(57)【要約】【課題】基材の形状によらず、煩雑な作業を必要とせずに簡便かつ短時間で作製することができ、タンパク質の非特異的吸着や細胞接着を大幅に抑制することができる生体不活性膜、コーティング液、およびその製造方法ならびに生体不活性処理済基材を提供する。【解決手段】高分子グラフト鎖間で立体反発が生じ、高分子グラフト鎖が伸びた構造となるまでに高密度に高分子グラフト鎖が無機微粒子表面に結合している複数の高分子鎖グラフト微粒子が、互いに架橋剤により架橋されてなることを特徴とする。【選択図】図１
2014043567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子グラフト鎖間で立体反発が生じ、前記高分子グラフト鎖が伸びた構造となるまでに高密度で前記高分子グラフト鎖が無機微粒子表面に結合している複数の高分子鎖グラフト微粒子が、互いに架橋剤により架橋されてなることを特徴とする生体不活性膜。
【請求項２】
前記高分子グラフト鎖のグラフト密度が０．１本鎖／ｎｍ2以上であることを特徴とする請求項１に記載の生体不活性膜。
【請求項３】
前記高分子グラフト鎖が、（メタ）アクリル酸またはその誘導体、（メタ）アクリルアミドまたはその誘導体、およびスチレン誘導体から選ばれる少なくとも１種の原料モノマーをリビングラジカル重合して得られた親水性のポリマー鎖であることを特徴とする請求項１または２に記載の生体不活性膜。
【請求項４】
前記高分子グラフト鎖が、次式（I）：
【化１】
2014043567.tif 000016
（式中、Ｒ1はＣ1〜Ｃ3アルキル基を示し、Ｒ2はＣ1またはＣ2アルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。ｎは３〜１０の整数を示す。）で表わされる重合開始基含有シランカップリング剤を前記無機微粒子に結合させた後、前記高分子グラフト鎖の原料モノマーをリビングラジカル重合して得られたものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の生体不活性膜。
【請求項５】
前記架橋剤が、前記高分子鎖グラフト微粒子と前記生体不活性膜が表面に形成された基材とを架橋していることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の生体不活性膜。
【請求項６】
前記架橋剤が、フェニルアジド基およびピリジンアジド基から選ばれる基を少なくとも２個有する化合物であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の生体不活性膜。
【請求項７】
前記無機微粒子の粒子径が１ｎｍ以上１μｍ以下であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の生体不活性膜。
【請求項８】
前記無機微粒子が、ケイ素酸化物、金属酸化物、金属、および金属硫化物から選ばれるいずれかの材料からなることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の生体不活性膜。
【請求項９】
高分子グラフト鎖間で立体反発が生じ、前記高分子グラフト鎖が伸びた構造となるまでに高密度で前記高分子グラフト鎖が無機微粒子表面に結合している高分子鎖グラフト微粒子、および架橋剤が溶媒中に溶解または分散していることを特徴とするコーティング液。
【請求項１０】
請求項９に記載のコーティング液の製造方法であって、リビングラジカル重合の重合開始基含有シランカップリング剤を表面に結合させた前記無機微粒子、リビングラジカル重合の触媒となる金属錯体、および前記高分子グラフト鎖の原料モノマーを溶媒に溶解または分散させてリビングラジカル重合を行い、沈殿物として前記高分子鎖グラフト微粒子を得る工程と、前記高分子鎖グラフト微粒子および前記架橋剤が室温で溶解または分散可能な良溶媒にこれらを溶解または分散し、前記高分子鎖グラフト微粒子の濃度を１．０〜２０．０質量％の範囲内、前記架橋剤の濃度を０．１〜１０．０質量％の範囲内として、前記コーティング液を調製する工程とを含むことを特徴とするコーティング液の製造方法。
【請求項１１】
請求項９に記載のコーティング液を基材に塗布して塗膜を形成する工程と、前記塗膜に紫外光を照射するか、または前記塗膜を熱処理することにより、前記高分子鎖グラフト微粒子同士を前記架橋剤によって架橋し、生体不活性膜を形成する工程とを含むことを特徴とする生体不活性膜の製造方法。
【請求項１２】
デッピング法、スピンコーティング法、およびキャスティング法から選ばれるいずれかの湿式成膜法で前記コーティング液を前記基材に塗布することを特徴とする請求項１１に記載の生体不活性膜の製造方法。
【請求項１３】
前記架橋剤が、フェニルアジド基およびピリジンアジド基から選ばれる基を少なくとも２個有する化合物であり、前記塗膜に紫外光を照射することにより、前記高分子鎖グラフト微粒子同士を前記架橋剤によって架橋し、生体不活性膜を形成することを特徴とする請求項１１または１２に記載の生体不活性膜の製造方法。
【請求項１４】
アミノ基含有シランカップリング剤で表面処理した金属製の前記基材に前記コーティング液を塗布し、前記基材と前記高分子鎖グラフト微粒子とを前記架橋剤により架橋することを特徴とする請求項１３に記載の生体不活性膜の製造方法。
【請求項１５】
前記塗膜に１００Ｗ以上の紫外光を１０秒以上照射することを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の生体不活性膜の製造方法。
【請求項１６】
前記塗膜を１２０℃以上の温度で１８時間以上熱処理することを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の生体不活性膜の製造方法。
【請求項１７】
細胞培養皿、細胞培養用フラスコ、コンタクトレンズケース、およびカテーテルから選ばれるいずれかの基材の表面に請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体不活性膜が形成されていることを特徴とする生体不活性処理済基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体不活性膜とその製造に使用されるコーティング液、およびその製造方法ならびに生体不活性処理済基材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
水と接触する基材は、一般に、生物学的に誘導された有機種の望ましくない蓄積を受ける傾向があり、それは、タンパク質の吸着、細菌の吸着、そしてそれに続く伝播、または血栓形成によるものである。
【０００３】
このような生物付着は深刻な結果をもたらし得る。例えば、医療分野ではカテーテルを介した細菌感染が生物付着によって生じることがあり、産業界ではフィルタの目詰まり、表面における有機材料の蓄積などの問題を引き起こす。
【０００４】
生物付着の軽減または防止のための一方法として、特許文献１では、複数の高分子鎖グラフト微粒子をジビニル化合物等で架橋した膜が開示されているが、ここでは粒子の表面での単位面積当たりの高分子の数は約０．０３本鎖／ｎｍ2と少ない。
【０００５】
