(57)【要約】【課題】ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を生じるＮＡＳＨモデル動物及びその作製方法を提供する。【解決手段】高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することにより得られるＮＡＳＨモデル動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することにより得られるＮＡＳＨモデル動物。
【請求項２】
高脂肪食が、脂肪を４０〜６０質量％含むものである請求項１記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項３】
肝障害剤の投与量が０．０５〜０．５ｍＬ／ｋｇ体重／回である請求項１又は２記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項４】
肝障害剤の投与回数が４〜８回である請求項１〜３のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項５】
肝障害剤の投与が皮下投与である請求項１〜４のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項６】
高脂肪食の摂取期間が、２週間以上である請求項１〜５のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項７】
肝障害剤が、四塩化炭素である請求項１〜６のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項８】
ＮＡＳＨモデル動物がマウスである請求項１〜７のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項９】
大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大している請求項１〜８のいずれか１項に記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項１０】
肝組織が線維化している請求項１〜９のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項１１】
血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、遊離脂肪酸、中性脂肪から選ばれる１以上が、通常飼料で飼育された動物に比べて高いものである請求項１〜１０のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項１２】
血清中のＡＳＴが２００Ｕ／Ｌ以上であり、ＡＬＴが３００Ｕ／Ｌ以上であり、遊離脂肪酸が１０００μＥｑ／Ｌ以上であり、中性脂肪が２０ｍｇ／ｄＬ以上である請求項１〜１１のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
【請求項１３】
高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することを特徴とするＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
【請求項１４】
高脂肪食が、脂肪を４０〜６０質量％含むものである請求項１３記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
【請求項１５】
肝障害剤の投与量が０．０５〜０．５ｍＬ／ｋｇ体重／回である請求項１３又は１４記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
【請求項１６】
肝障害剤の投与回数が４〜８回である請求項１３〜１５のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
【請求項１７】
肝障害剤の投与が皮下投与である請求項１３〜１６のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
【請求項１８】
高脂肪食の摂取期間が、２週間以上である請求項１３〜１７のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
【請求項１９】
肝障害剤が、四塩化炭素である請求項１３〜１８のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
【請求項２０】
