(57)【要約】【課題】任意のｐＨ領域毎に評価対象物の分子量の違いによる分離を高精度にかつ容易に行うことができる電気泳動用試験具およびその製造方法を提供すること。【解決手段】基材上に形成されたゲル層を有する分子量分析用の電気泳動用試験具であって、  前記ゲル層は、電気泳動の方向と直交する方向に、複数の分析領域を有しており、  複数の前記分析領域におけるゲルの網目サイズが相互に異なっていることを特徴とする電気泳動用試験具。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上に形成されたゲル層を有する分子量分析用の電気泳動用試験具であって、
前記ゲル層は、電気泳動の方向と直交する方向に、複数の分析領域を有しており、
複数の前記分析領域におけるゲルの網目サイズが相互に異なっていることを特徴とする電気泳動用試験具。
【請求項２】
前記分析領域は、ゲルの網目サイズが一定である主分析領域を有している請求項１に記載の電気泳動用試験具。
【請求項３】
前記分析領域は、前記主分析領域と前記電気泳動の方向に隣接し、前記主分析領域とゲルの網目サイズが異なる副分析領域をさらに有している請求項２に記載の電気泳動用試験具。
【請求項４】
前記分析領域は、電気泳動の方向にゲルの網目サイズが徐々に変化したグラジエント領域をさらに有している請求項２または３に記載の電気泳動用試験具。
【請求項５】
基材上に形成されたゲル層を有する電気泳動用試験具の製造方法であって、
モノマーを含有するゲル材料溶液を均一な塗布量で前記基材上に塗布するゲル材料塗布工程と、
前記基材上の前記ゲル材料溶液の塗布膜の一部にモノマー含有溶液と架橋剤含有溶液の少なくとも一方を塗布し、電気泳動の方向と直交する方向における、モノマーと架橋剤の少なくとも一方の濃度を調整する濃度調整工程と、
前記基材上の塗布膜をゲル化するゲル化工程とを含むことを特徴とする電気泳動用試験具の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動用試験具およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物が有する全タンパク質の構造および機能を網羅的に解析することを目的とするプロテオーム解析の一環として、２つの電気泳動法を組み合わせた２次元電気泳動法が利用されている。２次元電気泳動法では、１次元目に等電点電気泳動が行われ、続く２次元目にSDS-PAGEが行われる。これにより、数千種類ものタンパク質を高い分解能で一挙に分離することが可能となった。
【０００３】
このように、ゲル電気泳動法はタンパク質などの生体高分子の分離分析に不可欠な手法であるが、いずれの電気泳動法においても分析の精度および再現性は、用いるゲルの品質によるところが大きい。したがって、当該分野においては、分解能の高いゲルを搭載した電気泳動用試験具を安定して製造可能な技術の開発が望まれている。
【０００４】
特許文献１には、１次元目および２次元目電気泳動を一体化した一つのゲルで実現可能な電気泳動用支持体が開示されている。この支持体は、複数の独立した２次元目ゲルを１本の１次元目ゲルで束ねた構造であり、これにより１次元目電気泳動から２次元目電気泳動までを連続して行うことができる。また、各２次元目ゲルの網目サイズに勾配を形成することも可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−４２００４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の電気泳動用支持具の場合、並列した２次元目ゲル同士はスリットで隔てられて絶縁されているため、２次元目電気泳動の際に２次元目ゲル同士が同じように電圧が印加される保証がなく、しかも電極の設置作業などは煩雑化する。
また、特許文献１のゲルの網目サイズに勾配を形成する目的は分子量の測定領域を拡張する点にある。すなわち、電気泳動泳動開始側から反対側に向けてゲル穴の網目サイズが徐々に小さくなるように勾配を持たせることで、分子量が小さな試料がゲルの末端まで到達して、電気泳動領域を通り過ぎてしまい、小分子量の分子を分離できなくなる問題を解決できる。したがって、ゲルの電気泳動距離を増やすことなく分子量が大きいものから小さいものまで複数種類の分子が混合した試料を一回の電気泳動でおおまかに分離することには適している。しかしながら、このような測定方法では電気泳動距離の領域中に大分子量から小分子量までのスポット（特定分子量をもつ試料の電気泳動後の位置）が押し込まれることになり、隣接するスポット同士の距離が小さくなり、スポット同士の分離が困難となることから、分子量の分解能が低下する問題がある。すなわち、特定の分子量領域・ｐＨ領域の分子を精度よく分離する目的には適していない。
【０００７】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、任意の領域の評価対象物の分子量の違いによる分離を高精度にかつ容易に行うことができる電気泳動用試験具およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かくして、本発明によれば、基材上に形成されたゲル層を有する分子量分析用の電気泳動用試験具であって、
