(57)【要約】【課題】長鎖オリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドを低いリンカー担持量で、高合成量かつ高純度に合成するための核酸合成用固相担体を提供すること。【解決手段】モノビニル単量体単位、架橋性ビニル単量体単位、およびポリエチレングリコールユニットを有する多孔質樹脂ビーズと、その表面に担持された開裂性リンカーと、を備える核酸合成用固相担体であって、前記多孔質樹脂ビーズは、その表面に脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有し、前記開裂性リンカーは、カルボキシ基を有し、前記開裂性リンカーのカルボキシル基は、前記カルボキシ基と結合し得る基と、脱水縮合反応により結合され、開裂性リンカーの多孔質樹脂ビーズ重量に対する担持量が１〜８０μｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、核酸合成用固相担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノビニル単量体単位、架橋性ビニル単量体単位、およびポリエチレングリコールユニットを有する多孔質樹脂ビーズと、その表面に担持された開裂性リンカーと、を備える核酸合成用固相担体であって、
前記多孔質樹脂ビーズは、その表面に脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有し、前記開裂性リンカーは、カルボキシ基を有し、前記開裂性リンカーのカルボキシル基は、前記カルボキシ基と結合し得る基と、脱水縮合反応により結合され、
開裂性リンカーの多孔質樹脂ビーズ重量に対する担持量が１〜８０μｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、核酸合成用固相担体。
【請求項２】
モノビニル単量体単位がスチレン系単量体単位を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸合成用固相担体。
【請求項３】
ポリエチレングリコールユニットの数平均分子量が１００〜１００００であり、その多孔質樹脂ビーズ重量に対する結合量が０．００１〜１ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、請求項１または２に記載の核酸合成用固相担体。
【請求項４】
カルボキシ基と結合し得る基がヒドロキシ基またはアミノ基を含み、カルボキシル基を有する開裂性リンカーと共有結合していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸合成用固相担体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸合成用固相担体を用いて、開裂性リンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドを得ることを含む、核酸合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸合成用固相担体に関する。より詳しくは、表面に脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基、および、ポリエチレングリコールユニットを結合する、モノビニル単量体単位および架橋性ビニル単量体単位からなる多孔質樹脂ビーズに、開裂性リンカーを担持した核酸合成用固相担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドといった核酸の化学合成に、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。この方法は、例えば、先ず合成する核酸の３’末端になるヌクレオシドを、スクシニル基などの開裂性リンカーを介して固相担体にあらかじめ担持させ、この担体を反応カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。以降は核酸自動合成装置の合成プログラムにしたがって、例えば以下のように反応カラム中に合成用試薬が流される。（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液またはジクロロ酢酸／トルエン溶液等による、ヌクレオシド５’−ＯＨ基の脱保護、（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）／アセトニトリル溶液、および、活性化剤（テトラゾール等）／アセトニトリル溶液による５’−ＯＨ基へのアミダイトのカップリング反応、（３）無水酢酸／ピリジン／メチルイミダゾール／ＴＨＦ等による未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング、（４）ヨウ素／水／ピリジン等によるホスファイトの酸化。
【０００３】
この合成サイクルを繰り返し、目的の配列を持った核酸が合成される。最終的に合成された核酸は、アンモニアやメチルアミン等により開裂性リンカーを加水分解させることによって、固相担体から切り出される（非特許文献１参照）。
【０００４】
核酸の合成に使用される固相担体としては、これまでＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）やシリカゲルのような無機粒子が用いられてきたが、近年、安価に、かつ大量に合成するために、固相担体重量当りの核酸合成量を多くすることができる樹脂ビーズが用いられるようになってきた。このような樹脂ビーズとしては、例えば高架橋・非膨潤性の多孔質ポリスチレンビーズ（特許文献１参照）、低架橋・膨潤性の多孔質ポリスチレンビーズ（特許文献２参照）等が挙げられる。
【０００５】
一般に、合成するオリゴヌクレオチドの鎖長が長くなるほど、合成能（合成純度および合成量）が低下するという問題があり、これを解決するには固相担体の合成の起点となるヌクレオシドリンカーの担持量を少なくする必要がある。例えば２０塩基配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを高純度で合成するには市販の多孔質樹脂ビーズ系の固相担体のヌクレオシドリンカー担持量は２００μｍｏｌ／ｇ程度でも可能であるが、４０塩基配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドの場合は８０μｍｏｌ／ｇ以下にする必要がある。また、ＲＮＡオリゴヌクレオチドや修飾オリゴヌクレオチドを合成する場合も、嵩張った保護基や修飾基を含有するアミダイトをカップリングするので、合成能が低下しないようにヌクレオシドリンカー担持量を少なくして合成することが行われている。
【０００６】
しかし、核酸合成用固相担体として多孔質樹脂ビーズを用い、ヌクレオシドリンカー担持量を少なくしてオリゴヌクレオチドを合成した場合、予想外なことに予定されるよりも合成能が低くなるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平３−６８５９３号公報
【特許文献２】特開２００５−３２５２７２号公報
【特許文献３】特開２００８−７４９７９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Current Protocol in Nucleic Acid Chemistry(2000),UNIT3.6 Synthesis of Unmodified Oligonucleotide
