(57)【要約】      （修正有）【課題】血清およびタンパク質を含まない条件下での組換えタンパク質の工業的産生において、可能な限り長い期間にわたって連続的産生を可能とするシステム及び安定な組換えクローンの提供。【解決手段】細胞培養から得られオリジナル組換え細胞クローンを血清含有培地において培養し、そして無血清無タンパク質培地にこの細胞を再び適用することによりタンパク質を含まない条件下で産生時期に多世代にわたって安定で、かつ組換えタンパク質を発現する、組換え細胞クローンを得る。得られた細胞はさらに、産生条件と同じ条件下で、無血清無タンパク質培地で少なくとも４０世代の間培養される方法。安定な組換え細胞クローンが哺乳動物細胞であり、哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＢＨＫ細胞であり、安定な組換え細胞が、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質をコードする配列を含む細胞培養物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な組換え細胞クローンを調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
オリジナル組換え細胞クローンを調製する工程、
該オリジナル組換え細胞クローンを、血清含有培地で培養する工程、
該細胞を、無血清無タンパク質培地に再適用する工程、
該細胞培養を、安定な産物産生細胞について試験する工程、および
安定な産物産生細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下でクローニングする工程、
を含有することによって特徴付けられる、方法。
【請求項２】
クローニング後に、前記安定な細胞クローンを単離した形態で得ることによって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組換え哺乳動物細胞が、前記オリジナルクローンとして調製されることによって特徴付けられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞が、組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ細胞であることによって特徴付けられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組換え細胞クローンが、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質をコードする配列を含むことによって特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、該方法は、前記組換えタンパク質が、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、プロテインＳ、プロテインＣあるいはこれらの因子の１つの活性な形態、またはｖＷＦから成る群から選択される血液因子であることによって特徴付けられる、方法。
【請求項７】
前記オリジナル細胞クローンとして、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄの因子を発現する、組換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記オリジナル細胞クローンとして、第ＶＩＩＩ因子を発現する、組換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記オリジナル細胞クローンとして、第ＶＩＩＩ因子およびｖＷＦを共発現する組換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリジナル細胞クローンとして、第ＩＸ因子を発現する組換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリジナル細胞クローンとして、第ＩＩ因子を発現する組換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって調製され得ることによって特徴付けられる、組換え細胞クローン。
【請求項１３】
細胞培養物であって、該細胞培養物は、以下の工程：
血清含有培地でオリジナル組換えクローンを増殖させる工程、
該細胞を、細胞培養物まで、血清およびタンパク質を含まない条件下で培養する工程、
該細胞培養を、血清およびタンパク質を含まない条件下で、産物産生細胞について試験する工程、
安定な細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下でクローニングする工程、および
安定な細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下で増殖させる工程、
によって得られ得ることによって特徴付けられる、細胞培養物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の安定な組換え細胞クローンを培養することによって得られ得ることによって特徴付けられる、細胞培養物。
【請求項１５】
血清およびタンパク質を含まない条件下で組換え産物を発現するように誘導され得ることによって特徴付けられる、請求項１３または１４に記載の細胞培養物。
【請求項１６】
