(57)【要約】【課題】本発明の目的は、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得するシステムおよび方法を提供することにある。【解決手段】本発明に係る光学顕微鏡システムは、発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を観察するためのものであり、前記試料からの光を受ける対物レンズおよび前記対物レンズにより作られる像を画像データに変換するイメージセンサを少なくとも含む光学系と、前記細胞を含む試料を載置するステージと、前記ステージおよび／または前記対物レンズを光軸方向に移動させる移動手段と、前記ステージの前記光軸方向の位置および前記画像データを記録でき、前記ステージに対して前記移動を行うよう指示できるコンピュータとを含む。【選択図】図９
2014119762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を観察するための光学顕微鏡システムであって、
前記試料からの光を受ける対物レンズおよび前記対物レンズにより作られる像を画像データに変換するイメージセンサを少なくとも含む光学系と、
前記細胞を含む試料を載置するステージと、
前記ステージおよび／または前記対物レンズを光軸方向に移動させる移動手段と、
前記ステージの前記光軸方向の位置および前記画像データを記録でき、前記ステージに対して前記移動を行うよう指示できるコンピュータと
を含み、
前記コンピュータは、
前記細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすステージの位置、および前記観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすステージの位置を、それぞれ明視野ステージ位置および観察ステージ位置として予め記録し、
前記細胞または前記細胞と同種の細胞についての画像データを取得する際に、前記ステージに対して前記明視野ステージ位置に移動するよう指示し、移動後において前記光学系にて得られた画像データを記録し、続いて、前記ステージに対して、前記明視野ステージ位置と前記観察ステージ位置との差だけ前記観察対象部位に向けて移動するよう指示し、移動後において前記光学系にて得られた前記画像データを記録する
よう構成されている光学顕微鏡システム。
【請求項２】
前記コンピュータは、前記細胞または前記細胞と同種の細胞についての画像データを経時的に取得し、取得の度に、前記明視野ステージ位置および前記観察ステージ位置を記録するよう構成されている請求項１に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項３】
前記コンピュータは、前記明視野ステージ位置および前記観察ステージ位置の複数の組み合わせであって、各々が互いに異なる対物レンズに対応する組み合わせを予め記録しており、画像データを取得する際に、使用される前記対物レンズに応じた前記組み合わせを使用するよう構成されている請求項１または２に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項４】
前記コンピュータは、前記明視野ステージ位置および前記観察ステージ位置の複数の組み合わせであって、各々が前記対物レンズの色収差の特性並びに発光および／または蛍光の観察において使用される光の波長に対応する組み合わせを予め記録しており、画像データを取得する際に、使用される前記対物レンズおよび前記光の波長に応じた、前記明視野ステージ位置と前記観察ステージ位置との組み合わせを使用するよう構成されている請求項１または２に記載の光学顕微鏡システム。
【請求項５】
前記コンピュータは、画像データを取得する際に、前記ステージが明視野位置に移動した後、および／または前記ステージが前記明視野ステージ位置から、前記明視野ステージ位置と前記観察ステージ位置との差だけ前記観察対象部位に向けて移動した後、前記光学系にて得られた画像データの焦点が合っているかを判定し、合っていない場合には焦点が合うよう前記ステージに対してさらに移動するよう指示するよう構成されている請求項１から４の何れか１項に記載の光学顕微鏡システム
【請求項６】
発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を、光学顕微鏡を用いて観察する方法であって、
前記細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置と、前記観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置とを、それぞれ明視野位置および観察位置として予め決定すること、および
前記細胞または前記細胞と同種の細胞について、フォーカス面を前記明視野位置に合わせて明視野画像を取得した後、フォーカス面を、前記明視野位置と前記観察位置との差だけ、前記観察対象部位に向けて移動させ、前記観察対象部位の発光または蛍光の画像を取得すること
を含む方法。
【請求項７】
前記画像の取得は経時的に行われ、取得の度に、前記明視野位置および前記観察位置が決定される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予め決定された前記明視野位置および前記観察位置の複数の組み合わせであって、各々が互いに異なる対物レンズに対応する組み合わせの中から、使用される前記対物レンズに応じた前記組み合わせを使用して画像データを取得する請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
予め決定された前記明視野位置および前記観察位置の複数の組み合わせであって、各々が前記対物レンズの色収差の特性並びに発光および／または蛍光の観察において使用される光の波長に対応する組み合わせの中から、使用される前記対物レンズおよび前記光の波長に応じた前記組み合わせを使用して画像データを取得する請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
画像を取得する際に、フォーカス面を前記明視野位置に合わせた後、および／またはフォーカス面を、前記明視野位置と前記観察位置との差だけ前記観察対象部位に向けて移動させた後、画像の焦点が合っているかを判定し、合っていない場合には焦点を合わせることを含む請求項６から９の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡システムおよび光学顕微鏡を用いて細胞を観察する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発光または蛍光を利用して、生物試料をイメージングする技術は、生命科学の研究において必須のものとなっている。例えば、ルシフェラーゼといった発光酵素を含む生きた細胞に対して、ルシフェリンといった発光基質を投与して触媒反応を生じさせ、そのときに生じる発光が顕微鏡により検出される。あるいは、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）といった蛍光タンパク質を含む生きた細胞に対して、この蛍光タンパク質に応じた励起光を照射し、これによって生じる蛍光が顕微鏡により検出される。
