(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸および特にDNA, RNAまたはアンチセンスからなるカーゴ化合物を癌細胞に送達するための方法および材料の提供。【解決手段】キュプレドキシンに由来するタンパク質伝達ドメインの使用。緑膿菌から単離された特定の配列からなるペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物の使用。【選択図】図１Ａ
2014237640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物である単離されたペプチドであって、哺乳類組織において前悪性傷害の発生を阻害できる単離されたペプチド。
【請求項２】
請求項1に記載の単離されたペプチドであって、前記キュプレドキシンが、アズリン, シュードアズリン, プラストシアニン, ラスティシアニン, Laz, アウラシアニン, ステラシアニンおよびキュウリ塩基性タンパク質（cucumber basic protein）からなる群から選択される単離されたペプチド。
【請求項３】
請求項2に記載の単離されたペプチドであって、前記キュプレドキシンがアズリンである単離されたペプチド。
【請求項４】
前記キュプレドキシンは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan,  Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosaおよびVibrio parahaemolyticusからなる群から選択される生物体に由来する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
緑膿菌に由来する、請求項4に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
配列番号1、3〜19からなる群から選択されるペプチドの一部である、請求項1に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
配列番号1、3〜19からなる群から選択される配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
前記キュプレドキシンの短縮型である、請求項1に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは約 10 残基以上で約 100 残基以下である、請求項8に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
緑膿菌のアズリン残基50〜77, 緑膿菌のアズリン残基50〜67, 緑膿菌のアズリン残基36〜88, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列を含む、請求項8に記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
緑膿菌のアズリン残基50〜77, 緑膿菌のアズリン残基50〜67, 緑膿菌のアズリン残基36〜88, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列からなる、請求項10に記載の単離されたペプチド。
【請求項１２】
残基50〜77, 残基50〜67および残基36〜88からなる群から選択される緑膿菌アズリンの領域と均等（equivalent）なキュプレドキシンの残基を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
請求項1に記載の少なくとも１つのキュプレドキシンまたはペプチドを薬学的に許容される担体中に含んでいる薬学的組成物。
【請求項１４】
少なくとも２つのキュプレドキシンまたはペプチドを含む、請求項13に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記薬学的組成物が静脈内投与のために製剤化される、請求項13に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記キュプレドキシンは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan,  Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosaおよびVibrio parahaemolyticusからなる群から選択される生物体に由来する、請求項13に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記キュプレドキシンが緑膿菌に由来する、請求項16に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項13に記載の薬学的組成物であって、前記キュプレドキシンが配列番号1、3〜19からなる群から選択される薬学的組成物。
【請求項１９】
哺乳類の患者を治療するための方法であって、前記患者に治療上効果的な量の請求項13に記載の薬学的組成物を投与することを備える方法。
【請求項２０】
前記患者がヒトである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者が一般的な集団よりも癌を発生するリスクが高い、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌がメラノーマ, 乳房癌, 膵臓癌, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, 肺癌, 結腸直腸癌, 首および頭部癌（neck and head）, 膀胱癌, 前立腺癌, 皮膚癌, および子宮頚癌から選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者が少なくとも一つの危険性が高い特性（high risk feature）を有する、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が前悪性傷害を有する、請求項19に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者は癌または前悪性傷害が治癒している、請求項19に記載の方法。
【請求項２６】
請求項19に記載の方法であって、前記薬学的組成物が静脈内注射, 筋肉内注射, 皮下注射, 吸入, 局所的投与, 経皮性のパッチ, 坐剤, 硝子体注射および経口投与からなる群から選択される様式で投与される方法。
【請求項２７】
投与の様式が静脈内注射である、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
請求項21に記載の方法であって、前記薬学的組成物は少なくとも一つの他の化学予防薬と共投与される方法。
【請求項２９】
請求項26に記載の方法であって、前記薬学的組成物は別の化学予防薬とおよそ同時に投与される方法。
【請求項３０】
請求項13に記載の組成物をバイアル中に含んでいるキット。
【請求項３１】
前記キットが静脈内投与のために設計される、請求項30に記載のキット。
【請求項３２】
癌の発生を研究するための方法であって、哺乳類細胞を請求項 1に記載のキュプレドキシンまたはペプチドと接触させること；及び前悪性および悪性の細胞の発生を測定することを含んでいる方法。
【請求項３３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が乳腺細胞である、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が誘導されて癌を発生する、請求項32に記載の方法。
【請求項３６】
請求項1に記載のペプチドをコード化する発現ベクター。
【請求項３７】
キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物である単離されたペプチドであって；カーゴ化合物とカップルされ、哺乳類の癌細胞に選択的に進入できる単離されたペプチド。
【請求項３８】
前記キュプレドキシンは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan,  Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosaおよびVibrio parahaemolyticusからなる群から選択される生物体に由来する、請求項37に記載の単離されたペプチド。
【請求項３９】
請求項37に記載の単離されたペプチドであって、前記キュプレドキシンがアズリンである単離されたペプチド。
【請求項４０】
請求項39に記載の単離されたペプチドであって、前記アズリンが緑膿菌に由来する単離されたペプチド。
【請求項４１】
配列番号 25を含む、請求項37に記載の単離されたペプチド。
【請求項４２】
配列番号 25からなる、請求項37に記載の単離されたペプチド。
【請求項４３】
前記キュプレドキシンの短縮型である、請求項37に記載の単離されたペプチド。
【請求項４４】
前記ペプチドは約 10 残基以上で約 100 残基以下である、請求項37に記載の単離されたペプチド。
【請求項４５】
緑膿菌のアズリン残基50〜77（配列番号2）, 緑膿菌のアズリン残基50〜67（配列番号25）, 緑膿菌のアズリン残基36〜88（配列番号26）, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列を含む、請求項37に記載の単離されたペプチド。
【請求項４６】
前記カーゴ化合物がDNAまたはRNAである、請求項37に記載の組成物。
【請求項４７】
前記カーゴ化合物がアンチセンス分子である、請求項46に記載の組成物。
【請求項４８】
前記カーゴ化合物が哺乳類の癌細胞を遅延させる又は殺傷する、請求項37に記載の組成物。
【請求項４９】
前記カーゴ化合物が細胞毒性薬である、請求項48に記載の組成物。
【請求項５０】
前記カーゴ化合物がタンパク質, リポタンパク質, ポリペプチド, ペプチド, ポリサッカライド, 核酸, 色素, 微小粒子, ナノ粒子, 毒素および薬物からなる群から選択される、請求項37に記載の組成物。
【請求項５１】
前記カーゴ化合物がタンパク質およびポリペプチドからなる群から選択され、前記ペプチドが前記カーゴ化合物に連結されて融合タンパク質を形成する、請求項37に記載の組成物。
【請求項５２】
前記カーゴ化合物が毒素である、請求項37に記載の組成物。
【請求項５３】
前記カーゴ化合物が検出可能な物質である、請求項37に記載の組成物。
【請求項５４】
請求項37に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含んでいる薬学的組成物。
【請求項５５】
細胞（a cell）または複数細胞（cells）を請求項37に記載の組成物と接触させることを備える方法。
【請求項５６】
請求項55に記載の方法であって、前記細胞または複数細胞は癌に罹患している患者から由来し、さらに前記細胞または複数細胞を前記患者に再導入することを備える方法。
【請求項５７】
前記細胞が癌細胞である、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
請求項57に記載の方法であって、前記細胞が骨肉腫細胞, 肺の癌腫細胞, 結腸の癌腫細胞, リンパ腫細胞, 白血病細胞, 軟部組織の肉腫細胞, 乳房の癌腫細胞, 肝臓の癌腫細胞, 膀胱の癌腫細胞, メラノーマ細胞, 脳腫瘍細胞および前立腺の癌腫細胞からなる群から選択される癌細胞である方法。
【請求項５９】
癌を伴う患者を治療する方法であって、請求項37に記載の組成物が前記患者に治療上効果的な量で投与される方法。
【請求項６０】
請求項59に記載の方法であって、前記複合体が静脈内、局所、皮下、筋肉内、および腫瘍内からなる群から選択される経路で投与される方法。
【請求項６１】
請求項59に記載の方法であって、前記複合体は、別の癌治療と共に共投与される方法。
【請求項６２】
患者の癌を画像処理するための方法であって、請求項53に記載の組成物が前記患者に投与され、前記カーゴ化合物の位置が検出される方法。
【請求項６３】
請求項62に記載の方法であって、前記カーゴ化合物はＸ線造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置がＸ線CTで検出される方法。
【請求項６４】
請求項62に記載の方法であって、前記カーゴ化合物は磁気共鳴映像法の造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置がMRIで検出される方法。
【請求項６５】
請求項62に記載の方法であって、前記カーゴ化合物は超音波造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置が超音波画像処理で検出される方法。
【請求項６６】
癌を診断するための方法であって、細胞を請求項53に記載の組成物と接触し、前記カーゴ分子の位置が検出される方法。
【請求項６７】
請求項37に記載の組成物を含んでいる試薬を具備するキット。
【請求項６８】
請求項67に記載のキットであって、薬学的に許容されるアジュバントまたは賦形剤を含んでいる試薬をさらに具備するキット。
【請求項６９】
請求項67に記載のキットであって、前記試薬を投与するためのビヒクルをさらに具備するキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
米国特許出願第11/488,693号（2006年7月19日出願）, 米国特許出願第60/844,358号（2006年9月14日出願）, この出願は米国特許出願第11/244,105号（2005年10月6日出願）の利益を請求し、この出願は米国仮出願第60/616,782（2004年10月7日出願）, および米国仮出願第60/680,500（2005年5月13日に出願され、米国特許出願第10/720,603（2003年11月11日出願）の一部継続出願である）の利益を請求し、この出願は米国仮出願第60/414,550号（2003年8月15日出願）の利益を請求し、この出願は米国特許出願第10/047,710号（2002年1月15日出願）の一部継続出願であり、この出願は米国仮出願第60/269,133号（2001年2月15日出願）の利益を請求する。
【０００２】
［政府の利益に関する陳述］
これらの出願の内容の全体は、参照によって本出願の明細書等に完全に援用される。本出願の主題は、米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所（NIH）からの研究助成金（助成金番号AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45441, CA09432 およびN01-CM97567）によって助成された。米国政府は、本発明に特定の権利を有している。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、哺乳類の細胞、組織、または動物における前悪性傷害（premalignant lesions）の発生を阻害する、キュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物を含んでいる組成物に関する。また、本発明は、前悪性傷害、および最終的に癌の発生を阻害するための哺乳類における化学予防因子（chemopreventive agents）としてのキュプレドキシン、およびキュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物の使用に関する。
【０００４】
［背  景］
癌の化学的予防は、浸潤癌への発癌性の進行（carcinogenic progression）を好転（reverse）させる、抑制する、または予防（prevent）する天然の, 合成の又は生物学的な化学的な因子の使用である。ハイリスク集団の癌の予防における最近の臨床試験は、化学予防治療がハイリスク患者のための現実的な治療であることを示唆する。化学予防治療は、多巣性場（multifocal field）の発癌および多段階（multistep）の発癌の概念に基づいている。場での発癌（field carcinogenesis）において、組織の場をとおした全身性の発癌物質曝露によって、組織における拡散性の上皮傷害および変異した細胞のクローン増殖が生じる。場をとおしたこれらの遺伝的な変異は、一または二以上の前悪性または悪性の傷害が場において発生するだろう尤度（likelihood）を増加させる。これらの遺伝的および表現型の変更の段階的な蓄積における多段階の発癌。多段階の発癌において一または二以上の段階をアレストすることによって、癌の発生（進行）を妨害または予防しえる。一般にTsao等〔CA Cancer J Clin 54:150-180 (2004)〕を参照されたい。
【０００５】
アズリン, および他のキュプレドキシンは、癌細胞に特異的に細胞毒性である。アズリンによって、J774 肺癌細胞におけるアポトーシスが誘導される。Yamada等〔PNAS 99(22):14098-14103 (2002)〕。J774肺癌細胞への進入において、アズリンは、サイトゾルおよび核フラクションに局在し、腫瘍抑制因子タンパク質p53と複合体を形成し、それを安定化し、その細胞内レベルを増強する（Id.）。アズリン媒介性アポトーシスの誘導は、J774細胞に限定されない。また、アズリンは、ヒトメラノーマUISO-Mel-2またはヒト乳癌MCF-7細胞などの癌細胞に進入（enter）できる。Yamada等〔Infect Immun. 70:7054-7062 (2002)〕; Punj等〔Oncogene. 23:2367-2378 (2004)〕。両方の場合において、アズリンは、細胞内のp53レベルの上昇を許容し、係る細胞においてBax形成の増強およびアポトーシスの誘導が導かれる。最も興味深いことに、異種移植されたMel-2またはMCF-7ヒト癌を保持しているヌードマウスにおけるアズリンの腹腔内注射によって、係る細胞の統計的に有意な退行（regression）が導かれた（Id.）。
【０００６】
マウス乳腺の器官培養(MMOC)アッセイを使用して、乳腺のホルモン誘導性の構造分化および前記腺におけるDMBA誘導性の新生物発生前の過形成性の小窩小結節様傷害（DMBA-induced preneoplastic hyperplastic alveolar nodule-like lesions）の発生の両方への潜在的な化学予防因子の阻害効果を評価しえる。インシュリン (I) + プロラクチン (P) + アルドステロン (A)の存在下で6日インキュベーションした場合、若い処女動物（virgin animal）からの乳腺は完全に成長させた腺に分化できる。これらの腺は、妊娠マウスから得られた腺と形態学的に似ている。アルドステロンは、エストロゲン (E) + プロゲステロン (Pg)で置換できる。培地へのヒドロコルチゾン (H)の封入によって、乳腺の機能的な分化が刺激される。Mehta および Banerjee〔Acta Endocrinol.80:501 (1975)〕; MehtaおよびMoon〔Breast Cancer: Treatment and Prognosis 300, 300 (Basil A Stoll ed., Blackwell Press 1986)〕。従って、ホルモン誘導性の構造的および機能的な分化（この培養系で観察される）は、動物の様々な生理的な段階の間に観察されるホルモンへの応答を模倣する。
【０００７】
マウスは、MMOCにおいて癌形成前に区別される新生物発生前段階を呈する。C3Hマウスにおける係る新生物発生前の傷害は、マウス乳房腫瘍ウイルスで誘導される又はDMBAでＢＡＬＢ／ｃ  マウスで誘導される。増殖期の3 および 4日の間に腺を2 μg/ml DMBAに曝露し、インシュリンのみを含んでいる培地中での2-3 週間の腺が退行（regression）し、乳房小窩傷害(MAL；mammary alveolar lesions)の形成を生じる。Hawthorne等〔Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002)〕; Mehta等〔Methods in Cell Science 19:19-24 (1997)〕。さらにまた、同系の宿主への上皮細胞（DMBA誘導性の乳房の傷害を含んでいる腺から調製された）の移植によって、乳房腺癌の発生に至る。Telang等〔PNAS 76:5886-5890 (1979)〕。同じ系統のマウスがDMBAを投与される場合、これらの腫瘍は病理学的にインビボで観察されたものと類似していた（Id.）。
【０００８】
MMOCにおけるDMBA誘発性の乳房傷害の形成は、種々のクラスの化学予防因子（例えば、レチノイド）で阻害できる。これらの因子には、天然の産物、例えば、ブラシニンおよびレスベラトロール, チオール, 抗酸化剤, オルニチンデカルボキシラーゼのインヒビター、例えば、OFMO および デグエリン, プロスタグランジン合成のインヒビター, Caレギュレーターなどから由来する化学予防因子が含まれる。Jang等〔Science 275:218-220 (1997)〕; Mehta〔Eur. J. Cancer 36:1275-1282 (2000)〕; Metha等〔J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997)〕。これらの研究は、この器官培養系が乳房の発癌に対する化合物の有効性を決定するユニークなモデルを提供することを明瞭に実証している。結果は、係る化合物のインビボ投与で得られる阻害と密接に相関することが期待できる。
【０００９】
また、乳房管傷害(MDL；mammary ductal lesions)を形成させるためにMMOCを導入してもよい。アルドステロン および ヒドロコルチゾンの代わりにエストロゲン および プロゲステロンが培地に含まれる場合、MDLを誘導できる。卵巣ステロイドの存在下で小窩構造（alveolar structures）は非常に小さいが、組織病理学的な切片で管内の傷害が観察された。Mehta等〔J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)〕。抗エストロゲン（タモキシフェンなどの卵巣ホルモン依存的なER+乳房癌に選択的に働くもの）は、MDL形成を阻害するが、MALは阻害しない。従って、従来のMAL誘導プロトコールに加え、この修飾培養モデルを使用して、MALおよびMOLの両方における化学予防因子の効果を評価することができる。
【００１０】
前悪性傷害の発生を阻害する化学予防因子が必要とされる。係る化学予防因子は、前悪性傷害の初期の発生を予防すること、形成される前悪性傷害において細胞死を誘発すること、および／または前悪性傷害の悪性傷害への進行のいずれかを予防することができるべきである。係る化学予防因子は、特にハイリスク特性の存在, 前悪性傷害の存在, または以前の癌または前悪性傷害いずれかによる癌を発生させる危険性が高い患者を治療することに大きい有用性を有するだろう。
【００１１】
タンパク質の哺乳類細胞への進入は、タンパク質の小さいセグメントによって支配されていることがあり、これは一般的に「タンパク質伝達ドメイン（protein transduction domain）」またはＰＴＤと称される。このセグメントを外来（foreign）のタンパク質に付着させてシグナルとして使用することによって、係るタンパク質の哺乳類細胞への輸送を促進することができる。例えば、両親媒性のペプチドは、ヒト繊維芽細胞HS68またはマウスリンパ球性白血病L1210細胞における潜在的な抗腫瘍薬としての、ＤＮＡ切断性の金属ポルフィリンの摂取を促進させるために使用される〔Chaloin, L. et al. Bioconjugate Chem. 12:691-700, (2001)〕。細胞貫通性ペプチドと称されるペプチド〔例えば、ペネトラチン（penetratin）、トランスポータン（transportan）、Tat(アミノ酸47-57または48-60)およびモデル的な両親媒性のペプチドＭＡＰ〕は、薬理学的に重要な物質（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質およびペプチド）を輸送するための送達ビヒクルとして使用されている〔Hallbrink, M. et al. Biochim. Biophys. Acta 1515:101-109 (2001); Lindgren, M., et al. Trends Pharmacol. Sci. 21:99-103 (2000)〕。
【００１２】
係るペプチド、特に、ショウジョウバエ転写制御因子  アンテナペディアのDNA-結合ホメオドメイン、または21残基のペプチド担体Pep-1は、培養において多くのタイプの細胞（例えば、ヒトHS68またはマウスNIH-3T3線維芽細胞）で37゜Cまたは4゜Cの何れかでインターナライズされる。温度シフトの効果の欠乏は、キラル（chiral）なレセプタータンパク質を必要とする古典的なエンドサイトーシスとは異なる貫通機構の存在を示唆している〔Morris, M.C. et al. Nature Biotechnol. 19:1173-1176 (2001)〕。最も広く使用されている、薬理学的に活性な化合物を哺乳類細胞に輸送するためのペプチドの１つは、ヒト免疫不全症ウイルス１型(HIV-1)トランス活性化因子タンパク質Tatの１１アミノ酸のアルギニンリッチなタンパク質伝達ドメイン（PTD）である〔Schwarze, S.R. et al. Science 285:1569-1572 (1999), Schwarze, S.R. et al. Trends Cell Biol. 10:290-295 (2000)〕。120kDaのβ-ガラクトシダーゼ/Tat融合タンパク質の腹腔内注射によって、前記融合タンパク質のマウス中の実際上全ての組織への経細胞的（transcellular）な伝達が生じ、これには血液脳関門の通過も含まれる。HIV-1 Tatのこの短いペプチドドメインは、大きな分子または粒子（これには、磁性ナノ粒子, ファージベクター, リポソームおよびプラスミドDNAが含まれる）の細胞インターナリゼーションを媒介することが示されている。上記で議論した他の細胞貫通ペプチドとは異なり、完全長Tat又はその１１アミノ酸伝達ドメインによるカーゴタンパク質（cargo proteins）のインターナリゼーションは、4゜C で有意に損なわれ〔Liu, Y. et al. Nat. Med. 6:1380-1387 (2000), Suzuki, T. et al. J. Biol. Chem. 277:2437-2443 (2002)〕、レセプター（例えば、細胞膜ヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖）との相互作用が必要とされる。
【００１３】
現在同定された大抵のPTDsは、ウイルスおよび哺乳類の供給源に由来するものである。PTDsの他の供給源が、様々な実験手順の設計のために並びに動物およびヒトの治療および予防の処置のために所望されるであろう。PTDsの供給源の１つの代替は、細菌細胞である。細菌のタンパク質（例えば、コレラ毒素）は、哺乳類細胞のサイトゾルに進入することが知られているが〔Sofer, A. and Futerman, A.H. J. Biol. Chem. 270:12117-12122 (1995)〕、係るタンパク質の細胞毒性のため、細菌タンパク質又はそれに由来するPTDsを、薬理学的に重要なカーゴを輸送するために使用することは制限されている。
【００１４】
［態様の概要］
本発明は、哺乳類の細胞、組織、または動物における前悪性傷害（premalignant lesions）の発生を阻害する、キュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物であってもよいペプチドを含んでいる組成物に関する。具体的には、これらの組成物は、緑膿菌からのアズリン, アズリン (p28) 配列番号 2の50-77 残基領域, およびアズリン (p18) 配列番号 25の50-67 残基領域を具備してもよい。さらに、本発明は、キュプレドキシン、および／または哺乳類の細胞、組織、または動物の前悪性傷害の発生を阻害する能力を保持しているキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含みえる組成物に関する。これらの組成物は、とりわけ単離されたペプチドまたは薬学的組成物であってもよい。本発明の組成物は、哺乳類の患者における癌の発生を予防する方法に使用しえる。
【００１５】
本発明の一側面は、キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であってもよく；哺乳類組織において前悪性傷害の発生を阻害しえる単離されたペプチドである。キュプレドキシンは、アズリン, シュードアズリン（pseudoazurin）, プラストシアニン, ラスティシアニン（rusticyanin）, Laz, アウラシアニン（auracyanin）, ステラシアニンおよびキュウリ塩基性タンパク質（cucumber basic protein）であってもよく, 特にアズリンであってもよい。キュプレドキシンは、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Ulva pertussis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa およびVibrio parahaemolyticusなどの生物体からのものであってもよく, 特にPseudomonas aeruginosaであってもよい。幾つかの態様において、前記ペプチドは、配列番号1, 3〜19の一部（part）であってもよい又は配列番号1, 3〜19と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１６】
幾つかの態様において、前記単離されたペプチドは、キュプレドキシンの短縮型（truncation）であってもよい。前記単離されたペプチドは、約 10 残基以上で約 100 残基以下であってもよい。前記単離されたペプチドは、緑膿菌アズリン残基 50-77 配列番号2, 緑膿菌アズリン残基 50-67 配列番号25, 緑膿菌アズリン残基 36-88 配列番号26, または配列番号 20-24を含んでも又は（代替的に）からなってもよい。
【００１７】
本発明の別の側面は、本発明の少なくとも一つの（または二つの）キュプレドキシンまたは単離されたペプチドを薬学的に許容される担体中に含んでもよい薬学的組成物である。前記薬学的組成物は、静脈内投与のために製剤化されてもよい。幾つかの態様において、薬学的組成物中のキュプレドキシンは、Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Ulva pertussis, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa およびVibrio parahaemolyticusなどの生物体からのものであってもよく, および特にPseudomonas aeruginosaからのものであってもよい。前記キュプレドキシンは、配列番号1, 3〜19であってもよい。
【００１８】
本発明の別の側面は、哺乳類の患者を治療するための方法であって、前記患者に本発明の治療上効果的な量の前記薬学的組成物を投与することで哺乳類の患者を治療する方法である。患者は、ヒトであってもよく、一般的な集団よりも癌を発生するリスクが高くてもよい。幾つかの態様において、癌はメラノーマ, 乳房癌, 膵臓癌, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, 肺癌, 結腸直腸癌, 頚部および頭部癌（neck and head）, 膀胱癌, 前立腺癌, 皮膚癌, または子宮頚癌であってもよい。幾つかの態様において、患者は、少なくとも一つの危険性が高い特性（前悪性傷害）を有していてもよく、または癌または前悪性傷害が治癒されていてもよい。
【００１９】
薬学的組成物は、静脈内注射, 筋肉内注射, 皮下注射, 吸入, 局所的投与, 経皮性のパッチ, 坐剤, 硝子体注射（vitreous injection）または経口投与で投与されてもよく、特に静脈内注射で投与されてもよい。薬学的組成物は、少なくとも一つの他の化学予防薬と共投与されてもよく、特に別の化学予防薬とおよそ同じ時間で共投与されてもよい。
【００２０】
