(57)【要約】【課題】カスパーゼ１の活性化を効率的に阻害するカスパーゼ１活性化阻害剤、当該カスパーゼ１活性化阻害剤を用いた炎症や痒み等を効果的に治療することができる抗炎症剤及び鎮痒剤を提供する。【解決手段】ミトコンドリアの酸素消費を調節し、血糖降下作用を有するカスパーゼ１活性化阻害剤であって、プテロシンＢ、プテロシンＺ、アセチル−プテロシンＢ、プテロシンＦ、及びメトホルミンの中から選択される少なくとも１種のカスパーゼ１活性化阻害剤である。【選択図】図５
2014214144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアの酸素消費を調節し、血糖降下作用を有するカスパーゼ１活性化阻害剤であって、
プテロシンＢ、プテロシンＺ、アセチル−プテロシンＢ、プテロシンＦ、及びメトホルミンの中から選択される少なくとも１種のカスパーゼ１活性化阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のカスパーゼ１活性化阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項３】
請求項１に記載のカスパーゼ１活性化阻害剤を有効成分として含有する鎮痒剤。
【請求項４】
ミトコンドリアの酸素消費を調節するカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法であって、
被験物質を哺乳動物由来の培養組織又は細胞と接触させる工程と、
カスパーゼ１活性化剤としてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加する工程と、
カスパーゼ１の活性化を測定する工程と、
を包含するカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法。
【請求項５】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、トリコスタチンＡ、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、及びＭＳ２７５の中から選択される少なくとも１種である請求項４に記載のカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ１活性化阻害剤、抗炎症剤、鎮痒剤、及びカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カスパーゼ１は、炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（以下、ＩＬ−１βと称す）やインターロイキン１８（以下、ＩＬ−１８と称す）の前駆体の一部を切断して成熟体へと変換するシステインプロテアーゼである。カスパーゼ１遺伝子は炎症性刺激、例えばバクテリア由来のリポポリサッカライド（以下、ＬＰＳと称す）等で誘導される。
【０００３】
カスパーゼ１前駆体として発現するプロカスパーゼ１は、会合してインフラマソームと呼ばれる複合体を形成する。このインフラマソームの形成に伴って接近したプロカスパーゼ１は互いに自己消化して活性型のカスパーゼ１を生成する。このカスパーゼ１の活性化に対する阻害剤は、抗炎症剤、鎮痒剤として有望であると考えられ、カスパーゼ１を効率的に阻害する薬剤が求められている。また、このカスパーゼ１活性化阻害剤を効率的に評価する方法も求められている。
【０００４】
カスパーゼ１活性化阻害剤としては、例えば、クロレラの細胞壁破砕物がカスパーゼ１活性化阻害の効果を有していることが報告されている（特許文献１参照）。また、カスパーゼ１活性化阻害剤として、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトンが知られている（特許文献２参照）。
【０００５】
従来のカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法では、炎症性サイトカインを産生させる物質としてＬＰＳが使用されているが、ＬＰＳはプロカスパーゼ１の活性化を直接的に誘導するものではないため、細胞種によってはプロカスパーゼ１を効率的に活性化できない場合があった。また、ＬＰＳは種々の炎症性サイトカインの分泌を促進するため、カスパーゼ１活性化阻害の効果のみを比較するのが困難な場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−０８９３２４号公報
【特許文献２】特開平１１−３０２１９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１及び特許文献２に記載の物質には、カスパーゼ１の活性化を阻害する作用を有していることが開示されている。しかしながら、カスパーゼ１活性化阻害剤としての効果、及びその安定性については、必ずしも満足のいくものではなかった。また、これら特許文献には、カスパーゼ１の活性化を阻害する物質の評価方法については何ら開示されていない。
