(57)【要約】【課題】大腸癌検診に使用される便中ヘモグロビンまたはトランスフェリン項目のサーベイランスや標準化などの精度管理を精密に行うために使用できる疑似便とその方法が求められていた。【解決手段】、米粉や小麦粉にヘモグロビンまたはトランスフェリンなどの測定項目の成分および検出可能な第３物質を高濃度添加した擬似便を作成した。これを検体として採便器により疑似便を採取し、測定項目を測定する他、第３の物質濃度を測定することにより疑似便の採取量を正確に算出出来るようになった。これにより採便器の機能や採便者の技量が影響せずに、便中ヘモグロビンまたはトランスフェリン項目の精度管理が可能になった。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉体に水溶液を浸潤させて作成する擬似便において、ヘモグロビン及び・またはトランスフェリンおよび検出可能な第３の物質（以下第３物質という）を含有する事を特徴とする擬似便。
【請求項２】
請求項１の擬似便を器具によって採取し、希釈溶液に分散・希釈する工程を持つ便中ヘモグロビンまたはトランスフェリンを測定する方法において、擬似便を分散・希釈した溶液中の第３物質濃度を測定することにより擬似便の採取量を算出する事を特徴とする採取量の測定方法。
【請求項３】
請求項１の第３物質が、酸化還元酵素とペルオキシダーゼまたはジアホラーゼを使用して測定可能な物質である。請求項１の擬似便。
【請求項４】
請求項１の第３物質が、４−アミノアンチピリンである。請求項１の擬似便。
【請求項５】
請求項２の第３物質が、酸化還元酵素とペルオキシダーゼを使用して測定可能な物質である。請求項２の方法。
【請求項６】
請求項２の第３物質が、４−アミノアンチピリンである。請求項２の方法。
【請求項７】
請求項３の酸化還元酵素とペルオキシダーゼまたはジアホラーゼを使用して測定可能な物質が、グリセロールまたはグリセロール−３―リン酸、乳酸である請求項３の擬似便。
【請求項８】
請求項５の酸化還元酵素とペルオキシダーゼまたはジアホラーゼを使用して測定可能な物質が、グリセロールまたはグリセロール−３―リン酸、乳酸である請求項５の方法。
【請求項９】
請求項３の酸化還元酵素とペルオキシダーゼまたはジアホラーゼを使用して測定可能な物質がグルコースまたは２糖類、リン酸塩である請求項３の擬似便。
【請求項１０】
請求項５の酸化還元酵素とペルオキシダーゼまたはジアホラーゼを使用して測定可能な物質がグルコースまたは２糖類、リン酸塩である請求項５の方法。
【請求項１１】
請求項１、請求項３、請求項４，請求項７、請求項９の擬似便を使用し、採便器またはヘモグロビンまたはトランスフェリンの精度管理を行う方法。
【請求項１２】
請求項２、請求項５、請求項６、請求項８、請求項１０の方法を使用して採便器またはヘモグロビンまたはトランスフェリンの精度管理を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸癌検診分野において、サーベイや標準化などに使用される人工的な擬似便の組成、及び採取された擬似便量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
便中ヘモグロビンや便中トランスフェリンは、大腸癌の健診に重要なスクリーニング検査になっている。しかし、この重要な健診項目については、まだ標準化が行われておらず、各施設の測定値がどうなっているのかがほとんど不明で、その状況を知るために行われる全国的な検査値のサーベイランス（以後サーベイという）も実質上行われていないのが現状である。この理由は便検体中のヘモグロビンやトランスフェリンの安定性が極端に悪く、サーベイ用便検体を配布・保存する事が実質不可能である事や、採便した便量の誤差が大きい事が原因であった。安定性については、便の実検体を使用する代わりに、米粉や小麦粉、ジャガイモデンプン、トウモロコシ粉、大豆蛋白等を原料に、ヘモグロビンまたはトランスフェリンの安定化剤を添加した水溶液を混合均質化した人工的な擬似便を作成し、配布・保存に安定な擬似便を使用する事で、半ば解決の可能性がある。
【０００３】
