(57)【要約】【課題】より迅速に、より簡便に核酸配列の欠失または導入の判定行うために、電気泳動を行わずに、欠失または導入の判定を行う方法を提供することである。【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ検出剤、Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを使用することで、電気泳動をすることなく、融解曲線解析により、迅速に配列の欠失または、導入を判定することができる。さらに、使用するＤＮＡポリメラーゼをファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにすることにより、ゲノムＤＮＡの分離精製を行うことなく、より迅速に配列の欠失または、導入を検出することが可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＤＮＡ検出剤
（ｃ）Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマー
を含む反応組成中で増幅反応を行い、融解曲線解析によって得られたＴｍ値から判定する方法。
【請求項２】
標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を１つの反応液におけるＰＣＲ反応、融解曲線解析により行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各遺伝子型によって、増幅産物の鎖長に差異を持たせることで、Ｔｍ値の異なる増幅産物を与えることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである請求項１−３のいずれかに記載の方法
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）由来である請求項１−４のいずれかに記載の方法
【請求項６】
ＤＮＡ検出剤がインターカレーターである、請求項１−５のいずれかに記載の方法
【請求項７】
ゲノムＤＮＡの分離精製を行っていない生体試料を用いて、標的核酸中の配列の欠失または導入の判定を行うことを特徴とする請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
生体試料が、培養細胞、植物組織、植物細胞、動物組織、動物細胞からなる群より選ばれる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生体試料が、動物組織である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
生体試料が、ヒト、マウスあるいはラットから採取された組織である請求項７−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
生体試料の加熱処理を施す工程を含む、請求項７−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生体試料をホモジナイズする工程を含む、請求項７−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（ａ１）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）ＤＮＡ検出剤、および、（ｃ）Ｔｍ値の異なる増幅産物を与える特異的プライマーを含む、標的核酸中の配列欠失または導入を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、融解曲線解析を用いて標的核酸中の配列欠失、配列導入を判定する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明における配列の欠失とは、野生型の塩基配列の数個から数万個の塩基が失われた配列を有することをいい、配列導入とは、野生型の塩基配列に数個から数万個の塩基が導入された配列を有することをいう。この配列の欠失または、配列の導入は、人為的であっても、自然的に生じたものであってもよい。塩基の欠質または導入の好ましい個数は１０個以上である。
【０００３】
自然的な配列の欠失とは、先天的あるいは、後天的に染色体から遺伝子断片が欠失している状態であり、欠失が起こる位置により、様々な疾患や障害を引き起こすことが知られている。特に、配列欠失は、多くの癌細胞に認められる異常の一つであり、特定の癌には特定の配列欠失のパターンが存在し、共通して欠失が認められる領域には癌抑制遺伝子の存在が示唆されている。そのため、これらの配列欠失を迅速に検出することは、研究用途のみならず、臨床用途においても重要なこととなっている。
【０００４】
一方、人為的な配列の欠失、導入は、遺伝子改変技術により、野生型に対し、配列を欠失させた状態または配列を導入した状態である。この遺伝子改変技術を利用した配列の欠失、導入は、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、メダカ、シロイヌナズナ、イネ等に挙げられるモデル生物に対して実施されており、遺伝子研究、病態解析、生物資源の改良等、様々な用途に利用されている。これらの遺伝子改変を行う上で、遺伝子改変後や、系統維持において遺伝子型の判定が必要であり、配列欠失または配列導入を迅速に検出することが重要となっている。
【０００５】
