(57)【要約】      （修正有）【課題】改善された方法によって、基板材料が、被覆又はコーティングされた医療機器の提供。【解決手段】基板材料と；該基板材料の表面の少なくとも一部に結合したポリマー被覆材料であって、１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIのヘパリンコファクターII結合活性を有する複数の生物活性物質が少なくとも一部に共有結合した該ポリマー被覆材料と；該ポリマー被覆材料に結合した生体適合性組成物と；を含んでいて、該生体適合性組成物がアンチトロンビンIII結合活性を有する医療機器。【選択図】図２０
2014097402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板材料と；
該基板材料の表面の少なくとも一部に結合したポリマー被覆材料であって、ヘパリンコファクターII結合活性を有する複数の生物活性物質が少なくとも一部に共有結合した該ポリマー被覆材料と；
を含んでいて、
該生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである医療機器。
【請求項２】
殺菌後に、上記生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIを有する、請求項１に記載の医療機器。
【請求項３】
圧縮及び延伸の後に、上記生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIを有する、請求項１に記載の医療機器。
【請求項４】
上記複数の生物活性物質が、多糖を含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項５】
上記複数の生物活性物質が、グリコサミノグリカンを含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項６】
上記複数の生物活性物質が、デルマタン二硫酸を含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項７】
上記複数の生物活性物質が、末端が結合したデルマタン二硫酸を含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項８】
上記複数の生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、１平方センチメートル当たり少なくとも１２ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである、請求項１に記載の医療機器。
【請求項９】
上記複数の生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、１平方センチメートル当たり少なくとも２０ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである、請求項１に記載の医療機器。
【請求項１０】
基板材料と；
該基板材料の表面の少なくとも一部に結合したポリマー被覆材料であって、１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIのヘパリンコファクターII結合活性を有する複数の生物活性物質が少なくとも一部に共有結合した該ポリマー被覆材料と；
該ポリマー被覆材料に結合した生体適合性組成物と；
を含んでいて、
該生体適合性組成物がアンチトロンビンIII 結合活性を有する医療機器。
【請求項１１】
上記生体適合性組成物が、上記ポリマー被覆材料と共有結合している、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項１２】
上記生体適合性組成物が、上記ポリマー被覆材料と非共有結合している、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項１３】
上記複数の生物活性物質が、グリコサミノグリカンを含む、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項１４】
上記複数の生物活性物質が、デルマタン二硫酸を含む、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項１５】
上記複数の生物活性物質が、末端が結合したデルマタン二硫酸を含む、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項１６】
約３７℃且つ実質的に中性ｐＨの０．１５Ｍリン酸塩緩衝溶液の中で、上記生体適合性組成物の少なくとも一部が上記医療機器から放出される、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項１７】
上記生体適合性組成物が、有機化合物を含む、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項１８】
上記有機化合物が多糖である、請求項１７に記載の医療機器。
【請求項１９】
上記多糖がグリコサミノグリカンである、請求項１８に記載の医療機器。
【請求項２０】
上記多糖がデキストランである、請求項１７に記載の医療機器。
【請求項２１】
上記多糖が硫酸デキストランである、請求項１８に記載の医療機器。
【請求項２２】
上記生体適合性組成物がポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項２３】
上記生体適合性組成物が抗増殖剤である、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項２４】
上記抗増殖剤がデキサメタゾンである、請求項２３に記載の医療機器。
【請求項２５】
上記生体適合性組成物が、合成した非極性分子を含む、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項２６】
上記生体適合性組成物が無機化合物を含む、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項２７】
上記無機化合物がリン酸塩を含む、請求項２６に記載の医療機器。
【請求項２８】
上記複数の生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、上記基板材料の殺菌の後、基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項２９】
上記複数の生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、上記基板材料の圧縮及び延伸の後に、基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである、請求項１０に記載の医療機器。
【請求項３０】
基板材料と；
該基板材料の表面の少なくとも一部に結合したポリマー被覆材料であって、ヘパリンコファクターII結合活性を有する第一の複数の生物活性物質及びアンチトロンビンIII 結合活性を有する第二の複数の生物活性物質が少なくとも一部に共有結合した該ポリマー被覆材料と；
該ポリマー被覆材料に結合した生体適合性組成物と；
を含んでいて、
該生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIであり、且つ１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のアンチトロンビンIII である医療機器。
【請求項３１】
上記生体適合性組成物が、上記ポリマー被覆材料と共有結合している、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項３２】
上記生体適合性組成物が、上記ポリマー被覆材料と非共有結合している、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項３３】
上記第一の複数の生物活性物質が、グリコサミノグリカンを含む、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項３４】
上記第一の複数の生物活性物質が、デルマタン二硫酸を含む、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項３５】
上記第一の複数の生物活性物質が、末端が結合したデルマタン二硫酸を含む、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項３６】
約３７℃且つ実質的に中性ｐＨの０．１５Ｍリン酸塩緩衝溶液の中で、上記生体適合性組成物の少なくとも一部が上記医療機器から放出される、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項３７】
上記生体適合性組成物が、有機化合物を含む、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項３８】
上記有機化合物が多糖である、請求項３７に記載の医療機器。
【請求項３９】
上記多糖がグリコサミノグリカンである、請求項３８に記載の医療機器。
【請求項４０】
上記多糖がデキストランである、請求項３９に記載の医療機器。
【請求項４１】
上記多糖が硫酸デキストランである、請求項３９に記載の医療機器。
【請求項４２】
上記生体適合性組成物がポリエチレングリコールである、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項４３】
上記生体適合性組成物が抗増殖剤である、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項４４】
上記抗増殖剤がデキサメタゾンである、請求項４３に記載の医療機器。
【請求項４５】
上記生体適合性組成物が、合成した非極性分子を含む、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項４６】
上記生体適合性組成物が無機化合物を含む、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項４７】
上記無機化合物がリン酸塩を含む、請求項４６に記載の医療機器。
【請求項４８】
上記第一の複数の生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、上記基板材料の殺菌の後、基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項４９】
上記第一の複数の生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、上記基板材料の圧縮及び延伸の後に、基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである、請求項３０に記載の医療機器。
【請求項５０】
上記生体適合性組成物が、共に固定化したヘパリンとデルマタン二硫酸とを含む、請求項３０に記載の医療機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
医療機器分野では、ガラス、ポリマー、及び／又は金属の材料が一般的な基板材料である。これらの材料は、診断機器又は体外機器で使用できる。ガラス以外では、多くの材料は埋め込み型機器で使用できる。
【０００２】
基板材料に生物活性物質を生物活性のある形態での固定化する際には、その物質と基板材料それぞれの化学的性質の評価が伴う。基板材料の表面に生物活性物質を固定化するには、その基板材料の化学組成の修飾が必要とされる場合がある。これは通常は、基板材料の表面を処理することによって、化学的反応性を有する元素又は基の一群を生成させた後、適切な手順で生物活性物質を固定化することによって実現される。他の基板材料では、反応性化学基が内部に取り込まれた材料で、基板材料の表面を被覆又はコーティングする。そうして、その被覆材料の反応性化学基を通じて、生物活性物質を基板材料上に固定化する。基板材料を被覆又はコーティングするためのさまざまな方法が報告されている。被覆材料又はコーティング材料を有する基板材料に固定化される生物活性物質の代表的な例は、米国特許第４，８１０，７８４号、第５，２１３，８９８号、第５，８９７，９５５号、第５，９１４，１８２号、第５，９１６，５８５号、第６，４６１，６６５号に記載されている。
【背景技術】
【０００３】
生物活性を有する、化合物、組成物、物質が固定化されるとき、その「生物製剤」の生物活性は、その固定化プロセスによってマイナスの影響を受け得る。多くの生物製剤の生物活性は、その固定化された状態での生物製剤のコンホメーション（すなわち、一次構造、二次構造、三次構造等）に依存する。所期の機能を発揮するために、十分な活性を生物製剤に与えるコンホメーションでその生物製剤を被覆材料の中に組み込むには、固定化プロセスを注意深く選択することに加え、生物製剤の化学的変化が必要となる場合がある。
【０００４】
被覆と固定化のスキームを最適化しているにもかかわらず、特に追加のプロセス（例えば殺菌）が含まれると、固定化された生物製剤の生物活性は期待より低くなり得る。埋め込み型医療機器に関しては、使用する前に殺菌する必要がある。殺菌は、汚染物に対して敏感な体外用診断機器でも必要とされるであろう。そのような機器の殺菌には、通常は、しばしば数サイクル、その機器を高温、高圧、高湿度に暴露する必要がある。いくつかの例では、抗生剤（例えば酸化エチレン（ＥｔＯ）又は過酸化水素の蒸気）が殺菌プロセスに含まれる。殺菌に加え、固定化された生物製剤の、機械的な圧縮及び延伸、又は長期にわたる保管によってその生物製剤の活性が低下しうる。
【０００５】
特に、固定化された生物活性物質が殺菌、機械的な圧縮及び延伸、並びに／又は保管にさらされる場合に、生物活性の著しい低下を発生させない状態で、生物活性物質が表面に固定化された医療機器が必要とされている。このような医療機器は、殺菌、機械的な圧縮及び延伸、及び／又は保管の間での、固定化された生物活性物質の生物活性の低下を少なくするのに役立つ、生体適合性組成物又は生体適合性化合物を、その生物活性物質とともに含むことになろう。いくつかの例では、その追加の生体適合性組成物又は生体適合性化合物は、殺菌後の生物活性物質の生物活性を増大させるであろう。固定化について強い関心のある生物活性物質には、抗血栓症特性を有する物質が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヘパリンコファクターII結合活性を有する生物活性物質がその表面に固定化されている基板材料を備える、医療機器に関するものである。いくつかの実施態様において、その生物活性物質は、追加の生体適合性有機組成物と組み合わせて固定化される。その生体適合性有機組成物は、特に、他の場合には生物活性物質の生物活性が低下するであろう処理条件及び保管条件に固定化された生物活性物質を暴露した後でも、生物活性物質が大きなヘパリンコファクターII結合活性を保持することを可能とする。いくつかの実施態様においては、追加の生体適合性有機組成物は、生物活性物質が固定化される基板又はコーティングに対して、補助的な機能を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
適当な基板材料としては、生物活性物質を生物活性のある形態で基板材料の一つ以上の面に付着、拘束、又は固定化することのできる、反応性化学基を有する表面を持つ任意の材料が可能である。基板材料は、１種類以上の被覆組成物又は被覆材料をその表面に付着させることを通じ、その材料の表面に付加された複数の反応性化学基を備えることもできる。被覆材料の少なくとも一部には、生物活性物質と反応してその生物活性物質を生物活性のある形態で被覆材料に付着、拘束、又は固定化するのに役立つ化学元素、化学基、化合物、成分を有する。いくつかの実施態様では、生物活性物質を取り外し可能に固定化することができる。
【０００８】
少なくとも１種類の生物活性物質を、基板材料及び／又は被覆材料上にある適当な反応性化学基に化学的に付着、拘束、又は固定化する。複数の生物活性物質を、基板材料及び／又は被覆材料の表面に存在する複数の反応性化学基の少なくとも一部に固定化した後、生体適合性のある追加の有機組成物を、その生物活性物質、基板、及び／又はポリマー被覆材料に共有結合又は非共有結合させる。生体適合性有機組成物は、生物活性物質若しくは基板材料及び／又は被覆材料の反応性化学基と相互作用して、他の場合にはその生物活性物質の生物活性を著しく低下させるであろう条件下で、その生物活性物質が生物活性を失うことを防ぐ。このような条件として、殺菌と保管が挙げられる。膨張可能な管腔内医療機器では、例えばそのような機器の機械的な圧縮及び膨張によっても生物活性物質の生物活性が著しく低下し得る。
【０００９】
いくつかの場合には、追加の生体適合性有機組成物は、固定化、殺菌、保管、及び／又は機械的操作によって生物活性物質にしばしば誘導される望ましくない変化を制限することによって、特に固定化、殺菌、保管、及び／又は機械的操作の間を通じて、その生物活性物質の生物活性を維持するようである。活性を低下させる変化としては、生物活性物質のコンホメーションが変化してその物質の活性部位が不明確になることが挙げられる。活性を低下させる変化としては、互いに近くにある固定化された生物活性物質間の相互作用も挙げられる。ポリマー被覆材料に対する固定化された生物活性物質の再配置は、その生物活性物質の活性を低下させる可能性のある別の変化である。固定化された生物活性物質の単なる変性や分解は、生物活性物質が生物活性を失う別の手段となり得る。この明細書により詳しく説明するように、生物活性物質を、追加の生体適合性有機組成物の存在下で固定化、殺菌、保管、及び／又は機械的操作をすると、その追加の生体適合性有機組成物なしで同じ条件下で処理した同様の固定化された生物活性物質よりも、生物活性をはるかによく保持することができる。
【００１０】
追加の生体適合性有機組成物は、殺菌された医療機器から殺菌後処理の間に除去すること、又はその組成物は、その殺菌された医療機器を埋め込み部位に配置した後にインプラントのレシピエントの生理学的プロセスによって除去することができる。
【００１１】
好ましい生物活性物質は、基板及び／又は被覆材料の表面で、血栓の形成を低減又は抑制する。グリコサミノグリカンが本発明で用いるための好ましい抗血栓剤であり、デルマタン二硫酸、デルマタン二硫酸・アナログ、デルマタン二硫酸誘導体が特に好ましい。好ましい他の生物活性物質は、本発明の医療機器を埋め込んだ組織からの望ましくない細胞増殖を減らす。本発明で用いるための好ましい抗増殖剤として、限定するものではないが、デキサメタゾン、ラパマイシン、パクリタキセルなどがある。
【００１２】
したがって本発明の一実施態様は、基板材料と、その基板の表面の少なくとも一部に付着したポリマー被覆材料と、そのポリマー被覆材料の少なくとも一部に共有結合した、ヘパリンコファクターII結合活性を有する複数の生物活性物質とを含んでいて、ここで、その生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、少なくとも１平方センチメートル当たり５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである医療機器に関する。別の実施態様では、アンチトロンビン結合活性は、基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも１２ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターII、又は基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも２０ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである。いくつかの態様では、ヘパリンコファクターII結合活性は、基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも５０ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである。
【００１３】
本発明の別の一実施態様は、基板材料と、その基板材料の表面の少なくとも一部に付着したポリマー被覆材料と、１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIのヘパリンコファクターII結合活性を有する、そのポリマー被覆材料の少なくとも一部に共有結合した複数の生物活性物質と、そのポリマー被覆材料に結合される、アンチトロンビンIII 結合活性を有する生体適合性組成物とを備えることを特徴とする医療機器に関する。
【００１４】
本発明の別の一実施態様は、基板材料と、その基板材料の表面の少なくとも一部に付着したポリマー被覆材料と、そのポリマー被覆材料の少なくとも一部に共有結合した、ヘパリンコファクターII結合活性を有する第１の複数の生物活性物質及びアンチトロンビンIII 結合活性を有する第２の複数の生物活性物質と、そのポリマー被覆材料と結合される生体適合性組成物とを備え、上記生物活性物質が少なくとも基板材料１平方ｃｍ当たり５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIで、且つ、少なくとも基板材料１平方ｃｍ当たり５ピコモルのアンチトロンビンIII を持つ、ヘパリンコファクターII結合活性を有することを特徴とする医療機器に関する。
【００１５】
本発明のさらに別の一実施態様は、基板材料と、その基板材料の少なくとも一部に存在していてヘパリンコファクターII結合活性を有する複数の化学物質と、その基板材料と結合される第１の生体適合性組成物と、その化学物質及び組成物と混合される第２の生体適合性組成物とを含む医療機器に関する。
【００１６】
本発明のさらに別の一実施態様は、基板材料と、その基板材料の表面の少なくとも一部に付着したポリマー被覆材料と、そのポリマー被覆材料の少なくとも一部に存在していてヘパリンコファクターII結合活性を有する複数の化学物質と、そのポリマー被覆材料と結合される第１の生体適合性組成物と、その化学物質及び組成物と混合される第２の生体適合性組成物とを含む医療機器に関する。
【００１７】
非共有結合した生体適合性有機組成物に関する実施態様では、温度が約３７℃で実質的に中性ｐＨの０．１５Ｍのリン酸塩緩衝溶液の中に入れると、その有機組成物の少なくとも一部が、殺菌又は機械的操作をされた医療機器から数時間以内に放出されることがしばしばある。放出された化合物の存在は、定型的な分析技術を利用して緩衝溶液中で検出することができる。
【００１８】
共有結合した生体適合性有機組成物に関する実施態様では、その有機組成物は、殺菌又は機械的操作の後に、その殺菌又は機械的操作をされた医療機器の表面に実質的に保持される。
【００１９】
さらに別の実施態様では、共有結合した生体適合性有機組成物は、共有結合を解消することによってポリマー被覆材料から放出させることができる。共有結合を解消することによって放出された化合物の存在は、定型的な分析技術を利用して緩衝溶液中で検出することができる。
【００２０】
