(57)【要約】      （修正有）【課題】単一細胞における複数のタンパク質の活性化状態の同時定量方法を提供する。【解決手段】a）第一および第二の活性化可能なタンパク質を含む細胞集団を提供する工程、b）i）該第一の活性化可能なタンパク質の第一のアイソフォームと結合する第一の活性化状態特異的結合エレメント、および、ii）該第二の活性化可能なタンパク質の第一のアイソフォームと結合する第二の活性化状態特異的結合エレメントを含む複数の活性化状態特異的結合エレメントと該細胞集団を接触させる工程、ならびに、c）フローサイトメトリーを使用して、該第一および第二の結合エレメントの結合の有無を検出し、該第一および第二の活性化可能なタンパク質の活性化状態を決定する工程を含む、単一細胞内の少なくとも該第一と第二の活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出する。【選択図】図１Ａ
2014055964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）第一および第二の活性化可能なタンパク質を含む細胞集団を提供する工程；
b）i）該第一の活性化可能なタンパク質の第一のアイソフォームと結合する第一の活性化状態特異的結合エレメント、および、
ii）該第二の活性化可能なタンパク質の第一のアイソフォームと結合する第二の活性化状態特異的結合エレメント
を含む複数の活性化状態特異的結合エレメントと該細胞集団を接触させる工程；ならびに
c）フローサイトメトリーを使用して、該第一および第二の結合エレメントの結合の有無を検出し、該第一および第二の活性化可能なタンパク質の活性化状態を決定する工程
を含む、単一細胞内の少なくとも該第一と該第二の活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出する方法。
【請求項２】
第一の結合エレメントが第一の標識で標識されており、第二の結合エレメントが第二の標識で標識されており、かつ該第一および第二の標識が異なっている、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞集団が初代細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第一および第二の活性化可能なタンパク質の活性化状態情報を使用して、少なくとも1つの細胞の細胞状態を決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞の状態が薬物感受性である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
結合エレメントと接触させる前に、前記集団を候補薬剤と接触させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
候補薬剤が増強剤である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
増強剤がサイトカインである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
増強剤が成長因子である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
活性化状態がリン酸化状態である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも1つの活性化可能なタンパク質がキナーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1つの活性化可能なタンパク質がカスパーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
a）少なくとも第一の活性化可能なタンパク質を含む細胞集団を提供する工程；
b）該細胞集団を、該細胞集団内の該第一の活性化可能なタンパク質によって修飾される少なくとも1つの第一の基質を含む複数の基質と接触させる工程；および
c）フローサイトメトリーを使用して、該活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出する工程
を含む、単一細胞内の少なくとも第一の活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般にフローサイトメトリーを使用するタンパク質検出の分野に関する。より具体的には、本発明は、多染フローサイトメトリーを使用してシグナル伝達事象および細胞活性化プロフィールを同定することに関する。本発明は、さらに、活性化状態に影響を与え、したがって、シグナル伝達事象および活性化プロフィールをさらに特徴づけることができる増強剤の使用に関する。
【０００２】
本出願は、2004年7月21日に出願した米国特許出願第10/838,734号に対する優先権を主張し、これは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
タンパク質は、細胞の主成分であり、タンパク質の空間時間的発現パターンおよび細胞内局在化は、細胞の形状、構造、および機能を決定する。多くのタンパク質は動的に制御され、その結果、これらの活性は、一定の内因性または外因性の合図に応答して変化し、本明細書において「活性化事象」と呼ばれることが多い。このような制御は、一般に、通常シグナル伝達カスケードと記述されるタンパク質-タンパク相互作用ネットワークの状況で生じる。このようなカスケードの個々メンバーが、活性または非活性状態で存在することが多く、カスケードを介したシグナルの伝搬または阻害を引き起こすのは、これらの状態間の変換による。細胞の発生および機能におけるこれらの複合的役割を考えると、このようなカスケードの調節不全は、多くの疾患、特に癌などの不適当細胞増殖を含む疾患を引き起こし得る。
【０００４】
シグナル伝達カスケードを調査している研究者は、細胞集団の可溶化液に依存する方法、たとえばウエスタンブロット法を伝統的に使用してきた。このような方法は、多くの固有の限界を有し、重要な情報を不明瞭にし得る。たとえば、可溶化液を作製するために細胞集団を使用すると、まれな重要な活性化事象がもはや明らかでないほどに細胞事象を希釈してしまう可能性が高くなる。加えて、可溶化液の使用では、溶解により本質的にカスケード環境が変化してしまうため、シグナルカスケードにおける天然の細胞の活性化プロフィールに近似することができるだけである。このような限界を考えると、疾患における活性化事象の役割をより理解するためには、天然の環境におけるシグナル伝達カスケードの個々のメンバーに注目することができる新たな方法が必要である。
【０００５】
したがって、本発明は、単一細胞における複数のタンパク質の活性化状態の同時決定のためのアプローチを提供する。本アプローチにより、活性化状態を基準にして複雑な細胞集団における不均一性の迅速な検出が可能になり、細胞集団内の活性化状態に相関された変化を示す細胞サブセットの同定が可能になる。そのうえ、本アプローチにより、シグナル伝達活性化状態に基づいて疾病状態を分類する能力を含む細胞の活性または特性を相関することができる。加えて、細胞活性化の増強剤の使用により、このような経路および細胞集団をさらに特徴づけることができる。
【発明の概要】
【０００６】
好ましい態様において、本発明は、細胞集団のそれぞれの細胞において、少なくとも2つの活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出する方法を提供する。本方法の第一の工程は、2つの活性化可能なタンパク質を有する細胞集団を提供することである。その工程は、細胞集団を複数の活性化状態特異的結合エレメントと接触させる工程を伴う。これらの活性化状態特異的結合エレメントは、少なくとも、第一の活性化可能なタンパク質の第一のアイソフォームと結合する第一の活性化状態特異的結合エレメント；および第二の活性化可能なタンパク質の第一のアイソフォームと結合する第二の活性化状態特異的結合エレメントを有する。次いで、フローサイトメトリーを使用して2つのタンパク質の活性化状態を決定するために、エレメントの結合の有無が検出される。
【０００７】
さらなる態様において、2つの結合エレメントは、異なる標識で標識されている。さらなる態様において、試験される細胞は、初代細胞である。
【０００８】
さらなる態様において、第一および第二の活性化可能なタンパク質の活性化状態情報を使用して、少なくとも1つの細胞の細胞状態を決定する。
【０００９】
さらなる態様において、決定される細胞の状態は、薬物感受性である。
【００１０】
さらなる態様において、細胞集団は、結合エレメントと接触する前に、候補薬剤と接触される。
【００１１】
さらなる態様において、候補薬剤は、増強剤である。
【００１２】
さらなる態様において、増強剤は、サイトカインである。
【００１３】
さらなる態様において、増強剤は、成長因子である。
【００１４】
さらなる態様において、活性化可能なタンパク質のうちの少なくとも1つの活性化状態は、リン酸化状態である。
【００１５】
さらなる態様において、少なくとも1つの活性化可能なタンパク質は、キナーゼである。
【００１６】
さらなる態様において、少なくとも1つの活性化可能なタンパク質は、カスパーゼである。
【００１７】
代わりの態様において、本発明は、細胞集団のそれぞれの細胞における少なくとも1つの活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出する方法を提供する。本方法の第一の工程は、第一の活性化可能なタンパク質を含む細胞集団を提供する工程である。次の工程は、細胞集団を、活性化可能なタンパク質によって修飾される少なくとも1つの基質を含む複数の基質と接触させる工程を含む。次いで、フローサイトメトリーを使用して、修飾された基質の量を測定することによって活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出することができる。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞における複数の活性化可能なタンパク質の活性化状態を同時に検出するための方法および組成物を提供する。本発明は、単一細胞における複数の活性化可能なタンパク質の活性または活性化状態を協調的に調整することができる生理活性薬をスクリーニングする方法および組成物をさらに提供する。本方法および組成物は、疾病状態を予測し、または診断するために、および疾病状態の治療をモニターするために、細胞のタンパク質活性化プロフィールを決定するために使用することができる。さらに、本発明の方法および組成物は、任意に単一細胞における複数の活性化可能なタンパク質の活性化状態を連続して検出するために使用することができる。加えて、本発明の方法および組成物は、任意に単一タンパク質の活性化状態を検出し、または単一タンパク質の活性もしくは活性化状態を調整するために使用することができる。
【００１９】
本発明は、本発明の方法に有用な細胞集団、単一細胞、細胞可溶化物、タンパク質、および細胞集団、単一細胞、細胞可溶化物、タンパク質を含む試料を提供する。特に、本発明は、活性化可能なタンパク質の特定のアイソフォームと結合する活性化可能なタンパク質および活性化状態特異的抗体を提供する。一つの局面において、活性化状態-特異的抗体は、標識、好ましくは蛍光標識、およびより好ましくは、FRET標識に抱合される。
【００２０】
一つの局面において、本発明は、以下の工程：a）第一および第二の活性化可能なタンパク質を含む細胞集団を提供する工程；b）細胞集団を、以下を含む複数の活性化状態特異的抗体と接触させる工程：i）細胞集団における第一の活性化可能なタンパク質の対応するアイソフォームと結合できる少なくとも1つの第一の活性化状態特異的抗体；およびii）細胞集団における第二の活性化可能なタンパク質の対応するアイソフォームと結合できる少なくとも1つの第二の活性化状態特異的抗体；並びにc）フローサイトメトリーを使用して、細胞集団の単一細胞における第一および第二の活性化状態特異的抗体の結合を検出する工程を含む、単一細胞内の少なくとも第一および第二の活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出する方法であって、第一の活性化状態特異的抗体の結合は、第一の活性化可能なタンパク質の特異的活性化状態を指し示し、第二の活性化状態特異的抗体の結合は、第二の活性化可能なタンパク質の特異的活性化状態を指し示す方法を提供する。
【００２１】
さらなる局面において、第一の活性化可能なタンパク質は、キナーゼである。また、さらなる局面において、第一の活性化可能なタンパク質は、カスパーゼである。
【００２２】
さらなる局面において、第一の活性化可能なタンパク質は、第一のキナーゼであり、第二の活性化可能なタンパク質は、第二のキナーゼである。また、さらなる局面において、第一のキナーゼのアイソフォームは、第一のリン酸化されたキナーゼであり、第二のキナーゼのアイソフォームは、第二のリン酸化されたキナーゼである。もう一つの局面において、第一の活性化部位特異的抗体は、第一のリン酸化されたキナーゼに結合し、第二の活性化部位特異的抗体は、第二のリン酸化されたキナーゼに結合する。
【００２３】
さらなる局面において、第一の活性化可能なタンパク質は、第一のカスパーゼであり、第二の活性化可能なタンパク質は、第二のカスパーゼである。また、さらなる局面において、第一のカスパーゼのアイソフォームは、第一のプロカスパーゼの切断産物であり、第二のカスパーゼのアイソフォームは、第二のプロカスパーゼの切断産物である。もう一つの局面において、複数の活性化部位特異的抗体は、第一のカスパーゼのアイソフォームと結合する第一の活性化部位特異的抗体と、第二のカスパーゼのアイソフォームと結合する第二の活性化部位特異的抗体とを含む。
【００２４】
もう一つの局面において、本発明は、以下の工程：a）少なくとも第一の活性化可能なタンパク質を含む細胞集団を提供する工程；b）細胞集団を、細胞集団内の第一の活性化可能なタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる少なくとも第一の基質を含む複数の基質と接触させる工程；およびc）フローサイトメトリーを使用して、細胞集団の単一細胞における第一の基質の修飾を検出する工程を含む、単一細胞の少なくとも第一の活性化可能なタンパク質の活性化状態を検出する方法であって、修飾は、第一の活性化可能なタンパク質の特異的活性化状態を指し示す方法を提供する。
【００２５】
さらなる局面において、細胞集団は、第二の活性化可能なタンパク質をさらに含み；複数の基質は、細胞集団における第二の活性化可能なタンパク質の対応するアイソフォームによって修飾することができる第二の基質をさらに含み；およびc）は、フローサイトメトリーを使用して細胞集団の単一細胞における第二の基質の修飾を検出する工程をさらに含み、第二の基質の修飾は、第二の活性化可能なタンパク質の特異的活性化状態を指し示す。
【００２６】
もう一つの局面において、本発明は、以下の工程：a）少なくとも第一の活性化可能なタンパク質を含む細胞集団を提供する工程；b）細胞集団を、細胞集団内の第一の活性化可能なタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる少なくとも1つの第一の基質を含む複数の基質と接触させる工程；c）細胞集団を、細胞集団の第一の活性化可能なタンパク質の対応するアイソフォームに結合することができる少なくとも1つの第一の活性化状態特異的抗体を含む複数の活性化状態特異的抗体と接触させる工程；並びにd）フローサイトメトリーを使用して：i）第一の活性化可能なタンパク質の特異的活性化状態を指し示す、細胞集団の単一細胞における第一の活性化状態特異的抗体の結合；およびii）第一の活性化可能なタンパク質の特異的活性化状態を指し示す、単一細胞における第一の基質の修飾を検出する工程を含む、細胞における少なくとも第一の活性化可能なタンパク質の活性化状態に基づいて、単一細胞のタンパク質活性化状態プロフィールを検出する方法を提供する。
【００２７】
さらなる局面において、細胞集団は、第二の活性化可能なタンパク質をさらに含み；複数の基質は、細胞集団における第二の活性化可能なタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質をさらに含み；およびd）フローサイトメトリーを使用して、修飾が第二の活性化可能なタンパク質の特異的活性化状態を指し示す単一細胞における第二の基質の修飾を検出する工程をさらに含む。
【００２８】
さらなる局面において、複数の活性化状態-特異的抗体は、細胞集団における第二の活性化可能なタンパク質の対応するアイソフォームに結合することができる第二の活性化状態特異的抗体をさらに含み、および工程c）は、フローサイトメトリーを使用して、第二の活性化可能なタンパク質の特異的活性化状態を指し示す、細胞集団における単一細胞への第二の活性化状態特異的抗体の結合を検出するさらに含む。
【００２９】
もう一つの局面において、本発明は、以下の工程：a）細胞のそれぞれが、少なくとも第一の活性化可能なタンパク質と第二の活性化可能なタンパク質と第三の活性化可能なタンパク質であって、第一の活性化可能なタンパク質が第二の活性化可能なタンパク質を活性化することができ、これにより第二の活性化可能なタンパク質の特異的アイソフォーム（アイソフォーム-2）を形成し、かつ第二の活性化可能なタンパク質が第三の活性化可能なタンパク質を活性化することができ、これにより第三の活性化可能なタンパク質の特異的アイソフォーム（アイソフォーム-3）を形成するものを含む細胞集団を提供する工程；b）細胞を、第二の活性化状態特異的抗体と第三の活性化状態特異的抗体と候補生物活性剤とであって、第二の活性化状態特異的抗体がアイソフォーム-2に結合することができ、かつ第三の活性化状態特異的抗体がアイソフォーム-3に結合することができるものと接触させる工程；c）蛍光標示式細胞選別器（FACS）を使用して、アイソフォーム-2およびアイソフォーム-3の存在に基づいて細胞集団の単一細胞を選別する工程、並びにd）候補生物活性剤の有無において、単一細胞におけるアイソフォーム-2対アイソフォーム-3の比率を決定する工程を含む、細胞における少なくとも第一の活性化可能なタンパク質の活性を調整することができる生物活性剤をスクリーニングする方法であって、候補生物活性剤の有無におけるアイソフォーム-2対アイソフォーム-3の比率の相違は、候補生物活性剤が第一の活性化可能なタンパク質を修飾する能力を指し示す方法を提供する。
【００３０】
さらなる局面において、第一の活性化可能なタンパク質は、活性化剤によって活性化される。
【００３１】
さらなる局面において、第一の活性化可能なタンパク質は、カスパーゼである。もう一つの局面において、第一の活性化可能なタンパク質は、キナーゼであり；さらなる局面において、キナーゼは、PI3Kであり；かつさらなる局面において、PI3Kは、成長因子によって、または細胞表面受容体の活性化によって活性化される。
【００３２】
さらなる局面において、キナーゼは、PI3Kであり；第二の活性化可能なタンパク質は、PIP2であり；第三の活性化可能なタンパク質は、PIP3であり；アイソフォーム-2は、PIP 4,5二ホスホエステルであり；かつアイソフォーム-3は、PIP 3,4,5である。
【００３３】
さらなる局面において、第一の活性化可能なタンパク質は、ICAM-2であり；活性は、アポトーシスであり；第二の活性化可能なタンパク質は、PIP2であり；第三の活性化可能なタンパク質は、PIP3であり；アイソフォーム-2は、PIP 4,5二ホスホエステルであり；かつアイソフォーム-3は、PIP 3,4,5である。さらなる局面において、工程a）は、ICAM-2、ICAM-3、またはICAM-1をクラスタリングする工程をさらに含む。
【００３４】
さらなる局面において、複数の活性化状態特異的抗体は、抗AKT-ホスホ-Ser473、抗AKTホスホ-Thr308、抗p44/42 MAPKホスホ-Thr202/Tyr204、抗TYK2 ホスホ-Tyr1054/1055、抗p38 MAPKホスホ-Thr180/Tyr182、抗JNK/SAPK ホスホ-Thr183/Tyr185、抗ホスホ-チロシン、抗ホスホ-スレオニン、抗PIP2、および抗PIP3からなる一群の抗体より選択される少なくとも1つの抗体を含む。
【００３５】
さらなる局面において、工程a）は、細胞集団を少なくとも第一の活性化可能なタンパク質の活性化を誘導する薬剤と接触させる工程をさらに含む。
【００３６】
さらなる局面において、工程a）は、細胞集団を少なくとも1つの第一および第二の活性化可能なタンパク質の活性化を誘導する薬剤と接触させる工程をさらに含む。
【００３７】
さらなる局面において、工程a）は、細胞集団を第一、第二、および第三の活性化可能なタンパク質のうちの少なくとも1つの活性化を誘導する薬剤と接触させる工程をさらに含む。
【００３８】
さらなる局面において、本方法は、第一の活性化可能なタンパク質の活性化状態および第二の活性化可能なタンパク質の活性化状態に基づいて、単一細胞を選別する工程をさらに含む。
【００３９】
さらなる局面において、第一の活性化状態特異的抗体は、第一の標識を含み、第二の活性化状態特異的抗体は、第二の蛍光性の標識を含み、かつ選別は、蛍光性の活性化された細胞選別（FACS）による。
【００４０】
さらなる局面において、第一の活性化状態特異的抗体は、第一のFRET標識を含み；第二の活性化状態特異的抗体は、第二のFRET標識を含み、かつ選別は、蛍光標示式細胞選別器（FACS）による。
【００４１】
さらなる局面において、第一の活性化状態特異的抗体は、FRET標識を含み；第二の活性化状態特異的抗体は、標識を含み；および選別は、蛍光標示式細胞選別器（FACS）による。
【００４２】
さらなる局面において、工程a）は、細胞を固定する工程をさらに含む。
【００４３】
さらなる局面において、細胞は、哺乳動物細胞である。
【００４４】
代わりの態様において、本発明は、最初に個体の統計学的に十分な数を表すサイトカイン応答パネルを作製し、続いて患者についてのサイトカイン応答パネルを作製し、次いで患者の臨床的結果の予後に到達するために、該患者のサイトカイン応答パネルを、個体の統計学的に十分な数を表すサイトカイン応答パネルと比較することを含む、患者についての臨床的結果を予測する方法を提供する。
【００４５】
さらなる態様において、サイトカイン応答パネルは、最初に、刺激していない細胞における複数のホスホ-タンパク質のリン酸化状態を検出し、次いでサイトカイン刺激した細胞における複数のホスホ-タンパク質のリン酸化状態を検出し、もしあれば、刺激した細胞および刺激していない細胞におけるホスホ-タンパク質のリン酸化状態の相違を決定することによって作製される。
【００４６】
さらなる態様において、検出は、細胞内リン酸特異的フローサイトメトリーによって達成される。
【００４７】
さらなる態様において、ホスホ-タンパク質は、Stat1、Stat3、Stat5、Stat6、p38、およびErk1/2からなる群より選択される。
【００４８】
さらなる態様において、サイトカインは、Flt3リガンド、GM-CSF、G-CSFまたはIL-3からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】リン酸特異的抗体がキナーゼ活性と相関することを証明する実験の結果を示す。  A）i）p44/42、ii）p38、iii）JNK/SAPK、iv）AKTser473/AKTthr308、v）TYK2、vi）PKA-基質、およびvii）PKC-PAN基質に対するリン酸特異的抗体を、特異的キナーゼ誘導性および阻害性条件により、リン酸特異性について試験した。キナーゼを誘導する条件、並びに経路における特異的阻害剤を示してある。キナーゼが公知の基質に対して活性を有する能力を、それぞれのリン酸ウエスタンセットの下に示してある。AKT、p38、SAPK/JNK、p44/42、MAPK、およびTYK2に対する非リン酸特異的抗体は、キナーゼ全体の存在を反映する。キナーゼ活性は、リン酸特異的抗体によって検出される、それぞれのキナーゼのリン酸化を誘発することが見いだされた条件下で決定し、キナーゼのリン酸化された状態と相関させた。ホスホ-PKA基質およびホスホ-PKC-PAN基質抗体の性質を考えると、直接キナーゼ活性を測定することはできない。両方の抗体が、これらのそれぞれのキナーゼ基質認識モチーフのリン酸化された形態の複数のPKCおよびPKA標的タンパク質を認識するので、使用した条件によりPKCおよびPKAの一般的活性化を決定した。AKT、p44/42、p38、およびJNKキナーゼに対する免疫ブロット／キナーゼアッセイ法をNIH3T3において行い、TYK2、PKC、およびPKAについてのデータは、Jurkat細胞において行った（処置条件の生成についての材料および方法を参照されたい）。
【図１Ｂ】リン酸特異的抗体がキナーゼ活性と相関することを証明する実験の結果を示す。  B）表2に図解した誘導条件の前に、Jurkat細胞をキナーゼ誘導薬（誘導した）またはキナーゼ阻害剤（阻害した）で処置した。細胞内FACS染色のための細胞を調製して、リン酸特異的抗体-フルオロフォア抱合体の対数蛍光によって図に記述したキナーゼ活性について解析した。プロットオーバーレイでは、キナーゼ活性が増大されたか、または減少されたかのいずれかのそれぞれの変化を図示する。下段右パネルは、ホスホ-ERK活性（0.001、0.01、0.1、1.0、10μg/ml）によって測定したEGF処置の用量反応曲線を表す。使用した阻害剤および活性化因子は、以下のものであった：p44/42（ERK1/2）は、上皮細胞成長因子（EGF）で活性化され、MEK1/2阻害剤U012621-23*で阻害され；AKT活性化は、増殖培地および血小板由来成長因子の添加によって達成され、PI3Kキナーゼ阻害剤LY29400220*と共にインキュベーションすることによって阻害され；JNKは、アニソマイシン29*によって活性化され、スタウロスポリンによって阻害され；p38 MAPKは、アニソマイシン29*によって活性化され、化合物SB20358024、29*で阻害され；PKAは、ホルボール12ミリスタレート化13-アセテート（PMA）によって活性化され、リン酸検出は、プロテインホスファターゼ阻害剤カルシクリンA25*と共にインキュベーションすることによって行うことができ；PKCは、イオノマイシン（IO）によって活性化され、ビスインドリルマレイミドII26、27*を使用して阻害され；TYK2活性は、インターフェロンγ（IFNγ）によって誘導され、一般的チロシンキナーゼ阻害剤ゲニステイン28、3*を使用して阻害された。*対応する文献番号を参照し、「参照文献」下の実施例1において引用。
【図１Ｃ】リン酸特異的抗体がキナーゼ活性と相関することを証明する実験の結果を示す。  C）TYK2、PKA、およびPKC基質プローブは、リン酸特異的である。細胞内染色する前に刺激した試料（上に述べた）をラムダホスファターゼで処置すると、ホスホ-TYK2およびホスホ-PKA基質プローブによる検出が減少した。リン酸化されたPKC基質の検出を減少させるためには、ラムダホスファターゼに加えて仔ウシ腸管ホスファターゼで細胞を処置することが必要であった。
【図１Ｄ】リン酸特異的抗体がキナーゼ活性と相関することを証明する実験の結果を示す。  D）p44/42のリン酸化は、フローサイトメトリーによって測定される平均蛍光強度と相関する。リン酸特異的検出およびホスホ-p44/42キナーゼプローブによる平均蛍光強度（MFI）の両方によって測定されるp44/42リン酸化の半定量分析。Jurkat細胞を示された濃度にて30分間のEGFの用量反応曲線に供して、リン酸特異的抗体での免疫ブロットおよび開発したp44/42キナーゼプローブでのフローサイトメトリーの両方によってp44/42リン酸化について評価した。Yエラーバーは、MFI値についての標準偏差である。Xエラーバーは、刺激されていないコントロールと比較してリン酸化されたパーセントについての標準偏差である。示した値は、3つの独立した実験を表す。目に見えないエラーバーは、データ点によって隠されている。
【図２Ａ】多次元解析により、異なる刺激によって誘導されるシグナルネットワークに対する洞察を提供することを証明する実験の結果を示す。  A）CD4+およびCD19+リンパ球サブセット内の差動的キナーゼ活性。PBMCを示した刺激で1時間処置して、フローサイトメトリーによる細胞内キナーゼリン酸化状態決定のために調製した。異なる刺激によるCD4+のp44/42活性に関して、応答性亢進および反応性低下の両方を観察することができる。
【図２Ｂ】多次元解析により、異なる刺激によって誘導されるシグナルネットワークに対する洞察を提供することを証明する実験の結果を示す。  B）CD69によって測定されるT細胞活性化は、CD3/CD28およびPMA／イオノマイシン刺激に対して差動的p44/42キナーゼ活性を示す。刺激条件を図に示してある。
【図２Ｃ】多次元解析により、異なる刺激によって誘導されるシグナルネットワークに対する洞察を提供することを証明する実験の結果を示す。  C）人工T細胞刺激で測定される複数のキナーゼ活性。フローサイトメトリーによる細胞内キナーゼリン酸化状態決定のために、増殖培地中のJurkat細胞PMA／イオノマイシン（IO）処置したJurkat細胞を調製した。CD69発現は、T細胞活性化を示すのに役に立つ。X軸は、対数蛍光値に対応し、Y軸は、相対的細胞数に対応する。
【図２Ｄ】多次元解析により、異なる刺激によって誘導されるシグナルネットワークに対する洞察を提供することを証明する実験の結果を示す。  D）細胞粒状度の関数としてのp38のリン酸化。リン酸化されたp38および非リン酸化p38の同時測定により、細胞粒状度が増大するにつれて非リン酸化p38からリン酸化されたp38へ変化することを例証する（側方散乱パラメーターのオープンバーによって示される）。
【図２Ｅ】多次元解析により、異なる刺激によって誘導されるシグナルネットワークに対する洞察を提供することを証明する実験の結果を示す。  E）JNK活性の関数としてのp44/42およびp38キナーゼ活性の3パラメーター解析により、シグナリング・クロストークの潜在的マッピングを例証する。PBMCをIL-1αで処置した。JNK、p44/42、およびp38活性は、フローサイトメトリーによって同時に測定した。ホスホ-JNK/SAPKプロットにおけるオープンバーは、JNK活性化の強度を示す。
【図２Ｆ】多次元解析により、異なる刺激によって誘導されるシグナルネットワークに対する洞察を提供することを証明する実験の結果を示す。  F）IL-1β処置したPBMCにおけるTYK2活性の関数としてのAKT、p38、PKA、およびp44/42活性の5パラメーター解析。TYK2活性の開始時に、4つのキナーゼ全ての活性は検出できない。p38、p44/42、およびAKT活性の同調的活性化は、より高レベルのTYK2活性で観察される。PKA活性は、より高レベルのp38およびp44/42活性で観察される。
【図３Ａ】多染フローサイトメトリーによる静止T細胞単離、調製、および解析の流れ図を示す（11色、13パラメーター）。リンパ球の単離は、フィコール-プラーク勾配によって達成し、接着細胞を減少させた。フローサイトメトリープロットは、典型的なリンパ球ゲートおよびCD3集団の存在を図示する。磁気活性化細胞選別により、活性化されたT細胞、NK細胞、残りのマクロファージ、およびB細胞を除去し、静止T細胞を濃縮した。CD4+およびCD8+細胞の存在を確認するために、刺激前に濃縮された集団を評価した。IL-1α、IL-1β、またはIL-2への刺激を行い、表1に示した染料を使用してフローサイトメトリーのための細胞を調製した。時折、いくつかの表面マーカーのダウンレギュレーションが一定の刺激に対して観察され、重要な分子、すなわち、CD3、CD4、CD8の受容体ダウンレギュレーションによって示される（刺激処置の前にこれらのマーカーのフローサイトメトリープロットを比較するときに明らか）。5つの分化マーカーによる記憶およびナイーブゲーティングの例をCD4+およびCD8+ T細胞について示してある。CD45RAゲートの適切な配置をDe Rosa et alに従って行い、CD4+およびCD8+集団に対して別々に行った。分化マーカーに従って複数のゲーティングによってナイーブおよび免疫記憶細胞を同定後に、細胞内キナーゼ活性を決定した。キナーゼ・プロフィールをCD11aマーカーに対してプロットしてあるが、これらは、全てのナイーブおよび記憶マーカーにゲートされる。複数のキナーゼ活性の評価を2回の11色実験を組み合わせて行うことができる。
【図３Ｂ】多染フローサイトメトリーによる静止T細胞単離、調製、および解析の流れ図を示す（11色、13パラメーター）。リンパ球の単離は、フィコール-プラーク勾配によって達成し、接着細胞を減少させた。フローサイトメトリープロットは、典型的なリンパ球ゲートおよびCD3集団の存在を図示する。磁気活性化細胞選別により、活性化されたT細胞、NK細胞、残りのマクロファージ、およびB細胞を除去し、静止T細胞を濃縮した。CD4+およびCD8+細胞の存在を確認するために、刺激前に濃縮された集団を評価した。IL-1α、IL-1β、またはIL-2への刺激を行い、表1に示した染料を使用してフローサイトメトリーのための細胞を調製した。時折、いくつかの表面マーカーのダウンレギュレーションが一定の刺激に対して観察され、重要な分子、すなわち、CD3、CD4、CD8の受容体ダウンレギュレーションによって示される（刺激処置の前にこれらのマーカーのフローサイトメトリープロットを比較するときに明らか）。5つの分化マーカーによる記憶およびナイーブゲーティングの例をCD4+およびCD8+ T細胞について示してある。CD45RAゲートの適切な配置をDe Rosa et alに従って行い、CD4+およびCD8+集団に対して別々に行った。分化マーカーに従って複数のゲーティングによってナイーブおよび免疫記憶細胞を同定後に、細胞内キナーゼ活性を決定した。キナーゼ・プロフィールをCD11aマーカーに対してプロットしてあるが、これらは、全てのナイーブおよび記憶マーカーにゲートされる。複数のキナーゼ活性の評価を2回の11色実験を組み合わせて行うことができる。
【図３Ｂ−１】多染フローサイトメトリーによる静止T細胞単離、調製、および解析の流れ図を示す（11色、13パラメーター）。リンパ球の単離は、フィコール-プラーク勾配によって達成し、接着細胞を減少させた。フローサイトメトリープロットは、典型的なリンパ球ゲートおよびCD3集団の存在を図示する。磁気活性化細胞選別により、活性化されたT細胞、NK細胞、残りのマクロファージ、およびB細胞を除去し、静止T細胞を濃縮した。CD4+およびCD8+細胞の存在を確認するために、刺激前に濃縮された集団を評価した。IL-1α、IL-1β、またはIL-2への刺激を行い、表1に示した染料を使用してフローサイトメトリーのための細胞を調製した。時折、いくつかの表面マーカーのダウンレギュレーションが一定の刺激に対して観察され、重要な分子、すなわち、CD3、CD4、CD8の受容体ダウンレギュレーションによって示される（刺激処置の前にこれらのマーカーのフローサイトメトリープロットを比較するときに明らか）。5つの分化マーカーによる記憶およびナイーブゲーティングの例をCD4+およびCD8+ T細胞について示してある。CD45RAゲートの適切な配置をDe Rosa et alに従って行い、CD4+およびCD8+集団に対して別々に行った。分化マーカーに従って複数のゲーティングによってナイーブおよび免疫記憶細胞を同定後に、細胞内キナーゼ活性を決定した。キナーゼ・プロフィールをCD11aマーカーに対してプロットしてあるが、これらは、全てのナイーブおよび記憶マーカーにゲートされる。複数のキナーゼ活性の評価を2回の11色実験を組み合わせて行うことができる。
【図３Ｂ−２】多染フローサイトメトリーによる静止T細胞単離、調製、および解析の流れ図を示す（11色、13パラメーター）。リンパ球の単離は、フィコール-プラーク勾配によって達成し、接着細胞を減少させた。フローサイトメトリープロットは、典型的なリンパ球ゲートおよびCD3集団の存在を図示する。磁気活性化細胞選別により、活性化されたT細胞、NK細胞、残りのマクロファージ、およびB細胞を除去し、静止T細胞を濃縮した。CD4+およびCD8+細胞の存在を確認するために、刺激前に濃縮された集団を評価した。IL-1α、IL-1β、またはIL-2への刺激を行い、表1に示した染料を使用してフローサイトメトリーのための細胞を調製した。時折、いくつかの表面マーカーのダウンレギュレーションが一定の刺激に対して観察され、重要な分子、すなわち、CD3、CD4、CD8の受容体ダウンレギュレーションによって示される（刺激処置の前にこれらのマーカーのフローサイトメトリープロットを比較するときに明らか）。5つの分化マーカーによる記憶およびナイーブゲーティングの例をCD4+およびCD8+ T細胞について示してある。CD45RAゲートの適切な配置をDe Rosa et alに従って行い、CD4+およびCD8+集団に対して別々に行った。分化マーカーに従って複数のゲーティングによってナイーブおよび免疫記憶細胞を同定後に、細胞内キナーゼ活性を決定した。キナーゼ・プロフィールをCD11aマーカーに対してプロットしてあるが、これらは、全てのナイーブおよび記憶マーカーにゲートされる。複数のキナーゼ活性の評価を2回の11色実験を組み合わせて行うことができる。
【図３Ｂ−３】多染フローサイトメトリーによる静止T細胞単離、調製、および解析の流れ図を示す（11色、13パラメーター）。リンパ球の単離は、フィコール-プラーク勾配によって達成し、接着細胞を減少させた。フローサイトメトリープロットは、典型的なリンパ球ゲートおよびCD3集団の存在を図示する。磁気活性化細胞選別により、活性化されたT細胞、NK細胞、残りのマクロファージ、およびB細胞を除去し、静止T細胞を濃縮した。CD4+およびCD8+細胞の存在を確認するために、刺激前に濃縮された集団を評価した。IL-1α、IL-1β、またはIL-2への刺激を行い、表1に示した染料を使用してフローサイトメトリーのための細胞を調製した。時折、いくつかの表面マーカーのダウンレギュレーションが一定の刺激に対して観察され、重要な分子、すなわち、CD3、CD4、CD8の受容体ダウンレギュレーションによって示される（刺激処置の前にこれらのマーカーのフローサイトメトリープロットを比較するときに明らか）。5つの分化マーカーによる記憶およびナイーブゲーティングの例をCD4+およびCD8+ T細胞について示してある。CD45RAゲートの適切な配置をDe Rosa et alに従って行い、CD4+およびCD8+集団に対して別々に行った。分化マーカーに従って複数のゲーティングによってナイーブおよび免疫記憶細胞を同定後に、細胞内キナーゼ活性を決定した。キナーゼ・プロフィールをCD11aマーカーに対してプロットしてあるが、これらは、全てのナイーブおよび記憶マーカーにゲートされる。複数のキナーゼ活性の評価を2回の11色実験を組み合わせて行うことができる。
【図３Ｂ−４】多染フローサイトメトリーによる静止T細胞単離、調製、および解析の流れ図を示す（11色、13パラメーター）。リンパ球の単離は、フィコール-プラーク勾配によって達成し、接着細胞を減少させた。フローサイトメトリープロットは、典型的なリンパ球ゲートおよびCD3集団の存在を図示する。磁気活性化細胞選別により、活性化されたT細胞、NK細胞、残りのマクロファージ、およびB細胞を除去し、静止T細胞を濃縮した。CD4+およびCD8+細胞の存在を確認するために、刺激前に濃縮された集団を評価した。IL-1α、IL-1β、またはIL-2への刺激を行い、表1に示した染料を使用してフローサイトメトリーのための細胞を調製した。時折、いくつかの表面マーカーのダウンレギュレーションが一定の刺激に対して観察され、重要な分子、すなわち、CD3、CD4、CD8の受容体ダウンレギュレーションによって示される（刺激処置の前にこれらのマーカーのフローサイトメトリープロットを比較するときに明らか）。5つの分化マーカーによる記憶およびナイーブゲーティングの例をCD4+およびCD8+ T細胞について示してある。CD45RAゲートの適切な配置をDe Rosa et alに従って行い、CD4+およびCD8+集団に対して別々に行った。分化マーカーに従って複数のゲーティングによってナイーブおよび免疫記憶細胞を同定後に、細胞内キナーゼ活性を決定した。キナーゼ・プロフィールをCD11aマーカーに対してプロットしてあるが、これらは、全てのナイーブおよび記憶マーカーにゲートされる。複数のキナーゼ活性の評価を2回の11色実験を組み合わせて行うことができる。
【図４Ａ】シグナリングプロフィールを、多染フローサイトメトリーを使用して特定のリンパ球サブセットにおいて容易に識別可能であることを証明する実験の結果を示す。直接比較のためにナイーブおよび記憶T細胞キナーゼプロフィールを重ね合わせる。CD8+ナイーブ細胞においてキナーゼリン酸化が、Log 10蛍光強度（阻害剤／誘導因子実験から定義される値、図2）に接近し、しかし上回らないときに、閾値依存的キナーゼ活性化を含む機構を観察することができる。IL-1αCD4+ナイーブ細胞について反応性低下を見ることができる。
【図４Ｂ】シグナリングプロフィールを、多染フローサイトメトリーを使用して特定のリンパ球サブセットにおいて容易に識別可能であることを証明する実験の結果を示す。直接比較のためにナイーブおよび記憶T細胞キナーゼプロフィールを重ね合わせる。CD8+ナイーブ細胞においてキナーゼリン酸化が、Log 10蛍光強度（阻害剤／誘導因子実験から定義される値、図2）に接近し、しかし上回らないときに、閾値依存的キナーゼ活性化を含む機構を観察することができる。IL-1αCD4+ナイーブ細胞について反応性低下を見ることができる。
【図４Ｃ】シグナリングプロフィールを、多染フローサイトメトリーを使用して特定のリンパ球サブセットにおいて容易に識別可能であることを証明する実験の結果を示す。直接比較のためにナイーブおよび記憶T細胞キナーゼプロフィールを重ね合わせる。CD8+ナイーブ細胞においてキナーゼリン酸化が、Log 10蛍光強度（阻害剤／誘導因子実験から定義される値、図2）に接近し、しかし上回らないときに、閾値依存的キナーゼ活性化を含む機構を観察することができる。IL-1αCD4+ナイーブ細胞について反応性低下を見ることができる。
【図４Ｄ】シグナリングプロフィールを、多染フローサイトメトリーを使用して特定のリンパ球サブセットにおいて容易に識別可能であることを証明する実験の結果を示す。直接比較のためにナイーブおよび記憶T細胞キナーゼプロフィールを重ね合わせる。CD8+ナイーブ細胞においてキナーゼリン酸化が、Log 10蛍光強度（阻害剤／誘導因子実験から定義される値、図2）に接近し、しかし上回らないときに、閾値依存的キナーゼ活性化を含む機構を観察することができる。IL-1αCD4+ナイーブ細胞について反応性低下を見ることができる。
【図５】フローサイトメトリーによって活性および非活性キナーゼの両方の強度をモニターする実験の結果を示す  A）p44/42、p38、AKT、TYK2、およびJNKのためのリン酸および非リン酸特異的プローブは、その天然の状態のそれぞれのキナーゼを検出する。Jurkat細胞は、以下のとおりに処置した：AKT活性はPDGFで刺激し、MAPK活性はEGFで刺激し、p38およびJNK活性はアニソマイシンで刺激し、10分間刺激して表2に述べた濃度に従って誘導因子でそれぞれのキナーゼの初期活性化を誘導した。ホスホ-p44/42、ホスホ-p38、ホスホ-AKTser473、およびホスホAKTthr308、およびホスホ-JNK/SAPKでは、これらの非リン酸特異的対応物に対する所与の刺激により異なる集団を検出した。AKT陽性細胞をゲートして、パネルに表示したようにAKTser473-およびAKTthr308リン酸化プロットに対してプロットした。全ての非リン酸特異的キナーゼが刺激されていない細胞を比較のために適切に示した。
【図６Ａ】LFA-1刺激がJAB1およびサイトヘシン-1放出、並びにヒトナイーブCD4+ T細胞におけるリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。A）CD3、CD28、およびsICAM-2（5μg/ml、30分）で刺激した細胞からの核抽出物のホスホ-cJun免疫ブロット。
【図６Ｂ】LFA-1刺激がJAB1およびサイトヘシン-1放出、並びにヒトナイーブCD4+ T細胞におけるリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。B）α-JAB1、IgGトランスフェクトされた、およびトランスフェクトされなかった細胞におけるホスホ-cJun（S63）の単一細胞解析。平均蛍光強度を±SDプロットした。
【図６Ｃ】LFA-1刺激がJAB1およびサイトヘシン-1放出、並びにヒトナイーブCD4+ T細胞におけるリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。C）非刺激（パネルA-C）における、LFA-1刺激した（sICAM-25μg/ml）（パネルD-F）、およびα-JAB1トランスフェクトした細胞（G-I）のJAB1およびサイトヘシン-1の共焦点。パネルG-Iは、α-JAB1抗体で染色されなかった。
【図６Ｄ】LFA-1刺激がJAB1およびサイトヘシン-1放出、並びにヒトナイーブCD4+ T細胞におけるリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。D）非刺激、sICAM-2、およびCD3（5μg/ml、30分）刺激した細胞からのJAB1並びにサイトヘシン-1の免疫沈降物をホスホ-セリンおよびホスホ-スレオニンについて免疫染色し、その後に取り除いて、それぞれα-JAB1およびα-サイトヘシン-1を染色した。
【図６Ｅ】LFA-1刺激がJAB1およびサイトヘシン-1放出、並びにヒトナイーブCD4+ T細胞におけるリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。E）sICAM-2で刺激した（5μg/ml、30分）IgG、α-JAB1、α-サイトヘシン-1 N末端、α-C末端サイトヘシン-1、およびC末端サイトヘシン-1ペプチドをトランスフェクトした細胞におけるホスホ-p44/42（T202/Y204）のフローサイトメトリー検出。
【図６Ｆ】LFA-1刺激がJAB1およびサイトヘシン-1放出、並びにヒトナイーブCD4+ T細胞におけるリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。F）以下を証明する実験の結果を示す：A）フローサイトメトリーによるホスホ-p38（T180/Y182）、ホスホ-AKT（S473）、ホスホ-Lck（S158）、ホスホ-mek1/2（S217/221）、ホスホ-elk（S38）のCD3、CD28、およびLFA-1刺激の動力学解析。本発明者らは、ホスホ-AKT、ホスホ-p38、およびホスホ-mek1/2がCD3またはLFA-1刺激よりも広範囲にCD28刺激によって誘導されることを観察した。これらの報告は、CD28刺激によってこれらの経路の活性化を示唆する最近の知見と一致する（Kane et al., 2001； Li et al., 2001）。本発明者らは、ホスホ-lckが、LFA-1刺激の際の全時間にわたって、CD3およびCD28刺激に関して差動的に誘導される点に留意した。elk-1のリン酸化は、CD3およびCD28刺激によって与えられ、LFA-1刺激によりよりわずかな程度に与えられる。
【図７Ａ】ホスホ-タンパク質抗体アレイによるヒトナイーブT細胞におけるCD3/CD28/LFA-1シグナリングを証明する実験の結果を示す。A）CD3/CD28/LFA-1対C3/CD28刺激したナイーブCD4+T細胞の差動的ホスホ-タンパク質プロフィール。蛍光ホスホ-タンパク質アレイの比率を、MFIが平均蛍光強度：対数に等しい以下の式から算出した（材料および方法を参照されたい）。リン酸化倍数は、緑が高に対応し、赤が低に対応する蛍光強度スケールによって示してある。
【図７Ｂ】ホスホ-タンパク質抗体アレイによるヒトナイーブT細胞におけるCD3/CD28/LFA-1シグナリングを証明する実験の結果を示す。B）CD3、CD28、およびsICAM-2で刺激したCD4+T細胞の細胞周期解析。細胞周期のG0、G1、S+G2/M期の細胞を、二重染色を使用してKi-67およびDNA含量の発現について決定した。低Ki-67-シグナルは、G0の細胞とみなし、2n DNAであるKi-67+シグナルは、G1の細胞とみなし、2n DNAであるKi-67+シグナルをSまたはG2/Mの細胞とみなした。
【図８Ａ】A）およびB）は、ナイーブCD4+ T細胞の多次元解析を示す流れ図を示す。磁気細胞選別、13パラメーターフローサイトメトリー、転写因子プロファイリング、およびサイトカインビーズアレイを多重化して、免疫表現型を同定したナイーブヒトCD4+ T細胞（CD3+CD4+CD8-CD45RA+CD62L+CD11adimCD27+CD28+）に対する刺激効果を決定した。サイトカインおよびホスホ-タンパク質の細胞内レベルは、図に示したような表面表現型／活性化マーカーと相関された。C）は、細胞がsICAM-2およびCD28の個々刺激、並びにCD3/sICAM-2の組み合わせについて、ナイーブゲートしたCD4+ T細胞（5つの分化マーカーによって示したとおり）であることを証明する。B）刺激24および48時間後のCD25発現（示したとおり、10μg/ml）。
【図８Ａ−１】A）およびB）は、ナイーブCD4+ T細胞の多次元解析を示す流れ図を示す。磁気細胞選別、13パラメーターフローサイトメトリー、転写因子プロファイリング、およびサイトカインビーズアレイを多重化して、免疫表現型を同定したナイーブヒトCD4+ T細胞（CD3+CD4+CD8-CD45RA+CD62L+CD11adimCD27+CD28+）に対する刺激効果を決定した。サイトカインおよびホスホ-タンパク質の細胞内レベルは、図に示したような表面表現型／活性化マーカーと相関された。C）は、細胞がsICAM-2およびCD28の個々刺激、並びにCD3/sICAM-2の組み合わせについて、ナイーブゲートしたCD4+ T細胞（5つの分化マーカーによって示したとおり）であることを証明する。B）刺激24および48時間後のCD25発現（示したとおり、10μg/ml）。
【図８Ａ−２】A）およびB）は、ナイーブCD4+ T細胞の多次元解析を示す流れ図を示す。磁気細胞選別、13パラメーターフローサイトメトリー、転写因子プロファイリング、およびサイトカインビーズアレイを多重化して、免疫表現型を同定したナイーブヒトCD4+ T細胞（CD3+CD4+CD8-CD45RA+CD62L+CD11adimCD27+CD28+）に対する刺激効果を決定した。サイトカインおよびホスホ-タンパク質の細胞内レベルは、図に示したような表面表現型／活性化マーカーと相関された。C）は、細胞がsICAM-2およびCD28の個々刺激、並びにCD3/sICAM-2の組み合わせについて、ナイーブゲートしたCD4+ T細胞（5つの分化マーカーによって示したとおり）であることを証明する。B）刺激24および48時間後のCD25発現（示したとおり、10μg/ml）。
【図８Ｂ】A）およびB）は、ナイーブCD4+ T細胞の多次元解析を示す流れ図を示す。磁気細胞選別、13パラメーターフローサイトメトリー、転写因子プロファイリング、およびサイトカインビーズアレイを多重化して、免疫表現型を同定したナイーブヒトCD4+ T細胞（CD3+CD4+CD8-CD45RA+CD62L+CD11adimCD27+CD28+）に対する刺激効果を決定した。サイトカインおよびホスホ-タンパク質の細胞内レベルは、図に示したような表面表現型／活性化マーカーと相関された。C）は、細胞がsICAM-2およびCD28の個々刺激、並びにCD3/sICAM-2の組み合わせについて、ナイーブゲートしたCD4+ T細胞（5つの分化マーカーによって示したとおり）であることを証明する。B）刺激24および48時間後のCD25発現（示したとおり、10μg/ml）。
【図８Ｃ】A）およびB）は、ナイーブCD4+ T細胞の多次元解析を示す流れ図を示す。磁気細胞選別、13パラメーターフローサイトメトリー、転写因子プロファイリング、およびサイトカインビーズアレイを多重化して、免疫表現型を同定したナイーブヒトCD4+ T細胞（CD3+CD4+CD8-CD45RA+CD62L+CD11adimCD27+CD28+）に対する刺激効果を決定した。サイトカインおよびホスホ-タンパク質の細胞内レベルは、図に示したような表面表現型／活性化マーカーと相関された。C）は、細胞がsICAM-2およびCD28の個々刺激、並びにCD3/sICAM-2の組み合わせについて、ナイーブゲートしたCD4+ T細胞（5つの分化マーカーによって示したとおり）であることを証明する。B）刺激24および48時間後のCD25発現（示したとおり、10μg/ml）。
【図９】細胞内IL-2、並びに表面CD25およびCD69マーカーによってモニターされるT細胞活性化を示す実験の結果を示す。A）CD3/CD28対LFA-1刺激またはCD3対CD28刺激における6時間の滴定でのIL-2の細胞内検出。平均蛍光強度は、目視アレイとしてプロットしてある。B）非刺激、CD3/CD28/LFA-1（0.001μg/ml、1：1：1）刺激、およびCD3/CD28（10μg/ml）刺激したCD4 T細胞におけるCD69およびCD25発現の二変量解析。C）非刺激、CD3/CD28、およびCD3/CD28/LFA-1刺激の刺激後12時間の、CD69発現およびIL-2の細胞内検出の二変量プロット。
【図１０Ａ】転写因子核局在化および活性のプロファイリングを証明する実験の結果を示す。A）NFAT-ルシフェラーゼ、NF-κB-ルシフェラーゼ、およびAP-1-ルシフェラーゼをトランスフェクトしたJurkat細胞のリポーター遺伝子アッセイ法。CD3、CD3/CD28、およびCD3/CD28/LFA-1刺激を行い（6時間、10μg/ml）、ルシフェラーゼ活性倍数をプロットしてある。B）CD3、CD28、およびLFA-1刺激（10μg/ml、12時間）に対する転写因子（図に示したとおり）の核プロフィール。核抽出物（5μg/ml）転写因子特異的コンセンサス配列DNAをコーティングしたプレートにハイブリダイズさせて、ELISAによって検出した。値は、ネガティブコントロールに対して規準化して、655nmの吸光度単位として示した。CD3/CD28およびCD3/CD28/sICAM-2刺激した細胞（上記の通り）の核プロフィール。C）CD3/CD28に対するNFAT-ルシフェラーゼリポーター活性および上記のとおりのCD3/CD28/LFA-1滴定（示したとおり）。D-E）は、CD3、CD28、およびLFA-1刺激の転写因子プロファイリング並びに細胞数測定のビーズアレイを示す実験の結果を示す。A）刺激した細胞の核抽出物を調製して、p65、p50、cFos、creb、atf2、およびcRelに対するコンセンサス配列でコーティングした96ウェルプレートにハイブリダイズさせた。標準的なELISA技術を使用して結合したタンパク質を検出した。CD3刺激により、低レベルのNF-κBサブユニットp65およびp50、並びに検出不可能なレベルのcFos、cRel、CREBを示し、これらの効果は、LFA-1刺激と同様であった。しかし、CD3刺激単独では、CD28およびLFA-1刺激よりも高いレベルのaft2を示した。CD28刺激単独では、低レベルのNF-κB p65およびp50サブユニットを示し、CREBのレベルが上昇した。LFA-1刺激では、わずかに高いレベルのNF-κB p65サブユニットおよびcRelを示した。B）CD3/CD28およびCD3/CD28/LFA-1刺激に対して（10Dg/ml、16時間）分泌されたIFNα、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5、IL-2、およびTNFαに対する細胞数測定ビーズアレイ（CBA）。値は、組換えサイトカインを使用する標準曲線に対して算出し、処置した細胞の上清から同時に測定した。CD3およびLFA-1刺激単独後のサイトカイン分泌の測定では、有意なサイトカイン分泌を報告せず、CD28刺激により、IFNαが低レベルになると共にIL-4およびIL-5が高レベルになった。
