(57)【要約】【課題】白色脂肪組織の脂質代謝改善作用を有し、長期間服用しても安全で尚且つ確実な治療を行うのに充分満足できるような経口又は非経口用組成物、食品あるいは医薬を提供する【解決手段】アスナロの植物の全草又はその一部或いはその抽出物を含む白色脂肪組織の脂質代謝改善剤【選択図】図8
2014043433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスナロの植物の全草又はその一部或いはその抽出物を含む白色脂肪組織の脂質代謝改善剤。
【請求項２】
白色脂肪組織の脂質代謝改善剤を含有することを特徴とする請求項１に記載の経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体重の減少・白色脂肪組織重量の減少および肝臓中中性脂肪量の低下作用を有し、白色脂肪組織の脂質代謝改善作用剤、それらを含有する経口用又は非経口用組成物、食品又は医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の変化や運動不足により、肥満が社会的な問題となっている。肥満は、高血圧、高脂血症、糖尿病などの生活習慣病の原因であり、動脈硬化等更なるリスクファクターとなることが知られている。また、肝臓に脂肪が蓄積する症状は脂肪肝と呼ばれ、現在日本人の約20％が脂肪肝であると推測されている。脂肪肝は、生活習慣病の発症悪化に関係するだけでなく、肝炎・肝硬変等の肝障害の原因となることが知られている。
【０００３】
食事から摂取した余剰な脂質や糖質は、脂肪として体内に蓄積するが、この脂肪は主に脂肪細胞内に蓄積される。
この脂肪細胞は、主に褐色脂肪細胞と白色脂肪細胞に分類され、特に白色脂肪細胞は、皮下脂肪や内臓脂肪を構成する細胞であり、この白色脂肪細胞中の脂肪を低減させるあるいは、白色脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制することが、肥満低減に有効である。
【０００４】
本出願人は、アスナロ抽出物について、VLDL分泌抑制作用を見出し、特許出願を行った（特許文献1）。
その後継続的に研究を行った結果、さらに白色脂肪重量の減少作用を見出した。
さらに詳しくは、アスナロ抽出物摂取により、脂肪を取り込み肥大化する白色脂肪細胞に対し、生命の活動に必要な熱を産出する褐色脂肪細胞様の働きを付加することを見出した。
これは、単にＶＬＤＬ分泌抑制による脂肪減少ではなく、白色脂肪細胞の「褐色化」というべき現象を見出したものであり、基礎代謝の向上による脂質代謝改善作用が初めて明らかとなった。
【０００５】
従来、基礎代謝の向上作用剤としてトウガラシの辛味成分である「カプサイシン」が知られているが、
このカプサイシンは褐色脂肪細胞に対する脂肪分解促進効果によって体熱生産が促進され、その結果体脂肪を低減し得るとして食されているが、この辛みにより摂取量が制限され十分な効果が期待できないといった問題があった。またカプサイシン摂取により白色脂肪組織への働きかけは十分に効果が期待できないのが現状である。
【０００６】
また、アスナロ抽出物については、これまでに前駆脂肪細胞分化誘導阻害剤（特許文献2）、細胞接着抑制剤（特許文献3）が知られているが、白色脂肪組織の脂質代謝改善作用は、これら文献により導き出すことはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２２５２９７号公報
【特許文献２】特開２００２−１３８０４４号公報
【特許文献３】特開平９−３１５９９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、白色脂肪組織の脂質代謝改善作用を有し、長期間服用しても安全で尚且つ確実な治療を行うのに充分満足できるような経口又は非経口用組成物、食品あるいは医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上述した課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ひのき科アスナロ属のアスナロ（Thuiopsis dolabrata）、に、白色脂肪組織の脂質代謝改善作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）アスナロの植物の全草又はその一部或いはその抽出物を含む白色脂肪組織の脂質代謝改善剤
