(57)【要約】【課題】ＨＣＶ複製及び／又はウイルス又はウイルス様粒子の産生のための動物モデルを提供すること。【解決手段】本発明は、免疫無防備状態である動物を含む動物モデル内でＨＣＶ核酸を送達し、ＨＣＶタンパク質を複製及び発現するために、細胞内に存在するＨＣＶレプリコンを使用する。本発明は更に、哺乳動物におけるＨＣＶを処置又は予防する方法であって、免疫調節化合物及び別の抗ウイルス剤を含む組み合わせを哺乳動物に投与することを含む、方法も提供する。又、インターフェロンα又はその他何れかの免疫調節因子に対する感受性の低下を示す細胞株、及びこのような細胞株を作製又は単離する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ヒト及びチンパンジーにのみ感染する。結果として、ＨＣＶの分野は、ＨＣＶの感染及び／又は複製の強力な小動物モデルがないことに悩まされている。存在する、又は提案されたＨＣＶの感染及び複製のモデルは、複雑な技術及び／又は天然のＨＣＶに感染したヒトの接種材料の使用に依存する。幾つかの存在するモデルは、移植した自然に感染したＨＣＶ細胞、又はヒト血清を使用してｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでＨＣＶに感染した細胞を使用する。既存のモデルは又、肝臓を損傷するように遺伝的に突然変異したマウスの使用に依存し、及び／又は宿主の生物学を複雑にするＨＣＶ遺伝子を送達するウイルスベクターを使用する場合がある。例えば、１つの手法においては、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）が、肝臓が損傷された（Ａｌｂ−ｕＰＡ  ＳＣＩＤ／ｂｇ）マウスの肝臓に移植される。ＰＨＨが移植されると、マウスは、ＨＣＶを含むヒト血清に（ｉｎ  ｖｉｖｏで）感染する可能性がある。次いで、ＨＣＶがこれらのヒト肝細胞に感染する。或いは、供与体における自然感染の結果として、ｉｎ  ｖｉｖｏで感染したＰＨＨはマウスの肝臓に移植することができる。別の手法においては、ヒト肝細胞癌細胞（ＨＣＣ）が、ｅｘ  ｖｉｖｏでＨＣＶを含むヒト血漿とインキュベートされ、無胸腺ヌードマウスの肝臓に移植される。又、ＨＣＶレプリコン及び欠損を克服する少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合している制御配列を含む発現システムを使用して、必須の肝臓タンパク質を欠損する肝臓を損傷したマウスを形質転換することが提案された。又、プロテアーゼ等のＨＣＶタンパク質を送達するアデノウイルスベクターを使用することが開示されている。更に、感染性のモデルは、ｅｘ
ｖｉｖｏで肝臓のフラグメントを感染し、感染した肝臓をマウス（ＸＴＬ）に移植することを含む。
【０００２】
これらのシステムの不都合は、それらが多くの時間と労力を要し、新鮮なヒト肝細胞を単離及び移植するための特別な専門知識を必要とし、及び／又は遺伝子導入動物（高い死亡率を有する）を必要とし、感染性のウイルス接種材料を必要とし、及び／又は宿主と細胞生物学に重要な影響を与えるウイルスベクターを使用することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＣＶ複製及び／又はウイルス又はウイルス様粒子の産生のための動物モデルにおいて使用することのできる動物を提供する。本発明は、ＨＣＶ核酸を送達し、免疫無防備状態である動物を含む動物モデルにおいてＨＣＶタンパク質を複製及び発現するために細胞内に存在するＨＣＶレプリコンを利用する。レプリコンは、更にレポーター遺伝子を含み、ゲノム又はサブゲノムのレプリコンであってもよい。
【０００４】
前記動物は、免疫無防備状態である動物中に導入されたＨＣＶレプリコンを含有する細胞を含む。細胞は、既にＨＣＶレプリコンを含む（感染細胞）か、又はＨＣＶ  ＲＮＡの複製及びウイルスタンパク質の発現を補助するＨＣＶレプリコンを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションされている（トランスフェクト細胞）。細胞は又、レプリコンＲＮＡを使用して、動物においてｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトすることができる。細胞は又、更なるタンパク質を発現する場合もある。レプリコンは、レプリコンの複製及び／又は発現を監視するか、レプリコンからのウイルス又はウイルス様粒子の産生を監視するためのレポーター遺伝子を更に含む。レプリコンを含む細胞を動物に導入した後、ＨＣＶレプリコンの複製及び／又は発現を、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する場合がある。ウイルス又はウイルス様粒子の産生は、ウイルス又はウイルス様粒子についての動物の血液を試験することにより監視することができる。種々の実施形態によれば、動物における増殖及びレプリコン安定性に適応されるヒト由来細胞が使用される。一実施形態において、動物は本明細書に開示するような小動物である。
【０００５】
別の実施形態において、本発明は、複数の抗ウイルス剤の併用、及び複数の抗ウイルス剤を含む薬学的組成物を提供する。
【０００６】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＨＣＶを処置又は予防する方法であって、免疫調節化合物及び別の抗ウイルス剤を含む組み合わせを哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態において、抗ウイルス剤は、プロテアーゼ、ヘリカーゼ、ＧＴＰアーゼ、ポリメラーゼ等のウイルス酵素の阻害剤、ＩＲＥＳの阻害剤、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンス等の小分子、抗−ｃｄ８１化合物等のＨＣＶ生物学の阻害剤、及び本明細書で詳細に考察するその他既知の免疫調節因子からなる群から選択することができる抗Ｃ型肝炎ウイルス剤である。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、以下に示す実施例において提供される方法に従って得られるゲノム又はサブゲノムレプリコン（ｓｕｂ−ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を含む細胞株を提供する。幾つかの実施形態において、細胞株は、本明細書に記載の通り、動物において１回以上継代接種された後のインターフェロン又はその他幾つかの免疫調節因子に対する感受性の低下を示す。一実施形態において、本発明は、ＨＣＶレプリコン由来のＨＣＶウイルス又はウイルス様粒子の複製、発現又は産生を測定するのに有用な動物であって、該動物がレポーター遺伝子を含むＨＣＶレプリコンを含み、免疫無防備状態である動物を提供する。
【０００８】
ＨＣＶレプリコンを含む細胞は、初代肝細胞、幹細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、骨髄由来細胞、肝癌、肝芽腫からなる群から選択され、ヒト細胞株であっても、不死化細胞株であってもよい。好ましい実施形態において、動物は小動物であり、げっ歯類であってもよい。
【０００９】
本発明は又、ＨＣＶ複製を減少又は阻害する化合物を同定する方法であって、ａ）項目１〜４５の何れか１項に記載の免疫無防備状態である動物を提供する工程；ｂ）候補化合物を該動物に投与する工程；及びｃ）手順ａ）で提供される、該化合物と接触させていない動物の該レプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルと比較して、該動物の該レプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルを測定する工程を含み；該化合物と接触させた該動物のレプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルを減少又は阻害する化合物が、ＨＣＶの複製を阻害する又は減少させる化合物である、方法を提供する。
【００１０】
本発明は又、ＨＣＶ粒子の産生を減少又は阻害する化合物を同定する方法であって、ａ）免疫無防備状態である動物を提供する工程；ｂ）化合物を該動物に投与する工程（該化合物は、レプリコンの複製又は発現を減少させず、阻害しない）；及びｃ）手順ａ）で提供される、該化合物と接触させていない動物の該レプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルと比較して、該動物の該レプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルを測定する工程を含み；該化合物と接触させた該動物のレプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルを減少又は阻害する化合物が、ＨＣＶ粒子の産生を阻害する又は減少させる化合物である、方法を提供する。
【００１１】
本発明は又、治療有効量の第１の抗ウイルス剤、及び治療有効量の第２の抗ウイルス剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００１２】
本発明は又、本明細書に開示された薬学的組成物の抗ＨＣＶに有効な量を哺乳動物に投与することにより哺乳動物におけるＨＣＶ感染を処置又は予防する方法を提供する。
【００１３】
本発明は更に、本明細書に記載の一般的方法及び特定の実施例の何れかに記載の通り１つ及び複数の細胞株を樹立する方法も提供する。一実施形態において、本発明は、前記細胞株が、本明細書に開示される本発明の動物を継代接種した後に免疫調節因子に対して感受性が低い細胞株を提供する。
【００１４】
一実施形態において、免疫調節化合物はインターフェロンα２Ｂである。
別の実施形態において、本発明は、インターフェロンαに対する感受性が低下した腫瘍細胞株であって、（一実施形態において生物発光性である）レポーター遺伝子を含むＨＣＶレプリコンを含む腫瘍細胞を、免疫無防備状態のマウスであって、細胞移植される前に放射線照射されているマウスに移植する；強力な生物発光又はその他のマーカーを放射線照射した腫瘍を移植した後のマウスから切除する；細胞のための陽性選択剤の存在下で腫瘍の生物発光部分をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する；ルシフェラーゼ発現が高い細胞コロニーを選択して、前記細胞を培養する、手順により得られる、腫瘍細胞株を提供する。別の実施形態において、本発明は、レプリコンが回復した腫瘍細胞株であって、レプリコンを含む間に動物を継代接種していない親細胞株に比較して、インターフェロンα又は別の免疫修飾化合物に対する感受性の低下を示す、腫瘍細胞株を提供する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＨＣＶレプリコン由来のＨＣＶウイルス又はウイルス様粒子の複製、発現又は産生を測定するのに有用な動物であって、
レポーター遺伝子を含むＨＣＶレプリコンを含有する細胞を含み；
該動物が免疫無防備状態である、動物。
（項目２）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞が、初代肝細胞；幹細胞；腎臓細胞；肝臓細胞；骨髄由来細胞；ヘパトーム；肝芽腫からなる群から選択される、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記レプリコンを含む前記細胞が、ヒト細胞であるか、ヒト細胞に由来する、項目１又は２に記載の動物。
（項目４）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞が不死化細胞である、項目１に記載の動物。
（項目５）
前記レプリコンを含む前記細胞が腫瘍細胞である、項目１〜４の何れか１項に記載の動物。
（項目６）
前記細胞が、Ｈｕｈ  ７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３、ＩＭＹ細胞、ＦＬＣ４細胞、及びＨｅｐＧ２細胞から選択される、項目５に記載の動物。
（項目７）
前記細胞がＨｕｈ  ７細胞に由来する、項目６に記載の動物。
（項目８）
前記Ｈｕｈ  ７に由来する細胞が、Ｈｕｈ  ５−２細胞である、項目７に記載の動物。
（項目９）
小動物である、項目１〜８の何れか１項に記載の動物。
（項目１０）
前記小動物がげっ歯類である、項目９に記載の動物。
（項目１１）
前記げっ歯類がマウスである、項目１０に記載の動物。
（項目１２）
非トランスジェニック動物である、項目１〜１１の何れか１項に記載の動物。
（項目１３）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞が、前記生物を介した複数の継代により該動物における増殖に適応される、項目１〜１２の何れか１項に記載の動物。
（項目１４）
前記レプリコンを含む前記細胞が、前記動物において向上した増殖速度を有するように適応される、項目１〜１３の何れか１項に記載の動物。
（項目１５）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞が、前記動物において向上したレプリコン安定性を有するように適応される、項目１〜１４の何れか１項に記載の動物。
（項目１６）
前記適応された細胞が、前記動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで連続して皮下に継代接種されている、項目１３〜１５の何れか１項に記載の動物。
（項目１７）
前記ＨＣＶレプリコンがサブゲノムレプリコンである、項目１〜１６の何れか１項に記載の動物。
（項目１８）
前記ＨＣＶレプリコンがゲノムレプリコンである、項目１〜１６の何れか１項に記載の動物。
（項目１９）
前記レポーター遺伝子が、ＨＣＶポリタンパク質又はそのフラグメントをコードするモノシストロン性ＲＮＡの一部である、項目１〜１８の何れか１項に記載の動物。
（項目２０）
前記レポーター遺伝子が、ＨＣＶプロテアーゼにより前記ＨＣＶタンパク質から開裂される、項目１９に記載の動物。
（項目２１）
前記レポーター遺伝子産物が、前記ＨＣＶレプリコンの複製及び発現並びに前記ＨＣＶポリタンパク質の開裂の後にＨＣＶタンパク質に融合したままとなる、項目１９に記載の動物。
（項目２２）
前記レポーター遺伝子産物が、ＨＣＶ構造タンパク質に融合したままとなる、項目２１に記載の動物。
（項目２３）
前記レポーター遺伝子産物が、ＨＣＶ非構造タンパク質に融合したままとなる、項目２１に記載の動物。
（項目２４）
前記レポーター遺伝子産物が、ＮＳ５Ａに融合したままとなる、項目２３に記載の動物。
（項目２５）
前記レポーター遺伝子が、酵素；既知の抗体により検出可能な抗原；及び蛍光を発するタンパク質からなる群から選択される産物をコードする、項目１〜２４の何れか１項に記載の動物。
（項目２６）
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼである酵素をコードする、項目２５に記載の動物。
（項目２７）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞が更に、少なくとも１つの更なる遺伝子を発現する、項目１〜２６の何れか１項に記載の動物。
（項目２８）
前記更なる遺伝子が第２のレポーター遺伝子を含む、項目２７に記載の動物。
（項目２９）
前記第２のレポーター遺伝子が、前記動物に導入された細胞の生存能力のマーカーである、項目２８に記載の動物。
（項目３０）
前記更なる遺伝子がカベオリンを含む、項目２７〜２８の何れか１項に記載の動物。
（項目３１）
前記カベオリンが、カベオリン−３又はカベオリン−３の機能的同等物である、項目３０に記載の動物。
（項目３２）
前記カベオリン−３がヒトカベオリン−３である、項目３１に記載の動物。
（項目３３）
１つ以上の前記更なる遺伝子がプラスミド内にコードされる、項目２７〜３２の何れか１項に記載の動物。
（項目３４）
１つ以上の前記更なる遺伝子が、前記ＨＣＶレプリコン内にコードされる、項目２７〜３３の何れか１項に記載の動物。
（項目３５）
１つ以上の前記更なる遺伝子が、前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞のゲノム内に組み込まれる、項目２７〜３４の何れか１項に記載の動物。
（項目３６）
１つ以上の前記更なる遺伝子が、ＨＣＶ、前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞及び前記動物に対して異種である、項目２７〜３５の何れか１項に記載の動物。
（項目３７）
前記動物が、遺伝子の突然変異、照射、及び化学的免疫抑制の少なくとも１つにより免疫無防備状態にされる、項目１〜３６の何れか１項に記載の動物。
（項目３８）
前記動物がγ線照射されている、項目３７に記載の動物。
（項目３９）
前記動物がＳＣＩＤ動物である、項目１〜３８の何れか１項に記載の動物。
（項目４０）
レプリコンの発現及び／又は前記ＨＣＶレプリコンの複製が、該レプリコンを含む前記細胞が前記動物内に導入された後、少なくとも２日間維持される、項目１〜３９の何れか１項に記載の動物。
（項目４１）
レプリコンの発現及び／又は前記ＨＣＶレプリコンの複製が、該レプリコンを含む前記細胞が前記動物内に導入された後、少なくとも５日間維持される、項目４０に記載の動物。
（項目４２）
レプリコンの発現及び／又は前記ＨＣＶレプリコンの複製が、該レプリコンを含む前記細胞が前記動物内に導入された後、少なくとも７日間維持される、項目４０に記載の動物。
（項目４３）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞が、前記動物の門脈に該ＨＣＶレプリコンを含む該細胞を注射することによって該動物に導入される、項目１〜４２の何れか１項に記載の動物。
（項目４４）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞が、前記動物の肝臓に移植される、項目１〜４２の何れか１項に記載の動物。
（項目４５）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞が、前記動物の皮下に移植される、項目１〜４２の何れか１項に記載の動物。
（項目４６）
ＨＣＶ複製を減少又は阻害する化合物を同定する方法であって、
ａ）項目１〜４５の何れか１項に記載の免疫無防備状態である動物を提供する工程；
ｂ）候補化合物を該動物に投与する工程；及び
ｃ）手順ａ）で提供される、該化合物と接触させていない動物のレプリコン内に含まれるレポーター遺伝子の活性レベルと比較して、該動物の該レプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルを測定する工程、
を包含し；
該化合物と接触させた該動物のレプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルを減少又は阻害する化合物が、ＨＣＶの複製を阻害する又は減少させる化合物である、方法。
（項目４７）
複製の経過が、前記ＨＣＶレプリコンを含む細胞を前記動物に導入した後、少なくとも２日間観察される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
複製の経過が、前記ＨＣＶレプリコンを含む細胞を前記動物に導入した後、少なくとも５日間観察される、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
複製の経過が、前記ＨＣＶレプリコンを含む細胞を前記動物に導入した後、少なくとも７日間観察される、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞を前記動物に導入する前に、該動物が免疫無防備状態にされる、項目４６〜４９の何れか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞を前記動物に導入した後に、該動物が免疫無防備状態にされる、項目４６〜４９の何れか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞を前記動物に導入するのと同時に、該動物が免疫無防備状態にされる、項目４６〜４９の何れか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞が、皮下移植によって前記動物に導入される、項目４６〜５２の何れか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記細胞が前記動物の肝臓内に移植される、項目４６〜５２の何れか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞が、門脈を介して前記動物に導入された後、該動物の肝臓に移動する、項目４６〜５２の何れか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記動物がγ線照射により免疫無防備状態にされる、項目４６〜５５の何れか１項に記載の方法。
（項目５７）
ＨＣＶ粒子の産生を減少又は阻害する化合物を同定する方法であって、
ａ）項目１〜４３の何れか１項に記載の免疫無防備状態である動物を提供する工程；
ｂ）化合物を該動物に投与する工程であって、該化合物は、レプリコンの複製も発現も減少または阻害しない、工程；及び
ｃ）手順ａ）で提供される、該化合物と接触させていない動物の該レプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルと比較して、該動物の該レプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルを測定する工程、
を包含し；
該化合物と接触させた該動物の該レプリコン内に含まれる該レポーター遺伝子の活性レベルを減少又は阻害する化合物が、ＨＣＶ粒子の産生を阻害する又は減少させる化合物である、方法。
（項目５８）
複製の経過が、前記ＨＣＶレプリコンを含む細胞を前記動物に導入した後、少なくとも２日間観察される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
複製の経過が、前記ＨＣＶレプリコンを含む細胞を前記動物に導入した後、少なくとも５日間観察される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
複製の経過が、前記ＨＣＶレプリコンを含む細胞を前記動物に導入した後、少なくとも７日間観察される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞を前記動物に導入する前に、該動物が免疫無防備状態にされる、項目５７〜６０の何れか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞を前記動物に導入した後に、該動物が免疫無防備状態にされる、項目５７〜６０の何れか１項に記載の方法。
（項目６３）
前記ＨＣＶレプリコンを含む前記細胞を前記動物に導入するのと同時に、該動物が免疫無防備状態にされる、項目５７〜６０の何れか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記細胞が、皮下移植によって前記動物に導入される、項目５７〜６０の何れか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記細胞が前記動物の肝臓内に移植される、項目５７〜６０の何れか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記細胞が、門脈を介して前記動物に導入された後、該動物の肝臓に移動する、項目５７〜６０の何れか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記動物がγ線照射により免疫無防備状態にされる、項目５７〜６６の何れか１項に記載の方法。
（項目６８）
候補化合物を前記動物に投与する前に、ＨＣＶの複製又は粒子の形成を減少又は阻害する化合物が該動物に投与される、項目４６〜６７の何れか１項に記載の方法。
（項目６９）
治療有効量の第１の抗ウイルス剤、及び治療有効量の第２の抗ウイルス剤を含む薬学的組成物。
（項目７０）
