(57)【要約】【課題】脱髄を伴う状態の治療におけるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの使用の提供。【解決手段】本発明は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの投与によって、多発性硬化症を含む、脱髄および髄鞘形成不全を伴う疾病、疾患、または損傷を治療する方法を提供する。また、本発明は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの投与によって、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、および生存、ならびにニューロンの髄鞘形成を促進するための方法にも関する。加えて、本発明は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの投与によって、ＣＮＳニューロンの神経突起伸長または生存を促進するための方法に関する。【選択図】図１
2014055186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経生物学、神経学および薬理学に関する。より具体的には、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの投与によって、多発性硬化症等の脱髄、髄鞘形成不全、および中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病を治療するための方法に関する。また、本発明は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの投与によって、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、および生存、ならびにニューロンの髄鞘形成を促進するための方法にも関する。加えて、本発明は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの投与によって、ＣＮＳニューロンの神経突起伸長または生存を促進するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞機能は、近接する環境におけるニューロンと他の細胞との接触による影響を受ける（非特許文献１）。これらの細胞には、神経軸索をミエリンで覆う特殊化したグリア細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）のオリゴデンドロサイト、および末梢神経系（ＰＮＳ）のシュワン細胞が含まれる（非特許文献２）。
【０００３】
ミエリン鞘の形成は、ミエリン形成細胞および神経軸索を伴う細胞間相互作用の見事かつ動的な例である。概して、発達中、軸索が、この過程の促進または阻害のいずれかを行うために適切なシグナルを発現することにより、有髄化するかどうかを制御すると考えられる（非特許文献３）。
【０００４】
ＣＮＳニューロンは、損傷後に再生する先天的な可能性を有するが、ミエリン中に存在する阻害タンパク質により、再生を阻害される（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。
【０００５】
オリゴデンドロサイトに認められる幾つかのミエリン阻害タンパク質が、特徴付けられている。ミエリン阻害タンパク質の既知の例には、ＮｏｇｏＡ（非特許文献７、非特許文献８）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）（非特許文献９、非特許文献１０）、およびオリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ＯＭ−ｇｐ）（非特許文献１１）が挙げられる。これらのタンパク質のそれぞれが、ニューロンＮｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）のリガンドであることが、個別に示されている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献７、非特許文献１４）。
【０００６】
神経系の多くの疾病は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、ウォラー変性、ならびに副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、およびペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）等のある種の遺伝病を含む脱髄および髄鞘形成不全と関係する。かかる疾病の中で、ＭＳは最も広まっており、世界中で約２５０万人が罹患している。
【０００７】
ＭＳは、概して、再発−軽減パターンの神経障害から始まり、次いで、神経損傷の増大を伴う慢性期に進行する。ＭＳは、慢性病巣に局在するミエリン、オリゴデンドロサイト、および軸索の破壊と関連する。ＭＳにおいて観察される脱髄は、必ずしも永久的ではなく、疾病の初期段階における再髄鞘形成が記録されている。ニューロンの再髄鞘形成は、オリゴデンドロサイトを必要とする。
【０００８】
ＭＳに対して様々な疾病改変治療が使用可能であり、副腎皮質ステロイドおよびインターフェロンベータ等の免疫賦活剤の使用が含まれる。加えて、ＭＳにおけるオリゴデンドロサイトおよび髄鞘形成の中心的役割のために、オリゴデンドロサイト数を増加させる、または髄鞘形成を強化するための治療法を開発する努力が為されている。例えば、Ｃｏｈｅｎらの米国特許第５，５７４，００９号、非特許文献１５を参照されたい。しかしながら、ＭＳに対する付加療法を考案することが依然として急務である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８：８１９
【非特許文献２】Ｌｅｍｋｅ，１９９２，ｉｎ  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｚ．Ｈａｌｌ，Ｅｄ．，ｐ．２８１，Ｓｉｎａｕｅｒ
【非特許文献３】Ｃｏｌｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｐｏｔｔ，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１５：８３−１００（１９９７）
【非特許文献４】Ｂｒｉｔｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：１１−１４
【非特許文献５】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：２７９２−２８０３
【非特許文献６】Ｇｒｉｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．：２２：３１４４−３１６０
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９
【非特許文献８】Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，４３９−４４４
【非特許文献９】ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：８０５−８１１
【非特許文献１０】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：７５７−７６７
【非特許文献１１】Ｍｉｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１２７３−１２７９
【非特許文献１２】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１７，９４１−９４４
【非特許文献１３】Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０００，４０３，４３９−４４４
【非特許文献１４】Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２００２，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｎｅ２８，２００２
【非特許文献１５】Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６５−７３（２００２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＬＩＮＧＯ−４（ＤＡＡＴ９２４８、ロイシンリッチリピートニューロン６Ｄ、ＬＲＲＮ６Ｄ、ＰＲＯ３４００２、またはＱ６ＵＹ１８）がオリゴデンドロサイトに発現し、オリゴデンドロサイトの分化および軸索の髄鞘形成を負に調節するという発見に基づく。本発見に基づき、本発明は、概して、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの投与により、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存およびニューロンの髄鞘形成を促進するための方法に関する。
【００１１】
ある実施形態においては、本発明は、治療有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するステップを含む、哺乳動物におけるオリゴデンドロサイトの増殖、分化、および生存を促進するための方法を含む。
【００１２】
他の実施形態においては、本発明は、治療有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するステップを含む、哺乳動物におけるＣＮＳニューロンの神経突起伸長または生存を促進するための方法を含む。
【００１３】
さらに別の実施形態においては、本発明は、それを必要とする哺乳動物に治療有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するステップを含む、哺乳動物におけるオリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失に関連した疾病、疾患、または損傷を含む。
【００１４】
他の実施形態においては、本発明は、治療有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するステップを含む、哺乳動物におけるニューロンの髄鞘形成またはオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成を促進するための方法を含む。ある実施形態においては、哺乳動物は、脱髄および髄鞘形成不全を伴う疾病、疾患、損傷、または状態を診断されている。一部の実施形態においては、疾病、疾患、損傷、または状態は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線照射後の損傷、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠損、ビタミンＥ単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、およびベル麻痺から成る群より選択される。
【００１５】
加えて、本発明は、（ａ）組み換えＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを発現する培養宿主細胞を提供するステップと、（ｂ）神経系の疾病、疾患、もしくは損傷部位またはその近傍において、哺乳動物に該宿主細胞を導入するステップと、を含む、オリゴデンドロサイトまたはミエリンの破壊を伴う哺乳動物の疾病、疾患、または損傷を治療する方法を含む。また、別の実施形態においては、本発明は、哺乳動物に治療有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するステップを含む、哺乳動物のＣＮＳ疾病、疾患、または損傷を治療する方法を含む。
【００１６】
一部の実施形態においては、疾病、疾患、または損傷は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線照射後の損傷、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠損、ビタミンＥ単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、およびベル麻痺から成る群より選択される。一部の実施形態においては、培養宿主細胞は、治療対象の哺乳動物に由来する。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、インビボ遺伝子治療法によって、オリゴデンドロサイトまたはミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療する方法であって、疾患、疾病、または損傷の部位あるいはその近傍において、哺乳動物にて、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストが、損傷の部位またはその近傍において、ニューロンによる軸索伸長の阻害を低減するために十分な量でヌクレオチド配列から発現するように、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、哺乳動物に投与するステップを含む。ある実施形態においては、ベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＥＢ（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターから成る群より選択される、ウイルスベクターである。一部の実施形態においては、疾病、疾患、または損傷は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線照射後の損傷、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠損、ビタミンＥ単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、およびベル麻痺から成る群より選択される。一部の実施形態においては、ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および皮下投与から成る群より選択される経路によって投与される。
【００１８】
上記方法の様々な実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−４の、オリゴデンドロサイトの生存、増殖、および分化、ならびにニューロンの髄鞘形成を負に調節する能力に干渉する任意の分子であり得る。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ干渉）、およびＬＩＮＧＯ−４アプタマーから成る群より選択される。
【００１９】
ある可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠失するＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドフラグメント、その変異体、または誘導体を含むが、これらに限定されない。可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、（ｉ）ＬＩＮＧＯ−４免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインと、（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−４ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインとを含む、ポリペプチドを含む。一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−４  Ｉｇドメイン、ＬＩＮＧＯ−４ＬＲＲドメイン、および膜貫通ドメインを欠失する。一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−４  ＩｇドメインおよびＬＩＮＧＯ−４膜貫通ドメインを欠失する。さらに一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−４  ＬＲＲドメインを含む。一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−４  Ｉｇドメインを含む。一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基３０〜４８６または３０〜４９１を含む。
【００２０】
一部の実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ボーラス注入法または長期注入によって投与される。一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、中枢神経系に直接投与される。一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ＭＳの慢性病巣に直接投与される。
【００２１】
一部の実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、非ＬＩＮＧＯ−４部分を含む、融合ポリペプチドである。一部の実施形態においては、非ＬＩＮＧＯ−４部分は、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的部分、脳標的部分、レポーター部分、および精製促進部分から成る群より選択される。一部の実施形態においては、抗体Ｉｇ部分はヒンジおよびＦｃ部分である。
【００２２】
一部の実施形態においては、本発明の可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ポリマーに共役される。一部の実施形態においては、ポリマーは、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、およびポリペプチドから成る群より選択される。一部の実施形態においては、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一部の実施形態においては、本発明のポリペプチドおよび抗体は、１、２、３、または４つのポリマーに共役される。一部の実施形態においては、ポリマーの総分子量は、５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａである。
【００２３】
一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、環状ペプチドである。一部の実施形態においては、環状ペプチドは、該環状ペプチドのＮ末端に付着したビオチン分子とＣ末端に付着したシステイン残基とを含む。一部の実施形態においては、環状ペプチドは、該環状ペプチドのＮ末端およびＣ末端に付着したシステイン残基を含み、該Ｎ末端システイン残基はアセチル化される。
【００２４】
一部の実施形態においては、ＬＩＮＧＯアンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメントを含む。一部の実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から成る群より選択される。一部の実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチドは、ＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡのコード部分に対して相補的である少なくとも１０個の塩基を含む、アンチセンスポリヌクレオチドである。別の実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、アプタマーである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法であって、
（ｉ）  可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメント、
（ｉｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、
（ｉｖ）  ＬＩＮＧＯ−４アプタマー、および
（ｖ）  前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを含む有効量の組成物と、前記オリゴデンドロサイトを接触させるステップを含む、方法。
（項目２）
ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成を促進するための、またはニューロンの脱髄を阻止する方法であって、
（ｉ）  可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメント、
（ｉｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、
（ｉｖ）  ＬＩＮＧＯ−４アプタマー、および
（ｖ）  前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを含む組成物と、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの混合物を接触させるステップを含む、方法。
（項目３）
哺乳動物において、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法であって、
（ｉ）  可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメント、
（ｉｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、
（ｉｖ）  ＬＩＮＧＯ−４アプタマー、および
（ｖ）  前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目４）
哺乳動物において、髄鞘形成を促進する、またはニューロンの脱髄を阻止するための方法であって、
（ｉ）  可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメント、
（ｉｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、
（ｉｖ）  ＬＩＮＧＯ−４アプタマー、および
（ｖ）  前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目５）
哺乳動物において、髄鞘形成不全または脱髄を伴う疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、
（ｉ）  可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメント、
（ｉｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、
（ｉｖ）  ＬＩＮＧＯ−４アプタマー、および
（ｖ）  前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目６）
哺乳動物において、オリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失に関連した疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、
（ｉ）  可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメント、
（ｉｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、
（ｉｖ）  ＬＩＮＧＯ−４アプタマー、および
（ｖ）  前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目７）
哺乳動物において、ミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、
（ｉ）  可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメント、
（ｉｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、
（ｉｖ）  ＬＩＮＧＯ−４アプタマー、および
（ｖ）  前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目８）
前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドを含む、項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、
（ｉ）  ＬＩＮＧＯ−４  Ｉｇドメインまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４  ＬＲＲドメインまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、および
（ｉｉｉ）  前記ＬＩＮＧＯ−４ドメインまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の組み合わせから成る群より選択されるＬＩＮＧＯ−４領域を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、
（ｉ）  ＬＩＮＧＯ−４膜貫通ドメインまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、
（ｉｉ）  ＬＩＮＧＯ−４細胞内ドメインまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、および
（ｉｉｉ）  前記ＬＩＮＧＯ−４ドメインまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の組み合わせから成る群より選択されるＬＩＮＧＯ−４領域を欠失する、項目８または項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、配列番号２の３０〜４１１のアミノ酸、配列番号２の３０〜４９１のアミノ酸、および配列番号２の３０〜５３４のアミノ酸から成る群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、前記参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、前記参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、
配列番号２の３０〜６４のアミノ酸、配列番号２の３０〜８２のアミノ酸、配列番号２の３０〜１０６のアミノ酸、配列番号２の３０〜１３０のアミノ酸、配列番号２の３０〜１５４のアミノ酸、配列番号２の３０〜１７８のアミノ酸、配列番号２の３０〜２０２のアミノ酸、配列番号２の３０〜２２６のアミノ酸、配列番号２の３０〜２９８のアミノ酸、配列番号２の３０〜３２２のアミノ酸、配列番号２の３０〜３４６のアミノ酸、配列番号２の３０〜４１１のアミノ酸、配列番号２の３０〜４９１のアミノ酸、配列番号２の３０〜５３４のアミノ酸、配列番号２の６３〜８２のアミノ酸、配列番号２の６３〜１０６のアミノ酸、配列番号２の６３〜１３０のアミノ酸、配列番号２の６３〜１５４のアミノ酸、配列番号２の６３〜１７８のアミノ酸、配列番号２の６３〜２０２のアミノ酸、配列番号２の６３〜２２６のアミノ酸、配列番号２の６３〜２９８のアミノ酸、配列番号２の６３〜３２２のアミノ酸、配列番号２の６３〜３４６のアミノ酸、配列番号２の６３〜４１１のアミノ酸、配列番号２の６３〜４９１のアミノ酸、配列番号２の６３〜５３４のアミノ酸、配列番号２の８３〜１０６のアミノ酸、配列番号２の８３〜１３０のアミノ酸、配列番号２の８３〜１５４のアミノ酸、配列番号２の８３〜１７８のアミノ酸、配列番号２の８３〜２０２のアミノ酸、配列番号２の８３〜２２６のアミノ酸、配列番号２の８３〜２９８のアミノ酸、配列番号２の８３〜３２２のアミノ酸、配列番号２の８３〜３４６のアミノ酸、配列番号２の８３〜４１１のアミノ酸、配列番号２の８３〜４９１のアミノ酸、配列番号２の８３〜５３４のアミノ酸、配列番号２の１０７〜１３０のアミノ酸、配列番号２の１０７〜１５４のアミノ酸、配列番号２の１０７〜１７８のアミノ酸、配列番号２の１０７〜２０２のアミノ酸、配列番号２の１０７〜２２６のアミノ酸、配列番号２の１０７〜２９８のアミノ酸、配列番号２の１０７〜３２２のアミノ酸、配列番号２の１０７〜３４６のアミノ酸、配列番号２の１０７〜４１１のアミノ酸、配列番号２の１０７〜４９１のアミノ酸、配列番号２の１０７〜５３４のアミノ酸、配列番号２の１３１〜１５４のアミノ酸、配列番号２の１３１〜１７８のアミノ酸、配列番号２の１３１〜２０２のアミノ酸、配列番号２の１３１〜２２６のアミノ酸、配列番号２の１３１〜２９８のアミノ酸、配列番号２の１３１〜３２２のアミノ酸、配列番号２の１３１〜３４６のアミノ酸、配列番号２の１３１〜４１１のアミノ酸、配列番号２の１３１〜４９１のアミノ酸、配列番号２の１３１〜５３４のアミノ酸、配列番号２の１５５〜１７８のアミノ酸、配列番号２の１５５〜２０２のアミノ酸、配列番号２の１５５〜２２６のアミノ酸、配列番号２の１５５〜２９８のアミノ酸、配列番号２の１５５〜３２２のアミノ酸、配列番号２の１５５〜３４６のアミノ酸、配列番号２の１５５〜４１１のアミノ酸、配列番号２の１５５〜４９１のアミノ酸、配列番号２の１５５〜５３４のアミノ酸、配列番号２の１７９〜２０２のアミノ酸、配列番号２の１７９〜２２６のアミノ酸、配列番号２の１７９〜２９８のアミノ酸、配列番号２の１７９〜３２２のアミノ酸、配列番号２の１７９〜３４６のアミノ酸、配列番号２の１７９〜４１１のアミノ酸、配列番号２の１７９〜４９１のアミノ酸、配列番号２の１７９〜５３４のアミノ酸、配列番号２の２０３〜２２６のアミノ酸、配列番号２の２０３〜２９８のアミノ酸、配列番号２の２０３〜３２２のアミノ酸、配列番号２の２０３〜３４６のアミノ酸、配列番号２の２０３〜４１１のアミノ酸、配列番号２の２０３〜４９１のアミノ酸、配列番号２の２０３〜５３４のアミノ酸、配列番号２の２７５〜２９８のアミノ酸、配列番号２の２７５〜３２２のアミノ酸、配列番号２の２７５〜３４６のアミノ酸、配列番号２の２７５〜４１１のアミノ酸、配列番号２の２７５〜４９１のアミノ酸、配列番号２の２７５〜５３４のアミノ酸、配列番号２の２９９〜３２２のアミノ酸、配列番号２の２９９〜３４６のアミノ酸、配列番号２の２９９〜４１１のアミノ酸、配列番号２の２９９〜４９１のアミノ酸、配列番号２の２９９〜５３４のアミノ酸、配列番号２の３２３〜３４６のアミノ酸、配列番号２の３２３〜４１１のアミノ酸、配列番号２の３２３〜４９１のアミノ酸、配列番号２の３２３〜５３４のアミノ酸、配列番号２の３５８〜４１１のアミノ酸、配列番号２の３５８〜４９１のアミノ酸、配列番号２の３５８〜５３４のアミノ酸、配列番号２の４２６〜４９１のアミノ酸、配列番号２の４２６〜５３４のアミノ酸、任意の前記ポリペプチドフラグメントの変異体もしくは誘導体、および任意の前記ポリペプチドフラグメント、その変異体、もしくは誘導体のうちの少なくとも２つの組み合わせから成る群より選択されるポリペプチドフラグメントを含む、項目１〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは環状ペプチドである、項目８〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記環状ポリペプチドは、Ｎ末端に結合した第１の分子と、Ｃ末端に結合した第２の分子とをさらに含み、前記第１の分子および前記第２の分子は、互いに結合して前記環状分子を形成する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第１および第２の分子は、ビオチン分子、システイン残基、およびアセチル化システイン残基から成る群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の分子は、Ｎ末端に付着したビオチン分子であり、前記第２の分子は、前記ポリペプチドのＣ末端に付着したシステイン残基である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の分子は、Ｎ末端に付着したアセチル化システイン残基であり、前記第２の分子は、前記ポリペプチドのＣ末端に付着したシステイン残基である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｃ末端システインは付着したＮＨ２部分を有する、項目１８または項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、非ＬＩＮＧＯ−４部分をさらに含む、項目１〜２０のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記非ＬＩＮＧＯ−４部分は、前記可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドに融合される非相同ポリペプチドである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記非相同ポリペプチドは、免疫グロブリン、血清アルブミン、標的ポリペプチド、レポーターポリペプチド、精製促進ポリペプチド、前記ポリペプチドのうちのいずれかのフラグメント、および前記ポリペプチドまたはフラグメントのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記非相同ポリペプチドは、免疫グロブリンまたはそのフラグメントである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、ヒンジおよびｆｃ領域を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ポリマーに共役される、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリマーは、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、ポリペプチド、および前記ポリマーのうちの２つ以上の組み合わせから成る群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ポリマーはポリアルキレングリコールである、項目２９に記載の方法。
（項目２９）
前記ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、１、２、３、または４つのポリマーと共役する、項目２６〜２９のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記ポリマーの総分子量は、５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−４抗体またはそのフラグメントを含む、項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチドを含む、項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチドは、
（ｉ）  アンチセンスポリヌクレオチド、
（ｉｉ）  リボザイム、
（ｉｉｉ）  低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および
（ｉｖ）  低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から成る群より選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−４アプタマーを含む、項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記哺乳動物は、脱髄、髄鞘形成不全、または神経変性を伴う疾病、疾患、または損傷を診断されている、項目３〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記疾病、疾患、または損傷は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線照射後の損傷、化学療法の神経合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、ビタミンＥ単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、およびベル麻痺から成る群より選択される、項目５〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記疾病、疾患、または損傷は多発性硬化症（ＭＳ）である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ボーラス注入法または長期注入によって投与される、項目１から７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、中枢神経系に直接投与される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ＭＳの慢性病巣に直接投与される、項目３９または項目４０に記載の方法。
（項目４２）
（ａ）発現制御配列への操作可能な結合を通して、前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを用いて、前記オリゴデンドロサイトを形質移入するステップと、（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの発現を可能にするステップと、を含む、項目１または２のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
（ａ）発現制御配列への操作可能な結合を通して、前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを前記哺乳動物に投与するステップと、（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの発現を可能にするステップと、を含む、項目３〜４２のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記ポリヌクレオチドは、発現ベクターとして投与される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記発現ベクターはウイルスベクターである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、およびポックスウイルスベクターから成る群より選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記投与するステップは、（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞を提供するステップであって、前記培養宿主細胞は前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを発現する、ステップと、（ｂ）前記培養宿主細胞を前記哺乳動物に導入し、前記ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストが前記哺乳動物において発現するようにさせるステップと、を含む、項目４３〜４６のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