本発明の別の側面は、本発明の薬学的組成物をバイアル中に含んでいるキットである。前記キットを、静脈内投与のために設計してもよい。
【００２１】
本発明の別の側面は、癌の発生を研究するための方法であり、該方法は哺乳類細胞を本発明のキュプレドキシンまたはペプチドと接触させること及び前悪性および悪性の細胞の発生を測定することを含んでいる。幾つかの態様において、前記細胞はヒトおよび／または哺乳類の細胞であってもよい。幾つかの態様において、前記細胞は、誘導されて前悪性傷害を発生する。
【００２２】
本発明の別の側面は、本発明のペプチドをコード化する発現ベクターである。
【００２３】
本発明の別の側面は、カーゴ化合物およびアミノ酸配列を含んでいる複合体である（ここで、前記アミノ酸配列は少なくとも約90%の配列同一性をキュプレドキシン又はその断片に対して有する、又は前記アミノ酸配列又はその断片は前記カーゴ化合物と連結される、そして前記アミノ酸配列は前記カーゴ化合物の哺乳類癌細胞への進入を促進する）。幾つかの態様において、本複合体のアミノ酸配列は、少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性を、全長未満の野生型のキュプレドキシンまたはH.8外膜タンパク質に対して有する。他の態様において、前記カーゴ化合物は、タンパク質, リポタンパク質, ポリペプチド, ペプチド, ポリサッカライド, 核酸, 色素, 微小粒子, ナノ粒子, 毒素および薬物である。特定の態様において、前記カーゴはタンパク質またはポリペプチドであり、これにアミノ酸配列が連結されて融合タンパク質が形成される。特定の態様において、前記カーゴ化合物は、毒素（toxin）であり、より具体的には緑膿菌の外毒素Aである。他の態様において、前記カーゴは、検出可能な物質であり、より具体的には蛍光定量法、顕微鏡観察、Ｘ線CT、MRIまたは超音波によって検出可能なものである。最後に、本発明は、薬剤的に適切な担体中の複合体をも包含する。
【００２４】
本発明の別の側面は、カーゴ化合物を細胞に送達するための方法に関する。一態様において、この方法は、細胞（a cell）または複数細胞（cells）を上記の複合体と接触させることを備える。他の態様において、前記細胞または複数細胞は、癌に罹患している患者から由来し、前記患者に再導入される。他の態様において、前記細胞は、癌細胞であり、より具体的には骨肉腫細胞, 肺の癌腫細胞, 結腸の癌腫細胞, リンパ腫細胞, 白血病細胞, 軟部組織の肉腫細胞, 乳房の癌腫細胞, 肝臓の癌腫細胞, 膀胱の癌腫細胞または前立腺の癌腫細胞である。他の態様において、前記複合体は、患者に治療上効果的な量で投与される。他の態様において、前記複合体は、静脈内に、局所的に、皮下に、筋肉内に、または腫瘍へと投与される。他の態様において、前記複合体は、別の癌治療と共に共投与（co-administered）される。なお他の態様において、RNAiアプローチ, 薬剤抵抗性, 造血性の遺伝子移入（hematopoietic gene transfer）, 相同的組換え, リボザイム技術, アンチセンス技術, 腫瘍免疫療法および腫瘍抑制因子,トランスレーショナルリサーチ, 癌治療, 遺伝子送達システム(ウイルス性および非ウイルス性), 抗遺伝子治療(アンチセンス, siRNA & リボザイム), アポトーシス; メカニズムおよび療法, ワクチン開発, 免疫学および免疫療法, およびDNA合成および修復は、DNAおよび／またはRNAを本発明の複合体におけるカーゴ化合物として送達することに使用される。特定の態様において、カーゴ化合物は、アンチセンス分子である。
【００２５】
本発明の別の側面は、癌を診断する方法である。幾つかの態様において、検出可能な物質であるカーゴとの複合体が、癌を有する患者に投与され、前記カーゴの位置が検出される。特定の態様において、前記カーゴ化合物は、Ｘ線造影剤であり、Ｘ線CTで検出される；前記カーゴ化合物は、磁気共鳴映像法造影剤であり、MRIで検出される；前記カーゴは、超音波造影剤であり、超音波で検出可能である。他の態様において、細胞または複数細胞は検出可能な物質との複合体に接触させられて、前記カーゴの位置が検出される。
【００２６】
本発明の別の側面は、上記の複合体の何れかを含有するキットである。幾つかの態様において、前記キットは、薬学的に許容されるアジュバントまたは賦形剤をさらに含む。他の態様において、前記キットは、試薬（reagent）を投与するためのビヒクルをさらに含む。
【００２７】
本発明のこれらの及び他の側面、効果、および特性は、添付される図面および特定の態様の詳細な記述から明らかである。
【００２８】
［配列の簡単な説明］
配列番号 1;  緑膿菌からのアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。
【００２９】
配列番号 2;  p28, 緑膿菌アズリン残基 50-77のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００３０】
配列番号 3;  Phormidium laminosumからのプラストシアニンのアミノ酸配列(Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly)。
【００３１】
配列番号 4;  Thiobacillus ferrooxidansからのラスティシアニンのアミノ酸配列(Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys)。
【００３２】
配列番号 5;  Achromobacter cycloclastesからのシュードアズリンのアミノ酸配列(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn)。
【００３３】
配列番号 6;  Alcaligenes faecalisからのアズリンのアミノ酸配列(Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser)。
【００３４】
配列番号 7;  Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans Iからのアズリンのアミノ酸配列(Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn)。
【００３５】
配列番号 8;  Bordetella bronchisepticaからのアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val Asp)。
【００３６】
配列番号 9;  Methylomonas sp. Jからのアズリンのアミノ酸配列(Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu Glu)。
【００３７】
配列番号 10;  Neisseria meningitidis Z2491からのアズリンのアミノ酸配列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。
【００３８】
配列番号 11;  Pseudomonas fluorescenからのアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys)。
【００３９】
配列番号 12;  Pseudomonas chlororaphisからのアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys)。
【００４０】
配列番号 13;  Xylella fastidiosa 9a5cからのアズリンのアミノ酸配列(Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Ile Ala His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly Gly)。
【００４１】
配列番号 14;  Cucumis sativusからのステラシアニンのアミノ酸配列(Met Gln Ser Thr Val His Ile Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser Ile Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser)。
【００４２】
配列番号 15;  Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンAのアミノ酸配列(Met Lys Ile Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met Ala Met Val Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr Ile Glu Ile Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln Gln His Asn Trp Ile Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala Asp Lys Ser Asn Ile Ile Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val Val Asn)。
【００４３】
配列番号 16;  Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンBのアミノ酸配列(Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro)。
【００４４】
配列番号 17;  Cucumis sativusからのキュウリ塩基性タンパク質のアミノ酸配列(Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe Ile Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala Val Asn Ala Leu)。
【００４５】
配列番号 18;  Neisseria gonorrhoeae F62からのLazのアミノ酸配列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。
【００４６】
配列番号 19;  Vibrio parahaemolyticusからのアズリンのアミノ酸配列(Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Ile Met Gln Gly Lys Phe Glu Phe Lys)。
【００４７】
配列番号 20;  Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニン Bのアミノ酸 57〜89のアミノ酸配列(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp)。
【００４８】
配列番号 21;  Pseudomonas syringaeのアズリンのアミノ酸 51-77のアミノ酸配列(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
【００４９】
配列番号 22;  Neisseria meningitidisのLazのアミノ酸 89-115のアミノ酸配列(Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
【００５０】
配列番号 23;  Vibrio parahaemolyticusのアズリンのアミノ酸 52-78のアミノ酸配列(Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
【００５１】
配列番号 24;  Bordetella bronchisepticaのアズリンのアミノ酸 51-77のアミノ酸配列(Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp)。
【００５２】
配列番号 25;  p18, 緑膿菌のアズリン残基 50-67のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly)。
【００５３】
配列番号 26;  緑膿菌アズリンのアミノ酸 36-88のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly)。
【００５４】
配列番号 27;  緑膿菌アズリンのアミノ酸 36〜77のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００５５】
配列番号 28;  緑膿菌アズリンのアミノ酸 36〜89のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser)。
【００５６】
配列番号 29;  緑膿菌アズリンのアミノ酸 36〜128のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。
【００５７】
配列番号 30;  緑膿菌アズリンのアミノ酸 53〜70のアミノ酸配列(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys)。
【００５８】
配列番号 31;  緑膿菌アズリンのアミノ酸 53〜64のアミノ酸配列(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met)。
【００５９】
配列番号32；  アミノ酸配列  DGXXXXXDXXYXKXXD。
【００６０】
配列番号33；  アミノ酸配列  DGXXXXDXXYXKXXD。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】図1は、p28 および アズリンの有効性に関して評価した全ての腺の写真を示す。図 1Aは、DMBA処理した腺における小窩傷害およびDMBAと化学予防因子で処理された腺の比較の代表的な写真を示す。図 1B-1Fは、小窩傷害の発生におけるp28の効果の代表的な写真を示す。
【図１Ｂ】図1は、p28 および アズリンの有効性に関して評価した全ての腺の写真を示す。図 1Aは、DMBA処理した腺における小窩傷害およびDMBAと化学予防因子で処理された腺の比較の代表的な写真を示す。図 1B-1Fは、小窩傷害の発生におけるp28の効果の代表的な写真を示す。
【図１Ｃ】図1は、p28 および アズリンの有効性に関して評価した全ての腺の写真を示す。図 1Aは、DMBA処理した腺における小窩傷害およびDMBAと化学予防因子で処理された腺の比較の代表的な写真を示す。図 1B-1Fは、小窩傷害の発生におけるp28の効果の代表的な写真を示す。
【図１Ｄ】図1は、p28 および アズリンの有効性に関して評価した全ての腺の写真を示す。図 1Aは、DMBA処理した腺における小窩傷害およびDMBAと化学予防因子で処理された腺の比較の代表的な写真を示す。図 1B-1Fは、小窩傷害の発生におけるp28の効果の代表的な写真を示す。
【図１Ｅ】図1は、p28 および アズリンの有効性に関して評価した全ての腺の写真を示す。図 1Aは、DMBA処理した腺における小窩傷害およびDMBAと化学予防因子で処理された腺の比較の代表的な写真を示す。図 1B-1Fは、小窩傷害の発生におけるp28の効果の代表的な写真を示す。
【図１Ｆ】図1は、p28 および アズリンの有効性に関して評価した全ての腺の写真を示す。図 1Aは、DMBA処理した腺における小窩傷害およびDMBAと化学予防因子で処理された腺の比較の代表的な写真を示す。図 1B-1Fは、小窩傷害の発生におけるp28の効果の代表的な写真を示す。
【図１Ｇ】図1は、p28 および アズリンの有効性に関して評価した全ての腺の写真を示す。図 1Aは、DMBA処理した腺における小窩傷害およびDMBAと化学予防因子で処理された腺の比較の代表的な写真を示す。図 1B-1Fは、小窩傷害の発生におけるp28の効果の代表的な写真を示す。
【図２】図2は、DMBA誘導性の乳房小窩傷害に対するp28の有効性を示している図である。
【図３】図3は、管傷害の代表的な切片およびp28の効果の写真を示す。
【図４】図4は、DMBA誘導性の管傷害に対するp28の有効性を示している図である。
【図５】wt-アズリンおよびwt-アズリン50-77タンパク質伝達ドメインにおける、α-ヘリックスの局在化を示している図である。アズリン50-77ドメインにおける３つのアミノ酸の、プロリン残基での置換が指摘されている。
【図６Ａ】(A), (B)および(C):  (A)GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質の構築を示す図である。gfp遺伝子を、gst遺伝子の３’端に導入した(GST-GFP)。次に、azu 50-77断片をgfp遺伝子の３’端でインフレームに結合して、GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質を産生した。GST-GFP-azu 50-77を、細胞溶解産物から、単一の融合タンパク質として精製した。精製タンパク質を、SDS-PAGEで泳動し、クーマシーブルー染色(6(b))で及び抗アズリン抗体を用いたウエスタンブロッティング(6(c))で検出した。
【図６Ｂ】(A), (B)および(C):  (A)GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質の構築を示す図である。gfp遺伝子を、gst遺伝子の３’端に導入した(GST-GFP)。次に、azu 50-77断片をgfp遺伝子の３’端でインフレームに結合して、GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質を産生した。GST-GFP-azu 50-77を、細胞溶解産物から、単一の融合タンパク質として精製した。精製タンパク質を、SDS-PAGEで泳動し、クーマシーブルー染色(6(b))で及び抗アズリン抗体を用いたウエスタンブロッティング(6(c))で検出した。
【図６Ｃ】(A), (B)および(C):  (A)GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質の構築を示す図である。gfp遺伝子を、gst遺伝子の３’端に導入した(GST-GFP)。次に、azu 50-77断片をgfp遺伝子の３’端でインフレームに結合して、GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質を産生した。GST-GFP-azu 50-77を、細胞溶解産物から、単一の融合タンパク質として精製した。精製タンパク質を、SDS-PAGEで泳動し、クーマシーブルー染色(6(b))で及び抗アズリン抗体を用いたウエスタンブロッティング(6(c))で検出した。
【図７Ａ】(A), (B)および(C):  GST-緑色蛍光タンパク質(GFP)およびGST-GFP-アズリン融合タンパク質のインターナリゼーションに関する動態試験を示している図である。緑色蛍光を、様々な濃度のGST-GFP(10(a))またはGST-GFP-azu 50-77(10(b))を37°C、1hrで処理したJ774細胞でアッセイした。1万個の細胞を、フローサイトメトリーで分析した。(c)GST-GFP-azu 50-77のインターナリゼーションの時間依存性。J774細胞を200μg/mlのGST-GFP-azu 50-77で指摘された時間37°Cでインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。
【図７Ｂ】(A), (B)および(C):  GST-緑色蛍光タンパク質(GFP)およびGST-GFP-アズリン融合タンパク質のインターナリゼーションに関する動態試験を示している図である。緑色蛍光を、様々な濃度のGST-GFP(10(a))またはGST-GFP-azu 50-77(10(b))を37°C、1hrで処理したJ774細胞でアッセイした。1万個の細胞を、フローサイトメトリーで分析した。(c)GST-GFP-azu 50-77のインターナリゼーションの時間依存性。J774細胞を200μg/mlのGST-GFP-azu 50-77で指摘された時間37°Cでインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。
【図７Ｃ】(A), (B)および(C):  GST-緑色蛍光タンパク質(GFP)およびGST-GFP-アズリン融合タンパク質のインターナリゼーションに関する動態試験を示している図である。緑色蛍光を、様々な濃度のGST-GFP(10(a))またはGST-GFP-azu 50-77(10(b))を37°C、1hrで処理したJ774細胞でアッセイした。1万個の細胞を、フローサイトメトリーで分析した。(c)GST-GFP-azu 50-77のインターナリゼーションの時間依存性。J774細胞を200μg/mlのGST-GFP-azu 50-77で指摘された時間37°Cでインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。
【図８ａ】(A), (B) および(C):  (A)  GST-GFP融合に関して前に記載したとおり、外毒素AドメインIII(アミノ酸405-613)を、同様にドメインlbの一部(アミノ酸381-404)を、GST(GST-PEDIII)に融合したことを示す図である。azu 50-77断片を、PCRを用いて、GST-PEDIII(GST-PEDIII-azu 50-77)のＣ末端に結合させた。(B)  融合タンパク質を、グルタチオンセファロース4Bカラムゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製し、サイズを決定するためにSDS-PAGEで電気泳動した。(C)  UISO-Mel-2癌細胞における及び正常な線維芽細胞(FBT)細胞におけるGST-PEDIII-azu 50-77融合タンパク質の作用を、PEDIII-媒介性の細胞毒性で決定されるものとして示す図である。指摘した様々な濃度のGST-PEDIIIおよびGST-PEDIII-azu 50-77で、UISO-Mel-2およびFBT細胞を24hインキュベートし、その後、細胞生存度をＭＴＴアッセイで決定した。
【図８ｂ】(A), (B) および(C):  (A)  GST-GFP融合に関して前に記載したとおり、外毒素AドメインIII(アミノ酸405-613)を、同様にドメインlbの一部(アミノ酸381-404)を、GST(GST-PEDIII)に融合したことを示す図である。azu 50-77断片を、PCRを用いて、GST-PEDIII(GST-PEDIII-azu 50-77)のＣ末端に結合させた。(B)  融合タンパク質を、グルタチオンセファロース4Bカラムゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製し、サイズを決定するためにSDS-PAGEで電気泳動した。(C)  UISO-Mel-2癌細胞における及び正常な線維芽細胞(FBT)細胞におけるGST-PEDIII-azu 50-77融合タンパク質の作用を、PEDIII-媒介性の細胞毒性で決定されるものとして示す図である。指摘した様々な濃度のGST-PEDIIIおよびGST-PEDIII-azu 50-77で、UISO-Mel-2およびFBT細胞を24hインキュベートし、その後、細胞生存度をＭＴＴアッセイで決定した。
【図８ｃ】(A), (B) および(C):  (A)  GST-GFP融合に関して前に記載したとおり、外毒素AドメインIII(アミノ酸405-613)を、同様にドメインlbの一部(アミノ酸381-404)を、GST(GST-PEDIII)に融合したことを示す図である。azu 50-77断片を、PCRを用いて、GST-PEDIII(GST-PEDIII-azu 50-77)のＣ末端に結合させた。(B)  融合タンパク質を、グルタチオンセファロース4Bカラムゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製し、サイズを決定するためにSDS-PAGEで電気泳動した。(C)  UISO-Mel-2癌細胞における及び正常な線維芽細胞(FBT)細胞におけるGST-PEDIII-azu 50-77融合タンパク質の作用を、PEDIII-媒介性の細胞毒性で決定されるものとして示す図である。指摘した様々な濃度のGST-PEDIIIおよびGST-PEDIII-azu 50-77で、UISO-Mel-2およびFBT細胞を24hインキュベートし、その後、細胞生存度をＭＴＴアッセイで決定した。
【図９】UISO-Mel-2癌細胞およびFBT細胞に対する、GST-PEDIII-ラスティシアニン融合タンパク質の、PEDIII-媒介性の細胞毒性を示す図である。指摘した様々な濃度のGST-PEDIIIおよびGST-PEDIII-azu 50-77で、UISO-Mel-2およびFBT細胞を24hインキュベートし、その後、細胞生存度をＭＴＴアッセイで決定した。
【００６２】
［発明の詳細な記載］
定  義
本出願の明細書等で使用される「細胞」の用語には、特に「単一細胞（single cell）」として記載されないかぎり、該用語の単数形または複数形のいずれかが含まれる。
【００６３】
本出願の明細書等で使用される、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味させるために互換的に使用される。前記用語は、一または二以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに適用される。前記用語は、天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の用語は、糖鎖形成、脂質付着（lipid attachment）、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびADP-リボシル化を含む修飾をも包括的に含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、必ずしも全体的に直線状であるとはかぎらない。一例を挙げると、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝してもよく、環状であってもよく（分枝の有無）、これは一般的には天然のプロセシングを含む翻訳後修飾イベントおよび天然では生じないヒトの操作によって生じるイベントの結果である。環状の、分枝状の、および分枝環状（branched circular）のポリペプチドは、非翻訳的な天然のプロセスによって及び完全に合成的な方法によって合成しえる。
【００６４】
本出願の明細書等で使用される「薬理的な活性（pharmacologic activity）」の用語は、生物系（biological system）における薬または他の化学物質の効果を意味する。化学物質の効果は、有益(治療的)または有害(毒性)であってもよい。純粋な化学薬品（pure chemical）または混合物は、天然起源（植物, 動物, またはミネラル）であってもよい又は合成の化合物であってもよい。
【００６５】
本出願の明細書等に使用される「前悪性（premalignant）」の用語は、コントロールされずに分裂する前癌性の又は異常になる前の細胞を意味する。
【００６６】
本出願の明細書等に使用される「傷害（lesion）」の用語は、異常な組織の領域を意味する。
【００６７】
本出願の明細書等で使用される「病理学的コンディション（pathological condition）」の用語には、生きている動物又はその一部の正常状態を失うこと、身体機能の実行の中断または修正、および様々な因子（栄養不良, 工業災害, または気候）への、特定の感染性の因子（寄生虫, 寄生性の原生動物, 細菌, またはウイルス）への、生物体の遺伝性の欠陥（遺伝的な異常）への、又はこれらの因子の組み合わせへの応答から構成される正常からの解剖的な及び生理的な逸脱（deviations）が含まれる。
【００６８】
本出願の明細書等で使用される「コンディション（condition）」の用語には、生きている動物又はその一部の正常状態を失うこと、身体機能の実行の中断または修正から構成される正常からの解剖的な及び生理的な逸脱が含まれる。
【００６９】
本出願の明細書等で使用される「に罹患している（suffering from）」の用語には、病理学的コンディションからの回復における又は病理学的コンディションから回復した、現在観察可能な症状（symptoms）なしであっても病理学的コンディションを有している病理学的コンディションの症状を呈していることが含まれる。
【００７０】
本出願の明細書等に使用される「化学的予防（chemoprevention）」の用語は、癌のリスクを減少させる、または発生または再発を遅延させる試行のための薬物, ビタミン, または他の因子の使用である。
【００７１】
本出願の明細書等に使用される「治療（treatment）」の用語には、前記コンディションの又は治療されるコンディションに関連している症状の進行または重症性（severity）を、予防すること、低下させること、停止させること、又は好転させること（reversing）が含まれる。同様に、本出願の明細書等で使用される「治療」の用語には、必要に応じて、医療的（medical）な、療法的（therapeutic）な、および／または予防的（prophylactic ）な投与が含まれる。治療には、コンディション（例えば、癌）の発生の予防（preventing）または軽減（lessening）が含まれてもよい。
【００７２】
本出願の明細書等で使用される「細胞成長を阻害する（inhibit cell growth）」の用語は、細胞分裂および／または細胞増大（cell expansion）の緩徐化または中止（ceasing）を意味する。本用語には、細胞発生の阻害または細胞死の増加も含まれる。
【００７３】
「治療上効果的な量（therapeutically effective amount）」は、被験者が治療される特定のコンディションの発生を効果的に予防する、低下させる、停止させる、又は好転させるために或いは係るコンディションに存在している症状を部分的に又は全体的に軽減するために効果的な量である。治療上効果的な量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【００７４】
本発明のタンパク質または他の細胞の産物を修飾するために使用する場合、本出願の明細書等で使用される「実質的に純粋（substantially pure）」の用語は、例えば、増殖培地または細胞内容物（cellular contents）から単離され、他のタンパク質および／または他の化合物から実質的に遊離されるか又は混ぜられていない（unadulterated）形態のタンパク質を意味する。「実質的に純粋（substantially pure）」の用語は、単離された分画の少なくとも約 75%の乾燥重量または少なくとも「75%実質的に純粋」な量の因子を意味する。より具体的には、「実質的に純粋」の用語は、単離された分画の乾燥重量の少なくとも約 85%の又は少なくとも「85%の実質的に純粋」な化合物を意味する。最も具体的には、「実質的に純粋」の用語は、単離された分画の乾燥重量の少なくとも約 95%の又は少なくとも「95%の実質的に純粋」な化合物を意味する。また、「実質的に純粋」の用語は、例えば、合成タンパク質が試薬から及び合成反応の副産物から単離される場合などで、合成的に作出された本発明のタンパク質または化合物（compound）を修飾するためにも使用しえる。
【００７５】
本発明のペプチドまたは化合物を意味する場合、本出願の明細書等で使用される「医薬品グレード（pharmaceutical grade）」の用語は、通常その天然の状態で見出される物質に伴う成分から実質的（substantially）に又は本質的（essentially）に単離されたペプチドまたは化合物（合成試薬および副産物が含まれる）であり、医薬品としての使用を損なうだろう成分から実質的に又は本質的に単離される。例えば、「医薬品グレード」のペプチドは、発癌物質から単離されえる。幾つかの例において、「医薬品グレード」は、患者への静脈内投与に不適切な組成を与えるだろう任意の物質から実質的に又は本質的に単離されたペプチドまたは化合物を特定するために、意図した投与する方法によって修飾されてもよい（例えば、静脈内医薬品グレード）。例えば、「静脈内医薬品グレード」のペプチドは、洗剤（例えば、SDS）、および抗細菌剤（例えば、アジド）から単離されてもよい。
【００７６】
