(57)【要約】【課題】  長波長の光を放射でき，しかも生体組織に大きな影響を及ぼさないプローブを提供する【解決手段】  本発明は，１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の波長を放射できる蛍光プローブに関する。具体的には，本発明は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含む蛍光プローブなどに関する。この蛍光プローブの好ましい例は，Ｍ１Ｘ１から構成される内芯とＭ２Ｘ２から構成され外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の波長を放射できる蛍光プローブ。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光プローブであって，
水への溶解度が  ｇ／ｌ以上    ｇ／ｌ以下である蛍光プローブ。
【請求項３】
請求項１に記載の蛍光プローブであって，
量子ドットを含む蛍光プローブ。
【請求項４】
請求項１に記載の蛍光プローブであって，
Ｍ１Ｘ１から構成される内芯とＭ２Ｘ２から構成され外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含み，
前記Ｍ１は，Ｃｄ，Ｚｎ，Ｍｇ，Ｇａ，Ｈｇ，Ｃａ，Ｓｒ，Ｂａ，Ｉｎ，Ａｌ，Ｇｅ，Ｓｉ，Ｚｎ，及びＰｄのいずれか又は２種以上であり，
前記Ｘ１は，Ｏ，Ｓ，Ｓｅ，及びＴｅのいずれか又は２種以上であり，
前記Ｍ２は，Ｃｄ，Ｚｎ，Ｍｇ，Ｇａ，Ｈｇ，Ｃａ，Ｓｒ，Ｂａ，Ｉｎ，Ａｌ，Ｇｅ，Ｓｉ，Ｚｎ，及びＰｄのいずれか又は２種以上であり，
前記Ｘ２は，Ｏ，Ｓ，Ｓｅ，及びＴｅのいずれか又は２種以上である，
蛍光プローブ。
【請求項５】
請求項１に記載の蛍光プローブであって，
ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含む蛍光プローブ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の蛍光プローブであって，
さらに前記量子ドットの表面に結合した有機分子を含む，
蛍光プローブ。
【請求項７】
請求項６に記載の蛍光プローブであって，
前記有機分子は，グルタチオン又はグルタチオンの誘導体である，
蛍光プローブ。
【請求項８】
請求項１に記載の蛍光プローブであって，
有機化合物又は無機化合物を含む蛍光プローブ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光プローブを含む，血管造影剤。
【請求項１０】
ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する第１の量子ドットを含む第１の蛍光プローブを用いて第１の蛍光分析を行い第１の蛍光分析結果を得る第１の蛍光分析工程と，
ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有し，第１の量子ドットとはＰｂＳの内芯に対するＣｄＳの外殻の割合が異なる第２の量子ドットを含む第２の量子ポロー部を用いて第２の蛍光分析を行い第２の蛍光分析結果を得る第２の蛍光分析工程と， 
第１の蛍光分析結果及び第２の蛍光分析結果を用いて対象の蛍光分析を行う第３の蛍光分析工程と，
を含む，蛍光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，長波長領域の近赤外光を放射する近赤外プローブ，及びその近赤外プローブを用いた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光検出技術は，基礎生命科学研究や医療の分野で用いられている。一般に，蛍光検出技術は，可視光（例えば，波長が４００ｎｍ〜７００ｎｍの光）や比較的短波長の近赤外光（たとえば９００ｎｍ以下の光）を用いられていた。このため，従来の蛍光検出技術では，これらの光を放射するプローブが用いられていた。
【０００３】
可視光は，生体組織での散乱特性が高い。このため，可視光に反応するプローブを用いると生体の深部における情報を取得することが困難である。例えば，有機色素であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）は，比較的短波長の近赤外光（たとえば９００ｎｍ以下の光）を放出する。このため，ＩＣＧを用いることで，可視光を放射するプローブに比べて，生体の深部における情報を取得できる。
【０００４】
神隆「半導体量子ドット、その合成法と生命科学への応用」生産と技術第６３巻第２号（２０１１）５８頁〜６５頁（非特許文献１）には，半導体量子ドットを用いた蛍光プローブが提案されている。
【０００５】
特表２０１０−５２３５５７号公報（特許文献１）には，両親媒性ポリマーでカプセル化された半導体量子ドットを用いた蛍光プローブが提案されている。この文献には，ＣｄＳｅを内芯とし，ＺｎＳを外殻とした量子ドットを蛍光プローブとした実施例が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５２３５５７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】神隆「半導体量子ドット、その合成法と生命科学への応用」生産と技術第６３巻第２号（２０１１）５８頁〜６５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のとおり，長波長の光を放出するプローブを用いると，生体組織の影響を受けにくい蛍光分析を行うことができる。一方，プローブによっては，生体組織へ影響を及ぼすものがある。このため，長波長の光（長波長領域の近赤外光：例えば１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の光）を放射でき，しかも生体組織に大きな影響を及ぼさないプローブの開発が望まれる。上記被特許文献１においても，近赤外波長領域９００−１５００ｎｍで高輝度に発行する近赤外量子ドットの合成法の開発と生体イメージングへの応用が期待される旨が開示されている。そこで，本発明は，長波長の光（長波長領域の近赤外光：例えば１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の光）を高輝度に放射でき，しかも生体組織に大きな影響を及ぼさないプローブを提供することを第１の目的とする。
【０００９】
さらに，プローブを生体組織において用いるためには，プローブが水にある程度溶ける性質であることが望まれる。このため，本発明は，高い水溶性を示すプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の側面は，蛍光プローブに関する。この蛍光プローブは，１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の波長を放射できる。そして，この蛍光プローブの好ましいものは，水への溶解度が  ｇ／ｌ以上    ｇ／ｌ以下である。本発明は，通常の蛍光プローブに比べて長波長領域の蛍光を放射できる。また，本発明は，水への溶解性が高いため，蛍光プローブとして容易に用いることができる。
【００１１】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，Ｍ１Ｘ１から構成される内芯とＭ２Ｘ２から構成され外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含むものである。
Ｍ１及びＭ２は，同一でも異なっても良く，Ｃｄ，Ｚｎ，Ｍｇ，Ｇａ，Ｈｇ，Ｃａ，Ｓｒ，Ｂａ，Ｉｎ，Ａｌ，Ｇｅ，Ｓｉ，Ｚｎ，及びＰｄのいずれか又は２種以上である。
Ｘ１は及びＸ２は，同一でも異なってもよく，Ｏ，Ｓ，Ｓｅ，及びＴｅのいずれか又は２種以上である。
【００１２】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含む。実施例により実証されたとおり，この量子ドットを含む蛍光プローブは，蛍光領域や溶解性の面できわめて優れたものである。
【００１３】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，さらに量子ドットの表面に結合した有機分子を含む。この量子ドットの表面に結合した有機分子により，溶解性や，蛍光特性を調整することができる。有機分子の例は，グルタチオン又はグルタチオンの誘導体である。
【００１４】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，有機化合物又は無機化合物を含む蛍光プローブ。有機化合物又は無機化合物は，溶解性が高く，しかも好ましい蛍光特性を有するものであれば特に限定されない。
【００１５】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳのＰｂＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含む蛍光プローブである。この蛍光プローブの好ましい用途は，血管造影剤である。
【００１６】
本発明の第２の側面は，蛍光分析方法に関する。この蛍光分析方法は，先に説明した蛍光プローブを用いた蛍光分析方法であり。蛍光プローブとして上記したものを用い，測定する蛍光の波長領域を１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の所定の領域とする以外は，通常の蛍光分析と同様の方法を用いることができる。
【００１７】
