(57)【要約】      （修正有）【課題】茶由来の嗜好性の高い、膵リパーゼに対して高い阻害活性を示し、食事由来の脂肪吸収を抑制し、肥満の抑制や予防に寄与するリパーゼ活性阻害剤及び／又はα−グルコシダーゼ阻害剤の提供。【解決手段】茶由来の香味が良く、また安全性に優れているため長期摂取が可能である、高いリパーゼ阻害活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性を有するベンゾトロポロン環含有化合物を飲食品に添加する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１３）、
【化１３】
2014237649.tif 000051
式（１５）、
【化１５】
2014237649.tif 000052
式（１６）、
【化１６】
2014237649.tif 000053
式（１７）、
【化１７】
2014237649.tif 000054
式（１８）、
【化１８】
2014237649.tif 000055
式（１９）、
【化１９】
2014237649.tif 000056
式（２０）、
【化２０】
2014237649.tif 000057
式（２２）、
【化２２】
2014237649.tif 000058
または式（２３）、
【化２３】
2014237649.tif 000059
で表される化合物の一種以上を有効成分として添加する工程を含む、抗肥満剤の製造方法。
【請求項２】
抗肥満剤がリパーゼ阻害作用および／またはα−グルコシダーゼ阻害作用を有する、請求項１記載の抗肥満剤の製造方法。  
【請求項３】
抗肥満剤が食事由来の脂肪および糖の吸収を抑制する作用を有する、請求項１または２記載の抗肥満剤の製造方法。
【請求項４】
式（２４）：
【化２４】
2014237649.tif 000060
で表される化合物を有効成分として添加する工程を含む、抗肥満剤の製造方法。
【請求項５】
抗肥満剤がリパーゼ阻害作用および／またはα−グルコシダーゼ阻害作用を有する、請求項４記載の抗肥満剤の製造方法。  
【請求項６】
抗肥満剤が食事由来の脂肪および糖の吸収を抑制する作用を有する、請求項４または５記載の抗肥満剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベンゾトロポロン環含有化合物を含む抗肥満剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は現代社会における最も重大な疾患の１つであるが、その主たる要因は脂肪の過剰摂取である。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等を発症させることが知られている。内臓脂肪型肥満に加えて、高血糖・高血圧・脂質異常のうちいずれか２つ以上をあわせもった状態は、メタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）と呼ばれ、心臓病や脳卒中を発症する危険性が高いため、近年問題視されている。肥満に対する治療薬としては例えばリパーゼ阻害活性により腸管からの脂肪吸収の抑制作用を持つゼニカル（登録商標）が肥満改善薬として市販されているが、脂肪便、排便数の増加、軟便、下痢、腹痛等の副作用が報告され、必ずしも安全とは言いがたい（非特許文献１）。
【０００３】
肥満を予防するためには、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効な手段ではあるものの、しっかりとした栄養指導を受けなければならず、日常生活においての実行は困難である場合が多い。そこで、食事由来の脂肪が体内に吸収されることを安全かつ健康的に抑制することは、肥満及びそれに関連する疾患の治療あるいは健康増進の目的で、現実的で有用な方策であると考えられる。
【０００４】
このような背景のもと、安全でかつヒトに対する有効性が証明されている特定保健用食品の開発が注目されている。今までに食後の血清中性脂肪値の上昇を抑える食品素材としては、膵リパーゼ阻害により脂肪吸収を抑制するグロビン蛋白分解物、トリアシルグリセロールとは異なる消化吸収特性を持つジアシルグリセロール、魚油より精製されたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などが特定保健用食品として発売されている。
【０００５】
また、植物由来のリパーゼ阻害活性物質も最近注目されつつあり、特に、リパーゼ阻害活性を有するポリフェノール類に関しては、植物樹皮由来のタンニン、マメ科植物カワラケツメイに含まれるタンニン類やフラボノイド類およびその配糖体、緑茶中の主要な成分エピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレートを配合した脂質吸収抑制食品、ピーマン、シメジ、かぼちゃ、まいたけ、ひじき、緑茶、ウーロン茶、などの水抽出物からなるリパーゼ阻害剤、フラボンおよびフラボノール類、ヒドロキシ安息香酸類（没食子酸）、トリテルペン類化合物およびその誘導体、タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤などが報告されており、またブドウ種子抽出物のリパーゼ阻害作用（非特許文献２）、サラシア由来ポリフェノールによるリパーゼ阻害作用とラットの抗肥満作用（非特許文献３）、ウーロン茶抽出物によるマウスの抗肥満作用（非特許文献４）などが知られている。また、茶にはカテキン類が多く含まれ、その成分が多く分離・同定されており（非特許文献５）、茶由来の成分を含むリパーゼ阻害剤（特許文献１、特許文献２）に関する報告がある。なかでも紅茶やウーロン茶の色素として知られるテアフラビンはその分子内ガレート基数に比例して強いリパーゼ阻害活性を示す（特許文献２、非特許文献６）。しかし、これらのテアフラビン類の含有量や比率は茶の品種により一定ではない。
【０００６】
また、α-グルコシダーゼ阻害物質は、小腸上皮上に局在するα-グルコシダーゼを阻害し、糖質の分解・吸収を抑制・遅延することにより、血糖値上昇抑制作用を有する。よって、α-グルコシダーゼ阻害物質は高血糖症状の慢性化に由来する、糖尿病や肥満症など種々の疾患に有用である。  
【０００７】
１９３３年に麦芽成分にα−グルコシダーゼ阻害活性が見出されて以来、多くの小麦や豆類など植物由来のα−グルコシダーゼ阻害物質が発見されてきた。１９６６年には、微生物代謝産物から、α−グルコシダーゼ阻害活性をもつノジリマイシンが単離され、構造決定された。この類縁化合物である１−デオキシノジリマイシンが桑葉の抽出物から得られ、α−グルコシダーゼ阻害活性を有することが知られており、その活性低下をさせないための抽出方法が開示されている（特許文献３）。
【０００８】
また、コタラヒムブツの根からの抽出物から単離されたスルフォキシドを有する１３員環シクリトール構造を持つものはマルターゼ阻害活性を有することが報告されている（特許文献４）。また、アサガオや紫さつまいもの根から単離されたアントシアニン化合物として、ジアシル化されたペラルゴニジン、シアニジン、ペオニジンの３−ソフォロシド−５−グルコシドは、マルターゼ阻害活性を有することが報告されている（非特許文献７）。また、茶葉中に含まれるテアシネンシンＡ、ガロイル基を有するテアフラビンン誘導体、エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンなどに、マルターゼ阻害活性が認められている。しかし、ガロイル基を有するテアフラビンン誘導体はマルターゼ阻害活性を有するが、茶葉中の含有量は０．１〜０．２％と非常に少ない（特許文献５、非特許文献８）。  
