(57)【要約】      （修正有）【課題】電気泳動により試料の分離又は濃縮を行った後、蛍光Ｘ線分析を行うことによりタンパク質結合元素を分析する分析方法において、良好な検出感度を有する部材、及び、その分析方法を提供する。【解決手段】電気泳動用ゲル２１の一部または全体が、高分子製フィルム１１に重合して被覆されてなり、前記電気泳動用ゲルは、１試料を電気泳動させるための１レーンのみを有する略短冊形状をなし、最大厚は１．０ｍｍ未満である事を特徴とする、タンパク質結合元素の分析のための電気泳動用部材、及び該電気泳動用部材に、前記試料をアプライして電気泳動を行い、前記試料を分離又は濃縮させる工程と、前記電気泳動用ゲルを脱水させる工程と、前記濃縮又は分離された試料に含まれる、前記タンパク質に結合した元素を蛍光Ｘ線分析により検出する工程とより成ることを特徴とする方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動用ゲルの一部または全体が、高分子製フィルムに重合して被覆されてなり、
前記電気泳動用ゲルは、１試料を電気泳動させるための１レーンのみを有する略短冊形状をなし、最大厚は１．０ｍｍ未満である事を特徴とする、
タンパク質結合元素の分析のための電気泳動用部材。
【請求項２】
前記高分子製フィルムの素材は、炭素元素、水素元素及び酸素元素以外を含まない素材より構成される、請求項１に記載の、タンパク質結合元素の分析のための電気泳動用部材。
【請求項３】
試料内のタンパク質に結合した元素の分析方法であって、
電気泳動用ゲルの一部または全体が、高分子製フィルムに重合して被覆されてなり、
前記電気泳動用ゲルは、１試料を電気泳動させるための１レーンのみを有する略短冊形状をなし、最大厚は１．０ｍｍ未満である事を特徴とする電気泳動用部材に、前記試料をアプライして電気泳動を行い、前記試料を分離又は濃縮させる工程と、
前記電気泳動用ゲルを脱水させる工程と、
前記濃縮又は分離された試料に含まれる、前記タンパク質に結合した元素を蛍光Ｘ線分析により検出する工程とより成る
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記高分子製フィルムの素材は、炭素元素、水素元素及び酸素元素以外を含まない素材より構成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記電気泳動用の緩衝液は、キレート処置したものである請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記電気泳動用の電気泳動槽として、縦型の電気泳動槽を用いてなる、請求項３〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記脱水させる工程は、凍結乾燥によるものである請求項３〜６の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質結合元素の分析のための電気泳動用部材及びその分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生体中のタンパク質に何らかの物質が結合することと、生命機能や病態との関連性について、多くの研究がなされてきた。例えば、タンパク質にリン酸基が結合する、いわゆるタンパク質のリン酸化については、種々の病態と密接に関連しているとの報告が数多くなされている。そしてそのような研究に必要となるような、タンパク質にリン酸基が結合しているか否かを検出するための方法も、開発されてきた。
【０００３】
また最近では、癌細胞を用いた実験により、癌細胞の状態に応じて、癌細胞内での金属元素の局在に変化が見られるという知見が報告され（非特許文献１参照）、元素と病態との関連についても注目され始めている。こうした背景から、数多くの異なるタンパク質が混在する生体由来試料内において、どのタンパク質にどういった元素が結合しているのか、分析する方法を確立することが求められている。
【０００４】