前記第１の抗ウイルス剤がインターフェロン又はＨＣＶプロテアーゼ阻害剤である、項目６９に記載の薬学的組成物。
（項目７１）
前記第１の抗ウイルス剤がインターフェロンである、項目７０に記載の薬学的組成物。
（項目７２）
前記インターフェロンがα−インターフェロン又はペグ化α−インターフェロンである、項目７１に記載の薬学的組成物。
（項目７３）
前記第２の抗ウイルス剤がＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤である、項目７１に記載の薬学的組成物。
（項目７４）
前記ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤がＢＩＬＮ  ２０６１である、項目７３に記載の薬学的組成物。
（項目７５）
前記第２の抗ウイルス剤が、免疫調節因子、ＨＣＶヘリカーゼの阻害剤、ＨＣＶポリメラーゼの阻害剤又はＨＣＶプロテアーゼの阻害剤、リバビリン、アマンタジン、ＶＸ−４９７（メリメポジブ、Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＶＸ−４９８（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レボビリン、ビラミジン、セプレン（マキサミン）、ＸＴＬ−００１及びＸＴＬ−００２（ＸＴＬ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＮＡ９７５（Ａｎａｄｙｓ）、ＭＮ２８３−バロピクチタビン（Ｉｄｅｎｉｘ）から選択される、項目６９に記載の薬学的組成物。
（項目７６）
前記第２の抗ウイルス剤が抗ＨＣＶ抗ウイルス剤である、項目７５に記載の薬学的組成物。
（項目７７）
前記抗ＨＣＶ抗ウイルス剤が、ＨＣＶヘリカーゼの阻害剤、ＨＣＶポリメラーゼの阻害剤又はＨＣＶプロテアーゼの阻害剤、リバビリン、アマンタジン、ＶＸ−４９７（メリメポジブ、Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＶＸ−４９８（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レボビリン、ビラミジン、セプレン（マキサミン）、ＸＴＬ−００１及びＸＴＬ−００２（ＸＴＬ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＮＡ９７５（Ａｎａｄｙｓ）、ＭＮ２８３−バロピクチタビン（Ｉｄｅｎｉｘ）、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される、項目７６に記載の薬学的組成物。
（項目７８）
前記抗ウイルス剤の１つが、イミダゾキノリン、ＳＭＩＰＳ及びＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、項目６９又は７０に記載の薬学的組成物。
（項目７９）
抗ＨＣＶに有効な量の項目６９〜７８の何れか１項に記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物におけるＨＣＶ感染を処置又は予防するための方法。
（項目８０）
前記化合物が連続して投与される、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記化合物が同時に投与される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
本明細書に記載の一般的方法及び特定の実施例の何れかに記載される細胞株を樹立する方法。
（項目８３）
本明細書に記載の一般的方法及び特定の実施例の何れかに記載される細胞株。
（項目８４）
本明細書に記載の通り本発明の動物を継代接種した後に、前記細胞株が免疫調節因子に対して感受性が低い、項目８３に記載の細胞株。
（項目８５）
本明細書に記載の通り本発明の動物を継代接種した後に、前記細胞株がインターフェロンαに対して感受性が低い、項目８４に記載の細胞株。
（項目８６）
以下のプロセス：
レポーター遺伝子を含むＨＣＶレプリコンを含む細胞を免疫無防備状態のマウスに移植する工程；
移植後に、強い生物発光を発する腫瘍を該マウスから切除する工程；
該細胞に対して陽性選択剤の存在下で該腫瘍の生物発光部分をｉｎ  ｖｉｔroで培養する工程；
ルシフェラーゼの発現が高い細胞コロニーを選択して、該細胞を培養する工程
により得られる、インターフェロンαに対する感受性が低下した細胞株。
（項目８７）
腫瘍細胞株である、項目８６に記載の細胞株。
（項目８８）
前記マウスが、前記レプリコンを含む前記腫瘍細胞を移植する前に照射される、項目８７に記載の腫瘍細胞株。
（項目８９）
前記腫瘍が移植後２〜４週間の間に前記マウスから切除される、項目８６〜８８の何れか１項に記載の腫瘍細胞株。
（項目９０）
前記選択剤がＧ４１８である、項目８９に記載の腫瘍細胞株。
（項目９１）
前記細胞がもはや前記レプリコンを含有しなくなるまで、該細胞が連続してインターフェロンαに曝露される、項目８６〜９０の何れか１項に記載の腫瘍細胞株。
（項目９２）
前記細胞が、約２００ＩＵ／ｍＬのインターフェロンαの用量で、インターフェロンαに曝露される、項目９１に記載の腫瘍細胞株。
（項目９３）
腫瘍細胞株Ｔ７−ｌｌ；Ｔ７−ｌｌＣ；Ｌ１０−６；及びＬ１０−６Ｃからなる群から選択される腫瘍細胞株。
（項目９４）
前記免疫無防備状態のマウスがＳＣＩＤマウスである、項目８６〜９２の何れか１項に記載の腫瘍細胞株。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＮＳ３領域における２個のＨｕｈ７細胞適応突然変異Ｅ１２０２Ｇ及びＴ１２８０Ｉと、ＮＳ４Ｂ領域における１個の適応突然変異Ｋ１８４６Ｔを含む、サブゲノムＨＣＶレプリコン構築物ＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴ（ポリオウイルスＩＲＥＳレプリコン）を示す。これらの適応突然変異の位置を図１中の星により示す。示されるレプリコンは、本発明の一実施形態による動物モデルにおいて使用される。図２Ａは、Ｈｕｈ７細胞中でＨＣＶ  ５’ＵＴＲ／ＩＲＥＳによって促進されるルシフェラーゼ発現を有する、Ｈｕｈ７細胞中のＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴレプリコン（図１においてＰＶＩレプリコンを標識）、及びＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／５．１レプリコン（図１においてＨＣＶＩレプリコンを標識）を使用したトランスフェクションから２４、４８及び７２時間後に１×１０４細胞当たりの相対光量（ＲＬＵｓ）で発現するルシフェラーゼシグナルを示すグラフである。図２Ｂは、ＨＣＶＩレプリコン（適応突然変異Ｅ１２０２Ｇ，Ｔ１２８０Ｉ，Ｌ１７５７Ｉ，Ｎ２１０９Ｄ，Ｓ２１９７Ｐ，Ｐ２３２７Ｓ及びＫ２３５０Ｅを有する）を含むＨｕｈ７細胞、ＨＣＶＩレプリコン（適応突然変異Ｅ１２０２Ｇ，Ｔ１２８０Ｉ及びＫ１８４６Ｔを有する）を含むＨｕｈ７細胞、及びＰＶＩレプリコン（図１において星で示される適応突然変異Ｅ１２０２Ｇ，Ｔ１２８０Ｉ及びＫ１８４６Ｔを有する）を含む細胞のコロニー形成を示す。レプリコンを有する細胞はＧ４１８を使用して選択される。
【図３】図３は、５−２Ｈｕ７細胞及びＳ６．１−６細胞による腫瘍形成の速度の２つの試験（０６１及び１５９試験）結果を示すグラフである。０６１実験は、５−２  Ｈｕｈ７細胞の腫瘍形成の速度を決定し、１５９実験は、Ｓ６．１細胞及び５−２  Ｈｕｈ７細胞の腫瘍形成の速度を決定した。
【図４】図４は、Ｈｕｈ７  ＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴ由来のトランスフェクトされたＲＮＡを含むＳ６．１（高速増殖腫瘍）細胞クローンのルシフェラーゼ検定の結果を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、レプリコン含有細胞を移植したマウスの画像である。図５Ａは、Ｓ６．１−６細胞を皮下移植し、γ線照射したＳＣＩＤマウスの画像を示す。図５Ｂは、Ｓ６．１−６細胞を皮下移植したＳＣＩＤ−ｂｇマウスの画像を示す。図５Ｃは、マトリゲルの存在下で５−２  Ｈｕｈ７細胞を皮下移植したＳＣＩＤ−ｂｇマウスの画像を示す。画像は、接種から１、３、４及び７日後に取得し、生物発光を示した。
【図６】図６Ａ及びＧは、Ｓ６．１−６又は５−２  Ｈｕｈ７細胞を接種されたマウスの接種後の時間関数として平均生物発光を示すグラフである。図６Ａは、ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに皮下投与したＳ６．１−６細胞と比較した、ＳＣＩＤマウスに皮下移植し、γ線照射したＳ６．１−６細胞（代表的なマウスを図５Ａに示す）の平均生物発光を示す。図６Ｂは、５−２  Ｈｕｈ７細胞をマトリゲルの存在下で皮下移植したＳＣＩＤ／ｂｇマウスの平均生物発光を示す（代表的なマウスを図５Ｃに示す）。
【図７】図７は、Ｓ６．１−６細胞を皮下移植した、γ線照射したＳＣＩＤマウスの１、２、３、４、７、１０、１７及び２１日目における平均生物発光を、５−２  Ｈｕｈ７細胞を皮下移植し、γ線照射したＳＣＩＤマウスのそれと比較するグラフである。
【図８】図８は、Ｓ６．１−６細胞を皮下移植した３つの実験群：対照群、低用量ＩＦＮ−α群及び高用量ＩＦＮ−α群それぞれに由来する代表的なマウスの１、２、３、４及び７日における画像である。マウスにγ線を照射し、以下の投与量を投与した。対照群：担体（ハンクス液（ＨＢＳＳ）中、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを０．１ｍＬ）の１日１回（ＱＤ）皮下投与（ＳＣ）；低用量ＩＦＮ−α群；１８ｇのマウスに対し、１日当たり２，４００ＩＵのＩＦＮ−αを皮下投与：高用量ＩＦＮ−α群：１８ｇのマウスに対し、１日当たり２００，０００ＩＵのＩＦＮ−αを皮下投与。各日の投与前に画像を取得した。
【図９】図９は、図８に関連し、前述した各群の平均生物発光を示すグラフである。生物発光は毎日の投与前に測定した。
【図１０】図１０は、Ｈｕｈ７細胞をマウスに皮下移植し、腫瘍を増殖させてから４２日後の未処理マウス（担体）と比較した、ＩＦＮ−α（ＩＦＮ）で処理したマウスの生物発光シグナルを示すグラフである。４２日目に、マウスに以下の投与量を投与した：対照群：担体（ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン０．１ｍＬ）皮下投与ＩＦＮ−α群；１８ｇのマウスに対し２００，０００ＩＵ／日のＩＦＮ−α、皮下投与。生物発光は投与前及び投与後４３日目に測定した。
【図１１】図１１は、７日間にわたり測定した、肝臓に移植したＳ６−１−６細胞を移植したマウスの平均生物発光を示すグラフである。ＩＦＮ−α（ＩＦＮ）で処理されたマウスの平均生物発光を、未処理マウスのものと比較する。マウスを以下の投与量で処理した。担体又は対照群（第１群）を、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン０．１ｍＬを使用して、１日１回投与した。ＩＦＮα群（第２群）は、１８ｇのマウスに対し、１日当たり２００，０００ＩＵ／日のＩＦＮ−αを皮下投与により実施した。１、２、４及び７日目の投与前に生物発光を測定した。
【図１２】図１２は、Ｔ７−１１皮下モデルにおける平均生物発光とサブゲノムＲＮＡの複製間の相関関係である。（ａ）γ線照射したＳＣＩＤマウスにおける、マウス適応レプリコン含有Ｔ７−１１細胞及び親Ｓ６．１−６細胞の平均生物発光。Ｔ７−１１及びＳ６．１−６細胞を皮下移植し、種々の時点で平均生物発光を得、グラフにプロットした。１、１０、１５、２５及び３１日目における２つの群の代表的なマウスの画像を下のパネルに示す。（ｂ）腫瘍組織におけるＨＣＶウイルスＲＮＡの検出。全ＲＮＡ（１０μｇ）をＴ７−１１細胞の皮下移植後２６日目にγ線照射したＳＣＩＤマウス内で形成された腫瘍から単離し（レーン４）、ノーザンブロット解析を行った。ブロットを、ＨＣＶ  ＮＳ５領域に対応する放射標識したＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＨＣＶ  ＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の１×１０８ゲノムは、ハイブリダイゼーション反応のマーカー及び対照とし（レーン１）、２８Ｓ  ｒＲＮＡは、解析した各試料中に存在するＲＮＡの量の対照とした。レーン２及び３は、陰性対照として、投薬を受けていないＨｕｈ７及びＳ６．１細胞から抽出された全ＲＮＡであった。
【図１３Ａ】図１３は、Ｔ７−１１モデルにおけるＩＦＮ−α２Ｂ（ＩＦＮ）の抗ウイルス活性である。（ａ）皮下投与マウスモデルにおける濃度依存的なＩＦＮ抗ＨＣＶ効果。ＩＦＮ処理は、γ線照射したＳＣＩＤマウスにおけるＴ７−１１細胞の移植後１９日目に実施された。以下の投与量を１日１回、７日間皮下経路により投与した：対照、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍＬのヒトアルブミンを０．１ｍＬ；７，５００ＩＵ群、１８ｇのマウス当たり１日当たり７，５００ＩＵのＩＦＮ；１８ｇのマウス当たり１日当たり１５，０００ＩＦＵ。（ｂ）ＩＦＮ処理は、２群において１５，０００ＩＵ／マウス／日：１４日目にＩＦＮ１日１回投与を２週間；３日目にＩＦＮ１日１回投与を３日間で、（ａ）に記載されたのと同様に与えられる。個々のマウスを、投与前１９日目に、次いで、２１、２２、２６、２９及び３３日目にイメージングした。（ｃ）（ｂ）に記載の通り移植後３３日目の未処理、ＩＦＮ処理（１４日目にＩＦＮを１日１回投与）及びＩＦＮ回復（３日目にＩＦＮを１日１回投与）群の腫瘍組織中のＨＣＶ複製及び細胞死の免疫組織化学的解析。ＮＳ５Ｂのタンパク質発現を、フルオレセインイソチオシアネート結合ＮＳ５Ｂに対する抗体に結合したモノクローナル抗体を使用して検出した。細胞死は、方法（ｄ）肝臓マウスモデルにおけるＩＦＮ抗ＨＣＶ効果試験に記載の通り、ｃＰＡＲＰ抗体を使用して検出された。Ｔ７−１１細胞を、γ線照射したＳＣＩＤマウスの肝臓の１個の肝葉に直接移植した。ＩＦＮ処理は、移植後２７日目に開始し、皮下投与で１日１回２日間実施された（灰色の線）。処理群は１５，０００ＩＵ／マウス／日が、対照群はヒトアルブミンが投与された。データは、各パネルについての２〜４回の実験の代表である。エラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、Ｔ７−１１モデルにおけるＩＦＮ−α２Ｂ（ＩＦＮ）の抗ウイルス活性である。（ａ）皮下投与マウスモデルにおける濃度依存的なＩＦＮ抗ＨＣＶ効果。ＩＦＮ処理は、γ線照射したＳＣＩＤマウスにおけるＴ７−１１細胞の移植後１９日目に実施された。以下の投与量を１日１回、７日間皮下経路により投与した：対照、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍＬのヒトアルブミンを０．１ｍＬ；７，５００ＩＵ群、１８ｇのマウス当たり１日当たり７，５００ＩＵのＩＦＮ；１８ｇのマウス当たり１日当たり１５，０００ＩＦＵ。（ｂ）ＩＦＮ処理は、２群において１５，０００ＩＵ／マウス／日：１４日目にＩＦＮ１日１回投与を２週間；３日目にＩＦＮ１日１回投与を３日間で、（ａ）に記載されたのと同様に与えられる。個々のマウスを、投与前１９日目に、次いで、２１、２２、２６、２９及び３３日目にイメージングした。（ｃ）（ｂ）に記載の通り移植後３３日目の未処理、ＩＦＮ処理（１４日目にＩＦＮを１日１回投与）及びＩＦＮ回復（３日目にＩＦＮを１日１回投与）群の腫瘍組織中のＨＣＶ複製及び細胞死の免疫組織化学的解析。ＮＳ５Ｂのタンパク質発現を、フルオレセインイソチオシアネート結合ＮＳ５Ｂに対する抗体に結合したモノクローナル抗体を使用して検出した。細胞死は、方法（ｄ）肝臓マウスモデルにおけるＩＦＮ抗ＨＣＶ効果試験に記載の通り、ｃＰＡＲＰ抗体を使用して検出された。Ｔ７−１１細胞を、γ線照射したＳＣＩＤマウスの肝臓の１個の肝葉に直接移植した。ＩＦＮ処理は、移植後２７日目に開始し、皮下投与で１日１回２日間実施された（灰色の線）。処理群は１５，０００ＩＵ／マウス／日が、対照群はヒトアルブミンが投与された。データは、各パネルについての２〜４回の実験の代表である。エラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図１３Ｃ】図１３は、Ｔ７−１１モデルにおけるＩＦＮ−α２Ｂ（ＩＦＮ）の抗ウイルス活性である。（ａ）皮下投与マウスモデルにおける濃度依存的なＩＦＮ抗ＨＣＶ効果。ＩＦＮ処理は、γ線照射したＳＣＩＤマウスにおけるＴ７−１１細胞の移植後１９日目に実施された。以下の投与量を１日１回、７日間皮下経路により投与した：対照、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍＬのヒトアルブミンを０．１ｍＬ；７，５００ＩＵ群、１８ｇのマウス当たり１日当たり７，５００ＩＵのＩＦＮ；１８ｇのマウス当たり１日当たり１５，０００ＩＦＵ。（ｂ）ＩＦＮ処理は、２群において１５，０００ＩＵ／マウス／日：１４日目にＩＦＮ１日１回投与を２週間；３日目にＩＦＮ１日１回投与を３日間で、（ａ）に記載されたのと同様に与えられる。個々のマウスを、投与前１９日目に、次いで、２１、２２、２６、２９及び３３日目にイメージングした。（ｃ）（ｂ）に記載の通り移植後３３日目の未処理、ＩＦＮ処理（１４日目にＩＦＮを１日１回投与）及びＩＦＮ回復（３日目にＩＦＮを１日１回投与）群の腫瘍組織中のＨＣＶ複製及び細胞死の免疫組織化学的解析。ＮＳ５Ｂのタンパク質発現を、フルオレセインイソチオシアネート結合ＮＳ５Ｂに対する抗体に結合したモノクローナル抗体を使用して検出した。細胞死は、方法（ｄ）肝臓マウスモデルにおけるＩＦＮ抗ＨＣＶ効果試験に記載の通り、ｃＰＡＲＰ抗体を使用して検出された。Ｔ７−１１細胞を、γ線照射したＳＣＩＤマウスの肝臓の１個の肝葉に直接移植した。ＩＦＮ処理は、移植後２７日目に開始し、皮下投与で１日１回２日間実施された（灰色の線）。処理群は１５，０００ＩＵ／マウス／日が、対照群はヒトアルブミンが投与された。データは、各パネルについての２〜４回の実験の代表である。エラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図１３Ｄ】図１３は、Ｔ７−１１モデルにおけるＩＦＮ−α２Ｂ（ＩＦＮ）の抗ウイルス活性である。（ａ）皮下投与マウスモデルにおける濃度依存的なＩＦＮ抗ＨＣＶ効果。ＩＦＮ処理は、γ線照射したＳＣＩＤマウスにおけるＴ７−１１細胞の移植後１９日目に実施された。以下の投与量を１日１回、７日間皮下経路により投与した：対照、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍＬのヒトアルブミンを０．１ｍＬ；７，５００ＩＵ群、１８ｇのマウス当たり１日当たり７，５００ＩＵのＩＦＮ；１８ｇのマウス当たり１日当たり１５，０００ＩＦＵ。（ｂ）ＩＦＮ処理は、２群において１５，０００ＩＵ／マウス／日：１４日目にＩＦＮ１日１回投与を２週間；３日目にＩＦＮ１日１回投与を３日間で、（ａ）に記載されたのと同様に与えられる。個々のマウスを、投与前１９日目に、次いで、２１、２２、２６、２９及び３３日目にイメージングした。（ｃ）（ｂ）に記載の通り移植後３３日目の未処理、ＩＦＮ処理（１４日目にＩＦＮを１日１回投与）及びＩＦＮ回復（３日目にＩＦＮを１日１回投与）群の腫瘍組織中のＨＣＶ複製及び細胞死の免疫組織化学的解析。ＮＳ５Ｂのタンパク質発現を、フルオレセインイソチオシアネート結合ＮＳ５Ｂに対する抗体に結合したモノクローナル抗体を使用して検出した。細胞死は、方法（ｄ）肝臓マウスモデルにおけるＩＦＮ抗ＨＣＶ効果試験に記載の通り、ｃＰＡＲＰ抗体を使用して検出された。Ｔ７−１１細胞を、γ線照射したＳＣＩＤマウスの肝臓の１個の肝葉に直接移植した。ＩＦＮ処理は、移植後２７日目に開始し、皮下投与で１日１回２日間実施された（灰色の線）。処理群は１５，０００ＩＵ／マウス／日が、対照群はヒトアルブミンが投与された。データは、各パネルについての２〜４回の実験の代表である。エラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図１４Ａ】図１４は、Ｔ７−１１皮下モデルにおけるプロテアーゼ阻害剤ＢＩＬＮ  ２０６１（ＢＩ）単独の抗ウイルス効果である。（ａ）Ｔ７−１１細胞を、γ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植した。ＢＩＬＮ  ２０６１（ＢＩ）処理を、移植後２１日目に開始し、３０ｍｇ／ｋｇで１日１回、３日間実施した。ＢＩ処理は２４日目に中止した。個々のマウスを、投与２１日前に、次いで２２、２３、２４、３０及び３２日目にイメージングした。（ｂ）Ｔ７−１１細胞をγ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植した。マウスに対し、３０ｍｇ／ｋｇでＢＩ、及び／又は１５，０００ＩＵでＩＦＮを、細胞移植後１８日目に開始して実施した。生物発光は４日間毎日測定した。
【図１４Ｂ】図１４は、Ｔ７−１１皮下モデルにおけるプロテアーゼ阻害剤ＢＩＬＮ  ２０６１（ＢＩ）単独の抗ウイルス効果である。（ａ）Ｔ７−１１細胞を、γ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植した。ＢＩＬＮ  ２０６１（ＢＩ）処理を、移植後２１日目に開始し、３０ｍｇ／ｋｇで１日１回、３日間実施した。ＢＩ処理は２４日目に中止した。個々のマウスを、投与２１日前に、次いで２２、２３、２４、３０及び３２日目にイメージングした。（ｂ）Ｔ７−１１細胞をγ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植した。マウスに対し、３０ｍｇ／ｋｇでＢＩ、及び／又は１５，０００ＩＵでＩＦＮを、細胞移植後１８日目に開始して実施した。生物発光は４日間毎日測定した。
【図１５】図１５は、種々のレプリコンを有する細胞株の皮下投与に続くレプリコン発現のグラフ表示を示す。
【図１６】図１６は、ＨＣＶ複製におけるＢＩＬＮ  ２０６１の抗ウイルス効果を示す。腫瘍細胞移植後２５日目からＢＩＬＮ  ２０６１を１日１回、３０ｍｇ／ｋｇの皮下投与を開始した。未処理の対照群に比べて、処理群では、３日以内に１０倍の減少が観察された（Ｐ＞０．０００１）（図１６）。
【図１７】図１７は、細胞性適応がレプリコン細胞株におけるα−インターフェロンに対する耐性の上昇に関与することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（詳細な説明）
本発明は、ＨＣＶ複製及び／又はウイルス又はウイルス様粒子の産生の動物モデルに使用できる動物を提供する。モデルでは、レポーター遺伝子を含むＨＣＶレプリコンを含む細胞を有する動物を使用する。細胞は、レプリコンの複製及び／又は発現に結びつくルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を含むウイルス及び非ウイルス性タンパク質の発現を補助するＨＣＶレプリコンでトランスフェクトされる。ＨＣＶレプリコン含む細胞を動物に導入した後、レポーター遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるＨＣＶレプリコンの複製、発現又はウイルス粒子の産生を可能にする。種々の実施形態によれば、宿主内で増殖及び／又はレプリコン安定性に適合するヒト由来の細胞を使用することができる。動物モデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＣＶ抗−ウイルス化合物の潜在的な活性を評価するための検定として使用することができる。
【００１７】
モデルの幾つかの利点は、以下の通りである：即ち、遺伝子導入動物を必要としない；容易に利用可能な動物（例えばＳＣＩＤマウス）を使用できる；ヒト由来細胞を使用できる。更に、モデルは、感染性ヒト接種材料の使用を記載する以前のモデルと異なる、非感染性ＨＣＶレプリコンの使用を可能にする。従って、動物は、潜在的な抗ＨＣＶ治療薬をスクリーニング及び検出するためのより安全且つより便利なモデルを提供する。
【００１８】