前記安定な組換え細胞クローンが哺乳動物細胞であることによって特徴付けられる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養物。
【請求項１７】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＢＨＫ細胞であることによって特徴付けられる、請求項１６に記載の細胞培養物。
【請求項１８】
前記安定な組換え細胞が、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質をコードする配列を含むことによって特徴付けられる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の細胞培養物。
【請求項１９】
前記細胞が微細支持体上に固定されることによって特徴付けられる、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の細胞培養物。
【請求項２０】
血清およびタンパク質を含まない条件下で組換え産物を工業的に産生するための方法であって、該方法は、以下の工程：
請求項１２に記載の、単離された、安定な組換え細胞クローンを調製する工程、
該安定な細胞クローンを、無血清無タンパク質培地で、開始クローンから前記細胞培養物まで増殖させる工程、
前記安定な細胞を含む細胞培養物を、バイオリアクターで調製する工程、および
タンパク質を、該培養物上清から収集する工程、
を包含することによって特徴付けられる、方法。
【請求項２１】
前記無血清無タンパク質培地は、酵母抽出物または大豆抽出物を含む合成最小培地であることによって特徴付けられる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地は、シクロデキストリンまたはその誘導体を含むことによって特徴付けられる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記無血清無タンパク質培地は、プロテアーゼインヒビターを含むことによって特徴付けられる、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
安定な組換え細胞クローンを得るための方法であって、該方法は、以下の工程：
オリジナル組換えクローンを、血清含有培地で細胞培養まで増殖する工程、
該細胞を、産生条件と等しい血清およびタンパク質を含まない条件下で培養する工程、
該細胞培養物を、血清およびタンパク質を含まない条件下で、産物産生細胞について試験する工程、
組換え細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下でクローニングする工程、および
該安定な細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下で増殖させる工程、
包含することによって特徴付けられる、方法。
【請求項２５】
安定な組換え細胞クローンを得るための方法であって、該方法は、以下の工程： 
非組換え開始細胞を、血清およびタンパク質を含まない条件下で増殖させる工程、
安定な非組換え細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下でクローニングする工程、
該安定な細胞クローンを、組換え核酸によってトランスフェクトし、そして安定なトランスフェクト体の単離産生条件と等しい条件下で、無血清無タンパク質培地で、該トランスフェクト体を培養し、そして産物の安定性について該細胞を試験する工程、
を包含することによって特徴付けられる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無血清無タンパク質培地で、少なくとも４０世代の間安定である、安定な組換え細胞クローン、血清およびタンパク質を含まない培養条件下におけるこの安定な細胞クローンの増殖によって得られるバイオマス、およびバイオマスの手法による組換えタンパク質の調製のための方法に関する。さらに、本発明は、安定な組換え細胞クローンの調製のための方法に関する。さらに、本発明は、無血清無タンパク質合成最小培地における組換えタンパク質の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質、特に生物医学的製品（例えば、血液因子）の調製はますます重要となっている。組換え細胞の最適な増殖を可能にするために、通常、血清が培地に加えられる。血清の高い費用のために、および培養培地中の血清を介するウイルス病原体または分子病原体によって生じ得るコンタミネーションを防ぐために、多くの無血清培地が開発されてきたが、これらは、特に、ウシまたはヒト起源の添加物をなんら含んではならない。調製プロセスにおけるこのような培地の使用は、ウイルス病原体および分子病原体による調製産物のコンタミネーションの低い危険性を可能にするのみでなく、発現タンパク質のより簡単な精製をも可能にする。
【０００３】
組換え細胞は、ほとんどの場合、高細胞密度（「ワーキング細胞バンク（working cell bank）」の細胞密度とほぼ等しい）が達成されるまで、血清含有培地で培養され、次いで、産生段階の間、組換え細胞は、無血清培地に再び適用される。
【０００４】
Miyajiら（非特許文献１）は、インスリンおよびトランスフェリンを含む無血清培地において、血清非依存性細胞クローンを選択した。しかし、１６日後に、その生存可能な数および発現率は連続的に減少したことが示された。Miyajiら（非特許文献２）は、マーカー遺伝子との同時増殖によって、組換え細胞の発現率および生産性を改善することを試みた。
