(57)【要約】【課題】    本発明は、カシス葉由来の新規化合物を提供し、更にカシス葉抽出物およびカシス葉由来の抗酸化活性化合物並びに前記の新規化合物の単離方法を提供する。【解決手段】    スグリ科スグリ属植物カシスの葉部より８種の新規化合物および６種の既知化合物を単離し、葉部由来の７０％メタノール抽出物および７種の化学成分に抗酸化活性を有することを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スグリ科スグリ属植物カシス（Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ  Ｌ．）の葉部から低級脂肪族アルコールであるメタノールの含水物による抽出によって得られる抽出液又は抽出エキス、および上記抽出物を有効成分として含有する事を特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
化１で表わされる新規化合物。
【化１】
2014084322.tif 000008
【請求項３】
化２で示される抗酸化活性化合物。
【化２】
2014084322.tif 000009
【請求項４】
請求項３に記載の化合物の少なくとも一つを有効成分として含む抗酸化剤。
【請求項５】
請求項３に記載の化合物の少なくとも一つを含有することを特徴とする医薬組成物および健康食品。
【請求項６】
本発明中に記載されたスーパーオキシドアニオン補足活性に関する構造活性相関解析を基に開発された抗酸化剤。
【請求項７】
本発明中に記載されたスーパーオキシドアニオン補足活性に関する構造活性相関解析を基に開発された医薬組成物および健康食品。
【請求項８】
本発明中に記載されたスーパーオキシドアニオン捕捉活性に関する構造活性相関解析を基に考えられた、化３に記載されたスーパーオキシドアニオン捕捉活性発現が予想されうるリグナン化合物。
【化３】
2014084322.tif 000010
（式中のＲは各々独立に水素原子、水酸基、メトキシ又はそれ以外の置換基を表す）。
【請求項９】
スグリ科植物カシス葉を７０％メタノールにより抽出し、得られた７０％メタノール抽出エキスを各種クロマトグラフィーにより分画処理する事を特徴とする請求項２で示される新規化合物および請求項３で示される抗酸化活性化合物の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】    本発明はスグリ科（Ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａｃｅａｅ）スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）植物カシスの葉部抽出物および該抽出物に含有される化学成分とその用途に関する。より詳細には、カシス葉から単離された新規化合物と、抗酸化活性が認められた７０％メタノール抽出物および化合物を有効成分とする抗酸化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】    ヒトを初めとする好気的生物にとって酸素は必要不可欠な物質であるが、一方で活性酸素と呼称される酸素分子由来のフリーラジカルがミトコンドリアで生じる事が公知されている。活性酸素としては、酸素分子が１電子還元されたスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）のほかに、スーパーオキシドアニオンから生成された過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、過酸化水素と金属イオンによる反応によって生じたヒドロキシラジカル（ＨＯ・）、皮膚で紫外線が当たる際に発生する一重項酸素（１Ｏ２）がある。活性酸素はエネルギー産生や侵入異物攻撃、細胞情報伝達に必要不可欠なものである。【０００３】    生体内にはアスコルビン酸やグルタチオンなどの抗酸化物質や、スーパーオキシドディスムターゼやカタラーゼやカタラーゼなど活性酸素によって生じた障害を修復する抗酸化酵素の存在が知られており、これらは活性酸素に対する生体内防御システムとして機能している。しかしながら、生体内の活性酸素はストレスや喫煙などが引き金となって過剰に産生され、活性酸素の生成と生体内防御システムのバランスが崩れると、酸化ストレス反応がおこり脂質や核酸、蛋白質を傷害する事により細胞に損傷を与え、癌や脂質異常症など生活習慣病の発生と深く関連していることが分かっている。【０００４】    それゆえ過剰に増加した活性酸素を減少させる抗酸化剤については世界各国の研究機関、大学、企業などで盛んに研究が行われている。例えば、天然物由来の抗酸化剤としてはレスベラトロールやクェルセチンなどが挙げられ、動物レベルでの研究も盛んに行われている。また医療の現場においてはプロブコール（脂質異常症治療薬）やエダラボン（脳保護剤）などの抗酸化剤が利用されている。【０００５】    したがって、ヒトの疾病予防や健康維持の為には生体内の過剰な活性酸素を捕捉する事によって、それを無害化する反応に寄与する抗酸化剤の探索および開発は非常に重要であるという事が言える。一方、スーパーオキシドディスムターゼは強い酸化能力を有する活性酸素であるスーパーオキシドアニオンに対する抗酸化酵素であるが、年齢と共に減少する。また安定な有機ラジカルであるＤＰＰＨに対する捕捉活性を有する化合物は、自然界に多種存在するフリーラジカルに対する捕捉活性を示す可能性がある。以上のことからスーパーオキシドアニオン捕捉活性及びＤＰＰＨフリーラジカル補足活性測定試験は抗酸化剤研究にとって有用と考えられ得る測定試験法である。