(57)【要約】      （修正有）【課題】豚丹毒菌に対する効果的、経済的、かつ安全性の高いワクチンを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する組換えタンパク質、該組換えタンパク質をコードする遺伝子であって、他の特定の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、前記組換えタンパク質を含むヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する組換えタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子であって、
配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項４】
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡを含む請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培地で培養し、得られる培養物から組換えタンパク質を採取する工程を含む、請求項１又は２に記載の組換えタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の組換えタンパク質を含むヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
【請求項９】
請求項５に記載の組換えベクターを利用したヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
【請求項１０】
さらにアジュバンドを含む請求項８又は９に記載のヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
【請求項１１】
豚用である請求項８〜１０いずれかに記載のヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は豚丹毒菌のワクチン用抗原に関する。詳しくは、本発明は、豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターならびにそれらの豚丹毒菌の感染防御用ワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚丹毒は豚丹毒菌（エリシペロスリクス・ルシオパシエ菌  Erysipelothrix rhusiopathiae）の感染によって起こる人畜共通感染症である。前記豚丹毒菌は、豚、イノシシのほか、ヒトを含む哺乳類、鳥類に感染することが確認されている。中でも、名称のとおり、豚の疾病を引き起こす細菌として有名で、豚丹毒は世界中の養豚地帯で発生している。豚丹毒の経過は甚急性で致死率も高く、慢性経過をとった場合は関節炎を惹起し、保菌豚となることがある。出荷豚がと畜検査で陽性となった場合、その個体は全廃棄となり経済損失は極めて大きい。また、豚丹毒菌がヒトに感染した場合、敗血症や関節炎を発症させることも知られており、豚丹毒菌は、家畜衛生のみならず、公衆衛生面からも重要な細菌と位置づけられている。
【０００３】
前記豚丹毒の予防にはワクチンが有効で、日本ではアクリフラビン耐性の弱毒化した生ワクチンと不活化ワクチンが各メーカーから市販され広く使用されている。この弱毒生ワクチンは強毒株をアクリフラビン添加寒天培地で継代して弱毒化した菌で、１回の接種で６カ月以上の免疫が持続するといわれている。
【０００４】
一方、不活化ワクチンは全菌体の不活化抗原であり、我が国では単味のみならず混合ワクチン（２及び３種混合）として広く利用されている。生ワクチンと異なり、強い免疫を誘導するために免疫賦活を目的としてアジュバントを加えてあり、２回接種を必要とする。不活化ワクチンを使用する際の問題点として、接種時の発熱等の安全性とコストの問題が挙げられるが、このため防御に関わる成分のみを特定し、その成分のみからなるワクチン（コンポーネントワクチン）を提供することが望まれる。これに類する技術としては、血清型１８菌由来の表層防御抗原ポリペプチド及びそのカルボキシル末端に存在する２３７アミノ酸を除去した部分ポリペプチド（SpaCΔC）からなる防御抗原（特許文献１を参照）がある。
【０００５】
また、本発明者である下地、小川、施らは、豚丹毒菌の全ゲノムを解読し、豚丹毒菌の防御に関わる抗原としてSpaA、RspA抗原を新たに報告している（非特許文献１）。中でも、SpaA抗原は菌体表層にある主要防御抗原であり、この蛋白質をアジュバントと共に免疫することでマウス及び豚に防御を誘導できることを確認している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２５６５９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Journal of Bacteriology, 193: 2959-2971,2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒト又は非ヒト動物における豚丹毒菌の感染を効果的に防御でき、経済的に製造でき、しかも安全性の高い新規な豚丹毒菌ワクチンに関連するものであり、具体的には、前記ワクチンに利用できる組換えタンパク質及びその製造方法、前記組換えタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、さらにはヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記非特許文献１において、SpaAがＣ末端にグリシン及びトリプトファンで始まる約２０個のアミノ酸配列の繰り返し配列（ＧＷモジュール）を含むことに着目し、このＧＷモジュールがストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）菌で認められるコリン結合蛋白質であると予想した。