮特許出願第６０／７７６，１１３号明細書に対する優先権を主張し、これを参照により援用する。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発に関する記載事項
本発明の開発中に実施された作業の一部は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）補助金交付番号第５Ｒ２４ＲＲ０２１３１３−０５号による米国政府資金を利用した。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、細胞培養方法と、実質的に無血清であり、且つ基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ３リガンドを含む組成物とに関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト多能性細胞は、ヒトの発生初期の研究、並びに糖尿病及びパーキンソン病などのいくつかの疾患状態への治療介入に対し、独自の機会を提供する。例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来のインスリン産生β細胞の使用により、ドナー膵からの細胞を利用する現行の細胞療法と比べて大きな進歩がもたらされ得る。現在の糖尿病の細胞治療処置は、ドナー膵細胞を利用するもので、移植に必要な高品質の膵島細胞の不足により制約されている。１人のＩ型糖尿病患者に対する細胞治療には、約８×１０８個の膵島細胞の移植が必要となる（Ｓｈａｐｉｒｏら、２０００年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：２３０−２３８頁；Ｓｈａｐｉｒｏら、２００１ａ年、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １５：２４１−２６４頁；Ｓｈａｐｉｒｏら、２００１、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２２：８６１頁）。そのため、移植を成功させるうえで十分な膵島細胞を得るためには、少なくとも２人分の健常ドナー臓器が必要とされる。
【０００５】
従って、胚性幹（ＥＳ）細胞は、多能性細胞の生物学的諸相及び初期胚内における分化の根底にある機序を研究するための強力なモデル系となると同時に、哺乳動物を遺伝子操作する機会を提供し、結果として商業的、医学的及び農業的応用をもたらす。さらには、然るべきＥＳ細胞の増殖及び分化を使用することで、細胞の傷害又は機能不全により生じる疾患を処置するための、移植に好適な細胞の無限の供給源を作り出せる可能性がある。国際公開第９９／５３０２１号パンフレットに記載されるような初期原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞、インビボ又はインビトロ由来ＩＣＭ／胚盤葉上層、インビボ又はインビトロ由来原始外胚葉、始原生殖細胞（ＥＧ細胞）、テラトカルシノーマ細胞（ＥＣ細胞）、及び脱分化又は核移植により得られた多能性細胞を含む他の多能性細胞及び細胞系は、これらの特性及び適用性の一部又は全部を共通して備え得る。国際公開第９７／３２０３３号パンフレット及び米国特許第５，４５３，３５７号明細書は、げっ歯類以外の種に由来する細胞を含む多能性細胞について記載している。ヒトＥＳ細胞については、国際公開第００／２７９９５号パンフレット及び米国特許第６，２００，８０６号明細書に記載されており、ヒトＥＧ細胞については、国際公開第９８／４３６７９号パンフレットに記載されている。
【０００６】
ＥＳ細胞の多能性及び分化を調節する生化学的機序は、ほとんど解明されていない。しかしながら、入手可能な限られた実験上のデータ（及び多くの事例証拠）からは、インビトロ培養条件下での多能性ＥＳ細胞の継続的な維持が、細胞外環境中に存在するサイトカイン及び成長因子の存在に依存することが示唆される。
【０００７】
ヒトＥＳＣは、相当量の高品質なヒト細胞治療用分化細胞を開発するための出発物質の供給源を提供するが、これらの細胞は臨床上の安全性及び有効性を管理する想定上の規制ガイドラインに適合する条件下で入手及び／又は培養しなければならない。かかるガイドラインは、化学限定培地の使用を求めるものと思われる。かかる化学的に限定された／ＧＭＰ規格条件の開発が、ヒトの治療を目的としたｈＥＳＣ及びｈＥＳＣ由来細胞の使用の促進に必要とされている。
【０００８】
加えて、ｈＥＳＣに基づく細胞補充療法を最終的に適用するには、規制ガイドラインに準拠した大規模な培養及び分化条件を可能にする方法の開発が求められるであろう。いくつかのグループがｈＥＳＣ用の単純化した成長条件を報告しているが、これらの試験では相当な制約がある。しかしながら、これまで、多能性細胞の単離、長期にわたるクローン維持、遺伝子操作及び生殖系列伝播を成功させることは、概して困難であった。
【０００９】
幹細胞向けの細胞培養条件のほとんどは、いまだ培地中に血清代替物（ＫＳＲ）を含む（Ｘｕら、２００５年  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２３：３１５−３２３頁；Ｘｕら、２００５年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１８５−１８９頁；Ｂｅａｔｔｉｅら、２００５年  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２３：４８９−４９５頁；Ａｍｉｔら、２００４年  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、７０：８３７−８４５頁；Ｊａｍｅｓら、２００５年  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３２：１２７９−１２８２頁）。ＫＳＲは、高度に精製された供給源ではなく、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の粗画分を含む。他の条件は短期間の試験を行ったに過ぎず、従ってそれらの条件が長期間にわたり多能性を維持可能であるかどうかは不明である（Ｓａｔｏら、（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１０：５５−６３頁；米国特許出願公開第２００６／００３００４２号明細書及び同第２００５／０２３３４４６号明細書）。その他の条件は、ＦＧＦ２、アクチビンＡ、及びインスリンを含む化学限定培地で多能性の長期維持を示しているが、これらの細胞は、ヒト血清でコーティングされ、細胞のプレーティング前にヒト血清が「洗い落とされた」プレート上で成長させたものである（Ｖａｌｌｉｅｒら、２００５年  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１８（第１９部）：４４９５−５０９頁）。ＦＧＦ２はこれらの培地の全てにおける成分であったが、特にＦＧＦ２を高濃度で使用する必要がある一部の配合のように（最高１００ｎｇ／ｍｌ、Ｘｕら、２００５年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１８５−１８９頁）、ＦＧＦ２が絶対に必要なのかどうかは不明である。
【００１０】
さらに、これらのグループの全ては、その培地中にμｇ／ｍｌレベルのインスリンを含むか、又はＫＳＲを使用したためインスリンが存在した。インスリンは一般的には、インスリン受容体との結合を介したグルコース代謝及び「細胞生存」シグナル伝達において機能すると考えられる。しかしながら、生理学的濃度を上回るレベルでは、インスリンはまた、より低効率ながらＩＧＦ１受容体とも結合でき、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路を通じて古典的な成長因子活性を供与し得る。ＫＳＲ又はこれらの他の培地条件におけるかかる高レベルのインスリン（μｇ／ｍｌレベル）の存在／必要性は、主要な活性が、ｈＥＳＣにより発現するＩＧＦ１受容体との結合を介して誘発されることを示唆する（Ｓｐｅｒｇｅｒら、２００３年  ＰＮＡＳ、１００（２３）：１３３５０−１３３５５頁）。他の条件ではｈＥＳＣにおける全てのＩＧＦ１Ｒ及び細胞内シグナル伝達経路メンバーの発現が留意されるが、これはこの経路の機能活性を示している可能性が高い（Ｍｉｕｒａら、２００４年  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ、３：３３３−３４３頁）。ｈＥＳＣを培養するためにこれまで開発された全ての条件が、インスリン、ＫＳＲにより供給されるインスリン、又は血清により供給されるＩＧＦ１のいずれかを含むという事実から示唆されるとおり、インスリン又はＩＧＦ１はｈＥＳＣの自己複製に必要な主要シグナルを誘発し得る。この見解を支持するものとして、ＰＩ３キナーゼがｈＥＳＣ培養物中で阻害されると、この細胞は分化することが示されている（Ｄ’Ａｍｏｕｒら、２００５年  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３（１２）：１５３４−４１頁；ＭｃＬｅａｎら、２００７年  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２９−３８頁）。
【００１１】
最近の発表に、ｈＥＳＣ用のヒト化限定培地の概要が述べられている（Ｌｕｄｗｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、オンライン刊行２００６年１月１日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１１７７）。しかしながら、この最新の配合は、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ、ＬｉＣｌ、γ−アミノ酪酸及びピペコリン酸を含む、ｈＥＳＣの増殖に影響を与えることが示唆されるいくつかの要素を含んでいる。この最新の限定細胞培養培地はまた、インスリンも含むことが注記される。
【００１２】
ＥＧＦ成長因子ファミリーは少なくとも１４個のメンバーを有し、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ヘパリン結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ニューレグリンβ（ヘレグリンβ（ＨＲＧ−β）、グリア成長因子及びその他の呼称もある）、ＨＲＧ−α、アンフィレギュリン、ベータセルリン、及びエピレギュリンを含むが、これらに限定されない。これらの成長因子の全てがＥＧＦドメインを含み、一般的にはまず初めに膜貫通タンパク質として発現し、この膜貫通タンパク質がメタロプロテアーゼ（具体的には、ＡＤＡＭ）タンパク質によるプロセシングを受けることで可溶性のエクトドメイン成長因子が生成される。ＥＧＦファミリーメンバーはＥｒｂＢ１、２、３及び４細胞表面受容体のホモ二量体又はヘテロ二量体のいずれとも種々の親和性で相互作用する（Ｊｏｎｅｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、１９９９年、４４７：２２７−２３１頁）。ＥＧＦ、ＴＧＦα及びｈｂＥＧＦはＥｒｂＢ１／１（ＥＧＦＲ）ホモ二量体及びＥｒｂＢ１／２ヘテロ二量体を高親和性（１〜１００ｎＭの範囲）で結合する一方、ＨＲＧ−βはＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４を極めて高い親和性（１ｎＭ未満の範囲）で結合する。活性化したＥｒｂＢ受容体は、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路及びまたＭＡＰＫ経路も通じてシグナルを伝達する。ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３はｈＥＳＣのなかで最も高度に発現する成長因子受容体であり（Ｓｐｅｒｇｅｒら、２００３年  ＰＮＡＳ、１００（２３）：１３３５０−１３３５５頁）、ＨＲＧ−βはマウス始原生殖細胞の増殖を支持することが既に示されている（Ｔｏｙｏｄａ−Ｏｈｎｏら、１９９９年  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２１５（２）：３９９−４０６頁）。さらに、過剰発現及びその後のＥｒｂＢ２の不適切な活性化が、腫瘍発生と関連している（Ｎｅｖｅら、２００１年  Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１２  補遺１：Ｓ９−１３頁；Ｚｈｏｕ  ＆  Ｈｕｎｇ、２００３年  Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、３０（５  補遺１６）：３８−４８頁；Ｙａｒｄｅｎ、２００１年  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、６１  補遺２：１−１３頁）。あるｈＥＳＣ中にトリソミーとして蓄積することが観察されている染色体上には、ヒトＥｒｂＢ２（１７番染色体ｑ腕）、及びＥｒｂＢ３（１２番染色体ｑ腕）が存在する（Ｄｒａｐｅｒら、２００４年  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２（１）：５３−４頁；Ｃｏｗａｎら、２００４年  Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３５０（１３）：１３５３−６頁；Ｂｒｉｍｂｌｅら、２００４年  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．、１３（６）：５８５−９７頁；Ｍａｉｔｒａら、２００５年  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７（１０）：１０９９−１０３頁；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａら、２００５年  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１）：１９−２０頁；Ｄｒａｐｅｒら、２００４年  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．、１３（４）：３２５−３６頁；Ｌｕｄｗｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、オンライン刊行２００６年１月１日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１１７７）。
【００１３】
ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３（Ｂｒｏｗｎら、２００４年  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、７１：２００３−２０１１頁；Ｓａｌａｓ−Ｖｉｄａｌ  ＆  Ｌｏｍｅｌｉ、２００４年、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２６５：７５−８９頁）はマウス胚盤胞で発現するが、これは特に内部細胞塊（ＩＣＭ）に限定されず、並びにＥｒｂＢ１、ＥＧＦ及びＴＧＦβはヒト胚盤胞で発現する（Ｃｈｉａら、１９９５年  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２１（２）：２９９−３０７頁）。ＨＢ−ＥＧＦは、ヒトＩＶＦ胚盤胞培養物中において増殖効果を有する（Ｍａｒｔｉｎら、１９９８年  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．、１３（６）：１６４５−５２頁；Ｓａｒｇｅｎｔら、１９９８年  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１３  補遺４：２３９−４８頁）、及び１５％血清中で成長するマウスＥＳ細胞に対し中程度の追加的な効果を（Ｈｅｏら、２００５年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、近日刊行）。移植前及び移植後早期の発生は、ＥｒｂＢ２−／−、ＥｒｂＢ３−／−、ニューレグリン１−／−（Ｂｒｉｔｓｃｈら、１９９８年  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１２：１８２５−３６頁）、ＡＤＡＭ１７−／−（Ｐｅｓｃｈｏｎら、１９９８年  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１２８１−１２８４頁）及びＡＤＡＭ１９−／−（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ、２００５年  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２８３（２）：４５９−７１頁）ヌル胚において影響を受けないように思われる。従って、ｈＥＳＣにおけるＥｒｂＢ受容体ファミリーを介したシグナル伝達の重要性は、これまでのところ不明である。
【００１４】
ニューレグリン１（ＮＲＧ１）は、複数のスプライシング変異及びタンパク質プロセシング変異を呈する大型遺伝子である。これは多数のタンパク質アイソフォームを生成するが、本明細書においてこれらはまとめてニューレグリンと称される。ニューレグリンは主に、細胞表面膜貫通タンパク質として発現する。細胞外領域には、免疫グロブリン様ドメイン、炭水化物修飾領域及びＥＧＦドメインが含まれる。ＮＲＧ１発現アイソフォームは既に論考されている（Ｆａｌｌｓ、２００３年  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２８４：１４−３０頁）。細胞膜メタロプロテアーゼＡＤＡＭ１７及びＡＤＡＭ１９は、膜貫通型のニューレグリン１を可溶性ニューレグリン／ヘレグリンにプロセシングすることが示されている。ＨＲＧ−α及びＨＲＧ−βは、ニューレグリンの切断されたエクトドメインであり、ＥＧＦ及び他のドメインを含む。ＥＧＦドメインはＥｒｂＢ受容体の結合及び活性化を担うことから、組換え分子はこのドメインを含むだけで、本質的にこのタンパク質の全ての可溶性成長因子作用を呈することができる（Ｊｏｎｅｓら、１９９９年  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４４７：２２７−２３１頁）。また、ニューレグリンのプロセシングされた膜貫通型アイソフォームもあり、これはＥＧＦドメインのＥｒｂＢ受容体との相互作用を介することで隣接する細胞においてジャクスタクラインによるシグナル伝達を引き起こすと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
培養中の多能性の維持に向けたｈＥＳＣ研究の進展における重要な開発は、臨床上の安全性及び有効性を管理する想定上の規制ガイドラインに適合する培地及び細胞培養条件の解明であろう。ｈＥＳＣ用の化学限定培地を利用できるようになることが最良の結果といえるが、化学的に限定されていない成分であっても、それがＧＭＰ規格に合わせて生産されたならば許容されるであろう。従って、治療目的で使用可能な多能性幹細胞の集団を培養し、且つ安定化させるための方法及び組成物を特定する必要があり、ここで培養組成物は、ＧＭＰ規格に合わせて限定及び／又は生産される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ３リガンドを含む組成物に関し、組成物は実質的に無血清である。
【００１７】
本発明はまた、基礎塩栄養液と、分化可能細胞中のＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段とを含む組成物にも関する。
【００１８】
本発明は分化可能細胞の培養方法に関し、本方法は、分化可能細胞を細胞培養表面にプレーティングする工程、基礎塩栄養液を分化可能細胞に与える工程、及びＥｒｂＢ３を特異的に結合するリガンドを与える工程を含む。
【００１９】