前記培養宿主細胞は、神経系の疾病、疾患、または損傷の部位、あるいはその近傍において前記哺乳動物に導入される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記培養宿主細胞は、（ａ）項目４３に記載のポリヌクレオチド、あるいは項目４４に記載のベクターを用いて、受容宿主細胞を形質転換または形質移入するステップと、（ｂ）前記形質転換または形質移入した宿主細胞を培養するステップと、を含む方法によって作製される、項目４７または項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記培養宿主細胞は、治療対象の前記哺乳動物に由来する、項目４７〜４９のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および皮下投与から成る群より選択される経路によって投与される、項目４４〜５０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＬＩＮＧＯ−４が脳および脊髄の双方において高く発現していることを示す、転写レベルのグラフである。
【図２】ｈＬＩＮＧＯ−１とｈＬＩＮＧＯ−２との類似率および同一率は、それぞれ７０．４％および６０．７％である。ｈＬＩＮＧＯ−１とｈＬＩＮＧＯ−３との類似率および同一率は、それぞれ６６．４％および５５．４％である。ｈＬＩＮＧＯ−１とｈＬＩＮＧＯ−４との類似率および同一率は、それぞれ５２．１％および４４．３％である。
【図３】成体マウス組織のＱ−ＰＣＲである。ＬＩＮＧＯ−４は、成体マウス組織の脳および脊髄で高く発現している。ＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡ発現の定量化は、Ｑ−ＰＣＲによって実行した。
【図４】Ｐ６マウス組織のＱ−ＰＣＲである。ＬＩＮＧＯ−４は、出生後６日（Ｐ６）マウス組織の脳および脊髄で高く発現している。ＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡ発現の定量化は、Ｑ−ＰＣＲによって実行した。
【図５】ＤＮ  ＬＩＮＧＯ−４は、オリゴデンドロサイトの分化を促進する。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）発現の相対的レベルを検出するために、抗ＭＢＰおよび抗ＨＡ抗体（内部レンチウイルス対照）を用いた、外因性ＭＯＰＣ２１（対照）および１Ａ７（抗ＬＩＮＧＯ−１）モノクローナル抗体で処理したラットオリゴデンドロサイト培養物、ならびにｈＬＩＮＧＯ−４ＦＬ（全長）およびｈＬＩＮＧＯ−４  ＤＮ（ドミナントネガティブ）レンチウイルスに感染させたオリゴデンドロサイト培養物からの、ウェスタンブロットである。
【図６】ＤＮ  ＬＩＮＧＯ−４およびＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃは、オリゴデンドロサイトの分化を促進する。ＭＢＰおよびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）タンパク質の両方の存在を検出するために、抗ＭＢＰ（成熟オリゴデンドロサイト）抗体およびＭＯＧ抗体を用いた、ｈＬＩＮＧＯ−１  ＦＬ（全長）、ｈＬＩＮＧＯ−１  ＤＮ（ドミナントネガティブ）、ｈＬＩＮＧＯ−４  ＦＬ（全長）、およびｈＬＩＮＧＯ−４−ＤＮ（ドミナントネガティブ）レンチウイルスに感染させたオリゴデンドロサイト培養物、ならびにｈＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃで外因的に処理したオリゴデンドロサイト、および対照ポリペプチドからのウェスタンブロットである。
【図７】ＤＮ  ＬＩＮＧＯ−４は、共培養において、ニューロンのオリゴデンドロサイト髄鞘形成を促進する。ＭＢＰタンパク質の存在を検出するために抗ＭＢＰを使用した、外因性ＭＯＰＣ２１（負の対照）および１Ａ７（正の対照）抗体で処理した後根神経節（ＤＲＧ）とオリゴデンドロサイトとの共培養物、ならびにｈＬＩＮＧＯ−４ＦＬ（全長）およびｈＬＩＮＧＯ−４  ＤＮ（ドミナントネガティブ）レンチウイルスに感染させた共培養物の、ウェスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合は、該定義を含む本出願が優先される。文脈によって別段の必要がない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含み得る。本明細書で言及されるすべての発行物、特許、および他の参考文献は、それぞれ個別の発行物または特許出願が、参照によって組み込まれるものとして具体的および個別に示されるかのように、あらゆる目的のために参照することによってそれら全体が組み込まれる。
【００２７】
本明細書に記載されるものに類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に説明する。材料、方法、および実施例は単なる例証であり、限定することを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、発明を実施するための形態および特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【００２８】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義を提供する。
【００２９】
「１つ（ａまたはａｎ）の」実体という用語は、１つ以上のその実体を指し、例えば、「１つの免疫グロブリン分子」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を表すと理解されることに留意されたい。したがって、「１つ（ａまたはａｎ）」、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」という用語は、本明細書において同義的に使用することができる。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変型例は、任意の列挙される整数または整数群を含むことを示すが、いかなる他の整数または整数群の除外も示すことはない。
【００３１】
本明細書で使用する「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、または本明細書および特許請求の範囲を通して使用される「ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ」もしくは「ｃｏｎｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」等の変型例は、任意の列挙される整数または整数群を含むことを示すが、追加の整数または整数群は、特定の方法、構造、または組成物に追加され得ないことを示す。
【００３２】
本明細書で使用する「〜から本質的に成る（ｃｏｎｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語、または本明細書および特許請求の範囲を通して使用される「ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」等の変型例は、任意の列挙される整数または整数群を含むこと、および特定の方法、構造、または組成物の基本的または新規特性を実質的に変化させない、任意の列挙される整数または整数群を任意に含むことを示す。
【００３３】
本明細書で使用する「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および時間において、有効な量を指す。治療結果は、例えば、症状の緩和、長期生存、運動性の改善等であり得る。治療結果は「治癒」である必要はない。
【００３４】
本明細書で使用する「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および時間において、有効な量を指す。典型的には、予防的用量は、疾病前、または疾病の初期段階において対象に使用されるため、予防的有効量は、治療有効量よりも少なくなる。
【００３５】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」は、非翻訳５’および３’配列、コーディング配列、ならびに核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および変異体を含む、全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含有し得る。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成することができ、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には、二本鎖であり得るか、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成することができる。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成することができる。また、ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基、あるいは安定性または他の理由のために修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ骨格も含有し得る。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシン等の異常塩基を含む。多様な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【００３６】
本発明において、ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド等量式によって互いに結合したアミノ酸で構成することができ、遺伝子によってコードした２０のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、自然には発生しないアミノ酸）を含有し得る。本発明のポリペプチドは、翻訳後プロセシング等の自然過程または当該技術分野において公知の化学修飾手法のいずれかによって、修飾することができる。かかる修飾は、基本的教科書、およびより詳細な論文、ならびに膨大な研究文献において、十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドの任意の場所で生じ得る。同一タイプの修飾は、同一または異なる程度で、所与のポリペプチドにおける複数の部位において存在し得ることが理解されるであろう。また所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有し得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐され得、また分岐を伴い、または伴わず、環状であり得る。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の自然過程から生じ得るか、または合成方法によって形成され得る。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル反応、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ付加、タンパク質分解プロセシング、リン酸化反応、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質に対するトランスファーＲＮＡ媒介アミノ酸付加、およびユビキチン化を含む。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ１８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。
【００３７】
「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストについて言及する場合、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存、およびＣＮＳニューロンの神経突起伸長または生存を促進する任意のアンタゴニスト分子を含む。また、これらの用語は、ニューロンの髄鞘形成を促進する任意のアンタゴニスト分子も含む。本発明の可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−４タンパク質分解フラグメント、欠損フラグメント、特に、動物に送達されると、より簡単に作用部位に到達するフラグメントを含み得る。ポリペプチドフラグメントは、線形ならびに三次元エピトープを含む、天然ポリペプチドの抗原または免疫原性エピトープを含む、ポリペプチドの任意の部分をさらに含む。本発明の可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、上述のようなフラグメントを含む、変異体ＬＩＮＧＯ−４領域を含み、アミノ酸置換、欠損、または挿入による改変アミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、自然発生し得、それには対立遺伝子変異体等がある。「対立遺伝子変異体」とは、有機体の染色体上の特定位置を占有する遺伝子の代替型を意図する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。非自然発生の変異体は、当該技術分野において既知の突然変異誘発法を使用して産生することができる。可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠損、または追加を含み得る。本発明のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、誘導体分子も含み得る。例えば、本発明の可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、天然のポリペプチドでは認められない追加機能を呈するように改変されたＬＩＮＧＯ−４領域を含み得る。その例には、融合タンパク質およびタンパク質共役が含まれる。
【００３８】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」は、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの短いアミノ酸配列を指す。タンパク質フラグメントは、「独立している」か、または該フラグメントが領域の一部を形成する、より大きいポリペプチド内に包含され得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例には、例えば、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、および約１００アミノ酸長が挙げられる。
【００３９】
抗体または免疫グロブリン。一実施形態においては、本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、「抗体」または「免疫グロブリン」分子、あるいはその免疫特異的フラグメントであり、例えば、自然発生する抗体または免疫グロブリン分子、あるいは抗体分子と類似した様式で抗原に結合する操作された抗体分子またはフラグメントである。「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において同義的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本的免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照されたい。
【００４０】
以下でより詳細に説明されるように、「免疫グロブリン」という用語は、生物化学的に区別され得る５つの幅広いクラスのポリペプチドを含む。５つのクラスすべてが明らかに本発明の範囲内にあり、以下の説明は概してＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子を対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。４つの鎖が典型的にはジスルフィド結合により「Ｙ」配置に結合され、軽鎖が、「Ｙ」の口から始まり可変領域にわたって続き、重鎖を囲む。
【００４１】
軽鎖および重鎖の両方が、構造的相同性と機能的相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。この点に関して、軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定することが理解される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等の重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増す。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際にそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４２】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。概して、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、免疫グロブリンが雑種細胞、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、２つの重鎖の「尾」部分は、共有ジスフィルド結合または非共有結合により互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ配置の又状端のＮ末端から各鎖の下部のＣ末端へ及ぶ。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらのうちに幾つかのサブクラス（例えばγ１〜γ４）を有することを理解する。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定するのがこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（イソ型）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は、よく特徴付けられており、機能分化を付与することが既知である。これらのクラスおよびイソ型のそれぞれの修飾された形は、本開示を考慮すれば当業者には容易に識別可能であり、したがって、本発明の範囲内である。
【００４３】
前述の通り、可変領域によって、抗体が抗原のエピトープを選択的に認識し特異的に結合することが可能になる。つまり、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この抗体の四次構造が、Ｙのそれぞれの腕の端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖のそれぞれの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって定義される。一部の事例において、例えば、ラクダ科の種に由来する、またはラクダ科の免疫グロブリンに基づいて操作されたある免疫グロブリン分子では、完全な免疫グロブリン分子が重鎖のみから成り、軽鎖を有しない場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照されたい。
【００４４】
自然発生する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性の環境でその三次元配置につくと、抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置する、アミノ酸の短い非連続配列である。抗原結合ドメインのアミノ酸の残りは、「フレームワーク」領域と称され、分子間の可変性をあまり示さない。フレームワーク領域は主としてβシート配座を取り入れ、ＣＤＲは、βシート構造を接続し、一部の場合ではβシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってＣＤＲの正しい配向の位置付けを提供する、足場を形成する役目を果たす。位置付けられたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原のエピトープに対する表面の相補性を定義する。この相補的な表面が、抗体のその同族エピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、正確に定義されているため、当業者は任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域を容易に確認することができる（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたく、これらは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４５】
しかしながら、ラクダ科の種では、ＶＨＨと称される重鎖可変領域がＣＤＲの全体を形成する。ラクダ科ＶＨＨ可変領域と従来の抗体（ＶＨ）由来のものとの間の主要な差異には、（ａ）ＶＨＨの対応する領域と比較して、ＶＨの軽鎖接触表面のより疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨのより長いＣＤＲ３、および（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１とＣＤＲ３との間のジスルフィド結合の頻繁な発生が含まれる。
【００４６】
一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。主題の抗原結合分子に含まれ得る、少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は当該技術分野において既知であり、例示的な分子について、本明細書に記載する。
【００４７】
本発明の方法において使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントには、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化、もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスフィルド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント）、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書で開示する分子に結合する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野において既知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
【００４８】
一本鎖抗体を含む抗体フラグメントは、単独、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体または一部と組み合わせた可変領域を含み得る。また、本発明には、やはりヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせの可変領域を含む、抗原結合フラグメントが含まれる。本明細書で開示する診断および治療方法において使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントは、鳥類および哺乳類を含む任意の動物起源からのものであり得る。ある実施形態においては、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態においては、可変領域は、（例えばサメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源であり得る。本明細書で使用する「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、以下、および例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンに対して遺伝子導入した、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。
【００４９】
本明細書で使用する「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリンの重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば上方、中央、および／もしくは下方ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異体もしくはフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用される結合ポリペプチドは、ポリペプチド鎖（ＣＨ１ドメインを含む）、ポリペプチド鎖（ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも１部分、およびＣＨ２ドメインを含む）、ポリペプチド鎖（ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む）、ポリペプチド鎖（ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも１部分、およびＣＨ３ドメインを含む）、またはポリペプチド鎖（ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも１部分、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む）を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えばＣＨ２ドメインのすべてまたは一部）を欠失し得る。上述の通り、これらのドメイン（例えば重鎖部分）は、自然発生する免疫グロブリン分子からのアミノ酸配列とは異なるように修飾され得ることが、当業者には理解される。
【００５０】
本明細書で開示する治療方法において使用される、あるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントにおいて、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、該多量体の第２のポリペプチド鎖のものと同一である。代替として、本発明の方法において使用される重鎖部分を含有する単量体は、同一ではない。例えば、各単量体が異なる標的結合部位を含んで、例えば二重特異性抗体を形成し得る。
【００５１】
本明細書で開示する診断および治療方法において使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子由来であり得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。別の例においては、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ３分子に由来する、ヒンジ領域を含み得る。別の例においては、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ４分子に由来する、キメラヒンジを含み得る。
【００５２】
本明細書で使用する「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリンの軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。典型的には、軽鎖部分はＶＬまたはＣＬドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【００５３】
１つ以上のアミノ酸置換、追加、または欠損がコードタンパク質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、追加、または欠損を導入することによって、免疫グロブリン由来のポリペプチド（例えば免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の非自然変異体をコードする単離核酸分子を形成することができる。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発等の標準的手法によって、突然変異を導入することができる。例えば、１つ以上の非必須アミノ酸残基で、保存的アミノ酸置換を行うことができる。
【００５４】
また、本明細書で開示する治療方法において使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントについて、本発明のポリペプチドへのそれらの結合親和性に関して記載または特定することができる。例えば、結合親和性には、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄのものが含まれる。
【００５５】
本明細書で開示する治療方法において使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントは、本明細書で記載するＬＩＮＧＯ−４のアンタゴニストとして作用する。例えば、本発明の方法において使用される抗体は、アンタゴニストとして機能し、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの抑制活性をブロックまたは阻害することができる。
【００５６】
本明細書で使用する「キメラ抗体」という用語は、免疫反応領域または部位が第１の種から得られるか、またはそれに由来し、定常領域（無処置、部分的、または本発明に従って修飾され得る）が第２の種から得られる、任意の抗体を意味すると考えられる。ある実施形態においては、標的結合領域または部位は非ヒト源（例えばマウスまたは霊長類）からのものであり、定常領域はヒトである。
【００５７】
本明細書で使用する「操作された抗体」という用語は、重鎖および軽鎖のいずれかまたはその両方の可変ドメインが、既知の特異性の抗体からの１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、そして必要な場合は部分的なフレームワーク領域の置換および配列変更によって改変される、抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同一クラスまたはさらにサブクラスの抗体に由来することができるが、ＣＤＲが異なるクラスの抗体および／または異なる種からの抗体に由来することも想定される。既知の特異性の非ヒト抗体からの１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に植え付けられる、操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と称される。１つの可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインへ移行するために、すべてのＣＤＲをドナー可変領域からの完全なＣＤＲと置換する必要があるとは限らない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要であるこれらの残基のみを移行することが必要であり得る。例えば米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号に記載される説明を考慮すると、ルーチン実験の実行、または試行錯誤による試験のいずれかによって、機能的な操作された抗体またはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の能力内である。
【００５８】
本明細書で使用する「結合した」、「融合した」、または「融合」という用語は、同義的に使用される。かかる用語は、化学共役または組み換え手段を含む何らかの手段によって、２つ以上の要素または構成要素を結合することを指す。「インフレーム融合（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｆｕｓｉｏｎ）」は、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合し、オリジナルＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持する方法で、連続する、より長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、結果として生じる組み換え融合タンパク質は、オリジナルＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（かかるセグメントは、通常、自然では、結合されない）を含有する単一のタンパク質である。リーディングフレームは、そのようにして、融合セグメント全体で連続的に形成されるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離され得る。
【００５９】
ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、アミノからカルボキシル末端への方向での順序であり、配列内で互いに隣接する残基は、ポリペプチドの一次構造において隣接する。
【００６０】
本明細書で使用する「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程を指す。該過程は、細胞内での遺伝子のいかなる機能的存在の発現をも含み、遺伝子ノックダウンならびに一時的発現および安定発現の両方を含むが、これらに限定されない。これには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびポリペプチドへのかかるｍＲＮＡの翻訳が含まれるが、これらに限定されない。最終的に所望される産物が生化学物質である場合、発現は、該生化学物質および任意の前駆体の形成を含む。  
【００６１】
「対象」、「個人」、「動物」、「患者」、または「哺乳動物」とは、診断、予後、または治療法が所望される任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、家畜、農場動物、動物園動物、競技用動物、愛玩動物（イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、肉牛、乳牛等）、霊長類（類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー等）、イヌ科動物（イヌおよびオオカミ等）、ネコ科動物（ネコ、ライオン、およびトラ等）、ウマ科動物（ウマ、ロバ、およびシマウマ等）、食用動物（ウシ、ブタ、およびヒツジ等）、有蹄動物（シカおよびキリン等）、クマ等を含むが、これらに限定されない。ある実施形態においては、哺乳動物はヒト被験者である。
【００６２】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現の発現抑制または減少を指す。それは、その二本鎖領域において遺伝子発現抑制配列と相同であるｓｉＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子発現抑制過程である。遺伝子は、染色体に統合されて存在するか、あるいはゲノムに統合されない遺伝子導入ベクター内に存在し、有機体に対して内因性または外因性であり得る。遺伝子の発現は、完全または部分的のいずれかで阻害される。また、ＲＮＡｉは標的ＲＮＡの機能を阻害すると見なすことができ、標的ＲＮＡの機能は完全または部分的であり得る。
【００６３】
ＬＩＮＧＯ−４
本発明は、ＬＩＮＧＯ−４がオリゴデンドロサイトに発現し、オリゴデンドロサイトの分化および髄鞘形成を負に調節するという発見に基づく。
【００６４】
自然発生のヒトＬＩＮＧＯ−４は、約５９３個のアミノ酸から成るポリペプチドである。ヒトＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋの受入番号ＮＭ＿００１００４４３２：
【００６５】
【数１】
2014055186.tif 000003
【００６６】
【数２】
2014055186.tif 000004
として報告されている。
【００６７】
ヒトＬＩＮＧＯ−４（配列番号１のヌクレオチド１９１〜１９７２によってコードされる）のポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受入番号ＮＰ＿００１００４４３２：
【数３】
2014055186.tif 000005
として報告されている。
【００６８】
マウスＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋの受入番号ＮＭ＿１７７２５０：
【００６９】
【数４】
2014055186.tif 000006
【００７０】
【数５】
2014055186.tif 000007
として報告されている。
【００７１】
マウスＬＩＮＧＯ−４（配列番号３のヌクレオチド１９９〜２０５５によってコードされる）のポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受入番号ＮＰ＿７９６２２４：
【００７２】
【数６】
2014055186.tif 000008
【００７３】
【数７】
2014055186.tif 000009
として報告されている。
【００７４】
自然発生のヒトＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド（ＤＡＡＴ９２４８、ロイシンリッチリピートニューロン６Ｄ、ＬＲＲＮ６Ｄ、ＰＲＯ３４００２、またはＱ６ＵＹ１８としても知られる）は、５９３個のアミノ酸の約６４Ｋｄａタンパク質である（配列番号２）。ＬＩＮＧＯ−４は、少なくとも３つの他のヒトパラログであるＬＩＮＧＯ−１、ＬＩＮＧＯ−２、およびＬＩＮＧＯ−３を含むＬＩＮＧＯタンパク質ファミリーのメンバーである。Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２８（２００４）を参照されたい。ヒトＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、一連の約１２個のロイシンリッチリピート（Ｎ末端キャップ（ＬＲＲＮＴ）およびＣ末端キャップ（ＬＲＲＣＴ）を含む）（配列番号２）を含有する。予測されるリピート数は、使用されるタンパク質コンピュータモデリングプログラムに依存して異なり得る。ＬＲＲドメインは、ＬＩＮＧＯ−４タンパク質の約３８０個のアミノ酸残基を含む。また、ＬＩＮＧＯ−４は、少なくとも約５８個のアミノ酸を含むＩｇドメインを含有する。また、約２２アミノ酸長である膜貫通領域と、約３５個のアミノ酸の細胞内ドメインがある。加えて、自然発生のＬＩＮＧＯ−４タンパク質は、タンパク質のＮ末端に約２８アミノ酸長のシグナル配列を含有する（図２）。当業者が理解するように、本明細書で報告するＬＩＮＧＯ−４の様々なドメインの長さは概算であり、かつコンピュータ予測に基づき、異なるコンピュータプログラムは異なる結果を提供する。表１に、配列番号２のアミノ酸配列に基づく、様々なＬＩＮＧＯ−４ドメインの予想される境界を列挙する。
【００７５】
【表１】
2014055186.tif 000010
ヒトおよびマウスにおけるＬＩＮＧＯ−４の組織分布について研究した。成体マウスおよびＰ６（出生後６日目）のＬＩＮＧＯ−４の発現を、ノーザンブロットおよびＰＣＲによって決定された、神経系ニューロンおよび脳オリゴデンドロサイトに局在化させる（図１、３、および４を参照されたい）。
【００７６】
ＬＩＮＧＯ−４のアンタゴニストを使用した治療方法
本発明の一実施形態は、例えば多発性硬化症等の髄鞘形成不全または脱髄に関連した疾病、疾患、または損傷を、かかる疾病に罹患する動物において治療するための方法であって、有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを該動物に投与するステップを含む、該ステップから本質的に成る、または該ステップから成る方法を提供する。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、およびＬＩＮＧＯ−４アプタマーから成る群から選択される。
