(57)【要約】【課題】本発明は、免疫機構のうち主に自然免疫に関与するナチュラルキラー細胞を選択的に活性化し、マクロファージは有意に活性化しない免疫賦活剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る免疫賦活剤は、パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ｂｉｎｏｓ）自体を有効成分として含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ｂｉｎｏｓ）自体を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項２】
ナチュラルキラー細胞に対する選択的な賦活作用を有する請求項１に記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
さらに、パラクロレラ・バイノスの分泌物を含むものである請求項１または２に記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
乾燥体である請求項１〜３のいずれかに記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
パラクロレラ・バイノスがＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株である請求項１〜４のいずれかに記載の免疫賦活剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫賦活剤を含むことを特徴とする食品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫賦活剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫賦活剤を含むことを特徴とする飼料。
【請求項９】
養殖魚介類のためのものである請求項８に記載の飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択性が高く安全性に優れた免疫賦活剤、並びに、当該免疫賦活剤を含む食品、医薬組成物および飼料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫は脊椎動物が備える防御機構であり、自己と非自己を認識して非自己を排除する機構をいい、自然免疫と獲得免疫に分けられる。
【０００３】
即ち、病原微生物やウィルスなどの異物が生体内に侵入すると、先ず好中球などの顆粒球やマクロファージが攻撃し、さらにＮＫ細胞がこれらに感染した細胞を破壊し、マクロファージが感染細胞を貪食する。これを自然免疫という。
【０００４】
獲得免疫においては、抗原を摂取したマクロファージが生体内情報伝達物質であるサイトカインを放出し、Ｔ細胞を活性化する。また、マクロファージによる抗原提示のシグナルがヘルパーＴ細胞に伝達され、このＴ細胞は、マクロファージによって提示された抗原と結合することにより活性化される。活性化されたヘルパーＴ細胞は、サイトカインを産生してマクロファージを活性化すると共に、提示された抗原を認識するＢ細胞を活性化する。活性化したＢ細胞は増殖し、抗原に対する抗体を産生して放出する。かかる抗体は抗原を不活性化し、且つ、抗体が特異的に結合した抗原はマクロファージの攻撃に曝され易くなる。かかる抗原の情報はＴ細胞やＢ細胞に記憶され、同じ抗体が再侵入してきた場合に備えられる。
【０００５】
しかし、加齢、化学物質や運動不足、正しくない食生活、ストレスなどにより免疫力が低下することがある。例えば、４０歳代の免疫力はピーク時である２０歳代の約半分といわれており、がんの罹患者が急激に増加する時期と一致する。
【０００６】
そこで、低下した免疫を改善したり免疫力を向上するための薬剤、いわゆる免疫賦活剤が種々開発されている。例えば特許文献１には、褐藻の一種であるアスコフィラムノドサムから抽出された硫酸化多糖であるアスコフィランを有効成分として含む免疫賦活物質が記載されている。特許文献１には、アスコフィランがマウス由来のマクロファージ細胞を活性化し、そのＧ−ＣＳＦ産生やＴＮＦ−α産生を誘導することを証明する実験データが開示されている。
【０００７】
ところが、マクロファージは上記のとおり免疫機構で重要な役割を担う一方で、活性化されたマクロファージから産生されたＮＯ、ＰＧＥ2、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインが慢性炎症による組織障害を引き起こし、動脈硬化、リウマチ、がんなどの生活習慣病を引き起こすことが明らかにされている（非特許文献１）。よって、マクロファージの活性化には注意が必要である。
【０００８】