いくつかの実施態様では、生体適合性有機組成物は、機械的操作及び／又は殺菌の前に混合される場合がある。別の実施態様では、生体適合性有機組成物は、機械的操作及び／又は殺菌の後に（すなわち操作室の中で）混合される場合がある。これは、有機組成物が、その組成物を用いた基板又は機器の機械的操作又は殺菌の間に分解する可能性があるときは特に有用である。このようになっていると、有機組成物を、基板上又は機器上の個々の位置に用量を変えて配置することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】複数の反応性化学基を表面に有するポリマー基板材料の概略図である。
【図１Ａ】金属基板材料の概略図である。
【図２】複数の生物活性物質が固定化されたポリマー基板材料の概略図である。
【図３】複数の反応性化学基を表面に有するポリマー被覆材料を備えるポリマー基板材料の概略図である。
【図３Ａ】複数の反応性化学基を表面に有するポリマー被覆材料を備える金属基板材料の概略図である。
【図４】複数の生物活性物質が固定化されたポリマー被覆材料を備えるポリマー基板材料の概略図である。
【図４Ａ】複数の生物活性物質が固定化されたポリマー被覆材料を備える金属基板材料の概略図である。
【図５】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、追加の生体適合性組成物が結合したポリマー基板材料の概略図である。
【図６】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、追加の生体適合性組成物が結合したポリマー被覆材料を備えるポリマー基板材料の概略図である。
【図６Ａ】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、追加の生体適合性組成物が結合したポリマー被覆材料を備える金属基板材料の概略図である。
【図６Ｂ】複数の生物活性物質が固定化されたポリマー被覆材料を有するポリマー基板材料の概略図であり、図６に示した生体適合性組成物の一部が基板材料とポリマー被覆材料から放出された様子を示している。
【図６Ｃ】複数の生物活性物質が固定化されたポリマー被覆材料を有する金属基板材料の概略図であり、図６Ａに示した生体適合性組成物の一部が基板材料とポリマー被覆材料から放出された様子を示している。
【図７】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、追加の生体適合性組成物が結合した３層のポリマー被覆材料を有するポリマー基板材料の概略図である。
【図７Ａ】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、追加の生体適合性組成物が結合した３層のポリマー被覆材料を有する金属基板材料の概略図である。
【図７Ｂ】複数の生物活性物質が固定化された３層のポリマー被覆材料を有するポリマー基板材料の概略図であり、図７に示した生体適合性組成物の一部が基板材料とポリマー被覆材料から放出された様子を示している。
【図７Ｃ】複数の生物活性物質が固定化された３層のポリマー被覆材料を有する金属基板材料の概略図であり、図７Ａに示した生体適合性組成物の一部が基板材料とポリマー被覆材料から放出された様子を示している。
【図８】結合していないヘパリンの殺菌によってそのヘパリンの生物活性が著しく低下しないことを示す棒グラフである。
【図９】ポリマー被覆材料上の反応性化学基に末端が固定化されたヘパリンを酸化エチレンで殺菌している間及び殺菌した後に、さまざまな生体適合性組成物がその固定化されたヘパリンの生物活性に及ぼす効果を示す棒グラフである。
【図１０】基板上のポリマー被覆材料に固定化されたヘパリンを酸化エチレンで殺菌している間及び殺菌した後に、生体適合性有機組成物である付加されたヘパリン又は硫酸デキストランがその固定化されたヘパリンのＡＴIII 結合活性のレベルを大きくする能力を示す棒グラフである。
【図１１】ポリビニルアルコールでコーティングされた基板に末端が固定化されたヘパリンを酸化エチレンで殺菌している間及び殺菌した後に、付加された硫酸デキストランがその固定化されたヘパリンの生物活性を維持する能力を示す棒グラフである。
【図１２】基板材料の圧縮及び延伸の後に、付加されたグリセロールが、その基板のポリマー被覆材料に末端が固定化されたヘパリンの生物活性を維持する能力を示す棒グラフである。
【図１３】基板材料の機械的圧縮、酸化エチレンを用いた殺菌、そして基板材料の機械的延伸の後に、付加されたグリセロール及びヘパリンが、基板のポリマー被覆材料に末端が固定化されたヘパリンの生物活性を維持する能力を示す棒グラフである。
【図１４】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、反応性化学基が表面に存在しているポリマー被覆材料を備えるポリマー基板材料の概略図である。
【図１５】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、反応性化学基が表面に存在しているポリマー被覆材料を備える金属基板材料の概略図である。
【図１６】複数の生物活性物質と追加の生体適合性組成物が共有結合したポリマー被覆材料を備えるポリマー基板材料の概略図である。
【図１７】複数の生物活性物質と追加の生体適合性組成物が共有結合したポリマー被覆材料を備える金属基板材料の概略図である。
【図１８】第２の生体適合性組成物が結合した本発明の実施態様の概略図である。
【図１９】第２の生体適合性組成物が結合した本発明の実施態様の概略図である。
【図２０】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、第１の生体適合性組成物及び第２の生体適合性組成物が結合したポリマー被覆材料を備えるポリマー基板材料の概略図である。
【図２１】複数の生物活性物質が固定化されるとともに、第１の生体適合性組成物及び第２の生体適合性組成物が結合したポリマー被覆材料を備える金属基板材料の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ヘパリンコファクターII結合活性を有する生物活性物質がその表面に固定化された材料及び機器に関するものである。その生物活性物質は、固定化された物質のヘパリンコファクターII結合活性を他の場合には著しく低下させるであろう固定化、殺菌、機械的な圧縮及び延伸、並びに／又は保管の後でも、大きな生物活性を維持する。固定化された生物活性物質の生物活性は、そのような条件に曝露された後、生物活性物質に共有結合又は非共有結合した、少なくとも１つの追加の生体適合性組成物の存在によってプラスの影響を受ける場合がある。たいていの実施態様で、その追加の組成物は有機化合物である。しかしいくつかの実施態様では、その生体適合性組成物は無機化合物である。好ましい実施態様では、追加の組成物は、多糖の形態になった炭水化物である。好ましい多糖はグリコサミノグリカンである。好ましいグリコサミノグリカンは、ヘパリン組成物、ヘパリン・アナログ、ヘパリン誘導体、デルマタン二硫酸、デルマタン二硫酸・アナログ、及びデルマタン二硫酸誘導体である。
【００２３】
図１と図２を参照すると、いくつかのポリマー基板材料（１２）は、その基板材料の表面の少なくとも一部に分布した複数の反応性化学基（１６）を備えていて、そこに複数の生物活性物質（１７）が付着、拘束、又は固定化されることがわかる。生物活性物質（１７）の大半は、反応性化学基（１６）を通じて基板材料（１２）に共有結合している。ポリマー基板材料（１２）の表面は、滑らかな状態、粗い状態、多孔性状態、湾曲した状態、平坦な状態、角ばった状態、不規則な状態のいずれでも、これらの組み合わせでもよい。いくつかの実施態様では、多孔性表面を有する基板材料が、その材料の多孔性表面からその材料本体の内部へと延びる内部空隙スペースを有する。このような多孔性基板材料は孔同士を結合する内部基板材料を備えていて、その内部基板材料が、生物活性物質を固定化することのできる表面を提供することがしばしばある。多孔性であるかないかに関係なく、基板材料は、フィラメント、膜、シート、チューブ、メッシュ、織布、不織布の形態、又はこれらを組み合わせた形態にすることができる。
【００２４】
生物活性物質（１７）の固定化に適した基板材料（１２）としては、生体適合性ポリマー材料（例えば、ポリエチレン、ポリウレタン、シリコーン、ポリアミド含有ポリマー、及びポリプロピレン）があげられる。反応性化学基（１６）がポリマー材料の成分に導入されるのであれば、完全に密な、又は多孔性のポリテトラフルオロエチレンが、適当な１つのポリマー基板材料（１２）である。基板材料の一部として複数の反応性化学基を有する基板材料を、この明細書では“機能化可能な材料”と呼ぶ。生物活性物質が機能化可能な基板材料と反応すると、その基板材料は機能化されたとみなされ、そして生物活性物質が固定化される。その後の処理条件（例えば、殺菌、機械的圧縮及び延伸、又は保管）の間を通じて、固定化された物質の生物活性を維持するため、追加の生体適合性有機組成物を、機能化された材料及び固定化された物質と、非共有結合で結合させる。
【００２５】
基板材料は、１種類以上の被覆組成物又は被覆材料を表面に付着させることによって材料の表面に付加した複数の化学反応基も備えることができる。被覆材料の少なくとも一部には、生物活性物質と反応する化学元素、基、化合物、又は成分を有する。そしてこれらは生物活性の形態で、生物活性物質を被覆材料に付着、拘束、又は固定化するのに役立つ。被覆材料は、溶質、粒子、分散液、コーティング、オーバーレイのいずれかの形態で適用させることができ、限定するものではないが、共有結合、吸着（例えば、物理吸着又は化学吸着）、及び非共有結合（例えば、水素結合又はイオン結合）等の、さまざまな方法で基板材料に付着させることができる。好ましい実施態様では、被覆材料は溶液の形態で適用され、溶媒を除去したところの基板材料の１つ以上の面に、連続膜層又は不連続膜層を形成する。被覆材料は１つ以上の層にして適用させることができる。各層の被覆材料の化学成分は、同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施態様では、被覆材料は自ら架橋するか、他の層の他の被覆材料と架橋する。架橋結合は、共有結合又はイオン結合が可能である。
【００２６】
表面に反応性化学基（又は適切な反応性化学基）のない基板材料（１２、１４）（図１Ａ）は、少なくとも一部が、表面に複数の反応性化学基（１６）を有するポリマー被覆材料（１８）で覆われる（図３と図３Ａ）。そのポリマー被覆材料（１８）には、生物活性物質（１７）を付着、拘束、又は固定化することができる（図４と図４Ａ）。生物活性物質（１７）の大半は、ポリマー被覆材料（１８）の反応性化学基（１６）を通じてその被覆材料（１８）に共有結合する。ポリマー被覆材料（１８）は、基板材料（１２、１４）上の少なくとも一部に少なくとも１つの層を形成する。いくつかの実施態様では、ポリマー被覆材料（１８）は自ら架橋する（１９）か、他の層（１８Ａ、１８Ｂ）の他の被覆材料と架橋する（図７と図７Ａ）。架橋は、共有結合、イオン結合、又はその両方が可能である。被覆しやすい基板材料は、ガラス、金属（１４）、セラミック、ポリマー材料（１２）であり、その中でも特に化学的に不活性なポリマー材料（例えばポリテトラフルオロエチレン）である。
【００２７】
ヘパリンコファクターII結合能力又はアンチトロンビンIII 結合能力を持つ少なくとも１つのタイプの生物活性物質（１７）を、基板材料（１２、１４）及び／又は被覆材料（１８）の表面にある適当な反応性化学基（１６）に化学的に付着、拘束、又は固定化する。
【００２８】
生体適合性組成物（１１、１５、１００）としては、限定するものではないが、抗血栓剤、抗凝固剤、フィブリン溶解剤、血栓溶解剤、抗生剤、抗微生物／消毒化合物、抗ウイルス化合物、抗増殖剤、細胞接着化合物、細胞抗接着化合物、抗炎症剤などがある。特に興味のある抗血栓剤はグリコサミノグリカンであり、その中でも特にデルマタン二硫酸、デルマタン二硫酸誘導体、及びデルマタン二硫酸・アナログ並びにヘパリン、ヘパリン誘導体、及びヘパリン・アナログである。他の抗凝固剤として、限定するものではないが、ヒルジン、活性化されたプロテインＣ、プロスタグランジンなどがある。フィブリン溶解剤又は血栓溶解剤としては、限定するものではないが、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、及び組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔＰＡ）がある。抗生剤の例としては、限定するものではないが、ペニシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バンコマイシン、バシトラシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、及びセファロスポリンがある。セファロスポリンの例としては、セファロチン、セファピリン、セファゾリン、セファレキシン、セファラジン、セファドロキシル、セファマンドール、セフォキシチン、セファクロル、セフロキシム、セフォニシド、セフォラニド、セフォタキシム、モキサラクタム、セフトリゾキシム、セフトリアキソン、及びセフォペラゾンがある。抗微生物／消毒化合物の例としては、限定するものではないが、銀スルファジアジン、クロルヘキシジン、過酢酸、次亜塩素酸ナトリウム、トリクロサン、フェノール、フェノール化合物、ヨードフォア化合物、第四級アンモニウム化合物、塩素化合物、ヘパリンなどと、これらの組み合わせがある。抗ウイルス剤の例としては、限定するものではないが、α−メチル−１−アダマンタンメチルアミン、ヒドロキシ−エトキシメチルグアニン、アダマンタンアミン、５−ヨード−２’−デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、及びアデニンアラビノシドがある。細胞接着化合物としては、限定するものではないが、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、オステオポンチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤＳペプチド、ＹＩＧＳＲペプチド、及び抗体標的細胞表面抗原がある。細胞の付着に抵抗することのできる細胞としては、ポリＨＥＭＡ、ポリエチレングリコール、多糖、ポリビニルピロリドン、リン脂質などがある。他の生物活性物質としては、限定するものではないが、酵素、有機触媒、リボザイム、有機金属、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリアミノ酸、抗体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ステロイド分子、抗生剤、抗微生物化合物、抗真菌剤、サイトカイン、炭水化物、疎油性物質、脂質、調合薬、治療薬などがある。
【００２９】
すでに説明したように、多彩な生物活性物質（１７）を本発明で使用できるが、哺乳動物の血液の成分と相互作用することができて、基板材料（１２、１４）又は被覆材料（１８）の表面に凝固物又は血栓が形成されるのを阻止する物質が最も好ましい。そのような生物活性物質の多くはオリゴ糖又は多糖である。多糖のいくつかはグリコサミノグリカンであり、グルコサミン組成物やガラクトサミン組成物を含む。好ましいグリコサミノグリカンは、ヘパリン組成物、ヘパリン・アナログ、ヘパリン誘導体、デルマタン二硫酸、デルマタン二硫酸・アナログ、及びデルマタン二硫酸誘導体である。ヘパリンは、成長因子、酵素、モルフォゲン、細胞接着分子、サイトカインと結合することによって媒介される多くの生物学的機能を持つ複合グリコサミノグリカンである。抗凝固剤として機能するヘパリンの生物活性は、ヘパリンが、トロンビンとアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）を結合するための触媒として作用する能力に基づいている。ヘパリンの抗凝固活性の大半は、この結合を容易にする五糖配列と関係している。他の一つの複合グリコサミノグリカンはデルマタン二硫酸であり、これも多くの生物学的機能を持ち、そしてヘパリンコファクターII（ＨＣII）によるトロンビンの阻害に対して触媒として作用する能力に基づく抗凝固剤の生物活性を有する。デルマタン二硫酸は、米国特許第５，９２２，６９０号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に公開されている合成反応によってデルマタン硫酸から得てもよい。デルマタン二硫酸合成法の他の開示は、米国特許第５，７０５，４９３号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）でみられる。デルマタン二硫酸の合成法の記載と実質的に同様に、ヘパリンを化学プロセスによって修飾し、過硫酸ヘパリン誘導体及び活性化ＨＣIIを得てもよい。
【００３０】
本発明における固定化にとって最も好ましい多糖組成物は、Ｌａｒｍに付与された米国特許第４，６１３，６６５号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）の教示内容に従って作られる自由なアルデヒド末端基を有する多糖組成物である。最も使用に好ましい多糖はデルマタン二硫酸で、米国特許第５，９２２，６９０号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に従って作られる。自由なアルデヒド末端基を有するデルマタン二硫酸を作るとき、デルマタン二硫酸はジアゾ化によって分解にさらされて、自由なアルデヒド末端基を有する断片を形成する。自由なアルデヒド末端基により、基板又はポリマー被覆材料の第一級アミノ基にデルマタン二硫酸組成物の「端部を結合させて」イミンを形成することができる。そのイミンは、還元によって第二級アミンに変換される。そのデルマタン二硫酸組成物の端部を結合させることにより、デルマタン二硫酸組成物の生物活性のある部分を、凝固及び血栓の形成に関与する血液成分に、最もうまく曝露するコンホメーションでデルマタン二硫酸を固定化することができる。最適な状態で固定化されたデルマタン二硫酸は、血栓の形成及び凝固に関与する血液成分に曝露されると、その血液成分と相互作用し、基板及び／又は被覆材料の表面における血栓の形成若しくは他の凝固イベントを減らしたり、又は阻止したりする。
【００３１】
本発明で使用することが望ましい他の生物活性物質（１７）として、アンチトロンビンIII を媒介としてＸａ因子を抑制する「フォンダパリナックス（登録商標）」と呼ばれるヘパリン及び合成ヘパリン組成物、ＨＣIIとトロンビンとの結合の触媒作用をする物質、抗増殖剤、並びに抗炎症剤がある。
【００３２】
固定化スキームが最適化されているにもかかわらず、デルマタン二硫酸をベースとした生物物質の生物活性は、その物質を殺菌、機械的圧縮及び延伸、並びに／又は保管している間に著しく低下する（図９、図１１、図１２、図１３）。すでに説明したように、固定化された生物活性物質の生物活性の低下は、さまざまな因子によって引き起こされる可能性がある。固定化された物質の生物活性の低下が起こるメカニズムが何であれ、固定化された生物活性物質に生体適合性有機組成物を共有結合及び／又は非共有結合させると、その物質を殺菌、機械的操作（例えば機械的圧縮及び延伸）、及び／又は保管している間とその後も、その物質の生物活性が維持される場合がある。
【００３３】
追加の生体適合性有機組成物は、生物活性を持っていても持っていなくてもよい。追加の生体適合性有機組成物としては、ポリヒドロキシアルデヒド又はポリヒドロキシケトン並びにその誘導体の形態になった炭水化物が可能である。そのような炭水化物として、単糖、二糖、オリゴ糖、及び多糖（例えばグリコサミノグリカン、グリコサミノマンナン、及び保管用多糖（デキストランとその誘導体など））などがある。本発明で用いるのに適当な他の生体適合性有機組成物として、酸性ムコ多糖、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドや、分子量が約１００，０００ＭＷ未満で、帯電した、又は帯電していない他の生体適合性脂肪族化合物や芳香族化合物などがある。
【００３４】
図５〜図６Ａを参照すると、その表面に固定化された生物活性物質（１７）を有する、被覆された又は被覆されていない基板材料（それぞれ、１４、１２）は、その生物活性物質（１７）、基板材料（１４、１２）、及び／又は被覆材料（１８）に結合した追加の生体適合性組成物（１００）を有している。生体適合性組成物は有機物であることが好ましい。その生体適合性有機組成物は、固定化された生物活性物質、基板、及び／又は被覆材料にさまざまな方法で適用させることができる。好ましい一実施態様としては、炭水化物をベースとした適当な生体適合性組成物を水性溶媒に溶かし、そしてその溶液を、スプレー、浸漬コーティング、浸漬、ローリング、塗布、又は他の堆積手段により、固定化された生物活性物質、基板、及び／又はポリマー被覆材料に付着させる。適切な系においては、生体適合性組成物は有機溶媒に溶解されて同様に適用される。
【００３５】
本発明の好ましい一実施態様は、解剖の部位での移植、又はその他の留置のための、殺菌された医療機器に関する。空隙スペース又は管腔を区切る解剖構造の内部に留置して、その解剖構造を補強したり、又はその解剖構造によって区切られる空隙スペースを維持したりするための殺菌された医療機器が最も好ましい。殺菌されたこのような医療機器を血管構造の内部で使用する場合、末端が結合したヘパリンの形態で固定化された生物活性物質は、その機器の中又は周囲を通過する血液と相互作用して、その機器の血液と接触する表面で血栓又はそれ以外の凝固生成物が形成されるのを最少にしたり阻止したりする。好ましい一実施態様は、追加の生体適合性有機組成物は、基板材料及び／又は被覆材料と共有結合したポリエチレングリコール化合物である。共有結合したヘパリンは、殺菌された医療機器に留まることが可能である。好ましい殺菌法には、酸化エチレンガスがある。
【００３６】
医療機器の製造には機械的操作を必要とする場合があり、それは固定化された生物活性物質の生物活性を低下させることがしばしばある。上記の固定化された生物活性物質、基板材料、及び／又は被覆材料と結合した追加の生体適合性組成物は、医療機器の機械的圧縮及び延伸の後に、その固定化された生物活性物質の生物活性を維持する場合もある（図１２及び図１３）。膨張可能なステントとステント-グラフトは、固定化された生物活性物質の生物活性の改善が特に重要な医療機器である。
【００３７】
そのため、本発明は、生物活性物質が固定化されていて、殺菌中及び殺菌後にその固定化された物質の生物活性が大きく保持される殺菌された医療機器を提供する（図９〜図１１、図１３）。その医療機器は、殺菌前に、例えば圧縮及び延伸のような機械的操作を施すことができ、且つ大きな生物活性を維持することができる（図１２及び図１３）。
【００３８】
図１４は、架橋した（１９）ポリマー製の被覆材料又はコーティング材料（１８）を表面に有する、本発明のポリマー基板（１２）の実施態様（５０）を概略的に示している。被覆材料（１８）には、固定化された複数の生物活性物質“Ｂ”（１７）が結合している。被覆材料（１８）は、複数の化学反応基“Ｒ”（１３）も表面に備えており、そこに生体適合性組成物“Ｓ”（１５）を共有結合させることができる（図１６及び図１７）。いくつかの実施態様では、共有結合は解消することもできるため、適切な条件下で生体適合性組成物“Ｓ”（１５）を被覆材料から放出させることができる。図１５及び図１７は、金属基板（１４）を用いた同様の構造体（５０）について概略的に示している。