【０００９】
紅茶のテアフラビンおよび緑茶のカテキン類がα−グルコシダーゼ阻害活性を有することは報告されており（非特許文献８）、カテキン類の中では、３位にガロイル基をもつエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下、「ＥＧＣＧ」という）やエピカテキン−３−Ｏ−ガレート、テアフラビン類ではテアフラビン−３−Ｏ−ガレート、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートに活性が認められている。紅茶のα−グルコシダーゼ阻害活性については、その分画物などについても調べられており、発酵による重合の進んだ高分子画分にも活性があることが知られている（非特許文献９）。  
【００１０】
一方、紅茶やウーロン茶の製造における発酵において、茶葉のポリフェノールオキシダーゼなどの酵素の働きにより、カテキンあるいは没食子酸などのポリフェノール類が縮合し、ベンゾトロポロン環を有する化合物が形成されることが知られている（非特許文献１０）。  
【００１１】
茶の中にはテアフラビン以外にも多くのベンゾトロポロン環含有化合物の存在が報告されている。たとえば、プルプロガリン誘導体のアポトーシス誘導（特許文献６）やエピテアフラガリン類の食品向けの製造方法（特許文献７）、あるいはテアフラビンの３量体であるテアジベンゾトロポロンＡ（Theadibenzotropolone A）の酵素的製法と紅茶中での存在（非特許文献１１）などが報告されている。また種々のベンゾトロポロン環含有化合物の抗炎症作用（非特許文献１２）についても知られている。しかしながら、テアフラビン類、エピテアフラガリン類以外のベンゾトロポロン環含有化合物については、脂肪吸収に関わるリパーゼ阻害作用や血糖値上昇抑制作用に関わるα-グルコシダーゼ阻害作用は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７７３８４
【特許文献２】ＷＯ２００６／００４１１０
【特許文献３】特開２００７−６０９０８
【特許文献４】特開２００８−１３７９２５
【特許文献５】特開２００７−２３１００９
【特許文献６】特開２００４−３５９５７６
【特許文献７】ＷＯ２００７−１４１９４５
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Lancet  １９９８；３５２：１６７−１７２
【非特許文献２】Nutrition 2003;19(10):876-879
【非特許文献３】J. Nutr. 2002;132:1819-1824
【非特許文献４】Int. J. Obes. 1999;23:98-105
【非特許文献５】日本食品科学工業会誌第４６巻、第３号、１３８〜１４７頁、１９９９年３月
【非特許文献６】Chem. Pharm. Bull. 2008; 56: 266-272
【非特許文献７】J. Agric. Food Chem.2001,49,1952-1956
【非特許文献８】J. Agric. Food. Chem., 55, 99-105, 2007
【非特許文献９】Chem. Pharm. Bull. 56(3)、266-272、2008
【非特許文献１０】Tetrahedron 1973;29:125-142
【非特許文献１１】Tetrahedron Letters 2002;43:7129-7133
【非特許文献１２】Bioorganic & Medicinal Chemistry 2004;12:459-467
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ある植物の抽出物で効果があったとしても、その中に含まれる活性成分量を明確にしない限り、天然物が起源であるので、安定的に抗肥満活性を維持させることは困難である。また、上記に示した既報のリパーゼ阻害剤やα-グルコシダーゼ阻害剤は、効果が十分でないものもある。
【００１５】
また、嗜好性の低い植物由来の抗肥満剤は、飲食物として利用すると香味に悪影響を及ぼすことが予想される。一方、嗜好性の高い茶に起源を発する抗肥満剤は有効な素材候補となり得るが、たとえば嗜好性の高い紅茶やウーロン茶を飲用して脂質低下を図るとしても、大量に飲用しなければ効果が得られず、日常生活の中で行うことは現実的でない。単純に濃縮した紅茶やウーロン茶を提供したとしても、苦味・渋味が強く、カフェイン量も増えてしまうため、やはり、この方法も現実的な方策として適当ではない。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、天然物起源であり、効果の高い抗肥満剤を提供することである。  
【００１７】
また本発明の目的は、茶由来の嗜好性の高い、膵リパーゼに対して高い阻害活性を示し、食事由来の脂肪吸収を抑制し、および／または肥満の抑制や予防に寄与するリパーゼ活性阻害剤を提供することである。また、食事由来の糖分の吸収抑制、さらには高血糖症状の慢性化に起因する糖尿病の長期的な予防及び／又は治療に寄与するα−グルコシダーゼ阻害剤を提供することである。
【００１８】
また本発明の目的は、嗜好性が高く、かつ血中の中性脂肪低減、健康増進を目的とした飲食料を提供することである。
【００１９】
さらに本発明の目的は、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の上昇を抑える医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、茶葉より脂肪吸収に必須な膵リパーゼを強力に阻害する成分であり、かつ高いα−グルコシダーゼ阻害活性を有する成分を見出した。具体的には、茶葉中に存在する種々のポリフェノールのリパーゼ阻害活性およびα-グルコシダーゼ阻害活性を評価し、式（１）で表されるベンゾトロポロン環含有化合物に強いリパーゼ阻害活性があること、および強いα−グルコシダーゼ阻害活性があることを突き止めた。それらの化合物は紅茶に含まれるカテキンやポリフェノールの酸化物であることから、香味、安全性に優れており、長期摂取が可能である。これらの知見から、リパーゼ阻害剤やα−グルコシダーゼ阻害剤を飲食品などに添加することで、食事由来の脂肪や糖分の吸収を抑制し、血中中性脂肪の上昇を抑え、さらには高血糖症状の慢性化に起因する糖尿病の長期的な予防及び／又は治療を目的とした飲食品を提供することができることを見いだし、本発明を完成した。
【００２１】
すなわち本発明は、次の［１］〜［９］である。  
【００２２】
[１]  式（１）
【化１】
2014237649.tif 000002
（Ｒ１はＨまたはＯＨであり；
【００２３】
Ｒ２はＨまたは式（２）
【化２】
2014237649.tif 000003
で表される基であって、ここでＲ４はＯＨまたは式（３）
【００２４】
【化３】
2014237649.tif 000004
で表される基、または式（４）
【００２５】
【化４】
2014237649.tif 000005
で表される基であり；
【００２６】
Ｒ３はＨ、ＣＯＯＨ、式（５）
【化５】
2014237649.tif 000006
で表される基、または式（６）
【００２７】
【化６】
2014237649.tif 000007
で表される基であって、ここでＲ５はＯＨ、式（７）
【００２８】
【化７】
2014237649.tif 000008
で表される基、また式（８）
【００２９】
【化８】
2014237649.tif 000009
