(57)【要約】【課題】水の種類、温度、染色剤の種類、濃度、染色時間などの相違によって測定値がばらつく問題を生じず、安定して測定することが可能な微生物の検査方法及び装置を提供する。【解決手段】試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査装置１であって、光を透過する材質で形成された試料容器５に試料と蛍光染色試薬とを添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段７と、撹拌混合手段７により試料溶液５を撹拌しつつ試料容器５の被照射面に励起光を照射させる光源を備えた励起光源１０と、励起光源１０の励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光手段１４と、受光手段１４により変換された電気信号中の外乱を濾波するフィルタリング手段３４と、濾波された電気信号に基づいて微生物量を算出する制御手段２３と、を備えた。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査装置であって、
光を透過する材質で形成された試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加して試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、
該撹拌混合手段により前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を照射させる光源を備えた励起光源と、
該励起光源の励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光手段と、
該受光手段により変換された電気信号中の前記試料溶液自体の蛍光発光に関する低周波成分のノイズ及び／又は前記電気信号の波形に関する高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング手段と、
該フィルタリング手段により濾波された電気信号に基づき発光数を検出し、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段と、を備えたことを特徴とする微生物の検査装置。
【請求項２】
前記フィルタリング手段は、ハイパスフィルタとローパスフィルタとを連結したバンドパスフィルタである請求項１記載の微生物の検査装置。
【請求項３】
前記励起光源は、前記試料容器の被照射面に対して直交する励起光が照射されるように配置する一方、前記受光手段が、前記励起光源の励起光と直交した角度で蛍光発光を受光する受光面が配置されてなる請求項１又は２記載の微生物の検査装置。
【請求項４】
前記受光手段と前記試料容器との間には、観察範囲を規制するためのスリットを設けてなる請求項１から３のいずれかに記載の微生物の検査装置。
【請求項５】
前記励起光源と前記試料容器との間には、光源からの拡散光を一面に向かって同じ角度で均一に照射される平行光に変換する平行光変換手段を設けてなる請求項１から４のいずれかに記載の微生物の検査装置。
【請求項６】
前記平行光変換手段が、所定厚さの平板に所定径のねじ切孔を穿設して形成したものである請求項５記載の微生物の検査装置。
【請求項７】
前記平行光変換手段が、凸レンズで形成したものである請求項５記載の微生物の検査装置。
【請求項８】
試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査方法であって、
試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合工程と、
前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を照射する励起工程と、
前記励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光工程と、
該受光工程により変換された電気信号中の前記試料溶液自体の蛍光発光に関する低周波成分のノイズ及び／又は前記電気信号の波形に関する高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング工程と、
該フィルタリング工程により濾波された電気信号に基づき発光数を検出し、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物数推定工程と、を備えたことを特徴とする微生物の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の検査方法及びその装置に関し、特にバラスト水等に含まれて生存しているプランクトン等の微生物を検出するのに適した微生物の検査方法及びその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