【００３９】
図１８及び図１９は、架橋した（１９）ポリマー製の被覆材料又はコーティング材料（１８）を表面に有する、本発明のポリマー基板（１２）又は金属基板（１４）の実施態様（７０）を概略的に示している。被覆材料（１８）は、固定化された複数の生物活性物質“Ｂ”（１７）と、被覆材料に共有結合した第１の生体適合性組成物“Ｓ”（１５）を備えている。いくつかの実施態様では、共有結合は解消することもできるため、適切な条件下で生体適合性組成物“Ｓ”（１５）を被覆材料から放出させることができる。さらに、この実施態様は、生物活性物質“Ｂ”や生体適合性組成物“Ｓ”と混合される第２の生体適合性組成物“Ａ”（１１）を有する。
【００４０】
図２０及び図２１は、架橋した（１９）ポリマー被覆材料又はコーティング材料（１８）を表面に有する、本発明のポリマー基板（１２）又は金属基板（１４）の実施態様（８０）を概略的に示している。被覆材料（１８）には、複数の生物活性物質“Ｂ”（１７）が固定化されている。第１の生体適合性組成物（１００）が生物活性物質（１７）と結合している。さらに、この実施態様は、生物活性物質“Ｂ”や生体適合性組成物“Ｓ”と混合される第２の生体適合性組成物“Ａ”（１１）を有する。
【実施例】
【００４１】
本発明における表面のヘパリン活性の計算は、サンプル全体（隙間も含む）がその表面に固定化されたヘパリンを有している場合もあるが、サンプル材料の一面だけの表面積を用いて行なった。ヘパリン活性は、末端が結合したヘパリンが既知量のアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）と結合する能力又は容量を測定することによって分析した。結果は、基板材料１平方センチメートルに結合したアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）のピコモル数として表わした（ｐｍｏｌ  ＡＴIII ／ｃｍ２基板材料）。この分析法は、Ｌａｒｓｅｎ  Ｍ．Ｌ．他、「Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｈ−Ｄ−ＰＨｅ−ＰＩＰＡｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２３８）」（Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．、１９７８年、第１３巻、２８５〜２８８ページ）、及びＰａｓｃｈｅ他、「Ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｏ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｎｄｅｒ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」（Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ、１９９１年、第１５巻、２８１〜４９１ページ）に記載されている。
【００４２】
基板材料の表面積当たりのＡＴIII 結合活性は、被覆された又は被覆されていない基板材料の見かけの表面積当たりのＡＴIII に結合したピコモル数として定義される。基板の見かけの表面積には、被覆された複数の表面は考慮されず、多孔性基板材料の多孔度も考慮されない。基板材料が多孔性である場合には、多孔性が表面積に及ぼす効果はこれらの計算では考慮されない。例えば（多孔性材料でできた）円筒形チューブの形態のｅＰＴＦＥ移植血管において、そのチューブ状移植血管の内面にある基板材料にヘパリンの末端が固定化されている場合の見かけの表面積は、あらゆる円筒形状と同様に２πｒＬとして計算される（ただしｒはグラフトの内径であり、Ｌは軸方向の長さであり、πは円周率である）。ｅＰＴＦＥの多孔性と、表面積に及ぼすその効果は、この明細書では考慮しないことに注意することが重要である。したがって、分析のために切断されて正方形になる非多孔性基板材料は、長さ×幅という表面積を持つとされる。
【００４３】
本発明における表面のデルマタン二硫酸活性の計算は、サンプル全体（隙間も含む）がその表面に固定化されたデルマタン二硫酸を有している場合もあるが、サンプル材料の一方の側だけの表面積を用いて行なった。デルマタン二硫酸活性は、末端が結合したデルマタン二硫酸が既知量のヘパリンコファクターII（ＨＣII）と結合する能力又は容量を測定することによって分析した。結果は、基板材料１平方センチメートルにヘパリンコファクターII（ＨＣII）結合のピコモル数として表わした（ｐｍｏｌ  ＨＣII／ｃｍ２基板材料）。おおよそ１ｃｍ２のサイズのサンプルが構造体からに切断され、そして末端が結合したデルマタン硫酸がヘパリンコファクターII（ＨＣII）と結合する容量をデルマタン二硫酸活性について、測定することによって分析した。このデルマタン二硫酸活性の測定は、ヘパリン活性についての、Ｌａｒｓｅｎ  Ｍ．Ｌ．他、「Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｈ−Ｄ−ＰＨｅ−ＰＩＰＡｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２３８）」（Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．、１９７８年、第１３巻、２８５〜２８８ページ）、及びＰａｓｃｈｅ他、「Ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｏ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｎｄｅｒ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」（Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ、１９９１年、第１５巻、２８１〜４９１ページ）に以前に記載されているものと同様である。デルマタン二硫酸活性の分析については、ＨＣIIは、デルマタン二硫酸表面に結合することができ、可溶性デルマタン二硫酸の過剰によりその表面から溶出され、そしてトロンビン活性についての比色分析においてトロンビンと結合される。この分析は、ＨＣIIの媒介によるヒトトロンビンの阻害を測定することにより、存在しているＨＣIIの量を間接的に決定する。ＨＣIIの量は、既知量の、デルマタン二硫酸、ＨＣII、トロンビン、及び合成トロンビン基板を混合することによって導かれる標準曲線から決定する（アミド分解アッセイとして知られる）。可溶性デルマタン硫酸活性の測定についての、同様のアプローチが、以前に「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｄｅｒｍａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｔ  ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ」（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅａｍｏｓｔ．１９８８年、第６０巻、２３６〜２３９ページ）に報告されている。その結果を、基板材料単位表面積当たりのＨＣII結合の量（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）で表す。全てのサンプルをその分析中を通じて、湿潤条件に保持する。おおよそ１ｃｍ２のサンプルは、もし材料の両面を考慮するならば、どれも全面積で２ｃｍ２を有するが、サンプルの一面（すなわち、１ｃｍ２）のみがＨＣII−デルマタン二硫酸結合活性の計算（ｐｍｏｌ／ｃｍ２単位）に使われている、という事に注意することが重要である。
【００４４】
また他の一つの方法では、構造体に固定化されているデルマタン二硫酸への放射性標識ＨＣIIの結合の量を測定することによって、デルマタン二硫酸は直接的に定量化される。この手法は、Ｄｕ  Ｙ．Ｊ．他、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ｃａｔｈｅｔｅｒｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ」（Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．、２００７年、第８０Ａ巻、２１６〜２２５ページ）に記載された、ヘパリンが固定化された構造体へのアンチトロンビンIII 結合を測定するための方法と同様である。デルマタン二硫酸の構造体を、放射性同位体ヨウ素１２５（１２５Ｉ）によって共有結合標識されたＨＣII溶液でインキュベートする。インキュベート後、その表面を繰り返し洗浄し、そして構造体から放射される放射線の量をガンマカウンタにより測定する。放射とＨＣII質量の比が既知なので、ＨＣIIの量を決定することができる。この結果を、基板材料単位表面積当たりのＨＣII結合の量（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）で表す。
【００４５】
基板材料の表面積当たりのＨＣII結合活性は、被覆された又は被覆されていない基板材料の見かけの表面積当たりのＨＣIIに結合したピコモル数として定義される。基板の見かけの表面積には、被覆された複数の表面は考慮されず、多孔性基板材料の多孔度も考慮されない。基板材料が多孔性である場合には、多孔性が表面積に及ぼす効果はこれらの計算では考慮されない。例えば（多孔性材料でできた）円筒形チューブの形態のｅＰＴＦＥ移植血管において、そのチューブ状移植血管の内面にある基板材料にデルマタン二硫酸の末端が固定化されている場合の見かけの表面積は、あらゆる円筒形状と同様に２πｒＬとして計算される（ただしｒはグラフトの内径であり、Ｌは軸方向の長さであり、πはパイという数である）。ｅＰＴＦＥの多孔性と、表面積に及ぼすその効果は、この明細書では考慮しないことに注意することが重要である。したがって、分析のために切断されて正方形になる非多孔性基板材料は、長さ×幅という表面積を持つとされる。
【００４６】
実施例１
本実施例では、ヘパリンを酸化エチレン（ＥｔＯ）殺菌プロセスに暴露した後に、結合していない「純粋な」ヘパリンが生物活性を保持していることを示す。
【００４７】
本実施例では、凍結乾燥粉末形態の殺菌されていないＵＳＰグレードのヘパリン−ナトリウムをセルサス・ラボラトリーズ社（シンシナチ、オハイオ州）から取得した。試験するため、測定した量のヘパリンをＣＨＥＸ―ＡＬＬ（登録商標）殺菌パウチ（ロング・アイランド・シティ、ニューヨーク州）に入れた。ヘパリンを入れた１つのグループのパウチに対してＥｔＯ殺菌を行なった。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。別のグループに対しては、ＥｔＯなしの殺菌手続きを実施した。第３のグループには殺菌手続きを行なわなかった。
【００４８】
殺菌手続きの後、既知量のヘパリンを各パウチから取り出し、アメリカン・ディアグノスティカ社（スタンフォード、コネティカット州）から入手できるＡＣＴＩＣＨＲＯＭＥヘパリン（抗ＦＸａ）分析キットを用いて生物活性を調べた。各ヘパリン・サンプルの生物活性の値は、ヘパリンの国際単位をヘパリンの重量で割った値（ＩＵ／ｍｇ）として表わした。ヘパリンの国際単位は、ヘパリンを触媒とするＡＴIII によるＸａ因子の不活化に基づいて計算される。したがって国際単位は、ヘパリンのＡＴIII 結合活性の１つの指標である。ヘパリン活性が少しでも低下すると、ＡＣＴＩＣＨＲＯＭＥ試験から、同等な対照ヘパリンと比較したＩＵ／ｍｇの低下となってストレートに表われる。活性が低下したヘパリンは、殺菌プロセスによってある程度不活化されたと見なされる。
【００４９】
図８は、ＥｔＯによる殺菌が、結合していない状態の乾燥粉末ヘパリンのアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）結合活性に及ぼす効果を示す棒グラフである。図８は、各グループのヘパリン・サンプル（ｎ＝３）に関する活性レベルの平均を、ＩＵ／ｍｇを単位として示している。殺菌を経ていない対照ヘパリン・サンプルは、平均値が１３８ＩＵ／ｍｇであった。ＥｔＯなしの殺菌処理（すなわち高湿度、高温など）を行なった対照ヘパリン・サンプルは、平均値が１１９ＩＵ／ｍｇであった。ＥｔＯの存在下で殺菌処理を行なったヘパリン・サンプルは、平均値が１２３ＩＵ／ｍｇであった。ＥｔＯなしの殺菌処理を行なったヘパリン・サンプルは、殺菌していない対照サンプルと比べて活性が１４％低下したのに対し、ＥｔＯの存在下で殺菌処理を行なったヘパリン・サンプルは、活性の低下がわずかに１１％であった。図８からわかるように、結合していない純粋なヘパリン粉末をＥｔＯの存在下又は不在下で殺菌したとき、殺菌していない対照サンプルと比べてヘパリンに対するＡＴIII の結合が著しく少なくなることはない。結合していない非殺菌ヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性は、ＥｔＯなしの殺菌又はＥｔＯ殺菌によって著しく低下することはない。したがって、同様のＥｔＯ殺菌条件にさらした固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性の低下は、ＥｔＯ殺菌又はＥｔＯなしの殺菌を単に行なうこと以外のメカニズムによって起こっているに違いない。
【００５０】
実施例２
本実施例では、ヘパリン-アンチトロンビンIII （ＡＴIII ）の結合がＥｔＯ殺菌の暴露によっては著しく損なわれない、本発明の一実施態様による構造体について説明する。
【００５１】
米国特許第４，６１３，６６５号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に従って製造されたアルデヒドで修飾されたヘパリン組成物の末端を、米国特許第６，６５３，４５７号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に従って、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の表面に配置した被覆材料又はコーティング層に結合させた。追加の生体適合性有機組成物を被覆材料及び結合したヘパリンの中に組み込み、固定化されたそのヘパリンに対してＥｔＯ殺菌を行なっても生物活性が著しく低下しないようにした。
【００５２】
シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手した。ベースコーティングの形態の被覆材料をそのｅＰＴＦＥ材料に適用させるため、その被覆材料を直径１０ｃｍのプラスチック製刺繍用環状部材に取り付け、その支持されたｅＰＴＦＥ材料をまず最初に１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に約５分間浸し、次いでＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とＩＰＡが１：１の溶液に浸した。無水ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）ＰＥＩはＢＡＳＦ社から取得し、希釈して約４％の濃度にし、ｐＨを９．６に調節した。ｅＰＴＦＥ材料を上記溶液の中に約１５分間浸した後、材料をその溶液から取り出し、ｐＨ９．６の脱イオン（ＤＩ）水の中で１５分間リンスした。ｅＰＴＦＥ材料の表面に残ったＰＥＩを（アムレスコ社から取得した）グルタルアルデヒドの０．０５％水溶液（ｐＨ９．６）と１５分間架橋させた。追加のＰＥＩをこの構造体に付加するため、その構造体をＰＥＩの０．５％水溶液（ｐＨ９．６）の中に１５分間入れ、ＤＩ水（ｐＨ９．６）の中で１５分間再びリンスした。グルタルアルデヒドとＰＥＩ層が反応した結果として形成されるイミンを、シアンホウ水素化ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）溶液（５ｇを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９．６）を用いて１５分間還元し、ＤＩ水の中で３０分間リンスした。
【００５３】
追加のＰＥＩ層を構造体に付加するため、その構造体を０．０５％グルタルアルデヒド水溶液（ｐＨ９．６）の中に１５分間浸した後、０．５％ＰＥＩ水溶液（ｐＨ９．６）の中に１５分間浸した。次に構造体をＤＩ水（ｐＨ９．６）の中で１５分間リンスした。得られたイミンを還元するため、ＮａＣＮＢＨ３溶液（５ｇを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９．６）の中に構造体を浸した後、ＤＩ水の中で３０分間リンスした。第３層目を構造体に適用させるため、これらのステップを繰り返した。その結果、親水性の架橋したポリマー・ベースコーティングを、ベース材料の露出した面と隙間の面の実質的に全体に有する、多孔性疎水性フルオロポリマー・ベース材料が得られた。
【００５４】
構造体の表面に別のＰＥＩ層を配置するための準備として、中間化学層をポリマー・ベースコーティングに付着させた。この中間イオン電荷層は、硫酸デキストラン（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）と塩化ナトリウムの溶液（０．１５ｇの硫酸デキストランと１００ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３）の中で構造体を６０℃にて９０分間インキュベートした後、ＤＩ水で１５分間リンスすることによって作った。
【００５５】
ＰＥＩ層（この明細書では“キャップ層”と呼ぶ）を中間層に付着させるため、構造体を０．３％ＰＥＩ水溶液（ｐＨ９）の中に約４５分間入れた後、塩化ナトリウム溶液（５０ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした）の中で２０分間リンスした。ＤＩ水を用いた最後のリンスを２０分間実施した。
【００５６】
アルデヒドで修飾されたヘパリンの末端をＰＥＩ層に結合又は共役させるため、６０℃のヘパリン含有塩化ナトリウム溶液（１．５ｇのヘパリンと２９．３ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３．９）の中に構造体を１２０分間入れた。体積２．８６ｍｌの２．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣＮＢＨ３水溶液を１リットルのヘパリン溶液に添加した後、サンプルを添加した。次にサンプルをＤＩ水の中で１５分間リンスし、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、乾燥ヘパリンをｅＰＴＦＥ材料に結合させた。ヘパリンの存在と一様性は、構造体のサンプルの両側をトルイジン・ブルーで染色することによって調べた。染色によって均等に紫色になった表面が生じるというのは、ヘパリンが存在していてｅＰＴＦＥ材料に一様に結合していることを示す。
【００５７】
ヘパリンが結合した構造体に特別な化合物又は組成物を付加することにより、他の場合にはヘパリンの生物活性を低下させるであろう条件に曝露した後にヘパリンの生物活性を維持することができる。そのような条件として、限定するものではないが、ＥｔＯ殺菌、機械的圧縮及び延伸、並びに保管がある。
【００５８】
被覆材料でコーティングされた上記の構造体を以下の化合物の溶液に曝露し、コーティングの各部分に結合したヘパリンの生物活性を安定化させる効果を評価した。その化合物とは、ＵＳＰグレードの塩化カルシウム（フィッシャー・サイエンティフィック社）、ＵＳＰグレードのヘパリン・ナトリウム（セルサス社）、ポリエチレングリコール（分子量２０，０００、シグマ社）、ＤＥＡＥデキストラン（分子量５００，０００、ＰＫケミカル社）、硫酸デキストランのナトリウム塩（分子量８，０００、シグマ社）、及びデキストラン（分子量９，５００、シグマ社）のそれぞれをＤＩ水１００ｍｌ当たり０.５ｇの濃度にしてｐＨを９.６に調節したものである。エタノール１００ｍｌ当たり０.５ｇのデキサメタゾンの濃度にしてｐＨを調節しないものも利用した。この明細書では、これら溶液のそれぞれを“処理溶液”と呼ぶ。ＥｔＯ殺菌後に、アンチトロンビンに対するヘパリンの結合活性にこれらのさまざまな化合物が及ぼす効果は、基板材料１平方センチメートル（ｃｍ２）に結合したアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）のピコモル数として表わした。得られたデータを図９にまとめてある。
【００５９】
特定のヘパリン含有構造体を特定の処理溶液に曝露するため、その構造体を２リットルのビーカーに入れ、そして１００ｍｌの処理溶液を添加し、その構造体を処理溶液の中に完全に浸した。各構造体を６０℃の処理溶液に１時間曝露した。殺菌手続きをする前に、構造体は溶液から取り出し、凍結乾燥させた。
【００６０】
ＥｔＯ殺菌のための準備として、凍結乾燥させた各構造体をＴｏｗｅｒ  ＤＵＡＬＰＥＥＬ（登録商標）自己気密パウチ（アリージャンス・ヘルスケア社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【００６１】
ＥｔＯ殺菌の後、各構造体（対照を含む）をパウチから取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。
【００６２】
サイズが約１平方センチメートル（１ｃｍ２）のサンプルを構造体から切り出した後、末端が結合したヘパリンがＡＴIII に結合する能力を測定することにより、ヘパリンの活性を調べた。この分析法は、Ｌａｒｓｅｎ  Ｍ．Ｌ．他、「Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｈ−Ｄ−ＰＨｅ−ＰＩＰＡｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２３８）」（Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．、１９７８年、第１３巻、２８５〜２８８ページ）、及びＰａｓｃｈｅ他、「Ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｏ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｎｄｅｒ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」（Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ、１９９１年、第１５巻、２８１〜４９１ページ）に記載されている。結果は、単位表面積当たりに結合するＡＴIII の量として、ｐｍｏｌ／ｃｍ２の単で表わした。分析中を通じてすべてのサンプルを湿潤条件に保持した。約１平方センチメートル（１ｃｍ２）の各サンプルは、もし材料の両側を考慮すると合計で２平方センチメートル（２ｃｍ２）の表面積を持つが、ＡＴIII −ヘパリン結合活性（単位はｐｍｏｌ／ｃｍ２）の計算にはサンプルの１つの面しか利用しなかったことに注意することが重要である。
【００６３】