で表される基であり、Ｒ６は式（９）
【００３０】
【化９】
2014237649.tif 000010
で表される基、または式（１０）
【００３１】
【化１０】
2014237649.tif 000011
で表される基であり、ここでＲ１’は上記定義と同じ基であり、Ｒ２’は式（１１）
【００３２】
【化１１】
2014237649.tif 000012
で表される基であり、ここでＲ４’は上記Ｒ４と同じ基である）
で表される化合物（ただしエピテアフラガリン、エピテアフラガリン−３−Ｏ−ガレート、テアフラビン、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート、およびテアフラビン−３，３’−Ｏ−ジガレートを除く）を１種以上含む抗肥満剤。
【００３３】
[２]  Ｒ１がＨである化合物を１種以上含む、［１］に記載の抗肥満剤。
【００３４】
［３］  前記化合物が、以下の式（１２）、
【化１２】
2014237649.tif 000013
【００３５】
式（１３）、
【化１３】
2014237649.tif 000014
【００３６】
式（１４）、
【化１４】
2014237649.tif 000015
【００３７】
式（１５）、
【化１５】
2014237649.tif 000016
【００３８】
式（１６）、
【化１６】
2014237649.tif 000017
【００３９】
式（１７）、
【化１７】
2014237649.tif 000018
【００４０】
式（１８）、
【化１８】
2014237649.tif 000019
【００４１】
式（１９）、
【化１９】
2014237649.tif 000020
【００４２】
式（２０）、
【化２０】
2014237649.tif 000021
【００４３】
式（２１）、
【化２１】
2014237649.tif 000022
【００４４】
式（２２）、
【化２２】
2014237649.tif 000023
【００４５】
または式（２３）、
【化２３】
2014237649.tif 000024
で表される化合物である、[１]  に記載の抗肥満剤。
【００４６】
[４]  リパーゼ阻害剤および／またはα−グルコシダーゼ阻害剤である、[１]〜[３]のいずれかに記載の抗肥満剤。
【００４７】
[５]  食事由来の脂肪および糖の吸収を抑制するための、[１]〜[４]のいずれかに記載の抗肥満剤。
【００４８】
[６]  飲食料の形態であることを特徴とする、[１]〜[５]のいずれかに記載の抗肥満剤。
【００４９】
[７]  飲食料が、茶飲料、清涼飲料および健康食品からなる群から選択されるものである、[６]に記載の抗肥満剤。
【００５０】
[８]  医薬組成物の形態であることを特徴とする、[１]〜[５]のいずれかに記載の抗肥満剤。
【００５１】
[９]  式（２４）：
【化２４】
2014237649.tif 000025
で表される化合物。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の抗肥満剤としてのリパーゼ阻害剤は、茶葉に由来するベンゾトロポロン環含有化合物を含むことにより、優れたリパーゼ阻害活性を示す。本発明のリパーゼ阻害剤は、香味を損なうことなく、嗜好性が高くて、かつ中性脂肪低減、健康増進を目的とした飲食料を含む様々な用途に利用することができる。食事性脂肪の吸収を抑えるためには、食事と共に摂取することが望ましく、茶から得られた有効成分を強化した飲料は意義が大きい。特に、これらの成分を増強することにより、抗肥満作用、健康増進を目的とした飲料の提供が可能になった。
【００５３】
本発明の抗肥満剤としてのα−グルコシダーゼ阻害剤は、従来知られている天然物由来のα−グルコシダーゼよりも少量で食事由来の澱粉、多糖に由来する糖分の分解を抑制し、吸収を抑えることができる。また何れの化合物も茶類に含まれるカテキンやポリフェノールの酸化物であることから、香味、安全性に優れており、長期摂取が可能である。
【００５４】
また、本発明の抗肥満剤は、食経験の豊富な茶由来の成分であるベンゾトロポロン環含有化合物を含むため、安全性が高く、副作用の低減された医薬組成物としても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、化合物１２の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、化合物１２の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００５７】
抗肥満剤
本発明は、式（１）
【００５８】
【化２５】
2014237649.tif 000026
で表されるベンゾトロポロン環含有化合物を有効成分として含む抗肥満剤である。特に、有効成分としては、以下の式（１２）
【００５９】
【化２６】
2014237649.tif 000027
で表されるプルプロガリン（purprogallin）、
【００６０】
式（１３）
【化２７】
2014237649.tif 000028
で表されるプルプロガリンカルボン酸（purprogallin carboxylic acid）、
【００６１】
式（１４）
【化２８】
2014237649.tif 000029
で表されるテアフラバニン３−０−ガレート（theaflavanin 3-O-gallate）、
【００６２】
式（１５）
【化２９】
2014237649.tif 000030
で表されるＥＧＣＧ−カテコール（EGCG-catechol）、
【００６３】
式（１６）
【化３０】
2014237649.tif 000031
で表されるテアフラベートＡ（theaflavate A）、
【００６４】
式（１７）
【化３１】
2014237649.tif 000032
で表されるテアジベンゾトロポロンＡ（theadibenzotropolone A）、
【００６５】
式（１８）
【化３２】
2014237649.tif 000033
で表されるテアフラビンジガレート−トリマー１（TFdiGA-tri1）、
【００６６】
式（１９）
【化３３】
2014237649.tif 000034
で表されるテアフラビンジガレート−トリマー２（TFdiGA-tri2）、
【００６７】
式（２０）
【化３４】
2014237649.tif 000035
で表されるエピテアフラビン酸（epitheaflavic acid）、
【００６８】
式（２１）
【化３５】
2014237649.tif 000036
で表される３，４，６−トリヒドロキシ−１−（（２Ｒ，３Ｒ）−３，５，７−トリヒドロキシクロマン−２−イル）−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−５−オン、
【００６９】
式（２２）
【化３６】
2014237649.tif 000037
で表されるエピテアフラビン酸―３−Ｏ−ガレート（epitheaflavic acid-3-O-gallate）、
【００７０】
または式（２３）
【化３７】
2014237649.tif 000038
で表される（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシクロマン−３−イル２，３，４，６−テトラヒドロキシ−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ      
【００７１】
［７］アヌレン−８−カルボキシレートが好ましい。
【００７２】
