(57)【要約】【課題】ＲＮＡｉにおけるオフターゲット表現型の影響を減少させるためのＳｉＲＮＡ配列非依存性修飾フォーマットおよびその安定化型の提供。【解決手段】ｓｉＲＮＡのための修飾ヌクレオチドを含む修飾フォーマットを提供する。本明細書中に提供した修飾フォーマットおよび修飾ヌクレオチドを有する低分子干渉ＲＮＡは、内因性遺伝子のＲＮＡ干渉におけるオフターゲット効果を減少させる。さらなる修飾フォーマットがなされたｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼが豊富な環境に対して安定性を示すことが証明された。予想外に、ストランドバイアスの増加または維持は、内因性ＲＮＡ干渉の効力の維持に必要である一方で、細胞生物学アッセイにおけるオフターゲット効果の減少には十分でない。【選択図】図９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本教示は、一般に、ＲＮＡ干渉における配列非依存性オフターゲット表現型の影響を減少するための組成物、方法、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
緒言
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は強力に相補ｍＲＮＡ切断を誘導してｍＲＮＡを非機能性にし、その結果、細胞中の機能性タンパク質を喪失させる。これらの分子が作用する機構の一部は特徴づけられている。簡潔に述べれば、ｓｉＲＮＡの２つのＲＮＡ鎖の１つがＲＩＳＣと呼ばれる酵素複合体に組み込まれ、次いで、複合体は相補配列を含むｍＲＮＡに結合して切断し、それにより、タンパク質への翻訳から成熟ｍＲＮＡを排除することができる。２つの各ｓｉＲＮＡ鎖を、ＲＩＳＣ複合体に組み込むことができる。しかし、その５’末端のより弱い塩基対を有する鎖は組み込みを好む。したがって、任意のｓｉＲＮＡは、意図する標的ＲＮＡおよび非標的ＲＮＡの両方を切断することができる活性化ＲＩＳＣ複合体の混合物の産生を導くであろう。生物学的応用では、大多数、好ましくは全ての活性化ＲＩＳＣ複合体が所望の標的と相補的なｓｉＲＮＡ鎖を含むことが望ましい。本教示は、望ましくないｓｉＲＮＡ鎖によるｍＲＮＡ切断を減少するだけでなく、内因性遺伝子の干渉のためのオフターゲット効果も減少させるための方法、組成物、およびキットを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
予想外に、ストランドバイアスの増加または維持は、内因性ＲＮＡ干渉の効力の維持に必要である一方で、細胞生物学アッセイにおけるオフターゲット効果の減少には十分でない。効力を維持しながらオフターゲット効果を減少または最小にする能力を、本明細書中で、標的ｍＲＮＡが外因的に得られ、且つ標的ｍＲＮＡが内因性ｍＲＮＡである条件下、異なる修飾ヌクレオチド型がｓｉＲＮＡに導入される条件下、および異なる修飾フォーマットがｓｉＲＮＡに導入される条件下で研究した。さらに、多数の標的ＲＮＡのそれぞれのための複数のｓｉＲＮＡ修飾フォーマットを研究した。したがって、表現型および細胞生物学レベルで観察した場合にオフターゲット事象を減少または最小にし、且つ極めて強力なｓｉＲＮＡの効力を維持する修飾ヌクレオチドおよび修飾フォーマットは、任意のｓｉＲＮＡ配列に適用可能であり、ｓｉＲＮＡの塩基配列に依存しない。すなわち、本明細書中に提供した修飾フォーマットは、配列非依存性修飾である。
【０００４】
いくつかの実施形態では、化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、１５〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは、７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数であり、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つを含み、
ここで、各ｍは独立してビシクロヌクレオチドまたはトリシクロヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【０００５】
いくつかの実施形態では、上記のパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドおよび１５〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、化学合成した低分子干渉ＲＮＡを提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、１７〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（４）、フォーマット（５）、およびフォーマット（６）の１つを含むパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドならびに１７〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含む低分子干渉ＲＮＡであって、ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的であり、
（４）５’ｍｐ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐが０である場合、ｘは１２であり、ｐが１である場合、ｘは１１であり、ｐが２である場合、ｘは１０であり、ｐが３である場合、ｘは９であり、ｐが４である場合、ｘは８であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋２）を示す整数である）、
（５）５’ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋３）を示す整数である）、（６）５’ｍｐ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは３であり、ｙは９であり、ｚは１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋２）を示す整数である）、
ここで、
各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、且つオーバーハンギングヌクレオチドであり、ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、ｍが２’−修飾ヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、２’−修飾ヌクレオチド以外のヌクレオチドである、低分子干渉ＲＮＡを提供する。
【０００７】
低分子干渉ＲＮＡの１つの実施形態では、パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（４）を有し、ｐは２であり、ｘは１０であり、ｒは２であり、各ｎはオーバーハンギングヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、修飾ヌクレオチドであり、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、２つの３’−オーバーハング修飾ヌクレオチドを含み、各修飾ヌクレオチドは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドである。１つの実施形態では、パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端から３番目の位置および３’末端から４番目の位置の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである。３’末端から３番目の位置は、最後の位置から３番目である（すなわち、例えば、図１ＨのフォーマットＤＨ４７に関して、末端から２番目の前の位置）。３’末端から４番目の位置は、最後の位置から４番目である（すなわち、図１ＨのフォーマットＤＨ２９に関して、末端から３番目の前の位置）。かかるｓｉＲＮＡは、例えば、血清または血漿の存在下などでのヌクレアーゼに対して特に安定である。
【０００８】
低分子干渉ＲＮＡのいくつかの実施形態では、長さが１７ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位および３位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、長さが１８ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、および４位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、長さが１９ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、および５位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、長さが２０ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、および６位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、長さが２１〜３０ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、６位、および７位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである。図１ＫのフォーマットＤＨ１およびフォーマットＤＨ３９〜ＤＨ４３は、２１ヌクレオチド長であり、修飾ヌクレオチドとしてガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、６位、および７位の少なくとも１つを有するｓｉＲＮＡ修飾フォーマットの例である。いくつかの実施形態では、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、６位、および７位（上記引用の長さに依存する）のたった１つが修飾ヌクレオチドである。かかるｓｉＲＮＡはまた、例えば、血清の存在下などのヌクレアーゼに対して特に安定である。
【０００９】
標的遺伝子を含む細胞を上記の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ（式中、各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチドまたはトリシクロヌクレオチドである）と効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量で接触させる工程を含む、ＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の阻害のためにオフターゲット事象を減少させる、または、最小にする方法を提供する。句「効力を維持しながら」は、本明細書中で、効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量のｓｉＲＮＡの使用という文脈で使用される。この文脈では、この句は、オフターゲット事象を減少させながらｓｉＲＮＡのノックダウン活性の減少に耐性を示すことをいい、ノックダウン活性の減少が遺伝子関連表現型を誘発するかどうかによって決定される。一般に、「効力を維持しながら」は、通常のノックダウンレベルの８０％へのノックダウンの減少が許容されることを意味する。しかし、特定の遺伝子のノックダウンの減少の許容は、通常のノックダウンの５０％〜９５％の範囲であり得る。
【００１０】
さらなる実施形態では、標的遺伝子を含む細胞を化学合成した低分子干渉ＲＮＡとガイド鎖の効力を維持しながらパッセンジャー鎖による切断を減少または最小にするのに十分な量で接触させる工程を含み、低分子干渉ＲＮＡのパッセンジャー鎖が、配列非依存性修飾フォーマット（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、または（６）（式中、各ｍは、独立して、２’−修飾ヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、各Ｎは、独立して、非修飾ヌクレオチドである）の１つを含む、ＲＮＡ干渉による外因的に得られた標的遺伝子の発現阻害におけるパッセンジャー鎖による切断を減少または最小にする方法を提供する。切断の減少を、非修飾ｓｉＲＮＡの切断の減少と比較する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、接触は、細胞を含む細胞培養物または細胞を含む組織の化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｉｎ  ｖｉｖｏ接触である。さらなる実施形態では、接触は、細胞を含む組織、細胞を含む体液、または細胞を含む器官の化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｅｘ  ｖｉｖｏ接触である。さらに他の実施形態では、接触は、細胞を含む器官または動物の化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｉｎ  ｖｉｖｏ接触である。いくつかの実施形態では、接触は、必要とする被験体にヌクレアーゼ安定性を付与する修飾フォーマットを有する低分子干渉ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ血管内投与である。実施例８のデータによって証明されるように、投与後の同一の時点での修飾ヌクレオチドを欠くコントロール低分子干渉ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの存在量と比較した場合、安定化低分子干渉ＲＮＡの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏでの存在量はより多い。
【００１２】
本明細書中の実施形態によって得られ、外因的に得られた遺伝子に対して実施されたＲＮＡ干渉アッセイにより、種々の修飾フォーマットでの多数の修飾ヌクレオチド型によって効力を維持しながら増強されたストランドバイアスが得られることが証明されている。図４Ａおよび図４Ｂのビシクロヌクレオチドを使用したフォーマットＨ、Ｋ、およびＯのデータならびに図６Ａおよび図６Ｂの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを使用したフォーマットＨ、Ｋ、およびＯのデータを参照のこと。
【００１３】
予想外に、これらの修飾ヌクレオチドおよび修飾フォーマットは、内因性遺伝子のＲＮＡ干渉におけるオフターゲット事象を減少または最小にする能力が異なっていた。導入されたｓｉＲＮＡによるオフターゲット効果の基準である異なって発現される遺伝子の数を決定するためにマイクロアレイ分析を行った。異なって発現される遺伝子を、ｐ値が＜０．００１のＲＮＡ干渉による変化が少なくとも２倍の遺伝子と定義した。ＬＮＡ（登録商標）ヌクレオチド修飾フォーマットＨ  ｓｉＲＮＡは、同一のｓｉＲＮＡ配列を有する非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡによって異なって発現される遺伝子の数と比較した場合、異なって発現される遺伝子が３８％〜６８％少なかった。対照的に、２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨ  ｓｉＲＮＡは、非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡと比較した場合、異なって発現される遺伝子が０〜２２％少なかった。したがって、ＬＮＡ（登録商標）ヌクレオチド修飾ｓｉＲＮＡは、大域的遺伝子プロファイリング分析によって判断したところ、減少したオフターゲット効果で２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡよりも有効である。図９Ａ〜図９Ｃを参照のこと。
【００１４】
これらの予想外の所見を、実施例６に例示の細胞生物学研究を使用して確認した。一連の結果を内因性遺伝子のｓｉＲＮＡ干渉について分析した場合、図１１Ｃに示す種々の修飾フォーマットの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが非修飾フォーマットと比較して統計的に有意な程度に「オフターゲット」表現型を除去しないことが明らかであった。これらの結果は図１０Ｅの結果と対照的である。これにより、非修飾フォーマットＡと比較してより低いアポトーシスシグナルによって明らかなように、フォーマットＨを有するｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を除去する統計的に有意な能力が証明される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、以下にさらに記載するように、化学合成した低分子干渉ＲＮＡは、細胞ターゲティングリガンドとさらに会合する。
【００１６】
パッセンジャーオリゴヌクレオチド、ガイドオリゴヌクレオチド、または化学合成した低分子干渉ＲＮＡ、および生物学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、本明細書中で実施形態として意図される。さらに、例えば、パッセンジャーオリゴヌクレオチド、ガイドオリゴヌクレオチド、または化学合成した低分子干渉ＲＮＡ、およびトランスフェクション剤を含むキットは、本明細書中で実施形態と指定とされる。実施形態の修飾ヌクレオチドと共に修飾フォーマットを有する低分子干渉ＲＮＡにより、有効性が改善されてｓｉＲＮＡをデザインおよび試験する時間が節約され、特異性が改善されて間違った結果に費やす時間および費用が節約され、効力が改善されて所望の結果を達成するために使用される材料がより少なくなる。有効性および特異性の改善により、各遺伝子およびライブラリーのスクリーニング研究のための遺伝子あたりのｓｉＲＮＡの使用もより少なくなる。
【００１７】
別の実施形態では、ＲＮＡ干渉に及ぼすオフターゲット効果を減少させる方法は、標的転写ＲＮＡに相同な領域を含むパッセンジャーセンス鎖を有し、センス鎖に相補的なガイドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを得る工程であって、ｓｉＲＮＡは修飾フォーマットＨ、Ｑ、Ｖ−２、Ｙ、Ｙ＋１、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、またはＪＢ５を有する、工程、およびｓｉＲＮＡを細胞と接触させる工程を含む。オフターゲット効果の減少を、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡと同一の配列を有する非修飾ｓｉＲＮＡに起因するオフターゲット効果と比較して測定する。
【００１８】
さらなる実施形態では、ヌクレアーゼが豊富な環境におけるｓｉＲＮＡの安定性を増加させる方法は、標的転写ＲＮＡに相同な領域を含むパッセンジャーセンス鎖を有し、センス鎖に相補的なガイドアンチセンス鎖を有し、３’−オーバーハンギングヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡを得る工程であって、ｓｉＲＮＡは修飾フォーマットＤＨ４７、ＤＨ２９、ＤＨ１、ＤＨ３９、ＤＨ４０、ＤＨ４１、ＤＨ４２、またはＤＨ４３を有する、工程、およびｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ豊富な環境と接触させる工程を含む。ｓｉＲＮＡの安定性の増加を、同一修飾ヌクレオチド型を有し、同一配列を有するフォーマットＦを有するｓｉＲＮＡの安定性と比較して測定する。
【００１９】
さらなる実施形態は、標的遺伝子の発現阻害のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの適用におけるＲＮＡ干渉で使用するための本明細書中に提供した修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡを含む。標的遺伝子の発現が疾患と関連することが知られている場合、本明細書中のｓｉＲＮＡは、疾患のスクリーニング、診断、または治療に有用である。
【００２０】
本明細書中に記載のｓｉＲＮＡパフォーマンス研究の予想外の態様は、レポーターベースの鎖数アッセイが細胞表現型レベルでの修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡのパフォーマンスを予測できないことである。下記のマイクロアレイ大域遺伝子プロファイリングまたは細胞ベースのアッセイを使用して、表現型レベルでのパフォーマンスの差異が認められた。
【００２１】
本教示のこれらおよび他の特徴は、本明細書中の説明から明らかとなるであろう。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは、７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチドまたはトリシクロヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、
ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド。
（項目２）
項目１に記載のパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドおよび１５〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目３）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは１０であり、ｒは２である）を含む、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目４）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは９または１１であり、ｒは２である）を含む、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目５）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（２）（ｐは０であり、ｙは９であり、ｒは２である）を含む、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目６）
少なくとも１つのｍが、構造（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）：
【化２】
2014097073.tif 000003
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目７）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、項目６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目８）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは１であり、ｘは９または１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、項目６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目９）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（３）（式中、ｘは９または１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、項目６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目１０）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドおよびガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドがヌクレオチドループまたはリンカーループを介して共有結合して低分子ヘアピンオリゴヌクレオチドを形成する、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目１１）
ｓｉＲＮＡの各３’末端が、独立して、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドオーバーハングを有する、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目１２）
少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合以外である、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目１３）
前記化学合成した低分子干渉ＲＮＡが細胞ターゲティングリガンドとさらに会合する、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目１４）
５’末端がリン酸置換基、Ｃ１〜１２−アルキル置換基、Ｃ１〜１２−アルキルアミン置換基、Ｃ１〜１２−アルケニル置換基、Ｃ１〜１２−アルキニル置換基、Ｃ１〜１２−シクロアルキル置換基、Ｃ１〜１２−アラルキル置換基、アリール置換基、アシル置換基、またはシリル置換基でさらに誘導体化される、項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
（項目１５）
項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡおよび生物学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
（項目１６）
項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡおよびトランスフェクション剤を含むキット。
（項目１７）
標的遺伝子を含む細胞を項目２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡと効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量で接触させる工程を含む、ＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の阻害のためにオフターゲット事象を最小にする方法。
（項目１８）
前記遺伝子が内因性遺伝子である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記接触が、細胞を含む細胞培養物または細胞を含む組織と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記接触が、細胞を含む組織、細胞を含む体液、または細胞を含む器官と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｅｘ  ｖｉｖｏ接触である、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記接触が、細胞を含む器官または動物と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｉｎ  ｖｉｖｏ接触である、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
標的遺伝子を含む細胞を化学合成した低分子干渉ＲＮＡとガイド鎖の効力を維持しながらパッセンジャー鎖による切断を最小にするのに十分な量で接触させる工程を含み、前記低分子干渉ＲＮＡが、
パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｐ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数であり、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数であり、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、２’−修飾ヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、
各Ｎは、独立して、非修飾ヌクレオチドである、パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド、および１５〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドであって、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含む、ＲＮＡ干渉による外因的に得られた標的遺伝子の発現阻害におけるパッセンジャー鎖による切断を最小にする方法。
（項目２３）
前記２’−修飾ヌクレオチドの２’修飾が、Ｈ、ブロモ、クロロ、ヨード、フルオロ、アラビノース高次構造中のフルオロ（ＦＡＮＡ）、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮ、アジド、またはＯＲ、Ｒ、ＳＲ、ＮＨＲ、もしくはＮ（Ｒ）２（式中、Ｒはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、オキシアルキル、アルコキシアルキル、またはアルキルアミンであり、アルキル部分はＣ１〜Ｃ６である）を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１７〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（４）、フォーマット（５）、およびフォーマット（６）：
（４）５’ｍｐ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐが０である場合、ｘは１２であり、ｐが１である場合、ｘは１１であり、ｐが２である場合、ｘは１０であり、ｐが３である場合、ｘは９であり、ｐが４である場合、ｘは８であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋２）を示す整数である）
（５）５’ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋３）を示す整数である）
（６）５’ｍｐ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは３であり、ｙは９であり、ｚは１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋２）を示す整数である）の１つを含むパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド、および
１７〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドであって、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、且つオーバーハンギングヌクレオチドであり、
ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍが２’−修飾ヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、２’−修飾ヌクレオチド以外のヌクレオチドである、低分子干渉ＲＮＡ。
（項目２５）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（４）を有し、ｐは２であり、ｘは１０であり、ｒは２であり、各ｎはオーバーハンギングヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、修飾ヌクレオチドであり、
ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは２つの３’−オーバーハング修飾ヌクレオチドを含み、
各修飾ヌクレオチドは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドである、項目２４に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
（項目２６）
前記パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端から３番目の位置および３’末端から４番目の位置の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである、項目２５に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
（項目２７）
前記長さが１７ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位および３位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが１８ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、および４位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが１９ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、および５位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが２０ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、および６位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが２１〜３０ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、６位、および７位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである、項目２５に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
（項目２８）
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのｍが、以下の構造（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）：
【化３】
2014097073.tif 000004
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、項目２４、２５、２６、または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
（項目２９）
前記各修飾ヌクレオチドが、構造（ａ）：
【化４】
2014097073.tif 000005
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、項目２４、２５、２６、または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
（項目３０）
項目２４から２９のいずれか１項に記載の低分子干渉ＲＮＡおよび生物学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
（項目３１）
被験体を項目２５から３０のいずれか１項に記載の低分子干渉ＲＮＡと効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量で接触させる工程を含む、必要とされる被験体におけるＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の阻害のためのオフターゲット事象を減少させる方法。
（項目３２）
前記接触が血管内注射を介した投与である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目２６または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡを得る工程であって、各修飾ヌクレオチドが、構造（ａ）：
【化５】
2014097073.tif 000006
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、低分子干渉ＲＮＡを得る工程、および
前記低分子干渉ＲＮＡを必要とする被験体にｉｎ  ｖｉｖｏで投与する工程であって、投与後、修飾ヌクレオチドを欠く低分子干渉ＲＮＡの量と比較した場合、より大量の前記低分子干渉ＲＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで存在する、投与する工程、
を含む、方法。
【００２２】
