(57)【要約】【課題】本発明は、MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するペプチドを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するペプチドであって、3から15アミノ酸からなる環状部分と、1アミノ酸以上のテイルとを有するペプチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するペプチドであって、3から15アミノ酸からなる環状部分と、1アミノ酸以上のテイル部分とを有するペプチド。
【請求項２】
前記環状部分は、以下の(i)から(iii)の少なくとも1つの特徴を有する、請求項１に記載のペプチド：
(i) N末端がF、Y、W、H、又はこれらの鏡像異性体であり、C末端のCと結合して環を形成している；
(ii) 少なくとも2アミノ酸が、疎水性アミノ酸である；及び
(iii) 1又は2のYを含む。
【請求項３】
前記環状部分が、7アミノ酸で構成されており、以下の(a)から(f)の少なくとも1つの特徴を有する請求項１に記載のペプチド：
(a) N末端がF、Y、W、H、又はこれらの鏡像異性体であり、C末端のCと結合して環を形成している；
(b) N末端から2番目が、V、L、又はTである；
(c) N末端から3番目が、F、Y、又はHである；
(d) N末端から4番目が、S、A、P、N、又はQである；
(e) N末端から5番目が、A、V、S、L、又はTである；及び
(f) N末端から6番目が、A、V、F、又はYである。
【請求項４】
前記環状部分が、V-Y-S-A-Vとの配列、又はこの配列において1アミノ酸が欠失、付加、又は置換されている配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記V-Y-S-A-Vの配列において1アミノ酸が欠失、付加、又は置換されている配列が、請求項３に記載の(b)〜(f)の少なくとも1つの特徴を有する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記テイル部分は、7以上のアミノ酸を含み、以下の(I)及び(II)の少なくとも1つの特徴を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチド：
(I) 30％以上のアミノ酸が疎水性アミノ酸である；及び
(II) 2アミノ酸以上疎水性アミノ酸が連続している部位を含む。
【請求項７】
以下のいずれかのペプチド：
FVYSAVCLYVGSLYPCG；
FLYNAYCLWLAYCVNSCG；
FTHPIFCYPSADLCG；
FTYSAFCYAIANIAYCG；
fQWQCHIFTNLALTCG；
fVYSAVCLYVGSLYSCG；
fVYSAVCLYVGSLYSG;
fLYNAYCLWLAYCVNSCG；
fVYSAVCYSIAAAAAAARTG;
fVYSAVCYSIAAAAAAA；
fVDASACSFVNLWLTCG；
fSVACSAFVRIAHHASCG；
fTTYSAFCYAIANIAYCG；及び
fTYSAFCYAIANIAYCG
（式中、N末端のFはL-フェニルアラニンを、fはD-フェニルアラニンを示す。F又はfがN-クロロアセチル化されており、クロロアセチル基が最もN末端側のCと結合して環状を形成していてもよい。）。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドを含む、抗がん剤又は多剤耐性菌感染症治療薬の治療効果増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多剤排出輸送体MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、構造・作用の異なる薬剤を広範に認識して細胞から排出する多剤排出輸送体が注目されている。多剤排出輸送体は、原核生物から高等真核生物にわたって広く存在し、様々な薬剤耐性に関与している。例えば、病原菌から複数の抗生物質等を積極的に排出し、病原菌に多剤耐性能を与える。また、癌細胞から抗癌剤を排出し、抗癌剤の効果を抑制することもある。
【０００３】
多剤排出輸送体として、MATE（Multidrug And Toxic Compound Extrusion）タンパク質が知られている（非特許文献１及び２）。およそ450アミノ酸残基、12回の膜貫通ヘリックスを有し、薬剤とナトリウムイオンやプロトンを対向輸送する。
バクテリアのMATEは、広い範囲の抗生物質を排出し、薬剤耐性獲得に寄与しうる。これまでのバクテリアにおける生化学的研究から、MATEは、陽イオン性の有機化合物、特に芳香環内に4級アンモニウムを含む色素化合物（例えば、臭化エチジウム、アクリフラビン塩酸塩）を認識することが示唆されている。その他、フルオロキノロン系抗菌薬、アミノグリコシド系抗菌薬（例えば、カナマイシン、ストレプトマイシン）も、基質としてMATEに認識される（非特許文献３）。
【０００４】
MATEは、特に黄色ブドウ球菌や肺炎レンサ球菌などのグラム陽性細菌において薬剤排出を担っていると推測されており、MATEの阻害剤を得ることができれば、グラム陽性細菌をターゲットとした薬剤の効果を促進するために効果的であると考えられる。
また、MATEには、ヒトや植物においてもホモログが発見されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Miyamae, S. et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 45, 3341-3346 (2001)
【非特許文献２】Bachoual, R. et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 44, 1842-1845 (2000)
【非特許文献３】Kuroda, T. and Tsuchiya, T. Biochimica et biophysica acta 1794, 763-768, doi:10.1016/j.bbapap.2008.11.012 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、アミノ酸数が3〜15程度の環状部分と、アミノ酸数1以上のテイル部分からなる特定のペプチドは、MATEの多剤排出活性を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するペプチドであって、3から15アミノ酸からなる環状部分と、1アミノ酸以上のテイル部分とを有するペプチド；
〔２〕前記環状部分は、以下の(i)から(iii)の少なくとも1つの特徴を有する、上記〔１〕に記載のペプチド：