（２）白色脂肪組織の脂質代謝改善剤を含有することを特徴とする（1）記載の経口組成物。
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
アスナロ、あるいはその抽出物が白色脂肪組織の脂質代謝改善作用を有することから、これらを含有する脂質代謝改善剤は、肥満、あるいは動脈硬化性疾患などの予防又は／及び治療剤、それらを含有する経口用又は非経口用組成物、食品又は医薬として有用である。このような組成物は、天然由来であることから、長期間服用しても安全で、確実な治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アスナロ抽出物摂取試験マウスの体重増加量および総摂餌量
【図２】アスナロ抽出物摂取試験マウスの血漿中の中性脂肪量およびグルコース量
【図３】アスナロ抽出物摂取試験マウスの脂肪組織重量
【図４】アスナロ抽出物摂取試験マウスの肝臓組織中の中性脂肪量
【図５】ＲＴ−ＰＣＲ法による肝臓組織における脂肪酸合成関連遺伝子の発現（ＦＡＳＮ、Ｓｃｄ１）
【図６】ＲＴ−ＰＣＲ法による肝臓組織における脂肪酸合成関連遺伝子の発現（ＣＤ３６）
【図７】ＲＴ−ＰＣＲ法による白色脂肪組織におけるβ酸化関連遺伝子の発現
【図８】ＲＴ−ＰＣＲ法による白色脂肪組織における代謝関連遺伝子の発現
【図９】アスナロ水抽出物摂取試験マウスの体重増加量および総摂餌量
【図１０】アスナロ水抽出物摂取試験マウスの血漿中の中性脂肪量およびグルコース量
【図１１】アスナロ水抽出物摂取試験マウスの脂肪組織重量
【図１２】アスナロ水抽出物摂取試験マウスの肝臓組織中の中性脂肪量
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明で使用するアスナロ（Thuiopsis dolabrata）は、ひのき科アスナロ属の植物で、葉はやや質が厚く、うろこ状、交互対生、上・下面にあるものは舌型をなし、先端は円形〜鈍形である。下面の中央は雪白色であり、花は小さく、細枝の端に単生する。 球果は球形、径１１〜１５ｍｍ、１０月頃褐色に熟し、種子は卵状長楕円形で灰黄色をなし、幅の狭い側翼がある。 高さ２０〜３０ｍ、花期は５月であり、樹皮は赤褐色で、古くなると黒褐色になる。縦に薄く繊維状にはがれる。所々に地衣類などの着生がみられ、本州・四国・九州（鹿児島県高隈山まで）に分布している。
【００１４】
本発明のアスナロは通常食用として供されているもので良く、また産地についても何れの産地のものでもよく、特に限定されるものではない。
【００１５】
本発明におけるアスナロは、葉、茎、芽、枝、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部及び根、塊茎などの地下部、種子、果実、樹脂など全ての部位が使用可能である。
【００１６】
本発明におけるアスナロは、植物自体を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、超臨界抽出物、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、全てを含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００１７】
例えば、アスナロの葉乾燥物１０ｋｇに水８０Ｌを加え、９０℃で１時間、抽出することにより得た抽出液を、そのまま使用しても良いし、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００１８】
抽出されたアスナロ抽出物の溶液中の抽出物濃度は特に制限はないが、１５〜７０質量％、好ましくは２０〜６０質量％程度が好ましい。この濃度が１５質量％未満では、乾燥時に多量のエタノールや水などの溶液を蒸発させる必要があり、７０質量％を超えると溶液の粘度が高くなり過ぎ、加工適性が悪くなる恐れがある。
【００１９】
本発明によるアスナロの乾燥物または抽出物に、白色脂肪組織の脂質代謝改善作用を有することは、従来から全く知られておらず、本発明により得られた新知見である。
【００２０】
本発明の白色脂肪組織の脂質代謝改善作用剤のような医薬の適用方法としては、経口投与あるいは非経口投与を採用することができる。