【０００５】
Yamauchiら（非特許文献３）は、ヒト血清アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンを含む無血清培地で、マイクロタイタープレート上に血清依存性細胞を単一層として３〜４週間培養することによって、血清非依存性組換えＣＨＯサブクローンを樹立した。約０．１％の細胞が、血清非依存性であった。サブクローンの一部はまた、無血清培地における懸濁培養で増殖したが、ここでは、細胞は凝集体およびクランプを形成した。細胞の倍加時間は、１．５日であった。しかし、得られた血清非依存性クローンの安定性について、および血清を含まない条件下でのこれらのクローンの長期培養について、何の示唆も提供されていない。
【０００６】
細胞遊離段階の間の細胞の代謝活性および増殖の維持を可能にする培地は、しばしば添加物質（例えば、増殖因子、インスリンまたはトランスフェリン、あるいは血清構成成分に代わる接着因子）を含んだ。
【０００７】
インスリンまたはトランスフェリンのようなポリペプチド因子の添加を省くために、そして無タンパク質培地条件を可能とするために、種々の技術が開発されてきた。例えば、タンパク質を含まない条件下でさえも細胞増殖を可能とする、特別に規定された、完全無タンパク質培地が開発されてきた。
【０００８】
特許文献１は、細胞が所望のタンパク質に加えて増殖因子を共発現する、タンパク質を含まない条件下における組換えタンパク質の調製について記載する。
【０００９】
特許文献２は、宿主細胞の生産性を向上するための非イオン性界面活性剤またはシクロデキストリンの添加による、ＣＨＯ細胞における第ＶＩＩＩ因子の調製のための無タンパク質培地の使用について記載する。これらの添加物の有効性を増すために、例えば、ブチレートおよびリチウムを添加することが、推奨されてきた。
【００１０】
特許文献３は、グルタミン含有タンパク質加水分解産物を含む培地での細胞の培養について記載し、その加水分解産物の遊離アミノ酸含量は、全タンパク質重量の１５％未満であり、そしてその加水分解産物のペプチドは、４４ｋｄ未満の分子量を有する。合成最小培地は、細胞培養のための培養培地における基本培地として使用され、その基本培地には、タンパク質加水分解産物以外に、ウシ胎仔血清、ゲンタマイシンおよびメルカプトエタノールを含む他の添加物もまた、加えられる。血液因子の組換え調製に対するこの血清含有培地の使用は、述べられていない。
【００１１】
特許文献４は、タンパク質を含まない条件下における接着細胞の増殖を可能にする特定の合成表面について記載する。
【００１２】
細胞増殖を刺激するために、ヒトインスリンを過剰発現するＣＨＯ細胞を、共有結合インスリンが結合する人工基板上で増殖させた（非特許文献４）。
【００１３】
Reiterら（非特許文献５）は、血清含有培地において高密度で培養させたｒ−ＣＨＯ細胞の支持体への固定、および、引き続いて起こる、増殖期間の間の無タンパク質培地中での固定化細胞の灌流について記載し、ここでは、タンパク質の細胞上清への連続的放出が観察された。しかし、細胞は、無タンパク質培地中で、１０世代未満の間、灌流された。
【００１４】
タンパク質を含まない条件下での工業的な「大規模な」細胞培養の首尾よい調製のために、今日まで、利用可能な方法は、連続継代細胞系（特にＶＥＲＯ細胞（特許文献５））について記載されてきた。この細胞は、ここでは、血清およびタンパク質を含まない条件下で、元のアンプルから１２００Ｌの工業的規模まで培養された。しかし、使用された細胞は、組換え細胞ではなく、溶解プロセスでウイルス抗原の産生のために使用される宿主細胞である。
【００１５】
接着性ＶＥＲＯ細胞と対照的に、ＣＨＯ細胞は、例えば、限定された範囲で接着に依存しているだけである。血清含有条件下で従来の方法によって培養されたＣＨＯ細胞は、滑らかな微細支持体（microsupport）および多孔性微細支持体の両方に結合可能である（特許文献６、非特許文献５）。ＣＨＯ細胞を血清を含まない条件下で増殖させる場合、ＣＨＯ細胞はこの性質を失い、そして滑らかな支持体（例えば、Cytodex 3）に接着しないか、あるいは接着促進添加物（例えば、フィブロネクチン、インスリンまたはトランスフェリン）が培地に全く加えられない程度まで、ＣＨＯ細胞が滑らかな支持体から容易に分離する。血清を含まない条件下で、ＣＨＯ細胞の支持体への接着が少ないため、従って、組換えタンパク質の産生は、通常、懸濁培養で行われる。本明細書中で、この産生プロセスは、連続方法またはバッチ方法によって実行され得る。本明細書中で、組換え細胞培養は、最適細胞密度が達成されるまで、バイオリアクター中で培養される；タンパク質発現は、必要に応じて誘発され、そして、発現タンパク質のみでなく組換え細胞も含む培地は、収集のために、反応タンクから一定の間隔で流し出され、従って、産生プロセスから除去される。バイオマスの連続的損失の結果として、バイオリアクターでの産生効率は下がり、そしてその産生効率は、新鮮培地をゆっくり加えた後にのみ増加する。なぜなら、細胞は、所望の細胞密度に達するまで増殖しなくてはならないからである。従って、そして連続プロセスにもかかわらず、このシステムには生産速度が減少する遅延期が常に存在する。さらに、増殖および産生のための能力は、このようなシステムでは、最大の達成可能な細胞密度によって限定されている。
【００１６】
無タンパク質培地に対する血清含有条件下で培養された細胞の適用の際、発現タンパク質の収量および組換えＣＨＯ細胞の生産性は、血清含有条件と比較して、無タンパク質培地での適用後にひどく減少することが、一貫して観察された（非特許文献６）。