前記ゲル層は、電気泳動の方向と直交する方向に、複数の分析領域を有しており、
複数の前記分析領域におけるゲルの網目サイズが相互に異なっている電気泳動用試験具が提供される。
【０００９】
また、本発明の別の観点によれば、基材上に形成されたゲル層を有する電気泳動用試験具の製造方法であって、
モノマーを含有するゲル材料溶液を均一な塗布量で前記基材上に塗布するゲル材料塗布工程と、
前記基材上の前記ゲル材料溶液の塗布膜の一部にモノマー含有溶液と架橋剤含有溶液の少なくとも一方を塗布し、電気泳動の方向と直交する方向における、モノマーと架橋剤の少なくとも一方の濃度を調整する濃度調整工程と、
前記基材上の塗布膜をゲル化するゲル化工程とを含む
電気泳動用試験具の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の電気泳動用試験具およびその製造方法は、任意の領域の評価対象物の分子量の違いによる分離を高精度にかつ容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施形態１の電気泳動用試験具を示す斜視図である。
【図２】実施形態１の電気泳動用試験具の各分析領域を説明する概念図である。
【図３】本発明の電気泳動用試験具の製造方法を説明する図であって、（Ａ）はゲル材料塗布工程を示し、（Ｂ）は（Ａ）から引き続くモノマー濃度調整工程または架橋剤濃度調整工程を示し、（Ｃ）は（Ｂ）から引き続くゲル化工程を示す。
【図４】図３（Ｂ）とは別のモノマー濃度調整工程または架橋剤濃度調整工程を示す図である。
【図５】実施形態２の電気泳動用試験具の各分析領域を説明する図である。
【図６】実施形態３の電気泳動用試験具の各分析領域を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（実施形態１）
＜電気泳動用試験具＞
図１は本発明の電気泳動用試験具の実施形態１を示す斜視図であり、図２は実施形態１の電気泳動用試験具の各分析領域を説明する概念図である。なお、図１において符号Ｅは電極を示し、図２において符号１は２次元電気泳動における１次元目電気泳動に使用されたゲルを示している。
【００１３】
この電気泳動用試験具１０は、基材１１と、基材１１上に形成されたゲル層１２とを備え、ゲル層１２は、電気泳動の方向（矢印Ｘ方向）と直交する方向（矢印Ｙ方向）に、１次元目電気泳動用ゲルＧ１のｐＨに対応する複数の分析領域（実施形態１の場合、第１〜第３分析領域１Ａ〜１Ｃ）を有しており、複数の分析領域におけるゲルの網目サイズ％Ｔが相互に異なっている。
例えば、実施形態１の場合、電気泳動用試験具１０と１次元目電気泳動用ゲルＧ１のｐＨの対応関係は、第１分析領域１ＡがｐＨ３〜５、第２分析領域１ＢがｐＨ５〜７、第３分析領域１ＣがｐＨ７〜１０に概ね対応している。
【００１４】
ここで、%Tとは、モノマー材料であるアクリルアミド（A g）と架橋剤であるBis(B g)のg数を合わせた質量%濃度（g/mL）を、溶質(X mL)の総和%（Total%）と示すものであり、次式で示される。
％Ｔ＝[（A+B）/X ]×100
%Tは、ゲルの網目サイズを決める指標であり、「%Tが異なっている」とは、換言すると、ゲル層１２の網目構造の網目サイズが異なっていること意味する。
【００１５】
上記のごとく、ゲルの網目サイズ（％Ｔ）はゲルを製造する際の各材料の濃度より決定される量である。
また、本発明において、ゲル層１２の網目サイズの測定は次の方法で実験的に求めることもできる。
一般に、試料の電気泳動速度はゲル層の網目サイズが大きいほど大きいことが知られている。そこで、特定の電気泳動条件下でのゲル層の網目サイズと単位時間当たりの電気泳動速度との相関関係が既知のマーカー試料を用いて実際に電気泳動を行い、電気泳動速度を測定することによって、実験的にゲル層１２の網目サイズを測定することができる。
【００１６】
この電気泳動用試験具１０のゲル層１２に評価対象物を含有する試料液を浸透させ、かつ電気泳動による評価対象物を分子量の違いによって高精度に分離することができる。すなわち、この試験具１０は、２次元電気泳動における２次元目電気泳動に用いることができる試験具である。なお、この試験具１０の用途は２次元目電気泳動に限定されるものではなく、例えば、予めｐＨ値が分かっている評価対象物の分子量分画を個別に行うような場合にも使用可能である。
【００１７】
基材１１の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、一辺の長さが400〜100ｍｍの正方形または長方形のプレートが挙げられる。
基材１１の材料としては、電気泳動用試験具の基材としての機能が発揮できるものであれば特に限定されず、例えば、石英ガラスおよび無アルカリガラス等のガラスならびにポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）およびポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）等の樹脂ならびにアルミナおよび低温同時焼成セラミック等のセラミックスなどが挙げられる。また、基材が疎水性材料からなる場合、基材１１におけるゲル層１２が形成される面を親水性処理してもよく、これにより基材１１に対する後述のモノマー溶液の濡れ性が向上し、モノマー溶液がゲル化したゲル層１２と基材１１との密着性が向上する。親水性処理としては、硫酸を用いたニトロ化、硝酸を用いたスルホン化、酸素プラズマ処理等が挙げられる。
