(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオディーゼル燃料の新たな製造方法を提供する。【解決手段】リン脂質を含むバイオマス原料を酵素によって処理することにより、バイオマス原料中のリン脂質を加水分解するとともに脂肪酸ＦＡをエステルＭＥ化させてバイオディーゼル燃料を製造する。酵素としては、リン脂質に対して加水分解活性を示す酵素を用いることができ、好ましくは、特定の２種類のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むものの少なくともいずれか一方を用いる。これらのポリペプチドは、アミノ酸配列が、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたものであっても、少なくとも７５％の相同性を有しているものであってもよい。バイオマス原料を酵素処理することにより、生産性よく、容易にバイオディーゼル燃料を製造することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質を含むバイオマス原料を、リン脂質に対して加水分解活性を示す酵素によって処理することにより、バイオマス原料中のリン脂質を加水分解するとともに脂肪酸をエステル化させてバイオディーゼル燃料を製造する、バイオディーゼル燃料の製造方法。
【請求項２】
リン脂質を含むバイオマス原料を、下記の酵素Ａ及び酵素Ｂのすくなくとも一方の酵素によって処理することにより、バイオマス原料中のリン脂質を加水分解するとともに脂肪酸をエステル化させてバイオディーゼル燃料を製造する、バイオディーゼル燃料の製造方法。
酵素Ａ：下記の（ａ１）、（ａ２）、又は、（ａ３）のポリペプチドを含む酵素、
（ａ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ａ２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド；
（ａ３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド；
酵素Ｂ：下記の（ｂ１）、（ｂ２）、又は、（ｂ３）のポリペプチドを含む酵素、
（ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド；
（ｂ３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド。
【請求項３】
リン脂質を含むバイオマス原料を、下記の酵素Ｃ及び酵素Ｄのすくなくとも一方の酵素によって処理することにより、バイオマス原料中のリン脂質を加水分解するとともに脂肪酸をエステル化させてバイオディーゼル燃料を製造する、バイオディーゼル燃料の製造方法。
酵素Ｃ：下記の（ｃ１）、（ｃ２）、又は、（ｃ３）のポリペプチドを含む酵素、
（ｃ１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド；
（ｃ２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド；
（ｃ３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド；
酵素Ｄ：下記の（ｄ１）、（ｄ２）、又は、（ｄ３）のポリペプチドを含む酵素、
（ｄ１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド；
（ｄ２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド；
（ｄ３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【請求項４】
前記酵素がストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオディーゼル燃料の製造方法。
【請求項５】
前記バイオマス原料が廃棄物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオディーゼル燃料の製造方法。
【請求項６】
前記エステル化はメチルエステル化である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオディーゼル燃料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、廃棄物等を利用したバイオディーゼル燃料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、食用油又は廃棄食用油に含まれるグリセリドを原料に、アルカリや固体酸触媒、あるいはリパーゼを用いてバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ：Ｂｉｏ  Ｄｉｅｓｅｌ  Ｆｕｅｌ）を製造する方法が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、ナンヨウアブラギリ由来の植物油脂の遊離脂肪酸をあらかじめ硫酸でエステル化処理した原料油脂と、炭素数が２以下のアルキルアルコールとを、酸化カルシウム触媒の存在下でエステル交換反応させて、バイオディーゼル燃料を製造する方法が開示されている。
【０００４】
また、特許文献２には、グリセリドを含む油脂と、水とリパーゼとを混合して所定の分解率に達するまで加水分解反応させた後、アルコールを添加して、さらに該加水分解反応を続行させるバイオディーゼル燃料の製造方法が開示されている。
【０００５】
バイオディーゼル燃料は、バイオマス原料から得られるディーゼル燃料であり、化学物質としては、例えば、脂肪酸メチルエステルが、現在、知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−０１２２５４号公報
【特許文献２】特開２０１０−１０６１０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、食用油又は廃棄食用油をバイオディーゼル燃料の原料として用いる場合、需要と供給のバランスが成立しないといった問題や、食用の油と競合するなどといった問題がある。また、従来のバイオディーゼル燃料の製造方法では、製造コストが高いことや、反応後の廃液処理の方法、副産物グリセリンの余剰の対処が、実用化の課題として挙げられる。これらの問題から、バイオディーゼル燃料はその実用化が難しかった。
【０００８】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、生産性よく、容易にバイオディーゼル燃料を製造することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係るバイオディーゼル燃料の製造方法は、リン脂質を含むバイオマス原料を、酵素によって処理することにより、バイオマス原料中のリン脂質を加水分解するとともに脂肪酸をエステル化させてバイオディーゼル燃料を製造するものである。
【００１０】
前記酵素としては、リン脂質に対して加水分解活性を示す酵素を用いる。
【００１１】
前記酵素としては、好ましくは、下記の酵素Ａ及び酵素Ｂのすくなくとも一方の酵素、又は、下記の酵素Ｃ及び酵素Ｄのすくなくとも一方の酵素を用いる。
【００１２】
酵素Ａ：下記の（ａ１）、（ａ２）、又は、（ａ３）のポリペプチドを含む酵素、
（ａ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ａ２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド；
（ａ３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド。
【００１３】
酵素Ｂ：下記の（ｂ１）、（ｂ２）、又は、（ｂ３）のポリペプチドを含む酵素、
（ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド；
（ｂ３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド。
【００１４】
酵素Ｃ：下記の（ｃ１）、（ｃ２）、又は、（ｃ３）のポリペプチドを含む酵素、
（ｃ１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド；
（ｃ２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド；
（ｃ３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【００１５】
酵素Ｄ：下記の（ｄ１）、（ｄ２）、又は、（ｄ３）のポリペプチドを含む酵素、
（ｄ１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド；
（ｄ２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド；
（ｄ３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【００１６】
本発明では、前記酵素がストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来するものであることが好ましい。また、前記バイオマス原料が廃棄物であることが好ましい。また、前記エステル化はメチルエステル化であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、バイオマス原料を酵素処理することによりバイオディーゼル燃料を生成することができるので、生産性よく、容易にバイオディーゼル燃料を製造することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の酵素によりバイオディーゼル燃料を生成した結果を示すＴＬＣの写真である。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、酵素によりバイオディーゼル燃料を生成した結果を示すＴＬＣの写真である。
【図３】酵素によりバイオディーゼル燃料を生成した結果を示すＴＬＣの写真である。
【図４】酵素ＰＬＡ１を用いてメタノール２５ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った結果を示すグラフである。
【図５】酵素ＰＬＢを用いてメタノール２５ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った結果を示すグラフである。
【図６】メタノール２５ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った場合における、酵素ＰＬＡ１と酵素ＰＬＢとの比較を示すグラフである。
【図７】酵素ＰＬＡ１を用いてメタノール５０ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った結果を示すグラフである。
【図８】酵素ＰＬＢを用いてメタノール５０ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った結果を示すグラフである。
【図９】メタノール５０ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った場合における、酵素ＰＬＡ１と酵素ＰＬＢとの比較を示すグラフである。
【図１０】酵素ＰＬＡ１を用いてメタノール７５ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った結果を示すグラフである。
【図１１】酵素ＰＬＢを用いてメタノール７５ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った結果を示すグラフである。
【図１２】メタノール７５ｍｏｌ％の条件でバイオディーゼル燃料の生成を行った場合における、酵素ＰＬＡ１と酵素ＰＬＢとの比較を示すグラフである。
【図１３】バイオディーゼル燃料の生成における酵素ＰＬＡ１の傾向を示すグラフである。
【図１４】バイオディーゼル燃料の生成における酵素ＰＬＢの傾向を示すグラフである。
【図１５】バイオディーゼル燃料の生成における酵素ＰＬＡ１と酵素ＰＬＢとの傾向の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明によるバイオディーゼル燃料の製造方法では、リン脂質を含むバイオマス原料を、酵素Ａ、酵素Ｂ、酵素Ｃ、酵素Ｄから選ばれる少なくとも１種の酵素などの、リン脂質に対して加水分解活性を示す酵素によって処理する。
