(57)【要約】【課題】ミスフォールドタンパク質エピトープを予測するための方法およびシステムの提供。【解決手段】タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定する方法およびシステムが提供される。前記タンパク質の構造を表わすモデルから、１または複数のアミノ酸残基のセットが選択され；各セットのアンフォールディングの自由エネルギーが決定され；アンフォールディングの全確率が最小の確率を上回るか、またはアンフォールディングの自由エネルギーが最小のエネルギーを下回るセットからエピトープが同定される。他の態様において、本発明は、疾患を診断および治療し、また、エピトープ予測法により同定されるエピトープの存在について試料をスクリーニングするための、このようなエピトープおよび関連抗体の使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るための方法であって、前記方法は、
（ａ）ペプチドが配列番号５、７、２７〜４０、または７６の配列を有さないという条件で、配列番号１〜８０のうちの１つを有するペプチド内に常在する、任意の３つの連続するアミノ酸を含む免疫原を得るステップと；
（ｂ）前記免疫原を用いて、前記エピトープに選択的に結合する抗体を作製し、これにより、前記タンパク質の前記ミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るステップと
を含む、方法。
【請求項２】
配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０を有するペプチド内に常在する、少なくとも３つの連続するアミノ酸を包含するエピトープに結合する抗体。
【請求項３】
治療有効量の請求項２に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項４】
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示すか、またはそのリスクを有する被験体を処置するための医薬組成物であって、前記タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する、抗体またはその結合断片を含み、前記抗体が結合する前記ミスフォールドタンパク質が、タウ、Ａベータ、ＳＯＤ１  α−シヌクレイン、ＰｒＰＣ、ＴＴＲ、β２−ミクログロブリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＦａｓＲ、およびＮｏｔｃｈ１から選択される医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体が結合するエピトープが、配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチド内に常在する、少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体および処置される疾患が、
（ａ）ＣＪＤまたは関連のプリオン病に罹患した被験体を処置するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、また特に、３、４、６、７、８、９、または１０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｂ）家族性アミロイド性多発性神経障害もしくは老人性全身性アミロイドーシス、またはミスフォールドＴＴＲの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｃ）β２ミクログロブリンアミロイド沈着物の腎臓での蓄積、またはミスフォールドβ２ミクログロブリンの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２３、２４、２５、または２６により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｄ）筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはミスフォールドＳＯＤ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、また特に、配列番号２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、および３６により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｅ）白血病もしくは骨髄腫、またはミスフォールドＣＤ３８の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｆ）結腸癌転移および／またはミスフォールドＣＤ４４の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４６、４７、４８、４９、または５０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｇ）Ｆａｓ受容体が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号５１、５２、５３、５４、または５５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｈ）子宮頚癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、肺癌および乳癌、胸膜中皮腫、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫を含めた癌、または特定の急性骨髄性白血病およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病を含めた、ミスフォールドＮＯＴＣＨ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号５６、５７、５８、５９、または６０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｉ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号６１、６２、６３、６４、または６５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｊ）ミスフォールドＥＧＦＲが関与する特定の癌および関連障害に罹患した被験体を処置するための、配列番号７６を除外するという任意選択の条件で、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と
から選択される、請求項４または５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示すか、またはそのリスクを有する被験体を処置するためのワクチンであって、前記ワクチンは、前記タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを構成するペプチドを組み込む免疫原を含み、前記エピトープが、配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチド内に常在する、少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む、ワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンおよび前記処置される疾患が、
（ａ）ＣＪＤまたは関連のプリオン病に罹患した被験体を処置するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、また特に、配列番号３、４、６、７、８、９、または１０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｂ）ＢＳＥまたは関連のプリオン病のリスクを有する被験体、特に畜牛における予防のための、配列番号１１、１２、１３、１４、または１５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｃ）家族性アミロイド性多発性神経障害もしくは老人性全身性アミロイドーシス、またはミスフォールドＴＴＲの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｄ）β２ミクログロブリンアミロイド沈着物の腎臓での蓄積、またはミスフォールドβ２ミクログロブリンの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２３、２４、２５、または２６により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｅ）筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはミスフォールドＳＯＤ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、また特に、配列番号２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、および３６により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｆ）白血病もしくは骨髄腫、またはミスフォールドＣＤ３８の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｇ）結腸癌転移および／またはミスフォールドＣＤ４４の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４６、４７、４８、４９、または５０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｈ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号５１、５２、５３、５４、または５５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｉ）子宮頚癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、肺癌および乳癌、胸膜中皮腫、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫を含めた癌、または特定の急性骨髄性白血病およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病を含めた、ミスフォールドＮＯＴＣＨ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号５６、５７、５８、５９、または６０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｊ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号６１、６２、６３、６４、または６５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｋ）ミスフォールドＥＧＦＲが関与する特定の癌および関連障害に罹患した被験体を処置するための、配列番号７６を除外するという任意選択の条件で、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンとから選択される、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
配列番号１〜８０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、単離形態のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エピトープを同定する方法およびシステムを提供する。より具体的に述べると、本発明は、タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定する方法およびシステムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
小胞体（ＥＲ）は、その中で、真核生物ゲノムによりコードされるタンパク質のほぼ３分の１が、内腔分泌タンパク質または膜貫通タンパク質として移行し、フォールディングする、フォールディングに特化した環境である。タンパク質は、ゴルジ体へとカーゴを送達するための輸送媒体を生成させるコンカタマー複合体ＩＩ（ＣＯＰＩＩ）機構により、ＥＲから移出される（非特許文献１）。ＥＲ関連フォールディング（ＥＲＡＦ）経路はまた、ミスフォールドタンパク質を細胞質内プロテアソーム系への移行の標的とする、ＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）経路とも連携する（非特許文献２；非特許文献３）。細胞質タンパク質には、分子シャペロン、ならびにユビキチン−プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍａｌ）経路、および自己貪食性分解経路を伴う、タンパク質フォールディングの品質管理系も存在する（Ｋｕｂｏｔａ、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９年））。
【０００３】
細胞表面上、細胞外環境、または細胞質において発現した正常フォールドタンパク質が病理学的状態のためにミスフォールディングすると、多くのミスフォールディング病が発生し、その結果、ミスフォールド凝集物がもたらされる。アルツハイマー病（ＡＤ）、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびパーキンソン病／レビー小体病（ＰＤ、ＬＢＤ）などの神経変性疾患は、ＡＤにおけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタウ断片およびＡβ断片；ＡＬＳにおけるスーパーオキシドディスムターゼ１（ＳＯＤ１）；ならびにＰＤおよびＬＢＤにおけるα−シヌクレインを含めた、正常タンパク質のミスフォールド凝集物による神経細胞内沈着物と関連する。
【０００４】
神経系および他の組織で発現する細胞表面の糖タンパク質である、細胞プリオンタンパク質のミスフォールディングは、孤発性および家族性の原因を有するクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）、クールー病、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）に関与する。正常にフォールディングしたプリオンタンパク質（ＰｒＰＣと称する）は、鋳型指向ミスフォールディングと称する過程において、疾患によりミスフォールディングしたプリオンタンパク質（総称的にＰｒＰＳｃと称する）と物理的に接触することにより誘導される、病理学的にミスフォールディングした立体構造を取りうる。ＰｒＰＳｃの三次構造および二次構造は、ＰｒＰＣの三次構造および二次構造とは実質的に異なり、これにより、それまでは包埋されていた残基が溶媒に露出し、本発明ではこれを、一方から他方を区別するための根拠として用いる。ミスフォールディング過程を誘発する、ミスフォールディングしたプリオンタンパク質の元になる凝集物は、孤発性ＣＪＤにおける通り、内因的に発生する場合もあり、変異性ＣＪＤおよび乳腺刺激性ＣＪＤにおける通り、別の動物またはヒトに由来する感染病原体として獲得される場合もある。前者の場合、プリオンタンパク質遺伝子（ＰＲＮＰ）によりコードされる配列の特定の遺伝性突然変異は、個体にＰｒＰＣのミスフォールディングに対する素因を与え、プリオン病の臨床的発現を誘発する。現在のところ、プリオン病を治癒させる治療は存在せず、その結果、死亡率は１００％となっている（非特許文献４）。プリオンタンパク質は、動物の疾患にも関与している。経済的利害を伴う疾患には、畜牛のウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ヒツジのスクラピー、およびシカの慢性消耗性疾患である。ヒト疾患の場合と同様、動物のプリオン病にも、有効な治療またはワクチンによる予防が存在しない。
【０００５】
タンパク質ミスフォールディング病は、中枢神経系の疾患に限定されない。甲状腺ホルモンのキャリアタンパク質であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）のミスフォールディングおよび凝集が、家族性アミロイド性多発性神経障害、および老人性全身性アミロイドーシスに関与している（非特許文献５）。腎不全のために長年にわたり血液透析を受ける患者は、体内の大半の細胞上に存在する１型主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の構成要素である、腎内におけるβ２ミクログロブリンアミロイド沈着物の蓄積を患う場合がある（非特許文献６）。
【０００６】
タンパク質凝集による疾患は、大きな２つのクラス：天然では構造化されていないタンパク質またはペプチド（例えば、それぞれ、アルファシヌクレインおよびＡβ）を伴う疾患と、構造化されたドメインを保有するタンパク質（例えば、ＰｒＰＣおよびＴＴＲ）を伴う疾患とにおいて考えることができる。１つの仮説によれば、天然において構造化されているタンパク質は、進化により、生理学的条件において可溶性を維持するように選択されていると考えられている、すなわち、それらは、自発的には凝集しない。
【０００７】
タンパク質のミスフォールディングはまた、フォールディングの忠実性が全体的に低下する結果、ミスフォールドタンパク質が細胞表面に常在する（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）に至る、癌性細胞においても生じる。癌細胞では、細胞周期制御が調節異常を来す結果、それらが制御不能な形で増殖するに至る。抑制されずに、転移を介してこれらの細胞が増殖および分散すれば、内臓の解剖学的および機能的な障害が引き起こされ、死活的栄養物についての競合が生じる。正常なヒト細胞は、組織修復または組織再生に必要な場合を除き、分裂を防止する多くのシグナル伝達機構により、注意深い調節的制御下にある。癌性細胞では、これらのシグナルに対するそれらの感受性を失わせる体細胞突然変異が蓄積される。これらおよび他の突然変異の帰結は、タンパク質フォールディングの品質管理の低下である：健康な細胞は、適正にフォールディングされずに合成されたタンパク質を認識および破壊することが可能であるが、一部の癌細胞は、フォールディングの忠実性およびモニタリングの低下を示し、これにより、細胞膜内へのミスフォールドタンパク質の組込みがもたらされうる（Ｎａｔｕｒｅ、４２６巻、６９６８号、８８３〜９０９頁において総説されている）。正常時には分子内に包埋されている、これらのミスフォールドタンパク質の細胞外ドメインは、タンパク質表面上において細胞外環境へと露出し、それ自体としてエピトープを提示して選択的に同定される。したがって、ミスフォールディングした細胞表面タンパク質は、癌性細胞と、それらの適正なタンパク質フォールディング機構を保持する正常細胞とを識別するための診断ツールおよび治療的標的化をもたらしうる。
【０００８】
フォールディングの忠実性は、選択された腫瘍細胞が、特定のタンパク質を過剰発現させることにより、特に損なわれると予測される。どの膜タンパク質が過剰発現するかは、癌の形態に依存する。例えば、一部の侵襲性乳癌が、ＨＥＲ２を過剰発現させる（Ｍｉｌａｎｅｚｉら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ、８巻（４号）、４１７頁（２００８年））のに対し、一部の肺癌および結腸癌は、ＥＧＦＲを過剰発現させる（ＣｉａｒｄｉｅｌｌｏおよびＴｏｒｔｏｒａ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５８巻（１１号）、１１６０頁（２００８年））。機能不明の膜貫通タンパク質であるＣＤ２０は、Ｂ細胞リンパ腫細胞、毛様細胞白血病細胞、およびＢ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞上において発現する。ＣＤ３８が、白血病および骨髄腫と関連するのに対し、ＣＤ４４は、結腸癌転移に関与する表面糖タンパク質である。これらの多様な受容体を標的とすることにより、癌性細胞を同定し、細胞傷害性治療をそれらへと方向づける機構がもたらされる。
【０００９】
癌性細胞上におけるアポトーシス促進性シグナル伝達経路の活性化は、癌根絶の促進に関連する方法である。Ｆａｓ受容体（ＦａｓＲ）は、細胞内シグナル伝達カスケードを介してアポトーシスの誘発に関与し、このため、ＦａｓＲにアゴニストが結合すると、細胞死が誘発されうる（ＤａｎｉｅｌおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、８巻（２号）、１２４頁（２００８年））。非特異的にＦａｓを活性化させると、一般に、Ｆａｓ受容体を発現する健常細胞のアポトーシスがもたらされるため、この機構を治療戦略として利用する１つの手法は、癌性細胞上においてＦａｓ受容体を選択的に活性化させることでありうる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、細胞運命の決定に関与し、細胞表面における調節異常的な形でのＮｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈリガンド、およびＮｏｔｃｈ標的の発現は、子宮頚癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、腎癌、肺癌、および乳癌、胸膜中皮腫、および悪性黒色腫のほか、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫、ならびに一部の急性骨髄性白血病、およびＢ細胞性慢性リンパ球性白血病に関与している（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２巻、６５９８頁（２００３年））。Ｎｏｔｃｈタンパク質の細胞外ドメインを阻害することにより、癌性細胞上におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達を遮断すれば、制御不能の増殖の持続に必要とされる刺激を緩和する方策が与えられる。他の非悪性細胞もＮｏｔｃｈシグナル伝達を用いるので、この阻害を癌性細胞に限定することが理想的である。健常細胞がミスフォールドＮｏｔｃｈを細胞外環境へと提示することはないので、ミスフォールディングしたＮｏｔｃｈ受容体を特異的に標的とするならこれが達成されるであろう。加えて、細胞表面上におけるミスフォールディングしたＮｏｔｃｈ受容体タンパク質の存在を、悪性腫瘍の指標として用いることができれば、Ｎｏｔｃｈに対する、ミスフォールディングした立体構造に特異的な抗体を投与することにより、ミスフォールドＮｏｔｃｈを発現する悪性腫瘍細胞に対する免疫反応を誘導することができる。
【００１０】
特定の癌細胞において予測される、過剰発現およびフォールディングの忠実性の障害は、構造化されたタンパク質ドメインの部分的なアンフォールディングを伴う可能性が高い。
【００１１】
タンパク質のアンフォールディング過程は、タンパク質における自由エネルギーの変化を調べることにより説明することができる。ギブスの自由エネルギーは、定圧で生じる自発的反応に対して最小化される熱力学量である（Ａｔｋｉｎｓおよびｄｅ  Ｐａｕｌａ、「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第７版（２００２年））。化学過程におけるその変化ΔＧは、反応エンタルピーの変化ΔＨ、反応エントロピーの変化ΔＳ、および反応温度Ｔの関数：
【００１２】
【化１】
2014167025.tif 000002
である。
【００１３】
代替的に、タンパク質のアンフォールディングでは、これに伴うタンパク質系の容量変化が小さいため、ヘルムホルツの自由エネルギーの変化ΔＦ＝ΔＵ−ＴΔＳ［式中、エンタルピーの変化は、内部エネルギーの変化ΔＵにより置き換えられる］もほぼ等価であり、これもまた計算することができる。タンパク質のアンフォールディング過程の場合、ΔＨおよびΔＳは、水素結合のネットワーク、フォールディングの形状、溶媒との相互作用、翻訳後修飾の存在を含めた、タンパク質構造についての多くのパラメータに依存する複雑な関数である。ギブスの自由エネルギーの変化は、平衡におけるアンフォールディング定数Ｋ：
【００１４】
【化２】
2014167025.tif 000003
により、平衡におけるフォールド状態およびアンフォールド状態の占有と関連する。
【００１５】
タンパク質の部分アンフォールド状態についての占有の自由エネルギーがわかれば、すべての部分アンフォールド状態にわたるボルツマン因子の和として、分配関数Ｚ：
【００１６】
【化３】
2014167025.tif 000004
を構築することができる。
【００１７】
よって、所与の部分アンフォールド状態ｉについての平衡における占有確率は、
【００１８】
【化４】
2014167025.tif 000005
である。
【００１９】