従来の配列の欠失、配列導入を判定する技術としては、例えば、核酸配列決定法（シークエンシング法）、サザンブロット法、蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、リアルタイムＰＣＲ法などが知られている。しかし、操作の簡便さや迅速性が必要な遺伝子型の判定において、シークエンシング法やサザンブロット法、ＦＩＳＨ法は、煩雑な作業が必要であり時間がかかるため、問題があった。また、リアルタイムＰＣＲ法は、時間が短縮できるものの、確実に鋳型の２倍量の差を識別する必要があるため、サンプル調製を厳密に行う必要があった。
【０００６】
一方、定性的に遺伝子型を判定する方法として、近傍プライマーによるＰＣＲ法が知られている（非特許文献１）。この方法の場合、厳密な操作が不要であり、ＰＣＲ後、電気泳動をするだけで遺伝子型の判定が可能である。また、ゲノムＤＮＡの精製を行うことなくＰＣＲを実施し、電気泳動により遺伝子の判定を行う方法が開発されており、より短時間での検出が可能となっている（非特許文献２）。
【０００７】
しかしながら、かかる遺伝子型検出方法は、検出の簡便化が進められているものの、ＰＣＲ後、電気泳動が必要であるため、ＰＣＲ後にも操作が必要であり、操作の簡便性と迅速性においてさらに改善の余地がある。また、ＰＣＲ後、一度チューブを開放し、電気泳動をする方法は、キャリーオーバーをもたらす可能性が指摘されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｘｐ  Ａｎｉｍ．  ２００４  Ａｐｒ；５３（２）：１０３−１１．
【非特許文献２】ＷａＫｏ  ＢｉｏＷｉｎｄｏｗ  ２００７  Ｏｃｔ：Ｎｏ.８４  １１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
核酸配列の欠失または導入の判定は、多サンプルの処理や頻繁な処理が必要であることが多いため、操作が簡便で、迅速であることが重要となっている。そのため、本発明が解決しようとする課題は、電気泳動を行わずに、迅速な核酸配列の欠失または導入の判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記事情を鑑み、鋭意研究の結果、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ検出剤、Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを使用することで、電気泳動をすることなく、融解曲線解析により、迅速に配列の欠失または、導入を判定することができることを見出し、本発明の完成に至った。さらに、使用するＤＮＡポリメラーゼをファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにすることにより、ＤＮＡの精製を行うことなく、より迅速に配列の欠失または、導入を検出することができることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＤＮＡ検出剤
（ｃ）Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマー
を含む反応組成中で増幅反応を行い、融解曲線解析によって得られたＴｍ値から判定する方法。
［２］標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を１つの反応液におけるＰＣＲ反応、融解曲線解析により行うことを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］各遺伝子型によって、増幅産物の鎖長に差異を持たせることで、Ｔｍ値の異なる増幅産物を与えることを特徴とする［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである［１］−［３］のいずれかに記載の方法
［５］ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）由来である［１］−［４］のいずれかに記載の方法
［６］ＤＮＡ検出剤がインターカレーターである、［１］−［５］のいずれかに記載の方法
［７］ゲノムＤＮＡの分離精製を行っていない生体試料を用いて、標的核酸中の配列の欠失または導入の判定を行うことを特徴とする［１］−［６］のいずれかに記載の方法。
［８］生体試料が、培養細胞、植物組織、植物細胞、動物組織、動物細胞からなる群より選ばれる［７］に記載の方法。
［９］生体試料が、動物組織である［７］に記載の方法。
［１０］生体試料が、ヒト、マウスあるいはラットから採取された組織である［７］−［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］生体試料の加熱処理を施す工程を含む、［７］−［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］生体試料をホモジナイズする工程を含む、［７］−［１０］のいずれかに記載の方法。
［１３］（ａ１）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）ＤＮＡ検出剤、および、（ｃ）Ｔｍ値の異なる増幅産物を与える特異的プライマーを含む、標的核酸中の配列欠失または導入を判定するためのキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、電気泳動をすることなく、Ｔｍ値の異なる増幅産物を与えるプライマーを用い、ＰＣＲ増幅、融解曲線解析を行うことで、配列の欠失または、導入を判定することを可能とした。これにより、電気泳動のための操作が不要となるため、操作の煩雑さがなくなり、時間も短縮することができる。また、電気泳動のためにＰＣＲ後にチューブを開ける必要性がないため、ＰＣＲ増幅産物の飛散によるキャリーオーバーのリスクを大幅に低減することができる。
【００１３】