【００１７】
このことは、培養条件の変化の結果としての、組換えクローンの不安定性または増殖の減少によって説明される。変化した醗酵条件のために−そして安定なオリジナルクローンの使用にもかかわらず−細胞の大部分が、減少した発現を有する細胞に、または非産生細胞に常に変化し、この細胞は、産生プロセスの間、産物産生細胞を過剰増殖し、その結果、最後には、大部分が非産生細胞または低発現の細胞からなる醗酵培養物が得られる。
【００１８】
この状況の結果は、醗酵培養物の最大の産生能力は連続的に減少し、そして最大の産物産生は、一定数の世代または細胞継代に限定されるということである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】WO97/05240
【特許文献２】特許第2696001号
【特許文献３】WO96/26266
【特許文献４】米国特許第5,393,668号
【特許文献５】WO96/15231
【特許文献６】米国特許第4,978,616号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Miyajiら, 1990, Cytotechonology 3:133-140
【非特許文献２】Miyajiら, 1990, Cytotechnology 4:173-180
【非特許文献３】Yamauchiら, 1992, Biosci. Biotechonol. Biochem, 56:600-604
【非特許文献４】Itoら, 1996, PNAS USA 93:3598-3601
【非特許文献５】Reiterら, 1992, Cytotechnology 9:247-253
【非特許文献６】Patersonら, 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-658
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
従って、特に、血清およびタンパク質を含まない条件下での組換えタンパク質の工業的産生において、可能な限り長い期間にわたって連続的産生を可能とするシステムに対する必要性がある。
【００２２】
さらに、タンパク質を含まない条件下で産生時期に多世代にわたって安定で、かつ組換えタンパク質を発現する、組換え細胞クローンを得ることが望まれる。従って、本発明の課題は、血清およびタンパク質を含まない、培養および産生条件下で組換えタンパク質の調製のための効率的な方法を提供することである。
【００２３】
さらなる目的は、安定な組換え細胞クローンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明に従って、この課題は、細胞培養から得られ得る組換え細胞クローンを利用可能とすることによって解決され、ここで、細胞クローンは、血清含有培地においてオリジナル組換え細胞クローンを培養し、そして無血清無タンパク質培地にこの細胞を再び適用した後に得られる。本明細書中で、細胞はさらに、産生条件と同じ条件下で、無血清無タンパク質培地で少なくとも４０世代の間培養される。
【発明の効果】
【００２５】
従って、本発明に従う細胞クローンは、支配的な部分において、無血清無タンパク質培地で安定な様式で少なくとも４０世代の間培養し得る細胞集団を形成する。本明細書中で、８０％を超える、詳細には９９％を超える、本発明に従う細胞集団または本発明に従う細胞クローンが、少なくとも４０世代の間安定であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、血清含有培地から無血清無タンパク質培地へ再び適用した時点（Ａ）、無血清無タンパク質培地において１０世代後（Ｂ）、および無血清無タンパク質培地において６０世代後（Ｃ）、のオリジナルクローンのワーキング細胞バンクの顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な組換え細胞クローンから始めた細胞培養の、ワーキング細胞バンク段階（Ａ）、１０世代後（Ｂ）、および６０世代後（Ｃ）の顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、１０Ｌの灌流バイオリアクター中でｒＦＶＩＩＩ  ＣＨＯ細胞クローンを培養した結果を示す。  ａ）４２日の期間にわたるＦＶＩＩＩ活性（ｍＵ／ｍＬ）および灌流速度（１〜５／日）。  ｂ）灌流リアクター内の容積測定による生産性（単位第ＶＩＩＩ因子／ｌ／日）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書中で、細胞を培養することが、選択マーカーおよび／または増殖遺伝子に対する選択なしで（例えば、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞の場合、ＭＴＸが存在しないで）実行されることが好ましい。
【００２８】
本発明の文脈において、用語、オリジナル細胞クローン（Ursprungszellklon）は、組換え細胞クローントランスフェクト体を意味し、これは、組換えヌクレオチド配列による宿主細胞の形質導入後に、研究室条件下で安定な様式で組換え産物を発現する。オリジナルクローンは、血清含有培地で増殖最適化のために培養される。生産性を上げるために、オリジナルクローンは、必要に応じて、選択試薬の存在下で、かつ選択マーカーおよび／または増殖マーカーに対する選択を伴って培養される。工業的産生のために、オリジナル細胞クローンは、高い細胞密度が達成されるまで、血清含有培養条件下で培養され、そして、このオリジナル細胞クローンは、産生期直前に、無血清および／または無タンパク質培地に適用される。本明細書中で、培養は、好ましくは、選択圧なしで実行される。