レプリコンを含む細胞は、動物における種々の標的部位に導入又は移植することができる。細胞は、動物の肝臓及び／又は皮下腔に移植又は送達することができる。幾つかの実施形態において、導入された細胞は腫瘍を形成する。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでレプリコンを使用してトランスフェクトすることができ、又は動物に導入された後にｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトすることができる。
【００１９】
本発明のＨＣＶレプリコンのモデルは、レプリコン内に含まれるレポーター遺伝子の複製又は発現を検出又は監視することにより、ＨＣＶのゲノム又はサブゲノムレプリコンの複製又は発現を、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで監視するために使用することができる。
【００２０】
モデルは又、レプリコンを含む細胞から産生されたＨＣＶウイルス又はウイルス様粒子中に存在するレポーター遺伝子活性を検出又は監視することにより、ＨＣＶのライフサイクルにおける１つ以上の必須の手順を監視するための手段を提供する。ウイルスのライフサイクルには、ウイルスが細胞に入り、ウイルス粒子を産生し、他の細胞に感染するために細胞から出るために必要な手順が含まれる。これらの手順には、細胞表面への結合、細胞への侵入を促進する表面上の受容体との相互作用、ウイルスゲノムを放出するためのウイルス粒子の脱コート、ウイルスゲノムの複製及び発現、ウイルスゲノムの粒子へのパッケージを含む粒子の成熟、細胞から出て最終的に細胞を死滅させ、ウイルスの子孫を放出することが含まれる（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （１９９６）  Ｃｈａｐｔｅｒ
１０：  Ｖｉｒｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｄ．  Ｋｎｉｐｅを参照）。
【００２１】
モデルは、潜在的なＨＣＶ抗ウイルス化合物を評価するためのｉｎ  ｖｉｖｏ検定として使用される場合がある。一実施形態において、動物は、ＨＣＶの複製及び／又は粒子形成を減少又は予防することが知られている化合物が投与され、次いで、ＨＣＶの感染を減少又は予防する公知の化合物との相加又は相乗効果を有する第２の候補化合物が動物に投与される。モデルは又、以前に導入され、次いで動物から除去された、本明細書に開示されたＨＣＶレプリコンを含む細胞におけるＨＣＶレプリコンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製及び発現を測定するために使用される場合もある。
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＨＣＶの処置又は予防のための薬学的組成物及び化合物及び組み合わせを提供する。薬学的組成物には、同時又は連続して投与される化合物が含まれる。
【００２２】
薬学的組成物は、キットにおける成分として提供することができる。
【００２３】
薬学的組成物は、１つ以上の担体及び賦形剤を含んでいてもよい。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、本発明の化合物又は組み合わせを投与することにより、動物におけるＨＣＶを処置又は予防する方法を提供する。本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的担体及び／又は賦形剤を含む。張力を調整するため、ナトリウム塩等の生理食塩水を含むことが好ましい。１〜２０ｍｇ／ｍＬで存在し得る塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましい。
【００２５】
組成物は一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、更に好ましくは２９０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。本発明の組成物は、１つ以上の緩衝剤を含んでいてもよい。一般的な緩衝剤には、リン酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、又はクエン酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤は、通常は５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【００２６】
本発明の組成物のｐＨは、一般的に５．０〜７．５、更に一般的には最適な安定性のために５．０〜６．０又は６．０〜７．０である。従って、本発明の方法には、梱包前にバルクワクチンのｐＨを調整する手順が含まれる。
【００２７】
本発明の組成物は好ましくは無菌である。
【００２８】
本発明の組成物は、好ましくは非発熱性、例えば、投与量当たり１ＥＵ未満（内毒素単位、標準的測定）であり、好ましくは投与単位当たり０．１ＥＵ未満である。本発明の組成物は、好ましくはグルテンを含まない。本発明の組成物は、種々の形態で調製される場合がある。例えば、組成物は、注射液として、即ち、液剤又は懸濁液の何れかとして調製される場合がある。液剤又は懸濁液に好適な固体、注射液の前の液体担体も調製することができる（例えば、ＳｙｎａｇｉｓＴＭ等の凍結乾燥組成物、防腐剤を含む無菌水で再構築されるＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）。組成物は、軟膏、クリーム又は粉末等の局所投与用に調製される場合がある。組成物は、例えば、錠剤又はカプセルとして、スプレーとして、又はシロップ（風味をつけてもよい）として、経口投与用に調製される場合がある。組成物は、例えば、微粉又はスプレーを使用した吸入等の肺投与用に調製される場合がある。組成物は、座薬又は腟坐薬として調製される場合がある。組成物は、経鼻、経耳、又は眼投与、例えばドロップ用に調製される場合がある。組成物は、組み合わされた組成物が患者に投与する直前に再構築されるように設計されたキット形態である場合がある。例えば、凍結乾燥された抗体は、無菌水又は無菌緩衝剤と一緒にキット形態で提供されてもよい。本発明の組成物は、一般的に水性形態である。
【００２９】
本発明の組成物は、０．５ｍＬの投与量で患者に投与することができる。０．５ｍＬ投与の言及には、通常の差異、例えば、０．５ｍＬ±０．０５ｍＬが含まれることが理解される。
【００３０】
薬学的組成物には、所望の疾患又は病状を処置、改善又は予防するため、又は検出可能な治療効果を示すのに十分な量で、１つ以上の抗ウイルス化合物の有効量を含む。治療効果は又、身体症状の減少を含む。任意の特定の患者についての正確な有効量は、大きさ及び健康状態、病状の性質及び程度、投与のために選択された治療法又は治療法の組み合わせに依存するであろう。所定の状態についての有効量は、日常的な実験によって決定され、臨床医の判断の範囲内である。本発明の目的のため、有効量は、一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。公知の抗体をベースとする医薬品は、この点で案内を提供し、例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭは、２１ｍｇ／ｍＬの溶液の静脈注射によって投与され、４ｍｇ／体重１ｋｇの初期用量、及び２ｍｇ／体重１ｋｇの１週間の維持用量を有し、ＲｉｔｕｘａｎＴＭは３７５ｍｇ／ｍ２で週１回投与される。
【００３１】
本発明は、特に、ヒト患者における処置に適している。
【００３２】
幾つかの実施形態において、げっ歯類が使用され、好ましい一実施形態においてマウスが使用される。動物は、放射線照射により、生物学的又は化学的免疫抑制剤（例えばグルココルチコイド）又はそれらの組み合わせの投与により、遺伝子突然変異により免疫無防備状態である（例えば、ＳＣＩＤマウス）。
【００３３】
本明細書に開示されるような、他の小動物も使用することができる。
【００３４】
動物に導入される細胞は、ＨＣＶを有することができる何れかの細胞である場合があるが、好ましくは不死化されたヒト由来細胞であり、一実施形態においてはヒト肝癌Ｈｕｈ７細胞である。種々の実施形態によれば、細胞株にトランスフェクトされたレプリコンはゲノム又はサブゲノムである。レプリコンは、抗ゲノム（又は抗サブゲノム）鋳型からトランスフェクトすることができる。一実施形態において、レプリコンは、複製に必要な非構成ＨＣＶタンパク質を発現するサブゲノムレプリコンである。又、レプリコンには、レポーター遺伝子活性をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することを可能にするレポーター遺伝子が含まれる。一実施形態において、ルシフェラーゼはレポーターである。
【００３５】
レポーター遺伝子は、ＨＣＶレプリコン内に含まれ、レプリコンが複製される時に複製される。レポーター遺伝子は、モノシストロン性、二シストロン性又は三シストロン性ＲＮＡの何れかとして、ＨＣＶタンパク質をコードする遺伝子と共発現される。二シストロン性の配置においては、レプリコン内の１つ以上の遺伝子が、レプリコン上に存在する他の遺伝子の発現を制御しない別個の遺伝要素の翻訳制御下にある。更なる遺伝子は、（１）ＨＣＶタンパク質と共に、（２）レポーター遺伝子と共に、又は（３）レプリコン内に含まれる、他の更に別の転写制御要素の制御下で発現される場合がある。更に、ＨＣＶタンパク質はＨＣＶポリタンパク質として一緒に発現することができ、又はレポーター遺伝子及び任意の更なる遺伝子について上述のような別個の遺伝要素の発現下であってもよい。或いは、複製は、レポーター遺伝子の発現なしで、例えば、レポーターに特異的な核酸配列をコードする核酸の相対的な存在又は非存在について検定することにより、検出することができる。
【００３６】
遺伝子の翻訳を制御する遺伝要素は当業者に周知であり、例えば、ＨＣＶ、ポリオウイルス及び脳心筋ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が含まれる。
【００３７】
他の態様においては、本発明は、抗ＨＣＶ活性を有する化合物、即ち、ＨＣＶ複製及び／又はＨＣＶタンパク質の発現を減少又は阻害する化合物を同定する方法を提供する。化合物は、ＨＣＶレプリコンの複製を妨害することにより、複製を直接制御することができ、又は宿主内でＨＣＶ複製に必要なＨＣＶタンパク質の発現を妨害することにより、複製を間接的に制御することができる。或いは、以下で考察する通り、前記動物は、本質的に複製又は発現に影響しないが、ウイルス又はウイルス様粒子の形成を減少又は阻害する化合物を同定する方法を提供する。
【００３８】
ＨＣＶレプリコンのｉｎ  ｖｉｖｏ複製及び発現は、動物内のレポーター遺伝子活性を検出することにより直接ｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができる。或いは、動物内でのｉｎ  ｖｉｖｏ複製又は発現にもたらされるレポーター遺伝子活性は、血液又は組織を動物から除去した後に、血液又は組織中で検出することができる。
【００３９】
一実施形態において、更にレポーター遺伝子を含むＨＣＶレプリコンを含む細胞を有する動物をｉｎ  ｖｉｖｏで試験化合物と接触させる。レプリコンが複製される場合、レポーター遺伝子が複製だけされる。本明細書で考察する通り、実施例に依存し、レポーター遺伝子タンパク質の発現は起こらないが、ＨＣＶポリタンパク質の発現に結びついてもよい。動物内のレプリコン中に含まれるレポーター遺伝子の活性を、試験化合物と接触させていない細胞を含む動物中のレプリコン中に含まれるレポーター遺伝子活性と比較する。レプリコンの複製及び／又は発現を減少させる化合物は、ヒトにおけるＨＣＶ複製及び／又は発現の調節のための医薬品としての用途を有する場合がある化合物である。
【００４０】
別の実施形態において、更にレポーター遺伝子を含むＨＣＶレプリコンを含む細胞を有する動物を、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験化合物と接触させる。動物中のウイルス又はウイルス様粒子中に含まれるレポーター遺伝子の活性を、試験化合物と接触させていない細胞を含む動物中のウイルス又はウイルス様粒子中に含まれるレポーター遺伝子の活性と比較する。ウイルス又はウイルス様粒子中に含まれるレポーター遺伝子の活性を減少又は阻害するが、レプリコンの複製又は発現に影響しない化合物は、ＨＣＶウイルス又はウイルス様粒子の形成の調節のための医薬品としての用途を有する場合がある化合物である。
【００４１】
別の実施形態において、ＨＣＶレプリコンを含む細胞を動物に導入する。腫瘍由来の細胞及び腫瘍細胞はレプリコンを含有する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける複製の後、レプリコンを含む細胞を動物から外科的に除去し、組織培養で増殖し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験化合物と接触させる。ＨＣＶ複製及び／又は発現を、同一の方法で培養したが試験化合物と接触させていないＨＣＶレプリコンを含む細胞とｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて比較する。複製又は発現を減少又は阻害する化合物は、ＨＣＶ感染の処置に有用な医薬品の製造に有用である。
【００４２】
ＨＣＶレプリコン中に含まれるレポーター遺伝子がモノシストロン性の配置で提供される場合、ゲノム又はサブゲノムレプリコンによって産生されるポリタンパク質の一部として発現する。レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子産物の両方の境界（又はレポーター遺伝子産物がポリタンパク質のアミノ又はカルボキシル末端である場合は１個の境界）で開裂認識部位を提供することによってポリタンパク質から開裂され得る。開裂部位は、該部位において特異的に開裂するプロテアーゼ（例えば、ＨＣＶプロテアーゼ）によって認識される。或いは、レポーター遺伝子は開裂部位なしで構築することができ、従って、ＨＣＶタンパク質の１つに融合する融合タンパク質として持続することができる。ゲノムレプリコンにおいては、レポーター遺伝子が融合タンパク質の一部である場合、構造タンパク質（即ち、コア又はエンベロープ）と融合する。サブゲノムレプリコンにおいては、レポーター遺伝子が融合タンパク質の一部である場合、非構造タンパク質と融合する。好ましい一実施形態において、レポーター遺伝子が融合タンパク質を有するサブゲノムレプリコン中に含まれる場合、レポーターはＮＳ５Ａと融合する。レポーター遺伝子は常にタンパク質を発現する必要はない。幾つかの実施形態において、レポーターは、レポーターについての核酸配列特異性の相対的な存在又は非存在を検出することにより検出することができる。
【００４３】
前記動物は、薬物動態学（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、毒性研究及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗ウイルスＨＣＶ候補化合物の急速なスクリーニングのための、ＨＣＶ複製の阻害剤を評価及び同定するために使用することができるＨＣＶ複製の動物モデルを提供する。
【００４４】
レプリコン
「レプリコン」という用語は、細胞内に存在する場合、それ自体のコピーを直接生成することができるウイルス核酸を指す。ゲノム又はサブゲノム複製システムを使用する細胞をベースとするＨＣＶ複製システムは周知である。本明細書に開示されたレプリコンを含む細胞は、本発明に従い、マウス又は他の動物に導入される。細胞は、更なる核酸、遺伝子又はタンパク質を含むか、又は発現する、更なるウイルスレプリコン及び／又はプラスミドを更に含むことができる。１つ以上の他の更なる遺伝子及び／又は調節領域も存在してもよく、ＨＣＶレプリコンでトランスフェクトされた細胞中で発現される。更なる遺伝子又はタンパク質はＨＣＶレプリコン上に提供することができ、当該技術分野で周知の種々の技術を使用して宿主細胞ゲノムに、安定又は一過性にトランスフェクトすることができる。更なる遺伝子又はタンパク質は、例えば細胞生存のマーカーとして使用することができる。更に、更なる遺伝子又はタンパク質は、ＨＣＶ複製、発現及び／又はウイルス又はウイルス様粒子の産生を向上又は可能にする補助機能を提供することができる。
【００４５】
ゲノム遺伝子の発現を上方制御するか、他の送達ベクター中の遺伝子の更なるコピーを提供するか、又は染色体内に組み込まれることにより、内因性の宿主遺伝子が過剰発現される。逆に、阻害性タンパク質の下方制御を使用することができる。発現の下方制御法には、アンチセンス核酸、リボザイム、固定された核酸、マイクロＲＮＡ又はｓｉＲＮＡが含まれる。宿主細胞内で補助機能を提供するための補助因子として使用することのできる１つのタンパク質はカベオリン−３であり、更なる異種のカベオリン−３又は内因性のカベオリン−３の上方制御を本発明において使用することができる。カベオリン−３はシャペロニンとして報告されている。
【００４６】
カベオリン−３の発現が筋肉でのみ見られないことが発見された。意外なことに、ＨＣＶレプリコンを有するＨｕｈ−７細胞株において検出され、更に粒子状のＨＣＶタンパク質構造を有する細胞中で共局在化していることが発見された。ＨＣＶ感染によって発現は誘導されないが、低い内因性のレベルで存在すると思われる。カベオリン−３は、ＨＣＶの成熟において役割を果たすと思われる。
【００４７】
カベオリン−３についてのＧｅｎｅＣａｒｄは、コードＣＡＶ３を使用して見出すことができる。ＧｅｎｅＣａｒｄは、タンパク質がＬＧＭＤ１Ｃ、Ｍ−カベオリン及びＶＩＰ−２１と呼ばれることを示す。これまでに１０個のＳＮＰが開示されている。基準のヒトＣＡＶ３配列はＧＩ番号ＧＩ：４５０２５８９及びＮＰ＿００１２２５（配列番号１）を有する１５１量体である。
【００４８】
【化１】
2014027951.tif 000002
本明細書で使用される「更なる遺伝子」という用語は、細胞中でタンパク質を発現するか制御因子を提供する遺伝子又は他の核酸を含むことを意味する。更なる遺伝子は、ＨＣＶ及び宿主細胞に対して異種であり得、ＨＣＶ又は宿主細胞ゲノム由来であり得る。従って、本明細書で使用される該用語は宿主細胞ゲノム中に既に存在する宿主細胞遺伝子を意味するが、エピソーム要素としての更なる遺伝子として提供されるか、正常部位と異なる（又はそれに加え）宿主脂肪ゲノム上の部位に組み込まれる。
【００４９】
特に指示がない限り、本明細書で使用される単数形は複数形を包含してもよく、複数形は単数形を包含してもよい。従って、例えば、特に指示がない限り、「単数の細胞」の言及には複数の細胞が含まれ、「複数の細胞」の言及には単数の細胞が含まれてもよい。同様に、レプリコンを有する細胞のトランスフェクションは、複数の細胞が複数のレプリコンでトランスフェクトされる状態を含むことを意味する。同様に、「レプリコンを含む細胞の動物への導入」は、レプリコンを含む複数の細胞が動物に産生される状態を含むことを意味する。
【００５０】
「レプリコン」及び「遺伝要素」という用語は、センス鎖（ウイルスゲノムＲＮＡ）に変換され、複製に必要なウイルスタンパク質に翻訳され得る、ウイルスＲＮＡ又は任意の相補的配列（例えば、ｃＤＮＡ逆転写物又は相補的ＲＮＡ）のセンス鎖を含むと理解すべきである。当業者は、代替えの構築物を使用することができることを理解するであろう。
【００５１】
サブゲノムＨＣＶレプリコンは、少なくとも１つのＨＣＶタンパク質又はタンパク質の機能的フラグメントをコードするＨＣＶゲノムの１つ以上の領域を欠如する。サブゲノムレプリコンは非感染性である。
【００５２】
ＨＣＶの１つ以上の非構造タンパク質（例えば、プロテアーゼポリメラーゼ）を発現するが、全てのＨＣＶ構造タンパク質を発現しないサブゲノムＨＣＶレプリコンは当該技術分野において公知である。例えば、１つのシステムにおいて、ヒト肝癌細胞株５−２  Ｈｕｈ７は非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂを有する（Ｎｉｃｏｌｅ  Ｋｒｉｅｇｅｒ，  Ｖｏｌｋｅｒ  Ｌｏｈｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｒａｌｆ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ．  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ａｄａｐｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  ２００１，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７５（１０）：  ４６１４−４６２４）。サブゲノムは細胞株中で少なくとも幾つかのＨＣＶ非構造タンパク質を複製及び発現する。
【００５３】
幾つかの実施形態において、レプリコンは、少なくとも１つのＨＣＶ非構造タンパク質、選択可能なマーカー及びレポーターを複製し、発現するサブゲノムレプリコンである。選択可能なマーカーは、レプリコンを有する細胞の選択を可能にする。幾つかの実施形態において、Ｇ４１８を有する、選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）が使用される。薬剤耐性に基づく他のマーカーの具体例には、ａａｄ、ｂｌｅ、ｄｈｆｒ、ｈｐｔ、ｎｐｔＩＩ、ａｐｈＩＩ、ｇａｔ及びｐａｃが含まれる。他のマーカーは、プロマイシン、ゼオシン、又はハイグロマイシン等の抗生物質を使用した選択を可能にするが、当業者は、当該技術分野において公知である、レプリコンを有する細胞の選択を可能にする任意のマーカーを使用することができることを理解するであろう。
【００５４】
一実施形態において、レポーターはルシフェラーゼである。レポーター及びレポーター遺伝子については、以下で更に詳細に考察する。レポーター遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＨＣＶ複製及び／又は細胞の生存能力を監視するために使用することができる。
【００５５】
本発明の動物モデルにおいて使用されるＨＣＶレプリコンは感染性であっても、ウイルス又はウイルス様粒子を産生してもよく、又は非感染性であってもよい。
【００５６】
レプリコンは１つ以上の細胞適応突然変異を有する場合がある。これらの突然変異は、ＨＣＶ産生に許容されないか、効果的でない細胞内においてＨＣＶの複製を向上させるか可能にする。一実施形態において、Ｈｕｈ７細胞が使用される場合、レプリコンは以下の細胞適応突然変異、即ちＮＳ３領域におけるＥ１２０２Ｇ，Ｔ１２８０Ｉ、及びＮＳ４Ｂ領域におけるＫ１８４６Ｔを有し得る（Ｎｉｃｏｌｅ  Ｋｒｉｅｇｅｒ，  Ｖｏｌｋｅｒ
Ｌｏｈｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｒａｌｆ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ａｄａｐｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  ２００１，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７５（１０）：  ４６１４−４６２４；Ｖｏｌｋｅｒ  Ｌｏｈｍａｎｎ，  Ｓａｎｄｒａ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｕｌｒｉｋｅ  Ｈｅｒｉａｎ，  Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｐｅｎｉｎ，  ａｎｄ  Ｒａｌｆ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，  Ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  ２００３，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７７（５）：  ３００７−３０１９）。このような細胞適応突然変異は必ず必要なわけではなく、細胞によっては、細胞培養に適応させることなくＨＣＶ複製を補助できるものもある（例えば、ＨＣＶ−Ｎ又はＪＦＨ−１）。本発明のモデル及び動物は、これらの突然変異を使用するかにかかわらずＨＣＶレプリコンの増殖を補助することができる。