正常フォールドタンパク質とミスフォールドタンパク質との立体構造の違いにより、疾患特異的エピトープ（ミスフォールド形態において固有の形で溶媒に露出するタンパク質領域）の概念が導入される。したがって、このエピトープに対して作製される抗体は、もっぱら該ミスフォールドタンパク質だけに結合する能力を有し、これは、患者標本中におけるミスフォールドタンパク質の存在を同定することを介して、診断に用いられる。疾患特異的エピトープに対する抗体の治療への適用は、疾患の状況に依存する：ミスフォールドタンパク質を提示する癌細胞の場合、それらは、免疫系により破壊される癌性細胞をマークしうる；アミロイドーシスの場合、アミロイド原線維へのさらなるミスフォールド単量体の動員を阻害することにより、ミスフォールドタンパク質をマークし、免疫を介して貪食および破壊することにより、またおそらくは、正常フォールドタンパク質に対するミスフォールドタンパク質の結合を遮断することを介して、鋳型指向ミスフォールディングを防止することによりそれらは作用する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｌｅｅら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．（２００４年）２０巻、８７頁
【非特許文献２】Ｗｅｇｅｌｅら、Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２００４年）１５１巻、１頁
【非特許文献３】Ｙｏｕｎｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．（２００３年）２８巻、５４１頁
【非特許文献４】Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９４年）４８巻、６５５頁
【非特許文献５】ＢｅｎｓｏｎおよびＫｉｎｃａｉｄ、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ（２００７年）３６巻（４号）、４１１頁
【非特許文献６】Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒら、Ａｄｖ  Ｒｅｎ  Ｒｅｐｌａｃｅ  Ｔｈｅｒ（２００３年）１０巻（４号）、２７９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
有用な疾患特異的エピトープを同定する目的で、ミスフォールドタンパク質凝集物の高分解能構造は、合理的な予測の出発点をもたらしうる。残念ながら、技術的限界のために、ＰｒＰＳｃ、Ａベータからなるアミロイド、ＴＴＲ、もしくはＴｈｙ−１、または癌細胞上における任意のミスフォールドタンパク質についての、このような原子レベルの構造が有用となることはなく、安定的な不連続エピトープ、または構造化された立体構造エピトープの叙述も不要である。この手法のさらなる限界は、ミスフォールドタンパク質が、互換的形態の集団内に存在しうることであり、安定的な立体構造エピトープの形成は、普遍的でない可能性が高い。タンパク質内に含有されるすべての可能なエピトープに対して抗体を作製し、ミスフォールド形態に対する選択的反応性についてそれらをスクリーニングするステップを含む網羅的方法により、実験的に、ミスフォールディング特異的な直鎖状エピトープを同定することもまた、原理的には可能である。しかし、中程度のサイズのタンパク質において重複する何千もの直鎖状エピトープの場合、この「ショットガン法」は、高価で、手間がかかり、また時間浪費的である可能性が高い。したがって、タンパク質当たりの候補エピトープを、迅速かつ合理的な形で１０種または数種に限定し、次いで、これを、治療標的または診断標的としての適性について厳密に特徴づけうることが望ましい。
【００２２】
診断的観点および治療的観点からすると、タンパク質のミスフォールディングによりもたらされる疾患関連エピトープを同定することが重要である。現行の戦略は、全ミスフォールドタンパク質を免疫原として用いて、ミスフォールディング特異的抗体を調製することに焦点を当てている。この手法は、いくつかの欠点を有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるミスフォールディング機構と、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるミスフォールディング機構との差違により、組換えミスフォールドタンパク質は、疾患関連エピトープを露出させない場合がある。さらに、ミスフォールディング特異的エピトープは、全タンパク質環境ではよく認識されず（ＰｒＰＳｃなど）、全タンパク質による免疫化では、自己免疫性を誘発しうる天然の表面エピトープを免疫的に認識するリスクが生じる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
その態様のうちの１つにおいて、本発明は、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法であって、該システムが、入力ユニット、候補選択ユニット、自由エネルギー計算ユニット、およびエピトープ同定ユニットを含み、該方法は：
（ａ）該入力ユニットにより、該対象とするタンパク質の構造の少なくとも一部を表わすモデルを受け取るステップと；
（ｂ）該候補選択ユニットにより、該モデルから、１または複数のセットを選択するステップであって、各セットは１または複数のアミノ酸残基を含む、ステップと；
（ｃ）該自由エネルギー計算ユニットにより、各セットのアンフォールディングの自由エネルギーを決定するステップと；
（ｄ）該エピトープ同定ユニットにより、該エピトープを、
（ｉ）孤立した該セットの１または複数のアンフォールディングの自由エネルギーに基づき各セットのアンフォールディングの全確率を決定し、アンフォールディングの全確率が最小の確率を上回るセットからエピトープを同定すること；
（ｉｉ）アンフォールディングの自由エネルギーが最小のエネルギーを下回るセットからエピトープを同定すること
によって同定するステップと
を含む方法を提供する。
【００２４】
該方法は、
（ａ）該方法が、該入力ユニットにより、モデル内の領域の選択されたものを受け取るステップをさらに含み；
（ｂ）候補選択ユニットにより選択された該１または複数のセットの各々が、該領域内における少なくとも１つの残基を含む
ように適用することができる。
【００２５】
モデルは、対象とするタンパク質の少なくとも一部の構造でありうる。モデルはまた、対象とするタンパク質の少なくとも一部の予測された構造でもありうる。予測された構造は、対象とするタンパク質、またはその一部の一次配列から予測されうるか、あるいは該対象とするタンパク質に対して相同的な、１もしくは複数の他のタンパク質、またはその一部の構造から予測される。
【００２６】
候補選択ユニットにより、モデルから１または複数のセットを選択するステップは、該モデル内の１または複数の連続するアミノ酸残基の配列を含みうるすべてのセットを選択するステップを含む。候補選択ユニットにより、モデルから１または複数のセットを選択するステップはまた、該モデル内の１または複数の連続する残基の配列を含み、各セットが該領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、すべてのセットを選択するステップも含む。候補選択ユニットにより、モデルから１または複数のセットを選択するステップはまた、該モデル内の１または複数の連続するアミノ酸残基の、２つ以上の連続しない配列を含むすべてのセットを選択するステップも含む。候補選択ユニットにより、モデルから１または複数のセットを選択するステップはまた、該モデル内の１または複数のアミノ酸残基の、２つ以上の連続しない配列を含み、各セットが該領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、すべてのセットを選択するステップも含む。さらに、各配列は、最小の長さと最大の長さとの間の長さを含みうる。
【００２７】
自由エネルギー計算ユニットにより、各セットのアンフォールディングの自由エネルギーを決定するステップは、該セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップを含む。該セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップはまた、
（ａ）（ｉ）該セット内の少なくとも１つの極性原子を含み、（ｉｉ）モデルのアミノ酸配列中において１つより多いアミノ酸残基分、離れており、（ｉｉｉ）互いからカットオフ距離内にある、該モデル内の極性原子対の総数を決定するステップと；
（ｂ）該セットのアンフォールディングのエンタルピーを、（ａ）で決定された該対の総数に、一定の相互作用エネルギーをかけた積として決定するステップと
も含む。
【００２８】
該セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップはまた、
（ａ）（ｉ）極性原子または非極性原子を含み、（ｉｉ）該セット内の少なくとも１つの原子を含み、（ｉｉ）モデルのアミノ酸配列中において１つより多いアミノ酸残基分、離れており、（ｉｉｉ）互いからカットオフ距離内にある、該モデル内の原子対の総数を決定するステップと；
（ｂ）該セットのアンフォールディングのエンタルピーを、（ａ）で決定された該対の総数に、一定の相互作用エネルギーをかけた積として決定するステップとも含む。
【００２９】
カットオフ距離は、約２オングストローム〜約７オングストロームでありうる。一定の相互作用エネルギーは、約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ／相互作用〜約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ／相互作用でありうる。
【００３０】
セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップはまた、該セット内の少なくとも１つの原子を含む、モデル内の各極性原子対について、以下の式：
【００３１】
【化５】
2014167025.tif 000006
［式中、
ΔＨは、該極性原子対のアンフォールディングのエンタルピーであり；
【００３２】
【化６】
2014167025.tif 000007
は、フィッティングパラメータであり；
θは、該極性原子に関与する炭素に対する共有結合の間の角度であり；
ｒは、該極性原子対の間の距離であり；
βは、フィッティングパラメータである］
を解いた結果を合計するステップも含みうる。
【００３３】
セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップはまた、（ｉ）該セット内の少なくとも１つの原子を含み、（ｉｉ）極性原子または非極性原子を含む、モデル内の各原子対について、以下の式：
【００３４】
【化７】
2014167025.tif 000008
［式中、
ΔＨは、該極性原子対のアンフォールディングのエンタルピーであり；
【００３５】
【化８】
2014167025.tif 000009
は、フィッティングパラメータであり；
θは、該原子に関与する炭素に対する共有結合の間の角度であり；
ｒは、該原子対の間の距離であり；
βは、フィッティングパラメータである］
を解いた結果を合計するステップも含みうる。
【００３６】
セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップはまた、
（ａ）モデル内のアミノ酸残基を含む、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；
（ｂ）該セットを除去した、モデル内のアミノ酸残基を含む、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；
（ｃ）孤立した該セット内のアミノ酸残基を含む、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；
（ｄ）（ａ）で決定された極性官能基の溶媒露出表面積を差し引いた、（ｂ）および（ｃ）で決定された極性官能基の溶媒露出表面積の和を決定するステップ；
（ｅ）（ａ）で決定された非極性官能基の溶媒露出表面積を差し引いた、（ｂ）および（ｃ）で決定された非極性官能基の溶媒露出表面積の和を決定するステップ；
（ｆ）（ａ）で決定されたヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を差し引いた、（ｂ）および（ｃ）で決定されたヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積の和を決定するステップ；
（ｇ）以下の式：
【００３７】
【化９】
2014167025.tif 000010
［式中、
ΔＨは、該セットのアンフォールディングのエンタルピーの変化であり；
Ｔは、温度であり；
ΔＡＳＡ極性は、（ｄ）で決定される非極性官能基の溶媒露出表面積の変化であり；
ΔＡＳＡ非極性は、（ｅ）で決定される非極性官能基の溶媒露出表面積の変化であり；
ΔＡＳＡヒドロキシルは、（ｆ）で決定されるヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積の変化である］
を解くことにより、該セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップも含みうる。
【００３８】
孤立した該セットの、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップは、
（ａ）対象とするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置しない、該セット内の各アミノ酸残基について、
（ｉ）該アミノ酸残基と、対象とするタンパク質のアミノ酸配列内のアミノ酸残基に最も近接する第１の数のアミノ酸残基とにより形成されるポリペプチドを選択するステップ；
（ｉｉ）分子動力学シミュレーションにおいて該孤立ポリペプチドの運動をシミュレートすることにより、該ポリペプチドの複数の構造を得るステップ；
（ｉｉｉ）各構造の極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；ならびに
（ｉｖ）該すべての構造にわたり、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積の各々を平均するステップ；
（ｂ）対象とするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する、該セット内の各アミノ酸残基について、
（ｉ）該アミノ酸残基と、対象とするタンパク質のアミノ酸配列内のアミノ酸残基に最も近接する第２の数の近傍アミノ酸残基とにより形成されるポリペプチドを選択するステップ；
（ｉｉ）分子動力学シミュレーションにおいて該孤立ポリペプチドの運動をシミュレートすることにより、該ポリペプチドの複数の構造を得るステップ；
（ｉｉｉ）各構造の極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；ならびに
（ｉｖ）該すべての構造にわたり、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積の各々を平均するステップ
を含みうる。
【００３９】
第１の数は２でありえ、第２の数は１でありうる。
【００４０】
自由エネルギー計算ユニットにより、セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップは、
（ａ）分子動力学シミュレーションにおいて、モデルの運動をシミュレートするステップと；
（ｂ）各対が該セット内の少なくとも１つのアミノ酸を含む、該モデル内のすべてのアミノ酸残基対間の相互作用エネルギーを合計するステップと；
（ｃ）分子動力学シミュレーションにおいて、該セットがアンフォールド状態にある該モデルの運動をシミュレートするステップと；
（ｄ）該アンフォールド状態にある該セット内のすべてのアミノ酸残基対間の相互作用エネルギーを合計するステップと；
（ｅ）（ｂ）において決定された相互作用エネルギーから、（ｄ）において決定された相互作用エネルギーを差し引くステップと
を含みうる。
【００４１】
自由エネルギー計算ユニットにより、各セットのアンフォールディングの自由エネルギーを決定するステップは、該セットをアンフォールディングさせることにより、モデル内の１または複数の塩橋を切断する自由エネルギーを決定するステップを含みうる。
【００４２】
セットをアンフォールディングさせることにより、モデル内の１または複数の塩橋を切断する自由エネルギーを決定するステップは、互いからカットオフ距離内にあり、該セット内の少なくとも１つのアミノ酸を含む、モデル内の、正反対に荷電したアミノ酸残基の各対間において、タンパク質内の一定の誘電率を仮定して決定される、クーロンエネルギーの和を決定するステップを含む。カットオフ距離は、約７オングストロームでありうる。一定の誘電率は、約４〜約２０でありうる。
【００４３】
セットをアンフォールディングさせることにより、モデル内の１または複数の塩橋を切断する自由エネルギーを決定するステップはまた、該セット内の少なくとも１つのアミノ酸を含む、該モデル内のアミノ酸残基の各対間において、タンパク質内の一定の誘電率を仮定して決定される、クーロンエネルギーの和を決定するステップも含む。一定の誘電率は、約４〜約２０でありうる。
【００４４】
各セットのアンフォールディングの自由エネルギーを決定するステップは、以下の式：
【００４５】
【化１０】
2014167025.tif 000011
［式中、  ΔＧｐｔｍは、該アンフォールディングの自由エネルギーに対するグリカンの影響であり；
Ｒは、理想気体定数であり；
Ｔは、温度であり；
ａは、該グリカンの半径であり；
ｒ０は、該グリカンの中心から測定した、該グリカンの周囲にある該セットの開始位置であり；
ｅｒｆは、誤差関数であり；
ｂは、該アンフォールドセットの持続長であり；
ｎは、該アンフォールドセット内の残基数である］
を解くことにより、該自由エネルギーに対する１または複数のグリカンの影響を決定するステップを含みうる。
【００４６】
セットのうちの１または複数のアンフォールディングの自由エネルギーに基づき各セットのアンフォールディングの全確率を決定するステップは、各セットについて、該セットのアミノ酸残基の配列を含む、すべてのセットのアンフォールディングの平衡確率（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）の和を決定するステップを含む場合があり、各セットのアンフォールディングの平衡確率は、該セットのアンフォールディングの自由エネルギーに基づき決定される。
【００４７】
最小の確率は、同じ長さを有するすべてのセットのアンフォールディングの平均確率の倍数でありうる。該倍数は、少なくとも１０でありうる。該倍数はまた、少なくとも１００でありうる。
【００４８】
最小のエネルギーは、同じ長さを有するすべてのセットのアンフォールディングの平均自由エネルギーより小さい、一定の量でありうる。該一定の量は、少なくとも１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌでありうる。該最小のエネルギーは、８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下でありうる。
【００４９】
別の態様において、本発明は、タンパク質の天然フォールド形態と比べて、該タンパク質のミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を作製するのに有用な免疫原を得るための方法であって、
（ａ）上記で説明した、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法を適用して、前記タンパク質のミスフォールド形態により固有に提示されるエピトープを同定するステップと；
（ｂ）前記タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを含むペプチドを含む免疫原を作製するステップと
を含む方法を提示する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、場合を問わず、前出の方法により作製される免疫原を提供する。
【００５１】
別の態様において、本発明は、タンパク質の天然フォールド形態と比べて、該タンパク質のミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るための方法であって、
（ａ）上記で説明した、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法を適用して、前記タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するステップと；
（ｂ）前記エピトープに選択的に結合する抗体を作製し、これにより、前記タンパク質の前記ミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るステップと
を含む方法を提示する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、場合を問わず、前出の方法により調製される抗体を提供する。
【００５３】
別の態様において、本発明は、タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示す被験体を処置するのに有用な医薬組成物を得るための方法であって、薬学的に許容される担体を、該タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのミスフォールド形態に固有のエピトープに結合し、また、上記で説明した、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法を用いて同定された、医療的に有用な量の抗体またはその結合断片と組み合わせるステップを含む方法を提供する。
【００５４】
別の態様において、本発明は、タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示す被験体を処置するための方法であって、該被験体に、該タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する、有効量の抗体またはその結合断片を含む医薬組成物を投与するステップを含み、該エピトープが、上記で説明した、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法を適用することにより同定された方法を提供する。
【００５５】
別の態様において、本発明は、タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示す被験体を処置するための方法であって、該被験体に、該タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのミスフォールド形態に固有のエピトープを含むペプチドを組み込む免疫原を含む、有効量のワクチンを含む医薬組成物を投与するステップを含み、該エピトープが、上記で説明した、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法を適用することにより同定された方法を提供する。
【００５６】
別の態様において、本発明は、試料中におけるタンパク質のミスフォールド形態を検出するための方法であって、
（ａ）該タンパク質のミスフォールド形態を含有することが疑われる試料を、そのタンパク質の天然フォールド形態と比べて、該ミスフォールドタンパク質により固有に提示されるエピトープに選択的に結合する抗体または結合断片により処理し、前記エピトープが、上記で説明した、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法を適用することにより同定されているステップと；
（ｂ）抗原：抗体複合体が形成されているかどうかを決定し、その形成により、該試料中における、前記タンパク質のミスフォールド形態の存在が示されるステップと
を含む方法を提供する。
【００５７】
別の態様において、本発明は、タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を診断する方法であって、
（ａ）被験体から得られ、また、該タンパク質の該ミスフォールド形態を含有することが疑われる試料を、そのタンパク質の天然フォールド形態と比べて、該ミスフォールドタンパク質により固有に提示されるエピトープに選択的に結合する抗体または結合断片により処理し、前記エピトープが、上記で説明した、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法を適用することにより同定されているステップと；
（ｂ）抗原：抗体複合体が形成されているかどうかを決定し、その形成により、前記タンパク質のミスフォールド形態が該試料中に存在することが示されるステップと
を含む方法を提供する。
【００５８】
別の態様において、本発明は、タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るための方法であって、
（ａ）ペプチドが配列番号５、７、２７〜４０、または７６の配列を有さないという条件で、配列番号１〜８０のうちの１つを有するペプチド内に常在する、任意の３つの連続するアミノ酸を含む免疫原を得るステップと；
（ｂ）該免疫原を用いて、前記エピトープに選択的に結合する抗体を作製し、これにより、前記タンパク質の前記ミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るステップとを含む方法を提供する。
【００５９】
別の態様において、本発明は、配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０を有するペプチド内に常在する少なくとも３つの連続するアミノ酸を包含するエピトープに結合する抗体を提供する。
【００６０】