しかし、採取した擬似便量の誤差については、採取する際に使用する採便器が種々ある事や採取する個人差も発生する事で、誤差を実質上なくすことは困難性があった。具体的には、検査施設において使用されるキットに付属する採便器で便を採取する様になっており、その採便器については各社キットそれぞれで採便方式や機能が異なっているのが現状である。即ち、採便量、採便方法、採取した便の希釈溶液組成、希釈溶液量が検査施設毎に異なっており、加えてたとえ均質な擬似便を採取しても採取量が人個人の技量が大きく左右する事は、どうしても避けることが出来なかった。この様な状況では、標準化やサーベイが出来るような環境ではなかった。
【０００４】
擬似便は粉体に水溶液を混ぜ込んだスラリー状の物質であり、それを採取する採便器にはプラスチックの棒に溝や切り込み、ブラシなどを装備した採便棒があり、その採便棒の空間に便を擦り入れて取る方式が多い。さらに、実際の測定では、採便棒で採取された擬似便を、希釈液が保持された容器中に狭い部位を通過させて挿入し、疑似便を希釈するのであるが、この時に採便棒上の擬似便の一部の一定量が希釈液中に入るよう設計されている。この様子を図１に示す。即ち実際採取された擬似便の全量が希釈液中に入るのではなく、採取された一部が容器の中に入っていく構造になっており、この希釈液中に溶解した一部の擬似便の中のヘモグロビンや便中トランスフェリンが実際に測定される。要は採便棒上に採られた擬似便量ではなく、この希釈液中に分散、溶解する擬似便量こそ正確でなければならないことは明白である。しかし、これらで採取された擬似便量は、採便器の構造や方法、取り方や操作する人の技量の差に左右され、正確に一定量を採取することが困難であった。これでは、ヘモグロビンやトランスフェリンの測定値の誤差範囲を見ようとしても、測定機器が誤差の原因であるか、はたまた擬似便の採取量が誤差の原因であるか区別が出来ず、サーベイの評価や標準化はほとんど不可能であった。
【０００５】
通常、採便器で採取した擬似便量は、採取前、採取後の重量を測定して前後の重量差を計算すれば、採取量が重量で決定できると考えられるが、しかし、採便器の構造と方式は、図１のように、採便棒に一定以上の擬似便をとり、希釈液の中に入れる際に擬似便の一部が擦り取られて、一部しか希釈液中に分散されない方式であるため、重量法は不可能であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−２４２０２７号公報
【特許文献２】特開２００３−１８５６５４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１５  ｓｕｐｐｌ．２  １８−２３；１９９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
採便器の希釈液中に採便器の機能や採便者の技量が影響せずに、採取量そのものが簡易な方法で判明する方法と擬似便組成が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者は種々検討の結果、擬似便に検出可能な第３物質を高濃度添加した擬似便を使用し、擬似便を希釈液に分散させた際に、同時に第３の物質が希釈液に溶解するが、この第３の物質の濃度を別途測定する事により、採取された擬似便量が容易に算出できることを見いだし、本発明を完成した。具体的には、たとえばグリセロールなどの第３の物質を一定量含有させた擬似便を検体にして、採便器の採便棒で採取し、採便棒を希釈容器の挿入部位に挿入し、希釈液中に擬似便を均一に分散した後に、その溶液を検体として、中の第３の物質濃度を測定することにより採取量を正確に算出する方法を発明しこれを解決した。Aを擬似便中の第３の物質の添加量（mg/g）、Bを別途測定した第３の物質の濃度（mg/dL）、Cを希釈液の量（mL）とすると、計算は次の式にて計算される。
【数１】
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【発明の効果】
【００１０】
本発明は、第３の物質とヘモグロビンおよび、またはトランスフェリンなどを粉体に添加する前に溶液に共に溶解し、その溶液を添加混合する方法をとれば、ヘモグロビンおよび、またはトランスフェリンなどの均一性もチェックできることも大きな特徴である。