投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２１】
食品としては、そのまま、又は種々の栄養成分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、肥満、あるいは動脈硬化性疾患などに対する治療剤に有用な保健用食品又は食品素材として食される。例えば、上述した適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、茶、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
【００２２】
本発明のアスナロの有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定されるが、例えば、経口投与の場合、一般に乾燥重量として１日当たり１０〜５００ｍｇ/ｋｇ体重程度、好ましくは、１日当たり１５０〜３５０ｍｇ/ｋｇ体重程度とされ、１日に数回に分けて投与してもよい。
【００２３】
本発明の植物は天然由来であるためその毒性は低く、アスナロの全草のエタノール抽出物を長期間に亘ってラットに経口投与しても死亡例は認められず、体重変化も観察されなかった。
【００２４】
以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【００２５】
［製造例1］アスナロのエタノール抽出物の製造
アスナロの葉１１３．９ｇに、１Ｌのエタノールを加えて、常温で２０日間浸漬して抽出を行い、得られた抽出液をフィルター（東洋濾紙、Ｎｏ．１）を用いてろ過した。ろ過して得られたこれらの抽出液をロータリーエバポレーター（ＮＥ、東京理化製）にて濃縮乾固した後、凍結乾燥器（ＦＤＵ−２１００、東京理化製）にて減圧乾固することにより、エタノールを完全に留去した。得られたアスナロのエタノール抽出物の重量は、１４．４ｇ（収率：１２．６％）、であった。
【００２６】
[試験例１]
本試験例では、マウスを用い、体重、摂餌量、白色脂肪組織重量（臓器中）、褐色脂肪組織重量（背中）、血糖値、血漿コレステロール、血漿ＴＧ、肝臓中のＴＧおよびコレステロールを測定し、アスナロ抽出物摂取による効果を評価した。
【００２７】
動物：Ｃ57ＢＬ/6Ｊ（雄、１０週齢）
投与期間：１３週間（９１日間）
投与：混餌投与
試験群：ｎ＝8
ＬＦ：通常食（ＡＩＮ-93Ｇ；オリエンタル酵母社製）
ＨＦ：高脂肪ショ糖食（Ｆ2ＨＦＨＳＤ；オリエンタル酵母社製） 
アスナロ：（製造例1のアスナロ抽出物をＨＦに0.5％配合）
【００２８】
（マウスの飼育）
10週齢のＣ57ＢＬ/６Ｊ系の雄性マウス２４匹を日本エスエルシー株式会社より搬入し、室温約２２℃、湿度約40％、明期１２時間（8：00〜20：00）に設定した動物飼育室で飼育を行った。
搬入後１０日間は、馴化期間として固形飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母株式会社）、水を自由に摂取させた。
馴化期間終了時、体重を測定後、健康状態が良好なマウスを本試験に用いた。
上記マウスを各群の匹数（８匹）、体重が等しくなるように３群（ＬＦ、ＨＦ、アスナロ）に分け、通常食（ＬＦ）、高脂肪食（ＨＦ）、0.5％のアスナロ抽出物を添加した高脂肪食を９１日（１３週）間自由に摂取させた。試験期間中、２日間あるいは３日置きに摂餌量、および体重を測定し、食餌を交換した。
【００２９】
試験終了後、各群の体重を測定し、解剖して各組織を測定した。
1.5ｇの２．２．２−トリブロモエタノール（和光純薬株式会社）を1ｍｌのイソプロパノール（和光純薬株式会社）に溶解させ、生理食塩水で80ｍｌにメスアップした溶液を適量（Ｂ．Ｗ．×０．０２+０．０５ｍｌ）腹腔内投与し、麻酔後、開腹し、心臓より採血した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、血漿を分離した後、分析まで−８０℃で保存した。その後、肝臓を摘出し、０．９％（ｗ/ｖ）生理食塩水を用いて還流脱血後、重量を測定し、血漿と同様に分析まで−８０℃で保存した。
【００３０】
内臓脂肪組織として、精巣周囲脂肪、腎臓周囲脂肪および腸間膜脂肪を採取し、それぞれの組織重量を測定した。これら内臓脂肪の合計を白色脂肪量とした。