本発明の蛍光分析方法の好ましい態様は，２つ又はそれ以上の種類の量子ドットを用いて複数段階蛍光分析を行うものである。この方法は，少なくとも第１の蛍光分析工程，第２の蛍光分析工程，及び第３の蛍光分析工程を含む。第１の蛍光分析工程は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する第１の量子ドットを含む第１の蛍光プローブを用いて第１の蛍光分析を行い第１の蛍光分析結果を得る工程である。第２の蛍光分析工程は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有し，第１の量子ドットとはＰｂＳの内芯に対するＣｄＳの外殻の割合が異なる第２の量子ドットを含む第２の量子ポロー部を用いて第２の蛍光分析を行い第２の蛍光分析結果を得る工程である。第３の蛍光分析工程は，第１の蛍光分析結果及び第２の蛍光分析結果を用いて対象の蛍光分析を行う工程である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば，長波長の光（長波長領域の近赤外光：例えば１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の光）を高輝度に放射でき，しかも生体組織に大きな影響を及ぼさないプローブを提供することができる。
【００１９】
さらに本発明は，高い水溶性を示すプローブを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は，コア・シェル構造を有する近赤外（２ｎｄ）量子ドットの合成に関し，コア・シェル構造を有する近赤外量子ドット合成過程の模式図である。
【図２】図２は，ＣｄＳシェル形成を通じたＰｂＳ近赤外量子ドットのスペクトル変化を示す。
【図３】図３は，クロロホルム中におけるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの蛍光スペクトルを示す。
【図４】図４は，ピーク波長が１３００ｎｍにおけるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの透過型電子顕微鏡写真である。スケールバーは上の図が２０ｎｍ，下の図が５ｎｍである。
【図５】図５は，クロロホルム中における，ＰｂＳ量子ドットおよびＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのスペクトル半値幅を示す。黒および赤の曲線は，各発光ピーク波長に対するＰｂＳ量子ドットおよびＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのスペクトル半値幅をそれぞれ示す。
【図６】図６は，水中，およびクロロホルム中における，ピーク波長１１００ｎｍの時のＰｂＳ量子ドットおよびＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの蛍光スペクトルおよび量子収率（ＱＹ）を示す。
【図７】図７は，光学特性測定実験の模式図である。
【図８】図８は，組織切片からの自己蛍光の顕微鏡写真を示す。
【図９】図９は，可視光，近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）蛍光イメージングを用いた，量子ドットに浸した１５μｍ多孔質ビーズの，組織切片を通じた顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は，脳および心臓の組織切片における，標準化された蛍光強度と切片の厚みとの関係を示すグラフである。
【図１１】図１１は，脳および心臓の組織切片における，半値全幅と切片の厚みとの関係を示すグラフである。
【図１２】図１２は，皮膚におけるシグナル背景比を示すグラフである。
【図１３】図１３は，脳および心臓の組織切片における，シグナル背景比と切片の厚みとの関係を示すグラフである。
【図１４】図１４は，リンパ管造影を目的とした，ＢＳＡ抱合型量子ドットの模式図である。
【図１５】図１５は，標準化された量子ドット溶液の輝度を示す。
【図１６】図１６は，マウスの全身画像を示す。
【図１７】図１７は，可視光，近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）蛍光イメージングを用いたリンパ管造影図を示す。
【図１８】図１８は，可視光，近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）蛍光イメージングを用いたプロファイル解析を示す。
【図１９】図１９は，貪食細胞が，抹消組織からリンパ管に外来性物質を輸送する模式図である。
【図２０】図２０は，酸化鉄，近赤外（２ｎｄ）量子ドット，およびローダミン６Ｇを含むケイ素粒子の模式図である。
【図２１】図２１は，ＢＳＡ抱合１１００ｎｍ量子ドット，および１３００ｎｍ量子ドットを含むケイ素粒子をマウス後足に注入し，タイムラプス撮影によって後足からリンパ管への輸送を可視化した際のマウス後足撮影写真である。
【図２２】図２２は，ＢＳＡ抱合１１００ｎｍ量子ドット（黄色），および１３００ｎｍ量子ドットを含むケイ素粒子（青色）による，リンパ管および血管のマルチスペクトル近赤外（２ｎｄ）イメージング。
【図２３】図２３は，酸化鉄を含むケイ素粒子注入前，および注入後２４時間におけるリンパ管のＭＲＩ画像を示す。
【図２４】図２４は，リンパ管切片の免疫染色画像を示す。
【図２５】図２５は，ケイ素粒子とともにリンパ管へと移動する貪食細胞のマルチスペクトル近赤外（２ｎｄ）タイムラプス画像である。
【図２６】図２６は，ピーク波長が１１００ｎｍ，１３００ｎｍ，１５００ｎｍであるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの，水中における流体力学的大きさを示すグラフである。
【図２７】図２７は，１３００ｎｍＰｂＳ／ＣｄＳおよびＰｂｓ量子ドットのＸ線回折パターンを示すグラフである。
【図２８】図２８は，１３００ｎｍＰｂＳ／ＣｄＳおよびＰｂｓ量子ドットの誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）分析を示すグラフである。
【図２９】図２９は，イメージングシステムの写真である。
【図３０】図３０は，イメージングシステムの模式図を示す。
【図３１】図３１は，背側から見たマウスの自家蛍光スペクトルを示す。
【図３２】図３２は，腹側から見たマウスの自家蛍光スペクトルを示す。
【図３３】図３３は，顕微鏡画像における自家蛍光の量的比較のためのグラフである。
【図３４】図３４は，積分球を用いた，皮膚，脳，および心臓における光学特性の分光学的分析に関し，減衰係数ｍｔのスペクトルを示す。
【図３５】図３５は，積分球を用いた，皮膚，脳，および心臓における光学特性の分光学的分析に関し，吸光係数ｍａのスペクトルを示す。
【図３６】図３６は，モンテカルロシミュレーションの模式図を示す。
【図３７−１】図３７−１は，モンテカルロシミュレーションによりシミュレートされた，異なる光学パラメータ，および組織厚における組織イメージを示す。
【図３７−２】図３７−２は，モンテカルロシミュレーションによりシミュレートされた，異なる光学パラメータ，および組織厚における組織イメージを示す。
【図３８】図３８は，酸化鉄，近赤外（２ｎｄ）量子ドット，およびローダミン６Ｇを含む水中のケイ素粒子の水力学的大きさを示す。
【図３９】図３９は，細胞生死判別分析を示すグラフである。
【図４０】図４０は，グルタチオン被覆ＰｂＳ量子ドットの模式図である。
【図４１】図４１は，溶液の明視野写真を示す。
【図４２】図４２は，４℃（９００ｎｍ付近にピーク），２５℃（１１００ｎｍ付近にピーク），５０℃（１２００ｎｍ付近にピーク）における標準吸光度，および標準化された蛍光スペクトルを示す。
【図４３】図４３は，異なる反応ｐＨにおける各温度の蛍光スペクトルを示す。
【図４４】図４４は，発光ピーク波長の概要プロットである。
【図４５】図４５は，合成したＰｂＳ量子ドットの透過電子顕微鏡写真である。
【図４６】図４６は，ＰｂＳ量子ドットのＸ線回折パターンを示すグラフである。
【図４７】図４７は，流体力学的直径のヒストグラムである。
【図４８】図４８は，ＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットの模式図である。
【図４９】図４９は，ＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドット処置後のディッシュの近赤外‐２イメージである。
【図５０】図５０は，ＢＳＡ‐ＰｂＳ量子ドット処置後のディッシュの近赤外‐２イメージである。
【図５１】図５１は，ＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットにおける，近赤外‐２蛍光密度のヒストグラムである。
【図５２】図５２は，ＢＳＡ‐ＰｂＳ量子ドットにおける，近赤外‐２蛍光密度のヒストグラムである。
【図５３】図５３は，様々な濃度のＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドット存在下において２４時間培養したのち，トリパンブルーを用いて染色した，ＫＰＬ４およびＨｅＬａ細胞の細胞生存率を示す。
【図５４】図５４は，生体外および生体内における活性型免疫反応を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の第１の側面は，蛍光プローブに関する。この蛍光プローブは，１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の波長を放射できるものである。この蛍光プローブの好ましいものは，水への溶解度が  ｇ／ｌ以上    ｇ／ｌ以下である。蛍光プローブは，先に説明した特許文献に開示されるとおり公知である。所定のポンプ光が蛍光プローブ又は蛍光プローブを含む試料に照射すると，蛍光プローブに特有の波長領域に蛍光を放射する。この蛍光を放射する部位を測定することで，様々な試料を観測できる。水への溶解度は，公知の方法を用いて測定できる。
【００２２】
蛍光プローブの励起光（ポンプ光）の波長，放出する蛍光の波長は，様々な方法を用いて制御できる。例えば蛍光プローブが量子ドットを含む場合，量子ドットを構成する化合物の種類や割合を変化させることで上記の波長を制御できる。また，量子ドットの大きさを制御することでも，上記の波長を制御できる。さらに，量子ドットに付加する化合物の大きさを変化させることでも，上記の波長を制御できる。また，蛍光プローブが，有機化合物又は無機化合物を含みこの化合物から蛍光が放射される場合，化合物のエネルギー順位を求めることで，好ましい化合物の候補を求めることができる。
【００２３】
