(57)【要約】【課題】電気泳動により標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを分離する方法を提供する。【解決手段】レセプターとして、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いる、標的物質およびレセプターの複合体と遊離レセプターとを分子量の差で電気泳動により分離する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レセプターとして、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いる、標的物質およびレセプターの複合体と遊離レセプターとを分子量の差で電気泳動により分離する方法。
【請求項２】
前記標的物質の分子量は１，０００〜３０，０００である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的物質の分子量は、前記レセプターの分子量の１／１５０〜１／５である、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に存在するペプチドの中には疾患により存在量が変化するものがあり、これらのペプチドは特定の疾患のマーカーになりうる。例えば、血中Ｃ−ペプチドは、インスリンが合成される前段階の物質であるプロインスリンの構成物質であり、インスリンと同程度の割合で血液中に分泌され、ほとんどが分解されないまま血液中を循環し、尿とともに排出される。このため、血中や尿中のＣ−ペプチドを測定することによりインスリンの分泌量を把握することができる。
【０００３】
したがって、特定の疾患に関連するペプチドを特異的に検出することにより、疾患の診断を行うことが可能となり、これらのペプチドの検出方法は重要な臨床検査となりうる。
【０００４】
一方、標的物質に特異的に結合する物質（レセプター）を利用する方法は、標的物質の分離や定量を行う上で広く用いられている。標的物質が抗原である場合には、抗体（断片）を用いた抗原抗体反応を用いることができる。抗体は抗原への結合特異性が非常に高いため、抗原抗体反応を利用することにより抗原を特異的に検出することができる。
【０００５】
ここで、インスリン等に代表される生理活性物質は一般的に血中濃度が低い。例えばインスリンと等モルで分泌され、内因性インスリン分泌の指標となるＣ−ペプチドは、血中の濃度が正常範囲で０．６〜１０ｎｇ／ｍＬであり、これは血液中のグルコース量の２０００万分の１程度である。そのため、このＣ−ペプチドのように、血中濃度の低い生理活性物質およびその指標を標的物質として測定するためにはシグナルの増幅が必須である。すなわち、例えば、現存の血糖測定のように１分子のグルコースが１つの発色物質を出す系ではなく、１分子の抗原が数万の発色物質等のシグナルを出す系が必要である。
【０００６】
現在ではこのシグナルの増幅に酵素や蛍光物質等が用いられている。酵素の場合、１分子の酵素が触媒作用により単位時間当たり複数個の発色物質あるいは特定波長の光子を出す。蛍光物質の場合は励起光を照射することにより、単位時間当たりに複数個の励起光とは波長の異なる光子を出す。これらの酵素または蛍光物質を抗原特異的に結合する抗体に標識し（以下、標識された抗体を、「標識抗体」と称する。）、当該標識抗体を抗原に結合させ、上記の単位時間を最適な長さに調節することで、抗原は１分子当たり数万の発色物質あるいは光子等のシグナルを出すことができる。
【０００７】
しかしながら、標識抗体は、抗原との結合の有無に関わらず、存在するだけでシグナルを出し続けるという問題がある。すなわち、抗原の量に対応したシグナルを得たければ、抗原と未結合の標識抗体（以下、「遊離体」と称する。）を系より分離（以下、「Ｂ／Ｆ分離」と称する（Ｂ＝結合体  Ｆ＝遊離体の略）。）する必要がある。このＢ／Ｆ分離を測定操作に含んだ系は酵素免疫測定法（以下、「ＥＬＩＳＡ」と称する。）等のヘテロジニアス測定系に代表される。特にＥＬＩＳＡは現在、抗原を測定するための一般的な手法であり、研究施設や院内の検査室等で汎用的に使用されている。
【０００８】
しかしながら、Ｂ／Ｆ分離の操作は一般的に煩雑であり、正確な測定のためには熟練の技術あるいは大型の装置が必要となる。これらの問題により、ＥＬＩＳＡ等のヘテロジニアス測定系は、Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ（患者の身辺での検査）での測定には向いていない。
【０００９】
Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅで抗原を測定するためにはＢ／Ｆ分離の必要の無い測定系あるいは、Ｂ／Ｆ分離操作をなるべく簡便にした測定系を構築する必要がある。後者に応用可能な技術としては電気泳動移動度シフトアッセイ（以下、「ＥＭＳＡ」と称する。）が挙げられる（非特許文献１）。ＥＭＳＡは、核酸とタンパク質との特異的結合を利用するものである。通常、核酸をポリアクリルアミド、アガロースのようなゲル上で電気泳動に掛けると、それぞれの核酸の分子量に応じた位置にバンドが出現する。この際、電気泳動する核酸と相互作用（結合）するタンパク質を事前に系内（核酸を含む試料溶液）に添加した後に電気泳動を行なうと、核酸は本来出現すべき位置よりも高分子量側にバンドがシフトする。これは核酸−タンパク質の複合体が形成されることで全体の分子量が増加したためである。そしてタンパク質と反応しきれなかった未反応の核酸は、分子量が変化していないため、本来の位置にバンドが出現する。このＥＭＳＡの核酸を抗体、タンパク質を抗原に置き換えて考えると、混合溶液に電場を掛けるのみでＢ／Ｆ分離を達成しうる測定系が構築されることは明白である。実際に、非特許文献２や特許文献１では、抗原−標識抗体の複合体と遊離体とを分離し、抗原量を定量する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−１８１２９９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Garner, M.M.及びRevzin, A.、「特異的DNA領域へのタンパク質結合の定量に関するゲル電気泳動法：大腸菌ラクトースオペロン調節システムの構成要素への適用」、Nucleic Acids Research、9:3047-3060 (1981)
【非特許文献２】田中喜秀、鳴石奈穂「マイクロチップ電気泳動技術を用いたオンサイト唾液ストレス計側システムの開発」YAKUGAKU  ZASSHI 128(11) 1595-1604
【発明の概要】
【００１２】
しかしながら、これらの方法では抗原が限定され、抗原の分子量は標識抗体と同程度のものしか測定出来ないという問題があった。すなわち、分子量が一般的な抗体であるＩｇＧの６０分の１程度しかないＣ−ペプチドのような比較的低分子量の抗原の場合、抗原と標識抗体とが複合体を形成しても分子量の増加率はほとんど無く、Ｂ／Ｆ分離を行なうことが不可能であった。
【００１３】
そこで本発明は、電気泳動により標的物質およびレセプターの複合体と遊離レセプターとを分離する方法を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明は、レセプターとして、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いて、標的物質およびレセプターの複合体と遊離レセプターとを分子量の差で電気泳動により分離する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２Ａ】実施例１により得られた標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度の算出の際に指定したレーンを表す図である。