マウスの背部分から採取した脂肪組織を褐色脂肪として測定した。
【００３１】
統計処理
結果は、平均値±標準誤差で表した。統計処理には、全体の群間の差を一元配置分散分析で確認した。一元配置分散分析が有意だった場合に、個々の群間の差をフィッシャーのＬＳＤ検定により評価した。Ｐ値が0.05未満で優位であると判定した。
【００３２】
[体重・摂餌量]
図1に示す通り、アスナロ摂取群における体重増加抑制が有意に認められた。総摂餌量については、アスナロ摂取群とＨＦ群に差は認められなかった。
【００３３】
[血漿生化学検査]
解剖時に得られた血漿を実験に使用した。血漿グルコース濃度はグルコースＣ−ＩＩテストワコー、血漿ＴＧ濃度はトリグリセリドＥテストワコー（以上、和光純薬株式会社）を用いて測定した。
【００３４】
[血漿生化学分析]
血漿の中性脂肪、グルコース濃度を図２に示した。図に示す通りアスナロ抽出物摂取による血漿中のグルコース、ＴＧ濃度に差は認められなかった。
【００３５】
[脂肪組織重量]
採取した脂肪組織重量の結果を図3に示す。アスナロ抽出物摂取群において、腎周囲脂肪、腸間膜脂肪、白色脂肪、および褐色脂肪重量はＨＦ群に対して有意に低値を示した。
【００３６】
[肝臓データ]
肝臓中の中性脂肪値を図4に示す。アスナロ抽出物摂取群において、肝臓組織中の中性脂肪値はＨＦ群に対して有意に低値を示した。
【００３７】
[試験例２]ＤＮＡマイクロアレイを用いた各種遺伝子発現量の測定
動物実験により抗肥満効果がみられた素材(アスナロ)の臓器（白色脂肪・肝臓）からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイを実施することで、各臓器における遺伝子群の発現レベルを解析し、抗肥満における作用機序について検討した。また、DNAマイクロアレイの再現性の確認は、抽出したRNAを用いRT-PCR法により行った。
【００３８】
[実験方法]
（１）白色脂肪(精巣上体周囲)組織からのRNAの抽出
脂肪組織からのRNA抽出はQIAGEN社のRNeasy Microarray Tissue Mini Kitを用いて行った。各動物個体の精巣上体周囲白色脂肪組織約100 mgに対して、QIAzol Lysis Reagentを1 ml加え、ペッスルを用いてホモジナイズした。その後、15秒間緩やかに転倒混和し、2-3分間静置した。遠心分離(12,000x g、15分、4℃)を行い、上清を回収し、600μｌの70％EtOHを加えピペッティングした。その混合液をRNeasy Mini Spin Columnにセットし遠心分離(8,000x g、15秒、RT)を行い、カラムの透過液は排除した。次に、上述のカラムに700μｌのBuffer RW1を添加し、再度遠心分離(8,000x g、15秒、RT)を行い、カラムの透過液を排除した。さらに、500 mlのBuffer RPEをカラムに添加し、再度遠心分離(8,000x g、2分、RT)を行い、カラムの透過液を排除した。カラムにRNase Free Water 30μｌを加え、遠心分離(8,000x g、1分、RT)し、透過液をTotal RNAとして回収した。RNAの純度は、Agilent Technologies社のAgilent RNA 6000 ナノキットを用いプロトコールに従い測定を行った。RNAの長期保存は、得られたTotal RNA溶液に対して1/10量の3M 酢酸ナトリウム(pH 5.2)および2.5倍量の100％EtOHを加え、エタノール沈殿をさせた状態で-80℃にて保存した。
【００３９】
（２）肝臓組織からのRNA抽出
肝臓組織からのRNA抽出にはインビトロジェン株式会社のTRIzolを用いて行った。各動物個体の肝臓組織約50 mg に対して、1 mlのTRIzolを加え、ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、その後室温にて5分間静置した。200μｌのクロロホルムを加え、15秒間緩やかに転倒混和し、さらに2-3分間室温に静置した。その後、遠心分離(12,000x g、15分、4℃)し、上清に500μｌのイソプロパノールを加えピペッティングし、室温にて5-10分間静置した。