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、カスパーゼ１の活性化を効率的に阻害するカスパーゼ１活性化阻害剤、当該カスパーゼ１活性化阻害剤を用いた炎症や痒み等を効果的に治療することができる抗炎症剤及び鎮痒剤を提供することを目的とする。さらにカスパーゼ１活性化阻害剤を効果的に評価することができるカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を含む。
［発明１］
ミトコンドリアの酸素消費を調節し、血糖降下作用を有するカスパーゼ１活性化阻害剤であって、
プテロシンＢ、プテロシンＺ、アセチル−プテロシンＢ、プテロシンＦ、及びメトホルミンの中から選択される少なくとも１種のカスパーゼ１活性化阻害剤。
［発明２］
発明１に記載のカスパーゼ１活性化阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。
［発明３］
発明１に記載のカスパーゼ１活性化阻害剤を有効成分として含有する鎮痒剤。
［発明４］
ミトコンドリアの酸素消費を調節するカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法であって、
被験物質を哺乳動物由来の培養組織又は細胞と接触させる工程と、
カスパーゼ１活性化剤としてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加する工程と、
カスパーゼ１の活性化を測定する工程と、
を包含するカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法。
［発明５］
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、トリコスタチンＡ、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、及びＭＳ２７５の中から選択される少なくとも１種である発明４に記載のカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法。
【発明の効果】
【００１０】
本構成のカスパーゼ１活性化阻害剤は、カスパーゼ１の活性化を効率的に阻害し、皮膚における炎症や痒み等の症状を効果的に抑制することができる。さらに、本構成のカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法では、カスパーゼ１の活性化阻害を効果的に評価することができるため、有効なカスパーゼ１活性化阻害剤を効率的に選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によるカスパーゼ１の活性化を示した電気泳動の写真である。
【図２】図２は、ＭＳ２７５が異なる細胞種においてカスパーゼ１を活性化させることを示した電気泳動の写真である。
【図３】図３は、プテロシンＢ又はメトホルミンによるミトコンドリアの酸素消費の調節を示したグラフである。
【図４】図４は、プテロシンＢ又はメトホルミンの血糖降下作用を示したグラフである。
【図５】図５は、プテロシン化合物及びメトホルミンがカスパーゼ１の活性化を阻害することを示した電気泳動の写真である。
【図６】図６は、マウスによる皮膚疾患へのプテロシンＢの応用を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明に係るカスパーゼ１活性化阻害剤、当該カスパーゼ１活性阻害剤を用いた抗炎症剤及び鎮痒剤、並びにカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法に関する実施形態を図１〜図６に基づいて説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施形態に記載される構成に限定されることを意図しない。
【００１３】
＜カスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法＞
カスパーゼ１活性化阻害剤の説明の便宜上、先ずカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法について説明する。本発明において使用される「カスパーゼ１活性化阻害剤」とは、カスパーゼ１の前駆体であるプロカスパーゼ１が切断されて活性型のカスパーゼ１に変換することを阻害する物質をいう。より具体的には、プロカスパーゼ１が会合してインフラマソームを形成することを阻害したり、インフラマソームの形成に伴う自己消化による活性型のカスパーゼ１への変換を阻害する物質である。カスパーゼ１は、炎症性サイトカインであるＩＬ−１βとＩＬ−１８を活性化させることにより、炎症を誘導することが知られている。つまり、カスパーゼ１活性化阻害剤は、カスパーゼ１の活性化を阻害することにより炎症性サイトカインの活性化を抑制するため、炎症や痒み等の発症を抑える炎症剤や、鎮痒剤としての利用に有効である。
【００１４】
本発明のカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法は、カスパーゼ１の活性化阻害を評価する被験物質を哺乳動物由来の培養組織又は細胞と接触させる工程と、カスパーゼ１活性化剤としてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加する工程と、カスパーゼ１の活性化を測定する工程と、を包含している。