そして、豚丹毒菌でもストレプトコッカス・ニューモニエ菌と同じように、複数のコリン結合蛋白質を持つと考え、豚丹毒菌Fujisawa株の全ゲノム配列から、Ｃ末端にＧＷモジュールを含む繰り返しアミノ酸配列を含む蛋白抗原遺伝子を検索したところ、非特許文献１において機能不明であったコリン結合タンパク質を見出し、この塩基配列を基にリコンビナント蛋白を作製し、接種免疫した動物において防御が誘導されるかどうかを解析した。その結果、ERH_0768の組換えタンパク質がワクチン効果を有することを初めて確認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する組換えタンパク質、
〔２〕配列番号１に示すアミノ酸配列を含む前記組換えタンパク質、
〔３〕前記組換えタンパク質をコードする遺伝子であって、
配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、
〔４〕配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡを含む前記遺伝子、
〔５〕前記遺伝子を含む組換えベクター、
〔６〕前記組換えベクターを含む形質転換体、
〔７〕前記形質転換体を培地で培養し、得られる培養物から組換えタンパク質を採取する工程を含む、前記組換えタンパク質の製造方法、
〔８〕前記組換えタンパク質を含むヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン、
〔９〕前記組換えベクターを利用したヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン、
〔１０〕さらにアジュバンドを含む前記ヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン、
〔１１〕豚用である前記ヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヒト又は非ヒト動物用の豚丹毒菌ワクチンとして利用できる組換えタンパク質が提供される。この組換えタンパク質は、遺伝子組換え技術を用いて非病原性の組換え菌によって大量に生産することができ、また、これを成分とするワクチンは、市販の不活化ワクチンと異なりワクチン活性に不要な成分を削減できるコンポーネントワクチンであることから安全性が高く、豚丹毒菌全菌体を使用したワクチンよりも安価となる。
また、前記組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターを利用して、ＤＮＡワクチン又はウイルスワクチンを作製することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、リコンビナント抗原として発現されたERH_0768遺伝子産物の塩基配列：下線はpQE-30由来、その他はERH_0768の塩基配列を示す。
【図２】図２は、ERH_0768遺伝子リコンビナント抗原のアミノ酸配列：下線は；pQE-30由来、その他はERH_0768の配列を示す。
【図３】図３は、実施例１で精製したERH_0768遺伝子産物の電気泳動図を示す。
【図４】図４は、実施例２で行った豚丹毒菌強毒株攻撃後のマウス生残数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．組換えタンパク質
本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する組換えタンパク質に関する。
【００１４】
配列番号１に示すアミノ酸配列は、５９７アミノ酸から構成されている。Ｎ末端側の１６個のアミノ酸は発現ベクターpQE‐３０（QIAGEN 社）由来のものである。そして、続く５８１個のアミノ酸はERH_0768（ＣＤＳ  Ｔ０１５２５）由来の配列であり、その全アミノ酸配列からシグナル配列である、Ｎ末端側の２５アミノ酸を除いた配列である。
なお、ERH_0768の全アミノ酸配列や全塩基配列は、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）などの公知のデータベースで、確認することができる。
【００１５】
本発明において、「配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する」とは、ＮＣＢＩホームページの「protein blast」(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等を用いて配列番号１に示すアミノ酸配列との相同性を調べた場合に、９０％以上の相同性を有することをいう。
具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。これらの変異を施す配列の位置は、特に限定はないが、前記の相同性の範囲内であることに加えて、後述の豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を失わない位置であればよい。また、本発明では、pQE‐３０以外の発現ベクターを使用した場合に、配列番号１のＮ末端側のアミノ酸配列が変更されたアミノ酸配列も「配列番号１に示すアミノ酸配列」に含まれる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列を全て備えたアミノ酸配列は１００％の相同性を有するとする。
【００１６】
