(57)【要約】【課題】より収量が高いエルゴチオネインの製造方法、エルゴチオネイン誘導体の製造方法、エルゴチオネインを豊富に含む組成物、並びに当該組成物を含む食品、化粧料、及び飼料を提供すること。【解決手段】酒粕等の醸造粕を含む培地で担子菌を培養することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法、醸造粕を担子菌で発酵させてなる組成物、組成物を含む食品、化粧料、及び飼料を提供する。本発明は、特に食品分野、化粧料分野、及び畜産分野において有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）で示される化合物の製造方法であって、醸造粕を含む培地で担子菌を培養する工程を含む、製造方法：
【化１】
2014223051.tif 000014
式中：
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、又はアシル基を表し、アルキル基、アルケニル基、アリール基、又はアシル基は、任意にヒドロキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、又はアミン基で置換されていてもよく、かつ鎖中にヘテロ原子を含んでもよい。
【請求項２】
化学式（１）で示される化合物がエルゴチオネインである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
醸造粕が酒粕、焼酎粕、及びみりん粕からなる群より選択された少なくとも一種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
醸造粕が酒粕、又はみりん粕である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
担子菌がハラタケ目及びヒダナシタケ目からなる群より選択された少なくとも一種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
担子菌がブナシメジ、キツブナラタケ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ）、及びヤマブシタケからなる群より選択された少なくとも一種である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
醸造粕をブナシメジ、キツブナラタケ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ）、及びヤマブシタケからなる群より選択された少なくとも一種の担子菌で発酵させてなる組成物。
【請求項８】
醸造粕が酒粕、焼酎粕、及びみりん粕からなる群より選択された少なくとも一種である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
醸造粕が酒粕、又はみりん粕である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物を含む食品。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物を含む化粧料。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物を含む飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌によるエルゴチオネインの製造方法、エルゴチオネイン誘導体の製造方法、醸造粕を担子菌で発酵させてなる組成物、並びに当該組成物を含む食品、化粧料、及び飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸の一種であるエルゴチオネインは、動物の赤血球、肝臓等に広く分布している。エルゴチオネインは、菌類やマイコバクテリアによって生合成される。植物は、菌類によって分生胞子内で合成されたエルゴチオネインを根から吸収する。動物は、主に植物の摂取によりエルゴチオネインを得ている。また、近年、エルゴチオネインの誘導体であるβ−ヒドロキシエルゴチオネインが担子菌類に含まれることが明らかにされている（非特許文献１）。エルゴチオネインやその誘導体の正確な生物学的役割は未だに明らかにされていないが、エルゴチオネインやその誘導体には強力な抗酸化作用があることが知られている。近年、食品、化粧料、飼料としてのエルゴチオネインの利用が検討されている。
【０００３】