次に、遠心分離(12,000x g、10分、4℃)し、上清を除去し、沈殿に対して1 mlの50％EtOHを加え洗浄した(タッピング後、遠心分離(7,500x g、5分、4℃)し沈殿を回収)。その後、30分から1時間静置し、200μｌのRNase Free Waterに溶解しTotal RNAを得た。RNAの純度は、Agilent Technologies社のAgilent RNA 6000 ナノキットを用いプロトコールに従い測定を行った。RNAの長期保存は、得られたTotal RNA溶液に対して1/10量の3M 酢酸ナトリウム(pH 5.2)および2.5倍量の100％EtOHを加え、エタノール沈殿をさせた状態で-80℃にて保存した。
【００４０】
（３）DNAマイクロアレイ
DNAマイクロアレイはAffymetrix社のGeneChip 3’ IVT Express Kitを用いて行った。
【００４１】
（３）−１  Total RNA量の測定
エタノール沈殿させたToal RNA溶液を遠心分離(最大回転数、15分、4℃)し、上清を除去した。沈殿物に70％EtOHを加え、さらに遠心分離(最大回転数、15分、4℃)し、上清を除去し、沈殿物を5分間減圧乾固させた。その後、20μｌのRNase Free Waterに溶解させ、エタノールを除去したToal RNAを得た。その後、Thermo Fisher Scientific社のNano Drop 1000を用いて、Total RNA量の定量を行った。
【００４２】
（３）−２  一本鎖cDNAの合成(GeneChip 3’ IVT Express Kitを使用)
（３）−1より得られたTotal RNA 250 ng(液量が3μｌになるよう滅菌済み超純水で調製)にpoly-A controlを2μｌ加え、さらにFirst-Strand Master mixを5μｌ加え液量を10μｌにし、サーマルサイクラ―を用い42℃で2時間反応させることでTotal RNAより一本鎖cDNAを得た。
【００４３】
（３）−３  二本鎖cDNAの合成(GeneChip 3’ IVT Express Kitを使用)
（３）−２で合成した一本鎖cDNA溶液(全量10μｌ)に対して、Second-Strand Master Mixを20μｌ加え、サーマルサイクラ―を用い16℃で1時間、65℃で10分間反応させ、その後4℃を保持した。
【００４４】
（３）−４、ビオチンラベル化aRNAの合成および精製(GeneChip 3’ IVT Express Kitを使用)
（３）−３で合成した二本鎖cDNA溶液(全量30μｌ)に対して、IVT Master Mixを30μｌ添加し、サーマルサイクラ―を用いて40℃で16時間、その後4℃保持に設定し、オーバーナイトで反応させビオチンラベル化したaRNA溶液を得た。
aRNA溶液(全量60μｌ)にRNA Binding Beadsを10μｌ、aRNA Binding Buffer Concentrateを50μｌ加え混ぜ、混合溶液をU-Bottom Plateに移し、数回ピペッティングした。その後、120μｌの100％EtOHを加え、2分間600 rpmでプレートを振り、aRNAをビーズに結合させた。U-Bottom Plateをマグネテッィクスタンドに移し5分間静置後、上清を除いた。100μｌのaRNA wash solutionを加え、1分間1,000 rpmでプレートの溶液を混合した後に、再びマグネティックスタンドに5分間静置し、上清を除去し洗浄を行った。aRNA wash solutionを用いた洗浄は2回行った。1分間1,000 rpmでプレートを振りエタノールを蒸発させた後に、予備加温していたaRNA Elution solution 50μｌ加え混ぜ、3分間1,300 rpmでプレートを振った。U-Bottom Plateをマグネテッィクスタンドに移し5分間静置後、上清をPCR チューブに移した(約50μｌ)。得られたビオチンラベル化したaRNAの精製溶液をThermo Fisher Scientific社のNano Drop 1000を用いて、RNA量の定量を行った。
【００４５】
（３）−５、ラベル化aRNAの断片化
（３）−４により精製したラベル化aRNA 15μｇ(液量が32μｌになるように滅菌済み超純水で調製)に8μｌの5 x Array Fragmentation Bufferを加え、サーマルサイクラ―を用いて94℃で35分間反応させることでaRNAの断片化を行った。断片化したaRNAの確認は、1％アガロースゲルを用いた電気泳動により行った。