【００２０】
［酵素］
本明細書において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われる。それにより、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。
【００２１】
本明細書において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導されたもの）、あるいは、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
【００２２】
酵素としては、リン脂質に対して加水分解活性を示す酵素を用いる。いわゆるホスホリパーゼ（ＰＬ）と称せられる酵素である。ホスホリパーゼとしては、ＰＬＡ１、ＰＬＡ２、ＰＬＢなどを用いることができる。このような酵素としては、例えば、シグマアルドリッチ社から市販されているブタ膵臓由来、ムフェジコブラ由来、放線菌Streptomyces violaceoruber由来などのＰＬＡ２や、Thermomyces lanuginosus由来ＰＬＡ１、Lecitase Ultra由来ＰＬＡ１などの市販されている酵素などが挙げられる。あるいは、酵素として、三菱化学フーズ製ＰＬＡ１、ノボザイム製レシターゼ、ジェネンコア協和製ＰＬＡ２リポモッド６９９Ｌ、ナガセケムテックス製ＰＬＡ２ナガセ、ディー・エス・エムジャパン製ＰＬＡ２マキサパールＡ２、旭化成ファーマテック製ＰＬＡ２、旭化成ファーマテック製ＰＬＢなどの産業用酵素を用いてもよい。このうち、バイオディーゼル燃料の製造という観点から、酵素は、アルコール耐性（特にメタノールに対しての耐性）を有することが好ましい。
【００２３】
さらに、バイオディーゼル燃料の製造においては、これらの酵素よりも以下に説明する酵素Ａ、酵素Ｂ、酵素Ｃ及び酵素Ｄの方が好ましい。以下で説明する酵素は、カルシウム塩などの無機塩の添加を不要にすることができ、低温〜高温（２０〜７０℃）で反応させることができ、酵素処理の効率を向上させることができる。また、ｐＨ３〜１１で反応させることができるため、反応制御しやすい。また、酵素の力価が極めて高いため、反応効率が格段に高い。さらに、多くの種類のリン脂質に作用するため、反応収率が高い。
【００２４】
［酵素Ａ、酵素Ｃ］
酵素Ａは、（ａ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、（ａ２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド、又は、（ａ３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチドを含んでいる。
【００２５】
酵素Ｃは、（ｃ１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド、又は、（ｃ２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド、又は、（ｃ３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチドを含んでいる。
【００２６】
配列番号３に記載の塩基配列のポリヌクレオチドは、配列番号１に記載のポリペプチド（アミノ酸配列）をコードし得る。すなわち、本発明の好ましい一態様では酵素Ａと酵素Ｃとが一致する。
【００２７】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、グリセロールリン脂質中のグリセロール基のα位（ｓｎ−１位）の脂肪酸エステル結合を優先的に（ｓｎ−２位よりも優位に）加水分解する酵素、すなわちホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）の一種である。したがって、ＰＬＡ１である酵素Ａ及び酵素Ｃは、リン脂質から２−リゾリン脂質、グリセロール−３−リン酸、及び、グリセロール−３−ホスホコリンなどのグリセロール−３−リン酸エステル化合物（グリセロール−３−リン酸ホスホジエステル）の少なくとも１種以上、好ましくは３種全てを生成する酵素である。
【００２８】
ＰＬＡ１活性は、例えば、以下のようにして確認され得るが、確認方法はこれに限定されるものではない。具体的には、例えば、酵素反応の結果、生成する遊離脂肪酸量を測定することにより、ＰＬＡ１活性を確認することができる。
【００２９】
具体的な手法としては、まず、０．０２％（ｗ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ナカライテスク（株）製）１０ｍＬに卵黄ホスファチジルコリン１ｇ（ナカライテスク製）を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリンを調製する。この１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリン０．０２５ｍＬに、０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０６０ｍＬと、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．００５ｍＬとを加える。そして、３７℃で５分間予備加温した後、酵素活性を確認する試料０．０１０ｍＬを添加し、３７℃で５分間反応させる。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、反応を停止させる。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、例えば遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ  Ｃテストワコー」（和光純薬工業（株）製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定する。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位（１Ｕ）とする。
【００３０】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、例えば、緩衝液として、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．１〜５．６）、ビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ５．６〜７．２）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２〜８．８）、および、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８〜１０．５）、を用いて、上記の卵黄ホスファチジルコリンと酵素とを反応条件下におくと、そのｐＨ範囲内（ｐＨ４．１〜１０．５）でＰＬＡ１活性を示し得る。至適ｐＨはｐＨ５．６付近であるが、ｐＨ５〜８で実質的に１００％の活性を示す。
【００３１】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、例えば、上記のように卵黄ホスファチジルコリンと酵素とを３７℃にて５分間反応させた条件下でｐＨ５．６における加水分解活性を１００％とした場合、ｐＨ４．１からｐＨ１０の範囲内で５０％以上の活性を示すことが好ましい。
【００３２】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、例えば、上記の卵黄ホスファチジルコリンと酵素との反応条件下においては、約２０〜６５℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３０〜５５℃の範囲内にあり、より好ましくは４０〜５５℃の範囲内にあり、さらにより好ましくは約５０℃である。
【００３３】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、例えば、１２０ｍＭ  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で３０分間処理した場合、４℃から４０℃まででは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり得、そして４５℃でも８０％程度（例えば７５％）以上の活性が残存している。
【００３４】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、例えば、緩衝液として酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）を用いて、上記のリン脂質と酵素溶液とを反応条件下におくと、１００ｍＭのＥＤＴＡが存在しても阻害を受けず、ＥＤＴＡを添加しない場合とほぼ同一の活性を示すことが好ましい。また、１０ｍＭ  Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋の存在下では、約８０％の活性（例えば８０〜９５％程度の活性）を示すことが好ましい。一方、１０ｍＭのＦｅ３＋、Ｆｅ２＋では活性が阻害され得るものである。
【００３５】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、ｐＨ９．０の条件下で上記のように該酵素と基質とを５０℃にて５分間反応させた場合、卵黄ホスファチジルコリンが基質である場合に対する加水分解活性を１００％とすると、ＤＰＰＣに対して５０％以下（下限は３０％）、ＰＡに対して３５０％以上（上限は４００％）、ＰＧに対して４００％以上（上限は４５０％）、ＰＳに対して４５０％以上（上限は４８０％）、ＰＥに対して１００％以上（上限は１４０％）、ＰＩに対して３５０％以上（上限は３８０％）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ製）に対して３００％以上（上限は３６０％）、大豆レシチン（和光純薬製）に対して７５．０％以上（上限は９０％）であることが好ましい。
【００３６】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、卵黄ホスファチジルコリンを基質としたときに、ｐＨ５．６で５０℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ＤＰＰＣに対して１００％以上（上限は１４０％）、ＰＡに対して１００％以下（下限は６０％）、ＰＧに対して１５０％以上（上限は１９０％）、ＰＳに対して１５０％以上（上限は１９０％）、ＰＥに対して１００％以上（上限は１２０％）、ＰＩに対して２５０％以上（上限は２９０％）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ製、L-α-Phosphatidylcholine）に対して２５０％以上（上限は２９０％）、大豆レシチン（和光純薬製）に対して２５０％以上（上限は２８０％）の活性を有し、トリグリセリド（オリーブ油）に対する活性がほぼ０％（例えば５％以下、３％以下、又は１％以下、あるいは検出限界以下）であることが好ましい。このような基質特異性を有することが好ましいものである。
【００３７】
なお、ＤＰＰＣは、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholineの略である。ＰＡは、1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphateの略である。ＰＧは、1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol)の略である。ＰＳは、L-α-Phosphatidylserineの略である。ＰＥは、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineの略である。ＰＩは、L-α-Phosphatidylinositol）の略である。
【００３８】
