(57)【要約】【課題】Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのタンパク質の異種発現に対する代替的または改善されたアプローチ。これらのアプローチは、代表的には、発現レベル、精製の容易さ、細胞局在化、および／または発現されたタンパク質の免疫学的性質に影響を与える。【解決手段】例えば、本発明は、（ａ）本発明のタンパク質の少なくとも１つのドメインが除去されており、そして必要に応じて、（ｂ）融合パートナーが使用されない、本発明のタンパク質の異種発現の方法を提供する。【選択図】図８
2014000092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、タンパク質発現の分野にある。特に、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたは好ましくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のタンパク質の異種発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のタンパク質を開示する。これらのタンパク質は、代表的には、Ｎ末端ＧＳＴ融合物またはＣ末端Ｈｉｓタグ融合物のいずれかとして、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現される（すなわち、異種発現）と記載されるが、他の発現系（ネイティブのＮｅｉｓｓｅｒｉａでの発現を含む）もまた開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９９／２４５７８号
【特許文献２】国際公開第９９／３６５４４号
【特許文献３】国際公開第９９／５７２８０号
【特許文献４】国際公開第００／２２４３０号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は、これらのタンパク質の異種発現のための代替的なおよび改善されたアプローチを提供することである。これらのアプローチは、代表的には、発現のレベル、精製の容易さ、発現の細胞局在、および／または発現されたタンパク質の免疫学的特性に影響を及ぼす。また、本発明は以下を提供する：
（項目１）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで、（ａ）該タンパク質の少なくとも１つのドメインが欠失されており、そして必要に応じて、（ｂ）融合パートナーが使用されない、方法。
（項目２）  前記本発明のタンパク質がＯＲＦ４６である、項目１に記載の方法。
（項目３）  ＯＲＦ４６が、第１のドメイン（１〜４３３のアミノ酸）と第２のドメイン（４３３〜６０８のアミノ酸）に分割される、項目２に記載の方法。
（項目４）  前記本発明のタンパク質が５６４である、項目２に記載の方法。
（項目５）  タンパク質５６４が図８に示したようなドメインに分割される、項目４の方法。
（項目６）  前記本発明のタンパク質が９６１である、項目１に記載の方法。
（項目７）  タンパク質９６１が図１２に示されるようなドメインで分割される、項目６に記載の方法。
（項目８）  前記本発明のタンパク質が５０２であり、そして前記ドメインが（ＭＣ５８配列に従った番号において）２８〜１６７のアミノ酸である、項目１に記載の方法。
（項目９）  前記本発明のタンパク質が、２８７である、項目１に記載の方法。
（項目１０）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで（ａ）該タンパク質のＮ末端ドメインの一部分が欠失されている、方法。
（項目１１）  タンパク質２８７が、図５にしめされるドメインＡ、ドメインＢ、およびドメインＣに分割される、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）  （ｉ）ドメインＡ、（ii）ドメインＡおよびＢ、または（ｉｉｉ）ドメインＡおよびＣが、欠失される、項目１１の方法。
（項目１３）  項目１１に記載の方法であって、ここで、ドメインＡにいて、（ｉ）１〜１７のアミノ酸、（ｉｉ）１〜２５のアミノ酸、（ｉｉｉ）１〜６９のアミノ酸、または（ｉｖ）１〜１０６のアミノ酸が、欠失される、方法。
（項目１４）  本発明のタンパク質の異種発現の方法であって、ここで（ａ）融合パートナーが使用されないか、および
（ｂ）存在する場合、該タンパク質の天然のリーダーペプチドが使用される、
方法。
（項目１５）  項目１４に記載の方法であって、ここで、
前記本発明のタンパク質が以下：
１１１、１４９、２０６、２２５−１、２３５、２４７−１、２７４、２８３、
２８６、２９２、４０１、４０６、５０２−１、５０３、５１９−１、５２５−１、５５２、５５６、５５７、５７０、５７６−１、５８０、５８３、６６４、７５９、９０７、９１３、９２０−１、９３６−１、９５３、９６１、９８３、９８９、Ｏｒｆ４、Ｏｒｆ７−１、Ｏｒｆ９−１、Ｏｒｆ２３、Ｏｒｆ２５、Ｏｒｆ３７、Ｏｒｆ３８、Ｏｒｆ４０、Ｏｒｆ４０．１、Ｏｒｆ４０．２、Ｏｒｆ７２−１、Ｏｒｆ７６−１、Ｏｒｆ８５−２、Ｏｒｆ９１、Ｏｒｆ９７−１、Ｏｒｆ１１９、Ｏｒｆ１４３．１、ＮＭＢ０１０９、ＮＭＢ２０５０、００８、１０５、１１７−１、１２１−１、１２２−１、１２８−１、１４８、２１６、２４３、３０８、５９３、６５２、７２６、９２６、９８２、Ｏｒｆ８３−１およびＯｒｆ４３−１、
からなる群より選択される、方法。
（項目１６）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで（ａ）該タンパク質のリーダーペプチドが、異なるタンパク質由来のリーダーペプチドにより置換され、そして、必要に応じて（ｂ）融合パートナーが使用されない、方法。
（項目１７）  前記異なるタンパク質が、９６１、ＯＲＦ４、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯｍｐＡ、またはＥ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ＰｅｌＢであるか、または前記リーダーペプチドがＭＫＫＹＬＦＳＡＡである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  前記異なるタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯｍｐＡであり、そして前記本発明のタンパク質がＯＲＦ１である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  前記本発明のタンパク質が９１１であり、そして前記異なるタンパク質がＥ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ＰｅｌＢまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＯｍｐＡである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）  前記異なるタンパク質が、ＯＲＦ４であり、そして前記本発明のタンパク質が２８７である、項目１７に記載の方法。
（項目２１）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで、（ａ）該タンパク質のリーダーペプチドが欠失されており、そして必要に応じて、（ｂ）融合パートナーが使用されない、方法。
（項目２２）  前記本発明のタンパク質が９１９である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで本発明のタンパク質の発現が、該タンパク質の有毒活性が現れない温度で、実行される、方法。
（項目２４）  タンパク質９１９が３０℃で発現される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、タンパク質が有毒活性を減少するか、または除去するように変異される、方法。
（項目２６）  前記本発明のタンパク質が、９０７、９１９、または９２２２である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）  ９０７が、Ｇｌｕ−１１７で変異（例えば、Ｇｌｕ→Ｇｌｙ）した、項目２６に記載の方法。
（項目２８）  ９１９が、Ｇｌｕ−２５５での変異（例えば、Ｇｌｕ→Ｇｌｙ）および／またはＧｌｕ−３２３での変異（例えば、Ｇｌｕ→Ｇｌｙ）をした、項目２６に記載の方法。
（項目２９）  ９２２が、Ｇｌｕ−１６４での変異（例えば、Ｇｌｕ→Ｇｌｙ）、Ｓｅｒ−２１３での変異（例えば、Ｓｅｒ→Ｇｌｙ）および／またはＡｓｎ−３４８での変異（例えば、Ａｓｎ→Ｇｌｙ）をした、項目２６に記載の方法。
（項目３０）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここでベクターｐＳＭ２１４が使用されるか、またはベクターｐＥＴ−２４ｂが使用される、方法。
（項目３１）  前記本発明のタンパク質が９５３であり、そして前記ベクターがｐＳＭ２１４である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで、タンパク質が特定の多量体形態を取るように、該タンパク質が発現されるか、または精製される、方法。
（項目３３）  タンパク質９５３が単量体形態で発現され、そして／またはタンパク質９５３が単量体形態で精製される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）  タンパク質９６１が四量体形態で発現され、そして／またはタンパク質９６１が四量体形態で精製される、項目３２に記載の方法。
（項目３５）  タンパク質２８７が二量体形態で発現され、そして／またはタンパク質２８７が二量体形態で精製される、項目３２に記載の方法。
（項目３６）  タンパク質９１９が単量体形態で発現され、そして／またはタンパク質９１９が単量体形態で精製される、項目３２に記載の方法。
（項目３７）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで該タンパク質が、脂質化タンパク質として発現される、方法。
（項目３８）  前記本発明のタンパク質が９１９、２８７、ＯＲＦ４、４０６、５６７またはＯＲＦ２５である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで（ａ）該タンパク質のＣ末端領域が変異されており、そして必要に応じて（ｂ）融合パートナーが使用されない、方法。
（項目４０）  前記変異が、置換、挿入、または欠失である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）  前記本発明のタンパク質が、７３０、ＯＲＦ２９またはＯＲＦ４６である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、該タンパク質のリーダーペプチドが変異される、方法。
（項目４３）  前記本発明のタンパク質が９１９である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）  本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、該タンパク質中のポリグリシンストレッチが変異された、方法。
（項目４５）  前記タンパク質が、本発明のタンパク質である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）  前記本発明のタンパク質が、２８７、７４１、９８３またはＴｂｐ２である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）  （Ｇｌｙ）６が２８７または９８３から欠失された、項目４６に記載の方法。
（項目４８）  （Ｇｌｙ）４がＴｂｐ２または７４１から欠失された、項目４６に記載の方法。
（項目４９）  リーダーペプチドもまた欠失された、項目４７または４８に記載の方法。
（項目５０）  前記異種発現がＥ．ｃｏｌｉ宿主の中に存在する、項目１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）  項目１〜５０のいずれか１項に記載の方法により発現されたタンパク質。
（項目５２）  Ｎ末端アミノ酸配列ＭＫＫＹＬＦＳＡＡを含む、異種タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、異種リーダーペプチドを使用してタンパク質を発現させるために使用された構築物を示す。
【図２】図２は、異種リーダーペプチドを使用してタンパク質を発現させるために使用された構築物を示す。
【図３】図３は、ＯＲＦ１についての発現データを示す。
【図４】図４は、タンパク質９６１についての類似の発現データを示す。
【図５】図５は、タンパク質２８７のドメインを示す。
【図６】図６は、ドメインＡ内の欠失を示す。
【図７】図７は、ドメインＡ内の欠失を示す。
【図８】図８は、タンパク質５６４のドメインを示す。
【図９】図９は、９１９リーダーペプチドによって駆動されるＰｈｏＣレポーター遺伝子を示す。
【図１０】図１０は、９１９リーダーペプチドの変異体を使用して得られた結果を示す。
【図１１】図１１は、タンパク質７３０の挿入変異体を示す（Ａ：７３０−Ｃ１；Ｂ：７３０−Ｃ２）。
【図１２】図１２は、タンパク質９６１のドメインを示す。
【図１３】図１３は、ΔＧタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。点は、主な組換え産物を示す。
【図１４−１】図１４は、本発明に従った２６個のハイブリッドタンパク質を示す。
【図１４−２】図１４は、本発明に従った２６個のハイブリッドタンパク質を示す。
【図１４−３】図１４は、本発明に従った２６個のハイブリッドタンパク質を示す。
【図１４−４】図１４は、本発明に従った２６個のハイブリッドタンパク質を示す。
【図１４−５】図１４は、本発明に従った２６個のハイブリッドタンパク質を示す。
【図１４−６】図１４は、本発明に従った２６個のハイブリッドタンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（発明の開示）
（本明細書中での用語）
ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４およびＷＯ９９／５７２８０において開示された２１６６のタンパク質配列は、以下の配列番号により本明細書中で言及される：
【０００８】
【表１】
2014000092.tif 000003
この配列番号の番号付けに加えて、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５
４４およびＷＯ９９／５７２８０において用いられた命名の取り決めもまた用い
られる（例えば、ＷＯ９９／２４５７８およびＷＯ９９／３６５４４で用いられ
ように「ＯＲＦ４」、「ＯＲＦ４０」、「ＯＲＦ４０−１」など；ＷＯ９９／５
７２８０において用いらるように「ｍ９１９」、「ｇ９１９」および「ａ９１９
」など）。
【０００９】
Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９−１８１
５］の２１６０のタンパク質ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０は、本明細書中で
配列番号２１６７〜４３２６として言及される［ＷＯ００／６６７９１もまた参
照のこと］。
【００１０】
本明細書中で用いられる場合、用語「本発明のタンパク質」とは、以下を含む
タンパク質をいう：
（ａ）配列番号１〜４３２６の配列のうちの１つ；または
（ｂ）配列番号１〜４３２６の配列のうちの１つに対する配列同一性を有する
配列；または
（ｃ）配列番号１〜４３２６のうちの１つのフラグメント。
【００１１】
（ｂ）において言及される「配列同一性」の程度は、好ましくは、５０％より
大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）。こ
れは、変異体および対立遺伝子改変体を含む［例えば、ＷＯ００／６６７４１を
参照のこと］。同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同
性検索アルゴリズムにより、パラメーター、ギャップオープンペナルティー＝１
２およびギャップ伸長ペナルティー＝１を用いたアフィンギャップ検索を用いて
決定される。代表的には、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性が、機能的
等価の指標とみなされる。
【００１２】
（ｃ）で言及される「フラグメント」は、配列番号１〜４３２６の１つに由来
する少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきである。そして特定の配列に
依存して、ｎは７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２
０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）。
好ましくは、このフラグメントは、配列番号１〜４３２６のうちの１つに由来す
るエピトープを含む。好ましいフラグメントは、ＷＯ００／７１５７４およびＷ
Ｏ０１／０４３１６に開示されるフラグメントである。
【００１３】
本発明の好ましいタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂにお
いて見出される。
【００１４】
本発明に従う使用に好ましいタンパク質は、血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔ
ｉｄｉｓ  ２９９６株または３９４／９８株（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ株）のタ
ンパク質である。他に述べられなければ、本明細書中で言及されるタンパク質は
、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ２９９６株に由来する。しかし本発明は、概
して株により限定されないことが理解される。特定のタンパク質（例えば、「２
８７」、「９１９」など）に対する言及は、任意の株に由来するタンパク質を含
むとみなされ得る。
【００１５】
（非融合物発現）
異種発現に対する第１のアプローチにおいて、融合パートナーは用いられず、
ネイティブのリーダーペプチド（存在する場合）が用いられる。これは、代表的
には、融合パートナーに由来する任意の「干渉」を防止し、異種宿主における細
胞局在および／または翻訳後修飾および／または折りたたみを変化させ得る。
【００１６】
従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。
この方法において、（ａ）融合パートナーは用いられず、そして（ｂ）そのタン
パク質のネイティブなリーダーペプチド（存在する場合）が用いられる。
【００１７】
この方法は、代表的には、本発明のタンパク質を発現するベクターを調製し、
その結果、第１の発現されたアミノ酸がこのタンパク質の最初のアミノ酸（メチ
オニン）であり、そして最後に発現されたアミノ酸がこのタンパク質の最後のア
ミノ酸（すなわち、ネイティブな停止コドンの前にあるコドン）である工程を包
含する。
【００１８】
このアプローチは、好ましくは、ネイティブなリーダーペプチドを用いて以下
のタンパク質の発現について用いられる：１１１、１４９、２０６、２２５−１
、２３５、２４７−１、２７４、２８３、２８６、２９２、４０１、４０６、５
０２−１、５０３、５１９−１、５２５−１、５５２、５５６、５５７、５７０
、５７６−１、５８０、５８３、６６４、７５９、９０７、９１３、９２０−１
、９３６−１、９５３、９６１、９８３、９８９、Ｏｒｆ４、Ｏｒｆ７−１、Ｏ
ｒｆ９−１、Ｏｒｆ２３、Ｏｒｆ２５、Ｏｒｆ３７、Ｏｒｆ３８、Ｏｒｆ４０、
Ｏｒｆ４０．１、Ｏｒｆ４０．２、Ｏｒｆ７２−１、Ｏｒｆ７６−１、Ｏｒｆ８
５−２、Ｏｒｆ９１、Ｏｒｆ９７−１、Ｏｒｆ１１９、Ｏｒｆ１４３．１、ＮＭ
Ｂ０１０９およびＮＭＢ２０５０。タンパク質の名称において本明細書中で用い
られる接尾辞「Ｌ」は、ネイティブなリーダーペプチドを用いた様式における発
現を示す。
【００１９】
好ましくは、融合パートナーを用いないこのアプローチを用いて発現され、か
つネイティブなリーダーペプチドを有さないタンパク質としては、以下が挙げら
れる：００８、１０５、１１７−１、１２１−１、１２２−１、１２８−１、１
４８、２１６、２４３、３０８、５９３、６５２、７２６、９２６、９８２、Ｏ
ｒｆ８３−１およびＯｒｆ１４３−１。
【００２０】
有利には、ＯＲＦ２５またはＯＲＦ４０の発現について用いられ、ＧＳＴ融合
物またはＨｉｓ融合物より良好な抗細菌抗体を誘導するタンパク質を生じる。
【００２１】
このアプローチは、特に、リポタンパク質を発現するために適切である。
【００２２】
（リーダーペプチド置換）
異種発現に対する第２のアプローチにおいて、本発明のタンパク質のネイティ
ブなリーダーペプチドは、異なるタンパク質のリーダーペプチドにより置換され
る。さらに、融合パートナーを用いないことが好ましい。タンパク質自身のリー
ダーペプチドを異種宿主において用いると、しばしばその「天然の」細胞位置に
このタンパク質を局在させることができるが、いくらかの場合、リーダー配列は
、異種宿主によって効率的に認識されない。そのような場合、タンパク質を効率
的に標的化させることが公知のリーダーペプチドが、代わりに用いられ得る。
【００２３】
従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。
この方法において、（ａ）このタンパク質のリーダーペプチドは、異なるタンパ
ク質由来のリーダーペプチドにより置換され、そして必要に応じて、（ｂ）融合
パートナーは用いられない。
【００２４】
この方法は、代表的には、本発明のタンパク質をコードする核酸を得る工程；
この核酸を操作して、このタンパク質のリーダーペプチドをコードする核酸を除
去し、異なるタンパク質のリーダーペプチドをコードするヌクレオチドを導入す
る工程を包含する。得られた核酸は、発現ベクターに挿入されるか、または既に