当業者は、下記の図面が例示のみを目的とすると理解するであろう。図面は、本教示の範囲を制限することを決して意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｅ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｆ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｇ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｈ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｉ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｊ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図１Ｋ】図１Ａ〜図１Ｋは、ｓｉＲＮＡ研究のための修飾フォーマットを示す。ヌクレオチド上の数字は、フォーマットの５’末端と比較したｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。ｍ＝修飾ヌクレオチド、Ｎ＝ヌクレオチド、またはｍの修飾以外の修飾を有する修飾ヌクレオチド、ｎ＝ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、Ｐ＝リン酸基。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、種々の実施例で使用される発現レポーターベクターを示す略図を示す。図２Ａは、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ発現レポーターベクター（Ａｍｂｉｏｎ／  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）マップを示す。種々の目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード領域を、ルシフェラーゼ遺伝子の３’末端に存在するマルチクローニング部位（ＭＣＳ）内のＨｉｎｄＩＩＩ（ヌクレオチド４６３位）およびＳｐｅＩ（ヌクレオチド５２５位）制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入した。図２Ｂは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含むｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）β−ｇａｌコントロールベクター（Ａｍｂｉｏｎ／  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のマップを示す。コントロールベクターを、ＧＯＩを保有し、トランスフェクション正規化コントロールとして使用されるｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ  発現レポーターベクターと同時トランスフェクションした。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ発現ベクター中のクローン化ＧＯＩのｍＲＮＡとルシフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡとの間の方向の関係を示す略図を示す。図３Ａは、順方向（すなわち、ＧＯＩ  ｍＲＮＡの５’末端がｆＬｕｃ  ｍＲＮＡの３’末端の近位にある）を示す。図３Ｂは、逆方向（すなわち、ＧＯＩ  ｍＲＮＡの５’末端がｆＬｕｃ  ｍＲＮＡの３’末端の遠位にある）を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｅは、示した非修飾フォーマットＡおよび修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡについて実施例２および３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図４Ａは、示した修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡについてＲＮＡｉ研究を行った後の正規化したレポータータンパク質の存在量を示す。暗色のバーはガイド鎖によるノックダウン活性を示し、明色のバーはパッセンジャー鎖によるノックダウン活性を示す。修飾ｓｉＲＮＡ鎖の鎖数の結果の分布を示すために、図４Ｂ〜図４Ｅのデータを、「箱ひげ」表示ともいわれるボックスプロットフォーマットで示す。「箱ひげ」表示の暗色の横線はデータセットの中央値を示し、ボックスはデータセットの下位四分位点および上位四分位点でのデータの分布を示し、点線（ひげ）はデータセットの最小値および最大値を示し、長円形は各修飾フォーマットについてのデータセットにおける外れ値を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｅは、示した非修飾フォーマットＡおよび修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡについて実施例２および３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図４Ｂは、以下の式によって測定されたｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のノックダウン活性を示す：パッセンジャー鎖活性Ｐ＝（試験ｓｉＲＮＡで処理した逆方向クローン由来の残存するｆＬＵＣ活性／βｇａｌ活性）／（ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡで処理した逆方向クローン由来の残存するｆＬＵＣ活性／βｇａｌ活性）。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．１４３４；フォーマットＦ、０．１０１１；フォーマットＧ、０．０００２０５２；フォーマットＨ、０．０００１７５５；フォーマットＪ、０．０００２０５２；フォーマットＫ、０．００６５１６；フォーマットＭ、０．００２２４６；フォーマットＯ、０．０００９６２６。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｅは、示した非修飾フォーマットＡおよび修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡについて実施例２および３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図４Ｃは、以下の式によって測定されたガイド鎖のノックダウン活性を示す：ガイド鎖活性Ｇ＝（試験ｓｉＲＮＡで処理した順方向クローン由来の残存するｆＬＵＣ活性／βｇａｌ活性）／（ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡで処理した順方向クローン由来の残存するｆＬＵＣ活性／βｇａｌ活性）。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．０００１２７１；フォーマットＦ、０．８７７４；フォーマットＧ、０．０００６４９８；フォーマットＨ、０．８１１５；フォーマットＪ、０．０００００６５５７；フォーマットＫ、０．０１０５１；フォーマットＭ、０．７８９８；フォーマットＯ、０．８７７４。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｅは、示した非修飾フォーマットＡおよび修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡについて実施例２および３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図４Ｄは、図４Ｂおよび図４ＣのｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間のｆＬＵＣ活性の相違を示す。活性の相違を、正規化した順方向ｆＬＵＣ活性を正規化した逆方向ｆＬＵＣ活性から引くことによって計算した（すなわち、相違＝Ｐ−Ｇ）。したがって、パッセンジャー鎖（より低いノックダウン（すなわち、より高いルシフェラーゼ活性））の活性がガイド鎖（より高いノックダウン（すなわち、より低いルシフェラーゼ活性））より低い場合、活性値の相違は、０より高いと予想される。０未満の値は、パッセンジャー鎖がガイド鎖より活性が高いことを示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．００７９２；フォーマットＦ、０．０６０４３；フォーマットＧ、０．９６６４；フォーマットＨ、０．００１４；フォーマットＪ、０．００８７１５；フォーマットＫ、０．６６３４；フォーマットＭ、０．００２５１６；フォーマットＯ、０．０００６４９８。
【図４Ｅ】図４Ａ〜図４Ｅは、示した非修飾フォーマットＡおよび修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡについて実施例２および３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図４Ｅは、（ｌｏｇ２（Ｐ）−ｌｏｇ２（Ｇ））として計算した活性の変化倍率を示す。これにより、図４ＤのｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に及ぼすフォーマットの影響と比較したガイド鎖に及ぼす修飾フォーマットの影響が測定される。したがって、活性の変化倍率がより高いほど、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の偏りが高くなる。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．０００２７８１；フォーマットＦ、０．０８９３７；フォーマットＧ、０．２０７６；フォーマットＨ、０．０１９４４；フォーマットＪ、０．０００３２２３；フォーマットＫ、０．８５５３；フォーマットＭ、０．００２５１６；フォーマットＯ、０．００３５０４。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｃは、図４Ａ〜図４Ｅの研究と比較して修飾フォーマットが鎖スイッチングされた研究について実施例３に記載の結果を示す。すなわち、修飾Ｆについては、例えば、パッセンジャー（センス）鎖の１、２０、２１修飾をガイド（アンチセンス）鎖に導入し、ガイド（アンチセンス）鎖の２０、２１修飾をパッセンジャー（センス）鎖に導入した。図５Ａは、鎖をスイッチングした修飾を有する１２種の異なるｓｉＲＮＡについてのＲＮＡｉ研究の実施後の正規化したレポータータンパク質の存在量を示す。暗色のバーはガイド鎖によるノックダウン活性を示し、明色のバーはパッセンジャー鎖によるノックダウン活性を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｃは、図４Ａ〜図４Ｅの研究と比較して修飾フォーマットが鎖スイッチングされた研究について実施例３に記載の結果を示す。図５Ｂは、ボックスプロットフォーマットでの図５ＡのｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の相違を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果は、全フォーマットについて０．０３１２５で同一である。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、図４Ａ〜図４Ｅの研究と比較して修飾フォーマットが鎖スイッチングされた研究について実施例３に記載の結果を示す。図５Ｃは、図５ＢのｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果は、全フォーマットについて０．０３１２５で同一である。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｃは、修飾フォーマットの修飾ヌクレオチドが２’−Ｏメチル化された研究についての実施例３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図６Ａは、示した修飾フォーマットを有する６種の異なるｓｉＲＮＡについてＲＮＡｉ研究を行った後の正規化したレポータータンパク質の存在量を示す。暗色のバーはガイド鎖によるノックダウン活性を示し、明色のバーはパッセンジャー鎖によるノックダウン活性を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｃは、修飾フォーマットの修飾ヌクレオチドが２’−Ｏメチル化された研究についての実施例３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図６Ｂは、ボックスプロットフォーマットにおける図６ＡのｓｉＲＮＡ組および実施例３に記載の１８種の異なるさらなるｓｉＲＮＡ組についてのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間のｆＬＵＣ活性の相違を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ−１、０．００１９１８；フォーマットＨ、０．００００１５７４；フォーマットＨ＋１、０．００１０９１；フォーマットＶ−２、０．０００２１３１；フォーマットＫ、０．０００３６１９；フォーマットＯ、０．４０６。
【図６Ｃ】図６Ａ〜図６Ｃは、修飾フォーマットの修飾ヌクレオチドが２’−Ｏメチル化された研究についての実施例３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図６Ｃは、図６ＢのｓｉＲＮＡについてのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ−１、０．０２５１４；フォーマットＨ、０．００００１５７４；フォーマットＨ＋１、０．００７４４３；フォーマットＶ−２、０．０００１４６４；フォーマットＫ、０．０００３６１９；フォーマットＯ、０．５４４６。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、修飾フォーマットの修飾ヌクレオチドが２’，５’結合ヌクレオチドである研究についての実施例３に記載の鎖アッセイの結果を示す。図７Ａは、非修飾フォーマットＡを有するｓｉＲＮＡおよび修飾フォーマットＨ−１、Ｈ、Ｈ＋１、Ｖ−２、Ｋ、およびＯを有するｓｉＲＮＡについてのガイド鎖およびパッセンジャー鎖のノックダウン活性の相違を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ−１、０．３５９４；フォーマットＨ、０．０７４２２；フォーマットＨ＋１、０．５７０３；フォーマットＶ−２、０．４２５８；フォーマットＫ、０．２０３１；フォーマットＯ、０．０１９５３。図７Ｂは、図７ＡのｓｉＲＮＡについてのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間のノックダウン活性の変化倍率を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ−１、０．３００８；フォーマットＨ、０．０１９５３；フォーマットＨ＋１、０．２０３１；フォーマットＶ−２、０．４９６１；フォーマットＫ、０．１９２１；フォーマットＯ、０．００９０９。
【図８】図８は、８つの各内因性標的の６つのｓｉＲＮＡについてのノックダウン活性データを示す。４８の各ｓｉＲＮＡは、実施例４に記載のように組み込まれたビシクロ修飾ヌクレオチドをフォーマットする記載の修飾を有する。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．００００００００８６５７；フォーマットＦ、０．４６３１；フォーマットＧ、０．０００００９６９８；フォーマットＨ、０．５５６９；フォーマットＪ、０．００００００００１９１；フォーマットＫ、０．００００１３３６；フォーマットＭ、０．７２６９；フォーマットＯ、０．０５９３。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｃは、マイクロアレイ分析によって決定し、実施例５に記載の非修飾ｓｉＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡ、またはビシクロ修飾ｓｉＲＮＡの間の２倍異なって発現される遺伝子の交差のベン図を示す。各図について、左下の組（カラー表示の場合赤色）は非修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示し、上の組（カラー表示の場合青色）は２’−Ｏ−メチルフォーマットＨ修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示し、右下の組（カラー表示の場合緑色）はビシクロ修飾ヌクレオチド（ＬＮＡ（登録商標））フォーマットＨ修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｃは、マイクロアレイ分析によって決定し、実施例５に記載の非修飾ｓｉＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡ、またはビシクロ修飾ｓｉＲＮＡの間の２倍異なって発現される遺伝子の交差のベン図を示す。各図について、左下の組（カラー表示の場合赤色）は非修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示し、上の組（カラー表示の場合青色）は２’−Ｏ−メチルフォーマットＨ修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示し、右下の組（カラー表示の場合緑色）はビシクロ修飾ヌクレオチド（ＬＮＡ（登録商標））フォーマットＨ修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜図９Ｃは、マイクロアレイ分析によって決定し、実施例５に記載の非修飾ｓｉＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡ、またはビシクロ修飾ｓｉＲＮＡの間の２倍異なって発現される遺伝子の交差のベン図を示す。各図について、左下の組（カラー表示の場合赤色）は非修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示し、上の組（カラー表示の場合青色）は２’−Ｏ−メチルフォーマットＨ修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示し、右下の組（カラー表示の場合緑色）はビシクロ修飾ヌクレオチド（ＬＮＡ（登録商標））フォーマットＨ修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルにおける２倍以上変化した遺伝子を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼすＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１０Ａは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのサブセットのノックダウンが有糸分裂を増加させると予想され、そのサブセットが有糸分裂に影響を及ぼさないと予想され、そのサブセットが有糸分裂を減少させると予想される）についてＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯを有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．８０５；フォーマットＦ、０．５４８３；フォーマットＧ、０．３２１５；フォーマットＨ、０．００４５６１；フォーマットＪ、０．０００９５２；フォーマットＫ、０．０１９７４；フォーマットＭ、０．１００７；フォーマットＯ、０．９４３８；。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼすＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１０Ｂは、遺伝子サブセット（そのノックダウンが有糸分裂を減少させると予想される）についての図１０Ａに関するボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．３２４７；フォーマットＦ、０．４６８３；フォーマットＧ、０．１８１５；フォーマットＨ、０．０３４２３；フォーマットＪ、０．０１３８７；フォーマットＫ、０．０９８７４；フォーマットＭ、０．５５０９；フォーマットＯ、０．６７０５。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼすＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１０Ｃは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのサブセットのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想され、そのサブセットがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についてＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯを有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．２６４１；フォーマットＦ、０．５３６６；フォーマットＧ、０．０００１８８８；フォーマットＨ、０．００００１０２；フォーマットＪ、０．０００００２６３；フォーマットＫ、０．００００００５５３；フォーマットＭ、０．５３６６；フォーマットＯ、０．０５７５３。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼすＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１０Ｄは、遺伝子サブセット（実施例６に記載のように、そのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想される）についての図１０Ｃに関するボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．２１８８；フォーマットＦ、０．４３７５；フォーマットＧ、０．３１２５；フォーマットＨ、０．２１８８；フォーマットＪ、０．０３１２５；フォーマットＫ、０．０３１２５；フォーマットＭ、１；フォーマットＯ、０．２１８８。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼすＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１０Ｅは、遺伝子サブセット（実施例６に記載のように、そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）について図１０Ｃに関するボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの中央値が増加し、且つその分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＥ、０．５３０３；フォーマットＦ、０．８０４；フォーマットＧ、０．００００５４８８；フォーマットＨ、０．００００１３４７；フォーマットＪ、０．０００１２５３；フォーマットＫ、０．００００３０２３；フォーマットＭ、０．４４１；フォーマットＯ、０．１５５１。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｆは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす２’−Ｏ−メチル化修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１１Ａは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのサブセットのノックダウンが有糸分裂を増加させると予想され、そのサブセットが有糸分裂に影響を及ぼさないと予想される）についての非修飾フォーマットＡを有するｓｉＲＮＡならびに２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨおよびＫを有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．３５２９；フォーマットＫ、０．３２８９。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｆは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす２’−Ｏ−メチル化修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１１Ｂは、遺伝子サブセット（そのノックダウンが有糸分裂を減少させると予想される）についての図１１Ａに関するボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．３１２５；フォーマットＫ、０．５４６９。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜図１１Ｆは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす２’−Ｏ−メチル化修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１１Ｃは、遺伝子サブセット（そのノックダウンが有糸分裂に影響を及ぼさないと予想される）についての図１１Ａに関するボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明された有糸分裂オフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．９１０２；フォーマットＫ、０．４９６１。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜図１１Ｆは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす２’−Ｏ−メチル化修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１１Ｄは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのサブセットのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想され、そのサブセットがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）について２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨおよびＫを有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ  、０．３５２９；フォーマットＫ、０．３５２９。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜図１１Ｆは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす２’−Ｏ−メチル化修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１１Ｅは、遺伝子サブセット（実施例６に記載のようにそのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想される）についての図１１Ｄに関するボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．３１２５；フォーマットＫ、０．５４６９。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜図１１Ｆは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす２’−Ｏ−メチル化修飾フォーマットの影響についてのデータを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂またはアポトーシスの定量を値１．０に正規化するスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。実施例６を参照のこと。図１１Ｆは、遺伝子サブセット（実施例６に記載のように、そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての図１１Ｄに関するボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．９１０２；フォーマットＫ、０．７３４４。
【図１２Ａ−１】図１２Ａ−１は、Ｐ−Ｇ（ＰおよびＧは、非修飾フォーマットＡならびに試験フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｖ、Ｖ−１、Ｖ−２、Ｋ、およびＱ（修飾はＬＮＡ（登録商標）残基である）について図４Ｂおよび図４Ｃに関して定義した）として計算したパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の相違を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．０４１９９；フォーマットＨ＋１、０．１２３；フォーマットＨ−１、０．１７４８；フォーマットＨ−２、０．２４０２；フォーマットＶ、０．０６７３８；フォーマットＶ−１、０．０５３７１；フォーマットＶ−２、０．５７７１；フォーマットＫ、０．４６４８；フォーマットＱ、０．１０１６。図１２Ａ−２は、図１２Ａ−１のｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．３６５２；フォーマットＨ＋１、０．２７８３；フォーマットＨ−１、０．２４０２；フォーマットＨ−２、０．４１３１；フォーマットＶ、０．２０６１；フォーマットＶ−１、０．１０１６；フォーマットＶ−２、０．７００２；フォーマットＫ、０．６３７７；フォーマットＱ、０．７００２。
【図１２Ａ−２】図１２Ａ−１は、Ｐ−Ｇ（ＰおよびＧは、非修飾フォーマットＡならびに試験フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｖ、Ｖ−１、Ｖ−２、Ｋ、およびＱ（修飾はＬＮＡ（登録商標）残基である）について図４Ｂおよび図４Ｃに関して定義した）として計算したパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の相違を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．０４１９９；フォーマットＨ＋１、０．１２３；フォーマットＨ−１、０．１７４８；フォーマットＨ−２、０．２４０２；フォーマットＶ、０．０６７３８；フォーマットＶ−１、０．０５３７１；フォーマットＶ−２、０．５７７１；フォーマットＫ、０．４６４８；フォーマットＱ、０．１０１６。図１２Ａ−２は、図１２Ａ−１のｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．３６５２；フォーマットＨ＋１、０．２７８３；フォーマットＨ−１、０．２４０２；フォーマットＨ−２、０．４１３１；フォーマットＶ、０．２０６１；フォーマットＶ−１、０．１０１６；フォーマットＶ−２、０．７００２；フォーマットＫ、０．６３７７；フォーマットＱ、０．７００２。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、実施例６に記載の非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｈ−２、Ｈ−１、Ｈ＋１、Ｑ、Ｋ、Ｖ、Ｖ−１、およびＶ−２を有するｓｉＲＮＡの内因性標的についてのノックダウン活性データを示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．０２９５９８１６０；フォーマットＨ−２、０．００４２９６８４９；フォーマットＨ−１、０．０００８３３１６５；フォーマットＨ＋１、０．０５２７７９９００；フォーマットＱ、０．０１１４５４１７０；フォーマットＫ、０．７４５８５２０００；フォーマットＶ、０．００５６６０８３４；フォーマットＶ−１、０．９９８１００８００；フォーマットＶ−２、０．３７４６６１１００。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのノックダウンが有糸分裂を増加させると予想される）についての非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ｖ−１、およびＶ−２を有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂の定量を値１．０に正規化した、スクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．０１５６３；フォーマットＨ＋１、０．１９５３；フォーマットＨ−１、０．０７８１３；フォーマットＨ−２、０．０７８１３；フォーマットＶ、０．０５４６９；フォーマットＶ−１、０．１９５３；フォーマットＶ−２、１；フォーマットＫ、０．１９５３；フォーマットＱ、０．１９５３。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、遺伝子標的組（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ｖ−１、およびＶ−２を有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、アポトーシスの定量を値１．０に正規化した、スクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの中央値が増加し、且つその分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。非修飾フォーマットＡコントロールを各修飾フォーマットと比較したコントロールの％としての正規化したアポトーシスフラグメントについてのウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＨ、０．０４１９９；フォーマットＨ＋１、０．２０６１；フォーマットＨ−１、０．２７８３；フォーマットＨ−２、０．６３７７；フォーマットＶ、０．０５３７１；フォーマットＶ−１、０．４６４８；フォーマットＶ−２、０．００６８３６；フォーマットＫ、０．０１８５５；フォーマットＱ、０．０２４。
【図１３Ａ−１】図１３Ａ−１は、Ｐ−Ｇ（ＰおよびＧを、非修飾フォーマットＡならびに修飾フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｖ−２、Ｋ、およびＯ（修飾は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである）を有するｓｉＲＮＡについて図４Ｂおよび図４Ｃに関して定義した）として計算したパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の相違を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．００００１５７４；フォーマットＨ＋１、０．００１０９１；フォーマットＨ−１、０．００１９１８；フォーマットＶ−２、０．０００２１３１；フォーマットＫ、０．０００３６１９；フォーマットＯ、０．４０６。図１３Ａ−２は、図１３Ａ−１のｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．００００１５７４；フォーマットＨ＋１、０．００７４４３；フォーマットＨ−１、０．０２５１４；フォーマットＶ−２、０．０００１４６４；フォーマットＫ、０．０００３６１９；フォーマットＯ、０．５４４６。
【図１３Ａ−２】図１３Ａ−１は、Ｐ−Ｇ（ＰおよびＧを、非修飾フォーマットＡならびに修飾フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｖ−２、Ｋ、およびＯ（修飾は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである）を有するｓｉＲＮＡについて図４Ｂおよび図４Ｃに関して定義した）として計算したパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の相違を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．００００１５７４；フォーマットＨ＋１、０．００１０９１；フォーマットＨ−１、０．００１９１８；フォーマットＶ−２、０．０００２１３１；フォーマットＫ、０．０００３６１９；フォーマットＯ、０．４０６。図１３Ａ−２は、図１３Ａ−１のｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率を示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．００００１５７４；フォーマットＨ＋１、０．００７４４３；フォーマットＨ−１、０．０２５１４；フォーマットＶ−２、０．０００１４６４；フォーマットＫ、０．０００３６１９；フォーマットＯ、０．５４４６。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、非修飾フォーマットＡならびに修飾フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｋ、Ｖ−２、およびＯ（修飾は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである）を有するｓｉＲＮＡの内因性標的についてのノックダウン活性データを示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、３．４７Ｅ−０６；フォーマットＨ＋１、０．００１９５７５１７；フォーマットＨ−１、８．７９Ｅ−０９；フォーマットＫ、０．００５４４６０１３；フォーマットＶ−２、１．９５Ｅ−０９；およびフォーマットＯ、０．９９７２３９２。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのノックダウンが有糸分裂を増加させると予想される）についての非修飾フォーマットＡならびに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する修飾フォーマットＨ、Ｈ−１、Ｋ、およびＶを有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．１９５３；フォーマットＨ−１、０．６４０６；フォーマットＶ、０．１９５３；フォーマットＫ、０．６４０６。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての非修飾フォーマットＡならびに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する修飾フォーマットＨ、Ｈ−１、Ｖ、およびＫを有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。非修飾フォーマットＡを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．９１０２；フォーマットＨ−１、０．２５；フォーマットＶ、０．６５２３；フォーマットＫ、０．７３４４。