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高合成量かつ高純度で核酸を合成するための核酸合成用固相担体を提供することを目的とする。特に、長鎖オリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドを低いリンカー担持量で合成するための核酸合成用固相担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、核酸合成用固相担体用多孔質樹脂ビーズにポリエチレングリコールユニットを結合させることにより、低いリンカー担持量であっても高い合成能（高い合成純度および合成量）で、長鎖オリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドを合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１１】
（１）モノビニル単量体単位、架橋性ビニル単量体単位、およびポリエチレングリコールユニットを有する多孔質樹脂ビーズと、その表面に担持された開裂性リンカーと、を備える核酸合成用固相担体であって、
前記多孔質樹脂ビーズは、その表面に脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有し、前記開裂性リンカーは、カルボキシ基を有し、前記開裂性リンカーのカルボキシル基は、前記カルボキシ基と結合し得る基と、脱水縮合反応により結合され、
開裂性リンカーの多孔質樹脂ビーズ重量に対する担持量が１〜８０μｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、核酸合成用固相担体。
（２）モノビニル単量体単位がスチレン系単量体単位を含むことを特徴とする、（１）に記載の核酸合成用固相担体。
（３）ポリエチレングリコールユニットの数平均分子量が１００〜１００００であり、その多孔質樹脂ビーズ重量に対する結合量が０．００１〜１ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、（１）または（２）に記載の核酸合成用固相担体。
（４）カルボキシ基と結合し得る基がヒドロキシ基またはアミノ基を含み、カルボキシル基を有する開裂性リンカーと共有結合していることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸合成用固相担体。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸合成用固相担体を用いて、開裂性リンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドを得ることを含む、核酸合成方法。
【発明の効果】
【００１２】
長鎖オリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどを低いリンカー担持量で合成する場合においても、本発明の核酸合成用固相担体は核酸の合成量および合成純度が高いので、本発明の多孔質樹脂ビーズを使用することで、従来の多孔質樹脂ビーズを用いた核酸合成用固相担体の場合よりも核酸合成を効率的に行うことが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の核酸合成用固相担体の構造単位の一つであるモノビニル単量体単位は、ビニル基を分子内に１個有する単量体であれば特に限定されない。例えば、芳香族系ビニル単量体、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、酢酸ビニル、（メタ）アクリロニトリル、ビニルピリジン、ビニルピロリドンなどが挙げられる。
芳香族系ビニル単量体としては、ビニル基を分子内に１個有する、環構成原子として炭素以外に窒素原子などのヘテロ原子を含有していてもよい環員数５〜６の芳香環が挙げられる。該芳香環はフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、メトキシ基、エトキシ基などの炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基、メチル基、エチル基などの炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基（当該アルキル基は、ハロゲン原子、アルコキシ基などで置換されていてもよい）、アセトキシ基などの炭素数２〜１０の直鎖又は分岐鎖のアシルオキシ基、アミノ基、アセチルアミノ基などの炭素数２〜１０の直鎖又は分岐鎖のアシルアミノ基、シアノ基、ニトロ基などの置換基を有していてもよい。具体的には例えば、スチレン、エチルスチレン、メチルスチレン、ジメチルスチレン、トリメチルスチレン、ブチルスチレン等のアルキルスチレン、クロロスチレン、ジクロロスチレン、フルオロスチレン、ペンタフルオロスチレン、ブロモスチレン等のハロゲン化スチレン、クロロメチルスチレン、フルオロメチルスチレン等のハロゲン化アルキルスチレン、アミノスチレン、シアノスチレン、メトキシスチレン、エトキシスチレン、ブトキシスチレン、アセトキシスチレン、ニトロスチレン等のスチレン系単量体が挙げられる。
（メタ）アクリル酸アルキルエステルとしては、例えばアルキル基の炭素数が１〜２０個の直鎖または分岐鎖状の１価アルコールとアクリル酸またはメタクリル酸とから得られるエステルなどが挙げられる。当該アルコールは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、エポキシ基、フェニル基などで置換されていてもよい。また、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルなどのポリエチレングリコールモノアルキルエーテルなどとアクリル酸またはメタクリル酸とから得られるエステルなども含まれる。具体的には例えば、アクリル酸メチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸メトキシエチレングリコール、アクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸メトキシエチレングリコール、メタクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル、メタクリル酸ポリエチレングリコール、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸トリフルオロエチル、メタクリル酸オクタフルオロペンチルなどが挙げられる。モノビニル単量体は、単独で用いるほかに、異なるものを混合して用いることもできる。
モノビニル単量体は、好ましくはスチレン系単量体、または、スチレン単量体およびそれ以外のモノビニル単量体の混合物である。
【００１４】