「単離された（isolated）」、「精製された（purified）」、または「生物学的に純粋（biologically pure）」の用語は、通常本来の状態（native state）で見出される物質にともなう成分から実質的に又は本質的に遊離（free）した物質を意味する。従って、本発明の単離されたペプチドは、好ましくは前記ペプチドとそれらのインサイチュー環境で通常関連する物質を含有しない。ポリペプチドの「単離された」領域は、前記領域が由来するポリペプチドの全配列（whole sequence）を含まない領域を意味する。「単離された」核酸、タンパク質、またはそれぞれのその断片は、当業者にヌクレオチドシークエンシング, 制限消化, 部位特異的突然変異誘発, および核酸断片の発現ベクターへのサブクローニング、同様に、タンパク質またはタンパク質フラグメントの実質的に純粋な品質での取得など（しかし、限定されない）によって操作されえるように、そのインビボ環境から実質的に除去される。
【００７７】
ペプチドに関連して本出願の明細書等で使用される「バリアント（variant）」の用語は、野生型ポリペプチドと比較して、置換され、欠失され、または挿入されたアミノ酸を有しえるアミノ酸配列バリアントを意味する。バリアントは、野生型ペプチドの短縮型（truncations）であってもよい。「欠失（deletion）」はポリペプチド内からの一または二以上のアミノ酸の除去であり、「短縮（truncation）」は前記ポリペプチドの一または両方の末端（ends）からの一または二以上のアミノ酸の除去である。例えば、バリアントペプチドは、前記ポリペプチドをコード化している遺伝子を操作することによって作出されてもよい。バリアントは、基礎の組成物またはポリペプチドの特性を、変更させることで作出しえる（少なくとも幾つかのその薬理的な活性は変更させない）。例えば、アズリンの「バリアント」は、前悪性（premalignant）の哺乳類細胞の発生を阻害する能力を保持している変異アズリンであってもよい。幾つかのケースにおいて、バリアントペプチドは、ε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基などの非天然のアミノ酸で合成される。GhadiriおよびFernholz〔J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990)〕。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチド又はその部分と比較して20アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチド又はその部分と比較して15アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチド又はその部分と比較して10アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチド又はその部分と比較して6アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチド又はその部分と比較して5アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチド又はその部分と比較して3アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。
【００７８】
本出願の明細書等で使用される「アミノ酸」の用語は、任意の天然の又は非天然の又は合成のアミノ酸残基〔即ち、直接的に１、２、３以上の炭素原子、典型的には１つの(α)炭素原子によって連結された少なくとも１つのカルボキシルおよび少なくとも１つのアミノ残基を含んでいる任意の部分〕を含むアミノ酸部分（amino acid moiety）を意味する。
【００７９】
ペプチドに関連して本出願の明細書等で使用される「誘導体（derivative）」の用語は、被験者のペプチドに由来するペプチドを意味する。誘導（derivation）には、なおも前記ペプチドがある程度の基礎的な活性を維持するようなペプチドの化学的な修飾が含まれる。例えば、アズリンの「誘導体」は、例えば、哺乳類細胞の血管形成を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであってもよい。所望の化学的な修飾には、ペプチドのアミド化, アセチル化, 硫酸化（sulfation）, ポリエチレングリコール(PEG)修飾, リン酸化またはグリコシル化が含まれるが、これらに限定されない。加えて、誘導体ペプチドは、化学物質にポリペプチド又はその断片を融合させたものであってもよく、例えば、別のペプチド, 薬分子（drug molecule）または他の療法的なもしくは薬学的な剤又は検出可能なプローブであるが、これらに限定されない。
【００８０】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性〔percent (%) amino acid sequence identity〕」の用語は、２つの配列が整列された場合に、候補配列中のアミノ酸残基と同一であるポリペプチド中のアミノ酸残基のパーセンテージとして規定される。%アミノ酸同一性を決定するために、配列が必要に応じて整列される。ギャップは、最大%配列同一性を達成するために導入される；保存された置換は、配列同一性の一部として考慮されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列アライメント処理は、当業者に周知である。しばしば、公共で利用可能なコンピュータソフトウェア〔例えば、BLAST, BLAST2, ALIGN2またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェア〕を使用して、ペプチド配列が整列される。特定の態様において、Blastp（National Center for Biotechnology Information, Bethesda MDから利用可能）を、初期設定パラメータ〔long complexity filter, expect 10, word size 3, existence 11 and extension 1〕で使用した。
【００８１】
アミノ酸配列が整列される場合に、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂと（所与のアミノ酸配列Ｂで、又は、所与のアミノ酸配列Ｂに対して）の％アミノ酸配列同一性〔これは、所与のアミノ酸配列Ｂと（所与のアミノ酸配列Ｂで、又は、所与のアミノ酸配列Ｂに対して）特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は具備する所与のアミノ酸配列Ａとして、代替的に表現してもよい〕は、以下のように計算することができる：
%アミノ酸配列同一性=X/Y*100
式中で
Xは、配列アラインメントプログラムの又はアルゴリズムのAおよびBのアライメントによって、同一性マッチ（identical matches）であると評価されたアミノ酸残基の数であり、
Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。
【００８２】
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡとＢとの％アミノ酸同一性はＢとＡとの％アミノ酸同一性と等しくない。長い配列（longer sequences）と短い配列（shorter sequences）とを比較する場合、短い配列は「B」配列である。例えば、短縮型ペプチド（truncated peptides）を対応する野生型ポリペプチドと比較する場合、短縮型ペプチドが「B」配列である。
【００８３】
一般
本発明は、キュプレドキシン、およびキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物を含んでいる組成物、並びに哺乳類における癌の発生を予防する方法を提供する。また、本発明は、哺乳類における癌の発生または癌の再発を予防する能力を保持するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物を提供する。最も具体的には、本発明は、緑膿菌アズリン、およびアズリンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物を含んでいる組成物、および患者（特に、一般的な集団よりも癌を発生するリスクが高い患者）を治療するためのその使用を提供する。最終的に、本発明は、前悪性傷害を誘導する及び前悪性および／または悪性の細胞の発生を観察する前または後に、細胞をキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物と接触させることによって、哺乳類の細胞、組織、および動物の癌の発生を研究するための方法を提供する。
【００８４】
以前に、Pseudomonas aerugisnosaによって同化された酸化還元タンパク質（キュプレドキシンアズリン）が、選択的にJ774肺癌細胞に進入するが、正常細胞に進入せず、アポトーシスを誘導することが知られていた。Zaborina等〔Zaborina et al., Microbiology 146:2521-2530 (2000)〕。また、アズリンは、選択的にヒトメラノーマUISO-Mel-2またはヒト乳癌MCF-7細胞に進入し、そして殺傷できる。Yamada等〔PNAS 99:14098-14103 (2002)〕; Punj等〔Oncogene 23:2367-2378 (2004)〕。P. aeruginosaからのアズリンは、優先的にJ774マウス細網肉腫細胞に進入し、腫瘍抑制因子タンパク質p53と複合体を形成し、安定化し、p53の細胞内濃度を増加させ、アポトーシスを誘導する。Yamada等〔Infection and Immunity 70:7054-7062 (2002)〕。アズリン分子の様々なドメインの詳細な研究によって、次の事項が示された；その事項とは、アミノ酸50-77(p28)(配列番号2)が、インターナリゼーションおよび引き続くアポトーシス活性に重大な意味を持つタンパク質伝達ドメイン(PTD)を表すことである。Yamada等〔Cell. Microbial. 7:1418-1431 (2005)〕。
【００８５】
p28 および p18などのアズリン（およびアズリンから由来するペプチド）が化学予防の特性を有することが現在知られている。アズリン（p28）がマウス乳腺の器官培養における前悪性の新生物発生前の傷害の形成を予防することが現在知られている。マウスの乳腺器官培養モデルにおいて、50 μg/mlのアズリンは小窩傷害の形成を67%まで阻害することが認められた。同様に、25 μg/mlでのp28は、小窩傷害の形成を67%まで阻害することが認められた。例1を参照されたい。さらに、50 μg/mlのアズリンが管傷害の形成を79%まで阻害すること及び25 μg/mlのp28が管傷害の形成を71%まで阻害することが認められた。例1を参照されたい。共焦点顕微鏡観察およびFACによって、アズリン および p28が正常マウスの乳房上皮細胞(MM3MG)および乳癌細胞(4T1)に進入することが示された。また、P28は、温度, 時間および濃度依存的な様式でヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)に進入し、用量依存的な様式でMatrigel（登録商標）にプレートしたHUVECの毛管形成を阻害した。共焦点顕微鏡観察およびFACによって、p18が選択的にヒトメラノーマ (Mel-2,7,29), 乳房(MCF-7), 卵巣(SK-OV3), 膵臓(CAPAN-2), グリア芽細胞腫(LN-229), 星細胞腫(CCF-STTG1), 前立腺(LN-CAP), および腎臓(ACHN-CRL1611)の細胞株に進入することが示された。加えて、異種移植されたメラノーマを担持している胸腺欠損マウスにおいて赤外線色素（infrared dye）(λem 800nm)で標識したp18のイメージングによって、正常な器官および組織に蓄積することなく選択的に一次のs.c.腫瘍に取り込まれ、遠い器官に転移することが明らかに実証された。従って、アズリンおよびアズリンのバリアントを使用して、前悪性の新生物発生前の傷害の形成を阻害し、哺乳類の患者における癌の発生（特に、乳癌）を阻害しえることが現在知られている。
【００８６】
標準的な癌治療法（放射線治療 および 化学療法を含む）は、癌細胞のDNAの障害に関与する。通常のDNAダメージへの細胞応答には、DNA修復, 細胞周期アレストおよび致死性の活性化が含まれる〔Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row, 1988〕。例えば、DNAの二本鎖切断の誘導によって、欠失, 二動原体（dicentrics）, リング（rings）, および分裂後期ブリッジ（anaphase bridges）を含む致死的な染色体異常が生じる(Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row, 1994)。
【００８７】
腫瘍 および 様々な癌細胞による本発明のペプチドの選択的な取り込みが理由で、これらのペプチド（一態様においてp18を含む）を、物質を腫瘍および癌細胞に導入する非ウイルス性ベクターとして使用しえることが現在知られている。例えば、本発明のペプチドを使用して、DNAまたはRNAの断片を癌細胞に導入し、治療上のDNAまたはRNA断片治療を腫瘍または癌細胞に提供しえる。
【００８８】
以下に、非限定の例示的な技術および／または本発明のペプチドで導入できる特定のDNAまたはRNAの断片が記載される（一態様において、連結した分子の哺乳類の癌細胞への進入を促進するp18）。例えば、本発明は、遺伝子治療, RNAiのアプローチ, 造血性の遺伝子移入（hematopoietic gene transfer）, 相同的組換え, リボザイム技術, アンチセンス技術, 腫瘍免疫療法および腫瘍抑制因子（tumor suppressors）, 翻訳の研究（translational research）, 抗遺伝子治療(アンチセンス, siRNA & リボザイム), アポトーシス, 免疫学および免疫療法, DNAの合成および修復で使用できる。
【００８９】
遺伝子治療には、腫瘍抑制因子またはアポトーシスのインデューサーなどの外来遺伝子の癌細胞への伝達を遺伝子の発現に適切な条件下で行うことが関与する。一旦発現されると、遺伝子産物は、成長を遅くすること, 転移の潜在性を阻害すること, または徹底的に殺傷することのいずれかで腫瘍細胞に有益な効果を与える。歴史的には、癌遺伝子治療の臨床の有効性は、1)  腫瘍内での治療上の遺伝子発現の制御の欠如, および2)  ベクターの腫瘍への選択的なターゲティングで制限されてきた。本発明の化合物は、腫瘍細胞の選択的なターゲティングに取り組んだ。そのうえ、幾つかの戦略が遺伝子発現の制御のために提案されてきた。一つの戦略は、治療上の遺伝子を調節するプロモーターが腫瘍選択的な転写制御因子で活性化される転写性のターゲティングである。例には、乳癌におけるMUC-1 プロモーターおよび結腸癌におけるCEA プロモーターの使用が含まれる〔Kurihara et al., "Selectivity of a replication-component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen," J. Clin. Invest. 106(6): 763-771, 2000; Konishi et al., "Transcriptionally targeted in vivo gene therapy for carcinoembrionic antigen-producing adenocarcinoma," J. Med. Sci., 48(3): 79-89, 1999〕。
【００９０】
アンチセンス技術は核酸分子の細胞への導入に依存し、典型的には選択された遺伝子によって発現したmRNAと相補的である。典型的には、アンチセンス分子は、mRNA分子の翻訳を抑制し、遺伝子でコード化されたポリペプチドの発現を阻止する。アンチセンス技術の修飾によって、遺伝子のDNAに結合して三重ヘリックス（triple helix）を形成するアンチセンス分子で選択された遺伝子の転写が阻止されえる。本発明で使用できる一つの特定のアンチセンス薬は、G3139である（oblimersenとしても知られる；  Genta, Inc., Lexington, MAにより製造）。使用できる別の特定のアンチセンス分子は、G4460である（c-myb アンチセンスとしても知られる；  Genta, Berkeley Heights, NJにより製造）。
【００９１】
また、RNA干渉(RNAi)ベースの分子を、本発明のペプチドに付着できる。一般に、RNAiは、類似する特性を有する二本鎖RNA(「dsRNA」), 短いヘアピンRNA(「shRNA」)または他の核酸分子で媒介される。これらの核酸分子は、DicerおよびDroshaを含む細胞の酵素で小さな小片にプロセスされる又は切断される。核酸分子の小さな断片は、次にmRNAsのデグラデーションを媒介するタンパク質複合体(RISC複合体)によって取り込まれる。RISC複合体は、取り込まれた核酸分子と相補的な塩基対のmRNAを分解する。この様式で、mRNAは特異的に破壊され、タンパク質をコード化しているものを作出されることが阻止される。
【００９２】
リボザイム技術は核酸分子を細胞に導入することに依存し、それが標的ＲＮＡ分子に結合し、選択的な切断を触媒するＲＮＡ分子を発現する。典型的には、標的ＲＮＡ分子は、mRNA 分子であるが、レトロウイルスのＲＮＡ分子などであってもよい。
【００９３】
また、二遺伝子の不活化イベント（各々の対立遺伝子に対して一つ）を必要とする相同的組換えでのターゲット遺伝子欠失（Targeted gene deletion）は、本発明で使用することができる戦略である。
【００９４】
また、本発明の化合物に関連して送達される特定の療法は、癌の発生に重大な意味を持つタンパク質の発現を制御できる癌特異的な転写複合体(CSTCs; cancer-specific transcription complexes)に向けることができる。例えば、CSTCsに向けられる癌療法の技術に関して、本出願の明細書等に参照によって援用される米国特許出願第2008/0027002号を参照されたい。
【００９５】
キュプレドキシン間の高度の構造的な類似性によると、他のキュプレドキシンもアズリンと同様に哺乳類における前悪性傷害の形成を阻害するであろう。係るキュプレドキシンは、例えば、細菌または植物において見出される。幾つかのキュプレドキシンは、緑膿菌からのアズリンの薬物動態活性と類似する薬物動態活性を有していることが知られている。例えば、チオバシラス・フェロオキシダンス（Thiobacillus ferrooxidans）からのラスティシアニン（Rusticyanin）は、マクロファージに進入し、アポトーシスを誘発できる。Yamada等〔Cell Cycle 3:1182-1187 (2004)〕; Yamada等〔Cell. Micro. 7:1418-1431 (2005)〕。また、ホルミジウム・ラミノサム（Phormidium laminosum）からのプラストシアニンおよびアクロモバクター・サイクロクラステス（Achromobacter cycloclastes）からのシュードアズリン（pseudoazurin）は、マクロファージに対し細胞毒性である。米国特許公開第20060040269号（2006年2月23日  公開）。従って、他のキュプレドキシンを本発明の組成物および方法に使用することが企図される。また、哺乳類における癌の形成を阻害する能力を保持するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物を、本発明の組成物および方法に使用しえる。これらのバリアントおよび誘導体には、キュプレドキシンの短縮型、アミノ酸の保存された置換およびタンパク質の修飾（例えば、PEG化）、αヘリックスの全炭化水素の安定化が含まれえるが、これらに限定されない。
【００９６】
［発明の組成物］
本発明は、哺乳類の細胞, 組織および動物における前悪性傷害の発生を阻害するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であるペプチドを提供する。さらに、本発明は、哺乳類の細胞, 組織および動物における癌の発生を阻害するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であるペプチドを提供する。ある態様において、前記ペプチドは単離される。ある態様において、前記ペプチドは、実質的に純粋または医薬品グレードである。他の態様において、前記ペプチドは、前記ペプチドを含む又は前記ペプチドから本質的になる（consists essentially of）組成物に存在する。別の特定の態様において、前記ペプチドは、非抗原性（non-antigenic）であり、哺乳類（より具体的には、ヒト）の免疫応答を上昇させない。幾つかの態様において、前記ペプチドは、完全長キュプレドキシン未満であり、幾つかのキュプレドキシンの薬理的な活性を保持する。特に、幾つかの態様において、前記ペプチドは、マウス乳腺器官培養における前悪性傷害の発生を阻害する能力を保持しえる。
【００９７】
また、本発明は、キュプレドキシンまたはキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物である少なくとも１つのペプチドを（特に、薬学的組成物中に）含んでいる組成物を提供する。特定の態様において、薬学的組成物は、経口, 腹腔内, または静脈内などの特定の投与の様式（mode）で設計されるが、これらに限定されない。係る組成物を、水で水和してもよい又は水和の後で乾燥（例えば、凍結乾燥）してもよい。係る組成物は、アルコールなどの水以外の溶媒に存在してもよいが、これらに限定されない。
【００９８】
また、本発明は、哺乳類の細胞, 組織および動物における癌細胞および／または腫瘍に選択的に進入するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であるペプチドを含んでいる組成物を提供する。幾つかの態様において、前記ペプチドは、配列番号25を有しているp18である。幾つかの態様において、前記ペプチドは、p18のバリアント、誘導体、または構造上の均等物である。幾つかの態様において、前記組成物は、DNAまたはRNAとカップル（coupled）されたp18である。幾つかの態様において、前記DNAまたはRNAは、遺伝子または遺伝子の部分である。幾つかの態様において、前記DNAまたはRNAは、一旦送達されたら治療効果を有する。
【００９９】
キュプレドキシンの間での高い構造上の相同性のために、キュプレドキシンはアズリンおよびP28と同じ化学予防特性を有することが企図される。幾つかの態様において、キュプレドキシンは、アズリン, シュードアズリン, プラストシアニン, ラスティシアニン（rusticyanin）, アウラシアニン（auracyanin）ステラシアニン, キュウリ塩基性タンパク質またはLazであるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、前記アズリンは、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidans ssp.denitrificans I, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa, Ulva pertussisまたはVibrio parahaemolyticusから由来するものである。特定の態様において、前記アズリンは、緑膿菌からのものである。他の特定の態様において、前記キュプレドキシンは、配列番号1, 3〜19のアミノ酸配列を含む。
【０１００】
本発明は、野生型キュプレドキシンと比較して、置換され、欠失され、または挿入されたアミノ酸を有するアミノ酸配列バリアントであるペプチドを提供する。本発明のバリアントは、野生型キュプレドキシンの短縮型であってもよい。幾つかの態様において、本発明のペプチドは、完全長の野生型ポリペプチド未満であるキュプレドキシンの領域を含む。幾つかの態様において、本発明のペプチドは、短縮型キュプレドキシンの約10残基以上、約15残基以上、または約20残基以上を含む。幾つかの態様において、前記ペプチドは、短縮型キュプレドキシンの約100残基以下, 約50残基以下, 約40残基以下, 約30残基以下または約20残基以下を含む。幾つかの態様において、キュプレドキシンは、前記ペプチド（より具体的には、本発明のペプチドに関して配列番号1, 3〜19）に対し、少なくとも約 70% アミノ酸配列同一性, 少なくとも約 80% アミノ酸配列同一性, 少なくとも約 90% アミノ酸配列同一性, 少なくとも約 95% アミノ酸配列同一性または少なくとも約 99% アミノ酸配列同一性を有する。
【０１０１】
特定の態様において、キュプレドキシンのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基50〜77, アズリン残基50〜77 (p28, 配列番号2), アズリン残基50〜67 (p18, 配列番号25), またはアズリン残基36〜88(配列番号26)を含む。他の態様において、キュプレドキシンのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基50〜77, アズリン残基50〜77 (配列番号2), アズリン残基50〜67 (配列番号25), またはアズリン残基36〜88(配列番号26)からなる。他の特定の態様において、前記バリアントは、そのアズリンではないキュプレドキシンの均等な残基からなる。他のキュプレドキシンバリアントがアズリン残基50〜77（配列番号2）, またはアズリン残基36〜88（配列番号26）と類似する薬理的な活性を有するように設計できることが企図される。これを行うために、BLAST, BLAST2, ALIGN2 またはMegalign (DNASTAR)を用いて、対象のキュプレドキシンのアミノ酸配列を緑膿菌のアズリン配列と整列させて、緑膿菌アズリンのアミノ酸配列に局在する関連性のある残基、および対象のキュプレドキシン配列に見出される均等な残基、および均等なペプチドが設計される。
【０１０２】
本発明の一態様において、キュプレドキシンバリアントは、Chloroflexus aurantiacusのアウラシアニンBの少なくともアミノ酸57〜89を含む(配列番号20)。別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、Pseudomonas aeruginosaのアズリンの少なくともアミノ酸50〜67(配列番号25)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号21)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、髄膜炎菌Lazの少なくともアミノ酸89〜115(配列番号22)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、腸炎ビブリオ菌のアズリンの少なくともアミノ酸52〜78(配列番号23)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、Bordetella bronchisepticaのアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号24)を含む。
【０１０３】
前記バリアントには、合成のアミノ酸で作出された天然ではないペプチドも含まれてもよい。例えば、非天然のアミノ酸をバリアントペプチドへと統合して、血流中の組成物の半減期を延長又は至適化しえる。係るバリアントには、D,L-ペプチド類(ジアステレオマー), (例えば、Futaki et al., J. Biol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987));異常なアミノ酸を含んでいるペプチド(例えば、Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), オレフィンを含有している非天然アミノ酸を炭化水素ステープリング（hydrocarbon stapling）したもの(例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)), およびε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基を含んでいるペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
他の態様において、本発明のペプチドは、キュプレドキシンの誘導体である。キュプレドキシンの誘導体は、なおも前記ペプチドがある程度の基礎的な活性を維持するようなペプチドの化学的な修飾体である。例えば、アズリンの「誘導体」は、哺乳類の細胞、組織、または動物の前悪性傷害の発生を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであってもよい。所望の化学的な修飾には、ペプチドの炭化水素ステープリング, アミド化, アセチル化, 硫酸化（sulfation）, ポリエチレングリコール(PEG)修飾, リン酸化およびグリコシル化が含まれるが、これらに限定されない。加えて、誘導体ペプチドは、化学物質（chemical compound）にキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を融合させたものであってもよく、例えば、別のペプチド, 薬分子（drug molecule）または他の療法的なもしくは薬学的な剤又は検出可能なプローブであるが、これらに限定されない。所望の誘導体には、本発明のペプチドおよび組成物の血流中の半減期を当業者に周知の幾つかの方法などによって延長させる又は至適化することができる化学的な修飾体が含まれ、これには環状化ペプチド〔例えば、Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)〕, N-およびC末端の修飾〔例えば、Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)〕, およびオレフィン含有非天然アミノ酸（olefin-containing non-natural amino acid）を炭化水素ステープリングしたもの〔例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)〕が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
別の態様において、前記ペプチドは、キュプレドキシンの構造上の均等物である。キュプレドキシンおよび他のタンパク質の間の有意な構造上の相同性を決定する試験の例には、Toth等〔Developmental Cell 1:82-92 (2001)〕が含まれる。具体的には、キュプレドキシンおよび前記構造上の均等物の間の有意な構造上の相同性は、VASTアルゴリズムを用いて決定されえる。Gibrat等〔Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996)〕; Madej等〔Proteins 23:356-3690 (1995)〕。特定の態様において、キュプレドキシンおよび前記構造上の均等物の構造比較からのVAST  p値は、約10-3未満、約10-5未満、または約10-7未満であってもよい。他の態様において、キュプレドキシンおよび前記構造上の均等物の間の有意な構造上の相同性は、DALIアルゴリズムを用いて決定されてもよい。HolmおよびSander〔J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)〕。特定の態様において、ペアワイズ構造比較に関するDALI  Zスコアは、少なくとも約3.5, 少なくとも約7.0, または少なくとも約10.0である。
【０１０６】