別の態様において、本発明は、治療有効量の前出の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００６１】
別の態様において、本発明は、タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示すか、またはそのリスクを有する被験体を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、該タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する、抗体またはその結合断片を含む有効量の医薬組成物を投与するステップを含み、該抗体が結合する該ミスフォールドタンパク質が、タウ、Ａベータ、ＳＯＤ１  α−シヌクレイン、ＰｒＰＣ、ＴＴＲ、β２−ミクログロブリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＦａｓＲ、およびＮｏｔｃｈ１から選択される方法を提供する。抗体が結合するエピトープは、配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチド内に常在する少なくとも３つの連続するアミノ酸を含みうる。抗体および処置される疾患は、
（ａ）ＣＪＤまたは関連のプリオン病に罹患した被験体を処置するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、また特に、３、４、６、７、８、９、または１０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｂ）家族性アミロイド性多発性神経障害もしくは老人性全身性アミロイドーシス、またはミスフォールドＴＴＲの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｃ）β２ミクログロブリンアミロイド沈着物の腎臓での蓄積、またはミスフォールドβ２ミクログロブリンの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２３、２４、２５、または２６により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｄ）筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはミスフォールドＳＯＤ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、また特に、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、および３６により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｅ）白血病もしくは骨髄腫、またはミスフォールドＣＤ３８の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｆ）結腸癌転移またはミスフォールドＣＤ４４の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４６、４７、４８、４９、または５０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｇ）Ｆａｓ受容体が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号５１、５２、５３、５４、または５５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｈ）子宮頚癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、頭頚部癌（ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胸膜中皮腫、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫を含めた癌、または特定の急性骨髄性白血病およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病を含めた、ミスフォールドＮＯＴＣＨ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号５６、５７、５８、５９、または６０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｉ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号６１、６２、６３、６４、または６５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｊ）ミスフォールドＥＧＦＲが関与する特定の癌および関連障害に罹患した被験体を処置するための、配列番号７６を除外するという任意選択の条件で、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と
から選択することができる。
【００６２】
別の態様において、本発明は、タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示すか、またはそのリスクを有する被験体を処置するための方法であって、該被験体に、該タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを構成するペプチドを組み込む免疫原を含むワクチンを投与するステップを含み、該エピトープが、配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチド内に常在する少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む方法を提供する。ワクチンおよび処置される疾患は、
（ａ）ＣＪＤまたは関連のプリオン病に罹患した被験体を処置するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、また特に、３、４、６、７、８、９、または１０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｂ）ＢＳＥまたは関連のプリオン病のリスクを有する被験体、特に畜牛における予防のための、配列番号１１、１２、１３、１４、または１５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｃ）家族性アミロイド性多発性神経障害もしくは老人性全身性アミロイドーシス、またはミスフォールドＴＴＲの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｄ）β２ミクログロブリンアミロイド沈着物の腎臓での蓄積、またはミスフォールドβ２ミクログロブリンの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２３、２４、２５、または２６により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｅ）筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはミスフォールドＳＯＤ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、また特に、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、および３６により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｆ）白血病もしくは骨髄腫、またはミスフォールドＣＤ３８の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｇ）結腸癌転移またはミスフォールドＣＤ４４の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４６、４７、４８、４９、または５０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｈ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号５１、５２、５３、５４、または５５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｉ）子宮頚癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、肺癌および乳癌、胸膜中皮腫、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫を含めた癌、または特定の急性骨髄性白血病およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病を含めた、ミスフォールドＮＯＴＣＨ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号５６、５７、５８、５９、または６０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｊ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号６１、６２、６３、６４、または６５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｋ）ミスフォールドＥＧＦＲが関与する特定の癌および関連障害に罹患した被験体を処置するための、配列番号７６を除外するという任意選択の条件で、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと
から選択することができる。
【００６３】
別の態様において、本発明は、配列番号１〜８０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、単離形態のペプチドを提供する。ペプチドはまた、アミノ酸置換を含みうる。ペプチドはまた、アミノ酸欠失により、７残基を超えない長さまで短縮した変異体でもありうる。ペプチドはまた、少なくとも７残基の長さまでのアミノ酸付加により伸長した変異体でもありうる。
【００６４】
別の態様において、本発明は、タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するための、上記で説明した、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法の使用を提供する。
【００６５】
別の態様において、本発明は、対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する抗体を作製するための、上記で説明した、前記エピトープを同定するシステムを動作する方法により同定されるエピトープの使用を提供する。
【００６６】
別の態様において、本発明は、それに固有のエピトープを提示する対象とするタンパク質のミスフォールド形態を検出するための、上記で説明した、前記エピトープを同定するシステムを動作する方法により同定されるエピトープに結合する抗体の使用を提供する。
【００６７】
別の態様において、本発明は、それに固有のエピトープを提示する対象とするタンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患または障害を処置するための、上記で説明した、前記エピトープを同定するシステムを動作する方法により同定されるエピトープに結合する抗体の使用を提供する。
【００６８】
別の態様において、本発明は、それに固有のエピトープを提示する対象とするタンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患または障害を処置するワクチンを作製するための、上記で説明した、前記エピトープを同定するシステムを動作する方法により同定されるエピトープの使用を提供する。
【００６９】
他の態様において、本発明は、疾患を診断および治療し、また、エピトープ予測法により同定されるエピトープの存在について試料をスクリーニングするための、このようなエピトープおよび関連抗体の使用を提供する。
【００７０】
特に、さらなる態様において、本発明は、タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を作製するのに有用な免疫原を得るための方法であって、
ｉ）エピトープ予測法を適用して、前記タンパク質のミスフォールド形態により固有な形で提示されるエピトープを同定するステップと、
ｉｉ）前記タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを含むペプチドを含む免疫原を作製するステップと
を含む方法を提供する。
【００７１】
関連する態様において、本発明は、治療される被験体において、または作製宿主において、内因的に抗体をもたらすのに有用な免疫原であって、タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを含む免疫原を提供する。
【００７２】
他の関連する態様において、本発明は、試料中におけるミスフォールドタンパク質を検出するか、またはミスフォールドタンパク質による疾患を有する被験体を処置するのに有用な抗体であって、タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する抗体を提供する。実施形態において、抗体は、治療有効量の抗体を含む医薬組成物として提供される。別の実施形態において、抗体または結合断片は、試料中におけるミスフォールドタンパク質を検出するためのコンジュゲート標識と共に提供される。
【００７３】
その別の態様において、本発明は、ミスフォールドタンパク質を検出するか、またはこれらのタンパク質と関連する疾患を示す被験体を処置するのに有用な特異的配列を有するペプチド、また、これと選択的に結合する抗体を提供する。
【００７４】
実施形態において、ペプチドは単離形態で提供され、配列番号１〜８０のうちのいずれかにおいて示されるアミノ酸配列を有する。
【００７５】
実施形態において、本発明のエピトープ、ペプチド、および抗体は、それらのミスフォールド状態において疾患と関連するタンパク質であって、これらには、タウ、Ａベータ、ＳＯＤ１、α−シヌクレイン、ＰｒＰＣ、ＴＴＲ、β２−ミクログロブリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＦａｓＲ、およびＮｏｔｃｈ１が含まれるタンパク質に由来するか、またはこれらに結合する。
【００７６】
実施形態において、免疫原および対応する抗体は、ヒトタンパク質、また特に、疾患と関連するヒトタンパク質を標的として、その検出または治療に有用な診断剤または治療剤として用いるように選択される。
【００７７】
一部において、本発明は、部分的または完全にアンフォールディングする傾向にあり、このために分子間相互作用および凝集を受けやすい、構造化されたタンパク質ドメインの領域またはエピトープを同定する方法を提供する。代替的な実施形態において、本発明は、癌細胞において部分的にアンフォールディングする傾向にある、構造化されたタンパク質ドメインを同定する方法を提供する。
【００７８】
本発明の一態様では、該方法により、タンパク質の任意の領域のアンフォールディングの確率を同定し、そのタンパク質の原子分解能構造、または該対象とするタンパク質の原子分解能構造が求められない場合には、該対象とするタンパク質に構造が類似すると考えられる、高度の配列類似性を有する関連タンパク質の原子分解能構造を入力として受け取る。
【００７９】
本発明の別の態様では、該方法により、タンパク質のミスフォールディングおよび癌と関連する疾患を診断および治療するのに用いうる、タンパク質中の疾患特異的エピトープを予測する。本発明のさらに別の態様では、アンフォールディングの確率が比較的高く、抗体を発生させるためのエピトープとして用いられることが判明している領域の免疫原性を同定し、また、アンフォールド状態またはミスフォールド状態だけにおいて免疫反応性であることが予測されるエピトープを単離する方法が説明される。
【００８０】
代替的な態様では、コンピュータ、例えば、入力デバイス、プロセッサー、および出力デバイスを含めたコンピュータを用いて、本発明による方法を実施することができる。代替的な実施形態において、本発明は、部分的もしくは完全にアンフォールディングする傾向にある、構造化されたタンパク質ドメインの領域またはエピトープを同定するか、またはタンパク質中の疾患特異的エピトープを予測する、コンピュータで読み取り可能な媒体上に常在するコンピュータプログラムを、コンピュータについての指示書と共に包含する。代替的な実施形態において、本発明は、計算プラットフォームを実装するソフトウェア、専用ハードウェア、およびファームウェアを含めた、プログラム可能な汎用コンピュータのうちの１または複数を含めた計算システムを提供する。
【００８１】
代替的な態様では、本明細書で説明する方法により同定されるミスフォールディング特異的エピトープのほか、ミスフォールティング特異的エピトープに対して免疫反応性の抗体も、本発明の範囲内に包含される。このようなエピトープは、タンパク質のミスフォールディング、細胞増殖、および他の疾患を管理するための診断ツールおよび治療ツールとして有用でありうる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
対象とするタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するシステムを動作する方法であって、前記システムは、入力ユニット、候補選択ユニット、自由エネルギー計算ユニット、およびエピトープ同定ユニットを含み、前記方法は：
（ａ）前記入力ユニットにより、前記対象とするタンパク質の構造の少なくとも一部を表わすモデルを受け取るステップと；
（ｂ）前記候補選択ユニットにより、前記モデルから、１または複数のセットを選択するステップであって、各セットは１または複数のアミノ酸残基を含む、ステップと；
（ｃ）前記自由エネルギー計算ユニットにより、各セットのアンフォールディングの自由エネルギーを決定するステップと；
（ｄ）前記エピトープ同定ユニットにより、前記エピトープを
（ｉ）孤立した前記セットの１または複数のアンフォールディングの自由エネルギーに基づき各セットのアンフォールディングの全確率を決定し、アンフォールディングの全確率が最小の確率を上回るセットから前記エピトープを同定すること；または
（ｉｉ）アンフォールディングの自由エネルギーが最小のエネルギーを下回るセットから前記エピトープを同定することによって同定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
（ａ）前記方法が、前記入力ユニットにより、前記モデル内の領域の選択されたものを受け取るステップをさらに含み；
（ｂ）前記候補選択ユニットにより選択された前記１または複数のセットの各々が、前記領域内における少なくとも１つの残基を含む、
項目１に記載の方法。
（項目３）
前記モデルが、前記対象とするタンパク質の少なくとも一部の構造である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記モデルが、前記対象とするタンパク質の少なくとも一部の予測された構造である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記予測された構造が、前記対象とするタンパク質、またはその一部の一次配列から予測されるか、あるいは前記対象とするタンパク質に対して相同的な、１もしくは複数の他のタンパク質、またはその一部の構造から予測される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記候補選択ユニットにより、前記モデルから１または複数のセットを選択するステップが、前記モデル内の１または複数の連続するアミノ酸残基の配列を含む、すべてのセットを選択するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記候補選択ユニットにより、前記モデルから１または複数のセットを選択するステップが、前記モデル内の１または複数の連続する残基の配列を含む、すべてのセットを選択するステップを含み、各セットが前記領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記候補選択ユニットにより、前記モデルから１または複数のセットを選択するステップが、前記モデル内の１または複数の連続するアミノ酸残基の、２つ以上の連続しない配列を含む、すべてのセットを選択するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記候補選択ユニットにより、前記モデルから１または複数のセットを選択するステップが、前記モデル内の１または複数のアミノ酸残基の、２つ以上の連続しない配列を含む、すべてのセットを選択するステップを含み、各セットが前記領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、項目２に記載の方法。
（項目１０）
各配列が、最小の長さと最大の長さとの間の長さを含む、項目６、７、８、または９に記載の方法。
（項目１１）
前記自由エネルギー計算ユニットにより、各セットのアンフォールディングの自由エネルギーを決定するステップが、前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップが、
（ａ）（ｉ）前記セット内の少なくとも１つの極性原子から構成され、（ｉｉ）前記モデルのアミノ酸配列中において１つより多いアミノ酸残基分、離れており、かつ（ｉｉｉ）互いからカットオフ距離内にある、前記モデル内の極性原子対の総数を決定するステップと；
（ｂ）前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを、（ａ）で決定された前記対の総数に、一定の相互作用エネルギーをかけた積として決定するステップと
を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップが、
（ａ）（ｉ）極性原子または非極性原子から構成され、（ｉｉ）前記セット内の少なくとも１つの原子から構成され、（ｉｉ）前記モデルのアミノ酸配列中において１つより多いアミノ酸残基分、離れており、かつ（ｉｉｉ）互いからカットオフ距離内にある、前記モデル内の原子対の総数を決定するステップと；
（ｂ）前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを、（ａ）で決定された前記対の総数に、一定の相互作用エネルギーをかけた積として決定するステップと
を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記カットオフ距離が、約２オングストローム〜約７オングストロームである、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記一定の相互作用エネルギーが、約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ／相互作用〜約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ／相互作用である、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１６）
前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップが、前記セット内の少なくとも１つの原子から構成される、前記モデル内の各極性原子対について、以下の式：
【化１６】
2014167025.tif 000012
を解いた結果を合計するステップを含み、ここで、式中、
ΔＨは、前記極性原子対のアンフォールディングのエンタルピーであり；
【化１７】
2014167025.tif 000013
は、フィッティングパラメータであり；
θは、前記極性原子に関与する炭素に対する共有結合の間の角度であり；
ｒは、前記極性原子対の間の距離であり；
βは、フィッティングパラメータである、
項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップが、（ｉ）前記セット内の少なくとも１つの原子から構成され、（ｉｉ）極性原子または非極性原子から構成される、前記モデル内の各原子対について、以下の式：
【化１８】
2014167025.tif 000014
を解いた結果を合計するステップを含み、ここで式中、
ΔＨは、前記極性原子対のアンフォールディングのエンタルピーであり；
【化１９】
2014167025.tif 000015
は、フィッティングパラメータであり；
θは、前記原子に関与する炭素に対する共有結合の間の角度であり；
ｒは、前記原子対の間の距離であり；
βは、フィッティングパラメータである、
項目１１に記載の方法。
（項目１８）
前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップが、
（ａ）前記モデル内のアミノ酸残基を含む、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；
（ｂ）前記セットを除去した、前記モデル内のアミノ酸残基を含む、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；
（ｃ）孤立した前記セットのアミノ酸残基を含む、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；