【００２９】
これらの条件下では、無血清無タンパク質培地に再び適用されたこのような細胞培養物における、大部分（９５％を超える）の細胞が、産物非産生細胞に変化することがわかった。産物特異的抗体による免疫蛍光の方法によって、無血清無タンパク質培地における細胞の世代時間の関数として、培養での非産生細胞の数は増加し、産物産生細胞を過剰増殖させ、その結果、培養物の生産性が減るということが示され得る。
【００３０】
無血清無タンパク質培地への再適用の後に得られる細胞培養物は、血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な産物を産生する細胞集団の細胞クローンについて、必要に応じて選択圧の存在しない状態で、試験される。これは、例えば、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質に対してなされる、特異的に標識された抗原を用いる免疫蛍光によって、達成され得る。産物産生細胞として同定された細胞は、細胞培養物から単離され、そして、血清およびタンパク質を含まない条件（これは、好ましくは、産生条件と等しい）下で再び増殖される。細胞の単離は、本明細書中で、細胞の単離および産物産生細胞についての試験によってなされ得る。必要に応じて、安定な細胞を含む細胞培養物は、安定な組換えクローンについて再び試験され、次いで、このクローンは、細胞培養物から単離されクローンニングされる。次いで、血清およびタンパク質を含まない条件下で得られた安定な組換え細胞クローンは、血清およびタンパク質を含まない条件下でさらに増殖される。
【００３１】
本発明に従う組換え細胞クローンは、特に、無血清無タンパク質培地で少なくとも４０世代の間、好ましくは少なくとも５０世代、そして特に有利には６０世代を超えて、安定であり、かつ組換えタンパク質を発現することによって特徴付けらる。本明細書中で、この安定性は、例えば、支持体として、マトリックスまたは固体表面のような助けなしに、現れる。さらに、本発明に従えば、高い細胞密度を利用する培養を実行することを必要をしない。
【００３２】
本発明の特定の局面に従って、安定な組換え細胞クローンは、単離した形態で存在する。安定な細胞クローンから開始して、細胞培養は、血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な細胞の増殖によって達成される。
【００３３】
本発明に従う安定な組換え細胞クローンは、好ましくは、組換え哺乳動物細胞に由来する。本明細書中では、組換え哺乳動物細胞は、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質をコードする配列を含む任意の細胞であり得る。この規定は、全ての連続的増殖細胞（接着性のものも非接着性のものも両方とも）を含有する。組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ細胞を使用することが、特に好ましい。組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質は、血液因子、増殖因子および他の生物医学的関連産物であり得る。
【００３４】
本発明に従って、組換え血液因子（例えば、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、プロテインＳ、プロテインＣ、これらの因子の１つの活性化形態、またはｖＷＦ）に対するコード配列を含み、かつ安定な条件下で数世代にわたってこれらの血液因子を発現可能な、安定な組換え細胞クローンを使用することが好ましい。本明細書中で、ｖＷＦまたはｖＷＦ活性を有するポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド、ｖＷＦおよび第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第ＩＩ因子を発現するＣＨＯ細胞を使用することが、好ましい。
【００３５】
本発明に従って、血清およびタンパク質を含まない条件下で選択された細胞クローンは、特に、少なくとも４０世代、好ましくは少なくとも５０世代の間、そして特に有利には６０世代を超える間、無血清無タンパク質培地において安定であることによって特徴付けられる。
【００３６】
マスター細胞バンクを発展させるために、３０世代が必要とされる。１０００Ｌ規模で平均バッチ培養を実行するためには、少なくとも４０世代が要求される。従って、最初、個々のクローンから、約８〜１０世代を用いて、「マスター細胞バンク（ＭＣＢ）」、「ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）」を調製し、次いで、これらの条件下で２０〜２５世代までを用いて、産生規模（産生バイオマス）で細胞培養物を調製することが可能である。なぜなら、今日まで利用可能な細胞クローンは、血清または無タンパク質培地での数世代の増殖後不安定になり、ａ）産物産生細胞による均一な細胞培養、およびｂ）長期間にわたる安定な産物生産性、を得るには無力となるからである。
【００３７】
従って、本発明に従う細胞クローンは、無血清無タンパク質培地における産生条件下で少なくとも４０世代の間安定である。今日までに記載される方法は、タンパク質を含まない条件下で、産物生産性を有する１０世代未満の世代数のみを提供した（上記のＲｅｉｔｅｒら、１９９２）。