また、本発明の疑似便を使用することによって、従来、採取された疑似便量の誤差が大きいために不可能であった便潜血項目の精度管理が、疑似便量の誤差が補正できる本発明により、測定試薬および測定機器の誤差そのものが判るようになり、標準化やサーベイランスに大きく前進できる環境が整う事になる。また、さらに採便器の形状や希釈液のさらなる改良も、本発明の疑似便を使用することにより、採便量の誤差を小さくする改良研究の目安として使用できる事も大きなメリットになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は疑似便を市販採便器の一つを使用して、疑似便を採取する工程を図示したものである。Ａは採便器の中に装備している採便棒である。Ｂは希釈液を保持している希釈容器である。Ｃは採便棒を希釈容器の入り口に差し込む際に、入り口によって擦り取られた疑似便を示している。Ｄはヘモグロビンなどの分析装置の検体採取ノズルである。１は採便器の採便棒を外した状態である。２は採便棒を使って疑似便を採取した様子である。３は希釈容器の入り口から希釈容器の内部に採便棒を差し入れた様子であり、入り口の狭さが疑似便を擦りきって、一応一定量の疑似便が希釈液中に分散溶解する様子を示している。擦りきられて残った疑似便は容器の外側に残っている。４は疑似便が希釈容器の中の希釈液に溶解した様子を示している。５は容器を逆さまにして背後から分析装置の検体採取のノズルが注入された様子を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で使用可能な第３の物質は、具体的に適度な感度で検出測定できれば良いが、擬似便中にヘモグロビン及び・またはトランスフェリンが存在するので、これらの物質そのものの安定性またはこれらの物質の測定に影響する様な第３の物質は使用出来ないのは当然であり、また、擬似便に添加する濃度が、ある程度以上の必要があるため、水溶性の高いものが望まれる。そのようなものの具体的な物質としては、臨床検査の分野で酵素法により簡易に測定されている項目や、でグリセロール、またはグリセロール−３−リン酸、乳酸、コリン、グルコース、マルトース、トレハロース、スクロース、４−アミノアンチピリン、ｐ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロアニリン、等を用いることが出来るが、好ましくはグリセロール、グリセロール−３−リン酸、乳酸、グルコース、２糖類、４−アミノアンチピリンが良い。これらの検出には、通常臨床検査施設で測定されている技術が使用される。その測定法例としては、酸化還元酵素とペルオキシダーゼを使う方法やトリンダー試薬として知られているアニリン化合物と過酸化水素、およびペルオキシダーゼを使う方法などがある。
【００１３】
第３の物質の具体的な望ましい例として挙げたグリセロール、グリセロール−３−リン酸、乳酸、グルコース、２糖類、リン酸塩は、通常、検査室では生化学項目として測定されているものであり、酸化還元酵素、ペルオキシダーゼ、色源体などに必要であればリン酸化酵素または、分解酵素も使用する。具体的にはグリセロールの場合はグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼの組み合わせに色源体である４−アミノアンチピリン、およびトリンダー試薬を使用して測定する。グリセロール−３−リン酸の場合は、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼの組み合わせに色源体である４−アミノアンチピリン、およびトリンダー試薬を使用して測定する。乳酸の場合は、乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼの組み合わせに色源体である４−アミノアンチピリン、およびフェノールまたはトリンダー試薬を使用して測定する。トリンダー試薬の一例としては、３−メチル−（Ｎ-エチル−Ｎ−スルホプロピル）アニリン、３−メチル−｛Ｎ-エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシー３−スルホプロピル）｝アニリン（以下ＴＯＯＳと略す）、Ｎ−スルホプロピル−３，５―ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシー３−スルホプロピル）−３，５―ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ‘−アセチルエチレンジアミン、（以下ＥＭＳＥと略す）、など、４−アミノアンチピリンと酸化縮合して色素を発生するものはいずれも使用できる。
また、第３の物質として４−アミノアンチピリンを使用した場合は、その測定はさらに簡単になり、ペルオキシダーゼおよびトリンダー試薬と過酸化水素を使用すれば良い。