本発明において、「豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する」とは、後述の実施例２に記載のような手法により、豚丹毒強毒株（Ｆｕｊｉｓａｗａ株）を感染させた場合に、無免疫のマウスに比べて致死活性が有意に低減されていることをいう。
【００１７】
本発明の組換えタンパク質としては、製造し易く、前記防御免疫誘導活性に優れる観点から、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましい。
【００１８】
本発明の組換えタンパク質は、該組換えタンパク質をコードする遺伝子から作製することができる。
【００１９】
２．遺伝子
前記組換えタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
配列番号２に示す塩基酸配列は、１７９４塩基から構成されている。５’末端側の４８個の塩基配列は発現ベクターpQE‐３０（QIAGEN 社）由来のものである。そして、続く１７４６個のアミノ酸はERH_0768由来の配列であり、その全塩基配列からシグナル配列である、５’末端側の７５塩基を除いた配列である。
【００２０】
本発明において、「配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する」とは、ＮＣＢＩホームページの「nucleotide blast」等を用いて相同性検索を行った結果、９０％以上の相同性を示すことを意味する。具体的には、配列番号２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列が挙げられる。これらの変異を施す配列の位置は、特に限定はないが、前記の相同性の範囲内であることに加えて、形質転換体で作製されたタンパク質が前記のような豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を失わない位置であればよく、例えば、配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。また、本発明では、pQE‐３０以外の発現ベクターを使用した場合に、配列番号２の５’末端側の塩基配列が変更された塩基配列も「配列番号２に示す塩基配列」に含まれる。
また、配列番号２に示す塩基配列を全て備えた塩基配列は１００％の相同性を有するとする。
【００２１】
前記配列番号２に示す塩基配列は、例えば、常法に従い合成することで得ることができるし、後述の実施例１に記載のような手法で得ることもできる。
また、得られる塩基配列に対しては、必要に応じて、公知の手法に基づいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加させてもよい。
【００２２】
３．組換えベクター
本発明の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本発明の前記遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。前記組換えベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
【００２３】
前記プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、 pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、 pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば、 YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）、植物細胞宿主用プラスミド（pBI221、pBI121）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２４】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子が機能しうる態様で、宿主に応じたプロモーターに連結して導入される必要がある。ここで「機能しうる態様」とは、プロモーター活性によって、その下流に配置された本発明の遺伝子が宿主中で適切に発現され、その機能を発揮することをいう。使用されるプロモーターの種類は、宿主細胞によって適宜決定されるが、その詳細は次項で説明する。本発明のベクターは、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明では、構成的に発現するプロモーターのほか、条件特異的（例えば、組織特異的あるいは環境特異的）に活性化されるプロモーターを好適に利用することができる。こうしたプロモーターの使用により、条件特異的に本発明の遺伝子を発現させることが可能になる。例えば、前記組換えベクターをＤＮＡワクチン、ウイルスワクチン又は細菌ワクチンとして利用することができるが、いずれの場合でも、投与する非ヒト動物内で機能するプロモーターを選択するのが望ましい。使用されるプロモーターは、合成・天然を問わず豚、牛、鶏等の投与対象の非ヒト動物が保有する転写の系でプロモーターとして有効に機能しうるものならどのような塩基配列のものでも良く、ウイルス由来のＤＮＡや真核生物もしくは原核生物由来のＤＮＡであっても上記条件を満たす限り本発明で使用できる。
なお、前記ＤＮＡワクチンでは前記組換えベクターを組み込んだＤＮＡをワクチンとし、ウイルスワクチンでは前記組換えベクターを含むウイルスをワクチンとし、細菌ワクチンでは前記組換えベクターを含む細菌をワクチンとするが、いずれも処置対象の非ヒト動物に対して適当なＤＮＡ、ウイルス、細菌を適宜選択し、公知の手法に従って作製すればよい。なお細菌ワクチンに使用する細菌は、後述の形質転換体で宿主となる細菌と同じものも使用できる。
