(57)【要約】【課題】  脳や神経系についての研究の他、癌の研究などに用いる実験動物として有用な、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物、および実験動物などとしてのその用途を提供すること。【解決手段】  ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を完全に欠損させた、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質を部分的にも全く発現しないＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物である。その作製方法としては、例えば、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の第１エクソンから第３エクソンの全てを欠失させる方法が挙げられる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を完全に欠損させた、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質を部分的にも全く発現しないＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２】
ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の第１エクソンから第３エクソンの全てを欠失させた請求項１記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物。
【請求項３】
請求項１または２記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物の実験動物としての使用。
【請求項４】
脳および／または神経系の異常を示すモデル動物としての請求項３記載の使用。
【請求項５】
脳および／または神経系の異常がシナプス形成および／または神経伝達機能制御の異常である請求項４記載の使用。
【請求項６】
請求項１または２記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物由来の脳神経細胞の脳および／または神経系の異常を示すモデル細胞としての使用。
【請求項７】
請求項１または２記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物および／またはこの動物由来の脳神経細胞に対する作用を評価することによる脳および／または神経系の異常の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳や神経系についての研究の他、癌の研究などに用いる実験動物として有用な、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物、および実験動物などとしてのその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質は、本発明者らの研究グループによってラットの脳の神経細胞の樹状突起上のシナプス後肥厚部（ＰＳＤ：Ｐｏｓｔ−Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）分画から単離同定された、例えば配列表の配列番号１のアミノ酸配列（対応するｃＤＮＡ配列は配列表の配列番号２を参照のこと）で表される分子量が約７０ｋＤａであってロイシンジッパードメインとコイルドコイルドメインを持ったタンパク質であり、シナプス形成や神経伝達機能制御に重要な役割を果たしていることが知られている（例えば非特許文献１や非特許文献２を参照のこと）。近年、行動や学習という形で表出する脳や神経系についての研究が盛んに行われていることは一般にもよく知られているところであるが、そうした状況の中、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能にも注目が集まっている。また、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子は、ヒト染色体８ｐ２２由来の癌抑制遺伝子であるＦｅｚ１／Ｌｚｔｓ１遺伝子と相同であることが知られており、当該遺伝子の機能が明らかになることによって癌の発症の仕組みなどもこれまで以上に明らかになると期待されている。
【０００３】
個体レベルや組織・細胞レベルでＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を解析する際、当該遺伝子の機能を欠損させた非ヒト動物、例えばＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスを用いた解析が不可欠である。ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスは、非特許文献３において、高頻度の腫瘍形成の表現型を示すＦｅｚ１／Ｌｚｔｓ１遺伝子ノックアウトマウスとして既に紹介されている。非特許文献３に記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０（Ｆｅｚ１／Ｌｚｔｓ１）遺伝子ノックアウトマウスは、当該遺伝子が有する全部で３つのエクソン（第１エクソンから第３エクソン）のうちの第１エクソンのみをターゲットとし、第１エクソンの開始コドンの近傍（１２３ｂｐ下流）に終始コドンを導入することで、遺伝子機能の欠損がもたらされるように設計されている。しかしながら、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質は、Ｎ末端に脂質修飾を受けて細胞膜へ集積する機能ドメインを持つことから、第１エクソンの開始コドンの近傍に終始コドンを導入する方法では、当該ドメインの部分タンパク質が発現することで、遺伝子機能が完全に欠損されない可能性や発現した部分タンパク質が機能解析に何らかの影響を及ぼす可能性を否定できない。従って、非特許文献３に記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスは、この点において改良の余地を残している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｏｎｎｏ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１５，４６９５−４７０６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００２
【非特許文献２】Ｍａｒｕｏｋａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２５，１４２１−１４３０，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５
