(57)【要約】      （修正有）【課題】人工的な変異を有する制限エンドヌクレアーゼ酵素，および該酵素をコードするＤＮＡ分子の提供。【解決手段】人工的な変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼ酵素ＮｏｔＩの切断活性少なくとも類似の切断活性で基質を切断することが可能である，人工的な変異を有する制限エンドヌクレアーゼ酵素であって，人工的に導入した変異の少くとも一つが特定の配列のＫ１７６Ａ，Ｒ１７７Ａ，Ｒ２５３Ａ又はＫ１５０Ａに該当する，前記人工的な変異を有する制限エンドヌクレアーゼ酵素，及び該酵素をコードするＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの人工的に導入された変異及び少なくとも２の全体的な精度指数（ＦＩ）改善係数を有する制限エンドヌクレアーゼを含み、該制限エンドヌクレアーゼが、所定の緩衝液中において、人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼの切断活性と少なくとも類似の切断活性で基質を切断することが可能であり、前記人工的に導入された変異が標的化された変異、飽和突然変異導入又はＰＣＲ増幅操作を通じて導入された変異の少なくとも１つの産物である、組成物。
【請求項２】
人工的に導入された変異の少なくとも１つが、制限エンドヌクレアーゼ中の標的部位における反対に帯電した残基での、天然に存在する残基の置換である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
人工的に導入された変異の少なくとも１つが、制限エンドヌクレアーゼ中の標的部位における、フェニルアラニン及びアラニンから選択される残基での、天然に存在する残基の置換である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
人工的に導入された変異が存在しない制限酵素が、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＳｓｐＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＭｆｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｂｆＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｖｒＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｃｉＩ、ＨｐａＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＫｐｎＩ及びＢｓａＩからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＢａｍＨＩであり、及び人工的に導入された変異がＥ１６３Ａ／Ｅ１６７Ｔ；Ｋ３０Ａ；Ｅ８６Ａ；Ｅ８６Ｐ；Ｋ８７Ａ；Ｋ８７Ｅ；Ｋ８７Ｖ；Ｋ８７Ｎ；Ｐ１４４Ａ；Ｙ１６５Ｆ；Ｅ１６７Ａ；Ｅ１６７Ｒ；Ｅ１６７Ｋ；Ｅ１６７Ｌ；Ｅ１６７Ｉ；Ｋ３０Ａ／Ｅ８６Ａ；Ｅ８６Ａ／Ｋ１０６Ａ；Ｋ３０Ａ／Ｅ８６Ａ／Ｋ１０６Ａ；Ｋ３０Ａ／Ｋ８７Ａ；Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｅ；Ｅ８６Ａ／Ｙ１６５Ｆ；Ｋ３０Ａ／Ｅ１６７Ａ；Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ；Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ；Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｔ／Ｋ８８Ｎ／Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ；Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｒ／Ｋ８８Ｇ／Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ；Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｐ／Ｋ８８Ｒ／Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ／Ｅ２１１Ｋ；Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｔ／Ｋ８８Ｒ／Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ／Ｎ１５８Ｓ；Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｓ／Ｋ８８Ｐ／Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ；Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｇ／Ｋ８８Ｓ／Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ；Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｒ／Ｋ８８Ｑ／Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ；及びＥ８６Ｐ／Ｋ８７Ｗ／Ｋ８８Ｖ；及びＥ８６Ｐ／Ｐ１７３Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＥｃｏＲＩであり、及び人工的に導入された変異がＫ６２Ａ；Ｋ６２Ｓ；Ｋ６２Ｌ；Ｒ９Ａ；Ｋ１５Ａ；Ｒ１２３Ａ；Ｋ１３０Ａ；Ｒ１３１Ａ；Ｒ１８３Ａ；Ｓ２Ｙ；Ｄ１３５Ａ；Ｒ１８７Ａ及びＫ６２Ｅからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＳｃａＩであり、及び人工的に導入された変異がＲ１８Ａ；Ｒ１１２Ａ；Ｅ１１９Ａ；Ｈ１９３Ａ；Ｓ２０１Ｆ及びＨ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＳａｌＩであり、及び人工的に導入された変異がＲ８２Ａ；Ｋ９３Ａ；Ｋ１０１Ａ及びＲ１０７Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＳｐｈＩであり、及び人工的に導入された変異がＤ９１Ａ；Ｄ１３９Ａ；Ｄ１６４Ａ及びＫ１００Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＰｓｔＩであり、及び人工的に導入された変異がＥ２０４Ａ；Ｋ２２８Ａ；Ｋ２２８Ａ／Ａ２８９Ｖ及びＤ９１Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＮｃｏＩであり、及び人工的に導入された変異がＤ５６Ａ；Ｈ１４３Ａ；Ｅ１６６Ａ；Ｒ２１２Ａ；Ｄ２６８Ａ及びＡ２Ｔ／Ｒ３１Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＮｈｅＩであり、及び人工的に導入された変異がＥ７７Ａである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＳｓｐＩであり、及び人工的に導入された変異がＨ６５Ａ；Ｋ７４Ａ；Ｅ７８Ａ；Ｅ８５Ａ；Ｅ８９Ａ；Ｋ１０９Ａ；Ｅ１１８Ａ；Ｒ１７７Ａ；Ｋ１９７Ａ及びＹ９８Ｆからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＮｏｔＩであり、及び人工的に導入された変異がＫ１７６Ａ；Ｒ１７７Ａ；Ｒ２５３Ａ及びＫ１５０Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＳａｃＩであり、及び人工的に導入された変異がＱ１１７Ｈ／Ｒ１５４Ａ／Ｌ２８４Ｐ及びＱ１１７Ｈ／Ｒ２００Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＰｖｕＩＩであり、及び人工的に導入された変異がＴ４６Ａ、Ｔ４６Ｈ、Ｔ４６Ｋ、Ｔ４６Ｙ及びＴ４６Ｇからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＭｆｅＩであり、及び人工的に導入された変異がＹ１７３Ｆ及びＱ１３Ａ／Ｆ３５Ｙからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＨｉｎｄＩＩＩであり、及び人工的に導入された変異がＳ１８８Ｐ／Ｅ１９０Ａ及びＫ１９８Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＳｂｆＩであり、及び人工的に導入された変異がＫ２５１Ａである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＥａｇＩであり、及び人工的に導入された変異がＨ４３Ａである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＥｃｏＲＶであり、及び人工的に導入された変異がＤ１９Ａ；Ｅ２７Ａ及びＤ１９Ａ／Ｅ２７Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＡｖｒＩＩであり、及び人工的に導入された変異がＹ１０４Ｆ、Ｍ２９Ａ、Ｅ９６Ａ、Ｋ１０６Ａ、Ｓ１２７Ａ及びＦ１４２Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＢｓｔＸＩであり、及び人工的に導入された変異Ｎ６５Ａ、Ｙ５７Ｆ、Ｅ７５Ａ、Ｎ７６Ａ及びＫ１９９Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＰｃｉＩであり、及び人工的に導入された変異がＥ７８Ａ／Ｓ１３３Ａである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＨｐａＩであり、及び人工的に導入された変異がＹ２９Ｆ及びＥ５６Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＡｇｅＩであり、及び人工的に導入された変異がＲ１３９Ａ及びＳ２０１Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＢｓｍＢＩであり、及び人工的に導入された変異Ｎ１８５Ｙ／Ｒ２３２Ａ；Ｈ２３０Ａ；Ｄ２３１Ａ及びＲ２３２Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＢｓｐＱＩであり、及び人工的に導入された変異がＫ２７９Ｐ／Ｒ３８８Ｆ；Ｋ２７９Ａ；Ｋ２７９Ｆ；Ｋ２７９Ｐ；Ｋ２７９Ｙ；Ｋ２７９Ｅ；Ｋ２７９Ｄ；Ｒ３８８Ａ；Ｒ３８８Ｆ；Ｒ３８８Ｙ；Ｒ３８８Ｌ；Ｋ２７９Ｐ／Ｒ３８８Ｆ；Ｋ２７９Ａ／Ｒ３８８Ａ及びＤ２４４Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＳａｐＩであり、及び人工的に導入された変異がＫ２７３Ｐ；Ｒ３８０Ａ及びＫ２７３Ｐ／Ｒ３８０Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＫｐｎＩであり、及び人工的に導入された変異がＤ１４８Ｅ；Ｄ１６Ｎ／Ｒ１１９Ａ／Ｄ１４８Ｅ；Ｄ２Ａ／Ｄ１６Ｎ／Ｄ１４８Ｅ；Ｄ１６Ｎ／Ｅ１３４Ａ／Ｄ１４８Ｅ及びＤ１６Ｎ／Ｅ１３２Ａ／Ｄ１４８Ｅからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＢｓａＩであり、及び人工的に導入された変異がＹ２３１Ｆである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１の組成物をコードするＤＮＡ分子。
【請求項３３】
請求項３２のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項３４】
請求項１の組成物を発現させるためのＤＮＡを含有する宿主細胞。
【請求項３５】
（ａ）スター活性を有する制限エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列中の何れのアミノ酸残基が帯電したアミノ酸であるかを同定すること；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子配列中の帯電した残基の１つ又はそれ以上をコードする１つ又はそれ以上のコドンを変異させること；
（ｃ）異なる帯電した残基中に１つ又はそれ以上の異なるコドン変異を有する遺伝子配列のライブラリーを作製すること；
（ｄ）変異された遺伝子配列によって発現されたタンパク質の組を取得すること；及び
（ｅ）各タンパク質に対して、所定の緩衝液中でのＦＩ及び切断活性を測定すること；
を含む、方法。
【請求項３６】
緩衝液の所定の組中のタンパク質の組に属するタンパク質に関して、全体的なＦＩ改善係数を測定することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
緩衝液の所定の組がＮＥＢ１、ＮＥＢ２、ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液から構成される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
帯電したアミノ酸に対するコドンを変異させる工程と同じ工程又はその後の工程において、水酸化されたアミノ酸をコードするコドンを変異させることをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
帯電したアミノ酸に対するコドンを変異させる工程と同じ工程又はその後の工程において、アミド含有アミノ酸をコードするコドンを変異させることをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
フェニルアラニンへ変異されるチロシンを除き、コドンがアラニンへ変異される、請求項３５、３８及び３９に記載の方法。
【請求項４１】
変異されたコドンの１つ又はそれ以上の飽和突然変異導入を用いて、全体的なＦＩ改善係数を向上させることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
制限エンドヌクレアーゼは、配列特異的な様式で、二本鎖ＤＮＡを切断する酵素である（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０２；５９０５−５９０８（２００５）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３１：１８０５−１８１２（２００３）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３３：Ｄ２３０−２３２（２００５）；Ａｌｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，”ｅｄ．Ｐｉｎｇｏｕｄ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３９３−４０７（２００４））。制限エンドヌクレアーゼは、原核生物の間に遍在しており（Ｒａｌｅｉｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈ．８，ｅｄｓ．Ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７８−９２（１９９８））、原核生物中で、制限エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼとメチル転移酵素から主としてなる制限−修飾系の一部を形成する。同族メチル転移酵素は、宿主ＤＮＡが適切に保護され得るように、その対形成したエンドヌクレアーゼが修飾されたＤＮＡを認識し、これをエンドヌクレアーゼによる切断に対して抵抗性とする同じ特異的配列をメチル化する。しかしながら、外来ＤＮＡ、特に、バクテリオファージＤＮＡの侵入が存在する場合には、外来ＤＮＡが完全にメチル化され得る前に、外来ＤＮＡは分解される。制限−修飾系の主な生物学的機能は、バクテリオファージの感染から宿主を保護することである（Ａｒｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０５：３６１−３６５（１９７９））。組換え及び転位への関与などの他の機能も示唆されている（Ｃａｒｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２７：６７１−６７６（１９９８）；Ｈｅｉｔｍａｎ，Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ（Ｎ  Ｙ），１５：５７−１０８（１９９３）；ＭｃＫａｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３９：３５−４３（１９９５））。
【０００２】
２５０超の異なる標的配列に対する約３，０００の公知の制限エンドヌクレアーゼの特異性は、その最も興味深い特徴であると考えることができる。最初の制限エンドヌクレアーゼの配列特異的性質の発見後（Ｄａｎｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，６８：２９１３−２９１７（１９７１）；Ｋｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，５１：３９３−４０９（１９７０））、ある種の制限エンドヌクレアーゼは、最適でない条件下において、所定の認識配列と類似であるが、同一でない配列を切断することを科学者が発見するのに時間はかからなかった（Ｐｏｌｉｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，７２：３３１０−３３１４（１９７５）；Ｎａｓｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１４：８１１−８２１（１９８６））。この緩和された特異性は、制限エンドヌクレアーゼのスター活性と称される。制限エンドヌクレアーゼとＤＮＡ間での水によって媒介される相互作用が特異的複合体とスター複合体の間の中心的な差であることが示唆されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３４：３０２−３０６（１９９３）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９２：３４４４−３４４８（１９９５），Ｓｉｄｏｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，８７：２５６４−２５７６（２００４））。
【０００３】
スター活性は、分子生物学の反応における問題である。スター活性は、クローニングベクター又は他のＤＮＡ中に望ましくない切断を導入する。特有のフィンガープリントを生じさせるために、ある種のＤＮＡ基質が制限エンドヌクレアーゼによって切断される必要がある法医学的用途などの場合には、スター活性は、切断パターン特性を変化させることにより、分析を困難にする。スター活性を回避することは、鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８９：３９２−３９６（１９９２））及び遺伝子発現の連続分析（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４８４−４８７（１９９５））などの用途においても不可欠である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０２、２００５年、ｐｐ．５９０５−５９０８
【非特許文献２】Ｒｏｂｅｒｔｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３１、２００３年、ｐｐ．１８０５−１８１２Ｒｏｂｅｒｔｓ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３３、２００５年、Ｄ２３０−２３２
【非特許文献３】Ａｌｖｅｓ他、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，”ｅｄ．Ｐｉｎｇｏｕｄ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００４年、ｐｐ．３９３−４０７
【非特許文献４】Ｒａｌｅｉｇｈ他、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈ．８，ｅｄｓ．
【非特許文献５】Ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｉｎ他、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７８−９２（１９９８）
【非特許文献６】Ａｒｂｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０５、１９７９年、ｐｐ．３６１−３６５
【非特許文献７】Ｃａｒｌｓｏｎ他、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２７、１９９８年、ｐｐ．６７１−６７６
【非特許文献８】Ｈｅｉｔｍａｎ，Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ（Ｎ  Ｙ），１５、１９９３年、ｐｐ．５７−１０８
【非特許文献９】ＭｃＫａｎｅ他、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３９、１９９５年、ｐｐ．３５−４３
【非特許文献１０】Ｄａｎｎａ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，６８、１９７１年、ｐｐ．２９１３−２９１７
【非特許文献１１】Ｋｅｌｌｙ他、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，５１、１９７０年、ｐｐ．３９３−４０９
【非特許文献１２】Ｐｏｌｉｓｋｙ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，７２、１９７５年、ｐｐ．３３１０−３３１４
【非特許文献１３】Ｎａｓｒｉ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１４、１９８６年、ｐｐ．８１１−８２１
【非特許文献１４】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３４、１９９３年、ｐｐ．３０２−３０６
【非特許文献１５】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９２、１９９５年、ｐｐ．３４４４−３４４８
【非特許文献１６】Ｓｉｄｏｒｏｖａ他、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，８７、２００４年、ｐｐ．２５６４−２５７６
【非特許文献１７】Ｗａｌｋｅｒ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８９、１９９２年、ｐｐ．３９２−３９６
【非特許文献１８】Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０、１９９５年、ｐｐ．４８４−４８７
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一実施形態において、人工的に導入された少なくとも１つの変異及び少なくとも２の全体的精度指数（ＦＩ；ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）改善係数を有する制限エンドヌクレアーゼを含み、前記制限エンドヌクレアーゼが所定の緩衝液中において、人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼと少なくとも類似の切断活性で基質を切断することができ、人工的に導入された変異が標的化された変異、飽和変異導入又はＰＣＲ増幅操作を通じて導入された変異の少なくとも１つの産物である組成物が提供される。
【０００６】
本発明のさらなる実施形態において、人工的に導入された変異の少なくとも１つは、反対に帯電した残基での天然に存在する残基の置換から生じた標的化された変異である。アラニン又はフェニルアラニンが、標的部位の天然に存在する残基を置換し得る。
【０００７】
本発明のさらなる実施形態において、上記種類の組成物は、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＳｓｐＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＭｆｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｂｆＩ、ＥｇａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｖｒＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｃｉＩ、ＨｐａＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＫｐｎＩ及びＢｓａＩからなる群から選択される人工的に導入された変異が存在しない制限酵素を含む。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態は、表４に列記されている組成物を含む。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態において、表４に列記されている酵素の何れかをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター及び該ベクターからタンパク質を発現させるための宿主細胞が提供される。
【００１０】
本発明の一実施形態において、（ａ）スター活性を有する制限エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列中の何れのアミノ酸残基が帯電したアミノ酸であるかを同定する工程；（ｂ）制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子配列中の帯電した残基の１つ又はそれ以上をコードする１つ又はそれ以上のコドンを変異させる工程；（ｃ）異なる帯電した残基中の１つ又はそれ以上の異なるコドン変異を有する遺伝子配列のライブラリーを作製する工程；（ｄ）変異された遺伝子配列によって発現されたタンパク質の組を取得する工程；及び（ｅ）それぞれの発現されたタンパク質に対して、所定の緩衝液中でのＦＩ及び切断活性を測定する工程を有する方法が提供される。
【００１１】
前記方法の実施形態は、一群の所定の緩衝液（例えば、一群の緩衝液は、ＮＥＢ１、ＮＥＢ２、ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液を含有する。）中での、タンパク質の群に属するタンパク質に対して、全体的ＦＩ改善係数を測定する工程を含む。
【００１２】
前記方法の実施形態は、上記工程を含み、及び帯電したアミノ酸に対するコドンを変異させる工程と同じ工程において又はその後の工程において、水酸化されたアミノ酸又はアミドアミノ酸をコードするコドンをさらに変異させることを含む。
【００１３】
上記発明の一実施形態において、コドンは、フェニルアラニンへ変異されるチロシンを除き、アラニンへ変異される。
【００１４】
さらなる実施形態において、全体的ＦＩ改善係数は、変異されたコドンの１つ又はそれ以上の飽和突然変異導入を用いて改善される。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１−３２に関して、
＊記号は、その左側のレーンが、スター活性が観察された酵素の最低濃度を含有することを示す。
【００１６】
＃記号は、基質の完全な切断に十分な酵素の濃度を含有するレーンと隣接する及び右側の、不完全な切断を示すレーンを表す。
【００１７】
灰色の三角は、制限エンドヌクレアーゼ濃度の連続的減少を表す。
【００１８】
「Ｕ」は、酵素の単位を表す。
【００１９】
図１から３２に記載されている反応のそれぞれにおいて、反応混合物は、別段の記載がなければ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから得た緩衝液の３μＬ（表１及びＮＥＢのカタログ参照）、別段の記載がなければ、ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから得た希釈液中の指定された制限エンドヌクレアーゼ（表１及びＮＥＢのカタログ参照）の３μＬの容量並びに指定された基質（０．６μｇを含有する。）基質の可変容量及び反応混合物を合計３０μＬとするための水の容量を含有する。
【００２０】
反応は、３７℃で、１時間の温置時間で行った。結果は、０．８％アガロースゲル上で分析する。反応混合物の全体的容量、基質の量、反応の温度又は温置時間が上記のものから変動する場合には、図面の説明中に値が記載されている。
【００２１】
図１、５、８、１１から１８及び２０から３２に対するゲルの右側に、理論的消化パターンが与えられている。１つの制限エンドヌクレアーゼ部位のみを有する基質は、スーパーコイル化された形態に由来する１つの直線状バンドへ消化されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＮＥＢ３緩衝液中のＷＴＳｃａＩ（１，２００Ｕ）の調製物の希釈剤Ａを用いた２倍系列希釈で、λＤＮＡ基質（０．６μｇ）１．２μＬを消化し、アガロースゲル上で消化産物を調べることによる、野生型（ＷＴ）ＳｃａＩに対するＦＩの測定を示している。スター活性を持たない制限エンドヌクレアーゼの最高濃度は実線矢印で示されており、基質の完全な消化をもたらす最低濃度は、白抜きの矢印によって示されている。
