(57)【要約】【課題】  発酵工程における中和の手間が無く、目的とする有機酸を効率的に単離することができる、有機酸の製造方法を提供する。【解決手段】有機酸の製造方法であって、  １．発酵により有機酸を生産しｐＨが１〜５である有機酸含有粗液を得る工程、  ２．工程１で得られた有機酸含有粗液から有機酸をイオン交換クロマトグラフィー法により単離する工程、を含み、該イオン交換クロマトグラフィー法におけるイオン交換樹脂が両性イオン交換樹脂であり、且つ、溶離液が水である、製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸の製造方法であって、
１．発酵により有機酸を生産しｐＨが１〜５である有機酸含有粗液を得る工程、
２．工程１で得られた有機酸含有粗液から有機酸をイオン交換クロマトグラフィー法により単離する工程、
を含み、該イオン交換クロマトグラフィー法におけるイオン交換樹脂が両性イオン交換樹脂であり、且つ、溶離液が水である、製造方法。
【請求項２】
該有機酸が乳酸、コハク酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、リンゴ酸、又はフマル酸である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該有機酸が乳酸であり、乳酸を生産する微生物が、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体である、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
該両性イオン交換樹脂が、下記式（１）で表されるイオン交換基を備える、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
［化１］
−（ＣＨ２）ｋ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯ−      （１）
（ここで、Ｒ１及びＲ２は、夫々、独立に炭素数１〜３のアルキル基であり、ｋ及びｍは、夫々、独立に１〜４の整数である。）
【請求項５】
イオン交換クロマトグラフィーが、擬似移動層方式で行なわれる、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸の製造方法に関し、詳細には発酵により生産された有機酸を、発酵液から効率的に単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機酸、例えば乳酸、コハク酸等は、医薬、農薬、化粧品等の種々の用途において使用されている。有機酸の製造方法としては、発酵法が古くから用いられている。一般に、有機酸生産菌は生産される有機酸による発酵阻害があるので、発酵液にアルカリを加えてｐＨを中性付近に調整しながら発酵を行うことが多い。しかし、このような中和操作は煩雑であるし、有機酸塩から有機酸に戻す工程も必要となるため、製造コストが高い。
【０００３】
そこで、酸性条件下で発酵を行うことができる耐酸性を付与された菌、例えば耐酸性微生物を宿主とした形質転換体、を用いて発酵を行うことが提案されている（特許文献１）。この場合、生産される有機酸は、中和塩ではなく酸の形態である。
【０００４】
このような有機酸を含む発酵液から有機酸を単離する方法として、両性イオン交換樹脂を用いる方法が知られている（特許文献２）。同方法では、フタルアミド基を有するイオン交換樹脂を硫酸型とし、０．２Ｗ％の硫酸で溶離する。この方法によれば、例えばクエン酸を発酵液中のグルコースからきれいに分離することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１１／０２１６２９号
【特許文献２】特開２００９−１０１３５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記両性イオン交換樹脂は、架橋ポリマービーズをフタルイミド誘導体でアミドメチル化した後、けん化して得られる特殊な樹脂であり、工業用には不向きである。また、溶出液から硫酸を除く工程が必要である。さらに、斯かる強酸性下で溶離を行うと、有機酸が反応を起こす場合があり、なかには乳酸等の重合反応を起こしてしまうものもある。
【０００７】
そこで、本発明は、より一般的な樹脂を用いることができ、より化学的に安定な条件下で、発酵液から有機酸を単離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち本発明は、下記［１］〜［５］に記載する有機酸の製造方法である：
［１］有機酸の製造方法であって、
１．発酵により有機酸を生産しｐＨが１〜５である有機酸含有粗液を得る工程、
２．工程１で得られた有機酸含有粗液から有機酸をイオン交換クロマトグラフィー法により単離する工程、
を含み、該イオン交換クロマトグラフィー法におけるイオン交換樹脂が両性イオン交換樹脂であり、且つ、溶離液が水である、製造方法。
【０００９】
