(57)【要約】【課題】側弯症等の骨・関節疾患を検査する方法を提供する。【解決手段】第６染色体長腕２４．１領域（6q24.1領域）に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患の発症リスクおよび／または発症の有無を検査する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第６染色体長腕２４．１領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査することを特徴とする、骨・関節疾患の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
【請求項２】
前記骨・関節疾患が、側弯症である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記側弯症が、思春期特発性側弯症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一塩基多型が、GPR126遺伝子上に存在する一塩基多型である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記一塩基多型が、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する骨・関節疾患検査用プローブ。
【請求項７】
配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる骨・関節疾患検査用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は側弯症等の骨・関節疾患の発症リスクや発症の有無を判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
側弯症は、脊椎が左右方向に弯曲した病態をいう。側弯症の内、その病因が明らかでないものを特発性側弯症と呼び、側弯症の８０〜９０％を占める。
【０００３】
側弯症は、通学年代の児童に多く発症し、特に、女子に多く発症する。１０歳から骨格が成熟するまでの児童において、側弯の指標であるコブ角（Cobb angle）で少なくとも１０°の弯曲を示し、且つ、その病因が明らかでないものを思春期特発性側弯症（Adolescent idiopathic scoliosis；ＡＩＳ）と定義する。ＡＩＳの発症頻度は、通学年代の児童の内、日本で２％、世界では２〜３％であり、日本では毎年１万人程度が発症している。
【０００４】
側弯症の診断は主にＸ線検査により行われるが、Ｘ線検査は発症前や発症初期における側弯症の診断には有効でない。また、特発性側弯症の治療は、対症療法により行われるのみで、病因が明らかでない以上、原因療法は行われていない。よって、側弯症の発症前診断（リスク診断）や早期診断を可能にし、また、原因治療を可能にするため、側弯症と関連する遺伝子や一塩基多型（ＳＮＰｓ）の同定が望まれている。
【０００５】
ゲノムワイド連鎖解析（genome-wide linkage analysis）によりＡＩＳの病因となる多くの遺伝子座が見出されており、ＡＩＳは複雑な遺伝的素因に基づくと考えられている（非特許文献１、２）。また、候補遺伝子解析によりＡＩＳ感受性遺伝子が報告されているが（非特許文献３〜９）、いずれの遺伝子についても別の人種を被検者とした場合にＡＩＳとの関連の再現性が得られていない（非特許文献１０、１１）。
【０００６】
さらに、近年、伝達不平衡解析（Transmission Disequilibrium Test；ＴＤＴ）法に基づくゲノムワイド関連解析（Genome-wide association study；ＧＷＡＳ）によって、ＡＩＳと関連する遺伝子の候補が報告された（非特許文献１２）。しかしながら、それらは、多重検定補正後のケース−コントロール関連解析においてはＡＩＳとの関連の再現性が得られていない。
【０００７】
一方、近年、ＧＷＡＳによって、第１０染色体長腕２４．３１領域（10q24.31領域）に存在するＳＮＰｓが、日本人集団および中国人集団において、ゲノムワイド水準を満たしてＡＩＳと関連することが見出された（非特許文献１３、１４）。
【０００８】
第６染色体長腕２４．１領域（6q24.1領域）に存在するGPR126遺伝子は、adhesion-GPCR（adhesion class G protein-coupled receptor）ファミリーに属するオーファン受容体をコードする。GPR126遺伝子に存在するrs6570507は、ヨーロッパ人集団におけるＧＷＡＳのメタ解析により、体幹長（座高）との関連が見出されている（非特許文献１５）。しかしながら、GPR126遺伝子と側弯症との関連は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wise, C.A. et al., Curr. Genomics 9, 51-59 (2008).
【非特許文献２】Raggio, C. L. et al., J. Orthop. Res. 27, 1366-1372 (2009).
【非特許文献３】Wu, J. et al., Spine 31, 1131-1136 (2006).
【非特許文献４】Zhang, H.Q. et al., Spine 34, 760-764 (2009).
【非特許文献５】Chen, Z. et al., Eur. J. Hum. Genet. 17, 525-532 (2009).
【非特許文献６】Qiu, X. S. et al., Spine 32, 1748-1753 (2007).