さらに本発明では、使用するＤＮＡポリメラーゼをファミリーＢに属するポリメラーゼとすることで、ＤＮＡの精製を行うことなく、より迅速に配列の欠失または、導入を検出することが可能となった。本発明は、研究分野での応用に始め、診断用途などにおいて広く使用することができる。また、短時間で検出が可能になったことから、特に多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が多いに期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】標的核酸中の配列の欠失を検出するためプライマー設計例を示す図である。
【図２】標的核酸中の配列の導入を検出するためのプライマー設計例を示す図である。
【図３】Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、精製ゲノムＤＮＡからＰＣＲを実施し、融解曲線解析を用いてノックインマウスの遺伝子型判定を実施した結果の図である。
【図４】ゲノムＤＮＡの分離精製を行うことなく生体試料からＰＣＲを実施し、融解曲線解析を用いてノックインマウスの遺伝子型判定を実施した結果の図である。
【図５】ゲノムＤＮＡの分離精製を行うことなく生体試料からＰＣＲを実施し、融解曲線解析を用いて、生体試料から遺伝子の検出を実施した結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の核酸配列の欠失または導入を判定する方法は、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）ＤＮＡ検出剤、および、（ｃ）Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを含む反応組成中で増幅反応を行い、融解曲線解析によって得られたＴｍ値から核酸配列の欠失または導入を判定することを特徴とする。
【００１６】
本発明に用いるＤＮＡ検出剤は特に限定されず、ＤＮＡ表面のリン酸基に結合する色素や塩基間にインターカレートする色素（インターカレーター）などが挙げられるが、インターカレーターを用いることが好ましい。
インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに挿入して蛍光を発する色素である。
【００１７】
多数のインターカレーターが当技術分野で公知である。例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＥＲ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）  ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＬＣＧｅｅｎ（登録商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ヨウ化プロピジウム、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ、７−アミノ−アクチノマイシン  Ｄ、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）  ＧＲ、ＳＹＴＯ（登録商標）９，  ＳＹＴＯ（登録商標）１０、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１４、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、ＦＵＮ−１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明におけるＴｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーは、ＤＮＡ検出剤を用いた融解曲線解析による標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定する方法に利用される。該方法において、Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーは、核酸配列の欠失または導入の有無、あるいは、欠失または導入の態様に応じて、Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与えるよう設計されている。
【００１９】
例えば、各増幅産物それぞれに、Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーの対を作製して、増幅反応を行い、融解曲線解析により標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定すればよい。この方法においていずれかのプライマーを共通化してもよい。
【００２０】
本発明の核酸配列の欠失または導入を判定する方法においては、標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を１つの反応液におけるＰＣＲ反応、融解曲線解析により行ってもよいし、各増幅産物それぞれに対して増幅、融解曲線解析を別々の反応液で行ってもよい。例えば、複数の増幅産物に共通のプライマーと、Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを同時に用いて増幅反応を行い、融解曲線解析により標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定することができる。
【００２１】