【図２Ａ】１７２Ｕ又は５１２Ｕの開始濃度で１時間、希釈剤Ａを用いた３倍系列希釈中において、ＷＴＢａｍＨＩ又はＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）酵素で、ｐＵＣ１９基質（０．５μｇ）０．５μＬを消化したことの結果を示している。中央のレーンは、ＮＥＢ１ｋｂマーカーである（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。図２Ａは、ＮＥＢ１緩衝液を用いた結果を示している。
【図２Ｂ】１７２Ｕ又は５１２Ｕの開始濃度で１時間、希釈剤Ａを用いた３倍系列希釈中において、ＷＴＢａｍＨＩ又はＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）酵素で、ｐＵＣ１９基質（０．５μｇ）０．５μＬを消化したことの結果を示している。中央のレーンは、ＮＥＢ１ｋｂマーカーである（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。図２Ｂは、ＮＥＢ２緩衝液を用いた結果を示している。
【図２Ｃ】１７２Ｕ又は５１２Ｕの開始濃度で１時間、希釈剤Ａを用いた３倍系列希釈中において、ＷＴＢａｍＨＩ又はＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）酵素で、ｐＵＣ１９基質（０．５μｇ）０．５μＬを消化したことの結果を示している。中央のレーンは、ＮＥＢ１ｋｂマーカーである（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。図２Ｃは、ＮＥＢ３緩衝液を用いた結果を示している。
【図２Ｄ】１７２Ｕ又は５１２Ｕの開始濃度で１時間、希釈剤Ａを用いた３倍系列希釈中において、ＷＴＢａｍＨＩ又はＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）酵素で、ｐＵＣ１９基質（０．５μｇ）０．５μＬを消化したことの結果を示している。中央のレーンは、ＮＥＢ１ｋｂマーカーである（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。図２Ｄは、ＮＥＢ４緩衝液を用いた結果を示している。
【図３Ａ】希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中で酵素の６００Ｕの開始濃度を使用し、ＮＥＢ２緩衝液中のｐＢＲ３２２基質０．６μＬ（１つのＢａｍＨＩ切断部位のみを含有する。）を使用した、２つの時点にわたるＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）活性の比較を示す。図３Ａは、１時間での結果を示す。
【図３Ｂ】希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中で酵素の６００Ｕの開始濃度を使用し、ＮＥＢ２緩衝液中のｐＢＲ３２２基質０．６μＬ（１つのＢａｍＨＩ切断部位のみを含有する。）を使用した、２つの時点にわたるＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）活性の比較を示す。図３Ｂは、１４時間での結果を示す。
【図４Ａ】アガロースゲル上での、２つの異なる緩衝液中での１４時間の温置後における、希釈液Ａを用いたＢａｍＨＩ−ＨＦ（Ｅ１６３Ａ／Ｅ１６７Ｔ）の２倍系列希釈中でのｐＢＲ３２２基質０．６μＬの切断を示している。図４Ａは、酵素の６００Ｕの開始濃度を加えたＮＥＢ２緩衝液での結果を示している。
【図４Ｂ】アガロースゲル上での、２つの異なる緩衝液中での１４時間の温置後における、希釈液Ａを用いたＢａｍＨＩ−ＨＦ（Ｅ１６３Ａ／Ｅ１６７Ｔ）の２倍系列希釈中でのｐＢＲ３２２基質０．６μＬの切断を示している。図４Ｂは、酵素の２，４００Ｕの開始濃度を加えたＮＥＢ１緩衝液での結果を示している。
【図５Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＢａｍＨＩ−ＨＦ及びＷＴＢａｍＨＩを用いた切断反応の比較を示している。反応は、希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中のλＤＮＡ基質１．２μＬを用いて、ＮＥＢ４緩衝液中で行った。図５Ａは、ＦＩが４に等しい１，２００Ｕの開始濃度を有するＷＴＢａｍＨＩを示している。
【図５Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＢａｍＨＩ−ＨＦ及びＷＴＢａｍＨＩを用いた切断反応の比較を示している。反応は、希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中のλＤＮＡ基質１．２μＬを用いて、ＮＥＢ４緩衝液中で行った。図５Ｂは、ＦＩ＞４，０００である２，４００Ｕの開始濃度を有するＢａｍＨＩ−ＨＦを示す。
【図６Ａ】ＮＥＢ希釈剤Ｃを用いた３倍系列希釈中での、ＮＥＢ１から４緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）の比較を示している。反応混合物は、ＮＥＢ１から４緩衝液中のλＤＮＡ基質２μＬ（１μｇ）を含有した。図６Ａは、ＮＥＢ２緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩの１２０Ｕ及びＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）の２４０Ｕ、２倍系列希釈後の切断結果を示している。
【図６Ｂ】ＮＥＢ希釈剤Ｃを用いた３倍系列希釈中での、ＮＥＢ１から４緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）の比較を示している。反応混合物は、ＮＥＢ１から４緩衝液中のλＤＮＡ基質２μＬ（１μｇ）を含有した。図６Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩの１２０Ｕ及びＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）の２４０Ｕ、２倍系列希釈後の切断結果を示している。
【図６Ｃ】ＮＥＢ希釈剤Ｃを用いた３倍系列希釈中での、ＮＥＢ１から４緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）の比較を示している。反応混合物は、ＮＥＢ１から４緩衝液中のλＤＮＡ基質２μＬ（１μｇ）を含有した。図６Ｃは、ＮＥＢ１緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩの６０Ｕ及びＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）の１２０Ｕ、２倍系列希釈後の切断結果を示している。
【図６Ｄ】ＮＥＢ希釈剤Ｃを用いた３倍系列希釈中での、ＮＥＢ１から４緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）の比較を示している。反応混合物は、ＮＥＢ１から４緩衝液中のλＤＮＡ基質２μＬ（１μｇ）を含有した。図６Ｄは、ＮＥＢ３緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩの１２０Ｕ及びＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）の６０Ｕ、２倍系列希釈後の切断結果を示している。
【図７Ａ】２つの異なるＥｃｏＲＩ変異体及びＷＴＥｃｏＲＩを用いた切断結果を示している。様々な緩衝液中のＬｉｔｍｕｓ２８基質０．６μＬを使用した、１０時間にわたる、酵素１００，０００Ｕ及び希釈液Ｃ中でのその１０倍系列希釈の消化が示されている。Ｌｉｔｍｕｓ２８基質中には、１つのＥｃｏＲＩ切断部位のみが存在する。図７Ａ：ＮＥＢ４緩衝液中のＥｃｏＲＩ変異体Ｋ６２Ｅ。
【図７Ｂ】２つの異なるＥｃｏＲＩ変異体及びＷＴＥｃｏＲＩを用いた切断結果を示している。様々な緩衝液中のＬｉｔｍｕｓ２８基質０．６μＬを使用した、１０時間にわたる、酵素１００，０００Ｕ及び希釈液Ｃ中でのその１０倍系列希釈の消化が示されている。Ｌｉｔｍｕｓ２８基質中には、１つのＥｃｏＲＩ切断部位のみが存在する。図７Ｂ：ＮＥＢ４緩衝液中のＥｃｏＲＩ変異体Ｋ６２Ａ。
【図７Ｃ】２つの異なるＥｃｏＲＩ変異体及びＷＴＥｃｏＲＩを用いた切断結果を示している。様々な緩衝液中のＬｉｔｍｕｓ２８基質０．６μＬを使用した、１０時間にわたる、酵素１００，０００Ｕ及び希釈液Ｃ中でのその１０倍系列希釈の消化が示されている。Ｌｉｔｍｕｓ２８基質中には、１つのＥｃｏＲＩ切断部位のみが存在する。図７Ｃ：ＥｃｏＲＩ緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩ（ＮＥＢカタログ２００７−８参照）。
【図８Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＷＴＥｃｏＲＩの比較を示している。反応は、希釈液Ｃを用いた２倍系列希釈中のλＤＮＡ基質１．２μＬを使用した。図８Ａ：１９，２００Ｕの開始濃度を有するＷＴＥｃｏＲＩは、ＮＥＢ４緩衝液中でＦＩ＝４を示す。
【図８Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＷＴＥｃｏＲＩの比較を示している。反応は、希釈液Ｃを用いた２倍系列希釈中のλＤＮＡ基質１．２μＬを使用した。図８Ｂ：３８，４００Ｕの開始濃度を有するＥｃｏＲＩ−ＨＦは、ＮＥＢ４緩衝液中でＦＩ＝１６，０００を示す。
【図９Ａ】ＷＴＳｃａＩ（４．８Ｕ）、ＳｃａＩ（Ｈ１９３Ａ）（９．６Ｕ）、ＳｃａＩ（Ｓ２０１Ｆ）（１９．２Ｕ）及びＳｃａＩ（Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆ）（１９．２Ｕ）の系列希釈の比較を示している。各試料は、ます、１／１０に希釈した後、グリセロールの指定されたパーセントを有するＮＥＢ２緩衝液中で２倍系列希釈を行った。各反応混合物は、λＤＮＡ基質（１μｇ）２μＬを含有する。図９Ａ：５％グリセロール。
【図９Ｂ】ＷＴＳｃａＩ（４．８Ｕ）、ＳｃａＩ（Ｈ１９３Ａ）（９．６Ｕ）、ＳｃａＩ（Ｓ２０１Ｆ）（１９．２Ｕ）及びＳｃａＩ（Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆ）（１９．２Ｕ）の系列希釈の比較を示している。各試料は、ます、１／１０に希釈した後、グリセロールの指定されたパーセントを有するＮＥＢ２緩衝液中で２倍系列希釈を行った。各反応混合物は、λＤＮＡ基質（１μｇ）２μＬを含有する。図９Ｂ：３７％グリセロール。
【図１０Ａ】ＷＴＳｃａＩ及びＳｃａＩ−ＨＦ（Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆ）の比較を示している。酵素（指定されている単位濃度）は、希釈液Ａを用いて、２．５倍系列希釈でそれぞれ希釈した。反応混合物は、λＤＮＡ基質２μＬ及びＮＥＢ１から４緩衝液を含有する。図１０Ａ：ＮＥＢ２緩衝液中での切断。
【図１０Ｂ】ＷＴＳｃａＩ及びＳｃａＩ−ＨＦ（Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆ）の比較を示している。酵素（指定されている単位濃度）は、希釈液Ａを用いて、２．５倍系列希釈でそれぞれ希釈した。反応混合物は、λＤＮＡ基質２μＬ及びＮＥＢ１から４緩衝液を含有する。図１０Ｂ：ＮＥＢ４緩衝液中での切断。
【図１０Ｃ】ＷＴＳｃａＩ及びＳｃａＩ−ＨＦ（Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆ）の比較を示している。酵素（指定されている単位濃度）は、希釈液Ａを用いて、２．５倍系列希釈でそれぞれ希釈した。反応混合物は、λＤＮＡ基質２μＬ及びＮＥＢ１から４緩衝液を含有する。図１０Ｃ：ＮＥＢ１緩衝液中での切断。
【図１０Ｄ】ＷＴＳｃａＩ及びＳｃａＩ−ＨＦ（Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆ）の比較を示している。酵素（指定されている単位濃度）は、希釈液Ａを用いて、２．５倍系列希釈でそれぞれ希釈した。反応混合物は、λＤＮＡ基質２μＬ及びＮＥＢ１から４緩衝液を含有する。図１０Ｄ：ＮＥＢ３緩衝液中での切断。
【図１１Ａ】ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩに対するＦＩ測定を示している。両酵素は、希釈液Ａを用いて、２倍系列希釈中に希釈した。反応混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡ基質２μＬを含有する。図１１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ、ＮＥＢ１、２、３及び４緩衝液中で、ＦＩ＞１，０００、ＦＩ＞２，０００、ＦＩ＞５００及びＦＩ＞２，０００を示すＳａｌＩ−ＨＦの１，２００Ｕ、１，２００Ｕ、３００Ｕ及び１，２００Ｕの系列希釈を示す。
【図１１Ｂ】ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩに対するＦＩ測定を示している。両酵素は、希釈液Ａを用いて、２倍系列希釈中に希釈した。反応混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡ基質２μＬを含有する。図１１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ、ＮＥＢ１、２、３及び４緩衝液中で、ＦＩ＞１，０００、ＦＩ＞２，０００、ＦＩ＞５００及びＦＩ＞２，０００を示すＳａｌＩ−ＨＦの１，２００Ｕ、１，２００Ｕ、３００Ｕ及び１，２００Ｕの系列希釈を示す。
【図１１Ｃ】ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩに対するＦＩ測定を示している。両酵素は、希釈液Ａを用いて、２倍系列希釈中に希釈した。反応混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡ基質２μＬを含有する。図１１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ、ＮＥＢ１、２、３及び４緩衝液中で、ＦＩ＞１，０００、ＦＩ＞２，０００、ＦＩ＞５００及びＦＩ＞２，０００を示すＳａｌＩ−ＨＦの１，２００Ｕ、１，２００Ｕ、３００Ｕ及び１，２００Ｕの系列希釈を示す。
【図１１Ｄ】ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩに対するＦＩ測定を示している。両酵素は、希釈液Ａを用いて、２倍系列希釈中に希釈した。反応混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡ基質２μＬを含有する。図１１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ、ＮＥＢ１、２、３及び４緩衝液中で、ＦＩ＞１，０００、ＦＩ＞２，０００、ＦＩ＞５００及びＦＩ＞２，０００を示すＳａｌＩ−ＨＦの１，２００Ｕ、１，２００Ｕ、３００Ｕ及び１，２００Ｕの系列希釈を示す。
【図１１Ｅ】ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩに対するＦＩ測定を示している。両酵素は、希釈液Ａを用いて、２倍系列希釈中に希釈した。反応混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡ基質２μＬを含有する。図１１Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、それぞれ、ＮＥＢ１、２、３及び４緩衝液中で、ＦＩ＝８、ＦＩ＝１、ＦＩ＝３２及びＦＩ＝１を示すＷＴＳａｌＩの１９．２Ｕ、１５０Ｕ、９，６００Ｕ及び３８．４Ｕの系列希釈を示す。
【図１１Ｆ】ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩに対するＦＩ測定を示している。両酵素は、希釈液Ａを用いて、２倍系列希釈中に希釈した。反応混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡ基質２μＬを含有する。図１１Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、それぞれ、ＮＥＢ１、２、３及び４緩衝液中で、ＦＩ＝８、ＦＩ＝１、ＦＩ＝３２及びＦＩ＝１を示すＷＴＳａｌＩの１９．２Ｕ、１５０Ｕ、９，６００Ｕ及び３８．４Ｕの系列希釈を示す。
【図１１Ｇ】ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩに対するＦＩ測定を示している。両酵素は、希釈液Ａを用いて、２倍系列希釈中に希釈した。反応混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡ基質２μＬを含有する。図１１Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、それぞれ、ＮＥＢ１、２、３及び４緩衝液中で、ＦＩ＝８、ＦＩ＝１、ＦＩ＝３２及びＦＩ＝１を示すＷＴＳａｌＩの１９．２Ｕ、１５０Ｕ、９，６００Ｕ及び３８．４Ｕの系列希釈を示す。
【図１１Ｈ】ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩに対するＦＩ測定を示している。両酵素は、希釈液Ａを用いて、２倍系列希釈中に希釈した。反応混合物は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡ基質２μＬを含有する。図１１Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、それぞれ、ＮＥＢ１、２、３及び４緩衝液中で、ＦＩ＝８、ＦＩ＝１、ＦＩ＝３２及びＦＩ＝１を示すＷＴＳａｌＩの１９．２Ｕ、１５０Ｕ、９，６００Ｕ及び３８．４Ｕの系列希釈を示す。
【図１２Ａ】λＤＮＡ基質１．２μＬを加えたＮＥＢ４緩衝液中で反応された、希釈液Ａ中のＳｐｈＩ−ＨＦ（１９，２００Ｕ）及び希釈液Ｂ中のＷＴＳｐｈａＩ（１４３，６００Ｕ）の２倍系列希釈の結果を示している。図１２Ａは、ＷＴＳｐｈＩによる切断を示す。
【図１２Ｂ】λＤＮＡ基質１．２μＬを加えたＮＥＢ４緩衝液中で反応された、希釈液Ａ中のＳｐｈＩ−ＨＦ（１９，２００Ｕ）及び希釈液Ｂ中のＷＴＳｐｈａＩ（１４３，６００Ｕ）の２倍系列希釈の結果を示している。図１２Ｂは、ＳｐｈＩ−ＨＦによる切断を示す。
【図１３Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＰｓｔＩ−ＨＦの２倍系列希釈（３００Ｕ及び１５０Ｕ）及びＷＴＰｓｔＩの２倍系列希釈（２，４００Ｕ及び４，８００Ｕ）を用いたλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示す。系列希釈は、希釈液Ｃ中で行った。図１３Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＰｓｔＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図１３Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＰｓｔＩ−ＨＦの２倍系列希釈（３００Ｕ及び１５０Ｕ）及びＷＴＰｓｔＩの２倍系列希釈（２，４００Ｕ及び４，８００Ｕ）を用いたλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示す。系列希釈は、希釈液Ｃ中で行った。図１３Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＰｓｔＩによる切断を示している。
【図１４Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＮｃｏＩ−ＨＦの２倍系列希釈（４，８００Ｕ及び６００Ｕ）及びＷＴＮｃｏＩ（４，８００Ｕ及び１，２００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、λＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図１４Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＮｃｏＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図１４Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＮｃｏＩ−ＨＦの２倍系列希釈（４，８００Ｕ及び６００Ｕ）及びＷＴＮｃｏＩ（４，８００Ｕ及び１，２００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、λＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図１４Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＮｃｏＩによる切断を示している。
【図１５Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＮｈｅＩ−ＨＦ（２８７，２００Ｕ及び７６．８Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＮｈｅＩ（９，６００Ｕ及び３００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、ｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図１５Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＮｈｅＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図１５Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＮｈｅＩ−ＨＦ（２８７，２００Ｕ及び７６．８Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＮｈｅＩ（９，６００Ｕ及び３００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、ｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図１５Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＮｈｅＩによる切断を示している。
【図１６Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＳｓｐＩ−ＨＦ（９，６００Ｕ及び３８．４Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＳｓｐＩ（１９，２００Ｕ及び１９，２００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、λＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ｃ中で行った。図１６Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＳｓｐＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図１６Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＳｓｐＩ−ＨＦ（９，６００Ｕ及び３８．４Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＳｓｐＩ（１９，２００Ｕ及び１９，２００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、λＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ｃ中で行った。図１６Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＳｓｐＩによる切断を示している。
【図１７Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＮｏｔＩ−ＨＦ（２８７，２００Ｕ及び１９，２００Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＮｏｔＩ（１９，２００Ｕ及び７６，８００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、ｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ｃ中で行った。図１７Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＮｏｔＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図１７Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＮｏｔＩ−ＨＦ（２８７，２００Ｕ及び１９，２００Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＮｏｔＩ（１９，２００Ｕ及び７６，８００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、ｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ｃ中で行った。図１７Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＮｏｔＩＩによる切断を示している。
【図１８Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＳａｃＩ−ＨＦ（４，８００Ｕ及び７６．８Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＳａｃＩ（１９，２００Ｕ及び１２００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、ｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図１８Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＳａｃＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図１８Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＳａｃＩ−ＨＦ（４，８００Ｕ及び７６．８Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＳａｃＩ（１９，２００Ｕ及び１２００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、ｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図１８Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＳａｃＩによる切断を示している。
【図１９Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＰｖｕＩＩ−ＨＦ（９，６００Ｕ及び１９．２Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＰｖｕＩＩ（１９，２００Ｕ及び３００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ基質０．６μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図１９Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＰｖｕＩＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図１９Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＰｖｕＩＩ−ＨＦ（９，６００Ｕ及び１９．２Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＰｖｕＩＩ（１９，２００Ｕ及び３００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ基質０．６μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図１９Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＰｖｕＩＩによる切断を示している。
【図２０Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＭｆｅＩ−ＨＦ（３００Ｕ及び１９．２Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＭｆｅＩ（２，４００Ｕ及び３８．４Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、λＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図２０Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＭｆｅＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図２０Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＭｆｅＩ−ＨＦ（３００Ｕ及び１９．２Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＭｆｅＩ（２，４００Ｕ及び３８．４Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、λＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図２０Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＭｆｅＩによる切断を示している。
