(57)【要約】      （修正有）【課題】新規セリンパルミトイルトランスフェラーゼおよびその遺伝子を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド；特定のアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるか、または特定のアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド；特定のアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるか、または特定のアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、からなる群より選択されるポリペプチドのいずれか１つを含む、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるポリペプチドのいずれか１つを含む、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；および
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドが、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置にシステイン残基を有する、請求項１記載のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ。
【請求項３】
前記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドが、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有する、請求項１または２記載のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ。
【請求項４】
前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドと、前記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドとの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項記載のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】
以下からなる群より選択される遺伝子のいずれか１つを含む、請求項６記載の遺伝子：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と４０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列において１〜複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）配列番号３で示される塩基配列と５０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｆ）配列番号３で示される塩基配列において１〜複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項８】
前記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される遺伝子と、前記（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選択される遺伝子との組み合わせを含む、請求項６又は７記載の遺伝子。
【請求項９】
Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ由来の遺伝子である、請求項６〜８のいずれか１項記載の遺伝子。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載のベクターを含むか、または請求項６〜９のいずれか１項記載の遺伝子をゲノム上に含む形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換細胞を培養する工程を含むセリンパルミトイルトランスフェラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スターメレラ・ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）由来セリンパルミトイルトランスフェラーゼおよびその遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
３-ケトスフィンガニンは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの作用によりセリンとパルミトイル−ＣｏＡより生成される、セラミドの前駆体である（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
皮膚に存在するセラミドは、皮膚からの水分蒸散を防止し、外界からの様々な刺激から人体を守る役割を担っている。加齢等によりセラミドが減少すると、皮膚の保湿機能やバリア機能が低下する。一方、セラミドやその前駆体を外的に補うことにより、これらの皮膚機能を改善させることができる。よって、３-ケトスフィンガニンを含むセラミド前駆体は化粧品素材として有用である（特許文献１）。
【０００４】
これまで、セラミドおよびセラミド前駆体のほとんどは動物組織（主に脳または脊髄）または植物体の抽出物であった。しかし、動物組織からの抽出物は、狂牛病の因子であるｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ（ＢＳＥ）の感染の恐れがあることから、近年ではその使用が禁止されている。さらに、上記動物組織または植物由来のセラミド前駆体は、分離精製が困難なため、化粧品原料として求められる純度にするために手間と費用がかかる。そこで近年、酵母による発酵を用いた安価で安全なセラミド前駆体の生産法の開発が進められている（特許文献２）。
【０００５】
サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）などの酵母、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ）、ペニシリウム・ノテータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）などのカビ、およびスフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ）、デロビブリオ・ストルピー（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｔｏｌｐｉｉ）などのバクテリア等において、セラミドまたはセラミド前駆体が産生されることが報告されている。しかし、上記微生物によるセラミドまたはセラミド前駆体の産生量は微量である。そのため、変異育種や遺伝子組換え等による上記微生物のセラミドまたはセラミド前駆体の生産性向上が試みられている（特許文献３）。
【０００６】
真核生物のセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、ＬＣＢ１、ＬＣＢ２、ＴＳＣ３などのサブユニットから成る複合体で、ＬＣＢ１、ＬＣＢ２がセリンとパルミトイル−ＣｏＡとの縮合反応の中心的役割を担い、ＴＳＣ３が酵素活性の調節に寄与することが知られている（非特許文献２および３）。
【０００７】
Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａは、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａまたはＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａとも呼ばれ、ヒルガオ科植物やそれに寄生する昆虫に共生している酵母である。Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａは、バイオサーファクタントの一種であるソホロリピッドを生産することが知られている（非特許文献４）が、セラミド前駆体を生産することは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平８-５０８７４２号
【特許文献２】米国特許第６１９４１９６号
【特許文献３】特許第４７３７５３１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Barenholz, Y., Gadot, N., Valk, E., Gatt, S. (1973) Biochim. Biophys. Acta, 306:341-345
【非特許文献２】Haneda, K., (2003) Biochim. Biophys. Acta, 1632:16-30
【非特許文献３】Gable, K., Slife, H., Bacikova, D., Monaghan E., Dunn, T.M. (2000) J. Biol. Chem., 275(11):7597-7603
【非特許文献４】Davila, A.M., Marchal, R., Vandecasteele, J.P. (1992) Appl. Microbiol. Biotechnol., 38(1):6-11
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新規セリンパルミトイルトランスフェラーゼおよびそれをコードする遺伝子を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、新規セリンパルミトイルトランスフェラーゼの探索を試みた。その結果、本発明者は、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａより新規セリンパルミトイルトランスフェラーゼを単離し、またその遺伝子配列を初めて同定した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；および
