(57)【要約】      （修正有）【課題】巨大分子の物理的サイズや大きなゲノムＤＮＡ分子上のバイオマーカーなどの特徴を解析するための、ハイスループットの（処理能力の高い）解析を大規模並列態様で行うナノスケール装置を提供する。【解決手段】細長く引き伸ばされた単一の巨大分子を操作するナノ流体装置であって、表面と当該表面に実質的に平行に設けられた１又はそれ以上の、断面直径が１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも１０ｎｍである、流体ナノチャネルセグメントとを有する基板であって、前記流体ナノチャネルセグメントが、内部に巨大分子の少なくとも一部を滞留させて含み更にこれを細長く引き伸ばすことができる、基板と、前記流体ナノチャネルセグメントの少なくとも１つの少なくとも一部を覆うことのできる、少なくとも一部が可溶性の被分析物に対し透過性であるキャップとを有するナノ流体装置。【選択図】図１Ａ
2014097058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細長く引き伸ばされた単一の巨大分子を操作するナノ流体装置であって、
表面と当該表面に実質的に平行に設けられた１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントとを有する基板であって、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、当該流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部の内部に、巨大分子の少なくとも一部を滞留させて含み、更にこれを細長く引き伸ばすことができるものであり、各前記流体ナノチャネルセグメントは、断面直径が１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも１０ｎｍである、基板と、
前記１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントの内容物の少なくとも一部を光学検査できるようにする少なくとも１つの観察窓と
を有するナノ流体装置。
【請求項２】
請求項１記載のナノ流体装置において、前記複数の流体ナノチャネルセグメントは、実質的に互いに平行である、ナノ流体装置。
【請求項３】
請求項１記載のナノ流体装置において、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、前記巨大分子の回転半径の２倍未満の断面直径を有するものである、ナノ流体装置。
【請求項４】
請求項１記載のナノ流体装置において、前記１若しくはそれ以上のナノチャネルセグメントは、１若しくはそれ以上の境界により画成され、前記巨大分子の少なくとも一部を直鎖状の形態に保持するよう、当該巨大分子の当該一部を制約することができる、ナノ流体装置。
【請求項５】
請求項４記載のナノ流体装置において、前記１若しくはそれ以上の境界は、物理的な壁、荷電領域、化学的に処理した領域、磁場領域、異なる材料、自己組織化単分子膜、ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせを有するものである、ナノ流体装置。
【請求項６】
請求項４記載のナノ流体装置において、前記１若しくはそれ以上の境界は、疎水性領域、親水性領域、またはこれらの任意の組み合わせを有するものである、ナノ流体装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００７年３月２８日付け出願の米国特許出願第６０／９０８，５８２号および米国特許出願第６０／９０８，５８４号（言及によりその内容を本明細書に組み込むものとする）に基づく利益を主張するものである。
【０００２】
本特許明細書ファイルには、カラー図面またはカラー写真が少なくとも１つ含まれる。カラー図面またはカラー写真を伴う本特許明細書のコピー（複製）は、米国特許庁に要請し、必要な手数料を支払うことにより、入手できる。
【０００３】
本発明は、米国政府の支援によりなされたものである。同政府は、国立衛生研究所助成金第１Ｒ４３ＨＧ００４１９９−０１号に基づき、本発明について一定の権利を有することができる。
【０００４】
本発明の分野には、巨大分子解析のためのナノスケール装置と、当該装置を作製および使用する方法とが含まれる。本発明の分野には、ポリ核酸のサイズ決定および構造解析も含まれる。
【背景技術】
【０００５】
本明細書では、種々の科学文献および特許文献を参照している。その各々については、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０００６】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）などの生体分子は、ヌクレオチドから構成された長い分子であり、その直鎖状配列の決定は、ゲノムおよびポストゲノム研究のための有機体発現情報に直接関係する。
【０００７】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）などの生体分子は、ヌクレオチドから構成された長い分子であり、その直鎖状配列の決定は、ゲノムおよびポストゲノム研究のための有機体発現情報に直接関係する。
【０００８】
多くの場合、個体の一生の間にヌクレオチド配列の突然変異または再構成が起こると、遺伝的異常や細胞性悪性腫瘍などの疾患状態につながる。他の場合では、各個体間のわずかな配列の違いが、集団の遺伝子構造の多様性を反映している。このため、人はそれぞれ疾病素因（傾向）が異なり、ストレスや薬物療法といった環境からの刺激および信号に対する反応が異なる。その例として、一部の患者は特定の化合物に好反応を示す一方、他の患者では効果が得られず、場合によっては有害な副作用さえ出てしまう。もう１つの関心領域は、環境中の毒素または放射線など他の有害な刺激に対するＤＮＡなど生体分子の反応である。有害な刺激は、有害な細胞またはもはや機能しない細胞を排除する過程であるプログラム細胞死（アポトーシス）につながるおそれがある。アポトーシスは、細胞および核の形態変化により特徴付けられ、染色体ＤＮＡの断片化を伴うことが多い。
【０００９】
遺伝的多様性および医療薬理学的影響を研究する集団ゲノム学、比較ゲノム学、進化ゲノム学、医療ゲノム学、環境ゲノム学、毒性ゲノム学、薬理ゲノム学（「ゲノム学」は「ゲノミクス」ともいう）の分野では、膨大な配列決定および大きな標本数が必要とされる。そのため、このような研究からもたらされる知識は、特に医療・製薬産業に有益である。特に、癌ゲノム学および癌診断では、腫瘍形成につながるゲノムの不安定性に関する事象が研究されている。このように、これら全分野は、直鎖状配列、核酸など生体高分子の目的要素または領域の構造パターン変化、または生体高分子のメチル化パターンといったエピジェネティックバイオマーカーの高速決定を可能にする技術の恩恵を受けることになる。
【００１０】
ゲノムまたはエピゲノムの解析技術の大半では、大きなゲノム領域または大きな集団を全般的に解析する場合、過度に長時間かかり、またはコスト高になる。そのため、ゲノム解析のコストを少なくとも４桁削減するという目標（いわゆる「＄１０００ゲノム」マイルストーン）を達成するには、直接的な分子解析方法を実現する新たなパラダイムシフト技術が望まれる。「＄１０００ヒトゲノムを目指して」（Ｔｈｅ  Ｑｕｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＄１，０００  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ）（Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｗａｄｅ、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｔｉｍｅｓ、２００６年７月１８日）を参照。
【００１１】
また、新たな医薬品（薬物）を上市するには、平均７〜１０年の年月と８億万ドルの費用がかかる。そのため、製薬企業は、毒性面で問題が生じる率（ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｒａｔｅ）を最小限に抑えながら、より安全かつ経済的に医薬品を開発できる方法を模索している。
【００１２】
医薬品化合物の毒性は、遺伝子突然変異、大規模の染色体変化（異常）、組み換え、および染色体数変化（異常）の形でＤＮＡを損傷するおそれがある。遺伝毒性試験は、細菌内、哺乳類細胞内、および動物体内で行われる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の試験で、種々の機序で直接的または間接的に上記の損傷を誘発する化合物を検出するものである。この試験で陽性を示す化合物は、癌および／または遺伝性異常を誘発するヒト発癌性物質および／またはヒト変異原性物質の可能性がある。医薬品は、異なるレベルで有毒な可能性があるが、生殖細胞系列突然変異など医薬品によるＤＮＡ突然変異誘発は、多数の長期的有害事象の根底にある。
【００１３】
政府規制当局が指針を設定しているにもかかわらず、鎮痛剤のＣＯＸ−２群に関する最近の問題を含め、医薬品毒性の事例が発生している。開発パイプライン（新薬パイプライン）において毒性面で問題が生じる率は、長年にわたり改善が見られず、この工程のコストが増加の一途をたどる一因となっている。化合物スクリーニング中の前臨床試験では、有効性（薬効）および潜在的副作用を評価して薬剤がヒトに及ぼす作用を予測するため、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイおよび動物アッセイの双方が必要とされるが、これら遺伝毒性試験は高コスト・低速であるため普及せず、またスクリーニング効率を改善するための早期試験も行われていない。例えば、変異原性検出の標準的な第１段階はエームズ試験であるが、これは約３０年以上前に開発されたものである。しかし、このエームズ試験の改良版でさえも、１回の試験に２〜４日間の処理を要し、＄４，０００〜＄５，０００のコストがかかってしまう。この理由から、エームズ試験は医薬品開発の後期で使用されることが多い。
【００１４】
必要とされる遺伝毒性試験バッテリーの中でも大きな要素は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での染色体損傷の評価であり、これにはマウスリンパ腫Ｌ５１７８Ｙ細胞またはＴＫ遺伝子座（ヒトリンパ芽ＴＫ６細胞を使用）、ＨＰＲＴ遺伝子座（ＣＨＯ細胞、Ｖ７９細胞、またはＬ５１７８Ｙ細胞を使用）、あるいはＧＰＴ遺伝子座（ＡＳ５２細胞を使用）が関与する。毒性学分野では、このモデルシステムが単純で、また単に効率的かつ経済的な評価方法が他にないという理由から、これら特定の遺伝子座で化合物に誘発される突然変異事象をゲノム全体の代表として使用し、これらの遺伝子座で誘発される遺伝子変化がゲノムＤＮＡ全体の損傷の正確な評価になることを期待する。理想的には、化合物の露出時間、用量、被検細胞の試料採取時間、または任意の試験パラメータが変化するたび、被検細胞または被検系の少数の代表的遺伝子座だけでなくゲノム全体の損傷情報を、高効率・低コストの標準化された形式で詳しく評価できることが望ましい。少なくとも、コストおよび複雑度が極端に増大することなく、各染色体または重要な関心領域から１つずつといったように複数遺伝子座のパネルを解析できれば、非常に有益である。そのような総合的パンゲノム（全ゲノム）毒性評価を効率的に実現する新たな技術プラットフォームが、大いに望まれる。
【００１５】
ＤＮＡ損傷評価の分野において、数十年の歴史がある従来の細胞遺伝学的解析（染色体分析からＧバンド染色、ＦＩＳＨ法（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの略称）の各種形態に至るまで）技術は、多くの場合、中期染色体の拡散に依存し、それらの解像度はメガベース（塩基１００万個）規模に限られる。インターフェースＦＩＳＨ法またはファイバーＦＩＳＨ法では、弛緩したＤＮＡまたは部分的に伸長したＤＮＡを使って解像度の改善を試みているが、実施は依然困難であり、定量的な空間的情報を抽出する際の課題となっている。これらの技術は強力ではあるが、一貫性および再現性がないため工程の制御が難しく、最終的に技術者の技能に依存することになり、より高速で廉価な遺伝毒性試験への大規模化を困難にしている。
【００１６】