【図２１Ａ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ（４，８００Ｕ及び１，２００Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＨｉｎｄＩＩＩ（９，６００Ｕ及び４，８００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、λＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図２１Ａは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図２１Ｂ】ＮＥＢ３及びＮＥＢ４緩衝液中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ（４，８００Ｕ及び１，２００Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＨｉｎｄＩＩＩ（９，６００Ｕ及び４，８００Ｕ）の２倍系列希釈を用いた、λＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。系列希釈は、希釈液Ａ中で行った。図２１Ｂは、ＮＥＢ４緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ３緩衝液（下パネル）中でのＷＴＨｉｎｄＩＩＩによる切断を示している。
【図２２Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＳｂｆＩ−ＨＦ（開始濃度：７６，８００Ｕ）及びＷＴＳｂｆＩ（開始濃度：７６，８００Ｕ）の希釈液Ｃを用いた２倍系列希釈中でのλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２２Ａは、ＷＴＳｂｆＩによる切断を示している。
【図２２Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＳｂｆＩ−ＨＦ（開始濃度：７６，８００Ｕ）及びＷＴＳｂｆＩ（開始濃度：７６，８００Ｕ）の希釈液Ｃを用いた２倍系列希釈中でのλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２２Ｂは、ＳｂｆＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図２３Ａ】希釈液Ｃを用いた、それぞれ、ＮＥＢ２及びＮＥＢ１緩衝液中のＥａｇＩ−ＨＦ（１，２００Ｕ及び６００Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＥａｇＩ（１５０Ｕ及び３８．４Ｕ）の２倍系列希釈中での、ｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２３Ａは、ＮＥＢ２緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ１緩衝液（下パネル）中でのＥａｇＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図２３Ｂ】希釈液Ｃを用いた、それぞれ、ＮＥＢ２及びＮＥＢ１緩衝液中のＥａｇＩ−ＨＦ（１，２００Ｕ及び６００Ｕ）の２倍系列希釈及びＷＴＥａｇＩ（１５０Ｕ及び３８．４Ｕ）の２倍系列希釈中での、ｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２３Ｂは、ＮＥＢ２緩衝液（上パネル）及びＮＥＢ１緩衝液（下パネル）中でのＷＴＥａｇＩによる切断を示している。
【図２４Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＥｃｏＲＶ−ＨＦ（開始濃度：３８，４００Ｕ）及びＷＴＥｃｏＲＶ（開始濃度：２，００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２４Ａは、ＷＴＥｃｏＲＶによる切断を示している。
【図２４Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＥｃｏＲＶ−ＨＦ（開始濃度：３８，４００Ｕ）及びＷＴＥｃｏＲＶ（開始濃度：２，００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２４Ｂは、ＥｃｏＲＶ−ＨＦによる切断を示している。
【図２５Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＡｖｒＩＩ−ＨＦ（開始濃度：１，２００Ｕ）及びＷＴＡｖｒＩＩ（開始濃度：１，２００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのＴ７ＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２５Ａは、ＷＴＡｖｒＩＩによる切断を示している。
【図２５Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＡｖｒＩＩ−ＨＦ（開始濃度：１，２００Ｕ）及びＷＴＡｖｒＩＩ（開始濃度：１，２００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのＴ７ＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２５Ｂは、ＡｖｒＩＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図２６Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＢｓｔＸＩ−ＨＦ（開始濃度：３００Ｕ）及びＷＴＢｓｔＸＩ（開始濃度：３８．４Ｕ）の希釈液Ａ中での２倍系列希釈によるλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。反応は、５５℃で行った。図２６Ａは、ＷＴＢｓｔＸＩによる切断を示している。
【図２６Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＢｓｔＸＩ−ＨＦ（開始濃度：３００Ｕ）及びＷＴＢｓｔＸＩ（開始濃度：３８．４Ｕ）の希釈液Ａ中での２倍系列希釈によるλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。反応は、５５℃で行った。図２６Ｂは、ＢｓｔＸＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図２７Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＰｃｉＩ−ＨＦ（開始濃度：６００Ｕ）及びＷＴＰｃｉＩ（開始濃度：３００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２７Ａは、ＷＴＰｃｉＩによる切断を示している。
【図２７Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＰｃｉＩ−ＨＦ（開始濃度：６００Ｕ）及びＷＴＰｃｉＩ（開始濃度：３００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２７Ｂは、ＰｃｉＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図２８Ａ】ＮＥＢ２緩衝液中のＨｐａＩ−ＨＦ（開始濃度：４，８００Ｕ）及びＷＴＨｐａＩ（開始濃度９，６００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２８Ａは、ＷＴＨｐａＩによる切断を示している。
【図２８Ｂ】ＮＥＢ２緩衝液中のＨｐａＩ−ＨＦ（開始濃度：４，８００Ｕ）及びＷＴＨｐａＩ（開始濃度９，６００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２８Ｂは、ＨｐａＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図２９Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＡｇｅＩ−ＨＦ（開始濃度：６００Ｕ）及びＷＴＡｇｅＩ（開始濃度６００Ｕ）の希釈液Ｃを用いた２倍系列希釈中でのｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２９Ａは、ＷＴＡｇｅＩによる切断を示している。
【図２９Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＡｇｅＩ−ＨＦ（開始濃度：６００Ｕ）及びＷＴＡｇｅＩ（開始濃度６００Ｕ）の希釈液Ｃを用いた２倍系列希釈中でのｐＸｂａＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。図２９Ｂは、ＡｇｅＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図３０Ａ】ＮＥＢ４緩衝液中のＢｓｍＢＩ−ＨＦ（開始濃度：３００Ｕ）及びＷＴＢｓｍＢＩ（開始濃度：４，８００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。反応は、５５℃で行う。図３０Ａは、ＷＴＢｓｍＢＩによる切断を示している。
【図３０Ｂ】ＮＥＢ４緩衝液中のＢｓｍＢＩ−ＨＦ（開始濃度：３００Ｕ）及びＷＴＢｓｍＢＩ（開始濃度：４，８００Ｕ）の希釈液Ａを用いた２倍系列希釈中でのλＤＮＡ基質１．２μＬの切断を示している。反応は、５５℃で行う。図３０Ｂは、ＢｓｍＢＩ−ＨＦによる切断を示している。
【図３１Ａ】ＥｃｏＲＩ及びＭｆｅＩの発現のための、ＭｌｕＣＩＭのＤＮＡ配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）を示している。
【図３１Ｂ】ＥｃｏＲＩ及びＭｆｅＩの発現のための、ＭｌｕＣＩＭのＤＮＡ配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）を示している。
【図３２】ＳａｌＩの発現のためのＨｐｙ１６６ＩＩＭのＤＮＡ配列（配列番号３）を示している。
【図３３Ａ】ＭｆｅＩのＤＮＡ配列（配列番号４）及びタンパク質配列（配列番号５）を示している。
【図３３Ｂ】ＭｆｅＩのＤＮＡ配列（配列番号４）及びタンパク質配列（配列番号５）を示している。
【図３４Ａ】ＢｓｔＸＩのＤＮＡ配列（配列番号６）及びタンパク質配列（配列番号７）を示している。
【図３４Ｂ】ＢｓｔＸＩのＤＮＡ配列（配列番号６）及びタンパク質配列（配列番号７）を示している。
【図３５Ａ】Ｍ．ＢｓｔＸＩのＤＮＡ配列（配列番号８）及びタンパク質配列（配列番号９）を示している。
【図３５Ｂ】Ｍ．ＢｓｔＸＩのＤＮＡ配列（配列番号８）及びタンパク質配列（配列番号９）を示している。
【図３６Ａ】Ｓ．ＢｓｔＸＩのＤＮＡ配列（配列番号１０）及びタンパク質配列（配列番号１１）を示している。
【図３６Ｂ】Ｓ．ＢｓｔＸＩのＤＮＡ配列（配列番号１０）及びタンパク質配列（配列番号１１）を示している。
【図３７Ａ】ＰｃｉＩのＤＮＡ配列（配列番号１２）及びタンパク質配列（配列番号１３）を示している。
【図３７Ｂ】ＰｃｉＩのＤＮＡ配列（配列番号１２）及びタンパク質配列（配列番号１３）を示している。
【図３８Ａ】Ｍ．ＰｃｉＩのＤＮＡ配列（配列番号１４）及びタンパク質配列（配列番号１５）を示している。
【図３８Ｂ】Ｍ．ＰｃｉＩのＤＮＡ配列（配列番号１４）及びタンパク質配列（配列番号１５）を示している。
【図３９】ＳａｐＩ及びＢａｓｐＱＩをクローニングするための、ＣＴＣＴＴＣを認識し及びＮ４シトシン又はＮ６アデニンでメチル化するＭＩ．ＥａｒＩをコードするＤＮＡ配列（配列番号１７）を示している。
【図４０】ＳａｐＩ及びＢａｓｐＱＩをクローニングするための、ＣＴＣＴＴＣを認識し及びＮ４シトシン又はＮ６アデニンでメチル化するＭ２．ＥａｒＩをコードするＤＮＡ配列（配列番号１８）を示している。
【図４１Ａ】希釈液Ａ及びＮＥＢ１緩衝液＋１０％グリセロールを用いた２倍系列希釈中でｐＵＣ１９ＤＮＡ基質１μＬを切断することによって、ＷＴＢｓｐＱＩ１μＬ及び変異体（Ｋ２７９Ｐ／Ｒ３８８Ｆ）ＢｓｐＱＩ１μＬ（それぞれ、５１２Ｕ及び１，０２４Ｕの開始濃度）のＦＩを測定するためのアガロースゲルを示している。反応は、５０℃で行った。
【図４１Ｂ】希釈液Ａ及びＮＥＢ１緩衝液＋１０％グリセロールを用いた２倍系列希釈中でｐＵＣ１９ＤＮＡ基質１μＬを切断することによって、ＷＴＢｓｐＱＩ１μＬ及び変異体（Ｋ２７９Ｐ／Ｒ３８８Ｆ）ＢｓｐＱＩ１μＬ（それぞれ、５１２Ｕ及び１，０２４Ｕの開始濃度）のＦＩを測定するためのアガロースゲルを示している。反応は、５０℃で行った。
【図４２】希釈液Ａ及びＮＥＢ２緩衝液＋２５％ＤＭＳＯを用いた２倍系列希釈中でｐＵＣ１９ＤＮＡ基質を切断することによって、ＷＴＳａｐＩ５μＬ及び変異体（Ｋ２７３Ａ）ＳａｐＩ５μＬ（それぞれ、３２Ｕ及び１６の開始濃度）のＦＩを決定するためのアガロースゲルを示している。
【図４３Ａ】、ＷＴＫｐｎＩ５μＬ及びＤ１６Ｎ／Ｅ１３２Ａ／Ｄ１４８ＥＫｐｎＩ５μＬ（それぞれ、３２Ｕ及び２５６Ｕの開始濃度）によるｐＸｂａの触媒活性及びスター活性を示している。この酵素は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、５０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ及び５０％グリセロールを含有し、水で５０μＬの総容積にした希釈液を用いるＮＥＢ２緩衝液中での２倍系列希釈中のｐＸｂａＤＮＡ基質（０．５μｇ）２μＬを消化した。
【図４３Ｂ】、ＷＴＫｐｎＩ５μＬ及びＤ１６Ｎ／Ｅ１３２Ａ／Ｄ１４８ＥＫｐｎＩ５μＬ（それぞれ、３２Ｕ及び２５６Ｕの開始濃度）によるｐＸｂａの触媒活性及びスター活性を示している。この酵素は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、５０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ及び５０％グリセロールを含有し、水で５０μＬの総容積にした希釈液を用いるＮＥＢ２緩衝液中での２倍系列希釈中のｐＸｂａＤＮＡ基質（０．５μｇ）２μＬを消化した。
【図４４Ａ】以前に開示されていない表１中の酵素のアミノ酸配列及び表１中の酵素のＤＮＡ配列を示している。
【図４４Ｂ】以前に開示されていない表１中の酵素のアミノ酸配列及び表１中の酵素のＤＮＡ配列を示している。
【図４４Ｃ】以前に開示されていない表１中の酵素のアミノ酸配列及び表１中の酵素のＤＮＡ配列を示している。
【図４４Ｄ】以前に開示されていない表１中の酵素のアミノ酸配列及び表１中の酵素のＤＮＡ配列を示している。
【図４４Ｅ】以前に開示されていない表１中の酵素のアミノ酸配列及び表１中の酵素のＤＮＡ配列を示している。
【図４４Ｆ】以前に開示されていない表１中の酵素のアミノ酸配列及び表１中の酵素のＤＮＡ配列を示している。
【図４４Ｇ】以前に開示されていない表１中の酵素のアミノ酸配列及び表１中の酵素のＤＮＡ配列を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の実施形態は、所望の特徴を有する制限エンドヌクレアーゼを選択するための一般的な方法を提供する。この一般的な方法は、所望の制限エンドヌクレアーゼが作製されるかどうかを決定するための適切なアッセイに依拠している。特に、前記一般的な方法の実施形態は、工程の組を有する系統的なスクリーニング方法を提供する。この方法は、多くの制限エンドヌクレアーゼを使用する何百もの反応を実施することによって導かれた。本明細書中に提供されている実施例の多くは、低下したスター活性を有するが、ＷＴ制限エンドヌクレアーゼと少なくとも類似の切断活性を有する制限エンドヌクレアーゼを同定することに関する。しかしながら、例えば、所望される緩衝液中での改善された切断活性、熱安定性、所定の条件での反応の速度などに関連する制限エンドヌクレアーゼの他の特性を修飾することに対して、同じ方法を首尾よく適用できることも予想される。
【００２４】
上に論述されているように、関心の最終点は、スター活性を有する制限エンドヌクレアーゼを著しく低下したスター活性を有する高精度制限エンドヌクレアーゼへ転換させることである。スター活性は、個別の制限エンドヌクレアーゼによる切断特異性の混乱を表す。本明細書において、「スター活性の低下」及び「精度の増加」という用語は、互換的に使用される。制限エンドヌクレアーゼは、特定の配列でＤＮＡを切断する特性によって特徴付けられるが、幾つかの制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ中の別の部位で、ＤＮＡを非効率的にさらに切断する。この二次的切断は常に起こり得、又は増加した濃度、ある種の緩衝液、温度、基質の種類、保存及び温置時間の何れかなど、ある種の条件下においてのみ起こり得る。
【００２５】
タンパク質を構成し、特異性を決定する数百のアミノ酸によって作出される複雑な環境については殆ど知られていないことが一般に認められている。従来技術における１つのアプローチは、酵素とその基質間の接触点を同定するために、結晶学を使用することであった。それにも関わらず、非天然化学環境中で、一時的に構造を凍結させることに関連して、結晶学は制約を有する。
【００２６】
タンパク質中の何れかの部位でのアミノ酸の寄与及び基質分子の構造によって果たされている役割を決定する規則は、既存の分析技術を用いて把握することは難しいことが判明している。例えば、本明細書では、制限エンドヌクレアーゼ中のアミノ酸を変異させることは活性の全て又は一部の喪失を引き起こし得ることが示されている。
【００２７】
この点に関して、高いグリセロール濃度（＞５％ｖ／ｖ）、高い酵素対ＤＮＡ比（通常、＞酵素１００単位／ＤＮＡμｇ）、低いイオン強度（＜２５ｍＭ塩）、高いｐＨ（＞８．０）、有機溶媒（ＤＭＳＯ、エタノールなど）の存在及び他の二価陽イオン（Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋）でのＭｇ２＋の置換によって、スター活性が増加し得る理由を説明するための構造的な説明が提出されていない。ここでは、スター活性に影響を及ぼす要因の多様性故に、同じ反応条件下で、及び同じ所定の緩衝液中で、ＷＴ及び変異体スター活性の比較を実施すること、並びに前記特徴が他の反応条件で観察されたとしても、あらゆる高精度酵素がこれらの特徴を示すことができなければならない標準的な反応条件を開発することが必要である。
【００２８】
本発明の本実施形態は、特異的な改善された特性、すなわち、全体的な切断活性の著しい低下又はタンパク質を作製する宿主細胞からの収量の著しい喪失なしに、増強された切断精度を有する修飾された制限エンドヌクレアーゼを作製することに向けられる。改善された特性を有する変異体を発見するために、本明細書において開発された方法は、徹底的な実験から得られたものであり、得られた酵素の特性は、指定された条件において確定された。本明細書中に記載されている方法は、所定の条件下で何れかの制限エンドヌクレアーゼの酵素的特性を変化させるために使用され得るが、特定の確定された条件に限定されるものではない。
【００２９】
【表１】
2014027938.tif 000002
2014027938.tif 000003
2014027938.tif 000004
2014027938.tif 000005
【００３０】
前記方法は、同族活性とスター活性に必要とされるアミノ酸が異なるという知見から得られたものである。本明細書中に記載されている高精度制限エンドヌクレアーゼの改変は、同族活性及びスター活性は分離可能であり、これらの異なる活性に影響を及ぼす異なる不可欠なアミノ酸残基が存在することを示している。スター活性に影響を及ぼすことが本明細書において見出されたアミノ酸の位置は、タンパク質の活性部位内に必ずしも見出されない。ＦＩを（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３６，９，ｅ５０（２００８）も参照。）及び全体的な精度指数改善係数を決定する形態の成功基準を開発することによって、何れの制限エンドヌクレアーゼの切断特性も、本明細書において初めて決定された。
【００３１】
「全体的な精度指数改善係数」とは、選択された緩衝液の組内で最大の切断活性を有する対応するＷＴエンドヌクレアーゼの最も高いＦＩによって、最大の切断活性を有する変異体に対する最も高いＦＩを除したものを表す。選択された組は、１を超えるあらゆる大きさであり得るが、実際的には、１０未満の異なる緩衝液を含有し、より好ましくは、４つの緩衝液を含有する。前記組は、４未満の緩衝液も含み得る。特許請求の範囲に記載されている本発明では、何れの変異体制限エンドヌクレアーゼに関しても、さらに（但し、これらのみではない。）、ＮＥＢ１、ＮＥＢ２、ＮＥＢ３及びＮＥＢ４からなる緩衝液の組に対しても、好ましくは、少なくとも２の全体的なＦＩ改善係数が適用可能であるべきである。
【００３２】
「類似の切断活性」は、同じ条件下で、酵素の同じ量を基質の同じ量及び種類と反応させ、切断産物の量が、標準誤差の範囲内で同じと思われるように、及び定量的な類似性が１０％を超えるように、電気泳動後にゲル上で切断特性を視覚的に比較することによって測定することができる。
【００３３】
「人工的な」とは、「人によって作製された」ことを表す。
【００３４】
「標準的な条件」は、ＮＥＢ１から４緩衝液中で得られた結果から計算された全体的なＦＩ改善係数を表す。
【００３５】
本明細書中に記載されている一般的な方法は、以下の２７の制限エンドヌクレアーゼを用いて例示されている。ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｆｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰｃｉＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳａｐＩ、ＳｂｆＩ、ＳｃａＩ、ＳｐｈＩ及びＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ。しかしながら、上述されているように、著しいスター活性を有する何れの制限エンドヌクレアーゼの改変に関しても、前記方法は有効であることが予想される。
【００３６】
前記方法の実施形態は、低下したスター活性を有する変異体制限エンドヌクレアーゼを作製するための一般的なアプローチを使用する。ある種の酵素に関しては、２つのアイソシゾマー間で保存されていることが決定された帯電した残基を変異させることが有用であることが判明した（例えば、実施例２５中のＳａｐＩ参照）。しかしながら、一般に、前記方法は、エンドヌクレアーゼに対するタンパク質配列中の帯電した残基及び極性残基の全てを同定する第一の工程を含む。例えば、帯電したアミノ酸及び極性残基には、酸性残基Ｇｌｕ及びＡｓｐ、塩基性残基Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎ、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ並びに求核性残基Ｃｙｓが含まれる。各残基を標的とし、Ａｌａへ変異させ、増加した精度の所望される特性に関して、これらの標的化された変異の産物をスクリーニングする。得られた変異体の何れもが満足な結果を与えなければ、次の工程は、全ての水酸化されたアミノ酸（すなわち、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ）への変異を標的とすることであり、好ましい変異は、Ｓｅｒ及びＴｈｒからＡｌａ及びＴｙｒからＰｈｅである。実施例１６から２３に関して実施されたように、残基の両クラスへの変異を一度に標的とすることも可能である。Ａｌａへの変異は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅへの変異によって置換され得る。
【００３７】
これらの分析の後、上記工程で作製された好ましい変異体の１つ又はそれ以上が選択された検査下で標準を下回る成績をなお有するのであれば、これらの変異体を選択し、さらなる可能な１８のアミノ酸の各々へ再度変異させることができる。これは、飽和突然変異導入と称される。飽和突然変異導入は、ＥｃｏＲＩ（実施例２）に対して、部分的にはＢａｍＨＩ（実施例１）及びＰｖｕ（実施例１２）に対して好ましい高精度の変異体を与えた。飽和突然変異導入の結果に応じて、次の工程は、標的化された若しくは無作為な又は両方のさらなる変異を制限エンドヌクレアーゼ中に導入することである。実施例１１において、ＳｃＩ−ＨＦは、逆ＰＣＲの間に偶然に作製された無作為の変異を含む。実施例２０において、ＰｃｉＩ−ＨＦは無作為の変異から得られ、標的化された変異からは得られなかった。実施例２６において、ＢｓｐＱＩ−ＨＦは、精度を増強する上で相乗的に作用することが見出された２つの変異を含有する。
【００３８】
逆ＰＣＲなどの標的化された突然変異導入の様々な方法の使用は、タンパク質中の第二の部位へ非標的変異を導入することを含み得る。これらの第二の変異は、所望の特性を偶然に与え得る（実施例２０参照）。観察された効果に対して全ての変異が必要とされるかどうかを確定するために、複数の変異を有する変異された酵素を調べることが望ましい。実施例１１において、二重変異体中のＱ１１７Ｈは活性に対して全く効果を有していなかった。実施例２０において、さらなる自発的な変異は観察された改善された精度のために専ら必要とされるように見受けられるのに対して、実施例２４において、各変異は相乗的に作用した。
【００３９】
幾つかの事例において、変異は、改善された精度以外のさらなる利点を与え得る（例えば、Ｅ１６３Ａ又はＰ１７３Ａが酵素をより熱的に不安定とさせるＢａｍＨＩを参照。）。
【００４０】
実施例中に提供されている変異体の高精度／低下したスター活性特性は、標準的な緩衝液の組の中でのそれらの機能に従って選択された。異なる緩衝液組成物が選択されれば、他の変異が好ましい場合があり得る。しかしながら、変異体を発見するために同じ方法が適用される。表４は、各制限エンドヌクレアーゼに対して適用される変異を列記し、標準的緩衝液中の全体的なＦＩ改善係数を与える。
【００４１】
少なくとも２の全体的なＦＩ改善係数を与えるための高精度制限エンドヌクレアーゼの改変は、以下の工程の１つ又はそれ以上を含む。
【００４２】
１．ＷＴ制限エンドヌクレアーゼのスター活性の評価
本発明の一実施形態において、以下のプロトコールを用いて、制限エンドヌクレアーゼのスター活性の程度が検査される。エンドヌクレアーゼ活性は、原エンドヌクレアーゼの高い初濃度及びその系列希釈（例えば、２倍又は３倍希釈）を用いて、適切な基質に対して測定される。希釈時に、スター活性がもはや検出されないような少なくとも１つの濃度において、スター活性の観察を可能とするのに十分である限り、制限エンドヌクレアーゼの初濃度は重要でない。
【００４３】
適切な基質は、同族のエンドヌクレアーゼ活性によって切断され、及びスター活性を観察できるヌクレオチド配列を含有する。この基質は、制限エンドヌクレアーゼ又は第二のＤＮＡ基質に対する遺伝子を含有するベクターであり得る。表２において使用されている基質の例は、ｐＢＣ４、ｐＸｂａ、Ｔ７、λ及びｐＢＲ３２２である。
【００４４】
ＷＴ及び変異された制限エンドヌクレアーゼ中で、スター活性を容易に認識し、アッセイすることができるように、まず、原制限エンドヌクレアーゼの濃度が選択される。２００７から０８ＮＥＢカタログ中の指針に従って系列希釈を実施するために、ＮＥＢ希釈液Ａ、Ｂ又はＣなどの適切な希釈緩衝液が選択される。系列希釈された制限エンドヌクレアーゼは、反応容器の大きさによって決定される総反応容量の適切な基質の所定濃度と反応させる。例えば、反応混合物３０μＬが各ウェルに対して適切な容量であるマイクロタイタープレート中で複数の反応を実施することが都合がよい。従って、実施例は、３０μＬ中に基質０．６μｇ（５０μＬ中に基質１μｇと等しい。）を一般に使用する。反応混合物中の基質の量は重要でないが、反応間で一定していることが好ましい。切断反応は、１時間などの標準的な時間にわたって、所定の温度（例えば、２５℃、３０℃、３７℃、５０℃、５５℃又は６５℃）で起こる。切断産物は、上述のような精度指数を測定するためのあらゆる標準的な技術によって、例えば、０．８％アガロースゲル電気絵移動によって測定することができる。
【００４５】
全ての制限エンドヌクレアーゼが、そのＦＩから測定された場合に著しいスター活性を有するわけではない。しかしながら、エンドヌクレアーゼが約２５０以下の最高ＦＩ及び１００未満の最低ＦＩを有していれば、制限エンドヌクレアーゼは、有意なスター活性を有するものと分類される。このようなエンドヌクレアーゼは、単一の基質に対する精度を増加させるための酵素改変の標的として選択される。幾つかの事例では、よりよい切断活性のために、約５００を上回るＦＩ及び約１００未満のＦＩを有する制限エンドヌクレアーゼも改変される。
【００４６】
下表２は、改変前の幾つかの改変された制限エンドヌクレアーゼのＦＩを列記する。全ての試料は、０．８％アガロースゲル上で分析した。
【００４７】
【表２】
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＊基質：λは、λファージＤＮＡである。λ（Ｈ３）は、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλファージＤＮＡである。ｐＸｂａは、アデノウイルスのＸｂａＩによって消化された断片を有するｐＵＣ１９である。ｐＢＣ４：ｐＸｂａのより短い様式である。Ｔ７：Ｔ７ＤＮＡ。
【００４８】
＊＊ＦＩ−１からＦＩ−４：ＮＥ緩衝液１、２、３及び４中での酵素の精度指数。カッコ内の数字は、緩衝液の組内の緩衝液の何れかの中における同じ変異体制限エンドヌクレアーゼの「最高」切断活性と比較した、緩衝液の組内の指定された緩衝液中での変異体制限エンドヌクレアーゼの相対的切断活性に対する値である。
【００４９】
以下のＮＥＢ緩衝液の組成：
ＮＥＢ１：１０ｍＭＢｉｓＴｒｉｓプロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール（２５℃で、ｐＨ７．０）；
ＮＥＢ２：５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール（２５℃で、ｐＨ７．９）；