エルゴチオネインの製造方法としては、動物の血液や臓器から抽出する方法、オートムギ等の植物から抽出する方法、化学的に合成する方法、微生物から抽出する方法が知られている。エルゴチオネインを産生する微生物としては、マイコバクテリア、カビ類、子嚢菌及び担子菌が知られている。担子菌の菌糸体を利用したエルゴチオネインの製造方法としては、ヒメマツタケやアンニンコウを用いる方法が提案されている（特許文献１）が、その収量は十分なものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１５９９２０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】“Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ”、２００５年２月、第６９巻、第２号、ｐ．３５７−３６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、より収量が高いエルゴチオネインの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、醸造粕を含む培地で担子菌を培養することにより、高い収量でエルゴチオネインを製造可能であることを見出した。また、担子菌としてブナシメジ、キツブナラタケ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ）、ヤマブシタケを利用することによって、より高い収量でエルゴチオネインを製造可能であることを見出した。さらには、エルゴチオネインを豊富に含む飼料を動物に給餌することにより、動物の可食部にエルゴチオネインが移行し、エルゴチオネインを豊富に含む食肉等を得ることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明を概説すれば、本発明は、
［１］下記化学式（１）で示される化合物の製造方法であって、醸造粕を含む培地で担子菌を培養する工程を含む、製造方法：
【０００９】
【化１】
2014223051.tif 000002
式中：
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、又はアシル基を表し、アルキル基、アルケニル基、アリール基、又はアシル基は、任意にヒドロキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、又はアミン基で置換されていてもよく、かつ鎖中にヘテロ原子を含んでもよい、
［２］化学式（１）で示される化合物がエルゴチオネインである、［１］に記載の製造方法、
［３］醸造粕が酒粕、焼酎粕、及びみりん粕からなる群より選択された少なくとも一種である、［１］に記載の製造方法、
［４］醸造粕が酒粕、又はみりん粕である、［３］に記載の製造方法、
［５］担子菌がハラタケ目及びヒダナシタケ目からなる群より選択された少なくとも一種である、［１］に記載の製造方法、
［６］担子菌がブナシメジ、キツブナラタケ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ）、及びヤマブシタケからなる群より選択された少なくとも一種である、［５］に記載の製造方法、
［７］醸造粕をブナシメジ、キツブナラタケ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ）、及びヤマブシタケからなる群より選択された少なくとも一種の担子菌で発酵させてなる組成物、
［８］醸造粕が酒粕、焼酎粕、及びみりん粕からなる群より選択された少なくとも一種である、［７］に記載の組成物、
［９］醸造粕が酒粕又はみりん粕である、［８］に記載の組成物、
［１０］［７］〜［９］のいずれか一に記載の組成物を含む食品、
［１１］［７］〜［９］のいずれか一に記載の組成物を含む化粧料、並びに
［１２］［７］〜［９］のいずれか一に記載の組成物を含む飼料、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、収量が高いエルゴチオネインの製造方法、エルゴチオネイン誘導体の製造方法、エルゴチオネインを豊富に含む組成物、並びに当該組成物を含む食品、化粧料、及び飼料が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の製造方法は、醸造粕を含む培地で担子菌を培養することを特徴とする。醸造粕を含む培地で担子菌を培養することにより、高い収量でエルゴチオネインを製造可能である。担子菌の中にはエルゴチオネインの誘導体であるβ−ヒドロキシエルゴチオネインを産生するものが知られており、こうした担子菌を醸造粕を含む培地で培養することによってβ−ヒドロキシエルゴチオネインを製造することも可能である。更には、醸造粕を含む培地で担子菌を培養して得られたエルゴチオネイン又はβ−ヒドロキシエルゴチオネインを原料として、例えば当業者に公知の置換反応や付加反応によって、これらの誘導体を製造できる。すなわち本発明の製造方法は、下記化学式（１）で示される化合物の製造方法であって、醸造粕を含む培地で担子菌を培養する工程を含む。