その他、表面の「コーミング」、光ピンセット、流体力学的絞り込みフローチップの形式を使って個々のＤＮＡ分子の線状化を改善する近年の試みは、アッセイの一貫性、標準化、およびコスト実現可能性をさらに改善する必要性を反映したものである。残念なことに、標的ＤＮＡを引き伸ばす方法は、本質的に十分制御できず、分子の伸長状態は、過渡的かつ不均一で一貫性がないことが多く、複雑な解析工程と見なされている。このような変動性から、遺伝毒性試験において染色体ＤＮＡの構造的損傷を調べる大規模スクリーニングに対し、上記の単一分子解析アプローチ群の応用は限定されてしまっている。
【００１７】
また電気泳動は、アガロースやポリアクリルアミドなどのゲル中で、種々の分子量のポリマー（高分子）が種々の移動度を有することに基づき、これらポリマーの分離に使用されている。その分離所要時間は、大きなポリマーフラグメント（断片）の場合、数時間または数日にもなる。細胞単一の電気泳動アッセイは、環境中の毒素、放射線、または化学療法で使用される薬剤など毒性のある薬剤に誘発された染色体ＤＮＡ損傷を評価するため一般的に使用されている。現行の遺伝毒性試験で使用されることが多いコメット解析と呼ばれる一般的なアッセイでは、細胞をゲルマトリックス（基質）内に溶解したのち、ＤＮＡを電気泳動させ、蛍光色素で染色する。電気泳動中、ＤＮＡ断片は、コメットテイル（彗星状の尾）形状を生じている細胞から離れる方向へ遊走する。コメットテイルの幾何学的形状は、染色体ＤＮＡ内の二本鎖切断および一本鎖切断の数に関係するため、この情報から細胞の毒性薬剤へのばく露について半定量的な測度（指標）が得られる。この技術では損傷度を評価できるが、標準化が難しく、データは解釈に左右されやすい。また、染色体ＤＮＡの断片が絡み合ったままであるため互いに区別できず、個々の断片の切断位置またはサイズに関する有益な情報が得られない。
【００１８】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、略称ＣＧＨ）などアレイに基づいた他のアプローチでは、不均衡なゲノム構造変化（増幅、欠失（転座でも逆位でもない））を検出する際、解像度問題の一部の側面を克服する進歩が見られるが、比較ハイブリダイゼーション固有の問題だけに限定されている。新世代の配列決定技術は、大規模な並列読み取りにおいて、個々の遺伝子分子の配列データを比較的高速に提供することを目標としているが、このような技術で解析する分子は、比較的短いリード（読み枠）（２５塩基対まで）に断片化しなければならず、配列データは、多くの場合、重複しあうリードのタイリングパスを最小化することにより、計算的に生成される。このアプローチでは、各断片がゲノム全体の文脈から切り離されるため、（通常、各断片よりはるかに大きなスケールで起こる）全体的な遺伝子変化が目立たなくなることが多いという欠点がある。これは特に、巨大な反復配列の領域内の複雑なゲノムや、遺伝子コピー数多型の場合に関連性がある。そのため、このような技術では、ゲノム内の不連続な領域と対照的に、ゲノム全体に関する情報を提供する能力が欠落している。
【００１９】
分子コーミング技術は、単一分子レベルでより詳細な解析を実現し、細胞遺伝学研究を飛躍的に向上させた。分子コーミング法では、後退する流体のメニスカス（界面）が、その溶液滴の表面上での乾燥とともにＤＮＡを細長く引き伸ばす。その溶質は、「コーヒーステイン現象」として知られる現象により、当該液滴の境界へ向かって移動する（Ｄｅｅｇａｎ、１９９７年）。緩衝液にＤＮＡが含まれる場合、そのＤＮＡは液相の境界で表面にランダムに繋留されたのち、後退するメニスカスの剪断力により細長く引き伸ばされる。残念ながら、この伸長方法は本質的に制御が難しく、異なるマイクロスライド上のＤＮＡ試料を「完全に同じようにコーミング」することは不可能であり、表面上の分子の伸長の度合い、均一性、または配置を予測することもできない。ＤＮＡ分子は、（物理的に分離されていないため）多くの場合、線状化が不完全な状態で互いに重なり合い、それぞれの端部はメニスカスから開放されるとらせん形状に戻り、ＤＮＡ分子の伸長が不完全になってしまうことが多い。このような変動性により、このコーミングアプローチの用途は、患者の大規模スクリーニングに制限されている。
【００２０】
流体バイオチップ（生体素子）プラットフォームを使って個々のＤＮＡ分子の線状化を標準化する試みは他にも行われているが、望ましい線状化を実現するには比較的非効率的である。ＤＮＡは、自ら折り畳まれた状態に戻ることが多く、または自由溶液中でガウス分布したコイル状の立体配座（本質的に毛糸球状）を保つ場合さえある。さらに、このような技術では、多くの場合ＤＮＡの伸長が過渡的かつ不均一で一貫性のないことから良好な解像度が得られず、ＤＮＡの伸長状態を持続する上で十分な高速でＤＮＡが動いている間に、解析に使用する画像を捕捉しなければならない。また、これらの設計は、光検出器を設けた単一チャネル（流路）に分子を流通させる構造に基づくため、その処理能力（スループット）は著しく限られている。
【００２１】
そのため、ＤＮＡその他の巨大分子の断片のサイズおよび組成を、このような分子を線状化して解析することにより、効率的に決定する方法が必要とされている。そのような方法は、診断および治療用途に即時利用できるであろう。
【００２２】
当該方法は、最小量の試料、可能性として単一細胞で行えることが望ましい。これにより、細胞状態を監視し、癌細胞の悪性期などの疾病の発症および進行、またはアポトーシスにつながる刺激の毒性の度合いを理解する能力が大幅に向上する。また、これに関連して、そのような方法を実施できる装置も必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明では、ＤＮＡセグメントのサイズおよび組成を解析するという課題に対応するため、そのような分子を閉じ込め、線状化したのち、解析する方法と、そのような方法を実施できる装置とを提供する。
【００２４】
まず、本発明では、細長く引き伸ばされた単一巨大分子を操作することのできるナノ流体装置を提供し、このナノ流体装置は、表面と当該表面に実質的に平行に設けられた１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントとを有する基板であって、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、当該流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部の内部に、巨大分子の少なくとも一部を滞留させて含み、これを細長く引き伸ばすことができ、各前記流体ナノチャネルセグメントは、特徴的断面寸法が約１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも約１０ｎｍである、基板と、前記１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントの内容物の少なくとも一部を光学検査できるようにする少なくとも１つの観察窓とを有する。
【００２５】
また、ナノ流体装置を使って１若しくはそれ以上の巨大分子を特徴付ける方法も提供し、この方法は、基板の表面と実質的に平行に設けられた流体ナノチャネルセグメントにより、これを通過する前記巨大分子の少なくとも１つの領域の少なくとも一部を転座させる工程であって、前記流体ナノチャネルセグメントは、前記巨大分子の１つの領域の少なくとも一部を含んで、これを細長く引き伸ばすことができ、前記流体ナノチャネルセグメントは、特徴的断面寸法が約１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも約１０ｎｍである、前記巨大分子の少なくとも１つの領域の少なくとも一部を転座させる工程と、前記流体ナノチャネルセグメントの内容物の少なくとも一部を光学検査できるようにする観察窓を介して、前記ナノチャネル内を通過する前記巨大分子の１若しくはそれ以上の領域の転座に関する１若しくはそれ以上の信号（シグナル）を監視する工程と、前記監視された信号と、前記巨大分子の１若しくはそれ以上の特性との相関を求める工程とを有する。
【００２６】
さらに、本発明はいくつかの装置も提供し、その１つの装置は、表面と当該表面に実質的に平行に設けられた１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントとを有する基板を有し、その場合、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、当該流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部の内部に、巨大分子の少なくとも一部を滞留させて含んで、これを細長く引き伸ばすことができ、各前記流体ナノチャネルセグメントは、特徴的断面寸法が約１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも約１０ｎｍであり、前記少なくとも１つの流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部は、１若しくはそれ以上の励起源の照射を受ける。
【００２７】
また、本明細書では巨大分子解析装置も開示しており、これらの装置は、表面上に設けられた１若しくはそれ以上のナノチャネルを有し、当該ナノチャネルのうち１若しくはそれ以上は、約１０００ｎｍ未満の幅を有し、当該ナノチャネルのうち１若しくはそれ以上は、１若しくはそれ以上の境界（ボーダー）により画成され、前記巨大分子の少なくとも一部を直鎖状の形態に保持するよう、当該巨大分子の当該一部を制約（束縛）することができる。
【００２８】
本発明では、巨大分子を解析する方法も提供され、これらの方法は、巨大分子の少なくとも一部を直鎖状の形態に保持するよう制約（束縛）することのできる１若しくはそれ以上のナノチャネルを有する表面上に、１若しくはそれ以上の当該巨大分子を配置する工程と、１若しくはそれ以上のナノチャネル内で１若しくはそれ以上の巨大分子の少なくとも一部を細長く引き伸ばすよう、前記１若しくはそれ以上の巨大分子に駆動力を与える工程と、前記巨大分子のうち１若しくはそれ以上から生じる１若しくはそれ以上の信号を監視する工程とを有する。
【００２９】
また、本発明では、巨大分子解析装置を製作する方法も開示しており、これらの方法には、２若しくはそれ以上の境界（ボーダー）の配設により、１若しくはそれ以上のナノチャネルを表面上に画成する工程が含まれ、その場合、前記境界（ボーダー）のうち１若しくはそれ以上は、巨大分子を制約（束縛）することができ、前記ナノチャネルのうち１若しくはそれ以上は、約１０００ｎｍ未満の幅を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
上記の要約および以降の詳細な説明は、添付の図面を参照することで、さらに明確に理解される。本発明を例示する目的で本発明の例示的な実施形態を図面に示すが、本発明は、開示する具体的な方法、組成、および装置に限定されるものではない。また、これらの図面は、必ずしも縮尺どおりに描画したものではない。図面は、以下のとおりである。
【図１Ａ】図１Ａは、ナノチャネル装置内を流通する巨大分子の検出を例示したものであり、この場合、前記ナノチャネル内の巨大分子の通過は、目的の特性を励起源により励起し蛍光させ、その蛍光を光子検出装置で検出したのち、この蛍光信号の相関を前記巨大分子の長手方向に沿って求めることにより記録される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、前記装置の断面図を例示したものであり、この場合、前記光子検出器下を通過する前記目的の特性に励起源からの光が照射され、照射された前記特性により発せられた光子を前記検出器が監視する。
【図２Ａ】図２Ａは、ナノチャネル装置内を流通する巨大分子の検出を例示したものであり、この場合、前記巨大分子を流通させることにより、図２Ｂに示すように前記ナノチャネル内へスリットを透過してくる励起光で前記巨大分子が照射され、そのスリット下で前記巨大分子の領域から前記蛍光信号が取得されて、前記スリットから蛍光信号の流れ（ストリーム）を収集でき、これを使って、前記巨大分子の長手方向に沿った特徴を決定することができる。
【図２Ｂ】図２Ａは、ナノチャネル装置内を流通する巨大分子の検出を例示したものであり、この場合、前記巨大分子を流通させることにより、図２Ｂに示すように前記ナノチャネル内へスリットを透過してくる励起光で前記巨大分子が照射され、そのスリット下で前記巨大分子の領域から前記蛍光信号が取得されて、前記スリットから蛍光信号の流れ（ストリーム）を収集でき、これを使って、前記巨大分子の長手方向に沿った特徴を決定することができる。