【００４６】
（３）−６  ハイブリダイゼーション
（３）−５で得られた断片化したラベル化aRNA 12.5μｇ(（３）−５で得られた溶液から33.3μｌ分)に対して、216.7μｌのHybridization Cocktailを加えた。
アレイにはAffymetrix社のGeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arrayを用いた。アレイにPre-Hybridization Mix 200μｌを加え、45℃10分間プレハイブリダイゼーションを行った。一方で、aRNAを含むHybridization Cocktailは99℃で5分間ヒートブロックを用いて反応させ、その後45℃で5分間反応させ、遠心分離(最大回転数、5分、RT)した。アレイからPre-Hybridization Mixを除き、遠心分離後のHybridization Cocktailの上清200μｌをアレイに入れ、アレイを45℃、60 rpmで16時間反応させ、ハイブリダイゼーションを行った。
【００４７】
（３）−７  アレイの染色およびスキャン
ハイブリダイゼーション後のアレイの洗浄および染色は、GeneChip Operating Software（GCOS）およびGeneChip Fluidics Station 450を用いて行った。また、染色後のアレイのスキャンにはGCOSおよびGeneChip Scannerを用いて行った。
【００４８】
（３）−８  アレイの解析
アレイのパスウェイ解析には、Ingenuity社のIngenuity pathway analysis(IPA)を用いて行った。
【００４９】
（３）−９  ＲＴ−ＰＣＲ法
（１）および（２）より抽出したtotal RNAをTaKaRa社のPrimeScript RT reagent Kit を用いてPCR用のcDNAを合成した。さらに、Roche社のLightCycler   480 SYBR Green I Masterを用いてPCRを行った。各遺伝子のプライマーはoperon社のスタンダードオリゴを使用した。
【００５０】
[解析結果]
マイクロアレイ測定により肝臓組織では脂肪酸合成に関与するＦＡＳＮ（脂肪酸合成酵素）、Ｓｃｄ１（脂肪酸不飽和化酵素）、ＣＤ３６（脂肪酸トランスロカーゼ）の発現量が増加していた。また、白色脂肪細胞では、β酸化に関与するＡＣＡＤ８（アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ８）、ＡＣＡＤ１１（アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ１１）、ＡＣＡＤＳＢ（短鎖／分枝鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ）および脂質・エネルギーの代謝に関与するＰＰＡＲα、ＰＧＣ−１αの発現量が増加していた。マイクロアレイの再現性を確認するため、ＲＴ−ＰＣＲ法で上記の遺伝子の発現量を測定し、結果を図５〜８に示す。
【００５１】
[肝臓組織における脂肪酸合成関連遺伝子の発現]
ＦＡＳＮ（脂肪酸合成酵素）、Ｓｃｄ１（脂肪酸不飽和化酵素）、ＣＤ３６（脂肪酸トランスロカーゼ）を測定した。
CD36は長鎖脂肪酸にも結合し、長鎖脂肪酸の細胞内への輸送を促進することによって、脂肪組織のエネルギー貯蔵、および腸管の脂肪吸収に関与するとともに、おそらくは糖尿病や肥満などの代謝疾患の発病にも寄与している。
アスナロ摂取群は、ＨＦ群に対して上記３つの関連遺伝子について発現抑制傾向を示した。そのうち、ＣＤ３６に関しては、ＨＦ群に対して有意に発現が抑制された（図５、６）。
【００５２】
[白色脂肪組織におけるβ酸化関連遺伝子の発現]
β酸化とは脂肪酸を酸化して脂肪酸アシルＣｏＡを生成し、そこからアセチルＣｏＡを取り出す代謝経路のことである。動物細胞では脂肪酸からエネルギーを取り出すための重要な代謝経路である。