ＮＥＢ３：１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール（２５℃で、ｐＨ７．９）；
ＮＥＢ４：５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール（２５℃で、ｐＨ７．９）。
【００５０】
＊＊＊ＮＥＢ希釈液の組成は、以下のとおりである。（水の変わりに、希釈において希釈液を使用することによって、反応中のグリセロール濃度は一定に保たれる。）
希釈液Ａ：５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、２００ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、５０％グリセロール（２５℃で、ｐＨ７．４）；
希釈液Ｂ：３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、５００ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、５０％グリセロール（２５℃で、ｐＨ７．４）；
希釈液Ｃ：２５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、０．１５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２００ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、５０％グリセロール（２５℃で、ｐＨ７．４）。
【００５１】
２．高発現宿主細胞株の構築
宿主細胞が、低下したスター活性が求められている変異体制限エンドヌクレアーゼを過剰発現することができるのであれば都合がよい。制限酵素がイー・コリ中で高度に発現されていれば、スター活性は未精製抽出物中で容易に検出することが可能であり、これは、高精度制限エンドヌクレアーゼのスクリーニングを簡略化する。しかしながら、酵素切断から生じる毒性から何らかの方法で宿主細胞が保護されているのであれば、変異された制限エンドヌクレアーゼは、あらゆる宿主細胞中で発現させることができる。これには、メチラーゼの存在；ゲノムへの接近に対して障壁を与える細胞の区画（封入体又は周辺質など）中での生産；インビトロでの合成、エマルジョン中での生産（米国特許出願第１２／０３５，８７２号参照）宿主ゲノム中での切断部位の不存在の；インテインによって媒介される連結に供される構成要素部分中での酵素の製造（米国特許第６，８４９，４２８号参照）などが含まれ得る。
【００５２】
製造のための変異された制限エンドヌクレアーゼの過剰発現は、クローニングの標準的な技術、例えば、イー・コリ宿主の使用、高コピーであるｐＵＣ１９に由来する発現ベクター中へのエンドヌクレアーゼの挿入及び組換えタンパク質の一定した発現を可能とする相対的に小さなプラスミドの使用を用いて達成することができる。好ましくは、ベクターは、プロモーターに隣接して配置されたｌａｃプロモーター及びマルチコピー挿入部位などの適切なプロモーターを含有し得る。あるいは、遺伝子発現のＩＰＴＧ誘導を必要とするプロモーターを選択することができる。未精製抽出物中の活性が十分でなければ、未精製抽出物中の制限エンドヌクレアーゼに対するカラム精製工程を実施し得る。
【００５３】
３．制限エンドヌクレアーゼの突然変異導入
制限エンドヌクレアーゼ中の各帯電した基又は極性基をコードするＤＮＡを個別に標的として、変異されたＤＮＡを検査のためにクローニングし、調製し得る。各制限エンドヌクレアーゼ遺伝子中に、複数の変異を導入し得る。制限エンドヌクレアーゼの標的化された突然変異導入は、本分野において公知のあらゆる方法によって達成され得る。本明細書において使用される都合のよい方法は、逆ＰＣＲである。このアプローチでは、標的化されたコドンに加えて、コドンの５’及び３’両側に複数のヌクレオチド（例えば、１８ヌクレオチド）を含有する相補的なプライマーの対が合成される。適切なプライマーの選択は、目的のアミノ酸残基周囲において、目的のエンドヌクレアーゼの遺伝子配列を概観することによって容易に達成することができる。遺伝子配列の入手は、ＲＥＢＡＳＥ及びＧｅｎＢａｎｋを通じて行われる。本明細書において実施例中に記載されているエンドヌクレアーゼに対する配列は、図３１から３８及び４４に記載されている。ＰＣＲに対するテンプレートは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有するプラスミドである。ポリメラーゼは、好ましくは、Ｖｅｎｔ（Ｒ）又はＤｅｅｐＶｅｎｔＴＭＤＮＡポリメラーゼなどの高精度ポリメラーゼである。徐冷温度及びＭｇ２＋濃度を変動させることによって、多くの変異の導入を首尾よく達成することができる。次いで、ＰＣＲ増幅産物を精製し、好ましくは、ＤｐｎＩによって消化する。本発明の一実施形態において、対応するメチラーゼで予め修飾された形質転換受容性宿主細胞（例えば、イー・コリ）中に消化された産物を形質転換した。各変異体から得られたコロニーを拾い上げ、ＷＴがその中で増殖された条件と類似の条件下で（例えば、類似の増殖培地、薬物選択及び温度を用いて）増殖させた。得られた制限エンドヌクレアーゼを低下したスター活性に関してスクリーニングした。
【００５４】
４．低下したスター活性を有する変異体制限エンドヌクレアーゼのスクリーニング
変異体制限エンドヌクレアーゼ中のスター活性を測定するために、緩衝液組成、温度及び希釈液などの条件を確定すべきである。表２及び３は、３７℃で、３つの異なる希釈液を用いる４つの異なる緩衝液中での変異前及び後における組換えエンドヌクレアーゼのＦＩを示している。従って、何れの変異体が少なくとも２、１０超、少なくとも５０又は５００超の全体的な望ましい改善された精度指数係数を有するかを決定し、好ましい高精度変異体として酵素を選択することが可能である。
【００５５】
本発明の一実施形態において、まず、正常な緩衝液条件（５％以下のグリセロール）中での活性に関して、変異体制限エンドヌクレアーゼをスクリーニングした。ＷＴ制限エンドヌクレアーゼの活性の少なくとも約１０％を有する変異体に関して、スター活性を促進するスター活性促進条件、例えば、高いグリセロール濃度及び場合によって高いｐＨ中でも活性を測定した。好ましくは、正常な緩衝液中で最も低いスター活性を有するが、許容可能な同族活性を有する変異体を選択する。次いで、変異体の確認のために、プラスミドを抽出し、配列決定することができる。幾つかの事例では、高いグリセロール及び高いｐＨ条件を用いた場合でさえ、スター活性は容易に測定されない。代わりに、異なる緩衝液中での活性を測定及び比較し、ＮＥＢ３と比べてＮＥＢ４中で最も高い切断活性比を有するものを、スター活性の改善に関してさらに検査することができる。
【００５６】
５．単一の残基に対する飽和突然変異導入
前節に記載されているように、第一の工程は、制限エンドヌクレアーゼ中の標的アミノ酸をＡｌａに変異させることである。結果が満足できるものでなければ、飽和突然変異導入が行われる。これは、好ましくは、２つの方法のうちの１つによって行われる。１つの方法は、意図されるコドンをＮＮＮ中に変化させることである。突然変異導入後に、正常な条件下及びスター活性を促進する条件下で、複数のコロニーをアッセイする。あるいは、標的とされるアミノ酸のそれぞれの突然変異導入のために、異なるコドンを選択することができる。Ａｌａ：ＧＣＴ；Ｃｙｓ：ＴＧＣ；Ａｓｐ：ＧＡＣ；Ｇｌｕ：ＧＡＡ；Ｈｉｓ：ＣＡＣ；Ｉｌｅ：ＡＴＣ；Ｌｙｓ：ＡＡＡ；Ｌｅｕ：ＣＴＧ；Ｍｅｔ：ＡＴＧ；Ａｓｎ：ＡＡＣ；Ｐｒｏ：ＣＣＧ；ＧＩｎ：ＣＡＧ；Ａｒｇ：ＣＧＴ；Ｓｅｒ：ＴＣＣ；Ｔｈｒ：ＡＣＣ；Ｖａｌ：ＧＴＴ；Ｔｒｐ：ＴＧＧ及びＴｙｒ：ＴＡＣ。
【００５７】
６．組み合わせ
単一の変異がスター活性を十分に低下させなければ、２以上の変異を制限エンドヌクレアーゼ遺伝子中に導入することができる。変異の組み合わせ及び飽和突然変異導入は、何れの順序でも実施することができる。
【００５８】
７．変異体精製及び改善の評価
高精度変異体は、様々なクロマトグラフィーカラムの使用など、様々な方法で精製され得る。通常の品質評価に関しては、調製物由来のＤＮＡ及び非特異的ヌクレアーゼを除去するのに、１つのＦＰＬＣヘパリンカラムで十分である。イオン交換、疎水性、サイズ排除及びアフィニティーカラムを含む複数のカラムをさらなる精製のために使用することができる。
【００５９】
精製された高精度制限エンドヌクレアーゼは、４つのＮＥＢ緩衝液中でＦＩに関して測定され、ＷＴ制限エンドヌクレアーゼのＦＩと比較される。最適な緩衝液中でのＷＴのＦＩに対する高精度制限エンドヌクレアーゼのＦＩの比率が、全体的な改善係数である。
【００６０】
【表３】
2014027938.tif 000007
＊ＦＩは、基質の消化を完了する最低の濃度に対する、スター活性を示さない最高濃度の比率である。
【００６１】
＊＊カッコ内の数字は、緩衝液の組内の緩衝液の何れかの中における同じ変異体制限エンドヌクレアーゼの最大切断活性と比較した、緩衝液の組内の指定された緩衝液中での変異体制限エンドヌクレアーゼの相対的切断活性に対する値である。
【００６２】
【表４】
2014027938.tif 000008
【００６３】
上及び下に引用されている全ての参考文献並びに米国仮出願６０／９５９，２０３号は、参照により組み込まれる。
【００６４】
実施例
一文字コードによって、アミノ酸が表記されている場合には、これは、標準的な命名法であることが意図されている。コードに対する鍵は、例えば、ＮＥＢカタログ２００７／２００８の２８０ページ上に与えられている。
【００６５】
クローニングのために及び基質として使用されるプラスミドは、以下のような配列を有する。
【００６６】
ｐＬａｃｚｚ２（配列番号１０２）、ｐＳｙｘ２０−ｌａｃＩｑ（配列番号１０５）、ｐＢＣ４（配列番号１０３）、ｐＸｂａ（配列番号１０４）及びｐＡＧＲ３（配列番号１０６）。ｐＡＣＹＣはＧｅｎＢａｎｋＸＯ６４０３中に、Ｔ７はＧｅｎＢａｎｋＮＣ００１６０４中に、ｐＵＣ１８はＧｅｎＢａｎｋＬ０９１３６中に、及びｐＲＲＳは「Ｓｋｏｇｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，８８：１−５（１９９０）中に記載されている。ｐＳＸ３３は、ＥｃｏＲＩ部位において、ｐＬＧ３３９中にｌａｃＩ遺伝子を挿入することによって構築した。ｐＬＧ３３９は、「Ｓｔｏｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９，３３５−３４１（１９８２）」中に記載されている。
【００６７】
本明細書中で使用されるＮＥＢ緩衝液として特定されている緩衝液は全て、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから入手することが可能である。
【実施例１】
【００６８】
高精度ＢａｍＨＩの改変
１．ＢａｍＨＩメチラーゼ及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼを含有するプラスミドの抽出
形質転換受容性イー・コリ宿主細胞をｐＵＣ１８−ＢａｍＨＩＲ及びｐＡＣＹＣ１８４−ＢａｍＨＩＭで形質転換し、標準的なｍｉｎｉｐｒｅｐ技術を使用する標準的なＱｉａｇｅｎＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、ＢａｍＨＩＲを抽出した。
【００６９】
２．突然変異導入標的の選択
ＢａｍＨＩ及び関連する制限エンドヌクレアーゼＯｋｒＡＩをクローニングし、配列決定した。反応がＮＥＢ緩衝液（１、２及び４）中において、３７℃で行われれば、ＯｒｋＡＩは著しいスター活性を有することが見出された。本分析は、スター活性に必要なアミノ酸残基がＢａｍＨＩとＯｋｒＡＩエンドヌクレアーゼの間で類似しているという仮定を調べた。
【００７０】
ＢａｍＨＩの完全なタンパク質配列（配列番号１９）は、以下のとおりである。
【００７１】
【化１】
2014027938.tif 000009
【００７２】
ＯｋｒＡＩの完全なタンパク質配列（配列番号２０）は、以下のとおりである。
【００７３】
【化２】
2014027938.tif 000010
【００７４】
ＢａｍＨＩ及びＯｋｒＡＩエンドヌクレアーゼのタンパク質配列に対してＧＣＧによって行われた「Ｂｅｓｔｆｉｔ」類似性分析は、以下の結果を示した（上のタンパク質配列はＢａｍＨＩであり、下のタンパク質配列はＯｋｒＡＩである。
【００７５】
ｂａｍｈｉｒ．ｐｅｐ×ｏｋｒａｉｒ．ｐｅｐ
【００７６】
【化３】
2014027938.tif 000011
【００７７】
ＢａｍＨＩ中の類似の帯電した残基（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ）は、Ｅ２８、Ｋ３０、Ｋ５２、Ｋ６１、Ｅ７７、Ｋ８４、Ｅ８６、Ｋ８８、Ｄ９４、Ｋ９７、Ｋ１０６、Ｅ１１１、Ｅ１１３、Ｈ１２１、Ｒ１２２、Ｋ１２６、Ｋ１４６、Ｄ１５４、Ｒ１５５、Ｅ１６１、Ｅ１６３、Ｅ１７０、Ｅ１８２、Ｋ１９３、Ｄ１９６及びＲ２０１であることが明らかとなった。上記比較において、これらの残基には下線が付されている。公知の変異体Ｅ７７Ｋ、Ｄ９４Ｎ、Ｅ１１１Ｋ及びＥ１１３Ｋは不活性であることが以前に報告されていたので（Ｘｕ，Ｓｈｕａｎｇ−ｙｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２６６：４４２５−４４２９（１９９１））、除外した。最初の突然変異導入選択は、アラニンへの変異のために、２２の共有される帯電アミノ酸残基を標的とした。Ｅ２８Ａ、Ｋ３０Ａ、Ｋ５２Ａ、Ｋ６１Ａ、Ｋ８４Ａ、Ｅ８６Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ１０６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１２２Ａ、Ｋ１２６Ａ、Ｋ１４６Ａ、Ｄ１５４Ａ、Ｒ１５５Ａ、Ｅ１６１Ａ、Ｅ１６３Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｅ１８２Ａ、Ｋ１９３Ａ、Ｄ１９６Ａ及びＲ２０１Ａ。
【００７８】
３．ＢａｍＨＩの突然変異導入
選択された変異の点突然変異導入は、逆ＰＣＲによって行った。対応するコドンは全て、ＧＣＡ（アラニン）に変化させた。突然変異導入のために、以下のプライマーを使用した。
【００７９】
【化４】
2014027938.tif 000012
2014027938.tif 000013
2014027938.tif 000014
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【００８０】
１００μＬの反応容量のＰＣＲ反応は、各ＰＣＲプライマー２μＬ、ｐＵＣ１８−ｂａｍｈｉＲ、４００μＭｄＮＴＰ、ＤｅｅｐＶｅｎｔＴＭＤＮＡポリメラーゼ４ユニット及びＭｇＳＯ４０、２又は６μＬを含有する１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液１０μＬを含有し、さらに水を加えた。
【００８１】
ＰＣＲ反応条件は、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃４分の２５サイクル及び７２℃で７分間の最終伸長時間であった。標準的なＱｉａｇｅｎスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）上で、ＰＣＲ産物を精製した。ＤｐｎＩの２０単位によって、ＰＣＲ産物の６から１６μＬを１時間消化した。イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ｂａｍＨＩＭ）中に、消化された産物を形質転換した。
【００８２】
６つのＰＣＲ反応後、改変された２２変異から１４が得られた。Ｅ２８Ａ、Ｋ３０Ａ、Ｋ６１Ａ、Ｅ８６Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｋ１２６Ａ、Ｋ１４６Ａ、Ｅ１６１Ａ、Ｅ１６３Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｅ１８２Ａ及びＲ２０１Ａ。一晩培養物中の細胞可溶化液から変異体タンパク質を抽出し、活性をＷＴＢａｍＨＩと比較した。正常な酵素活性は５％グリセロールあり又はなしのＮＥＢ２緩衝液中でアッセイされたのに対して、スター活性は３９．２％グリセロールありのＮＥＢ２中で測定されたが、まず、より低いパーセントのグリセロールを使用することができた。異なる反応に対して使用された基質は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９又はλＤＮＡであった。切断反応は、３７℃で、３０分間又は１時間行った。変異体（Ｋ９７Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｋ１２６Ａ、Ｅ１６１Ａ、Ｅ１８２Ａ、Ｒ２０１Ａ）は不活性である（ＷＴＢａｍＨＩ活性の１％未満）のに対して、Ｅ２８Ａ、Ｋ１４６Ａ、Ｅ１６３Ａ、Ｅ１７０Ａ変異体はＷＴ酵素と類似の活性レベル（スター活性を含む。）を有していた。３つの変異体Ｋ３０Ａ、Ｅ８６Ａ及びＫ１２６Ａは、ＷＴＢａｍＨＩと比較して、著しく低下したスター活性を有することが見出された。Ｋ３０Ａ及びＥ８６ＡはＷＴ酵素と類似の全体的な切断活性を有していたが、スター活性の著しい低下を示すことも明らかとなった。これに対して、Ｋ１２６ＡはＷＴ酵素の全体的な切断活性の２５％を有するに過ぎず、Ｋ３０Ａ及びＥ８６Ａに対して観察されたものほど著しいスター活性に対する改善を有していなかった。
【００８３】
ｐＵＣ１８−ｂａｍＨＩＲプラスミドに対する再チェックによって、正常な高コピープラスミドが低コピープラスミドへ変異したことが明らかとなった。高コピープラスミド中にｂａｍＨＩＲ遺伝子を転移させるために、プライマーの対を設計した。
【００８４】
【化５】
2014027938.tif 000017
2014027938.tif 000018
【００８５】
テンプレートは、Ｋ３０Ａ、Ｅ８６Ａ又はＫ１２６Ａに変異を有するｐＵＣ１８−ｂａｍｈＩＲＷＴであった。ＰＣＲ組成物は、テンプレート５μＬ、各プライマー２μＬ、４００μＭｄＮＴＰ、１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液１０μＬ、４単位のＤｅｅｐＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ２μＬ、ＭｇＳＯ４０、２、６μＬを加えたＨ２Ｏ７２μＬを含有した。ＰＣＲ条件は、９４℃５分間に続いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃４０秒の２５サイクル並びに７分の最終伸長期間であった。ＳｐｈＩ及びＫｐｎＩでＰＣＲ産物を消化し、酵素消化の同じ対を用いて、ｐＵＣ１９へ連結させた。ｐＡＣＹＣ−ｂａｍＨＩＭを含有する形質転換受容性イー・コリ中に、連結された産物を形質転換した。ＢａｍＨＩＲＫ３０ＡのｐＵＣ１９バージョンを含有する２６のコロニー及びＥ８６Ａを含有するそのうち１２を同定し、増殖させた。これらの培養物からのＢａｍＨＩの活性をチェックした。これらの全ては活性を有する。各変異の５つのコロニーから得られたプラスミドを抽出し、各変異の３つからＢａｍＨＩＲプラスミドを配列決定した。プラスミドｐＵＣ１９−ＢａｍＨＩ（Ｋ３０Ａ）及びｐＵＣ１９−ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ａ）の正体を確認した。
【００８６】
ｐＵＣ１９−ＢａｍＨＩ（Ｋ３０Ａ）ベクターを用いて、ｐＵＣ１８−ＢａｍＨＩＲ中で成功を収めなかった変異を繰り返した。ＰＣＲ混合物は、テンプレート１μＬ及び各プライマー２μＬ、４００μＭｄＮＴＰ、１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液１０μＬ、４単位のＤｅｅｐＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ２μＬ、１００μＭＭｇＳＯ４０、２、６μＬを加えたＨ２Ｏ７６μＬを含有する増幅混合物を含有した。ＰＣＲ条件は、９４℃５分間に続いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃３分３０秒の２５サイクル並びに７分の最終伸長期間であった。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩによって消化し、ｐＡＣＹＣ−ＢａｍＨＩＭで形質転換された形質転換受容性イー・コリへ形質転換した。ｐＵＣ１９基質に対して、酵素活性をチェックした。反応組成物は、細胞抽出液３μＬ、ＮＥＢ２の３μＬ、５０％グリセロール３μＬ、０．５μｇｐＵＣ１９の０．５μＬ、Ｈ２Ｏ２０．５μＬであった。反応は、３７℃で１時間であった。Ｋ３０Ａ／Ｒ１２２Ａ、Ｋ３０Ａ／Ｒ１５５Ａ及びＫ３０Ａ／Ｋ１９３Ａは、不活性であった。Ｋ３０Ａ／Ｋ５２Ａ及びＫ３０Ａ／Ｋ８８Ａは、Ｋ３０Ａ活性の約１／１０であった。Ｋ３０Ａ／Ｋ１０６Ａ、Ｋ３０Ａ／Ｄ１５４Ａ及びＫ３０Ａ／Ｄ１９６Ａの正常な活性は、Ｋ３０ＡＢａｍＨＩのものと同様であった。高濃度のグリセロール（３９．２％）で、これら３つの変異体のスター活性をＫ３０Ａと比較することによって、Ｋ３０Ａ／Ｄ１９６ＡはＫ３０Ａと類似のスター活性を有し、Ｋ３０Ａ／Ｄ１５４ＡはＫ３０Ａより高いスター活性を有し、Ｋ３０Ａ／Ｋ１０６ＡはＫ３０Ａより低いスター活性を有することが示された。ｐＵＣ１９ベクター中のＢａｍＨＩのＫ１０６Ａ変異を単離する試みは、細胞毒性のために失敗した。
【００８７】
逆ＰＣＲを用いて、Ｋ３０、Ｅ８６及びＫ１０６部位に対する変異を組み合わせた。Ｋ３０Ａ／Ｅ８６Ａ、Ｅ８６Ａ／Ｋ１０６Ａ、Ｋ３０Ａ／Ｋ１０６Ａ及びＫ３０Ａ／Ｅ８６Ａ／Ｋ１０６Ａ。Ｋ３０Ａ／Ｅ８６Ａは、好ましい変異体であるように見受けられた。精製後、全てのＮＥＢ緩衝液中で、ＢａｍＨＩ変異体に対して、ＦＩは２５％向上することが見出された。
【００８８】
Ｋ３０及びＥ８６の部位に対して、さらなる突然変異導入を無作為に行った。
【００８９】
Ｋ３０に対して、
【００９０】
【化６】
2014027938.tif 000019
【００９１】
Ｅ８６に対して、
【００９２】
【化７】
2014027938.tif 000020
【００９３】
ＰＣＲ組成物は、テンプレート（ｐＵＣ１９−ＢａｍＨＩＲ（Ｋ３０Ａ）１μＬ又はｐＵＣ１９−ＢａｍＨＩＲ（Ｅ８６Ａ）であり、上記のような増幅混合物を使用した。ＰＣＲは、９４℃５分間に続いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃３分３０秒の２５サイクル並びに７分の最終伸長期間で行った。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩによって消化し、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＢａｍＨＩＭ）中に形質転換した。
【００９４】
Ｋ３０無作為変異に対して合計１５５のコロニーを選び出し、Ｅ８６部位に対して１５８コロニーを選び出した。コロニーを一晩増殖させ、細胞抽出物にした。４２．５％グリセロールを加えたＮＥＢ２緩衝液中の細胞抽出物１μＬを用いて、３７℃で１時間、ｐＵＣ１９の０．５μｇを消化した。３７℃で３０分間、３９．２％グリセロールを加えたＮＥＢ２緩衝液中のｐＵＣ１９の０．５μｇに対して、１、４、１６倍希釈下で、明白に低下したスター活性を有する細胞抽出物を再度アッセイした。低下したスター活性を有することが観察された変異体に対して、対応するプラスミドを抽出し、変異を確認するために配列決定した。計３つのクローン（＃１２、＃６６及び＃８２）がＫ３０変異を含有し、計３３のクローン（＃５、＃１５、＃１６、＃１９、＃２９、＃４７、＃５１、＃５５、＃５６、＃５８、＃６１、＃６９、＃７１、＃７３、＃７６、＃８２、＃８６、＃８８、＃９３、＃９４、＃９７、＃９８、＃１００、＃１０４、＃１０７、＃１１３、＃１１７、＃１１８、＃１２９、＃１３２、＃１３６、＃１３９及び＃１５１）を配列決定した。配列決定後、＃１２及び＃６６はＫ３０Ｇ変異を含有し、＃８２はＫ３０Ｎ変異を含有することが明らかとなった。驚くべきことに、コドン（ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ）が異なるだけで、３３の変異の全てがＥ８６Ｐである。これらのコドンのうち、イー・コリ中では、ＣＣＧが最も高い頻度で生じた（クローン＃９８、＃１３６及び＃１３９）。
【００９５】
Ｋ３０Ｇ、Ｋ３０Ｎ及びＫ３０Ａに対応する細胞抽出物は、１、２、４、８、１６及び３２倍として系列希釈されたのに対して、Ｅ８６Ｐ及びＥ８６Ａは、１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８及び２５６倍として系列希釈された。３９．２％グリセロールを加えたＮＥＢ２中において、３７℃で３０分間、系列希釈された抽出物をｐＵＣ１９の０．５μｇと反応させた。極端な条件下で、Ｅ８６Ｐは、他の変異体よりずっと優れているように見受けられた。最大３２倍の消化まで、著しいスター活性のバンドは存在しなかった。Ｅ８６ＰとＫ３０変異体（Ｋ３０Ｇ、Ｋ３０Ｎ及びＫ３０Ａ）の差は非常に大きいので、Ｅ８６Ｐ変異体中のこれらの変異の全てを組み合わせることはさらに必要でなかった。
【００９６】
λＤＮＡ１μｇ基質（ＷＴＢａｍＨＩ活性測定に対しても使用される。）に対して、ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）の活性を測定した。３７℃で１時間、ＮＥＢ１緩衝液中においてアッセイを行った。
【００９７】
４．ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）及びＷＴＢａｍＨＩの詳しい比較
Ａ．異なるＮＥＢ緩衝液中でのＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）の活性
λＤＮＡ基質を用いて、３７℃で１時間、ＮＥＢ１、ＮＥＢ２、ＮＥＢ３、ＮＥＢ４及びＮＥＢＢａｍＨＩ緩衝液中で、精製されたＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）の活性を測定した。ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）は、ＮＥＢ１緩衝液及びＮＥＢ２中で最も高い活性を有していたが、ＮＥＢ３、ＮＥＢ４及びＢａｍＨＩ緩衝液中で、５０％、５０％及び２５％の活性レベルを有していた。
【００９８】
Ｂ．ｐＵＣ１９に対するＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）及びＷＴＢａｍＨＩの切断活性の比較
ｐＵＣ１９中には、１つのＧＧＡＴＣＣ部位（ＢａｍＨＩ部位）及び６つのＡＧＡＴＣＣ部位（ＢａｍＨＩスター活性部位）が存在したので、ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）及びＷＴＢａｍＨＩを比較するための好ましい基質として、ｐＵＣ１９を選択した。
【００９９】
異なる緩衝液中において、ＮＥＢ希釈緩衝液Ａを用いた１、３、９、２７、８１、２４３、７２９、２１８１、６５６１及び１９６８３倍の系列希釈中で、ＷＴＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）によって、ｐＵＣ１９の０．５ｍｇを消化した。ＷＴＢａｍＨＩは全てのＮＥＢ正常な緩衝液中でスター活性を示したのに対して、ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）はスター活性バンドを全く示さなかった（図２から５）。これによって、同族切断活性を保持しながら、ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）は大幅に低下したスター活性を有することが示された。
【０１００】
Ｃ．λＤＮＡ基質に対するＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）及びＷＴＢａｍＨＩの切断活性の比較
精度指数を計算するために、希釈緩衝液で制限酵素を希釈し、グリセロール濃度は常に５％に保った。ここで使用される標準的な反応条件では、λＤＮＡ基質濃度は１μｇであり、合計反応容量は５０μＬであった。酵素容量を１０％に保つために、５μＬの容量で酵素を添加した。これは、３０μＬの合計容量で、制限酵素３μＬによって消化された基質０．６μｇに等しい。３７℃で１時間、ＮＥＢ１、ＮＥＢ２、ＮＥＢ３、ＮＥＢ４及びＮＥＢＢａｍＨＩ緩衝液中で、１から３２７６８までの１：２系列希釈中において、ＷＴＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）３μＬによって、λＤＮＡ０．６ｍｇを消化した。
【０１０１】
【表５】
2014027938.tif 000021
【０１０２】
５．高精度変異体のためのＢａｍＨＩのさらなる改善
１時間のレベルで、ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）は、優れた高精度ＢａｍＨＩ変異体であるように見受けられた。しかしながら、反応時間を延長すると（例えば、一晩又は１４時間）、Ｅ８６Ｐのスター活性が１時間の時点で検出されなかった場合でさえ、スター活性バンドが出現した（図３）。改善された高精度ＢａｍＨＩの検索を継続した。
【０１０３】
６．他の帯電した残基及び極性残基の変異
配列番号１９中の２、４、５、６、１０、１１、１３、１４、１８、１９、２０、４３、５１、６２、６９、７０、７６、７７、７８、８１、８７、８９、９４、９８、１０１、１０４、１０７、１１１、１１３、１３２、１３３、１３５、１３７、１６０、１６７、２００、２０４、２０５、２０７、２０８、２０９、２１１、２１３の位置において、他の帯電した残基（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）をＡｌａへ変異させた。ｐＵＣ１９−ＢａｍＨＩ（Ｋ３０Ａ）のテンプレートに対して、変異を行った。
【０１０４】