本発明は分化可能細胞の培養方法に関し、本方法は、分化可能細胞を細胞培養表面にプレーティングする工程、及び基礎塩栄養液を分化可能細胞に与えるとともに、分化可能細胞中のＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段を提供する工程を含む。
【００２０】
本発明はまた、分化可能細胞の培養方法にも関し、本方法は、消化に先立ち培養チャンバ内に入れられている分化可能細胞の層に消化溶液を与える工程を含み、ここで消化により細胞の層は単一細胞に分離される。消化後、単一細胞は分化可能細胞培養液を含む新しい組織培養チャンバ内に置かれ、ここで分化可能細胞培養液は基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ３リガンドを含む。単一分化可能細胞は培養されると、単一細胞の成長及び分裂が可能な条件下に置かれる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、限定条件下（８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、１００ｎｇ／ｍｌのＬＲ−ＩＧＦ１、１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ）で成長させたＢＧ０１ｖにおけるＡＤＡＭ１９、ニューレグリン１、及びＥｒｂＢ１〜３のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ発現解析を表す。ＧＡＰＤＨ及びＯＣＴ４の対照反応が示される。
【図２】図２は、ＡＧ８７９を使用したＢＧ０１ｖ細胞の増殖の阻害を表す。ＢＧ０１ｖ細胞は６ウェルトレイにプレーティングされ、プレーティングの２４時間後にＤＭＳＯ（図２Ａ）、５０ｎＭ〜２０μＭのＡＧ１４７８（図２Ｂ）、または１００ｍＭ〜２０μＭのＡＧ８７９（図２Ｃ）に対して曝露された。培養５日後、培養物は固定され、アルカリホスファターゼ活性について染色された。ＡＧ１４７８はこれらの濃度（２０μＭ）では増殖に影響を及ぼさなかったが、ＡＧ８７９は５μＭで細胞成長を実質的に遅延させた。
【図３】図３は、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、２００ｎｇ／ｍｌのＬＲ−ＩＧＦ１及び８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む限定培養培地であるＤＣ−ＨＡＩＦで培養された（図３Ａおよび図３Ｂ）、および１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、及び２００ｎｇ／ｍｌのＬＲ−ＩＧＦ１を含有する限定培養培地（ＤＣ）で培養された（図３Ｃおよび図３Ｄ）ＢＧ０１ｖ細胞の形態を表す。
【図４】図４は、ＲＴ−ＰＣＲによる、マウスＥＳ細胞（図４Ａ）およびＭＥＦ（図４Ｂ）におけるＡＤＡＭ１９、ニューレグリン１、及びＥｒｂＢ１〜４の発現を表す。
【図５】図５は、マウスＥＳ細胞におけるＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ２シグナル伝達の阻害を表す。２×１０５個のマウスＲ１  ＥＳ細胞が、１０％ＦＢＳ、１０％ＫＳＲ、１０００Ｕ／ｍｌのマウスＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ）添加の１：１０００のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上にプレーティングされた。翌日、ＤＭＳＯ（担体対照）が新鮮培地と共に添加された。培養物は８日目に固定され、アルカリホスファターゼ活性について染色された。ＤＭＳＯ（図５Ａ）および１〜５０μＭのＡＧ１４７８（図５Ｂおよび図５Ｃ）は明確には増殖を阻害しなかった。ＡＧ８７９は５０μＭ（図５Ｄと図５Ｆを比較）で細胞成長を実質的に阻害し、および２０μＭで増殖を遅延させた可能性がある（図５Ｅ）。
【図６】図６は、馴化培地（ＣＭ）で成長させたＢＧ０２細胞の増殖の阻害を表す。（図６Ａ）５０μＭのＡＧ８２５はＣＭで成長させたＢＧ０２  ｈＥＳＣの増殖を阻害した。（図６Ｂ）ＡＧ８２５はｈＥＳＣ中のＥｒｂＢ２  Ｙ１２４８リン酸化を阻害する。（図６Ｃ）種々の組み合わせの成長因子におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣの連続継代のコロニー計数。（図６Ｄ）ＢＧ０２細胞を使用したｈＥＳＣ増殖におけるＩＧＦ１及びＨＲＧの役割に関する細胞計数分析（左）。（図６Ｅ）二回繰り返された実験のＯＣＴ４／ＤＡＰＩ免疫染色から、ＩＧＦ１及びＨＲＧによりＯＣＴ４＋細胞の割合がＡｃｔＡ／ＦＧＦ２条件と比較して有意に上昇したことが実証された。（図６Ｆ）ＢＧ０１  ＤＣ−ＨＡＩＦ  ｈＥＳＣであって、成長因子を一晩欠乏させた培養物；欠乏させた後、ＤＣ−ＨＡＩＦを伴い１５分間パルスを印加した培養物；又は定常状態の培養物のＲＴＫブロッティング解析が示される（左）。平均値及び正規化相対強度の範囲がプロットされる（右）。
【図７】図７は、種々の成長因子の組み合わせで限定条件下に成長させたマウスＥＳ細胞を表す。図７Ａは、２×１０５個の細胞を種々の成長因子の組み合わせで８日間成長させた後のＡＰ＋コロニーのスコア化を示す。図７Ｂ〜図７Ｇは、種々の成長因子の組み合わせで成長させたＡＰ＋コロニーの４倍率画像を示す。
【図８】図８は、ＤＣ−ＨＡＩＦ培地で維持されるヒトＥＳ細胞の特徴を表す。（図８Ａ）ＢＧ０２  ＤＣ−ＨＡＩＦ  ｐ２５細胞由来の奇形腫の分析から、潜在的な外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多能性分化能が実証された。（図８Ｂ）１５％ＦＣＳ／５％ＫＳＲで培養されたＢＧ０２細胞の免疫染色であり、このＢＧ０２細胞は分化している。（図８Ｃ）ＣＭ（６４代の継代）又はＤＣ−ＨＡＩＦ（限定培地で１０代又は３２代の継代）で維持されたＢＧ０２細胞において、４７，２９６個の転写プローブを含む高密度Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ−６  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｅａｄｃｈｉｐを使用して検出された転写産物の分布に関するベン図である。（図８Ｄ）ＢＧ０２  ＤＣ−ＨＡＩＦ  ｐ３２細胞の転写プロファイルは、ＣＭ（上）で維持されたＢＧ０２細胞のものと極めて類似しており、ＤＣ−ＨＡＩＦ（下）での初期及び後期の継代培養物においては実質的に変化しなかったことを実証する散布図解析である。（図８Ｅ）Ｂｅａｄｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して生成された種々の集団における相対遺伝子発現の階層クラスタ分析のデンドログラムである。
【図９】図９は、ＤＣ−ＨＡＩＦ培地の存在下にヒト化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）上で培養された細胞の形態を表す。（図９Ａ）成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：２００希釈）上で成長したＣｙＴ４９細胞（１：２００希釈）。ＣｙＴ４９細胞はまた、ヒト全血清（図９Ｂ）、ヒトフィブロネクチン（図９Ｃ）およびＶＩＴＲＯＧＲＯ（商標）（図９Ｄ）でコーティングされた組織培養皿上においても成長可能であった。
【図１０】図１０は、ヒトＥＳ細胞の単一細胞継代を表す。（図１０Ａ〜図１０Ｄ）ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）による継代及び約５×１０５個の細胞の６０ｍｍ培養皿へのプレーティング後のＢＧ０２細胞の段階的画像である。（図１０Ａ）最初のプレーティングから１．５時間後、皿に接着した生細胞を示す。（図１０Ｂ）プレーティング後２０時間目、大多数の細胞が凝集して小さいコロニーを形成した。これらのコロニーはプレーティング後４日目（図１０Ｃ）まで増殖により拡大し、プレーティング後５〜６日間で皿全体を覆う上皮様単層を形成する（図１０Ｄ）。（図１０Ｅ）正常男性核型が、ＤＣ−ＨＡＩＦでＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）により１９回継代されたＢＧ０２培養物において実証された。
【図１１】図１１は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）（図１１Ａ）、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（図１１Ｂ）、ＴｒｙｐＬＥ（図１１Ｃ）またはＶｅｒｓｅｎｅ（図１１Ｄ）を使用したヒトＥＳ細胞の単一細胞継代後の細胞形態を表す。
【図１２】図１２は、ＤＣ−ＨＡＩＦで培養されたヒトＥＳ細胞の大規模増殖を表す。（図１２Ａ）細胞が１０１０個を超えるまで増殖した後のＢＧ０２細胞のフローサイトメトリー分析。８５％超の細胞が、ＯＣＴ４、ＣＤ９、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１〜８１を発現した。（図１２Ｂ）多能性のマーカーであるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１、ＳＯＸ２、ＵＴＦ１、ＣＲＩＰＴＯ、ＦＯＸＤ３、ＴＥＲＴ及びＤＰＰＡ５の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。分化系列のマーカー、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＳＸ１及びＨＡＮＤ１は検出されなかった。（図１２Ｃ）ヒト染色体特異的反復配列を使用した蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）から、ｈＣｈｒ１２、１７、Ｘ及びＹについて正常なコピー数の維持が実証された。
【図１３】図１３は、ＨＲＧ−β及びＩＧＦ１を含む限定培地で、但しＦＧＦ２の不在下、７代、すなわち２ヶ月超にわたり成長させたｈＥＳＣ  ＢＧ０２細胞の形態（図１３Ａ）および正常核型（図１３Ｂ）を表す。
【図１４】図１４は、ＤＣ−ＨＡＩＦ（３２代の継代）又はＤＣ−ＨＡＩ（１０代の継代）で維持されるｈＥＳＣ（ＢＧ０２）からの転写産物の散布図解析を表す。発現した転写産物の大部分が双方の試料から検出され、ｈＥＳＣを外因性ＦＧＦ２の不在下で培養しても転写は実質的に変化しなかった。発現レベルが＞０の全ての検出転写産物（全ての点）、又は検出信頼水準が＞０．９９を呈する転写産物（Ｒ２選択、破線の楕円により示される点）を使用して相関係数（Ｒ２）が求められた。傾斜線は平均値及び２倍差の限界を表す。
【図１５】図１５は、ＤＣ−ＨＡＩＦで維持された初期及び後期継代ＢＧ０２細胞の種々の集団における相対遺伝子発現の階層クラスタ分析のデンドログラムを表す。細胞は高度にクラスタ化し（約０．００７５）、馴化培地（ＣＭ）で維持されたＢＧ０２及びＢＧ０３細胞（約０．０３７）との高い類似性を保持した。ＤＣ−ＨＡＩで維持されたＢＧ０２細胞もまた、他の調査対象のｈＥＳＣ集団で高度にクラスタ化された。図１５の説明としては、ＣＭは馴化培地であり、ＤＣは上記に定義されるとおりの限定培養培地ＤＣ−ＨＡＩＦであり、ａｐはＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）単一細胞継代であり、ＤＣ−ＨＡＩはＦＧＦ２を含まないことを除き、本明細書に定義されるとおりのＤＣ−ＨＡＩＦと同一のものである。
【図１６】図１６は、９６ウェルプレートにおいてＤＣ−ＨＡＩＦで培養されたＢＧ０２細胞の形態及びアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｓｏｐｈａｔａｓｅ）染色を表す。図１６ＡおよびＢはそれぞれ、９６ウェルプレートのなかのあるウェルで成長したＢＧ０２細胞（１０４細胞／ウェル）の位相差画像（図１６Ａ）およびアルカリホスファターゼ染色（図１６Ｂ）である。図１６ＣおよびＤはそれぞれ、３８４ウェルプレートのなかのあるウェルで成長したＢＧ０２細胞（１０３細胞／ウェル）の位相差画像（図１６Ｃ）およびアルカリホスファターゼ染色（図１６Ｄ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
特に注記されない限り、本明細書で使用される用語は、関連技術分野の当業者による慣習的用法に従うものと理解されたい。以下に提供される用語の定義に加え、分子生物学における一般的な用語の定義はまた、Ｒｉｅｇｅｒら、１９９１年「Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ」、第５版、Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合弁事業、（１９９８年  補遺）にも見ることができる。明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、単数形（「ａ」又は「ａｎ」）はそれが使用される文脈に応じて１つ又は複数を意味し得ることを理解されたい。従って、例えば「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、少なくとも１個の細胞を利用できることが意味され得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「接触させる」（すなわち、細胞、例えば分化可能細胞を化合物と接触させる）は、化合物と細胞とを共にインビトロでインキュベートする（例えば、化合物を培養中の細胞に添加する）ことを含むよう意図される。用語「接触させる」は、インビボでの細胞の、ＥｒｂＢ３リガンド、及び場合によりＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む限定細胞培地に対しての、対象者の体内において自然に起こり得る曝露（すなわち、自然の生理学的過程の結果として起こり得る曝露）を含むように意図されるものではない。細胞を、ＥｒｂＢ３リガンド、及び場合によりＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む限定細胞培地と接触させる工程は、任意の好適な方法で行うことができる。例えば細胞は、接着培養、又は懸濁培養で処理されてもよい。限定培地と接触させた細胞を細胞分化環境でさらに処理して、細胞を安定化させ得るか、又は細胞を分化させ得ることが理解される。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「分化する」は、由来元の細胞型より高度に分化した細胞型の産生を参照する。従ってこの用語は、部分的及び最終的に分化した細胞型を包含する。
【００２５】
本発明の特定の実施形態において、用語「豊富な」は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を超える所望の細胞系列を含む細胞培養物を参照する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、化合物の「有効量」という用語は、限定培地の残りの成分の存在下において培養中の分化可能細胞の安定化を、支持細胞の不在下、且つ血清又は血清代替物の不在下で１ヶ月より長い間もたらすのに十分な化合物の濃度を参照する。この濃度は、当業者により容易に決定される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「発現する」は、細胞におけるポリヌクレオチドの転写又はポリペプチドの翻訳を参照し、結果として分子のレベルは、その分子を発現しない細胞中のレベルより分子を発現する細胞中で計測可能な程度に高くなる。分子の発現を計測するための方法は当業者に周知であり、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング、及び免疫染色を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
細胞、細胞系、細胞培養物又は細胞集団に言及して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、細胞、細胞系、細胞培養物、又は細胞集団がインビトロで培養可能となるように、天然の細胞源から実質的に分離されていることを参照する。加えて、用語「単離する」は、２個以上の細胞群からの１個又は複数の細胞の物理的な選択を参照するために使用され、ここで細胞は、細胞形態及び／又は様々なマーカーの発現に基づき選択される。
【００２９】
本発明は、以下の好ましい本発明の実施形態の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例を参照することにより、さらに容易に理解され得る。しかしながら、本組成物及び方法の開示及び記載の前に、本発明は、特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件、又は特定の方法等に限定されず、そのため、当然ながら変わり得ることが理解されるべきであり、そこでの数多くの修正例及び変形例は当業者に明らかであろう。
【００３０】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅及び精製について、またＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどの関わる酵素反応についての標準的な技術、及び様々な分離技術は当業者に周知であり、当業者により一般的に用いられている。数多くの標準技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２年「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｕ（編）１９９３年  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８、第Ｉ部；Ｗｕ（編）１９７９年  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８；Ｗｕら（編）１９８３年  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００及び１０１；Ｇｒｏｓｓｍａｎ及びＭｏｌｄａｖｅ（編）１９８０年  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ（編）１９７２年「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓｅ、１９８１年「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ」、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；Ｓｃｈｌｅｉｆ及びＷｅｎｓｉｎｋ、１９８２年「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」；Ｇｌｏｖｅｒ（編）１９８５年「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」第Ｉ巻及び第ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ（編）１９８５年「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国；及びＳｅｔｌｏｗ及びＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ、１９７９年「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第１〜４巻、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。略称及び命名法が用いられる場合、それらはその分野で標準的と見なされ、且つ本明細書に引用されるような専門雑誌で一般的に使用されるものである。
【００３１】