【００５７】
レプリコンは、好ましくは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。適切なＩＲＥＳは、ポリオウイルス、脳−心筋ウイルス（ＥＭＣＶ）、及びＨＣＶそれ自体から公知である。ポリオウイルスＩＲＥＳ（「ＰＶＩ」）を含むレプリコンは、ＰＶＩレプリコンと呼ばれる場合がある。図１は、レプリコンＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴを示す。ＰＶＩはルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃ）の上流であり、発現を促進する。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（ＥＩ）は、３’ＮＴＲによる３’末端に隣接するＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ領域の翻訳を指示する。レプリコンはＮｅｏ選択マーカーを有する。特に、Ｌｕｃ発現は、ＨＣＶ  ５’ＮＴＲよりもＰＩによって促進される。星は、適応突然変異である、ＮＳ３領域におけるＥ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、及びＮＳ４Ｂ領域におけるＫ１８４６Ｔを示す。
【００５８】
ＰＶＩを有するサブゲノムレプリコン及び／又は高度に適応した突然変異は、突然変異及び／又はＰＶＩなしで、レプリコンを超えた、向上した翻訳及び複製効率をもたらす。例えば、５−２  Ｈｕｈ７細胞中で使用される構築物はＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／５．１である。図２Ａは、トランスフェクションの２４、２７、４８及び７８時間後におけるＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／５．１と比較し、ＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴでトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞の１０，０００個の細胞当たりの相対的光単位（ＲＬＵ）として表わされるルシフェラーゼ読み出し情報を示す。Ｌｕｃ発現がポリオウイルスＩＲＥＳによって促進されるので、ＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／５．１レプリコンはＰＶＩレプリコンによって標識される。ＬｕｃがＨＣＶレプリコンの５’ＮＴＲ領域（ＩＲＥＳ）によって促進されるので、ＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴレプリコンはＨＣＶＩレプリコンを標識する。ルシフェラーゼ読み出し情報は、ＰＶＩレプリコンがＨＣＶＩレプリコンを超える向上した転写効率を有することを示す。
【００５９】
図２Ｂは、Ｇ４１８選択下でのコロニー形成を示す。ＨＣＶＩレプリコン（適応突然変異Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、Ｌ１７５７Ｉ、Ｎ２１０９Ｄ、Ｓ２１９７Ｐ、Ｐ２３２７Ｓ及びＫ２３５０Ｅを有する）を含むＨｕｈ７細胞、ＨＣＶＩレプリコン（適応突然変異Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ及びＫ１８４６Ｔを有する）を有するＨｕｈ７細胞、及びＰＶＩレプリコン（適応突然変異Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ及びＫｌ８４６Ｔを有する）を含むＨｕｈ７細胞を増殖させた。レプリコンを有する細胞を、Ｇ４１８を使用して選択した。図２Ｂに示す通り、多くのＰＶＩレプリコンを有する細胞は、ＨＣＶＩレプリコンを有する細胞よりも複製された。更に、突然変異を含むＨＣＶＩ細胞は、適応突然変異なしでＨＣＶＩ細胞を超えた、向上した複製を有する。
【００６０】
動物モデルは、向上した翻訳及び複製効率の結果を得るように、Ｈｕｈ７細胞適応突然変異及びポリオウイルスＩＲＥＳを含む図１に示すレプリコンを含み得る。しかし、本発明は、ＨＣＶのゲノム又はサブゲノムレプリコン、又はプロテアーゼ及び／又はポリメラーゼ等のＨＣＶ非構造タンパク質を発現する他の遺伝要素を使用して実施することができる。これには、適応突然変異を含まないレプリコン又はその他の遺伝要素、並びに適応突然変異を含むレプリコン又はその他の遺伝要素が含まれる。
【００６１】
ＨＣＶゲノム及びサブゲノムレプリコンは、種々のウイルス株及び遺伝子型から由来してもよい。ＨＣＶゲノムは、任意のタイプ（例えば、１、２、３、４、５、６）又はサブタイプ（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ、１ｌ、１ｍ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｋ、４ａ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、４ｎ、４ｏ、４ｐ、４ｑ、４ｒ、４ｓ、４ｔ、５ａ、６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ、６ｊ、６ｋ、６ｌ、６ｍ、６ｎ）であり得る。この命名は、ＮＩＡＩＤＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｃｖ−ｄｂ／ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｔａｂｌｅ．ｈｔｍｌ）に記載の通り、最新の標準であり、以前の遺伝子型７〜９は、遺伝子型６のサブタイプに再分類されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：  ３０１３−２４）。従って、新しい分類には、以前の分類、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、４α、４β、７ａ、７ｂ、７ｃ／ＮＧＩＩ／ＶＩＩ、７ｄ、ＮＧＩ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａ／ＴＤ３及び１１ａが含まれる。本発明に使用される適切なＨＣＶの株は、遺伝子型２ａ株ＪＦＨＡ（Ｋａｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｍｅｄ
Ｖｉｒｏｌ  ６４：３３４−９）である。
【００６２】
ＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを、相補的なＤＮＡコピーを作製するために使用することができる。ＤＮＡのコピーは逆転写（ＲＴ）によって作製することができる。或いは、ＤＮＡのコピー又はそのフラグメントは、合成手段によって完全に、又は一部を作製することができる。ＲＮＡゲノムのＤＮＡコピーが利用可能になると、二重鎖ＤＮＡに変換することができ、次いでベクター（例えば、プラスミド）内にクローニングすることができ、プラスミドは、ウイルスＲＮＡが転写され得るＤＮＡ鋳型を製造するために使用することができる。別の方法として、ＤＮＡはベクターを使用することなしにウイルスＲＮＡを生成するために使用することができ、このような場合、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのための適切なプロモーターはウイルスゲノムの出発点の上流に導入される。適切なプロモーターには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応に使用されるＴ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターが含まれる。ウイルスのＤＮＡコピーは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅することができる。
【００６３】
別の方法として、ウイルスの転写物は、Ｑβレプリカーゼ等のＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ鋳型から製造することができる。転写が媒介する増幅（ＴＭＡ）反応はＲＮＡを増幅するために使用することができる。
【００６４】
ＨＣＶ配列を含むプラスミドは、当該技術分野において周知の何れかの方法により構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）  １９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｊｏｅ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００  ｏｒ  ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９９９，  ｅｄ．  Ｍ．  Ｉｎｎｉｓ，  Ｄ．  Ｇｅｌｆａｎｄ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｎｉｎｓｋｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。図１に示すＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴレプリコンは、ｐＦＫ  １
１３８９  ＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／５．１（Ｋｒｉｅｇｅｒ  Ｎｉｃｏｌｅ，  Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｖｏｌｋｅｒ，  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｒａｌｆ．  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ａｄａｐｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  ２００１，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７５（１０）：４６１４−４６２４）由来の２．６ｋｂのＸｂａｌｌ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＦＫ  Ｉ３４１  ＰＩ  Ｌｕｃ  ＮＳ３−３’／ＥＴ（ＲｅＢＬｉｋｏｎから入手可能）由来のＸｂａｌ−ＮｏｔＩフラグメントで置換することにより構築することができる。
【００６５】
レポーター遺伝子
本発明の動物は、宿主が犠牲にならないように、リアルタイムで、及び繰り返し、以下の化合物の抗ＨＣＶ活性を可能にする。更に、抗ＨＣＶ活性が単一の時点及びＨＣＶ複製の動物モデルでそのような観測を容易にするより、むしろ繰り返して定量化されることが望ましい。
【００６６】
好ましくは、レポーター遺伝子は容易に検定される。例えば、レポーター遺伝子は可視のシグナル等の検出可能なシグナルを与える。レポーター遺伝子は、それ自体で可視のシグナルを与えるか、又は蛍光タンパク質又は酵素等の可視の変化を与える反応を触媒するタンパク質をコードする。レポーター遺伝子は、両方とも、着色された基質及び／又は産生物で通常に使用される、β−ガラクトシダーゼ又はペルオキシダーゼ等の酵素をコードすることができる。レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又はＹＦＰ又はＣＦＰ等のそれらの蛍光誘導体等の蛍光タンパク質をコードすることができる。レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ等の発光タンパク質をコードすることができる。レポーター遺伝子は、細胞内でのＤＮＡ複製を促進し、又は薬剤耐性マーカーをコードすることができる。レポーター遺伝子は、抗原に特異的に結合する抗体を使用して検出することができる抗原をコードすることができる。レポーター遺伝子は又、核酸ハイブリダイゼーション及び／又は増幅技術を使用して検出することができるユニークな核酸配列であってもよい。前記リストは具体例であり、レポーター遺伝子の源を限定することを意図せず、更に多くのレポーター遺伝子が当業者によって容易に認識され得る。
【００６７】
本発明において用途を見出し得るレポーター遺伝子には、例えば、検出のための公知の抗体を有する抗原（例えば、ヒト成長ホルモン及びヒト成長ホルモンに対する抗体）、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができる活性を有する酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質等）が含まれる。更に、既述の通り、レポーターをコードする核酸の存在の検出は又、複製、発現又は粒子産生を検出することによって監視することができる。
【００６８】
従って、本明細書に定義されるように、レポーター遺伝子「活性」の検出には、レポーター遺伝子の産物の物理的存在又は化学的活性の検出が含まれ、又はレポーター遺伝子に特異的な核酸配列の全て又は一部の検出が含まれる。
【００６９】
幾つかの実施形態において、レプリコンはレポーターとしてルシフェラーゼを使用する。ルシフェラーゼ活性は、Ｘｅｎｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．から入手できる技術及び装置にしたがい、生きている動物中でｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。動物、例えばマウスの腹腔内にルシフェラーゼの基質としてルシフェリンを注射する。次いで、これらの動物を麻酔し、ＣＣＤカメラを使用して発光シグナルを捕獲することによってルシフェラーゼ活性を定量する。この方法においては、任意の所定の時間にわたり繰り返して動物を測定することができる。ルシフェラーゼに加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏで定量することができる他のレポーター遺伝子がある。緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質又はその変形は、ハロゲン光源及びＣＣＤカメラを使用してｉｎ  ｓｉｔｕで可視化することができる。イメージングの第三の方法は、レポーター遺伝子としてＨＳＶチミジンキナーゼを使用することを含む。この方法においては、レポーター遺伝子の活性量を、マイクロＰＥＴシステムを使用して定量する。動物は、マイクロＰＥＴにより評価される前に、基質９−（４−［１８Ｆ］フルオロ−３−ヒドロキシメチルブチル）グアニンを投与される。
【００７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでシグナルが検出されるレポーターを使用することに代え、又は加えて、モデルは、例えば、マウスを検死した後に腫瘍から抽出した生検から活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができるレポーター遺伝子を有してもよい。この方法において使用することができるレポーター遺伝子には、酵素、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ＣＡＴ及び他の同様のレポーターが含まれる。更に、血液中で測定される分泌タンパク質をコードするレポーター遺伝子を使用することができる。このようなレポーター遺伝子の具体例は、分泌性アルカリホスファターゼ、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子は又、配列特異的マーカーを含むことができる。
【００７１】
細胞株
宿主内でＨＣＶレプリコンの複製を補助することのできる、どのような細胞株も使用することができる。Ｈｕｈ７細胞株に加えて、ヒト癌細胞株ＨｅＬａ、マウス肝癌Ｈｅｐａ１−６、ＨＥＫ２９３、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２及びＩＭＹ−Ｎ９（融合ヒト肝癌及びＨｅｐＧ２細胞に由来する細胞株）が、ＨＣＶレプリコンの複製を補助することが知られている。従って、これらの腫瘍細胞株、又はＨＣＶゲノム又はサブゲノムレプリコンの複製を補助する（プロテアーゼ及び／又はポリメラーゼを含むＨＣＶ非構造タンパク質を発現する）、どのような他の細胞株も、モデルにおいて使用することができる。幾つかの実施形態において、細胞株は、ヒト細胞、好ましくはヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７細胞に由来する。
【００７２】
本発明において使用するための１つの細胞株は、肝細胞癌、即ち、Ｈｕｈ７（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４２：  ３８５８−６３）として知られているヒト肝癌細胞株に由来する。有用なＨｕｈ７−由来細胞株は、完全長のＨＣＶレプリコンを補助する「２１−５」である（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ７６：  ４００８−２１）。他の適切な細胞株は、Ｈｕｈ−７のサブ系であり、細胞培養において完全ＨＣＶ複製を補助することのできるＨｕｈ−７．５及びＨｕｈ−７．８であり（Ｂｌｉｇｈｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：  １３００１−１４；国際特許第ＷＯ２００４／０４４１８２号）、Ｈｕｈ−７．５が好ましい。Ｈｕｈ７細胞（及びそれらの誘導体）の継代接種により由来する細胞、及びＨｕｈ７細胞をα−インターフェロン及び／又はγ−インターフェロンで処理することにより由来する細胞も使用することができる。国際特許第ＷＯ２００４／０４４１８２号に開示されているように、ＨＣＶについて許容される細胞株は、（ａ）ＨＣＶに感染した細胞を培養し；（ｂ）ＨＣＶの細胞を治療し；及び（ｃ）ＨＣＶ複製について許容される培養細胞のサブラインを同定することを含む方法によって製造することができる。
【００７３】
ＨＣＶ複製のための動物モデルにおけるヒト由来細胞の使用は幾つかの理由により好ましい。第一に、ヒト由来細胞の使用は、ＨＣＶ複製の正確なモデルを提供する。第二に、同種細胞の使用には、レプリコンを阻害する宿主からのインターフェロン応答が含まれ、細胞は、宿主生物に関して好ましくは異種である。これは、モデルを維持すること、及び候補化合物又はプロトコールの効果を確認することを困難にする。例えば、レプリコンを有するマウス細胞の使用は、レプリコンを阻害するマウスのインターフェロンα応答を引き起こすが、ヒト由来細胞はマウスのインターフェロンαに対する感受性を有さない。
【００７４】
幾つかの実施形態において、細胞は腫瘍細胞であることに留意する必要がある。腫瘍細胞（例えば、Ｈｕｈ−７、ＨｅＬａ等）は宿主を更に容易に継代接種することができる。しかし、本発明は腫瘍細胞に限定されず、ＨＣＶレプリコンの複製を補助する細胞又は細胞株を使用して実施することができる。
【００７５】
種々の実施形態によれば、細胞株は、１）宿主中のｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞の増殖速度を上昇させ（腫瘍細胞を使用した場合）及び／又は２）宿主中のｉｎ  ｖｉｖｏでレプリコンの発現を上昇するために適応される（例えば、ルシフェラーゼレポーターが使用される生物発光ルシフェラーゼシグナルによって測定される）。細胞株は、上昇する腫瘍増殖速度及び／又はモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性に適応され、本明細書において適応細胞株と呼ばれる。
【００７６】
種々の実施形態によれば、細胞株は、まずｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖速度に適応され、次いで上昇するレプリコン発現に適応される。
【００７７】
高増殖適応細胞：
幾つかの実施形態において、増殖速度のための細胞株が宿主を通じて継代接種され、通常は連続的な継代接種によりｉｎ  ｖｉｖｏに適応される。
【００７８】
幾つかの実施形態において、継代接種は細胞を皮下移植し腫瘍を増殖させることを含む。最も大きい（即ちより速く増殖する）腫瘍を特定し、適応可能であれば更に継代接種させるために集める。腫瘍を切除し、髄質に刻み入れる。この方法においては、細胞は、マウスにおいて増殖速度が増加した腫瘍について適応される。最終的な継代接種からの最も大きい腫瘍を集め、細胞培養中に広げ、適応細胞株を形成した。
【００７９】
幾つかの実施形態において、継代接種は、細胞を肝臓に移植し、腫瘍を増殖させることを含む。最も速く増殖する腫瘍を特定し、上で説明した通り適用可能であれば更なる継代接種のために集める。最終的な形態培養からの最も大きい腫瘍を集め、細胞培養中に広げ、適応細胞株を形成した。
【００８０】
図３は、５−２  Ｈｕｈ７細胞及びＳ６．１細胞による腫瘍形成の速度を示す。Ｓ６．１細胞株は、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの連続的な皮下継代接種による５−２  Ｈｕｈ７細胞に由来する。（Ｓ６．１細胞株を、５−２  Ｈｕｈ７細胞に由来するように、「Ｈｕｈ７（５−２）−Ｓ６．１」と呼ぶ）Ｓ６．１細胞株の生成は、以下の実施例において詳細に説明する。５−２  Ｈｕｈ７細胞の２つの群及びＳ６．１細胞の１つの群をＳＣＩＤ／ｂｇマウスに皮下移植した。腫瘍の体積を測定した。腫瘍の形成は、Ｓ６．１細胞を適応したマウスにおいて有意に早く、平均的な腫瘍の体積は２０日で１０倍を示した。これは、開示したような、連続的継代接種により産生された細胞株が、向上した腫瘍増殖速度を有することを示す。
【００８１】
Ｓ６．１細胞及び以下に示す実施例における細胞株は、レプリコンを有する５０２Ｈｕｈ７細胞株に由来する。しかし、レプリコンを有しない細胞は、増殖速度に適応させた後に、（モデルで使用する、又は安定性の向上に適応させるために）レプリコンでトランスフェクトさせることができることを、当業者は理解するはずである。
【００８２】
安定したレプリコンを有する宿主適応細胞：
幾つかの実施形態において、安定したレプリコンを有する細胞は、細胞中でルシフェラーゼ（又はその他のレポーター）検定を実施し、最も高いルシフェラーゼシグナルを発現する細胞を広げることにより単離される場合がある。
【００８３】
増殖速度についての適応が最初に実施される実施形態において、増殖速度について適応される細胞がレプリコンを含まない（例えば、細胞が継代接種の間にレプリコンを回復する場合もあれば、適応細胞がレプリコンを有しない細胞に由来する場合もある）。これらの場合、細胞はレプリコンでトランスフェクトされ、ルシフェラーゼ検定を実施する前にクローニングされる（Ｇ４１８選択により細胞クローンを有するレプリコンを選択する）場合がある。
【００８４】
幾つかの実施形態において、安定したレプリコンの単離は更に、腫瘍を増殖させるための宿主において、前述した検定において最も高いルシフェラーゼシグナルを発現する腫瘍細胞を移植（例えば、皮下又は肝臓内）することを含む。例えば、４０日間増殖した細胞を集め、次いでＧ４１８の存在下でクローニングする。最も高いルシフェラーゼ発現を有する細胞株を同定するために、細胞クローンのルシフェラーゼ活性が測定される。
【００８５】
増殖及び／又はレプリコン安定性についての適応は、ある研究及び細胞株について望ましいが、本発明は又、細胞株、例えば、レプリコンを含む５−２  Ｈｕｈ７細胞等の細胞株に直接由来して（非適応）実施される場合があることに留意する必要がある。
【００８６】
幾つかの実施形態において、高速増殖適応細胞は必要でないか望ましくなく、例えば、幾つかの実施形態において、遅く増殖する適応細胞が、例えば７日間の長い期間、ＨＣＶレプリコンを監視するのに有用である。例えば、ある研究、特に短期間の研究が、有意に明白な腫瘍増殖の前に実施される。腫瘍細胞が使用される幾つかの実施形態において、細胞は適応され、腫瘍の増殖を最大にする方法で移植される。別の実施形態において、細胞にとって、有意な腫瘍増殖を有することは望ましくなく、明白な腫瘍が存在するようになる前に動物モデルが使用される（例えば試験化合物との接触）。