(i) N末端がF、Y、W、H、又はこれらの鏡像異性体であり、C末端のCと結合して環を形成している；
(ii) 少なくとも2アミノ酸が、疎水性アミノ酸である；及び
(iii) 1又は2のYを含む；
〔３〕前記環状部分が、7アミノ酸で構成されており、以下の(a)から(f)の少なくとも1つの特徴を有する上記〔１〕に記載のペプチド：
(a) N末端がF、Y、W、H、又はこれらの鏡像異性体であり、C末端のCと結合して環を形成している；
(b) N末端から2番目が、V、L、又はTである；
(c) N末端から3番目が、F、Y、又はHである；
(d) N末端から4番目が、S、A、P、N、又はQである；
(e) N末端から5番目が、A、V、S、L、又はTである；及び
(f) N末端から6番目が、A、V、F、又はYである；
〔４〕前記環状部分が、V-Y-S-A-Vとの配列、又はこの配列において1アミノ酸が欠失、付加、又は置換されている配列を含む、上記〔１〕に記載のペプチド；
〔５〕前記V-Y-S-A-Vの配列において1アミノ酸が欠失、付加、又は置換されている配列が、上記〔３〕に記載の(b)〜(f)の少なくとも1つの特徴を有する、上記〔４〕に記載のペプチド。
〔６〕前記テイル部分は、7以上のアミノ酸を含み、以下の(I)及び(II)の少なくとも1つの特徴を有する、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載のペプチド：
(I) 30％以上のアミノ酸が疎水性アミノ酸である；及び
(II) 2アミノ酸以上疎水性アミノ酸が連続している部位を含む；
〔７〕以下のいずれかのペプチド：
FVYSAVCLYVGSLYPCG；
FLYNAYCLWLAYCVNSCG；
FTHPIFCYPSADLCG；
FTYSAFCYAIANIAYCG；
fQWQCHIFTNLALTCG；
fVYSAVCLYVGSLYSCG；
fVYSAVCLYVGSLYSG;
fLYNAYCLWLAYCVNSCG；
fVYSAVCYSIAAAAAAARTG;
fVYSAVCYSIAAAAAAA；
fVDASACSFVNLWLTCG；
fSVACSAFVRIAHHASCG；
fTTYSAFCYAIANIAYCG；及び
fTYSAFCYAIANIAYCG
（式中、N末端のFはL-フェニルアラニンを、fはD-フェニルアラニンを示す。F又はfがN-クロロアセチル化されており、クロロアセチル基が最もN末端側のCと結合して環状を形成していてもよい。）；
〔８〕上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸；及び
〔９〕上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載のペプチドを含む、抗がん剤又は多剤耐性菌感染症治療薬の治療効果増強剤、に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペプチドによれば、MATEによる薬剤排出輸送活性を抑制することができる。したがって、多剤耐性菌感染症治療剤や抗がん剤と共に投与することにより、これらの薬剤が細胞外に排出されるのを防ぎ、薬剤の治療効果を高めることができる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１は、遺伝暗号のリプログラミングとセレクションのスキームを示す。図１Ａは、開始CAUコドンボックスにおけるホルミルメチオニンをN-クロロアセチル-L-フェニルアラニン又はN-クロロアセチル-D-フェニルアラニンで置き換えるために用いた、本セレクションに用いられたリプログラミングされた遺伝暗号を示す。白いボックスは、NNKライブラリー領域には現れないコドンを表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、N-クロロアセチル-L-フェニルアラニン又はN-クロロアセチル-D-フェニルアラニンで始まる非標準的なペプチド産生を示す概念図である。これにより得られたペプチドでは、下流のシステインとの間の大環状化反応が自発的に起こる。
【図１Ｃ】図１Ｃは、PfMATEタンパク質のへの親和性を用いた環状ペプチドのセレクションにおけるラウンドの1つを示す概念図である。
【図２Ａ】図２は、4℃及び37℃で行ったセレクションの進行とクローンアッセイを示す。図２Ａは、4℃のセレクションにおけるPhMATEに結合するL-及びD-プールの濃縮を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、37℃のセレクションにおけるPhMATEに結合するL-及びD-プールの濃縮を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、固定されたPfMATEへの個々のペプチド−mRNAの結合を示す。
【図３】図３は、化学合成したペプチドの構造とMALDIスペクトルを示す。
【図４】図４は、選択されたペプチドの阻害活性を示す。グラフは、細胞のエチジウムブロマイド排出能に対する、各種用量のペプチドD1、D5、D8及びL6の影響を示す。
【図５】図５ａは、本発明のペプチドMaD5とMad3Sの化学式を示す。図５ｂは、MaD5とMaD3SをPfMATEと共結晶化し、複合体X線解析構造を行い、スペースフィリングモデルで可視化した図を示す。図５ｃは、各ペプチドの細胞のエチジウムブロマイド排出能に対する阻害活性を調べた結果を示す。
【図６】図６は、MaD5とMaD3SによるPhMATEのエチジウムブロマイド排出阻害を測定した際の実測値を示す。
【図７】図７ａは、MaD5とPfMATEの複合体X線解析図、図７ｂはMaD5の化学構造、図７ｃはMaD3SとPfMATEの複合体X線解析図、図７ｄはMaD3Sの化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に係るペプチドは、MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するものであって、3から15アミノ酸からなる環状部分と、1アミノ酸以上のテイルとを有する。
本明細書においてMATEタンパク質とは、非特許文献１及び２に記載された約450アミノ酸残基からなり、12回の膜貫通ヘリックスを有するタンパク質、及びそのファミリーをいい、そのホモログも含む。
MATEタンパク質は、例えば、Pyrococcus furiosus由来のPfMATE、T.sibiricus MATE、T.naphthophila MATE、T.maritima TM1701、M.jannaschii MJ0709、M.smithii NorM、E.coli c2456、V.cholerae VcmN、V.cholerae NorM、Homosapiens MATE、哺乳類におけるホモログ（SLC47Aなど）、植物におけるホモログ等を含むがこれらに限定されない。