荷物を積載していない船舶は、当該船舶を安定させるためにバラスト水を搭載して航行し、荷物を積載する海域において前記バラスト水を排出する。
バラスト水は、通常、搭載する海域と異なる海域に排出されるため、該バラスト水に含まれるプランクトンや細菌等の微生物を本来の生息地以外の海域に運び、生態系を破壊する等の問題を引き起こす虞がある。
【０００３】
このような問題に対処するため、バラスト水の規制に関する国際的なルールが策定され、「船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管理のための国際条約（バラスト水管理条約）」が採択されている。
【０００４】
上記バラスト水管理条約に関連する「バラスト水サンプリングに関するガイドライン（G２）」は、「バラスト水排出基準（D−２）」において、船舶から排出されるバラスト水に含まれて生存している微生物の許容個体数を、例えば、最小サイズが５０μｍ以上の微生物（以下、「Ｌサイズ生物」という。）については１０個／ｍ３以下、最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物（以下、「Ｓサイズ生物」という。）については１０個／ｍＬ以下と、前記微生物の最小サイズにより区分して規定している。
【０００５】
現在までに、上記バラスト水などの水中で生息している微生物細胞を計測する方法として、特許文献１に記載されたものが知られている。
【０００６】
上記特許文献１に記載の方法によれば、微生物の生細胞に存在する酵素又は補酵素と反応し、細胞内で蛍光物質を生成する化学物質を微生物を含む測定対象試料に作用させ、一定時間混合接触を行った後、細胞内に生成した蛍光物質を励起するに必要な波長の光を試料に照射し、そのとき試料中の個々の微生物から発する光を点の数として計測することを特徴とする微生物細胞の生細胞の計測方法である。
【０００７】
これにより、従来の寒天培養方法では１０時間〜数十時間必要であった測定時間が１０分以内と格段に早くなり、また、生菌の発する光を点として光学的、電気的に検知計測する手段を確立したことにより、生菌の直接自動計数が可能となり殺菌装置のコントロール、製品品質の迅速管理が速やかに行えるといったメリットがある。
【０００８】
しかしながら、上記特許文献１記載の方法にあっては、水の種類、温度、染色剤の種類、濃度、染色時間などの相違によって測定値がばらつく問題があり、改善が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平３−４３０６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記問題点にかんがみ、水の種類、温度、染色剤の種類、濃度、染色時間などの相違によっても測定値がばらつく問題は生じず、安定して測定することが可能な微生物の検査方法及び装置を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため本発明は、試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査装置であって、光を透過する材質で形成された試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加して試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、該撹拌混合手段により前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を照射させる光源を備えた励起光源と、該励起光源の励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光手段と、該受光手段により変換された電気信号中の前記試料溶液自体の蛍光発光に関する低周波成分のノイズ及び／又は前記電気信号の波形に関する高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング手段と、該フィルタリング手段により濾波された電気信号に基づき発光数を検出し、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段とを備える、という技術的手段を講じた。
【００１２】
また、請求項２記載の発明は、前記フィルタリング手段が、ハイパスフィルタとローパスフィルタとを連結したバンドパスフィルタであることを特徴とする。
【００１３】
そして、請求項３記載の発明は、前記励起光源が、前記試料容器の被照射面に対して直交する励起光が照射されるように配置する一方、前記受光手段が、前記励起光源の励起光と直交した角度で蛍光発光を受光する受光面が配置されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項４記載の発明は、前記受光手段と前記試料容器との間に、観察範囲を規制するためのスリットを設けたことを特徴とする。