【図１０Ｂ】転写因子核局在化および活性のプロファイリングを証明する実験の結果を示す。A）NFAT-ルシフェラーゼ、NF-κB-ルシフェラーゼ、およびAP-1-ルシフェラーゼをトランスフェクトしたJurkat細胞のリポーター遺伝子アッセイ法。CD3、CD3/CD28、およびCD3/CD28/LFA-1刺激を行い（6時間、10μg/ml）、ルシフェラーゼ活性倍数をプロットしてある。B）CD3、CD28、およびLFA-1刺激（10μg/ml、12時間）に対する転写因子（図に示したとおり）の核プロフィール。核抽出物（5μg/ml）転写因子特異的コンセンサス配列DNAをコーティングしたプレートにハイブリダイズさせて、ELISAによって検出した。値は、ネガティブコントロールに対して規準化して、655nmの吸光度単位として示した。CD3/CD28およびCD3/CD28/sICAM-2刺激した細胞（上記の通り）の核プロフィール。C）CD3/CD28に対するNFAT-ルシフェラーゼリポーター活性および上記のとおりのCD3/CD28/LFA-1滴定（示したとおり）。D-E）は、CD3、CD28、およびLFA-1刺激の転写因子プロファイリング並びに細胞数測定のビーズアレイを示す実験の結果を示す。A）刺激した細胞の核抽出物を調製して、p65、p50、cFos、creb、atf2、およびcRelに対するコンセンサス配列でコーティングした96ウェルプレートにハイブリダイズさせた。標準的なELISA技術を使用して結合したタンパク質を検出した。CD3刺激により、低レベルのNF-κBサブユニットp65およびp50、並びに検出不可能なレベルのcFos、cRel、CREBを示し、これらの効果は、LFA-1刺激と同様であった。しかし、CD3刺激単独では、CD28およびLFA-1刺激よりも高いレベルのaft2を示した。CD28刺激単独では、低レベルのNF-κB p65およびp50サブユニットを示し、CREBのレベルが上昇した。LFA-1刺激では、わずかに高いレベルのNF-κB p65サブユニットおよびcRelを示した。B）CD3/CD28およびCD3/CD28/LFA-1刺激に対して（10Dg/ml、16時間）分泌されたIFNα、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5、IL-2、およびTNFαに対する細胞数測定ビーズアレイ（CBA）。値は、組換えサイトカインを使用する標準曲線に対して算出し、処置した細胞の上清から同時に測定した。CD3およびLFA-1刺激単独後のサイトカイン分泌の測定では、有意なサイトカイン分泌を報告せず、CD28刺激により、IFNαが低レベルになると共にIL-4およびIL-5が高レベルになった。
【図１０Ｃ】転写因子核局在化および活性のプロファイリングを証明する実験の結果を示す。A）NFAT-ルシフェラーゼ、NF-κB-ルシフェラーゼ、およびAP-1-ルシフェラーゼをトランスフェクトしたJurkat細胞のリポーター遺伝子アッセイ法。CD3、CD3/CD28、およびCD3/CD28/LFA-1刺激を行い（6時間、10μg/ml）、ルシフェラーゼ活性倍数をプロットしてある。B）CD3、CD28、およびLFA-1刺激（10μg/ml、12時間）に対する転写因子（図に示したとおり）の核プロフィール。核抽出物（5μg/ml）転写因子特異的コンセンサス配列DNAをコーティングしたプレートにハイブリダイズさせて、ELISAによって検出した。値は、ネガティブコントロールに対して規準化して、655nmの吸光度単位として示した。CD3/CD28およびCD3/CD28/sICAM-2刺激した細胞（上記の通り）の核プロフィール。C）CD3/CD28に対するNFAT-ルシフェラーゼリポーター活性および上記のとおりのCD3/CD28/LFA-1滴定（示したとおり）。D-E）は、CD3、CD28、およびLFA-1刺激の転写因子プロファイリング並びに細胞数測定のビーズアレイを示す実験の結果を示す。A）刺激した細胞の核抽出物を調製して、p65、p50、cFos、creb、atf2、およびcRelに対するコンセンサス配列でコーティングした96ウェルプレートにハイブリダイズさせた。標準的なELISA技術を使用して結合したタンパク質を検出した。CD3刺激により、低レベルのNF-κBサブユニットp65およびp50、並びに検出不可能なレベルのcFos、cRel、CREBを示し、これらの効果は、LFA-1刺激と同様であった。しかし、CD3刺激単独では、CD28およびLFA-1刺激よりも高いレベルのaft2を示した。CD28刺激単独では、低レベルのNF-κB p65およびp50サブユニットを示し、CREBのレベルが上昇した。LFA-1刺激では、わずかに高いレベルのNF-κB p65サブユニットおよびcRelを示した。B）CD3/CD28およびCD3/CD28/LFA-1刺激に対して（10Dg/ml、16時間）分泌されたIFNα、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5、IL-2、およびTNFαに対する細胞数測定ビーズアレイ（CBA）。値は、組換えサイトカインを使用する標準曲線に対して算出し、処置した細胞の上清から同時に測定した。CD3およびLFA-1刺激単独後のサイトカイン分泌の測定では、有意なサイトカイン分泌を報告せず、CD28刺激により、IFNαが低レベルになると共にIL-4およびIL-5が高レベルになった。
【図１０Ｄ】転写因子核局在化および活性のプロファイリングを証明する実験の結果を示す。A）NFAT-ルシフェラーゼ、NF-κB-ルシフェラーゼ、およびAP-1-ルシフェラーゼをトランスフェクトしたJurkat細胞のリポーター遺伝子アッセイ法。CD3、CD3/CD28、およびCD3/CD28/LFA-1刺激を行い（6時間、10μg/ml）、ルシフェラーゼ活性倍数をプロットしてある。B）CD3、CD28、およびLFA-1刺激（10μg/ml、12時間）に対する転写因子（図に示したとおり）の核プロフィール。核抽出物（5μg/ml）転写因子特異的コンセンサス配列DNAをコーティングしたプレートにハイブリダイズさせて、ELISAによって検出した。値は、ネガティブコントロールに対して規準化して、655nmの吸光度単位として示した。CD3/CD28およびCD3/CD28/sICAM-2刺激した細胞（上記の通り）の核プロフィール。C）CD3/CD28に対するNFAT-ルシフェラーゼリポーター活性および上記のとおりのCD3/CD28/LFA-1滴定（示したとおり）。D-E）は、CD3、CD28、およびLFA-1刺激の転写因子プロファイリング並びに細胞数測定のビーズアレイを示す実験の結果を示す。A）刺激した細胞の核抽出物を調製して、p65、p50、cFos、creb、atf2、およびcRelに対するコンセンサス配列でコーティングした96ウェルプレートにハイブリダイズさせた。標準的なELISA技術を使用して結合したタンパク質を検出した。CD3刺激により、低レベルのNF-κBサブユニットp65およびp50、並びに検出不可能なレベルのcFos、cRel、CREBを示し、これらの効果は、LFA-1刺激と同様であった。しかし、CD3刺激単独では、CD28およびLFA-1刺激よりも高いレベルのaft2を示した。CD28刺激単独では、低レベルのNF-κB p65およびp50サブユニットを示し、CREBのレベルが上昇した。LFA-1刺激では、わずかに高いレベルのNF-κB p65サブユニットおよびcRelを示した。B）CD3/CD28およびCD3/CD28/LFA-1刺激に対して（10Dg/ml、16時間）分泌されたIFNα、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5、IL-2、およびTNFαに対する細胞数測定ビーズアレイ（CBA）。値は、組換えサイトカインを使用する標準曲線に対して算出し、処置した細胞の上清から同時に測定した。CD3およびLFA-1刺激単独後のサイトカイン分泌の測定では、有意なサイトカイン分泌を報告せず、CD28刺激により、IFNαが低レベルになると共にIL-4およびIL-5が高レベルになった。
【図１０Ｅ】転写因子核局在化および活性のプロファイリングを証明する実験の結果を示す。A）NFAT-ルシフェラーゼ、NF-κB-ルシフェラーゼ、およびAP-1-ルシフェラーゼをトランスフェクトしたJurkat細胞のリポーター遺伝子アッセイ法。CD3、CD3/CD28、およびCD3/CD28/LFA-1刺激を行い（6時間、10μg/ml）、ルシフェラーゼ活性倍数をプロットしてある。B）CD3、CD28、およびLFA-1刺激（10μg/ml、12時間）に対する転写因子（図に示したとおり）の核プロフィール。核抽出物（5μg/ml）転写因子特異的コンセンサス配列DNAをコーティングしたプレートにハイブリダイズさせて、ELISAによって検出した。値は、ネガティブコントロールに対して規準化して、655nmの吸光度単位として示した。CD3/CD28およびCD3/CD28/sICAM-2刺激した細胞（上記の通り）の核プロフィール。C）CD3/CD28に対するNFAT-ルシフェラーゼリポーター活性および上記のとおりのCD3/CD28/LFA-1滴定（示したとおり）。D-E）は、CD3、CD28、およびLFA-1刺激の転写因子プロファイリング並びに細胞数測定のビーズアレイを示す実験の結果を示す。A）刺激した細胞の核抽出物を調製して、p65、p50、cFos、creb、atf2、およびcRelに対するコンセンサス配列でコーティングした96ウェルプレートにハイブリダイズさせた。標準的なELISA技術を使用して結合したタンパク質を検出した。CD3刺激により、低レベルのNF-κBサブユニットp65およびp50、並びに検出不可能なレベルのcFos、cRel、CREBを示し、これらの効果は、LFA-1刺激と同様であった。しかし、CD3刺激単独では、CD28およびLFA-1刺激よりも高いレベルのaft2を示した。CD28刺激単独では、低レベルのNF-κB p65およびp50サブユニットを示し、CREBのレベルが上昇した。LFA-1刺激では、わずかに高いレベルのNF-κB p65サブユニットおよびcRelを示した。B）CD3/CD28およびCD3/CD28/LFA-1刺激に対して（10Dg/ml、16時間）分泌されたIFNα、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5、IL-2、およびTNFαに対する細胞数測定ビーズアレイ（CBA）。値は、組換えサイトカインを使用する標準曲線に対して算出し、処置した細胞の上清から同時に測定した。CD3およびLFA-1刺激単独後のサイトカイン分泌の測定では、有意なサイトカイン分泌を報告せず、CD28刺激により、IFNαが低レベルになると共にIL-4およびIL-5が高レベルになった。
【図１１】ヒトナイーブCD4 T細胞におけるIL-4およびIFNαの細胞内産生を証明する実験の結果を示す。CD3対CD28およびCD3/CD28対LFA-1刺激の6時間後の刺激の滴定におけるIFNαおよびIL-4の細胞内レベル。平均蛍光値を刺激されていない細胞に対して規準化し、IL-4/IFNαの対数比を計算して、強度輪郭プロットとしてプロットした。強度レベルは、範囲指標（右）に示した。
【図１２】CD3/CD28およびCD3/CD28/LFA-1刺激（10Dg/ml、16時間）に対し分泌されたIFNα、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5、IL-5、およびTNFαに対する細胞数測定ビーズアレイおよび細胞数測定ビーズアレイ（CBA）を示す実験の結果を示す。値は、組換えサイトカインを使用して標準曲線に算出し、PharMingenからのCBAアレイを使用して、処置した細胞の上清から同時に測定した。
【図１３Ａ】NIH3T3における異所性ICAM-2のクラスタリングが、p44/42 MAPKカスケードを活性化したことを証明する実験の結果を示す。A）細胞表面にターゲットするICAM-2およびICAM2-ACレトロウイルス発現ベクター。ICAM-2およびICAM2-ACをトランスフェクトしたNIH3T3の原形質膜ターゲティングは、それぞれの末端に対して特異的な抗ヒト抗体を使用するフローサイトメトリーによって検証した。
【図１３Ｂ】NIH3T3における異所性ICAM-2のクラスタリングが、p44/42 MAPKカスケードを活性化したことを証明する実験の結果を示す。B）ウエスタンブロット法により、Jurkat細胞由来の内因性ICAM-2と比較したICAM-2およびICAM2-AC発現を検証した。
【図１３Ｃ】NIH3T3における異所性ICAM-2のクラスタリングが、p44/42 MAPKカスケードを活性化したことを証明する実験の結果を示す。C）p44/42 MAPKカスケードは、表面ICAM-2クラスタリングにより開始される。血清を欠乏させたICAM-2細胞を抗ヒトICAM-2モノクローナル抗体によって示された時間ICAM-2架橋した（10μg/ml）。細胞可溶化物を収集して、標準的な電気泳動および免疫ブロットプロトコルに供した。リン酸化されたタンパク質を検出するためにRAF、MEK、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Elk-1、およびRsk1に対するリン酸特異的抗体を使用した。次いで、ブロットを取り除き、規準化抗体（非リン酸特異的抗体）を使用してそれぞれのキナーゼに対して再びプローブした。
【図１３Ｄ】NIH3T3における異所性ICAM-2のクラスタリングが、p44/42 MAPKカスケードを活性化したことを証明する実験の結果を示す。D）p44/42 MAPKキナーゼ活性アッセイ法によって決定すると、ICAM-2クラスタリングにより、p44/42 MAPK活性を誘導する。血清欠乏細胞をICAM-2（10μg/ml）に対して30分間架橋して、p44/42 MAPK活性について評価した。陽性および陰性を示したレーンは、内部MAPKキナーゼコントロールを示しており、コントロールIgGは、誘導条件のネガティブコントロールとして使った。
【図１４Ａ】p44/42 MAPK活性が増殖速度の増強を媒介することを証明する実験の結果を示す。A）ICAM-2クラスタリングによって細胞周期に再び入って開始した。細胞を72時間血清欠乏させて、化学剤の非存在下において細胞を同調させ、その後にICAM-2架橋して（10μg/ml、18時間）、フローサイトメトリーによる細胞周期解析に供した。エラーバーは、三回の実験の標準偏差を意味する。特定の細胞周期段階のためのゲーティングを示してある（左）。
【図１４Ｂ】p44/42 MAPK活性が増殖速度の増強を媒介することを証明する実験の結果を示す。B）MTT細胞生存率測定によって測定すると、接触阻害により、細胞周期停止を誘導した。示した細胞タイプを96ウェルプレートに示したように細胞密度を増大させて播種し、MTT試薬と共に細胞をインキュベートすることによって細胞呼吸を測定した。産物の検出は、最初の2時間の沈殿期間の4時間後に580nmにて吸光度を読むことによって行った。エラーバーは、三回の実験の標準偏差を意味する。
【図１４Ｃ】p44/42 MAPK活性が増殖速度の増強を媒介することを証明する実験の結果を示す。C）全時間にわたって細胞密度によってモニターされる増殖速度。示した細胞タイプを104細胞にて播種し、示した時間を通じて標準的なクローン原性アッセイ法によって細胞密度をモニターした。エラーバーは、三回の実験の標準偏差を意味する。
【図１５Ａ】ICAM-2が表面β1、β2およびβ3インテグリンに結合することを証明する実験の結果を示す。A）アフィニティークロマトグラフィーにより、いくつかのICAM-2相互作用表面タンパク質を検出する。ICAM-2FITCプローブを導入したNIH3T3からICAM-2の免疫枯渇によって作製して、化学的にFITCに抱合し（第一および第二のパネル）、抗ICAM-2免疫ブロットおよび蛍光標識化によって試験した。標識プローブとしてICAM-2-FITCを利用するファーウエスタンアプローチにより、ICAM-2可溶化液の96および16kdA相互作用タンパク質バンドを検出する（第三のパネル）。ICAM-2およびベクターコントロール細胞の表面タンパク質をビオチン化して、構築されたICAM-2結合固体支持体およびストレプトアビジン-アガロース支持体を利用するアフィニティークロマトグラフィーデュアルカラム系に供した。ICAM-2相互作用し、および表面発現されるいくつかのタンパク質バンドを同定した（ストレプトアビジンFITCによって検出されるビオチン標識）（第四のパネル）。
【図１５Ｂ】ICAM-2が表面β1、β2およびβ3インテグリンに結合することを証明する実験の結果を示す。B）ICAM-2可溶性タンパク質は、細胞の表面と結合する。ICAM-2-FITCプローブを使用してNIH3T3、Jurkat、およびBaF3細胞を標識し、フローサイトメトリーによって検出した。従来のトリプシンでの細胞の処置により、ICAM-2-FITC結合が減った（右パネル）。
【図１５Ｃ】ICAM-2が表面β1、β2およびβ3インテグリンに結合することを証明する実験の結果を示す。C）ICAM-2は、β1、β2、およびβ3のインテグリンと相互作用する。ICAM-2固体支持体からの最終溶出およびその後のストレプトアビジン-アガロースカラム通過を、モノクローナル抗体を使用してβ-インテグリンに対して免疫ブロットした。β1、β2、およびβ3インテグリンの検出により、MALDLMS解析の質量分析読みを洗練して、検証した。
【図１５Ｄ】ICAM-2が表面β1、β2およびβ3インテグリンに結合することを証明する実験の結果を示す。D）β2インテグリンとのICAM-2相互作用は、p44/42 MAPKキナーゼ活性を誘導する。β-1、β2、およびβ3インテグリンは、ICAM-2、ICAM2-AC、およびベクターコントロール細胞におけるICAM-2架橋の前に血清欠乏させた細胞において、モノクローナル抗体で遮断された。
【図１５Ｅ】ICAM-2が表面β1、β2およびβ3インテグリンに結合することを証明する実験の結果を示す。E）定量的フローサイトメトリーによるインテグリンプロフィール評価。α-5、αL、β1、β2、β3、β4モノクローナル抗体をフィコエリトリン（PE）に抱合させて、QuantiBRiTE PEビーズを使用してフローサイトメトリーによって定量化した（同化のための材料および方法を参照されたい）。標準抗原濃度曲線の関数としての蛍光シグナルの線形回帰分析により、細胞あたりの表面分子の数を定量することができる。エラーバーは、三回の実験の標準偏差を意味する。
【図１５Ｆ】ICAM-2が表面β1、β2およびβ3インテグリンに結合することを証明する実験の結果を示す。F）可溶性ICAM-2で誘導されるp44/42 MAPKリン酸化および活性は、αLインテグリンに対する抗体によって遮断される。ICAM-2可溶性タンパク質を、血清欠乏させたJurkat細胞において、αLに対して前処置したモノクローナル抗体（mAb遮断実験と同様）の有無において、示した濃度にて30分間インキュベートした。ホスホ-p44/42 MAPK（左）およびp44/42 MAPK活性アッセイ法（右）のための免疫ブロット。
【図１６Ａ】ICAM-2/LFA-1相互作用が、PYK2およびSYKによってRafに伝達されることを証明する実験の結果を示す。Src関連キナーゼに対する種々の薬理学的阻害剤を使用する阻害剤スクリーンにより、PYK2およびSYKがICAM-2で誘導されるRafおよびp44/42 MAPKキナーゼへのシグナルを中継する際に必要なことを同定する。血清を欠乏させた細胞を10μMの示した化合物で処置して30分後にICAM-2を30分間架橋し（10μg/ml）、標準的な免疫ブロット法においてリン酸特異的抗体を使用してリン酸化されたRafおよびp44/42 MAPKについて評価する。0.1%のDMSOに溶解したコントロールIgGは、ネガティブコントロールとして使った。ブロットは、三回の実験を代表する。B）LFA-1サブユニットとのSYKおよびPYK相互作用は、ICAM-2相互作用により強められる。免疫共沈降実験を行ってαLおよびβ2インテグリンを免疫沈降し、示したように30分間刺激の関数として、SYKおよびPYKの存在について免疫ブロットした（抗体は10μg/mlにて使用し、化合物は、1μMで使用し、コントロール19は、ネガティブコントロールとして使った）。相互免疫共沈降により、β2インテグリン（下段パネル）とのPYKおよびSYKの会合を確認する。C）PYK2は、抗ホスホチロシン免疫沈降およびその後のPYK2に対する免疫ブロットによって決定すると、ICAM-2またはさらなる刺激の存在下においてリン酸化される。
【図１６Ｂ】ICAM-2/LFA-1相互作用が、PYK2およびSYKによってRafに伝達されることを証明する実験の結果を示す。Src関連キナーゼに対する種々の薬理学的阻害剤を使用する阻害剤スクリーンにより、PYK2およびSYKがICAM-2で誘導されるRafおよびp44/42 MAPKキナーゼへのシグナルを中継する際に必要なことを同定する。血清を欠乏させた細胞を10μMの示した化合物で処置して30分後にICAM-2を30分間架橋し（10μg/ml）、標準的な免疫ブロット法においてリン酸特異的抗体を使用してリン酸化されたRafおよびp44/42 MAPKについて評価する。0.1%のDMSOに溶解したコントロールIgGは、ネガティブコントロールとして使った。ブロットは、三回の実験を代表する。B）LFA-1サブユニットとのSYKおよびPYK相互作用は、ICAM-2相互作用により強められる。免疫共沈降実験を行ってαLおよびβ2インテグリンを免疫沈降し、示したように30分間刺激の関数として、SYKおよびPYKの存在について免疫ブロットした（抗体は10μg/mlにて使用し、化合物は、1μMで使用し、コントロール19は、ネガティブコントロールとして使った）。相互免疫共沈降により、β2インテグリン（下段パネル）とのPYKおよびSYKの会合を確認する。C）PYK2は、抗ホスホチロシン免疫沈降およびその後のPYK2に対する免疫ブロットによって決定すると、ICAM-2またはさらなる刺激の存在下においてリン酸化される。
【図１６Ｃ】ICAM-2/LFA-1相互作用が、PYK2およびSYKによってRafに伝達されることを証明する実験の結果を示す。Src関連キナーゼに対する種々の薬理学的阻害剤を使用する阻害剤スクリーンにより、PYK2およびSYKがICAM-2で誘導されるRafおよびp44/42 MAPKキナーゼへのシグナルを中継する際に必要なことを同定する。血清を欠乏させた細胞を10μMの示した化合物で処置して30分後にICAM-2を30分間架橋し（10μg/ml）、標準的な免疫ブロット法においてリン酸特異的抗体を使用してリン酸化されたRafおよびp44/42 MAPKについて評価する。0.1%のDMSOに溶解したコントロールIgGは、ネガティブコントロールとして使った。ブロットは、三回の実験を代表する。B）LFA-1サブユニットとのSYKおよびPYK相互作用は、ICAM-2相互作用により強められる。免疫共沈降実験を行ってαLおよびβ2インテグリンを免疫沈降し、示したように30分間刺激の関数として、SYKおよびPYKの存在について免疫ブロットした（抗体は10μg/mlにて使用し、化合物は、1μMで使用し、コントロール19は、ネガティブコントロールとして使った）。相互免疫共沈降により、β2インテグリン（下段パネル）とのPYKおよびSYKの会合を確認する。C）PYK2は、抗ホスホチロシン免疫沈降およびその後のPYK2に対する免疫ブロットによって決定すると、ICAM-2またはさらなる刺激の存在下においてリン酸化される。
【図１７Ａ】共焦点顕微鏡観察により、LFA-1とのICAM-2相互作用およびその後のPYK2のリン酸化後のJurkat細胞における表層膜に対するPYK2およびSYKの細胞再分布を明らかにすることを証明する実験からの結果を示す。Jurkat細胞を可溶性ICAM-2タンパク質（10μg/ml）またはウシ血清アルブミン（刺激されていない、10μg/ml）で10分間処置し、共焦点顕微鏡観察のために準備した（材料および方法を参照されたい）。細胞をPYK2、SYK2、およびチロシン402がリン酸化されたPYK2（PYK2 pTyr402と示した）に対して染色した。パネルA〜Fは、刺激されていない細胞を表し、パネルG〜Lは、ICAM-2処置した細胞を表す。矢印は、PYK2およびSYKの細胞分布の顕著な相違を強調するのに使う。スケールバーをパネルの左下角に示してある（マイクロメーターで）。パネルG〜Lは、高拡大で分布相違を明らかに見られる。
【図１７Ｂ】共焦点顕微鏡観察により、LFA-1とのICAM-2相互作用およびその後のPYK2のリン酸化後のJurkat細胞における表層膜に対するPYK2およびSYKの細胞再分布を明らかにすることを証明する実験からの結果を示す。Jurkat細胞を可溶性ICAM-2タンパク質（10μg/ml）またはウシ血清アルブミン（刺激されていない、10μg/ml）で10分間処置し、共焦点顕微鏡観察のために準備した（材料および方法を参照されたい）。細胞をPYK2、SYK2、およびチロシン402がリン酸化されたPYK2（PYK2 pTyr402と示した）に対して染色した。パネルA〜Fは、刺激されていない細胞を表し、パネルG〜Lは、ICAM-2処置した細胞を表す。矢印は、PYK2およびSYKの細胞分布の顕著な相違を強調するのに使う。スケールバーをパネルの左下角に示してある（マイクロメーターで）。パネルG〜Lは、高拡大で分布相違を明らかに見られる。
【図１８Ａ】細胞間接触により、フローサイトメトリーに基づいたキネシスアッセイ法によって決定されるLFA-1発現細胞におけるp44/42 MAPK活性およびICAM-2発現細胞におけるAKT活性を惹起することを証明する実験からの結果を示す。A）Jurkat細胞およびレトロウイルスで導入したICAM-2細胞を30分間混合して、CD3およびCD4表面マーカーに対する表面染色によるフローサイトメトリーに供して、蛍光抱合したリン酸特異的モノクローナル抗体（生産のための材料および方法を参照されたい）を使用してホスホ-p44/42MAPKおよびホスホ-AKTを細胞内染色した。蛍光対数強度に対して決定される高度および低度にリン酸化されたAKTおよびp44/42 MAPK集団をゲーティングして、CD3およびCD4表面マーカーに従って解析した。プロットは、CD3対ホスホ-AKTser473またはホスホ-p44/42を示すが、CD4についても同様である。
【図１８Ｂ】細胞間接触により、フローサイトメトリーに基づいたキネシスアッセイ法によって決定されるLFA-1発現細胞におけるp44/42 MAPK活性およびICAM-2発現細胞におけるAKT活性を惹起することを証明する実験からの結果を示す。B）細胞間ICAM-2/LFA-1相互作用により惹起されるシグナリング経路のモデル。LFA-1は、ICAM-2が係合すると、PYK2およびSYKを介して媒介されるRAF/MEK/MAPKカスケードを活性化する。ICAM-2発現細胞は、ICAM-2が細胞表面上でクラスター形成するにつれて、AKT生存経路を活性化する。
【図１９Ａ】スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対する抗アポトーシス分子についてのレトロウイルスライブラリースクリーンにより、ICAM-2を同定することを証明する実験の結果を示す。A）cDNAライブラリースクリーニングスキーム。107個のNIH3T3細胞にJurkat T細胞レトロウイルスcDNAライブラリーを感染させて、アポトーシスを誘導するために、スタウロスポリン（1μM）で24時間処置した（Stolzenberg et al., 2000）。生存するクローンを1週間増殖させて、3回の繰り返し選択に供した。どのウイルス成分が抗アポトーシス機能をコードしたかを決定するために、表現型導入アッセイ法を行った。生存細胞集団のアリコートに天然のモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）を感染させた。これにより、複製欠陥のあるウイルスのベクタープロウイルスをレスキューし、感染粒子を産生させた。NIH3T3細胞にレスキューされたウイルスベクターを感染させて、抗アポトーシス表現型を確認するためにスタウロスポリンで処置した。
【図１９Ｂ】スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対する抗アポトーシス分子についてのレトロウイルスライブラリースクリーンにより、ICAM-2を同定することを証明する実験の結果を示す。B）スタウロスポリン誘導アポトーシスのスクリーンを生存する集団の複雑さ。生存集団の複雑さを評価するためにRT-PCRを行った。生存集団（1D）は、いくつかの別々のバンドを示し、導入後集団（2D）は、単一バンドを示した。M-分子量マーカー。最初に10%にてライブラリー内に封じ込めたネガティブコントロールベクター（LacZ）は、検出不可能であったが、Bcl-2発現ベクターの非依存的感染は、容易に検出される。
【図１９Ｃ】スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対する抗アポトーシス分子についてのレトロウイルスライブラリースクリーンにより、ICAM-2を同定することを証明する実験の結果を示す。C）感染させたNIH3T3におけるICAM-2をコードするレトロウイルスベクターウエスタンブロット分析。
【図１９Ｄ】スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対する抗アポトーシス分子についてのレトロウイルスライブラリースクリーンにより、ICAM-2を同定することを証明する実験の結果を示す。D）ICAM-2をコードするレトロウイルスベクターは、表面ICAM-2を異所性に発現する。右パネル：BaF3 プロB細胞にICAM-2をコードするレトロウイルスのベクター構築物またはベクターコントロールを感染させ、フローサイトメトリーにより、内因性および発現されたICAM-2表面発現レベルをアッセイした。左パネル：フローサイトメトリーによって内因性ICAM-2の発現について染色したHUVEC細胞。
【図１９Ｅ】スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対する抗アポトーシス分子についてのレトロウイルスライブラリースクリーンにより、ICAM-2を同定することを証明する実験の結果を示す。E）スタウロスポリンまたは抗Fas抗体の24時間の処置に対するICAM-2を導入したNIH3T3およびJurkat T細胞の用量反応曲線。白正方形：ICAM-2発現細胞。黒正方形：ベクター単独を発現するコントロール細胞。スタウロスポリンまたは抗Fas mAbを伴わないそれぞれの培養におけるアポトーシス細胞の比率は、3%未満であった。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）±SDとして表してある。
【図２０Ａ】ICAM-2の過剰発現により、広く作用する抗アポトーシス表現型を生じることを証明する実験の結果を示す。A）スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対するICAM-2の効果をアネキシン-V結合アッセイ法によって評価した。ICAM-2発現NIH3T3およびベクターコントロールNIH3T3を、スタウロスポリン（1μM、24時間）の有無におけるアネキシン-V結合アッセイ法に供した。DMSO媒体をネガティブコントロールとして使った。スタウロスポリンを伴わないそれぞれの培養におけるアポトーシス細胞の比率は、5% +/-1.2であった。
【図２０Ｂ】ICAM-2の過剰発現により、広く作用する抗アポトーシス表現型を生じることを証明する実験の結果を示す。B）種々のアポトーシス誘導因子のある状況でのJurkat、NIH3T3、70Z/3、およびBaF3細胞におけるICAM-2過剰発現の効果。感染細胞を、示したとおりに24時間スタウロスポリン（1μ1M）、抗Fas抗体（5μg/ml）で処置するか、またはIL-3を欠乏させて、記述したとおりにアポトーシスについて評価した（Jacobson and Raff, 1995）。細胞にICAM-2、ICAM2-AN、ベクターコントロール、またはBcl-2をコードするレトロウイルス構築物を感染させ、示したようにアポトーシスに供した（24時間、70Z/3細胞：0.2μM STP、4時間）。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）+/-SDとして表してある。
【図２０Ｃ】ICAM-2の過剰発現により、広く作用する抗アポトーシス表現型を生じることを証明する実験の結果を示す。C）α-アクチニン結合部位が生存のために必要とされた。ICAM-2、野生型配列（赤い線）；ICAM2ΔC、細胞質のドメイン欠失（実線、細い線）；ICAM-2のCスクランブル、スクランブルしたα-アクチニン結合部位をもつ全長（ハッチングした線）を抗ICAM-2-FITCモノクローナル抗体（IC2/2）によってFACS選別し、エトポシドと共にインキュベートした（100μM、24時間）。エトポシド処置の後の24時間の回復期に続いて、生細胞をスコアした。生存する細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）+/-SDとして表してある。
【図２１Ａ】PI3-キナーゼがICAM-2の抗アポトーシスの効果のために必要であることを証明する実験の結果を示す。A）PI3Kの薬理学的阻害剤は、ICAM-2の抗アポトーシスを抑止する。ICAM-2またはベクターを導入したBaF3細胞を、100nMワートマニンの添加あり（黒）またはなし（白）にてスタウロスポリン（1μM）で24時間処置した（左の棒グラフ）。アポトーシスは、核染色および蛍光顕微鏡（左の棒グラフ）によって、およびアネキシン-V結合アッセイ法（右側の棒グラフ）によって決定した。スタウロスポリンを伴わないそれぞれの培養におけるアポトーシス細胞の比率は、8% +/-2であった。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）+SDとして表してある。ICAM-2、1CAM2-AC、またはベクターを導入したNIH3T3を、10μM LY294002の有無においてスタウロスポリン（1μM）で24時間処置した（右側の棒グラフ）。DMSO媒体をネガティブコントロールとして使った。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）+/-SDとして表してある。
【図２１Ｂ】PI3-キナーゼがICAM-2の抗アポトーシスの効果のために必要であることを証明する実験の結果を示す。B）ICAM-2（上段）またはベクターコントロール細胞（下段）におけるPI3KおよびAKT局在化の共焦点イメージ。
【図２１Ｃ】PI3-キナーゼがICAM-2の抗アポトーシスの効果のために必要であることを証明する実験の結果を示す。C）ICAM-2（上段）またはベクターコントロール細胞（下段）におけるエズリンおよびPI3Kのp85サブユニット（緑）の局在化の共焦点イメージ。
【図２２Ａ】ICAM-2シグナルが、ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル産生、PDK-1およびAKT活性化、並びにびその後のAKT下流エフェクターのリン酸化を生じることを証明する実験の結果を示す。A）ICAM-2は、αアクチニンおよびエズリンと相互作用する。ICAM-2、ICAM2-ΔC、またはコントロール細胞をICAM-2に対して免疫沈降させ、α-アクチニンまたはエズリンのいずれかに対して免疫ブロットした。コントロール可溶化液は、免疫沈降に供しておらず、検出された相互作用タンパク質のための正のコントロールを反映する。
【図２２Ｂ】ICAM-2シグナルが、ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル産生、PDK-1およびAKT活性化、並びにびその後のAKT下流エフェクターのリン酸化を生じることを証明する実験の結果を示す。B）ICAM-2細胞は、高レベルのホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステルを示す。ICAM-2およびコントロール細胞を血清欠乏させ（48時間）、LY294002（10μM、24時間）で処置するか、または増殖培地中で培養し、フローサイトメトリーによるホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル検出の細胞内検出のために調製する。
【図２２Ｃ】ICAM-2シグナルが、ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル産生、PDK-1およびAKT活性化、並びにびその後のAKT下流エフェクターのリン酸化を生じることを証明する実験の結果を示す。C）PDK-1 Iキナーゼレベルは、ICAM-2細胞において上昇し、Y-27632によって部分的に阻害される。PDK-1キナーゼを示した化合物と共にインキュベートした細胞から免疫沈降させて（10μM、1時間）、不活性SGK酵素およびペプチド基質での免疫キナーゼ反応に供した。ペプチド基質に対するATPのリン酸転移は、シンチレーション計数によって検出して、毎分カウント数CPMとして示した。
【図２２Ｄ】ICAM-2シグナルが、ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル産生、PDK-1およびAKT活性化、並びにびその後のAKT下流エフェクターのリン酸化を生じることを証明する実験の結果を示す。D）ICAM-2およびコントロール細胞の膜／サイトゾル画分におけるAKTに対する免疫ブロットおよびAKTキナーゼ活性。
【図２２Ｅ】ICAM-2シグナルが、ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル産生、PDK-1およびAKT活性化、並びにびその後のAKT下流エフェクターのリン酸化を生じることを証明する実験の結果を示す。E）AKTキナーゼレベル並びにセリン473およびスレオニン308の二重のリン酸化は、スタウロスポリンの存在下でICAM-2細胞において持続される。
【図２２Ｆ】ICAM-2シグナルが、ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル産生、PDK-1およびAKT活性化、並びにびその後のAKT下流エフェクターのリン酸化を生じることを証明する実験の結果を示す。F）AKTキナーゼ基質BADおよびGSK3は、スタウロスポリン処置後にICAM-2発現細胞においてリン酸化されるままである。DMSO媒体（-）または1μMスタウロスポリン（+）で処置したICAM-2、ICAM-2ΔC、およびコントロールベクター細胞からの抽出物を、示したように免疫ブロットによってBADおよびGSK3リン酸化についてアッセイした。
【図２３Ａ】内因性ICAM-2の結合が、エズリンのチロシンリン酸化を誘導し、PI3Kを膜にリクルートして、PDK-1およびAKTキナーゼ活性化を生じることを証明する実験の結果を示す。A）ICAM-2の発現レベルは、異なる起源の株化細胞全体で変化する。定量的フローサイトメトリー解析を行って、形質転換し、および形質転換していない線維芽細胞全体のICAM-2表面分子の数、T細胞および異なるB細胞分化状態のリンパ球、並びに骨髄球系統を評価した（生成のための材料および方法を参照されたい）。表面分子／細胞の数は、三回の実験の平均（バー）+/-SDとして表してある。
【図２３Ｂ】内因性ICAM-2の結合が、エズリンのチロシンリン酸化を誘導し、PI3Kを膜にリクルートして、PDK-1およびAKTキナーゼ活性化を生じることを証明する実験の結果を示す。B）内因性ICAM-2の架橋は、エズリンチロシンリン酸化を誘導し、ICAM-2相互作用を増強した。示されるように、Jurkat細胞をモノクローナル抗体を使用してICAM-2に対して示した時間架橋して、免疫沈降／免疫ブロットに供した。
【図２３Ｃ】内因性ICAM-2の結合が、エズリンのチロシンリン酸化を誘導し、PI3Kを膜にリクルートして、PDK-1およびAKTキナーゼ活性化を生じることを証明する実験の結果を示す。C）srcおよびRho依存的キナーゼの化学抑制剤によるエズリンホスホチロシンの阻害。
【図２３Ｄ】内因性ICAM-2の結合が、エズリンのチロシンリン酸化を誘導し、PI3Kを膜にリクルートして、PDK-1およびAKTキナーゼ活性化を生じることを証明する実験の結果を示す。D）ICAM-2の関数としてのエズリンリン酸化およびPI3Kのp85サブユニットとの相互作用の増強。上記のとおりに決定した。
【図２３Ｅ】内因性ICAM-2の結合が、エズリンのチロシンリン酸化を誘導し、PI3Kを膜にリクルートして、PDK-1およびAKTキナーゼ活性化を生じることを証明する実験の結果を示す。E）ICAM-2結合の関数としてのPDK-1活性、上記のとおりである）。
【図２３Ｆ】内因性ICAM-2の結合が、エズリンのチロシンリン酸化を誘導し、PI3Kを膜にリクルートして、PDK-1およびAKTキナーゼ活性化を生じることを証明する実験の結果を示す。F）ICAM-2結合の関数として、PI3KおよびAKTは膜に局在化する。時間の関数として、ICAM-2結合したJurkat細胞に対して膜／細胞内可溶質分画を行い、PI3KおよびAKTに対する免疫ブロットに供した。
【図２４Ａ】内因性ICAM-2の結合により、リンパ球におけるAKT活性化を誘導して、細胞を生存させることを証明する実験の結果を示す。A）ICAM-2架橋により、時間の関数としてJurkat T細胞におけるAKT活性、その後のGSK3、FKHR、およびAFXのリン酸化を誘導する。血清欠乏させたJurkat T細胞をアイソタイプコントロールまたは抗ヒトICAM-2（10μg/ml）のいずれかと共に示した時間インキュベートした。AKTキナーゼ活性は、記述したとおりに決定した。免疫ブロット解析により、ICAM-2架橋の関数としてAKT二重リン酸化、FKHRおよびGSK3リン酸化、並びにBADリン酸化を検証した。
【図２４Ｂ】内因性ICAM-2の結合により、リンパ球におけるAKT活性化を誘導して、細胞を生存させることを証明する実験の結果を示す。B）ICAM-2架橋により、BaF3プレ-B細胞におけるAKT活性が誘導される。
【図２４Ｃ】内因性ICAM-2の結合により、リンパ球におけるAKT活性化を誘導して、細胞を生存させることを証明する実験の結果を示す。C）スタウロスポリン（1μm6時間）で処置したJurkat T細胞でのICAM-2クラスタリングにより、アポトーシスの減少を示すことがフローサイトメトリーアネキシン-V結合アッセイ法によって測定される。スタウロスポリン（+）またはDMSO媒体（-）で処置の30分前に、ICAM-2 mAb（10μg/ml）を使用して106個のJurkat T細胞に対してICAM-2を架橋した。アポトーシスは、アネキシン-V結合アッセイ法を使用してフローサイトメトリーによって決定した。
【図２４Ｄ】内因性ICAM-2の結合により、リンパ球におけるAKT活性化を誘導して、細胞を生存させることを証明する実験の結果を示す。D）ICAM-2生存シグナルは、GTPγS、Psi-テクトリゲニン、Y-27632、およびハービマイシンAの存在下において抑止される。Jurkat細胞を示した阻害剤と共にインキュベートした後（10μM、1時間）、ICAM-2を架橋して（10μg/ml、1時間）抗Fas（50ng/ml、8時間）で処置した。細胞を、アネキシン-V結合アッセイ法によってアポトーシスについて評価した。
【図２４Ｅ】内因性ICAM-2の結合により、リンパ球におけるAKT活性化を誘導して、細胞を生存させることを証明する実験の結果を示す。E）ICAM-2架橋は、PI3Kとのエズリン会合を誘導する。ICAM-2、ベクターコントロール、Jurkat、およびICAM-2を架橋したJurkat細胞（10μg/ml、15分）を、示したとおりに免疫沈降およびその後の免疫ブロットに供した。
【図２５Ａ】ICAM-2の結合によりAKT活性を誘導し、初代B細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。A）ヒト末梢血単球をICAM-2について架橋した後（10μg/ml 45分）、TNFα 200ng/mlプラス1μg/mlシクロヘキシミド）および抗Fas抗体（10ng/mlのCH11）で12時間処置することによってアポトーシスに供した。多パラメーターFACS解析では、CD4+およびCD19+集団におけるICAM-2で誘導されるAKT活性が、アポトーシスから保護することを例証する。（1x106事象を最低80,000個のCD19+細胞を数え上げるために収集した）。
【図２５Ｂ】ICAM-2の結合によりAKT活性を誘導し、初代B細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。B）PBMCをICAM-1、-2、-3、CD43、またはCD44（10μg/ml 45分）について架橋して、フローサイトメトリーによるホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル、ホスファチジルイノシトール4,5二リン酸エステル、またはホスホ-AKTser473検出のホスファチジルイノシトール検出に供した。細胞サブセットは、示したようにゲートし、表示してある。
【図２５Ｃ】ICAM-2の結合によりAKT活性を誘導し、初代B細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。C）PBMCをICAM-1、-2、-3、CD43、またはCD44（10μg/ml 45分）について架橋した後、上記のとおりにアポトーシスを誘導した。アポトーシスをフローサイトメトリーによって検出されるアネキシン-V結合によって測定し、CD19+細胞をゲートした。
【図２５Ｄ】ICAM-2の結合によりAKT活性を誘導し、初代B細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。D）PBMCをICAM-2について架橋した後（10μM、30分）、阻害化合物Psi-テクトリゲニンおよびY-27632の有無において、上記のとおりアポトーシスを誘導した。アポトーシスは、アネキシン-V結合アッセイによって測定した。
【図２５Ｅ】ICAM-2の結合によりAKT活性を誘導し、初代B細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。E）LFA-1重ね合わせアッセイ法。LFA-1+Jurkat細胞をLY294002で処置した後に（2μM、1時間）ベクターコントロールまたはICAM-2発現細胞のいずれかに対して重ね合わせた。一部のJurkat試料をLFA-1またはMac-1に対するモノクローナル抗体で処置した後（5μg/ml、30分）、ICAM-2またはベクターコントロールに対して重ね合わせた。細胞を37℃にて30分間混合し、次いでフローサイトメトリーに供した。Jurkat細胞をゲートして、ホスホ-AktSer473 ICAM-2細胞を示した解析から除いた。
【図２５Ｆ】ICAM-2の結合によりAKT活性を誘導し、初代B細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。F）ICAM-2を媒介した細胞生存シグナルのためのモデル。ICAM-2オリゴマー形成により、Src/Rho依存的機構を介して、エズリンをリクルートし、リン酸化する。これにより、PI3Kのp85調節サブユニットとエズリンの相互作用を介して、膜にPI3Kがリクルートされる。PI3Kの膜転位置によりホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステルが産生され、これがPDK-1を活性化し、そのPHドメインに結合することによって原形質膜にAKTをリクルートする。サイトゾルAKTの膜への転位置により、PDK1/2はser473およびthr308にてAKTをリン酸化して、AKTを活性化することができる。AKTは、その後に下流エフェクターGSK3、BAD、FKHR（および潜在的に細胞型に応じてその他）をリン酸化する。これらのエフェクターのリン酸化により、アポトーシスを遮断して、生存シグナルを単独または相乗的に生じさせることができる。
【図２６Ａ】スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対する抗アポトーシス分子のためのレトロウイルスライブラリースクリーンを証明する実験の結果を示す。A）cDNAライブラリースクリーニングスキーム。107個のNIH3T3細胞にJurkat T細胞レトロウイルスcDNAライブラリーを感染させて、アポトーシスを誘導するために、スタウロスポリン（1μM）で24時間処置した（Stolzenberg et al., 2000）。生存するクローンを1週間増殖させて、3回の繰り返し選択に供した。どのウイルス成分が抗アポトーシス機能をコードしたかを決定するために、表現型導入アッセイ法を行った。生存細胞集団のアリコートに天然のモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）を感染させた。これにより、複製欠陥のあるウイルスのベクタープロウイルスをレスキューし、感染粒子を産生させた。NIH3T3細胞にレスキューされたウイルスベクターを感染させて、抗アポトーシス表現型を確認するためにスタウロスポリンで処置した。
【図２６Ｂ】スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対する抗アポトーシス分子のためのレトロウイルスライブラリースクリーンを証明する実験の結果を示す。B）スタウロスポリン誘導アポトーシスのスクリーンを生存する集団の複雑さ。生存集団の複雑さを評価するためにRT-PCRを行った。生存集団（1D）は、いくつかの別々のバンドを示し、導入後集団（2D）は、単一バンドを示した。M-分子量マーカー。最初に10%にてライブラリー内に封じ込めたネガティブコントロールベクター（LacZ）は、検出不可能であったが、BcL-2発現ベクターの非依存的感染は、容易に検出される。
【図２７Ａ】ICAM-2の過剰発現がスタウロスポリンで誘導されるアポトーシスを阻害することを証明する実験の結果を示す。A）感染させたNIH3T3におけるICAM-2をコードするレトロウイルスベクターウエスタンブロット分析。
【図２７Ｂ】ICAM-2の過剰発現がスタウロスポリンで誘導されるアポトーシスを阻害することを証明する実験の結果を示す。B）ICAM-2をコードするレトロウイルスベクターは、表面ICAM-2を異所性に発現する。右パネル：BaF3 プロB細胞にICAM-2をコードするレトロウイルスのベクター構築物またはベクターコントロールを感染させ、フローサイトメトリーにより、内因性および発現されたICAM-2表面発現レベルをアッセイした。左パネル：フローサイトメトリーによって内因性ICAM-2の発現について染色したHUVEC細胞。
【図２７Ｃ】ICAM-2の過剰発現がスタウロスポリンで誘導されるアポトーシスを阻害することを証明する実験の結果を示す。C）スタウロスポリンまたは抗Fas抗体の24時間の処置に対するICAM-2を導入したNIH3T3およびJurkat T細胞の用量反応曲線。白正方形：ICAM-2発現細胞。黒正方形：ベクター単独を発現するコントロール細胞。スタウロスポリンまたは抗Fas mAbを伴わないそれぞれの培養におけるアポトーシス細胞の比率は、3%未満であった。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）±SDとして表してある。
【図２７Ｄ】ICAM-2の過剰発現がスタウロスポリンで誘導されるアポトーシスを阻害することを証明する実験の結果を示す。D）ネガティブコントロールNIH3T3ベクターコントロールの核濃縮核（-STP）、ポジティブコントロールNIH3T3ベクターコントロール（+STP）、およびICAM-2発現NIH3T3。核は、Hoescht（5μg/ml）およびアクリジンオレンジ（25μM）および臭化エチジウム（25μM）で染色した。挿入は、細胞死または細胞生存度の程度を示す。
【図２７Ｅ】ICAM-2の過剰発現がスタウロスポリンで誘導されるアポトーシスを阻害することを証明する実験の結果を示す。E）スタウロスポリンで誘導されるアポトーシスに対するICAM-2の効果をアネキシン-V結合アッセイ法によって評価した。ICAM-2発現NIH3T3およびベクターコントロールNIH3T3を、スタウロスポリン（1μM、24時間）の有無におけるアネキシン-V結合アッセイ法に供した。DMSO媒体をネガティブコントロールとして使った。スタウロスポリンを伴わないそれぞれの培養におけるアポトーシス細胞の比率は、5% ± 1.2であった。
【図２８Ａ】ICAM-2が抗アポトーシスの効果を媒介することを証明する実験の結果を示す。A）種々のアポトーシス誘導因子のある状況でのJurkat、NIH3T3、70Z/3、およびBaF3細胞におけるICAM-2過剰発現の効果。感染細胞を、示したとおりに24時間スタウロスポリン（1μ1M）、抗Fas抗体（5μg/ml）で処置するか、またはIL-3を欠乏させて、記述したとおりにアポトーシスについて評価した（Jacobson and Raff, 1995）。Jurkat T細胞にICAM-2をコードするレトロウイルス構築物またはベクターコントロールで感染させた。マウス・プレ-B 70Z/3細胞にICAM-2をコードするレトロウイルスベクター構築物またはベクターコントロールを感染させて、スタウロスポリン（0.2μM）で4時間処置して、アポトーシスについて評価した。IL-3-依存的BaF3細胞に、ICAM-2、ICAM2-ΔN、またはBcl2をコードするレトロウイルスベクター構築物を感染させた。アポトーシスを誘導するために、細胞をIL-3-欠損培地において24時間維持した。ICAM-2または細胞外ドメインのインフレーム欠失をコードするレトロウイルスベクターを発現するBaF3-細胞を抗マウスFasで24時間処置して、細胞死について評価した。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）±SDとして表してある。