蛍光プローブの溶解性は，公知の方法を用いて適宜調整すればよい。例えば蛍光プローブが量子ドットを含む場合，先に説明したように量子ドット自体を調整しても良いし，量子ドットに結合する化合物を調整しても良い。また，量子ドットをカプセル化してもよい（例えば，特表２０１０−５２３５５７号公報）。
【００２４】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，コア−シェル構造を有する量子ドットを含む。具体的に説明するとこの態様の例は，Ｍ１Ｘ１から構成される内芯とＭ２Ｘ２から構成され外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含むものである。Ｍ１及びＭ２は，同一でも異なっても良く，Ｃｄ，Ｚｎ，Ｍｇ，Ｇａ，Ｈｇ，Ｃａ，Ｓｒ，Ｂａ，Ｉｎ，Ａｌ，Ｇｅ，Ｓｉ，Ｚｎ，及びＰｄのいずれか又は２種以上である。Ｘ１は及びＸ２は，同一でも異なってもよく，Ｏ，Ｓ，Ｓｅ，及びＴｅのいずれか又は２種以上である。
【００２５】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含む。実施例により実証されたとおり，この量子ドットを含む蛍光プローブは，蛍光領域や溶解性の面できわめて優れたものである。さらに実施例において実証されたとおり，内芯に対する外殻の割合が変わると，放出する蛍光の波長が変化する。すなわち，この態様の量子ドットは，製造工程を修正するだけで，発光の周波数を制御することができる。
【００２６】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，さらに量子ドットの表面に結合した有機分子を含む。この量子ドットの表面に結合した有機分子により，溶解性や，蛍光特性を調整することができる。  有機分子の例は，グルタチオン又はグルタチオンの誘導体である。グルタチオンの誘導体には，グルタチオンの塩，溶媒和物のほか，グルタチオンの置換基が低級（Ｃ１−３）アルキル等で置換されたものも含む。
【００２７】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，有機化合物又は無機化合物を含む蛍光プローブ。有機化合物又は無機化合物は，溶解性が高く，しかも好ましい蛍光特性を有するものが好ましい。
【００２８】
本発明の蛍光プローブの好ましい態様は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳのＰｂＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する量子ドットを含む蛍光プローブである。量子ドットの製造方法は，例えば先に説明した文献に開示されるとおり公知である。本発明でも組成等を調整する他は公知の方法を適宜用いることで量子ドットを製造できる。
【００２９】
本発明の蛍光プローブの好ましい用途は，血管造影剤である。すなわち，本発明は，上記したいずれかの蛍光プローブを含む血管造影剤をも提供する。実施例により実証されたとおり，本発明は，従来の血管造影剤に比べて格段に優れた造影効果を有する。
【００３０】
本発明の第２の側面は，蛍光分析方法に関する。この蛍光分析方法は，先に説明した蛍光プローブを用いた蛍光分析方法であり。蛍光プローブとして上記したものを用い，測定する蛍光の波長領域を１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の所定の領域とする以外は，通常の蛍光分析と同様の方法を用いることができる。蛍光分析方法の例は，本発明の蛍光プローブを対象に投与等した後に，対象に所定の波長の励起光を照射し，発生する蛍光を測定するものである。蛍光分析方法に用いられる蛍光分析系は，観測する蛍光の波長領域を適宜修正するほかは，公知の蛍光分析系を用いることができる。
【００３１】
本発明の蛍光分析方法の好ましい態様は，２つ又はそれ以上の種類の量子ドットを用いて複数段階蛍光分析を行うものである。この方法は，少なくとも第１の蛍光分析工程，第２の蛍光分析工程，及び第３の蛍光分析工程を含む。第１の蛍光分析工程は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有する第１の量子ドットを含む第１の蛍光プローブを用いて第１の蛍光分析を行い第１の蛍光分析結果を得る工程である。第２の蛍光分析工程は，ＰｂＳの内芯とＣｄＳの外殻とを有するコア−シェル構造を有し，第１の量子ドットとはＰｂＳの内芯に対するＣｄＳの外殻の割合が異なる第２の量子ドットを含む第２の量子ポロー部を用いて第２の蛍光分析を行い第２の蛍光分析結果を得る工程である。第３の蛍光分析工程は，第１の蛍光分析結果及び第２の蛍光分析結果を用いて対象の蛍光分析を行う工程である。
【００３２】
先に説明したとおり，ＰｂＳ／ＣｄＳコア−シェル量子ドットは，ＣｄＳの割合を変化させることで発光する光の波長を変化させることができる。この性質を利用して，２つの異なる波長についての蛍光を測定する。そしてそれらの差分を求める。このようにすることで，ノイズを軽減した蛍光分析を行うことができる。
【実施例１】
【００３３】
ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの合成
図１は，コア・シェル構造を有する近赤外（２ｎｄ）量子ドットの合成に関し，コア・シェル構造を有する近赤外量子ドット合成過程の模式図である。オレイルアミン（ＯＬＡ）の表面修飾を受けたＰｂＳコアは，ＣｄＳに覆われ，シェルを形成する。メルカプトウンデカン酸を用いた配位子置換によって，シェル表面は親水性になる。
【００３４】
塩化鉛（ＩＩ）（２７８ｍｇ）（和光純薬工業）を，室温下で三つ口フラスコを用い，５ｍｌオレイルアミン（和光純薬工業）と１ｍｌオレイン酸（和光純薬工業）の混合物に溶かした。アルゴン大気中で溶液を１３０℃まで加熱したのち，激しく撹拌しながら，トルエンを溶媒とした０．５ｍｌのジメチルカドミウム溶液（質量濃度１０％）（Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ），０．５ｍｌのヘキサメチルジシラチアン（東京化成工業），および９．５ｍｌのトリブチルホスフィン（東京化成工業）の混合物を加えた。溶液の蛍光スペクトルを測定することで，ＰｂＳ量子ドットの発光ピークが，反応時間の増大とともに長波長側にシフトする，ＰｂＳ量子ドットの成長を観察した。望ましい発光ピークを有するＰｂＳ量子ドットが得られ次第，溶液を速やかに室温まで冷却した。ＰｂＳ量子ドットを沈殿させるため，溶液にメタノールを加えた。反応時間を制御することで，発光ピークがそれぞれ１０００ｎｍ，１２００ｎｍ，および１４００ｎｍであるＰｂＳ量子ドットが得られた。得られたＰｂＳ量子ドットを，室温下，アルゴン大気中で５０ｍｌのトルエンに溶解した。溶液を９０℃まで加熱したのち，約０．２５ｍｌのＣｄ−Ｓ前駆体溶液（２．５ｍｌのジメチルカドミウム溶液，および０．５ｍｌのヘキサメチルジシラチアン）を滴下しつつ加えた。溶液の蛍光スペクトルを測定し，ＣｄＳのシェル構造を観察した。望ましいＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットが得られ次第，溶液を速やかに室温まで冷却した。ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットを沈殿させるため，溶液にエタノールを加えた。沈殿した量子ドットをクロロホルムに溶解させた。シェル構造を形成するＣｄ−Ｓ前駆体溶液の量を制御することで，発光ピークがそれぞれ１０００ｎｍ，１２００ｎｍ，および１４００ｎｍであるＰｂＳ量子ドットから，発光ピークがそれぞれ１０００ｎｍ，１２００ｎｍ，および１４００ｎｍであるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットが得られた。
【００３５】
ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの親水化
ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのクロロホルム溶液を，ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で完全に除去した。ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの沈殿に，ボルテックスで撹拌しながらテトラヒドロフランを加えた。ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのテトラヒドロフラン溶液１Ｍに対して，等量の５０ｍｇ／ｍｌメルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のテトラヒドロフラン溶液を撹拌しつつ加えた。その後，ＭＵＡ被覆ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの沈殿に対し，その半分の量の１００ｍｇ／ｍｌカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（和光純薬工業）水溶液を加えた。ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの沈殿を遠心分離により取り除き，取り除いた沈殿は水に溶解した。ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドット水溶液を，０．２２μｍ膜フィルターを用いて濾過したのち，１５，０００ｇで５分間遠心し，集まったＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットを除去した。
【００３６】
量子ドットに対するＢＳＡの抱合
発光ピーク５２０ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドット，および発光ピーク７２０ｎｍのＣｄＳｅＴｅ／ＣｄＳ量子ドットを文献“T. Jin, F. Fujii, H. Sakata, M. Tamura, M. Kinjo, Chem Commun
(Camb),2829-31 (Jun 14, 2005).及び文献 M. Hasegawa, Y.