【図１４】図１４Ａは、非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１を有するｓｉＲＮＡの内因性標的についてのｍＲＮＡノックダウン活性のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＨ、０．００５３０２；フォーマットＭ、０．０２４７５；フォーマットＷ、１；フォーマットＷ＋１、０．８４２３；フォーマットＷ−１、０．５０９６；フォーマットＹ、０．９３２；フォーマットＹ＋１、０．８８７；フォーマットＹ−１、０．５８９１。図１４Ｂは、非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５を有するｓｉＲＮＡの内因性標的についてのｍＲＮＡノックダウン活性のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＨ、０．００５３０２；フォーマットＭ、０．０２４７５；フォーマットＪＢ１、０．００９６１３；フォーマットＪＢ２、０．７２５９；フォーマットＪＢ３、０．４２１３；フォーマットＪＢ４、０．０４９０４；フォーマットＪＢ５、０．９７２。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１を有するｓｉＲＮＡの影響についてのデータを示す。実施例６を参照のこと。図１５Ａは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのノックダウンが有糸分裂を減少させると予想される）についての実施例６に記載の正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、有糸分裂の定量を値１．０に正規化したスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．４９６１；フォーマットＭ、１；フォーマットＷ、０．０１９５３；フォーマットＷ＋１、０．５７０３；フォーマットＷ−１、０．０７４２２；フォーマットＹ、０．０３９０６；フォーマットＹ＋１、０．４９６１；フォーマットＹ−１、０．０９７６６。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１を有するｓｉＲＮＡの影響についてのデータを示す。実施例６を参照のこと。図１５Ｂは、遺伝子標的組（そのノックダウンが有糸分裂に影響を及ぼさないと予想される）についての図１５Ａに関するボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明された有糸分裂オフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較して中央値約０．７を有する非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。非修飾フォーマットＡコントロールを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＨ、０．５；フォーマットＭ、０．７５；フォーマットＷ、０．２５；フォーマットＷ＋１、０．２５；フォーマットＷ−１、０．２５；フォーマットＹ、０．２５；フォーマットＹ＋１、０．２５；フォーマットＹ−１、１。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１を有するｓｉＲＮＡの影響についてのデータを示す。実施例６を参照のこと。図１５Ｃは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想される）についての正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．７５；フォーマットＭ、０．２５；フォーマットＷ、０．２５；フォーマットＷ−１、１；フォーマットＷ＋１、０．２５；フォーマットＹ、０．２５；フォーマットＹ−１、０．２５；フォーマットＹ＋１、０．２５。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１を有するｓｉＲＮＡの影響についてのデータを示す。実施例６を参照のこと。図１５Ｄは、遺伝子標的のサブセット（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての図１５Ｃに関するボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの中央値が３．５より大きい値であり、且つその分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．０１２２１；フォーマットＭ、０．８５０１；フォーマットＷ、０．０７７１５；フォーマットＷ＋１、０．０６３９６；フォーマットＷ−１、０．１７６３；フォーマットＹ、０．０３４１８；フォーマットＹ＋１、０．０２１；フォーマットＹ−１、０．２０３６。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜図１６Ｄは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５を有するｓｉＲＮＡの影響についてのデータを示す。実施例６を参照のこと。図１６Ａは、遺伝子標的組（そのノックダウンが有糸分裂を減少させると予想される）についての正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．４９６１；フォーマットＭ、１；フォーマットＪＢ１、０．３５９４；フォーマットＪＢ２、０．６５２３；フォーマットＪＢ３、０．０２７３４；フォーマットＪＢ４、０．１６４１；フォーマットＪＢ５、０．２０３１。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜図１６Ｄは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５を有するｓｉＲＮＡの影響についてのデータを示す。実施例６を参照のこと。図１６Ｂは、遺伝子標的組（そのノックダウンが有糸分裂に影響を及ぼさないと予想される）についての図１６Ａに関するボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明された有糸分裂オフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較して中央値が約０．６５であり、それにより、有糸分裂の減少を示す非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。非修飾フォーマットＡコントロールを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．５；フォーマットＭ、０．７５；フォーマットＪＢ１、０．２５；フォーマットＪＢ２、０．２５；フォーマットＪＢ３、０．７５；フォーマットＪＢ４、０．２５；フォーマットＪＢ５、０．２５。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜図１６Ｄは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５を有するｓｉＲＮＡの影響についてのデータを示す。実施例６を参照のこと。図１６Ｃは、遺伝子標的組（実施例６に記載のように、そのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想される）についてのサイレンシングに起因する正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを示す。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．７５；フォーマットＭ、０．２５；フォーマットＪＢ１、０．２５；フォーマットＪＢ２、０．２５；フォーマットＪＢ３、０．２５；フォーマットＪＢ４、０．５；フォーマットＪＢ５、０．７５。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜図１６Ｄは、細胞生物学研究におけるオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に及ぼす非修飾フォーマットＡならびにＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５を有するｓｉＲＮＡの影響についてのデータを示す。実施例６を参照のこと。図１６Ｄは、遺伝子標的組（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての図１６Ｃに関するボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロール処置サンプルと比較してデータの中央値が３より大きい値で増加し、且つその分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。各修飾フォーマットを非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．０１２２１；フォーマットＭ、０．８５０１；フォーマットＪＢ１、０．０００９７６６；フォーマットＪＢ２、０．０００４８８３；フォーマットＪＢ３、０．０００４８８３；フォーマットＪＢ４、０．００３４１８；フォーマットＪＢ５、０．００３４１８。
【図１７】図１７は、３７℃で９０％血清中における非修飾ｓｉＲＮＡについての時間の関数としての血清安定性についてのアッセイを示す。０、５、１０、１５、３０、６０、１２０分間のインキュベーション後の８つの異なるｓｉＲＮＡについての全長ｓｉＲＮＡ二重鎖の残存率を示す。
【図１８】図１８Ａは、実施例７に記載の条件下で９０％血清で処置した場合の全長ｓｉＲＮＡの残存率のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡのｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ修飾フォーマットＦ（フォーマットは、Ｅｌｍｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：１、４３９−４４７、２００５）によってｓｉＬＮＡ５として引用され、本明細書中で安定性の参照コントロールとして使用される）、ならびに修飾フォーマットＨ、ＤＨ２１、ＤＨ２０、ＤＨ３、ＤＨ３０、ＤＨ３５、ＤＨ６、ＤＨ３４、およびＤＨ２（修飾はＬＮＡ（登録商標）残基である）を有するｓｉＲＮＡについてのデータを示す。フォーマットＦを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）の結果を以下に示す：フォーマットＨ、０．００７８１３；フォーマットＤＨ２１、０．００７８１３；フォーマットＤＨ２０、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３０、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３５、０．０１５６３；フォーマットＤＨ６、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３４、０．０２４８８；フォーマットＤＨ２、０．２０４９。図１８Ｂは、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡと比較した、実施例７に記載のフォーマットＡ、Ｆ、Ｈ、ＤＨ２１、ＤＨ２０、ＤＨ３、ＤＨ３０、ＤＨ３５、ＤＨ６、ＤＨ３４、ＤＨ２のＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡノックダウンの関数のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡコントロールを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＦ、０．０５４６９；フォーマットＨ、０．３８２８；フォーマットＤＨ２１、０．００７８１３；フォーマットＤＨ２０、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３０、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３５、０．０１５６３；フォーマットＤＨ６、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３４、０．０３９０６；フォーマットＤＨ２、０．６４０６。
【図１９】図１９Ａは、実施例７に記載の条件下で９０％血清で処置した場合の全長ｓｉＲＮＡの残存率のボックスプロットを示す。修飾フォーマットＦ、ＤＨ２、ＤＨ１９、ＤＨ４、ＤＨ３１、ＤＨ２７、およびＤＨ２５（修飾はＬＮＡ（登録商標）残基である）についてのデータを示す。フォーマットＦを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＤＨ２、０．２０４９；フォーマットＤＨ１９、０．１９５３；フォーマットＤＨ４、０．０２２４９；フォーマットＤＨ３１、０．０１５６３；フォーマットＤＨ２７、０．１０９４；フォーマットＤＨ２５、０．１０９４。図１９Ｂは、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡと比較した、実施例７に記載のフォーマットＦ、ＤＨ２、ＤＨ１９、ＤＨ４、ＤＨ３１、ＤＨ２７、およびＤＨ２５のＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡノックダウンの関数のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡコントロールを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＦ、０．０５４６９；フォーマットＤＨ２、０．６４０６；フォーマットＤＨ１９、０．０１５６３；フォーマットＤＨ４、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３１、０．０１５６３；フォーマットＤＨ２７、０．０１５６３；フォーマットＤＨ２５、０．００７８１３。
【図２０】図２０Ａは、実施例７に記載の条件下で血清で処置した場合の全長ｓｉＲＮＡの残存率のボックスプロットを示す。修飾フォーマットＦ、ＤＨ２、ＤＨ４７、ＤＨ２９、ＤＨ２８、およびＤＨ１８（修飾はＬＮＡ（登録商標）残基である）についてのデータを示す。フォーマットＦを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＤＨ２、０．２０４９；フォーマットＤＨ４７、０．０３９０６；フォーマットＤＨ２９、０．０７８１３；フォーマットＤＨ２８、０．０１４１５；フォーマットＤＨ１８、０．０６８３６。図２０Ｂは、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡと比較した、実施例７に記載のフォーマットＦ、ＤＨ２、ＤＨ４７、ＤＨ２９、ＤＨ２８、およびＤＨ１８のＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡノックダウンの関数のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡコントロールを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：Ｆ、０．０５４６９；フォーマットＤＨ２、０．６４０６；フォーマットＤＨ４７、０．３１２５；フォーマットＤＨ２９、０．０２２４９；フォーマットＤＨ２８、０．０１５６３；フォーマットＤＨ１８、０．０１５６３。
【図２１】図２１Ａは、実施例７に記載の条件下で血清で処置した場合の全長ｓｉＲＮＡの残存率のボックスプロットを示す。修飾フォーマットＦ、ＤＨ３６、ＤＨ２、ＤＨ９、ＤＨ４６、ＤＨ３３、およびＤＨ１０（修飾はＬＮＡ（登録商標）残基である）についてのデータを示す。フォーマットＦを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＤＨ３６、０．１６０９；フォーマットＤＨ２、０．２０４９；フォーマットＤＨ９、０．５５３４；フォーマットＤＨ４６、０．０２０７１；フォーマットＤＨ３３、０．１５０８；フォーマットＤＨ１０、０．０５４６９。図２１Ｂは、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡと比較した、実施例７に記載のフォーマットＦ、ＤＨ３６、ＤＨ２、ＤＨ９、ＤＨ４６、ＤＨ３３、およびＤＨ１０のＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡノックダウンの関数のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡコントロールを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＦ、０．０５４６９；フォーマットＤＨ３６、０．０１５６３；フォーマットＤＨ２、０．６４０６；フォーマットＤＨ９、０．１４８４；フォーマットＤＨ４６、０．１４８４；フォーマットＤＨ３３、０．００７８１３；フォーマットＤＨ１０、０．００７８１３。
【図２２】図２２Ａは、実施例７に記載の条件下で血清で処置した場合の全長ｓｉＲＮＡの残存率のボックスプロットを示す。修飾フォーマットＦ、ＤＨ２、ＤＨ７、ＤＨ２３、ＤＨ１、ＤＨ４８、ＤＨ４９、ＤＨ４４、およびＤＨ４５（修飾はＬＮＡ（登録商標）残基である）についてのデータを示す。フォーマットＦを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＤＨ２、０．２０４９；フォーマットＤＨ７、０．３８２８；フォーマットＤＨ２３、０．０３４６１；フォーマットＤＨ１、０．１４８４；フォーマットＤＨ４８、０．６４０６；フォーマットＤＨ４９、０．１４１０；フォーマットＤＨ４４、０．３１２５；フォーマットＤＨ４５、０．１０５２。図２２Ｂは、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡと比較した、実施例７に記載のフォーマットＦ、ＤＨ２、ＤＨ７、ＤＨ２３、ＤＨ１、ＤＨ４８、ＤＨ４９、ＤＨ４４、およびＤＨ４５のＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡノックダウンの関数のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＦ、０．０５４６９；フォーマットＤＨ２、０．６４０６；フォーマットＤＨ７、０．０５４６９；フォーマットＤＨ２３、０．００７８１３；フォーマットＤＨ１、０．００７８１３；フォーマットＤＨ４８、０．１９５３；フォーマットＤＨ４９、０．４６０９；フォーマットＤＨ４４、０．００７８１３；フォーマットＤＨ４５、０．０１５６３。
【図２３】図２３Ａは、実施例７に記載の条件下で血清で処置した場合の全長ｓｉＲＮＡの残存率のボックスプロットを示す。修飾フォーマットＦ、ＤＨ２、ＤＨ３８、ＤＨ１、ＤＨ３９、ＤＨ４０、ＤＨ４１、ＤＨ４２、およびＤＨ４３（修飾はＬＮＡ（登録商標）残基である）についてのデータを示す。フォーマットＦを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＤＨ２、０．２０４９；フォーマットＤＨ３８、０．０４２０６；フォーマットＤＨ１、０．１４８４；フォーマットＤＨ３９、０．０７８１３；フォーマットＤＨ４０、０．２５００；フォーマットＤＨ４１、０．２６２０；フォーマットＤＨ４２、０．１０９４；フォーマットＤＨ４３、０．３６２１。図２３Ｂは、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡと比較した、実施例７に記載のフォーマットＦ、ＤＨ２、ＤＨ３８、ＤＨ１、ＤＨ３９、ＤＨ４０、ＤＨ４１、ＤＨ４２、およびＤＨ４３のＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡノックダウンの断片のボックスプロットを示す。非修飾フォーマットＡを各修飾フォーマットと比較したウィルコクソン検定（対応のある）による統計的有意性の計算を以下に示す：フォーマットＦ、０．０５４６９；フォーマットＤＨ２、０．６４０６；フォーマットＤＨ３８、０．００７８１３；フォーマットＤＨ１、０．００７８１３；フォーマットＤＨ３９、０．００７８１３；フォーマットＤＨ４０、０．０１５６３；フォーマットＤＨ４１、０．００７８１３；フォーマットＤＨ４２、０．００７８１３；フォーマットＤＨ４３、０．０２３４４。
【図２４】図２４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの存在の定量を示す。スパイクしたコントロール動物由来の肝臓中のｓｉＲＮＡの存在量を、非修飾フォーマットＡのｓｉＲＮＡおよびフォーマットＤＨ１またはフォーマットＤＨ４７を有するＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットした安定化ｓｉＲＮＡを注射した試験動物由来の肝臓中のｓｉＲＮＡの存在量と比較する。ＣＴはサイクル閾値である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
種々の実施形態の説明
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明は例示および説明のみを目的とし、本教示の範囲を制限することを意図しないと理解すべきである。本出願では、他で特記しない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。例えば、「少なくとも１つ」は、１つを超えて存在し得ることを意味する。また、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」、および「ｉｎｃｌｕｄｅ」、またはこれらの基本用語の変更形態（例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｅｄ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」であるが、これらに限定されない）は本発明を制限することを意図せず、「以下の要素を含むが他を排除しないこと」を意味する。本明細書中で使用する場合、用語「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」は、組み合わせに対する任意の本質的な意義から他の要素を排除する。「または」の使用は、他で示さない限り、「および／または」を意味する。用語「および／または」は、この用語の前後の用語を共にまたは個別に使用することができることを意味する。限定されない例として、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」または「ＸおよびＹ」を意味することができる。
【００２５】
他で特記しない限り、一定範囲の値を本明細書中に提供する場合は常に、この範囲は、最初の値および最後の値ならびにその間の任意の値または範囲が含まれることを意味する。例えば、「０．２〜０．５」は、０．２、０．３、０．４、０．５、その間の範囲（０．２〜０．３、０．３〜０．４、０．２〜０．４など）、その間の値（０．２５、０．３５、０．２２５、０．３３５、０．４９など）、およびその間の値の範囲（０．２６〜０．３９など）などを意味する。
【００２６】
本出願で引用された全ての文献および類似資料（特許、特許出願、論文、書籍、学術論文、およびインターネットウェブページが含まれるが、これらに限定されない）は、かかる文献および類似資料の形式と無関係に、任意の目的でその全体が参考として明白に援用される。１つまたは複数の援用された文献および類似資料が本出願中の用語の定義と矛盾するように用語を定義または使用する場合には、本出願を優先する。本教示を種々の実施形態と合わせて記載するが、本教示がかかる実施形態に制限されることを意図しない。それどころか、当業者に認識されるように、本教示は、種々の変更形態、修正形態、および等価物を含む。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「またはその組み合わせ」は、本用語の前に列挙した用語の全ての順列および組み合わせをいう。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図し、特定の状況において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢも含むことを意図する。この例に続いて、１つまたは複数の用語の繰り返しを含む組み合わせ（ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、およびＣＡＢＡＢＢなど）が明確に含まれる。当業者は、文脈から明白でない限り、典型的には、用語数または任意に組み合わせた用語に制限はないと理解するであろう。本明細書中で使用する場合、用語「代替物」は、別の産物の存在を示す産物を意味する。例えば、増幅産物は、増幅された核酸の代替物である。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、ｓｉＲＮＡの「修飾フォーマット」は、図１Ａ〜図１Ｋに記載のパターンまたはフォーマットによって例示される修飾ヌクレオチドおよび「修飾以外の」ヌクレオチドのパターンを意味する。修飾ヌクレオチドは、以下に記載されている。「修飾以外の」は、特定のフォーマットの修飾ヌクレオチドの修飾以外の修飾を有する非修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを意味する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「配列非依存性修飾」は、実施形態によって得られた修飾ヌクレオチドおよび修飾フォーマットをｓｉＲＮＡの特定の配列を問わずに任意のｓｉＲＮＡに適用することができることを意味する。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「オンターゲット」事象は、発現の減少、ｍＲＮＡレベルの減少、または特定の表現型の増減によって証明されるように、標的遺伝子のｍＲＮＡがこの遺伝子をターゲティングするためにデザインされたｓｉＲＮＡに影響を受ける（すなわち、ノックダウンされる）ことを意味する。「オンターゲット」事象を、例えば、標的に影響を及ぼすことが公知の薬物の使用などまたはオルソログ由来の標的ｍＲＮＡの導入による喪失した表現型のレスキューなどの別の方法によって検証することができる。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「オフターゲット事象」は、ＲＮＡ干渉における所望の事象以外の任意の事象を意味する。オフターゲット事象の例は、ターゲティングされない遺伝子のｍＲＮＡがｓｉＲＮＡに影響を及ぼされた（すなわち、ノックダウンされた）場合である。かかる「オフターゲット事象」を、適切に関連するオルソログ由来の標的ｍＲＮＡの供給によってレスキューすることができる。「オフターゲット事象」は、非ターゲット発現を変化させる方法での別のｍＲＮＡ、内因性ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質との相互作用に起因し得る。かかるオフターゲット事象は、例えば、ＲＩＳＣに組み込まれたヌクレオチド配列と非標的ｍＲＮＡとの間のミスマッチ塩基対合または細胞環境内の非特異的相互作用に起因し得る。不適切なＲＩＳＣ結合、不適切なＲＩＳＣ媒介相互作用、および不適切なＲＩＳＣ媒介切断は、オフターゲット事象に寄与し得る。オフターゲット事象はまた、細胞傷害応答、インターフェロン応答、マイクロＲＮＡ効果、または非コードＲＮＡとの相互作用に起因し得る。最も一般的なオフターゲット事象は、おそらく、ＲＩＳＣ複合体へのパッセンジャー（センス）鎖の望ましくない組み込みである。しかし、ｓｉＲＮＡに影響を受けるオフターゲット事象は全く予想できず、非特異的な傾向を示す。オフターゲット事象はオフターゲット効果を生じ、この用語を本明細書中で交換可能に使用する。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、用語「効力」は、その標的ｍＲＮＡを最初のｍＲＮＡレベルの５０％にノックダウンするのに必要な各ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡプールの濃度の基準である。一般に、効力を、ＩＣ５０（最大半量（５０％）のｍＲＮＡ阻害に必要なｓｉＲＮＡの濃度）を単位として記載する。効力を、本明細書中で、一定範囲のｓｉＲＮＡ濃度（例えば、１００ｎＭ〜１０ｐｍの範囲の少なくとも６つ）のトランスフェクションおよびサンプルに対するｑＲＴ−ＰＣＲ分析の実施によって決定する。結果をプロットし、５０％のｍＲＮＡノックダウンが達成される濃度に対する外挿によってＩＣ５０を決定する。カーブフィッティングプログラムを使用して、ｍＲＮＡ標的の５０％ノックダウンを達成するのに必要なｓｉＲＮＡ濃度を決定する。本明細書中で使用する場合、用語「効力」を、用語「ノックダウン活性」と交換可能に使用し、この用語は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡへの曝露後のｍＲＮＡの存在量と比較した試験ｓｉＲＮＡへの曝露後のｍＲＮＡの減少量の基準である。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、用語「効力」は、ｍＲＮＡノックダウンの最小閾値が得られるｓｉＲＮＡの比率である。用語「効力」を、一般に、ｓｉＲＮＡの集合物またはｓｉＲＮＡデザインアルゴリズムの予測力に適用する。効力を、標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡノックダウンのｑＲＴ−ＰＣＲまたはベクターベースの測定によって測定し、その結果を、ノックダウンの最小閾値が得られるｓｉＲＮＡの比率（例えば、７０％以上ノックダウンするｓｉＲＮＡの比率）として示す。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、用語「特異性」は、ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで遺伝子調節に影響を及ぼす精度または標的遺伝子機能のノックダウンによって示される真の表現型の基準である。特異性を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの結果として一定の閾値と比較して変化し、意図する標的ではなく、標的遺伝子のシグナル伝達経路に存在することが知られていない遺伝子数の決定によって測定する。当該分野の標準閾値は、２変化倍率である。細胞生物学研究では、特定の標的に対する高特異性ｓｉＲＮＡにより、表現型が予想外の表現型とほとんどまたは全く重複しない。低特異性ｓｉＲＮＡにより、オフターゲット効果に起因する表現型が得られる。
【００３５】
効力の「改善」は、同一の濃度で別のｓｉＲＮＡよりも低いＩＣ５０または高いノックダウン率を有するｓｉＲＮＡをいう。特異性の「改善」は、別のｓｉＲＮＡよりも少ない遺伝子で影響を及ぼすｓｉＲＮＡをいう。効力の「改善」は、より高いｓｉＲＮＡ群率によって異なるアルゴリズムを使用して得られる別のｓｉＲＮＡ群と比較して最小の指定量のノックダウンが得られるアルゴリズムを使用して得られるｓｉＲＮＡ群をいう。
【００３６】
本明細書中に記載の研究のために、試験結果をコントロールの結果と比較し、全ての結果を非ターゲティングであるようにデザインされたナンセンスｓｉＲＮＡに正規化する。対応のあるサンプルについてのウィルコクソン検定は、対応のあるサンプルのｔ検定のノンパラメトリックな等価物である。ウィルコクソン検定は、サンプル１およびサンプル２の対応のあるデータの間の相違の絶対値をランキングし、正負の相違数の統計値を計算する（サンプル２−サンプル１として相違を計算する）。使用ソフトウェアは、ｃｒａｎ．ｏｒｇ．から無料で利用可能な「Ｒ  Ｐａｃｋａｇｅ」である。
【００３７】
用語「ヌクレオチド」は、一般に、単量体としてか、ジヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド内のヌクレオシドのリン酸エステルをいう。ヌクレオシドは、一般に、リボース（リボヌクレオシド）またはデオキシリボース（デオキシリボヌクレオシド）のＣ−１’炭素に連結したプリン塩基またはピリミジン塩基である。天然に存在するプリン塩基には、一般に、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）が含まれる。天然に存在するピリミジン塩基には、一般に、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ）が含まれる。ヌクレオシド塩基がプリンである場合、リボースまたはデオキシリボースはプリンの９位で核酸塩基に結合し、核酸塩基がピリミジンである場合、リボースまたはデオキシリボースはピリミジンの１位で核酸塩基に結合する。リボヌクレオチドはリボヌクレオシドのリン酸エステルであり、デオキシリボヌクレオチドはデオキシリボヌクレオシドのリン酸エステルである。用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方の一般名である。ジヌクレオチドは、一般に、３’−５’ホスホジエステル結合を介して共有結合された２つのヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドは、一般に、２つを超えるヌクレオチドを有し、ポリヌクレオチドは、一般に、ヌクレオチド単量体のポリマーをいう。出願人は、本明細書中で、用語「ヌクレオチド」および「ヌクレオシド」を便宜上交換可能に使用しているが、当業者は、この用語が出現する状況からどの用語を適用可能であるかを容易に理解している。
【００３８】
ヌクレオチド単量体は、「ヌクレオシド間結合またはヌクレオチド間結合」（例えば、ホスホジエステル結合）によって連結し、ここで、本明細書中で使用する場合、用語「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエステル結合（そのリン酸アナログが含まれる）をいい、かかる対イオンが存在する場合、関連対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）が含まれる。さらなるヌクレオシド間結合またはヌクレオチド間結合を以下に記載する。オリゴヌクレオチドが一連の文字によって示される場合は常に、他で示さない限り、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序であるか、文脈からその逆が意図されることが当業者に明白であると理解されるであろう。オリゴヌクレオチドの合成方法についての記載を、米国特許第４，３７３，０７１号；同第４，４０１，７９６号；同第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；同第４，５００，７０７号；同第４，６６８，７７７号；同第４，９７３，６７９号；同第５，０４７，５２４号；同第５，１３２，４１８号；同第５，１５３，３１９号；および同第５，２６２，５３０号などで見出すことができる。オリゴヌクレオチドは、任意の長さであり得る。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「塩基対合」は、標準的なワトソン−クリック塩基対合をいう。二本鎖（二重鎖）核酸中に一般的に見出される塩基対合は、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、およびＡ：Ｕである。かかる塩基対は相補塩基対といわれ、一方の塩基対はその対合した塩基と相補的である。下記のヌクレオチドアナログは、相補ヌクレオチドまたは相補ヌクレオチドアナログと対合する場合に水素結合を形成することもできる。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対に関してだけでなく、ワトソン−クリック塩基対合規則によって標準的な相補規則にしたがって塩基対合することができるか、比較的ストリンジェントな条件下で特定の核酸セグメントとハイブリッド形成することができる核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの逆平行鎖に関しても使用される。例えば、配列５’−ＡＧＴＴＣ−３’は配列５’−ＧＡＡＣＴ−３’と相補的である。用語「完全に素補的な」または「１００％相補的な」などは、逆平行鎖間の塩基が完全に対合する（ポリヌクレオチド二重鎖中にミスマッチはない）相補配列をいう。核酸ポリマーは、その全配列の一部のみに相補的であり得る。用語「部分的相補性」、「部分的に相補的な」、「不完全な相補性」、または「不完全に相補的な」などは、１００％未満完全な（例えば、ポリヌクレオチド二重鎖中に少なくとも１つのミスマッチが存在する）逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基の任意のアラインメントをいう。さらに、そのアラインメント中に１つまたは複数のミスマッチ、ギャップ、または挿入が存在する場合、２つの配列はその長さの一部について相補的であるといわれる。
【００４１】