【００１８】
ゲル層１２は、溶媒中にモノマーおよびゲル化剤を混合させた溶液がゲル化した層であり、電気泳動の方向（矢印Ｘ方向）と直交する方向（矢印Ｙ方向）に複数の分析領域を有している。これら複数の分析領域について詳しくは後述する。
【００１９】
ゲル層１２の材料は、電気泳動用試験具のゲル層としての機能が発揮できるものであれば特に限定されず、例えば、一般的なポリアクリルアミドゲルの材料としては、アクリルアミド（モノマー）、ビスアクリルアミド（架橋剤）、ｐＨ調整材料（ｐＨバッファ）、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ：重合促進剤）、ゲル化剤および純水が挙げられる。ゲル化剤としては、リボフラビン類もしくは２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン等のアセトフェノン類もしくはベンゾフェノン類もしくはアゾイソブチロニトリル類等の光重合開始剤または過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）もしくは過酸化ベンゾイル等の熱重合開始剤を用いることができる。
【００２０】
ゲル層１２は、基材１１の一面のほぼ全面に形成され、厚さは800〜1200μｍ程度である。
このゲル層１２を乾燥した乾燥膜の厚さは100μｍ以下に収縮するが、平面方向の寸法はほとんど変化しない。
【００２１】
図１と図２に示すように、ゲル層１２は、そのＸ方向の一端１２ｘａに沿って配置された転写領域Ｔと、Ｙ方向の一端１２ｙａ側に配置された第１分析領域１Ａと、第１分析領域１Ａと隣接した第２分析領域１Ｂと、Ｙ方向の他端ｙｂに配置された第３分析領域１Ｃとを備える。
【００２２】
第１分析領域１Ａは、大面積の主分析領域１Ａｍと、主分析領域１ＡｍのＸ方向の一端１２ｘａ側に配置された小面積のグラジエント領域１Ａｇとを有する。
第２分析領域１Ｂは、大面積の主分析領域１Ｂｍと、主分析領域１ＢｍのＸ方向両端側に配置された小面積の一対のグラジエント領域１Ｂｇ1、１Ｂｇ2とを有する。
第３分析領域１Ｃは、大面積の主分析領域１Ｃｍと、主分析領域１ＣｍのＸ方向の他端１２ｘｂ側に配置された小面積のグラジエント領域１Ｃｇとを有する。
【００２３】
ゲル層１２の転写領域Ｔは、２次元電気泳動における１次元目電気泳動に使用されたゲルＧ１が押し付けられる領域であり、そのＹ方向の長さおよびＸ方向の幅はゲルＧ１の長さおよび幅と同等である。なお、このゲルＧ１は、長さ方向にｐＨ勾配を有しており、実施形態１の場合、ｐＨ３〜１０のｐＨ勾配を有している。
ゲルＧ１が転写領域Ｔに押し付けられることにより、ゲルＧ１中のｐＨ値に応じて分離された評価対象物であるタンパク質がゲル層１２の転写領域Ｔに転写される。そして、ゲルＧ１からゲル層１２の転写領域Ｔに移動したタンパク質は、転写領域Ｔにおいて濃縮される。
【００２４】
第１、第２および第３分析領域１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、１次元目電気泳動用ゲルＧ１のｐＨにそれぞれ対応する領域であり、第１〜第３分析領域１Ａ〜１Ｃにおける電気泳動の移動度は相互に異なっている。換言すると、第１〜第３分析領域１Ａ〜１Ｃにおける電気泳動の移動度を制御する各領域のゲルの網目サイズは相互に異なっている。
【００２５】
詳しく説明すると、１次元目電気泳動において、ゲルＧ１のｐＨ３〜５の領域、ｐＨ５〜７の領域およびｐＨ７〜１０の領域には、小さな分子量（数kDa）、中間の分子量（数十kDa）および大きな分子量（数百kDa）のタンパク質が混在することがある。
【００２６】
一方、２次元目電気泳動において、全体的に移動度が大きいゲルを利用すれば分解能は向上するが、移動度が大きすぎるとある程度の時間で大部分のタンパク質がゲル末端まで泳動してしまうため、タンパク質を検出できない問題がある。これを回避するにはゲルを長くする必要があるが、そうするとゲルが大型化し、材料コストが増加する等の問題が生じる。これらの問題は、特に、分析するターゲットが２種類以上ある場合により顕著となる。例えば、より高精度で分析したい領域が２つある場合であって、「ｐＨ値が小さい領域で小分子量のタンパク質を高精度で検出したい」という要望と、「ｐＨ値が大きい領域で大分子量のタンパク質を高精度で検出したい」という要望の両方を1つの２次元電気泳動用ゲルで満たす場合、移動しにくい大分子量のタンパク質を高精度に検出できるように移動度をある程度大きくした（ゲルの網目サイズを大きくした）ゲルを使用すると、大分子量のタンパク質は高精度に検出できるが、小分子量の大部分のタンパク質は泳動しすぎてゲル末端まで到達して検出できないという問題が発生する。
【００２７】
このような問題を解決するために、実施形態１の電気泳動用試験具１０は、ゲルの網目サイズが異なる複数の分析領域がゲル層１２にＹ方向に並列して設けられている。