Tsukasaki, T. Ohyanagi, T. Jin, *Chem Commun (Camb)*49, 228-30 (Jan 11, 2013).に記載の方法にしたがって合成した。ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドット，およびＣｄＳｅＴｅ／ＣｄＳ量子ドットの表面を前述のようにＭＵＡで覆い，親水化した。ＭＵＡ被覆量子ドットのＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ  ８．０）１Ｍに対して，１０−２倍量の１ｍＭ  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ  ８．０）を撹拌しつつ加えた。３０分後，１０−１倍量の１ｍＭ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ  ８．０）を加え，室温で１時間反応させた。抱合していないＢＳＡおよびＥＤＣは，ＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）を用い，１００ｋＤａまでの分子を取り除く限外濾過膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じて除去した。
【００３７】
量子ドットの特定
４８８ｎｍの励起光におけるＩｎＧａＡｓフォトダイオードアレイ（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ；  ＨＯＲＩＢＡ）を用いたナノログスペクトルメーターシステムにより，量子ドットの蛍光スペクトルを測定した。量子ドットの吸収スペクトルを，Ｖ−６７０分光光度計（ＪＡＳＣＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて測定した。
ＢＳＡ抱合ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの流体力学的サイズを，６３３ｎｍのＨｅ／Ｎｅレーザーを備えたゼータナイザーナノ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用い，動的光散乱により測定した。Ｃｕκα（λ＝１．５４０６Å）Ｘ線ｎ源を備えたＤ２  ＰＨＡＳＥＲ回折計（ＢＲＵＫＥＲ）を用いて，粉末Ｘ線回析（ＸＲＤ）パターンを測定した。ＸＲＤサンプルは透明なシリコンスライド上に載せた。データは，回析角１０〜９０°，サンプリング幅０．１ｏおよび１ｓの継続スキャンモードで，２．５ｍｍソーラースリットおよび１．０ｍｍ発散スリットにおいて収集した。２００ｋＶのＨｉｔａｃｈｉ  Ｈ−８００（日立ハイテクノロジーズ）を用いて，ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの透過型電子顕微鏡写真を撮影した。サンプル溶液２μｌをカーボン蒸着電子顕微鏡用グリッド上に滴下し，溶媒を蒸発させるため一晩放置した。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）スペクトルは，Ａｇｉｌｅｎｔ  ７７００ｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のヘリウム衝突モードにおいて採取された。すべてのサンプルは，５％ＨＮＯ３に溶解したのち，石灰化された。実験器具は標準サンプルとして，１μｇ／ｌのＬｉ，Ｍｇ，Ｃｏ，Ｙ，Ｃｅ，Ｔｌを用いて調整した。発光ピークがそれぞれ１０００ｎｍ，１３００ｎｍ，および１５００ｎｍであるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの蛍光量子収率を，発光ピークが１０００ｎｍである標準的ＰｂＳ量子ドットを用いた類似の方法によって測定した。絶対ＰＬ量子収率測定装置
（Ｃ１００２７，浜松ホトニクス）を用いて，ＰｂＳ量子ドットの量子収率は０．６と測定された。発光ピークが１０００ｎｍであるＰｂＳ量子ドット，および４８８ｎｍにおける吸光度が０．１であるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの蛍光強度との比較により，ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの量子収率を計算した。後述のように，蛍光相関分光法を補助的に用いて，ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのモル吸光係数（ε）を求めた。ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの表面は，ＦＩＴＣラベルされたポリエチレンイミン（ＭＷ  ２５００００）で覆った。そして，ＦＩＴＣラベルされたポリエチレンイミン被覆ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの水中濃度を，蛍光相関分光法によって，１０−８Ｍ  ローダミン６Ｇ規定液を用いて測定した。ランベルト・ベールの法則（吸光度＝εｃｌ，ｃは溶液の濃度，ｌは光路長）に基づき，水中におけるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのモル吸光係数（ε）をそれぞれ求めた。吸収波長４８８ｎｍにおいて，発光ピークがそれぞれ１０００ｎｍ，１３００ｎｍ，および１５００ｎｍであるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのモル吸光係数（ε）は，それぞれ，６．３ｘ１０５Ｍ−１ｃｍ−１，１６．６ｘ１０５Ｍ−１ｃｍ−１，および２２．４ｘ１０５Ｍ−１ｃｍ−１である。
【００３８】
可視‐近赤外（１ｓｔ）‐近赤外（２ｎｄ）イメージングシステム
イメージングシステムは，０．６３ｘから６．３ｘのズーム機能を持つマクロズームシステム（ＭＶＸ，オリンパス）を用いて構築した。可視，近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）領域におけるマルチスペクトル画像を入手するために，カスタマイズされた対物およびイメージングチューブレンズを通じて，光学収差を可視化した。レンズおよび鏡の透過性および反射性は，可視，近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）領域を通じて調節された。可視および近赤外（１ｓｔ）イメージングには，ＧＦＰフィルターセット（Ｓｅｍｒｏｃｋ）およびＣｙ５．５フィルターセット（Ｓｅｍｒｏｃｋ）がそれぞれ用いられた。７８５ｎｍレーザーのための励起フィルター，７８５ｎｍレーザーを反射し，８００ｎｍ以上のレーザーを透過するダイクロイックミラー，および遮断波長が８００ｎｍである長距離発光フィルターを含む，カスタマイズされたフィルターセットを，近赤外（２ｎｄ）イメージングに用いた。
【００３９】
カスタマイズされたフィルターセットに次いで，それぞれ，１１００±２５ｎｍ，１３００±２５ｎｍ，および１５００±２５ｎｍにカスタマイズされた発光フィルターを用いて，近赤外（２ｎｄ）領域におけるマルチスペクトラルイメージングを行った。可視イメージングにおいて，光波長が４８２ｎｍであるキセノンランプを励起光源として用いた。近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）イメージングにおいては，６７０ｎｍおよび７８５ｎｍのレーザー光源（ＢＷＦ１シリーズ，Ｂ＆Ｗ  ＴＥＫ）をそれぞれ励起光源として用いた。サンプルステージにおける最大励起力は，４８２ｎｍ励起において５．０ｍＷ／ｃｍ２，６７０ｎｍ励起において２５．１ｍＷ／ｃｍ２，および０．６３ｘにおいて２５．５ｍＷ／ｃｍ２である。可視および近赤外（１ｓｔ）イメージングにおいては，ｉＸｏｎ３  Ｓｉ  ＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ）を用いた。近赤外（２ｎｄ）イメージングにおいては，ＩｎＧａＡｓ  ＣＭＯＳカメラ（Ｃ１０６３３‐３４，浜松ホトニクス）を用いた。タイリング処理した広視野画像を得るため，電気ステージを用いた。コントロールおよびデータ取得は，ＩＱ２（Ａｎｄｏｒ）およびＨＣＩｍａｇｅ（浜松ホトニクス）といったソフトウェア，およびＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてカスタマイズされたプログラムによって行った。
【００４０】