【００１５】
さらに、請求項５記載の発明は、前記励起光源と前記試料容器との間に、光源からの拡散光を一面に向かって同じ角度で均一に照射される平行光に変換する平行光変換手段を設けたことを特徴とする。
【００１６】
そして、請求項６記載の発明は、前記平行光変換手段が、所定厚さの平板に所定径のねじ切孔を穿設して形成したものであることを特徴とする。
【００１７】
請求項７記載の発明は、前記平行光変換手段が、凸レンズで形成したものであることを特徴とする。
【００１８】
請求項８記載の発明は、試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査方法であって、試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合工程と、前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を照射する励起工程と、前記励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光工程と、該受光工程により変換された電気信号中の前記試料溶液自体の蛍光発光に関する低周波成分のノイズ及び／又は前記電気信号の波形に関する高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング工程と、該フィルタリング工程により濾波された電気信号に基づき発光数を検出し、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物数推定工程と、を備えたものである。
【発明の効果】
【００１９】
操作者が試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加した後、撹拌混合手段を作動させて試料溶液の撹拌・混合を行い、次いで、励起光源及び受光手段を作動させると、微生物が蛍光発光してその受光量が受光手段により電気信号に変換されて取り込まれる。そして、制御手段では、当該電気信号に基づいて発光数が検出され、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量が算出されるようになる。このとき、受光手段には、微生物とは異なる海水成分の蛍光発光や、蛍光染色試薬の加水分解などの影響により、電気信号の外乱が発生して受光手段に取り込まれ、制御手段においては、微生物量の測定誤差や、計測誤差が生じる懸念がある。
本発明によれば、電気信号が制御手段に取り込まれる前に、フィルタリング手段によって外乱が濾波されるので、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とを明確に区別することができる。これにより、微生物量の測定誤差が生じることはなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の全体を示す斜視図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る測定部の概略平断面図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の全体構成を示すブロック図である。
【図４】本発明のフィルタリング手段の回路の一例を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の測定フローを示すフロー図である。
【図６】平行光変換手段の一実施形態を示す概略断面図である。
【図７】スリットの有無により観察面が狭まることを示す作用図である。
【図８】微生物の個体数と光電子増倍管（ＰＭＴ）の受光カウントとの相関関係を示すグラフである。
【図９】微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を示すグラフである。
【図１０】フィルタリング手段を装着する前の取得電圧の波形を示すグラフである。
【図１１】フィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明を実施するための形態を図面を参照しながら説明する。図１は本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の全体を示す斜視図であり、図２は本発明の一実施形態に係る測定部の概略平断面図であり、図３は本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の全体構成を示すブロック図である。
【００２２】