【非特許文献３】Ｖｅｃｃｈｉｏｎｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１，２７５−２８９，Ｍａｒｃｈ  ２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を完全に欠損させた、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物、および実験動物などとしてのその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の点に鑑みてなされた本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、請求項１記載の通り、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を完全に欠損させた、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質を部分的にも全く発現しないことを特徴とする。
また、請求項２記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、請求項１記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物において、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の第１エクソンから第３エクソンの全てを欠失させたことを特徴とする。
また、本発明は、請求項３記載の通り、請求項１または２記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物の実験動物としての使用である。
また、請求項４記載の使用は、脳および／または神経系の異常を示すモデル動物としての請求項３記載の使用である。
また、請求項５記載の使用は、請求項４記載の使用において、脳および／または神経系の異常がシナプス形成および／または神経伝達機能制御の異常であることを特徴とする。
また、本発明は、請求項６記載の通り、請求項１または２記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物由来の脳神経細胞の脳および／または神経系の異常を示すモデル細胞としての使用である。
また、本発明は、請求項７記載の通り、請求項１または２記載のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物および／またはこの動物由来の脳神経細胞に対する作用を評価することによる脳および／または神経系の異常の予防・治療薬のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を完全に欠損させた、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物、および実験動物などとしてのその用途を提供することができる。本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能が完全に欠損されており、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質を部分的にも全く発現しない。従って、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質の部分タンパク質が発現することで、遺伝子機能が完全に欠損されない可能性や発現した部分タンパク質が機能解析に何らかの影響を及ぼす可能性が全くないので、脳や神経系の他、癌などにおけるＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能解明のための優れた実験動物である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例における本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスの作製のためのターゲッテンティングベクターの構築概略図である。
【図２】同、ＰＣＲ法によるＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子に対する相同組み換えが起こったＥＳ細胞クローンの選別結果の一例を示す図である。
【図３】同、マウスの尾から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子型を特定した結果を示す図である。
【図４】同、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）と野生型マウス（ＷＴ：ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）の大脳皮質組織におけるＰＳＤ−Ｚｉｐ７０ｍＲＮＡの発現の有無を示す図である。
【図５】同、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）と野生型マウス（ＷＴ：ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）の大脳皮質組織におけるＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質の発現の有無を示す図である。
【図６】同、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）と野生型マウス（ＷＴ：ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）の大脳皮質組織を用いて電気生理学的解析（微小興奮性シナプス後電流の計測）を行った結果を示すグラフである。
【図７】同、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）と野生型マウス（ＷＴ：ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）のＹ字迷路を用いた行動特性の評価結果を示すグラフである。
【図８】同、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）と野生型マウス（ＷＴ：ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）のオープンフィールド試験による行動特性の評価結果を示すグラフである。
【図９】同、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）と野生型マウス（ＷＴ：ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）の高架十字迷路を用いた行動特性の評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を完全に欠損させた非ヒト動物、即ち、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子であるＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子（そのｃＤＮＡ配列としては例えば配列表の配列番号２で表されるものが挙げられるがこの配列に限定されるものではない）に対して破壊や欠失や置換などが行われることで、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質を部分的にも全く発現しない非ヒト動物である。なお、本発明における非ヒト動物としては、例えばマウスやラットなどの齧歯目の動物が挙げられる。
【００１０】