図２は，ＣｄＳシェル形成を通じたＰｂＳ近赤外量子ドットのスペクトル変化を示す。図３は，クロロホルム中におけるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの蛍光スペクトルを示す。ピーク波長が１１００ｎｍ，１３００ｎｍ，及び１５００ｎｍのＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドット蛍光スペクトルを示す。図４は，ピーク波長が１３００ｎｍにおけるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの透過型電子顕微鏡写真である。スケールバーは上の図が２０ｎｍ，下の図が５ｎｍである。図５は，クロロホルム中における，ＰｂＳ量子ドットおよびＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのスペクトル半値幅を示す。黒および赤の曲線は，各発光ピーク波長に対するＰｂＳ量子ドットおよびＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットのスペクトル半値幅をそれぞれ示す。図６は，水中，およびクロロホルム中における，ピーク波長１１００ｎｍの時のＰｂＳ量子ドットおよびＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの蛍光スペクトルおよび量子収率（ＱＹ）を示す。黒および赤の曲線は，水中，およびクロロホルム中におけるＰｂＳ量子ドットおよびＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの蛍光スペクトルを，それぞれ示す。
【実施例２】
【００４１】
可視‐近赤外（１ｓｔ）‐近赤外（２ｎｄ）イメージングシステムを用いた組織切片の光学特性測定
図７は，光学特性測定実験の模式図である。組織切片は図の上と下，２枚のカバーガラスに挟まれた形で存在する。粒子は，量子ドットに浸した１５μｍ多孔質ビーズを示す。矢印は励起光，多孔質ビーズから放出され，それぞれ透過，吸収，後方散乱した光の標準的な経路の例を示す。
【００４２】
１５μｍ多孔質ビーズ（ＳＯＵＣＥ  １５ＩＳＯ，ＧＥヘルスケア）溶液を脱水し，イソプロピルアルコールに置換した。発光ピークがそれぞれ５２０，７２０，１１００，１３００，および１５００ｎｍである，クロロホルムを溶媒とした量子ドット混合液を，多孔質ビーズ溶液に加えた。一時間のローテーション撹拌ののち，多孔質ビーズ溶液を遠心し，エタノールを１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡのＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液に徐々に置換した。皮膚，脳，および心臓の組織片をＨＯＳ：ＨＲ‐１マウス（星野試験動物飼育所）から得たのち，自家蛍光測定のため２枚のカバーガラスで挟んだ。厚みの異なる脳および心臓の組織切片は，マイクロスライサー（ＤＴＫ−１０００  ＤｏｓａｋａＥＭ）を用いて作成し，１５μｍ多孔質ビーズと共に，あるいはビーズを加えずに，２枚のカバーガラスで挟んだ。光学特性測定のための顕微鏡写真を，６．３ｘの可視‐近赤外（１ｓｔ）‐近赤外（２ｎｄ）イメージングシステムを用いて取得した。可視‐近赤外（１ｓｔ）‐近赤外（２ｎｄ）イメージングにおける自家蛍光顕微鏡写真の量的比較のために，単位励起力，あるいは単位バンド幅あたりの光子数を画像強度として測定した。光学特性分析は，Ｇ−ｔｒａｃｋ（Ｇ−ａｎｇｓｔｒｏｍ），Ｇ−ｃｏｕｎｔ（Ｇ−ａｎｇｓｔｒｏｍ），ｉｍａｇｅ  Ｊ，およびＯｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）といったソフトウェア，およびＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてカスタマイズされたプログラムによって行った。
【００４３】
分光計を用いた光学特性スぺクトル測定
８５０ｎｍ以下のためには光電子増倍管（Ｒ２６５８Ｐ，浜松ホトニクス），８５０ｎｍ以上のためにはＩｎＧａＡｓフォトダイオードアレイ（シンフォニー，堀場製作所）を伴うナノログ分光計システム（堀場製作所）を用いて，４８２ｎｍ，６７０ｎｍ，および７８５ｎｍの励起光，および遮断波長がそれぞれ５１０ｎｍ，７１０ｎｍ，および８１０ｎｍである長距離発光フィルターにおける，マウス全身の自家蛍光スペクトルを測定した。自家蛍光強度の標準化のため，励起力をモニターした。マウスは回転型チャンバーに入れ，背側および腹側から励起光を照射した。サンプル角度は，マウスから放たれた拡散反射光が直接検出領域に入らないように調整した。光学特性パラメータスペクトル測定のため，皮膚，脳，および心臓の組織片をＨＯＳ：ＨＲ‐１マウス（星野試験動物飼育所）から得たのち，自家蛍光測定のため２枚のカバーガラスで挟んだ。拡散透過率および平行透過率測定のため，サンプルは平行透過率の光路を覆う球形カバーを除去した積分級の入り口に置いた。拡散反射率測定のため，サンプルは積分級の出口に置いた。拡散透過率，平行透過率，および拡散反射率スペクトルはＪａｓｃｏ  Ｖ‐６７０分光光度計（ジャスコインターナショナル）を用いて測定した。減衰係数は平行透過率をもとに計算した。吸光係数は拡散透過率および拡散反射率をもとに計算した。散乱係数は，減衰係数をもとに求めた減算吸光係数をもとに計算した（R. Splinter, B. A. Hooper, *An introduction to biomedical
optics*(2007)）。
【００４４】
図８は，組織切片からの自己蛍光の顕微鏡写真を示す。５２０は，４８２ｎｍ励起光に対する可視領域での標準的な蛍光イメージング波長を示す。７２０は，６７０ｎｍ励起光に対する近赤外（１ｓｔ）領域での標準的な蛍光イメージング波長を示す。１１００，１３００，および１５００は，７８５ｎｍ励起光に対する近赤外（２ｎｄ）領域での標準的な蛍光イメージング波長を示す。スケールバーは２００μｍを示す。グラデーションバーは，毎秒あたりカウントされた光子を示す。
【００４５】
図９は，可視光，近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）蛍光イメージングを用いた，量子ドットに浸した１５μｍ多孔質ビーズの，組織切片を通じた顕微鏡写真である。最上段は，多孔質ビーズが組織切片の上部に接したカバーガラス側にある場合の顕微鏡写真である。それより下段は，多孔質ビーズが組織切片下部のカバーガラス側にある場合の顕微鏡写真である。脳および心臓由来の組織切片の厚みは，それぞれ１２０μｍ，１００μｍ，２００μｍである。標準化された強度の図において，蛍光強度は最上段の図に示された最大強度に対して標準化されている。また，コントラスト調整された図において，コントラストは最大振幅に合わせられている。スケールバーは３０μｍを示す
【００４６】
図１０は，脳および心臓の組織切片における，標準化された蛍光強度と切片の厚みとの関係を示すグラフである。線形曲線は指数関数を用いた近似の結果を示す。線はそれぞれ，５２０，７２０，１１００，１３００，および１５００ｎｍのイメージング波長を示す。縦軸のバーは標準誤差を示す。
【００４７】
図１１は，脳および心臓の組織切片における，半値全幅と切片の厚みとの関係を示すグラフである。曲線はスプライン近似の結果を示す。縦軸のバーは標準誤差を示す。
【００４８】
図１２は，皮膚におけるシグナル背景比を示すグラフである。棒グラフは，それぞれ，多孔質ビーズが組織切片の上部または下部に接したカバーガラス側にある場合のシグナル背景比を示す。バーは標準誤差を示す。
【００４９】
図１３は，脳および心臓の組織切片における，シグナル背景比と切片の厚みとの関係を示すグラフである。バーは標準誤差を示す。
【実施例３】
【００５０】
マウス生体におけるリンパ管造影および非侵襲的イメージング
図１４は，リンパ管造影を目的とした，ＢＳＡ抱合型量子ドットの模式図である。ＢＳＡはＭＵＡリンカーを通じて量子ドットの表面に共有結合している。
【００５１】
マウスは顕微鏡ステージの上で麻酔する。発光ピークがそれぞれ５２０ｎｍ，７２０ｎｍ，１１００ｎｍ，１３００ｎｍ，および１５００ｎｍであるＢＳＡ被覆量子ドットの輝度を，溶液を露光時間や蛍光波長に関するカメラ調整を通じて標準化し，また，複数のμＭ濃度における領域当たりの平均光子量で示される，量子ドット濃度に関しても同様の操作を行った。リンパ管造影のため，等量の，発光ピークがそれぞれ５２０ｎｍ，７２０ｎｍ，１１００ｎｍ，１３００ｎｍ，および１５００ｎｍである，ＢＳＡ被覆量子ドットのＰＢＳ（ｐＨ７．４）混合液を，１００μｌ／ｍｉｎの速度で１５０μｌ，マウス後足に注射した。標準化された設定を用いて，マウス全身を０．６３ｘで観察した。タイリング処理しつつ，電気ステージを用いてホールボディーイメージングを行い，ｉｍａｇｅ  Ｊのプラグインに切り替えた。