本発明の抗肥満剤の有効成分である上記のベンゾトロポロン環含有化合物は、緑茶、紅茶、ウーロン茶等の天然材料から溶媒抽出によって、または化学合成もしくは酵素合成によっても得ることができる。  
【００７３】
抽出原料の天然材料は、茶葉をそのまま用いてもよいし、粉砕して用いてもよい。抽出に用いる溶媒は、水、有機溶媒、またはこれらの混合物などを用いることができるが、熱水が好ましい。得られた抽出液は、適切な分離用担体を用いて、分離・精製することができる。分離用担体としては、上記のベンゾトロポロン環含有化合物を吸着し、適切な分離用溶媒によって分離することができるものであれば、いずれをも用いることができる。例えば、スチレン系やデキストラン系の合成吸着剤を用いて分離・精製することができる。このような分離用担体に上記の抽出液を負荷したのち、適切な溶媒を用いて、上記のベンゾトロポロン環含有化合物を分離する。より具体的には、本明細書の実施例１の記載に従って、本発明の抗肥満剤に用いる上記のベンゾトロポロン環含有化合物を得ることができる。このようにして得られた上記のベンゾトロポロン環含有化合物は、濃縮して用いてもよく、また、凍結乾燥等の方法によって粉末として用いてもよい。  
【００７４】
上記のベンゾトロポロン環含有化合物の合成は、ポリフェノールオキシダーゼ（PPO）、パーオキシダーゼ（POD）などの酵素により、あるいはフェリシアン化カリウム（K3[Fe（CN）6]）などの酸化剤を触媒として、カテキン類（epigallocatechin-3-O-gallate 、epicatechin-3-O-gallate 、epicatechin 、epigallocatechinなど）と没食子酸を原料として行うことができる。具体的には、例えば本明細書の実施例２および７の記載に従って行うことができる。
【００７５】
本発明の抗肥満剤は、リパーゼ、特に膵リパーゼに対する強い阻害作用を有する。リパーゼ阻害活性の測定は、背景技術に示した先行出願に記載されているいずれのリパーゼ活性評価法によっても行われることができる。例えば、蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステルを基質として使用し、リパーゼによる反応で生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより評価することができる。例示的には、実施例６に記載の方法にてリパーゼ阻害活性を測定することができる。リパーゼ阻害活性は、例えば５０％の阻害を与える試料量ＩＣ５０として表すことができる。
【００７６】
本発明の抗肥満剤は、強いα−グルコシダーゼ阻害作用を有する。α−グルコシダーゼ阻害活性の測定は、背景技術に示した先行出願に記載されているいずれの活性評価法によっても行われることができる。例示的には、実施例１１に記載の方法にてα−グルコシダーゼ阻害活性を測定することができる。α−グルコシダーゼ阻害活性は、例えば５０％の阻害を与える試料量ＩＣ５０として表すことができる。
【００７７】
上記のベンゾトロポロン環含有化合物の精製品または粗精製品は、単独で抗肥満剤として使用することもでき、または溶媒や担体とともに抗肥満剤として使用することが可能である。溶媒または担体は、下記飲食料および／または医薬品としての使用を考えて、食品としてまたは医薬品として安全に使用できるものであることが好ましい。本発明の抗肥満剤は種々の用途を有し、例えば試験研究用、中性脂肪の蓄積を予防するための飲食料、医薬組成物としての使用が例示される。
【００７８】
飲食料
本発明の抗肥満剤は、食事からの脂肪分の摂取に伴う血中中性脂肪の望ましくない上昇を抑制する飲食料の形態であることができる。飲食料の好ましい例は、日常的に摂取する飲食料、例えば、緑茶、麦茶、ウーロン茶、紅茶、コーヒー、スポーツドリンク、飲料水、調味料、ドレッシングである。しかし飲食料は通常食するものであればよく、清涼飲料、カクテル、ビール、ウイスキー、焼酎、ワイン、清酒、調味料、ドレッシング、味付け米、加工食品、インスタント食品、レトルト食品、チョコレート、生クリーム、洋菓子、乳製品、健康食品、サプリメント等であってもよい。
【００７９】
飲食料の形態である本発明の抗肥満剤においては、式（１）で表わされるベンゾトロポロン環含有化合物の摂取量が１食あたり０．１ｍｇ〜１０ｇとなるように含まれるが、０．５ｍｇ〜５ｇの範囲が好ましい。ただし、本発明の抗肥満剤に用いる式（１）で表わされるベンゾトロポロン環含有化合物は食品に由来するため、安全性が非常に高く、飲食料に対する添加量に実質的上限はない。
【００８０】
医薬組成物
本発明の抗肥満剤は、リパーゼ阻害剤として、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の望ましくない上昇を防止および／または低下させるための医薬組成物としても使用できる。また本発明の抗肥満剤は、α−グルコシダーゼ阻害剤として、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の望ましくない上昇を防止および／または低下させるための医薬組成物としても使用できる。好ましい薬剤は、経口投与される薬剤であり、その例として、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、キャンデー、ドロップ剤等があげられる。薬剤には、式（１）で表されるベンゾトロポロン環含有化合物ベンゾトロポロン環含有化合物を、１回服用量当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５ｇの量で含む。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、リパーゼ活性阻害成分およびα−グルコシダーゼ阻害剤成分の安全性が高いため、長期間にわたって服用しても安全である。したがって、生活習慣病としての肥満の防止または解消のために、日常的に服用することも可能である。
【００８２】
新規化合物
さらに本発明は、紅茶の中に存在する新規化合物として、下に示す化合物を提供する。
【００８３】
【化３８】
2014237649.tif 000039
【００８４】
本化合物は、抗肥満素材として有用である。
【００８５】
本発明を以下の実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００８６】
ＬＨ−２０による分離
インド・アッサム種の紅茶葉を９０℃の熱水で抽出し凍結乾燥した物に、１０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水を加え、加温溶解させた。湯浴中で６０−７０℃に加温しながら、１５ｍｌをセファデックスＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製）６０ｍｌに負荷した。２０％アセトン（アセトン：蒸留水＝２：８、ｖ／ｖ）４５ｍｌ、ついで６０ｍｌ（１カラム体積）で洗浄し、その後、３０％アセトン（アセトン：蒸留水＝３：７、ｖ／ｖ）、５０％アセトン（アセトン：蒸留水＝１：１、ｖ／ｖ）、６０％アセトン（アセトン：蒸留水＝６：４、ｖ／ｖ）、それぞれ４カラム体積分の溶媒で溶出し１カラム体積ずつ分画した。合計１４のフラクション各６０ｍｌから２ｍｌを採取し、減圧濃縮処理によって０．１ｍｌに調製した５０％ジメチルスルホキシド水溶液（ジメチルスルホキシド：蒸留水＝１：１、ｖ/ｖ）をリパーゼ阻害活性測定に供した。また、各フラクションを、減圧濃縮、凍結乾燥し、得た固形分から回収量を算出し、実施例５の成分分析に用いた。重量およびリパーゼ阻害活性の回収率は表１に示した。
【００８７】
【表１】