【００２８】
ここで本発明の電気泳動用試験具の利点を詳しく説明する。上記で説明したように、本発明の電気泳動用試験具１０はゲルの網目サイズが異なる複数の分析領域を有しており、複数の分析領域は、任意のｐＨ領域・分子量領域に対応させることができると共に、各分析領域でタンパク質を最適な移動度で分離できるゲルの網目サイズを設定ことができる。
ここで特に高い分子量分解能が必要とされる分析領域においては、隣接するスポット同士の距離が広くなり、スポットどうしの分離が容易となるように、ゲルの網目サイズを大きくすることができる。逆に、高い分子量分解能が必要とされない測定領域においては、ゲルの網目サイズを小さくすることにより、電気泳動距離を短くすることができ、ゲルの電気泳動領域の無駄を低減できる。すなわち、特に高い分子量分解能が必要とされる分析領域を長くとり、分子量分解能を必要としない分析領域を短くすることができるため、分子量が大きいものから小さいものまで一回の測定で分析できるだけでなく、特に高い分子量分解能が必要とされる分析領域の分析精度を向上させることができる。ゲルの網目サイズが小さい領域を設定する理由は上述のように小分子量のタンパク質が泳動しすぎてゲル末端まで到達して検出できなくなる問題を回避するためでもある。
上記のような電気泳動用ゲルを作製する目的のひとつとして、ユーザーニーズに合わせて高分解能領域を設定することが可能な点がある。たとえば、特定の病気の診断に電気泳動によるタンパク質分析を用いる場合であって、該病気の診断のために分析が必要なタンパク質の種類があらかじめ知られている場合、該タンパク質のｐＨ・分子量領域で分子量分解能が高くなるようにゲルの網目サイズを設定すれば、高速かつ高精度でタンパク質分析による病気診断が可能となる。
ここでは、第１分析領域１Ａの主分析領域１Ａｍのゲルの網目サイズは、ｐＨ３〜５の領域に集まる種々のサイズのタンパク質のうちから小さな分子量（数kDa）のタンパク質（例えばペプチド）を高精度に検出できる一定サイズに設定される。このときのゲルの網目サイズ（％Ｔ）としては、例えば、15%〜20%程度である。
【００２９】
また、第２分析領域１Ｂの主分析領域１Ｂｍのゲルの網目サイズは、ｐＨ５〜７の領域に集まる種々のサイズのタンパク質のうちから中間の分子量（数十kDa）のタンパク質を高精度に検出できる一定サイズに設定される。このときのゲルの網目サイズ（％Ｔ）としては、例えば、10%〜15%程度である。
また、第３分析領域１Ｃの主分析領域１Ｃｍのゲルの網目サイズは、ｐＨ７〜１０の領域に集まる種々のサイズのタンパク質のうちから大きな分子量（数百kDa）のタンパク質を高精度に検出できる一定サイズに設定されている。このときのゲルの網目サイズ（％Ｔ）としては、例えば、5%〜10%程度である。
なお、図２において、（小）(中)（大）は第１〜第３分析領域１Ａ〜１Ｃの相対的なゲルの網目サイズを表している。
【００３０】
第１分析領域１Ａのグラジエント領域１Ａｇのゲルの網目サイズは、主分析領域１Ａｍが本来対象とするタンパク質のサイズよりも少し大きいサイズのタンパク質を検出できるよう、他端１２ｘｂから一端１２ｘａに向かって主分析領域１Ａｍのゲルの網目サイズより少しずつ大きく変化したサイズに設定されている。
第２分析領域１Ｂのグラジエント領域１Ｂｇ1のゲルの網目サイズは、主分析領域１Ｂｍが本来対象とするタンパク質のサイズよりも少し大きいサイズのタンパク質を検出できるよう、他端１２ｘｂから一端１２ｘａに向かって主分析領域１Ｂｍのゲルの網目サイズより少しずつ大きく変化したサイズに設定されている。
第２分析領域１Ｂのグラジエント領域１Ｂｇ2のゲルの網目サイズは、主分析領域１Ｂｍが本来対象とするタンパク質のサイズよりも少し小さいサイズのタンパク質を検出できるよう、一端１２ｘａから他端１２ｘｂに向かって主分析領域１Ｂｍのゲルの網目サイズより少しずつ小さく変化したサイズに設定されている。
第３分析領域１Ｃのグラジエント領域１Ｃｇのゲルの網目サイズは、主分析領域１Ｃｍが本来対象とするタンパク質のサイズよりも少し小さいサイズのタンパク質を検出できるよう、一端１２ｘａから他端１２ｘｂに向かって主分析領域１Ｃｍのゲルの網目サイズより少しずつ小さく変化したサイズに設定されている。
【００３１】
このように、第１〜第３分析領域１Ａ〜１Ｃがグラジエント領域１Ａｇ、１Ｂｇ1、１Ｂｇ2、１Ｃｇを含むことにより、各主分析領域１Ａｍ〜１Ｃｍが本来対象としないタンパク質の分離概要も同時に把握することができる。タンパク質の分離概要を把握することのメリットとしては、分離概要を見ることによって電気泳動の成否をおおまかに判断できる点などがある。
なお、実施形態１では、各グラジエント領域１Ａｇ、１Ｂｇ1、１Ｂｇ2、１ＣｇのＸ方向の寸法を40ｍｍ程度に短く設定した場合を例示したが、100ｍｍ程度まで延ばしてもよい。
【００３２】
２次元電気泳動における１次元目電気泳動では、評価対象物（タンパク質）を含む試料液を１次元電気泳動用ゲルＧ１中に浸透させた後、ゲルＧ１の長さ方向の両端に一対の電極を当接させて所定電圧を所定時間印加する。これにより、ゲルＧ１中のタンパク質がｐＨ値の違いによって分離される。