特定のタンパク質に結合する元素を分析するための方法としては、例えば、試料から目的とするタンパク質を濃縮、分離又は抽出した後に、そのタンパク質に結合する元素を分析する方法が考えられる。試料から目的とするタンパク質を濃縮、分離又は抽出する手段としては、例えば、ゲル等の担体を用いた電気泳動法があげられ、タンパク質に結合する元素を分析する手段としては、例えば、蛍光Ｘ線分析法があげられる。しかし、これら両手段を単純に組み合わせても、電気泳動後の電気泳動用ゲルには、自らがＸ線を発するような物質や、水分を始めとした蛍光Ｘ線を散乱させるような物質が多く含まれていることから、目的とする微量の元素からの蛍光Ｘ線による微弱な信号は、バックグラウンドに埋もれてしまい、検出するのは不可能であった。
【０００５】
このような課題を解決するために、試料を電気泳動した後のゲルの凍結乾燥を行い、次いで凍結乾燥後のゲルを蛍光Ｘ線分析にかけることにより、タンパク結合元素を分析する方法が提案されている（非特許文献２参照）。こうすることにより、蛍光Ｘ線が電気泳動ゲル内に含まれる水分によって散乱することにより生じるＸ線の散乱を抑制し、バックグラウンドを下げることができる。しかしそれでも、凍結乾燥により生じるゲルの歪みなど、精度の高い検出感度を得るためには依然として多くの課題を抱えているのが実情であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｕｒａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５  Ｊｕｎ：  ６５（１２）：  ４９９８−５００２
【非特許文献２】山内和人、平成２２年度ＣＲＥＳＴ研究年報、［online］、平成２３年９月７日、科学技術振興機構、［平成２４年１１月２６日検索］、インターネット＜http://www.jst.go.jp/kisoken/crest/report/heisei22/pdf/pdf18/18-016.pdf＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような事情に鑑み、本発明の目的とするところは、電気泳動により試料の分離又は濃縮を行った後、蛍光Ｘ線分析を行うことによりタンパク質結合元素を分析する分析方法において、良好な検出感度を有する電気泳動用部材及びその分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕電気泳動用ゲルの一部または全体が、高分子製フィルムに重合して被覆されてなり、前記電気泳動用ゲルは、１試料を電気泳動させるための１レーンのみを有する略短冊形状をなし、最大厚は１．０ｍｍ未満である事を特徴とする、タンパク質結合元素の分析のための電気泳動用部材、
〔２〕前記高分子製フィルムの素材は、炭素元素、水素元素及び酸素元素以外を含まない素材より構成される、前記〔１〕に記載の、タンパク質結合元素の分析のための電気泳動用部材、
〔３〕試料内のタンパク質に結合した元素の分析方法であって、電気泳動用ゲルの一部または全体が、高分子製フィルムに重合して被覆されてなり、前記電気泳動用ゲルは、１試料を電気泳動させるための１レーンのみを有する略短冊形状をなし、最大厚は１．０ｍｍ未満である事を特徴とする電気泳動用部材に、前記試料をアプライして電気泳動を行い、前記試料を分離又は濃縮させる工程と、前記電気泳動用ゲルを脱水させる工程と、前記濃縮又は分離された試料に含まれる、前記タンパク質に結合した元素を蛍光Ｘ線分析により検出する工程とより成ることを特徴とする方法、
〔４〕前記高分子製フィルムの素材は、炭素元素、水素元素及び酸素元素以外を含まない素材より構成される前記〔３〕に記載の方法、
〔５〕前記電気泳動用の緩衝液は、キレート処置したものである前記〔３〕又は〔４〕に記載の方法、
〔６〕前記電気泳動用の電気泳動槽として、縦型電気泳動槽を用いてなる、前記〔３〕〜〔５〕の何れかに記載の方法、
〔７〕前記脱水させる工程は、凍結乾燥によるものである前記〔３〕〜〔６〕の何れかに記載の方法、
である。
【発明の効果】
【０００９】