ところで、アルギン酸産生能を有する新規な微細藻類として、パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ｂｉｎｏｓ）が見出されている（特許文献２）。また、本発明者らは、アルギン酸オリゴマーが免疫賦活作用を有することを見出している（特許文献３〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１２０７０７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０２４３６７号パンフレット
【特許文献３】特開２００５−１４５８８５号公報
【特許文献４】国際公開第２００７／０６９４６８号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】細田明美ら，東京医療保健大学紀要，第５巻，第１号，第７〜１３頁（２０１１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、免疫力を高めることは非常に重要であり、様々な免疫賦活剤が開発されている。しかし、アスコフィランやアルギン酸オリゴマーは、マクロファージ活性化作用を示す。マクロファージの活性化は生活習慣病などをかえって促進するおそれがあり得るので、免疫力の向上に寄与しつつも、マクロファージは積極的に活性化しない薬剤が求められている。
【００１２】
そこで本発明は、免疫機構のうち主に自然免疫に関与するナチュラルキラー細胞を選択的に活性化し、マクロファージは有意に活性化しない免疫賦活剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ｂｉｎｏｓ）自体が、マクロファージを実質的に活性化しない一方で、ナチュラルキラー細胞を選択的に活性化できることを見出して、本発明を完成した。
【００１４】
以下、本発明を具体的に記載する。
【００１５】
［１］パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ｂｉｎｏｓ）自体を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
【００１６】
［２］ナチュラルキラー細胞に対する選択的な賦活作用を有する上記［１］に記載の免疫賦活剤。マクロファージを活性化せず、ナチュラルキラー細胞を選択的に賦活化する本発明の効果は、従来の免疫賦活剤にはない優れたものである。
【００１７】
［３］さらに、パラクロレラ・バイノスの分泌物を含むものである上記［１］または［２］に記載の免疫賦活剤。かかる免疫賦活剤の優れた選択的免疫賦活作用は、実験的に証明されている。
【００１８】
［４］乾燥体である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の免疫賦活剤。かかる免疫賦活剤は、取扱いが容易であり利便性が高い。
【００１９】
［５］パラクロレラ・バイノスがＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株である上記［１］〜［４］のいずれかに記載の免疫賦活剤。当該株の優れた選択的免疫賦活作用は、本発明者らによる実験的知見により証明されている。
【００２０】
［６］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫賦活剤を含むことを特徴とする食品。本発明に係る免疫賦活剤は比較的安全なものであることから、食品に添加することもできる。
【００２１】
［７］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫賦活剤を含むことを特徴とする医薬組成物。本発明に係る免疫賦活剤は比較的安全なものであることから、医薬としても、例えば恒常的な摂取も可能であり、疾患や症状の治療のみならず、それらの予防にも有用である。
【００２２】
［８］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫賦活剤を含むことを特徴とする飼料。
【００２３】
［９］養殖魚介類のためのものである上記［８］に記載の飼料。本発明に係る免疫賦活剤は比較的安全なものであることから、特に、狭い空間内において高密度に育成され、病気の発生し易い養殖魚類や養殖エビ類の飼料に配合して用いることが有効である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る免疫賦活剤は、マクロファージを有意に活性化することなく、免疫機構のうち主に自然免疫に関与するナチュラルキラー細胞を選択的に活性化する。よって、活性化されたマクロファージから産生される炎症性サイトカインなどを原因とする生活習慣病などの疾患を抑制しつつ、免疫力を向上することができる。その上、本発明に係る免疫賦活剤は、合成化合物ではなく、微細藻類自体を有効成分とするものであるため、より安全である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明に係る微細藻類であるＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株、クロレラ、または免疫賦活作用を有する硫酸化多糖であるアスコフィランを投与したマウスから得られた脾臓細胞と、マウスリンパ腫細胞であるＹＡＣ−１細胞を共培養した場合における、ＹＡＣ−１細胞に対する細胞傷害性の経時的変化を比較するためのグラフである。