【図２８Ｂ】ICAM-2が抗アポトーシスの効果を媒介することを証明する実験の結果を示す。B）α-アクチニン結合部位は、生存のために必要とされる。NIH3T3細胞には、レトロウイルス構築物をコードするICAM-2：ICAM-2、野生型配列（ハッチングした線）；ICAM-2ΔC、細胞質のドメイン欠失（実線、細い線）；ICAM-2のCスクランブル、スクランブルしたα-アクチニン結合部位をもつ全長（ハッチングした線）を導入した。導入した細胞を未変性タンパク質（IC2/2）のみを認識した蛍光抱合抗ICAM-2モノクローナル抗体で標識した。次いで、細胞をFACSによって精製した（MoFlo, Cytomation, Ft. Collins, CO）。選別した細胞を培養し、次いで、細胞に100μMエトポシドを24時間曝露した。生存細胞を薬物の除去後に24時間回復させて、生細胞の数を記録した。生存細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）±SDとして表してある。
【図２８Ｃ】ICAM-2が抗アポトーシスの効果を媒介することを証明する実験の結果を示す。C）α-アクチニンおよびエズリンをICAM-2で免疫共沈降し、ICAM-2のC末端と相互作用させる。ICAM-2は、ICAM-2、ICAM2-ΔC、およびベクターコントロールを導入したNIH3T3から免疫沈降された。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離して、α-アクチニン、エズリン、およびICAM-2に対する免疫ブロッティングに供した。
【図２９Ａ】PI3Kの薬理学的阻害剤が、ICAM-2抗アポトーシスの効果を抑止することを証明する実験の結果を示す。A）ICAM-2の抗アポトーシスの効果は、ワートマニンおよびLY294002の両方に感受性である。ICAM-2またはベクターを導入したBaF3細胞を、100nMワートマニンの添加のあり（黒）またはなし（白）にてスタウロスポリン（1μM）で24時間処置した。アポトーシスは、核染色および蛍光顕微鏡（左の棒グラフ）によって、およびアネキシン-V結合アッセイ法（右側の棒グラフ）によって決定した。スタウロスポリンを伴わないそれぞれの培養におけるアポトーシス細胞の比率は、8%±2であった。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）±SDとして表してある。ICAM-2、1CAM2-ΔC、またはベクターを導入したNIH3T3を、10μM LY294002の有無においてスタウロスポリン（1μM）で24時間処置した。DMSO媒体をネガティブコントロールとして使った。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）±SDとして表してある。
【図２９Ｂ】PI3Kの薬理学的阻害剤が、ICAM-2抗アポトーシスの効果を抑止することを証明する実験の結果を示す。B）ICAM-2発現NIH3T3細胞は、PI3K阻害剤LY294002の存在下においてアポトーシスに感受性である。スタウロスポリン（1μM）またはLY294002（10μM）処置したICAM-2、ICAM2-ΔC、およびコントロールベクターを導入したNIH3T3細胞においてBrdU TUNELアッセイ法を行った。アポトーシス細胞の割合は、三回の培養の平均（バー）±SDとして表してある。
【図３０Ａ】ICAM-2がAKTキナーゼ活性並びにBADおよびGSKのリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。A）AKTキナーゼレベル並びにセリン473およびスレオニン308の二重リン酸化は、ICAM-2発現細胞において上昇し、スタウロスポリンの存在下において持続される。AKTキナーゼをスタウロスポリンの有無において（1μMスタウロスポリン（+）またはDMSO-媒体（-）で）ICAM-2、ICAM-2ΔC、およびコントロールベクター（pBMN-Z-IN-GFP）を発現するNIH3T3線維芽細胞から免疫沈降し、GSKタンパク質基質と共にインキュベートした。リン酸化されたGSKは、抗ホスホ-GSK特異的免疫ブロットによって同定した。
【図３０Ｂ】ICAM-2がAKTキナーゼ活性並びにBADおよびGSKのリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。B）AKTキナーゼ基質BAD、FKHR、およびGSK3は、スタウロスポリン処置後にもICAM-2発現細胞においてリン酸化されるままである。DMSO媒体（-）または1μMスタウロスポリン（+）で処置したICAM-2、ICAM-2ΔC、およびコントロールベクターを発現するNIH3T3線維芽細胞からの抽出物をBADおよびGSK3リン酸化について、およびBADおよびGSK3を免疫沈降してホスホ-BADまたはホスホ-GSK3特異的抗体での免疫ブロットによってアッセイした。
【図３０Ｃ】ICAM-2がAKTキナーゼ活性並びにBADおよびGSKのリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。C）ICAM-2の抗アポトーシスの効果は、免疫ブロットによって決定されるBcl-2またはBcl-XL/Sから独立している。ICAM-2またはICAM2-ΔCを導入したNIH3T3をDMSO媒体（-）または1μMスタウロスポリン（+）で24時間処置し、免疫ブロットによってBcl2およびBcl-XL/S発現についてアッセイした。
【図３０Ｄ】ICAM-2がAKTキナーゼ活性並びにBADおよびGSKのリン酸化を誘導することを証明する実験の結果を示す。D）ICAM-2の発現レベルは、異なる起源の株化細胞全体で変化する。定量的フローサイトメトリー解析を行って、形質転換し、および形質転換していない線維芽細胞全体のICAM-2表面分子の数、リンパ球T細胞および異なるB細胞の分化状態、並びに骨髄球系統を評価した。ゲノム平均蛍光値を、既知量のフィコエリスリン分子でラベルしたビーズのゲノム平均蛍光値に由来する標準曲線に対して補正した（生成のための材料および方法を参照されたい）。表面分子／細胞の数は、三回の実験の平均（バー）±SDとして表してある。
【図３１Ａ】内因性ICAM-2の架橋が、BaF3 B-細胞におけるAKT活性化を誘導し、Jurkat T細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。A）モノクローナル抗-ICAM2抗体でICAM-2を架橋することにより、AKT活性を誘導した。血清欠乏BaF3プレB細胞を正常ラットIgG2（アイソタイプコントロール）または抗マウスICAM-2のいずれかと共に10μg/mlにて示した時間インキュベートした。AKTキナーゼ活性を記述したとおりに決定した。免疫ブロット分析を行って、ICAM-2架橋の関数として、AKT二重のリン酸化、FKHRリン酸化、およびBADリン酸化を検証した。アイソタイプコントロールは、AKTリン酸化またはFKHRもしくはBAD（データ示さず）のリン酸化を誘導しなかった。
【図３１Ｂ】内因性ICAM-2の架橋が、BaF3 B-細胞におけるAKT活性化を誘導し、Jurkat T細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。B）スタウロスポリン（1μm6時間）で処置したJurkat T細胞でのICAM-2クラスタリングにより、アポトーシスの減少を示すことがフローサイトメトリーアネキシン-V結合アッセイ法によって測定される。スタウロスポリン（+）またはDMSO媒体（-）で処置の30分前に、モノクローナル抗-ICAM-2抗体（10μg/ml）を使用して106個のJurkat T-細胞でICAM-2を架橋した。アポトーシスは、アネキシン-V結合アッセイ法を使用してフローサイトメトリーによって決定した。（100,000事象を収集した）。
【図３１Ｃ】内因性ICAM-2の架橋が、BaF3 B-細胞におけるAKT活性化を誘導し、Jurkat T細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。C）Jurkat T細胞でのICAM-2架橋は、スタウロスポリン処置の際の死滅割合を低下させる。死細胞の割合は、三回の実験の平均（バー）±SDとして表される。
【図３１Ｄ】内因性ICAM-2の架橋が、BaF3 B-細胞におけるAKT活性化を誘導し、Jurkat T細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。D）ICAM-2架橋により、時間の関数としてJurkat T細胞におけるAKT活性、およびその後のGSK3、FKHR、AFXのリン酸化を誘導する。
【図３１Ｅ】内因性ICAM-2の架橋が、BaF3 B-細胞におけるAKT活性化を誘導し、Jurkat T細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。E）ICAM-2架橋は、スタウロスポリン誘導アポトーシスを克服することができる。106個のJurkat T-細胞を（+）によって示したようにスタウロスポリン（1μM）で1時間処置してアポトーシスを誘導した。スタウロスポリン誘導アポトーシスの1時間後に、モノクローナル抗-ICAM2抗体（10μg/ml）を使用してICAM-2を示された時間架橋した。切断されたカスパーゼの減弱は、アイソタイプコントロール（10μg/ml）（データ示さず）では観察されなかった。
【図３１Ｆ】内因性ICAM-2の架橋が、BaF3 B-細胞におけるAKT活性化を誘導し、Jurkat T細胞をアポトーシスから保護することを証明する実験の結果を示す。F）ICAM-2架橋は、AKT活性を誘導し、その後のBADのリン酸化、およびスタウロスポリンによるアポトーシスの誘導が作動しないようにするのに十分である。Jurkat細胞を上で述べたように処置した。AKT活性は、AKTキナーゼアッセイ法、並びにser473およびthr308に対するリン酸特異的抗体での免疫ブロットによる二重のリン酸化AKTの検出によって決定した。BADリン酸化は、BADに対する免疫沈降、続くリン酸特異的抗体ser112およびser136での免疫ブロッティングによって検出した。アイソタイプコントロール（10μg/ml）では、AKT活性化は生じなかった（データ示さず）。
【図３２Ａ】初代ヒトCD4+およびCD19+細胞においてTNFαおよびFasで誘導されるアポトーシスに対する耐性が、ICAM-2架橋後に活性AKTによって媒介されることを証明する実験の結果を示す。A）ヒト末梢血単球をモノクローナル抗体（中段パネル）または抗ICAM-2標識抗体（下段パネル）を使用して、ICAM-2クラスタリング後のAKT活性についてアッセイし、その後にCD4またはCD19マーカーをゲートした（50,000事象を収集した）。
【図３２Ｂ】初代ヒトCD4+およびCD19+細胞においてTNFαおよびFasで誘導されるアポトーシスに対する耐性が、ICAM-2架橋後に活性AKTによって媒介されることを証明する実験の結果を示す。B）ヒト末梢血単球をICAM-2について架橋した後（10μg/ml 45分）、TNFα 200ng/mlプラス1μg/mlシクロヘキシミド）および抗Fas抗体（10ng/mlのCH11）で12時間処置することによってアポトーシスに供した。多パラメーターFACS解析では、CD4+およびCD19+集団におけるICAM-2で誘導されるAKT活性が、アポトーシスから保護することを例証する。（1x106事象を最低80,000個のCD19+細胞を数え上げるために収集した）。
【図３２Ｃ】初代ヒトCD4+およびCD19+細胞においてTNFαおよびFasで誘導されるアポトーシスに対する耐性が、ICAM-2架橋後に活性AKTによって媒介されることを証明する実験の結果を示す。C）ICAM-2を媒介した抗アポトーシスシグナリングのためのモデル。ICAM-2は、細胞内リンカータンパク質のα-アクチニンおよびエズリンに結合し、これが原形質膜にPI3Kをリクルートする。PI3Kは、イノシトールリン酸を産生して、AKTを原形質膜に対してそのpHドメインに結合することによってリクルートする。サイトゾルAKTの膜への転位置により、PDK1/2はser473およびthr308にてAKTをリン酸化して、AKTを活性化することができる。AKTは、その後に下流エフェクターGSK3、BAD、FKHR（および潜在的に細胞型に応じてその他）をリン酸化する。これらのエフェクターのリン酸化により、アポトーシスを遮断して、生存シグナルを単独または相乗的に生じさせることができる。
【図３３Ａ】可溶性ICAM-2結合が、LFA-1クラスタリングおよび細胞骨格の分極を誘導することを証明する結果を示す。A）レトロウイルスで導入されたNIH3T3から精製したヒトICAM-2（材料および方法を参照されたい）を純度、サイズ、並びに未変性ゲル電気泳動およびゲル濾過による凝集形成について試験した。2つの異なる調製から精製したICAM-2およびNSO細胞からのICAM2-FCの解析。分子量は、標準分子量からの相対的な移動距離を使用して算出した。濃度は、標準としてBSAの段階希釈を使用して決定した。分子量および濃度は、図に示した。
【図３３Ｂ】可溶性ICAM-2結合が、LFA-1クラスタリングおよび細胞骨格の分極を誘導することを証明する結果を示す。B）時間の関数としての、細胞表面に対するICAM-2リガンド結合。5×106個の刺激していないJurkat T細胞およびPMA刺激したJurkat T細胞（1μg/ml、30分）をICAM-2-FITCまたはLFA-1-FITC抗体（1μg/ml）と共にインキュベートして、時間依存的フローサイトメトリーに供した。平均蛍光強度は、ゲートした同質の細胞集団の時間あたりにプロットした。流速は、200〜300細胞/秒に維持し、蛍光強度値を10ミリ秒間隔にて1200秒間得た。
【図３３Ｃ】可溶性ICAM-2結合が、LFA-1クラスタリングおよび細胞骨格の分極を誘導することを証明する結果を示す。C）サイトカラシンD処置した（10μM、30分）Jurkat細胞での37℃および4℃におけるICAM-2-FITCおよびα-LFA-1-FITC表面結合のフローサイトメトリー解析。
【図３３Ｄ】可溶性ICAM-2結合が、LFA-1クラスタリングおよび細胞骨格の分極を誘導することを証明する結果を示す。D）104細胞あたりのICAM-2-FITC結合の曲線フィット解析。Jurkat細胞を37℃にて30分間、示した濃度にて50μL体積でICAM-2-FITCと共にインキュベートした。細胞を1×洗浄して、104細胞の平均蛍光強度（MFI）を解析した。パーセントICAM-2-FITC結合は、以下の式から算出した：100×[（MFIM[x]−MFI未染色）／（MFI[飽和]-MFI未染色）]は、[x]=ICAM-2-FITC濃度および[飽和]=結合が飽和された濃度であった。値を式Y=m1*M0/（m2+M0）にあてはめた（材料および方法を参照されたい）。
【図３３Ｅ】可溶性ICAM-2結合が、LFA-1クラスタリングおよび細胞骨格の分極を誘導することを証明する結果を示す。E）〜H）可溶性ICAM-2およびICAM-2-FITC産生を示す。E）精製したICAM-2の未変性ゲル電気泳動。ゲルをクマシー染色し、精製したICAM-2は、凝集体を示さなかった（ゲル濾過の後に、本発明者らは、精製工程において添加したグリセロールがより高分子量種形成を除去することを見いだした）。
【図３３Ｆ】可溶性ICAM-2結合が、LFA-1クラスタリングおよび細胞骨格の分極を誘導することを証明する結果を示す。E）〜H）可溶性ICAM-2およびICAM-2-FITC産生を示す。F）未変性PAGEによるICAM-2の純度解析。量は、全てのレーンの濃度測定から決定した。パーセント純度は、レーンの総密度と比較してバンドの密度を算出することによって決定した。調製1（左）からの、および調製2（右）からのICAM-2。純度は、98%よりも大きかった。
【図３３Ｇ】可溶性ICAM-2結合が、LFA-1クラスタリングおよび細胞骨格の分極を誘導することを証明する結果を示す。E）〜H）可溶性ICAM-2およびICAM-2-FITC産生を示す。G）ICAM-2をFITCに抱合させて、精製した抱合体（回転クロマトグラフィによって）を抗ICAM-2抗体（左パネル）で免疫ブロットし、その後ゲル（右パネル）内の蛍光抱合について検証した。
【図３３Ｈ】可溶性ICAM-2結合が、LFA-1クラスタリングおよび細胞骨格の分極を誘導することを証明する結果を示す。E）〜H）可溶性ICAM-2およびICAM-2-FITC産生を示す。H）低濃度にて40℃におけるサイトカラシンDでの細胞の処置により、細胞のサブセットにおいてICAM-2結合の増強が引き起こされ、37℃にて飽和した。37℃および4℃におけるサイトカラシンD処置したJurkat細胞および未処置Jurkat細胞におけるフローサイトメトリーによるICAM-2-FITC表面結合の滴定。平均蛍光強度（MFI）をICAM-2-FITC濃度の関数としてプロットした。
【図３４Ａ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。A）Jurkat細胞におけるICAM-2刺激（10μg/ml、30分）によるアクチンおよび微小管構築の共焦点顕微鏡観察。アクチンは、ファロイジン-alexa633によって、およびチューブリンは、タキソール-alexa546によって染色した。挿入は、代表的処置における拡大した細胞イメージを示す。
【図３４Ｂ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。B）上記のとおりのアクチンおよび微小管に対するフローサイトメトリー染色。
【図３４Ｃ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。C）左：ICAM-2-FITCの蛍光形状解析（1μg/ml、示した時間）表面分布。強度色勾配は、高および低蛍光強度値を示す。右：ICAM-2-FITC表面結合（10μg/ml,30分）および抗β2-alexa568（クローンCTB104）の共焦点顕微鏡観察。
【図３４Ｄ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。D）37℃および4℃におけるサイトカラシンD処置したJurkat細胞におけるフローサイトメトリーによるICAM-2-FITC表面結合（蛍光強度）および表面分布（蛍光パルス）のための染色。
【図３４Ｅ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。E）テキストに記載されているように細胞あたりの飛行時間型あたりのICAM-2-FITC蛍光強度の値。
【図３４Ｆ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。F）mAb24-alexa633によるLFA-1活性化のためのフローサイトメトリー染色。示したとおりの刺激（10μM、30分）、PMA（1μg/ml）後のICAM-2刺激（10μg/ml、30分）。染色は、37℃にて行った。
【図３４Ｇ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。G）mAb24-633の平均蛍光強度（MFI）値およびICAM-2クラスター値は、時間の関数として上記のとおりに算出した。
【図３４Ｈ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。  H〜I）は、ICAM-2で誘導されるp44/42 MAPKリン酸化、およびLFA-1mAbによる阻害、並びにその他の刺激との比較を示す。H）ICAM-2で刺激したJurkat細胞からの総可溶化液のホスホ-p44/42 MAPK免疫ブロット（図に示した濃度、30分）、およびその後のLFA-1 mAbの濃度増大での遮断。
【図３４Ｉ】ICAM-2で誘導されるLFA-1クラスタリング、活性化、およびアクチン／微小管再編成の同時検出を証明する実験の結果を示す。  H〜I）は、ICAM-2で誘導されるp44/42 MAPKリン酸化、およびLFA-1mAbによる阻害、並びにその他の刺激との比較を示す。I）ホスホ-p44/42 MAPKのFACSに基づいた検出を使用する、刺激に対するホスホp44/2 MAPK誘導の比較。刺激は、1mg/ml（PHA、PMA、イオノマイシン）、10mg/ml（LFA-1mAbおよびICAM-2）、またはPD98059およびU0126について10mMのいずれかであった。化学的阻害は、刺激の30分前に行った。データは、刺激されていない細胞と比較したパーセントホスホ-p44/24 MAPK陽性細胞として示してある。LFA-1 mAb架橋とICAM-2刺激との間の分散に留意されたい。
【図３５Ａ】ICAM-2で誘導されるLFA-1相互作用を経たp44/42 MAPK活性化を証明する実験の結果を示す。A）処置したJurkat細胞（上記のとおり）におけるICAM-2-FITC（接着）およびmAb24-Alexa633（LFA-1活性化）の平均蛍光強度値（MFI）。コントロール非刺激および／または化合物前処理した値を減算した。
【図３５Ｂ】ICAM-2で誘導されるLFA-1相互作用を経たp44/42 MAPK活性化を証明する実験の結果を示す。B）上段パネル：フローサイトメトリーによるJurkat細胞におけるICAM-2用量の関数としての細胞内ホスホ-p44/42のMAPK検出（材料および方法を参照されたい）。平均蛍光強度値（MFI）には、±標準偏差（SD）をプロットした。下段パネル：ICAM-2処置したJurkat細胞を、上記のとおりに細胞内ホスホ-p44/42 MAPKについて染色した。示したとおりICAM-2処置の前にβ2およびαLインテグリンに対するmAb（10μg/ml、10分）を滴定し、MFI±SDをプロットした。
【図３５Ｃ】ICAM-2で誘導されるLFA-1相互作用を経たp44/42 MAPK活性化を証明する実験の結果を示す。C）ICAM-2で誘導されるp44/42 MAPK活性は、p44/42 MAPKキナーゼアッセイ法によって決定するとβ2およびαLインテグリン抗体によって遮断される。誘導および阻害のための条件は、上記のとおりである。組換え活性p44/42 MAPKを内部ポジティブコントロールとして使った（「+」によって示してある）。
【図３５Ｄ】ICAM-2で誘導されるLFA-1相互作用を経たp44/42 MAPK活性化を証明する実験の結果を示す。D）化学剤（10μM）、EDTA（1mM）、またはPMA、イオノマイシンおよびICAM-2刺激（上記のとおり）の存在下におけるフローサイトメトリーによる細胞内ホスホ-p44/42についての阻害および活性化プロフィール。MFI値±SDをプロットしてある。
【図３５Ｅ】ICAM-2で誘導されるLFA-1相互作用を経たp44/42 MAPK活性化を証明する実験の結果を示す。E）sICAM-2が、Pyk2およびSyk膜局在化を誘導することを示す。ICAM-2タンパク質（10mg/ml）またはウシ血清アルブミン（刺激されていない、10mg/ml）で10分間処置し、共焦点顕微鏡観察のために調製した（材料および方法を参照されたい）Jurkat細胞の共焦点顕微鏡観察。細胞をPyk2およびSykについて染色した。パネルA〜Cは、刺激されていない細胞を表し、パネルD〜Fは、ICAM-2処置した細胞を表す。スケールバーをパネルの左下角に示してある（マイクロメーターで）。
【図３６】ICAM-2で誘導されるPyk2およびSykのリン酸化、並びにα2インテグリン会合を証明する実験の結果を示す。A）チロシンキナーゼ阻害剤によるホスホ-rafおよびホスホ-p44/42免疫ブロット阻害プロフィール。1X106個の細胞を示した化合物で処置し（10μM、30分）、次いでICAM-2で刺激した（10μg/ml、30分）。細胞可溶化物をホスホ-rafおよびホスホ-p44/42について免疫ブロットした。化合物単独では、検出可能なリン酸化を誘導しなかった。B）Pyk2およびSykをリン酸化し、ICAM-2刺激時にα2インテグリンで免疫共沈降する。リン酸特異性は、ホスホ-PykpY402およびホスホ-syk（Tyr525/526）抗体によって決定した。C）時間あたりのICAM-2刺激の関数としての、PKCα/β、Pyk2、およびSykのリン酸化状態の動力学解析。細胞を処置して、上記のように加工した。リン酸特異的PKCα/βII（Thr638）および以下の抗体を使用した；Pyk2およびSykを最初に免疫沈降して、抗ホスホチロシン抗体（PY20）でプローブし、取り除いて、その後に示した非リン酸特異的抗体でプローブした。免疫ブロットは、三回の実験を代表する。E）LFA-1で誘導されるPyk2およびSykのリン酸化が、PKCに依存的であることを示す。本発明者らは、ホスホ-チロシンに基づいたELISAを使用して、sICAM-2で誘導されるPyk2およびSykリン酸化のチロシンキナーゼに対する化学抑制剤による阻害についてスクリーニングした。Pyk2リン酸化は、特異的Pyk2阻害剤のチルホスチンA9に加えて、PKC阻害剤ビスインドリマレイミドII（BIM II）およびスタウロスポリン（STP）の存在下において抑止された。また、Pyk2リン酸化は、ホスホリパーゼCgの阻害剤（ネオマイシン）、Sykの阻害剤（ピセタノール）、およびPKC阻害剤BIM Iによる影響を受けた（補充図4A）。Sykリン酸化は、Pyk2、PLCg1の阻害によって完全に抑止され、PKC阻害剤によって強い影響を受けた。したがって、Pyk2およびSykの両方のリン酸化は、PKC活性に依存的であったが、Sykリン酸化は、さらにPLCg1およびPyk2活性に依存的であった。この方法によって特異的PKCアイソザイムを評価することはできなかった。  それぞれの化学抑制剤の存在下において、それぞれのキナーゼのリン酸化状態を検証することによるsICAM-2刺激に応答するPKC、Pyk2、PLCg1、およびSyk活性の階層を決定するために、化学的遺伝的アプローチを行った。BIM IIでのPKCの阻害により、Pyk2、PLCgI、およびSykのリン酸化が抑止された。ネオマイシンによるPLCg1の阻害により、Sykのリン酸化が抑止され、Pyk2について阻害は観察されなかった。ピセタノールによるSykの阻害では、Pyk2またはPLCg1のリン酸化を遮断しなかった。これらの観察は、PKC活性化がPYK2、PLCg、およびSYK活性の上流にあること、またSYK活性がPYK2およびPLCg1活性に重要であることを示唆する。したがって、LFA-1からRaf-1への上流シグナリング事象には、PKC/Pyk2/PLCg1/Sykを含むように見える。しかし、本発明者らは、ホスホ-タンパク質免疫沈降技術では、複合体に存在するこれらの分子の可能性を除けないことを認める。本発明者らは、現在別の研究においてこれらの複合体を追求している。
【図３７】ICAM-2が、IL-2で活性化されたヒトPBMCにおける細胞障害性リンパ球活性を誘導することを証明する実験の結果を示す。A）PBMCをIL-2の存在下において12時間ICAM-2（10Dg/ml）で処置し、次いで、50：1のE：T比でCFSE標識した標的HL60細胞と共に4時間インキュベートした。残りのHL60細胞は、フローサイトメトリーによって定量化した。B）PBMCをIL-2（100U/ml、12時間）で処置し、ICAM-1、-2、または3 FCタンパク質（10Dg/ml）で処置して、上記のとおりの細胞障害性アッセイ法に使用した。結果は、4回の独立した実験を代表する。
【図３８Ａ】ICAM-2がCD56+CD8+細胞障害性リンパ球サブセットからパーフォリンおよびグランザイム放出を媒介してICAM-1およびICAM-3との分散を示すことを証明する実験の結果を示す。IL-2で活性化したPBMCを12時間ニセ処置（IgG）、ICAM-1、ICAM-2、またはICAM-3処置（10μg/ml FC融合タンパク質）した後、標的HL60細胞と共に50：1のE：T比で4時間インキュベーションした。次いで、細胞をCD8-CY5PE、CD56-PE表面染色、並びにパーフォリン-CY5およびグランザイム-A-FITC細胞内染料でのフローサイトメトリーのために調製した。細胞は、パネルIに示すしたようにCD56+CD8low、CD56+CD8med、CD56+CD8high、CD56-CD8-、CD56-CD8high集団について、適切なゲート内に集団頻度でゲートした。パネルII〜Vは、パーフォリンおよびグランザイム-A対数蛍光強度について示したサブセット・ゲート集団である。結果は、3回の独立した実験を代表してあり、25：1および12.5：1のE：T比と同様であった（データ示さず）。手動較正を行った。B）CD56CD8集団サブセットをゲートし（示したとおり）、ICAM-1、-2、-3刺激された細胞について細胞内パーフォリンを示した。パーフォリンの割合は、MFIが平均蛍光強度に等しい場合、以下の式から算出した：100×[（MFI実験-MFIアイソタイプmAb）／（MFIコントロール-MFIアイソタイプmAb）]。刺激していない細胞をコントロールとして使用した。C）細胞内グランザイム-A値は、上記のとおりに算出して示した。
【図３８Ａ−１】ICAM-2がCD56+CD8+細胞障害性リンパ球サブセットからパーフォリンおよびグランザイム放出を媒介してICAM-1およびICAM-3との分散を示すことを証明する実験の結果を示す。IL-2で活性化したPBMCを12時間ニセ処置（IgG）、ICAM-1、ICAM-2、またはICAM-3処置（10μg/ml FC融合タンパク質）した後、標的HL60細胞と共に50：1のE：T比で4時間インキュベーションした。次いで、細胞をCD8-CY5PE、CD56-PE表面染色、並びにパーフォリン-CY5およびグランザイム-A-FITC細胞内染料でのフローサイトメトリーのために調製した。細胞は、パネルIに示すしたようにCD56+CD8low、CD56+CD8med、CD56+CD8high、CD56-CD8-、CD56-CD8high集団について、適切なゲート内に集団頻度でゲートした。パネルII〜Vは、パーフォリンおよびグランザイム-A対数蛍光強度について示したサブセット・ゲート集団である。結果は、3回の独立した実験を代表してあり、25：1および12.5：1のE：T比と同様であった（データ示さず）。手動較正を行った。B）CD56CD8集団サブセットをゲートし（示したとおり）、ICAM-1、-2、-3刺激された細胞について細胞内パーフォリンを示した。パーフォリンの割合は、MFIが平均蛍光強度に等しい場合、以下の式から算出した：100×[（MFI実験-MFIアイソタイプmAb）／（MFIコントロール-MFIアイソタイプmAb）]。刺激していない細胞をコントロールとして使用した。C）細胞内グランザイム-A値は、上記のとおりに算出して示した。
【図３８Ａ−２】ICAM-2がCD56+CD8+細胞障害性リンパ球サブセットからパーフォリンおよびグランザイム放出を媒介してICAM-1およびICAM-3との分散を示すことを証明する実験の結果を示す。IL-2で活性化したPBMCを12時間ニセ処置（IgG）、ICAM-1、ICAM-2、またはICAM-3処置（10μg/ml FC融合タンパク質）した後、標的HL60細胞と共に50：1のE：T比で4時間インキュベーションした。次いで、細胞をCD8-CY5PE、CD56-PE表面染色、並びにパーフォリン-CY5およびグランザイム-A-FITC細胞内染料でのフローサイトメトリーのために調製した。細胞は、パネルIに示すしたようにCD56+CD8low、CD56+CD8med、CD56+CD8high、CD56-CD8-、CD56-CD8high集団について、適切なゲート内に集団頻度でゲートした。パネルII〜Vは、パーフォリンおよびグランザイム-A対数蛍光強度について示したサブセット・ゲート集団である。結果は、3回の独立した実験を代表してあり、25：1および12.5：1のE：T比と同様であった（データ示さず）。手動較正を行った。B）CD56CD8集団サブセットをゲートし（示したとおり）、ICAM-1、-2、-3刺激された細胞について細胞内パーフォリンを示した。パーフォリンの割合は、MFIが平均蛍光強度に等しい場合、以下の式から算出した：100×[（MFI実験-MFIアイソタイプmAb）／（MFIコントロール-MFIアイソタイプmAb）]。刺激していない細胞をコントロールとして使用した。C）細胞内グランザイム-A値は、上記のとおりに算出して示した。
【図３８Ａ−３】ICAM-2がCD56+CD8+細胞障害性リンパ球サブセットからパーフォリンおよびグランザイム放出を媒介してICAM-1およびICAM-3との分散を示すことを証明する実験の結果を示す。IL-2で活性化したPBMCを12時間ニセ処置（IgG）、ICAM-1、ICAM-2、またはICAM-3処置（10μg/ml FC融合タンパク質）した後、標的HL60細胞と共に50：1のE：T比で4時間インキュベーションした。次いで、細胞をCD8-CY5PE、CD56-PE表面染色、並びにパーフォリン-CY5およびグランザイム-A-FITC細胞内染料でのフローサイトメトリーのために調製した。細胞は、パネルIに示すしたようにCD56+CD8low、CD56+CD8med、CD56+CD8high、CD56-CD8-、CD56-CD8high集団について、適切なゲート内に集団頻度でゲートした。パネルII〜Vは、パーフォリンおよびグランザイム-A対数蛍光強度について示したサブセット・ゲート集団である。結果は、3回の独立した実験を代表してあり、25：1および12.5：1のE：T比と同様であった（データ示さず）。手動較正を行った。B）CD56CD8集団サブセットをゲートし（示したとおり）、ICAM-1、-2、-3刺激された細胞について細胞内パーフォリンを示した。パーフォリンの割合は、MFIが平均蛍光強度に等しい場合、以下の式から算出した：100×[（MFI実験-MFIアイソタイプmAb）／（MFIコントロール-MFIアイソタイプmAb）]。刺激していない細胞をコントロールとして使用した。C）細胞内グランザイム-A値は、上記のとおりに算出して示した。
【図３８Ａ−４】ICAM-2がCD56+CD8+細胞障害性リンパ球サブセットからパーフォリンおよびグランザイム放出を媒介してICAM-1およびICAM-3との分散を示すことを証明する実験の結果を示す。IL-2で活性化したPBMCを12時間ニセ処置（IgG）、ICAM-1、ICAM-2、またはICAM-3処置（10μg/ml FC融合タンパク質）した後、標的HL60細胞と共に50：1のE：T比で4時間インキュベーションした。次いで、細胞をCD8-CY5PE、CD56-PE表面染色、並びにパーフォリン-CY5およびグランザイム-A-FITC細胞内染料でのフローサイトメトリーのために調製した。細胞は、パネルIに示すしたようにCD56+CD8low、CD56+CD8med、CD56+CD8high、CD56-CD8-、CD56-CD8high集団について、適切なゲート内に集団頻度でゲートした。パネルII〜Vは、パーフォリンおよびグランザイム-A対数蛍光強度について示したサブセット・ゲート集団である。結果は、3回の独立した実験を代表してあり、25：1および12.5：1のE：T比と同様であった（データ示さず）。手動較正を行った。B）CD56CD8集団サブセットをゲートし（示したとおり）、ICAM-1、-2、-3刺激された細胞について細胞内パーフォリンを示した。パーフォリンの割合は、MFIが平均蛍光強度に等しい場合、以下の式から算出した：100×[（MFI実験-MFIアイソタイプmAb）／（MFIコントロール-MFIアイソタイプmAb）]。刺激していない細胞をコントロールとして使用した。C）細胞内グランザイム-A値は、上記のとおりに算出して示した。
【図３８Ｂ】ICAM-2がCD56+CD8+細胞障害性リンパ球サブセットからパーフォリンおよびグランザイム放出を媒介してICAM-1およびICAM-3との分散を示すことを証明する実験の結果を示す。IL-2で活性化したPBMCを12時間ニセ処置（IgG）、ICAM-1、ICAM-2、またはICAM-3処置（10μg/ml FC融合タンパク質）した後、標的HL60細胞と共に50：1のE：T比で4時間インキュベーションした。次いで、細胞をCD8-CY5PE、CD56-PE表面染色、並びにパーフォリン-CY5およびグランザイム-A-FITC細胞内染料でのフローサイトメトリーのために調製した。細胞は、パネルIに示すしたようにCD56+CD8low、CD56+CD8med、CD56+CD8high、CD56-CD8-、CD56-CD8high集団について、適切なゲート内に集団頻度でゲートした。パネルII〜Vは、パーフォリンおよびグランザイム-A対数蛍光強度について示したサブセット・ゲート集団である。結果は、3回の独立した実験を代表してあり、25：1および12.5：1のE：T比と同様であった（データ示さず）。手動較正を行った。B）CD56CD8集団サブセットをゲートし（示したとおり）、ICAM-1、-2、-3刺激された細胞について細胞内パーフォリンを示した。パーフォリンの割合は、MFIが平均蛍光強度に等しい場合、以下の式から算出した：100×[（MFI実験-MFIアイソタイプmAb）／（MFIコントロール-MFIアイソタイプmAb）]。刺激していない細胞をコントロールとして使用した。C）細胞内グランザイム-A値は、上記のとおりに算出して示した。
【図３８Ｃ】ICAM-2がCD56+CD8+細胞障害性リンパ球サブセットからパーフォリンおよびグランザイム放出を媒介してICAM-1およびICAM-3との分散を示すことを証明する実験の結果を示す。IL-2で活性化したPBMCを12時間ニセ処置（IgG）、ICAM-1、ICAM-2、またはICAM-3処置（10μg/ml FC融合タンパク質）した後、標的HL60細胞と共に50：1のE：T比で4時間インキュベーションした。次いで、細胞をCD8-CY5PE、CD56-PE表面染色、並びにパーフォリン-CY5およびグランザイム-A-FITC細胞内染料でのフローサイトメトリーのために調製した。細胞は、パネルIに示すしたようにCD56+CD8low、CD56+CD8med、CD56+CD8high、CD56-CD8-、CD56-CD8high集団について、適切なゲート内に集団頻度でゲートした。パネルII〜Vは、パーフォリンおよびグランザイム-A対数蛍光強度について示したサブセット・ゲート集団である。結果は、3回の独立した実験を代表してあり、25：1および12.5：1のE：T比と同様であった（データ示さず）。手動較正を行った。B）CD56CD8集団サブセットをゲートし（示したとおり）、ICAM-1、-2、-3刺激された細胞について細胞内パーフォリンを示した。パーフォリンの割合は、MFIが平均蛍光強度に等しい場合、以下の式から算出した：100×[（MFI実験-MFIアイソタイプmAb）／（MFIコントロール-MFIアイソタイプmAb）]。刺激していない細胞をコントロールとして使用した。C）細胞内グランザイム-A値は、上記のとおりに算出して示した。
【図３９】ICAM-2で誘導されるLFA-1を媒介したp44/42 MAPKが、ヒトCD56+CD8+細胞におけるLFA-1活性化と相関することを証明する実験の結果を示す。A）CFSE標識したHL60細胞およびCD56+CD8+細胞の抱合体形成。抱合体フローサイトメトリーに基づいたアッセイ法を、ICAM-2での処置（10μg/ml、30分）の前に、示した化学薬品（10μM、30分）で処置したPBMCに対して行った。CFSE標識されたHL60を25：1のE：T比で5分間インキュベートして、1%のパラホルムアルデヒドで固定した。次いで、細胞をCD8およびCD56抗体で免疫標識し、CD8+CD56+細胞集団をゲートして、パーセントHL60蛍光を総HL60細胞と比較して作製した。B）IL-2で活性化されたPBMCは、ICAM-2で処置（10μg/ml、30分）、またはニセ処置（IgG）のいずれかで処置し、活性LFA-1（mAb24-Alexa633）、ホスホ-p44/42-Ax488、CD8-CY5PE、およびCD56-PEについて染色した。CD56+CD8+細胞集団をゲートして、活性なLFA-1対ホスホ-p44/42について示してある。mAb24-Ax633およびホスホ-44/42-Ax488の平均蛍光強度（MFI）を上に記述したように全期間にわたって計算して、示した。
【図４０Ａ】サイトカイン応答パネルは、原発性急性骨髄性白血病におけるシグナル伝達ノードが増強したことを明らかにする。図40A、正常および白血病性の細胞のシグナル伝達ネットワークを調査するために、6つのホスホ-タンパク質標的による6つの刺激条件の格子をデザインした。列に示した刺激状態には、非刺激または20ng/mLのFL、GM-CSF、G-CSF、IL-3、もしくはIFN-γを含んだ。標的リン酸化には、列に示したStat1、Stat3、Stat5、Stat6、p38、およびErk1/2に対するリン酸特異的抗体を使用して検出した。格子のそれぞれの正方形は、1つの条件に対して1つのリン酸化部位の反応を表す（シグナリングノード状態と呼んだ）。格子とそれが基づいているフローサイトメトリーデータとの間の関係をU937細胞について図解してある。これらの細胞において、刺激されていない状態と比較して最も大きな増加を示した平均蛍光強度（MFI）が、IFN-γに続くStat1のリン酸化について観察された。
【図４０Ｂ】サイトカイン応答パネルは、原発性急性骨髄性白血病におけるシグナル伝達ノードが増強したことを明らかにする。図40B、HL-60 AML株化細胞、正常CD33+白血球、および6人のAML患者試料の代表サイトカイン応答パネルを示してある。これらのAML芽球を使用する繰り返し実験では同様の結果を得て（n=3）、正常な健康なドナー間の変異は、最小限であった（n=6）。それぞれのシグナリングノードの刺激に対する反応は、log2として算出される（MFI刺激した／MFI刺激していない）。
【図４１Ａ】腫瘍試料間で変動する基底および増強されたシグナリングノードを、AMLバイオシグネチャーを定義するために使用した。図41A、サイトカイン応答パネルを30人の総AML患者の試料に拡大して、それぞれのホスホ-タンパク質の基底および増強されたシグナリングを強調するように再編成した。それぞれの最初の列を色づけして、基底リン酸化の変化を示した（AML芽球の最小と比較して）。アッセイした900のサイトカイン反応の中で、93（10.3%）が刺激（0.55倍を超える）後に検出可能なリン酸化の増加を示した。ノード状態の分散を有意性を決定するために使用した。
【図４１Ｂ】腫瘍試料間で変動する基底および増強されたシグナリングノードを、AMLバイオシグネチャーを定義するために使用した。図41B、有意なサイトカイン応答は、主に7/30サイトカイン応答ノードに制限され、腫瘍全体に0.1（黄色の円）よりも大きく分散した。
【図４１Ｃ】腫瘍試料間で変動する基底および増強されたシグナリングノードを、AMLバイオシグネチャーを定義するために使用した。図41C、それぞれのノード状態のために分散に対してプロットした絶対中央値のグラフは、ノイズに対するシグナルの閾値を示す。7つの有意なサイトカイン応答状態および6つの基底リン酸化状態を腫瘍シグナル伝達の13個のパラメータープロフィールとして使用し、バイオシグネチャーと呼んた。
【図４２】臨床的予後のマーカーに対して有意な相関を示す4群からのシグナル伝達バイオシグネチャーによってAML患者を群化した。図42A、6人の正常な供血者（D01〜D06）、U937およびHL-60腫瘍株、並びに30人のAML患者試料に由来する分化したCD33+骨髄性細胞の13パラメーターのバイオシグネチャーを階層的クラスタリングを使用して類似性にしたがって群化した。AMLおよび腫瘍株サイトカイン応答についてのヒートマップをドナー試料中央値にスケール変更して、ダイナミックな色の範囲を提供した。正常なドナー試料は、共にクラスター形成し、群として表される。以前に示したように、基底反応は、AML試料内の最小と比較してある。図42B、AML患者の4つの主な群が、これらのシグナル伝達バイオシグネチャーの類似性に基づいて同定された。本発明者らは、Signaling Cluster（SC）命名法で、これらの群を、これらを定義するシグナリングに基づいて命名し、同定された患者の群内にいくつかの臨床マーカーをマップした。SC-P2またはSC-NPプロフィールをもつ患者試料は、対照的な臨床マーカーを示し、これらのマーカーは、SCを定義するサイトカイン応答と頻繁に相関される（有意性は、χ2乗試験を使用して評価した）。SC-P2およびSC-NPは、それぞれ患者の33.3%および36.7%に相当する。化学療法で処置したSC-P2プロフィールをもつ患者は、緩解を示さなかった（9/9、p=0.002）。SC-P2患者試料は、頻繁にFlt3（8/10）に突然変異を有するが、SC-NPプロフィールをもつ患者試料は、わずかなサイトカイン応答の増強しか示さず、野生型Flt3（9/11）はほとんど常に発現した（p=0.02）。SC-P2プロフィールをもつ試料は、まれにCD15/ルイスX抗原を発現した（9/10、p=0.03）。細胞遺伝学的変化により、SC-P2およびSC-NPの枝分れ間で分けられた（20/20,p<0.001）。
【図４３】原発性AMLにおけるFlt3突然変異は、骨髄球性のシグナル伝達ノードを増強し得る。図43A、野生型または突然変異体Flt3である患者試料の基底およびサイトカイン応答ノード状態は、アッセイした全30人のAMLについて示してある。リン酸化されたStat5のMFIは、野生型Flt3である患者と突然変異体Flt3である患者とにおいてほとんど異ならなかった。対照的に、GM-CSFで誘導されるStat5リン酸化およびG-CSFで誘導されるStat5およびStat3リン酸化は、全てFlt3突然変異と相関された（それぞれ、p=0.04、0.02、および0.01）。骨髄球性シグナリングに対するFlt3突然変異の全体的効果を表す方法として、本発明者らは、バイオシグネチャーからの4つの骨髄球性シグナリング状態のサイトカイン応答を合計した：p-Stat3/G-CSFおよびp-Stat5/GM-CSF/G-CSF/IL-3。この合計された骨髄球性のサイトカイン応答は、Flt3突然変異をもつAML患者において有意に高かった（p=0.005）。図43B、代表的な2Dフローサイトメトリープロットを、野生型Flt3をもつ5人の患者および突然変異体Flt3（ITD）をもつ6人の患者について示してある。プロットの最上列において、Stat5は、Flt3突然変異をもつAML芽球においてGM-CSFの15分後にリン酸化されたことを参照することができるが、Stat3ではできない。プロットの下段列において、Stat5およびStat3は、Flt3突然変異をもつAML芽球においてG-CSF刺激後にリン酸化される。両方の場合において、野生型Flt3をもつAML試料は、これらのノードにてサイトカイン応答の欠如を示した。
【図４４】野生型Flt3および突然変異体Flt3（ITD）をもつAML患者試料におけるG-CSF刺激後のStat5およびStat3リン酸化の代表的な2Dフローサイトメトリープロット。SC-NPおよびSC-P2からの患者の試料におけるStat5およびStat3リン酸化の2D輪郭プロット表現（それぞれ、yおよびx軸）。基底リン酸化のレベルおよびG-CSFに対する応答の両方を示してある。
【図４５Ａ】腫瘍バイオシグネチャーおよび腫瘍細胞シグナリングの増強されたモデル。図45A。腫瘍バイオシグネチャーを同定するための一般的な方法を、AMLにおけるSTATおよびRas/MAPKシグナリングノード状態の例を使用して示してある。
【図４５Ｂ−１】腫瘍バイオシグネチャーおよび腫瘍細胞シグナリングの増強されたモデル。図45B-1。プロフィールSC-NPおよびSC-P2からの腫瘍ネットワークの複合マップは、それぞれのクラスターにおいて観察される共通のシグナリング事象で構築した。強調したノードは、プロフィール群からの大部分の試料において基底が高いか、または増強されたことが検出された。
【図４５Ｂ−２】腫瘍バイオシグネチャーおよび腫瘍細胞シグナリングの増強されたモデル。図45B-2。プロフィールSC-NPおよびSC-P2からの腫瘍ネットワークの複合マップは、それぞれのクラスターにおいて観察される共通のシグナリング事象で構築した。強調したノードは、プロフィール群からの大部分の試料において基底が高いか、または増強されたことが検出された。
【図４６Ａ】SC-P2とプロファイルされた3人のAML患者は、増強されたシグナリング機構において類似性および相違を示した。個々の患者試料のシグナリング表現型を要約する経路マップを図45B-1のとおりにSC-P2とプロファイルされた3人について示してある。
【図４６Ｂ】SC-P2とプロファイルされた3人のAML患者は、増強されたシグナリング機構において類似性および相違を示した。個々の患者試料のシグナリング表現型を要約する経路マップを図45B-1のとおりにSC-P2とプロファイルされた3人について示してある。
【図４６Ｃ】SC-P2とプロファイルされた3人のAML患者は、増強されたシグナリング機構において類似性および相違を示した。個々の患者試料のシグナリング表現型を要約する経路マップを図45B-1のとおりにSC-P2とプロファイルされた3人について示してある。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
発明の詳細な説明
シグナリングカスケードの細胞内アッセイ法は、特定のシグナル伝達カスケード内のエレメントの活性化状態に基づいて機能的データを測定し、相関させることができないことによって限定されていた。このような測定および相関は、シグナリングの間に、または疾患徴候においてまれな細胞サブセットに生じるシグナリング状態の変化を区別するために重要である。シグナリングカスケードにおける変化の相関は、集団における病態の相違を分類する際にも使用を見いだすことができる。本発明は、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞において複数の活性化可能なエレメント（たとえばタンパク質）の活性化状態を同時に検出するための方法および組成物を提供することにより、並びにこのような状態を集団における相違に相関させるための解析手段を提供することにより、これらの問題に対応する。
【００５１】
以下は、これらの全体が明白に参照として組み入れられる：2002年7月10日に出願の米国特許出願第10/193,462号；2001年7月10日に出願の米国仮出願第60/304,434号、および2001年8月2日に出願の米国仮出願第60/310,141号。
【００５２】
本発明は、単一細胞において活性化可能なエレメントの活性化状態を調整することができる生理活性薬をスクリーニングする方法および組成物をさらに提供する。したがって、本方法および組成物は、疾病状態を予測し、または診断するために有用なだけでなく、疾病状態の治療をモニターするためにも有用である。たとえば、タンパク質のセットのリン酸化状態を決定することにより、関連したカテゴリー内の細胞の亜集団を分類およびクラスター化することができ、これは、次に予後、疾患進行、特定の薬物に対する反応、その他などの決定を行う際の助けとなる。
【００５３】
また、本発明は、特定エレメントの活性化状態と関連して集めることができる機能的データの量を増幅するための増強剤の使用を含む方法および組成物を提供する。たとえば、本発明の方法および組成物は、単一源に由来するが、個々に異なる増強剤（たとえば、種々のサイトカイン）に曝露された細胞の活性化プロフィールを決定するために使用することができ、異なる増強剤の影響によって生じる活性化プロフィールの変化を解析に取り込むことができる。
【００５４】
活性化
本明細書に使用される、「活性化可能なエレメント」またはこれらの文法的相当語句は、特定の生物学的、生化学的、または物理的特性、たとえば酵素活性、修飾（たとえば、翻訳後修飾）、または高次構造を有するエレメントの特定の形態に対応する少なくとも2つのアイソフォーム（および、場合によっては3つ以上のアイソフォーム）を有する細胞のエレメントをいう。好ましい態様において、活性化可能なエレメントは、タンパク質である。一般的に、下記の考察では、活性化可能なタンパク質をいうが、さらに下記に論議するとおり、脂質、炭水化物、および代謝産物などのその他の活性化可能な細胞エレメントも、含まれる。活性化可能なエレメントは、特定の生物活性、修飾、もしくは高次構造に関する活性化または非活性化であることができる。具体的には、活性化可能なタンパク質の「活性化された」または「活性な」アイソフォームは、特定の生物活性、修飾、または高次構造を有するが、活性化可能なタンパク質の「非活性化の」または「非活性な」アイソフォームは、それぞれ特定の生物活性、修飾、または高次構造を有さない（または、そのレベルが低いか、もしくは減弱されている）。一部の態様において、活性または活性化状態と関連する複数のアイソフォームがあってもよく；たとえば、活性化可能な酵素の場合、基質結合のために利用できる「開いた」高次構造と関連するアイソフォーム、第二の「遷移状態」アイソフォーム、および活性を欠いたアイソフォーム（たとえば、活性が阻害される場合）があってもよい。同様に、一定のタンパク質は、複数のリン酸化状態、複数のグリコシル化状態、その他を有してもよい。したがって、活性化可能なエレメントは、一般に「不活性」アイソフォームおよび少なくとも1つの「活性な」アイソフォームを有する。しかし、一部の場合には、アイソフォームを有さないエレメントを解析に含むことが望ましいかもしれず；たとえば、1つの読み出しが、特定の代謝産物の有無であることができ、たとえば、「活性化可能な」状態でなくてもよい。
【００５５】
好ましい態様において、活性化可能なエレメントの生物学的、生化学的な、または物理的性質（たとえば、酵素活性、修飾、または高次構造）は、活性化剤によって、もしくは細胞シグナリング事象によって誘導でき、または「活性化可能な」。活性化剤の例には、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ（たとえば、カスパーゼ）、薬物、およびホルモンを含むが、これらに限定されるわけではない。細胞シグナリング事象の例には、同族の分子もしくはリガンドをクラスター形成し、または結合するエレメントを含むが、これらに限定されるわけではない。これらの例を、とりわけ、下記に詳述する。
【００５６】
また、本発明は、「増強された」細胞を利用する。「活性化」とは対照的に、「増強された」状態は、増強剤に曝露後の細胞の状態をいい、場合によっては次いで活性化することができる。以下に詳細に記述したとおり、増強剤は、活性化可能なタンパク質が活性化アイソフォーム間を切り換える能力に直接または間接的に影響を与えることによって、シグナリングカスケードに対してこれらの効果を及ぼす。増強剤の例は、一般に、自然界における化学的／生化学的（たとえば、IIsおよびIFN）、または物理的な（熱的、pH、限定された培地、UV放射など）の両方の、細胞の活性化に関連した多種多様な環境合図を含む。