ＮＡＳＨモデル動物がマウスである請求項１３〜１９のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物を用いることを特徴とする、ＮＡＳＨ予防治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物を用いることを特徴とする、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に類似した病態を示すＮＡＳＨモデル動物及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肥満の人で飲酒習慣がないにも関わらず、脂肪肝から肝硬変や肝がんになる患者が増えている。脂肪性肝疾患のうち、明らかな飲酒歴がないのにも関わらず、アルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害を認める症例をＮｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ）といい、そのうち肝組織で肝細胞の風船様腫大を伴う脂肪性肝炎を認める症例を特にＮＡＳＨと呼んでいる。当該ＮＡＳＨは、肝硬変や肝がんになるリスクが高いことから、この予防、治療手段の開発が望まれている。
【０００３】
ＮＡＳＨ治療薬の開発には、その病態モデルが必要である。ＮＡＳＨ又はＮＡＦＬＤのモデル動物としては、メチオニン及び／又はコリン欠乏食モデル（非特許文献1、特許文献１）、亜硝酸塩やヒドロキシルアミンを投与してメトヘモグロビン血症を発症させ、生体内低酸素状態を形成させるモデル（特許文献２）等が知られているが、これらはいずれも組織学的にＮＡＳＨの病態を反映しているとは言い難い。また、ストレプトゾトシンなどのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ阻害剤を投与するモデルマウス（特許文献３）、高脂肪食とテトラサイクリン系抗生物質を投与するモデルマウス（特許文献４）、高脂肪食摂取と四塩化炭素を１回投与するモデルマウス（非特許文献２）も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−３４９４５７号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／０１８１９１
【特許文献３】特開２００９−１７８１４３号公報
【特許文献４】ＷＯ２００６／０３０７９２
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２３（２００８）１６３５−１６４８
【非特許文献２】Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００５；１１（９）：１３９２−１３９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これらの動物モデルの病理所見では、大滴性脂肪肝のみが認められ、ＮＡＳＨに特有の肝細胞における小葉中心静脈周囲における炎症および肝細胞の風船様腫大は認められないことから、これらの動物モデルはヒトのＮＡＳＨモデルとは言い難い。
従って、本発明の課題は、ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を生じるＮＡＳＨモデル動物及びその作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を呈するモデル動物を作製すべく種々検討したところ、全く意外にも、高脂肪食を摂取させて肥満にさせるとともに、肝障害を誘発する薬剤（以下、肝障害剤という）を４回以上投与することにより、大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大しているという、ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を有するモデル動物が作製できること、さらに当該モデル動物を用いれば被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果が評価でき、ＮＡＳＨ予防治療剤がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
従って、本発明は、高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することにより得られるＮＡＳＨモデル動物を提供するものである。
また、本発明は、高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することを特徴とするＮＡＳＨモデル動物の作製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ＮＡＳＨモデル動物を用いることを特徴とする、ＮＡＳＨ予防治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