【図２Ｂ】実施例１において、標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度とＣ−ペプチド量との関係を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第一実施形態は、レセプターは、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いる、標的物質およびレセプターの複合体標的物質およびレセプターの複合体（以下、「標的物質−レセプターの複合体」または単に「複合体」とも称する場合がある。）と遊離レセプターとを分子量の差で電気泳動により分離する方法である。なお、本明細書中、「標的物質およびレセプターの複合体」または「標的物質−レセプターの複合体」とは、２種以上のレセプターが結合した標的物質のことを意味し、特記しない限り１種のレセプターが結合した標的物質を包含しない。
【００１７】
電気泳動による標的物質−レセプター複合体の検出は、ＥＬＩＳＡ法などと比べて非常に簡便な操作で精度よく検出できるため、非常に有用な手段である。
【００１８】
本発明によれば、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとの分子量の差により、電気泳動の移動度に差が生じ、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを明確に分離することが可能となる。したがって、本発明の方法によれば、極めて簡便な方法により標的物質を検出できる。また、標的物質が疾患に関連する物質である場合には、該標的物質を検出することにより、疾患の診断を簡便に行うことができる。
【００１９】
また、本発明の方法によると、一旦、予め標的物質の含有量が既知のサンプルで検量線を作成しておくと、その検量線に基づいて、標的物質の含有量を正確に測定できる。本発明によれば、標的物質の含有量を直接的に測定することができるので、信頼性が高く、また、複数のサンプルの標的物質の含有量を簡便にかつ同時に測定できる。
【００２０】
したがって、本発明の方法により標的物質が低分子の場合でも、Ｂ／Ｆ分離を簡便に行なうことができる標的物質の測定系を構築することが可能である。よって、本発明によれば、Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅで抗原を検出可能な基礎測定原理が提供される。
【００２１】
以下、本発明の具体的態様について詳細に説明する。
【００２２】
［電気泳動に用いるサンプル］
電気泳動に用いるサンプルは、標的物質（例えば、抗原）と、標的物質に特異的に結合するレセプター（例えば、抗体）とを結合させる反応（例えば、抗原抗体反応）を行った後のサンプルである。したがって、電気泳動に用いるサンプルには標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとが含まれる。なお、上記標的物質−レセプター複合体には、すべてのレセプターが標的物質と結合した複合体と、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体と、がある。このうち、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体では分子量の差により、複合体と遊離レセプターとを分離できない場合がある。すなわち、２種のレセプターを使用する場合には、１種のレセプターと標的物質との複合体は、当該レセプターとの分子量の差がほとんど生じないため、本発明の方法によっても、遊離レセプターと複合体との分離が困難である。このため、電気泳動に用いるサンプルでは、可能な限りすべてのレセプターが標的物質と結合して複合体を形成することが好ましい。具体的には、電気泳動に用いるサンプル中の、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体の量が、サンプル中標的物質の１０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、サンプル中標的物質の１ｍｏｌ％以下であることがより好ましい。このような量であれば、標準物質の濃度を十分な精度で測定でき、また、疾患の診断にも十分適用できる。なお、電気泳動に用いるサンプル中の、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体の量の下限は、なるべく低いことが好ましいので、サンプル中標的物質の０ｍｏｌ％であるが、サンプル中標的物質の１ｍｏｌ％以上であれば十分である。
【００２３】
標的物質と、標的物質に特異的に結合するレセプターとを結合させる反応は、従来公知の方法によって行われる。具体的には、標的物質と、標的物質のそれぞれ異なる部位に特異的に結合する少なくとも２種以上のレセプターと、を混合して反応させる。一態様として、抗原抗体反応の条件を挙げると、反応温度は、通常４〜５０℃、好ましくは４〜４２℃、さらに好ましくは２０〜４０℃である。反応時間は、通常５分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜１６時間、さらに好ましくは３０分間〜１２０分間である。本来の抗原抗体反応の好ましい反応時間は上記の通りであるが、標的物質を迅速に測定する場合には抗原抗体反応を早めに切り上げても問題はない。迅速に測定結果を算出するためには抗原抗体反応を数分〜１０分程度で切り上げることが好ましい。反応溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝溶液、トリシン緩衝液等を使用することができる。標的物質と反応させるレセプターの量は、適宜設定すればよいが、標的物質に対して、通常大過剰のレセプターが添加される。具体的には、レセプターを、標的物質（抗原）１分子に対して、１分子以上の量で添加し、好ましくは１分子を超えて１００分子以下となるような量、より好ましくは１０〜１００分子となるような量で添加される。ここで、通常の検査などでは、標的物質（抗原）の量は不明であるが、このような場合には、一般的にその標的物質（抗原）が試料中に存在する量（例えば、Ｃ−ペプチドでは、０．６〜１０ｎｇ／ｍＬ程度）を基準として、上記混合比となるように、レセプターを添加すればよい。
【００２４】
反応に供する際には、抗原およびレセプターは適当な溶媒（例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、トリシン緩衝液、グリシン緩衝液、トリス−グリシン緩衝液等）に溶解して用いることができる。標的物質−レセプター結合反応（例えば、抗原抗体反応）を行った試料は電気泳動する前に、前処理を行ってもよい。前処理としては、遠心操作やフィルター濾過により、大きな凝集体を取り除く操作が挙げられる。
【００２５】
電気泳動に供するサンプルは、ｐＨを下記泳動用緩衝液（ランニングバッファー）のｐＨに調整することが好ましい。ただし、ランニングバッファーに対し、サンプル（バッファー）の量は微量であるので、サンプル（バッファー）のｐＨがランニングバッファーとは異なっていても泳動が始まれば同じｐＨになり、特にサンプルのｐＨ調整を行わなくともよい。
【００２６】
［標的物質］
本発明における標的物質としては、目的（診断しようとする疾患の種類）に応じて、適宜選択される。