【００５７】
本明細書に使用される、「アイソフォーム」またはこれらの文法的相当語句は、特定の検出可能な生物活性、修飾、または高次構造を有する活性化可能なエレメントの形態をいう。アイソフォームは、活性化された（または、活性な）形態、または活性化可能なタンパク質の非活性化（または、活性でない）形態であることができる。特定の、もしくは特異的な特性または活性は、一般に活性化可能なタンパク質の活性化されたアイソフォームと関連し、時に本明細書において「活性化状態活性」と称される。
【００５８】
活性化のタイプ
活性化可能なタンパク質の活性化は、種々の異なる形態をとることができ、一般にタンパク質の生物学的、生化学的、および／または物理的特性の変化を含む。たとえば、多くの活性化可能なタンパク質は、タンパク質の共有結合性修飾に応答して動的に調節される。その他の活性化事象は、非共有結合性であってもよく；たとえば、多くの酵素の活性化は、一般に阻害剤分子の非共有結合を含むアロステリック阻害を受けやすい。
【００５９】
当業者に認識されるであろうとおり、多種多様な活性化事象の本発明における使用を見いだすことができる。一般に、基本的要求は、活性化により、いくつかの指標（「活性化状態指標」と名付けた）によって、好ましくは標識された結合エレメントに対する結合が変化することによって、または検出可能な生物活性の変化によって検出可能である活性化可能なタンパク質の変化を生じることである（たとえば、活性化状態は、非活性化状態の活性の欠如を測定することができ、かつ比較することができる酵素活性を有する）。重要なことは、検出可能な事象または部分を使用して、2つ以上の活性化状態（たとえば「オフ」および「オン」）のアイソフォームの間を区別することである。
【００６０】
したがって、本発明は、リン酸化、切断、プレニル化、分子間クラスター形成、高次構造変化、グリコシル化、アセチル化、システイニル化、ニトロシル化、メチル化、ユビキネーション（ubiquination）、硫酸化、並びにセレン含有タンパク質および融合タンパク質の活性化されたアイソフォームの産生を含むが、これらに限定されるわけではない多種多様な活性化事象の検出を提供する。
【００６１】
共有結合性修飾の1つの例は、アミノ酸の側鎖のヒドロキシル基に対するリン酸基の置換（リン酸化）である。特定のタンパク質基質を認識して、これらのタンパク質基質上のセリン、スレオニン、またはチロシン残基のリン酸化を触媒する多種多様なタンパク質が公知である。このようなタンパク質は、一般に「キナーゼ」と名付けられている。リン酸化することができる基質タンパク質は、ホスホタンパク質と呼ばれることが多い。一旦リン酸化されても、基質タンパク質は、基質タンパク質を特異的に認識するプロテインホスファターゼの作用により、そのリン酸化された残基がヒドロキシルのものへ変換し戻され得る。プロテインホスファターゼは、セリン、スレオニン、またはチロシン残基上のヒドロキシル基によるリン酸基の置換を触媒する。キナーゼおよびホスファターゼの作用を介して、タンパク質は、多数の残基上で可逆的または不可逆的にリン酸化され得るし、その活性は、これにより調節され得る。したがって、活性化可能なタンパク質の1つまたは複数のリン酸基の有無は、本発明の好ましい読み取りである。
【００６２】
活性化可能なタンパク質の共有結合性修飾のもう一つの例は、ヒストンのアセチル化である。種々のアセチラーゼおよびデアセチラーゼの活性を介して、ヒストンタンパク質のDNA結合機能が厳密に調節されている。さらに、ヒストンアセチル化およびヒストンデアセチル化は、悪性腫瘍の進行に連結していた。Nature, 2004 May 27； 429(6990)： 457-63を参照されたい。
【００６３】
活性化のもう一つの形態は、活性化可能なエレメントの切断を含む。たとえば、タンパク質制御の1つの形態は、ペプチド結合のタンパク分解性切断を含む。ランダムまたは誤った方向に向けられたタンパク分解性切断は、タンパク質の活性に有害であり得るが、多くのタンパク質は、特定のペプチド結合を認識して切断するプロテアーゼの作用によって活性化される。多くのタンパク質が、前駆体タンパク質またはプロタンパク質に由来し、これが、特異的なペプチド結合のタンパク分解性切断に続いてタンパク質の成熟アイソフォームを生じる。多くの成長因子は、このように合成されて、プロセスされ、タンパク質の成熟アイソフォームは、典型的には、前駆体形態によって示されない生物活性を有する。また、多くの酵素は、このように合成されて、プロセスされ、タンパク質の成熟アイソフォームは、典型的には酵素的に活性であり、タンパク質の前駆体形態は、酵素的に不活性である。このタイプの制御は、一般に可逆的ではない。したがって、タンパク質加水分解で活性化されたタンパク質の活性を阻害するには、「再付着」以外の機構を使用しなければならない。たとえば、多くのタンパク質加水分解で活性化されたタンパク質は、比較的短命なタンパク質であり、これらの代謝回転により、効率的にシグナルの非活性化を生じる。また、阻害剤を使用してもよい。セリンおよびシステインプロテアーゼは、タンパク質加水分解で活性化される酵素の一つには、カテプシンおよびカスパーゼを含む。
【００６４】
好ましい態様において、活性化可能な酵素は、カスパーゼである。カスパーゼは、プログラム細胞死（当技術分野において「アポトーシス」と称される）を媒介するプロテアーゼの重要な種類である。カスパーゼは、大部分の細胞に構成的に存在し、単鎖酵素前駆体としてサイトゾルに在る。これらは、鎖を大および小カスパーゼ・サブユニットに分けるための第一のタンパク分解性切断並びにN末端ドメインを除去するための第二の切断によって完全に機能的なプロテアーゼに活性化される。サブユニットは、2つの活性部位で四量体を構築する（Green, Cell 94：695-698, 1998）。また、当技術分野において「酵素前駆体」として公知の多くのその他のタンパク質加水分解で活性化される酵素も、活性化可能なエレメントとして本発明における使用が見いだされる。
【００６５】
代わりの態様において、活性化可能なエレメントの活性化は、エレメントのプレニル化を含む。「プレニル化」および本明細書に使用される文法的相当語句は、エレメントに対する任意の脂質基の付加を意味する。プレニル化の一般例は、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基の付加、ミリストイル化、およびパルミトイル化を含む。一般に、これらの基は、活性化可能なエレメントに対するチオエーテル結合を経て付着されるが、その他の付着を使用してもよい。
【００６６】
代わりの態様において、活性化可能なエレメントの活性化は、活性化可能なエレメントの分子間のクラスター形成として検出される。「クラスター形成」または「多量体化」、および本明細書に使用される文法的相当語句は、1つまたは複数のシグナル伝達エレメントの任意の可逆的または不可逆的会合を意味する。クラスターは、2、3、4、その他のエレメントで構成することができる。2つのエレメントのクラスターは、二量体と呼ばれる。3つ以上のエレメントのクラスターは、一般にオリゴマーと呼ばれ、クラスターの個々数が、それ自体の名称を有し；たとえば、3つのエレメントのクラスターは、三量体であり、4つのエレメントのクラスターは、四量体などである。
【００６７】
クラスターは、同一のエレメントまたは異なるエレメントから構成されることができる。同一のエレメントのクラスターは、「ホモ」クラスターと呼ばれ、異なるエレメントのクラスターは、「ヘテロ」クラスターと呼ばれる。したがって、クラスターは、β2-アドレナリン作動性受容体の場合と同様に、ホモ二量体であることができる。または、クラスターは、GABAB-Rの場合と同様に、ヘテロ二量体であることができる。その他の態様において、クラスターは、TNFαの場合と同様にホモ三量体であるか、または膜結合型および可溶性CD95によって形成されるものがアポトーシスを調整するようにヘテロ三量体である。さらなる態様において、クラスターは、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体の場合と同様に、ホモ-オリゴマーであるか、またはTGFβ1の場合と同様にヘテロ-オリゴマーである。
【００６８】
好ましい態様において、エレメントの活性化またはシグナリング能は、エレメントのクラスター形成が誘導される実際の機構にかかわりなく、クラスター形成によって媒介される。たとえば、エレメントは、a）リガンドに結合することによって膜結合した受容体として（両方の天然に存在する、または合成のリガンドを含むリガンド）、b）その他の表面分子に対する結合によって膜結合受容体として、またはc）リガンドに結合する細胞内（非膜結合）受容体として、活性化されてクラスター形成することができる。
【００６９】
好ましい態様において、活性化可能なエレメントは、細胞表面受容体などのリガンド結合によってクラスター形成する膜結合受容体エレメントである。本明細書に使用される「細胞表面受容体」は、直接または間接的に細胞の活性を調整し得る様式で、たとえば特異的プロモーターの細胞内二次メッセンジャー活性または転写を経て、細胞の表面に存在し、細胞外環境と相互作用し、および環境に関する情報を細胞内に伝達し、または導入して、特定の遺伝子の転写を生じる分子をいう。受容体エレメントの1つの種類には、リガンド結合により活性化されてクラスター形成する膜結合タンパク質またはタンパク質の複合体を含む。当技術分野において公知のとおり、これらの受容体エレメントは、種々の形態を有することができるが、一般に、これらは少なくとも3つのドメインを含む。第一に、これらの受容体は、細胞外または細胞内のいずれかに位置することができる（通常前者である）リガンド結合ドメインを有する。第二に、これらの受容体は、膜結合ドメイン（通常、膜貫通ドメイン）を有し、これは、7回膜貫通ドメイン（Gタンパク質結合受容体に関して下記に論議した）または脂質がそれ自体脂質二重層内に入るときに膜会合できる受容体のアミノ酸のうちの1つに対して、ミリスチル化などの脂質修飾という形をとることができる。最後に、受容体は、受容体の下流の効果を伝播する役割を担うシグナリングドメインを有する。
【００７０】
このような受容体エレメントの例には、PDGF-R（血小板由来成長因子受容体）、EGF-R（表皮成長因子受容体）、VEGF-R（血管内皮の成長因子）、uPAR（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体）、ACHR（アセチルコリン受容体）、IgE-R（免疫グロブリンE受容体）、エストロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体、インテグリン受容体（β1、β2、β3、β4、β5、β6、α1、α2、α3、α4、α5、α6）、MAC-1（β2およびcd11b）、αVβ3、オピオイド（opiod）受容体（μおよびκ）、FC受容体、セロトニン受容体（5-HT、5-HT6、5-HT7）、β-アドレナリン受容体、インスリン受容体、レプチン受容体、TNF受容体（組織壊死因子）、サイトカイン受容体（IL1-a、IL-b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、CCR5、CCR7、CXCR4、CCR-1-10、CCL20）、スタチン受容体、FAS受容体、BAFF受容体、FLT3受容体、GMCSF受容体、およびフィブロネクチン受容体を含むが、これらに限定されるわけではないホルモン受容体、サイトカイン受容体、ステロイド受容体、接着受容体、および成長因子受容体を含む。
【００７１】
好ましい態様において、活性化可能なエレメントは、サイトカイン受容体である。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、およびコロニー刺激因子を含む細胞間の連絡の可溶性メディエータのファミリーである。サイトカインの特徴的特色は、これらの機能的重複性および多面作用にある。異なるスーパーファミリーを構成する大部分のサイトカイン受容体は、固有のタンパク質チロシンキナーゼドメインを有していないが、それでも受容体刺激は、通常、受容体それ自体を含む細胞内タンパク質の迅速なチロシンリン酸化を引き起こす。サイトカイン受容体スーパーファミリーの多くのメンバーは、STAT転写活性化因子のリン酸化の結果としてJakタンパク質チロシンキナーゼファミリーを活性化する。IL-2、IL-4、IL-7、およびインターフェロンγは全て、Jakキナーゼを活性化することを示された（Frank et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：7779-7783）； （Scharfe et al. (1995) Blood 86：2077-2085）； （Bacon et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：7307-7311）；および（Sakatsume et al. (1995) J. Biol. Chem. 270：17528-17534）。また、Jakリン酸化の下流事象も解明されている。たとえば、IL-2に対するTリンパ球の曝露により、転写（STAT）タンパク質STAT1α、STAT1β、およびSTAT3の、並びに2つのSTAT関連タンパク質、p94およびp95のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子のリン酸化を生じることが示された。STATタンパク質は、核に転位置して、特定のDNA配列に結合することが見いだされ、したがって、IL-2が特定の遺伝子を活性化し得る機構が免疫細胞機能に関与することを示唆する（Frank et al. 前記）。Jak3は、IL-2、IL-4、およびIL-7サイトカイン受容体のガンマ鎖と会合する（Fujii et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92：5482-5486）および（Musso et al. (1995) J. Exp. Med. 181：1425-1431）。Jakキナーゼは、成長ホルモン、エリスロポエチン、およびIL-6などのサイトカイン受容体を経てそのシグナルを伝える多くのリガンドによって活性化されることが示された（Kishimoto (1994) Stem cells Suppl. 12：37-44）。
【００７２】
好ましい態様において、活性化可能なエレメントは、腫瘍壊死因子α受容体などの神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。腫瘍壊死因子α（TNF-αまたはTNF-α）は、主に活性化マクロファージおよびリンパ球によって産生されるが、内皮細胞およびその他の細胞型においても発現される多面的サイトカインである。TNF-αは、炎症性、免疫学的、および病態生理学的応答の主要なメディエータである。（Grell, M., et al., (1995) Cell, 83：793-802）。TNFの2つの異なる形態、26kDaの膜発現形態および26kDaの形態のタンパク分解性切断に由来する可溶性17kDaサイトカインが存在する。可溶性TNFポリペプチドは、長さ157のアミノ酸であり、主要な生物学的活性分子である。
【００７３】
TNF-αは、高親和性細胞表面受容体との相互作用を介してその生物学的効果を及ぼす。2つの異なった膜TNF-α受容体がクローニングされ、特徴づけられた。これらは、p55 TNF-Rと命名された55kDaの種とp75 TNF-Rと命名された75kDaの種である（Corcoran. A.E., et al., (1994) Eur. J. Biochem., 223：831-840）。2つのTNF受容体は、アミノ酸レベルで28%の類似性を示す。これは、細胞外ドメインに限定され、それぞれおよそ40アミノ酸の4回繰り返しシステインリッチモチーフからなる。それぞれのモチーフは、保存された位置に4〜6個のシステインを含む。デイホフ解析では、それぞれの受容体の最初の3回の繰り返し内に最も高いサブユニット間の類似性を示す。この特徴的構造は、TNF-R／神経成長因子受容体スーパーファミリーを含む多数のその他の受容体および細胞表面分子で共有されている（Corcoran. A.E., et al., (1994) Eur. J. Biochem., 223：831-840）。
【００７４】
TNFシグナリングは、三価のリガンドTNFによるか、または架橋モノクローナル抗体のいずれかによる受容体クラスター形成によって開始される（Vandevoorde, V., et al., (1997) J. Cell Biol., 137：1627-1638）。TNFおよび構造的に関連したサイトカインのリンホトキシン（LT）の結晶学的研究では、両サイトカインは、三つが対称に縁と縁が束ねられたサブユニットをもつホモ三量体として存在することを示した。構造的に、TNFまたはLTは、いずれもこれらの受容体の繰り返しパターンを反映しない。それぞれの単量体は、円錐形状であり、錐状体の塩基の対向側に、2つの親水性ループを含む。最近のp55可溶性TNF-R/LT複合体の結晶構造決定により、隣接した単量体からのループが共に連結して単量体間の溝を形成すること、およびTNF-Rがこれらの溝に結合するという仮説が確認された（Corcoran. A.E., et al., (1994) Eur. J. Biochem., 223：831-840）。
【００７５】
好ましい態様において、活性化可能なエレメントは、受容体チロシンキナーゼである。受容体チロシンキナーゼは、これらの細胞外ドメインの構造類似性およびこれらの細胞質ドメインのチロシンキナーゼ触媒領域の組織に基づいて5つのサブグループに分けることができる。サブグループI（上皮細胞成長因子（EGF）受容体様）、II（インスリン受容体様）、およびEPH/ECKファミリーは、システインリッチ配列を含む（Hirai et al., (1987) Science 238：1717-1720 および Lindberg and Hunter, (1990) Mol. Cell. Biol. 10：6316-6324）。これらの3種類の受容体チロシンキナーゼのキナーゼ領域の機能的ドメインは、隣接配列としてコードされる（Hanks et al. (1988) Science 241 ：42-52）。サブグループIII（血小板由来成長因子（PDGF）受容体様）およびIV（線維芽細胞成長因子（FGF）受容体）は、これらの細胞外ドメインに免疫グロブリン（Ig）様の折り畳みを有すること、並びにこれらが無関係なアミノ酸の不定範囲によって2部に分けられたキナーゼドメインを有することで特徴づけられる（Yanden and Ullrich (1988) supra および Hanks et al. (1988) 前記）。
【００７６】
公知のメンバーのうちで最も多数のファミリーは、Ephファミリー（元来は、エリスロポエチン産生肝臓癌株化細胞から単離されたファミリーの最初のメンバー）である。原型の記述から、Eph受容体（Hirai et al. (1987) Science 238：1717-1720）は、配列がこのファミリーの少なくとも10個のメンバーについて報告されており（一見オルソロガス受容体の計数ではない）複数の種において見いだされた。さらなる部分配列、および新たなメンバーがさらに報告される割合から、ファミリーがさらにより大きいことを示唆している（Maisonpierre et al. (1993) Oncogene 8：3277-3288； Andres et al. (1994) Oncogene 9：1461-1467； Henkemeyer et al. (1994) Oncogene 9：1001-1014； Ruiz et al. (1994) Mech. Dev. 46：87-100； Xu et al. (1994) Development 120：287-299； Zhou et al. (1994) J. Neurosci. Res. 37：129-143；およびTuzi and Gullick (1994) Br. J. Cancer 69：417-421の参照文献）。著しいことに、Ephファミリーは多数のメンバーであるにもかかわらず、これらの分子は全て、公知のリガンドがないオーファン受容体として同定された。
【００７７】
本明細書に使用される「Eph受容体」または「Eph-型受容体」という用語は、少なくとも11個のパラロガス遺伝子を含む受容体チロシンキナーゼの種類をいうが、この種類の中にはより多くの相同分子種、たとえば異なる種に由来する相同体が存在する。Eph受容体は、一般に、相同性によって関連された受容体の別々の群であり、容易に認識でき、たとえばこれらは、典型的にはN末端の近くのシステイン残基の特徴的間隔および2つのフィブロネクチンIII型リピートを含む細胞外ドメインによって特徴づけられる（Hirai et al. (1987) Science 238：1717-1720； Lindberg et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10：6316-6324； Chan et al. (1991) Oncogene 6：1057-1061； Maisonpierre et al. (1993) Oncogene 8：3277-3288； Andres et al. (1994) Oncogene 9：1461-1467； Henkemeyer et al. (1994) Oncogene 9：1001-1014； Ruiz et al. (1994) Mech. Dev. 46：87-100； Xu et al. (1994) Development 120：287-299； Zhou et al. (1994) J. Neurosci. Res. 37：129-143；およびTuzi and Gullick (1994) Br. J. Cancer 69:417-421の参照文献）。例示的なEph受容体は、eph、elk、eck、sek、mek4、hek、hek2、eek、erk、tyro1、tyro4、tyro5、tyro7、tyro11、cek4、cek5、cek6、cek7、cek8、cek9、cek10、bsk、rtk1、rtk2、rtk3、myk1、myk2、ehk1、ehk2、pagliaccio、htk、erk、およびnuk受容体を含む。
【００７８】
もう一つの態様において、受容体エレメントは、ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーは、本明細書において、3つのドメイン構造：活性化リガンドに結合する細胞外ドメイン、短い膜貫通セグメント、および細胞質に存在するドメインをもつ一回膜貫通受容体を定義するために使用される。これらの受容体の細胞外ドメインは、約200〜210アミノ酸を含むこれらの細胞外リガンド結合ドメインと、低いが有意な相同性を有する。相同領域は、領域のN末端の半分に位置する4つのシステイン残基、およびちょうど膜貫通ドメインの外側に位置するTrp-Ser-X-Trp-Ser（WSXWS）モチーフによって特徴づけられる。これらの受容体のさらに構造的なおよび機能的な詳細は、Cosman, D. et al., (1990)によって提供される。IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、成長ホルモンGM-CSF、G-CSF、M-CSFおよびエリスロポエチンの受容体は、たとえばこの受容体ファミリーのメンバーとして同定された。
【００７９】
さらなる態様において、受容体エレメントは、リンパ球機能抗原-1（LFA-1）以外のインテグリンである。ヘテロ二量体として機能する受容体のインテグリンファミリーのメンバーは、種々のαおよびβサブユニットで構成され、細胞の細胞骨格と細胞外基質との間の相互作用を媒介する。（Giancotti and Ruoslahti, Science 285、1999年8月13日に概説されている）。種々の組み合わせのαおよびβサブユニットにより、広範囲にわたるリガンド特異性を生じ、これは、細胞型特異的因子の存在下でさらに増大され得る。インテグリンクラスター形成は、RAS、MAPキナーゼ、およびホスホチジルイノシトール-3-キナーゼなどの多数の細胞内シグナルを活性化することが知られている。好ましい態様において、受容体エレメントは、以下のインテグリンから選択されるβインテグリンおよびαインテグリンで構成されるヘテロ二量体（LFA-1以外の）であるか；β1、β2、β3、β4、β5、β6、α1、α2、α3、α4、α5、およびα6、またはMAC-1（β2およびCd11b）、もしくはαVβ3である。
【００８０】
もう一つの態様において、活性化可能なエレメントは、その他の表面分子との接触によってシグナリングのためにクラスター形成する。論議した受容体とは対照的に、これらのエレメントは、その他の表面分子との接触により、シグナリングのためのクラスター形成し、一般に、リガンドとして第二の細胞の表面に提示された分子を使用する。このクラスの受容体は、細胞間相互作用に重要であり、細胞間接着および免疫認識などを媒介する。
【００８１】
このような受容体エレメントの例は、CD3（T細胞受容体複合体）、BCR（B細胞受容体複合体）、CD4、CD28、CD80、CD86、CD54、CD102、CD50、並びにICAM 1、2、および3である。
【００８２】
好ましい態様において、受容体エレメントは、T細胞受容体複合体（TCR）である。TCRは、2つの異なるヘテロ二量体のαβまたはγδのいずれかとして生じ、両方とも非多形CD3ポリペプチドγ、δ、ε、ζと共に発現される。CD3ポリペプチド、特にζおよびその変異体は、細胞内シグナリングのために重要である。αβTCRヘテロ二量体を発現する細胞は、大部分のリンパ様コンパートメントにおいて優勢であり、古典的なヘルパーまたは細胞障害性T細胞応答の役割を担う。多くの場合、αβTCRリガンドは、クラスIまたはクラスII MHC分子に結合したペプチド抗原である（Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott-Raven Publishers, 1999, Chapter 10, pp 341-367）。
【００８３】
好ましい態様において、受容体エレメントは、B細胞抗原受容体（BCR）である。特異的B細胞との抗原接触により、BCR膜貫通シグナリング機能がトリガーされる。BCR分子は、抗原結合後に迅速に内在化されて、エンドソームまたはリソソームにおける抗原摂取および分解を引き起こす。タンパク質抗原の場合、抗原由来ペプチドが、クラスII MHC分子の溝に結合する。結合により、この複合体が細胞表面に送られ、そこでこれが特異的ヘルパーT細胞のための刺激として役立つ。ヘルパーT細胞による抗原認識は、それがB細胞としっかりと、かつ持続性に相互作用するように、並びにB細胞増殖および分化因子を合成するように誘導する。このような方法で活性化されたB細胞を増殖させて、抗体分泌細胞（形質細胞とも呼ばれる）に末端分化させてもよい（Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott-Raven Publishers, 1999, Chapters 6-7, pp 183-261）。
【００８４】
好ましい態様において、エレメントは、細胞内接着分子（ICAM）である。ICAM-1、-2、および-3は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着分子である。これらの受容体のそれぞれが、一回膜貫通ドメインを有し、全てが、Ig-ループに構造が類似する細胞外結合ドメインを経てβ2インテグリンに結合する。（Signal Transduction, Gomperts, et al., eds, Academic Press Publishers, 2002, Chapter 14, pp 318-319）。
【００８５】
もう一つの態様において、活性化可能なエレメントは、Gタンパク質結合受容体の大ファミリーのメンバーである。Gタンパク質結合受容体がクラスター形成できることは、最近報告された。（Kroeger, et al., J Biol Chem 276：16, 12736-12743、2001年4月20日； Bai, et al., J Biol Chem 273：36, 23605-23610、 1998年9月4日； Rocheville, et al., J Biol Chem 275 (11), 7862-7869、2000年3月17日）。本明細書に使用されるGタンパク質結合受容体およびこれらの文法的相当語句は、ヘテロ三量体の「Gタンパク質」と結合する受容体のファミリーをいう。多くの異なるGタンパク質が受容体と相互作用することが公知である。Gタンパク質情報伝達系は、3つの成分：受容体自体、GTP結合タンパク質（Gタンパク質）、および細胞内標的タンパク質を含む。細胞膜は、スイッチボードとして作用する。受容体が、同じタイプのGタンパク質に対して作用する場合、異なる受容体を介して届くメッセージにより単一の効果を生じ得る。一方、受容体が異なる種類のGタンパク質に対して作用する場合、またはGタンパク質が異なるエフェクターに対して作用する場合、単一の受容体を活性化するシグナルにより、複数の効果を生じ得る。
【００８６】
これらの静止状態において、アルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）サブユニットからなるGタンパク質は、ヌクレオチドグアノシン二リン酸（GDP）と複合体を形成し、受容体と接触する。ホルモンまたはその他の第一メッセンジャーが、受容体に結合すると、受容体は、高次構造を変え、これにより、Gタンパク質とのその相互作用を変化させる。これにより、αサブユニットがGDPを放出するようになり、より大量のヌクレオチドグアノシン三リン酸（GTP）がそれを置換して、Gタンパク質を活性化する。次いで、Gタンパク質は解離して、なおも複合体を形成したβおよびγサブユニットからαサブユニットを分離する。経路に応じて、GαサブユニットまたはGβγ複合体がエフェクターと相互作用する。エフェクター（これは、たいてい酵素である）は、次々と不活性前駆体分子を活性な「二次メッセンジャー」（細胞質を介して広まってもよい）に変換し、代謝カスケードをトリガーする。数秒後に、Gαは、GTPをGDPに変換し、これによりそれ自体を不活性化する。次いで、不活性化されたGαは、Gβγ複合体と再び会合し得る。
【００８７】
何百（何千ではない場合）もの受容体が、ヘテロ三量体Gタンパク質を介してメッセージを伝えるが、そのうちの少なくとも17個の異なった形態が単離されている。最も大きな変動は、αサブユニットにおいて見られるが、いくつかの異なるβおよびγサブユニットが報告されている。さらに、多くの異なるGタンパク質依存的エフェクターが存在する。
【００８８】
大部分のGタンパク質結合受容体は、7回原形質膜をとおった単一タンパク質鎖で構成される。このような受容体は、7回膜貫通受容体（STR）と称されることが多い。同じリガンドに結合する多くの異なる受容体を含む100個以上の異なるSTRが見いだされており、より多くの発見を待っているSTRが存在する可能性が高い。
【００８９】
加えて、天然リガンドが未知であるSTRも同定され；これらの受容体は、上記したように、「オーファン」Gタンパク質結合受容体と呼ばれる。例には、Neote et al. (1993) Cell 72, 415； Kouba et al. FEBS Lett. (1993)321 , 173；およびBirkenbach et al. (1993) J. Virol. 67, 2209によってクローニングされた受容体を含む。
【００９０】
Gタンパク質結合受容体のための公知のリガンドには、以下を含む：アデノシン、cAMP、ATP、UTP、ADP、メラトニンなどのプリンおよびヌクレオチド；5‐ヒドロキシトリプタミン、アセチルコリン、ドーパミン、アドレナリン、ヒスタミン、ノルアドレナリン、チラミン／オクトパミンなどの生体アミン（および関連した天然リガンド）およびその他の関連化合物；副腎皮質刺激ホルモン（acth）、メラニン細胞刺激ホルモン（msh）、メラノコルチン、ニューロテンシン（nt）、ボンベシンおよび関連したペプチド、エンドセリン、コレシストキニン、ガストリン、ニューロキニンb（nk3）、無脊椎動物タキキニン様ペプチド、物質k（nk2）、物質p（nk1）、神経ペプチドy（npy）、甲状腺刺激ホルモン放出因子（trf）、ブラジキニン、アンジオテンシンii、β‐エンドルフィン、c5aアナフィラトキシン（anaphalatoxin）、カルシトニン、ケモカイン（インタークリンとも呼ばれる）、コルチコトロピン放出因子（crf）、ダイノルフィン、エンドルフィン、fmlpおよびその他のホルミル化されたペプチド、フォリトロピン（fsh）、真菌接合フェロモン、ガラニン、胃抑制ポリペプチド受容体（gip）、グルカゴン様ペプチド（glps）、グルカゴン、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（gnrh）、成長ホルモン放出ホルモン（ghrh）、昆虫利尿ホルモン、インターロイキン-8、ロイトロピン（leutropin）（1h/hcg）、メト-エンケファリン、オピオイドペプチド、オキシトシン、副甲状腺ホルモン（pth）およびpthrp、下垂体アデニリルシクラーゼ活性化ペプチド（pacap）、セクレチン、ソマトスタチン、トロンビン、甲状腺刺激ホルモン（tsh）、血管作用性小腸ペプチド（vip）、バソプレッシン、バソトシンなどのペプチド；ip-プロスタサイクリン、pg-プロスタグランジン、tx-トロンボキサンなどのエイコサノイド；脊椎動物11-シスレチナール、無脊椎動物11-シスレチナール、およびその他の関連化合物などの網膜に基づいた化合物；カンナビノイド、アナンダミド、リゾホスファチジン酸、血小板活性化因子、ロイコトリエンなどの脂質および脂質に基づいた化合物；カルシウムイオンおよびグルタミン酸などの興奮性アミノ酸およびイオン。
【００９１】
好ましいGタンパク質結合受容体には、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：α1-アドレナリン作動性受容体、α1β-アドレナリン作動性受容体、α2-アドレナリン作動性受容体、α2B-アドレナリン作動性受容体、β1-アドレナリン作動性受容体、β2-アドレナリン作動性受容体、β3-アドレナリン作動性受容体、m1アセチルコリン受容体（AChR）、m2 AChR、m3 AChR、m4 AChR、m5 AChR、D1ドーパミン受容体、D2ドーパミン受容体、D3ドーパミン受容体、D4ドーパミン受容体、D5ドーパミン受容体、A1アデノシン受容体、A2aアデノシン受容体、A2bアデノシン受容体、A3アデノシン受容体、5-HT1a受容体、5-HT1b受容体、5HT1様受容体、5-HT1d受容体、5HT1d様受容体、5HT1dβ受容体、サブスタンスK（ニューロキシンA）受容体、fMLP受容体（FPR）、fMLP様受容体（FPRL-1）、アンジオテンシンII 1型受容体、エンドセリンETA受容体、エンドセリンETB受容体、トロンビン受容体、成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）受容体、血管作用性小腸ペプチド受容体、オキシトキシン受容体、ソマトスタチンSSTR1およびSSTR2、SSTR3、カンナビノイド受容体、卵胞刺激ホルモン（FSH）受容体、ロイトロピン（LH/HCG）受容体、甲状腺刺激ホルモン（TSH）受容体、トロンボキサンA2受容体、血小板活性化因子（PAF）受容体、C5aアナフィラトキシン受容体、CXCR1（IL-8受容体A）、CXCR2（IL-8受容体B）、δオピオイド受容体、κオピオイド受容体、mip-1α／ランテス受容体（CRR1）、ロドプシン、レッドオプシン、グリーンオプシン、ブルーオプシン、代謝調節型グルタミン酸mGluR1-6、ヒスタミンH2受容体、ATP受容体、ニューロペプチドY受容体、アミロイドタンパク質前駆体受容体、インスリン様成長因子II受容体、ブラジキニン受容体、生殖腺刺激ホルモン受容体、コレシストキニン受容体、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、抗利尿ホルモン受容体、グルカゴン受容体、および副腎皮質刺激ホルモンII受容体。加えて、細胞に対するHIVウイルスの付着に関与する少なくとも5つの受容体（CCおよびCXC受容体）がある。HIVのための2つの主要な補助受容体は、CXCR4（fusin受容体、LESTR、SDF1受容体）およびCCR5（m向性）である。より好ましい受容体には、以下のヒト受容体を含む：メラトニン受容体1a、ガラニン受容体1、ニューロテンシン受容体、アデノシン受容体2a、ソマトスタチン受容体2、およびコルチコトロピン放出因子受容体1。メラトニン受容体1aが特に好ましい。その他のGタンパク質結合受容体（GPCR）が当技術分野において公知である。
【００９２】
好ましい態様において、活性化可能なエレメントは、クラスター形成可能な細胞内受容体である。この種類のエレメントは、膜結合型ではない。これらは、細胞内マトリックスを介して自由に拡散し、そこで、これらが可溶性リガンドに結合した後、クラスター形成およびシグナル伝達する。前述したエレメントとは対照的に、この種類の多くのメンバーは、クラスター形成後にDNAに結合して、RNA転写を直接変化することができる。
【００９３】
好ましい態様において、クラスター形成ができる細胞内受容体は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）である。PPARは、親油性化合物に応答する可溶性受容体であり、脂肪酸代謝に関与する種々の遺伝子を誘導する。3つのPPARサブタイプ、PPARα、β、およびγは、レチノイドX受容体とのリガンド結合およびヘテロ二量体化後にDNAと結合することが示された。（Summanasekera, et al., J Biol Chem、M211261200、2002年12月13日。）
【００９４】
もう一つの態様において、活性化可能なエレメントは、核酸である。核酸の活性化および非活性化は、不活性化リーダー配列の切断、並びに構造的もしくは機能的変化を誘導する共有結合性または非共有結合性修飾を含むが、これらに限定されるわけではない多数の方法で生じ得る。たとえば、多くの触媒RNA、たとえばハンマーヘッドリボザイムは、切断が生じるまでリボザイムの触媒活性を非活性化する不活性化リーダー配列を有するようにデザインすることができる。共有結合性修飾の例は、DNAのメチル化である。メチル化による非活性化は、一定の遺伝子、たとえばリンパ腫におけるSOCS遺伝子を調節するSTATのサイレンシングの際の要因であることが示された。Leukemia. 2004年2月； 18(2)： 356-8. SOCS1 and SHP1 hypermethylation in mantle cell lymphoma and follicular lymphoma： implications for epigenetic activation of the Jak/STAT pathway. Chim CS, Wong KY, Loong F, Srivastava Gを参照されたい。
【００９５】
もう一つの態様において、活性化可能なエレメントは、小分子、炭水化物、脂質、または活性化されたアイソフォームを有することができるその他の天然に存在するか、もしくは合成の化合物である。加えて、上で指摘したように、これらのエレメントの活性化には、1つの形態から別の形態への転換を含む必要はないが、化合物の有無として検出することができる。たとえば、cAMP（環状アデノシン一リン酸）の活性化は、非環状AMPから環状AMPへの転換ではなくcAMPの存在として検出することができる。
【００９６】
増強
一つの態様において、本発明は、環境合図の導入後に（たとえば、増強剤を投与することによって）細胞の活性化プロフィールを決定することを含む。このような態様において、これには、決定される活性化の絶対レベルだけでなく、エレメントの活性化において役割を果たすシグナリングカスケードがある。一般に、増強剤は、細胞の活性化プロフィールの決定前に、シグナリングカスケードを変化させるために使用され、増強剤の影響は、増強されていない細胞と比較した活性化プロフィールの相違として測定される。たとえば、腫瘍細胞の複合集団全体で、単一細胞レベルで複数のリン酸化事象を同時に測定することにより、異なる細胞サブセットにおける経路異常を構築し、区別することができる。同様に、増強は、細胞の「プライミング」として見ることができる。プライミングの一つの例は、ナイーブ細胞の免疫記憶細胞への進歩である。このプライミングの一つの結果は、プライミング入力に対してこれらを以前に曝露したことにより、活性化のためのこれらの閾値がナイーブ細胞よりも低くなるにつれて、免疫記憶細胞がより急速に応答することである。
【００９７】
本発明の増強剤の役割を理解するために重要なことは、細胞または細胞集団のいずれか一つの活性化プロフィールが、1つまたは複数の異なる活性化可能なエレメントの活性化状態を決定することを含むという事実を認識することである。これらのエレメントのそれぞれが、シグナリングカスケードまたはネットワークにおいて特異的なノードを形成する。多くの細胞のシグナリングネットワークは、相互接続しており、一つのノードに影響を及ぼす合図が、その他のノードが活性化状態間を切り換える能力に対して効果を有し得る。従って、種々の増強剤の有無における種々のノードの活性化状態を調査することによって、ノードを相互接続する根底にあるネットワーク構造を決定し、このような根底にある構造に対するこれらの影響により、活性化プロフィールを分類することができる。増強、および活性化プロフィールを分類する際のその役割は、下記の見出し「解析」下で、および実施例2において詳述してある。
【００９８】
上で指摘したように、増強剤は、多種多様な環境合図および入力の形をとることができる。増強剤を定義する特徴は、合図または入力により細胞のシグナリングネットワークに影響を与えることができることである。増強剤の例には、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：熱、冷却、紫外線などの物理的パラメーター、並びにサイトカイン、薬物、ホルモン、抗体、ペプチド、およびタンパク質断片、細胞単独または細胞の状況のいずれか、細胞それ自体、ウイルス、並びに生物学的および非生物学的複合体（たとえば、ビーズ、プレート、ウイルスエンベロープ、主要組織適合複合体などの抗原提示分子）。
【００９９】
好ましい態様において、増強剤は、細胞または細胞集団である。たとえば、エフェクターとして考えられる正常T細胞の共通プールを異なる患者に由来する種々の腫瘍細胞集団に曝露することができ、腫瘍が、エフェクターにおいて種々のシグナリングプロフィールを生じる（および、エフェクターが種々の腫瘍細胞における増強されたシグナリングを相互に刺激する）能力をモニターすることができる。同様に、疾患をもつ患者に由来する正常T細胞を種々の腫瘍細胞集団（同じ患者に由来する）と混合することができ、正常T細胞および腫瘍細胞内のシグナリング能（活性化事象）をプロファイルすることができる。このようなアッセイ法を単一のチューブにおいて行って、細胞表面エピトープを認識する抗体を使用して関連した細胞亜集団（たとえば、エフェクターおよび腫瘍細胞）を同定することができる。さらに、これらのアッセイ法を一連の増強条件下で行うことができる（たとえば、抗体を使用する同時刺激）。
【０１００】
状態の検出
一般に、特定のタンパク質（すなわち、活性化可能なエレメント）の活性化状態を検出するために、種々の方法がある。一つの態様において、タンパク質の1つのアイソフォームに特異的に結合する、標識された結合エレメント（「BEs」）が使用される。または、活性化可能なタンパク質の状態は、読み出しのために使用される；たとえば、シグナリングドメインをもつ細胞表面受容体の場合、シグナリングドメインの活性（または、これらの欠如）を直接アッセイすることができる。たとえば、2つのアイソフォームは、活性なし（ネガティブ・シグナル）対キナーゼ活性（色素生産基質を使用して測定される）であってもよい。
【０１０１】
結合エレメント
「結合エレメント」、「BE」、およびこれらの文法的相当語句は、エレメントの1つのアイソフォームをもう一方よりも検出することができる任意の分子、たとえば核酸、小有機分子、およびタンパク質を意味する。
【０１０２】
好ましい態様において、BEは、タンパク質であり、本明細書に使用される「タンパク質」という用語は、少なくとも2つの共有結合性に付着されたアミノ酸を意味し、これらには、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成のペプチド擬態構造で構成されていてもよい。したがって、本明細書に使用される「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。たとえば、ホモ-フェニルアラニン、シトルリン、およびノルロイシン（noreleucine）は、本発明の目的のためにアミノ酸と考えられる。また、「アミノ酸」は、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基を含む。側鎖は、（R）または（S）配置のいずれかであってもよい。好ましい態様において、アミノ酸は、（S）またはL-配置である。非天然に存在しない側鎖が使用される場合、たとえばインビボの分解を防止し、または遅延させるために、非アミノ酸置換基を使用してもよい。天然に存在しないアミノ酸を含むタンパク質は、合成してもよく、または場合によっては、組換えで作製してもよい；van Hest et al., FEBS Lett 428：(1-2) 68-70 1998年5月22日およびTang et al., Abstr. Pap Am. Chem. S218： U138 Part 2 1999年8月22日を参照されたい、これらは両方とも、明白に本明細書に参照として組み入れられる。
【０１０３】
好ましい態様において、タンパク質BEは、抗体である。特に好ましい態様において、タンパク質BEは、活性化状態特異的抗体である。したがって、本発明の方法および組成物は、抗原性に検出可能かつ抗原性に識別可能である試料中の任意の特定のエレメントアイソフォームを、試料中に存在する活性化可能なエレメントのその他のアイソフォームから検出するために使用してもよい。たとえば、本発明の活性化状態特異的抗体は、複合細胞集団のサブセットまたは亜集団の異なるシグナリングカスケードを同定するための方法；および潜在的シグナリング階層におけるタンパク質活性化（たとえば、キナーゼ活性化）の順序づけに使用することができる。
【０１０４】
「抗体」は、本明細書において、認識される免疫グロブリン遺伝子の全部または一部によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。たとえばヒトにおいて認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ（k）、λ（I）、および重鎖遺伝の座位を含み、これらは、共に無数の可変領域遺伝子、並びにIgM、IgD、IgG、IgE、およびIgAアイソタイプをそれぞれコードする定常域遺伝子ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（g）、シグマ（e）、およびアルファ（a）を含む。抗体は、本明細書において、全長抗体および抗体断片を含むことが意味され、任意の生物体に由来する天然の抗体、操作された抗体、または実験的、治療的、もしくは下記に定義したようなその他の目的のために組換えで産生した抗体を指し得る。「抗体」という用語には、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、scFvなどの当技術分野において公知である抗体断片、または抗体全体の修飾によって産生されたか、もしくは組換えDNA技術を使用してデノボ合成されたもののいずれかの、抗体のその他の抗原結合部分列を含む。本明細書に記述したようなFc変異体を含む全長抗体は、特に好ましい。「抗体」という用語には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。抗体は、アンタゴニスト、アゴニスト、中和性、阻害性、または刺激性であることができる。
【０１０５】
本発明の抗体は、非ヒト、キメラ、ヒト化、または完全にヒトであってもよい。キメラおよびヒト化抗体の概念の記述については、Clark et al., 2000およびその中の引例（Clark, 2000, Immunol Today 21：397-402）を参照されたい。キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に作動可能に連結されたヒト以外の抗体の可変領域、たとえばマウスまたはラット起源のVHおよびVLドメインを含む（たとえば、米国特許第4,816,567号を参照されたい）。好ましい態様において、本発明の抗体は、ヒト化されている。本明細書に使用される「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域（FR）および非ヒト（通常、マウスまたはラット）抗体に由来する1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）を含む抗体を意味する。CDRを提供する非ヒト抗体は、「ドナー」と呼ばれており、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれている。ヒト化は、主にアクセプター（ヒト）VLおよびVHフレームワークに対するドナーCDRの移植に依存する。（Winter 米国特許第5225539号）。このストラテジーを「CDR移植」と称する。最初の移植構築物において失われた親和性を回復するために、対応するドナー残基に対して選択されたアクセプターフレームワーク残基の「逆突然変異」が必要とされることが多い（米国特許第5530101号；米国特許第5585089号；米国特許第5693761号；米国特許第5693762号；米国特許第6180370号；米国特許第5859205号；米国特許第5821337号；米国特許第6054297号；米国特許第6407213号）。また、ヒト化抗体は、至適には、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことが考えられ、したがって、典型的にはヒトFc領域を含むと考えられる。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において周知であり、本質的にWinter および同僚の方法にしたがって行うことができる（Jones et al., 1986, Nature 321：522-525； Riechmann et al., 1988, Nature 332：323-329； Verhoeyen et al., 1988, Science, 239：1534-1536）。また、ヒト化マウスモノクローナル抗体のさらなる例、たとえばヒトプロテインC（O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11：321-8）、インターロイキン2受容体（Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86：10029-33）、およびヒト表皮性成長因子受容体2（Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-9）に結合する抗体が当技術分野において公知である。もう一つの態様において、本発明の抗体は、完全にヒトであってもよく、すなわち抗体の配列が完全または実質的にヒトである。トランスジェニック・マウスの使用（Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8：455-458）または選択方法と組み合わせたヒト抗体ライブラリー（Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9：102-108）を含む多数の方法が、完全ヒト抗体を作製するための当技術分野において公知である。
【０１０６】
グリコシル化されない抗体は、具体的に「抗体」の定義の中に含まれる。本明細書に使用される「グリコシル化されない抗体」は、Fc領域の位置297にて付着された炭水化物を欠いている抗体を意味し、番号付けはKabatと同様にEU系に従っている。グリコシル化されない抗体は、たとえば化学的または酵素的にFc炭水化物が除去された抗体である脱グリコシルした抗体であってもよい。または、グリコシル化されない抗体は、たとえば、グリコシル化パターンをコードするものもしくは残基の突然変異によって、またはタンパク質に炭水化物を付着しない生物体での、たとえば細菌での発現によってFc炭水化物を伴わずに発現された抗体である、非グリコシル化または未グリコシル化抗体であってもよい。
【０１０７】
Fc変異体部分を含む全長抗体は、具体的に「抗体」の定義の中に含まれる。「全長抗体」は、本明細書において、可変領域および定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。たとえば、ヒトおよびマウスを含む大部分の哺乳類において、IgGクラスの全長抗体は、四量体であり、2つの免疫グロブリン鎖の2つの同一対からなり、各対は、1つの軽鎖および1つの重鎖を有し、それぞれの軽鎖は、免疫グロブリンドメインVLおよびCLを含み、かつそれぞれの重鎖は、免疫グロブリンドメインVH、Cg1、Cg2、およびCg3を含む。一部の哺乳類では、たとえばラクダおよびラマでは、IgG抗体は、それぞれの重鎖がFc領域に付着された可変ドメインを含む2つの重鎖のみからなっていてもよい。本明細書に使用される「IgG」は、認識される免疫グロブリン・ガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、このクラスには、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む。マウスにおいて、このクラスには、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3を含む。
【０１０８】
本明細書に使用される、「活性化状態特異的抗体」または「活性化状態抗体」という用語またはこれらの文法的相当語句は、対応し、かつ特異的な抗原と特異的に結合する抗体をいう。好ましくは、対応し、かつ特異的な抗原は、活性化可能なエレメントの特定のアイソフォームである。また、活性化状態特異的抗体の結合は、好ましくは特異的な活性化可能なエレメントの特異的活性化状態を指し示す。したがって、好ましい態様において、活性化可能なエレメントの対応するアイソフォームに対する活性化状態特異的抗体の結合は、エレメント並びにそのエレメントの活性化状態の同一性を指し示す。
【０１０９】