本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物の作製方法は、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を完全に欠損させた非ヒト動物、即ち、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質を部分的にも全く発現しない非ヒト動物を作製することができる方法であればどのようなものであってもよいが、例えば、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子が有する全部で３つのエクソン（第１エクソンから第３エクソン）を、当該領域をＮｅｏ遺伝子カセットなどのマーカー遺伝子を含むカセットで置換することで欠失させることを目的としたターゲッティングベクターを作製し、作製されたベクターをエレクトロポレーション法によってＥＳ細胞に導入し、相同組み換えを起こしたＥＳ細胞を選択し、選択されたＥＳ細胞系を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させることによって得られるヘテロ接合体マウス（Ｆ１／雑種第一代）同士を交配させることによって作製することができる。
【００１１】
本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、出生から繁殖可能齢までの外見的特徴が野生型非ヒト動物と大差がなく、繁殖能力についても野生型非ヒト動物と同等であるので、例えばＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質が重要な役割を果たしているシナプス形成や神経伝達機能制御に対する個体レベルや組織・細胞レベルでの遺伝子機能の解析を行うための実験動物として有用である。うつ病をはじめとする感情障害や統合失調症などの精神疾患や精神発達遅滞ではシナプス形成の異常がその発症に関わっていることが知られている。従って、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、こうした疾患の発症メカニズムの解明や予防・治療法の開発などのための貴重な研究材料となる。また、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質は、Ｌａｐｓｅｒ１タンパク質のＳｈａｎｋ３（自閉症関連遺伝子産物）結合ドメインと相同な配列を有しており、自閉症などの発達障害にも関与することが強く示唆されているので、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、こうした疾患の発症メカニズムの解明や予防・治療法の開発などのための貴重な研究材料にもなる。また、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子は、癌抑制遺伝子としての機能も有するので、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、癌の発症メカニズムの解明や予防・治療法の開発などのための貴重な研究材料にもなる。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明をＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスの実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１３】
（Ａ）本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスの作製
１．ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子近傍のゲノムＤＮＡのクローニング
ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の第１エクソンの上流域８．２ｋｂと第３エクソンの下流域１．９５ｋｂの領域のそれぞれのゲノムＤＮＡ断片を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統由来のマウスゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーの陽性クローンからそれぞれクローニングした。
【００１４】
２．ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０ターゲッティングベクターの構築（図１）
ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０ターゲッティングベクターは、第１エクソンの上流域８．２ｋｂｐと第３エクソンの下流域１．９５ｋｂｐの領域のそれぞれに対する相同配列の間に、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターによって発現されるネオマイシン耐性遺伝子カセット（Ｎｅｏ遺伝子カセット）をＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子がコードされている方向に対して逆向きに挿入することによって作製した。
【００１５】
３．ＥＳ細胞への相同組み換え
制限酵素を用いてこのＰＳＤ−Ｚｉｐ７０ターゲッティングベクターを直鎖状とし、エレクトロポレーション法によってＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ系統由来ＥＳ細胞（ｉＴＬ  ＩＣ１細胞）に導入した。ネオマイシン耐性ＥＳ細胞クローンをＧ４１８によって選択し、ＰＣＲ法によって相同組み換え体を選別した。ＰＣＲ法による相同組み換えの確認は、図１に示したネオマイシン耐性遺伝子カセット配列に対して作製したプライマーＮ１（配列表の配列番号３）と、３’側相同配列よりも下流領域の配列に対して作製したプライマーＡ２（配列表の配列番号４）を用い、相同組み換えが起こった場合に増幅される２．２ｋｂの断片を指標にして行った。図２にＥＳ細胞クローンの選別結果の一例を示す。図２から明らかなように、相同組み換えが起こったことを示す２．２ｋｂの断片が増幅されたＥＳ細胞クローンの存在が確認できた（クローン６２１，６２５，６２６，６４６）。
【００１６】
４．組み換えＥＳ細胞の個体への導入および組み換えマウスの作製
相同組み換えが起こったＥＳ細胞クローン（クローン６２５）を用い、文献（Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３）の方法に準じて胚盤胞期のＢａｌｂ／ｃ系統由来の受精卵に対してマイクロインジェクションによって導入し、これを擬妊娠したＢａｌｂ／ｃ系統仮親の子宮内に移植した。作出されたキメラマウスのうち、キメラ細胞頻度が高いオス個体を用いてＢａｌｂ／ｃメス個体と交配してその仔の体色判別することより、生殖細胞にＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子相同組み換えの起こった生殖系列オスキメラ個体を選別した。この選別された生殖系列オスキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスマウスと交配することによりヘテロ接合体マウス（Ｆ１／雑種第一代）を作出し、次いでホモ接合体マウスを得るためにこのヘテロ接合体マウス間で交配を行い、メンデルの法則に従って本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスを作製した。