例えば、汎用性ポリマーの一つであるＰＭＭＡではこのような０．０１ｎｍ2以上０．１本鎖／ｎｍ2未満のものは準希薄ポリマーブラシ（Semi-dilute polymer brush）とも呼ばれ、高分子はランダムコイル状（Random coil）、伸びたコイル状（Stretched coil）などの形態をとるが、生物付着の抑制についてはさらに改善の余地があった。
【０００６】
一方、近年では簡便性・汎用性を有する精密重合法として、リビングラジカル重合法が飛躍的な発展をみせ、様々な新材料が容易に合成されるようになった（特許文献２、３）。このリビングラジカル重合法の表面グラフト重合への適用をブレークスルーとして、長さの揃ったポリマーを飛躍的に高い密度でグラフトすることが可能となった。
【０００７】
表面占有率にして約１０％以上にも達するこの高密度ポリマーブラシには、準希薄ポリマーブラシとは全く異なる性質の発現が期待される。これまでに、高密度ポリマーブラシが、（i）伸び切り鎖長に匹敵するほど大きな膨潤膜厚（伸張配向）と高い圧縮抵抗を示すこと、（ii）大きな浸透圧と高度に延伸された分子鎖形態に由来して、溶融状態でも溶媒中でも（一定以上の大きさの分子をブラシ層に取り込まない）明確なサイズ排除効果を示し、さらに、タンパク質など生体関連物質の吸着を抑制しうること、（iii）同種ブラシ間でも相互貫入が起こらず、その結果、膨潤ブラシ間の摩擦係数が極度に低くなることなどが実証された。
【０００８】
例えば、各種の親水性ポリマーの高密度ポリマーブラシを合成し、そのタンパク吸着特性を検討した結果、高密度ポリマーブラシ特有のサイズ排除効果がタンパク質の非特異的吸着を大幅に抑制することや、これらの親水性高密度ポリマーブラシに対するマウス由来Ｌ９２９繊維芽細胞の接着特性を検討した結果、準希薄ブラシに比べて細胞接着を飛躍的に抑制されることなどが明らかにされつつある。
【０００９】
しかしながら、比較的単純な形状の基材の表面に直接にグラフト重合を行い高密度ポリマーブラシを形成した場合については以上のようなタンパク質の非特異的吸着や細胞接着を抑制した結果が得られているが、実用的な材料、例えばカテーテルなどの医療材料の表面への生体不活性膜の付与については未だ実証をともなう十分な検討はされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６／０１６８００号パンフレット
【特許文献２】特開２０１０−２８０５９４号公報
【特許文献３】特許第３４２２４６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記のような実用的な材料の表面に生体不活性膜を付与する場合、リビングラジカル重合により、生体適合性高分子を用いて、高密度に高分子鎖を材料表面にグラフトする方法では、(1)開始基を材料表面へ導入、(2)リビングラジカル重合（真空中または不活性ガス下で加熱処理、重合時間が数十分から数十時間）、(3)洗浄など、時間のかかる数段階の作業が必要であり、大量生産等を考慮すると実用的な点ではさらに改良が求められていた。
【００１２】
特に、医療材料の形状は、平板、繊維、チューブ、円形、球など複雑なもの多いが、開始基の均一な導入やリビングラジカル重合などの作業を行うのは、複雑な形状になるほど難しくなるという問題点があった。
【００１３】
なお、特許文献２には、高分子グラフト鎖間での立体反発により高分子グラフト鎖が伸びた構造となるまでに高密度にした微粒子が開示され、ＤＤＳなどへの使用が検討されているが、架橋剤と反応させて基材に膜を形成することは記載されていない。
【００１４】
本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、基材の形状によらず、煩雑な作業を必要とせずに簡便かつ短時間で作製することができ、タンパク質の非特異的吸着や細胞接着を大幅に抑制することができる生体不活性膜、コーティング液、およびその製造方法ならびに生体不活性処理済基材を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題を解決するために、本発明の生体不活性膜は、高分子グラフト鎖間で立体反発が生じ、前記高分子グラフト鎖が伸びた構造となるまでに高密度で前記高分子グラフト鎖が無機微粒子表面に結合している複数の高分子鎖グラフト微粒子が、互いに架橋剤により架橋されてなることを特徴としている。
【００１６】
この生体不活性膜において、前記高分子グラフト鎖のグラフト密度が０．１本鎖／ｎｍ2以上であることが好ましい。
【００１７】
この生体不活性膜において、前記高分子グラフト鎖が、（メタ）アクリル酸またはその誘導体、（メタ）アクリルアミドまたはその誘導体、およびスチレン誘導体から選ばれる少なくとも１種の原料モノマーをリビングラジカル重合して得られた親水性のポリマー鎖であることが好ましい。
【００１８】
この生体不活性膜において、前記高分子グラフト鎖が、次式（I）：
【００１９】
【化１】
2014043567.tif 000003
【００２０】
（式中、Ｒ1はＣ1〜Ｃ3アルキル基を示し、Ｒ2はＣ1またはＣ2アルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。ｎは３〜１０の整数を示す。）で表わされる重合開始基含有シランカップリング剤を前記無機微粒子に結合させた後、前記高分子グラフト鎖の原料モノマーをリビングラジカル重合して得られたものであることが好ましい。
【００２１】
この生体不活性膜において、前記架橋剤が、前記高分子鎖グラフト微粒子と前記生体不活性膜が表面に形成された基材とを架橋していることが好ましい。
【００２２】
この生体不活性膜において、前記架橋剤が、フェニルアジド基およびピリジンアジド基から選ばれる基を少なくとも２個有する化合物であることが好ましい。
【００２３】
この生体不活性膜において、前記無機微粒子の粒子径が１ｎｍ以上１μｍ以下であることが好ましい。
【００２４】
この生体不活性膜において、前記無機微粒子が、ケイ素酸化物、金属酸化物、金属、および金属硫化物から選ばれるいずれかの材料からなることが好ましい。
【００２５】
本発明のコーティング液は、高分子グラフト鎖間で立体反発が生じ、前記高分子グラフト鎖が伸びた構造となるまでに高密度で前記高分子グラフト鎖が無機微粒子表面に結合している高分子鎖グラフト微粒子、および架橋剤が溶媒中に溶解または分散していることを特徴としている。
【００２６】
本発明のコーティング液の製造方法は、前記のコーティング液の製造方法であって、リビングラジカル重合の重合開始基含有シランカップリング剤を表面に結合させた前記無機微粒子、リビングラジカル重合の触媒となる金属錯体、および前記高分子グラフト鎖の原料モノマーを溶媒に溶解または分散させてリビングラジカル重合を行い、沈殿物として前記高分子鎖グラフト微粒子を得る工程と、前記高分子鎖グラフト微粒子および前記架橋剤が室温で溶解または分散可能な良溶媒にこれらを溶解または分散し、前記高分子鎖グラフト微粒子の濃度を１．０〜２０．０質量％の範囲内、前記架橋剤の濃度を０．１〜１０．０質量％の範囲内として、前記コーティング液を調製する工程とを含むことを特徴としている。
【００２７】