【００２７】
標的物質としては、特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、糖鎖、核酸、低分子化合物（好ましくは、分子量が１ｋＤａ以下の低分子化合物）およびこれらの複合体等が挙げられる。中でも、標的物質は、本発明の有益性の観点からは、ペプチドであることが好ましい。
【００２８】
本明細書において、タンパク質またはペプチドには、遊離体、リン酸基、メチル基、アセチル基、糖鎖、脂質、ニトリル基等の修飾を受けた修飾体、酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩、核酸と結合している核タンパク質など他の物質と結合しているタンパク質またはペプチドが含まれる。
【００２９】
標的物質の分子量としては、本発明の効果をより発揮するという観点からは、１，０００〜３０，０００であることが好ましく、１，０００〜１０，０００であることがより好ましく、１,０００〜５,０００であることがさらに好ましい。標的物質の分子量が上記範囲を超える場合であっても遊離レセプターの分離、標的物質の検出は可能であるが、本発明の効果は、上記範囲内において効果的に発揮される。すなわち、標的物質の分子量が低い場合、例えばペプチドの場合、ペプチド単体を電気泳動で検出しようとすると、泳動後の転写、抗体の添加、染色等の操作を種々検討する必要があり、ペプチドに抗体等のレセプターを結合させた状態で電気泳動を行う方が容易に泳動で対象を検出できる。さらに、ペプチドのような分子量の低い標的物質は、従来のＥＭＳＡの様な方法の場合、分子ふるいによる分離によっても、遊離レセプターと複合体との分子サイズの差が小さいことに起因して明確に分離されない。しかしながら、本発明の分離方法によれば、比較的分子量が小さい標的物質であっても、容易にかつ明確に遊離レセプターと複合体とを分離することができる。かような観点から、本発明では比較的分子量が小さい標的物質であることが好ましい。標的物質が未知物質である場合には公知の分析方法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、アミノ酸分析等）により分子量を求めることができる。
【００３０】
また、標的物質の分子量が、レセプターの分子量の１／１５０〜１／５であるのが好ましい。標的物質の分子量が、上記範囲内であれば、標的物質−レセプターの複合体と遊離レセプターとの分子量の差に基づいて、電気泳動における移動度の差が効果的に生じ、標的物質−レセプターの複合体と遊離レセプターとを電気泳動により簡便に精度よく分離することができる。なお、レセプターの分子量が上記範囲を超える場合であっても遊離レセプターの分離、標的物質の検出は可能であるが、本発明の効果は、上記範囲内において効果的に発揮される。
【００３１】
本発明は、Ｃ−ペプチドなどの低分子量の物質であっても、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとの分子量の差により、電気泳動の移動度に差が生じ、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを明確に分離することが可能となる。
【００３２】
電気泳動の際、電気泳動される物質（例えば、標的物質−レセプター複合体）は、ゲルと電界とによる力が常に負荷され続ける。そのため、標的物質−レセプター複合体を形成したとしても、電気泳動の際に、標的物質−レセプター複合体の構造が安定に存在することが難しい場合がある。一般的には、低分子量の標的物質に比較的大きな分子量を有する（それぞれ別の部位を認識する）レセプターを２種以上結合させた場合、標的物質に結合するレセプター同士が非常に近接した状態となるため、立体的に不安定な状態で、標的物質−レセプター複合体が電気泳動に耐えうる安定性を有していないことが推測される。すなわち、電気泳動の際にレセプターの少なくとも１種が標的物質から外れるということが生じうる。その場合、電気泳動で検出される対象としては、１種のレセプターが結合する標的物質となり、電気泳動では、レセプター遊離体のシグナルと１種のレセプターが結合する標的物質のシグナルとが分離できず、結果として、精度よく標的物質の濃度が測定できない、という結果となってしまう。
【００３３】
しかしながら、本願発明者は、Ｃ−ペプチドのように、低分子量の標的物質を検出する際に、これらの物質にそれぞれ異なる部位に特異的に結合するレセプターを２種以上用いた場合においても、標的物質−レセプター複合体が電気泳動の際に安定に存在することができ、電気泳動により標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを明確に分離することができることを見出した。これらの効果は、標的物質の分子量が上記範囲内である場合に特に発揮され、極めて簡便な方法により標的物質を検出できる。
【００３４】
標的物質の具体例としては以下のタンパク質を好ましく挙げることができる；インスリン、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＬＰ−１(グルカゴン様ペプチドー１)、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、アディポネクチン、Ｈ−ＦＡＢＰ（心筋型脂肪酸結合タンパク質）、ミオグロビン、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ（Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド）。
【００３５】
なお、本明細書において特記しない限り「タンパク質」には、ペプチドが包含されるが、１０ｋＤａ未満のポリペプチドを特に「ペプチド」と称する場合がある。また、タンパク質は天然物であっても合成物であってもよい。
【００３６】
標的物質は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）由来の試料（血液、血漿、血清、組織、関節液、尿、リンパ液等）、細胞（培養細胞、細胞株等）、その培養上清、それらの抽出物、それらの部分精製画分等から調製することができる。また、各種環境の土壌、水等から抽出してもよい。この際、標的物質は、公知のタンパク質の精製方法を用いて精製することにより、製造されうる。具体的には、例えば、哺乳動物の組織または細胞を界面活性剤の存在下でホモジナイズし、得られる組織の粗抽出物画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより、精製されうる。標的物質は市販品であってもよい。
【００３７】
また、標的物質を精製（抽出）せずに、被検試料をそのまま用いてもよい。例えば、被検者の血液、血漿、血清、組織、関節液、尿、リンパ液等の生体成分等の被検試料を用いて標的物質−レセプター結合反応を行ってもよい。この際、被検試料に対して、希釈、精製等の処理を行ってもよい。
【００３８】
［レセプター］
本発明においてレセプターとは標的物質と特異的に結合することができる物質を指す。本発明において、レセプターは、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いる。すなわち、抗原の異なるエピトープを認識する２種以上の抗体を用いる。
【００３９】