（ｄ）（ａ）で決定された極性官能基の溶媒露出表面積を差し引いた、（ｂ）および（ｃ）で決定された極性官能基の溶媒露出表面積の和を決定するステップ；
（ｅ）（ａ）で決定された非極性官能基の溶媒露出表面積を差し引いた、（ｂ）および（ｃ）で決定された非極性官能基の溶媒露出表面積の和を決定するステップ；
（ｆ）（ａ）で決定されたヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を差し引いた、（ｂ）および（ｃ）で決定されたヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積の和を決定するステップ；
（ｇ）以下の式：
【化２０】
2014167025.tif 000016
を解くことにより、前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップであって、ここで式中、
ΔＨは、前記セットのアンフォールディングのエンタルピーの変化であり；
Ｔは、温度であり；
ΔＡＳＡ極性は、（ｄ）で決定される非極性官能基の溶媒露出表面積の変化であり；
ΔＡＳＡ非極性は、（ｅ）で決定される非極性官能基の溶媒露出表面積の変化であり；
ΔＡＳＡヒドロキシルは、（ｆ）で決定されるヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積の変化である、
ステップ、
を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
孤立した前記セットの、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップが、
（ａ）前記対象とするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置しない、前記セット内の各アミノ酸残基について、
（ｉ）前記アミノ酸残基と、前記対象とするタンパク質のアミノ酸配列内のアミノ酸残基に最も近接する第１の数のアミノ酸残基とにより形成されるポリペプチドを選択するステップ；
（ｉｉ）分子動力学シミュレーションにおいて孤立した前記ポリペプチドの運動をシミュレートすることにより、前記ポリペプチドの複数の構造を得るステップ；
（ｉｉｉ）各構造の極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；ならびに
（ｉｖ）すべての前記構造にわたり、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積の各々を平均するステップ；
（ｂ）前記対象とするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する、前記セット内の各アミノ酸残基について、
（ｉ）前記アミノ酸残基と、前記対象とするタンパク質のアミノ酸配列内のアミノ酸残基に最も近接する第２の数の近傍アミノ酸残基とにより形成されるポリペプチドを選択するステップ；
（ｉｉ）分子動力学シミュレーションにおいて孤立した前記ポリペプチドの運動をシミュレートすることにより、前記ポリペプチドの複数の構造を得るステップ；
（ｉｉｉ）各構造の極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の溶媒露出表面積を決定するステップ；ならびに
（ｉｖ）すべての前記構造にわたり、極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基の決定された溶媒露出表面積の各々を平均するステップ
を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の数が２であり、前記第２の数が１である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記自由エネルギー計算ユニットにより、前記セットのアンフォールディングのエンタルピーを決定するステップが、
（ａ）分子動力学シミュレーションにおいて、前記モデルの運動をシミュレートするステップと；
（ｂ）前記モデル内のすべてのアミノ酸残基対間の相互作用エネルギーを合計するステップであって、各対が前記セット内の少なくとも１つのアミノ酸を含む、ステップと；
（ｃ）分子動力学シミュレーションにおいて、前記セットがアンフォールド状態にある前記モデルの運動をシミュレートするステップと；
（ｄ）前記アンフォールド状態にある前記セット内のすべてのアミノ酸残基対間の相互作用エネルギーを合計するステップと；
（ｅ）（ｂ）において決定された相互作用エネルギーから、（ｄ）において決定された相互作用エネルギーを差し引くステップと
を含む、項目１１に記載の方法。
（項目２２）
前記自由エネルギー計算ユニットにより、各セットのアンフォールディングの自由エネルギーを決定するステップが、前記セットをアンフォールディングさせることにより、前記モデル内の１または複数の塩橋を切断する自由エネルギーを決定するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記セットをアンフォールディングさせることにより、前記モデル内の１または複数の塩橋を切断する自由エネルギーを決定するステップが、互いからカットオフ距離内にある、前記モデル内の、正反対に荷電したアミノ酸残基の各対間においてクーロンエネルギーの和を決定するステップを含み、ここで、各対は、前記セット内の少なくとも１つのアミノ酸を含み、前記クーロンエネルギーは、前記タンパク質内の一定の誘電率を仮定して決定される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記カットオフ距離が、約７オングストロームである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記一定の誘電率が、約４〜約２０である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記セットをアンフォールディングさせることにより、前記モデル内の１または複数の塩橋を切断する自由エネルギーを決定するステップが、前記モデル内のアミノ酸残基の各対間において、クーロンエネルギーの和を決定するステップを含み、ここで、各対は、前記セット内の少なくとも１つのアミノ酸を含み、前記クーロンエネルギーは、前記タンパク質内の一定の誘電率を仮定して決定される、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記一定の誘電率が、約４〜約２０である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
各セットのアンフォールディングの自由エネルギーを決定するステップが、以下の式：
【化２１】
2014167025.tif 000017
を解くことにより、前記自由エネルギーに対する１または複数のグリカンの影響を決定するステップを含み、ここで式中、
ΔＧｐｔｍは、アンフォールディングの前記自由エネルギーに対するグリカンの影響であり；
Ｒは、理想気体定数であり；
Ｔは、温度であり；
ａは、前記グリカンの半径であり；
ｒ０は、前記グリカンの中心から測定した、前記グリカンの周囲にある前記セットの開始位置であり；
ｅｒｆは、誤差関数であり；
ｂは、アンフォールドされた前記セットの持続長であり；
ｎは、アンフォールドされた前記セット内の残基数である、
項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記セットのうちの１または複数のアンフォールディングの自由エネルギーに基づき各セットのアンフォールディングの全確率を決定するステップが、各セットについて、前記セットのアミノ酸残基の配列を含む、すべての前記セットのアンフォールディングの平衡確率の和を決定するステップを含み、各セットのアンフォールディングの平衡確率が、前記セットのアンフォールディングの自由エネルギーに基づき決定される、項目１または２に記載の方法。
（項目３０）
前記最小の確率が、同じ長さを有するすべてのセットのアンフォールディングの平均確率の倍数である、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記倍数が、少なくとも１０である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記倍数が、少なくとも１００である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記最小のエネルギーが、同じ長さを有するすべてのセットのアンフォールディングの平均自由エネルギーより小さい、一定の量である、項目１または２に記載の方法。
（項目３４）
前記一定の量が、少なくとも１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記最小のエネルギーが、８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である、項目１または２に記載の方法。
（項目３６）
タンパク質の天然フォールド形態と比べて、前記タンパク質のミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を作製するのに有用な免疫原を得るための方法であって、前記方法は：
（ａ）項目１から３１のいずれかに記載の方法を適用して、前記タンパク質のミスフォールド形態により固有に提示されるエピトープを同定するステップと；
（ｂ）前記タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを含むペプチドを含む免疫原を作製するステップと
を含む、方法。
（項目３７）
場合を問わず、項目３６に記載の方法により作製される免疫原。
（項目３８）
タンパク質の天然フォールド形態と比べて、前記タンパク質のミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るための方法であって、前記方法は：
（ａ）項目１から３１のいずれかに記載の方法を適用して、前記タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するステップと；
（ｂ）前記エピトープに選択的に結合する抗体を作製し、これにより、前記タンパク質の前記ミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るステップと
を含む、方法。
（項目３９）
場合を問わず、項目４０に記載の方法により調製される抗体。
（項目４０）
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示す被験体を処置するのに有用な医薬組成物を得るための方法であって、前記方法は、薬学的に許容される担体と、前記タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのミスフォールド形態に固有のエピトープに結合し、また、項目１から３１のいずれかに記載の方法を用いて同定された、医療的に有用な量の抗体またはその結合断片とを組み合わせるステップを含む、方法。
（項目４１）
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示す被験体を処置するための方法であって、前記方法は、前記被験体に、前記タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する、有効量の抗体またはその結合断片を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記エピトープが、項目１から３１のいずれかに記載の方法を適用することにより同定された、方法。
（項目４２）
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示す被験体を処置するための方法であって、前記方法は、前記被験体に、前記タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのミスフォールド形態に固有のエピトープを含むペプチドを組み込む免疫原を含む、有効量のワクチンを含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記エピトープが、項目１から３１のいずれかに記載の方法を適用することにより同定された、方法。
（項目４３）
試料中におけるタンパク質のミスフォールド形態を検出するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記タンパク質のミスフォールド形態を含有することが疑われる試料を、そのタンパク質の天然フォールド形態と比べて、前記ミスフォールドタンパク質により固有に提示されるエピトープに選択的に結合する抗体または結合断片により処理するステップであって、前記エピトープが、項目１から３１のいずれかに記載の方法を適用することにより同定されている、ステップと；
（ｂ）抗原：抗体複合体が形成されているかどうかを決定し、その形成により、前記試料中における、前記タンパク質のミスフォールド形態の存在が示されるステップと
を含む、方法。
（項目４４）
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を診断する方法であって、前記方法は、
（ａ）被験体から得られ、また、前記タンパク質の前記ミスフォールド形態を含有することが疑われる試料を、そのタンパク質の天然フォールド形態と比べて、前記ミスフォールドタンパク質により固有に提示されるエピトープに選択的に結合する抗体または結合断片により処理するステップであって、前記エピトープが、項目１から３１のいずれかに記載の方法を適用することにより同定されている、ステップと；
（ｂ）抗原：抗体複合体が形成されているかどうかを決定し、その形成により、前記試料中における、前記タンパク質のミスフォールド形態の存在が示されるステップと
を含む、方法。
（項目４５）
タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るための方法であって、前記方法は、
（ａ）ペプチドが配列番号５、７、２７〜４０、または７６の配列を有さないという条件で、配列番号１〜８０のうちの１つを有するペプチド内に常在する、任意の３つの連続するアミノ酸を含む免疫原を得るステップと；
（ｂ）前記免疫原を用いて、前記エピトープに選択的に結合する抗体を作製し、これにより、前記タンパク質の前記ミスフォールド形態に選択的に結合する抗体を得るステップと
を含む、方法。
（項目４６）
配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０を有するペプチド内に常在する、少なくとも３つの連続するアミノ酸を包含するエピトープに結合する抗体。
（項目４７）
治療有効量の項目４６に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目４８）
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示すか、またはそのリスクを有する被験体を処置するための方法であって、処置を必要とする被験体に、前記タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する、抗体またはその結合断片を含む有効量の医薬組成物を投与するステップを含み、前記抗体が結合する前記ミスフォールドタンパク質が、タウ、Ａベータ、ＳＯＤ１  α−シヌクレイン、ＰｒＰＣ、ＴＴＲ、β２−ミクログロブリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＦａｓＲ、およびＮｏｔｃｈ１から選択される方法。
（項目４９）
前記抗体が結合するエピトープが、配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチド内に常在する、少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記抗体および処置される疾患が、
（ａ）ＣＪＤまたは関連のプリオン病に罹患した被験体を処置するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、また特に、３、４、６、７、８、９、または１０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｂ）家族性アミロイド性多発性神経障害もしくは老人性全身性アミロイドーシス、またはミスフォールドＴＴＲの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｃ）β２ミクログロブリンアミロイド沈着物の腎臓での蓄積、またはミスフォールドβ２ミクログロブリンの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２３、２４、２５、または２６により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｄ）筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはミスフォールドＳＯＤ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、また特に、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、および３６により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｅ）白血病もしくは骨髄腫、またはミスフォールドＣＤ３８の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｆ）結腸癌転移および／またはミスフォールドＣＤ４４の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４６、４７、ｆ８、４９、または５０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｇ）Ｆａｓ受容体が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号５１、５２、５３、５４、または５５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｈ）子宮頚癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、肺癌および乳癌、胸膜中皮腫、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫を含めた癌、または特定の急性骨髄性白血病およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病を含めた、ミスフォールドＮＯＴＣＨ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号５６、５７、５８、５９、または６０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｉ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号６１、６２、６３、６４、または６５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
（ｊ）ミスフォールドＥＧＦＲが関与する特定の癌および関連障害に罹患した被験体を処置するための、配列番号７６を除外するという任意選択の条件で、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と
から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示すか、またはそのリスクを有する被験体を処置するための方法であって、前記方法は、前記被験体に、前記タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを構成するペプチドを組み込む免疫原を含むワクチンを投与するステップを含み、前記エピトープが、配列番号１〜４、６、８〜２６、２８、２９、３１〜３６、４１〜７５、および７７〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチド内に常在する、少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む、方法。
（項目５２）
前記ワクチンおよび前記処置される疾患が、
（ａ）ＣＪＤまたは関連のプリオン病に罹患した被験体を処置するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、また特に、３、４、６、７、８、９、または１０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｂ）ＢＳＥまたは関連のプリオン病のリスクを有する被験体、特に畜牛における予防のための、配列番号１１、１２、１３、１４、または１５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｃ）家族性アミロイド性多発性神経障害もしくは老人性全身性アミロイドーシス、またはミスフォールドＴＴＲの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｄ）β２ミクログロブリンアミロイド沈着物の腎臓での蓄積、またはミスフォールドβ２ミクログロブリンの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２３、２４、２５、または２６により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｅ）筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはミスフォールドＳＯＤ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、また特に、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、および３６により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｆ）白血病もしくは骨髄腫、またはミスフォールドＣＤ３８の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｇ）結腸癌転移および／またはミスフォールドＣＤ４４の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４６、４７、４８、４９、または５０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｈ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号５１、５２、５３、５４、または５５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｉ）子宮頚癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、肺癌および乳癌、胸膜中皮腫、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫を含めた癌、または特定の急性骨髄性白血病およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病を含めた、ミスフォールドＮＯＴＣＨ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号５６、５７、５８、５９、または６０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｊ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号６１、６２、６３、６４、または６５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
（ｋ）ミスフォールドＥＧＦＲが関与する特定の癌および関連障害に罹患した被験体を処置するための、配列番号７６を除外するという任意選択の条件で、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと
から選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
配列番号１〜８０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、単離形態のペプチド。
（項目５４）
アミノ酸置換を含む、項目５３に記載のペプチド。
（項目５５）
アミノ酸欠失により、７残基を超えない長さまで短縮した変異体である、項目５３に記載のペプチド。
（項目５６）
少なくとも７残基の長さまでのアミノ酸付加により伸長した変異体である、項目５３に記載のペプチド。
（項目５７）
タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープを同定するための、項目１から３１のいずれかに記載の方法の使用。
（項目５８）
抗体を作製するための、項目１から３１のいずれかに記載の方法により同定されるエピトープの使用であって、前記抗体は前記エピトープに選択的に結合する、使用。
（項目５９）
タンパク質のミスフォールド形態を検出するための、項目１から３１のいずれかに記載の方法により同定されるエピトープに結合する抗体の使用であって、前記タンパク質は、前記エピトープを提示する、使用。
（項目６０）