【００３８】
安定性の基準として、最小数である少なくとも４０世代、好ましくは５０を超える、そして特に有利には６０を超える世代が、産生プロセスで使用され、そのプロセスの間、タンパク質の安定な発現が起こり、そして細胞の形態ならびに表現型は変化せず、そして腫瘍遺伝子的特徴が全く現れない。
【００３９】
予期しなかったが、本発明による細胞クローンは、血清およびタンパク質を含まない条件下で、血清含有培地で培養されたオリジナル細胞クローンと比較してさえも、増加した生産性を示すことが示された。
【００４０】
別の局面によると、本発明は、血清およびタンパク質を含まない条件下で、少なくとも９０％の、好ましくは９５％より多くの、そして特により有利には９８％より多くの、安定な組換え細胞を含む細胞培養物を利用可能とし、この安定な組換え細胞は、少なくとも４０世代の間、特に少なくとも５０世代の間、安定であり、かつ組換え産物を発現する。本発明の文脈において、細胞培養物は、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）、ワーキング細胞バンク（WCB-Arberitszell-bank）または工業的産生バイオリアクターにおける産生バイオマスを意味する。
【００４１】
本発明に従って、細胞培養は、特に、血清およびタンパク質を含まない条件下での、上述した型の安定な組換え細胞クローンを培養することによって得られる。
【００４２】
本発明に従う細胞培養物は、本明細書中で、個々のクローン（すなわちシード細胞）からＭＣＢ、ＷＣＢまたはバイオマスまでの、血清およびタンパク質を含まない条件下でのバイオリアクターにおける産生規模で、好ましくは選択および／またはマーカー遺伝子に対する選択圧なしでの、単離された安定な細胞クローンの増殖によって、得られ得る。特に、本発明に従って安定な組換えクローンから得られた細胞培養物中の組換え細胞は、血清およびタンパク質を含まない条件下で、少なくとも４０世代の間安定であることが示された。
【００４３】
ほとんどタンパク質を含まない培養および産生条件下で、本発明に従って利用可能となった細胞培養物（これは、血清およびタンパク質非依存性安定細胞クローンから調製される）は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に有利には少なくとも９８％の安定な組換え細胞を含む。本明細書中で、用語「安定な組換え細胞」は、詳細には、安定な細胞クローンに由来する組換え哺乳動物細胞を意味する。本明細書中で、組換えＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＢＨＫ細胞を使用することが好まれ、これらの細胞は、血液因子、好ましくは、組換えｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子およびｖＷＦ、第ＩＸ因子または第ＩＩ因子を発現する。
【００４４】
本発明に従う細胞培養物は、懸濁培養物として、安定な組換え細胞を含み得る。この細胞はまた、支持体、特に微細支持体に固定され得、ここでは、多孔性の微細支持体が特に好ましい。例えば、Cytoline（登録商標）またはCytopore（登録商標）のような多孔性支持体は、特に適切であることがわかった。
【００４５】
別の局面によると、本発明は、本発明に従って利用可能となった安定な細胞クローンを使用して、血清およびタンパク質を含まない条件下で、組換え産物を工業的に生産するための方法を示す。本明細書中の方法は、細胞培養物の調製のための、上記の型の単離された安定な組換え細胞クローンの調製工程を含む。本明細書中で、単離された安定な細胞クローンの増殖は、安定な個々の細胞クローンから細胞培養物まで、血清およびタンパク質を含まない条件下で起こる。特に、安定な細胞クローンの継代培養はまた、タンパク質を含まない条件下で、特にプロテアーゼ（例えば、トリプシンなど）の添加なしに、起こる。結果として、組換え産物の産生において利用される細胞培養物の調製中のいかなるときでも、ヒトまたは動物起源の血清およびタンパク質を含む添加物の細胞培養物への添加によって、ある環境下で起こり得るコンタミネーションが起きない、ということが保証される。従って、開始クローンから始まり、そしてワーキング細胞バンクの調製、バイオマスの産生、そして引き続い起こる、血清およびタンパク質を含まない条件下での組換えタンパク質の産生を介する調製を可能とする方法が、初めて記載される。
【００４６】
本発明に従う細胞培養物（これは、９０％を超える、好ましくは９５％を超える、そして特に有利には９８％を超える、安定な産物産生細胞を含む）を用いる組換え産物の調製は、懸濁培養物としてまたは細胞を支持体に固定させて実行され得る。本明細書中で、このプロセスは、バッチ形式もしくは連続形式で、または無血清無タンパク質培地による灌流技術によって、実行され得る。
【００４７】
次いで、発現する組換えタンパク質は、細胞培養物上清から得られ、次いで、公知の技術水準の方法で精製され、そしてさらに処理される。
【００４８】
無血清無タンパク質培地として、任意の公知の合成培地を使用し得る。従来の合成最小培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、ならびに炭水化物供給源および水を含み得る。例えば、それは、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２培地であり得る。大豆抽出物および酵母抽出物の含量は、０．１〜１００ｇ／Ｌ、特に有利には１〜５ｇ／Ｌであり得る。特に好ましい実施形態において、大豆抽出物（例えば、大豆ペプトン）を使用し得る。大豆ペプトンの分子量は、５０ｋｄ未満、好ましくは１０ｋｄ未満である。