配列番号１９中の９、１７、２６、３２、３６、４１、４２、４４、４６、５０、６５、６６、７１、７２、７５、９６、１０３、１１４、１１８、１１９、１２３、１５０、１５１、１５３、１５７、１６５、１６９、１８４、１８６、１９５、１９９、２０２の位置において、他の極性残基（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ）をＡｌａに変異させたのに対して、Ｔｙｒは、Ｐｈｅに変異させた。
【０１０５】
類似の変異及びスクリーニング法を使用することによって、以下の変異が低下したスター活性を有することが発見された。Ｋ３０Ａ／Ｋ８７Ａ、Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｅ、Ｅ８６Ａ／Ｙ１６５Ｆ及びＫ３０Ａ／Ｅ１６７Ａ。追加のＤＭＳＯの存在下で改善された特性を有する変異体として、Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｅが同定された。しかしながら、正常な反応緩衝液中でのこの変異体の活性は、ＷＴＢａｍＨＩのものよりずっと低かった。
【０１０６】
変異の以下の組み合わせを作製した。Ｅ８６Ｐ／Ｙ１６５Ｆ、Ｅ８６Ｐ／Ｅ１６７Ａ、Ｅ８６Ｐ／Ｙ１６５Ｆ／Ｅ１６７Ａ、Ｋ３０Ａ／Ｙ１６５Ｆ／Ｅ１６７Ａ、Ｋ３０Ｇ／Ｙ１６５Ｆ／Ｅ１６７Ａ、Ｋ３０Ａ／Ｙ１６５Ｆ／Ｅ１６７Ａ、Ｅ８６Ａ／Ｙ１６５Ｆ／Ｅ１６７Ａ。全ては、低い活性を有していた。
【０１０７】
この点まで、Ｅ１６７Ａ及びＹ１６５ＦはＢａｍＨＩスター活性に対して強い効果を有し、Ｋ８７Ａは中程度の効果を有し、並びにＫ３０Ａ及びＥ８６Ａは弱い効果を有することが見出された。Ｅ８６Ｐは、１時間のレベルでスター活性を低下させるが、一晩では低下させない特殊な変異である。
【０１０８】
７．全ての他の残基へのＥ１６７及びＹ１６５の変異
Ａｌａに関してはＧＣＡ、Ｃｙｓに関してはＴＧＣ、Ａｓｐに関してはＧＡＣ、Ｐｈｅに関してはＴＴＣ、Ｇｌｙに関してはＧＧＴ、Ｈｉｓに関してはＣＡＣ、Ｉｌｅに関してはＡＴＣ、Ｌｙｓに関してはＡＡＡ、Ｌｅｕに関してはＣＴＧに、Ｍｅｔに関してはＡＴＧ、Ａｓｎに関してはＡＡＣ、Ｐｒｏに関してはＣＣＧ、Ｇｌｎに関してはＣＡＧに、Ａｒｇに関してはＣＧＴに、Ｓｅｒに関してはＴＣＣ、Ｔｈｒに関してはＡＣＣ、Ｖａｌに関してはＧＴＴ、Ｔｒｐに関してはＴＧＧ及びＴｙｒに関してはＴＡＣへコドンを変化させることによって、ｐＵＣ１９−ＢａｍＨＩ中において、Ｅ１６７を他の全ての残基へ変異させた。
【０１０９】
全ての変異体の比較後、Ｅ１６７Ｔ変異は好ましかったのに対して、Ｅ１６７Ｒ、Ｅ１６７Ｋ、Ｅ１６７Ｌ及びＥ１６７Ｉ変異は、Ｅ１６７Ａと比較された低下したスター活性の改善を示した。
【０１１０】
Ａｌａに関してはＧＣＴ、Ｃｙｓに関してはＴＧＣ、Ａｓｐに関してはＧＡＣ、Ｇｌｕに関してはＧＡＡ、Ｇｌｙに関してはＧＧＴ、Ｈｉｓに関してはＣＡＣ、Ｉｌｅに関してはＡＴＣ、Ｌｙｓに関してはＡＡＡ、Ｌｅｕに関してはＣＴＧに、Ｍｅｔに関してはＡＴＧ、Ａｓｎに関してはＡＡＣ、Ｐｒｏに関してはＣＣＧ、Ｇｌｎに関してはＣＡＧに、Ａｒｇに関してはＣＧＴに、Ｓｅｒに関してはＴＣＣ、Ｔｈｒに関してはＡＣＣ、Ｖａｌに関してはＧＴＴ、Ｔｒｐに関してはＴＧＧへ対応するコドンを変化させることによって、Ｙ１６５も他の全てのアミノ酸残基へ変異させた。
【０１１１】
全ての変異体を比較した後、Ｙ１６５Ｆの存在は著しい切断活性をもたらしたが、直前に列記されている他の変異は低い活性を示し、又は切断活性を示さなかった。
【０１１２】
８．ＢａｍＨＩ（Ｅ１６７Ｔ）に対するさらなる変異
上記と同じ操作で、ｐｕｃ１９−ＢａｍＨＩ（Ｅ１６７Ｔ）のテンプレート上において、全ての帯電した残基及び極性残基をＡｌａに変異させた。
【０１１３】
好ましい変異としてＥ１６３Ａ／Ｅ１６７Ｔが、ＢａｍＨＩ−ＨＦとして同定された。
【０１１４】
９．ＷＴＢａｍＨＩに対するＢａｍＨＩ−ＨＦの比較
スター活性を低下させるために必要とされる他の変異に付加された場合に、Ｐ１７３Ａと同様に、Ｅ１６３への変異の導入は、ＢａｍＨＩ変異体の低下した熱安定性をもたらした。
【０１１５】
ＢａｍＨＩ−ＨＦは、ＢａｍＨＩ（Ｅ８６Ｐ）とは異なり、ＮＥＢ１から４緩衝液中での一晩の反応において、著しいスター活性を有していなかった。図４は、ＮＥＢ１及びＮＥＢ２中での結果を示している。従って、好ましい高精度ＢａｍＨＩとして、ＢａｍＨＩ（Ｅ１６３Ａ／Ｅ１６７Ｔ）を選択した。
【０１１６】
３７℃で、希釈液Ａを加え、λＤＮＡ基質に対して、４つのＮＥＢ緩衝液全ての中で、ＢａｍＨＩ−ＨＦの精度指数を測定し、ＷＴ酵素と比較した。
【０１１７】
【表６】
2014027938.tif 000022
【０１１８】
ＢａｍＨＩ−ＨＦは、ＮＥＢ１中で最高の活性を有し（精度指数は、＞８，０００である。）、ＷＴＢａｍＨＩは、ＮＥＢ２及びＮＥＢ３中で最高の活性を有し、最高のＦＩは３２である。全体的なＦＩ改善係数（変異体及びＷＴ酵素の各々に対して最良の緩衝液中でのＦＩの比率である。）は、＞８，０００／３２＝２５０倍である。
【０１１９】
１０．ＢａｍＨＩのさらなる変異
Ｅ１６３Ａ／Ｅ１６７Ｔ／Ｐ１７３Ａは、スター活性の好ましい低下を有し、さらに、熱的に不安定であると予想された。
【０１２０】
（Ｅ８６Ｐ／Ｋ８７Ｓ／Ｋ８８Ｐ／Ｅ１６３Ｓ／Ｅ１７０Ｔ／Ｐ１７３Ａ）を検査した。この変異体は、比活性の１０倍低下を示したが、宿主細胞からのタンパク質の増加した収率によって補われた。
【０１２１】
低下した熱的安定性、低下したスター活性及び許容可能な比活性を共有した他のＢａｍＨＩ変異体には、以下のものが含まれる。
【０１２２】
【化８】
2014027938.tif 000023
【実施例２】
【０１２３】
高精度ＥｃｏＲＩの調製
１．ＥｃｏＲＩの発現
ＥｃｏＲＩに対するＰＣＲは、以下のプライマーを使用した。
【０１２４】
【化９】
2014027938.tif 000024
【０１２５】
次いで、制限エンドヌクレアーゼの第二の対（ＳｐｈＩ及びＡｃｃ６５Ｉ）でＰＣＲ産物を消化し、制限エンドヌクレアーゼの同じ第二の対で消化されたｐＵＣ１９へ連結した。次いで、ｐＡＣＹＣ−ＭｌｕｃＩＭで予め改変された形質転換受容性イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に、連結されたプラスミドを形質転換した。
【０１２６】
２．ＥｃｏＲＩの突然変異導入
ＥｃｏＲＩのアイソシゾマーであるＲｓｒＩ（同じく、そのスター活性に関して知られている。）とのＥｃｏＲＩの比較から得られた標的アミノ酸残基の最初の選択。
【０１２７】
ＥｃｏＲＩ対ＲｓｒＩ
【０１２８】
【化１０】
2014027938.tif 000025
【０１２９】
既知の活性中心残基であるＤ９１、Ｅ１１１及びＫ１１３を除き、４２の帯電した残基は、２つのエンドヌクレアーゼ中において同一であり又は類似していた。帯電した残基は、以下のとおりであった。
【０１３０】
Ｋ４、Ｒ９、Ｋ１５、Ｋ２９、Ｈ３１、Ｄ３２、Ｅ３７、Ｅ４９、Ｒ５６、Ｒ５８、Ｋ６３、Ｅ６８、Ｋ７１、Ｄ７４、Ｋ８９、Ｅ９６、Ｋ９８、Ｋ９９、Ｒ１０５、Ｈ１１４、Ｄ１１８、Ｋ１３０、Ｄ１３３、Ｄ１３５、Ｅ１４４、Ｒ１４５、Ｈ１４７、Ｋ１４８、Ｅ１５２、Ｅ１６０、Ｈ１６２、Ｅ１７０、Ｅ１７７、Ｒ１８３、Ｄ１８５、Ｒ２００、Ｄ２０２、Ｒ２０３、Ｅ２５３、Ｒ２６４、Ｄ２６９。
【０１３１】
これらの帯電した残基の全てをＡｌａ（コドンＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＣ又はＧＣＧ）へ変異し、変異された遺伝子を増幅し、以下のようにクローニングした。
【０１３２】
増幅混合物は、実施例１において使用したものと同じであり（各ＰＣＲプライマー２μＬ、４００ｍＭｄＮＴＰ、ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ４単位、さらなるＭｇＳＯ４０、２、６μＬを加えた１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液１０μＬ及び総反応容積は１００μＬであった。）、ｐＵＣ１９−ＥｃｏＲＩ１μＬへ添加した。
【０１３３】
ＰＣＲ反応条件は、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３分３０秒間の２５サイクル、７２℃で７分間の最終伸長時間であった。ＰＣＲの後、標準的なＱｉａｇｅｎスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、産物を精製した。ＤｐｎＩの２０単位によって、ＰＣＲ産物１６μＬを１時間消化した。メチラーゼ保護された形質転換受容性のイー・コリ調製物中に消化された産物を形質転換した。
【０１３４】
３．ＥｃｏＲＩ高精度変異体のスクリーニング
各変異に対して、それぞれ３つのコロニーを摘み出し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを加えたＬＢ中で一晩増殖させた。変異体がＷＴＥｃｏＲＩと少なくとも同様の活性を有することを確認するために、ｐＢＲ３２２及びλＤＮＡに対して活性アッセイを行った。次いで、３７℃で１時間反応させた、２倍系列希釈、５０％グリセロール１２μＬ、ＮＥＢ１緩衝液３μＬ、ｐＢＲ３２２の０．５μＬ及び水１１．５μＬ中の細胞抽出物３μＬを用いて、これらの変異体を検査した。しかしながら、何れの変異も、スター活性の成績を向上させなかった。
【０１３５】
この結果から、アイソシゾマーの間で、有効な変異が相同的残基として必ずしも認識され得ないと結論付けられた。
【０１３６】
４．残り３２の帯電した残基に対する反復突然変異導入
アミノ酸残基５、１２、１４、２６、４０、４３、４４、５９、６２、６５、７２、７６、１００、１０３、１１７、１２３、１３１、１９２、２２１、２２５、２２６、２２７、２２８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４９、２５７、２６８、２７２及び２７７を標的とすることによって、工程２に記載されているように、残り３２の全ての帯電した残基をＡｌａへ変異した。
【０１３７】
上の数字は、ＥｃｏＲＩタンパク質配列（配列番号８３）中のアミノ酸位置に対応する。
【０１３８】
５．反復選択
変異の異なる種類を含有する各試料から、４つのコロニーを摘み出し、ＣＡＭを加えたＬＢ４ｍＬ中で増殖させた。音波処理後、ＮＥＢ１緩衝液中の正常なグリセロール条件中でλＤＮＡ基質に対して、細胞抽出物を検査した。ＮＥＢ２緩衝液３μＬ中の２倍系列希釈中の細胞抽出物３μＬをｐＵＣ１９の０．５μＬ及び反応混合物中に３９．２％グリセロールの最終濃度を与えるための５０％グリセロール２３．５μＬへ添加することによって、類似の活性を有する抽出物をｐＵＣ１９基質に対して再度検査した。
【０１３９】
これらの変異体全てのうち、Ｋ６２Ａは、最も低いスター活性及び高いＦＩを有する変異であることが明らかとなった。Ｒ９Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｒ１２３Ａ、Ｋ１３０Ａ、Ｒ１３１Ａ、Ｒ１８３Ａ変異体は全て、スター活性の部分的低下を示した。興味深いことに、標的化された変異Ｋ５Ａを含有する１つのクローンは部分的な改善を示した。さらに、配列決定後に、二次変異Ｓ２Ｙが発見された。これらの２つの変異の分離によって、この単離株に対する効果的な変異はＳ２Ｙであることが明らかとなった。Ｄ１３５Ａ及びＲ１８７ＡＥｃｏＲＩも、ずっと低いスター活性を有していた。しかしながら、これらの変異体の切断活性は最適でなかった。
【０１４０】
６．ＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）のＷＴＥｃｏＲＩとの比較
４つの異なるＮＥＢ緩衝液中でλＤＮＡ０．６μｇを消化することによって、ＮＥＢ希釈緩衝液Ｃを用いた３倍系列希釈中で、並列比較を行った（図６）。ＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）は、ＷＴＥｃｏＲＩより大幅に低いスター活性を有していた。
【０１４１】
ＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）及びＷＴＥｃｏＲＩに対して精度指数測定を測定することによって、より定量的な比較を行った。精度指数の測定のための条件は、基質としてのλＤＮＡ及び希釈緩衝液Ｃを用いる表２と同じであった。３７℃で１時間、反応を温置し、０．８％アガロースゲル上で消化産物を分析した。
【０１４２】
【表７】
2014027938.tif 000026
【０１４３】
７．ＥｃｏＲＩのさらなる変異
λＤＮＡ基質に対して、ＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）はスター活性を有することは明らかでなかったが、１０時間の消化後に、Ｌｉｔｍｕｓ２８基質を用いて、スター活性が観察された。ＮＥＢ４中のＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）は、ＥｃｏＲＩ緩衝液中のＷＴＥｃｏＲＩと比較して、著しく低下したスター活性を有していた（図７）。
【０１４４】
さらなる改善を調べた。実施例１のように、Ｋを対応するコドンへ変化させることによって、ＥｃｏＲＩ（Ｋ６２）を全ての他のアミノ酸残基へ変異させた。Ｋ６２Ｓ及びＫ６２Ｌは、Ｋ６２Ａと類似していた。ＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ｅ）は、図６に示されているように、ＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ａ）と比較すると、１００倍以上の全体的精度指数改善係数を有していた。ＥｃｏＲＩ（Ｋ６２Ｅ）は、ＥｃｏＲＩ−ＨＦと名づけられた。
【０１４５】
８．ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＷＴＥｃｏＲＩの比較
希釈液Ｃ中でのＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＷＴＥｃｏＲＩに対するＦＩ測定によって、定量的比較を行った。ＦＩ測定のための条件は、基質としてλＤＮＡを用いる表２と同じであった。反応条件は３７℃１時間であり、０．８％アガロースゲル上で結果を分析した（図８）。
【０１４６】
【表８】
2014027938.tif 000027
【０１４７】
全体的精度指数改善倍数は、６４倍であることが明らかとなった（ＮＥＢ３中のＷＴＥｃｏＲＩの２５０に対して、ＮＥＢ４中でＥｃｏＲＩ−ＨＦに対して１６，０００）。
【実施例３】
【０１４８】
高精度ＳｃａＩを改変する
１．ＳｃａＩの発現
ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼに対する配列はＲＥＢＡＳＥ及びＧｅｎＢａｎｋ中に記載されており、図４４に示されている（配列番号９７）。それぞれ、ｐＲＲＳ−ＳｃａＩ及びｐＡＣＹＣ１８４−ＳｃａＩＭを作製するために、これらの酵素を発現する遺伝子をプラスミド中に挿入した。次いで、形質転換受容性イー・コリ宿主細胞中に、ｐＡＣＹＣ１８４−ＳｃａＩＭを形質転換した。ｐＲＲＳベクターはｐＵＣ１９に由来し、多重クローニング部位の存在のみが異なる。発現株を作製するために、ｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲをイー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＳｃａＩＭ）中に形質転換した。播種及び細胞培養は、３０℃で行った。
【０１４９】
２．ＳｃａＩの突然変異導入
ＳｃａＩは、配列決定された２つのアイソシゾマー：ＬＩａＤＩ及びＮｍｅＳＩを有する。しかしながら、ＬＩａＤＩ又はＮｍｅＳＩのスター活性に関する既知の情報は存在せず、これらの酵素の活性部位に関する情報も一切存在しない。従って、タンパク質中の位置４、８、１１、１２、１４、１８、２５、２７、３０、３７、３９、４０、４３、４６、５１、５７、６１、６８、７２、７４、８０、８６、９７、１０３、１０８、１１２、１１４、１１９、１２０、１２１、１２７、１２８、１２９、１３３、１３５、１３９、１４０、１４１、１４７、１５２、１５６、１５８、１５９、１６１、１６２、１７１、１７２、１７５、１７９、１８２、１８４、１８７、１７２、１７５、１９２、１９３、１９５、２００、２２２、２２７における標的化された変異のために、まず、５８の帯電した残基全てを選択した。
【０１５０】
上の数字は、ＳｃａＩタンパク質配列（配列番号９７）中のアミノ酸位置に対応する。
【０１５１】
プライマーの設計及びＰＣＲの方法は、ＢａｍＨＩに関して実施例１中に、及びＥｃｏＲＩに関して実施例２中に記載されている方法と類似している。突然変異導入は、徐冷温度及びＤＮＡポリメラーゼを変動させることによって達成した。ＤｐｎＩを用いて、ＰＣＲ産物を消化し、形質転換受容性イー・コリ（ｐＡＣＹＣ１８４−ＳｃａＩＭ）中に形質転換した。
【０１５２】
３．ＳｃａＩ高精度変異体の選択
ＳｃａＩ変異体の各変異体から得た４つのコロニーを摘み出し、１００μｇ／ｍＬＡｍｐ及び３３μｇ／ｍＬＣａｍを加えたＬＢ４ｍＬ中において、３０℃で一晩増殖させた。各細胞培養物を音波処理し、ＮＥＢ２緩衝液中のλＤＮＡに対して、活性を検査した。明らかに活性を有するものを、１０、１００及び１，０００倍希釈で再検査した。ＳｃａＩは極めて著しいスター活性を有していたので、スター活性のバンドは、変異体対ＷＴ制限エンドヌクレアーゼに対して容易に比較された。ＮＥＢ希釈緩衝液Ａによる２倍系列希釈を用いて、低下したスター活性を有するものを再検査した。変異体の各々に対して、ＦＩを測定した。ＮＥＢ２緩衝液中のＷＴＳｃａＩに対して、ＦＩは１／８であった。類似の活性レベルを有する４つの変異体は、ＷＴＳｃａＩと比較して、大幅に低下したスター活性を有することが見出された。変異体＃６−３ＳｃａＩは２倍高い活性を有し、ＦＩは、ＷＴＳｃａＩより４又は３２倍優れていた。＃２６−２ＳｃａＩは２倍高い活性及びＷＴより８倍又は６４倍優れたＦＩを有する。＃２８−２ＳｃａＩは２倍高い活性を有し、ＦＩはＷＴより１２０又は１０００倍優れており、＃５４−３はＷＴと同じ活性を有しており、ＦＩはＴＷより２５０又は２０００倍優れている。
【０１５３】
λＤＮＡ基質の消化に関して、３６．７％グリセロールの存在下で、４つの変異体：＃６−３、＃２６−２、＃２８−２及び＃５４−３ＳｃａＩをさらに検査した。＃５４−３は、他の３つの変異体より、低下したスター活性のより大きな改善を示した。
【０１５４】
プラスミドを抽出した後、＃６−３を配列決定し、Ｒ１８Ａに変異を有することが明らかとなった。＃２６−２を配列決定し、Ｒ１１２Ａに変異を有することが明らかとなった。＃２８−２を配列決定し、Ｅ１１９Ａに変異を有することが明らかとなった。これらの変異は、予想された。しかしながら、＃５４−３は、二重変異体−Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆを有することが明らかとなった。Ｓ２０１Ｆは、ＰＣＲの間に起こった自発的二次変異であり、Ｈ１９３Ａ変異のプライマー領域の外側に位置していた。
【０１５５】
何れの残基がスター活性の低下に対して主に原因となるかを理解するために、以下のプライマーを用いて、単一変異（Ｓ２０１Ｆ）をＳｃａＩ中に導入した。
【０１５６】
【化１１】
2014027938.tif 000028
【０１５７】
ＳｃａＩ（Ｈ１９３Ａ）、ＳｃａＩ（Ｓ２０１Ｆ）及びＳｃａＩ（Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆ）に対する配列を確認した。５％及び３７％のグリセロールレベルで、３つの変異体及びＷＴＳｃａＩを比較した（図９）。Ｓ２０１Ｆは、僅かに寄与したに過ぎないＨ１９３Ａとは対照的に、ＦＩへ著しく寄与した。しかしながら、これら２つの変異は、ＦＩを改善する上で加算的であるように見受けられた。Ｓ２０１Ｆは５％グリセロール中でスター活性を示さなかったが、３７％グリセロール中で幾らかのスター活性を示した。Ｈ１９３Ａは５％グリセロール中の幾らかのスター活性を有し、３７％グリセロール中で著しいスター活性を有していた。しかしながら、これら２つの変異の組み合わせでは、５％又は３７％グリセロールの何れかにおいても、スター活性は検出しなかった。この発見は、水酸基を有するアミノ酸がスター活性のための主要な活性残基であり得ることを示すのみならず、変異の正しい組み合わせは、精度の向上を極めて高いレベルまで押し上げることができることも示している。帯電した残基の変異がスター活性を改善することができなければ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒに対する変異は精度指数を首尾よく改善するし得ることがここで観察される。ＳｃａＩ（Ｈ１９３Ａ／Ｓ２０１Ｆ）をＳｃａＩ−ＨＦと表記した。
【０１５８】
４．ＳｃａＩ−ＨＦ及びＷＴＳｃａＩの比較
４つの異なるＮＥＢ緩衝液中のλＤＮＡ１μｇ上に対して、異なるＮＥＢ緩衝液中のＮＥＢ希釈緩衝液Ａによる２．５倍系列希釈で、ＳｃａＩ−ＨＦ及びＷＴＳｃａＩを３７℃で、１時間比較した（図１０）。
【０１５９】
【表９】
2014027938.tif 000029
【０１６０】
ＳｃａＩ−ＨＦは、ＮＥＢ２及びＮＥＢ４緩衝液中で最高の成績を示し、これらの緩衝液中において最高のＦＩは２５０であった。ＷＴＳｃａＩはＮＥＢ２緩衝液中で最高の成績を示し、この緩衝液中においてＦＩは１／８であった。全体的なＦＩ改善係数は、２５０／（１／８）＝４０００であった。
【実施例４】
【０１６１】
高精度ＳａｌＩの改変
１．ＳａｌＩの発現
ｐｌａｃｚｚ１−ＳａｌＩＲ及びｐＡＣＹＣ−Ｈｐｙ１６６ＩＩＭで形質転換されたイー・コリ中でＳａｌＩを発現させた（ｐｌａｃｚｚＩは、隣接するマルチコピー部位の中に挿入された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現させるために、ｌａｃプロモーターを使用するｐＵＣ１９プラスミドである。）。Ｈｐｙ１６６ＩＩＭは、ＳａｌＩの４つの塩基の外側を保護する。
【０１６２】
２．ＳａｌＩの突然変異導入
前実施例中の類似のＰＣＲ法を用いて、ＳａｌＩ中の８６の帯電した残基をＡｌａに変異した。５、６、８、９、１２、１３、１９、２７、３１、３４、３５、３７、４２、４３、４５、５０、６０、６３、６５、６７、７３、８２、８３、８４、９０、９３、９７、１００、１０１、１０３、１０７、１０９、１１１、１１４、１１６、１１９、１２６、１２９、１３１、１３４、１４０、１４３、１４５、１４７、１４８、１５６、１５７、１６４、１６８、１７２、１７３、１７４、１８０、１８１、１８６、１９０、１９１、１９３、２１０、２１８、２２６、２３２、２３５、２３７、２３８、２４４、２４６、２５０、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６４、２６６、２７１、２７５、２９７、３００、３０４、３０５、３０６、３０８、３０９、３１１。
【０１６３】
上の数字は、ＳａｌＩタンパク質配列（配列番号９４）中のアミノ酸位置に対応する。
【０１６４】
Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、変異体を３０℃で一晩増殖させた。
【０１６５】
３．ＳａｌＩ−ＨＦの選択
前実施例に記載されているように、ＳａｌＩ−ＨＦの選択を行った。主要な差は、５％グリセロール又は高グリセロール濃度の何れかの中で、未精製抽出物中において、ＳａｌＩのスター活性を容易にアッセイできないということであった。グリセロールは、ＳａｌＩのスター活性を促進したのみならず、同族活性も大幅に阻害した。
【０１６６】
ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたλＤＮＡに対して、５％グリセロール及び３７％グリセロール中の両方で、活性を有する変異体のアッセイを行った。４つのＮＥＢ緩衝液全ての中で、切断活性に関して、変異体＃２２、＃２６、＃２９、＃３１、＃４３及び＃５１を検査した。異なる条件及び基質中での比較を数巡行った後、高い切断高活性を保持するが、大幅に低下したスター活性を示す＃３１、ＳａｌＩ（Ｒ１０７Ａ）が好ましい変異体であることが明らかとなった。ＳａｌＩ（Ｒ１０７Ａ）をＳａｌＩ−ＨＦと表記した。
【０１６７】
４．ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩの比較
ＳａｌＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｌＩのＦＩを測定した（図１１）。結果は、表１０として示されている（下記）。
【０１６８】
【表１０】
2014027938.tif 000030
【０１６９】
Ｓａｌ−ＨＦは、ＮＥＢ２及びＮＥＢ４緩衝液中で最高の成績を示し（何れも、ＦＩは、＞２０００）、ＷＴＳａｌＩは、ＮＥＢ３緩衝液中で最高の成績を示した（ＦＩは、４であった。）。全体的なＦＩ改善係数は、＞２０００／４＝＞５００であった。
【実施例５】
【０１７０】
高精度ＳｐｈＩの改変
１．ＳｐｈＩの発現
イー・コリ（ｐｌａｃｚｚ１−ＳｐｈＩＲ、ｐＡＣＹＣ１８４−ＣｖｉＡＩＩＭ）中で、ＳｐｈＩを発現させた。ＣｖｉＡＩＩＭは、ＳｐｈＩの内部の４塩基を保護する。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、形質転換された細胞を３７℃で一晩増殖させた。
【０１７１】
２．ＳｐｈＩの突然変異導入
実施例１から実施例４に記載されている方法を用いて、ＳｐｈＩ中の全ての帯電した残基をＡｌａに変異した。計７１の変異を行った。３、５、１２、１８、２１、２４、２５、３０、３１、３５、４３、４６、５１、５４、５７、５８、６０、６１、７２、７５、７７、７８、８７、９０、９１、９５、１００、１０４、１０７、１０８、１１０、１１３、１２０、１２３、１２４、１２５、１２９、１３０、１３１、１３９、１４０、１４２、１４６、１４７、１５５、１５７、１５９、１６４、１７０、１７２、１７３、１７５、１７８、１８４、１８６、１９０、１９４、１９６、１９７、１９８、２０６、２０７、２０９、２１２、２１５、２２１、２２７、２３０、２３１、２３２、２３５。
【０１７２】
上の数字は、ＳｐｈＩタンパク質配列（配列番号９８）中のアミノ酸位置に対応する。
【０１７３】
３．ＳｐｈＩ−ＨＦの選択
各変異の４つのコロニーを、３７℃で一晩、Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で増殖させた。活性選択は、ＮＥＢ２中の５％グリセロール及び３０％グリセロール中で、主にｐＢＲ３２２に対して行った。前記実施例の経験を用いて、高精度ＳｐｈＩの選択は簡潔であった。ＳｐｈＩ変異体Ｄ９１Ａ、Ｋ１００Ａ、Ｄ１３９Ａ及びＤ１６４Ａが、ＳｐｈＩ中のスター活性を著しく低下させることが見出された。
【０１７４】
これらのうち、Ｋ１００Ａが、最も少ないスター活性を有する好ましい変異であった。ＳｐｈＩ（Ｋ１００Ａ）は、ＳｐｈＩ−ＨＦと命名された。
【０１７５】
４．ＳｐｈＩ−ＨＦ及びＷＴＳｐｈＩの比較
ＳｐｈＩ−ＨＦ及びＷＴＳｐｈＩの比較を、それぞれの好ましい緩衝液中において、並列的に行った。ＮＥＢ希釈緩衝液Ａを用いてＳｐｈＩ−ＨＦを２倍系列希釈し、ＮＥＢ４中で反応させ、ＷＴＳｐｈＩはＮＥＢ希釈緩衝液Ｂで２倍系列希釈された。λＤＮＡ上での消化が、図１２中で比較されている。
【０１７６】
【表１１】
2014027938.tif 000031
【０１７７】
ＳｐｈＩ−ＨＦはＮＥＢ４中で最も成績がよく、ＮＥＢ４中において、ＦＩは、２０００以上である。ＷＴＳｐｈＩはＮＥＢ１又はＮＥＢ２中で最も成績がよく、これらの中で、好ましいＦＩは６４である。全体的なＦＩ改善係数は、３２以上であった。
【実施例６】
【０１７８】
高精度ＰｓｔＩの改変
１．ＰｓｔＩの発現
ＰｓｔＩは、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＨｐｙＣＨ４ＶＭ、ｐＰＲ５９４−ＰｓｔＩＲ）から発現させた。ＨｐｙＣＨ４ＶＭは、ＰｓｔＩの内部の４塩基を保護する。ｐＰＲ５９４は、Ａｍｐ耐性及びｐｔａｃプロモーターを有する発現ベクターである。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中において、３０℃で細胞を増殖させ、次いで、ＩＰＴＧによって、培養を一晩誘導した。
【０１７９】
２．ＰｓｔＩの突然変異導入
前実施例中に記載されている方法を用いて、９２の帯電した残基をＡｌａに変異させた。これらは、８、１０、１１、１４、２５、２６、３８、４０、４１、４４、４５、４７、５８、６１、６３、６６、６７、６９、７３、７４、７７、７８、８２、８５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０４、１０５、１１６、１１９、１２７、１２８、１３６、１４２、１４５、１４６、１５０、１５１、１５２、１５６、１５９、１６９、１７０、１７４、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１９１、１９７、２０２、２０４、２０７、２１２、２１４、２１７、２１８、２２６、２２７、２２８、２３１、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４６、２５１、２５７、２５８、２６１、２６３、２７３、２８２、２８４、２８６、２８７、２９５、２９７、３０２、３０５、３０６、３０９、３１３、３１４、３１９及び３２０であった。
【０１８０】
上の数字は、ＰｓｔＩタンパク質配列（配列番号９１）中のアミノ酸位置に対応する。
【０１８１】
ＤｐｎＩでＰＣＲ産物を消化した後、形質転換受容性イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＨｐｙＣＨ４ＶＭ）中に試料を形質転換し、Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢプレート上で増殖させた。
【０１８２】
３．ＰｓｔＩ−ＨＦの選択
ＰｓｔＩ−ＨＦの選択は、先述の試料と類似していた。正常な活性の酵素活性は、５％グリセロールを用いて、λＤＮＡに対して検査し、スター活性は、ＮＢ４緩衝液及び２０％ＤＭＳＯの条件で、ｐＢＲ３２２基質に対して検査した。ＤＭＳＯは、同じ濃度のグリセロールより著しくスター活性を増強した。選択の間に、＃２６、＃５６及び＃６５は、ＷＴと比べて、低下したスター活性を有した。それぞれを配列決定すると、変異は、Ｄ９１Ａ、Ｅ２０４Ｇ及びＫ２２８Ａ／Ａ２８９Ｖであることが明らかとなった。変異体＃２６ＰｓｔＩ（Ｄ９１Ａ）をＰｓｔＩ−ＨＦと表記した。