【００７７】
加えて、本発明は、哺乳動物におけるニューロンの髄鞘形成を促進するための方法であって、治療有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するステップを含む、該ステップから本質的に成る、または該ステップから成る、方法を対象とする。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、およびＬＩＮＧＯ−４アプタマーから成る群から選択される。
【００７８】
本発明の追加の態様は、多発性硬化症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、またはグロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）等のオリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失に関連した疾病、疾患、または損傷を、かかる疾病に罹患する動物において治療するための方法であって、有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを該動物に投与するステップを含む、該ステップから本質的に成る、または該ステップから成る方法を提供する。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、およびＬＩＮＧＯ−４アプタマーから成る群から選択される。
【００７９】
本発明の別の態様には、哺乳動物におけるオリゴデンドロサイトの増殖、分化、および生存を促進するための方法であって、治療有効量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するステップを含む、該ステップから本質的に成る、または該ステップから成る方法が含まれる。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、およびＬＩＮＧＯ−４アプタマーから成る群から選択される。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態には、治療有効量の組成物を用いて、哺乳動物におけるＣＮＳニューロンの神経突起伸長または生存を促進するための方法であって、治療量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するステップを含む、該ステップから本質的に成る、または該ステップから成る方法が含まれる。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、およびＬＩＮＧＯ−４アプタマーから成る群から選択される。
【００８１】
本発明の別の態様には、哺乳動物におけるＣＮＳ疾病、疾患、または損傷を治療する方法であって、該哺乳動物にＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を投与するステップを含む、該ステップから本質的に成る、または該ステップから成る方法が含まれる。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、およびＬＩＮＧＯ−４アプタマーから成る群から選択される。
【００８２】
本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト、例えば可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、またはＬＩＮＧＯ−４アプタマーは、オリゴデンドロサイトによるニューロンの髄鞘形成を負に調節するＬＩＮＧＯ−４の能力を停止、減少、阻止、または阻害する治療薬として、調製および使用することができる。加えて、本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、オリゴデンドロサイトの分化、増殖、および生存を負に調節するＬＩＮＧＯ−４の能力を停止、減少、阻止、または阻害する治療薬として調製および使用することができる。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態は、オリゴデンドロサイトの増殖または生存を誘発して、オリゴデンドロサイトまたはミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療する方法であって、疾病、疾患、または損傷の部位、またはその近傍において、軸策伸長の阻害を低減し、髄鞘形成を促進するために十分な量を哺乳動物に投与する方法を含む。
【００８４】
本発明の方法では、患者への、例えば可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、またはＬＩＮＧＯ−４アプタマーの直接投与を介して、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与することができる。代替として、特定のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを産生する発現ベクターを介して、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与することができる。本発明のある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、（１）ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを発現する核酸、例えばベクターを有する移植可能な宿主細胞を形質転換または形質移入するステップと、（２）哺乳動物の疾病、疾患、または損傷部位に、形質転換した宿主細胞を移植するステップと、を含む治療方法において投与される。例えば、形質転換した宿主細胞をＭＳの慢性病巣の部位に移植することができる。本発明の一部の実施形態においては、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から除去し、一時的に培養し、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストをコードする単離核酸を用いて形質転換または形質移入し、それが除去された、同一哺乳動物に移植して戻す。細胞は、それが移植される同一部位から摂取することができるが、そうである必要はない。かかる実施形態は、時としてエクスビボ遺伝子治療法として知られ、限定された時間で、作用の部位に局在するＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの連続供給を提供することができる。
【００８５】
本発明の方法によって治療または緩和され得る疾病または疾患は、哺乳動物ニューロンの髄鞘形成不全または脱髄に関連する疾病、疾患、または損傷を含む。具体的には、ニューロンを取り囲むミエリンが、欠失している、不完全である、適切に形成されていない、または悪化している疾病および疾患を含む。かかる疾病は、多発性硬化症（ＭＳ）の再発、緩和、二次進行性、および一次進行性形態を含むＭＳ、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、および横断脊髄炎を含むが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の方法によって治療または緩和され得る疾病または疾患には、オリゴデンドロサイトの増殖または分化の細胞死または欠失に関連する疾病、疾患、または損傷が含まれる。かかる疾病には、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、およびウォラー変性が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明の方法によって治療または緩和され得る疾病または疾患には、神経変性疾病または疾患が含まれる。かかる疾病には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
本発明の方法によって治療または緩和され得る追加の疾病、疾患、または損傷の例は、脊髄損傷、慢性脊髄症または神経根障害、外傷性脳損傷、運動ニューロン疾患、軸索せん断、打撲傷、麻痺、放射線照射後の傷害または化学療法の他の神経学的合併症、脳卒中、大ラクナ、中規模から大規模の血管閉塞、びまん性白質病変、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏（単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群）、Ｂ１２、Ｂ６（ピリドキシン−ペラグラ）、チアミン、葉酸、ニコチン酸欠乏、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ベル麻痺、または軸索再生、再ミエリン形成、またはオリゴデンドロサイト生存または分化／増殖を必要とする任意の神経損傷を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド
本発明の可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドには、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドのフラグメント、変異体、または誘導体が含まれる。上記表１は、ヒトＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの様々なドメインを説明する。他の種、例えばマウスＬＩＮＧＯ−４（配列番号４）のＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドについて、同様のドメイン構造を推定することができる。典型的には、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの膜貫通ドメインを欠失し、任意でＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの細胞質ドメインを欠失する。例えば、ある可溶性ヒトＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ヒトＬＩＮＧＯ−４の膜貫通ドメインを含む、配列番号２のアミノ酸５３５〜５５７を欠失する。加えて、ある可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドのＬＲＲドメインおよびＩｇドメインを含む。
【００９０】
また、変異体ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドとは配列が異なり得る。特に、ＬＩＮＧＯ−４の生物活性を感知できるほど失うことなく、ＬＩＮＧＯ−４配列にあるアミノ酸置換を導入することができる。例示的実施形態においては、変異体ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、および／または配列番号２のアミノ酸３０〜４１１、配列番号２のアミノ酸３０〜４９１、および配列番号２のアミノ酸３０〜５３４、または配列番号４の等価フラグメントから成る群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号２または配列番号４の任意の所与のフラグメントとは配列が異なる変異体ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドには、１つ以上のアミノ酸置換（保存的または非保存的）、１つ以上の欠損、および／または１つ以上の挿入が含まれ得る。本発明のある実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、例えば哺乳動物における、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存の促進、ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成の促進、または脱髄の阻止を行う。
【００９１】
可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４の少なくとも６、例えば１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００個以上のアミノ酸のフラグメントを含み得る。加えて、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、少なくとも１、例えば５、１０、１５、または２０個の保存的アミノ酸置換を含み得る。また、配列番号２または配列番号４の参照ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの対応するフラグメントも考慮される。本発明のある実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、例えば哺乳動物における、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存の促進、ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成の促進、または脱髄の阻止を行う。
【００９２】
「ＬＩＮＧＯ−４参照アミノ酸配列」または「参照アミノ酸配列」とは、いずれのアミノ酸置換も導入されない特定の配列を意味する。当業者が理解するように、置換がない場合、本発明の「単離ポリペプチド」は、参照アミノ酸配列に同一のアミノ酸配列を含む。
【００９３】
保存的置換には、バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびスレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンの群のうちの置換が含まれる。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。前述の極性、塩基性、または酸性基のうちの１つのメンバーの、同一基の他のメンバーによる任意の置換は、保存的置換と見なすことができる。
【００９４】
非保存的置換には、（ｉ）電気的陽性側鎖を有する残基（例えばＡｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）が、電気的陰性残基（例えばＧｌｕまたはＡｓｐ）の代わりに、またはそれによって置換される、（ｉｉ）親水性残基（例えばＳｅｒまたはＴｈｒ）が、疎水性残基（例えばＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）の代わりに、またはそれによって置換される、（ｉｉｉ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基の代わりに、またはそれによって置換される、あるいは（ｉｖ）巨大な疎水性または芳香族側鎖を有する残基（例えばＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ）が、より小さな側鎖（例えばＡｌａ、Ｓｅｒ）を有するか、または側鎖を有しない（例えばＧｌｙ）ものの代わりに、またはそれによって置換されるものが含まれる。
【００９５】
当該技術分野で既知の通り、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で説明される際、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｕｎｉｘ（登録商標）用ウィスコンシン配列解析パッケージバージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）等の当該技術分野において既知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを使用して、決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間相同性の最適なセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列調整プログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータは、当然のことながら、同一性の割合（％）が、参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、相同性の差が参照配列におけるアミノ酸の総数の最大５％まで許容されるように設定される。
【００９６】
本発明の方法において使用されるさらなる可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸３０〜６４、配列番号２のアミノ酸３０〜８２、配列番号２のアミノ酸３０〜１０６、配列番号２のアミノ酸３０〜１３０、配列番号２のアミノ酸３０〜１５４、配列番号２のアミノ酸３０〜１７８、配列番号２のアミノ酸３０〜２０２、配列番号２のアミノ酸３０〜２２６、配列番号２のアミノ酸３０〜２９８、配列番号２のアミノ酸３０〜３２２、配列番号２のアミノ酸３０〜３４６、配列番号２のアミノ酸３０〜４１１、配列番号２のアミノ酸３０〜４９１、配列番号２のアミノ酸３０〜５３４、配列番号２のアミノ酸６３〜８２、配列番号２のアミノ酸６３〜１０６、配列番号２のアミノ酸６３〜１３０、配列番号２のアミノ酸６３〜１５４、配列番号２のアミノ酸６３〜１７８、配列番号２のアミノ酸６３〜２０２、配列番号２のアミノ酸６３〜２２６、配列番号２のアミノ酸６３〜２９８、配列番号２のアミノ酸６３〜３２２、配列番号２のアミノ酸６３〜３４６、配列番号２のアミノ酸６３〜４１１、配列番号２のアミノ酸６３〜４９１、配列番号２のアミノ酸６３〜５３４、配列番号２のアミノ酸８３〜１０６、配列番号２のアミノ酸８３〜１３０、配列番号２のアミノ酸８３〜１５４、配列番号２のアミノ酸８３〜１７８、配列番号２のアミノ酸８３〜２０２、配列番号２のアミノ酸８３〜２２６、配列番号２のアミノ酸８３〜２９８、配列番号２のアミノ酸８３〜３２２、配列番号２のアミノ酸８３〜３４６、配列番号２のアミノ酸８３〜４１１、配列番号２のアミノ酸８３〜４９１、配列番号２のアミノ酸８３〜５３４、配列番号２のアミノ酸１０７〜１３０、配列番号２のアミノ酸１０７〜１５４、配列番号２のアミノ酸１０７〜１７８、配列番号２のアミノ酸１０７〜２０２、配列番号２のアミノ酸１０７〜２２６、配列番号２のアミノ酸１０７〜２９８、配列番号２のアミノ酸１０７〜３２２、配列番号２のアミノ酸１０７〜３４６、配列番号２のアミノ酸１０７〜４１１、配列番号２のアミノ酸１０７〜４９１、配列番号２のアミノ酸１０７〜５３４、配列番号２のアミノ酸１３１〜１５４、配列番号２のアミノ酸１３１〜１７８、配列番号２のアミノ酸１３１〜２０２、配列番号２のアミノ酸１３１〜２２６、配列番号２のアミノ酸１３１〜２９８、配列番号２のアミノ酸１３１〜３２２、配列番号２のアミノ酸１３１〜３４６、配列番号２のアミノ酸１３１〜４１１、配列番号２のアミノ酸１３１〜４９１、配列番号２のアミノ酸１３１〜５３４、配列番号２のアミノ酸１５５〜１７８、配列番号２のアミノ酸１５５〜２０２、配列番号２のアミノ酸１５５〜２２６、配列番号２のアミノ酸１５５〜２９８、配列番号２のアミノ酸１５５〜３２２、配列番号２のアミノ酸１５５〜３４６、配列番号２のアミノ酸１５５〜４１１、配列番号２のアミノ酸１５５〜４９１、配列番号２のアミノ酸１５５〜５３４、配列番号２のアミノ酸１７９〜２０２、配列番号２のアミノ酸１７９〜２２６、配列番号２のアミノ酸１７９〜２９８、配列番号２のアミノ酸１７９〜３２２、配列番号２のアミノ酸１７９〜３４６、配列番号２のアミノ酸１７９〜４１１、配列番号２のアミノ酸１７９〜４９１、配列番号２のアミノ酸１７９〜５３４、配列番号２のアミノ酸２０３〜２２６、配列番号２のアミノ酸２０３〜２９８、配列番号２のアミノ酸２０３〜３２２、配列番号２のアミノ酸２０３〜３４６、配列番号２のアミノ酸２０３〜４１１、配列番号２のアミノ酸２０３〜４９１、配列番号２のアミノ酸２０３〜５３４、配列番号２のアミノ酸２７５〜２９８、配列番号２のアミノ酸２７５〜３２２、配列番号２のアミノ酸２７５〜３４６、配列番号２のアミノ酸２７５〜４１１、配列番号２のアミノ酸２７５〜４９１、配列番号２のアミノ酸２７５〜５３４、配列番号２のアミノ酸２９９〜３２２、配列番号２のアミノ酸２９９〜３４６、配列番号２のアミノ酸２９９〜４１１、配列番号２のアミノ酸２９９〜４９１、配列番号２のアミノ酸２９９〜５３４、配列番号２のアミノ酸３２３〜３４６、配列番号２のアミノ酸３２３〜４１１、配列番号２のアミノ酸３２３〜４９１、配列番号２のアミノ酸３２３〜５３４、配列番号２のアミノ酸３５８〜４１１、配列番号２のアミノ酸３５８〜４９１、配列番号２のアミノ酸３５８〜５３４、配列番号２のアミノ酸４２６〜４９１、配列番号２のアミノ酸４２６〜５３４、またはかかるポリペプチドのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む、該アミノ酸配列から本質的に成る、または該アミノ酸配列から成るヒトＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、例えば哺乳動物における、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存の促進、ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成の促進、または脱髄の阻止を行う。
【００９７】
当業者には十分理解されるであろうが、上で列挙したもの等のＬＩＮＧＯ−４フラグメントは、例えば、ＬＩＮＧＯ−４ドメイン領域の代替予測に基づき、いずれかの末端において、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸分長さが異なり得る（より長いかより短いかのいずれかである）。加えて、上で列挙したフラグメントのうちのいずれもが、Ｎ末端に分泌シグナルペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸１〜２８または配列番号２のアミノ酸１〜２９をさらに含み得る。また、明細書のいずれかの箇所で記載したもの等の他の分泌シグナルペプチドを使用することもできる。また、配列番号２、配列番号４、または本明細書に記載するそのフラグメントと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの対応するフラグメントも、考慮される。
【００９８】
本発明の方法において使用される可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドには、２つ以上の可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの任意の組み合わせが含まれ得る。したがって、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかである可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド二量体が考慮される。本明細書に記載する２つ以上の可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドを直接接続することができ、あるいは好適なペプチドリンカーを介して接続することもできる。かかるペプチドリンカーは、本明細書のいずれかの箇所で記載される。
【００９９】
本発明の方法において使用される可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、環状であり得る。可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの環化は線状ペプチドの配座の自由度を減少し、構造的により制約された分子をもたらす。ペプチド環化の多くの方法が当該技術分野において既知である。例えば、ペプチドのアミノ酸残基のＮ末端とＣ末端との間のアミド結合の形成による、「骨格−骨格」環化である。「骨格−骨格」環化方法には、２つのω−チオアミノ酸残基（例えばシステイン、ホモシステイン）間のジスルフィド架橋の形成が含まれる。本発明のある可溶性ＬＩＮＧＯ−４ペプチドは、環状ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドを形成するようにペプチドのＮ末端およびＣ末端上の修飾を含む。かかる修飾には、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分およびビオチンを有するシステイン残基が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド環化の他の方法は、Ｌｉ  ＆  Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）に記載されており、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１００】
本発明の方法において使用される環状ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドには、Ｃ１ＬＳＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｃ２（配列番号４３）が含まれるが、これに限定されず、式中、Ｘ１はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであり、Ｘ２はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであり、Ｘ３はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであり、Ｃ１は、任意で付着される環化（例えばアセチル基またはビオチン）を促進する部分を有し、Ｃ２は、任意で付着される環化（例えばＮＨ２部分）を促進する部分を有する。
【０１０１】
抗体またはその免疫特異的フラグメント
また、本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストには、ＬＩＮＧＯ−４特異的抗体、またはＬＩＮＧＯ−４活性のアンタゴニストである抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体が含まれる。例えば、あるＬＩＮＧＯ−４抗体の、オリゴデンドロサイト上に発現したＬＩＮＧＯ−４への結合は、オリゴデンドロサイトの成長もしくは分化の阻害をブロックするか、またはＣＮＳニューロンの脱髄もしくは髄鞘形成不全をブロックする。
【０１０２】
本明細書に記載する方法において使用されるあるアンタゴニスト抗体は、特定のＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドフラグメントまたはドメイン、例えば本明細書に記載するＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、フラグメント、変異体、または誘導体に、特異的または選択的に結合する。本発明のある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体は、例えば哺乳動物における、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するか、ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成を促進するか、あるいは脱髄を阻止する。
【０１０３】
他の実施形態においては、本発明は、ＬＩＮＧＯ−４の少なくとも１つのエピトープに特異的または選択的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体を含み、該エピトープは、配列番号２もしくは配列番号４の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、配列番号２もしくは配列番号４の少なくとも７個、少なくとも９個、もしくは少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む、該アミノ酸から本質的に成る、または該アミノ酸から成る。配列番号２または配列番号４の所与のエピトープのアミノ酸は、記載されるように、連続的または線状であり得るが、そうである必要はない。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４の少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面に発現されるもののような、または例えばＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合される可溶性フラグメントのような、ＬＩＮＧＯ−４の細胞外ドメインによって形成される非線状エピトープを含む、該非線状エピトープから本質的に成る、または該非線状エピトープから成る。したがって、ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４の少なくとも１つのエピトープは、配列番号２または配列番号４の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０、あるいは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００個の連続的または非連続的アミノ酸を含むか、該アミノ酸から本質的に成るか、または該アミノ酸から成り、非連続的アミノ酸がタンパク質折り畳みによってエピトープを形成する。
【０１０４】
他の実施形態においては、本発明は、ＬＩＮＧＯ−４の少なくとも１つのエピトープに特異的または選択的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、該エピトープは、さらに、前述の配列番号２または配列番号４の１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の連続的または非連続的アミノ酸を含むか、該アミノ酸から本質的に成るか、または該アミノ酸から成り、タンパク質を修飾する追加部分、例えば炭水化物部分を、ＬＩＮＧＯ−４抗体が、修飾された標的タンパク質に対して、タンパク質の修飾されていない形に対してよりも高い親和性で結合するように含むことができる。代替として、ＬＩＮＧＯ−４抗体は、標的タンパク質の修飾されていない形には全く結合しない。
【０１０５】
ある実施形態においては、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−４または前述のフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合、すなわち、そのようなエピトープに、無関係の、もしくは無作為のエピトープに結合するであるよりも容易に結合するか、ＬＩＮＧＯ−４または前述のフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに選択的に結合、すなわち、そのようなエピトープに、関連する、同様の、相同である、もしくは類似のエピトープに結合するであろうよりも容易に結合するか、ＬＩＮＧＯ−４または前述のフラグメントもしくは変異体のあるエピトープにそれ自体特異的もしくは選択的に結合する、参照抗体の結合を競合的に阻害するか、あるいは、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、もしくは約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤによって特徴付けられる親和性で、ＬＩＮＧＯ−４または前述のフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに結合する。特定の態様においては、抗体またはそのフラグメントは、マウスＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントと比べて、ヒトＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する。
【０１０６】
抗体結合解離定数の文脈において使用される「約」という用語は、抗体親和性を測定するために利用される方法に特有のある程度の変動を許容する。例えば、使用される器具類の精度レベル、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に依存し、「約１０−２Ｍ」という語は、例えば０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含む場合がある。
【０１０７】
特定の実施形態においては、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１、もしくはｌ０−３秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。代替として、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、もしくは１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１もしくは１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。
【０１０８】
他の実施形態においては、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１もしくは５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。代替として、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、もしくは５×１０６Ｍ−１秒−１、もしくは１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。
【０１０９】
一実施形態においては、本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、抗体分子、またはその免疫特異的フラグメントである。具体的に記載されていない限り、本明細書において抗体に関連して使用される「そのフラグメント」とは、免疫特異的フラグメント、すなわち、抗原特異的フラグメントを指す。一実施形態においては、本発明の抗体は、二重特異性結合分子、結合ポリペプチド、あるいは抗体であり、例えば、二重特異性抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン欠損抗体、または１つを超えるエピトープ、例えば１つを超える抗原もしくは同一抗原上の１つを超えるエピトープに対する結合特異性を有する融合タンパク質である。一実施形態においては、二重特異性抗体は、ＬＩＮＧＯ−４上の少なくとも１つのエピトープに対して特異的である少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、ＬＩＮＧＯ−４のエピトープに対して特異的である２つの標的結合ドメインと、第２の標的に対して特異的である２つの標的結合ドメインとを有する、四価抗体であり得る。したがって、四価の二重特異性抗体は、それぞれの特異性に対して二価であり得る。
【０１１０】
本発明のある実施形態は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的フラグメントの投与を含み、定常領域ドメインのうちの１つ以上の少なくともごく一部が欠損しているか、または別様に改変されて、エフェクタ機能の低下、非共有的に二量体化する能力、腫瘍部位に局在化する能力の向上、血清半減期の減少、または全体と比較した場合に血清半減期の増加、ほぼ同一の免疫原性の非改変抗体等の所望の生化学的特性を提供する。例えば、本明細書に記載する治療方法において使用されるある抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似するポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインのうちの少なくとも一部分を欠失する、ドメイン欠損抗体である。例えば、ある抗体において、修飾された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が削除、例えばＣＨ２ドメインのすべてまたは一部が削除される。
【０１１１】
本明細書に記載する治療方法において使用するための、あるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントにおいては、当該技術分野において既知の手法を使用して、エフェクタ機能を低下するようにＦｃ部分を突然変異することができる。例えば、定常領域の修飾を用いて、ジスフィルド結合またはオリゴ糖部分を修飾し、抗原特異性または抗体の柔軟性の向上により局在性の強化を可能にし得る。修飾の結果として生じる生理学的特性、バイオアベイラビリティ、および他の生化学的効果は、過度の実験を行うことなく、公知の免疫学的手法を使用して容易に測定および定量化することができる。
【０１１２】
本明細書で開示する診断および治療方法において使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントの修飾された形態は、当該技術分野において既知の手法を使用して、前駆体全体または親抗体から形成することができる。例示的な手法を本明細書でより詳細に説明する。
【０１１３】
本明細書で開示する診断および治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的フラグメントは、当該技術分野において既知である手法を使用して形成または製造することができる。ある実施形態においては、抗体分子またはそのフラグメントは、「組み換えによって産生」、すなわち、組み換えＤＮＡ技術を使用して産生される。抗体分子またはそのフラグメントを形成するための例示的な手法を、本明細書のいずれかの箇所でより詳細に説明する。
【０１１４】
本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体またはそのフラグメントは、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって生成することができる。
【０１１５】
ポリクローナル抗体は、当該技術分野において公知の様々な手技によって産生することができる。例えば、ＬＩＮＧＯ−４免疫特異的フラグメントを、ウサギ、マウス、ラット等を含むが、これらに限定されない様々な宿主動物に投与して、抗原に対して特異的であるポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発することができる。宿主の種に依存して、免疫学的反応を増強させるために様々なアジュバントを使用することができ、これには、フロイントのもの（完全および不完全）、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム等の潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。また、かかるアジュバントは、当該技術分野において公知である。
【０１１６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、組み換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせを含む、当該技術分野において既知の多様な手法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）で教示されるものを含む、ハイブリドーマ法を使用して産生することができる（該参考文献は、参照することによりその全体が組み込まれる）。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核性、原核性、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法ではない。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、および組み換え、およびファージディスプレイ技術を含む、当該技術分野において既知の多様な手法を使用して調製することができる。