2014237649.tif 000040
【００８８】
実施例６の方法でリパーゼ阻害活性を測定した結果、収量の多かった２０％アセトン−１フラクションおよび２０％アセトン−２フラクションはそれぞれ、多糖類、カフェイン類を含み、活性は殆どないことがわかった。一方次に収量が多く、重量比で１１．２％を含む５０％アセトン−２フラクションは３３．６％の活性が溶出しており、その後ろの５０％アセトン−３フラクションには１７．１％の活性が溶出している。これらの画分を含む５０％アセトン溶出部分に活性の７０．９％が溶出していることがわかった。実施例５の分析では活性の高いベンゾトロポロン環含有化合物の多くは５０％アセトンで溶出しており、高い活性とよく一致している。
【実施例２】
【００８９】
試験化合物の合成
１．プルプロガリン（purprogallin）
２．プルプロガリンカルボン酸（purprogallin carboxylic acid）
３．エピテアフラガリン（epitheaflagallin）
４．エピテアフラガリン−３−Ｏ−ガレート（epitheaflagallin-3-O-gallate）
５．テアフラベートＡ（theaflavate A）
６．テアジベンゾトロポロンＡ（theadibenzotropolone A）
７．テアフラビンジガレート−トリマー１（TFdiGA-tri1）
８．テアフラビンジガレート−トリマー２（TFdiGA-tri2）
９．エピテアフラビン酸（epitheaflavic acid）
１０．テアフラバニン(theaflavanin)
１１．エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート（epitheaflavic acid-3-O-gallate）
１２．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシクロマン−３−イル２，３，４，６−テトラヒドロキシ−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−８−カルボキシレート
【００９０】
エピテアフラガリン(3)およびエピテアフラガリン−３−Ｏ−ガレート(4)の合成
エピガロカテキン(EGC;和光純薬株式会社製)または、エピガロカテキン−３−Ｏ-ガレート(EGCG;和光純薬株式会社製)0.2mmolにフェリシアン化カリウム、0.8mmolおよびNaHCO3、0.8mmolを加えた水溶液150mlを氷冷し、0.2mmolのピロガロールの水溶液50mlを滴下し、1時間撹拌を続けた。反応液を20ml容のSep-pak C18（ウォーターズ株式会社製）に負荷し、60mlの水洗いの後、5%アセトニトリル/水で洗浄し、0.1％ギ酸を含む50%アセトニトリル/水で反応生成物を溶出した。溶出物を凍結乾燥し、以下の分取HPLCで精製した。
【００９１】
EGCとピロガロールの反応物は、ＹＭＣ−Ｐａｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃ−１８（２０×３００ｍｍ、ワイエムシー株式会社製）に負荷し、０．１％ギ酸存在下、３０−５０％アセトニトリルの直線勾配（６ｍｌ／ｍｉｎ、６０分）において溶出させ、４８分から５０分に溶出した成分を凍結乾燥し、4ｍｇの茶色固体（エピテアフラガリン(3)）を得た。またこのクロマトグラムにおいて６８分から７０分に溶出した成分を凍結乾燥し、2ｍｇの茶色固体（プルプロガリン(1)）を得た。
【００９２】
EGCGとピロガロールの反応物は、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（２０ｍｍ×２５０ｍｍ、野村化学株式会社製）に負荷し、０．１％ギ酸存在下、１５−５０％アセトニトリルの直線勾配（６ｍｌ／ｍｉｎ、６０分）において溶出させ、４４分から４６分に溶出した成分を凍結乾燥し、６ｍｇの茶色固体（エピテアフラガリン−３−Ｏ−ガレート(4)）を得た。またこのクロマトグラムにおいて４８分から５０分に溶出した成分を凍結乾燥し、3ｍｇの茶色固体（プルプロガリン(1)）を得た。
【００９３】
上記の反応同様に、没食子酸800ｍｇを反応させ、没食子酸２分子が重合して生成するプルプロガリンカルボン酸（purprogallin carboxylic acid（２））65ｍｇを得た。また、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（epicatechin-3-O-gallate(ＥＣＧ)）100ｍｇを反応させ、ＥＣＧ２分子が重合して生成するテアフラベート  Ａ（theaflavateA（５））3ｍｇを得た。さらに、エピカテキン（epicatechin(ＥＣ)）とEGCGそれぞれ400ｍｇを反応させ、主生成物として得られるテアフラビン−３−O-ガレートと共に、副生成物のテアジベンゾトロポロンＡ（theadibenzotropoloneA（６））2ｍｇを得た。また上記の反応と同様に、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（epicatechin-3-O-gallate(ＥＣＧ)）とEGCGそれぞれ200ｍｇを反応させて得た１２ｍｇのテアフラビン−３，３‘−ジガレートと２０ｍｇのECGを反応させ、テアフラビンジガレート−トリマー１（TFdiGA-tri1（７））およびテアフラビンジガレート−トリマー２（TFdiGA-tri2（８））それぞれ１．７ｍｇおよび０．６ｍｇを得た。また同様に330mgの没食子酸と101mgのECからエピテアフラビン酸（epitheaflavic  acid（９））を48mg、869mgのピロガロール（pyrogallol）と400mgのECからテアフラバニン（theaflavanin）（１０）12mg、470ｍｇの没食子酸と221mgのECGからエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート（epitheaflavic  acid-3-O-gallate（１１））を37mgおよび（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシクロマン−３−イル２，３，４，６−テトラヒドロキシ−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−８−カルボキシレート（１２））3.3mgを同時に得た。
【実施例３】
【００９４】
化合物の構造解析
実施例２で得られた化合物について、ＭＳおよびＮＭＲ測定を行った。マススペクトルはＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、ＵＫ）により、イオン源にＺスプレーイオンソースをつけたＥＳＩを用い、ネガティブ、Ｖモードで測定した。Ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔａｇｅ：４５Ｖ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：３ＫＶ、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｍｐ．：８０℃、Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐ：１８０℃、ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ５５４．２６１５［Ｍ−Ｈ］−）を用いた。
【００９５】
各化合物の精密質量と分子式、質量の理論値を表２に示す。