本発明の核酸合成用固相担体の構造単位の一つである架橋性ビニル単量体は、架橋剤として使用されるものであり、ビニル基を分子内に２個以上、好ましくは２〜３個有し、前述のモノビニル単量体と架橋網目構造を形成しうるものであれば特に限定されないが、例えば、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、トリビニルシクロヘキサン、ジ（メタ）アクリル酸エチレングリコール、ジ（メタ）アクリル酸ジエチレングリコール、ジ（メタ）アクリル酸トリエチレングリコール、それ以上の多価のエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジ（メタ）アクリル酸プロピレングリコール、ジ（メタ）アクリル酸ジプロピレングリコール、ジ（メタ）アクリル酸トリプロピレングリコール、それ以上の多価値のプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジ（メタ）アクリル酸ブタンジオール、ジ（メタ）アクリル酸ヘキサンジオール、ジ（メタ）アクリル酸ノナンジオールなどが挙げられる。
架橋性ビニル単量体は、単独で用いるほかに、異なるものを混合して用いることもできる。架橋性ビニル単量体は、特に好ましくはｐ−ジビニルベンゼン、ｍ−ジビニルベンゼン、またはそれらの混合物である。
【００１５】
本発明の多孔質樹脂ビーズの架橋性ビニル単量体単位は、多孔質樹脂ビーズ重量当りに占める量として１００〜５０００μｍｏｌ／ｇ、好ましくは３００〜３０００μｍｏｌ／ｇである。架橋性ビニル単量体単位が１００μｍｏｌ／ｇ未満では、得られる粒子の耐溶剤性、熱安定性、多孔性が十分でなく、核酸合成用固相担体として用いた時に所望の効果を期待し難い。逆に５０００μｍｏｌ／ｇを超えると、有機溶剤中での膨潤度が低くなるために、核酸合成用固相担体として使用した時に得られる核酸の合成純度および合成量が低下する傾向にある。
【００１６】
多孔質樹脂ビーズの表面に存在する「脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基」は、カルボキシ基と脱水縮合反応して結合を形成しうるものであれば特に限定はなく、好ましくは、ヒドロキシ基またはアミノ基を含む基であり、具体的には、ヒドロキシ基、アミノ基、ヒドロキシメチル基等のヒドロキシ−Ｃ１−２０アルキル基、アミノメチル等のアミノ−Ｃ１−２０アルキル基などが挙げられる。
脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基は、
（１）脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を含有するビニル単量体を、上記モノビニル単量体および架橋性ビニル単量体に共重合させるか、または
（２）加水分解などの反応によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換し得る基を含有するビニル単量体を、上記モノビニル単量体および架橋性ビニル単量体に共重合させた後に加水分解などの反応に付することによって、
多孔質樹脂ビーズの表面に導入することができる。製法については後掲にて詳述する。
【００１７】
本発明の核酸合成用固相担体において、多孔質樹脂ビーズが有するポリエチレングリコールユニットとは、ポリエチレングリコール構造（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−：ｎは２以上の整数を示す。）を有するものであれば特に限定はない。ポリエチレングリコールユニットと多孔質樹脂ビーズの結合様式は特に限定はなく、エステル結合、エーテル結合、アミド結合などが含まれる。
本発明の核酸合成用固相担体にポリエチレングリコールユニットを結合するには、ポリエチレングリコールユニットを含有するビニル単量体、例えば、アクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル、アクリル酸ポリエチレングリコールフェニルエーテル、アクリル酸ポリエチレングリコール、メタクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル、メタクリル酸ポリエチレングリコールフェニルエーテル、メタクリル酸ポリエチレングリコール等を共重合する方法が挙げられる。
【００１８】
本発明の核酸合成用固相担体にポリエチレングリコールユニットを結合する別の方法として、一旦、懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、ポリエチレングリコールユニットを導入することで製造してもよい。例えば、クロロメチルスチレン等を共重合してクロロメチル基を導入した多孔質樹脂ビーズに、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコールモノフェニルエーテル等のポリエチレングリコールオリゴマーを反応させることにより得られる。あるいは、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、グリシジル基等の官能基を導入した多孔質樹脂ビーズに、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールビスカルボキシメチルエーテル、ポリエチレングリコールビスアミン、ポリエチレングリコールビス３−アミノプロピル、ポリエチレングリコールグリシジル等を、縮合剤等を用いて結合することにより得られる。
本発明の核酸合成用固相担体に結合するポリエチレングリコールユニットの数平均分子量は１００〜１００００、好ましくは１５０〜５０００、より好ましくは、２００〜３０００、さらに好ましくは２００〜２０００である。
ポリエチレングリコールユニットの数平均分子量がこの範囲より低いと、担体表面の親水化度が低くなるため、低いリンカー担持量において、核酸合成能が低くなる傾向にある。逆にこの範囲を超えると、ポリエチレングリコールユニットが担体に結合しにくい、または、ポリエチレングリコールユニットが核酸合成を阻害するため、核酸合成能が低くなる傾向にある。
ポリエチレングリコールユニットの数平均分子量は、高速液体クロマトグラフィーを使用したゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法によって測定することができる。また、所望の数平均分子量のポリエチレングリコールユニットを含む市販品を使用することができる。
なお、ポリエチレングリコールユニットを含有するビニル単量体を共重合させる場合は、当該ビニル単量体自体の数平均分子量をポリエチレングリコールユニットの数平均分子量として取り扱えばよい。
【００１９】
本発明の核酸合成用固相担体に結合するポリエチレングリコールユニットの固相担体中の多孔質樹脂ビーズ重量に対する結合量は０．００１〜１ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは０．００５〜０．７ｍｍｏｌ／ｇ、さらに好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／ｇ〜０．６ｍｍｏｌ／ｇである。
ポリエチレングリコールユニットの結合量がこの範囲より低いと、担体表面の親水化度が低くなるため、低いリンカー担持量において、核酸合成能が低くなる傾向にある。逆にこの範囲を超えると、ポリエチレングリコールユニットが核酸合成を阻害するため、核酸合成能が低くなる傾向にある。
ポリエチレングリコールユニットの多孔質樹脂ビーズ重量に対する結合量は、ポリエチレングリコールユニットを含有するビニル単量体やポリエチレングリコールユニットを導入するための多孔質樹脂ビーズ上の官能基（クロロメチル基、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、グリシジル基等）の量を調整することにより、設定することができる。
【００２０】