本発明の生体不活性膜の製造方法は、前記のコーティング液を基材に塗布して塗膜を形成する工程と、前記塗膜に紫外光を照射するか、または前記塗膜を熱処理することにより、前記高分子鎖グラフト微粒子同士を前記架橋剤によって架橋し、生体不活性膜を形成する工程とを含むことを特徴としている。
【００２８】
この生体不活性膜の製造方法において、デッピング法、スピンコーティング法、およびキャスティング法から選ばれるいずれかの湿式成膜法で前記コーティング液を前記基材に塗布することが好ましい。
【００２９】
この生体不活性膜の製造方法において、前記架橋剤が、フェニルアジド基およびピリジンアジド基から選ばれる基を少なくとも２個有する化合物であり、前記塗膜に紫外光を照射することにより、前記高分子鎖グラフト微粒子同士を前記架橋剤によって架橋し、生体不活性膜を形成することが好ましい。
【００３０】
この生体不活性膜の製造方法において、アミノ基含有シランカップリング剤で表面処理した金属製の前記基材に前記コーティング液を塗布し、前記基材と前記高分子鎖グラフト微粒子とを前記架橋剤により架橋することが好ましい。
【００３１】
この生体不活性膜の製造方法において、前記塗膜に１００Ｗ以上の紫外光を１０秒以上照射することが好ましい。
【００３２】
この生体不活性膜の製造方法において、前記塗膜を１２０℃以上の温度で１８時間以上熱処理することが好ましい。
【００３３】
本発明の生体不活性処理済基材は、細胞培養皿、細胞培養用フラスコ、コンタクトレンズケース、およびカテーテルから選ばれるいずれかの基材の表面に前記の生体不活性膜が形成されていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の生体不活性膜、コーティング液、およびその製造方法ならびに生体不活性処理済基材によれば、基材の形状によらず、煩雑な作業を必要とせずに簡便かつ短時間で作製することができ、タンパク質の非特異的吸着や細胞接着を大幅に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の生体不活性膜の一例を模式的に示す断面図である。
【図２】実施例で合成したＴＥＧＢＡ（架橋剤）のＮＭＲスペクトルである。
【図３】実施例１（Ｅｎｔｒｙ１）、実施例２（Ｅｎｔｒｙ２）、実施例３（Ｅｎｔｒｙ３）の紫外線照射膜の写真である。
【図４】実施例１（Ｅｎｔｒｙ１）、実施例２（Ｅｎｔｒｙ２）、実施例３（Ｅｎｔｒｙ３）の紫外線照射膜のＡＦＭ像である。
【図５】実施例１（Ｅｎｔｒｙ１）、実施例２（Ｅｎｔｒｙ２）、実施例３（Ｅｎｔｒｙ３）、比較例１（Ｅｎｔｒｙ４）の紫外線照射膜のコーティング表面にヒト血管内皮細胞（１万個／ｃｍ2）を播種し、２４時間経過した後の細胞接着像の写真である。
【図６】実施例１（Ｅｎｔｒｙ１）、実施例２（Ｅｎｔｒｙ２）、実施例３（Ｅｎｔｒｙ３）、比較例１（Ｅｎｔｒｙ４）の紫外線照射膜のコーティング表面にヒト血管内皮細胞（１万個／ｃｍ2）を播種し、２４時間経過した後の各コーティング表面への細胞接着数を示すグラフである。
【図７】実施例２（Ｅｎｔｒｙ２）のサンプルを用い、ウシ由来血清（ＦＢＳ）中に含まれる共雑タンパクの吸着量を水晶振動子により測定した結果を示すグラフである。
【図８】実施例４（Ｅｎｔｒｙ５，６）の紫外線照射膜の写真である。
【図９】実施例４（Ｅｎｔｒｙ５，６）の紫外線照射膜のＡＦＭ像である。
【図１０】実施例５（Ｅｎｔｒｙ７，８）の紫外線照射膜の写真である。
【図１１】実施例５（Ｅｎｔｒｙ７，８）の紫外線照射膜のＡＦＭ像である。
【図１２】実施例６（Ｅｎｔｒｙ１２）の各サンプルについて細胞増殖（生存）能力分析キット（ＷＳＴ−１）を用いて細胞生存率の評価を行った結果を示すグラフである。
【図１３】実施例７（Ｅｎｔｒｙ１３、架橋剤濃度０．５ｗｔ％）のＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰをＦＥＰフィルム上にコーティングし、紫外線照射による硬化前後でコーティング膜のＦＴ−ＩＲ測定を行った結果を示す。
【図１４】実施例７（Ｅｎｔｒｙ１４、架橋剤濃度１ｗｔ％）のＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰをＦＥＰフィルム上にコーティングし、紫外線照射による硬化前後でコーティング膜のＦＴ−ＩＲ測定を行った結果を示す。
【図１５】実施例７（Ｅｎｔｒｙ１５、架橋剤濃度２．５ｗｔ％）のＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰをＦＥＰフィルム上にコーティングし、紫外線照射による硬化前後でコーティング膜のFT-IR測定を行った結果を示す。
【図１６】実施例７（Ｅｎｔｒｙ１６、架橋剤濃度５ｗｔ％）のＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰをＦＥＰフィルム上にコーティングし、紫外線照射による硬化前後でコーティング膜のFT-IR測定を行った結果を示す。
【図１７】実施例８（Ｅｎｔｒｙ １７，２３，２６）の紫外線照射膜のＡＦＭ像である。
【図１８】実施例８の各サンプルに対してヒト血管内皮細胞（１万個／ｃｍ2）を播種し、２４時間経過した後の各コーティング表面への細胞接着数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００３７】
本発明において、「高分子グラフト鎖」とは、無機微粒子表面から重合反応によって原料モノマーを２個以上伸長して形成されたポリマー鎖を意味する。
【００３８】
また、「高密度」とは、グラフト鎖間で立体反発が生じる程度までグラフト鎖が密集した場合のグラフト鎖の密度を意味し、この場合、グラフト鎖は、表面に垂直な方向にほぼ伸びきった形態をとる。
【００３９】
また、「結合」とは、一般的な化学反応により形成される結合を意味し、例えば、共有結合、イオン結合等が挙げられる。
【００４０】
本発明において、「生体不活性膜」とは、次のような点から把握される。親水性のポリマー（生体適合性ポリマー）は、リビングラジカル重合で高密度ポリマーブラシにすると、タンパク質の非特異的吸着や細胞接着を抑制することが報告されており、高密度ポリマーブラシの構造と化学組成がタンパク質の非特異的吸着や細胞接着に与える影響について各種の検討がされている（レビュー： (a) Senaratne, W., Andruzzi, L., and Ober, C. K. 2005. Self-assembled monolayers and polymer brushes in biotechnology: Current applications and futre perspectives. Biomacromolecules6: 2427. (b) Fristrup, C. J., Jankova, K., and Hvilsted, S. 2009. Surface-initiated atom transfer radical polymerization-a technique to develop biofunctional coatings. Soft Matter5: 4623.  