第３の物質としてグルコース、マルトース、トレハロース、スクロースの場合は、たとえば、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、トリンダー試薬、必要であれば、２糖類の分解酵素を使用すればよい。
第３の物質として、リン酸塩の場合は、イノシン、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、トリンダー試薬などにより測定される。
擬似便に、第３の物質を添加する方法としては、一般的に粉体に溶液を含浸させる方法でよいが、米粉や小麦粉、トウモロコシ粉、ジャガイモデンプンなどの粉体に、第３の物質が溶液に溶解した状態でその溶液を添加することが良い。均質になるよう良く混ぜ、時々数カ所の部位をサンプリングして、均質かどうか第３の物質の濃度を検定することにより確認できる。
【実施例１】
【００１４】
擬似便の作成
豆平社製上用粉１０ｇに脱イオン水３倍量を加えて撹拌、静止後、上清を捨ててゴミなどを取り除く工程を２回繰り返し、グラスフィルターで濾過した。さらにこれを２４時間減圧下に室温乾燥して上用粉の洗浄品を作成した。一方、２０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（同仁化学社製、ＰＨ＝７）にヘモグロビンの安定化剤として和光純薬社製牛血清アルブミンを５ｍｇ／ｍＬ、  和光純薬社製スクロースを１０ｍｇ／ｍＬ、和光純薬社製アジ化ナトリウムを０．１％含有させた水溶液にシグマアルドリッチ社製人ヘモグロビンＡ０を０．０８ｍｇ／ｍＬ、和光純薬社製グリセロールを１０％になる様添加混合した溶液（これを添加溶液とする）を作成した。
擬似便は、上記洗浄された上用粉と添加溶液を１：１．１重量比で混合し、冷温下、均一になるまでよく撹拌、混合してペースト状の擬似便を作成した。
【実施例２】
【００１５】
擬似便の均一性の確認
実施例１の擬似便の数カ所から、約１０ｍｇのサンプルを取り、その重量（Ｓａ）を量り、２ｍＬの脱イオン水が入った試験管に入れて震倒撹拌してサンプルを分散させた。
試験管を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離してその上清をグリセロール測定のために供した。グリセロール測定試薬は協和メデックス社製、デタミナーＬ  ＴＧの試薬１と試薬２を容積比３：１の比であらかじめ混合した試薬を用意した。この試薬３ｍＬに上清を５０μＬ添加し、３７℃１０分間加温した後、５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。グリセロール濃度（Ｇａ）の算出は、グリセロールの標準液を同時に測定し、その比較から算出した。測定されたグリセロール濃度は、擬似便が均一であれば、サンプリングした重量に比例するはずであり、Ｇａ／Ｓａ比は、ほぼ一定であれば均一と言える。結果を表１に示す。９８．８％から１０１．１％の間に入る良好な均質性が示された。
【表１】
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【実施例３】
【００１６】
従来法での疑似便中ヘモグロビン濃度の測定と誤差範囲
５人の実験者を用意し、実施例１の擬似便を使用し、栄研（株）社製のヘモの採便器と測定試薬、測定機器を使って、擬似便中のヘモグロビン濃度（Ｈｂ）を測定した。結果を表２に示す。それぞれ得られた値は、希釈液中の濃度で示され、１２８．６ｎｇ／ｍＬ〜１８１．４ｎｇ／ｍＬと広い範囲に広がり、標準誤差は１４．２％となった。擬似便採取者がかなり注意深く採取したにも拘わらず、採取する者によりかなり測定値が変動した。測定されたヘモグロビン濃度の表示が１ｇの便量当たりのヘモグロビン量となっているが、これはこの採便器で一定量の便量を採取することが前提になって計算されており、その一定量の便量から計算された数字であるため、誤差の真実は採取された擬似便量の誤差が大きく影響していると思われた。これでは、測定試薬や測定機器の誤差はほとんど判らない状況であった。
【表２】
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さらに、その擬似便を採取分散させた採便器の希釈液を検体として、別途希釈液に溶解したグリセロール濃度を協和メデックス社製トリグリセライド測定キット、デタミナー  Ｌ―ＴＧのＲ１とＲ２をあらかじめ３：１に混合した溶液をグリセロール測定試薬として使用し、検体中のグリセロール（Ｇｂ）を測定した。このＧｂ値を元にして、採便量の計算式