【００８７】
宿主
本発明は、細胞を投与又は移植し、周知である処置又は応答を測定するための化合物を投与する方法について、動物、好ましくは小動物、特に哺乳動物を使用して実施される。好ましい一実施形態において、げっ歯類が使用され、一実施形態においてマウスが使用される。マウスに言及される実施例が本明細書において詳細に与えられるが、当業者は、その他の種類のげっ歯類及びその他の小動物を使用して本発明をどのように実施するかを理解するであろう。例えば、適切な宿主には、マウス、ラット、マーモット及びツバイ等のトガリネズミが含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
動物は、遺伝突然変異（例えば、無胸腺ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス又はラット、Ｒａｇ１マウス、Ｒａｇ２マウス）、化学的免疫抑制剤の投与、放射線照射（例えば、γ線照射）又はそれらの組み合わせによって免疫無防備状態にされる。化学的免疫抑制剤の１つのクラスは、コルチゾン等のグルココルチコイドである。Ｊｅａｎｅｔｔｅ  Ｉ．  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｌｅｏｎａｒｄｏ  Ｔｏｎｅｌｌｉ，  Ｅｓｔｈｅｒ  Ｍ．  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，  ”Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ”Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００２，  ２０：１２５−６３を参照されたい。他の具体例には、アザチオプリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル及びシクロスポリンが含まれ、一般的に静脈注射又は経口経路により与えられる。更なる化学的免疫抑制剤には、シクロホスファミド、アサチオプリン及びシクロスポリンが含まれる。骨髄に影響を及ぼす他の化合物（抗癌剤）を使用してもよい。通常、先天性及び適応免疫システムの両方が損傷される。
【００８９】
広範なＳＣＩＤマウス、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ）製のＪＡＸＴＭマウス等が利用可能である。これらには、本発明の使用について安定したＳＣＩＤ  ｂｅｉｇｅ（又はＳＣＩＤ−ｂｇ）マウスが含まれる。
【００９０】
既述の通り、幾つかの実施形態において、ヒト由来細胞株が好ましい。動物モデルにおけるヒト由来細胞株（又はその他の異種）を使用することにおける１つの困難は、動物が細胞を拒絶することである。動物を免疫抑制する又は免疫無防備にすることで、細胞の拒絶から動物を予防できる場合がある。しかし、免疫抑制のレベルが非常に高い場合、ラットの死亡率は高くなる。更に、異なる細胞株は、異なるタイプの免疫無防備状態の宿主を必要とする。
【００９１】
出願者等は、γ線照射したＳＣＩＤマウスが、Ｈｕｈ７由来細胞に使用すると特によいことを発見した。動物はγ線に曝露することによりγ線照射される。一実施形態において、細胞移植の当日及び腫瘍細胞の移植の前の日に実施する。
【００９２】
γ線照射したＳＣＩＤマウスが、ＳＣＩＤ／ｂｇマウスよりもシグナルを長く維持することを見出した。図５Ａ〜Ｃは、代表的な、Ｓ６．１−６細胞を皮下移植した、γ線照射したＳＣＩＤマウス（図５Ａ）、及びＳ６．１−６細胞（図５Ｂ）又は５−２  Ｈｕｈ７を皮下移植したγ線照射していないＳＣＩＤ／ｂｇマウスの全身の画像を示す。以下で説明する通り、Ｓ６．１−６細胞株は、マウスに連続して継代接種した５−２  Ｈｕｈ７に由来する細胞株である。図５Ａ〜Ｃに示す通り、γ線照射したマウスは、実験の全ての７日間、シグナルを維持したが、ＳＣＩＤ／ｂｇマウスは維持しなかった。図６Ａは、Ｓ６．１−６細胞を有するレプリコンを皮下移植した、ＳＣＩＤ／ｂｇマウスとγ線照射したＳＣＩＤマウスとの時間による平均生物発光を比較する。図６Ｂは、５−２  Ｈｕｈ７細胞を有するレプリコンを皮下移植したＳＣＩＤ／ｂｇマウスの時間による平均生物発光を示す。Ｘ軸に平行する水平の破線はバックグラウンドシグナルを示す。ＳＣＩＤ／ｂｇマウスは、シグナルの早い低下を示し、約４日で生物発光のバックグラウンドレベルに達する。Ｓ６．１−６細胞は、ＳＣＩＤ／ｂｇマウス中の５−２  Ｈｕｈ７細胞よりも向上したシグナルを示す（３日目に僅かに高いシグナルを示す）が、シグナルは、ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの両方の群で約４日でバックグラウンドに達する。γ線照射したマウスは、実験の全ての７日間でバックグラウンドを超える容易に検出可能なシグナルを維持した。
【００９３】
標的
幾つかの実施形態において標的器官は動物の肝臓である。これは、かなり大多数のＨＣＶ感染が肝臓にある人間の状況に最も類似している。肝臓中の腫瘍細胞を得るために使用することのできる外科的技術は、１）脾臓内注射；２）肝実質内への直接注射；及び３）門静脈への注射である。脾臓へ注射する場合、細胞は脾臓内注射から門脈循環に入って、肝臓内に停止し、肝実質に血管外遊出する。
【００９４】
レプリコンを有する細胞は、また注射により動物の皮下スペースに移植又は導入される。皮下投与は簡単な技術であるので、これは例えば急速スクリーニングが望ましい実施形態において、も好ましい。
【００９５】
一般的に、レプリコンは、感染した血清からヒトの接種材料を使用して導入されない。
【００９６】
化合物
本発明者等は、本明細書に開示される動物が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＣＶの複製又は形成又は産生における相乗効果又は相加効果を有する化合物を同定するために使用することができることを見出した。化合物は、免疫調節化合物及び他の抗ウイルス剤との組み合わせである化合物が同定された。一実施形態において、免疫調節化合物はインターフェロンαであり、他の抗ウイルス剤はＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａプロテアーゼである。従って、本発明には、免疫調節化合物と他の抗ウイルス剤との組み合わせが含まれる。
【００９７】
本明細書で使用される「抗ウイルス剤」は、哺乳動物においてウイルスの形成及び／又は複製を減少又は阻害するのに効果的な薬剤を意味する。本明細書で使用される抗ウイルス剤は、一般的に免疫系に作用し、ウイルスの複製を阻害する又は減少させる薬剤が含まれることを意味し、ウイルス生物学に特異的に作用し、ウイルスの複製を減少又は阻害する薬剤をも含む。抗ウイルス剤には、ＳＭＩＰＳ等の免疫調節因子、インターフェロン等が含まれ、１つ以上のウイルスの機能の妨害を標的とする薬剤が含まれる。
【００９８】
抗ＨＣＶ抗原の場合においては、ＨＣＶ感染性ウイルスの複製又は粒子形成を阻害する何れかの抗ウイルス剤が抗ウイルス剤及び抗ＨＣＶウイルス剤であると考えられる。これには、哺乳動物においてウイルスの形成及び／又は複製に必要な宿主又はウイルスの何れかの機序を妨害する薬剤が含まれる。例えば、抗ＨＣＶウイルス剤には、リバビリン、アマンタジン、ＶＸ−４９７（メリメポジブ、Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＶＸ−４９８（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レボビリン、ビラミジン、セプレン（マキサミン）、ＸＴＬ−００１及びＸＴＬ−００２（ＸＴＬ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＮ２８３−Ｖａｌｏｐｉｃｔｉｔａｂｉｎｅ（Ｉｄｅｎｉｘ）が含まれる。抗ウイルス剤には又、プロテアーゼ、ヘリカーゼ及びポリメラーゼ機能等のウイルスの複製及びパッケージに必要な１つ以上の酵素活性を妨害することのできる、核酸（ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ等）又は小分子が含まれる。抗ＨＣＶウイルス剤には又、プロテアーゼ、ヘリカーゼ及びポリメラーゼ機能等のＨＣＶの複製及びパッケージに必要な１つ以上の酵素活性を妨害することのできる、核酸（ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ等）又は小分子が含まれる。このような核酸は、アンチセンス分子、二重鎖ＤＮＡ、及びｓｉＲＮＡ等の形態で提供され得る。従って、抗ウイルス剤には、免疫系の非特異的又は特異的調節剤の何れかとしての、更に後述するような免疫調節化合物が含まれる。抗ＨＣＶ剤には又、ＨＣＶに対する治療的又は予防的ワクチン、及びＨＣＶ受容体結合を妨害する抗体又は小分子が含まれる。
【００９９】
候補化合物
本発明のスクリーニング方法において全て使用される、通常の候補化合物には、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、脂質、金属、小さい有機分子、ＲＮＡアプタマー、抗体及びその他の公知の薬剤、ポリアミン、抗体又は抗体の誘導体（例えば、抗原結合フラグメント、ｓｃＦｖｓを含む一本鎖抗体等）、及びそれらの誘導体の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。小さい有機小分子は、約５０を超え、約２，５００ダルトン未満、最も好ましくは約３００〜約８００ダルトンの分子量を有する。候補化合物は、合成又は天然化合物の大きなライブラリーに由来するもであってもよい。例えば、合成化合物ライブラリーは、ＭａｙＢｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｅｖｉｌｌｅｔ［英国コーンウォール］）又はＡｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から市販されている。或いは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態における天然化合物のライブラリーを使用してもよい。更に、候補化合物は、個々の化合物又は混合物の何れかとして組み合わせの化学を使用して合成的に製造されたものでもよい。化合物には、抗体、又は抗原結合能力を保持している抗体のフラグメントが含まれる。
【０１００】
免疫調節化合物
本発明において使用される免疫調節化合物又は薬剤（又は免疫調節因子）には、哺乳動物における免疫系応答を向上又は増強し、又はＨＣＶ複製及び／又は粒子形成を減少又は阻害するのに効果的な薬剤（化合物又は生物材料）が含まれる。
【０１０１】
免疫調節因子には、例えば、クラスＩのインターフェロン（α−、β−、δ−及びω−インターフェロン、τ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン及びアシアロインターフェロン等）、クラスＩＩのインターフェロン（γ−インターフェロン等）及びペグ化インターフェロンが含まれる。本発明において使用される他の免疫調節化合物には、Ｂ７−１又はＢ７−２等のリンパ球に対する免疫源提示を向上する刺激性化合物、又はサイトカイン、リンフォカイン、及びケモカインが含まれ、ＩＬ−２、修飾ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５をｓｅｒ１２５に修飾）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰＩβ、ＦＬＰ−３、リバビリン及びＲＡＮＴＥＳが含まれるが、これらに限定されず、組成物中に含有することができる。
【０１０２】
本発明において使用される免疫調節因子には又、更に後述するような、小分子免疫増強剤（ＳＭＩＰＳ）、ヌクレオシド類似体及び他のトール様受容体作動薬が含まれる。
【０１０３】
好ましいＴＬＲモジュレータは、ＴＬＲ７（例えば、イミダゾキノリン）、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）の作動薬である。
【０１０４】
ＴＬＲ７モジュレータには、ロキソリビン、Ｎ７及びＣ８位におけるグアノシン類似体、イサトリビン、ＡＮＡ−９７１、ＡＮＡ−９７５、又はイミダゾキノリン化合物、又はそれらの誘導体が含まれる。一実施形態において、ＴＬＲ作動薬はイミキモド又はレシキモドである。更なるＴＬＲ７作動薬はＷ００２０８５９０５に開示されている。
【０１０５】
ＴＬＲ８モジュレータは、レシキモド（Ｒ８４８）等のイミダゾキノリン分子であり、レシキモドは、またＴＬＲ−７によって認識され得る。使用される場合があるその他のＴＬＲ−８作動薬には、国際特許出願第ＷＯ０２００４０７１４５９号に記載のものが含まれる。
【０１０６】
ＴＬＲ９モジュレータ：一実施形態において、ＴＬＲ−９を通じてシグナル応答を置き起こすことができるＴＬＲ作動薬は、ＨＳＰ９０、又はメチル化されていないＣｐＧヌクレオチドを含むＤＮＡ、特に、ＣｐＧモチーフを含む後述する配列の内容である。
【０１０７】
免疫賦活オリゴヌクレオチド
本発明において免疫調節因子として使用するのに好適な免疫賦活オリゴヌクレオチドには、ＣｐＧモチーフ（メチル化されていないシトシン、次いでグアノシンを含み、リン酸結合により結合している配列）を含むヌクレオチド配列が含まれる。パリンドローム又はポリ（ｄＧ）配列を含む細菌の二重鎖ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドは又、免疫賦活剤として示された。
【０１０８】
ＣｐＧ’ｓには、ホスホロチオエート修飾等のヌクレオチド修飾／類似体が含まれ、二重鎖又は一本鎖であってもよい。場合により、グアノシンは２’−デオキシ−７−デアザグアノシン等の類似体で置換されてもよい。可能な類似体置換基の具体例としては、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ：  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ”，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００３）  ３１（９）：  ２３９３−２４００；国際特許第ＷＯ０２／２６７５７号及び第ＷＯ９９／６２９２３号を参照されたい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果については、Ｋｒｉｅｇ，  ”ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ：  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ？”，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２００３）  ９（７）：  ８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ＣｐＧ  ＤＮＡ”，  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （２００２）
３２：１７９−１８５；国際特許第ＷＯ９８／４０１００号；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号及び米国特許第６，４２９，１９９号で詳細に考察されている。
【０１０９】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴ又はＴＴＣＧＴＴ等のＴＬＲ９に配向していてもよい。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９：  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＣｐＧ  ＤＮＡｓ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００３）  ３１  （ｐａｒｔ  ３）：  ６５４−６５８を参照されたい。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ等のＣｐＧ配列はＴｈ１免疫応答の誘導に特異的であり、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ等はＢ細胞応答に更に特異的である。ＣｐＧ−Ａ及びＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮＳは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｓ
Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ”，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （２００３）
１７０（８）：  ４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ，  ”Ｆｒｏｍ  Ａ  ｔｏ  Ｚ  ｏｎ  ＣｐＧ”，  ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （２００２）  ２３（２）：６４−６５；及び国際特許第ＷＯ０１／９５９３５号を参照されたい。
【０１１０】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの具体例には、ホスホロチオエート修飾分子内結合を含む、以下の配列が含まれる。
【０１１１】
【化２】
2014027951.tif 000003
国際特許第ＷＯ０５／２５６１４号を参照されたい。
【０１１２】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオトドは、５’末端が受容体認識されやすいように製造される。場合により、２個のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が３’末端に結合し、イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒｓ）を形成してもよい。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，  ＢＢＲＣ  （２００３）  ３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９：  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＧｐＧ  ＤＮＡｓ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００３）  ３１．  （ｐａｒｔ  ３）：  ６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”ＣｐＧ  ｐｅｎｔａ−  ａｎｄ  ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ”  ＢＢＲＣ  （２００３）
３００：８５３−８６１及び国際特許第ＷＯ０３／０３５８３６号を参照されたい。
【０１１３】
小分子の免疫増強剤（ＳＭＩＰｓ）
１．イミダゾキノリン化合物
本発明においてアジュバントに使用するのに好適なイミダゾキノリン化合物の例には、Ｓｔａｎｌｅｙ，  ”Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  （２００２）  ２７（７）：  ５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ，  ”Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ”，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  （２００３）  ４（２）：  ２１４−２１８；Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ６４（２）：  ７９−８３  Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０４（ｌ）：  ６４−７４、米国特許第４６８９３３８号、第４９２９６２４号、第５２３８９４４号、第５２６６５７５号、第５２６８３７６号、第５３４６９０５号、第５３５２７８４号、第５３８９６４０号、第５３９５９３７号、第５４８２９３６号、第５４９４９１６号、第５５２５６１２号、第６０８３５０５号、第６４４０９９２号、第６６２７６４０号、第６６５６９３８号、第６６６０７３５号、第６６６０７４７号、第６６６４２６０号、第６６６４２６４号、第６６６４２６５号、第６６６７３１２号、第６６７０３７２号、第６６７７３４７号、第６６７７３４８号、第６６７７３４９号、第６６８３０８８号、第６７０３４０２号、第６７４３９２０号、第６８００６２４号、第６８０９２０３号、第６８８８０００及び第６９２４２９３号に詳細に説明されている、イミキモド及びその類似体が含まれる。
【０１１４】
好ましいＳＭＰＩｓには、
Ｎ２−メチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
ｌ−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−ｌＨ−イミダゾ  ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
２−［［４−アミノ−ｌ−（２−メチルプロピル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール；
酢酸２−［［４−アミノ−ｌ−（２−メチルプロピル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチル；
４−アミノ−ｌ−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−ｌ−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール；
ｌ−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−ｌ−イル］−２−メチルプロパン−２−オール；
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミンが含まれる。
【０１１５】
ヌクレオシド類似体
ヌクレオシド類似体、例えば、（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５：７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１１６】
【化３】
2014027951.tif 000004
及びそれらのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）米国特許第６，９２４，２７１号、米国特許出願第２００５／００７０５５６ｖｉ号、米国特許第５，６５８，７３１号に開示された化合物；（ｆ）化学式
【０１１７】
【化４】
2014027951.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１Ｏアリール、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又は置換Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ３は存在しないか、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル又は置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、又はＲ４−５において結合が一緒に５員環を形成し；
【０１１８】
【化５】
2014027951.tif 000006