発現ベクターの一部分であり得る。発現されたタンパク質は、Ｎ末端における置
換リーダーペプチド、続いて、リーダーペプチドがない本発明のタンパク質から
なる。
【００２５】
このリーダーペプチドは、好ましくは、本発明の別のタンパク質（例えば、配
列番号１〜４３２６のうちの１つ）に由来するが、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉタンパ
ク質由来（例えば、ＯｍｐＡリーダーペプチド）またはＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒ
ｏｔｏｖａｒａタンパク質（ＰｅｌＢリーダーペプチド）でもあり得る。
【００２６】
特に有用な置換リーダーペプチドは、ＯＲＦ４のリーダーペプチドである。こ
のリーダーは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける脂質化を方向付け得、細胞局在を改善し得
、そしてタンパク質２８７、９１９およびΔＧ２８７の発現に特に有用である。
このリーダーペプチドおよび９６１のＮ末端ドメインはまた、特に有用である。
【００２７】
別の有用な置換リーダーペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯｍｐＡのリーダーペプ
チドである。このリーダーは、Ｅ．ｃｏｌｉの膜局在化を方向付け得る。これは
ＯＲＦ１の発現について特に有利であり、融合物および自身のリーダーペプチド
から発現されたタンパク質の両方より良好な抗細菌抗体を誘導するタンパク質を
生じる。
【００２８】
別の有用な置換リーダーペプチドは、ＭＫＫＹＬＦＳＡＡである。これは、分
泌物を培養培地へ方向付け得、そして非常に短くかつ活性である。このリーダー
ペプチドの使用は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質の発現に限定されない。すな
わち、任意のタンパク質（特に、細菌タンパク質）の発現を方向付けるために用
いられ得る。
【００２９】
（リーダーペプチド欠失）
異種発現に対する第３のアプローチにおいては、本発明のタンパク質のネイテ
ィブなリーダーペプチドが、欠失される。さらに、融合パートナーを用いないこ
とが好ましい。
【００３０】
従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供し、こ
の方法において、（ａ）このタンパク質のリーダーペプチドを欠失し、そして必
要に応じて（ｂ）融合パートナーを用いない。
【００３１】
この方法は、代表的には、以下の工程を包含する：本発明のタンパク質をコー
ドする核酸を得る工程；この核酸を操作して、このタンパク質のリーダーペプチ
ドをコードするヌクレオチドを除去する工程。得られる核酸は、発現ベクターに
挿入され得るか、または既に発現ベクターの一部であり得る。発現されたタンパ
ク質の最初のアミノ酸は、成熟なネイティブタンパク質のアミノ酸である。
【００３２】
この方法は、発現のレベルを増大させ得る。タンパク質９１９に関しては、例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルは、リーダーペプチドが欠失される場合
にはるかに高い。増加した発現は、リーダーペプチドの非存在下での変化した局
在の原因であり得る。
【００３３】
この方法は、好ましくは、９１９、ＯＲＦ４６、９６１、０５０−１、７６０
および２８７の発現のために用いられる。
【００３４】
（ドメインベースの発現）
異種発現に対する第４のアプローチにおいて、このタンパク質は、ドメインと
して発現される。これは、融合系と関連して用いられ得る（例えば、ＧＳＴ融合
物またはＨｉｓタグ融合物）。
【００３５】
従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。
この方法において（ａ）このタンパク質の少なくとも１つのドメインが欠失され
、そして必要に応じて（ｂ）融合パートナーは用いられない。
【００３６】
この方法は、代表的には、以下の工程を包含する：本発明のタンパク質をコー
ドする核酸を得る工程；この核酸を操作して、このタンパク質内の少なくとも１
つのドメインを除去する工程。得られる核酸は、発現ベクターに挿入され得るか
、または既に発現ベクターの一部であり得る。融合パートナーが用いられない場
合、発現されたタンパク質の最初のアミノ酸は、このタンパク質のドメインの最
初のアミノ酸である。
【００３７】
タンパク質は、代表的には、このタンパク質をデータベースにおける公知の配
列と整列させ、次いで、互いに異なる整列パターンを示すタンパク質の領域を決
定することにより概念的なドメインに分けられる。
【００３８】
この方法は、好ましくは、タンパク質２８７の発現に用いられる。このタンパ
ク質は、３つのドメイン（Ａ、ＢおよびＣといわれる（図５を参照のこと））に
概念的に分割され得る。ドメインＢは、ＩｇＡプロテアーゼと強く整列し、ドメ
インＣは、トランスフェリン結合タンパク質と強く整列し、そしてドメインＡは
、データベース配列との強い整列は示さない。２８７の多型形態の整列は、ＷＯ
００／６６７４１に開示される。
【００３９】
一旦タンパク質がドメインに分けられると、これらは、（ａ）単に発現され得
るか、（ｂ）タンパク質から欠失され得る（例えば、タンパク質ＡＢＣＤ→ＡＢ
Ｃ、ＡＣＤ、ＢＣＤなど）か、または（ｃ）再配置（例えば、タンパク質ＡＢＣ
→ＡＣＢ、ＣＡＢなど）され得る。これらの３つのストラテジーは、所望の融合
パートナーと組み合わされ得る。
【００４０】
ＯＲＦ４６はまた、概念的に、２つのドメイン−種と血清群との間で十分に保
存されている第１のドメイン（アミノ酸１−４３３）、および十分に保存されて
いない第２のドメイン（アミノ酸４３３−６０８）、に分けられる。第２のドメ
インは、好ましくは欠失される。ＯＲＦ４６の多型形態のアラインメントは、Ｗ
Ｏ００／６６７４１に開示されている。
【００４１】
タンパク質５６４はまた、複数のドメインに分けられ（図８）、タンパク質９
６１（図１２）およびタンパク質５０２（ＭＣ５８タンパク質のアミノ酸２８−
１６７）も同様である。
【００４２】
（ハイブリッドタンパク質）
異種発現についての第５の取り組みにおいて、本発明の２つ以上（例えば、３
，４，５，６、またはそれ以上）のタンパク質が、単一のハイブリッドタンパク
質として発現される。非ナイセリア融合パートナー（例えば、ＧＳＴまたはポリ
Ｈｉｓ）が用いられることが好ましい。
【００４３】
これは、２つの利点を提供する。第１に、それ単独では不安定であり得るか、
またはほとんど発現され得ないタンパク質が、この問題を克服する安定なハイブ
リッドハートナーを加えることにより、補助され得る。第２に商業的な製造が簡
易化される−２つの別々に有用なタンパク質を製造するために、１回のみの発現
および精製が行なわれることが必要とされる。
【００４４】
従って、本発明は、２つ以上の本発明のタンパク質の同時異種発現のための方
法を提供する。この方法において、２つ以上の本発明のタンパク質は、融合され
る（すなわち、それらは、単一のポリペプチド鎖として翻訳される）。
【００４５】
この方法は、代表的に以下の工程を包含する：本発明の第１のタンパク質をコ
ードする第１の核酸を獲得する工程；本発明の第２のタンパク質をコードする第
２の核酸を獲得する工程；第１の核酸および第２の核酸を連結する工程。得られ
る核酸は、発現ベクターに挿入され得るか、またはすでに発現ベクターの一部で
あり得る。
【００４６】
好ましくは、本発明に従うハイブリッドタンパク質の構成タンパク質は、同じ
株由来である。
【００４７】
ハイブリッドにおいて融合されるタンパク質は、直接的に連結され得るか、ま
たはリンカーペプチドを介して（例えば、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇ
ｎ、ここでｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）を介して、
またはクローニングを容易にする短いペプチド配列を介して）連結され得る。ポ
リグリシンリンカーのＣ末端にΔＧタンパク質を連結しないことが、明らかに好
ましい。
【００４８】
融合タンパク質は、ネイティブのリーダーペプチドを欠失し得るか、またはＮ
末端融合パートナーのリーダーペプチド配列を含み得る。
【００４９】
この方法は、タンパク質ｏｒｆ１、ｏｒｆ４、ｏｒｆ２５、ｏｒｆ４０、Ｏｒ
ｆ４６／４６．１、ｏｒｆ８３、２３３、２８７、２９２Ｌ、５６４、６８７、
７４１、９０７、９１９、９５３、９６１、および９８３の発現に十分適してい
る。
【００５０】
ＮＨ２−Ａ−Ｂ−ＣＯＯＨ形態の、以下の表において「Ｘ」により示される４
２個のハイブリッドが好ましい。
【００５１】
【表２】
2014000092.tif 000004
従って、ハイブリッドとして発現される好ましいタンパク質は、ＯＲＦ４６．
１、２８７、７４１、９１９、９５３、９６１、および９８３である。これらは
、それらの本質的な全長形態で用いられ得るか、またはポリグリシン欠損（ΔＧ
）形態が用いられ得るか（例えば、ΔＧ−２８７、ΔＧＴｂｐ２、ΔＧ７４１、
ΔＧ９８３など）、もしくは、短縮された形態が用いられ得るか（例えば、Δ１
−２８７、Δ２−２８７など）、あるいは、ドメイン欠損バージョンが用いられ
得る（例えば、２８７Ｂ、２８７Ｃ、２８７ＢＣ、ＯＲＦ４６１−４３３、ＯＲ
Ｆ４６４３３−６０８、ＯＲＦ４６，９６１ｃなど）。
【００５２】
特に、以下が好ましい：（ａ）９１９および２８７を含むハイブリッドタンパ
ク質；（ｂ）９５３および２８７を含むハイブリッドタンパク質；（ｃ）２８７
およびＯＲＦ４６．１を含むハイブリッドタンパク質；（ｄ）ＯＲＦ１およびＯ
ＲＦ４６．１を含むハイブリッドタンパク質；（ｅ）９１９およびＯＲＦ４６．
１を含むハイブリッドタンパク質；（ｆ）ＯＲＦ４６．１および９１９を含むハ
イブリッドタンパク質；（ｇ）ＯＲＦ４６．１、２８７、および９１９を含むハ
イブリッドタンパク質；（ｈ）９１９および５１９を含むハイブリッドタンパク
質；および（ｉ）ＯＲＦ９７および２２５を含むハイブリッドタンパク質。さら
なる実施形態は、図１４に示される。
【００５３】
２８７が用いられる場合、ハイブリッドのＣ末端で用いられることが好ましい
；２８７がＮ末端で用いられる場合、２８７のΔＧ形態が用いられる（例えば、
ＯＲＦ４６．１、９１９、９５３、または９６１とのハイブリッドのＮ末端とし
て）ことが好ましい。
【００５４】
２８７が用いられる場合、好ましくはこれは、２９９６株由来であるか、また
は３９４／９８株由来である。
【００５５】
９６１が用いられる場合、好ましくはこれは、そのＮ末端である。９６１のド
メイン形態が用いられ得る。
【００５６】
ＯＲＦ４６、２８７、９１９、および９５３の多型形態のアラインメントは、
ＷＯ００／６６７４１に開示されている。任意のこれらの多型が、本発明に従い
用いられ得る。
【００５７】
（温度）
異種発現についての６番目の取り組みにおいて、本発明のタンパク質は、低温
にて発現される。
【００５８】
発現されたナイセリアタンパク質（例えば９１９）は、Ｅ．ｃｏｌｉに対して
有毒であり得、これは、その有毒活性が現れない温度にて、その有毒なタンパク
質を発現させることにより、回避され得る。
【００５９】
従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供し、こ
の方法において、本発明のタンパク質の発現は、このタンパク質の有毒な活性が
現れない温度にて実施される。
【００６０】
好ましい温度は、３０℃付近である。これは、９１９の発現に特に適している
。
【００６１】
（変異）
上記のように、発現されたナイセリアタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉに対して有
毒であり得る。この毒性は、この有毒な活性を減少または消滅させるようにこの
タンパク質を変異することにより回避され得る。特に、毒性の酵素活性を減少ま
たは消滅させるための変異が、好ましくは、部位特異的変異誘発を使用して、用
いられ得る。
【００６２】
従って、異種発現についての７番目の取り組みにおいて、発現されたタンパク
質は、有毒な活性を減少または消滅させるために変異される。
【００６３】
従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供し、こ
の方法において、タンパク質は、有毒な活性を減少または消滅させるために変異
される。
【００６４】
好ましくはこの方法は、タンパク質９０７、９１９、または９２２の発現のた
めに用いられる。９０７における好ましい変異は、Ｇｌｕ−１１７での変異（例
えば、Ｇｌｕ→Ｇｌｙ）であり；９１９における好ましい変異は、Ｇｌｕ−２５
５での変異（例えば、Ｇｌｕ→Ｇｌｙ）および／またはＧｌｕ−３２３での変異
（例えば、Ｇｌｕ→Ｇｌｙ）であり；９２２における好ましい変異は、Ｇｌｕ−
１６４での変異（例えば、Ｇｌｕ→Ｇｌｙ）、Ｓｅｒ−２１３での変異（例えば
、Ｓｅｒ→Ｇｌｙ）、および／またはＡｓｎ−３４８での変異（例えば、Ａｓｎ
→Ｇｌｙ）である。
【００６５】
（代替のベクター）
異種発現についての８番目の取り組みにおいて、代替のベクターが、このタン
パク質を発現させるために用いられた。これは、発現の収率を改善するためであ
り、例えば、ＧＭＰでの使用についてすでに承認されているプラスミドを利用す
ることであり得る。
【００６６】
従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供し、こ
の発明において、代替のベクターが用いられる。この代替のベクターは、好まし
くはｐＳＭ２１４であり、融合パートナーを伴わない。リーダーペプチドは、含
まれても含まれなくてもよい。
【００６７】
このアプローチは、特にタンパク質９５３に有用である。ｐＳＭ２１４から発
現された９５３のネイティブなリーダーペプチドを有する９５３の発現および局
在化は、ｐＥＴベクターよりもかなり良好である。
【００６８】
ｐＳＭ２１４はまた、以下：ΔＧ２８７、Δ２−２８７、Δ３−２８７、Δ４
−２８７、Ｏｒｆ４６．１、９６１Ｌ、９６１、９６１（ＭＣ５８）、９６１ｃ
−Ｌ、９１９、９５３およびΔＧ２８７−Ｏｒｆ４６．１とともに用いられ得る
。
【００６９】
別の適切なベクターは、ｐＥＴ−２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ；カナマイシン耐性
を用いる）であり、ここでも融合パートナーを用いない。ｐＥＴ−２４ｂは、以
下：ΔＧ２８７、Δ２−２８７Ｋ、Δ３−２８７Ｋ、Δ４−２８７Ｋ、Ｏｒｆ４
６．１Ｋ、Ｏｒｆ４６Ａ−Ｋ、９６１−Ｋ（ＭＣ５８）、９６１ａ−Ｋ、９６１
ｂ−Ｋ、９６１ｃ−Ｋ、９６１ｃ−Ｌ−Ｋ、９６１ｄ−Ｋ、ΔＧ２８７−９１９
−Ｋ、ΔＧ２８７−Ｏｒｆ４６．１−ＫおよびΔ２８７−９６１−Ｋとともに用
いるのに好ましい。
【００７０】
（多量体形態）
異種発現に対する９番目のアプローチでは、タンパク質が、特定の多量体形態
をとるように、発現されるかまたは精製される。
【００７１】
このアプローチは、タンパク質９５３に特に適切である。９５３（単量体形態
）の特定の１つの多量体形態の精製によって、他の形態（二量体形態）よりも大
きい殺菌活性を有するタンパク質が得られる。
【００７２】
タンパク質２８７および９１９は、二量体形態で精製され得る。
【００７３】
タンパク質９６１は、１８０ｋＤａのオリゴマー形態（例えば、テトラマー（
四量体））で精製され得る。
【００７４】
（脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ））
異種発現に対する１０番目のアプローチでは、タンパク質が脂質化されたタン
パク質として発現される。
【００７５】
このように、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供す
る。この方法では、タンパク質は脂質化されたタンパク質として発現される。
【００７６】
これは、特に９１９、２８７、ＯＲＦ４、４０６、５７６−１およびＯＲＦ２
５の発現に有用である。９１９、２８７、およびＯＲＦ４のポリマー形態は、Ｗ
Ｏ００／６６７４１に開示される。
【００７７】
この方法は、代表的に、Ｎ末端融合パートナーは用いないで、適切なリーダー
ペプチドの使用を包含する。
【００７８】
（Ｃ末端欠失）
異種発現に対する１１番目のアプローチでは、本発明のタンパク質のＣ末端が
変異している。さらに、融合タンパク質を用いないことが好ましい。
【００７９】
このように、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供す
る。この方法では、（ａ）タンパク質のＣ末端領域が変異しており、そして必要
に応じて、（ｂ）融合タンパク質を用いない。
【００８０】
この方法は、代表的に、以下の工程：本発明のタンパク質をコードする核酸を
入手する工程；この核酸を操作して、タンパク質のＣ末端部分をコードするヌク
レオチドを変異させる工程、を包含する。得られた核酸は、発現ベクター中に挿
入され得るか、またはすでに発現ベクターの一部であり得る。発現されたタンパ
ク質の最初のアミノ酸は、成熟したネイティブタンパク質の最初のアミノ酸であ
る。
【００８１】
この変異は、置換、挿入、または好ましくは欠失であり得る。
【００８２】
この方法は、特にタンパク質７３０、ＯＲＦ２９、およびＯＲＦ４６について
、発現のレベルを増大させ得る。タンパク質７３０について、Ｃ末端領域の、お
よそ６５〜およそ２１４のアミノ酸が欠失され得る；ＯＲＦ４６については、Ｃ
末端領域のおよそ１７５アミノ酸が欠失され得る；ＯＲＦ２９については、Ｃ末
端が欠失されて、およそ２３０〜３７０のＮ末端アミノ酸が残され得る。
【００８３】
（リーダーペプチド変異）
異種発現に対する１２番目のアプローチでは、本発明のタンパク質のリーダー
ペプチドが変異している。これは、特にタンパク質９１９の発現に有用である。
【００８４】
このように、本発明は、タンパク質のリーダーペプチドが変異している、本発
明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。
【００８５】
この方法は、代表的に、以下の工程：本発明のタンパク質をコードする核酸を
入手する工程；この核酸を操作して、リーダーペプチド内のヌクレオチドを変異
させる工程、を包含する。得られた核酸は、発現ベクター中に挿入され得るか、
またはすでに発現ベクターの一部であり得る。
【００８６】
（ポリグリシン欠失）
異種発現に対する１３番目のアプローチでは、野生型配列におけるポリグリシ
ン（ｐｏｌｙ−ｇｌｙｃｉｎｅ）ストレッチが変異している。これが、タンパク
質発現を強化する。
【００８７】
このポリグリシンストレッチは、配列（Ｇｌｙ）ｎを有し、ここでｎ≧４（例
えば、５、６、７、８、９またはそれ以上）である。このストレッチは、（Ｇｌ
ｙ）ｎをバラバラにするかまたは除去するように変異される。これは、欠失（例
えば、ＣＧＧＧＧＳ→ＣＧＧＧＳ、ＣＧＧＳ、ＣＧＳまたはＣＳ）、置換（例え
ば、ＣＧＧＧＧＳ→ＣＧＸＧＧＳ、ＣＧＸＸＧＳ，ＣＧＸＧＸＳなど）、および
／または挿入（例えば、ＣＧＧＧＧＳ→ＣＧＧＸＧＧＳ、ＣＧＸＧＧＧＳ、など
）によるものであってもよい。
【００８８】
このアプローチは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌタンパク質（ナイセリアのタンパク
質）には限定されない。このアプローチは、異種発現を強化するため、任意のタ
ンパク質（特に細菌タンパク質）に用いられ得る。しかし、ナイセリアの（Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａｌ）タンパク質について、このアプローチは、特に２８７、７４
１、９８３およびＴｂｐ２を発現するのに適切である。２８７の多量体形態の整
列は、ＷＯ００／６６７４１に開示されている。
【００８９】
このように、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供す
る。この方法では、（ａ）タンパク質内のポリグリシンストレッチが変異されている。
【００９０】
この方法は、代表的に、以下の工程：本発明のタンパク質をコードする核酸を
入手する工程；この核酸を操作して、タンパク質内のポリグリシンストレッチを
コードするヌクレオチドを変異させる工程、を包含する。得られた核酸は、発現
ベクター中に挿入され得るか、またはすでに発現ベクターの一部であり得る。
【００９１】
逆に、反対のアプローチ（すなわち、ポリグリシンストレッチの導入）を用い
て、所定の異種タンパク質の発現を抑制または減弱し得る。
【００９２】
（異種宿主）
本発明のタンパク質の発現は、ネイティブな宿主（すなわち、このタンパク質
が天然に発現される生物体）に生じ得るが、本発明は異種の宿主を利用する。異
種宿主は、原核生物または真核生物であり得る。Ｅ．ｃｏｌｉが好ましいが、他
の適切な宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  
ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｎｎａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔ
ａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母など、が挙げられる。
【００９３】
（ベクターなど）
上記の方法に加えて、本発明は、以下：（ａ）これらの方法に有用な核酸およ
びベクター、（ｂ）このようなベクターを含む宿主細胞、（ｃ）この方法によっ
て発現されるかまたは発現可能なタンパク質、（ｄ）これらのタンパク質を含む
組成物（これは、例えば、ワクチンとして、または診断試薬として、または免疫
原性組成物として適切であり得る）、（ｅ）医薬（例えば、ワクチン）として、
または診断試薬としての使用のためのこれらの組成物、（ｆ）以下の製造におけ
るこれらの組成物の使用：（１）ナイセリア細菌による感染を処置または予防す
るための医薬、（２）ナイセリア細菌の存在、もしくはナイセリア細菌に対して
惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬、および／または（３）ナイセ