以上にしてなる本発明によれば、電気泳動用ゲルが、高分子製フィルムに重合されていることにより、電気泳動用ゲルと高分子フィルム間に隙間が無くなり、電気泳動用ゲルを蛍光Ｘ線分析にかけた際のバックグラウンドを抑制し、検出感度を向上させることができる。また、使用する電気泳動用ゲルは、その最大厚が１．０ｍｍ未満で、且つ、１試料を電気泳動させるための１レーンのみを有する略短冊形状となっており、一般的に使用されるような複数レーンを有する電気泳動用ゲルに比べ、脱水工程を短時間で一気に為し得るため、電気泳動後の濃縮又は分離された試料が電気泳動ゲル内でにじみにくく、また脱水によるゲルの歪みも少なく、更に検出感度を向上させることを可能にする。
【００１０】
また、使用する高分子製フィルムの素材として、例えば炭素元素、水素元素及び酸素元素以外の不純物を含まない素材より構成される素材、つまりそれ自体が蛍光Ｘ線をあまり発しないような素材を使用することにより、蛍光Ｘ線分析を行う際におけるバックグラウンドを抑制し、更に検出感度を向上させることができる。
【００１１】
また、電気泳動の際に使用する電気泳動用の緩衝液を、キレート処置した後に使用することにより、電気泳動用の緩衝液に含まれる金属元素が蛍光Ｘ線分析の際に検出されず、バックグラウンドを抑制し、更に検出感度を向上させることができる。
【００１２】
また、電気泳動の際に使用する電気泳動槽として、縦型の電気泳動槽を使用することにより、電気泳動した際に、よりにじみの少ないバンドを得られることから、より精度の高い分析が可能となる。
【００１３】
また、電気泳動用ゲルを脱水させる工程は、凍結乾燥により脱水させることにより、脱水工程における電気泳動用部材の歪みを最小限に抑えることができ、更に精度の高い蛍光Ｘ線分析を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明における電気泳動用部材を作製するための器具。
【図２】本発明の分析方法における装置の配置例。
【図３】凍結乾燥後の厚さ測定試験結果。
【図４】電気泳動後のタンパク質分離能評価試験結果。
【図５】蛍光Ｘ線分析法を利用したタンパク質結合元素の検出感度評価試験結果。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、電気泳動用ゲルの一部または全体が、高分子製フィルムに重合して被覆されてなり、前記電気泳動用ゲルは、１試料を電気泳動させるための１レーンのみを有する略短冊形状をなし、最大厚は１．０ｍｍ未満である事を特徴とするタンパク質結合元素の分析のための電気泳動用部材、及び該電気泳動用部材に試料をアプライして電気泳動を行い、前記試料を分離又は濃縮させる工程と、前記電気泳動用ゲルを脱水させる工程と、前記濃縮又は分離された試料に含まれる、前記タンパク質に結合した元素を蛍光Ｘ線分析により検出する工程とより成ることを特徴とする方法である。
【００１６】
次に、本発明の実施形態を、添付図面に基づき説明する。
【００１７】
本発明に係る電気泳動用部材は、高分子製フィルム１１及び電気泳動用ゲルとが重合したものからなる。
【００１８】
電気泳動に使用する電気泳動用ゲルは、水分を含んだ担体より成る。蛍光Ｘ線分析を行うに当たって、水分はＸ線を散乱させることにより分析の精度に悪影響を及ぼすが、本発明に係る分析方法においては、後述するように、蛍光Ｘ線分析を行う前に電気泳動用部材を脱水させるため、電気泳動用ゲルに水分が含まれることは問題とならない。しかし、電気泳動用ゲルを脱水させた後に残る担体が蛍光Ｘ線を放つため、それが蛍光Ｘ線分析をした際にバックグラウンドとして計測され、目的とする試料の測定感度を低下させる要因となる。従って、検出感度を向上させるためには担体があまり含まれていない電気泳動用ゲル、つまり含水率の高い電気泳動用ゲルを使用することが望ましい。電気泳動用ゲルの担体としては、一般的にタンパク質の電気泳動に使用される公知の電気泳動用ゲルを用いることができ、例えばポリアクリルアミド、等電点電気泳動用担体等を使用することができるが、これらに限定されない。
【００１９】