さらに、本発明は、前記ＮＡＳＨモデル動物を用いることを特徴とする、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＮＡＳＨモデル動物は、大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大しているという、ヒトのＮＡＳＨ特有の症状を有することから、ヒトＮＡＳＨモデルとして有用である。本発明のＮＡＳＨモデル動物を用いれば、ヒトのＮＡＳＨに有効な医薬や食品のスクリーニングが可能となる。また、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１の高脂肪食及び四塩化炭素（０．１ｍＬ／ｋｇ体重）投与による肝細胞の組織学的変化を示す図である。Ａ：Ｇｒｏｕｐ  １（無処置対照群）、Ｂ：Ｇｒｏｕｐ  ２（高脂肪食対照群）、Ｃ：Ｇｒｏｕｐ  ３（高脂肪食+四塩化炭素１回投与群）、Ｄ〜Ｆ：Ｇｒｏｕｐ  ９（高脂肪食+四塩化炭素８回投与群）Ａ：正常な肝臓の組織像。Ｂ：中心静脈周囲から小葉中間帯にかけて観察された肝細胞内の小脂肪滴。Ｃ：高脂肪食対照群と同じく中心静脈周囲から小葉中間帯にかけて観察された小脂肪滴。Ｄ：大滴性脂肪肝（矢頭）。Ｅ：中心静脈周囲に観察された肝細胞の風船様腫大（矢印）。Ｆ：中心静脈周囲におけるリンパ球主体の炎症細胞浸潤。＊：中心静脈、＃：門脈域、Ａ〜Ｄ，Ｆ：×２０、Ｅ：×４０、Ａ〜Ｆ：Ｈ−Ｅ染色
【図２】実施例１の高脂肪食及び四塩化炭素（０．１ｍＬ／ｋｇ体重）投与による線維化を示す図である。Ａ：Ｇｒｏｕｐ  １（無処置対照群）、Ｂ：Ｇｒｏｕｐ  ２（高脂肪食対照群）、Ｃ：Ｇｒｏｕｐ  ３（高脂肪食＋四塩化炭素１回投与群）、Ｄ：Ｇｒｏｕｐ  ９（高脂肪食＋四塩化炭素 ８回投与群）Ａ：正常な肝臓の組織像。Ｂ、Ｃ：中心静脈周囲、門脈域ともに線維化は確認されなかった。Ｄ：中心静脈周囲において肝細胞を取り囲むように線維化が観察された。＊：中心静脈、＃：門脈域、Ａ〜Ｄ：×２０、Ｍ−Ｔ染色
【図３】Ａ〜Ｃは実施例２の高脂肪食及び四塩化炭素（０．２５ｍＬ／ｋｇ体重）８回投与による線維化を示す図である。Ａ：大滴性脂肪肝；小葉中心部から周辺部にかけて肝細胞内に大滴性脂肪が蓄積、Ｂ：細胞質内の空胞はＳｕｄａｎIII染色陽性（脂肪）、Ｃ：中心静脈周囲の軽微な線維化＊：中心静脈、＃：門脈域、Ａ：×１０、Ｂ，Ｃ：×２０Ａ：Ｈ−Ｅ染色、Ｂ：ＳｕｄａｎIII染色（凍結切片）、Ｃ：Ｍ−Ｔ染色
【図４】Ａ〜Ｂは実施例２の高脂肪食及び四塩化炭素（０．２５ｍＬ／ｋｇ体重）８回投与による炎症症状を示す図である。Ａ：中心静脈周囲の炎症性細胞の浸潤、Ｂ：中心静脈周囲に観察された肝細胞の風船様腫大（矢印）＊：中心静脈、Ａ：×２０、Ｂ：×４０、Ａ、Ｂ：Ｈ−Ｅ染色
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のＮＡＳＨモデル動物は、高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することにより作製できる。
【００１２】
用いられる動物は、特に制限されるものではなく、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル等を挙げることができるが、マウスを用いることが好ましい。マウスを用いる場合は、通常のマウスであればよく、雑種でも系統種でもよいが、実験動物として用いられているマウス、例えばＣ５７ＢＬ／６系マウス、Ｃ３Ｈ系マウス、ＩＣＲ系マウス、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス等が好ましい。
【００１３】
高脂肪食としては、脂肪を２０質量％以上含有する食餌であればよく、さらに脂肪を３０〜８０質量％含有する食餌、特に脂肪を４０〜６０質量％含有する食餌が好ましい。ここで脂肪としては、動物性脂肪、植物性脂肪にかかわらず、あらゆる種類の脂肪を用いることができ、コーン油、大豆油、なたね油、牛脂、豚脂を例示することができるが、特に牛脂、豚脂が好ましい。また高脂肪食中の脂肪以外の成分は、通常の食餌成分であればよく、タンパク質、炭水化物、ミネラル等を含んでもよい。
【００１４】
高脂肪食の摂取期間は、肥満が生じるのに必要な期間であればよく、特に制限されないが、２週間以上が好ましく、さらに４週間以上、特に８〜１６週間が好ましい。また高脂肪食摂取の開始時期は特に制限されないが、５週齢からが好ましい。また、高脂肪食は、動物に毎日自由摂取させればよい。
【００１５】
用いられる肝障害剤は特に制限されるものではなく、例えば、四塩化炭素、ガラクトサミン、アセトアミノフェン、ＬＰＳ（リポ多糖）等を挙げることができるが、特に四塩化炭素が好ましい。
【００１６】
肝障害剤は、４回以上投与することが、動物にヒトＮＡＳＨ特有の症状を発症させる点で重要である。投与回数は４〜１０回が好ましく、４〜８回がより好ましい。投与回数が４回未満の場合には、肝臓に炎症や線維化が生じず、ヒトのＮＡＳＨ特有の症状が発症しない。
【００１７】