【０１１７】
当該技術分野において認識されるプロトコルを使用して、一例では、該当する抗原（例えば精製されたＬＩＮＧＯ−４抗原、またはかかる抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注入によって、哺乳動物に抗体を生じさせる。典型的には、この免疫化は、活性化された脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む、免疫反応を導出する。得られた抗体を動物の血清から収穫してポリクローナル調製物を提供することができるが、個別のリンパ球を脾臓、リンパ節、または末梢血から単離して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均質な調製物を提供することが、しばしば望ましい。ある特定の実施形態においては、リンパ球は脾臓から得られる。
【０１１８】
この公知の過程では（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））、抗原を注入された哺乳動物からの比較的短命、または死ぬ運命にあるリンパ球が、不死化腫瘍細胞系（例えば骨髄腫細胞系）と融合され、これにより、不死であるとともに、Ｂ細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生することができる、ハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を産生する。得られたハイブリッドは、選択、希釈、および単一の抗体を形成するために特異的な遺伝子を含む各個別の株での再成長によって、単一の遺伝子的株に分離される。それらは所望の抗原に対して均質である抗体を産生し、それらの純粋な遺伝的素性に関して、「モノクローナル」と称される。
【０１１９】
典型的には、このように調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する、好適な培養基に播種および生育される。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および成長のための試薬、細胞系、および培地は、多くの供給源から市販されており、標準的なプロトコルが十分に確立されていることを理解するであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長する培養基は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定される。ある実施形態においては、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、または酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ検定によって判定される。ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生することが同定された後、該クローンを希釈手技を制限することによりサブクローン化し、標準的な方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９−１０３（１９８６））。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばタンパク質Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィ等の従来の精製手技により、培養基、腹水、または血清から分離し得ることがさらに理解されるであろう。
【０１２０】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の手法によって生成することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生する）等の酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖の定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【０１２１】
また、当業者は、抗体または抗体フラグメント（例えば抗原結合部位）をコードするＤＮＡもまた、抗体ファージライブラリーに由来し得ることを理解するであろう。特定の、そのようなファージを利用して、レパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウス）から発現した抗原結合ドメインを提示することができる。対象となる抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば、標識化された抗原、または固体表面またはビーズに結合した、または捕獲された抗原を使用して、選択または同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはファージ遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のうちのいずれかに組み換えによって融合されたジスフィルド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現する、ｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む、繊維状ファージである。例示的な方法は、例えば欧州特許第３６８６８４Ｂ１号、米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）、Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９８：２６８２（２００１）、Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されており、これらのそれぞれが、参照することによって本明細書に組み込まれる。幾つかの発行物（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））が、鎖シャフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大きなファージライブラリーを構成するための戦略としての組み合わせ感染およびインビボ組み換えについて記載している。別の実施形態においては、リボソームディスプレイを使用して、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージを置換することができる（例えば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）、またはＩｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）を参照されたい）。さらに別の実施形態においては、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。かかる手技は、単離およびその後のモノクローナル抗体のクローン化のための従来のハイブリドーマ法に対する代替法を提供する。
【０１２２】
ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えばリンパ系組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。ある実施形態においては、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーにより一緒に結合され、ファージミドベクター（例えばｐ  ＣＡＮＴＡＢ６またはｐＣｏｍｂ３  ＨＳＳ）にクローン化される。該ベクターを大腸菌に電気穿孔し、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法において使用されるファージは、典型的にはｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージであり、ＶＨまたはＶＬ領域は、通常ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組み換えによって融合される。対象となる抗原（すなわち、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはそのフラグメント）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば、標識化された抗原、または固体表面またはビーズに結合した、または捕獲された抗原を使用して、選択または同定することができる。
【０１２３】
抗体を形成するために使用され得るファージディスプレイ法のさらなる例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）、Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）、Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ１８７：９−１８（１９９７）、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５７：１９１−２８０（１９９４）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号、国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、第ＷＯ９１／１０７３７号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９３／１１２３６号、第ＷＯ９５／１５９８２号、第ＷＯ９５／２０４０１号、ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号で開示されるものが含まれ、これらのそれぞれが、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離して、これを使用して、ヒト抗体、または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを含む抗体全体を生成し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。また、国際公開第ＷＯ９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）、およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＪＲＩ３４：２６−３４（１９９５）、およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（該参考文献は、参照することによってその全体が組み込まれる）で開示されるもの等の、当該技術分野において既知である方法を使用して、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換えによって産生する手法を用いることもできる。
【０１２５】
別の実施形態においては、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手技を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離および配列決定することができる。ある実施形態においては、単離されてサブクローン化されたハイブリドーマ細胞が、そのようなＤＮＡの供給源として機能する。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別様には免疫グロブリンを産生しない、骨髄腫細胞等の原核または真核性宿主細胞に形質移入される。より具体的には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載するように合成のものであり得る）を使用して、１９９５年１月２５日に出願された、Ｎｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号で開示されるような、抗体製造のために定常および可変領域配列をクローン化することができ、該特許は参照することによって本明細書に組み込まれる。これは、本質的に、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを使用したＰＣＲによる増幅を含む。また、この目的に好適なプライマーについても、米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下でより詳細に説明するように、所望の抗体を発現する形質転換した細胞を比較的大量に成長させて、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を行うことができる。
【０１２６】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を調べて、例えば、配列の超可変性領域を決定するために、他の重鎖および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列と比較する等の、当該技術分野において公知の方法によって、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定することができる。ルーチン的な組み換えＤＮＡ手法を使用して、ＣＤＲのうちの１つ以上を、フレームワーク領域内、例えば、非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域に挿入することができる。フレームワーク領域は、自然発生のものまたはコンセンサスフレームワーク領域、例えばヒトフレームワーク領域であり得る（ヒトフレームワーク領域の表については、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照されたい）。ある実施形態においては、フレームワーク領域とＣＤＲとの組み合わせによって生成されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えばＬＩＮＧＯ−４の少なくとも１つのエピトープに対して特異的に結合する抗体をコードする。さらなる実施形態においては、１つ以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内に形成して、例えば、抗体のその抗原への結合を改善することができる。加えて、かかる方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠損を形成し、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠失する抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドへの他の改変は、本発明によって包含され、当該技術分野の技能内である。
【０１２７】
ある実施形態においては、本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的フラグメントは、治療される動物、例えばヒトにおいて有害な免疫反応を導出することはない。一実施形態においては、当該技術分野において認識される手法を使用して、本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的フラグメントを修飾して、それらの免疫原性を低下させることができる。例えば、抗体は、形成され得るヒト化、霊長類化、脱免疫化、またはキメラ抗体であり得る。これらのタイプの抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持、または実質的に保持するが、ヒトにおいては免疫原性が低い、非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来する。これは、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域に植え付けて、キメラ抗体を生成すること、（ｂ）臨界的フレームワーク残基を保持して、または保持せずに、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ以上の少なくとも一部をヒトフレームワークおよび定常領域に植え付けること、あるいは、（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりヒト様区分でそれらを「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことを含む、様々な方法によって達成することができる。かかる方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、および米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１９０，３７０号で開示されており、これらのすべては、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
また、脱免疫化を使用しても、抗体の免疫原性を低下させることができる。本明細書で使用する「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を含む（例えば、国際公開第ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、第ＷＯ００３４３１７Ａ２号を参照されたい）。例えば、出発抗体からのＶＨおよびＶＬ配列を解析し、ヒトＴ細胞エピトープは、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の鍵となる残基に関するエピトープの位置を示す各Ｖ領域から「マッピング」される。Ｔ細胞エピトープ地図からの個別のＴ細胞エピトープを解析して、最終抗体の活性を改変するリスクの低い代替アミノ酸置換を同定する。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の代替ＶＨおよびＶＬ配列を設計し、次いで、これらの配列を一連の結合ポリペプチド、例えば本明細書で開示する診断および治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的フラグメントに組み込み、その後機能を試験する。典型的には、１２〜２４個の変異体抗体を生成し、試験する。次いで、修飾されたＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を発現ベクターにクローン化し、その後のプラスミドを抗体全体を産生するために細胞系に導入する。次いで、抗体を適切な生化学的および生物学的検定で比較し、最適な変異体を同定する。
【０１２９】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体等の、異なる動物種に由来する、分子である。キメラ抗体の産生方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６３９７号を参照されたく、これらは参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを有する、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体からの抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、改変、例えば抗原結合を改善するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基と置換される。これらのフレームワーク置換は、例えば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用をモデリングし、抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定し、特定の部分における通常でないフレームワーク残基を同定すること等の、当該技術分野において公知の方法によって同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照されたく、これらは参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）。抗体は、例えば、ＣＤＲ−植え付け（欧州特許第２３９，４００号、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたは再表面形成（欧州特許第５９２，１０６号、欧州特許第５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、ならびに鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野において既知の様々な手法を使用してヒト化することができる。
【０１３０】
組み換え抗体を生成するためのさらに別の高効率の手段が、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。具体的には、この手法は、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体の生成をもたらす。本参考文献は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本手法は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号、および第５，７５６，０９６号においても記載されており、これらのそれぞれが、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
完全にヒトである抗体は、ヒト患者の治療に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する、前述のファージディスプレイ法を含む、当該技術分野において既知の様々な方法によって形成することができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号、および第４，７１６，１１１号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／４６６４５号、第ＷＯ９８／５０４３３号、第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９８／１６６５４号、第ＷＯ９６／３４０９６号、第ＷＯ９６／３３７３５号、および第ＷＯ９１／１０７４１号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
また、ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、内因性免疫グロブリンを産生することができないヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる遺伝子導入マウスを使用して、産生することができる（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号、および第５，５８９，３６９号を参照されたく、これらのそれぞれが、参照することによって本明細書に組み込まれる）。例えば、キメラおよび生殖系突然変異マウスにおける、抗体の重鎖結合領域のホモ接合性欠損は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為または相同的組み換えによって、マウス胚幹細胞に導入することができる。代替として、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚幹細胞に導入することもできる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同的組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別々に、または同時に、非機能的にすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠損は、内因性抗体の産生を阻止する。修飾された胚幹細胞を拡大し、胚盤胞に微量注入し、キメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスを育種して、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生する。選択した抗原、例えば所望の標的ポリペプチドのすべてまたは一部分で、遺伝子導入マウスを通常の様式で免疫化する。該抗原を対象とするモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化された遺伝子導入マウスから得ることができる。遺伝子導入マウスが宿すヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、その後、クラス転換および体細胞突然変異を受ける。このようにして、かかる手法を使用して、治療的に有用であるＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するための本技術の概略については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するための本技術、ならびにかかる抗体を産生するためのプロトコルの詳細な説明については、例えば、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９６／３４０９６号、第ＷＯ９６／３３７３５号、米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、および第５，９３９，５９８号を参照されたく、これらは参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）等の企業が、前述のものに類似した技術を使用して、選択した抗原を対象とするヒト抗体の提供に従事している可能性がある。
【０１３３】
ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を生成する別の手段が、米国特許第５，８１１，５２４号に開示されており、これは、参照することによって本明細書に組み込まれる。また、これらのヒト抗体に関連する遺伝子材料も、本明細書に記載するように単離および操作し得ることが理解されるであろう。
【０１３４】
選択したエピトープを認識する完全にヒトである抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される手法を使用して生成することができる。本アプローチでは、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同一エピトープを認識する完全にヒトである抗体の選択を誘導する。（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。また、米国特許第５，５６５，３３２号も参照されたい。
【０１３５】
代替として、単鎖抗体の産生について記載される手法（米国特許第４，６９４，７７８号、Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を使用することができる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを結合することにより形成され、単鎖抗体をもたらす。また、大腸菌における機能的Ｆｖフラグメントの構築のための手法を使用することもできる（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。一本鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用され得る手法の例には、米国特許第４，９４６，７７８号、および第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）、およびＳｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）で記載されるものが含まれる。
【０１３６】
別の実施形態においては、リンパ球は、顕微操作および単離される可変遺伝子によって、選択することができる。例えば、末梢血単核球を免疫化した哺乳動物から単離し、約７日間、インビトロで培養することができる。スクリーニング基準を満たす特定の特異的ＩｇＧについて、培養物をスクリーニングすることができる。陽性ウェルからの細胞を単離することができる。個別のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳにより、あるいはそれらを補体媒介溶血プラーク検定で同定することによって、単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞を管の中に顕微操作することができ、例えばＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクターにクローン化し、発現のために細胞（例えば真核性または原核細胞）に形質移入することができる。
【０１３７】
代替として、当業者に公知の手法を使用して、抗体産生細胞系を選択および培養することができる。かかる手法は、様々な実験室便覧および主要な発行物に記載されている。この点に関して、以下に記載する本発明における使用に好適な手法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されており、これは、参照することによって補足を含むその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
本明細書で開示する治療方法において使用される抗体は、抗体を合成するための当該技術分野において既知である任意の方法、特に、化学合成または本明細書に記載する組み換え発現手法により、産生することができる。
【０１３９】
さらに、本発明の範囲が、抗原結合ＤＮＡ配列のすべての対立遺伝子、変異体、および突然変異をさらに包含することが理解されるであろう。
【０１４０】
一実施形態においては、公知の方法に従い、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、同時または別々のいずれかで、抗体軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを形成することができる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づく、より特異的なプライマーによって開始することができる。また、上で説明したように、ＰＣＲを使用して、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することができる。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマー、またはマウス定常領域プローブ等のより大きな相同プローブによってスクリーニングすることができる。
【０１４１】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、当該技術分野において既知の手法を使用して細胞から単離することができ、例えば、組み換えＤＮＡ手法に関連する前述の参考文献に詳細に記載される標準的な公知の手法に従って、制限マッピングおよび配列決定することができる。当然ながら、ＤＮＡは、単離過程またはその後の解析の間の任意の時点において、本発明に従う合成のものであり得る。
【０１４２】
抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは類似体、例えば、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖の組み換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構成を必要とする。本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその一部分（例えば重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を産生するためのベクターは、当該技術分野において公知の手法を使用する組み換えＤＮＡ技術によって産生することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法を、本明細書に記載する。当業者に公知の方法を使用して、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構成することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ手法、合成的手法、およびインビボ遺伝子組み換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモータに操作可能に結合された、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７号、国際公開第ＷＯ８９／０１０３６号、および米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のためのそのようなベクターにクローン化することができる。
【０１４３】
発現ベクターは、従来の手法により宿主細胞に移され、次いで、本明細書に記載する方法において使用される抗体を産生するために、形質移入した細胞を従来の手法により培養する。したがって、本発明は、異種プロモータに操作可能に結合する、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二重鎖抗体を発現するためのある実施形態においては、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体を発現するために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、宿主細胞において同時発現させることができる。
【０１４４】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書のいずれかの箇所に記載する方法において使用される抗体分子を発現することができる。
【０１４５】
本発明の、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクター、および軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターの、２つの発現ベクターで、宿主細胞を共形質移入することができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有し得る。代替として、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用することもできる。かかる状況においては、軽鎖を有利に重鎖の前に配置し、過剰な毒性遊離重鎖を回避する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０１４６】
本発明の抗体分子が組み換えによって発現されると、例えば、クロマトグラフィ（例えばイオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対する親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、示差溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的手法による、免疫グロブリン分子を精製するための、当該技術分野において既知である任意の方法によって精製することができる。代替として、本発明の抗体の親和性を増加するための方法が、米国特許第ＵＳ２００２０１２３０５７Ａ１号に開示されている。
【０１４７】
一実施形態においては、本発明の方法において使用される結合分子または抗原結合分子は、１つ以上のドメインが部分的または全体において欠損している合成定常領域を含む（「ドメイン欠損抗体」）。ある実施形態においては、同等の修飾された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されている、ドメイン欠損コンストラクトまたは変異体を含む（ΔＣＨ２コンストラクト）。他の実施形態については、短い連結ペプチドを欠損したドメインの代わりに置換し、可変領域に柔軟性および運動の自由度を提供することができる。当業者は、かかるコンストラクトが、抗体の異化率に対するＣＨ２ドメインの調節特性のために、ある状況下では望ましくあり得ることを理解するであろう。
【０１４８】
ある実施形態においては、本明細書で開示する方法において使用される修飾された抗体は、ミニボディである。ミニボディは、当該技術分野における、記載される方法を使用して形成することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号または国際公開第ＷＯ９４／０９８１７Ａ１号を参照されたい）。
【０１４９】
別の実施形態においては、本明細書で開示する方法において使用される修飾された抗体は、当該技術分野において既知であるＣＨ２ドメイン欠損抗体である。ドメイン欠損コンストラクトは、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えばＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄからの）を使用して得ることができる（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照されたい）。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインを欠損し、ドメイン欠損ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように操作されている。
【０１５０】
一実施形態においては、本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体、またはそのフラグメントは、単量体サブユニット間の会合を可能にする限り、小数の、または単一ですらあるアミノ酸の欠損または置換を有する、免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択した領域における単一アミノ酸の突然変異が、Ｆｃ結合を実質的に減少させ、それにより腫瘍局在性を増加するために十分であり得る。同様に、調節すべきエフェクタ機能（例えば補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインのその一部を単に削除することが望ましくあり得る。定常領域のかかる部分的欠損は、対象の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を無傷で残しつつ、抗体の選択した特性（血清半減期）を改善することができる。さらに、上記で暗に示したように、開示される抗体の定常領域は、得られたコンストラクトの特性を増強する、１つ以上のアミノ酸の突然変異または置換を通じた合成のものであり得る。この点に関して、修飾された抗体の配置および免疫原性特性を実質的に維持しながら、保存された結合部位（例えばＦｃ結合）によって提供される活性を混乱させることが可能であり得る。さらに他の実施形態は、エフェクタ機能等の望ましい特性を強化するか、あるいはより多くの細胞毒素または炭水化物付着を提供するための、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。かかる実施形態においては、選択した定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製することが望ましくあり得る。
【０１５１】