【００４９】
以下の組成物を含有する培地を使用することが特に好ましい：合成最小培地（１〜２５ｇ／Ｌ）、大豆ペプトン（０．５〜５０ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．０５〜１ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１〜１０ｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌ）、エタノールアミン（０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０００１〜０．０１ｇ／Ｌ）。必要に応じて、消泡剤として、非イオン界面活性剤（例えば、ポリプロピレングリコール（PLURONIC F-61、PLURONIC F-68、 SYNPERONIC F-68、PLURONIC F-71またはPLURONIC F108）が培地に加えられ得る。
【００５０】
この薬剤は、通常、通気のネガティブ効果から細胞を保護するために使用される。なぜなら、界面活性剤の添加なしでは、上昇する曝気気泡は、これらの気泡（「スパージング」）の表面に位置したこれらの細胞に損傷を生じ得るからである（MurhammerおよびGoochee, 1990, Biotechonol. Prog. 6:142-148）。
【００５１】
本明細書中で、非イオン性界面活性剤の量は、０．０５〜１０ｇ／Ｌであり得るが、０．１〜５ｇ／Ｌのできる限り少ない量として使用することが特に好ましい。さらに、培地はまた、シクロデキストリンまたはその誘導体を含み得る。
【００５２】
しかし、非イオン性界面活性剤またはシクロデキストリンの添加は、本発明に不可欠ではない。無血清無タンパク質培地が、プロテアーゼインヒビター（例えば、組織培養における使用に適切で、かつ合成または植物由来のセリンプロテアーゼインヒビター）を含むことが好ましい。
【００５３】
本明細書中で、Ｏ２濃度、培地における灌流速度または変化速度、ｐＨ、温度および培養技術のような細胞培養についてのパラメーターは、使用される個々の細胞の型に依存し、そして、これらは、当業者によって簡単な様式で決定され得る。例えば、ＣＨＯ細胞の培養は攪拌された容器中で行われ得、そして無タンパク質培地を用いる灌流は、灌流速度１〜１０容積変化／日、ｐＨ７．０〜７．８（好ましくはｐＨ７．４）、Ｏ２濃度４０〜６０％（好ましくは５０％）、そして温度３４〜３８℃（好ましくは３７℃）で起こり得る。
【００５４】
さらなる局面では、本発明は、以下の工程を包含する安定な組換え細胞クローンを得るための方法を利用可能にする；
−オリジナル組換えクローンを、血清含有培地で、好ましくは選択圧なく、細胞培養物まで増殖させる工程、
−好ましくは産生条件と等しい条件である血清およびタンパク質を含まない条件下で、細胞を培養する工程、
−血清およびタンパク質を含まない条件下で、細胞培養物を、産物産生細胞について試験する工程、
−血清およびタンパク質を含まない条件下で、安定な組換え細胞クローンをクローニングする工程で、ここでは、このクローニングは、通常公知な技術（例えば、希釈による細胞の単離および個々のクローンを増殖）によって行われ得る、工程、
−血清およびタンパク質を含まない条件下で単離された細胞クローンを増殖させる工程、および
−必要に応じて、細胞培養物を、産物再生細胞について試験する工程。
【００５５】
本明細書中で、無タンパク質培地で、少なくとも１０世代の間、好ましくは少なくとも２０世代の間、そして特に有利には少なくとも５０世代の間、安定な組換えタンパク質を発現する、これらの組換え細胞クローンのみが、安定であると考えられるべきである。
【００５６】
別の局面によると、本発明は、以下の工程を包含する安定な組換え細胞クローンを得るための方法を利用可能にする；
−血清およびタンパク質を含まない条件下で非組換え開始細胞または細胞株を増殖し、そして血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な非組換え細胞クローンをクローニングする工程、
−組換え核酸によって安定な細胞クローンをトランスフェクトし、そして安定な組換え細胞クローンを単離する工程、
−必要に応じて、産生条件と同じである条件下で、無血清無タンパク質培地で安定な細胞クローンのトランスフェクト体を培養する工程、
−安定な組換え細胞を、産生および産物安定性について試験する工程。
【００５７】
本発明は、以下の実施例を参考として援用するが、この実施例に限定されない。
【実施例】
【００５８】
（実施例）
（実施例１：血清含有培地から無血清無タンパク質培地への再適用後のｒｖＷＦ ＣＨＯ細胞の安定性）