MATEタンパク質は、上述のとおり、ナトリウムイオンやプロトンと薬剤とを対向輸送し、細胞中の薬剤を排出する。
【００１１】
本明細書において「多剤排出輸送活性の阻害」とは、MATEタンパク質が有する薬剤を細胞外に排出輸送する活性の全部又は一部を抑制することを意味する。あるペプチドが、MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するか否かは、例えば、実施例に記載された方法で、当業者が確認することができる。
本発明に係るペプチドをMATEタンパク質と共結晶化し、X線結晶構造解析を行ったところ、環状部分がMATEタンパク質の基質結合部位の溝に嵌合していることが確認された。このことは、本発明に係るペプチドが、MATEタンパク質のコンフォメーション変化を阻害することによって、多剤排出輸送活性を阻害していることを示唆する。また、テイル部分は、一度溝に嵌合したペプチドが溝から外れるのを防いでいるものと考えられる。
但し、本発明に係るペプチドは、そのメカニズムにかかわらず、多剤排出輸送活性を阻害するものを広く包含する。
【００１２】
本発明に係るペプチドにおいて、環状部分は3から15アミノ酸からなる。3から15アミノ酸には、環を形成するためのアミノ酸も含まれる。環状部分は3以上15以下のいずれの数のアミノ酸としてもよいが、例えば3以上10以下、4以上7以下の範囲とすることも好ましい。
【００１３】
本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体、誘導体を含む。本明細書においてアミノ酸は、天然タンパク性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
本明細書において、アミノ酸は、1文字または3文字表記で示される。
【００１４】
後述する実施例に示すとおり、本発明に係るペプチドの環状部分は、MATEタンパク質の基質結合部位に嵌合したD5ペプチドの配列等に基づき、例えば、以下の(i)から(iii)の性質を備えたものとすることができる。
(i) N末端がF、Y、W、H、又はこれらの鏡像異性体であり、C末端のCと結合して環を形成している。
(ii) 少なくとも2アミノ酸が、疎水性アミノ酸である。
(iii) 1又は2のYを含む。
F、Y、W、Hは芳香環アミノ酸である。本明細書において、疎水性アミノ酸とは、A、V、L、I、M、W、F、Pをいう。
【００１５】
また、本発明に係るペプチドの環状部分は、7アミノ酸であることも好ましく、その場合、以下の(a)から(f)の少なくとも1つの特徴を備えたものとすることができる。
(a) N末端がF、Y、W、H、又はこれらの鏡像異性体であり、C末端のCと結合して環を形成している。
(b) N末端から2番目が、V、L、又はTである。
(c) N末端から3番目が、F、Y、又はHである。
(d) N末端から4番目が、S、A、P、N、又はQである。
(e) N末端から5番目が、A、V、S、L、又はTである。
(f) N末端から6番目が、A、V、F、又はYである。
F、Y、W、Hは芳香環アミノ酸であり、V、L、Tは比較的小さい疎水性残基を有するアミノ酸である。F、Y、Hはいずれも芳香環アミノ酸であり、S、A、P、N、Qは比較的小さい疎水性あるいは中性の残基である。また、A、V、S、L、Tは疎水性残基であり、A、V、F、Yは疎水性又は芳香環残基である。
各アミノ酸は修飾されていてもよく、例えばNアルキルアミノ酸あるいは側鎖が蛋白質性でないアミノ酸であってもよい。
【００１６】
本発明に係るペプチドの環状部分は、V-Y-S-A-Vとの配列を含んでいてもよく、又はV-Y-S-A-Vとの配列において1アミノ酸が欠失、付加、又は置換されている配列を含んでいてもよい。
1アミノ酸置換されている場合、置換等される場所は特に限定されないが、その結果得られるペプチドは、上記(b)から(f)の少なくとも1つの性質を備えていることが好ましい。
V-Y-S-A-VのN末端側又はC末端側には、環状化に必要な任意のアミノ酸を結合させることができる。
【００１７】
本発明に係るペプチドのテイル部分は、1以上のアミノ酸を含む限り特に限定されないが、疎水性が高いほうが好ましい。疎水性の高いテイルや、8アミノ酸以上含むテイルを有するペプチドは、MATEタンパク質からはずれにくいものと考えられる。
したがって、テイル部分は、以下の(I)又は(II)の少なくとも1つの性質を備えることが好ましい。
(I) 30％以上のアミノ酸が疎水性アミノ酸である；及び
(II) 2アミノ酸以上疎水性アミノ酸が連続している部位を含む。
【００１８】
本発明に係るペプチドの、非限定的な例として以下のものが挙げられる。
FVYSAVCLYVGSLYPCG；
FLYNAYCLWLAYCVNSCG；
FTHPIFCYPSADLCG；
FTYSAFCYAIANIAYCG；
fQWQCHIFTNLALTCG；
fVYSAVCLYVGSLYSCG；
fVYSAVCLYVGSLYSG;
fLYNAYCLWLAYCVNSCG；
fVYSAVCYSIAAAAAAARTG;
fVYSAVCYSIAAAAAAA；
fVDASACSFVNLWLTCG；
fSVACSAFVRIAHHASCG；
fTTYSAFCYAIANIAYCG；及び
fTYSAFCYAIANIAYCG
【００１９】
これらのペプチドは、後述する実施例において行ったセレクションで選択されたものから、さらに、MATEタンパク質の基質結合部位に嵌合したD5ペプチドの配列等に基づいて多剤排出輸送活性が高いと推測されるものと、選択された頻度が高いものを挙げている。
配列中、Fは、L-フェニルアラニンを表し、fは、D-フェニルアラニンを表す。F又はfは、N-クロロアセチル化されていてもよく、その場合、クロロアセチル基ともっともC末端側にあるCが結合して環状を形成していてもよい。
【００２０】
本発明に係るペプチドは、そのC末端がカルボキシル基又はカルボキシレート基のみでなく、アミドやエステルになっていてもよい。また、本発明のポリペプチドには、ポリペプチドの塩も含まれる。ポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基や酸との塩が用いられ、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（p-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、投与したときに細胞内に導入されるよう、特定の機能を有するペプチドと融合させてもよい。
また、本発明のポリペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化、糖鎖付加などの修飾が加えられたものであってもよい。他のペプチドやタンパク質と融合させたものであってもよい。