【００１５】
被験物質を接触させる哺乳動物由来の培養細胞としては、例えば、脂肪細胞、肝臓細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、筋芽細胞、線維芽細胞等から得られる初代培養細胞や株化細胞（例えば、マウス筋芽細胞としてはＣ２Ｃ１２細胞；マウス肝臓細胞としてはＡＭＬ−１２細胞；マウス線維芽細胞としては３Ｔ３−Ｌ１細胞等が挙げられる）、又は遺伝子組み換え手法により作製された形質転換細胞等が挙げられる。被験物質をこれら細胞と接触させることにより、被験物質のカスパーゼ１活性化阻害の能力を評価することができる。
【００１６】
カスパーゼ１の活性化を阻害する物質を効果的に評価するためには、先ず哺乳動物の細胞や組織中のカスパーゼ１を活性化させる必要がある。炎症性サイトカインを活性化させる物質としては一般にＬＰＳが用いられているが、ＬＰＳは細胞膜に存在するＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を介して転写因子であるＮＦ−κＢを活性化させ、炎症性サイトカインの分泌を誘導している。つまり、ＬＰＳはプロカスパーゼ１の活性化を直接的に誘導するものではなく、細胞種によってはプロカスパーゼ１を効率的に活性化できない場合があった。また、ＬＰＳは、種々の炎症性サイトカインの分泌を促進させる機能が非常に強いため、被験物質のカスパーゼ１の阻害効果のみを評価することが困難な場合があった。本発明のカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法では、カスパーゼ１の活性化剤としてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（以下、ＨＤＡＣ阻害剤と称す）を使用する。本発明者らは、ＨＤＡＣ阻害剤を使用することにより、細胞種に関係なくプロカスパーゼ１をカスパーゼ１に活性化させることを初めて見出した。ＨＤＡＣ阻害剤は、プロカスパーゼ１を効果的に活性化できるため、カスパーゼ１の活性化に対する阻害効果を容易に評価することができる。
【００１７】
本発明に使用するＨＤＡＣ阻害剤としては、クラス１−ヒストン脱アセチル化酵素を特異的に阻害する薬剤が好ましい。具体的には、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＴＦ２３５７、ベリノスタット（Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、ＭＧＣＤ０１０３、アピシジン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、及びＭＳ２７５であり、より好ましくは、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、及びＭＳ２７５であり、特に好ましくは、ＭＳ２７５である（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００８）４０９，５８１−５８９）。
【００１８】
カスパーゼ１の活性化を測定する方法としては、例えば、活性型のカスパーゼ１に変換する際に形成されるプロカスパーゼ１の切断断片を、ウエスタンブロッティング法により検出したり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定することが挙げられる。
【００１９】
＜カスパーゼ１活性化阻害剤＞
本発明者らは、カスパーゼ１活性化阻害剤について鋭意検討を重ねた結果、特に、ミトコンドリアの酸素消費を調節し、血糖降下作用を有する物質の多くが前駆体であるプロカスパーゼ１から活性型のカスパーゼ１への変換を阻害することを見出した。特に、プテロシン化合物及び糖尿病治療薬として知られるメトホルミンは、カスパーゼ１の活性化に対する強い阻害作用を有していた。
【００２０】
本発明でいうプテロシン化合物は、以下の式（１）で表される。なお、式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ2は塩素原子、水酸基、又はアセチル基である。
【００２１】
【化１】
2014214144.tif 000003
【００２２】
具体的には、以下の６種のプテロシン化合物であり、これらのうち、プテロシンＢ、プテロシンＦ、プテロシンＺ、及びアセチル−プテロシンＢが特に好ましい。
【００２３】
【化２】
2014214144.tif 000004
【００２４】
＜抗炎症剤及び鎮痒剤＞
本発明の抗炎症剤は、上記カスパーゼ１活性化阻害剤を有効成分として、薬学的に許容される基材や担体と組み合わせて、炎症を軽減する抗炎症剤として提供される。本発明の抗炎症剤は、例えば、気管支炎、鼻炎、関節炎、微生物等の感染による炎症、アレルギー疾患による炎症等の症状に適用される。
【００２５】