【図２】図２は、本発明に係る微細藻類であるＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株、クロレラ、または免疫賦活作用を有する硫酸化多糖であるアスコフィランを投与したマウスから得られた脾臓細胞と、マウスリンパ腫細胞であるＹＡＣ−１細胞を共培養した場合における、ＹＡＣ−１細胞に対する細胞傷害性を比較するためのグラフである。
【図３】図３は、本発明に係る微細藻類であるＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株とクロレラのマクロファージ細胞に対する細胞傷害性を試験した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明に係る微細藻類であるＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株とクロレラの、ＮＯ産生を指標としたマクロファージ細胞活性化作用を比較するためのグラフである。
【図５】図５は、本発明に係る微細藻類であるＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株とクロレラの、ＴＮＦα産生を指標としたマクロファージ細胞活性化作用を比較するためのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明に係る免疫賦活剤は、パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ｂｉｎｏｓ）自体を有効成分として含むことを特徴とする。
【００２７】
パラクロレラ・バイノスは、トレボキシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）と緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）とにまたがるクロレラ属のうち、トレボキシア藻綱に属するものであるが、１８Ｓ  ｒＤＮＡおよび１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いた分子系統学的解析によれば他のクロレラとは別のグループを形成するものである。
【００２８】
一般的に、パラクロレラ・バイノスは、野外で採取した淡水サンプルから、一般的な培地を使った継代培養によりコロニーを分離し、最終的に分子系統学的解析により属種を特定することにより得ることができる。
【００２９】
パラクロレラ・バイノスは、淡水培地やＬＢ培地などの一般的な培地中、好気条件、嫌気条件のいずれでも生育可能であるが、室温〜３０℃、明条件、好気条件で特によく増殖する。
【００３０】
パラクロレラ・バイノスのうち、特に好適なＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：  日本国  茨城県つくば市１丁目１番地１  中央第６
（ｉｉ）  受託日：  ２００８年２月２８日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５１３
（ｉｖ）  国際受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９
（ｖ）  国内寄託から国際寄託への移管日：  ２００８年５月２３日
【００３１】
本発明に係るＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株の形態的特徴などは、以下のとおりである。
【００３２】
【表１】
2014097940.tif 000002
【００３３】
後記の実施例のとおり、パラクロレラ・バイノス藻類は、ナチュラルキラー細胞に対して非常に優れた選択的賦活化作用を有する。よって、パラクロレラ・バイノス以外のパラクロレラ藻類も、ナチュラルキラー細胞に対して、パラクロレラ・バイノス藻類と同様の選択的賦活化作用を有する可能性がある。そのようなパラクロレラ・バイノス以外のパラクロレラ藻類としては、例えば、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｄｉｃｔｙｏｓｈａｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｍｕｃｉｄｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｄｉｃｌｏｓｔｅｒ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋが挙げられる。
【００３４】
本発明に係るパラクロレラ・バイノスには、その変異体であって、ナチュラルキラー細胞に対する選択的な賦活化作用を有するものも含むものとする。ここで「変異体」とは、人為的な選択、交雑、突然変異、遺伝子組み換えなどにより改良したパラクロレラ・バイノス藻類をいうものとする。
【００３５】