【００２１】
本発明に係るペプチドは、液相法や固相法などの化学合成によって製造してもよいし、翻訳合成によって製造してもよい。当業者は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって、種々の手法で本発明に係るペプチドを製造することができる。
【００２２】
固相法は、例えば、水酸基を有するレジンの水酸基と、α-アミノ基が保護基で保護された第一のアミノ酸（通常、目的とするペプチドのC末端アミノ酸）のカルボキシ基をエステル化反応させる。エステル化触媒としては、1-メシチレンスルホニル-3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール（MSNT）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。
次に、第一アミノ酸のα−アミノ基の保護基を脱離させるとともに、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第二のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第一及び第二のアミノ酸を結合させる。さらに、第二のアミノ酸のα-アミノ基を脱保護し、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第三のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第二及び第三のアミノ酸を結合させる。これを繰り返して、目的とする長さのペプチドが合成されたら、すべての官能基を脱保護する。
【００２３】
固相合成のレジンとしては、Merrifield resin、MBHA resin、Cl-Trt resin、SASRIN resin、Wang resin、Rink amide resin、HMFS resin、Amino-PEGA resin（メルク社）、HMPA-PEGA resin（メルク社）等が挙げられる。これらのレジンは、溶剤（ジメチルホルムアミド（DMF）、2−プロパノール、塩化メチレン等）で洗浄してから用いてもよい。
α-アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル（Cbz又はZ）基、tert−ブトキシカルボニル（Boc）基、フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル（Alloc）基等が挙げられる。Cbz基はフッ化水素酸、水素化等によって脱保護でき、Boc基はトリフルオロ酢酸（TFA）により脱保護でき、Fmoc基はピペリジンによる処理で脱保護できる。
α-カルボキシ基の保護は、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、tert−ブチルエステル、シクロヘキシルエステル等を用いることができる。
アミノ酸のその他の官能基として、セリンやトレオニンのヒドロキシ基はベンジル基やtert−ブチル基で保護することができ、チロシンのヒドロキシ基は2−ブロモベンジルオキシカルボニル希やtert−ブチル基で保護する。リジン側鎖のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシ基は、α−アミノ基、α−カルボキシ基と同様に保護することができる。
【００２４】
カルボキシ基の活性化は、縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDCあるいはWSC）、（1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（BOP）、1-［ビス（ジメチルアミノ）メチル］-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシドヘキサフルオロホスファート（HBTU）等が挙げられる。
レジンからのペプチド鎖の切断は、TFA、フッ化水素（HF）等の酸で処理することによって行うことができる。
【００２５】
遺伝子組み換え法や無細胞翻訳系によるペプチドの製造は、本発明のペプチドをコードする核酸（DNA又はRNA）を用いて行うことができる。
【００２６】
本発明のペプチドをコードする核酸は、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。例えば、自動合成装置によって合成することができる。得られたDNAをベクターに挿入するために制限酵素認識部位を加えたり、できたペプチド鎖を酵素などで切り出すためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んでもよい。
【００２７】
本発明のペプチドをコードする核酸は、発現ベクターのプロモータの下流に挿入して発現させることができる。ベクターとしては、大腸菌由来プラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、バクテリオファージ（λファージ、M13ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等を使用することができる。
【００２８】
プロモータは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、SV40（simian virus 40）由来プロモータ、CMV（cytomegalovirus）由来プロモータを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、trpプロモータ、T7プロモータ、lacプロモータ等を用いることができる。
発現ベクターには、DNA複製開始点（ori）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ（FLAG、HA、GST、GFPなど）をコードする核酸等を組み込むこともできる。
【００２９】
本発明に係るペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターは、以下に示すとおりin vitroで宿主を形質転換し、本発明のペプチドを発現させるために用いてもよく、そのまま対象に投与して、in vivoで本発明のペプチドを発現させるために用いることもできる。
【００３０】
形質転換に用いる宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌）、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞を用いることができる。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。