本発明の組成物のペプチドが、二以上のキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および／または構造上の均等物であってもよいことが企図される。例えば、前記ペプチドは、ＰＥＧ化されているアズリンの短縮型であってもよく、このようにしてバリアントおよび誘導体の双方が作出される。一態様において、本発明のペプチドは、オレフィン含有拘束鎖（olefin-bearing tethers）を含んでいるα,α-二置換型の非天然のアミノ酸で合成され、そしてルテニウム触媒性オレフィンメタセシス（ruthenium catalyzed olefin metathesis）による全炭化水素ステープリングが行われる。Scharmeister等〔J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000)〕; Walensky等〔Science 305:1466-1470 (2004)〕。加えて、アズリンの構造上の均等物であるペプチドは他のペプチドに融合されて、構造上の均等物および誘導体の双方であるペプチドが作出される。これらの例は、説明のための記載であり、本発明を限定するものではない。キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、銅に結合しても結合しなくてもよい。
【０１０７】
幾つかの態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、幾つかの緑膿菌アズリン（特に、p28）の薬理的な活性を有する。特定の態様において、キュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物は、具体的には乳腺器官培養であるが限定されない哺乳類の細胞、組織、または動物における前悪性傷害の発生を阻害し予防しえる。また、本発明は、具体的にはメラノーマ, 乳房癌, 膵臓癌, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, 肺癌細胞, 肺癌, 結腸直腸癌, 頚部および頭部癌（neck and head）, 膀胱癌, 前立腺癌, 皮膚癌, および子宮頚癌であるが、これらに限定されない哺乳類の前悪性傷害の発生を阻害する能力を有しえるキュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物を提供する。癌細胞の発生の阻害は、対照の処理と比較して統計的に有意な前悪性傷害の発生の任意の減少または増加の割合の軽減（lessening）である。
【０１０８】
現在、キュプレドキシンが哺乳類の細胞、組織、または動物（具体的には乳房細胞, より具体的にはマウス乳腺）の前悪性傷害および最終的に癌の発生を阻害できることが知られているので、この化学予防活性を保持しているキュプレドキシンのバリアントおよび誘導体を設計することが可能である。係るバリアント、誘導体、および構造上の均等物は、例えば、キュプレドキシンおよびキュプレドキシン由来ペプチドの様々なバリアント、誘導体、および構造上の均等物の「ライブラリ（library）」を作ること、および次に各々を化学予防活性（特にマウス乳腺器官培養における化学予防活性）を当該技術分野において既知の多くの方法（例1の方法に例示されているような）のいずれかを用いて試験することによって作出できる。生じる化学予防活性を有するキュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物を、アズリンまたはp28の代わりに又はアズリンまたはp28に加えて本発明の方法に使用できることが企図される。
【０１０９】
幾つかの特定の態様において、キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、マウス乳腺器官培養(MMOC)における7,12-ジメチルベンズ (a) アントラセン(DMBA)誘導性の前悪性傷害の発生を、無処置の対照と統計学的に異なる程度まで阻害しえる。ペプチドを、この活性に関して、例1またはMehta等〔J Natl Cancer Inst 93:1103-1106 (2001)〕およびMehta等〔Meth Cell Sci 19:19-24 (1997)〕に記載のMMOCモデル系を用いることによって試験できる。癌の発生が阻害されるかどうかを決定するための他の方法は、当該技術分野において周知であり、同様に使用しえる。
【０１１０】
幾つかの特定の態様において、キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、無処置の対照と統計学的に異なる度合（degree）までMMOCモデルにおける乳房小窩傷害（MAL）の発生を阻害する。幾つかの特定の態様において、キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、無処置の対照と統計学的に異なる度合までMMOCモデルにおける乳房管傷害（MDL）の発生を阻害する。例 1で記載されたとおり、ペプチドをこれらの活性に関して、DMBAで前悪性傷害を形成させるために導入されるMMOCモデル系を用いて試験できる。例 1で提供されるとおり、MMOCモデル系における前悪性傷害の発生の評価は、形態的分析または組織病理学的分析で決定されてもよい。
【０１１１】
幾つかの特定の態様において、バリアント、誘導体、または構造上の均等物は、哺乳類の細胞, 組織 および動物に選択的に進入できる。幾つかの態様において、前記バリアントは、p18の誘導体または構造上の均等物である。幾つかの態様において、バリアント、誘導体、または構造上の均等物は、哺乳類の細胞, 組織 および動物に選択的に進入し、DNAまたはRNAを送達できる。幾つかの態様において、前記DNAまたはRNAは、遺伝子または遺伝子の部分である。幾つかの態様において、前記DNAまたはRNAは、一旦送達されたら治療効果を有する。
【０１１２】
キュプレドキシン
これらの小さい青色銅タンパク質（キュプレドキシン）は、電子伝達タンパク質(10-20kDa)であり、細菌の電子伝達鎖に関与する又は未知の機能のものである。銅イオンは、タンパク質マトリックスに単独で結合する。銅の周囲の二つのヒスチジンおよび一つのシステインのリガンドに対する特殊な歪んだ三方晶系の平面配置（special distorted trigonal planar arrangement）によって、金属部位の非常に特有な電気的特性を生じ、そして強度の青色を生じる。いくつかのキュプレドキシンは、中等度から高度の分解能で結晶学的に特徴づけられている。
【０１１３】
通常、キュプレドキシンは、配列の相同性は低いが、構造上の相同性は高い。GoughおよびClothia〔Structure 12:917-925 (2004)〕; De Rienzo等〔Protein Science 9:1439-1454 (2000)〕。例えば、アズリンのアミノ酸配列は、アウラシアニンBの配列と31%同一であり、ラスティシアニンの配列と16.3%、プラストシアニンの配列と20.3%、シュードアズリンの配列と17.3%同一である。表1を参照されたい。しかしながら、これらのタンパク質の構造上の類似性は、明白である。アズリンとアウラシアニンBとの構造の比較に関するVASTp値は10-7.4であり、アズリンとラスティシアニンとでは10-5であり、アズリンとプラストシアニンとでは10-5.6であり、アズリンとシュードアズリンとでは10-4.1である。
【０１１４】
全てのキュプレドキシンは、八鎖のグリークキーβバレルまたはβサンドイッチフォールドを所有し、高度に保存された部位構造を有する。De Rienzo等〔Protein Science 9:1439-1454 (2000)〕。多くの長鎖脂肪族残基（例えば、メチオニンおよびロイシン）の存在による顕著に疎水性のパッチが、アズリン, アミシアニン（amicyanins）, ラン藻のプラストシアニン, キュウリ塩基性タンパク質、および、低い程度で、シュードアズリンおよび真核生物のプラストシアニン中の銅部位の周囲に存在する（Id）。また、疎水性のパッチはステラシアニンおよびラスティシアニンの銅部位に低い程度で見出されるが、しかし、異なる特性を有している（Id）。
【表１】
2014237640.tif 000003
【０１１５】
1整列長（Aligned Length）：  ２つの構造間で重ね合わせたC-アルファ原子の対応対（equivalent pairs）の数（即ち、いかほどの残基が使用されて、3Dの重ね合わせが計算されているか）。
【０１１６】
2P-VAL：  VAST p値は、比較の有意性の測定値である（確率としてあらわされる）。例えば、前記p値が0.001である場合、見込み（odds）はこの程度の適合を偶然に観察することに対し1000対1の確率である。VASTからのp値は、MMDBデータベースにおいて500の非依存性（independent）および無関係（unrelated）のタイプのドメインが存在するとの仮定を用いる多重比較（multiple comparisons）の影響に関して調整される。従って、示されるp値は、各ドメイン対のペアワイズ比較に関するp値を500で除したものに対応する。
【０１１７】
3スコア：  VAST構造類似度スコア。この数は、重ね合わせた二次構造要素の数と、その重ね合わせの質に関する。高いVASTスコアは、高い類似度と相関する。
【０１１８】
4RMSD：  二乗平均平方根の重ね合わせ残基のオングストローム表示。この数は、二つの構造の至適な重ね合わせ後に均等なC-アルファ原子間の二乗平均距離（mean square distances）の平方根として計算された。RMSD値は構造アラインメントの程度で概算（scales）されること及びRMSDを全体の構造上の類似度のディスクリプタ（descriptor）として用いる場合にこのサイズを考慮しなければならないことが注意される。
【０１１９】
5線虫（C.elegans）の主要精子タンパク質は、卵成熟におけるエフリンのアンタゴニストであることが証明された。Kuwabara等〔Genes and Development 17:155-161 (2003)〕。
【０１２０】
アズリン
アズリンは、128アミノ酸残基の銅含有タンパク質であり、特定の細菌における電子伝達に関与するキュプレドキシンファミリーに属する。アズリンには、緑膿菌（PA）(配列番号1)(「wt-アズリン」), A. xylosoxidans, およびA. denitrificansからのものが含まれる。Murphy等〔J. Mol. Biol. 315:859-871 (2002)〕。アズリン間のアミノ酸配列同一性は60-90%の間で変動し、これらのタンパク質は強い構造上の相同性を示した。全てのアズリンは、ギリシャキーモチーフ（Greek key motif）を有する特徴的なβ-サンドイッチを有し、単一の銅原子がタンパク質の同じ領域に常に配置される。加えて、アズリンは、銅部位を取り囲む基本的に中性で疎水性のパッチを所有する（Id）。
【０１２１】
プラストシアニン
プラストシアニンは分子あたり一分子の銅を含有するシアノバクテリア、藻類および植物の可溶性タンパク質であり、彼等の酸化型において青色である。彼等は、彼等が電子伝達体として機能する葉緑体中で生じる。ポプラのプラストシアニンの構造が1978に決定されてから、藻類(セネデスムス, アオノリ, コナミドリムシ)および植物(フランスマメ)のプラストシアニンの構造が結晶学又はNMR法によって決定されている（ポプラの構造は1.33Åの解像度で示されている）。配列番号3は、Phormidium laminosum（好熱性のシアノバクテリア）のプラストシアニンのアミノ酸配列を表す。別の所望のプラストシアニンは、Ulva pertussisからのものである。
【０１２２】
藻類および維管束植物の間の配列多様性（例えば、コナミドリムシおよびポプラのタンパク質間で62%の配列同一性）が存在するにもかかわらず、三次構造は保存されている（例えば、コナミドリムシおよびポプラのタンパク質間でCαポジションにおいて、0.76Å rmsの偏差）。構造上の特性には、八鎖の逆平行β-バレルの一端での歪んだ四面体の銅結合部位（distorted tetrahedral copper binding site）、明白な陰性のパッチ、および平坦な疎水性表面が含まれる。前記銅部位は、電子伝達機能に至適化されている。また、陰性の及び疎水性のパッチは、生理的な反応パートナーの認識に関与することが提案されている。化学修飾、クロス-リンキング、および部位特異的突然変異誘発実験によって、チトクロムfとの結合相互作用における陰性及び疎水性のパッチの重要性が確認され、プラストシアニンが関与する二つの機能上の意味ある電子伝達経路のモデルが確認された。一つの推定上の電子伝達経路は、相対的に短く(約4Å)、疎水性パッチ中の溶媒に暴露された銅リガンド  His-87が関与する；他方で、他のものは、より長く（約12〜15Å）、陰性パッチにおいてほぼ保存されている残基Tyr-83が関与する。Redinbo等〔J. Bioenerg. Biomembr. 26:49-66 (1994)〕。
【０１２３】
ラスティシアニン
ラスティシアニンは、硫黄菌属（現在ではAcidithiobacillusと称される）から得られた青色銅含有単一鎖ポリペプチドである。Thiobacillus ferrooxidansの極度に安定で高度に酸化されているキュプレドキシンラスティシアニン（配列番号4）の酸化型のＸ線結晶構造は、多波長異常分散法（multiwavelength anomalous diffraction）で1.9Åの解像度で決定された。ラスティシアニンは、六および七鎖のbシートから構成されるコアベータ-サンドイッチフォールド（a core beta-sandwich fold）から構成される。他のキュプレドキシンのように、銅イオンは、特殊な歪んだ四面体に配置された四つの保存された残基（His 85, Cys138, His143, Met148）のクラスターによって配位される。Walter, R.L.等〔J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996)〕。
【０１２４】
シュードアズリン
シュードアズリンは、青色銅含有単一鎖ポリペプチドのファミリーである。Achromobacter cycloclastesから得られたシュードアズリンのアミノ酸配列は、配列番号5に示される。シュードアズリンのＸ線構造分析によって、これらのタンパク質間の配列相同性が低いにもかかわらず、シュードアズリンはアズリンと類似する構造を有することが示される。二つの主要な差異が、シュードアズリンおよびアズリンの全体構造の間に存在する。アズリンと比較して、シュードアズリン中には二つのα-ヘリックスからなるカルボキシル末端の伸展が存在する。中間のペプチド領域（mid-peptide region）中に、アズリンは、短いα-ヘリックスを含んでいるフラップを形成する伸展したループを含有する（シュードアズリンでは短くなっている）。銅原子部位での唯一の大きな差異は、MET側鎖のコンホメーションおよびMet-S銅結合長（シュードアズリンではアズリンよりも有意に短い）である。
【０１２５】
フィトシアニン（Phytocyanins）
フィトシアニンとして同定可能なタンパク質には、キュウリ塩基性タンパク質, ステラシアニン（stellacyanin）, マビシアニン（mavicyanin）, ウメシアニン（umecyanin）, キュウリピーリングキュプレドキシン（cucumber peeling cupredoxin）, エンドウ豆の鞘の推定上の青色銅タンパク質, およびシロイヌナズナの青色銅タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。キュウリ塩基性タンパク質およびエンドウマメ鞘タンパク質以外の全てにおいて、青色銅部位に通常見つけられる軸性メチオニンリガンド（axial methionine ligand）はグルタミンで置換される。
【０１２６】
アウラシアニン
アウラシアニンA, アウラシアニンB-1、およびアウラシアニンB-2と称される３つの小さい青色銅タンパク質は、好熱性の緑色グライディング光合成細菌（Chloroflexus aurantiacus）から分離された。二つのB型は、糖タンパク質であり、互いにほとんど同一の特性を有しているが、A型とは別である。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、14(A), 18(B-2), および22(B-1)kDaの見かけ上の単量体分子量が示される。
【０１２７】
アウラシアニンAのアミノ酸配列が決定され、アウラシアニンAが139残基のポリペプチドであることが示された。Van Dreissche等〔Protein Science 8:947-957 (1999)〕。His58, Cys123, His128, およびMet132は、それらが既知の小銅タンパク質（small copper proteins）プラストシアニンおよびアズリンとして進化上で保存された金属リガンドである場合に、予想される様式で配置（spaced）される。また、二次構造予測によって、アウラシアニンが、緑膿菌からのアズリンおよびポプラ葉からのプラストシアニンのものと類似する全β-バレル構造を有することが指摘される。しかしながら、アウラシアニンは、両方の小銅タンパク質配列クラスの特性を有していると思われる。アズリンの共通配列との全体の類似度（overall similarity）は、プラストシアニンの共通配列とのものと大まかに同じである（すなわち、30.5%）。アウラシアニンのＮ末端配列領域1〜18には、グリシンおよびヒドロキシアミノ酸が著しく豊富に存在する（Id.）。Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンの鎖Aに関して、例示的なアミノ酸配列  配列番号15を参照されたい（NCBIタンパク質データバンクアクセッションNo.AAM12874）。
【０１２８】
アウラシアニンB分子は、標準的なキュプレドキシンフォールドを有する。Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンBの結晶構造が、試験された。Bond等〔J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001)〕。付加的なＮ末端鎖を例外として、前記分子は、細菌性のキュプレドキシン（アズリン）のものと非常に類似している。他のキュプレドキシンでのように、Cuリガンドの１つは前記ポリペプチドの鎖4に存在し、他の３つは鎖7および8の間の大きいループに沿って存在する。Cu部位の配置は、後者の３つのリガンド間のアミノ酸スペーシングを参照して議論される。アウラシアニンBの結晶学的に特徴づけされたCu-結合ドメインは、おそらく幾つかの他の膜関連電子伝達タンパク質における既知の係留（tethers）と有意な配列同一性を呈するＮ末端尾部によって細胞質膜の周辺腔側へ係留される。B型のアミノ酸配列は、McManus等に記載される〔McManus et al. J. Biol. Chem. 267:6531-6540 (1992)〕。Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンの鎖Bに関して、例示的なアミノ酸配列  配列番号16を参照されたい（NCBIタンパク質データバンクアクセッションNo.1QHQA）。
【０１２９】
ステラシアニン
ステラシアニンは、フィトシアニンのサブクラスである（植物のキュプレドキシンのユビキタスファミリー）。ステラシアニンの例示的な配列は、本出願に配列番号14として含まれる。ウメシアニン、西洋わさびの根(Koch et al., J. Am. Chem. Soc. 127:158-166 (2005))からのステラシアニンおよびキュウリステラシアニン(Hart el al., Protein Science 5:2175-2183 (1996))の結晶構造も、知られている。前記タンパク質は、他のフィトシアニンと全体的なフォールド類似性を有する。エフリンB2タンパク質外部ドメイン三次構造は、ステラシアニンと有意な類似性を有する。Toth等〔Developmental Cell 1:83-92 (2001)〕。ステラシアニンの例示的なアミノ酸配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のタンパク質データバンクでアクセッション番号  1JER（配列番号14）として見つけられる。
【０１３０】
キュウリ塩基性タンパク質
キュウリ塩基性タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、本出願に配列番号17として含まれる。キュウリ塩基性タンパク質(CBP)の結晶構造（１型の青色銅タンパク質）は、1.8Åの解像度で決定された。前記分子はグリークキーβバレル構造を有している他の青色銅タンパク質と類似している、但し前記バレルは１つの側で開き、「ベータ-サンドイッチ」または「ベータ-タコ（beta-taco）」として記載されることが適切である。Guss等〔J. Mol. Biol. 262:686-705 (1996)〕。エフリンB2タンパク質のエクトドメイン（ectodomian）の三次構造は、キュウリ塩基性タンパク質に対して高い類似度（50のα炭素に対しrms偏差1.5Å）を有する。Toth等〔Developmental Cell 1:83-92 (2001)〕。
【０１３１】
Cu原子は、Cu-N(His39) = 1.93 A, Cu-S(Cys79) = 2.16 A, Cu-N(His84) = 1.95 A, Cu-S(Met89) = 2.61 Aの結合長（bond lengths）を有する正常な青色銅NNSS'配位を有する。ジスルフィド連結(Cys52)-S-S-(Cys85)は、分子構造の安定化に重要な役割を担っていると思われる。前記ポリペプチドフォールドは、CBPが高度の配列同一性を有する青色銅タンパク質(phytocyanins)のサブファミリーおよび非金属タンパク質（ブタクサアレルゲンRa3）に典型的である。フィトシアニンとして同定可能なタンパク質は、CBP, ステラシアニン, マビシアニン, ウメシアニン, キュウリピーリングキュプレドキシン, エンドウ豆の鞘の推定上の青色銅タンパク質, およびシロイヌナズナの青色銅タンパク質である。CBPおよびエンドウマメ鞘タンパク質以外の全てにおいて、青色銅部位に通常見つけられる軸性メチオニンリガンドはグルタミンで置換される。キュウリ塩基性タンパク質の例示的な配列は、NCBIタンパク質データバンクアクセッション番号  2CB（配列番号17）に見つけられる。
【０１３２】
使用の方法
本発明は、他は健常な患者における新規の悪性化（de novo malignancies）を予防するための方法を提供し、該方法は前記患者に上記のキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、又は構造上の均等物である少なくとも一つのペプチドを投与することを含む。化学予防治療は、癌発生（cancergenesis）に関与するプロセスの中断が癌の発生を予防するとの仮説に基づいている。現在、キュプレドキシン 緑膿菌 アズリンおよび短縮型アズリンペプチドp28は、前悪性傷害の初期形成を阻害すること, または存在する前悪性傷害の成長を絶やすこと（killing）又は阻害することのいずれかによって、前悪性傷害の発生を阻害することが知られている。上記のとおり、前悪性傷害の発生を阻害する能力を有するキュプレドキシン, またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物が他は健常な患者における化学予防治療に使用しえることが企図される。幾つかの態様において、係る他は健常な患者（otherwise healthy patients）は、一般的な集団におけるよりも癌を発生するリスクが高い患者である。本発明の組成物で治療によって予防しえる癌には、限定されることなく、メラノーマ, 乳房癌, 膵臓癌, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, 肺癌, 結腸直腸癌, 頚部および頭部癌（neck and head）, 膀胱癌, 前立腺癌, 皮膚癌, および子宮頚癌が含まれる。幾つかの態様において、前記患者はヒトであってもよい。他の態様において、前記患者はヒトではない。
【０１３３】
さらに、本発明は、癌の発生を研究する方法を含み、該方法は哺乳類細胞を発癌物質での誘導の前後にキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる組成物と接触させること及び前記細胞の発生を観察（observing）することを備える。幾つかの態様において、前記細胞はマウス乳腺細胞であるが、他では哺乳類において悪性となりえる他の細胞である。
【０１３４】
一般的な集団よりも癌を発生するリスクが高い患者は、リスクが高い特性を有する患者、前悪性傷害を有する患者、および初期癌が治癒した又は前悪性傷害を最終的（definitively）に治療した患者であってもよい。一般にTsao等〔CA Cancer J Clin 54:150-180 (2004)〕を参照されたい。リスクが高い特性は、患者の行動的（behavioral）, 遺伝的, 環境的（environmental）または生理的な因子であってもよい。患者を様々な形態の癌に罹患しやすくする行動的な因子には、喫煙, 食餌, アルコール消費, ホルモン補充療法, 高い肥満度指数, 未産婦, 檳榔子の使用, 頻繁な口内洗浄剤の使用, ヒト パピローマウイルスへの暴露, 幼児期および慢性の太陽曝露, 早期年齢の初回性交（early age of first intercourse）, 複数の性的パートナー, および経口避妊薬の使用が含まれるが、これらに限定されない。患者を様々な形態の癌に罹患しやすくする遺伝的な因子には、癌の家族歴, BRCA1 および BRCA2の遺伝子保因状態（gene carrier status）, 乳房新生物の前歴, 家族性大腸ポリープ症 (FAP), 遺伝性の非ポリープ性結腸直腸癌 (HNPCC), 赤色またはブロンドの毛髪および色白表現型（fair-skinned phenotype）, 色素性乾皮症, および民族性が含まれるが、これらに限定されない。患者を様々な形態の癌に罹患しやすくする環境的な因子には、ラドンへの曝露, 多環式の芳香族炭化水素, ニッケル, クロム酸塩, ヒ素, アスベスト, クロロメチルエーテル, ベンゾ[a]ピレン, 照射, およびゴムからの芳香族アミンまたはペイントの職業被曝が含まれるが、これらに限定されない。患者を様々な形態の癌に罹患しやすくする他の種々の因子には、気流閉塞を伴う慢性閉塞性肺疾患, 慢性膀胱感染, 住血吸虫症, 高齢（older age）, および免疫無防備状態（immunocompromised status）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
加えて、癌を発生するリスクが高い患者は、特定の種類の癌が発生した様々なリスクモデルの使用によって決定されてもよい。例えば、乳癌に罹患しやすい患者は、とりわけGailリスクモデル, またはClausモデルを用いて決定されてもよい。Gail等〔J Natl Cancer Inst 81:1879-1886 (1989)〕; Cuzick〔Breast 12:405-411 (2003)〕; Huang等〔Am J Epidemiol 151:703-714 (2000)〕を参照されたい。
【０１３６】
前悪性傷害を伴う患者は、一般的な集団よりも癌を発生するリスクが高い。患者における前悪性傷害の存在は、当業者に周知の多くの方法で決定されてもよい。前悪性傷害から由来する中間マーカーまたはバイオマーカーを、患者が前悪性傷害を保持するかどうかを決定するために患者で測定してもよい。染色体異常は、大多数の癌患者において腫瘍細胞および隣接する組織学的に正常な組織で生じる。染色体異常における進行は、前悪性傷害から浸潤癌（invasive cancer）への表現型の進行とパラレル（parallels）である。Thiberville等〔Cancer Res. 55:5133-5139 (1995)〕。従って、癌と関連する染色体異常は、患者における前悪性傷害を検出する中間マーカーとして使用しえる。癌と関連する共通の染色体異常には、腫瘍抑制因子遺伝子における対立遺伝子欠失（allelic deletions）またはヘテロ接合性の消失(LOH)、例えば、3p (FHITなど), 9p (p16INK4, p15INK4B, およびp19ARFに関する9p21), 17p (p53 遺伝子などに関する17p13)および13q (網膜芽細胞腫遺伝子Rbなどに関する13q14)が含まれるが、これらに限定されない。3p および 9pにおける欠失は、喫煙および早期段階の肺癌と関連する。Mao等〔J. Natl. Cancer Inst. 89:857-862 (1997)〕。3p, 5q, 8p, 17p および 18qに影響する欠失は、上皮性癌における共通の変化である。一般にTsao等〔CA Clin. Cancer J. Clin. 54:153 (2004)〕を参照されたい。癌と関連する他の染色体突然変異には、癌遺伝子（oncogenes）を活性化するものが含まれる。その存在を中間マーカーとして使用しえる癌遺伝子には、Ras, c-myc, 上皮成長因子, erb-B2 および サイクリン E, D1 および B1が含まれるが、これらに限定されない。一般に、id.  154を参照されたい。
【０１３７】
他の中間マーカー（intermediate markers）は、前悪性細胞（premalignant cells）および癌細胞でアップレギュレートされた遺伝子の産物であってもよい。前悪性細胞でアップレギュレートされえる遺伝子には、シクロオキシゲナーゼ  COX-1 および COX-2, テロメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。癌細胞（および幾つかの前悪性の細胞）の他のバイオマーカーには、p53, 上皮細胞成長因子レセプター (GFR), 核内増殖抗原(PCNA), RAS, COX-2, Ki-67, DNA 異数性, ＤＮＡポリメラーゼ-α, ER, Her2neu, E-カドヘリン, RARβ, hTERT, p16INK4a, FHIT (3p14), Bcl-2, VEGF-R, HPV 感染, LOH 9p21, LOH 17p, p-AKT, hnRNP A2/B1, RAF, Myc, c-キット, サイクリン D1, E および B1, IGF1, bcl-2, p16, LOH 3p21.3, LOH 3p25, LOH 9p21, LOH 17p13, LOH 13q, LOH 8p, hMSH2, APC, DCC, DPC4, JV18, BAX, PSA, GSTP1, NF-kB, AP1, D3S2, HPV 感染, LOH 3p14, LOH 4q, LOH 5p, 膀胱腫瘍抗原 (BTA), BTK TRAK (Alidex, Inc., Redmond WA), 尿路マトリックス タンパク質 22, フィブリン分解物, 自己分泌型運動促進因子レセプター, BCLA-4, サイトケラチン 20, ヒアルロン酸, CYFRA 21-1, BCA, ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン, および 組織ポリペプチド抗原(TPA)が含まれるが、これらに限定されない。一般に、id.  155-157を参照されたい。
【０１３８】
また、初期癌（initial cancers）が治癒した又は前悪性傷害を最終的に治療した患者は、一般的な集団よりも癌を発生するリスクが高い。続発性原発腫瘍（second primary tumor）は、癌の既往歴のある患者での新規の原発性癌を意味する。続発性原発腫瘍は、頭部および頚部癌での死亡率の主な原因である（Id.  150）。続発性原発腫瘍は、前のものが新たなものの原因であり、後のものが現存の腫瘍から起因する転移とは区別される。乳房, 頭部および頚部, 肺, および皮膚の癌または前悪性傷害が治癒した患者は、特に続発性原発腫瘍を発生するリスクが高い。
【０１３９】
キュプレドキシン、又はそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる組成物を、当業者に周知の多くの経路および多くの措置（regimens）によって前記患者に投与できる。特定の態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、静脈内に, 筋肉内に, 皮下に, 局所的に、口腔に、または吸入で投与される。前記組成物は、ペプチドを癌を発生するリスクがある患者の部位に送達する任意の手段によって患者に投与されてもよい。特定の態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、静脈内に投与される。