図９は、被覆された基板材料に固定化されたヘパリンと非共有結合するさまざまな生体適合性有機組成物が、その固定化されたヘパリンのＥｔＯ殺菌への暴露後に、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性に及ぼす効果を示す棒グラフである。
【００６４】
固定化されたヘパリンに対するアンチトロンビンIII 結合活性は、基板材料１平方センチメートル当たりの結合したＡＴIII のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表示した。対照サンプルの１つの集合は殺菌しなかった。対照サンプルの別の集合は、固定化されたヘパリン及び被覆材料に非共有結合した生体適合性有機組成物がない状態でＥｔＯを用いて殺菌した。残りの各棒は、固定化されたヘパリンと被覆材料に非共有結合した生体適合性有機組成物が存在しているときの固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を示している。どの棒も、ｎ＝３個のサンプルの平均値を示しているが、硫酸デキストランだけはｎ＝６個のサンプルである。
【００６５】
この棒グラフからわかるように、殺菌した対照サンプルでは、殺菌していない対照サンプルと比べてアンチトロンビンIII 結合活性が劇的に低下した。殺菌していない対照サンプルのアンチトロンビンIII 結合活性は、基板材料１ｃｍ２につき１０３ピコモルであった。殺菌した対照サンプルのアンチトロンビンIII 結合活性は、基板材料１ｃｍ２につき６６ピコモルであった。ＥｔＯを用いて殺菌すると、殺菌していないサンプルと比べてアンチトロンビンIII 結合活性が３６％低下した。
【００６６】
固定化されたヘパリン及び被覆材料に非共有結合した、上記の生体適合性有機組成物が、殺菌後にアンチトロンビンIII 結合活性に及ぼす影響は、次の段落にまとめてある。各構造体からのそれぞれの生体適合性有機組成物をすでに説明したようにしてリンスした後、アンチトロンビンIII 結合活性を測定した。
【００６７】
ヘパリンを構造体に付加したとき、平均アンチトロンビンIII 結合活性は１０８ｐｍｏｌ／ｃｍ２であった。構造体にデキストランを付加すると、平均アンチトロンビンIII 結合活性は基板材料１ｃｍ２につき９８ピコモルになった。構造体に硫酸デキストランを付加したとき、平均アンチトロンビンIII 結合活性は基板材料１ｃｍ２につき１３４ピコモルであった。さらに、ポリエチレングリコールにより、平均アンチトロンビンIII 結合活性は基板材料１ｃｍ２につき１２９ピコモルになった。興味深いことに、これらの値は、殺菌していない対照サンプルの平均値である基板材料１ｃｍ２につき１０３ピコモルよりも大きい。
【００６８】
無機物である塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を構造体に付加したとき、固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性は基板材料１ｃｍ２につき７５ピコモルであった。構造体にデキサメタゾンを付加すると、平均アンチトロンビンIII 結合活性は基板材料１ｃｍ２につき４２ピコモルになった。ＤＥＡＥデキストランは固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を低下させるらしく、基板材料１ｃｍ２につき平均活性が５ピコモルであった。
【００６９】
これらの結果から、固定化されたヘパリンと被覆材料に非共有結合した適切な生体適合性組成物があると、ＥｔＯ殺菌の後に、末端が結合したヘパリンがアンチトロンビンIII 結合活性を維持又は増大させる能力を持つことがわかる。
【００７０】
実施例３
本実施例では、埋め込み型医療機器の１つの要素である基板材料上の、ポリマー被覆材料に末端が結合したヘパリンが有する大きいアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）結合活性を生み出す、追加の生体適合性組成物の能力について説明する。
【００７１】
この実施例で用いる埋め込み型医療機器は、多孔性の延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料からなるチューブをニチノール・ワイヤで補強した形態のものであり、Ｗ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＶＩＡＢＡＨＮ（登録商標）内部人工器官という商品名で入手した。このチューブ状機器は、長さが１５ｃｍ、直径が６ｍｍであった。
【００７２】
ＶＩＡＢＡＨＮ（登録商標）内部人工器官は送達用カテーテルの内部に拘束されていたため、ヘパリンをその表面に固定化する前にカテーテルから取り出す必要があった。カテーテルに拘束された各機器は、処理のため、拘束用のシースに取り付けた紐を引っ張り、そのシースを機器の周囲から解放することによって取り出した。各機器は、非拘束状態になると膨張し、独立した基板材料として使用した。それぞれの基板材料（内部人工器官機器）を、体積比が３０：７０のＰＥＩ溶液（ＤＩ水の中に５％）とＩＰＡ（ＵＳＰグレード）に約１２時間浸し、ポリマー被覆材料（１８）を基板材料（１２）の表面に付着させた。ポリマー被覆材料（１８）は複数の反応性化学基（１６）を備えており、アルデヒドで修飾された複数のヘパリン分子（１７）の末端を最終的にその反応性化学基に結合させた。
【００７３】
少なくとも１つの追加の被覆材料（１８Ａ、１８Ｂ）層を第１のＰＥＩ層（１８）の上に配置した。これは、各内部人工器官機器を別のシリコーン製チューブの中に配置し、そして、そのチューブを蠕動ポンプと溶液リザーバに接続することによって実施した。こうすることにより、被覆材料を含む追加の溶液を繰り返してチューブ状医療機器の中心を通過させることができたため、その機器の内面が主にコーティングされた。
【００７４】
上記の動的流れシステムのうちの１つの中に各内部人工器官が収容された状態で、体積％比が４５：５５の０.１０％（ｐＨ９.０）ＰＥＩとＩＰＡ水溶液の形態になった被覆材料（１８）を約２０分間その内部人工器官の中を通過させた。次に各内部人工器官をＤＩ水（ｐＨ９.０）の中で５分間リンスし、０.０５％グルタルアルデヒド水溶液（ｐＨ９.０）に２０分間曝露することによってＰＥＩ層を架橋させた。次にこれらの内部人工器官を再びＰＥＩ水溶液（０.１０％、ｐＨ９.０）で５分間リンスした。得られたイミンをシアンホウ水素化ナトリウム溶液（１リットルのＤＩ水の中に５ｇ、ｐＨ９.０）で１５分間還元し、ＤＩ水の中で３０分間リンスした。
【００７５】
中間イオン電荷層を各内部人工器官の架橋したＰＥＩ層の上に配置するため、硫酸デキストランと塩化ナトリウムの溶液（０.１５ｇの硫酸デキストランと１００ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３）を動的流れシステムの中とＰＥＩ層の上を６０℃にて約９０分間流した。その後、このシステムをＤＩ水で１５分間リンスした。
【００７６】
ＰＥＩの“キャップ”層（１８Ｂ）をイオンで帯電した硫酸デキストラン層（１８Ａ）に付加するため、ＰＥＩ水溶液（０.０７５％、ｐＨ９.０）を動的流れシステムの中を約４５分間流した後、塩化ナトリウム溶液（５０ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした）の中で１５分間リンスした。リンスの後、ＤＩ水を２.５分間という短時間吹きかけた。
【００７７】
アルデヒドで修飾されたヘパリンの末端をＰＥＩ層に結合又は共役させるため、６０℃のヘパリン含有塩化ナトリウム溶液（１５ｇのヘパリンと２９.３ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３.９）の中に構造体を１２０分間入れた。体積２.８６ｍｌの２.５％(ｗ／ｖ)ＮａＣＮＢＨ３水溶液を１リットルのヘパリン溶液に添加してから１０分後、そのステップを開始した。ＤＩ水の中で１５分間１回目のリンスを行なった後、ホウ酸塩緩衝溶液（０.７ｇのＮａＣｌと、１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で約２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。次に、構造体を凍結乾燥させた。選択したサンプルをトルイジン・ブルーで染色すると、表面が一様に紫色になった。これは、ヘパリンが一様に結合していることを示す。
【００７８】
上記の実施例２で説明した研究で得られた結果に基づき、ＵＳＰグレードのヘパリン（ナトリウム塩）と、ＤＩ水１００ｍｌにつき０.５ｇの濃度にした８，０００ＭＷの硫酸デキストラン（ナトリウム塩）を好ましい生体適合性有機組成物として選択し、ＥｔＯ殺菌中と殺菌後の固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を維持又は安定化させた。
【００７９】
それぞれの好ましい生体適合性有機組成物に関し、ポリマー被覆材料に末端が結合したヘパリンを有する内部人工器官の断片を、その生体適合性有機組成物の溶液（それぞれ１００ｍｌのＤＩ水に０.５ｇの濃度、ｐＨ９.６）を収容したプラスチック製チューブの中に配置し、６０℃にて１時間インキュベートした。処理した各サンプルをプラスチック製チューブから取り出し、凍結乾燥させた。
【００８０】
凍結乾燥させた各サンプルを個別のＴｏｗｅｒ  ＤＵＡＬＰＥＥＬ（登録商標）自己気密パウチ（アリージャンス・ヘルスケア社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封し、ＥｔＯで殺菌した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【００８１】
酸化エチレンを用いた殺菌の後、各構造体をパウチから取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間に洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。
【００８２】
ＥｔＯ殺菌した各機器から基板材料のサンプル（長さ約０.５ｃｍ）を切り出し、そして上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、固定化されたヘパリンの生物活性を測定した。サンプルは、分析プロセスを通じて湿潤な状態に維持した。結果は、機器の全表面積（すなわち反管腔側の面と管腔面の両方）ではなく、各機器の管腔面で測定した基板材料の単位面積当たりのアンチトロンビンIII に結合したピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【００８３】
図１０は、ヘパリンと硫酸デキストランの形態である別々の生体適合性有機組成物が、ＥｔＯによる殺菌中及び殺菌後に、被覆された基板材料に固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性に及ぼす効果を示す棒グラフである。アンチトロンビンIII 結合活性は、基板材料１平方センチメートル当たりの結合したアンチトロンビンIII のピコモル数として表わす。結果からわかるように、生体適合性有機組成物としてヘパリンと硫酸デキストランを用いると、ＥｔＯ殺菌後に、固定化されたヘパリンに対するアンチトロンビンIII 結合活性は大きく、それぞれ基板材料１ｃｍ２につき９７ピコモルと９１ピコモルである。どの棒も、ｎ＝６個のサンプルの平均値を表わしている。
【００８４】
実施例４
本実施例では、本発明の一実施態様の構造体として、アルデヒドで修飾されたヘパリンの末端を、イオン的に中性の第１の被覆層を含むポリマー被覆材料に結合させた構造体について説明する。この構造体のヘパリン−ＡＴIII 結合は、ＥｔＯ殺菌によって著しくは減少しなかった。
【００８５】
この構造体でベースコーティングとして用いる被覆材料は、ヘパリン含有の被覆材料又はコーティングが、イオン電荷を本質的に持たないように選択した。ポリビニルアルコールとＰＥＩを被覆材料として使用した。
【００８６】
米国特許第６，６５３，４５７号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に従い、アルデヒドで修飾されたヘパリン組成物の末端を、被覆された基板材料に結合させた。基板材料（１２）は、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料であった。追加の生体適合性有機組成物（１００）を構造体のヘパリン含有被覆材料（１８）に組み込み、ＥｔＯ殺菌によってヘパリンの生物活性が著しく低下しないようにした。
【００８７】
シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手した。被覆材料層又はベースコーティングをｅＰＴＦＥ基板材料に適用させるため、その被覆材料を直径１０ｃｍのプラスチック製刺繍用環状部材に取り付け、その支持されたｅＰＴＦＥ材料をまず最初に１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に約５分間浸した。その後、そのｅＰＴＦＥ材料をＵＳＰグレードのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（スペクトラム社）の２％水溶液に１５分間浸した。ＤＩ水の中で１５分間リンスした後、ＰＶＡ層を２％のグルタルアルデヒドと１％の塩酸（ＨＣｌ）を含む水溶液に１５分間曝露し、その場でＰＶＡ（１８）を架橋させた（１９）。この構造体をＤＩ水の中で１５分間リンスした後、ＤＩ水による２回目の１５分間のリンスを行なった。得られた架橋したＰＶＡベースコーティングは、正味のイオン電荷を持っていなかった。
【００８８】
ポリマー被覆材料（１８Ａ）からなる別の層を構造体に付加するため、その構造体を０.１５％ＰＥＩ水溶液（ｐＨ１０.５）に３０分間浸した。得られたイミンを還元するため、構造体をシアンホウ水素化ナトリウム水溶液（１リットルのＤＩ水の中に５ｇ、ｐＨ１０.５）に１５分間浸した。構造体をＤＩ水の中で１５分間リンスした後、ＤＩ水による２回目の１５分間のリンスを行なった。
【００８９】
表面に複数の反応性化学基を有する被覆されたｅＰＴＦＥ基板材料を、６０℃にしたヘパリン溶液（１.０ｇのヘパリンと２９.３ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３.９）に９０分間浸した。体積２.８６ｍｌの２.５％(ｗ／ｖ)ＮａＣＮＢＨ３水溶液を１リットルのヘパリン溶液に添加した後、このステップを開始した。ＤＩ水の中で１５分間１回目のリンスを行なった後、ホウ酸塩緩衝溶液（０.７ｇのＮａＣｌと、１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で約２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。次に、構造体を凍結乾燥させた。次に、構造体のサンプルをトルイジン・ブルーで染色した。この染色により、表面が一様に紫色になった。これは、ヘパリンが、被覆されたｅＰＴＦＥ材料の表面に一様に結合していることを示す。
【００９０】
ＵＳＰグレードの８，０００ＭＷの硫酸デキストラン（ナトリウム塩）（シグマ社）の形態になった生体適合性有機組成物を含む水溶液で構造体を処理するため、その構造体を６０℃にした１００ｍｌの処理溶液（０.５ｇの硫酸デキストラン／１００ｍｌのＤＩ水、ｐＨ９.６）に１時間浸した。構造体を処理溶液から取り出し、凍結乾燥させた。
【００９１】
凍結乾燥させた各サンプルをＴｏｗｅｒ  ＤＵＡＬＰＥＥＬ（登録商標）自己気密パウチ（アリージャンス・ヘルスケア社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れ、ＥｔＯで殺菌した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【００９２】
ＥｔＯ殺菌の後、各構造体（対照を含む）をパウチから取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。
【００９３】
ヘパリンの末端が結合した膜のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。サンプルは、分析プロセスを通じて湿潤な状態に維持した。結果は、基板材料の単位面積当たりアンチトロンビンIII に結合したピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【００９４】
図１１は、ＥｔＯによる殺菌後に、硫酸デキストランの形態である生体適合性有機組成物が、延伸多孔性ポリテトラフルオロエチレン基板材料、並びにポリビニルアルコール及びＰＥＩの被覆材料に、末端が固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性に及ぼす影響を示す棒グラフである。固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性は、基板材料１平方センチメートル当たりのアンチトロンビンIII に結合したピコモル数として表わす。
【００９５】
殺菌していない対照サンプルのアンチトロンビンIII 結合活性は、基板材料１平方センチメートル当たり１５０ピコモルであった。殺菌した対照サンプルのアンチトロンビンIII 結合活性は、基板材料１平方センチメートル当たり９３ピコモルであった。酸化エチレンで殺菌したサンプルを硫酸デキストランで処理したものは、アンチトロンビンIII 結合活性が基板材料１平方センチメートル当たり１１５ピコモルであった。この値は、酸化エチレンで殺菌した機器を硫酸デキストラン処理溶液に曝露しなかった場合の対照値（すなわち基板材料１平方センチメートル当たり９３ピコモル）よりも大きかった。これは、付加された硫酸デキストランにより、ＥｔＯ殺菌の後に、固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性が増大したことを示している。これら構造体のどちらも、非処理でＥｔＯを用いずに殺菌した対照（基板材料１平方センチメートル当たり１５０ピコモル）よりもアンチトロンビンIII 結合活性が著しく低かった。
【００９６】
結果からわかるように、硫酸デキストランは、ＥｔＯ後、イオン的に中性の第１の被覆層を含むポリマー被覆材料を有する構造体に固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性に大きな影響を与えた。どの棒も、ｎ＝３個のサンプルの平均値を表わしている。
【００９７】
実施例５
本実施例では、追加の生体適合性有機組成物が、ヘパリンの生物活性を大きく低下させるのに十分な大きさの機械的応力を印加している間及び印加後に、被覆された基板材料に固定化された生物活性を有するヘパリンの生物活性を維持又は増大させる能力について説明する。
【００９８】
この実施例では、上記の実施例３に記載したようにして、管腔内人工器官の形態の埋め込み型医療機器にヘパリン含有コーティングを設けた。各人工器官は、多孔性の延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料からなるチューブをニチノール・ワイヤで補強した形態のものであり、Ｗ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＶＩＡＢＡＨＮ（登録商標）内部人工器官という商品名で入手した。このチューブ状機器は、長さが１５ｃｍ、直径が６ｍｍであった。機器の表面にヘパリン含有コーティングを形成するのに実施例３に詳述したのと同じ方法を利用した。
【００９９】
生体適合性有機組成物（１００）で処理するため、アルデヒドで修飾されたヘパリン（１７）が少なくとも一部に結合したポリマー被覆材料（１８）を用い、管腔内機器の基板材料（１２）を製造した。製造した機器の断片をプラスチック製チューブの中に配置し、６０℃のグリセロール溶液（１００ｍｌのＤＩ水の中に５ｍｌのシグマ−オールドリッチ社のシグマウルトラ・グリセロール、ｐＨ９.６）とともに１時間インキュベートした。処理した各機器をプラスチック製チューブから取り出して凍結乾燥させた。
【０１００】
円筒形の各内部人工器官を血管内送達システムの上に配置し、拘束用のシースを用いて送達システムに拘束するのに十分な小ささになるまで機械的に圧縮した。実施例３に従って作った機器は、コーティング中に組み込まれたヘパリンの活性を著しく低下させることなく、送達システム上の内部人工器官の圧縮に伴う機械的応力に耐えることができる。
【０１０１】
試験する各内部人工器官に対して正反対の操作である圧縮及び延伸をさせている間、末端が結合されたヘパリンの生物活性が維持されるよう、非共有結合する生体適合性有機組成物（１００）としてグリセロールを選択した。対照となる各内部人工器官の断片は、末端が結合した（すなわち共有結合した）ヘパリン（１７）とポリマー被覆材料（１８）に加えて非共有結合した生体適合性グリセロール組成物（１００）を含むことはなかった。各内部人工器官を凍結乾燥させた。
【０１０２】
送達システムの上で管腔内機器を圧縮してコンパクトにするため、各内部人工器官を引っ張り、直径が固定されたテーパー状漏斗の中を通過させた。各内部人工器官には、引っ張って漏斗の中を通過させるため、一端に６本の縫合糸（Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ（登録商標）ＣＶ−０、０Ｎ０５）が縫い付けられていた。各内部人工器官を引っ張ることにより直径が約３ｍｍである２５ｍｌのピペットの先端（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、製品番号３５７５２５）の開口部を通過させ、そして直径が約３.１ｍｍのガラス製チューブの中に入れることで、各内部人工器官をコンパクトな状態に保持した。
【０１０３】
圧縮の後、各内部人工器官を３７℃の０.９％生理食塩水の中で広げ、リンスし、この明細書に記載したようにしてアンチトロンビンIII 結合活性を調べた。結果を図１２に示してある。試験用の各内部人工器官を作るため、ＤＩ水の中で１５分間洗浄した後、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸、２.７ｇのＮａＯＨ、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。
【０１０４】
各内部人工器官からヘパリン含有材料のサンプル（長さ約０.５ｃｍ）を切り出し、そして上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用して、その固定化されたヘパリンの生物活性を測定した。サンプルは、分析プロセスを通じて湿潤な状態に維持した。結果は、基板材料の単位面積当たりのアンチトロンビンIII 結合のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１０５】
図１２は、ヘパリンが固定化されたグリセロール組成物が、圧縮及び延伸の後に、被覆された基板材料に及ぼす効果を示す棒グラフである。結果から、固定化されたヘパリンにグリセロールを付加すると、その固定化されたヘパリンの圧縮及び延伸の後に、結合したヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性は、グリセロールが付加されていない同様の処理をされた対照サンプルと比較して著しく大きくなることがわかる。鉛直方向のどの棒も、ｎ＝３個のサンプルの平均値を表わしている。