本発明は、基礎塩栄養液及び有効量のＥｒｂＢ３リガンドを含む組成物及び方法に関し、組成物は実質的に無血清である。本発明の組成物及び方法は、細胞、特に分化可能細胞の培養に有用である。分化可能細胞の培養における種々の時点で、様々な成分が細胞培養物に添加され得るため、培地は本明細書に記載されるもの以外の成分を含み得ることが理解される。しかしながら、培養物の調製中、又は分化可能細胞の培養中の少なくともある時点において、限定培地は基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼを活性化させるための手段を含むことが企図される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「分化可能細胞」は、少なくとも部分的に成熟した細胞に分化できるか、又は細胞の分化に関与できる、例えば、少なくとも部分的に成熟した細胞に分化できる他の細胞と融合できる細胞又は細胞集団を記載するのに使用される。本明細書中で使用される場合、「部分的に成熟した細胞」は、同一の器官又は組織由来の成熟細胞の表現型の少なくとも１つの特徴、例えば形態又はタンパク質発現などを呈する細胞である。例えば、正常な成熟肝実質細胞は一般的には、とりわけ、アルブミン、フィブリノゲン、α１−アンチトリプシン、プロトロンビン凝固因子、トランスフェリン、及びシトクロムＰ−４５０などの解毒酵素といったタンパク質を発現する。従って、本発明で定義される場合、「部分的に成熟した肝実質細胞」は、アルブミン又は別の１つ又は複数のタンパク質を発現し得るか、又は正常な成熟肝実質細胞の外見又は機能をとり始め得る。さらに、「部分的に成熟した膵β細胞」は、とりわけプロインスリンタンパク質を産生又は発現し得る。細胞は当然ながら遺伝子操作され得るが、細胞の少なくとも部分的に成熟した細胞に分化する能力が、組換え操作技術、例えばトランスフェクションなどに依存することはないといえる。
【００３３】
本発明は、分化可能細胞の供給源又は可塑性に関しない、分化可能細胞に有用な組成物及び方法を企図する。細胞の「可塑性」は本明細書では、当該技術分野において使用される場合とほぼ同様に使用される。つまり、細胞の可塑性は、胚、胎児又は発達した生物体からの組織又は器官に見られる特定の細胞型に分化する細胞の能力を指す。細胞の「可塑性がより高い」ほど、細胞が分化可能であり得る組織は多くなる。「多能性細胞」は、多能性細胞、多分化能細胞、少分化能（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）細胞及び単能性細胞、及び／又は胚、胎児又は発達した生物体に見られる成熟した、又は部分的に成熟した細胞型の全てではないがいくつかに分化するか、又はそれを生じさせる能力を有し得る細胞及びその子孫を含む。「多分化能細胞」は、多分化能細胞から得られる成熟した、又は部分的に成熟した細胞型が特定の組織、器官又は器官系の細胞に限定されていることを除き、多分化能前駆細胞、少分化能前駆細胞及び単能性細胞前駆細胞、及び／又は１つ又は複数の成熟した、又は部分的に成熟した細胞型に分化するか、又はそれを生じさせる能力を有し得る細胞及びその子孫を含む。例えば、多分化能の造血前駆細胞及び／又はその子孫は、１つ又は複数の型の少分化能細胞、例えば骨髄系前駆細胞及びリンパ球前駆細胞などに分化するか、又はそれを生じさせ、および通常血液中に見られる他の成熟細胞成分も生じさせる能力を有する。「少分化能細胞」は、成熟した、又は部分的に成熟した細胞に分化する能力が多分化能細胞より制限されている細胞及びその子孫を含む。しかしながら、少分化能細胞はなお、少分化能細胞及び単能性細胞、及び／又は所与の組織、器官又は器官系の１つ又は複数の成熟した、又は部分的に成熟した細胞型に分化する能力を有し得る。少分化能細胞の一例は骨髄系前駆細胞であり、これは最終的には成熟した、又は部分的に成熟した赤血球、血小板、好塩基球、好酸球、好中球及び単球を生じさせることができる。「単能性細胞」は、他の単能性細胞及び／又はある型の成熟した、又は部分的に成熟した細胞型に分化するか、又はそれを生じさせる能力を有する細胞及びその子孫を含む。
【００３４】
分化可能細胞は、本明細書で使用される場合、多能性であっても、多分化能を有しても、少分化能を有しても、又はさらには単能性であってもよい。本発明の特定の実施形態において、分化可能細胞は多能性分化可能細胞である。より具体的な実施形態において、多能性分化可能細胞は、胚性幹細胞、ＩＣＭ／胚盤葉上層細胞、原始外胚葉細胞、始原生殖細胞、及びテラトカルシノーマ細胞からなる群から選択される。詳細な一実施形態において、分化可能細胞は哺乳動物胚性幹細胞である。さらに詳細な実施形態において、分化可能細胞はヒト胚性幹細胞である。
【００３５】
本発明はまた、動物体内の任意の供給源由来の分化可能細胞も企図するが、但し細胞は本明細書に定義されるとおり分化可能であるものとする。例えば、分化可能細胞は、胚又はそのなかの任意の始原生殖細胞層から、胎盤又は絨毛組織から、又は、脂肪、骨髄、神経組織、乳腺組織、肝組織、膵臓、上皮、呼吸器系、性腺及び筋組織を含む成人幹細胞などのより成熟した組織から採取されてもよいが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、分化可能細胞は胚性幹細胞である。他の具体的な実施形態において、分化可能細胞は成人幹細胞である。さらに他の具体的な実施形態において、幹細胞は胎盤由来又は絨毛由来幹細胞である。
【００３６】
当然ながら本発明は、分化可能細胞の生成能を有する任意の動物由来の分化可能細胞の使用を企図する。分化可能細胞を採取する動物は、脊椎動物又は無脊椎動物、哺乳動物又は非哺乳動物、ヒト又は非ヒトであってもよい。動物供給源の例としては、霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ及びブタを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の分化可能細胞は、当業者に周知の任意の方法を使用して得ることができる。例えば、ヒト多能性細胞は脱分化法及び核移植法を使用して産生できる。加えて、本発明で使用されるヒトＩＣＭ／胚盤葉上層細胞又は原始外胚葉細胞はインビボ又はインビトロで得ることができる。原始外胚葉細胞は、接着培養で、又は国際公開第９９／５３０２１号パンフレットに記載されるとおり、懸濁培養で細胞凝集体として生成されてもよい。さらに、ヒト多能性細胞は、手作業での継代法、及び酵素又は非酵素継代などのバルク継代法を含む当業者に周知の任意の方法を使用して継代できる。
【００３８】
特定の実施形態においてＥＳ細胞が利用される場合、胚性幹細胞は正常核型を有するが、他の実施形態において、胚性幹細胞は異常核型を有する。一実施形態においては、大多数の胚性幹細胞が正常核型を有する。５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％を上回る、又は９５％を上回る中期の調査対象が正常核型を呈するであろうことが企図される。
【００３９】
別の実施形態においては、大多数の胚性幹細胞が異常核型を有する。５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％を上回る、又は９５％を上回る中期の調査対象が異常核型を呈することが企図される。特定の実施形態において、異常核型は、細胞が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は２０より多い継代数にわたり培養された後に明らかとなる。具体的な一実施形態において、異常核型は少なくとも１つの常染色体のトリソミーを含み、ここで常染色体は、１、７、８、１２、１４、及び１７番染色体からなる群から選択される。別の実施形態において、異常核型は２つ以上の常染色体のトリソミーを含み、ここで２つ以上の常染色体のうちの少なくとも１つは、１、７、８、１２、１４、及び１７番染色体からなる群から選択される。一実施形態において、常染色体は１２番染色体又は１７番染色体である。別の実施形態において、異常核型は追加的な性染色体を含む。一実施形態において、核型は２つのＸ染色体及び１つのＹ染色体を含む。また、染色体の転座が起こり得ることも企図され、かかる転座は用語「異常核型」のなかに包含される。前述の染色体異常と他の染色体異常との組み合わせもまた、本発明により包含される。
【００４０】
本組成物及び方法は、基礎塩栄養液を含む。本明細書で使用される場合、基礎塩栄養液は、細胞に水及び正常な細胞代謝に必須の特定のバルク無機イオンを提供し、細胞内及び細胞外浸透平衡を維持し、炭水化物をエネルギー源として提供し、及び緩衝系を提供して培地を生理学的ｐＨの範囲に維持する塩の混合物を参照する。基礎塩栄養液の例としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭ１  １６４０、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、α−最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、及びイスコフ変法ダルベッコ培地、及びこれらの混合物がを含むが、これらに限定されない。詳細な一実施形態において、基礎塩栄養液は、ＤＭＥＭとハムのＦ１２との約５０：５０の混合物である。
【００４１】
本組成物はさらに、微量元素を含むことが企図される。微量元素は市販品として、例えばＭｅｄｉａｔｅｃｈから購入できる。微量元素の非限定的な例としては、アルミニウム、塩素、硫酸塩、鉄、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン酸塩及びマグネシウムを含む化合物を含むがこれらに限定されない。微量元素を含有する化合物の具体例としては、ＡｌＣｌ３、ＡｇＮＯ３、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＣｄＣｌ２、ＣｄＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＣｒＣｌ３、Ｃｒ２（ＳＯ４）３、ＣｕＳＯ４、クエン酸鉄、ＧｅＯ２、ＫＩ、ＫＢｒ、ＬＩ、モリブデン酸、ＭｎＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３、ＮａＶＯ３、ＮＨ４ＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮｉＳＯ４、ＲｂＣｌ、セレン、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｈ２ＳｅＯ３、亜セレン酸・２Ｎａ、セレノメチオノン、ＳｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＺｒＯＣｌ２、並びにこれらの混合物及び塩を含むが、これらに限定されない。セレン、亜セレン酸塩又はセレノメチオノンが存在する場合、これは約０．００２〜約０．０２ｍｇ／Ｌの濃度である。加えて、ヒドロキシルアパタイトもまた存在し得る。
【００４２】
アミノ酸が限定培地に添加され得ることが企図される。かかるアミノ酸の非限定的な例としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン／Ｇｌｕｔａｍａｘ、塩酸Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、塩酸Ｌ−システイン−Ｈ２Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、塩酸Ｌ−ヒスチジン−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、塩酸Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物、及びＬ−バリンである。特定の実施形態において、アミノ酸は、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−バリン、及びこれらの混合物である。
【００４３】
限定培地がアスコルビン酸を含み得ることもまた企図される。好ましくは、アスコルビン酸は初期濃度が約１ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、又は約２ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌ、又は約５ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ、又は約１０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ又は約５０ｍｇ／Ｌで存在する。
【００４４】
加えて、本組成物及び方法はまた、血清アルブミン、トランスフェリン、Ｌ−グルタミン、脂質、抗生物質、β−メルカプトエタノール、ビタミン、ミネラル、ＡＴＰなどの他の成分も含み得るとともに、類似した成分が存在し得る。存在し得るビタミンの例としてはビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｅ、トコトリエノール、Ｋ１及びＫ２を含むが、これらに限定されない。当業者は、所与の培養に使用するためのミネラル、ビタミン、ＡＴＰ、脂質、必須脂肪酸等の最適濃度を決定できる。補助剤の濃度は、例えば、約０．００１μＭ〜約１ｍＭ以上であり得る。供給され得る補助剤の濃度の具体例としては、約０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、４．０μＭ、５．０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ等を含むが、これらに限定されない。具体的な一実施形態において、本組成物及び方法はビタミンＢ６及びグルタミンを含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はビタミンＣ及び鉄分補助剤を含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はビタミンＫ１及びビタミンＡを含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はビタミンＤ３及びＡＴＰを含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はビタミンＢ１２及びトランスフェリンを含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はトコトリエノール及びβ−メルカプトエタノールを含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はグルタミン及びＡＴＰを含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はω−３脂肪酸及びグルタミンを含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はω−６脂肪酸及びビタミンＢ１を含む。別の具体的な実施形態において、本組成物及び方法はα−リノレン酸及びＢ２を含む。
【００４５】
本発明の組成物は実質的に無血清である。本明細書で使用される場合、「実質的に無血清」は、本発明の溶液中に血清がないことを指す。血清は本発明の組成物及び方法にとって必須の成分ではない。従って、任意の本組成物中の血清の存在は、例えば出発物質由来の不純物又は初代細胞培養物からの残留血清のみに起因しなければならない。例えば、本質的に無血清の培地又は環境の含有し得る血清は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％未満であり、ここで本培地又は環境には本明細書における生理活性の維持能力の向上がなお観察される。本発明の特定の実施形態において、本質的に無血清の組成物は、血清又は血清代替物を含まないか、又は限定培地に添加される血清又は血清代替物の成分を単離することによる微量の血清又は血清代替物しか含まない。
【００４６】
本発明の組成物及び方法はまた、分化可能細胞内のＥｒｂＢ２チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段も含む。具体的な一実施形態において、本発明の組成物及び方法は、少なくとも１つのＥｒｂＢ３リガンドの存在を含む。一般的には、ＥｒｂＢ３リガンドはＥｒｂＢ３受容体に結合し、ＥｒｂＢ２受容体と共に二量体化することとなる。ひいてはＥｒｂＢ２受容体が、分化可能細胞内の細胞内チロシンキナーゼ活性に概して関与する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ＥｒｂＢ３リガンド」は、ＥｒｂＢ３と結合するリガンドを指し、ひいてはこれがＥｒｂＢ２と二量体化し、従ってＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体受容体のＥｒｂＢ２部分のチロシンキナーゼ活性が活性化される。ＥｒｂＢ３リガンドの非限定的な例としては、ニューレグリン１、ＨＲＧ−β、ＨＲＧ−α、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）、グリア成長因子２（ＧＧＦ２）、並びに感覚及び運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）を含むがこれらに限定されないニューレグリン１のスプライス変異体及びアイソフォーム、ニューレグリン２およびＮＲＧ２−β、エピレギュリン、及びビレギュリン（Ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）を含むがこれらに限定されないニューレグリン２のスプライス変異体及びアイソフォームを含む。
【００４８】
一実施形態において、ＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段は、ニューレグリン１、ヘレグリンβ（ＨＲＧ−β）、ヘレグリンα（ＨＲＧ−α）、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）、グリア成長因子２（ＧＧＦ２）、運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）、ニューレグリン２、ニューレグリン２β（ＮＲＧ２−β）、エピレギュリン、ビレギュリン（Ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）及びこれらの変異体及び機能断片からなる群から選択される少なくとも１つのＥｒｂＢ３リガンドを含む。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物及び方法は、２つ以上のＥｒｂＢ３リガンドを使用するなど、ＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための２つ以上の手段を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の組成物及び方法のより具体的な実施形態において、ＥｒｂＢ３リガンドはＨＲＧ−β又はその変異体若しくは機能断片である。一実施形態において、培養添加タンパク質、ポリペプチド又はこれらの変異体若しくは機能断片が誘導される種は、培養される細胞の種と同じである。例えば、マウスＥＳ細胞が培養される場合、アミノ酸配列がマウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＨＲＧ−β配列と同一のＨＲＧ−βを培養中の添加剤として使用でき、このＨＲＧ−βは「同一種」と見なされる。他の実施形態において、生物学的添加剤が誘導される種は、培養される細胞と異なる。例えば、マウスＥＳ細胞が培養される場合、アミノ酸配列がヒトＨＲＧ−β配列と同一のＨＲＧ−βを培養中の添加剤として使用でき、このＨＲＧ−βは「異種」と見なされる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「機能断片」は、完全長ポリペプチドと同様の生理学的作用又は細胞作用を及ぼす完全長ポリペプチドの断片又はスプライス変異体である。機能断片の生物学的作用は、同様の生理学的作用又は細胞作用が見られる限り、完全長ポリペプチドと同じ範囲又は強度である必要はない。例えば、ＨＲＧ−βの機能断片は検出可能な程度にＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼを刺激できる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「変異体」は、キメラ又は融合ポリペプチド、相同体、類似体、オルソログ、及びパラログを含む。加えて、参照タンパク質又は参照ポリペプチドの変異体は、アミノ酸配列が参照タンパク質又は参照ポリペプチドと少なくとも約８０％同一なタンパク質又はポリペプチドである。具体的な実施形態において、変異体は、参照タンパク質又は参照ポリペプチドと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％又はさらには１００％同一である。本明細書で使用される場合、用語「〜と一致する」及び「〜と一致している」は、それらが配列アラインメントに関する場合、参照タンパク質又は参照ポリペプチド、例えば野生型のヒト又はマウスニューレグリン１内の列挙された位置、及び参照タンパク質又は参照ポリペプチド上の位置と整列させたときの修飾タンパク質又は修飾ポリペプチドにおけるそれらの位置を意味することが意図される。従って、対象タンパク質又は対象ポリペプチドのアミノ酸配列を参照タンパク質又は参照ポリペプチドのアミノ酸配列と整列させた場合、参照タンパク質又は参照ポリペプチド配列の特定の列挙位置「と一致する」配列は、参照配列の当該位置と整列するものではあるが、必ずしも参照配列の正確な数値上の位置にあるわけではない。配列間で一致するアミノ酸を決定するための配列の整列方法は、以下に記載される。