【非特許文献７】Wang, H. et al., Spine 33, 2199-2203 (2008).
【非特許文献８】Inoue, M. et al., Stud. Health Technol. Inform. 91, 90-96 (2002).
【非特許文献９】Yeung, H.Y. et al., Stud. Health Technol. Inform. 123, 18-24 (2006).
【非特許文献１０】Takahashi, Y. et al., J. Orthop. Res. 29, 834-837 (2011).
【非特許文献１１】Takahashi, Y. et al., J. Orthop. Res. 29, 1055-1058 (2011).
【非特許文献１２】Sharma, S. et al., Hum Mol Genet. 20, 1456-1466 (2011).
【非特許文献１３】Takahashi, Y. et al., Nat. Genet. 43, 1237-1240 (2011).
【非特許文献１４】Fan, YH. et al., J. Hum. Genet. 57, 244-246 (2012).
【非特許文献１５】Soranzo, N. et al., PLoS Genet 5, e1000445 (2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、側弯症等の骨・関節疾患の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第６染色体長腕２４．１領域（6q24.1領域）に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が思春期特発性側弯症（ＡＩＳ）と関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより側弯症等の骨・関節疾患の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
[１]
第６染色体長腕２４．１領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査することを特徴とする、骨・関節疾患の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
[２]
前記骨・関節疾患が、側弯症である、前記方法。
[３]
前記側弯症が、思春期特発性側弯症である、前記方法。
[４]
前記一塩基多型が、GPR126遺伝子上に存在する一塩基多型である、前記方法。
[５]
前記一塩基多型が、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、前記方法。[６]
配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する骨・関節疾患検査用プローブ。
[７]
配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる骨・関節疾患検査用プライマー。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、これまで予測が困難であった側弯症等の骨・関節疾患の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。また、側弯症等の骨・関節疾患の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は側弯症等の骨・関節疾患の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＧＷＡＳおよび一連の再現試験（replication studies）の概要を示す図。
【図２】第６染色体長腕２４．１領域（6q24.1）とＡＩＳとの関連解析の結果および組み換え率（recombination rate）を示す図。関連解析の結果は、コクラン・アーミテージ傾向検定のＰ値の-log10として示す。菱形は、ＡＩＳとの最も強い関連を示したＳＮＰを示す。
【図３】ゼブラフィッシュのGPR126遺伝子のモルファントの表現型を示す図および写真。（Ａ）体長および眼球直径を図示した側面図。（Ｂ）〜（Ｅ）受精後１４日目における、（Ｂ）体長、（Ｃ）眼球直径、（Ｄ）アリザリンレッド染色した骨格、および（Ｅ）脊椎数。＊：Ｐ＜０．０５。ＮＳ：有意ではない。ctrl MO：コントロール。gpr126 MO：GPR126遺伝子のモルファント。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第６染色体長腕２４．１領域（6q24.1領域）に存在するＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査することを特徴とする、骨・関節疾患の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは骨・関節疾患の発症リスクの検査及び骨・関節疾患の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、骨・関節疾患の発症リスクおよび／または発症の有無と関連付ける。
【００１６】
骨・関節疾患としては、特に限定されないが、例えば、脊椎の疾患、具体的には、側弯症が挙げられる。本発明の方法は、特に、従来病因が特定されていない特発性側弯症の検査に好適に用いられる。側弯症は、先天性、若年性、思春期性、成人性等、いずれの時期に発症するものであってもよいが、思春期性側弯症であるのが好ましく、思春期特発性側弯症（ＡＩＳ）であるのがより好ましい。
【００１７】
本発明の方法は、いずれの人種の被検者に対しても用いることができる。本発明の方法は、例えば、日本人や中国人等のアジア人の被験者や白人の被験者に好適に用いることができる。また、本発明の方法は、いずれの性別の被検者に対しても用いることができるが、特に、女性被検者に対して好適に用いることができる。