【０１０６】
生体適合性有機グリセロール組成物が付加されていないポリマー被覆材料に固定化されたヘパリンに対して正反対の操作である圧縮及び延伸を行なうと、同様の構成になっていて同様の処理をした対照材料にその正反対の操作である圧縮及び延伸を行なわなかった場合（１３７ｐｍｏｌ／ｃｍ２）と比較し、アンチトロンビンIII 結合活性が著しく低下した（８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）。ヘパリンが固定化された被覆された基板材料を生体適合性有機グリセロール組成物で処理し、処理しない構造体と同じ機械的操作を施すと、固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性は、対照材料と似た値に留まった（１２９ｐｍｏｌ／ｃｍ２）。
【０１０７】
実施例６
本実施例では、生体適合性有機組成物の付加が、圧縮、延伸、ＥｔＯ殺菌という操作を施した後に、実施例３と５に記載したコーティングされた医療機器のアンチトロンビンIII 結合活性に及ぼす効果について説明する。
【０１０８】
本実施例で用いる埋め込み型医療機器は、実施例３に記載したのと同様にして構成した。この医療機器は、多孔性の延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料からなるチューブをニチノール・ワイヤで補強した形態のものであり、Ｗ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＶＩＡＢＡＨＮ（登録商標）内部人工器官という商品名で入手した。このチューブ状機器は、長さが１５ｃｍ、直径が６ｍｍであった。この機器の表面にヘパリン含有コーティングを形成するのに実施例３に詳述したのと同じ方法を利用した。
【０１０９】
生体適合性有機組成物（１００）で処理するため、アルデヒドで修飾されたヘパリン（１７）が少なくとも一部に結合したポリマー被覆材料（１８）を用い、管腔内機器の基板材料（１２）を作成した。製造した機器をプラスチック製チューブの中に配置し、ヘパリンとグリセロールとの溶液（１００ｍｌのＤＩ水の中に０.５ｇのＵＳＰヘパリンと５ｍｌのグリセロールを溶かした、ｐＨ９.６）とともに６０℃にて１時間インキュベートした。実施例２、３、及び５の結果に基づいてこれらの化合物を選択した。処理した各機器をヘパリンとグリセロールとの溶液から取り出して凍結乾燥させた。機器に対する以後の処理及び分析は、上記の実施例５と同じであった。
【０１１０】
図１３は、グリセロール及びヘパリンの形態である生体適合性物質が持つ、基板材料上のポリマー被覆材料に固定化されたヘパリンの、生物活性を維持するための能力を示す棒グラフである。これは、基板、及びヘパリンが固定化されたポリマー被覆材料への、ＥｔＯ殺菌操作、並びに圧縮及び延伸という機械的操作の暴露の、操作中と操作後の両方で、生物活性を維持する能力である。鉛直方向のどの棒も、ｎ＝３個のサンプルの平均値を表わしている。
【０１１１】
生体適合性有機組成物であるグリセロール及びヘパリンが付加されておらず、且つＥｔＯ殺菌操作、並びに正反対の操作である圧縮及び延伸という操作に暴露された、ヘパリン固定の被覆された基板材料では、アンチトロンビンIII 結合活性が、ＥｔＯ殺菌操作、並びに正反対の操作である圧縮及び延伸という操作を施していない、同様の構成で同様の処理をした対照材料（１５８ｐｍｏｌ／ｃｍ２）と比較し、著しく低下した（６３ｐｍｏｌ／ｃｍ２）。ヘパリン固定の被覆された基板材料を生体適合性有機組成物であるグリセロール及びヘパリンで処理し、その処理をしていない構造体と同じＥｔＯ殺菌条件及び機械的操作にさらすと、固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性はその対照材料と似た値に留まった（１４７ｐｍｏｌ／ｃｍ２）。
【０１１２】
実施例７
本実施例では、ヘパリンでコーティングされた市販の医療機器のアンチトロンビンIII 結合活性が比較的小さいことを示す。この機器は、長さが５０ｃｍ、直径が６ｍｍで、殺菌されて包装されたヘパリンがコーティングされた移植血管であり、ジョテック社（ヘヒンゲン、ドイツ）からＦＬＯＷＬＩＮＥ  ＢＩＰＯＲＥ（登録商標）ヘパリンコーティング移植血管（カタログ番号１５ＴＷ５００６Ｎ）という商品名で入手できた。製造者によると、このチューブ状移植血管は、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料でできており、ヘパリンがこのグラフトの管腔面に共有結合とイオン結合によって結合している。ヘパリンは安定でｅＰＴＦＥに永久的に結合していると製造者は述べている。ヘパリン含有グラフトの表面は抗血栓であるとのことである。
【０１１３】
このヘパリン含有移植血管のサンプル（長さ０.５ｃｍ）を入手し、上記の実施例２に記載したようにして試験した。本発明の材料と同様、移植血管のアンチトロンビンIII 結合活数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。前の実施例と同様、機器の全表面積ではなく、各機器の管腔の表面積だけを測定した。ＡＴIII 結合分析の結果から、生物活性を有するヘパリンが移植血管の管腔面に存在しているという製造者の主張にもかかわらず、アンチトロンビンIII 結合活性は見られなかった。アンチトロンビンIII 結合活性分析では、基板材料１平方センチメートル当たり約５ピコモル（５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）以上のレベルのアンチトロンビンIII 結合活性を検出できることに注意されたい。
【０１１４】
実施例８
本実施例では、生体適合性有機組成物としてのペプチド抗生剤を、被覆又はコーティングされた基板材料に固定化された生物活性を有するヘパリンと組み合わせて利用することについて説明する。この構造体は、ＥｔＯ殺菌の後に顕著なＡＴIII 結合を示した。
【０１１５】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ―４０６）という商品名で入手し、実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施した。
【０１１６】
上記の構造体をバシトラシン（７２，０００単位／グラム）の溶液（１００ｍｌの脱イオン水（ＤＩ水）に０.５ｇの濃度）に曝露するため、その構造体を１００ｍｌのバシトラシン溶液に室温にて３時間浸した。構造体を溶液から取り出し、凍結乾燥させた後、殺菌手続きを実施した。
【０１１７】
ＥｔＯ殺菌のための準備として、凍結乾燥させた各構造体をＴｏｗｅｒ  ＤＵＡＬＰＥＥＬ（登録商標）自己気密パウチ（アリージャンス・ヘルスケア社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【０１１８】
ＥｔＯ殺菌の後、構造体をパウチから取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１０００ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。
【０１１９】
ヘパリンの末端が結合した膜のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。サンプルは、分析プロセスを通じて湿潤な状態に維持した。結果は、基板材料の単位面積当たりの結合したアンチトロンビンIII のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１２０】
バシトラシンで処理した後に酸化エチレンで殺菌したサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性が９ｐｍｏｌ／ｃｍ２であった（ｎ＝３）。
【０１２１】
実施例９
本実施例では、被覆又はコーティングされた基板材料に固定化された生物活性のあるヘパリンをＥｔＯ殺菌した後、生体適合性有機組成物を付加することについて説明する。本実施例では、生体適合性有機組成物としてペプチド抗生剤を選択した。このようにして処理した構造体は、ＥｔＯ殺菌の後、顕著なヘパリン−ＡＴIII 結合を有していた。
【０１２２】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手し、実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施した。
【０１２３】
ＥｔＯ殺菌のため、凍結乾燥させた各構造体をＴｏｗｅｒ  ＤＵＡＬＰＥＥＬ（登録商標）自己気密パウチ（アリージャンス・ヘルスケア社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【０１２４】
ＥｔＯ殺菌の後、構造体をＮＵＡＩＲＥバイオハザード対策用安全キャビネット、クラスII、タイプＡ／Ｂ３、モデルＮＵ−４２５−６００（プリマス、ミネソタ州）の中で無菌状態で処理した。
【０１２５】
サイズが約１平方センチメートル（１ｃｍ２）の殺菌したサンプルを構造体から切り出し、そして濾過殺菌したバシトラシン溶液（ホスピラ社から購入した０.９％塩化ナトリウム洗浄溶液１０ｍｌに７７０００単位／ｇのものを６４９.４ｍｇ溶かした）に浸したところ、ＵＳＰグレードの０.９％塩化ナトリウム洗浄溶液１ｍｌにつき約５０００単位の濃度になった。サンプルを室温にて２分間このバシトラシン溶液に曝露した。
【０１２６】
サンプルを溶液から取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸、２.７ｇのＮａＯＨ、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。
【０１２７】
ヘパリンの末端が結合したシート材料のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。サンプルは、分析プロセスを通じて湿潤な状態に維持した。結果は、基板材料の単位面積当たりの結合したアンチトロンビンIII のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１２８】
最初に酸化エチレンで殺菌し、次いでバシトラシンを用いて処理したサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性が１８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２であった（ｎ＝３）。この結果からわかるように、被覆された基板材料に固定化された生物活性のあるヘパリンを殺菌した後に、そのヘパリンの生物活性を著しく低下させることなく治療剤をそのヘパリンと混合することができる。
【０１２９】
実施例１０
本実施例では、被覆された基板材料に固定化された生物活性のあるヘパリンを生体適合性有機組成物と混合し、ＥｔＯ殺菌し、そして最後にペプチド抗生剤で処理することについて説明する。このようにして処理した構造体は、顕著なヘパリン−ＡＴIII 結合を有する。
【０１３０】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手し、実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施した。
【０１３１】
上記の構造体を、１００ｍｌのＤＩ水につき０.５ｇの濃度にしてｐＨを９.６に調節したポリエチレングリコール（分子量２０，０００、シグマ社）の溶液に曝露した。構造体をビーカーの中に入れ、１００ｍｌのポリエチレングリコール溶液を添加して構造体をその溶液の中に完全に浸した。構造体を６０℃にて１時間そのポリエチレングリコール溶液に曝露した。構造体を溶液から取り出し、凍結乾燥させた後、殺菌手続きを行なった。
【０１３２】
ＥｔＯ殺菌のため、凍結乾燥させた構造体をＣｏｎｖｅｒｔｏｒｓ（登録商標）自己気密パウチ（カーディナル・ヘルス社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【０１３３】
ＥｔＯ殺菌の後、構造体をＮＵＡＩＲＥバイオハザード対策用安全キャビネット、クラスII、タイプＡ／Ｂ３、モデルＮＵ−４２５-６００（プリマス、ミネソタ州）の中で無菌状態で処理した。
【０１３４】
サイズが約１平方センチメートル（１ｃｍ２）の殺菌したサンプルを構造体から切り出した後、濾過殺菌したバシトラシン溶液（０.９％塩化ナトリウム洗浄溶液１０ｍｌに７７０００単位／ｇのものを６４９.４mｇ溶かした）に浸したところ、ＵＳＰグレードの０.９％塩化ナトリウム洗浄溶液１ｍｌにつき約５０００単位の濃度になった。サンプルを室温にて２分間このバシトラシン溶液に曝露した。
【０１３５】
サンプルを溶液から取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸、２.７ｇのＮａＯＨ、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした。
【０１３６】
ヘパリンの末端が結合した膜のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。サンプルは、分析プロセスを通じて湿潤な状態に維持した。結果は、基板材料の単位面積当たりのアンチトロンビンIII に結合したピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１３７】
最初にポリエチレングリコールで処理し、酸化エチレンで殺菌し、次いでバシトラシンで処理したサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性が１９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２であった（ｎ＝３）。したがって、生物活性のあるヘパリンが固定化されていて、そのヘパリンに第１の生体適合性有機組成物（ＰＥＧ）が混合された、殺菌済みの被覆された基板材料は、ＥｔＯ殺菌の後に第２の生体適合性有機組成物（バシトラシン）でさらに処理するとき、顕著なＡＴIII 結合活性を維持することができる。
【０１３８】
実施例１１
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたデキストラン）を被覆材料に共有結合させることについて説明する。この組成物をＥｔＯで殺菌した後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１３９】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手した。このｅＰＴＦＥ材料には実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施したが、構造体をコーティングした後、凍結乾燥させるのではなく、ＤＩ水の中に保管した。
【０１４０】
被覆材料でコーティングされた上記の構造体を、アルデヒドで活性化させたデキストラン（分子量４０，０００、ピアス社）溶液（アルデヒドで活性化させたデキストラン０.０５０ｇとＮａＣｌ２.９３ｇを１００ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ５.５）に６０℃にて１２０分間曝露した。体積０.２８６ｍｌの２.５％(ｗ／ｖ)ＮａＣＮＢＨ３水溶液をアルデヒドで活性化させたデキストラン溶液１００ｍｌに添加した後、サンプルを添加した。
【０１４１】
アルデヒドで活性化させたデキストラン溶液から構造体を取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１，０００ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、ｅＰＴＦＥ材料に結合した乾燥ヘパリンを生成させた。
【０１４２】
ＥｔＯ殺菌のための準備として、凍結乾燥させた構造体をＣｏｎｖｅｒｔｏｒｓ（登録商標）自己気密パウチ（カーディナル・ヘルス社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【０１４３】
ヘパリンの末端が結合した殺菌済みの膜のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。結果は、基板材料の単位面積当たりの結合したアンチトロンビンIII のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１４４】
本実施例で記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２であった（ｎ＝３）。本実施例から、末端が共有結合したヘパリンに加え、生体適合性有機組成物をコーティング層に共有結合させたとき、ＥｔＯ殺菌の後にヘパリンの大きな活性を維持できることがわかる。
【０１４５】
実施例１２
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコール、分子量１，０００）を被覆材料に共有結合させることについて説明する。この組成物をＥｔＯ殺菌した後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１４６】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手した。このｅＰＴＦＥ材料には実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施したが、構造体をコーティングした後、凍結乾燥させるのではなく、ＤＩ水の中に保管した。
【０１４７】
被覆材料でコーティングされた上記の構造体を、アルデヒドで活性化させたＰＥＧ（分子量１，０００、ナノックス社）溶液（０.２０ｇのＰＥＧと３.９０ｇのＮａＣｌを１３３ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ５.５）に６０℃にて１２０分間曝露した。体積０.３８０ｍｌの２.５％(ｗ／ｖ)ＮａＣＮＢＨ３水溶液を１００ｍｌのＰＥＧ溶液に添加した後、サンプルを添加した。
【０１４８】
構造体をＰＥＧ溶液から取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１，０００ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、ｅＰＴＦＥ材料に結合した乾燥ヘパリンを生成させた。
【０１４９】
ＥｔＯ殺菌のための準備として、凍結乾燥させた構造体をＣｏｎｖｅｒｔｏｒｓ（登録商標）自己気密パウチ（カーディナル・ヘルス社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【０１５０】
ヘパリンの末端が結合した殺菌済みの膜のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。結果は、基板材料の単位面積当たりの結合したアンチトロンビンIII のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１５１】
本実施例で記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が９６ｐｍｏｌ／ｃｍ２であった（ｎ＝３）。本実施例から、末端が共有結合したヘパリンに加え、生体適合性有機組成物をコーティング層に共有結合させたとき、ヘパリンは大きな活性を維持できることがわかる。
【０１５２】
実施例１３
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコール、分子量５，０００）を被覆材料又はコーティング材料に共有結合させることについて説明する。この組成物をＥｔＯ殺菌した後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１５３】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手した。このｅＰＴＦＥ材料には実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施したが、構造体をコーティングした後、凍結乾燥させるのではなく、ＤＩ水の中に保管した。
【０１５４】
被覆材料でコーティングされた上記の構造体を、アルデヒドで活性化させたＰＥＧ（分子量５，０００、ナノックス社）溶液（０.２０ｇのＰＥＧと３.９０ｇのＮａＣｌを１３３ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ５.５）に６０℃にて１２０分間曝露した。体積０.３８０ｍｌの２.５％(ｗ／ｖ)ＮａＣＮＢＨ３水溶液を１００ｍｌのＰＥＧ溶液に添加した後、サンプルを添加した。
【０１５５】
構造体をＰＥＧ溶液から取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１，０００ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、ｅＰＴＦＥ材料に結合した乾燥ヘパリンを生成させた。
【０１５６】
ＥｔＯ殺菌のための準備として、凍結乾燥させた構造体をＣｏｎｖｅｒｔｏｒｓ（登録商標）自己気密パウチ（カーディナル・ヘルス社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【０１５７】
ヘパリンの末端が結合した殺菌済みの膜のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。結果は、基板材料の単位面積当たりの結合したアンチトロンビンIII のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１５８】
本実施例で記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が６４ｐｍｏｌ／ｃｍ２であった（ｎ＝３）。本実施例から、末端が共有結合したヘパリンに加え、生体適合性有機組成物をコーティング層に共有結合させたとき、ヘパリンは大きな活性を維持できることがわかる。
【０１５９】
実施例１４
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（ＥＤＣで活性化させたＵＳＰヘパリン）を被覆材料に共有結合させることについて説明する。この組成物をＥｔＯ殺菌した後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１６０】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手した。このｅＰＴＦＥ材料には実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施したが、構造体をコーティングした後、凍結乾燥させるのではなく、ＤＩ水の中に保管した。
【０１６１】