また、酵素Ａ及び酵素Ｃは、卵黄レシチン（Ｌ）を基質とし、ｐＨ７．２で５０℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）に対して５０％以上（上限２００％）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）に対して５００％以上（上限６００％）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）に対して１５０％以上（上限３５０％）、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に対して３００％以上（上限４５０％）、Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）に対して３００％以上（上限７００％）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ＰＯＰＧ）に対して１００％以上（上限３００％）、大豆由来のＬ−α−ホスファチジルコリン（ＳＢ−ＰＣ）に対して１００％以上（上限１５０％）、大豆レシチン（ＳＢＬ）に対して３０％以上（上限１５０％）、Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に対して２５０％以上（上限３５０％）、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰｌｓＰＥ（Ｃ１８，２０：４））に対して５０％以上（上限９０％）、１−ヘキサデシル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰｌｓＰＥ（Ｃ１６，１８：１））に対して２００％以上（上限３００％）、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰｌｓＰＣ（Ｃ１８，２０：４））に対して０％、大豆油及びオリーブ油に対して１０％以下（下限０％）、４−ニトロフェニルブチレート（ｐＮＰＢ）、４−ニトロフェニルオクタノエート（ｐＮＰＯ）、４−ニトロフェニルデカノエート（ｐＮＰＤ）、４−ニトロフェニルラウレート（ｐＮＰＬ）、４−ニトロフェニルミリステート（ｐＮＰＭ）、４−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）及び４−ニトロフェニルステアレート（ｐＮＰＳ）に対して１５％以下（下限０％）の相対活性を有することが好ましい。
【００３９】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が２５，０００〜３０，０００の範囲内（例えば、約２８，０００、又は、約２７，０００）を示すことが好ましい。また、酵素Ａ及び酵素Ｃは、アミノ酸組成から計算した分子量が、２５，０００〜３０，０００の範囲内であることが好ましい。例えば、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株由来の天然の酵素では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約２８，０００であり、具体的には２８，０００を示す。このストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株由来の天然の酵素では、そのアミノ酸組成から計算した分子量は２７，１９９である。
【００４０】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、６．０〜６．１の範囲内（例えば６．０６）の等電点を示すことが好ましい。酵素の等電点は、そのアミノ酸配列から、ＧＥＮＥＴＹＸにより算出され得る。
【００４１】
酵素Ａ及び酵素Ｃ、すなわちホスホリパーゼＡ１の一態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるものである。ホスホリパーゼＡ１は、好ましくは配列番号１の３４位から２６９位までのアミノ酸配列（本明細書では、「配列番号１に記載内のアミノ酸配列」ともいう）を有する。
【００４２】
酵素Ａ及び酵素Ｃは、ＰＬＡ１活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載内のアミノ酸配列に対して、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であっても良い。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、ＰＬＡ１活性を有する限り、酵素Ａ及び酵素Ｃに含まれる。
【００４３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載内のアミノ酸配列に対して、相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＰＬＡ１活性を有する限り、酵素Ａ及び酵素Ｃに含まれる。酵素Ａ及び酵素Ｃは、好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載内のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
【００４４】
タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。
【００４５】
酵素Ａ及び酵素Ｃの供給源は特に限定されるものではないが、酵素Ａ及び酵素Ｃは、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくはストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）およびストレプトマイセス・アルブス（Streptomyces albus）であり、最も好ましくはストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４菌株、以下「ＮＡ２９７株」という）である。このストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７は、配列番号３の塩基配列で示されるポリヌクレオチドをＤＮＡ中に有している。
【００４６】
例えば、上記ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomycesalbidoflavus）ＮＡ２９７（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４）は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものを酵素製剤として製造することができる。
【００４７】
酵素製剤の製造に用い得る微生物はストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属し、かつ、酵素Ａ又は酵素Ｃを生産し得る微生物であってもよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、ＰＬＡ１活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であっても酵素Ａ及び酵素Ｃの製造に用いることができる。また、ストレプトマイセス属に属さなくても、上記の酵素Ａ又は酵素Ｃを生産し得る微生物であれば、それを用いることもできる。
【００４８】
ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomycesalbidoflavus）ＮＡ２９７を用いた酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。
【００４９】
この菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、まず、この菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第１鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、酵素Ａ及び酵素Ｃが安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２０〜３７℃であることが好ましい。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１〜７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。
【００５０】
酵素Ａ及び酵素Ｃに含まれるポリペプチドは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及び／又は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、酵素Ａ及び酵素Ｃを構成するポリペプチドは、ＨＰＬＣ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定できる。
【００５１】
［酵素Ｂ及び酵素Ｄ］
酵素Ｂは、（ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、（ｂ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチド、又は、（ｂ３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、リン脂質に対して加水分解活性を示すポリペプチドを含んでいる。
【００５２】
酵素Ｄは、（ｄ１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド、又は、（ｄ２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド、又は、（ｄ３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチドを含んでいる。
【００５３】
配列番号４に記載の塩基配列のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のポリペプチド（アミノ酸配列）をコードし得る。すなわち、本発明の好ましい一態様では酵素Ｂと酵素Ｄとが一致する。
【００５４】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、グリセロール基のα位（ｓｎ−１位）の脂肪酸エステル結合と、グリセロール基のβ位（ｓｎ−２位）の脂肪酸エステル基との両方の脂肪酸エステル基を加水分解する酵素活性を有する。すなわち、酵素Ｂ及び酵素Ｄは、ホスホリパーゼＡ１活性及びホスホリパーゼＡ２活性を併有する酵素であり、いわゆるホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）と称される酵素の１種である。したがって、ＰＬＢである酵素Ｂ及び酵素Ｄは、リン脂質からリゾリン脂質、グリセロール−３−リン酸、及び、グリセロール−３−ホスホコリンなどのグリセロール−３−リン酸エステル化合物（グリセロール−３−リン酸ホスホジエステル）の少なくとも１種以上、好ましくは３種全てを生成する酵素である。
【００５５】
ＰＬＢ活性は、例えば、以下のようにして確認され得るが、確認方法はこれに限定されるものではない。具体的には、例えば、酵素反応の結果、生成する遊離脂肪酸量を測定することにより、ＰＬＢ活性を確認することができる。
【００５６】
具体的な手法としては、まず、１０％（ｗ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ナカライテスク（株）製）１０ｍＬにジミリストイルホスファチジン酸１ｇ（フナコシ製）を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸を調製する。この１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸０．００５ｍＬに、０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）０．０２５ｍＬと、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．００２ｍＬと、蒸留水０．０６３ｍＬとを加える。そして、３７℃で５分間予備加温した後、酵素活性を確認する試料０．００５ｍＬを添加し、３７℃で５分間反応させる。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、反応を停止させる。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、例えば遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ  Ｃテストワコー」（和光純薬工業（株）製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定する。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位（１Ｕ）とする。