【００９６】
【表２】
2014237649.tif 000041
【実施例４】
【００９７】
（茶葉抽出物中での定量）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定は、４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ（アプライド社製）で、ターボイオンスプレーを用い、ネガティブモードで、以下の条件で測定した；Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：４６ｅＶ（ｎｅｇａ．）、Ｉｏｎｓｐｒａｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：４５００Ｖ、温度：４５０℃。
【００９８】
ＭＲＭ（multiple reaction monitoring）における各化合物の溶出時間と測定チャンネルは表３のとおりである。
【００９９】
【表３】
2014237649.tif 000042
【０１００】
カラム：ＹＭＣ-Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃ１８、Ｓ-６μｍ（株式会社ワイエムシー、２ｍｍφ×１５０ｍｍ）
流速：０．２ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１Ｖ／Ｖ％ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１Ｖ／Ｖ％ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ
グラジエントプログラム：Ａ／Ｂ＝９１／９（０分）→Ａ／Ｂ＝４０／６０（１７分）→Ａ／Ｂ＝１５／８５（１７．１分）→Ａ／Ｂ＝１５／８５（１７．１分〜１９分）
【０１０１】
上記の条件を用いてインドアッサムCTCの熱水抽出物の測定を行った。化合物２から８が茶葉に存在することが確認された。定量値は表４に示す。
【０１０２】
【表４】
2014237649.tif 000043
【実施例５】
【０１０３】
（各化合物の茶葉分画物中での分布）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定は、Ｑ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、英国）で、イオン源にＺスプレーイオンソースをつけたＥＳＩを用い、ネガティブ、Ｖモードで測定した。Ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔａｇｅ：３３Ｖ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：３ＫＶ、Source Ｔｅｍｐ：１５０℃、Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐ：２５０℃、ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ５５４．２６１５［Ｍ−Ｈ］−）を用いた。
カラム：YMC-Polymer C18、S-6μm（株式会社ワイエムシー、２ｍｍφ×１５０ｍｍ）
流速：０．２ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１Ｖ／Ｖ％  ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１Ｖ／Ｖ％  ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ
グラジエントプログラム：Ａ／Ｂ＝７０／３０→Ａ／Ｂ＝５０／５０（２０分）→Ａ／Ｂ＝５０／５０（２５分）
【０１０４】
上記の条件を用いて実施例２で分画したインドアッサム茶葉の各フラクションの測定を行った。化合物２（m/z  263.02、R.T.＝９．２９分）は３０％アセトン−１フラクション、化合物３（m/z  399.07、R.T.＝９．８３分）は５０％アセトン−２、３フラクション、化合物４（m/z  551.08、R.T.＝１３．４８分）は５０％アセトン−３、４フラクション、化合物５（m/z  851.15、R.T.＝１７．５０分）は５０％アセトン−４フラクション、化合物９（m/z  427.07、R.T.＝８．６０分）は５０％アセトン−３フラクション、化合物１０（m/z  383.08、R.T.＝９．６５分）は３０％アセトン−３および４フラクション、化合物１１（m/z  579.08、R.T.＝１３．８６分）は５０％アセトン−２フラクション、化合物１２（m/z  535.09、R.T.＝１３．９０分）は５０％アセトン−２フラクションに検出された。
【実施例６】
【０１０５】
リパーゼ阻害活性の測定
測定サンプルは実施例２の方法に従い合成、精製した。
１．プルプロガリン（purprogallin）
２．プルプロガリンカルボン酸（purprogallin carboxylic acid）
５．テアフラベートＡ（theaflavate A）
６．テアジベンゾトロポロンＡ（theadibenzotropolone A）
７．テアフラビンジガレート−トリマー１（TFdiGA-tri1）
８．テアフラビンジガレート−トリマー２（TFdiGA-tri2）
９．エピテアフラビン酸（epitheaflavic acid）
１０．テアフラバニン（theaflavanin）
１１．エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート（epitheaflavic acid-3-O-gallate）
１２．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシクロマン−３−イル２，３，４，６−テトラヒドロキシ−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−８−カルボキシレート
１３．エピガロカテキンガレート（EGCG）（和光純薬株式会社製）
【０１０６】
測定方法
リパーゼ活性の測定は、基質に蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（４−ＭＵＯ；シグマ社製）を使用し、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施した。測定にあたり、緩衝液は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．３６ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。基質である４−ＭＵＯは０．１ＭのＤＭＳＯ溶液とした後に上記緩衝液で４０００倍希釈したものを、また、リパーゼはブタ膵リパーゼ（シグマ社製）を同様に上記緩衝液を用いて４００Ｕ／ｍｌ溶液として調製したものを酵素測定に供した。
【０１０７】
酵素反応は、２５℃条件下において、９６穴マイクロプレートに５０μｌの４−ＭＵＯ緩衝液溶液、２５μｌの蒸留水（あるいは試料水溶液）を添加し混合した後に、２５μｌのリパーゼ緩衝液溶液を添加することにより開始させた。３０分間反応を行った後に、１００μｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Labsystem社製Fluoroskan Asent CF）を用い測定した。
【０１０８】
被験試料の阻害活性は、対照（蒸留水）の活性に対して５０％阻害を与える試料量ＩＣ５０（μＭ）として求めた。
