(57)【要約】      （修正有）【課題】新たな特発性肺線維症モデル細胞を構築し、特発性肺線維症発症の発症およびアポトーシス抵抗性のメカニズムを解明、アポトーシス調節剤（特に特発性肺線維症の治療薬）のスクリーニングに役立てる。【解決手段】ＨＦＬ１細胞にアンチセンス核酸分子の導入によりｍｉＲ−２９を阻害することにより細胞外マトリックスを過剰生産し、かつアポトーシスに抵抗性を示す細胞を得られることを見出した。本発明はＨＦＬ１細胞のｍｉＲ−２９を阻害することを特徴とする特発性肺線維症モデル細胞の提供に関する。【選択図】図１
2014223047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＦＬ１細胞のｍｉＲ−２９を阻害することを特徴とする特発性肺線維症モデル細胞。
【請求項２】
配列番号１の核酸を導入することによりｍｉＲ−２９を阻害した請求項１記載の特発性肺線維症モデル細胞。
【請求項３】
請求項１又は２記載の特発性肺線維症モデルを用いることを特徴とするＦａｓＬ誘導性アポトーシスの感受性調節剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
以下の工程を含む請求項３記載のスクリーニング方法。
ａ）被検物質の存在下、請求項１又は２記載の特発性肺線維症モデルをＦａｓＬ刺激し、誘導されるアポトーシス量を測定する工程
ｂ）被検物質の非存在下、請求項１又は２記載の特発性肺線維症モデルをＦａｓＬ刺激し、誘導されるアポトーシス量を測定する工程
ｃ）工程１及び２で得られたアポトーシス量の変動を算出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、アポトーシス抵抗性特発性肺線維症モデル及び当該モデルを用いたＦａｓＬ誘導性アポトーシス調節剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、診断後の５年生存率が約２０％と極めて予後が悪い難知性疾患の１つである。効果的であると証明された特定の治療はなく、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリンの単剤もしくは併用投与がしばしば行われるが、ほとんどの患者は治療を行っても悪化するため（非特許文献１）、より有効な治療薬の登場が期待される。【０００３】  ＩＰＦの発症メカニズムは明らかではないが、ＩＰＦ患者の肺線維芽細胞は、コラーゲン、フィブロネクチン、ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ）などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が過剰産生される他、アポトーシス（プログラムされた細胞死）に対し抵抗性を示すことが知られている（非特許文献２）。また、近年ではＩＰＦ患者の肺組織におけるｍｉｃｒｏＲＮＡ発現変動が報告されている（非特許文献３）。【０００４】  ＩＰＦの発症メカニズム研究のための肺線維症モデル細胞としては、ＴＧＦ−β１で刺激した肺線維芽細胞が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】メルクマニュアル
【非特許文献２】Ｔｏｂｙ  Ｍ．Ｍａｈｅｒ著  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｊｕｌｙ  １；１８２（１）：７３−８２．
【非特許文献３】Ｋｕｓｕｍ  Ｖ．Ｐａｎｄｉｔ著  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．２０１１  Ａｐｒ；１５７（４）：１９１−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  しかしながら、ＴＧＦ−β１はユビキタスに生理機能を発揮するため、ＴＧＦ−β１で刺激した肺線維芽細胞を用いたスクリーニングでは、ＴＧＦ−β１シグナルの上流を阻害する化合物ばかりがヒットするおそれがある。その結果、ＴＧＦ−β１刺激細胞を用いたスクリーニングにより得られたヒット化合物は、制御性Ｔ細胞への分化阻害による過剰な免疫反応誘導等をはじめとする副作用を有する可能性が高い。
そこで、本発明は、ＴＧＦ−β１刺激細胞とは異なる新たな特発性肺線維症モデル細胞を構築し、特発性肺線維症発症の発症およびアポトーシス抵抗性のメカニズムを解明、アポトーシス調節剤（特に特発性肺線維症の治療薬）のスクリーニングに役立てることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、細胞外マトリックスの過剰生産による肺の線維化、アポトーシスに対する抵抗性が特発性肺線維症モデルの指標として、これら性質を備える細胞の構築を目指し検討を進めた。その結果、特定の細胞でｍｉＲ−２９を阻害することにより細胞外マトリックスを過剰生産し、かつアポトーシスに抵抗性を示す細胞を得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】  すなわち、本発明は、ＨＦＬ１細胞のｍｉＲ−２９を阻害することを特徴とする特発性肺線維症モデル細胞である。
本発明はまた、ＨＦＬ１細胞のｍｉＲ−２９を阻害した特発性肺線維症モデル細胞を用いることを特徴とするＦａｓＬ誘導性アポトーシスの感受性調節剤のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【０００９】  本発明により、特発性肺線維症モデル細胞が提供され、特発性肺線維症の発症およびアポトーシス抵抗性のメカニズム解明に役立つとともに、アポトーシス調節剤（特に特発性肺線維症の治療薬）の簡便なスクリーニング系の提供が可能となった。
また、本発明の特発性肺線維症モデル細胞はＥＣＭ過剰蓄積を示し、かつＦａｓＬ誘導性アポトーシスに対して抵抗性を示すというＩＰＦに限定的な表現系を有するため、ＩＰＦの効果的な治療薬・予防薬の創生に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ導入よるＦａｓＬ誘導性アポトーシス抵抗性を示す。Ｖａｌｕｅｓ  ａｒｅ  ｍｅａｎｓ  ±  ＳＤ（ｎ＝３）、＊＊＊：ｐ＜０．００１
【図２】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ導入によるＦａｓＬ誘導性アポトーシスへの感受性亢進を示す。Ｖａｌｕｅｓ  ａｒｅ  ｍｅａｎｓ  ±  ＳＤ（ｎ＝３）、＊＊＊：ｐ＜０．００１
【図３】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ導入によるＣＯＬ３Ａ１の発現量の上昇を示す。Ｖａｌｕｅｓ  ａｒｅ  ｍｅａｎｓ  ±  ＳＤ（ｎ＝６）、  ＊＊  ：  ｐ＜０．０１
【図４】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ導入によるＣＯＬ３Ａ１の発現量の減少を示す。Ｖａｌｕｅｓ  ａｒｅ  ｍｅａｎｓ  ±  ＳＤ（ｎ＝６）、＊＊＊：ｐ＜０．００１