【００５７】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、例えば、緩衝液として、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．１〜５．６）、ビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ５．６〜７．２）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２〜８．８）、および、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８〜１０．５）、を用いて、上記のホスファチジン酸と酵素とを反応条件下におくと、そのｐＨ範囲内（ｐＨ４．１〜１０．５）でＰＬＢ活性を示し得る。至適ｐＨは、ｐＨ８〜８．８付近とすることができる。
【００５８】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、例えば、上記のようにジミリストイルホスファチジン酸と酵素とを３７℃にて５分間反応させた条件下でｐＨ８．４における加水分解活性を１００％とした場合、ｐＨ７．２からｐＨ１０．０の範囲内で５０％以上の活性を示すことが好ましい。
【００５９】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、例えば、上記のようにジミリストイルホスファチジン酸と酵素との反応条件下においては、約２０〜６５℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３７〜６０℃の範囲内であり、より好ましくは４５〜５５℃の範囲内であり、さらにより好ましくは約５０℃である。
【００６０】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、例えば、１６０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）で３０分間処理した場合、４℃から４５℃まででは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり得、そして好ましくは、５０℃でも８０％程度（例えば７５％）以上の活性が残存している。
【００６１】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、例えば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いて、上記のリン脂質と酵素溶液とを反応条件下におくと、１０ｍＭのＥＤＴＡによって阻害を受けず、ＥＤＴＡを添加しない場合とほぼ同一の活性を示すことが好ましい。また、１０ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下では、約９０％の活性（例えば８５〜９５％程度の活性）を示すことが好ましい。一方、１０ｍＭのＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋では活性が阻害され得るものである。
【００６２】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、ｐＨ８．４の条件下で上記のように該酵素と基質とを５０℃にて５分間反応させた場合、ジミリストイルホスファチジン酸が基質である場合に対する加水分解活性を１００％とすると、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して９５％以上、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及び、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）に対して２０％以上、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して２５％以上の活性を有することが好ましい。また、同じ条件において、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、トリステアリンおよびジパルミトイルグリセリドに対する活性がほぼ０％（例えば５％以下、３％以下、又は１％以下、あるいは検出限界以下）であることが好ましい。このような基質特異性を有することが好ましいものである。
【００６３】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が３８，０００〜４０，０００の範囲内（例えば、約３９，０００、又は、３８，９００）を示すことが好ましい。また、酵素Ｂ及び酵素Ｄは、アミノ酸組成から計算した分子量が、４１，０００〜４３，０００の範囲内であることが好ましい。例えば、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株由来の天然の酵素では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約３９，０００、具体的には３８，９００を示す。このストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株由来の天然の酵素では、そのアミノ酸組成から計算した分子量は約４２，０００である。
【００６４】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、６．２〜６．６の範囲内（例えば６．４）の等電点を示すことが好ましい。酵素の等電点は、そのアミノ酸配列から、ＧＥＮＥＴＹＸにより算出され得る。
【００６５】
酵素Ｂ及び酵素Ｄ、すなわちホスホリパーゼＢの一態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものである。ホスホリパーゼＢは、好ましくは配列番号２の３１位から４１２位までのアミノ酸配列（本明細書では、「配列番号２に記載内のアミノ酸配列」ともいう）を有する。
【００６６】
酵素Ｂ及び酵素Ｄは、ＰＬＢ活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であっても良い。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、ＰＬＢ活性を有する限り、酵素Ｂ及び酵素Ｄに含まれる。
【００６７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＰＬＢ活性を有する限り、酵素Ｂ及び酵素Ｄに含まれる。ＰＬＢは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
【００６８】
タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。
【００６９】
酵素Ｂ及び酵素Ｄの供給源は特に限定されるものではないが、酵素Ｂ及び酵素Ｄは、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）およびストレプトマイセス・リディカス（Streptomyces lydicus）が挙げられる。これらの菌株は近縁であることから同種の活性の酵素Ｂ及び酵素Ｄが得られると考えられる。
【００７０】
例えば、上記ストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５）は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものを酵素製剤として製造することができる。ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４は、配列番号４の塩基配列で示されるポリヌクレオチドをＤＮＡ中に有している。
【００７１】
また、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyceschattanoogensis）ＮＢＲＣ１２７５４でもＮＡ６８４株と同様の活性が得られることを実験で確認している。したがって、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４とストレプトマイセス・チャッタノゲンシスとは同様の活性を示すものである。
【００７２】
酵素製剤の製造に用い得る微生物はストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属し、かつ、酵素Ｂ又は酵素Ｄを生産し得る微生物であってもよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、ＰＬＢ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であってもＰＬＢの製造に用いることができる。また、ストレプトマイセス属に属さなくても、上記のＰＬＢを生産し得る微生物であれば、それを用いることもできる。
【００７３】
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４を用いた酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。
【００７４】
この菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、まず、この菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第１鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、酵素Ｂ及び酵素Ｄが安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２０〜３７℃であることが好ましい。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１〜７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。
【００７５】
酵素Ｂ及び酵素Ｄに含まれるポリペプチドは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及び／又は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、酵素Ｂ及び酵素Ｄを構成するポリペプチドは、ＨＰＬＣ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定できる。
【００７６】
［微生物］
酵素Ａ、酵素Ｂ、酵素Ｃ及び酵素Ｄは、微生物によって産生し得るものである。ここで、酵素Ａ及び酵素Ｂについてはそのアミノ酸配列情報から、また、酵素Ｂ及び酵素Ｄについてはその塩基配列情報から、人工的にポリペプチドを生成することができ、ＢＤＦの製造に人工合成によって得た酵素（ポリペプチド）を用いてもよい。しかしながら、微生物により酵素を産生する場合、容易に上記の酵素を得ることができる。
【００７７】
微生物としては、上述したストレプトマイセス属の菌を利用することができるが、上記のポリヌクレオチドが導入された微生物を用いてもよい。すなわち、配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、及び、配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び、配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドが導入された微生物である。上記のポリヌクレオチドが導入された微生物は、ベクターや形質転換体によって得ることができる。つまり、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主に導入することにより、酵素Ａ、酵素Ｂ、酵素Ｃ又は酵素Ｄを産生する能力を保有する形質転換体を作製することができる。
【００７８】
ここで、酵素Ａで示したポリペプチド（ＰＬＡ１）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつＰＬＡ１活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドが挙げられる。