【００１２】
【化２】
2014223051.tif 000003
【００１３】
上記の化学式（１）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、又はアシル基を表し、アルキル基、アルケニル基、アリール基、又はアシル基は、任意にヒドロキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、又はアミン基で置換されていてもよく、かつ鎖中にヘテロ原子を含んでもよい。Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３としては、水素原子、ヒドロキシ基、及びアルキル基が好適に例示される。
【００１４】
また、上記のＲ１としては水素原子、及びヒドロキシ基が、上記のＲ２としては水素原子、及びメチル基が、上記のＲ３としては水素原子、及びメチル基がより好適に例示される。なお、Ｒ３が水素原子である化合物は、下記の化学式（２）に示す互変異性を起こしうる。
【００１５】
【化３】
2014223051.tif 000004
【００１６】
上記の化学式（１）で示される化合物としては、エルゴチオネイン、β−ヒドロキシエルゴチオネイン、Ｓ−メチルエルゴチオネイン、及びＳ，Ｎ−ジメチルエルゴチオネインがより好適に例示され、なかでもエルゴチオネイン、及びβ−ヒドロキシエルゴチオネインが最も好適に例示される。
【００１７】
本明細書において醸造粕とは、アルコール醸造等の発酵食品の製造過程で生じる副生成物のことを指す。本発明に使用される醸造粕としては、例えば酒粕（日本酒を製造した後の残留物）やワイン粕等の醸造酒を製造した後の残留物、焼酎粕（焼酎製造における蒸留後の残留物）等の蒸留酒を製造した後の残留物、みりん粕（みりんを製造した後の残留物）、及び醤油粕（醤油諸味の絞り粕）が例示され、なかでも酒粕、又はみりん粕が好適に例示される。本発明に使用される醸造粕の醸造原料としては、例えば米、麦、そば、トウモロコシ等の穀物類、サツマイモ等のイモ類、大豆、ごま等の豆類、しょうが、しそ等の野菜類、果実類、サトウキビの搾汁液等が例示され、特に本発明を限定するものではないが、なかでも米、イモ、麦、大豆、そば、トウモロコシ、ごま、しょうが及びしそが好適に例示される。
【００１８】
前記の醸造粕を含む培地は、担子菌を培養可能なものである限り特に限定はなく、醸造粕そのものであってもよく、醸造粕と他の成分等とを混合することによって作製された固形状の培地（固形培地）、又は液状の培地（液体培地）であってもよい。液体培地の場合、培地中の醸造粕の含有量（Ｗ／Ｖ％）は、本発明を特に限定するものではないが、０．０１〜１００％、好ましくは０．１〜２０％、より好ましくは１〜５％が例示される。
【００１９】
前記の担子菌の培養に適した成分としては、例えば無機塩類、有機酸類、無機酸類、ペプトン類、ペプチド・アミノ酸、エキス類、及び糖類が例示される。無機塩類としては、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸カリウムアルミニウム、及びモリブデン酸ナトリウムが例示される。有機酸類としては、ニトリロ三酢酸ナトリウム、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、ギ酸、及びシュウ酸が例示される。無機酸類としては、ホウ酸が例示される。ペプトン類としては、獣肉ペプトン、カゼインペプトン、及び植物ペプトン（例えば大豆ペプトン）が例示される。エキス類としては、酵母エキス、及び牛肉エキスが例示される。糖類としては、デンプン等の多糖類、及びグルコース等の単糖類が例示される。
【００２０】
また、食用の担子菌の人工的な栽培に使用される公知の菌床培地の成分、例えばオガクズ、バガス、コーンコブ、籾殻、豆皮、コメ、コーン、オーツ、オカラ、ビートパルプ、米糠、フスマ、穀類等と醸造粕とを組み合わせて固形培地を調製し、本発明に使用してもよい。また、固形培地が湿潤状態になるように、さらに水を添加しても良い。固形培地における醸造粕の含有量（醸造粕を含めた各種成分を乾燥重量で換算したＷ／Ｗ％）は、本発明を特に限定するものではないが、１〜８０％、好ましくは５〜６０％、より好ましくは１０〜５０％、例えば３３％が例示される。
【００２１】