結合は、それぞれ独立してＮ、Ｃ、Ｏ又はＳである、〜Ｘ１及びＸ２によって示される結合により達成され；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−０−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル又はＲ９ａであり、Ｒ９ａは
【０１１９】
【化６】
2014027951.tif 000007
であり、結合は〜で示される結合により達成され；
Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、又は−ＯＨであり；
各Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル、又は置換Ｃ１−６アルキルであり；
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリール又はヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、又は置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、又はトリホスフェートであり；
各ｎは、独立して０、１、２又は３であり；
各ｐは、独立して０、１又は２である化合物であるか、
又は（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の何れかの薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）の何れかの互変異性体、該互変異性体の薬学的に許容される塩；ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）を有する化合物である（米国特許第５，０１１，８２８号）。
【０１２０】
３．チオセミカルバゾン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なチオセミカルバゾン化合物の具体例、化合物の製剤化方法、製造方法及びスクリーニング方法は、国際特許第ＷＯ０４／６０３０８号に開示されているものが含まれる。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１２１】
４．トリプタンスリン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なトリプタンスリン化合物の具体例、化合物の製剤化方法、製造方法及びスクリーニング方法は、国際特許第ＷＯ０４／６４７５９号に開示されているものが含まれる。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１２２】
５．更なるＳＭＩＰｓ
（ｉ）アシルピペラジン化合物、インドレジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物（米国特許第６，６０５，６１７、ｖｉｉ  国際特許第ＷＯ０２／１８３８３号）、ヒドラプタラミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物（国際特許出願第ＷＯ２００４／０１８４５５号）、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物、及びベンザゾール化合物（国際特許第ＷＯ０３／０８２２７２号）が含まれる、国際特許出願第ＷＯ２００４／８７１５３号に開示される化合物。
【０１２３】
（ｉｉ）メチルイノシン５’−モノホスフェート（”ＭＩＭＰ”）（Ｓｉｇｎｏｒｅｌｌｉ  ＆  Ｈａｄｄｅｎ（２００３）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３（８）：１１７７−８６）。
【０１２４】
（ｉｉｉ）化学式
【０１２５】
【化７】
2014027951.tif 000008
（式中、Ｒは水素、直鎖又は分岐鎖の、非置換又は置換、飽和又は不飽和アシル、アルキル（例えばシクロアルキル）、アルケニル、アルキニル及びアリール基である）を有するポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物（国際特許第ＷＯ２００４／０６４７１５号）又はその薬学的に許容される塩又は誘導体。具体例には、カズアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カズアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カズアリン、７−エピ−カズアリン、３，７−ジエピ−カズアリン等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
（ｉＶ）γイヌリン（Ｃｏｏｐｅｒ  （１９９５）  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：５５９−８０）、又はアルガムリン等の誘導体。
【０１２７】
ＰＫ／ＰＤ実験
本発明の動物モデルは、潜在的な抗ウイルス化合物及びプロトコールの薬物動態、薬力学及び毒性実験のために使用することができる。モデルは又、ＨＣＶ複製の経過を監視するため、及び薬剤の作用機序を決定するためにも使用することができる。
【０１２８】
前記動物モデルは、レプリコンの複製を阻害する化合物又はプロトコールを特定し、評価するために使用することができる。前記動物モデルは、ウイルスのライフサイクルにおける他の手順を阻害する抗ウイルス化合物（例えば、ウイルスのパッケージング又は細胞から出ることを阻害する化合物）を同定するために使用することもできる。
【０１２９】
動物は、候補化合物又は候補プロトコールを使用して処理される。或いは、動物は、ＨＣＶに対する効果的な免疫調節因子であることが知られているか決定されている化合物、例えば、インターフェロンαを組み合わせて処理される。抗ウイルス活性を定量し、対照又は未処理のモデルと比較し、又は定量し、複数の候補化合物の相対的順位を決定するために使用される。幾つかの実施形態において、予防化合物又はプロトコールを同様に特定し、細胞移植前に、化合物又はプロトコールを投与することにより、評価及び／又は順位付けをする。これらの場合、化合物又はプロトコールは又、細胞の移植後にも投与できると考えられる。
【０１３０】
試験薬剤（候補化合物）は、腹腔内、皮下、静脈内に、又は経口的に投与される。投与経路及び投与スケジュールは、各候補化合物について個々に決定することができ、各送達方法について作成された薬剤露出量に基づく。薬剤の露出は、薬物動態学実験において測定される。薬剤が体内にどのくらい長く残留するかを知ることにより、この情報は、試験化合物の複数の濃度の投与スケジュールを決定するために使用することができる。スケジュールは、７日間、試験化合物の治療的有効量を維持するように選択することができる。
【０１３１】
抗ウイルス活性は幾つかの方法で測定することができる。第１の方法は、前述した１つ以上のレポーター遺伝子を使用する（例えば、ルシフェラーゼ検定技術）。レポーター遺伝子活性、又はレポータータンパク質の量はＨＣＶレプリコンの複製量と相関するはずである。レポータータンパク質のレベルの測定に加えて、候補化合物又はプロトコールの効果は、ＨＣＶ  ＲＮＡのレベル又はウイルスタンパク質のレベルを測定することにより決定することができる。濃度及び／又は時間依存反応曲線（例えば、ＥＣ５０、ＩＣ５０）は、候補化合物及びプロトコールについて決定することができる。
【０１３２】
幾つかの実施形態において、第２のレポーター遺伝子は、安定に又は一過性に細胞内にトランスフェクトされ、細胞の生存度を評価することを可能にする。試験化合物が標的細胞を死滅させる場合、何れかの抗ウイルス活性よりも細胞死のために第１のレポーターは検出されない。従って、第２のレポーターはＨＣＶレプリコンを含む細胞の生存度のマーカーとして作用する。
【０１３３】
１つの適切な第２のレポーターはＲｅｎｉｌｌａ（ウミホタル）ルシフェラーゼ遺伝子である。これを測定する他の方法は、サブゲノムレプリコン上のＨＣＶ遺伝子、及びＨｕｈ７細胞中に含まれるヒト遺伝子の遺伝子コピー数を定量することである。細胞当たりのレプリコン含量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨｕｈ７細胞の増殖の間、相対的に安定のままであり、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏのケースであると考えられる。従って、腫瘍組織内のヒト遺伝子コピー数に対するＨＣＶ遺伝子コピー数の比を比較することにより、ＨＣＶ阻害剤を使用したマウスの処理がサブゲノムレプリコンの複製を阻害する場合（ヒト遺伝子コピー数に対するＨＣＶ遺伝子の比が減少する）に、又はヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するか、レプリコンを含む細胞の腫瘍細胞死を誘導する場合（ヒト遺伝子コピー数に対するＨＣＶの比が相対的に一定のままである）に測定することができる。これを実施するために、動物を検死し、分子解析のために腫瘍試料を取得した。腫瘍組織１ｍｇ当たりのＨＣＶ遺伝子及びヒト遺伝子のコピー数を、ベースラインのために０日目、及び後の時間に再び定量化した。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施される測定が好ましい。
【０１３４】
上で考察した通りに測定した有効性の情報に加えて、初期薬物動態（時間による濃度）及び／又は毒性データを得るためにモデルを使用することができる。例えば、安全性の限界、最も低い有効濃度及び毒性の徴候を示す最も低い濃度が決定される。薬物動態及び毒性の定量は周知であり、任意の公知の方法により定量することができる。このような方法の具体例は、Ｙ．  Ｋｗｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，  Ｋｌｅｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１；Ｒ．Ｄ．  Ｓｃｈｏｅｎｗａｌｄ  （ｅｄｉｔｏｒ）  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００２；及びＳ．Ｃ．  Ｇａｄ，  Ｄｒｕｇ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００２に開示されている。
【０１３５】
レプリコンを含む細胞の移植は薬物動態及び毒性実験に必要でないが、モデルは、これらの実験を、薬理学的実験と同じ動物において同時に実施することを可能にする。
【０１３６】
種々の実施形態によれば、本発明のモデルは、異なる長さの実験のために使用することができる。
【０１３７】
一実施形態において、モデルは相対的に短期間の実験のために使用することができる。短期間の実験は（試験化合物処理から）１０日以内であってもよく、２〜７日又は数日であってもよい。例えば、実施例７に以下に示す通り、本発明の実施形態によるＨＣＶ動物モデルの公知の抗ウイルス化合物（ＩＦＮ−α）による処理は、未処理のモデルに比較し、２日で平均生物発光の検出可能な低下をもたらした。
【０１３８】
本明細書で使用される「インターフェロン」又は「インターフェロン−ａ」又は「インターフェロンアルファ」又は「インターフェロン−α」又は前記の何れかと、「２Ｂ」との組み合わせはインターフェロンα２Ｂを示すことを意味する。
【０１３９】
別の実施形態において、モデルは長期間の実験のために使用することができる。長期間の実験は、特に、化合物又は治療薬の毒性又は安全性の限界（毒性に対する活性の測定）の評価に有用である。毒性効果は、化合物に対する露出により時間とともに上昇する。又、化合物を効果のない状態にする突然変異が試験化合物の繰り返し投与の後に選択することができるので、薬剤耐性を評価することができ、化合物による長期間の処理は、このような突然変異を誘導する。長期間のモデルは、化合物のＰＫ／ＰＤの評価を可能にするのみならず、毒性評価、及び潜在的な薬剤耐性の発生の評価を改善することを可能にする。
【０１４０】
別の実施形態において、本発明は更に：
本明細書に開示されたレプリコンを有する腫瘍細胞を、細胞移植前に放射線照射されるＳＣＩＤマウスに皮下移植する（その他の免疫無防備状態の毒性機序を使用してもよい）；
強い生物発光を照射する腫瘍を切除する；
レプリコンのための選択的マーカーの存在下、腫瘍の生物発光部分をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する；
高いルシフェラーゼ発現を有する細胞コロニーを選択し、レプリコンのための陽性選択剤（例えば、本明細書に開示されるＧ４１５）の存在下で増殖する、得られたクローンを増殖する
手順により作製される腫瘍細胞株を提供する。該方法を１回以上繰り返し、ＩＦＮ−αに対する感受性の低下した細胞株を更に選択する。細胞株は、本明細書に開示された高用量のインターフェロンα中で培養することにより、レプリコンを回復することができる。
【０１４１】
当該技術分野で公知なように、レポーター及び動物を免疫無防備状態にする更なる方法を使用することができる。
【実施例】
【０１４２】
以下の実施例は、本発明の詳細な説明の態様を提供する。これらの実施例は、本発明のこれらの態様を例示し更に明瞭に説明するために提供され、決して限定されることを意図するのではない。
【０１４３】
（実施例１）プラスミドの構築、及びＲＮＡ翻訳、及びトランスフェクション効率
プラスミドの構築：
レプリコンｐ１１４／ＥＴ（図１に示す通り、ＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴ又はＰＶＩレプリコンとして記載）を、ｐＦＫＩ３４１ＰＩＬｕｃＮＳ３−３’／ＥＴ（Ｌｏｈｍａｎｎ，  Ｖ．，Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｕ．  Ｈｅｒｉａｎ，  Ｆ．
Ｐｅｎｉｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ．  ２００３：  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：３００７−１９）から１．６ｋｂのＸｂａＩ−ＮｏｔＩフラグメントを除去し、ｐＦＫＩ３８９ＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／５．１由来の２．６ｋｂのＸｂａＩ−ＮｏｔＩフラグメント（Ｋｒｉｅｇｅｒ，  Ｎ．，  Ｖ．  Ｌｏｈｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：４６１４−２４）と置換することによって、構築した。
【０１４４】
ＨＣＶＩレプリコンは２００１，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７５（１０）：４６１４−４６２４に開示されている。
【０１４５】
ＲＮＡトランスフェクション：全てのプラスミドをＳｃａＩを使用して直線化し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＲＮＡを合成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したＲＮＡを既述の通り精製した（Ｇｕｏ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｖ．Ｖ．  Ｂｉｃｈｋｏ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓｅｅｇｅｒ．  ２００１．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：８５１６−８５２３）。全ＲＮＡを使用した細胞のトランスフェクションに使用される条件は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したＲＮＡを使用したトランスフェクションに使用される条件と同じであった（前述のＧｕｏ，  ｅｔ
ａｌ．らを参照）。サブ融合性のＨｕｈ７細胞をトリプシン処理し、完全ＤＭＥＭで１回、血清を含まないＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で１回洗浄した。細胞ペレットを、血清を含まないＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に、１０細胞／ｍＬの密度になるように再懸濁した。エレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍの隙間；ＢＴＸ［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）中の２００ｍＬの細胞懸濁液に、１〜１０ｍｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したＲＮＡを加えた。直ちに、２００Ｖ及び１，０００ｍＦに設定したＥＣＭ６３０装置（ＢＴＸ）を使用して、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞懸濁液を室温に５分間維持し、次いで、１０％ウシ胎児血清及び必須でないアミノ酸を補充したＤＭＥＭに希釈し、直径１０ｃｍのシャーレに播種した。２４時間後に、Ｇ４１８を、０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように加えて、培地を１日おきに交換した。２〜３週間後に、Ｇ４１８耐性コロニーは目に見えるようになる。
【０１４６】
ＨＣＶレプリコンの翻訳及びトランスフェクションの効果：ｐ１１４／ＥＴ（図１におけるＰＶＩレプリコン）又はＨＣＶ１レプリコン（図１参照）の何れか由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を使用して、Ｈｕｈ−７細胞をトランスフェクトし（前記参照）、レプリコン含有Ｇ４１８耐性細胞を選択するためにＧ４１８の存在下で標準的な組織培養法を使用して増殖した。ＰＶＩレプリコンのルシフェラーゼ発現は、１０，０００細胞当たりのＲＬＵの規模をベースとしたＨＣＶＩレプリコンの発現よりも高かった（図２Ａ参照）。ＰＶＩレプリコンについてのコロニー形成の効果は又、ＨＣＶＩレプリコンよりも高い。図２Ｂは、Ｈｕｈ−７細胞をトランスフェクトするのに使用したＲＮＡの量が、両方のトランスフェクションで等しいにもかかわらず、ｐ１１４／ＥＴ（ＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴ）ＲＮＡでトランスフェクトしたＨｕｈ−７培養物中のＧ４１８耐性コロニーの数が、ＨＣＶＩレプリコンＲＮＡでトランスフェクションした後に観察されるコロニー数よりも高いことを示す。
【０１４７】
（実施例２）マウスに適応させたＳ６．１細胞の生成
５−２  Ｈｕｈ７細胞を、高用量のグルコース、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、必須でないアミノ酸、及び２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＤＭＥＭ中に広げた。細胞を３〜７日毎に、１：３〜１：１０の範囲に分割した。０．２ｍＬのＨＢＳＳ中の５００万個の細胞を、１０匹のメスＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国マサチューセッツ州ウィルミントン］）の右脇腹に皮下移植した。５〜３６日目まで、腫瘍体積（０．５×幅×幅×長さ）を週に２回測定した。腫瘍の幅及び長さはノギスを使用して測定した。１、８及び３７日目に、ＩＶＩＳカメラシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州アラメダ］）を使用してｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングによるルシフェラーゼ活性についてマウスをイメージングした。３７日目に、最も大きい腫瘍を有する３匹のマウスのみイメージングした。３匹の最も大きい腫瘍（３６日目に測定し、３９３、４６８及び５３２ｍｍ３）を３７日目に集め、２枚の滅菌したスライドグラスのつや消しした先端を使用して粥状にすりつぶした。粥状の細胞の５０〜１００μＬの部分を、１０匹の麻酔したＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスに、それぞれ外套針を使用して皮下に挿入した。この第２の試験における腫瘍体積を、８〜２６日目まで週に２回測定した。２８日目に、４個の最も大きい腫瘍（２６日目に、７５９、８３１、１０８３及び１５８５ｍｍ３）を集め、粥状の細胞と組み合わせ、既述の通り、他の１０匹のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスに移植した。腫瘍の体積を、７〜２１日目まで週に２回測定した。２２日目に、３個の最も大きい腫瘍（２１日目に、５８４、６３８及び７０７ｍｍ３）を集め、同じ方法で５匹のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスに移植した。腫瘍の体積を、６〜２３日まで週に２回測定した。２４日目に、３個の最も大きい腫瘍（２３日目に、９７８、１２４９及び１５１９ｍｍ３）を集め、細胞培養物に広げ、細胞株Ｈｕｈ７（５−２）−Ｓ６．１を生成した。図３に示す通り、同じ数の細胞をマウスに皮下移植した場合、Ｓ６．１細胞５−２細胞より速い細胞を形成した。
【０１４８】
（実施例３）レプリコンを有する細胞株Ｓ６．１−６の生成
Ｈｕｈ７−１１４ＥＴ−７細胞（ｐ１１４／ＥＴを有するＨｕｈ７細胞、或いは、図１において、ＰＩＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／ＥＴ又はＰＶＩと呼ばれる）から抽出した、１０μｇの全ＲＮＡを、前述したプロトコールに従い、Ｓ６．１細胞にトランスフェクトした。０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でのＧ４１８の存在下で選択することによって、レプリコンを有する細胞クローンを得た。各細胞クローンについてルシフェラーゼ検定を実施した。図４は、各クローンについてのルシフェラーゼの相対的活性を示す。Ｓ６．１−６細胞は、高レベルのルシフェラーゼシグナルを発現し、更に広げ、ｉｎ  ｖｉｖｏの動物実験に使用した。
【０１４９】
（実施例４）保存マウスに適応させた細胞株Ｓ６．１−ＰＩの生成
Ｓ６．１細胞に適応させたマウスを、上述のようなエレクトロポレーションにより直線化されたＰＶＩレプリコン由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡでトランスフェクトした。０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＧ４１８を使用してコロニーを選択した。ルシフェラーゼ活性は、製造業者の記載の通りに、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇｌｏ−ｓｔｅｄａｙ  Ｌｕｃ検定キットにより測定した。図４は、異なる細胞クローンに対してプロットした、１，０００個の細胞当たりのルシフェラーゼ活性の相対光量（ＲＬＵ）を示す。細胞クローン＃１、２、４、６、Ｆ及びＪは、細胞株Ｓ６．１−ＰＩを生成するために保存した。
【０１５０】
（実施例５）レプリコンを有する細胞株Ｓ６．１−Ｔ１２−２、Ｓ６．１−Ｔ１５、Ｓ６．１−Ｔ７の単離
レプリコンを有する保存Ｓ６．１細胞を移植した、ナンバー１２のマウス由来の腫瘍を４３日目に集め、完全ＤＭＥＭ培地で１週間培養した。細胞をトリプシン処理し、次いで、Ｇ４１８（２５０μｇ／ｍＬ）の存在下で、１００ｍｍのプレートに連続して希釈した。２週間後、１００ｍｍプレート中のＧ４１８耐性コロニーを、上述のようなＩＶＩＳカメラシステムを使用してイメージングした。ルシフェラーゼ陽性コロニーを９６ウェルプレートに移し、広げてルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ発現細胞クローンの１つを、Ｓ６．１−Ｔ１２−２と命名した。Ｓ６．１−Ｔ１５及びＳ６．１−Ｔ７等の、Ｌｕｃを安定に発現するが、Ｓ６．１−Ｔ１２−２よりも速く腫瘍を形成する他の細胞株を同じ方法で作製することができる。
【０１５１】
（実施例６）マウス肝臓に適応させた細胞の生成