［２］該有機酸が乳酸、コハク酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、リンゴ酸、又はフマル酸である、上記［１］記載の製造方法。
【００１０】
［３］該有機酸が乳酸であり、乳酸を生産する微生物が、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体である、上記［１］又は［２］記載の製造方法。
【００１１】
［４］該両性イオン交換樹脂が、下記式（１）で表されるイオン交換基を備える、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［化１］
−（ＣＨ２）ｋ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯ−      （１）
（ここで、Ｒ１及びＲ２は、夫々、独立に炭素数１〜３のアルキル基であり、ｋ及びｍは、夫々、独立に１〜４の整数である。）
［５］イオン交換クロマトグラフィーが、擬似移動層方式で行なわれる、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法によれば、発酵工程においてｐＨ調整をする必要が無い。また、汎用樹脂で行うことができるので、工業用途に適する。さらに、水で溶離できるので、追加の除去工程も不要であり、有機酸も化学的に安定である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の方法による、乳酸、グルコース、及びエタノールの溶出曲線の一例である。
【図２】図２は、図１と同じ方法における、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａイオンの溶出曲線の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において「発酵」とは、微生物に目的化合物（有機酸）を生産させることを意味する。
【００１５】
本発明において、有機酸はカルボキシル基を有する有機化合物であればよく、例えば乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、グルタル酸、および、アジピン酸等が挙げられる。好ましくは乳酸、コハク酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、リンゴ酸、フマル酸、又はマレイン酸であり、なかでも、広い用途を有する点で、乳酸が好ましい。これらの有機酸は、Ｄ体、Ｌ体、ＤＬ体のいずれであってもよく、また、オリゴマー、即ち、重合度２〜１５程度のポリマー、を形成していても良い。
【００１６】
工程１の発酵は、微生物により有機酸が生産されれば、該有機酸のみが生産されるホモ型発酵であっても、該有機酸以外にエタノール等が生産されるヘテロ型であってもよい。
【００１７】
微生物は、野生型及び遺伝子組み換え型のいずれのものであってもよい。野生型微生物としては、例えば、ストレプトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、及びラクトバチルス属等の乳酸発酵菌；アネロビオスピリリウム属、及びコリネバクテリウム属等のコハク酸発酵菌が挙げられる。
【００１８】
遺伝子組換え型微生物としては、遺伝子組換え乳酸生産酵母が挙げられ、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ該宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体（特許文献２）、サッカロミセス属の酵母等の耐酸性微生物を宿主とし、該耐酸性微生物に乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体（特開２００１−２０４４６４号公報）、及び乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入され、かつピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子を欠失または失活させたサッカロミセス・セレビシエ（出芽酵母）（特開２００８−４８７２６号公報）等が挙げられる。これらのうち、ｐＨを中性付近に調整することを必要とせずに高い生産性で乳酸を生産できる点で、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ該宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体が好ましい。
【００１９】
発酵に用いる発酵液は、特に限定されず、目的とする有機酸の生産に適するＮａ、Ｋ等の基本的無機塩類、及び炭素源を含めばよい。また必要に応じて、窒素源、及びアミノ酸等の成分を含んでいてもよい。発酵液は、天然、合成または半合成発酵液のいずれであってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピドなどの発酵促進因子などを配合することができる。