【図３Ａ】図３は、ナノチャネル内を流通する巨大分子からスリットを使って取得される蛍光信号が、いかにデータの流れ（ストリーム）を生成できるか、その実施例を例示した図である。図３Ａは、前記チャネルに沿って流れる前記分子の蛍光信号を示した図であり、データ解析アルゴリズムを使うと、巨大分子の数と、それらの長さとを決定することができる。
【図３Ｂ】図３は、ナノチャネル内を流通する巨大分子からスリットを使って取得される蛍光信号が、いかにデータの流れ（ストリーム）を生成できるか、その実施例を例示した図である。図３Ｂは、図３Ａの前記巨大分子について、これらの巨大分子が前記スリットを通過する際の時間に対する蛍光信号強度のプロットを例示した図であり、図３Ｄは、図３Ｃの前記巨大分子について、これらの巨大分子が前記スリットを通過する際の時間に対する蛍光信号強度のプロットを例示した図である。どちらの場合も、検出された信号から、巨大分子サイズ分布に関する情報を決定することができる。
【図３Ｃ】図３は、ナノチャネル内を流通する巨大分子からスリットを使って取得される蛍光信号が、いかにデータの流れ（ストリーム）を生成できるか、その実施例を例示した図である。図３Ｂは、図３Ａの前記巨大分子について、これらの巨大分子が前記スリットを通過する際の時間に対する蛍光信号強度のプロットを例示した図であり、図３Ｄは、図３Ｃの前記巨大分子について、これらの巨大分子が前記スリットを通過する際の時間に対する蛍光信号強度のプロットを例示した図である。どちらの場合も、検出された信号から、巨大分子サイズ分布に関する情報を決定することができる。
【図３Ｄ】図３は、ナノチャネル内を流通する巨大分子からスリットを使って取得される蛍光信号が、いかにデータの流れ（ストリーム）を生成できるか、その実施例を例示した図である。図３Ｂは、図３Ａの前記巨大分子について、これらの巨大分子が前記スリットを通過する際の時間に対する蛍光信号強度のプロットを例示した図であり、図３Ｄは、図３Ｃの前記巨大分子について、これらの巨大分子が前記スリットを通過する際の時間に対する蛍光信号強度のプロットを例示した図である。どちらの場合も、検出された信号から、巨大分子サイズ分布に関する情報を決定することができる。
【図４Ａ】図４Ａは、ナノチャネル装置内を流通する巨大分子の例を示したものであり、この場合、前記巨大分子は、前記ナノチャネルに画成した領域に集光された励起光で照射される。このような実施形態では、前記ナノチャネル内で照射を受けた前記巨大分子の領域から前記蛍光信号が取得され、前記巨大分子を流して前記照射領域を通過させることにより、前記巨大分子から蛍光信号の流れ（ストリーム）を収集でき（図４Ｂ）、これを使って、前記巨大分子の長手方向に沿った特徴を決定することができる。
【図４Ｂ】図４Ａは、ナノチャネル装置内を流通する巨大分子の例を示したものであり、この場合、前記巨大分子は、前記ナノチャネルに画成した領域に集光された励起光で照射される。このような実施形態では、前記ナノチャネル内で照射を受けた前記巨大分子の領域から前記蛍光信号が取得され、前記巨大分子を流して前記照射領域を通過させることにより、前記巨大分子から蛍光信号の流れ（ストリーム）を収集でき（図４Ｂ）、これを使って、前記巨大分子の長手方向に沿った特徴を決定することができる。
【図５Ａ】図５Ａは、ナノチャネル装置内を流通する巨大分子を例示したものであり、この場合、前記巨大分子は、チップ装置に一体化（集積）された励起光源に照射される。この実施形態では、前記ナノチャネル内で照射を受けた前記巨大分子の領域から前記蛍光信号が取得され、前記巨大分子を流して前記照射領域を通過させることにより、前記巨大分子から蛍光信号の流れ（ストリーム）を収集でき（図５Ｂ）、これを使って、前記巨大分子の長手方向に沿った特徴を決定することができる。
【図５Ｂ】図５Ａは、ナノチャネル装置内を流通する巨大分子を例示したものであり、この場合、前記巨大分子は、チップ装置に一体化（集積）された励起光源に照射される。この実施形態では、前記ナノチャネル内で照射を受けた前記巨大分子の領域から前記蛍光信号が取得され、前記巨大分子を流して前記照射領域を通過させることにより、前記巨大分子から蛍光信号の流れ（ストリーム）を収集でき（図５Ｂ）、これを使って、前記巨大分子の長手方向に沿った特徴を決定することができる。
【図６Ａ】図６Ａは、ナノチャネル装置に流入して少なくとも部分的に細長く引き伸ばされた巨大分子の例を示した図であり、その場合、ナノチャネルはキャップで覆われている−前記巨大分子が伸長されたのち、前記ナノチャネルの内面に付着したら、前記キャップを取り外し（図６Ｂを参照）、前記巨大分子の伸長領域を露出させて付加的な解析、工程（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）などを行えるようにする。
【図６Ｂ】図６Ａは、ナノチャネル装置に流入して少なくとも部分的に細長く引き伸ばされた巨大分子の例を示した図であり、その場合、ナノチャネルはキャップで覆われている−前記巨大分子が伸長されたのち、前記ナノチャネルの内面に付着したら、前記キャップを取り外し（図６Ｂを参照）、前記巨大分子の伸長領域を露出させて付加的な解析、工程（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）などを行えるようにする。
【図７】図７は、分岐したナノチャネルネットワークを例示したものであり、この内部で各ナノチャネルは１若しくはそれ以上のナノチャネルに接続される−巨大分子がこのネットワーク内を流通するに伴い、当該巨大分子の伸長の度合いは、前記ナノチャネルの断面寸法の関数となり、その一例として、連続した３つのナノチャネル内を流通する巨大分子において、それら３つのナノチャネルの断面直径が変化する場合（Ｄ３>Ｄ２>Ｄｌ）、当該巨大分子の伸長の度合いも変化し（Ｌ３<Ｌ２<Ｌ１）、同様に当該巨大分子上の目的の特性間の距離も測定可能な態様で変化する（Ｔ３<Ｔ２<Ｔ１）。
【図８Ａ】図８Ａは、いくつかの流体ナノチャネルセグメント内を移動中の標識した巨大分子を図示したものであり、この場合、前記セグメントはグリッド状のパターン内に設けられており、これらのＤＮＡ分子は前記セグメント内を移動するに伴い細長く引き伸ばされる。
【図８Ｂ】図８Ｂは、非直線的な流体ナノチャネルセグメント内を移動中の標識した巨大分子を図示したものである。
【図９Ａ】図９は、（図９Ａ）表面にトポロジーパターンを作製して溝（トレンチ）の境界を画成したナノトレンチ（ナノスケールの溝）内で細長く引き伸ばされたＤＮＡ分子と、（図９Ｂ）表面特性を変化させて溝の境界を画成したナノトラックまたはナノレーン内で細長く引き伸ばされたＤＮＡ分子とを例示したものである。
【図９Ｂ】図９は、（図９Ａ）表面にトポロジーパターンを作製して溝（トレンチ）の境界を画成したナノトレンチ（ナノスケールの溝）内で細長く引き伸ばされたＤＮＡ分子と、（図９Ｂ）表面特性を変化させて溝の境界を画成したナノトラックまたはナノレーン内で細長く引き伸ばされたＤＮＡ分子とを例示したものである。
【図１０】図１０は、ナノチャネル装置内で細長く引き伸ばされた巨大分子を例示した図であり、この場合、キャップ材料は、前記巨大分子と相互作用可能な薬剤に対し透過性で、前記巨大分子はナノチャネル内に滞留する−このような透過性キャップを使用すると、ナノチャネルを薬剤で前処理し、前処理済みのナノチャネルに進入した前記巨大分子が前記薬剤と相互作用するようにもできる。
【図１１】図１１は、ナノチャネルネットワークの種々の構成を例示した図であり、ナノチャネルが互いに液体流通可能なネットワークや、ナノチャネルが互いに平行に設けられたネットワークなどを図示している。
【図１２Ａ】図１２Ａは、種々のサイズのＤＮＡフラグメントを例示した図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａで四角で囲まれたＤＮＡ断片を拡大した図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、図１２Ａおよび図１２Ｂの前記四角で囲まれたＤＮＡ断片の位置の関数として画像強度を示した図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、長さの異なるいくつかの標識したＤＮＡ断片を示した図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３ＡのＤＮＡ断片の位置の関数として画像強度を示した図である。
【図１４】図１４は、本明細書に開示したナノチャネル装置および方法に関する２つの応用を示した図である−図１４の左側のパネルでは、当該ナノチャネル装置を使った巨大分子集団の特徴付けを示しており、この特徴付けには、当該集団の分子サイズ分布、または当該集団に含まれる特定のバイオマーカーの濃度を含めることができ、図１４の右側のパネルでは、当該ナノチャネル装置を使った個々の分子の特徴付けを示しており、この特徴付けには、個々の分子サイズと、単一分子におけるバイオマーカーの空間的位置とが含まれる。
【図１５】図１５は代表的なナノチャネル装置の概略図であり、そのうち（Ａ）は試料供給口を示し、（Ｂ）は当該装置上に設けられたナノチャネルを示し、（Ｃ）は前記ナノチャネルを流通してきた試料を受容する廃棄領域を示し、（Ｄ）は当該ナノチャネル装置の外部にある他の装置や機器などと電気的な接続または他の接続を形成することのできる構造を示している。
【図１６】図１６は、プラスチックハウジングに嵌合するナノチャネル装置の概略図であり、前記プラスチックハウジングには、前記ナノチャネル装置と、その外部の他の装置とのインターフェース用に位置合わせされた１若しくはそれ以上の接続部が含まれる−図１６は、ナノチャネルアレイの概略図も示しており、これらのナノチャネルは、マイクロ流体と、柱状構造体（ピラー）セットとのインターフェースとなり、前記柱状構造体は、１若しくはそれ以上の巨大分子を、当該巨大分子が当該ナノチャネルに入る前に、少なくとも部分的に線状化することができる。
【図１７】図１７および１８は、荷電領域および非荷電領域を有した表面上に形成されたパターンの顕微鏡画像であり、前記荷電領域は、指示粉末でマーク（標識）されている。
【図１８】図１７および１８は、荷電領域および非荷電領域を有した表面上に形成されたパターンの顕微鏡画像であり、前記荷電領域は、指示粉末でマーク（標識）されている。
【図１９】図１９はナノチャネルアレイを示した図であり、この場合、巨大分子は、前記巨大分子の供給口または注入口で当該巨大分子を固定するよう作用するビーズを含む−これらのビーズは、当該ナノチャネルの供給口を閉塞するようサイズ調整される。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、本開示の一部を形成する添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することで、より容易に理解されるであろう。本発明は本明細書に説明し示す具体的な装置、方法、応用、条件、またはパラメータに限定されず、また本明細書で使用する用語は単に例をとって特定の実施形態を説明するためものであり本明細書の特許請求の範囲に記載された発明を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。また、添付の請求項を含む本明細書において単数形扱いしている名称は、別段の断りがない限り、複数形も包含し、特定の数値に言及している場合は、別段の断わりがない限り、少なくともその特定の値が包含される。本明細書における用語「複数」は、１より大きいことをいう。ある範囲で値を表現している場合、異なる別の実施形態は、特定の１つの値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、直前に「約」、「ほぼ」、「おおよそ」などを伴う近似値として値を表している場合、その特定の値は、本発明の範囲内で別の実施形態を形成することが理解されるであろう。すべての範囲は、包括的で組み合わせ自在である。
【００３２】
本明細書において明瞭化のため別個の実施形態の文脈で説明している本発明の特定の特徴は、組み合わせて単一の実施形態でも提供できることを理解すべきである。逆に、簡略化のため単一の実施形態の文脈で説明している本発明の種々の特徴も、別個にまた任意のサブコンビネーションで提供可能である。さらに、範囲として値に言及している場合は、その範囲内のすべての個々の値が含まれる。