抗炎症剤としては、薬学的に許容される基材や担体と組み合わせて提供される。抗炎症剤には、薬学的に許容される限度において、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、分散剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保湿剤、着色剤、香料、増粘剤、殺菌剤、細胞賦活剤等の添加剤を適宜配合することができる。
【００２６】
抗炎症剤としては、医薬品又は医薬部外品を含み、カスパーゼ１活性化阻害剤を有効成分として含有する。当該抗炎症剤は、経口又は非経口のいずれで適用される剤型であってもよい。経口投与で投与される抗炎症剤の剤型としては、例えば、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤等が挙げられる。非経口で投与される抗炎症剤の剤型としては、例えば、外用剤、経皮剤、経鼻剤、液剤、貼付剤、皮膚外用剤等が挙げられる。抗炎症剤におけるカスパーゼ１活性化阻害剤の配合割合は、その有効量や、抗炎症剤の剤型や、投与形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、製剤中、０．１〜９９．９重量％含有させることができる。
【００２７】
本発明の鎮痒剤は、上記カスパーゼ１活性化阻害剤を有効成分として、薬学的に許容される基材や担体と組み合わせて、かゆみ（掻痒感）を軽減する鎮痒剤として提供される。本発明の鎮痒剤は、例えば、しっしん、虫さされ、乾燥肌、知覚過敏肌等のかゆみを伴う症状に適用される。
【００２８】
鎮痒剤には、薬学的に許容される限度において、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、分散剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、紫外線吸収剤、公知の局所麻酔剤、保湿剤、着色剤、香料、増粘剤、殺菌剤、細胞賦活剤、抗炎症剤等の添加剤を適宜配合することもできる。
【００２９】
鎮痒剤としては、医薬品又は医薬部外品を含み、カスパーゼ１活性化阻害剤を有効成分として含有する。鎮痒剤の剤型としては、使用方法や適用部分に従って従来公知の剤型に調製することができ、例えば、軟膏、ローション、ゲル、エアゾール剤等が挙げられる。鎮痒剤におけるカスパーゼ１活性化阻害剤の配合割合は、その有効量や、鎮痒剤の剤型等に応じて適宜設定されるが、例えば、製剤中、０．１〜７０重量％含有させることができる。
【実施例】
【００３０】
本発明のカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法で用いるＨＤＡＣ阻害剤に関する試験、及び本発明のカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法で評価したカスパーゼ１活性化阻害剤に関する試験を実施した。試験結果を以下に示す。
【００３１】
＜ＨＤＡＣ阻害剤によるカスパーゼ１の活性化＞
（Ｃ２Ｃ１２細胞の培養）
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞：ＡＴＣＣより入手）を１２ウェルプレートでコンフレント状態になるまで１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養した。その後、ＨＤＡＣ阻害剤を含有した上記培地に置換し、３時間、６時間、１８時間培養したＣ２Ｃ１２細胞を試験に供した。ＨＤＡＣ阻害剤としては、ＭＳ２７５、ＳＡＨＡ、ＴＳＡを使用し、各濃度を１０μＭ、５μＭ、２μＭにした。
【００３２】
（ＡＭＬ−１２細胞の培養）
ＡＭＬ−１２細胞（マウス肝臓細胞：ＡＴＣＣより入手）を１２ウェルプレートでコンフレント状態になるまで１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）及び１％ＩＴＳｍｉｘ（ライフテクノロジー社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養した。その後、ＭＳ２７５を含有した上記培地に置換し、１２時間培養したＡＭＬ−１２細胞を試験に供した。
【００３３】
（マウス線維芽細胞の培養）
線維芽細胞は、マウス胎児（妊娠１８日目）の背中の皮膚から単離し、１２ウェルプレートでコンフレント状態になるまで１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ  Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養した。その後、ＭＳ２７５を含有した上記培地に置換し、１２時間培養した線維芽細胞を試験に供した。
【００３４】
（ウエスタンブロッティング）
（１）ＳＤＳサンプルバッファ(０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー、０．６％２−メルカプトエタノール)に各試験サンプルのＣ２Ｃ１２細胞、ＡＭＬ−１２細胞、及び線維芽細胞を溶解して、タンパク質量が同量となるようにポリアクリルアミドゲルに分注し、電気泳動を行った。
（２）ポリアクリルアミドゲルで分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した後、ＰＶＤＦメンブレンを１％ＢＳＡでブロッキングした。