【０００３】
生物試料のイメージングにおいて、観察すべき位置に適切にフォーカスを合せることが重要となる。例えば、細胞内の特定の構造を発光または蛍光を用いて観察する場合、フォーカスが合っていないと正しく細胞内の構造を認識することができない。また、光が微弱な場合には、フォーカスを合せることが難しくなるため、実験上の誤差の原因にもなりかねない。
【０００４】
特許文献１および２には、フォーカスを合せる技術が開示されている。特許文献１では、対物レンズを通して光を試料容器の底面へ照射し、光の照射位置を上下に移動させながら試料容器の底面からの鏡面反射光の強度を順番に検出し、検出した光の感度に基づいて試料容器の底面位置を検出し、検出した位置情報を元に試料容器内の試料の位置を推定し、推定した位置に光をフォーカスしている。特許文献２では、対物レンズを通して光を試料容器の底面へ下から斜めに照射し、試料容器の底面からの鏡面反射光のＸＹ平面上でのずれ量を光検出器で検出し、検出したずれ量に基づいて試料容器の光軸上での底面位置を検出し、検出した位置情報を元に試料容器内の試料の位置を推定し、推定した位置に光をフォーカスしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５４１４３０号公報
【特許文献２】特表２００２−５４２４８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得するシステムおよび方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
実施形態１に係る方法は、発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を、光学顕微鏡を用いて観察する方法であって、前記細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置と、前記観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置とを、それぞれ明視野位置および観察位置として予め決定すること、および前記細胞または前記細胞と同種の細胞について、フォーカス面を前記明視野位置に合わせて明視野画像を取得した後、フォーカス面を、前記明視野位置と前記観察位置との差だけ、前記観察対象部位に向けて移動させ、前記観察対象部位の発光または蛍光の画像を取得することを含む。
【０００８】
実施形態２に係る光学顕微鏡システムは、発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を観察するためのものであり、前記試料からの光を受ける対物レンズおよび前記対物レンズにより作られる像を画像データに変換するイメージセンサを少なくとも含む光学系と、前記細胞を含む試料を載置するステージと、前記ステージおよび／または前記対物レンズを光軸方向に移動させる移動手段と、前記ステージの前記光軸方向の位置および前記画像データを記録でき、前記ステージに対して前記移動を行うよう指示できるコンピュータとを含み、前記コンピュータは、前記細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすステージの位置、および前記観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすステージの位置を、それぞれ明視野ステージ位置および観察ステージ位置として予め記録し、前記細胞または前記細胞と同種の細胞についての画像データを取得する際に、前記ステージに対して前記明視野ステージ位置に移動するよう指示し、移動後において前記光学系にて得られた画像データを記録し、続いて、前記ステージに対して、前記明視野ステージ位置と前記観察ステージ位置との差だけ前記観察対象部位に向けて移動するよう指示し、移動後において前記光学系にて得られた前記画像データを記録するよう構成されている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得するシステムおよび方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、細胞と、対物レンズと、フォーカス面との関係を概略的に示す図である。
【図２】図２は、フォーカス面が細胞に対して特定の位置にあるときに観察される像を概略的に示す図である。
【図３】図３は、細胞に対するフォーカス面の位置と、観察される明視野像におけるコントラストとの関係を概略的に示す図である。
【図４】図４は、アクロマート、アポクロマートおよびフルオリートという３種のレンズの波長ごとの合焦位置を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、フォーカス面を一定間隔ずつ移動させながら観察される、細胞の明視野画像の集まりである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、フォーカス面を一定間隔ずつ移動させながら観察される、細胞の発光画像の集まりである。
【図６】図６は、図５Ａおよび図５Ｂにて取得された画像の一部である。
【図７】図７は、発光の波長と、明視野位置と観察位置との差との関係を示すグラフである。
【図８】図８は、発光の波長と、明視野位置および観察位置との関係を示すグラフである。
【図９】図９は、実施形態に係る光学顕微鏡システムを概略的に示す図である。
【図１０】図１０は、実施形態を使用して取得されたタイムラプスのデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１実施形態は、発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を、光学顕微鏡を用いて観察する方法に関する。
【００１２】
細胞は、例えば、動物または植物に由来する細胞であってよく、または、微生物細胞であってよい。細胞は、生きた細胞であってよい。また、細胞は、培養細胞のように単離された１以上の細胞であってよい。あるいは、細胞は、幹細胞のように分化過程でコロニー化した細胞群であってよい。あるいは、細胞は、組織中の１以上の細胞であってよい。この場合、例えば、組織切片を顕微鏡のステージにセットし、その切片中の１つ１つの細胞を観察してもよい。さらに、細胞は、個体中の１以上の細胞であってよい。
【００１３】
観察対象部位は、細胞に含まれるあらゆる部分または構造であってよい。例えば、核といった細胞小器官、細胞膜、細胞質等であってよい。さらに、細胞全体が発光および／または蛍光を発する場合には、細胞自体が観察対象部位となる。