【００５２】
イメージ解析は，ＩＱ２（Ａｎｄｏｒ）およびＨＣＩｍａｇｅ（浜松ホトニクス），ｉｍａｇｅ  ＪおよびＯｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）といったソフトウェア，およびＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてカスタマイズされたプログラムによって行った。３ｍｌのＮＰ‐９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），２００μｌ酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）イオンの磁気ナノ粒子溶液，および６４０μｌのオルトケイ酸テトラエチル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を，それぞれ１５ｍｌシクロヘキサンで希釈した。３０分後，１００μｌの１０％アンモニア（和光純薬工業）を加えた。２４時間撹拌しつつ，ケイ酸組成物の反応を継続した。１０μＭ  ローダミン６Ｇ（和光純薬工業）の５０μｌクロロホルム溶液，発光ピークが１３００ｎｍである５μＭ  ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの２００μｌクロロホルム溶液，および，オルトケイ酸テトラエチル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）６４０μｌを，加え，２４時間撹拌しつつ，ケイ酸組成物の反応を継続した。反応プロセスは２ないし３回繰り返した。反応液はアセトンおよびエタノールを用いて３回洗浄し，エタノールに置換した。最終的に，エタノールを１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡのＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液に徐々に置換した。ケイ素粒子の流体力学的大きさは，Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）による動的光散乱を通じ，６３３Ｈｅ／Ｎｅレーザーを用いて測定した。溶液を１時間静置したのち，数回にわたり容器を傾けて上清を除去し，１〜２μｌの大きさのケイ素粒子を分離した。０．１ｍｇ／ｍｌのリポ多糖（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌを後足に注入したのち６時間後，酸化鉄を含む５０μｌケイ素粒子溶液，近赤外（２ｎｄ）量子ドット，およびローダミン６Ｇを注入した。
【００５３】
自作の１２ｍｍ表面型ＲＦコイルを用い，中心磁場が１１．７Ｔである室温ボアＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  イメージングシステム（Ｂｒｕｋｅｒ）によって，ケイ素粒子溶液の注入前および注入後のＭＲ画像を得た。２次元取得モードにおいて，ＦＲＡＳＨパルスシーケンスを用いて，ＭＲＩを取得した（ＴＲ／ＴＥ，４００／３ｍｓ；ｆｌｉｐ  ａｎｇｌｅ，３０；ｍａｔｒｉｘ  ｓｉｚｅ，２５６ｘ１９２；ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｖｉｅｗ，１２．８ｍｍｘ９．６ｍｍ；ｓｌｉｃｅ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ，３００μｍ；ｖｏｘｅｌ  ｓｉｚｅ，５０μｍｘ５０μｍｘ３００μｍ；ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｖｅｒａｇｅ，１６）。免疫染色を行ったマウスは，ケイ素粒子注入後２４時間後に処分した。左膝窩リンパ節を固定，封入し，５μｌの連続組織切片を得た。切片はマウスマクロファージで処理し，食細胞マーカーＦ４／８０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＤＡＰＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。
【００５４】
ＢＳＡ被覆ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットにおける細胞生死判別試験
ＨｅＬａ細胞における，ＢＳＡ被覆ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの細胞毒性を，セルカウンターを用いて測定した。細胞は，それぞれ異なるＢＳＡ被覆ＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドット濃度下，異なる時間培養した。培養後，細胞を洗浄し，再び培地にサスペンドした。細胞懸濁液１０μｌを，１０μｌトリパンブルー溶液と混合した。細胞の生死はセルカウンター（Ｃｏｕｕｎｔｅｓｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。
【００５５】
可視‐近赤外（１ｓｔ）‐近赤外（２ｎｄ）イメージングにおけるモンテカルロシミュレーション
モンテカルロシミュレーションを用いて，微粒子の蛍光イメージをシミュレートした。シミュレーションにおけるアルゴリズムは，最も広く，様々な出願（２８）において用いられる方法である，ワング法と同等のものを用いた。本シミュレーションにおいて，粒子光源は蛍光微粒子に設置し，モンテカルロ法を用いて組織中における粒子の軌道を計算した。微粒子の顕微鏡イメージは，簡単な方法により生成した。微粒子の中心部が位置する，焦点を合わせられた面における光子の位置を，復帰方向および出射された光子の位置を用いて計算した。したがって，本シミュレーションにおける焦点を合わせられた面は，無限正確解像度を持つ面に焦点を合わせる点において常に正確である。本シミュレーションにおいて，光子は，生／死二つの状態に離散化された。シミュレーション幾何学は図Ｓ８に示される。シミュレーションは，２枚の０．１７ｍｍカバーガラス（Ｇ１，Ｇ２）に挟まれた組織サンプルに対して行われた。光子は，深さｚを持つｘｙ平面の原点に位置し，１５ｍｍの直径を持つ球形蛍光物体（Ｏ）の任意の位置で生成される。光子の初期方向は等方的である。本シミュレーションにおいて，５×１０９個の光子が生成された。光子の軌道は，組織に吸収されるまで，境界線から飛び出すまで，あるいは２０ｃｍ以上移動するまでトレースされた。出射された光子は，焦点距離および直径がそれぞれ２８．５７ｍｍおよび１４．２８ｍｍである対物レンズを通じて集められた。光子がレンズの外に到達した場合，あるいは，レンズに対する標準方向に対し大きな方向角，すなわち関口数のアークタンジェント（０．２５９）より大きな角を有した場合，光子は廃棄される。レンズは対物面に焦点を合わせる，と事前に推測したように，イメージは焦点面（ｏｐ）において再構築される。焦点面の２．５ｍｍ四方の各領域における光子の量をカウントした。カバーガラスの光学パラメータは次のとおりである。散乱係数０．００１ｍｍ−１，吸光係数０．００１ｍｍ−１，異方性パラメータ  １．０，反射係数  １．５２。組織の光学パラメータ，ｍｓおよびｍａ，は，積分球を伴う分光計測定で得られた標準値（表Ｓ２）より用いられ，反射係数および異方性はそれぞれ１．３４および０．９に固定された。プログラムコードは，Ｌｕｎｄ  ｇｒｏｕｐにより独自に開発されたコード，すなわちＣＵＤＡＭＣＭＬ（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ.ａｔｏｍｉｃ.ｐｈｙｓｉｃｓ.ｌｕ.ｓｅ／ｆlｅａｄｍｉｎ／ａｔｏｍｆｙｓｉｋ／Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＣＵＤＡＭＣＭＬ.ｚｉｐ ）に由来し，用途に合うようカスタマイズした。
【００５６】
図１５は，標準化された量子ドット溶液の輝度を示す。５２０は，４８２ｎｍ励起光に対する可視領域での標準的な蛍光イメージング波長を示す。７２０は，６７０ｎｍ励起光に対する近赤外領域での標準的な蛍光イメージング波長を示す。１１００，１３００，および１５００は，７８５ｎｍ励起光に対する近赤外（２ｎｄ）領域での標準的な蛍光イメージング波長を示す。ウェル領域は０．３ｃｍ２である。グラデーションバーは，毎秒あたりカウントされた光子を示す。
【００５７】
図１６は，マウスの全身画像を示す。白線で囲んだ領域はリンパ管造影領域を示す。量子ドットは，白矢印で示した後足から注入した。スケールバーは１０ｍｍを示す。
【００５８】