図１及び図２に示すように本発明の検査装置１は、ＣＰＵ基板などの制御機構を内蔵して測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行う本体部２と、該本体部２に並設した操作ボタン等の配置構成からなる操作部３と、前記測定結果等を表示するために液晶パネル等で形成された表示部４と、光を透過する透明な材質（例えば、ガラスや石英やアクリル樹脂等）で形成された試料容器５を収容し、試料溶液Ｓ中の微生物数を光学的に計数する測定部６とを主要部として構成されている。符号７は試料容器５内に収容された試料溶液Ｓを撹拌するための回転子であり、該回転子７は前記試料容器５内に試料溶液Ｓ及び発光試薬とともに収容し、前記試料容器５を測定部６に収容したときに、該測定部６内に内蔵されたマグネティックスターラ２７により回転駆動される構成となっている。これにより、試料容器５内の試料と発光試薬とからなる試料溶液Ｓを所定温度で撹拌混合しながら試料溶液Ｓ中の微生物数を計数することができ、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。
【００２３】
図１に示す検査装置１の寸法は、幅が３００ｍｍ、奥行が３００ｍｍ、高さが１００ｍｍ、重量は約２〜４ｋｇの範囲に形成されており、手持ちトランク（図示せず）等に収容して、どこにでも持ち運び可能であり、船舶内での測定や、屋外での測定が可能である。
そして、光を透過する透明な材質で形成された試料容器５は、底面が５０ｍｍ×５０ｍｍ、高さが６０ｍｍの角柱状に形成され、水位が４０ｍｍのときの内容量が１００ｍｌ（ミリリットル）に設定されている。試料容器５はこのような角柱状に限定されることはなく、内容量を１００ｍｌ（ミリリットル）程度確保することができれば、円柱状であっても、立方体であってもよい。
【００２４】
前記測定部６は、図１、図２及び図３に示すように、試料容器５を収容して保持する試料容器収容部９と、前記試料容器５に向けて励起光を照射する光源部１３と、該光源部１３から照射された励起光により試料容器５内で漂って発光している微生物を観察するための受光部１９とを備えている。そして、受光部１９からは、フィルタリング手段３４を介してＣＰＵ基板２３に電気的に連絡されている。ＣＰＵ基板２３では、受光部１９からの電気信号により試料溶液Ｓ中の微生物数を計数し、測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行うことができる。
【００２５】
前記試料容器収容部９は、前記試料容器５の少なくとも二面を取り囲む保持プレート８ａ，８ｂにより形成され、前記光源部１３からの光の照射を遮断しないように前記試料容器５を収容保持するものである。
そして、図２に示すように、試料容器５の被照射面Ｇに対して法線ＡＰによる励起光が入射されるよう光源部１３が配置される。前記光源部１３は、前記試料容器収容部９近傍に配置されたＬＥＤ光源１０と、該ＬＥＤ光源１０の前面に配置され、拡散光を平行光に変換する平行光変換手段１１（ＬＥＤは光源からランダム方向に拡散して照射される光であるため、一面に向かって同じ角度で均一に光線が当たる平行光に変換するもの）と、スリット状の平行光からなる励起光を試料容器５に照射する励起光用バンドパスフィルタ１２とを備えている。
【００２６】
図６は平行光変換手段１１の一実施形態を示す概略断面図である。図６（ａ）に示す例は、平行光変換手段１１として所定厚さの平板３１に所定径のねじ切孔３２を穿設して形成したものであり、光路長に合わせて平板３１の厚さＬとねじ切孔の孔径とが適宜設定されている。これにより、ＬＥＤ光源１０から照射される入射角度θの散乱光は、ねじ切孔３２を通過する際には平行光に変換されるものとなる。図６（ａ）に示す例では、θとＬとの最適条件をＳＮ比の試験により決定しており、例えば、Ｍ３（ネジ孔の外径）×０．５（ピッチ）とすれば、θが９．５°、Ｌが１５ｍｍのときが最適であった。
【００２７】
図６（ｂ）に示す平行光変換手段１１は、ＬＥＤ光源１０の前面に凸レンズ３３を設けたものであり、ＬＥＤ光源１０から照射された散乱光は、凸レンズ３３内を通過して外部に出射する際には平行光に変換されるものとなる。
【００２８】
なお、本実施形態の光源部１３は、光源としてＬＥＤ光源１０を用いたが、微生物に含まれる蛍光物質を励起させることができれば、ＬＥＤ光源１０に限らず、平行光の照射が可能な平行光ＬＥＤ光源やレーザ光源や電球を採用することもできる。言うまでもないが、平行光の照射が可能な平行光ＬＥＤやレーザ光源を採用するときは、前述の平行光変換手段１１は不要となる。
【００２９】
そして、図２に示すように、前記受光部１９は、光源部１３からの法線ＡＰによる励起光と直交した角度を持って受光面Ｆが配置されるように設けられる。また、受光部１９は前記ＬＥＤ光源１０から試料容器５に向けて励起光が照射される平行光に対し、これと直交する光軸で蛍光が受光されるように配置構成した光電子増倍管（ＰＭＴ）１４と、該光電子増倍管（ＰＭＴ）１４の前面に配置した蛍光用バンドパスフィルタ１５と、該蛍光用バンドパスフィルタ１５の前面に配置した集光用レンズ１６と、該集光用レンズ１６の前面に配置したスリット１７と、該スリット１７と前記試料容器５との間隙に設置され、微生物に含まれる蛍光物質を励起させ、これにより発光した蛍光を集光し結像させるためのリレーレンズ１８と、を備えたものである。