【００１４】
観察対象部位は、発光および／または蛍光を発する。発光を使用する場合には、例えばルシフェラーゼといった発光酵素が利用され、蛍光を使用する場合には、例えばＧＦＰといった蛍光タンパク質が利用される。発光酵素を利用する場合には、それに応じた基質を細胞に投与して、発光反応を誘導することで生物発光を生じさせる。蛍光タンパク質を利用する場合には、それに応じた励起光を細胞に照射することで蛍光を生じさせる。蛍光および発光を同時に使用する場合、同一の細胞内でこれらを生じさせてよく、あるいは異なる細胞においてそれぞれを生じさせてよい。さらに、いわゆるＦＲＥＴまたはＢＲＥＴのように、２種の蛍光タンパク質間における相互作用または発光タンパク質と蛍光タンパク質との間の相互作用を介して、発光および／または蛍光を生じさせてもよい。
【００１５】
発光酵素および蛍光タンパク質は、一般的な手法により細胞に導入することができる。例えば、発光酵素および／または蛍光タンパク質の遺伝子を細胞に導入し、その遺伝子を発現させることで、発光酵素および／または蛍光タンパク質を含む細胞を作製することができる。また、これらの遺伝子に、観察対象部位に局在するタンパク質の遺伝子を繋いでおくことで、発光酵素または蛍光タンパク質とこの局在タンパク質との融合タンパク質を含む細胞を作製することができ、観察対象部位において特異的に発光または蛍光を生じさせることもできる。
【００１６】
光学顕微鏡は、細胞を観察するのに適した倍率を有する対物レンズ、明視野像を観察するための光源、蛍光タンパク質に励起光を照射するための光源、細胞からの発光および／または蛍光を観察するためのフィルター等を必要に応じて備える。
【００１７】
光学顕微鏡は、人の目で観察するための接眼レンズを備えてよい。また、光学顕微鏡は、観察された像を画像データに変換するための撮像素子を備えてよい。さらに、光学顕微鏡は、ステージの移動、レンズの移動、撮像等を、プログラムに沿って自動で行うための手段を備えていてよい。
【００１８】
本発明に係る方法は、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置と、観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置とを、それぞれ明視野位置および観察位置として予め決定することを含む。
【００１９】
フォーカス面とは、フォーカスが厳密に合った状態で対象を観察することができるような平面を意味する。一般に、顕微鏡の設定条件ごとに、１つのフォーカス面が存在する。図１には、細胞と、対物レンズと、フォーカス面との関係が概略的に示されている。図１では、細胞１１および培地１７が入れられたシャーレ１６が、顕微鏡に備えられているステージ１５上に置かれている様子が示されている。対物レンズ１４が、シャーレ１６の底面に位置している。シャーレ１６は例えば透明なプラスティックで出来ており、対物レンズ１４により、シャーレ１６の底面を介して、細胞１１が観察される。細胞１１の中には、核１２が存在している。対物レンズ１４に対して、ただ１つのフォーカス面１３が存在している。フォーカス面１３は、対物レンズ１４をその光軸方向に移動させたり、ステージ１５を前記光軸方向に移動させたり、光学系内部の設定を変更すること等により、また、互いの距離を対物レンズの光軸方向に対し相対的に移動可能な移動手段と組み合わせることによって光軸方向に移動させることができる。
【００２０】
細胞に対するフォーカス面の位置に応じて、観察される細胞の像は異なる。図２には、フォーカス面が細胞に対して特定の位置にあるときに観察される像が概略的に示されている。図２ａのように、細胞２１とフォーカス面２３とが大きく離れている場合、細胞を認識することができない明視野像が得られるか（図２ｂ）、またはフォーカスが合っておらず輪郭の不鮮明な細胞の明視野像が得られる。一方、図２ｃのように、フォーカス面２３と細胞２１との距離がごく小さいか、またはフォーカス面２３と細胞２１とが交わっている場合、細胞とその周囲とのコントラストにより、輪郭が鮮明な細胞の明視野像が得られる（図２ｄ）。
【００２１】
第１実施形態に係る方法では、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像、すなわち、細胞を最も鮮明に認識することができる明視野像が得られるときの、フォーカス面の位置が決定される。
【００２２】
図３には、細胞に対するフォーカス面の位置と、明視野像のコントラストとの関係が概略的に示されている。特に、図３の左側には、フォーカス面の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と、その位置に応じた明視野像におけるコントラスト（ｃｏｎｔｒａｓｔ）との関係を示すグラフが示されている。図３の右側には、細胞３１とフォーカス面３３との位置関係が示されている。左側のグラフ中のｐｏｓｉｔｉｏｎと、右側の概略図中の、細胞３１を基準としたフォーカス面３３の位置とは対応しており、例えば、右側の概略図において、細胞３１の上部に記載されたフォーカス面３３は、左側のグラフ中の上側の破線で示される位置のコントラストを与える。
【００２３】
図３からわかるように、細胞３１を通過するようにフォーカス面３３を移動させながら明視野像を観察した場合、コントラストがピークとなる点が２つ存在する。この２つのピークは、フォーカス面３３が、それぞれ細胞３１の上端付近および下端付近に存在するときに得られる。
【００２４】
また、一般に、細胞の明視野像を観察すると、細胞が黒く、その周囲が白くなるような像を示す場合と、細胞が白く、その周囲が黒くなるような像を示す場合がある。便宜上、前者のようなコントラストをポジティブコントラストと呼び、後者のようなコントラストをネガティブコントラストと呼ぶ。ポジティブコントラストとネガティブコントラストとの切り替わりは、図３のグラフにおいて、コントラストの２つのピークの間の谷になっている位置である。この位置は、細胞３１のほぼ中央の位置に相当する。
【００２５】
したがって、図３の左側のグラフにおけるコントラストの２つのピークのうち、一方はポジティブコントラストであり、他方はネガティブコントラストとなる。本発明において決定される、コントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置は、この２つのピークに対応する何れか１つの位置であってよく、またはこの２つのピークに対応する両方の位置であってよい。このように決定された、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置を、便宜上、明視野位置と称し、特に、ポジティブコントラストに対応する位置を第１明視野位置、ネガティブコントラストに対応する位置を第２明視野位置とそれぞれ称する。
【００２６】