本発明におけるＴｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーは、増幅産物のＴｍ値の差異が、１℃以上、好ましくは３℃以上、より好ましくは５℃以上になるように設計すればよい。この各増幅産物のＴｍ値は、各リアルタイムＰＣＲ装置、解析ソフトウェアにより求められる。また、増幅産物の融解温度は、市販のプライマー設計プログラム、または公共機関等が提供するオンラインのプログラム、例えばＯｌｉｇｏ  ＣａｌｃｕｌａｔｏｒのＢａｓｉｃ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ＃ｈｅｌｐｔｈｅｒｍｏ）などを利用することで、容易に推測することができる。
【００２２】
各遺伝子型によって、増幅産物のＴｍ値に差異を生じさせることは、増幅長に差異を持たせることにより可能となる。増幅産物の鎖長に差異を持たせる方法は、ある増幅長までは、増幅長によりＴｍ値が異なる点を利用している。そのため、２種類以上の増幅産物の鎖長の差異が、５０ｂｐ以上であることが好ましい。また、一番長い増幅産物の鎖長が２ｋｂ以下、好ましくは、１ｋｂ以下、より好ましくは、５００ｂｐ以下であることが望ましい。また、増幅長の長短の組み合わせは限定されるものではなく、野生型が短くても、配列欠失型または配列導入型が短くてもよい。
【００２３】
本発明におけるプライマーの長さとしては、好ましくは１３〜３５塩基であり、より好ましくは１６塩基以上であり、また、３０塩基以下が好ましい。また、ＰＣＲ反応に用いる各プライマー量比は限定されることはなく、増幅産物のピーク比を確認しながら、適宜調整すればよいが、ピークが高くなる増幅産物を与えるプライマー比を下げ、ピークのバランスを揃えることが望ましい。
【００２４】
図１、図２を用いてさらに詳細に説明する。図１Ａは、標的遺伝子の配列の欠失を検出するためのプライマー設計例である。この例では、フォワードプライマーを共通プライマーとし、野生型特異的プライマーによる増幅産物の増幅長が、欠失型特異的プライマーによる増幅産物の増幅長よりも長くなるように設計している。そのため、野生型特異的増幅産物のＴｍ値が、欠失型特異的増幅産物よりも高くなる。つまり、上記のプライマー３種を混合し、ＰＣＲ反応、融解曲線解析を実施した場合、野生型はＴｍ値が高い増幅産物のみが検出され、欠失型はＴｍ値が低い増幅産物のみが検出させる。また、ヘテロ接合体は、この両者が増幅され、融解曲線におけるピークが２本検出される。このように野生型と配列欠失型、そのヘテロ接合体の識別を増幅長の違いによるＴｍ値の差異により可能としている。
【００２５】
このプライマー設計例は、特に限定されるものではなく、図１Ｂに示すように野生型を短い増幅産物として配列の欠失を検出してもよく、図２Ａに示すように野生型を長い増幅産物として配列の導入を検出してもよく、図２Ｂに示すように野生型を短い増幅産物として配列の導入を検出してもよい。
そのため、本発明では、各遺伝子型によって、増幅産物の鎖長に差異を持たせ、Ｔｍ値の異なる増幅産物を与えることで、標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を1つの反応液におけるＰＣＲ反応、融解曲線解析により行うことを可能としている。
【００２６】
本発明におけるＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されず、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体的には、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン、プロメガなど）、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、Ｕｌｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）などが挙げられる。
【００２７】
ゲノムＤＮＡの分離精製を行っていない生体試料を用いて配列の欠失または、導入の判定を行う場合は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することが望ましい。なかでも、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼがより好ましいものであるが、本発明に使用するＤＮＡポリメラーゼは、ゲノムＤＮＡの分離精製を行っていない生体試料から増幅が可能なＤＮＡポリメラーゼであればよく、それらのいずれにおいても適用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００２８】
本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、上記のＤＮＡポリメラーゼにおいて、アミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。該変異体は、公知の技術方法による特定部位への変異導入により改変されたものであってもよい。
【００２９】
本発明では、生体試料からゲノムＤＮＡの分離精製を行い、標的核酸中の配列の欠失または導入の判定を実施してもよい。このゲノムＤＮＡの分離精製は、限定されるものではないが、商業的に入手可能なＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  −Ｇｅｎｏｍｅ−（ＴＯＹＯＢＯ）、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  −Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ−（ＴＯＹＯＢＯ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｐｌａｎｔ ＩＩ（タカラバイオ）、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ）、ＦｌｅｘｉＧｅｎｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（キアゲン）等を用いることができる。