本発明の核酸合成用固相担体の形状は、必ずしも厳密な球状を呈する必要は無く、少なくとも粒状であれば良い。しかしながら、固相合成用反応カラムへの充填効率を高くでき、また、破損し難いという点から、本発明の核酸合成用固相担体は、好ましくは球状である。
【００２１】
本発明の核酸合成用固相担体のレーザー回折散乱法により測定したメジアン粒子径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは１０〜５００μｍ、さらに好ましくは２０〜３００μｍである。本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径は、レーザー回折散乱法により測定される。具体的には、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液を分散媒に用いて、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置ＬＡ−９５０（堀場製作所社製）により測定し、平均粒径を求める。
メジアン粒子径は、核酸合成用固相担体の多孔質樹脂ビーズを懸濁重合で製造する際の重合開始前の撹拌条件や分散安定剤の種類・濃度に依存する。従って、これらを調整することで、メジアン粒子径を望ましい範囲に調整することが可能である。
【００２２】
本発明の核酸合成用固相担体の水銀圧入法により測定したメジアン細孔径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜３００ｎｍである。
本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径は、水銀圧入法により測定される。具体的には、０．２ｇの多孔質樹脂ビーズを水銀ポロシメーターＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ Ｃｏ．社製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀圧入法により測定する。
メジアン細孔径は、核酸合成用固相担体の多孔質樹脂ビーズを懸濁重合で製造する際の重合開始前の撹拌条件や多孔質化剤の種類や濃度に依存する。従って、これらを調整することで、メジアン細孔径を望ましい範囲に調整することが可能である。
【００２３】
本発明の核酸合成用固相担体の製造方法は特に限定されず、例えば、
（１）モノビニル単量体、架橋性ビニル単量体、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を含有するビニル単量体、および、ポリエチレングリコールユニットを結合する単量体を多孔質化剤および重合開始剤と混合、溶解し、分散安定剤を分散または溶解した水中で懸濁共重合させて作製した多孔質樹脂ビーズを用いて製造する方法、
（２）モノビニル単量体、架橋性ビニル単量体、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を含有するビニル単量体、および官能基（クロロメチル基、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、グリシジル基等）を含有するビニル単量体を多孔質化剤および重合開始剤と混合、溶解し、分散安定剤を分散または溶解した水中で懸濁共重合させて、多孔質樹脂ビーズを合成した後、ポリエチレングリコールユニットを官能基と反応させることによって導入して作製した多孔質樹脂ビーズを用いて製造する方法、
（３）モノビニル単量体、架橋性ビニル単量体、加水分解などの反応によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換し得る基を含有するビニル単量体、および、ポリエチレングリコールユニットを結合する単量体を多孔質化剤および重合開始剤と混合、溶解し、分散安定剤を分散または溶解した水中で懸濁共重合させること等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、加水分解などの反応によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を導入して作製した多孔質樹脂ビーズを用いて製造する方法、
（４）モノビニル単量体、架橋性ビニル単量体、加水分解などの反応によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換し得る基を含有するビニル単量体、および官能基（クロロメチル基、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、グリシジル基等）を含有するビニル単量体を多孔質化剤および重合開始剤と混合、溶解し、分散安定剤を分散または溶解した水中で懸濁共重合させること等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、加水分解などの反応によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を導入し、さらにポリエチレングリコールユニットを官能基と反応させることによって導入して作製した多孔質樹脂ビーズを用いて製造する方法、
などが挙げられる。
【００２４】
懸濁共重合の際の、単量体の総重量に対する架橋性ビニル単量体の仕込み量は、好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは０．３〜３ｍｍｏｌ／ｇである。
【００２５】
懸濁共重合の際の、単量体の総重量に対する脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を含有するビニル単量体、または、加水分解などの反応によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換し得る基を含有するビニル単量体の仕込み量は、好ましくは０．００１〜１ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは０．００５〜０．５ｍｍｏｌ／ｇである。
【００２６】
懸濁共重合は、上述の各単量体、多孔質化剤、および、重合開始剤との混合溶解物を、分散安定剤を分散または溶解した水中で撹拌乳化することにより行われる。
【００２７】
本発明における多孔質化剤とは、懸濁共重合系における水以外の溶媒を意味し、炭化水素およびアルコールが好ましく用いられる。炭化水素として具体的には、脂肪族の飽和または不飽和炭化水素、あるいは芳香族炭化水素を用いることができ、好ましくは炭素数５〜１２の脂肪族炭化水素であり、より好ましくは、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ウンデカン、ドデカン等が挙げられる。またこの際得られるビーズの多孔質度を増すために、アルコールを共存させることが望ましい。本発明におけるアルコールとしては、例えば脂肪族アルコールを挙げることができ、その炭素数は、好ましくは５〜９である。このようなアルコールとして具体的には、２−エチルヘキサノール、ｔ−アミルアルコール、ノニルアルコール、２−オクタノール、シクロヘキサノール等が挙げられる。
【００２８】
懸濁共重合の際の多孔質化剤に用いられる炭化水素とアルコールの重量比は、炭化水素およびアルコールの具体的な組合せによって適宜変更され、それにより得られる固相合成用担体の比表面積を大きくすることができる。炭化水素とアルコールの好ましい配合割合は、重量比で１：９〜６：４である。
【００２９】