（３ａ）プロカスパーゼ１の発現量、及びカスパーゼ１の活性化に伴うプロカスパーゼ１の切断断片ｐ２０の増加量を評価するために、抗カスパーゼ１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いて、４℃１６時間で１次抗体反応を行った。洗浄後、抗マウス−ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ社製）で２次抗体反応を行った。
（３ｂ）ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害を評価するために、抗アセチルリジン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）で、４℃１６時間で１次抗体反応を行った。洗浄後、抗マウス−ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ社製）で２次抗体反応を行った。
（４）ＰＶＤＦメンブレン上の抗原を、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア社製)を使用してシグナル強度を検出した。
【００３５】
図１は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によるカスパーゼ１の活性化を示した電気泳動の写真である。図１に示されるように、ＨＤＡＣ阻害剤を添加後、カスパーゼ１の活性化を示すｐ２０の量が時間の経過に伴って増加し、プロカスパーゼ１の検出量が減少している。つまり、何れのＨＤＡＣ阻害剤もプロカスパーゼ１を活性化させることが明確に示された。また、何れのＨＤＡＣ阻害剤もアセチルリジンの増加が著しいことから、ヒストン脱アセチル化酵素を効率的に阻害していることが示された。つまりヒストン脱アセチル化酵素の阻害とカスパーゼ１の活性化とは密接に関連していることが明らかとなった。
【００３６】
図２は、ＭＳ２７５が異なる細胞種（Ｃ２Ｃ１２細胞、ＡＭＬ−１２細胞、及び線維芽細胞）においてカスパーゼ１を活性化させることを示した電気泳動の写真である。図２に示されるように、何れの細胞種においてもＨＤＡＣ阻害剤であるＭＳ２７５がカスパーゼ１を活性化させていることが明確に示された。この結果から、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞の種類に関係なく、カスパーゼ１を効率的に活性化させることが明らかとなった。
【００３７】
＜ミトコンドリアにおける酸素消費の調節と血糖降下作用＞
（プテロシンＢの精製）
（１）食用ワラビ湿重１０ｋｇをミキサー（象印マホービン株式会社製；ＢＭ−ＲＥ０８型）で粉砕し、炭酸水素ナトリウム１００ｇを加え撹拌後、６０℃で１週間乾燥させた。
（２）乾燥ワラビに１Ｌのヘキサン・クロロホルム混合溶媒（ヘキサン：クロロホルム＝３：１）を加えてワラビエキスを抽出した。混合溶媒を回収し、エバポレーター（東京理化器械株式会社製；Ｎ−１０００型）で溶媒を揮散させてワラビエキスを濃縮した。この抽出操作を１０回繰り返して、ワラビ抽出物を取得した。
（３）ワラビ抽出物を３ｍｌのクロロホルムに懸濁し、シリカゲルクロマトグラフィー（ナカライテスク株式会社製；シリカゲル６０）を用いてプテロシンＢ画分を分離した。カラム（直径２ｃｍ、高さ２０ｃｍ）をクロロホルムで平衡化した後、ワラビ抽出物のクロロホルム懸濁液３ｍｌをカラムに供した。溶出溶媒としてクロロホルムとメタノールとの混合溶媒を使用した。溶出溶媒は、９０ｍｌずつクロロホルムとメタノールとの混合比率を変化させてカラムに供し、プテロシンＢ画分をグラジュエント溶出させた。プテロシンＢ画分はクロロホルム：メタノール（９５：５）で溶出した。溶出溶媒をエバポレーターで揮散させ、プテロシンＢ画分をメタノール５ｍｌに溶解させた。
（４）得られたプテロシンＢ画分を、活性炭カラム（和光純薬工業株式会社製；０３１−０２１３５型）を用いて精製した。活性炭カラム（直径２ｃｍ、高さ２０ｃｍ）をメタノールで平衡化した後、プテロシンＢ画分のクロロホルム懸濁液３ｍｌをカラムに供した。溶出溶媒としてクロロホルムとメタノールとの混合溶媒を使用した。溶出溶媒は、９０ｍｌずつクロロホルムとメタノールとの混合比率を変化させてカラムに供し、プテロシンＢをグラジュエント溶出させた。プテロシンＢはメタノール：クロロホルム（７：３）で溶出した。溶出溶媒をエバポレーターで揮散させ、試料をクロロホルム５０ｍｌに溶解させた。クロロホルムに溶解後、エバポレーターで徐々に溶媒を除き、２０ｍｌまで濃縮し、−２０℃で一晩放置した。結晶化したプテロシンＢをフィルター濾過で回収し、ヘキサンで洗浄後、ＮＭＲにより純度を測定した。プテロシンＢの純度は、＞９５％であった。
【００３８】
（酸素消費量の測定）