レセプターとしては、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する２種以上であれば特に制限されず、例えば、抗体、抗原との結合活性を有する抗体の断片（抗体フラグメント）、ＤＮＡアプタマー等の核酸、タンパク質、タンパク質で構成された受容体、バインディングプロテイン、ペプチド、生体レセプター、糖鎖などが挙げられる。これらのでも、標的物質（抗原）との特異的結合性が高いことから、レセプターとしては抗体または抗体の断片を用いることが好ましい。これらの抗体は、組み合わせて用いてもよい。なお、抗原の同じエピトープを認識するレセプターを組み合わせる場合は、異なるエピトープを認識する他のレセプターもさらに必要である。
【００４０】
抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、改変抗体（例えば抗原認識部位のみヒト化した「ヒト化抗体」など）、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体などが挙げられる。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、いずれのクラスのものであってもよい。抗原への特異的結合性の観点からはモノクローナル抗体を用いることがより好ましい。
【００４１】
抗体の断片（フラグメント）としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体等が挙げられる。
【００４２】
なお、かかるレセプターは、標的物質との結合が阻害されない範囲内において修飾を受けたものであってもよい。かかる修飾の例としては、検出効率を向上するための、蛍光標識物質を化学結合で結合させた蛍光標識化、レセプターを構成する原子を放射性同位体で標識する放射能標識化、対になる物質に対して特異的な結合性を示す物質を化学的に結合させた特異的結合対標識化（例えば、ビオチン、多糖に結合性を示すレクチンを化学的に結合させた標識など）等が例示される。標識に用いられる標識物質としては、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）またはテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３Ｈ等のラジオアイソトープ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはフィコエリトリン等の酵素が挙げられる。また、レセプター（例えば、抗体）とグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の蛍光発光蛋白質などと融合させてもよい。また、電気泳動等に有利なように化学修飾したレセプターでもよく、修飾前のレセプターが有する官能基と反応できる架橋剤を使用して化学修飾を行うことができる。架橋剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）Ｎ−スクシンイミジル（４−イオードアセチル）アミノベンゾエート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）（ＳＩＡＢ）、ジマレイミド（ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ）、６−ヒドラジノニコチミド（６−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｎｉｃｏｔｉｍｉｄｅ）（ＨＹＮＩＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（ＭＢＣ）等の多官能性試薬が挙げられる。かような修飾物質の修飾方法は従来公知の方法により行うことができる。
【００４３】
なお、レセプターとしては、電気泳動緩衝液中で標的物質結合活性を維持していることが必要である。
【００４４】
レセプターの製造は従来公知の方法により作製することができる。
【００４５】
例えば、モノクローナル抗体は次の手順で作成することができる。
【００４６】
まず、抗原を、動物に対して、抗原の投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられる。抗血清中の抗体価の測定は常法により行うことができる。抗原を免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、Nature 256:495(1975)記載の方法に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様の、例えば塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡもしくはプロテインＧなどを用いた特異的精製法による免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００４７】
一方、ポリクローナル抗体は、例えば次の手順で作成することができる。
【００４８】
ポリクローナル抗体は、例えば、抗原とキャリアーとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から活性型ハプトグロビンに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造されうる。抗原とキャリアーとの複合体を形成する際に、キャリアーの種類および抗原とキャリアーとの混合比は、キャリアーに架橋させた抗原に対して抗体が効率良く製造できれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい。キャリアーとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等が用いられる。また、抗原とキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。抗原とキャリアーとの複合体は、免疫される動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。用いられる動物としては、モノクローナル抗体作成の場合と同様の哺乳動物が挙げられる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の手順で行なうことができる。
【００４９】
抗体は市販品を用いてもよい。
【００５０】
抗体の市販品としては、例えば、抗原をＣ−ｐｅｐｔｉｄｅとする場合には、Ａｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［７Ｅ１０］（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））とＡｎｔｉ−ｈ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ９１０３  ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［５Ｂ８］（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））とＡｎｔｉ−ｈ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ９１０３  ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［２Ｂ７］（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））とＡｎｔｉ−ｈ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ９１０３  ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［２Ａ１１］（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｎｏｖａ社製））とＡｎｔｉ−ｈ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ９１０３  ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ−ｈ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ９１０1  ＳＰＴＮ−５（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））とＡｎｔｉ−ｈ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ９１０３  ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［２Ａ１１］（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｎｏｖａ社製））とＡｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［４Ｈ８］（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））、Ａｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［４Ｈ８］（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））とＡｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［５Ｂ８］（Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））等の組み合わせが挙げられる。
【００５１】
［電気泳動］
本発明では、電気泳動下においても標的物質とレセプターとが特異的に結合することが必要であるため、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下で電気泳動を行う必要がある。本発明では、電気泳動下において、用いる２種以上のレセプターの標的物質認識部位および当該レセプターの認識部位と結合する標的物質の結合部位が維持されていればよい。例えば、陰イオン系界面活性剤（例えばＳＤＳ、ＬＤＳ）またはカオトロピック剤（尿素、ホルムアミド、グアニジン、ヨウ化カリウム）等のタンパク質変性剤を使用する場合であっても、レセプター（抗体）のパラトープおよび抗原のエピトープが変性しないものであれば問題ない。
【００５２】
したがって、本発明においては、電気泳動法としては、標的物質−レセプター複合体とレセプター遊離体との移動度が異なり、分離できるものであればいずれの方法も使用できる。具体的には、アガロースゲル電気泳動、パルスフィールド電気泳動（pulsed-field gel electrophoresis；ＰＦＧＥ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis；ＰＡＧＥ）等のゲル電気泳動；泳動ゲル中にｐＨ勾配を形成させた等電点電気泳動；等電点電気泳動（１次元目）およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を組み合わせた二次元電気泳動；尿素及びホルムアミドを変性剤として使用する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）；などが挙げられる。なお、上記担体電気泳動では、上記以外にも、デキストラン等のゲルを下記記載のキャピラリー高分子等の担体を代わりに使用してもよい。また、マイクロチップ電気泳動等の無担体電気泳動法でも担体を用いた電気泳動法でもよい。
【００５３】
ここで、本発明に係る電気泳動では、上述のように、陰イオン系界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＬＤＳ）、カオトロピック剤（例えば、尿素、ホルムアミド、グアニジン、ヨウ化カリウム）等のタンパク質変性剤を使用（例えば、上記変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）しても、あるいは上記タンパク質変性剤を使用しなくても（ｎａｔｉｖｅな電気泳動）、いずれでもよい。後者の場合には、トリス−グリシンシステムを使用した高いｐＨ条件の緩衝液を一般的に使用する。
【００５４】
また、キャピラリー電気泳動に用いるキャピラリー内に分子ふるい効果を持たせるようなポリマーを泳動用緩衝液等と共に充填してもよい（キャピラリー高分子溶液電気泳動）。この際、キャピラリーに充填されるポリマー（キャピラリー高分子）としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されないが、具体的には、ポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール）、ポリプロピレンオキサイド等のポリエーテル類；ポリエチレンイミン等のポリアルキレンイミン；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸メチル等のポリ（メタ）アクリル酸エステル等のポリ（メタ）アクリル酸系ポリマー；ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等のポリアミド系ポリマー；；ポリビニルアセテート，ポリビニルピロリドン、ポリビニルオキサゾリドン等のポリビニル系ポリマー；プルラン、エルシナン、キサンタン、デキストラン、グアガム等の水溶性ヒドロキシルポリマー；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性セルロース；およびこれらの誘導体、ならびにこれらポリマーを構成するモノマーユニットのコポリマー等が挙げられる。
【００５５】
これらのうち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロース電気泳動を使用することが好ましく、透明性が高く、電気的に中性であることから、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することがより好ましい。この際、ポリアクリルアミドゲルは、濃度勾配ゲルであってもあるいは均一濃度ゲルであってもよい。具体的には、４−１６％（ｗ／ｖ）の濃度勾配ゲル、５−２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ゲル、あるいは８〜１２％（ｗ／ｖ）の一定濃度ゲルを用いることができる。一般的には一定濃度ゲルよりは濃度勾配ゲルの方が、バンドがシャープである。ポリアクリルアミドゲルは適宜調製してもよいし、市販品を用いてもよい。ポリアクリルアミドゲルとしては、トリス−グリシンゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等）、トリス−酢酸ゲル（例えばＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、またはビストリスゲル（例えば、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など）が挙げられる。アクリルアミドゲルを製造する際に用いられる緩衝液のｐＨは６〜８程度であることが好ましい。