また、本発明は、抗体またはそのフラグメントがＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドに免疫特異的に結合する、本明細書に記載する変異体（誘導体を含む）、もしくは抗体分子（例えばＶＨ領域および／またはＶＬ領域）を含む、それらから本質的に成る、またはそれらから成る、抗体の使用を提供する。当業者に既知である標準的手法を使用して、限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発を含む、結合分子をコードするヌクレオチド配列における突然変異を導入することができる。様々な実施形態において、変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３に対して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、同様の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基と置換する、置換である。同様の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。代替として、飽和突然変異誘発等により、コード配列のすべてまたは一部に沿って無作為に突然変異を導入することができ、得られた突然変異体を生物活性についてスクリーニングし、活性を保持する突然変異体を同定することができる。
【０１５２】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみ、またはＣＤＲ領域のみに、突然変異を導入することが可能である。導入される突然変異は、無変化または中立的なミスセンス突然変異であり得、すなわち、抗原を結合する抗体の能力に対して効果を有しないか、あるいはほとんど有しない。これらのタイプの突然変異は、コドン使用頻度の最適化、またはハイブリドーマの抗体産生の改善に有用であり得る。代替として、非中立的なミスセンス突然変異は、抗体の抗原を結合する能力を改変することができる。これは絶対要件ではないが、ほとんどの無変化または中立的なミスセンス突然変異の位置は、フレームワーク領域内である可能性が高く、一方ほとんどの非中立的ミスセンス突然変異の位置は、ＣＤＲ内である可能性が高い。当業者は、抗原結合活性を改変しない、または結合活性を改変する（例えば抗原結合活性の改善、または抗体特異性の変更）等の、所望の特性を持つ突然変異分子を設計し、試験することができるであろう。突然変異誘発後、コードされたタンパク質をルーチン的に発現させることができ、本明細書に記載する手法を使用して、あるいは当該技術分野において既知である手法をルーチン的に修正することにより、コードされたタンパク質の機能的および／または生物的活性を判定することができる。
【０１５３】
融合ポリペプチドおよび抗体
本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドおよび抗体は、非相同ポリペプチドのＮまたはＣ末端にさらに組み換えによって融合することができる。例えば、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、検出検定において標識として有用な分子、および非相同ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素等のエフェクタ分子に対して、組み換えによって融合または共役することができる。例えば、国際公開第ＷＯ９２／０８４９５号、第ＷＯ９１／１４４３８号、第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、および欧州特許第３９６，３８７号を参照されたい。
【０１５４】
本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド等量式によって、互いに結合したアミノ酸で構成することができ、２０遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。
【０１５５】
本発明は、ＬＩＮＧＯ−４の機能を阻害する、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体融合を含む、該融合から本質的に成る、または該融合から成る、融合タンパク質を提供する。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドもしくは抗体が融合される非相同ポリペプチドは、機能的に有用であるか、またはＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体を標的にするために有用である。本発明のある実施形態においては、本明細書に記載する可溶性ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチド、例えば、ＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、もしくは細胞外ドメイン全体を含むＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド（配列番号２のアミノ酸３４〜５３２に相当する）、または任意の他のＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、非相同ポリペプチド部分に融合されて、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト融合ポリペプチドを形成する。ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト融合タンパク質および抗体を使用して、様々な目的、例えば、血清半減期の増加、バイオアベイラビリティの改善、特定の臓器または組織タイプへのインビボ標的、組み換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、精製の容易化、およびより高い親和力を達成することができる。達成すべき目的に応じて、非相同部分は、不活性であるか、または生物活性であり得る。また、インビトロまたはインビボで、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に対して安定に融合されるか、または切断可能であるかを選択することができる。これらの他の目的を達成するための非相同部分は、当該技術分野において既知である。
【０１５６】
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト融合ポリペプチドまたは抗体の発現の代替として、選択した非相同部分を事前に形成し、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に対して化学的に共役することができる。大部分の場合において、選択した非相同部分は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に対して融合されるか、または共役されるかにかかわらず、同様に機能する。したがって、以下の非相同アミノ酸配列の説明において、別様に記載されない限り、非相同配列は、融合タンパク質の形態、または化学的共役体として、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に結合され得るものとして理解されたい。
【０１５７】
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体等の薬理活性のポリペプチドは、しばしば急速なインビボクリアランスを呈し、体内で治療上有効な濃度を達成するために大量摂取を必要とする結果となる。加えて、約６０ｋＤａより小さいポリペプチドは、糸球体ろ過を経る可能性があり、腎臓毒性に至る場合がある。ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体等の比較的小さいポリペプチドの融合または共役を用いて、かかる腎臓毒性のリスクを低減または回避することができる。様々な非相同アミノ酸配列、すなわち、治療ポリペプチドのインビボ安定性、すなわち、血清半減期を増加させるためのポリペプチド部分または「担体」が知られている。
【０１５８】
その長い半減期、広範なインビボ分散、および酵素または免疫機能の欠失のために、本質的に全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＨＳＡフラグメントが、非相同部分として一般に使用される。Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）において教示されるもの等の方法および材料の適用により、ＨＳＡを使用して、ＬＩＮＧＯ−４部分に基づいて薬理活性を表示する一方で、有意に高い、例えば、１０倍から１００倍高いインビボ内安定性を示す、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト融合ポリペプチドもしくは抗体、またはポリペプチド／抗体共役体を形成することができる。ＨＳＡのＣ末端は、可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分のＮ末端に融合することができる。ＨＳＡは自然に分泌されるタンパク質であるため、融合タンパク質が真核発現系、例えば、哺乳動物の発現系において産生される場合、ＨＳＡシグナル配列を利用して、細胞培養基への可溶性ＬＩＮＧＯ−４融合タンパク質の分泌を得ることができる。
【０１５９】
ある実施形態においては、本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、標的部分をさらに含む。標的部分は、体の特定の部分、例えば、脳またはその分室に局在性を導くタンパク質またはペプチドを含む。ある実施形態においては、本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、脳標的部分に付着するか、または融合される。脳標的部分は、共有結合されるか（例えば、直接翻訳融合、または任意で切断可能な直接またはスペーサ分子を通じた化学結合）、または非共有結合される（例えば、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、ＩｇＧ等の可逆的相互作用を通して）。他の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、１つ以上の脳標的部分に付着する。さらなる実施形態においては、脳標的部分は、本発明の方法において使用される複数のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に付着する。
【０１６０】
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に関連する脳標的部分は、かかるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の脳送達を強化する。タンパク質または治療薬に融合される場合に、血液脳障壁（ＢＢＢ）を通してタンパク質または治療薬を送達する、多数のポリペプチドが説明されている。非限定的な例には、単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４）、ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体であるｍＡＢ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６）、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合するＢ２、Ｂ６、およびＢ８ペプチド（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６）、トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０）、および米国特許第６，３０６，３６５号の配列番号１−１８が挙げられる。上記参照文献の内容は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
強化されたＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト組成物の脳送達は、当該技術分野において十分に確立された多数の手段によって測定される。例えば、脳標的部分に結合した、放射活性的に、酵素的に、または蛍光的に、標識されたＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体を動物に投与し、脳局在化を決定し、および、脳標的部分に関連しない等量の放射活性物質で標識したＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体と局在化とを比較する。強化した標的を決定する他の手段は、上記の参考文献に記載されている。
【０１６２】
シグナル配列は、小胞体の膜を越えてタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合を構成するために有用なシグナル配列には、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））が含まれる。代替として、他のシグナル配列を使用することができる。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照されたい。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって、小胞体のルーメンにおいて切断する。これは、Ｆｃ領域および可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分を含有する免疫融合の分泌を生じる。
【０１６３】
一部の実施形態においては、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分との間のタンパク質分解的切断部位をコードし得る。かかる切断部位は、例えば、コードした融合タンパク質のタンパク質分解的切断を提供し得、これにより、Ｆｃドメインを標的タンパク質から分離する。有用なタンパク質分解的切断部位には、トリプシン、プラスミン、トロンビン、Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼＫ等のタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列が含まれる。
【０１６４】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み込むことができる。有用なベクターには、直鎖核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド等が含まれる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、そこでは、免疫融合ＤＮＡの転写が、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサおよびプロモータの制御下で配置される。例えば、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）、およびＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照されたい。適切な宿主細胞は、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換または形質移入することができ、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの発現および分泌に使用することができる。典型的に使用される宿主細胞には、不死のハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＣＯＳ細胞が含まれる。
【０１６５】
一実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、ヒンジおよびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分に融合される。ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃ融合の潜在的な利点には、溶解性、インビボ安定性、および多価性、例えば二量体化が含まれる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ  Ｆｃ領域であり得る（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。代替として、ＩｇＥまたはＩｇＭ  Ｆｃ領域であり得る（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）。例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域等のＩｇＧ  Ｆｃ領域が一般に使用される。一実施形態においては、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に定義するパパイン切断部位のすぐ上流でヒンジ領域において開始する配列（すなわち、残基２１６であり、Ｋａｂａｔシステムに従って、重鎖定常領域の第１の残基を１１４とする）、または他の免疫グロブリンの類似部位を融合に使用する。融合を行う正確な部位は重要ではなく、特定の部位がよく知られており、分子の生物活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択することができる。Ｆｃ融合をコードするＤＮＡを構成および発現するための材料および方法は、当該技術分野において既知であり、過度の実験を行わずに可溶性ＬＩＮＧＯ−４融合を得るために適用することができる。本発明の一部の実施形態は、Ｃａｐｏｎらの米国特許第５，４２８，１３０号および第５，５６５，３３５号に記載されるＬＩＮＧＯ−４融合タンパク質を用いる。
【０１６６】
一部の実施形態においては、完全に無傷の野生型Ｆｃ領域は、本発明の方法において使用されるＦｃ融合タンパク質に不要かつ所望されない場合があるエフェクタ機能を示す。したがって、特定の結合部位は、分泌カセットの構成中に、Ｆｃ領域から削除することができる。例えば、軽鎖との同時発現は不要であるため、重鎖結合タンパク質、Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））の結合部位は、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから削除され、この部位が免疫融合の効率的な分泌を干渉しないようにする。ＩｇＭにおいて存在するもの等の膜貫通ドメイン配列も、一般的に削除される。
【０１６７】
ある実施形態においては、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を使用する。代替として、免疫グロブリンγの他のサブクラス（γ−２、γ−３、およびγ−４）のＦｃ領域を分泌カセットにおいて使用することができる。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域には、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部が含まれる。一部の実施形態においては、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２を削除したＦｃであり、ヒンジ領域およびＣＨ３領域の一部を含むが、ＣＨ２領域は含まない。ＣＨ２を削除したＦｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）によって説明されている。一部の実施形態においては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域を使用する。
【０１６８】
ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃ融合タンパク質は、幾つかの異なる構成で構築することができる。１つの構成において、可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分のＣ末端は、Ｆｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合される。わずかに異なる構成において、短鎖ポリペプチド、例えば、２〜１０アミノ酸は、可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端との間の融合に組み込まれる。かかるリンカーは、立体配座の柔軟性を提供し、一部の状況において、生物活性を改善し得る。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分に維持される場合、ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃ融合は二量体化し、したがって、二価分子を形成する。単量体Ｆｃ融合の相同集団は、単一特異的な二価二量体を産出する。それぞれ異なる特異性を有する２つの単量体Ｆｃ融合の混合物は、二重特異性二価二量体を産出する。
【０１６９】
可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドは、非相同ペプチドに融合して、可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分の精製または同定を促進することができる。例えば、ヒスチジンタグを可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドに融合し、市販のクロマトグラフ培地を使用して、精製を促進することができる。
【０１７０】
「リンカー」配列とは、融合タンパク質における２つのポリペプチドコード領域を分離する、一連の１つ以上のアミノ酸である。典型的なリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸を含む。さらなるリンカーは、少なくとも１０または少なくとも１５個のアミノ酸を含む。ある実施形態においては、ペプチドリンカーのアミノ酸は、リンカーが親水性になるように選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（Ｇ４Ｓ）３（配列番号５）は、十分な柔軟性を提供するため、多数の抗体に広く適用可能な好ましいリンカーである。他のリンカーには、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（Ｇ４Ｓ）２（配列番号６）、Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号７）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ
Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ（配列番号８）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ（配列番号９）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐ（配列番号１０）、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号１１）、Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ（配列番号１２）、およびＧｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ（配列番号１３）が含まれる。より短いリンカーの例には上記リンカーのフラグメントが含まれ、より長いリンカーの例には上記リンカーの組み合わせ、上記リンカーのフラグメントの組み合わせ、および上記リンカーと上記リンカーのフラグメントとの組み合わせが含まれる。
【０１７１】
本発明のＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドを、ポリペプチドタグに融合することができる。本明細書で使用する「ポリペプチドタグ」という用語は、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドに付着、接続、または結合することができ、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドを同定、精製、濃縮、または単離するために使用することができる、アミノ酸の任意の配列を意味することが意図される。ポリペプチドタグのＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドへの付着は、例えば、（ａ）ポリペプチドタグをコードする核酸配列、および（ｂ）ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子を構成することにより生じ得る。例示的なポリペプチドタグには、例えば、翻訳後に修飾され得るアミノ酸配列、例えばビオチン化されたアミノ酸配列が含まれる。他の例示的なポリペプチドタグには、例えば、抗体（もしくはそのフラグメント）、または他の特異的結合試薬によって認識および／または結合され得るアミノ酸配列が含まれる。抗体（もしくはそのフラグメント）、または他の特異的結合試薬によって認識され得るポリペプチドタグには、例えば、「エピトープタグ」のような当該技術分野において既知のものが含まれる。エピトープタグは、天然または人工のエピトープタグであり得る。天然および人工のエピトープタグは、当該技術分野において既知であり、例えば、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ、またはポリヒスチジンペプチド等の人工エピトープが含まれる。ＦＬＡＧペプチドには、配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１４）、またはＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１５）が含まれる（Ｅｉｎｈａｕｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：１−３：４５５−４６５（２００１））。Ｓｔｒｅｐエピトープは、配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１６）を有する。また、ＶＳＶ−Ｇエピトープも使用することができ、配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号１７）を有する。もう１つの人工エピトープは、６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）を有するポリＨｉｓ配列（配列番号１８）である。自然発生のエピトープには、モノクローナル抗体１２ＣＡ５によって認識される、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号１９）（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：１７０−１７９（１９９５））、およびモノクローナル抗体９Ｅ１０によって認識される、ヒトｃ−ｍｙｃ（Ｍｙｃ）からの１１アミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号２０）（Ｍａｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６２：１２９−１３４（１９９５））が含まれる。もう１つの有用なエピトープは、モノクローナル抗体ＹＬ１／２によって認識されるトリペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ���ある（Ｓｔａｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８３：２９８−３０２（１９９１））。
【０１７２】
ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドとポリペプチドタグとを、結合アミノ酸配列を介して接続することができる。本明細書で使用する「結合アミノ酸配列」は、１つ以上のプロテアーゼによって認識および／または切断され得るアミノ酸配列であり得る。１つ以上のプロテアーゼによって認識および／または切断され得るアミノ酸配列は、当該技術分野において既知である。例示的なアミノ酸配列は、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、Ｘａ因子、ＡＰＣ、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、カテプシンＧ、レニン、アンジオテンシン変換酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ）、マクロファージエラスターゼ、Ｃｉｒ、およびＣｉｓのプロテアーゼによって認識されるものである。前述のプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列は、当該技術分野において既知である。特定のプロテアーゼによって認識される例示的な配列は、例えば米国特許第５，８１１，２５２号に見出すことができる。
【０１７３】
本発明の一部の実施形態においては、可溶性ＬＩＮＧＯ−４融合コンストラクトを使用して、細菌中の可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分の産生を強化する。かかるコンストラクトにおいて、通常、高レベルで発現および／または分泌される細菌タンパク質を、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして用いる。例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）、Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）を参照されたい。
【０１７４】
好適な融合パートナーのアミノおよびカルボキシ末端において、可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分を融合することにより、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドの二価または四価形態を得ることができる。例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分をＩｇ部分のアミノおよびカルボキシ末端と融合し、２つの可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分を含有する二価単量体ポリペプチドを産生することができる。かかる２つの単量体を二量体化する際に、Ｉｇ部分によって、四価形態の可溶性ＬＩＮＧＯ−４タンパク質が得られる。かかる多価形態を使用して、標的に対する高い結合親和性を達成することができる。可溶性ＬＩＮＧＯ−４の多価形態は、可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分を縦一列に配置することによって取得し、コンカテマーを形成することもでき、それは、単独で用いるか、ＩｇまたはＨＳＡ等の融合パートナーに融合することができる。
【０１７５】
ＬＩＮＧＯ−４共役体
本明細書で開示する治療方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、修飾される誘導体、すなわち、共有結合によってＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体がＬＩＮＧＯ−４の生物学的機能を阻害することがないような任意の種類の分子の共有結合によって修飾される、誘導体を含む。例としてであって、限定する目的ではないが、本発明のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ付加、ホスフィル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合等によって修飾され得る。多数の化学修飾のいずれも、限定されないが、特定の化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む既知の手技によって実行され得る。加えて、該誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０１７６】
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、翻訳後プロセシング等の自然過程、または当該技術分野において公知の化学修飾手法によって、修飾することができる。かかる修飾は、基本的教科書、およびより詳細な論文、ならびに膨大な研究文献において、十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ酸もしくはカルボキシル末端、または炭水化物等の部分上を含む、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の任意の位置で起こり得る。同一タイプの修飾が、特定のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体内の複数部位において、同一または異なる程度で存在し得ることを理解されたい。また、特定のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、多くのタイプの修飾を含み得る。ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、例えばユビキチン化の結果として分岐され得、分岐を伴って、あるいは分岐を伴わずに環状であり得る。環状、分岐、および分岐環状ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、翻訳後自然過程の結果として生じ得るか、または合成方法によって形成され得る。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル反応、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ付加、タンパク質分解プロセシング、リン酸化反応、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質に対するトランスファーＲＮＡ媒介アミノ酸付加、およびユビキチン化を含む。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ  １−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。
【０１７７】
対応するアミノ反応基およびチオール反応基を含有する多数の架橋剤のいずれをも使用して、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドを異種融合パートナーに結合させることができる。好適なリンカーの例は、チオール反応マレイミドを挿入するアミン反応架橋剤、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、およびＧＭＢＳを含む。他の好適なリンカーは、チオール反応ハロ酢酸基、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢを挿入する。スルフヒドリル基と反応させて縮小可能な結合を産生するための保護または非保護チオールを提供するリンカーは、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、およびＳＡＴＰを含む。かかる試薬は市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【０１７８】
共役は、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を伴う必要はない。例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−４−アルブミン融合は、遺伝子工学手法を使用して得ることができ、可溶性ＬＩＮＧＯ−４部分は、そのＮ末端、Ｃ末端、または両方において血清アルブミン遺伝子に融合される。
【０１７９】
本発明の一部の実施形態は、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはＬＩＮＧＯ−４抗体を伴い、１つ以上のポリマーがＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたは抗体に共役（共有結合）される。かかる共役に好適なポリマーの例には、ポリペプチド（上述）、糖ポリマー、およびポリアルキレングリコール鎖が含まれる。典型的には、溶解性、安定性、またはバイオアベイラビリティのうちの１つ以上を改善する目的で、ポリマーを可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはＬＩＮＧＯ−４抗体に共役するが、必ずしもそうではない。
【０１８０】
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に対する共役に概して使用されるポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４、または５ＰＥＧポリマーは、それぞれＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に共役して、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体単独と比較して、血清半減期を増大させることができる。ＰＥＧ部分は、非抗原的であり本質的に生物不活性である。本発明の実践において使用されるＰＥＧ部分は、分岐または非分岐であり得る。
【０１８１】
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に付着したＰＥＧ部分の数、および個別のＰＥＧ鎖の分子量は異なり得る。概して、ポリマーの分子量が高いほど、ポリペプチドに付着したポリマー鎖が少ない。通常、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に付着した総ポリマー質量は、２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。したがって、１つのポリマー鎖が付着する場合、鎖の分子量は、概して２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖が付着する場合、各鎖の分子量は、概して１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖が付着する場合、分子量は、概して７〜１４ｋＤａである。
【０１８２】
例えば、ＰＥＧ等のポリマーは、ポリペプチド上の任意の好適な露出反応基を通して、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に結合することができる。露出反応基は、例えば、内部リジン残基のＮ末端アミノ基もしくはエプシロンアミノ基、または両方であり得る。活性ポリマーは、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体上の任意の遊離アミノ基において反応および共有結合することができる。また、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の遊離カルボキシル基、適切に活性したカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化カーボハイドレート部分、およびメルカプト基（入手可能な場合）を、ポリマー付着のための反応基として使用することもできる。