さらに、標的ポリヌクレオチドの「相補物」は、標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部と逆平行結合で組み合わせることができるポリヌクレオチドをいう。逆平行結合は、分子内（例えば、核酸分子内のヘアピンループの形態）または分子間（２つ以上の一本鎖核酸分子が互いにハイブリッド形成する場合など）であり得る。用語「〜に対応する」は、核酸に関する場合、特定の配列が逆平行配列と十分に相補的であり、その結果、２つの配列が適切な条件下でアニーリングして二重鎖を形成することを意味する。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「パッセンジャー（センス）」鎖、領域、またはオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのセンス鎖の少なくとも一部の同一のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列またはｍＲＮＡの少なくとも一部のヌクレオチド配列をいう。「パッセンジャー（センス）鎖」は、別のポリヌクレオチドの相補ガイド（アンチセンス）領域と二重鎖を形成するポリヌクレオチドのセンス領域を含む。ヘアピン一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｈＲＮＡ）は、同一分子内にパッセンジャー（センス）領域およびガイド（アンチセンス）領域も含むことができ、この領域は、以下にさらに説明するように、ループ配列またはループリンカー部分によって連結された二重鎖構造を形成する。ヘアピンは、左方向（すなわち、５’−アンチセンス−ループ−センス−３’）または右方向（すなわち、５’−センス−ループ−アンチセンス−３’）のいずれかであり得る。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して遺伝子サイレンシングを誘導する低分子干渉ＲＮＡ二重鎖をいう。低分子干渉ＲＮＡの長さは様々であり得、アンチセンス領域とセンス領域との間およびアンチセンス領域と標的ｍＲＮＡ配列との間に多くても１つまたは２つのミスマッチ塩基対を含むことができる。各ｓｉＲＮＡは、１５〜３０塩基対、１８〜２５塩基対、１９〜２２塩基対、２１塩基対、または１９塩基対を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、独立して、５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に１、２、３、４、または５つの非対合オーバーハンギングヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは平滑末端を有する。さらに、用語「ｓｉＲＮＡ」には、２つの個別の鎖の二重鎖およびヘアピン構造を形成することができる一本鎖（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチド（４〜３０、６〜２０、または７〜１５ヌクレオチドなど）のループ配列を有することができるか、非ヌクレオチド部分（炭化水素結合領域など）またはその組み合わせを含むことができる。ｓｈＲＮＡはミスマッチまたはバルジを含むことができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本教示は、非修飾ヌクレオチドと比較して塩基対合に対する親和性が増強されているか、親和性の増強が一部をなすヌクレオチド配列に寄与する修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、本明細書中で意図されるように、ＲＮＡの配座平衡を、ＲＮＡ二重鎖のＡ形態幾何学と一致するノーザン（Ｃ３’エンド）高次構造にシフトさせる。それにより、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を安定化させることもできる。いくつかの実施形態では、塩基対合に対する親和性を、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドを有するパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドの構築によって増強する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの修飾ヌクレオチドには、独立して、修飾糖部分、修飾塩基部分、修飾ヌクレオシド間部分、またはこれらの修飾部分のいずれかの組み合わせが含まれる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドには、修飾糖部分（２’−ハロ（式中、ハロはクロロ、フルオロ、ブロモ、またはヨードである）が含まれるが、これらに限定されない）；アラビノまたはアラビノース高次構造中の２’−フルオロ（ＦＡＮＡ）；２’−Ｈ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＣＮ、アジド；または−ＯＲ、−Ｒ、−ＳＲ、−ＮＨＲ、もしくは−Ｎ（Ｒ）２（式中、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、オキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミンであり、アルキル部分はＣ１〜Ｃ６である）が含まれる。
【００４７】
さらなる２’修飾には、２’−Ｏ−（ＣＨ２）４ＮＨ２；２’−Ｏ−アントラキノリルアルキル（ここで、アルキルはメチルまたはエチルを含む）；２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３；２’−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ３（式中、ｎは１〜４である）；２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＲ−Ｘ（式中、Ｘ＝ＯＨ、Ｆ、ＣＦ３、またはＯＣＨ３およびＲ＝Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、またはＣＨ２ＯＣＨ３）；ペプチド核酸単量体またはその誘導体（ＰＮＡ）；２’修飾（ここで、２’位はアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ）である）などが含まれる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドには、修飾糖部分または疑似糖（以下が含まれるが、これらに限定されない：ビシクロヌクレオチド構造（ａ）、トリシクロヌクレオチド構造（ｂ）、またはビシクロヌクレオチド構造（ｃ）：
【００４９】
【化１】
2014097073.tif 000007
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ホスファート、Ｃ１〜１２−アルキル、Ｃ１〜１２−アルキルアミン、Ｃ１〜１２−アルケニル、Ｃ１〜１２−アルキニル、Ｃ１〜１２−シクロアルキル、Ｃ１〜１２−アラルキル、アリール、アシル、シリル、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド間結合を介して結合したヌクレオシド、またはその組み合わせであり、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはオリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合を介して結合したヌクレオシドである。５’末端を、置換基（ホスファート、Ｃ１〜１２−アルキル、Ｃ１〜１２−アルキルアミン、Ｃ１〜１２−アルケニル、Ｃ１〜１２−アルキニル、Ｃ１〜１２−シクロアルキル、Ｃ１〜１２−アラルキル、アリール、アシル、またはシリルなど）によってさらに誘導体化することができる。いくつかの実施形態では、５’末端を、例えば、Ｃ１２またはＣ６置換基またはホスファートによって誘導体化する。
【００５０】
ビシクロヌクレオチドには、上記の構造（ａ）および（ｃ）のビシクロヌクレオチドが含まれる。構造（ａ）のビシクロヌクレオチドはロックド核酸またはＬＮＡ（登録商標）とも呼ばれ、例えば、β−Ｄおよびα−Ｌビシクロヌクレオチド、ビシクロヌクレオチド（キシロ−ロックド核酸（米国特許第７，０８４，１２５号）、Ｌ−リボ−ロックド核酸（米国特許第７，０５３，２０７号）、１’−２’ロックド核酸（米国特許第６，７３４，２９１号および同第６，６３９，０５９号）、および３’−５’ロックド核酸（米国特許第６，０８３，４８２号）など）が含まれる。構造（ｃ）のビシクロヌクレオチドおよびかかるビシクロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、Ｍａｉｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４，３２：１２，３６４２−３６５０）およびＭａｄｅｒｉａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２００７，３５：６，１９７８−１９９１）に記載されている。構造（ｂ）のトリシクロヌクレオチドおよびかかるトリシクロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、Ｉｔｔｉｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４，３２：１，３４６−３５３）に記載されている。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドには、修飾ヌクレオシド間リンカー部分（ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニリダート、ホスホルアミダート、ボロノホスファート、チオホルムアセタール（−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−）、メチレン（メチルイミノ）、ジメチルヒドラジノ、ホスホリル結合モルホリノ、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、およびリン原子が＋５酸化状態にあり、且つ１つまたは複数の酸素原子が非酸素部分（例えば、硫黄）に置換された任意のホスファートアナログが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。ペプチド核酸は、骨格が通常はＮ−（２−アミノ−エチル）−グリシン単位から形成される合成ペプチド様結合（アミド結合）を含み、それにより、アキラルおよび非荷電性の分子が得られる核酸アナログである。例示的なリン酸アナログには、関連対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）が含まれる（かかる対イオンが存在する場合）。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドには、修飾塩基部分（ピリミジン核酸塩基およびプリン核酸塩基が含まれるが、これらに限定されない）、その誘導体およびアナログ（１つまたは複数のアルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロ（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、チオールまたはアルキルチオール部分に置換されたピリミジンおよびプリンが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。アルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、１〜６個の炭素原子を含む。本明細書中で意図されるさらなる修飾ヌクレオチドには、オキセタン修飾塩基（オキセタン修飾を含む塩基の考察については、米国特許出願公開第２００４０１４２９４６号を参照のこと）が含まれる。
【００５３】
ピリミジン、ピリミジン誘導体、およびピリミジンアナログには、ブロモチミン、１−メチルシュードウラシル、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、２−
チオピリミジン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、３−メチルシトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ウラシル、４−アセチルシトシン、４−チオウラシル、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、４−（６−アミノヘキシルシトシン）、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、５−（Ｃ３，Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−ブロモウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−クロロウラシル、５−エチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシル、５−プロピルウラシル、５−プロピニルウラシル、チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、５−ヨード−２’−デオキシウラシル、５−フルオロウラシル、５−メチルウラシル、三環系カルバゾールベースのピリミジンアナログ、三環系フェノキサジンベースのピリミジンアナログ、イソシトシン、シュードイソシトシン、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、およびユニバーサルヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
いくつかの実施形態では、プリン、プリン誘導体、およびプリンアナログには、アザプリン、アザグアニン、アザアデニン、デアザプリン、デアザグアニン、デアザアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルアデニン、１−メチルイノシン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノプリン、６−チオグアニン、６−チオアデニン、６−チオプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、７−メチルグアニン、７−ハロ−７−デアザプリン（式中、ハロは、ブロモ、フルオロ、ヨード、またはクロロである）、７−プロピン−７−デアザプリン、８−ブロモアデニン、８−ヒドロキシアデニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）−カルバモイル）トレオニン、メチルチオアデニン、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシン、ワイブトキソシン、ワイブトシン、イソグアニン、キューオシン、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、およびユニバーサルヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
ユニバーサル塩基は、１つを超える特定の塩基型または任意の特定の塩基と塩基対合することができる。他の実施形態では、ユニバーサル塩基は、任意の塩基と特異的に水素結合しないが、疎水性スタッキングによって同一核酸鎖上の隣接塩基と相互作用する。ユニバーサル塩基には、インドール（７−アザインドール、６−メチル−７−アザインドール、プロピニル−７−アザ−インドール、アレニル−７−アザインドールなど）、イソカルボスチリル、プロピニルイソカルボスチリル、イミジソピリジン、およびピロールピリジンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、図１Ａ〜図１Ｋに記載のパターンまたはフォーマットによって例示の本明細書中で「フォーマット」と呼ばれる特定のパターンでｓｉＲＮＡ中に存在する。いくつかの実施形態では、化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは１５〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは、７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つを含み、
ここで、各ｍは独立してビシクロヌクレオチドまたはトリシクロヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００５７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが本質的に１５〜３０ヌクレオチド長からなり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つから本質的になり、
ここで、各ｍは独立してビシクロヌクレオチドまたはトリシクロヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドである、化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドを提供する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、１５〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を含み、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、少なくとも１３ヌクレオチドからオリゴヌクレオチドの全長に相当するヌクレオチド数までのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域を含む。いくつかの実施形態では、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、２つの３’ヌクレオチドを除いてパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドの全長と連続的に相補的な領域を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部と少なくとも１２個の連続するヌクレオチドが相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部と少なくとも１３ヌクレオチドからガイドオリゴヌクレオチドの全長に相当するヌクレオチド数まで相補的である。いくつかの実施形態では、ガイドオリゴヌクレオチドは、２つの３’ヌクレオチドを除いて標的ｍＲＮＡの一部と完全に相補的である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、１７〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（４）、フォーマット（５）、およびフォーマット（６）：
（４）５’ｍｐ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐが０である場合、ｘは１２であり、ｐが１である場合、ｘは１１であり、ｐが２である場合、ｘは１０であり、ｐが３である場合、ｘは９であり、ｐが４である場合、ｘは８であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋２）を示す整数である）、
（５）５’ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋３）を示す整数である）、
（６）５’ｍｐ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは３であり、ｙは９であり、ｚは１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋２）を示す整数である）
の１つを含むパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド、ならびに１７〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドであって、ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、ここで、
各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、且つオーバーハンギングヌクレオチドであり、ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、ｍが２’−修飾ヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、２’−修飾ヌクレオチド以外のヌクレオチドである、低分子干渉ＲＮＡを提供する。
【００６１】
低分子干渉ＲＮＡの１つの実施形態では、パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは配列非依存性修飾フォーマット（４）を有し、ｐは２であり、ｘは１０であり、ｒは２であり、各ｎはオーバーハンギングヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、修飾ヌクレオチドであり、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、２つの３’−オーバーハング修飾ヌクレオチドを含み、各修飾ヌクレオチドは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドである。１つの実施形態では、パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端から３番目の位置および３’末端から４番目の位置の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである。３’末端から３番目の位置は、最後の位置から３番目である（すなわち、例えば、図１ＨのフォーマットＤＨ４７に関して、末端から２番目の前の位置）。３’末端から４番目の位置は、最後の位置から４番目である（すなわち、図１ＨのフォーマットＤＨ２９に関して、末端から３番目の前の位置）。かかるｓｉＲＮＡは、例えば、血清の存在下などでのヌクレアーゼに対して特に安定である。
【００６２】
低分子干渉ＲＮＡのいくつかの実施形態では、長さが１７ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位および３位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、長さが１８ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、および４位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、長さが１９ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、および５位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、長さが２０ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、および６位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、長さが２１〜３０ヌクレオチドである場合、ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、６位、および７位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである。図１ＫのフォーマットＤＨ１およびフォーマットＤＨ３９〜ＤＨ４３は、２１ヌクレオチド長であり、修飾ヌクレオチドとしてガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、６位、および７位の少なくとも１つを有するｓｉＲＮＡ修飾フォーマットの例である。かかるｓｉＲＮＡはまた、例えば、血清または血漿の存在下などでヌクレアーゼに対して特に安定である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは１０であり、ｒは２である）（フォーマットＨ、図１Ａに記載のフォーマットＨを有する２１量体）、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは９または１１であり、ｒは２である）（フォーマットＨ−１またはフォーマットＨ＋１、図１Ｂに記載のかかるフォーマットを有する２１量体）、または配列非依存性修飾フォーマット（２）（式中、ｐは０であり、ｙは９であり、ｒは２である）（フォーマットＶ、図１Ｃに記載のフォーマットＶを有する２１量体）を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは１であり、ｘは９または１０であり、ｒは２である）（フォーマットＷまたはフォーマットＷ＋１、図１Ｄに記載のかかるフォーマットを有する２１量体を示す）を含み、各ｍは、構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する。いくつかの実施形態では、パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（３）（式中、ｘは９または１０であり、ｒは２である）（フォーマットＹまたはフォーマットＹ＋１、図１Ｄに記載のかかるフォーマットを有する２１量体）を含み、各ｍは、構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する。
【００６５】
さらなる実施形態では、ガイド（アンチセンス）鎖の各Ｎはビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド（アンチセンス）鎖は修飾を持たない。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは、修飾フォーマットＨ（式中、修飾ヌクレオチドｍはフォーマットの１位、２位、１３位、および１４位に存在し、各ｍはＬＮＡ（登録商標）であり、各ｎはデオキシヌクレオチドであり、各Ｎはリボヌクレオチドである）を有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは修飾フォーマットＨを有し、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは、修飾フォーマットＶ（式中、修飾ヌクレオチドｍはフォーマットの１位、２位、１２位、および１４位に存在し、各ｍはＬＮＡ（登録商標）であり、各ｎはデオキシヌクレオチドであり、各Ｎはリボヌクレオチドである）を有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは、修飾フォーマットＶを有し、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは、フォーマット（２）（式中、ｐは０であり、ｙは７である）を有する修飾フォーマットＶ−２を有する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは、修飾フォーマットＱ（式中、修飾ヌクレオチドｍは、フォーマットの１３位および１４位に存在し、各ｍはＬＮＡ（登録商標）であり、各ｎはデオキシヌクレオチドであり、各Ｎはリボヌクレオチドである）を有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは修飾フォーマットＱを有し、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは、フォーマット（４）（式中、ｐが０である場合、ｘは１２であり（フォーマットＱ）、ｐが１である場合、ｘは１１であり（フォーマットＪＢ２）、ｐが２である場合、ｘは１０であり（フォーマットＨ）、ｐが３である場合、ｘは９であり（フォーマットＪＢ５）、ｐが４である場合、ｘは８であり（フォーマットＪＢ３）、ｒは２である）を有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは、フォーマット（５）（式中、ｘは１１であり（フォーマットＪＢ１）、ｒは２である）を有する。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡパッセンジャーオリゴヌクレオチドは、フォーマット（６）（式中、ｐは３であり、ｙは９であり、ｚは１であり（フォーマットＪＢ４）、ｒは２である）を有する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、化学合成した低分子干渉ＲＮＡは、ヌクレオチドループまたはリンカーループを介して共有結合したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドおよびガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、これらが低分子ヘアピンオリゴヌクレオチドを形成する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの各３’末端は、独立して、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドオーバーハングを有し、いくつかの実施形態では、各３’末端は、各オーバーハングのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドを含む２つのヌクレオチドオーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオーバーハンギングヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの各３’末端は２つのヌクレオチドオーバーハングを有し、１つ、２つ、３つ、または４つ全てのオーバーハンギングヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合以外である。
【００７２】
化学合成：干渉ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成を、標準的方法にしたがって行う。合成方法の制限されない例には、ジエステル法、トリエステル法、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法、および固相化学を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成が含まれる。これらの方法は、以下でさらに詳細に考察されている。
【００７３】
ビシクロヌクレオチド構造（構造（ａ）が含まれる）を有するオリゴヌクレオチドを、例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ（米国特許第６，７７０，７４８および同第６，２６８，４９０号に記載）；Ｗｅｎｇｅｌ（米国特許第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号、および同第６，６７０，４６１号、ならびに米国特許出願公開２００５／０２８７５６６号および同第２００３／０２２４３７７号に記載）；Ｋｏｃｈｋｉｎｅ（米国特許第６，７３４，２９１号および同第６，６３９，０５９号ならびに米国特許出願公開２００３／００９２９０５号に記載）、Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ（米国特許出願公開２００４／０２１９５６５号に記載）、およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ．，ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９，８３６２−８３７９，２００７）にしたがって合成する。
【００７４】
トリシクロヌクレオチド構造（ｂ）を有するオリゴヌクレオチドを、例えば、Ｉｔｔｉｇ，Ｄ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１，３４６−３５３，２００４）にしたがって合成する。ビシクロヌクレオチド構造（ｃ）を有するオリゴヌクレオチドを、例えば、Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１２，３６４２−３６５０，２００４）にしたがって合成する。ＦＡＮＡ置換基を有するオリゴヌクレオチドを、Ｄｏｗｌｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００６，３４：６，ｐ  １６６９−１６７５）にしたがって合成する。
【００７５】
オリゴヌクレオチド合成のジエステル法は、最初にＫｈｏｒａｎａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０３，６１４．１９７９）によって使用可能な状態にまで開発された。基本工程は、２つの適切に保護したヌクレオチドを結合させてホスホジエステル結合を含むジヌクレオチドを形成することである。ジエステル法は十分に確立されており、ＤＮＡ分子を合成するために使用されている。
【００７６】
ジエステル法とトリエステル法との間の主な相違は、反応物および生成物のリン酸分子上の後者の余剰な保護基中の存在である（Ｉｔａｋｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０：４５９２  １９７５）。リン酸保護基は、通常クロロフェニル基であり、これがヌクレオチドおよびポリヌクレオチド中間体を有機溶媒に可溶にする。したがって、クロロホルム溶液中で精製する。本方法における他の改善点には、（ｉ）三量体およびより大きなオリゴマーのブロックカップリング、（ｉｉ）中間体および最終生成物の両方のための高速液体クロマトグラフィの広範囲の使用、および（ｉｉｉ）固相合成が含まれる。
【００７７】
ポリペプチドの固相合成のために開発されたテクノロジーを利用して、最初のヌクレオチドを固相材料に付着させ、ヌクレオチドの段階的添加に進めることが可能であった。全ての混合および洗浄工程を単純化し、手順を自動化することが可能となる。これらの合成は、現在、自動核酸合成機を使用して日常的に行われている。
【００７８】
ホスホルアミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３（４９）６１２３；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２（４８）２２２３）は、オリゴヌクレオチド合成のための圧倒的に最も広範に使用されているカップリング化学となっている。当業者に周知のように、オリゴヌクレオチドのホスホルアミダイト合成は、活性化剤との反応によってヌクレオシドホスホルアミダイト単量体の前駆体を活性化して活性化中間体を形成させる工程、その後に成長中のオリゴヌクレオチド鎖（一般に、その一方の末端が適切な固体支持体に係留されている）に活性化中間体を連続的に添加して、オリゴヌクレオチド生成物を形成する工程を含む。
【００７９】
ｓｉＲＮＡを、逆相精製カートリッジ、イオン交換ＨＰＬＣ、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム勾配遠心法、カラム、フィルター、核酸に結合する薬剤（グラスファイバーなど）を含むカートリッジ、または当業者に公知の任意の他の手段によって精製することができる。一本鎖構造と二本鎖構造とを判断するためにゲル電気泳動を使用することができ、純度を決定するためにイオン交換ＨＰＬＣを使用することができ、同一性を決定するためにＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用することができ、ｓｉＲＮＡを定量するためにＵＶ分光法を使用することができる。
【００８０】
内因性標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物（例えば、植物、動物、真菌などの真核生物、細菌などの原核生物）に由来し得るかこれらに含まれ得る。植物は単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物であり得る。動物は脊椎動物または無脊椎動物であり得る。微生物を農業または産業で使用することができるか、植物または動物に病原性を示しても良い。真菌には、カビ形態および酵母形態の両方の生物が含まれる。脊椎動物の例には、魚類および哺乳動物（ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、およびヒトが含まれる）が含まれ、無脊椎動物には、線虫、昆虫、クモ類、および他の節足動物が含まれる。
【００８１】
標的遺伝子は、細胞、内因性遺伝子、導入遺伝子、または外因性遺伝子（病原体（例えば、その感染後に細胞中に存在するウイルス）の遺伝子など）に由来する遺伝子であり得る。標的遺伝子を有する細胞は、生殖系列細胞または体細胞、全能性細胞または多能性細胞、分裂細胞または非分裂細胞、実質細胞または上皮細胞、または不死化細胞または形質転換細胞などに由来し得る。細胞は配偶子または胚であり得、胚である場合、単細胞胚、構成細胞、または多細胞胚由来の細胞であり得る。したがって、用語「胚」は、胎児組織を含む。標的遺伝子を有する細胞は、未分化細胞（幹細胞など）、分化細胞（器官または組織（胎児組織が含まれる）の細胞由来など）、または生物中に存在する任意の他の細胞であり得る。分化細胞型には、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、ニューロン、膠細胞、血球、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、角化細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌性または外分泌腺の細胞が含まれる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、転写ＲＮＡ（コードＲＮＡおよび非コードＲＮＡが含まれる）である。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」には、その子孫が含まれる。子孫は、細胞分裂によって形成される任意および全てのその後の世代である。人為的または偶然の変異を原因として全子孫が同一でなくてよいと理解される。宿主細胞を「トランスフェクション」または「形質転換」することができ、これらは、外因性核酸を宿主細胞に移入または導入する過程をいう。形質転換細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。本明細書中で使用する場合、用語「操作された」および「組換え」細胞または宿主細胞は、外因性核酸配列（例えば、低分子干渉ＲＮＡまたはかかるＲＮＡをコードするテンプレート構築物など）が導入された細胞をいうことが意図される。したがって、組換え細胞は、組換えによって導入された核酸を含まない天然に存在する細胞と識別可能である。
【００８４】
一定の実施形態では、ＲＮＡまたはタンパク性配列を同一宿主細胞中で他の選択されたＲＮＡまたはタンパク性配列と同時発現させることができることが意図される。同時発現を、２つ以上の異なる組換えベクターでの宿主細胞の同時トランスフェクションによって行うことができる。あるいは、単一の組換えベクターを、ＲＮＡの複数の異なるコード領域を含むように構築し、次いで、単一ベクターでトランスフェクションした宿主細胞中で発現させることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、内因性標的遺伝子を含む組織はヒト組織である。一定の実施形態では、組織は、血液（例えば、赤血球、白血球、血小板、血漿、血清、または全血）を含むが、これらに限定されない。一定の実施形態では、組織は固形組織を含む。一定の実施形態では、組織はウイルス、細菌、または真菌を含む。一定の実施形態では、組織はｅｘ  ｖｉｖｏ組織を含む。
【００８６】