上で指摘したように、活性化状態特異的抗体は、キナーゼ活性を検出するために使用することができるが、キナーゼ活性化を決定するためのさらなる手段も、本発明によって提供される。たとえば、プロテインキナーゼによって特異的に認識され、これによりリン酸化される基質が公知である。このようなリン酸化された基質と特異的に結合するが、このようなリン酸化されていない基質と結合しない抗体（ホスホ基質抗体）を試料中の活性化されたキナーゼの存在を決定するために使用してもよい。
【０１１０】
さらなる態様において、エレメント活性化プロフィールは、固定された多数の活性化状態抗体を使用して決定される。抗体は、単離された試料を受ける領域を有する不溶性支持体（たとえば、マイクロタイタープレート、アレイ、その他）に拡散できないように結合されていてもよい。不溶性支持体は、組成物が結合することができる任意の組成物でできていてもよく、可溶性材料から容易に分離され、さもなければスクリーニングの全体的方法に適合する。このような支持体の表面は、固体、または多孔性、および任意の便利な形状であってもよい。適切な不溶性支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜、およびビーズを含む。これらは、典型的にはガラス、プラスチック（たとえば、ポリスチレン）、多糖体、ナイロン、またはニトロセルロース、テフロン（商標）、その他でできている。小量の試薬および試料を使用して多数のアッセイ法を同時に実施することができるので、マイクロタイタープレートおよびアレイは特に便利である。一部の場合には、磁気ビーズ等が含まれる。
【０１１１】
組成物の結合の特定の様式は、本発明の試薬および全体的方法に適合し、組成物の活性を維持し、かつ拡散されない限り、重要ではない。好ましい結合の方法は、抗体の使用（これは、タンパク質が支持体に結合するときに、リガンド結合部位または活性化配列のいずれかを立体的に遮断しない）、「粘着性に」またはイオン支持体に対する直接の結合、化学的架橋、表面での抗体の合成などを含む。抗体の結合後、過剰の結合していない材料を洗浄によって除去する。次いで、試料を受ける領域をウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、またはその他の無害なタンパク質もしくはその他の部分とのインキュベーションを介して遮断してもよい。
【０１１２】
活性化可能なエレメントの活性化されたアイソフォームの抗原性は、活性化可能なエレメントの非活性化アイソフォームの抗原性から、または異なる活性化状態のアイソフォームの抗原性から識別可能である。好ましい態様において、エレメントの活性化されたアイソフォームは、エレメントの非活性化アイソフォームに存在しないエピトープを、またはその逆を有する。もう一つの好ましい態様において、この相違は、リン酸塩部分などのエレメントに対する部分の共有結合性添加のためか、もしくはタンパク質切断を介したエレメントにおける構造上の変化のためか、またはさもなければ抗原性に識別可能な方法で同じ配列を提示するようにエレメントを生じさせるエレメントにおける誘導される高次構造変化のためである。もう一つの好ましい態様において、このような高次構造上の変化により、エレメントの活性化されたアイソフォームを、非活性化アイソフォームに存在しない少なくとも1つのエピトープに存在させるか、またはエレメントの活性化されていないアイソフォームによって提示される少なくとも1つのエピトープに存在させない。一部の態様において、抗体を区別するためのエピトープは、エレメントの活性部位に集中するが、当技術分野において公知のとおり、エレメントの一つの領域における高次構造上の変化は、同様にエレメントの異なる領域における変化も生じさせ得る。
【０１１３】
タンパク質のリン酸化されたアイソフォームと特異的に結合するが、タンパク質の非リン酸化されたアイソフォームと特異的に結合しない多くの抗体が産生されており、その多くが市販されている（たとえば、Cell Signaling Technologyのカタログを参照されたい、その内容は、参照として本明細書に組み入れられる）。多くのこのような抗体は、可逆的にリン酸化されるシグナル伝達タンパク質の研究のために産生されてきた。特に、プロテインキナーゼのリン酸化された活性化されたアイソフォームと特異的に結合する多くのこのような抗体が産生されており、時に本明細書において、キナーゼ活性化状態抗体またはこれらの文法的相当語句と称される。特に本発明に使用するための好ましい抗体は、以下を含む：ホスホ-AKT Ser473モノクローナル抗-4E2、ホスホ-p44/42 MAPキナーゼ（Thr202/Tyr204）モノクローナル抗体、ホスホ-TYK2（Tyr1054/1055）抗体、ホスホ-p38 MAPキナーゼ（Thr180/Tyr182）モノクローナル抗体28B10、ホスホ-PKC-PAN基質抗体、ホスホ-PKA-基質、ホスホ-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）G9モノクローナル抗体、ホスホ-チロシンモノクローナル抗体（P-tyr-100）、p44/42 MAPK、p38 MAPK、JNK/SAPK、およびホスホ-AKT-Thr308。
【０１１４】
好ましい態様において、抗体全体ではなく活性化状態抗体のエピトープ認識断片が使用される。もう一つの好ましい態様において、エピトープ認識断片は、固定されている。もう一つの好ましい態様において、エピトープを認識する抗体軽鎖が使用される。エピトープを認識する軽鎖遺伝子産物をコードする組換え核酸は、当技術分野に周知の組換え手段によってこのような抗体断片を産生するために使用してもよい。
【０１１５】
また、非活性化状態抗体を本発明に使用してもよい。好ましい態様において、非活性化状態抗体は、エレメントの活性化および非活性化形態のエピトープに結合する。このような抗体は、試料中の非活性化プラス活性化されたエレメントの量を決定するために使用してもよい。もう一つの好ましい態様において、非活性化状態抗体は、エレメントの非活性化形態に存在するが、エレメントの活性化形態に存在しないエピトープに結合する。このような抗体は、試料中の非活性化エレメントの量を決定するために使用してもよい。両方のタイプの非活性化状態抗体を使用して、たとえば本明細書に記述したような候補生物活性剤での処置の前後の試料からの活性化状態エレメントの量の変化が、非活性化状態エレメントの量の変化と一致するかどうかを決定してもよい。たとえば、このような抗体は、活性化されたエレメントの増加が、非活性化状態エレメントの活性化によるものか、もしくはエレメントの発現増加によるものか、または両方かどうか決定するために使用することができる。
【０１１６】
もう一つの好ましい態様において、抗体は、公知のものに類似のビーズを使用して固定され、フローサイトメトリーにおける標準化のために使用される。ビーズに対する多数の活性化状態特異的抗体の付着は、当技術分野において公知の、および／または本明細書に記述した方法によって行ってもよい。このような抱合されたビーズは、存在する場合に多数の活性化されたエレメントを多くの固定された抗体に結合させることができる条件下で、試料、好ましくは細胞抽出物と接触させてもよい。一義的に標識された非活性化状態抗体を含む多くの第二の抗体を、固定された活性化状態特異的抗体活性化されたエレメント複合体に添加してもよく、ビーズをそれぞれの標識の存在に基づいてFACSによって選別してもよく、標識の存在は、対応する第二の抗体の結合および対応する活性化されたエレメントの存在を示す。
【０１１７】
本発明の別の実施例において、タンパク質BEの芳香族アミノ酸を、D-もしくはL-ナフイルアラニン、D-もしくはL-フェニルグリシン、D-もしくはL-2-チエニルアラニン、D-もしくはL-1-、2-、3-、もしくは4-ピレネイルアラニン、D-もしくはL-3-チエネイルアラニン、D-もしくはL-（2-ピリジニル）-アラニン、D-もしくはL-（3-ピリジニル）-アラニン、D-もしくはL-（2-ピラジニル）-アラニン、D-もしくはL-（4-イソプロピル）-フェニルグリシン、D-（トリフルオロメチル）-フェニルグリシン、D-（トリフルオロメチル）-フェニルアラニン、D-p-フルオロフェニルアラニン、D-もしくはL-p-ビフェニルフェニルアラニン、D-もしくはL-p-メトキシビフェニルフェニルアラニン、D-もしくはL-2-インドール（アルキル）アラニン、およびD-もしくはL-アルキルアラニンで置換してもよく、式中アルキルは、置換されたか、または非置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-イソチル、イソ-ペンチル、およびC1〜C20の非酸性アミノ酸であってもよい。
【０１１８】
酸性アミノ酸、および（ホスホノ）アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、もしくはセリン；または硫酸化の（たとえば、-SO3H）スレオニン、セリン、もしくはチロシンの非限定の例などのこれらの誘導体または類似体は、負電荷を維持すると共に、非カルボン酸塩アミノ酸で置換することができる。
【０１１９】
その他の置換には、「アルキル」を任意の天然のアミノ酸と化合させることによって作製され得る非天然のヒドロキシル化されたアミノ酸を含み得る。本明細書に使用される「アルキル」という用語は、メチル、エチル、n-プロピル、イロプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラシスイルなどの1〜24炭素原子の分枝または分枝のない飽和した炭化水素基をいう。アルキルには、窒素、酸素および硫黄の原子とのヘテロアルキルを含む。好ましいアルキル基は、本明細書において、1〜12炭素原子を含む。塩基性アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸リジン、アルギニン、オルニチン、シトルリン、または（グアニジノ）-酢酸、もしくはその他の（グアニジノ）アルキル-酢酸の任意の位置においてアルキル基で置換し得るし、「アルキル」は、上記と同様に定義される。また、ニトリル誘導体（たとえば、COOHの代わりにCN-部分を含む）をアスパラギンまたはグルタミンの代わりに置換してもよく、メチオニンスルホキシドをメチオニンの代わりに置換してもよい。このようなペプチド誘導体の調製法は、当業者に周知である。
【０１２０】
加えて、任意のポリペプチドの任意のアミド連鎖をケトメチレン部分によって置換してもよい。このような誘導体は、酵素による分解に対して安定性特性が増大されることが予想され、したがって、経口、経静脈、筋肉内、腹腔内、局所的、直腸、眼内、またはその他の経路によって投与されるときにインビボ半減期が増大され得る化合物の製剤のために利点を有する。
【０１２１】
本発明の変種ポリペプチドのアミノ酸のさらなるアミノ酸修飾には、以下を含んでいてもよい：システイニル残基を2-クロル酢酸またはクロロアセトアミドなどのα-ハロ酢酸（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得てもよい。また、システイニル残基をブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-（5-イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル-2-ピリジルジスルフィド、パラクロロメルクリ安息香酸、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールなどの化合物との反応によって誘導体化してもよい。
【０１２２】
ジエチルプロカルボナートなどの化合物は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるので、ヒスチジル残基を、たとえばpH 5.5〜7.0においてこの薬剤との反応によって誘導体化してもよく、またパラブロモフェナシルブロミドを使用してもよく；たとえば、この場合、反応には、好ましくはpH 6.0にて0.1Mのカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【０１２３】
リジニルおよびアミノ末端残基をコハク酸またはその他のカルボン酸無水物などの化合物と反応させてもよい。これらの薬剤による誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有すると予想される。
【０１２４】
α-アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の適切な試薬は、イミドエステルなど、たとえば、メチルピコリンイミダート；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチルイソ尿素；2,4ペンタンジオン；およびグリオキシル酸でのトランスアミナーゼ触媒反応などの化合物を含む。アルギニル残基は、公知の方法の工程に従って、1つまたはいくつかの従来の試薬（これらの中にはフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリン）との反応によって修飾してもよい。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのために、反応をアルカリ状態で行うことが必要である。さらに、これらの試薬をリジンの基、並びにアルギニンイプシロン-アミノ基と反応させてもよい。芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってスペクトル標識をチロシル残基に導入するなどのための、チロシル残基自体の特異的修飾が周知である。
【０１２５】
N-アセチルイミヂソール（acetylimidizol）およびテトラニトロメタンは、それぞれO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成するために使用してもよい。カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）を、1-シクロヘキシル-3-（2-モルホリニル-（4-エチル）カルボジイミドまたは1-エチル-3-（4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（R’-N-C-N-R’）との反応によって選択的に修飾してもよい。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基を、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミル残基に変換してもよい。
【０１２６】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に頻繁に脱アミドされ得る。または、これらの残基は、少し酸性の条件下で脱アミドさせてもよい。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に入る。
【０１２７】
好ましい態様において、活性化状態特異的BEは、活性化可能なエレメント上の標的構造と結合する認識構造を含むペプチドである。種々の認識構造が当技術分野において周知であり、ファージディスプレイ・ライブラリーによるものを含む当技術分野において公知の方法を使用して作製することができる（たとえば、Gururaja et al. Chem. Biol. (2000) 7：515-27； Houimel et al., Eur. J. Immunol. (2001) 31：3535-45； Cochran et al. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123：625-32； Houimel et al. Int. J. Cancer (2001) 92：748-55を参照されたい、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる）。または、コンビナトリアルケミストリー法を使用して、活性化可能なタンパク質上の標的構造に対する親和性をもつ重合体などの認識構造を産生してもよい（たとえば、Barn et al., J. Comb. Chem. (2001) 3：534-41； Ju et al., Biotechnol. (1999) 64：232-9を参照されたい、それぞれが明白に参照として本明細書に組み入れられる）。さらなる態様において、認識構造は、抗ラミニン単鎖抗体断片（scFv）である（たとえば、Sanz et al., Gene Therapy (2002) 9：1049-53； Tse et al., J. Mol. Biol. (2002) 317：85-94を参照されたい、それぞれが明白に参照として本明細書に組み入れられる）。好ましい態様において、活性化状態特異的BEは、以下の認識構造を含む：SKVILFE--ランダムペプチドループ---SKVILFE。このような認識構造を有するBEは、特異的な標的構造に対して高親和性で結合することができる。さらに、フルオロフォアを、本発明の方法に使用するためのこのようなBEに付着させることができる。
【０１２８】
好ましい態様において、BEは、核酸である。「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」またはこれらの文法的相当語句は、本明細書において、共に共有結合性に連結された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含むと考えられるが、一部の場合には、下記に概説したように、たとえば以下のモノを含む互生バックボーンを有していてもよい核酸類似体も含まれる：リンアミド（Beaucage et al., Tetrahedron 49(10)：1925 (1993) およびその中の引例； Letsinger, J. Org. Chem. 35：3800 (1970)； Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81：579 (1977)； Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14：3487 (1986)； Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110：4470 (1988)；並びに Pauwels et al., Chemica Scripta 26：141 91986)）、ホスホロチオアート（Mag et al., Nucleic Acids Res. 19：1437 (1991)；および米国特許第5,644,048号）,ホスホロジチオアート（Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111：2321 (1989)）、O-メチルホスホロアミダート（O-methylphophoroamidite）結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues： A Practical Approach, Oxford University Pressを参照されたい）、並びにペプチド核酸バックボーンおよび結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114：1895 (1992)； Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31：1008 (1992)； Nielsen, Nature, 365：566 (1993)； Carlsson et al., Nature 380：207 (1996)を参照されたい、これらの全てが、参照として組み入れられる）。その他の類似体核酸には、ポジティブバックボーン（Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：6097（1995）；非イオン性バックボーン（米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号、および第4,469,863号；Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30：423 (1991)； Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110：4470 (1988)； Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13：1597 (1994)； Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook； Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4：395 (1994)； Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34：17 (1994)； Tetrahedron Lett. 37：743 (1996)）、並びに米国特許第5,235,033号および第5,034,506号、並びにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記述したものを含む非リボースバックボーン。1つまたは複数の炭素環式の糖を含む核酸も、核酸の定義の中に含まれる（Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp169-176を参照されたい）。いくつかの核酸類似体は、Rawls, C & E News June 2, 1997 page 35に記述されている。これらの参照の全ては、本明細書に参照として明白に組み入れられる。これらのリボース-リン酸バックボーンの修飾は、標識などのさらなる部分の付加を容易にするために、または生理学的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増大するために行ってもよい。
【０１２９】
当業者によって認識されるとおり、これらの核酸類似体の全てが、本発明における使用が見いだされ得る。加えて、天然に存在する核酸および類似体の混合物を作製することができる。または、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体との混合物を作製してもよい。ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（PNA）は、特に好ましい。これらのバックボーンは、天然に存在する核酸の高度に荷電されたホスホジエステル骨格とは対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。
【０１３０】
核酸は、特定されるとおり、一本鎖でも、もしくは二本鎖でも、または二本鎖もしくは一本鎖の配列の両方の部分を含んでいてもよい。核酸は、DNAでも、ゲノムおよびcDNAの両方でも、核酸がデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの任意の組み合わせを含むRNAまたはハイブリッドでも、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニンヒポキサニン、イソシトシン、イソグアニン、その他を含む任意の塩基の組み合わせであってもよい。本明細書に使用される「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、並びにヌクレオチド類似体およびアミノ修飾されたヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドを含む。加えて、「ヌクレオシド」は、天然に存在しない類似体の構造を含む。したがって、たとえば、それぞれが塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、本明細書においてヌクレオシドと称される。
【０１３１】
核酸BEは、天然に存在する核酸、ランダムな核酸、または「偏った」ランダム核酸であってもよい。たとえば、タンパク質について上で概説したように、原核生物または真核生物のゲノムの消化を使用してもよい。最終発現産物が核酸である場合、少なくとも10、好ましくは少なくとも12、より好ましくは少なくとも15、最も好ましくは少なくとも21個のヌクレオチドの位置がランダム化される必要があり、ランダム化が完全とはいえない場合がより好ましい。同様に、最終発現産物がタンパク質である場合、少なくとも5、好ましくは少なくとも6、より好ましくは少なくとも7個のアミノ酸位置がランダム化される必要があり、再度、ランダム化が完全とはいえない場合がより好ましい。
【０１３２】
好ましい態様において、BEは、合成化合物である。多種多様な有機化合物および生体分子のランダム並びに定方向合成のために、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含む多くの技術を利用できる。たとえば、ランダム化学法、並びに酵素法を含む新化合物を作製するための方法について論議する国際公開公報第94/24314号を参照されたい（本明細書によって明白に参照により組み入れられる）。
【０１３３】
または、好ましい態様では、BEとして、天然の化合物を、利用でき、または容易に産生される細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態で利用する。
【０１３４】
さらに、天然または合成的に産生された化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通じて容易に修飾される。本発明に使用してもよいBEを産生するために、公知の薬物を、酵素の修飾を含む定方向またはランダムな化学修飾に供してもよい。
【０１３５】
もう一つの好ましい態様において、BEは、小有機化合物である。BEは、化学的に修飾することができる一連の基質から合成することができる。「化学的に修飾される」は、本明細書において、従来の化学反応、並びに酵素反応を含む。これらの基質には、一般に以下のものを含むが、これらに限定されるわけではない：アルキル基（アルカン、アルケン、アルキン、およびヘテロアルキルを含む）、アリール基（アレーンおよびヘテロアリールを含む）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環状化合物、複素環化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、β-ラクタム、テトラサイリン（tetracylines）、セファロスポリン、および炭水化物を含む）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、エコジソン（ecodysone）、その他を含む）、アルカロイド（麦角、ビンカ、クラーレ、ピロリスジン（pyrollizdine）、およびマイトマイシンを含む）、有機金属化合物、ヘテロ原子を有する化合物、アミノ酸、並びにヌクレオシド。化学的（酵素的を含む）反応を、新たな基質またはBEを形成するための部分に対して行い、次いで本発明に使用することができる。
【０１３６】
好ましい態様において、BEは、炭水化物である。本明細書に使用される炭水化物という用語は、一般式（CH2O）nをもつ任意の化合物を含むことが意味される。好ましい炭水化物の例は、ジ、トリおよび、オリゴ糖、同様にグリコーゲン、セルロース、およびデンプンなどの多糖体である。
【０１３７】
好ましい態様において、BEは、脂質である。本明細書に使用される脂質という用語は、無極性有機溶媒中で可溶性である任意の水不溶性有機分子を含むことが意味される。好ましい脂質の例は、コレステロールなどのステロイド、およびスフィンゴミエリンなどのリン脂質である。
【０１３８】
標識
本発明の方法および組成物は、標識またはタグを含むBEを提供する。標識とは、直接（すなわち、一次標識）または間接的（すなわち、二次標識）に検出することができる分子を意味し；たとえば、標識は、視覚化すること、および／または測定すること、またはさもなければその有無を知ることができるように同定することができる。化合物は、検出可能なシグナルを提供する標識、たとえば放射性同位元素、蛍光剤、酵素、抗体、磁性粒子などの粒子、化学発光、または特異的結合分子、その他に対して直接または間接的に抱合されることができる。特異的結合分子は、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンその他などの対を含む。好ましい標識には、標識を含む光学的蛍光および色素生産性色素、標識酵素および放射性同位元素を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１３９】
2つの活性化状態特異的抗体の例を使用する際に、「一義的に標識された」とは、第一の活性化されたエレメントを認識する第一の活性化状態抗体が、第一の標識を含み、かつ第二の活性化されたエレメントを認識する第二の活性化状態抗体が、第二の標識を含み、第一と第二の標識とは、検出可能かつ識別可能であって、第一の抗体および第二の抗体を一義的に標識することを意味する。
【０１４０】
一般に、標識は、4つの種類にあてはまる：a）放射性または重い同位元素であってもよい同位体標識；b）磁気、電気的、熱的標識；c）発光、亜リン酸、および蛍光色素または部分を含む有色の光学的標識；並びにd）結合パートナー。また、標識は、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、その他）、および磁性粒子を含むことができる。好ましい態様において、検出標識は、一次標識である。一次標識は、フルオロフォアなどの直接検出することができるものである。
【０１４１】
好ましい標識には、蛍光色素または部分などの光学的標識を含む。フルオロフォアは、「小分子」蛍光体またはタンパク質蛍光体（たとえば、緑色蛍光タンパク質およびこれらの全ての変異体）のいずれであることもできる。
【０１４２】
「蛍光標識」とは、その固有の蛍光特性を経て検出され得る任意の分子を意味する。適切な蛍光標識には、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル-クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（商標）、テキサスレッド、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LCレッド640、Cy5、Cy5.5、LCレッド705、およびオレゴングリーンを含むが、これらに限定されるわけではない。適切な光学的色素は、1996 Molecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandに記述されており、本明細書によって明白に参照として組み入れられる。また、適切な蛍光標識には、以下のものを含むが、これらに限定されるわけではない：緑色蛍光タンパク質（GFP；Chalfie, et al., Science 263(5148)：802-805（1994年2月11日）；およびEGFP；Clontech-Genbankアクセッション番号U55762）、青色蛍光タンパク質（BFP；Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal (Quebec) Canada H3H 1 J9； 2. Stauber, R. H. Biotechniques 24(3)：462-471 (1998)； 3. Heim, R. and Tsien, R. Y. Curr. Biol. 6：178-182 (1996)）、増強された黄色蛍光タンパク質（EYFP；1. Clontech Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303）、ルシフェラーゼ（Ichiki, et al., J. Immunol. 150(12)：5408-5417 (1993)）,β-ガラクトシダーゼ（Nolan, et al., Proc Natl Acad Sci USA 85(8)：2603-2607 （1988年4月））およびRenilla国際公開公報第92/15673号；国際公開公報第95/07463号；国際公開公報第98/14605号；国際公開公報第98/26277号；国際公開公報第99/49019号；米国特許第5,292,658号；米国特許第5,418,155号；米国特許第5,683,888号；米国特許第5,741 ,668号；米国特許第5,777,079号；米国特許第5,804,387号；米国特許第5,874,304号；米国特許第5,876,995号；および米国特許第5,925,558号）。上記の引例の全ては、明白に参照として本明細書に組み入れられる。
【０１４３】
本発明に使用するための特に好ましい標識には、以下を含む：Alexa-蛍光体色素（Alexa
蛍光体350、Alexa蛍光体430、Alexa蛍光体488、Alexa蛍光体546、Alexa蛍光体568、Alexa蛍光体594、Alexa蛍光体633、Alexa蛍光体660、Alexa蛍光体680）、カスケードブルー、カスケードイエロー、およびR-フィコエリトリン（PE）（Molecular probes）（Eugene, Oregon）、FITC、ローダミン、およびテキサスレッド（Pierce, Rockford, Illinois）、Cy5、Cy5.5、Cy7（Amersham Life Science, Pittsburgh, Pennsylvania）。
Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APCのための直列型抱合プロトコルは、当技術分野において公知である。標識化の程度を決定するために蛍光プローブ抱合体の定量化を評価してもよく、色素分光特性を含むプロトコルは、また当技術分野において周知である。
【０１４４】
もう一つの好ましい態様において、蛍光標識は、GFPであり、より好ましくは、レニラ（Renilla）、プチロサルカス（Ptilosarcus）、またはエクオラ（Aequorea）種のGFPである。
【０１４５】
好ましい態様において、二次検出可能な標識が使用される。二次標識は、間接的に検出されるものであり；たとえば、二次標識は、検出のために一次標識と結合すること、または反応することができ、さらなる産物に対して作用して一次標識（たとえば酵素）、その他を生じることができる。二次標識には、結合パートナー対のうちの一方；化学的に修正可能な部分；ヌクレアーゼ阻害剤、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、その他を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１４６】
好ましい態様において、二次標識は、結合パートナー対である。たとえば、標識は、その結合パートナーに結合するハプテンまたは抗原であってもよい。たとえば、適切な結合パートナー対は：抗原（タンパク質（ペプチドを含む）および小分子など）および抗体（これらの断片を含む（FAbs、その他））；タンパク質およびビオチン／ストレプトアビジンを含む小分子；酵素および基質または阻害剤；その他のタンパク質-タンパク質相互作用対；受容体-リガンド；並びに炭水化物およびこれらの結合パートナーを含むが、これらに限定されるわけではない。核酸-核酸結合タンパク質対も有用である。好ましい結合パートナー対には、ビオチン（またはイミノ-ビオチン）およびストレプトアビジン、ジゲオキシニン（digeoxinin）およびAbs、並びにProlinx（商標）試薬を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１４７】
好ましい態様において、結合パートナー対は、抗原と特異的に結合する抗原および抗体を含む。「特異的に結合する」とは、本明細書において、パートナーが対と系のその他の成分または混入物との間を分化するために十分な特異性で結合することを意味する。結合は、非特異的結合を除去するための洗浄液工程を含むアッセイ条件下で結合したままであるほど十分なはずである。一部の態様において、対の解離定数は、約10-4〜10-9M-1未満であると考えられ、約10-5〜10-9M-1が好ましく、約10-7〜10-9M-1未満が特に好ましい。
【０１４８】
好ましい態様において、二次標識は、化学的に修飾可能な部分である。本態様において、反応性官能基を含む標識を標識される分子に取り込ませる。次いで、官能基をその後に（たとえば、アッセイ法の前後のいずれか）一次標識で標識することができる。適切な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基、およびチオール基を含むが、これらに限定されるわけではなく、アミノ基およびチオール基が特に好ましい。たとえば、アミノ基を含む一次標識は、たとえば当技術分野において公知であるリンカーを使用して、アミノ基を含む二次標識に付着することができる；たとえば、周知のホモまたはヘテロ二官能性リンカー（1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200を参照されたい（参照として本明細書に組み入れられる））。
【０１４９】
好ましい態様において、複数の蛍光標識が本発明の方法および組成物に使用される。好ましい態様において、それぞれの標識は、その他の標識から異なっており、識別可能である。
【０１５０】
当技術分野において明らかなように、標準的方法を使用して、またはMolecular Probesからのタンパク質-タンパク質／タンパク質-色素架橋キット（Eugene, Oregon）を使用することにより、抗体-標識抱合を行ってもよい。
【０１５１】
好ましい態様において、標識された抗体は、細胞における活性化可能なタンパク質の機能解析のために使用される。このような解析を行う際に、いくつかの実験領域が考えられる：（1）染料のための適当な組み合わせの抗体カクテルの同定、（2）抗原（すなわち、活性化可能なタンパク質）および関心対象の抗体クローンを使用する染色のための経時的手順の同定、並びに（3）細胞刺激を行う細胞培養条件の完全な評価。異なる抗体クローンでは、異なる結果を生じ、異なるプロトコルにおいて同じように染料されないので、抗原クローン選択は、ヒト細胞の表面抗原にとって特に重要である。また、細胞タイプの選択および培養条件の最適化は、相違を検出する際に重要な要素である。たとえば、いくつかの株化細胞は、培養条件に適応する能力を有し、不均一な応答を生じ得る。
【０１５２】
多色、多パラメーターのフローサイトメトリーの利用には、タンパク質に対して定義されたフルオロフォア（「FTP」）比で一次抱合された抗体が必要である。FTP比の範囲を示すのでは、一般に十分ではなく、2つの分子においてFTP比が異なるにつれて、ホスホエピトープ染色において有意な減少を表し得るので、むしろ完全に最終生成物を定量化することが必要である。それぞれのフルオロフォアの最適なFTPは、唯一無二であり、ホスホエピトープに対する抗体クローンの間で異なる可能性がある点に留意することも重要である。
【０１５３】
好ましい態様において、任意のタンパク質フルオロフォア（すなわちPE、APC、PE-直列型抱合体（PE-TR、PE-Cy5、PE-CY5.5、PE-CY7、PE-Alexa色（PE-AX610、PE-AX647、PE-680、PE-AX700、PE-AX750）、APC-直列型抱合体、APC-AX680、APC-AX700、APC-AX750、APC-CY5.5、APC-CY7）、GFP、BFP、CFP、DSRED、およびフィコビリタンパク質を含む藻類タンパク質の全ての誘導体についての最適比は、1：1である（1つのタンパク質色素に対して1つのab）。
【０１５４】
さらなる態様において、FTP比は、内部染料について1〜6であり；AX488について、FTPは、好ましくは2〜5、より好ましくは4であり；AX546について、FTP比は、好ましくは2〜6、およびより好ましくは2であり；AX594について、FTP比は、好ましくは2〜4であり；AX633について、FTPは、好ましくは1〜3であり；AX647について、FTP比は、好ましくは1〜4、およびより好ましくは2である。AX405、AX430、AX555、AX568、AX680、AX700、AX750について、FTP比は、好ましくは2〜5である。
【０１５５】
または、以下に詳細に論議したFRETに基づく検出系を使用してもよい。FRETは、本発明における、たとえば2つのFRET標識の近接が活性化によって変化するクラスター形成または多量体化を含む活性化状態を検出する際の使用を見いだす。好ましい態様において、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）対のメンバーである少なくとも2つの蛍光標識が使用される。
【０１５６】
FRETは、1つの蛍光色素の励起により、光量子の発光を伴わずにもう一つのものに移されるという、当技術分野において公知の現象である。FRET対は、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアからなる。ドナーの蛍光発光スペクトルおよびアクセプターの蛍光吸収スペクトルが重ならなければならず、2つの分子が近接していなければならない。ドナーの50%が不活性化されている（エネルギーをアクセプターに移す）際のドナーとアクセプターとの間の距離は、Forster半径（Ro）によって定義され、典型的には10〜100Åである。FRET対を含む蛍光発光スペクトルの変化は、近接している（すなわち、互いに100Å以内の）ものの数の変化を示すことによって検出することができる。これは、典型的には2つの分子の結合または解離によって生じ、そのうちの一方がFRETドナーで標識されており、そのうちの他方がFRETアクセプターで標識されており、このような結合により、FRET対が近接することとなる。このような分子の結合により、アクセプターの蛍光発光の増大および／またはドナーの蛍光発光の消光を生じることとなる。
【０１５７】
本発明に有用なFRET対（ドナー／アクセプタ）には、EDANS／フルオレッセイン、IAEDANS／フルオレッセイン、フルオレッセイン／テトラメチルローダミン、フルオレッセイン／LCレッド640、フルオレッセイン／Cy 5、フルオレッセイン／Cy 5.5、およびフルオレッセイン／LCレッド705を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１５８】
FRETのもう一つの局面において、蛍光ドナー分子および非蛍光アクセプター分子（「消光剤」）を使用してもよい。本出願において、ドナーの蛍光発光は、消光剤が近傍からドナーに移されたときに増大し、消光剤がドナーの近傍にきたときに、蛍光発光が減少する。有用な消光剤には、TAMRA、DABCYL、QSY 7、およびQSY 33を含むが、これらに限定されるわけではない。有用な蛍光ドナー／消光剤対には、EDANS／DABCYL、テキサスレッド／DABCYL、BODIPY／DABCYL、ルシファーイエロー／DABCYL、クマリン／DABCYL、およびフルオレッセイン／QSY 7色素を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１５９】
当業者であれば、FRETおよび蛍光消光により、時間とともに標識分子の結合をモニタリングして、結合反応の時間経過に関する連続的情報を提供することができることを認識するであろう。
【０１６０】
好ましくは、FRETの程度の変化は、ドナーおよびアクセプター部分からの蛍光の量の比率の変化の関数として決定され、過程は「レシオイング（ratioing）」と称される。基質、励起強度、および励起波長における試料の濁度またはその他のバックグラウンド吸光度の絶対量の変化が、ほぼ平行してドナーおよびアクセプターからの蛍光強度に影響を及ぼす。したがって、2つの発光強度の比は、いずれの単独強度よりも豊富で、かつ切断の好ましい基準である。
【０１６１】
本明細書に記述した比率測定蛍光リポーター系は、発現および非発現単一の生細胞の両方において感受性の高い検出および単離ができるので、これは、タンパク質組込み解析のための既存のリポーター以上に有意な利点を有する。好ましい態様において、アッセイ系では、容易に充填され、次いで細胞内にトラップされる非毒性の無極性蛍光基質を使用する。同族タンパク質による蛍光基質の修飾により、基質が産物に変換されるにつれて、蛍光発光変化を生じる。リポーター読み取りは、比率測定によるので、これは、これが個々の細胞に充填された基質の量などの変数を制御するという点で、リポータータンパク質アッセイ法の中で独特である。安定で、容易に検出される、細胞内読み出しにより、発現解析の前にクローン細胞系を確立する必要がなくなる。この系およびその他の類似のフロー選別系は、何百万もの生細胞のプールから特定の受容体エレメントのクラスター形成および／または活性化プロフィールを有する細胞を単離するために使用することができる。
【０１６２】
また、本発明の方法および組成物は、標識酵素を利用してもよい。標識酵素とは、検出可能な産物を産生する標識酵素基質の存在下において反応し得る酵素を意味する。本発明に使用するための適切な標識酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼを含むが、これに限定されるわけではない。このような基質の使用のための方法は、当技術分野において周知である。標識酵素の存在は、一般に、同定可能な産物を産生する標識酵素基質との反応における酵素の触媒作用を介して明らかにされる。このような産物は、テトラメチルベンゼジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの反応など、不透明であってもよく、種々の色を有していてもよい。ルミノール（Pierce Chemical Co.から入手可能な）などの、蛍光反応生成物を産生するその他の標識酵素基質が開発されている。標識酵素基質で標識酵素を同定するための方法は、当技術分野において周知であり、多くの市販のキットが利用できる。種々の標識酵素の使用のための例および方法は、Savage et al., Previews 247：6-9 (1998), Young, J. Virol. Methods 24：227-236 (1989)に記述されており、そのそれぞれが、これらの全体において参照として本明細書に組み入れられる。
【０１６３】
放射性同位元素とは、任意の放射性分子を意味する。本発明に使用するために適した放射性同位元素は、14C、3H、32P、33P、35S、125I、および131Iを含むが、これらに限定されるわけではない。標識としての放射性同位元素の使用は、当技術分野において周知である。
【０１６４】
言及したとおり、標識は、間接的に検出してもよく、すなわち、タグが結合対のパートナーである。「結合対のパートナー」とは、第一および第二の部分が互いに対して特異的結合親和性を有する、第一および第二の部分の一方を意味する。本発明に使用するための適切な結合対には、抗原／抗体（たとえば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（DNP）／抗DNP、ダンシル-X-抗ダンシル、フルオレッセイン／抗フルオレッセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエロー、およびローダミン抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（または、ビオチン／ストレプトアビジン）、およびカルモジュリン結合タンパク質（CBP）／カルモジュリンを含むが、これらに限定されるわけではない。その他の適切な結合対には、FLAG-ペプチド[Hopp et al., BioTechnology, 6：1204-1210 (1988)]；KT3エピトープペプチド[Martin et al., Science, 255：192-194 (1992)]；チューブリンエピトープペプチド[Skinner et al., J. Biol. Chem., 266：15163-15166 (1991)]；およびT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87：6393-6397 (1990)]などのポリペプチド、並びにそれぞれ、これらに対する抗体を含む。当業者によって認識されるであろうとおり、結合対パートナーは、本明細書に記述したような標識化のため以外の適用に使用してもよい。
【０１６５】
当業者によって認識されるであろうとおり、1つの結合対のパートナーは、また別の結合対のパートナーであってもよい。たとえば、抗原（第一の部分）は、第一の抗体（第二の部分）と結合してもよく、これは、次に第二の抗体（第三の部分）のための抗原であってもよい。このような環境により、第一の部分と第三の部分の間接的な結合を、それぞれに対する結合対パートナーである中間の第二の部分を介してできることがさらに認識される。
【０１６６】
当業者によって認識されるであろうとおり、結合対のパートナーは、上記したような標識を含んでいてもよい。これにより、標識を含む結合パートナーの結合によりタグを間接的に標識することができることがさらに認識される。上述のような、結合対のパートナーであるタグに標識を付着する工程は、本明細書において、「間接的な標識化」と称される。
【０１６７】
「表面基質結合分子」または「付着タグ」およびこれらの文法的相当語句は、特定の表面基質に対して結合親和性を有する分子を意味し、基質は、一般に表面に適用され、取り込まれ、またはさもなければ付着される結合対のメンバーである。適切な表面基質結合分子およびこれらの表面基質には、ポリ-ヒスチジン（ポリ-his）、またはポリ-ヒスチジン-グリシン（ポリ-his-gly）タグおよびニッケル基質；グルタチオン-S トランスフェラーゼタグおよびその抗体基質（Pierce Chemicalから入手可能）；インフルエンザHAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5基質[Field et al., Mol. Cell. Biol., 8：2159-2165 (1988)]；c-mycタグおよびそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7、および9E10抗体基質[Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5：3610-3616 (1985)]；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D（gD）タグおよびその抗体基質[Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6)：547-553 (1990)]を含むが、これらに限定されるわけではない。一般に、本発明に有用な表面結合基質分子は、ニッケル基質に結合するポリヒスチジン構造（His-タグ）、抗体を含む表面基質と結合する抗原、アビジン基質と結合するハプテン（たとえば、ビオチン）、およびカルモジュリンを含む表面基質と結合するCBPを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１６８】
抗体が包埋された基質の産生は、周知であり；Slinkin et al., Bioconj. Chem., 2：342-348 (1991)； Torchilin et al., 上記； Trubetskoy et al., Bioconj. Chem. 3：323-327 (1992)； King et al., Cancer Res. 54：6176-6185 (1994)；および Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5：220-235 (1994)を参照されたい（その全てが、本明細書に参照として明白に組み入れられる）、抗原とタンパク質の付着または産生は、上記してある。カルモジュリンが包埋された基質は、市販されており、CBPをもつタンパク質の産生は、Simcox et al., Strategies 8：40-43 (1995)に記述されており、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１６９】
当業者によって認識されるであろうとおり、本発明のタグ成分は、主にタグの形態に応じて種々の方法で作製することができる。本発明の成分とタグとは、好ましくは共有結合によって付着される。
【０１７０】
また、タグがポリペプチドでもあるときの組換え手段によるタグ-ポリペプチドの産生は、下記に記述してある。タグ標識されたタンパク質の産生は、当技術分野において周知であり、このような産生のためのキットは、市販されている（たとえば、KodakおよびSigmaより）。タグ標識されたタンパク質の例には、Flag-ポリペプチドおよびHis-ポリペプチドを含むが、これらに限定されるわけではない。タグ標識されたタンパク質の産生および使用のための方法は、たとえば Winston et al., Genes and Devel. 13：270-283 (1999)（その全体が本明細書に組み込まれる）、並びに上述したキットと共に提供される製品ハンドブックにおいて見いだされる。
【０１７１】
標的分子および基質のビオチン標識は、周知であり、たとえばタンパク質、核酸、炭水化物、カルボン酸のビオチン標識のためのアミン反応性およびチオール反応性の薬剤を含む多数のビオチン標識薬剤が公知である；chapter 4, Molecular Probes Catalog, Haugland, 6th Ed. 1996を参照されたい、参照として本明細書に組み入れられる。ビオチン化された基質は、アビジンまたはストレプトアビジンを経てビオチン化された成分に付着することができる。同様に、多数のハプテン化試薬も公知である（同上）。
【０１７２】
放射性同位元素でタンパク質を標識化するための方法が当技術分野において公知である。たとえば、このような方法は、Ohta et al., Molec. Cell 3：535-541 (1999)において見いだされ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１７３】
組換えに手段よるタグを有するタンパク質の産生は、周知であり、このようなタンパク質を産生するためのキットが市販されている。たとえば、このようなキットおよびその使用は、Joanne Crowe et al.,によりQiagenからのQIAexpress Handbookに記述されており、本明細書によって参照として明白に組み入れられる。
【０１７４】