図３は、プテロシンＢ又はメトホルミンによるミトコンドリアの酸素消費の調節を示したグラフである。縦軸は酸素消費量を、横軸は経過時間を表している。横軸の一目盛は、１１分に相当する。ミトコンドリアにおける酸素消費量の測定は、細胞外フラックスアナライザー（プライムテック株式会社製；ＸＦｅ２４型）を使用した。Ｃ２Ｃ１２細胞（５０００個）を専用のプレートに播き、専用の測定培地で酸素消費量の基準値を求めた。次いで、プテロシンＢとメトホルミン（ＭＰバイオメディカルズ社製）とを夫々別々の細胞に添加した。プテロシンＢはＤＭＳＯで希釈し、最終濃度が３００μＭになるように調製した。メトホルミンは、専用の測定用培地で希釈し、最終濃度が１ｍＭになるように調製した。コントロールは、ＤＭＳＯのみを添加した。次に、ミトコンドリアの酸素消費機能を確認するため、カルボニルシアニド−p−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）を最終濃度１μＭとなるように添加し、ミトコンドリアのＡＴＰ産生を脱共役させて、最大酸素消費を誘発させた。最後に、ロテノンとアンチマイシンＡ（シグマアルドリッチ社製）とを夫々、最終濃度が１μＭとなるように添加してミトコンドリアの電子伝達系を停止させ、最大酸素消費が電子伝達系依存であることを確認した。
【００３９】
（血糖値の低下の測定）
図４は、プテロシンＢ又はメトホルミンの血糖降下作用を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸は経過時間を表している。糖尿病モデルマウスｄｂ／ｄｂ（日本チャールズ・リバー株式会社製）を使用した。試験区を、普通食（ＣＥ−２；日本クレア株式会社製）を与えたもの、プテロシンＢを含有する食事（ＣＥ−２に０．０２％のプテロシンＢを配合）を与えたもの、メトホルミンを含有する食事（ＣＥ−２に０．０７％のメトホルミンを配合）を与えたものに分け、６週の糖尿病モデルマウスで血糖値が揃うように調整した。６週の糖尿病モデルマウスの平均体重は約３４ｇであり、１日に約５ｇの餌を摂取することからプテロシンＢは約３０ｍｇ／ｋｇ、メトホルミンは約１００ｍｇ／ｋｇ摂取することになる。その後、８週間処理した後、グルコース耐性試験を行った。各試験区の糖尿病モデルマウスを４時間絶食させた後、１．５ｇ／ｋｇのグルコースを経口投与し、所定の時間経過毎（０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分）に血液を尾静脈から採血してグルコースＣテスト（和光純薬工業株式会社製）により測定した。
【００４０】
（プテロシン化合物及びメトホルミンのカスパーゼ１活性化阻害に関する評価）
図５は、プテロシン化合物及びメトホルミンがカスパーゼ１の活性化を阻害することを示した電気泳動の写真である。プテロシン化合物及びメトホルミンについて、本発明の評価方法を用いてカスパーゼ１の活性化を阻害する能力を評価した。Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞：ＡＴＣＣより入手）を１２ウェルプレートでコンフレント状態になるまで１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養した。その後、１０μＭのＭＳ２７５と各被験物質を含有した上記培地に置換し、１２時間培養した細胞を試験に供した。被験物質としては、プテロシンＢ、プテロシンＺ、プテロシンＦ、アセチル−プテロシンＢ（プテロシン化合物は、医薬基盤研究所薬用植物資源研究センターより入手した）及びメトホルミンを使用し、最終濃度を夫々、３００μＭとなるように添加した。コントロールにはＭＳ２７５及びＤＭＳＯを添加し、ブランクにはＤＭＳＯのみ添加した。
【００４１】
図３及び図４に示すように、プテロシン化合物及びメトホルミンは、ミトコンドリアの酸素消費を調節する能力を有していた。また、プテロシン化合物は、メトホルミンと同様に血糖値を低下させる機能を有していた。これら機能を有するプテロシンＢ、プテロシンＺ、アセチル−プテロシンＢ、プテロシンＦ、及びメトホルミンのカスパーゼ１の活性化阻害能を評価すると、図５に示すように、何れの化合物もカスパーゼ１の活性化を効果的に阻害する能力を有していた。
【００４２】
＜皮膚疾患へのプテロシンＢの応用＞
図６は、マウスによる皮膚疾患へのプテロシンＢの応用を示した写真である。カスパーゼ１の活性化は、皮膚において、ＩＬ−１βやＩＬ−１８を活性化させて痒みを誘発させる。プテロシンＢを用いて痒みに対する抑制効果を評価した。アトピー性皮膚炎モデルＮｃ／Ｎｇマウス（日本チャールズ・リバー株式会社製）を使用した。トリニトロフェノールで皮膚炎を発症させ、プテロシンＢを１％含有させたワセリンを耳に塗布したものと、ワセリンのみを塗布したものとを比較した（Ｎ＝３）。図６からも明らかなように、プテロシンＢを含有させたワセリンで処理したマウスは、若干の引掻き傷が見られたが、略痒みを抑えることが確認された。これに対して、ワセリンのみを塗布したマウス（未処理）は、両耳及び両頬に引掻き傷が多く見受けられた。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明に係るカスパーゼ１活性化阻害剤、抗炎症剤、鎮痒剤、及びカスパーゼ１活性化阻害剤の評価方法は、例えば、化粧品分野、及び医薬品分野に利用することができる。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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