【０００６】    多彩な化学構造と生物活性を有する天然有機化合物は、新薬のシーズ化合物の探索に大きく貢献している。近年の新薬開発に関する統計データによると、半数以上の新薬創製に天然有機化合物が関与している（非特許文献１）。しかしながら地球上には高等植物だけでも２７万種の植物が存在し、その内生理活性のスクリーニングが行われているのはその内の１５％に過ぎない（非特許文献２、３）。それゆえ近年、伝承医学で用いられてきた伝承薬用植物を利用する化学成分研究が数多く行われている。【０００７】    スグリ科スグリ属に属する落葉性低木植物カシス（学名：Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ  Ｌ．）はクロスグリとして知られ、主に北アジアやヨーロッパに分布している。その果実は��ャム・リキュール・菓子など幅広く食品業界で用いられていると共に、フラボノイド・カロテノイド・ビタミンＣなどを豊富に含有し、抗酸化活性が報告されていることから健康食品としても有用である（非特許文献４）。またその葉部はヨーロッパで伝承的にリウマチの治療に用いられており、抗酸化活性や抗炎症活性が認められている（非特許文献５、６、７）。更にカシス葉は比較的容易に入手できるが、葉に関する化学成分研究はプロデルフィニジンやフラボノイドが含有されているという報告を除いて、これまで十分に行われていなかった（非特許文献８、９）。【０００８】    リグナン化合物はフェニルプロパノイドＣ６−Ｃ３構造が２〜４個酸化縮合した基本骨格を持つ化合物群である。２分子のＣ６−Ｃ３単位からなるリグナン化合物は、側鎖のβ位同士が酸化的に縮合した骨格を持つ真正リグナンと、それ以外の骨格を有するネオリグナンがある。また３分子又は４分子縮合して生じた化合物はセスキリグナン又はジリグナンと呼ばれる。リグナンは高等植物、特に木本植物の材に多く分布する。通常のリグナン化合物は分子内に数個のフェノール性水酸基を有し、抗酸化活性が認められているものが多く、その他にも抗腫瘍活性・降圧活性など種々の生理活性が公知されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｓ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ｏｖｅｒ  ｔｈｅ  Ｌａｓｔ  ２５  Ｙｅａｒｓ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６６：４６１−４７７，２００７．
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．１３：１６１−１７１，２００８．
【非特許文献３】Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ  ａｎｄ  Ｔｈｒｅａｔｅｎｅｄ  Ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｓｅｒｖ．６：２４９，１９７９．
【非特許文献４】Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ，ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ，ｆｌａｖｏｎｏｉｄ，ａｎｄ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．５９（９）：４７６３−４７７０，２０１１．
【非特許文献５】Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ  ｌｅａｖｅｓ  ｏｎ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｔｓ．ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．４：２５，２００４．
【非特許文献６】Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ  ｌｅａｖｅｓ，ｒｅｄｕｃｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ＩＣＡＭ−１  ａｎｄ  ＶＣＡＭ−１．Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍ．２：２−９，２００５．
【非特許文献７】Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ  ｏｎ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ＣＯＸ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ．Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６５（６）：４３４−４４１，２００２．
【非特許文献８】Ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３１（３）：９７１−９７３，１９９２．