チオール、アミン、カルボキシル、その他などの化学的に反応性の基での標識の官能性付与は、一般に当技術分野において公知である。好ましい態様において、タグには、共有結合を促進するための官能性をもたせる。タグの共有結合は、直接またはリンカーを経ていてもよい。一つの態様において、リンカーは、比較的短い結合部分であり、これが分子を付着するために使用される。結合部分は、本発明の成分に対して直接合成してもよく、タグの付着を容易にするために少なくとも1つの官能基を含む。または、たとえば官能性をもたせたタグに官能性をもたせた成分を付着するために使用される結合部分を、少なくとも2つの官能基に有してもよい。さらなる態様において、リンカーは、重合体である。本態様において、共有結合性付着は、直接または成分もしくはタグから重合体に対して結合部分の使用を介して、いずれかで達成される。好ましい態様において、共有結合性付着は、直接であり、すなわちリンカーは使用されない。本態様において、成分は、好ましくは、官能性をもたせたタグに直接付着するために使用するカルボン酸などの官能基を含む。成分およびタグは、上記の一覧表に記載されたものを含む種々の方法で付着してもよいことが理解されるはずである。好ましい態様において、タグは、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端に付着される。当業者によって認識されるであろうとおり、標識の共有結合性付着の上記記載は、実質的に本開示のいずれの2つの分子の付着にも適用される。
【０１７５】
好ましい態様において、タグは、上記で一般に概説したように、共有結合性付着を促進するための官能性をもたせてある。したがって、イソチオシアナート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびスルホニルハライドを含むが、これらに限定されるわけではない官能基を含む、多種多様なタグが市販されており、これらの全てを、本明細書に記述したように、第二の分子にタグを共有結合性に付着するために使用してもよい。タグの官能基の選択は、上で概説したようなリンカー、または本発明の成分のいずれかに対して付着する部位に依存する。したがって、たとえば、タンパク質のカルボン酸基に対する直接の結合のためには、アミノ修飾されたか、またはヒドラジン修飾されたタグを、当技術分野において公知のとおり、たとえば1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDAC）を使用して、カルボジイミド化学を経て結合するために使用してもよい（Set 9 and Set 11 of the Molecular Probes Catalog, 前記を参照されたい；またPierce 1994 Catalog and Handbook, pages T-155 to T-200を参照されたい。これらの両方が参照として本明細書に組み入れられる）。一つの態様において、本明細書に記述したタグの多くのために市販されているようなタグに、カルボジイミドが最初に付着される。
【０１７６】
代わりの活性化状態指標
本発明で有用な代わりの活性化状態指標は、このような活性化の結果を示すことによって活性化を検出することができるものである。たとえば、基質のリン酸化は、その基質をリン酸化する役割を担うキナーゼの活性化を検出するために使用することができる。同様に、基質の切断は、このような切断の役割を担うプロテアーゼの活性化の指標として使用することができる。結合エレメントに関して上記した標識およびタグなどの、このような指標を検出可能なシグナルに連関させることができる方法が当技術分野において周知である。たとえば、基質の切断により、消光部分の除去を生じ、したがって事前に消光された標識から検出可能なシグナルを生じさせることができる。
【０１７７】
FACS解析
好ましい態様において、本発明は、単一細胞についての活性化可能なエレメントの活性化プロフィールを決定するための方法を提供する。本方法は、少なくとも2つの活性化可能なエレメントの活性化状態に基づいて、FACSによって細胞を選別することを含む。BE（たとえば、活性化状態特異的抗体）を、活性化可能なエレメント活性化状態に基づいて細胞を選別するために使用して、後述するように検出することができる。または、上記のとおりの非BE系を本明細書に記述した任意の系に使用することができる。
【０１７８】
本発明の方法および組成物に蛍光標識された成分を使用すると、種々のタイプの蛍光モニタリングシステム、たとえば、FACSシステムを使用して本発明を実施することができることが認識されるであろう。好ましくは、FACSシステムが使用され、または高スループットスクリーニング専用のシステム、たとえば96ウェルまたはより大きなマイクロタイタープレートが使用される。蛍光物質に対するアッセイを行う方法は、当技術分野において周知であり、たとえばLakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York： Plenum Press (1983)； Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, in： Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, ed. Taylor, D. L. & Wang, Y.-L., San Diego： Academic Press (1989), pp. 219-243； Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park： Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978), pp. 296-361に記述されている。
【０１７９】
試料中の蛍光は、蛍光計を使用して測定することができる。一般に、第一の波長を有する励起源からの励起放射は、励起光学系を通過する。励起光学系は、励起放射を生じさせて試料を励起させる。反応において、試料中の蛍光タンパク質は、励起波長とは異なる波長を有する放射を放射する。次いで、収集光学系が、試料からの発光を収集する。装置には、特定の温度にて試料を維持し、一方でそれをスキャンする温度調節器を含むことができる。一つの態様によれば、多軸移動ステージは、曝露される種々のウェルの位置を定めるために、複数の試料を保持するマイクロタイタープレートを移動する。多軸移動ステージ、温度調節器、自動フォーカシング機能、並びにイメージングおよびデータ収集に関連するエレクトロニクスは、適切にプログラムされたディジタル計算機によって管理することができる。また、コンピュータにより、アッセイの間に、収集されたデータを提示のためのもう一つの形式に変換することができる。一般に、公知のロボットシステムおよび部品を使用することができる。
【０１８０】
好ましい態様において、蛍光を検出するためにフローサイトメトリーが使用される。また、蛍光を検出するためのその他の方法、たとえば量子ドット法（たとえば、 Goldman et al., J. Am. Chem. Soc. (2002) 124：6378-82； Pathak et al. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123：4103-4；および Remacle et al., Proc. Natl. Sci. USA (2000) 18：553-8を参照されたい、それぞれが、参照として本明細書に明白に組み入れられる）、並びに共焦点顕微鏡観察を使用してもよい。一般に、フローサイトメトリーは、個々の細胞がレーザー光線の経路を通過することを含む。付着され、またはその中に見いだされる任意の蛍光分子のビームおよび励起の散乱により、読み取り可能な出力、たとえばサイズ、粒状度、または蛍光強度を生じるように、細胞が光電増倍管によって検出される。
【０１８１】
本発明の方法の検出工程、選別工程、または単離工程は、蛍光標示式細胞選別器（FACS）技術を必要とし得るし、この場合、細胞を特定の表面マーカーを含む集団から選択するためにFACSが使用され、または選択工程には、標的細胞捕獲および／またはバックグラウンド除去のための回収可能な支持体として磁気応答性粒子の使用を必要とし得る。種々のFACSシステムが当技術分野において公知であり、本発明の方法に使用することができる（たとえば、1999年4月16日に出願された国際公開公報第99/54494号；2001年7月5日に出願された米国特許出願第20010006787号を参照されたい、それぞれが参照として本明細書に明白に組み入れられる）。
【０１８２】
好ましい態様において、FACS細胞選別器（たとえば、FACSVantage（商標） Cell Sorter, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Calif.）を使用して、増強の有無におけるこれらの活性化プロフィール（ポジティブ細胞）に基づいて細胞を選別し、収集する。
【０１８３】
一つの態様において、細胞を、最初に特定の活性化可能なエレメントの特定のアイソフォームに向けられた蛍光標識された活性化状態特異的BE（たとえば抗体）と接触させる。このような態様において、それぞれの細胞に対して結合したBEの量は、細胞を含む小滴を、細胞選別器を通過させることよって測定することができる。ポジティブ細胞を含む小滴に対して電磁石電荷を与えることによって、細胞をその他の細胞から分離することができる。次いで、ポジティブに選択された細胞を無菌の収集容器に収集することができる。これらの細胞選別手順は、たとえばFACSVantage（商標） Training Manual, with particular reference to sections 3-11 to 3-28 and 10-1 to 10-17に詳述されており、これは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１８４】
もう一つの態様において、ポジティブ細胞は、活性化可能なエレメントのアイソフォームの存在に基づいて、細胞の磁気分離を使用して選別することができる。このような分離技術では、ポジティブに選択される細胞を最初に特異的結合エレメント（たとえば、抗体、または活性化可能なエレメントのアイソフォームに結合する試薬）と接触させる。次いで、細胞を検索可能な粒子（たとえば、磁気応答粒子）と接触させ、これを特異的エレメントに結合する試薬と結合させる。次いで、細胞-結合エレメント-粒子複合体を、たとえば磁場を使用して非ポジティブまたは標識されていない細胞から物理的に分離することができる。磁気応答性粒子を使用するときは、ポジティブまたは標識された細胞を磁場を使用して容器に保持し、一方でネガティブ細胞を除去することができる。これらおよび同様の分離手順は、たとえばthe Baxter Immunotherapy Isolex training manualに記述されており、その全体が本明細書に組み入れられる。
【０１８５】
好ましい態様において、単一細胞についての受容体エレメント活性化状態プロフィールの決定のための方法が提供される。本方法は、細胞集団を提供する工程、およびFACSによって細胞集団を選別する工程を含む。好ましくは、細胞は、少なくとも2つの活性化可能なエレメントの活性化状態に基づいて分離される。好ましい態様において、多数のエレメントの活性化状態を同時に決定するために、多数の活性化可能なエレメント活性化状態抗体が使用される。
【０１８６】
好ましい態様において、少なくとも2つのエレメントの活性化状態に基づいたFACSによる細胞選別は、表面マーカーの存在、粒状度、および細胞サイズなどのその他のFACS読み取り可能な出力の決定で組み合わせて、多数のエレメントの活性化状態と単一細胞についてのFACSによる測定可能なその他の細胞品質との間の相関を提供する。
【０１８７】
好ましい態様において、細胞選別は、エレメントのクラスター形成に基づいて行われる。一つの態様において、エレメントのクラスター形成は、重複弁別器を使用して同定することができる。
【０１８８】
重複弁別器は、単一のG2またはM段階細胞からG0またはG1段階細胞を識別する際に最初にこれが使用されたため、このように名づけられている。当技術分野において周知のとおり、細胞周期のG0およびG1段階の細胞は、DNAの単一量を有し、一方G2およびM段階の細胞は、細胞分裂に備えて2倍のこれらのDNA量を有する。したがって、細胞内のDNAの量を検出するだけであるFACS装置は、G0またはG1段階細胞の重複、それぞれがDNAの単一量を含む2つの細胞、およびDNAの二倍量を含む単一細胞のG2またはM段階細胞との間を識別することができない。しかし、重複弁別器は、後述するように細胞サイズ検出も取り込むため、重複を2倍のサイズであるとして、同量のDNAを有するが単一のG2またはM段階細胞から区別することができる。
【０１８９】
本明細書に使用される重複弁別器は、2つのFACS読み込み可能な出力を比較することによって機能する。最初のこれらの2つのFACS読み込み可能な出力は、蛍光強度である。一般に、FACS装置は、蛍光色素を励起するためにレーザーを使用し、これらの蛍光色素によって放射される光量子を検出するために光電増倍管を利用する。次いで、放射された光量子は、ボルトパルス分布と呼ばれる電圧値に変換される。蛍光強度は最大をとるだけではなく、ボルトパルス分布の最大強度として、またはボルトパルス分布を組み込むことのいずれかによって測定して、より正確な値を得ることができる。重複識別のために必要な第二のFACS読み込み可能な出力は、シグナルパルス幅である。シグナルパルス幅は、細胞がレーザー光線を通過する間に要する時間の測定値であり、一般に「飛行時間」（TOF）と呼ばれる。TOFは、レーザーを通過する細胞のサイズに比例するので、細胞が大きくなるほどビームを通過するためにより長い時間を要し、細胞が小さいほどより短い時間を要し、TOFは、また、その細胞の表面領域にも比例する。
【０１９０】
重複弁別器は、シグナルパルス幅と表面領域との間が比例することにより、エレメントのクラスター形成を検出する際に有効である。細胞の表面領域に対して蛍光強度を規準化することにより、クラスター形成は、クラスター形成していない状態の強度と比較して、表面領域の強度単位あたりの増加として検出される。次いで、この規準化された蛍光強度を時間とともにプロットして、生物活性剤の投与などの一定の事象後のクラスター形成の増減を表す。重複弁別器を使用してクラスター形成を検出する例を下記の実施例1に示してある。
【０１９１】
認識されるとおり、本発明は、またシグナル伝達におけるエレメントのクラスター形成事象の順序づけを提供する。特に、本発明により、技師は、単一細胞内における多数のエレメントのクラスター形成および活性化のレベルの相関に基づいて、エレメントのクラスター形成および活性化階層を構築することができる。順序づけは、単一の時点での細胞または細胞集団の活性化状態をコントロールと比較することによって、または残りの細胞から生じる亜集団を観察するために複数時点での細胞を比較することによって達成することができる。
【０１９２】
本発明は、細胞集団における細胞のサブセットの存在を決定する有益な方法を提供する。理想的には、細胞間のシグナリングの相違が、シグナル伝達事象およびその中の変化を定性的にも、また定量的にもマスクしないことを保証するために、シグナル伝達経路を均一細胞集団において評価する。究極の均一系は、単一細胞であるので、本発明により、細胞の個々の評価ができ、真の相違を有意な方法で同定することができる。
【０１９３】
したがって、本発明は、より大きな細胞集団内の細胞サブセットを区別する方法を提供する。本明細書に概説したとおり、これらの細胞サブセットは、集団内のその他のサブセットと比較すると、変化した生物学的特徴（たとえば、活性化状態、増強に対する応答の変化）を示すことが多い。たとえば、本明細書に概説したとおり、本発明の方法は、初代細胞集団などの集団、たとえば末梢血単核細胞から、その他のサブセットと比較して応答（たとえば、薬剤抵抗性または感受性）が変化した細胞サブセットを同定できる。加えて、この種の評価により、異なる活性化状態、増強に対する応答の変化、細胞系統、細胞分化状態、その他の間を区別する。
【０１９４】
認識されるとおり、これらの方法は、複合体細胞集団、このような末梢血単核細胞、またはナイーブおよび記憶リンパ球における人工的および刺激的条件の両方で異なったシグナリングカスケードの同定を提供する。
【０１９５】
さらなる技術
当業者によって認識されるように、本方法および組成物は、FACS解析に加えて種々のその他のアッセイ形式での使用を見いだす。たとえば、DNAチップに類似のチップを本発明の方法に使用することができる。アレイおよび前もって示されたアレイのチップに核酸をスポットするための方法は、公知である。加えて、合成のためのタンパク質チップおよび方法も公知である。これらの方法および材料は、活性化状態BEを前もって示されたアレイのチップに付加するために適応させてもよい。好ましい態様において、このようなチップは、多数のエレメント活性化状態BEを含み、細胞表面に存在するエレメントのエレメント活性化状態プロフィールを決定するために使用される。
【０１９６】
代わりの態様において、チップは、一般に非標識の場合に、多数の「第二のBEのセット」を含む。このようなチップを試料、好ましくは細胞抽出物と接触させて、エレメント活性化状態特異的BEを含む多数の第二のBEをサンドイッチ・アッセイ法に使用して、試料中の多数の活性化されたエレメントの存在を同時に決定する。好ましくは、複数の活性化状態特異的BEのそれぞれでは、検出を容易にするために一義的に標識される。
【０１９７】
代わりの態様において、個々の細胞についての活性化プロフィールを検出するために、共焦点顕微鏡観察を使用することができる。共焦点顕微鏡観察は、空間的にフィルターされた個々の検体位置からの光を経時的に収集し、次いで電子的に処理して検体の拡大イメージを与えることに依存する。共焦点顕微鏡観察に含まれるシグナル処理では、単一細胞内の標識された結合エレメントをさらに検出することができ、従って本態様において、細胞は、1つまたは複数の結合エレメントで標識することができる。好ましい態様において、共焦点顕微鏡観察と関連して使用される結合エレメントは、蛍光標識に対して抱合された抗体であるが、その他のタンパク質または核酸などのその他の結合エレメントも可能である。
【０１９８】
さらなる態様において、本発明の方法および組成物は、「細胞内ウエスタンアッセイ法」と組み合わせて使用することができる。このようなアッセイ法では、細胞を最初に標準的な組織培養技術を使用して標準的組織培養瓶内で培養する。一旦最適な集密度まで培養したら、増殖培地を除去し、細胞を洗浄してトリプシン処理する。次いで、細胞を計数して、適切な数の細胞を移すために十分な体積をマイクロウェル・プレート（たとえば、Nunc（商標）96 Microwell（商標）プレート）にアリコートをとる。次いで、個々のウェルを最適な集密度まで完全培地中で培養し、その時に培地を無血清培地と置き換える。この時点で、コントロールはそのままにするが、実験ウェルは、生物活性剤、たとえばEGFと共にインキュベートする。生物活性剤と共にインキュベーション後、細胞を固定し、調査する活性化エレメントに対する標識された抗体で染色する。一旦、細胞を標識すると、プレートをOdyssey Imager （LiCor, Lincoln Nebraska）などのイメージャーを使用して、Odyssey Operator's Manual v1.2.（これは、その全体が本明細書により組み入れられる）に記述された技術を使用して走査することができる。マルチウェルプレートの走査によって得られたデータを解析して、後述するように活性化プロフィールを決定することができる。
【０１９９】
使用することができる生物活性候補物質のタイプ
好ましい態様において、本発明は、エレメント活性を調整することができる生物活性剤をスクリーニングするための方法を提供する。たとえば、薬物および候補薬物をスクリーニングして、活性化プロフィールに対する薬物／候補の効果を評価すること、または所望のプロフィールを作製することができる。本方法は、細胞を候補生物活性剤と接触させる工程、およびFACSを含む本明細書に概説した技術を使用して該細胞におけるエレメント活性化を決定する工程を含む。
【０２００】
好ましい態様において、本方法は、複数の細胞を複数の候補生物活性剤と接触させる工程、および少なくとも1つのエレメントの活性化に基づいてFACSによって細胞を選別する工程を含む。
【０２０１】
「候補生物活性剤」、「候補薬剤」、「候補モジュレーター」、「候補調整薬」、もしくは「外因性化合物」、またはこれらの文法的相当語句は、本明細書において、任意の分子、たとえばタンパク質、小有機分子、炭水化物（多糖体を含む）、ポリヌクレオチド、脂質、その他を意味する。具体的には、薬物は、候補生物活性剤の定義に含まれる。一般に、種々の濃度における差動的反応を得るために、複数のアッセイ混合物を異なる薬剤濃度で並列して実行することができる。典型的には、これらの濃度のうちの1つは、すなわち0濃度にて、または検出以下のレベルで、ネガティブコントロールとして役立ち得る。加えて、ポジティブコントロールを使用することができる。
【０２０２】
候補薬剤は、多数の化学種を包含する。好ましい態様において、候補薬剤は、小分子である。もう一つの好ましい態様において、候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含む有機分子、特に小有機分子であり、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの官能性化学基を含む。候補薬剤は、環状炭素もしくは複素環式構造および／または1つもしくは複数の化学的な官能基で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造を含む。
【０２０３】
候補薬剤は、当業者によって認識されるであろうとおり、合成または天然の化合物ライブラリーを含む多種多様な供与源から得られる。当業者によって認識されるであろうとおり、本発明は、多種多様な公知のコンビナトリアルケミストリー型ライブラリーを含む、候補モジュレーターの任意のライブラリーをスクリーニングするための迅速かつ簡単な方法を提供する
【０２０４】
好ましい態様において、結合エレメントに関して上記したように、候補薬剤は、合成化合物である。本方法の1つの利点は、アッセイ前に候補薬剤を特徴づける必要がないことである。本発明の方法を使用して、任意の候補薬剤を、活性化可能なエレメントの活性を調節する（たとえば、増大し、または減少する）能力についてスクリーニングすることができる。加えて、当技術分野において公知のとおり、試験した化学的部分を本質的に同定するために、分割合成反応を使用してコードタグを使用してもよい。
【０２０５】
または、好ましい態様では、候補薬剤として、利用でき、または容易に産生される細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーを利用する。
【０２０６】
さらに、天然または合成的に産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通じて容易に修飾される。構造類似体を産生するために、公知の薬物を、酵素の修飾を含む定方向またはランダムな化学修飾に供してもよい。
【０２０７】
好ましい態様において、候補薬剤は、タンパク質、核酸、および化学的部分を含む。
【０２０８】
好ましい態様において、候補薬剤は、上記記載のようなタンパク質である。好ましい態様において、候補薬剤は、天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質の断片である。したがって、たとえば、タンパク質を含む細胞の抽出物、またはタンパク質性細胞抽出物のランダムもしくは定方向消化物を、より完全には後述したように試験してもよい。この方法で、多くの候補薬剤に対してスクリーニングするために、原核生物および真核生物のタンパク質ライブラリーを作製してもよい。細菌、真菌、ウイルス、および哺乳類タンパク質のライブラリーは、本態様において特に好ましく、好ましくは後者であり、特に好ましくはヒトタンパク質である。
【０２０９】
好ましい態様において、候補薬剤は、約2〜約50アミノ酸、好ましくは約5〜約30アミノ酸、および特に好ましくは約8〜約20のペプチドである。上記で概説したように、ペプチドは、天然に存在するタンパク質の消化、ランダムペプチド、または「偏った」ランダムペプチドであってもよい。「ランダム化された」またはこれらの文法的相当語句は、本明細書において、それぞれの核酸およびペプチドがそれぞれ本質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般に、これらのランダムペプチド（また下記に論議したように核酸）は、化学的に合成されるので、これらには、任意の位置にて任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を組み込んでいてもよい。合成法は、ランダム化されたタンパク質または核酸を作製するようにデザインすることができ、配列の全長にわたって全てまたは大部分の可能性のある組み合わせを形成し、したがって、ランダム化された候補生物活性タンパク質の薬剤ライブラリーを形成することができる。
【０２１０】
本ライブラリーは、確率的に十分な多様性の範囲で特定の活性化可能なタンパク質と相互作用させるように、十分に構造的に多様なランダム化された薬剤の集団を提供するべきである。したがって、相互作用ライブラリーは、そのメンバーのうちの少なくとも1つが、活性化可能なタンパク質と相互作用する構造か、またはシグナル伝達経路に関与する活性化可能なタンパク質のその他の特異的成分を有するように、十分に大きくなければならない。相互作用ライブラリーに必要とされる絶対サイズを測定することは困難であるが、免疫応答での性質がヒントを与える：107〜108の異なる抗体の多様性では、生物体に直面する可能性のある大部分の抗原と相互作用するほど十分な親和性をもつ少なくとも1つの組み合わせを提供する。また、発行されたインビトロでの選択技術では、標的に対して親和性をもつ構造を見いだすために107〜108のライブラリーサイズで十分であることを示した。本明細書において一般に提唱されるものなどの、長さがペプチド7〜20アミノ酸の全ての組み合わせのライブラリーは、207（109）〜2020をコードする可能性を有する。したがって、107〜108の異なる分子のライブラリーにより、本方法は、7アミノ酸について理論的に完全な相互作用ライブラリーの「作業」サブセット、および2020ライブラリーについての形状のサブセットが可能である。したがって、好ましい態様において、少なくとも106、好ましくは少なくとも107、より好ましくは少なくとも108、および最も好ましくは少なくとも109個の異なる配列を本方法で同時に解析する。好ましい方法は、ライブラリーサイズおよび多様性が最大である。
【０２１１】
一つの態様において、ライブラリーは、任意の位置に配列優先度または定常性を伴わずに完全にランダム化される。好ましい態様において、ライブラリーは、偏りがある。すなわち、配列内のいくつかの位置は、定常性を保持するか、または限られた数の可能性から選択される。たとえば、好ましい態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、たとえば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏りがある（小さい、または大きい）残基、システインの産生に向かう、架橋性のための、SH-3ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、スレオニン、チロシン、もしくはヒスチジン、その他の定義された分類内で、またはプリンに、その他で、ランダム化される。
【０２１２】
好ましい態様において、偏りは、分子の公知の分類と相互作用するペプチドまたは核酸の方に向かう。たとえば、候補薬剤がペプチドであるときは、細胞内シグナリングの多くが、小さなペプチドドメインを介してその他のポリペプチドと相互作用するポリペプチドの短い領域を経て行われることは公知である。たとえば、HIV-1エンベロープ細胞質ドメインに由来する短い領域は、細胞カルモジュリンの作用を遮断することが以前に示された。Wasp由来のマストパラン毒素に対して相同性を示すFas細胞質ドメインの領域は、死を誘導するアポトーシス性またはGタンパク質誘導性機能をもつ短いペプチド領域に限定することができる。アフリカツメガエルに由来する天然のペプチドであるマガイニン（Magainin）は、強力な抗腫瘍性および抗菌性活性を有し得る。プロテインキナーゼCアイソザイム（βPKC）の短いペプチド断片は、刺激後のアフリカツメガエル卵細胞におけるβPKCの核転位置を遮断することを示した。また、短いSH-3標的ペプチドは、SH-3タンパク質に対する特異的結合のためのニセ基質として使用されてきた。この領域には、文献が多いので、これは、もちろん生物活性で利用できるペプチドのわずかな一覧である。したがって、小さなペプチドが細胞内シグナリングカスケードに対して活性を有する可能性について、多くの先例がある。加えて、多くの分子のアゴニストおよびアンタゴニストを同様に候補モジュレーターの偏ったランダム化の基礎として使用してもよい。
【０２１３】
したがって、偏ってランダム化された候補モジュレーターを作製するための開始点として、多数の分子またはタンパク質ドメインが適している。共通の機能、構造、または親和性を与える多数の小分子ドメインが公知である。加えて、当技術分野において認識されるように、弱いアミノ酸相同性の領域は、強力な構造相同性を有し得る。SH-2ドメイン、SH-3ドメイン、プレクストリン、デスドメイン、プロテアーゼ切断／認識部位、酵素阻害剤、酵素基質、およびTrafを含むが、これらに限定されるわけではない多数のこれらの分子、ドメイン、および／または対応するコンセンサス配列が公知である。
【０２１４】
好ましい態様において、候補調整薬は、ポリペプチドである。もう一つの好ましい態様において、ポリペプチドは、少なくとも4〜20アミノ酸を有する環状ペプチドである。また、もう一つの好ましい態様において、ポリペプチドは、触媒的に不活性なポリペプチドである。触媒的に不活性なポリペプチドの例は、触媒的に不活性な活性化可能なタンパク質、およびより具体的には、触媒的に不活性なキナーゼ（たとえば、PI3K）またはカスパーゼを含むが、これらに限定されるわけではない。さらなる局面において、候補調整薬は、活性化可能なタンパク質のペプチド断片であり、ペプチド断片には、活性化可能なタンパク質の全長アミノ酸配列の部分列であるアミノ酸配列を含む。
【０２１５】
好ましい態様において、候補薬剤は、結合エレメントに関して上記した核酸である。
【０２１６】
好ましい態様において、候補薬剤は、結合エレメントに関して上記した有機部分である。
【０２１７】
当業者によって認識されるであろうとおり、たとえば本発明の方法において候補薬剤を組み合わせることによって、複数のタイプの候補薬剤を一度にスクリーニングすることが可能性である。したがって、使用する候補薬剤のライブラリーは、薬剤（すなわち、ペプチド）の1つのタイプのみ、または複数のタイプ（ペプチドおよび有機薬剤）を含んでいてもよい。
【０２１８】
一般的スクリーニング法
活性化プロフィールを決定するための全般的プロトコルにおいて、細胞を最初に小体積の培地に懸濁する。次いで、細胞をマルチウェルプレートまたはその他の適切な基質にアリコートに分けて、生物活性剤の有無においてインキュベートすることができる。適切な期間、適切な温度にてインキュベーションを続けた後、インキュベーションを終わらせて、細胞を当技術分野において周知のように固定することができる。
【０２１９】
一旦固定させたら、細胞をペレットにしてメタノール中に再懸濁し、透過化させることができるが、その他の透過化処理法も本発明に適合している。細胞をこの位置にて貯蔵すること、または標識された結合エレメントと組み合わせて適切に解析することができる。
【０２２０】
「組み合わせた」とは、公知の方法を使用して、または本発明の方法を使用して、検出可能である活性を促進する条件下（たとえば、活性化可能なタンパク質の対応する抗原もしくはアイソフォームに対する抗体の結合、または活性化可能なタンパク質の活性化状態）で、インビトロにおいて反応混合物に、またはインビボにおいて細胞に種々の成分を組み合わせることを意味する。
【０２２１】
解析は、反応パネルを作製することによって開始する。反応パネルは、マルチウェルプレートの実験的配置と同様に、ノード（行において）および状態（列において）の二次元アレイに隣接している。ノードは、プロフィールを研究するそれぞれのタンパク質に対応する。その他の特徴を有するその他の反応パネルも、本発明における使用を見いだすことができる。反応パネルは、マルチウェルプレートからそれぞれの試料について出力されるFACS（またはその他の検出方法）を表す。典型的には、[MFI刺激した／MFI刺激していない]のlog2をとるが、その他の規準化法も公知であり、本発明と組み合わせて使用することができる。基底ノードについては、同じスケールで測定値を置くために、[MFI基底×／MFI試料最小基底]のlog2が使用される。活性化プロフィールを同定するためには、全ての試料についてノード状態を収集し、試料全体の相違を研究する。複数の時点が含まれるときは、試料のそれぞれの時点を別々の試料として処置することができる。正常細胞で見られるよりも相違が大きいノード状態は、典型的には活性化プロフィールに含まれる。
【０２２２】
上で議論したように、本発明は、細胞におけるエレメントの活性化の検出のための方法および組成物を提供する。本明細書に使用される細胞という用語および文法的相当語句は、本明細書において、任意の細胞、好ましくは任意の原核生物または真核生物細胞を意味する。
【０２２３】
適切な原核細胞には、大腸菌（E. coli）などの細菌、種々のバシラス属（Bacillus）種、および好熱菌などの極限環境微生物細菌、その他を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２２４】
適切な真核細胞には、コウジカビ属（Aspergillus）、トリコデルマ属、およびパンカビ属の種を含む酵母および糸状菌などの真菌；トウモロコシ、モロコシ、タバコ、アブラナ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、ヒマワリ、その他のものを含む植物細胞；並びに魚、鳥類、および哺乳類を含む動物細胞を含むが、これらに限定されるわけではない。適切な魚細胞には、サケ、マス、チュラピイア（tulapia）、マグロ、コイ、ヒラメ、オヒョウ、メカジキ、タラ、およびゼブラフィッシュ種に由来するものを含むが、これらに限定されるわけではない。適切な鳥類細胞には、ニワトリ、カモ、ウズラ、キジ、およびシチメンチョウ、およびその他のヤケイまたは猟鳥のものを含むが、これらに限定されるわけではない。適切な哺乳類細胞には、ウマ、ウシ、バッファロ、シカ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどの齧歯類、ヤギ、ブタ、霊長類、イルカおよびクジラを含む海洋哺乳類、並びに任意の組織または幹細胞型のヒト株化細胞などの株化細胞、および多能性および非多能性のものを含む幹細胞、並びに非ヒト接合体に由来する細胞を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２２５】
また、適切な細胞は、多種多様な疾患状態、さらに病気にかかっていない状態の間に関係する細胞タイプを含む。したがって、適切な真核細胞タイプには、全てのタイプの腫瘍細胞（特に黒色腫、骨髄性白血病、肺癌腫、乳房、卵巣、結腸、腎臓、前立腺、膵臓、および精巣）、心筋細胞、樹状細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（T細胞およびB細胞）、肥満細胞、好酸球、血管内膜細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、赤血球、肝細胞、単核白血球を含む白血球、造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋細胞幹細胞などの幹細胞（分化および脱分化因子をスクリーニングするために使用するためのもの）、破骨細胞、軟骨細胞、およびその他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラニン形成細胞、肝細胞、腎臓細胞、並びに脂肪細胞を含むが、これらに限定されるわけではない。初代腫瘍細胞などの初代疾患状態細胞が特に好ましい。また、適切な細胞は、Jurkat T細胞、NIH3T3細胞、CHO、COS、その他を含むが、これらに限定されるわけではない公知の研究細胞を含む。ATCC株化細胞カタログを参照されたい、本明細書により明白に参照として組み入れられる。
【０２２６】
好ましい態様において、本発明に使用される細胞は、患者から採取される。本明細書に使用される「患者」とは、ヒトおよびその他の動物の両方、並びに実験動物などのその他の生物体をいう。したがって、本方法および組成物は、ヒトおよび獣医学的適用に適用できる。好ましい態様において、患者は、哺乳類であり、より好ましい態様において、患者は、ヒトである。
【０２２７】
増強モデルにおける薬剤のスクリーニング
増強の研究のための全般的プロトコルにおいて、細胞（たとえば、一般的なスクリーニング法に関して上記した任意の細胞タイプを含むが、これらに限定されるわけではない）を最初に小体積の培地に懸濁し、計数する。それぞれからの適切な量の生細胞が試料（4つのコア染料のためのもの）中に存在するはずであり、加えてそれぞれの貯蔵試料について適切な量が存在するはずである。次いで、細胞を適切な濃度に希釈し、以下に示すように、それぞれの適切な体積をマルチウェルプレートまたはその他の適切な基質にアリコートに分ける（実施例3を参照されたい）。次いで、増強剤を適切な濃度および体積に細胞のそれぞれのカラムに添加した。増強を適切な期間および適切な温度にて続ける。増強終了のために、細胞を洗浄して増強剤を除去することができる。次いで、増強細胞を生物活性剤と共にインキュベートして、その薬剤の効果をスクリーニングすることができる。薬剤に対する曝露は、当技術分野において公知のとおり、細胞を固定することによって種々の時点にて終結させることができる。
【０２２８】
増強後で、細胞をペレットにしてメタノール中に再懸濁し、透過化させることができ、上で議論したように、透過化処理のその他の方法も本発明に適合している。細胞は、この時点で貯蔵することができ、または標識された結合エレメントとインキュベートして適切に解析することができる。
【０２２９】
反応パネルの作製、ノードの規準化、および算出される相違を含む解析を上記の通りに進める。
【０２３０】
一旦、ノードを規準化して、相違が決定されたなら、バイオシグネチャー（biosignature)ノード状態の教師なしクラスター形成を使用して試料をグループ化する。生じるグループ内の臨床パラメーターの分布を統計的有意性試験（たとえば、以前に定義された仮説に対するχ二乗およびスチューデントt検定）を使用して決定する。次いで、同様の増強がある試料のグループには、名称を与えることができ、観察された全ての可能性のある経路相互作用に基づいて経路マップを強調して、それぞれのグループの観察に従って暗くすることができる。一般に、グループの試料の半分以上が、全ての試料の中央値を上回る増強を示す場合、その経路は、強調される。そうではない経路は、暗くされる。
【０２３１】
経路マップは、これらの観察された増強に基づいて個々の試料について構築することができ、これらのマップに基づいて、試料がグループに属する（および、そのグループと同様の特徴を有することが予測される）表現型を同定することができる。一旦、予測パネルがグループについて作製されれば、これを元のものと同様のさらなる試料セットに対して確証することができる。さらなるデータにより、マップを最小化し、最適化して、所与の試料についてできる限り正確で、できる限り少ないノード状態測定値にすることができる。
【０２３２】
解析
フローサイトメトリーの進歩により、最高13個の同時パラメーターの個々の細胞を数え上げることができ（De Rosa et al., 2001）、ゲノムおよびタンパク質データサブセットの研究へと向かっている（Krutzik and Nolan, 2003； Perez and Nolan, 2002）。パラメーター、エピトープ、および試料の数が増大するにつれて、フローサイトメトリー実験の複雑さおよびデータ分析の検証が急速に伸びてきた。刺激パネルの開発によってデータ複雑さのさらなる層が付加されており、これにより、実験条件のセットが増える中でのシグナル伝達ノードの研究が可能になる。生じる実験的なおよび情報科学的検証を扱うために、本発明は、フローサイトメトリー実験をアレイ化し、評価を容易にするためのヒートマップを使用して結果を倍数変化に近づけるための技術を提供する。
【０２３３】
アレイ化するなどのフローサイトメトリー実験を示すことができる多数の有用な方法が、ある。一般的に言って、アレイ化されたフローサイトメトリー実験では、実験計画法に基づいて、多次元的フローサイトメトリーデータを単純化して、フローサイトメトリー試料間の相違を観察した。フローサイトメトリー試料のセットの変化を比較する一般的な方法では、1つのパラメーターのヒストグラムを同じプロット上に重ね合わせる。アレイ化したフローサイトメトリー実験は、理想的には、実験試料を比較する細胞に対して、染色されていないコントロール集団、染色されたコントロール、または刺激されていない細胞を含む。このコントロールは、アレイの最初の時点で配置して、その後に実験試料が順番にコントロールに続く。しかし、多数のヒストグラムまたは2Dフローサイトメトリープロットのセットは、扱いにくくなる可能性がある。
【０２３４】
実験試料間の相違は、それぞれの試料の中央蛍光指数（MFI）の変化と比較してピークに色をつけて強調することができる。この基底状態からの変化は、以下として算出される：
2014055964.tif 000003
【０２３５】
式1-1において、パラメーターについての倍数変化（たとえば、タンパク質リン酸化、タンパク質発現レベル）は、実験の刺激された（たとえば増強された）MFIと刺激のない同じ細胞のMFIなどのコントロールMFIとの間の変化によって表される。変化のlog2をとっているので、増加は正の値であり、減少は負の値であり、小さな変化は、ゼロに近い。明瞭に実験結果を伝えるために、同じ明度を実験計画法に従ってアレイ化することができる。この比較的小さなサイズの実験では、アレイ化されたアプローチの利点はあまり明らかでなく、アレイ化したフローサイトメトリーの開発が駆り立てられた多数の標的、試料、時点、および細胞サブセットに対してこの技術が発展される。
【０２３６】
具体例は、本発明のこれらの局面を記述する際に有用である。この例における標的ホスホ-タンパク質であるStat1は、シグナリングノードと呼ばれ、それが研究される刺激条件をノード状態と呼ぶ。それが多様な細胞シグナリング機構を記述するので、この一般的専門用語は、アレイ化されたフローサイトメトリー実験のために有用である。したがって、細胞内シグナルが細胞を縦走する機構には、リン酸化、タンパク分解性切断、ユビキチン化、アセチル化、発現レベル、およびその他の翻訳後タンパク質状態を含む。これらの事象のそれぞれをモニターするために、フローサイトメトリーアッセイ法が記述されており、したがって、多数のタンパク質事象を単一細胞において同時にマップすることができる。
【０２３７】
共通の条件セット下でいくつかのシグナル伝達ノードをアレイ化し、反応パネルを生じることにより、標的細胞集団の二次元プロフィールを提供する。この特定の例において、U937株化細胞における6つのホスホ-タンパク質のシグナリングを比較した。これらのホスホ-タンパク質は、個々の細胞において同時にアッセイすること、または複製した試料において連続してアッセイすることができる。このような方法で、多パラメーターのデータのあらゆるチャンネルを同時に比較することができ、並行して解析した試料を組み合わせて、比較することができる。この技術は、十分に発展した一連のアッセイ法をそれぞれの試料を一様にプロファイルするモデルに移行するときに、特に有用である（たとえば、患者の試料）。1つのパネルの反応を別の試料または普遍的コントロールから減算することによって、研究者は、2つの試料間で異なる残りのシグナリング機構を迅速に同定することができる。
【０２３８】
また、シグナリングノードの固定セットについて個々のまたは組み合わせた刺激をスクリーニングするためにも、アレイ化されたフローサイトメトリーを使用することができる。プレートに基づいたアレイ化されたフローサイトメトリー実験では、行および列が反応について試験した刺激条件の格子を表す。プレートのそれぞれのウェルは、集団として同じ細胞を含むと思われ、シグナル伝達試験管として機能する。刺激は、x、y座標に与えられ、刺激の設定時間後に細胞を固定し、細胞のそれぞれのセットを同じセットの複数の標的について同時に染色した。アレイ化したフローサイトメトリー実験を96ウェルプレートにそのままフォーマット化することには、いくつかの利点を有する。多チャネルの試薬の添加により、実験誤差、設備均一性を低下させることができ、短期間で相前後して多数の生化学的実験を開始および停止することができる。
【０２３９】
アレイ化されたフローサイトメトリーのもう一つの例では、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）／イオノマイシンで増強後の4分の時点における末梢血白血球（PBL）のシグナリング機構が比較される。細胞を、骨髄球性系統細胞（CD33）についての表面マーカー、および4つのシグナリングタンパク質のリン酸化（p38、Stat1、およびp53）で染色した。シグナリングは、逆時間経過で連続して開始して、全ての試料を固定して、同時に染色した。特にこの実験に目立ったことは、静止非応答者バックグラウンドから細胞のサブセットを別々に解析するときに、いくつかのホスホ-タンパク質の反応が明らかにされただけであることである。この結果では、古典的なホスホ-タンパク質の解析のための一パラメーター技術（たとえば、ウエスタンブロット法）を使用して行うことが極めて困難であると考えられ、また細胞内シグナリングを崩壊させ得る処理である総PBLからの骨髄性細胞の物理的単離を含んでしまう可能性が高いと考えられる。
【０２４０】
実験試料とコントロール間の相違を明らかにするために、MFI変化をlog2倍変化に近似させる。このような方法でシグナル伝達事象を数え上げることにより、フローサイトメトリーデータが統計的方法およびクラスター化アルゴリズムに移動可能になる。（この文脈における「クラスター化」という用語の使用は、受容体クラスター形成とは異なり、この状況では、多くの方法のデータ点を共にクラスター化するアルゴリズムをいう点に留意されたい。さらに、多様なパラメーターが同様の倍数誘導スケールで置かれたときに、試料のクロスプラットフォーム比較を行うことができる（たとえば、タンパク質発現、RNA含量、DNA含量および細胞周期表示、多様な条件下でのタンパク質リン酸化、繰り返された遺伝因子の長さ、患者の生残期間、生体外刺激後の細胞死）。
【０２４１】
一旦、重要なパラメーターのセットが同定されたら、同様のプロフィールをもつ試料の教師なしクラスター化により、試料の集団内の群および関係を同定するための強力な方法が提供される。DNAマイクロアレイ生物学者によって開発された慣例に従って、フローサイトメトリーからの集団を関心対象のそれぞれの細胞または試料を列に配置して、実験および遺伝子に類似の関心対象のそれぞれのパラメーターを行に配置するように配置することができる。一旦、適切な集団およびパラメーターが入力されれば、多数のクラスター化技術を行うことができる。一般に、教師なしクラスター化をうまく使用するには、クラスター化するほとんどまたは全ての因子がクラスター化する試料群にとって重要なように知的に選択されるか、または分散マッピング（下記を参照されたい）と同様にアルゴリズムを使用して選択される、関心対象のパラメーターに依存する。これは、単に値の類似性だけに基づいた教師なしクラスター化群試料が、それぞれのシグナリングノード状態を報告したためである。この技術では、このように同定された群が臨床的に関連しないかもしれないというリスクを有するが、強力に人工的に、事前に組織化された群が回避されるので、強力な誘因をもたらす。下記に概説したように、このアプローチを急性骨髄性白血病におけるシグナリング病態を同定するために使用した。また、このアプローチを使用して固定された系に対して特異的活性をもつ化合物を容易に同定することができる。
【０２４２】
フローサイトメトリーデータのクラスター化の前に、関心対象の集団およびこれらの集団を特徴づけるための方法が決定される。アレイ化されたフローサイトメトリーでは、クラスター化のための集団を同定する少なくとも2つの一般的方法がある：
1.個々の試料またはサブセット（たとえば、治験における患者）についての「外から内への」パラメーターセットの比較。このより一般的な場合において、細胞集団を、関心対象の標的に対して相同であるとみなされる異なったセットを作製するような方法で、同質または系統でゲートする。試料-レベル比較の例は、患者の腫瘍細胞におけるシグナリングプロフィールの同定およびこれらのプロフィールの臨床応答の非ランダム分布との相関である。関心対象の集団が、マッピングしてその他の集団に対してそのプロフィールを比較する前に事前に定義されているので、これは、外から内へのアプローチとみなされる。
2.不均一集団における個々の細胞のレベルのパラメーターの「内から外への」比較。この例は、一定の条件下での混合された造血細胞のシグナル伝達状態マッピングおよびその後の計算的に同定された細胞クラスターの系統特異的マーカーとの比較である。これは、分類の前に特異的集団の存在を推定しないので、単一細胞研究に対する内から外へのアプローチとみなすことができる。このアプローチの主要な欠点は、少なくとも初めに、複数の一過性マーカーを数え上げることが必要で、単一細胞表面エピトープでは決してアクセスできないであろう集団を生じることである。その結果、このような集団の生物学的有意性を決定するのが困難となり得る。この従来にないアプローチの主な利点は、系統または細胞型間の潜在的な任意の差異を引き出すことなく細胞集団を偏りなく追跡することである。
【０２４３】
これらの技術のそれぞれにおいて、フローサイトメトリーにより単一細胞レベルにて大量の多パラメーターのデータを送達する能力を利用する。腫瘍は、一般に単一の実体として処置され、歴史的技術にしたがって分類されるので、癌について、腫瘍データの第三の「メタレベル」が存在する。これらの技術には、器官または組織の起源、分化の程度、増殖インデックス、転移性伝播、および患者に関する遺伝的または代謝的データを含んだ。
【０２４４】
加えて、本発明は、腫瘍シグナリング空間をマッピングするための分散マッピング技術を提供する。これらの方法では、推定上の正常コントロールから独立して腫瘍を比較することができるので、これにより、腫瘍生物学の研究に有意な進歩を示す。伝統的な差動的状態解析法（たとえば、DNAマイクロアレイ、減算ノーザンブロッティング）は、一般に、正常なコントロール、一般に隣接している理論的に形質転換されていない組織とそれぞれの患者の試料からの腫瘍の比較に依存する。または、これらは、複数のクラスター化および再クラスター化、次いで表現型に従って患者の試料をさらに層別化することに依存する。対照的に、腫瘍状態の分散マッピングでは、最初に腫瘍試料をそれ自体と、次いで親腫瘍集団に対して比較する。その結果、腫瘍の中で最も多くの多様性をもつノード状態が、差動的状態解析におけるコアパラメータを提供する。多様な腫瘍のプールを考慮すると、この技術により、研究者は、腫瘍と提唱された正常コントロールとの間の相違に対して、差動的腫瘍病態の基礎をなす分子事象（たとえば、化学療法に対する腫瘍応答）を同定することができる。
【０２４５】
分散（σ2）は、腫瘍試料のセット全体のノードについて観察される状態の多様性を表すことができる一つの方法である。アレイ化されたフローサイトメトリー実験に関して、ノード状態の分散は、試料セットの平均値からのそれぞれの試料の測定値の偏差を平均二乗として算出される：
2014055964.tif 000004
【０２４６】
式1-2において、xは、それぞれの試料のlog2倍ノード状態測定値であり、xは、全ての試料全体にわたるxの平均であり、Nは、試料の数である。パラメーターは、ノード状態測定値が頻繁にかつ大量に変化する場合に最高の分散を有する。この技術を使用した洗練のための領域には、技術的理由のためにMFIにおいて必ずしも同様の相違を報告しない多様なパラメーターの比較におけるものがある。ノード状態についてのMFI変化は、BEの不十分なフルオロフォア標識化または高BE染色バックグラウンドのために低下し得る。これらの問題は、一般にノード状態の相違を減少させ、潜在的に有意な情報を見過ごすことになる。ノード状態の臨床的プロファイリングを行う際に、十分に特徴づけられた試薬で研究すること、および同様のスケールでノードとこれらの状態とを比較することが重要である。
【０２４７】
分散マッピングを使用して患者試料のシグナリング空間をプロファイルするときに、同様の方法でシグナリングが撹乱されている腫瘍を、組織または細胞タイプの起源を問わず共にグループ化する（AMLのプロファイリングを参照されたい）。同様に、系統マーカーまたは組織の起源に基づいて比較的類似すると考えられる2つの腫瘍は、環境の刺激を解釈するための非常に異なる能力を有し得るし、2つの異なる群にプロファイルされるであろう。この技術により本発明者らが見いだしたことは、急性骨髄性白血病腫瘍試料においてシグナリングが増強されたことが、細胞障害性化学療法に対する患者の応答を予測するということである（AMLのプロファイリングを参照されたい）。同じ技術（σ2<0.1）でプロファイルしたときに、正常組織のセットでは、一般に低域分散を示す。本技術では、免疫応答および感染による個々の細胞シグナリングに対する攪乱を検出することが予想されるので、正常組織で検出されるいくらかの分散は、無症状性病態を反映し得る。これらの観察は、アレイ化されたフローサイトメトリー実験において情報価値のあるノード状態についての作業分散閾値を（σ2=0.1）示唆した。この分散閾値は、アレイ化されたフローサイトメトリーが極めて感受性であること、および精度の進歩により、バックグラウンドノイズがさらに低くなり、この閾値の値をより低くすることができることを示す。腫瘍において、多くのノード状態に対する分散は、閾値を十分に上回る（AMLのプロファイリングにおける有意なノードのための中央値σ2は、0.34であった）。これらの結果は、腫瘍シグナリングの分散マッピングにより、腫瘍シグナリングネットワークの進化における有意差を検出することを示す。
【０２４８】