【００２６】
４．形質転換体（宿主細胞）
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主は、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジン等から株化した植物細胞やプロトプラスト、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞等が挙げられる。
また、本発明の組換えベクターを導入した宿主をワクチンとする場合には、例えば、ウイルスワクチンではアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、
等のウイルス、細菌ワクチンでは豚丹毒菌、乳酸菌、サルモネラ菌等が挙げられる。
これらの宿主は目的に応じて適宜選択すればよい。
【００２７】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えば、E. coli  HMS174（ＤＥ３)、Ｋ１２、ＤＨ１等が挙げられ、枯草菌としては、例えば、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)MI 114、207-21等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の上記宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。また、tacプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)]や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２８】
酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピヒア・パストリス等が用いられる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を挙げることができる。酵母へのベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983)]等を挙げることができる。
【００２９】
植物細胞を宿主とする場合は、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジン等から株化した細胞や該植物から調製したプロトプラストが用いられる。この場合、プロモーターとしては植物中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター等が挙げられる。植物への組換えベクターの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法等の間接導入法や、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等の直接導入法等が挙げられる。また、アグロバクテリウム感染法を用いた植物細胞の形質転換を用いてもよい。
【００３０】
ウイルスを宿主とする場合には、例えば、CMV、RSV、SV40 等のウイルス由来のプロモーターが用いられる。
【００３１】
５．組換えタンパク質の製造
本発明の組換えタンパク質は、前述の形質転換体（宿主細胞）を適当な培地で培養し、その培養物から豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本発明の形質転換体の培養は、常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる天然培地、あるいは合成培地で培養すればよい。また、植物細胞を宿主として用いている場合には、チアミン、ピリドキシン等のビタミン類を添加した植物細胞用の培地で培養すればよい。
【００３２】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３３】
培地中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００３４】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下、３０〜３７℃位で６時間〜３日間程度行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５程度に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養後、本発明の組換えタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより該組換えタンパク質を抽出する。また、本発明の組換えタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、組換えタンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の組換えタンパク質を単離精製することができる。
【００３５】
６．豚丹毒菌ワクチン
本発明の組換えタンパク質は、ヒト又は非ヒト動物における豚丹毒菌の感染症を防ぐためのワクチン（以下、豚丹毒菌ワクチンという）用の抗原として使用できる。したがって、本発明の豚丹毒菌ワクチンは、前記組換えタンパク質を含むものである。ただし、前記組換えタンパク質をそのままワクチンとして使用した場合、抗体の産生や感染防御効果は弱いと考えられる。そのため、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤等と適宜組み合わせて製剤化することによって、前記組換えタンパク質に対する抗体の産生や、感染防御効果の増強が必要になる。各種免疫賦活剤の添加も有効である。