本試験では、ＡＣＡＤ８（アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ８）、ＡＣＡＤ１１（アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ１１）、ＡＣＡＤＳＢ（短鎖／分枝鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ）を測定した。
アスナロ摂取群は、ＨＦ群に対して上記3つの関連遺伝子について有意に発現増加傾向を示した（図７）。
【００５３】
[白色脂肪組織における代謝関連遺伝子の発現]
ＰＰＡＲαは、主に肝臓や骨格筋で脂肪酸の輸送や代謝に関連する遺伝子の発現を制御しており、脂質代謝に深く関与している。
ＰＧＣ−１αは、運動によって骨格筋で誘導され、ミトコンドリア生合成を起こすなどの作用を発揮する。ＰＧＣ−１αトランスジェニックマウスは肥満や糖尿病になりにくく、寿命が延長する。そのため、ＰＧＣ−１αにより筋肉で何らかの因子が分泌され、他の臓器に作用することが予想されていた。筋肉特異的なＰＧＣ−１αトランスジェニックマウスでは、白色脂肪組織が「褐色化」している事が知られている（Nature. 2012 Jan 11;481(7382):463-8）。
本試験では、白色脂肪組織における代謝関連遺伝子の発現として、ＰＰＡＲαおよびＰＧＣ−１αを測定した。
アスナロ摂取群は、ＨＦ群に対して上記２つの関連遺伝子について発現増加傾向を示した（図８）。
【００５４】
［製造例２］アスナロの水抽出物の製造
アスナロの葉１，９１０ｇに、８０℃の温水１２Ｌを加えて、８０℃で２時間浸漬して抽出を行った。この浸漬液を１００メッシュの金属網でろ過し、抽出液８，７９０ｇを得た（抽出液1）。抽出残渣を上記同様に８０℃の温水１２Ｌを加えて、８０℃で２時間浸漬して抽出を行い、浸漬液を１００メッシュの金属網でろ過し、抽出液１１，３８０ｇを得た（抽出液2）。抽出液１および2を混合し、ロータリーエバポレーター（ＮＥ、東京理化製）にて濃縮乾固した後、凍結乾燥器（ＦＤＵ−２１００、東京理化製）にて減圧乾固することにより、水分を除去した。得られたアスナロのエタノール抽出物の固形分量は、２１０ｇ（収率：１１．０％）であった。
【００５５】
[試験例３]
試験例1と同様にマウスを用い、体重、摂餌量、白色脂肪組織重量（臓器中）、褐色脂肪組織重量（背中）、血糖値、血漿コレステロール、血漿ＴＧ、肝臓中のＴＧおよびコレステロールを測定し、アスナロ水抽出物摂取による効果を評価した。
【００５６】
動物：ＤＢＡ/1ｊ（雄、４週齢）
投与期間：４週間（２８日間）
投与：混餌投与
試験群：ｎ＝8
ＬＦ：通常食（ＣＥ−２；オリエンタル酵母社製）
ＨＦ：高脂肪ショ糖食（ＨＦＤ３２日本クレア社製） 
アスナロ：（製造例2のアスナロ抽出物をＨＦに0.2％、0.5％配合）
【００５７】
（マウスの飼育）
4週齢のＤＢＡ/1ｊ系の雄性マウス３２匹を日本エスエルシー株式会社より搬入し、室温約２３℃、湿度約５０％、明期12時間（7：00〜19：00）に設定した動物飼育室で飼育を行った。
搬入後7日間は、馴化期間として固形飼料ＣＥ−２（オリエンタル酵母株式会社）、水を自由に摂取させた。
馴化期間終了時、体重を測定後、健康状態が良好なマウスを本試験に用いた。
上記マウスを各群の匹数（８匹）、体重が等しくなるように４群（ＬＦ、ＨＦ、アスナロ0.2％、0.5％）に分け、通常食（ＬＦ）、高脂肪食（ＨＦ）、0.2％及び0.5％のアスナロ抽出物を添加した高脂肪食を２８日（４週）間自由に摂取させた。試験期間中、２日間あるいは３日置きに摂餌量、および体重を測定し、食餌を交換した。
【００５８】
試験終了後、各群の体重を測定し、解剖して各組織を測定した。
採血はジエチルエーテル麻酔後、開腹し、心臓より採血した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、血漿を分離した後、分析まで−８０℃で保存した。
【００５９】
内臓脂肪組織として、精巣周囲脂肪、腎臓周囲脂肪および腸間膜脂肪を採取し、それぞれの組織重量を測定した。これら内臓脂肪の合計を白色脂肪量とした。
マウスの背部分から採取した脂肪組織を褐色脂肪として測定した。
【００６０】
統計処理
結果は、平均値±標準誤差で表した。統計処理には、全体の群間の差を一元配置分散分析で確認した。一元配置分散分析が有意だった場合に、個々の群間の差をダネットの多重比較検定により評価した。Ｐ値が0.05未満で優位であると判定した。