【０１８３】
共役反応において、典型的には、ポリペプチドのモル当たり約１．０から約１０モルの活性ポリマーが、ポリペプチド濃度に依存して用いられる。通常、選択した比率は、反応を最大にする一方で、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の所望の薬理活性を損ない得る副作用（非特異性である場合が多い）を最小にするバランスを示す。ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の生物活性（例えば、本明細書に記載する、または当該技術分野において既知である任意の検定において示される）の少なくとも５０％が保持される。さらなる実施形態においては、ほぼ１００％が保持される。
【０１８４】
ポリマーは、従来の化学反応を使用して、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に共役することができる。例えば、ポリアルキレングリコール部分は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体のリジンエプシロンアミノ基に結合することができる。リジン側鎖への結合は、ＰＥＧコハク酸スクシニミジル（ＳＳ−ＰＥＧ）およびプロピオン酸スクシニミジル（ＳＰＡ−ＰＥＧ）等のＮヒドロキシルスクシニミド（ＮＨＳ）活性エステルを用いて行うことができる。好適なポリアルキレングリコール部分には、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが含まれる。これらの試薬は市販されている。追加のアミン反応ＰＥＧリンカーは、スクシニミジル部分と置換することができる。これらは、例えば、イソチオシアン酸、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、炭酸ベンゾトリアゾール、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、および炭酸ＰＮＰを含む。通常、条件を最適化して、反応の選択性および程度を最大化する。反応条件のかかる最適化は、当該技術分野における通常技術の範囲内である。
【０１８５】
ＰＥＧ付加は、当該技術分野において既知の任意のＰＥＧ付加反応によって実行することができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）、ならびに欧州特許出願第０１５４３１６号および第０４０１３８４号を参照されたい。ＰＥＧ付加は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似する反応水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を使用して実行することもできる。
【０１８６】
アシル化によるＰＥＧ付加は、概してポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させるステップを含む。任意の反応性ＰＥＧ分子をＰＥＧ付加に用いることができる。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）にエステル化したＰＥＧは、頻繁に使用される活性ＰＥＧエステルである。本明細書で使用する「アシル化」は、限定されないが、治療タンパク質とＰＥＧ等の水溶性ポリマーとの間の、アミド、カルバミン酸、ウレタン等の種類の結合を含む。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照されたい。反応パラメータは、概して、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドを損傷または不活性化する温度、溶媒、およびｐＨ状態を回避するように選択される。
【０１８７】
概して、接続結合は、アミドであり、典型的には、得られた産物の少なくとも９５％は、モノ−、ジ−、またはトリ−ＰＥＧ付加される。しかしながら、より高い段階のＰＥＧ付加を有する一部の種は、使用される特異的反応条件に依存した量で形成され得る。任意で、精製したＰＥＧ付加種は、例えば、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、疎水性交換クロマトグラフィ、および電気泳動法を含む従来の精製方法によって、混合物、特に未反応の種から分離される。
【０１８８】
アルキル化によるＰＥＧ付加は、概して、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体と反応させるステップを含む。加えて、反応条件を操作して、実質的にＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基のみにおけるＰＥＧ付加、すなわちモノ−ＰＥＧ付加タンパク質のみに対する好適な条件を提供する。モノ−ＰＥＧ付加またはポリ−ＰＥＧ付加のいずれの場合においても、ＰＥＧ基は、典型的には、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に付着する。特に−ＣＨ２−基を参照して、この種類の結合は、「アルキル」結合として知られる。
【０１８９】
Ｎ末端標的モノ−ＰＥＧ付加産物を産生するための還元アルキル化による誘導体化は、誘導体化に使用可能な異なるタイプの一次アミノ基（リジン対Ｎ末端）を利用する。反応は、リジン残基のエプシロン−アミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基とのｐＫａ差の利用を可能にするｐＨで行う。かかる選択的誘導体化によって、アルデヒド等の反応基を含有する水溶性ポリマーのタンパク質への付着を制御し、ポリマーとの共役は、主にタンパク質のＮ末端で生じ、リジン側鎖アミノ基等の他の反応基の有意な修飾は生じない。
【０１９０】
アシル化およびアルキル化アプローチの両方において使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されたポリマーは、典型的には、アシル化の場合は活性エステルまたはアルキル化の場合はアルデヒド等の単一反応基を有するように修飾し、本方法において提供されるように重合の程度を制御できるようにする。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは耐水性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであるか、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓらの米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。ポリマーは分岐であるか、または非分岐であり得る。アシル化反応の場合、選択されるポリマーは、典型的には、単一反応性エステル基を有する。還元アルキル化の場合、選択されるポリマーは、典型的には、単一反応性アルデヒド基を有する。概して、水溶性ポリマーは、通常、哺乳動物の組み換え発現系によってより簡便に形成されるため、自然発生するグリコシル残基から選択されない。
【０１９１】
ＰＥＧ付加可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたは抗体を調製するための方法は、概して、（ａ）分子が１つ以上のＰＥＧ基に付着する状況下で、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体をポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体等）と反応させるステップと、（ｂ）反応産物を取得するステップと、を含む。概して、アシル化反応のための最適反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、個別に決定される。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの比率が大きいほど、概して、ポリＰＥＧ付加産物の割合（％）が大きくなる。
【０１９２】
モノポリマー／可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはＬＩＮＧＯ−４抗体の実質的に相同の集団を産生するための還元アルキル化は、概して、（ａ）還元アルキル化条件下、ポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能にするために好適なｐＨで、可溶性ＬＩＮＧＯ−４タンパク質またはポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と反応させるステップと、（ｂ）反応産物を取得するステップと、を含む。
【０１９３】
モノポリマー／可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたはＬＩＮＧＯ−４抗体の実質的に相同の集団の場合、還元アルキル化反応条件は、ポリペプチドまたは抗体のＮ末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的付着を可能にする条件である。かかる反応条件は、概して、リジン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基間のｐＫａ差を提供する。本発明の目的のために、ｐＨは、概して、３〜９、典型的には３〜６の範囲である。
【０１９４】
可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたは抗体は、例えば、タンパク質分解によってその後放出され得る部分等のタグを含み得る。したがって、リジン部分は、最初にリジンおよびＮ末端の両方と反応するＴｒａｕｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）等の低分子量リンカーで修飾したＨｉｓタグを反応させ、次いでＨｉｓタグを放出することによって、選択的に修飾することができる。その後、ポリペプチドは、マレイン酸、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、または遊離もしくは保護ＳＨ等のチオール反応性頭部基を含有するＰＥＧで選択的に修飾され得る遊離ＳＨ基を含有する。
【０１９５】
Ｔｒａｕｔ試薬は、ＰＥＧ付着のための特定部位を設定する任意のリンカーと置換することができる。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と置換することができる。同様に、タンパク質を、マレイミド（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ、得られた産物を、遊離ＳＨを含有するＰＥＧと反応させることができる。
【０１９６】
一部の実施形態においては、ポリアルキレングリコール部分は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体のシステイン基に結合される。結合は、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、またはチオール基を使用して達成することができる。
【０１９７】
任意で、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたは抗体は、不安定結合を通してポリエチレン−グリコール部分に共役される。不安定結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解、またはスルフヒドリル切断において切断することができる。例えば、結合は、インビボ（生理的）条件下で切断することができる。
【０１９８】
反応基がＮ末端におけるαアミノ基上にある場合、反応は、概して約ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ５、６、７、または８において、生物活性のある材料を不活性ポリマーと反応させるために使用される任意の好適な方法で起こり得る。概して、過程は、活性ポリマーを調製するステップと、その後にタンパク質を活性ポリマーと反応させて、製剤に好適な可溶性タンパク質を産生するステップと、を含む。
【０１９９】
ＬＩＮＧＯ−４ポリヌクレオチドアンタゴニスト
特定の実施形態は、脱髄または髄鞘形成不全疾患を治療するための方法であって、該方法は、ＬＩＮＧＯ−４をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含む、有効量のＬＩＮＧＯ−４ポリヌクレオチドアンタゴニストを投与するステップを含む。ＬＩＮＧＯ−４ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−４の発現を阻止する（ノックダウン）。本発明のある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４ポリヌクレオチドアンタゴニストは、例えば哺乳動物における、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するか、ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成を促進するか、または脱髄を阻止する。ＬＩＮＧＯ−４ポリヌクレオチドアンタゴニストには、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、そのような結合分子は動物に別々に投与されるが（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照されたい）、そのような結合分子を、宿主細胞に取り込まれ、インビボで発現するポリヌクレオチドからインビボで発現することもできる。また、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）も参照されたい。
【０２００】
ＲＮＡｉとは、標的ｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）を介する特定のｍＲＮＡ（例えばＬＩＮＧＯ−４）との相互作用によって標的遺伝子の発現を抑制する。そして、ｄｓＲＮＡ複合体を細胞による分解の標的にする。さらなるＲＮＡｉ分子には、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（短鎖干渉ヘアピンとも）が含まれる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループで接続された標的遺伝子からのセンスおよびアンチセンス配列を含有する。ｓｈＲＮＡは核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡとともに分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＵ６プロモータを使用して、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現することができる。
【０２０１】
ＲＮＡｉは、それらの「標的」ｍＲＮＡに対して配列特異的相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１）。ショウジョウバエ細胞を含まない可溶化物における生化学的研究は、ＲＮＡ依存性遺伝子発現抑制の媒介物が、２１〜２５ヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）であることを示している。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は本発明の方法において有利に使用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲとして知られるＲＮアーゼによるｄｓＲＮＡのプロセシングから得られる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１）。ｓｉＲＮＡ二重鎖産物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と称される多タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体に動員されると思われる。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡに誘導され、ｓｉＲＮＡ二重鎖が配列特異的に相互作用し、触媒的な様式で切断を媒介すると考えられる。（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１、Ｂｏｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，２００１）。
【０２０２】
ＲＮＡｉは、遺伝子機能を解析し、哺乳動物細胞における必須遺伝子を同定するために使用されており（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３，２００２、Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−４５６５，２００１）、非限定的な例のニューロンによるものが含まれる（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−１１９２９，２００２）。また、ＲＮＡｉは、限定されないが、ポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３７９−３８０，２００２）およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５１９６−５２０１，２００２）を含むウイルスの感染、複製、および／または成長の阻害またはブロック、ならびに癌遺伝子の発現の減少（例えばｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子、Ｓｃｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｐ２６  ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，２００２）等の治療様式について評価される。ＲＮＡｉは、哺乳類（マウス）および両生類（ツメガエル）の胚（それぞれＣａｌｅｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９９：１４２３６−１４２４０，２００２、およびＺｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６６４−１６６９，２００２）、および出生後マウス（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２：１０７−１０８，２００２）における遺伝子発現の調節、ならびに成体遺伝子導入マウスにおける導入遺伝子発現の減少に、使用されている（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９，２００２）。細胞培養およびインビボにおけるｓｉＲＮＡの有効性および特異性を決定するための方法が、説明されている（例えば，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９６：１０００−１００４，２００２、Ｌａｓｓｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２（１４７）：ＰＬ１３，２００２、およびＬｅｉｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９５：７４４−７４８，２００２を参照されたい）。
【０２０３】
限定されないが、ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉを媒介する分子は、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９，２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，２００２）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，２００２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，２００２）、および大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩ等のヌクレアーゼを使用した二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，２００２）により、インビトロで産生することができる。
【０２０４】
また、ｓｉＲＮＡ分子は、２つのオリゴヌクレオチドを互いにアニールすることによって形成することもでき、典型的には、二本鎖および一本鎖部分の両方を含む、以下の一般構造を有する。
【０２０５】
【化１】
2014055186.tif 000011
式中、Ｎ、Ｘ、およびＹはヌクレオチドであり、ＸはＹに水素結合し、「：」は２つの塩基の間の水素結合を示し、ｘは１〜約１００の値を有する自然数であり、ｍおよびｎは独立して０〜約１００の値を有する全整数である。一部の実施形態においては、Ｎ、Ｘ、およびＹは独立してＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴまたはＵである。自然発生ではない塩基およびヌクレオチドが、特に合成ｓｉＲＮＡ（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドのアニールの産物）の場合、存在し得る。二本鎖の中央区分は「コア」と称され、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有し、一本鎖部分は測定単位としてヌクレオチド（ｎｔ）を有するオーバーハングである。示されるオーバーハングは３’オーバーハングであるが、５’オーバーハングを有する分子も本発明の範囲内である。また、オーバーハングを有しないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）、およびコアの片側にはオーバーハングを有するが、もう一方の側には有しないもの（例えば、ｍ＝０およびｎ＞１、またはその逆もまた同様）も本発明の範囲内である。
【０２０６】
当初、ＲＮＡｉ技術は、哺乳類系に容易に適用可能であるとは思われなかった。これは、哺乳動物においては、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、アポトーシスカスケードおよび細胞死をもたらすためである（Ｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３２７９−３２８３，１９９７）。加えて、ｄｓＲＮＡが、哺乳動物細胞において、やはり細胞生理学の変化に通じ得る、インターフェロンカスケードを活性化することが永く知られてきた（Ｃｏｌｂｙ
ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３，１９７１、Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１７，１９７２、Ｌａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５８Ｌ７８２，１９６７、Ｌｏｍｎｉｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５５，１９７０、およびＹｏｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２，１９６６）。しかしながら、ＰＫＲおよびインターフェロンカスケードのｄｓＲＮＡ媒介活性化は、約３０塩基対より長いｄｓＲＮＡを必要とする。対照的に、３０塩基対長未満のｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞にてＲＮＡｉを生じさせることが示されている（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１）。したがって、より長いｄｓＲＮＡ分子に関連する望ましくない非特異的効果を、実質的により長いｄｓＲＮＡを含まない短いＲＮＡを調製することによって回避し得ることが期待される。
【０２０７】
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１、Ｂｏｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，２００１、Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９，２００２、Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２，１９９９、Ｎａｇａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．６：６３−７０，１９９９、Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９，１９９０、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １３：６７−７３，２００２、Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１０７７−１０８７，２０００、Ｒｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：３３４３−３３５３，１９９２、Ｔａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９９：１２３−１３２，１９９９、およびＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，２００１。
【０２０８】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８，２００２）は、ＲＮＡｉを生じさせる手段としてヘアピン状に折り畳んだ小さなＲＮＡ分子を使用した。したがって、かかる短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本発明の方法において有利に使用される。機能的ｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは多様であり、ステムの長さは約２５〜約３０ｎｔのいずれかの範囲であり得、ループの大きさは、発現抑制作用に影響を及ぼさない４〜約２５ｎｔの範囲であり得る。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲのＲＮアーゼのｄｓＲＮＡ産物に類似し、いずれの事象においても、特定の遺伝子の発現を阻害するための同一能力を有すると考えられる。
【０２０９】
本発明の一部の実施形態においては、ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクター（例えばｐＬＬ３．７）から発現する。
【０２１０】
アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより、あるいは三重らせん形成により、遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス手法については、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）で説明されている。三重らせん形成については、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）、Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）、およびＤｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３００（１９９１）で説明されている。該方法は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。
【０２１１】
例えば、ＬＩＮＧＯ−４をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを転写に関与する遺伝子の領域に対して相補的に設計し、それにより、標的タンパク質の転写および産生を阻止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子の標的ポリペプチドへの翻訳をブロックする。
【０２１２】
一実施形態においては、外因性配列から転写によって、ＬＩＮＧＯ−４遺伝子に対して特異的であるアンチセンス核酸を細胞内で産生する。例えば、ベクターまたはその一部分が転写され、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。かかるベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができる限り、エピソームのままであってもよく、染色体に統合されてもよい。かかるベクターは、当該技術分野において標準的な組み換えＤＮＡ技術方法によって構成することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス性、または他の、脊椎動物細胞における複製および発現のために使用される当該技術分野において既知のものであり得る。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物、例えばヒト細胞において作用する、本明細書のいずれかの箇所に記載するもの等の、当該技術分野において既知の任意のプロモータによってであり得る。
【０２１３】
アンチセンス分子の絶対的な相補性は必要ではない。ＬＩＮＧＯ−４をコードするＲＮＡの少なくとも一部分に対する配列相補性とはＲＮＡとハイブリダイズし得るために十分な相補性を有し、安定した二重鎖または三重鎖を形成する配列を意味する。ハイブリダイズ能は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、それが含有し得る、ミスマッチする塩基が多くなるが、依然として、安定した二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成する。当業者は、標準的な手技の使用によってミスマッチの許容度を確認し、ハイブリダイズされた複合体の融点を判定することができる。
【０２１４】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでを含む５’非翻訳配列に相補的であるオリゴヌクレオチドが、翻訳の阻害に最も効率的に機能するはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に対する配列相補性は、同様に、ｍＲＮＡの翻訳の阻害にも有効であることが示されている。一般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照されたい。したがって、５’または３’のうちのいずれかの非翻訳非コード領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドを、ＬＩＮＧＯ−４の翻訳を阻害するアンチセンスアプローチにおいて使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補的部位を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率の低い翻訳の阻害因子であるが、本発明に従って使用することができる。アンチセンス核酸は、典型的には少なくとも６ヌクレオチド長であり、例えば、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の態様においては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２１５】
本明細書で開示する治療方法において使用されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾された形であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子、ハイブリダイゼーション等の安定性を向上させるために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチド等の他の付随基（ａｐｐｅｎｄｅｄ  ｇｒｏｕｐ）（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするためのもの）、または細胞膜を横断する輸送を促進する薬剤、（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）、Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７））、１９８８年１２月１５日公開の国際公開第ＷＯ８８／０９８１０号を参照されたい）、または血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日公開の国際公開第ＷＯ８９／１０１３４号を参照されたい）、ハイブリダイゼーションに誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８）を参照されたい）、または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照されたい）を含むことができる。この目的のために、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションに誘発される架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションに誘発される切断剤等に、オリゴヌクレオチドを共役することができる。
【０２１６】
本明細書で開示する治療方法において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、５フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る。
【０２１７】
また、本明細書で開示する治療方法において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およ
びヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含み得る。
【０２１８】
さらに別の実施形態において、本明細書で開示する治療方法において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらの類似体を含む群から選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。
【０２１９】
さらに別の実施形態において、本明細書で開示する治療方法において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡとともに、通常の状況とは対照的に、鎖が互いに並行に続く特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
【０２２０】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されるもの等）を使用することにより、当該技術分野において既知の標準的な方法によって合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された有孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））等を使用することによって調製することができる。
【０２２１】
本明細書で開示する治療方法において使用されるポリヌクレオチド組成物は、触媒性ＲＮＡ、またはリボザイムをさらに含む（例えば、１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／１１３６４号、Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照されたい）。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって決定付けられる位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが２つの塩基の５’−ＵＧ−３’配列を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構成および産生は、当該技術分野において公知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１（１９８８）でより完全に記載されている。ある実施形態においては、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端近傍に位置するように、すなわち、効率を改善し、非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限に抑えるように、操作される。
【０２２２】
アンチセンスアプローチにおいてと同様、本明細書で開示する診断および治療方法において使用されるリボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば安定性、標的化等を改善するように）で構成することができ、インビボでＬＩＮＧＯ−４を発現する細胞に送達することができる。リボザイムをコードするＤＮＡコンストラクトは、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入について前述したものと同一の様式で、細胞に導入することができる。送達の１つの方法は、形質移入した細胞が、内因性のＬＩＮＧＯ−４のメッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、例えばｐｏｌ
ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモータ等の、強力な構造性または誘発可能プロモータの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡコンストラクトの使用を伴う。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり、触媒性であるため、効率的により低い細胞内濃度が必要とされる。
【０２２３】
ＬＩＮＧＯ−４アプタマーアンタゴニスト
別の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、独特の配列を有し、所望の標的（例えばポリペプチド）に対して特異的に結合する特性を有し、所与の標的の特異的リガンドである、ヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。本発明のヌクレオチドアプタマーには、ＬＩＮＧＯ−４に結合する二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ分子が含まれる。本発明のある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アプタマーアンタゴニストは、例えば哺乳動物におけるオリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するか、ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成を促進するか、あるいは脱髄を阻止する。
【０２２４】