【００３３】
用語
本明細書における用語「チャネル」または「流路」とは、境界（ボーダー）により画成される領域をいう。そのような境界は、物理的、電気的、化学的、磁気的なものなどであってよい。用語「ナノチャネル」は、特定の流路が、特定の寸法についてナノスケールのものと見なされることを明瞭化するため使用される。
【００３４】
本明細書における用語「生体分子」とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、タンパク質、および生体由来の他の分子をいう。
【００３５】
これまで、直径２００ｎｍ未満のナノチャネルは、二本鎖ＤＮＡ分子を線状化して分子が曲がった状態に戻るのを防ぎ、自由溶液中で通常見られる自然なガウス分布のコイル構造になってしまうのを完全に防止することが示されている（Ｃａｏら、ＡＰＬ、２００２年ａ）。このような立体配座の制約（束縛）は、単一分子ＤＮＡ解析の理想的な手段である（Ｃａｏら、ＡＰＬ、２００２年ｂ）。ナノチャネルは、通常、数百キロベース〜メガベースのサイズ範囲の断片を線状化することが示されている（Ｔｅｇｅｎｆｅｌｄｔら、ＰＮＡＳ、２００４年）。さらに、ナノスケール環境での流体流れの性質により、乱流が妨げられ、通常であれば長いＤＮＡ分子を断片化する剪断力の多くも排除される。これは、直鎖状巨大分子の解析、特に特異的プローブまたは非特異的バーコード標識方式によるゲノム構造パターン変化の分子解析、そしてＣｐＧアイランドクラスターのエピゲノムバイオマーカーなど目的特性の分子解析において、特に有益である。
【００３６】
これらの好適な特徴により、さらに、断片化またはサブクローニングを行わず元のままの状態の天然ＤＮＡを使って長い範囲の直鎖状配列を決定できる可能性が生まれる。また、３０ｃｍもの長さの並行な若しくは互いに入り混じったナノチャネルを、数万チャネル（流路）／ｃｍを超える密度で作製できるため、リード（読み枠）長または能力の制限もない。何より、適切に制御された製作または自己組織化（自己集合）アプローチで作製された密閉型または非密閉型のナノチャネルに、ゲノムＤＮＡなどのポリマー（高分子）を閉じ込め線状化すると、最終的に、単一分子レベルでのポリマー定量測定を非常に望ましい態様で標準化できるようになる。
【００３７】
ナノチャネルは、アスペクト比（長さ／直径）が高い点で、アスペクト比が非常に低いナノ細孔と異なる。通常、ナノ細孔は直径０．５〜１００ｎｍだが、長さはわずか数ｎｍである。ナノチャネルは、直径は同程度でも、長さは少なくとも１０ｎｍある。
【００３８】
ナノチャネルの有効径は、ナノチャネル内にあるポリマー部分を確実に完全またはほぼ完全に線状化できるよう、解析対象ポリマーの回転半径及び持続長から決定される。半屈曲性ポリマー鎖は、自由溶液中で集まってランダムコイルとなり、その回転半径はＲｇ＝（Ｌｐ／６）１／２と定義される。ここで、Ｌはポリマー鎖の全長の計算値、ｐはポリマー鎖の持続長である。長さ１６．５ミクロンで持続長約５００のλ−ＤＮＡセグメントの回転半径は、約７３４ｎｍとなる（Ｃｈｅｎら「Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ」（作製されたナノ細孔を使った単一ＤＮＡ分子輸送のプロービング）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４、４、１１、２２９３−２２９８）。４６８１塩基対の二本鎖ＤＮＡ断片の回転半径は、約２８０ｎｍである（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｂｅａｄｓ」（プロテオミクスで使用すべき、金ナノビーズを使った新規性のある方法の開発における進歩）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｊｏｒｇ  Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ他編、Ｐｒｏｃ．  ｏｆ  ＳＰＩＥ  Ｖｏｌ．６０９２、６０９２Ｃ（２００６年））。そのため、ナノチャネルは、解析するポリマーコイルの回転半径の２倍より小さい直径を有することができる。そのような寸法のナノチャネルは、変動する自由なポリマーコイルに対し、エントロピー力による閉じ込め（ｅｎｔｒｏｐｉｃ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）作用を及ぼし始め、当該ポリマーコイルを伸長させ、および／または線状化する。
【００３９】
ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片などの生体分子は長いポリマーであり、このサイズには、不均一な生体試料に関する重要な未知の情報が包含されていることが多い。電気泳動は、通常、アガロースやポリアクリルアミドなどのゲル中で、種々の分子量のポリマーが種々の移動度を有することに基づき、これらポリマーの分離に使用されている。その分離所要時間は、大きなポリマーフラグメント（断片）の場合、数時間または数日にもなる。本願では、その目的上、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、または他の単一分子などの生体分子を、巨大分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）と呼ぶ。
【００４０】
上述のとおり、寸法が十分小さく長いナノチャネルは、エントロピー力による閉じ込めによりこれらのポリマー鎖を線形状に細長く引き伸ばして、当該ポリマー鎖の個々の分子量に相関した見掛けの全長を定量的に解明できるようにする上で効果的である。
【００４１】
これは、遺伝毒性−１つまたは複数の特定化合物により生じた遺伝子損傷の決定−などの応用に特に重要であり、その場合、１若しくはそれ以上の重要な染色体ＤＮＡ断片のサイズおよび配列に、アポトーシスの段階および毒性刺激へのばく露レベルに関する重要な情報が含まれている。遺伝毒性試験は、医薬品について特に重要である。「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｓ２Ｂ  Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ａ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂａｔｔｅｒｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（産業界向け指針  Ｓ２Ｂ遺伝毒性：医薬品の遺伝毒性試験のための標準バッテリー）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ、１９９７年）を参照。医薬品の遺伝毒性試験では、（１）細菌の遺伝子突然変異に関する試験、（２）哺乳類細胞の染色体損傷について細胞発生に関する評価を行う生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験、または生体外マウスリンパ腫ＴＫアッセイ、および（３）げっ歯類の造血細胞を使った染色体損傷に関する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）試験を行うよう推奨される（上記文献を参照）。そのため、遺伝毒性試験を効率的に行う方法があれば、製薬産業でただちに応用することができる。
【００４２】
ＤＮＡ断片のサイズを決定すると、前記刺激により直接的または間接的に生じた因子が長いポリマーと相互作用する場所、または特異的な位置で特異的な条件に相関して損傷が起こる場所についてさらに詳しい情報が得られる。アポトーシス中には、染色体ＤＮＡがまず５０〜３００ｋｂｐｓサイズの断片へと分解されることが報告されている。それに続く分解段階の結果、各断片は１ｋｂｐ未満になる（Ｎａｇａｔａら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆ．２００３）。
【００４３】
毒性ゲノム学（トキシコゲノミクス）の分野では、環境中の毒素、放射線、または化学療法で使用される薬剤など毒性のある薬剤に誘発された染色体ＤＮＡ損傷を評価する際、細胞単一の電気泳動アッセイが一般的に使用されている。コメット解析と呼ばれる一般的アッセイでは、細胞をゲルマトリックス（基質）内に溶解したのち、ＤＮＡを電気泳動させ、蛍光色素で染色する。
【００４４】
電気泳動中、ＤＮＡ断片は、いわゆるコメットテイル（彗星状の尾）形状を生じた細胞から離れる方向へ遊走する。コメットテイルの幾何学的形状は、染色体ＤＮＡ内の二本鎖切断および一本鎖切断の数に関係するため、この情報から細胞の毒性薬剤へのばく露について半定量的な測度（指標）が得られる。この技術は、その定義どおり単一細胞解析を行えるが、標準化が難しく、データは解釈に左右されやすい。また、染色体ＤＮＡの断片は絡み合ったままであるため互いに区別できず、個々の断片の切断位置またはサイズに関する有益な情報が得られない。
【００４５】
最後に、もう１つの重要な分野は、放射線に起因したＤＮＡ損傷の評価である。過失により各種形態の放射線にばく露（被ばく）するケースとは別に、癌患者の半数以上が何らかの時点で放射線治療を受ける。殺腫瘍効果を最大に保ちながら副作用を最小限に抑えるよう正しい放射線量を決定することは、困難な課題である。一般的な放射線治療計画の治療回数は３０であるが、現行の治療計画は、基本的にいわゆる「平均的」患者の最適治療データに基づいて開始時に設定され、個々の患者に適したものでない可能性がある。放射線腫瘍学分野では、新たな診断および治療法を見出して、放射線治療を個別化医療用に最適化することが最優先課題である。
【００４６】
分子レベルにおいて、放射線治療は、本質的に腫瘍細胞のＤＮＡを破壊して腫瘍細胞を殺す。この遺伝子損傷を、有益なフィードバックを医師に提供する態様で検出できれば、その後の治療を調整する上で役立つ。現行の放射線量測定アッセイにおいて、ばく露後のゲノム損傷および細胞生存率は、腫瘍または周囲の正常細胞の内部で何が起こっているかについては直接的な定量的情報なく、比較的長時間を要する低速な態様でアッセイされることが多い。
【００４７】
放射線治療に適用する場合、ナノチャネルアレイに基づく装置は、物理的にゲノムＤＮＡ試料の自然なコイル構造をほぐして直鎖状の形態にし、断片化による損傷の度合いなどの集団特性を分析することができる。この方法では、腫瘍およびその周囲の組織から採取されたＤＮＡ試料の完全性の変化を監視し、瞬時に損傷を定量化して「機能的」腫瘍情報を得ることにより、より適切に治療法を修正できる。
【００４８】
本発明の一態様では、細長く引き伸ばされた単一巨大分子を操作することのできるナノ流体装置を提供し、このナノ流体装置は、表面と当該表面に実質的に平行に設けられた１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントとを有する基板であって、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、当該流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部の内部に、巨大分子の少なくとも一部を滞留させて含んで、これを細長く引き伸ばすことができ、各前記流体ナノチャネルセグメントは、特徴的断面寸法が約１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも約１０ｎｍである、基板と、前記１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントの内容物の少なくとも一部を光学検査できるようにする少なくとも１つの観察窓とを有する。
【００４９】
一部の実施形態では、図１１に示すように、前記流体ナノチャネルセグメントが流体的に相互接続されず、場合により本質的に互いに平行に設けられる。
【００５０】
他の実施形態では、これも図１１に示すように、前記流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部が、流体的に相互接続される。これらのうち、いくつかの実施形態では、流体的に相互接続された流体ナノチャネルセグメントが、分岐パターンまたはグリッドパターンで設けられる。当業者に公知の自己組織化技術を使うと、特定パターンのナノチャネルを実現することができる。
【００５１】