【非特許文献９】Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｌａｃｋ  Ｃｕｒｒａｎｔ  Ｌｅａｖｅｓ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣ．Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３３（５）：６１５−６２８，２０１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】    本発明は上記問題に鑑みて為されたものであり、本発明によりカシス葉由来の新規化合物を提供し、更にカシス葉抽出物および抗酸化活性化合物を有効成分として含む抗酸化剤並びに前記の新規化合物の単離方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】    上記課題を解決するために、本発明者らはスグリ科スグリ属植物カシスの葉部の化学成分研究を鋭意進めた結果、今まで報告された事のない８種の新規化合物および６種の既知化合物を見出し、各種クロマトグラフィーおよび化学変換、過去の論文のデータとの比較などを用いてその化学構造を決定した。それと共に従来知られていなかった、カシス葉由来の７０％メタノール抽出物および７種の化学成分に抗酸化活性を有することを見出し、上記の課題を解決するに至った。【００１２】    すなわち本発明によれば、８種の新規リグナン化合物ｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ〜ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｈおよび６種の既知化合物（２種のリグナン、１種のノルセスキテルペン配糖体、１種のフラボノイド、１種のフェニルプロパノイド）が提供される。【００１３】    本発明において別の形態として、前記記載の抽出物又は前記記載の化合物群のうち、６種の抗酸化活性化合物を含有する事に特徴を有する抗酸化剤を提供する事が出来る。【００１４】    本発明において別の形態として、前記記載の抽出物又は６種の化合物を含有する事に特徴を有する医薬品組成物および健康食品を提供する事が出来る。【００１５】    本発明はまた、スグリ属植物カシス葉を７０％メタノールで抽出し、得られた７０％メタノール抽出物を水、３０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール、アセトンで分配処理し、更に３０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール分画物を各種クロマトグラフィーにて分画処理することを特徴とする化１で示される新規化合物および化２で示される抗酸化化合物の単離方法に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】    本発明の新規リグナン化合物ｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ〜ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｈおよび６種の既知化合物を単離する為には、スグリ属植物のカシス葉の７０％メタノールを用いて抽出を行い、その結果得られた抽出物が使用できる。
【００１７】    上記のように、本発明の新規リグナン化合物ｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ〜ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｈおよび６種の既知化合物を単離する為には、スグリ属植物のカシス葉の７０％メタノール抽出物を用いるのが好ましいが、これに限定されることなく、前記記載の化合物群を生産する能力を有する植物および微生物なども使用できる。
【００１８】    本発明のカシスとしては、葉部を採取した後に乾燥し、そのままもしくは細断・粉砕したものを抽出材料として用いる事が出来る。細断・粉砕したものを用いると、抽出効率の点で好ましい。また抽出操作は複数回繰り返すのが抽出効率の点からは好ましい。抽出後に濾別して得られる抽出液は、減圧下で濃縮して抽出エキスとしてもよい。
【００１９】    本発明の化合物群をカシス葉の抽出エキスより採取するには、上記抽出エキスに対して各種有機溶媒を用いて分配処理し、さらに公知の方法、例えば順相又は逆相カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、又は繰り返すことによって単離、精製することができる。この際の坦体・溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することが出来る。
【００２０】    これより本発明を以下の実施例で詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００２１】（１）カシス葉７０％メタノール抽出エキスの調製
中国黒竜江省で採取したカシス葉の乾燥物をミキサーにより粉砕し、その粉砕物３．０ｋｇに３．０Ｌのメタノール（関東化学株式会社製、大量分取液体クロマトグラフィー用）に水を混合し、７０％（ｖ／ｖ）とした溶媒を加え、非振盪下、室温にて１時間抽出した。抽出後、濾過を行い、抽出残渣に更にメタノール（３．０Ｌ）を加え、１時間抽出し、同様に濾過作業を行った。この操作を３回繰り返し、１回目、２回目、３回目の抽出液をあわせ、ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下溶媒留去し、抽出エキスして６９５ｇ（生薬からの収率：２３．２％）を得た。【００２２】（２）カシス葉７０％メタノール抽出エキスの分離・精製