【０１８３】
４．ＰｓｔＩ−ＨＦ及びＷＴＰｓｔＩの比較
ＰｓｔＩ−ＨＦ及びＷＴＰｓｔＩのＦＩは、ＮＥＢ１から４緩衝液中で、λＤＮＡ基質に対して別個に測定した。希釈緩衝液は、ＮＥＢ希釈緩衝液Ｃである。比較は図１３に示されており、結果は表１２に列記されている（以下）。
【０１８４】
【表１２】
2014027938.tif 000032
【０１８５】
好ましいＦＩが＞２０００であるＮＥＢ２及びＮＥＢ４中において、ＰｓｔＩ−ＨＦは最高の成績であり、ＷＴＰｓｔＩはＦＩが１２０であるＮＥＢ３中で、最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞２０００／１２０＝１６倍であった。
【実施例７】
【０１８６】
高精度ＮｃｏＩの改変
１．ＮｃｏＩの発現
ＮｃｏＩの発現は、イー・コリ（ｐＳＹＸ２０−ＮｃｏＩＭ，ｐＲＲＳ−ＮｃｏＩＲ）中で行った。ｐＲＲＳは、ｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐＳＹＸ２０はｐＲＲＳベクターを有する適合的な低コピー数プラスミドである。Ａｍｐ及びカナマイシン（Ｋａｎ）を加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０１８７】
２．ＮｃｏＩの突然変異導入
ＮｃｏＩ中の６６の帯電した残基の全てをＡｌａに変異した。これらの残基は、７、８、１９、２２、２７、３０、３１、３２、３３、３７、３９、４２、４６、５５、５６、６１、６２、６４、６８、６９、７５、８４、８８、８９、９２、９３、９５、９７、１００、１１６、１３６、１４４、１４６、１６２、１６６、１７０、１７８、１８３、１８５、１８７、１８８、１８９、１９６、１９９、２０２、２０４、２０９、２１１、２１２、２１３、２１６、２１９、２２７、２２９、２３７、２４１、２４４、２５０、２５１、２５７、２５９、２６１、２６８、２７９、２８２、２８５。
【０１８８】
上の数字は、ＮｃｏＩタンパク質配列（配列番号８８）中のアミノ酸位置に対応する。
【０１８９】
前記方法は、逆ＰＣＲ後のＤｐｎＩ消化を用いて、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＳＹＸ２０−ＮｃｏＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０１９０】
３．ＮｃｏＩ−ＨＦの選択
ＮｃｏＩ−ＨＦの選択は、ＰｓｔＩ−ＨＦの選択と同様であった。活性は、５％グリセロールとともに、基質としてλＤＮＡを用いて、上述のようにアッセイした。スター活性は、１９％ＤＭＳＯ中のｐＢＲ３２２又はλを用いて測定した。以下の変異が、スター活性を改善させることが見出された。Ａ２Ｔ／Ｒ３１Ａ、Ｄ５６Ａ、Ｈ１４３Ａ、Ｅ１６６Ａ、Ｒ２１２Ａ及びＤ２６８Ａ。これらの変異体のうち、ＮｃｏＩ（Ａ２Ｔ／Ｒ３１Ａ）をＮｃｏＩ−ＨＦとして選択した。
【０１９１】
４．ＮｃｏＩ−ＨＦ及びＷＴＮｃｏＩの比較
ＮｃｏＩ−ＨＦ及びＷＴＮｃｏＩのＦＩは、ＮＥＢ１から４緩衝液中で、λＤＮＡ基質に対して別個に測定した。比較は図１４に示されており、結果は表１３に列記されている（以下）。
【０１９２】
【表１３】
2014027938.tif 000033
【０１９３】
ＮｃｏＩ−ＨＦは、ＮＥＢ４中で最も大きなスター活性の低下を示し、ＮＥＢ４中において、好ましいＦＩは＞１６０００であり、ＷＴＮｃｏＩは、ＮＥＢ１、ＮＥＢ２及びＮＥＢ４中で最も優れた成績を示し、これらの中において、好ましいＦＩは１２０であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞１６０００／１２０＝１２５であった。
【実施例８】
【０１９４】
高精度ＮｈｅＩの改変
１．ＮｈｅＩの発現
ｐＡＣＹＣ−ＮｈｅＩ及びｐｌａｃｚｚ１−ＮｈｅＩＲで形質転換されたイー・コリ中でＮｈｅＩを発現させた。ｐｌａｃｚｚ１は、ｐＵＣ１９由来のプラスミドである。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０１９５】
２．ＮｈｅＩの突然変異導入
ＮｈｅＩ中の９２の帯電した残基全てを、以下の残基としてＡｌａに変異した。５、６、７、１４、１７、１９、２２、２５、２８、３１、３８、３９、４２、４７、４９、５２、５６、５８、５９、６０、６４、７４、７５、７６、７７、８０、９１、９３、１０４、１０５、１１０、１１２、１１６、１１７、１２３、１２６、１３０、１３１、１３３、１３５、１３７、１４７、１４９、１５２、１５９、１６０、１６５、１６７、１７０、１７１、１７４、１７９、１８３、１９５、２０２、２０５、２０７、２０９、２１０、２１１、２１４、２１６、２１８、２２１、２２５、２３１、２４１、２４３、２４４、２５０、２５２、２５６、２５７、２５９、２６４、２６６、２６７、２８１、２８５、２８７、２８８、２８９、２９１、２９７、３００、３０７、３１３、３１５、３１８、３２１、３２４、３２５。
【０１９６】
上の数字は、ＮｈｅＩタンパク質配列（配列番号８９）中のアミノ酸位置に対応する。
【０１９７】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＮｈｅＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０１９８】
３．ＮｈｅＩ−ＨＦの選択
前実施例に従って、ＮｈｅＩ−ＨＦの選択を行った。標準及びスター活性アッセイは、それぞれ、ＮＥＢ４緩衝液及び５％グリセロール及び３９％グリセロール中に、基質としてｐＢＲ３２２を含有した。１つの変異のみが、ＮｈｅＩを改善する上で有意であることが明らかとなった。これは、Ｅ７７Ａであった。ＮｈｅＩ（Ｅ７７Ａ）をＮｈｅＩ−ＨＦとして選択した。
【０１９９】
４．ＮｈｅＩ−ＨＦ及びＷＴＮｈｅＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液のそれぞれの中で、ｐＸｂａ（アデノウイルスから得たＸｂａＩ消化された片を含有するプラスミド基質）に対して、ＮｈｅＩ−ＨＦ及びＷＴＮｈｅＩのＦＩを別々に測定した。比較は図１５に示されており、結果は表１４に列記されている（以下）。
【０２００】
【表１４】
2014027938.tif 000034
【０２０１】
ＮｈｅＩ−ＨＦは、そのＦＩが＞１２８，０００であるＮＥＢ１緩衝液中で最適な活性を示した。ＷＴＮｈｅＩは、その最高のＦＩが３２であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４緩衝液中において、最大の活性を有しており、従って、全体的なＦＩ改善係数は、＞１２８，０００／３２＝＞４０００である。
【実施例９】
【０２０２】
高精度ＳｓｐＩの改変
１．ＳｓｐＩの発現
ｐＡＣＹＣ−ＳｓｐＩＭ及びｐｌａｃｚｚ１ＳｓｐＩＲで形質転換されたイー・コリからＳｓｐＩを発現させた。ｐｌａｃｚｚ１は、ｐＵＣ１９由来のプラスミドである。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０２０３】
２．ＳｓｐＩの突然変異導入
ＳｓｐＩ中の８１の帯電した残基全てをＡｌａに変異させた。これらは、３、８、１２、１３、１８、１９、２０、３５、４０、４２、４４、４７、５２、６０、６２、６５、６８、６９、７２、７４、７６、７７、７８、７９、８３、８５、８８、８９、９０、９６、１００、１０８、１０９、１１８、１１９、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３７、１４４、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１６５、１６８、１７０、１７２、１７７、１７８、１７９、１８１、１８５、１８６、１８７、１９１、１９４、１９５、１９７、２０２、２０４、２１５、２２２、２２９、２３７、２４０、２４６、２５０、２５６、２５７、２５９、２６０、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７４であった。
【０２０４】
上の数字は、ＳｓｐＩタンパク質配列（配列番号９９）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２０５】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＳｓｐＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０２０６】
３．ＳｓｐＩ高精度変異体の選択
それぞれ、ＮＥＢ４緩衝液及び５％グリセロール及び３９％グリセロール中のΦＸ１７４基質を用いて、ＮｈｅＩの標準的な同族及びスター活性アッセイを行った。変異体＃１６（Ｈ６５Ａ）、＃２０（Ｋ７４Ａ）、＃２３（Ｅ７８Ａ）、＃２６（Ｅ８５Ａ）、＃２８（Ｅ８９Ａ）、＃３３（Ｋ１０９Ａ）、＃３４（Ｅ１１８Ａ）、＃５２（Ｒ１７７Ａ）、＃６２（Ｋ１９７Ａ）、＃６７（Ｄ２２９Ａ）は全て、低下したスター活性を示した。Ｋ１０９Ａは、最も大きなスター活性の低下を示した。スター活性のさらなる改善を探索することを決定した。
【０２０７】
４．さらなる変異
当初Ｔｙｒとして同定された全ての残基はＰｈｅへ変異されたのに対して、他の残基Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｒｐはＡｌａへ変異された。このグループは、以下の位置に、９５の残基の変異を含んだ。２、６、７、９、１０、１３、２２、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３９、４１、５１、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６３、７１、７５、８１、８４、８７、９１、９４、９８、１０４、１０６、１０７、１１０、１１１、１１３、１１４、１２３、１２５、１３４、１３６、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４６、１５２、１５７、１５９、１６０、１６４、１７３、１７５、１８０、１８３、１９０、１９２、１９３、１９６、１９８、１９９、２０１、２０５、２０７、２１１、２１４、２１８、２１９、２２０、２２１、２２３、２２５、２２６、２２７、２２８、２３０、２３２、２３３、２３５、２３８、２３９、２４１、２４９、２５４、２５５、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０。
【０２０８】
上の数字は、ＳｓｐＩタンパク質配列（配列番号１１３）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２０９】
ＰＣＲ及び選択は、上と同じ手順によって行った。これらの変異体のうち、Ｙ９８Ｆは最も低いスター活性を有しており、この点で、ＳｓｐＩ（Ｋ１０９Ａ）より優れていることが明らかとなった。ＳｓｐＩ（Ｙ９８Ｆ）をＳｓｐＩ−ＨＦと表記し、生産株として寄託した。
【０２１０】
５．ＳｓｐＩ−ＨＦ及びＷＴｓｓｐＩの比較
ＳｓｐＩ−ＨＦ及びＷＴｓｓｐＩのＦＩは、ＮＥＢ１から４緩衝液中で、λＤＮＡ基質を用いて別個に測定した。希釈液は、ＮＥＢＣであった。比較は図１６に示されており、結果は表１５に列記されている（以下）。
【０２１１】
【表１５】
2014027938.tif 000035
【０２１２】
ＳｓｐＩ−ＨＦは、好ましいＦＩが５００であるＮＥＢ４中において最高の成績であり、ＷＴＳｓｐＩは、好ましいＦＩが６４であるＮＥＢ１、ＮＥＢ２及びＮＥＢ４中において最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、５００／６４＝８であった。
【実施例１０】
【０２１３】
高精度ＮｏｔＩの改変
１．ＮｏｔＩの発現
ＮｏｔＩは、ＮＥＢ４緩衝液中で著しいスター活性を有し、ＮＥＢ３緩衝液中ではより低いスター活性を有する。何れのＮＥＢ緩衝液中においてもスター活性を低下するように、ＮｏｔＩを改変した。ｐＡＣＹＣ１８４−ＥａｇＩＭ及びｐｌａｃｚｚ２−ＮｏｔＩＲで形質転換された形質転換受容性イー・コリ中で、ＮｏｔＩを発現させた。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３７℃で一晩増殖させた。
【０２１４】
２．ＮｏｔＩの突然変異導入
ＮｏｔＩ中の９７の帯電した残基全てを、以下の残基としてＡｌａに変異した。２、４、８、１０、１７、２１、２２、２６、３１、３４、３５、３６、４９、５２、５７、５９、６２、７２、７４、７５、７７、８４、８７、９６、９７、１０５、１１７、１２１、１２２、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３、１４０、１４１、１４５、１５０、１５２、１５６、１６０、１６５、１６７、１７４、１７６、１７７、１８２、１８７、１８９、１９３、１９４、２００、２０５、２０８、２１０、２１９、２２４、２２５、２２７、２３６、２３７、２４５、２５１、２５３、２６７、２７１、２７２、２８０、２８３、２９０、２９２、２９４、２９６、３０４、３０６、３０８、３１０、３１４、３１９、３２１、３２３、３２７、３３１、３３５、３３６、３３９、３５３、３５４、３５６、３５８、３６１、３６５、３６７、３６８、３６９、３７０、３７８、３８２。
【０２１５】
上の数字は、ＮｏｔＩタンパク質配列（配列番号９０）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２１６】
変異体を酵素中に導入するための前記方法は、逆ＰＣＲ後のＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、ｐＡＣＹＣ−ＥａｇＩＭを含有するイー・コリ中に、処理された産物を形質転換した。
【０２１７】
３．ＮｏｔＩ−ＨＦの選択
前実施例に記載されているように、ＮｏｔＩ−ＨＦの選択を行った。標準的な同族及びスター活性アッセイは、それぞれ、ＮＥＢ４緩衝液及び５％グリセロール及びＮＥＢＥｘｏＩ緩衝液（６７ｍＭグリシン−ＫＯＨ、ｐＨ９．５、６．７ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール）及び３７％グリセロール中で、ｐＸｂａ基質を使用した。＃３７（Ｋ１５０Ａ）、＃４４（Ｋ１７６Ａ）、＃４５（Ｒ１７７Ａ）、＃６３（Ｒ２５３Ａ）は全て、低下したスター活性を示した。Ｋ１５０Ａは、スター活性を低下させるための好ましい変異であった。ＮｏｔＩ（Ｋ１５０Ａ）をＮｏｔＩ−ＨＦとして選択した。
【０２１８】
４．ＮｏｔＩ−ＨＦ及びＷＴＮｏｔＩの比較
ＮｏｔＩ−ＨＦ及びＷＴＮｏｔＩのＦＩは、ＮＥＢ１から４緩衝液中でｐＸｂａ基質を用いて別個に測定した。比較は図１７に示されており、結果は表１６に列記されている（以下）。
【０２１９】
【表１６】
2014027938.tif 000036
【０２２０】
ＮｏｔＩ−ＨＦは、好ましいＦＩが＞１２８０００であるＮＥＢ２中において最高の成績であり、ＷＴＮｈｅＩは、好ましいＦＩが４０００であるＮＥＢ３中において最高の成績であった。全体的な精度指数の改善係数は、＞１２８０００／４０００＝＞３２であった。ＮｏｔＩを改変することは、ＮｏｔＩのＦＩをさらに改善したのみならず、最適な緩衝液も変化させた。
【実施例１１】
【０２２１】
高精度ＳａｃＩの改変
１．ＳａｃＩの発現
ｐＬＧ−ＳａｃＩＭ及びｐＲＲＳ−ＳａｃＩＲで形質転換されたイー・コリ中でＳａｃＩを発現した。ｐＲＲＳは、ｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐＬＧは、低コピー数の適合的プラスミドである。Ａｍｐ及びＫａｎを加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０２２２】
２．ＳａｃＩの突然変異導入
ＳａｃＩ中の１０１の帯電した残基全てを、以下の残基としてＡｌａに変異した。６、７、１１，１５、１６、１９、２４、２５、２９、３０、３９、４０、４２、４５、５８、６１、６２、６３、６５、６７、７０、７１、７２、７４、７５、７６、８１、８５、９４、９８、１０４、１０５、１１４、１１６、１２０、１２３、１２７、１２９、１３３、１３４、１４１、１４３、１４４、１４５、１４６、１５０、１５１、１５４、１６９、１７０、１７２、１８１、１８７、１９６、１９７、２００、２０１、２１１、２１６、２２０、２２１、２２４、２２７、２２８、２３２、２３８、２４０、２４６、２４８、２５０、２５８、２７０、２７１、２７７、２８１、２８８、２８９、２９５、２９６、２９７、２９９、３０３、３０６、３１３、３１４、３２１、３２２、３２４、３３２、３３６、３３７、３４０、３４２、３４４、３４５、３４７、３４９、３５０、３５３、３５７。
【０２２３】
上の数字は、ＳａｃＩタンパク質配列（配列番号９３）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２２４】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＬＧ−ＳａｃＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０２２５】
３．ＳａｃＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＳａｃＩ−ＨＦの選択を行った。標準的な活性のチェックはＮＥＢ４中の５％グリセロールを加えたｐＵＣ１９を使用し、スター活性のチェックは、３９％グリセロールを加えたＮＥＢ４緩衝液中においてｐＵＣ１９に対して行った。＃５２ＳａｃＩ（Ｑ１１７Ｈ／Ｒ１５４Ａ／Ｌ２８４Ｐ）及び＃６０ＳａｃＩ（Ｑ１１７Ｈ／Ｒ２００Ａ）は何れも、低下したスター活性を有し、ＳａｃＩＱ１１７Ｈ／Ｒ２００Ａは、好ましい変異であることが判明した。Ｑ１１７Ｈは、テンプレートから持ち越された変異であり、ＳａｃＩの活性に影響を及ぼさなかった。ＳａｃＩ（Ｑ１１７Ｈ／Ｒ２００Ａ）をＳａｃＩ−ＨＦとして選択した。
【０２２６】
４．ＳａｃＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｃＩの比較
ＳａｃＩ−ＨＦ及びＷＴＳａｃＩのＦＩは、ＮＥＢ１から４緩衝液中でｐＸｂａ基質に対して別個に測定した。比較は図１８に示されており、結果は表１７に列記されている（以下）。
【０２２７】
【表１７】
2014027938.tif 000037
【０２２８】
ＳａｃＩ−ＨＦは、ＦＩが４０００であるＮＥＢ４中において最高の成績であり、ＷＴＳａｃＩは、好ましいＦＩが１２０であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４中において最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、４０００／１２０＝３２であった。
【実施例１２】
【０２２９】
高精度ＰｖｕＩＩの改変
１．ＰｖｕＩＩの発現
ｐＡＣＹＣ−ＰｖｕＩＩＭ及びｐｌａｃｚｚ２−ＰｖｕＩＩＲで形質転換されたイー・コリ中でＰｖｕＩＩを発現させた。ｐｌａｃｚｚ２は、ｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐＡＣＹＣは、低コピー数の適合的プラスミドである。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０２３０】
２．ＰｖｕＩＩの突然変異導入
ＰｖｕＩＩ中の４７の帯電した残基全てを、以下の残基としてＡｌａへ変異させた。３、５、８、１１、１５、１８、２１、２５、２６、３０、３４、３８、５４、５５、５８、６１、６６、６８、７０、７５、７８、８３、８４、８５、９３、９５、１０５、１１０、１１４、１１６、１１８、１１９、１２１、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３４、１３６、１３７、１３８、１４３、１４７、１５１、１５２及び１５５。
【０２３１】
上の数字は、ＰｖｕＩＩタンパク質配列（配列番号９２）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２３２】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＰｖｕＩＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０２３３】
３．ＰｖｕＩＩ高精度変異体の選択
ＰｖｕＩＩ−ＨＦの選択は、前実施例と同様であった。標準的な活性のチェックはＮＥＢ４中の５％グリセロールを加えたλＤＮＡ基質を使用し、スター活性のチェックは、３９％グリセロールを加えたＮＥＢ４緩衝液中においてｐＢＲ３２２に対して行った。何れの変異体も、高精度ＰｖｕＩＩとして認定されなかった。
【０２３４】
４．さらなる突然変異導入工程
さらなる突然変異導入工程は、ＰｖｕＩＩ中のＳｅｒ、Ｔｈｒの全てのＡｌａへの変異及びＴｙｒのＰｈｅへの変異であった。変異された位置は、２、１９、４６、４９、６７、７１、７７、８１、８２、９４、１０４、１１３、１２３、１２４、１３２、１３３、１４８、１５４及び１５７であった。
【０２３５】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＰｖｕＩＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０２３６】
ＰｖｕＩＩ（Ｔ４６Ａ）は、ＷＴＰｖｕＩＩより低いスター活性を有するが、さらなる改善が望まれた。
【０２３７】
コドンを対応するアミノ酸へ変化させることによって、他の全てのアミノ酸残基へＴ４６を変異させた。これらの変異の全てのうち、Ｔ４６Ｈ、Ｔ４６Ｋ、Ｔ４６Ｙ、Ｔ４６Ｇは全てＴ４６Ａより優れていた。Ｔ４６ＧをＰｖｕＩＩ−ＨＦとして選択する。
【０２３８】
５．ＰｖｕＩＩ−ＨＦ及びＷＴＰｖｕＩＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液中の希釈液Ａを用いて、ｐＢＲ３２２に対して、ＰｖｕＩＩ−ＨＦ及びＷＴＰｖｕＩＩのＦＩを別個に測定した。比較は図１９に示されており、結果は表１８に列記されている（以下）。
【０２３９】
【表１８】
2014027938.tif 000038
【０２４０】
ＰｖｕＩＩ−ＨＦは、ＦＩが５００であるＮＥＢ４中において最高の成績であり、ＷＴＰｖｕＩＩは、好ましいＦＩが２５０であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４中において最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、５００／２５０＝２であった。全体的なＦＩ改善係数はＰｖｕＩＩに関して高くないが、ＦＩは、ＮＥＢ４中で２，０００倍向上した。
【実施例１３】
【０２４１】
高精度ＭｆｅＩの改変
１．ＭｆｅＩの発現
ｐＡＣＹＣ−ＭｌｕＣＩＭ及びｐＲＲＳ−ＭｆｅＩＲで形質転換されたイー・コリ中でＭｆｅＩを発現させた。ｐＲＲＳは、ｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐＡＣＹＣは、低コピー数の適合的プラスミドである。ＭｌｕＣＩＭは、ＭｆｅＩの４つの内部核酸配列であるＡＡＴＴをメチル化する。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３７℃で一晩増殖させた。
【０２４２】
２．ＭｆｅＩの突然変異導入
ＭｆｅＩの突然変異導入を３つのバッチで行った。第一のバッチは、以下のアミノ酸位置としてＡｌａへ変異された帯電された残基の全てである。３、５、９、１９、２４、３６、３９、４４、４５、４７、４８、５０、６０、６１、６４，６５、７２、８３、８７、９０、９２、９３、９８、１００、１０１、１０３、１０７、１０９、１１０、１１５、１１９、１２０、１２１、１２４、１３２、１３５、１４２、１４３、１４４、１５３、１５５、１５８、１５９、１６１、１６２、１６４、１６５、１７１、１７２、１７５、１８１、１８４、１８７、１８８、１９２、１９５、１９６、１９８、１９９、２００。第二のバッチは、水酸基を有する残基（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ）の全てであり、Ｓｅｒ及びＴｈｒはＡｌａへ変化され、ＴｙｒはＰｈｅへ変化される。残基は、４、７、２１、２８、３８、４０、４３、５３、７４、７５、７６、８１、８９、９１、１１２、１２２、１２７、１３４、１３６、１５７、１６７、１７０、１７３、１７７、１８５及び２００である。第三のバッチは、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐの残基であり、全てＡｌａへ変化され、残基は、１０、１２、１３、２５、２６、２９、３１、３２、３５、５１、５５、６７、６８、７７、７８、８４、８８、９６、１０２、１０５、１１７、１２３、１２６、１４１、１４８、１４９、１５２、１６８、１６９、１７４、１７６、１７８、１７９、１８０、１８３、１９１、１９３、１９４である。
【０２４３】
上の数字は、ＭｆｅＩタンパク質配列（配列番号５）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２４４】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＭｌｕＣＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０２４５】
３．ＭｆｅＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＭｆｅＩ−ＨＦの選択を行った。ＮＥＢ４中の５％グリセロールとともにΦＸ１７４基質を用いて、切断活性を測定し、３９％グリセロールを加えたＮＥＢ４緩衝液中でΦＸ１７４基質を用いて、スター活性を測定した。この酵素に対する著しい困難は、多くの変異が低下したスター活性を有する酵素の切断活性を改善したが、ＷＴ酵素より高いグリセロール濃度を必要としたということであった。ＭｆｅＩ（Ｋ５０Ａ）は、高濃度のグリセロール中で低下したスター活性及び高い切断活性を有する１つの例であるが、より低いグリセロール濃度では、活性は低かった。ＭｆｅＩ（Ｙ１７３Ａ）も、スター活性を低下させた。好ましい変異は、Ｑ１３Ａ／Ｆ３５Ｙであった。Ｆ３５Ｙの変異はテンプレートから得られ、Ｑ１３Ａは標的化された変異であった。ＭｆｅＩ（Ｑ１３Ａ／Ｆ３５Ｙ）をＭｆｅＩ−ＨＦと表記した。
【０２４６】
４．ＭｆｅＩ−ＨＦ及びＷＴＭｆｅＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液中のＮＢＥ希釈液Ａ中での希釈を用いて、λＤＮＡ基質に対して、ＭｆｅＩ−ＨＦ及びＷＴＭｆｅＩのＦＩを別個に測定した。比較は図２０に示されており、結果は表１９に列記されている（以下）。
【０２４７】
【表１９】
2014027938.tif 000039
【０２４８】
ＭｆｅＩ−ＨＦは、好ましいＦＩが１０００以上であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４中において最高の成績であり、ＷＴＭｆｅＩは、好ましいＦＩが３２であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４中において最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞１０００／３２＝３２倍であった。
【実施例１４】
【０２４９】
高精度ＨｉｎｄＩＩＩの改変
１．ＨｉｎｄＩＩＩの発現
ＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子の両方を含有するｐＵＣ１９−ＨｉｎｄＩＩＩＲＭで形質転換されたイー・コリ中でＨｉｎｄＩＩＩを発現させた。Ａｍｐを加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０２５０】
２．ＨｉｎｄＩＩＩの突然変異導入
ＨｉｎｄＩＩＩ中の８８の帯電した残基をＡｌａへ変異させた。これらは、２、３、７、８、１４、２０、２２、３４、３７、３９、４２、４５、５２、５５、６１、６２、６６、６９、７４、８４、８７、８９、９４、１００、１０１、１０９、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２４、１２６、１２８、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１５３、１５８、１６２、１６３、１７１、１７２、１８０、１８２、１８３、１９０、１９７、１９８、２０１、２０２、２０７、２０９、２１４、２１５、２１８、２２２、２２５、２２７、２２８、２２９、２３７、２３８、２４３、２４４、２４５、２４９、２５０、２５１、２５４、２５５、２６１、２６５、２６６、２６７、２７０、２７４、２７５、２８１、２８３、２８６、２９０、２９３、２９６、２９７であった。
【０２５１】
以下の位置において、全ての残基Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐをＡｌａへ変化させたのに対して、ＴｙｒはＰｈｅへ変化させた。４、１１、１５、１７、１８、１９、２１、２３、２６、２７、３０、３１、３６、３８、４６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、７６、７７、８０、８２、８３、８８、９１、９９、１０２、１０３、１０４、１１２、１１３、１１６、１１８、１２１、１２２、１２５、１３１、１３３、１３９、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５１、１５２、１５４、１５５、１５７、１５９、１６０、１６４、１６８、１６９、１７０、１７８、１８４、１８５、１８７、１８８、１８９、１９１、１９３、１９４、１９５、１９９、２００、２０３、２０４、２０６、２１０、２１１、２１２、２１３、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２４、２３０、２３２、２３３、２３６、２４０、２４１、２４６、２５２、２５３、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２７７、２７８、２７９、２８０、２８４、２８７、２８８、２９４、２９５、２９９。
【０２５２】