【００３０】
また、本発明における特徴は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、ゲノムＤＮＡを分離精製することなく生体試料を用いて、標的核酸中の配列の欠失または導入を判定することにもある。ゲノムＤＮＡの分離精製が不要であるため、前処理時間の短縮、操作の煩雑さの低減につながる。生体試料は特に限定されるものではないが、培養細胞、植物組織、植物細胞、動物組織、動物細胞等が挙げられ、より具体的には、イネ葉やタバコ葉、米粒などの植物組織、ヒトやマウス、ラットから採取された組織等が挙げられる。また、前記生体試料は乾燥や凍結を行ったものであってもよい。
【００３１】
さらに、生体試料は直接添加し検出してもよいし、水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁・希釈後添加し検出してもよいが、ＰＣＲの増幅効率の観点から、簡易的な前処理を実施してもよい。具体的には、加熱処理する方法、ホモジナイズする方法が挙げられる。
【００３２】
加熱処理する方法では、前記生体試料をそのまま加熱処理してもよいが、前記生体試料を水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁・希釈後、加熱処理することが好ましい。加熱処理工程における加熱温度は特に制限されないが、例えば８０℃以上であり、好ましくは８０℃〜９９℃、より好ましくは、９０℃〜９９℃である。また、処理時間も制限されるものではないが、例えば３０秒以上であり、好ましくは１分以上〜３０分、より好ましくは５分〜１５分である。加熱処理後の生体試料はそのままＰＣＲ反応液に添加してもよいが、ｐＨの中和を行った後に添加してもよく、水やＢｕｆｆｅｒ等で希釈した後に添加してもよい。また、添加割合は特に制限されることはなく、ＰＣＲ反応による増幅が認められる範囲で添加すればよい。
【００３３】
生体試料をホモジナイズする工程は、前記生体試料をそのままホモジナイズしてもよいが、前記生体試料を水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁・希釈後、ホモジナイズすることが好ましい。ホモジナイズは、生体試料を磨り潰せばよく、乳鉢等を用いて磨り潰しでもよく、商業的に入手可能なホモジナイザーやペッスル等を用いてホモジナイズを行ってもよい。ホモジナイズを実施した生体試料は、そのままＰＣＲ反応液に添加してもよいが、ｐＨの中和を行った後に添加してもよく、水やＢｕｆｆｅｒ等で希釈した後に添加してもよい。また、添加割合は特に制限せれることはなく、ＰＣＲ反応による増幅が認められる範囲で添加すればよい。
【００３４】
本発明におけるＰＣＲ反応液は、前記ＤＮＡ検出剤、Ｔｍ値の異なる２種類以上の増幅産物を与える特異的プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、テンプレート以外の組成成分は、特に限定されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も限定されるものではない。前記組成成分として、１種類以上のデオキシヌクレオチド三リン酸または、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。
【００３５】
緩衝剤としては、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。
また、反応バッファー中には、１．０〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
また、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。
【００３６】
さらに、反応バッファー中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。
【００３７】
本発明はまた、（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）ＤＮＡ検出剤、および、（ｃ）Ｔｍ値の異なる増幅産物を与える特異的プライマーを含む、標的核酸中の配列欠失または導入を判定するためのキットである。
【００３８】
本発明における標的遺伝子の配列の欠失または導入を検出するためには、融解曲線解析が可能な機器を使用する。融解曲線解析を実施可能な機器として、リアルタイムＰＣＲ機器が挙げられるが限定されるものではない。具体例としては、ロッシュ・ダイアグノスティック社のライトサイクラー（登録商標）、アプライドバイオシステム社のＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭ（登録商標）７０００ / ７７００、７５００ / ７５００ ＦＡＳＴ リアルタイムＰＣＲシステム、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム、ＳｔｅｐＯｎｅ / ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム、キアゲン社のＲｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ、タカラバイオ社のＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド社のＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎ、ＣＦＸ３８４ Ｔｏｕｃｈ、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ、アジレント・テクノロジー社のＭｘ３０００Ｐ、Ｍｘ３００５Ｐ、Ｍｘ４０００等が挙げられる。また、ＰＣＲ反応については、上記のリアルタイムＰＣＲ機器を使用してもよいが、融解曲線解析と独立して、サーマルサイクラーを使用してもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１：マウス精製ゲノムからの導入配列の検出