【００６１】
[体重・摂餌量]
図９に示す通り、アスナロ水抽出0.2％及び0.5％摂取群における体重増加抑制が認められた。総摂餌量については、アスナロ摂取群とＨＦ群に差は認められなかった。
【００６２】
[血漿生化学検査]
解剖時に得られた血漿を実験に使用した。血漿グルコース濃度はグルコースＣ−ＩＩテストワコー、血漿ＴＧ濃度はトリグリセリドＥテストワコー（以上、和光純薬株式会社）を用いて測定した。
【００６３】
[血漿生化学分析]
血漿の中性脂肪、グルコース濃度を図１０に示した。図に示す通りアスナロ水抽出物摂取群による血漿中のグルコースは、ＨＦ群に対して有意な差は認められなかった。
【００６４】
[脂肪組織重量]
採取した脂肪組織重量の結果を図１１に示す。アスナロ水抽出物摂取群において、腎周囲脂肪、腸間膜脂肪、白色脂肪、および褐色脂肪重量はＨＦ群に対して低値を示した。
【００６５】
[肝臓データ]
肝臓中の中性脂肪値を図１２に示す。アスナロ水抽出物摂取群において、肝臓組織中の中性脂肪値はＨＦ群に対して有意に低値を示した。
以下に処方例を示す。
【００６６】
［錠剤の製造］
製造例で得られたアスナロの全草のエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組
成の錠剤を製造した。
【００６７】
（組      成）                            （配合：質量％）
アスナロ全草エタノール抽出物                    ２４
乳糖                                          ６３
コーンスターチ                                １２
グァーガム                                      １
［ジュースの製造］
製造例で得られたアスナロの葉のエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組
成のジュースを製造した。
【００６８】
（組       成）                          （配合：質量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁                          ５．０
果糖ブドウ糖液糖                              １１．０
クエン酸                                        ０．２
Ｌ−アスコルビン酸                              ０．０２
香料                                            ０．２
色素                                            ０．１
アスナロ葉エタノール抽出物                      ０．２
水                                            ８３．２８
【００６９】
[結果]
アスナロの抗肥満メカニズムを解明するため、動物実験およびDNAマイクロアレイを行った。その結果、高脂肪・高ショ糖食群(HF群)と比較して、アスナロエタノール抽出摂取群(ＡＳ群)では体重の減少・白色脂肪組織重量の減少および肝臓中中性脂肪量の低下を確認した。またＤＮＡマイクロアレイの結果から、ＡＳ群では白色脂肪組織での脂肪酸酸化(β酸化)に関連する遺伝子の発現量増加と、肝臓組織での脂肪酸合成に関連する遺伝子の発現量低下を確認した。これらの結果から、アスナロはこれまで知られているVLDL分泌抑制作用だけでなく、脂肪代謝改善作用も有することが新たにわかった。特に白色脂肪組織における代謝関連遺伝子の発現試験においてＰＧＣ-1αの発現増加が認められたことから、白色脂肪細胞の「褐色化」による脂質代謝改善が確認できた。
また、アスナロの水抽出群に於いてもエタノール抽出群と同様に体重の減少・白色脂肪組織重量の減少および肝臓中中性脂肪量の低下を確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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