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなる群より選択されるいずれか１つを含む、セリンパルミトイルトランスフェラーゼを提供する。
また本発明は、上記セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を提供する。
また本発明は、上記セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有するベクターを提供する。
また本発明は、上記ベクターを含むか、または上記セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をゲノム上に含む形質転換細胞を提供する。
さらに本発明は、上記形質転換細胞を培養する工程を含むセリンパルミトイルトランスフェラーゼの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、新規セリンパルミトイルトランスフェラーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＳＤ−ｕｒａ培地における本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子欠損株の生育。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 1985, 227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」としては、１〜２００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２５個、さらにより好ましくは１〜１０個、なお好ましくは１〜５個、なおさらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
また本明細書において、「１〜複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」としては、１〜８００個、好ましくは１〜４００個、より好ましくは１〜２００個、さらに好ましくは１〜１００個、さらにより好ましくは１〜５０個、なお好ましくは１〜２０個、なおさらに好ましくは１〜１０個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ」とは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。本明細書におけるセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有する限りにおいて、全長タンパク質、またはその部分ポリペプチドもしくはそのサブユニットを含み得る。
【００１８】
本明細書において、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性」とは、Ｌ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡとの縮合反応を触媒する活性であり得る。本明細書において、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチド」とは、Ｌ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡとの縮合反応によるセラミド前駆体（例えば３−ケトスフィンガニン）の生産を触媒するタンパク質またはポリペプチド（酵素）であり得る。タンパク質またはポリペプチドのセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性は、生成されるセラミド前駆体を測定することで決定することができる。例えば、一定の条件においてＬ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡとセリンパルミトイルトランスフェラーゼとの存在下で生成されるセラミド前駆体（例えば３−ケトスフィンガニン）を測定することにより、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有すると判断できる。
生成されるセラミド前駆体の量は、反応液からセラミド前駆体を抽出し、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどに供することによって測定することができる。また、基質に放射性同位体を使用すれば、生成物の放射性同位体量を定量することによって生成されるセラミド前駆体の量を測定することができる。例えば、細胞培養液からのセラミド前駆体の抽出には、クロロホルム、メタノール、アセトンなどの有機溶媒を使用することができる。
【００１９】
本発明は、新規セリンパルミトイルトランスフェラーゼを提供する。一実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼとしては、（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼとの配列同一性は低いにもかかわらず、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、例えばＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９）などから取得することができる。
【００２０】
別の実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼとしては、（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であり得る。
【００２１】
また別の実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼとしては、（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては１００個以下、好ましくは５０個以下、より好ましくは２５個以下、さらに好ましくは１０個以下であり得る。
【００２２】
好ましくは、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置のアミノ酸残基はシステインである。上記システイン残基は、上述した公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼＬＣＢ１サブユニットのポリペプチドにおいて高度に保存されているアミノ酸残基である。
【００２３】
さらに別の実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼとしては、（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼとの配列同一性は低いにもかかわらず、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、例えばＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９）などから取得することができる。
【００２４】
さらにまた別の実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼとしては、（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であり得る。
【００２５】
さらに別の実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼとしては、（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては１１５個以下、好ましくは５８個以下、より好ましくは２９個以下、さらに好ましくは１２個以下であり得る。
【００２６】
好ましくは、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドは、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有する。より好ましくは、当該（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドにおけるピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフは、配列番号４の３８１位から３８８位、またはそれに相当する領域に存在する。当該ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフは、上述した公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼＬＣＢ２サブユニットのポリペプチドにおいて高度に保存されている。
【００２７】
本明細書において、上記「相当する位置」または「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列（配列番号２または４で示されるアミノ酸配列）と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２８】