【図５】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ導入によるＳＰＡＲＣの発現量の上昇を示す。Ｖａｌｕｅｓ  ａｒｅ  ｍｅａｎｓ  ±  ＳＤ（ｎ＝６）、＊＊＊：ｐ＜０．００１
【図６】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ導入によるＳＰＡＲＣの発現量の減少を示す。Ｖａｌｕｅｓ  ａｒｅ  ｍｅａｎｓ  ±  ＳＤ（ｎ＝６）、＊＊＊：ｐ＜０．００１
【図７】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ及びｉｎｈｉｂｉｔｏｒ導入による細胞膜表面上のＦａｓ発現量の上昇及び減少を示す（ｎ＝２）。
【図８】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ及びｉｎｈｉｂｉｔｏｒ導入によるＦａｓＬ誘導時のＤＩＳＣ（Ｄｅａｔｈ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）形成促進及び抑制を示す（ｎ＝１）。
【図９】ＨＦＬ１へのｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ及びｉｎｈｉｂｉｔｏｒ導入によるＦａｓＬ誘導時の外因性アポトーシスシグナルの亢進及び抑制を示す（ｎ＝１）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】以下、本発明の公的な実施形態について詳細に説明する。
【００１２】  本発明は、ＨＦＬ１細胞のｍｉＲ−２９を阻害することを特徴とする特発性肺線維症モデル細胞を提供する。
【００１３】  本発明において「ｍｉＲ−２９」とは、ｍｉＲ−２９ａ、ｂ又はｃのｍｉｃｒｏＲＮＡである。ｍｉＲ２９ｂ−１及び２９ａは、ヒトの染色体７及びマウスの染色体６から得られた同じ転写物から生ずるのに対し、ｍｉＲ２９ｂ−２及びｍｉＲ２９ｃを含有するｍｉｃｒｏＲＮＡクラスターは、両方の種の染色体１から転写される。ヒトｍｉＲ−２９ファミリーメンバーを、以下に列挙する。
【００１４】ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ：ｕａｇｃａｃｃａｕｃｕｇａａａｕｃｇｇｕｕａ  （配列番号２）
ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ：ｕａｇｃａｃｃａｕｕｕｇａａａｕｃａｇｕｇｕｕ  （配列番号３）
ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ：ｕａｇｃａｃｃａｕｕｕｇａａａｕｃｇｇｕｕａ  （配列番号４）
【００１５】  ｍｉＲ−２９の阻害方法は、ｍｉＲ−２９の機能又は発現を阻害すれば特に限定はなく、例えばｍｉＲ−２９のアンチセンス核酸分子を用いたアンチセンス法を挙げることができる。ここでアンチセンス法とは、ｍｉＲ−２９と対になるような塩基配列を有する核酸分子を特異的に結合させることで、ターゲットの核酸分子の機能を阻害する手法であり、強力に阻害することを目的として、非天然型の人工合成核酸で配列選択的に修飾されたアンチセンス核酸分子を用いてもよい。
【００１６】  ｍｉＲ−２９のアンチセンス核酸分子としては、配列番号２のアンチセンス、配列番号３のアンチセンス、配列番号４のアンチセンスが挙げられるが、好ましくは配列番号１の核酸（ｕａａｃｃｇａｕｕｕｃａａａｕｇｇｕｇｃｕａ）．である。
また、ｍｉＲ−２９のアンチセンス核酸分子の導入は、当業者が通常行う手法により行うことができる。例えばカチオン性遺伝子導入試薬を使用したリポフェクション法やファージ、プラスミド等のベクターを用いた方法を挙げることができる。ｍｉＲ−２９ｃ阻害剤の導入条件としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いたＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法が望ましい。
【００１７】  本発明において「ＨＦＬ１細胞」とは、ヒト胎児肺由来の正常二倍体線維芽細胞であり、例えば独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＢＲ細胞バンクより入手可能である（登録番号ＩＦＯ５００７４）。ＨＦＬ１細胞は、Ａ５４９細胞やＩＭＲ９０細胞と比較して、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ導入時におけるＦａｓＬ誘導性アポトーシスの抵抗性の点でＡ５４９細胞よりも高い抵抗性を示し、ターゲット因子（ＣＯＬ３Ａ１やＳＰＡＲＣなど）の発現の点でＩＭＲ９０細胞より高い発現上昇度を示す。
【００１８】  本発明において特発性肺線維症（特発性線維化肺胞炎）とは、最もよくみられる特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）の型で、主として男性の喫煙者において進行性の肺線維症を引き起こす。症状および徴候は数カ月から数年にわたって発現し、労作性呼吸困難、咳および吸気性断続性ラ音（ベルクロラ音）を含む。診断は、病歴、身体診察、胸部Ｘ線、および肺機能検査に基づき、また、必要であればＨＲＣＴまたは肺生検もしくはその両方によって確認される（メルクマニュアル）。
【００１９】  本発明の特発性肺線維症モデル細胞は、細胞外マトリックスであるＣＯＬ３Ａ１やＳＰＡＲＣの発現が促進される。また、ＦａｓＬ誘導性アポトーシスに対して抵抗性を示す。
本発明の特発性肺線維症モデル細胞は、当業者が通常行う方法で培養することが可能である。例えば、ＧＩＢＣＯ社のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ（１０％ＦＢＳ及び１ｘペニシリン・ストレプトマイシン含有）を用い、３７℃かつ５％ＣＯ２条件にて培養することができる。
【００２０】  本発明はまた、ＨＦＬ１細胞のｍｉＲ−２９を阻害した特発性肺線維症モデル細胞を用いることを特徴とするＦａｓＬ誘導性アポトーシスの感受性調節剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２１】  本発明においてＦａｓＬ誘導性アポトーシスとは、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）もしくはＡｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−Ｆａｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ等を添加することによりアポトーシスを誘導するものである。アポトーシス誘導剤としては、ＢｌｅｏｍｙｃｉｎやＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅなども挙げられるが、Ｆａｓ刺激は、生体内で実際に生じている現象であることや、ＩＰＦ患者の病態との関連（ＩＰＦ患者の肺線維芽細胞は実際にＦａｓＬ誘導性アポトーシスに抵抗性を示す）が認められる点で優れている。