上記に得られた７０％メタノール抽出エキスをダイヤイオンＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーにて水、３０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール、アセトンで順次、分配処理を行い、水分画物（４６．０ｇ）、３０％メタノール分画物（９．９ｇ）、７０％メタノール分画物（１９．８ｇ）、１００％メタノール分画物（２１．５ｇ）、アセトン分画物（５．９ｇ）が得られた。得られた３０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール分画物のそれぞれに対して順相シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー、逆相オクタデシルシリル（以下、ＯＤＳ）オープンカラムクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（以下、ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって繰り返し処理することにより、単離精製を行った。【００２３】    本発明者は３０％メタノール分画物からは既知化合物としてロセオシド（ｒｏｓｅｏｓｉｄｅ、２．０ｍｇ）、イカリシドＢ１（ｉｃａｒｉｓｉｄｅ  Ｂ１、６．０ｍｇ）、ｐ−クマル酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ  ｐ−ｃｏｕｍａｒａｔｅ、３４０ｍｇ）を得た。【００２４】    本発明者は７０％メタノール分画物からは新規リグナン化合物としてｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ（４１ｍｇ）、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ（５．０ｍｇ）、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ（１６ｍｇ）、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｄ（４４ｍｇ）、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｇ（３．０ｍｇ）、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｈ（２６ｍｇ）および既知化合物として（−）−ラレアトリシン（（−）−ｌａｒｒｅａｔｒｉｃｉｎ、１１５ｍｇ）、３，３’−ジデメトキシネクタンドリンＢ（３，３’−ｄｉｄｅｍｅｔｈｏｘｙｎｅｃｔａｎｄｒｉｎ  Ｂ、１２ｍｇ）、ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ、２２ｍｇ）を得た。【００２５】    本発明者は１００％メタノール分画物からは新規リグナン化合物として、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｅ（６．０ｍｇ）およびｒｉｂｅｓｉｎ  Ｆ（１０ｍｇ）を得た。【００２６】    各新規化合物の化学構造については、常法に従って構造決定を行った。すなわち、核磁気共鳴（以下、ＮＭＲ）スペクトルを測定し、１Ｈおよび１３Ｃのスペクトルにおけるケミカルシフト値、スペクトル形状、結合定数、カップリングの状態および補助的に高分解能ＥＳＩ−ＭＳによる質量分析を行った。Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ〜ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｄの絶対立体配置に関しては化学変換反応および円二色性（以下、ＣＤ）スペクトルを用いたＣＤ励起子キラリティー法によって決定した。各既知化合物に関しては１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルなど各種スペクトルのデータを過去の論文のデータと比較・解析して、化学構造を決定した。【００２７】    ＮＭＲスペクトルの測定に関しては、ＮＭＲ分析装置（日本電子社製ＥＣＰ−５００）を用い、ＮＭＲ分析用の試料を重水素化メタノール（ＣＤ３ＯＤ）に溶解して、１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）スペクトル、ＤＥＰＴスペクトル、ＨＭＱＣスペクトル、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル、ＨＭＢＣスペクトル、ＮＯＥＳＹスペクトルの測定を行った。【００２８】    単離された新規化合物はｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ〜ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｄが７，７’−エポキシリグナン、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｅ〜ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｇがテトラヒドロキシフラン型セスキリグナン、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｈがスピロ環ジリグナンであると分類できる。【００２９】  以下に本発明において単離された新規化合物の諸物性値並びに構造式（化４）を示す。【００３０】