【００５２】
例えばＴＧＦ−βをコードする参照アミノ酸配列と、少なくとも、例えば約９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、アミノ酸配列が参照ＴＧＦ−βをコードする参照アミノ酸配列の１００アミノ酸につき最大約５つまでの修飾を含み得ることを除き、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意味するものと理解される。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を有するペプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の最高約５％が欠失しているか、又は別のアミノ酸と置換されてもよく、又は参照配列中の全アミノ酸の最高約５％までの複数のアミノ酸が参照配列中に挿入されてもよい。こうした参照配列の修飾は、参照アミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端位置、又はこれらの末端位置間の任意の箇所で起こってもよく、いずれの場合も参照配列中又は参照配列内の１つ又は複数の隣接群中のアミノ酸間に個別に散在し得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「同一性」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の参照ヌクレオチド又は参照アミノ酸配列と比較した同一性の尺度である。概して、配列は最高位の整合性が得られるように整列される。「同一性」それ自体は当該技術分野で認められている意味を有し、公開されている技術を使用して計算できる。（例えば、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８年）；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）；「Ｃｏｍｕｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ」、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４年）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）；及び「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１年）を参照）。２本のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の同一性を計測するうえではいくつかの方法が存在するが、用語「同一性」は当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．、Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３頁（１９８８年））。２本の配列間の同一性又は類似性を決定するために一般に用いられる方法としては、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ」、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９４年）及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．、Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３頁（１９８８年）に開示されるものを含むが、これらに限定されない。コンピュータプログラムもまた、同一性及び類似性を計算する方法及びアルゴリズムを含み得る。２本の配列間の同一性及び類似性を決定するためのコンピュータプログラム方法の例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（ｉ）：３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３頁（１９９０年））及びＦＡＳＴＤＢを含むが、これらに限定されない。同一性及び類似性を決定するための方法の例は、Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｇ．及びＧａｒｉａｎ，Ｒ．、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００年）に考察され、参照により援用される。本発明の一実施形態において、２つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムはＢＬＡＳＴＰである。
【００５４】
本発明の別の実施形態において、２つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムはＦＡＳＴＤＢであり、これはＢｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５頁（１９９０年）、参照により援用）のアルゴリズムに基づく。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列及び対象配列はアミノ配列である。配列アラインメントの結果は同一性パーセントで表される。アミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて同一性パーセントを計算するために使用され得るパラメータとしては、マトリックス＝ＰＡＭ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ  ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００か、又は対象アミノ配列長のうち、より短い方を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
内側の付加又は欠失ではなく、Ｎ末端又はＣ末端の付加又は欠失によって対象配列が問い合わせ配列より短いか、又は長い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは同一性パーセントを計算するうえで、対象配列のＮ末端及びＣ末端トランケーション又は付加を考慮しないため、手動での補正が行われてもよい。問い合わせ配列と比べ、５’又は３’末端で切断された対象配列について、同一性パーセントは、参照配列に対し整合／整列しないＮ末端及びＣ末端である問い合わせ配列の塩基数を、問い合わせ配列の全塩基の百分率として計算することにより補正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果が整合／整列を決定する。次に整列パーセンテージが、特定のパラメータを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセントから減算され、最終的な同一性パーセントスコアが算出される。この補正済みスコアはアラインメントがいかに互いに「一致する」かを、同一性パーセンテージと同時に決定するために使用できる。それぞれ参照又は対象配列のＮ末端又はＣ末端を越えて伸長する問い合わせ（対象）配列又は参照配列の残基は、同一性パーセントスコアを手動で調節するためのものと考えることができる。すなわち、比較配列のＮ末端又はＣ末端と整合/整列しない残基は、同一性パーセントスコア又はアラインメント番号付けを手動で調節するときに考慮され得る。
【００５６】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を１００残基の参照配列と整列させて同一性パーセントを決定する。欠失は対象配列のＮ末端で起こっており、従って、ＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端の最初の１０残基の整合／整列を示さない。１０個の対をなさない残基は配列の１０％に相当し（整合しないＮ末端及びＣ末端での残基数／問い合わせ配列中の総残基数）、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算される同一性パーセントスコアから減算される。残りの９０残基が完全に整合すれば、最終同一性パーセントは９０％となる。別の例において、９０残基の対象配列が１００の参照配列と比較される。このとき欠失は内部欠失であるため、対象配列のＮ末端又はＣ末端に問い合わせ配列と整合／整列しない残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算される同一性パーセントが手動で補正されることはない。
【００５７】
本発明はまた、キメラ又は融合ポリペプチドも提供する。本明細書で使用される場合、「キメラポリペプチド」又は「融合ポリペプチド」は、第２の異なるポリペプチドと機能的に連結する参照ポリペプチドのメンバーの少なくとも一部分を含む。第２のポリペプチドは、参照ポリペプチドと実質的に同一でなく、且つ同じ又は異なる生物体由来のポリペプチドと一致するアミノ酸配列を有する。融合ポリペプチドに関して、用語「機能的に連結する」は、参照ポリペプチド及び第２のポリペプチドの双方の配列が使用される配列に属する提示機能を果たすよう互いに融合していることを示すよう意図される。第２のポリペプチドは参照ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端と融合し得る。例えば、一実施形態において、融合ポリペプチドはＧＳＴ−ＩＧＦ−１融合ポリペプチドであり、ここではＩＧＦ−１配列がＧＳＴ配列のＣ末端と融合している。かかる融合ポリペプチドは組換えポリペプチドの精製を促進し得る。別の実施形態において、融合ポリペプチドはそのＮ末端に異種シグナル配列を含み得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ポリペプチドの発現及び／又は分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて増加し得る。
【００５８】
断片及び融合ポリペプチドに加え、本発明は天然に存在するポリペプチドの相同体及び類似体を含む。「相同体」は本明細書では、類似した、又は「同一の」ヌクレオチド又はアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの核酸又はポリペプチドと定義される。相同体としては、以下で定義されるとおりの、対立遺伝子変異体、オルソログ、パラログ、アゴニスト、及びアンタゴニストを含む。用語「相同体」はさらに、遺伝暗号の縮重に起因して参照ヌクレオチド配列と異なり、ひいては参照ヌクレオチド配列によりコードされるものと同じポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。本明細書で使用される場合、「天然に存在する」は、自然界に存在する核酸又はアミノ酸配列を参照する。
【００５９】
ポリペプチドのアゴニストは、ポリペプチドの生物活性と実質的に同じもの、又はそのサブセットを保持できる。ポリペプチドのアンタゴニストは、天然に存在する型のポリペプチドの活性の１つ又は複数を阻害できる。
【００６０】
本発明の組成物及び方法の別のより具体的な実施形態において、ＥｒｂＢ３リガンドはＨＲＧ−β又はその変異体若しくは機能断片である。ＥｒｂＢ３リガンドのさらなる非限定的な例が、米国特許第６，１３６，５５８号明細書、同第６，３８７，６３８号明細書、及び同第７，０６３，９６１号明細書に開示され、これらは参照により援用される。
【００６１】
ヘレグリンは一般に、Ｃ末端部分が異なる２つの変異ＥＧＦ様ドメインに基づき、２つの主要なタイプ、αとβとに分類される。しかしながら、これらのＥＧＦ様ドメインは、そこに含まれる６個のシステイン残基の間隔が同じである。アミノ酸配列比較に基づき、Ｈｏｌｍｅｓらは、ＥＧＦ様ドメイン中の第１番目と第６番目のシステインの間でＨＲＧがヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）と４５％類似しており、アンフィレギュリン（ＡＲ）と３５％同一であり、ＴＧＦ−αと３２％同一であり、及びＥＧＦと２７％同一であることを明らかにした。
【００６２】
４４ｋＤａのｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）は、ヒトＨＲＧのラット等価物である。ＨＲＧポリペプチドと同様に、ＮＤＦは免疫グロブリン（Ｉｇ）相同ドメインと、それに続くＥＧＦ様ドメインを有するとともに、Ｎ末端シグナルペプチドが欠失している。現在、ＥＧＦ様ドメインの配列に基づきαポリペプチド又はβポリペプチドのいずれかに分類される少なくとも６種の異なる線維芽細胞性促進性ＮＤＦ（ｐｒｏ−ＮＤＦ）がある。アイソフォーム１〜４は、ＥＧＦ様ドメインと膜貫通ドメインとの間の可変伸長部に基づき特性決定される。このように、異なるＮＤＦアイソフォームは選択的スプライシングにより生成され、異なる組織特異的機能を果たし得るものと思われる。参照により援用される欧州特許第５０５  １４８号明細書、国際公開第９３／２２４２４号パンフレット、及び国際公開第９４／２８１３３号パンフレットを参照されたい。
【００６３】
本発明の一実施形態において、本組成物及び方法は、外因性インスリン及びインスリン代用物を含まない。「外因性インスリン又はインスリン代用物」という語句は、本明細書では、本発明の組成物又は方法に意図的には添加されないインスリン又はインスリン代用物を示すために使用される。従って、本発明の特定の実施形態において、本方法及び組成物は、意図的に供給されるインスリン又はインスリン代用物を含まない。しかしながら、本組成物又は方法は必ずしも内因性インスリンを含まないとは限らない。本明細書で使用される場合、「内因性インスリン」は、培養細胞が本発明の方法に従い培養される場合独自にインスリンを産生している可能性があることを示す。内因性インスリンはまた、初代細胞培養物由来の残留不純物又は出発物質由来の不純物を示すためにも使用され得る。具体例として、本組成物及び方法は、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１μｇ／ｍｌ未満のインスリンを含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「インスリン」は、通常の生理学的濃度においてインスリン受容体と結合するとともにインスリン受容体を通じたシグナル伝達を誘発できるタンパク質、又はその変異体若しくは断片を参照する。用語「インスリン」は、天然ヒトインスリン、又は他の哺乳動物インスリンのポリペプチド配列、又はそれらの配列に対する任意の相同体若しくは変異体を有するタンパク質を包含する。加えて、インスリンという用語は、インスリン受容体と結合してインスリン受容体を通じたシグナル伝達を誘発する能力を有するポリペプチド断片を包含する。用語「インスリン代用物」は、インスリンの代わりに使用してインスリンと実質的に同様の効果をもたらし得る任意の亜鉛含有化合物を参照する。インスリン代用物の例としては、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、及び硫酸亜鉛を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
明確にすれば、インスリン様成長因子は、本発明において企図されるようなインスリンの代用物又は相同体ではない。従って、別の具体的な実施形態において、本発明の組成物及び方法は、少なくとも１種のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）又はその変異体若しくは機能断片の使用を含む。別の実施形態において、本発明の組成物及び方法は、いかなる外因性インスリン様成長因子（ＩＧＦ）も含まない。具体的な実施形態において、本発明の組成物及び方法は、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１ｎｇ／ｍｌ未満のＩＧＦ−１を含む。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「ＩＧＦ−１Ｒの活性化因子」は、細胞増殖、分化、及びアポトーシスの調節に中心的な役割を果たすマイトジェンを参照する。ＩＧＦ−１Ｒの活性化因子の作用は、一般的にはＩＧＦ−１Ｒを通じて媒介されるが、これは他の受容体を通じても媒介され得る。ＩＧＦ−１Ｒはまた、腫瘍ウイルスタンパク質及び癌遺伝子産物により誘発される細胞形質転換にも関与し、その相互作用は特異的結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）群により調節される。加えて、大集団のＩＧＦＢＰプロテアーゼがＩＧＦＢＰを加水分解し、結果として結合しているＩＧＦが放出され、ひいてはＩＧＦ−１Ｒと相互作用するその能力が回復される。本発明の目的上、リガンド、受容体、結合タンパク質、及びプロテアーゼは、全てＩＧＦ−１Ｒの活性化因子と見なされる。一実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの活性化因子は、ＩＧＦ−１、又はＩＧＦ−２である。さらなる実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの活性化因子は、ＩＧＦ−１類似体である。ＩＧＦ−１類似体の非限定的な例としては、ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１、Ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−１、［Ａｒｇ３］ＩＧＦ−１、［Ａｌａ３１］ＩＦＧ−１、Ｄｅｓ（２，３）［Ａｌａ３１］ＩＧＦ−１、［Ｌｅｕ２４］ＩＧＦ１、Ｄｅｓ（２，３）［Ｌｅｕ２４］ＩＧＦ−１、［Ｌｅｕ６０］ＩＧＦ−１、［Ａｌａ３１］［Ｌｅｕ６０］ＩＧＦ−１、［Ｌｅｕ２４］［Ａｌａ３１］ＩＧＦ−１、及びこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態において、ＩＦＧ−１類似体はＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１であり、これはヒトインスリン成長因子１の組換え類似体である。ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１は当初は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌの濃度、又は約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することが企図される。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法は、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）又はＴＧＦ−βファミリーメンバー又はその変異体若しくは機能断片を含む。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦ−βファミリーのメンバー」などの用語は、既知のＴＧＦ−βファミリーメンバーとの相同性か、又は既知のＴＧＦ−βファミリーメンバーとの機能上の類似性のいずれかによって、一般に当業者によりＴＧＦ−βファミリーに属するものとして特徴付けられる成長因子を参照する。本発明の詳細な実施形態において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが存在する場合、その変異体又は機能断片のＴＧＦ−βファミリーメンバーがＳＭＡＤ２又は３を活性化する。特定の実施形態において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）及び骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）からなる群から選択される。一実施形態において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーはアクチビンＡである。