【００５６】
泳動ゲル中にｐＨ勾配を形成させた等電点電気泳動にも本発明は適用できる。等電点電気泳動にて検出する場合は、標的物質−レセプターの複合体と遊離レセプターとを等電点が収束へ向かう移動速度の差で分離を行う。
【００５７】
電気泳動は、通常、緩衝液を電気泳動用緩衝液（ランニングバッファー）として用いて行われる。ここで、緩衝液は、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されず、通常電気泳動に使用される緩衝液が同様にしてあるいは適宜修正して使用できる。具体的には、緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝液組成物を含有する溶液であれば特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等が挙げられる。具体的な泳動用緩衝液としては、例えば、トリス−グリシン緩衝液、トリス緩衝液、トリス−トリシン緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝溶液、ＭＯＳＰ緩衝溶液等や、一般に電気泳動用緩衝液として使用される緩衝液が挙げられ、市販の電気泳動用キット中に提供されている緩衝液等も使用することができる。泳動用緩衝液は、一般に電気泳動用緩衝液として使用される濃度で使用することができる。
【００５８】
緩衝液のｐＨは、特に制限されず、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されない。ただし、レセプターが標的物質結合活性を維持し、かつ負に帯電する環境下としては、試薬の安定性、反応性などを考慮すると、通常、中性〜弱塩基性付近であることが好ましい。かような観点から、泳動用緩衝液のｐＨは、６〜９であることがより好ましい。緩衝液のｐＨ調整には、塩酸などの酸性物質や水酸化ナトリウムなどの塩基性物質を用いて適宜調整すればよい。
【００５９】
電気泳動における印加電電圧は、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常５〜２０００Ｖ／ｃｍの範囲で印加される。
【００６０】
電気泳動時間は通常、３０〜１８０分であり得る。迅速な分離という観点からは、泳動時間は数分〜１０分程度であることが好ましい。なお、電気泳動温度は、特に制限されないが、通常、室温（２０〜２５℃）で行われる。
【００６１】
電気泳動後に標的物質−レセプター複合体および遊離レセプターを検出する方法の１つとしてゲル染色が挙げられる。レセプターがタンパク質である場合の染色方法としては、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色法、銀染色法や、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ社製）、Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）などの色素を用いた染色法などが挙げられる。また、遊離レセプターと分離された標的物質−レセプター複合体のバンドを、画像解析ソフトウェア等を用いて、当該バンドの色素のシグナル強度（染色の濃さ）（以下、「バンドのシグナル強度」とも称する場合がある。）を算出し、標的物質量を定量することもできる。また、キャピラリー電気泳動の場合は、ＵＶ／ＶＩＳ吸光光度計（フォトダイオードアレイ）等を用いて直接検出することができる。
【００６２】
［検出方法］
本発明の分離法により、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを明確に分離することができる。したがって、本発明の分離法を用いれば、標的物質である抗原を検出することができる。
【００６３】
標的物質に対して、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上のレセプターを混合して反応させ、標的物質−レセプター複合体と、遊離レセプターとの分子量差を増大させた後、混合試料を電気泳動に掛け、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを分子量に依存する移動度の差で分離し、標的物質−レセプター複合体からのシグナルを検出することで、標的物質を検出する。
【００６４】
具体的には、本発明の第一実施形態の変形例は、標的物質と、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する２種以上のレセプターとを結合させて、標的物質−レセプター複合体を形成させる段階と、電気泳動を行う段階と、標的物質を検出する段階と、を含む、標的物質の検出方法である。ここで「検出」とは、「標的物質の存在、非存在、または濃度を検出」することを意味する。このような方法により、簡便にかつ特異的に標的物質を検出することができる。
【００６５】
標的物質−レセプター複合体を形成させる段階、および、電気泳動を行う段階については、上記第一実施形態で記載したとおりである。
【００６６】
標的物質の検出方法としては、上記した染色法により得られたバンドのシグナル強度から標的物質量を定量する方法に加えて、標的物質−レセプター複合体を可視化する方法も用いることができる。
【００６７】
染色法により得られたバンドのシグナル強度から標的物質量を定量する方法としては、具体的には、下記の方法により求めることができる。
【００６８】
例えば、電気泳動後の染色（例えば、銀染色）の結果より、標的物質−レセプター複合体のバンドが検出される。当該バンドの色素のシグナル強度は、標的物質量に比例する。すなわち、予め測定した標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度について、標的物質量との検量線を作成することができ、当該検量線に基づいて、検出された標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度を比較することで、サンプル中の標的物質量を正確に測定できる。
【００６９】
本発明では、予め標的物質量が既知のサンプルを用いて、標的物質量に対する標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度の関係（検量線）を作成することが好ましい。すなわち、予め標的物質量が既知のサンプルについて、電気泳動を行い、標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度を算出し、標準物質量とバンドのシグナル強度との検量線を作成する。画像解析としては、特に制限されず、公知の画像解析ソフトが用いられる。例えば、ｉｍａｇｅＪ、ＮＩＨｉｍａｇｅ、ＳＣＩＯＮｉｍａｇｅ、等が挙げられる。画像解析より標的物質量を算出する具体的な方法としては、検出された標的物質−レセプター複合体バンドにおいて、測定範囲（レーン）を指定し、画像解析により縦方向に対する濃度分布図を表示させ、それぞれのピークを積分することで算出することができる。
【００７０】
また、標的物質−レセプター複合体を可視化する方法としては、標的物質が可視化できるのであればいずれの方法も用いることができ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）を用いることができる。この際、標的物質に直接反応する一次レセプター（例えば、一次抗体）を標識してもよいし（直接法）、標識していない一次レセプター（例えば、一次抗体）を用いて１度目の標的物質−レセプター結合反応（例えば、抗原抗体反応）を行い、一次レセプター（一次抗体）自体を標的物質（例えば、抗原）とする別のレセプター（二次レセプター）（例えば、抗体（二次抗体））を標識してもよい（間接法）。