【００７９】
また、酵素Ｂで示したポリペプチド（ＰＬＢ）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつＰＬＡ１活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８０】
また、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列中の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、４０個、６０個、または１００個の連続した配列を１つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、洗浄条件：４２℃、０．５×ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００８１】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。
【００８２】
微生物中で、上記の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターをＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込むことが好ましい。また、転写・翻訳を制御するユニットにあたるターミネーターをＤＮＡ鎖の３’側下流に組み込むことが好ましい。より好ましくは、上記プロモーターとターミネーターの両方をそれぞれの部位に組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されており、その方法を利用することが可能である。また、必要に応じてシグナル配列を用いることで細胞外に効率的に分泌生産させることができる。この時使用するシグナル配列はホスホリパーゼでもその他のものでも良い。
【００８３】
形質転換の対象となる宿主は、上記の酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、細菌、放線菌、枯草菌、大腸菌、酵母、カビなどが挙げられる。より具体的には、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発がされている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発がされているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
【００８４】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。
【００８５】
得られた形質転換体は、上記のように酵素の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したポリペプチドを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理して酵素を製造することができる。
【００８６】
宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、当業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンを含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。
【００８７】
［バイオマス原料］
バイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）の製造に使用するバイオマス原料は、リン脂質を含むものであれば特に限定されるものではなく、植物油、動物油、魚油、微生物油をはじめ、生体廃棄物、バイオ廃棄物、食品廃棄物、下水汚泥、活性汚泥、余剰汚泥、ヒト排泄物、家畜排泄物、生ゴミ、雑草や廃棄農作物、藻類（淡水藻又は海水藻、微細藻類）などの過剰繁殖生物廃棄物、生物細胞、生物死体など、種々の廃棄物を使用することができる。特に、廃棄物を原料に用いた場合、廃棄物を利用してバイオディーゼル燃料を製造することができるため、廃棄物をエネルギー源として再利用することができ、また、廃棄物の処理を容易にし得るものであり、エネルギー資源と環境に配慮した燃料を得ることができる。また、例えば、無尽蔵に廃棄される下水汚泥や、食用油製造時に廃棄されるガム質（リン脂質）や種子などの絞りかすを用いれば、大量のエネルギーを継続して取り出すことが可能である。また、酵素処理によってバイオディーゼル燃料を製造できるため、アルカリや酸などの廃液の処理を容易に又はほとんど不要にすることが可能である。また、グリセリンをグリセロール−リン酸化合物（グリセロール−３−リン酸ホスホジエステル）として補足するので、副産物のグリセリンを大量に排出することも抑制することができる。
【００８８】
バイオマス原料は、水又はアルコールなどの有機溶剤を添加し、粘度、固形物濃度、リン脂質濃度などを適宜調整して、酵素処理しやすい分散液やスラリーの状態にしてもよい。また、固形物がミキシング可能な状態で混合された固体混合物であってもよい。要するに、リン脂質と酵素とが接触し得る状態であれば、酵素反応を進行させることが可能になる。
【００８９】
［加水分解反応］
バイオディーゼル燃料の製造においては、バイオマス原料を上記の酵素によって酵素処理することにより、バイオマス原料中のリン脂質が加水分解され、脂肪酸がエステル化する。得られた脂肪酸エステルがバイオディーゼル燃料となる。脂肪酸エステルはメチルエステルであることが好ましい。脂肪酸メチルエステルはバイオディーゼル燃料として容易に認可され得るものであり、燃料効率の高い燃料を得ることができるものである。また、バイオディーゼル燃料としての使用が可能であれば、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステルなどの炭化水素のエステルであってもよい。
【００９０】
加水分解反応及びエステル化反応は、下記の＜反応式１＞に従って進行する。
【００９１】
＜反応式１＞
【００９２】
【化１】
2014027908.tif 000003
【００９３】
上記の反応式１において、矢印「Ａ１」で示す部位がホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）によって加水分解される部位であり、矢印「Ａ２」で示す部位がホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）によって加水分解される部位である。ホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）はＡ１とＡ２の両方の部位を加水分解する。反応式１の上段は、ＰＬＡ１が作用した後、ＰＬＡ２が作用して、脂肪酸エステルとグリセロール−３−リン酸化合物（グリセロール−３−リン酸ホスホジエステル）が生成される経路である。反応式１の下段は、ＰＬＡ２が作用した後、ＰＬＡ１が作用して、脂肪酸エステルとグリセロール−３−リン酸化合物（グリセロール−３−リン酸ホスホジエステル）が生成される経路である。ＰＬＢでは上段と下段の反応が同時進行する。上記の酵素Ａ及び酵素ＣはＰＬＡ１活性を有するものであり、このようなＰＬＡ１にあっては、脂肪酸をより多く得るために、ＰＬＡ２の酵素やＰＬＢの酵素と併用してもよい。
【００９４】
加水分解反応においては、エステル化によって脂肪酸と反応するアルコールの存在下で反応を行うことが好ましい。例えば、脂肪酸メチルエステルを製造する場合には、メタノール（ＭｅＯＨ）の存在下で加水分解反応を行うことが好ましい。これにより、加水分解反応と同時にエステル化を進行させることができ、脂肪酸エステルを容易に製造することができる。すなわち、一旦、遊離脂肪酸を生成した後、遊離脂肪酸をエステル化するような２ステップの反応よりも、簡単にバイオディーゼル燃料を製造することができる。
【００９５】
エステル化される脂肪酸としては、原料に含まれリン脂質に結合した脂肪酸であれば、限定されるものではないが、例えば、炭素数４〜３０、好ましくは炭素数８〜２４である飽和又は不飽和の脂肪酸を例示することができる。具体的には、酪酸（ブチル酸）、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられる。
【００９６】
加水分解反応の際の条件としては、酵素が加水分解作用を発揮する条件とすることができる。
【００９７】
例えば、反応条件としては、酵素を失活させない程度のアルコール存在下で酵素が作用する温度とｐＨの条件であることが好ましい。より好ましくは、１〜８０ｍｏｌ％、好ましくは５〜７５ｍｏｌ％、さらに好ましくは１０〜５５ｍｏｌ％程度のメタノール存在下、酵素の最適温度、ｐＨ条件で反応を行う。温度としては、酵素活性の観点からは、１０〜７０℃が好ましく、２０〜６５℃がより好ましく、３５〜５５℃がさらに好ましい。また、温度として、室温（例えば、２０〜２５℃）で反応させることも好ましい。室温での反応の場合、加温することなく、バイオディーゼル燃料を得ることが可能となる。ｐＨとしては、ｐＨ４〜１１において酵素反応が進行し得るのでこの範囲が好ましい。酵素活性の観点からは、酵素Ａ及び酵素Ｃでは、ｐＨ４．１〜１０．５がより好ましく、ｐＨ５〜９がさらに好ましく、ｐＨ５．５〜８がよりさらに好ましい。また、酵素Ｂ及び酵素Ｄでは、ｐＨ５．６〜１０．４がより好ましく、ｐＨ７〜１０がさらに好ましく、ｐＨ７．５〜９がよりさらに好ましい。また、温和な条件という観点からは、中性領域（ｐＨ６〜８程度）のｐＨで反応させることも好ましい。
【００９８】
酵素の量としては、酵素の純度や力価、酵素製剤中の活性成分の含有量などによって変動し得るが、例えば、酵素の取扱い性や酵素反応の均一性の観点から、原料１００質量部に対して、酵素０．０００００１質量部以上、酵素０．００００１質量部以上、酵素０．０００１質量部以上、酵素０．００１質量部以上、又は酵素０．０１質量部以上、などにすることができる。また、酵素処理の効率化の観点から、原料１００質量部に対して、酵素１０質量部以下、酵素１質量部以下、酵素０．１質量部以下、酵素０．０１質量部以下、又は酵素０．００１質量部以下、などにすることができる。酵素の量は、例えば、賦形剤などの助剤で酵素力価を調整することにより調節したりすることが可能である。
【００９９】
また、酵素としては、ある程度の力価があればよいと思われるが、例えば、リン脂質に対する力価が０．１Ｕ／ｍＬ以上、１Ｕ／ｍＬ以上、１０Ｕ／ｍＬ以上、又は、１００Ｕ／ｍＬ以上のものを使用することができ、また、リン脂質に対する力価が１００００Ｕ／ｍＬ以下、１０００Ｕ／ｍＬ以下、又は、５００Ｕ／ｍＬ以下のものを使用することができる。適宜の力価にすることにより、酵素反応の処理性を向上させることができる。
【０１００】
メタノールなどの脂肪酸をエステル化するためのアルコールの量としては、リン脂質１００質量部に対してアルコール１〜１００質量部となる量にすることが好ましく、５〜７５質量部となる量にすることがより好ましく、１０〜６０質量部となる量にすることがさらに好ましい。また、酵素活性をできるだけ失活させないようにするために、ポリペプチドを含有する処理物のアルコール濃度を低くしてもよい。
【０１０１】
反応時間としては、酵素反応を進行させる観点からは長い方がよく、処理効率を高める観点からは短いほうがよいが、例えば、１〜７２時間程度とすることが好ましく、１２〜７２時間程度とすることがより好ましく、２４〜４８時間程度とすることがさらに好ましい。
【０１０２】
また、脂肪酸をエステル化するためのアルコール（例えばメタノール）を酵素処理中に逐次添加するなどしてもよい。例えば、メタノールを逐次添加する場合、添加したメタノールを順次エステル化することができ、酵素を失活させずに、バイオディーゼル燃料を製造することができる。また、酵素を必要に応じて逐次に添加してもよいし、酵素として固定化酵素を利用してもよい。酵素の逐次添加や固定化酵素の使用により、酵素の失活を抑制することが可能となり得る。
【０１０３】
ところで、バイオディーゼル燃料の製造においては、ポリペプチドを含む酵素を原料に加えて酵素処理することで脂肪酸エステルが得られるものであるが、例えば、上記の酵素（ポリペプチド）を産生する微生物を原料に加え、微生物から酵素を産生させるとともに、その産生した酵素によって原料から脂肪酸エステルを生成させるようにすることもできる。この場合、原料に微生物を加えて所定の反応条件にするだけで脂肪酸エステルを得ることができ、容易にバイオディーゼル燃料を製造することが可能となる。前記所定の条件とは、微生物から酵素が産生し、かつ、酵素が加水分解反応を行う条件であるが、いずれも生体由来物であるので、簡単に条件を設定することができる。