【００１８】
6q24.1領域に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs6570507を挙げることができる。ここで、rs番号は、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs6570507は、6q24.1領域のGPR126遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰ、例えばGPR126遺伝子上に存在するＳＮＰ、を解析することによって骨・関節疾患を検査することができる。GPR126遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000006.11の142623056〜142767403の領域が挙げられる。
【００１９】
rs6570507はGenBank Accession No. NC_000006.11の142679572番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＡである場合は骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＡＡ＞ＡＧ＞ＧＧの順で骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。
【００２０】
なお、rs6570507について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、配列番号１に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
【００２１】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【００２２】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。ｒ2は連鎖不平衡係数である。また上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。もしくは、複数人（通常は２０〜４０人程度）から採取したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、遺伝子型を考慮して解析した場合は、リスクアレルのホモ接合体  ＞  リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体  ＞  非リスクアレルのホモ接合体の順で骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。
【００２３】
rs6570507と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs9403383、rs6909857、rs972982、rs9403382、rs9389986、rs2050157、rs9496346、rs7741741、rs9389985、rs2039986、rs1891308、rs9403380、rs1418201、rs1040525、rs9496369、rs6570509、rs6937121が挙げられる。
【００２４】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて骨・関節疾患と関連付けることにより、骨・関節疾患を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つと、骨・関節疾患と関連する既知のＳＮＰｓ（非特許文献１３等）や当該既知のＳＮＰｓと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓとを組み合わせて解析してもよい。骨・関節疾患と関連する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、骨・関節疾患の検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、GPR126遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【００２５】
ＳＮＰの解析に用いる試料は、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されない。ＳＮＰの解析に用いる試料としては、例えば、血液、尿等の体液、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００２６】
ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側  数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお
、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００２８】
また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００２９】
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３０】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３１】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【００３２】
このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、骨・関節疾患を検査するためのデータを得ることができる。