シグナリングプロフィールのクラスター化が同定されたときは、臨床応答、遺伝子変異の存在、およびタンパク質発現レベルなどのその他の因子が群内でランダムに分布されていないかどうかを決定するために有用であることが多い。アレイ化されたフローサイトメトリー実験におけるこのような仮説を実験または文献が示唆する場合、スチューデントt検定およびχ2検定などの単純な統計的検定で判断することができる。同様に、実験内に2つの変動要因が考えられる場合、直線回帰によるr2相関係数を使用してこの関係の程度を表すために使用される。これらの試験のそれぞれを使用して、下記に概説したようなアレイ化されたフローサイトメトリーデータを評価し、腫瘍患者試料のプールの解析の際のこれらの適切な使用は、本明細書に導入される。
【０２４９】
アレイ化されたフローサイトメトリー実験において試験される多くの仮説により、フローサイトメトリーノード状態の値が2つの群間で有意に異なるかどうかを求める。2つの集団からの平均が有意に異なるかどうかを求めるためには、スチューデントt検定がp値を得るのに適した方法である。たとえば、下記の実施例に示すように、本発明者らは、G-CSFに対するStat3の増加反応がFlt3遺伝子に突然変異をもつ患者の試料において見いだされるという仮説を試験する。アレイ化されたフローサイトメトリーデータのその他のパラメーターとのこのようなクロスプラットフォーム比較には、スチューデントのt検定が最も頻繁に使用される。このような試験のためのt値を算出する：
2014055964.tif 000005
【０２５０】
式1-3において、XAは、群A全体のノード状態の平均値であり、SAは、群A全体のノード状態の標準偏差であり、NAは、群Aにおける試料の数である。また、式1-2の分母は、標準誤差とも称される。自由度（df）と共に（この場合N−2である）、t値を使用して統計表の仮説に関するp値を調べる。比較される両方のパラメーター（たとえば、「突然変異ポジティブ」および「突然変異ネガティブ」）について、試料が別々の群に組織される場合、p値を決定するためにχ2検定を使用することが適している。特定のシグナリングプロフィールをもつ試料における遺伝子変異の有無などの、シグナリングプロフィールに由来するクラスター群内の要素を比較するときは、この試験が最も一般的である。χ2検定で算出されたp値は、パラメーターが群間でランダムに分布されていない程度を表す。2つの群（AおよびB）に関するパラメーターのセット（p1、p2、p3、...）についてのχ2値は、予想される分布に対して観察された分布を比較することによって算出される。群Aにおけるパラメーターp1について予想される分布
2014055964.tif 000006
は、以下として算出される：
2014055964.tif 000007
【０２５１】
式1-4において、
2014055964.tif 000008
は、群Aにおけるp1試料で観察された数であり、Nは、比較される総試料の数であり、およびΣOAは、群Aで観察された試料の総数である。式1-2において算出される期待値は、χ2値を算出するための実測値と共に使用される：
2014055964.tif 000009
【０２５２】
式1-5における合計は、パラメーターおよび群の全ての可能な組み合わせ全体で行う。次いで、生じるχ2値および自由度（この単純な場合、パラメーターの数）を使用して統計表のp値を調べる。
【０２５３】
一般に、p値が、ランダムに起こって観察される効果の機会が20回に1回未満であったことを示すα=0.05を下回る閾値のときに、有意であるとみなされる。観察が極めて有意なことを示すためには、0.001以下であるp値が一般に採用される。しかし、一部の試験では、閾値を修正しなければならない。最初に仮説を示さずに複数のt検定を行うときは、t検定の危険性の可能性が生じる。たとえば、時には、研究者が腫瘍患者群を群（たとえば、「腫瘍」および「正常な」、または「腫瘍A」および「腫瘍B」）に分け、次いで、これらの群のそれぞれについて多くのパラメーター（たとえば、5,000遺伝子の発現）の有意性を試験する。この場合において、試験したそれぞれの遺伝子で機会が増大したことによって、いずれか一つの遺伝子についての平均が異なるように見える確率、およびしたがってα-値は、スケール変更されるべきである。α値が変倍されてない場合、より高いp値をもつ実際のヒットの中に存在する偽陽性を観察する可能性がある。
【０２５４】
α値を変倍させる1つの直接法は、パラメーターまたは試験される仮説の数によってこれを割ることである。従って、5,000の要素を2つの群内で同時に試験する場合、有意性の閾値は、α=0.00001のずっと厳密な値に設定されるべきである。この問題に対するその他の解法は、仮説単位として遺伝子の群を使用して、試験回数を低下させること、および既存の仮説を試験することである。本発明者らは、分散マッピングおよび教師なしクラスター化を使用することにより、本発明者らのプロファイリング方法を適応して複数のt検定の危険を回避した（AMLプロファイリングを参照されたい）。一旦、このように群が同定されれば、χ2検定を使用して個々のパラメーター（たとえば、化学療法応答）が群間でランダムに分布されていないかどうかを決定することができる。加えて、分散マッピングを使用してシグナリングプロフィールを同定した後に、適切にt検定を使用して、Flt3野生型および突然変異体患者試料（AMLプロファイリング参照されたい）におけるStat5の基底および増強された活性などの個々の仮説の有意性を決定することができる。
【０２５５】
多くのアレイ化されたフローサイトメトリー実験で望まれる結果は、シグナリング分子のネットワークがアポトーシスおよび増殖などの細胞プロセスの制御に対してどのように共に機能するかを決定することである。多元的情報を視覚化するための強力な技術では、自己編成マップ（SOM）を使用して、パラメーター間の関係−本発明においてはシグナル伝達ノード状態の研究者に対して画像をスケッチする。パラメーター間の関連空間をマップするための基本アルゴリズムは、解析におけるパラメーター間のピアソン積率相関係数（r）の平方を決定することによって開始する：
2014055964.tif 000010
【０２５６】
アレイ化されたフローサイトメトリーに対する式1-5の適用の際に、XおよびYは、関係が算出される2つのノード状態からの倍数MFI値であり、Nは、試料の数であり、および合計は、試料のセットにおける全ての値に対して生じる。次いで、有意性閾値（r2＞0.5）を上回る関係のものを、シグナリングノード間の関連性距離の基準として使用する。それぞれの関連したノードを、いくらかの弾性で、関連があるノードからの1-r2の距離に配置する。この技術を使用して一組の白血病ノード間：Bcl-2発現、p53蓄積、および5p53リン酸化の関係をマップした（Jonathan Irishの未発表の研究）。この技術は、関連したノードまたはノード-状態のネットワークとして、シグナリングの直観的なマップを提供する。SOMは、仮説生成およびデータ可視化のための強力なツールであるが、因果関係を示すためには採用すべきではない。アレイ化されたフローサイトメトリーSOMの永続する目標は、状態間の関係を維持すると共に、異なる解析のレベルでノードおよびノード状態を明らかに表すことである。
【０２５７】
白血病患者試料のアレイ化されたフローサイトメトリー解析では、原発組織試料が培養液中で培養するために適応された細胞と著しく異なることを示す。シグナル伝達のための初代細胞アッセイ法に移る際に、本発明者らは、本コントロールについて長年文献によって示唆されたように、その原発腫瘍細胞が必ずしも構成的に調節不全であるわけではないことを見いだして驚いた（Benekli et al., 2002； Gouilleux-Gruart et al., 1997； Spiekermann et al., 2002）。代わりに、本発明者らは、腫瘍細胞が、増殖の増大、アポトーシスの阻害、およびその他の腫瘍回避機構を反映してシグナリング応答を発生したと理解した。環境合図で明らかにされるこれらの経路は、「増強された」とみなされる。シグナル伝達ノードの基底状態および増強された状態の両方を評価することは、腫瘍シグナリング病態を解明するために好ましい方法である（AMLプロファイリングを参照されたい）。
【０２５８】
応答パネルおよびシグナリングが増強されたモデルの開発により、本発明者らは、細胞シグナリングの景観を記述するための新たな専門用語を開発することが有用であることを見いだした。加えて、このような病理学的シグナリング表現型を使用して、ヒト疾患を分類し、患者のリスクを層別化し、および最終的にこれらが最も有効である患者の群に対して疾患療法をターゲットすることができる。シグナリングが増強されたこの全般的モデルにより、腫瘍を生じる選択圧：細胞死を誘発することなく獲得増殖性シグナルの中心的推進力が概説される。急性骨髄性白血病では、このような増殖シグナルが、骨髄球性サイトカインG-CSF、GM-CSF、およびIL-3に対するStat5の、並びにFlt3-リガンドに対するFlt3エフェクターの（AMLプロファイリングを参照されたい）応答が増強される形をとり、アポトーシスの喪失は、Bcl-2ファミリー・メンバー発現、Stat1シグナリングの喪失、p38 MAPK制御の変化、およびp53活性の中の抑制を介して達成される（Jonathan Irish、未発表データ）。環境合図に対するこれらのシグナリングノードの応答（たとえば、増強）は、臨床的に関連した腫瘍プロフィールの同定に非常に有用である。したがって、本発明は、化学療法に抵抗する腫瘍細胞が、環境合図によって活性化される潜在性シグナルを含むことを示す。従って、調節不全の腫瘍シグナリング機構を理解することには、発癌遺伝子および腫瘍抑制因子の発現レベルの評価、並びにシグナリング分子が活性になる能力を含み得る。
【０２５９】
増強されたモデルにおいて概説したノード状態の3つの種類に由来し得るいくつかの当然の結論がある。一群の細胞または試料間のノード状態の増強を、ノードが増強されていないか、または異なって増強された試料のセットなどの実験的に定義されたコントロール群と比較する。基底ノード状態の定義を実験条件と比較して、基底状態であるとみなされることに影響を及ぼす予想外の因子があるかもしれない可能性を反映させる。別の方法をとると、この腫瘍細胞シグナリングのモデルには、あらゆる試料のプロフィールにおけるあらゆるノードについての内部コントロールが必要である。実際の結果として、試料変動に対する試料の大部分を、増強されたシグナリングの応答パネルプロフィールから除く。さらに、腫瘍シグナリングの増強されたモデル下で、実験試料のセットを推定上の正常セットだけでなく、異なるシグナリング表現型を示すその他の腫瘍に対しても比較することができる。これは、正常な集団がきわめて少ないか、腫瘍と一緒の患者から得られなかったときに、または正常前駆体が特定の腫瘍についてのものかが不明なときに、特に重要である。下記に示したとおり（AMLプロファイリングを参照されたい）、この種の増強されたシグナリングモデルにより、単に細胞シグナリングにおける相違のみによって腫瘍群を決定することができる。
【０２６０】
増強されたモデルに基づいて行うことができるもう一つの推論は、全てもしくはほとんど全ての試料または細胞におけるノード状態が同様に所与の環境合図に応答する場合には、その応答能力にもかかわらずこれは増強されないことがある。直観に反して、これは、増強されたモデルの重要な要素である。実際に、これは、ノード状態が増強されたことを記述することを意味し、プロファイルした試料のコホート内に有意なサイズのコントロール集団がなければならない。そしてこの集団は、先験的に定義されなければならないが、そのためには、集団と関連するさらなるパラメーターを同定することによって、実験に有意性を有することをいくつかの点で示されなければならない（たとえば、遺伝子変異、腫瘍マーカー、臨床効果）。
【０２６１】
この情報ノードのモデルおよびこれらが占める状態は、細胞のタンパク質が高次構造を採用するプロセス、翻訳後修飾、または特異的シグナルを伝達するための局在化を記述するための柔軟な用語を提供する。この状況において、病気にかかった細胞をプロファイルするために使用される応答パネルを、プログラマーが不完全なコンピュータプログラムのバグを同定するために使用する一連の診断の命令と同じ方法で使用する。両方の場合において、入力は、出力の情報を最大にし、かつ説明書が誤って解釈される場合を明らかにするように選択される。
【０２６２】
腫瘍において崩壊したシグナリングノードを同定することによって、治療応答の正確な診断および薬理学的介入のための分子標的の同定を開発することができる。多くの場合、腫瘍細胞のシグナル伝達が調節不全されると、プログラム細胞死のシグナルを送る。増殖シグナリングにおけるこれらのネガティブな結果は、通常アポトーシス性腫瘍抑制因子経路によって行われ、腫瘍では失われているか、または、不活性化されていることが多い。アポトーシス性経路が、抗アポトーシス分子（たとえば、Bcl-2、Bcl-XL、Toso）の発現などの別のシグナルによって不活性化されている腫瘍では、抗アポトーシス機構をターゲットし、およびプログラム細胞死を再活性化する機会がある。従って、いくつかの発癌遺伝子の発現により、同時にプロライフおよびプロデスの指示を送る増殖シグナルの蓄積としてモデル化することができる。これらの発癌遺伝子の協調は、プロデスシグナリングの結果を使用不能にしてしまうその他の変形である。このモデルは、癌遺伝子発現の反転により腫瘍細胞の迅速な死を引き起こすことを示す結果で一致する（Chin et al., 1999； Felsher, 2003）。
【０２６３】
基底状態または静止状態での刺激されたノード状態の制御は、増強されたモデルおよびアレイ化されたフローサイトメトリー方法に固有である。このビルトイン制御により、その他の規準化技術で得ることが困難なレベルの明快さが可能になり、この場合、試料間の変動がプロフィールを支配する（たとえば、正常なコントロールに対してそれぞれの試料を比較する）。これは、特に患者試料についてあてはまる。基底ノード状態間での情報価値が頻繁に変動すること；基底状態は、腫瘍シグナリングにとって歴史的に重要であること、および急性骨髄性白血病の例では、ほどんどの基底状態が試料間で広範に変動すること：に留意することが重要である（Stat1の顕著な例外と共に、AMLプロファイリングを参照されたい）。基底状態のノードを含めるためには、応答と同じスケールで基底値を置かなければならない。これは、それぞれの基底状態を、観察される最小または中央値などの腫瘍疾患試料間の定点と比較することによって達成することができる：
2014055964.tif 000011
【０２６４】
式1-7は、相当するlog2スケールでの基底値の広がりを提供するが、標準状態からの変化に関する任意の情報を示すために採用すべきではない。
【０２６５】
ハードウエア/一般的技術
本明細書に提供されるアッセイ法の工程の順序は変更することができることは当業者によって理解される。しかし、種々の選択肢（化合物、選択される特性または工程の順序の）が本明細書に提供されるが、一方、それぞれが個々に提供され、本明細書に提供したその他の選択肢とはそれぞれ別個であることも理解されよう。さらにまた、アッセイ法の感受性を増大させるであろう当技術分野において明白であり、かつ公知である工程も、本発明の範囲内に包含される。たとえば、洗浄工程、遮断工程、その他をさらに追加してもよい。
【０２６６】
好ましい態様において、反応混合物または細胞は、96ウェルのプレートまたはその他の市販のマルチウェルプレートの1つのウェルに含められる。また別の好ましい態様において、反応混合物または細胞は、FACS装置内に存在する。本発明に有用なその他のマルチウェルプレートには、384ウェルプレートおよび1536ウェルプレートが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明において有用な、反応混合物または細胞を入れるための他の容器も、当業者には明らかであろう。
【０２６７】
活性化可能なタンパク質の活性化状態もしくは活性、またはこのような活性化状態もしくは活性の調節を検出するアッセイ成分の添加は、アッセイされる活性に適した条件下で連続的にまたは予め定めた順序もしくはグループで実施できる。このような条件は本明細書に記載されており、当技術分野において公知である。そのうえ、さらなる手引きを下記に提供してある（たとえば、実施例を参照されたい）。
【０２６８】
好ましい態様において、本発明の方法は、液体を操作する構成成分の使用を含む。液体操作システムは、任意の数の構成成分を含む自動機械化システムを含むことができる。加えて、本明細書に概説した任意の、または全ての工程を自動化してもよく；したがって、たとえば、系を完全にまたは部分的に自動化してもよい。
【０２６９】
当業者によって認識されるであろうとおり、使用することができる多種多様な構成成分があり、これらには以下を含むが、これらに限定されるわけではない：1つまたは複数のロボットアーム；マイクロプレートを適切な位置に置くためのプレート操作装置；相互夾雑防止プレートのウェルの蓋を取り外し、もとに戻すための蓋またはキャップの自動操作装置；使い捨てチップを含む試料分配用チップアッセンブリー；試料分配用の洗浄可能チップアッセンブリー；96ウェルのローディングブロック；冷却試薬ラック；マイクロタイタープレートピペット置き（任意に、冷却される）；プレートおよびチップの積み重ね用タワー；並びにコンピュータシステム。 
【０２７０】
完全に機械化されたシステムまたは微量液体システムは、スクリーニング適用の全工程を実施するために、自動液体操作、粒子操作、細胞操作および微生物操作装置（高スループットピペット操作を含む）を含む。これには、吸引、分配、混合、希釈、洗浄、正確に測定した容積の移動；回収、およびピペットチップの廃棄などの液体、粒子、細胞、および生物体操作；並びに単一試料の吸引物から複数送達するために同一容積を繰返しピペットで分配することが含まれる。これらの操作は、液体、粒子、細胞、および生物の移動で相互に夾雑することはない。この機器は、マイクロプレート試料のフィルター、膜、および／または娘プレートへの自動複製、高密度の移動、全プレートの段階希釈、および高性能操作を行う。
【０２７１】
好ましい態様において、アッセイの構成成分に対して特異性をもつ化学誘導粒子、プレート、カートリッジ、試験管、磁性粒子、または他の固相マトリックスが使用される。マイクロプレート、試験管、または任意の固相マトリックスの結合表面は、非極性表面、高度に極性をもつ表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質またはペプチドを結合させる親和性媒体、表面固定タンパク質（たとえば、組換えプロテインAまたはG）、ヌクレオチド樹脂またはコーティングを含み、およびその他の親和性マトリックスも本発明に有用である。
【０２７２】
好ましい態様において、マルチウェルプレート、マルチチューブ、ホルダー、カートリッジ、ミニチューブ、深底ウェルプレート、ミクロチューブ、凍結用バイアル、角底ウェルプレート、フィルター、チップ、光ファイバー、ビーズ、およびその他の固相マトリックスのためのプラットフォーム、または種々の容量をもつプラットフォームは、さらに容量を増やすことができるようにアップグレードが可能なモジュラープラットフォームに適応される。このモジュラープラットフォームは、変速が可能なオービタルシェーカー、ソース試料、並びに試料および試薬の希釈のためのマルチポジションワークデッキ、アッセイプレート、試料および試薬の貯蔵槽、ピペットチップ、並びに能動洗浄ステーションを含む。 
【０２７３】
好ましい態様において、サーモサイクラーおよび温度調節システムを、熱交換器（たとえば制御ブロックまたはプラットフォーム）の温度の安定化に使用して、インキュベート試料の0℃から100℃の正確な温度制御を提供する。
【０２７４】
好ましい態様において、単一磁性プローブもしくは複数の磁性プローブ、親和性プローブを含む相互交換可能ペピットヘッド（単一または複数チャネル）、またはピペッターは、液体、粒子、細胞、および生物を自動機械により操作する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁性分離装置またはプラットフォームは、単一試料様式または複数試料様式で液体、粒子、細胞、および生物を操作する。
【０２７５】
一部の態様において、計測手段は、検出器を含み、標識およびアッセイに応じて多様な種々の検出器が可能である。好ましい態様において、有用な検出器には、マルチ蛍光チャネルを有する顕微鏡；単波長および二重波長のエンドポイントおよび動力学性能をもつ蛍光、紫外線および可視光の分光測定検出を提供するプレートリーダー、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、ルミネセンス、消光、二光量子励起、および強度再配分；データおよび画像を捕捉し定量可能なフォーマットに変換するCCDカメラ；並びにコンピューターワークステーションを含む。
【０２７６】
好ましい態様において、検出は、FACSによる。もう一つの局面において、検出は、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、たとえば逆相HPLCにより、さらなる局面において、検出は、質量解析法による。
【０２７７】
これらの機器は、マルチウェルプレートまたはチューブでの細胞培養増殖および形質転換のための、並びにさらに危険な操作のための、無菌薄層流もしくは換気フードに適合し、または封入され、内蔵される。生細胞は、経時的生細胞アッセイ法のために、温度、湿度、およびガスが制御された増殖制御条件下で増殖させることができる。細胞の自動形質転換および自動コロニー採取により、所望の細胞の迅速なスクリーニングを容易にできる。
【０２７８】
フローサイトメトリーまたはキャピラリー電気泳動法形式を磁性およびその他のビーズ、粒子、細胞および生物の個々の捕捉に使用することができる。
【０２７９】
融通性をもつハードおよびソフトウエアは、複数の適用のために機器を適合することができる。ソフトウエアのプログラムモジュールにより、方法の作製、修正、および実施をすることができる。システム診断モジュールにより、装置のアラインメント、正しい接続、およびモーター操作をすることができる。カスタマイズされたツール、検査室器具、並びに液体、粒子、細胞、および生物体の移動パターンは、種々の適用での実施を可能にする。データベースは、方法およびパラメーターを保存することができる。自動機械化インターフェースおよびコンピュータインターフェースは装置間の情報のやり取りをすることができる。
【０２８０】
好ましい態様において、自動機械化装置は、メモリーと一組の入力／出力装置（たとえば、キーボード、マウス、モニター、プリンター、その他）間で母線を介して情報をやり取りする中央演算ユニットを含む。繰り返せば、下記に概略するように、これは、本発明の多重複合装置のためにCPUに付加するかまたはCPUの代用とすることができる。中央演算ユニット、メモリー、入力／出力装置および母線間の一般的な相互作用は、当技術分野において公知である。従って、実施される実験に応じた多様な種々の手順がCPUメモリーに保存される。
【０２８１】
これらの機械化液体操作システムによって、緩衝液、試薬、試料、洗浄液、標識プローブ、その他などのアッセイ成分を含む任意の数の種々の試薬を利用することができる。
【０２８２】
以下の実施例は、上に記載した本発明の使用様式をより完全に記述するために、並びに本発明の種々の局面を実施するために想定される最良の形態を説明するために役立つ。これらの実施例は、全く本発明の真の範囲を限定するものではなく、説明の目的ために提供されることは理解されよう。米国特許出願第60/304,434号および米国特許出願第60/310,141号の出願日の恩典を主張する2002年7月に出願の親出願米国特許出願第10/193,462号を含む本明細書に引用した全ての参考文献は、その全体が本明細書に明白に参照として組み入れられる。 
【実施例】
【０２８３】
実施例1
本実施例では、本発明の方法および組成物を使用して、本発明者ら（また本明細書において、「本発明者ら」とも称される）は、白血球機能抗原-1（LFA-1）が、免疫細胞シナプスの形成に必須であり、種々の自己免疫疾患の病理において役割を有することを示す。本実施例では、本発明の方法および組成物を使用して、本発明の発明者らは、ICAM-2が、微小管およびアクチン細胞骨格の両方による受容体のクラスター形成並びに活性化につながるLFA-1シグナル伝達経路を誘導することを示す。ICAM-2は、単一細胞解析によって測定したときに、21.7pM／細胞結合親和性を示した。ICAM-2/LFA-1の係合は、PKCの活性化およびアクチンと微小管細胞骨格の両方の再編成を誘導した。これらの事象は、活性なLFA-1を介する細胞障害性T細胞エフェクター-標的細胞結合に際して、p44/42 MAPK経路のSyk依存活性化をもたらした。ICAM-2は、ヒトCD56+CD8+パーフォリン放出および結果としての標的白血病細胞に対する細胞障害性を媒介する。その他のICAMと比較して、ICAM-3は、ICAM-2の作用に最も類似し、ICAM-1と類似しない。IL-2プレ活性化ヒトPBMCでは、CD56+CD8med集団のパーフォリン放出の媒介は、ICAM-2＞ICAM-3＞＞ICAM-1であった。全てのICAMは、CD56+CD8high集団でパーフォリンおよびグランザイムAの低下に寄与した。これらの結果によって、サブセット特異的細胞障害性T細胞免疫におけるICAM-2/LFA-1の特定の機能的結果が同定された。
【０２８４】
導入
白血球機能抗原-1（LFA-1）は、白血球の接着に関与するα、βヘテロ二量体インテグリンである（van Kooyk, Y., and Figdor, C. G. (2000) Curr Opin Cell Biol 12, 542-547）。現時点で、LFA-1は、リンパ球接着に関与し、免疫学的シナプスの形成（Dustin, M. L., and Shaw, A. S. (1999) Science 283, 649-650）、並びにリンパ球の血管外遊出および再循環（Volkov, Y., et al., (2001). Nat Immunol 2, 508-514）で主要な役割をもつことはよく理解されている。LFA-1接着は、細胞内接着分子（ICAM）-1、-2、および-3リガンドによって支配されている（van Kooyk and Figdor, 2000）。LFA-1インテグリンが変異または欠損している症候群である白血球接着不全症（LAD）に罹患した患者は、重篤な再発性細菌感染および全体的免疫障害を示す（Bunting, M., et al., (2002) Curr Opin Hematol 9, 30-35）。これらの臨床症状の中で、LFA-1ノックアウトマウスは、LFA-1が養子免疫療法における腫瘍退縮の媒介で潜在的な役割を果たすことができることを示唆した（Mukai, S., et al., (1999) Cell Immunol 192, 122-132； Nishimura, T., et al., (1999) J Exp Med 190, 617-627）。これらの研究では、遺伝的にリンパ球接着分子と免疫機能障害とが連関するが、これらの免疫病理を媒介する分子の詳細は、ほとんど理解されていない。
【０２８５】
LFA-1の研究は、主にインテグリンの接着の役割に焦点をあわせていた。LFA-1インテグリン活性化および受容体のクラスター形成の生理的プロセスが、どのように相互に関連し、さらにリガンド結合に際して細胞シグナルに変換されるかは明らかではない。これらの事象が存在しないと、どのようにしてLADの破壊的作用およびLFA-1ノックアウトマウスでの免疫障害反応がもたらされるのかはよく理解されていない。従って、本発明者らは、ICAM-LFA-1の相互反応モデルの分子的詳細を解明し、細胞対細胞接触で開始するLFA-1のシグナリング機構を理解しようとした。可溶性ICAM-2での処理に応じてLFA-1受容体の動的変化をモニターするために多パラメーター単一細胞解析を利用し、本発明者らは、アクチンおよび微小管細胞骨格の両方によってICAM-2接着がLFA-1の活性化およびクラスター形成と接着されることを見いだした。微小管細胞骨格は、多パラメーターフローサイトメトリーで測定されるように、LFA-1のクラスター形成が進行する事象であるLFA-1の構造変化（活性化）を制約した。LFA-1の活性化が誘導されると、Pyk2およびSykキナーゼ活性の両方に依存する事象であるp44/42分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ経路（MAPK；RAF/MEK/ERK）の活性化をもたらす。
【０２８６】
本発明者らは、細胞間の接触を必要とする事象である細胞障害性T細胞と標的白血病細胞との間の接着におけるICAM-2媒介LFA-1活性化についてのこれらの分子的詳細を研究した。ヒトCD56+CD8+T細胞のICAM-2刺激は、白血病細胞のパーフォリン／グランザイム-Aを媒介した細胞毒性を誘導することができた。この導かれた細胞死は、ICAM-3およびより少ない程度でICAM-1、他の2つのLFA-1リガンドによって分担された。これらの結果は、ICAM-2/LFA-1で導かれる細胞毒性Tリンパ球免疫のためのシグナリング機構の特徴を示し、腫瘍によるICAM-2およびおそらくはICAM-3の分泌は、導かれた細胞毒性T細胞免疫反応を回避させることができる機構を示唆する。
【０２８７】
結果
組換えICAM-2はLFA-1媒介接着を促進する
本発明者らは、Jurkat T株化細胞モデルを系として選択し、初めにLFA-1シグナリング機構を解析し、次いでヒトT細胞での発見を検証した。生化学的に精製したICAM-2タンパク質を産生し、他のリガンドの非存在下でICAM-2/LFA-1相互作用を調べた。本発明者らは、免疫親和性クロマトグラフィーおよびその後のゲル濾過を使用して、レトロウイルスで導入したNIH3T3細胞からヒトICAM-2を精製した。本発明者らは、これをNSOマウスミエローマ細胞で産生されたICAM-2-FC融合タンパク質と比較した。これらのマウスに基づいた哺乳類発現系は、これらがICAM-2の生物活性型を産生することに基づいて選択した。ICAM-2FCタンパク質の生化学的解析は、融合タンパク質の予想される分子量と一致し（76ｋD）、精製したヒトICAM-2は、72〜74ｋDの分子量を示した。このサイズは、Jurkat T細胞から精製した75kDのICAM-2と類似していた（データ示さず）。
【０２８８】
本発明者らはFITC結合ICAM-2（ICAM-2-FITC）を作製し、LFA-1受容体の動態をフローサイトメトリーおよびレーザー走査共焦点顕微鏡観察（LSCM）によって調べた。本発明者らは、ICAM2-FITCの結合動力学を単一細胞でモニターすることによって、LFA-1受容体のリガンド結合について調べた。最初の150秒で低い結合が観察され、それに対して750秒まで増加が続き、その後一定になった。対照的に、抗-LFA-1抗体は、初めの50〜100秒で最初のスパイクを示し、800秒まで均衡を保った。PMA処理によるLFA-1の事前の活性化（McDowall, A., et al. (1998) J Biol Chem 273, 27396-27403）によって、ICAM-2の即時結合が示された。150秒後に、徐々にICAM-2が結合することから、何らかの結合誘導事象の後に、LFA-1とそのICAM-2リガンドとの結合の強化が生じることを示唆した（抗-LFA-1またはPMA活性化LFA-1を使用したときには観察されない特質）。ICAM-2-FITCの結合は、トリプシン処理細胞では観察されず（データ示さず）、LFA-1に対する抗体によって遮断された（下記に説明してある）。従って、時間の関数としてICAM-2リガンドの結合の増加があると思われ、標的細胞上に誘導される結合部位が存在することが示唆された。 
【０２８９】
ICAM-2結合集団のフローサイトメトリーによる解析では、アクチン細胞骨格および温度の両方に対する依存性を示した。ICAM-2接着は、4℃に対して37℃で増強された。アクチン脱重合剤サイトカリシンDによる前処理により、2つのICAM-2結合集団を37℃および4℃の両方で明らかにし、抗-LFA-1で観察された結合現象とは対照的であった。ICAM-2-FITCの飽和は、37℃において4℃よりも容易に観察された（データ示さず）。ICAM-2の単一細胞結合親和性の測定は、細胞当たりのICAM-2-FITC結合百分率を計算して得た。曲線適合解析によって、解離定数では、0.21±0.07M/104細胞であることを示した。この値は、21.7pM/細胞に等しく、細胞表面LFA-1の生理学的状況内でICAM-2について報告された最初のリガンド結合測定を示している。従って、ICAM-2リガンド結合の定量的単一細胞解析により、生理学的温度での強力な結合が示唆される。
【０２９０】
可溶性ICAM-2は、LFA-1のクラスター形成および細胞骨格の分極化を誘導する
本発明者らは、LFAの系合が細胞骨格構造を変化させるかどうかを調べ、ICAM-2刺激によるアクチンおよび微小管の両方の細胞骨格の再編成を観察した。本発明者らは、細胞骨格構造をフローサイトメトリーでモニターし、脱重合化に対応した効果であるICAM-2結合によるアクチンおよび微小管の構成が同時に変化することを観察した。ICAM-2処理では、1分以内にLFA-1の迅速なクラスター形成を誘導し、多数のクラスター形成事象は、5分で生じる。ICAM-2-FITCリガンドを使用して細胞表面を可視化することにより、ICAM-2リガンドがLFA-1受容体のクラスター形成を誘導することを示した。このクラスター形成事象は、非遮断2インテグリン抗体（クローンCTB104）を使用して、一部の同時局在を示した。従って、本発明者らは、ICAM-2とLFA-1の結合は、LFA-1/ICAM-2複合体の再編成を生じるシグナルを誘導すると推測した。従って、本発明者らは、アクチン／微小管細胞骨格で観察される変化と比較してこれを調べることを決定した。
【０２９１】
本発明者らは、ICAM-2結合によるLFA-1受容体の動態を多パラメーターのフローサイトメトリーによって評価し、LFA-1活性化とクラスター形成と相関させた。本発明者らは、FACSCaliburマシーンで重複弁別器モジュールを使用して、単一細胞のレーザー励起による分散と集中蛍光パルス（FFP）とを区別した。4℃に対して37℃でのICAM-2のインキュベーションでは、サイトカリシンD処理に際して大きく強化される効果であるFFPの減少を示した。ICAM-2-FITCの表面結合を蛍光強度によってモニターし、蛍光パルス（FP）の飛行時間（TOF）に対して規準化した。TOFは、レーザー励起細胞面積に比例するので、本発明者らは、TOFあたりのICAM-2-FITCの強度の値をLFA-1のクラスター形成のための定量的評価として解釈した。この値をICAM-2刺激に対する時間の関数として計算すると、LSCMで観察されるクラスター形成事象の増加と比例している。
【０２９２】
ICAM-2接着は、微小管細胞骨格によって調節されるLFA-1の高次構造変化を誘導する
ICAM-2接着の増強およびLFA-1クラスター形成の誘導は、ICAM-2リガンドに対する全体的な結合活性の増加を反映しているが、これは必ずしもLFA-1の活性化状態（高親和性状態）を反映しているわけではない（McDowall et al., 1998）。LFA-1活性化に際して、高次構造変化により、mAb24抗体によって認識されるエピトープが曝露される（Neeson P.J., et al., (2000) J Leukoc Biol 67, 847-855）。mAb24-Alexa633抱合体を使用して、ICAM-2刺激によるLFA-1の活性化状態をフローサイトメトリーによって調べた。非刺激細胞は、mAb24結合を示さず、PMA処理で観察された誘導とは対照的であった。ICAM-2刺激細胞は、サイトカリシンDによって減弱された効果である活性なLFA-1で二峰性集団を示した。微小管破壊剤のノコダゾールおよびタキソールによる処理では、ICAM-2刺激によりLFA-1の完全な活性化を生じた。対照的に、サイトカリシンDによるアクチン細胞骨格の破壊では、ICAM-2で誘導されるLFA-1活性化を減少させたが、LFA-1受容体のクラスター形成およびそれに続くICAM-2結合は、増強された。従って、アクチンおよび微小管細胞骨格ネットワークは、LFA-1の活性および結合活性に異なる衝撃を与える。
【０２９３】
本発明者らは、時間あたりのICAM-2刺激の関数として、LFA-1の活性化およびクラスター形成をフローサイトメトリーによって同時にモニターした。mAb24抗体の平均蛍光をLFA-1クラスター形成値と相関させることによって、LFA-1活性化は、30秒以内にLFA-1のクラスター形成を進行させ、mAb24抗体の結合の有意な増大があるが、クラスター形成の増大は、軽度であることが示された。しかし、さらに30秒〜30分後では、mAb24の相対的結合がいくぶん増大するが、クラスター形成値が有意に増大した。従って、これらの結果は、ICAM-2リガンドで誘導されるLFA-1活性化後に、LFA-1のクラスター形成が続くことを示唆している。
【０２９４】
本発明者らは、細胞をPKC阻害剤のビスインドリルマレイミドI（BIMI）で処置することにより、mAb24の結合を使用して測定すると、ICAM-2誘導LFA-1活性化が抑制されることを観察した。ICAM-2-FITCの結合によって測定されるICAM-2接着は、影響を受けなかった。このことは、リガンドで誘導される受容体高次構造変化は、細胞内キナーゼに依存することを示唆した。興味深いことに、ICAM-2は、PKC活性化に必要な成分であるカルシウムの流入を誘導した（データ示さず）。従って、これらの観察は、ICAM-2リガンドによって誘導されるmAb24のネオエピトープの曝露は、PKC依存的細胞内シグナリング事象をトリガーすることを示唆している。本発明者らは、LFA-1に対するICAM-2の結合によって生じる下流のシグナリングの結果を調べることに決めた。
【０２９５】
ICAM-2はLFA-1を介してp44/42 MAPK活性を誘導する
フローサイトメトリーに基づいたキナーゼのプロファイリング実験を行い、ICAM-2刺激によるPKC活性化の下流のシグナリング経路を同定した。ICAM-2での処置により、P44/42 MAPKのリン酸化および活性化の両方が誘導された。ICAM-2の力価は、単一細胞のフローサイトメトリー解析で決定すると、P44/42 MAPKのリン酸化に相関し、キナーゼ活性解析と一致する結果であった。特異的インテグリンに対するmAbの力価は、ICAM-2結合と競合し、従って誘導されるP44/42 MAPKリン酸化を減少させた。この阻害は、種々のインテグリンに対するmAbでの前処置後には観察されず、ICAM-2/LFA-1相互作用は、P44/42 MAPK活性化を媒介していたことを示した。
【０２９６】
PKC、PYK2、およびSYKの活性化は、P44/42 MAPK活性のICAM-2/LFA-1誘導のために必要である
本発明者らは、フローサイトメトリーに基づいたP44/42 MAPKキナーゼ阻害および活性化プロファイリングを行って、LFA-1シグナリングに必要な成分を同定した。PKC阻害剤のBIMI、細胞骨格破壊剤のサイトカリシンD、タキソール、ノコダゾール、およびEDTAによる二価陽イオンの隔離により、ICAM-2で誘導されるP44/42 MAPKシグナルが減少したことから、LFA-1のリガンドで誘導される事象が、アクチン-微小管細胞骨格によるシグナル伝達に機械的にリンクされていることを示唆した。LFA-1からP44/42 MAPKへのシグナル伝達に必要な上流のキナーゼを同定するために、一連のキナーゼ阻害剤を適用して、これらがICAM-2で誘導されるP44/42 MAPK活性を停止させる能力について試験したが、srcおよびp56lckの阻害剤であるハービマイシンAおよびエモジンは、効果を有さなかった。チロホスチンA9およびピセアタンノール（それぞれプロリン-チロシンキナーゼ2（Pyk2）および脾臓チロシンキナーゼ（Syk）の特異的阻害剤）（Avdi, et al. (2001) J Biol Chem 276, 2189-2199； Fuortes, et al., (1999) J Clin Invest 104, 327-335）は、ICAM-2で誘導されるP44/42 MAPKおよびその上流の活性化因子Raf-1の活性化を停止させた。
【０２９７】
本発明者らは、Pyk2およびSykが特定のインテグリンと相互作用するかどうかを試験した。Pyk2およびSykは、ICAM-2の処置によりリン酸化され、インテグリンと共に共免疫沈澱したことから、Pyk2およびSykは、膜へ移動することが示された。これは、時間に応じたICAM-2刺激によるPyk2およびSykのリン酸化と一致した。PKC/II、およびPyk2のリン酸化は、1分で、続いてSykのリン酸化が5分で検出された。上記結果をまとめると、ICAM-2によって付与されるLFA-1シグナリング機構は、少なくともPKCによって開始され、Pyk2およびSykによってP44/42 MAPK経路に伝えられることが示唆された。
【０２９８】
LFA-1は、エフェクター-標的細胞接着に関与して、ヒト細胞障害性T細胞の活性化を促進する
LFA-1は、いくつかの免疫学的シナプスで生じる過程であるリンパ球間の接着に関与するので、本発明者らは、生理学的状況でのICAM-2/LFA-1相互作用について同定された分子的事象の解明に関心をもった。クラスター形成したICAM-2の組織分布的提示は、発現レベルに依存せずに、ナチュラルキラー細胞が細胞障害性を開始する効果的な標的構造であることが示唆されている（Helander, T. S., et al., (1996) Nature 382, 265-268）。本発明者らは、最初にFACSに基づいたエフェクター-標的殺傷アッセイ法を適用して、種々のエフェクター：標的細胞比の刺激ヒトPBMCによる処置によるHL60白血病細胞の標的細胞溶解を定量的にモニターした。標的細胞溶解のフローサイトメトリー検出では、標準的クロム放出アッセイ法よりも感受性が高いことが報告されている（Lecoeur, H., et al., (2001) J Immunol Methods 253, 177-187）。本発明者らは、HL60細胞を蛍光染料CFSEで標識し、標準的なエフェクター-標的細胞に基づいたアッセイ法においてフローサイトメトリーによって細胞量をモニターした。可溶性ICAM-2は、IL-2の存在下で標的細胞溶解を開始することができたが、IL-2の非存在下ではできなかった。IL-2で事前に活性化した細胞では、ICAM-1およびICAM-3は、ICAM-2とは対照的に強力な細胞障害性反応を開始しなかった。
【０２９９】
ナチュラルキラー細胞（NK）は、不均一集団、すなわち特異的細胞障害性Tリンパ球（CTL、その中のC8+サブセットを含む）、NK細胞（CD16+およびその中のサブセット）、およびCD4+ TH1細胞を含むので（Biron, C. A., and Brossay, L. (2001) Curr Opin Immunol 13, 458-464.）、本発明者らは、ICAM-2が特定のヒトNK細胞サブセットに固有であるかどうかを決定した。本発明者らは、フローサイトメトリーの多次元ゲート能力を利用し、ヒトPBMCで観察される細胞溶解活性に寄与している個々の異なる細胞集団を同定した。また、本発明者らは、フローサイトメトリーによってパーフォリンおよびグランザイム-Aの細胞内レベルをモニターした（2つのタンパク質は、これらの集団内のNK細胞による標的細胞溶解を媒介する）。本発明者らは、ヒトPBMCにおける、CD8およびCD56表面染色によって6つの異なる集団を同定し、続く全ての細胞内機能アッセイについてこれらのサブセットに対してゲートした。本発明者らは、ICAM-1、ICAM-2、およびICAM-3可溶性リガンド、並びにHL60標的細胞の存在下でエフェクター-標的細胞障害性アッセイ法を行った。本発明者らは、刺激後に集団内サブセット頻度に有意な変化を観察しなかった。CD56+CD8low集団は、ICAM-1、-2、または-3による刺激により、細胞内パーフォリンまたはグランザイム-Aの有意な変化を示さなかった。CD56+CD8med集団は、ICAM-2およびICAM-3に対してパーフォリン陰性集団の頻度にわずかな増大（1.5〜2倍）を示した（21.5% ICAM-2＞19.8% ICAM-3＞13.7% ICAM-1）。CD56+CD8high集団は、非刺激と比較して、ICAM-1、-2、-3刺激についてグランザイム-Aおよびパーフォリンの両方の減少を示し、ICAM-1（4.12%）またはICAM-3（3.07%）と比較して、ICAM-2（58.3%）ではグランザイム-A陰性集団の有意な減少を伴った。また、CD56-CD8highは、全てのICAM刺激によってグランザイム-Aおよびパーフォリンの両方の低下を示した。CD56-CD8-集団内のサブセットは、ポジティブに同定することができないので、これらを解析から省いた。
【０３００】
また、非刺激細胞と比較してCD56CD8サブセットのパーフォリンおよびグランザイム-Aの細胞内の量を定量することによっても、下記に証拠を示したようにICAMに対する類似点および相違点が同定された。ICAM-2およびICAM-3は、ICAM-1よりも強力にグランザイム-Aおよびパーフォリンの低下を媒介した。加えて、IL-2で事前に活性化した細胞において、ICAM刺激に関して相違が認められた：ICAM-2＞ICAM-3＞＞ICAM-1の順で、特にCD56+CD8med/high集団でパーフォリンの低下が示された。また、ICAM-2およびICAM-3は、CD56+CD8lowにおいてパーフォリンの低下を誘導したが、ICAM-2は、IL-2による事前の活性化を必要とした。ICAM-2＞ICAM-3＞ICAM-1＞非刺激の順で、CD8highサブセットについて、より低レベルのグランザイム-Aが検出された。IL-2での事前の活性化の存在下で、全てのICAMは、CD56+CD8high/med集団でグランザイム-Aの放出を誘導し、特にICAM-2によって低下した。CD56+CD8low集団では、グランザイム-Aに対して特に有意な変化は認められなかった。これらの相違は、種々のエフェクター-標的細胞比（50：1、25：1、12.5：1）でも同様であった（データ示さず）。従って、CD56CD8サブセットにおける細胞溶解活性刺激におけるICAM-1、-2、および-3に対して、類似性および相違が存在する。3つのICAMは、全てCD56-CD8high集団におけるパーフォリン放出を媒介した。ICAM-2およびICAM-3は、CD56+CD8high集団およびCD56+CD8med集団におけるパーフォリン／グランザイム-A放出の媒介と最も類似していた。
【０３０１】
本発明者らは、CD56+CD8+細胞（CD8medおよびCD8highサブセットの両方）に焦点を合わせ、Syk、p44/42 MAPKの阻害または細胞骨格の破壊が、エフェクター-標的（E：T）細胞抱合体に有害な影響を与えるかどうかをフローサイトメトリーによる抱合体形成アッセイ法（Morgan, M. M., et al., (2001) J Immunol 167, 5708-5718）によって試験した。細胞骨格のアクチンおよび微小管の破壊は、E：T抱合体形成を増強し、これらの薬剤による破壊がLFA-1活性化を増強するという先の結果と一致した。ピセアタノールによるsykの阻害は、抱合体形成を阻害したが、一方、PD98059によるp44/42 MAPKの阻害は、阻害しなかった。これらの結果は、syk活性がエフェクター-標的細胞のLFA-1接着に必要であることを示唆し、syk/ZAP-70は、同じ細胞でのLFA-1活性化のためにLFA-1が必要であるということを示す報告と一致する（Soede, R. D., et al., (1999) J Immunol 163, 4253-4261）。p44/42MAPKは、E：T抱合体形成に必要ではないようであった。活性LFA-1およびp44/42の細胞内活性化のモニタリングにより、ICAM-2によって刺激されたCD56+CD8+細胞におけるこれら2つのマーカーの時間依存的な相関を示した。
【０３０２】
考察
本報告では、以下の事柄が観察された：（1）ICAM-2は、サイトカインまたはTCRシグナリングなどの外因性活性化因子の非存在下で、LFA-1のクラスター形成、活性化、および細胞骨格の再編成を誘導することができる；（2）LFA-1は、リガンド結合によりPKC、Pyk2、およびSykを含むp44/42 MAPK経路へシグナルを伝達する；並びに（3）LFA-1受容体の動態は、アクチンおよび微小管の両細胞骨格ネットワークの両方によって機械的にシグナル伝達に連結されている。これらの分子的事象の生理学的結果は、パーフォリンおよびグランザイムAによって媒介されるCD56+CD8+T細胞の細胞障害性をトリガーし、これは、ICAM-2およびICAM-3によって大半が共有されるが、ICAM-1はこれを共有しなかった。
【０３０３】
2インテグリンシグナリング機構は、実験系に応じて変動し、細胞の形態および運動性における接着性役割の中心に据えられている（Dib, K. (2000) Front Biosci 5, D438-451）。2インテグリンシグナリングは、とりわけパキシリン、vav、およびGTPase活性化タンパク質のチロシンリン酸化を介して細胞骨格の再編成に関与することが示された（Fuortes, M., et al., (1994) J Cell Biol 127, 1477-1483； Zheng, L., et al., (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93, 8431-8436）。LFA-1を媒介した白血球接着に焦点を当てた研究では、LFA-1結合活性におけるPKCの調節的役割を示し（Bleijs, D. A., et al., (2001) J Biol Chem 276, 10338-10346.； Hedman, H., and Lundgren, E. (1992) J Immunol 149, 2295-2299）、TCRシグナリングがLFA-1を活性化可能なことを明示した（Peterson, E. J., et al., (2001) Science 293, 2263-2265）。また、ケモカインは、TCRシグナリングの非存在下において、リンパ球／内皮接触の間にLFA-1の活性化因子として使われ得ることが示された（Constantin, G., et al., (2000) Immunity 13, 759-769）。LFA-1インテグリンの接着、クラスター形成、および活性化が、外部刺激（ケモカイン）または内部刺激（TCRまたは共働刺激分子）の非存在下で、どのようにして細胞内シグナリング事象と連関しているかは明らかではなかった。
【０３０４】
ICAM-2の最初のIgドメイン（P1、アミノ酸21〜42）の合成ペプチドは、高濃度（62M）でLFA-1媒介接着を誘導することができ、これは、バルク細胞接着アッセイ法において、48倍低いICAM-2可溶性タンパク質濃度（1.3M）に匹敵した（Kotovuori, A., et al., (1999) J Immunol 162, 6613-6620）。しかし、P1結合は、活性なLFA-1高次構造を誘導せず、カルシウム流入も誘導しなかったが（Kotovuori et al. 1999）。一方、全長ICAM-2の結合では、活性なLFA-1（図45Dを参照されたい）およびカルシウム流入事象をも生じた（データ示さず）。算出された217±66nM（104細胞当たり）のICAM-2親和性は、操作されたLFA-1の「活性を有する」ロックされたIドメインのBIAコア解析を使用して報告された605±55nM KDとは対照的である（Shimaoka, M., et al., (2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98, 6009-6014）。報告されたICAM-2に対する親和性は、生理的状況内の単一細胞解析を利用しており、ときに、精製または遺伝子操作されたLFA-1を利用することができない。ペプチド対タンパク質濃度について観察される相違は、おそらくペプチド合成時の不純物および／または内因性ICAM-2の天然の炭水化物成分の存在のためである可能性が高く、これは、そのほぼ66kDの分子量の30ｋD以上を構成し、LFA-1に対するICAM-2の結合を適合させるために必要であることが示唆されている（Casasnovas, J. M., et al. (1997) Nature 387, 312-315； de Fougerolles, A. R., et al. (1991) J Exp Med 174, 253-267）。
【０３０５】
本発明者らは、ICAM-2リガンドによって誘導されたときのLFA-1受容体の活性化およびクラスター形成におけるアクチン並びに微小管細胞骨格の役割を多パラメーターフローサイトメトリーによって調べた。アクチン細胞骨格の破壊は、LFA-1のクラスター形成およびICAM-2の結合を増強し、アクチン細胞骨格がLFA-1の運動性を制約することを示唆する先の研究を実証した（Lub, M., et al., (1997) Mol Biol Cell 8, 341-351）。興味深いことに、アクチンの脱重合化は、ICAM-2で誘導されるLFA-1活性化を停止させた。対照的に、ノコダゾールおよびタキソールの両方による微小管の破壊は、mAb24によって認識されるネオ-エピトープの曝露によって決定される、LFA-1の活性化を増強した。最近、微小管の脱重合化は、マクロファージ株化細胞における2インテグリンの側方運動性を増大することが報告され（Zhou, X., et al., (2001) J Biol Chem 276, 44762-44769）；したがって、微小管がLFA-1活性化エピトープの曝露に必要なリガンド結合により、高次構造変化を調節することが考えられる。これらの観察は、アクチン-微小管細胞骨格が、リガンド結合によりLFA-1の高結合活性および高親和性状態の両状態を調節することを示唆している。本発明者らは、LFA-1シグナル伝達が、試験した全ての細胞骨格破壊剤（サイトカリシンD、ノコダゾール、およびタキソール）の存在下で停止することを観察し、LFA-1受容体が細胞骨格によるシグナル伝達機構にリンクされていることが示された。したがって、LFA-1の高結合活性および高親和性状態の機構連関の解除により、これらの2つの状態を調節／媒介する細胞内事象がLFA-1インテグリン-細胞骨格接合部に存在し、リガンド結合により細胞内シグナリングタンパク質に対してLFA-1受容体の動態を伝達することを示唆している。
【０３０６】