電気泳動用ゲルに含まれる担体の放つ蛍光Ｘ線に由来するバックグラウンドをできるだけ抑制するために、電気泳動用ゲルは、なるべく薄いものが望ましい。具体的には、電気泳動用ゲルの最大厚は、１．０ｍｍ未満であることが好ましく、０．６ｍｍ以下であることがより好ましい。最大厚とは、電気泳動用ゲルにおける、最も分厚い部分の厚みをいうが、基本的に本発明に係る電気泳動用部材を構成する電気泳動用ゲルは、その全体が一定の厚みになるように構成するのが望ましいが、これに限定されない。
【００２０】
高分子製フィルム１１は、後述するような、本発明に係る電気泳動用部材を凍結乾燥し、蛍光Ｘ線分析にかける際に、電気泳動用ゲルの支持体としての役割を果たす。このような高分子製フィルム１１を構成する高分子としては、蛍光Ｘ線分析を行う際に、バックグラウンドを少しでも低下させるために、自ら発する蛍光Ｘ線（以下、自家蛍光Ｘ線という）が極力少ないものが好ましく、炭素元素、水素元素及び酸素元素以外の不純物を含まない素材が望ましい。このような素材として、例えばポリイミド、プロレン、ポリプロピレン、ポリエステル、エノムＳ等があげられるが、これらに限定されない。また、これらの素材の中の一種を使用して高分子製フィルム１１を作製してもよいし、複数種によるアロイにより作製してもよい。
【００２１】
高分子製フィルム１１は、自家蛍光Ｘ線によるバックグラウンドを少しでも抑えるために、なるべく薄いものであるのが望ましい。具体的には高分子製フィルム１１の厚みは５０μｍ以下であることが好ましく、３０μｍ以下であることがより好ましい。
【００２２】
このような電気泳動用部材は、例えば、図１に示すような、本体ガラス板１２、蓋ガラス板１３、及びゴム紐１４とからなる電気泳動用ゲル作製器材を用いて作製することができる。また、必要に応じてコーム１５を使用することもできる。
【００２３】
本体ガラス板１２は、単数又は複数の溝部１７を有しており、各溝部１７は、ゴム紐１４を挟んで本体ガラス板１２と蓋ガラス板１３とを重ね合わせることにより、その一つ一つが、短冊状の電気泳動用ゲルを作製するための型枠となる。前述のように、本発明に係る電気泳動用部材を構成する電気泳動用ゲルの厚みはなるべく薄いものが好ましく、その厚みに応じて溝部１７の深さも決定される。
【００２４】
本体ガラス板１２のおもて側１２ａには、各溝部１７にあわせて、各溝部１７とほぼ同じ幅で、長さが本体ガラス板１２の縦方向の長さＬよりも長い高分子製フィルム１１を重ねておく。そして前記高分子製フィルム１１の両端を、それぞれ本体ガラス板１２の裏側１２ｂに向けて折り返し、該裏側１２ｂの面にテープ等で貼りつけて固定する。これ以外にも、高分子製フィルム１１を本体ガラス板１２に固定する方法としては、例えば本体ガラス板１２の縦方向の長さＬの２倍以上の長さを有する高分子製フィルム１１を用意し、その両端を本体ガラス板１２の裏側１２ｂに向けて折り返し、高分子製フィルム１１の両端同士をテープで貼り合わせるような態様であってもよい。このように、少なくとも高分子製フィルム１２が本体ガラス板１２の溝部１７に接した状態で固定されるような態様であればよく、これらに限定されない。
【００２５】
ゴム紐１４は図１に示すように本体ガラス板１２と略同じ寸法で、当該ゴム紐１４を間に挟み込むような形で、前述の高分子製フィルム１１を固定した本体ガラス板１２と、蓋ガラス板１３とを重ね合わせ、これらを横方向からクリップ１６で挟んで全体を固定する。ゴム紐１４は、液体状になった電気泳動用ゲルを、溝部１７に注入した際に、溝部１７の外に流出するのを防ぐシーリング材としての役割を有しており、シリコーンゴム等のゴムにより、作製するとよい。ゴム紐１４の形状としては、図示したように紐状であってもよいし、いわゆる「コの字型」に成形したようなものであってもよい。但し、前述したシーリング材としての役割を確保し、各溝部１７に注入された電気泳動用ゲルがつながってしまうのを防止するという観点から、溝部１７の深さと略同じ厚みを有している必要がある。
【００２６】