【００３６】
また、豚丹毒菌ワクチンの別の形態としては、前記組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む前記組換えベクターを利用したＤＮＡワクチン、ウイルスワクチン、細菌ワクチンも含まれる。
前記ＤＮＡワクチン、ウイルスワクチン、細菌ワクチン等の調製方法は特に限定されない。ＤＮＡワクチン、ウイルスワクチン、細菌ワクチン等も上記の組換えタンパク質の場合と同様に滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤等と適宜組み合わせて製剤化することができる。
【００３７】
また、前記豚丹毒菌ワクチンにはアジュバントを配合してもよい。配合されるアジュバントには、例えばアルミニウム塩等の無機物質、微生物もしくは微生物由来物質（ＢＣＧ、ムラミルジペプチド、百日せき菌、百日せきトキシン、コレラトキシン等）、界面活性作用物質（サポニン、デオキシコール酸等）、油性物質（鉱油、植物油、動物油）のエマルジョン等があり、これらは、単独で使用するか、複数を組み合わせて使用することができる。
本発明のワクチンは、このアジュバントの配合によって、豚丹毒菌に対する優れた防御効果と高い安全性を獲得することができる。
【００３８】
本発明のワクチンは、ヒト又は非ヒト動物に投与することを目的とする。非ヒト動物としては、豚、イノシシのほか、ヒト、マウスなどを含む哺乳類、鳥類が挙げられる。
【００３９】
本発明のワクチンのヒト又は非ヒト動物への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、ヒトや非ヒト動物の体重や齢、投与方法、使用目的等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００４０】
なお、本発明のワクチンによる作用には、豚丹毒菌種の感染経験の無い動物、あるいは感染の後の発症前の状態に有る動物への予防的な投与によって、感染症の発症を阻害する作用が含まれる。この発症の阻害とは、１）発症そのものを防ぐ作用、２）発症を遅らせる作用、３）発症後の症状を軽減する作用、４）発症後の治癒を早める作用、５）発症した個体から他の個体への感染力を阻害する作用が含まれる。
【実施例】
【００４１】
(実施例１)組換えタンパク質の作製
豚丹毒菌の全ゲノム配列（アクセションナンバーAP012027）において、C末端にGWモジュールを含む繰り返しアミノ酸配列を含むタンパク質を検索し、ERH_0768を同定した。豚丹毒菌Fujisawa株のゲノムＤＮＡをテンプレートに、ERH_0768遺伝子は、768F（配列番号３：CCCGAGCTCGAGGAGCGAAAACCGAGAGAA）及び768R（配列番号４：CCCAAGCTTCTATTTTTTTAGTGCTCCTTG）のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い増幅した。この増幅産物をSac I及びHind IIIの制限酵素で消化後、同制限酵素で消化したpQE30ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）にライゲーション後、クローニングを行った。なお、前記ＰＣＲ、ライゲーション及びクローニングは公知の手法に基づいて行った。また、塩基配列の決定は、サンガー法により行い、図１、配列番号２に示す配列であることを確認した。この組換えタンパク質は、図２及び配列番号１に示すようにＮ末端側に６個の連続したヒスチジン配列のタグを含み、ERH_0768の全アミノ酸配列からシグナル配列である、Ｎ末端側の２５アミノ酸を除いたERH_0768のアミノ酸配列をからなる約７０ｋＤａの組換えタンパク質である（図３参照）。
【００４２】
(実施例２)マウスにおける有効性試験
実施例１で得られた組換えタンパク質について、マウス豚感染モデルを用いた組み換えワクチンとしての有効性を以下のようにして評価した。
【００４３】
（材料及び方法）
供試動物：４週齢のddyマウス２０匹をワクチン群１０匹、対照群１０匹に振り分けた。
ワクチンの調整：ERH_0768遺伝子産物をＰＢＳで終濃度０．２ｍｇ／ｍｌになるように希釈したもの１容量と１／３容量のＩＳＡ‐２５(ＳＥＰＰＩＣ)を混合、乳化したものをワクチンとして用いた。
ワクチン接種方法：各ワクチン群に対して２週間隔で２回、下肢筋肉内に０．１ｍｌずつ接種した。対照群については接種を行わなかった。
攻撃材料：豚丹毒菌強毒株(Ｆｕｊｉｓａｗａ株)を一晩培養した菌液を攻撃材料とし  た。
攻撃方法：最終免疫後２週後に攻撃材料０．１ｍｌ(１×１０5ＣＦＵ／ｍｌ)を下肢皮下に接種した。
観察及び効果判定：攻撃後１０日間、臨床症状観察を行った。
【００４４】
その結果を図４に示す。
対照群においては攻撃後２日目からマウスの死亡が観察され、４日目には全頭が死亡した。一方、ワクチン免疫群では５日目からマウスの死亡が観察され、観察終了時の生存率は３０％であった。
これらの結果からERH_0768遺伝子産物を免疫したマウスは、豚丹毒菌強毒株（Ｆｕｊｉｓａｗａ株）攻撃による致死活性に対する防御効果を示すことが確認された。
【００４５】
また、上記のように、豚丹毒菌の感染可能性があるマウスで防御効果が確認されたことから、豚丹毒菌の宿主である豚、イノシシなどの哺乳類、鳥類、さらにはヒトにおける防御効果も期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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