【００３３】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、側弯症等の骨・関節疾患を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１に示す塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。なお、「当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基」及びその前後の領域の塩基配列は、例えば、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）から取得できる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
【００３４】
また、プライマーとしては、上記ＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１に示す塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングした
りすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
【００３５】
上記ＳＮＰ部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【００３６】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３８】
（１）思春期特発性側弯症（ＡＩＳ）と関連するＳＮＰｓの同定
ＡＩＳ感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万ヶ所のＳＮＰｓを用いて、ある疾患の患者（ケース）とその疾患にかかっていない被験者（コントロール）との間で、多型の頻度に差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。
【００３９】
ＧＷＡＳおよび一連の再現試験（replication studies）の概要を図１に示す。なお、本研究は、理化学研究所の倫理委員会および参加機関の倫理委員会によって承認され、全ての被検者および一部の被検者の両親からインフォームドコンセントを得た。
【００４０】
（１−１）ＧＷＡＳ
ＡＩＳは女性に多く発症することから、ＧＷＡＳの被検者としては日本人女性を採用した。ＧＷＡＳに用いたＡＩＳ被検者（ケース（case））1,050名は、８ヶ所の病院で募集した。全ＡＩＳ被検者は、臨床検査および放射線検査を受け、側弯症の専門医によりＡＩＳと診断された。ＡＩＳの診断基準は、非特許文献９、１０に記載の通りである。なお、全ＡＩＳ被検者において、側弯の指標であるコブ角（Cobb angle）は２０°を超えていた。ＧＷＡＳに用いた対照被検者（コントロール（control））1,474名は、BBJ（BioBank Japan）に登録されたＡＩＳ以外の疾患の患者、および大阪御堂筋ロータリークラブで募集した健康なボランティアからなる。
【００４１】
ＡＩＳ被検者1,050名の遺伝子型を、Illumina Human610 Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析した。対照被検者1,474名の遺伝子型を、Illumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析した。クオリティコントロールとして、コール率（call rate）が０．９９未満のＳＮＰｓ、Hardy-Weinberg平衡検定でのＰ値がカットオフ値以下（Ｐ≦１０-6）のＳＮＰｓ、単型のＳＮＰｓ（monomorphic SNPs）、ＡＩＳ被検者と対照被検者とで共有されていないＳＮＰｓ、あいまいなコール（ambiguous call）のＳＮＰｓ、identify-by-state（ＩＢＳ）≧１．７の近縁ペアの内の低コール率の被検者（ＡＩＳ被検者１６名、対照被検者１名）、および主成分分析（ＰＣＡ）により外れ値（outlier）であると判定された被検者（ＡＩＳ被検者１名）を除外した。クオリティコントロールを通過したＡＩＳ被検者1,033名および対照被検者1,473名の465,762個のＳＮＰｓ（Ｘ染色体上のＳＮＰｓを含む）について、コクラン・アーミ
テージ傾向検定（Cochran-Armitage trend test）によりＡＩＳとの関連を評価した。
【００４２】
ＧＷＡＳの結果、既にゲノムワイド水準でＡＩＳとの有意な相関が報告されている10q24.31領域の３つのＳＮＰｓ（非特許文献１３）以外に、６つのＳＮＰｓについてＡＩＳとの関連が示唆された。
【００４３】
（１−２）日本人女性被検者による再現試験
上記６つのＳＮＰｓの内、同一遺伝子座内（ｒ2＞０．８）および10q24.31領域内のＳＮＰｓを除外し、３つのＳＮＰｓ（rs6570507、rs7695327、およびrs3123295）を選択して再現試験に供した。再現試験には、ＧＷＡＳの被検者とは独立の日本人女性被検者を用いた。680名のＡＩＳ被検者、および、9,672名の対照被検者を、ＧＷＡＳの被検者と同様の基準で採用した。ＡＩＳ被検者680名の遺伝子型は、multiplex-PCR invader assay（Third Wave Technologies）により解析した。対照被検者9,672名の遺伝子型は、Illumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析した。
【００４４】
再現試験の結果、上記３つのＳＮＰｓの内、第６染色体に存在するrs6570507が、ボンフェローニ補正後の有意性の閾値であるＰ＜１．６７×１０-2（＝０．０５／３）を満たし、ＡＩＳとの有意な関連を示した（表１の「Replication」欄）。
【００４５】
また、Mantel-Haenszel法を用いてＧＷＡＳと日本人女性被検者による再現試験のメタ解析を行った結果、rs6570507は、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜５×１０-8を満たし（Ｐ＝４．１０×１０-10）、ＡＩＳとの有意な関連を示した（表１の「Combined」欄）。