組織は、核酸送達組成物もしくはさらなる薬剤で形質転換されるかこれらと接触させるべき宿主細胞を含むことができる。組織は、生物の一部であるか、生物から分離することができる。一定の実施形態では、組織およびその構成細胞は、血液（例えば、造血細胞（ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ４＋細胞など）、リンパ球、および他の血液系統細胞）、骨髄、脳、幹細胞、血管、肝臓、胚、骨、乳房、軟骨、子宮頸部、結腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、帯膜、線維芽細胞、濾胞、神経節細胞、膠細胞、杯細胞、腎臓、リンパ節、筋肉、ニューロン、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、皮膚、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣を含むことができるが、これらに限定されない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、細胞内および細胞外のヌクレアーゼに対して安定な修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡを提供する。かかるｓｉＲＮＡは、体液の存在下で既知の安定化ｓｉＲＮＡよりも長期間全長で維持されることが本明細書中で証明された。ヌクレアーゼ安定化ｓｉＲＮＡは、特に高濃度のヌクレアーゼを含む体液および組織（例えば、血清、血漿、ならびに特に血管化された器官および組織が含まれる）で有用である。
【００８８】
ｓｉＲＮＡを、細胞ターゲティングリガンドと会合することができる。本明細書中で使用する場合、「細胞ターゲティングリガンド」は、細胞表面受容体などのターゲティングされた部位に特異性を有する細胞指向分子である。「ターゲティングされた部位に対する特異性」は、細胞ターゲティングリガンドの細胞との接触の際、イオン強度、温度、およびｐＨなどの生理学的条件下で特異的結合が起こることを意味する。細胞−リガンド相互作用は、相互作用の促進に有効な条件下で安定な複合体を形成するためのリガンドの一定の残基の細胞の特定の残基との特異的な静電気的相互作用、疎水性相互作用、または他の相互作用によって起こり得る。
【００８９】
例示的な細胞ターゲティングリガンドには、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリアミド、細胞受容体に親和性を示すペプチド、抗体などのタンパク質、脂肪酸、ビタミン、フラボノイド、糖、抗原、受容体、レポーター分子、レポーター酵素、キレート剤、ポルフィリン、介入物、ステロイドおよびステロイド誘導体、ホルモン（プロゲスチン（例えば、プロゲステロン）、糖質コルチコイド（例えば、コルチゾール）、鉱質コルチコイド（例えば、アルドステロン）、アンドロゲン（例えば、テストステロン）、およびエストロゲン（例えば、エストラジオール）など）、ヒスタミン、ホルモン模倣物（モルヒネなど）、および大環状分子が含まれるが、これらに限定されない。細胞受容体に親和性を示すペプチドには、エンドルフィン、エンケファリン、成長因子（例えば、上皮成長因子）、ポリ−Ｌ−リジン、ホルモン、インスリン、リボヌクレアーゼ、血清アルブミン結合ペプチド、タンパク質のペプチド領域、および能動輸送または受動輸送のいずれかによって細胞膜を透過することができる他の分子が含まれ得る。
【００９０】
実施形態にしたがってＲＮＡｉを行うのに適切なｓｉＲＮＡ送達方法には、ｓｉＲＮＡをオルガネラ、細胞、組織、または生物に導入することができる、本明細書中に記載されているか当業者に公知の任意の方法が含まれる。かかる方法には、注入などによるｓｉＲＮＡの直接送達（微量注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストランおよびその後のポリエチレングリコールの使用、直接超音波処理、リポソーム媒介トランスフェクション、微粒子銃、炭化ケイ素繊維との撹拌、アグロバクテリウム媒介形質転換形質転換、ＰＥＧ媒介形質転換、および乾燥／阻害媒介取り込みが含まれる）などが含まれるが、これらに限定されない。これらなどの技術の使用にもかかわらず、オルガネラ、細胞、組織、または生物を、安定または一過性に形質転換することができる。血清安定化修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが非修飾ｓｉＲＮＡと比較して４００％のレベルにてｉｎ  ｖｉｖｏで存在するという実施例８のデータによって証明されるように、ヌクレアーゼ消化に対して安定化されたｓｉＲＮＡ（その実施形態は本明細書中に提供されている）は、直接注入に特に適切である。
【００９１】
ｓｉＲＮＡを視覚化または検出するための技術には、顕微鏡法、アレイ、蛍光測定法、ライトサイクラーまたは他のリアルタイムＰＣＲ装置、ＦＡＣＳ分析、シンチレーションカウンター、ホスホイメージャー、ガイガー計数管、ＭＲＩ、ＣＡＴ、抗体ベースの検出方法（ウェスタン、免疫蛍光、免疫組織化学）、組織化学的技術、ＨＰＬＣ、分光法、質量分析；放射線技術、キャピラリーゲル電気泳動、および物質収支（Ｍａｓｓ  Ｂａｌａｎｃｅ）技術が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、核酸を、効率的に単離するために標識またはタグ化することができる。本発明の他の実施形態では、核酸をビオチン化する。
【００９２】
「標識」または「レポーター」は、その結合を検出することが可能な部分または性質をいう。標識を、共有結合または非共有結合することができる。標識の例には、蛍光標識（例えば、消光剤または吸収体が含まれる）、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量改変基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどが含まれる）などが含まれる。蛍光標識には、負電荷の色素（フルオレセインファミリーの色素（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、およびＺＯＥが含まれる）など）、中性の色素（ローダミンファミリーの色素（例えば、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡが含まれる）など）、または正電荷の色素（シアニンファミリーの色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７が含まれる）など）が含まれ得る。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）から入手可能であり、テキサスレッドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手可能であり、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。一定の実施形態では、蛍光剤分子は、フルオレセイン色素であり、消光剤分子はローダミン色素である。
【００９３】
標識またはレポーターは、フルオロフォアおよび蛍光消光剤の両方を含むことができる。蛍光消光剤は、蛍光性蛍光消光剤（フルオロフォアＴＡＭＲＡなど）または非蛍光性蛍光消光剤（ＮＦＱ）（例えば、組み合わせＮＦＱ−マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）から供給され、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と共に使用されるＭＧＢ  ＥＣＬＩＰＳＥ（商標）マイナーグルーブバインダーなど）であり得る。フルオロフォアは、核酸に結合することができる任意のフルオロフォア（例えば、上記で引用したＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ２、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７ならびにＶＩＣ、ＮＥＤ、ＬＩＺ、ＡＬＥＸＡ、Ｃｙ９、およびｄＲ６Ｇなど）であり得る。
【００９４】
標識のさらなる例には、ブラックホール消光剤（ＢＨＱ）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（ＩＤＴ）、ＱＳＹ消光剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、およびダブシルおよびダブセルスルホナート／カルカルボキシラート消光剤（Ｅｐｏｃｈ）が含まれる。標識は、フルオレセイン色素のスルホン酸誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）、介入標識（臭化エチジウムなど）、ＳＹＢＲ（商標）ＧｒｅｅｎＩ、およびＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）も含むことができる。
【００９５】
種々の実施形態では、当業者に公知の任意の方法によって蛍光を検出することができ、これらの方法は、定性的または定量的であり得る。定量的結果を、例えば、蛍光光度計を用いて得ることができる。いくつかの実施形態では、マイクロアレイおよび関連ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍなど）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １７００化学発光マイクロアレイ分析器および特に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、およびＮｉｍｂｌｅＧｅｎから入手可能な他の市販のアレイシステムと共に使用して検出することができる（Ｇｅｒｒｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−６２，１９９９；Ｄｅ  Ｂｅｌｌｉｓら，Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｂｉｏｔｅｃ  １４：２４７−５２，２００２；およびＳｔｅａｒｓら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０−４５（補遺を含む）２００３も参照のこと）。
【００９６】
生物学的に許容可能なキャリアは、適切に保存し、必要に応じて、１つまたは複数の本実施形態の干渉ＲＮＡを均一な用量で送達させるキャリアをいう。キャリア型は、ｓｉＲＮＡが、固体、液体、またはエアゾール形態のいずれで使用されるか、注射などの投与経路のために無菌である必要があるかどうかに依存し得る。ｓｉＲＮＡ組成物を、遊離塩基形態、中性形態、または塩形態の組成物に処方することができる。ｓｉＲＮＡの塩形態は、オフターゲット効果を減少させ、本明細書中に記載のｓｉＲＮＡに匹敵するノックダウン活性を維持する性質を有する。塩形態の例には、有機酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。ｓｉＲＮＡ組成物を、細胞内で活性形態に代謝することができるプロドラッグ形態で提供することができ、かかるプロドラッグ形態には、Ｓ−アセチルチオエチル基またはＳ−ピバロイルチオエチル基などの保護基を含むことができる。
【００９７】
組成物が液体形態である実施形態では、キャリアは、溶媒または分散媒（無ＲＮアーゼ水、緩衝液、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）、グリシン、許容可能な防腐剤（例えば、抗菌薬、抗真菌薬）、共溶媒、界面活性剤、浸透促進剤（例えば、クレメフォアおよびＴＷＥＥＮ（商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））、ヒアルロン酸、マンニトール、塩化ベンザルコニウム、増粘剤（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、等張剤、吸収遅延剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味物質、色素、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。滅菌注射液を、種々の上記列挙の成分と共にｓｉＲＮＡを適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、その後に濾過滅菌することによって調製する。処方物は、生物学的に許容可能なキャリアと混合した本明細書中の実施形態の干渉ＲＮＡまたはその塩を９９重量％まで含む。実施形態の干渉ＲＮＡを、溶液、懸濁液、または乳濁液として使用することができる。
【００９８】
実施形態の干渉ＲＮＡの使用に許容可能なキャリアには、脂質ベースの試薬であるｓｉＰＯＲＴ（商標）ＮｅｏＦＸ（商標）トランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ  カタログ番号ＡＭ４５１０）、ポリアミンベースの試薬であるｓｉＰＯＲＴ（商標）アミントランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ  カタログ番号ＡＭ４５０２）、カチオン性および中性の脂質ベースの試薬であるｓｉＰＯＲＴ（商標）脂質トランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ  カタログ番号ＡＭ４５０４）、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、さらにはポリカチオン（ポリエチレンイミンなど）、カチオン性ペプチド（Ｔａｔ、ポリアルギニン、またはペネトラチンなど）、またはリポソームが含まれる。リポソームを、標準的なビヒクル形成脂質およびステロール（コレステロールなど）から形成し、リポソームは、例えば、ターゲティング分子（細胞表面抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体など）を含むことができる。さらに、リポソームは、ＰＥＧ化リポソームであり得る。
【００９９】
干渉ＲＮＡを、溶液中、懸濁液中、または生体内分解性もしくは生体内非分解性送達デバイス中に送達させることができる。干渉ＲＮＡを、単独で送達させるか、ポリエチレングリコール部分、コレステロール部分、または受容体媒介エンドサイトーシスのための成長因子などとの定義された共有結合性抱合体の成分として送達させることができる。干渉ＲＮＡを、カチオン性脂質、カチオン性ペプチド、またはカチオン性ポリマーと複合体化するか、核酸結合性を有するタンパク質、融合タンパク質、またはタンパク質ドメイン（例えば、プロタミン）と複合体化するか、ナノ粒子またはリポソーム中にカプセル化することもできる。適切なターゲティング部分（抗体または抗体フラグメントなど）を含めることによって組織または細胞特異的送達を行うことができる。任意の従来のキャリアがｓｉＲＮＡと不適合である場合を除き、組成物中でのその使用または生物キャリアとしてのその使用が本明細書中の実施形態によって意図される。
【０１００】
本明細書中の実施形態の干渉ＲＮＡを、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、脳室内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、子宮内、直腸内、局所、腫瘍内、髄腔内、筋肉内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所、局部、吸入（例えば、エアゾール吸入）、注射、注入、連続注入、局所潅流による標的細胞の直接浸漬、カテーテル、洗浄液、クリーム、液体組成物（例えば、リポソーム）、または当業者に公知の他の方法もしくは上記の任意の組み合わせ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９０）で投与することができる。
【０１０１】
ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のための投薬量は０．０１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重であり、１日、１週間、１ヶ月、または１年に１回または複数回投与することができる。一般に、本明細書中の実施形態の修飾ヌクレオチドおよび修飾フォーマットを有する干渉ＲＮＡの有効量は、効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量であり、それにより、標的細胞の表面上の細胞外濃度は１００ｐＭ〜１μＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、または２ｎＭ〜約２５ｎＭまたは約１０ｎＭになる。この局部濃度を達成するために必要な量は、多数の要因（送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞または標的組織との間の細胞層数、送達が局部または全身のいずれであるかなどが含まれる）によって変化するであろう。送達部位での濃度は、標的細胞または標的組織の表面よりも大幅に高いかもしれない。処方物は、約ｐＨ４〜９またはｐＨ４．５〜ｐＨ７．４である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡが内因性標的遺伝子発現レベルをノックダウンする能力を、以下のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価する。細胞を、製造者によって説明された「逆」トランスフェクションプロトコールにしたがってｓｉＰＯＲＴ（商標）ＮｅｏＦＸ（商標）トランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ  カタログ番号ＡＭ４５１０）を使用してトランスフェクションする。非修飾コントロールまたは修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡを、例えば、１ｎＭまたは５ｎＭのいずれかの最終濃度になるように９６ウェル組織培養プレートにプレートする。ＳｉＰＯＲＴ（商標）ＮｅｏＦＸ（商標）トランスフェクション剤をｓｉＲＮＡと少なくとも１０分間複合体化し、その後にｓｉＲＮＡ／トランスフェクション剤複合体上に新たにトリプシン処理した細胞（約４．０×１０３）を重層する。プレートを、組織培養条件下にて３７℃で４８時間インキュベートする。
【０１０３】
トランスフェクションした細胞の回収後、製造者のプロトコールにしたがってＭａｇＭＡＸ（商標）−９６総ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ  カタログ番号ＡＭ１８３０）を使用して総ＲＮＡを単離する。ＲＮＡを５０μｌの無ヌクレアーゼ水中に溶出する。製造者のプロトコールにしたがってＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ，カタログ番号４３６８８１４）を使用して、反応体積３０μｌでｃＤＮＡを生成する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号４３３１１８２）を、総ＰＣＲ反応体積１０μｌで２μｌのｃＤＮＡを使用して行う。技術的複製物を生成し、各サンプルについての１８Ｓ値を計算する。増幅前の均一性を、以下の式：
ｄｄＣＴ＝（ｓｉＲＮＡ処置ＣｔＧＯＩ−ｓｉＲＮＡ処置Ｃｔ１８Ｓ）−（ＮｅｇコントロールＣｔＧＯＩ−ＮｅｇコントロールＣｔ１８Ｓ）
（式中、
ＧＯＩ＝目的の内因性遺伝子
１８Ｓ＝１８ＳリボゾームＲＮＡ正規化群
ｓｉＲＮＡ処置＝ｓｉＲＮＡで処置された生物サンプル
Ｎｅｇコントロール＝任意の公知の標的ｍＲＮＡと相同でないｓｉＲＮＡで処置した生物サンプル）
を使用したｄｄＣＴの計算によってチェックする。
残存率を、以下の式を使用して計算した：
残存率＝１００×２−（ｄｄＣＴ）
標的タンパク質レベルを、例えば、ウェスタンブロットによって、トランスフェクションから約７２時間後に（実際の時間はタンパク質代謝回転率に依存する）評価することができる。培養細胞からのＲＮＡおよび／またはタンパク質の標準的な単離技術は、当業者に周知である。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡの視覚化または検出技術には、上記で引用した技術が含まれる。核酸を標識またはタグ化して、効率的に単離することが可能である。したがって、任意の所与のｓｉＲＮＡのサイレンシング能力を、多数の試験手順のうちの１つによって研究することができる。
【０１０５】
本明細書中で使用する場合、「キット」は、ＲＮＡ干渉におけるオフターゲット効果の減少のための少なくともいくつかの品目の組み合わせをいう。キットの実施形態は、例えば、本明細書中の実施形態の修飾フォーマットの修飾ヌクレオチドを有する少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む。少なくとも１つのｓｉＲＮＡはオーダーメイドであり得る。いくつかの実施形態では、キットは、修飾フォーマットＨ、Ｑ、Ｖ−２、Ｙ、Ｙ＋１、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、またはＪＢ５のビシクロヌクレオチドを有する少なくとも１つのｓｉＲＮＡを生物学的に許容可能なキャリア（緩衝液など）およびトランスフェクション剤または他の適切な送達ビヒクルと共に含む。
【０１０６】
キットの実施形態は、ヒト、マウス、およびラットの全ての細胞型においてハウスキーピング遺伝子をターゲティングする有効なポジティブコントロールｓｉＲＮＡをさらに含むことができる。キットの実施形態は、ターゲティングしない有効なネガティブコントロールｓｉＲＮＡをさらに含むことができる。ｓｉＲＮＡコントロールを予めプレートし、検出可能なマーカーで標識することができる。
【０１０７】
キットの実施形態は、免疫蛍光またはウェスタン分析によってタンパク質レベルでノックダウンをモニタリングするための抗体などの意図する標的遺伝子のノックダウンを評価するための試薬、レポータータンパク質の酵素活性または存在を評価するための試薬、または細胞生存率の評価のための試薬をさらに含むことができる。標的ｍＲＮＡまたはレポーターｍＲＮＡの検出のためにＲＴ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブを含めることができる。キットの実施形態は、ＲＮアーゼインヒビターをさらに含むことができる。
【０１０８】
キットの容器手段には、一般に、成分を配置することができ、いくつかの実施形態では、適切に等分することができる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他のパッケージング手段が含まれるであろう。１つを超える成分をキットに含める（成分を共にパッケージングすることができる）場合、キットはまた、一般に、さらなる成分を個別に配置することができる少なくとも１つの第２、第３、または他のさらなる容器を含むであろう。しかし、成分の種々の組み合わせを、容器手段にパッケージングすることができる。本教示のキットはまた、典型的には、本明細書中に記載の修飾フォーマットの修飾ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡを含めるための手段および市販するために厳重に封じ込める任意の他の試薬容器を含むであろう。かかる容器は、所望の容器手段を保持する射出成形または吹き込み成形されたプラスチック容器を含むことができる。キットの成分を１つおよび／またはそれを超える液体で提供する場合、液体は滅菌水溶液であり得る水溶液を含む。
【０１０９】
一定の実施形態では、少なくとも１つのキット成分は、凍結乾燥され、乾燥粉末として提供される。試薬および／または成分を乾燥粉末として提供する場合、粉末を、適切な溶媒の添加によって再構成することができる。一定の実施形態では、溶媒を別の容器手段で提供する。キットは、無菌の生物学的に許容可能な緩衝液および／または他の希釈剤を含めるためのさらなる容器手段も含むことができる。
【０１１０】
キットは、キット成分およびキット中に含まれない任意の他の試薬の使用説明書も含むことができる。説明書は、実行可能に変化し得る。
【０１１１】
本発明の方法およびキット実施形態を、高容量スクリーニングのために使用することができる。ｓｉＲＮＡまたは候補ｓｉＲＮＡのいずれかのライブラリーを、本明細書中の実施形態を使用して構築することができる。次いで、このライブラリーを高処理アッセイ（マイクロアレイが含まれる）で使用することができる。多数の遺伝子を迅速且つ正確に分析するための定量法を含むチップベースの核酸テクノロジーが特に意図される。固定プローブアレイの使用により、チップテクノロジーを使用して高密度アレイとして標的分子を分離し、ハイブリッド形成に基づいてこれらの分子をスクリーニングすることができる。本明細書中で使用する場合、用語「アレイ」は、核酸の組織的な配列をいう。例えば、所望の供給源（例えば、成人ヒトの脳）を代表する核酸集団を、最小数のプールに分割し、プール中で所望のスクリーニング手順を使用して標的遺伝子を検出または枯渇させ、１つのマルチウェルプレートに分配することができる。アレイは、以下を含む所望のｍＲＮＡ供給源から得ることができる核酸集団の水性懸濁液のアレイであり得る：複数の個別のウェルを含むマルチウェルプレート（各ウェルは核酸集団の異なる内容物の水性懸濁液を含む）。アレイ、その使用、およびその実行の例を、米国特許第６，３２９，２０９号、同第６，３２９，１４０号、同第６，３２４，４７９号、同第６，３２２，９７１号、同第６，３１６，１９３号、同第６，３０９，８２３号、同第５，４１２，０８７号、同第５，４４５，９３４号、および同第５，７４４，３０５号（本明細書中で参考として援用される）で見出すことができる。
【０１１２】
マイクロアレイは当該分野で公知であり、遺伝子産物（例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ポリペプチド、およびそのフラグメント）に順に対応するプローブが公知の位置で特異的にハイブリッド形成または結合することができる表面からなる。１つの実施形態では、マイクロアレイは、各位置が遺伝子によってコードされる産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）の個別の結合部位を示し、生物ゲノム中の大部分またはほとんど全ての遺伝子産物の結合部位が存在するアレイ（すなわち、マトリックス）である。好ましい実施形態では、「結合部位」は、特定の同族ｃＤＮＡが特異的にハイブリッド形成することができる核酸または核酸アナログである。核酸または結合部位のアナログは、例えば、合成オリゴマー、全長ｃＤＮＡ、全長未満のｃＤＮＡ、または遺伝子フラグメントであり得る。
【０１１３】
固体支持体を、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または他の材料から作製することができる。核酸を表面に結合する方法の例には、ガラスプレート上のプリントまたはマスキングが含まれる。原則として、任意のアレイ型（例えば、ナイロンハイブリッド形成メンブレン上のドットブロット）を使用することができるが、当業者に認識されるように、ハイブリッド形成体積がより小さいので、非常に小さいアレイが好ましいであろう。
【０１１４】
本教示の実施形態を、以下の実施例を考慮してさらに理解することができるが、実施例が本教示の範囲を制限すると決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１５】
（実施例１）ｓｉＲＮＡ修飾フォーマット
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、標準的なホスホルアミダイトベースのヌクレオシド単量体および確立された固相オリゴマー形成サイクルを使用して、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３（４９）６１２３；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２（４８）２２２３）にしたがって化学合成した。ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成機（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｐ，Ｐｉａｎｏ，ＴＸ）によってオリゴヌクレオチドを合成した。アクチベーターの８つの等価物をＬＮＡ（登録商標）ホスホルアミダイトの全ての等価物について使用して、付加塩基あたり９８％超の収率の満足な段階的カップリングを行った。各ｓｉＲＮＡ鎖の精製を、使い捨ての逆相精製カートリッジまたはイオン交換ＨＰＬＣのいずれかを使用して行った。アニーリングしたサンプルの一本鎖構造と二本鎖構造とを判断するためにゲル電気泳動を使用し、一本鎖の純度を決定するためにイオン交換ＨＰＬＣを使用し、一本鎖の同一性を決定するためにＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用し、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡの両方の定量のためにＵＶ分光法を使用した。各ｓｉＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖は共に２１ヌクレオチド長であり、両３’末端上の２つの塩基オーバーハングを使用して全ｓｉＲＮＡをデザインした。各ガイド（アンチセンス）鎖の１位を、「Ａヌクレオチド」または「Ｕヌクレオチド」のいずれかであるようにデザインした。シチジン（Ｃ）ヌクレオシドをビシクロ−糖として修飾する場合、置換核酸塩基は、５−メチル化シチジン残基であった。ウリジン（Ｕ）ヌクレオシドをビシクロ−糖として修飾した場合、置換核酸塩基はチミン（Ｔ）残基であった。オーバーハンギングヌクレオチドは、図１Ａ〜図１Ｋに示すように、（独立して）：デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドである。フォーマット「Ｏ」の場合、ガイド鎖を化学的にリン酸化した。全ての他の３’末端および５’末端を、ヒドロキシル基を含むように合成した。
【０１１６】
ｓｉＲＮＡ分子に導入された修飾ヌクレオチドには、ロックド核酸（ＬＮＡ（登録商標）残基）（特に、上記構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有するもの）；２’−Ｏ−メチルヌクレオチド誘導体；および２’−５’結合ヌクレオチドが含まれる。ＬＮＡ（登録商標）アミダイトをＰｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）およびＥｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ（Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入し、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド誘導体ならびに３’−および２’−ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡアミダイトを、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。
【０１１７】
ｓｉＲＮＡに導入された修飾フォーマットには、図１Ａ（非修飾コントロールであるフォーマットＡに加えてフォーマットＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、およびＯ）、図１Ｂ（フォーマットＭ、Ｈ（反復）、Ｈ（−ｌ）、Ｈ（−２）、Ｈ（＋ｌ）、およびＱ）、図１Ｃ（フォーマットＭ（反復）、Ｈ（反復）Ｖ、Ｖ（−ｌ）、Ｖ（−２）、Ｖ（＋ｌ）、図ＩＤ（フォーマットＷ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ−１、およびＹ＋１）、図１Ｅ（フォーマットＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５）に記載の修飾フォーマット、ならびに実施例７にさらに記載されている図１Ｆ〜図１Ｋに記載の修飾フォーマットが含まれていた。
【０１１８】
修飾フォーマットには、パッセンジャー（センス）鎖のみ（フォーマットＥ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ＋１、Ｑ、Ｖ、Ｖ−１、Ｖ−２、Ｖ＋ｌ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ−１、Ｙ＋１、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、ＪＢ５、ＤＨ３、ＤＨ３０、およびＤＨ２８（ＤＨフォーマットについては実施例７を参照のこと））またはガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖の両方（フォーマットＦ、Ｇ、Ｊ、Ｏ、およびＤＨ３、ＤＨ３０、およびＤＨ２８以外の全てのＤＨフォーマット（ＤＨフォーマットについては実施例７を参照のこと））に対する修飾を含んでいた。図１Ａ〜図１Ｅの修飾フォーマットを、以下にさらに記載する。
【０１１９】
【数１】
2014097073.tif 000008
フォーマットＦは、Ｍｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｍａｒｃｈ，２００７６：３，８３３−８４３）によって以前に報告されている。フォーマットＥおよびＦは、Ｅｌｍｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊａｎｕａｒｙ  １４，２００５．３３：１，４３９−４４７）によって以前に報告されている。フォーマットＯは、Ｊａｃｋｓｏｎら（ＲＮＡ  Ｍａｙ  ８，２００６１２：７１１９７−１２０５）によって記載されている。
【０１２０】
（実施例２）ｓｉＲＮＡサイレンシング効果のアッセイ方法
外因的に得られた遺伝子についての所与のｓｉＲＮＡのガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖によって媒介される切断活性を、以下のようにアッセイした。目的の遺伝子（ＧＯＩ）由来のｃＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡリガーゼおよび標準的なクローニング技術を使用した遺伝子のＤＮＡのコード鎖の方向に対して順方向または逆方向のいずれかでｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ発現レポーターベクターシステム（Ａｍｂｉｏｎ／  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ  カタログ番号ＡＭ５７９５）にクローニングした。以下のＧＯＩについての全長ｃＤＮＡクローンをＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から購入した。
【０１２１】
【数２】
2014097073.tif 000009
ＧＯＩのコード配列のサイズは、１．２ｋｂから６ｋｂ長超までの範囲であった。各ＧＯＩ由来のｃＤＮＡフラグメントを、図２Ａに示す哺乳動物プロモーター／ターミネーター系の調節下でホタルルシフェラーゼレポータータンパク質を含むｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ発現レポーターベクターのＨｉｎｄＩＩＩ（ヌクレオチド４６３位）／ＳｐｅＩ（ヌクレオチド５２５位）マルチクローニング部位に個別にサブクローニングした。標準的なＰＣＲベースの技術を使用して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を操作した。図３Ａおよび図３Ｂに示すｆＬｕｃ  ｍＲＮＡに対して順方向および逆方法のいずれかでＧＯＩのｍＲＮＡに融合したルシフェラーゼｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ転写物を発現するレポーターベクターを生成した。ｆＬｕｃ−ＧＯＩ融合ｍＲＮＡを、ｆＬｕｃコード配列の５’開始部位の最も近くに存在するＣＭＶプロモーターの調節下で発現する。レポーター構築物をｆＬｕｃまたはｃＤＮＡ  ＧＯＩに相補的なｓｉＲＮＡと細胞に同時トランスフェクションする場合、ＲＮＡ干渉の結果としてのノックダウンを、残存ｆルシフェラーゼタンパク質または残存ｆＬｕｃ−ＧＯＩ融合ｍＲＮＡのいずれかの測定によってモニタリングする。各ＧＯＩの各方向由来の全てのサブクローニングしたフラグメントの５’および３’末端の５００ヌクレオチドをヌクレオチド配列分析に供してベクター内に含まれるｃＤＮＡの同一性および方向を検証した。したがって、これらのベクターは、ガイド鎖（順方向クローン）またはパッセンジャー鎖（逆方向クローン）のいずれかによって媒介されるｓｉＲＮＡ切断のモニタリングのための代替物の供給源としての機能を果たした。
【０１２２】
図２Ｂに示すｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）β−ガラクトシダーゼレポーターコントロールベクター（Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｉｎ
ＴＸ  カタログ番号＃ＡＭ５７９５）を、トランスフェクション効率の正規化のための製造者のプロトコールにしたがって使用した。β−ｇａｌコード配列を、ＣＭＶプロモーターの調節下で発現させる。ｆＬｕｃレポーターから得たシグナルを、各β−ｇａｌレポーター遺伝子から得たシグナルで割って各アッセイについての正規化ルシフェラーゼ活性を計算する。
【０１２３】
トランスフェクション：Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、ウェルあたり約８．０×１０３細胞の密度で９６ウェル組織培養プレートにプレートした。２４時間後、ｓｉＰＯＲＴ（商標）アミントランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ  カタログ番号ＡＭ４５０２）を最終濃度が３０ｎＭの調査対象のｓｉＲＮＡ，４０ｎｇのｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼ−ＧＯＩプラスミド、および４ｎｇのｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）トランスフェクションコントロールプラスミドと共に標準的なトランスフェクションプロトコールを使用して細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を完全培地で洗浄し、トランスフェクションから４８時間後に分析のために回収した。３つの生物学的複製物を、各プラスミドの調査対象の各ｓｉＲＮＡについて試験した。並行して、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ／  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ  カタログ番号ＡＭ４６３６）を、同一の実験条件下でトランスフェクションして、試験ｓｉＲＮＡ由来のパッセンジャー鎖およびガイド鎖によるｍＲＮＡノックダウン率の計算のための非ターゲティングｓｉＲＮＡを使用した基本発現レベルを測定した。
【０１２４】
Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）組み合わせレポーター遺伝子アッセイ系：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）組み合わせレポーター遺伝子アッセイシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ  カタログ番号Ｔ１００３）を使用して、製造者が推奨するプロトコールにしたがって、同一サンプル中のルシフェラーゼおよびβ−ｇａｌを同時に検出した。ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して発光を読み取った。
【０１２５】
Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）アッセイシステムへのルシフェリン基質添加の２〜５秒後にルシフェラーゼアッセイを行った。プレートを少なくとも４５分間静置後、β−ガラクトシダーゼの検出および測定のための基質を添加した。適切なβ−ｇａｌ読み取りを使用して各ウェルを正規化して、ルシフェラーゼシグナル／β−ｇａｌシグナル比を得た。次いで、ルシフェラーゼ発現のノックダウンまたは残存率を、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクションした細胞に対する生物サンプルの正規化によって計算した。
【０１２６】
（実施例３）ｓｉＲＮＡ修飾フォーマットのサイレンシング効果を鎖スイッチングすることができる
本研究のために、３つの外因的に得た各標的ｍＲＮＡのために２つのｓｉＲＮＡを非修飾フォーマットＡおよび８つの異なる各試験修飾フォーマット（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯ）で合成した。したがって、各試験フォーマットにより、６つのｓｉＲＮＡのデータが得られる。図４Ａ〜図４Ｅのデータについて、図１Ａおよび図１Ｂを参照してフォーマットの文字によって示した位置の修飾ヌクレオチド「ｍ」は、上記構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有するＬＮＡ（登録商標）残基であった。図４Ａに例示した本研究のために選択したｓｉＲＮＡを、両鎖の一部に対して鎖サイレンシング活性を有すると実験的に判断した。かかる集団により、ストランドバイアス（すなわち、一方の鎖のサイレンシング活性を損なう一方で他方の鎖の活性を保持する能力）を導入するための修飾を有する影響の分析が可能になった。このｓｉＲＮＡ集団について、非修飾ガイド鎖によって媒介されたルシフェラーゼ−ＧＯＩ  ｍＲＮＡの、平均して約７０％ノックダウンが証明され、非修飾パッセンジャー鎖によって媒介されたルシフェラーゼ−ＧＯＩ  ｍＲＮＡの、平均して約５８％ノックダウンが証明された（図４Ａ、フォーマットＡ）。
【０１２７】
非修飾フォーマットＡおよび各試験修飾フォーマット（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯ）についてのＲＮＡｉ研究実施後の正規化したレポータータンパク質の存在量を図４Ａにプロットする。データが順方向のＧＯＩを有するクローンに起因するので、暗色のバーはガイド鎖によるサイレンシングに起因する活性の残存率を示す。データが逆方向のＧＯＩを有するクローンに起因するので、図４Ａの明色のバーはパッセンジャー鎖のサイレンシングに起因する活性の残存率を示す。スクランブルした（ナンセンス）ｓｉＲＮＡと並行したトランスフェクションによって正規化し、そのトランスフェクションにより、両鎖に少量のノックダウンが得られる。このシグナルの減少（約２０％）により、全ての正規化した結果についてレポータータンパク質が見かけ上増加する。これは、正規化がナンセンスｓｉＲＮＡの負の値に基づくからである。この見かけ上の増加は、修飾標識Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯのパッセンジャー鎖データで最も顕著である。このモデルレポーター系は、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の活性の変化の検出で有用である。
【０１２８】
図４Ａのデータは、修飾フォーマットＥ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、およびＯを有するｓｉＲＮＡのガイド（アンチセンス）鎖がコントロールフォーマットＡガイド鎖と同一のサイレンシング活性を本質的に達成したことを証明している。修飾フォーマットＧおよびＪの存在下で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖がその標的をサイレンシングする能力が低下し、フォーマットＪの場合、ｓｉＲＮＡのガイド鎖がその標的をサイレンシングする能力が平均して２０％ノックダウン活性未満に低下した。
【０１２９】
図４Ａに示した修飾フォーマットの大部分によって非修飾コントロールガイド鎖と類似のガイド（アンチセンス）鎖媒介切断が得られる一方で、全ての試験修飾フォーマットは、パッセンジャー鎖がその標的をサイレンシングする能力を激しく妨害され、本質的にパッセンジャー鎖が干渉活性に不活性にされる。
【０１３０】
鎖活性に及ぼす修飾フォーマットの影響をさらに試験するために、鎖数アッセイのために使用されるｓｉＲＮＡ組を、さらなる１８ｓｉＲＮＡを含めるために拡大した。図４Ｂ〜図４Ｅのデータは、箱ひげプロットとも呼ばれるボックスプロットフォーマットでのより大きなｓｉＲＮＡ集団のアッセイ結果を示す。各プロットについて、暗色の横線は各修飾フォーマットについてのデータセットの中央値を示す。ボックスは各修飾フォーマットのデータセットの下位四分位点および上位四分位点でのデータの分布を示す一方で、点線（髭）は各修飾フォーマットのデータセットの最小値および最大値を示す。円は各修飾フォーマットのデータセットで起こり得る外れ値を示す。
【０１３１】
このより大きなｓｉＲＮＡ組のｓｉＲＮＡのＨｅｌａ細胞におけるトランスフェクション後のパッセンジャー鎖の活性を図４Ｂに示す。以下の式を使用して活性を計算する：Ｐ（パッセンジャー鎖活性）＝（試験ｓｉＲＮＡ  β−ｇａｌ活性で処理した逆方向クローン由来のｆＬＵＣ残存）／（ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ  β−ｇａｌ活性で処理した逆方向クローン由来のｆＬＵＣ残存）。図４Ｂのデータは、フォーマットＡと比較した場合のパッセンジャー鎖ノックダウン活性の中央値の上方へのシフトによって認められる修飾ｓｉＲＮＡフォーマットのパッセンジャー鎖の活性の喪失を証明している。修飾フォーマットＧ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯのデータは統計的に有意であるので（ｐ＜０．０５）、修飾フォーマットがパッセンジャー鎖活性の減少に有効であることが証明された。
【０１３２】
図４Ｂのために分析したｓｉＲＮＡ組のＨｅｌａ細胞におけるトランスフェクション後のガイド鎖の活性を図４Ｃに示す。以下の式を使用して活性を計算する：Ｇ（ガイド鎖活性）＝（試験ｓｉＲＮＡ  β−ｇａｌ活性で処理した順方向クローン由来のｆＬＵＣ残存）／（ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ／β−ｇａｌ活性で処理した順方向クローン由来のｆＬＵＣ残存）。フォーマットＥ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、およびＯは、ガイド鎖の活性に負の影響を及ぼさなかった（すなわち、「害さない」）。フォーマットＥは、非修飾フォーマットＡと比較してガイド鎖活性の中央値の下方のシフトによって示される統計的に有意な様式でガイド鎖がルシフェラーゼシグナルを減少させる能力を増加させるようである。フォーマットＡの非修飾ｓｉＲＮＡと比較してこれらのフォーマットについての中央値の上方へのシフト（ｐ＜０．０５）によって証明されるように、修飾フォーマットＧ、Ｊ、およびＫはガイド鎖活性を減少させた。
【０１３３】
図４Ｄのデータは、以下の式を使用して図４Ｂおよび図４Ｃのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間のｆＬＵＣ活性の相違を示す：活性の相違＝Ｐ−Ｇ（上記のＰおよびＧの定義を使用）。ｆＬＵＣレポーターアッセイは細胞におけるｓｉＲＮＡトランスフェクション後のｆルシフェラーゼ活性量を測定するので、活性なｓｉＲＮＡ鎖の活性が高いほどより多数の各ｆＬＵＣレポーターｍＲＮＡをノックダウンし、それにより、ルシフェラーゼ活性の相対量が減少する。したがって、パッセンジャー鎖の活性がガイド鎖より低い場合、この活性相違の計算値は０を超えるであろう。パッセンジャー鎖の活性がガイド鎖より高い場合、値は０未満であろう。修飾フォーマットＪにより、２つの試験ｓｉＲＮＡ鎖間の活性の相違が減少した。
【０１３４】
図４Ｅのデータは、図４Ｂおよび図４ＣのｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率を示す。活性の変化倍率を、上記のＰおよびＧの定義を使用してｌｏｇ２（Ｐ）−ｌｏｇ２（Ｇ）として計算した。値０は、各鎖が等しいサイレンシング能力を有するｓｉＲＮＡを示す。活性の変化倍率が高いほど、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の偏りが大きい。図４Ｅのボックスプロットの比較により、パッセンジャー鎖とガイド鎖との間のストランドバイアスが、コントロール非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットＡと比較して、修飾フォーマットＥ、Ｈ、Ｍ、およびＯについて有意に増強される（ｐ＜０．０５）ことが証明される。したがって、修飾フォーマットＥ、Ｈ、Ｍ、およびＯを有するｓｉＲＮＡは、非修飾フォーマットＡと比較して鎖数が増加した。フォーマットＧ、Ｊ、およびＫは、パッセンジャー鎖とガイド鎖との間の相違倍率がより低いが、フォーマットＪのみはフォーマットＡと比較して活性の変化倍率が有意に減少した。もっとも高い各ストランドバイアスは、フォーマットＨによって証明された。
【０１３５】
修飾フォーマットが各修飾フォーマットについてパッセンジャー鎖からガイド鎖へおよびガイド鎖からパッセンジャー鎖への修飾フォーマットの鎖スイッチング（ＳＷ）によって極めて強力なｓｉＲＮＡ鎖のサイレンシング活性に影響を及ぼす能力を試験するための研究を行った。すなわち、図５Ａの修飾フォーマットＦＳＷについて、例えば、パッセンジャー（センス）鎖の１位、２０位、および２１位でのフォーマットＦの修飾（図１Ａ）をガイド（アンチセンス）鎖に導入し、ガイド（アンチセンス）鎖の２０位および２１位でのフォーマットＦの修飾（図１Ａ）をパッセンジャー（センス）鎖に導入した。
【０１３６】
図５Ａのデータは、ＲＮＡｉ研究の実施後の正規化したレポータータンパク質の存在量を、非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットＡを有する１２のｓｉＲＮＡおよび図４Ａと比較してスイッチングされた鎖の修飾を有する同一の１２のｓｉＲＮＡについてプロットする鎖アッセイの結果を示す。非フォーマット化フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡのガイド鎖とパッセンジャー鎖との間のｆＬＵＣシグナルの残存率の大きな相違によって証明されるように、図５ＡのデータについてのｓｉＲＮＡがストランドバイアスを有するという点で、図５Ａのデータについて研究したｓｉＲＮＡ組は、図４Ａのデータについて研究した組と異なる。この「鎖スイッチング」アッセイでノックダウンを測定するために使用された実験条件は、図４Ａのデータを作成するために使用された実験条件と同一であった。
【０１３７】
図５Ａのデータによって示されるように、ガイド鎖のサイレンシング活性は、鎖スイッチングされた修飾によって劇的に減少した。平均して、鎖スイッチングされた修飾フォーマットを有するガイド鎖は、２０％未満ノックダウンされた。鎖スイッチングされた修飾フォーマットＨＳＷは、このｓｉＲＮＡ集団のガイド（アンチセンス）鎖を不活化するための最も強力な修飾フォーマットの１つであった。
【０１３８】
鎖スイッチングされた修飾フォーマットを有する試験パッセンジャー鎖によって種々の結果が得られた。しかし、鎖スイッチングされた修飾フォーマットを有する全ての試験パッセンジャー鎖は、図５ＡにおいてフォーマットＡの非修飾ｓｉＲＮＡよりもノックダウンに有効であった。理論に拘束されることを望まないが、鎖スイッチングされた修飾フォーマットでのパッセンジャー鎖によって達成されるノックダウンの増強によって示唆されるように、ガイド鎖効力の妨害の結果として、パッセンジャー鎖の効力を間接的または二次的に増強することが可能である。
【０１３９】
図５Ｂは、フォーマットが図４Ｄに関して上に記載されているボックスプロットフォーマットでの図５Ａのデータを示す。したがって、パッセンジャー鎖の活性がガイド鎖の活性より低い場合、相違は０を超えると予想され、この相違は修飾フォーマットＡによって証明され、このｓｉＲＮＡ集団についての活性相違の中央値は約０．６５である。鎖スイッチングされた修飾フォーマットは０未満の活性相違を有し、これは、フォーマットＨＳＷ、ＭＳＷ、ＦＳＷ、ＥＳＷ、およびＯＳＷが非修飾フォーマットＡと比較してガイド鎖よりもむしろパッセンジャー鎖を好むように鎖数をスイッチングさせたことを示す。もっとも高い鎖数の増強は鎖スイッチングされた修飾フォーマットＭＳＷについて認められ、活性相違の中央値は約約−０．５である。
【０１４０】
図５ＢのｓｉＲＮＡについてのパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率（ｌｏｇ２（Ｐ）−ｌｏｇ２（Ｇ））を、図５Ｃ中の各修飾フォーマットについて示す。これらの結果は、ガイド鎖にノックダウン活性を付与し、且つパッセンジャー鎖を本質的に不活性化する修飾フォーマットが、鎖スイッチングした場合に、ガイド鎖のノックダウン活性を減少させ、且つパッセンジャー鎖のノックダウン活性を増加させることができることを示す。
【０１４１】
図４Ａおよび図４Ｄに類似の研究（ＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドを使用）を、修飾ヌクレオチドが２’−Ｏメチル化された種々の修飾フォーマットを使用して行った。本研究のために、３つの各標的ｍＲＮＡについて２つのｓｉＲＮＡを非修飾フォーマットＡおよび各試験フォーマットで合成した。したがって、各試験フォーマットから６つのｓｉＲＮＡのデータが得られる。図４Ａの研究に関して、本研究のために選択した特定のｓｉＲＮＡ配列は、非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡの両鎖がサイレンシングを示したｓｉＲＮＡ配列である。非修飾ｓｉＲＮＡのガイド（アンチセンス）鎖は、平均して７０％まで標的ｍＲＮＡを減少させる一方で、パッセンジャー（センス）鎖は５５％まで標的ｍＲＮＡを減少させた。
【０１４２】
パッセンジャー（センス）鎖活性に関して、図６Ａのデータは、本質的に全てのｍＲＮＡ産物が培養下でのｓｉＲＮＡとのインキュベーションの４８時間後のルシフェラーゼアッセイに利用可能であることを証明する。すなわち、これらのサンプルにおける遺伝子発現の残存率の増加によって示されるように、修飾ヌクレオチドが２’−Ｏメチル化された修飾フォーマットを有する試験ｓｉＲＮＡにより、パッセンジャー（センス）鎖の効力の有意な喪失が証明される。ノックダウンに対するこのパッセンジャー鎖の不活性は、ＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドを使用した修飾フォーマットのデータと一致する。ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｋ、およびＯのデータとも一致して、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを有する修飾フォーマットＨ、Ｋ、およびＯを有するガイド鎖の効力は、非修飾コントロールフォーマットＡと比較して本質的に不変であった。したがって、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する修飾フォーマットは、ガイド（アンチセンス）鎖活性の維持に有効なようである一方で、標的を外因的に得たこれらの鎖アッセイにおいてパッセンジャー（センス）鎖の切断活性を無効にする。
【０１４３】
図６Ｂは、ボックスプロットフォーマットでの図６Ａのために研究したｓｉＲＮＡ（６つのｓｉＲＮＡ）およびさらなる１８のｓｉＲＮＡ配列のデータを示す。フォーマットＡ群の活性の相違は、大部分のｓｉＲＮＡがガイド鎖に偏る（約０．５の中央値で示す）ことを示す。しかし、示した修飾フォーマットで２’ＯＭｅを使用して生成したｓｉＲＮＡは、コントロールフォーマットＡと比較した場合にパッセンジャー鎖とガイド鎖との間でより大きな相違が証明された。フォーマットＨおよびＨ＋１により、鎖間に最も大きな相違が誘導された。２’−ＯＭｅ修飾塩基を有するフォーマットＯは、鎖間の活性の相違を増大させることができなかった。
【０１４４】
上述のように計算したガイド鎖と比較したパッセンジャー鎖の活性の変化倍率を図６Ｃに示す。変化倍率分析は、フォーマットＨによってフォーマットＡの非修飾ｓｉＲＮＡと比較して最も大きな変化倍率が得られることを示した。しかし、図６Ｃの説明で引用されたウィルコクソン値によって判断したところ、鎖間の活性の有意な変化倍率は、フォーマットＨ−１、Ｈ、Ｈ＋１、Ｖ−２、およびＫによっても認められたが、フォーマットＯによって認められなかった。
【０１４５】
第３の修飾ヌクレオチド型を、種々の修飾フォーマットで研究した。図７Ａは、修飾フォーマットの修飾ヌクレオチドが２’，５’結合ヌクレオチドであった鎖アッセイの結果を示す。順方向および逆方向でクローン化したＧＯＩのｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）研究由来のｆＬＵＣシグナルの活性の相違（それにより、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の有効性およびノックダウン活性の相違を示す）を、非修飾フォーマットＡおよび試験フォーマットＨ−１、Ｈ、Ｈ＋１、Ｖ−２、Ｋ、およびＯについてプロットする。非修飾コントロールフォーマットＡの鎖数の結果と２’，５’結合塩基を含む試験フォーマットの結果との比較は、ｓｉＲＮＡの鎖数の統計的に有意である変化がフォーマットＯを除いた２’、５’結合塩基修飾を含めることによって得られなかったことを示した。２’−５’結合塩基修飾を有するフォーマットＯは活性の相違を減少させ、このことは、統計的に有意な様式でのガイド鎖のノックダウン活性の喪失を示す。
【０１４６】
上述のように計算したパッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率を図７Ｂに示す。パッセンジャー鎖とガイド鎖との間の活性の変化倍率の減少によって示されるように、変化倍率分析は２’−５’結合核酸を含むフォーマットＯが負の方向でｓｉＲＮＡの鎖数に影響を及ぼすことを示した。さらに、フォーマットＨ−１、Ｈ＋１、Ｖ−２、およびＫでの２’−５’結合核酸由来のデータは統計的に有意でないので、これらのフォーマットはｓｉＲＮＡの鎖数の改善に適切ではない。図７Ｂの説明で引用されたウィルコクソン値によって判断したところ、２’−５’塩基修飾で修飾したフォーマットＨのみが、鎖数の統計的に有意な増加を示した。
【０１４７】
ガイド鎖とパッセンジャー鎖との切断活性の相違に関する統計分析は、図４Ａおよび図６Ａのデータに基づいて、ストランドバイアスの最も大きな変化が修飾フォーマットＨでＬＮＡ（登録商標）および２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドによって導入されたことを証明した。鎖数分析はまた、フォーマットＧ、フォーマットＪ、およびフォーマットＫが統計的に有意な様式でガイド鎖の活性を減少させたことを証明した。したがって、これらを、ｓｉＲＮＡ特異性の増強のための次の検討材料からはずした。図４Ａのデータによって証明されるように、ＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドを有するフォーマットＨは、平均してパッセンジャー鎖の８倍のガイド鎖の切断活性の相違を誘導した。比較すると、非修飾コントロールフォーマットＡは、平均してパッセンジャー鎖の４倍のガイド鎖活性の増加が証明された。したがって、フォーマットＨ修飾は、至適にデザインしたｓｉＲＮＡ中に通常存在するストランドバイアスを倍増させた。
【０１４８】
さらに、これらのデータは、ＬＮＡ（登録商標）修飾残基を有する鎖スイッチングされたフォーマットがパッセンジャー鎖を不活化するのと同様の効率でガイド鎖を不活化することができることを証明した。
【０１４９】
図１２Ａ−１および図１２Ａ−２のデータは、表示のフォーマットのＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドを含むように生成した１２のｓｉＲＮＡのノックダウン活性を示す。試験群の鎖数は、大部分のｓｉＲＮＡがより高い活性のガイド鎖に非対称に偏っていることを示す（図１２Ａ−１のフォーマットＡの活性相違の中央値０．５によって示される）。しかし、修飾フォーマットおよびＬＮＡ（登録商標）残基を使用して生成したｓｉＲＮＡは、非修飾フォーマットＡと比較してパッセンジャー鎖とガイド鎖活性との間により大きな相違が証明された。フォーマットＨ修飾フォーマットは、統計的に有意な様式で鎖間の活性の相違を増強したが、図１２Ａ−２のデータによって示されるように、活性の変化倍率は有意ではなかった。
【０１５０】
図１３Ａ−１および図１３Ａ−２のデータは、表示のフォーマットで２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含むように生成したｓｉＲＮＡを示す。図１３Ａ−１の活性相違の中央値０．５によって証明されるように、試験群の鎖数は、大部分のｓｉＲＮＡがより高い活性のガイド鎖に非対称に偏っていることを示す。しかし、図１３Ａ−２に示すように、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを使用して生成したｓｉＲＮＡは、非修飾コントロールフォーマットＡと比較してパッセンジャー鎖とガイド鎖活性との間により大きな変化倍率が証明された。フォーマットＨ、Ｋ、およびＶ−２は、鎖間に最も巨大且つ統計的に有意な変化倍率を誘導した（ｐ＜０．０５）。フォーマットＯを除く全フォーマットのデータは、非修飾ｓｉＲＮＡと比較して統計的に有意であった。
【０１５１】
（実施例４）内因性遺伝子のサイレンシングに及ぼすｓｉＲＮＡ修飾フォーマットの影響
修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡによる内因性遺伝子のサイレンシングを試験して、修飾フォーマットがそのｍＲＮＡ標的をノックダウンするようにｓｉＲＮＡの有効性を変化させたかどうかを決定した。本研究のために、内因性遺伝子のノックダウンを、Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、Ｕ２ＯＳ細胞（ヒト骨肉腫細胞株、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−９６）、およびＨＵＨ７細胞（ヒト肝細胞癌細胞株、番号ＪＣＲＢ  ０４０３，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｂａｎｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）への低濃度の修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡのトランスフェクションによって試験した。Ｈｅｌａ細胞データを本明細書中で考察する。
【０１５２】
製造者によって説明された「逆方向」トランスフェクションプロトコールを使用したｓｉＰＯＲＴ（商標）ＮｅｏＦＸ（商標）トランスフェクション剤（Ａｍｂｉｏｎ／  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ  カタログ番号ＡＭ４５１０）を使用して、Ｈｅｌａ細胞をトランスフェクションした。非修飾コントロールまたは修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡを、１ｎＭまたは５ｎＭのいずれかの最終濃度になるように９６ウェル組織培養プレートにプレートした。ＳｉＰＯＲＴ（商標）ＮｅｏＦＸ（商標）トランスフェクション剤をｓｉＲＮＡと少なくとも１０分間複合体化し、その後に新たにトリプシン処理したＨｅｌａ細胞（約４．０×１０３細胞）をｓｉＲＮＡ／トランスフェクション剤複合体上に重層した。プレートを、組織培養条件下にて３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１５３】
製造者によって説明された「順方向」トランスフェクションプロトコールを使用したＨｙＰｅｒＦｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション剤（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）を使用して、Ｕ２ＯＳ細胞をトランスフェクションした。非修飾コントロールまたは修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡを、３ｎＭまたは３０ｎＭのいずれかの最終濃度になるように９６ウェル組織培養プレートにプレートした。ＨｙＰｅｒＦｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション剤をｓｉＲＮＡと少なくとも１０分間複合体化し、複合体を培養液中のＵ２ＯＳ細胞（約４．０×１０３）に添加した。プレートを、組織培養条件下にて３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１５４】
トランスフェクションした細胞の回収後、製造者のプロトコールにしたがってＭａｇＭＡＸ（商標）−９６総ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ  カタログ番号ＡＭ１８３０）を使用して総ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを５０μｌの無ヌクレアーゼ水で溶出した。製造者のプロトコールにしたがってＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ
ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ，カタログ番号４３６８８１４）を使用して、反応体積３０μｌでｃＤＮＡを生成した。２μｌのｃＤＮＡを使用して全ＰＣＲ反応体積１０μｌでＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号４３３１１８２）を行った。技術的複製物を生成し、各サンプルの１８Ｓ値を計算した。予備増幅の均一性を、上記式を使用したｄｄＣＴの計算によってチェックした。
【０１５５】
以下の式を使用して残存率を計算した：残存率＝１００×２−（ｄｄＣＴ）。
【０１５６】
ｍＲＮＡノックダウン比を、以下の式を使用して計算した：
ｍＲＮＡノックダウン比＝１−（２−（ｄｄＣＴ））および
ｍＲＮＡノックダウン率＝ｍＲＮＡノックダウン比×１００
このノックダウン研究のために、８つの各内因性標的ｍＲＮＡのための６つのｓｉＲＮＡを、非修飾フォーマットＡおよび８つの試験修飾フォーマットＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯで合成した。したがって、各試験フォーマットにより、４８のｓｉＲＮＡのデータが得られる。図８のデータについて、図１Ａ〜図１Ｃを参照してフォーマットの文字によって示した位置の修飾ヌクレオチド「ｍ」は、上記構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有するＬＮＡ（登録商標）残基であった。
【０１５７】
図８は、最終濃度５ｎＭの修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡでのＨｅｌａ細胞における内因性ｍＲＮＡ標的のサイレンシングおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを使用したトランスフェクションから４８時間後の標的のノックダウン率のアッセイについてのデータを示す。これらの研究由来の結果は、フォーマットＧ、Ｊ、およびＫで修飾フォーマットしたＬＮＡ（登録商標）を含むｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡのノックダウン活性を損なう一方で、フォーマットＥ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、およびＯで修飾フォーマットしたＬＮＡ（登録商標）を含むｓｉＲＮＡが非修飾フォーマットＡ群で認められたノックダウンと比較してノックダウンを維持または増加させることを証明する。したがって、種々の位置でＬＮＡ（登録商標）残基を有するいくつかの修飾フォーマットは、ｓｉＲＮＡのノックダウン活性に負の影響を及ぼさなかったが、ガイド鎖対パッセンジャー鎖の鎖数を増強するのに十分であった。ヒト肝細胞癌細胞（ＨＵＨ７）およびヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）中のこのＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡ集団におけるｓｉＲＮＡのノックダウン活性も決定した。これらの細胞株では、各修飾フォーマットのＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡは、異なるトランスフェクション効率を考慮してＨｅＬａ細胞で認められるものと類似のノックダウン活性を示した（データ示さず）。したがって、サイレンシング能力は、使用した細胞株型に影響を受けなかった。
【０１５８】
ＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドを使用した修飾フォーマットＨ、Ｈ−２、Ｈ−１、Ｈ＋１、Ｑ、Ｋ、Ｖ、Ｖ−１、およびＶ−２についてのさらなるノックダウン活性データを図１２Ｂに示す。このデータセットは、４つの異なる内因性ｍＲＮＡ標的をターゲティングする２４の異なるｓｉＲＮＡを示す。２４の各ｓｉＲＮＡを各フォーマットで合成し、各群におけるｓｉＲＮＡのノックダウンを同様に分析した。最終濃度５ｎＭでＨｅｌａ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後にＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを用いてアッセイを行った。結果はフォーマットＫおよびＶ−２でのｓｉＲＮＡのノックダウン活性のわずかな減少を示しているが、これは、非修飾ｓｉＲＮＡから統計的に有意ではない。修飾フォーマットＨ、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ＋１、Ｑ、Ｖ、およびＶ−１は、非修飾ｓｉＲＮＡ群で認められたノックダウン活性と比較してｍＲＮＡ標的のノックダウン活性を維持または増加させた。
【０１５９】
図１３Ｂのデータは、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを使用した修飾フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｋ、Ｖ−２、およびＯのノックダウン活性を示す。このデータセットは、４つの異なる内因性ｍＲＮＡ標的をターゲティングする２４の異なるｓｉＲＮＡを示す。２４の各ｓｉＲＮＡを各フォーマットで合成し、各群におけるｓｉＲＮＡのノックダウンを同様に分析した。最終濃度５ｎＭでＨｅｌａ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後にＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを用いてアッセイを行った。結果は、修飾フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｋ、Ｖ−２、およびＯが非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡで認められたノックダウンと比較してノックダウンを維持または増加させることを証明している。
【０１６０】
フォーマットＡと比較したＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドを使用した修飾フォーマットＨ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１についてのさらなるデータを図１４Ａに示す。このデータセットは、５つの異なる内因性ｍＲＮＡ標的をターゲティングする１５の異なるｓｉＲＮＡを示す。１５の各ｓｉＲＮＡを表示のフォーマットで合成し、各群におけるｓｉＲＮＡのノックダウンを同様に分析した。最終濃度３０ｎＭでＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後にＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを用いてアッセイを行った。結果は、ＬＮＡ（登録商標）残基で修飾した修飾フォーマットＷ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１を有するｓｉＲＮＡが非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットＡと比較してノックダウン活性を維持することを証明している。共に統計的に有意な様式で、修飾フォーマットＭを有するｓｉＲＮＡは非修飾フォーマットＡを有するｓｉＲＮＡと比較してノックダウン活性が損なわれ、修飾フォーマットＨを有するｓｉＲＮＡは非修飾フォーマットＡを有するｓｉＲＮＡと比較してノックダウン活性を改善する。
【０１６１】
図１４Ｂのデータは、フォーマットＡと比較したＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドを使用した修飾フォーマットＨ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５のノックダウン活性を示す。このデータセットは、５つの異なる内因性ｍＲＮＡ標的をターゲティングする１５の異なるｓｉＲＮＡを示す。１５の各ｓｉＲＮＡを表示のフォーマットで合成し、各群におけるｓｉＲＮＡのノックダウンを同様に分析した。最終濃度３０ｎＭでＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後にＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを用いてアッセイを行った。結果は、修飾フォーマットＪＢ２、ＪＢ３、およびＪＢ５を有するｓｉＲＮＡがノックダウン活性に関して非修飾フォーマットＡと統計的に有意に異ならず、フォーマットＨ、ＪＢ１、およびＪＢ４を有するｓｉＲＮＡがフォーマットＡと比較した場合にノックダウン活性を改善し、フォーマットＭを有するｓｉＲＮＡがフォーマットＡと比較した場合にノックダウン活性がより低いことを証明している。
【０１６２】
本実施例で試験したｓｉＲＮＡ修飾フォーマットのうち、フォーマットＧ、Ｊ、Ｋ、およびＭは、非修飾フォーマットと比較した場合にノックダウン活性を損なわせる。
【０１６３】
（実施例５）オフターゲット効果の指標としての大域遺伝子発現プロファイリングに及ぼす修飾フォーマットＨを有するｓｉＲＮＡの影響
フォーマットＨのＬＮＡ（登録商標）および２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが異なって発現される遺伝子の特徴に影響を及ぼす能力を、マイクロアレイ分析を使用した遺伝子プロフィールの測定によって非修飾ｓｉＲＮＡと比較した。ＦＤＦＴ１遺伝子をターゲティングするようにデザインされた４つのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした四連の生物サンプルに対してマイクロアレイゲノム分析を行った。ＦＤＦＴ１はコレステロール
生合成に関与するが、試験用の細胞に不可欠ではない遺伝子である。この基準は、アレイ分析によって検出可能な遺伝子発現の相違は機能的ｍＲＮＡ標的の喪失に起因する任意の生物学的カスケードの結果よりもむしろｓｉＲＮＡによって媒介された切断のみによる結果であることを確認する。
【０１６４】
３つの各ｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ番号１８３、番号１８４、および番号１９２と命名）を、上記で概説した標準的手順を使用して非修飾フォーマットＡ、ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、および２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨでＨｅｌａ細胞に個別にトランスフェクションし、２４時間後にトランスフェクションされた細胞を回収した。ＲＮＡを、マイクロアレイ分析のために標準的手順を使用して単離した。ヒトプローブセットを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＵ１３３  Ｖ２マイクロアレイチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を、これらの研究のために使用した。コントロールには、試験治療を欠く場合に遺伝子発現のベースラインレベルを記録するためのネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、「偽」トランスフェクションされた細胞、および無処理細胞が含まれていた。データの正規化後、結果を分析して、偽（送達因子のみ）コントロールサンプルの結果と比較して各サンプル組で２倍以上変化した遺伝子の同一性を決定した。次いで、計画比較を使用した一元配置分散分析を使用して、各偽処理条件対実験条件についてのｐ値を決定した。次いで、異なって発現される遺伝子プローブ組を、ｐ＜０．００１での２倍変化と定義した。異なって発現される遺伝子の数は、ｓｉＲＮＡによるオフターゲット効果の基準である。
【０１６５】