【００６８】
ノーダルが存在する場合、ノーダルは当初は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約２０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ〜約７５０ｎｇ／ｍｌ、又はより好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することが企図される。アクチビンＡが使用される場合、アクチビンＡは当初は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌの濃度、又は最も好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することが企図される。ＴＧＦ−βが存在する場合、ＴＧＦ−βは当初は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、又はより好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することが企図される。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の組成物及び方法は、ＦＧＦ受容体の活性化因子を含まない。現在、線維芽細胞成長因子のファミリーには少なくとも２２個の既知のメンバーがあり、これらの因子が、４つのＦＧＦ受容体のうちの少なくとも１つに結合する。本明細書で使用される場合、用語「ＦＧＦ受容体の活性化因子」は、既知のＦＧＦファミリーメンバーとの相同性か、又は既知のＦＧＦファミリーメンバーとの機能上の類似性のいずれかによって、一般に当業者によりＦＧＦファミリーに属するものとして特徴付けられる成長因子を参照する。特定の実施形態において、ＦＧＦ受容体の活性化因子は、α−ＦＧＦ及びＦＧＦ２などのＦＧＦであるが、これらに限定されない。詳細な実施形態において、本組成物及び方法は、外因性ＦＧＦ２を含まない。語句「外因性ＦＧＦ２」は、本明細書では、本発明の組成物又は方法に意図的には添加されない線維芽細胞成長因子２、すなわち塩基性ＦＧＦを示すために使用される。従って、本発明の特定の実施形態において、本方法及び組成物は意図的に供給されるＦＧＦ２を含まない。しかしながら、本組成物又は方法は必ずしも内因性ＦＧＦ２を含まないとは限らない。本明細書で使用される場合、「内因性ＦＧＦ２」は、培養細胞が本発明の方法に従い培養される場合ＦＧＦ２を独自に産生している可能性があることを示す。「内因性ＦＧＦ２」はまた、初代細胞培養物由来の残留不純物又は出発物質由来の不純物を示すためにも使用され得る。具体例として、本組成物及び方法は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１ｎｇ／ｍｌ未満のＦＧＦ２を含む。
【００７０】
しかしながら、本発明の組成物及び方法は、ＦＧＦポリペプチド、その機能断片又はその変異体のいずれかを含む、ＦＧＦ受容体の少なくとも１つの活性化因子を含み得ることが企図される。ＦＧＦ２が存在する場合、ＦＧＦ２は当初は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約１２ｎｇ／ｍｌの濃度、又は最も好ましくは約８ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することが企図される。別の具体的な実施形態において、本発明の組成物及び方法は、ＦＧＦ２以外のＦＧＦ受容体の少なくとも１つの活性化因子を含み得る。例えば、本発明の組成物及び方法は、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０若しくはＦＧＦ−２２のうちの少なくとも１つ又はその変異体若しくは機能断片を含んでもよい。具体的な実施形態において、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０若しくはＦＧＦ−２２のうちの少なくとも２つ、又はそれらの変異体若しくは機能断片の組み合わせが存在する。別の実施形態において、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−２２の３つ全て、又はそれらの変異体若しくは機能断片が存在する。ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０又はＦＧＦ−２２のいずれか、又は変異体若しくは機能断片が存在する場合、各々は当初、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、より具体的には約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、より具体的には約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌ、より具体的には約１ｎｇ／ｍｌ〜約１２ｎｇ／ｍｌの濃度、又は最も具体的には約８ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することが企図される。
【００７１】
さらなる特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法は、血清アルブミン（ＳＡ）を含む。具体的な実施形態において、ＳＡは、ウシＳＡ（ＢＳＡ）又はヒトＳＡ（ＨＡＳ）のいずれかである。さらにより具体的な実施形態において、ＳＡの濃度は、容量対容量（ｖ／ｖ）で約０．２％より高いが、約１０ｖ／ｖ％未満である。さらにより具体的な実施形態において、ＳＡの濃度は、約０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２．０％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、３．０％、３．２％、３．４％、３．６％、３．８％、４．０％、４．２％、４．４％、４．６％、４．８％、５．０％、５．２％、５．４％、５．６％、５．８％、６．０％、６．２％、６．４％、６．６％、６．８％、７．０％、７．２％、７．４％、７．６％、７．８％、８．０％、８．２％、８．４％、８．６％、８．８％、９．０％、９．２％、９．４％、９．６％及び９．８％（ｖ／ｖ）より高い。
【００７２】
さらなる実施形態において、本組成物及び方法は、少なくとも１種の不溶性基質を含む。例えば、分化可能細胞は、ポリスチレン、ポリプロピレンなどの化合物を含む細胞培養表面上に置かれてもよいが、これらに限定されない。次に表面は、不溶性基質でコーティングされてもよい。具体的な実施形態において、不溶性基質は、コラーゲン、フィブロネクチン及びそれらの断片又は変異体からなる群から選択される。不溶性基質の他の例としては、フィブリン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン及びナイドジェンを含むが、これらに限定されない。
【００７３】
従って、本発明の細胞培養環境及び方法は、細胞を接着培養でプレーティングする工程を含む。本明細書で使用される場合、用語「プレーティングされた」及び「プレーティングする」は、細胞を接着培養で成長可能にする任意の過程を参照する。本明細書で使用される場合、用語「接着培養」の参照する細胞培養系とは、固体表面上で細胞が培養されるもので、この固体表面は次に不溶性基質でコーティングされ得、これが次に以下に列挙されるものなどの別の基質表面コート、又は培養中に細胞を増殖させるか、若しくは安定化させる任意の他の化学的又は生物学的材料でコーティングされ得る。細胞は固体表面又は基質に緊密に接着しても、又はしなくてもよい。接着培養用基質は、ポリオルニチン、ラミニン、ポリリジン、精製コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、硫酸ヘパリンプロテオグリカン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、及びポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）のいずれか１つ又はこれらの組み合わせを含んでもよい。さらに、接着培養用基質は、支持細胞層により固着する、又は多能性ヒト細胞又は細胞培養物により固着するマトリックスを含んでもよい。本明細書で使用される場合、用語「細胞外マトリックス」は、上記のもの、並びに支持細胞層又は多能性ヒト細胞又は細胞培養物により固着するマトリックスなどの固体基質を包含するが、これらに限定されない。一実施形態において、細胞はＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングされたプレート上にプレーティングされる。別の実施形態において、細胞はフィブロネクチンでコーティングされたプレート上にプレーティングされる。特定の実施形態において、細胞がフィブロネクチン上にプレーティングされる場合、プレートは、２〜３時間にわたり室温で、組織級の水で希釈された１０μｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃３３０１６−０１５）でコーティングすることにより調製される。別の実施形態において、血清が最長２４時間まで培地に置かれてもよく、それにより細胞をプラスチックにプレーティングすることが可能となる。血清を使用して細胞の付着を促進する場合、培地は除去され、本質的に無血清の組成物がプレーティングされた細胞に添加される。
【００７４】
本発明の組成物及び方法は、分化可能細胞が本質的に支持細胞又は支持細胞層を含まない条件下で培養されることを企図する。本明細書で使用される場合、「支持細胞」は、インビトロで成長し、標的細胞と共培養されると標的細胞をその現在の分化状態で安定化させる細胞である。本明細書で使用される場合、「支持細胞層」は用語「支持細胞」と同義的に使用できる。本明細書で使用される場合、用語「本質的に支持細胞を含まない」は、支持細胞を含有しないか、又は最小限の（ｄｅ  ｍｉｎｉｍｕｓ）数の支持細胞しか含まない組織培養条件を参照する。「最小限の」とは、分化可能細胞が支持細胞上で培養された前の培養条件からその時の培養条件に持ち越される支持細胞の数を意味する。上記方法の一実施形態において、標的細胞をその現在の分化状態で安定化させる支持細胞から、馴化培地が得られる。別の実施形態において、限定培地は非馴化培地であり、これは支持細胞からは得られない培地である。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「安定化させる」は、細胞又は細胞の培養物の分化状態に言及して使用される場合、細胞は培養下で複数の代にわたり、及び好ましくは培養下で無限に増殖し続けるであろうが、ここで培養物中の全てではないがほとんどの細胞が同一の分化状態であることを示す。加えて、安定化させた細胞が分裂する場合、分裂は一般的には、同じ細胞型の細胞をもたらすか、又は同じ分化状態の細胞をもたらす。安定化させた細胞又は細胞集団は一般に、細胞培養条件が変化せず、且つ細胞が継代され続けても成長し過ぎることがなければ、それ以上分化又は脱分化しない。一実施形態において、安定化させた細胞は、無限に、又は少なくとも２代より長く安定状態で増殖することが可能である。より具体的な実施形態において、細胞は、３代、４代、５代、６代、７代、８代、９代より長く、１０代より長く、１５代より長く、２０代より長く、２５代より長く、又は３０代より長く安定している。一実施形態において、細胞は、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、又は１１ヶ月より長い連続継代の間、安定している。別の実施形態において、細胞は、約１年より長い連続継代の間、安定している。一実施形態において、幹細胞は限定培地における定期的な継代により、幹細胞の分化が所望されるまで、培養下に多能性状態で維持される。本明細書で使用される場合、用語「増殖する」は、細胞培養物中の細胞数の増加を指す。
【００７６】
特定の実施形態において、本組成物及び方法は、ＢＭＰシグナル伝達の不活性化因子を含む。本明細書で使用される場合、「ＢＭＰシグナル伝達の不活性化因子」は、１つ又は複数のＢＭＰタンパク質の、又はその上流若しくは下流のシグナル伝達成分のいずれかの、その可能なシグナル伝達経路のいずれかを介した活性を拮抗する作用剤を参照する。ＢＭＰシグナル伝達を不活性化させるために使用される化合物は、当該技術分野において周知の、又はこれ以降発見される任意の化合物であり得る。ＢＭＰシグナル伝達の不活性化因子の非限定的な例としては、ドミナントネガティブな切断されたＢＭＰ受容体、可溶性ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体−Ｆｃキメラ、ノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ｖｅｎｔｒｏｐｉｎ）、高用量アクチビン、及びアムニオンレス（ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）を含む。
【００７７】
特定の実施形態において、本組成物及び方法は、少なくとも１つのホルモン、サイトカイン、アディポカイン、成長ホルモン又はこれらの変異体若しくは機能断片を含み得る。現在のところ特定の実施形態において、限定培地中に存在する成長ホルモンは、限定培地で培養される分化可能細胞と同一種であろうことが企図される。従って、例えばヒト細胞が培養される場合、成長ホルモンはヒト成長ホルモンである。培養細胞と異なる種由来の成長ホルモンの使用もまた企図される。好ましくはホルモン、サイトカイン、アディポカイン及び／又は成長ホルモンは、約０．００１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．００１ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、又はより好ましくは約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌの初期濃度で存在する。
【００７８】
本発明の組成物及び方法に含まれ得るサイトカイン及びアディポカインの例としては、サイトカインの４つのαヘリックス束ファミリー、サイトカインのインターロイキン１（ＩＬ−１）ファミリー、サイトカインのＩＬ−１７ファミリー及びサイトカインのケモカインファミリーを含むが、これらに限定されない。当然ながら、本発明は、これらのサイトカインファミリーの各々のメンバー及びサブクラス、例えばＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、Ｃケモカイン及びＣＸ３Ｃケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホトキシン、ｃ−キットリガンド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、白血病抑制因子、ビスファチン、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）などを企図するが、これらに限定されない。当然ながら当業者は、本発明が上に列挙した因子の変異体又は機能断片を企図することを理解するであろう。
【００７９】
本発明は分化可能細胞の培養方法に関し、本方法は、分化可能細胞を細胞培養表面にプレーティングする工程、基礎塩栄養液を細胞に与える工程、及び細胞中のＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段を提供する工程を含む。
【００８０】
一実施形態において、分化可能細胞は、本発明の組成物の少なくとも１つと、血清又は血清代替物の不在下、且つ支持細胞層の不在下で、細胞が少なくとも１ヶ月間未分化状態で維持されるように接触させる。多能性は、表面マーカー、転写マーカー、核型、及び３つの胚葉の細胞への分化能に関する細胞の特性決定を通じて決定できる。これらの特性は当業者に周知である。
【００８１】
分化可能細胞は、本発明の限定培地との接触前及び／又は接触後に、酵素的に、非酵素的に、又は手作業で解離する方法を使用して継代できることが企図される。酵素的解離方法の非限定的な例としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）などのプロテアーゼの使用を含む。一実施形態においては、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）を使用して、接触させた細胞が継代される。酵素的継代方法が使用される場合、得られる培養物は、使用される酵素に応じてサイズの変わる、一重、二重、三重、及び塊の細胞の混合物を含み得る。非酵素的解離方法の非限定的な例は、細胞分散緩衝液である。手作業での継代技術は、Ｓｃｈｕｌｚら、２００４年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２２（７）：１２１８−３８頁など、当該技術分野において十分な記載がある。継代方法の選択は細胞外マトリックスの選択に影響を受け、当業者によって容易に決定される。
【００８２】
具体的な一実施形態において、分化可能細胞の培養方法は、解離に先立ち培養チャンバ内に入れられている幹細胞の層に解離溶液を与える工程を含み、ここで解離により細胞の層は単一細胞に分解される。解離後、単一細胞は幹細胞培養液を伴う新しい組織培養チャンバ内に置かれ、ここで幹細胞培養液は基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ３リガンドを含む。単一幹細胞は培養されると、単一細胞の成長及び分裂が可能な条件下に置かれる。
【００８３】
本発明の方法で使用される分離溶液は、細胞に対し広範な毒性を引き起こすことなく細胞を単一細胞に分解又は脱凝集させることが可能な任意の分離溶液であり得る。分離溶液の例としては、トリプシン、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ、又はＶＥＲＳＥＮＥ（商標）（ＥＤＴＡ）及びトリプシンを含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、少なくともいくつかの単一細胞が脱凝集され、且つ再培養可能であるならば、コンフルエント層のあらゆる細胞が単一細胞に脱凝集される結果となる必要はない。
【００８４】
分化可能細胞を利用して、その可塑性又は他の特性に影響を及ぼす分子又は因子をスクリーニングしてもよい。例えば、分化可能細胞を使用して、アポトーシス、分化又は増殖、並びに分化可能細胞から生じた分化系列における類似の作用を誘発する作用因子を同定できるであろう。
【００８５】