【００３０】
前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４と試料容器５との間のスリット１７は、観察面をスリット状に狭めるものである。すなわち、図７に示すように、（ａ）スリットなしの状態では、受光面Ｆが円で形成されるバックグラウンドを監視するのに対し、（ｂ）スリットありの状態では、受光面Ｆが斜線を除いた縦長スリットで形成されるバックグラウンドを監視することになる。したがって、受光面Ｆの受光面積が（ｂ）のように狭まる結果、ノイズとなるバックグラウンドの蛍光発光の面積も狭まるため、バックグラウンドの蛍光発光に対する微生物の蛍光発光の信号の比が向上し、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するのである。
【００３１】
なお、受光部１９は、受光センサとして光電子増倍管（ＰＭＴ）１４を用いた例を示したが、これに限定されることはなく、シリコンフォトダイオード（ＳiＰＤ）や、アヴァランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）など、光電子増倍管（ＰＭＴ）と同様に微生物に含まれる蛍光物質の発光を検知することができる各種の光検出器を採用することができる。
【００３２】
さらに、図３を参照して、本実施形態の検査装置１の電気的な制御構成を説明する。本体部２を形成する筐体２０内中央には、ＡＣ電源２１や二次電池２２から電源の供給を受けて、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４により光から電気に変換された出力信号を解析したり、任意の輝度範囲以上にあるか否かを判定したり、任意の輝度の信号をパルスカウントしたり、前記ＬＥＤ光源１０のオン・オフ制御などを行うＣＰＵ基板２３が配置されている。前記ＡＣ電源２１と前記ＣＰＵ基板２３との間には、ＡＣ／ＤＣ変換器２４を介在させてある。
【００３３】
前記ＣＰＵ基板２３には、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４、前記ＬＥＤ光源１０、読み出し書き込み用記憶部となるＲＡＭ２５及び読み出し専用記憶部となるＲＯＭ２６がそれぞれ電気的に接続される。また、図１に示す操作部３の電源ボタン３ａ、測定開始ボタン３ｂ、外部出力ボタン３ｃ及び設定ボタン３ｄが電気的に接続されている。そして、前記電源ボタン３ａの押下によりオン・オフの切換制御が行われ、前記測定開始ボタン３ｂの押下により測定が開始され、外部出力ボタン３ｃの押下により外部のプリンタやパソコンへデータの転送が行われ、設定ボタン３ｄの押下により、測定の種類の切換（Ｌサイズ微生物の測定かＳサイズ微生物の測定かの切換）や、判定基準の設定の変更や、しきい値の設定の変更や、測定時間の設定の変更を行うことができる構成となっている。
【００３４】
そのほか、前記ＣＰＵ基板２３には、前記回転子７を磁力により回転させるマグネティックスターラ２７、液晶パネル等で形成された表示部４、ＣＰＵ基板２３など制御機器の冷却用ファン２８、及びＲＳ−２３２Ｃなど外部出力端子２９を接続してある。
【００３５】
図４は本発明の要部となるフィルタリング手段の回路の一例を示す図である。図４に示すように、光電子増倍管（ＰＭＴ）１４とＣＰＵ基板２３との間には、演算増幅器３５、ハイパスフィルタ回路３６及びローパスフィルタ回路３７を電気的に接続している。前記演算増幅器３５は、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４により受光した受光量に応じて生成された出力電流を電圧に変換し、微小な電流であっても検出を可能とするものである。また、ハイパスフィルタ回路３６は、入力信号のうち、所定の周波数より高い周波数の成分を減衰させず、所定の周波数より低い周波数の成分を逓減させるフィルタリング手段である。一方、ローパスフィルタ回路３７は、入力信号のうち、所定の周波数より低い周波数の成分を減衰させず、所定の周波数より高い周波数の成分を逓減させるフィルタリング手段である。そして、前記ハイパスフィルタ回路３６とローパスフィルタ回路３７とを連結すると、必要な範囲の周波数のみを通過させるバンドパスフィルタ回路３８となる。
【００３６】