図９Ａ〜図９Ｃは、ｓｉＲＮＡ番号１８３（図９Ａ）、ｓｉＲＮＡ番号１８４（図９Ｂ）、およびｓｉＲＮＡ番号１９２（図９Ｃ）（ＦＤＦＴ１遺伝子をターゲティングするようにデザインされた３つの異なるｓｉＲＮＡ）の結果のベン図を示す。各図は、表示の非修飾ｓｉＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡ、またはＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡにおける３つのｓｉＲＮＡのうちの１つの結果を示す。ベン図は、各実験条件で変化した特定の遺伝子の数およびｓｉＲＮＡ条件間の遺伝子の共通部分を示す。各図について、左下の組（カラー表示の場合赤色）は非修飾ｓｉＲＮＡで処理されたサンプルにおける２倍以上変化した特定の遺伝子の数を示し、上の組（カラー表示の場合青色）は２’−Ｏ−メチルフォーマットＨ修飾ｓｉＲＮＡで処理されたサンプルにおける２倍以上変化した特定の遺伝子の数を示し、右下の組（カラー表示の場合緑色）はＬＮＡ（登録商標）フォーマットＨ修飾ｓｉＲＮＡで処理されたサンプルにおける２倍以上変化した特定の遺伝子の数を示す。
【０１６６】
ｓｉＲＮＡ番号１８３（図９Ａ）について、非修飾ｓｉＲＮＡは３１個の遺伝子（２＋１９＋１０＋０）のｍＲＮＡレベルを１／２以下に減少させた。２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡは、３２個の遺伝子（３＋０＋１０＋１９）のｍＲＮＡレベルを１／２以下に減少させ、そのうちの２９個は非修飾コントロールｓｉＲＮＡにも影響を受けた。２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡで処理したサンプルは、非修飾ｓｉＲＮＡとオフターゲット遺伝子数がたった３遺伝子しか異ならなかった。ＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡは、１０個の遺伝子（０＋０＋１０＋０）のｍＲＮＡレベルを１／２以下に減少させ、その全てが非修飾コントロールおよび２’−Ｏ−メチル修飾によっても変化する。したがって、これら１０個の遺伝子は、配列依存性であり、本明細書中に示した教示によって軽減できないオフターゲット効果を示す。したがって、ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットは、２’−Ｏ−メチル修飾（オフターゲット効果を０％減少）と比較して、オフターゲット遺伝子発現の変化の除去に有意な影響を及ぼした（オフターゲット効果を６８％減少）。
【０１６７】
ｓｉＲＮＡ番号１８４（図９Ｂ）のために、非修飾ｓｉＲＮＡは、７０個の異なって発現される遺伝子（１４＋２３＋３３＋１）のｍＲＮＡレベルをＨｅｌａ細胞中で１／２以下に減少させた。２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡは、６６個の遺伝子（９＋１＋３３＋２３）のｍＲＮＡレベルを１／２以下に減少させた。対照的に、ＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡは、異なって発現される遺伝子の数を非修飾ｓｉＲＮＡの結果と比較して５０％まで（３５個の遺伝子（０＋１＋３３＋１））減少させた。ＬＮＡ（登録商標）修飾で処理されたサンプル（３３遺伝子）における大多数の異なって発現される遺伝子も、非修飾および２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡで処理されたサンプルで異なって発現すると同定された。かかる遺伝子は、配列依存性であり、本明細書中に示した教示によって軽減できないオフターゲット効果を示す。したがって、ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットも、２’−Ｏ−メチル修飾（オフターゲット効果を６％減少）と比較して、オフターゲット遺伝子発現の変化の除去に有意な影響を及ぼした（オフターゲット効果を５０％減少）。
【０１６８】
ｓｉＲＮＡ番号１９２（図９Ｃ）について、非修飾ｓｉＲＮＡは、１０３個の異なって発現される遺伝子（２８＋１３＋６１＋１）のｍＲＮＡレベルを１／２以下に減少させた。２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡは、８１個の遺伝子（７＋０＋６１＋１３）のｍＲＮＡレベルを１／２以下に減少させた。ＬＮＡ（登録商標）修飾ｓｉＲＮＡは、６４個の遺伝子（２＋１＋６１＋０）のｍＲＮＡレベルを１／２以下に減少させた。したがって、ＬＮＡ（登録商標）修飾は、非修飾ｓｉＲＮＡと比較してオフターゲット効果を約３８％排除した。このｓｉＲＮＡについて、６１個の遺伝子は、配列依存性であり、本明細書中に示した教示によって軽減できないオフターゲット効果を示す。ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットはまた、２’−Ｏ−メチル修飾（オフターゲット効果を２１％減少）と比較して、オフターゲット遺伝子発現の変化の除去に有意な影響を及ぼした（オフターゲット効果を３８％減少）。
【０１６９】
要約すると、マイクロアレイ分析は、ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ  ｓｉＲＮＡが非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡと比較した場合に異なって発現される遺伝子の産生が３８％〜６８％少なく、２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨ  ｓｉＲＮＡが非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡと比較した場合に異なって発現される遺伝子の産生が０％〜２２％少ないことを証明した。したがって、ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ  ｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果の数が最も少なかった。
【０１７０】
（実施例６）細胞生物学研究における修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡのパフォーマンス
細胞生物学研究を行って、修飾フォーマットおよび修飾ヌクレオチド型がｓｉＲＮＡによって誘発されたオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型に影響を及ぼす能力を評価した。
【０１７１】
修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが「オンターゲット」または所望の表現型を維持し、「オフターゲット」または望ましくない表現型を軽減するかどうかを決定するために、測定可能で高度に特徴づけられた生物学的応答を誘導したｓｉＲＮＡを選択した。したがって、オフターゲット表現型の除去に加えてオンターゲット表現型の保存をモニタリングした。試験修飾フォーマットを使用してｓｉＲＮＡを合成し、下記のようにアッセイに適切な細胞にトランスフェクションした。
【０１７２】
本明細書中で「成長アッセイ」と呼ばれるアッセイを行って、細胞レベルで非修飾ｓｉＲＮＡおよびネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較した、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡの相違を調査した。成長アッセイは、３０ｎＭおよび３ｎＭでのｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＵ２ＯＳ骨肉腫細胞株における細胞表現型関連パラメータ（増殖、アポトーシス、および形態学など）の測定を含んでいた。ｓｉＲＮＡ濃度が高いほどより高いオフターゲット効果が認められ、したがって、かかるオフターゲット効果の除去のための障壁がより高いので、本明細書では３０ｎＭアッセイ由来の結果を考察する。成長アッセイの分析は、表示の表現型のマーカーである以下の抗原の免疫蛍光検出を含んでいた：
１．切断ラミン−Ａ（アポトーシス）、
２．リン酸化ヒストンＨ３（有糸分裂）、
３．チューブリン（品質管理の基準であり（すなわち、細胞構造のバックグラウンドの決定）、全細胞を特徴づける細胞骨格形態）、および
４．Ｈｏｅｓｃｈｔ染色（細胞数を正規化する核形態）。
【０１７３】
ロボット制御の画像収集ソフトウェア（Ｃｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＭＥＴＡＭＯＲＰＨ（登録商標）画像分析ソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を備えた倍率１０倍の対物レンズを使用したＩＭＡＧＥＸＰＲＥＳＳＭＩＣＲＯ（商標）自動蛍光顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して免疫蛍光を回収した。３８４個の各ウェルサンプル中の４点を回収し、３つの生物学的複製物のデータを平均し、類似の様式で処理したネガティブｓｉＲＮＡコントロールサンプル（スクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡ）と比較した。画像分析後、データを以下のプロトコールにしたがって評価する。
１）指標の計算：ウェル内の各部位について、分裂期核およびアポトーシス核の数を総核数に対して正規化し、総画像領域から非細胞バックグラウンド領域を引いて細胞占有面積を計算し、次いで、核数に対して正規化した。
２）サンプルウェル平均の計算：ウェル内の全部位の平均を計算し、さらに、プレートあたりの全ネガティブコントロールウェルの全部位を平均化した。
３）正規化：三連の各プレートについてのサンプルおよびポジティブコントロールを、ネガティブｓｉＲＮＡコントロールウェルの平均に対して正規化した。
４）三連の平均の計算：プレート三連物の平均を各処理および読み取りについて計算した。
【０１７４】
既刊文献によって種々の細胞で機能的に十分に特徴づけられる試験遺伝子を選択した。試験遺伝子は、表１の遺伝子を含んでいた。
【０１７５】
【表１】
2014097073.tif 000010
予想される表現型の測定可能な強い誘導（例えば、ＷｅｅｌまたはＰＬＫ１のノックダウン後の有糸分裂の３００％増加）を示したｓｉＲＮＡを同定した（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ら（２００４）ＰＮＡＳ，１０１，４４１９−４４２４；Ｌｅａｃｈ，Ｓ．Ｄ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８，３１３２−３１３６；Ｃｏｇｓｗｅｌｌ，Ｊ．Ｐ．ら（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆ．１１，６１５−６２３）。ＢＵＢ１Ｂ遺伝子のノックダウンは、Ｎｅｇコントロールと比較して有糸分裂の比率を減少させると予想される（Ｌａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｋａｐｏｏｒ，Ｔ．Ｍ  ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，９３−９８）。
【０１７６】
さらに、オフターゲット表現型を示すｓｉＲＮＡを同定した。例えば、ＬＤＬＲ（アポトーシスを誘導しないと予想される遺伝子）（他のかかる遺伝子については表１を参照のこと）に対するｓｉＲＮＡは、アポトーシスを５００％増加させることが証明された。かかるｓｉＲＮＡ配列は、修飾フォーマットがｓｉＲＮＡの特異性を改善することができるかどうかを決定するためのツールとしての役割を果たした。観察可能なオンターゲット表現型およびオフターゲット表現型を有する個別のｓｉＲＮＡ組を、いくつかの修飾フォーマットおよび上記の構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドまたはＬＮＡ（登録商標）残基のいずれかを含むように生成した。これらの修飾ｓｉＲＮＡを、オンターゲットおよびオフターゲット表現型について試験して、オンターゲット表現型を維持しながらオフターゲット効果を除去することができる修飾フォーマットを決定した。
【０１７７】
細胞ベースのアッセイで並行して分析されたネガティブコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルについての正規化された値（図中にＮｅｇとして記す）と比較した修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡ細胞ベースのアッセイの結果を、図１０Ａ〜図１０Ｅ、図１１Ａ〜図１１Ｆ、図１２Ｃ〜図１２Ｄ、図１３Ｃ〜図１３Ｄ、図１５Ａ〜１５Ｄ、および図１６Ａ〜図１６Ｄに箱ひげプロットとしてプロットする。
【０１７８】
ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯを有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを図１０Ａに示す。ｓｉＲＮＡは、ＢＵＢ１Ｂ、ＷＥＥ１、ＣＤＣ２、ＣＤＫ２、ＣＡＳＰ３、およびＣＣＮＤ１（有糸分裂表現型に異なる影響を及ぼす遺伝子）をターゲティングした。すなわち、この遺伝子組は、サイレンシングされた場合に有糸分裂を増加させるサブセット、サイレンシングされた場合に有糸分裂を減少させるサブセット、およびサイレンシングされた場合に有糸分裂に影響を及ぼさないと予想されるサブセットが含まれる。これらの異なる影響のために、遺伝子のサブセット（そのノックダウンにより、有糸分裂減少が予想される表現型が得られる）を分析し、データを図１０Ｂに示す。
【０１７９】
図１０Ｂのデータは、遺伝子（ＢＵＢ１Ｂ、ＣＤＣ２、ＣＣＮＤ１）（そのノックダウンが有糸分裂を減少させると予想される）をターゲティングするｓｉＲＮＡのトランスフェクション後の正規化した有糸分裂細胞を示す（Ｌａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｋａｐｏｏｒ，Ｔ．Ｍ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，９３−９８；Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．ら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１４，４５５７−４５６５；Ｋｌｉｅｒ，Ｍ．（２００８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＥＰＵＢ）。したがって、これらのデータはオンターゲット表現型の影響を測定する。すなわち、このアッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが機能的ｓｉＲＮＡ組を「害さない」ことを確認する。Ｎｅｇコントロール処理サンプルの正規化した値は、中央値約１．０を示す。非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡによって中央値約０．５５が得られ、これは、有糸分裂の約１／２減少を示した。Ｎｅｇコントロールと比較して有糸分裂が減少した全修飾フォーマットを示した。修飾フォーマットＨおよびＪを有するｓｉＲＮＡにより、ウィルコクソン値および非修飾フォーマットＡからの有糸分裂の中央値の乖離によって証明されるように、非修飾フォーマットＡと比較して有糸分裂に及ぼすその影響が統計的に有意に異なった（オンターゲット効果がより低い）。したがって、図８のｍＲＮＡノックダウンに関する結果と一致して、細胞ベースのアッセイは、フォーマットＪが高度に機能的なｓｉＲＮＡの所望の特徴に適合しないことを証明している。
【０１８０】
細胞ベースの成長アッセイにより、切断されたラミン−Ａを示す細胞由来の蛍光シグナルの定量によってＮｅｇコントロール処理サンプルと比較したアポトーシスも測定した（Ｒａｏ，Ｌ．ら（１９９６）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３５，１４４１−１４５５）。歴史的に、ゲノム規模のｓｉＲＮＡスクリーニング実験で認められた最も一般的な予想外の表現型は細胞死である。これらの研究についてのこのｓｉＲＮＡ集団では、修飾フォーマットが望ましくない細胞表現型を除去することができるかどうかを決定するためのツールとして予想外の細胞死を誘導することが知られているｓｉＲＮＡ配列が含まれていた。
【０１８１】
ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯを有するｓｉＲＮＡでのＵ２ＯＳ細胞の処理に起因するアポトーシスフラグメントの定量の結果を、図１０Ｃに示す。ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルを使用してｓｉＲＮＡトランスフェクション後のアポトーシスのベースラインを確立し、データを１．０に正規化した。この集団中のｓｉＲＮＡは以下の遺伝子をターゲティングする：ＢＵＢ１Ｂ、ＣＤＣ２、ＣＣＮＤ１、ＷＥＥ１  ＣＡＳＰ３、およびＣＤＫ２（そのサブセットのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想され、そのサブセットがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される遺伝子標的組）。これらの異なる影響により、遺伝子のサブセット（そのノックダウンによってアポトーシス増加の表現型が予想される）を分析し、データを図１０Ｄに示す。
【０１８２】
図１０Ｄは、ＷＥＥ１をターゲティングするｓｉＲＮＡのトランスフェクション後のＵ２ＯＳ細胞におけるアポトーシス測定の結果を示す。ＷＥＥ１のノックダウンによりアポトーシスが増加すると予想される（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ら（２００４）ＰＮＡＳ，１０１，４４１９−４４２４；Ｌｅａｃｈ，Ｓ．Ｄ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８，３１３２−３１３６）。したがって、これらのデータはオンターゲット表現型の影響を測定する。すなわち、このアッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが機能的ｓｉＲＮＡ組を「害さない」ことを確認する。ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルを使用してアポトーシスの正規化ベースラインを確立した。ＷＥＥ１をターゲティングするフォーマットＡの非修飾ｓｉＲＮＡはＮＥＧ処理サンプルと比較して約７．５の中央値を示し、したがって、予想される表現型の変化が得られた。フォーマットＪおよびＫを有する修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡは、非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡと比較した場合に統計的に有意な様式でアポトーシス量を減少させることによってオンターゲット表現型を減少させた。これにより、フォーマットＪおよびＫがｓｉＲＮＡのパフォーマンスを損なうことが証明された。これらのデータは、修飾フォーマットＪおよびＫを有するｓｉＲＮＡによるノックダウンに関する図８のデータと一致する。
【０１８３】
遺伝子のサブセット（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡがオフターゲット表現型を除去する能力の分析を図１０Ｅのデータによって示す。経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果を排除または減少させるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの中央値が増加し、且つその分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである（図１０Ｅ）。研究したｓｉＲＮＡはフォーマットＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、およびＯを有し、標的遺伝子（そのノックダウンによってアポトーシスが誘導されないと予想される）には、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２、およびＣＤＣ２が含まれていた。Ｎｅｇコントロール処理集団を使用して、アポトーシスのベースラインを確立した。非修飾フォーマットＡと比較してより低いアポトーシスシグナルによって証明されるように、フォーマットＧ、Ｈ、Ｊ、およびＫを有するｓｉＲＮＡにより、統計的に有意なオフターゲット効果を除去する能力が証明される（図１０Ｅ）。
【０１８４】
修飾フォーマットＪおよびＫを有するｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡオンターゲット有効性を損ねることが証明された図１０Ｄのデータならびに修飾フォーマットＧ、Ｊ、およびＫを有するｓｉＲＮＡがノックダウン活性を損ねることを証明した図８のデータを考慮して、フォーマットＧ、Ｊ、およびＫが他の機能的ｓｉＲＮＡを「害する」ようである。
【０１８５】
ＬＮＡ（登録商標）残基の代わりに２’Ｏ−メチル化残基を含む修飾ヌクレオチドの使用によって修飾フォーマットのさらなる特徴づけを行い、他の修飾型がｓｉＲＮＡによってオフターゲット効果を減少させることができるかどうかを決定した。図１１Ａは、２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨおよびＫを有し、ＷＥＥ１、ＰＬＫ１、ＦＤＦＴ１、ＬＤＬＲ、およびＳＣ５ＤＬ（有糸分裂表現型に異なる影響を及ぼす遺伝子）をターゲティングするｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。すなわち、この遺伝子組は、サイレンシングした場合に有糸分裂を増加させるサブセットおよびサイレンシングした場合に有糸分裂に影響を及ぼさないと予想されるサブセットを含む。これらの異なる影響のために、遺伝子のサブセット（そのノックダウンにより、有糸分裂の増加が予想される表現型が得られる）を分析し、データを図１１Ｂに示す。
【０１８６】
図１１Ｂは、２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨおよびＫを有するｓｉＲＮＡによるＷＥＥ１またはＰＬＫ１をターゲティングするｓｉＲＮＡのトランスフェクション後のＵ２ＯＳ細胞における有糸分裂の測定結果を示す。ＷＥＥ１またはＰＬＫ１のサイレンシングによってＵ２ＯＳ細胞において有糸分裂が増加することは、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ら（（２００４）ＰＮＡＳ，１０１，４４１９−４４２４），Ｌｅａｃｈ，Ｓ．Ｄ．ら（（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８，３１３２−３１３６）およびＣｏｇｓｗｅｌｌ，Ｊ．Ｐ．ら（（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆ，１
１  ，６１５−６２３）に記載されており、Ｎｅｇコントロール処理サンプルと比較して有糸分裂の４倍増加を誘導した非修飾フォーマットＡを有するｓｉＲＮＡのデータによって確認される。したがって、これらのデータは、オンターゲット表現型の影響を測定する。すなわち、このアッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが機能的ｓｉＲＮＡ組を「害さない」ことを確認する。図１１Ｂのデータに示すように、２’ＯＭｅ修飾フォーマットＨおよびＫを有するｓｉＲＮＡを使用して類似のレベルの有糸分裂に及ぼす影響が認められる。本研究は、フォーマットＨおよびＫでの２’ＯＭｅ修飾が他の機能的ｓｉＲＮＡを害さないことを証明している。
【０１８７】
２’ＯＭｅ修飾フォーマットＨおよびＫを有するｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を減少させることができるかどうかを決定するために、遺伝子のサブセット（ＦＤＦＴ１、ＳＣ５ＤＬ、およびＬＤＬＲ）（そのノックダウンが有糸分裂に影響を及ぼさないと予想される）をターゲティングするｓｉＲＮＡをＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクションし、有糸分裂に及ぼす影響を決定した。しかし、経験的に証明された有糸分裂オフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。図１１Ｃにデータを示す。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである（図１１Ｃ）。フォーマットＨの２’ＯＭｅ残基を有するｓｉＲＮＡは、各ｓｉＲＮＡ配列を比較した場合に非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットＡで認められた多数のオフターゲット表現型を減少させた。フォーマットＫの２’ＯＭｅ残基を有するｓｉＲＮＡは、非修飾ｓｉＲＮＡと比較して有糸分裂の影響の中央値を上昇させた。しかし、フォーマットＨおよびＫのこの２’−Ｏ−メチル修飾についてのデータは、非修飾フォーマットＡのデータと統計的に有意に異ならなかった。
【０１８８】
２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨおよびＫを有するｓｉＲＮＡでのＵ２ＯＳ細胞の処理に起因するアポトーシス画分の定量の結果を図１１Ｄに示す。ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルを使用してｓｉＲＮＡトランスフェクション後のアポトーシスのベースラインを確立し、データを１．０に正規化した。この集団中のｓｉＲＮＡは、この集団中のｓｉＲＮＡは、遺伝子（ＷＥＥ１、ＰＬＫ１、ＦＤＦＴ１、ＬＤＬＲ、およびＳＣ５ＤＬ）（そのサブセットのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想され、そのサブセットがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）をターゲティングする。これらの異なる影響により、遺伝子のサブセット（そのノックダウンによってアポトーシス増加の表現型が得られると予想される）を分析し、データを図１１Ｅに示す。
【０１８９】
図１１Ｅは、２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットＨおよびＫを有する１２のｓｉＲＮＡ組によるＷＥＥ１およびＰＬＫ１をターゲティングするｓｉＲＮＡのトランスフェクション後のＵ２ＯＳ細胞におけるアポトーシス測定の結果を示す。したがって、これらのデータはオンターゲット表現型の影響を測定する。すなわち、このアッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが機能的ｓｉＲＮＡ組を「害さない」ことを確認する。ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルを使用してアポトーシスの正規化ベースラインを確立した。ＷＥＥ１またはＰＬＫ１をターゲティングするフォーマットＡの非修飾ｓｉＲＮＡはＮＥＧ処理サンプルと比較して約４倍以上のアポトーシスの中央値を示し、したがって、予想される表現型の変化が得られた。フォーマットＨおよびフォーマットＫの２’ＯＭｅ修飾ｓｉＲＮＡを使用して、類似のアポトーシスレベルが認められた。この研究は、ＨおよびＫフォーマットの２’ＯＭｅ修飾がｓｉＲＮＡの有効性を減少させず、非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットＡと類似の表現型を示すことを証明している。
【０１９０】
遺伝子組（ＦＤＦＴ１、ＬＤＬＲ、およびＳＣ５ＤＬ）（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての２’−Ｏ−メチル修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡがオフターゲット表現型を除去する能力の分析を図１１Ｆのデータによって示す。経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果を排除または減少させるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。研究したｓｉＲＮＡは、フォーマットＡ、Ｈ、およびＫを有する。Ｎｅｇコントロール処理集団を使用して、アポトーシスのベースラインを確立し、これは特に広範囲のアポトーシスの結果を示す。コントロールフォーマットＡの中央値は、Ｎｅｇコントロール処理サンプルの中央値と類似していた。修飾フォーマットＨおよびＫの２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡは、各ｓｉＲＮＡ配列を評価した場合に非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットＡで認められた多数のオフターゲット表現型を減少させたが、試験集団に関して、オフターゲット効果の減少は統計的に関連する様式で認められた。
【０１９１】
フォーマットＨ、Ｈ−２、Ｈ−１、Ｈ＋１、Ｑ、Ｖ、Ｖ−１、Ｖ−２、およびＫを示す図１Ａ〜図１Ｃの略図に示すように、さらなる修飾フォーマットを試験した。ＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドは、構造（ａ）（式中、Ｒ１およびＲ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２であり、Ｒ４およびＲ５は本明細書中に記載のｓｉＲＮＡ中のヌクレオチドの位置によって決定されるとおりである）を有していた。図１２ＣのｓｉＲＮＡ修飾フォーマットについてのＵ２ＯＳ細胞における有糸分裂のオンターゲット表現型アッセイ（すなわち、「害さない」アッセイ）を行った。図１２Ｃのデータによって示されるように、非修飾ｓｉＲＮＡは、Ｎｅｇコントロール処理細胞と比較してｓｉＲＮＡ処理細胞における有糸分裂の約２倍の増加を証明した。これらのフォーマットでＬＮＡ（登録商標）によって修飾された修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡのオンターゲットパフォーマンスは、予想される表現型に負の影響を及ぼさなかった。修飾フォーマットＨは、統計的に有意に表現型を増加させる。
【０１９２】
図１２Ｄは、図１２ＣのＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡのオフターゲット効果の除去に関するデータを示す。遺伝子標的組（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）（ＦＤＦＴ１、ＬＤＬＲ、またはＳＣ５ＤＬ）についての非修飾フォーマットＡを有し、ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｈ＋１、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ｖ−１、およびＶ−２のためのｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロット。ネガティブコントロール（Ｎｅｇ）は、アポトーシスの定量を値１．０に正規化したスクランブルした非ターゲティングｓｉＲＮＡである。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの中央値が増加し、且つその分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。望ましくないアポトーシス表現型の除去に最も有効であった修飾フォーマットがフォーマットＨ、Ｋ、Ｑ、およびＶ−２である一方で、修飾フォーマットＨ−２、Ｈ−１、Ｈ＋１、Ｖ、およびＶ−１は、非修飾ｓｉＲＮＡと比較して任意の統計的有意性でアポトーシス性フラグメントの測定値を変化させなかった。
【０１９３】
修飾フォーマットＨ、Ｈ−１、Ｋ、およびＶについての２’ＯＭｅヌクレオチドによって修飾されたｓｉＲＮＡはまた、図１３Ｃのデータによって示すように、Ｕ２ＯＳ細胞ベースのアッセイにおいてオンターゲット表現型に負の影響を及ぼさない。図１３Ｃは、遺伝子標的組（そのノックダウンが有糸分裂を増加させると予想される）（ＷＥＥ１およびＰＬＫ１）についての非修飾フォーマットＡを有し、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する修飾フォーマットのためのｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。このアッセイは、「害さない」アッセイである。非修飾ｓｉＲＮＡは、予想されるＮｅｇコントロール処置サンプルの約２倍を超える有糸分裂の中央値を示した。修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡのデータは、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡが細胞ベースのアッセイにおいて予想される表現型に負の影響を及ぼさないことを証明している。
【０１９４】
図１３Ｄは、遺伝子標的組（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）（ＦＤＦＴ１、ＳＣ５ＤＬ、またはＬＤＬＲ）についての非修飾フォーマットＡを有するｓｉＲＮＡならびに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する修飾フォーマットＨ、Ｈ−１、Ｖ、およびＫを有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングに起因する正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。ｓｉＲＮＡ組は、各フォーマットについて１３個の異なるｓｉＲＮＡを含んでいた。２’ＯＭｅ修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡから非修飾コントロールフォーマットＡと統計的に有意に異なるデータが得られず、これは、２’ＯＭｅ修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡで認められたものと同一のオフターゲット効果を維持していたことを証明する。
【０１９５】
フォーマットＨに類似し、図１Ｄに記載のさらなる修飾フォーマットを研究した。図１５Ａは、フォーマットＡ、Ｈ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１のＬＮＡ（登録商標）修飾ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡについての正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。Ｕ２ＯＳ細胞の有糸分裂指数の予測される減少が得られるようにＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＮＤ１、およびＣＤＣ２  ｍＲＮＡをノックダウンするためのｓｉＲＮＡ組を選択した。したがって、これらのデータは、オンターゲット表現型の影響を測定する。すなわち、このアッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが機能的ｓｉＲＮＡ組を「害さない」ことを確認する。図１５Ａのデータに示すように、非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡで処理されたサンプルの有糸分裂の中央値は、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルと比較して約０．７５へと有糸分裂の減少を示した。フォーマットＨ、Ｍ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ−１、およびＹ＋１で修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡは有糸分裂に及ぼすこれらのｓｉＲＮＡの影響を有意に変化させず、これは、これらの修飾フォーマットが「害さない」ことを証明している。しかし、修飾フォーマットＹおよびＷはｓｉＲＮＡの予想されるオンターゲットへの影響を減少させ、これは、これらの修飾フォーマットがオンターゲット機能を妨害することを証明している。
【０１９６】
図１５Ｂは、ＣＡＳＰ３（そのノックダウンが有糸分裂に影響を及ぼさないと予想される）についての図１５Ａに関するボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明された有糸分裂オフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較して中央値約０．７を有する非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。修飾フォーマットＨ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、およびＹ＋１を有するｓｉＲＮＡは、フォーマットＡのｓｉＲＮＡによって証明されるオフターゲット効果を逆にした。フォーマットＭおよびＹ−１でのｓｉＲＮＡの修飾により、フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡのオフターゲット表現型は逆にされなかった。図１５Ｂのデータについてｐ＜０．０５のウィルコクソン値は得られなかった。これはおそらく各フォーマットのｓｉＲＮＡの小集団に起因する。
【０１９７】