リア細菌に対する抗体を惹起し得る試薬、（ｇ）患者を処置する方法であって、
これらの組成物の治療上有効な量をこの患者に投与する工程を包含する、方法、
を提供する。
【００９４】
（配列）
本発明はまた、以下の実施例に記載される任意の配列を有するタンパク質また
は核酸を提供する。本発明はまた、これらに同一な配列を有するタンパク質およ
び核酸もまた提供する。上記のように、「配列同一性」の程度は、好ましくは、
５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％
、またはそれ以上）。
【００９５】
さらに、本発明は、好ましくは、「高ストリンジェンシー」な条件（例えば、
０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液中で６５℃）下で、この実施例中に開示さ
れた核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００９６】
本発明はまた、本発明によるタンパク質をコードする核酸を提供する。
【００９７】
本発明が上記の核酸に相補的な配列を含む核酸を（例えば、アンチセンスまた
はプローブの目的で）提供することも理解されるべきである。
【００９８】
本発明に従う核酸は、当然ながら、多くの方法で（例えば、ゲノムまたはｃＤ
ＮＡのライブラリーから、生物体自体からの、化学合成などによって）調製され
得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）を
とり得る。
【００９９】
さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、そしてまたそれらのア
ナログ（例えば、改変骨格を含むもの）を含み、そしてまたペプチド核酸（ＰＮ
Ａ）なども含む。
【実施例】
【０１００】
（発明を実行するための様式）
（実施例１−９１９および９１９のリーダーペプチド）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清型Ｂ、２９９６株）由来のタンパク質９
１９は、以下の配列を有する。
【０１０１】
【化１】
2014000092.tif 000005
リーダーペプチドには、下線を付した。
【０１０２】
他の株由来の９１９の配列は、ＷＯ００／６６７４１の図７および図１８に見
出され得る。
【０１０３】
ＷＯ９９／５７２８０の実施例２は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨｉｓ−融合とし
てのタンパク質９１９の発現を開示する。このタンパク質は、良好な表面曝露抗
原である。
【０１０４】
３つの代替の発現ストラテジーが９１９に対して用いられた：
１）そのリーダーペプチド（Ｎ末端の成熟したシステインなしの）およびいか
なる融合パートナーも有さない９１９（「９１９タグなし」）：
【０１０５】
【化２】
2014000092.tif 000006
このリーダーペプチドおよびシステインを、予測リーダー配列から下流の５’
末端増幅プライマーを設計することによって除外した。
【０１０６】
２）９１９自体のリーダーペプチドを有するが、いかなる融合パートナーも有
さない９１９（「９１９Ｌ」）；および
３）ＯＲＦ４由来のリーダーペプチド
【０１０７】
【化３】
2014000092.tif 000007
を有する９１９（「９１９ＬＯｒｆ４」）
【０１０８】
【化４】
2014000092.tif 000008
を、９１９に対して使用した。
【０１０９】
この構築物を作製するために、ＯＲＦ４リーダーペプチドをコードする全配列
を、テイルとして５’−プライマー中に含んだ（プライマー９１９Ｌｏｒｆ４  
Ｆｏｒ）。ＮｈｅＩ制限部位を、ＯＲＦ４リーダーをコードする配列における２
個のヌクレオチド変化によって作製し（アミノ酸改変はない）、異なる遺伝子が
ＯＲＦ４リーダーペプチド配列に融合されることを可能にした。終止コドンを、
３’末端プライマー配列の全てに含んだ。
【０１１０】
このタンパク質の３つの形態全てを発現し、精製し得た。
【０１１１】
「９１９Ｌ」および「９１９ＬＯｒｆ４」発現産物を、［３Ｈ］−パルミテー
ト標識の取り込みによって示されるように、両方とも脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ
）した。９１９タグなしは、３Ｈ標識を取り込まず、そして細胞内に位置した。
【０１１２】
９１９ＬＯｒｆ４を、９１９Ｌより容易に精製し得た。これを精製し、マウス
を免疫するために使用した。生じた血清は、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡ試験にお
いて、また、殺菌性のアッセイにおいても優れた結果を与えた。リポタンパク質
が、外膜に局在することを示した。
【０１１３】
９１９タグなしは、優れたＥＬＩＳＡ力価および高い血清の殺菌性活性を与え
た。ＦＡＣＳは、９１９タグなしの細胞表面の位置を確認した。
【０１１４】
（実施例２−９１９および発現温度）
９１９ＬＯｒｆ４タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉの３７℃での増殖は、細菌の溶解を生じた。この問題を克服するため、組換え細菌を３０℃で増殖させた
。溶解を、発現を妨げることなく回避した。
【０１１５】
（実施例３−９０７、９１９および９２２の変異）
タンパク質９０７、９１９および９２２は、ムレイン加水分解酵素、より詳細
には溶解性トランスグリコシラーゼであると仮定された。ムレイン加水分解酵素
は、外膜に存在し、そしてペプチドグリカンの分解に関与する。
【０１１６】
従って、精製されたタンパク質９１９タグなし、９１９Ｌｏｒｆ４、９１９−
Ｈｉｓ（すなわち、Ｃ末端のＨｉｓタグを有する）および９２２−Ｈｉｓを、ム
レイン加水分解酵素活性について試験した［Ｕｒｓｉｎｕｓ＆Ｈｏｌｔｊｅ（１
９９４）Ｊ．Ｂａｃｔ．１７６：３３８−３４３］。２つの異なるアッセイを使
用した。１つは、可溶ムロペプチドへの不溶ムレイン網状袋の分解を決定し、他
は、ポリ（ＭｕｒＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎ＞３０グリカン鎖の崩壊を測定する。
【０１１７】
第一のアッセイは、基質としてメソ−２，６−ジアミノ−３，４，５−［３Ｈ
］ピメリン酸で放射性標識したムレイン網状袋を使用する。酵素（合計３〜１０
μｇ）を、１０ｍＭのトリスマレアート（ｐＨ５．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２
、０．２％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および［３Ｈ］Ａ２ｐｍ標識ムレ
イン網状袋（約１００００ｃｐｍ）を含む、１００μｌの合計容積で３７℃で４
５分間インキュベートした。このアッセイ混合物を、１５分間の１％ｗ／ｖのＮ
−アセチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム１００μｌと共に氷上に１５
分間置き、そして１００００ｇで１５分間遠心分離してペレット化した材料を沈
殿させた。上清における放射能を、液体シンチレーションカウントによって測定
した。Ｅ．ｃｏｌｉの可溶な溶解性トランスグリコシラーゼＳｌｔ７０を、この
アッセイの陽性コントロールとして使用した；陰性コントロールは、酵素なしの
上記のアッセイ溶液を含んだ。
【０１１８】
９１９−Ｈｉｓ以外の全てのタンパク質は、第一のアッセイにおいて陽性の結
果を与えた。
【０１１９】
第二のアッセイは、ポリ（ＭｕｒＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）グリカン鎖の加水分
解をモニターする。精製された鎖である、Ｎ−アセチル−Ｄ−１−［３Ｈ］グル
コサミンで標識されたポリ（ＭｕｒＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎ＞３０を、１０ｍ
Ｍのトリスマレアート（ｐＨ５．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２％ｖ／ｖ
のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中の３μｇの９１９Ｌと共に、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。この反応を、５分間煮沸することによって停止させ、そして
このサンプルのｐＨを、１０μｌの２０％ｖ／ｖリン酸の添加によって約３．５
に調整した。基質および産物を、Ｈａｒｚら、［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（
１９９０）１９０：１２０−１２８］に記載されるように、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ
３００  Ｃ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣによって分離した。Ｅ．ｃｏｌｉの溶
解性トランスグリコシラーゼ、Ｍｌｔ  Ａを、このアッセイにおいて陽性コント
ロールとして使用した。陰性コントロールを、酵素の非存在下で実行した。
【０１２０】
このアッセイによって、単離されたグリカン鎖を加水分解する９１９ＬＯｒｆ
４の能力を、無水二糖類サブユニットがＨＰＬＣによってオリゴ糖から分離され
た場合に、実証した。
【０１２１】
タンパク質９１９Ｌｏｒｆ４を、動力学的分析のために選択した。９１９Ｌｏ
ｒｆ４の活性は、アッセイ緩衝液中の０．２％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加によって、３．７倍増強した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在は、９
１９タグなしの活性に効果を有さなかった。酵素活性に対するｐＨの効果を、ト
リスマレアート緩衝液中で、５．０〜８．０の範囲にわたって決定した。反応の
ために最適なｐＨが、５．５であることを決定した。１８℃〜４２℃の範囲の温
度にわたって、最大の活性を、３７℃で観察した。ムレイン加水分解酵素活性に
対する種々のイオンの効果を、１０ｍＭの最終濃度での種々のイオンの存在下で
反応を実行することによって決定した。最大の活性はＭｇ２＋で見出され、これ
は、活性を２．１倍刺激した。Ｍｎ２＋およびＣａ２＋もまた、酵素活性を類似
の程度に刺激したが、Ｎｉ２＋およびＥＤＴＡの添加は、有意な効果を有しなか
った。対照的に、Ｆｅ２＋およびＺｎ２＋の両方は、酵素活性を有意に阻害した。
【０１２２】
未標識のＥ．ｃｏｌｉのムレイン網状袋の消化から生じる反応産物の構造を、
Ｇｌａｕｎｅｒ［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１７２：４５１−４
６４］に記載のように、逆相ＨＰＬＣによって分析した。ムラミダーゼＣｅｌｌ
ｏｓｙｌで消化したムレイン網状袋を、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳカラムを較正
し、そして標準化するために使用した。主な反応産物は、１，６無水二糖テトラ
ペプチドおよび１，６無水二糖トリペプチドであり、１，６無水ムラミン酸の分
子内結合の形成を実証する。
【０１２３】
これらの結果は、９１９がムレイン加水分解酵素であり、特に酵素の溶解性ト
ランスグリコシラーゼファミリーのメンバーであることを、実験的に実証する。
さらに、ムレイン網状袋を加水分解する９２２−Ｈｉｓの能力は、このタンパク
質がまた、溶解性トランスグリコシラーゼであることを示唆する。
【０１２４】
この活性は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された場合の９１９の毒性効果を説明
する助けになり得る。
【０１２５】
酵素活性を除外するため、合理的な変異誘発を使用した。９０７、９１９およ
び９２２は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の３つの脂質化された膜結合ムレイン溶解性トラ
ンスグリコシラーゼに、かなり低い相同性を示す：
９１９（４４１アミノ酸）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＬＴＡ（Ｐ４６８８５）に対
して４４０アミノ酸重複にわたり、２７．３％同一である。
【０１２６】
９２２（３６９アミノ酸）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＬＴＢ（Ｐ４１０５２）に対
して３１０アミノ酸重複にわたり、３８．７％同一である。
【０１２７】
９０７−２（２０７アミノ酸）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＬＴＣ（Ｐ５２０６６）
に対して１４９アミノ酸重複にわたり、２６．８％同一である。
【０１２８】
９０７−２はまた、ペリプラズム空間に位置する可溶な溶解性トランスグリコ
シラーゼである、Ｅ．ｃｏｌｉのＭＬＴＤ（Ｐ２３９３１）およびＳｌｔ７０（
Ｐ０３８１０）と相同性を共有する。有意な配列相同性は、９１９、９２２およ
び９０７−２間に検出され得ず、対応するＭＬＴＡタンパク質、ＭＬＴＢタンパ
ク質およびＭＬＴＣタンパク質間で、同じである。
【０１２９】
結晶構造は、Ｓｌｔ７０［１ＱＴＥＡ；１ＱＴＥＢ；Ｔｈｕｎｎｉｓｓｅｎら
（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１２７２９−１２７３７］およ
びＳｌｔ３５［１ＬＴＭ；１ＱＵＳ；１ＱＵＴ；ｖａｎ  Ａｓｓｅｌｔら（１９
９９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  ７：１１６７−８０］（これは
、４０ｋＤａのＭＬＴＢの可溶形態である）について利用可能である。
【０１３０】
この触媒性残基（グルタミン酸）は、Ｓｌｔ７０およびＭＬＴＢの両方につい
て同定されている。
【０１３１】
Ｓｌｔ７０の場合、変異誘発研究は、グルタミン（Ｇｌｎ）による触媒性Ｇｌ
ｕ５０５の保存的置換さえ、酵素活性の完全な喪失を引き起こすことを実証した
。Ｓｌｔ３５は、Ｓｌｔ７０に対する明らかな配列の類似を有さないが、Ｓｌｔ
３５の触媒ドメインは、驚くべき類似性を示す。ＭＬＴＢにおけるこの対応する
触媒性残基は、Ｇｌｕ１６２である。
【０１３２】
酵素のクレフトの正しい折り畳みにおいて重要な役割を果たすと考えられる別
の残基は、グルタミン酸の下流のよく保存されたグリシン（Ｇｌｙ）である。最
近、Ｔｅｒｒａｋら［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９９）３４：３５０
−６４］は、触媒性グルタミン酸の下流の７０〜７５残基あたりに位置する芳香
族アミノ酸である、別の重要な残基の存在を示唆した。
【０１３３】
Ｓｌｔ７０と９０７−２との配列アラインメント、およびＭＬＴＢと９２２と
の配列アラインメントを、ＭｅｎＢ抗原において対応する触媒性残基を同定する
ために、実行した。
【０１３４】
この触媒性ドメイン領域における２つのアラインメントを、以下に報告する。
【０１３５】
【化５】
2014000092.tif 000009
これらのアラインメントから、９０７−２において対応する触媒性グルタミン
酸が、Ｇｌｕ１１７であり、一方９２２においてはＧｌｕ１６４であるという結
果になる。両方の抗原がまた、酵素のクレフトの折り畳みにおいて構造的役割を
有し得る下流のグリシン（太字）を共有し、そして９２２は、７０アミノ酸ほど
下流の保存された芳香族残基（太字）を有する。
【０１３６】
タンパク質９１９の場合、このタンパク質のＥ．ｃｏｌｉのホモログである、
ＭＬＴＡについて利用可能な３次元構造は存在せず、そして潜在的触媒性残基に
ついては何も知られていない。それにもかかわらず、９１９における３つのアミ
ノ酸が、ＭＬＴＡとのアラインメントにより、触媒性残基として予測される。
【０１３７】
【化６】
2014000092.tif 000010
これら３つの潜在的触媒性残基を、記号「下向きの黒三角」によって示す：
１）３つの保存されたグリシン（Ｇｌｙ２６３、Ｇｌｙ２６５およびＧｌｙ２
７２）ならびに約７５〜７７残基下流に位置する３つの保存された芳香族残基の
前のＧｌｕ２５５（ＭＬＴＡにおいてはＡｓｐ）。これら下流の残基を、□で示
す。
【０１３８】
２）２つの保存されたグリシン（Ｇｌｙ３４７およびＧｌｙ３５５）ならびに
８４〜８５残基下流に位置する２つの保存された芳香族残基（Ｔｙｒ４０６また
はＰｈｅ４０７）の前の（ＭＬＴＡにおいて保存された）Ｇｌｕ３２３。これら
下流の残基を、◇によって示す。
【０１３９】
３）１つのグリシン（Ｇｌｙ３６９）および保存された芳香族残基（Ｔｒｐ４
２８）の前のＡｓｐ３６２（予測されるＧｌｕの代わり）。これら下流の残基を
、○によって示す。
【０１４０】
９１９の多型形態のアラインメントは、ＷＯ００／６６７４１に開示される。
【０１４１】
触媒性残基の予測に基づき、各々単一のアミノ酸置換を含む９１９の３種の変
異体および９０７の１種の変異体を、作製した。９１９タンパク質における２５
５位および３２３位でのグルタミン酸、ならびに３６２位でのアスパラギン酸、
そして９０７タンパク質における１１７位でのグルタミン酸を、ＰＣＲベースの
ＳＤＭを使用してグリシン残基で置換した。これを行うために、ＧｌｕまたはＡ
ｓｐからＧｌｙへのコドンの変化を含む内部プライマーを、設計した。
【０１４２】
【表３】
2014000092.tif 000011
グリシンのヌクレオチドコードに下線を付した；変異したヌクレオチドは、小文
字である。
【０１４３】
９１９−Ｅ２５５変異体、９１９−Ｅ３２３変異体および９１９−Ｅ３６２変
異体を作製するために、鋳型として２０ｎｇのｐＥＴ９１９−ＬＯｒｆ４  ＤＮ
Ａを使用し、そして以下のプライマー組：
１）Ｏｒｆ４Ｌ  ｆｏｒ／９１９−Ｅ２５５  ｒｅｖ
２）９１９−Ｅ２５５  ｆｏｒ／９１９Ｌ  ｒｅｖ
３）Ｏｒｆ４Ｌ  ｆｏｒ／９１９−Ｅ３２３  ｒｅｖ
４）９１９−Ｅ３２３  ｆｏｒ／９１９Ｌ  ｒｅｖ
５）Ｏｒｆ４Ｌ  ｆｏｒ／９１９−Ｄ３６２  ｒｅｖ
６）９１９−Ｄ３６２  ｆｏｒ／９１９Ｌ  ｒｅｖ
を使用してＰＣＲを実行した。
【０１４４】
２回目のＰＣＲを、ＰＣＲ  １〜２、３〜４または５〜６の産物を鋳型として
使用し、そして「Ｏｒｆ４Ｌ  ｆｏｒ」および「９１９Ｌ  ｒｅｖ」をそれぞれ
前向きおよび逆向きのプライマーとして使用して実行した。
【０１４５】
変異体９０７−Ｅ１１７については、ＰＣＲを、鋳型として２９９６株の染色
体ＤＮＡ２００ｎｇを使用し、そして以下のプライマー組：
７）９０７Ｌ  ｆｏｒ／９０７−Ｅ１１７  ｒｅｖ
８）９０７−Ｅ１１７  ｆｏｒ／９０７Ｌ  ｒｅｖ
を使用して実行した。
【０１４６】
２回目のＰＣＲを、ＰＣＲ７および８の産物を鋳型として使用し、そしてオリ
ゴ「９０７Ｌ  ｆｏｒ」および「９０７Ｌ  ｒｅｖ」をプライマーとして使用し
て、実行した。
【０１４７】
各変異を含むＰＣＲフラグメントを、標準的な手順に従って進め、ＮｄｅＩお
よびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、そしてｐＥＴ−２１ｂ＋ベクターにクローニン
グした。各変異の存在を、配列決定分析によって確認した。
【０１４８】
９０７におけるＧｌｕ１１７のＧｌｙへの変異を、同様に実行し、９２２にお
ける残基Ｇｌｕ１６４、Ｓｅｒ２１３およびＡｓｎ３４８の変異も同様である。
【０１４９】
９１９のＥ２５５Ｇ変異体は、活性において５０％の減少を示す；Ｅ３２３Ｇ変異体は、活性において７０％の減少を示す；Ｅ３６２Ｇ変異体は、活性におい
て減少を示さない。
【０１５０】
（実施例４−多量体形態）
２８７−ＧＳＴ、９１９タグなしおよび９５３−Ｈｉｓを、四次構造の分析ま
たは調製目的のために、ゲル濾過に供した。ネイティブなタンパク質の分子量を
、ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２（Ｈ／Ｒ  １０／３０）またはＳｕｐｅｒ
ｄｅｘ  ７５ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のいずれかを使用して、評
価した。２８７、９１９および９５３についてのクロマトグラフィーに使用され
た緩衝液は、それぞれ、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのビ
シン（ｐＨ８．５）および５０ｍＭのビシン（ｐＨ８．０）であった。
【０１５１】
さらに、各緩衝液は、１５０〜２００ｍＭのＮａＣｌおよび１０％ｖ／ｖのグ
リセロールを含んだ。タンパク質を、適切な緩衝液に対して透析し、そして２０
０μｌの容積でアプライした。ゲル濾過を、０．５〜２．０ｍｌ／分の流速で実
行し、そして溶出を２８０ｎｍでモニターした。画分を回収し、そしてＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって分析した。青色デキストラン２０００および分子量標準リボヌ
クレアーゼＡ、キモトリプシンＡオボアルブミン、アルブミン（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を使用してカラムを較正した。サンプルの分子量を、Ｋａｖ対標準のログ
Ｍｒの較正曲線から概算した。ゲル濾過の前に、２８７−ＧＳＴを、ＧＳＴ部分
を切断するためにトロンビンで消化した。
【０１５２】
２８７、９１９および９５３−Ｈｉｓについて概算した分子量は、それぞれ７
３ｋＤａ、４７ｋＤａおよび４３ｋＤａであった。これらの結果は、９１９が単
量体であるが、２８７および９５３の両方が主に自然状態で二量体であることを
示唆する。９５３−Ｈｉｓの場合、ゲル濾過中に２つのピークを観察した。大き
いピーク（８０％）は９５３の二量体構造を示し、小さいピーク（２０％）は、
予測された単量体の大きさを有した。９５３の単量体形態が、二量体より大きい
殺菌性活性を有することを見出した。
【０１５３】
（実施例５−ｐＳＭ２１４およびｐＥＴ−２４ｂベクター）
そのネイティブなリーダーペプチドを含みかつ融合パートナー（ｆｕｓｉｏｎ