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患または障害を処置するための、項目１から３１のいずれかに記載の方法により同定されるエピトープに結合する抗体の使用であって、前記タンパク質は、前記エピトープを提示する、使用。
（項目６１）
タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患または障害を処置するワクチンを作製するための、項目１から３１のいずれかに記載の方法により同定されるエピトープの使用であって、前記タンパク質は、前記エピトープを提示する、使用。
【００８２】
この「発明の概要」は、本発明のすべての特徴を必ずしも説明するものではない。本発明の特定の実施形態についての以下の説明をよく検討すれば、当業者には、本発明の他の態様および特徴が明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従い、アンフォールディングする傾向にあるタンパク質の領域内におけるエピトープを同定し、このようなエピトープに対する抗体を作製する方法についてのフローチャートである。
【図２】図２は、ヒトプリオンタンパク質について、例示的なアンフォールディングのエネルギーランドスケープについての２つのグラフを提示する図である。
【図３】図３は、ミスフォールディング疾患および癌に関与する９つのタンパク質について同定される、例示的なアンフォールディング特異的エピトープについての図示である。
【図４】図４は、本発明の別の実施形態に従う、アンフォールディングする傾向にあるタンパク質の領域内におけるエピトープを同定するためのシステムについてのシステムダイアグラムである。
【図５】図５は、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を保有するマウスに対する、ＰｒＰ  ＹＭＬ反応性１Ａ１抗体による治療の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本明細書で説明される本発明をより完全に理解しうるために、以下の説明を記載し、用語を定義する。本明細書で直接的に定義されない用語は、本発明の技術分野内で理解される通り、それらと通常関連する意味を有すると理解されたい。
【００８５】
アンフォールディングの自由エネルギー関数
本発明の構成要素は、タンパク質の１または複数のアミノ酸残基のセットのアンフォールディングについて、自由エネルギーの変化を計算することである。「背景技術」で説明した通り、自由エネルギーの変化は、タンパク質の構造パラメータおよび溶媒和パラメータについての複雑な関数である。本発明によるエピトープ予測法では、アンフォールディングの自由エネルギーに対する寄与を対象とし、これは、・ΔＨ：部分的に、溶媒との水素結合が破壊されること、また、それらが再形成されることから、また、天然タンパク質の立体構造内において接触し合う疎水性基間のファンデルワールス相互作用が、アンフォールディング時において破壊されることから生じる、アンフォールディングのエンタルピー；
・ΔＳ溶媒和：新たに溶媒に露出するアミノ酸またはタンパク質の残基の周囲に構造化される溶媒和殻の形成から生じる、アンフォールディングの溶媒和エントロピー；
・ΔＳ立体配置：アンフォールディング時において、タンパク質のアンフォールド領域の立体構造の自由度が増大することから生じる、アンフォールディングの立体配置エントロピー；
・ΔＧ塩橋：天然構造において存在した塩橋を切断する自由エネルギー；
・ΔＧ電荷移動：タンパク質内の荷電基を、フォールドタンパク質の低誘電率環境と、遊離溶媒水の高誘電率環境との間で移動させるときの自由エネルギー；
・ΔＧｐＨ：アンフォールディングの結果として、タンパク質の酸性側鎖または塩基性側鎖のｐＫａ、ならびにタンパク質のＮ末端およびＣ末端のｐＫａを変化させるときの自由エネルギー；ならびに
・ΔＧＰＴＭ：フォールド状態およびアンフォールド状態の安定性に対する、グリカンを含めた翻訳後修飾の効果
を包含する。
【００８６】
エピトープ予測法は、タンパク質の原子分解能構造（例えば、核磁気共鳴、Ｘ線結晶構造解析、電子顕微鏡法、または当技術分野で公知の他の方法により決定される）のほか、本明細書でさらに説明される他の構造を入力として受け取りうる。エピトープ予測法では、例えば、以下：
ΔＧアンフォールディング＝ΔＨ−ＴΔＳ溶媒和−ＴΔＳ立体配置＋ΔＧ塩橋＋ΔＧ電荷移動＋ΔＧｐＨ＋ΔＧＰＴＭ
の通りにこれらの寄与の値を解析することにより、タンパク質に由来するアミノ酸残基のセットをアンフォールディングさせるときの自由エネルギーを正確に決定することができる。
【００８７】
上記で説明したアンフォールディングの自由エネルギーに対する寄与は例示的であり、アンフォールディングの自由エネルギーを計算する際に網羅的であるか、または必要であることを意図するものではないことを理解されたい。したがって、アンフォールディングの自由エネルギーの計算から、上記で説明した寄与のうちの１もしくは複数を除外することもでき、かつ／またはアンフォールディングの自由エネルギーの計算に、当技術分野で公知の１もしくは複数の他の寄与を追加することもできるが、なお、本発明の範囲内に収まる。
【００８８】
アンフォールディングのエンタルピー
アンフォールディングのエンタルピーは、水素結合（タンパク質内における水素結合、および溶媒との水素結合の両方の）エネルギー、ファンデルワールスエネルギー、および陽イオン−パイエネルギーの変化を含め、タンパク質構造の一部がアンフォールディングすることから生じる、内部エネルギーおよび系の圧力と容量との積の変化を記述する。アンフォールディングのエンタルピーは、いくつかの方法で計算することができるが、これらに限定されない。
【００８９】
セットのアンフォールディングのエンタルピーは、アンフォールディングにより破壊される水素結合対間における個別の相互作用を同定することにより決定することができる。各相互作用には、その結合を切断するのに必要なエネルギーとしてのポテンシャルエネルギーを割り当てることができる。距離に依存しない手法では、互いからカットオフ距離ｒｃｒｉｔ内に存在することが見出され、セット内の少なくとも１つの原子を有する任意の極性原子（例えば、Ｎ、Ｏ、またはＳ）に、約１〜約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ／相互作用でありうる一定の相互作用エネルギーεを割り当てる（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１１巻（４号）、２８１〜２９６頁（１９９１年））。代替的に、該一定の相互作用は、約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ／相互作用〜約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ／相互作用でもありうる。
【００９０】
次いで、アンフォールディングするセットのアミノ酸配列内の各極性原子を考察し、また、ｒｃｒｉｔ内にあるタンパク質のアミノ酸配列内の、該セットから１残基を超えて離れた残基に属するすべての極性原子を同定することにより、該セットのアンフォールディングの総エンタルピーを決定することができる。重複する相互作用は除外することができ（そうしなければ、アンフォールディングするセット内の残基間における相互作用を２度ずつ数えることになる）、また、この相互作用数にεを乗じて、アンフォールディングの総エンタルピーを決定することができる。代替法では、上記で説明した、距離に依存しない手法を、極性原子および非極性原子を含む原子対に適用することができる。
【００９１】
カットオフ距離は、約４．８オングストロームでありうる。代替的に、カットオフ距離は、約２オングストローム〜約７オングストローム、または約３〜約５オングストロームなど、その間の（１または複数の）任意の値でありうる。一定の相互作用エネルギーεは、上記で説明した方法によりタンパク質を完全にアンフォールディングさせる場合に、実験によって決定されるタンパク質の安定性を再現するように選択することができる。アンフォールディングするセットのアミノ酸配列内の各極性原子を考察し、また、ｒｃｒｉｔ内にあるタンパク質のアミノ酸配列内の、該セットから３残基を超えて離れた残基に属するすべての極性原子および／または非極性原子を同定することにより、該セットのアンフォールディングの総エンタルピーを決定することができる。
【００９２】
相互作用エネルギーは、２つの極性原子の分離距離ｒが変化するのに応じて、それらの間における相互作用エネルギーが変化するように距離依存的でありうる。この距離依存性は、２つの極性原子を分離するエネルギーが、
【００９３】
【化１１】
2014167025.tif 000018
により表わされるように、水素結合による相互作用をモデル化するのに用いられる「１０乗／１２乗」ポテンシャル（Ｇｏｒｄｏｎ  Ｄ  Ｂら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、９巻、５０９頁（１９９９年））の形態を取りうる。
【００９４】
この式において、θは、隣接する炭素原子に対する極性原子の共有結合間の角度であり、ｒは、極性原子間の分離距離である。角度θを、水素結合が存在するかどうかを決定する際のカットオフ角度に限定することができる。カットオフ角度が小さくなるほど、水素結合の数は少なくなる。一実施形態において、カットオフ角度は、約２０度でありうる。代替的に、カットオフ角度は、約１５〜約３５度でありうる。定数ε’およびβは、水素結合１個当たりの平均相互作用エネルギーが、約１〜約２ｋｃａｌ／ｍｏｌであるように選択することができる。一実施形態では、約５〜約６の値を有するようにβをとる。代替的な実施形態では、水素結合１個当たりの平均相互作用エネルギーが、約０．５〜約２ｋｃａｌ／ｍｏｌであるように、定数ε’およびβを選択することができる。さらなる代替法では、上記で説明した距離法を、極性原子および非極性原子を含む原子対に適用することができる。
【００９５】
別の実施形態では、溶媒露出表面積（ＡＳＡ）を用いて、アンフォールディング時におけるエンタルピー変化を記述することができる。アンフォールディング時において表面積を露出させるエンタルピー変化は、実験的に決定されている（ＭｕｒｐｈｙおよびＦｒｉｅｒｅ、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ、４３巻、３１３頁（１９９２年））。このエンタルピー変化は、残基の極性特徴、非極性特徴、またはヒドロキシル特徴に依存する。それは、
【００９６】
【化１２】
2014167025.tif 000019
の通り、摂氏温度ＴにおけるＡＳＡの変化との関連で与えられる。
【００９７】
ヒドロキシルであると考えうる、トレオニン残基、セリン残基、およびチロシン残基のヒドロキシル基内の酸素を除き、構造内の窒素原子、酸素原子、および硫黄原子は、極性と考えることができる。炭素原子は、非極性と考えることができ、水素は、それらが結合する原子に従って分類することができる：炭素上の水素は非極性と考えることができ、極性原子上の水素は極性と考えることができ、また、ヒドロキシル酸素上における水素は、ヒドロキシルと考えることができる。構造内の各原子のＡＳＡは、１．４オングストロームのプローブ半径を用いる水プローブスウィーピング法（ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｎｄｓ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、５５巻（３号）、３７９頁（１９７１年））、または当技術分野で公知の、他の任意の適切な方法により計算することができる。アンフォールディング時における、対象とするタンパク質のアミノ酸残基セットのＡＳＡ変化は、該セットがアンフォールディングしたときのタンパク質と、天然に構造化されたタンパク質とのＡＳＡの差違を求めることにより、例えば：
１．アンフォールディングすると考えられるセットを該タンパク質の構造から消去し、該部分構造内の極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基のＡＳＡを計算するステップ；
２．該アンフォールドセット内の残基を取り、該アンフォールドセット内の各残基が１つのトリペプチドの中央位置に配置されるトリペプチドとして、タンパク質配列のトリプレットを分離するステップ。これにより、各トリペプチドを、全原子分子動力学シミュレーションで用いて、遊離トリペプチドの運動を決定することができる。シミュレーション時において、該トリペプチドの複数の構造を収集し、各構造について、極性基、非極性基、およびヒドロキシル基のＡＳＡを計算し、該構造間の平均を求めることができる。該アンフォールドセット内の各残基について、遊離トリペプチドの平均ＡＳＡ値を合計すると、該タンパク質の遊離部分の全ＡＳＡを求めることができる；
３．完全な天然タンパク質構造内の極性官能基、非極性官能基、およびヒドロキシル官能基のＡＳＡを計算するステップ；
４．ステップ（３）において計算されたＡＳＡをとり、これを、（１）および（２）において見出される溶媒露出表面積の総和（ＳＡＳＡ）値から差し引くステップ
により計算することができる。
【００９８】
この差違を求める結果として得られるＳＡＳＡ値を、上記の実験によるエンタルピー変化の式に代入することにより、アンフォールディング時におけるエンタルピー変化が求められる。
【００９９】
代替的に、上記で説明した方法の第２のステップを改変して、３残基を超えるかまたはこれ未満の長さのポリペプチドを用いることもできる。
【０１００】
さらなる代替法では、対象とするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置するセット内のアミノ酸残基に対して、異なる形で該方法を適用することもできる。例えば、対象とするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置しないセット内の各アミノ酸残基の場合、該アミノ酸残基と、該対象とするタンパク質のアミノ酸配列内のアミノ酸残基に最も近接する第１の数のアミノ酸残基とを含むポリペプチドを選択することができる。対象とするタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置するセット内の各アミノ酸残基の場合、該アミノ酸残基と、対象とするタンパク質のアミノ酸配列内のアミノ酸残基に最も近接する第２の数の近傍アミノ酸残基とを含むポリペプチドを選択することができる。一実施形態において、該ポリペプチドはトリペプチドであることが可能であり、該第１の数は２であり、該第２の数は１でありうる。代替的な実施形態において、該第１の数および第２の数は同様の場合もあり、同様でない場合もあり、また、ゼロから対象とするタンパク質の長さから１を減じた値までの範囲でありうる。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、フォールド状態およびアンフォールド状態にあるタンパク質に対する、全原子分子動力学シミュレーション、または粗視化分子動力学シミュレーションにより、該エンタルピー変化を計算することもできる。例えば：
１．経時的に反復する形でニュートンの運動方程式を解いて系の時間発展を決定することにより、ヒトの生理学的状態を表わす圧力および密度下にある水分子からなる溶媒により取り囲まれた該タンパク質を含有する系内におけるフォールドタンパク質の運動をシミュレートするステップ。反復間の時間は、約１〜２フェムト秒とすることができ、系の温度は、最も一般的には摂氏３７度である、タンパク質が由来する生物の生理学的温度と等しくすることができる。代替的な実施形態において、時間ステップは、約０．１フェムト秒〜約１０フェムト秒であり、系の温度は、タンパク質のアンフォールディング温度未満の任意の温度でありうる。シミュレーションは、タンパク質がその平衡運動をサンプリングするまで、最も一般的には、約２０〜約４０ナノ秒にわたり継続される。最新のポテンシャルエネルギー関数（Ｂｒｏｏｋｓ，  Ｊ、Ｃｏｍｐ  Ｃｈｅｍ、３０巻、１５４５頁（２００９年））を用いて、シミュレーションから天然状態にある残基間における対エネルギーを抽出し、これをシミュレーション全体で平均することができる；
２．まず、超生理学的温度を用いるか、またはタンパク質の２つ以上の構造要素に外力を直接に適用して、タンパク質をその天然の立体構造からアンフォールディングさせることにより、水分子からなる溶媒により取り囲まれたタンパク質を含有する系内におけるアンフォールドタンパク質の運動をシミュレートするステップ。系の温度を周期的に冷ましてそれを生理学的温度に戻すことで、シミュレーションからポテンシャルエネルギーを抽出することが可能となる。ポテンシャルエネルギーの情報を抽出した後では、系を超生理学的温度に戻して、異なる形でアンフォールディングした立体構造へとより急速に時間発展させることが可能となりうる。シミュレーションでは、セットに付加する立体構造を増加させても、平均の対エネルギーが、最も一般的には１ｋｃａｌ／ｍｏｌである、所望の精度を超える量で変化することはない場合に確立される、対象とするタンパク質のアンフォールディングした立体構造を表わすセットをサンプリングしなければならない。一実施形態では、超生理学的温度と生理学的温度とを１０００回にわたり交代させることができる。代替的には、１０回だけ交代させることもできる。したがって、交代は、約１０〜約１０００回の範囲でありうる。さらなる代替法において、交代は、計算システムによりシミュレートすることが可能な任意の値でありうる；
３．ステップ（１）および（２）から、タンパク質のアミノ酸残基の所与のセットについて、アンフォールディングの自由エネルギーを計算するステップ。これは、アンフォールドセット内のすべての残基対間における、ステップ（２）による相互作用エネルギーを足し合わせ、この和から、アンフォールドセットおよび全タンパク質内のすべての残基対間における、ステップ（１）による相互作用エネルギーを差し引くステップを包含する；により、該エンタルピー変化を計算することができる。
【０１０２】
代替的に、ステップ（１）および（２）を、同等の粗視化シミュレーションにより置き換えることもでき、この場合、タンパク質および溶媒の詳細な原子構造は、系のパラメータ化された記述により置き換えられ、そこで、各タンパク質残基および溶媒分子は、内部自由度を有さない均一の実体として処理される。さらなる代替法では、各タンパク質残基を、そのペプチド骨格および側鎖を個別に表わす実体へと分割することもできる。またさらなる代替法では、タンパク質−溶媒系内において、該系を、他の形で原子総数未満の任意の数の対象へと分割する適用も可能である。またさらなる代替法では、タンパク質を取り囲む溶媒を、該タンパク質の運動に対する溶媒分子の効果を近似する陰伏的な力の場により置き換えることもできる。
【０１０３】
溶媒和エントロピー
溶媒和エントロピーは、新たに露出する基の周囲における溶媒ケージの形成を伴う可能性があり、これにより、溶媒運動の自由度を低下させうる、タンパク質内の官能基の露出の変化に起因して溶媒が取りうるミクロ状態の数の変化を記述する。ヒドロキシル基を含めた極性基の溶媒和エントロピーが０となるのは一般に、３３５Ｋの温度であり、非極性基の溶媒和エントロピーが０となるのは一般に、３８５Ｋである（Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、８３巻、８０６９頁（１９８６年））。この結果、また、例えば、「アンフォールディングのエンタルピー」の表題下で説明した通りに計算されるＳＡＳＡの変化を用いて、任意の温度Ｔにおける溶媒和エントロピーを計算することができる。
【０１０４】
本発明の代替的な実施形態では、ポアソン−ボルツマンの式を解いて、総極性溶媒和エネルギーを決定することにより、総溶媒和エントロピーを計算することができる（Ｂａｋｅｒ  ＮＡら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９８巻、１００３７頁（２００１年））。
【０１０５】
立体配置エントロピー
立体配置エントロピーは、アンフォールドセグメントに対する立体拘束性の低下に起因する、アンフォールディング時におけるタンパク質のミクロ状態数の変化を記述する。タンパク質をその天然状態へとフォールディングさせると、タンパク質の骨格および側鎖の可動性は拘束される。したがって、タンパク質の天然状態は、その部分的なアンフォールド状態において存在する場合と比較して、立体配置エントロピーが低く、この場合、アミノ酸残基のアンフォールドセットは、はるかに多数の配置を取ることが自由であるが、該タンパク質の、なおもフォールディングしている部分との連続性により、該アンフォールドセットの開始位置および終止位置が固定される制限の下にあるほか、該タンパク質の該フォールド部分および該アンフォールド鎖自体の立体排除容量に起因する制約の下にもある。
【０１０６】
タンパク質の完全なアンフォールディング時における、立体配置エントロピーの変化に対する各アミノ酸の寄与は公知であり（例えば、Ｄ’Ａｑｕｉｎｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２５巻、１４３頁（１９９６年）を参照されたい）、例えば、該アンフォールドセットに関与する各アミノ酸についての値を合計することにより、これを、本発明によるエピトープ予測法へと組み込むことができる。アンフォールディング時における、溶媒に対する側鎖の露出と関連する立体配置エントロピー変化の成分は、側鎖が完全に包埋された天然構造にある残基はこの寄与を１００％受け取り、側鎖が完全に露出した残基はこれをまったく受け取らないように、天然構造内に存在する側鎖の溶媒露出度に基づいて、これをあらかじめ評価することができる。
【０１０７】
部分的アンフォールディングの場合、タンパク質の、なおもフォールディングしている部分が存在することにより、アンフォールドセットの立体配置の総自由度は低下する。アンフォールドポリマー鎖についての拡散方程式モデルを用いて、この効果を処理することができ、この場合、タンパク質の残余部分は、平面的な吸収限界として処理することができる。これにより、なおもフォールディングしているタンパク質の残余部分による立体拘束性に起因する状態の減少を説明することができる。タンパク質の半径は一般に、ポリマーの典型的な溶融鎖による旋回半径より大きいので、平面限界による近似は、初期のアンフォールディングイベントにとって望ましい。吸収限界の存在下において、距離ｒで空間容量Δτ内へと伝搬するランダムウォーク系の確率分布ｐｗは、
【０１０８】
【化１３】
2014167025.tif 000020
［式中、ｂは、タンパク質のアルファ炭素間の距離（３．４オングストローム）であり、ｚは、吸収限界から、残基のランダムウォークの終点までの距離であり、ｎは、ランダムウォークする残基数である］により与えることができる。
【０１０９】
塩橋エネルギー
塩橋エネルギーは、アンフォールディングのエンタルピーの、別個に計算される成分を記述する。それは、天然構造内の完全電荷と部分電荷とにおけるクーロン相互作用の破壊から生じ、また、誘電環境が、タンパク質内の環境から水中の環境へとシフトするのに応じて、各電荷を取り囲む誘電体の分極変化から生じる。アンフォールディングするアミノ酸残基のセット内の残基に関与する塩橋の破壊は、エネルギーの損失を負わせる。タンパク質内に存在するすべての荷電残基を考察することにより、この効果に対処することができる。各荷電残基について、約７オングストローム未満の距離でタンパク質内に存在する正反対に荷電残基を同定することができ、重複しない各正反対に荷電残基対により、既存の塩橋が同定される。代替法では、約３〜約１０オングストロームの塩橋カットオフ距離を用いることができる。距離ｒにより分離される２つの電荷ｑ１とｑ２とにおける塩橋のクーロンエネルギーＥは、Ｅ＝１／（４πκε０）×ｑ１ｑ２／ｒ２［式中、ε０は、自由空間の誘電率であり、タンパク質の内部に特徴的な一定の誘電率κを約１０〜約２０と仮定する］によるクーロンの関係を用いて計算することができる。代替的に、κは、約２〜約２０でありうる。部分的なアンフォールディングにより破壊されるこれらの塩橋のエネルギーを合計すると、セットのアンフォールディングに関与する塩橋の総エネルギー変化が求められる。
【０１１０】
代替法では、正反対に荷電であれ、同符号荷電であれ、すべての荷電粒子対間の相互作用を同定し、クーロンポテンシャルに基づくエネルギーを割り当てることができる。塩橋エネルギーの変化が、アンフォールドセットのメンバーに関与する相互作用エネルギーの和であるように、これらの相互作用は、アンフォールディング時において消失したとみなされる。さらなる代替法では、タンパク質の内部および周囲における静電環境を記述する、局所的に変化する誘電関数を用いてポアソン−ボルツマンの式を解くことにより、すべての荷電粒子対間の相互作用を計算することができる。
【０１１１】
電荷移動エネルギー
荷電残基を含有するタンパク質のアンフォールディング部分は、誘電環境間において、エネルギーを変化させながら、それらの荷電基を移動させる。エネルギー変化ΔＧ電荷移動は、
【０１１２】
【化１４】
2014167025.tif 000021
に従い、それぞれ、フォールド状態およびアンフォールド状態にある荷電基周囲の誘電環境である、εフォールドおよびεアンフォールドと、周囲の誘電環境からの荷電基の分離距離ｒとに依存する。
【０１１３】
本発明では、タンパク質内部については、誘電率の平均である１０〜２０により、また、水については、溶媒に対する荷電基の露出により重みづけした７８の比誘電率により、εフォールドを決定する。アンフォールド時の誘電率εアンフォールドは、バルク水の誘電率である７８とし、ｒは、イオン半径に水分子の半径を加えた値、すなわち、２．８〜３オングストロームであるとする。代替的に、εフォールドは、約２〜約１０とすることもできる。アンフォールドセット内の各荷電基の移動エネルギーを合計すると、アンフォールディングの総移動エネルギーを得ることができる。