論文：(a) Yoshikawa, C., Goto, A., Tsujii, Y., Fukuda, T., Kimura, T., Yamamoto, K., and Kishida, A. 2006. Protein repellency of well-defined, concentrated poly(2-hydroxyethyl methacrylate) brushes by the size-exclusion effect.  Macromolecules 39: 2284. (b) Yoshikawa, C., Goto, A., Ishizuka, N., Nakanishi, K., Kishida, A., Tsujii, Y., and Fukuda, T. 2007. Size-Exclusion Effect and Protein Repellency of Concentrated Polymer Brushes Prepared by Surface-initiated Living Radical Polymerization. Macromol. Symp. 248: 189. (c) C. Yoshikawa, Y. Hashimoto, S. Hattori, T. Honda, K. Zhang, D. Terada, A. Kishida, Y.Tsujii, H. Kobayashi, Suppression of Cell Adhesion on Well-defined Concentrated PolymerBrushes of Hydrophilic Polymers. Chem. Letters, 2010, 39, 142-143.  (d) Feng, W., Brash, J. L., and Zhu, S. 2006. Non-biofouling materials prepared by atom transfer radical polymerization grafting of 2-methacryloloxyethyl phosphorylcholine: Separate effect of graft density and chain length on protein repulsion. Biomaterials27: 847. (e) Iwata, R., Suk-In, P., Hoven, V. P., Takahara, A., Akiyoshi, K., and Iwasaki, Y. 2004. Control of nanobiointerfaces generated from well-defined biomimetic polymer brush for protein and cell manipulations. Biomacromolecules 5: 2308. (f) Mei, Y., Elliott, J. T., Smith, J. R., Langenbach, K. J., Wu, T., Xu, C., Beers, K. L., Amis, E. J., and Henderson, L. 2006. Gradient substrate assembly for quantifying cellular response to biomaterials. J. Biomed. Mater. Res. 79A(4): 974.）。このような従来における検討結果から生体不活性膜として把握される範囲は当業者であれば明らかであろう。
【００４１】
図１は、本発明の生体不活性膜の一例を模式的に示す断面図である。なお、図１の架橋態様はあくまでも例示であって、実際の架橋態様はこの図に限定されるものではない。
【００４２】
本発明の生体不活性膜３１は、高分子グラフト鎖２３が無機微粒子２２表面に結合している複数の高分子鎖グラフト微粒子２１が、互いに架橋剤２５で架橋されている。
【００４３】
高分子鎖グラフト微粒子２１は、高分子グラフト鎖２３間で立体反発が生じ、高分子グラフト鎖２３が伸びた構造となるまでに高密度で高分子グラフト鎖２３が無機微粒子２２表面に結合している。
【００４４】
生体不活性膜３１は、基材４１の表面に形成され、高分子鎖グラフト微粒子２１は、架橋剤２５で基材４１の表面とも架橋されている。
【００４５】
特許文献１では、複数の高分子鎖グラフト微粒子がジビニル化合物等で架橋された膜が開示されているが、ここでは粒子の表面での単位面積当たりの高分子の数は約０．０３本鎖／ｎｍ2と少ない。このような準希薄ポリマーブラシ（Semidilute polymer brush）では、高分子はランダムコイル状（Random coil）、伸びたコイル状（Stretched coil）などの形態をとる。これに対して本発明で使用されるような高密度ポリマーブラシは、高分子グラフト鎖間での立体反発により高分子グラフト鎖が伸長した形態をとっており、そのタンパク質の非特異的吸着や細胞接着に対するサイズ排除特性は特許文献１の技術とは全く異なるものである。
【００４６】
すなわち、高分子鎖グラフト微粒子と架橋剤の使用によって、基材の形状によらず、煩雑な作業を必要とせずに簡便かつ短時間で作製することができ、かつ、高密度ポリマーブラシに起因してタンパク質の非特異的吸着や細胞接着を大幅に抑制することができる生体不活性膜を、実施例に開示したような実験事実に基づいて初めて見出し本発明を完成するに至ったものである。
【００４７】
高分子グラフト鎖のグラフト密度は、０．１本鎖／ｎｍ2が好ましく、０．１〜１．２本鎖／ｎｍ2がより好ましく、０．３〜１．２本鎖／ｎｍ2がより好ましい。このグラフト密度を制御することにより、タンパク質の非特異的吸着や細胞接着を抑制することができる。
【００４８】
本発明において、「グラフト密度」または「密度」とは、微粒子表面の単位面積（ｎｍ2）あたりの表面に結合したグラフト鎖の本数を意味する。グラフト密度（σ）は、元素分析により微粒子表面から伸長して形成された高分子グラフト鎖の量（グラフト量、ｗ）を求め、その値とコア微粒子の表面積（Ｓ、ｎｍ2）、グラフトポリマーまたはフリーポリマーの数平均分子量Ｍｎならびにアボガドロ数（Ａｖ）を用いて以下のようにして算出される。
算出方法：σ＝（ｗ／Ｍｎ）Ａｖ／Ｓ
高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）は、２，０００〜１００，０００が好ましい。また、高分子グラフト鎖の重合度は、例えば１０〜１０，０００である。また、高分子グラフト鎖の分子量分布は、均質なグラフト表面を有する点を考慮すると、１〜１．５が好ましく、１〜１．３がより好ましい。
【００４９】
高分子グラフト鎖は、例えば、無機微粒子表面上の重合開始基を基点とした原料モノマーのリビングラジカル重合によって得ることができる。
【００５０】
リビングラジカル重合としては、原始移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、窒素酸化物系リビングラジカル重合（ＮＭＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合などが知られているが、本発明では目的に応じていずれの方法を用いてもよい。
【００５１】
原料モノマーの種類としては、高分子グラフト鎖が親水性のポリマー鎖となり、かつ生体適合性を有するモノマーであれば、特に限定されず、当業者の認識する範囲で適宜に選択することができる。
【００５２】