ｐａｒｔｎｅｒ）を含まない９５３タンパク質を、ｐＥＴベクターからおよび
ｐＳＭ２１４ベクターからも発現させた［Ｖｅｌａｔｉ  Ｂｅｌｌｉｎｉら、（
１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１７７−１９２］。
【０１５４】
９５３配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４−１株を宿主細胞として使用して、
ｐＳＭ２１４の中へ全長遺伝子としてクローン化した。これを行うために、９５
３遺伝子の全ＤＮＡ配列（ＡＴＧ〜終止コドン）を、以下のプライマーを使用す
るＰＣＲによって増幅した：
９５３Ｌ  ｆｏｒ／２  ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡ
ＴＣＴＴＣＧＣＣＧＣ            ＥｃｏＲＩ
９５３Ｌ  ｒｅｖ／２  ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＧ
ＣＣＴＣＧＡＴＴ            ＨｉｎｄＩＩＩ
（これらは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含む）。
この増幅されたフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そし
て同様の２つの酵素で消化したｐＳＭ２１４ベクターを使用して、ライゲーショ
ンを行った。ライゲーションされたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４−１
細胞へ形質転換し（３７℃で６５分間、氷中でインキュベーションすることによ
って）、そして細菌細胞を、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天上へプレーティングした。
【０１５５】
２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む４ｍｌのＬＢ培養液中で、組換え
コロニーを一晩中３７℃にて増殖させ；細菌細胞を遠心分離し、そしてプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、そしてこれをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化
によって分析した。このタンパク質を発現する組換えコロニーの能力を分析する
ために、これらの組換えコロニーを２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含
むＬＢ培養液中へ接種し、そして３７℃で１６時間増殖させた。細菌細胞を遠心
分離し、ＰＢＳ中で再懸濁した。タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびク
マシーブルー染色によって分析した。
【０１５６】
ｐＳＭ２１４プラスミドからの発現レベルは、予想外に高かった。
【０１５７】
配列をｐＳＭ２１４ベクターにクローン化するために使用したオリゴは、以下
のようであった：
【０１５８】
【表４】
2014000092.tif 000012
９５３Ｌについて記載されるように、これらの配列を操作し、クローン化し、そして発現させた。
【０１５９】
ｐＥＴ−２４ベクターに関しては、ｐＥＴ−２１について以下に記載されるよ
うに、ｐＥＴ−２４中で配列をクローン化し、そしてタンパク質を発現させた。
ｐＥＴ−２は、ｐＥＴ−２１と同様の配列を有するが、アンピシリンカセットの
代わりにカナマイシン耐性カセットを含む。
【０１６０】
配列をｐＥＴ−２４ｂベクターへクローン化するために使用されるオリゴヌク
レオチドは、以下であった：
【０１６１】
【表５】
2014000092.tif 000013
＊このプライマーを全２８７型のためのリバースプライマーとして使用した。
§ΔＧ２７８Ｋリバースプライマーと共に使用したフォワードプライマー。
【０１６２】
（実施例６−ＯＲＦ１およびそのリーダーペプチド）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＯＲＦ１（血清群Ｂ、株ＭＣ５８）を外
膜か、または分泌タンパク質であると予測した。これは以下の配列を有する：
【０１６３】
【表６】
2014000092.tif 000014
リーダーペプチドに下線を引いている。
【０１６４】
ＯＲＦ１の多型は、ＷＯ９９／５５８７３において開示されている。
【０１６５】
３つの発現方法をＯＲＦ１に対して使用した：
１）Ｈｉｓ標識を使用するＯＲＦ１（ＷＯ９９／２４５７８（ＯＲＦ１−Ｈｉｓ
）に従って）；
２）それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まないＯ
ＲＦ１（「ＯＲＦ１Ｆ」）；および
３）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯｍｐＡ由来のリーダーペプチド（ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡ
ＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ）を含むＯＲＦ１（「Ｏｒｆ１ＬＯｍｐＡ」）
【０１６６】
【表７】
2014000092.tif 000015
この構築物を作製するために、クローンｐＥＴ９１１ＬＯｍｐＡ（以下を参照
のこと）をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、そしてＯｍｐＡリーダー
配列を有するベクターに対応するフラグメントを精製した（ｐＥＴＬＯｍｐＡ）
。成熟タンパク質をコードするＯＲＦ１遺伝子をオリゴヌクレオチドＯＲＦ１−
ＦｏｒおよびＯＲＦ１−Ｒｅｖ（それぞれ、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認
識部位を含む）を用いて増幅し、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして精製
されたｐＥＴＯｍｐＡフラグメントへライゲーションした（図１を参照のこと）
。さらなるＡＳジペプチドをＮｈｅＩ部位の側に導入した。
【０１６７】
タンパク質の全ての３つの型を発現させた。Ｈｉｓ標識化されたタンパク質を
精製し得、そして暴露され、そして分泌される可能性がある表面として確認した
（図３を参照のこと）。このタンパク質を、マウスを免疫化するために使用して
、そして生じた血清は、殺菌性のアッセイにおいて優れた結果を与えた。
【０１６８】
ＯＲＦ１ＬＯｍｐＡを全膜として精製し、そして膜の内側および外側の両方に
おいて局在化させた。予想外に、ＯＲＦ１ＬＯｍｐＡに対して惹起された血清は
、Ｈｉｓ標識化されたタンパク質に対して惹起した血清よりも、さらにより良い
ＥＬＩＳＡおよび抗殺菌性の性質を示した。
【０１６９】
ＯＲＦ１Ｌを、ＯＲＦ１Ｌが局在している外膜として精製した。
【０１７０】
（実施例７−タンパク質９１１およびそのリーダーペプチド）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質９１１（血清群Ｂ、ＭＣ５８
株）は、以下の配列を有する：
【０１７１】
【表８】
2014000092.tif 000016
リーダーペプチドに下線を引いている。
【０１７２】
３つの発現方法を９１１に対して使用した：
１）それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まない９
１１（「９１１Ｌ」）；
２）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯｍｐＡ由来のリーダーペプチドを含む９１１（「９１１Ｌ
ＯｍｐＡ」）
この構築物を作製するために、ＯｍｐＡリーダーペプチドをコードする全体配列
を５’プライマー中にテールとして含んだ（プライマー９１１ＬＯｍｐＡ  Ｆｏ
ｒｗａｒｄ）。ＮｈｅＩ制限酵素認識部位を、ＯｍｐＡリーダーペプチドをコー
ドする配列と予想される成熟タンパク質をコードする９１１遺伝子との間に挿入
し（１つのアミノ酸（セリン）の挿入）、この構築物の使用によりＯｍｐＡリー
ダーペプチド配列の下流の異なる遺伝子をクローン化を可能にした。
【０１７３】
３）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ＰｅｌＢ由来のリーダーペプチ
ド（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ）を含む９１１（「９１１Ｌ
ｐｅｌＢ」）。
【０１７４】
この構築物を作製するために、５’末端ＰＣＲプライマーをリーダー配列から
下流に設計し、そしてＰｅｌＢリーダー配列に対して直接的に融合される９１１
を有するために、ＮｃｏＩ制限酵素認識部位を含め；３’末端プライマーに終止
コドンを含めた。使用した発現ベクターはｐＥＴ２２ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）で
あり、これは、ＰｅｌＢリーダーペプチドについてのコード配列を有する。Ｎｃ
ｏＩ部位は、ＰｅｌＢ配列の後に、さらなるメチオニンを導入する。
【０１７５】
タンパク質の全ての３つの型を発現させた。ＥＬＩＳＡ力価は９１１Ｌを用い
た場合に最も高く、９１９ＬＯｍｐＡもまた良好な結果をもたらした。
【０１７６】
（実施例８−ＯＲＦ４６）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の完全なＯＲＦ４６タンパク質（血清群Ｂ
、２９９６株）は、以下の配列を含む：
【０１７７】
【表９】
2014000092.tif 000017
リーダーペプチドに下線を引いている。
【０１７８】
他の株由来のＯＲＦ４６の配列は、ＷＯ００／６６７４１中に見出され得る。
【０１７９】
３つの発現方法をＯＲＦに対して使用した：
１）それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まない
ＯＲＦ４６（「ＯＲＦ４６−２Ｌ」）；
２）リーダーペプチドを含まず、かついずれの融合パートナーも含まないＯＲ
Ｆ４６（「ＯＲＦ４６−２」）であって、以下の予想されるリーダー配列から下
流に５’末端増幅プライマーを設計することによってリーダーペプチドが除かれ
た、ＯＲＦ４６：
【０１８０】
【表１０】
2014000092.tif 000018
３）最初の４３３アミノ酸（「ＯＲＦ４６．１Ｌ」）からなる短縮型タンパク
質として、ａａ１〜４３３に対応する部分配列を増幅させるためのＰＣＲプライ
マーを設計することによって構築した、ＯＲＦ４６。
終止コドンを３’末端プライマー配列中に含めた。
【０１８１】
ＯＲＦ４６−２Ｌを、Ｅ．ｃｏｌｉに対して非常に低いレベルで発現させた。
このリーダーペプチド（ＯＲＦ４６−２）の除去は、この問題を解決しない。し
かしながら、短縮型ＯＲＦ４６．１Ｌ型（血清群および種の間でよく保存されて
いる最初の４３３アミノ酸）は、良く発現し、そしてＥＬＩＳＡ試験および殺菌
アッセイにおいて優れた結果を与える。
【０１８２】
ＯＲＦ４６．１をまた、ハイブリッドタンパク質の基礎として使用した。ＯＲ
Ｆ４６．１を２８７，９１９、およびＯＲＦ１と融合させた。このハイブリッド
タンパク質は、一般的に不溶性であるが、ＥＬＩＳＡおよび殺菌性（ホモログの
２９９６株に対して）のいくつかの良い結果を与えた：
【０１８３】
【表１１】
2014000092.tif 000019
比較のために、ＯＲＦ４６．１、２８７（ＧＳＴ融合としてか、またはΔＧ２
８７型でのいずれかで）および９１９の「３重」ハイブリッドを構築し、この３
つの抗原の単一混合物に対比して、種々の株（ホモログの２９９６株を含む）に
対して試験した。ＦＣＡをアジュバントとして使用した：
【０１８４】
【表１２】
2014000092.tif 000020
さらに、このハイブリッドは、同等かまたは優れた免疫学的活性を示す。
【０１８５】
２つのタンパク質（株２９９６）のハイブリッドを、種々の異種株に対して、
個々のタンパク質と比較した：
【０１８６】
【表１３】
2014000092.tif 000021
さらに、このハイブリッドは、同等かまたは優れた免疫学的活性を示す。
【０１８７】
（実施例９−タンパク質９６１）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の完全な９６１タンパク質（血清群Ｂ、Ｍ
Ｃ５８株）は、以下の配列を含む：
【０１８８】
【表１４】
2014000092.tif 000022
リーダーペプチドに下線を引いている。
【０１８９】
９６１発現に対して３つの方法を使用した：
１）ＧＳＴ融合を融合を用いる９６１（ＷＯ９９／５７２８０に従う）（「Ｇ
ＳＴ９６１」）；
２）それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まない
９６１（「９６１Ｌ」）；および
３）リーダーペプチドを含まず、かついずれの融合パートナーも含まない９６
１（「９６１標識化されていない」）であって、以下の予想されるリーダー配列
から下流に５’末端増幅プライマーを設計することによってリーダーペプチドが
除かれた、９６１：
このタンパク質の全ての３つの型を発現した。ＧＳＴ融合タンパク質を精製し
得、そしてこれに対する抗体によって９６１が暴露された表面であることを確認
した（図４）。マウスを免疫化するためにこのタンパク質を使用し、そして生じ
た血清は、殺菌アッセイにおいて優れた結果を与えた。９６１Ｌもまた精製しそ
して非常に高いＥＬＩＳＡ力価を得た。
【０１９０】
タンパク質９６１は、相変異（ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）であるようで
ある。さらに、このタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの全ての株に
おいて見出されない。
【０１９１】
（実施例１０−タンパク質２８７）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ｂ、２９９６株）のタンパク質２８７
は、以下に示す配列を含む：
【０１９２】
【表１５】
2014000092.tif 000023
リーダーペプチドに下線を引いている。
【０１９３】
他の株由来の２８７の配列は、ＷＯ００／６６７４１の図５および図１５中に
見出され得る。
【０１９４】
ＷＯ９９／５７２８０の実施例９は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＧＳＴ融合として２
８７の発現を開示する。
【０１９５】
Ｅ．ｃｏｌｉ中で２８７発現させる多くのさらなる方法を使用し、以下を含む
：
１）Ｈｉｓ標識化された融合体としての２８７（「２８７−Ｈｉｓ」）；
２）それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まない
２８７（「２８７Ｌ」）；
３）ＰＲＦ４リーダーペプチドを含みかついずれの融合パートナーも含まない
２８７（「２８７ＬＯｒｆ４」）；および
４）リーダーペプチドを含まずかついずれの融合パートナーも含まない２８７
（「２８７標識化されていない」）：
【０１９６】
【表１６】
2014000092.tif 000024
これらの全てのタンパク質を発現および精製し得た。
【０１９７】
「２８７Ｌ」および「２８７ＬＯｒｆ４」をリポタンパク質として確認した。
【０１９８】
図２に示すように、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて９１９ＬＯｒｆ４を消化
することによって、「２８７ＬＯｒｆ４」を構築した。２８７コード配列に融合
された、５’末端プライマー（２８７ＬＯｒｆ４）中のテールとしての、欠損し
ているアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の、添加によって、全体のＯＲＦ４リー
ダーペプチドを修復した。成熟タンパク質をコードする２８７遺伝子を、オリゴ
ヌクレオチド２８７ＬＯｒｆ４  ＦｏｒおよびＲｅｖ（それぞれ、ＮｄｅＩ部位
およびＸｈｏＩ部位を含む）を用いて増幅し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し
、そして精製されたｐＥＴＯｒｆ４フラグメントにライゲーションした。
【０１９９】
（実施例１１−ネイティブなリーダーペプチドを含む／含まないさらなる非融
合タンパク質）
ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４およびＷＯ９９／５７２８０由
来のさらなるタンパク質のＥ．ｃｏｌｉ発現について、同様の方法を採用した。
【０２００】
以下は融合パートナーを含まずに発現された：００８、１０５、１１７−１、
１２１−１、１２８−１、１４８、２１６、２４３、３０８、５９３、６５２、
７２６、９８２、およびＯｒｆ１４３−１。タンパク質１１７−１は、ＦＡＣＳ
によって暴露された表面として確認され、そして高いＥＬＩＳＡ力価を与えた。
【０２０１】
以下は、ネイティブなリーダーペプチドを含むが融合パートナーを含まずに発
現された：１１１、１４９、２０６、２２５−１、２３５、２４７−１、２７４
、２８３、２８６、２９２、４０１、４０６、５０２−１、５０３、５１９−１
、５２５−１、５５２、５５６、５５７、５７０、５７６−１、５８０、５８３、６６４、７５９、９０７、９１３、９２０−１、９２６、９３６−１、９５３
、９６１、９８３、９８９、Ｏｒｆ４、Ｏｒｆ７−１、Ｏｒｆ９−１、Ｏｒｆ２
３、Ｏｒｆ２５、Ｏｒｆ３７、Ｏｒｆ３８、Ｏｒｆ４０、Ｏｒｆ４０．１、Ｏｒ
ｆ４０．２、Ｏｒｆ７２−１、Ｏｒｆ７６−１、Ｏｒｆ８５−２、Ｏｒｆ９１、
Ｏｒｆ９７−１、Ｏｒｆ１１９、Ｏｒｆ１４３．１。これらのタンパク質に接尾
語「Ｌ」を加えた。
【０２０２】
Ｈｉｓタグ化されたタンパク質７６０を、リーダーペプチドを含むかまたは含
まずに発現させた。シグナルペプチドの欠失は、発現レベルを大いに減少させた
。このタンパク質は、可溶化のための２Ｍ尿素を使用して最も容易に精製され得
た。
【０２０３】
Ｈｉｓタグ化されたタンパク質２６４は、それ自身のシグナルペプチドを用い
て良好に発現し、その３０ｋＤａタンパク質はウェスタンブロットの陽性な結果
を与えた。
【０２０４】
全てのタンパク質は、首尾よく発現した。
【０２０５】
５９３、１２１−１、１２８−１、５９３、７２６、および９８２の細胞質内
の局在を確認した。
【０２０６】
９２０−１Ｌ、９５３Ｌ、ＯＲＦ９−１Ｌ、ＯＲＦ８５−２Ｌ、ＯＲＦ９７−
１Ｌ、５７０Ｌおよび５８０Ｌおよび６６４Ｌのペリプラズム中の局在を確認し
た。
【０２０７】
ＯＲＦ４０Ｌの外膜中の局在、および内膜中の００８および５１９−１Ｌの局
在を確認した。ＯＲＦ２５Ｌ、ＯＲＦ４Ｌ、４０６Ｌ、５７６−１Ｌは全て、膜
に局在することものとして確認された。
【０２０８】
タンパク質２０６は、リポタンパク質でないことが見出された。
【０２０９】
ＯＲＦ２５およびＯＲＦ４０はネイティブリーダーペプチドを含むが、融合パ
ートナーを含まずに発現し、そしてタンパク質５９３は、そのネイティブリーダ
ーペプチドを含まずかつ融合パートナーも含まずに発現し、良い抗細菌血清によ
って惹起された。驚くべきことに、ＯＲＦ２５およびＯＲＦ４０の形態は、融合
タンパク質を含まずに発現し、そしてそれ自身のリーダーペプチド（すなわち「
ＯＲＦ２５Ｌ」「ＯＲＦ４０Ｌ」）を使用することで、細菌性アッセイにおいて
融合タンパク質よりも良い結果を与えた。
【０２１０】
タンパク質９２０Ｌおよび９５３ＬをＮ末端配列決定にかけ、それぞれＨＲＶ
ＷＶＥＴＡＨおよびＡＴＹＫＶＤＥＹＨＡＮＡＲＦＡＦを得た。この配列決定に
よって、予想されるリーダーペプチドが開裂されたことを確認し、そしてペリプ
ラズム位置で結合される場合、ネイティブリーダーペプチドから発現されるとき
、このタンパク質がＥ．ｃｏｌｉによって正しくプロセスおよび局在化されるこ
とを確認した。
【０２１１】
内膜に局在しているタンパク質５１９．１ＬのＮ末端配列は、ＭＥＦＦＩＩＬ
ＬＡであり、リーダー配列が開裂されていないことを示した。それゆえ、未開裂
のリーダー配列および膜透過アンカーの両方として、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ
ｅ由来のＰＢＰ１のリーダーペプチドト同様の様態で、機能し得る［ＲｏｐｐおよびＮｉｃｈｏｌａｓ（１９９７）Ｌ．Ｂａｃｔ．１７９：２７８３−２７８７
．］。実際に、Ｎ末端領域は、強い疎水性の特徴を示し、そしてＴｍｐｒｅｄ．
プログラムによって、膜貫通であることが予想される。
【０２１２】
（実施例１２−リポタンパク質）
組換えリポタンパク質中のパルミチン酸塩の結合を、Ｋｒｅｆｔら、［Ｊ．Ｂ
ａｃｔ．（１９９８）１８０：３４４１−３４４７．］の方法によって、実証し
た。目的のプラスミドを内部に含む単一コロニーを、一晩中、３７℃で、２０ｍ
ｌのＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中で、増殖させた。この培養液
を、５．０ｍｌの新しい培地ＬＢ／Ａｍｐ培地（５μＣ／ｍｌ［３Ｈ］パルミチ
ン酸塩（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む）中で、０．１のＯＤ５００になるまで希釈
した。培養物のＯＤ５００が０．４〜０．８に達した時に、組換えリポタンパク
質を、ＩＰＴＧ（終濃度１．０ｍＭ）を用いて１時間誘導した。細菌を、卓上遠
心機の中で、２７００ｇで１５分間遠心分離することによって回収し、そして、
１．０ｍｌ氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１２０μｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ
−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０％  ｗ／ｖ  ＳＤＳ中へ再
懸濁し、１０分間煮沸することによって破砕した。１３０００ｇで１０分間遠心
分離した後、上清を回収し、そして１．２ｍｌの氷冷アセトンを添加しそして１