本発明の組成物及び方法は単一細胞継代を可能にするため、９６ウェルプレート及び３８４ウェルプレートなどの限定されないハイスループット設定での分化可能細胞の培養が成功している。図１６は、本明細書に記載される方法を使用して、９６ウェル及び３８４ウェルプレートの双方においてＤＣ−ＨＡＩＦで培養されたＢＧ０２細胞の形態及びアルカリホスファターゼ染色を示す。簡潔には、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）を使用して分離されたうえ、９６ウェル及び３８４ウェルプレートにプレーティングされ、そこで培養されたｈＥＳＣ細胞が、他の培養皿を使用して観察されたものと同様のプレーティング効率を示した。加えて、細胞はコロニーを形成し、５日間にわたり同様の環境において増殖に成功した。これらのより小さい培養物は形態的に未分化のままであり、未分化細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼが陽性として一様に染色された。さらには、ｈＥＳＣはまた、ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ａｃｅａｂｉｏ．ｃｏｍ）からのＲＴ−ＣＥＳ（商標）方法を使用して細胞増殖及び生存率を計測するために使用できる、インピーダンスのリアルタイム計測を提供する９６ウェル培養装置（図示せず）で成長させることもできた。かかる手法により、分化可能細胞に対する僅かな、又は即時的な作用の無標識同定及び定量化、並びに増殖、アポトーシス及び形態変化の計測が、リアルタイムで可能となり得る。
【００８６】
本発明の組成物及び方法は実質的に、本組成物及び方法が基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段を含むのであれば、上記の、又は本明細書の他所に記載される要素の任意の組み合わせを含み得る。当業者は認識するであろうとおり、本発明の組成物及び方法の要素はプロトコル設計に応じて変わり得る。従って、本発明の一実施形態は、分化可能細胞の９６ウェルプレート及び／又は３８４ウェルプレート中での培養に関する。実際に、本発明の方法及び組成物を使用すれば、細胞培養チャンバ、すなわち培養皿はもはや特定の寸法に限定されない。従って、本発明の方法は、特定の培養チャンバ寸法に限定されない。
【００８７】
本明細書に記載される組成物及び方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば、本明細書に記載される組成物及び方法は、ヒト発生の初期をモデル化するうえで有用である。さらには、本明細書に記載される組成物及び方法はまた、純粋な組織又は細胞型の作成によるなどして、神経変性障害、糖尿病又は腎不全などの疾患状態への治療的介入にも役立ち得る。
【００８８】
分化可能細胞から分化する細胞型は、創薬、薬剤開発及び試験、毒物学、治療目的での細胞産生、並びに基礎科学研究を含むがこれらに限定されない、様々な分野の研究開発においていくつかの使用法がある。これらの細胞型は、広範な研究分野の関心を引く分子を発現する。これらには、標準的な参考文献に記載されるような様々な細胞型の機能を必要とすることが知られる分子が含まれる。これらの分子としては、サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、細胞外マトリクス、転写因子、分泌ポリペプチド及び他の分子、及び成長因子受容体を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明の分化可能細胞は細胞分化環境との接触を通じて分化し得ることが企図される。本明細書で使用される場合、用語「細胞分化環境」は、分化可能細胞が分化するよう誘発されるか、又は分化細胞に富むヒト細胞培養物となるよう誘発される細胞培養条件を参照する。好ましくは、成長因子により誘発される分化細胞系列は本質的に均一であり得る。用語「均一な」は、所望の細胞系列を約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％より多く含む集団を参照する。
【００９０】
細胞分化培地又は環境を利用して、本発明の分化可能細胞を部分的に、最終的に、又は可逆的に分化させてもよい。本発明に従えば、細胞分化環境の培地は、例えば、ＫＯＤＭＥＭ培地（ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地）、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２倍地、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、ＦＧＦ２（線維芽細胞成長因子２）、ＫＳＲ又はｈＬＩＦ（ヒト白血病抑制因子）を含む、様々な成分を含み得る。細胞分化環境はまた、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２、Ｂ２７及びβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）などの補助剤も含み得る。限定はされないが、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、硫酸ヘパリン、レチノイン酸、表皮成長因子ファミリー（ＥＧＦ）のメンバー、ＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ８を含む線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー、血小板由来成長因子ファミリー（ＰＤＧＦ）のメンバー、限定はされないが、ノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ｖｅｎｔｒｏｐｉｎ）、高用量アクチビン、及びアムニオンレス（ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）などを含む形質転換成長因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／成長及び分化因子（ＧＤＦ）の因子ファミリーアンタゴニスト、又はこれらの変異体若しくは機能断片を含むさらなる要素が細胞分化環境に添加され得ることが企図される。ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦアンタゴニストはまた、ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体−Ｆｃキメラの形態で添加されることもあり得る。添加され得る他の要素としては、限定はされないが、Ｄｅｌｔａ様及びＪａｇｇｅｄファミリーのタンパク質並びにＮｏｔｃｈプロセシング又は切断の阻害因子、又はそれらの変異体若しくは機能断片を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーを通じたシグナル伝達を活性化又は不活性化させ得る分子を含む。他の成長因子としては、インスリン様成長因子ファミリー（ＩＧＦ）のメンバー、インスリン、ウィングレス関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、及びヘッジホッグ因子ファミリー又はそれらの変異体若しくは機能断片を含むことができる。さらなる要素を添加して、中内胚葉幹／前駆体、内胚葉幹／前駆体、中胚葉幹／前駆体、又は最終的な内胚葉幹／前駆体の増殖及び生存並びにこれらの前駆体の誘導体の生存及び分化を促進してもよい。
【００９１】
本明細書に記載される組成物は、試験化合物が、分化可能細胞の多能性、増殖、及び／または分化を調節するかどうかを判定するための試験化合物のスクリーニングに有用である。分化可能細胞の多能性、増殖及び／又は分化は、当業者により容易に確認され得る。非限定的な方法としては、細胞形態の調査、様々なマーカーの発現、奇形腫形成、細胞計数及びインピーダンス計測を含む。
【００９２】
分化細胞の所望の細胞系列への発達、又はその未分化状態での維持は、所望の細胞系列の特徴を示すマーカー遺伝子の発現並びに分化可能細胞型の特徴を示すマーカー遺伝子の発現の不足を定量化することによりモニタできる。かかるマーカー遺伝子の遺伝子発現を定量化する一方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を介したものである。Ｑ−ＰＣＲの実施方法は、当該技術分野において周知である。当該技術分野において周知の他の方法を使用しても、マーカー遺伝子発現を定量化できる。マーカー遺伝子発現は、対象となるマーカー遺伝子に特異的な抗体を使用することにより検出できる。
【００９３】
特定の実施形態において、スクリーニング方法は、分化可能細胞の多能性、増殖及び／又は分化の調節能を有する化合物の同定方法を包含し、（ａ）分化可能細胞を提供する工程、（ｂ）細胞を基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ３リガンドを含む組成物中で培養する工程であって、組成物が本質的に無血清である工程、（ｃ）細胞を試験化合物と接触させるとともに、多能性、増殖及び／又は分化の増加又は減少が、化合物と接触させた細胞に生じているかどうかを判定する工程であって、前記増加が、化合物が多能性、増殖及び／又は分化を調節することの指標となる工程とを含む。特定の実施形態において、ＥｒｂＢ３リガンドはＨＲＧ−βである。他の実施形態において、ＥｒｂＢ３リガンドを試験化合物に置換することで、試験化合物の効果を判定できる。例えば、試験化合物で生じる多能性、増殖及び／又は分化の効果を、ＥｒｂＢ３リガンドで生じる多能性、増殖及び／又は分化の効果と比較して、試験化合物の分化可能細胞に対する効果を判定できる。本明細書に記載される任意の組成物を本発明のスクリーニング方法に使用し得ることが企図される。
【００９４】
さらに別の実施形態において、細胞をＥｒｂＢ３リガンド（ＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性）の不在下で培養することにより、細胞に対するＥｒｂＢ３リガンド（ＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性）の不在の効果を判定できる。
【００９５】
本明細書に記載される方法を使用して、実質的に他の細胞型を含まない所望の細胞系列を含む組成物を生成できる。あるいは、分化可能細胞と所望の細胞系列との混合物を含む組成物もまた生成できる。
【００９６】
本発明のある実施形態において、所望の細胞系列の細胞は、かかる細胞に特異的な親和性タグを使用することにより単離できる。標的細胞に特異的な親和性タグの一例は、標的細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書に記載される方法により生成された細胞培養物中に存在するであろう他の細胞型には実質的に存在しないマーカーポリペプチドに特異的な抗体である。
【００９７】
本発明はまたキットにも関し、ここでキットは、基礎塩栄養液及びＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激する能力を有する少なくとも１つの化合物を含む。一実施形態において、キットは、本明細書に記載されるとおりの、少なくとも１つのＥｒｂＢ３リガンドを含む。別の実施形態において、キットは、２つ以上のＥｒｂＢ３リガンドを含む。別の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるとおりのＴＧＦ−β又はＴＧＦ−βファミリーメンバーの少なくとも１つ又はそれらの変異体若しくは機能断片を含む。さらに別の実施形態において、キットは、ＴＧＦ−β又はＴＧＦ−βファミリーメンバーの２つ以上又はそれらの変異体若しくは機能断片を含む。なお別の実施形態において、キットは、少なくとも１つの線維芽細胞成長因子又はその変異体若しくは機能断片を含む。別の実施形態において、キットは、２つ以上の線維芽細胞成長因子又はその変異体若しくは機能断片を含む。特定の実施形態において、キットは、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２又はそれらの変異体若しくは機能断片のうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態において、キットは、血清アルブミンを含む。なお別の実施形態において、キットは、血清及び／又は本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つの不溶性基質及び／又は少なくとも１つの分離溶液を含む。
【００９８】
本発明のキットは実質的に、上記の、又は本明細書の他所に記載される成分の任意の組み合わせを含み得る。当業者は認識するであろうとおり、本発明のキットで供給される成分は、キットの使用目的に応じて変わり得る。従って、キットは本出願に記載される様々な機能を果たすよう設計されてもよく、それに応じてかかるキットの成分は変わり得る。
【００９９】
本出願の全体を通じて様々な刊行物が参照される。これらの刊行物及びそれらの刊行物のなかで全体として引用される参考文献の全ての開示は、本明細書によって全体として参照により本出願に援用され、それにより本発明の関わる技術分野の水準がより十全に説明される。
【実施例】
【０１００】
ヒト胚性幹細胞系ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）が、本明細書に記載される実験のいくつかで使用された。ＢＧ０１ｖ  ｈＥＳＣ系は核型上、変異細胞系であり、特有のトリソミーを含む安定な核型（核型：４９、ＸＸＹ、＋１２、＋１７）を呈する。親培養物が前述のとおり維持された（Ｓｃｈｕｌｚら、２００３年、ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、４：２７頁；Ｓｃｈｕｌｚら、２００４年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２２（７）：１２１８−３８頁；Ｒｏｓｌｅｒら、２００４年、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ、２２９：２５９−２７４頁；Ｂｒｉｍｂｌｅら、２００４年  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．、１３：５８５−５９６頁）。簡潔には、細胞は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はフィブロネクチンでコーティングした皿において、２０％ＫＳＲ、８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×非必須アミノ酸、０．５Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．５Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２を含むマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）からの馴化培地（ＭＥＦ−ＣＭ）内で成長させて、コラゲナーゼを用いて継代した。
【０１０１】
本明細書で試験される限定培養（ＤＣ）培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１×非必須アミノ酸、０．５Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．５Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、米国より）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、０．２％の無脂肪酸Ｃｏｈｎ画分Ｖ  ＢＳＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１×微量元素混合物Ａ、Ｂ及びＣ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）及び５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。ＦＧＦ２（Ｓｉｇｍａ）、ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘレグリンβＥＧＦドメイン（ＨＲＧβ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ノーダル（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＩＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＧＦα（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨＲＧα（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む、様々なレベルの組換え成長因子が使用された。ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１はＩＧＦ１の修飾されたバージョンであって、ｈＥＳＣで発現するものもあるＩＧＦ１結合タンパク質に対する親和性が低減している。ＤＣ−ＨＡＩＦは上記の限定培養培地であり、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、２００ｎｇ／ｍｌのＬＲ−ＩＧＦ１及び８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む。ＤＣ−ＨＡＩは上記の限定培養培地であり、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、及び２００ｎｇ／ｍｌのＬＲ−ＩＧＦ１を含有する。ＤＣ−ＨＡＩＦ及びＤＣ−ＨＡＩの双方において、当然ながらＬＲ−ＩＧＦ１成分はＩＦＧ１に換えてもよい。
【０１０２】
成長因子低減ＢＤ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）マトリクス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州、米国）を約１：３０〜約１：１０００の最終濃度範囲まで冷温のＤＭＥＭ／Ｆ−１２中に希釈することにより、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティング皿が調製された。一実施形態において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）の濃度は約１：２００である。１ｍｌ／３５ｍｍ皿を用いて、１〜２時間室温で、又は少なくとも一晩４℃で皿がコーティングされた。プレートは最長１週間まで４℃で保存された。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液は使用直前に除去された。
【０１０３】
試験条件について、複数の条件を比較するため親培養物が６ウェル皿にプレーティングされた。培養物は一般的には、試験条件に直接プレーティングされた。培養物は毎日評価され、プレーティング後４〜５日で形態学的基準に基づき段階評価された。１〜５の評価尺度には、培養物全体の調査、及び未分化コロニーの全体的な割合、それらの相対的サイズ、及び明らかな分化を呈するコロニー又はコロニーの一部の割合の評価が関わる。評価５は「理想的な」培養物を示し、大部分の未分化コロニー及び無視できる程度の分化を伴う。評価４は非常に良好な培養物を示すが、一部に明らかな分化を伴う。評価３は許容範囲の培養物を示すが、およそ半分のコロニーが明らかな分化を呈する。評価２の培養物は主として分化しており、時折、未分化らしき細胞を伴う。評価１の培養物は分化コロニーを含むか、又は培養物が接着しなかったか、若しくは生存できなかった。未分化細胞の良好な増殖を呈した培養物が継代され、これらの条件下での長期培養が評価された。
【０１０４】
実施例１−ＢＧ０１ｖ細胞におけるＥｒｂＢ１〜３、Ｎｒｇ１及びＡＤＡＭ１９の発現