【０１４０】
一態様において、前記方法は、患者にキュプレドキシンまたはキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる１単位用量の組成物および別の化学予防薬を含んでいる１単位用量の組成物を共投与することを備えてもよく、いずれかの順序で、他のものを投与後におよそ同時又はおよそ所与の時間内（例えば、他の薬の投与後の約1分間〜約60分間または他の薬の投与後の約1時間〜約12時間）に投与される。所望の化学予防薬には、タモキシフェン, アロマターゼ インヒビター、例えば、レトロゾールおよびアナストロゾール (Arimidex（登録商標）), レチノイド、例えば、N-[4-ヒドロキシフェニル] レチンアミド (4-HPR, フェンレチニド), 非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)、例えば、アスピリンおよびスリンダク, セレコキシブ (COX-2 インヒビター), defluoromethylornithing (DFMO), ウルソデオキシコール酸, 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル 補酵素 A レダクターゼ インヒビター, EKI-785 (EGFR インヒビター), ベバシズマブ (VEGF-レセプターに対する抗体), セツキシマブ (EGFRに対する抗体), レチノール、例えば、ビタミン A, ベータカロチン, 13-シスレチノイン酸, イソトレチノインおよびレチニル・パルミテート（retinyl palmitate）, α-トコフェロール, インターフェロン, 腫瘍崩壊性のアデノウイルス dl1520 (ONYX-015), ゲフィチニブ, エトレチナート, フィナステリド, インドール-３-カルビノール, レスベラトロール, クロロゲン酸, ラロキシフェン,およびオルチプラズが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
癌細胞および腫瘍への化合物の選択的な進入を促進させる組成物
本発明は、カーゴ化合物を細胞に送達するための方法および材料に関する。本発明によるカーゴ化合物の送達は、適切な輸送ポリペプチドの使用によって達成される。本発明の一態様において、前記カーゴ化合物は、前記輸送ポリペプチドに連結される。適切な輸送ペプチドは、キュプレドキシン、または「キュプレドキシン進入ドメイン」を含んでいるキュプレドキシンの断片を含む。「キュプレドキシン進入ドメイン（cupredoxin entry domain）」の用語は、キュプレドキシンが哺乳類癌細胞へと進入するために必要とされるアミノ配列を含むキュプレドキシンの断片を意味する。本発明によって送達されるカーゴ化合物には、タンパク質, リポタンパク質, ポリペプチド, ペプチド, ポリサッカライド, 核酸（RNA, DNAおよびアンチセンス核酸を含む）, 色素, 蛍光および放射性のタグ, 微小粒子またはナノ粒子, 毒素, 無機および有機の分子, 小分子, および薬物（例えば、化学予防薬）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、前記薬物および毒素は、腫瘍細胞を殺傷する。
【０１４２】
本発明の一態様において、キュプレドキシンは、アズリン、例えば、緑膿菌のアズリン（配列番号1）である。本発明の他の態様において、キュプレドキシンは、とりわけプラストシアニン, ラスティシアニン, またはシュードアズリンである。特定の態様において、アズリンは、とりわけ緑膿菌, Pseudomonas syringa, Neisseria meningitides, 淋菌（Neisseria gonorrhoeae）, 腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）または気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）からのものである。
【０１４３】
一態様において、カーゴ化合物は、細胞（例えば、癌細胞）を殺傷する又は該細胞における細胞周期進行を遅延させるために送達される。係る癌細胞は、とりわけ骨肉腫細胞, 肺の癌腫細胞, 結腸の癌腫細胞, リンパ腫細胞, 白血病細胞, 軟部組織の肉腫細胞または乳房, 肝臓, 膀胱もしくは前立腺の癌腫細胞などであってもよい。例えば、カーゴ化合物は、とりわけ細胞周期を制御しているタンパク質、例えば、p53;サイクリン依存性キナーゼインヒビター、例えば、p16, p21 もしくはp27;自殺タンパク質、例えば、チミジンキナーゼもしくはニトロ還元酵素;サイトカインもしくは他の免疫調節性のタンパク質、例えば、インターロイキン1, インターロイキン2もしくは顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(GM-CSF);または毒素、例えば、緑膿菌の外毒素Aであってもよい。他の態様において、上記クラスの化合物の１つの生物学的に活性な断片が送達される。別の態様において、カーゴ化合物は、標的組織の画像を発生させるために送達される。例えば、標的組織は癌であってもよく、カーゴ化合物はＸ線コンピュータ断層撮影法 (CT), 磁気共鳴映像法(MRI)および超音波で検出するための画像を発生するために一般的に使用されるものでよい。これらの態様において、カーゴ化合物は、ガンマ線もしくは陽電子放出放射性同位元素（positron emitting radioisotope）, 磁気共鳴映像法の造影剤, Ｘ線の造影剤, または超音波の造影剤である。
【０１４４】
さらに、本発明は、選択的にDNAまたはRNAを哺乳類の癌細胞に導入する方法を含む。係る態様において、前記DNAまたはRNAは、カーゴ化合物である。幾つかの態様において、前記方法は、p18をDNAまたはRNAとカップルして提供することと、その化合物を哺乳類の体に導入することを含む。幾つかの態様において、前記DNAまたはRNAは、遺伝子または遺伝子の断片である。幾つかの態様において、前記DNAまたはRNAは、哺乳類細胞に一旦導入されたら治療効果を有する。
【０１４５】
キュプレドキシン進入ドメイン
本発明は、連結されたカーゴを哺乳類癌細胞（非癌性細胞ではなく）へと輸送することを許容するタンパク質伝達ドメイン（protein transduction domain）を提供する。キュプレドキシンタンパク質が、連結されたカーゴを哺乳類癌細胞へと進入させることを促進するタンパク質伝達ドメイン（キュプレドキシン進入ドメイン）を具備することが発見された。幾つかの態様において、全体のキュプレドキシンタンパク質を使用することによって、連結したカーゴを癌細胞へと選択的に輸送することを促進できる。他の態様において、キュプレドキシンの部分を使用して、連結したカーゴを癌細胞へと輸送できる。幾つかの態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、完全長の野生型タンパク質未満のキュプレドキシンの領域からなる。幾つかの態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、キュプレドキシンの約10残基、約15残基、または約20残基以上からなる。幾つかの態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、キュプレドキシンの約50残基、約40残基、または約30残基以下からなる。幾つかの態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、キュプレドキシンに対し、少なくとも約90%アミノ酸配列同一性、少なくとも約95%アミノ酸配列同一性、または少なくとも約99%アミノ酸配列同一性を有する。
【０１４６】
幾つかの態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、アズリン進入ドメイン（azurin entry domain）である。本発明の一態様において、アズリン進入ドメインは、緑膿菌アズリンの少なくともアミノ酸50〜77(配列番号2)を含んでいる。本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸36〜77(配列番号27)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸36〜89(配列番号28)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸36〜128(配列番号29)を含む。本発明のなお別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸50〜67(配列番号25)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸53〜70(配列番号30)を含む。本発明のなお別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸53〜64(配列番号31)を含む。
【０１４７】
本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、緑膿菌アズリン以外のキュプレドキシンからの進入ドメインである。異なる態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、ラン藻 Phormidium laminosumからのプラストシアニン(配列番号3), Thiobacillus ferrooxidansからのラスティシアニン(配列番号4); Achromobacter cycloclastesからのシュードアズリン(配列番号5), Pseudomonas syringaeからのアズリン(配列番号21), 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）からのアズリン(配列番号10), 腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）からのアズリン(配列番号8), またはChloroflexus aurantiacusからのアウラシアニン(配列番号15および16)の断片であってもよい。
【０１４８】
本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、Chloroflexus aurantiacusのアウラシアニンBの少なくともアミノ酸57〜89を含む(配列番号20)。本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号21)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、髄膜炎菌Lazの少なくともアミノ酸89〜115(配列番号22)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、腸炎ビブリオ菌のアズリンの少なくともアミノ酸52〜78(配列番号23)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、気管支敗血症菌のアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号24)を含む。
【０１４９】
キュプレドキシン進入ドメインの修飾
本発明の別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、化学的に修飾されて又は遺伝的に変更されて、カーゴ化合物を細胞へと輸送する能力を保持しているバリアントを産生する。例えば、例14は、ポジション54、61および70に導入されたプロリン残基を有している緑膿菌アズリンが、UISO-Mel-2細胞に進入する能力を保持していることを示している。
【０１５０】
別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、保存されたアミノ酸配列DGXXXXXDXXYXKXXD(配列番号32)またはDGXXXXDXXYXKXXD(配列番号33)を具備する（式中のDはアスパラギン酸であり, Gはグリシンであり, Yはチロシンであり, Kはリジンであり, およびXは任意のアミノ酸である）。例17を参照されたい。
【０１５１】
キュプレドキシン進入ドメインのバリアントは、標準的な技術によって合成されえる。誘導体は、本来の化合物から、直接的に又は修飾もしくは部分的な置換によって形成されたアミノ酸配列である。アナログ（Analogs）は、本来の化合物と類似するが同一ではない構造を有し、特定の成分もしくは側鎖に関してそれと異なる構造を有しているアミノ酸配列である。アナログは、合成されてもよい又は異なる進化上の起源からのものであってもよい。
【０１５２】
バリアントは、完全長又は完全長以外であってもよい（誘導体またはアナログが、修飾されたアミノ酸を含有している場合）。キュプレドキシン進入ドメインのバリアントには、次のものが含まれるが、これらに限定されない；そのものとは、アライメントを相同性アルゴリズムで実施して、整列された配列と比較した場合に、同一サイズのアミノ酸配列に対して少なくとも約65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, または99%同一性までキュプレドキシン進入ドメインと実質的に相同性である領域を具備している分子である。
【０１５３】
別の態様において、キュプレドキシン進入ドメインのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基50〜77（配列番号2）と有意な構造上の類似性を有する。他の態様において、キュプレドキシン進入ドメインのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基50〜67 （配列番号25）と有意な構造上の類似性を有する。キュプレドキシンおよび他のタンパク質の間の有意な構造上の相同性を決定する試験の例には、Toth等〔Developmental Cell 1:82-92 (2001)〕が含まれる。具体的には、キュプレドキシン進入ドメインのバリアントおよび緑膿菌アズリン残基50〜77（配列番号2）の間の有意な構造上の相同性は、VASTアルゴリズム〔Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995)〕を用いて決定される。特定の態様において、キュプレドキシン進入ドメインのバリアントおよび緑膿菌アズリン残基50〜77（配列番号2）の構造比較からのVAST  p値は、約10-3未満、約10-5未満、または約10-7未満である。他の態様において、キュプレドキシン進入ドメインのバリアントおよび緑膿菌アズリン残基50〜77（配列番号2）の間の有意な構造上の相同性は、DALIアルゴリズム〔Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)〕を用いて決定することができる。特定の態様において、ペアワイズ構造比較に関するDALI  Zスコアは、少なくとも約3.5, 少なくとも約7.0, または少なくとも約10.0である。
【０１５４】
キュプレドキシン進入ドメインへの修飾は、当該技術分野において既知の方法〔例えば、オリゴヌクレオチド媒介性(部位特異的な)突然変異誘発, アラニンスキャンニング, およびPCR突然変異誘発〕を用いて作出することができる。部位特異的突然変異誘発(Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329-50 (1987)), カセット突然変異誘発（cassette mutagenesis）, 制限選択突然変異誘発(Wells et al., Gene 34:315-23 (1985))または他の既知の技術を、クローン化したＤＮＡに使用して、キュプレドキシン進入ドメインのバリアント核酸を産生することができる。加えて、キュプレドキシン進入ドメインと構造上の類似性を有する進入ドメインをコード化しているヌクレオチドを、当該技術分野において周知の方法で合成しえる。さらに、野生型またはバリアントのキュプレドキシン進入ドメインであるタンパク質分子を、当該技術分野において周知の方法で合成しえる。
【０１５５】
キュプレドキシン進入ドメインおよびカーゴ化合物に連結させたキュプレドキシン進入ドメインの複合体をコード化している核酸
別の側面において、本発明は、カーゴ化合物に連結させたキュプレドキシン進入ドメインを含んでいる融合タンパク質をコード化している核酸分子を提供する（ここで、前記カーゴ化合物は、タンパク質またはペプチドである）。本発明による核酸分子は、当該技術分野において既知の技術の組合せによって調製することができる。一例をあげると、キュプレドキシン進入ドメインに関する核酸配列およびカーゴ化合物は、化学的な合成またはクローニングによって個々に調製することができる。核酸配列を、次にリガーゼで連結して、所望の核酸分子が得られる。
【０１５６】
キュプレドキシン進入ドメインを用いるカーゴ化合物を送達する方法
多くのアルギニンリッチペプチドは、哺乳類細胞膜を通じてトランスロケート（translocate）することが知られており、タンパク質カーゴ化合物を係る細胞の内側に運搬する。Suzuki, T等〔 J. Biol. Chem. 277:2437-43 (2002)〕。例えば、HIV Tatタンパク質の短いアルギニンリッチな１１アミノ酸（アミノ酸47〜57）セグメントによって、カーゴタンパク質を哺乳類細胞へと輸送することが許容される。Schwarze, SR.等〔Trends Cell Biol. 10:290-95 (2000)〕。アルファーヘリックス含量を増加し、アルギニン残基の配置を至適化する合成の進入ドメインは、タンパク質伝達ドメインとして高い可能性を有していることが示されている。Ho, A.等〔Cancer Res. 61:474-77 (2001)〕。比較すると、P. aeruginosaのアズリンは、単一のアルギニン残基を有する。従って、その進入のモードがTatタンパク質のものと異なっていることが信じられている（しかし、本発明に関しては頼りにしない）。
【０１５７】
本発明は、カーゴ化合物が細胞へと進入することを促進するキュプレドキシン断片の使用を包含する。係る断片は、細胞への進入に必要とされる断片を同定する任意の方法によって決定しえる。１つの係る方法において、キュプレドキシン断片はマーカー物質と連結され、キュプレドキシン断片が細胞に進入するかどうかを決定するための試験が実施される。係る方法を使用して、既に議論したキュプレドキシンの適切な断片を同定しえる。
【０１５８】
本発明の様々な態様において、カーゴ化合物はキュプレドキシン又はその断片に付着させられる；これはアズリンおよびアズリン様タンパク質のなかでも、P. aeruginosaからのアズリン(配列番号1); ラン藻（Phormidium laminosum）からのプラストシアニン(配列番号3); Thiobacillus ferrooxidansからのラスティシアニン(配列番号4); またはAchromobacter cycloclastesからのシュードアズリン(配列番号5), Pseudomonas syringaeからのアズリンの断片(配列番号21), 髄膜炎菌からのアズリン(配列番号10), 腸炎ビブリオ菌からのアズリン(配列番号19), 気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）からのアズリン(配列番号8), Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンAおよびB(配列番号15および16)などである。他の態様において、前記カーゴは、p28 (配列番号 2)またはp18 (配列番号 25)などのキュプレドキシン進入ドメインに連結される。
【０１５９】
本発明の様々な態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、カーゴ化合物を細胞へと、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで送達する。例えば、送達は、キュプレドキシン進入ドメインおよびカーゴ化合物の複合体を細胞培養物〔例えば、パプ塗抹標本（pap smear）〕に添加することによってインビトロで達成しえる。或いは、送達は、前記複合体を患者から除去したサンプル（例えば、血液、組織、または骨髄）に添加すること、処理したサンプルを前記患者に戻すことによってエクスビボで達成しえる。送達は、前記複合体を患者へと直接的に投与することによっても達成しえる。本発明の方法は、治療上の、予防的な、診断上の、または研究上の目的で使用してもよい。本発明により達成されるカーゴ化合物には、タンパク質, リポタンパク質, ポリペプチド, ペプチド, ポリサッカライド, 核酸（アンチセンス核酸を含む）, 色素, 微粒子またはナノ粒子, 毒素, 有機物および無機の分子, 小分子, および薬物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
一態様において、検出可能な物質、例えば、蛍光物質（例えば、緑色蛍光タンパク質）；発光物質；酵素（例えば、β-ガラクトシダーゼ）；または放射線標識した又はビオチン化したタンパク質が送達されて、検出可能な表現型を細胞に与える。同様に、検出可能な物質（例えば、蛍光物質）で標識された微粒子またはナノ粒子を、送達することができる。適切なナノ粒子の一例は、２００２年５月７日に発行された米国特許第6,383,500号（本出願の明細書等に参照によって援用される）に記載されている。多くのこのような検出可能な物質は、当業者に知られている。
【０１６１】
幾つかの態様において、カーゴ化合物は、Ｘ線コンピュータ断層撮影法, 磁気共鳴映像法, 超音波画像処理または放射性核種シンチグラフィー（radionuclide scintigraphy）に適切な検出可能な物質である。これらの態様において、カーゴ化合物は、患者に診断目的で投与される。造影剤（contrast agent）は、Ｘ線CT、MRI、および超音波で得られた画像を増強するために、カーゴ化合物として投与される。腫瘍組織を標的とする放射性核種カーゴ化合物の、キュプレドキシン進入ドメインを介した投与を、放射性核種シンチグラフィーのために使用することができる。幾つかの態様において、キュプレドキシン進入ドメインは、カーゴ化合物が存在する又は非存在の放射性核種を含有してもよい。他の態様において、カーゴ化合物は、ガンマ線もしくはポジトロンを放射している放射性同位元素、磁気共鳴映像法の造影剤、Ｘ線造影剤、または超音波造影剤（ultrasound contrast agent）である。
【０１６２】
カーゴ化合物としての使用に適切な超音波造影剤には、生体適合性ガスのマイクロバブル、液体担体、および界面活性剤ミクロスフェア（surfactant microsphere）が含まれ、更に任意で標的成分およびマイクロバブルの間の連結成分（Ln）を含むが、これらに限定されない。本発明において、「液体担体（liquid carrier）」の用語は水溶液（aqueous solution）を意味し、「界面活性剤（surfactant）」の用語は溶液の界面の張力を減少させる任意の両親媒性物質を意味する。界面活性剤ミクロスフェアを形成させるための適切な界面活性剤のリストは、EP0727225A2（本出願の明細書等に参照によって援用される）に開示される。界面活性剤ミクロスフェアの用語には、ナノスフェア（nanospheres）、リポソーム、ベシクルなどが含まれる。生体適合性ガスは、空気またはC3-C5パーフルオロアルカンなどのフルオロカーボンであってもよい（これはエコー発生性に差異を与えて、超音波画像にコントラストを与える）。前記ガスは、キュプレドキシン進入ドメインを付着（任意で、結合基を介して）させたミクロスフェア中に封入（encapsulated）または含有される。付着は、共有結合性、イオン性、またはファンデルワールス力によるものであってもよい。係る造影剤の具体例には、複数の腫瘍血管新生レセプター結合ペプチド、ポリペプチド、またはペプチドミメティックス（peptidomimetics）を伴う、脂質封入パーフルオロカーボン（lipid encapsulated perfluorocarbons）が含まれる。
【０１６３】
カーゴ化合物としての使用に適切なＸ線造影剤には、1以上のＸ線吸収剤または原子番号20以上の「重」原子が含まれ、更に任意でキュプレドキシン進入ドメインおよびＸ線吸収原子の間の連結成分（Ln）を含むが、これらに限定されない。Ｘ線造影剤に頻繁に使用される重原子は、ヨウ素である。最近、金属キレート剤（例えば、米国特許第5,417,959号）および複数の金属イオンから構成されるポリキレート剤（例えば、米国特許第5,679,810号）が開示された。最近、多核性クラスター複合体（multinuclear cluster complexes）が、Ｘ線造影剤として開示された（例えば、米国特許第5,804,161, PCT WO91/14460, およびPCT WO92/17215）。
【０１６４】
カーゴ化合物としての使用に適切なMRI造影剤には、1以上の常磁性の金属イオンが含まれ、更にキュプレドキシン進入ドメインおよび常磁性の金属の間の任意の連結成分（Ln）が含まれるが、これらに限定されない。常磁性の金属イオンは、金属複合体または金属酸化物粒子（metal oxide particles）の形態で存在する。米国特許第5,412,148および5,760,191は、MRI造影剤に使用する常磁性の金属イオンのためのキレーターの例を記載している。米国特許第5,801,228号, 米国特許第5,567,411号, および米国特許第5,281,704号は、MRI造影剤に使用する２以上の常磁性の金属イオンを錯化（complexing）するために有用なポリキレーター（polychelants）の例を記載している。米国特許第5,520,904は、MRI造影剤に使用する常磁性の金属イオンから構成される微粒子組成物（particulate compositions）を記載している。
【０１６５】
別の態様において、カーゴ化合物は、細胞を殺傷する又は細胞（例えば、癌細胞）における細胞周期進行を遅延させるために送達される。係る癌細胞は、例えば、骨肉腫細胞、肺の癌腫細胞、結腸の癌腫細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、軟部組織の肉腫細胞または乳房、肝臓、膀胱、または前立腺の癌腫細胞であってもよい。例えば、カーゴ化合物は、細胞周期制御タンパク質、例えば、p53;サイクリン依存性キナーゼインヒビター、例えば、p16、p21、またはp27;自殺タンパク質、例えば、チミジンキナーゼ、またはニトロ還元酵素;サイトカインまたは他の免疫調節性のタンパク質、例えば、インターロイキン1、インターロイキン2、または顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(GM-CSF);または毒素、例えば、緑膿菌外毒素Aであってもよい。他の態様において、上記クラスの化合物の１つの生物学的に活性な断片が送達される。
【０１６６】
なお別の態様において、カーゴ化合物は、核酸である。幾つかの態様において、前記核酸は、上記のクラスの化合物の一つをコードする。なお別の態様において、カーゴ化合物は、癌を治療するために使用される薬物である。係る薬物には、5-フルオロウラシル；インターフェロンα；メトトレキセート；タモキシフェン；およびビンクリスティン（Vincrinstine）などが含まれる。上記の例は説明の目的でのみ記載され、多くの他の係る化合物は当業者に知られている。他の態様において、前記核酸は、遺伝子治療に有用である。
【０１６７】
癌を治療するために適切なカーゴ化合物には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、エチレンイミン、およびトリアゼン（triazenes）; 抗代謝剤、例えば、葉酸アンタゴニスト、プリンアナログ、およびピリミジンアナログ;抗生物質、例えば、アントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、およびプリカマイシン;酵素、例えば、L−アスパラギナーゼ;ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;5.アルファ.-レダクターゼ阻害剤;17.ベータ.-水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ３型の阻害剤;ホルモン剤、例えば、糖質コルチコイド、エストロゲン/抗エストロゲン、アンドロゲン/抗アンドロゲン、プロゲスチン、および黄体形成ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、酢酸オクトレオチド（octreotide acetate）;微小管破壊剤、例えば、エクテイナスチジン（ecteinascidins）又はそのアナログおよび誘導体;微小管安定化剤、例えば、タキサン、例えば、パクリタキセル(タキソール TM)、ドセタキセル(タキソテール TM)、及びそのアナログ、およびエポチロン（epothilones）、例えば、エポチロンA-F及びそのアナログ;植物由来産物、例えば、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、タキサン;およびトポイソメラーゼ阻害剤;プレニルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;および種々の剤、例えば、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ミトタン、ヘキサメチルメラミン、プラチナ配位複合体（platinum coordination complexes）、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン;および抗癌および細胞毒性剤として使用される他の剤、例えば、生物学的応答調節剤（biological response modifiers）、成長因子;免疫調整剤（immune modulators）およびモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
これらのクラスの抗癌および細胞毒性剤の代表的な例には、塩酸メクロレタミン, シクロホスファミド, クロランブシル, メルファラン, イホスファミド, ブスルファン, カルムスチン, ロムスチン, セムスチン, ストレプトゾシン, チオテパ, ダカルバジン, メトトレキセート, チオグアニン, メルカプトプリン, フルダラビン（fludarabine）, ペンタスタチン（pentastatin）, クラドリビン（cladribin）, シタラビン, フルオロウラシル, 塩酸ドキソルビシン, ダウノルビシン, イダルビシン, 硫酸ブレオマイシン, マイトマイシンC, アクチノマイシンD, サフラシン（safracins）, サフラマイシン（saframycins）, キノカルシン（quinocarcins）, ディスコデルモライド（discodermolides）, ビンクリスチン, ビンブラスチン, 酒石酸ビノレルビン（vinorelbine tartrate）, エトポシド, リン酸エトポシド, テニポシド, パクリタキセル, タモキシフェン, エストラムスチン, リン酸エストラムスチンナトリウム, フルタミド, ブセレリン, ロイプロリド, プテリジン, ダイネース（diyneses）, レバミゾール, アフラコン（aflacon）, インターフェロン, インターロイキン, アルデスロイキン, フィルグラスチム, サルグラモスチム, リツキシマブ, BCG, トレチノイン, 塩酸イリノテカン, ベタメゾン（betamethosone）, 塩酸ゲムシタビン, アルトレタミン, およびトポテカ（topoteca）並びにその任意のアナログまたは誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
これらのクラスの好適なメンバーには、パクリタキセル, シスプラチン, カルボプラチン, ドキソルビシン, カルミノマイシン, ダウノルビシン, アミノプテリン, メトトレキセート, メトプテリン, マイトマイシン C, エクテナサイジン743, またはポフィロマイシン（pofiromycin）, 5-フルオロウラシル, 6-メルカプトプリン, ゲムシタビン, シトシンアラビノシド, ポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシド, リン酸エトポシドまたはテニポシド, メルファラン, ビンブラスチン, ビンクリスチン, リューロシジン（leurosidine）, ビンデシンおよびリューロシン（leurosine）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