【０１０４】
生成された脂肪酸エステルは、バイオディーゼル燃料として利用することが可能となる。バイオディーゼル燃料として利用するためには、酵素反応によって得られた脂肪酸エステルを含む組成物から、バイオディーゼル燃料として利用する脂肪酸エステルを精製することが好ましい。精製は、沈殿分離、カラム分離、液相分離、比重分離、蒸留分離など、種々の分離方法を使用することができる。精製方法としては、食用油からバイオディーゼル燃料を製造する方法と同じ方法を用いることができる。精製度としては、完全に脂肪酸エステルを単離するほど精製しなくてもよい。すなわち、バイオディーゼル燃料として使用可能であれば、ある程度の精製度でよく、脂肪酸エステルを含む混合物（粗組成物）であってよい。ただし、安全上の観点から、燃焼したときに有毒ガスが発生する成分が取り除かれていることが好ましい。また、取扱いの観点からは、室温（２５℃）で液体又は固体であることが好ましく、さらに、室温（２５℃）でも液体であることが好ましい。
【０１０５】
精製方法の一例を挙げると、例えば、まず、組成物に脂肪酸エステルが可溶化可能な溶剤を加え、溶解しない固形物を沈殿やろ過により取り除く。溶剤としては、水や有機溶剤を用いることができる。有機溶剤としては、メタノールやエタノールなどのアルコールを用いることができる。次に、比重差特性を利用し、生成物を遠心分離または静置して脂肪酸エステル層を分離し、回収する。静置時間は１時間以上、好適には１２時間以上、より好適には１８時間程度、さらに好適には２４時間程度とすればよい。次に、脂肪酸エステル層に含まれている溶剤を留去などして除去する。留去により溶媒を除去する場合には、溶剤として沸点が低いもの（例えば１００℃以下）を用いることが好ましい。沸点が低いと容易に留去することができ、加熱に多くのエネルギーを必要としないという利点がある。留去方法としては、例えば常圧または減圧蒸留等が挙げられる。
【０１０６】
このようにして、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂肪酸エステルを得ることができる。バイオディーゼル燃料の好ましい用途については、食用油から製造されたバイオディーゼル燃料と同じような用途でよい。バイオディーゼル燃料は燃焼によりエネルギーとして取り出すことが可能である。例えば、バイオディーゼル燃料として、ボイラーやディーゼルエンジンの燃料などに利用することができる。
【０１０７】
ところで、副産物として得られるグリセロール３−リン酸化合物（グリセロール−３−リン酸ホスホジエステル）は、リン酸成分（肥料）として土壌改良材等に利用可能である。すなわち、上記の酵素処理で得られたバイオディーゼル燃料以外の分画成分は、さらに有効利用し得る。
【０１０８】
以上のように、上記の酵素を用いたバイオディーゼル燃料の製造方法では、原料の廃棄物と酵素、メタノールを混ぜるだけでバイオディーゼル燃料（脂肪酸メチルエステル）を製造することができることから、アルカリや強い加熱も必要ないので、製造場所が限定されず、簡便で、複雑な装置も技術も不要である。例えば、生ゴミに酵素とメタノールを入れて混ぜれば燃料ができるということも可能である。
【実施例】
【０１０９】
［酵素Ａ：ポリペプチドＡの精製］
（ａ）微生物の培養
菌体として、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomycesalbidoflavus）ＮＡ２９７（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４）を使用した。
【０１１０】
まず、トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）５００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに５０ｍｌずつ分注して、さらに１％大豆レシチンと０．１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を添加した後、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。
【０１１１】
そして、予め平板培地に生育した上記菌体のコロニーを適当量とり、トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地５０ｍＬに０．５ｍｌずつ接種し、２８℃で５５時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。
【０１１２】
（ｂ）硫安分画
上記（ａ）で回収した培養上清に、８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１５,０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）３０ｍｌで可溶化し、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で透析し、粗酵素液を得た。
【０１１３】
（ｃ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液に終濃度で１．５Ｍの硫酸アンモニウムを添加し、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ３８ｍｍ、東ソー社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１．５Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０１１４】
（ｄ）ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ  ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた。これを、２０ｍＭ  ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＳＰ（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０１１５】
（ｅ）ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０１１６】
（ｆ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記（ｅ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析したところ、溶出画分において、分子量約２８，０００Ｄａで、単一のバンドが観察された。これにより、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株より、電気泳動的に単一に精製されたポリペプチド（ポリペプチドＡという）を得た。このポリペプチドＡは、ＨＰＬＣ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定された。
【０１１７】
（ｇ）アミノ酸配列の解析
ポリペプチドＡを用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。また、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより内部アミノ酸配列の解析を行った。解析により、ストレプトマイセス・アルビドフラブスＮＡ２９７から得られた精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号１に示すものであることが確認された。よって、ポリペプチドＡは酵素Ａであることが確認された。
【０１１８】
なお、Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて酵素のアミノ酸配列に基づいて等電点を予測した結果、ポリペプチドＡの等電点は６．０６であった。
【０１１９】
［酵素Ｂ：ポリペプチドＢの精製］
（ａ）微生物の培養
菌体として、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５）を使用した。
【０１２０】
まず、ＮＢ培地「１％ ペプトン（べクトン・ディンキンソン社製）、１％肉エキス（極東製薬工業（株）製）、０．５％ 塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）、ｐＨ７．２」３００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍｌずつ分注して、さらに１％大豆レシチンと０．１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を添加した後、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。
【０１２１】
そして、予め平板培地に生育した上記菌体のコロニーを適当量とり、トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍｌずつ接種し、２８℃で１０８時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。
【０１２２】
（ｂ）硫安分画
上記（ａ）で回収した培養上清に、８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した。この沈殿を可溶化し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で透析し、粗酵素液を得た。
【０１２３】
（ｃ）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液を、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍカラム」（内径２６ｍｍ、高さ５５ｍｍ、東ソー社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０１２４】
（ｄ）ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。これを、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＨｉＴｒａｐ  Ｑ」（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０１２５】
（ｅ）ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥカラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化した「ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０１２６】
（ｆ）Ｍｏｎｏ  Ｓカラムクロマトグラフィー
上記（ｅ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ  メス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた。２０ｍＭ  メス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化した「Ｍｏｎｏ  Ｓ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０１２７】
（ｇ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記（ｅ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析したところ、溶出画分において、分子量約３９，０００Ｄａで、単一のバンドが観察された。これにより、電気泳動的に単一に精製されたポリペプチド（ポリペプチドＢという）を得た。このポリペプチドＢは、ＨＰＬＣ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定された。
【０１２８】
（ｈ）アミノ酸配列の解析