本発明に係る免疫賦活剤は、パラクロレラ・バイノス藻類体に加え、その分泌物を含んでいてもよい。パラクロレラ・バイノスの分泌物とは、パラクロレラ・バイノスの培養に従って細胞外へ放出される物質をいう。
【００３６】
当該分泌物を含む免疫賦活剤は、例えば、パラクロレラ・バイノスを培養した培養液や、その乾燥体とすることができる。或いは、パラクロレラ・バイノスを培養した培養液から藻類体を濾過や遠心分離で分離した後、液体部分を精製や部分精製し、特に活性の強いものを藻類体に加えてもよい。
【００３７】
本発明に係る免疫賦活剤の有効成分としてパラクロレラ・バイノス自体を用いる場合、当該藻類自体とその培養液との混合物、当該藻類の懸濁液、当該藻類の乾燥物、当該藻類のホモジェネートなどを用いることができる。
【００３８】
当該藻類自体は、例えば、その培養液を濾過や遠心分離することにより得ることができる。
【００３９】
当該藻類自体、および藻類自体とその培養液は、さらに乾燥してもよい。例えば、上記のように得られた当該藻類自体を５０℃以上、２００℃以下で１０秒間以上、１０時間以下程度乾燥すればよい。乾燥時には減圧してもよい。また、凍結乾燥してもよい。具体的な乾燥条件は、乾燥すべき藻類体や培養液の量、使用する機器などに応じて適宜調整することができる。また、菌体の乾燥物は、さらに粉砕してもよい。
【００４０】
当該藻類の懸濁液の溶媒としては、特に制限されないが、例えば生理食塩水などの等張液または略等張液を挙げることができる。
【００４１】
当該藻類のホモジェネートは、例えば、当該藻類を生理食塩水などの等張液または略等張液に懸濁した懸濁液を、ホモジェナイザーでホモジェナイズしたものを挙げることができる。
【００４２】
本発明に係る免疫賦活剤は、ナチュラルキラー細胞に対する選択的な活性化作用を有することから、安全性の高い免疫賦活剤の有効成分として用いることができる。
【００４３】
このような製剤の形態は特に制限されず、適宜選択すればよい。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、コーティング製剤などの固形製剤；溶液剤、懸濁液剤、エアゾール剤などの液剤などとすることができる。また、製剤形態に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、コーティング剤、蒸留水や生理食塩水などの溶媒、乳化剤、抗酸化剤などの安定剤、ｐＨ調整剤などを添加してもよい。
【００４４】
本発明に係る免疫賦活剤は、食品に配合してもよい。食品に配合することにより、ヒトの免疫力を改善もしくは増強することができる。なお、本発明において食品とは、ヒトの食餌をいうものとする。例えば、食品の材料として用いたり、食品に添加混合することが考えられる。また、いわゆる病院食に添加することも好適である。
【００４５】
また、本発明に係る免疫賦活剤は、免疫力を改善または増強するための医薬組成物へ配合することも考えられる。
【００４６】
本発明に係る免疫賦活剤は、非常に安全である。よって、食品や医薬組成物に配合し、長期にわたる継続的な摂取も可能であり、それにより、疾患や症状を治療できるのみならず、予防することも可能になる。
【００４７】
本発明に係る免疫賦活剤は、飼料に配合してもよい。飼料に配合することにより、免疫力を改善もしくは増強することができる。なお、本発明において飼料とは、ヒト以外の生物の食餌をいうものとする。
【００４８】
本発明の飼料は、養殖魚介類に用いることが好ましい。養殖魚介類には、限られた空間で成育せしめられるために病気が蔓延し易いので、飼料に抗生物質が配合される場合がある。しかし、かかる抗生物質には残留の問題がある。そこで、本発明に係る免疫賦活剤をこれらの飼料に配合すれば、魚介類の免疫力を高めて病気を予防できるのに加え、比較的安全であることから、残留による問題も少ない。
【００４９】
本発明において養殖魚介類とは、食品または食品材料として利用するため人工的に育成される魚介類をいい、例えば、タイ、ヒラメ、マグロ、ブリ、カンパチ、シマアジ、イサキなどの海水魚；ウナギ、イワナ、アマゴ、マスなどの淡水魚；クルマエビ、ブラックタイガー、ヴァナメイ、コウライエビ、オーストラリアタイガー、ギアナピンクなどのクルマエビ属；カキ、アワビ、ホタテ、シンジュガイ、イタヤガイ、ヒオウギガイなどの貝類を挙げることができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５１】
実施例１：  本発明に係る微細藻類の培養
表２の組成を有する培地（ｐＨ６．５）を調製した。
【００５２】
【表２】
2014097940.tif 000003
【００５３】
振盪フラスコに上記培地（１００ｍＬ）を入れ、殺菌後、パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．  ｂｉｎｏｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株を接種した。アルミホイルで遮光した後、３０℃で７２時間振盪し、前培養した。前培養は、複数ロット行った。別途、表３の組成を有する培地を調製した。