また、上記の担子菌の培養に適した成分と醸造粕との混合方法には特に限定はなく、当業者が用いる通常の方法で行えばよい。例えば醸造粕と直接混合する、水溶液として混合する等の方法が例示され、例えば無菌的に調製したすべての成分を溶解した水溶液と、醸造粕とを無菌的に混合する方法が選択される。また、混合後にはオートクレーブなどの無菌処理を行うこともできる。
【００２２】
本明細書において担子菌とは、キノコのうち担子菌門に属する菌を示す。本発明に用いられる担子菌としては、本発明を特に限定するものではないが、食用、薬用に用いられる担子菌類が例示される。本発明に用いられる担子菌としては、ハラタケ目、ヒダナシタケ目、ホコリタケ目、ヒメノガステル目、又はキクラゲ目に属する担子菌が例示される。本発明の製造方法によって得られるエルゴチオネインの収量の観点からは、好ましくはハラタケ目又はヒダナシタケ目に属する担子菌が、より好ましくはシメジ科、ハラタケ科、ヒラタケ科、オキナタケ科、ウロコタケ科、キシメジ科、又はサンゴハリタケ科に属する担子菌が、さらにより好ましくはブナシメジ、キツブナラタケ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ、及びヤマブシタケが例示される。
【００２３】
本発明に用いられる担子菌は、人工的な培養が可能な菌株で、本発明に適用できる菌株であれば特に限定はない。野生の菌株、市販の菌株、野生の子実体からの組織分離株、選抜、交配、細胞融合、遺伝子組換え等の手法により育種した株、更には当業者にとって自明な方法により育種した菌株や変異株等を、本発明における担子菌として用いることができる。
【００２４】
また、本発明に用いる担子菌としては、固体培養や液体培養等により得られる培養物を用いても良く、例えば子実体及び培養菌糸体から選択されるものをそのまま、若しくはそれらの乾燥物又はそれらの加工処理物を用いてもよい。乾燥または加工処理方法としては、担子菌の発酵能力を完全に損なうことがなければよく、自然乾燥、加圧乾燥、常圧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などの従来用いられている方法を適宜用いればよい。
【００２５】
担子菌の培養は通常の培養条件で行うことができる。液体培地を使用する場合、例えば温度４〜３５℃、振とう０〜１００ｒｐｍでの培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。培養温度は、所望の組成物の製造が達成されるのであれば前記の範囲以外の温度で実施してもよい。固形培地を使用する場合には、加湿条件で実施してもよい。また、培養期間も特に限定はないが、例えば１時間〜１２週間、好適には１日〜４週間が例示される。
【００２６】
本発明の製造方法は、醸造粕を含む培地で担子菌を培養した後に、エルゴチオネインを抽出する工程を含んでいてもよい。この抽出工程としては、本発明を特に限定するものではないが、溶媒抽出が例示される。この場合の抽出溶媒としては、例えば水、クロロホルム、エタノールやイソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、及び酢酸エチル等の親水性もしくは親油性の溶媒を挙げることができ、所望により単独で、もしくは適宜混合液として用いることができる。水を抽出溶媒として使用する場合には、温水又は熱水によりエルゴチオネインを抽出してもよい。前記の抽出は培養物全体について実施してもよいが、培養物より分離した固形物又は液状物について実施してもよい。
【００２７】
本発明の製造方法は、上記の抽出工程により得られた抽出物よりさらにエルゴチオネインを精製する工程を含んでいても良い。エルゴチオネインの精製には、当該分野で公知の技術を利用することができる。
【００２８】
本発明は、醸造粕をブナシメジ、キツブナラタケ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ、及びヤマブシタケからなる群より選択された少なくとも一種の担子菌で発酵させてなる組成物を提供する。本発明の組成物は、高い抗酸化作用を有するエルゴチオネインを豊富に含むため、食品、化粧料、及び飼料として有用である。
【００２９】
本発明の組成物の原料として利用される醸造粕としては、前記の本発明のエルゴチオネインの製造方法において例示された醸造粕が同様に例示される。本発明の組成物の原料として利用される醸造粕は、食用の担子菌の人工的な栽培に使用される公知の菌床培地の成分、例えばオガクズ、バガス、コーンコブ、籾殻、豆皮、コメ、コーン、オーツ、オカラ、ビートパルプ、米糠、フスマ、穀類等を含んでいてもよい。また、醸造粕を担子菌で発酵する条件としては、前記の本発明のエルゴチオネインの製造方法における担子菌の培養の条件として例示されたものと同様の条件が例示される。
【００３０】