決定された明視野位置は、適宜、記録される。記録は、例えば顕微鏡の設定状態を記録することで行われる。顕微鏡の設定状態とは、対物レンズの位置を調整するためのハンドルの目盛の状態、ステージの高さの状態等を含む。あるいは、記録は、コンピュータ上で作動するソフトウェアによって記録される。
【００２７】
第１実施形態に係る方法では、明視野位置とともに、観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置が決定される。すなわち、フォーカス面を移動して、観察の対象として適切な発光または蛍光の像を特定し、そのときのフォーカス面の位置を決定する。観察対象部位は、細胞のなかで様々な位置に存在し得るため、最適な位置が決定される。このとき決定される、観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置を、便宜的に、観察位置と称する。
【００２８】
図２ｅおよび図２ｆには、観察対象部位についての発光または蛍光の像を観察する様子が概略的に示されている。図２ｅに示される図では、細胞２１中の核２２に発光酵素または蛍光タンパク質が存在しており、既に発光または蛍光を発する状態となっている。図２ｅのように、この核２２をフォーカス面２３が通過するとき、図２ｆのように、核２２を観察することができる。なお、発光または蛍光を観察する場合には、その発光または蛍光以外の光を遮断することで、図２ｆのように、発光または蛍光のみを明瞭に観察することができる。
【００２９】
決定された観察位置は、適宜、記録される。記録は、例えば顕微鏡の設定状態を記録することで行われる。顕微鏡の設定状態とは、対物レンズの位置を調整するためのハンドルの目盛の状態、ステージの高さの状態等を含む。あるいは、記録は、コンピュータ上で作動するソフトウェアによって記録される。
【００３０】
明視野位置および観察位置の決定に続き、それらの情報に基づいて、観察対象部位の発光または蛍光の画像が取得される。
【００３１】
明視野位置および観察位置の決定の際に使用した細胞と、画像の取得の際に使用する細胞とは、同一の細胞であってよく、または、異なる細胞であるものの同種の細胞であってよい。例えば、細胞を経時的に観察する場合には、ある細胞を使用して位置の決定を行った後、その細胞について、引き続き画像の取得を繰り返し行うことができる。あるいは、小さなスケールで培養した細胞を使用して位置を決定した後、同一条件にて大きなスケールで培養した細胞について画像を取得することができる。
【００３２】
発光または蛍光の画像の取得のために、まず、フォーカス面を明視野位置に合わせて明視野の画像が取得される。明視野位置へのフォーカス面の移動は、手動で行ってもよく、または自動で行ってもよい。自動で行われる場合、例えば、コンピュータ上で作動するソフトウェア等の制御によって行われる。取得される画像は、コンピュータ等に記録される。一方、手動で行う場合、例えば、コンピュータと一体または接続されるディスプレイ上の画面に、取得した各種画像を表示させ、使用者がコンピュータと一体または接続される各種入力用操作手段（キーボード、入力用マウス等）を操作して、画面を見ながらフォーカス面を移動させてもよい。
【００３３】
明視野画像の取得に続いて、フォーカス面が明視野位置から移動される。このとき、フォーカス面は、明視野位置と観察位置との差の分だけ、観察対象部位に向けて移動される。すなわち、フォーカス面は観察位置に移動する。移動は、上述したように手動で行われてもよい。あるいは、移動は、例えばコンピュータ上で作動するソフトウェア等による制御によって自動で行われてもよく、この場合、コンピュータ上に記録された、明視野位置および観察位置の情報に基づいてそれらの差が算出され、その差の分だけフォーカス面が観察対象部位に移動するように顕微鏡を作動させる。
【００３４】
フォーカス面の移動が完了した後、観察対象部位についての発光または蛍光の画像が取得される。取得される画像は、コンピュータ等に記録される。
【００３５】
明視野画像の取得、フォーカス面の移動、および発光または蛍光の画像の取得は、繰り返し行うこともできる。例えば、経時的に観察する場合には、特定のスケジュールに基づいて、これらの操作が繰り返し行われる。例えば、画像の取得の度に、明視野位置および観察位置の決定を行うことができる。すなわち、明視野位置および観察位置の決定と、それらの位置を利用した画像の取得とから成る一連の工程を、複数回繰り返していもよい。
【００３６】
なお、決定される明視野位置として、第１明視野位置が選択された場合には、その第１明視野位置にて明視野画像が取得され、第１明視野位置と観察位置との差の分だけフォーカス面が移動され、一方、第２明視野位置が選択された場合には、その第２明視野位置にて明視野画像が取得され、第２明視野位置と観察位置との差の分だけフォーカス面が移動される。
【００３７】
また、第１明視野位置と第２明視野位置との両方が決定された場合には、そのうちの何れか一方を、フォーカス面の移動および発光または蛍光の画像の取得のために使用してよく、または、それらの両方を使用してよい。両方を使用する場合、フォーカス面の移動および発光または蛍光の画像の取得を、それぞれの明視野位置に関して、それぞれ行うことができ、この場合、取得される２つの発光または蛍光の画像のうち、両方を記録することができ、または一方を記録することができる。また、取得されたこれら２つの画像に基づいて、測定上の誤差を解消するような修正等を行った１つの画像を作成してもよい。
【００３８】
明視野位置および観察位置の決定の際の観察条件と同一の観察条件が、発光および蛍光の画像の取得にも適用されることが好ましい。観察条件の例は、対物レンズの種類、対物レンズの倍率、発光または蛍光の波長（すなわち、発光酵素または蛍光タンパク質の種類）、細胞の厚さ等である。
【００３９】
例えば、対物レンズは、色収差の特性が種類ごとに異なっている。一般に、対物レンズでは色収差が補正されているが、補正の違いにより合焦位置に違いが生じる。図４には、アクロマート、アポクロマートおよびフルオリートという３種のレンズの波長ごとの合焦位置が示されている（http://bioimaging.jp/learn/016/より抜粋）。例えば、アクロマートは、赤（６５６．３ｎｍ）および青（４８６．１ｎｍ）の２色について補正されており、この２色については焦点位置からのずれ量がともにゼロとなっている。アポクロマートは、これら２色と紫（４３５．８ｎｍ）の計３色について補正されている。フルオリートは、これら赤（６５６．３ｎｍ）および青（４８６．１ｎｍ）の２色について補正されており、紫（４３５．８ｎｍ）については、アクロマートとアポクロマートの中間程度の補正がなされている。したがって、実施形態に係る方法では、対物レンズの特性の違いに考慮して、対物レンズを選択することが好ましい。特に、発光および／または蛍光の観察において使用される光の波長が複数種類である場合には、使用される光の波長との組み合わせを考慮して対物レンズを選択するのが好ましい。