【００５４】
【表３】
2014097940.tif 000004
【００５５】
なお、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成は、表２に示すものと同一である。また、消泡剤としては、ＡＤＥＫＡ社製のアデカノールＬＧ１０９を用いた。５Ｌ容ジャーファーメンターに上記培地（２０００ｍＬ）を入れ、殺菌後、上記の前培養液（２００ｍＬ）を接種した。アルミホイルで遮光した後、内温３０℃、通気量２Ｌ／分、撹拌数４５０ｒｐｍ、ｐＨ６〜７で１４３時間培養した。ｐＨは、３０ｗ／ｗ％の水酸化ナトリウム水溶液と１５ｗ／ｗ％の硫酸水溶液で調整した。また、培養開始の２３時間後から、殺菌した流加用培地を培養液に流加した。流加用培地は、培養液中のグルコース濃度が２０ｇ／Ｌを超えないように添加速度を適宜調節し、培養終了までに合計５６０ｍＬを添加した。流加用培地の組成は、表４に示すとおりである。なお、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成は、表２に示すものと同一である。
【００５６】
【表４】
2014097940.tif 000005
【００５７】
培養終了後、当該培養液からサンプルをとって藻体乾燥物含量を測定したところ、５４．３ｇ／Ｌであった。
【００５８】
実施例２：  免疫賦活活性試験
上記実施例１で得られた培養液を、ドラムドライヤーで１４０℃、約１分間（ドラムとの接触時間）乾燥することにより、藻体乾物を得た。得られた藻体乾物の一部をメタノールに懸濁して粒度分布を測定したところ、ｄ50は１７２．１μｍであった。５週令の雄性ＩＣＲマウス（Ｔｅｘａｍ，Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｊａｐａｎ）に体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの量の当該藻体乾物を０．１ｍｌの生理食塩水に懸濁し、３日間連続して腹腔内注射した。また、比較のため、市販のクロレラ乾燥物粉末（販売者：原料屋ドットコム社，製品名：クロレラ粉末と、免疫賦活作用を有する硫酸化多糖であるアスコフィランも生理食塩水に溶解または懸濁し、同様に腹腔内注射した。さらに、コントロールとして、生理食塩水のみ腹腔内注射した。各グループ当たり、マウスを３匹用いた。４日目にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１０％のＦＢＳを含む）に懸濁した。同培地にて２回洗浄した後、１ｍＬ当たり５×１０7細胞の濃度に調整した。
【００５９】
一方、標的細胞として、マウスリンパ腫細胞であるＹＡＣ−１細胞を用いた。対数増殖期のＹＡＣ−１細胞を培地にて１ｍＬ当たり１．０×１０6細胞の濃度とした後、１５μＭの細胞染色用色素溶液（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，同人化学研究所製）にて３７°Ｃで３０分間標識反応を行った。遊離のｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを遠心分離にて除去した後、３７°Ｃにて２時間インキュベートした。細胞を遠心分離により再度洗浄後、アニオントランスポーター阻害剤（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ，１．２５ｍＭ）を加え、標的細胞とした。
【００６０】
標識ＹＡＣ−１細胞懸濁液（０．２ｍＬ）と脾臓細胞懸濁液（０．２ｍＬ）を混合し、５％のＣＯ2雰囲気中、３７°Ｃで４時間インキュベートした。脾臓細胞数と標的細胞数の比（Ｅ／Ｔ比）は５０：１とした。０時間後（インキュベート開始時）、２時間後および４時間後に遠心分離にて細胞を分離し、上澄み４０μＬと５００μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を混合後、蛍光高度計（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｍｏｄｅｌ  ６５０−４０）を用い、蛍光強度をＥｘ：５３０ｎｍ／Ｅｍ：４８５ｎｍにて測定した。免疫活性は、標的細胞の溶解により遊離した色素の割合（％）として、次の式で算出した。
Specific calcein release＝［｛（mean test release）−（mean spontaneous release）｝／｛（mean total release）−（mean spontaneous release）｝］×100
【００６１】
なお、自発的放出は培地のみで測定した。また、１００％溶解は２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて測定した。０時間後、２時間後および４時間後における標的細胞に対する細胞傷害性を図１に、また、４時間後における標的細胞に対する細胞傷害性を比較するためのグラフを図２に示す。
【００６２】