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＢＧ０１ｖ細胞におけるＥｒｂＢ１〜３、ニューレグリン及びＡＤＡＭ−１９の発現を実証した（図１）。１００ｎｇ／ｍｌのＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１（ＬＲ−ＩＧＦ１）、８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有する上記のとおりのＤＣ培地で培養されたＢＧ０１ｖ細胞が回収され、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造者の指示に従いＲＮＡが調製された。ｉＳｃｒｉｐｔキット（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡが調製され、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｐｔｉｃｏｎサーマルサイクラーを使用してリアルタイムＰＣＲが実行された。
【０１０５】
ＡＤＡＭ１９（Ｈｓ００２２４９６０＿ｍ１）、ＥＧＦＲ（Ｈｓ００１９３３０６＿ｍ１）、ＥｒｂＢ２（Ｈｓ００１７０４３３＿ｍ１）、ＥｒｂＢ３（Ｈｓ００１７６５３８＿ｍ１）、ＮＲＧ１（Ｈｓ００２４７６２０＿ｍ１）、ＯＣＴ４（Ｈｓ００７４２８９６＿ｓ１）及び対照ＧＡＰＤＨについてのＴａｑＭａｎアッセイ・オンデマンド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用された。リアルタイム増幅プロットが図１に示され、未分化ＢＧ０１ｖ細胞におけるこれらの転写産物の発現が示されている。
【０１０６】
実施例２−ＥｒｂＢ２の阻害がＢＧ０１ｖ細胞の増殖を遅延させる
リガンドのＥＧＦドメインファミリーは、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーと結合する。ｈＥＳＣにおけるＥｒｂＢチロシンキナーゼの既知の阻害剤の効果を調査するため、ＢＧ０１ｖ細胞が、６ウェルトレイのなか１：１０００で希釈されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上、１００ｎｇ／ｍｌのＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１、８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有する限定培養培地（ＤＣ）にプレーティングされた。翌日、ＤＭＳＯ（担体対照）、５０ｎＭ〜２０μＭのＡＧ１４７８（ＥｒｂＢ１阻害剤）、又は１００ｎＭ〜２０μＭのＡＧ８７９（ＥｒｂＢ２阻害剤）が新鮮培地と共に添加された。細胞はさらに５日間培養され、培地は毎日交換された。次に培養物は固定され、アルカリホスファターゼ活性について染色された。
【０１０７】
対照及びＡＧ１４７８培養細胞においてＡＰ＋ＢＧ０１ｖ細胞のサブコンフルエントなコロニーが観察された（図２Ａ、及びＢ）が、これはＤＭＳＯ及びＡＧ１４７８（５０ｎＭ〜２０μＭ）のいずれも細胞増殖に対し明らかな影響を及ぼさなかったことを示している。しかしながら、ＡＧ８７９は５μＭ（図２Ｃ）で細胞成長を実質的に阻害し、２０μＭ（図示せず）で細胞死を引き起こした。ＡＧ８７９で成長させた培養物は分化しなかったようであり、且つ多能性形態及びアルカリホスファターゼ活性は維持したようだが、これはＡＧ８７９が分化を誘発することなく増殖を阻害した可能性が高いことを示しており、ＢＧ０１ｖ細胞が細胞生存上、ＥｒｂＢ２シグナル伝達に依存することが示唆される。逆に、上記と同様の条件下で成長させたＢＧ０１ｖ細胞は、増殖に関してＥｒｂＢ１シグナルに依存しないものと思われる。
【０１０８】
実施例３−ＢＧ０１ｖ細胞は、ヘレグリン含有限定培地で維持される
ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３の発現及びＡＧ８７９による増殖の阻害から、ＢＧ０１ｖ細胞が活性な内因性ＥｒｂＢシグナル伝達を有するとともに、外因性ＨＲＧ−βにもまた応答し得ることが示唆された。ＢＧ０１ｖ細胞を、１：１０００に希釈されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β、２００ｎｇ／ｍｌのＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１、８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含むＤＣ培地で成長させた（図３Ａ及びＢ）。４代にわたり、すなわち２０日超の間成長させたこれらの細胞は、未分化形態を呈し、自発的な分化の上昇は示さなかった。
【０１０９】
さらにＢＧ０１ｖ細胞はまた、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧβ、２００ｎｇ／ｍｌのＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１、及び１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含むＤＣ培地でも、２代または１３日超の間、維持された。これらの培養物は正常に増殖し、自発的な分化を呈することは極めて少なかったが、これによりＢＧ０１ｖ細胞がＦＧＦ２の不在下でもＨＲＧβにより限定条件下で維持できることが実証された。
【０１１０】
実施例４−ＥＳ細胞におけるＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼの役割
ＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＥＳＣが、ＡＤＡＭ１９、ニューレグリン１（Ｎｒｇ１）、及びＥｒｂＢ１〜４を発現することが実証された（図４Ａ）。ｍＥＳＣにおいて、ＥｒｂＢ２及び３はＥｒｂＢ１より高いレベルで発現したように見え、ＥｒｂＢ４の検出は低いレベルであった。これらのデータから、内因性ＨＲＧ−βがｍＥＳＣ自己複製の促進に関与している可能性が示唆される。
【０１１１】
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＥｒｂＢ受容体転写産物の発現もまた調査された（図４Ｂ）。ＭＥＦは、歴史的にマウス及びヒトＥＣ細胞及びＥＳ細胞の維持に使用されてきたＥ１２．５〜１３．５内臓由来の異種細胞集団である。この集団内でのＮｒｇ１及びＡｄａｍｌ９の発現から、ＨＲＧ−βエクトドメインがＭＥＦ馴化培地中にも存在し、多能性に対して大きな効果を及ぼし得ることが示唆される。
【０１１２】
ＡＧ１４７８及びＡＧ８７９を使用してマウスＥＳ細胞におけるＨＲＧ／ＥｒｂＢシグナル伝達の役割が調査された。Ｒ１マウスＥＳ細胞が、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１０％ＫＳＲ、０．５Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．５Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ）、０．１ｍＭのβ−ＭＥの標準条件下で維持され、０．５％のトリプシン／ＥＤＴＡにより継代された。２×１０５細胞／ウェルが、６ウェルトレイの１：１０００で希釈されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上にプレーティングされた。プレーティングの翌日、ＤＭＳＯ（担体対照）、１〜５０μＭのＡＧ１４７８、又は１〜５０μＭのＡＧ８７９が新鮮培地と共に添加された。細胞はさらに８日間培養され、培地は毎日交換された。次に培養物は固定され、アルカリホスファターゼ活性について染色された。
【０１１３】
ＤＭＳＯ及び１〜５０μＭのＡＧ１４７８は細胞増殖に対し明らかな影響を一切及ぼさず、アルカリホスファターゼ陽性のｍＥＳＣのサブコンフルエントなコロニーが観察された（図５Ａ〜Ｃ）。しかしながら、ＡＧ８７９は５０μＭ（図５Ｄ及び５Ｆを比較）で細胞成長を実質的に阻害したうえ、２０μＭ（図５Ｅ）で増殖を遅延させた可能性もある。ＡＧ８７９で成長させたｍＥＳＣは、分化しなかったようであり、且つ多能性形態、及びアルカリホスファターゼ活性を維持した。
【０１１４】
この結果は、ＡＧ８７９がｍＥＳＣの分化を誘発することなくｍＥＳＣの増殖を阻害した可能性が高いことを示しており、ｍＥＳＣが増殖にＥｒｂＢ２シグナル伝達を必要とすることが示唆される。逆に、ｍＥＳＣは増殖においてＥｒｂＢ１シグナルには依存しないように思われる。増殖を阻害するために必要なＡＧ８７９の濃度は、限定条件で成長させたＢＧ０１ｖ細胞に必要な濃度よりｍＥＳＣについて約１０倍高かったが、これはｍＥＳＣ条件において使用された血清が薬物の活性を妨げた可能性があること、ＡＧ８７９の親和性がヒトＥｒｂＢ２チロシンキナーゼよりマウスＥｒｂＢ２チロシンキナーゼに対するほうが低いこと、又はＥｒｂＢ２が異なる種のＥＳ細胞では若干異なる役割を果たし得ることのいずれかを示している。
【０１１５】
別の高度に選択的なＥｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤であるチロホスチンＡＧ８２５（Ｍｕｒｉｌｌｏら、２００１年  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１、７４０８−７４１２頁）を使用して、ヒトＥＳＣにおけるＥｒｂＢ２の役割を調べた。ＡＧ８２５は馴化培地（ＣＭ）で成長するｈＥＳＣの増殖を著しく阻害した（図６Ａ）。ＡＧ８２５は細胞死を広範囲に及ぼすことなく増殖を阻害し、生存ｈＥＳＣは５日超の間維持可能であった（図示せず）。ウエスタンブロッティングは、ＡＧ８２５がＤＣ−ＨＡＩＦで成長する欠乏／ヘレグリン（ＨＲＧ）パルス印加ｈＥＳＣにおいてチロシン−１２４８でＥｒｂＢ２の自己リン酸化を阻害したことを示した（図６Ｂ）。このように、ＥｒｂＢ２シグナル伝達の途絶がｈＥＳＣ増殖を大幅に阻害した。限定成長条件下でｈＥＳＣを樹立するうえで、培養物はＣＭ条件からＤＣ−ＨＡＩＦへと直接継代が可能であって、およびそれが呈した自発的な分化は最小限であった（図６Ｃ）。コロニー及び細胞計数アッセイから、ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１及びＨＲＧが、本発明の実施形態の１つに関連して自己複製及び増殖において主要な役割を果たしたことが確認された（図６Ｄ、６Ｅ）。定常状態ＤＣ−ＨＡＩＦ培養物、及びＤＣ−ＨＡＩＦを伴いパルス印加された欠乏培養物の双方において、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＲ、ＦＧＦ２α、ＥｒｂＢ２、及びＥｒｂＢ３のリン酸化もまた観察された（図６Ｆ）。
【０１１６】
実施例５−限定条件下でのマウスＥＳ細胞の培養
マウスＥＳ細胞におけるＨＲＧ／ＥｒｂＢ２シグナル伝達の役割をさらに調査するため、ＤＣ培地中でのＲ１  ＥＳ細胞の増殖が、成長因子の組み合わせを使用して調査された。１×１０５細胞／ウェルが、０．２％ゼラチンでコーティングされた６ウェルトレイのなか、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β、１００ｎｇ／ｍｌのＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１、１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、１０００Ｕ／ｍｌのマウスＬＩＦ又は１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（下表１）の組み合わせを含むＤＣにプレーティングされた。８日間にわたり増殖が観察された。
【０１１７】
生存コロニーは、少なくともＬＩＦ／ＨＲＧ−β又はＬＩＦ／ＢＭＰ４を含有する条件のみで成長した（表１）。これらの組み合わせにＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１又はアクチビンが添加されても、その他の明らかな有益性は観察されなかった。対照の親培養物では正常な増殖が観察されたが、成長因子を一切含まない限定培地では生存コロニーは観察されなかった。
【０１１８】
【表１】
2014097063.tif 000002
【０１１９】
１０又は５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ又は１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４からの選択された組み合わせで、６−ウェルトレイのなかの１：１０００のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上に２×１０５細胞／ウェルをプレーティングすることにより定量的アッセイが行われた。培養物を８日間成長させ、固定し、アルカリホスファターゼコロニーの数が計数された（図７Ａ）。成長因子のない限定条件にコロニーは観察されず、ＨＲＧ−β、ＨＲＧ−β／ＥＧＦ及びＨＲＧ−β／ＢＭＰの組み合わせでは４５個未満のコロニーが観察された。ＬＩＦ単独では１３５８個のコロニーが観察された一方、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β／ＬＩＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β／ＬＩＦの組み合わせでは、それぞれ４１１４個及び３７３４個のコロニーが観察された。ここから、限定条件においては、ＬＩＦが単独で実質的な多能性シグナルを提供したうえ、ＨＲＧ−βがＬＩＦと共に多大な相乗効果を呈して、このアッセイのｍＥＳＣコロニーにおける増殖数を２倍超としたことが示された。このアッセイの低倍率拡大画像もまた、この増殖相乗効果を示す（図７Ｂ〜Ｇ）。
【０１２０】
実施例６−ＤＣ−ＨＡＩＦで維持されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の多能性の特性決定
複数の手法を使用して、ＤＣ−ＨＡＩＦでのｈＥＳＣの可塑性の維持を確認した。ＤＣ−ＨＡＩＦで６ヶ月間（２５代）培養されたＢＧ０２細胞は、複合奇形腫（図８Ａ）及び３つの典型的な胚葉をインビトロで（図８Ｂ）形成する可能性を維持した。転写解析を使用して、ＣＭ及びＤＣ−ＨＡＩＦで維持されたｈＥＳＣ細胞における全体的な発現を比較した（Ｌｉｕら、２００６年、ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６、２０頁）。ＤＣ−ＨＡＩＦで１０代及び３２代にわたり成長させたＢＧ０２細胞、及びＣＭで６４代にわたり成長させたＢＧ０２細胞においては１１，６００個より多い転写産物が検出された。全ての集団に共通の転写産物が約１０３６４個あり（図８Ｃ）、これにはＣＤ９、ＤＮＭＴ３、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＴＥＲＴ及びＵＴＦ１などの既知のｈＥＳＣマーカーが含まれていた（図示せず）。ＣＭ培養物とＤＣ−ＨＡＩＦ培養物との比較（Ｒ２選択＝０．９２８）、並びに継代細胞の初期と後期との比較（Ｒ２選択＝０．９５９）では、高い相関係数が観測された（図８Ｄ）。階層クラスタ分析から、ＤＣ−ＨＡＩＦで維持されたＢＧ０２細胞が高度に群化され、ＣＭで維持されたＢＧ０２細胞及びＢＧ０３細胞との高い類似性を保持したことが明らかとなった（図８Ｅ）。これらのデータは、未分化ｈＥＳＣが胚様体又は線維芽細胞と比較して高度にクラスタ化されたことを示した先行分析（Ｌｉｕら、２００６年、ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６、２０頁）と一致する。このように、本発明の組成物で維持された細胞は、多能性（ｐｌｕｉｒｐｏｔｅｎｃｙ）の主要なマーカーを維持することが可能である。従って、本発明の組成物は、分化可能細胞の自己複製を支持するための単純培地として使用できる。
【０１２１】
実施例７−ＤＣ−ＨＡＩＦにおけるヒト化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）上でのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の維持
ＥｒｂＢ２シグナル伝達の役割を調べてｈＥＳＣ用の限定培地を開発するため、最初に、成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）１：３０でコーティングした培養皿上でＤＣ−ＨＡＩＦ培養物を増殖させたが、１：２００（図９Ａ）、又は１：１０００で希釈したこの基質上での長期間の維持にも成功することができた。ＢＧ０２及びＣｙＴ４９  ｈＥＳＣはまた、ヒト血清（図９Ｂ）、ヒトフィブロネクチン（図９Ｃ）、又は専売のヒト化ＥＣＭであるＶＩＴＲＯＧＲＯ（商標）（図９Ｄ）でコーティングされた組織培養皿上でも５代より長く維持できた。
【０１２２】
実施例８−ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の単一細胞継代
複数の研究グループが、特定の三倍性（ｔｒｉｐｌｏｄｉｅｓ）、特にｈＣｈｒ１２及び１７の三倍性が、特定の準最適培養条件下でｈＥＳＣに蓄積されることを実証している（Ｂａｋｅｒら、２００７年  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２）：２０７−２１５頁）。三倍性の出現は、継代において培養物が単一細胞に分割されるときの細胞生存率の低さと最も直接的に関係しているものと思われ、これらの異数性を内包する細胞に強い選択的成長の優位性をもたらすことが推定される。逆に、本発明の一実施形態、ＤＣ−ＨＡＩＦで成長するｈＥＳＣは、単一細胞に分割された後のプレーティングにおいて高い生存率を維持した（図１０Ａ〜Ｄ）。ＢＧ０１及びＢＧ０２細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）によりそれぞれ１８代及び１９代より長く継代された後も正常核型を維持した（図１０Ｅ）。細胞における正常核型の維持から、ｈＥＳＣ培養物の単一細胞への脱凝集は、ＤＣ−ＨＡＩＦで維持されたｈＥＳＣにおいては本質的にこうしたトリソミーの蓄積につながらないことが実証された。ＢＧ０１及びＢＧ０２培養物はまた、複数の継代作用剤で単一細胞に脱凝集することによっても継代された（図１１）。培養物は５代にわたりＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ、又はＶＥＲＳＥＮＥ（商標）（ＥＤＴＡ）により分割され、核型決定された。データから、本発明の組成物でのｈＥＳＣの培養及び継代により、様々な細胞解離試薬を使用して、少なくとも２つのヒト胚細胞系において正常核型が維持されたことが実証された。
【０１２３】
本発明の組成物を使用して、未分化ｈＥＳＣの大規模増殖もまた可能である。６０ｍｍプレート内のＢＧ０２細胞のコンフルエントな出発培養物をＤＣ−ＨＡＩＦで４代にわたり増殖させて、単一の実験において２０日間で１．１２×１０１０個超の細胞を得た。フローサイトメトリーにより調査した場合、ＯＣＴ４、ＣＤ９、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１〜８１などの多能性（ｐｌｕｉｒｐｏｔｅｎｃｙ）マーカーの発現を維持するバッチにおいて８５％超の細胞により実証されたとおり、培養物は未分化のままであった（図１２Ａ）。他の多能性マーカーの発現もまたＲＴ−ＰＣＲ分析により観察されたが、分化系列α−フェトプロテイン、ＭＳＸ１及びＨＡＮＤ１のマーカーは検出されなかった（図１２Ｂ）。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析から、ＤＣ−ＨＡＩＦで培養及び継代された細胞は、ｈＣｈｒ１２（９８％２コピー）、ｈＣｈｒ１７（９８％２コピー）、ｈＣｈｒＸ（９５％１コピー）及びｈＣｈｒＹ（９８％１コピー）について、予想されたコピー数を維持したことが実証された（図１２Ｃ）。核型決定分析からはまた、正常な正倍数染色体含量及び結合プロファイルがこれらの細胞において維持されたことも実証された。
【０１２４】
実施例９−インスリン及びＩＧＦ１は生理学的濃度で適用された場合にｈＥＳＣに対し異なる効果を及ぼす