【００２２】  ここでＦａｓＬとは、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：腫瘍壊死因子）ファミリーに属するサイトカインである。
アポトーシスを効率的に誘導するためにＦａｓＬ及びＡｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−Ｆａｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙは、１００ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加することが好ましい。
【００２３】  ＦａｓＬ誘導性アポトーシスの定量は、当業者が通常行う手法により測定することが可能である。例えば、細胞膜構造変化に基づくアポトーシス検出、ＴＵＮＥＬ法によるアポトーシスの検出、アポトーシスによる断片化ＤＮＡを検出などが挙げられる。
【００２４】  本発明のスクリーニング法における被検物質としては、公知又は新規な合成化合物、天然有機化合物、各種タンパク質、各種ペプチド、細胞培養上清等を用いることができる。
【００２５】  アポトーシス量の変動に基づいて感受性調節剤を選別する。例えば、ｍｉＲ−２９を阻害した場合の阻害率を１００％として、被検物質を存在下において阻害率が５０％以下まで回復したものをＦａｓＬ誘導性アポトーシスの感受性を向上させる調節剤として選出する。
【００２６】  また、本発明者らは、ＨＦＬ１にｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを導入することでＦａｓＬ誘導性アポトーシスに抵抗性を示し、一方ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの導入がＦａｓＬ誘導性アポトーシスを促進させることを見出した。
さらに、ｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ導入はＦａｓ発現量を抑制し、一方ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ導入はＦａｓ発現量を増加させることも確認した。Ｆａｓの発現変化はＤＩＳＣ形成及び外因性アポトーシスシグナルとの相関が確認された。以上のことから、ｍｉＲ−２９の発現を促進すれば、ＦａｓＬ誘導性アポトーシスが促進され、ｍｉＲ−２９の発現を抑制すればＦａｓＬ誘導性アポトーシスも抑制（抵抗性）されることが理解できる。
【００２７】  したがって、本発明のスクリーニングによりｍｉＲ−２９  ｍｉｍｉｃやｍｉＲ−２９を発現促進する化合物が、ＦａｓＬ誘導性アポトーシスの感受性を向上させることが容易に推測される。
ここでｍｉＲ−２９ｍｉｍｉｃは、配列番号２、３又は４のようなｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡが細胞内に増加すればよく、ｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡの直接の前駆体であるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡや配列番号５〜８のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを細胞に導入しても良い。
【００２８】ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ（配列番号５）、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ−２９ｂ−１（配列番号６）、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ−２９ｂ−２（配列番号７）、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ−２９ｃ（配列番号８）
【００２９】  次に、本発明を参考例および実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
【００３０】（実施例１  ｍｉｃｒｏＲＮＡ導入効率の検討）
ｍｉＲ−２９ｃのｍｉＲＩＤＩＡＮ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（配列番号１）の導入効率を検討するため、ＨＦＬ１にｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｗｉｔｈ  Ｄｙ５４７（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎにて導入し、４８時間後の導入効率を共焦点顕微鏡により確認した。その結果、最も導入効率の良かった以下の条件を最適なプロトコルとして決定した。
【００３１】１０μＭ  ｍｉＲＩＤＩＡＮ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．５０μＬ／ｃｍ２  ｄｉｓｈ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  ０．５０μＬ／ｃｍ２  ｄｉｓｈ
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ                          ｕｐ  ｔｏ  ５０μＬ／ｃｍ２  ｄｉｓｈ
【実施例２】
【００３２】ＨＦＬ１を１０％ＦＢＳ含有ペニシリン・ストレプトマイシン抜きのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地にて播種するのと同時に、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（配列番号１）及びｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ（配列番号８）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いたＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法により導入した。導入してから１６時間後に１０％ＦＢＳ及びペニシリン・ストレプトマイシン含有のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地に交換し、さらに４８時間培養を継続した。その後、２５０ｎｇ／ｍＬ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−Ｆａｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ：ＣＨ−１１）及び１μｇ／ｍＬ  Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＣＨＸ）を２４時間刺激した。２４時間後のＨＦＬ１をＡｎｎｅｘｉｎＶ及びＰＩにて二重染色し、フローサイトメーターにてアポトーシス細胞死の割合を解析した。
ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの結果を図１に、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの結果を図２に示した。ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの導入によりＦａｓＬ誘導性アポトーシスに抵抗性を示し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの導入によりＦａｓＬ誘導性アポトーシスへの感受性が亢進することが明らかとなった。
なお、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしてはｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を使用し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃとしてはＡｍｂｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。
【実施例３】
【００３３】ＨＦＬ１を１０％ＦＢＳ含有ペニシリン・ストレプトマイシン抜きのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地にて播種するのと同時に、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（配列番号１）及びｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ（配列番号８）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いたＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法により導入した。導入してから１６時間後に１０％ＦＢＳ及びペニシリン・ストレプトマイシン含有のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地に交換し、さらに４８時間培養を継続した。その後、各々の細胞サンプルからＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ＣＯＬ３Ａ１の発現はＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲを用いて解析した。内在性コントロールとしては１８Ｓを用い、ＣＯＬ３Ａ１の発現を補正した。
ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの結果を図３に、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの結果を図４に示した。ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの導入によりＣＯＬ３Ａ１の発現が上昇し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの導入によりＣＯＬ３Ａ１の発現が減少することが明らかとなった。
なお、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしてはｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を使用し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃとしてはＡｍｂｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。
【実施例４】
【００３４】ＨＦＬ１を１０％ＦＢＳ含有ペニシリン・ストレプトマイシン抜きのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地にて播種するのと同時に、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（配列番号１）及びｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ（配列番号８）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いたＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法により導入した。導入してから１６時間後に１０％ＦＢＳ及びペニシリン・ストレプトマイシン含有のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地に交換し、さらに４８時間培養を継続した。その後、各々の細胞サンプルからＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ＳＰＡＲＣの発現はＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲを用いて解析した。内在性コントロールとしては１８Ｓを用いてＳＰＡＲＣ発現の補正を行った。
ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの結果を図５に、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの結果を図６に示した。ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの導入によりＳＰＡＲＣの発現が上昇し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの導入によりＳＰＡＲＣの発現が減少することが明らかとなった。
なお、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしてはｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を使用し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃとしてはＡｍｂｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。
【実施例５】
【００３５】ＨＦＬ１を１０％ＦＢＳ含有ペニシリン・ストレプトマイシン抜きのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地にて播種するのと同時に、ｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（配列番号１）及びｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ（配列番号８）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いたＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法により導入した。導入してから１６時間後に１０％ＦＢＳ及びペニシリン・ストレプトマイシン含有のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地に交換し、さらに４８時間培養を継続した。培養後の細胞をＦａｓ抗体にて３０分間氷上で染色し、細胞表面上のＦａｓ発現量はフローサイトメトリーを用いて解析した。