形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするペプチドが発現する。培地は、宿主の種類等に応じて適宜選択される。
【００３１】
形質転換体の培養物からのペプチドの精製は、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから超音波処理、凍結融解などの方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS−PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
得られたペプチドは、公知の方法又はそれに準ずる方法で遊離体から塩に、又は塩から遊離体に変換してもよい。
【００３２】
翻訳合成系は、無細胞翻訳系としてもよい。無細胞翻訳系は、例えば、リボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）、リボソームRNA、アミノ酸、rRNA、GTP、ATP、翻訳開始因子（IF）伸長因子（EF）、終結因子（RF）、およびリボソーム再生因子（RRF）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を含む。発現効率を高くするために大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液加えてもよい。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を加えてもよい。
これらを含む系に、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、数100μgから数mg/mLのタンパク質を生産することができる。DNAからの転写を併せて行うためにRNAポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のRTS-100（登録商標）、PGI社のPURESYSTEM（登録商標）等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。
【００３３】
無細胞翻訳系においては、天然のアミノアシルtRNA合成酵素に合成されるアミノアシルtRNAに代えて、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸をtRNAに連結（アシル化）した人工のアミノアシルtRNAを用いてもよい。かかるアミノアシルtRNAは、人工のリボザイムを用いて合成することができる。
かかるリボザイムとしては、フレキシザイム（flexizyme）（H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662； H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084； H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359 "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides"；N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894 "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group"；及びWO2007/066627等）が挙げられる。フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Fx）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等の呼称でも知られる。
【００３４】
フレキシザイムによって生成された、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸が連結されたtRNAを用いることにより、所望のコドンを、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸と関連付け、遺伝暗号をリプログラミングして翻訳することができる。所望のアミノ酸としては、特殊アミノ酸を用いてもよい。
特殊アミノ酸の例を下表に示すが、これらに限定されない。なお、表中DBEとCMEは、特殊アミノ酸をフレキシザイムでtRNAに結合させるときのエステルの種類であり、DBEは、3,5-dinitrobenzyl esterを意味し、CMEは、cyanomethyl esterを意味する。
【００３５】
本発明に係るペプチドにおいて環状化構造を形成する方法は特に限定されず、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、C-S-C結合、C-N-C結合、C=N-C結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、チオアミド結合などによることができるが、これらに限定されない。
【００３６】
環状化のために、N末端にクロロアセチル化したアミノ酸を用い、配列中にCysを配してもよい。これにより、N末端アミノ酸とCysとのチオエーテル結合により、ペプチドが自然に環状化する。クロロアセチル化アミノ酸とCysとの間に形成されるチオエーテル結合は生体内の還元条件下でも分解を受けにくいので、ペプチドの血中半減期を長くして生理活性効果を持続させることが可能である。
クロロアセチル化アミノ酸としては、例えば、N-Chloroacetyl-L-alanine、N-Chloroacetyl-L-phenylalanine、N-Chloroacetyl-L-tyrosine、N-Chloroacetyl-L-tryptophan、N-Chloroacetyl-D-alanine、N-Chloroacetyl-D-phenylalanine、N-Chloroacetyl-D-tyrosine、N-Chloroacetyl-D-tryptophan、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophaneを用いることができる。
また、クロロアセチル化アミノ酸として、Nγ-(2-chloroacetyl)-α,γ-diaminobutylic acid、又はNγ-(2-chloroacetyl)-α,γ-diaminopropanoic acidを用いれば、ペプチド鎖のどの部位にも導入できるので、任意の箇所のアミノ酸と、同じペプチド内のシステインとの間にチオエーテル結合が生成され、環状構造が形成される。