【００４６】
【表１】
2014132875.tif 000002
ＲＡＦ；リスクアレル頻度（Risk Allele Frequency）
ＣＩ；信頼区間（Confidence Interval）
ａ：コクラン・アーミテージ傾向検定のＰ値。
ｂ：９５％ＣＩでのアレルのオッズ比（Odds Ratio）。
ｃ：Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定のＰ値。
ｄ：Mantel-Haenszel法により算出したＰ値。
【００４７】
（１−３）日本人被検者による試験のメタ解析
さらに、106名の男性ＡＩＳ被検者、および、14,794名の男性対照被検者を、ＧＷＡＳの被検者と同様の基準で採用し、再現試験を行った。Mantel-Haenszel法を用いてＧＷＡＳと日本人女性被検者および日本人男性被検者による再現試験のメタ解析を行った結果、rs6570507は、ＡＩＳとのさらに有意な関連を示した（表２の「Japanese Combined」欄）。
【００４８】
【表２】
2014132875.tif 000003
ＲＡＦ；リスクアレル頻度（Risk Allele Frequency）
ＣＩ；信頼区間（Confidence Interval）
ａ：コクラン・アーミテージ傾向検定のＰ値。
ｂ：９５％ＣＩでのアレルのオッズ比（Odds Ratio）。
ｃ：Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定のＰ値。
ｄ：Mantel-Haenszel法により算出したＰ値。
【００４９】
（１−４）中国人被検者および白人被検者による再現試験
さらに、日本人女性被検者でＡＩＳとの有意な関連が認められたrs6570507について、中国人（漢民族）集団および白人集団におけるＡＩＳとの関連を検証した。
【００５０】
中国人ＡＩＳ被検者743名は、南京大学医学院付属楼鼓病院で採用した。全ＡＩＳ被検者は、臨床検査および放射線検査を受け、側弯症の専門医によりＡＩＳと診断された。ＡＩＳの診断基準は、非特許文献１１に記載の通りである。中国人対照被検者1,209名は、健康なボランティアからなる。中国人被検者の遺伝子型は、multiplex PCR-based invader assayにより解析した。
【００５１】
白人被検者は、テキサス大学サウスウエスタン医学センターの倫理委員会に承認されたプロトコルに従って採用した。すなわち、白人ＡＩＳ被検者457名は、テキサス州スコティッシュライト小児病院（ＴＳＲＨＣ）の整形外科の患者及びその家族から採用した。全ＡＩＳ被検者は、臨床検査および放射線検査を受け、側弯症の専門医によりＡＩＳと診断された。ＡＩＳの診断基準は、非特許文献１２に記載の通りである。白人対照被検者744名は、テキサスの地元住民およびＴＳＲＨＣの整形外科以外の患者から採用した。白人被検者の遺伝子型は、Illumina Human OmniExpress 12v1 Chipにより解析した。PLINK v1.07を用いてクオリティコントロールを行い、白人ＡＩＳ被検者10名および白人対照被検者7名を除外した。
【００５２】
その結果、中国人および白人の両集団において、rs6570507とＡＩＳの関連が再現された（表２の「Replication」欄）。また、Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定のＰ値はいずれも０．０５未満であり（表２の「Phet」欄）、試験間での有意な不均一性（significant heterogeneity）は認められなかった。また、全試験のメタ解析によるＰ値は、１．２３×１０-14であった（表２の「All Combined」欄）。
【００５３】
すなわち、本実施例は、人種を問わずＡＩＳと有意に関連する領域を初めて報告するものである。
【００５４】
（１−５）補完（imputation）
さらなるＡＩＳ関連領域の調査のため、１０００ゲノムプロジェクト（http://www.1000genomes.org/）の東アジア集団サンプルのリファレンスハプロタイプデータに基づき、MACHおよびMinimac softwareを用いて、全ゲノムの遺伝子型の補完を行った。
【００５５】
その結果、１２ヶ所の遺伝子座についてＡＩＳとの関連が示唆された。そこで、１２ヶ所の遺伝子座の内、これまでにＡＩＳとの関連が認められていない８ヶ所の遺伝子座のそれぞれにおける最もＡＩＳとの関連が強い（最もＰ値が低い）ＳＮＰについて、786名のＡＩＳ被検者および3,422名の対照被検者からなる独立したデータセットを用いて遺伝子型の解析を行った。しかしながら、いずれのＳＮＰも、ボンフェローニ補正後にＡＩＳとの関連を再現できなかった。
【００５６】
（１−６）第６染色体長腕２４．１領域（6q24.1）のマッピング
ＡＩＳとの有意な関連が見出されたrs6570507は、第６染色体長腕２４．１領域（6q24.1）に存在する。そこで、１０００ゲノムプロジェクトのデータを用いて、当該領域のマッピングを行った。結果を図２に示す。rs7774095がＡＩＳとの最も強い関連を示し、rs6570507がそれに続いた。ただし、ＧＷＡＳにおいては、rs7774095とＡＩＳの関連（Ｐ＝１．２３×１０-5，ＯＲ＝１．２９）は、rs6570507とＡＩＳの関連（Ｐ＝１．３７×１０-6，ＯＲ＝１．３２）よりは小さいものであった。当該領域には、rs6570507と強い連鎖不平衡にある１７個のＳＮＰｓ（rs9403383、rs6909857、rs972982、rs9403382、rs9389986、rs2050157、rs9496346、rs7741741、rs9389985、rs2039986、rs1891308、rs9403380、rs1418201、rs1040525、rs9496369、rs6570509、rs6937121）があり、これらのＳＮＰｓは、rs6570507と同様に、ＡＩＳと関連する。rs6570507およびこれら１７個のＳＮＰｓは、いずれも、当該領域のGPR126遺伝子内に位置していた。