ポリペプチドＢを用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。また、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより内部アミノ酸配列の解析を行った。解析により、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４から得られた精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号２に示すものであることが確認された。よって、ポリペプチドＢは酵素Ｂであることが確認された。
【０１２９】
なお、Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて酵素のアミノ酸配列に基づいて等電点を予測した結果、ポリペプチドＢの等電点は６．４であった。
【０１３０】
［微生物のＤＮＡ］
配列番号１のポリペプチドをコードする塩基配列は、配列番号３の塩基配列であり、そのため、ストレプトマイセス・アルビドフラブスＮＡ２９７は、配列番号３のポリヌクレチドをＤＮＡとして有していることが推定される。そして、このストレプトマイセス・アルビドフラブスにおけるコア領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて解析したところ、配列番号３のポリヌクレオチドが確認された。よって、ストレプトマイセス・アルビドフラブスＮＡ２９７は配列番号３のポリヌクレチドをＤＮＡの一部として有していることが確認された。
【０１３１】
配列番号２のポリペプチドをコードする塩基配列は、配列番号４の塩基配列であり、そのため、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４は配列番号４のポリヌクレチドをＤＮＡとして有していることが推定される。そして、このストレプトマイセス・エスピーにおけるコア領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて解析したところ、配列番号４のポリヌクレオチドが確認された。よって、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４は配列番号４のポリヌクレチドをＤＮＡの一部として有していることが確認された。
【０１３２】
［ホスホリパーゼ活性］
上記のポリペプチドＡ及びポリペプチドＢについて、次の方法によりホスホリパーゼ活性及び活性の条件を確認した。
【０１３３】
（ａ）ポリペプチドＡ
０．０２％（ｗ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ナカライテスク（株）製）１０ｍＬに卵黄ホスファチジルコリン１ｇ（ナカライ製、L-α-phosphatidylcholine（egg yolk））を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリンを調製した。この１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリン０．０２５ｍＬに、０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０６０ｍＬと、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．００５ｍＬとを加えた。そして、３７℃で５分間予備加温した後、ポリペプチドＡを含む試料０．０１０ｍＬを添加し、３７℃で５分反応させた。ここで、リン脂質１００質量部に対するポリペプチドＡの質量は、０．０１ｍｌがすべて酵素で比重１とすれば４質量部となるが、使用するサンプル中のポリペプチドＡの純度によってポリペプチドＡの質量が変わるのでポリペプチドＡ含有試料の添加量の調整に留意した。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、酵素反応を停止させた。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ  Ｃテストワコー」（和光純薬工業（株）製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位とした。
【０１３４】
この酵素試験により、ポリペプチドＡはＰＬＡ１活性を示すことが確認された。
【０１３５】
また、リン脂質である１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジンコリンについて、上記と同様の方法にて、酵素反応を行った。酵素反応後の反応液をガスクロマトグラフにて分析したところ、モル比（１位：２位）は５分後で７１．５：２８．５程度となり、１０分後で６２．７：３７．３程度となり、パルミチン酸が優位に得られ、公知のＰＬＡ１（三菱化成フーズ）などとほぼ同等以上の活性を示すことが確認された。これにより、ポリペプチドＡは、ｓｎ−１位を優位に加水分解するＰＬＡ１であることが確認された。
【０１３６】
ｐＨの条件としては、ポリペプチドＡは、少なくともｐＨ４．０〜１０．５の範囲で強いＰＬＡ１活性を示すことが確認された。
【０１３７】
温度の条件としては、ポリペプチドＡは、少なくとも２０〜６０℃の範囲で強いＰＬＡ１活性を示すことが確認された。
【０１３８】
（ｂ）ポリペプチドＢ
１０％（ｗ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ナカライテスク（株）製）１０ｍＬにジミリストイルホスファチジン酸１ｇ（フナコシ製）を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸を調製した。この１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸０．００５ｍＬに、０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）０．０２５ｍＬと、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．００２ｍＬと、蒸留水０．０６３ｍＬとを加えた。そして、３７℃で５分間予備加温した後、ポリペプチドＢを含む試料０．００５ｍＬを添加し、３７℃で５分反応させた。ここで、リン脂質１００質量部に対するポリペプチドＢの質量は、０．００５ｍｌがすべて酵素で比重１とすれば２質量部となるが、使用するサンプル中のポリペプチドＢの純度によってポリペプチドＢの質量が変わるのでポリペプチドＢ含有試料の添加量の調整に留意した。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、酵素反応を停止させた。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ  Ｃテストワコー」（和光純薬工業（株）製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位とした。
【０１３９】
この酵素試験により、ポリペプチドＢはＰＬＢ活性を示すことが確認された。
【０１４０】
また、リン脂質である１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジンコリンについて、上記と同様の方法にて、酵素反応を行った。酵素反応後の反応液をガスクロマトグラフにて分析したところ、パルミチン酸とオレイン酸が約２：３で得られることが確認された。これにより、ポリペプチドＢは、ｓｎ−１位とｓｎ−２位を同程度で加水分解するＰＬＢであることが確認された。
【０１４１】
ｐＨの条件としては、ポリペプチドＢは、少なくともｐＨ６．０〜１０．５の範囲で強いＰＬＢ活性を示すことが確認された。
【０１４２】
温度の条件としては、ポリペプチドＢは、少なくとも２０〜６５℃の範囲で強いＰＬＢ活性を示すことが確認された。
【０１４３】
［実施例１、２］
リン脂質を含む原料として、大豆レシチン（和光純薬製）を用いた。酵素として、上記のポリペプチドＡを含み１００Ｕ／ｍＬ（下限６０Ｕ／ｍＬ）のＰＬＡ１活性を有する酵素製剤（実施例１）、又は、上記のポリペプチドＢを含み１００Ｕ／ｍＬ（下限６０Ｕ／ｍＬ）のＰＬＢ活性を有する酵素製剤（実施例２）を用いた。これらの酵素製剤は発現上清である。
【０１４４】
まず、大豆レシチン４．８５ｇと、メタノール０．３ｇと、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液０．２５ｍＬ（ｐＨ８）とを混合した。次に、実施例１又は実施例２の酵素製剤０．２５ｍｌを加え、スターラーにより、この混合物を、室温（約２５℃）、２４時間、の条件で撹拌・混合した。
【０１４５】
酵素処理後、この混合物をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）により分析した。ＴＬＣの条件は、ＴＬＣ担体としてメルク社製シリカゲル６０を用い、展開溶媒として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：酢酸（９：１：０．１  体積比）の混合溶媒を用いた。
【０１４６】
図１は、実施例２（酵素：ポリペプチドＢ）における酵素処理後の結果を示すＴＬＣの写真である。
【０１４７】
レーン１はオレイン酸のスポットであり、脂肪酸（ＦＡ）の比較対照である。レーン２は、大豆油のスポットであり、リン脂質（トリグリセリド：ＴＧ）の比較対照である。レーン３は、原料のレシチンのスポットである。ただし、レーン３では、レシチンと緩衝液とメタノールとの混合物で反応前のものを展開させている。なお、酵素を用いずに酵素処理と同様の処理をしたものを展開した場合もレーン３と同じ結果を与えた。レーン４は、上記によって得られた酵素処理物のスポットである。レーン５は、原料である廃食用油をアルカリ（ＫＯＨ）により化学的製造法で得た脂肪酸エステル（ＭＥ）のスポットである。
【０１４８】
図１に示されるように、レーン３（原料）とレーン４（酵素処理物）とを比較すると、レーン４では脂肪酸メチルエステルのスポットが出現しており、大豆レシチンを酵素（ポリペプチドＢ）で反応させると、バイオディーゼル燃料となる脂肪酸メチルエステルが生成することが確認された。
【０１４９】
また、同様に、実施例１（ポリペプチドＡ）においても脂肪酸メチルエステルが得られることが確認された。
【０１５０】
さらに、実施例１及び実施例２の酵素処理後の混合物をライターで着火したところ、燃焼した。これにより、バイオディーゼル燃料として利用可能であることが確認された。
【０１５１】
［酵素例１〜７］
実施例１、２の場合と同様の方法で、酵素例１〜７により大豆レシチンの酵素処理を行った。なお、反応条件は、３７℃程度、２４時間（塩化カルシウム無添加）又は１８時間（塩化カルシウム添加）、スターラーで撹拌、とした。また、ＴＬＣの条件は、ＴＬＣ担体としてメルク社製シリカゲル６０を用い、展開溶媒として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：酢酸（９：１：０．１  体積比）の混合溶媒を用い、試料をヘキサンで１０倍希釈後に２μｌをアプライする、とした。
【０１５２】
表１は、酵素例１〜７のサンプルの詳細である。
【０１５３】
【表１】
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【０１５４】
酵素処理は、塩化カルシウム添加条件と、塩化カルシウム無添加条件とで行った。表２は塩化カルシウム無添加条件の反応液組成であり、表３は塩化カルシウム添加条件の反応液組成である。なお、塩化カルシウム添加では、最終の塩化カルシウム濃度は１０ｍＭとなった。Ｅｎｚは酵素を示す。
【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
【表３】
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【０１５７】
図２は、塩化カルシウム無添加条件における結果である。
【０１５８】
図２（ａ）は、酵素例１（ポリペプチドＡを含む酵素）、及び、酵素例２（ポリペプチドＢを含む酵素）における酵素処理後の結果を示すＴＬＣの写真である。図２（ａ）において、レーン１は酵素例１（Ｅｎｚ１）、レーン２は酵素例２（Ｅｎｚ２）、レーン３は化学的製造法で得た脂肪酸エステル（ＢＤＦ）を示す。
【０１５９】