【００２０】
好ましくは、糖としてグルコースを用いる。発酵初期の発酵液（１００質量％）中のグルコース濃度は１質量％以上が好ましく、１〜２５質量％がより好ましく、２〜１６質量％がさらに好ましい。発酵によりグルコース濃度が低下するため、必要によりグルコースを添加して発酵を継続することが好ましい。発酵終期のグルコース濃度は１質量％以下となってもよい。また、有機酸を単離しながら発酵液を循環させて連続的に発酵を行う場合には上記グルコース濃度を維持することが好ましい。グルコース濃度を２質量％以上とすることにより、有機酸の生産性がより向上する。また、発酵液中のグルコースを１６質量％以下とすることにより、有機酸の生産効率がより向上する。
【００２１】
また、生産性を高くするために、高密度発酵を行うことが好ましい。高密度発酵では、発酵液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１〜５０ｇ／Ｌとすることが好ましく、０．２〜４０ｇ／Ｌとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集や精製効率の低下などの問題が生じるおそれがある。なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ＝１は、酵母乾燥重量の０．２ｇ／Ｌ、湿重量の０．８ｇ／Ｌに相当する。
【００２２】
発酵には公知の酵母発酵方法を用いることができ、例えば循環発酵、攪拌発酵等により行うことができる。発酵温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、発酵時間は適宜決定することができる。発酵は、回分発酵であってもよく、連続発酵であってもよい。例えば、回分発酵で発酵を行った後、菌体を発酵液から分離して、有機酸を含む発酵液を取得することができる。また、連続発酵法では、例えば、発酵中の発酵槽から発酵液の一部を抜き出し、抜き出した発酵液から有機酸を分離するとともに、有機酸を分離した残りの発酵液にグルコースや新たな発酵液を加えて発酵槽に戻すことを繰り返して、連続的に発酵する方法が挙げられる。連続発酵を行うことにより、有機酸の生産性がより向上する。
【００２３】
生産された有機酸を含む有機酸含有粗液は、ｐＨが１〜５であり、好ましくは１．５〜４、特に好ましくは１．５〜３．５である。本発明の有機酸の製造方法では、発酵液への有機酸の蓄積によりｐＨが低くなっても、ｐＨ調整を行わずに有機酸を生産する。すなわち、発酵液のｐＨが低くなった後も、そのまま発酵を継続する連続発酵により有機酸を製造する。有機酸の生産性を高くするために、発酵液のｐＨが３．５以下になった後であっても、さらに発酵を継続することが好ましい。特に、上述のシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体は、耐酸性が優れているため、生産された有機酸を含む発酵液のｐＨを調整することなく発酵を継続することができる。
【００２４】
工程２では、工程１で得られる有機酸を含む有機酸含有粗液から、有機酸を、イオン交換クロマトグラフィー法により単離する。該有機酸含有粗液は、クロマトグラフィーに付する前に、遠心分離またはろ過等の処理に付し、菌体等の固形分を分離することが好ましい。また、必要に応じて、水を追加して希釈、或いは水を除去して濃縮してもよい。
【００２５】
該イオン交換クロマトグラフィー法は、固定相として両性イオン交換樹脂を用い、溶離液として水を用いる。両性イオン交換樹脂は、架橋共重合体、例えばスチレン／ジビニルベンゼン共重合体、を樹脂母体とし、この樹脂母体に結合されたアニオン交換基とカチオン交換基とを有する。樹脂母体は、ゲル型であってもマクロポーラス型であってもよい。アニオン交換基としては、トリメチルアンモニウム基、ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基が挙げられる。カチオン交換基としては、有機酸イオンよりも弱酸であるカルボキシル基、及び、上述のアニオン交換基と組み合わされたベタイン構造を形成している基が挙げられる。また両性イオン交換樹脂としては、強塩基性イオン交換体に、アクリル酸を含浸させて重合させた、スネークケイジ型と呼ばれる樹脂であってもよい。
【００２６】
該イオン交換樹脂の粒径は、平均粒径（D５０）で、５０μｍ〜２ｍｍが好ましく、０．２〜１．３ｍｍがより好ましい。粒径分布は、均一なイオン交換がしやすい点で、狭い方が好ましく、予め篩分けして粒度を揃えたイオン交換樹脂を用いてもよい。また、該イオン交換樹脂の交換容量は、０．１〜１０ｍｅｑ／ｇ樹脂が好ましく、０．５〜５ｍｅｑ／ｇ樹脂がより好ましい。    
両性イオン交換樹脂としては、下記イオン交換基が、アクリル系又はスチレン系の架橋共重合体の樹脂母体に結合された両性イオン交換樹脂が好ましい。
［化２］
−（ＣＨ２）ｋ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯ−      （１）
