(57)【要約】      （修正有）【課題】強固な外殻を有する検体から核酸を溶出し、核酸及び核酸増幅阻害物を含む溶出液を、直接核酸増幅する方法、及び、そのための試薬を提供する。【解決手段】検体にアルカリ性の試薬を添加し、熱処理することで検体から核酸を溶出させ、核酸増幅阻害物質耐性の高いＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを用いることで、該溶出液から直接核酸増幅が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
強固な外殻を有する検体中の核酸を増幅する方法であって、
（a）検体をアルカリ熱処理し、核酸を溶出する工程、
（c）得られた核酸溶出液を精製処理せずに核酸増幅反応に供する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに、
（b）核酸溶出液を中和処理する工程を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸増幅反応が、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｇｏポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼからなる群のうち少なくとも１以上のポリメラーゼであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
検体が、植物またはその種子である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
植物が、ユリ目、ヤシ目、イネ目、ショウガ目、マメ目、バラ目、ウリ目、ムクロジ目、ブドウ目、ナデシコ目、ナス目、キク目のいずれかに属することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
強固な外殻を有する検体中の核酸を増幅する方法に用いる試薬またはキットであって、アルカリ化剤、中和剤、及び、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを含む試薬またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体から核酸を溶出し、直接増幅する方法・試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学の発展に伴い、病原菌の検出、品種鑑定、品質検査、体質検査などを目的とした遺伝子検査が実施されている。遺伝子検査は、検体からの核酸の調製、ＰＣＲ法に代表される核酸増幅法による増幅、電気泳動等による解析の一連の流れからなる。核酸の調製においては、核酸を検体から回収し、必要な場合は精製し、核酸増幅可能な状態にする必要がある。
【０００３】
検体から核酸を回収する一般的な方法として、検体を物理的に破砕する物理破砕法（特許文献１）、フェノールや塩化ベンジルなどによりタンパク質や細胞壁を変性させ、核酸を溶出させる有機溶媒法（非特許文献１）、アルカリ処理と熱処理もしくは界面活性剤処理を組み合わせ、検体の構造を破壊し核酸を溶出させるアルカリ抽出法などが知られている。しかし、いずれの方法も、検体の破壊により脂質や多糖類などの不純物が混入し増幅反応を阻害するため、溶出液から核酸を精製する工程が必要となり、コストや簡便さの点で問題があった。
【０００４】
この問題を解決する目的で、核酸を溶出させた試料から煩雑な核酸精製工程を経ずに、直接核酸増幅に供する簡便な核酸増幅法が開発されている（特許文献２、３）。例えば、特許文献３では、プロテアーゼと界面活性剤で検体を処理後、精製工程を行うことなく、核酸増幅を行う方法が記載されている。しかし、この方法は、検体が動物組織、血液細胞や微生物などに限定されており、植物などの強固な外殻を有し、ポリフェノールなどの二次代謝産物や多糖類、脂質などの核酸増幅阻害物質を多量に含有する検体には適用し難いという問題があった。
【０００５】
そのため、植物検体から核酸を調製する場合は核酸溶出工程に加え、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）処理（特許文献４）などの煩雑な精製工程が必要となり、このような検体を用いた遺伝子検査の簡便化を妨げていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２３８８５４
【特許文献２】特開２００３−３１０２６５号広報
【特許文献３】ＷＯ２００７／１１６４５０号広報
【特許文献４】特開平１１−１６９１７０号広報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎ  ｇＴｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＣＳＨＬ出版
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、強固な外殻を有する検体から核酸を溶出し、核酸及び核酸増幅阻害物を含む溶出液を用いて直接核酸増幅する方法、及び、そのための試薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、強固な外殻を有する検体にアルカリ性の試薬を添加し、熱処理することで検体から核酸を溶出させ、核酸増幅阻害物質耐性の高いアーキア由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを用いることで、前記溶出液から直接核酸増幅が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。つまり本発明は、以下の構成からなる。
【００１０】
強固な外殻を有する検体中の核酸を増幅する方法であって、
（１）検体をアルカリ熱処理し、核酸を溶出する工程、
（２）得られた核酸溶出液を精製処理せずに核酸増幅反応に供する工程