ここで「親水性」とは、高密度ポリマーブラシの構造と化学組成がタンパク質の非特異的吸着や細胞接着に与える影響についての各種の検討（上記の文献を参照）より当業者の認識する範囲内のものであって、特に限定されないが、１つの例としては、生体不活性膜の静水接触角が好ましくは５０°未満、より好ましくは４０°未満、さらに好ましくは３０°未満となり得る範囲内である。
【００５３】
原料モノマーの種類としては、例えば、（メタ）アクリル酸またはその誘導体、（メタ）アクリルアミドまたはその誘導体、およびスチレン誘導体などを用いることができる。
【００５４】
なお、本明細書において「（メタ）アクリル」とは「アクリル」および「メタクリル」を意味する。
【００５５】
好ましい例は、ＣＨ2＝ＣＲaＣＯＯＲbで表わされるアクリル酸誘導体またはメタクリル酸誘導体を含む。ここでＲaは水素原子またはメチル基を示し、Ｒbは、次の群から選ばれるいずれかを示す：
・アルカリ金属
・少なくともオキシエチレン単位を含むＣ6〜Ｃ30の親水性基
・少なくとも水酸基を含むＣ2〜Ｃ20の親水性基
・少なくともエーテル酸素を含むＣ3〜Ｃ20の親水性基
・少なくとも１級アミノ基、２級アミノ基、または３級アミノ基を含むＣ3〜Ｃ20の親水性基
・−ＳＯ3−、−ＰＯ4−−、および−ＣＯＯ−から選ばれるいずれかのアニオン基と４級アンモニウムカチオンとの内部塩構造を有するＣ6〜Ｃ20の親水性基
高分子グラフト鎖は１つのモノマー種（ホモポリマー）を含んでもよいし、またはランダムに、もしくは規則的なブロックで配列された複数の種（コポリマー）を含んでもよい。
【００５６】
高分子鎖グラフト微粒子の無機微粒子は、例えばシリカ等のケイ素酸化物；金属；金属酸化物；金属硫化物等が挙げられる。前記金属としては、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ等の貴金属；Ｔｉ、Ｚｒ、Ｔａ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｖ、Ｓｂ、Ｉｎ、Ｈｆ、Ｙ、Ｃｅ、Ｓｃ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｆｅ等の遷移金属等が挙げられる。
【００５７】
無機微粒子の粒子径は、１ｎｍ以上５μｍ以下が好ましく、１ｎｍ以上１μｍ以下がより好ましい。この無機微粒子の粒子径を制御することにより、緻密な粒子膜が形成され、タンパク質の非特異的吸着や細胞接着を抑制することができる。
【００５８】
無機微粒子の粒子径は、１種類であっても２種類以上の混合であってもよい。無機微粒子の粒径が１種類である場合、高分子鎖グラフト微粒子の大きさが均一となり、緻密な塗膜を形成できる。
【００５９】
高分子鎖グラフト微粒子は、例えば以下のようにして製造することができる。まず、重合開始基含有カップリング剤としての化合物を、化学吸着法により無機微粒子表面に固定する。
【００６０】
そして、１種類以上の原料モノマーを供給してリビングラジカル重合を行う。
【００６１】
重合開始基含有カップリング剤を予め無機微粒子表面に固定することにより、無機微粒子表面上でグラフト密度を一定に保持しつつグラフト重合を進行させることができる。つまり、グラフト量はグラフト鎖のＭｎ（数平均分子量）に比例して増大させることができ、重合をリビング的に進行させ、微粒子表面上のほぼすべてのグラフト鎖をほぼ均等に成長させることができる。
【００６２】
無機微粒子表面のグラフト密度は、重合開始基含有カップリング剤と重合開始基を含有しないカップリング剤との割合を調製することで、変更することができる。具体的には、無機微粒子がケイ素酸化物の粒子である場合、重合開始基含有カップリング剤と重合開始基を含有しないカップリング剤との割合が１：０であれば、グラフト密度は０．１本鎖／ｎｍ２以上である。
【００６３】
重合開始基含有カップリング剤としての化合物は、微粒子との親和性等を考慮して選択することができる。
【００６４】
無機微粒子がケイ素酸化物、金属酸化物、または金属硫化物の粒子である場合、その重合開始基含有カップリング剤としては、前記の式（I）に示す重合開始基含有カップリング剤が好ましい。
【００６５】
式（I）中、Ｒ1はＣ1〜Ｃ3アルキル基、好ましくはＣ1またはＣ2アルキル基を示し、Ｒ2はＣ1またはＣ2アルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子、好ましくは臭素原子または塩素原子を示す。ｎは３〜１０の整数を示す。
【００６６】
式（I）で表わされる化合物としては、（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＢＰＥ）、（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシヘキシルトリエトキシシラン（ＢＨＥ）などが挙げられる。
【００６７】
その他、例えば微粒子が金や銀、白金などの金属である場合、その重合開始基含有カップリング剤としては、例えば、ジスルフィド化合物などを用いるこが好ましい。ジスルフィド化合物としては、例えば、次式（II）で表わされる化合物を用いることができる。
【００６８】
【化２】
2014043567.tif 000004
【００６９】
高分子鎖グラフト微粒子は、リビングラジカル重合の重合開始基含有シランカップリング剤を表面に結合させた無機微粒子、リビングラジカル重合の触媒となる金属錯体、および高分子グラフト鎖の原料モノマーを溶媒に溶解または分散させてリビングラジカル重合を行い、沈殿物として得ることができる。
【００７０】
このようなリビングラジカル重合の詳細や使用する触媒などは当業者であれば適宜に選択し得るであろう。
【００７１】
リビングラジカル重合の終了後、目的とする高分子鎖グラフト微粒子は、反応液から当該分野で通常用いられる方法、例えば抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈殿、ろ過、乾燥、吸着、析出、クロマトグラフィーなどの方法を単独または組み合わせることにより、単離することができる。
【００７２】
本発明の生体不活性膜は、以上に説明したような高分子鎖グラフト微粒子と、架橋剤とを溶解または分散させたコーティング液を用いて調製することができる。
【００７３】
このコーティング液を調製する際には、まず、例えばリビングラジカル重合の重合開始基含有シランカップリング剤を表面に結合させた無機微粒子、リビングラジカル重合の触媒となる金属錯体、および高分子グラフト鎖の原料モノマーを溶媒に溶解または分散させてリビングラジカル重合を行い、沈殿物として前記高分子鎖グラフト微粒子を得る。その後、高分子鎖グラフト微粒子および架橋剤が室温で溶解または分散可能な良溶媒にこれらを溶解または分散し、高分子鎖グラフト微粒子の濃度を１．０〜２０．０質量％の範囲内、架橋剤の濃度を０．１〜１０．０質量％の範囲内として、コーティング液を調製することができる。
【００７４】