環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)に記載された方法に従って行うことができる。
【００３７】
上述した遺伝暗号のリプログラミングを利用した無細胞系の翻訳合成により合成する場合は、N-クロロアセチル-L-フェニルアラニンやN-クロロアセチル-D-フェニルアラニンを、開始tRNAfMetCAUにチャージし、任意の位置にシステインを入れることにより、翻訳された後、自発的に環が形成される。
【００３８】
本発明の核酸は、本発明のペプチドをコードする核酸であり、DNAであってもRNAであってもよい。本発明の核酸は、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。例えば、自動合成装置によって合成することができる。得られたDNAをベクターに挿入するために制限酵素認識部位を加えたり、できたペプチド鎖を酵素などで切り出すためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んでもよい。
【００３９】
本発明に係るペプチドは、MATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害するので、多剤排出輸送活性によって、薬剤が排出されることによる弊害を防ぐために利用することができる。例えば、抗がん剤と共に投与し、抗がん剤がMATEタンパク質によって癌細胞から排出されるのを防ぎ、抗がん剤の効果を増強することができるものと考えられる。また、MRSAなどの多剤耐性菌感染症治療薬と共に投与し、当該治療薬が菌から排出されるのを防いで、治療薬の効果を増強することができるものと期待される。
よって、本発明は、本発明に係るペプチドを含む、抗がん剤又は多剤耐性菌感染症治療薬の治療効果増強剤も提供する。
【００４０】
本発明に係る治療効果増強剤は、本発明に係るペプチドをそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。
製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。
上記医薬組成物が、ペプチドを含む場合、ペプチド等の経粘膜吸収されにくい難吸収性薬物の吸収を改善する吸収促進剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、サポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸等の胆汁酸塩；EDTA、サリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、N-アシルコラーゲンペプチド、N-アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、一酸化窒素供与体等を用いることができる。
【００４１】
本発明に係る治療効果増強剤の投与量や、当業者が、患者の症状、年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、製剤の種類等に応じて、適宜決定することができる。
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
１．N-ClAc-L-Phe-tRNAfMetCAU及びN-ClAc-D-Phe-tRNAfMetCAUの調製
Gotoらの方法（Goto Y. et al., Nat Protoc 2011, 6: 779-790; Goto Y. et al., ACS Chem Biol 2008, 3: 120-129）に従って、N-クロロアセチル-L-フェニルアラニン及びN-クロロアセチル-D-フェニルアラニンを、開始tRNAfMetCAUにチャージした。チャージされたセレクションのラウンド1用のtRNAは、5.25nmolのアリコートを乾燥ペレットとして-80℃で保存した。ラウンド2及びその後のラウンド用のtRNAは、175pmolのアリコートを乾燥ペレットとして-80℃で保存した。
【００４４】
２．ライブラリーの構築
DNAライブラリーの構築は、Hayashiらの方法（Hayashi, Y. et al., ACS Chemical Biology 2012, 7: 607-613）に準じて行った。7〜15のランダムなアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドプライマーを、伸長及びPCRプライマー（下表）と共に使用した。相補的な領域は、イタリックで示され、同一の領域は太字で示されている。
【表１】
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mRNAライブラリーをライブラリーのテンプレートNNK15:NNK14:NNK13:NNK12:NNK11:NNK10:NNK9:NNK8:NNK7に対して、それぞれ160:40:10:2.5:0.625:0.156:0.391:0.00977:0.00244 pmolで加え、全量を100μLとした。
【００４５】
３．タンパク質の固定
セレクションのラウンド1では、HEPES緩衝化生理食塩水（25 mM HEPES、150 mM NaCl、0.1 % Cymal-6 (w/v)、pH 7.0、150 (l）中で、Invitrogen Dynabeads（登録商標）His-Tag Isolation & Pulldown magnetic beads（保存用バッファーを除く前で15(l）のHisタグ結合部位を、HisタグをつけたPfMATE（751pmol）を用いて飽和させた。
ラウンド2及びその後のラウンドでは、HEPES緩衝化生理食塩水（25 mM HEPES、150 mM NaCl、0.1 % Cymal-6 (w/v)、pH 7.0、150 (l）中で、Invitrogen Dynabeads（登録商標）His-Tag Isolation & Pulldown magnetic beads（保存用バッファーを除く前で1(l）のHisタグ結合部位を、HisタグをつけたPfMATE（50 pmol）を用いて飽和させた。
タンパク質−ビーズ混合物を、穏やかに撹拌しながら室温で20分インキュベートした。インキュベーション後、HEPES緩衝化生理食塩水（ラウンド1では300μl、ラウンド2以降では30μl）でビーズを3回洗浄し、結合していないPfMATEを除去した。
【００４６】
４．mRNA−ピューロマイシン
４−１．ラウンド１