カーゴ化合物として有用な抗癌及び他の細胞毒性剤には、以下のものが含まれる：次の文献に記載のエポチロン（epothilone）誘導体、独国特許第4138042.8; WO97/19086, WO98/22461, WO98/25929, WO98/38192, WO99/01124, WO99/02224, WO99/02514, WO99/03848, WO99/07692, WO99/27890, WO99/28324, WO99/43653, WO99/54330, WO99/54318, WO99/54319, WO99/65913, WO99/67252, WO99/67253およびWO00/00485;  WO99/24416(米国特許第6,040,321号をも参照されたい)に記載のサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびWO97/30992およびWO98/54966に記載のプレニル-タンパク質トランスフェラーゼインヒビター;および米国特許第6,011,029号に包括的かつ具体的に記載されている薬剤〔米国特許を、任意のARモジュレーター, ERモジュレーターなどのNHRモジュレーター（本発明のものを含むが、これらに限定されない）をLHRHモジュレーターと又は外科的な性腺摘除と共に、特に癌治療において実施することができる化合物〕などである。
【０１７１】
本発明の化合物と共にカーゴ化合物として用いる場合、上記の他の治療剤を使用してもよい；この際の量はPhysicians' Desk Reference(PDR)で指摘された量または当業者によって決定された量などである。
【０１７２】
キュプレドキシン進入ドメインを含んでいる薬学的組成物
カーゴ化合物と連結されたキュプレドキシン進入ドメインの複合体を含有している薬学的組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化、ドラジェー作出（dragee-making）、乳化、封入（encapsulating）、エントラッピング（entrapping）、または凍結乾燥処理などの任意の従来の様式にしたがって製造することができる。前記複合体は、当該技術分野において周知の薬学的に認容される担体と容易に組み合わせることができる。係る担体によって、錠剤, ピル, ドラジェー, カプセル剤, 液体, ゲル, シロップ, スラリー, 懸濁液などとして製剤化する調製が可能となる。適切な賦形剤には、充填剤およびセルロース調製物なども含まれてもよい。他の賦形剤には、香味剤（flavoring agents）、発色剤、粘着防止剤（detackifiers）、増粘剤（thickeners）、および他の認容される添加物、アジュバント、または結合剤などが含まれてもよい。
【０１７３】
係る組成物を、細胞タイプの検出もしくは画像処理に又は細胞死に関連するコンディションの治療に又はその予防などに使用することができる。前記組成物を、細胞死に対する耐性に関連するコンディションを予防または治療するために十分な量で投与することができる。本出願の明細書等に使用される「細胞死に対する耐性に関連するコンディション（a condition related to resistance to cell death）」の用語は、妥当な熟達した医者または臨床医によって決定された同類型の健常な細胞と比較した場合、少なくとも細胞の寿命が延長する傾向によって特徴付けられる疾患（disease）, 状態（state）, または不調（ailment）を意味する。典型的には、宿主の生物体は、哺乳類、例えば、ヒトまたは動物である。
【０１７４】
キュプレドキシン進入ドメインを含有している組成物の投与
キュプレドキシン進入ドメインを含有している組成物は、口、頬、吸入、舌下、直腸、膣、尿道、鼻、局所、経皮（percutaneous）、即ち、経皮（transdermal）または非経口〔静脈内、筋肉内、皮下および冠内（intracoronary）への投与を含む〕などの任意の適切な経路によって投与することができる。前記組成物及びその薬学的製剤は、その意図する目的を達成するために効果的な任意の量で投与することができる。細胞死への耐性に関連するコンディションを治療するために投与される場合、前記組成物は治療上効果的な量で投与される。「治療上効果的な量（therapeutically effective amount）」は、治療される対象に存在している症状（symptoms）の発症を予防する又は軽減（alleviate）するために効果的な量である。治療上効果的な量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【０１７５】
適切な投与量は、使用するキュプレドキシン進入ドメインを含有している化合物、宿主、投与のモード、および治療される又は診断されるコンディションの性質および重症度などに応じて変化するだろう。しかしながら、本発明の方法の一態様において、ヒトにおいて満足な治療結果は、約0.001〜約20mg/kg体重のキュプレドキシン進入ドメインを含有している化合物の1日投与量で得られることが指摘される。一態様において、ヒトの治療に関して指示される1日投与量は、約0.7mg〜約1400mgのキュプレドキシン進入ドメインを含んでいる化合物の範囲であってもよく、一日用量（daily doses）、週用量（weekly doses）、月用量（monthly doses）、および／または連続的な用量などで都合よく投与される。一日用量は、1〜12回／日の別々の投与量であってもよい。或いは、用量は、隔日、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、３日毎、週毎、及び31日まで同様に日を増加させて投与することができる。投薬は、錠剤、パッチ、i.v.投与などを含む任意の適用可能な用量形態を用いる連続的、断続的（intermittent）、または単一用量の投薬であってもよい。より具体的には、前記組成物は、治療上効果的な量で投与される。特定の態様において、治療上効果的な量は、約0.01〜20mg/kg体重である。特定の態様において、用量レベルは、約10mg/kg/日, 約15mg/kg/日, 約20mg/kg/日, 約25mg/kg/日, 約30mg/kg/日, 約35mg/kg/日, 約40mg/kg/日, 約45mg/kg/日または約50mg/kg/日である。
【０１７６】
キュプレドキシン進入ドメインを含有している化合物を患者へと導入する方法は、幾つかの態様において、癌を治療することが知られている他の薬物との共投与である。係る方法は、当該技術分野において公知である。特定の態様において、キュプレドキシン進入ドメインを含有している化合物は、癌を治療するための他の薬物を含有している又は該薬物と共に投薬されるカクテル又は共投薬（co-dosing）の一部である。係る薬物は、本出願の明細書等にリストされているものであり、具体的には5-フルオロウラシル;インターフェロンα;メトトレキセート;タモキシフェン;およびビンクリスチンである。上記の例は説明の目的でのみ記載され、多くの他の係る化合物は当業者に知られている。
【０１７７】
キュプレドキシン進入ドメインまたは何れかの進入ドメインおよびカーゴ化合物を組合せた融合タンパク質をコード化している核酸分子を、ベクターへと挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与〔Nabel等  米国特許第5,328,470号  1994．ＵＳＡ〕によって又はステレオタクティック注射（stereotactic injection）〔Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 91, pp 3054-57 (1994)〕によって対象へと送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物（pharmaceutical preparation）は、認容される希釈剤を具備してもよい又は遺伝子送達ビヒクルが包埋された遅延放出性マトリックスを具備してもよい。或いは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）から無傷（intact）の状態で産生することができる場合、薬学的調製物は遺伝子送達システムを産生する１以上の細胞を具備してもよい。
【０１７８】
一側面において、前記複合体がインサイチューで産生されるようなＤＮＡとして前記組成物が送達される。一態様において、例えば、Ulmer等〔Science 259:1745-1749 (1993)〕に記載され、Cohen〔Science 259 1691-1692 (1993)〕で議論されたように、前記DNAは「裸（naked）」である。裸のDNAの取り込みは、細胞に効率的に輸送される担体（例えば、生分解性ビーズ）に前記DNAをコーティングすることによって増加しえる。係る方法において、前記DNAは、当業者に既知の任意の様々な送達システムに存在させてもよく、これには核酸発現系、細菌性の及びウイルス性の発現系が含まれる。DNAを係る発現系に導入するための技術は、当業者に公知である（例えば、WO90/11092、WO93/24640、WO93/17706、および米国特許第5,736,524号を参照されたい）。
【０１７９】
遺伝物質を生物体から生物体へとシャトルさせるために使用されるベクターは、２つの一般的なクラスに分けることができる：クローニングベクターは、適切な宿主細胞中での増幅に非必須の領域（この中に外来ＤＮＡを挿入することができる）を有している複製するプラスミドまたはファージである；外来ＤＮＡは、ベクターの構成要素であるかのように複製し、増殖する。発現ベクター(例えば、プラスミド、酵母、または動物ウイルスゲノム)を使用して、外来ＤＮＡ（例えば、前記組成物のＤＮＡ）を転写する及び翻訳するために、外来性の遺伝物質を宿主の細胞または組織へと導入する。発現ベクターにおいて、導入されたＤＮＡは、宿主細胞にシグナルを与えて挿入されたＤＮＡを転写させるプロモーターなどの因子に作動可能に連結されている。幾つかのプロモーターは、特別に有用である（例えば、特定の因子に応答して、遺伝子転写をコントロールする誘導性プロモーター）。組成物ポリヌクレオチドを誘導性プロモーターへと作動可能に連結することによって、wt-アズリン進入ドメイン組成物ポリペプチドまたは断片の発現をコントロールすることができる。伝統的な誘導性プロモーターの例には、α-インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、およびステロイド、例えば、糖質コルチコイド〔Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990)〕およびテトラサイクリンに反応性のものが含まれる。他の望ましい誘導性プロモーターには、構築物が導入されている細胞に内在性（endogenous）ではないものが含まれる。しかしながら、誘導剤が外因性（exogenously）に供給される場合、それらのプロモーターはそれらの細胞中で反応性である。一般的には、有用な発現ベクターは、プラスミドである。しかしながら、発現ベクターの他の形態、例えば、ウイルス性のベクター(例えば、複製欠陥性レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス)も企図される。
【０１８０】
ベクターの選択は、使用される生物体（organism）または細胞およびベクターの望まれる運命（fate）によって決定される。一般的には、ベクターは、シグナル配列、複製の起点、マーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター、および転写終結配列を具備する。
【０１８１】
キュプレドキシン進入ドメイン  カーゴ化合物複合体を具備しているキット
別の側面において、本発明は、パッケージまたは容器に一または二以上の次のものを含んでいるキットを提供する:
(１)  カーゴ化合物と連結させたキュプレドキシン進入ドメインの複合体を含んでいる試薬；
(2)  薬学的に許容されるアジュバントまたは賦形剤を含んでいる試薬;
(3)  投与のためのビヒクル（例えば、シリンジ）;
(4)  投与のための説明書。 
構成要素(１)〜（４）の２以上が同じ容器中にある態様も、企図される。
【０１８２】
キュプレドキシン  キュプレドキシン進入ドメイン, キュプレドキシン進入ドメイン ― カーゴ化合物複合体, 又はそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる薬学的組成物
キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる薬学的組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化、ドラジェー作出（dragee-making）、乳化、封入（encapsulating）、エントラッピング（entrapping）、または凍結乾燥処理などの任意の従来の様式にしたがって製造することができる。実質的に純粋または医薬品グレードのキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、当該技術分野において周知の薬学的に認容される担体と容易に組み合わせることができる。係る担体によって、錠剤, ピル, ドラジェー, カプセル剤, 液体, ゲル, シロップ, スラリー, 懸濁液などとして製剤化する調製が可能となる。適切な担体または賦形剤には、充填剤およびセルロース調製物なども含まれてもよい。他の賦形剤には、香味剤（flavoring agents）、発色剤、粘着防止剤（detackifiers）、増粘剤（thickeners）、および他の認容される添加物、アジュバント、または結合剤などが含まれてもよい。ある態様において、薬学的調製物（pharmaceutical preparation）は、実質的に保存剤なしである。他の態様において、前記薬学的調製物は、少なくとも１つの保存剤を含有してもよい。薬学的剤形（pharmaceutical dosage forms）の一般的な方法論は、Ansel等(Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD (1999))に見つけられる。
【０１８３】
本発明に使用されるキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる組成物は、注射(例えば、皮内, 皮下, 筋肉内, 腹腔内など)による、吸入による、局所的投与による、坐剤による、経皮性パッチによる又は口による様式を含む様々な様式で投与しえる。薬物送達システム（drug delivery systems）の一般的な情報は、Ansel等(Id.)に見つけられる。幾つかの態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、又は構造上の均等物を含んでいる組成物は、とりわけ、皮下および静脈内注射のために製剤化し、直接的に注射可能剤（injectibles）として使用できる。特に、注射可能な製剤は、化学予防薬治療に適切な患者を治療するために効果的に使用することができる。また、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、又は構造上の均等物を含んでいる組成物は、保護剤（例えば、ポリプロピレングリコールまたは類似のコーティング剤）と混合した後に経口的に摂取できる。
【０１８４】
投与が注射によるものの場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、水溶液中に製剤化され、具体的には生理学的に適合する緩衝液（例えば、ハンクス液、リンゲル溶液、または生理食塩緩衝液（physiological saline buffer）中に製剤化しえる。前記溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの製剤化の薬剤を含有してもよい。或いは、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、使用前に、滅菌したパイロジェンが存在しない水などの適切なビヒクルで構成するための粉末形態であってもよい。幾つかの態様において、前記薬学的組成物は、前記ペプチドによって刺激される免疫応答を増強するために添加されるアジュバントまたは任意の他の物質を含まない。幾つかの態様において、前記薬学的組成物は、前記ペプチドに対する免疫応答を阻害する物質を含む。
【０１８５】
投与が静脈内流体（intravenous fluids）による場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の投与に使用する静脈内流体は、クリスタロイド（crystalloids）またはコロイド（colloids）から構成されてもよい。本出願の明細書等に使用されるクリスタロイドは、ミネラル塩または他の水溶性の分子の水溶液（aqueous solutions）である。本出願の明細書等に使用されるコロイドは、大きな不溶性の分子（例えば、ゼラチン）を含む。静脈内流体は、無菌（sterile）であってもよい。
【０１８６】
静脈内投与に使用しえるクリスタロイド流体には、表2に記載される通常の生理食塩水(0.9%の濃度の塩化ナトリウム溶液), リンゲル乳酸またはリンゲル溶液, および5%デキストロース水溶液（時々、D5Wと称される）が含まれるが、これらに限定されない。
【表２】
2014237640.tif 000004
【０１８７】
投与が吸入によるものである場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用することによって、加圧パックからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーの形態で送達しえる。加圧されたエアロゾルの場合、投与量単位（dosage unit）は、一定量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。吸入器（inhaler）または注入器（insufflator）に使用するためのゼラチンなどのカプセルまたはカートリッジを、タンパク質の粉末混合物および適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）を含有するよう製剤化しえる。
【０１８８】
投与が局所的投与によるものである場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を、当該技術分野において周知の溶液剤、ゲル、軟膏、クリーム、ゼリー、懸濁剤などとして製剤化してもよい。幾つかの態様において、投与は経皮パッチ（transdermal patch）の手段による。投与が坐剤(例えば、直腸または膣)である場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、従来の坐剤基剤を含有している組成物に製剤化してもよい。
【０１８９】
投与が経口である場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、容易にキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を当該技術分野において周知の薬学的に認容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化できる。固形担体（例えば、マンニトール, ラクトース, マグネシウムステアラート, など）を用いてもよい；係る担体によって、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を、治療される対象による経口摂取のための、錠剤、丸剤、ドラジェー剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能となる。経口の固形製剤（例えば、粉剤、カプセル、および錠剤）に関して、適切な賦形剤には、充填剤（例えば、糖、セルロース調製物、顆粒化剤、および結合剤）が含まれる。
【０１９０】
当該技術において周知の他の都合のよい担体には、多価担体、例えば、細菌性のカプセル性のポリサッカライド、デキストラン、または遺伝的に操作されたベクターも含まれる。加えて、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含む徐放性製剤によって、長時間にわたるキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の放出が許容される；持続性放出製剤無しでは、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、対象の系から排出される、および／または治療効果を惹起する又は増強する前にプロテアーゼおよび単純な加水分解などによって分解されるだろう。
【０１９１】
本発明のペプチドの血流中の半減期は、当業者に周知の幾つかの方法によって延長または至適化できる。本発明のペプチドバリアントには、哺乳類の細胞、組織、または動物における前悪性傷害の発生を阻害するために血管形成を阻害するペプチドの能力を保持している間に、血流中の安定性、比活性、長命性（longevity）を増加および／またはキュプレドキシンの免疫原性を減少しえる様々なバリアントが含まれえるが、これらに限定されない。係るバリアントには、ペプチドの加水分解を減少させる、ペプチドの脱アミドを減少させる、酸化を減少させる、免疫原性を減少させる、ペプチドの構造上の安定性を増加させる、またはペプチドのサイズを増加させるものが含まれるが、これらに限定されない。係るペプチドには、環状化ペプチド(Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)を参照されたい), D,L-ペプチド(ジアステレオマー), Futaki et al., J. Biol. Chem.  Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al., Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987); 異常アミノ酸を含んでいるペプチド(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)を参照されたい), NおよびC末端の修飾体(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)を参照されたい), 炭化水素ステープリング(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)を参照されたい)およびPEG化（PEGylation）も含まれる。
【０１９２】
様々な態様において、前記薬学的組成物は、担体および賦形剤(緩衝剤, 炭水化物, マンニトール, タンパク質, ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、 グリシン, 抗酸化剤, 静菌剤, キレート剤, 懸濁剤, 増粘剤および／または保存剤を含むが、これらに限定されない), 水, 油, 生理食塩水, 水性のデキストロースおよびグリセロール溶液, 生理的なコンディションに近づけるために必要とされる他の薬学的に許容される補助的な物質（例えば、緩衝作用剤、張性調整剤、湿潤剤など）を含む。当業者に既知の適切な任意の担体を本発明の組成物を投与するために使用できるが、担体のタイプは投与のモード（mode）に依存して変化するだろうことが認識されている。化合物を、周知の技術を用いてリポソーム内に被包（encapsulated）させてもよい。生分解性ミクロスフェアを、本発明の薬学的組成物のための担体として用いてもよい。適切な生分解性ミクロスフェアは、米国特許第4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344および5,942,252号などに開示される。
【０１９３】
前記薬学的組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌してもよい又は濾過滅菌してもよい。生じる水溶液は、使用のためにパックされるか、又は無菌条件下で濾過して凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌水溶液と混合されてもよい。
【０１９４】
キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の投与
キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を、薬学的組成物として製剤化し、口、頬、吸入、舌下、直腸、膣、尿道、鼻、局所、経皮（percutaneous）、即ち、経皮（transdermal）または非経口〔静脈内、筋肉内、皮下および冠内（intracoronary）を含む〕または硝子体投与などの任意の適切な経路によって投与することができる。その薬学的製剤（pharmaceutical formulation）は、その意図する目的を達成するために効果的な任意の量で投与することができる。より具体的には、前記組成物は、治療上効果的な量で投与される。特定の態様において、治療上効果的な量は、一般的に約0.01〜20mg/日/kg体重である。
【０１９５】
キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる化合物は、単独または他の活性剤（active agents）および／またはカーゴ化合物と組み合わせて、癌の予防のために有用である。適切な投与量は、使用するキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物、宿主、投与のモード、および潜在的な癌（potential cancer）の性質および重症度などに応じて変化するだろう。しかしながら、一般に、ヒトで満足な結果は、約 0.01-20 mg/kg体重の一日投与量（daily dosages）で得られることが指摘された。ヒトで指摘された1日投与量は、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の化合物の約0.7mg〜約1400mgの範囲であり、一日用量（daily doses）、週用量（weekly doses）、月用量（monthly doses）、および／または連続的な用量などで都合よく投与される。一日用量は、1〜12回／日の別々の投与量であってもよい。また、用量は、隔日、三日毎、四日毎、五日毎、六日毎、週毎、及び31日以上まで同様に日を増加させて投与することができる。投薬（dosing）は、パッチ, i.v.投与などを用いる連続的なものであってもよい。
【０１９６】
正確な製剤化、投与の経路、及び投与量は、患者のコンディションに応じて主治医によって決定される。投与量およびインターバルを個々に調整して、治療効果を維持するために十分である活性なキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物（カーゴ化合物の存在下または非存在下）の血漿レベルを提供することができる。一般に、所望のキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、意図する投与経路および標準的な薬務（pharmaceutical practice）に関して選択される薬学的な担体との混合物として投与される。
【０１９７】
一側面において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、ＤＮＡとして送達されて、ポリペプチドがインサイチューで産生される。一態様において、例えば、Ulmer等〔Science 259:1745-1749 (1993)〕に記載され、Cohen〔Science 259:1691-1692 (1993)〕で議論されたように、前記DNAは「裸（naked）」である。裸のDNAの取り込みは、担体（例えば、生分解性ビーズ）に前記DNAをコーティングすることによって増加され、これは次に細胞に効率的に輸送される。係る方法において、前記DNAは、当業者に既知の任意の様々な送達システムに存在させてもよく、これには核酸発現系、細菌性の及びウイルス性の発現系が含まれる。DNAを係る発現系に導入するための技術は、当業者に公知である（例えば、WO90/11092、WO93/24640、WO93/17706、および米国特許第5,736,524号を参照されたい）。
【０１９８】
遺伝物質を生物体から生物体へとシャトルさせるために使用されるベクターは、２つの一般的なクラスに分けることができる：クローニングベクターは、適切な宿主細胞中での増幅に必須の領域を有している複製するプラスミドまたはファージであり、この中に外来ＤＮＡを挿入することができる；外来ＤＮＡは、ベクターの構成要素であるかのように複製し、増殖する。発現ベクター(例えば、プラスミド、酵母、または動物ウイルスゲノム)を使用して、外来ＤＮＡ（例えば、キュプレドキシンのＤＮＡ）を転写する及び翻訳するために、外来性の遺伝物質を宿主の細胞または組織へと導入する。発現ベクターにおいて、導入されたＤＮＡは、宿主細胞にシグナルを与えて挿入されたＤＮＡを高度に転写させるプロモーターなどの因子に作動可能に連結されている。幾つかのプロモーターは、特別に有用である（例えば、特定の因子に応答して、遺伝子転写をコントロールする誘導性プロモーター）。キュプレドキシン及びそのバリアントおよび誘導体を誘導性プロモーターと作動可能に連結することによって、特異的な因子に応じてキュプレドキシン及びそのバリアントおよび誘導体の発現をコントロールすることができる。伝統的な誘導性プロモーターの例には、α-インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、およびステロイド、例えば、糖質コルチコイド〔Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990)〕およびテトラサイクリンに反応性のものが含まれる。他の望ましい誘導性プロモーターには、構築物が導入されている細胞に内在性（endogenous）ではないものが含まれる。しかし、誘導因子が外因性（exogenously）に供給される場合、それらのプロモーターはそれらの細胞中で反応性である。一般的には、有用な発現ベクターは、プラスミドである。しかしながら、発現ベクターの他の形態、例えば、ウイルス性のベクター(例えば、複製欠陥性レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス)も企図される。加えて、本発明のペプチド（一態様において、p18を含む）を、治療化合物を癌細胞または腫瘍に選択的に送達するためのベクターとして使用してもよい。
【０１９９】
ベクターの選択は、使用される生物体（organism）または細胞およびベクターの望まれる運命（fate）によって決定される。一般的には、ベクターは、シグナル配列、複製の起点、マーカー遺伝子、ポリリンカー部位、エンハンサー因子、プロモーター、および転写終結配列を具備する。
【０２００】
キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいるキット
一側面において、本発明は、パッケージまたは容器に一または二以上の次のものを含んでいる措置（regimens）またはキットを提供する:
（1）  少なくとも一つのキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる薬理学的に活性な組成物；
(2)  付加的な化学予防薬、
(3)  生物学的に活性な組成物を患者に投与する装置（例えば、シリンジ, ネブライザーなど）。
【０２０１】
キットが供給される場合、前記組成物の異なる成分を別々の容器にパッケージし（適切な場合）、使用前に直ちに混合してもよい。成分をこのようにパッケージングすることによって、活性成分の機能を失うことなく、長期間の保存が別々に許容される。
【０２０２】