次に、１次元目電気泳動を終了したゲルＧ１を、本発明の電気泳動用試験具１０のゲル層１２の転写領域Ｔに押し付けることにより、ｐＨ値の違いによって分離されたタンパク質が転写領域Ｔに転写移動する。このとき、ゲルＧ１の酸性側が転写領域Ｔの一端１２ｙａ側に向け、ゲルＧ１の塩基性側を転写領域Ｔの他端１２ｙｂ側に向けて押し付ける。なお、転写時間としては30〜60分程度であり、印加電圧としては200〜300Ｖ程度である。
【００３３】
転写工程終了後、図１に示すように、試験具１０のゲル層１２のＸ方向両端に一対の電極Ｅを当接させて所定電圧を所定時間印加する。
これにより、ｐＨ３〜５に対応する転写領域Ｔに転写されたタンパク質は、第１分析領域１Ａのグラジエント領域１Ａｇを通過して主分析領域１Ａｍへ移動し、分子量の小さいものほど他端側１２ｘｂの近くまで移動する。なお、グラジエント領域１Ａｇで停滞するタンパク質が存在する場合もある。
また、ｐＨ５〜７に対応する転写領域Ｔに転写されたタンパク質は、第２分析領域１Ｂのグラジエント領域１Ｂｇ1を通過して主分析領域１Ｂｍへ移動し、分子量の小さいものほど他端側１２ｘｂの近くまで移動する。なお、グラジエント領域１Ｂｇ1で停滞するタンパク質およびグラジエント領域１Ｂｇ2まで移動するタンパク質が存在する場合もある。
【００３４】
また、ｐＨ７〜１０に対応する転写領域Ｔに転写されたタンパク質は、第３領域１Ｃの主分析領域１Ｃｍへ移動し、分子量の小さいものほど他端側１２ｘｂの近くまで移動する。なお、グラジエント領域１Ｃｇまで移動するタンパク質が存在する場合もある。
このように、本発明の電気泳動用試験具１０を用いた２次元目電気泳動では、第１〜第３分析領域１Ａ〜１Ｃにおいて、分子量サイズ毎のタンパク質の分子量分画が行われる。
なお、本発明の電気泳動用試験具１０において、グラジエント領域および副分析領域は必須でなく、主分析領域のみでもよい場合は、グラジエント領域および副分析領域を省略することができる。
【００３５】
＜電気泳動用試験具の製造方法＞
次に、図３を参照しながら前記電気泳動用試験具１０の製造方法の一例について説明する。
【００３６】
＜製造方法１＞
この電気泳動用試験具１０の製造方法では、まず、図３（Ａ）に示すように、モノマーを含有するゲル材料溶液１２ｘを均一な塗布量で基材１１上に塗布するゲル材料塗布工程が行われる。このとき、ゲル材料溶液１２ｘの塗布方法は特に限定されるものではなく、例えば、スリットコーター、ディスペンサー、インクジェット等が挙げられるが、効率よく塗布できる観点からスリットコーターもしくはディスペンサーが好ましい。
【００３７】
ゲル材料溶液１２ｘには、所定濃度でモノマーが含まれる以外に、架橋剤、ｐＨ調整材料、重合促進剤、ゲル化剤および純水がそれぞれ所定濃度で含まれる。なお、実施形態１の場合、ゲル化剤として光重合開始剤が用いられる。
また、実施形態１の場合、基材１１の周囲に枠体Ｆを設置し、ゲル材料溶液１２ｘが基材１１上から零れないようにしているが、ゲル材料溶液１２ｘを基材１１上から零れないように塗布できるのであれば枠体Ｆはなくてもよい。
このゲル材料塗布工程により、均一なモノマー濃度のゲル材料溶液１２ｘの塗布膜が均一な厚さで基材１１上に形成される。
【００３８】
次に、図３（Ｂ）に示すように、基材１１上のゲル材料溶液１２ｘの塗布膜の一部のみに、モノマー含有溶液１２ｙを塗布するモノマー濃度調整工程が行われる。このモノマー含有溶液１２ｙは、モノマーが含まれ、かつ架橋剤が含まれていなければよい。
実施形態１の場合、図２で説明した第１分析領域１Ａを形成する第１形成領域Ａｘと第２分析領域１Ｂを形成する第２形成領域Ｂｘに、インクジェットヘッドＪにてモノマー含有溶液１２ｙを所定の塗布量で塗布している。このとき、第１形成領域Ａｘへのモノマー含有溶液１２ｙの塗布量は第２形成領域Ｂｘよりも多くする。
これにより、基材１１上の塗布膜において、第３領域１Ｃを形成する第３形成領域Ｃｘのモノマー濃度が最も低く、第１形成領域Ａｘのモノマー濃度が最も高くなる。
なお、インクジェットの変わりに、ディスペンサーを用いてもよい。
【００３９】
次に、図３（Ｃ）に示すように、基材１１上の塗布膜１２ｚに光Ｌを照射してゲル化するゲル化工程が行われる。光照射によるゲル化は、ゲル化工程を短時間で完了することができる。
これにより、塗布膜１２ｚにおけるモノマー濃度が最も高い第１形成領域Ａｘは最も小さいゲルの網目サイズを有する第１分析領域１Ａとなり、モノマー濃度が最も低い第３形成領域Ｃｘは最も大きいゲルポアサイズを有する第３分析領域１Ｃとなり、モノマー濃度が中間の第２形成領域Ｂｘは中間のゲルの網目サイズを有する第２分析領域１Ｂとなる（図２参照）。
なお、グラジエント領域は従来公知の方法で製造できる。
【００４０】
＜製造方法２＞
図３（Ｂ）で説明したモノマー濃度調整工程は、次の架橋剤濃度調整工程に変更してもよい。
この架橋剤濃度調整工程は、モノマー濃度調整工程で用いたモノマー含有溶液１２ｘの代わりに架橋剤含有溶液を用いること以外は、モノマー濃度調整工程と同様である。なお、架橋剤含有溶液は、架橋剤が含まれ、かつモノマーが含まれていなければよい。
このようにしても、図２で説明したゲル層１２を得ることができる。
【００４１】
＜製造方法３＞