【００７１】
標識に用いられる標識物質としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（Ｌｉｆｅ社）、Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｏｕｒ（Ａｎａ  ｓｐｅｃ社）、ＩＲＤｙｅ（ＬＩ−ＣＯＲ社）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３Ｈ等のラジオアイソトープ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（例えばセイヨウペルオキシダーゼ）、β−ガラクトシダーゼまたはフィコエリトリン等の酵素、アクリジニウムエステルなどの化学物質が挙げられる。酵素を標識物質として用いた場合には、酵素に依存する第２のシグナル（例えば無色の基質からの着色生成物の形成）を発生させてもよく、この場合標識酵素の他基質が必要となる。例えば、ペルオキシダーゼの場合、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどが用いられ、アルカリホスファターゼの場合、パラニトロフェニルリン酸ナトリウムなどが用いられる。
【００７２】
標識物質により標識する方法は従来公知の方法を用いることができ、例えば、特定の官能基と結合を形成できる活性基と蛍光物質などの標識物質とが結合した標識物質活性基と、レセプターとを混合して標識する方法や活性基をその両端に具備する各種のクロスリンカーを用いて、標識物質とレセプターとをクロスリンカーを介して架橋することで標識する方法などがある。それ以外の方法としては、ビオチン化抗体用いたＬＡＢ（Ｌｉｎｋｅｄ  Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ）法、ＬＳＡＢ（Ｌｉｎｋｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ）法などが挙げられる。
【００７３】
上記標識物質の検出法としては、従来公知の方法を用いることができる。酵素により生じた産物の検出および／または定量は、当該産物の吸光度を測定することにより行なうことができる。例えば、酵素基質として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いた場合には、６５５ｎｍにおける吸光度を測定すればよい。また、標識物質がラジオアイソトープの場合、放射線計数装置で測定すればよいし、蛍光物質の場合には蛍光励起して視覚化するか、定量を行う場合には、蛍光測定器や画像処理システムで測定すればよい。
【００７４】
標的物質の定量は、例えば、既知濃度の標的物質が含まれる標準試料を用いて得られた蛍光強度を利用して検量線を作製することによって、試料中に含まれる標的物質の量を簡便に定量することができる。
【００７５】
本発明により求められる検量線は、泳動条件などの外来要因にはよらず、定常的なものであるため、検量線として有効である。このため、この検量線を利用することにより、サンプル中の標的物質量を正確に測定することが可能である。よって、本発明によれば、サンプル中の標的物質量を、電気泳動によって測定することができる。
【００７６】
上記検出方法は、特に標的物質が何らかの疾患に関与するマーカーである場合に臨床検査において非常に有用な手段となる。
【００７７】
例えば、ヒトＣ−ペプチドは３１個のアミノ酸からなるペプチドであり、インスリン前駆物質であるプロインスリンの構成成分である。Ｃ−ペプチドはプロインスリンがエンドペプチダーゼにより切断されインスリンが血中へ放出される際に、分解産物として同時に放出される。したがって、Ｃ−ペプチドはインスリンの分泌動態の指標としての役割を果たし、血中Ｃ−ペプチドの動態は糖尿病患者等の内因性インスリンの分泌能を調べるために重要な指標となり得る。実際、Ｃ−ペプチドの測定は糖尿病の診断または治療に利用されており、更にはインスリノーマ、インスリン自己免疫症候群などの診断にも有用である。本発明の第一の実施形態の分離方法またはこの変形例の検出方法によれば、Ｃ−ペプチドのような低分子のペプチドであっても分離・検出可能であるため、これによりＣ−ペプチド量を定量化することができる。さらに、正常値と比較することにより、インスリンの分泌量を検査することができる。正常値より被験者のＣ−ペプチド量が低ければ、被験者のインスリン分泌能が低下していることがわかる。したがって、本発明の好適な実施形態は、標的物質がＣ−ペプチドである。
【００７８】
［診断方法］
また、本発明の他の実施形態は、第一の実施形態の分離・検出方法を用いた標的物質に関与する疾患の診断方法である。具体的には、被検者から試料を採取する段階と、前記試料中の標的物質と標的物質に特異的に結合するレセプターとを結合させて標的物質−レセプター複合体を形成させる段階と、電気泳動を行う段階と、標的物質を検出する段階と、標的物質の健常者の値と比較して被検者が標的物質に関与する疾患に罹患しているか否かを判定する段階と、を含み、前記レセプターは、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上である、標的物質に関与する疾患の診断方法である。ここで、被検者又は健常者は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であることが好ましい。上記疾患としては、例えば、標的物質がＣ−ペプチドの場合、インスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などが挙げられる。健常者の値と比較して被験者のＣ−ペプチド量が高ければ、インスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群などに罹患している可能性があり、健常者の値と比較して被験者のＣ−ペプチド量が低ければ、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などに罹患している可能性がある。
【００７９】
さらに、本発明の他の実施形態は、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上のレセプターを含む、を含む標的物質に関与する疾患の検査キットである。
【００８０】
検査キットに含まれる２種以上のレセプターは、好適にはレセプターを含む容器を含む。レセプターは予め緩衝液に溶解された状態であってもよい。２種以上のレセプターは、予め混合されていてもよいし、個別に容器に充填されていてもよい。また。上記検査キットは、アッセイ用の緩衝液またはその濃縮ストック溶液を含む電気泳動用セットを含むのが好ましい。電気泳動用セットには、その他、電気泳動槽、電気泳動用ガラス板、バッファー槽、スペーサー、コーム、クリップ、パワーサプライ、又はペリスタポンプ等の一般的な電気泳動用装置；電気泳動用試薬；ゲル等の担体；検出試薬等を含めることができる。
【００８１】