次に、液体状になった電気泳動用ゲルを、各溝部１７におけるゴム紐１４の存在しない端から各溝部１７に、ゴム紐１４の存在しない各溝部１７の上部から注入する。注入に際しては、例えば注射筒やピペットなど、レーンのサイズに応じて適当な器具を選択するとよく、注入の際には、なるべく気泡が入らないように留意する。またコーム１５を使用する場合には、電気泳動用ゲルが固まる前に、コーム１５を差し込み、室温等で静置して電気泳動用ゲルが固まるのを待つ。コーム１５の素材としては特に限定はないが、硬質の素材を使用した方が操作性に優れる。
【００２７】
電気泳動用ゲルは、電気泳動用ゲルの効果に伴い高分子製フィルム１１と重合し、電気泳動用ゲルと高分子製フィルムが密に結合した電気泳動用部材を得ることができる。このように、電気泳動用ゲルと高分子製フィルムとの間の隙間を最小限に抑止することにより、後述する蛍光Ｘ線分析をおこなった際におけるバックグラウンドが抑制され、検出感度の向上を図ることができる
【００２８】
作製した電気泳動用部材は、公知の電気泳動槽を使用して電気泳動をすることができる。電気泳動に際しては、その電気泳動槽の仕様に応じて、本体ガラス板１２から電気泳動用部材を取り出して電気泳動槽にセットし、電気泳動をおこなってもよいが、ゴム紐１４は取り外しつつも、電気泳動用部材が、本体ガラス板１２、蓋ガラス板１３に挟まれたままの状態で電気泳動をした方が簡便である。その場合には、本体ガラス板１２、蓋ガラス板１３、及びゴム紐１４は、使用する電気泳動槽の仕様（サイズ、形状など）に合わせたものを用意する必要がある。
【００２９】
電気泳動の際に使用する電気泳動槽としては、電気泳動用部材を地面に対して水平に保った状態で電気泳動をおこなう、いわゆる水平型電気泳動槽を使用してもよいが、電気泳動用部材を地面に対して直立させた状態で電気泳動をおこなう、いわゆる縦型電気泳動槽を使用した方が、結果的に電気泳動時における電気抵抗をより一定に保つことができ、明瞭なバンドを得ることができる。また、一つの短冊状電気泳動用部材に対して一試料をアプライするとよい。
【００３０】
電気泳動の際に使用する緩衝液は、もし緩衝液中に硬Ｘ線が検知する元素が含まれている場合、蛍光Ｘ線分析の際に、前記硬Ｘ線が検知する元素がバックグラウンドとして検出され、検出力低下の原因となる。従って、電気泳動の際に使用する緩衝液としては、硬Ｘ線が検知する元素を含有しないものを使用するのが望ましい。もし硬Ｘ線が検知する元素を含有する緩衝液を、電気泳動用の緩衝液として使用する場合には、電気泳動に先だって、緩衝液をキレート処置するとよい。その際に使用するキレート剤としては、エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸、フェナントロリンなど、緩衝液に含まれる硬Ｘ線が検知する元素の価数に応じて、公知のものから適宜選択したものより作製したキレート剤を使用するとよい。ここで用いられるキレート処置の方法としては、キレート剤を用いて緩衝液内から金属元素を除去できる方法であれば特に限定はないが、例えばキレートビーズにより前記金属元素をキレートし、次いで遠心分離によりキレートビーズを除去する方法があげられる。
【００３１】
電気泳動に使用する試料としては、生体組織由来の試料を適宜使用することができる。例えば筋肉、神経、血管、臓器等を構成する正常組織の他、癌組織等の病巣由来の組織、培養した細胞等から調製した試料を使用することができ、これらに限定されない。また、試料を調整する方法に関しては、その種類に応じ、公知の方法を採用することができる。
【００３２】
一般的に電気泳動用の試料を調整する際には、試料中のタンパク質を最小単位に分離するために、デシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳという。）で処理して試料調製をおこなうことが多い。しかし、例えば試料内に含まれるタンパク質に結合する金属元素を分析することを目的とする場合には、ＳＤＳで処理してしまうと、元素とタンパク質とが分離してしまい、目的を達成できない。従って、試料内のタンパク質に結合する元素の分析を目的とする場合には、公知の試料調整方法にならいつつも、ＳＤＳ処理をおこなう工程は回避して、試料を調整し、いわゆるｎａｔｉｖｅゲル電気泳動をおこなうことが望ましい。この場合、電気泳動により分離又は濃縮されたタンパク質は、二量体や三量体の形で存在することになるが、逆に、自然に存在する状態のタンパク質に結合する金属元素を分析することが可能である。