本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、上記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドのいずれか１つを含み得る。本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つを単独で含んでいてもよく、または上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちの２つ以上を組み合わせて含んでいてもよい。一実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つからからなるものであってもよく、または上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちの２つ以上の組み合わせからからなるものであってもよい。
【００２９】
組み合わせの例としては、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つと、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つとの組み合わせ；上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つ以上と、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つ以上との組み合わせ、などが挙げられる。このうち、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つと上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つとの組み合わせが好ましい。
【００３０】
本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼの好ましい例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３１】
本発明はまた、上記本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を提供する。一実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子、および（ｄ）配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子、および配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子は、それぞれ、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ、および配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードしている。
【００３２】
別の実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と４０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子はまた、配列番号１で示される塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。
【００３３】
またあるいは、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、（ｃ）配列番号１で示される塩基配列において１〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては３０５個以下、好ましくは１５２個以下、より好ましくは７６個以下、さらに好ましくは３１個以下であり得る。
【００３４】
さらに別の実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、（ｅ）配列番号３で示される塩基配列と５０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子はまた、配列番号３で示される塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。
【００３５】
またあるいは、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、（ｆ）配列番号３で示される塩基配列において１〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては３４６個以下、好ましくは１７３個以下、より好ましくは８７個以下、さらに好ましくは３５個以下であり得る。
【００３６】
上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子は、好ましくは、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置のアミノ酸残基がシステインであるポリペプチドをコードしている。
上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子は、好ましくは、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有するポリペプチドをコードしている。より好ましくは、当該ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフが配列番号４の３８１位から３８８位、またはそれに相当する領域に存在するポリペプチドをコードしている。
【００３７】
本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、上記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される遺伝子のいずれか１つを含み得る。本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つを単独で含んでいてもよく、または上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子のうちの２つ以上を組み合わせて含んでいてもよい。一実施形態において、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つからからなるものであってもよく、または上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子のうちの２つ以上の組み合わせからからなるものであってもよい。
【００３８】
組み合わせの例としては、上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つと、上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つとの組み合わせ；上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つ以上と、上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つ以上との組み合わせ、などが挙げられる。このうち、上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つと上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つとの組み合わせが好ましい。
【００３９】
本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の好ましい例としては、配列番号１で示される塩基配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、配列番号３で示される塩基配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４０】
本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、例えばＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ（ＮＢＲＣ１０２４３）またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９）などから、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、当該遺伝子は、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａの全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１または３の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。あるいは、当該遺伝子は、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的または化学的に合成することができる。
【００４１】
またあるいは、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、上記の手順で単離または合成された遺伝子の塩基配列に対して、紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。例えば、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、配列番号１または３で示される塩基配列に公知の方法で突然変異導入し、得られた塩基配列を発現させてセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を調べ、所望のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択することによって、得ることができる。
【００４２】