末端が結合したヘパリンをすでに含むＰＥＩ層にＵＳＰグレードのヘパリンを結合又は共役させるため、ＵＳＰグレードのヘパリンを含む６０℃の塩化ナトリウム溶液（１５ｇのＵＳＰヘパリンと２９.３ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３.９）の中に１２０分間構造体を入れた。０.１ＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ＢｕｐＨ（登録商標）ＭＥＳ緩衝化生理食塩水（ピアス社）と、１５ｇのＵＳＰヘパリンと、２９.３ｇのＮａＣｌと、０.２０ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）と、０.１３ｇのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）とを１リットルのＤＩ水に溶かした溶液（ｐＨ５.５）に構造体を移し、４時間室温にした。
【０１６２】
構造体を上記溶液から取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１，０００ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、ｅＰＴＦＥ材料に結合した乾燥ヘパリンを生成させた。
【０１６３】
ＥｔＯ殺菌のための準備として、凍結乾燥させた構造体をＣｏｎｖｅｒｔｏｒｓ（登録商標）自己気密パウチ（カーディナル・ヘルス社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【０１６４】
ヘパリンの末端が結合した殺菌済みの膜のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。結果は、基板材料の単位面積当たりの結合したアンチトロンビンIII のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１６５】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が３１ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。本実施例から、末端が共有結合したヘパリンに加え、生体適合性有機組成物をコーティング層に共有結合させたとき、ヘパリンは大きな活性を維持できることがわかる。
【０１６６】
実施例１５
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、そのヘパリンをそのコーティング層に２回目の共有結合をさせることについて説明する。末端が共有結合したヘパリンの２回目の共有結合を実現するため、カルボン酸基をＥＤＣで活性化させ、そしてコーティング層に存在する残った第一級アミノ基と反応させた。この組成物をＥｔＯで殺菌した後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１６７】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手した。このｅＰＴＦＥ材料には実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施したが、構造体をコーティングした後、凍結乾燥させるのではなく、ＤＩ水の中に保管した。
【０１６８】
０.１ＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ＢｕｐＨ（登録商標）ＭＥＳ緩衝化生理食塩水（ピアス社）と、１５ｇのＵＳＰヘパリンと、２９.３ｇのＮａＣｌと、０.２０ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）と、０.１３ｇのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）とを１リットルのＤＩ水に溶かした溶液（ｐＨ５.５）に膜を移し、４時間室温にした。
【０１６９】
構造体を上記溶液から取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１，０００ｍｌのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、ｅＰＴＦＥ材料に結合した乾燥ヘパリンを生成させた。
【０１７０】
ＥｔＯ殺菌のための準備として、凍結乾燥させた構造体をＣｏｎｖｅｒｔｏｒｓ（登録商標）自己気密パウチ（カーディナル・ヘルス社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封した。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施した。
【０１７１】
ヘパリンの末端が結合した殺菌済みの膜のサンプル（約１ｃｍ２）を切り出した後、上記のＡＴIII 結合分析法（実施例２）を利用し、その固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を測定した。結果は、基板材料の単位面積当たりの結合したアンチトロンビンIII のピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わした。
【０１７２】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。本実施例から、ヘパリンは、末端を共有結合させることに加えてさらにコーティング層に共有結合させたとき、ＥｔＯ殺菌の後にヘパリンが大きな活性を維持できることがわかる。
【０１７３】
実施例１６
本実施例では、生体適合性有機組成物としてのペプチド抗生剤を、被覆された基板材料に固定化された生物活性のあるヘパリンと組み合わせて用いることについて説明する。この構造体は、機械的圧縮及び延伸の後のアンチトロンビンIII 結合活性が非常に大きかった。
【０１７４】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。次に、実施例８に記載したのと実質的に同等な条件を利用してバシトラシンを適用した。次に、ヘパリン化したこの管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、リンスし、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０１７５】
バシトラシンで処理した後、圧縮し、延伸させたサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が２３４ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０１７６】
実施例１７
本実施例では、事前に圧縮及び延伸をさせた、被覆された基板材料に固定化された生物活性のあるヘパリン対して、生体適合性有機組成物を付加することについて説明する。ペプチド抗生剤を生体適合性有機組成物として選択した。このようにして処理した構造体は、圧縮及び延伸の後でも、顕著なヘパリン−ＡＴIII 結合を有していた。
【０１７７】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した後、実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、延伸させた。次に、実施例９に記載したのと実質的に同等な方法で管腔内人工器官をバシトラシンで処理し、リンスした。次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したようにして試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０１７８】
圧縮し、延伸させた後、バシトラシンを付加したヘパリン化したサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が２０７ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０１７９】
実施例１８
本実施例では、被覆された基板材料に固定化された生物活性のあるヘパリンについて説明する。固定化された生物活性のあるヘパリンを生体適合性有機組成物と混合し、機械的に圧縮し、機械的に延伸させた後、ペプチド抗生剤で処理した。このようにして処理した構造体は、機械的操作の後でも、顕著なヘパリン−ＡＴIII 結合を有していた。
【０１８０】
実施例１７に記載したようにして管腔内人工器官を処理し、試験したが、１点だけ異なっている。それは、実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で圧縮及び延伸を行なう前に、実施例１０に記載したようにしてポリエチレングリコールをヘパリン化管腔内人工器官と混合した点である。
【０１８１】
生体適合性有機組成物と混合したヘパリン化サンプルを圧縮し、延伸させた後にバシトラシンを付加したものは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が２１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０１８２】
実施例１９
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたデキストラン）をその被覆材料に共有結合させることについて説明する。この組成物を機械的に圧縮し、延伸させた後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１８３】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。アルデヒドで活性化させたデキストランを実施例１１に記載したのと実質的に同等な方法でコーティング層に固定化した。次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０１８４】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が１５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０１８５】
実施例２０
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコール、分子量１，０００）をその被覆材料に共有結合させることについて説明する。この組成物を機械的に圧縮し、延伸させた後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１８６】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコールを実施例１２に記載したのと実質的に同等な方法でコーティング層に固定化した。次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０１８７】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が２２１ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０１８８】
実施例２１
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコール、分子量５，０００）をその被覆材料に共有結合させることについて説明する。この組成物を機械的に圧縮し、延伸させた後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１８９】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコールを実施例１３に記載したのと実質的に同等な方法でコーティング層に固定化した。次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０１９０】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が２１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０１９１】
実施例２２
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（ＥＤＣで活性化させたＵＳＰヘパリン）をその被覆材料に共有結合させることについて説明する。この組成物を機械的に圧縮し、延伸させた後、ヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１９２】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化する。実施例１４に記載したのと実質的に同等な方法でＵＳＰヘパリンをコーティング層に固定化した。次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０１９３】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が１５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０１９４】
実施例２３
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、そのヘパリンをそのコーティング層の反応基に２回目の共有結合をさせる。末端が共有結合したヘパリンの２回目の共有結合を実現するため、カルボン酸基をＥＤＣで活性化させ、コーティング層に存在する残った第一級アミノ基と反応させた。この組成物を機械的に圧縮し、延伸させた。その後、この構造体のヘパリンは大きな生物活性を示した。
【０１９５】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。固定化されたヘパリンを、実施例１５に記載したのと実質的に同等な方法でコーティング層にさらに共有結合させた。次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０１９６】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が１４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０１９７】
実施例２４
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、不安定な結合を通じてさらに生体適合性有機組成物をその被覆材料に結合させる。この不安定な結合により、治療化合物を局所的に送達できる一方で、安定に結合したヘパリンは、殺菌と、機械的な圧縮及び延伸の後に顕著なＡＴIII 結合活性を保持した。
【０１９８】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。アルデヒドで修飾された追加のヘパリンの末端を不安定な共有結合を通じてコーティング層に結合させるため、６０℃のヘパリン含有塩化ナトリウム溶液（アルデヒドで修飾されたヘパリン１５ｇとＮａＣｌ ２９.３ｇを１リットルのＤＩ水に溶かす、ｐＨ３.９）の中に構造体を１２０分間入れた。アルデヒドで修飾されたヘパリンを２回目に共役させる間に還元剤ＮａＣＮＢＨ３を添加しなかったことに注意することが重要である。第一級アミンとアルデヒドの間に形成される結合は、還元されない状態に放置される場合、不安定となる。次に、サンプルをＤＩ水の中で１５分間リンスし、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、乾燥ヘパリンをｅＰＴＦＥ材料に結合させた。
【０１９９】
次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、実施例３に記載したようにして殺菌した。次に、実施例５に記載したようにしてその管腔内人工器官を延伸させ、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０２００】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が３１ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２０１】
実施例２５
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、不安定な結合を通じてさらに生体適合性有機組成物を被覆材料に結合させる。この不安定な結合により、治療化合物を局所的に送達できる一方で、安定に結合したヘパリンは、機械的な圧縮及び延伸の後に顕著なＡＴIII 結合活性を保持した。
【０２０２】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。アルデヒドで修飾された追加のヘパリンの末端を不安定な共有結合を通じてコーティング層に結合させるため、６０℃のヘパリン含有塩化ナトリウム溶液（アルデヒドで修飾されたヘパリン１５ｇとＮａＣｌ ２９.３ｇを１リットルのＤＩ水に溶かす、ｐＨ３.９）の中に構造体を１２０分間入れた。アルデヒドで修飾されたヘパリンを２回目に共役させる間に還元剤ＮａＣＮＢＨ３を添加しなかったことに注意することが重要である。第一級アミンとアルデヒドの間に形成される結合は、還元されない状態に放置される場合、不安定となる。次に、サンプルをＤＩ水の中で１５分間リンスし、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、乾燥ヘパリンをｅＰＴＦＥ材料に結合させた。
【０２０３】
次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、延伸させ、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０２０４】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性が５ｐｍｏｌ／ｃｍ２の平均値が１９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２０５】
実施例２６
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、不安定な結合を通じてさらに生体適合性有機組成物をその被覆材料に結合させる。この不安定な結合により、治療化合物を局所的に送達できる一方で、安定に結合したヘパリンは、ＥｔＯ殺菌の後に顕著なＡＴIII 結合活性を保持した。
【０２０６】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手し、実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施した。アルデヒドで修飾された追加のヘパリンの末端を不安定な共有結合を通じてコーティング層に結合させるため、６０℃のヘパリン含有塩化ナトリウム溶液（アルデヒドで修飾されたヘパリン１５ｇとＮａＣｌ ２９.３ｇを１リットルのＤＩ水に溶かす、ｐＨ３.９）の中に構造体を１２０分間入れた。アルデヒドで修飾されたヘパリンを２回目に共役させる間に還元剤ＮａＣＮＢＨ３を添加しなかったことに注意することが重要である。第一級アミンとアルデヒドの間に形成される結合は、還元されない状態に放置される場合、不安定となる。次に、サンプルをＤＩ水の中で１５分間リンスし、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、乾燥ヘパリンをｅＰＴＦＥ材料に結合させた。
【０２０７】
次に、ヘパリン化した材料を実施例２に記載したようにして殺菌し、試験用に切断し、ＡＴIII 結合を分析した。
【０２０８】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が１０８ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２０９】
実施例２７
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコール）を被覆材料に共有結合させ、最後に、混合した生体適合性有機組成物（バシトラシン）を非共有結合で付加する。この組成物は、ＥｔＯ殺菌の後に顕著なＡＴIII 結合活性を保持した。
【０２１０】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手し、実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施した。アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコール（分子量１，０００）を実施例１２に記載したのと実質的に同等な方法で被覆材料に共有結合させた後、バシトラシンを実施例８に記載したようにして混合してこの組成物に非共有結合させた。次にこの組成物を殺菌し、実施例８に記載したようにしてサンプリングし、固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を実施例２に記載したＡＴIII 結合分析法を利用して測定した。
【０２１１】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が１２７ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２１２】
実施例２８
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコール）を被覆材料に共有結合させ、最後に、混合した生体適合性有機組成物（バシトラシン）を非共有結合で付加する。この組成物は、機械的に圧縮し、延伸させた後に顕著なＡＴIII 結合活性を示した。
【０２１３】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。アルデヒドで活性化させたポリエチレングリコール（分子量１，０００）を実施例１２に記載したのと実質的に同等な方法で被覆材料に共有結合させた後、バシトラシンを実施例８に記載したようにして混合してこの組成物に非共有結合させた。次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、試験用に切断し、リンスし、ＡＴIII 結合を分析した。
【０２１４】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が２４９ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２１５】
実施例２９
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたデキストラン）を被覆材料に共有結合させ、最後に、混合した生体適合性有機組成物（デキサメタゾン）を非共有結合で付加する。この組成物は、ＥｔＯ殺菌の後に顕著なＡＴIII 結合活性を示した。
【０２１６】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手し、実施例２と実質的に同じ方法を用いてヘパリン含有コーティングを施した。アルデヒドで活性化させたデキストランを実施例１１に記載したのと実質的に同等な方法で被覆材料に共有結合させた後、デキサメタゾンを混合してこの組成物に非共有結合させ、次いでその組成物を実施例２に記載したようにして殺菌してサンプリングした。固定化されたヘパリンのアンチトロンビンIII 結合活性を実施例２に記載したＡＴIII 結合分析法を利用して測定した。