【００３３】
電気泳動の際の電圧、電気泳動時間等の各種条件設定に関しても、特に通常の電気泳動の際の条件と変わりはなく、試料や目的とするタンパク質の分子量にあわせて適当な条件で電気泳動をおこなうとよい。
【００３４】
電気泳動の後、電気泳動用部材を取り出す。前述のように、本体ガラス板１２、蓋ガラス板１３に挟まれたままの状態で電気泳動をする場合には、電気泳動前にゴム紐１４及びコーム１５を取り外して電気泳動を行い、電気泳動後、これらを取り出して、蓋ガラス板１３を外し、電気泳動用部材を本体ガラス板１２より外す。
【００３５】
電気泳動後に得た電気泳動用部材は、脱水させることにより、電気泳動用ゲル中の水分を除去する。脱水させる方法としては、電気泳動用ゲルから水分を飛ばすことのできるような方法であれば特に限定はなく、例えば乾燥させる等の方法がある。中でも特に、凍結乾燥により脱水させる方法が、溶液に浸したりアルコール固定を行ったりせずに乾燥操作を行えることから、タンパク質に結合した元素の遊離を最小限に抑えることができ、より好ましい。
【００３６】
電気泳動用ゲルを脱水させる方法の選択や、その脱水させる際の詳細な操作条件としては、電気泳動用部材のサイズや、電気泳動用部材を構成する電気泳動用ゲルの素材等に応じて、適当な条件で行うとよい。
【００３７】
電気泳動用部材を構成する電気泳動用ゲルを脱水させた後、前記電気泳動用ゲル内において、バンドごとに分離されたタンパク質に結合する元素を、蛍光Ｘ線分析法により分析する。
【００３８】
蛍光Ｘ線分析は、図２に示したように、保持板に脱水後の電気泳動用部材を固定し、放射光を照射することにより生じた蛍光Ｘ線を分析することによっておこなう。
【００３９】
保持板２２は、電気泳動用部材を緩みなく張った状態で固定できるものであれば特に限定はないが、蛍光Ｘ線分析におけるバックグラウンドを抑制するという観点からは、分析対象となり得る元素を含有しない素材より成ることが望ましい。また、同じく測定の際のバックグラウンドを抑制するという観点から、図２に示したように、電気泳動用部材を構成する高分子製フィルム１１の両端を、テープ等により固定することが可能な上で、放射光２４を照射した際に、電気泳動用ゲル２１の手前側にも奥側にも遮蔽物が存在しないような状態になるような形状であることが、より望ましい。このような形状としては、図２に示した「コの字型」以外にも、「Ｕ字型」や「中抜き矩形」、「中抜き円形」等が例示されるが、これらに限定されるものではなく、電気泳動用部材の両端を固定した上で、放射光２４を照射した際に、電気泳動用ゲル２１の手前側と奥側に遮蔽物が存在しないような保持板としての形状を有していればよい。電気泳動用ゲル２１は、放射光の発生源からみて高分子製フィルム１１の手前側に配されるように保持板２２に固定するのが好ましいが、これに限定されない。
【００４０】
電気泳動用ゲル２１に照射して蛍光Ｘ線を発生させるための一次Ｘ線としては、検出力を確保する観点から、高輝度のものであることが望ましく、例えばシンクロトロンより発せられる放射光であることが望ましい。
【００４１】
照射された放射光２４は、電気泳動用ゲル２１に入射した後、蛍光Ｘ線２５を発生させる。そして検出器２３により、蛍光Ｘ線２５の検出をおこなう。検出器２３としては、公知のＸ線検出器を使用することができるが、測定対象が電気泳動用ゲル２１中のバンドに含まれるタンパク質に結合する微量の元素である場合、高いエネルギー分析能力をもつ検出器であることが望ましく、例えば半導体検出器が望ましい。また半導体検出器の中でも、比較的高い計数効率を有し、冷却作業も簡便にこなすことが可能なシリコン半導体検出器が好適である。
【００４２】