を含むことを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、強固な外殻を有する検体から核酸を溶出後、精製工程を行うことなく直接核酸増幅することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に記載する。
【００１３】
本発明において、強固な外殻を有する検体とは、セルロース、ヘミセルロース、キチン、キトサン、アルギン酸、細胞壁多糖類、ペプチドグリカンなどの多糖類、リグニンなどの芳香属高分子化合物、ケラチンなどの繊維状タンパク質、珪酸、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなどの無機物のいずれか１つ以上から構成される外殻及び／または構造支持体を有している検体を意味する。
【００１４】
例えば、種子（脂肪性種子、でんぷん性種子、ヤシ目、イネ目、ショウガ目、マメ目、バラ目、ウリ目、ムクロジ目、ブドウ目、ナデシコ目、ナス目）、葉（ユリ目、コンブ目）、木質部、根、茎、シュート、カルス、酵母、珪藻、歯、骨、毛髪、爪、皮膚、垢、鱗、羽毛、節足動物の外骨格（エビ、カニ、昆虫など）、軟体動物の貝殻、サンゴなどが例示できるが、これらに限定されものではない。
【００１５】
本発明で言うウリ目植物とは、ウリ目に属する植物であれば特に限定はないが、例えば、キュウリ、スイカ、カボチャ、ヒョウタン、ヘチマ、トウガン、テッポウウリ、ユウガオ、ニガウリ、メロン等が挙げられる。
【００１６】
また、本発明は強固な外殻を有しない検体、例えば、上記以外の動植物、微生物、ウイルス、プラスミドにも適用することが可能である。
【００１７】
本発明において抽出される核酸とは、ヒト、牛等の哺乳動物や植物等の内在性の核酸に限定されず、細菌、ウイルス、プラスミド等の外来性の核酸などの検体中に存在するあらゆる核酸が対象となる。
【００１８】
本発明において、検体からの核酸の溶出はアルカリ熱処理により行う。
【００１９】
アルカリ熱処理に使用するアルカリ化剤としては、検体から効率的に核酸を溶出できれば特に限定されず、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、トリエチルアミン、Ｔｒｉｓ、炭酸緩衝液等が好適に用いられる。好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウムであり、特に好ましくは水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウムである。
【００２０】
アルカリ化剤の濃度は、５Ｍ以下が好ましく、１Ｍ以下がより好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭがさらに好ましい。アルカリ化剤の濃度が低すぎると核酸の溶出効率が低下し、またアルカリ化剤の濃度が高すぎると、核酸の分解を引き起こすなどの理由から好ましくない。
【００２１】
本発明におけるアルカリ熱処理時のｐＨは特に限定されないが、ｐＨ１０以上が好ましく、ｐＨ１２以上がより好ましい。
【００２２】
本発明において、アルカリ化剤と検体との混合後の熱処理温度は、６０℃以上が好ましく、７０℃以上がより好ましく、９０℃以上がさらに好ましい。また、加熱時間は１０秒以上が好ましく、１分以上がより好ましく、また１５分以下が好ましい。加熱時間が短すぎると核酸の抽出が不十分となり、長すぎると核酸が分解する恐れがある。
【００２３】
本発明において、アルカリ熱処理を行った核酸溶出液は、中和剤を用いて中和処理するのが好ましい。使用する中和剤は特に限定されず、アルカリ化剤によってアルカリ性となった試料を中性領域に調整できれば良い。
【００２４】
中和剤としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸などの無機酸、グリシン、リン酸、フタル酸、クエン酸、バルビツール酸、コハク酸、クエン酸、酢酸などの有機酸、リン酸緩衝液やグッド緩衝液等の緩衝剤が好適に用いられる。
【００２５】
これらの中でも、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等のグッド緩衝液が好ましく、Ｔｒｉｓが特に好ましい。
【００２６】
核酸増幅反応に供する核酸溶出液のｐＨは、抽出された核酸が安定で、かつ、核酸増幅反応に影響しない領域であえば特に限定されないが、ｐＨ６〜９．５が好ましく、よりｐＨ７〜９がより好ましい。
【００２７】
本発明において、核酸の溶出の際にアルカリ化剤及び／または中和剤に添加剤を添加しておくことも可能である。例えば、アルブミン、ポリアミン、シクロデキストリン、ＰＶＰ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、トレハロース、ポリエチレングリコールなどの核酸増幅阻害物質マスク剤、アニオン性、カチオン性、双性イオン性または非イオン性界面活性剤、プロテイナーゼＫ、ケラチナーゼ、リゾチーム、セルラーゼなどの高分子分解酵素などの検体破砕助剤、ヌクレアーゼインヒビター、ｐＨ指示薬、還元剤、キレート剤、カオトロピック剤、コスモトロピック剤などの核酸保護剤、リボボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼなどが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
また、核酸溶出工程以前に、検体を物理的に破砕しても良く、例えば、凍結融解による破砕や、ホモジナイザーによる物理的破砕法などと組み合わせることが可能である。
【００２９】
また、核酸増幅工程以前に、溶出液をフィルター濾過や遠心に供する、固相担体への選択的な吸着処理することなどにより、核酸と夾雑物を分離しても構わない。
【００３０】
本発明において、アルカリ熱処理により得られた核酸溶出液は、精製工程を行うことなく核酸増幅反応に供することが可能となる。すなわち、核酸を溶出させる方法としてはアルカリ熱処理の他にも知られているが、溶出液を直接核酸増幅反応に供することができる点で、本発明のアルカリ熱処理法が最も好適である。