製造方法１におけるモノマー濃度調整工程および製造方法２における架橋剤濃度調整工程は、次のモノマー・架橋剤濃度調整工程に変更してもよい。
このモノマー・架橋剤濃度調整工程は、モノマーと架橋剤を少なくとも含むモノマー・架橋剤含有溶液、もしくはゲル材料溶液１２ｘを用いること以外は、モノマー濃度調整工程および架橋剤濃度調整工程と同様である。
このようにしても、図２で説明したゲル層１２を得ることができる。
【００４２】
＜製造方法４＞
製造方法１〜３では、第１および第２形成領域Ａｘ、Ｂｘにおけるモノマー濃度または／および架橋剤濃度を、第３形成領域Ｃｘにおけるモノマー濃度または／および架橋剤濃度よりも高くしているが、モノマーおよび架橋剤のような網目構造に寄与する材料ではなく、網目構造に寄与しない材料を用いて図３（Ｂ）で示した濃度調整工程を行ってもよい。網目構造に寄与しない材料として、例えば、グリセロールと水の混合溶液を用いることができる。
【００４３】
この製造方法４では、図３（Ａ）で示したゲル材料塗布工程の後、第３および第２形成領域Ｃｘ、Ｂｘにおけるモノマー濃度または／および架橋剤濃度が、第１形成領域Ａｘにおけるモノマー濃度または／および架橋剤濃度よりも相対的に低くなるように、第３および第２形成領域Ｃｘ、Ｂｘに前記混合溶液を塗布する。このとき、第３形成領域Ｃｘの塗布量を第２形成領域Ｂｘの塗布量よりも多くする。
このようにしても、図２で説明したゲル層１２を得ることができる。
【００４４】
＜製造方法５＞
製造方法５では、製造方法１〜４で説明したモノマー含有溶液または／および架橋剤含有溶液と、グリセロールと水の混合溶液とを用いて、図３（Ｂ）で示した濃度調整工程を行う。
この場合、図４に示すように、第１インクジェットヘッドＪ１を用いて第１形成領域Ａｘにモノマー含有溶液または／および架橋剤含有溶液を塗布し、第２インクジェットヘッドＪ２を用いて第３形成領域Ｃｘにグリセロールと水の混合溶液を塗布する。
【００４５】
このようにすれば、モノマー濃度または／および架橋剤濃度は、第２形成領域Ｂｘよりも第１形成領域Ａｘが相対的に高くなり、かつ第２形成領域Ｂｘよりも第３形成領域Ｃｘが相対的に低くなる。
このようにしても、図２で説明したゲル層１２を得ることができる。
なお、第１および第２インクジェットヘッドＪ１、Ｊ２を一体化し、１個のインクジェットヘッドからモノマー含有溶液または／および架橋剤含有溶液と、グリセロールと水の混合溶液とを吐出するようにしてもよい。
【００４６】
（実施形態２）
図５は実施形態２の電気泳動用試験具の各分析領域を説明する図である。
図５に示すように、実施形態２の電気泳動用試験具１１０は、図２で示した実施形態１の電気泳動用試験具１０のゲル層１２における領域構成が異なる以外は、実施形態１と同様に製造することができる。
【００４７】
実施形態２において、ゲル層１１２は、１次元目電気泳動用ゲルＧ２のｐＨ３〜６に対応する第１分析領域２Ａと、ｐＨ６〜８に対応する第２分析領域２Ｂと、ｐＨ８〜１０に対応する第３分析領域２Ｃと、第１〜第３分析領域２Ａ〜２ＣのＸ方向一端１１２ｘａ側に配置された転写領域Ｔとを備える。
第１分析領域２Ａは、転写領域Ｔ側に配置された小面積の副分析領域２Ａｍ1と、副分析領域２Ａｍ1と隣接する大面積の主分析領域２Ａｍ2とを有している。
第２分析領域２Ｂは、大面積の主分析領域２Ｂｍ2と、主分析領域２Ｂｍ2のＸ方向両端１１２ｘａ、１１２ｘｂ側に配置された小面積の一対の副分析領域２Ｂｍ1、２Ｂｍ3とを有している。
第３分析領域２Ｃは、転写領域Ｔ側に配置された大面積の主分析領域２Ｃｍ1と、主分析領域２Ｃｍ1と隣接する小面積の副分析領域２Ｃｍ2とを有している。
【００４８】
ここで、図５において、（小）(中)（大）は、実施形態１と同様に、第１〜第３分析領域２Ａ〜２Ｃの相対的なゲルの網目サイズを表している。
すなわち、（小）と示された第１分析領域２Ａの主分析領域２Ａｍ2、第２領域２Ｂの副分析領域２Ｂｍ3および第３領域２Ｃの副分析領域２Ｃｍ2のゲルの網目サイズは小さな分子量（数kDa）のタンパク質を高精度に検出できる一定サイズに設定されている。
また、（中）と示された第２領域２Ｂの主分析領域２Ｂｍ2のゲルの網目サイズは中間の分子量（数十kDa）のタンパク質を高精度に検出できる一定サイズに設定されている。
また、（大）と示された第１領域２Ａの副分析領域２Ａｍ1、第２領域２Ｂの副分析領域２Ｂｍ1および第３領域２Ｃの主分析領域２Ｃｍ1のゲルの網目サイズは大きな分子量（数百kDa）のタンパク質を高精度に検出できる一定サイズに設定されている。
【００４９】
第１分析領域２Ａに副分析領域２Ａｍ1と主分析領域２Ａｍ2を設けることにより、ｐＨ３〜６の領域に集まる種々のサイズのタンパク質のうちから大きな分子量（数百kDa）のタンパク質と小さな分子量（数kDa）のタンパク質を、１回の２次元目電気泳動にて同時に分析することが可能になる。
また、第２分析領域２Ｂに副分析領域２Ｂｍ1と主分析領域２Ｂｍ2と副分析領域２Ｂｍ3を設けることにより、ｐＨ６〜８の領域に集まる種々のサイズのタンパク質のうちから大きな分子量（数百kDa）のタンパク質と中間の分子量（数十kDa）のタンパク質と小さな分子量（数kDa）のタンパク質を、１回の２次元目電気泳動にて同時に分析することが可能になる。