図１７は，可視光，近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）蛍光イメージングを用いたリンパ管造影図を示す。白線はプロファイル解析に用いた線を示す。スケールバーは２ｍｍを示す。
【００５９】
図１８は，可視光，近赤外（１ｓｔ），および近赤外（２ｎｄ）蛍光イメージングを用いたプロファイル解析を示す。
【００６０】
図１９は，貪食細胞が，抹消組織からリンパ管に外来性物質を輸送する模式図である。ケイ素粒子が末梢組織に注入されると，貪食細胞はそれを外来性の異物と認識して取り込み，輸入リンパ管およびリンパ管に移動して，Ｔ細胞に異物を光源として提示する。
【００６１】
図２０は，酸化鉄，近赤外（２ｎｄ）量子ドット，およびローダミン６Ｇを含むケイ素粒子の模式図である。酸化鉄粒子は，ＭＲＩ画像のコントラストを確保するため，粒子内層に埋め込まれている。近赤外（２ｎｄ）量子ドットおよびローダミン６Ｇは，可視光よび近赤外（２ｎｄ）蛍光イメージングのため，粒子の外層に埋め込まれている。ケイ素粒子の直径は１−２μｍである。
【００６２】
図２１は，ＢＳＡ抱合１１００ｎｍ量子ドット，および１３００ｎｍ量子ドットを含むケイ素粒子をマウス後足に注入し，タイムラプス撮影によって後足からリンパ管への輸送を可視化した際のマウス後足撮影写真である。スケールバーは４ｍｍを示す。
【００６３】
図２２は，ＢＳＡ抱合１１００ｎｍ量子ドット（黄色），および１３００ｎｍ量子ドットを含むケイ素粒子（青色）による，リンパ管および血管のマルチスペクトル近赤外（２ｎｄ）イメージング。スケールバーは４ｍｍを示す。
【００６４】
図２３は，酸化鉄を含むケイ素粒子注入前，および注入後２４時間におけるリンパ管のＭＲＩ画像を示す。白い点線はリンパ管を示す。矢印は蛍光観察の方向を示す。矢じりは，リンパ管内に見られる，後足から注入されたケイ素粒子を示す。スケールバーは１ｍｍを示す。
【００６５】
図２４は，リンパ管切片の免疫染色画像を示す。矢じりは，ローダミン６Ｇを含むケイ素粒子と結合したＦ４／８０抗体で標識された貪食細胞を示す。線で囲まれた領域の拡大図は左上に示される。スケールバーは５０μｍを示す。
【００６６】
図２５は，ケイ素粒子とともにリンパ管へと移動する貪食細胞のマルチスペクトル近赤外（２ｎｄ）タイムラプス画像である。スケールバーは５００μｍを示す。
【００６７】
以下，実施例１〜３におけるデータ等の基となるスペクトル等について簡単に説明する。
図２６は，ピーク波長が１１００ｎｍ，１３００ｎｍ，１５００ｎｍであるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの，水中における流体力学的大きさを示すグラフである。ヒストグラムは，それぞれ，ピーク波長が１１００ｎｍ，１３００ｎｍ，１５００ｎｍであるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットを指し示す。ピーク波長が１１００ｎｍ，１３００ｎｍ，１５００ｎｍであるＰｂＳ／ＣｄＳ量子ドットの流体力学的大きさは，それぞれ，４．５，７．５，１０．５ｎｍである。曲線はガウス曲線である。
【００６８】
図２７は，１３００ｎｍＰｂＳ／ＣｄＳおよびＰｂｓ量子ドットのＸ線回折パターンを示すグラフである。曲線は，ＰｂＳ／ＣｄＳ，およびＰｂｓ量子ドットのＸ線回析パターンを示す。バーは粗ＰｂＳおよびＣｄＳのＸ線回析シミュレーション結果をそれぞれ示す。
【００６９】
図２８は，１３００ｎｍＰｂＳ／ＣｄＳおよびＰｂｓ量子ドットの誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）分析を示すグラフである。上および下のグラフは，それぞれ，ＰｂＳ／ＣｄＳおよびＰｂｓ量子ドットの分析結果である。青および赤は，それぞれＣｄ，Ｐｂのピークを示す。Ｃｄのピークは，ＰｂＳ／ＣｄＳＰｂｓ量子ドット分析の場合にのみ検出される。
【００７０】
図２９は，イメージングシステムの写真である。図３０は，イメージングシステムの模式図を示す。
【００７１】
図３１は，背側から見たマウスの自家蛍光スペクトルを示す。図３２は，腹側から見たマウスの自家蛍光スペクトルを示す。緑，可視‐近赤外（１ｓｔ）‐近赤外（２ｎｄ）イメージングシステムに備えられた５２０，７２０．１１００，１３００，および１５００ｎｍの発光フィルターの範囲，４８２，６７０，および７８５ｎｍにおける励起波長を示す。近赤外（２ｎｄ）領域における自家蛍光は，すべての励起波長において，ほとんど検出されない。一方，１０００ｎｍ以下の自己蛍光は，近赤外（２ｎｄ）領域における４８２，および６７０ｎｍにおけるそれに比べ明白である。自家蛍光の様子は，身体の部位によって異なる。
【００７２】
図３３は，顕微鏡画像における自家蛍光の量的比較のためのグラフである。肌，脳，および心臓における自家蛍光の結果を示す。バーは標準誤差を示す。５２０は，４８２ｎｍ励起光に対する可視領域での標準的な蛍光イメージング波長を示す。７２０は，６７０ｎｍ励起光に対する近赤外（１ｓｔ）領域での標準的な蛍光イメージング波長を示す。１１００，１３００，および１５００は，７８５ｎｍ励起光に対する近赤外（２ｎｄ）領域での標準的な蛍光イメージング波長をそれぞれ示す。自家蛍光スペクトルと同様，可視光領域および近赤外（１ｓｔ）領域での蛍光イメージングは，近赤外（２ｎｄ）領域における蛍光イメージングに比べ明白である。
【００７３】
図３４は，積分球を用いた，皮膚，脳，および心臓における光学特性の分光学的分析に関し，減衰係数ｍｔのスペクトルを示す。図３５は，積分球を用いた，皮膚，脳，および心臓における光学特性の分光学的分析に関し，吸光係数ｍａのスペクトルを示す。
【００７４】
図３６は，モンテカルロシミュレーションの模式図を示す。光子源（Ｏ）は２枚のカバーガラス（Ｇ１，Ｇ２）に挟まれた組織サンプル（Ｔ）に位置し，光子のランダム軌道はモンテカルロシミュレーションで追跡された。脱出した光子はレンズ（Ｌ）で集められ，図像面に焦点を合わせられた。ｏｐは焦点面である。
【００７５】
図３７−１は，モンテカルロシミュレーションによりシミュレートされた，異なる光学パラメータ，および組織厚における組織イメージを示す。図３７−２は，モンテカルロシミュレーションによりシミュレートされた，異なる光学パラメータ，および組織厚における組織イメージを示す。イメージは，組織厚０．１，０．２，０．５，および１．０ｍｍ，かつ３セットの光学パラメータにおけるシミュレーション結果である。それぞれ，（Ａ）ｍｓ＝１５ｍｍ−１，ｍａ＝０．９ｍｍ−１。（Ｂ）ｍｓ＝１０ｍｍ−１，ｍａ＝０．２６８ｍｍ−１。（Ｃ）ｍｓ＝５ｍｍ−１，ｍａ＝０．５ｍｍ−１，における，５２０，７２０，および１３００ｎｍにおける脳組織の標準値である。標準化されたイメージ中の囲み図は，ｙ＝０ｍｍにおける組織断面を示す。各シミュレーションは２つのイメージ，粗イメージとピーク密度により標準化されたイメージが付属する。粗イメージにおけるオブジェクトの輝度は，拡散および培地の吸収により密度が失われるため，その深さは急速に減衰していく。しかしながら，標準化されたイメージにおけるオブジェクトの形状は，イメージの組織断面に示されたように，比較的保持されている。（Ａ）において，オブジェクト外側の密度は，組織厚の増加につれ，ピーク密度に比べて著しく増加している。これは，焦点外の光子および弾道上の光子により励起された，オブジェクトイメージを形成する複数の拡散プロセスが，培地の高度な拡散に伴い著しく減衰しているためである。これらのイメージは質的に実験イメージを説明している。１・３ｍｍにおけるイメージは最も明確である。
【００７６】
図３８は，酸化鉄，近赤外（２ｎｄ）量子ドット，およびローダミン６Ｇを含む水中のケイ素粒子の水力学的大きさを示す。曲線はガウス曲線である。ケイ素粒子の水力学的大きさは１．４ｍｍである。
【００７７】
図３９は，細胞生死判別分析を示すグラフである。１００ｎＭの濃度までは，細胞生存率は一定であることがわかる。
【００７８】
表１は，可視‐近赤外（１ｓｔ）‐近赤外（２ｎｄ）イメージングシステムにより測定した，組織切片光学特性パラメータを示す。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
表２は，積分球を備えた分光計により測定された組織光学特性パラメータを示す。
【００８１】
【表２】
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【実施例４】
【００８２】
図４０は，グルタチオン被覆ＰｂＳ量子ドットの模式図である。
【００８３】