【０１１４】
代替的な実施形態では、周囲残基の分極率、およびドバイの式（Ｏｎｓａｇｅｒ  Ｌ  Ｊ．、Ａｍ．  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、５８巻、１４８６〜１４９３頁（１９３６年））、またはカークウッド−フレーリッヒ（Ｆｒｏｈｌｉｃｈ）の式を用いて、各荷電基のフォールド状態における誘電率を計算することができる。
【０１１５】
ｐＨ効果
プロトン化エネルギーは、タンパク質内の酸性基および塩基性基上における水素の占有確率の変化に起因するエネルギー変化を記述する。アンフォールディング時には、酸性基および塩基性基の周囲の静電環境が変化するのに応じて、それらのプロトン化エネルギーが変化する。フォールディング時における酸性基および塩基性基のｐＫａは、天然タンパク質の構造から計算することができる（例えば、Ｈｕｉ  Ｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（２００５年）、６１巻、７０４〜７２１頁；  Ｈｉｌｓｅｒら、米国特許第７，０２７，９６９号を参照されたい）。この情報を用いて、アンフォールド状態における酸性残基または塩基性残基のｐＫａが、遊離アミノ酸の場合と同じであるとすると、アンフォールドセット内の残基について、アンフォールディング時におけるプロトン化の自由エネルギーの変化を計算することができる。
【０１１６】
グリカンを含めた翻訳後修飾
翻訳後修飾エネルギーは、ジスルフィド結合、グリカン、ＧＰＩアンカー、および関連する現象が存在することに起因する、エネルギー／エントロピーを組み合わせた項を記述する。タンパク質の安定性に対するグリカンの主要な影響は、立体構造エントロピーを低下させることにより、アンフォールド状態の自由エネルギーを上昇させることである。その容量がグリカンの容量と等しい球体による立体拘束性と符合する、ランダムウォーク成分についての解析的表現を用いることにより、骨格エントロピーの低下に対処することができる。エントロピー喪失ΔＧＰＴＭに対する表式は、
【０１１７】
【化１５】
2014167025.tif 000022
である。
【０１１８】
この表式において、Ｒは、理想気体定数であり、Ｔは、対象とする温度（一般に摂氏３７度）であり、ａは、有効グリカン球面の半径であり、ｒ０は、該有効球面の中心から骨格Ｃアルファ原子までの距離であり、ｂは、アンフォールドタンパク質の持続長（２〜３残基）であり、ｎは、持続長数である。官能基の位置から伸びる各タンパク質鎖（のＮ末端およびＣ末端）について、エントロピー喪失を合計することができる。
【０１１９】
エネルギー関数の使用
ａ）組合せによるアンフォールディング
上記で説明したエネルギー関数を適用して、対象とするタンパク質の１または複数のアミノ酸残基セットについて、アンフォールディングの自由エネルギーを計算することができる。セットは、対象とするタンパク質のモデル内の任意の数のアミノ酸残基による任意の選択を含みうる。セットはまた、対象とするタンパク質のアミノ酸残基による特定種類の部分配列に、また、該対象とするタンパク質の１または複数の指定された領域内にも制約することができる。例えば、セットの種類は、モデル内の１もしくは複数の連続するアミノ酸残基の配列を含むすべてのセット；モデル内の１もしくは複数の連続するアミノ酸残基の配列を含むすべてのセットであって、各セットが領域内において少なくとも１つの残基を含むセット；モデル内の１もしくは複数の連続するアミノ酸残基の、２つ以上の連続しない配列を含むすべてのセット；モデル内の１もしくは複数のアミノ酸残基による２つ以上の連続しない配列を含むすべてのセットであって、各セットが領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むセット；最小の長さと最大の長さとの間の長さを有するアミノ酸残基配列に限定されるセット；または前出のセットの任意の組合せを含みうる。
【０１２０】
最小の長さおよび最大の長さは、所望される候補エピトープのアミノ酸残基配列の長さに基づいて選択することができる。対象とするタンパク質の全長以下である任意の長さを選択することができる。例えば、最小の長さおよび最大の長さは、約３〜約２０でありうる；代替的に、最小の長さおよび最大の長さは、約５〜約１５でありうる。
【０１２１】
特定の一実施形態では、タンパク質の１または複数のアミノ酸による連続する部分配列を、一度に１つずつ、繰り返しアンフォールディングさせることにより、複数のアミノ酸残基のセットを形成することができ、該セットを、アンフォールディング率およびフォールディング機構が予測される環境に適用する。アンフォールディングさせる部分配列は、１残基から、タンパク質中における総残基数までの長さで、また、第１の残基から、［最後の残基からアンフォールド領域内の残基数を差し引いて１を加えた残基］の位置で変化しうる。例えば、長さ１００残基のタンパク質の場合、この結果、該タンパク質の５０５０の部分アンフォールド状態を表わす、５０５０セットの集団が得られる。各セットについて、上記で説明した通りに、アンフォールディングの自由エネルギーを計算することができる。これらのセットの自由エネルギーは、該セットの中央残基の位置がｘ軸上で表わされ、アンフォールド領域の長さがｙ軸上で表わされ、アンフォールディングの自由エネルギーがｚ軸上で表わされる、３次元のグラフ上で表わすことができる。タンパク質の連続する部分配列を一度に１つずつアンフォールディングさせうる、上述の単一配列による近似に合わせて、このグラフを、単一配列によるエネルギーランドスケープと称することができる。例えば、図２として、ヒトプリオンタンパク質の単一配列によるエネルギーランドスケープを示す例示的な２つのグラフを示す。同じ範囲のアンフォールドタンパク質に対応するすべての立体配置状態が、同じ総エネルギーを有することを近似して、これらのセットを集団として処理すると、各セットについてのボルツマン因子を、「背景技術」で説明した分配関数で除することにより、各セットについてのアンフォールディングの平衡確率を計算することができる。次いで、これらの平衡確率を、アンフォールディング配列の位置および長さの関数としてプロットすることができる。残基のアンフォールディングの全確率を求めるには、アンフォールディングした立体配置内においてこの残基を含有する、すべてのセットの平衡確率を合計することができる。すべての残基についてこのようにして求められるアンフォールディングの全確率を、タンパク質内の残基番号の関数としてプロットすることができる。
【０１２２】
アンフォールディングの全確率が最も高いタンパク質の領域を同定することは、エネルギーランドスケープ内の極小点を見出すことと等価であり、これは、まず、結果の目視により行うことができ、次いでまた、該自由エネルギーランドスケープ上の谷の深さを検討することにより精緻化することができる。一定の長さのアミノ酸残基配列を含むセットのアンフォールディングの平均自由エネルギーを計算することができ、また、アンフォールディングの自由エネルギーが、該平均エネルギーより量Ｅだけ少ない、同じ一定の長さのアミノ酸残基配列を含むすべてのセットを同定することができる。対象とするすべての部分配列長について、この計算を繰り返すことができる。アンフォールディングの平均エネルギーから量Ｅを減じた量を、「最小のエネルギー」と称することができ、それが計算される各部分配列の長さに応じて変化しうる。一実施形態において、Ｅは、アンフォールディングの平均自由エネルギーを有するセットに対して、アンフォールディングの確率が１０倍に増大することに対応する、１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の場合もあり；代替的に、Ｅは、アンフォールディングの全確率が１００倍に増大することに対応する、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の場合もある。候補エピトープについて、アンフォールディングする傾向にある領域を選択する目的では、約３〜約２０のアンフォールド配列長に対応する極小点が許容される場合もあり；代替的に、アンフォールド配列の長さが、約５〜約１５の場合もある。一実施形態では、長さ１００残基のタンパク質の場合、単一配列によるランドスケープ内の、５カ所を超えない最も顕著な極小点、また、これらに対応する候補エピトープを、さらなる解析のために選択する。代替的な実施形態では、５カ所を超えるかまたは５カ所未満の最も顕著な極小点を、さらなる解析のために選択することができる。
【０１２３】
別の実施形態では、タンパク質の、２つの連続しない部分配列または連続する部分配列をアンフォールディングさせることによりセットを形成し、この結果、二重配列によるエネルギーランドスケープと称する５次元オブジェクトを得る。これは、残基指標をｘ軸上に示し、アンフォールド残基の総数をｙ軸上に示し、また、アンフォールディングの自由エネルギーまたは確率をｚ軸上に示す、３次元グラフへと投影することができる。二重配列によるエネルギーランドスケープは、異なる部位におけるアンフォールディングイベント間の相互作用を同定するのに有用な場合があり、また、タンパク質の一部がアンフォールディングすると、該タンパク質の別の部分が、どのくらいアンフォールディングを受けやすくなりうるかを説明しうる。したがって、フォールド構造の残余部分において候補エピトープ領域をアンフォールディングさせることの構造的帰結を決定することができる。加えて、または代替的に、単一配列によるエネルギーランドスケープからは明らかでないさらなる候補エピトープを示唆する、相関的かつ協同的なアンフォールディング挙動を決定することもできる。
【０１２４】
さらに別の実施形態では、対象とするタンパク質の、可能なすべての数の連続する部分配列または連続しない部分配列によるすべてのセットについて、アンフォールディングのエネルギーを計算することができ、これにより、多次元のエネルギーランドスケープがもたらされる。これにより、部分アンフォールド状態についての網羅的な集団がもたらされる。しかし、この手法は計算が面倒であり、したがって、例えば、タンパク質のアンフォールディング機構を構築するのに、すべての部分アンフォールド状態を完全に開示することが望ましい場合に用いることができる。この方法では、上記で説明したエネルギー関数を用いて、タンパク質内のすべての可能な残基セットについて、アンフォールディングの自由エネルギーを計算する。アミノ酸残基のセットは、もはや連続する必要がない。極小のアンフォールディングの自由エネルギーを同定し、対応するアミノ酸残基の部分配列（各部分アンフォールド構造に由来する１または複数の配列）を、候補エピトープとして選択する。この方法では、単一の連続鎖のアンフォールディングからは明らかとならない場合がある、不安定な領域の組合せが網羅的に検索される。
【０１２５】
さらにまた代替的な実施形態では、アンフォールディングの全確率が最小の確率を上回るセットからエピトープを同定する。セットは、所望に応じて、連続するアミノ酸残基配列または連続しないアミノ酸残基配列の任意の変化を含みうる。エピトープのアンフォールディングの全確率は、該エピトープのアミノ酸残基配列を含む、すべてのセットのアンフォールディングの平衡確率の和として決定される。次いで、さらなる解析のために、アンフォールディングの全確率が「最小の確率」を上回るエピトープを同定する。最小の確率は、考察されるエピトープの長さに応じて変化する場合があるが、タンパク質内の、連続するアミノ酸残基の部分配列が同じ長さである、すべてのセットのアンフォールディングの全確率の平均の倍数として定義することができる。アンフォールディングの全確率が、所望の最小の確率を上回るエピトープを選択する目的で、任意の値の倍数を選択することができる。一実施形態において、該倍数は、１０以上でありうる。代替的な実施形態において、該倍数は１００以上でありうる。
【０１２６】
エピトープ予測法は、入力として、核磁気共鳴、もしくはＸ線結晶構造解析、もしくは電子顕微鏡法、または他の方法などの高分解能法により決定される、対象とするタンパク質またはその一部（タンパク質のドメインまたは断片など）の原子分解能構造を受け取りうる。該構造は、分解能が約１０オングストローム以下の場合もあり、分解能が約５オングストローム以下の場合もある。対象とするタンパク質の原子分解能構造は、直接求められる場合もあり、アミノ酸配列が対象とするタンパク質に類似する別の（１または複数の）タンパク質または（１または複数の）ポリペプチドの原子分解能構造に基づいて決定する場合もある。例えば、ヒトＴＮＦ受容体の構造は、ＰＤＢ（ＩＤコード：１ＴＮＲ）から得ることができ、直接用いることができる。代替的に、ｆａｓの構造は、構造予測プログラムであるＬＯＭＥＴＳまたはＩ−ＴＡＳＳＥＲ（Ｙａｎｇ  Ｚｈａｎｇ、「Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３Ｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、９巻、４０頁（２００８年）、（ｈｔｔｐ：／／ｚｈａｎｇ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｋｕ．ｅｄｕ／ＬＯＭＥＴＳ／））の後、分子動力学（ＭＤ）法により２０ナノ秒にわたって平衡化／最小化することにより決定される、１ＴＮＲに対する相同性モデリングに基づいて決定することもできる。ＰＤＢ内の関連構造に従い、ペプチドの番号付けを割り当てることができる。さらなる代替法では、原子解像能を有さない対象とするタンパク質の構造も、入力として受け取ることができる。例えば、残基解像能を有する対象とするタンパク質の構造が、入力となりうる。
【０１２７】
対象とするタンパク質の構造が、いまだ十分正確には解明されていない場合は、対象とするタンパク質に対して高度の配列相同性を有することが公知であるタンパク質の構造をその代わりに用いることができ、その自由エネルギーランドスケープの極小点を、本方法の最初の２つの構成要素により決定することができる。例えば、高度の配列相同性は、別のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかまたは類似の場合もあり、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかまたは類似の場合もあるアミノ酸配列を包含する。「類似の」とは、対象とするタンパク質のアミノ酸配列が、最適な形で整列された場合に、別のアミノ酸配列と、「保存的アミノ酸（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」または「保存的アミノ酸（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」だけ異なることを意味する。保存的アミノ酸の分類は、親水性もしくは疎水性、サイズもしくは容量、または電荷に基づきうる。アミノ酸は、主にアミノ酸側鎖の特性に応じて、疎水性または親水性として特徴づけうることが一般的である。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、１７９巻、１２５〜１４２頁、１９８４年）により標準化されたコンセンサスの疎水性スケールに基づくと、疎水性アミノ酸は、ゼロを超える疎水性を示し、親水性アミノ酸は、ゼロ未満の疎水性を示す。疎水性アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、およびＴｒｐが含まれ、親水性アミノ酸には、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓが含まれる。
【０１２８】
一部の実施形態において、「保存的アミノ酸（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」または「保存的アミノ酸（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」とは、同様の親水性値（例えば、プラスもしくはマイナス２．０、またはプラスもしくはマイナス１．５、またはプラスもしくはマイナス１．０、またはプラスもしくはマイナス０．５の範囲内の値）を有するアミノ酸を指し、この場合、Ｔｙｒ（−１．３）またはＰｒｏ（−１．６）など、ハイドロパシー指数が約−１．６である以下：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；およびＴｒｐ（−３．４）のアミノ酸は、アミノ酸残基に割り当てられる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号で詳述される）。
【０１２９】
代替的な実施形態において、保存的アミノ酸とは、同様のハイドロパシー指数（例えば、プラスもしくはマイナス２．０、またはプラスもしくはマイナス１．５、またはプラスもしくはマイナス１．０、またはプラスもしくはマイナス０．５の範囲内の値）を有するアミノ酸を指す。このような実施形態では、以下：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）の通り、その疎水性および電荷特徴に基づき、各アミノ酸残基にハイドロパシー指数を割り当てることができる。
【０１３０】
代替的な実施形態において、保存的アミノ酸は、以下：非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒの通り、非極性クラス、酸性クラス、塩基性クラス、および中性クラスに分類される。
【０１３１】
疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸は、それらの側鎖の特徴に基づき、さらに細分化することができる。例えば、芳香族アミノ酸とは、側鎖が、少なくとも１つの芳香環またはヘテロ芳香環を含有する疎水性アミノ酸である。芳香族アミノ酸には、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐが含まれる。非極性アミノ酸とは、生理学的ｐＨでは荷電せず、また、２つの原子により共有される電子対が、一般に、該２つの原子の各々により同等に保持される結合を有する側鎖を伴う（すなわち、側鎖が極性でない）疎水性アミノ酸である。非極性アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、およびＭｅｔが含まれる。非極性アミノ酸をさらに細分化して、脂肪族の炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である、脂肪族アミノ酸を包含させることができる。脂肪族アミノ酸には、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅが含まれる。
【０１３２】
極性アミノ酸とは、生理学的ｐＨでは荷電しないが、２つの原子により共有される電子対が、該原子のうちの一方により緊密に保持される１つの結合を有する側鎖を伴う親水性アミノ酸である。遺伝子によりコードされる極性アミノ酸には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎが含まれる。酸性アミノ酸とは、側鎖のｐＫａ値が７未満の親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、水素イオンの喪失により、生理学的ｐＨでは負に荷電した側鎖を有することが典型的である。酸性アミノ酸には、ＡｓｐおよびＧｌｕが含まれる。塩基性アミノ酸とは、側鎖のｐＫａ値が７を超える親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、ハイドロニウムイオンとの会合により、生理学的ｐＨでは正に荷電した側鎖を有することが典型的である。塩基性アミノ酸には、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓが含まれる。
【０１３３】
上記の分類は絶対的なものではなく、アミノ酸は、複数のカテゴリーに分類されうることを、当業者は理解するであろう。加えて、アミノ酸は、公知の挙動、および、特定のアッセイに基づくか、または既に同定されたアミノ酸と比較される、特徴的な化学的特性、物理的特性、または生物学的特性に基づいて分類することもできる。
【０１３４】
公知の構造を有するが、対象とする配列、すなわち、最高度の配列相同性を有するタンパク質に構造的に整列される配列も有する、仮説的タンパク質内においてアンフォールディングする可能性が高い領域を検討することにより、候補エピトープを見出すことができる。その構造が、候補エピトープの局所的安定性など、さらなる情報をもたらすと判定されている配列について、これらを、候補エピトープと比較することができる。
【０１３５】
代替的に、タンパク質の一次配列に基づく非経験的予測により、構造を決定することもできる。
【０１３６】
ｂ）アンフォールディングの解析モデル
アミノ酸がフォールディングまたはアンフォールディングしている、モデルの二状態性により、イジング様モデルへの対応づけが可能となる。イジング様モデルは、タンパク質フォールディングに導入されており（ＭｕｎｏｚおよびＥａｔｏｎ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６巻、１１３１１頁（１９９９年））、本発明に適合させて、アンフォールディングおよびミスフォールディングをモデル化することができる。統計力学ツールと併せて上記で説明したエネルギー関数を用いると、１または複数の配列鎖が溶融した、部分アンフォールドタンパク質についての分配関数を見出すことができる。
【０１３７】
イジングモデルのフォーマリズムにおいて、エネルギー関数は、配列的には隔たっているが空間的には近接して相互作用し合うアミノ酸を表わす、非局所的相互作用を含有する。状態全体にわたり解析的に実行される部分トレースは、本方法の組合せ構成要素の有効性をしのぎ、多数の連続配列を同時にアンフォールディングさせうる。本方法の組合せ構成要素は、適切な場合、統計力学ツールと共に部分トレースを伴う解析的方法により置き換えることができる。
【０１３８】
ｃ）エネルギーランドスケープによる候補に基づくエピトープの選択
エネルギーランドスケープを検討することにより選択したミスフォールディング特異的な候補エピトープを精緻化して、ミスフォールドタンパク質には高アフィニティーで選択的に結合するが、正常フォールドタンパク質にも、該生物のプロテオーム内の他のタンパク質にも結合しないエピトープを、さらなる開発のために選択することができる。この目的で、一連のスクリーニングステップを、本発明の第３の構成要素として実装することができる：
・候補エピトープが、それに対して作製される抗体にとって十分に免疫原性である可能性を増大させるため、おそらくは疎水性残基より一般に免疫原性である親水性残基（すなわち、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、メチオニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシン）が十分な数だけ存在するかどうかについて、その配列を検討することができる。Ｂ細胞反応により抗体を生成させるエピトープの免疫原性を推定する手法は、別所（Ｒｏｇｇｅｎ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、８巻、７５頁（２００８年））で開発されており、これを用いて、候補エピトープを、それらが頑健な抗体生成を誘発する可能性について評価することができる。
【０１３９】
・候補エピトープが、天然の立体構造内においてそれを含有するタンパク質に対して免疫反応性でない可能性を減少させるため、該天然構造内における、溶媒に対するエピトープの露出を調べることができる。溶媒に対する露出は、ミスフォールディング時における選択的な免疫反応性の可能性を増大させるため、天然構造内のエピトープは、これを最小化させうる。しかし、エピトープの重要な部分、特に、親水性基および荷電基は、フォールド状態においても溶媒に露出することがしばしば起こる。遊離ペプチドを再現しうる形で露出する親水性基または荷電基を有する候補エピトープは棄却されるが、同じ配列の遊離ペプチドにより再現されない立体構成を有する候補エピトープは保持される。例えば、親水性基または極性基が、天然構造内のタンパク質の別個の側面上において露出し、抗体により同時に認識されることがない場合にこれは生じうる。タンパク質の構造セットを求めることができる場合は、該タンパク質内のすべての領域についての二乗平均平方根偏差を計算し、これを用いてエピトープの選択を精緻化することができる。フォールド状態においてＲＭＳＤが大きな領域は、これが、より大きな運動性の指標であるため、エピトープとしてはあまり望ましくない。
【０１４０】
・候補エピトープが、標的生物の他のタンパク質内に存在しない可能性を減少させるため、例えば、該生物のプロテオーム内の類似の配列を同定しうるタンパク質ＢＬＡＳＴにより、エピトープ配列の検索を実施することができる。これらの類似の配列は、候補エピトープを標的とする薬剤に対して曝露されると、その診断的有用性または治療的有用性を損なう、有害な交差反応を引き起こしうる。一般に、正常状態にある候補配列は、プロテオーム内の他の配列と共有するその残基が８０％未満であるものとする；極めて異なるエピトープが示す類似性は最小限であり、例えば、ゲノム内の他のタンパク質配列との共有は５０％未満であるとする。
【０１４１】
次いで、上記で列挙した基準のうちの１または複数を満たす候補エピトープを、ミスフォールディング特異的エピトープとして受け取ることができる。
【０１４２】
したがって、一実施形態において、本方法は、以下の部分を含むがこれらに限定されない。