【００４０】
なお、実施形態に係る方法では、複数種の対物レンズにそれぞれ対応する明視野位置および観察位置の複数の組み合わせを予め決定しておき、画像を取得する際には、それらの中から、使用する対物レンズに応じた組み合わせを選択して使用してもよい。特に、対物レンズの色収差の特性の違いに着目して、対物レンズごとに明視野位置および観察位置の複数の組み合わせを予め決定してよい。さらに、対物レンズの色収差の特性と、発光および／または蛍光の観察において使用される光の波長との関係に着目して、明視野位置および観察位置の複数の組み合わせを予め決定し、画像を取得する際には、使用する対物レンズの色収差の特性と光の波長との関係に対応した組み合わせを使用してもよい。
【００４１】
また、実施形態に係る方法では、画像を取得する度に、焦点を合わせるように調節することができる。すなわち、画像を取得する際に、オートフォーカスにより明視野位置および観察位置を調整してもよい。具体的には、フォーカス面を明視野位置に合わせた後、および／またはフォーカス面を、明視野位置と観察位置との差だけ前記観察対象部位に向けて移動させた後、画像の焦点が合っているかを判定し、合っていない場合には焦点を合わせることができる。
【００４２】
実施形態に係る観察方法によれば、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得することができる。
【００４３】
特に、画像取得の際にフォーカスを合せる操作に要する時間を短縮することができる。さらに、そのような操作を自動化することにより、画像取得の効率を飛躍的に向上させることができる。操作のための時間が短縮されることにより、例えば経時的に画像を取得する際に、画像取得の時間間隔を狭めることができ、または、画像取得のタイミングの選択肢を広げることができる。
【００４４】
また、画像取得を繰り返す場合に、毎回、決まった位置にて画像が取得されるため、実験の正確さが向上する。特に、時間の経過につれて、光が弱まったり、光が消失したりする場合であっても、画像取得すべき位置を見失うことなく、それまで取得していた位置と同じ位置にて画像を取得することができる。
【００４５】
さらに、光が微弱な細胞では、毎回目視にて位置を設定することは、観察者にとって大きな負担となるものの、本発明に係る方法によればそのような負担を軽減することができる。
【００４６】
また、レンズ毎に明視野位置および観察位置の情報を取得し、蓄積しておくことも可能であり、レンズを交換したりした場合であっても、蓄積された情報に基づいて適切な位置にフォーカスを合わせることが可能となる。
【００４７】
また、第１実施形態に係る方法では、発光および蛍光の何れを発する細胞でも使用できるが、特に発光を発する細胞を使用する場合には、発光に起因する問題を回避することが可能となる。一般的に発光は蛍光に比べて放射する光の強度が小さく、露光時間を長くとる必要がある。そのため、発光を用いてフォーカスを合わせることは、比較的手間となる。しかし、第１実施形態に係る方法を用いることで、このような手間を解消することが可能となる。
【００４８】
本発明の第２実施形態は、光学顕微鏡システムに関する。
【００４９】
図９には、実施形態に係る光学顕微鏡システム１００が概略的に示される。
【００５０】
図示されるように、実施形態に係る光学顕微鏡システム１００は、少なくとも光学系１０７、ステージ１５、移動手段およびコンピュータ１０８を含む。
【００５１】
光学系１０７は、試料の画像データを作成する。例えば、図９では、ステージ１５上に細胞１１を含む培地１７を収容したシャーレ１６が置かれている。この場合、光学系１０７は、細胞１１を含む像を画像データとして作成する。光学系１０７は、少なくとも対物レンズ１０５およびイメージセンサ１０６を含む。光学系１０７は、結像レンズ、各種フィルター、光源等をさらに含んでよい。
【００５２】
対物レンズ１０５は、試料からの光を受けて像を形成し、イメージセンサ１０６に送る。イメージセンサ１０６は、対物レンズ１０５から送られてきた像を画像データに変換する。イメージセンサ１０６は、コンピュータ１０８に接続されており、コンピュータ１０８に向けて画像データを送る。
【００５３】
ステージ１５は、細胞１１を含む試料を載置することができる。さらに、ステージ１５は、対物レンズ１０５の光軸方向に移動可能である。また、ステージ１５は、対物レンズ１０５の光軸方向と垂直な方向にも移動可能であってよい。便宜上、光軸方向の移動をＺ方向の移動と称し、光軸方向と垂直な方向の移動をＸＹ方向の移動と称する。
【００５４】
移動手段は、ステージ１５および／または対物レンズ１０５を光軸方向（すなわちＺ方向）に移動させる。移動手段によるステージ１５のＺ方向の移動は、コンピュータ１０８の指示に基づいて自動で行われる。しかしながら、Ｚ方向の移動は、自動による移動とともに、手動による移動も行うことができてよい。Ｚ方向の移動を担う移動手段は、例えば図９に示されるような、Ｚ方向駆動部１０１およびＺ方向制御部１０２であってよい。Ｚ方向駆動部１０１は、ステージ１５に接続されており、ステージ１５を直接駆動する。Ｚ方向制御部１０２は、Ｚ方向駆動部１０１およびコンピュータ１０８に接続されており、コンピュータ１０８からの指示に基づいて、Ｚ方向駆動部１０１に対して、ステージ１５の移動について指示を行う。また、移動手段は、対物レンズ１０５を移動させる駆動部および制御部であってもよい。
【００５５】
ＸＹ方向の移動は、コンピュータ１０８の指示に基づいて自動で行われてよく、または手動で行われてもよい。あるいは、ＸＹ方向の移動は、自動および手動の両方で行われてよい。ＸＹ方向の移動は、例えば図９に示されるような、ＸＹ方向駆動部１０３およびＸＹ方向制御部１０４によって行われてよい。ＸＹ方向駆動部１０３は、ステージ１５に接続されており、ステージ１５を直接駆動する。ＸＹ方向制御部１０４は、ＸＹ方向駆動部１０３とコンピュータ１０８に接続されており、コンピュータ１０８からの指示に基づいて、ＸＹ方向駆動部１０３に対して、ステージ１５の移動について指示をする。
【００５６】
コンピュータ１０８は、ステージ１５の光軸方向の位置を記録できる。ステージ１５のＺ方向の位置についての情報は、例えば、Ｚ方向駆動部１０１およびＺ方向制御部１０２を介して取得される。また、コンピュータ１０８は、イメージセンサ１０６から送られてくる画像データを記録できる。さらに、コンピュータ１０８は、ステージ１５に対してＺ方向の移動を行うよう指示できる。コンピュータ１０８は、例えば、ＣＰＵ１０９およびディスプレイ１１０を含み、そのほかに入力用のデバイス等を含んでもよい。
【００５７】
コンピュータ１０８は、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすステージの位置、および観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすステージの位置を、それぞれ明視野ステージ位置および観察ステージ位置として予め記録するよう構成されている。コントラストが最大かどうかの判断および発光または蛍光の如何なる像を取得するかどうかの判断は、使用者によって行われてよく、またはコンピュータ１０８によって行われてもよい。