時間−２０℃で静置することによって、タンパク質を沈殿させた。タンパク質は
、１３０００ｇで１０分間遠心分離することによってペレットを形成し、そして
２０〜５０μｌ（培養液の終濃度によって負荷量を標準化するように計算される
）の１．０％  ｗ／ｖＳＤＳに再懸濁した。１５μｌのアリコートを５μｌのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と共に煮沸し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した。電気泳動ゲルを１０％  ｖ／ｖ酢酸中で１時間固定化した後、増幅溶
液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で３０分間浸した。このゲルを熱の下で減圧乾燥し、
そしてハイパーフィルム（Ｋｏｄａｋ）に−８０℃で一晩中暴露した。
【０２１３】
脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）を確実にする、［３Ｈ］パルミチン酸塩標識
の結合を、以下のタンパク質について見出した：Ｏｒｆ４Ｌ、Ｏｒｆ２５Ｌ、２
８７Ｌ、２８７ＬＯｒｆ４、４０６．Ｌ、５７６Ｌ、９２６Ｌ、９１９Ｌおよび
９１９ＬＯｒｆ４。
【０２１４】
（実施例１３−２８７中のドメイン）
異なる機能クラスに属するタンパク質に対する２８７の異なる領域の相同性に
基づいて、図５に示されるような３つの「ドメイン」分けられる。２番目のドメ
インは、ＩｇＡプロテアーゼに対して相同性を示し、３番目のドメインは、トラ
ンスフェリン結合タンパク質に対して相同性を示す。
【０２１５】
３つの「ドメイン」の各々は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株との間で、異
なる程度の配列保存性を示し、ドメインＣは９８％同一、ドメインＡは８３％同
一、一方ドメインＢはわずかに７１％同一である。株ＭＣ５８中のタンパク質２
８７は、株２９９６のタンパク質２８７よりも６１アミノ酸長い。２つの配列の
整列は、図７に示され、そして種々の株についての整列は、ＷＯ００／６６７４
１中に開示されている（本明細書中の図５および図１５を参照のこと）。
【０２１６】
３つのドメインをＣ末端でＨｉｓタグ化されたタンパク質として、個々に発現
させた。これを、以下の構築物を使用して、ＭＣ５８株および２９９６株に対し
て行った：
２８７ａ−ＭＣ５８（ａａ１−２０２）、２８７ｂ−ＭＣ５８（ａａ２０３−２
８８）、２８７ｃ−ＭＣ５８（ａａ３１１−４８８）。
２８７ａ−２９９６（ａａ１−１３９）、２８７ｂ−２９９６（ａａ１４０−２
２５）、２８７ｃ−２９９６（ａａ２５０−４２７）。
【０２１７】
これらの構築物を作製するために、終止コドン配列を３’末端プライマー配列
中から除いた。ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ、またはＮｄｅＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を使用して、それぞれの増幅されるフラグメント
を、発現ベクターｐＥＴ１９ｂ＋へクローン化するために、５’プライマーはＮ
ｈｅＩ制限酵素認識部位を含み、そして３’プライマーはＸｈｏＩをテールとし
て含んだ。
【０２１８】
全ての６つの構築物を発現させたが、２８７ｂ−ＭＣ８は、可溶化のための変
性および再折り畳み（リフォールディング）を必要とした。
【０２１９】
ドメインＡの欠失を以下に記載する（「Δ４  ２８７−Ｈｉｓ」）。
【０２２０】
また、２９９６株由来の種々のドメインを使用して、ＭｅｎＡ（Ｆ６１２４株
）およびＭｅｎＣ株（ＢＺ１３３株）と同様に、同種および異種のＭｅｎＢ株に
対して、免疫学的データ（血清殺菌性アッセイ）を得た：
【０２２１】
【表１７】
2014000092.tif 000025
株ＭＣ５８のドメインを使用して、以下の結果が得られた：
【０２２２】
【表１８】
2014000092.tif 000026
。
【０２２３】
（実施例１４−２８７における欠失）
個々のドメインを発現することと同様に、第１のドメイン内の漸進的欠失を作
製することによって、２８７をまた発現した（Ｃ末端Ｈｉｓタグタンパク質とし
て）。菌株２９９６由来のタンパク質２８７のこれらの４つの欠失変異体を使用
した（図６）：
１）アミノ酸１８−４２７（すなわち、リーダーペプチドが欠失した）からな
る「２８７−Ｈｉｓ」；
２）アミノ酸２６−４２７からなる「Δ１  ２８７−Ｈｉｓ」；
３）アミノ酸７０−４２７からなる「Δ２  ２８７−Ｈｉｓ」；
４）アミノ酸１０７−４２７からなる「Δ３  ２８７−Ｈｉｓ」；および
５）アミノ酸１４０−４２７（＝２８７−ｂｃ）からなる「Δ４  ２８７−Ｈ
ｉｓ」；
「Δ４」タンパク質はまた、菌株ＭＣ５８（「Δ４  ２８７ＭＣ５８−Ｈｉｓ
」；ａａ２０３−４８８）について作製した。
【０２２４】
この構築物を、上記のように、２８７ａ／ｂ／ｃと同じ様式で、作製した。
【０２２５】
全ての６つの構築物は発現され得、そして、タンパク質は精製され得る。しか
し、２８７−Ｈｉｓの発現は、非常に乏しかった。
【０２２６】
発現はまた、Ｃ末端Ｈｉｓタグが省略された場合に、非常に高かった。
【０２２７】
相同なＭｅｎＢ菌株（２９９６）および異種ＭｅｎＢ菌株、ならびにＭｅｎＡ
（Ｆ６１２４菌株）およびＭｅｎＣ（ＢＺ１３３菌株）に対する、免疫学的デー
タ（血清殺菌性アッセイ）をまた、欠失変異体を使用して得た：
【０２２８】
【表１９】
2014000092.tif 000027
Δ４欠失についての同じ高い活性は、菌株ＭＣ５８に由来する配列を使用して
、見られた。
【０２２９】
従って、より優れた発現特徴を示すと同様に、この変異体は、免疫学的に等価
または優れている。
【０２３０】
（実施例１５−ポリグリシン欠失）
以前の実施例の「Δ１  ２８７−Ｈｉｓ」構築物は、短いＮ末端欠失（ＧＧＧ
ＧＧＧＳ）によってのみ、２８７−Ｈｉｓおよび「２８７未標識」と異なる。し
かし、欠失したセリンをＮｈｅクローニング部位に存在するコドンで置換する発
現ベクターを使用することは、（Ｇｌｙ）６のみの欠失と等しい。従って、この
（Ｇｌｙ）６配列の欠失は、タンパク質発現に対して劇的な効果を有することを
示している。
【０２３１】
ＧＧＧＧＧＧまでのＮ末端アミノ酸を欠失しているタンパク質は、「ΔＧ２８
７」と呼ばれる。菌株ＭＣ５８において、その配列（リーダーペプチドは下線を
引かれている）は、以下のようである：
【０２３２】
【化７】
2014000092.tif 000028
ΔＧ２８７（Ｈｉｓタグを有するまたは有さない（それぞれ、「ΔＧ２８７−
Ｈｉｓ」および「ΔＧ２８７Ｋ」））は、「２８７−Ｈｉｓ」または「２８７未
標識」と比較して、非常に良好なレベルで発現される。
【０２３３】
遺伝子可変性データに基づいて、ΔＧ２８７−Ｈｉｓの改変体を多数のＭｅｎ
Ｂ菌株由来（特に菌株２９９６、ＭＣ５８、１０００、およびＢＺ２３２由来）
のＥ．ｃｏｌｉ中で発現した。結果はまた良好であった。
【０２３４】
ポリＧｌｙ欠失が、発現を改善するための一般的なストラテジーであり得るこ
とが仮定された。従って、同様の（Ｇｌｙ）ｎモチーフ（Ｎ末端の近く、システ
インの下流）を含む他のＭｅｎＢリポタンパク質（主に、Ｔｂｐ２（ＮＭＢ０４
６０）、７４１（ＮＭＢ１８７０）および９８３（ＮＭＢ１９６９））が同定さ
れた：
【０２３５】
【化８】
2014000092.tif 000029
Ｔｂｐ２遺伝子および７４１遺伝子は菌株ＭＣ５８由来であった；９８３遺伝
子および２８７遺伝子は、菌株２９９６由来であった。これらは、ｐＥＴベクタ
ー中にクローン化され、そして、それらのリーダー配列ペプチドについてコード
する配列なしで、または「ΔＧ形態」（共にＣ末端Ｈｉｓタグに融合される）と
して、Ｅ．ｃｏｌｉ．中で発現される。各場合において、同じ効果（ポリグリシ
ンストレッチの欠失を保有するクローンにおいて、発現は、良好であった）が見
られ、そして、グリシンが発現されたタンパク質に存在する場合、発現は乏しい
かまたは存在しなかった。
【０２３６】
【表２０】
2014000092.tif 000030
タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１３に示す。
【０２３７】
（ΔＧ２８７およびハイブリッド）
ΔＧ２８７タンパク質を、菌株ＭＣ５８、１０００およびＢＺ２３２について
作製および精製した。これらの各々は、高いＥＬＩＳＡ力価を与え、そしてまた
、８１９２を超える血清殺菌性力価を与えた。ΔＧ２８７Ｋ（ｐＥＴ−２４ｂか
ら発現される）は、ＥＬＩＳＡおよび血清殺菌性アッセイにおいて優れた力価を
与えた。ΔＧ２８７−ＯＲＦ４６．１Ｋはまた、ｐＥＴ−２４ｂにおいて、発現
され得る。
【０２３８】
ΔＧ２８７はまた、９１９、９５３、９６１（配列は以下に示される）および
ＯＲＦ４６．１の上流でインフレームで、直接融合された。
【０２３９】
【化９−１】
2014000092.tif 000031
【化９−２】
2014000092.tif 000032
【化９−３】
2014000092.tif 000033
【化９−４】
2014000092.tif 000034
ハイブリッドタンパク質に対して惹起された抗体の殺菌性効力（相同な菌株）
を、９１９およびＯＲＦ４６．１についての成分抗原（２８７−ＧＳＴを使用す
る）の簡単な混合物に対して惹起された抗体と比較した：
【０２４０】
【表２１】
2014000092.tif 000035
異種ＭｅｎＢ菌株に対する、ならびに血清型ＡおよびＣに対する殺菌性活性に
ついてのデータをまた得た：
【０２４１】
【表２２】
2014000092.tif 000036
従って、Ｎ末端にΔＧ２８７を有するハイブリッドタンパク質は、簡単な混合
物より免疫学的に優れており、ΔＧ２８７−ＯＲＦ４６．１は、異種菌株に対し
てでさえ、特に効果的である。ΔＧ２８７−ＯＲＦ４６．１Ｋは、ｐＥＴ−２４
ｂ中で発現され得る。
【０２４２】
同じハイブリッドタンパク質は、２９９６ではなく、ニュージーランド菌株３
９４／９８を使用して、作製した。
【０２４３】
【化１０−１】
2014000092.tif 000037
【化１０−２】
2014000092.tif 000038
【化１０−３】
2014000092.tif 000039
【化１０−４】
2014000092.tif 000040
（ΔＧ９８３およびハイブリッド）
ΔＧ９８３（Ｈｉｓ融合物）に応答して生成された殺菌性力価を、種々の菌株
（相同な２９９６菌株を含む）に対して測定した：
【０２４４】
【表２３】
2014000092.tif 000041
ΔＧ９８３はまた、そのＣ末端にＯＲＦ４６．１、７４１、９６１、または９
６１ｃを有する、ハイブリッドとして発現された。
【０２４５】
【化１１−１】
2014000092.tif 000042
【化１１−２】
2014000092.tif 000043
【化１１−３】
2014000092.tif 000044
【化１１−４】
2014000092.tif 000045
【化１１−５】
2014000092.tif 000046
【化１１−６】
2014000092.tif 000047
【化１１−７】
2014000092.tif 000048
【化１１−８】
2014000092.tif 000049
（ΔＧ７４１およびハイブリッド）
ΔＧ７４１（Ｈｉｓ融合物）に応答して生成された殺菌性力価を、種々の菌株
（相同な２９９６菌株を含む）に対して測定した：
【０２４６】
【表２４】
2014000092.tif 000050
見られ得るように、ΔＧ７４１誘導性抗殺菌性力価は特に、異種菌株ＭＣ５８
に対して特に高かった。
【０２４７】
ΔＧ７４１はまた、タンパク質９６１、９６１ｃ、９８３およびＯＲＦ４６．１の上流にインフレームで直接融合された。
【０２４８】
【化１２−１】
2014000092.tif 000051
【化１２−２】
2014000092.tif 000052
【化１２−３】
2014000092.tif 000053
【化１２−４】
2014000092.tif 000054
（実施例１６−２８７／ΔＧ２８７とのＣ末端融合物（「ハイブリッド」））
本発明に従って、２つのタンパク質Ａ＆Ｂのハイブリッドは、ＮＨ２−Ａ−Ｂ
−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−Ｂ−Ａ−ＣＯＯＨのいずれかであり得る。この差異の
影響を、９１９、９５３およびＯＲＦ４６．１に対するタンパク質２８７のＣ末
端（「２８７−Ｈｉｓ」形態で）またはＮ末端（ΔＧ２８７形態−上に示される
配列）のいずれかを使用して調査した。相同菌株２９９６を含む、菌株のパネル
を使用した。ＦＣＡをアジュバントとして使用した：
【０２４９】
【表２５】
2014000092.tif 000055
より良い殺菌性力価は、一般に、Ｎ末端で（ΔＧ形態で）２８７を使用して見
られる。
【０２５０】
タンパク質９６１［ＮＨ２−ΔＧ２８７−９６１−ＣＯＯＨ−上に示される配
列］に融合される場合、得られたタンパク質は不溶性であり、そして精製のため
に変性および再生されなければならない。再生に従って、約５０％のタンパク質
が、不溶性のままであることが見出された。可溶性および不溶性タンパク質を比
較し、そして、はるかに高い殺菌力価が、可溶性タンパク質（アジュバントとし
てのＦＣＡ）を用いて得られた：
【０２５１】
【表２６】
2014000092.tif 000056
しかし、不溶性形態を用いる力価は、代わりにミョウバンアジュバントを使用
することによって改善した。
【０２５２】
【表２７】
2014000092.tif 000057
（実施例１７−２８７へのＮ末端融合物（「ハイブリッド」））
Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するか、またはそのリーダーペプチドは有さないが、Ｃ
末端Ｈｉｓタグを有する全長としてのタンパク質２８７の発現は、かなり低い発
現レベルを与える。より良好な発現は、Ｎ末端ＧＳＴ融合を使用して達成される
。  Ｎ末端融合パートナーとしてＧＳＴを使用することに対する代替として、２
８７を、タンパク質９１９（「９１９−２８７」）、タンパク質９５３（「９５
３−２８７」）およびタンパク質ＯＲＦ４６．１（「ＯＲＦ４６．１−２８７」
）のＣ末端に配置した。両方の場合において、リーダーペプチドを欠失させ、ハイブリッドは、直接インフレーム融合物であった。
【０２５３】
９５３−２８７ハイブリッドを生成するために、２つのタンパク質のリーダー
ペプチドを、各配列のリーダーから下流の順方向プライマーを設計することによ
って除外した；停止コドン配列を９５３逆方向プライマーでは除外したが、２８
７逆方向プライマーには含まれた。９５３遺伝子について、増幅に使用される５
’および３’プライマーは、それぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含み
、故に、２８７遺伝子の増幅のために５’および３’プライマーは、それぞれＢ
ａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を含んだ。この方法において、ＮｄｅＩ−Ｂａ
ｍＨＩ（第一の遺伝子をクローン化するために）そしてこれに引続いてＢａｍＨ
Ｉ−ＸｈｏＩ（第二の遺伝子をクローン化するために）を使用して、ｐＥＴ２１
ｂ＋における２つの遺伝子の配列指向性クローニングを達成し得た。
【０２５４】
９１９−２８７ハイブリッドを、２８７の成熟部分をコードする配列をｐＥＴ
２１ｂ＋中の９１９−Ｈｉｓクローンの３’末端でＸｈｏＩ部位にクローニング
することによって得た。２８７遺伝子の増幅に使用されるプライマーを、ＰＣＲ
フラグメントの５’末端でＳａｌＩ制限部位を、そしてＰＣＲフラグメントの３
’末端でＸｈｏＩ制限部位を導入するために設計した。ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ
制限酵素によって生成された結合性の末端は適合性であるので、ＳａｌＩ−Ｘｈ
ｏＩで消化された２８７ＰＣＲ産物は、ＸｈｏＩで切断したｐＥＴ２１ｂ−９１
９クローン中に挿入され得た。
【０２５５】
ＯＲＦ４６．１−２８７ハイブリッドを同様にして得た。
【０２５６】
ハイブリッドタンパク質に対して惹起された抗体の殺菌効果（相同菌株）を、
成分抗原の単純な混合物に対して惹起された抗体と比較した：
【０２５７】
【表２８】
2014000092.tif 000058
異種ＭｅｎＢ菌株ならびに血清型ＡおよびＣに対する殺菌活性データをまた、
９１９−２８７および９５３−２８７について得た：
【０２５８】
【表２９】
2014000092.tif 000059
ＯＲＦ４６．１および９１９のハイブリッドをまた構築した。最良の結果（４
倍高い力価）が、Ｎ末端での９１９で達成された。
【０２５９】
ハイブリッド９１９−５１９Ｈｉｓ、ＯＲＦ９７−２２５Ｈｉｓおよび２２５
−ＯＲＦ９７Ｈｉｓをまた試験した。これらは、中程度のＥＬＩＳＡ力価（ｆｉ
ｔｒｅ）および殺菌性抗体応答を与えた。
【０２６０】
（実施例１８−ＯＲＦ４由来のリーダーペプチド）
上に示されるように、ＯＲＦ４のリーダーペプチドを他のタンパク質（例えば
、タンパク質２８７および９１９）の成熟配列へ融合し得る。このことは、Ｅ．
ｃｏｌｉにおける脂質化を指向し得る。
【０２６１】
（実施例１９−５６４中のドメイン）
タンパク質「５６４」は、非常に大きく（２０７３ａａ）、そして完全な形態
でそれをクローン化および発現することが困難である。発現を容易にするために
、このタンパク質を図８に示すように４つのドメインに分けた（ＭＣ５８配列に
従う）：
【０２６２】
【表３０】
2014000092.tif 000060
これらのドメインは、以下の相同性を示す：
・ドメインＡは、他の細菌性毒素に対して相同性を示す：
【０２６３】
【化１３】
2014000092.tif 000061
・ドメインＢは、相同性を示さず、５６４に特異的である。
・ドメインＣは、以下に相同性を示す：
【０２６４】
【化１４】
2014000092.tif 000062
・ドメインＤは、他の細菌性毒素に対して相同性を示す：
ｇｂ｜ＡＡＦ８４９５５．１｜ＡＥ００４０３２＿１４  ＨＡ−ｌｉｋｅ  ｓｅ
ｃｒｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ[Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ]（２
９％）
ＭＣ５８菌株配列を使用して、５６４ａｂの良好な細胞内発現をＧＳＴ融合物（精製なし）およびｈｉｓタグ化タンパク質の形態で得た；このドメイン対をまた
リポタンパク質として発現した。このリポタンパク質は、膜外／上清画分で中程
度の発現を示した。
【０２６５】
ｂドメインは、ｈｉｓ−タグ化タンパク質（精製なし）として発現された場合
に、中程度の細胞内発現、およびＧＴＳ−融合物として良好な発現を示した。
【０２６６】
ｃドメインは、ＧＳＴ−融合物として良好な細胞内発現を示したが、不溶性で
あった。ｄドメインは、ｈｉｓ−タグ化生成物（精製なし）として中程度の細胞
内発現を示した。ｃｄタンパク質ドメイン対は、ＧＴＳ融合物として中程度の細
胞内発現を示した（精製なし）。
【０２６７】
良好な殺菌性アッセイ力価を、ｃドメインおよびｂｃ対を使用して観察した。
【０２６８】
（実施例２０−９１９リーダーペプチド）
９１９由来の２０マーリーダーペプチドが、上の実施例１で論じられる：
ＭＫＫＹＬＦＲＡＡＬ  ＹＧＩＡＡＡＩＬＡＡ
実施例１で示されるように、このリーダーの欠失は、ＯＲＦ４リーダーペプチ
ドと置換される場合のように、異種発現を改善する。発現に対する９１９リーダ
ーの影響を、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  Ｍｏｒｇａｎｉｉ由来のＰｈｏＣレセプタ
ー遺伝子にコード配列を融合することによって調査した（Ｔｈａｌｌｅｒら（１
９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０：１３４１−１３５０）。構築物を
ＮｄｅＩとＸｈｏＩ部位の間のｐＥＴ２１−ｂプラスミド中にクローン化した（
図９）：
【０２６９】
【化１５】
2014000092.tif 000063
このプラスミドからのＰｈｏＣの発現レベルは、同じ構築物ではあるがネイテ
ィブなＰｈｏＣシグナルペプチドを含む構築物について見出された発現レベルよ
の２００分の１未満である。同じ結果が、Ｔ７プロモーターをＥ．ｃｏｌｉ  Ｐ
ｌａｃプロモーターで置換した後でさえ得られた。このことは、発現に対する９
１９リーダー配列の影響が、使用されるプロモーターに依存しないことを意味す
る。
【０２７０】
観察された結果が、９１９シグナルペプチドヌクレオチド配列のいくつかの特
性（二次構造の形成、ＲＮＡａｓｅへの感受性など）に起因するか、またはこの
シグナルペプチドの存在によって誘導されるタンパク質の不安定性に起因するか
否かを調査するために、多くの変異体を作製した。使用されるこのアプローチは
、縮重コドンを含む合成リンカーをクローニングすることによる９１９シグナル
ペプチド配列のヌクレオチド置換であった。この方法においては、変異体をヌク
レオチドおよび／またはアミノ酸置換によって得た。
【０２７１】
２つの異なるリンカーを使用して、最初の１９塩基対（Ｌ１）中および塩基２
０〜３６（Ｓ１）の間に９１９シグナルペプチド配列の２つの異なる領域における変異を作製するように設計した。
【０２７２】
【化１６】
2014000092.tif 000064
得られた変異体のいくつかのアラインメントを以下に示す。
【０２７３】
【化１７】
2014000092.tif 000065
配列アラインメントに示されるように、分析されたほとんどの変異体は、宿主細
胞により予想外に生成されたインフレーム欠失を含む。
【０２７４】
変異体の選択を、Ｌ１およびＳ１の変異クローンの混合物から調整されたＤＮ
ＡでＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することによって行った。単
一の形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌメチルグリ
ーン、１ｍｇ／ｍｌ  ＰＤＰ（フェノールフタレインジホスフェート）を含むＬ