キットに含まれる試薬を、異なる成分の寿命が長くなり、容器の材料によって吸収させられることがない又は変化させられることがない任意の種類の容器に供給することができる。例えば、封止されたガラスアンプルは、凍結乾燥されたキュプレドキシン及びそのバリアント、誘導体および構造上の均等物を、又は中性で非反応性のガス（例えば、窒素）でパッケージされている緩衝剤を含有してもよい。アンプルは、任意の適切な材料からなるものでよく、例えば、ガラス、有機物ポリマー、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレンなど、セラミック、金属、または類似する試薬を保持するために典型的に用いられる他の材料である。適切な容器の他の例には、アンプルなどの類似する物から製造されえる単純なボトルおよびアルミニウムまたは合金などのホイル裏打ちされた内装を備えるエンベロープが含まれる。他の容器には、検査チュウブ、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどが含まれる。容器は、無菌のアクセスポートを有してもよく、例えば、皮下注射針で突き刺すことが可能なストッパーを有しているボトルである。他の容器は、除去する際に成分が混合されることを許容する容易に除去可能な膜によって分離された２つの区画を有してもよい。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであってもよい。
【０２０３】
キットには、説明用物品（instructional materials）が供給されていてもよい。説明書は、紙または他の物質に印刷されてもよく及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク, CD-ROM, DVD-ROM, Zipディスク, ビデオテープ, 録音テープ, フラッシュメモリー装置などの電子的に読み込み可能な媒体として提供されてもよい。詳細な説明書は、キットに物理的に付属していなくてもよい；代わりに、使用者がキットの製造者またはディストリビューターによって特定されたインターネットウェブサイトに接続してもよい又は電子メールとして供給されてもよい。
【０２０４】
キュプレドキシン、キュプレドキシン進入ドメイン、及びそのバリアント、誘導体、および構造上の均等物の修飾
キュプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、化学的に修飾されて又は遺伝子的に改変されて、上記のバリアントおよび誘導体を産生してもよい。係るバリアントおよび誘導体は、標準の技術によって合成されえる。キュプレドキシン進入ドメインは、同様に修飾されてもよい。
【０２０５】
キュプレドキシンの天然の対立遺伝子バリアント（allelic variants）に加えて、前悪性傷害の発生を阻害するキュプレドキシンの能力を有意に変化させないキュプレドキシンをコード化しているアミノ酸配列の変更を生じるキュプレドキシンコード配列への変異によって変化を導入することができる。「非必須（non-essential）」なアミノ酸残基は、キュプレドキシンの野生型配列から薬理的な活性を変更させることなく変更できる残基である。他方で、「必須（essential）」なアミノ酸残基は、係る薬理的な活性に必要とされるものである。例えば、キュプレドキシンの間で保存されているアミノ酸残基は、特に変化を受け入れられないことが予想されるので、「必須」である。
【０２０６】
ポリペプチドの薬理的な活性を変化させない「保存的（conservative）」な置換を施すことができるアミノ酸は、当該技術分野において周知である。有用な保存的な置換は、表3の「好適な置換」に示される。１つのクラスのアミノ酸が同じタイプの別のアミノ酸で置換される保存的な置換は、該置換が前記化合物の薬理的な活性を実質的に変更しないかぎり、本発明の範囲内である。
【表３】
2014237640.tif 000005
【０２０７】
（１）ポリペプチドバックボーンの構造（例えば、βシートまたはαヘリックス  コンホメーション）、（２）荷電、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖のバルクに影響する「非保存的（Non-conservative）」な置換によって、薬理的な活性を修飾することができる。残基は、表4に記載の共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる。非保存的な置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスへと交換することを意味する。置換を、保存された置換部位に又は非保存部位（non-conserved sites）に導入しえる。
【表４】
2014237640.tif 000006
【０２０８】
バリアントポリペプチドは、当該技術分野において既知の方法〔例えば、オリゴヌクレオチド媒介性の(部位特異的な)突然変異誘発, アラニンスキャンニング, およびPCR突然変異誘発〕を用いて作出することができる。部位特異的突然変異誘発(Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329-350 (1987)), カセット突然変異誘発（cassette mutagenesis）, 制限選択突然変異誘発(Wells et al., Gene 34:315-323 (1985))または他の既知の技術を、クローン化したＤＮＡに使用して、キュプレドキシンバリアントＤＮＡを産生することができる。
【０２０９】
キュプレドキシンの既知の変異を使用して、本発明の方法に使用されるバリアントキュプレドキシンを創造することができる。例えば、アズリンのC112DおよびM44KM64E突然変異体は、本来（native）のアズリンと異なる細胞毒性および成長アレストの活性を有することが知られる。また、このような変更された活性は、本発明の治療方法に有用であるはずである。
【０２１０】
本発明の更に完全なる理解は、以下の特定の例を参照することによって得ることができる。例は、説明の目的でのみ記載され、本発明の範囲を限定するものではない。形態における変化および均等物での置換は、状況（circumstances）が手段（expedient）を示唆（suggest）する又は与える（render）ものとして企図される。特定の用語が本出願の明細書等に用いられるが、係る用語は、説明の意味で企図されるものであり、限定することを目的としていない。本出願の明細書等に記載した本発明の修飾およびバリエーションを、発明の精神および範囲から逸脱することなくなすことができる。
【０２１１】
［例］
例 1:  MMOCモデルでのDMBA誘導性の乳房の傷害におけるペプチド P-28の効果
マウス乳腺の器官培養(MMOC)モデルによって、DMBAへの応答における乳房小窩傷害(MAL)または乳房管傷害(MDL)の発生に対する潜在的な化学予防因子の有効性を評価することが許容される。適切なインキュベーション条件下でDMBAによって、培地中のホルモン環境に基づいてMALまたはMDLのいずれかが形成される。Hawthorne等〔Pharmaceutical Biology 40: 70-74 (2002)〕; Mehta等〔J. Natl. Cancer Inst. 93: 1103-1106 (2001)〕。培養においてエストロゲンおよびプロゲステロン処理した腺によって管傷害が発生する、他方でアルドステロンおよびヒドロコルチゾン処理した腺によってエストロゲンおよびプロゲステロン非依存性の小窩傷害が形成される。発癌物質または化学予防因子に暴露されない乳腺は成長促進ホルモンの非存在下で構造的な退行（structural regression）を経験する、他方で3日および4日の間の24-hrのDMBAでの処理によってホルモンの欠乏に起因する構造の退行が予防される。この事項は腺が正常なホルモン応答性を失い、この時点で発生のコースが変更されたことが原因であることが想定された。形質転換した細胞を同系マウスに移植して乳房腺癌（mammary adenocarcinoma）を発生させることによって、これらの未抑制領域（unrepressed areas）の前悪性の新生物発生前の性質が証明された。
【０２１２】
胸部の乳腺のペアを各々のＢＡＬＢ／ｃマウスから無菌的に摘出し、腺を幾つかのグループに分けた。p28の効果を、培地中での4つの異なる希釈で評価した。発癌物質処理した腺（検査因子なし）は、化学予防因子の非存在下で発生率パーセントを決定するための手段として利用される。加えて、対照を含めて、化学的予防のポジティブコントロールとして利用した。アズリンを、培地に50 μg/mlの濃度で含ませた。小窩傷害(MAL)に関して、染色した腺で傷害の発生率（所与の処理群における腺の全体数と比較した何らかの傷害を含んでいる腺）を評価した。管傷害(MDL)に関して、類似するプロトコールを適合させた。しかしながら、以下の方法のセクションに指摘したとおり、ホルモンの組み合わせは、小窩および管の傷害に関して異なる。腺をホルマリン中で固定し、組織病理学的に処置した。切片は、エオシンおよびヘマトキシリンで染色され、顕微鏡下で評価した。ここで、対照および処理群の間の管傷害の多様性（multiplicity）が比較される。
【０２１３】
器官培養処置研究に使用される実験動物は、3ないし4週齢の若い, 処女BALB/c雌性マウスであり、Charles River（Charles River, Wilmington, MA）から得られた。マウスを、毎日1 μg エストラジオール-17β + 1 mg プロゲステロンでの皮下注射で9日間処理した。この処理は、ステロイドで前処理されず、インビトロでホルモンに反応することに失敗した動物である限り必須である。全体的な培養手順が、詳細に記載される。Jang等〔Science 275:218-220 (1997)〕; Mehta〔Eu. J. Cancer 36:1275-1282 (2000)〕; Mehta等〔J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997)〕; Mehta等〔J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)〕。
【０２１４】
要約すると、動物を頚椎脱臼で屠殺し、胸部の乳腺のペアを絹ラフト（silk rafts）上で解剖し、無血清のWaymouth MB752/1培地で10日間インキュベーションした（5つの腺/5 ml/皿）。乳房小窩傷害(MAL)を誘発するプロトコールのために、培地にグルタミン, 抗生物質 (ペニシリン および ストレプトマイシン 100 units/ml 培地) および 成長促進ホルモン, 5 μg インシュリン (I), 5 μg プロラクチン (P), 1 μg アルドステロン (A) および 1 μg ヒドロコルチゾン (H)をmlごと培地に添加した。管傷害(MDL)の誘導のために、培地に5 μg/ml, 5 μg/ml P, 0.001 μg/ml エストラジオール 17βおよび 1 μg/ml プロゲステロン (Pg)を含有させた。Mehta等〔J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)〕。発癌物質DMBA (2 μg/ml)を、3 および 4日の間に培地に添加した。本研究に関して、DMBAをDMSOに終濃度4 mg/mlで溶解し、50 μg Iを100 mlの培地に添加し、2 μg/mlの最終的な濃度とした。対照の皿には、DMSOをビヒクルとして含有させた。
【０２１５】
４日に、DMBAが、新鮮な培地で腺をリンスすることで培地から除去され、DMBAなしの新鮮な培地を含んでいる新しい皿に移された。10日間のインキュベーション後、腺をIのみを含んでいる培地（5 μg/ml）で別に14日間維持した。全培養期間の間、腺を95% O2 および5% CO2の環境で37゜Cで維持した。化学予防因子を、成長促進期（growth -promoting phase）の最初の十日間の間に培地に含ませた。検査ペプチド p28を、12.5 μg/ml〜100 μg/mlの範囲の4 濃度で評価した。アズリンを、培地中に50 μg/mlの濃度で評価した。そのペプチドを、滅菌水に溶解し、使用前に濾過した。培地を、週に三回（月曜日, 水曜日および金曜日）交換した。曝露の終わりに、腺をホルマリンで固定した。
【０２１６】
結果を、カイ二乗分析およびフィッシャーの直接確率検定（Fisher's Exact Test）で分析した。
【０２１７】
MALの形態的分析（Morphometic Analysis）。MALの検査に関して、腺をアルムカルミン（alum carmine）で染色し、傷害の存在に関して評価した。腺を、乳房の傷害, 腺ごとの傷害の重症度, および因子の毒性の存在または非存在に関して点数をつけた。キシレンに保存した腺を、解剖顕微鏡下で各腺に関して、乳房の傷害の存在または非存在, 発生率, および重症度に関して評価した。乳腺を乳房傷害に関して陽性または陰性として点数をつけた。そして、パーセント発生率を、傷害を呈している腺の比とその群における腺の全体数（total number）として決定した。化学予防因子での治療が原因での管の拡張（Dilation of ducts）または乳房の構造の崩壊（disintegration of mammary structure）は、毒性作用と考えられた。データを、潜在的な化学予防因子の有効性を決定するために発生率に関して統計分析にかけた。
【０２１８】
図 1Aは、DMBA処理した腺における小窩傷害およびDMBAと化学予防因子で処理された腺の比較の代表的な写真を示す。小窩傷害の発生におけるp28の効果は、図1B-1Fに示され、図 2で要約される。ペプチド p28は、25 μg/mlの濃度で67%までMAL 形成を阻害した。さらに100 μg/mlまで濃度を増加させることによって、ペプチドの有効性は増強しなかった。ペプチドとアズリンの比較によって、p28がMAL発生に関してアズリンと同様に効果的であることが指摘された。50 μg/mlの濃度のアズリンによって、67%の阻害が生じた。統計学的分析によって、12.5 μg/mlよりも高い濃度でDMBA対照と比べて、p28の効果が統計的に有意であることが指摘された（(p<0.01, フィッシャーの直接確率検定; Chi二乗分析）。
【０２１９】
MDLの組織病理学的な評価。MDLに関して、腺の組織病理学的な評価をおこなった。腺を長軸方向で5-ミクロンの切片にきり、エオシンヘマトキシリンで染色した。各々の腺の長軸方向の切片を、幾つかの場（fields）に分けて、各々の場を管傷害に関して評価した。Mehta等〔J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)〕。要約すると、全体の腺を、顕微鏡下で評価した；  小さな腺は、大きな腺と比較して少数のトータルの場（total fields）を有する。従って、各々の腺は、可変数（variable number）の場を有する。しばしば管の全体をとおした切片の数も、腺の間で非常に変動する。このことによって、群の間で可変数が生じる。管の過形成または非定型性（atypia）を含んでいる場を、決定し、各々の腺に関して評価した場の総数と比較した。過形成または非定型性および重度に閉塞した腺の間で識別はなされない。これらの組織学的なパターンの何れかを含んでいる何れかの場は、傷害に関して陽性と考えられた。処理群を重症度に関して対照と比較し、パーセント阻害を計算した。
【０２２０】
図 3は、代表的な管傷害を示している。DMBAは、過形成, 非定型性から管の完全な閉塞に変化する管傷害を誘導する。管傷害の比/管の切片の総数を決定した。また、12.5 μg/mlの濃度のp28によって、僅かMDL形成の15%を抑制した。しかしながら、25 μg/mlで50 μg/mlのアズリンで観察されたものと匹敵する傷害の有意な阻害が認められた。12.5 μg/mlよりも高い濃度でのp28の有効性は、統計的に有意であった(p<0.01, フィッシャーの直接確率検定)。これらの結果は、図4に要約される。しばしば化学予防因子の効果は、MAL および MDLの間で区別できる。例えば、タモキシフェンは、MDLの発生を阻害したが、MALの発生を阻害しなかった。アズリン および p28が両方のエストロゲンおよびプロゲステロン依存的な管傷害と同様に非依存性の小窩傷害を阻害したことは興味深い。
【０２２１】
この例によって、p28 および アズリンの両方が乳房組織における前癌性の傷害の発生を予防できることが指摘される。従って、p28 および アズリンを哺乳類の患者における化学予防因子として使用しえる。
【０２２２】
例 2:  遺伝子送達のための潜在的なベクターとしてのキュプレドキシンおよび誘導体ペプチドによる癌細胞の選択的な貫通
アズリン（キュプレドキシンファミリーのタンパク質のメンバー）が、緑膿菌から単離され、インビトロおよびインビボで、癌細胞に進入し、p53-媒介性のアポトーシスを誘導することを我々は実証した。遺伝子送達のための潜在的なベクターとしての陽イオン性および陰イオン性のキュプレドキシンおよび誘導体ペプチドの貫通の選択性を評価した。次のキュプレドキシンを試験した：  アズリン(14kDa, pI 5.7), ラスティシアニン(17kDa, pI 8.0), および プラストシアニン(11kDa, pI 5.4)。アズリンが最も選択的な貫通を有していたことを結果は指摘した。
【０２２３】
アズリン (azu)の25 アミノ酸(a.a.)断片を合成し、種々の癌および組織学的に適合した正常細胞への貫通を評価した。共焦点顕微鏡観察およびフローサイトメトリー(FACS)分析によって、Alexafluor 568(800Da)で標識された18 アミノ酸(1.7kDa, azu 50-67) 断片(p18)が選択的にヒトメラノーマ (Mel-2,7,29), 乳房(MCF-7), 卵巣(SK-OV3), 膵臓(CAPAN-2), グリア芽細胞腫(LN-229), 星細胞腫(CCF-STTG1), 前立腺(LN-CAP), および腎臓(ACHN-CRL1611)の細胞株に進入することが、それぞれの対照には進入しないことが示された。LDH放出および溶血アッセイによって、p18が貫通の間に癌細胞膜構造を破壊しない又はヒト赤血球の溶血を生じないことが示され、p18が膜構造を破壊することなくヒト癌細胞を貫通することを示唆している。細胞インターナリゼーションの特異的なインヒビター（サイトカラシン D; アクチン重合の阻害, タキソール; 微小管脱重合の阻害, クロルプロマジン; クラスリン媒介性エンドサイトーシスの阻害, アジ化ナトリウム; 代謝性の阻害, またはスタウロスポリン; 細胞周期阻害）でのMel-2細胞の前処理は、p18の貫通に無視できる影響を有していた。しかしながら、Mel-2 細胞とニスタチン(カベオラ形成インヒビター)およびブレフェルジンA(ゴルジ体崩壊因子)のインキュベーションによって、有意にp18の貫通が阻害され、エンドサイトーシスプロセスが部分的にp18の貫通に関与しえることを示唆している。異種移植されたメラノーマを担持している胸腺欠損マウスにおいて赤外線色素(λem 800nm)で標識したp18のイメージングによって、正常な器官および組織に蓄積することなく選択的に一次のs.c.腫瘍に取り込まれ、遠い器官に転移することが明らかに実証された。本発明のペプチド（一態様において、p18を含んでいる）は、それ自体として、遺伝子(または任意のDNA/RNA断片)治療のための非ウイルス性ベクターとして顕著な有用性を有している。
【０２２４】
例3 - プラスミドの構築
融合体グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)-短縮型wt-アズリン(azu)誘導体を発現しているプラスミッドを、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって構築した。図5は、様々な短縮型のwt-アズリン構築物の模式図を示す。pGST-azu 36-128（配列番号34）に関して、増幅されたＰＣＲ断片を、市販のGST発現ベクターpGEXSX(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855)のBamHlおよびEcoRl部位に導入した。前記断片を、鋳型としてpUC19-azuおよびプライマー, 5'-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC-3'(配列番号35)および5'-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3'(配列番号36)で増幅した（配列中の付加的に導入したBamHlおよびEcoRl部位を、それぞれ下線で示した）。azu遺伝子のカルボキシル末端短縮を、QuickChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA 92037)を用いて停止コドンを導入することによって累積的に行なった。
【０２２５】
pGST-azu 36-50(配列番号37), pGST-azu 36-77(配列番号38)およびpGST-azu 36-89(配列番号39)に関して、停止コドンを、それぞれSer51, Ser78, およびGly90に導入した。pGST-azu 36-128を保持しているプラスミドを、鋳型ＤＮＡとして使用した。部位特異的変異誘発に関する３つのセットのオリゴヌクレオチドを、以下に示す。pGST-azu 36-50に関して:  5'-GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCC GCC GAC ATG CAG-3' (配列番号40), および5'-CTG CAT GTC GGC GGC GGT TCA CAG TAC CCA GTT GTG GCC-3' (配列番号41)。pGST-azu 36-77に関して:  5'-CCT GAA GCC CGA CGA CTG ACG TGT CAT CGC CCA CAC C-3' (配列番号42)および5'-GGT GTG GGC GAT GAC ACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G-3' (配列番号43)。pGST-azu 36-89に関して:  5'-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGAAGG ACT CGG TGA CC-3' (配列番号44), および5'-GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG-3 (配列番号45)。プラスミドpGST-azu 50-77およびpGST-azu 67-77を、pGST-azu 36-77を鋳型DNAとして用いるPCRによって産生した。
【０２２６】
増幅したPCR断片（azu 50-77およびazu 67-77）を、フォワードプライマー5'-CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACA TGC AGG G-3' (配列番号46) および5'-CGGGATCC CCG GCC TGG ACA AGG ATT ACC TGA AGC CCG-3 (配列番号47)を用いて取得した（配列中の付加的に導入したBamHI部位は、下線で示される）。リバースプライマー5'-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3'(配列番号48)を、双方のケースで使用した。
【０２２７】
gst-azu 50-77を保持しているプラスミドを、オリゴヌクレオチド  5'-GAC GGC ATG GCT TCC TGA CTG GAC AAG GAT TAC C -3' (配列番号49), および5'-GGT AAT CCT TGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC- 3' (配列番号50)を用いて、Gly67に停止コドンを導入することによってpGST-azu 50-66を産生するために使用した。緑色蛍光タンパク質をコード化している緑色蛍光タンパク質遺伝子(gfp)も、PCRで増幅した。使用したフォワードおよびリバースプライマーは、各オリゴヌクレオチドの5’端にBamHlおよびEcoRI部位を含んでいる5'-CGGGATCC CCA TGG TGA GCA AGGGCG-3' (配列番号51) および5'-CGGAATTC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC G-3' (配列番号52)であった。結果として生じるPCR断片を、pGST-GFPを作出するためにpGEXSXベクターへと連結した。gst-gfp-azu 50-77を保持しているプラスミドDNAを調製するために、azu 50-77遺伝子を、鋳型としてpGST-azu 50-77とプライマー5'-CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CATGCA GGG-3' (配列番号53)および5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGC TCA GTC GTC GGG CTT CAG GTA ATC C-3' (配列番号54)とでＰＣＲで増幅した（配列中の導入したXhoIおよびNotI部位を、それぞれ下線で示す）。精製したazu 50-77断片を、XholおよびNotlにユニークな制限酵素部位でpGST-GFPに導入した。
【０２２８】
例4 - タンパク質の精製
Wt-アズリンおよびM44KM64E突然変異体アズリンを、文献〔Yamada, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, pp. 4770-75 (2004), および同時係属の米国特許出願第10/720,603（この出願の内容は、参照によって援用される）〕に記載のとおり、調製し、精製した。要約すると、wt-アズリン遺伝子を、文献〔Kukimoto et al., FEBS Lett, vol. 394, pp 87-90 (1996)〕に記載の方法にしたがってPCRで増幅した。PCRを、緑膿菌株PAO1からのゲノムDNAを鋳型DNAとして用いて行なった。
【０２２９】
545bpの増幅したＤＮＡ断片（HindlllおよびPstlで消化した）を、pUC19の対応している部位に挿入し、アズリン遺伝子をlacプロモーターの下流に配置して、発現プラスミドpUC19-azuAを得た。大腸菌JM109を、アズリン遺伝子を発現させるための宿主株として使用した。組換え型の大腸菌株を、50μg ml-1アンピシリン, 0.1mM IPTG;および0.5mM CuSO4を含有している2YT培地中で、16h、37°Cで培養して、アズリンを産生させた。
【０２３０】
M44KM64E突然変異体アズリンの調製に関して、アズリン遺伝子の部位特異的突然変異誘発を、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて行なった。突然変異を、DNAシークエンシングで確認した。  
【０２３１】
プラスミドDNA（Acidithiobadilus ferrooxidansのキュプレドキシンラスティシアニンをコード化しているrus遺伝子を保持しているpET9a）を、ササキカズヒコ博士（Central Research Institute of Electric Power Industry, Chiba, Japan）から取得した。
【０２３２】
ラスティシアニンを、ササキの方法〔Sasaki, K., et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 67, pp. 1039-47 (2003)〕を若干修正した方法を用いて、rus遺伝子を保持している大腸菌BL21(DE3)から単離した。簡単に説明すると、酢酸緩衝剤(pH4.0)およびCM-セファロース(Sigma Chemicals, St. Louis, MO 63178)を、β-アラニン緩衝剤(pH4.0)およびTSK-ゲルCM-650カラム(Tosoh Bioscience, LLC, Montgomeryville, PA 18936)の代わりに使用した。２つの他の精製されたキュプレドキシン（Phormidium laminosumからのプラストシアニンおよびAchromobacter cycloclastesからのシュードアズリン）は、それぞれDr. Beatrix G.（Schlarb-Ridley, University of Cambridge, UK）およびDr.Christopher Dennison（University of Newcastle Upon Tyne, UK）から取得した。
【０２３３】
全ての組換え型のGST-融合誘導体を、以下のとおり精製した：大腸菌BL21を宿主株として使用した。Lブロス中で0.4mMのIPTGで誘導後の初期の対数増殖期に、GST-融合タンパク質を、細胞抽出物からグルタチオンセファロース4Bアフィニティークロマトグラフィーおよびセファデックス75ゲル-濾過カラムとPBS(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855)を用いて精製した。精製タンパク質（wtアズリンおよびGST-誘導体または他のキュプレドキシン）を、ALEXA FLUOR(登録商標)(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 97402)で標識し、製造者の説明書にしたがって単離した。非結合性の遊離している蛍光化学薬品を、ゲル濾過カラムで除去した。
【０２３４】
例5 - 細胞培養
J774およびUISO-Mel-2細胞(Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maryland U.S.A.から利用可能)を、文献〔Yamada, T. et al.  Infect. Immun. vol. 70, pp. 7054-62 (2002); Goto, M., et al. Mol. Microbiol. vol. 47, pp. 549-59 (2003);およびYamada, T., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 99, pp. 14098-103 (2002)、これらの文献の内容は、参照によって援用される〕に記載のとおり培養した。ヒトの正常な線維芽細胞〔University of Illinois at Chicago (UIC), Chicagoの外科部の保存培養コレクション〕を、2mM L-グルタミン, 0.1mM MEM必須アミノ酸を含有しているEagleの塩と10%の熱不活化ウシ胎児血清、100ユニット/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンとを添加されたＭＥＭ中で培養した。MCF-7およびMOF-10F細胞を、文献〔Punj et al. Oncogene 23:2367-78 (2004)〕に記載のとおり培養した。
【０２３５】
例6 - J774, UISO-Mel-2および線維芽細胞の共培養および共焦点顕微鏡観察
J774, UISO-Mel-2, および線維芽細胞を、個々のカバーガラス上で培養した。一晩インキュベーションした後、前記細胞を新鮮な培地で洗浄した。全ての３つの細胞株を、200μg/mlのwt-アズリン結合型ALEXA FLUOR(登録商標)568を含有している培養皿に配置した。前記細胞を、0.5または3.5h、37゜Cで5%C02の存在下でインキュベートした。
【０２３６】
顕微鏡サンプルの調製に関して、細胞を、一晩37゜Cでカバーガラス上で培養した。培養した細胞を、タンパク質処理前に、37゜Cまたは4゜Cに2h配置した。予め温めた37゜Cの新鮮な培地または氷冷の4゜Cの新鮮な培地を、赤色蛍光〔ALEXA FLUOR(登録商標)568で標識した〕キュプレドキシン又はGST-融合誘導体と混合し、細胞とインキュベートした。前記細胞を、ＰＢＳで洗浄し、メタノールで-20゜C、5min固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、核を染色するために1.5μg/mlの4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含有しているマウンティングメディア（VECTASHILD, Vector, Burlingame, CA）を添加した後、画像を共焦点顕微鏡で取得した。
【０２３７】
例7 - キュプレドキシンのJ774細胞への進入