の式に代入して、採便量（Ｓａ）を計算した。
ただし、Ａは擬似便中のグリセロールの添加量で、ここでは５２．４ｍｇ／ｇであり、Ｇｂは別途測定したグリセロールの濃度（ｍｇ／ｄＬ）、Ｃ:希釈液の量（ｍＬ）  ここでは、2ｍＬである。
結果を表２と合わせて表３にまとめた。
擬似便量をグリセロール濃度から算出して、その値を用いてヘモグロビン測定値を補正したところ、標準誤差が４．７％と補正なしの結果と比較して、約３分の１になり、この誤差範囲であれば、採取した擬似便量の誤差が実質上ほぼ無くなり、ヘモグロビン測定に於ける試薬と測定機器の標準化が可能になる程度になった。
【表３】
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【実施例４】
【００１７】
実施例１のグリセロールの代わりに、（株）林原製トレハロースを１０％添加した同様のヘモグロビン溶液を用いて擬似便を作成した。
５人の実験者を用意し、実施例３と同様に採便器と希釈液およびヘモグロビン測定試薬を使用し、擬似便が分散、溶解した希釈液中のヘモグロビン濃度（Ｈｂ）を測定した。一方、希釈液中のトレハロース濃度を下記に示す測定試薬を使用して測定した。
トレハロース測定試薬
５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７）
トレハラーゼ（シグマ社製）  ５Ｕ／ｍＬ
ムタロターゼ（シグマ社製）  ２Ｕ／ｍＬ
グルコースオキシダーゼ  （天野エンザイム社製）１０Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ  （東洋紡（株）製）  １０Ｕ／ｍＬ
ＴＯＯＳ（同仁化学（株）製）  ０．２ｍｇ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（和光純薬製）  ０．１ｍｇ／ｍＬ
測定は試験管にトレハロース測定試薬３ｍＬを入れ、３７℃で予備加温した後、希釈液の検体２０μＬを添加して撹拌し、３７℃加温１０分後に５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。トレハロースの１０ｍｇ／ｄＬの標準液を比較対照として希釈液中のトレハロース濃度を算出した。ただし、Ａは擬似便中のトレハロースの添加量で、ここでは４９．８ｍｇ／ｇであり、Ｇｂは別途測定したトレハロースの濃度（ｍｇ／ｄＬ）、Ｃ:希釈液の量（ｍＬ）  ここでは、2ｍＬである。結果を表４に示す。
従来の方法で擬似便中のヘモグロビン濃度（Ｈｂ）を測定した場合、得られた値（希釈液中の濃度）は、１２２．８ｎｇ／ｍＬ〜１７９．３ｎｇ／ｍＬと広い範囲に広がり、標準誤差は１５．５％となった。擬似便採取者がかなり注意深く採取したにも拘わらず、採取する者によりかなり測定値が変動した。しかし、別途トレハロースを測定して採取便量を算出し便量で補正したところ、５．１％と非常に良好な誤差範囲になった。
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【産業上の利用可能性】
【００１８】
本疑似便は、日本国内における便潜血として広く用いられている大腸癌検診の全国的なサーベイランスの試料として使用する事により、全国的な統計データとして利用できる他、この疑似便にさらにヘモグロビンの標準液を混合してヘモグロビンの標準疑似便として利用すれば潜血項目の標準化に大きな役割を果たすと思われる。また、採便器の採取誤差を小さくさせるために使用すれば採便器の改良にも役立ち、より技術レベルの高い採便器を製造する事ができるようになる。また、採便器を使用する際の訓練にも使用可能である。
【符号の説明】
【００１９】
図１に用いられている符号は次の通りである。
Ａ    採便棒
Ｂ    希釈容器
Ｃ    擦りきられ、口に残った疑似便
Ｄ    ヘモグロビン測定器の検体ノズル
１は採便器の採便棒を外した状態。
２は採便棒を使って疑似便を採取した様子。
３は希釈容器の入り口から希釈容器の内部に採便棒を差し入れた様子。
４は疑似便が希釈容器の中の希釈液に溶解した様子。
５は容器を逆さまにして背後から分析装置の検体採取のノズルが注入された様子。
【図１】
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