放射光２４を発するシンクロトロンと保持板２２との間には、放射光２４の放出方向を確定するためのスリットを置いてもよい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例に基づき、本発明の実施形態をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００４４】
（比較例１）
高分子製フィルムとして、東レ・デュポン社製ポリイミドフィルム「カプトン（登録商標）」（品番：１００Ｈ／１００Ｖ）を用意した。
【００４５】
（比較例２）
一般的に使用されている等電点電気泳動用ゲルとして、ライフテクノロジー社製等電点電気泳動用ゲル「Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ｐＨ３−１０」（品番：ＥＣ６６５５Ａ）を用意した。
【００４６】
（実施例１）
図１に示した器具を用いて、電気泳動用部材を作製した。尚、高分子製フィルムとしては、東レ・デュポン社製ポリイミドフィルム「カプトン（登録商標）」（品番：１００Ｈ／１００Ｖ）を使用した。縦方向の長さＬは６．５ｃｍ、溝部の幅は５．０ｍｍとし、前記高分子製フィルムは、幅４．８ｍｍ、長さ１４．０ｃｍにカットし、本体ガラス板の溝部に巻き付け、本体ガラス板のうら側にて、テープで固定した。その後ゴム紐、蓋ガラス板をセットしてクリップで挟んだ後、液体状になった電気泳動用ゲルを溝部に注入した。電気泳動用ゲルは、ポリアクリルアミド (アクリルアミドモノマー, N, N’-メチレンアクリルアミド)（ディー・アール・シー社製）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ディー・アール・シー社製）、ＡＰＳ（和光純薬社製、品番：０１２−０８０２３）及びＴＥＭＥＤ（和光純薬社製、品番：２０５−０６３１０）をＭｉｌｌｉＱ水に添加し、ポリアクリルアミドが５．０重量％となるように調整した。液体状の電気泳動用ゲルを溝部に注入した後、コームを差し込んで室温に静置して電気泳動用ゲルが固まるのを待ち、電気泳動用部材を得た。次に濃縮ゲルとして、同各種溶液を混合しポリアクリルアミドが４．０％になる用に調製した。
【００４７】
（評価１：凍結乾燥後の厚さ測定試験）
上記比較例１、２及び実施例１を使用して電気泳動を行い、霜が付着してダメージ負うのを避けるためにテフロン（登録商標）フィルム（Ｎｉｌａｃｏ社製、品番：９６５１２５）で覆った後、―２０℃下に１２時間置いた。そして、−４０℃で６時間以上予備冷凍を行った後、−２５℃、５Ｐａで３６〜７２時間かけて凍結乾燥を行った。その後各比較例及び実施例の厚みを測定した。尚、測定に際しては各比較例及び実施例はそれぞれ１５以上の例数を用意し、平均値＋標準偏差で集計・表示した。
【００４８】
図３に凍結乾燥後の厚さ測定試験の結果を示した。グラフ中の凍結乾燥した実施例１の電気泳動用部材は、市販品である比較例２の一般的な電気泳動用ゲルに同様の操作を行ったものに比べて顕著に薄くなる事が確認された。
【００４９】
（評価２：電気泳動後のタンパク質分離能評価試験）
実施例１の電気泳動用部材を複数用意し、本体ガラス板、蓋ガラス板、及びゴム紐にセットしたままの状態で、縦型の電気泳動槽（日本エイドー株式会社製、品番：ＮＡ−１０１２）、及び水平型の電気泳動槽（ミューピッド社製、Ｍｕｐｉｄ（登録商標）−２ｐｌｕｓ）を用いて電気泳動をおこなった。電気泳動用の試料としてはマーカータンパク質ＮａｔｉｖｅＭａｒｋTM  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ライフテクノロジー社製、品番：Ｌｃ０７２５）を用いた。コーム及びゴム紐を取り外し、前記試料をアプライして電気泳動を行い、電気泳動終了後、電気泳動用部材を上記本体ガラス板、蓋ガラス板より取り出して、クマシー（登録商標）・ブリリアント・ブルー染色（以下、ＣＢＢ染色という。）をおこなった。その後ＣＢＢ染色後の電気泳動用部材を観察し、両電気泳動槽を用いた場合におけるバンドの明瞭性について比較を行った。
【００５０】