５−２  Ｈｕｈ７細胞を、９匹のＳＣＩＤマウス（放射線照射なし）の肝臓に脾臓内注射することにより播種した。脾臓を体外に出し、０．０５ｍＬのＨＢＳＳ中の２．５×１０５〜３．５×１０６細胞を脾臓に注入した。脾臓を生理食塩水に浸した無菌ガーゼに１０分間置き、細胞を肝臓に移動させた。次いで、脾臓に付着した血管を焼灼し、血管結紮により脾臓を剥離した。０、１及び２日目にＸｅｎｏｇｅｎカメラシステムを使用してマウスをイメージングし、２日目までにシグナルはバックグラウンドレベルまで低下した。７、１０、１５及び２９日目にマウスを再度イメージングし、バックグラウンド以上のシグナルは観察されなかった。細胞の接種から６週間で、検死を定期的に実施し、肝臓内の腫瘍増殖をチェックした。４８日目に、１匹のマウスの肝臓から細胞を集め、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、細胞株Ｈｕｈ７（５−２）−Ｈ２を生成した。
【０１５２】
次いで、これらのＨｕｈ７（５−２）−Ｈ２細胞を、１０匹の放射線照射していないＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスの肝臓に直接移植した。手術中、肝臓を体外に出し、２μＬの細胞（１００μＬのＨＢＳＳ中）を単一の肝葉に直接注入した。細胞を、同じ肝葉の異なる位置における実質に注入した（各位置に５０μＬ）。次いで、外科的切開を閉じ、一晩、マウスを手術から回復させた。細胞接種の３０日後、２匹のマウスについて検死を実施し、肝臓中の腫瘍の増殖をチェックした。１匹のマウスの肝臓から１個の腫瘍を集め、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、細胞株Ｈｕｈ７（５−２）−Ｈ２Ｌ１．１を生成した。３４及び４０日目に、４匹のマウスから腫瘍を集め、２個の細胞株、Ｈｕｈ７（５−２）−Ｈ２Ｌ２．２及びＨｕｈ７（５−２）−Ｈ２Ｌ２．３を生成した。
【０１５３】
次いで、Ｈｕｈ７（５−２）−Ｈ２Ｌ１．１細胞を、前述したのと同じ方法に従い、他の１０匹の放射線照射していないＳＣＩＤ−ｂｇマウスの肝臓に直接移植した。１０匹のマウスのうち５匹が、接種の２７日後に、全身腫瘍組織量にて腹部が膨張し始めた。この日に、３匹のマウスのそれぞれの肝臓から腫瘍を集めた。これらの腫瘍を粥状の腫瘍と一緒にし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、細胞株Ｈｕｈ７（５−２）−Ｈ２Ｌ２．１を生成した。細胞接種の２９日後に、他のセットの３匹のマウスの肝臓から腫瘍を集めた。これらの腫瘍を粥状の腫瘍として一緒にし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、細胞株Ｈｕｈ７（５−２）−Ｈ２Ｌ２．２を生成した。
【０１５４】
（実施例７）ＳＣＩＤ／ｂｇマウス及び放射線照射したマウスに皮下移植した、５−２
Ｈｕｈ７及びＳ６．１−６細胞の生物発光シグナル安定性
Ｓ６．１−６細胞を上述の通り調製した。５×１０６細胞をγ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植した。５×１０６個の５−２  Ｈｕｈ７細胞（マトリゲル中）をＳＣＩＤ／ｂｇマウス（放射線照射なし）に皮下移植し、５×１０６の５−２  Ｈｕｈ７細胞（マトリゲルなし）をγ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植した。移植の前日に、ＳＣＩＤマウスに、３グレイ（ＧＹ）の放射線を照射した（３．２分以下）。細胞を、注入により右脇腹に移植した。ＳＣＩＤ／Ｂｇマウス中に急速に低下する生物発光シグナルの維持を向上するために、マトリゲルを５−２Ｈｕｈ−７細胞に加えた。
【０１５５】
１、３及び４日目のみにイメージングした５−２  Ｈｕｈ７細胞を受けたＳＣＩＤ／ｂｇマウスを除いては、１、２、３、４及び７日目の、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像を取得し、生物発光を定量した。図５は、１、３、４及び７日の放射線照射したＳＣＩＤマウス、及びＳ６．１−６細胞を有するＳＣＩＤ／ｂｇマウス（それぞれ、図５Ａ及び５Ｂ）、及び５−２  Ｈｕｈ７細胞を有するＳＣＩＤ／ｂｇマウス（図５Ｃ）の画像を示す。生物発光シグナルは、Ｓ６．１細胞を有するγ照射したＳＣＩＤマウスについて７日間維持された（レプリコン中のルシフェラーゼが過剰であることを示す）が、５−２  Ｈｕｈ７細胞又はＳ６．１−６細胞を有するＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいては、３日にのみシグナルが検出可能であった。図６Ａ及びＢは、経時的に（全てのマウスの）平均生物発光を示すグラフである。生物発光は、５−２  Ｈｕｈ７（図６Ｂ）又はＳ６．１−６細胞（図６Ａ）の何れかを有するＳＣＩＤ／ｂｇマウスについては４日目に本質的にバックグラウンドであるが、放射線照射したＳＣＩＤマウスは、少なくとも７日間、バックグラウンドを超えた認識可能なシグナルを維持する。
【０１５６】
（実施例８）放射線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植したモデルの５−２  Ｈｕｈ７及びＳ６．１−６の生物発光
Ｓ６．１−６細胞を上述の通り調製した。５×１０６個の細胞をγ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植した。５×１０６細胞の５−２  Ｈｕｈ７細胞をγ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植した。細胞を注射により、右脇腹に皮下移植した（０．２ｍＬの、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン中の５×１０６細胞）。前日及び細胞移植前に、ＳＣＩＤマウスに、３ＧＹ（３．２分以下）の放射線を照射した。
【０１５７】
１、２、３、４、７、１０、１７及び２１日目に、生物発光を定量した。図７は、経時的に（全てのマウス）の平均生物発光を示すグラフである。Ｓ６．１−６マウスは、移植後１７日目まで５−２マウスよりも強いシグナルを有していた。Ｓ６．１−６細胞由来のルシフェラーゼシグナルは移植後の最初の５日にわたり上昇したが、５−２細胞由来のシグナルは同じ期間にわたり減少した。データは、Ｓ６．１細胞が移植後の最初の５日間に強いことを示す。データは又、バックグラウンド（１．０×１０５光子／秒）を超えて認識可能なシグナルが、Ｓ６．１及び５−２  Ｈｕｈ７細胞の両方で少なくとも２１日間維持されることを示す。
【０１５８】
２群の腫瘍体積の測定を、１１、１４、１７及び２１日目に実施した。１１日目の平均腫瘍体積は５−２  Ｈｕｈ７モデルの場合１００ｍｍ３であり、Ｓ６．１−６モデルの場合１００ｍｍ３であった。２１日目までには、５−２  Ｈｕｈ７モデルの場合１７０ｍｍ３であり、Ｓ６．１−６モデルの場合５７０ｍｍ３であった。
【０１５９】
（実施例９）インターフェロンαを使用した、皮下モデルの処理
レプリコンを有するＳ６．１−６細胞を上述の通り調製した。当日、及び細胞移植前に、メス担体ＳＣＩＤマウスに３ＧＹのγ線を約３．２分間照射した。０．２ｍＬの担体中の５×１０６細胞を４２匹のマウスの右脇腹に皮下移植し、３群（対照群、低ＩＦＮ−α投与群、高ＩＦＮ−α投与群）に分けた。各群には１４匹のマウスが含まれる。各群に対して以下のように投与される。
対照群：担体（ＨＢＳＳ中、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン０．１ｍＬ）、１日当たり、皮下投与
低ＩＦＮ−α投与群：１８ｇのマウスに対し、２，４００ＩＵのＩＦＮ−α、皮下投与
高ＩＦＮ−α投与群：１８ｇのマウスに対し、２００，０００ＩＵのＩＦＮ−α、皮下投与
インターフェロン−α注射液ＩＮＴＲＯＮ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）を使用した。１８００万国際単位（ＩＵ）／バイアル；３００万ＩＵ／０．５ｍＬ（ＮＤＣ００８５−１１６８−０１）、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（カタログ番号Ａ５８４３、Ｓｉｇｍａ，低エンドトキシン）を、ＩＦＮ溶液を希釈するための担体として使用した。週末を除き、投与溶液を毎日新しく調製した。各投与前に、１、２、３、４及び７目にｉｎ  ｖｉｖｏ画像を取得した。１日目の画像をベースライン画像として使用した。
【０１６０】
図８は、各群の代表的なマウス：マウス＃１−３（対照群）、マウス＃２−３（低ＩＦＮ−α投与群）及びマウス＃３−５（高ＩＦＮ−α投与群）の１、２、３、４及び７日目の画像を示す。１日当たりの平均生物発光を図９に示す。
【０１６１】
平均生物発光の有意な低下は、高用量及び低用量レベルの両方におけるインターフェロン−αの最初の投与の１日後（２日目）に検出された。担体と比べ、低用量群においては３．６倍のシグナルの低下が観察され、高用量群においては１４倍の低下が観察された。処理群は、３及び４日目にもシグナルを低下し続け、７日目にバックグラウンドのレベルに達し、これは、担体対照群より１０倍低い。担体群は、２７日目まで、５×１０５〜１×１０６のシグナルを維持した。
【０１６２】
ＩＦＮ−αの時間及び濃度依存的抗ウイルス効果はヒトの臨床転帰、及びＭｅｒｃｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００１  ７：９２７−９３３に報告されたキメラマウスの異種移植片モデルと一致していることがわかった。
【０１６３】
担体群の腫瘍体積の想定は、１７〜２７日目まで（及び６匹のマウスについては４３日目まで）実施された。１７日目の平均腫瘍体積は１００ｍｍ３であり、２７日目では５２０ｍｍ３であった。
【０１６４】
（実施例１０）インターフェロン−αによる皮下腫瘍モデルの処理
レプリコンを含む５−２  Ｈｕｈ７細胞を実施例１に記載の通り調製し、ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。移植の当日及び前日に、マウスに、３ＧＹのγ線を約３．２分間照射した。４２及び４３日目に、以下のようにして、２匹のマウスを担体で、２匹のマウスをＩＦＮ−α群で処理した。
対照群：担体（ＨＢＳＳ中、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを０．１ｍＬ）、１日当たり、皮下投与
ＩＦＮ群：１８ｇのマウスに対し、２００，０００ＩＵのＩＦＮ−α、皮下投与
インターフェロン−α注射液ＩＮＴＲＯＮ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）を使用した。１８００万国際単位（ＩＵ）／バイアル；３００万ＩＵ／０．５ｍＬ（ＮＤＣ００８５−１１６８−０１）、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（カタログ番号Ａ５８４３、Ｓｉｇｍａ，低エンドトキシン）を使用した。４２及び４３日目に、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像を取得し、生物発光を定量した。
【０１６５】
図１０は、処理及び未処理（担体）マウスについての生物発光を示す。バックグラウンドシグナルは１×１０５光子／秒である。生物発光は、ＩＦＮ−α処理マウスについて約７〜８倍減少し、未処理マウスについては約１．５倍未満の減少である。平均生物発光シグナルは、投与前には２つの群についてほぼ等しかった（処理群の場合１．０７×１０６光子／秒、及び未処理群の場合１．１０×１０６光子／秒）が、生物発光は処理群について劇的に減少し、未処理群については僅かに増加した（処理群について１．３５×１０５光子／秒、未処理群について１．３７×１０６光子／秒）。
【０１６６】
（実施例１１）インターフェロン−αによる肝臓モデルの処理
レプリコンを含むＳ６．１−６細胞を実施例３に記載の通り調製した。細胞を集め、１×１０６細胞／０．０５ｍＬ／注射液になるように、ＨＢＳＳに再懸濁した。メスのＳＣＩＤマウスを剪毛し、３ＧＹのγ線を約３．２分間照射した。手術前に、マウスに約４時間放射線照射した。
【０１６７】
皮膚及び腹腔を通じて切開を実施し、次いで、徐々に肝葉を露出させた。０．０５ｍＬのＨＢＳＳ中の腫瘍細胞を、肝葉の２箇所に注入した（１×１０６細胞／０．０５ｍＬ／注射液）。マウスにおける外科的切開を閉じ、マウスを、一晩手術から回復させた。
【０１６８】
次いで、マウスを任意抽出し、インターフェロン−α又はプラセボを、１日目の開始及び７日目の終了時に１回皮下投与した。各群は９匹のマウスを含み、該処置は以下を含む。
第１群：担体（ＨＢＳＳ中、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを０．１ｍＬ）、１日１回、皮下投与
第２群：１８ｇのマウスに対し、１日当たり２００，０００ＩＵのＩＦＮ−α２ｂ、皮下投与
インターフェロン−α注射液ＩＮＴＲＯＮ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）を使用した。１８００万国際単位（ＩＵ）／バイアル；３００万ＩＵ／０．５ｍＬ（ＮＤＣ００８５−１１６８−０１）。投与溶液は、週末を除き、毎日新しく調製した。
【０１６９】
１（手術の１日前）、２、４及び７日目に、腹部の視野からのｉｎ  ｖｉｖｏ画像を取得した。化合物の投与開始前に取得した、１日目の画像を、ベースライン画像として使用した。マウスの腹腔内に、ルシフェラーゼの基質、ルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇ注射し、密閉された光チャンバー内にマウスを置き、冷却したＣＣＤカメラ（ＩＶＩＳシステム、Ｘｅｎｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州アラメダ］）を使用してシグナルを捕獲することにより、各マウス由来の生物発光シグナルを腹部の視野から測定した。興味のある領域がマウスの肝臓領域の周辺に形成され、シグナルを光子／秒で定量した。
【０１７０】
１日当たりの平均生物発光を図１１に示す。生物発光における有意な低下が、インターフェロンαの最初の投与後１日（２日目）に検出された。シグナルの対数減少が、担体に比較して処理群で見られた。４日目に、処理群の平均ルシフェラーゼシグナルは、バックグラウンドの近くであり、担体群よりも対数として約１．５倍低い。
【０１７１】
ＩＦＮ−αの時間依存性抗ウイルス効果は、ヒトの臨床転帰と一致している。
【０１７２】
（実施例１２）インターフェロン−αによる、皮下二重レポーターモデルの処理
ＩＦＮ−αによる処理後の生物発光の減少が蛍ルシフェラーゼを発現するＳ６．１−６細胞を死滅するためではないことを証明するため、ＣＭＶプロモーターに由来するウミホタルルシフェラーゼを発現する対照プラスミドをトランスフェクションによりレプリコン細胞に導入した。１日目に、同時にトランスフェクトした、レプリコン含有Ｓ６．１−６細胞を、前もって放射線処理したＳＣＩＤマウスに、皮下移植した。ルシフェリン基質を投与した後に、蛍ルシフェラーゼ生物発光について、全てのマウスをイメージングした。マウスを任意抽出し、処理、及び担体群に分けた。処理及び担体群のマウスは、相互に１０％以内の初期の平均的蛍ルシフェラーゼ生物発光を有していた。イメージング後、マウスをＩＦＮ又は担体で処理した。２及び３日目に、全てのルシフェリン生物発光が消失するのを確実にするため、いかなる基質も存在させないでマウスをイメージングした。次いで、セレンテラジン基質の投与後に、ウミホタルルシフェラーゼ生物発光についてマウスをイメージングした。４〜５時間後、全てのウミホタルルシフェラーゼ発光が消失するのを確実にするため、いかなる基質も存在させないでマウスをイメージングした。次いで、ルシフェリン基質の投与後に、ルシフェラーゼ生物発光についてマウスをイメージングした。移植した細胞を有しない、３匹の未感作のマウスをセレンテラジンを使用してイメージングし、バックグラウンド生物発光を決定した。平均バックグラウンドシグナルを、各マウスのウミホタル生物発光から引き、最終的なウミホタル生物発光を得た。
【０１７３】
結果を以下に示す。
【０１７４】
【化８】
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２日目に、ＩＦＮ−αで処理した群は、担体群に比べ、蛍ルシフェラーゼにおいて２５．２倍減少したが、ＩＦＮ−α処理及び対照群の間で観察されたウミホタルルシフェラーゼにおいては僅か１．７倍の減少であった。蛍のシグナルにおける有意な減少は、レプリコンによるＩＦＮ−αの特異的な効果による。データは、生物発光における減少の原因である担体群と比較し、ＩＦＮ−α処理群において有意な細胞殺滅又は毒性はないことを示す。
【０１７５】
（実施例１３）試験化合物、例えばＩＦＮ−αによる、又は試験化合物なしでの皮下モデルの処理：血液中のウイルス又はウイルス様粒子の測定
レポーター遺伝子を有するゲノムレプリコンの一例は、Ｗａｋｉｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＴＵＲＥ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２００５）  Ｖｏｌ．  １１：  ｐｇｓ  ７９１−７９６に開示されている。該ゲノムレプリコンは、５’〜３’の順序で以下の要素、即ち、５’ＨＣＶ  ＵＴＲ（ＨＣＶ  ＩＲＥＳを含む）；ルシフェラーゼ遺伝子；ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ；ＨＣＶゲノムの残り（３’ＵＴＲを介したコアタンパク質）を含む。
【０１７６】
ゲノムレプリコン由来のＲＮＡを合成し、Ｓ６．１細胞をトランスフェクトするために使用する。
【０１７７】
メスのＳＣＩＤマウスに、３ＧＹのγ線を約３．２分間照射した。０．２ｍＬの担体中の、５×１０６細胞を４２匹のマウスの右脇腹に皮下移植し、３群（対照群、低ＩＦＮ−α投与群、高ＩＦＮ−α投与群）に分けた。各群には１４匹のマウスが含まれる。濃度は、各群に対して以下のように与えられる。
対照群：担体（ＨＢＳＳ中、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを０．１ｍＬ）、１日当たり、皮下投与
低ＩＦＮ−α投与群：１８ｇのマウスに対し、２，４００ＩＵのＩＦＮ−α、皮下投与
高ＩＦＮ−α投与群：１８ｇのマウスに対し、２００，０００ＩＵのＩＦＮ−α、皮下投与
インターフェロン−α注射液ＩＮＴＲＯＮ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）を使用した。１８００万国際単位（ＩＵ）／バイアル；３００万ＩＵ／０．５ｍＬ（ＮＤＣ００８５−１１６８−０１）、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（カタログ番号Ａ５８４３、Ｓｉｇｍａ、低エンドトキシン）を、ＩＦＮ溶液を希釈するための担体として使用した。週末を除き、投与溶液を毎日新しく調製した。
【０１７８】
投与の直前、及びＩＦＮ−α投与の２４時間後に、動物から採血して血清を調製した。標準のルシフェラーゼ検定キットを使用して、血清を、直接ルシフェラーゼの基質とインキュベートした。或いは、ウイルス又はウイルス様粒子を遠心して沈殿させた。沈殿を溶解緩衝剤とインキュベートし、標準のルシフェラーゼ検定キットを使用してルシフェラーゼを検定した。キットには、溶解緩衝剤及びルシフェラーゼの基質が含まれる。相対光量（ＲＬＵ）を決定し、ＩＦＮ−αで処理した動物から得られるシグナルを、担体のみを与えた動物と比較する。これらの測定から、ウイルス又はウイルス様粒子の阻害の程度を決定する。実施例１１に開示されたように、レプリコンを含む細胞をマウスの肝臓に導入した後に、同様に、同じ実験を実施した。
【０１７９】
（実施例１４）インターフェロン−αによる肝臓モデルの処理
実施例１３に既述の通り、Ｓ６．１細胞をゲノムレプリコンでトランスフェクトした。細胞を集め、１×１０６細胞／０．０５ｍＬ／注射液になるように、ＨＢＳＳに再懸濁した。メスのＣ．Ｂ１７  ＳＣＩＤマウスを剪毛し、３ＧＹで約３．２分間γ線照射した。手術前に、約４時間、マウスを放射線照射した。
【０１８０】
皮膚及び腹腔を通して切開し、次いで１個の肝葉を徐々に露出させた。０．０５ｍＬのＨＢＳＳ中の腫瘍細胞を、肝葉の２箇所に注入した（１×１０６細胞／０．０５ｍＬ／注射液）。マウスにおける外科的切開を閉じ、マウスを、一晩手術から回復させた。
【０１８１】
次いで、マウスを任意抽出し、インターフェロン−α又はプラセボを、１日目の開始及び７日目の終了時に、１回、皮下投与した。各群は９匹のマウスを含み、該処置は以下を含む。
第１群：担体（ＨＢＳＳ中、１００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを０．１ｍＬ）、１日１回、皮下投与
第２群：１８ｇのマウスに対し、１日当たり２００，０００ＩＵのＩＦＮ−α２ｂ、皮下投与
インターフェロン−α注射液ＩＮＴＲＯＮ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）を使用した。１８００万国際単位（ＩＵ）／バイアル；３００万ＩＵ／０．５ｍＬ（ＮＤＣ００８５−１１６８−０１）。
【０１８２】
投与溶液は、週末を除き、毎日新しく調製した。
【０１８３】
投与の直前、及びＩＦＮ−α投与の２４時間後に、動物から採血して血清を調製した。標準のルシフェラーゼ検定キットを使用して、血清を、直接ルシフェラーゼの基質とインキュベートした。或いは、ウイルス又はウイルス様粒子を遠心して沈殿させた。沈殿を溶解緩衝剤とインキュベートし、標準のルシフェラーゼ検定キットを使用してルシフェラーゼを検定した。キットには、溶解緩衝剤及びルシフェラーゼの基質が含まれる。相対光量（ＲＬＵ）を決定し、ＩＦＮ−αで処理した動物から得られるシグナルを、担体のみを与えた動物と比較する。これらの測定から、ウイルス又はウイルス様粒子の阻害の程度を決定する。
【０１８４】
（実施例１５）長期間安定した、適応されるレプリコンを含む細胞クローンのｉｎ  ｖｉｖｏでの選択
Ｔ７−１１細胞。０．２ｍＬのハンクス液（ＨＢＳＳ）中の５００万個のＳ６．１−６細胞を、細胞移植前に放射線照射（３Ｇｙ）されたＣ．Ｂ１７  ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。強い生物発光を発する腫瘍を２７日目に切除し、腫瘍の生物発光する部分を０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。Ｇ４１８耐性コロニーのルシフェラーゼ発現を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳＴＭイメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国カリフォルニア州アラメダ］）を使用して評価し、高い発現を有する１個のコロニーを広げ、細胞株Ｔ７−１１を生成した。選択されたコロニーを広げ、γ線照射したＳＣＩＤマウスに皮下移植し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのレポーターの寿命を評価した。選択されたコロニーの殆どは、Ｓ６．１−６細胞において見られるのと同等の時間によるｉｎ  ｖｉｖｏのシグナルの減少を示した。対照的に、１個のクローン、Ｔ７−１１におけるシグナルは、図１２ａ及び図１５に示す通り、移植の２週間後に、バックグラウンドを２倍対数（ｔｗｏ  ｌｏｇｓ）を超えて上昇し続けた。この２倍対数のダイナミックレンジは、２週間以上の間、Ｔ７−１１細胞において安定であった。
【０１８５】
ＨＣＶ感染の最初の標的器官である肝臓内のＴ７−１１細胞の安定性を評価するため、細胞を１個の肝葉に直接注入し、時間による生物発光シグナルを解析した。Ｔ７−１１細胞は、１週間以上の間、バックグラウンドが１〜２倍対数を超える生物発光シグナルを示し、それ故、皮下投与及び肝臓モデルの両方についてこの細胞株の有用性が証明された。このデータは、対照動物として図１３ｄに示される。
【０１８６】