【化４】
2014084322.tif 000002
【００３１】Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ
無色固体、Ｃ１８Ｈ１８Ｏ３、ＭＷ：２８２
［α］Ｄ２７−８８．０°（ｃ０．４０、ＭｅＯＨ）
高分解能ＥＳＩＭＳ：計算値（Ｍ−Ｈ−）：２８１．１１７８
実測値：２８１．１１６１
ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２３２（４．３９）、２７６（３．５９）
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３３８９、３０１９、２９１４、２８３９、２３６６、２３４５、１６１３、１５９８、１５１３、１３６５、１２６１、１２２６、１１８９、１１０３、１０２２、１００８
ＣＤ［ＭｅＯＨ、［θ］２７（ｎｍ）］：−１８８７６８（２３４）
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ３０５．１（Ｍ＋Ｎａ＋）【００３２】Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｂ
無色固体、Ｃ２０Ｈ２２Ｏ５、ＭＷ：３４２
［α］Ｄ２７−３５５．１°（ｃ０．５１、ＭｅＯＨ）
高分解能ＥＳＩＭＳ：計算値（Ｍ−Ｈ−）：３４１．１３９０
実測値：３４１．１３７６
ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２３２（４．２１）、２８２（３．８４）
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３４２７、１５９５、１５０９、１４４１、１３８３、１３６４、１２７０、１２３８、１２１８、１１２９、１１７６、１１６０、１０２８
ＣＤ［ＭｅＯＨ、［θ］２７（ｎｍ）］：−３７６８５（２３６）、−７８７７（２８０）
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ３６５．１（Ｍ＋Ｎａ＋）【００３３】Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｃ
無色固体、Ｃ１８Ｈ１８Ｏ３、ＭＷ：２８２
［α］Ｄ２７＋３３．０°（ｃ１．６０、ＭｅＯＨ）
高分解能ＥＳＩＭＳ：計算値（Ｍ−Ｈ−）：２８１．１１７８
実測値：２８１．１１４５
ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２２９（４．４１）、２７７（３．６０）
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３３４８、３０２６、２９６８、２９３１、２８７４、１６１４、１５９８、１５１５、１４５１、１３６６、１２３０、１１７１、１１０６、１０６９
ＣＤ［ＭｅＯＨ、［θ］２７（ｎｍ）］：−２８６７２（２３４）
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ３０５．１（Ｍ＋Ｎａ＋）【００３４】Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｄ
無色固体、Ｃ２０Ｈ２２Ｏ５、ＭＷ：３４２
［α］Ｄ２７＋２０．８°（ｃ０．０５、ＭｅＯＨ）
高分解能ＥＳＩＭＳ：計算値（Ｍ−Ｈ−）：３４１．１３９０
実測値：３４１．１３９４
ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２２９（４．１３）、２８０（３．８３）
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３４３４、１５９３、１５１０、１４４２、１３７７、１２７４、１１２８、１０２８
ＣＤ［ＭｅＯＨ、［θ］２７（ｎｍ）］：−１５３８１（２３７）、−８９０５（２８７）
ＢＳＩＭＳ：ｍ／ｚ３６５．１（Ｍ＋Ｎａ＋）【００３５】Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｅ
無色固体、Ｃ２７Ｈ３０Ｏ４、ＭＷ：４１８
［α］Ｄ２７−３５．０°（ｃ０．５６、ＭｅＯＨ）
高分解能ＥＳＩＭＳ：計算値（Ｍ＋Ｎａ＋）：４４１．２０４１
実測値：４４１．２０７８
ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２２６（４．５０）、２７９（３．８７）
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３３９８、３０１７、２９６１、２９２５、２８５４、１６１４、１５１４、１４５６、１３７７、１２３８，１１７１、１０９２、１００５
ＣＤ［ＭｅＯＨ、［θ］２７（ｎｍ）］：−９５６５（２２１）、３２６７（２３７）
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ４４１．１（Ｍ＋Ｎａ＋）【００３６】Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｆ
無色固体、Ｃ２７Ｈ３０Ｏ４、ＭＷ：４１８
［α］Ｄ２７−１５．７°（ｃ０．４０、ＭｅＯＨ）
高分解能ＥＳＩＭＳ：計算値（Ｍ＋Ｎａ＋）：４４１．２０４１
実測値：４４１．２０７４
ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２２６（２．８９）、２７８（２．２６）