【０１０９】
結果
化合物１〜２、および５〜１４のリパーゼ阻害活性を表５に示した。
【０１１０】
【表５】
2014237649.tif 000044
【０１１１】
ベンゾトロポロン環含有化合物はいずれもリパーゼ阻害活性を示した。尚、強いリパーゼ阻害を示すことが知られている（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（EGCG;化合物１３）はＩＣ５０＝０．３４９μMであった。フリーのカルボン酸残基を持つプルプロガリンカルボン酸（purprogallin carboxylic acid（２））、エピテアフラビン酸（epitheaflavic  acid（９））以外はＥＧＣＧと同等かそれ以上の強い活性を示し、ベンゾトロポロン環がリパーゼ阻害活性に寄与していることが示された。カルボン酸残基は活性を弱める働きがあることがわかった。従って、式（１）において、Ｒ３はＣＯＯＨ以外が好ましい。
【実施例７】
【０１１２】
（１）化合物の調製
ペルオキシダーゼを用いた化合物１２および 化合物１４（テアフラバニン ３−Ｏ−ガレート）の合成
ペルオキシダーゼはZymed Laboratories製Horseradish Peroxidaseを用い、epicatechin 3-O-gallate（ECG）は茶抽出物より逆相HPLCで精製した純度90 % 以上のもの、ピロガロールはナカライテスク（株）製（純度99.0%）を使用した。
【０１１３】
（２）反応
4.3 mgのHorseradish Peroxidaseを10 ml の0.058 M 酢酸バッファーに溶解し、アセトン500 μlに溶解したECG 250 mg（0.566 mmol）と、アセトン500 μlに溶解したPyrogallol 192.8 mg （1.53 mmol）を加え、攪拌し、30℃の条件下で、3%(ｗ/v) 過酸化水素水を450 μl加え反応を開始した。反応の効率を上げる為、反応開始より10分後、20分後に二度にわたり3% 過酸化水素水を450 μl 追加した。反応開始より30分後に 192.8 mg （1.53 mmol）のPyrogallol と3% 過酸化水素水、450 μlを追加して、さらに30分間反応した。
【０１１４】
反応開始より60分後に、反応液を逆相系の固相（Waters製、Sep-Pak、C18-Vac 20cc(5g)）に負荷し、蒸留水40 ml で洗浄後、20％（v/v）アセトニトリル水溶液 20ml、70％（v/v）アセトニトリル水溶液 ４0 mlで続けて溶出し、70％アセトニトリル溶出液を濃縮、凍結乾燥することで68.0mgの化合物１２および化合物１４（テアフラバニン３−Ｏ−ガレート）を含む画分を得た。
【０１１５】
化合物１２および化合物１４（テアフラバニン３−Ｏ−ガレート）を含む混合物を下記の条件のHPLCにより精製した。
【０１１６】
ＹＭＣ−Ｐａｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃ−１８（２０×３００ｍｍ、ワイエムシー株式会社製）に負荷し、０．１％ギ酸存在下、３０％アセトニトリルのアイソクラティック溶出30分の後、３０−４５％アセトニトリルの直線勾配（６ｍｌ／ｍｉｎ、１５０分）において溶出させ、１４４分から１４８分に溶出した成分および１５８分から１６２分に溶出した成分を凍結乾燥し、実施例２における化合物１２と同一の化合物を3.9mg、化合物１４（テアフラバニン  ３−Ｏ−ガレート）を3.0mg得た。またこのクロマトグラムにおいて１０８分から１１３分に溶出した成分を凍結乾燥し、36ｍｇの茶色固体（実施例２における化合物１：purprogallin）を得た。
【実施例８】
【０１１７】
反応生成物の機器分析・構造解析
実施例７で得られた化合物１２および１４について、ＭＳおよびＮＭＲ測定を行った。
【０１１８】
マススペクトルはＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、ＵＫ）により、イオン源にＺスプレーイオンソースをつけたＥＳＩを用い、ネガティブ、Ｖモードで測定した。Ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔ．：３３Ｖ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：２．７ｋＶ、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｍｐ．：８０℃、Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐ：１８０℃、ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ５５４．２６１５［Ｍ−Ｈ］−）を用いた。MS測定時はコリージョンエネルギーは4eV、MS/MS測定時は22eVに設定した。
【０１１９】
化合物１２および１４はそれぞれ、m/z 535.0883、535.0871 [M-H]- の分子イオンを与え、分子式はC27H20O12  （理論値：535.0877）と算出された。コリージョンエネルギーを２２eVとしたMS/MSの結果、化合物１２は２６３．０７および２１９．０７のフラグメントイオンを検出し、化合物１４は３８３．０８および１６９．０１のフラグメントイオンを検出した。化合物１４は既知の化合物であるテアフラバニン３−０−ガレート（theaflavanin 3-O-gallate）と判明した。
【０１２０】
化合物１２の構造を確認するためNMRを測定した。化合物１２の１３Ｃ  ＮＭＲおよび１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１および図２に示す。ＮＭＲは、以下の条件で測定を行った。実施例７で得られた３ｍｇの化合物１２をＣＤ３ＯＨに溶解し、ＣＤ３ＯＨのプロトンと１３Ｃの残存ピークであるδ３．３０およびδ４８．９７を内部標準とした。項目は１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＳＱＣ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹおよびＲＯＥＳＹをＤＭＸ−７５０ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（BRUKER BIOSPIN, Germany)で測定した。その結果、実施例７で得られた化合物１２は下に示す構造であると確認された。
【０１２１】
【化３９】
2014237649.tif 000045
【０１２２】
上記構造式には各原子のナンバリングを示している。  
【０１２３】
NMRの測定結果とシグナルの帰属を以下に示す。
【０１２４】
【表６】
2014237649.tif 000046
【０１２５】
また、下に化合物１４の構造を示す。
【０１２６】
【化４０】
2014237649.tif 000047
【実施例９】
【０１２７】
化合物１５の合成
epigallocatechin−３−O-gallate(ＥＧＣＧ;和光純薬株式会社製)229.2mg（0.5mmol）にフェリシアン化カリウム（ナカライテスク製）、3.293g（10mmol）およびNaHCO3、０．８４ｇ（10mmol）を加えた水溶液４００mlを氷冷し、275.3mg（2.5mmol）のcatecholの水溶液１００mlを1時間かけて滴下し、撹拌を続けた。反応液を３００ｍLのSephadex LH-20(ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製)に負荷し、４０％アセトン/水  １L、４５％アセトン/水  １．２L、５０％アセトン/水９００ｍLで順次溶出し、凍結乾燥し、４５％画分に７７ｍｇのEGCG−catecholを含む画分が得られた。以下の分取ＨＰＬＣで精製した。