前記１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントは、場合により湾曲した形態または蛇行した形態であってよく、あるいは断面寸法が変化してもよい。すべてのナノチャネルは、断面寸法が同等と考えられ、場合により、流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つが、別の流体ナノチャネルセグメントの断面寸法と異なる断面寸法を有することが考えられる。
【００５２】
また、図１１のように、ナノチャネルセグメントを相互接続し、場合により断面を変化させる可能性も考えられる。
【００５３】
本発明に適した基板には、金属、セラミック、ポリマー、ガラス、シリコン、半導体、プラスチック、誘電体、ＳｉＧｅ、ＧａＡｓ、ＩＴＯ、溶融石英などがある。最適な基板は、利用者の必要性により決定される。
【００５４】
適切な流体ナノチャネルセグメントは、約５００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、または場合により約５０ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約２ｎｍ未満、あるいは約０．５ｎｍ未満の特徴的断面寸法を有する。
【００５５】
流体ナノチャネルセグメントは、巨大分子の回転半径の約２倍未満の特徴的断面寸法を適切に有する。一部の実施形態では、ナノチャネルが、少なくとも巨大分子の持続長にほぼ等しい特徴的断面寸法を有する。
【００５６】
本発明に適した流体ナノチャネルセグメントは、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、少なくとも約１０００ｎｍ、少なくとも約２μｍ、少なくとも約５μｍ、少なくとも約１０μｍ、または場合により少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍの長さを有する。流体ナノチャネルセグメントは、一部の実施形態において、１立方センチメートルにつき少なくとも１流体ナノチャネルセグメントの密度で設けられる。
【００５７】
本発明の観察窓は、スリット、円形、方形、またはこれらの任意の組み合わせを有することができる。一部の構成では、観察窓が着脱可能（取り外し可能）または透過性である（図１０を参照）。透過性の窓は、１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントの内容物を、当該流体ナノチャネルセグメントの外部にある環境と適切に流体的に流通させることができる。
【００５８】
図９Ａおよび図９Ｂに示すように、流体ナノチャネルセグメントは、溝として特徴付けることができ、一部の装置は、少なくとも１つの溝の少なくとも一部を覆うことのできるキャップを有する。図６を参照。一部の実施形態では、前記キャップの少なくとも一部がナノチャネルセグメント内に滞留した巨大分子と相互作用できる可溶性の被分析物に対し透過性であり（図１０）、または着脱可能であり、あるいは場合により光透過性である。一部の実施形態では、１若しくはそれ以上の巨大分子が、流体ナノチャネルセグメント内で少なくとも部分的に細長く引き伸ばされ、前記キャップがはずされた後も実質的に伸長された形態に保たれる。図６Ｂを参照。
【００５９】
他の実施形態では（図１）、流体ナノチャネルセグメントは、トンネルとして特徴付けられ、場合により表面（界面）化学反応を生じる１若しくはそれ以上の領域により境界をなすゾーンとして特徴付けることができる。図９Ｂを参照。適切な表面化学反応を生じる物質としては、疎水性種、親水性種、界面活性剤、チオール、アミン、ヒドロキシル、アルコール、カルボニル、シランなどがある。表面化学反応を生じる他の物質については、本明細書の他の部分で説明している。
【００６０】
１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントは、導管、ポンプ、フィルター、スクリーン、閉鎖部、ゲル、ヒーター、スプリッタ、リザーバといった１若しくはそれ以上の流体装置と液体流通可能であることが考えられる。
【００６１】
当該装置での使用に適した巨大分子には、ポリマー、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、生体分子、タンパク質などがある。適切なポリマーには、単独重合体（ホモポリマー）、共重合体（コポリマー）、ブロック共重合体、ランダム共重合体、分岐共重合体、デンドリマー、またはこれらの任意の組み合わせなどがある。
【００６２】
本装置には、特定の実施形態において、当該装置の外部にある１若しくはそれ以上の機器と当該装置とを液体流通可能にできる１若しくはそれ以上のコネクタが含まれる。適切な機器には、ポンプ、導管、フィルター、スクリーン、ゲル、ヒーター、閉鎖部、スプリッタ、リザーバ、またはこれらの任意の組み合わせなどがある。
【００６３】
また、本明細書では、ナノ流体装置を使って１若しくはそれ以上の巨大分子を特徴付ける方法も開示しており、この方法は、基板の表面と実質的に平行に設けられた流体ナノチャネルセグメントにより、これを通過する前記巨大分子の少なくとも１つの領域の少なくとも一部を転座させる工程であって、前記流体ナノチャネルセグメントは、前記巨大分子の１つの領域の少なくとも一部を含んで、これを細長く引き伸ばすことができ、前記流体ナノチャネルセグメントは、特徴的断面寸法が約１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも約１０ｎｍである、前記巨大分子の少なくとも１つの領域の少なくとも一部を転座させる工程と、前記流体ナノチャネルセグメントの内容物の少なくとも一部を光学検査できるようにする観察窓を介して、前記ナノチャネル内を通過する前記巨大分子の１若しくはそれ以上の領域の転座に関する１若しくはそれ以上の信号（シグナル）を監視する工程と、前記監視された信号と、前記巨大分子の１若しくはそれ以上の特性との相関を求める工程とを有する。
【００６４】
本明細書の特許請求の範囲に記載された方法としては、少なくとも１つの生物学的実体を、目的とする１つまたは複数の薬剤、そのような薬剤の代謝産物、および当該薬剤の塩などにばく露させる工程も含めることができる。薬剤としては、色素、標識、タンパク質、酵素、プローブ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびこれらと同様な種などがある。
【００６５】
ばく露は、前記薬剤を注入し、処理し、スプレー（噴霧）し、トランスフェクションし、分解し、浸漬し、流入させ、または塗布することにより実施される。一例として、細胞は、色素剤を含む培地で一定時間培養することにより、当該色素剤にばく露させることができる。
【００６６】
本明細書の特許請求の範囲に記載された方法を適切に実施できる対象としての生物学的実体は、細胞に限定されるものではなく、そのような実体には、生物、生体分子、タンパク質なども含まれる。また、そのような実体の構成要素にも、本明細書の特許請求の範囲に含まれる実体に含まれる。
【００６７】
また、一部の実施形態では、前記方法に、前記生物学的実体から１若しくはそれ以上の巨大分子を単離する工程も含まれる。この単離工程は、当業者に公知の手段により実施できる。そのような手段の非限定的なリストには、例えば抽出、溶解、精製、引張り、操作、反応、蒸留、電気泳動が含まれる。
【００６８】
種々の巨大分子には、本明細書の特許請求の範囲に記載された方法を適切に実施できる。これらの巨大分子には、タンパク質、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）などがある。ポリマーその他の鎖構造分子も、本明細書の特許請求の範囲に記載された方法で適切に使用できる。
【００６９】
また、当該方法に使用される巨大分子は、１若しくはそれ以上の巨大分子を２若しくはそれ以上のセグメントに分割したものであってよい。一部のケースでは、これにより、前記巨大分子をより効率的に処理または保管できるようになる。
【００７０】
巨大分子の分割は、レージング、超音波処理、化学的な処理、物理的な操作、生物学的な処理、溶解、束縛・制限などにより実施する。当業者であれば、所与の巨大分子を分割し、あるいはセグメント化または短縮する上で適した方法が認識されるであろう。
【００７１】
当該方法には、さらに、蛍光標識、放射性標識、磁気標識、またはこれらの任意の組み合わせを、前記巨大分子の１若しくはそれ以上の領域に結合させる工程が含まれる。この結合工程は、前記標識が、巨大分子、巨大分子の少なくとも一部、または他の関心領域に対し特異的に相補的な場合に行える。
【００７２】
転座工程には、流体の流れ、磁場、電場、放射場、機械的な力、電気浸透力、電気泳動力、界面動電力、温度勾配、圧力勾配、表面特性勾配、毛細管流、またはこれらの任意の組み合わせを適用する工程が含まれる。転座工程には、前記巨大分子の少なくとも一部を、流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部の内部に制御可能に移動させる工程、または制御されたスピードで、制御された方向へ、前記巨大分子の少なくとも一部を移動させて、流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部を通過させる工程を含めることが考えられる。
【００７３】
監視工程には表示工程、解析工程、プロット工程、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。信号を監視する方法については、当業者であれば明確に理解されるであろう。
【００７４】
前記監視される１若しくはそれ以上の信号には、光信号、放射信号、蛍光信号、電気信号、磁気信号、化学信号、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００７５】
特定の実施形態において、信号は、電子スピン共鳴する分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位元素、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、帯電した移動分子、半導体ナノ結晶、半導体ナノ粒子、コロイド金ナノ結晶、リガンド、マイクロビーズ、磁気ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、発色基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、脂質、またはこれらの任意の組み合わせにより生じるものである。
【００７６】
一部の実施形態において、前記分子は標識されず、赤外分光法、紫外分光法、またはこれらの任意の組み合わせにより監視されるものである。
【００７７】
前記信号は、蛍光、化学発光、リン光、生物発光、またはこれらの任意の組み合わせを誘導する１若しくはそれ以上の励起源を使って生成されるものである。適切な励起源には、レーザー、可視光源、赤外光源、紫外光源、またはこれらの任意の組み合わせなどがある。
【００７８】
前記相関を求める工程は、流体ナノチャネルセグメント内で巨大分子の一部または全部を細長く引き伸ばすことにより、当該巨大分子を巨大分子の集団から明確に区別できるようにし、当該明確に区別できる巨大分子またはその一部の特徴を決定する工程を有する。一部の実施形態において、前記巨大分子の少なくとも一部は、前記監視工程中、静止している。
【００７９】
一部の場合、前記巨大分子の少なくとも一部は、前記流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部内で、１回を超えて転座されることが考えられる。そのような転座により、所与の巨大分子の同じ領域について、多重（複合）解析が可能になる。
【００８０】
前記相関を求める工程には、前記巨大分子の少なくとも一部の長さを決定する工程と、１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメント内に閉じ込められた前記巨大分子の少なくとも一部の、部分的に細長く引き伸ばされた見掛けの長さを決定する工程とが適切に含まれる。前記部分的に細長く引き伸ばされた見掛けの長さは、部分的に細長く引き伸ばされた巨大分子を閉じ込めている前記流体ナノチャネルセグメントに沿った直線的な距離として決定される。
【００８１】
また、前記相関を求める工程は、前記巨大分子の１若しくはそれ以上の構成要素を識別（同定）する工程と、前記巨大分子の少なくとも一部の１つ以上の修飾の有無を決定する工程とを含むことが考えられる。 .