【００５８】
さらに、コンピュータ１０８は、最適な細胞の画像データを取得するよう構成されている。具体的には、コンピュータ１０８は、明視野ステージ位置および観察ステージ位置の決定において使用した細胞、またはその細胞と同種の細胞についての画像データを取得する際に、ステージ１５に対して明視野ステージ位置に移動するよう指示し、移動後において光学系１７にて得られた画像データを記録する。これにより、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像が得られる。続いて、コンピュータ１０８は、ステージ１５に対して、明視野ステージ位置と観察ステージ位置との差だけ観察対象部位に向けて移動するよう指示し、移動後において光学系１７にて得られた前記画像データを記録する。これにより、観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像が得られる。
【００５９】
さらに、コンピュータ１０８は、細胞についての画像データを経時的に取得するように構成されていてよい。そして、コンピュータ１０８は、画像データの取得の度に、予め明視野ステージ位置および観察ステージ位置の記録を行ってよい。すなわち、明視野ステージ位置および観察ステージ位置の決定と、それらの位置を利用した画像の取得とから成る一連の工程が複数回繰り返されてもよい。
【００６０】
また、コンピュータ１０８は、前記明視野ステージ位置および前記観察ステージ位置の複数の組み合わせであって、互いに異なる対物レンズにそれぞれ対応する組み合わせを予め記録しておいてもよい。そして画像データを取得する場合、使用する対物レンズに対応した組み合わせを使用してよい。特に、対物レンズの色収差の特性の違いに着目して、対物レンズごとに明視野位置および観察位置の複数の組み合わせを決定してよい。さらに、発光および／または蛍光の観察において観察に使用される光の波長が複数種類である場合には、コンピュータ１０８は、前記明視野ステージ位置および前記観察ステージ位置の複数の組み合わせであって、前記対物レンズの色収差の特性並びに発光および／または蛍光の観察において使用される光の波長にそれぞれ対応する組み合わせを予め記録しておいてもよい。そして、画像データを取得する際に、使用する対物レンズおよび光の波長に応じた、明視野ステージ位置と観察ステージ位置との組み合わせを使用してよい。
【００６１】
また、コンピュータ１０８は、画像データを取得する際に焦点を自動で合わせるように構成されていてよい。すなわち、画像を取得する際に、オートフォーカスにより明視野位置および観察位置を調整するように構成されていてもよい。具体的には、ステージが明視野位置に移動した後、そのときの画像データの焦点が合っているかを判定し、合っていない場合には、焦点が合うようにステージを移動させる。同様に、発光または蛍光の画像データを取得する位置にステージが移動した後、そのときの画像データの焦点が合っているかを判定し、合っていない場合には、焦点が合うようにステージを移動させる。
【００６２】
実施形態に係る光学顕微鏡システム１００は、さらに、光学顕微鏡システム１００の少なくとも一部を覆うハウジング１１１を含んでもよい。ハウジング１１１は、例えば、遮光の役割や、細胞１１の培養のために必要な環境を維持する役割を担う。
【００６３】
以下、光学顕微鏡システム１００の動作の例を説明する。
【００６４】
１つ目の例は、画像データの取得の度に、予め明視野ステージ位置および観察ステージ位置の記録を行う例である。
【００６５】
この場合、まず、コンピュータ１０８に対し、明視野での撮影条件（露出時間、Ｚ方向の移動距離、撮影枚数等）を入力する。次に、手動または自動により、ステージ１５の位置を移動させ、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすステージの位置を明視野ステージ位置として決定する。そして、コンピュータ１０８が、この明視野ステージ位置を記録する。さらに、必要に応じて、コンピュータ１０８は、この明視野ステージ位置における画像データを光学系１０７を介して取得し、記録する。続いて、手動または自動により、ステージ１５の位置を移動させ、観察対象として適切な発光および／または蛍光の像をもたらすステージの位置を観察ステージ位置として決定する。そして、必要に応じて、コンピュータ１０８が、この観察ステージ位置を記録する。以上が、明視野ステージ位置および観察ステージ位置の決定の工程である。
【００６６】
続いて、画像データが取得される。具体的には、コンピュータ１０８の指示により、ステージ１５が明視野ステージ位置に移動する。移動後、明視野の画像データが光学系１０７により取得され、コンピュータ１０８に送られ、記録される。次に、コンピュータ１０８の指示により、ステージ１５が観察ステージ位置に移動する。移動後、発光および／または蛍光の画像データが光学系１０７により取得され、コンピュータ１０８に送られ、記録される。
【００６７】
以上のような位置の決定の工程と画像データの工程とが、経時的に繰り返される。
【００６８】
２つ目の例は、使用する対物レンズ１０５に応じて、対応する明視野ステージ位置および観察ステージ位置を使用する例である。
【００６９】
この場合、まず、ある対物レンズ１０５を光学系１０７に装着した状態で、コンピュータ１０８に対し、明視野での撮影条件（対物レンズ特性、倍率、波長特性等）を入力する。次に、手動または自動により、ステージ１５の位置を移動させ、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすステージの位置を明視野ステージ位置として決定する。そして、コンピュータ１０８が、この明視野ステージ位置を記録する。さらに、必要に応じて、コンピュータ１０８は、この明視野ステージ位置における画像データを光学系１０７を介して取得し、記録する。続いて、手動または自動により、ステージ１５の位置を移動させ、観察対象として適切な発光および／または蛍光の像をもたらすステージの位置を観察ステージ位置として決定する。そして、必要に応じて、コンピュータ１０８が、この観察ステージ位置を記録する。このような位置の決定を、別の対物レンズ１０５に替えて繰り返す。
【００７０】