高分子鎖グラフト微粒子および架橋剤が室温で溶解または分散可能な良溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、クロロフェノール、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、ジクロロメタン、ジエチルアセテート、ジエチルケトン、炭酸ジメチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、ｍ−クレゾール、モノ−およびジ−アルキル置換グリコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジエチルエーテル、ｐ−クロロフェノール、１，２−プロパンジオール、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−ヘキサノン、２−メトキシエタノール、２−メチル−２−プロパノール、２−オクタノン、２−プロパノール、３−ペンタノン、４−メチル−２−ペンタノン、ヘキサフルオロイソプロパノール、メタノール、酢酸メチル、アセト酢酸メチル、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、ｎ−メチルピロリドン−２、酢酸ｎ−ペンチル、フェノール、テトラフルオロ−ｎ−プロパノール、テトラフルオロイソプロパノール、テトラヒドロフラン、トルエン、キシレン、水などが挙げられる。これらは１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７５】
本発明のコーティング液は、例えば、湿式成膜法として既に知られている方法によって基材に塗布することができる。例えば、デッピング法、スピンコーティング法、キャスティング法などを用いることができる。
【００７６】
このコーティング液は、基材の全体をコーティングすることもできるし、部分的にコーティングすることもできる。例えば、フォトリソグラフィによって、コーティングを部分的に架橋させ、未架橋部分を除去することも可能である。
【００７７】
本発明の生体不活性膜は、コーティング液を基材に塗布して塗膜を形成し、次いで高分子鎖グラフト微粒子同士を架橋剤によって架橋することで形成することができる。
【００７８】
架橋を開始させる方法としては、例えば、電子ビーム放射線、電磁放射線（紫外光（ＵＶ）、可視光および近赤外）、熱、および湿気硬化性化合物が使用される場合の湿気の添加などが挙げられる。
【００７９】
好ましい実施形態においては、架橋は紫外光の照射または熱によって行われる。この場合、架橋剤としては、例えば、フェニルアジド基およびピリジンアジド基から選ばれる基を少なくとも２個有する化合物を用いることができる。
【００８０】
フェニルアジド基およびピリジンアジド基から選ばれる基を少なくとも２個有する化合物としては、直鎖状の分子量２００〜１０００の範囲内のものが好ましいものとして例示される。
【００８１】
このような化合物としては、例えば、オキシエチレン単位を２〜６個有するポリエチレングリコールビスアジドベンゾエートを挙げることができる。このうち、トリエチレングリコールビスアジドベンゾエート（ＴＥＧＢＡ）は次の構造を有する。
【００８２】
【化３】
2014043567.tif 000005
【００８３】
上記のような架橋剤は、紫外光の照射または熱によって、高分子グラフト鎖に結合する。すなわち、コーティングした塗膜に紫外光を照射するか、またはコーティングした塗膜を加熱（熱処理）することにより、高分子鎖グラフト微粒子同士を前記の架橋剤によって架橋し、生体不活性膜を形成することができる。
【００８４】
このときの紫外光照射の条件としては、塗膜に１００Ｗ以上の紫外光を１０秒以上照射することが好ましい。
【００８５】
本発明ではあらかじめ生体不活性なグラフト表面をもつ高分子鎖グラフト微粒子を用意してあるので、それ含む溶液をコートし、単純な架橋反応（例えば、紫外線照射を３０秒行う）だけで、簡便に生体不活性膜を作製することができる。そして紫外線照射によれば短時間で生体不活性膜を作製することができる。
【００８６】
また、生体不活性膜を熱処理によって形成する場合には、熱処理の条件としては、塗膜を１２０℃以上で１８時間以上熱処理することが好ましい。
【００８７】
このフェニルアジド基およびピリジンアジド基から選ばれる基を少なくとも２個有する化合物を架橋剤として用いた場合、この架橋剤のアジド基が基材表面と反応して結合し、基材と高分子鎖グラフト微粒子とを架橋剤により架橋することもできる。例えば、基材表面にアルキル基、アミノ基、水酸基などがある場合には、この架橋剤と基材表面との架橋反応が進行する。
【００８８】
さらに、架橋部となるフェニルアジド基は、一般に医療材料として用いられる多くの汎用ポリマー材料（ＰＰ、ＰＥ、ＰＥＴ、ＰＭＭＡ、ＰＳ、ＰＵ、セルロースなど）やガラス材料（−ＯＨ基）と反応することが知られており（Langmuir 1991, 7, 2010-2012  Biomacromolecules 2007, 8, 679-685  Macromolecules 1994,27, 7809-7814  Langmuir 1996,11, 2267-2271  Chemical Reviews, Volume 88, Number 2, March/April, 1988）、材料（材質）によらずほとんどの基材において架橋をすることができる。
【００８９】
また、金属製の基材を用いた場合、あらかじめ金属製の基材をアミノ基含有シランカップリング剤またはアルキル基含有シランカップリング剤で表面処理し、この表面処理した金属製の基材に、前記のフェニルアジド基およびピリジンアジド基から選ばれる基を少なくとも２個有する化合物を架橋剤として用いたコーティング液を塗布することで、基材と高分子鎖グラフト微粒子とを架橋剤により架橋することができる。
【００９０】
アミノ基含有シランカップリング剤としては、例えば、次式（III）で表わされる化合物を用いることができる。
【００９１】
【化４】
2014043567.tif 000006
【００９２】
式中、Ｒ1はＣ1〜Ｃ3アルキル基、好ましくはＣ1またはＣ2アルキル基を示し、Ｒ2はＣ1またはＣ2アルキル基を示す。ｎは３〜１０の整数を示す。
【００９３】
式（III）で表わされる化合物としては、ＡＭＰ（３−アミノプロピルトリメトキシシラン）などが挙げられる。
【００９４】
アルキル基含有シランカップリング剤としては、例えば、上記式（III）のＳｉに結合したアミノアルキル基をアルキル基、好ましくは炭素数１〜８の直鎖のアルキル基に置換したものを用いることができる。
【００９５】
本発明の生体不活性膜は、任意の適切な厚さで調製することができる。通常、５０ｎｍ〜数十マイクロメートルの間の範囲の厚さを有する。好ましくは、コーティングの厚さは、５０ｎｍ〜１０００ｎｍである。
【００９６】
本発明の生体不活性膜が適用される基材としては、特に限定されないが、例えば、平坦または湾曲、剛性または可撓性の基材を用いることができ、各種の金属性基材、樹脂製基材、ガラス製基材などを用いることができる。
【００９７】
本発明の生体不活性膜を表面に形成した生体不活性処理済基材として、例えば、細胞培養皿、細胞培養用フラスコ、コンタクトレンズケース、カテーテル、インプラント、ステント、生体サンプル（例えば、血液）採取管、マイクロタイタープレート、微小流体デバイス、バイオセンサー、マイクロチューブ、ＰＣＲ管、分離フィルタ、ピペットチップなどを挙げることができる。中でも、細胞培養皿、細胞培養用フラスコ、コンタクトレンズケース、カテーテルなどに好適である。