前記相関を求める工程は、自動化された手段、コンピュータ制御された手段、機械的な手段、手動手段、またはこれらの任意の組み合わせにより行われる。前記相関を求める工程は、前記ナノチャネルの検出領域で観測された信号変調に基づき、二本鎖核酸分子を特徴付けるアルゴリズムを含み、当該アルゴリズムは、コンピュータ可読媒体上に存在するものである。
【００８２】
前記巨大分子の前記１若しくはそれ以上の特性は、当該巨大分子の少なくとも一部に存在する１若しくはそれ以上の標的特徴であると考えられる。適切な標的特徴としては、メチル化パターンなどのエピジェネティック（後成的）因子が含まれる。
【００８３】
また、標的特徴としては、１若しくはそれ以上の特定の分子配列、ＳＮＰ（一塩基多型）、ハプロタイプ、反復配列、コピー数多型、ＤＮＡ分子の１若しくはそれ以上の遺伝子座の変化、オープンリーディングフレーム（読み枠）、イントロン、エクソン、調節因子、またはこれらの任意の組み合わせの位置を含む１若しくはそれ以上のゲノム構造などがある。さらに、標的特徴としては、化合物／薬物の結合部位／複合体、ＤＮＡ修復または切断の結合部位／複合体、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスヌクレオチドの結合部位／複合体、転写／調節因子の結合部位／複合体、制限酵素の結合／切断部位／複合体、または遺伝子操作され若しくは化学修飾された他のすべての結合部位／複合体、またはこれらの任意の組み合わせなども含まれる。
【００８４】
本方法には、一部の実施形態において、さらに、既知の長さＬ１の第１の標識したプローブと、既知の長さＬ２の第２の標識したプローブとに巨大分子を接触させる工程であって、前記第１の標識したプローブは、コピー数がわかっている対照ゲノム配列に対し相補的であり、前記第２の標識したプローブは、目的ヌクレオチド配列に対し特異的である、工程と、前記流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部内に前記巨大分子を導入する工程と、前記流体ナノチャネルセグメント内で、前記標識した巨大分子を細長く引き伸ばす工程と、前記第１の標識したプローブおよび前記ゲノム対照配列の結合と、前記第２の標識したプローブおよび前記目的ヌクレオチド配列の結合とを検出する工程と、前記第１の標識したプローブに対応するハイブリダイゼーション信号の全長（Ｓ１）と、前記第２の標識したプローブに対応するハイブリダイゼーション信号の全長（Ｓ２）を確定する工程とを含めることができる。
【００８５】
本方法には、さらに、前記目的ヌクレオチド配列のコピー数を計算する工程が含まれる。前記コピー数は、比Ｎ１＝Ｓ１／Ｌ１およびＮ２＝Ｓ２／Ｌ２を計算することにより算出され、ここで、Ｎ１は前記ゲノム対照配列のコピー数に対応し、Ｎ２は前記目的ヌクレオチド配列のコピー数に対応する。前記対照配列のコピー数は整数であり、またＮ２とＮ１との差は、解析対象であるゲノムの異常を示すことが考えられる。.
当該方法では、さらに、前記対照ゲノム配列が、ゲノムごとに全長がわかっている別個の部分を含むと考えられ、その場合、前記目的配列は、正常遺伝子ごとに長さがわかっている別個の部分を有し、Ｎ２とＮ１との有意な差は、前記ゲノムの遺伝子異常を示すことが考えられる。
【００８６】
一部の実施形態において、前記目的配列は、トリソミーに係る染色体に関するものであってよく、前記対照ゲノム配列は、前記トリソミーに係る染色体以外の染色体のものであり、比Ｎ２／Ｎ１が約１．５の場合はトリソミー遺伝子型を示す。他の実施形態において、前記目的ヌクレオチド配列は、ゲノムの一部の欠失を有する。さらに他の実施形態では、前記目的ヌクレオチド配列が、反復配列を有する。
【００８７】
本方法は、一部の態様において、前記対照ゲノム配列および前記目的ヌクレオチド配列が、所与のゲノムについて同一である実施形態を含み、その場合、１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメント内で、存在する各ゲノムの数量を決定するよう、１若しくはそれ以上の異なるゲノムが解析される。
【００８８】
前記比Ｎ２／Ｎ１は、２０％未満の統計誤差を有すると考えられる。
【００８９】
さらに、前記方法には、前記対照ゲノム配列および前記目的ヌクレオチド配列は、同じゲノムからのものである実施形態、または場合により、前記対照ゲノム配列は、前記目的ヌクレオチド配列と同じ染色体からのものである実施形態が含まれると考えられる。
【００９０】
本方法には、さらに、いわゆる隣接プローブ（フランキングプローブ）により、試料ヌクレオチドの複数領域を、目的ヌクレオチドゾーンの任意の一端において標識し、対照ヌクレオチドの複数領域を、目的ヌクレオチドゾーンの任意の一端において標識する工程を含めることができる。そのような実施形態では、前記方法に、（ａ）前記標識したヌクレオチドを少なくとも実質的に細長く引き伸ばす上で十分な断面直径を有する別個の流体ナノチャネルセグメント内に、前記標識したヌクレオチドを導入する工程と、（ｂ）前記試料ヌクレオチドの前記標識と、前記対照ヌクレオチドの前記標識との間の距離を決定する工程と、前記試料ヌクレオチドおよび前記対照ヌクレオチドをさらに線状化するよう、またこれらのヌクレオチドが伸長するに伴い、前記対照ヌクレオチド上の前記標識と前記試料ヌクレオチド上の前記標識との間の距離に関する追加情報を取得するよう、工程（ａ）および（ｂ）を１若しくはそれ以上の回数繰り返す工程とが含まれる。
【００９１】
これらの実施形態には、さらに、前記対照ヌクレオチドの前記標識と前記試料ヌクレオチドの前記標識との間の前記距離を比較することにより、前記試料ヌクレオチド上の前記目的ゾーンの長さを決定する工程が含まれ、その場合、前記対照ヌクレオチドの前記標識と前記試料ヌクレオチドの前記標識との間の前記距離間の差は、前記試料ヌクレオチド上の前記目的ゾーンの異常を示す。
【００９２】
さらに、装置であって、表面と当該表面に実質的に平行に設けられた１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントとを有する基板を有する装置が提供され、その場合、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、当該流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部の内部に、巨大分子の少なくとも一部を滞留させて含んで、これを細長く引き伸ばすことができ、各前記流体ナノチャネルセグメントは、特徴的断面寸法が約１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも約１０ｎｍであり、前記少なくとも１つの流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部は、１若しくはそれ以上の励起源の照射を受ける。
【００９３】
適切な流体ナノチャネルセグメントと、そのパターンおよび寸法については、本明細書の他の部分で説明している。適切な基板についても、本明細書の他の部分で説明している。
【００９４】
本装置は、一部の実施形態において、前記照射を受ける流体ナノチャネルセグメントと、前記光源との間に設けられた観察窓を含むことが考えられ、前記観察窓は、スリットを有し、また一部の実施形態では着脱可能（取り外し可能）である。また、前記観察窓は、１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントの内容物を、当該流体ナノチャネルセグメントの外部にある環境と流体的に流通させることができると考えられる。
【００９５】
前記流体ナノチャネルセグメントは、溝として特徴付けられ、当該溝については、本明細書の他の部分で説明している。そのような溝を覆う上で適したキャップについても、本明細書の他の部分で説明しており、１若しくはそれ以上の巨大分子は、前記流体ナノチャネルセグメント内で少なくとも部分的に細長く引き伸ばされ、前記キャップがはずされた後も実質的に伸長された形態に保たれると考えられる。
【００９６】
また、流体ナノチャネルは、表面（界面）化学反応を生じる１若しくはそれ以上の領域により境界をなすゾーンとして特徴付けられ、これら流体ナノチャネルについては、本明細書の他の部分で説明している。
【００９７】
前記１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントは、本明細書の他の部分で説明する１若しくはそれ以上の流体装置と液体流通可能であり、前記流体装置には、スクリーン、閉鎖部、ゲル、ヒーター、スプリッタ、リザーバ、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００９８】
一部の実施形態では、当該装置に、１若しくはそれ以上のナノチャネルに近接して位置する１若しくはそれ以上の障害物が含まれる。そのような障害物は、巨大分子が前記ナノチャネルに進入しやすくなるよう、巨大分子をアンフォールディングする、つまりほどく際に役立つ。
【００９９】
本発明での使用に適した巨大分子については、本明細書の他の部分で説明している。他の部分で説明したように、前記装置には、当該装置の外部にある１若しくはそれ以上の機器と当該装置とを液体流通可能にできる１若しくはそれ以上のコネクタを含めることができる。適切な機器については、本明細書の他の部分で説明している。
【０１００】
前記装置での使用に適した励起源には、レーザー、ハロゲン光、水銀灯、赤外光源、紫外光源、ダイオード、導波路、放射線源、またはこれらの任意の組み合わせなどがある。装置には、さらに、励起源光のスペクトルを送信することのできる１若しくはそれ以上のフィルターを含めることができる。
【０１０１】
前記１若しくはそれ以上の励起源の照射を受ける、前記少なくとも１つの流体ナノチャネルセグメントの前記少なくとも一部は、１若しくはそれ以上のスリットとして特徴付けられ、または１若しくはそれ以上の円形スポット、オーバル、多角形、またはこれらの任意の組み合わせとして特徴付けられる。
【０１０２】
適切な励起源は、少なくとも１つの流体ナノチャネルセグメントを、その少なくとも一部にわたり走査することができる。一部の実施形態では、前記装置に、１若しくはそれ以上の励起源が含まれる。
【０１０３】
この装置には、１若しくはそれ以上の照射を受けた流体ナノチャネルセグメント内から発せられた光信号を受信することができるよう設けられた検出器が適切に含まれる。
【０１０４】