肝障害剤の投与手段は、腹腔投与、静脈投与、経口投与、皮下投与等、特に限定されるものではないが、皮下投与が好ましい。また投与量は、通常の肝障害を生じさせる量である１ｍｌ／ｋｇ体重／回よりも低用量であることが、ヒトＮＡＳＨ特有の症状を発症させるために重要であり、具体的には、０．０５〜０．５ｍＬ／ｋｇ体重／回が好ましく、０．１〜０．２５ｍＬ／ｋｇ体重／回がより好ましい。０．０５ｍＬ／ｋｇ体重／回よりも少ないと、ＮＡＳＨの症状を呈しない場合があり、０．５ｍＬ／ｋｇ体重／回よりも多いと、ヒトＮＡＳＨ特有の症状を発症せず、通常の肝障害モデル動物となってしまう場合があるため好ましくない。肝障害剤の投与開始時期は、特に限定されるものではないが、高脂肪食摂取開始後２週間後からが好ましく、特に高脂肪食開始後４週間後からがより好ましく、さらに好ましくは８週間後からである。また、肝障害剤の投与間隔は、週に１〜３回が好ましく、週に２回が特に好ましい。なお、肝障害剤投与期間中も高脂肪食は摂取し続けるのが好ましい。
【００１８】
より好ましい高脂肪食の摂取と肝障害剤投与のスケジュールは高脂肪食を８週間以上摂取させた後、高脂肪食の摂取を続けつつ、週に２回、肝障害剤を０．１〜０．２５ｍＬ／ｋｇ体重／回、合計４回以上皮下投与するというものである。
【００１９】
高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与すれば、動物にヒトＮＡＳＨ特有の病理所見が現われる。その病態とは、大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、風船様に腫大した肝細胞が認められることである。従来のＮＡＳＨモデルでは、小葉内の中心静脈周囲における炎症及び風船様腫大と、大滴性脂肪肝との両方の病理所見が生じるものがなかった。従って、本発明のＮＡＳＨモデル動物は、ヒトのＮＡＳＨの病態モデルとして特に有用である。ここで、肝細胞の風船様腫大について、風船様腫大が生じる場所は特に限定されるものではないが、ヒトＮＡＳＨの症状により類似しているという点から中心静脈周囲に生じていることが好ましい。また、脂肪肝とは、肝臓に大量の脂肪が沈着した状態のことをいい、より詳細には、大滴性脂肪肝（沈着）及び／又は小脂肪的蓄積（沈着）が認められる状態であるが、ヒトのＮＡＳＨにより類似しているという点で、大滴性脂肪肝（沈着）が認められるものである必要がある。
【００２０】
また、本発明のＮＡＳＨモデル動物は、さらに肝組織が線維化するという症状も呈していることが好ましく、線維化まで生じているＮＡＳＨモデル動物は、ＮＡＳＨの診断基準としてよく知られているＭａｔｔｅｏｎｉらの分類のＮＡＳＨ（Ｔｙｐｅ  ４）によく合致しており、より病態が進んだＮＡＳＨのモデル動物となり得る。また、ヒトＮＡＳＨの症状に類似しているという点から、線維化は中心静脈周囲に生じていることがより好ましい。
【００２１】
さらに、本発明のＮＡＳＨモデル動物は、血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ（ＧＯＴ））、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ（ＧＰＴ））、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）から選ばれる１以上が通常飼料で飼育された動物に比べて高いものである。好ましくは、ＡＳＴは、２００Ｕ／Ｌ以上、より好ましくは５００Ｕ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以上である。ＡＬＴは３００Ｕ／Ｌ以上、より好ましくは８００Ｕ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは１２００Ｕ／Ｌ以上である。遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）は１０００μＥｑ／Ｌ以上、より好ましくは１２００μＥｑ／Ｌ以上である。中性脂肪は２０ｍｇ／ｄＬ以上、より好ましくは３０ｍｇ／ｄＬ以上である。ヒトＮＡＳＨ患者においても、上記の指標は健常人に比べて高いことが報告されており、本発明のＮＡＳＨモデル動物は、ヒトＮＡＳＨの症状に類似した病態を示すものである。
【００２２】
本発明のＮＡＳＨモデル動物は、ヒトのＮＡＳＨ特有の症状を呈しており、ＮＡＳＨの病態の研究用として有用であるとともに、ＮＡＳＨ予防治療剤（ＮＡＳＨ予防治療薬、ＮＡＳＨ予防治療用食品）などのスクリーニングに有用である。また、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価にも有用である。
【００２３】
動物に高脂肪食を摂取させ、肝障害剤の投与前、投与の間及び／又は投与後に被験物質を投与し、肝障害剤を４回以上投与した後、肝障害の程度を観察することにより、該被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果が評価でき、ＮＡＳＨ予防治療剤のスクリーニングができる。ここで、肝障害の程度は、被験物質非投与群との対比、及び／又は正常動物群（通常食群、肝障害剤非投与群など）との対比により行うことができる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
（１）モデル動物の作製
作製したＮＡＳＨモデルマウスを以下に示した（表１）。