懸濁共重合の際の多孔質化剤の重量は、上記各単量体の総重量に対して好ましくは０．５〜２．５倍であり、より好ましくは０．８〜２．２倍であり、さらに好ましくは１．０〜２．０倍である。この値が大小いずれの場合でも、得られる多孔質樹脂ビーズの比表面積が小さくなり、化学反応による合成反応物の量が少なくなる。
【００３０】
本発明において、懸濁共重合する際の方法自体は従来公知の方法を援用してもよい。
懸濁共重合する際の分散安定剤としては特に限定されず、従来公知のポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ゼラチン、デンプン、カルボキシルメチルセルロース等の親水性保護コロイド剤、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、りん酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、ベントナイト等の難溶性粉末等が用いられる。分散安定剤の添加量は特に限定されないが、好ましくは懸濁重合系の水の重量に対して、０．０１〜１０重量％である。この値が少ない場合は、懸濁重合の分散安定性が損なわれて多量の凝集物が生成する。この値が多い場合は、微小ビーズが多数生成する。
【００３１】
懸濁共重合する際の重合開始剤としては特に限定されず、従来公知のジベンゾイルパーオキサイド、ジラウロイルパーオキサイド、ジステアロイルパーオキサイド、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）−２−メチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）シクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジ−ｔ−ヘキシルパーオキサイド、ｔ−ブチルクミルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、１，１，３，３−テトラメチルブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ヘキシルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエー卜、ｔ−ブチルペルオキシイソプロピルモノカルボネート等の過酸化物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物が用いられる。重合開始剤の添加量は特に限定されず、当業者であれば適切な量を選択することが可能である。
【００３２】
懸濁共重合の際の反応条件は、適宜に設定することができ、例えば６０〜９０℃における３０分間〜４８時間の撹拌が挙げられる。撹拌速度は、例えば１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍ、好ましくは２００ｒｐｍ〜８００ｒｐｍである。
【００３３】
懸濁共重合によって得られた共重合体は適宜、洗浄、乾燥、分級等の処理を施してもよい。さらに、懸濁共重合等によって多孔質樹脂ビーズを合成した後、脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合し得る基、または／および、ポリエチレングリコールユニットを導入してもよく、導入方法は前述のとおりである。
【００３４】
本発明の核酸合成用固相担体は、多孔質樹脂ビーズにカルボキシ基を有する開裂性リンカーを担持する。開裂性リンカーは、核酸合成反応の起点となる化合物であり、合成した核酸を核酸合成用固相担体から切り離すために、加温下、アルカリ性などの条件で開裂するものである。
本発明の核酸合成用固相担体のカルボキシ基を有する開裂性リンカーとしては、例えば、化１に示したヌクレオシドスクシニルリンカーが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、様々な修飾基を結合したヌクレオシドリンカー、ユニバーサルリンカー（例えば、米国第５６８１９４５号明細書、米国第６６５３４６８号明細書、国際公開第２００５／０４９６２１号パンフレット、米国第２００５／０１８２２４１号明細書に記載のリンカー）のようにヌクレオシドを含有しないリンカーを用いることができる。
【００３５】
【化１】
2014000075.tif 000002
【００３６】
式中、Ｂ１で表される塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の核酸塩基が挙げられ、これらの核酸塩基のアミノ基はアセチル基、イソブチリル基、ベンゾイル基等の保護基で保護されていてもよい。
Ｘは、水素原子、水酸基、ハロゲン原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子など）、炭素数１〜２０のアルコキシ基（例、メトキシ基など）、ｔｅｒｔブチルジメチルシリル基などで保護された水酸基などが挙げられる。
本発明の核酸合成用固相担体の開裂性リンカーの担持量は、１〜８０μｍｏｌ／ｇ、好ましくは１〜６０μｍｏｌ／ｇ、より好ましくは３〜５０μｍｏｌ／ｇ、さらに好ましくは５〜４５μｍｏｌ／ｇである。リンカー担持量が１μｍｏｌ／ｇ未満の時は、合成できる核酸量が少なくなり過ぎる。リンカー担持量が８０μｍｏｌ／ｇを超える場合は、ポリエチレングリコールユニットを結合しない核酸合成用固相担体と核酸の合成能に差が見られなくなる。
核酸合成用固相担体の開裂性リンカーの担持量は、多孔質樹脂ビーズに対する開裂性リンカーの使用量を調整することによって、適宜設定することができる。
【００３７】
本発明の核酸合成用固相担体の開裂性リンカーの担持方法は、特に限定されるものではなく、例えば、開裂性リンカーのカルボキシ基と、多孔質樹脂ビーズの脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を縮合剤の存在下、脱水縮合反応させて共有結合させる方法が挙げられる。
【００３８】
本発明の核酸合成用固相担体の多孔質樹脂ビーズに、このような脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を導入するには、ヒドロキシ基の場合は、ヒドロキシ基を含有するビニル単量体、例えば、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル、アクリル酸４−ヒドロキシブチル、メタクリル酸４−ヒドロキシブチル、ヒドロキシスチレンなどを共重合する方法が挙げられ、アミノ基の場合は、アミノ基を含有するビニル単量体、例えば、アミノスチレン、アミノメチルスチレンなどをモノビニル単量体および架橋性ビニル単量体に共重合する方法が挙げられる。
脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を含有するビニル単量体がスチレン系単量体である場合は、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合しうる基はビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位であってもよい。
【００３９】
本発明の核酸合成用固相担体に含有される脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基は、一旦懸濁共重合等によって加水分解などの反応によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換し得る基を有する多孔質樹脂ビーズを合成した後、加水分解等によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換することで製造してもよい。