本質的に、ｈＥＳＣについてこれまで報告されている培養条件の全ては超生理学的なレベルのインスリンを含み、それによりＩＲ及びＩＧＦ１Ｒの双方を刺激できる。ＩＧＦ１と比較して、インスリン及びインスリン代用物の及ぼす活性を識別するため、ｈＥＳＣが生理学的レベルのこれらの成長因子における限定培地条件下で培養される。インスリン及びＩＧＦ１の濃度が約０．２〜約２００ｎｇ／ｍｌで滴定され、細胞を５日後に計数することにより細胞増殖がモニタされる。増殖に成功した培養物は連続的に５回継代される。生理学的レベルのＩＧＦ１がｈＥＳＣ培養物の増殖を支持する一方、生理学的レベルのインスリンは支持せず、これはインスリン又はインスリン代用物の活性がＩＧＦ１の代わりにはならないこと、及びＩＧＦ１及びインスリン（又はインスリン代用物）がｈＥＳＣに対する作用に関して別個のクラスの生物活性に相当することを示す。
【０１２５】
実施例１０−補助剤の効果のスクリーニング方法
最初に、中程度の密度で成長するｈＥＳＣの成長又は分化に対するビタミンＢ１２及びビタミンＢ６の効果を調査するため、ＢＧ０２細胞がＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）を使用して分割され、１×１０５細胞／ウェルが６ウェルトレイの限定培養（ＤＣ）培地にプレーティングされる。ＤＣ培地は、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β、２００ｎｇ／ｍｌのＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１、及び１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０を含む。ビタミンＢ６（０．５μＭ）及び／又はビタミンＢ１２（０．５μＭ）が実験用ウェルに添加される。各条件の細胞数が７日後に計数される。実験用ウェル及び対照ウェルの双方の細胞計数及びコロニー計数から、ビタミンＢ６及びビタミンＢ１２の細胞成長に対する効果に関する洞察が提供されることとなる。
【０１２６】
加えて、ＯＣＴ４などの分化マーカーを実験用ウェルでアッセイすることにより、分化可能細胞の分化状態に対する添加剤及び補助剤の効果を判定できる。
【０１２７】
実施例１１−ＦＧＦ２の不在下におけるｈＥＳＣの培養
ＢＧ０２細胞が２０代にわたりＤＣ−ＨＡＩで長期間維持され（図１３Ａ）、ＢＧ０１細胞もまたＤＣ−ＨＡＩで連続継代され、双方ともＦＧＦ２の不在下であった。培養物は劣化したり、又は明白な分化を呈したりはせず、培養期間全体を通じて未分化コロニーの正常な増殖を呈した。ＢＧ０２培養物における正常な男性核型の維持が、６代後もＤＣ−ＨＡＩにおいて実証された（図１３Ｂ、２０／２０正常中期伸展）。
【０１２８】
転写解析を使用して、ＤＣ−ＨＡＩＦ及びＤＣ−ＨＡＩで維持されたｈＥＳＣ細胞における全般的な発現が比較された。全細胞ＲＮＡがｈＥＳＣからＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離され、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により製造者の推奨するプロトコルに従い処理された。試料増幅がＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ増幅キットを使用して１００ｎｇの全ＲＮＡで行われ、非標識ＵＴＰとの１：１の比でのビオチン−１６−ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の取り込みにより標識が実現された。標識され、増幅された材料（１アレイ当たり７００ｎｇ）が、４７，２９６個の転写プローブを含有するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｎｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ−６  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｅａｄｃｈｉｐと、製造者の指示に従い（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）ハイブリダイズされた。アレイがＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｒｅａｄｅｒ共焦点スキャナにより走査されたうえ、一次データが処理され、バックグラウンド減算、及びデータ解析が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して製造者の指示に従い行われた。０．９９の最小検出信頼スコア（標的配列シグナルを示す計算されたカットオフは陰性対照と区別できた）を使用して転写産物発現の存在又は不在が判別された。他のｈＥＳＣ試料向けに記載される並列手法を使用して（Ｌｉｕら、２００６年、ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６：２０頁）データ解析が行われた。階層クラスタ分析が先行文献に記載されるとおり（Ｌｉｕら、２００５年、ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６：２０頁）に行われ、これは類似性尺度としては、ＡＮＯＶＡにより同定された（ｐ＜０．０５）特異的発現遺伝子を使用した平均連鎖法及びユークリッド距離に基づいた。アレイ製造に使用される感受性及び品質対照試験及びＢｅａｄ  ｓｔｕｄｉｏソフトウェアにおいて使用されるアルゴリズムの詳細な説明は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手できる。検出された転写産物の大部分は、ＣＤ９、ＤＮＭＴ３、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＴＥＲＴ及びＵＴＦ１などの既知のｈＥＳＣマーカーを含め（図示せず）、ＤＣ−ＨＡＩＦ及びＤＣ−ＨＡＩの双方のＢＧ０２培養物で発現した。ＤＣ−ＨＡＩＦとＤＣ−ＨＡＩとの培養物比較においては高い相関係数が観測された（Ｒ２選択＝０．９６１）（図１４）。階層クラスタ分析から、ＤＣ−ＨＡＩで維持されたＢＧ０２細胞が高度に群化され、ＤＣ−ＨＡＩＦで維持された細胞、並びに複数の培養フォーマットにおけるＢＧ０２及び他のｈＥＳＣ系と高い類似性を保持したことが実証された（図１５）。これらのデータは、未分化ｈＥＳＣが胚様体又は線維芽細胞と比較して高度にクラスタ化されたことを示す先行分析と一致する（Ｌｉｕら、２００６年、ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６：２０頁）。
【０１２９】
さらに、ＤＣ−ＨＡＩで維持されたＢＧ０２細胞は、ＳＣＩＤベージュマウス（図示せず）で形成された複合奇形腫において典型的な中胚葉、内胚葉及び外胚葉に分化し、形式上、外因性ＦＧＦ２の不在下で成長させた培養物における多能性の維持を実証している。
【０１３０】
単一細胞継代に関連して外因性ＦＧＦ２が必要とされたかどうかを調査するため、ＢＧ０１細胞をＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）で継代し、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ−β及び２００ｎｇ／ｍｌのＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ１のみを含む限定条件（ＤＣ−ＨＩ）下で成長させた。これらのＤＣ−ＨＩ培養物は１０代の間維持されたが、明白な分化又は増殖の遅延は呈示しなかった。
【０１３１】
これらの研究から、ｈＥＳＣが最小限ヘレグリン及びＩＧＦ１を含有する限定培地中に維持される場合には、外因性ＦＧＦ２の供給は必要ないことが明らかに実証された。さらに、ＦＧＦ２のない培養物は、転写プロファイル及びインビボでの中胚葉、内胚葉及び外胚葉への分化を含む、多能性の鍵となる特性を保持した。
【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月23日(2014.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞と、基礎塩栄養液と、ＥｒｂＢ３リガンドとを含む組成物であって、実質的に無血清であり、
前記多能性幹細胞は３つの胚葉のすべてを生じ得るものであり、
前記ＥｒｂＢ３リガンドはＥｒｂＢ３受容体に結合し、これがＥｒｂＢ２受容体と共に二量体化してＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体を形成し得るものであり、これにより、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体においてＥｒｂＢ２受容体のチロシンキナーゼ活性が活性化される、組成物。
【請求項２】
外因性インスリン及びインスリン代用物を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
インスリン様成長因子又はその機能断片をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＥｒｂＢ３リガンドが、ニューレグリン１、ヘレグリンβ（ＨＲＧ−β）、ヘレグリンα（ＨＲＧ−α）、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）、グリア成長因子２（ＧＧＦ２）、運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）、ニューレグリン２、ニューレグリン２β（ＮＲＧ２−β）、エピレギュリン、ビレギュリン及びこれらの機能断片からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＥｒｂＢ３リガンドがＨＲＧ−β又はその機能断片である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−βファミリーメンバー又はこれらの機能断片をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＴＧＦ−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、及びこれらの機能断片からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＴＧＦ−βファミリーメンバーがアクチビンＡである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
インスリン様成長因子又はその機能断片をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
外因性線維芽細胞成長因子を含まない、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２及びこれらの機能断片からなる群より選択される少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＦＧＦが、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−２２である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
血清アルブミン（ＳＡ）をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＳＡがウシＳＡ（ＢＳＡ）又はヒトＳＡ（ＨＳＡ）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＳＡの濃度が０．２ｖ／ｖ％より高い、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＳＡの濃度が５ｖ／ｖ％未満である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
多能性幹細胞と、基礎塩栄養液と、前記多能性幹細胞におけるＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段とを含む組成物。
【請求項１８】
前記ＥｒｂＢ２特異的チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段が、前記多能性幹細胞中のＥｒｂＢ３を特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記多能性幹細胞が霊長類胚性幹細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞、ＩＣＭ／胚盤葉上層細胞、ＥＧ細胞、および脱分化または核移植により得られる多能性細胞からなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
多能性幹細胞の培養方法であって、
ａ）前記多能性幹細胞を細胞培養培地において接着培養で固体表面において培養する工程であって、前記細胞培養培地が基礎塩栄養液とＥｒｂＢ３リガンドとを含み、前記細胞培養培地が実質的に無血清であり、
前記多能性幹細胞は３つの胚葉のすべてを生じ得るものであり、
前記ＥｒｂＢ３リガンドはＥｒｂＢ３受容体に結合し、これがＥｒｂＢ２受容体と共に二量体化してＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体を形成し得るものであり、これにより、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体においてＥｒｂＢ２受容体のチロシンキナーゼ活性が活性化される、工程と、
ｂ）前記細胞培養培地において適切な培養条件下、接着培養で前記多能性幹細胞を維持する工程であって、前記細胞培養培地が定期的に交換され、前記多能性幹細胞は増殖するが分化しない、工程
とを含む、方法。
【請求項２２】
多能性幹細胞の培養方法であって、
ａ）前記多能性幹細胞を細胞培養培地において懸濁物中で培養する工程であって、前記細胞培養培地が基礎塩栄養液とＥｒｂＢ３リガンドとを含み、前記細胞培養培地が実質的に無血清であり、
前記多能性幹細胞は３つの胚葉のすべてを生じ得るものであり、
前記ＥｒｂＢ３リガンドはＥｒｂＢ３受容体に結合し、これがＥｒｂＢ２受容体と共に二量体化してＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体を形成し得るものであり、これにより、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体においてＥｒｂＢ２受容体のチロシンキナーゼ活性が活性化される、工程と、
ｂ）前記細胞培養培地において、懸濁物中で前記多能性幹細胞を維持する工程であって、前記細胞培養培地が定期的に交換され、前記多能性幹細胞は増殖するが分化しない、工程
とを含む、方法。
【請求項２３】
多能性幹細胞の増殖および／または分化を調節する化合物を同定する方法であって、
ａ）基礎塩栄養液とＥｒｂＢ３リガンドと候補化合物とを含む細胞培養培地で前記多能性幹細胞を培養する工程であって、前記細胞培養培地が実質的に無血清であり、
前記多能性幹細胞は３つの胚葉のすべてを生じ得るものであり、
前記ＥｒｂＢ３リガンドはＥｒｂＢ３受容体に結合し、これがＥｒｂＢ２受容体と共に二量体化してＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体を形成し得るものであり、これにより、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体においてＥｒｂＢ２受容体のチロシンキナーゼ活性が活性化される、工程と、
ｂ）対照と比較して、前記化合物と共に培養された前記多能性幹細胞において増殖および／または分化の増加または減少が生じるかどうかを判定する工程であって、前記増加または減少は、前記化合物が前記多能性幹細胞の増殖および／または分化を調節することを示すものである、工程
とを含む、方法。
【請求項２４】
前記培養する工程が、接着培養で固体表面において前記多能性幹細胞を培養する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養する工程が、懸濁培養培地において前記多能性幹細胞を培養する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞培養培地が外因性インスリン及びインスリン代用物を含まない、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞培養培地がインスリン様成長因子又はその機能断片をさらに含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＥｒｂＢ３リガンドが、ニューレグリン１、ヘレグリンβ（ＨＲＧ−β）、ヘレグリンα（ＨＲＧ−α）、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）、グリア成長因子２（ＧＧＦ２）、運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）、ニューレグリン２、ニューレグリン２β（ＮＲＧ２−β）、エピレギュリン、ビレギュリン及びこれらの機能断片からなる群より選択される、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＥｒｂＢ３リガンドがＨＲＧ−β又はその機能断片である、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞培養培地が形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−βファミリーメンバー又はこれらの機能断片をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＧＦ−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、及びこれらの機能断片からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＧＦ−βファミリーメンバーがアクチビンＡである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞培養培地がインスリン様成長因子又はその機能断片をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞培養培地が外因性線維芽細胞成長因子を含まない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞培養培地が、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２及びこれらの変異体及び機能断片からなる群より選択される少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのＦＧＦが、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−２２である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞培養培地が血清アルブミン（ＳＡ）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＳＡがウシＳＡ（ＢＳＡ）又はヒトＳＡ（ＨＳＡ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＳＡの濃度が０．２ｖ／ｖ％より高い、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＳＡの濃度が５ｖ／ｖ％未満である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項２１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞、ＩＣＭ／胚盤葉上層細胞、ＥＧ細胞、および脱分化または核移植により得られる多能性細胞からなる群より選択される、請求項２１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【外国語明細書】
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