核酸アプタマーは、当該技術分野において既知の方法を使用、例えば指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）過程を介して選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、第５，５８０，７３７号、第５，５６７，５８８号、第５，７０７，７９６号、第５，７６３，１７７号、第６，０１１，５７７号、および第６，６９９，８４３号に記載される、標的分子に非常に特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、これらの特許は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法が、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている（やはり参照することによって本明細書に組み込まれる）。ＳＥＬＥＸ過程は、様々な二次元および三次元構造を形成する核酸の能力、ならびに単量体であるかポリマーであるかに関わらず、他の核酸分子およびポリペプチドを含む、事実上任意の化合物とのリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）、ヌクレオチド単量体内で利用可能な化学的多用途性に基づく。任意の大きさまたは組成の分子が、標的となり得る。
【０２２５】
ＳＥＬＥＸ法は、所望の結合親和性および選択性を達成するために、同一の一般的選択スキームを使用する、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、分割、および増幅の段階的反復を含む。好ましくは無作為化配列のセグメントを含む、核酸の混合物から開始し、ＳＥＬＥＸ方法は、結合に適した条件下で混合物を標的と接触させるステップと、標的分子に特異的に結合したこれらの核酸から結合していない核酸を分割するステップと、核酸と標的との複合体を分離するステップと、核酸と標的との複合体から分離した核酸を増幅し、核酸のリガンド富化混合物を得るステップと、を含む。結合、分割、分離、および増幅のステップは、標的分子に対して非常に特異的で高親和性の核酸リガンドを得るために所望の数の周期を通じて繰り返される。
【０２２６】
ヌクレオチドアプタマーを、例えば診断ツールまたは特異的阻害因子として使用して、細胞内シグナル伝達および輸送経路を分析することができる（Ｊａｍｅｓ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：５４０−５４６）。ヌクレオチドアプタマーの高親和性および特異性により、それらは薬物送達の良好な候補である。例えば、ナノモル範囲のＩＣ５０値を有する、毒素リシンに対するアプタマーアンタゴニストが単離された（Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７５：４９３７−４９４２）。また、ヌクレオチドアプタマーは、感染症、悪性腫瘍、およびウイルス表面タンパク質に対して使用して、細胞内感染力を低下させることができる。
【０２２７】
本発明の方法において使用されるヌクレオチドアプタマーは、他のポリヌクレオチドについて本明細書に記載されるように、修飾（例えば骨格もしくは塩基の修飾、またはペプチドに共役することにより）することができる。
【０２２８】
ＬＩＮＧＯ−４のタンパク質構造を使用し、ＳＥＬＥＸ過程を使用して、ＬＩＮＧＯ−４に作用するアプタマーをスクリーニングすることにより、ＬＩＮＧＯ−４媒介過程を阻害するアプタマーの同定が可能になるであろう。
【０２２９】
本発明の方法において使用されるポリペプチドアプタマーは、ＬＩＮＧＯ−４に結合し、それによりその作用をブロックするそれらの能力について選択される無作為ペプチドである。ポリペプチドアプタマーは、両端でタンパク質の足場に付着する可変短ペプチドドメインを含み得る。この二重の構造的制約が、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵するレベル（ナノモル範囲）まで大きく高める。例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７８（８）：４２６−４３０を参照されたい。可変短ペプチドの長さは、典型的には約１０〜２０アミノ酸であり、足場は、良好な溶解性および緻密特性を有する任意のタンパク質であり得る。足場タンパク質の１つの非限定的な例は、細菌タンパク質であるチオレドキシン−Ａである。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５（２４）：１４２７２−１４２７７を参照されたい。
【０２３０】
ポリペプチドアプタマーは、タンパク質機能の主要な阻害因子として作用するペプチドまたは小さなポリペプチドである。ペプチドアプタマーは、標的タンパク質に特異的に結合し、その機能的能力をブロックする（Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４，２６６−１４，２７１）。当該技術分野において既知である様々な手法によって、標的タンパク質に高い親和性および特異性で結合するペプチドアプタマーを単離することができる。ペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法（Ｘｕ，Ｃ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２，４７３−１２，４７８）、またはリボソームディスプレイ法（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２）によって、ランダムペプチドライブラリーから単離することができる。また、それらは、ファージライブラリーから（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０）、あるいは化学的に生成されたペプチドライブラリーから単離することもできる。加えて、ポリペプチドアプタマーは、リガンド調節ペプチドアプタマー（ＬｉＲＰＡ）の選択を用いて選択することもできる。例えば、Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ＢＦ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  １２（７）：８４７−８５５を参照されたく、これは、参照することによって本明細書に組み込まれる。ペプチドアプタマーを合成する手段が困難であるために、それらの使用はポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑であるが、これらは無制限の化学的多様性を有する。ポリヌクレオチドアプタマーは、４つのみのヌクレオチド塩基を利用するために限定される一方、ペプチドアプタマーははるかに拡張したレパートリーを有する（すなわち、２０個のアミノ酸）。
【０２３１】
本発明の方法において使用されるペプチドアプタマーは、他のポリペプチドについて本明細書のいずれかの箇所で記載されるように、修飾（例えばポリマーに共役、またはタンパク質に融合）することができる。
【０２３２】
ベクターおよび宿主細胞
宿主発現系は、対象となるコード配列が産生され、その後精製される媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質移入される際に、原位置で本発明のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリペプチドまたは抗体を発現することができる細胞も表す。これらには、抗体コード配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌（例えば大腸菌、枯草菌）等の微生物、抗体コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えばサッカロミセス属、ピキア属）、抗体コード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、組み換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、または抗体コード配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系、あるいは哺乳動物細胞のゲノム（例えばメタロチオネインプロモータ）もしくは哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）に由来するプロモータを含有する組み換え発現コンストラクトを宿す哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。大腸菌等の細菌性細胞または例えば組み換え抗体分子全体を発現するための真核性細胞が、組み換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモータ要素（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）等のベクターと併せて、抗体の効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）、Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０２３３】
細菌系では、発現される抗体分子に意図される使用に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を生成するために、大量のかかるタンパク質を産生する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが、望ましくあり得る。かかるベクターには、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列を、ｌａｃＺコード領域とインフレームで個別にベクターにライゲートすることができる、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））、ならびにｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））等が含まれるが、これらに限定されない。また、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現することができる。概して、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２３４】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして典型的に使用される。該ウイルスは、ツマジロクサヨトウ細胞中で成長する。抗体コード配列を該ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個別にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモータ（例えばポリヘドリンプロモータ）の制御下に置くことができる。
【０２３５】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、対象となる抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモータおよび三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートすることができる。次いで、インビトロまたはインビボ組み換えによって、キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染した宿主内で生存能力があり、抗体分子を発現することができる組み換えウイルスをもたらす。（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４））。また、挿入した抗体コード配列を効率的に翻訳するためには、特異的開始シグナルも必要であり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、確実にインサート全体が翻訳されるように、所望のコード配列のリーディングフレームと一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、様々な起源のものであり得る。適切な転写エンハンサ要素、転写ターミネータ等を含むことによって、発現の効率を高めることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照されたい）。
【０２３６】
加えて、挿入した配列の発現を調節、または遺伝子産物を特定の所望の様式で修飾および処理する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のかかる修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対して特長的かつ特異的な機序を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のために、遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核性宿主細胞を使用することができる。かかる哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、特に、例えばＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄ等の乳癌細胞系、ならびに例えばＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ等の正常な乳腺細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３７】
組み換えタンパク質を長期間高収率で産生するには、典型的には、安定発現が用いられる。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞系を操作することができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えばプロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）によって制御されるＤＮＡ、および選択可能なマーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作した細胞を富化培地中で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えることができる。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定的に統合し、成長して増殖巣を形成し、今度はそれがクローン化され、細胞系へと拡大し得るようにする。本方法を有利に使用して、抗体分子を安定的に発現する細胞系を操作することができる。
【０２３８】
限定されないが、単純ヘルペスウイルチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）遺伝子を含む、多数の選択系を、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる。また、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）、およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３））、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））の遺伝子の選択の基礎として、代謝拮抗物質耐性を使用することができる。使用され得る組み換えＤＮＡ技術の当該技術分野において一般的に既知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２および１３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｌｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３９】
ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたは抗体の発現レベルを、ベクター増幅によって高めることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅されると、宿主細胞の培養物中に存在する阻害因子のレベルの上昇により、マーカー遺伝子の複製物の数が増加する。増幅された領域は抗体遺伝子に関連するため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２４０】
例えば可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−４抗体、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチド、またはＬＩＮＧＯ−４アプタマー等のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストをコードする核酸を含むベクターを使用して、本発明の方法において使用されるアンタゴニストを産生することができる。かかる核酸が操作可能に結合されるベクターおよび発現制御配列の選択は、所望の機能特性、例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞に依存する。
【０２４１】
操作可能に結合されるコード配列の発現の調節に有用な発現制御要素は、当該技術分野において既知である。例には、誘発可能プロモータ、構造性プロモータ、分泌シグナル、および他の調節要素が含まれるが、これらに限定されない。誘発可能プロモータが使用される場合は、例えば、栄養状態の変化、または温度の変化によって、宿主細胞培地中で制御することができる。
【０２４２】
ベクターは、原核性レプリコン、すなわち、細菌宿主細胞において組み換えＤＮＡ分子の自己複製および維持を染色体外に導く能力を有するＤＮＡ配列を含み得る。かかるレプリコンは、当該技術分野において公知である。加えて、原核性レプリコンを含むベクターは、発現が薬物耐性等の検出可能なマーカーを付与する遺伝子も含み得る。細菌薬物耐性遺伝子の例は、アンピリシンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０２４３】
また、原核性レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞において、コード遺伝子配列の発現を導くための原核性またはバクテリオファージプロモータも含み得る。細菌宿主に適合するプロモータ配列は、典型的には、発現対象のＤＮＡセグメントを挿入するために便宜的な制限部位を含有するプラスミドベクターにおいて提供される。かかるプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の好適な原核性宿主細胞を使用して、本発明の方法において使用されるタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を発現することができる。
【０２４４】
この発明の目的のために、多数の発現ベクター系を用いることができる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他のクラスは、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用を伴う。加えて、ＤＮＡをクロモソームに統合した細胞は、形質移入した宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって、選択することができる。マーカーは、栄養素要求株宿主に対する原栄養体、殺生剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅等の重金属に対する耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現対象のＤＮＡ配列に直接結合されるか、または同時形質転換によって同一細胞に導入される。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２）を参照されたい）。また、ｍＲＮＡの最適合成のために、追加要素が必要とされる場合もある。これらの要素は、シグナル配列、接合シグナル、ならびに転写プロモータ、エンハンサ、および終止シグナルを含み得る。
【０２４５】
一実施形態においては、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）と称されるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許発現ベクターを使用することができる。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサ、マウスβグロビン主要プロモータ、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、およびリーダー配列を含有する。該ベクターは、ＣＨＯ細胞における形質移入時、次いでＧ４１８含有培地での選択、およびメトトレキサート増幅時に、極めて高レベルの発現を生じることが見出されている。当然のことながら、本発明において、真核細胞中で発現を導出できる、いかなる発現ベクターをも使用することができる。好適なベクターの例には、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）が含まれるが、これらに限定されない。さらなる真核細胞発現ベクターが当該技術分野において既知であり、市販されている。典型的には、かかるベクターは、所望のＤＮＡセグメントを挿入するための便宜的な制限部位を含有する。例示的なベクターには、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが含まれる。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号で開示されている。
【０２４６】
概して、好適に高レベルのアンタゴニストを発現するものについて、多数の形質転換した細胞をスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって実行され得るルーチン実験である。
【０２４７】
哺乳動物宿主細胞発現に対して頻繁に使用される調節配列には、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を導くウイルス要素、例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモータおよびエンハンサ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモータ／エンハンサ等）、Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモータ／エンハンサ等）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマ、および天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモータ等の強力な哺乳動物プロモータ等が含まれる。ウイルス調節要素およびその配列に関するさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌの米国特許第４，５１０，２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒの米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０２４８】
組み換え発現ベクターは、宿主細胞（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子において、ベクターの複製を調節する配列を担持し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌの米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞上で、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキサート等の薬物に対する耐性を付与する。頻繁に使用される選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞において、メトトレキサート選択／増幅で使用するため）、およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【０２４９】
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストをコードするベクターを、好適な宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、任意の好適な方法によって行うことができる。外因性ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該技術分野において既知であり、デキストラン媒介性形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性形質移入、原形質融合、電気穿孔、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および原子核へのＤＮＡの直接顕微注入を含む。加えて、ウイルスベクターによって、哺乳動物細胞に核酸分子を導入することができる。
【０２５０】
本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを発現するための宿主細胞は、原核性または真核性であり得る。例示的な真核宿主細胞には、酵母および哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１６５８）、および新生ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が含まれるが、これらに限定されない。他の有用な真核宿主細胞には、昆虫細胞および植物細胞が含まれる。例示的な原核宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセスを含む。
【０２５１】
宿主細胞の形質転換は、用いられるベクターおよび宿主細胞に適した従来の方法によって達成することができる。原核性宿主細胞の形質転換については、電気穿孔および塩治療方法を用いることができる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換については、電気穿孔、陽イオン脂質、または塩治療方法を用いることができる。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）、Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照されたい。
【０２５２】
ある実施形態においては、タンパク質発現に使用される宿主細胞系は、哺乳動物起源であり得、当業者であれば、そこで発現する所望の遺伝子産物に最適な特定の宿主細胞系を選択的に決定することができると考えられる。例示的な宿主細胞系には、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞系は、典型的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公開文献から入手可能である。
【０２５３】
産生細胞系のポリペプチドの発現は、既知の手法を使用して強化することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）システムは、ある条件下で、発現を強化するために一般に使用される。例えば、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、および０３２３９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号を参照されたい。
【０２５４】
遺伝子治療法
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、オリゴデンドロサイトの生存、増殖、および分化を促進すること、またはニューロンの髄鞘形成を促進することが治療上有効である、神経系疾病、疾患、または損傷の治療に対する遺伝子治療法アプローチを使用して、例えば、ヒト患者等の哺乳動物において、インビボで産生することができる。これは、好適な発現制御配列に操作可能に結合する、好適なＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストコード核酸の投与を伴う。概して、かかる配列が、ウイルスベクターに組み込まれる。かかる遺伝子治療法に好適なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＥＢ（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターは、複製不全ウイルスベクターであり得る。そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠損を有するアデノウイルスベクターが、典型的に使用される。アデノウイルスベクターを使用する場合、ベクターは、通常、選択可能なマーカー遺伝子を有しない。
【０２５５】
医薬組成物
本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、ヒトを含む哺乳動物に投与するための医薬組成物に製剤化することができる。本発明の方法において使用される医薬組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の一部グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン等の塩、または電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂等を含む、医薬上許容し得る担体を含む。
【０２５６】
本発明の方法で使用される組成物は、任意の好適な方法で、例えば、非経口的、脳室内、経口的、吸入スプレーにより、局所的、経直腸的、経鼻腔的、頬側、経膣的、または埋め込まれた容器を介して投与され得る。本明細書で使用する「非経口的」という用語は、皮下、経静脈、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、髄板内、および頭蓋内注射または注入法を含む。前述のように、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、神経系において作用し、オリゴデンドロサイトの生存、増殖、および分化、ならびにニューロンの髄鞘形成を促進する。したがって、本発明のある方法においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、それらが血液脳関門を横断するように投与される。この横断は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト分子自体が本来有する物理化学特性、医薬製剤中の他の構成要素、または血液脳関門を破るための針、カニューレ、または手術器具等の機械的装置の使用に起因し得る。ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストが、本来、血液脳関門を横断しない分子である場合、例えば横断を促進する部分に融合する場合、好適な投与経路は、例えば髄腔内または頭蓋内であり、例えばＭＳの慢性病巣への直接投与である。ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストが、本来、血液脳関門を横断する分子である場合、投与経路は、以下に記載の様々な経路のうちの１つ以上により得る。
【０２５７】
本発明の方法で使用される組成物の無菌注入形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。かかる懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、当該技術分野において既知の手法に従って製剤化され得る。また、無菌注入調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注入溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の懸濁液であり得る。用いることができる許容される媒体および溶媒には、水、リンガー溶液、および等浸透圧の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、無菌の固定油が、溶媒または懸濁培地として従来用いられている。この目的において、任意の無菌性固定油を用いることができ、合成モノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は、オリーブオイルまたはキャスターオイル等の医薬的に許容し得る天然油と同様に、特にそれらのポリオキシエチル化版での注入剤の調製に有用である。また、かかる油溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロース等の長鎖アルコール希釈剤または分散剤、あるいは乳化剤および懸濁液を含む医薬的に許容し得る剤形で一般に使用される、同様の分散剤も含有し得る。また、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および他の乳化剤等の界面活性剤、または医薬的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造に一般に使用されるバイオアベイラビリティエンハンサを、製剤の目的で使用することもできる。
【０２５８】
非経口製剤は、単回ボーラス注射、後に維持量が加えられる、注入または負荷ボーラス用量であり得る。かかる組成物は、特定の固定または可変間隔、例えば、１日に１回、または「必要に応じて」投与され得る。
【０２５９】
本発明の方法で使用されるある種の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液、または溶液を含む、許容し得る剤形で経口投与され得る。また、ある種の医薬組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。かかる組成物は、生理食塩水で、ベンジルアルコールもしくは他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを強化するための吸収プロモータ、ならびに／または他の従来の可溶化もしくは分散剤を用いた溶液として調製され得る。
【０２６０】
担体材料と組み合わせて単一剤形を産生できるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの量は、治療される宿主、使用されるアンタゴニストの種類、および特定の投与モードに依存して異なる。該組成物は、単回投与、複数回投与、または確定した期間をかけて注入投与することができる。また、投与量レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療または予防反応）を提供するように調整することもできる。
【０２６１】
本発明の方法は、「治療有効量」または「予防有効量」のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを使用する。かかる治療または予防有効量は、個人の疾病状態、年齢、性別、および体重等の要因に従って異なり得る。また、治療有効量または予防有効量は、任意の毒性または有害な影響よりも、治療的に有益な効果が上回る量である。
【０２６２】
任意の特定患者に対する特定の投与量および治療レジメンは、使用される特定のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事、投与時間、排出率、薬物の組み合わせ、および治療対象の特定の疾病の重度を含む、様々な要因に依存する。医療従事者によるかかる要因の判断は、当該技術分野における通常技術の範囲内である。また、量は、治療対象の個別の患者、投与経路、製剤の種類、使用される化合物の特徴、疾病の重度、および所望の効果にも依存する。使用される量は、当該技術分野において公知の薬理および薬物動態の原理によって決定することができる。
【０２６３】
本発明の方法において、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、概して、大脳心室内または髄腔内的に、神経系、例えば、ＭＳの慢性病巣に直接投与される。本発明の方法に従って投与される組成物は、１日に体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０ｍｇの投与量のＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストが投与されるように製剤化することができる。本発明の一部の実施形態においては、投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１〜１．０ｍｇである。一部の実施形態においては、投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり０．００１〜０．５ｍｇである。
【０２６４】
ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニスト抗体を用いる治療については、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ、より普通には０．０１〜５ｍｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）の範囲であり得る。例えば、投与量は、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり１０ｍｇであるか、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲の中間にある用量も、本発明の範囲内であることが意図される。かかる投与量を、毎日、１日おき、１週間に１回、または実験による分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って、対象に投与することができる。例示的な治療は、長期間、例えば少なくとも６ヶ月をかけて、複数回投与での投与を含む。追加の例示的な治療レジメンは、２週間毎に１回、または１ヶ月に１回、あるいは３〜６ヶ月毎に１回の投与を含む。例示的な投与量スケジュールには、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または１週間に１回６０ｍｇ／ｋｇの投与が含まれる。一部の方法においては、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投与量は、示した範囲内に含まれる。
【０２６５】
ある実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストポリヌクレオチドをコードする核酸分子を用いて対象を治療することができる。核酸の用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇＤＮＡの範囲である。伝染性ウイルスベクターの用量は、１用量当たり１０〜１００ビリオン以上の範囲で変化する。
【０２６６】
また、補足的な活性化合物を、本発明の方法において使用される組成物に組み込むこともできる。例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−４ポリペプチドまたは融合タンパク質を、１つ以上の追加治療薬と共製剤化および／または同時投与することができる。
【０２６７】