ＷＥＥ１遺伝子（そのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想される）をターゲティングするｓｉＲＮＡ組についての正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットをフォーマットＡ、Ｈ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１について図１５Ｃに示す。非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡはＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルと比較して４．０を超えるアポトーシスの中央値を示し、これは、ＷＥＥ１ノックダウンの結果としてのアポトーシスの堅調な増加を証明している。したがって、試験データはオンターゲット表現型の影響を測定する。すなわち、このアッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが機能的非修飾ｓｉＲＮＡ組を「害さない」ことを確認する。図１５Ｃのデータに示すように、修飾フォーマットＨ、Ｍ、およびＷ−１を有するｓｉＲＮＡはフォーマットＡと比較して類似のアポトーシスの増加を示すのに対して、フォーマットＷ、Ｗ＋１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１は、非修飾ｓｉＲＮＡフォーマットＡと比較してアポトーシスにより弱い影響を及ぼす。図１５Ｃのデータについてｐ＜０．０５のウィルコクソン値は得られなかった。これはおそらく各フォーマットのｓｉＲＮＡの小集団に起因する。アポトーシスへの影響の減少にもかかわらず、化学修飾フォーマットＷ、Ｗ＋１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１は、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルと比較して標的ｍＲＮＡをノックダウンし（図１４Ａ）、アポトーシスを誘導する能力を維持する。
【０１９８】
遺伝子標的組（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを、修飾フォーマットＡ、Ｈ、Ｍ、Ｗ、Ｗ＋１、Ｗ−１、Ｙ、Ｙ＋１、およびＹ−１を有するｓｉＲＮＡについて図１５Ｄに示す。この組中のｓｉＲＮＡは、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ２、またはＣＤＫ２をターゲティングする。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較してデータの中央値が３．５以上であり、且つその分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。フォーマットＨ、Ｙ、およびＹ＋１を有するｓｉＲＮＡによるサイレンシングは、フォーマットＡと比較してオフターゲット効果の統計的に有意な逆転を示す。
【０１９９】
図１Ｅに記載のなおさらなるｓｉＲＮＡ修飾フォーマットを研究した。ｓｉＲＮＡをＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクションし、有糸分裂への影響を本明細書中に記載のように測定した。図１６Ａは、非修飾フォーマットＡを有し、ＬＮＡ（登録商標）修飾フォーマットＨ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５のためのｓｉＲＮＡについての正規化した有糸分裂細胞のボックスプロットを示す。Ｕ２ＯＳ細胞の有糸分裂指数の予想される減少が得られるようにＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＮＤ１、およびＣＤＣ２  ｍＲＮＡをノックダウンするためにｓｉＲＮＡ組（標的ｍＲＮＡあたり３つのｓｉＲＮＡ）を選択した。したがって、これらのデータは、オンターゲット表現型の影響を測定する。すなわち、このアッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが機能的ｓｉＲＮＡ組を「害さない」ことを確認する。図１６Ａのデータによって示されるように、非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡで処理されたサンプルの有糸分裂の中央値は、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルと比較して約０．７５へと有糸分裂の減少を示した。フォーマットＨ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ４、およびＪＢ５で修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡは有糸分裂に及ぼすｓｉＲＮＡのオンターゲットの影響を有意に変化させず、これは、ｓｉＲＮＡがこれらのフォーマットに耐性を示すことを証明している。しかし、修飾フォーマットＪＢ３を有するｓｉＲＮＡはこれらの遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡの予想されるオンターゲットの影響を有意に減少させ、これは、フォーマットＪＢ３がオンターゲット機能を干渉することを証明している。
【０２００】
図１６Ｂは、遺伝子標的ＣＡＳＰ３（そのノックダウンが有糸分裂に影響を及ぼさないと予想される）についての図１６Ａに関する修飾フォーマットのボックスプロットを示す。しかし、経験的に証明された有糸分裂オフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロールと比較して中央値が約０．６５であり、それにより、有糸分裂の減少を示す非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。図１６Ｂのデータによって証明されるように、修飾フォーマットＨ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ４、およびＪＢ５は、これらのオフターゲット効果を逆にすることができた。修飾フォーマットＭおよびＪＢ３はＣＡＳＰ３をターゲティングするｓｉＲＮＡのオフターゲット表現型を減少させず、これは、これらのフォーマットがオフターゲット表現型の除去に有効でないことを証明している。図１６Ｂのデータについてｐ＜０．０５のウィルコクソン値は得られなかった。これはおそらく各フォーマットのｓｉＲＮＡの小集団に起因する。
【０２０１】
修飾フォーマットＡ、Ｈ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５を有するｓｉＲＮＡについての遺伝子標的ＷＥＥ１（そのノックダウンがアポトーシスを増加させると予想される）のサイレンシングに起因する正規化したアポトーシスフラグメントのボックスプロットを図１６Ｃに示す。したがって、これらのデータは、オンターゲット表現型の影響を測定する。すなわち、このアッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが機能的ｓｉＲＮＡ組を「害さない」ことを確認する。図１６Ｃのデータによって示すように、非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡで処理されたサンプルのアポトーシスの中央値はＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルと比較して４．０超へのアポトーシス増加を示し、これは、ＷＥＥ１ノックダウンの結果としてのアポトーシスの堅調な増加を証明している。修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡは種々の程度に予想される表現型を誘導し、これは、全試験フォーマットが機能的ｓｉＲＮＡ組を害さないことを証明している。図１５Ｂのデータについてｐ＜０．０５のウィルコクソン値は得られなかった。これはおそらく各フォーマットのｓｉＲＮＡの小集団に起因する。
【０２０２】
図１６Ｄは、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ２、およびＣＤＫ２を含む遺伝子標的組（そのノックダウンがアポトーシスに影響を及ぼさないと予想される）についての図１６Ｃに関する修飾フォーマットのボックスプロットをフォーマットＡ、Ｈ、Ｍ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５でＬＮＡ修飾ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡについて示す。しかし、経験的に証明されたアポトーシスオフターゲット効果を有するｓｉＲＮＡを、かかるｓｉＲＮＡが修飾フォーマットされた場合にオフターゲット効果が排除または減少されるかどうかを決定するための研究のために特異的に選択した。ｓｉＲＮＡがオフターゲット効果を有することは、Ｎｅｇコントロール処理サンプルと比較してデータの中央値が３を超えて増加し、且つその分布がより広くなる非修飾フォーマットＡのボックスプロットによって明らかである。図１６Ｄのデータによって示されるように、修飾フォーマットＨ、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５を有するｓｉＲＮＡは、フォーマットＡと比較した場合にアポトーシスオフターゲット効果を統計的に有意な様式で逆にすることができる。フォーマットＭを有するｓｉＲＮＡは、アポトーシス効果を統計的に有意な程度に逆にできない。
【０２０３】
まとめると、図１０Ｅ、１１Ｃ、１１Ｆ、１２Ｄ、１３Ｄ、１５Ｂ、１５Ｄ、１６Ｂ、および１６Ｄのデータは、オフターゲット表現型の影響を予想外に減少させる修飾フォーマットにはフォーマットＧ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｑ、Ｖ−２、Ｙ、Ｙ＋１、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５が含まれることを証明している。これらの修飾フォーマットのうち、フォーマットＧ、Ｊ、およびＫは、他の機能的ｓｉＲＮＡが活性をノックダウンする能力を「害する」。高機能性ｓｉＲＮＡはオフターゲット表現型の影響を減少させる性質を有し、さらに、ノックダウン活性の点から「害さない」。他の機能的ｓｉＲＮＡにかかる高機能性を提供する修飾フォーマットには、フォーマットＨ、Ｑ、Ｖ−２、Ｙ、Ｙ＋１、ＪＢ１、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４、およびＪＢ５が含まれる。
【０２０４】
上記の鎖数の影響（図４Ｅ、６Ｃ、７Ｂ、１２Ａ、１３Ａのデータ、本明細書中の実施例３）およびオフターゲット効果の減少を付与する能力の両方について研究した修飾フォーマットにより、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡがオフターゲット効果の除去でどのようにして挙動するのかを鎖数アッセイから予想することができるかどうかが評価される。古典的レポーターアッセイを使用した実施例３の鎖数データは、修飾フォーマットＥ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｏ、およびＭが細胞表現型アッセイにおいて十分に機能すると予想されることを証明している。実際に、これらのフォーマットのうちの３つが十分に機能し、３つが機能しなかった。したがって、鎖数アッセイは、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが所望の細胞表現型の達成で機能的あるかどうかの予測には無効なようである。
【０２０５】
（実施例７）安定化した、修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡ
本実施例は、上記で考察したノックダウン活性の性質の維持およびオフターゲット効果の除去に加えてヌクレアーゼを含む体液への曝露に対して特に安定な修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡを提供する。Ｅｌｍｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：１，４３９−４４７，２００５）は、本明細書中のフォーマットＦと同一の修飾フォーマットを有するｓｉＬＮＡ５と呼ばれる安定化ｓｉＲＮＡおよびどのフォーマットを本実施例の安定性研究のための基準コントロールとして使用するのかを報告している。本明細書中で使用する場合、用語「体液への曝露に安定な」は、ヌクレアーゼを含む体液の存在下で同一の体液に同一の期間曝露された修飾フォーマットＦを有するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡが同一またはより高い程度にその全長を維持することを意味する。
【０２０６】
本実施例が安定化した修飾フォーマットを提供する一方で、前の実施例で提供された修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ活性の懸念が最も低い環境での使用に適切である。
【０２０７】
フォーマットＦに関して、実施例６および図１０Ｅ由来のデータは、修飾フォーマットＦを有するｓｉＲＮＡがオフターゲット細胞の影響の除去で実質的に無効であることを証明している。
【０２０８】
９０％マウス血清中のｓｉＲＮＡに安定性を付与する修飾フォーマットを決定するための研究を、ＣＬＴＣおよびＷＥＥ１のｍＲＮＡをターゲティングする８つの異なるｓｉＲＮＡ配列に対して行った。下記および図１Ｆ〜図１Ｋに記載の修飾フォーマットについて、実施例１に記載のようにｓｉＲＮＡを合成した。
【０２０９】
【数３】
2014097073.tif 000011
修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡに導入した修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ（登録商標）残基）、特に、上記の構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有するものであった。
【０２１０】
本明細書中で使用される場合、安定性アッセイにより、熱不活性化されていない９０％マウス血清（カタログ番号４４１３５，ＪＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）中での修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡのインキュベーション後の全長産物の存在量が得られる。全ｓｉＲＮＡを、使用前に強いヌクレアーゼ活性を有することが確認された同一ロットのマウス血清で処理した。ヒト血清（カタログ番号ＣＣ−５５００，ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）およびウシ胎児血清（カタログ番号ＳＶ３００１４，ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）を使用して類似の結果が得られた（データ示さず）。
【０２１１】
各アッセイのために、最終体積５０μＬの１０μＭの修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡを、９０％マウス血清中で経時変化に示す時間（図１７）または５時間（図１８Ａ〜図２３Ｂ）のいずれかにて３７℃でインキュベーションした。血清中でのインキュベーションと並行して、各ｓｉＲＮＡ組をＰＢＳ（カタログ番号９６２５，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で血清処理サンプルと同一の期間処理して、ＨＰＬＣ研究のための全長産物の量についてのベースラインを確立した。インキュベーション後、ｓｉＲＮＡをフェノール（カタログ番号９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で抽出し、５μｇグリコーゲンキャリア（１μｌ／管，カタログ番号ＡＭ９５１０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の存在下でエタノール沈殿させて、小ＲＮＡの回収を強化した。ｓｉＲＮＡおよび切断産物を遠心分離（１５，０００×ｇで１５分間）によって回収し、ＨＰＬＣ分析前にＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水）に溶解した。
【０２１２】
過塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ４）含有アセトニトリルの連続勾配を使用したイオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して、全長産物を定量した。固定相は、Ｗａｔｅｒｓ  ２７９５  ＡＬＬＩＡＮＣＥ（登録商標）分析ＨＰＬＣシステムおよびＥＭＰＯＷＥＲ（商標）Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と共に使用されるＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰＡＣ（登録商標）２００カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ，Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）であった。ｓｉＲＮＡ二重鎖が変性しないような温度を維持した。定量およびＵＶ検出を、Ｗａｔｅｒｓ２９９８フォトダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）によって２５４ｎｍで行う。注入量１０μｌ〜２０μｌのＧＡＰｄＨのｍＲＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡ（各末端に２つのオーバーハンギング３’ヌクレオチドを有する２１量体の二重鎖）（１０μＭ）を使用して、カラムの質および保持時間を確認する。ＨＰＬＣの結果の分析は、１００％とした無処理ｓｉＲＮＡについてのピーク面積および血清処理サンプルについての同一保持時間（＋／−０．１〜０．２分）でのピーク面積に基づき、これにより残存率を計算した。
【０２１３】
血清安定性について試験した同一のｓｉＲＮＡを、内因性遺伝子のノックダウン活性について個別に試験して、修飾フォーマットがｓｉＲＮＡの、そのｍＲＮＡ標的をノックダウンする効率を変化させたかどうかを決定した。製造者によって記載された「順方向」プロトコールにてトランスフェクションでリポフェクタミン（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用したことを除いて実施例４に記載のように最終濃度５ｎＭの修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡおよび非修飾コントロールｓｉＲＮＡをＨｅｌａ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞の回収後、全細胞溶解物を、製造者のプロトコールにしたがってＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｉｎｃ．カタログ番号ＡＭ１７２８）を使用して単離した。ｃＤＮＡの調製、遺伝子発現アッセイ、およびノックダウン活性の計算を、実施例４のように行った。
【０２１４】
本研究の８つの異なるｓｉＲＮＡの非修飾形態の血清中での分解を、血清曝露から５〜１０分以内に５０％を超える全長分子が分解される図１７のデータによって示す。
【０２１５】
非修飾フォーマットＡ、安定性コントロールフォーマットＦ、ならびに修飾フォーマットＨ、ＤＨ２１、ＤＨ２０、ＤＨ３、ＤＨ３０、ＤＨ３５、ＤＨ６、ＤＨ３４，およびＤＨ２についての９０％血清で記載の条件下にて５時間処理した場合に全長を保持するｓｉＲＮＡの比率のボックスプロットを図１８Ａに示す。非修飾フォーマットＡおよび修飾フォーマットＨは、記載の条件下で完全に分解された。安定性基準となるコントロールフォーマットＦは、記載の条件下で血清中で約４３％が全長ｓｉＲＮＡである中央値を有する。図１８Ａのデータ分析は、たった１つの３’末端および／またはその付近のヌクレオチドの修飾では血清中で修飾ｓｉＲＮＡを保護するには不十分であることを示す（フォーマットＦと比較した場合のフォーマットＤＨ２１、ＤＨ２０、ＤＨ３、およびＤＨ３０）。２つまたは３つのオーバーハンギングヌクレオチドの修飾も血清中での修飾ｓｉＲＮＡの保護には不十分である（フォーマットＦと比較した場合のフォーマットＤＨ６、ＤＨ３４、およびＤＨ３５）。４つ全てのオーバーハンギングヌクレオチドが修飾されたフォーマットＤＨ２は、フォーマットＦ以上に良好に血清中で保護する。図１８Ｂは、図１８Ａのために研究したｓｉＲＮＡのＮｅｇコントロールの比率としてのｍＲＮＡノックダウンのボックスプロットを示す。図１８Ｂによって示されるように、非修飾フォーマットＡのｓｉＲＮＡは、ＮｅｇコントロールｓｉＲＮＡ処理サンプルと比較してノックダウンの中央値が約８５％である。ｓｉＲＮＡ修飾フォーマットＤＨ２０は、特に、フォーマットＨと比較したノックダウン活性の減少を示す。研究したこの修飾フォーマット組のうち、フォーマットＤＨ２のみがその安定性およびノックダウン活性のためにさらなる研究が考慮される。
【０２１６】
図１９Ａに示すように、センス鎖の３’末端から２番目および３番目の位置への２つの修飾ヌクレオチドの配置は、アンチセンス鎖の２つまたは３つの末端残基（ＤＨ４、ＤＨ３１、ＤＨ１９）中の修飾ヌクレオチドと共に、血清安定性に有害な作用を及ぼすようである。これらのデータは、オーバーハンギングヌクレオチドとしての修飾ヌクレオチドの位置づけをさらに支持する。さらに、図１９Ｂのデータによって示されるように、フォーマットＤＨ１９、ＤＨ２７、およびＤＨ２５は、フォーマットＡと比較して有意なノックダウン活性の減少を示す。フォーマットＤＨ３１は、７０％を超えるノックダウン活性を有していた。保護されていない末端残基を遊離しながらの内部残基（ＤＨ２７（７位）およびＤＨ２５（６位および９位）に関して）の保護は、データをフォーマットＤＨ２のデータと比較した場合にノックダウン能力に関して逆効果なようである。
【０２１７】
図２０Ａに示すデータは、コントロールフォーマットＦと比較した修飾フォーマットＤＨ４７およびＤＨ２９の安定性の増加およびＤＨ１８の安定性のなおさらなる増加を証明している。修飾フォーマットＤＨ４７およびＤＨ２９により、オーバーハンギングの位置およびフォーマットＨの位置の修飾ヌクレオチドに加えて、センス鎖配列の末端から３番目および４番目の位置のうちの１つ（すなわち、２１量体について、１８位および１９位のうちの１つ）で修飾ヌクレオチドが得られる。フォーマットＤＨ１８により、ＤＨ２９に関する修飾ヌクレオチドが得られ、さらに、アンチセンス鎖の３番目の位置（すなわち、２１量体について、１９位）に修飾ヌクレオチドが得られる。フォーマットＤＨ２８のデータは、フォーマットＤＨ２９と直接比較した場合、アンチセンス鎖のオーバーハンギング位置での修飾ヌクレオチドの欠如が保護されたセンス鎖によって得られた安定性をノックアウトすることも証明している。フォーマットＦと比較した場合、フォーマットＤＨ４７およびＤＨ２８のデータは、ｐ＜０．０５の場合にウィルコクソン値を有する。図２０Ｂのデータは、フォーマットＤＨ４７、ＤＨ２９，およびＤＨ２８が７０％を超えるノックダウン活性を有することを証明している。フォーマットＤＨ１８などの場合のアンチセンス鎖の末端から３番目の位置（１９位）の修飾は、安定性が強化される一方で、ノックダウン活性を約６０％の中央値に損なう。上記データに基づいて、フォーマットＤＨ４７およびＤＨ２９は共にコントロールフォーマットＦよりもｓｉＲＮＡの安定性が増加し、フォーマットＤＨ４７によって非修飾フォーマットＡに匹敵するノックダウン活性が得られ、フォーマットＤＨ２９によって７０％を超えるノックダウン活性が得られる。
【０２１８】
図２１Ａに示す修飾フォーマットを有するｓｉＲＮＡでは修飾フォーマットＦまたはフォーマットＤＨ２を有するｓｉＲＮＡを超える血清安定性の増加は得られない。添加血清の安定性の欠如は、オーバーハンギングヌクレオチドが修飾される修飾フォーマットを支持する。図２１Ａのために研究したｓｉＲＮＡのノックダウン活性データは全て、図２１Ｂによって示される活性の７０％超を証明している。
【０２１９】
修飾フォーマットＦを有するｓｉＲＮＡと図２２Ａの修飾フォーマットＤＨ２３、ＤＨ４８、ＤＨ４９、ＤＨ４４、およびＤＨ４５を有するｓｉＲＮＡとの血清安定性の比較は、オーバーハンギングヌクレオチドの位置の修飾ヌクレオチドをさらに支持する。フォーマットＤＨ１およびＤＨ７などのオーバーハンギングヌクレオチドの位置での修飾ヌクレオチドを有することに加えて、アンチセンス鎖の２位のヌクレオチドの修飾は、血清中の安定性の中央値を増加させる（図２２Ａ）。図２２Ｂのデータは、フォーマットＤＨ２３を除く図２２Ａの全てのフォーマットしたｓｉＲＮＡが７０％を超えるノックダウン活性を達成することを証明している。まとめると、オーバーハンギングヌクレオチドの位置に加えてガイド鎖の２位に修飾ヌクレオチドを有するフォーマットＤＨ１およびＤＨ７により、血清安定性およびノックダウン活性の両方の性質が得られる。修飾フォーマットＤＨ７を有するｓｉＲＮＡは１３位および１４位およびこれらの近くの位置に修飾ヌクレオチドを欠き、したがって、オフターゲット効果を除去する性質を得ることができない。しかし、かかるｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果が予想されない環境下でのサイレンシングに有用であり得る。
【０２２０】
図２３Ａに示したデータは、フォーマットＨおよびオーバーハンギング位置（それぞれ、ＤＨ３８、ＤＨ１、ＤＨ３９、ＤＨ４０、ＤＨ４１、ＤＨ４２、ＤＨ４３）の修飾ヌクレオチドに加えて、アンチセンス鎖の１、２、３、４、５、６、または７位（位置番号１は５’  ヌクレオチドである）での１つのヌクレオチド修飾の影響を試験する。データは、血清安定性の中央値が試験した全てのフォーマットしたｓｉＲＮＡによって増加し、修飾ヌクレオチドがガイドアンチセンス鎖の５’末端からさらに離れて配置されるにつれて安定性が減少する傾向があることを証明している。
【０２２１】
図２３Ｂのデータによって示されるように、フォーマットＤＨ３８を有するｓｉＲＮＡを除いた全てのフォーマットしたｓｉＲＮＡは、７０％を超えるノックダウン活性を有する。この所見は、アンチセンス鎖の５’末端に配置された修飾ヌクレオチドの不適合性を強調している。アンチセンス鎖の５’末端へのリン酸基の付加により、生物活性が部分的に救済されるが、安定性の救済が犠牲になった（データ示さず）。まとめると、血清の安定性およびノックダウンに関するデータは、ガイドアンチセンス鎖の２、３、４、５、６、または７位（５’末端に関して）での少なくとも１つのヌクレオチド修飾がｓｉＲＮＡ安定性を増強する一方で、少なくとも７０％のノックダウン活性も得られることを証明している。
【０２２２】
図１８Ａ〜図２３Ｂのデータをまとめると、少なくとも７０％のノックダウン活性を維持しながらフォーマットＦを超える血清安定性が得られる修飾フォーマットは、フォーマットＤＨ４７、ＤＨ２９、ＤＨ７、ＤＨ１、ＤＨ３９、ＤＨ４０、ＤＨ４１、ＤＨ４２、およびＤＨ４３である。
【０２２３】
フォーマットＤＨ７は１３位および１４位およびその付近に修飾ヌクレオチドを欠き、したがって、オフターゲット効果を除去する性質を得ることができない。
【０２２４】
フォーマットＤＨ４７、ＤＨ２９、ＤＨ１、ＤＨ３９、ＤＨ４０、ＤＨ４１、ＤＨ４２、およびＤＨ４３は、パッセンジャーセンス鎖中の１、２、１３、１４、２０、２１位に修飾ヌクレオチドを有し、ＤＨ４７およびＤＨ２９については、１８位または１９位のいずれか１つに修飾ヌクレオチドを有し、ガイドアンチセンス鎖中の２０位および２１位に修飾ヌクレオチドを有し、ＤＨ３９〜ＤＨ４３については２、３、４、５、６、または７位の任意の１つに修飾ヌクレオチドを有する。両ヌクレオチドがパッセンジャーセンス鎖の１位で修飾される二重の塩基対は、ノックダウン活性に有害なようである（ＤＨ２０、ＤＨ１９、ＤＨ４、ＤＨ１８）。
【０２２５】
（実施例８）安定化ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達
非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡならびに修飾フォーマットＤＨ１およびＤＨ４７を有する安定化ｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで送達させ、コントロールおよび試験動物由来の肝臓中の全長ｓｉＲＮＡの存在量を比較した。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの信頼性があり且つ頑健な定量が可能であり、全長分子のみを特異的に検出するＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのステム−ループＲＴ−ＰＣＲアッセイを、分析のために使用した（２００４年９月２１日出願のＣｈｅｎらの米国特許出願公開第２００５／０２６６４１８号、Ｃｈｅｎ，Ｃ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３，ｅｌ７９，２００５）。
【０２２６】
Ｚｈａｎｇら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｌｉｅｒａｐｙ  １０，１７３５−１７３７．１９９９）およびＬｅｗｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２，１０７−１０８．２００２）に記載のように、Ｆａｓ遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡを、水圧（高圧）尾静脈注入を使用してマウス（１ｎｍｏｌを２．５ｍｌ  ＰＢＳ（マウス体重の１０％）で希釈）に投与した。各修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡを４匹のマウスに注射した。修飾ヌクレオチドは、構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有するＬＮＡ（登録商標）残基であった。
【０２２７】
注射５分後、マウスを屠殺し、全肝臓を回収し、ドライアイス中で凍結させた。製造者のプロトコールにしたがってｍｉｒＶａｎａ（商標）ＰＡＲＩＳ（商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、全ＲＮＡを全肝臓から単離し、以下のように修飾した。細胞破壊緩衝液（２０ｍｌ）を添加し、サンプルを均質化した。溶解物（４００μｌ）を新規のチューブに移し、変性溶液（４００μｌ）を各チューブに添加し、ボルテックスによってチューブを十分に混合した。８００μｌフェノールの添加、５分間のボルテックス、および１０分間の遠心分離によってフェノール抽出を行った。上相（３００μｌ）を新規のチューブに移し、３７５μｌ（１．２５ｖｏｌ）の１００％エタノールと混合した。キットのプロトコールにしたがって濾過カラムに混合物を通過させ、１００μｌの溶離緩衝液で最終溶離を行った。ＲＮＡ濃度を測定し、１０ｎｇ／μｌに調整した。
【０２２８】
ｓｉＲＮＡの定量アッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に記載のようにステム−ループデザインを有するＲＴプライマーを使用したｓｉＲＮＡのガイド鎖の逆転写（ＲＴ）およびその後のＰＣＲを含んでいた。１０μｌのＲＴ反応物中で、１ｎｇ／μｌの総ＲＮＡおよび５０ｎＭのＲＴプライマーを８５℃で５分間変性させ、次いで、６０℃で５分間、次いで、４℃でアニーリングした。酵素ミックス（０，２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、最終濃度；３．３３単位／μｌのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１×ＲＴ緩衝液、０．２５単位／μｌのＲＮアーゼインヒビター）の添加後、反応混合物を１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間、次いで、４℃でインキュベーションした。標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲプロトコールを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてリアルタイムＰＣＲを行った。１０μｌのＰＣＲ反応混合物は、１μｌ  ＲＴ産物、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス、０．２μＭ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、１．５μＭ順方向プライマー、および０．７μＭ逆方向プライマーを含んでいた。反応物を９５℃で１０分間インキュベーションし、その後に９５℃で１５秒間を４０サイクル、および６０℃で１分間インキュベーションした。
【０２２９】
均質化の前に、個別のコントロール無処理マウス群由来の凍結した全肝臓に、３００、２００、１００、および５０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡをスパイクした。これらの「スパイクした」サンプルは、研究のコントロールとしての機能を果たし、注入サンプルとコントロールサンプルとの間のサイクル閾値（Ｃｔ）の比較のための検量線が得られる。上記のように、ＲＮＡをコントロール器官から単離した。用語「Ｃｔ」は、シグナルが最初に統計的に有意に記録された場合のＰＣＲサイクル数を示す。したがって、Ｃｔ値が低いほど、核酸標的の濃度が高い。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイでは、典型的には、各サイクルでＰＣＲ産物の量がほぼ倍増する。したがって、反応が全く阻害されず、且つ精製核酸とほぼ１００％の効率で反応する場合、蛍光シグナルが倍増するはずである。
【０２３０】
図２４は、「スパイクした」コントロール、非修飾フォーマットＡ注入した動物、ならびにフォーマットＤＨ１およびフォーマットＤＨ４７  ｓｉＲＮＡ処置動物についてのＣｔ値を示す。水圧注入の５分後に肝臓中で約５％の非修飾フォーマットＡ  ｓｉＲＮＡが検出された。対照的に、フォーマットＤＨ１およびＤＨ４７を有する修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡの約２０％が検出され、非修飾ｓｉＲＮＡと比較して４００％増加した。このｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、安定化のために修飾フォーマットしたｓｉＲＮＡが全身投与の際に全長ｓｉＲＮＡの送達を有意に増加させることを証明している。
【０２３１】
本教示の組成物、方法、およびキットは、本明細書中に広範且つ一般的に記載されている。一般的開示の範囲に含まれる各々のより狭い種および亜属の分類も本教示の一部を形成する。これには、本教示の一般的説明が含まれる。これには、削除された資料が本明細書中に具体的に引用されるかどうかと無関係に、属からの任意の対象物を除去する但し書きまたは否定による限定を含む。
【０２３２】
開示の教示が種々の適用、方法、および組成物に関して記載されているにもかかわらず、本明細書中の教示を逸脱することなく種々の変更形態および修正形態が可能であると認識されるであろう。本教示をより良好に例示するために上記実施例を提供しているが、これは、本明細書中の教示の範囲を限定することを意図しない。本教示の一定の態様を、以下の特許請求の範囲を考慮してさらに理解することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2014097073.tif 000013
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
2014097073.tif 000020
【図１Ｊ】
2014097073.tif 000021
【図１Ｋ】
2014097073.tif 000022
【図３】
2014097073.tif 000023
【図４Ａ】
2014097073.tif 000024
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2014097073.tif 000032
【図６Ｂ】
2014097073.tif 000033
【図６Ｃ】
2014097073.tif 000034
【図７】
2014097073.tif 000035
【図８】
2014097073.tif 000036
【図１０Ａ】
2014097073.tif 000037
【図１０Ｂ】
2014097073.tif 000038
【図１０Ｃ】
2014097073.tif 000039
【図１０Ｄ】
2014097073.tif 000040
【図１０Ｅ】
2014097073.tif 000041
【図１１Ａ】
2014097073.tif 000042
【図１１Ｂ】
2014097073.tif 000043
【図１１Ｃ】
2014097073.tif 000044
【図１１Ｄ】
2014097073.tif 000045
【図１１Ｅ】
2014097073.tif 000046
【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ−１】
2014097073.tif 000048
【図１２Ａ−２】
2014097073.tif 000049
【図１２Ｂ】
2014097073.tif 000050
【図１２Ｃ】
2014097073.tif 000051
【図１２Ｄ】
2014097073.tif 000052
【図１３Ａ−１】
2014097073.tif 000053
【図１３Ａ−２】
2014097073.tif 000054
【図１３Ｂ】
2014097073.tif 000055
【図１３Ｃ】
2014097073.tif 000056
【図１３Ｄ】
2014097073.tif 000057
【図１４】
2014097073.tif 000058
【図１５Ａ】
2014097073.tif 000059
【図１５Ｂ】
2014097073.tif 000060
【図１５Ｃ】
2014097073.tif 000061
【図１５Ｄ】
2014097073.tif 000062
【図１６Ａ】
2014097073.tif 000063
【図１６Ｂ】
2014097073.tif 000064
【図１６Ｃ】
2014097073.tif 000065
【図１６Ｄ】
2014097073.tif 000066
【図１７】
2014097073.tif 000067
【図１８】
2014097073.tif 000068
【図１９】
2014097073.tif 000069
【図２０】
2014097073.tif 000070
【図２１】
2014097073.tif 000071
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2014097073.tif 000074
【図２】
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【図９Ａ】
2014097073.tif 000076
【図９Ｂ】
2014097073.tif 000077
【図９Ｃ】
2014097073.tif 000078
【外国語明細書】
2014097073000001.pdf