【０１４３】
ａ）二次構造または三次構造を有するタンパク質のアミノ酸配列内に含有される、１または複数のアミノ酸残基の任意のセットについて、アンフォールディングのギブスの自由エネルギーまたはヘルムホルツの自由エネルギーを決定するためのエネルギー関数。この自由エネルギー関数は、以下で詳細に説明される複数の形態を取りうるが、最も一般的には、アンフォールディングの自由エネルギーに対する以下のエネルギー寄与：エンタルピーの変化、溶媒和エントロピーの変化、立体構成エントロピーの変化、塩橋の切断エネルギー、酸性残基および塩基性残基のｐＨに依存するイオン化エネルギー、誘電環境間における荷電基の移動エネルギー、ならびにグリカンおよび／またはジスルフィド結合の安定化エネルギー（対象とするタンパク質が、これらの構造要素を含有する場合）のすべてを考慮に入れる。
【０１４４】
ｂ）対象とするタンパク質の１または複数のアミノ酸のすべてまたは複数のセットについて、アンフォールディングの自由エネルギーおよびアンフォールディングの全確率を計算するのに自由エネルギー関数を適用し、結果として得られるエネルギーを解釈に適する形で表示する方法。本発明の特定の場合において、これは、タンパク質の配列内に含有されるアミノ酸残基のすべての連続する部分配列のセットについて、アンフォールディングの自由エネルギーを計算するステップと、アンフォールディングの自由エネルギーまたは全確率をアンフォールド配列の長さおよびタンパク質配列内における位置の関数として示す、３次元表面プロット上において該自由エネルギーを表示するステップとを伴う。本発明の別の特定の場合は、２つのアンフォールディングする部分配列を含有する、すべての部分アンフォールド状態の自由エネルギーを計算するステップを伴う（タンパク質フォールディングの分野では、「二重配列による近似」として公知である）。アンフォールディングのエネルギーランドスケープ表面上における極小点に対応するアンフォールド配列を、最もアンフォールディングする可能性が高い領域として同定し、したがって、ミスフォールディング特異的エピトープの候補として同定する。
【０１４５】
ｃ）部分ｂ）で定義した、ミスフォールディング特異的な候補エピトープを取り、それらの免疫原性、タンパク質のフォールド形態において免疫反応性である傾向、また、プロテオームの他のタンパク質内における発生を解析するステップ。免疫原性であり、対象とするタンパク質がそのフォールド形態にある場合は抗体に対して非反応性であり、また、他の細胞表面または細胞外タンパク質において交差反応性を引き起こす可能性が高い形では存在しない候補エピトープだけを選択する。
【０１４６】
ｄ）タンパク質内に含有される、配列が連続するすべての可能な候補エピトープについてアンフォールディングの自由エネルギーを計算することに基づき、タンパク質におけるミスフォールディング特異的エピトープを予測する方法。該方法では、相対的に確率の高いアンフォールディングイベントが自由エネルギー表面上の極小点または谷に位置する、アンフォールディングイベントの自由エネルギーランドスケープを作製することによりこれらの領域を同定する。該方法ではまた、これらの極小点の周囲にエネルギー等高線を描くことが可能であり、これにより、所与のアンフォールディングイベントが、他のより広範なアンフォールディングイベントの素因を示す確率が決定される。
【０１４７】
ｅ）アンフォールディングの確率が相対的に高いことが判明している領域の免疫原性を同定して、抗体を開発するためのエピトープとして用い、また、アンフォールド状態またはミスフォールド状態だけにおいて免疫反応性であることが予測されるエピトープを単離する方法。この手法の顕著で実際的な利点は、免疫原およびスクリーニング標的内では二次構造または三次構造が欠如するために、該方法により規定される遊離ペプチドに対して作製される抗体は、部分的に変性した親タンパク質内において伸長した同一の直鎖状アンフォールド配列を特異的に認識する可能性が極めて高いということである。
【０１４８】
図１として、本方法の一実施形態のステップを説明するフローチャートを示す。
【０１４９】
エピトープを同定するためのシステム
代替的な実施形態では、上記で説明したエピトープ予測法を、タンパク質中のミスフォールド形態内に存在するエピトープを同定するシステムにおいて実装する。図４として、入力ユニット１０１、候補選択ユニット１０３、自由エネルギー計算ユニット１０５、およびエピトープ同定ユニット１０７を含むシステム１００を示す。
【０１５０】
本実施形態において、システム１００は、プロセッサーおよびメモリーを有するコンピュータ（図示しない）を含む。メモリーは、プロセッサーにより実行されると、本明細書で説明される、入力ユニット１０１、候補選択ユニット１０３、自由エネルギー計算ユニット１０５、およびエピトープ同定ユニット１０７の機能性をもたらす、その上に記録されたステートメントおよびインストラクションを含有する。代替的な実施形態において、入力ユニット１０１、候補選択ユニット１０３、自由エネルギー計算ユニット１０５、およびエピトープ同定ユニット１０７は、１または複数のネットワークを介して通信し合う１または複数の地点に位置する、１または複数のプロセッサーおよびメモリーを含みうる。プロセッサーは、１または複数のコンピュータ上において、アプリケーション専用回路、プログラマブル論理制御装置、フィールドプログラマブルゲートアレイ、マイクロコントローラー、マイクロプロセッサー、仮想マシン、電子回路、また当業者に公知の他のプロセッシングデバイスを含みうる。さらに、メモリーは、１または複数のランダムアクセスメモリー、フラッシュメモリー、読み取り専用メモリー、ハードディスクドライブ、光学ドライブおよび光学ドライブ用メディア、フラッシュドライブ、また、当業者に公知の、コンピュータにより読み取り可能な他の保存用メディアを含みうる。
【０１５１】
入力ユニット１０１は、タンパク質の構造を表わすモデルを受け取るように構成される。上記で説明した通り、入力ユニット１０１は、核磁気共鳴、Ｘ線結晶構造解析、電子顕微鏡法、または当技術分野で公知の他の方法などの技法を用いることにより得られるタンパク質の原子モデルを受け取りうる。加えて、入力ユニット１０１はまた、アンフォールドタンパク質のエピトープについて評価されるモデル化されたタンパク質の領域、選択される領域内のアミノ酸セットの種類、また、上記で説明したアンフォールディングの自由エネルギー関数のパラメータを含め、システム１００の動作を定義する動作パラメータを受け取るようにも構成される。本実施形態において、入力ユニット１０１は、システム１００のメモリー内に保存された構成データを読み取ることにより、タンパク質モデルおよび動作パラメータを受け取る。代替的な実施形態において、入力ユニット１０１は、例えば、キーボードによる手動入力など、当技術分野で公知の任意の手段を介して、タンパク質を表わすモデル、および動作パラメータ、またはリモートサーバー内のアクセスデータを受け取りうる。さらに代替的な実施形態において、入力ユニット１０１は、タンパク質を表わす１または複数のモデル、上記で説明した動作パラメータ、また、当業者に明らかな他の動作パラメータを受け取りうる。
【０１５２】
候補選択ユニット１０３は、モデルから、１または複数のアミノ酸残基による１または複数のセットを選択するように構成される。選択されるセットの種類を指定するパラメータは、入力ユニット１０１により候補選択ユニット１０３へと与えられる。セットの種類は、モデル内の位置、長さ、アミノ酸残基の連続しない配列の数について選択することができる。例えば、セットの種類は、モデル内の１もしくは複数の連続するアミノ酸残基の配列を含むすべてのセット；モデル内の１もしくは複数の連続するアミノ酸残基の配列を含むすべてのセットであって、各セットが領域内において少なくとも１つの残基を含むセット；モデル内の１もしくは複数の連続するアミノ酸残基の、２つ以上の連続しない配列を含むすべてのセット；モデル内の１もしくは複数のアミノ酸残基による２つ以上の連続しない配列を含むすべてのセットであって、各セットが領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むセット；最小の長さと最大の長さとの間の長さを有するアミノ酸残基配列に限定されるセット；または前出のセットの任意の組合せを含みうる。
【０１５３】
代替的な実施形態では、選択されるセットの種類、および／または評価される領域を指定するパラメータが入力ユニット１０１によっては受け取られず、候補選択ユニット１０３は、特定の種類のセットおよび／または特定の領域を選択するようにあらかじめ構成される。例えば、候補選択ユニット１０３は、全モデル内の１または複数の連続するアミノ酸残基の配列を含む、すべてのセットを選択するように構成することができる。
【０１５４】
自由エネルギー計算ユニット１０５は、上記で説明した、アンフォールディングの自由エネルギー関数を適用することにより、候補選択ユニット１０３により選択された各セットについて、アンフォールディングの自由エネルギーを決定するように構成される。本実施形態において、自由エネルギー計算ユニット１０５は、エンタルピーの変化については、全原子分子動力学、または溶媒露出表面積の変化、または空間的に近接する水素以外の原子数の変化；溶媒和エントロピーの変化については、溶媒露出表面積の変化；立体配置エントロピーの変化、および翻訳後修飾効果については、解析的拡散モデル；塩橋エネルギーおよび電荷移動エネルギーについては、誘電率を一定とするか、または空間的に変化させる、ポアソン−ボルツマンの式、またはクーロンの式を用いて、アンフォールディングの自由エネルギー関数の各要素を決定するように構成される。代替的な実施形態において、自由エネルギー計算ユニット１０５は、各要素を決定するための、上記で説明した方法のうちの１つ、またはそのうちの２つ以上による平均を用いて、アンフォールディングの自由エネルギー関数の各要素を決定しうる。
【０１５５】
エピトープ同定ユニット１０７は、２つの方法のうちの１つにより、タンパク質のミスフォールド形態において存在する１または複数のエピトープを同定するように構成される。（ａ）領域内の各残基についてアンフォールディングの全確率を決定し、アンフォールディングの全確率が最小の確率を上回るセットからエピトープを同定することによるか、または（ｂ）アンフォールディングの自由エネルギーが最小のエネルギーを下回るセットからエピトープを同定することにより、エピトープを同定することができる。エピトープ同定ユニット１０７は、エピトープについて記載するデータを、システム１００のメモリー内に保存することにより、エピトープを同定する。代替的な実施形態において、エピトープは、ディスプレイまたは印刷媒体上におけるグラフ表示または数値表示を提示することにより同定することができる。
【０１５６】
動作中において、アンフォールドタンパク質のエピトープについて評価されるタンパク質モデル、および動作パラメータは、構成データとして、システム１００のメモリー内に保存される。入力ユニット１０１が、メモリーから構成データを読み取ることにより、タンパク質モデルおよび動作パラメータを受け取る。次いで、候補選択ユニット１０３が、入力ユニット１０１により受け取られた動作パラメータにより指定された特徴を有する、モデル内のアミノ酸残基のセットを選択する。次いで、自由エネルギー計算ユニット１０５が、候補選択ユニット１０３により選択された各セットについて、アンフォールディングの自由エネルギーを決定する。自由エネルギー計算ユニット１０５により各セットについて決定されたアンフォールディングの自由エネルギーに基づき、（ａ）領域内の各残基についてアンフォールディングの全確率を決定し、アンフォールディングの全確率が最小の確率を上回るセットからエピトープを同定することによるか、または（ｂ）アンフォールディングの自由エネルギーが最小のエネルギーを下回るセットからエピトープを同定することにより、エピトープ同定ユニット１０７が、エピトープを同定する。次いで、エピトープ同定ユニット１０７が、エピトープについて記載するデータを、システム１００のメモリーに保存する。
【０１５７】
例示的な実施形態
本発明者らは、本明細書で説明されるエピトープ予測法を用いて、ヒトプリオンタンパク質、ウシプリオンタンパク質、ヒトスーパーオキシドディスムターゼ１、ヒトトランスサイレチン、ヒトβ２ミクログロブリン、ヒトＮｏｔｃｈ受容体、ヒトＣＤ３８、ヒトＣＤ４４、ヒト腫瘍壊死因子受容体、ヒトＦＡＳ受容体、およびヒト上皮成長因子受容体のミスフォールディング特異的エピトープを同定した。本発明者らは、「発明を実施するための形態」で説明した上記のステップを実装して、図３に示し、また、以下の表１に列挙する配列を得た。
【０１５８】
【表１−１】
2014167025.tif 000023
【０１５９】
【表１−２】
2014167025.tif 000024
表１に列挙されるペプチドは、それらの単離形態、すなわち、これらの配列が常在する親ペプチドから取り出された形態、また好ましくは、他のすべてのペプチドが本質的に不在である形態において、本発明の重要な実施形態を構成する。
【０１６０】
表１をよく検討すると、本発明に従う方法により、対象とするタンパク質内における大量の潜在的エピトープを取り出し、それらを、１００、５０、２０、１０以下のミスフォールディング特異的エピトープへと減少させうることが理解されるであろう。
【０１６１】
これらのエピトープは、疾患特異的エピトープを同定するための本発明の効能を示す例であることを意図する。本発明のエピトープ予測法をタンパク質に対して用いて同定されるすべてのエピトープ、また、それらに対して免疫反応性であるように作製された抗体は、本発明の態様であると考えられる。
【０１６２】
本発明に従うエピトープ予測法を適用することにより、他の既存の特許においてミスフォールディング特異的エピトープとして既に特許請求されているエピトープを同定しうることは、注目に値する。したがって、本発明者らは、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００００３４６号、ならびに米国特許第ＵＳ２００８０２０６２５１Ａ１号および同第ＵＳ２００７０２９２４１０Ａ１号で既に特許請求されている、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）１エピトープなど、本発明により同定されるが、他の手段によっても同定され、また、ミスフォールドタンパク質を選択的に同定する目的で既に特許請求されているエピトープを、本特許の特許請求の範囲から除外する。
【０１６３】
本発明は、タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態により「固有の形で」提示されるエピトープに関する。エピトープを提示することにより、タンパク質の２つの形態を区別するための根拠が得られ、ミスフォールドタンパク質を標的とすることが可能となり、また、天然フォールドタンパク質は、本発明の治療的適用および診断的適用における複雑化因子として実質的に除去される。原理的に述べると、エピトープは、ミスフォールドタンパク質のエピトープに結合する抗体または他のリガンドが、そのタンパク質の天然フォールド形態に結合しないか、またはこれに対する結合を著明に低下させる場合、そのタンパク質に固有である。結合の差違が、識別可能な検査結果、または治療結果をもたらすのに有効であれば、該結合の差違の具体的な大きさはそれほど重要でない。したがって、本エピトープ、また、それらを同定するのに用いられる方法は、同じタンパク質のミスフォールド形態と天然フォールド形態とを区別するための根拠を提供する。
【０１６４】
本明細書の文脈において、タンパク質のミスフォールド形態は、天然フォールドタンパク質においては見出されないエピトープを提示する形態として特徴づけられる。これは、異なる環境条件（例えば、システインの酸化）、タンパク質フォールディングの監視における欠陥（例えば、シャペロン機能の無効性）、翻訳後修飾の異常（例えば、グリコシル化の成熟欠損）、別のタンパク質との相互作用異常（例えばＰｒＰＣ−ＰｒＰＳｃ間相互作用）、または遺伝子における突然変異の結果としてもたらされる、異なる立体構造を取るタンパク質から生じることが典型的である。ミスフォールディングの結果として、タンパク質は、まれで望ましくない凝集状態を取りうる。代替的に、ミスフォールドタンパク質は、他のタンパク質と会合しない状態を保ちうるが、その正常状態と比べて、異なる免疫原性を示しうる。タンパク質のミスフォールド形態には、例えば、該タンパク質が、ミスフォールディング時、また、場合によって凝集時において、部分的にアンフォールディングした立体構造を取る場合の、一過性のミスフォールド状態が含まれることを理解されたい。
【０１６５】
本明細書で用いられる「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞受容体もしくはＴ細胞受容体、または抗体もしくはその結合断片により認識されるタンパク質の領域を指し、本明細書では、該エピトープが常在する親タンパク質内において見出されるアミノ酸配列を有する直鎖状ペプチドにより表わされる。本発明によるエピトープには、例えば、タンパク質が、ミスフォールディング時、また、場合によって凝集時において、部分的にアンフォールディングした立体構造を取る場合に一過性で露出しうる、該タンパク質内のエピトープが含まれることを理解されたい。本明細書の上記で述べた通り、エピトープは通常、抗体の結合に必要な最小限のドメインを表わす、少なくとも３つの連続する残基を含む。しかし、エピトープは、５残基、典型的に、一般的な抗体生成宿主内における最小限の免疫原性に必要な長さである７残基、１０残基、１５残基、２０残基以上など、より多数の連続する残基を包含しうることが理解されるであろう。最も重要なことは、抗体結合ドメインを保有するエピトープを提供することである。したがって、また、表１を参照すると、具体的に列挙されたペプチドは、特に、７残基未満からなるペプチドの場合、それ自体がエピトープとして用いられることに加え、それらの片側または両側において、付加的アミノ酸残基をさらに含むことを理解されたい。付加的残基は、親タンパク質の環境において、該ペプチドと通常会合する残基でありうる。逆に、とりわけ、ペプチドが７を超える残基からなる場合、該ペプチドの短縮形態もまた、エピトープとして用いうることを理解されたい。短縮の範囲は、所与のペプチドの実際の長さに応じて変化しうる。列挙されたペプチド内における、任意の連続する７残基は、それ自体免疫原性であると予測することができ、また、任意の３、４、５、６、または７以上の連続する残基は、抗体が結合するエピトープとして有用であると予測することができる。
【０１６６】
例えば、ヒトＰｒＰＣタンパク質にエピトープ予測法を適用すると、予測される両方のペプチドである、ＬＧＧＹＭＬおよびＧＧＹＭＬＧＳ（それぞれ、配列番号１および２）に共通の配列であるＹＭＬにより表わされるベータ鎖１内においてエピトープを提示する、アンフォールディングイベントが予測される。上記の議論から、これらもまたＹＭＬを含み、また、親タンパク質の配列にも基づく、特異的ペプチドによる変異体も、本発明の実施形態に包含されることが理解されるであろう。このようなペプチドには、例えば、ＧＧＹＭＬＧＳ（配列番号８１）、ＧＧＹＭＬＧ（配列番号８２）、ＧＹＭＬＧＳ（配列番号８３）、ＧＧＹＭＬ（配列番号８４）、ＹＭＬＧＳ（配列番号８５）、ＧＹＭＬ（配列番号８６）、ＹＭＬＧ（配列番号８７）、およびＹＭＬ（配列番号８８）が含まれうる。
【０１６７】
標準的な実施法に従う固相合成または液相合成により、本明細書で言及されるエピトープおよび他の遊離ペプチドを調製することができ、また、確立された手順に従い、これらを単離し、また場合によって精製しうることも理解されるであろう。
【０１６８】
これらのエピトープ内における特定のアミノ酸を置換しても、該エピトープに対する免疫反応性には影響しないことが、当業者には明らかである。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、およびこれらのすべての組合せは、このエピトープに対して作製された抗体の感受性を変化させる可能性が低い。したがって、ミスフォールド特異的タンパク質を同定する目的で、上記に列挙したエピトープに対して反応性である抗体を生成することが可能なすべてのエピトープは、本発明の態様である。
【０１６９】
場合によっては、エピトープ内に存在するアミノ酸を誘導体化して、ミスフォールド形態に対してより頑健な免疫反応、またはより選択的な反応性を得ることが望ましい。例えば、ＳＯＤ１に由来するエピトープであるＦＧＤＮＴＡＧＣＴＳＡ（配列番号３２）は、ＳＯＤ１がミスフォールディングすると、酸化により、システインスルフィン酸またはシステインスルホン酸（システイン酸）へと誘導体化されうるシステインを含有する。したがって、例えば、システインの代わりにシステイン酸残基を含有する遊離ペプチドに対する抗体は、該タンパク質のミスフォールド形態に対して、潜在的により特異的である。一般に、本明細書で説明する方法に従い同定され、また、それらの構成要素であるアミノ酸の誘導体を含有する候補エピトープは、本発明の態様である。
【０１７０】
プロリンを含有するエピトープの場合、ｃｉｓ立体構成またはｔｒａｎｓ立体構成に固定されるプロリン類似体を含有する抗原ペプチドを調製することが望ましい場合がある。このような類似体は、既に説明されている（Ｓｃｈｅｒａｇａら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１２１巻（４９号）、１１５５８頁（１９９９年）；  Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｏｒｇ
Ｃｈｅｍ、６８巻（６号）、２３４３頁（２００２年））。ｃｉｓアミド結合による立体異性体と、ｔｒａｎｓアミド結合による立体異性体とで極めて大きなエネルギー差が存在する他のアミノ酸と異なり、構造化されないペプチド内におけるプロリンは、比較的急速な時間スケールにおける、ｃｉｓ形態とｔｒａｎｓ形態との相互転換が可能である。プロリンがフォールドタンパク質内へと組み込まれる場合、立体相互作用により、それは、２つの可能な立体構造体のうちの一方だけに固定されるが、アンフォールディング時において、それは、自由にラセミ体化する。天然構造において存在する立体化学反応性とは反対の立体化学反応性を示すプロリン類似体を組み込むペプチドに対する抗体を作製することにより、アンフォールド状態に対する抗体の選択性がはるかに上昇する。したがって、本方法により予測され、プロリンのｃｉｓ類似体またはｔｒａｎｓ類似体を組み込むエピトープペプチドは、本発明の態様である。
【０１７１】
したがって、上記の表１において例示した、本発明の方法により予測されるエピトープは、少なくとも３つの連続する残基を含み、最大２０以上の残基を含むことが理解されるであろう。エピトープ内の残基は、親抗体内においてそれ自体として表わされる場合もあり、１つ、２つ、または３つの残基が、該親タンパク質内では見出されない残基により置換されている、その変異体の場合もある。置換アミノ酸は、ＩｌｅまたはＶａｌによるＬｅｕの置換など、保存的アミノ酸置換の場合もあり、酸化形態、ニトロ化形態、もしくはカルボキシル化形態など、元のアミノ酸の化学改変形態、または特定の光学異性代替物の場合もある。
【０１７２】
したがって、表１を具体的に参照すると、本発明のエピトープの実施形態には、７残基より長いペプチドは、残基数を７まで減少させるのに有効な任意の数の残基だけ短縮し、７残基より短いペプチドは、親タンパク質内に存在する、これを挟み込む残基を包含するように伸長させた変異体と、別のアミノ酸により１つ、２つ、または３つの残基が置換された類似体とが含まれる。
【０１７３】
例えば、表１に列挙したペプチドに対する、それらの短縮形態または伸長形態において有用なエピトープを同定するため、厳密性をより高いレベルまたはより低いレベルに設定し、これにより、特定のエピトープを構成するペプチドを指定する場合に適用される基準を緩和または強化して、エピトープ予測法を適用または再適用することができる。
【０１７４】
エピトープを構成するアミノ酸配列を含むペプチドは、選択された抗体生成宿主内において抗体を作製するのに必要な免疫原性を、それら自体が付与されている場合は、それらに特異的に結合する抗体を作製するのに、それら自体有用でありうる。このような免疫原性を欠くエピトープの場合、該エピトープ配列を含有する免疫原を供給することが望ましい。本明細書で用いられる「免疫原」とは、該エピトープを含むペプチドまたは他の分子の免疫原性形態を指し、それ自体で免疫原性である場合に該ペプチド自体により表わされるか、または、免疫原性増強剤と組み合わせたペプチドにより表わされる。任意の確立された薬剤をこの目的で用いることができる。これらの薬剤には、アミド結合を介するなど直接的に、あるいはカルボジイミドなどの化学リンカー、システイン、または、グリシンもしくはＧｌｙ４−Ｓを含めたグリシン−セリン配列など、任意のペプチドスペーサー配列を介して間接的にエピトープに連結させうる担体タンパク質が含まれることが典型的である。例えば、所与のエピトープを含む単離ペプチドは、ＭＡＰ抗原にコンジュゲートさせることもでき、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートさせることもできる。そのサイズが大きいために、ＫＬＨは極めて免疫原性であり、また、コンジュゲーションに用いうるリシン残基の数が多いため、ＫＬＨは、ポリペプチドに結合させるのに極めて有用である。エピトープに対応するペプチドは、同じペプチドまたは異なるエピトープに対応する、同じであるかまたは異なるペプチドの別のコピーに、該ペプチドを繰り返し連結するのに有効なリンカーをさらに含みうる。別の実施形態において、ペプチドは、その免疫原性または溶解性を増強する付加的アミノ酸を含みうる。一実施形態において、付加的アミノ酸の数は、１〜約１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜５である。付加的残基は、ペプチドの立体構造に物質的な影響を及ぼさないことが重要である。