適切な検出器は、電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ、略称ＣＣＤ）検出システム、相補型金属酸化膜半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ−ｏｘｉｄｅ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、略称ＣＭＯＳ）検出システム、フォトダイオード検出システム、光電子増倍管検出システム、シンチレーション検出システム、フォトンカウンティング（光子計数）検出システム、電子スピン共鳴検出システム、蛍光検出システム、光子検出システム、電気的な検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、略称ＡＦＭ）検出システム、走査型トンネリング顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、略称ＳＴＭ）検出システム、走査型電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ）検出システム、光学的な検出システム、核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、略称ＮＭＲ）検出システム、近接場検出システム、全内部反射（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ、略称ＴＩＲ）検出システム、パッチクランプ検出システム、静電容量検出システム、またはこれらの任意の組み合わせなどである。
【０１０５】
また、本明細書では巨大分子解析装置も開示している。本明細書に開示する装置には、表面上に設けられた１若しくはそれ以上のナノチャネルが含まれ、当該ナノチャネルのうち１若しくはそれ以上は、約１０００ｎｍ未満の幅を有し、当該ナノチャネルのうち１若しくはそれ以上は、１若しくはそれ以上の境界（ボーダー）により画成され、前記巨大分子の少なくとも一部を直鎖状の形態に保持するよう、当該巨大分子の当該一部を制約（束縛）することができる。
【０１０６】
ナノチャネルは、約１０ｎｍ〜約１０ｃｍ範囲、または約１００ｎｍ〜約１ｃｍ範囲の長さを適切に有する。ナノチャネルは、直線状であり、互いに平行であり、相互接続されており、湾曲しており、または曲がっていてもよいが、本発明のナノチャネルは、長さ約１０ｎｍ〜約１００ｃｍ、または長さ約１００ｎｍ〜約１０ｃｍ、あるいは場合により長さ約１ｍｍ〜約１ｃｍの本質的に直線状の部分を少なくとも１つ適切に含む。その例として、本明細書の特許請求の範囲に記載された発明には、ナノチャネルが表面上に折り畳まれたラジエータータイプのパターンで構成される実施形態が含まれる。
【０１０７】
ナノチャネルの幅は、適切に１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、または５０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、前記ナノチャネルが約１０ｎｍ未満、または場合により約５ｎｍ未満の幅を適切に有する。
【０１０８】
上記のように、本発明に係る２若しくはそれ以上のナノチャネルは、相互接続することができる。ナノチャネルは、一定の断面、または利用者の必要性に応じて変化する断面を有することができる。
【０１０９】
本発明のナノチャネルを画成する境界（ボーダー）は、種々の構成を有する。適切な境界（ボーダー）は、物理的な壁やリッジなどであってよい。あるいは、境界（ボーダー）には、荷電領域、化学的に処理した領域、磁場領域などがある。疎水性および親水性の領域は、特に適切な境界（ボーダー）と考えられる。場合により、境界（ボーダー）は、ガラス、プラスチック、ポリマー、または金属のストリップ（帯状体）など異なる材料から形成される。他の実施形態において、境界（ボーダー）は、自己組織化単分子膜（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ、略称ＳＡＭ）により形成される。他の実施形態において、前記ナノチャネルは逆構造となり、ばく露する表面が、当該ナノチャネルの境界（ボーダー）を画成し、この境界を成す露出面と当該チャネルの中央経路は定性的に異なるものになる。ナノチャネルは、巨大分子の少なくとも一部を適切に閉じ込めて、当該巨大分子の当該一部を細長く引き伸ばすことができる。例えば、親水性の巨大分子は、疎水性の境界（ボーダー）を成したナノチャネル内に配置すると、細長く引き伸ばすことができる。この例において、前記巨大分子は、前記境界（ボーダー）に制約（束縛）され、細長く引き伸ばされる。
【０１１０】
本明細書に開示する装置に適した表面としては、ガラス、セラミック、シリコン、金属、ポリマーなどがある。表面は、利用者の必要性に応じて選択されることになり、当業者であれば、そのような表面上に境界（ボーダー）領域を画成する上で必要な種々の化学処理または他の処理に合わせて特定の表面を最適に変更できることが明確に理解されるであろう。
【０１１１】
本明細書の特許請求の範囲に記載された装置には、少なくとも１つの前記ナノチャネルの少なくとも一部の上位に設けられた観察窓も含まれる。そのような観察窓は、１若しくはそれ以上の巨大分子に対し透過性のものとすることができる。その例として、観察窓には、１若しくはそれ以上の細孔、穴、チャネル（流路）またはナノチャネルを含めることができ、そのいずれによっても、巨大分子は、本明細書の特許請求の範囲に記載された装置内で３次元方向に動くことができるようになる。そのような３次元構成では、巨大分子を複数の方向へ導入および経路誘導することができ、一部の実施形態では、本明細書の特許請求の範囲に記載された装置内で巨大分子の複数領域を同時に観察できるようになる。
【０１１２】
本明細書に開示する発明には、検出器も含まれる。そのような検出器は、本明細書の特許請求の範囲に記載された装置内の分子から生じる信号を適切に監視または捕捉することができ、当該検出器としては、ＣＣＤカメラまたはフォトンカウンティング（光子計数）装置などがある。
【０１１３】
本明細書の特許請求の範囲に記載された発明は、巨大分子を解析する方法も提供する。この方法には、巨大分子の少なくとも一部を直鎖状の形態に保持するよう制約（束縛）することのできる１若しくはそれ以上のナノチャネルを有する表面上に、１若しくはそれ以上の当該巨大分子を配置する工程と、１若しくはそれ以上のナノチャネル内で１若しくはそれ以上の巨大分子の少なくとも一部を細長く引き伸ばすよう、前記１若しくはそれ以上の巨大分子に駆動力を与える工程と、前記巨大分子のうち１若しくはそれ以上から生じる１若しくはそれ以上の信号を監視する工程とが含まれる。
【０１１４】
巨大分子は、分注工程、滴下工程、流入工程などにより、表面上に適切に配置される。巨大分子は、当該巨大分子の前記表面上への配置に役立つ水や緩衝液などの流体に含まれて適切に搬送される。その搬送流体は、利用者の必要性に基づき選択され、適切な搬送流体については当業者に知られている。
【０１１５】
一部の実施形態において、１若しくはそれ以上の巨大分子は、その少なくとも一部が、１若しくはそれ以上のナノチャネル内に配置される。
【０１１６】
適切な駆動力源としては、圧力勾配、磁場、電場、後退するメニスカス、表面張力、熱勾配、引張力、押圧力などがある。巨大分子に力を加えるための他の態様には、光トラップ、光ピンセット、物理的プローブ、原子間力顕微鏡などがあり、これらは当業者であれば公知のものである。駆動力は、一定のもの、可変のもの、二値的状態を交互に繰り返すものであってよく、駆動力の周波数および強度は、利用者の必要性に応じて異なる。
【０１１７】
一部の実施形態では、１若しくはそれ以上の巨大分子が、解析用に前記表面に繋留される。繋留は、ビオチン−アビジン結合、金およびチオ基の相互作用、抗体−抗原相互作用、および抗体−エピトープの相互作用により実現できる。当業者であれば、表面に分子を繋留する適切な方法が理解できるであろう。
【０１１８】
他の実施形態では、動的な力により、巨大分子が少なくとも部分的に固定される。例えば、巨大分子の一端には、特定のナノチャネルの断面より大きい直径を有するビーズを含めることができる。そのような巨大分子に流体の流れを適用すると、巨大分子のビーズが前記ナノチャネル内に進入できないため、当該巨大分子は、ビーズ側の一端が前記ナノチャネル進入側の端部で固定され、前記ナノチャネルの少なくとも一部の中で長く伸びた状態になる。このような実施形態では、流体の流れ場の方向を逆転させるなどして上記と反対方向の駆動力を適用すると、前記巨大分子を前記ナノチャネルから放出（リリース）できる。磁場および電場も、ナノチャネル内に巨大分子を固定する上で適切に使用され、これらの場は容易に反転して、固定された巨大分子を開放することができる。このような方法では、所与のナノチャネルセットを再利用して所与の巨大分子を何度も解析し、またはリサイクルして異なる巨大分子または巨大分子のセットを解析することが可能である。
【０１１９】
巨大分子から生じる信号の監視は、特に当該信号を記録、プロット、または表示することにより行われ、監視される信号は、ナノチャネル内で実質的に直鎖状の形態になっている巨大分子の一部から適切に得られる。前記監視は、観察窓を介して行い、または１若しくはそれ以上の巨大分子を直接測定して行うことができる。
【０１２０】
本明細書に開示する方法には、生じた信号を解析する工程も含まれ、その解析には、１若しくはそれ以上の監視された信号と、１若しくはそれ以上の巨大分子の１若しくはそれ以上の特性との相関を求める工程が適切に含まれる。相関を求める工程には、例えば特定の信号の存在を、ＤＮＡセグメントにおける特定の突然変異の存在に関係付ける工程を含めることができる。
【０１２１】
また、本発明では、巨大分子解析装置を製作する方法も提供される。これらの方法には、２若しくはそれ以上の境界（ボーダー）の配設により、１若しくはそれ以上のナノチャネルを表面上に画成する工程が含まれ、その場合、前記境界（ボーダー）のうち１若しくはそれ以上は、巨大分子を制約（束縛）することができ、前記ナノチャネルのうち１若しくはそれ以上は、約１０００ｎｍ未満の幅を有する。
【０１２２】
本方法で形成されるナノチャネルは、５００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、または場合により１０ｎｍ未満の幅を有することができる。最適なナノチャネル幅は、利用者の必要性および試験対象である巨大分子により決定される。
【０１２３】
境界（ボーダー）の配設は、特に、前記表面の少なくとも一部を帯電させる工程、前記表面の少なくとも一部を疎水化させる工程、前記表面の少なくとも一部を親水化させる工程、前記表面の少なくとも一部を磁化させる工程、またはこれらの任意の組み合わせにより行われる。一実施形態において、境界（ボーダー）の配設は、望ましいパターンの境界またはナノチャネルに対し相補的な表面形状を有する表面形状を有した型（モールド）に、前記表面の少なくとも一部を接触させる工程により行われる。本発明に適した型は、１若しくはそれ以上のナノスケール特徴（形状）を有し、当業者に公知の方法で作製できる。
【０１２４】
例示的な実施形態の１つを図９Ｂに示しており、この図では、表面Ｂ−疎水性の表面であってよい−と、表面Ｂとは異なる親水性または他の表面であってよい表面Ａとの境界（ボーダー）により画成されたナノチャネルまたはナノレーン（ｎａｎｏｌａｎｅ）を例示している。また、上記と同様な境界（ボーダー）を使用すると、図７に示したものなど、より複雑なナノチャネルパターンを画成することもできる。
【０１２５】