上記遺伝子を発現させることによって、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼを生産することができる。例えば、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を適切な培地で培養すれば、形質転換細胞内で当該本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が発現してセリンパルミトイルトランスフェラーゼが産生される。
【００４３】
従って、本発明はまた、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換細胞を提供する。本発明はさらに、上記本発明の形質転換細胞を培養する工程を含むセリンパルミトイルトランスフェラーゼの製造方法を提供する。
【００４４】
上記本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入するか、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞のゲノムに導入するか、または、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼを内在的に有する微生物の発現制御領域を改変することによって作製することができる。
【００４５】
上記宿主細胞は、いずれの生物種の細胞であってもよいが、例えば、哺乳類の細胞、昆虫細胞、植物細胞、または微細藻類、カビ、酵母、バクテリア等の微生物の細胞などが挙げられ、好ましくは酵母細胞、より好ましくはＣａｎｄｉｄａ属、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母の細胞が挙げられ、さらに好ましくはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞が挙げられる。
【００４６】
本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターは、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をベクターに導入することによって作製することができる。当該遺伝子を導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましく、タンパク質の高発現を誘導するプラスミドベクターがより好ましい。当業者は、宿主細胞の種類にあわせて、好適なベクターを選択することができる。タンパク質発現用プラスミドベクターは、宿主に応じて作製してもよいが、市販品を使用してもよい。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合はｐＫＳ１−ＳＴ（コスモバイオ製）、大腸菌の場合はｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ製）などが利用できる。
【００４７】
上記ベクターにおいては、上記本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、本発明のプラスミドが適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）がさらに組み込まれていてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように当該遺伝子が配置されていることをいう。当該制御配列の例としては、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーターｐＧＡＰＤＨ、酸性ホスファターゼのプロモーターｐＰＨＯ１、ガラクトキナーゼのプロモーターｐＧＡＬ１、アルドース１−エピメラーゼのプロモーターｐＧＡＬ１０、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターｐＡＤＨ１などが挙げられる。上記各プロモーターは酵母由来のプロモーターが好ましく、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のプロモーターがより好ましく、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ由来のプロモーターがさらに好ましい。
【００４８】
本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞のゲノムに導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｈａｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Gene, 77, 61, 1989）等により調製された当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該遺伝子を含むＤＮＡ断片は、宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター配列の下流に導入されてもよく、あるいは、予め本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、当該プロモーター配列と作動可能に連結した断片を作製し、当該断片を宿主のゲノムに導入してもよい。さらに、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はまた、当該遺伝子が適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）と予め連結されていてもよい。
【００４９】
上記発現量の多い遺伝子のプロモーター配列としては、上述した制御配列の例に挙げたプロモーターに加え、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）のプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）のプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）のプロモーター、翻訳伸長因子（ＴＥＦ１）、ヘキソーストランスポーター（ＨＸＴ７）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ１）のプロモーターなどが挙げられる。上記各プロモーターは酵母由来のプロモーターが好ましく、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のプロモーターがより好ましく、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ由来のプロモーターがさらに好ましい。
【００５０】
上記本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子またはそれを含むベクターを宿主細胞に導入する手段としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、酢酸リチウム法、熱処理法など、通常使用されるいずれの方法でも用いることができる。本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が適切に導入された形質転換細胞は、当該遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子などのマーカー遺伝子を導入すれば、当該マーカー遺伝子の発現を指標として選択することができる。
【００５１】
上記形質転換細胞においては、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現が強化されていることが好ましい。本明細書において、上記形質転換細胞における「セリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現の強化」とは、当該形質転換細胞におけるセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現量が、当該形質転換細胞の親株と比較して増加していることを指す。
【００５２】
上記形質転換細胞においては、上記本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が過剰発現されていることが好ましい。
例えば、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を内在的に有する宿主細胞においては、当該セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の上流に、野生型とは異なるプロモーター、好ましくは、上述した宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーターを導入し、連結することにより、当該セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現させてセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を強化することができる。
一方、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を内在的に有しない宿主細胞においては、当該微生物に本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現可能に導入することによって、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を付与することができる。発現可能に導入する手段としては、例えば、当該セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の上流に、上述した宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーターが連結されたベクターを用いる方法や、上述した蛋白質の高発現を誘導するプラスミドに当該セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を連結して宿主細胞に導入する方法、または宿主細胞に当該セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子をゲノムに導入して、当該宿主細胞で発現量の多い遺伝子のプロモーターの下流に連結する方法、などが挙げられる。