【００５７】
（２）GPR126の機能解析
GPR126遺伝子は、adhesion-GPCR（adhesion class G protein-coupled receptor）ファミリーに属するオーファン受容体をコードする。
【００５８】
マウスにおいては、軟骨形成の重要な調節因子であるSox9遺伝子の欠損により、椎間板におけるGPR126遺伝子の発現が低下することが示唆されている。一方、ヒトにおいて、側弯症に関連する骨格組織におけるGPR126遺伝子の発現については検討されていなかった。そこで、ヒトにおいて、骨、軟骨、椎間板を含む種々の組織におけるGPR126遺伝子の発現を調べた。その結果、GPR126遺伝子が軟骨において強く発現していることが明らかとなった。また、in situハイブリダイゼーションにより、胎生期のマウスにおけるGPR126遺伝子の発現を解析したところ、GPR126遺伝子は椎体軟骨細胞の増殖部位で発現していることが見出された。
【００５９】
次に、ゼブラフィッシュを用いて、骨格形成におけるGPR126の機能を調べた。GPR126遺伝子の翻訳阻害モルフォリノ（gpr126 translation-blocking morpholino；5'-ACCGACCACTGATGAACGAAATCAT-3'；配列番号２）を１細胞期胚へ注入し、GPR126遺伝子の機能喪失がもたらす影響について調べた。その結果、GPR126遺伝子のモルファント（gpr126 morphant）は、コントロールと比較して、体長が短く、脊椎の骨化が遅延した（図３）。また、GPR126遺伝子のモルファントは、コントロールと比較して、逃避反応が遅かった。なお、GPR126遺伝子の翻訳阻害モルフォリノに代えて、スプライシング阻害モルフォリノ（5'-TGCCACTGCAAG CAAACAGGGCACA-3'；配列番号３）を用いた場合も同様であった。
【００６０】
（３）考察
側弯症は、骨格成長の異常により引き起こされると広く考えられている（Kouwenhoven,
J.W. & Castelein, R.M., Spine (Phila Pa 1976) 33, 2898-908 (2008)）。形態学的研究によれば、ＡＩＳ患者は、長手方向に早いアンバランスな椎体の成長と、脊椎以外の骨
格の長さの非対称性を示すと報告されている（Guo, X., et al., J Bone Joint Surg Br 85, 1026-31 (2003); Burwell, R.G., et al., Stud Health Technol Inform 135, 3-52 (2008); Burwell, R.G. et al., Scoliosis 4, 24 (2009)）。GPR126遺伝子のノックアウトマウスは、四肢の姿勢の異常や成長障害を示すと報告されている（Monk, K.R., et al., Development 138, 2673-80 (2011)）。GPR126遺伝子は、身長（body hight）と関連すると報告されている（Zhao, J. et al., BMC Med Genet 11, 96 (2010); Soranzo, N. et
al., PLoS Genet 5, e1000445 (2009); Sovio, U. et al., PLoS Genet 5, e1000409 (2009); Lettre, G. et al., Nat Genet 40, 584-91 (2008)）。また、GPR126遺伝子に存在するrs6570507は、ヨーロッパ人集団におけるＧＷＡＳのメタ解析により、体幹長（座高）との関連が見出されている（非特許文献１５）。よって、GPR126遺伝子は、脊椎形成異常を通じて、ＡＩＳ感受性に影響する可能性がある。
【００６１】
また、多くの研究により、GPR126遺伝子は髄鞘形成（myelination）に必須であると示唆されている（Monk, K.R., et al., Development 138, 2673-80 (2011); Pogoda, H.M. et al., Dev Biol 298, 118-31 (2006); Monk, K.R. et al., Science 325, 1402-5 (2009)）。髄鞘（myelin sheath）は、脊椎動物の神経系において軸索による高速な活動電位の伝導を可能にし、神経伝導速度を向上させる。また、側弯症は、種々の神経障害において見出される（Kouwenhoven, J.W. & Castelein, R.M., Spine (Phila Pa 1976) 33, 2898-908 (2008); Carter, G.T. et al., Am J Phys Med Rehabil 74, S140-9 (1995)）。よって、GPR126遺伝子は、神経系の制御異常を通じて、ＡＩＳ感受性に影響する可能性がある。例えば、GPR126遺伝子のモルファントにおける逃避反応の遅延は、神経系の欠陥に関連している可能性がある。
【００６２】
なお、本願発明は、いかなる意味においても、上記で考察した理論に拘束されるものではない。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
以上の通り、全ゲノムレベルでのケース−コントロール（Case-Control）関連解析により、ゲノムワイド水準を満たしてＡＩＳと関連する領域が見出された。当該領域に存在するＳＮＰｓは側弯症等の骨・関節疾患の検査に有用であり、側弯症等の骨・関節疾患の予防および／または治療に貢献するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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