上式（１）において、Ｒ１及びＲ２は、夫々、独立に炭素数１〜３のアルキル基であり、ｋ及びｍは、夫々、独立に１〜４の整数である。左端のアルキレン基を介して、該イオン交換基が樹脂母体に結合されている。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、ｋ及ｍが１である。このような両性イオン交換樹脂としては、例えば、ダイヤイオンＡＭＰ０３（三菱化学社製）がある。
【００２７】
溶離液として用いる水は、脱イオン水、蒸留水、純水のいずれであってもよい。水の比抵抗は１〜１０ＭΩ・ｃｍが好ましい。また、溶離を行う温度は、５〜8０℃が好ましく、15〜35℃がより好ましい。
【００２８】
クロマトグラフィーは、回分固定層方式、移動層方式、擬似移動層方式のいずれであってもよい。回分固定層方式では、イオン交換樹脂を充填したカラムに、有機酸含有粗液を供給した後、溶離液を適切な速度で供給して、成分を分離する。移動層方式では、イオン交換樹脂を、有機酸含有粗液中の有機酸と、不純物成分、夫々、の移動速度の中間の速度で、溶離液の流れと逆の方向に移動させて行う。擬似移動層方式は、複数のカラムを円環状に接続したものを用い、有機酸粗液の供給、有機酸の取り出し口を所定の周期で、溶離液の流れ方向に一カラム分移動することにより行う。溶離液を追加することなく、連続的に単離を行うことができる点で、擬似移動層方式が好ましい。
【００２９】
溶離液の空塔速度（ＳＶ：Superficial Velocity）は、回分固定層方式の場合、０．１〜１０ｈｒ−１が好ましい。また、送液圧力は０．１〜２ＭＰａが好ましい。
【００３０】
有機酸含有粗液の負荷は、上記範囲のＳＶで、イオン交換樹脂の総容量に対して、有機酸量が０．１〜０．２倍量となる量を通液することにより行う。  
負荷後、溶離液である水を上記範囲のＳＶで通液すると、例えば図１に示すように、
流出液量（B.V.）、即ちイオン交換樹脂ベッドの体積に対する通液容積で、約０．４〜０．９で、有機酸含有粗液中の非電解質成分、例えばグルコース、及び中性塩、例えば塩化ナトリウムが溶出し、その後、有機酸が溶出し始める。リン酸イオン等の多価イオンは、イオン交換樹脂に吸着されて、ほとんど溶出されない。溶出液の画分を分取して、酵素センサー、電導度計、ＩＣＰ等の分析手段で溶出成分をモニタしながら、有機酸の溶出を検出し、回収することができる。
【００３１】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
＜乳酸含有粗液の調製＞
特許文献２（ＷＯ２０１１／０２１６２９）に記載された方法で、形質転換体（ＡＳＰ２７８２）を得た。該形質転換体をＤ１２液体培地（グルコース１２％）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２０時間発酵させたところ、乳酸濃度８５．７ｇ／Ｌの発酵液（ｐＨ２．３）が得られた。該発酵液を、遠心分離（１２０００  Ｇ、５  分間）に付し、上澄みを乳酸含有粗液として得た。
【００３３】
＜イオン交換クロマトグラフィー＞
直径１０ｍｍのクロマト用カラムに純水を入れ、予め純水に浸漬して膨潤させた両性イオン交換樹脂（ダイアニオンＡＭＰ０３、三菱化学社製）１０ｍｌを加えて、樹脂ベッドを作り、純水の液面を樹脂ベッドの上端に合わせた。該樹脂ベッドの上部に、乳酸含有粗液１ｍｌを添加した後、ＳＶを１ｈｒ−１に調整して純水を通液し、溶出液を１ｍｌずつ分取した。各画分を適宜純水で希釈して、乳酸、グルコース、エタノールを各酵素センサーで、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、ＣａをＩＣＰで、及びリン酸イオンをイオン交換クロマトグラフィーで、夫々、定量した。流出液量（B.V.）を横軸とし、濃度を縦軸としてプロットして得られた、乳酸、グルコース、エタノールの溶出曲線を図１に、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａイオンの溶出曲線を図２に、夫々、示す。ただしリン酸イオンは検出されなかったのでプロットを省略した。
【実施例２】
【００３４】
溶出液を２ｍｌずつ分取したことを除き、実施例１と同様にして、クロマトグラフィーを行ったところ、実施例１と同様の溶出曲線を、再現性良く得ることができた。
【００３５】
図１、２から分かるように、発酵液中の乳酸をその他の成分と明確に分離することができた。また、溶出液を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、いずれの実施例においても、オリゴマー状の乳酸は、検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の方法によれば、一般的なイオン交換樹脂を用いて、化学的に安定な条件下で、発酵液から有機酸を単離することができる。
【図１】
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【図２】
2014027887.tif 000004