【００１７】
（Ｂ）（Ａ）で作製した本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスがＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子およびタンパク質を発現していないことの確認
１．ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０の遺伝子型の確認
同腹子として出生したマウスの尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＥＳ細胞選別の際に用いたプライマーＮ１とプライマーＡ２を用いてＰＣＲを行った。上記の通り、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子を欠失した染色体を持つ場合には２．２ｋｂの断片が増幅される。また、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の第３エクソン内の配列に対して作製したプライマーＺ１（配列表の配列番号５）とプライマーＡ２を用いてＰＣＲを行った。この場合、野生型のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子が残存する染色体を持つ場合には２．１ｋｂの断片が増幅される。図３にこれらのＰＣＲ法による遺伝子型特定の結果を示す。
【００１８】
２．ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０ｍＲＮＡの発現の確認
同腹子として出生した１２週齢の野生型マウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）および本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）から得られた大脳皮質組織を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＰＳＤ−Ｚｉｐ７０ｍＲＮＡの発現を確認した。大脳皮質組織よりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、それを鋳型としてランダムプライマーを用いた逆転写を行ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型としてＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子のコード領域に対して作製したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０ｍＲＮＡの発現を確認した。陽性対照はＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子を用いた。結果を図４に示す。図４から明らかなように、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスでは、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０ｍＲＮＡの発現を確認することができなかった。
【００１９】
３．ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質の発現の確認
同腹子として出生した８週齢の野生型マウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）および本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）から得られた大脳皮質組織を用いてウエスタンブロット解析を行った。大脳皮質組織は１００倍容量のＳＤＳサンプルバッファーで溶解し、各５μＬを用いてアクリルアミドゲル電気泳動によって展開し、ＰＶＤＦ膜上に転写を行った。１次抗体としては抗ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０特異抗体（ウサギ産生ポリクローナル抗体）、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（ヤギ産生ポリクロ―ナル抗体）を用い、化学発光法によって検出した。陽性対照はβ−アクチンタンパク質およびＴｕｊ１（神経細胞特異的チューブリンβ３）タンパク質をそれぞれの特異抗体を用いて検出した。結果を図５に示す。図５から明らかなように、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスでは、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質の発現を確認することができなかった。
【００２０】
４．まとめ
以上の結果から、本来、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０タンパク質が豊富に発現する大脳皮質において、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスは、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０の発現がｍＲＮＡとタンパク質いずれにおいても消失していることが確認できた。
【００２１】
（Ｃ）（Ａ）で作製した本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスの外見的特徴と繁殖能力
出生から繁殖可能齢までの外見的特徴は野生型マウスと大差がなく、繁殖能力についても野生型マウスと同等であった。
【００２２】
（Ｄ）（Ａ）で作製した本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス由来の脳神経細胞を用いたＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の欠失によるシナプス形成や神経伝達機能制御への影響の検討（脳神経細胞の電気生理学的変化）
８週齢の野生型マウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）および本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）から得られた大脳皮質組織を用いて電気生理学的解析を行った。具体的には、Ｙａｓｕｄａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３；６（１）：１５−１６に記載の方法に準じ、大脳皮質組織から厚さ４００μｍの急性脳スライス標本を作製し、前部帯状回皮質の第２／３層の錐体細胞に対して１μＭテトドロトキシンと１００μＭピクロトキシンの存在下でホールセルパッチクランプ法によって膜電位−７５ｍＶで固定して微小興奮性シナプス後電流を計測した。微小興奮性シナプス後電位は、振幅がシナプス後部の機能的な神経伝達物質の存在量、頻度は機能的なシナプスの形成密度あるいはシナプス前部のシナプス小胞の開口頻度を反映し、これらの減少はシナプス形成や神経伝達機能制御の異常によって起こる。結果を図６に示す。図６から明らかなように、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスは、微小興奮性シナプス後電流の振幅については野生型マウスと大差がなかったが、頻度については野生型マウスに比較して有意な減少が認められた（野生型マウス：ｎ＝１２，ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス：ｎ＝１５，ｐ＜０．０５）。以上の結果から、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス由来の脳神経細胞は、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の欠失によるシナプス形成や神経伝達機能制御の異常に基づく脳や神経系の異常を示すモデル細胞として、こうした異常の、メカニズムの解明や、電気生理学的変化に対する程度の緩和や改善を指標とした予防・治療薬のスクリーニングなどに利用することができることがわかった。