図２（ｂ）は、ホスホリパーゼ活性を示す酵素（酵素例３、４、５）で処理した後の結果を示すＴＬＣの写真である。図２（ｂ）において、レーン１は化学的製造法で得た脂肪酸エステル（ＢＤＦ）、レーン２は酵素例３（Ｅｎｚ３）、レーン３は酵素例５（Ｅｎｚ５）、レーン４は酵素例４（Ｅｎｚ４）、レーン５は、混合物（レシチンと緩衝液とメタノールとの混合物：Ｃｏｎ）を同条件でスターラーにて攪拌したものである。
【０１６０】
図２（ａ）及び（ｂ）の結果から、酵素例１（ポリペプチドＡを含む酵素）、及び、酵素例２（ポリペプチドＢを含む酵素）、酵素例３（ＰＬＡ１活性あり）、酵素例５（ＰＬＡ１活性及びＰＬＡ２活性あり）、において、バイオディーゼル燃料が製造されていることが示された。なお、酵素例４（ＰＬＡ２活性あり）は、本条件下においては酵素活性が弱く、ＢＤＦが生成しなかった。表１のように酵素活性はあるのにＢＤＦが生成されないのは、Ｃａ塩を添加しないと酵素が活性化しないか、メタノール耐性が低いか、大豆レシチンには作用しないのか、のいずれかの要因、あるいは複数の要因によるものと考えられる。
【０１６１】
図３は、塩化カルシウム添加条件における、酵素例４、６、７での酵素処理後の結果を示すＴＬＣの写真である。図３において、レーン１は酵素例７（Ｅｎｚ７：ＰＬＡ２活性あり）、レーン２は酵素例４（Ｅｎｚ４：ＰＬＡ２活性あり）、レーン３は酵素例６（Ｅｎｚ６：ＰＬＢ活性あり）、レーン３は化学的製造法で得た脂肪酸エステル（ＢＤＦ）を示す。
【０１６２】
酵素例４、６、７では、本条件下においては酵素活性が弱く、塩化カルシウム添加条件でも脂肪酸エステルがまったく生成されていないことが確認された。原因として、メタノール耐性が低いことや、粗レシチンに作用しにくいことが考えられる。
【０１６３】
［ＢＤＦ生成活性］
アルコール濃度及び酵素の違いによるＢＤＦ活性（ＢＤＦの産生量、産生物）の違いを試験した。
【０１６４】
リン脂質を含む原料として、大豆レシチン（和光純薬製）を用いた。酵素として、上記のポリペプチドＡを含み２０７．２１Ｕ／ｍＬ（８５．０８５Ｕ／ｍｇ）のＰＬＡ１活性を有する酵素製剤（酵素Ａ、以下この試験において「ＰＬＡ１」という）、又は、上記のポリペプチドＢを含み２７０．１５Ｕ／ｍＬ（１３４．９２８Ｕ／ｍｇ）のＰＬＢ活性を有する酵素製剤（酵素Ｂ、以下この試験において「ＰＬＢ」という）を用いた。これらの酵素製剤は組換え発現株の培養上澄み液を硫安沈殿した後、透析したものである。酵素反応において、メタノール濃度は、２５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、７５ｍｏｌ％の三つの濃度条件とした。
【０１６５】
まず、大豆レシチン４．２ｇと、所定量のメタノールと、所定量の蒸留水（ＤＷ：Distilled Water）と、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液０．２５ｍＬ（ｐＨ８）とを混合した。メタノールの配合量は、メタノール２５ｍｏｌ％条件では１．５５ｇ、メタノール５０ｍｏｌ％条件では２．８ｇ、メタノール７５ｍｏｌ％条件では３．２ｇにした。蒸留水（ＤＷ）の配合量は、メタノール２５ｍｏｌ％条件では２ｇ、メタノール５０ｍｏｌ％条件では１ｇ、メタノール７５ｍｏｌ％条件では０ｇ（添加しない）にした。次に、ＰＬＡ１又はＰＬＢの酵素製剤０．２５ｍｌを加え、スターラーにより、この混合物を、３７℃、回転数２００ｒｐｍの条件で撹拌・混合し、酵素反応を行った。表４に反応液組成を示す。
【０１６６】
【表４】
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【０１６７】
経時的（０、３、６、１２、２４、４８時間）に、酵素処理した混合物（反応液）をサンプリングし、ＧＣ（ガスクロマトグラフィー）により分析した。反応液の採取は、各時間において、０．５ｇを採取することにより行った。そして、５００μＬのヘキサンを加え３０ｓボルテックスにより撹拌し、１５，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎの遠心分離を行った。遠心分離後、上層のヘキサン層を取り出し、ＧＣ測定用のサンプルとした。ＧＣ測定時にはΔＡｒｅａの値が検量線内に収まるように適宜希釈を行った。
【０１６８】
ＧＣカラムとして、ＤＢ−ＷＡＸ（Ｊ＆Ｗ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，  ０．２５μｍ）を使用した。市販FAME（パルミチン酸メチルエステル（分子量270.4）、ステアリン酸メチルエステル（分子量298.5）、オレイン酸メチルエステル（分子量296.49）、リノール酸メチルエステル（分子量294.48）、リノレン酸メチルエステル（分子量292.46）を用いて検量線を作成し、反応生成物各成分の定量分析を行った。
【０１６９】
図４〜１５に結果を示す。図４〜１５は、脂肪酸エステル（ＢＤＦ）の生成量の経時変化を示すグラフである。
【０１７０】
図４は、ＰＬＡ１を用いてメタノール２５ｍｏｌ％の条件で行った場合のグラフを示している。図５は、ＰＬＢを用いてメタノール２５ｍｏｌ％の条件で行った場合のグラフを示している。図６は、メタノール２５ｍｏｌ％の条件で行った場合における、ＰＬＡ１とＰＬＢとの比較を示している。
【０１７１】
図７は、ＰＬＡ１を用いてメタノール５０ｍｏｌ％の条件で行った場合のグラフを示している。図８は、ＰＬＢを用いてメタノール５０ｍｏｌ％の条件で行った場合のグラフを示している。図９は、メタノール５０ｍｏｌ％の条件で行った場合における、ＰＬＡ１とＰＬＢとの比較を示している。
【０１７２】
図１０は、ＰＬＡ１を用いてメタノール７５ｍｏｌ％の条件で行った場合のグラフを示している。図１１は、ＰＬＢを用いてメタノール７５ｍｏｌ％の条件で行った場合のグラフを示している。図１２は、メタノール７５ｍｏｌ％の条件で行った場合における、ＰＬＡ１とＰＬＢとの比較を示している。
【０１７３】
図１３は、ＰＬＡ１の結果をまとめたＰＬＡ１のメタノール濃度傾向を示すグラフである。図１４は、ＰＬＢの結果をまとめたＰＬＢのメタノール濃度傾向を示すグラフである。図１５は、図１３及び図１４の結果をまとめたＰＬＡ１とＰＬＢとの傾向の比較を示すグラフである。
【０１７４】
図４、５、７、８、１０、１１において、「１６：０」、「１８：０」、「１８：１」、「１８：２」、「１８：３」は脂肪酸を表し、「１６：０」はパルミチン酸、「１８：０」はステアリン酸、「１８：１」はオレイン酸、「１８：２」はリノール酸、「１８：３」はリノレン酸を表している。「−Ｍｅ」はメチルエステルを表している。「Ｔｏｔａｌ  ＦＡＭＥ」は生成した脂肪酸メチルエステルの合計量を表している。
【０１７５】
図４〜１５のグラフから分かるように、ＰＬＡ１（酵素Ａ）及びＰＬＢ（酵素Ｂ）は、いずれも脂肪酸メチルエステル（ＢＤＦ）を生成しており、ＢＤＦ生成活性を有している。ここで、図６に示されるように、メタノール２５ｍｏｌ％では、ＰＬＡ１が、ＰＬＢよりもＢＤＦ生成活性が高い。一方、図９、図１２に示されるように、メタノール５０ｍｏｌ％及び７５ｍｏｌ％では、ＰＬＢが、ＰＬＡ１よりもＢＤＦ生成活性が高い。したがって、メタノール濃度が低い条件ではＰＬＡ１が有利であり、メタノール濃度が高い条件ではＰＬＢが有利であることが確認される。また、図１５から、ＢＤＦ生成活性のレベルは、メタノール２５ｍｏｌ％条件下のＰＬＡ１とメタノール５０ｍｏｌ％条件下のＰＬＢとが生成活性が高い傾向があり、メタノール５０ｍｏｌ％及び７５ｍｏｌ％条件下のＰＬＡ１は生成活性がやや低い傾向にあることが分かる。また、ＰＬＡ１及びＰＬＢはいずれもメタノール濃度が高くなると生成活性が低くなるが、ＰＬＡ１よりもＰＬＢの方がメタノール濃度変化に対する生成活性の変動はより少ない。このため、例えば、メタノール含有量３０ｍｏｌ％以下ではＰＬＡ１によりＢＤＦを生成することが好ましい。また、メタノール含有量４０ｍｏｌ％以上ではＰＬＢによりＢＤＦを生成することが好ましい。また、メタノール含有量３０ｍｏｌ％より大きく４０ｍｏｌ％より小さい範囲では、ＰＬＡ１及びＰＬＢから１種を選択して用いたり、これらを併用したりすることが好ましい。
【０１７６】
ＢＤＦ生成について、反応４８ｈ時のＦＡＭＥ  Ｔｏｔａｌから収率を算出した。表５に収率を算出した表を示す。反応液０．５ｇからヘキサン抽出後の上層ヘキサン中のＦＡＭＥ量（ｍｇ）及びＦＡＭＥ濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、上層体積が５００〜６００μｌであったことから、表に示す通りとなる。これにより、「反応液中のＦＡＭＥ濃度（ｍＭ）」、「モル収率（％、大豆レシチンの主成分であるホスファチジルコリンの平均分子量７６５から仕込み大豆レシチンのモル濃度を算出した。また、ホスファチジルコリンなどのグリセロリン脂質１ｍｏｌからは原理的に２ｍｏｌの脂肪酸が生じることから１００％反応した場合の脂肪酸濃度（Ｍ）を１００％としてモル収率を算出した）」、「重量収率（％、レシチン濃度（ｍｇ／ｍｌ）を１００％とした場合）」、「ＢＤＦ−ｍｇ／反応液１ｇ」について、表に示す結果が得られた。
【０１７７】
【表５】
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【０１７８】
［バイオマス廃棄物の酵素処理］
バイオマス廃棄物の酵素処理方法について説明する。
【０１７９】
植物や動物などの生体廃棄物、下水余剰汚泥などからＨｏｌｃｈ法などによりレシチンを抽出し、エバポレーターにて減圧留去することで粗レシチンを得ることができる。この粗レシチンを原料として、上記の酵素で酵素処理することによりバイオディーゼル燃料を製造することができる。
【０１８０】
バイオマス原料としてセイタカアワダチソウを検討した。セイタカアワダチソウ葉２０ｇ（乾燥重量９．０４ｇ）から機械的破砕と溶媒抽出により１５．８ｍｇのリン脂質が得られ、収率は０．１７質量％であった。また、葉の含水率は５４．８質量％であった。得られたリン脂質のＴＬＣ分析したところ、セイタカアワダチソウ葉から抽出されたリン脂質には、主にホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）が含まれており、大豆油製造副産物粗レシチンとほぼ同じ組成であることがわかった。よって、セイタカアワダチソウなどの植物からリン脂質が得られることが確認され、このリン脂質を用いてＢＤＦを製造できることが分かった。
【０１８１】
また、下水汚泥からリン脂質の抽出を試みた。試料として下水処理場から廃棄処分される消化ケーキ、消化汚泥、余剰汚泥、濃縮汚泥を用いた。これら汚泥１００ｇ（湿重量）から溶媒抽出した結果、余剰汚泥から最も多量のリン脂質抽出することができた。得られたリン脂質は１２．７ｍｇで、収率は０．０１２７質量％であった。上述の植物葉に比べ約１０分の１の収率であったが、含水率を９９%として算出すると１．２７質量％となり、この換算が妥当であれば、下水汚泥からリン脂質を抽出した方が効率的であると言える。下水汚泥から抽出されたリン脂質をＴＬＣ分析したところ、余剰汚泥から抽出されたリン脂質には、主にホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が含まれていることがわかった。よって、余剰汚泥などの汚泥からリン脂質を得られることが確認され、このリン脂質を用いてＢＤＦを製造できることが分かった。
【受託番号】
【０１８２】
［Streptomyces albidoflavus ＮＡ２９７（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４）］
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国  〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１１年１月２６日。
［Streptomyces sp. ＮＡ６８４（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５）］
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国  〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１１年１月２６日。
【配列表フリーテキスト】
【０１８３】
配列番号１：ポリペプチドＡ
配列番号２：ポリペプチドＢ
配列番号３：ポリペプチドＡの発現遺伝子
配列番号４：ポリペプチドＢの発現遺伝子
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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