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３３８７、３０２５、２９５９、２３２５、１６１３、１５１４、１４５０、１３７７、１２３８，１１７１、１１２０、１１０１、１０２８、１００５
ＣＤ［ＭｅＯＨ、［θ］２７（ｎｍ）］：３１８５（２２４）、−４９５０（２３６）
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ４４１．１（Ｍ＋Ｎａ＋）【００３７】Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｇ
無色固体、Ｃ２７Ｈ３０Ｏ５、ＭＷ：４３４
［α］Ｄ２７−３１．０°（ｃ０．３０、ＭｅＯＨ）
高分解能ＥＳＩＭＳ：計算値（Ｍ＋Ｎａ＋）：４５７．１９９１
実測値：４５７．２０２０
ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２２６（４．４０）、２８０（３．８４）
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３４２２、２９５５、２９２４、２８５４、１６１０、１５１３、１４５９、１３７７、１２５０、１１７３、１１０６、１０２２
ＣＤ［ＭｅＯＨ、［θ］２７（ｎｍ）］：−８２７６（２１７）、１３６８（２３６）
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ４５６．７（Ｍ＋Ｎａ＋）【００３８】Ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｈ
無色固体、Ｃ３６Ｈ３２Ｏ６、ＭＷ：５６０
［α］Ｄ２７−２０．６°（ｃ０．５２、ＭｅＯＨ）
高分解能ＥＳＩＭＳ：計算値（Ｍ−Ｈ−）：５５９．２１３７
実測値：５５９．２１５５
ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２３０（４．１２）、２７７（３．６２）
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：３４１３、２９２５、２８５９、１６１３、１５１８、１４５２、１３７５、１２３５、１１６９、１１０６、１０２３
ＣＤ［ＭｅＯＨ、［ｅ］２７（ｎｍ）］：−６４８２４（２０８）、５８０２（２２３）、−２１２３６４（２３５）
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ５８３．３（Ｍ＋Ｎａ＋）【００３９】本発明において単離した新規化合物の１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲデータをまとめて以下の表１−１〜１−３に示す。
【表１−１】
2014084322.tif 000003
【表１−２】
2014084322.tif 000004
【表１−３】
2014084322.tif 000005
【実施例２】
【００４０】抗酸化活性の測定方法
なお、以下の実施例において抗酸化活性の測定は、ＷＳＴ法を用いるスーパーオキシドアニオン捕捉活性測定試験法およびＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性測定試験法により行った。【００４１】スーパーオキシドアニオン捕捉活性測定試験法（ＷＳＴ法）
カシス葉７０％メタノール抽出エキスおよび単離された化合物群に対して、株式会社同仁化学研究所のＳＯＤ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（ＷＳＴ−１法）を用いて測定した。本試験系では、キサンチンとキサンチンオキシダーゼにより、活性酸素の一つであるスーパーオキシドアニオンが発生する。発生したスーパーオキシドアニオンは発色試薬であるテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）と反応し、高水溶性ホルマザンであるＷＳＴ−１ホルマザンを形成し黄色く発色する。反応溶液中にスーパーオキシドアニオン捕捉活性が認められる物質が存在すると、ＷＳＴ−１ホルマザンの生成は抑制され、スーパーオキシドアニオンの一部はＨ２Ｏ２とＯ２に不均一化されることから、ＷＳＴ−１ホルマザンに起因する吸光度を測定することでスーパーオキシドアニオン捕捉活性を評価する。
９６ウェルプレートに試料溶液（２０μＬ、生化学用メタノール）と発色試薬（テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１，キサンチン，２００μＬ）を加えプレートミキサーで３０秒間擾絆し、さらにキサンチンオキシダーゼ（２０μＬ）を加え、３７℃で２０分間酵素反応させた（Ｓ）。その後、吸光度測定装置（日本分光社製製品名：Ｐ−２２００）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に試料溶液を添加しないもの（Ｃ）、キサンチンオキシダーゼを添加しないもの（ＳＢ）、試料溶液、酵素溶液ともに添加しないもの（ＣＢ）とした。得られた吸光度を式２に従って算出し、スーパーオキシドアニオン捕捉活性とした。なお、試料はメタノールに溶解し、測定は何れも３連としてその平均値を用いた。また対照物質としてブチルヒドロキシアニソール（以下、ＢＨＡ）を用いた。
スーパーオキシドアニオン捕捉活性（％）＝｛（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ）｝／Ｃ−ＣＢ×１００（式２）【００４２】ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性測定試験法