本発明は、選択した標的組織へのＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの任意の好適な送達方法を包含し、それには、水溶液のボーラス注入または制御放出システムの埋め込みが含まれる。制御放出インプラントの使用は、反復注射の必要性を低減する。
【０２６８】
本発明の方法において使用されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、脳に直接注入することができる。化合物を直接脳に注入するための様々なインプラントが知られており、神経系疾患に罹患するヒト患者への治療化合物の送達に有効である。これらには、ポンプ、定位固定的に埋め込まれた一時的間質カテーテル、永久間質カテーテルインプラント、および手術的に埋め込まれた生体分解性インプラントを使用しての、脳への長期注入が含まれる。例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記、Ｓｃｈａｒｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）、Ｇａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ
Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）、ｃｈａｐｔｅｒ  ６６，５７７−５８０頁，Ｂｅｌｌｅｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ
ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）、およびＢｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）を参照されたい。
【０２６９】
また、組成物は、化合物に対する好適な送達または支持システムとして機能する、生体適合担体材料に分散したＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストも含み得る。持続放出担体の好適な例には、座薬またはカプセル等の造形品形態の半透性ポリマーマトリクスが含まれる。埋め込み可能、または微小カプセル持続放出マトリクスには、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシブチル酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれる。
【０２７０】
本発明の一部の実施形態においては、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストは、直接注入によって、患者の脳の適切な領域に投与される。例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照されたい。代替手法が利用可能であり、本発明に従って、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを投与するために適用することができる。例えば、カテーテルまたはインプラントの定位固定配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−Ｍｕｎｄｉｎｇｅｒ単位、およびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的ローカライズ単位を使用して達成することができる。２ｍｍスライス厚の１２０ｍｌのオムニパーク、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌを注入した造影コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンは、３次元の多平面治療計画を可能にし得る（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この機器は、ＣＴおよびＭＲＩ標的情報を明確な標的確認のために合成する、磁気共鳴映像法研究に基づく計画を可能にする。
【０２７１】
ＧＥ  ＣＴスキャナ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）とともに使用するために改変したＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）、ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をこの目的で使用することができる。したがって、埋め込みの朝に、ＢＲＷ定位固定フレームのアニュラベースリングを患者の頭蓋骨に取り付けることができる。連続ＣＴ断面を、底板に留めたグラファイトロッドローカライザフレームを用いて、（標的組織）領域を通して、３ｍｍ間隔で取得することができる。コンピュータ化した治療計画プログラムは、グラファイトロッド画像のＣＴ座標を使用して、ＶＡＸ１１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ）上で実行し、ＣＴスペースとＢＲＷスペースとの間をマッピングすることができる。
【０２７２】
本明細書に記載する脱髄または髄鞘形成不全疾患の治療方法は、典型的には、ヒトにおいて使用する前に、所望の治療または予防活性に関してインビトロで試験された後、許容し得る動物モデルにおいてインビボで試験される。遺伝子導入動物を含む好適な動物モデルは、当業者には公知である。例として、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの分化および生存効果を示すインビトロ検定について、本明細書に記載する。軸索の髄鞘形成に関するＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストの効果は、実施例において説明されるように、インビトロで試験することができる。最後に、インビボ試験は、ＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストを発現する遺伝子導入マウスを形成することによって、または本明細書に記載されるＬＩＮＧＯ−４アンタゴニストをモデルのマウスまたはラットに投与することによって行うことができる。
【実施例】
【０２７３】
実施例１
ＬＩＮＧＯ−４は中枢神経系において高度に発現する
オリゴデンドロサイトは、Ａ２Ｂ５前駆細胞（Ａ２Ｂ５を発現する）から幾つかの発達段階を経て成熟し、ミエリン化前オリゴデンドロサイト（Ｏ１およびＯ４を発現する）に分化して、最後にミエリン化オリゴデンドロサイト（Ｏ１、Ｏ４、およびＭＢＰを発現する）に成熟する。したがって、Ａ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４、およびＭＢＰマーカーの存在および不在をモニタリングすることによって、所与の細胞の発達段階を決定し、オリゴデンドロサイト生物学におけるＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃの役割を評価することができる。オリゴデンドロサイト生物学の一般的な概説については、例えば、Ｂａｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｍ−Ｄｉｎｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７（２００１）を参照されたい。
【０２７４】
マウス組織におけるＬＩＮＧＯ−４の発現を、以下の方法による定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）検定によって評価した。順方向プライマー５’−ＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＣＣＴＣＡＡ−３’（配列番号２１）、逆方向プライマー５’−ＧＣＡＧＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴ−３’（配列番号２２）、およびＦＡＢ標識プローブ５’−ＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２３）を使用して、Ｍｏｕｓｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｐａｎｅｌ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からの組織ｍＲＮＡをＴａｑｍａｎのＲＴ−ＰＣＲにかけ（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７：２２１−２２８（２００４）で記載されるように行った）、ＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡレベルを定量した。プライマーおよびＦＡＢ標識プローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖ１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計した。
【０２７５】
相対的なＬＩＮＧＯ−４の発現レベルは、まず該組織内のＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡレベルを、同一組織内のアクチンのｍＲＮＡレベルに対して正規化することによって決定した。その後、各組織における正規化したＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡレベルを、眼における正規化した発現レベルと比較することにより、相対的なＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡレベルを決定し、これに１の値を割り当てた。相対的なＬＩＮＧＯ−４の発現レベルを図１に示す。ＬＩＮＧＯ−４は、脳および脊髄において最大限に発現した。心臓、子宮、脾臓、胃、腎臓、眼、唾液腺、肝臓、およびリンパ節の発現レベルは検出可能であったが、脳および脊髄と比較すると少なかった。
【０２７６】
実施例２
ヒトＬＩＮＧＯ−４は、ヒトＬＩＮＧＯ−１と相同である
４つのヒトＬＩＮＧＯパラログのアミノ酸配列を整列させて比較した。図２を参照されたい。ＬＩＮＧＯ−１と他の各種のヒトパラログとの間の類似性および同一性の割合を、以下の表２に示す。ｈＬＩＮＧＯ−１とｈＬＩＮＧＯ−２とが最も密接に関係するが、ｈＬＩＮＧＯ−１とｈＬＩＮＧＯ−４とは顕著な類似性および同一性を共有する。
【０２７７】
【表２】
2014055186.tif 000012
実施例３
ＬＩＮＧＯ−４は脊髄において特異的に発現する
実施例１で記載した方法を使用し、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によってＬＩＮＧＯ−１、ＬＩＮＧＯ−２、およびＬＩＮＧＯ−３と比較して、ＬＩＮＧＯ−４の発現について様々なマウス組織を調べた。まず、ＬＩＮＧＯ−１、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＩＮＧＯ−３、およびＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡレベルを、アクチンのｍＲＮＡに対して正規化した。これらの実験において、ＬＩＮＧＯ−１、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＩＮＧＯ−３、およびＬＩＮＧＯ−４のｍＲＮＡを、Ｍｏｕｓｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のｍＲＮＡレベルと比較することにより決定し、これに１の値を割り当てた。
【０２７８】
ＬＩＮＧＯの発現レベルを、以下のプライマー対を使用して検定した。
ＬＩＮＧＯ−４：  実施例１に記載されるものと同一プライマー
ＬＩＮＧＯ−１：  ５’ＰＣＲプライマー−５’−ＣＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＣ−３’（配列番号２４）、
３’ＰＣＲプライマー−５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号２５）、および
ＦＡＭ標識プローブ５’−ＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴ−３’（配列番号２６）。
ＬＩＮＧＯ−２：５’ＰＣＲプライマー−５’−ＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＣＣＴＴＡＡ−３’（配列番号２７）、
３’ＰＣＲプライマー−５’−ＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＡＧＴＧ−３’（配列番号２８）、および
ＦＡＭ標識プローブ５’−ＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＣＣ−３’（配列番号２９）。
ＬＩＮＧＯ−３：５’ＰＣＲプライマー−５’−ＣＧＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡ−３’（配列番号３０）、
３’ＰＣＲプライマー−５’−ＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号３１）、および
ＦＡＭ標識プローブ５’−ＣＴＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧ−３’（配列番号３２）。
【０２７９】
試験した１１組織タイプのうち、ＬＩＮＧＯ−４は、成体およびＰ６マウス組織の脊髄において、最も高いレベルの発現を示した。ＬＩＮＧＯ−１、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＩＮＧＯ−３、およびＬＩＮＧＯ−４の相対発現の結果を、図３（生体組織）および図４（Ｐ６組織）に示す。
【０２８０】
実施例４
ＬＩＮＧＯ−４発現コンストラクトの調製ＬＩＮＧＯ−４のＦＬおよびＤＮレンチウイルスベクターの構成
おおむねＭｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−５１（２００５）に記載される方法に従って、野生型およびドミナントネガティブ形態のＬＩＮＧＯ−４を発現するレンチウイルスベクターを構築した。該文献は、参考によりその全体が本明細書に援用される。簡潔に述べると、ヒト全長ＬＩＮＧＯ−４（ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４）をコードするＤＮＡ配列、アミノ酸残基１〜５９３（配列番号２の）を、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによりヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅した。
５’ＰＣＲプライマー：
５’−ＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号３３）。
３’ＰＣＲプライマー：
５’−ＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＡＣＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号３４）。
【０２８１】
ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４のＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４ｂｌｕｎｔＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。得られたＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４クローンをｐＪＳＴ１０１１と指定し、インサートおよび隣接するベクターのＤＮＡ配列を確認した。
【０２８２】
ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４クローンｐＪＳＴ１０１１は、順方向ＰＣＲプライマー−５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＣＴＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号３５）、および逆方向ＰＣＲプライマー−５’−ＧＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＴＡＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＡＧＧＧＴＡＧＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号３６）を使用して、予測シグナル配列（アミノ酸１〜２９）の後のＬＩＮＧＯ−４の予測細胞外ドメイン（アミノ酸３０〜５３５）の前にＨＡエピトープタグを挿入するために、部位特異的突然変異誘発にかけた。ＨＡ−ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４をコードする得られたプラスミドをｐＪＳＴ１０３７と指定し、そのＤＮＡ配列を確認した。ｐＪＳＴ１０３７のＨＡ−ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４コード配列をＮｏｔＩフラグメントとして単離し、同様に消化したレンチウイルスベクターＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰにサブクローン化し、ｐＪＳＴ１０４０を得た。
【０２８３】
ＨＡタグ付全長ＬＩＮＧＯ−４（ＨＡ−ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４）のアミノ酸１〜５７１をコードする、ＨＡタグ付ドミナントネガティブＬＩＮＧＯ−４タンパク質、ＨＡ−ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−４をコードする遺伝子を、以下のプライマーを使用して、ｐＪＳＴ１０３７からＰＣＲによって増幅した。
５’ＰＣＲプライマー−５’−ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号３７）、および
３’ＰＣＲプライマー−
５’−ＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号３８）。
【０２８４】
得られたＰＣＲフラグメントをＮｏｔＩで消化し、同様に消化したレンチウイルスベクターＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰにクローン化した。得られたプラスミドをｐＪＳＴ１０４３と指定し、ＨＡ−ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−４インサートのＤＮＡ配列および隣接するベクターの配列を確認した。
【０２８５】
Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，”Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−０６（２００３）により記載されるように、ＨＡ−ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４（ｐＪＳＴ１０４０）およびＨＡ−ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−４（ｐＪＳＴ１０４３）をコードするレンチウイルスベクターを２９３細胞に形質移入し、レンチウイルスを産生した。
【０２８６】
ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃ融合タンパク質の構築および精製
ＬＩＮＧＯ−４の生物学的機能を研究するために、ヒトＬＩＮＧＯ−４の細胞外部分（残基１〜５３５）をヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合して、コンストラクトを形成した。順方向プライマー５’−ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号３９）、および逆方向プライマー５’−ＡＡＡＡＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧ−３’（配列番号４０）を用い、鋳型としてヒト全長ＬＩＮＧＯ−４クローンｐＪＳＴ１０１１を使用して、ヒトＬＩＮＧＯ−４の細胞外ドメインの部分的コード配列をＰＣＲによって得た。
【０２８７】
ＬＩＮＧＯ−４の細胞外ドメインをコードするＰＣＲ産物をＮｏｔＩ（５’）およびＳａｌＩ（３’）で消化し、ＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃをコードするＳａｌＩ（５’）からＢａｍＨＩ（３’）のＤＮＡカセットを用いて、ベクターｐＮＥ００１（Ｂｉｏｇｅｎ
Ｉｄｅｃ）にクローン化し、ｐＪＳＴ１０６４を得た。ｐＪＳＴ１０６４内のインサートのＤＮＡ配列は、ヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域とインフレームで、ＬＩＮＧＯ−４のシグナル配列および細胞外ドメイン（アミノ酸１〜５３５）をコードすることが判定され、確認された。ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃフラグメントを包含するｐＪＳＴ１０６４  ＮｏｔＩフラグメントを、ＣＨＯ発現ベクター、ＰＶ９０（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）のＮｏｔＩクローン化部位にサブクローン化した。得られたプラスミドをＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＪＳＴ１０８４と指定した。
【０２８８】
プラスミドｐＪＳＴ１０８４を用いて、ＣＨＯ宿主細胞ＤＧ４４の電気穿孔によって、ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃ融合タンパク質を発現する安定細胞株を生成した。ヌクレオシド非依存性増殖を選択するために、形質移入したＣＨＯ細胞を１０％の透析した血清および４ｍＭグルタミンの存在下、αマイナスＭＥＭ中で培養した。形質移入から１４日後、細胞に新鮮な培地を供給した。ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃを発現する細胞をスクリーニングするために、ＣＨＯ細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）で標識し、ＦＡＣＳ  Ｍｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）での高速フローサイトメトリーソーティングにかけた。最も高いレベルのＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃを発現した細胞を選択した。これらの細胞を７日間拡張培養し、その後再度標識し、再度ソーティングした。最も高いレベルのＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃを発現する細胞を、個別のクローンとして９６ウェルプレートに単離した。これらのクローンを２週間増殖させて、次いで、発現レベルを調べるために、ＦＡＣＳ解析の１日前に新鮮な培地を供給した。最も高いレベルのＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃを発現したクローンを拡張し、凍結細胞バンクを確立した。細胞株を、無血清培地ＢＣＭ１６中の懸濁培養で増殖するように適合させた。これらのクローンによって産生されたＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃの力価は、細胞株を４〜５継代の間３７℃で成長させ、次いで５０％最大細胞密度まで細胞を増殖させ、生存細胞密度が７５％に降下するまで、１０〜１５日間、２８℃でそれらを培養して決定した。この時点で、培養培地を採取し、細胞およびデブリを遠心分離によって取り除き、培養上清を、抗ヒトＩｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）をプローブとして使用して、ウェスタンブロット解析によりＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃレベルについて力価決定した。
【０２８９】
ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃ融合タンパク質を、以下のように清澄化した培養基から精製した。９ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を、９００ｍｌの馴化培地に添加した。培地を３ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に、３時間、４℃でバッチ負荷した。樹脂を１．５ｃｍの（Ｉ．Ｄ．）カラムに収集し、３ｍｌのＰＢＳで４回、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する４ｍｌのＰＢＳで２回、次いで３ｍｌのＰＢＳで再度洗浄した。ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃをカラムから２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．８および１００ｍＭ  ＮａＣｌで１．５ｍｌの画分に溶出し、７５μｌの０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．６を添加して中和した。ピークタンパク質含有画分を２８０ｎｍの吸光度により同定し、プールし、さらに１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムでの精製にかけた。負荷の前に、ＮａＣｌを６００ｍＭまで添加し、ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を５０ｍＭまで添加した。カラムを６００μｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．５、および１Ｍ  ＮａＣｌで２回、その後１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃをカラムから２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．８および１００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出し、０．５ｍｌの画分を収集し、２５μｌの０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．６を添加して中和した。ピークタンパク質含有画分を２８０ｎｍの吸光度によって同定し、プールした。精製したＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃタンパク質を分取し、−７０℃で保存した。
【０２９０】
実施例５
ドミナントネガティブＬＩＮＧＯ−４はオリゴデンドロサイトの分化を促進する
Ｃｏｎｎ，Ｍｅｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；１９９０）に記載されるものを以下の通り修正して、雌のＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓ  Ｐ２ラットからオリゴデンドロサイトの富化集団を成長させた。簡潔に述べると、前脳を切開し、ハンクス緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れた。組織を１ｍｍのフラグメントに切断し、０．０１％トリプシンおよび１０μｇ／ｍｌのＤｎａｓｅ中で、１５分間、３７℃でインキュベートした。分離した細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたＴ７５組織培養フラスコで平板培養し、２０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１０日間、３７℃で増殖させた。フラスコを終夜２００ｒｐｍ、３７℃で振盪してオリゴデンドロサイト前駆体（Ａ２Ｂ５＋）を収集し、９５％純度の集団を得た。ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で１週間、培養物を維持した。ＦＧＦ／ＰＤＧＦの除去により、Ａ２Ｂ５＋細胞は３〜７日後にＯ４＋ミエリン化前オリゴデンドロサイトに分化し、７〜１０日後にＯ４＋およびＭＢＰ＋成熟オリゴデンドロサイトに分化した。オリゴデンドロサイトを１細胞当たり２ＭＯＩでレンチウイルスに感染させ、ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４およびＤＮ−ＬＩＮＧＯ−４の過剰発現が、ウェスタンブロットにより確認された（データ図示せず）。
【０２９１】
Ａ２Ｂ５オリゴデンドロサイトの分化を、オリゴデンドロサイトの分化マーカーであるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する抗体を使用し、ウェスタンブロットによって測定した。感染していないオリゴデンドロサイトを、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／００８５４７号、米国公開出願第２００６／０００９３８８号、およびＭｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，１２２８−１２３３（２００７）に記載されている抗ＬＩＮＧＯ−１モノクローナル抗体１Ａ７で処理した。該参照文献の各々は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。無関係のＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ
ＭＯＰＣ２１（Ｐｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）より入手可能）を、それぞれ正および負の対照として使用した。ＬＩＮＧＯ−４レンチウイルスはＨＡタグを発現し、これをレンチウイルス感染細胞の発現レベル対照として使用した。図５に示すように、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−４の過剰発現は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の発現の増加によって示されるように、オリゴデンドロサイトの分化を促進した。対照的に、全長ＬＩＮＧＯ−４の過剰発現は反対の効果を有し、ＭＢＰ発現の減少によって明白であるように、分化を阻害した。本研究は、オリゴデンドロサイトにおけるドミナントネガティブＬＩＮＧＯ−４タンパク質の発現が、オリゴデンドロサイトの分化を促進することを示す。
【０２９２】
同様の実験において、感染していないＡ２Ｂ５オリゴデンドロサイトをｈＬＩＮＧＯ−４  Ｆｃタンパク質で処理した。オリゴデンドロサイトの分化を、オリゴデンドロサイトの分化マーカーであるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する抗体、ならびに別のオリゴデンドロサイト分化マーカーであるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対する抗体を使用し、ウェスタンブロットによって測定した。上述のＬＩＮＧＯ−４  ＦＬおよびＬＩＮＧＯ−４  ＤＮレンチウイルス感染オリゴデンドロサイト、ならびにＬＩＮＧＯ−１  ＦＬおよびＬＩＮＧＯ−１  ＤＮレンチウイルス感染オリゴデンドロサイト（米国公開出願第２００７／００５９７９３号に記載され、該出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を、対照として使用した。図６に示すように、ｈ  ＬＩＮＧＯ−４  Ｆｃでの処理、ならびにＬＩＮＧＯ−１  ＤＮまたはＬＩＮＧＯ−４  ＤＮの過剰発現は、ＭＢＰおよびＭＯＧの発現の増加によって示されるように、オリゴデンドロサイトの分化を促進した。対照的に、全長ＬＩＮＧＯ−１または全長ＬＩＮＧＯ−４の過剰発現は反対の効果を有し、ＭＢＰまたはＭＯＧ発現の欠失によって明白であるように、分化を阻害した。本研究は、外因性ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃタンパク質での処理は、オリゴデンドロサイトの分化を促進することを示す。
【０２９３】
実施例６
ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃは、共培養においてオリゴデンドロサイトの髄鞘形成を促進する
後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの共培養をＬＩＮＧＯ−４  ＦＬおよびＬＩＮＧＯ−４  ＤＮで感染させ、ウェスタンブロット解析により髄鞘形成を試験することによって、髄鞘形成におけるＬＩＮＧＯ−４の役割をインビトロで調べた。かかる研究には、ＤＲＧニューロンおよびオリゴデンドロサイトの初代培養を最初に生成することが必要であった。
【０２９４】
雌のＬｏｎｇ  ＥｖａｎｓラットＥ１４−Ｅ１７胎児後根神経節を、Ｐｌａｎｔ  ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６０８３−９１（２００２）に記載されるように培養した。切開したＤＲＧを、２〜６日目の間、フルオロデオキシウリジンの存在下、そして８〜１１日目は１×Ｂ２７、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＮＬＡ培地中で、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたカバースリップ（１００μｇ／ｍｌ）上で２週間、平板培養した。
【０２９５】
Ａ２Ｂ５＋オリゴデンドロサイトをＭｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７：２２１−２２８（２００４）に記載される通り調製し、トリプシン処理によって採取した。
【０２９６】
共培養研究には、実施例４に記載の通り調製されたＬＩＮＧＯ−４  ＦＬまたはＬＩＮＧＯ−４  ＤＮレンチウイルスで感染させたＡ２Ｂ５＋オリゴデンドロサイトを、ＤＲＧニューロン点滴培養物に添加した。また、対照共培養物を、正および負の対照として、それぞれ１Ａ７またはＭＯＰＣ２１抗体の存在下で調製した。２週間の間、培養培地（Ｂ２７および１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで補完したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）を３日毎に交換した。ウェスタンブロット解析は、ミエリンの主要なタンパク質構成要素であるＭＢＰの発現が、ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃ処理培養物において増加したことを示した（図７）。ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−４の発現または１Ａ７での処理は、ＭＢＰの発現によって示されるように、ＤＲＧ髄鞘形成をもたらした。対照的に、ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４の過剰発現は、ＭＢＰの発現をブロックした。培養物中のＦＬ−ＬＩＮＧＯ−４およびＤＮ−ＬＩＮＧＯ−４タンパク質の発現を、ウェスタンブロットによって確認した（データ図示せず）。これらの研究は、ＦＬ  ＬＩＮＧＯ−４の発現は髄鞘形成を阻害し、ＤＮ  ＬＩＮＧＯ−４の発現は阻害を逆戻りさせ得ることをさらに示す。
【０２９７】
実施例７
ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃは、インビボのオリゴデンドロサイトの生存および髄鞘形成を促進する
成体野生型Ｃ５７Ｂｌ／６雄マウスに６週間、クプリゾン（０．２重量％、粉砕マウス餌とともに挽いて粉にした）を供給し、脳梁内に脱髄を誘発する。クプリゾン摂食の２、２．５、および３週間の時点で、ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃを脱髄している脳梁に定位固定的に注入する。対照マウスに、ＬＩＮＧＯ−４−Ｆｃを含有しない滅菌培地を、同一間隔で定位固定的に注入する。クプリゾン摂食の６週間後、２、４、および６週間、マウスを正常な食餌（粉砕マウス餌のみ）に戻し、再髄鞘形成させる。
【０２９８】
クプリゾン処理マウスをケタミン（体重１ｋｇ当たり８０ｍｇ）およびキシラジン（体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ）で麻酔し、定位固定手術用に設計された固定化装置に位置付ける（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。頭皮を開き、ブレグマの０．７ｍｍ後方、０．３ｍｍ側方、１．７ｍｍの深さの定位座標を用いて、１０ｍｌのハミルトンシリンジで、野生型受容マウスの急性的に脱髄した脳梁に、滅菌化合物（１ｍｌのＨＢＳＳ中の１μＭ）を片側注入する（Ｍｅｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．６３（２）：３１３−１８（１９９９））。加えて、対照受容マウスに、化合物を含有しないＨＢＳＳを定位固定的に注入する。頭蓋骨の開口をＧｅｌｆｏａｍで充填し、該部分にペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を塗布し、創傷を縫合する。注入後、マウスを実験の週毎に殺処理し、その脳を除去して分子、生化学、および組織学的解析用に加工した。
【０２９９】
前述の発明を、理解を明瞭にするために、図解および例を用いてある程度詳細に説明したが、当業者には、本発明の教示を踏まえると、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正が成され得ることが容易に明白となるであろう。
【０３００】
本明細書において言及されたすべての発行物および特許出願は、それぞれの個別の発行物または特許出願が、参照することによって組み込まれると、具体的かつ個別に示されているかのように、それと同一程度まで、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
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【数２５】
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【数２６】
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【数２７】
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【数２８】
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【数２９】
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【数３０】
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【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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