また、第３分析領域２Ｃに主分析領域２Ｃｍ1と副分析領域２Ｃｍ2を設けることにより、ｐＨ８〜１０の領域に集まる種々のサイズのタンパク質のうちから大きな分子量（数百kDa）のタンパク質と小さな分子量（数kDa）のタンパク質を、１回の２次元目電気泳動にて同時に分析することが可能になる。
なお、各分析領域はニーズに応じて自由に設定可能であり、上記においてはｐＨ８〜１０のたんぱく質を分析する例を示したが、必要に応じてｐＨ７〜１０の範囲にするなど、適宜設定すればよい。
【００５０】
（実施形態３）
図６は実施形態３の電気泳動用試験具の各分析領域を説明する図である。
図６に示すように、実施形態３の電気泳動用試験具２１０も、図２で示した実施形態１の電気泳動用試験具１０のゲル層１２における領域構成が異なる以外は、実施形態１と同様に製造することができる。
【００５１】
実施形態３において、ゲル層２１２は、１次元目電気泳動用ゲルＧ３のｐＨ３〜１０におけるΔｐＨ＝１毎の領域に対応する第１分析領域３Ａ、第２分析領域３Ｂ、第３分析領域３Ｃ、第４分析領域３Ｄ、第５分析領域３Ｅ、第６分析領域３Ｆ、第７分析領域３Ｇを有すると共に、第１〜第７分析領域３Ａ〜３ＧのＸ方向一端２１２ｘａ側に配置された転写領域Ｔを有している。
【００５２】
第１分析領域３Ａは、大面積の主分析領域３Ａｍからなる。
第２分析領域３Ｂは、大面積の主分析領域３Ｂｍと、主分析領域３ＢｍのＸ方向一端２１２ｘａ側に配置された小面積のグラジエント領域３Ｂｇとを有する。
第３分析領域３Ｃは、大面積の主分析領域３Ｃｍからなる。
第４分析領域３Ｄは、大面積の主分析領域３Ｄｍと、主分析領域３ＤｍのＸ方向一端２１２ｘａ側に配置された小面積のグラジエント領域３Ｄｇとを有する。
第５分析領域３Ｅは、大面積の主分析領域３Ｅｍからなる。
第６分析領域３Ｆは、大面積の主分析領域３Ｆｍと、主分析領域３ＤｍのＸ方向他端２１２ｘｂ側に配置された小面積のグラジエント領域３Ｆｇとを有する。
第７分析領域３Ｇは、大面積の主分析領域３Ｇｍからなる。
【００５３】
ここで、図６において、（小）(中)（大）は、実施形態１と同様に、第１〜第７分析領域３Ａ〜３Ｇの相対的なゲルの網目サイズを表している。
すなわち、（小）と示された第２分析領域３Ｂの主分析領域３Ｂｍのゲルの網目サイズは小さな分子量（数kDa）のタンパク質を高精度に検出できる一定サイズに設定されている。
また、（中）と示された第１、第３、第４、第５および第７分析領域３Ａ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｇの各主分析領域３Ａｍ、３Ｃｍ、３Ｄｍ、３Ｅｍ、３Ｇｍのゲルの網目サイズは中間の分子量（数十kDa）のタンパク質を高精度に検出できる一定サイズに設定されている。
また、（大）と示された第６分析領域３Ｆの主分析領域３Ｆｍのゲルの網目サイズは大きな分子量（数百kDa）のタンパク質を高精度に検出できる一定サイズに設定されている。
【００５４】
第２分析領域３Ｂのグラジエント領域３Ｂｇのゲルの網目サイズは、主分析領域３Ｂｍが本来対象とするタンパク質のサイズよりも少し大きいサイズのタンパク質を検出できるよう、他端２１２ｘｂから一端２１２ｘａに向かって主分析領域３Ｂｍのゲルの網目サイズより少しずつ大きく変化したサイズに設定されている。
第４分析領域３Ｄのグラジエント領域３Ｄｇのゲルの網目サイズは、主分析領域３Ｄｍが本来対象とするタンパク質のサイズよりも少し大きいサイズのタンパク質を検出できるよう、他端２１２ｘｂから一端２１２ｘａに向かって主分析領域３Ｄｍのゲルの網目サイズより少しずつ大きく変化したサイズに設定されている。
第６分析領域３Ｆのグラジエント領域３Ｆｇのゲルの網目サイズは、主分析領域３Ｆｍが本来対象とするタンパク質のサイズよりも少し小さいサイズのタンパク質を検出できるよう、一端２１２ｘａから他端２１２ｘｂに向かって主分析領域３Ｆｍのゲルの網目サイズより少しずつ小さく変化したサイズに設定されている。
【００５５】
このように、ΔｐＨ＝１毎の領域に対応する領域をゲル層２１２に設けること、および、一部のｐＨ領域のみゲルの網目サイズを異ならせることにより、大半のｐＨ領域について所定サイズのタンパク質を分離すると共に、一部のｐＨ領域について異なるサイズのタンパク質の詳細分離を実現することができる。
それに加え、グラジエント領域３Ｂｇ、３Ｄｇ、３Ｆｇにより、各主分析領域３Ｂｍ、３Ｄｍ、３Ｆｍが本来対象としないタンパク質の分離概要も同時に把握することができる。
なお、各分析領域はニーズに応じて自由に設定可能であり、必要に応じて所望のｐＨ範囲に適宜設定すればよい。
【００５６】
（他の実施形態）
１．図２で説明した実施形態１において、主分析領域とグラジエント領域との間に、主分析領域の移動度（ゲルの網目サイズ）とは異なる移動度を有する副分析領域を設けてもよい。
２．図５で説明した実施形態２において、主分析領域および／または副分析領域に隣接してグラジエント領域を設けてもよい。
３．図６で説明した実施形態３において、グラジエント領域を副分析領域に置き換えてもよく、あるいは、副分析領域を追加してもよい。
【００５７】
（まとめ）