本実施例においては、Ｒｏｓａ２６の領域にＣｒｅＥＲを導入したノックインマウスの遺伝子型の判定を、精製ゲノムを用いて実施した。精製ゲノムは、野生型マウス、ヘテロマウス、ノックインマウスそれぞれについて、３ｍｍ程度のマウステールから、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ −Ｇｅｎｏｍｅ−（ＴＯＹＯＢＯ）を使用しＤＮＡの分離精製を行うことにより得た。
【００４１】
本実施例におけるプライマー設計は、まず共通プライマーを設計した後、各々の遺伝子型特異的増幅産物のＴｍ値に差異が生じるように各遺伝子型特異的増幅産物を生じさせるプライマーの位置を、Ｔｍ値計算プログラムのＢａｓｉｃ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ＃ｈｅｌｐｔｈｅｒｍｏ）を用いて増幅産物のＴｍ値を予測し決定した。この際、各遺伝子型の増幅長が異なるように設計することで、Ｔｍ値に差異が生じるように設計している。
具体的には、共通プライマー＃１（配列番号１）の位置を決定した後、野生型増幅産物の増幅長が６４ｂｐ（予測Ｔｍ値；７９℃）、ノックイン特異的増幅産物の増幅長が２２９ｂｐ（予測Ｔｍ値：８３度℃）になるように、野生型プライマー＃１（配列番号２）、ノックイン型プライマー＃１（配列番号３）を設計した。
また、上記とは各遺伝子型の増幅長が逆になるように、共通プライマー＃１（配列番号１）に対し、野生型増幅産物の増幅長が８３ｂｐ（予測Ｔｍ値：７９℃）となるように野生型プライマー＃２（配列番号４）、ノックイン特異的増幅産物の増幅長が５４ｂｐ（予測Ｔｍ値：７４℃）になるようにノックイン型プライマー＃２（配列番号５）を設計した。
【００４２】
【表１】
2014223026.tif 000002
【００４３】
本実施例では、ファミリーＡに属するポリメラーゼであるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをベースとしたリアルタイムＰＣＲ試薬であるＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）  ＳＹＢＲ（登録商標）  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。テンプレートしては、上記のマウス精製ゲノムを使用し、表２に示す反応液を調製後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて、表３に示す下記条件にてＰＣＲ反応による増幅、融解曲線解析による検出を実施した。
【００４４】
【表２】
2014223026.tif 000003
【００４５】
【表３】
2014223026.tif 000004
【００４６】
これらの結果を図３に示す。図３は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、精製ゲノムＤＮＡからＰＣＲを実施し、融解曲線解析を用いてノックインマウスの遺伝子型判定を実施した結果である。その結果、各遺伝子型の増幅長に差異を生じさせＴｍ値を変えることで、野生型、ヘテロ型、ノックイン型それぞれの遺伝子型の判定が可能であった。また、各遺伝子型の増幅長の差異を利用しＴｍ値に差異が生じるようにプライマーを設計するだけで、遺伝子型の判定が可能であることを確認することができた。
【００４７】
実施例２：生体試料からの導入配列の検出
本実施例においては、Ｒｏｓａ２６の領域にＣｒｅＥＲを導入したノックインマウスの遺伝子型の判定を、生体試料を用いて実施した。生体試料は、野生型マウス、ヘテロマウス、ノックインマウスそれぞれについて、３ｍｍ程度のマウステールに５０ｍＭ  ＮａＯＨを１８０μＬ添加し、９５℃、１０分間熱処理を実施、その後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０μＬにて中和することにより得た。
【００４８】
本実施例におけるプライマー設計は、実施例１と同様な方法にて設計した。具体的には、表４に示すように、共通プライマー＃２（配列番号６）を設計し、野生型増幅産物の増幅長が１００ｂｐ（予測Ｔｍ値：７９℃）となるように野生型プライマー＃３（配列番号７）、ノックイン特異的増幅産物の増幅長が３４１ｂｐ（予測Ｔｍ値：８４℃）になるようにノックイン型プライマー＃３（配列番号８）を設計した。
【００４９】
本実施例では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、ＰＣＲバッファーは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）に添付のものを使用した。また、インターカレーターは、１／３０，０００倍希釈のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  を使用し、ＰＣＲ反応液を表５に示す反応組成になるように調製した。前記ＰＣＲ反応液ついて、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて、表６に示す下記条件にてＰＣＲ反応による増幅、融解曲線解析による検出を実施した。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