「加水分解などの反応によって脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換し得る基」としては、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基等の炭素数２〜１０の直鎖、分岐鎖又は環状のアシルオキシ基、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基等の炭素数２〜１０の直鎖、分岐鎖又は環状のアシルアミノ基、アセトキシメチル基等の炭素数２〜１０の直鎖、分岐鎖又は環状のアシルオキシ−Ｃ１−２０アルキル基、アセチルアミノメチル基等の炭素数２〜１０の直鎖、分岐鎖又は環状のアシルアミノ−Ｃ１−２０アルキル基、クロロメチル基等のハロ−Ｃ１−２０アルキル基などが挙げられる。
【００４０】
このような製造過程において、本発明の脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換し得る基を含有するモノビニル単量体としては、例えば、アセチルアミノスチレンなどのアシルアミノスチレン、アセトキシスチレン、エタノイルオキシスチレン、ベンゾイルオキシスチレンなどのアシルオキシスチレン、クロロメチルスチレンなどのハロアルキルスチレンが挙げられる。
脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換し得る基を含有するモノビニル単量体がスチレン系単量体である場合は、変換して脱水縮合反応によりカルボキシル基と結合しうる基となるアシルオキシ基、アシルアミノ基、ハロアルキル基などは、ビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位であってもよい。
【００４１】
懸濁共重合等によって合成した多孔質樹脂ビーズ中のアシルオキシ基、アシルアミノ基は、通常の加水分解反応、例えば、水性アルコール（水性エタノール、水性メタノール）中、水酸化ナトリウム等の無機塩基との反応によって、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基、具体的にはヒドロキシ基、アミノ基に変換することができる。また、ハロアルキル基は、フタルイミドおよびヒドラジン、アンモニアまたは水酸化ナトリウムなどとの反応によって、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基、具体的にはアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基に変換することができる。
【００４２】
脱水縮合反応は、反応に不活性な溶媒中で行うことができる。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒が挙げられ、中でもアセトニトリルが好ましい。
縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドまたはその塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム(ＰｙＢｏｐ)、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスファート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。中でもＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）が好ましい。
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、−１０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、３０分〜７０時間である。
脱水縮合反応の後、好ましくは、未反応の脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に対してキャッピングを行う。キャッピングは、従来公知の方法で行うことができ、例えば、その未反応の脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基をアセチル化することにより行うことが好ましい。アセチル化反応は限定されるものではないが、例えば、無水酢酸を含む溶液を、塩基性触媒（例えば、１−メチルイミダゾール、ピリジン、ジメチルアミノピリジン等）を含む溶液と共に固相担体に添加することが好ましい。
【００４３】
以上のような処理を経て、本発明の核酸合成用固相担体を得ることができる。
本発明の核酸合成用固相担体を用いる核酸合成には、従来から知られている方法を適用することができる。
【００４４】
例えば、ヌクレオシドリンカーを担持した核酸合成用固相担体の場合、ヌクレオシドの５’末端から所定の塩基配列となるように、ヌクレオシドホスホロアミダイトを一段ずつ結合する。この合成反応は自動合成装置を用いて行うことができる。例えば、核酸合成用固相担体を充填した反応カラムに、５’−ＯＨ脱保護剤溶液、ヌクレオシドホスホロアミダイト溶液、アミダイト活性化剤溶液、酸化剤溶液、キャッピング剤溶液、洗浄溶液としてのアセトニトリルなどが順次送られ、反応が繰り返される。最終的には、開裂性リンカー部分をアルカリ溶液で加水分解するなどして切断し、目的の核酸を得ることができる。
【００４５】
本発明の核酸合成用固相担体を用いる核酸合成は、特に、２０塩基長以上の長鎖のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡやＲＮＡを、開裂性リンカーの担持量を少なくして（１〜８０μｍｏｌ／ｇ）合成する際に有用である。
【００４６】
以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
多孔質樹脂ビーズの作製
冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた、５００ｍＬセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、ポリビニルアルコール（クラレ製）２．６ｇおよび蒸留水２６０ｇを入れ、３００ｒｐｍで撹拌してポリビニルアルコールを溶解した。ここにスチレン（和光純薬製）２３．７ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）３．２ｇ、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）２１．５ｇ、メタクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル（シグマアルドリッチ製、平均Ｍｎ３００）５．４ｇ、２−エチルヘキサノール（和光純薬製）６０．３ｇ、イソオクタン（和光純薬製）２５．９ｇおよびベンゾイルパーオキサイド（２５％含水、日油製）１．１ｇを混合して溶解した溶液を添加して、窒素気流下、室温にて撹拌（５０ｒｐｍ）した後、８０℃に昇温して１０時間、懸濁共重合を行った。