グルタチオンおよび酸化カリウムは和光純薬工業から購入した。ウシ血清アルブミン，酢酸鉛，および硫化カリウムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。Ｎ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド，および１‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐３‐エチルカルボジイミド塩酸塩は，それぞれ，同仁堂およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓから購入した。すべての化学物質は研究室規格である。抗ＨＥＲ２抗体は中外製薬より購入した。
【００８４】
合成したＰｂＳ量子ドットの特徴
蛍光および吸収スペクトルはＳＰＥＸ  ＮａｎｏＬｏｇ（堀場製作所）およびＶ‐６７０（ＪＡＳＣＯ）を用いて，それぞれ測定した。合成したＰｂＳ量子ドットの形態は，高分解能透過電子顕微鏡２２００‐ＦＸ（ＪＥＯＬ）を用い，加速電圧２００ｋＶにおいて測定した。合成したＰｂＳ量子ドットのＸ線回折および流体力学的直径は，それぞれ，Ｄ２  Ｐｈａｓｅｒ（Ｂｒｕｃｋｅｒ  ＡＸＳ）およびＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ‐ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定した。図２（ｂ）における蛍光スペクトルは，各スペクトルのピーク値を用いて標準化した。
【００８５】
ＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットの調整
２ｍｇ／ｍｏｌのＥＤＣ水溶液１０μｌを，合成したＰｂＳ量子ドット溶液１ｍｌに加えた。ただちに２０μｌのＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（Ｓｕｌｆｏ‐ＮＨＳ）を加え，撹拌した。２時間後，１ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体１００μｌをゆっくり加えた。溶液は一晩４℃に保ち静置した。
【００８６】
細胞培養および生体内イメージング
ＫＰＬ‐４  ＧＦＰおよびＨｅＬａ細胞培養のため，１０％ウシ血清に浸したダルベッコ変法イーグル培地に，１００ｍｇ／ｍｌペニシリンおよび１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを用いた。調整されたＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットを，各培養皿に，２８０μｇ／ｍｌの濃度になるように加えた。エンドサイト―シスを除く特異的結合を評価するために，４℃で一時間，細胞を培養した。非結合ＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットはＰＢＳで３回洗浄した。調整された培養皿は，自作の近赤外−２双眼立体顕微鏡を用いて撮影した。量的比較のため，イメージはＩｍａｇｅ  Ｊを用いて分析し，近赤外−２シグナルを数えた。
ＰｂＳ量子ドットおよびＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットの細胞毒性を評価するため，異なる濃度のＰｂＳ量子ドットおよびＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットを培地に加え，培養環境（３７℃，５％  ＣＯ２，および加湿環境）で２４時間培養した。その後，細胞をＰＢＳで洗浄し，ＰＢＳ内に懸濁した。懸濁細胞はトリパンブルー溶液で染色し，細胞数をＣｏｕｎｔｅｓｓ細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で数えた。サンプルの生存率はコントロールにより標準化され，コントロールにはＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットの代わりに等量の水が加えられた。
【００８７】
生体内イメージング
ＫＰＬ４‐ＧＦＰ細胞（マウス一個体あたり０．５×１０７個）懸濁液を，５週令の雌ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（日本チャールスリバー）の背側皮膚組織に植え付けた。数週間後，直径１０ｍｍ以下の腫瘍をもつマウスを選んだ。２．８ｍｇ／ｍｌのＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドット溶液２００μｌを，移植マウスの尾静脈に注入した。
近赤外‐２生体イメージは，近赤外−２双眼立体顕微鏡を用いて，注入後０時間および４８時間後に観察した。明視野および近赤外‐２領域における全身生体イメージングは，低解像度（×０．８６）で行われ，個々のフレームが小さかった（ｍｍ×ｍｍ）ため，一個体あたり６×５フレームを要した。
【００８８】
腫瘍における詳細なイメージングは，高解像度（×２．０）で得られた。全ての近赤外‐２イメージは，Ｉｍａｇｅ  Ｊにおいてガウス点広がり関数を求めるのに用いられた。４８時間後，マウスは深麻酔により安楽死させた。腫瘍および他の器官は分離された。生体外近赤外‐２およびＧＦＰイメージは，低解像度の近赤外−２双眼立体顕微鏡，および，５１０ｎｍ励起フィルターおよび５３５ｎｍ発光フィルターを備えたＭＳ‐ＦＸ‐Ｐｒｏ生体内イメージングシステム（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＣＡ）を用いて得られた。
【００８９】
図４１は，溶液の明視野写真を示す。図４２は，４℃（９００ｎｍ付近にピーク），２５℃（１１００ｎｍ付近にピーク），５０℃（１２００ｎｍ付近にピーク）における標準吸光度，および標準化された蛍光スペクトルを示す。図４３は，異なる反応ｐＨにおける各温度の蛍光スペクトルを示す。図４４は，発光ピーク波長の概要プロットである。
【００９０】
図４５は，合成したＰｂＳ量子ドットの透過電子顕微鏡写真である。図４６は，ＰｂＳ量子ドットのＸ線回折パターンを示すグラフである。図４７は，流体力学的直径のヒストグラムである。
【００９１】
図４８は，ＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットの模式図である。図４９は，ＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドット処置後のディッシュの近赤外‐２イメージである。スケールバーは１００μｍである。図５０は，ＢＳＡ‐ＰｂＳ量子ドット処置後のディッシュの近赤外‐２イメージである。スケールバーは１００μｍである。図５１は，ＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットにおける，近赤外‐２蛍光密度のヒストグラムである。図５２は，ＢＳＡ‐ＰｂＳ量子ドットにおける，近赤外‐２蛍光密度のヒストグラムである。図５３は，様々な濃度のＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドット存在下において２４時間培養したのち，トリパンブルーを用いて染色した，ＫＰＬ４およびＨｅＬａ細胞の細胞生存率を示す。
【００９２】
図５４は，生体外および生体内における活性型免疫反応を示す写真である。図５４（ａ）は，マウスにおける異種移植したＫＰＬ‐４  ＧＦＰ乳腫瘍細胞の明視野写真である。図５４（ｂ）は，２００ｍｌの２．８ｍｇ／ｍｌＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットを１０秒間注入した直後の近赤外‐２生体イメージである。図５４（ｃ）は，２００ｍｌの２．８ｍｇ／ｍｌＨＥＲ２‐ＰｂＳ量子ドットを１０秒間注入後，４８時間経過後の近赤外‐２生体イメージである。白矢印は腫瘍細胞シグナルを示す。図５４（ｄ）は，９０秒間注入後４８時間経過後の近赤外‐２イメージを示す。図５４（ｅ）は，赤い四角内の拡大図を示す。図５４（ｆ）は，１００ｍｍスケールバーと図５４（ｅ）のクローズアップ画像を示す。図５４（ｇ）は，腫瘍および他の主要器官の生体外イメージを示す。明視野（左），近赤外‐２（中央），およびＧＦＰ（右）。スケールバーは５ｍｍを示す。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は，蛍光プローブや蛍光プローブを用いた蛍光分析，及び血管造影剤に関する。したがって，本発明は化学産業で利用されうるほか，製薬業においても利用されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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