続いて、画像データが取得される。具体的には、まず、観察に適した対物レンズ１０５を装着する。次に、コンピュータ１０８の指示により、ステージ１５が明視野ステージ位置に移動する。このとき、コンピュータ１０８は、使用する対物レンズ１０５に応じた明視野ステージ位置を指定する。移動後、明視野の画像データが光学系１０７により取得され、コンピュータ１０８に送られ、記録される。次に、コンピュータ１０８の指示により、ステージ１５が観察ステージ位置に移動する。このとき、コンピュータ１０８は、使用する対物レンズ１０５に応じた観察ステージ位置を指定する。移動後、発光および／または蛍光の画像データが光学系１０７により取得され、コンピュータ１０８に送られ、記録される。どのような対物レンズ１０５を使用しているかは、手動でコンピュータ１０８に入力してもよいし、コンピュータ１０８が自動で情報を取得してもよい。自動で取得する場合、例えば、光学系１０７を介して、対物レンズ１０５の情報がコンピュータ１０８に伝えられる。
【００７１】
実施形態に係る光学顕微鏡システムによれば、実施形態に係る観察方法と同様に、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得することができる。
【実施例】
【００７２】
＜実施例１＞
種々のルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞を対象として、フォーカス面を移動させながら明視野画像および発光画像を取得した。さらに、取得された画像から明視野位置および観察位置を抽出し、グラフにプロットした。
【００７３】
［ＨｅＬａ細胞の準備］
それぞれ異なるルシフェラーゼ遺伝子を発現する複数のＨｅＬａ細胞を作製した。これらのルシフェラーゼは、互いに異なる波長の発光を生じる発光反応を触媒する。
【００７４】
９種のルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターを使用した。それぞれのベクターに含まれるルシフェラーゼ遺伝子は、ＮａｎｏＬｕｃ、Ｒｅｎｉｌｌａ、ＣＢＧ、Ｌｕｃ２およびＣＢＲ（これら５種はプロメガ株式会社製である）、ならびにＥｌｕｃ、ＳＬＧ、ＳＬＯおよびＳＬＲ（これらの４種はＴＯＹＯＢＯ製である）であった。
【００７５】
３５ｍｍガラスボトムディッシュにて一晩培養したＨｅＬａ細胞に対して、上記９種のルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターをそれぞれトランスフェクションし、トランスフェクトされた９種のＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭ培地を用いてそれぞれ一晩培養した。遺伝子のトランスフェクションには、ＦｕＧＥＭＥ（プロメガ株式会社製）を用い、それぞれ１μｇ／μｇのＤＮＡを導入した。翌日、それぞれの培地を、ＨＥＰＥＳ入りＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、フェノールレッド抜き）に置き換えた。
【００７６】
［ＨｅＬａ細胞の観察］
ＨｅＬａ細胞の発光観察のために、培地にそれぞれのルシフェラーゼに適した発光基質を添加し、発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を使用して、ＨｅＬａ細胞を観察した。ＣＢＧ、Ｌｕｃ２、ＣＢＲ、Ｅｌｕｃ、ＳＬＧ、ＳＬＯおよびＳＬＲには、Ｄ−ルシフェリン（プロメガ株式会社製：最終濃度１ｍＭ）を添加し、ＮａｎｏＬｕｃに対しては、フリマジン（プロメガ株式会社製：Ｎａｎｏ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍキット添付の基質を２００倍希釈して使用）、そしてＲｅｎｉｌｌａ観察時には、セレンテラジン（プロメガ株式会社製：最終濃度５０μＭ）を加えた。対物レンズとして、ＵＰｌａｎＡｐｏ  １００ｘ  ＮＡ１．３５  Ｏｉｌ（オリンパス株式会社製）およびＵｐｌａｎ  ＦＬＮ  ４０ｘ  ＮＡ１．３  Ｏｉｌ（オリンパス株式会社製）の２つを使用した。ｂｉｎｎｉｎｇは１×１と設定した。ＣＣＤカメラとして、ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）を顕微鏡に備え付けた。フォーカス面を移動させるために、Ｚフォーカスコントローラー（ＥＳ１０ＺＥ  プライアー・サイエンティフィック株式会社製）をＬＶ２００に取り付けて使用した。
【００７７】
露出時間は、ルシフェラーゼの種類および対物レンズの種類に応じて決定し、以下の表１の通りとした。表の各ルシフェラーゼは、最大吸収波長（λｍａｘ）の短い順となっており、波長のＮａｎｏＬｕｃが４６１ｎｍ付近（青色）、Ｒｅｎｉｌｌａが４９３ｎｍ付近（青色）、Ｅｌｕｃが５４１ｎｍ（緑色）付近、ＣＢＧが５５０ｎｍ付近（緑色）、ＳＬＧが５５７ｎｍ付近（緑色）、ＳＬＯが５８６ｎｍ付近（黄色）、Ｌｕｃ２が６０９ｎｍ付近（橙色）、ＣＢＲが６１７ｎｍ付近（橙色）、およびＳＬＲが６２６ｎｍ付近（赤色）である。
【００７８】
【表１】
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フォーカス面を、１００倍レンズ使用時にはＺ方向に０．５μｍずつ、４０倍レンズ使用時にはＺ方向に２μｍずつ、それぞれ段階的に移動させ、各位置における明視野画像および発光画像を撮影し、保存した。これらの移動ピッチ（単位移動数）は対象となる試料（ここでは１個の細胞）の光軸方向の大きさに応じて設定し、フォーカス面が細胞を３回、好ましくは５回以上停止するようにした。このようにフォーカス面を段階的に移動させることは、蛍光よりも露光時間が長い発光の観察において効率を良くし、且つ充分な撮影精度を得るのに都合が良いことが確認された。
【００７９】
保存した観察画像を、画像解析システム“ｃｅｌｌＳｅｎｓ（登録商標）”（オリンパス株式会社製）を用いて、対物レンズに近い側（近点側）および遠い側（遠点側）のそれぞれにおいてコントラストの最も高い画像を与えたフォーカス面の位置と、最適な発光画像を与えたフォーカス面の位置とを決定した。
【００８０】
近点側の最も高いコントラストの明視野画像を与えるフォーカス面の位置と発光画像を与えるフォーカス面の位置との差、ならびに遠点側の最も高いコントラストの明視野画像を与えるフォーカス面の位置と発光画像を与えるフォーカス面の位置との差をグラフにプロットした。
【００８１】
［観察結果］
ある１つのルシフェラーゼとある１つの対物レンズを使用して取得された明視野画像および発光画像を図５Ａおよび図５Ｂに示す。
【００８２】
図５Ａには、フォーカス面が複数の細胞が存在する試料中を通過したときに、一定間隔置きに取得された１から１７の明視野画像が配列されている。画像１から画像８付近まででは、細胞が白く、その周囲が黒く見えるのに対し、画像９付近から画像１７まででは、それらが反転し、細胞が黒く、その周囲が黒く見えている。
【００８３】
図５Ｂには、フォーカス面が複数の細胞が存在する試料中を通過したときに、一定間隔置きに取得された１から１７の発光画像が配列されている。これらの画像の番号は、図５Ａの画像の番号と対応しており、同じ番号の画像は、フォーカス面が同じ位置にあるときに取得された画像である。画像毎に、発光している細胞の見え方がわずかに変わっている様子がわかる。特に、特定の１つの細胞に着目した場合、画像１では、輪郭が不明瞭で弱い光で発光しているのに対し、画像８付近では、輪郭がはっきりし、光も強くなっており、しかしながら、画像１７付近では、再び輪郭が不明瞭となり、光も弱まっていることがわかる。