【０１２８】
EGCG−catecholを含む画分は、ＹＭＣ−Ｐａｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃ−１８（２０×３００ｍｍ、ワイエムシー株式会社製）に負荷し、６ｍｌ／ｍｉｎの流速で、０．１％ギ酸存在下、２５−４５％アセトニトリルの直線勾配（７５分）の後、４５％アセトニトリルのアイソクラティック溶出30分間保持した。９２分から９５分に溶出した成分を凍結乾燥し、24ｍｇの茶色固体（化合物１５：EGCG-catechol）を得た。下に、化合物１５の構造を示す。
【０１２９】
【化４１】
2014237649.tif 000048
【実施例１０】
【０１３０】
リパーゼ活性測定
【０１３１】
測定方法
リパーゼ活性の測定は、基質に蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（４−ＭＵＯ；シグマ社製）を使用し、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施した。測定にあたり、緩衝液は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．３６ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。基質である４−ＭＵＯは０．０１ＭのＤＭＳＯ溶液とした後に上記緩衝液で667倍希釈したものを、また、リパーゼはブタ膵リパーゼ（シグマ社製：Type VI-S ）を同様に上記緩衝液を用いて４００Ｕ／ｍｌ溶液として調製したものを酵素測定に供した。
【０１３２】
酵素反応は、２５℃条件下において、９６穴マイクロプレートに５０μｌの４−ＭＵＯ緩衝液溶液、２５μｌの蒸留水（あるいは試料水溶液）を添加し混合した後に、２５μｌのリパーゼ緩衝液溶液を添加することにより開始させた。反応時の基質濃度は、７．５μMとなり、実施例６の１２．５μMと比較し希釈されていること、かつDMSO濃度が高くなっていることから、基質の溶解性が上がってより正確な阻害活性が測定できるように工夫している。３０分間反応を行った後に、１００μｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Labsystem社製Fluoroskan Asent CF）を用い測定した。
【０１３３】
被験試料の阻害活性は、対照（蒸留水）の活性に対して５０％阻害を与える試料量ＩＣ５０（μＭ）として求めた。
【０１３４】
化合物３、４、１２、１３、１４、１５のリパーゼ阻害活性を測定した。結果を表７に示した。
【０１３５】
【表７】
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【０１３６】
化合物１２、１４、１５共に陽性対象であるEGCGよりも強い活性を持ち、またリパーゼ阻害剤として公知の４（特開2009-114079）と比較しても同等かそれ以上の強い活性を示した。
【０１３７】
尚、化合物１４および１５は特表2007-504168に抗酸化剤、抗炎症剤としてその構造が示されているが、リパーゼ阻害、α―グルコシダーゼ阻害については知られていなかった。
【０１３８】
化合物１２、１４は実施例に示した酵素のほか、ポリフェノールオキシダーゼ（PPO）、あるいはフェリシアン化カリウムなどの酸化剤を用いても合成することが可能である。またECGとpyrogallol の組み合わせのみでなくgallic acidと反応することによっても合成することができる。
【実施例１１】
【０１３９】
各種ベンゾトロポロン環含有化合物のα−グルコシダーゼ阻害活性の測定
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液は、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏと０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを混合しｐＨ７．０に調整し、２ｇ／Ｌの牛血清アルブミン（ナカライテスク株式会社製、Ｆ−Ｖ、ｐＨ５．２、純度９６％）および０．２ｇ／ＬのＮａＮ３（ナカライテスク株式会社製、試薬特級）を添加した。酵素溶液は上記、緩衝液にα−グルコシダーゼ（和光純薬工業株式会社製、酵母由来、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を０．５ｕｎｉｔｓ／ｍｇタンパク／ｍｌ（１００μｇ／２０ｍｌ）となるように溶解した。基質溶液は、上記、緩衝液にｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ナカライテスク株式会社製、試薬特級）を５ｍＭ（７．５２５ｍｇ／５ｍｌ）となるように溶解した。  
【０１４０】
評価に用いたサンプルのうち、陽性対象であるエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（１３：EＧＣＧ）は、和光純薬工業製、化合物１，３，４，５，１１，１２，１４，１５は実施例１〜２または７で合成・精製したものを用いた。  
【０１４１】
これらのサンプルを１０ｍｇ／ｍｌＤＭＳＯとなるように調製し、６段階に２倍希釈を行った。９６穴マイクロプレートを用い、サンプル溶液１０μＬに酵素液４５μＬを加え、３７℃で５分間、プレインキュベーションした後、基質溶液を４５μＬ加え４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５ｎｍ）を測定し、３７℃で５分間、インキュベーションした後、Ａ４０５ｎｍの吸光度を測定した。阻害率は、コントロールとしてサンプルのかわりにＤＭＳＯのみを添加したものとのＡ４０５ｎｍの差として算出し、各活性測定は２連で行った。    
【０１４２】
この結果、各化合物のα−グルコシダーゼ阻害活性をＩＣ５０値で示すと、表８のようになり、化合物１２、１４は特に強い活性を示した。
【０１４３】
【表８】
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【０１４４】
リパーゼ阻害活性の結果とあわせて、これらのベンゾトロポロン環含有化合物には、強い消化酵素の阻害活性があり、中でも両酵素に対して強い阻害活性を示す、化合物１２は紅茶の中にも存在することが確認されたが今まで知られていなかった化合物であり、抗肥満素材として有用であることが見出された。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明の抗肥満剤は、茶葉に由来するベンゾトロポロン環含有化合物を含むことにより、優れたリパーゼ阻害活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性を示す。本発明の抗肥満剤は、香味を損なうことなく、嗜好性が高くて、かつ中性脂肪低減など、健康増進を目的とした飲食料を含む様々な用途に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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