例えば、ナノチャネルを有した型（モールド）または他の基板を、疎水性の化合物に接触させることができる。次いでその型を親水性の表面に接触させて、境界（ボーダー）として作用する疎水性のパッチを当該表面上に残し、前記型上のナノチャネルパターンに対応したナノチャネルを当該表面上に画成する。型または他のパターンを使用すると、荷電領域または磁場領域をもたらすこともできる。これは特に、荷電種、疎水性種、親水性種、磁性種、強磁性種、またはこれらの任意の組み合わせに前記型を接触させることにより達成される。図１７および図１８には例示的なパターンを示しており、これらのパターンは、基板上に荷電領域を配置し、荷電領域に結合する指示粉末を当該基板の上方から散布して当該荷電領域を強調（ハイライト）し、結合しなかった粉末を取り除くことにより作製されたものである。
【０１２６】
実施例および他の例示的な実施形態
一般手順。キャッピング材料は、種々の角度で試料ウエハーを傾け、スパッタリング、ＣＶＤ（化学気相成長法）、電子ビーム蒸着を行って成膜した。この工程は、前記ナノチャネルの直径を低減し、かつキャップを設けるため使用したものである。
【０１２７】
ほとんどの場合、１００〜３４０ｎｍのＳｉ０２が当該チャネルの開口部に成膜された。効果的な密閉は、試験済みの種々の成膜条件により実現された。ガス圧力３０ｍＴｏｒｒ、ＲＦ電力約９００Ｗ、およびＤＣバイアス１４００Ｖで、約９ｎｍ／分の成膜率が達成された。それより低い圧力５ｍＴｏｒｒでは、成膜率が推定１７ｎｍ／ｍｉｎに上昇した。前記ナノチャネルの開口部上には、５ｍＴｏｒｒでスパッタリングして充填材料を成膜した。ナノチャネルアレイおよびナノチャネル装置の作製に関するさらに詳しい情報は、米国特許出願公開番号第ＵＳ２００４−００３３５１５  Ａ１号および第ＵＳ２００４−０１９７８４３  Ａ１号で参照できる（それぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする）。
【実施例１】
【０１２８】
溝幅１００ｎｍ、溝高さ（深さ）１００ｎｍの互いに平行で直線的な複数のチャネル（流路）を有したシリコン基板が提供された。これらのチャネル開口部に、上記の一般手順に基づき、ガス圧力５ｍＴｏｒｒでスパッタを行った。このスパッタ成膜時間は、１０〜２５分間で、これにより、不完全な密閉状態から完全な密閉状態までの範囲のナノチャネルアレイが得られる。（加熱式）電子ビーム蒸着装置（Ｔｅｍｅｓｃａｌ  ＢＪＤ−１８００）により、二酸化ケイ素を前記基板上に成膜した。前記基板は、二酸化ケイ素のビーム源からの成膜（蒸着）ビーム入射に対し、種々の角度で配置した。成膜率は、約３ｎｍ／分に設定可能で、１５０ｎｍの密閉材料を約５０分間で成膜した。前記密閉材料の入射成膜ビームの角度を変化させると、チャネルの幅および高さ（深さ）をそれぞれ１５０ｎｍ未満および１５０ｎｍに低減でき、成膜角度を接線方向に近づけ浅くすると実質的に密閉することができる。
【実施例２】
【０１２９】
この例では、ナノチャネルアレイを表面修飾剤に接触させた。実施例１に基づき作製したナノチャネルアレイを、真空槽内でポリエチレングリコールを含んだ表面修飾剤溶液に浸漬すると、前記チャネルの湿潤および処理を促進し、当該ナノチャネル内に閉じ込められた気泡を除去（脱泡）することができる。
【実施例３】
【０１３０】
この実施例では、試料リザーバにナノチャネルアレイを設けてナノ流体チップを得る方法について説明する。実施例１の一般手順に基づき、幅１００ｎｍ、深さ１００ｎｍのナノチャネルを有したナノチャネルアレイを作製した。このナノチャネルアレイをフォトレジストでスピンコーティングし、フォトマスクを使って露光し、前記チャネルアレイの両端に領域を設けた露光した領域を反応性イオンでエッチングして前記ナノチャネル両端を露出させ、深さ１ミクロン、幅約１ミリメートルのリザーバを、前記基板縁部の前記チャネル両端に設けた。
【実施例４】
【０１３１】
この実施例では、ＤＮＡ巨大分子を含む流体をナノ流体チップに充填して当該ＤＮＡを解析する方法について説明する。直径２ｍｍの円柱形状のプラスチック試料送達管を、実施例３のナノチャネルアレイの前記リザーバの１つと液体流通可能に配置した。加圧／減圧装置に接続可能な外部の試料送達／回収装置に、前記送達管を接続した。緩衝液の毛細管現象を利用して前記ナノチャネルを湿潤させた。染色したラムダファージ巨大分子（ラムダＤＮＡ）などを含んだ緩衝液を、電場（１〜５０Ｖ／ｃｍ）により前記ナノチャネルアレイに導入した。溶液濃度は、０．０５〜５マイクログラム／ｍＬで、前記ラムダＤＮＡは、色素ＴＯＴＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製、米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）により、１０：１塩基対／色素の比で染色した。この染色ＤＮＡ溶液を、０．１Ｍの抗酸化剤と、固着防止剤として使用される０．１％の直鎖状ポリアクリルアミドとを含有した０．５ｘＴＢＥ（ｐＨ７．０のトリス−ボロアセテート緩衝液）で０．０１〜０．０５マイクログラム／ｍＬに希釈した。
【実施例５】
【０１３２】
この実施例では、ナノチャネル内で線状化したＤＮＡ巨大分子の全体または大きな部分を画像化する方法について説明する。前記ＤＮＡ巨大分子は、蛍光標識し、実施例４で説明した手順に従って前記ナノチャネルに流入させた。１００Ｗハロゲンランプなどの励起光源の光を倍率６０倍のレンズで集光して前記ナノチャネルに照射することにより、視野内のＤＮＡ分子を励起した。前記ＴＯＴＯ−１色素で染色した分子からの蛍光放射を、前記レンズを通じて収集し、ダイクロイック（二色性）フィルターで反射させ、ＴＯＴＯ−１から発せられる波長帯に対し透過性のフィルターを通過させた。その光をＣＣＤカメラで検出し、前記視野内の前記ＤＮＡ分子の画像を生成した。
【実施例６】
【０１３３】
この実施例では、ナノチャネル内で線状化したＤＮＡ分子の物理的な全長より小さい検出領域を通過中のＤＮＡ巨大分子を検出する方法について説明する。ＤＮＡは、染色し、実施例４で説明した前記ナノチャネルに流入させた。前記検出領域は、励起光が通過できる幅狭のスリットを画成したことにより制約を受けた。このスリットは、前記ナノチャネル上に１００ｎｍのアルミニウム膜を成膜し、フォトリソグラフィおよび塩素プラズマエッチングを使って前記アルミニウム膜に１ミクロンのスリットを開けることにより画成したものである。前記ＤＮＡは、前記ナノチャネル内の前記アルミニウムスリット下の部分を通過するに伴い、励起光に照射されて、蛍光を発する。その蛍光放射を、実施例５で説明したように収集し、光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ、略称ＰＭＴ）を使って検出した。前記ＰＭＴでは、前記ＤＮＡ分子が前記スリットを完全に通過し終わるまで、信号が測定された。ＤＮＡが前記スリットを通過するスピード（通常、１〜１００ミクロン／秒）と、信号が検出された時間長との相関を求めることにより、前記ＤＮＡ分子のサイズを決定した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月14日(2014.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細長く引き伸ばされた単一の巨大分子を操作するナノ流体装置であって、
表面と当該表面に実質的に平行に設けられた１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントとを有する基板であって、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、当該流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部の内部に、巨大分子の少なくとも一部を滞留させて含み、更にこれを細長く引き伸ばすことができるものであり、各前記流体ナノチャネルセグメントは、断面直径が１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも１０ｎｍである、基板と、
前記流体ナノチャネルセグメントの少なくとも１つの少なくとも一部を覆うことのできるキャップであって、前記キャップの少なくとも一部は可溶性の被分析物に対し透過性である、キャップと
を有するナノ流体装置。
【請求項２】
請求項１記載のナノ流体装置において、前記ナノ流体装置はさらに少なくとも１つの観察窓を有し、前記観察窓は前記１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントの内容物の少なくとも一部を光学検査できるようにするものである、ナノ流体装置。
【請求項３】
請求項１記載のナノ流体装置において、前記基板は複数の流体ナノチャネルセグメントを有し、前記複数の流体ナノチャネルセグメントは実質的に平行である、ナノ流体装置。
【請求項４】
請求項１記載のナノ流体装置において、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、前記巨大分子の回転半径の２倍未満の断面直径を有するものである、ナノ流体装置。
【請求項５】
請求項１記載のナノ流体装置において、前記１若しくはそれ以上のナノチャネルセグメントは、１若しくはそれ以上の境界により画成され、前記巨大分子の少なくとも一部を直鎖状の形態に保持するよう、当該巨大分子の当該一部を制約することができる、ナノ流体装置。
【請求項６】
請求項５記載のナノ流体装置において、前記１若しくはそれ以上の境界は、物理的な壁、荷電領域、化学的に処理した領域、磁場領域、異なる材料、自己組織化単分子膜、ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせを有するものである、ナノ流体装置。
【請求項７】
請求項５記載のナノ流体装置において、前記１若しくはそれ以上の境界は、疎水性領域、親水性領域、またはこれらの任意の組み合わせを有するものである、ナノ流体装置。
【請求項８】
細長く引き伸ばされた単一の巨大分子を操作するナノ流体装置であって、
表面と当該表面に実質的に平行に設けられた１若しくはそれ以上の流体ナノチャネルセグメントとを有する基板であって、前記流体ナノチャネルセグメントのうち少なくとも１つは、当該流体ナノチャネルセグメントの少なくとも一部の内部に、巨大分子の少なくとも一部を滞留させて含み、更にこれを細長く引き伸ばすことができるものであり、各前記流体ナノチャネルセグメントは、断面直径が１０００ｎｍ未満で長さが少なくとも１０ｎｍである、基板を有するものであり、
前記１若しくはそれ以上のナノチャネルセグメントは、１若しくはそれ以上の境界により画成されるものであり、前記１若しくはそれ以上の境界は、荷電領域、化学的に処理した領域、磁場領域を有するものである、
ナノ流体装置。
【請求項９】
請求項８記載のナノ流体装置において、前記１若しくはそれ以上の境界は、荷電領域を有するものである、ナノ流体装置。
【請求項１０】
請求項８記載のナノ流体装置において、前記１若しくはそれ以上の境界は、磁場領域を有するものである、ナノ流体装置。
【外国語明細書】
2014097058000001.pdf
2014097058000002.pdf
2014097058000003.pdf
2014097058000004.pdf