【００８４】
図５Ａおよび図５Ｂから、近点側の最も高いコントラストの明視野画像、遠点側の最も高いコントラストの明視野画像、および最適な発光画像を選択した。それらを図６に示す。図６ａは、近点側の最も高いコントラストの明視野画像であり、図５Ａでは画像６に対応する。図６ｂは、遠点側の最も高いコントラストの明視野画像であり、図５Ａでは画像１１に対応する。図６ｃは、最適な発光画像であり、図５Ｂでは画像８に対応する。
【００８５】
種々の条件において取得された画像から、それぞれ、近点側明視野位置、遠点側の明視野位置および観察位置を決定し、それらから算出された明視野位置と観察位置との差を算出した。その結果を、ルシフェラーゼによる発光の波長を横軸とし、明視野位置と観察位置との差を縦軸とするグラフにプロットした（図７）。図７ａは、近点側の明視野位置と観察位置との差をまとめたグラフである。図７ｂは、遠点側の明視野位置と観察位置との差をまとめたグラフである。それぞれの図において、１００倍の対物レンズを使用して得られたプロットを線で結び、さらに、４０倍の対物レンズを使用して得られたプロットを線で結んでいる。
【００８６】
また、近点側の明視野位置、遠点側の明視野位置および観察位置を、ルシフェラーゼによる発光の波長を横軸とし、位置を縦軸とするグラフにプロットした（図８）。図８ａには、１００倍の対物レンズを使用して得られた結果がまとめられており、図８ｂには、４０倍の対物レンズを使用して得られた結果がまとめられている。図８では、それぞれの位置を観察位置によって標準化しており、観察位置は常に０の位置となり、明視野位置は観察位置を基準とした位置としてプロットされている。また、それぞれの図において、近点側の明視野位置のプロットを線で結び（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）、遠点側の明視野位置のプロットを線で結び（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）、さらに、観察位置のプロットを線で結んだ（Ｌｕｃ  Ｆｏｃｕｓ）。
【００８７】
図７および図８の結果から、観察に使用する発光の波長が異なることで、明視野位置も異なる場合があることがわかる。また、図７の結果から、より低い倍率のレンズを使用すると、明視野位置と観察位置との差が大きくなる傾向にあることがわかる。さらに、図８の結果から、近点側の明視野位置と比べて、遠点側の明視野位置の方が、観察位置に近くなる傾向にあることがわかる。また、明視野位置と観察位置との差は、発光試薬としてのルシフェラーゼの各最大吸収波長により、ずれ量が決まる傾向があった。このずれ量の大小は、発光強度ではなく使用する対物レンズの特性（とくに色収差特性と倍率）の組合せで予め調整できることが示された。このことは、例えば複数種類の発光および／蛍光によりフォーカス面を調節する場合に、試薬ごとの最大吸収波長に応じてずれ量を調節するように試料ステージを移動しながら撮像するのが好ましいことを示唆している。
【００８８】
＜実施例２：タイムラプス観察＞
ｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子のプロモーターで制御されたルシフェラーゼベクターを導入したＨｅＬａ細胞を対象として、フォーカス面を移動させながら明視野画像および発光画像を取得した。さらに、取得された画像から明視野位置および観察位置を抽出し、グラフにプロットした。
【００８９】
［ＨｅＬａ細胞の準備］
ｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子のプロモーターで制御されたＬｕｃ２ルシフェラーゼベクターを安定的に発現したＨｅＬａ細胞を作製した。３５ｍｍガラスボトムディッシュにて一晩培養したＨｅＬａ細胞を培養し、ＨＥＰＥＳ入りＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、フェノールレッド抜き）に置き換えた。
【００９０】
［ＨｅＬａ細胞の観察］
ＨｅＬａ細胞の発光観察のために、Ｄ−ルシフェリン（プロメガ株式会社製：最終濃度１ｍＭ）を添加し、発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を使用して、ＨｅＬａ細胞を観察した。対物レンズとしてＵＰｌａｎＳＡＰＯ  ２０ｘ（オリンパス株式会社製）を使用した。ｂｉｎｎｉｎｇは１×１と設定した。ＣＣＤカメラとして、ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）を顕微鏡に備え付けた。フォーカス面を移動させるために、Ｚフォーカスコントローラー（ＥＳ１０ＺＥ  プライアー・サイエンティフィック株式会社製）をＬＶ２００に取り付けて使用した。あらかじめ遠点側の最も高いコントラストの明視野画像、および最適な発光画像に対するフォーカス位置を設定した（明視野画像：フォーカス位置１０μｍ、発光画像フォーカス位置０μｍ）。明視野画像と発光画像のタイムラプス観察を実施した。露出時間は、明視野撮影時は１００ｍｓｅｃ、発光画像撮影時を４分として、１５分間隔で、１５時間連続撮影を行った。
【００９１】
［観察結果］
観察結果を図１０に示す。図１０には、観察開始時、観察５時間、観察１０時間および観察１５時間の４つの時点における、明視野画像（フォーカス位置は１０μｍおよび０μｍ）および発光画像（フォーカス位置は０μｍ）が示される。
【００９２】
２種の明視野画像を比較すると、フォーカス位置が１０μｍである場合の方が、より高いコントラストで細胞１つずつの様子を観察できることがわかる。フォーカス位置が０μｍの場合、発光画像としては適切であるが、明視野画像としては適切でないことがわかる。また、経時的に繰り返し観察を行っても、明視野画像および観察画像のそれぞれに適切な画像が取得できることがわかる。
【符号の説明】
【００９３】
１１…細胞、１２…核、１３…フォーカス面、１４…対物レンズ、１５…ステージ、１６…シャーレ、１７…培地、２１…細胞、２２…核、２３…フォーカス面、２４…視野、３１…細胞、３２…核、３３…フォーカス面、１００…光学顕微鏡システム、１０１…Ｚ方向駆動部、１０２…Ｚ方向制御部、１０３…ＸＹ方向駆動部、１０４…ＸＹ方向制御部、１０５…対物レンズ、１０６…イメージセンサ、１０７…光学系、１０８…コンピュータ、１０９…ＣＰＵ、１１０…ディスプレイ、１１１…ハウジング。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図１０】
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