上の数字は、ＨｉｎｄＩＩＩタンパク質配列（配列番号８５）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２５３】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ株ＥＲ３０８１中に、処理された産物を形質転換した。
【０２５４】
３．ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦの選択を行った。標準的な活性のチェックはＮＥＢ４中の５％グリセロールを加えたλＤＮＡを使用し、スター活性は、３９％グリセロールを加えたＮＥＢ４緩衝液中においてλＤＮＡ基質を用いて測定した。ＨｉｎｄＩＩＩの２つの変異体が、低下したスター活性を有することが見出された。これらは、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｋ１９８Ａ）及びＳ１８８Ｐ／Ｅ１９０Ａであった。ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｋ１９８Ａ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦと表記した。
【０２５５】
４．ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ及びＷＴＨｉｎｄＩＩＩの比較
希釈液Ｂを加えたＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中で、λＤＮＡ基質を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ及びＷＴＨｉｎｄＩＩＩのＦＩを別個に測定した。比較は図２１に示されており、結果は表２０に列記されている（以下）。
【０２５６】
【表２０】
2014027938.tif 000040
【０２５７】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦは、好ましいＦＩが＞６４０００であるＮＥＢ２中において最高の成績であり、ＷＴＨｉｎｄＩＩＩは、好ましいＦＩが２５０であるＮＥＢ２中において最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、４０００／１２０＝３２であった。
【実施例１５】
【０２５８】
高精度ＳｂｆＩの改変
１．ＳｂｆＩの発現
ｐＵＣ１９−ＳｂｆＩＲＭで形質転換されたイー・コリ中で、ＳｂｆＩを発現させた。Ａｍｐを加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０２５９】
２．ＳｂｆＩの突然変異導入
ＳｂｆＩ中の７８の帯電した残基をＡｌａへ変異させた。これらは、５、８、１５、１８、２３、２７、３０、３４、４６、４９、５０、５３、５８、６３、６６、７０、７１、７４、８１、８２、８３、８５、８６、８７、９０、９４、１０３、１１５、１２０、１２１、１２７、１３２、１３５、１３６、１４３、１４４、１４７、１５０、１５２、１５４、１６４、１６９、１７０、１８３、１８４、１８７、１８８、１９２、１９６、２０４、２０６、２０８、２１３、２１４、２１５、２１８、２１９、２２６、２２８、２３０、２３３、２３７、２３８、２３９、２４１、２４８、２５１、２５３、２５７、２５８、２５９、２６０、２６２、２６６、２８２、２８４、２８５、２８８、２９３、２９７、２９９、３０４、３０５、３０７、３１１、３１６及び３２２であった。
【０２６０】
ＳｂｆＩ中のＳｅｒ及びＴｈｒの残基も、Ａｌａへ変異させた。Ｔｙｒは、Ｐｈｅに変異させた。以下の位置を標的とした。３、４、５、１０、１３、１６、３１、３５、３８、５４、５５、５６、６８、７６、７８、８０、８８、１０９、１１１、１１６、１１９、１２９、１３１、１３７、１４６、１６２、１７４、１９７、１９８、２０１、２０５、２１０、２２４、２５２、２６３、２７０、２７２、２８６、２９８、３１５、３２１。
【０２６１】
Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐの別の５５残基も、２、２４、２６、２９、３２、５１、６２、６５、６７、７２、８４、９１、９２、９５、９７、１０１、１０４、１０６、１１０、１１２、１１４、１１７、１２４、１３４、１４０、１５７、１６０、１７１、１７８、１７９、１８５、１８９、１９３、２１２、２１７、２２５、２３１、２４３、２４５、２４７、２５６、２６５、２６８、２７７、２７９、２８０、２８１、２８３、２８７、２８９、２９０、２９６、３０１、３１３及び３１７の位置で、Ａｌａへ変異させた。
【０２６２】
上の数字は、ＳｂｆＩタンパク質配列（配列番号９６）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２６３】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。イー・コリ株ＥＲ２９８４中に変異された産物を形質転換した。
【０２６４】
３．ＳｂｆＩ−ＨＦの選択
前実施例に記載されているように、ＳｂｆＩ−ＨＦの選択を行った。標準的な活性のチェックはＮＥＢ４中の５％グリセロールとともにλＤＮＡ基質を使用し、スター活性のチェックは、エキソヌクレアーゼＩ緩衝液中のλＤＮＡに対して行った。ＳｂｆＩ（Ｋ２５１Ａ）をＳｂｆＩ−ＨＦと表記した。
【０２６５】
４．ＳｂｆＩ−ＨＦ及びＷＴＳｂｆＩの比較
ＳｂｆＩ−ＨＦ及びＷＴＳｂｆＩのＦＩは、希釈液Ｃを加えたＮＥＢ１から４緩衝液中で、λＤＮＡに対して別個に測定した。比較は図２２に示されており、結果は表２１に列記されている（以下）。
【０２６６】
【表２１】
2014027938.tif 000041
【０２６７】
ＳｂｆＩ−ＨＦは、好ましいＦＩが１０００であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４中において最高の成績であり、ＷＴＳｂｆＩは、好ましいＦＩが８であるＮＥＢ１中において最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、１０００／８＝１２５であった。
【実施例１６】
【０２６８】
高精度ＥａｑＩの改変
１．ＥａｇＩの発現
ｐＢＲ３２２−ＥａｇＩＩＲＭで形質転換されたイー・コリ中で、ＥａｇＩを発現させた。２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０２６９】
２．ＥａｇＩの突然変異導入
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎ残基は、Ａｌａに変異した。Ｔｙｒは、Ｐｈｅに変異した。これらは、以下の残基であった。２、３、４、５、６、９、１３、１４、１７、１９、２１、２３、２７、３５、３６、３７、４０、４２、４３、４４、４５、４６、４９、５１、５３、５５、５６、５８、６０、６６、６７、６９、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７８、８０、８２、８６、８７、９２、９３、９４、９５、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０５、１１２、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２２、１２５、１２７、１３２、１３４、１３５、１３７、１３９、１４０、１４１、１４５、１４７、１４８、１５０、１５２、１５４、１５５、１５６、１５７、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６９、１７２、１７３、１７６、１７７、１７８、１７９、１８２、１８５、１８７、１８８、１８９、１９３、１９６、１９７、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１２、２１７、２２０、２２１、２２２、２２４、２２５、２３０、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４５、２４６、２４７、２４８、２５１、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６３、２６４、２６５、２６６、２７０、２７２、２７３、２７５、２７６、２７７、２７９、２８０、２８３、２８６、２８８、２８９、２９１、２９５、２９６。
【０２７０】
上の数字は、ＥａｇＩタンパク質配列（配列番号８２）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２７１】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ株ＥＲ３０８１中に処理された産物を形質転換し、テトラサイクリンを加えたＬＢ寒天プレート上で増殖させた。
【０２７２】
３．ＥａｇＩ−ＨＦの選択
ＥａｇＩ−ＨＦの選択は、グリセロールの高濃度、ＤＭＳＯの高濃度又は高いｐＨを使用する、前実施例とは異なる方法を用いて行った。発現が低すぎて、未精製抽出物中でスター活性を示すことができなかったので、スター活性をチェックするために変異体の各々を精製することは極めて退屈である。前実施例から、ＨＦエンドヌクレアーゼはＮＥＢ３と比べてＮＥＢ４中で増加した切断活性を有する傾向があると推定された。従って、未精製抽出物中のＥａｇＩの活性は、ＮＥＢ３及びＮＥＢ４の両方の中で測定した。ＮＥＢ４／ＮＥＢ３の最も高い比を有するものを選択した。ＥａｇＩ（Ｈ４３Ａ）をＥａｇＩ−ＨＦと表記した。
【０２７３】
４．ＥａｇＩ−ＨＦ及びＷＴＥａｇＩの比較
ＥａｇＩ−ＨＦ及びＷＴＥａｇＩのＦＩは、ＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中でｐＸｂａ基質に対して別個に測定した。比較は図２３に示されており、結果は表２２に列記されている（以下）。
【０２７４】
【表２２】
2014027938.tif 000042
【０２７５】
好ましいＦＩが５００であるＮＥＢ２及びＮＥＢ４中において、ＥａｇＩ−ＨＦは最高の成績であり、ＷＴＥａｇＩは好ましいＦＩが２５０であるＮＥＢ３及びＮＥＢ４中で、最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、５００／２５０＝２であった。
【実施例１７】
【０２７６】
高精度ＥｃｏＲＶの改変
１．ＥｃｏＲＶの発現
ｐＡＣＹＣ−ＥｃｏＲＶＭ及びｐｌａｃｚｚ１−ＥｃｏＲＶで形質転換されたイー・コリ株中でＥｃｏＲＶを発現させた。ｐｌａｃｚｚ１は、ｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐＡＣＹＣは、低コピー数の適合的プラスミドである。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３７℃で一晩増殖させた。
【０２７７】
２．ＥｃｏＲＶの突然変異導入
Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｒｐ残基をＡｌａに変化させた。Ｔｙｒは、Ｐｈｅに変化させた。これらは、２、４、５、６、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３５、３６、３７、３８、４１、４２、４４、４５、４７、４８、４９、５３、５４、５７、５８、５９、６１、６４、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７４、７５、７６、７８、７９、８１、８２、８４、８５、８６、９０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１３１、１３２、１３６、１３８、１３９、１４０、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、１５５、１５７、１５８、１６１、１６３、１６４、１６７、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７９、１８３、１８５、１８６、１８７、１８８、１９１、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２０１、２０３、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４１、２４２、２４４及び２４５であった。
【０２７８】
上の数字は、ＥｃｏＲＶタンパク質配列（配列番号８４）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２７９】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＥｃｏＲＶＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０２８０】
３．ＥｃｏＲＶ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＥｃｏＲＶ−ＨＦの選択を行った。標準的な活性のチェックはＮＥＢ４中の５％グリセロールを加えたｐＸｂａ使用し、スター活性のチェックは、３９％グリセロールを加えたエキソヌクレアーゼＩ緩衝液中においてｐＸｂａに対して行った。ＥｃｏＲＶ（Ｄ１９Ａ／Ｅ２７Ａ）は、ＷＴＥｃｏＲＶと比較して、低下したスター活性を有することが明らかとなった。この変異体は、ＥｃｏＲＶ−ＨＦと表記した。この変異体に関して、Ｅ２７Ａは標的化された変異であり、Ｄ１９Ａは自発的変異であった。二重変異体は、Ｄ１９Ａ及びＥ２７Ａ単変異体より大きなスター活性の低下を有していた。
【０２８１】
４．ＥｃｏＲＶ−ＨＦ及びＷＴＥｃｏＲＶの比較
ＥｃｏＲＶ−ＨＦ及びＷＴＥｃｏＲＶのＦＩは、ＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中でｐＸｂａ基質に対して別個に測定した。比較は図２４に示されており、結果は表２３に列記されている（以下）。
【０２８２】
【表２３】
2014027938.tif 000043
【０２８３】
好ましいＦＩが＞６４０００であるＮＥＢ２及びＮＥＢ４中において、ＥｃｏＲＶ−ＨＦは最高の成績であり、ＷＴＥｃｏＲＶは好ましいＦＩが１０００であるＮＥＢ３中で、最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞６４０００／１０００＝６４であった。
【実施例１８】
【０２８４】
高精度ＡｙｒＩＩの改変
１．ＡｖｒＩＩの発現
ｐＵＣ１９−ＡｖｒＩＩＲＭで形質転換されたイー・コリ中で、ＡｖｒＩＩを発現させた。Ａｍｐを加えたＬＢ中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【０２８５】
２．ＡｖｒＩＩの突然変異導入
Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｒｐ残基をＡｌａに変化させ、ＴｙｒをＰｈｅに変化させた。これらは、２、３、４、６、８、９、１０、１２、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２７、２９、３０、３１、３２、３４、３６、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、６８、７０、７２、７４、７５、７６、７７、７９、８０、８２、８３、８４、８６、８７、８８、９４、９５、９６、９７、１００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３６、１３９、１４２、１４３、１４４、１４５、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１６１、１６３、１６４、１６５、１６６、１６８、１６９、１７３、１７４、１７７、１７８、１８１、１８２、１８４、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９５、１９８、２００、２０２、２０６、２０７、２１１、２１５、２１６、２２０、２２３、２２４、２２６、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４８、２４９、２５３、２５５、２５６、２６０、２６２、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８４、２８５、２８６、２８８、２８９、２９０、２９１、２９９、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１５、３１６、３１８、３２１、３２２、３２４、３２５、３２８、３３１、３３３、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４３、３４６、３４７、３４８、３５０、３５１、３５３、３５４、３５５、３５６、３５８であった。
【０２８６】
上の数字は、ＡｖｒＩＩタンパク質配列（配列番号８０）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２８７】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ発現株ＥＲ２９８４中に、処理された産物を形質転換した。
【０２８８】
３．ＡｖｒＩＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＡｖｒＩＩ−ＨＦの選択を行った。ＮＥＢ４中の５％グリセロールとともにｐＢＣ４を用いて、切断活性を測定し、３９％グリセロールを加えたＥｘｏＩ緩衝液中でｐＢＣ４を用いて、スター活性を測定した。変異体＃１６（Ｍ２９Ａ）、＃５７（Ｅ９６Ａ）、＃６０（Ｙ１０４Ｆ）、＃６２（Ｋ１０６Ａ）、＃１５４（Ｓ１２７Ａ）、＃１７０（Ｆ１４２Ａ）は全て、改善を示した。ＡｖｒＩＩ（Ｙ１０４Ｆ）をＡｖｒＩＩ−ＨＦと表記した。
【０２８９】
４．ＡｖｒＩＩ−ＨＦ及びＷＴＡｖｒＩＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中で希釈液Ｂを用いて、Ｔ７ＤＮＡ基質に対して、ＡｖｒＩＩ−ＨＦ及びＷＴＡｖｒＩＩのＦＩを別個に測定した。比較は図２５に示されており、結果は表２４に列記されている（以下）。
【０２９０】
【表２４】
2014027938.tif 000044
【０２９１】
ＡｖｒＩＩ−ＨＦは、好ましいＦＩが１０００であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４中において最高の成績であり、ＷＴＡｖｒＩＩは、好ましいＦＩが６４であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４中において最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、１０００／６４＝１６であった。
【実施例１９】
【０２９２】
高精度ＢｓｔＸＩの改変
１．ＢｓｔＸＩの発現
ｐＡＣＹＣＢｓｔＸＩＭＳ及びｐＵＣ１９−ＢｓｔＸＩＲで形質転換されたイー・コリ中で、ＢｓｔＸＩを発現させた。ｐＡＣＹＣは、低コピー数適合的プラスミドである。メチラーゼ機能を有するために、ＢｓｔＸＩは、メチラーゼ遺伝子と特異性遺伝子の両方を有さなければならない。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３７℃で一晩増殖させた。
【０２９３】
２．ＢｓｔＸＩの突然変異導入
ＢｓｔＸＩ中に、２３７のアミノ酸変異を以下のように施した。Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐをＡｌａに変化させた。Ｔｙｒは、Ｐｈｅに変異した。これらは、４、６、７、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４６、４８、５０、５３、５４、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、７１、７２、７３、７５、７６、７８、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８９、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１０３、１０５、１０６、１０８、１１０、１１１、１１２、１１４、１１７、１１８、１２０、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３７、１３８、１３９、１４１、１４２、１４４、１４５、１４６、１４８、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６２、１６３、１６６、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１８２、１８５、１８８、１８９、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９８、１９９、２０１、２０４、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２３、２２８、２２９、２３０、２３３、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４４、２４５、２４８、２４９、２５０、２５３、２５４、２５５、２５８、２５９、２６０、２６１、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７２、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８２、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９１、２９３、２９４、２９５、３００、３０１、３０２、３０４、３０５、３０６、３０８、３０９、３１２、３１４、３１７、３１８、３１９、３２０、３２３、３２４、３２５、３２６、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４９、３５３、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６２、３６３、３６４、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７４、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２及び３８３であった。
【０２９４】
上の数字は、ＢｓｔＸＩタンパク質配列（配列番号７）中のアミノ酸位置に対応する。
【０２９５】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＢｓｔＸＩＭＳ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０２９６】
３．ＢｓｔＸＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＢｓｔＸＩ−ＨＦの選択を行った。ＮＥＢ４中の５％グリセロールとともにｐＢＣ４を用いて、切断活性を測定し、３９％グリセロールを加えたＮＥＢ４緩衝液中でｐＢＣ４ＤＮＡ基質を用いて、スター活性を測定した。変異体＃３６（Ｙ５７Ｆ）、＃４４（Ｎ６５Ａ）、＃４８（Ｅ７５Ａ）、＃４９（Ｎ７６Ａ），及び＃１２４（Ｋ１９９Ａ）は全て、低下したスター活性を有していた。ＢｓｔＸＩ（Ｎ６５Ａ）をＢｓｔＸＩ−ＨＦと表記した。
【０２９７】
４．ＢｓｔＸＩ−ＨＦ及びＷＴＢｓｔＸＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中で希釈液Ａを用いて、λＤＮＡ基質に対して、ＢｓｔＸＩ−ＨＦ及びＷＴＢｓｔＸＩのＦＩを別個に測定した。比較は図２６に示されており、結果は表２５に列記されている（以下）。
【０２９８】
【表２５】
2014027938.tif 000045
【０２９９】
好ましいＦＩが＞２５０であるＮＥＢ２及びＮＥＢ４中において、ＢｓｔＸＩ−ＨＦは最高の成績であり、ＷＴＢｓｔＸＩは好ましいＦＩが３２であるＮＥＢ２、ＮＥＢ３及びＮＥＢ４中で、最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞２５０／３２＝８であった。
【実施例２０】
【０３００】
高精度ＰｃｉＩの改変
１．ＰｃｉＩの発現
ｐＡＣＹＣ−ＰｃｉＩ及びｐｌａｃｚｚ１−ＰｃｉＩＲで形質転換されたイー・コリ中でＰｃｉＩを発現させた。ｐｌａｃｚｚ１は、ｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐＡＣＹＣは、低コピー数の適合的プラスミドである。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３７℃で一晩増殖させた。
【０３０１】
２．ＰｃｉＩの突然変異導入
ＰｃｉＩ中の１５１アミノ酸残基をＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒで変異させた。ＴｒｐをＡｌａに変化させ、ＴｙｒをＰｈｅに変化させた。これらは、２、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１４、１７、１８、１９、２１、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４４、４６、４７、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６３、６７、６８、６９、７１、７４、７５、７８、８０、８１、８２、８５、８６、９１、９２、９５、９７、９８、１０１、１０３、１０４、１０７、１０９、１１３、１１４、１１５、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４３、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６１、１６４、１６５、１６７、１７２、１７５、１７８、１７９、１８０、１８２、１８４、１８５、１８６、１９０、１９２、１９３、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０２、２０３、２０６、２０７、２０９、２１０、２１５、２１８、２２１、２２２、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２３８、２３９、２４１、２４２、２４３、２４４、２４６、２４７、２４８、２５３、２５４、２５５、２５６。
【０３０２】
上の数字は、ＰｃｉＩタンパク質配列（配列番号１５）中のアミノ酸位置に対応する。
【０３０３】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＰｃｉＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０３０４】
３．ＰｃｉＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＰｃｉＩ−ＨＦの選択を行った。ＮＥＢ４中の５％グリセロールとともにＳａｌＩ切断されたｐＢＲ３２２を用いて、切断活性を測定し、３９％グリセロールを加えたＥｘｏＩ緩衝液中でＳａｌＩ切断されたｐＢＲ３２２を用いて、スター活性を測定した。二重変異体ＰｃｉＩ（Ｅ７８Ａ／Ｓ１３３Ａ）は、低下したスター活性及び強力な切断活性を有していた。この変異体は、上記標的化された変異の１つではなく、偶然のランダムな現象であった。
【０３０５】
４．ＰｃｉＩ−ＨＦ及びＷＴＰｃｉＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中で希釈液Ａを用いて、ｐＸａｂ基質に対して、ＰｃｉＩ−ＨＦ及びＷＴＰｃｉＩのＦＩを別個に測定した。比較は図２７に示されており、結果は表２６に列記されている（以下）。
【０３０６】
【表２６】
2014027938.tif 000046
【０３０７】
好ましいＦＩが＞２０００であるＮＥＢ２、ＮＥＢ３及びＮＥＢ４中において、ＰｃｉＩ−ＨＦは最高の成績であり、ＷＴＰｃｉＩは好ましいＦＩが１２０であるＮＥＢ３中で、最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞２０００／１２０＝１６であった。
【実施例２１】
【０３０８】
高精度ＨｐａＩの改変
１．ＨｐａＩの発現
ｐＡＣＹＣ−ＭｓｅＩＭ及びｐｌａｃｚｚｌ−ＨｐａＩＲで形質転換されたイー・コリ中でＨｐａＩを発現させた。ｐｌａｃｚｚ１は、ｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐＡＣＹＣは、低コピー数の適合的プラスミドである。Ａｍｐ及びＣａｍを加えたＬＢ中で、細胞を３７℃で一晩増殖させた。
【０３０９】
２．ＨｐａＩの突然変異導入
ＨｐａＩ中の１５６アミノ酸残基をＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＴｈｒで変異させた。ＴｒｐをＡｌａに変化させ、ＴｙｒをＰｈｅに変化させた。これらは、７、８、９、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２９、３０、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４６、４７、４８、５０、５１、５６、５７、５９、６０、６５、６７、６９、７１、７２、７４、７５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８９、９１、９３、９４、９５、９９、１００、１０４、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４１、１４２、１４６、１４７、１４９、１５０、１５２、１５６、１５８、１５９、１６０、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７２、１７３、１７６、１７７、１８０、１８１、１８２、１８４、１８５、１８７、１８８、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９６、１９７、２０２、２０４、２０６、２０８、２０９、２１１、２１２、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９。