図１〜図２のとおり、本発明に係る微細藻類は、脾臓細胞に含まれるナチュラルキラー細胞を活性化し、リンパ腫細胞を攻撃することが実証された。また、その免疫賦活活性は、クロレラよりも明らかに優れており、且つ、免疫賦活物質として知られているアスコフィランと同等であることが明らかとなった。
【００６３】
実施例３：  マクロファージの活性化試験
マウスマクロファージ細胞であるＲＡＷ２６４．７を、３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割合で９６−ｗｅｌｌプレートに付着させた。上記実施例２で得た本発明に係る微細藻類の乾燥物または市販のクロレラ乾燥物粉末（販売者：原料屋ドットコム社，製品名：クロレラ粉末）を生理食塩水に懸濁し、０〜１０００μｇ／ｍＬの濃度になるように各ウェルに加え、５％のＣＯ2雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、コントロール（サンプル濃度が０％の場合）に対する細胞生残率をＭＴＴ法で測定した。また、上澄中のＮＯレベルをＧｒｉｅｓｓ法で測定した。なお、細胞により産生されたＮＯは液中で直ぐに酸化されてＮＯ2になるので、実際には液中におけるＮＯ2の濃度を測定した。細胞生残率を図３に、ＮＯレベルを図４に示す。
【００６４】
図３のとおり、本発明微細藻類の存在下とクロレラの存在下では、高濃度のクロレラで低下が認められるものの、少なくとも低〜中程度の濃度においては、マクロファージ細胞の生残率にそれほどの違いはない。
【００６５】
その一方で、図４のとおり、クロレラ存在下では、高濃度で低下傾向が見られるものの、ＮＯ2濃度が濃度依存的に高まっており、クロレラがマクロファージを活性化していることが分かる。それに対して本発明微細藻類の存在下では、ＮＯ2はほとんど発生いていない。かかる結果より、本発明微細藻類は、上記実施例２の結果のとおりナチュラルキラー細胞を活性化する一方で、マクロファージ細胞は活性化しないことが明らかにされた。
【００６６】
実施例４：  マクロファージの活性化試験
マウスマクロファージ細胞であるＲＡＷ２６４．７を、３．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割合で９６−ｗｅｌｌプレートに播いた後、５％のＣＯ2雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートし、プレートに付着させた。別途、上記実施例２で得た本発明に係る微細藻類の乾燥物または市販のクロレラ乾燥物粉末（販売者：原料屋ドットコム社，製品名：クロレラ粉末）を１００μｇ／ｍＬの濃度になるように生理食塩水へ懸濁し、当該懸濁液１００μＬを各ウェルに加え、同様の条件で２４時間インキュベートした。
【００６７】
次に、各ウェルにおけるＴＮＦ−α濃度を測定した。具体的には、ＥＬＩＳＡ用９６−ｗｅｌｌプレートに希釈サンプルを加え、さらに抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（一次抗体）を１ウェル当たり１００μＬ添加した。室温で２４時間静置した後、洗浄用溶液で５回洗浄し、ブロッキング溶液を１ウェル当たり２００μＬ添加した。室温で２４時間静置後、さらに洗浄用溶液で５回洗浄した。上記懸濁液を加える直前（０時間）と、その後、２時間毎に各ウェルからサンプルを採取し、生理食塩水で１００倍に希釈した後、１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温で２時間静置した。洗浄用溶液で５回洗浄し、ブロッキング溶液で希釈したＨＲＰ−抗ＩｇＧ抗体（二次抗体）を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置した。洗浄用溶液で５回洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ基質溶液Ｂ（米国ＫＰＬ社製）を１：１で混合した基質溶液を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置した。次いで、反応停止剤として１Ｎリン酸水溶液を５０μＬずつ添加し、よく攪拌した後、マイクロプレートリーダーにより吸光度（Ａ＝４５０ｎｍ）を測定した。得られた測定値を検量線と比較することにより、希釈液中のＴＮＦ−αの濃度を測定した。結果を図５に示す。
【００６８】
図５のとおり、クロレラの存在下ではＴＮＦ−α濃度が上昇している。ＴＮＦ−αは活性化されたマウスマクロファージ細胞から放出されるものであるので、クロレラによりマウスマクロファージ細胞が活性化されたことが分かる。
【００６９】
一方、本発明微細藻類の存在下では、ＴＮＦ−αの放出はほとんど認められなかった。かかる結果より、本発明微細藻類は、上記実施例２の結果のとおりナチュラルキラー細胞を活性化する一方で、マクロファージ細胞は活性化しないことが明らかにされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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