解析結果を図７に示した。ｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの導入により細胞膜表面上のＦａｓ発現量が減少し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの導入により細胞膜表面上のＦａｓ発現量が上昇することが明らかとなった。
なお、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしてはｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を使用し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃとしてはＡｍｂｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。
【実施例６】
【００３６】ＨＦＬ１を１０％ＦＢＳ含有ペニシリン・ストレプトマイシン抜きのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地にて播種するのと同時に、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（配列番号１）及びｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ（配列番号８）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いたＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法により導入した。導入してから１６時間後に１０％ＦＢＳ及びペニシリン・ストレプトマイシン含有のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地に交換し、さらに７２時間培養を継続した。ＤＩＳＣ（Ｄｅａｔｈ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成させるため２５０ｎｇ／ｍＬ  ＣＨ−１１及び１ｕｇ／ｍＬ  ＣＨＸを２時間刺激した後、ＬＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒを用いて蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質をＦａｓ抗体と２時間、さらにｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｂｅａｄｓと１時間反応させることでＦａｓ及びその結合蛋白質を免疫沈降した。沈降させたＤＩＳＣの発現解析はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法を用いて解析した。
解析結果を図８に示した。ｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの導入によりＤＩＳＣ形成が抑制され、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの導入によりＤＩＳＣ形成が促進されることが明らかとなった。
なお、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしてはｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を使用し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃとしてはＡｍｂｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。
【実施例７】
【００３７】ＨＦＬ１を１０％ＦＢＳ含有ペニシリン・ストレプトマイシン抜きのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地にて播種するのと同時に、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（配列番号１）及びｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃ（配列番号８）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いたＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法により導入した。導入してから１６時間後に１０％ＦＢＳ及びペニシリン・ストレプトマイシン含有のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ  ｍｅｄｉｕｍ培地に交換し、さらに４８時間培養を継続した。その後ＦａｓＬ刺激によるアポトーシス誘導を起こすため、２５０ｎｇ／ｍＬ  ＣＨ−１１及び１μｇ／ｍＬ  ＣＨＸを２４時間刺激し、外因性アポトーシスシグナルをＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｎｇ法にて解析した。
解析結果を図９に示した。ｍｉＲ−２９ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの導入によりＣａｓｐａｓｅ−８／３活性化が抑制され、Ｃａｓｐａｓｅ−３活性化に伴うＰＡＲＰ−１の分解も抑制されていた。一方ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃの導入によりＣａｓｐａｓｅ−８／３活性化が促進され、顕著なＰＡＲＰ−１分解が起こることが明らかとなった。
なお、ｍｉＲ−２９  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしてはｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を使用し、ｍｉＲ−２９ｃ  ｍｉｍｉｃとしてはＡｍｂｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】  本発明により、特発性肺線維症モデル細胞が提供され、アポトーシス調節剤（特に特発性肺線維症の治療薬）の簡便なスクリーニングが可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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