Ｂプレートに単一形質転換体を描画することによって、高いＰｈｏＣ活性につい
てスクリーニングした。この培地上でＰｈｏＣ産生細胞は、緑色になる（図１０
）。
【０２７５】
これらの変異体によって生成されたＰｈｏＣの定量分析を、ｐＮＰＰをＰｈｏ
Ｃ活性の基質として使用する液体培地中で実施した。液体培地中で０、３０、９
０、１８０分間増殖した細胞抽出物および変異体上清中で測定された比活性は以
下であった：
（細胞抽出物）
【０２７６】
【表３１】
2014000092.tif 000066
（上清）
【０２７７】
【表３２】
2014000092.tif 000067
変異体のいくつかは、大量のＰｈｏＣを生成し、特に変異体９Ｌ１ａは、培養培
地中にＰｈｏＣを分泌し得る。これは、この変異体のシグナルペプチド配列が、
たった９アミノ酸長であるので、注目すべきである。これは、今日までに記載さ
れた最も短いシグナルペプチドである。
【０２７８】
（実施例２１−Ｍａｆ関連タンパク質のＣ末端欠失）
ＭａｆＢ関連タンパク質として７３０、ＯＲＦ４６およびＯＲＦ２９が挙げら
れる。
【０２７９】
ＭＣ５８由来の７３０タンパク質は、以下の配列を有する：
【０２８０】
【化１８】
2014000092.tif 000068
リーダーペプチドを下線で示す。
【０２８１】
７３０は、ＯＲＦ４６と同様の特徴を示す（上の実施例８を参照のこと）：
−Ｏｒｆ４６に関しては、ＭｅｎＢ、ＭｅｎＡおよび淋菌の間の７３０配列の保
存は、Ｎ末端部分でのみ高い（＞８０％）。〜３４０からのＣ末端は、高度に相
違している。
−その予測される二次構造は、この分子の中心領域（ａａ．２２７〜２４７）に
わたる疎水性セグメントを含む。
−Ｅ．ｃｏｌｉ中の全長遺伝子の発現は、非常に低いタンパク質収率を与える。
シグナルペプチド配列を除外したタグ化または非タグ化構築物からの発現は、宿
主細胞に対して毒性効果を有する。言い換えると、細胞質中の全長成熟タンパク
質の存在は、宿主細胞に対して高度に毒性であるが、一方、周辺質への移行（シ
グナルペプチドによって媒介される）は細胞の生存度への検出可能な影響を有さ
ない。リーダーのない７３０の発現についてのクローンが、ｒｅｃＡの遺伝的背
景（Ｅ．ｃｏｌｉ菌株：クローニングについてＨＢ１０１；発現についてＨＭＳ
１７４（ＤＥ３））を使用して非常に低い頻度でしか得られ得ないために、７３
０のこの「細胞内毒性」は特に高い。
【０２８２】
この毒性を克服するために、ＯＲＦ４６について実施例８に記載されたアプロ
ーチと同様のアプローチを７３０について使用した。４つのＣ末端短縮形態を得
、そのそれぞれを十分に発現する。すべてを、Ｈｉｓ−タグ化したリーダーのな
い７３０の細胞内発現から得た。
【０２８３】
形態Ａは、成熟タンパク質（ａａ．２８〜２２６）のＮ末端親水性領域から構
成される。これを、予測されたよりも大きなＭＷを有する可溶性Ｈｉｓタグ化産
物として精製した。
【０２８４】
形態Ｂは、血清型（ａａ．２８〜３４０）間で保存された領域の末端まで伸長
する。これを不溶性Ｈｉｓタグ化産物として精製した。
【０２８５】
Ｃ１およびＣ２と命名されたＣ末端が短縮された形態を、菌株ＨＭＳ１７４（
ＤＥ３）中で高レベルの７３０−Ｈｉｓクローンを発現するクローンについての
スクリーニングの後に得た。簡単には、全長成熟７３０タンパク質をコードする
Ｈｉｓタグ化配列を含むｐＥＴ２１ｂプラスミドを使用して、ｒｅｃＡ菌株ＨＭ
Ｓ１７４（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換体を低頻度で得た。これは、２つ
の表現型を示した：大きなコロニーおよび非常に小さなコロニー。いくつかの大
きいコロニーおよび小さなコロニーを７３０−Ｈｉｓクローンの発現について分
析した。大きなコロニー由来の細胞のみが、抗７３０Ａ抗体によって認識される
タンパク質を過剰発現した。しかし、異なるコロニーで過剰発現されたタンパク質は、異なる分子質量を示した。２つのクローンの配列決定は、両方の場合にお
いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＳ配列の組込みが、７３０のＣ末端領域をコードする配
列内に生じたことを明らかにした。この２つの組込み事象は、Ｃ１の場合におい
て１つの付加コドン、そしてＣ２の場合において１２の付加コドンを有するイン
フレーム融合物を精製した（図１１）。生じた７３０の「変異」形態は、以下の
配列を有する：
【０２８６】
【化１９】
2014000092.tif 000069
挿入によって生成された付加アミノ酸を下線で示す。
【０２８７】
【化２０】
2014000092.tif 000070
挿入によって生成された付加アミノ酸を下線で示す。
【０２８８】
結論として、７３０−Ｃ１形態の細胞内発現は、非常に高いレベルのタンパク
質を与え、そして宿主細胞に対して毒性作用を有さないが、ネイティブなＣ末端
の存在は毒性である。これらのデータは、７３０の「細胞内毒性」がタンパク質
のＣ末端の６５アミノ酸と結合することを示唆する。
【０２８９】
ＯＲＦ２９の最初の２３１アミノ酸または３６８アミノ酸への等価な短縮を、
リーダーペプチド（アミノ酸１〜２６；欠失は、細胞質発現を与える）を用いて
かまたはリーダーペプチドなしで、およびＨｉｓタグ化を用いてまたはＨｉｓタ
グなしでの発現を使用して実施した。
【０２９０】
（実施例２２−９６１中のドメイン）
上の実施例９に記載されるように、９６１のＧＳＴ融合物は、Ｅ．ｃｏｌｉで
最も良好に発現した。発現を改善するために、タンパク質をドメインに分けた（
図１２）。
【０２９１】
９６１のドメインを、ＹａｄＡ（Ｙｅｒｓｉｎｉａによって生成される付着因
子、これは、表面の突起を作製するオリゴマーを形成する細菌表面上に局在化される付着因子であることが実証されている（Ｈｏｉｃｚｙｋら（２０００）ＥＭ
ＢＯ  Ｊ  １９：５９８９〜９９））に基づいて設計し、これらは：リーダーペ
プチド、ヘッドドメイン、コイル状コイル領域（茎）、および膜アンカードメイ
ンである。
【０２９２】
これらのドメインを、リーダーペプチドを用いて、または用いずに発現し、そ
して必要に応じてＣ末端ＨｉｓタグまたはＮ末端ＧＳＴのいずれかに融合した。
９６１の異なるドメインを発現するＥ．ｃｏｌｉクローンを、一晩（ｏ／ｎ）培
養物から、またはＩＰＴＧで３時間インキュベーションした後の、発現されたタ
ンパク質の生成および局在化についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロ
ットによって分析した。結果は以下である：
【０２９３】
【表３３】
2014000092.tif 000071
この結果は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける以下のことを示す：
・９６１−Ｌは、外膜で高度に発現されそして局在化される。ウエスタンブロッ
ト分析によって、２つの特異的結合が検出された：１つは、〜４５ｋＤａ（予測
された分子量）および１つは〜１８０ｋＤａであり、このことは、９６１−Ｌが
オリゴマーを形成し得ることを示す。さらに、これらの凝集物は、一昼夜の培養
物（ＩＰＴＧ誘導なし）においてより発現される。このクローンのＯＭＶ調製物
を使用してマウスを免疫化し、そして血清を得た。一昼夜培養物（主にオリゴマ
ー形態）を使用して、その血清は殺菌性であった；ＩＰＴＧ誘導化培養物（主に
単量体）は、殺菌性ではなかった。
・９６１Δ１−Ｌ（アンカー領域における部分的な欠失を有する）は、外膜で高
度に発現され、そして局在化されるが、オリゴマーを形成しない；
・９６１ｃ−Ｌ（アンカー領域なし）は、可溶性形態で生成され、そして上清中
に搬出される。
【０２９４】
ＥＬＩＳＡでの力価およびＨｉｓ−融合物を使用する血清殺菌性アッセイでの
力価は以下のようであった：
【０２９５】
【表３４】
2014000092.tif 000072
異なる形態の９６１を発現するＥ．ｃｏｌｉクローン（９６１、９６１−Ｌ、
９６１Δ１−Ｌおよび９６１ｃ−Ｌ）を使用して、９６１が接着因子（ＹａｄＡ
を参照のこと）であるか否かを調査した。接着アッセイを、（ａ）ヒト内皮細胞
および（ｂ）一晩培養物または３時間のＩＰＴＧ誘導のいずれかの後のＥ．ｃｏ
ｌｉクローンを使用して実施した。一晩増殖した９６１−Ｌ（９６１Δ１−Ｌ）
およびＩＰＴＧ誘導９６１ｃ−Ｌ（表面にタンパク質を発現するクローン）は、
ヒト内皮細胞に付着する。
【０２９６】
９６１ｃをまた、ハイブリッドタンパク質に使用した（上記を参照のこと）。
９６１およびそのドメイン改変体は、効率的な発現を指向するので、それらは、
理想的には、ハイブリッドタンパク質のＮ末端部分として適する。
【０２９７】
（実施例２３−さらなるハイブリッド）
本発明のさらなるハイブリッドタンパク質を、以下に示す（また図１４も参照
のこと）。これらは、個々のタンパク質と比較した場合、有利である。
【０２９８】
【化２１−１】
2014000092.tif 000073
【化２１−２】
2014000092.tif 000074
【化２１−３】
2014000092.tif 000075
【化２１−４】
2014000092.tif 000076
【化２１−５】
2014000092.tif 000077
【化２１−６】
2014000092.tif 000078
【化２１−７】
2014000092.tif 000079
【化２１−８】
2014000092.tif 000080
【化２１−９】
2014000092.tif 000081
【化２１−１０】
2014000092.tif 000082
【化２１−１１】
2014000092.tif 000083
【化２１−１２】
2014000092.tif 000084
【化２１−１３】
2014000092.tif 000085
【化２１−１４】
2014000092.tif 000086
【化２１−１５】
2014000092.tif 000087
本発明は、例示の目的でのみ記載されており、そして本発明の範囲および精神
の範囲内にとどまったまま改変がなされ得るということが理解される。例えば、
他の系統由来のタンパク質の使用が、予想される［例えば、ＯＲＦ４、ＯＲＦ４
０、ＯＲＦ４６、２２５、２３５、２８７、５１９、７２６、９１９および９５
３の多型配列については、ＷＯ００／６６７４１を参照のこと］。
【０２９９】
（実験の詳細）
（ＦＰＬＣタンパク質の精製）
以下の表は、使用したＦＰＬＣタンパク質精製のまとめである：
【０３００】
【表３５】
2014000092.tif 000088
緩衝溶液は、２０〜１２０ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍｇ／ｍｌのＣＨＡＰＳお
よび１０％ｖ／ｖグリセロールを含んだ。この透析液を、１３０００ｇで２０分
間遠心分離し、そして、モノＱ  ＦＰＬＣイオン交換樹脂またはモノＳ  ＦＰＬ
Ｃイオン交換樹脂のいずれかに適用した。緩衝液およびイオン交換樹脂を、目的
のタンパク質のｐＩおよびＦＰＬＣプロトコールマニュアル［Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ：ＦＰＬＣ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕ
ｓｓｉｎｇ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ］の推薦に従って選択した。タンパク質を、段階
的ＮａＣｌ勾配を使用して溶出した。精製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析
し、そしてタンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定した。
【０３０１】
「プロトコール」列中の文字は、以下をいう：
（ＦＰＬＣ−Ａ）：クローン１２１．１、１２８．１、５９３、７２６、９８
２、周辺タンパク質９２０Ｌおよびハイブリッドタンパク質９１９〜２８７、９
５３〜２８７を、細胞の破壊の後に得られたＥ．ｃｏｌｉの可溶化分画から精製
した。目的のプラスミドを保有する単一コロニーを、２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ（
１００μｇ／ｍｌ）液体培地中で、３７℃で一晩増殖させた。細菌を、１．０Ｌ
の新鮮な培地中で１：３０に希釈し、そして３０℃または３７℃のいずれかで、
ＯＤ５５０が０．６〜０．８に達するまで増殖させた。組換えタンパク質の発現
を、１．０ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを用いて誘導した。３時間のインキュベー
ションの後、細菌を、８０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離することで収集し
た。必要な場合、細胞を−２０℃で保存した。全ての一連の手順を、氷上または
４℃で行った。細胞質ゾルタンパク質（１２１．１、１２８．１、５９３、７２
６、および９８２）ならびに周辺タンパク質９２０Ｌについて、細菌を、完全プ
ロテアーゼインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有す
る２５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ
４５０を使用した超音波処理によって溶解した。分裂した細胞を、８０００ｇ
で３０分間遠心分離して、破壊されない細胞および封入体を沈降させ、そしてこ
の上清を３．９Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加によって３５％ｖ／ｖ飽和にした。
この沈殿物を、８０００ｇ、３０分間で沈降させた。この上清を、３．９Ｍ（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４の添加によって７０％ｖ／ｖの飽和にし、そしてこの沈殿物を上
記のように収集した。目的のタンパク質を含むペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって同定し、そして適切なイオン交換緩衝液（以下を参照のこと）に対して６
時間または一晩透析した。９５３Ｌを発現するＥ．ｃｏｌｉ由来の周辺分画を、
Ｅｖａｎｓら、［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９７４）１０：１０１０〜１
０１７］のプロトコールに従って調製し、そして適切なイオン交換緩衝液に対し
て透析した。緩衝液およびイオン交換樹脂を、目的のタンパク質のｐＩおよびＦ
ＰＬＣプロトコールマニュアル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の推薦に従って選択した
。緩衝溶液は、２０ｍＭのＮａＣｌおよび１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含
有した。この透析物を、１３０００ｇで２０分間遠心分離し、そしてモノＱ  Ｆ
ＰＬＣイオン交換樹脂またはモノＳ  ＦＰＬＣイオン交換樹脂のいずれかに適用
した。緩衝液およびイオン交換樹脂を、目的のタンパク質のｐＩおよびＦＰＬＣ
プロトコールマニュアル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の推薦に従って選択した。タン
パク質を、イオン交換樹脂から、段階的ＮａＣｌ勾配または連続的ＮａＣｌ勾配
のいずれかを使用して溶出した。精製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、
そしてタンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定した。周辺タンパク質
のリーダーペプチドの切断を、ＮＨ２末端の配列決定によって実証した（以下を
参照のこと）。
【０３０２】
（ＦＰＬＣ−Ｂ）：これらのタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉの膜分画から精製し
た。目的のプラスミドを保有する単一コロニーを、２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ（１
００μｇ／ｍｌ）液体培地中で、３７℃で一晩増殖させた。細菌を、１．０Ｌの
新鮮な培地中で１：３０に希釈した。クローン４０６．１Ｌおよび９１９ＬＯｒ
ｆ４を３０℃で、そしてＯｒｆ２５Ｌおよび５７６．１Ｌを３７℃で、ＯＤ５５
０が０．６〜０．８に達するまで増殖させた。９１９ＬＯｒｆ４の場合、３０℃
での増殖が必須であった。なぜなら３７℃での組換えタンパク質の発現は、細胞
の溶解を生じたからである。組換えタンパク質の発現を、１．０ｍＭの最終濃度
でＩＰＴＧを用いて誘導した。３時間のインキュベーションの後、細菌を、８０
００ｇで１５分間、４℃で遠心分離することで収集した。必要な場合、細胞を−
２０℃で保存した。全ての一連の手順を、４℃で行った。細菌を、完全プロテア
ーゼインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する２５
ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そしてＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓを２〜３回通過する
浸透圧ショックによって溶解した。分解されない細胞を、５０００ｇで１５分間
遠心分離することにより除去し、膜を１０００００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ５
０、３８０００ｒｐｍ）で４５分間遠心分離して沈降させた。Ｄｏｕｎｃｅホモ
ジナイザーを使用して、膜ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１．０ＭのＮａＣｌ、および完全プロテアーゼインヒビターの７．５ｍｌ
中に再懸濁した。この上清を２４時間混合し、１０００００ｇで４５分間遠心分
離し、このペレットを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．０Ｍの
ＮａＣｌ、５．０ｍｇ／ｍｌのＣＨＡＰＳ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールお
よび完全プロテアーゼインヒビターの７．５ｍｌ中に再懸濁した。この溶液を一
晩混合し、１０００００ｇで４５分間遠心分離し、この上清を６時間、適切に選
択された緩衝液に対して透析した。Ｏｒｆ２５．Ｌの場合、ＣＨＡＰＳ抽出の後
に得たこのペレットが、組換えタンパク質を含むことを見出した。この分画を、
さらなる精製なしに、マウスを免疫化するために使用した。
【０３０３】
（ＦＰＬＣ−Ｃ）：ＦＰＬＣ−Ａと同様であるが、しかし精製物は、細胞破壊
の後よりもむしろ、ポリミキシンＢを有するＥ．ｃｏｌｉの透析の後に得た可溶
化分画に由来した。
【０３０４】
（ＦＰＬＣ−Ｄ）：目的のプラスミドを保有する単一コロニーを、２０ｍｌの
ＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中で、３７℃で一晩増殖させた。細
菌を、１．０Ｌの新鮮な培地中で１：３０に希釈し、そして３０℃で、ＯＤ５５
０が０．６〜０．８に達するまで増殖させた。組換えタンパク質の発現を、１．
０ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを用いて誘導した。３時間のインキュベーションの
後、細菌を、８０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離することで収集した。必要
な場合、細胞を−２０℃で保存した。全ての一連の手順を、氷上または４℃で行
った。細胞を、２０ｍＭのＢｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、
１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、完全プロテアーゼインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に再懸濁し、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ
４５０を使用して破壊した。この超音波処理物を、８０００ｇで３０分間遠心
分離して破壊されない細胞および封入体を沈降させた。この組換えタンパク質を
、３．９Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加によって、３５％ｖ／ｖと７０％ｖ／ｖと
の間の飽和である溶液から沈殿した。この沈殿物を、８０００ｇ、３０分間で沈
降させ、２０ｍＭのＢｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、１０％
（ｖ／ｖ）グリセロールに再懸濁し、この緩衝液に対して６時間または一晩透析
した。この透析物を１３０００ｇで２０分間遠心分離し、そしてＦＰＬＣ樹脂に
適用した。このタンパク質を、カラムから段階的ＮａＣｌ勾配を使用して溶出し
た。精製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてこのタンパク質濃度を
ブラッドフォード法によって決定した。
【０３０５】
（クローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドの設計）
目的の抗原をコードする遺伝子を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ  ＭＣ
５８のゲノム配列に基いて設計したオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより
増幅した。２９９６株からのゲノムＤＮＡを、別段特定しなければ、常にＰＣＲ
のテンプレートとして使用し、そして他の増幅したフラグメントを発現ベクター
ｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）においてクローン化して、Ｃ末端のＨｉｓタ
グ産物としてこのタンパク質を発現させるか、またはｐＥＴ−２４＋（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ）においてクローン化して「無タグ」形態（例えば、ΔＧ２８７Ｋ）とし