高脂肪食（牛脂４０％混餌飼料）を自由摂取させて８週間飼育した雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系マウスに下記の条件で四塩化炭素（０．１ｍＬ／ｋｇ体重）を皮下投与し、四塩化炭素を最後に投与してから下記の時間が経過した後、エーテル麻酔下で放血屠殺した。また、各群５匹から肝臓を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。また表２に高脂肪食の組成を示した。
Ｇｒｏｕｐ１とＧｒｏｕｐ９については、放血屠殺する直前に、腹部大動脈から採血した。得られた血液を１時間以上氷上にて放置した後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、血清を調製した。
なお、四塩化炭素を２回以上投与する場合は、１週間の最大投与回数が２回となるようにした。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
【表２】
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【００２８】
（２）病理組織学的観察
固定後の肝臓を常法により切り出し、パラフィン包埋後、パラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（Ｈ−Ｅ）染色を施して、光学顕微鏡にて観察した。さらに膠原線維の有無を確認するためにパラフィン切片にＭａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（Ｍ−Ｔ）染色を実施した。
（３）血液生化学性状の測定
７１７０型自動分析装置（(株)日立製作所）を用いて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ（ＧＯＴ））、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ（ＧＰＴ））、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）を測定した。
（４）ＮＡＳＨの診断基準
現在、臨床におけるＮＡＳＨの病理組織学的診断基準には、Ｍａｔｔｅｏｎｉらの分類（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９９，１１６：１４１３−１４１９）、Ｋｌｅｉｎｅｒらの分類（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００５，４１：１３１３−１３２１）、及びＢｒｕｎｔらの分類（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９９，９４：２４６７−２４７４）がある。米国肝臓学会  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｏｐｉｃ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ２００２ではＮＡＳＨの必須所見として大滴性脂肪肝、小葉内炎症、肝細胞の風船様腫大をあげ、ＮＡＦＬＤのＴｙｐｅ  ３（Ｍａｔｔｅｏｎｉらの分類（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９９，１１６：１４１３−１４１９））以上をＮＡＳＨと組織診断している（表３）。また、日本肝臓学会でも組織診断基準にＭａｔｔｅｏｎｉらの分類を奨励している。これらのことから今回、ＭａｔｔｅｏｎｉらによるＮＡＦＬＤの分類をＮＡＳＨの診断基準として用いた。
すなわち、ＮＡＳＨは大滴性脂肪肝、小葉内炎症および肝細胞の風船様腫大を必須とし（表３のＴｙｐｅ  ３）、これらの症状に加えて、マロリー小体又は線維化が認められる場合はＴｙｐｅ  ４に分類される。
また、臨床でのヒトＮＡＳＨでは小葉内炎症、風船様腫大及び／又は線維化が中心静脈周囲で生じていることが報告されていることから、上記の症状が中心静脈周囲で生じている場合に、ヒトＮＡＳＨの症状により類似した病態ということができる。
【００２９】
【表３】
2014209849.tif 000004
【００３０】
（５）結果
（ａ）高脂肪食対照群（Ｇｒｏｕｐ  ２）の病理組織的変化
高脂肪食対照群（Ｇｒｏｕｐ  ２）では中心静脈周囲から小葉中間帯において、肝細胞に小脂肪滴が認められた（図１Ｂ）。小脂肪滴は無処置対照群では観察されなかったことから高脂肪食の投与に起因した変化と考えられた。
【００３１】
（ｂ）高脂肪食+四塩化炭素１回投与後の経時的な病理組織的変化（Ｇｒｏｕｐ  ３〜５）
高脂肪食+四塩化炭素の１回投与群（Ｇｒｏｕｐ  ３〜５）において、高脂肪食対照群（Ｇｒｏｕｐ  ２）と同様に、小脂肪滴が中心静脈周囲から小葉中間帯において認められた（図１Ｃ）。しかし、これらの群においては、ＮＡＦＬＤに観察される大滴性脂肪肝、及びＮＡＳＨに観察される肝細胞の風船様細胞や線維化などの所見は確認されなかった（表４、５，図１Ｃ）。