本発明の組成物は、醸造粕をブナシメジ、キツブナラタケ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ、及びヤマブシタケからなる群より選択された少なくとも一種の担子菌で発酵させて得られた発酵産物である限り、その形態に特に限定はない。本発明の組成物の形態としては、液状、固形、粉末、ゲル状、ゾル状、スラリー状等の形態とすることが可能であり、その後の用途に合わせた形状に加工することができる。なお、本発明の組成物は、上記の担子菌の菌糸を含みうる。
【００３１】
本発明の製造方法によって製造されたエルゴチオネインや本発明の組成物は、それ単独で、又は他の成分と組み合わせて食品、化粧料、及び飼料とすることができる。本発明の組成物を含む食品、化粧料、及び飼料は、それぞれ本発明の好適な一態様である。
【００３２】
本発明の製造方法によって製造されるエルゴチオネインや本発明の組成物を含む食品は、高い抗酸化作用を示すため、体内での活性酸素の生成を抑制し、活性酸素による傷害や過酸化脂質の生成、並びにこれらに起因する動脈硬化、高血圧、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳溢血、糖尿病、癌、認知症、免疫の低下、及びメタボリックシンドローム等を予防することが期待できる。
【００３３】
本発明の製造方法によって製造されるエルゴチオネインや本発明の組成物を含む化粧料は、高い抗酸化作用を示すため、活性酸素による傷害やこれに起因する皮膚の荒れ、老化等を予防することが期待できる。
【００３４】
化粧料の形状に特に限定はなく、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ケン、浴用洗剤、シャンプー、リンス又は軟膏が好適である。本発明の製造方法によって製造されるエルゴチオネインや本発明の組成物を含む化粧料は、本発明の製造方法によって製造されるエルゴチオネインや本発明の組成物に加えて、所望により水性成分、油性成分、植物抽出物、動物抽出物、界面活性剤、アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、色素、香料等のその他の成分を原料として用い、化粧品分野における公知の方法に従って適宜製造することができる。
【００３５】
本発明の製造方法によって製造されるエルゴチオネインや本発明の組成物を含む飼料は、エルゴチオネインが有する高い抗酸化作用による動物の健康増進、あるいは健康維持の効果が期待できる。動物の健康増進や健康維持の効果は、例えば成長の促進、飼育時の薬剤使用量の低減につながる。また、当該飼料を摂取した動物の可食部、乳汁（牛乳等）、卵（鶏卵等）へのエルゴチオネインの移行が期待できる。
【００３６】
生体中の脂質や食肉中の脂質は、酸化されると分子内にペルオキシド結合を有する過酸化脂質を生じ、さらに代謝、還元、分解されると、アルデヒド等の二次生成物を生じる。これらの脂質の過酸化物は、異臭を放ち、食肉の風味や食味にも悪影響を及ぼす。また、脂質の過酸化物は、動脈硬化、糖尿病、痴呆、癌等の疾病の発症や進展、更には生体の免疫機能の低下の原因の一つと考えられている。高い抗酸化作用を有するエルゴチオネインの動物の可食部への移行により、当該可食部の脂質の酸化の抑制に繋がる。また、高い抗酸化作用を有する食品の製造が可能となる。このため、本発明の飼料を動物に給餌することにより、動物の解体時の肉質低下の抑制、高い抗酸化作用を有する食肉の生産、食肉の抗酸化力の向上による鮮度保持力の向上、並びに食肉の臭み、風味、食味の改善が期待できる。従って、エルゴチオネイン又は本発明の組成物を含む飼料を動物に給餌する工程を含む、動物の解体時の肉質低下の抑制方法、高い抗酸化作用を有する食肉の生産方法、食肉の抗酸化力の向上による鮮度保持力の向上方法、並びに食肉の臭み、風味、食味の改善方法も、本発明の一態様として例示される。また、エルゴチオネイン又は本発明の組成物を含む、動物の解体時の肉質低下の抑制剤、食肉の抗酸化力向上剤、食肉の鮮度保持力向上剤、並びに食肉の臭み、風味、食味の改善剤も、本発明の一態様として例示される。更には、１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以上のエルゴチオネインを含む畜産食品（例えば、食肉、乳製品、卵製品等）も、本発明の一態様として例示される。
【００３７】