【０２１７】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が７７ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２１８】
実施例３０
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、生体適合性有機組成物（アルデヒドで活性化させたデキストラン）を被覆材料に共有結合させ、最後に、混合した生体適合性有機組成物（デキサメタゾン）を非共有結合で付加する。この組成物は、機械的に圧縮し、そして延伸させた後に顕著なＡＴIII 結合活性を示した。
【０２１９】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。アルデヒドで活性化させたデキストランを実施例１１に記載したのと実質的に同等な方法で被覆材料に共有結合させた後、デキサメタゾンを実施例２に記載したようにして混合してこの組成物に非共有結合させた。このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、試験用に切断し、リンスし、ＡＴIII 結合を分析した。
【０２２０】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が１９７ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２２１】
実施例３１
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、不安定な結合を通じてさらに生体適合性有機組成物（ポリエチレングリコール）をその被覆材料に結合させ、最後に、混合した生体適合性有機組成物（デキサメタゾン）を非共有結合で付加する。この組成物は、ＥｔＯ殺菌の後に大きなＡＴIII 結合活性を示した。
【０２２２】
本実施例では、シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手し、実施例２と実質的に同じプロセスを用いてヘパリン含有コーティングを施した。実施例１２と実質的に同等なプロセスを用いて、アルデヒドで修飾されたポリエチレングリコール（１，０００ＭＷ）を、不安定な共有結合を通じてコーティング層に結合させたが、ＮａＣＮＢＨ３は付加しなかった。アルデヒドで修飾されたポリエチレングリコールを共役させる間に還元剤ＮａＣＮＢＨ３を添加しなかったことに注意することが重要である。第一級アミンとアルデヒドの間に形成される結合は、還元されない状態に放置される場合、不安定となる。次に、サンプルをＤＩ水の中で１５分間リンスし、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、乾燥ヘパリンとポリエチレングリコールをｅＰＴＦＥ材料に結合させた。次に、デキサメタゾンを実施例２に記載したようにして混合してこの組成物と非共有結合させた。次に、ヘパリン化したこの材料を実施例２に記載したようにして殺菌し、サンプリングし、アンチトロンビンIII 結合活性をＡＴIII 結合分析法を利用して分析した。
【０２２３】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が１１４ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２２４】
実施例３２
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるヘパリンを共有結合させた後、不安定な結合を通じてさらに生体適合性有機組成物（ポリエチレングリコール）をその被覆材料に結合させ、最後に、混合した生体適合性有機組成物（デキサメタゾン）を非共有結合で付加する。この組成物は、機械的に圧縮し、延伸させた後に顕著なＡＴIII 結合活性を示した。
【０２２５】
本実施例では、管腔内人工器官の形態になった埋め込み型医療機器を実施例３と実質的に同等なプロセスを用いてヘパリン化した。実施例１２に記載したのと実質的に同等な方法で、アルデヒドで修飾されたポリエチレングリコール（１，０００ＭＷ）を、不安定な共有結合を通じてコーティング層に結合させたが、ＮａＣＮＢＨ３は付加しなかった。アルデヒドで修飾されたポリエチレングリコールを共役させる間に還元剤ＮａＣＮＢＨ３を添加しなかったことに注意することが重要である。第一級アミンとアルデヒドの間に形成される結合は、還元されない状態に放置される場合、不安定となる。次に、サンプルをＤＩ水の中で１５分間リンスし、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、乾燥ヘパリンとポリエチレングリコールをｅＰＴＦＥ材料に結合させた。次に、デキサメタゾンを実施例２に記載したようにして混合してこの組成物と非共有結合させた。次に、このヘパリン化管腔内人工器官を実施例５に記載したのと実質的に同等な方法で機械的に圧縮し、機械的に延伸させ、試験用に切断し、リンスし、ＡＴIII 結合を分析した。
【０２２６】
本実施例に記載したようにして作ったサンプルは、アンチトロンビンIII 結合活性の平均値が１８８ｐｍｏｌ／ｃｍ２（ｎ＝３）であった。
【０２２７】
実施例３３
本実施例では、ＨＣII結合活性を有する延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層への、生物活性のあるデルマタン二硫酸の合成及び共有結合について説明する。
【０２２８】
米国特許第５，９２２，６９０号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に従い、デルマタン二硫酸を生成する。米国特許第６，６５３，４５７号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に従って、この物質をさらに処理して、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の表面に配置した被覆材料又はコーティング層への結合のために、米国特許第４，６１３，６６５号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に従って、アルデヒドで修飾されたデルマタン二硫酸組成物を生成する。
【０２２９】
シート形態のｅＰＴＦＥ材料をＷ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＧＯＲＥ（登録商標）マイクロ濾過媒体（ＧＭＭ−４０６）という商品名で入手する。ベースコーティングの形態の被覆材料をｅＰＴＦＥ材料に適用するため、その被覆材料を直径１０ｃｍのプラスチック製刺繍用環状部材に取り付け、その支持されたｅＰＴＦＥ材料をまず最初に１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に約５分間浸し、次いでＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とＩＰＡが１：１の溶液に浸す。無水ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）ＰＥＩはＢＡＳＦ社から取得し、希釈して約４％の濃度にし、ｐＨを９．６に調節する。ｅＰＴＦＥ材料を上記溶液の中に約１５分間浸した後、材料をその溶液から取り出し、ｐＨ９．６の脱イオン（ＤＩ）水の中で１５分間リンスする。ｅＰＴＦＥ材料の表面に残ったＰＥＩを１５分間（アムレスコ社から取得した）グルタルアルデヒドの０．０５％水溶液（ｐＨ９．６）と架橋させる。追加のＰＥＩをこの構造体に付加するため、その構造体をＰＥＩの０．５％水溶液（ｐＨ９．６）の中に１５分間入れ、ＤＩ水（ｐＨ９．６）の中で１５分間再びリンスする。グルタルアルデヒドとＰＥＩ層が反応した結果として形成されるイミンを、シアンホウ水素化ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）溶液（５ｇを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９．６）を用いて１５分間還元し、ＤＩ水の中で３０分間リンスする。
【０２３０】
追加のＰＥＩ層を構造体に付加するため、その構造体を０．０５％グルタルアルデヒド水溶液（ｐＨ９．６）の中に１５分間浸した後、０．５％ＰＥＩ水溶液（ｐＨ９．６）の中に１５分間浸す。次に構造体をＤＩ水（ｐＨ９．６）の中で１５分間リンスする。得られたイミンを還元するため、ＮａＣＮＢＨ３溶液（５ｇを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９．６）の中に構造体を浸した後、ＤＩ水の中で３０分間リンスする。第３の層を構造体に付着させるため、これらのステップを繰り返す。結果は、親水性の架橋したポリマー・ベースコーティングを、ベース材料の露出した面と隙間の面に実質的に全体に有する、多孔性疎水性フルオロポリマー・ベース材料である。
【０２３１】
構造体の表面に別のＰＥＩ層を配置するための準備として、中間化学層をポリマー・ベースコーティングに付着させる。この中間イオン電荷層は、硫酸デキストラン（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）と塩化ナトリウムの溶液（０．１５ｇの硫酸デキストランと１００ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３）の中で構造体を６０℃にて９０分間インキュベートした後、ＤＩ水で１５分間リンスすることによって作る。
【０２３２】
ＰＥＩ層（この明細書では“キャップ層”と呼ぶ）を中間層に付着させるため、構造体を０．３％ＰＥＩ水溶液（ｐＨ９）の中に約４５分間入れた後、塩化ナトリウム溶液（５０ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした）の中で２０分間リンスする。ＤＩ水を用いた最後のリンスを２０分間実施する。
【０２３３】
アルデヒドで修飾されたデルマタン二硫酸の末端をＰＥＩ層に結合又は共役させるため、６０℃のヘパリン含有塩化ナトリウム溶液（１．５ｇのデルマタン二硫酸と２９．３ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３．９）の中に構造体を１２０分間入れる。体積２．８６ｍｌの２．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣＮＢＨ３水溶液を１リットルのデルマタン二硫酸溶液に添加した後、サンプルを添加する。次にサンプルをＤＩ水の中で１５分間リンスし、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、乾燥デルマタン二硫酸をｅＰＴＦＥ材料に結合させる。デルマタン二硫酸の存在と一様性は、構造体のサンプルの両側をトルイジン・ブルーで染色することによって調べる。染色によって均等に紫色になった表面が生じるというのは、デルマタン二硫酸が存在していてｅＰＴＦＥ材料に一様に結合していることを示す。
【０２３４】
サイズが約１平方センチメートル（１ｃｍ２）のサンプルを構造体から切り出した後、末端が結合したデルマタン二硫酸がＨＣIIに結合する能力を測定することにより、ヘパリンの活性を調べた。本発明における表面のデルマタン二硫酸活性の計算は、サンプル全体（隙間も含む）がその表面に固定化されたデルマタン二硫酸を有している場合もあるが、サンプル材料の一方の側だけの表面積を用いて行なった。デルマタン二硫酸活性は、末端が結合したデルマタン二硫酸が既知量のヘパリンコファクターII（ＨＣII）と結合する能力又は容量を測定することによって分析する。結果は、基板材料１平方センチメートルに結合したヘパリンコファクターII（ＨＣII）のピコモル数として表わした（ｐｍｏｌ  ＨＣII／ｃｍ２基板材料）。サンプルは、構造体からおおよそ１ｃｍ２のサイズに切断され、そしてデルマタン二硫酸活性について、末端が結合したデルマタン二硫酸がヘパリンコファクターII（ＨＣII）と結合する容量を測定することによって分析した。このデルマタン二硫酸活性の測定は、ヘパリン活性についての、Ｌａｒｓｅｎ  Ｍ．Ｌ．他、「Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｈ−Ｄ−ＰＨｅ−ＰＩＰＡｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２３８）」（Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．、１９７８年、第１３巻、２８５〜２８８ページ）、及びＰａｓｃｈｅ他、「Ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｏ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｎｄｅｒ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」（Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ、１９９１年、第１５巻、２８１〜４９１ページ）に以前に記載されているものと同様である。デルマタン二硫酸活性の分析では、ＨＣIIは、デルマタン二硫酸表面に結合することができ、可溶性デルマタン二硫酸の過剰によりその表面から溶出され、そしてトロンビン活性についての比色分析においてトロンビンと結合される。この分析は、ＨＣIIの媒介によるヒトトロンビンの阻害を測定することにより、存在しているＨＣIIの量を間接的に決定する。ＨＣIIの量は、既知量の、デルマタン二硫酸、ＨＣII、トロンビン、及び合成トロンビン基板を混合することによって導かれる標準曲線から決定する（アミド分解アッセイとして知られる）。可溶性デルマタン硫酸活性の測定についての、同様のアプローチが、以前に「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｄｅｒｍａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｔ  ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ」（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅａｍｏｓｔ．１９８８年、第６０巻、２３６〜２３９ページ）に記載されている。その結果を、基板材料単位表面積当たりのＨＣII結合の量（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）で表す。全てのサンプルをその分析中を通じて、湿潤条件に保持する。おおよそ１ｃｍ２のサンプルはどれも全面積で２ｃｍ２を有するが、もし材料の両面を考慮するならば、サンプルの一面（すなわち、１ｃｍ２）のみがＨＣII−デルマタン二硫酸結合活性の計算（ｐｍｏｌ／ｃｍ２単位）に使われている、という事に注意することが重要である。
【０２３５】
また別の方法では、構造体に固定化されているデルマタン二硫酸への放射性標識ＨＣIIの結合の量を測定することによって、デルマタン二硫酸は直接的に定量化される。この手法は、Ｄｕ  Ｙ．Ｊ．他、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ｃａｔｈｅｔｅｒｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ」（Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．、２００７年、第８０Ａ巻、２１６〜２２５ページ）、に記載された、ヘパリンが固定化された構造体への結合したアンチトロンビンIII を測定するための方法と同様である。デルマタン二硫酸の構造体を、放射性同位体ヨウ素１２５（１２５Ｉ）によって共有結合標識されたＨＣII溶液でインキュベートする。インキュベート後、その表面を繰り返し洗浄し、そして構造体から放射される放射線の量をガンマカウンタにより測定する。放射とＨＣII質量の比が既知なので、ＨＣIIの量を決定することができる。この結果を、基板材料単位表面積当たりのＨＣII結合の量（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）で表す。
【０２３６】
基板材料の表面積当たりのＨＣII結合活性は、被覆された又は被覆されていない基板材料の見かけの表面積当たりの結合したＨＣIIのピコモル数として定義される。基板の見かけの表面積には、被覆された複数の表面は考慮されず、多孔性基板材料の多孔度も考慮されない。基板材料が多孔性である場合には、多孔性が表面積に及ぼす効果はこれらの計算では考慮されない。例えば（多孔性材料でできた）円筒形チューブの形態のｅＰＴＦＥ移植血管において、そのチューブ状移植血管の内面にある基板材料にヘパリンの末端が固定化されている場合の見かけの表面積は、あらゆる円筒形状と同様に２πｒＬとして計算される（ただしｒはグラフトの内径であり、Ｌは軸方向の長さであり、πはパイという数である）。ｅＰＴＦＥの多孔性と、表面積に及ぼすその効果は、この明細書では考慮しないことに注意することが重要である。したがって、分析のために切断されて正方形になる非多孔性基板材料は、長さ×幅という表面積を持つとされる。その結果は、基板材料単位表面積当たりのＨＣII結合の量（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）で表される。全てのサンプルはその分析中を通じて、湿潤な状態に保たれる。おおよそ１ｃｍ２のサンプルはどれも全面積で２ｃｍ２を有するが、もし材料の両面を考慮するならば、サンプルの一面（すなわち、１ｃｍ２）のみがＨＣII結合活性の計算（ｐｍｏｌ／ｃｍ２単位）に使われている、という事に注意することが重要である。
【０２３７】
本実施例に記載したように作成したいくつかのサンプルでは５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有する。他のサンプルでは１２ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有する。また他のサンプルでは２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有する。これらの結果はＨＣII結合活性を有する表面を生成する能力を示す。
【０２３８】
実施例３４
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に、生物活性のあるデルマタン二硫酸を共有結合させた後、追加の生体適合性有機組成物を混合することについて説明する。第一の生体適合性有機組成物には、ＵＳＰヘパリン、多糖、調合薬、親水性分子、及び抗血栓化合物がある。第二の化合物は、ポリエチレングリコールであり、合成且つ親水性の化合物である。この構造体は５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を示す。
【０２３９】
構造体を実施例３３に記載したように作成する。デルマタン二硫酸の共有結合の後、これらの構造体を次の生体適合性有機組成物：ＵＳＰグレードのヘパリン・ナトリウム（セルサス社）、及びポリエチレングリコール（分子量２０，０００、シグマ社）をＤＩ水１００ｍｌ当たり０.５ｇの濃度にしてｐＨを９.６に調節したもの、に暴露する。この明細書では、これら溶液のそれぞれを「処理溶液」と呼ぶ。特定のデルマタン二硫酸含有構造体を特定の処理溶液に曝露するため、その構造体を２リットルのビーカーに入れ、そして１００ｍｌの処理溶液を添加し、その構造体を処理溶液の中に完全に浸す。各構造体を６０℃の処理溶液に１時間曝露する。構造体を溶液から取り出し、凍結乾燥させる。
【０２４０】
次に、各構造体（対照を含む）をＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスする。
【０２４１】
本実施例に記載したように作成したサンプルは、実施例３３に記載したように試験をすると、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有する。これらの結果は、混合した追加の分子を備える、ＨＣII結合活性を有する表面を生成する能力を示す。
【０２４２】
実施例３５
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるデルマタン二硫酸を共有結合させた後、追加の生体適合性有機組成物を混合させることについて説明する。この化合物、デキサメタゾン、は合成且つ親水性の物質である。
【０２４３】
被覆材料でコーティングされた上記の構造体を、１００ｍｌのエタノールに０．５ｇを含むｐＨ調節してないデキサメタゾン溶液に暴露する。本明細書では、この溶液を「処理溶液」と呼ぶ。特定のヘパリン含有構造体をこの処理溶液に曝露するため、その構造体を２リットルのビーカーに入れて１００ｍｌの処理溶液を添加し、その構造体を処理溶液の中に完全に浸す。この構造体を６０℃の処理溶液に１時間曝露する。その後、構造体を溶液から取り出し、凍結乾燥させる。
【０２４４】
次に、各構造体（対照を含む）をＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスする。
【０２４５】
本実施例に記載したように作成したサンプルは、実施例３３に記載したように試験をすると、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有する。これらの結果は、混合した追加の分子を備える、ＨＣII結合活性を有する表面を生成する能力を示す。
【０２４６】
実施例３６
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるデルマタン二硫酸を共有結合させた後、追加の生体適合性有機組成物を混合すことについて説明する。その構造体は、酸化エチレンによる殺菌後に、顕著なＨＣII結合を示す。
【０２４７】
生物活性のあるデルマタン二硫酸を持つサンプルを、実施例３３に記載したように作成する。生体適合性有機組成物であるポリエチレングリコール、ＵＳＰヘパリン、及びデキサメタゾンを実施例３４及び３５に記載したように、それぞれのサンプルと混合する。
【０２４８】
ＥｔＯ殺菌のための準備として、凍結乾燥させた各構造体をＴｏｗｅｒ  ＤＵＡＬＰＥＥＬ（登録商標）自己気密パウチ（アリージャンス・ヘルスケア社、マクゴー・パーク、イリノイ州）の中に入れて密封する。酸化エチレンを用いた殺菌は、コンディショニングが１時間、ＥｔＯガスの滞在時間が１時間、設定温度が５５℃、通気時間が１２時間という条件下で実施する。
【０２４９】
ＥｔＯ殺菌の後、各構造体（対照を含む）をパウチから取り出し、ＤＩ水の中で１５分間洗浄し、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間洗浄し、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスする。
【０２５０】
本実施例に記載したように作成したサンプルは、実施例３３に記載したように試験をすると、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有する。これらの結果は、混合した追加の分子を備える、ＥｔＯ殺菌後でもＨＣII結合活性を有する表面を生成する能力を示す。
【０２５１】