図４（ａ）には縦型電気泳動槽を使用した場合、図４（ｂ）には水平型電気泳動槽を使用した場合における、ＣＢＢ染色後のバンドの画像を示した。この結果、縦型の電気泳動槽を用いて電気泳動をおこなった電気泳動用部材の方が、より明瞭なバンドを得られる事が確認された。以上より、縦型の電気泳動槽を使用した方が、水平型の電気泳動槽を使用するよりも、タンパク質の分離能に優れることが確認された。
【００５１】
（比較例３）
Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  １（以下、ＳＯＤ１という）精製タンパク質（和光純薬工業株式会社製、品番１９４−１３８２１）を、濃度勾配を緩衝液で希釈することにより試料を調製した。その後、比較例２の電気泳動用ゲルに前記試料をアプライし、等電点電気泳動を行った。電気泳動の際における緩衝液としては、キレート処置したものを使用した。電気泳動後、前記等電点電気泳動用ゲルを取り出して、東レ・デュポン社製ポリイミドフィルム「カプトン（登録商標）」（品番：１００Ｈ／１００Ｖ）と重ね合わせた。
【００５２】
（実施例２）
ＭｉｌｌｉＱ水に、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ第５分画（以下、ＢＳＡという。）（シグマ・アルドリッチ社製、品番：Ａ８０２２）１４．３μｇ及びシスプラチン（ブリストル・マイヤーズ  スクイブ社製）を加えて１００μＬとし、試料を得た。そして前記シスプラチン処理したＢＳＡ７μＬに３００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する６倍濃縮ローディングバッファー１．４μＬを加えてｐＨを６．８としたものと、６０％グリセロールを、実施例１の電気泳動用部材にアプライして電気泳動をおこなった。電気泳動の際における緩衝液としては、キレート処置したものを使用した。電気泳動後、電気泳動用部材を取り出した。
【００５３】
（評価３：蛍光Ｘ線分析法を利用したタンパク質結合元素の検出感度評価試験）
比較例３及び実施例２の電気泳動用部材を保持板に設置し、シンクロトロンから高輝度放射線を照射した。放射光におけるＸ線エネルギー電圧は１５ｋｅＶ、入射Ｘ線光子数は〜２―３×１０12ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃに設定した。シンクロトロンと保持板との間には、５００〜８００μｍ×５００〜８００μｍのＸ線スリットを置き、シリコンドリフト検出器（Ｒｏｎｔｅｃ社製、ＸＦＬＡＳＨ  ＤＥＴＥＣＴＯＲ  Ｔｙｐｅ  １２０１）を使用して、ＣＣＤカメラで撮像しながら、３〜１０ｓｅｃ／ｐｉｘｅｌで蛍光Ｘ線分析をおこなった。尚、比較例３においてはＳＯＤ１に包含される銅（Ｃｕ）及び亜鉛（Ｚｎ）元素を、実施例２においてはＢＳＡに結合する白金（Ｐｔ）元素を分析対象とした。
【００５４】
図５に示すように、比較例３においては、金属元素の検出限界の下限値が５０〜１５０ｐｇ／ｍｍ3であったのに対し、実施例２においては、同値が０．０１〜０．１ｐｇ／ｍｍ3であった。従って、本発明に係る電気泳動用部材を使用することにより、タンパク質に結合する金属元素の検出感度を顕著に向上させることが確認された。
【符号の説明】
【００５５】
１１  高分子製フィルム
１２  本体ガラス板
１２ａ  本体ガラス板のおもて側
１２ｂ  本体ガラス板のうら側
１３  蓋ガラス板
１４  ゴム紐
１５  コーム
１６  クリップ
１７  溝部
２１  電気泳動用ゲル
２２  保持板
２３  検出器
２４  放射光
２５  蛍光Ｘ線
Ｌ  縦方向の長さ
【図１】
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【図２】
2014134521.tif 000004
【図３】
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【図５】
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【図４】
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