カシス葉７０％メタノール抽出エキスおよび単離された化合物群を生化学用メタノール中に溶解して得られた試料（１０μＬ）と、０．１５ｍＭ−ＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）−メタノール溶液（９０μＬ）と混合し、９６ウェルプレートに入れ、遮光下及び３７℃で３０分間反応させた。それを３０分後に吸光度測定装置（日本分光社製製品名：Ｐ−２２００）にて５１５ｎｍにおける吸光度を測定し、抽出エキスおよび単離された１４種類の化合物群（Ｓ）又は化合物無添加のコントロール（Ｃ）と比較して吸光度の増大抑制を以下の式３に従ってラジカル捕捉活性率（％）として評価し、その値をＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性とした。測定は何れも３連としてその平均値を用いた。また対照物質としてＢＨＡを用いた。
ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性（％）＝（Ｃ−Ｓ）／Ｃ×１００  （式３）【００４３】    以上のカシス葉７０％メタノール抽出エキスおよび単離された化合物群に対する抗酸化活性測定試験の結果を表２に示す。【００４４】    表２：カシス葉７０％メタノール抽出エキスおよび化合物群のスーパーオキシドアニオン捕捉活性及びＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性測定試験の測定値
2014084322.tif 000006
【００４５】    カシス葉７０％メタノール抽出エキスにスーパーオキシドアニオン捕捉活性が認められた。活性を測定した化合物群では新規化合物であるｒｉｂｅｓｉｎ  Ｂ−〜ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｄ、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｇ〜ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｈおよび既知化合物である３，３’−ジデメトキシネクタンドリンＢ、ケンフェロールが対照化合物であるＢＨＡと比較して、強いスーパーオキシドアニオン捕捉活性を有することが確認された。【００４６】以下、スーパーオキシドアニオン捕捉活性が認められた活性化合物群の構造活性相関について説明する。【００４７】    スーパーオキシドアニオン捕捉活性が認められた活性化合物のうち、７，７’−エポキシリグナンであるｒｉｂｅｓｉｎ  Ａ、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｂ、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｃ、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｄのスーパーオキシドアニオン補足活性に関する測定結果より構造活性相関を解析すると、テトラヒドロフラン部に存在する８位および９位間の二重結合およびフェニル部に存在する３位および３’位に置換されるメトキシ基の存在がスーパーオキシドアニオン補足活性を高める化学構造であると考えられる。【００４８】    更にスーパーオキシドアニオン捕捉活性が認められた活性化合物のうち、テトラヒドロフラン型セスキリグナンであるｒｉｂｅｓｉｎ  Ｅ、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｆ、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｇのスーパーオキシドアニオン補足活性に関する測定ではｒｉｂｅｓｉｎ  Ｇのみに補足活性が認められ、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｅ、ｒｉｂｅｓｉｎ  Ｆには認められなかった。上記の測定結果より構造活性相関を解析すると、テトラヒドロフラン部の相対立体配置又はオルト位ヒドロキシ基を有するフェニル部の有無という化学構造内の違いがスーパーオキシドアニオン捕捉活性発現に関与していると考えられる。
以下の化５はスーパーオキシドアニオン捕捉活性発現に関与すると考えられる化学構造である。【００４９】
【化５】
2014084322.tif 000007
【００５０】    カシス葉７０％メタノール抽出エキスはＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性を示した。活性を測定した化合物群では新規化合物であるｒｉｂｅｓｉｎ  Ｄおよび既知化合物であるケンフェロールが対照化合物であるＢＨＡと比較して、穏やかなＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】  本発明によって提供される抗酸化活性が認められた抽出液又は抽出エキス、化合物は生体内での過剰な活性酸素など、酸化ストレスが発症に関与している癌や脂質異常症・２型糖尿病などの生活習慣病、炎症などの予防又は治療に有効であると考え得る抗酸化剤である。上記の抽出液又は抽出エキス、抗酸化活性が認められた化合物は、それぞれそのままの状態又は適当な媒体で希釈して、医薬品、健康食品などの製造分野に置いて公知の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤など種種の医薬品の形態で好適に使用する事が出来る。