【００３１】
他の一般的な核酸溶出法のうち、物理破砕法では液体窒素や破砕装置を必要とし、フェノール・クロロホルム法では溶出液に残存するフェノール・クロロホルムにより核酸増幅反応が阻害される。
【００３２】
あるいは、アルカリ処理と界面活性剤処理を組み合わせた手法では、溶出液に残存する界面活性剤により核酸増幅反応が阻害され、酵素法では、溶出効率が低く溶出液の作製に長時間を必要とし、塩化ベンジル法では溶出液に残存する塩化ベンジルにより核酸増幅反応が阻害されるという問題がある。
【００３３】
一方、本発明のアルカリ熱処理法は、短時間で溶出液を作製できるだけでなく、アルカリを中和すると、その後の核酸増幅反応に悪影響を与えないという利点も有している。
【００３４】
本発明において、核酸増幅反応とは、ＰＣＲ法に代表される核酸配列を増幅させる手法であり、例えば、ＰＣＲ法以外にＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＣＰＴ（Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）法、Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）法、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）法等の公知の方法が例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明において、核酸増幅反応に使用するＤＮＡポリメラーゼは、核酸増幅阻害物質の共存下で活性を有すれば限定されないが、アーキア由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼが好適に用いられる。アーキア由来Ｂファミリーに分類されるＤＮＡポリメラーゼには、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼが例示される。
【００３６】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼとしては、ＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来）、Ｔｇｏポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ由来）、Ｔｌｉポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来）などが挙げられ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤｅｅｐＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＧＢ−Ｄ由来）、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来）、Ｐｈｏポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来）、Ｐｗｏポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ由来）などが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
また、本発明において、アーキア由来Ｂファミリーポリメラーゼはアミノ酸置換変異、アミノ酸挿入変異、キメラ化、欠損変異、化学修飾、抗体修飾などなされていても良く、アーキア由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼが含まれていれば、その他のポリメラーゼやアクセサリータンパク質が混合されていても良い。
【００３８】
本発明において、核酸増幅阻害物質とは、タンパク質、ペプチド、トリアシルグリセロール、リン脂質、糖脂質、脂肪酸などの脂質、ブドウ糖、果糖、ショ糖、ガラクツロン酸、還元糖などの糖類、デンプン、ポリガラクツロン酸、ヘパリン、アルギン酸、ヒアルロン酸、不溶性多糖などの多糖類、ポルフィリン類、テルペン類、ポリフェノール、腐植酸、フルボ酸、タンニン、メラニン、クエン酸、無機金属、キレート剤、植物色素、植物二次代謝産物などが含まれる。
【００３９】
核酸増幅阻害物質を豊富に含有する検体としては、植物検体などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明には、前記アルカリ化剤、前記中和剤、前記アーキア由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅試薬を組み合わせたキットも含まれる。また、本発明に用いる試薬や前記キットを核酸調製装置、核酸増幅装置、核酸自動解析装置などに組み込むことも可能である。
【００４１】
本発明において、用いる試薬は、強固な外殻を有する検体中の核酸を増幅するための試薬、キットは、前記アルカリ化剤、前記中和剤、前記アーキア由来ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅試薬から選ばれる少なくとも１以上から構成される。核酸増幅試薬は緩衝剤、塩、金属陽イオン、デオキシリボヌクレオチド３リン酸など、効率的な核酸増幅反応に必要な物質を含む。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
以下の実施例、比較例においては検体として、ミカン（種子）、ダイズ（種子）、トウモロコシ（種子）、リンゴ（種子）、ソバ（種子）、コムギ（種子）、ラッカセイ（種子）、キク（葉）、ラン（葉）、スイカ（種子）、トマト（種子）、バナナ（果肉）を用いた。各検体に対応するプライマーはシグマ社の受託合成システムにより、以下の配列を作製した。
ミカン用プライマーＦ：５’−（AGTTAAAAAGCTCGTAGTTG）−３’（配列番号１）
ミカン用プライマーＲ：５’−（GCACTCTAATTTCTTCAAAG）−３’  （配列番号２）