本発明の組成物を含む飼料を動物に給餌する工程を含む動物の飼育方法も、本発明の一態様である。本発明の飼育方法における動物としては、人が利用するために飼育している哺乳類、鳥類、及び魚介類が例示され、家畜、実験動物、及び愛玩動物がより好適に例示される。家畜としては、牛、豚、馬、山羊、めん羊、鹿、らくだ、ラマ等の哺乳類、鶏、アヒル、七面鳥、ダチョウ等の家禽が例示される。実験動物としては、実験用に飼育されている動物であれば特に限定はないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等が例示される。魚介類としては、飼育、すなわち養殖可能であれば特に限定はないが、ブリ、マダイ、ギンザケ、カンパチ、ヒラメ、トラフグ、シマアジ、マアジ、ヒラマサ、タイリクスズキ、スズキ、スギ、クロマグロ、クルマエビ、コイ、ウナギ、ニジマス、アユ、ヤマメ、アマゴ、ニツコウイワナ、エゾイワナ、ヤマトイワナ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミ等の甲殻類、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキ等の貝類が例示される。愛玩動物としては犬、猫等が例示される。
【００３８】
本発明を特に限定するものではないが、例えば本発明の飼育方法を牛に適用する場合、本発明の飼料の１日当たりの給餌量は、エルゴチオネイン量に換算して、１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは１００ｍｇ〜１ｇとなるように設定すればよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
（１）担子菌の培養
酒粕培地あるいはＳＧＹ培地１を３０ｍｍ径試験管に１７ｍＬずつ分注し、１２１℃で２０分滅菌した。これらの液体培地に共通する組成を表２に、それぞれの液体培地に特有の組成を表１に示す。
【００４１】
【表１】
2014223051.tif 000005
【００４２】
【表２】
2014223051.tif 000006
【００４３】
次に、ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）プレートで被検担子菌（ブナシメジ、キツブナラタケ）を培養し、生育した各菌糸を培地ごとメスで３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの塊で切り出した。そして、１サンプルあたり２又は３個の塊を上記の液体培地に無菌的に接種し、２０℃、約９０ｒｐｍで４週間振とう培養した。こうして得られた培養液を、担子菌培養液とした。
【００４４】
（２）分析サンプル調製
各担子菌培養液をフィルターでろ過し、菌体とろ液に分けた。菌体に１ｍＬの滅菌水を加え６０℃、３０分間処理（熱水抽出処理）し、１４，１００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清をサンプリングし、これを菌体熱水抽出物とした。
【００４５】
（３）エルゴチオネイン含量の測定
（２）で得られた各菌体熱水抽出物の全量を凍結乾燥した後、これらに７０％エタノールを５００μＬずつ加えて溶解したものを試験用サンプルとした。こうして得られた各試験用サンプル５００μＬをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣのカラムにはＨＩＬＩＣ系（具体的にはＷａｔｅｒｓ製Ａｔｌａｎｔｉｓ  ＨＩＬＩＣ  ｓｉｌｉｃａ３μｍ、φ２．１×１５０ｍｍ）を用い、移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム：アセトニトリル＝１：４（アイソクラティック条件）を用いた。また、流速は０．５ｍＬ／分、カラム温度は４０℃とし、ＵＶ検出器にて２２０ｎｍの吸収によりエルゴチオネインに由来するピークを検出した。エルゴチオネイン量は、所定の保持時間に出現するピークの面積を既知濃度のエルゴチオネイン標品のピーク面積と比較することにより定量した。その結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2014223051.tif 000007
【００４７】
その結果、酒粕培地で担子菌を培養することにより、ＳＧＹ培地１で培養した場合と比べ、はるかに高い収量でエルゴチオネインを製造可能であることが明らかとなった。
【００４８】
実施例２
（１）担子菌の培養
酒粕培地あるいはＳＧＹ培地２を５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに２００ｍＬずつ分注し、１２１℃、２０分滅菌した。酒粕培地は、実施例１−（１）で調製した酒粕培地と同じ組成となるように調製した。ＳＧＹ培地２の組成を表４に示す。
【００４９】
【表４】
2014223051.tif 000008
【００５０】