これらの方法により、当該本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換細胞を得ることができる。
【００５３】
例えば、上記（ａ）〜（ｃ）として例示した遺伝子または上記（ｄ）〜（ｆ）として例示した遺伝子を上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に連結する方法、当該（ａ）〜（ｃ）の遺伝子と当該（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子を両方とも上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に別々に連結する方法、当該（ａ）〜（ｃ）の遺伝子を上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に連結し、且つ当該（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子を上記ＴＤＨ３のプロモーターの下流に連結する方法などにより、これらの遺伝子を過剰発現させて、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を強化することができる。過剰発現する遺伝子の種類とプロモーターの組み合わせはどのような組み合わせでも良く、過剰発現の方法はゲノムに挿入する方法でもプラスミドを利用する方法でも良い。
【００５４】
上記形質転換細胞は、遺伝子導入前の細胞と同様の条件で培養することができる。当該形質転換細胞を培養すれば、当該形質転換細胞内で当該本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が発現してセリンパルミトイルトランスフェラーゼが産生される。産生されたセリンパルミトイルトランスフェラーゼを培養物から単離または精製することにより、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼを取得することができる。取得したセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、Ｌ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡからの３−ケトスフィンガニンの生産の触媒等として使用することができる。
【００５５】
以下、実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【実施例】
【００５６】
実施例１  Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ由来セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の探索
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３株を、５０ｇ／ＬのＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ（日本ＢＤ製）５ｍＬを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。得られた培養液を、ＳＬ培地（１０％（Ｄ）−グルコース、１％尿素、０．５％ＢａｃｔｏTMＹｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１０％パルミチン酸エチル（東京化成工業）、塩酸にてｐＨ５．０となるよう調整）５ｍＬに２％植菌した。培養器は１００ｍＬ容試験管を用い、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養し、菌体を回収した。
回収した菌体のＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用い、方法は添付のプロトコールを一部改変した。すなわち、回収した菌体にＢｕｆｆｅｒ  Ｙ１（１ｍＬ）を添加し、３０℃で３０分振とうする際に、バッファーにザイモリエイス−２０Ｔを１００Ｕ／ｍＬとなるよう添加し、細胞壁を溶解させた。得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡよりＳＭＡＲＴｅｒ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いて、完全長ｃＤＮＡライブラリを合成した。遺伝子発現解析は株式会社ジナリスに委託し、ｃＤＮＡ配列情報、およびアノテーションデータを得た。
【００５７】
遺伝子発現解析により取得した配列を、ＢＬＡＳＴ解析することにより、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの候補遺伝子として２種類の配列を見出した（配列番号１および３）。これらの配列は、それぞれ、配列番号２および４に示すアミノ酸配列をコードすると推定された。配列番号２は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットとして知られるＬＣＢ１と低いが配列同一性を示した。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍａｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＬＣＢ１と４２％、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ由来ＬＣＢ１と３５％の同一性であった。一方、配列番号２の配列にＬＣＢ１の機能発現に関与するシステイン残基（１６３位）が保存されていることを確認した（Gableら、Journal of Biological Chemistry Vol.277, No.12, pp.10194-10200, 2002）。配列番号４はセリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットとして知られるＬＣＢ２と低いが配列同一性を示した。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＬＣＢ２と５２％、Ｐ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ由来ＬＣＢ２と５０％の同一性であった。一方、配列番号４の配列において、ＬＣＢ２の機能発現に関与するピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を３８１位から３８８位に確認した（Gableら、 Journal of Biological Chemistry Vol.277, No.12, pp.10194-10200, 2002、Tamuraら、Plant Cell Physiology Vol.42, No.11, pp.1274-1281, 2001）。
なお、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＬＣＢの１９１位に相当するアミノ酸残基はバリンであることがセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性に必要であるとされているが、配列番号２および４に示すアミノ酸配列ではバリンではなくアラニンであった。
さらに、配列番号１示される遺伝子および配列番号３で示される遺伝子は、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株ゲノムにも存在することが分かった。以後の実施例において、配列番号１および配列番号３で示されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を、それぞれ本発明のＬＣＢ１遺伝子およびＬＣＢ２遺伝子と称する。
【００５８】
実施例２  本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の欠損株の表現型解析
（１）ウラシル要求性株の取得
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９）を０．６８％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％  グルコース、０．０３％ウラシルおよび１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ−Ｕ寒天培地に接種したのち、３０℃で１ヶ月間培養し、得られた菌体を１ｍＬの０．８％食塩水に一白金耳懸濁し、０．６８％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％グルコース、０．０３％ウラシル、および５−フルオロオロチン酸、１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ-ＵＦ寒天培地に１００μＬ塗抹し３０℃で２週間培養した。生育したコロニーを再度ＳＤ−ＵＦ寒天培地で培養した後、それぞれについてウラシル要求性、５−フルオロオロチン酸耐性を確認し、ウラシル要求性株を取得した。