【０３１０】
上の数字は、ＨｐａＩタンパク質配列（配列番号８６）中のアミノ酸位置に対応する。
【０３１１】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＭｓｅＩＭ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０３１２】
３．ＨｐａＩ−ＨＦの選択
前実施例と異なる方法を用いて、ＨｐａＩＩ−ＨＦの選択を行った。ＮＥＢ２緩衝液中のλＤＮＡ基質を用いて、切断活性及びスター活性を測定した。このＨｐａＩは、ＮＥＢ４よりＮＥＢ２中でずっと高いスター活性を有し、５％グリセロール中で明確に観察することができた。
【０３１３】
ＨｐａＩ（Ｙ２９Ｆ）及びＨｐａＩ（Ｅ５６Ａ）は何れも、低下したスター活性を有する好ましい変異であった。ＨｐａＩ（Ｅ５６Ａ）をＨｐａＩ−ＨＦと表記した。
【０３１４】
４．ＨｐａＩ−ＨＦ及びＷＴＨｐａＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中で希釈液Ａを用いて、λＤＮＡ基質に対して、ＨｐａＩ−ＨＦ及びＷＴＨｐａＩのＦＩを別個に測定した。比較は図２８に示されており、結果は表２７に列記されている（以下）。
【０３１５】
【表２７】
2014027938.tif 000047
【０３１６】
ＨｐａＩ−ＨＦは、好ましいＦＩが＞２０００であるＮＥＢ２中において最高の成績であり、ＷＴＰｃｉＩは、好ましいＦＩが１６であるＮＥＢ４中において最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞２０００／１６＝１２０であった。
【実施例２２】
【０３１７】
高精度ＡｇｅＩの改変
１．ＡｇｅＩの発現
ｐＲＲＳ−ＡｇｅＩＲＭ及びｐｓｙｘ２０−ｌａｃＩｑで形質転換されたイー・コリ中でＡｇｅＩを発現した。ｐＲＲＳは、ｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐｓｙｘ２０−ｌａｃＩｑは、ｌａｃＩｑプロモーター下で発現されるｌａｃＩを有する低コピー数の適合的プラスミドである。２００Ｋｌｅｔｔ単位になるように、Ａｍｐ及びＫａｎを加えたＬＢ中において、３７℃で細胞を増殖し、次いで、０．５ｍＭＩＰＴＧとともに、一晩２５℃で誘導された。ＡｇｅＩの発現は不安定であるため、これを達成することが極めて困難であった。
【０３１８】
２．ＡｇｅＩの突然変異導入
ＡｇｅＩ中の１４９アミノ酸残基をＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＴｈｒで変異させた。ＴｒｐをＡｌａに変化させ、ＴｙｒをＰｈｅに変化させた。これらは、２、４、６、７、９、１４、１６、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３７、３８、４０、４２、４３、４４、４５、４９、５１、５３、５５、５６、５８、６０、６２、６４、６５、６７、６８、６９、７２、７３、７５、７７、７８、７９、８２、８３、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９４、９６、９７、１０２、１０３、１０４、１０５、１１０、１１１、１１４、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２８、１２９、１３０、１３４、１３５、１３８、１３９、１４０、１４２、１４４、１４６、１４７、１４８、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６６、１６８、１７０、１７３、１７４、１７６、１７７、１７８、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１９２、１９５、１９８、２００、２０１、２０６、２１１、２１２、２１４、２１７、２１９、２２０、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３１、２３３、２３４、２３５、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４５、２４７、２４８、２５０、２５１、２５３、２５５、２５６、２５８、２６０、２６２、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７２であった。
【０３１９】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐｓｙｘ２０−ｌａｃＩｑ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０３２０】
上の数字は、ＡｇｅＩタンパク質配列（配列番号７９）中のアミノ酸位置に対応する。
【０３２１】
３．ＡｇｅＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＡｇｅＩ−ＨＦの選択を行った。標準的な活性のチェックはＮＥＢ４中の５％グリセロールを加えたｐＸｂａを使用し、スター活性のチェックは、３９％グリセロールを加えたＮＥＢ４緩衝液中においてｐＸｂａに対して行った。発現系の困難のために、意味のある変異体が得られる前に、この選択を８回繰り返した。２つの変異体Ｓ２０１Ａ及びＲ１３９Ａは低下したスター活性を有し、Ｒ１３９ＡをＡｇｅＩ−ＨＦと表記した。
【０３２２】
４．ＡｇｅＩ−ＨＦ及びＷＴＡｇｅＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中で希釈液Ａを用いて、ｐＸｂａ基質に対して、ＡｇｅＩ−ＨＦ及びＷＴＡｇｅＩのＦＩを別個に測定した。比較は図２９に示されており、結果は表２８に列記されている（以下）。
【０３２３】
【表２８】
2014027938.tif 000048
【０３２４】
好ましいＦＩが＞５００であるＮＥＢ１及びＮＥＢ４中において、ＡｇｅＩ−ＨＦは最高の成績であり、ＷＴＡｇｅＩは好ましいＦＩが１６であるＮＥＢ３中で、最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞５００／１６＝３２であった。
【実施例２３】
【０３２５】
高精度ＢｓｍＢＩの改変
１．ＢｓｍＢＩの発現
ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＡＩＭ、ｐｔａｃｚｚ２−ＢｓｍＢＩＲ及びｐｓｙｘ２０−ｌａｃＩｑで形質転換されたイー・コリ中で、ＢｓｍＢＩを発現させた。ｐｔａｃｚｚ２は、誘導性ｐｔａｃプロモーターを担持するｐＵＣ１９由来のプラスミドであり、ｐＡＣＹＣは、低コピー数の適合的プラスミドである。ＢｓｍＡＩＭ（ＧＴＣＴＣ）は、ＢｓｍＢＩ（ＣＧＴＣＴＣ）の特異性を包含する。ｐｓｙｘ２０−ｌａｃＩｑは、ｌａｃＩの強い発現を有する低コピー数ベクターである。細胞を３７℃で一晩増殖させ、次いで、Ａｍｐ、Ｃａｍ及びＫａｎを加えたＬＢ中で誘導した。
【０３２６】
２．ＢｓｍＢＩの突然変異導入
ＢｓｍＢＩ中の３５８アミノ酸残基をＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＴｈｒで変異させた。ＴｒｐをＡｌａに変化させ、ＴｙｒをＰｈｅに変化させた。これらは、８、９、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３７、３８、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７２、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８８、９１、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０３、１０４、１０５、１０６、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３８、１４１、１４３、１４４、１４５、１４７、１４９、１５０、１５４、１５５、１５７、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７９、１８０、１８１、１８２、１８４、１８５、１８６、１８８、１８９、１９１、１９４、１９５、１９７、２００、２０１、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４２、２４３、２４７、２５０、２５１、２５２、２５７、２５８、２６０、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６８、２６９、２７１、２７３、２７４、２７９、２８０、２８２、２８３、２８４、２８７、２８８、２８９、２９２、２９４、２９５、２９６、２９７、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０９、３１０、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３２０、３２１、３２４、３２５、３２６、３２８、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４８、３４９、３５１、３５２、３５３、３５５、３５６、３５７、３５８、３６０、３６１、３６３、３６４、３６６、３６７、３６８、３７０、３７２、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３８４、３８５、３８６、３８８、３８９、３９０、３９３、３９４、３９５、３９６、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１８、４２１、４２４、４２５、４２６、４２８、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３６、４３７、４３８、４３９、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４６、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５７、４５８、４６０、４６１、４６２、４６４、４６６、４６７、４６８、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７７、４７８、４７９、４８０、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９１、４９２、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５１０、５１１、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２２、５２３。
【０３２７】
上の数字は、ＢｓｍＢＩタンパク質配列（配列番号８１）中のアミノ酸位置に対応する。
【０３２８】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＡＩＭ、ｐｓｙｘ２０−ｌａｃＩｑ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０３２９】
３．ＢｓｍＢＩＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＢｓｍＢＩ−ＨＦの選択を行った。ＮＥＢ４中の５％グリセロールとともにλＤＮＡを用いて、切断を測定し、３９％グリセロールを加えたＮＥＢ４緩衝液中でＬｉｔｍｕｓ２８ｉを用いて、スター活性を測定した。好ましい変異体には、Ｈ２３０Ａ、Ｄ２３１Ａ及びＮ１８５Ｙ／Ｒ２３２Ａが含まれた。Ｎ１８５Ｙ／Ｒ２３２ＡをＢｓｍＢＩ−ＨＦと表記した。
【０３３０】
４．ＢｓｍＢＩ−ＨＦ及びＷＴＢｓｍＢＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液の各々の中で希釈液Ａを用いて、λＤＮＡ基質に対して、ＢｓｍＢＩ−ＨＦ及びＷＴＢｓｍＢＩのＦＩを別個に測定した。比較は図３０に示されており、結果は表２９に列記されている（以下）。
【０３３１】
【表２９】
2014027938.tif 000049
【０３３２】
好ましいＦＩが＞５００であるＮＥＢ１、ＮＥＢ２及びＮＥＢ４中において、ＢｓｍＢＩ−ＨＦは最高の成績であり、ＷＴＢｓｍＢＩは、好ましいＦＩが１２０であるＮＥＢ３中で、最高の成績であった。全体的なＦＩ改善係数は、＞５００／１２０＝４であった。
【実施例２４】
【０３３３】
低下したスター活性を有するＢｓｐＱＩ変異形を改変する
１．ＢｓｐＱＩ制限エンドヌクレアーゼの部位指定突然変異導入
ＫｍＲ及びＡｍｐＲであるｐＳＸ３３−ＥａｒＩＭＩＭ２及びｐＺＺｌａｃＩ−ＰｓｐＱＩでイー・コリを形質転換した。Ｍ．ＥａｒＩ（ＣＴＣＴＴＣ）は、ＢｓｐＱＩ部位（ＧＣＴＣＴＴＣ）も修飾し、従って、イー・コリ染色体を同時形質転換及び修飾するために、ｐＳＸ３３−ｅａｒＩＭＩＭ２（図１７及び１８）を使用した。ＷＴアミノ酸配列が、図１６に示されている。
【０３３４】
部位指定突然変異導入によって、ＢｓｐＱＩ中の帯電した又は帯電していない１２２のアミノ酸残基（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ）をＡｌａへ変化させた。以下の条件下で、ＰＣＲを実施した。ＤＮＡ変性、９８℃３０秒間、１サイクル；ＤＮＡ変性／プライマー徐冷／伸長、９８℃１０秒間、５５℃から６５℃３０秒間、７２℃２分間、ＰＣＲ１８サイクル；７２℃１５分間、１サイクル。１００μＬ反応中に、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）の２単位、１ｍＭｄＮＴＰ、テンプレートＤＮＡ１０ｎｇから１００ｎｇ、５×反応緩衝液２０μＬ、０．０４μＭプライマー、１００μＬの総容量するための滅菌水。
【０３３５】
テンプレートＤＮＡ（Ｄａｍメチル化）を破壊するために、ＰＣＲＤＮＡをＤｐｎＩで消化し、ｐＳＸ３３−ｅａｒＩＭ１Ｍ２とともにイー・コリ中へ同時形質転換した。各形質転換体（ＬＢ５ｍＬ、５０μｇ／ｍＬＫｍＲ及び１００μｇ／ｍＬＡｍｐＲ）を一晩培養し、２つの部分に分けた。遠心によって、一部（１．５ｍＬ）を採集し、音波処理緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール）中での音波処理によって溶解した。５０℃で１時間、細胞抽出物を加熱し、変性されたイー・コリタンパク質を遠心によって除去した。ｐＵＣ１９ＤＮＡに対する制限活性及びスター活性に関して、清澄化された可溶化液をアッセイした。
【０３３６】
ＢｓｐＱＩスター活性アッセイ条件：ｐＵＣ１９ＤＮＡ１μｇ、１０×ＮＥＢ緩衝液１の５μＬ、２５％ＤＭＳＯ、清澄化された細胞抽出液２．５μＬ、総容量を５０μＬとする滅菌脱イオン水、５０℃で１時間温置した。０．８から１％アガロースゲル中での電気泳動によって、消化されたＤＮＡを分割した。
【０３３７】
細胞培養の第二の部分（誘導されていない。）を採集し、Ｑｉａｇｅｎスピンカラム精製操作（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、プラスミドＤＮＡを調製した。所望の変異を確認するために、巨大色素ジデオキシターミネータ配列決定法によって、ｂｓｐＱＩＲ対立遺伝子を配列決定した。低下したスター活性変異体の同定後、新鮮な形質転換体を取得し、ＩＰＴＧによって誘導された培養物を作製した。４つの全ての緩衝液中でＷＴ酵素と比較して低下したスター活性を確認するために、制限及びスター活性を再度アッセイした。
【０３３８】
部位指定突然変異導入によって構築された１２２のＢｓｐＱＩ変異体のうち、２つのＢｓｐＱＩ変異形Ｒ３８８Ａ及びＫ２７９Ａが低下したスター活性を示す。Ｒ３８８Ａのスター活性は、緩衝液１及び１０％グリセロール中で、約１６倍低下した。しかしながら、Ｒ３８８Ａは、高い酵素濃度で、なおスター活性を示した。ＢｓｐＱＩ変異形Ｋ２７９Ａも、低下したスター活性を示した（低下したスター活性の８倍を超える改善）。
【０３３９】
高い酵素濃度でスター活性をさらに低下させるために、Ｒ３８８及びＫ２７９をＰｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＬｅｕに置換した。様々なＲ３８８Ｘ及びＫ２７９Ｘ変異体のＩＰＴＧによって誘導された細胞抽出物を、制限及びスター活性に関してアッセイした。Ｒ３８８Ｆ又はＫ２７９Ｐは、細胞抽出物又は精製された酵素の何れかの中で、最低のスター活性を示すことが明らかとなった。アミノ酸置換によって、比活性は影響を受けなかった。
【０３４０】
ＢｓｐＱＩスター活性をさらに低下させるために、部位指定突然変異導入により、２つのアミノ酸置換を１つの変異体酵素（二重変異体、Ｋ２７９Ｐ／Ｒ３８８Ｆ）中に組み合わせた。この二重変異体は、１０％グリセロールを加えた緩衝液１及び緩衝液２中でスター活性を欠如している（図４１Ｂ）。
【０３４１】
【表３０】
2014027938.tif 000050
【実施例２５】
【０３４２】
低下したスター活性を有するＳａｐＩ変異形を改変する
対応する位置がＳａｐＩ中のＫ２７３及びＲ３８０であるＢｓｐＱＩ中に、保存されたＫ２７９及びＲ３８８アミノ酸残基が見出された。まず、６×Ｈｉｓタグ付加されたＳａｐＩ発現クローンをｐＵＣ１９中に構築した。ＳｐａＩ発現株は、ｐＳＸ３３−ｅａｒＩＭ１Ｍ２並びにＫｍＲ及びＡｍｐＲであったｐＵＣ−ＳａｐＩで形質転換されたイー・コリであった。部位指定突然変異導入によって、Ｌｙｓ２７３からＰｒｏ（Ｋ２７３Ｐ）への及びＡｒｇ３８０からＰｈｅ（Ｒ３８０Ｆ）へのアミノ酸置換をＳａｐＩ中に導入した。ＳａｐＩ単一変異体Ｒ３８０Ａも構築した。制限活性及びスター活性の反応が実施されたときに、ＳａｐＩ変異形Ｒ３８０Ａ及びＫ２７３Ｐ／Ｒ３８０Ｆの何れもが低下したスター活性を示した（図４２）。
【０３４３】
ＳａｐＩ活性を３７℃で測定したことを除き、ＰＣＲ、形質転換、プラスミドＤＮＡの調製及び酵素活性アッセイは、ＢｓｐＱＩに対して記載されているように実施した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラフィーを通して、６×Ｈｉｓタグ付加されたＳａｐＩ変異形Ｋ２７３Ｐ／Ｒ３８０Ｆを精製し、２５％ＤＭＳＯ又は５％グリセロールの存在下で、減少したスター活性を示すことが示された。
【実施例２６】
【０３４４】
ＫｐｎＩ高精度変異体の改変
２つの活性を含有するＫｐｎＩを、より低いスター活性を有する変異体へ変化させた（国際公開ＷＯ０７／０２７４６４号）。以下の実施例は、改善されたスター活性及び野生型と類似の切断活性を有する新規変異体を記載する。
【０３４５】
触媒性残基（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓ）又は極性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）を除く帯電したアミノ酸残基をアラニンへ個別に変異させた。
【０３４６】
所望の変異を有するプライマーを用いた逆ＰＣＲによって、突然変異導入を実施した。一般に、１００μＬの最終容量で、４ｄＮＴＰの各々の０．４ｍＭ、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）、テンプラートＤＮＡ２０ｎｇ、プライマーの各々の４０μｍｏｌ及びＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）の４Ｕを用いて逆ＰＣＲを行った。
【０３４７】
それぞれ、Ｐｌａｃ又はＰｔａｃプロモーターの制御下でＫｐｎＩＲを含有するプラスミドｐＵＣ１９又はｐＡＧＲ３をテンプレートとして使用した。９４℃４分間の後、変性のために９４℃３０秒間、徐冷のために５５℃３０秒間及び伸長のために７２℃５分間の２５サイクルという温度スキームを用いて、ＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡを分解するために、３７℃で１時間、ＤｐｎＩ（ＮＥＢ）２０μＬによって反応を処理する前に、このサイクルに続いて、７２℃７分間での温置を行った。８０℃で２０分間、ＤｐｎＩを不活化した後、ｐＳＹＸ２０−ＫｐｎＩＭによって予め形質転換された化学的に形質転換受容性ＮＥＢ５α（ＮＥＢ）の５０μＬを形質転換するために、反応２μＬを使用した。アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びカナマイシン３０μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレート上に、形質転換された細菌を播種し、３７℃で、１２から１５時間温置した。
【０３４８】
２００ｒｐｍで振盪しながら、１２から１５時間、３７℃で、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びカナマイシン３０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ１ｍＬ中に、各構築物の３から４つのコロニーを培養した。培養物を遠心して沈降させ、音波処理緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ）０．２ｍＬ中に再懸濁した。再懸濁された細胞を２０秒間音波処理した後、１３，０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心した。上清の希釈物を作製し、その５μＬをＫｐｎＩ切断活性に関してアッセイした。
【０３４９】
変異体のスクリーニングのために、５０μＬの総容量で、可溶化液上清の１０又は１００倍希釈物の５μＬ、ｐＸｂａＤＮＡ（ＮＥＢ）の０．５μｇ及び１×ＮＥ緩衝液４を用いて活性アッセイ反応を実施した。３７℃で１時間温置した後、６×ＤＮＡ搭載色素１０μＬを添加することによって、アッセイ反応を停止させ、１×ＴＢＥ中で０．８％アガロースゲルを通した電気泳動によって分析した。２５％ＤＭＳＯを含有する緩衝液中で、低下したスター活性に関して、親酵素（ＫｐｎＩＤ１４８Ｅ）と比べて増加した全体的切断活性を示した変異体をアッセイした。
【０３５０】
１×ＮＥ緩衝液４中の５％グリセロール及びＢＳＡの０．２ｍｇ／ｍＬの存在下で、ｐＸｂａＤＮＡ（ＮＥＢ）１μｇとともに温置された酵素の希釈物５μＬを用いて、アッセイを行った（総容量＝５０μＬ）。３７℃で１時間の温置後、３７℃で１５分間、プロテイナーゼＫ（ＮＥＢ）２０μｇによって反応を処理し、次いで、１×ＴＢＥ中の０．８％アガロースゲルを通した電気泳動によって分析した。２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．９、１ｍＭＤＴＴ、ＭｇＳＯ４／ＣａＣｌ２／ＭｎＣｌ２の漸増濃度を含有する緩衝液中の酵素５０Ｕ及びｐＸｂａＤＮＡ１μｇを用いて、３７℃で１時間、二価金属依存性アッセイを行った後、１×ＴＢＥ中の０．８％アガロースゲルを通して電気泳動を行った。総反応容量は、５０μＬである。
【０３５１】
無作為の突然変異導入の結果は、先述されている野生型酵素及びＫｐｎＩＤ１６３Ｉ／Ｋ１６５Ａ変異体より低いスター活性を示した好ましい変異体ＫｐｎＩＤ１４８Ｅであった（国際公報ＷＯ０７／０２７４６４）。しかしながら、ＫｐｎＩＤ１４８Ｅは、高い酵素濃度で、スター活性を示した。この観察されたスター活性を低下させるために、Ｄ１４８Ｅ背景中に二重及び三重変異体を構築した。ＫｐｎＩ（Ｄ１６Ｎ／Ｅ１３２Ａ／Ｄ１４８Ｅ）は、変異体Ｄ１４８Ｅより低いスター活性及びより高い特異性活性を有することが見出された。部位指定突然変異導入によって、Ｄ１４８からＥへのアミノ酸置換及びＥ１３２からＡへのアミノ酸置換を導入した。Ｄ１６からＮへの変異は、ＰＣＲによって導入した。標準的な反応条件において、３７℃で、（６つのＫｐｎＩ部位を含有する）基質ＤＮＡｐＸｂａとともに精製された酵素を１時間温置することによって、表３１中に示された低下したスター活性が得られた。
【０３５２】
【表３１】
2014027938.tif 000051
【０３５３】
４０００Ｕまで、変異体Ｄ１６Ｎ／Ｅ１３２Ａ／Ｄ１４８Ｅに対して、ｐＸｂａのスター活性は観察されなかった。ＫｐｎＩＤ１４８Ｅ及びＤ１６Ｎ／Ｅ１３２Ａ／Ｄ１４８Ｅで切断されると、ＫｐｎＩ部位を持たないｐＢＲ３２２基質に対して観察されたスター活性も減少した。
【実施例２７】
【０３５４】
高精度ＢｓａＩの改変
１．ＢｓａＩの発現
ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＵＣ１９−ＢｓａＩＲ及びｐｓｙｘ２０−ｌａｃｌｑで形質転換されたイー・コリ中で、ＢｓａＩを発現させた。ｐＡＣＹＣは、低コピー数適合的プラスミドである。ＢｓｍＡＩＭ（ＧＴＣＴＣ）は、ＢｓｍＢＩの特異性（ＣＧＴＣＴＣ）を包含する。ｐｓｙｘ２０−ｌａｃＩｑは、ｌａｃＩの強い発現を有する低コピー数ベクターである。Ａｍｐ、Ｃａｍ及びＫａｎを加えたＬＢ中で、細胞を３７℃で一晩増殖させた。
【０３５５】
２．ＢｓａＩの突然変異導入
ＢｓａＩのアミノ酸は、ＢｓｍＢＩのアミノ酸と似ている。対応する以前の有効部位周囲及びこの部位の１１アミノ酸を、Ｒ２２９Ａ、Ｓ２３０Ａ、Ｙ２３１Ｆ、Ｔ２３２Ａ、Ｔ２３３Ａ、Ｄ２３４Ａ、Ｒ２３５Ａ、Ｒ２３６Ａ、Ｆ２３８Ａ、Ｅ２３９Ａ、Ｙ２４０Ｆとして変異させる。
【０３５６】
前記方法は、逆ＰＣＲ後にＤｐｎＩ消化を使用し、前実施例と同一であった。次いで、イー・コリ（ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＡＩＭ、ｐｓｙｘ２０−ｌａｃＩｑ）中に、処理された産物を形質転換した。
【０３５７】
３．ＢｓａＩ−ＨＦの選択
前実施例と類似の方法を用いて、ＢｓａＩ−ＨＦの選択を行った。標準的な活性のチェックはＮＥＢ４中の５％グリセロールを加えたλＤＮＡを使用し、スター活性のチェックは、３９％グリセロールを加えたＮＥＢ４緩衝液中においてＬｉｔｍｕｓ２８ｉに対して行った。設計された１１の変異体のうち１つの変異体Ｙ２３１Ｆは、スター活性を低下させ、ＢｓａＩ−ＨＦと表記される。
【０３５８】
４．ＢｓａＩ−ＨＦ及びＷＴＢｓａＩの比較
ＮＥＢ１から４緩衝液中の希釈液Ａを用いて、λＤＮＡに対して、ＢｓａＩ−ＨＦ及びＷＴＢｓａＩのＦＩを別個に測定した。結果は、表３２に列記されている（下記）。
【０３５９】
【表３２】
2014027938.tif 000052
【０３６０】
最高のＦＩが＞８０００であるＮＥＢ２、ＮＥＢ３及びＮＥＢ４中において、ＢｓａＩ−ＨＦは最高の成績であり、ＷＴＢｓａＩは最高のＦＩが１２０であるＮＥＢ２及びＮＥＢ４中で、最高の成績であった。従って、全体的なＦＩ改善係数は、＞８０００／１２０＝＞６４であった。
【図１】
2014027938.tif 000053
【図２Ａ】
2014027938.tif 000054
【図２Ｂ】
2014027938.tif 000055
【図２Ｃ】
2014027938.tif 000056
【図２Ｄ】
2014027938.tif 000057
【図３Ａ】
2014027938.tif 000058
【図３Ｂ】
2014027938.tif 000059
【図４Ａ】
2014027938.tif 000060
【図４Ｂ】
2014027938.tif 000061
【図５Ａ】
2014027938.tif 000062
【図５Ｂ】
2014027938.tif 000063
【図６Ａ】
2014027938.tif 000064
【図６Ｂ】
2014027938.tif 000065
【図６Ｃ】
2014027938.tif 000066
【図６Ｄ】
2014027938.tif 000067
【図７Ａ】
2014027938.tif 000068
【図７Ｂ】
2014027938.tif 000069
【図７Ｃ】
2014027938.tif 000070
【図８Ａ】
2014027938.tif 000071
【図８Ｂ】
2014027938.tif 000072
【図９Ａ】
2014027938.tif 000073
【図９Ｂ】
2014027938.tif 000074
【図１０Ａ】
2014027938.tif 000075
【図１０Ｂ】
2014027938.tif 000076
【図１０Ｃ】
2014027938.tif 000077
【図１０Ｄ】
2014027938.tif 000078
【図１１Ａ】
2014027938.tif 000079
【図１１Ｂ】
2014027938.tif 000080
【図１１Ｃ】
2014027938.tif 000081
【図１１Ｄ】
2014027938.tif 000082
【図１１Ｅ】
2014027938.tif 000083
【図１１Ｆ】
2014027938.tif 000084
【図１１Ｇ】
2014027938.tif 000085
【図１１Ｈ】
2014027938.tif 000086
【図１２Ａ】
2014027938.tif 000087
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４４Ｆ】
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【図４４Ｇ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月24日(2013.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＥＢ緩衝液１、２、３及び４の少なくとも一つにおいて、人工的な変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼ酵素の切断活性と少なくとも類似の切断活性で基質を切断することが可能である、人工的な変異を有する制限エンドヌクレアーゼ酵素であって、前記人工的な変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがＮｏｔＩであり、人工的に導入した変異の少なくとも一つが配列番号９０のＫ１７６Ａ、Ｒ１７７Ａ、Ｒ２５３Ａ又はＫ１５０Ａに該当する、前記人工的な変異を有する制限エンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項２】
請求項１に記載の制限エンドヌクレアーゼ酵素をコードするＤＮＡ分子。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む、請求項１に記載の制限エンドヌクレアーゼ酵素を発現するための宿主細胞。
【外国語明細書】
2014027938000001.pdf