【実施例】
【００９８】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１：Ｅｎｔｒｙ１）
[サンプル作製]
１．高分子鎖グラフト微粒子の作製
重合開始基含有シランカップリング剤（２−ブロモ−２メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＢＰＥ）の合成
【００９９】
【化５】
2014043567.tif 000007
【０１００】
（１）ＢＰＥの合成
２段階反応により行った。第１段階として、アリルアルコール（４２ｇ）、トリエチルアミン（８８ｇ）およびテトラハイドロフラン（ＴＨＦ）（１Ｌ）の混合溶液を氷冷し、その中へ２−ブロモイソブチリルブロマイド（１００ｇ）を滴下した。
【０１０１】
その後、反応液を０℃で３時間攪拌し、さらに室温で１０時間攪拌した。反応液を濃縮し、ＴＨＦを加え、塩を析出させ、濾過し、濾液を濃縮した後、得られたものをクロロホルム（１Ｌ）により希釈し、それを１Ｎ塩酸水溶液（３×５００ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３×５００ｍｌ）、純水（３×５００ｍｌ）の順で洗浄した。
【０１０２】
有機相を乾燥し、濃縮後、減圧蒸留により精製し、１−（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシ−２−プロペン（ＢＰＰ）を収率５０％で得た。
【０１０３】
第２段階として、フラスコの中へＢＰＰ（３４ｇ）、トリエトキシシラン（８１．５ｇ）、トルエン（１７０ｍｌ）およびカルステッド触媒（５００μＬ）を順次入れ、その混合液をアルゴン雰囲気下、室温で１２時間攪拌した。
【０１０４】
反応後減圧蒸留により精製し、ＢＰＥを収率２０％で合成した。
（２）シリカ微粒子への開始基の導入
＜シリカ微粒子へのＢＰＥ固定化＞
シリカ微粒子として、平均粒径１３０ｎｍのシリカ微粒子（日本触媒（株）製、製品名「シーホスター（登録商標）ＫＥ−Ｅ１０」（平均粒径１３０ｎｍ）を用いた。
【０１０５】
シリカ微粒子のエタノール分散液（７．７ｗｔ％，３０ｍＬ）を２８％アンモニア水溶液（１３．９ｇ）とエタノール（２００ｍＬ）の混合液中へ加えた。
【０１０６】
その混合液を室温で２時間攪拌した後、エタノール（１０ｍＬ）に溶解したＢＰＥ（２ｇ）を滴下し、室温で１８時間攪拌した。
【０１０７】
その後、シリカ微粒子を遠心分離機により回収し、エタノールにより洗浄した後、開始基を有するシリカ微粒子を得た。
【０１０８】
この開始基を有するシリカ微粒子は、エタノール中で保存した。
（３）シリカ微粒子を用いたリビングラジカル重合
開始基を有するシリカ微粒子（２００ｍｇ）、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル  メタクリレート（ＰＥＧＭＡ、オキシエチレン単位の数：８〜９個）（５．０ｇ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（７．６ｍｇ）、２、２−ビピリジン（１６．４ｍｇ）およびエチル２−ブロモイソブチレート（ＥＢＩＢ）（７．３ｍｇ）のメタノール（５ｇ）溶液をグローブボックス中でパイレックス（登録商標）製ガラス管に入れた後、３０℃で３時間重合して、高分子グラフト鎖がシリカ微粒子表面に結合した複合粒子を得た。
【０１０９】
複合粒子の精製は、遠心分離とメタノールへの再分散を繰り返すことにより行った。
【０１１０】
高分子グラフト鎖におけるモノマー転化率は、ＮＭＲにより求めた。
【０１１１】
また、ＥＢＩＢから生成する遊離ポリマー(ＰＰＥＧＭＡ)の分子量および分子量分布は、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により求めた。
【０１１２】
熱重量分析（ＴＧ−ＤＴＡ）により求めたグラフト量と遊離ポリマーの分子量から、グラフト密度を算出し、全てのサンプルにおいて、０．２鎖／ｎｍ2以上の高いグラフト密度を有していることを確認した。
【０１１３】
なお、ここで用いた重合条件、重合結果を表１にまとめた。
【０１１４】
【表１】
2014043567.tif 000008
【０１１５】
２．架橋剤（トリエチレングリコールビスアジドベンゾエート：ＴＥＧＢＡ）の合成
まず、４−アジドベンゾイックアシッド（３．０ｇ）、トリエチレングリコール（１．９ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（０．２６ｇ）をジクロロメタン６０ｍｌに溶解させた。
【０１１６】
これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド）（６．０４ｇ）を加え、１９時間撹拌したのち、さらに０．１Ｍ塩酸（２００ｍｌ）を加え、１５分撹拌した。
【０１１７】
次に、これを水層と有機層を分離した後、有機層を純水（２００ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）、純水（２００ｍｌ）で洗浄した。
【０１１８】
有機層は濃縮し、ＴＥＧＢＡを収率７４％で得た。
【０１１９】
このＴＥＧＢＡ（架橋剤）のＮＭＲスペクトル（図２）を調べ、分子構造を確認した。
【０１２０】
下記に示す反応による。
【０１２１】
【化６】
2014043567.tif 000009
【０１２２】
３．微粒子を用いたコーティング液の調製
ＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰｓの濃度を２．０〜９．０ｗｔ％、ＴＥＧＢＡの濃度を０．５ｗｔ％として、高分子鎖グラフト微粒子、ＴＥＧＢＡを含むトルエン溶液を作製した（実施例１のコーティング液）。
４．コーティング
スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ，ＭＳ−Ａ１００）を使用し、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＭＰ）を修飾されたシリコン基板上に、上記のコーティング液を１５００回転３０秒の条件でコートし、実施例１のコーティング塗布膜を形成した。
５．コーティング液塗布膜への紫外線照射
紫外線ランプ（アズワン、ハンディータイプＵＶ硬化装置）を用い、実施例１のコーティング塗布膜のコーティング表面に１００Ｗで、３０秒紫外線を照射して、実施例１の紫外線照射膜を形成した。
【０１２３】
照射後、コーティングはトルエンまたはクロロホルムなどの良溶媒を用い、超音波洗浄した。
【０１２４】
なお、紫外線照射しない場合、超音波洗浄により、実施例１のコーティング塗布膜はシリコン基板から剥がれることを確認している。
（実施例２：Ｅｎｔｒｙ２）
ＰＰＥＥＧＭＡグラフトシリカ微粒子（ＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰｓ）の濃度を５．０ｗｔ％とした以外は、実施例１と同様にして、実施例２のコーティング液を作製した。
【０１２５】
実施例２のコーティング液を用いた以外は、実施例１と同様にして、実施例２のコーティング塗布膜を形成し、実施例２の紫外線照射膜を形成した。
（実施例３：Ｅｎｔｒｙ３）
ＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰｓの濃度を９．０ｗｔ％とした以外は、実施例１と同様にして、実施例３のコーティング液を作製した。
【０１２６】
実施例３のコーティング液を用いた以外は、実施例１と同様にして、実施例３のコーティング塗布膜を形成し、実施例３の紫外線照射膜を形成した。
[実施例１〜３のサンプル評価]
６．写真、ＡＦＭ像評価
図３は、実施例１（Ｅｎｔｒｙ１）、実施例２（Ｅｎｔｒｙ２）、実施例３（Ｅｎｔｒｙ３）の紫外線照射膜の写真であり、図４はＡＦＭ像である。均一な膜が、シリコン基板から剥がれることなく形成された。
７．細胞接着評価
実施例１（Ｅｎｔｒｙ１）、実施例２（Ｅｎｔｒｙ２）、実施例３（Ｅｎｔｒｙ３）、比較例１（Ｅｎｔｒｙ４）の膜のコーティング表面へ、ヒト血管内皮細胞（１万個／ｃｍ2）を播種した。なお比較例１（Ｅｎｔｒｙ４）は、ＴＥＧＢＡのみを含有するコーティング液を使用した。
【０１２７】
２４時間後の細胞接着像を図５（HUVEC adhesion test on the VS-like coatingの写真）に、各コーティング表面への細胞接着数を図６に示す（図６の縦軸は細胞播種数で標準化したものである）。複合微粒子を含むコーティング表面には細胞がほとんど接着しないことが確認された。比較例１との対比からも、ＰＰＥＧＭＡ-ＳｉＰｓが存在することで細胞接着が大幅に抑制されたといえる。
【０１２８】
表２に、実施例１〜３のコーティング組成物とHUVEC adhesionテスト結果を示す。
【０１２９】
【表２】
2014043567.tif 000010
【０１３０】
８．タンパク吸着評価
実施例２（Ｅｎｔｒｙ２）のサンプルを用い、ウシ由来血清（ＦＢＳ）中に含まれる共雑タンパクの吸着について水晶振動子測定により調べた。
【０１３１】
希釈しないＦＢＳを用い、１時間の吸着量を調べた結果を図７（ウシ由来血清タンパク（ＦＢＳ）の吸着測定）に示す。１時間後リン酸バッファーで洗浄するとベースラインが元の位置に戻ることから、吸着量はほぼ０ｎｇ／ｃｍ2であり、タンパク吸着を阻害することが確認された。
（実施例４：Ｅｎｔｒｙ５，６）
９．ポリマー基材へのコーティング膜作成
実施例２と同じコーティング液を用いて、ＰＥＴフィルム、ＦＥＰフィルムへコーティング塗布膜を作成し、同様に紫外線照射膜を形成した（Ｅｎｔｒｙ５，６：表３参照）。写真を図８に、ＡＦＭ像を図９に示す。シリコン基板上と同様に、ポリマーフィルム上でもコーティング膜が得られた。
【０１３２】
【表３】
2014043567.tif 000011
【０１３３】
（実施例５：Ｅｎｔｒｙ７，８）
１０．コーティング液塗布膜の加熱処理膜
ＡＭＰ固定化シリコン基板および未処理のシリコン基板上に、実施例２と同じコーティング液を用いて、コーティング塗布膜を作成し、１２０℃で２０時間加熱し、熱処理膜を作成した（Ｅｎｔｒｙ７，８：表４参照）。
【０１３４】
熱処理膜は室温に戻した後、トルエンまたはクロロホルムなどの良溶媒を用い、超音波洗浄した。光学写真を図１０に、ＡＦＭ像を図１１に示す。
【０１３５】
【表４】
2014043567.tif 000012
【０１３６】
（実施例６：Ｅｎｔｒｙ１２）
１１．細胞毒性評価（溶出試験）
未反応の架橋剤が存在する場合、細胞培養中に架橋剤が溶出し、細胞に影響（毒性）を与える可能性がある。そこで、以下の溶出試験を行った。
【０１３７】
まず、表５に示すサンプルをシリコン基板上に作成した。それらのサンプルを２４ウェルプレートに並べ、血清培地を1ml加え、インキュベーターで２４時間静置した。９６ウェルプレートにヒト血管内皮細胞（１．５×１０4個／ウェル）を準備し（前培養）、サンプルを浸漬しておいた血清培地を各５０μｌずつ９６ウェルの細胞へ添加し、２４時間培養した。
【０１３８】
その後、細胞増殖（生存）能力分析キット、ＷＳＴ−１（タカラバイオ）を用いて細胞生存率の評価を行った。図１２に結果を示す。縦軸の吸光度は生細胞の割合を示しており、いずれのサンプルもシリコン基板上の吸光度（生存率）とほぼ同じであった。このことから、未反応の架橋剤はほとんどない、あるいは溶出したとしても細胞に影響を与えないと考えられる。
【０１３９】
【表５】
2014043567.tif 000013
【０１４０】
（実施例７：Ｅｎｔｒｙ１３，１４，１５，１６）
１２．UVによる架橋反応の確認
架橋剤の紫外線による架橋度を調べるために、架橋剤の濃度を変えてPPEGMA-SiPをFEPフィルム上にコーティングした（表６）。紫外線照射による硬化前後でコーティング膜のFT-IR測定を行った（図１３〜図１６）。架橋剤の濃度によらず、紫外線照射後はアジド基のピークがほぼ消失しており、紫外線照射によりほぼすべてのアジド基が架橋反応に消費されていることがわかる。
【０１４１】
【表６】
2014043567.tif 000014
【０１４２】
（実施例８：Ｅｎｔｒｙ１７〜３１）
１３．各種ポリマーフィルムへのコーティング
各種ポリマーフィルムに対し、表７に示す組成物濃度でコーティングを行い、ＵＶ照射または加熱処理による架橋を行った。ＵＶ照射条件は１００Ｗで３０秒間、加熱処理条件は１２０度１８０時間とした。各架橋処理後、サンプルはトルエン、クロロホルム、エタノールなど有機溶媒を用いて超音波洗浄した。
【０１４３】
【表７】
2014043567.tif 000015
【０１４４】
一例として、Ｅｎｔｒｙ１７，２３，２６のＡＦＭ像を図１７に示す（いずれもコーティング条件は同じ）。超音波洗浄後も表面はＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰｓで覆われていることがわかる。
１４．細胞接着
表７のサンプルに対してヒト血管内皮細胞（１万個／ｃｍ2）を播種した。リファレンスとして細胞培養用プラスチックシート（ＴＣＰＳ）（Ｗａｋｏ）を用いた。各コーティング表面への２４時間後の細胞接着数を図１８に示す（図１８の縦軸は細胞播種数で標準化したものである）。図１８より、いずれのポリマー基材表面においても血管内皮細胞はほとんど接着しないことが確認された。
【０１４５】
以上のように、実施例１〜８では、コーティング液塗布膜への紫外線照射または熱処理によって、煩雑な作業を必要とせずに簡便にコーティング膜を作製することができ、特に紫外線照射によって短時間でコーティング膜を作製することができた。そして得られたコーティング膜は、タンパク質の非特異的吸着や細胞接着を大幅に抑制することができ、生体不活性膜として機能した。
【符号の説明】
【０１４６】
２１      高分子鎖グラフト微粒子
２２      無機微粒子
２３      高分子グラフト鎖
２５      架橋剤
３１      生体不活性膜
４１      基材
【図１】
2014043567.tif 000017
【図２】
2014043567.tif 000018
【図３】
2014043567.tif 000019
【図４】
2014043567.tif 000020
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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