前記演算増幅器３５は、オペアンプＯＰと抵抗Ｒとを有する。そして、前記ハイパスフィルタ回路３６及びローパスフィルタ回路３７は、互いに電気的に接続された抵抗Ｒ１，Ｒ２とコンデンサＣ１，Ｃ２とをそれぞれ有している。これにより、演算増幅器３５により光電子増倍管（ＰＭＴ）１４からの出力電流が電圧に変換され、次いで、バンドパスフィルタ回路３８の入力側から信号Ｖin（ｔ）を入力すると、出力側では外乱となる電気信号が濾波された信号Ｖout（ｔ）が出力されることになる。この濾波された信号Ｖout（ｔ）をＣＰＵ基板２３に入力すれば、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とがすでに明確に区別されているから、微生物量の測定誤差が生じることはなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
【００３７】
図５は測定フローを示すフロー図であり、図１乃至図５を参照して上記構成における作用を説明する。
【００３８】
まず、作業者はピペット等を使用し、温度２０℃程度のバラスト水から１００ｍｌ（ミリリットル）を試料として採取し、試料容器５に投入する（図５のステップ１）。次に、試料容器５内に蛍光染色試薬を添加する（図５のステップ２）。この蛍光染色試薬は一般的に知られているカルセインＡＭ（Calcein-AM，ドイツ国Promocell GMBH 社製）や、ＦＤＡなどを使用することができる。カルセインＡＭは、植物性プランクトンに対して染色しやすい傾向がある一方、ＦＤＡは、動物性プランクトンに対して染色しやすい傾向があり、このため、染色試薬による染色を、カルセインＡＭとＦＤＡとを混合した試薬により染色を行うと、試薬の染色時間を短くして、染色に要する時間を従来の半分にすることが可能となる。そして、作業者は試料容器５に回転子７を投入後、検査装置１の測定部６に収容し、測定部６の蓋３０を被着することで測定準備が完了する。ここで、電源ボタン３ａを押下すれば、該測定部６内に内蔵されたマグネティックスターラ２７の駆動により回転子７が回転し、試料溶液Ｓが撹拌されることになる（図５のステップ３）。
【００３９】
次に、作業者は操作部の測定開始ボタン３ｂの押下により、所定時間後ＬＥＤ光源１０が点灯し、励起光用バンドパスフィルタ１２を透過した光が試料容器５に照射されることになる。このとき、例えば、波長特性として４５０nm〜４９０nmの波長の光が照射され、試料容器５内の検体（微生物）が蛍光発光することになる（図５のステップ４）。そして、この蛍光が蛍光用バンドパスフィルタ１５を透過して光電子増倍管（ＰＭＴ）１４により検知されることになる（図５のステップ５）。
【００４０】
光電子増倍管（ＰＭＴ）１４は、光電効果の利用により光エネルギが電気エネルギに変換されるとともに、電流増幅機能が付加され、高感度に蛍光発光を検知することができる。検知した電気信号は、演算増幅器３５により増幅されてバンドパスフィルタ回路３６に入力され、外乱となる電気信号が濾波された信号が出力される（図５のステップ６）。そして、外乱となる電気信号が濾波された信号はＣＰＵ基板２３に送られ、一定しきい値以上の受光波形がカウントされることになる（図５のステップ７）。
【００４１】
さらに、ＣＰＵ基板２３では、受光波形カウント値から前記試料容器５内の水１００ｍｌ（ミリリットル）中に存在する微生物数を推定して、排水基準を満たすか否かを表示部４に表示されるのである（図５のステップ８）。
【００４２】
以下、本発明の実施例について説明する。まず、上記実施形態の微生物の検査装置の検査精度の確認試験を行った。
【実施例１】
【００４３】
微生物の個体数と光電子増倍管（ＰＭＴ）の受光カウントとの相関関係を調査した。Ｓ型シオミズツボワムシ（最小サイズ約１００μｍ＝Ｌサイズ生物）を複数の試料容器５（１００ｍＬ容量）にそれぞれ５個体、１０個体、５０個体、１００個体、１０００個体と個体別に収容し、それぞれを蛍光染色試薬ＦＤＡ（濃度０．０１[ミリmol／リットル]）で染色した。その結果、収容した微生物の個体数に応じて、波形のカウント数が増加してきており、５個体、１０個体、５０個体及び１００個体の５サンプルについては直線的に応答した（図８(a)、図８(b)参照）。このため、得られた波形のカウント数からバラスト水１００ｍＬ中に存在する微生物の個体数が推定できる。
【実施例２】
【００４４】
微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を行った（図９(a)〜(d)参照）。熱により殺滅処理（６０℃、３０分の加熱）したＳ型シオミズツボワムシ（最小サイズ約１００μｍ＝Ｌサイズ生物）を、蛍光染色試薬ＦＤＡ（濃度０．０１[ミリmol／リットル]）で染色する。殺滅処理１時間後、殺滅処理２０時間後、殺滅処理５日後の３サンプルを作成してそれぞれ測定した。その結果、殺滅処理したものはいずれも一定のしきい値以上の波形が発見されず、殺滅処理せずに微生物が存在するサンプルと殺滅処理して微生物が存在しないサンプルとの判別が可能である。
【実施例３】
【００４５】