重合生成物を、蒸留水およびアセトン（和光純薬製）を用いて濾過洗浄して、全量約１Ｌになるようにアセトン中に分散させた。この分散液を、液を傾けても沈澱が乱れない程度になるまで放置した後、上清のアセトンを廃棄した。この沈澱に再びアセトンを加えて全量を約１Ｌにして、静置、アセトン廃棄の操作を繰り返すことにより分級した。この分散液を濾過し、減圧乾燥することにより、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−アセトキシスチレン−メタクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
次いで冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた５００ｍＬフラスコに、上記の共重合体からなる多孔質樹脂ビーズの粉末２０ｇ、エタノール８０ｇ、蒸留水５０ｇおよび水酸化ナトリウム２ｇを仕込み、撹拌しながら７５℃で１８時間反応させた。この分散液を塩酸で中和後、蒸留水およびアセトンを用いて濾過洗浄し、減圧乾燥することにより、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−ヒドロキシスチレン−メタクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
【００４８】
多孔質樹脂ビーズへのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅの担持
表１の（実施例１）の配合で、多孔質樹脂ビーズ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＯＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テ卜ラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ，アルドリッチ製）、アセトニトリル（和光純薬製）を混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、減圧乾燥した。
これらの多孔質樹脂ビーズに、ＣａｐＡ（２０％無水酢酸／８０％アセトニトリル）１１２．５ｍＬ、ＣａｐＢ（２０％Ｎ−メチルイミダゾール／３０％ピリジン／５０％アセトニトリル）１２．５ｍｌ、４−ジメチルアミノピリジン（アルドリッチ製）６３ｍｇ、アセトニトリル１２．５ｍｌを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、減圧乾燥してＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した多孔質樹脂ビーズを得た。ＤＭＴ−ｄＴ−３’ −ｓｕｃｃｉｎａｔｅの担持量は、ｐ−卜ルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて脱保護したＤＭＴ基の吸光度測定（４１２ｎｍ）から求めた。
得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は７．２μｍｏｌ／ｇだった。
【００４９】
２１ｍｅｒ  ＲＮＡの合成評価
上記で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した多孔質樹脂ビーズを合成スケール１μｍｏｌになるように合成カラムに入れ、ＡＢＩ３４００  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ製）にセットして、ヌクレオシドホスホロアミダイト濃度０．１Ｍ、ＤＭＴ−ｏｆｆの条件にて２１ｍｅｒ混合配列のＲＮＡを合成した。合成後のカラムを乾燥させた後、多孔質樹脂ビーズからのＲＮＡの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行い、フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）から核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相当）を求めた。次に、濾液を乾燥した後、得られたＲＮＡの２’水酸基の脱保護を行い、濾液をＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製）して、Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％（目的の配列長をもつＲＮＡオリゴヌクレオチドの割合）を求めた。結果を表２に示した。
【００５０】
比較例１
重合の配合を、ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート０ｇ、スチレン４７．０ｇ、ｐ−アセトキシスチレン４．７ｇ、ジビニルベンゼン（含有量５５％）８．３ｇ、２−エチルヘキサノール５５．４ｇ、イソオクタン２３．７ｇを用いた以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−ヒドロキシスチレン共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
得られた多孔質樹脂ビーズに、表１の（比較例１）の配合を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した。得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は１１μｍｏｌ／ｇだった。
実施例１と同様にして、２１ｍｅｒ混合配列のＲＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【実施例２】
【００５１】
実施例１で得られた多孔質樹脂ビーズに、表１の（実施例２）の配合を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した。得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は４５μｍｏｌ／ｇだった。
上記で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した多孔質樹脂ビーズを合成スケール１μｍｏｌになるように合成カラムに入れ、ＡＢＩ３４００  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ製）にセットして、ヌクレオシドホスホロアミダイト濃度０．１Ｍ、ＤＭＴ−ｏｎの条件にて４０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。合成後のカラムを乾燥させた後、多孔質樹脂ビーズからのＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行い、フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）から核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相当）を求めた。また、濾液をＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製）して、Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％（目的の配列長をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの割合）を求めた。結果を表２に示した。
【００５２】
比較例２