てこのタンパク質を発現した。
【０３０６】
タンパク質を融合パートナーがなく、そして（もし存在する場合）独自のリー
ダーペプチドを有して発現した場合、オープンリーディングフレーム（ＡＴＧ〜
終止コドン）の増幅を実施した。
【０３０７】
タンパク質が、「無タグ」形態で発現された場合、このリーダーペプチドを、
推定されたリーダーペプチドから下流の５’末端増幅プライマーを設計すること
により、取り除いた。
【０３０８】
ＰＣＲで使用するプライマーの融点は、プライマー全体においてハイブリダイ
ズするヌクレオチドの数と種類に依存し、以下の式によって決定した：
Ｔｍ１＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）                （尾部排除）
Ｔｍ２＝６４．９＋０．４１（％ＧＣ）−６００／Ｎ  （プライマー全体）
選択されたオリゴヌクレオチドの融点は、オリゴ全体に対して通常６５〜７０
℃であり、そしてハイブリダイズする領域単独について５０〜６０℃である。
【０３０９】
オリゴヌクレオチドを、Ｐｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成
機を使用して合成し、２．０ｍｌのＮＨ４ＯＨでこのカラムから溶出し、そして
５６℃で５時間のインキュベーションにより脱保護した。このオリゴを、０．３
Ｍの酢酸ナトリウムと２容量のエタノールを添加することにより沈澱させた。こ
の試料を遠心分離し、そしてこのペレットを水中に再懸濁した。
【０３１０】
【表３６−１】
2014000092.tif 000089
【表３６−２】
2014000092.tif 000090
【表３６−３】
2014000092.tif 000091
【表３６−４】
2014000092.tif 000092
【表３６−５】
2014000092.tif 000093
【表３６−６】
2014000092.tif 000094
【表３６−７】
2014000092.tif 000095
【表３６−８】
2014000092.tif 000096
【表３６−９】
2014000092.tif 000097
【表３６−１０】
2014000092.tif 000098
【表３６−１１】
2014000092.tif 000099
【表３６−１２】
2014000092.tif 000100
＊このプライマーを、Ｈｉｓタグに対する２８７の全てのＣ末端融合逆方向プ
ライマーとして使用した。
【０３１１】
§２７８−Ｈｉｓリバースプライマーと組合せて使用された順方向（Ｆｏｒｗ
ａｒｄ）プライマー。
【０３１２】
ＮＢ−全ＰＣＲ反応は、別段特定（例えば、ＭＣ５８株）しない限り２９９６
株を使用した。
【０３１３】
ＡＴＧで開始する全ての構築物は、特異なＮｈｅＩ部位の後に存在せず、ＡＴ
Ｇコドンはクローニング部位について使用したＮｄｅＩ部位の一部である。５’
端におけるクローニング部位としてＮｈｅＩを使用して（例えば、これら全てが
、Ｎ末端に２８７を含んでいる）をつくられたこの構築物は、抗原のコード配列
に融合された２つのさらなるコドン（ＧＣＴ  ＡＧＣ）を有している。
【０３１４】
（染色体ＤＮＡテンプレートの調製）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６、ＭＣ５８、３９４．９８、１００
０およびＢＺ２３２（およびその他）を、１００ｍｌのＧＣ培地中で対数期まで
増殖させ、遠心分離で回収し、そして５ｍｌの緩衝液（２０％ｗ／ｖスクロース
、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁した。氷上での１０分間のインキュベーション後、細
菌を１０ｍｌの溶解溶液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％Ｎａ−Ｓａｒｋｏｓｙｌ、
５０μｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）の添加によって溶解し、そしてこ
の懸濁液を３７℃で２時間インキュベートした。２回のフェノール抽出（ｐＨ８
で平衡化）および１回のＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を
実施した。ＤＮＡを、０．３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノールを添加
することによって沈澱させ、そして遠心分離によって収集した。このペレットを
７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１回洗浄し、４．０ｍｌ  ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で再溶解した。ＤＮＡの
濃度は、ＯＤ２６０を読取ることで測定した。
【０３１５】
（ＰＣＲ増幅）
標準ＰＣＲプロトコールは、以下のとおりであった：２００ｎｇの２９９６、
ＭＣ５８１０００、もしくはＢＺ２３２株由来のゲノムＤＮＡまたは１０ｎｇの
組換えクローンのプラスミドＤＮＡ調製物を、４０μＭの各オリゴヌクレオチド
プライマー、４００〜８００μＭのｄＮＴＰ溶液、１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍ
Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む）、２．５単位のＴａｑＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒ
ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＡｍｐｌｉＴａＱ、Ｂｏｅｒｈｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ  ＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを使用する）の存在下
でテンプレートとして使用した。
【０３１６】
９５℃にて予め３分間の全混合物のインキュベーション後、各サンプルに、以
下の二工程増幅を行った：最初の５サイクルを、プライマーの制限酵素テールを
除くハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ１）を使用して行った。これに続いて、
全長オリゴについて算出したハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ２）に従って３
０サイクル行った。伸長時間（６８℃または７２℃で実施した）を、増幅される
Ｏｒｆの長さによって変化させた。Ｏｒｆ１の場合、伸長時間（３分から開始す
る）を、サイクル毎に１５秒ずつ増加させた。これらのサイクルを、７２℃での
１０分の伸長工程で完了させた。
【０３１７】
増幅したＤＮＡを、１％アガロースゲルに直接ロードした。正確なサイズのバ
ンドに対応するＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔ
ｉｏｎ  Ｋｉｔを製造業者のプロトコルに従って使用し、ゲルから精製した。
【０３１８】
（ＰＣＲフラグメントおよびクローニングベクターの消化）
増幅フラグメントに対応する精製ＤＮＡを、ｐＥＴ−２１ｂ＋、ｐＥＴ２２ｂ
＋またはｐＥＴ−２４ｂ＋へのクローニングのために適切な制限酵素を用いて消
化した。消化されたフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（製
造業者の指示書に従って）を使用して精製し、そして、水または１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）のいずれかを用いて溶出した。プラスミドベクター
を、適切な制限酵素を用いて消化し、１．０％アガロースゲルにロードし、そし
てこの消化されたベクターに対応するバンドをＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ
Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して精製した。
【０３１９】
（クローニング）
予め消化して、そして精製した各遺伝子に対応するフラグメントを、ｐＥＴ−
２１ｂ＋、ｐＥＴ２２ｂ＋またはｐＥＴ−２４ｂ＋に連結した。モル比３：１の
フラグメント／ベクターを、製造業者によって供給された連結緩衝液中でＴ４  
ＤＮＡリガーゼとともに使用した。
【０３２０】
リガーゼ反応溶液および細菌を４０分間氷上でインキュベートし、次に、３７
℃で３分間インキュベートして、組換えプラスミドをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５またはＨＢ１０１中に形質転換した。これに続いて、８００μｌのＬＢ
ブロスを添加して、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を、Ｅｐｐｅｎ
ｄｏｒｆの微量遠心機において最大速度で遠心分離し、そして約２００μｌの上
清に再懸濁して、ＬＢアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）寒天上にプレートした
。
【０３２１】
組換えクローンのスクリーニングを、無作為に選択したコロニーを、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた４．０ｍｌのＬＢブロス中で３７℃にて一晩増
殖させることにより行った。次に、細胞をペレットにして、そしてプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを
製造業者の指示書に従って使用して、抽出した。各々個々のミニプレップの約１
μｇを、適切な制限酵素を用いて消化し、そして消化物を、１〜１．５％アガロ
ースゲル（予想されるインサートサイズに依存する）に、分子量マーカー（１ｋ
ｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、ＧＩＢＣＯ）と並行してロードした。陽性クローン
のスクリーニングを、インサートサイズに基づいて行った。
【０３２２】
（発現）
発現ベクター中に各遺伝子をクローニングした後、組換えプラスミドを、組換
えタンパク質産物の発現に適切なＥ．ｃｏｌｉ株中に形質転換した。１μｌの各
構築物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＤＥ３を、上記のように形質転換
した。単一の組換えコロニーを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を加えた２ｍｌの
ＬＢに接種し、３７℃で一晩でインキュベートし、次に、１００ｍｌのフラスコ
中でＡｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を加えた２０ｍｌのＬＢ中に１：３０で希釈し
、ＯＤ６００が０．１と０．２との間にした。これらのフラスコを、ＯＤ６００
が、発現の誘導に適切な指数増殖（０．４〜０．８ＯＤ）を示すまで回転型水浴
振とう機中で３０℃または３７℃でインキュベートした。タンパク質の発現を１
．０ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導した。３０℃または３７℃での３時間の
インキュベーションの後、ＯＤ６００を測定し、そして発現を試験した。サンプ
ルの最最終濃度を、ＯＤによって確認した。１．０ｍｌの各サンプルを微量遠心
機において遠心分離し、そのペレットをＰＢＳ中に再懸濁してＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびクマシーブルー染色によって分析した。
【０３２３】
（Ｇａｔｅｗａｙクローニングおよび発現）
ＧＡＴＥ標識された配列を、ＧＡＴＥＷＡＹクローニング技術（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ）を用いてクローニングし、そして発現させた。組換えクローニング（Ｒ
Ｃ）は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム中へのファージの組込みおよびＥ．ｃｏｌｉゲノム
からのファージの切り出し、それぞれを媒介する組換え反応に基づく。組込みは
、細菌のゲノム中に位置するａｔｔＢ部位内へのファージＤＮＡのａｔｔＰ部位
の組換え（ＢＰ反応）を含み、そしてａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位に隣接し
て組み込まれたファージゲノムを生成する。切り出しは、ａｔｔＰ部位およびａ
ｔｔＢ部位の後にａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位を組換える（ＬＲ反応）。組
み込む反応は、２つの酵素［ファージタンパク質インテグラーゼ（Ｉｎｔ）およ
び細菌タンパク質組込み宿主因子（ＩＨＦ）］（ＢＰクロナーゼ（ｃｌｏｎａｓ
ｅ））を必要とする。切り出し反応は、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびさらなるファー
ジ酵素、切り出し酵素（Ｘｉｓ）（ＬＲクロナーゼ）を必要とする。２５ｂｐの
細菌のａｔｔＢ組換え部位の人工誘導体（Ｂ１およびＢ２と称される）を、ナイ
セリアのＯＲＦを増幅するＰＣＲ反応に用いられるプライマーの５’末端に付加
した。得られた産物を、ＢＰクロナーゼを用いて、ファージａｔｔＰ組換え部位
（Ｐ１およびＰ２）の相補的誘導体を含む「ドナー（Ｄｏｎｏｒ）ベクター」中
にＢＰクローニングした。得られた「侵入（ｅｎｔｒｙ）クローン」は、ａｔｔ
Ｌ部位（Ｌ１およびＬ２）の誘導体に隣接するＯＲＦを含み、これらのクローン
をＬＲクロナーゼを用いて、ａｔｔＬ適合性ａｔｔＲ部位（Ｒ１およびＲ２）の
誘導体を含む発現「目的（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクター」中にサブクロー
ニングした。これは、「発現クローン」を生じ、ここで、ＯＲＦは、Ｂ１および
Ｂ２に隣接し、そしてＧＳＴまたはＨｉｓのＮ末端タグにインフレームで融合し
た。
【０３２４】
ＧＡＴＥＷＡＹ発現のために用いたＥ．ｃｏｌｉ株は、ＢＬ２１−ＳＩである
。この株の細胞を、塩（０．３ＭのＮａＣｌ）を含む培地中での増殖によってＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導する。
【０３２５】
ここで留意すべき点は、この系がＮ末端Ｈｉｓタグを与えることである。
【０３２６】
（膜タンパク質の調製）
内膜、外膜または全部の膜のいずれかから主に構成される画分を、膜局在化リ
ーダー配列で発現された組換えタンパク質を得るために単離した。組換えタンパ
ク質について富化された膜画分の調製のための方法を、Ｆｉｌｉｐら［Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．（１９７３）１１５：７１７−７２２］およびＤａｖｉｅｓら［Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９０）１４３：２１５−２２５］から適応した。
目的のプラスミドを保有する単一コロニーを、２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ（１００
μｇ／ｍｌ）液体培地中で３７℃にて一晩で増殖させた。細菌を、新鮮な培地１
．０Ｌ中で１：３０に希釈し、ＯＤ５５０が０．６〜０．８に達するまで、３０
℃または３７℃のいずれかで増殖させた。組換えタンパク質の発現を、最終濃度
１．０ｍＭでＩＰＴＧを用いて誘導した。３時間インキュベート後、細菌を８０
００ｇで４℃にて１５分間遠心分離することによって収集し、そして２０ｍｌの
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および完全プロテアーゼインヒビタ
ー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に再懸濁した。全ての引き続く
手順を４℃または氷上にて実施した。
【０３２７】
細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０を使用して超音波処理す
ることにより破砕し、そして５０００ｇで２０分間遠心分離して破砕されていな
い細胞および封入体を沈降させた。この上清（膜および細胞の残骸を含む）を５
００００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ５０、２９０００ｒｐｍ）で７５分間遠心分
離し、２０ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓプロパン（ｐＨ６．５）、１．０ＭのＮａＣ
ｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールで洗浄し、そして５００００ｇで７５分間、
再び沈降させた。このペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
、２０％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ、完全プロテアーゼインヒビター（１．０
ｍＭのＥＤＴＡ、最終濃度）に再懸濁し、そして２０分間インキュベートして内
膜を溶解した。細胞の残骸を、５０００ｇで１０分間遠心分離することによって
ペレットにし、そして上清を７５０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ５０、３３０
００ｒｐｍ）で７５分間遠心分離した。タンパク質００８Ｌおよび５１９Ｌを上
清中に見出した。このことは、内膜に局在化したことを示唆する。これらのタン
パク質の代わりに内膜および全膜画分の両方（上記のようにＮａＣｌで洗浄した
）を用いて、マウスを免疫した。７５０００ｇのペレットから得た外膜小胞を、
２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、そして７５０００ｇで７
５分間または一晩遠心分離した。ＯＭＶを、５００μｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に最終的に再懸濁した
。Ｏｒｆ１ＬおよびＯｒｆ４０Ｌを、両方とも外膜の画分に局在化および富化さ
せ、この画分を、マウスを免疫するために用いた。タンパク質濃度を、標準的Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって評価し、一方、内膜画分の
タンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて決定し
た。単離手順からの種々の画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイした。
【０３２８】
（Ｈｉｓタグ化タンパク質の精製）
２８７の種々の形態を２９９６株およびＭＣ５８株からクローニングした。そ
れらを、Ｃ末端Ｈｉｓタグ化融合体と構築し、成熟形態（ａａ  １８〜４２７）
、欠失（Δ１、Δ２、Δ３およびΔ４）を有する構築物およびＢドメインまたは
Ｃドメインのいずれかから構成されるクローンを含んだ。Ｈｉｓ−融合体として
精製した各クローンについて、単一のコロニーを画線し、ＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレート上で３７℃にて一晩増殖させた。このプレートから単
離したコロニーを、２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中に
接種し、振とうさせながら３７℃にて一晩増殖させた。一晩の培養物を１．０Ｌ
のＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中に１：３０で希釈し、そして最
適な温度（３０℃または３７℃）にてＯＤ５５０が０．６〜０．８に達するまで
増殖させた。組換えタンパク質の発現を、ＩＰＴＧ（最終濃度１．０ｍＭ）の添
加によって誘導し、そして、培養物をさらに３時間インキュベートした。細菌を
８０００ｇ、４℃にて１５分間の遠心分離によって収集した。細菌のペレットを
、（ｉ）可溶性タンパク質について、冷緩衝液Ａ（３００ｍＭのＮａＣｌ、５０
ｍＭのリン酸緩衝液、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）、または（ｉｉ）
不溶性タンパク質について、緩衝液Ｂ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍ
Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ８．８および、必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれか７
．５ｍｌに再懸濁した。可溶性形態で精製したタンパク質は、２８７−Ｈｉｓ、
Δ１、Δ２、Δ３およびΔ４の２８７−Ｈｉｓ、Δ４の２８７ＭＣ５８−Ｈｉｓ
、２８７ｃ−Ｈｉｓならびに２８７ｃＭＣ５８−Ｈｉｓを含んだ。タンパク質２
８７ｂＭＣ５８−Ｈｉｓは、不溶性であり、これをそれに応じて精製した。この
細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０を用いて、氷上で、３０秒
間、４０Ｗで４回、超音波処理によって破砕し、そして１３０００×ｇで４℃に
て３０分間、遠心分離した。不溶性タンパク質について、ペレットを、２．０ｍ
ｌの緩衝液Ｃ（６Ｍの塩酸グアニジン、１００ｍＭのリン酸緩衝液、１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に再懸濁し、そしてＤｏｕｎｃｅホモジナイ
ザーの１０パスで処理した。ホモジネートを１３０００ｇで３０分間遠心分離し
、そして上清を保持した。可溶性調製物および不溶性調製物の両方についての上
清を、１５０μｌのＮｉ２＋樹脂（適切なように、緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂのい
ずれかで予め平衡にした）と混合し、そして３０分間、穏やかに撹拌しながら、
室温でインキュベートした。この樹脂は、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）であり、製造業者のプロトコ
ルに従って調製した。回分式調製物を、７００ｇで４℃にて５分間遠心分離し、
上清を捨てた。この樹脂を、２回（回分式）、１０ｍｌの緩衝液Ａまたは緩衝液
Ｂを用いて１０分間洗浄し、１．０ｍｌの緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂ中に再懸濁し
、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、（ｉ）４℃にて緩衝液Ａま
たは（ｉｉ）室温にて緩衝液Ｂのいずれかを用いて、流入のＯＤ２８０が０．０
２〜０．０１に達するまで、洗い続けた。この樹脂を、（ｉ）冷緩衝液Ｃ（３０
０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８
．０）または（ｉｉ）緩衝液Ｄ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのリ
ン酸緩衝液、ｐＨ６．３および、必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれかを用いて
、流入のＯＤ２８０が０．０２〜０．０１に達するまで、さらに洗浄した。Ｈｉ
ｓ−融合タンパク質を、（ｉ）冷溶出緩衝液Ａ（３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍのリン酸緩衝液、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）、または（ｉｉ）
溶出緩衝液Ｂ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ
４．５および、必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれか７００μｌの添加によって
溶出し、そしてＯＤ２８０が全ての組換えタンパク質を得たことを示すまで画分
を収集した。２０μｌの各溶出画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
析した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて評価した。
【０３２９】
（変性したＨｉｓ融合タンパク質の再生）
変性が、２８７ｂＭＣ８を可溶化するために必要とされたので、再生工程を、
免疫化の前に用いた。グリセロールを、上記で得た変性画分に添加して、１０％
ｖ／ｖの最終濃度にした。このタンパク質を、透析緩衝液Ｉ（１０％ｖ／ｖのグ
リセロール、０．５Ｍのアルギニン、５０ｍＭのリン酸緩衝液、５．０ｍＭの還元型グルタチオン、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン、２．０Ｍの尿素、ｐＨ８
．８）を使用して２００μｇ／ｍｌになるまで希釈し、そして同じ緩衝液に対し
て、４℃で１２〜１４時間透析した。さらなる透析を、透析緩衝液ＩＩ（１０％
ｖ／ｖのグリセロール、０．５Ｍのアルギニン、５０ｍＭのリン酸緩衝液、５．
０ｍＭの還元型グルタチオン、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン、ｐＨ８．８）
に対して４℃で１２〜１４時間実施した。タンパク質濃度を、以下の式を用いて
評価した：
タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）＝（１．５５×ＯＤ２８０）−（０．７６×ＯＤ２６
０）
（アミノ酸配列分析）
タンパク質のＮＨ２末端の自動化配列分析を、製造業者の勧告書に従って、オ
ンラインフェニルチオヒダントイン−アミノ酸分析機器（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌ
ｄ）を備えたＢｅｃｋｍａｎシークエンサー（ＬＦ  ３０００）で実施した。
【０３３０】
（免疫化）
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、抗原を用いて、０、２１および３５日目に免疫し、そ
して血清を４９日目に分析した。
【０３３１】
（血清分析−ＥＬＩＳＡアッセイ）
無莢膜の（ａｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）ＭｅｎＢ  Ｍ７株およびカプセル化され
た株を、チョコレート寒天プレート上にプレートし、そして５％ＣＯ２とともに
３７℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーを寒天プレートから滅菌ドラ
コン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを用いて収集し、そして０．２５％グルコースを含
有するＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ）中に接種した。細菌
の増殖を３０分毎に、ＯＤ６２０を追跡することによりモニターした。細菌をＯ
Ｄが０．４〜０．５の値に達するまで増殖させた。培養物を４０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離した。上清を捨て、そして細菌をＰＢＳを用いて２回洗浄し、０
．０２５％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁し、そして３７℃で
１時間インキュベートし、次いで４℃にて一晩攪拌しながらインキュベートした
。１００μｌの細菌細胞を、９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレートの各ウェルに添
加し、そして４℃で一晩でインキュベートした。次いでそのウェルをＰＢＴ洗浄
緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄した。２０
０μｌの飽和緩衝液（水中の２．７％のポリビニルピロリドン  １０）を各ウェ
ルに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰ
ＢＴで３回洗浄した。２００μｌの希釈血清（希釈緩衝液：ＰＢＳ中に１％  Ｂ
ＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％  ＮａＮ３）を各ウェルに添加し
、そしてそのプレートを３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＴで
３回洗浄した。希釈緩衝液中に１：２０００に希釈した１００μｌのＨＲＰ結合
体化ウサギ抗マウス（Ｄａｋｏ）血清を、各ウェルに添加し、そしてこのプレー
トを３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＴ緩衝液で３回洗浄
した。ＨＲＰに対する１００μｌの基質緩衝液（２５ｍｌのクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５）、１０ｍｇのＯ−フェニルジアミンおよび１０μｌのＨ２Ｏ２）を各ウェ
ルに添加し、そしてこのプレートを室温で２０分間放置した。１００μｌの１２
．５％Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加し、そしてＯＤ４９０を追跡した。ＥＬＩＳ
Ａの力価を、免疫前の血清のレベルを超える０．４のＯＤ４９０値を与える血清
の希釈として任意に算出した。０．４のＯＤ４９０を有する血清の希釈が、１：
４００より高い場合、ＥＬＩＳＡが陽性であるとみなした。
【０３３２】
（血清分析−ＦＡＣＳ  Ｓｃａｎ細菌結合アッセイ）
無莢膜ＭｅｎＢ  Ｍ７株をチョコレート寒天プレートにプレートし、そして５％ＣＯ２とともに３７℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーを寒天プレ
ートから滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを用いて回収し、そして０．２５
％グルコースを含有する８ｍｌの各Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉ
ｆｃｏ）を含む４本のチューブに中に接種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ
６２０を追跡することによりモニターした。細菌を、ＯＤが０．３５〜０．５の
値に達するまで増殖させた。培養物を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。
上清を捨て、ペレットをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．４％Ｎ
ａＮ３）中に再懸濁し、そして５分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞をＯ
Ｄ６２０が０．０５に達するようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。１００μ
ｌの細菌細胞を、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。１０
０μｌの希釈（１：１００、１：２００、１：４００）血清（ブロッキング緩衝
液中）を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを４℃で２時間インキュベート
した。細胞を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を吸引し、そして各
ウェルに２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより、細胞
を洗浄した。１００μｌのＲ−フィコエリトリン結合体化Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マ
ウス（１：１００希釈）を各ウェルに添加し、そしてプレートを１時間４℃でイ
ンキュベートした。細胞を、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって遠心沈
殿させ、そして２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより
、洗浄した。その上清を吸引し、そして細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ、０
．２５％のホルムアルデヒドに再懸濁した。そのサンプルをＦＡＣＳｃａｎチュ
ーブに移して、そして読み取った。ＦＡＣＳｃａｎ（レーザーパワー１５ｍＷ）
設定の条件は、以下のとおりであった：ＦＬ２オン；ＦＳＣ−Ｈ閾値：９２；Ｆ
ＳＣ  ＰＭＴ電圧：Ｅ０１；ＳＳＣ  ＰＭＴ：４７４；増幅器ゲイン  ６．１；
ＦＬ−２  ＰＭＴ：５８６；補正値：０。
【０３３３】
（血清分析−殺菌性アッセイ）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６をチョコレート寒天プレート上で、
５％ＣＯ２とともに３７℃で一晩増殖させた（凍結ストックから開始した）。コ
ロニーを回収し、そしてこれを用いて、０．２５％のグルコースを含有する７ｍ
ｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスに接種して、ＯＤ６２０が０．０５〜
０．０８に達した。この培養物を、ＯＤ６２０の値が０．２３〜０．２４に達す
るまで、振とうしながら３７℃にて約１．５時間インキュベートした。細菌を、
１０５のＣＦＵ／ｍｌの作業希釈で１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＣａＣｌ
２および０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７
．２）（アッセイ緩衝液）中に希釈した。最終反応混合物の全容量は、２５μｌ
の連続２倍の希釈の試験血清、作業希釈での１２．５μｌの細菌、１２．５μｌ
の乳仔ラビット補体（最終濃度２５％）を有する５０μｌであった。
【０３３４】
コントロールは、補体血清とともにインキュベートした細菌、細菌および５６
℃にて３０分間加熱することによって不活化された補体とともにインキュベート
した免疫血清を含んだ。乳仔ウサギ補体の添加直後に、１０μｌのコントロール
を、傾斜法（ｔｉｌｔ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いてＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ
寒天プレート上にプレートした（時間０）。９６ウェルプレートを、３７℃にて
１時間回転させながらインキュベートした。７μｌの各サンプルを、Ｍｕｅｌｌ
ｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート上に斑点状にプレートしたのに対して、１０μ
ｌのコントロールを、傾斜法を用いて、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレ
ート上にプレートした（時間１）。寒天プレートを、３７℃にて１８時間インキ
ュベートし、時間０および時間１に対応するコロニーを計数した。
【０３３５】
（血清分析−ウェスタンブロット）
ＭｅｎＢ株２９９６由来の精製タンパク質（５００ｎｇ／レーン）、外膜小胞
（５μｇ）および全細胞抽出物（２５μｇ）を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上にロードし、そしてニトロセルロース膜に転写した。この転写を、２
時間、１５０ｍＡ、４℃にて転写緩衝液（０．３％のＴｒｉｓベース、１．４４
％のグリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノール）を用いて行った。この膜を飽和緩
衝液（ＰＢＳ中の１０％のスキムミルク、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）
中での４℃の一晩のインキュベーションにより飽和させた。この膜を洗浄緩衝液
（ＰＢＳ中の３％のスキムミルク、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）を用い
て２回洗浄し、そして洗浄緩衝液中に１：２００に希釈したマウス血清とともに
、３７℃にて２時間インキュベートした。この膜を２回洗浄し、そして１：２０
００希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇとともに９０分間
インキュベートした。この膜をＰＢＳ中の０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を
用いて２回洗浄し、そしてＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用
いて、発色させた。この反応を水を添加して停止させた。
【０３３６】
ＯＭＶを以下のように調製した：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を
、５つのＧＣプレート上で５％ＣＯ２とともに３７℃で一晩増殖させ、ループを
用いて収集し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
２ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁した。熱不活化を５６℃にて４５分間行い、そして
細菌を５分間氷上で超音波処理することにより破砕した（５０％の衝撃係数、５
０％の出力、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ３ｍｍ  ｍｉｃｒｏｔｏｐ）
。破砕されなかった細胞を５０００ｇ、１０分間の遠心分離によって除去し、そ
して全細胞エンベロープ画分を含む上清を回収し、そしてさらに５００００ｇ、
４℃にて一晩遠心分離した。膜を含むペレットを、２％サルコシル、２０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁し、そして室温
で２０分間インキュベートして、内膜を可溶化した。この懸濁液を、１００００
ｇで１０分間遠心分離し、凝集物を除去し、そしてこの上清をさらに５００００
ｇで３時間、遠心分離して、このペレット（外膜を含む）をＰＢＳで洗浄し、そ
して同じ緩衝液中に再懸濁した。タンパク質濃度を、Ｄ．Ｃ．Ｂｉｏ−Ｒａｄ  
Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（改変されたＬｏｗｒｙ法）によって、ＢＳＡを標準物
として用いて測定した。
【０３３７】
全細胞抽出物を以下のように調製した：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９
９６を、ＧＣプレート上で一晩増殖させ、ループを用いて収集し、そして１ｍｌ
の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に再懸濁した。熱不活化を５６℃にて３０分間
行った。
【０３３８】
（９６１ドメインの研究）
（細胞画分の調製）９６１の種々のドメインを発現するＥ．ｃｏｌｉクローン
の全溶解物、ペリプラズム、上清およびＯＶＭを、一晩培養した細菌かまたはＩ
ＰＴＧを用いた誘導から３時間後の細菌を用いて調製した。簡潔には、ペリプラ
ズムを、１００μｇ／ｍｌのポリミキシン（ｐｏｌｉｍｉｘｉｎｅ）を有する２
５％サッカロースおよび５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）中に細菌を懸濁すること
で得た。室温にて１時間後、細菌を１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そ
してその上清を収集した。培養物上清を、０．２μｍでろ過し、そして氷中にて
２時間５０％ＴＣＡを用いて沈澱させた。遠心分離（１３０００ｒｐｍにて３０
分間）後ペレットを７０％エタノールで２回リンスし、そしてＰＢＳ中に懸濁し
た。ＯＭＶ調製を既に記載したように実施した。各細胞画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
またはＧＳＴ−９６１に対して惹起されるポリクローナル抗血清を用いてウェス
タンブロットで分析した。
【０３３９】
（接着アッセイ）Ｃｈａｎｇ上皮細胞（Ｗｏｎｇ−Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ誘導体
、クローン１−５ｃ−４、ヒト結膜）を、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、１５ｍＭ
のＬ−グルタミンおよび抗生物質を補給したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に扶養し
た。
【０３４０】
接着力アッセイについて、サブコンフルエントな培養物のＣｈａｎｇ上皮細胞
を、ＰＢＳでリンスし、そしてトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて処
理してプラスチックの支持体からこれらの細胞を剥離した。次いで、これらの細
胞を、ＰＢＳ中に懸濁し、計数し、そして５×１０５細胞／ｍｌとなるまでＰＢ
Ｓ中に希釈した。
【０３４１】
一晩培養した細菌またはＩＰＴＧを用いて誘導した後の細菌を、ペレット化し
、そして１３０００で５分間遠心分離することによってＰＢＳで２回洗浄した。
約２〜３×１０８（ｃｆｕ）を０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）とと
もに１ｍｌの緩衝液（５０ｍＭのＮａＨＣＯ３および１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐ
Ｈ８）を含む）中で、暗下で室温にて３０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ標
識した細菌を２〜３回洗浄し、そしてＰＢＳ中に１〜１．５×１０９／ｍｌで懸
濁した。２００μｌのこの懸濁液（２〜３×１０８）を、３７℃にて３０分間、
２００μｌ（１×１０５）の上皮細胞とともにインキュベートした。次いで、細
胞を、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して非接着細菌を除去し、２００μｌの
ＰＢＳ中に懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎチューブに移し、そして読み取った。
【図１】
2014000092.tif 000101
【図２】
2014000092.tif 000102
【図３】
2014000092.tif 000103
【図４】
2014000092.tif 000104
【図５】
2014000092.tif 000105
【図６】
2014000092.tif 000106
【図８】
2014000092.tif 000107
【図９】
2014000092.tif 000108
【図１０】
2014000092.tif 000109
【図１１】
2014000092.tif 000110
【図１２】
2014000092.tif 000111
【図１３】
2014000092.tif 000112
【図１４−１】
2014000092.tif 000113
【図１４−２】
2014000092.tif 000114
【図１４−３】
2014000092.tif 000115
【図１４−４】
2014000092.tif 000116
【図１４−５】
2014000092.tif 000117
【図１４−６】
2014000092.tif 000118
【図７】
2014000092.tif 000119
【配列表】
2014000092000001.app