さらに、標準サンプルとして濃度が既知である標的物質およびこれを含む容器をキットが含んでいてもよい。レセプターは、診断が容易となることから、蛍光物質等の標識物質で標識されていることが好ましい。キットに含まれる各試薬は、１試料測定分毎に容器に分注されて提供されていてもよく、複数試料測定分が各試薬毎に纏めて個々の容器に含まれて提供されてもよい。後者の場合は、用時に各試薬を所定の測定用容器に分注して使用する。試薬が１試料測定分毎に提供される場合は、各試薬を含む容器はカートリッジとして一体成形されてもよく、そのカートリッジの異なる区画に各試薬が格納されていてもよい。レセプターが凍結乾燥品としてキットに含まれる場合は、これらを溶解するために適した上述のような緩衝液が更にキットに含まれることがある。これらのレセプターが含まれる、あるいはキットに含まれることのあるアッセイ用のその他の容器はレセプターおよび標的物質と相互作用せず、アッセイに利用される反応、例えば酵素反応、化学発光反応を妨害しない材料であればどんな材質のものでもよい。必要であればそのような相互作用を起こさないように表面を予め処理して提供されてもよい。検査キットには、通常取り扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８３】
（実施例１）
１．抗体溶液１の調製
Ａｎｔｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［７Ｅ１０］（ａｂｃａｍ社製，Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）（２ｍｇ／ｍＬ）２５０μＬを、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ  ７．４）６ｍＬで希釈した。
【００８４】
２．抗体溶液２の調製
Ａｎｔｉ  ｈ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ９１０３  ＳＰＲＮ−５（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）（５ｍｇ／ｍＬ）１５０μＬを、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ  ７．４）９．２３ｍＬで希釈した。
【００８５】
３．Ｃ−ペプチド抗原溶液
Ｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ（ｈｕｍａｎ）（ＷＡＫＯ社製、分子量＝３，６１７）５００μｇを、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ  ７．４）４．１４ｍＬに溶解し、Ｃ−ペプチド抗原溶液を調製した。
【００８６】
４．測定サンプルの調製
３．で調製したＣ−ペプチド抗原溶液を、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ  ７．４）にてそれぞれ、１５倍、３０倍、６０倍、１２０倍、２４０倍に希釈し、Ｃ−ペプチド希釈系列溶液ａ〜ｅを作製した。Ｃ−ペプチド希釈系列溶液ａ〜ｅを、下記表１に従って、それぞれ上記１．および２．で調製した抗体溶液１および２と、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ  ７．４）と、サンプルバッファーと、混合し、室温（２５℃）で１時間静置し、Ｃ−ペプチド希釈系列溶液１〜１５（表１中、「レーン番号」として記載）を調製した。
【００８７】
なお、ＴＲＩＳ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）（和光純薬）０．４９ｇ、ブロモフェノールブルー（和光純薬）８０ｍｇ、およびグリセロール（和光純薬）８ｍＬを、ミリＱ水で２０ｍＬにメスアップし、塩酸（和光純薬）でｐＨ７．４に調整したものを、サンプルバッファーとして用いた。
【００８８】
【表１】
2014145680.tif 000002
【００８９】
５．電気泳動
ゲルウェルに、カソードバッファーおよびアノードバッファーを所定の量、充填した。その後、上記４．で作製したそれぞれの泳動サンプル（Ｃ−ペプチド希釈系列溶液１〜１５）をゲルのウェルに５μＬずつアプライした。
【００９０】
室温（２５℃）にて１５０Ｖ定電圧にて電気泳動を行なった。ブロモフェノールブルーの泳動最前線がゲル全体の３分の４程度まで進行したら泳動を止め、和光純薬；銀染色ＫｉｔワコーＩを使用し、添付文書記載の手順に従って銀染色を行なった。使用した機材および溶液は以下のとおりである。
【００９１】
【化１】
2014145680.tif 000003
【００９２】
銀染色の結果を図１に示す。
【００９３】
１種の抗体のみを用いた泳動サンプル（Ｃ−ペプチド希釈系列溶液１〜４および５〜８／レーン番号１〜４および５〜８）では、抗原の濃度を増加しても高分子量側に明確なバンドは出現しなかった。一方、２種の抗体を混合した泳動サンプル（Ｃ−ペプチド希釈系列溶液９〜１４／レーン番号９〜１４）では、高分子量側（分子量マーカーで２４２ｋＤａ辺り）にシャープなバンドが出現し、そのバンドの濃さ（シグナル強度）は抗原の濃度に対応していることが確認された。また、高分子量側のバンドが濃くなるにつれ、低分子量側（分子量マーカーで１４６ｋＤａ辺り）のバンドが減少していることがわかる。これらのことより、上記の手順で、比較的低分子量の抗原に対して標識抗体を複数個反応させることで、標的物質−レセプター複合体と遊離体との分子量差を増大させ、電気泳動により標的物質−レセプター複合体と遊離体とを分子量の差で分離することが可能であることが示された。
【００９４】
次に、フリーソフトである「ｉｍａｇｅＪ」を用いて、Ｃ−ペプチドの定量解析を行った。定量解析は、標的物質−レセプター複合体バンドが検出できた９，１０，１１，１２，１３，１４の各レーンについて、図２Ａに示されるそれぞれのレーンを指定（０．３ｃｍ×１．５ｃｍ）し、縦方向に対する濃度分布図を表示させ、それぞれのピークを積分することで算出した。
【００９５】
図２Ｂに、算出したＣ−ペプチド量に対する標的物質−レセプター複合体バンドのシグナル強度との関係をプロットした。図２Ｂにより、Ｃ−ペプチド量が０〜１．６ｎｇの範囲において、各レーン、すなわちレーン９〜１３の標的物質−レセプター複合体バンドのシグナル強度に対して良好な直線性を示した（以下、当該直線性を、「Ｃ−ペプチド量とバンド染色の濃さとの直線性」と称する。）。すなわち、Ｃ−ペプチド量と複合体バンドのシグナル強度とは比例関係であり、シグナル強度から、Ｃ−ペプチド量を正確に測定できることが考察される。定量性の低い銀染色でこの結果は驚くべきことである。
【００９６】
Ｃ−ペプチド量３．２ｎｇにおいては、レーン１４の標的物質−レセプター複合体バンドのシグナル強度が、Ｃ−ペプチド量とバンドのシグナル強度との直線性から外れている。これは遊離抗体のバンド（下部の１４６ｋＤａ付近のバンド）がレーン１３の結果で消失していることから考えると、添加されたＣ−ペプチドの量に対し、あらかじめ添加されていた抗体の量が不足していたと思われる（レーン１３でバンドが消失していたことから、レーン１３で用いたＣ−ペプチド希釈系列溶液中のＣ−ペプチドと抗体との量がほぼ同じであったと考えられる）。この問題を解決することは非常に簡単で、あらかじめ添加する抗体の量を増やせばよい。
【００９７】
したがって、本発明の方法によると、この各測定サンプルレーンの標的物質−レセプター複合体バンドのシグナル強度を測定することで、別途求めたＣ−ペプチド量とバンドのシグナル強度との比例関係により、サンプルのＣ−ペプチド含有量を正確に算出できることが期待できる。
【図２Ｂ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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