比較例１で得られた多孔質樹脂ビーズに、表１の（比較例２）の配合を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した。得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は４２μｍｏｌ／ｇだった。
実施例２と同様にして、４０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【００５３】
比較例３
実施例１で得られた多孔質樹脂ビーズに、表１の（比較例３）の配合を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した。得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は１０８μｍｏｌ／ｇだった。
実施例１と同様にして、２１ｍｅｒ混合配列のＲＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【００５４】
比較例４
比較例１で得られた多孔質樹脂ビーズに、表１の（比較例４）の配合を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した。得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は９６μｍｏｌ／ｇだった。
実施例１と同様にして、２１ｍｅｒ混合配列のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【実施例３】
【００５５】
重合の配合を、スチレン（和光純薬製）４６．９ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）３．７ｇ、ジビニルベンゼン（含有量５５％、和光純薬製）７．３ｇ、メタクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル（シグマアルドリッチ製、平均Ｍｎ９５０）３．０ｇ、２−エチルヘキサノール（和光純薬製）５５．４ｇ、イソオクタン（和光純薬製）２３．７ｇおよびベンゾイルパーオキサイド（２５％含水、日油製）１．２ｇ用いた以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−ヒドロキシスチレン−メタクリル酸ポリエチレングリコールメチルエーテル共重合体からなる多孔質樹脂ビーズを得た。
得られた多孔質樹脂ビーズに、表１の（実施例３）の配合を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した。得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は５５μｍｏｌ／ｇだった。
上記で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した多孔質樹脂ビーズを合成スケール１μｍｏｌになるように合成カラムに入れ、ＡＢＩ３４００  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ製）にセットして、ヌクレオシドホスホロアミダイト濃度０．１Ｍ、ＤＭＴ−ｏｎの条件にて２０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。合成後のカラムを乾燥させた後、多孔質樹脂ビーズからのＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行い、フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）から核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相当）を求めた。また、濾液をＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製）して、Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％（目的の配列長をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの割合）を求めた。結果を表２に示した。
【００５６】
比較例５
比較例２で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した多孔質樹脂ビーズを用いて、実施例３と同様にして、２０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【実施例４】
【００５７】
実施例３で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した多孔質樹脂ビーズを用いて、実施例２と同様にして、４０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【実施例５】
【００５８】
実施例３で得られた多孔質樹脂ビーズに、表１の（実施例５）の配合を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した。得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は７．１μｍｏｌ／ｇだった。
実施例１と同様にして、２１ｍｅｒ混合配列のＲＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【００５９】
比較例６
比較例１で得られた多孔質樹脂ビーズに、表１の（比較例６）の配合を用いた以外は実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した。得られた多孔質樹脂ビーズのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ担持量は５．４μｍｏｌ／ｇだった。
実施例１と同様にして、２１ｍｅｒ混合配列のＲＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【実施例６】
【００６０】
実施例３で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した多孔質樹脂ビーズを用いて、実施例１と同様にして、２１ｍｅｒ混合配列のＲＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【００６１】
比較例７
比較例２で得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを担持した多孔質樹脂ビーズを用いて、実施例１と同様にして、２１ｍｅｒ混合配列のＲＮＡを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ％を求めた。結果を表２に示した。
【００６２】
【表１】
2014000075.tif 000003
【００６３】
【表２】
2014000075.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の核酸合成用固相担体は、リンカー担持量が低い場合でも、長鎖オリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどの合成量および合成純度が高いので、従来の多孔質樹脂ビーズを用いた場合よりも核酸合成を効率的に行うことが可能となる。