実施例３７
本実施例では、機械的圧縮及び延伸の後で、医療機器基板上のデルマタン二硫酸（１７）ＨＣII結合が５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超の、本発明の一実施態様である構造体について説明する。
【０２５２】
本実施例で用いる埋め込み型医療機器は、多孔性の延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料からなるチューブをニチノール・ワイヤで補強した形態のものであり、Ｗ．Ｌ．ゴア＆アソシエイツ社（フラッグスタッフ、アリゾナ州）からＶＩＡＢＡＨＮ（登録商標）内部人工器官という商品名で入手する。このチューブ状機器は、長さが１５ｃｍ、直径が６ｍｍである。
【０２５３】
ＶＩＡＢＡＨＮ（登録商標）内部人工器官は送達用カテーテルの内部に拘束されているため、ヘパリンをその表面に固定化する前にカテーテルから取り出す必要がある。カテーテルに拘束された各機器は、処理のため、拘束用のシースに取り付けた紐を引っ張り、そのシースを機器の周囲から解放することによって取り出す。各機器は、非拘束状態になると延伸し、独立した基板材料として使用する。それぞれの基板材料（内部人工器官機器）を、体積比が３０：７０のＰＥＩ溶液（ＤＩ水の中に５％）とＩＰＡ（ＵＳＰグレード）に約１２時間浸し、ポリマー被覆材料（１８）を基板材料（１２）の表面に付着させる。ポリマー被覆材料（１８）は複数の反応性化学基（１６）を備えており、アルデヒドで修飾された複数のデルマタン二硫酸分子（１７）の末端を最終的にその反応性化学基に結合させる。
【０２５４】
少なくとも１つの追加の被覆材料（１８Ａ、１８Ｂ）層を第１のＰＥＩ層（１８）の上に配置する。これは、各内部人工器官機器を別のシリコーン製チューブの中に配置し、そして、そのチューブを蠕動ポンプと溶液リザーバに接続することによって実施する。こうすることにより、被覆材料を含む追加の溶液を繰り返してチューブ状医療機器の中心を通過させることができるため、その機器の内面が主にコーティングされる。
【０２５５】
上記の動的流れシステムのうちの１つの中に各内部人工器官が収容された状態で、体積の％比が４５：５５の０.１０％（ｐＨ９.０）ＰＥＩとＩＰＡ水溶液の形態になった被覆材料（１８）を約２０分間その内部人工器官の中を通過させる。次に各内部人工器官をＤＩ水（ｐＨ９.０）の中で５分間リンスし、０.０５％グルタルアルデヒド水溶液（ｐＨ９.０）に２０分間曝露することによってＰＥＩ層を架橋させる。次にこれらの内部人工器官を再びＰＥＩ水溶液（０.１０％、ｐＨ９.０）で５分間リンスする。得られたイミンをシアンホウ水素化ナトリウム溶液（１リットルのＤＩ水の中に５ｇ、ｐＨ９.０）で１５分間還元し、ＤＩ水の中で３０分間リンスする。
【０２５６】
中間イオン電荷層を各内部人工器官の架橋したＰＥＩ層の上に配置するため、硫酸デキストランと塩化ナトリウムの溶液（０.１５ｇの硫酸デキストランと１００ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３）を動的流れシステムの中とＰＥＩ層の上を６０℃にて約９０分間流す。その後、このシステムをＤＩ水で１５分間リンスする。
【０２５７】
ＰＥＩの“キャップ”層（１８Ｂ）をイオンで帯電した硫酸デキストラン層（１８Ａ）に付加するため、ＰＥＩ水溶液（０.０７５％、ｐＨ９.０）を動的流れシステムの中を約４５分間流した後、塩化ナトリウム溶液（５０ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした）の中で１５分間リンスする。リンスの後、ＤＩ水を２.５分間という短時間吹きかける。
【０２５８】
アルデヒドで修飾されたデルマタン二硫酸の末端をＰＥＩ層に結合又は共役させるため、６０℃のデルマタン二硫酸含有塩化ナトリウム溶液（１５ｇのデルマタン二硫酸と２９.３ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ３.９）の中に構造体を１２０分間入れる。そのサンプルを入れる前に、体積２.８６ｍｌの２.５％(ｗ／ｖ)ＮａＣＮＢＨ３水溶液を、その１リットルのデルマタン二硫酸溶液に添加する。次にサンプルをＤＩ水の中で１５分間リンスし、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸と、２.７ｇのＮａＯＨと、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスした後、構造体全体を凍結乾燥させることにより、乾燥デルマタン二硫酸をｅＰＴＦＥ材料に結合させる。デルマタン二硫酸の存在と一様性は、構造体のサンプルの両側をトルイジン・ブルーで染色することによって調べる。染色によって均等に紫色になった表面が生じるというのは、デルマタン二硫酸が存在していてｅＰＴＦＥ材料に一様に結合していることを示す。
【０２５９】
送達システムの上で管腔内機器を圧縮してコンパクトにするため、各内部人工器官を引っ張り、直径が固定されたテーパー状漏斗の中を通過させる。各内部人工器官には、引っ張って漏斗の中を通過させるため、一端に６本の縫合糸（Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ（登録商標）ＣＶ−０、０Ｎ０５）が縫い付けられている。各内部人工器官を引っ張ることにより直径が約３ｍｍである２５ｍｌのピペットの先端（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、製品番号３５７５２５）の開口部を通過させ、そして直径が約３.１ｍｍのガラス製チューブの中に入れることで、各内部人工器官をコンパクトな状態に保持する。
【０２６０】
圧縮の後、各内部人工器官を３７℃の０.９％生理食塩水の中で広げる。試験用の各内部人工器官を作るため、ＤＩ水の中で１５分間洗浄した後、ホウ酸塩緩衝溶液（１０.６ｇのホウ酸、２.７ｇのＮａＯＨ、０.７ｇのＮａＣｌを１リットルのＤＩ水に溶かした、ｐＨ９.０）の中で２０分間リンスし、最後にＤＩ水の中で１５分間リンスする。
【０２６１】
各内部人工器官からデルマタン二硫酸含有材料のサンプル（長さ約０.５ｃｍ）を切り出し、そして上記のヘパリンコファクターII結合分析法（実施例３３）を利用し、その固定化されたヘパリンの生物活性を測定する。サンプルは、分析プロセスを通じて湿潤な状態に維持する。結果は、基板材料の単位面積当たりの結合しヘパリンコファクターIIのピコモル数（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）として表わしている。
【０２６２】
本実施例のサンプルは、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有する。これらの結果は、機械的圧縮及び延伸の後でも、ＨＣII結合活性を有する表面を生成する能力を示す。
【０２６３】
実施例３８
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）の医療機器の上に配置した被覆材料又はコーティング層に生物活性のあるデルマタン二硫酸（１７）を共有結合させた後、追加の生体適合性有機組成物を混合することについて説明する。その構造体は、機械的圧縮及び延伸の後に、大きなＨＣII結合を示す。
【０２６４】
生物活性のあるデルマタン二硫酸を持つサンプルを実施例３７に記載したように作成する。生体適合性有機組成物であるポリエチレングリコール、ＵＳＰヘパリン、及びデキサメタゾンを実施例３４及び３５に記載したように、それぞれのサンプルに混合する。
【０２６５】
この構造物を、実施例３７に記載したように、さらに機械的に圧縮し、留置し、リンスし、サンプリングし、試験する。このように扱われたサンプルは、実施例３３に記載したように試験をすると、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有する。
【０２６６】
実施例３９
本実施例では、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のＨＣII結合、且つ５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）結合を有する、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層への、生物活性のあるデルマタン二硫酸（１７）及び生物活性のあるヘパリン（１７）の共有結合について説明する。
【０２６７】
米国特許第６，６５３，４５７号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）に従って、米国特許第４，６１３，６６５号（参考としてその内容はこの明細書に組み込まれているものとする）によって、アルデヒドで修飾されたヘパリン組成物を生成する。
【０２６８】
アルデヒドで修飾したデルマタン二硫酸の結合に関連する操作を除いて、実施例３３に記載したように、ｅＰＴＦＥ構造体を準備する。この処理手順中で、デルマタン二硫酸１．５ｇの代わりに、アルデヒドで修飾したヘパリン１．５ｇ及びアルデヒドで修飾したデルマタン二硫酸１．５ｇをその溶液に加えただけである。
【０２６９】
ＨＣII結合活性を実施例３３に記載したように測定する。末端が結合したヘパリンがＡＴIII に結合する能力を測定することにより、サンプルのＡＴIIの活性も調べる。この分析法は、Ｌａｒｓｅｎ  Ｍ．Ｌ．他、「Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｈ−Ｄ−ＰＨｅ−ＰＩＰＡｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２３８）」（Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．、１９７８年、第１３巻、２８５〜２８８ページ）、及びＰａｓｃｈｅ他、「Ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｏ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｎｄｅｒ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」（Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ、１９９１年、第１５巻、２８１〜４９１ページ）に記載されている。結果は、単位表面積当たりに結合するＡＴIII の量として、ｐｍｏｌ／ｃｍ２の単で表わす。分析中を通じてすべてのサンプルを湿潤条件に保持する。約１平方センチメートル（１ｃｍ２）の各サンプルは、もし材料の両側を考慮すると合計で２平方センチメートル（２ｃｍ２）の表面積を持つが、ＡＴIII −ヘパリン結合活性（単位はｐｍｏｌ／ｃｍ２）の計算にはサンプルの１つの面しか利用しないことに注意することが重要である。
【０２７０】
本実施例に記載したように準備し、そして試験した構造体は、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有し、且つ５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のＡＴIII 結合を示す。
【０２７１】
実施例４０
本実施例では、混合した生体適合性有機組成物を内包した延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料上に配置した、被覆材料又はコーティング層への、生物活性のあるデルマタン二硫酸（１７）及び生物活性のあるヘパリン（１７）の共有結合について、及び、ＥｔＯ殺菌後で、結果として得られるＨＣII結合が５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超で、且つＡＴIII 結合が５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のことについて説明する。
【０２７２】
サンプルを実施例３９に記載したように作成する。生体適合性有機組成物であるポリエチレングリコール、ＵＳＰヘパリン、及びデキサメタゾンを実施例３４及び３５に記載したように、それぞれのサンプルに混合する。さらに実施例３６に記載したように、これらのサンプルを殺菌する。
【０２７３】
本実施例に記載したように準備し、且つ測定した構造体は、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を有し、且つ５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）結合を示す。
【０２７４】
実施例４１
本実施例では、混合した生体適合性有機組成物（１１）を内包した延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）の上に配置した被覆材料又はコーティング層への、生物活性のあるデルマタン二硫酸（１７）及び生物活性のあるヘパリン（１７）の共有結合について、及び、機械的圧縮及び延伸の後で、得られるＨＣII結合が５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超で、且つＡＴIII 結合が５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のことについて説明する。
【０２７５】
アルデヒドで修飾したデルマタン二硫酸の付着に関連する操作を除いて、ＶＩＡＢＡＨＮ（登録商標）内部人工器官を実施例３７に記載したように準備する。この処理手順中で、デルマタン二硫酸１．５ｇの代わりに、アルデヒドで修飾したヘパリン１．５ｇ及びアルデヒドで修飾したデルマタン二硫酸１．５ｇをその溶液に加えただけである。次に、生体適合性有機組成物であるポリエチレングリコール、ＵＳＰヘパリン、及びデキサメタゾンを実施例３４及び３５に記載したように、それぞれのサンプルに混合する。試験の前に、実施例３４に記載したようにサンプルをリンスする。
【０２７６】
本実施例に記載したように準備し、そして試験した構造体は、機械的圧縮及び延伸の後で、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を示し、且つ５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）結合を示す。
【０２７７】
実施例４２
本実施例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）上に配置した被覆材料又はコーティング層への、生物活性のあるデルマタン二硫酸（１７）の共有結合とそれに続く殺菌ついて説明する。その構造体は、酸化エチレン（ＥｔＯ）殺菌への暴露後で、大きなＨＣII結合を示す。
【０２７８】
生物活性のあるデルマタン二硫酸のサンプルを実施例３３に記載したように作成し、そして実施例３６に記載したように殺菌する。本実施例に記載したように作成し、且つ試験した構造体は５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を示す。
【０２７９】
実施例４３
本実施例では、ＥｔＯ殺菌後に５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のＨＣII結合及び５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のアンチトロンビンIII （ＡＴIII ）結合とを有する、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）材料の上に配置した被覆材料又はコーティング層への生物活性のあるデルマタン二硫酸（１７）及び生物活性のあるヘパリン（１７）の共有結合について説明する。
【０２８０】
サンプルを実施例３９に記載したように作成し、実施例３６に記載したように殺菌にさらし、そして実施例３９に記載したように試験をする。本実施例に記載したように作成し、そして試験した構造体は５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のヘパリンコファクターII結合活性を示し、且つ５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のＡＴIII 結合を示す。
【０２８１】
実施例４４
本実施例では、殺菌の後で、医療機器基板上のデルマタン二硫酸（１７）ＨＣII結合が５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超の、本発明の一実施態様である構造体について説明する。
【０２８２】
生物活性のあるデルマタン二硫酸のサンプルを実施例３７に記載したように作成し、実施例３６に記載したように殺菌にさらし、そして実施例３３に記載したように試験をする。本実施例に記載したように作成し、そして試験した構造体は５ｐｍｏｌ／ｃｍ２超のＨＣII結合活性を示す。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図６】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月24日(2014.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板材料と；
該基板材料の表面の少なくとも一部に結合したポリマー被覆材料であって、１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIのヘパリンコファクターII結合活性を有する複数の生物活性物質が少なくとも一部に共有結合した該ポリマー被覆材料と；
該ポリマー被覆材料に結合した生体適合性組成物と；
を含んでいて、
該生体適合性組成物がアンチトロンビンIII 結合活性を有する医療機器。
【請求項２】
上記生体適合性組成物が、上記ポリマー被覆材料と共有結合している、請求項１に記載の医療機器。
【請求項３】
上記生体適合性組成物が、上記ポリマー被覆材料と非共有結合している、請求項１に記載の医療機器。
【請求項４】
上記複数の生物活性物質が、グリコサミノグリカン及びデルマタン二硫酸からなる群より選択された物質を含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項５】
上記複数の生物活性物質が、末端が結合したデルマタン二硫酸を含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項６】
約３７℃且つ実質的に中性ｐＨの０．１５Ｍリン酸塩緩衝溶液の中で、上記生体適合性組成物の少なくとも一部が上記医療機器から放出される、請求項１に記載の医療機器。
【請求項７】
上記生体適合性組成物が、有機化合物を含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項８】
上記有機化合物が多糖である、請求項７に記載の医療機器。
【請求項９】
上記多糖がグリコサミノグリカン、デキストラン及び硫酸デキストランから選択される、請求項８に記載の医療機器。
【請求項１０】
上記生体適合性組成物がポリエチレングリコール及びデキサメタゾンから選択される、請求項１に記載の医療機器。
【請求項１１】
上記生体適合性組成物が、合成した非極性分子及び無機化合物のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項１２】
上記生体適合性組成物が、リン酸塩を含む無機化合物を含む、請求項１１に記載の医療機器。
【請求項１３】
上記複数の生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、上記基板材料の殺菌、圧縮及び延伸のうちの少なくとも１つの後、基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである、請求項１に記載の医療機器。
【請求項１４】
基板材料と；
該基板材料の表面の少なくとも一部に結合したポリマー被覆材料であって、ヘパリンコファクターII結合活性を有する第一の複数の生物活性物質及びアンチトロンビンIII 結合活性を有する第二の複数の生物活性物質が少なくとも一部に共有結合した該ポリマー被覆材料と；
該ポリマー被覆材料に結合した生体適合性組成物と；
を含んでいて、
該生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIであり、且つ１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のアンチトロンビンIII である医療機器。
【請求項１５】
上記生体適合性組成物が、上記ポリマー被覆材料と共有結合している、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項１６】
上記生体適合性組成物が、上記ポリマー被覆材料と非共有結合している、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項１７】
上記第一の複数の生物活性物質が、グリコサミノグリカン及びデルマタン二硫酸から選択された物質を含む、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項１８】
上記第一の複数の生物活性物質が、末端が結合したデルマタン二硫酸を含む、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項１９】
約３７℃且つ実質的に中性ｐＨの０．１５Ｍリン酸塩緩衝溶液の中で、上記生体適合性組成物の少なくとも一部が上記医療機器から放出される、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項２０】
上記生体適合性組成物が、有機化合物を含む、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項２１】
上記有機化合物が多糖である、請求項２０に記載の医療機器。
【請求項２２】
上記多糖がグリコサミノグリカン、デキストラン及び硫酸デキストランから選択される、請求項２１に記載の医療機器。
【請求項２３】
上記生体適合性組成物がポリエチレングリコール及びデキサメタゾンから選択される、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項２４】
上記生体適合性組成物が、合成した非極性分子及び無機化合物のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項２５】
上記無機化合物がリン酸塩を含む、請求項２４に記載の医療機器。
【請求項２６】
上記第一の複数の生物活性物質のヘパリンコファクターII結合活性が、上記基板材料の殺菌、圧縮及び延伸のうちの少なくとも１つの後、基板材料１平方センチメートル当たり少なくとも５ピコモル（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）のヘパリンコファクターIIである、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項２７】
上記生体適合性組成物が、共に固定化したヘパリンとデルマタン二硫酸とを含む、請求項１４に記載の医療機器。
【外国語明細書】
2014097402000001.pdf