次に、ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）プレートで被検担子菌（ブナシメジ、タモギタケ、ヒラタケ、ササクレヒトヨタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ）をそれぞれ培養し、生育した各菌糸を培地ごとメスで３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの塊で切り出した。そして、１サンプルあたり５個の塊を上記の液体培地に無菌的に接種し、２５℃、約９０ｒｐｍで２０日間振とう培養した。こうして得られた培養液を、担子菌培養液とした。
【００５１】
（２）分析サンプル調製
各担子菌培養液をフィルターでろ過し、菌体とろ液に分けた。菌体を凍結乾燥後、粉砕し、凍結乾燥物０．２ｇに対して１ｍＬの７０％エタノールを加え、激しくボルテックスを行った。そして２，０００×ｇ、２分間遠心分離を行い上清を回収後、０．４５μｍのフィルターでろ過を行った。得られた抽出液を試験用サンプルとした。
【００５２】
（３）エルゴチオネイン含量の測定
（２）で得られた試験用サンプルの全量を実施例１−（３）と同様の条件でＨＰＬＣに供し、各試験用サンプルに含まれるエルゴチオネイン量を定量した。結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
2014223051.tif 000009
【００５４】
その結果、酒粕培地で担子菌を培養することにより、ＳＧＹ培地２で培養した場合と比べ、高い収量でエルゴチオネインを製造可能であることが明らかとなった。
【００５５】
実施例３
（１）液体種菌の調製
５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに分注後に１２１℃、２０分間の条件で滅菌されたＳＧＹ液体培地（組成：グルコース２．０％、ポリペプトン−Ｓ０．２％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．０５％、及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５％、ｐＨ６．０）２００ｍＬにタモギタケＰｃ１７−０３株を接種して、２５℃で１４日間９０ｒｐｍで振とう培養した。こうして得られた培養物を液体種菌とした。
【００５６】
（２）固形培地の調製
酒粕とオーツ、コーンコブ、籾殻、大豆皮（豆皮）、又はオカラとを乾燥重量比で１：３の割合となるように混合し、計５種類の混合物を調製した。また、みりん粕（宝酒造社製）とおから又は大豆皮とを乾燥重量比で１：３の割合となるように混合し、２種類の混合物を調製した。更に、米ぬかと杉おが粉を乾燥重量比で１：１の割合となるよう混合した。これらの混合物に水道水を加えて水分含量を６２％にした後、良く混合し湿潤状態にした。こうして得られた各種培地をポリプロピレン製のキノコ用広口培養ビン（１１００ｍＬ）に約６００ｇそれぞれ圧詰して、中央に直径２ｃｍ程度の接種孔を開け、フタをした後、１１８℃、９０分間高圧蒸気殺菌を行った後、放冷して固形培地とした。また、各種混合物の代わりにオーツに水道水を加えて水分含量を６２％とする以外は上記と同様の方法により、オーツから固形培地を調製した。
【００５７】
（３）固形培地による担子菌の培養
実施例３−（２）で調製した各種固形培地に実施例３−（１）で調製した液体種菌約２０ｍＬを接種し、温度２５℃、湿度６０％の条件の下、培地全体を菌糸が覆うまで培養した。各種固形培地において培地全体を菌糸が覆うまで要した日数を下記の表６に示す。
【００５８】
【表６】
2014223051.tif 000010
【００５９】
また、オーツから調製した固形培地と、酒粕とオーツとの混合物から調製した固形培地については、６０日間の培養を行ったものについても試験した。
【００６０】
（４）分析サンプル調製
実施例３−（３）で培養したタモギタケ菌床培養物を培養ビンから掻き出した後、培養物を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を粉砕した後、この粉砕物０．１ｇに対して１ｍＬの７０％エタノールを加えて激しくボルテックスし、エルゴチオネインの抽出を行った。そして、２，０００×ｇ、２分間の遠心分離を行い、得られた上清を０．４５μｍのフィルターでろ過した。こうして得られたろ液をエルゴチオネイン含量の測定用サンプルとした。
【００６１】
（５）エルゴチオネイン含量の測定
実施例３−（４）で得られたエルゴチオネイン含量の測定用サンプルを、実施例１−（３）と同様の条件でＨＰＬＣに供し、各サンプルに含まれるエルゴチオネインを定量した。各培地組成におけるエルゴチオネインの定量結果を表７に示す。