【表５】
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【００５２】
【表６】
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【００５３】
また、同様なプライマー設計、サンプルを用い、クルードサンプルから増幅可能なＭｉｇｈｔｙＡｍｐ（登録商標）  ｆｏｒ Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を使用し、表７、表８に記載の条件にて検出を実施した。
【００５４】
【表７】
2014223026.tif 000008
【００５５】
【表８】
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【００５６】
これらの結果を図４に示す。図４は、ゲノムＤＮＡの分離精製を行うことなく生体試料からＰＣＲを実施し、融解曲線解析を用いてノックインマウスの遺伝子型判定を実施した結果である。その結果、ゲノムＤＮＡの分離精製を行わずに、各遺伝子型の増幅長に差異を生じさせＴｍ値を変えることで、野生型、ヘテロ型、ノックイン型それぞれの遺伝子型の判定が可能であった。
【００５７】
実施例３：生体試料からの遺伝子の検出
実施例１、２では、各遺伝子型の増幅長に差異を生じさせＴｍ値に差異を生じさせることで遺伝子型の判定が可能になることを示した。続いて、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することで、生体試料から遺伝子の検出が可能であるか検証した。生体試料として、イネ葉、血液、口腔粘膜、培養細胞、牛肉、豚肉、毛髪、爪を使用した。
【００５８】
本実施例に用いた生体試料の前処理方法を詳細に記載する。
イネ葉：３ｍｍ各のイネ葉に１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡからなるバッファーを１００μＬ添加し、ペッスルにてホモジナイズを実施、その後、水にて１／２５に希釈することによりサンプルを得た。
血液：水で、１／２５に希釈したものをサンプルとした。
口腔粘膜：口腔粘膜を綿棒で採取し、２００μＬの水で懸濁することにより、サンプルを得た。
培養細胞：培養細胞（ＨｅＬａ細胞）を回収し、１０の６条細胞を５００μＬの水で懸濁し、サンプルとした。
牛肉・豚肉：約１５ｍｇの牛肉・豚肉に、５０ｍＭ  ＮａＯＨを１８０μＬ添加し、９５℃で１０分間熱処理を実施した。その後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０μＬにて中和することによりサンプルを得た。
毛髪：毛根を含む範囲で毛髪１ｃｍ程度をサンプルとした。
爪：３ｍｍ各程度の爪をサンプルとした。
【００５９】
本実施例では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、表９に記載のプライマー（表の上の行から順に配列番号９〜１６）、表１０に記載の反応組成、表１１に記載のＰＣＲ反応条件にて、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて増幅、融解曲線解析による検出を実施した。
【００６０】
【表９】
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【００６１】
【表１０】
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【００６２】
【表１１】
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【００６３】
これらの結果を図５に示す。図５は、ゲノムＤＮＡの分離精製を行うことなく生体試料からＰＣＲを実施し、融解曲線解析を用いて、生体試料から遺伝子の検出を実施した結果である。その結果、各生体試料から、ゲノムＤＮＡの分離精製を行うことなく、融解曲線解析にて標的核酸を検出できることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により、電気泳動をすることなく、Ｔｍ値の異なる増幅産物を与えるプライマーを用い、ＰＣＲ増幅、融解曲線解析を行うことでより簡便に、迅速に標的核酸中の配列欠失または導入を判定することが可能となった。また、使用するＤＮＡポリメラーゼをファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとすることで、ＤＮＡの分離精製を行うことなく、より迅速にＰＣＲ反応を開始することが可能となった。本発明は、研究分野での応用に始め、診断用途などにおいて広く使用することができるが、短時間に操作も簡便に判定が可能となったことから、特に、多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が多いに期待できる。さらに本発明では、電気泳動のためにＰＣＲ後にチューブを開ける必要性がないため、ＰＣＲ増幅産物の飛散によるキャリーオーバーのリスクを大幅に低減することができ、擬陽性等のリスクを低減させることができるため、産業上利用する際の擬陽性等のリスク低減に繋がることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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