【００３２】
（ｃ）高脂肪食+四塩化炭素の投与回数増加に伴う病理組織的変化（Ｇｒｏｕｐ  ６〜９）
高脂肪食+四塩化炭素の複数回投与群（Ｇｒｏｕｐ  ６〜９）では大滴性脂肪肝が認められた（図１Ｄ）。この大滴性脂肪肝は四塩化炭素の投与回数の増加に伴い、発生頻度が高く、かつ強くなる傾向が認められた（表４、５）。一方、中心静脈周囲における小脂肪滴は減少する傾向が認められた（表４、５）。これまでに大滴性脂肪肝及び小脂肪滴の相互関係についての報告はないが、大滴性脂肪肝は四塩化炭素の複数回投与に起因した変化であると考えられた。さらに四塩化炭素の複数回投与群（Ｇｒｏｕｐ  ６〜９）において肝細胞の風船様腫大が中心静脈周囲に５例中２〜３例の割合で各群に認められた（図１Ｅ）。
【００３３】
また、高脂肪食＋四塩化炭素を４回以上投与した群（Ｇｒｏｕｐ  ７〜９）では、中心静脈周囲においてリンパ球を主体とした炎症細胞浸潤（炎症）及び軽度の線維化が観察された（図１Ｆ，図２Ｄ）。炎症細胞浸潤（炎症）の発生頻度は、投与回数に比例して増加する傾向が認められた（表４、５）。線維化は中心静脈周辺かつ肝細胞を取り囲むように認められ（図２Ｄ）、５例中３〜４例の割合で各群に認められた（表４、５）。しかし、ヒトの肝硬変で報告されているようなｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓまで進行した線維化像はすべての群において認められなかった。
【００３４】
病理組織学的検査の結果、高脂肪食＋四塩化炭素を１回投与した群（Ｇｒｏｕｐ  ３〜５）においては、肝細胞内に小脂肪滴の蓄積のみ認められたが、高脂肪食＋四塩化炭素を４回以上投与した群においては、臨床でのヒトＮＡＳＨで報告されている中心静脈周囲の炎症細胞浸潤（炎症）、中心静脈周囲の肝細胞の風船様腫大及び中心静脈周囲の線維化が観察された。高脂肪食＋四塩化炭素を４回以上投与した群のうち、高脂肪食＋四塩化炭素の４回投与群（Ｇｒｏｕｐ  ７）及び高脂肪食＋四塩化炭素の６回投与群（Ｇｒｏｕｐ  ８）では５例中１例、高脂肪食＋四塩化炭素の８回投与群（Ｇｒｏｕｐ  ９）では５例中３例が、Ｍａｔｔｅｏｎｉらが分類したＮＡＳＨの診断基準（表３のＴｙｐｅ  ４）に一致することが明らかになった。
【００３５】
（ｄ）血液生化学性状（Ｇｒｏｕｐ  １、９）
血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、遊離脂肪酸、中性脂肪を測定したところ、高脂肪食＋四塩化炭素の８回投与群（Ｇｒｏｕｐ  ９）で通常食群（Ｇｒｏｕｐ  １）に対して有意に高かった（表６）。
ＡＳＴ、ＡＬＴ、遊離脂肪酸、中性脂肪は、ヒトＮＡＳＨ患者でも健常人に比べて上昇していることが報告されており、ヒトＮＡＳＨと同様の結果が得られた。
【００３６】
今回の結果から、マウスでは高脂肪食の単独投与のみではＮＡＳＨ様病変は誘発されず、高脂肪食の給餌かつ四塩化炭素の単回投与及び２回投与の場合においても、ＮＡＳＨ様病変は誘発されないことが明らかとなった。また、四塩化炭素を単回投与してから７２時間経過させても、症状が進行することはなく、ＮＡＳＨ様病変は誘発されないことが明らかとなった。
一方、四塩化炭素を４回以上投与することでＮＡＳＨ様病変が誘発されること、さらに四塩化炭素の投与回数の増加によりＮＡＳＨ様病変が強くかつ高頻度に誘導されることが明らかとなった。
また、四塩化炭素８回投与群では、血液生化学性状もヒトＮＡＳＨと類似した結果を示すことが明らかとなった。
ＮＡＳＨの発生機序については十分明らかにされておらず、複数回に渡って肝臓に障害を与えることでＮＡＳＨが誘発されるとの報告もない。今回の結果から、肝障害剤を、通常、肝障害を生じさせる量である１ｍｌ／ｋｇ体重／回よりも低用量で、かつ４回以上投与することにより、ＮＡＳＨ様病変が誘発されることが明らかとなった。ＮＡＳＨの発生機序が未だ不明確な点に鑑みると、ＮＡＳＨ様病変が前記の方法により誘発される理由は、不明である。
【００３７】
【表４】
2014209849.tif 000005
【００３８】
【表５】
2014209849.tif 000006
【００３９】
【表６】
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【００４０】
実施例２
四塩化炭素の投与量を０．２５ｍＬ／ｋｇ体重とした以外は、実施例１と同様に四塩化炭素皮下投与８回（２回／週）を行った。
その結果、表７に示す病理組織所見、図３、４に示す肝臓症状を有するＮＡＳＨモデルマウスを得た。このマウスは、中心静脈周囲に炎症を呈し、線維化を生じており、また、大滴性脂肪肝、肝細胞の風船様腫大を呈した。
【００４１】
【表７】
2014209849.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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