ラウンド1では、ライゲーション反応溶液（20 % DMSO、1x T4 RNAリガーゼバッファー、1.5 (Mピューロマイシンリンカー、1 (M mRNA、236 pmolのT4リガーゼ、200 (l）を室温で30分インキュベートした。反応停止溶液（0.6 M NaCl、10 mM EDTA、pH 7.5、200 (l）を加えて反応を停めた。溶液を、25:24:1のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール（400 (l）で抽出し、第二の抽出をクロロホルム:イソアミルアルコール（400 (l）で行った。 水相に800μlのエタノールを加えて、mRNA-ピューロマイシン複合体を沈殿させた。得られた沈殿物を遠心処理（13000rpm、15分）でペレットにし、70％エタノール（400μl）で洗浄してから、遠心処理（13000rpm、3分）を行って、空気乾燥させた。沈殿物を30μlの水に溶解させた。
【００４７】
４−２．ラウンド2以降
ラウンド2及びその後の全てのラウンドでは、ライゲーション反応溶液（20 % DMSO、1x T4 RNAリガーゼバッファー、1.5 μM ピューロマイシンリンカー、1 (M mRNA、47.2 pmolのT4 ligase、40 (l)を室温で30分インキュベートした。反応溶液に水40μlを加えた。80μlの反応停止溶液（0.6 M NaCl、10 mM EDTA、pH 7.5）を加えて反応を停止させた。溶液を、25:24:1のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール（160 (l）で抽出し、第二の抽出を24:1のクロロホルム:イソアミルアルコール（160 (l）で行った。水相に320μlのエタノールを加えて、mRNA-ピューロマイシン複合体を沈殿させた。沈殿物を70％エタノールで洗浄してから空気乾燥させた。沈殿物を8μlの水に溶解させた。
【００４８】
５．PfMATE結合環状ペプチドのセレクション
５−１．4℃でのセレクション
in vitroセレクションのラウンド1は、180 pmolのmRNA-ピューロマイシン複合体と、5.25 nmolのClAc-L-Phe-tRNAfMetCAU又はClAc- D-Phe-tRNAfMetCAUを用い、反応体積150μlのFITシステムで行った（Hayashi, Y. et al., ACS Chemical Biology 2012, 7: 607-613；Yamagishi Y. et al., Chem Biol 2011, 18: 1562-1570, 図１Ａ〜Ｃに概略を示す）。
翻訳反応液は、37℃で30分インキュベートした後、室温で12分インキュベートして行った。EDTA溶液（200mM、15μl）を各翻訳反応液に加えた。環状化を促進させるため、反応用液を再び37℃で30分インキュベートした。
反応溶液を、HPES緩衝化生理食塩水で予め洗浄したSephedex G-25カラムに通して塩を除去した。塩を除いたペプチド−mRNA溶液のそれぞれに、2xブロッキング溶液（1 M NaCl、0.2%アセチル化ウシ血清アルブミン、25 mM HEPES、150 mM NaCl、0.1 % Cymal-6 (w/v)、pH 7.0、165 (l）を加えた。
【００４９】
不要なビーズ結合ペプチド−mRNA及びHisタグを有するFITシステムの成分は、ペプチド−mRNAを、保存用バッファーを除いた磁気ビーズ（保存用バッファーを除く前で150μl）とインキュベートして除いた。
上清を分離し、上清の1μlを逆転写反応とリアルタイムPCRに用い、inputしたペプチド−mRNAの濃度を測定した。
残りの上清（329μl）のうち300μのペプチド−mRNA溶液を、PhMATE−ビーズ（「タンパク質の固定」の項目で調製したもの）とともに1時間4℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。
インキュベーション後、上清を除去し、氷冷したHEPES緩衝化生理食塩水（800μl）で磁気ビーズを3回洗浄して、磁気ビーズに結合していないペプチド−mRNAを除去した。このビーズに、逆転写反応溶液（1.25x MMLV RT buffer、0.625 mM dNTP、3.125 (M primer CGS3an13.R39、8 U RNase In、300 U RTase (+H)、40 (l）を加えた。反応液を、42℃で1時間インキュベートした。ビーズを含む逆転写反応液に、200μlのポリメラーゼを含まないPCR Reaction MIX（1x Taq PCR Buffer、2.5 mM MgCl2、0.5 mM dNTP、0.25 (M primer T7g10M.F48、0.25 (M primer GS3an13.R39)を加え、95℃で5分インキュベートした。上清を新しいチューブに移し、600μlのポリメラーゼを含まないPCR Reaction MIXと6μlのTaqを加えた。ビーズとの結合により回収されたペプチド−mRNAを定量するため、反応液から20μlをリアルタイムPCRのために取り分けた。残りの826μlの溶液は、16×（95℃/40秒、50℃/40秒、72℃/40秒）のサイクルに供した。PCR産物を1当量（one equivalent volume）の25:24:1 フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出し、続いて1当量の24:1 クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出した。
水相にNaCl溶液（3M、82μl）を加え、エタノール（1640μl）を加えてDNA産物を沈殿させた。ペレットをKCl溶液（50mM、30μl）に溶解させた。溶解させたDNA（4μl）を16μlの転写反応溶液（1.2x T7 buffer、12 mM ジチオスレイトール、24 mM MgCl2、26.4 mM KOH、4.5 mM NTPs、4 U RNase inhibitor、及び T7 polymerase）に加えた。転写反応溶液を37℃で一晩（12時間以上）インキュベートした。
【００５０】
ラウンド2から7のセレクションは、上記方法に修正を加えて行った。
in vitro翻訳反応は、175pmolのClAc-L-Phe-tRNAfMetCAU又はClAc-D-Phe-tRNAfMetCAUと、7.5pmolのmRNA−ピューロマイシン複合体（全量5μl）を用いて行った。標的タンパク質に親和性を有するRNAアプタマーを単離するのを防ぐために、セレクションに先立って相補的DNAを逆転写した。
セレクションのインキュベーションは30分に短縮した。ペプチド−mRNAからDNAを融解させる間は、100μlのポリメラーゼを含まないPCR Reaction MIXを用いた。ビーズに結合したペプチド−mRNAの量は、一本鎖DNAを含む上清から1μlのアリコートをとって決定した。