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株および得られたウラシル要求性株を５０ｇ／ＬのＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ（日本ＢＤ製）５ｍＬを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。培養液１ｍＬを５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集めた菌体からＧｅｎとるくんTM（ＴＡＫＡＲＡバイオ）を用い、添付の方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。表１記載のプライマー（配列番号５，６）およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ．ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてウラシル生合成に関わるオロチジンでカルボキシラーゼをコードするＵＲＡ３遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産物を鋳型としてＵＲＡ３遺伝子の配列をシーケンス解析し、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３株の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ９１６８２８）と比較した。その結果、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株はＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３株のＵＲＡ３遺伝子と同じ配列を有すること、ウラシル要求性株は皆５４位のシステインがチロシンに変異していることが確認された。得られた変異体をＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株として取得した。
【００５９】
【表１】
2014000076.tif 000002
【００６０】
（２）ＬＣＢ１およびＬＣＢ２欠損用プラスミドの作製
実施例２で得られたＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株ゲノムＤＮＡを鋳型に、表２記載の配列番号７と８のプライマーおよび配列番号９と１０のプライマーを用いて、本発明のＬＣＢ１遺伝子の上流領域および下流領域を増幅した。同様に、配列番号１３と１４のプライマーおよび配列番号１５と１６のプライマーを用いて、本発明のＬＣＢ２遺伝子の上流領域および下流領域を増幅した。さらに、配列番号１１と１２のプライマーおよび配列番号１７と１８のプライマーを用いて、当該プライマー領域を含むＵＲＡ３遺伝子領域を増幅した。次に得られたＰＣＲ産物を鋳型にＳＯＥ-ＰＣＲによって本発明のＬＣＢ１遺伝子上流領域とＵＲＡ３遺伝子と該ＬＣＢ１遺伝子下流領域（配列番号７、１０のプライマー）、または本発明のＬＣＢ２遺伝子上流領域とＵＲＡ３遺伝子と該ＬＣＢ２遺伝子下流領域（配列番号１３、１６のプライマー）の組み合わせでＤＮＡを連結させ、ｐＴＡ２ベクターとライゲーションすることによってｐＴＡ２-ｌｃｂ１：：ＵＲＡ３プラスミドおよびｐＴＡ２-ｌｃｂ２：：ＵＲＡ３プラスミドを構築した。さらに、ｐＴＡ２-ｌｃｂ１：：ＵＲＡ３プラスミドを鋳型に表２記載の配列番号７、１０のプライマーを使用してＬＣＢ１遺伝子欠損用カセットを増幅し、またｐＴＡ２-ｌｃｂ２：：ＵＲＡ３プラスミドを鋳型に表２記載の配列番号１３、１６のプライマーを使用してＬＣＢ２遺伝子欠損用カセットを増幅したのち、Ｈｉｇｈ  ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて精製した。
【００６１】
【表２】
2014000076.tif 000003
【００６２】
（３）Δｌｃｂ１株およびΔｌｃｂ２株の作製
上記（１）で作製したＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株を、５ｍＬのＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。得られた培養液を、ＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝１〜２になるまで培養した。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄した。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上に置き、ピペッティングで懸濁した。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、形質転換用のＤＮＡ溶液を１μｇ加えた。酵母懸濁液を氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５μＦ，３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかけた。氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈを加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して菌体を回収し、２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養した。選択培地には、０．６８％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，２％  グルコース、０．０７７％  ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ）、２０〜２００μＭ  フィトスフィンゴシン（Ｃｏｓｍｏｆｅｒｍ）、０．０５％  レオドールＯ３２０Ｖ（花王）、および１．５％  Ａｇａｒを含むＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ寒天培地を使用した。生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ-ＰＨＳ培地および０．６８％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，２％  グルコース、０．０７７％  ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ）、および１．５％  Ａｇａｒを含むＳＤ-ｕｒａ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ-ｕｒａ-ＰＨＳ培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は本発明のＬＣＢ１遺伝子欠損株の場合は表２記載の配列番号７、１０のプライマー、本発明のＬＣＢ２遺伝子欠損株の場合は表２記載の配列番号１３、１６のプライマーを用いてＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、および配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ１株、およびＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ２株として取得した。
【００６３】
（４）表現型解析
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌ
ｃｂ１株、およびＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ２株を１００μＭフィ
トスフィンゴシンおよび０．０５％レオドールＯ３２０Ｖを含むＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ-ＰＨＳ寒天培地）に塗抹し、生育したコロニーを５ｍＬのＹＰＤ-ＰＨＳ培地を含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。得られた菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、５ｍＬのＳＤ−ｕｒａ培地で３回洗浄し、ＯＤ６００が約０．３になるように合わせてＳＤ−ｕｒａ培地または２０〜１００μＭフィトスフィンゴシンおよび０．０５％レオドールＯ３２０Ｖを含むＳＤ−ｕｒａ−ＰＨＳ培地または２０μＭジヒドロスフィンゴシンおよび０．０５％レオドールＯ３２０Ｖを含むＳＤ−ｕｒａ−ＤＨＳ培地に植菌した。培養器は５００ｍＬ容ひだ付フラスコを用い、３０℃、２１０ｒｐｍで４８時間培養し、培養挙動を解析した。
【００６４】
図１に培養２４時間目のＯＤ６００の測定結果を示す。Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ１株およびＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ２株は、Ｓ
Ｄ−ｕｒａ培地では増殖しないのに対し、ＳＤ−ｕｒａ−ＰＨＳ培地では増殖し、フィトスフィンゴシン濃度が１００μＭのときＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株とほぼ同等に増殖することが確認された。この性質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｌｃｂ１変異株の性質と一致し、評価した遺伝子がセリンパルミトイルトランスフェラーゼのＬＣＢサブユニットの遺伝子であることが確かめられた。よって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＬＣＢの１９１位に相当するアミノ酸残基はバリンであることは必須ではないとの予想外の結果が得られた。
【図１】
2014000076.tif 000004
【配列表】
2014000076000001.app