本発明の電気泳動用試験具は、基材上に形成されたゲル層を有する分子量分析用の電気泳動用試験具であって、
前記ゲル層は、電気泳動の方向と直交する方向に、複数の分析領域を有しており、
複数の前記分析領域におけるゲルの網目サイズが相互に異なっている。
【００５８】
本発明の電気泳動用試験具は、次のように構成されてもよい。
（１）各分析領域は、ゲルの網目サイズが一定である主分析領域をそれぞれ有している。
この構成は、ゲル層形成時において、基材上に一定濃度のゲル材料溶液を塗布した後、基材上の塗布膜の特定領域のみにさらに塗布工程を行って濃度を高くすることにより、相互に異なるゲルの網目サイズを有する複数種類の分析領域を形成するという簡易的な製造方法の採用を可能とする。
また、この構成は、ｐＨに対応して集まった複数種類の評価対象物のうち、分析したい分子量サイズの評価対象物に適したゲルの網目サイズで各分析領域が形成される。よって、ｐＨに対応して分析したい評価対象物を絞って詳細に分析することができる。
【００５９】
（２）各分析領域は、前記電気泳動の方向にゲルの網目サイズが相互に異なった主分析領域と副分析領域を有していてもよい。
このようにすれば、ｐＨに対応して、分子量サイズが異なる評価対象物を１回の２次元目電気泳動にて同時に分析することができる。
【００６０】
（３）各分析領域は、電気泳動の方向にゲルの網目サイズが徐々に変化したグラジエント領域を有していてもよい。
このようにすれば、ターゲットとする評価対象物の分析と同時に、対象外の物質の分離概要も同時に把握することができる。
【００６１】
本発明の電気泳動用試験具の製造方法は、基材上に形成されたゲル層を有する電気泳動用試験具の製造方法であって、
モノマーを含有するゲル材料溶液を均一な塗布量で前記基材上に塗布するゲル材料塗布工程と、
前記基材上の前記ゲル材料溶液の塗布膜の一部にモノマー含有溶液と架橋剤含有溶液の少なくとも一方を塗布し、電気泳動の方向と直交する方向における、モノマーと架橋剤の少なくとも一方の濃度を調整する濃度調整工程と、
前記基材上の塗布膜をゲル化するゲル化工程とを含む。
【００６２】
この電気泳動用試験具の製造方法によれば、ゲル層形成時において、基材上に一定濃度のゲル材料溶液を塗布した後、基材上の塗布膜の特定領域のみにさらにモノマー含有溶液および／または架橋剤含有溶液を塗布してその塗布領域の濃度を高くし、それによって特定領域のゲルの網目サイズを小さく調整することができる。
あるいは、基材上の塗布膜の特定領域のみに、例えば、グリセロールと水の混合溶液を塗布してその塗布領域の濃度を低くし、それによって特定領域のゲルの網目サイズを大きく調整してもよい。
あるいは、特定部位のゲルの網目サイズを小さく調整し、かつ別の特定部位のゲルの網目サイズを大きく調整するようにしてもよい。
【００６３】
本発明の電気泳動用試験具の製造方法は、次のように構成されてもよい。
（I）前記ゲル材料塗布工程が、ディスペンサーまたはスリットコーターを用いて行われてもよい。
このようにすれば、広い面積の基板上に短時間でゲル材料溶液を均一な塗布量で塗布することができる。
【００６４】
（II）前記モノマー濃度調整工程または前記架橋剤濃度調整工程が、インクジェットまたはディスペンサーを用いて行われてもよい。
このようにすれば、基材上の塗布膜の所定領域のみに所定塗布量で正確にモノマー含有溶液または架橋剤含有溶液を塗布することができる。よって、電気泳動の方向と直交する方向（１次元目電気泳動用ゲルのｐＨ勾配の方向）および電気泳動の方向にゲルの網目サイズが異なる複数の分析領域を高精度に形成することができる。このとき、インクジェットは溶液塗布の位置制御および塗布量制御を高精度に行うことができるため特に好ましい。
【００６５】
（III）前記ゲル材料溶液が光重合開始剤を含み、前記ゲル化工程が基材上の塗布膜に光を照射することにより行われてもよい。
このようにすれば、ゲル化工程を短時間で完了することができる。なお、重合系は光重系と熱重合系のどちらでも構わないが、形成されたゲル層内部の構造分布を抑制することを考慮すると、複数段の溶液塗布の後に一括してゲル化させる光重合系の方が好ましい。
【００６６】
なお、開示された実施の形態は、全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上述の説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【００６７】
１Ａ〜１Ｃ、２Ａ〜２Ｃ  第１〜第３分析領域
１Ａｇ、１Ｂｇ1、１Ｂｇ2、１Ｃｇ、３Ｂｇ、３Ｄｇ、３Ｆｇ  グラジエント領域
１Ａｍ〜１Ｃｍ、３Ａｍ〜３Ｇｍ  主分析領域
１Ｇ、２Ｇ、３Ｇ  １次元目電気泳動用ゲル
２Ａｍ1、２Ｂｍ1、２Ｂｍ3、２Ｃｍ2  副分析領域
２Ａｍ2、２Ｂｍ2、２Ｃｍ1  主分析領域
３Ａ〜３Ｇ  第１〜第７分析領域
１０、１１０、２１０  電気泳動用試験具
１１  基材
１２、１１２、２１２  ゲル層
１２ｘ  ゲル材料溶液
１２ｙ  モノマー含有溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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