ラウンド7の後は、さらなる濃縮は見られなかった（図２Ａ）。第7世代のDNAライブラリーを、TA-cloningを用いてpGEM-T Easyプラスミドにライゲートした。任意の個々のクローンを取り、FASMACによりシーケンシングを行った。それぞれの配列を下表に示す。
【表２】
2014027904.tif 000003
【００５１】
５−２．37℃でのセレクション
第二のセレクションは、phMATE固定に伴ってセレクションとすべてのビーズの洗浄工程を37℃で行った以外は、「4℃でのセレクション」と同様に行った。また、空のコドンCAU（伸長）及びUAA（アンバー）を埋めるために、プロパルギル及びエチルインドリルN-置換グリシン−tRNA（Kawakami et al., J Am Chem Soc 2008, 130: 16861-16863）をそれぞれ用いた。しかし、最終的に選ばれたクローンの中にモノマーユニットは含まれていなかった。さらに、37℃で行ったこの第二のセレクションのラウンド6では、2つの条件でセレクションを行った。ラウンド6の条件の1つでは、mRNAを含まない化学合成したMATEin-L6（最終濃度32μM。後述）を加えた。もう1つのセレクションの条件は前のラウンドに従った。ラウンド6で十分な濃縮が見られたため、セレクションを終了した（図２Ｂ）。
競合結合ペプチドMATEin-L6を用いたものも用いなかったものも、このセレクションから得られた第6世代はクローン化及びシーケンシングした（表２）。
クローンアッセイは、「4℃でのセレクション」に記載したとおり行った。MATEin-D1とMATEin-D5は自動合成装置（Syro, Biotage）で合成した。
【００５２】
６．クローンアッセイ
個々のクローンの結合能を、ライブラリーmRNAの代わりに個々のクローンから転写したmRNAを用いて調べた（図２Ｃ）。アッセイの条件は、セレクションのラウンド2以降の条件と同一とした。
【００５３】
７．ペプチドの化学合成
ペプチドは、セレクションで用いた（Gly-Ser）3リンカーをグリシン1つのみに代えて、化学合成した。MATEin-L6は、手動で合成した。MATEin-D8は自動ペプチド合成装置（Syro、Biotage）で合成した。ペプチドは、レジンから切断した後、YamagishiあるいはHayashiらの方法（Yamagishi Y. et al., Chem Biol 2011, 18: 1562-1570；Hayashi, Y. et al., ACS Chemical Biology 2012, 7: 607-613）に従って環状化した。環状ペプチドはHPLC（Imtakt Cadenza CD-C18 250 × 10 mm column、Gilson HPLC）で精製した。MLDI-ROF質量分析装置（autoflex speed、Bruker）で質量を確認した（図３）。
【００５４】
８．阻害アッセイ
MATEin-L6、-D1、-D5、及び-D8ペプチドについて、Liらの方法(Li X et al., Antimicrob Agents Chemother, 47: 27-33）を修正したエチジウム蓄積法を用いて、阻害活性を調べた。E. coli ΔAcrB を用いてPfMATEを発現させた。PfMATEを発現する細胞を、100mg/lのアンピシリンを含むLB培地で、200rpmで振とうしながら37℃で一晩培養した。正式のE. coliを100mg/lのアンピシリンを含む新鮮なLB培地で100倍（体積）に希釈した。細胞はOD600が0.5になるまで培養し、IPTG（最終濃度0.5mM）を加えて発現を誘導した。誘導された細胞を、200rpmで振とうしながら20℃で一晩インキュベートした。細胞を0.5Mのトリス緩衝液（pH7.0）で1回洗浄し、0.5Mのトリス緩衝液（pH7.0）に最終OD600が0.5となるように再懸濁した。
96穴のブラックプレート（1/2 area、Perkin Elmer）の各ウェルで、44.5μlの上記細胞懸濁液を、0〜250μMの0.5μlのペプチド（DMSO中）に加えた。ポジティブコントロールとして、1つのサンプルにはカルボニルシアニド-m-クロロフェニルヒドラゾン（最終濃度100μM）を加えた。エチジウムブロマイド（0.5mM、5μl）を最終濃度50μMとなるように加え、直ちにプレートをプレートリーダーFlexastation 3に載置した。エチジウムブロマイドの添加から最初の読み取り（t=0秒）（Molecular Devices）までは約15秒であった。
結果を図４に示す。
D1、D5、D8ペプチドは、いずれも用量依存的にMATEタンパク質の多剤排出輸送活性を阻害していることが確認された。特にD5は高い阻害効果を示した。一方、L6は阻害活性を示さなかった。
CCCP（Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone）はMATE阻害剤であり、CCCPのデータは、化学的にPhMATEの機能を喪失させて100％阻害がかかった場合を示す。
【００５５】
９．X線結晶構造解析
図５ａに示す配列のMaD5とMaD3Sを合成し、それぞれPfMATEと共結晶化し、複合体X線構造解析を行った。結果を図５ｂに示す。テイル部分のペプチドは、複合体X線構造解析では、そのダイナミックなうときにより可視化できなかったが、αヘリックス状でPfMATEの活性部位から外に向かって出ていると予想される。図では、ぺプチドはスペースフィリングモデルで可視化されている。
またこれらのペプチドの阻害活性を、上記８．と同様に、内部に蓄積したエチジウムブロマイド（EtBr）の排出量で検出した。実測データを図６に、1μMの濃度の結果を図５ｃに示す。コントロールは、PfMATEが十分に機能している場合に、細胞外に排出されずに細胞内に残ったエチジウムブロマイドの量を示す。
図７ａに、MaD5とPfMATEの複合体X線解析図を示す。点線で示したアミノ酸は構造解析では非可視部位である。図７ｂはMaD5の化学構造、図７ｃはMaD3SとPfMATEの複合体X線解析図である。点線で示したアミノ酸は構造解析では非可視部位である。図７ｄはMaD3Sの化学構造を示す。
図５〜７に示されるとおり、本発明に係るペプチドは、MATEタンパク質の基質結合部位の溝に嵌合し、排出機能を阻害した。
なお、L6をMATEタンパク質と共結晶化し、X線構造解析を行ったところ、L6ペプチドがMATEタンパク質の基質結合部位の溝に嵌合せず、タンパク質の外表面に付着していることが確認された（データ示さず）。このことは、L6が、上記８．の阻害アッセイにおいて、MATEに対する阻害活性を示さなかったことと合致する。
【図１Ａ】
2014027904.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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