細胞移植。メスのＳＣＩＤマウスを細胞移植の部位で剪毛し、細胞移植の１日前又は同日に３Ｇｙでγ線照射した。皮下移植のため、０．２ｍＬのＨＢＳＳ中の５００万個の細胞を右脇腹に移植した。肝臓内直接投与のため、マウスを麻酔し、１個の肝葉を、小さい切開を通して露出させた。２０〜５０μＬのＨＢＳＳ中の１〜２百万個の細胞を、肝実質に直接注入した。
【０１８７】
Ｌ１０−１６細胞。Ｔ７−１１細胞株を生成するために使用された方法を、Ｓ６．１細胞に代えて、出発細胞としてＴ−１１細胞を使用して繰り返した。２００万個のＴ７−１１細胞を、直接肝臓注入を使用してγ線照射したメスのＣ．Ｂ１７  ＳＣＩＤマウスの肝臓に移植した。３７日後、４．６×１０６光子／秒の生物発光を示す腫瘍を有する１匹のマウスを安楽死させ、肝臓及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養から腫瘍を集めた。０．５ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む培地中で、Ｇ４１８を発現するコロニーが選択され、これらのコロニーから、ルシフェラーゼ陽性のクローンを集めた。これらのＧ４１８及びルシフェラーゼ陽性クローンは広がり、細胞株Ｌ１０−１６を生成した。
【０１８８】
Ｌ１０−１６細胞を、Ｔ１７−１１について実施したように、γ線照射したＳＣＩＤマウスに移植した。マウスは、１ヶ月以上の間、安定したルシフェラーゼ発現を示した。結果を図１５に示す。
【０１８９】
ルシフェラーゼシグナルは、Ｔ７−１１腫瘍におけるＲＮＡ複製に反映する
ルシフェラーゼシグナルがＨＣＶ  ＲＮＡ複製に関連しない可能性を除外するため、腫瘍細胞内のウイルスＲＮＡ及びタンパク質レベルを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されるウイルスＲＮＡにおいて、３２Ｐで標識された負鎖を使用して調べるノーザンブロット、及びＮＳ５Ｂに対する抗体を使用する免疫蛍光検定（ＩＦＡ）により調べた。結果は、移植の２６日後に集めたＴ７−１１腫瘍組織においてプラス鎖のＨＣＶ  ＲＮＡが検出されることを示した（図１２ｂ、レーン４）。結果と一致し、２０％以上の細胞がウイルスタンパク質ＮＳ５Ｂを発現している。図１３ｃに関して、ＮＳ５Ｂ蛍光抗体を使用した免疫検定データは細胞内でのＮＳ５Ｂの発現を示した。データは、Ｔ７−１１細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける構造的ＨＣＶ  ＲＮＡ複製及びタンパク質の発現を補助することを示した。
【０１９０】
（実施例１６）Ｔ７−１１細胞を皮下移植したＳＣＩＤマウスにおけるＩＦＮ−α２Ｂの有効性
生物発光シグナルが安定しており、前記バックグラウンドの約２倍対数を超える場合に、Ｔ７−１１を移植したマウスを使用した有効性の実験を開始した。移植の１９日後に、７５００ＩＵ／マウス／日又は１５０００ＩＵ／マウス／日のＩＦＮ−α２Ｂでマウスの処理を開始した。対照動物は、ヒトアルブミンの投与を受けた。図１３ａに示す通り、低用量群における生物発光シグナル（７，５００ＩＵ／マウス／日）は、対照群に比べ、処理の３及び７日後に、それぞれ５及び１０倍減少した（Ｐ＜０．００１）。高用量群について、３及び７日後には、それぞれ１０及び２５倍のシグナルの減少を示した（Ｐ＜０．０１）。データは、ＩＦＮ−α２Ｂ処理がＨＣＶ  ＲＮＡレベルにおける濃度依存的な有効性を有することを明らかに証明した。更に、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖及び機能を活性化することが知られているインターロイキン２（ＩＬ−２）は、ＩＦＮ−α、抗腫瘍において役割を演じる化合物及び免疫調節応答の非特異的活性を評価するための対照として使用される。腎細胞癌（ＲＣＣ）モデルにおける抗腫瘍活性に使用される濃度をベースとし、２ｍｇ／ｋｇのインターロイキン２（ＩＬ−２）でマウスを処理した（Ｆａｎ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００５）  １７５：７００３−８）。結果は、ＩＬ−２が処理の５日間にわたり、生物発光シグナルに影響を及ぼさないことを示した。
【０１９１】
生物発光シグナルにおける減少が、化合物の露出に直接関連することを証明するため、処理の３日後に投薬を停止した。ＩＦＮ−α２Ｂ（１５，０００ＩＵ／マウス）処理を中止した４日後に、処理群においてウイルスＲＮＡにおける回復が明らかに観察され、平均生物発光シグナルが、未処理群と同じレベルまで回復した（Ｐ＞０．０５）（図１３ｂ）。対照的に、毎日の投与を継続している処理群においては、平均生物発光シグナルはバックグラウンドまで減少し続けた（Ｐ＜０．０１）（図１３ｂ）。実験の終わりに、腫瘍組織を生化学及び免疫組織化学の分析のために切除し、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルが生物発光レベルと一致していることを証明した。対照及びＩＦＡによる回復群においては、平均２０％以上の細胞が検出可能なウイルスＮＳ５Ｂタンパク質を示したが、ＩＦＮ−α２Ｂ処理群においては、１％未満の細胞がウイルス複製について陽性に染色された（図１３ｃ）。ＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＨＣＶ  ＲＮＡのレベルはＩＦＡのデータと一致し、未処理マウス由来の腫瘍組織中のＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡレベルは処理マウスより１０倍高かった（データなし）。これらの結果はｉｎ  ｖｉｖｏの画像データと一致し、生物発光レベルが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＣＶ  ＲＮＡ複製におけるＩＦＮ−α２Ｂの効果を正確に反映することを示す。
【０１９２】
Ｈｕｈ７細胞のＩＦＮ−αによるｉｎ  ｖｉｖｏにおける処理がアポトーシスを誘導することは報告されていないが、本発明者等は、ＩＦＮ−αが、ｉｎ  ｖｉｖｏでウイルスを含む腫瘍細胞の除去を誘導するアポトーシスプログラムを誘導する可能性を除外することはできない。細胞死が、処理したマウスにおける生物発光シグナルの減少に寄与するかどうかを調べるため、腫瘍組織内のアポトーシス細胞の断片を、活性化キャスパーゼ３及び開裂したポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ｃＰＡＲＰ）の免疫組織学的解析により測定した。結果は、活性化キャスパーゼ３（データは示さず）及びｃＰＡＲＰの染色が、全ての３つの群において、１〜５％の腫瘍細胞において同様に存在することを示した。Ｋｉ６７に対する抗体、細胞増殖のマーカー（データは示さず）を使用した染色は、ＩＦＮ−α２Ｂ処理群及び対照群のあいだで違いがないことを示し、これは、処理後のこのモデルにおける生物発光シグナルの減少はウイルス複製の直接阻害に起因することを示す。
【０１９３】
ひとまとめにして考えると、マウスのモデルにおけるＩＦＮ−α２Ｂの有効性の実験は、生物発光シグナル処理群において濃度依存的な様式で減少し、これは腫瘍組織におけるウイルスＲＮＡ及びタンパク質レベルの減少と関連することを示した。生物発光シグナルの減少は、特に複製におけるＩＦＮ−αの阻害効果のためであり、細胞死のためではない。
【０１９４】
（実施例１７）Ｔ７−１１細胞を有する肝臓モデルにおけるＩＦＮ−α２Ｂの有効性
肝臓におけるＩＦＮ−α２Ｂの有効性を評価するため、Ｔ７−１１細胞を、γ線照射したＳＣＩＤマウスの１個の肝葉に直接注入した。シグナルが安定である場合、１５，０００ＩＵ／マウス／日でのＩＦＮ−α処理を接種２７日後に開始した。生物発光シグナルは、ＩＦＮ−α２Ｂ処理群において、担体群に比べ、２日目に１０倍以上減少した（図１３ｄ）（Ｐ＜０．０００１）。この結果は、皮下モデルで観察された結果と非常に類似していた（図１３ａ参照）。処理後にシグナルがベースラインに到達するので、処理の除去５日後に、ほんの僅かな回復が観察された（図１３ｄ）。ルシフェラーゼが肝臓と関連することを確認するため、本発明の終わりに健康診断によって腫瘍の位置を、決定した。
【０１９５】
（実施例１８）マウスモデルにおける、ＨＣＶへの小分子、ウイルス特異的プロテアーゼ阻害剤（ＢＩＬＮ  ２０６１）の有効性
臨床的試験の有効性を評価するためのモデルの使用の可能性、ＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ（ＢＩＬＮ  ２０６１）の阻害剤を試験した。ＢＩＬＮ  ２０６１が２４時間以上の間の持続する血漿への露出を示すことを示す薬物動態学（ＰＫ）データをベースとする皮下経路によりＢＩＬＮ  ２０６１が送達された。Ｔ７−１１細胞の皮下移植の２１後に、ＢＩＬＮ  ２０６１を１日１回、３０ｍｇ／ｋｇの投与を開始した。図１４ａに示す結果は、生物発光シグナルは、対照群に比べ、３日以内に、約２倍の対数で減少することを示す（Ｐ＝０．０００６）。予想されるように、処理終了の数日後に、シグナルは未処理群と同じレベルに回復した（Ｐ＝０．５３３８）。データは、化合物がｉｎ  ｖｉｖｏでＨＣＶ  ＲＮＡを効果的に減少するが、レプリコンを含む細胞において逆効果はないことを証明した。
【０１９６】
（実施例１９）マウスモデルにおけるプロテアーゼ阻害剤（ＢＩＬＮ  ２０６１）及びＩＦＮ−αの併用療法の有効性
ＢＩＬＮ  ２０６１及びＩＦＮ−α２Ｂの組み合わせによるＨＣＶ複製におけるプロテアーゼ阻害剤ＢＩＬＮ  ２０６１の効果を調べた。以前に開示されている（Ｌａｍａｒｒｅ，Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎ  ＮＳ３  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２６，  １８６−９  （２００３））ように、ＢＩＬＮ  ２０６１はＮＳ３プロテアーゼである。処理は、γ線処理されたＳＣＩＤマウスにおいて、Ｔ７−１１細胞の皮下移植１８日後に開始された。３群のマウスに、１日に３０ｍｇ／ｋｇのＢＩＬＮ  ２０６１単独、１５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−α単独、又は２つの薬剤の組み合わせを、それぞれ投与した。処理の２日後、平均的発光シグナルは、ＢＩＬＮ  ２０６１又はＩＦＮ−α２Ｂで処理したマウスにおいて、対照群と比較して１６倍又は７倍減少した（Ｐ＜０．０１）（図１４ｂ）。対照的に、ＢＩＬＮ  ２０６１／ＩＦＮ−α２Ｂの併用療法で処理したマウスにおいては、生物発光において約１００倍の減少が観察された（Ｐ＜０．００１）（図１４ｂ）。明らかに、併用療法は、何れかの試薬単独での処理よりも更に効果的にＨＣＶ  ＲＮＡ複製を阻害し、ＨＣＶ処置のための新しい処置戦略を評価するためのモデルの有用性を証明した。
【０１９７】
（実施例２０）ヒトＩＦＮ−α２Ｂに対する感受性が低下した細胞の選択
予備的なデータは、Ｔ７−１１細胞におけるＲＮＡ複製が、親Ｓ６．１−６細胞におけるよりも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒトＩＦＮ−α２Ｂに対して５〜８倍耐性であることを示し、Ｔ７−１１細胞における抗ウイルス応答が減衰するように見え、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるレプリコンＲＮＡの観測された安定性の向上を説明する状態を示唆する。本発明者等は又、このＩＦＮ−αに非感受性な表現型が細胞レベルで獲得した適応突然変異と関連し、ウイルスＲＮＡレベルでないことを見出した。
【０１９８】
Ｔ７−１１細胞又はＬ１０−１６細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−αのＥＣ５０によって決定されるＩＦＮの非感受性表現型が維持する。これらの細胞はレプリコンが回復し、次いで高用量のＩＦＮ−α中で連続して培養される。これらの細胞を密集するまで増殖させ、培地に２００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−αを補充する。細胞を、この条件下に２週間維持する。２週間後、細胞を分け、Ｇ４１８を含むか又は含まない完全培地で増殖させる。Ｇ４１８を含む培地内で増殖しないことは、レプリコンが細胞内にもはや存在しないことを示す。得られた細胞株を、「Ｔ７−１１Ｃ」及び「Ｌ１０−６Ｃ」（回復した）と呼ぶ。同一のレプリコンＲＮＡ（ｒｅｐ１１４／ＥＴ）のＳ６．１、回復したＴ７−１１細胞（図１７において「Ｔ７−１１Ｃ」）及び回復したＬ１０−１６細胞（図１７において「Ｌ１０−１６Ｃ」）中への一時的なトランスフェクションにより、これらの全てｉｎ
ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−α処理によりレプリコンＲＮＡを除去し、回復したＴ７−１１細胞のみが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−αのＥＣ５０によって決定されるようなＩＦＮの非感受性表現型を維持する。
【０１９９】
前述した方法は、インターフェロンαに加えて、他の免疫調節化合物に対して感受性の低下した腫瘍細胞株を単離するために使用することができる。
【０２００】
（実施例２１）Ｔ７−１１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製におけるプロテアーゼ阻害剤の有効性
ＢＩＬＮ  ２０６１の抗ウイルス作用についても調べた。腫瘍細胞の移植２５日目からＢＩＬＮ  ２０６１を１日１回、皮下への３０ｍｇ／ｋｇの投与を開始した。処理群において、未処理の対照群と比較し、３日以内に１０倍の減少が観察された（Ｐ＞０．０００１）（図１６）。ひとまとめにして考えると、肝臓モデルにおけるＩＦＮ−α及びＢＩＬＮ  ２０６１の作用は、皮下モデルにおいて観察されたものと非常に類似しており（図１３ｂ及び１３ｄを参照）、抗ＨＣＶ化合物の評価のための両方のモデルの有用性が証明された。
【０２０１】
特定の実施例に加えて、以下の一般的方法が使用される。
【０２０２】
方法：
細胞培養
ヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ−７（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４２：３８５８−６３）を、高用量のグルコース、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、及び必須でないアミノ酸を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＥＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールズバッド］）中で、５％ＣＯ２中で３７℃に維持した。レプリコン含有細胞クローンのために、Ｇ４１８（ゲネチシン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールズバッド］）を最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように加えた。
【０２０３】
プラスミドの構築
ｐＦＫＩ３４１ＰＩＬｕｃＮＳ３−３’／ＥＴ由来の１．６ｋｂのＸｂａｌ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＦＫＩ３８９ＬｕｃＵｂｉＮｅｏＮＳ３−３’／５．１由来の２．６ｋｂのＸｂａｌ−ＮｏｔＩフラグメントと置換することにより、レプリコンｒｅｐ１１４／ＥＴを構築した。
【０２０４】
ＲＮＡの調製及びエレクトロポレーション
ＳｃａＩを使用してプラスミドを直線化し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ［米国テキサス州オースティン］）を使用してＲＮＡを合成した。ＲＮＡを抽出し、製造業者の説明書に従い、ＴＲＩｚｏｌを使用して精製した。ＲＮＡのトランスフェクションは、既述の通り実施した。
【０２０５】
Ｓ６．１、Ｓ６．１−６及びＴ７−１１細胞株のサブクローニング
Ｓ６．１細胞：５００個のＨｕｈ  ５−２細胞を１０匹のメスＳＣＩＤ／ｂｇマウスの右脇腹に皮下移植した。３個の最も大きい腫瘍を細胞の移植３７日後に集め、２枚の滅菌したスライドグラスのつや消しした先端を使用して粥状にすりつぶした。粥状の細胞の５０〜１００μＬを、１０匹の麻酔したＳＣＩＤ−ｂｉｇｅマウスに、それぞれ外套針を使用して皮下に挿入した。このｉｎ  ｖｉｖｏ継代接種手順を、それぞれ２２及び２８日目に腫瘍由来の粥状細胞を使用して２回以上繰り返した。最終の移植の２４日後に、最も大きい３つの腫瘍を集め、腫瘍細胞を広げ、細胞株Ｓ６．１を生成した。
【０２０６】
Ｓ６．１−６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した、５μｇのｒｅｐ１１４／ＥＴを、Ｓ６．１細胞内にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む培地中で安定した細胞クローンを選択した。Ｇ４１８耐性コロニーのルシフェラーゼ発現を評価し、最も高い発現を有するコロニーを広げ、細胞株Ｓ６．１−６を生成した。
【０２０７】
Ｔ７−１１細胞：０．２ｍＬのハンクス液（ＨＢＳＳ）中の５００万個のＤ６．１−６細胞を、細胞移植前に放射線照射（３Ｇｙ）されたメスのＣ．Ｂ１７  ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。強い生物発光を照射する腫瘍を２７日後に切除し、腫瘍の生物発光部分を、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。Ｘｅｎｏｇｅｎ
ＩＶＩＳＴＭイメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国カリフォルニア州アラメダ］）を使用して、Ｇ４１８耐性コロニーのルシフェラーゼ発現を評価し、高い発現を有する１個のコロニーを広げ、細胞株Ｔ７−１１を生成した。
【０２０８】
ノーザンハイブリダイゼーションによるＨＣＶ  ＲＮＡの解析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールズバッド］）を使用して、腫瘍組織試料から全ＲＮＡを抽出した。２．２Ｍのホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルにより、１０μｇの全ＲＮＡを分画し、ＮＳ５Ａの３’末端及びＮＳ５Ｂの５’末端に相補的な、３２Ｐ−標識されたネガティブセンスリボプローブ（Ｐｒｏｍｅｇａ［米国ウィスコンシン州マディソン］）とハイブリダイズするナイロン膜（Ａｍｂｉｏｎ［米国テキサス州オースティン］）に転写した。
【０２０９】
免疫組織化学的解析
ホルマリン固定、又は４％パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋した腫瘍の何れかから、４μｍ厚みの切片を調製した。開裂したＰＡＲＰ及び活性化キャスパーゼ３の検出のため、ポリクローナウウサギ抗−開裂ＰＡＲＰ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ［米国カリフォルニア州カマリロ］）及びポリクローナルウサギ抗−開裂したキャスパーゼ３抗体（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）を、ビオチニル化抗−ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ［米国ペンシルバニア州ウェストグローブ］）と一緒に使用した。Ｋｉ−６７について、マウスモノクローナル抗−ヒトＫｉ−６７抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ［米国アリゾナ州トゥーソン］）及びビオチニル化抗−マウスＩｇＧ１二次抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．［米国ニュージャージー州フランダース］）を使用した。ウイルスタンパク質ＮＳ５Ｂの発現の検出のために、ポリクローナルウサギ抗−ＮＳ５Ｂ抗体（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国カリフォルニア州エメリービル］）、及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合ヤギ抗−ウサギ免疫グログリン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールズバッド］）を使用した。
【０２１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
メスのＣ．Ｂ１７  ＳＣＩＤ（ＳＣＩＤ）、ＳＣＩＤ／ｂｇ、Ｎｕ／Ｎｕ及びＢａｌｂ／ｃマウス（５〜１３週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ米国マサチューセッツ州ウィルミントン）から得た。全ての実験は、実験動物の福祉を監督している動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指示の下、ＡＡＬＡＳに保証された施設中で実施された。
【０２１１】
細胞の移植。メスのＳＣＩＤマウスを、細胞移植をする部位で剪毛し、細胞移植の１日前又は当日の何れかに３Ｇｙのγ線を照射した。皮下移植については、０．２ｍＬのＨＢＳＳ中の５００万個の細胞を右脇腹に移植した。肝臓内の直接移植については、マウスを麻酔し、小さい切開から１個の肝葉を露出させた。２０〜５０μＬのＨＢＳＳ中の１〜２００万個の脂肪を肝実質に直接注入した。
【０２１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏの全身画像撮影。麻酔したマウスに、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国カリフォルニア州アラメダ］）を腹腔内注射した。１０〜２０分後、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳＴＭシステム中のＣＣＤカメラを使用してマウスをイメージングした。生物発光シグナル強度を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国カリフォルニア州アラメダ］）を使用して定量した。
【０２１３】
薬剤処理。ＩＦＮ−α２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）  Ａ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｏｕｇｈ［米国ニュージャージー州］）、ＢＩＬＮ  ２０６１及びｒＩＬ−２（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ／Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国カリフォルニア州エメリービル］）を、上部の肩甲骨の領域に皮下投与した。
【０２１４】
統計解析。マウスの対照及び処理群の生物発光シグナルの相違は、両側マンホイットニー検定により比較した。マウスの対照、処理及び回復群の間のシグナルの相違は、ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定により比較した。ＡＰ−値＜０．０５が有意であると考えられた。
【０２１５】
以上において、理解を明確にするために、前記発明を多少詳細に説明してきたが、特定の変更及び改変が本発明の適用範囲内で実施されることは明らかになるであろう。本発明の方法及び組成物の両方を実施する多くの代替方法があることに留意する必要がある。従って、本発明の実施形態は、本発明の実施形態は例示するものであり、限定するものではなく、本発明は本明細書に開示された詳細に限定されることはない。
【０２１６】
引用された全ての文献は、全体が参考として及び全ての目的のために本明細書で援用される。
【０２１７】
【化９】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【外国語明細書】
2014027951000001.pdf