いくつかの化学的阻害剤のスクリーニングを設計して、LFA-1のp44/42 MAPKに対するシグナリング事象に関与するタンパク質を同定した。p44/42 MAPK経路の活性化には、Pyk2およびSykの両方が必要であり、ICAM-2結合によるPKC活性化に依存することが同定された。Pyk2のリン酸化は、B細胞におけるLFA-1/ICAM-1相互作用によって媒介されるホモタイプ接着に付随していた（McDonald, J. T., et al., (2000) Immunol Invest 29, 71-80）。加えて、Pyk2活性化は、その他のモデル系におけるp44/42 MAPK活性に必要であることが示された（Barsacchi, R., et al., J. (1999) FEBS Lett 461, 273-276； Lev, S., et al., (1995) Nature 376, 737-745）。Sykは、III3シグナリングに必須のチロシンキナーゼであり（Saci, A., et al., (2000) Biochem J 351 Pt 3, 669-676）、およびFc RIシグナリングをras/MAPK経路にリンクしている（Jabril-Cuenod, et al., (1996) J Biol Chem 271, 16268-16272）。Sykの阻害または除去は、薬理学的手段（ピセアタンノールによる阻害を介する）、生化学的手段（優性ネガティブSyk）、または遺伝的手段（Syk-/-マウス）のいずれであっても、天然の細胞障害性を阻害する（Brumbaugh, K. M., et al., (1997) J Exp Med 186, 1965-1974； Colucci, F., et al., (1999) J Immunol 163, 1769-1774）。したがって、NK細胞機能に重要であることが示されたキナーゼのSykに対するLFA-1活性化シグナリングは、表面インテグリンの活性化とエフェクター細胞機能との間の生化学的リンクを提供する。
【０３０７】
本発明者らは、Pyk2およびSykが両方とも、p44/42 MAPK（RAF/MEK/ERK）カスケードの上流のキナーゼであるRaf-1へのICAM-2で誘導されるLFA-1シグナリングにおいて必要であることを証明した。p44/42 MAPKの阻害は、CD56+CD8+細胞抱合の発生を妨げなかった。免疫蛍光解析により、NK白血病株化細胞YTのp44/42 MAPK阻害剤、PD98059による処置では、エフェクター-標的細胞接触部位へのパーフォリンの再分布を阻害することが示された（Wei, S., et al., (1998) J Exp Med 187, 1753-1765）。加えて、p44/42 MAPK経路は、ナチュラルキラー細胞における細胞障害性の調節に重要であることが示された（Jiang, K., et al., (2000) Nat Immunol 1, 419-425）。したがって、LFA-1/ICAM-2結合により活性になることが本明細書において証明されたp44/42 MAPK経路は、少なくともパーフォリン顆粒エキソサイトーシスに関係することが示された。したがって、ICAM-2によって誘発されるLFA-1シグナリング経路は、ヒトCD56+CD8+細胞障害性T細胞集団におけるエフェクター-標的細胞接着事象および細胞溶解機構の活性化の両方にマップされるシグナリング接合部を含む。これらの結果は、細胞溶解性シグナリング機構とのLFA-1インテグリン接着の機能的結果の直接的証拠を提供する。
【０３０８】
また、本発明者らは、エフェクター-細胞抱合の際のパーフォリンおよびグランザイム-Aの放出によって証明されたように（この効果は、ICAM-1とは対照的であった）、ICAM-2は、細胞溶解活性の媒介でICAM-3と類似することを観察した（図8を参照されたい）。本発明者らは、ICAM-1のものとも異なっているICAM-2とICAM-3間の細胞内シグナリング機構の類似性を以前に観察した（Perez, O. D., et al., (2002) Immunity 16, 51-65）。しかし、高い細胞溶解活性が、バルクPBMCにおいて観察されたので、結果は、細胞障害性能力をもつその他の未同定のサブセットをICAM-2が刺激する可能性を排除していない（図9を参照されたい）。
【０３０９】
細胞障害性T細胞における以前の研究により、LFA-1/ICAM相互作用の遮断が、エフェクター−標的細胞接着を阻害することが証明され、したがってNK細胞の細胞溶解活性を遮断すると結論された（Donskov, F., et al., (1996) Nat lmmun 15, 134-146； Krensky, A. M., et al., (1984) J Immunol 132, 2180-2182； Matsumoto, G., et al., (2000) Eur J Immunol 30, 3723-3731）。LFA-1-/-マウス由来のNK細胞の機能研究により、LFA-1接着がIL-2で活性化されるNK殺傷に必要であること（Matsumoto et al., 2000）、またLFA-1-/- CD8+T細胞がT細胞活性化およびエフェクター機能にとって不完全であることが実証された（Shier, P., et al., (1999) J Immunol 163, 4826-4832）。興味深いことに、NK細胞の細胞障害性は、LAD患者由来のNK細胞では不完全である（Shibuya, K., et al., (1999) Immunity 11, 615-623）。つい最近、細胞障害性Tリンパ球の指揮された殺傷は、微小管形成中心（MTOC）のCTL標的部位のLFA-1への分極化を必要とすることが示された（Kuhn, J. R., and Poenie, M. (2002) Immunity 16, 111-121）、これはLFA-1は厳密な接着以外の機能的役割をもつ可能性を示している。
【０３１０】
結論として、本発明者らは、ICAM-2が、LFA-1リガンドとして、LFA-1受容体の活性化およびクラスター形成（微小管およびアクチン細胞骨格を順次分極化させ、p44/42 MAPK経路を活性化させる事象）を媒介することができることを見いだした。これらの事象は、CD56+CD8+ T細胞のエフェクター-標的細胞結合、およびパーフォリン／グランザイムAを媒介した細胞溶解活性に必要であることが見いだされた。本効果は、ICAM-3と共有された。本明細書において報告したLFA-1受容体の動態および細胞内シグナリングを支配する機構は、LFA-1シグナリングが、分子相互作用を生じることによる接着の役割を有することに加えて、CD56+CD8+細胞溶解活性に機能的に寄与することを示唆している。不適切なMTOCの局在は、CD8+腫瘍浸潤T細胞における溶解性顆粒のエキソサイトーシスを阻害し、これによってマウス腫瘍モデルにおけるCTL反応に必要なパーフォリンを媒介した細胞溶解活性を停止させることが示された（Radoja, S., et al., (2001) J Immunol 167, 5042-5051）。皮肉なことに、欠損CD8+腫瘍浸潤T細胞は、インビトロで効果的に殺傷を媒介することができ（Radoja, S., et al., (2001) J Immunol 166, 6074-6083）、腫瘍を媒介した阻害機構が腫瘍内のミクロ環境に存在することが示唆された。可溶性ICAM（1および3）の産生は、癌患者および自己免疫患者由来の血清で観察されたが、解析は、ICAM-2にまで拡大されなかった（Bloom, et al., (2002) J Rheumatol 29, 832-836）。可溶性ICAM-2レベルが白血病患者において増大し、化学療法により減少することを指摘した報告が1つだけある（Mustjoki, S., et al., (2001 ) Br J Haematol 113, 989-1000）。これらの観察の原因は、不明である。本明細書に示した研究に関して、表面ICAM-2の異常調節または可溶性ICAM-2の分泌のいずれかにより、エフェクター-標的細胞部位でのCD56+CD8+細胞溶解活性が不完全にトリガーされるかまたは遮断され、腫瘍がT細胞溶解を回避することができると推測するのは当を得ているであろう。その他のインテグリンリガンドとの相互作用におけるICAM-2のその他の特異的な役割により、エフェクター：標的細胞との境界面から広がる事象のより十分な理解が得られるであろう。
【０３１１】
材料および方法
免疫学的および化学的試薬
1、2、3、4、5、6、1、4、5、L、LFA-1、Pyk2、Syk、Mac-1、ICAM-1、およびICAM-3に対するmAb（PharMingen）。CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD45直接抱合体（FITC/PE/PERCP/APC/ビオチン）、グランザイム-A-FITC（PharMingen）。パーフォリン-CY5およびCD8-CY5PE（Herzenberg Laboratory, Stanford Universityから贈与）。ICAM-2 mAbおよびICAM-2-FITC（IC2/2 Research Diagnostics）。抗-ホスホPYK2（Y402）、抗ホスホ-p44/42（pT185Py187）（Biosource）。抗-ホスホPKC（Thr638）、抗-ホスホ-Syk（Tyr525/526）、抗-ホスホRaf1（Ser259）（Cell Signaling Technologies）。使用したタンパク質および化学試薬：フルオレセインイソチオシアネート（FITC）（Pierce）、Alexaフルア染料シリーズ488、546、568、633、タキソール-alexa546、ファロイジン-alexa633、およびCFSE（Molecular Probes）、チロホスチンA9および18、SB203580、ピセアタノール、ビスインドリルマレイミドIおよびII、ハービマイシンA（Calbiochem）。エモジン、ゲニステイン、DMSO、PMA、PHA、スタウロスポリン、イオノマイシン、ヨウ化プロピオジウム、サイトカリシンD（Sigma）。タンパク質A/Gアガロース（SCBT）。組換えヒトIL-2（Roche）、組換えヒトICAM-1-FC、ICAM2-FC、ICAM3-FC（Genzyme）。マウスおよびウサギIgGに対する二次抗体（Santa Cruz）。擬似処置は以下から成った：マウスIgG（抗体の場合）、1% BSA（タンパク質の場合）、または0.001% DMSO媒体（化学物質の場合）。
【０３１２】
細胞培養
NIH3T3細胞は、DMEM、10% DCS、1% PSQ（ダルベッコー修正イーグル培養液、10% ドナー仔牛血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシン（1000単位/mlおよび2mMのL-グルタミンPSQ）中で維持した。Jurkat T細胞は、RPMI-1640、10% FCS、1% PSQ中で1×105細胞/mlで維持し、全ての機能アッセイのために血清は12時間枯渇させた。細胞は5% CO2/37℃加湿インキュベーターで維持した。ヒト末梢血単球は、健常ドナーからの全血（Stanford Blood Bank）のフィコール-プラーク密度遠心分離（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）によって得て、接着細胞を枯渇させた。磁気活性化細胞選別を使用して、示した実験のためにナイーブCD8+T細胞の陰性単離を実施した（Dynal, Oslo, Norway）。
【０３１３】
可溶性ICAM-2の作製並びにICAM-2-FITCおよびICAM2-ビーズの合成
全長ICAM2 cDNAをJurkat細胞から入手し、記載したように（Perez et al. 2002）BamHI/Sal1部位でレトロウイルスベクターPBM-Z-INにクローン化した。ヒトICAM-2をレトロウイルス感染によってNIH3T3細胞に過剰発現させ、免疫親和性クロマトグラフィーによって収集した。二段階溶解法を使用してICAM-2を親和性精製し、続いて抗-ICAM-2固体支持体で精製した。細胞を緩衝液A（20mMトリス（pH7.5）、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、0.1% NP40、2.5mMのNa2PO4、1mM -グリセロホスフェート、1mMのNa3VO4、１μg/mlのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim））で5分間4℃で溶解させ、続いて50% （v/v）の緩衝液B（緩衝液Aプラス1%トリトンX-100）で30分間4℃で透過化した。上清は遠心（14000RPM、4℃、5分）によって集められた。C末端に対する抗-ICAM-2pAb（4mgs, Santa Cruz）を製造元の推奨にしたがってAffi-Gel Hz活性化支持体（Biorad）と抱合させた。この支持体には、Fc領域を介してIg分子を結合させ、より高い抗原結合性能を生じさせる。収集した上清のバッチ溶解を行い（4℃、2時間）、緩衝液C（0.1% Tween-20、PBS（pH7.4））で4回洗浄した。ICAM-2タンパク質を4.5MのNaCl（トリス、pH6.8）で溶出させ、一晩透析し（PBS（pH7.4）、0.001% アジ化物、0.001% グリセロール、4℃）、サイズ排除スピンクロマトグラフィーを使用して濃縮し、0.01% グリセロールを使用して安定化させた。抗-ICAM-2固体支持体を緩衝液Cで再平衡化させて、0.001%のチメロソール中で保存し、3回まで再使用した。純度は、クーマシーゲルによって評価したところ＞98%であった。サイズ排除クロマトグラフィーにより、より高分子量の凝集物を除去して、精製ICAM-2が未変性ゲル電気泳動で観察されなかった。本方法で20mgを精製し、本実験に使用した。ICAM-2-FITCの合成は、NHS-フルオレセイン（Pierce）への化学的抱合によって達成し、未反応染料をゲル濾過によって除去した。ICAM-2-FITCプローブは、フローサイトメトリーによって決定すると、トリプシン処置Jurkat細胞に組み込まれることはなく、またはLFA-1抗体クローンTS1/22もしくはTS1/18（Developmental Hybridoma Studies Bank）または非標識ICAM-2タンパク質で遮断したときに結合することもない。ICAM-2-FITCの結合は、2インテグリンクローンCT104（Santa Cruz）によって遮断されなかった。精製ICAM-2は、NSOマウスミエローマ細胞（Genzyme）から精製された組換えICAM-2FC融合タンパク質に匹敵した。ICAM-1FCおよびICAM-3FCも、NSO細胞（Genzayme）から精製した。タンパク質は、14,000RPMで使用5分前に遠心した。1mgのICAM-2タンパク質を製造元（Dynal）の推奨に従って2×108のエポキシ活性化ビーズと抱合させた。総計2gのICAM-2タンパク質を含む4×105のビーズを示したとおりに使用した。ゲルの画像化は、VersaDoc機（Biorad）で行い、Quantity One定量化ソフトを使用して解析した。
【０３１４】
フローサイトメトリー
細胞内および細胞外染色は、記載したように行った（Perez and Nolan, 2002）。活性キナーゼのための細胞内プローブは、リン酸特異的抗体をAlexaフルア染料シリーズと記載したように抱合させて作製し、ホスホ-タンパク質最適化条件で使用した（Perez and Nolan, 2002）。動力学的解析は、37℃に維持した時間同期化96ウェル内の固定緩衝液を直接適用することによって行った。細胞内アクチンおよび微小管染色は、ファロイジン-Alexa633およびタキソール-Alexa546染料（Molecular Probes）を使用して行った。接着とクラスター形成解析は、本文に記載したようにICAM-2-FITCを使用して行った。LFA-1活性化は、mAb24-Alexa633またはmAb-Alexa546抱合体のいずれかによって評価し、37℃で表面染色を行った。フローサイトメトリーデータは、106細胞／試料による3回の独立した実験の代表である。10〜50,000事象を収集し、FACSCalibur機で手動により較正した。棒グラフで示したデータは、相乗平均蛍光強度（MFI）として表し、アイソタイプコントロールに対して規準化した。対数比は、非刺激細胞のMFIに対する刺激のMFIと定義される。データは、Flowjoソフトウエア（Treestar）を使用して解析した。
【０３１５】
単一細胞ICAM-2結合測定
ICAM-2-FITC結合の割合は、100*（（MFIexp−MFIctl）／（MFIfinal−MFIctl））として表され、式中、MFIexpは、実験濃度の平均蛍光強度に等しく、MFIctlは、非染色細胞の平均蛍光強度に等しく、MFIfinalは、結合が飽和した最終濃度の平均蛍光強度に等しい。試料を図42に示したとおりの最終濃度で30分37℃で50Lの染色媒体（def RPMI, 4%FCS）中でインキュベートし、１×洗浄し（500L、PBS、pH7.4、1mMのEDTAを含む）、100Lの1%パラホルムアルデヒドに再懸濁した。染色条件の希釈因数および72.1kDの分子量をモル濃度の決定の際に使用した。染色緩衝液には、2.4mMのカルシウムおよび2mMのマグネシウムを含んた。データは、Kaleidagraphソフトウエアを使用して、等式V=Vmax[S]/(Km+[S])に適合させた。式中、Vは、結合%であり、［S］は、ICAM-2-FITC濃度であり、Kmは、ミカエリス-メンテンの結合定数である。
【０３１６】
レーザー走査共焦点顕微鏡観察
Jurkat細胞を示したように処置し、ポリ-L-リジン（Sigma）被覆滅菌カバースリップに穏やかに遠心することによって（1000RPM、10分）付着させ（1mg/ml、30分）、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.4）で2回洗浄し、2.7%パラホルムアルデヒド（PBS）で固定した。細胞を透過化し（5分、PBS中の0.1%トリトン-X-100）、PBSで2回洗浄し、4%のFCSで遮断し、示したように抗体または細胞内染色に供した。染色したカバースリップをマウントし、Zeissレーザー走査共焦点顕微鏡510を使用して観察した。
【０３１７】
免疫沈澱、免疫ブロッティングおよびキナーゼアッセイ
細胞抽出物は、2×106細胞（示したように処置）を氷冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液（20mMトリス（pH7.5）、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1%トリトンX-100、2.5mMのNa2PO4、1mM -グリセロホスフェート、1mMのNa3VO4、1g/mlのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim））に収集することによって調製した。抽出物を14,000RPM（5分、4℃）で遠心し、10〜20g（BCAタンパク質アッセイ法（Pierce））を標準的な方法を使用して免疫ブロッティングに供した。免疫沈澱物（IP）は、プロテインA/Gプラス-アガロースビーズによって事前に清澄化し、一次抗体と共に1時間、プロテインA/Gプラス-アガロースビーズと共に1時間インキュベートし、溶解緩衝液で4×洗浄した。ブロットを表示の抗体とインキュベートし、ECL（Amersham）を使用して発色させた。免疫ブロットのストリッピングおよびプローブによる再検査は（示したとおり）、ストリッピング緩衝液（62.5mMのトリス（pH6.8）、10% SDS、1%-メルカプトエタノール）と共にインキュベートすることによって行った（30分、55℃）。MAPK活性は、p44/42 MAPKキナーゼキットによって製造元（Cell Signaling Technologies）の推奨に従って検出した。
【０３１８】
細胞溶解活性、パーフォリン放出アッセイ、および抱合体形成アッセイ
標的細胞溶解は、フローサイトメトリーに基づいたCFSE標識HL60細胞の検出によって測定した。HL60細胞を1gのCFSEで標識した（30分、37℃）。標的を2回洗浄し、ニセ処置、IL-2活性化（100U/ml）、CD3/CD28活性化（1g/ml）処置するか、またはICAM2ビーズもしくは可溶性ICAM-1、-2、もしくは3で処置し（10g/ml、30分、37℃）、その後104標的細胞／ウェルで96ウェル丸底プレートに播種した。CTLを50：1、25：1、および12.5：1のE：T比で添加し、37℃で4時間インキュベートした。次いで、細胞を多パラメーターフローサイトメトリーおよび細胞内パーフォリン染色のために処置した。%特異的溶解を以下の等式から算出した：%特異的溶解 = 100-100×（実験のHL60カウント／全コントロールHL60カウント）。HL60カウントは、CFSE蛍光によって検出した。パーフォリンの%は、以下の等式から算出した：%パーフォリン = 100×［（実験のパーフォリンMFI-アイソタイプmAb MFI）／（全パーフォリンMFI-アイソタイプmAB MFI）］。MFIは、フローサイトメトリーにに基づいた細胞内検出の平均蛍光強度を指す。細胞抱合体は、記載したように（Morgan eｔ al. 2001）、フローサイトメトリーによって決定した。化学物質阻害は、示した刺激の前に10Mの示した化合物（30分、37℃）で行った。全ての実験は、3回行った。
【０３１９】
実施例2
ホスホ-タンパク質で駆動されるシグナリングネットワークは、腫瘍の成長因子応答の変化をサポートし、腫瘍細胞病態の開始および維持にとって重要であると考えられる。急性骨髄性白血病（AML）において、増殖の調節不全およびアポトーシスの阻害は、未成熟骨髄球性前駆細胞の蓄積および発癌進行を引き起こす。本発明者らは、本明細書において、広く研究された基底リン酸化状態に加えて、サイトカイン刺激に対するホスホ-タンパク質反応を調査して、調節不全のシグナリングノードを明らかにし、シグナリング病態プロフィールを同定することができたことを示す。本発明者らは、ホスホ-タンパク質プロフィールの教師なしクラスター化を使用して、受容体チロシンキナーゼFlt3の突然変異および化学療法耐性などの予後指標と相関するAML患者群を同定することができたことをさらに示した。Flt3突然変異をもつ患者において、生化学的相違を使用して、骨髄球性サイトカインGM-CSFおよびG-CSFに対するStat3およびStat5の反応の増強を示した患者群を定義した。
【０３２０】
シグナル伝達の増強されたモデルにおいて、調節不全の細胞増殖は、細胞の内部シグナリング状態の感作相違を伴うことが予測される。AML前駆体であるとみなされた細胞において活性な1つの重要なシグナル伝達ネットワークは、Janusキナーゼ／シグナルトランスデューサーおよび転写の活性化（STAT）経路である。Statタンパク質は、通常細胞増殖、分化、および生存を調節する造血性サイトカイン受容体シグナリング経路において重要である。AMLにおいて、いくつかの報告では、発癌に関与するStat3およびStat5などのSTATが構成的に活性化され、処置的介入のための有効な標的であるかもしれないことを示唆する。一部のAMLで構成的に活性化されることが公知の平行したシグナリング系は、Rasおよび分裂促進因子で活性化されるプロテインキナーゼ（Ras-MAPK）経路である（MAPKタンパク質p38およびErk1/2を含む）。重要なタンパク質の基底リン酸化が変化されたことに加えて、シグナル伝達の増強されたモデルでは、癌細胞が、これらに環境入力に対して不適当なまたは感作された様式で反応を生じさせるさらなるシグナリングの変化を有し得ることを予測する。このような環境入力に対する曝露により、特定の腫瘍サブタイプの増殖を開始し、または維持するために必要とされる根底にある変化を反映し-原因となるか、もしくは反応する-ホスホ-タンパク質ネットワークにおける相違のさらなる測定値を反映することを明らかにすることができた。したがって、腫瘍間のホスホ-タンパク質シグナリング変異は、処置に対する差動的疾病経過および反応マーカーとして使用し得る。
【０３２１】
本発明者らは、シグナリングが30人の成人AML患者の十分に特徴づけられたコホートに由来する白血病性芽球における病的な相違を分類するために使用することができるかどうかを検査しようとした。より自然な状況において同時に複数の事象を測定する標準を満たすために、本発明者らは、これらの患者から抽出した初代白血病細胞における複数のリン酸化された活性化されたシグナリング分子を検出するために、細胞内リン酸特異的フローサイトメトリーを適用した。36個のホスホ-タンパク質状態（6個の基底状態および30個のサイトカイン応答）で構成されるサイトカイン応答パネルは、腫瘍細胞のシグナル伝達が変化されたことを調査するようにデザインした（図40a）。格子におけるそれぞれの正方形は、30,000個の細胞事象を含んだ多次元フローサイトメトリーファイルに近い。それぞれのホスホ-タンパク質ノードのサイトカイン応答を、刺激した試料の中央値の蛍光強度（MFI）のlog2倍数相違を非刺激によって割って算出することによって、基底状態と比較した。データは、応答パネルにおいて視覚的に単純化してあるが、興味深いサブセットの単一細胞ホスホ-タンパク質応答の詳細な検査のために多パラメーターフローサイトメトリーデータを利用できる。
【０３２２】
サイトカイン応答パネルには、リン酸化されたStat1、Stat3、Stat5、Stat6、p38、およびErk1/2の検出を含む。これらのタンパク質により、白血病誘発の誘因の疑いがあるシグナルネットワークの調査が提供される。本発明者らは、刺激されていない細胞および20ng/mLのFlt3リガンド（FL）、GM-CSF、G-CSF、IL-3、またはIFN-γで15分間刺激した細胞についてのデータを収集した。一例として、本発明者らは、このパネルをU937組織球性リンパ腫株化細胞（図40a）、HL-60 AML株化細胞、および正常末梢血からのCD33+サブセットの複数の試料（図40b）に適用した。CD33+細胞は、骨髄球性系統の分化細胞を表し、供血者から試料間のサイトカイン応答の変動性を評価するために使用した。一般に、正常リンパ球サブセットのサイトカイン応答は、ドナー間でほとんど変更せず（σ2＜0.1、n=6）、株化細胞およびCD33+細胞におけるシグナリングは、以前に報告されたシグナル伝達4の機構を反映した。次いで、本発明者らは、30人のAML患者試料のうちの6人についてサイトカイン応答格子を調製した（図40b、P06を介してAML-P01）。株化細胞、分化細胞試料、およびAML試料において繰り返し測定値を収集し（n≧3）、技術およびモノクローナル抗体が以前の研究と同様の再現性のレベルを示したことを検証した。しかし、重要なことに、刺激に対する応答では、患者の腫瘍試料全体のシグナリングにおける類似性および相違を強調した。たとえば、AML-P02およびAML-P03は、多くの類似性を示したが、AML-P02は、Stat5のリン酸化を介してGM-CSFおよびG-CSFに応答し、一方AML-P03は、GM-CSFのみに応答した（図40b）。さらに、このセットの大部分の患者試料およびコントロールは、IFN-gに続くStat1の強力なリン酸化を示したが、AML-P05およびAML-P01では、この応答がなかった。
【０３２３】
本発明者らは、患者の応答間の有意な類似性および相違を捜すために、全30人のAML患者を含むようにこのサイトカイン応答パネルを拡大した（図41a）。従来のAML発癌の研究は、構成的シグナル伝達経路に焦点を当てており、細胞シグナリング状態の調節不全をモニターするためには、この活性化レベルで十分かもしれないという仮説から研究した。基底STATおよびRas-MAPKタンパク質リン酸化における相違は、AMLにおける広範囲にわたるシグナリング経路の様々の構成的活性を示す以前の報告と一致していた。
【０３２４】
しかし、根底にある腫瘍突然変異の相違は、シグナリングが増強される際に相違を引き起こすかもしれないという仮説を支持して、初代AML芽球の多くのホスホタンパク質応答は、STATおよびRAS/MAP-K経路メンバーリン酸化のかなりの誘導および相違を示した（図41a、b）。6つの基底リン酸化状態に加えて、本発明者らは、AML患者試料全体に有意な相違を示した30個のサイトカイン応答状態のうちの7つを同定した（σ2＞0.1、図41 b、黄色で強調してある）。これらは、以下の通りであった：（i）G-CSFに続くStat3のリン酸化、（ii〜v）GM-CSF、G-CSF、IL-3、およびIFN-γに続くStat5のリン酸化、（vi）IFN-γに続くStat1リン酸化、並びに（vii）FLに続くErk1/2のリン酸化。残りの腫瘍サイトカイン応答は、正常の分化したCD33+細胞における相違以下の変動を示し、有意性閾値に最も近い2つのノード状態も、その後の患者グループ化に影響しなかった。相違に対する絶対中央値のグラフは、ノイズ閾値に対するシグナルおよび中央基底状態またはサイトカイン応答に対する相違の関係を示す（図41c）。
【０３２５】
増強されたシグナリング仮説に基づいて、本発明者らは、これらの13個のホスホ-タンパク質状態が、差動的腫瘍病態を開始し、または持続するために必要とされる根底にある発癌性事象を表し、患者のリスクを層別化するために使用することができることを予測した。本発明者らは、これらのホスホ-タンパク質バイオシグネチャーの教師なしクラスター化を使用してAMLについてのシグナル伝達に基づいた分類を構成した。仮説として臨床結果によって患者を事前にグループ化し、次いでそれぞれのノード状態について試験することに対して、患者を生物学的仮説に従ってクラスター化し、次いで臨床的パラメーターに対する相関について試験したときは、複数のT検定の統計的リスクを回避することができる。また、この方法により、正常コントロール細胞がきわめて少なく、または大量に得ることが困難なときでも、疾患サブグループを同定することができ、提唱された正常コントロールに対してそれぞれの試料を比較するのではなく、実験試料間の相違を使用して群を定義しているので、骨髄球性前駆細胞でも同様である。
【０３２６】
類似性によってバイオシグネチャーをグループ化するために（図42a）、本発明者らは、Multiple Experiment Viewer（MeV）（http：//www.tigr.org/software/tm4/mev.html）において利用できる完全連結法階層的クラスター化アルゴリズムを使用した。類似性グループ化により、4つの主なAML患者のクラスターが同定された（図42b）。これらのそれぞれをSignaling Cluster（SC）と呼び、クラスターの一次シグナリングプロフィールに基づいて：（i）ほとんどまたは全く増強されたサイトカイン応答を示さず、基底リン酸化を変化したSC-NP（下線を引いた文字は、同種頭字語を意味する）、（ii）増強されたサイトカイン応答および高い基底ホスホ-タンパク質状態を示したSC-PB、（iii）強度の増強されたシグナリング、低基底リン酸化、およびIFN-gに対するp-Stat1応答を示したSC-P1、並びに（iv）低基底リン酸化の状況において多くの増強されたサイトカイン応答を示したSC-P2をいう。
【０３２７】
増強されたシグナリング仮説を試験するために、本発明者らは、AMLに対する予後徴候があると以前に決定された臨床的因子がバイオシグネチャーに由来したSCと有意に相関するかどうかを求めた（図42b）。経過1化学療法に対する耐性-（シタラビン・プラス・アントラサイクリンを関連する細胞障害性に耐えるほど十分健康な患者に与えた）は、SC-P2と有意に相関した（p=0.002、図42b）。SC-P2の患者は、このコホートの33%を構成した（10/30）。この知見は、ヒト癌のそのシグナル伝達に基づいた分類（臨床的結果についての先験的知識）により、療法に対する応答の予測的な患者の分類を行うことができることを証明する。
【０３２８】
本発明者らが既存の骨髄球性シグナルネットワークを増強するかもしれないと予測した1つの遺伝子変化は、Flt3受容体チロシンキナーゼの突然変異であった。Flt3の異常は、およそ30%のAML患者において検出され、AML11,12においてネガティブな予後指標として十分に確立されている。
【０３２９】
株化細胞における実験では、突然変異体Flt3の発現により構成的Stat5およびRas-MAPK活性を生じさせることが示唆されたが、この接続は、Flt3突然変異体および野生型患者に由来する初代AML芽球27における基底Stat5リン酸化の以前に発表された比較では観察されなかった。
【０３３０】
特に、高骨髄球性サイトカイン応答を示したAML患者試料は、Flt3の内部直列型複製を含んだが、-増強されたSCプロフィールをもたない試料は、これらの突然変異を欠いていた（p=0.02）。SC-P2にクラスター化しないFlt3突然変異をもつ患者のうち、4/7が、Asp835 Flt3突然変異またはN-Ras突然変異のいずれかを含むその他の突然変異を示した（データ示さず）。他人によって報告されたように、本発明者らも、正常またはFlt3-突然変異体AML患者におけるStat5の基底リン酸化に有意差は観察されなかった（図43a）。
【０３３１】
Stat5、およびより小さい範囲のStat3の増強されたシグナリングは、Flt3突然変異を示すAML患者の群において共通であった。GM-CSFに続くStat5およびG-CSFのリン酸化は、Flt3突然変異をもつ患者において有意に増強された（p=0.04および0.02、それぞれ、図43aおよび図43b）。また、G-CSFに続くStat3リン酸化（これは、AMLにおいて有意な相違を示す唯一のStat3バイオシグネチャー状態であった）は、Flt3突然変異と相関したことは注目すべきである（p=0.01、図43aおよび図43b）。骨髄球性シグナル伝達ノードに対するFlt3突然変異の効果を示すために、本発明者らは、4つのサイトカイン応答ノード状態（G-CSFに続くp-Stat3、並びにGM-CSFに続くp-Stat5、G-CSF、およびIL-3）を合計し、AML患者試料における骨髄球性サイトカイン応答とFlt3突然変異との間の相関をグラフで示した。本発明者らは、Flt3突然変異が既存のAMLにおける増強された経路を介してシグナリングを増強するという考えを強く支持する著しい相関を観察する（p=0.005、図43a）。これは、増強された骨髄球性シグナル伝達を示す患者、特にSC-P2のプロフィールをもつものは、STAT経路阻害剤を含む療法によく応答するかもしれないことを示す。さらに、これらのデータは、それぞれのSCグループ化が、その他のゲノムおよびタンパク質の変化と組み合わせたときに、白血病細胞の分裂促進的シグナルネットワークにおいて共通のサイン生じるという、白血病誘発のために必要とされる増殖性の利点を反映することを示唆する。6つの細胞表面抗原の、SC群またはFlt3との相関により、SC-P2およびFlt3突然変異と有意に相関したCD15/Lewis Xの予想外の喪失を同定した（χ2検定では、それぞれp=0.03およびp＜0.001を示した、図42b）。
【０３３２】
36.7%の患者（11/30）を含んだSC-NPのプロフィールは、主に低〜サイトカイン応答なしおよびIFN-γに続くStat1の低リン酸化を含んだ（図42a）。この群と関連するさらなる応答は、IL-3に続く低Stat5リン酸化およびG-CSFに続く低Stat3リン酸化であっり、これらは両方とも、SC-P2において観察される変化と反対である。興味深いことに、SC-NPにおいて、9；11転位置をもつ2人の患者（AML-P27およびAML-P24）および染色体5の喪失をもつ2人の患者（AML-P23およびAML-P17）を含む密接に関連した枝分れに入る細胞遺伝学的変化10があった（図42a、階層枝分れAML-P23からAML-P30）。検出可能な細胞遺伝学的な変化のない患者は、密接に関連したSC-P1の枝分れを形成した（図42a、階層枝分れAML-P13からAML-P20）。SC-NPおよびSC-P1の枝分れ間での変化し、または二倍体の細胞遺伝学的分割は、統計学的に有意であった（p＜0.001）。9；11の転位置をもつただ一人のその他の患者のAML-P03は、Flt3のAsp835突然変異を含んでおり、SC-PBとしてプロファイルした。SC-NPプロフィールを示したAML-P26は、このコホートの唯一の患者であり、Stat5およびStat3の座位である染色体17のコピーがなくなっていた。
【０３３３】
バイオシグネチャーに基づいた単一細胞の重要な利点は、上に示したように、これらは生物学的に有意なクラスター化をすることができるほど十分に複雑なデータを近似し、一方でさらなる検査のために根底にあるフローデータを保持していることである。コントロールを確証し、および応答の程度を比較することに加えて、本発明者らは、もとのフローサイトメトリーヒストグラムおよび2Dプロットを調べ、より高い次元のデータの表現により、独特の特色をもつ細胞のサブセットが同定されたことを見いだした。たとえば、Stat5およびStat3のGM-CSF並びにG-CSF応答に対する2Dカウンタープロットにより、10人の代表的なAML患者試料についてFlt3変異性状態によるグループ化が示される（図43b）。Stat3、およびStat5は、両方とも白血病において構成的に活性であると考えられており、多くの構造的な類似性を共有し、Flt3突然変異は、GM-CSFに続く増強されたStat5リン酸化と相関されるが、Stat3リン酸化との関係を有さないことに留意されたい（最上列）。対照的に、大部分の場合において、Flt3突然変異は、個々の初代AML芽球におけるp-Stat5/G-CSFノードおよびp-Stat3/G-CSFノードの増強と相関するように見えた（下段列）。これは、Flt3突然変異が、二次元フローサイトメトリーにおいて観察され細胞の有意なサブセットにおいて、重要なホスホ-タンパク質転写因子の予想外の同時活性化を引き起こすことができることを強く示唆する。
【０３３４】
AML-P05からの芽球ホスホ-タンパク質シグナリングは、MeVソフトウェアにより、Flt3突然変異の検出にもかかわらず、SC-NPと同様のプロフィールを有すると分類された。SC-P2のプロフィールと同様のp-Stat5およびp-Stat3増強をもつAML-P05芽球の定義されたサブセットの存在は、驚くべきであことであり、一部の細胞が変化したシグナリングを引き起こす後天性のさらなる突然変異を有し得ることを示唆する（図43b）。AML-P05は、Flt3-ITDおよび非-SC-P2プロフィールをもつ全てのその他の患者と同様に、経過1化学療法後に緩解に向かった（p＜0.001、図42b）。加えて、入力刺激に対する腫瘍細胞サブセット応答を区別する多パラメーターアプローチを使用して、腫瘍微小不均一性の分類についての十分に認識された制限が克服されるかもしれない。高次元の情報の抽出により、特にさらなるホスホ-タンパク質またはその他の単一細胞事象が同時に測定されるときに、本明細書に示したものなどの系の理解を洗練するためにさらに適用することができるであろう。これらのサブセット相違が、単に非応答性細胞を表すかどうかにかかわらず、癌「幹」細胞2、または腫瘍内のクローンの進化のその他の段階は、決定されないままである。
【０３３５】
本明細書において報告したAMLの機構に基づいた分類は、ホスホ-プロテオームが腫瘍病態において情報価値があり得ることを示す。加えて、サイトカイン応答アプローチが、癌研究以外の分野に容易に適用することができることを証明した。細胞集団を外部刺激に応答させることによって、根底にあるシグナリング病態の相違を区別することができ、これにより患者集団を分類することができる。この点に関して、AML芽球は、構成的に活性なSTATおよびRas-MAPKシグナリングを有するものと一般に考えられているので、これらがサイトカイン刺激に応答したことは衝撃を与える。これらの腫瘍の増強されたサイトカイン応答を基底リン酸化状態についての情報で組み合わせて、臨床的関連をもつ分類を作製するためにクラスター化することができるという知見は、機構に基づいた癌療法をデザインし、試験する臨床グループにとって重要となるであろう。本結果は、キナーゼ阻害剤またはその他の治療を含む患者の化学療法計画が、バイオシグネチャーで定義された患者の応答群内の特定の細胞サブセットのために仕立てられ、および向けられる可能性があることを示唆する。
【０３３６】
材料および方法
AML芽球の患者および調製
本研究は、構内倫理委員会の承認を得て、試料はインフォームドコンセント後に収集した。試料は、継続して新規AMLおよび高末梢血芽球カウント20である患者の大きな群から選択した。これらの患者は、1999年4月〜2003年8月に病院に入院し、平均年齢が60歳で年齢が29〜84歳の範囲である。これらの患者は、高い芽球カウントについて選択されたので、濃縮されたAML細胞集団は、以前に開発された技術28に従った安全な標準化された凍結保存の前に、末梢血液試料の単純な密度勾配分離を使用して調製した（Ficoll-Hypaque；NyCoMed, Oslo, Norway；比密度1.077）。これらの患者は、Flt3シグナリングおよびAML20における突然変異について以前に研究された群の後半部分を表す。急性骨髄性白血病株化細胞HL-60および単球様リンパ腫株化細胞U-937は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（www.atcc.org）からのものであり、RPMI培地（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）+10%のウシ胎児血清（HyClone, South Logan, UT, USA）中で培養した。
【０３３７】
AML芽球の刺激
＞95%のAML芽球を含む末梢血を5mLのStem Span H3000で定義された無血清培地（Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada）に解凍し、計数し、1mLあたり2×106細胞にて再懸濁する。次いで、6つのFACSチューブ（Falcon 2052, BD-Biosciences, San Jose, CA）を2mLのそれぞれの白血病試料で満たして、37℃にて2時間静止させた。凝集を防止するためにAML芽球を穏やかに再懸濁して、37℃にてさらに45分間静止させた。この時間後、媒体（欠損RPMI培地、Invitrogen, Carlsbad, CA）または40μLの刺激を20ng/mLの終濃度にそれぞれのチューブに添加した。刺激には、ヒト組換えFlt3リガンド（FL）、GM-CSF、G-CSF、IL-3、およびIFN-γ（全てPeprotech, Inc., Rocky Hill, NJ, USAから）を含んだ。試料を37℃のインキュベーターに15分間戻して、シグナル伝達およびリン酸化させ、その後、100μLの32%のパラ-ホルムアルデヒド（PFA, Electron Microscopy Services Fort Washington, PA, USA）を1.6%の終濃度に、細胞のそれぞれの2mLチューブに添加した。細胞を室温で15分間固定し、10分間2mL氷冷メタノール中に再懸濁することによって透過させ、フローサイトメトリーのために染色するまで4℃にて貯蔵した。
【０３３８】
細胞内リン酸特異的なフローサイトメトリー
PFA固定、メタノール透過したAML芽球を、2mLのリン酸緩衝食塩水（PBS）を添加することによって再水和させ、穏やかに再懸濁し、次いで遠心分離した。細胞ペレットを2mLのPBSで一度洗浄し、150μLのPBS+0.1% BSA（Sigma, ST. Louis, MO, USA）に再懸濁し、3つの新たなFACSチューブへ均一に分けた。試料あたり0.065μgの一次抱合リン酸特異的抗体を含む50μLの抗体混合物を、AML芽球のそれぞれのチューブに添加して、染色を室温で20分間進行させた。Alexa（Ax）色素（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）を結合した一次抱合抗体（全てBD-Pharmingen, San Diego, CA, USAから）には、ホスホ-Stat3（Y705）-Ax488、ホスホ-Stat5（Y694）-Ax647、ホスホ-Stat6（Y641）-Ax488、ホスホ-Stat1（Y701）-Ax647、ホスホ-p38（T180/Y182）-Ax488、およびホスホ-Erk1/2（T202/Y204）-Ax647を含み、その後のAlexa-488およびAlexa 647（Molecular Probes, Eugene, OR）の検出のために、それぞれFL-1およびFL-4に対して対で適用した（Stat5/Stat3、Stat1/Stat6、およびErk/p38）。次いで、染色したAML芽球を2mLのPBS+0.1% BSAを添加することによって洗浄して、200μL PBSの最終量に再懸濁した。およそ30,000個のゲートしていない事象をベンチトップ FACSCalibur 二重-レーザーサイトメーター（Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA）でそれぞれの試料を収集した。正常PBLにおける骨髄球性系統の細胞を検出するために使用したときは、CD33に対する抗体は、フィコエリトリン抱合体であり（clone WM53, BD-Pharmingen, San Diego, CA, USA）、FL-2で検出される。
【０３３９】
統計解析
サイトカイン刺激に続くSTATおよびRas-MAPKタンパク質のリン酸化の変化は、刺激されていない細胞集団を上回って刺激されたもののlog2倍数平均蛍光指数（MFI）を算出することによって近似した。基底リン酸化における相違は、腫瘍間の最小を上回る試料におけるlog2倍数MFIを算出することによって比較した。観察されたもの対予想される分布の統計的有意性を決定するために、本発明者らは、χ2検定を使用し（図42b）、2つの集団の平均値における相違の有意性を決定するために、本発明者らは、スチューデントT検定を使用した（α=0.05、図43a）。既存の仮説を確証するために標準的T検定を使用した。
【０３４０】
実施例3
以下の実施例では、特定薬剤に対する曝露に基づいて増強データを作製し、解析するために、本発明の方法および組成物を使用する。
【０３４１】
12人の患者のそれぞれからの5収集（総60人の試料）を含む初期の患者試料を、表1に示したサイトカイン応答パネルに適応する96ウェルプレートにアリコートに分ける。次いで、96ウェルプレートのそれぞれを表2に詳述した4色または6色抗体カクテルで染色する。
【０３４２】
患者試料に加えて、3つの株化細胞（U937、HL60、MV411）をインビトロでの薬物研究のために使用する。株化細胞は、サイトカイン刺激の前に5回の時点（1時間、2時間、4時間、12時間、24時間）にて個々に薬物で処置する。生じる15個の試料を96ウェルプレートにアリコートに分け、上記の通りに染色する。
【０３４３】
最後に、6人の正常供血者からの収集を「コントロール」試料として処置する。これらのコントロール試料には、6人のドナーのそれぞれからの5収集を含み、初期の患者試料と同じく処理する。加えて、6人のドナーのそれぞれからの5収集をインビトロでの薬物研究に使用した3つの株化細胞と同じく処理する。
【０３４４】
フローサイトメトリーデータは、完全に処理した試料のそれぞれについて収集し、上記した生物情報学ツールを経て解析し、統計的有意性解析を処理したフローデータに基づいて作製する。
（表１）増強の研究のための全般的プロトコル
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（表２）1試料を使用する増強実験のための96ウェル実験応答パネルレイアウト（薬物処理時にて採取した患者試料に対応する）
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（表３）4色および6色染色
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図３Ｂ−３】
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【図３Ｂ−４】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ】
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【図３３Ｈ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３４Ｈ】
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【図３４Ｉ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ａ−１】
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【図３８Ａ−２】
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【図３８Ａ−３】
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【図３８Ａ−４】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
2014055964.tif 000173
【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ−１】
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【図４５Ｂ−２】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月29日(2013.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞または該細胞を有する患者を分類するための方法：
1つまたは複数の活性化可能なエレメントを有する、患者由来の1つまたは複数の細胞を提供する工程；
2つ以上の異なる増強剤と該1つまたは複数の細胞を接触させる工程；
該2つ以上の異なる増強剤によって増強された該1つまたは複数の細胞の各々における該1つまたは複数の活性化可能なエレメントの活性化状態を単一細胞に基づいて検出する工程であって、該1つまたは複数の活性化可能なエレメントの各々がシグナル伝達経路における特定のシグナル伝達ノードを形成する、工程；
該1つまたは複数の増強された細胞の各々でシグナル伝達経路における特別なシグナル伝達ノードを形成する、該1つまたは複数の活性化可能なエレメントの検出された活性化状態に基づいて、該細胞または該細胞を有する患者についての細胞活性化プロフィールを作成する工程；および
該細胞活性化プロフィールに基づいて、該細胞または該細胞を有する患者を分類する工程を含む、方法。
【請求項２】
細胞活性化プロフィールが、増殖状態、アポトーシス状態、またはそれらの組み合わせである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
2つ以上の増強剤が、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、生物活性剤、受容体リガンド、細胞、および治療剤からなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
2つ以上の異なる増強剤と1つまたは複数の細胞を別々の培養において接触させる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
1つまたは複数の異なる活性化可能なエレメントの各々がタンパク質である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
検出される活性化状態の少なくとも1つが翻訳後修飾である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
翻訳後修飾が、リン酸化、プレニル化、グリコシル化、アセチル化、システイニル化、ニトロシル化、メチル化、ユビキチン化、および硫酸化からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
検出される活性化状態の少なくとも1つが切断状態である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
タンパク質が、カスパーゼ3、カスパーゼ7、カスパーゼ９、およびPARPからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
検出する工程が、1つまたは複数の活性状態特異的結合エレメントと1つまたは複数の細胞を接触する工程であって、該1つまたは複数の活性状態特異的結合エレメントの各々が1つまたは複数の活性化可能なエレメントの特定の状態に結合する、工程を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
1つまたは複数の活性状態特異的結合エレメントがタンパク質である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質が抗体である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、抗PI3K、抗PIP2、抗PIP3、抗AKT-ホスホ-Ser473（モノクローナル抗体4E2）、抗ホスホAKT(Thr308)、抗p44/42 MAPK（抗ホスホ-Thr202/Tyr204、抗ホスホThr185/Tyr187）、抗ホスホTYK2（Tyr1054/1055）、抗ホスホp38 MAPK（Thr180/Tyr182:モノクローナル抗体28B10）、抗ホスホ JNK/SAPK（Thr183/Tyr185:モノクローナル抗体G9）、抗ホスホ-チロシン（P-tyr-100）、抗ホスホ-スレオニン、抗ホスホ-PKC-PAN基質抗体、抗ホスホ-PKA-基質、抗ホスホPYK2（Tyr402）、抗ホスホPKC（ホスホ Thr638）、抗ホスホ-Syk（Tyr525/526）、抗ホスホRaf1（Ser259）、抗ホスホ-Stat1（Tyr701）、抗ホスホ-Stat3（Tyr705）、抗ホスホ-Stat5（Tyr694）、抗ホスホ-Stat6（Tyr641）、抗ホスホ-p38（Thr180/Tyr182）、および抗ホスホ-Erk1/2（Thr202/Tyr204）からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
活性化状態特異的結合エレメントの1つまたは複数が標識可能なラベルで識別可能に標識されている、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
検出する工程が、フローサイトメーター；蛍光のマルチチャネルを有する顕微鏡；蛍光、紫外線および／もしくは可視光、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、発光、消光、二光子励起、ならびに／又は、強度再配分を検出するように作られているプレートリーダー；データおよび画像を捕捉し定量可能なフォーマットに変換するように作られている電荷結合素子（CCD）カメラ；高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）；質量分析計からなる群より選択される検出器によって実施される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。