プラスミドｐｈＡｃｔ−ｒｖＷＦおよびｐＳＶ−ｄｈｆｒで同時トランスフェクトされたＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞、およびｖＷＦ発現クローンを、Fischerら（1994, FEBS Letters 351:345-348）に記載されるように、サブクローニングした。安定な様式でｒｖＷＦを発現したサブクローンから、ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）を、血清を含むがＭＴＸが存在しないむ条件下で、調製し、そして、血清を含む条件下で多孔性超微細支持体（Cytopore（登録商標））上に、細胞を固定した。支持体マトリックスが細胞密度２×１０7細胞／ｍＬに達した後、無血清無タンパク質培地への細胞の変換を行った。さらに、数世代の間、細胞を血清およびタンパク質を含まない条件下で培養した。標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光の方法によって、無血清無タンパク質培地において、種々の時間に、細胞を試験した。細胞の安定性の評価を、培地変更の前に、無血清無タンパク質培地において１０世代後および６０世代後に、ワーキング細胞バンクで行った。ワーキング細胞バンクが、なお１００％のｒｖＷＦ産生細胞を示した（図１Ａ）が、ｒｖＷＦ産生細胞の一部は、無血清無タンパク質培地において１０世代後に、約５０％に減少した（図１Ｂ）。６０世代後には、９５％を超える細胞が非産生細胞と同定された（図１Ｃ）。
【００５９】
（実施例２：安定な組換えＣＨＯクローンのクローニング）
実施例１による、ｒｖＷＦ ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物（これは、無血清無タンパク質培地で６０世代の間培養された（図１Ｃ））から、希釈液を調製し、そして、各場合に、０．１細胞／ウェルをマイクロタイタープレートに播種した。この細胞を、血清もタンパク質添加物も含まないＤＭＥＭ／ＨＡＭ１２培地で、かつ選択圧もなく、約３週間培養し、そして標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光方法によって、この細胞を試験した。ポジティブと同定された細胞クローンを、シードセルバンクの調製のための開始クローンとして使用した。このシードセルバンクから、無血清無タンパク質培地で、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）を調製し、そして個々のアンプルを冷凍し、そしてワーキング細胞バンクの後の調製のために貯蔵した。個々のアンプルから開始して、ワーキング細胞バンクを、無血清無タンパク質培地で調製した。この細胞を、多孔性超微細支持体上に固定し、そして数世代の間、血清およびタンパク質を含まない条件下で培養し続けた。標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光方法によって、異なる時期に、無血清無タンパク質培地で、生産性について、この細胞を試験した。ワーキング細胞バンクの段階で、および無血清無タンパク質培地において１０世代後ならびに６０世代後に、細胞の安定性の評価を行った。ワーキング細胞バンクの段階（図２Ａ）、および１０世代後（図２Ｂ）ならびに６０世代後（図２Ｃ）に、約１００％の細胞がｒｖＷＦを発現するポジティブな安定組換えクローンであると同定された。
【００６０】
（実施例３：組換え細胞クローンの細胞特異的生産性）
組換え細胞を培養する間の規定された段階から、規定された細胞数を取り出し、そして２４時間の間新鮮な培地によって培養した。ｒｖＷＦ：Ｒｉｓｔｏ−ＣｏＦ［リストセチン補助因子］活性を、細胞培養上清において決定した。表１は、本発明による安定な組換え細胞クローンにおける細胞特異的生産性は、無血清無タンパク質培地において、６０世代後でさえも、安定であったこと、そしてこの生産性は、血清含有培地で培養されたオリジナルクローンと比較して、向上したことを示す。
【００６１】
【表１】
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（実施例４：タンパク質および血清を含まない最小培地でのｒＦＶＩＩＩ ＣＨＯ細胞の培養）
ｒＦＶＩＩＩ ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、１０Ｌの攪拌タンク内で培養し、そして灌流させた。ここでは、無血清無タンパク質培地を使用した。本明細書中で、この細胞を、多孔性超超微細支持体（Cytopore（登録商標）、Pharmacia）に固定し、そして少なくとも６週間培養した。灌流速度は、４容積変化／日で、ｐＨは６．９〜７．２で、Ｏ２濃度は約２０〜５０％で、そして温度は３７℃であった。
【００６２】
図３は、１０Ｌの灌流バイオリアクター内でｒＦＶＩＩＩ ＣＨＯ細胞クローンを培養した結果を示す。
【００６３】
ａ）４２日の期間にわたるＦＶＩＩＩ活性（ｍＵ／ｍＬ）および灌流速度（１〜５／日）。
【００６４】
ｂ）灌流リアクター内の容積測定の生産性（単位因子ＶＩＩＩ／Ｌ／日）。
【００６５】
【表２】
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表２は、ｒＦＶＩＩＩ発現細胞の安定性および特異的生産性を示す。これらの結果のために、１５、２１、２８、３５および４２日後にサンプルを取り出し、３００Ｇで遠心分離し、そして新鮮な無血清無タンパク質培地に再懸濁した。さらに２４時間後に、細胞培養上清中の第ＶＩＩＩ因子濃度および細胞数を決定した。これらのデータから、特異的ＦＶＩＩＩ生産性を計算した。
【００６６】
８８８ｍＵ／１０６細胞／日という安定な平均生産性が達成された。この安定な生産性はまた、無血清無タンパク質培地で、１５、２１、２８、３５および４２日後に、標識された抗ＦＶＩＩＩ抗原を用いる免疫蛍光によって確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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