【００６２】
【表７】
2014223051.tif 000011
【００６３】
表７に示す通り、酒粕やみりん粕を含む固形培地で培養を行うことで、酒粕、みりん粕を含まない固形培地で培養を行った場合よりも多くのエルゴチオネインが生産された。
【００６４】
実施例４
（１）畜産試験飼料調製
水分含量を６４％とする以外は実施例３−（２）と同様の方法で、酒粕：コーンコブ培地（乾燥重量比１：３、水分６４％）を調製した。こうして調製した培地に実施例３−（１）と同様の方法で調製した液体種菌（タモギタケＰｃ１７−０３株）約２０ｍＬを接種し、温度２５℃、湿度６０％の条件の下、４０日間の培養を行った。培養後、菌床を掻き出し、６０℃の熱風乾燥を６時間行った。こうして得られた乾燥物を試験飼料とした。なお、試験飼料のエルゴチオネイン含量を実施例１−（３）と同様の方法で定量したところ、０．５１９ｍｇ／ｇ乾重量であった。
【００６５】
（２）給餌試験
試験牛としてホルスタイン種の雌牛を用いた。試験区の牛には、一日あたりコーンサイレージ１０ｋｇ、自家配合飼料３ｋｇ、クレイングラス７ｋｇ、及び試験飼料１．５ｋｇ（エルゴチオネイン７７９ｍｇ含む）を与えた。尚、対照区の牛には、上記餌のうち試験飼料を除いたものを用いた。毎日給餌を行い、８週間試験飼料を与えた。８週間の試験飼料給餌の前後では、牛の身体状態に変化は認められなかった。このことから、本発明の組成物を含む飼料の安全性が確認できた。また、本発明の組成物を含む飼料には、健康維持の効果があることが示唆された。給餌を開始して５６日目に屠畜を行った後、各組織（肝臓、胸最長筋、半膜様筋）を切り出し、凍結乾燥した。
【００６６】
（３）各組織からのエルゴチオネインの抽出
凍結乾燥した各組織サンプルから１ｇを秤量し、粉砕後、１０ｍＬの１０ｍＭ過塩素酸を添加した。１０分間ソニケーションを行った後、１５分間混和した。１７５０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上清を回収後さらに１７８００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行った。そして、得られた上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液を測定用サンプルとした。測定用サンプル中のエルゴチオネイン量を実施例１−（３）と同様の方法で行い、組織中のエルゴチオネイン量を算出した。その結果を表８に示す。
【００６７】
【表８】
2014223051.tif 000012
【００６８】
表８に示す通り、エルゴチオネインを豊富に含む飼料を給餌することにより、可食部にエルゴチオネインが移行し、エルゴチオネインを豊富に含む食肉等を得ることが可能であることが分かった。
【００６９】
実施例５
（１）固形培地の調製
みりん粕、大豆皮（豆皮）、及びオカラを乾燥重量比で２：３：３の割合となるように混合し、この混合物に水道水を加えて水分含量を６２％にした後、良く混合し湿潤状態にした。こうして得られた培地を試験管（口径３０ｍｍ、長さ２００ｍｍ）に２０ｇずつ移し、菌座（培地の上部）が試験管の底から６０ｍｍとなるように圧詰した。シリコ栓でフタをし、１２１℃、２０分間高圧蒸気殺菌を行った後、放冷して固形培地とした。
【００７０】
（２）固形培地による担子菌の培養
実施例３−（１）と同様の方法で担子菌液体種菌約２ｍＬを接種し、温度２５℃、湿度６０％の条件の下、３７日間培養した。また、タモギタケＰｃ１７−０３株の代わりにウスヒラタケ、エリンギ、クロアワビタケ、ヒラタケ、プレオロータス  サジョール−カジュ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ）、又はヤマブシタケを用いる以外は実施例３−（１）と同様の方法で担子菌液体種菌を調製した。こうして調製した液体種菌約２ｍＬを上記固形培地に接種し、温度２５℃、湿度６０％の条件の下、３７日間、それぞれ培養した。
【００７１】
（３）エルゴチオネインの分析
培養終了後、スパーテルで菌床培養物を掻き出し、実施例３-（４）と同様の方法でエルゴチオネインを抽出し、実施例３−（５）と同様の方法でエルゴチオネイン量を確認した。各菌株の生産したエルゴチオネイン量を表９に示す。
【００７２】
【表９】
2014223051.tif 000013
【００７３】
その結果、本発明の製造方法により、試験したどの菌株においてもエルゴチオネインを多く生産可能であることが示された。このように、醸造粕はエルゴチオネインの生産に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、特に食品分野、化粧料分野、畜産分野において有用である。