Wt-アズリン、その変異体バリアント、M44KM64E、プラストシアニン、シュードアズリン、およびラスティシアニンを、J774細胞と例6でのとおりインキュベートし、細胞を共焦点顕微鏡で検査した。これらの実験において、キュプレドキシンを、赤色の蛍光を発するALEXA FLUOR(登録商標)568と結合し、J774細胞と200μg/mlの濃度で1hr、37゜Cでインキュベートした。そして、別の実験において、野生型のアズリンおよびラスティシアニンを、J774細胞と約6〜7μＭの濃度で1hr、37゜Cでインキュベートした。核を、DAPIで青色に染色した。タンパク質なしのコントロールを、維持した。全例において、キュプレドキシンが、J774細胞のサイトゾルに進入することが認められた。類似する実験において、アウラシアニンAおよびBは、MCF7癌細胞に優先的に進入し、非癌性のコントロール細胞には進入しない。
【０２３８】
例8 - Wt-アズリンおよびラスティシアニンの様々な細胞タイプへの進入
Wt-アズリンは、MCF-7細胞と対比して、MCF-10F細胞に対し減弱した細胞毒性活性を呈する。Punj等〔 Oncogene 23:2367-2378 (2004)〕。J774, 腹腔マクロファージ, 肥満細胞, ヒト乳癌MCF-7およびヒト正常上皮のMCF-10F細胞〔University of Illinois at Chicago (UIC), Chicagoの外科部門〕を、例５のとおり処理し、検査し、そして、試験して、wt-アズリンが係る細胞に進入するかどうかを決定した。
【０２３９】
Wt-アズリンは、45mmのインキュベーションの間にJ774細胞にインターナライズした。対照的に、それは腹腔マクロファージまたは肥満細胞に非常に非効率的にインターナライズした。6hrのインキュベーション後であっても、係る細胞は、僅か限定的な進入しか示さなかった。同様に、wt-アズリンは乳癌MCF-7細胞に効率的に進入するが、正常な哺乳類MCF-10F細胞には非常に減少した進入率を示した。
【０２４０】
ALEXA FLUOR(登録商標)結合型アズリンは、UISOMel-2およびMCF-7癌細胞に効率的に進入したが、正常な哺乳類MCF10A1細胞には進入しなかった。しかしながら、ALEXA FLUOR(登録商標)結合型ラスティシアニンは、UISO-Mel-2およびMCF-7癌細胞のサイトゾルに進入するのみならず、正常なMCF10A1細胞にも進入した。ラスティシアニンがサイトゾルにおいて均質に分布する癌細胞とは異なり、MCF10A1細胞では多くのラスティシアニンは核を取囲む核膜腔（perinuclear space）に隔離された。
【０２４１】
例9 - Wtアズリン媒介性の細胞毒性および成長阻害
様々な細胞中でのwt-アズリンの進入の特異性を更に評価するために、我々は、Alexa fluor-結合型wt-アズリンの、J774、UISO-Mel-2および正常な線維芽細胞への37゜Cで30minおよび3.5hrでのインキュベーションの間での進入を決定した。Wt-アズリンが、J774およびUISO-Mel-2に30mmで急速に進入することが認められた；非常に少量のwt-アズリンが、この期間に線維芽細胞のサイトゾルで認められた。3.5hrのインキュベーション後に、僅かに少量のwt-アズリンが線維芽細胞において認められた。
【０２４２】
3(4,5ジメチルチアゾール-2-イル-2,5テトラゾリウム臭化物)(MTT)アッセイを、wt-アズリンの細胞毒性の測定に関して、文献〔Yamada, T., et al. Infect. Immun. 70:7054-62 (2002), Goto, M., et al.  Mol. Microbiol 47:549-59 (2003),および２００３年１１月２４日に出願された同時係属の米国特許第10/720,603、これらの文献の内容は参照によって援用される〕に記載のとおり行なった。図1(b)は、顕著なwt-アズリン媒介性の細胞毒性が、24hrインキュベーションの間でJ774およびUISO-Mel-2細胞でのみ観察されたことを示している。
【０２４３】
M44KM64E突然変異体アズリンは、非常に僅かなアポトーシス誘導活性をJ774細胞において示し、1mg/mlの濃度でＧ１からＳ期への細胞周期進行を有意に阻害（約９５％）した。細胞周期進行を、フローサイトメトリーで文献〔Hiraoka, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101:6427-32 (2004) およびYamada, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:4770-75 (2004)、これらの文献の内容は参照によって援用される〕に記載のとおり分析した。図1(a)は、線維芽細胞が500μg/mlまたは1mg/mlのM44KM64E突然変異体アズリンで処理される場合に、細胞周期進行の阻害の程度は約２０％であったことを示している。
【０２４４】
例10 - Wt-アズリンの線維芽細胞およびMCF-10F細胞へのマイクロインジェクション
Wt-アズリンを、文献〔Punj, V., et al., Oncogene 23:2367-78 (2004)〕に記載の方法を用いて、線維芽細胞およびMCF-10F細胞へとマイクロインジェクションした。細胞を、核ＤＮＡの凝縮および断片化へと誘導するアポトーシス誘導に関して検査した。有意な核DNA(DAPIで青色に標識された)の凝縮および断片化が、wt-アズリンでマイクロインジェクションした単一細胞で5hrインキュベーション後に観察されたが、アズリンで30min間インキュベーションされたものでは認められなかった。
【０２４５】
例11 - Wt-アズリン融合誘導体の37゜Cでのインターナリゼーション
ＮおよびＣ末端の双方で切断されたwt-アズリンの一連のGST融合体を、例１に記載のとおり調製し、精製した〔図2(a)および2(b)〕。ALEXA FLUOR(登録商標)568結合型wt-アズリン、GSTおよびGST-azu融合誘導体を用いて、J774細胞における37゜Cで1hrのインキュベーションでのインターナリゼーションを例５に記載の方法で検査した。核を、DAPIで青色に染色した。
【０２４６】
wt-アズリンがインターナライズした間に、GSTは細胞の周囲に残存し、インターナライズしていなかった。GST-azu 36-128およびGST-azu 36-89は、GST-azu 36-77のようにインターナライズした。しかしながら、更に短縮化によって、次の事項が実証された；その事項とは、GST-azu 50-77はインターナライズするが、GST-azu 36-50は高度に非効率的であることであり、表面に凝集塊（clumps）を形成しているようにみえたことである。
【０２４７】
例12 - アズリン融合誘導体の4゜Cでのインターナリゼーション
wt-アズリンおよびGST-azu融合誘導体のインターナリゼーションが、4゜CでインキュベーションされたJ774細胞で検査された。4゜Cで、J774細胞の内側での1hrのインキュベーションの間のインターナリゼーションは、重度に損傷された。類似する損傷は、GST-azu 36-128およびGST-azu 36-89においても認められた。短いGST-azu 36-77, GST-azu 50-77, GST-azu 50-66およびGST-azu 67-77は、4゜Cでインターナリゼーションの重篤な損傷を実証した。
【０２４８】
例13 - GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質の、J774およびメラノーマUISO-MeI-2細胞中でのエネルギー依存的なインターナリゼーション
GSTをGFPと融合して、GST-GFP融合誘導体を作出した。さらに、azu 50-77を、GST-GFP(Mr 53kDa)融合タンパク質と融合した(図6(a))。精製したGST、GST-GFP、およびGST-GFP-azu 50-77融合誘導体の移動度を、SDS-PAGEで検査した〔図6(b)〕。検出を、クーマシーブルー染色および抗-アズリン抗体を用いたウエスタンブロッティングで行なった〔図6(c)〕。
【０２４９】
様々な濃度のGST-GFPで処理されたJ774細胞のフローサイトメトリーでの決定によって、このタンパク質がJ774細胞に結合することが示された。GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質の濃度を増加させて処理したJ774細胞のフローサイトメトリーでの分離によって、GST-GFP単独よりも有意に減少した蛍光が実証された（図7）。哺乳類細胞におけるGFPのインターナリゼーションが、蛍光の損失に至ることが知られていることが注意される。この蛍光の減少は、J774細胞が200μg/mlのGST-GFP-azu 50-77融合タンパク質で処理され、37゜Cで増加時間でインキュベートした際にも明瞭である。
【０２５０】
GST-GFPおよびGST-GFP-azu 50-77の結合およびインターナリゼーションプロフィールにおいて何らかの差異が存在するかどうかを決定するために、J774およびUISO-Mel-2細胞の両方を、GST-GFPおよびGST-GFP-azu 50-77と37゜Cおよび4゜Cでインキュベートした。共焦点顕微鏡を用いて、緑色蛍光の位置を測定した。J774細胞において、GST-GFP融合タンパク質は、表面に結合し、37゜Cおよび4゜Cの両方でインターナライズしなかった。対照的に、GST-GFP-azu 50-77は、37゜Cでインターナライズすることが認められたが、4゜Cでは認められなかった。UISO-Mel-2細胞において、GST-GFP融合タンパク質は、37゜Cおよび4゜Cの両方で表面に保持された。対照的に、J774細胞と類似して、GST-GFP-azu 50-77融合タンパク質は、37゜Cでインターナライズすることが認められたが、4゜Cでは認められなかった。
【０２５１】
例14 - 細胞膜浸透およびエンドサイトーシス機構による、Wt-アズリンの哺乳類細胞への進入
wt-アズリンの進入がレセプター媒介性エンドサイトーシスのみに依存する場合、それをプロトノホアカルボニルシアン化  m-クロロフニルヒドラゾン(CCCP；protonophore carbonyl cyanide m-chlorophrnylhydrazone)、エネルギー産生のミトコンドリアの脱共役因子（uncoupler）、または前記レセプターをブロックする、非標識のアズリンもしくは他のキュプレドキシンとのプレインキュベーションによってブロックすることができる。J774およびUISO-MeI-2細胞をキュプレドキシンと10倍過剰濃度で2hr、4゜Cでインキュベートし、細胞を徹底的に洗浄してキュプレドキシンを除去し、ALEXA FLUOR（登録商標）568-結合アズリンと1hr、37゜Cでインキュベートした。キュプレドキシンで処理されなかった細胞におけるものと、同量のインターナライズしたアズリンが存在した。細胞の微小繊維ネットワークを破壊するレセプター媒介性エンドサイトーシスの既知の阻害剤であるサイトカラシンD（Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo 63195から市販されている）およびゴルジ装置を破壊し、古典的なベシクル媒介性の分泌を阻害することが知られているブレフェルジン(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo 63195から市販されている)の効果も、試験された。CCCPを20pM濃度で処理することによって、0.25〜0.5pMのサイトカラシンDでなされたように、UISO-MeI-2細胞におけるアズリンの摂取が有意に減少された。他方で、ブレフェルジンA（Brefeldin A）は、有意な効果を有していなかった。
【０２５２】
例15 - GST-PEDIII-azu 50-77融合誘導体の、UISO-Mel-2細胞への進入
緑膿菌の外毒素AドメインIII(PEDIII)のGST-融合体を、文献〔Hwang, J. et al., Cell 48:129-36 (1987); Reiter, Y. and Pastan, I., Trends Biotechnol. 16:513-20 (1998)〕に記載のとおり、構築した。このGST-PEDIII融合誘導体は、外毒素Aのアミノ酸381〜613を含有していた。PEDIIIは、ADP-リボシルトランスフェラーゼ活性を保持していることが知られており、真核細胞における細胞タンパク質合成を真核生物の伸長因子2を阻害することによって阻害する。
【０２５３】
GST-GFP-azu 50-77に関して記載されたとおりPCRを用いて、azu 50-77配列をGST-PEDIII融合タンパク質のカルボキシル末端に導入した（図8(a)）。これら２つの融合タンパク質 (GSTPEDIIIおよびGST-PEDIII-azu 50-77)を、グルタチオンセファロース4Bカラムクロマトグラフィーで、52および54kDaのタンパク質として精製した(図8(b))。UISO-Mel-2および正常な線維芽細胞(FBT)細胞を、次に24h、37゜Cで様々な濃度のこれらのタンパク質とインキュベートし、細胞死の程度を例9に記載のとおりＭＴＴアッセイで測定した。
【０２５４】
GST-PEDIIIは僅かに低い細胞毒性を実証しているが、GST-PEDIII-azu 50-77融合タンパク質は高い細胞毒性を有している〔というのもUISO-Mel-2細胞に効率的に進入するからである〕（図8(c)）。対照的に、融合タンパク質は、線維芽細胞に対する低いレベルの細胞毒性を実証した。
【０２５５】
例16 - wt-アズリンにおけるα-ヘリックスの不安定化は、そのUISO-Mel-2細胞へのインターナリゼーションに実質的な影響を有さない
α-ヘリックスがアズリン進入において役割を担っているかどうかを検査するために、３つのヘリックス不安定化プロリン残基をwt-アズリンのポジション54、61、および70に導入し（図６）、完全長A54PT61PK70P変異体アズリンのUISO-Mel-2細胞への進入を検査した。また、これらのポジションにおける単一及び二重の変異を、構築し、進入に関して試験した。A54PT61PK70P突然変異体アズリンを、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、アズリン遺伝子に部位特異的突然変異誘発を行うことによって調製した。
【０２５６】
前記突然変異体を、200μg/mlでUISO-Mel-2細胞と1hr、37°Cでインキュベートし、その後に蛍光を共焦点顕微鏡で測定した。全例において、ALEXA FLUOR(登録商標)568-結合型変異体アズリンは、UISO-Mel-2細胞に進入した。同様に、GST-GFP-azu 50-77 融合タンパク質（同様に、その3重のA54PT61PK70P azu変異体バリアント）がUISO-Mel-2細胞への進入に関して検査された場合に、有意な差異は観察されなかった。
【０２５７】
例17 - GST-PEDIII-ラスティシアニン融合誘導体のUISO-Mel-2細胞への進入
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の外毒素AドメインIII(PEDIII)のGST-融合体を、例15のように構築した。PCRをGST-GFP-azu 50-77に関して記載のように用いて、完全長のラスティシアニン配列を、GST-PEDIII融合タンパク質のカルボキシル末端に導入した。前記融合タンパク質を、グルタチオンセファロース4Bカラムクロマトグラフィーで精製した。UISO-Mel-2およびFBT細胞を24h、37゜Cで様々な濃度の前記融合タンパク質とインキュベーションし、細胞死の程度を例７に記載のとおりＭＴＴアッセイで測定した。
【０２５８】
GST-PEDIII-ラスティシアニン融合タンパク質は、UISO-Mel-2細胞に対して高い細胞毒性を呈した(図9)。対照的に、融合タンパク質は、FBT細胞に対して僅か低いレベルの細胞毒性を示した。
【図２】
2014237640.tif 000007
【図４】
2014237640.tif 000008
【図６Ａ】
2014237640.tif 000009
【図６Ｂ】
2014237640.tif 000010
【図６Ｃ】
2014237640.tif 000011
【図７Ａ】
2014237640.tif 000012
【図８ｃ】
2014237640.tif 000013
【図９】
2014237640.tif 000014
【図１Ａ】
2014237640.tif 000015
【図１Ｂ】
2014237640.tif 000016
【図１Ｃ】
2014237640.tif 000017
【図１Ｄ】
2014237640.tif 000018
【図１Ｅ】
2014237640.tif 000019
【図１Ｆ】
2014237640.tif 000020
【図１Ｇ】
2014237640.tif 000021
【図３】
2014237640.tif 000022
【図５】
2014237640.tif 000023
【図７Ｂ】
2014237640.tif 000024
【図７Ｃ】
2014237640.tif 000025
【図８ａ】
2014237640.tif 000026
【図８ｂ】
2014237640.tif 000027
【配列表】
2014237640000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月27日(2014.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のアズリン残基50〜77, 緑膿菌のアズリン残基50〜67, 緑膿菌のアズリン残基36〜88, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列からなる単離されたペプチドと、薬学的に許容される担体とを含み、前記ペプチドが、哺乳類の患者における前悪性障害の発生を阻害するために治療上効果的な量存在する、薬学的組成物。
【請求項２】
請求項1に記載の薬学的組成物であって、前記薬学的組成物が、静脈内注射, 筋肉内注射, 皮下注射, 吸入, 局所的投与, 経皮性のパッチ, 坐剤, 硝子体注射および経口投与からなる群から選択される様式での投与のために製剤化される、薬学的組成物。
【請求項３】
前記様式が静脈内注射である、請求項2に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
請求項1に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物は少なくとも一つの他の化学予防薬と組み合わせて使用される、薬学的組成物。
【請求項５】
請求項1に記載の薬学的組成物であって、前記単離されたペプチドがカーゴ化合物とカップルされた薬学的組成物。
【請求項６】
前記カーゴ化合物がDNA、RNAまたはアンチセンス分子である、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記カーゴ化合物が哺乳類の癌細胞を遅延させる又は殺傷する、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記カーゴ化合物が毒素または細胞毒性薬である、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記カーゴ化合物がタンパク質およびポリペプチドからなる群から選択され、前記単離されたペプチドが前記カーゴ化合物に連結されて融合タンパク質を形成する、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項5に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物が静脈内、局所、皮下、筋肉内、および腫瘍内からなる群から選択される経路での投与のために製剤化される薬学的組成物。
【請求項１１】
患者における前記カーゴ化合物の位置の検出により癌を画像処理するための薬学的組成物であって、カーゴ化合物にカップルされた単離されたペプチドを含み、前記単離されたペプチドは、哺乳類の癌細胞に選択的に進入し、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のアズリン残基50〜77, 緑膿菌のアズリン残基50〜67, 緑膿菌のアズリン残基36〜88, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列からなり；前記カーゴ化合物が検出可能な物質である、薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項11に記載の薬学的組成物であって、前記カーゴ化合物はＸ線造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置がＸ線CTで検出される薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項11に記載の薬学的組成物であって、前記カーゴ化合物は磁気共鳴映像法の造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置がMRIで検出される薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項11に記載の薬学的組成物であって、前記カーゴ化合物は超音波造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置が超音波画像処理で検出される薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
GST-PEDIII-ラスティシアニン融合タンパク質は、UISO-Mel-2細胞に対して高い細胞毒性を呈した(図9)。対照的に、融合タンパク質は、FBT細胞に対して僅か低いレベルの細胞毒性を示した。
本願発明の実施態様は以下のとおりである。
（１）
キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物である単離されたペプチドであって、哺乳類組織において前悪性傷害の発生を阻害できる単離されたペプチド。
（２）
（1）に記載の単離されたペプチドであって、前記キュプレドキシンが、アズリン, シュードアズリン, プラストシアニン, ラスティシアニン, Laz, アウラシアニン, ステラシアニンおよびキュウリ塩基性タンパク質（cucumber basic protein）からなる群から選択される単離されたペプチド。
（３）
（2）に記載の単離されたペプチドであって、前記キュプレドキシンがアズリンである単離されたペプチド。
（４）
前記キュプレドキシンは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan,  Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosaおよびVibrio parahaemolyticusからなる群から選択される生物体に由来する、（1）に記載の単離されたペプチド。
（５）
緑膿菌に由来する、（4）に記載の単離されたペプチド。
（６）
配列番号1、3〜19からなる群から選択されるペプチドの一部である、（1）に記載の単離されたペプチド。
（７）
配列番号1、3〜19からなる群から選択される配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、（1）に記載の単離されたペプチド。
（８）
前記キュプレドキシンの短縮型である、（1）に記載の単離されたペプチド。
（９）
前記ペプチドは約 10 残基以上で約 100 残基以下である、（8）に記載の単離されたペプチド。
（１０）
緑膿菌のアズリン残基50〜77, 緑膿菌のアズリン残基50〜67, 緑膿菌のアズリン残基36〜88, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列を含む、（8）に記載の単離されたペプチド。
（１１）
緑膿菌のアズリン残基50〜77, 緑膿菌のアズリン残基50〜67, 緑膿菌のアズリン残基36〜88, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列からなる、（10）に記載の単離されたペプチド。
（１２）
残基50〜77, 残基50〜67および残基36〜88からなる群から選択される緑膿菌アズリンの領域と均等（equivalent）なキュプレドキシンの残基を含む、（1）に記載の単離されたペプチド。
（１３）
（1）に記載の少なくとも１つのキュプレドキシンまたはペプチドを薬学的に許容される担体中に含んでいる薬学的組成物。
（１４）
少なくとも２つのキュプレドキシンまたはペプチドを含む、（13）に記載の薬学的組成物。
（１５）
前記薬学的組成物が静脈内投与のために製剤化される、（13）に記載の薬学的組成物。
（１６）
前記キュプレドキシンは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan,  Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosaおよびVibrio parahaemolyticusからなる群から選択される生物体に由来する、（13）に記載の薬学的組成物。
（１７）
前記キュプレドキシンが緑膿菌に由来する、（16）に記載の薬学的組成物。
（１８）
（13）に記載の薬学的組成物であって、前記キュプレドキシンが配列番号1、3〜19からなる群から選択される薬学的組成物。
（１９）
哺乳類の患者を治療するための方法であって、前記患者に治療上効果的な量の（13）に記載の薬学的組成物を投与することを備える方法。
（２０）
前記患者がヒトである、（19）に記載の方法。
（２１）
前記患者が一般的な集団よりも癌を発生するリスクが高い、（19）に記載の方法。
（２２）
前記癌がメラノーマ, 乳房癌, 膵臓癌, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, 肺癌, 結腸直腸癌, 首および頭部癌（neck and head）, 膀胱癌, 前立腺癌, 皮膚癌, および子宮頚癌から選択される、（21）に記載の方法。
（２３）
前記患者が少なくとも一つの危険性が高い特性（high risk feature）を有する、（21）に記載の方法。
（２４）
前記患者が前悪性傷害を有する、（19）に記載の方法。
（２５）
前記患者は癌または前悪性傷害が治癒している、（19）に記載の方法。
（２６）
（19）に記載の方法であって、前記薬学的組成物が静脈内注射, 筋肉内注射, 皮下注射, 吸入, 局所的投与, 経皮性のパッチ, 坐剤, 硝子体注射および経口投与からなる群から選択される様式で投与される方法。
（２７）
投与の様式が静脈内注射である、（24）に記載の方法。
（２８）
（21）に記載の方法であって、前記薬学的組成物は少なくとも一つの他の化学予防薬と共投与される方法。
（２９）
（26）に記載の方法であって、前記薬学的組成物は別の化学予防薬とおよそ同時に投与される方法。
（３０）
（13）に記載の組成物をバイアル中に含んでいるキット。
（３１）
前記キットが静脈内投与のために設計される、（30）に記載のキット。
（３２）
癌の発生を研究するための方法であって、哺乳類細胞を（1）に記載のキュプレドキシンまたはペプチドと接触させること；及び前悪性および悪性の細胞の発生を測定することを含んでいる方法。
（３３）
前記細胞がヒト細胞である、（32）に記載の方法。
（３４）
前記細胞が乳腺細胞である、（32）に記載の方法。
（３５）
前記細胞が誘導されて癌を発生する、（32）に記載の方法。
（３６）
（1）に記載のペプチドをコード化する発現ベクター。
（３７）
キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物である単離されたペプチドであって；カーゴ化合物とカップルされ、哺乳類の癌細胞に選択的に進入できる単離されたペプチド。
（３８）
前記キュプレドキシンは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan,  Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosaおよびVibrio parahaemolyticusからなる群から選択される生物体に由来する、（37）に記載の単離されたペプチド。
（３９）
（37）に記載の単離されたペプチドであって、前記キュプレドキシンがアズリンである単離されたペプチド。
（４０）
（39）に記載の単離されたペプチドであって、前記アズリンが緑膿菌に由来する単離されたペプチド。
（４１）
配列番号 25を含む、（37）に記載の単離されたペプチド。
（４２）
配列番号 25からなる、（37）に記載の単離されたペプチド。
（４３）
前記キュプレドキシンの短縮型である、（37）に記載の単離されたペプチド。
（４４）
前記ペプチドは約 10 残基以上で約 100 残基以下である、（37）に記載の単離されたペプチド。
（４５）
緑膿菌のアズリン残基50〜77（配列番号2）, 緑膿菌のアズリン残基50〜67（配列番号25）, 緑膿菌のアズリン残基36〜88（配列番号26）, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列を含む、（37）に記載の単離されたペプチド。
（４６）
前記カーゴ化合物がDNAまたはRNAである、（37）に記載の組成物。
（４７）
前記カーゴ化合物がアンチセンス分子である、（46）に記載の組成物。
（４８）
前記カーゴ化合物が哺乳類の癌細胞を遅延させる又は殺傷する、（37）に記載の組成物。
（４９）
前記カーゴ化合物が細胞毒性薬である、（48）に記載の組成物。
（５０）
前記カーゴ化合物がタンパク質, リポタンパク質, ポリペプチド, ペプチド, ポリサッカライド, 核酸, 色素, 微小粒子, ナノ粒子, 毒素および薬物からなる群から選択される、（37）に記載の組成物。
（５１）
前記カーゴ化合物がタンパク質およびポリペプチドからなる群から選択され、前記ペプチドが前記カーゴ化合物に連結されて融合タンパク質を形成する、（37）に記載の組成物。
（５２）
前記カーゴ化合物が毒素である、（37）に記載の組成物。
（５３）
前記カーゴ化合物が検出可能な物質である、（37）に記載の組成物。
（５４）
（37）に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含んでいる薬学的組成物。
（５５）
細胞（a cell）または複数細胞（cells）を（37）に記載の組成物と接触させることを備える方法。
（５６）
（55）に記載の方法であって、前記細胞または複数細胞は癌に罹患している患者から由来し、さらに前記細胞または複数細胞を前記患者に再導入することを備える方法。
（５７）
前記細胞が癌細胞である、（55）に記載の方法。
（５８）
（57）に記載の方法であって、前記細胞が骨肉腫細胞, 肺の癌腫細胞, 結腸の癌腫細胞, リンパ腫細胞, 白血病細胞, 軟部組織の肉腫細胞, 乳房の癌腫細胞, 肝臓の癌腫細胞, 膀胱の癌腫細胞, メラノーマ細胞, 脳腫瘍細胞および前立腺の癌腫細胞からなる群から選択される癌細胞である方法。
（５９）
癌を伴う患者を治療する方法であって、（37）に記載の組成物が前記患者に治療上効果的な量で投与される方法。
（６０）
（59）に記載の方法であって、前記複合体が静脈内、局所、皮下、筋肉内、および腫瘍内からなる群から選択される経路で投与される方法。
（６１）
（59）に記載の方法であって、前記複合体は、別の癌治療と共に共投与される方法。
（６２）
患者の癌を画像処理するための方法であって、（53）に記載の組成物が前記患者に投与され、前記カーゴ化合物の位置が検出される方法。
（６３）
（62）に記載の方法であって、前記カーゴ化合物はＸ線造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置がＸ線CTで検出される方法。
（６４）
（62）に記載の方法であって、前記カーゴ化合物は磁気共鳴映像法の造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置がMRIで検出される方法。
（６５）
（62）に記載の方法であって、前記カーゴ化合物は超音波造影剤であり、前記カーゴ化合物の位置が超音波画像処理で検出される方法。
（６６）
癌を診断するための方法であって、細胞を（53）に記載の組成物と接触し、前記カーゴ分子の位置が検出される方法。
（６７）
（37）に記載の組成物を含んでいる試薬を具備するキット。
（６８）
（67）に記載のキットであって、薬学的に許容されるアジュバントまたは賦形剤を含んでいる試薬をさらに具備するキット。
（６９）
（67）に記載のキットであって、前記試薬を投与するためのビヒクルをさらに具備するキット。
【外国語明細書】
2014237640000001.pdf