【００２３】
（Ｅ）（Ａ）で作製した本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスを用いたＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の欠失による空間作業記憶や不安傾向への影響の検討
１．空間作業記憶への影響
８〜１０週齢の野生型マウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）および本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）のそれぞれについて、Ｙ字迷路を用いて行動特性を評価した。具体的には、Ｓａｒｔｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）．１９８８；９４（４）：４９１−４９５に記載の方法に準じ、長さと幅が等しい３本のアームが等角度に配置された構造を有するＹ字迷路の中心にマウスを置いて５分間自由に移動させた。マウスの移動をビデオカメラによって撮影し、時間内にアームに進入した回数と順番を記録した。マウスがアームに進入した回数から１引いた値を自発運動量、３回連続で異なるアームに進入した回数を自発運動量の値で除した数値を交替量（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）として算出した。交替量は直前に入ったアームの記憶を短期的に保持する空間作業記憶の能力を反映する。結果を図７に示す。図７から明らかなように、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスは、時間内の自発運動量については野生型マウスと大差がなかったが、交替量については野生型マウスに比較して有意な減少（空間作業記憶の能力が障害）が認められた（野生型マウス：ｎ＝１８，ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス：ｎ＝２０，ｐ＜０．０５）。
【００２４】
２．不安傾向への影響（その１）
８〜１０週齢の野生型マウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）および本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）のそれぞれについて、オープンフィールド試験による行動特性を評価した。具体的には、Ｗａｌｓｈ  ＲＮ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １９７６；８３（３）：４８２−５０４に記載の方法に準じ、高さ２０ｃｍの壁で囲われた６０ｃｍ四方の正方形の容器の中心にマウスを置いて５分間自由に移動させた。マウスの移動をビデオカメラによって撮影し、時間内に容器内で移動した軌跡を記録した。容器の中心から３０ｃｍ四方の区域を中央部とした。マウスは壁際に沿って移動する傾向が強いが、本能的な探索行動によって身を隠すことができない中央部にも進入する。中央部への進入回数が少ないほど強い不安を反映していると判断することができる。結果を図８に示す。図８から明らかなように、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスは、時間内の総移動距離については野生型マウスと大差がなかったが、中央部への進入回数については野生型マウスに比較して有意な減少（不安傾向の増強）が認められた（野生型マウス：ｎ＝１２，ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス：ｎ＝１４，ｐ＜０．０５）。
【００２５】
３．不安傾向への影響（その２）
８〜１０週齢の野生型マウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０＋／＋）および本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０−／−）のそれぞれについて、高架十字迷路を用いて行動特性を評価した。具体的には、Ｌｉｓｔｅｒ  ＲＧ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）．１９８７；９２（２）：１８０−１８５に記載の方法に準じ、高さ５０ｃｍの場所に長さと幅が等しい４本のアームが全体で十字を形成するように配置され、向かい合う２本のアームは側面を高さ１５ｃｍの壁に囲まれているが、それに直交する２本のアームは側面に壁がない構造を有する高架十字迷路の中心にマウスを置いて５分間自由に移動させた。マウスの移動をビデオカメラによって撮影し、時間内に高架十字迷路内で移動した軌跡を記録した。側面に壁がないアームは高架となっているため、マウスは落下に対する不安を感じるので、そこでの運動量が少ないほど強い不安を反映していると判断することができる。結果を図９に示す。図９から明らかなように、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスは、時間内の側面に壁がないアームでの運動量が野生型マウスと比較して有意に少なかった（不安傾向の増強）（野生型マウス：ｎ＝１３，ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウス：ｎ＝１５，ｐ＜０．０５）。
【００２６】
４．まとめ
以上の結果から、本発明のＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウトマウスは、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の欠失により、空間作業記憶の能力が障害されているとともに、不安傾向が増強されていることから、シナプス形成や神経伝達機能制御の異常に基づく脳や神経系の異常を示すモデル動物として、こうした異常の、メカニズムの解明や、空間作業記憶の能力の障害や不安傾向の増強に対する程度の緩和や改善を指標にした予防・治療薬のスクリーニングなどに利用することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子の機能を完全に欠損させた、ＰＳＤ−Ｚｉｐ７０遺伝子ノックアウト非ヒト動物、および実験動物などとしてのその用途を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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