ダイズ用プライマーＦ：５’−（GGTGGAGGACAAATGAGCAGCGA）−３’（配列番号３）
ダイズ用プライマーＲ：５’−（ATGCTTCATGATTCCCTAAGTCTGGAAACT）−３’（配列番号４）
トウモロコシ用プライマーＦ：５’−（CCTATAGCTTCCCTTCTTCC）−３’（配列番号５）
トウモロコシ用プライマーＲ：５’−（TGCTGTAATAGGGCTGATGA）−３’（配列番号６）
リンゴ用プライマーＦ：５’−（GTAATCCACGATTATTCTTGC）−３’（配列番号７）
リンゴ用プライマーＲ：５’−（ACGAAGACTTCTTCTACAGGATC）−３’（配列番号８）
ソバ用プライマーＦ：５’−（AACGCCATAACCAGCCCGATT）−３’（配列番号９）
ソバ用プライマーＲ：５’−（CCTCCTGCCTCCCATTCTTC）−３’（配列番号１０）
コムギ用プライマーＦ：５’−（CATCACAATCAACTTATGGTGG）−３’（配列番号１１）
コムギ用プライマーＲ：５’−（TTTGGGAGTTGAGACGGGTTA）−３’（配列番号１２）
ラッカセイ用プライマーＦ：５’−（CGAAGGAAACCCCGCAATAAAT）−３’（配列番号１３）
ラッカセイ用プライマーＲ：５’−（CGACGCTATTTACCTTGTTGAG）−３’（配列番号１４）
トマト用プライマーＦ：５’−（AGACCACGAGAACGATATTTGC）−３’（配列番号１５）
トマト用プライマーＲ：５’−（TTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA）−３’（配列番号１６）
バナナ用プライマーＦ：５’−（TCGTCACCTATTGGGATGC）−３’（配列番号１７）
バナナ用プライマーＲ：５’−（GCTTTAATAAGTGCTTCGGTG）−３’（配列番号１８）
キク、ラン、スイカ用プライマーＦ：５’−（CGGACGAGAATAAAGATAGAGT）−３’（配列番号１９）
キク、ラン、スイカ用プライマーＲ：５’−（TTTTGGGGATAGAGGGACTTGA）−３’（配列番号２０）
【実施例１】
【００４４】
アルカリ熱処理とＢファミリーＤＮＡポリメラーゼによる核酸解析
＜アルカリ熱処理による核酸溶出＞
検体（乾燥重量２００ｍｇ以下）の入ったＰＣＲチューブに５０ｍＭ  ＮａＯＨを１５０μｌ添加し、９８℃にて１０分間熱処理し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２１μｌ添加し、よく混合後、これを核酸溶出液とした。
【００４５】
＜ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅＞
溶出液を、精製工程を介することなく、ＰＣＲ法に供した。核酸増幅用酵素としては、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼであるＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いた。ＫＯＤ  Ｄａｓｈの説明書に従い、５μｌの溶出液と各１５ｐｍｏｌのプライマーをＰＣＲチューブへ入れ、５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(Ｔ３０００(バイオメトラ社製))にセットし、９４℃で３０秒、６０℃で２秒、７２℃で３０秒のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドにより染色し、核酸増幅の有無を解析した。その結果を表１に示した。
【００４６】
【表１】
2014000015.tif 000002
【００４７】
＜結果＞
解析の結果、全ての検体において、核酸が増幅された。
【００４８】
（比較例１）アルカリ熱処理とＡファミリーＤＮＡポリメラーゼによる核酸解析
＜アルカリ熱処理法＞
核酸溶出液の作製は、実施例１と同様の手法により、アルカリ熱処理により実施した。
【００４９】
＜ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅＞
溶出液を、精製工程を行うことなく、ＰＣＲ法に供した。核酸増幅用酵素としては、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼであるｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。ｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの説明書に従い、５μｌの溶出液と各１５ｐｍｏｌのプライマーをＰＣＲチューブへ入れ、５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(Ｔ３０００(バイオメトラ社製))にセットし、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ産物の内、３μｌを２％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドにより染色し、核酸増幅の有無を解析した。その結果を表１に示した。
【００５０】
＜結果＞
全ての検体において、核酸が増幅されなかった。
【００５１】
（比較例２）熱処理とＢファミリーＤＮＡポリメラーゼによる核酸解析
＜熱処理による核酸溶出＞
検体（乾燥重量２００ｍｇ以下）の入ったＰＣＲチューブにＤＷを１７１μｌ添加し、９８℃にて１０分間熱処理し、これを核酸溶出液とした。
【００５２】
＜ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ＞
核酸増幅は、実施例１と同様の手法により、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼであるＫＯＤ  Ｄａｓｈを用い、ＰＣＲを実施し解析した。その結果を表１に示した。
【００５３】
＜結果＞
全ての検体において、核酸が増幅されなかった。
【配列表】
2014000015000001.app