前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１４とＣＰＵ基板２３との間に、フィルタリング手段を装着する前と装着した後の取得電圧の波形を比較する。
図１０はフィルタリング手段を装着する前の取得電圧の波形である。図１０(a)に示す取得電圧の波形は、外乱（バックグラウンド成分約０．９Ｖ波形）と、しきい値を超えた生きた微生物と確認できる明確な山と、しきい値を超えない不明瞭な山との３つが混在したものとなっている。また、図１０(b)に示す取得電圧の波形は、外乱（バックグラウンド成分約１．４Ｖ波形）と、しきい値を超えた生きた微生物と確認できる明確な山との２つが混在したものとなっている。さらに、図１０(c)に示す取得電圧の波形は、外乱（バックグラウンド成分約０．４Ｖ波形）と、しきい値を超えない不明瞭な山との２つが混在したものとなっている。
【００４６】
図１１はフィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形である。図１１(a)に示す取得電圧の波形は、外乱となるバックグラウンド成分を取り除くため、ハイパスフィルタ回路３６のみを装着したときのものである。図１０(b)に示す波形と比較すると、約１．４Ｖあったバックグラウンド成分が０Ｖに収束されており、外乱が除去されていることが分かる。
【００４７】
図１１(b)の波形は、図１１(a)で示す破線の円で囲まれた山の波形を拡大したときの立ち上がり波形である。図１１(b)の波形では、しきい値を挟んで上下動を繰り返しており、測定誤差を大きくする要因となる。そこで、このような高周波波形を除去する目的でローパスフィルタ回路３７を装着するのが望ましい。
【００４８】
図１１(c)に示す取得電圧の波形は、外乱の除去と高周波波形の除去とを行うため、ハイパスフィルタ回路３６とローパスフィルタ回路３７とを結合したバンドパスフィルタ３８を装着したときのものである。図１１(a)の波形と比較すると、高周波ノイズが除去されて波形が滑らかとなった。
【００４９】
図１１(d)の波形は、図１１(c)で示す破線の円で囲まれた山の波形を拡大したときの立ち上がり波形である。図１１(d)の波形では、図１１(b)のようなギザギザ波形がなくなって滑らかになり、しきい値を挟んで上下動を繰り返すこともなくなった。これにより、測定誤差を極めて小さくすることで、精度よく測定することが可能となる。
【００５０】
以上のように本実施形態によれば、試料容器５に試料と蛍光染色試薬とを添加した後、撹拌混合手段７により試料溶液の撹拌・混合を行い、次いで、前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を入射させ、さらに、受光手段により微生物の蛍光発光を受光するため、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。そして、装置を小型化することが可能となり、製造コストが安価となる。
また、電気信号が制御手段に取り込まれる前に、フィルタリング手段によって外乱が濾波されるので、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とを明確に区別することができ、微生物量の測定誤差が生じることはなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、バラスト水を排出する際に排出基準を満たしているか否かを確認するための微生物の検査装置に適用することができる。
【符号の説明】
【００５２】
１    検査装置
２    本体部
３    操作部
４    表示部
５    試料容器
６    測定部
７    回転子
８    保持プレート
９    試料容器収容部
１０    ＬＥＤ光源
１１    平行光変換手段
１２    励起光用バンドパスフィルタ
１３    光源部
１４    光電子増倍管（ＰＭＴ）
１５    蛍光用バンドパスフィルタ
１６    集光用レンズ
１７    スリット
１８    リレーレンズ
１９    受光部
２０    筐体
２１    ＡＣ電源
２２    二次電池
２３    ＣＰＵ基板
２４    ＡＣ／ＤＣ変換器
２５    ＲＡＭ
２６    ＲＯＭ
２７    マグネティックスターラ
２８    ファン
２９    外部出力端子
３０    蓋
３１    平板
３２    ねじ切孔
３３    シリンドリカルレンズ
３４    フィルタリング手段
３５    演算増幅器
３６    ハイパスフィルタ回路
３７    ローパスフィルタ回路
３８    バンドパスフィルタ回路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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