【０１７５】
したがって、それ自体免疫原性でなく、また、免疫原を構成しないエピトープも免疫原とすることができ、また、それらとコンジュゲートさせるか、または共有結合させた、免疫性増強剤を組み込むことにより、免疫原として提供することができる。
【０１７６】
選択された宿主内において抗体を作製する目的で、免疫原を適切な媒体と組み合わせることにより、免疫原を含む組成物を調製することができる。このような媒体には、フロイントの完全アジュバント、または適切な生理食塩液もしくはリン酸緩衝生理食塩液（０．０５〜１．０％）が含まれる。
【０１７７】
次いで、これらのエピトープが構造化されない状態にある場合に、これらに対して反応する抗体を調製する。言及した通り、各ペプチドをＫＬＨなどの担体タンパク質にコンジュゲートさせて免疫原を形成し、これを、場合によって、フロイントの完全アジュバントなどのアジュバントと組み合わせて、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギなど、哺乳動物の生成宿主内へと注入し、該ペプチドに対する抗体を生成する免疫反応を惹起する。標準的な免疫化プロトコールを用いることができ、本明細書で例示する通り、免疫化剤に対して濃縮することにより、血液から抗体を回収することができる。
【０１７８】
ミスフォールディング特異的エピトープに選択的に結合する抗体は、ＩｇＧクラスまたはＩｇＭクラスのポリクローナル抗体の場合もあり、モノクローナル抗体の場合もあり、また、任意の哺乳動物、特に、ヤギ、ウサギ、またはマウスに由来する場合もあり、組換え法による場合もある。より一般的に、本発明において有用な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、また、キメラ抗体、ヒト化抗体のほか、完全ヒト抗体を含めた組換え抗体を含め、各種の完全形態が含まれる。キメラ抗体は、特定の種に由来する抗体内における対応する配列と相同であるか、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する重鎖および／もしくは軽鎖の一部を含む一方で、該（１または複数の）鎖の残余部分は、別の種に由来する対応する配列と相同であるか、または異なる抗体クラスに属する。ヒト化抗体は、非ヒト抗体に由来する最小限の配列を含むキメラ抗体であり、通常、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、ヒト抗体フレームワーク内へと組込み、これを、抗原結合を保持および増強する非ヒト残基を組み込むようにさらに改変することができる。「完全」ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーの使用を介することを含め、現在確立されている各種の技法を用いて、また特に、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウスなど、トランスジェニック動物内へと導入することにより、非ヒト宿主内において作製することができる。感作すると、遺伝子再配置、遺伝子アセンブリー、および抗体レパートリーの使用を介することを含め、ヒトにおいて見られる抗体に多くの点で酷似するヒト抗体が作製される。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含めた任意の有用なクラスであることが可能であり、また、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含めたアイソタイプでありうる。エフェクター機能の改変をもたらし、これにより、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を増強するように、抗体の定常領域（Ｆｃ）もまた操作するか、またはこれにコンジュゲートさせることができる。
【０１７９】
好ましい実施形態において、抗体は、標的エピトープを構成する配列に選択的に結合する。選択的結合剤とは、それらが異なる、非関連のエピトープに結合する場合のアフィニティーより少なくとも１桁大きい（例えば、少なくとも２、３、４、または５桁大きい）アフィニティーで標的エピトープに結合し、また、溶媒に露出する配向性において該標的エピトープを提示するタンパク質に結合する薬剤である。例えば、癌細胞上におけるＥＧＦＲに結合する抗体の結合アフィニティーは、正常組織上におけるＥＧＦＲに対するその結合アフィニティーより、少なくとも１桁大きいことが好ましい。当技術分野ではこの目的で十分に確立されていることが一般的なアッセイおよび技法に基づき、相対的結合アフィニティーを決定することができ、また、このようにして抗体を選択することができる。
【０１８０】
一部の適用において、抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’  断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片を含め、これらもまた標的エピトープに結合するその断片により、または、抗体断片から形成される、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および多重特異性抗体により置換しうることが理解されるであろう。Ｆｃ領域を組み込む抗体断片はまた、エフェクター機能の改変を提供し、これにより、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を増強するように操作するか、またはこれにコンジュゲートさせることができる。
【０１８１】
タンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する抗体は、ハイスループット法を用いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）または標的エピトープに結合する他の配列を同定する、ファージディスプレイシステムおよび他のシステムの適用を介するなど、免疫化以外の技法により作製しうることもまた理解されるであろう。結果として得られる抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて初めて作製されたということは本質的でない。
【０１８２】
実施形態において、抗体は、配列番号１〜４、６、８〜２６、２８〜３６、４１〜７５、および７７〜８０で示されるエピトープを提示するミスフォールドタンパク質に選択的に結合する抗体である。
【０１８３】
エピトープ予測法を用いて同定されるエピトープに結合する、ミスフォールド特異的抗体を用いると、タンパク質ミスフォールディング病および癌における診断的有用性および治療的有用性が潜在的に大きい。ＣＪＤ、ＢＳＥ、ＧＳＳ、ＦＦＩ、クールー病、ＡＬＳ、アレクサンダー病、家族性アミロイド性多発性神経障害、老人性全身性アミロイドーシス、およびミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｉｎ）アミロイドーシスを含めたタンパク質ミスフォールディング病の場合、それら各々の１または複数の原因タンパク質に対するミスフォールディング特異的抗体により、患者試料におけるミスフォールドタンパク質を同定することにより該疾患の診断を施し、また、さらなるミスフォールディングを選択的に阻害し、ミスフォールディングしたタンパク質複合体を免疫的に標的化して破壊することにより毒性が最小限の治療を施す。白血病、骨髄腫、および腺癌を含めた癌の場合、組織標本に対してミスフォールド特異的抗体を適用することにより、癌性細胞の表面上において選択的に存在するミスフォールドタンパク質の存在または不在を判定する。こうして、それらの表面上においてミスフォールドタンパク質を実際に発現する癌は、該ミスフォールドタンパク質に対して抗体を注入することによる治療を受けやすい。本発明は、それらのエピトープがエピトープ予測法により同定される、ミスフォールドタンパク質を認識する抗体を組み込むことにより、タンパク質ミスフォールディング病または癌のための診断検査および治療手順を、それ自体製品として提供する。
【０１８４】
より具体的に述べると、本発明は、診断用もしくは治療用のエピトープ、またはそれらにより作製されたミスフォールディング特異的抗体の使用を提供する。
【０１８５】
治療的使用の場合、エピトープまたはそれらに選択的に結合する抗体を用いて、該エピトープがそれに対して固有であるタンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示すか、またはそのリスクを有する、患者または被験体を処置することができる。「治療する」、「治療」、「治療すること」、「治療的使用」、または「治療レジメン」という用語は、本発明による組成物を投与する場合の予防的様態、緩和的様態、および治療的様態を包含し、また、炎症に基づく病態、感染性疾患、アレルギー反応、免疫亢進反応、または治療される他の症状を含め、タンパク質のミスフォールド形態により直接的もしくは間接的に引き起こされるか、またはこれと直接的もしくは間接的に関連する、疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ）、状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、症状、徴候、または障害を改善するか、あるいはこれと関連する症状、徴候、状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、または障害の進行を防止するか、阻害するか、遅延させるか、または可逆化する、本製品の任意およびすべての使用を包含する。
【０１８６】
「被験体」または「患者」という用語は一般に、ヒトおよび他の霊長動物、ネコ、イヌ、げっ歯動物、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、アメリカアカシカ、または他の有蹄動物、ヤギ、家禽などが含まれるがこれらに限定されない愛玩動物、動物園動物、および農場動物を含めた、哺乳動物および他の動物を指す。被験体は、所与のミスフォールドタンパク質標的と関連する疾患または障害を予測、評価、または診断するために検査を受ける被験体、またはこのために検査を受けた被験体を包含する。被験体は、現在臨床的に実施されている方法など、他の方法を用いて既に評価または診断されている場合もあり、一般的集団の一部（対照の被験体）として選択される場合もある。被験体は、とりわけミスフォールド形態にある標的タンパク質を生成するか、またはその発現を欠いているトランスジェニック動物、例えば、マウス（例えば、「ノックアウト」マウス）などのげっ歯動物でありうる。例えば、被験体は、標的タンパク質の正常形態を過剰発現するトランスジェニックマウスの場合もあり、該標的タンパク質のミスフォールド形態を感染させた野生型のマウスまたはハムスターの場合もある。
【０１８７】
治療するには、能動的免疫化に用いられる免疫原、また、受動的免疫化に用いられる抗体などの有効成分を「有効量」で用いる。これらは、治療レジメンにおいて、内因性のミスフォールドタンパク質の影響を低減するのに有用な量である。本発明が、多種多様な疾患に適用可能であり、また、内因性タンパク質の影響を低減するのに有効な特定の量および特定の治療レジメンが、各疾患について確立された臨床的実施法に従い、各疾患に応じて変化することは明らかであろう。
【０１８８】
一実施形態において、本発明は、タンパク質のミスフォールド形態と関連する疾患を示す被験体を処置するように、該タンパク質のそのミスフォールド形態に固有のエピトープの任意の免疫原性形態を含むワクチンを治療用に提供する。治療するには、毎日１回〜毎週１回、毎月１回、毎年１回、１０年ごとに１回の範囲で変化しうるスケジュールで被験体を免疫化する。典型的なレジメンには、免疫化の後、６週間ごとの間隔で追加投与の注射を行う。別のレジメンは、免疫化の後、１、２、および１２カ月後に追加投与の注射を行う。代替的に、追加投与の注射は、被験体の免疫反応および生理学的状態に応じて変化する。免疫化するには、治療１回当たり約０．０００１マイクログラム〜１０グラム、約０．０１マイクログラム〜約１グラム、約１マイクログラム〜約１ｍｇ、および約１００〜２５０マイクログラムの範囲の用量で、エピトープを含有する免疫原を投与することができる。一実施形態において、治療を投与する時期は、以下：０カ月後、２カ月後、６カ月後、９カ月後、および／または１２カ月後のうちの１または複数である。１つのレジメンにおいて、投与は、最初の免疫化の２、６、９、および１２カ月後である。別のレジメンにおいて、投与は、最初の免疫化の２および４週間後であり、次いで、その後は毎月である。代替的なレジメンにおいて、投与は、被験体の生理学的状態、および／または以前の免疫化に対する被験体の応答に応じて変化する。投与経路には、場合によって、筋肉内注射および腹腔内注射が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、組成物は、三角筋内へと注射される。
【０１８９】
ワクチン組成物はそれ自体、アジュバントをさらに含みうる。非経口免疫化のためのアジュバントには、アルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびヒドロキシリン酸アルミニウムなど）が含まれる。標準的なプロトコールに従い、抗原を、アルミニウム化合物により沈殿させることもでき、これに吸着させることもできる。非経口投与では、ＲＩＢＩ（マサチューセッツ州、ハミルトン、ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ社製）など、他のアジュバントも用いることができる。
【０１９０】
本発明の実施形態において、疾患の治療において有用なワクチンには、以下：
ａ）ＣＪＤまたは関連のプリオン病に罹患した被験体を処置するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、また特に、３、４、６、７、８、９、または１０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｂ）ＢＳＥまたは関連のプリオン病のリスクを有する被験体、特に畜牛における予防のための、配列番号１１、１２、１３、１４、または１５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｃ）家族性アミロイド性多発性神経障害もしくは老人性全身性アミロイドーシス、またはミスフォールドＴＴＲの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｄ）β２ミクログロブリンアミロイド沈着物の腎臓での蓄積、またはミスフォールドβ２ミクログロブリンの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２３、２４、２５、または２６により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｅ）筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはミスフォールドＳＯＤ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、また特に、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、および３６により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｆ）白血病もしくは骨髄腫、またはミスフォールドＣＤ３８の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｇ）結腸癌転移またはミスフォールドＣＤ４４の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４６、４７、４８、４９、または５０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｈ）Ｆａｓ受容体が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号５１、５２、５３、５４、または５５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｉ）子宮頚癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、肺癌および乳癌、胸膜中皮腫、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫を含めた癌、または特定の急性骨髄性白血病およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病を含めた、ミスフォールドＮＯＴＣＨ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号５６、５７、５８、５９、または６０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｊ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号６１、６２、６３、６４、または６５により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと；
ｋ）ミスフォールドＥＧＦＲが関与する特定の癌および関連障害に罹患した被験体を処置するための、配列番号７６を除外するという任意選択の条件で、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０により指定されるエピトープを含む免疫原を組み込むワクチンと
が含まれる。
【０１９１】
上記で言及したワクチンは、上記で指定したエピトープの代わりに、１、２、または３カ所のアミノ酸付加、アミノ酸置換、またはアミノ酸欠失を組み込むその変異体を含みうることが理解されるであろう。特に、エピトープは、６つ、７つ、または８つのアミノ酸、好ましくは７つのアミノ酸からなるように短縮するかまたは伸長させ、また、例えば、アミノ酸が、その酸化形態またはその光学異性代替物により置換される、最大２カ所であり、通常１カ所のアミノ酸置換を組み込む変異体でありうる。
【０１９２】
このようなワクチンに加え、本発明は、所与のミスフォールドタンパク質の存在が関連する状態／疾患を含め、上記で言及した状態を示す被験体の治療における抗体の治療的使用を提供する。治療するには、標的エピトープに選択的に結合する抗体を、抗体および薬学的に許容される担体を剤形中に含む医薬組成物として投与する。
【０１９３】
剤形は、場合によって、液体の剤形である。抗体溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と混合することが適切な水中において調製することができる。グリセロール、液体のポリエチレングリコール、アルコールを伴うかまたは伴わないＤＭＳＯおよびその混合物中、また、油中における分散液もまた調製することができる。通常の保管条件下および使用条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する防腐剤を含有する。適切な製剤を選択および調製するための従来の手順および成分については、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（２００３年、第２０版）；および「Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：    Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ」（ＵＳＰ  ２４
ＮＦ１９）、１９９９年刊行において説明されている。製剤は、場合によって、緩衝剤、抗酸化剤、安定化剤、担体、希釈剤、およびｐＨ調節剤が含まれるがこれらに限定されない賦形剤を含有する。注射用に適する医薬形態には、水性の滅菌溶液または滅菌分散液、および滅菌注射液または滅菌分散液を即席で調製するための滅菌粉末が含まれる。
【０１９４】
治療において、抗体の用量は、場合によって、被験体の体重当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、および約１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の実施形態において、用量は、被験体の体重当たり約１００ｍｇ／ｋｇ〜約５ｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、および約７５０ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｇ／ｋｇの範囲である。
【０１９５】
本発明による抗体の治療的使用は、細胞または体液が、該抗体により標的とされるエピトープを提示する疾患、すなわち、ミスフォールディングした標的タンパク質が存在する疾患を示す被験体へと、注射または注入により抗体を投与することを伴う。以下で論じる通り、抗体により標的とされるエピトープを提示する細胞を同定する組織試料または体液の検討と併せて、それらの臨床症状により、治療から利益を得る被験体を同定することができる。
【０１９６】
本発明の実施形態において、疾患を治療するのに有用な抗体組成物には、以下：
ａ）ＣＪＤまたは関連のプリオン病に罹患した被験体を処置するための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、また特に、３、４、６、７、８、９、または１０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｂ）家族性アミロイド性多発性神経障害もしくは老人性全身性アミロイドーシス、またはミスフォールドＴＴＲの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｃ）β２ミクログロブリンアミロイド沈着物の腎臓での蓄積、またはミスフォールドβ２ミクログロブリンの存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２３、２４、２５、または２６により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｄ）筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはミスフォールドＳＯＤ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、また特に、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、および３６により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｅ）白血病もしくは骨髄腫、またはミスフォールドＣＤ３８の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４１、４２、４３、４４、または４５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｆ）結腸癌転移またはミスフォールドＣＤ４４の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号４６、４７、４８、４９、または５０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｇ）Ｆａｓ受容体が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号５１、５２、５３、５４、または５５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｈ）子宮頚癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、肺癌および乳癌、胸膜中皮腫、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞非ホジキンリンパ腫を含めた癌、または特定の急性骨髄性白血病およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病を含めた、ミスフォールドＮＯＴＣＨ１の存在と関連する疾患に罹患した被験体を処置するための、配列番号５６、５７、５８、５９、または６０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｉ）Ｆａｓ受容体の活性化が関与する癌に罹患した被験体を処置するための、配列番号６１、６２、６３、６４、または６５により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と；
ｊ）ミスフォールドＥＧＦＲが関与する特定の癌および関連障害に罹患した被験体を処置するための、配列番号７６を除外するという任意選択の条件で、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０により指定されるエピトープに選択的に結合する抗体と
を組み込む組成物が含まれる。
【０１９７】
上記で言及した抗体組成物は、抗体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である抗体を含むことが可能であり、また、完全なＦｃ領域または機能的に同等なその変異体により付与される活性エフェクター機能を含むことが望ましいことが理解されるであろう。
【０１９８】
本発明の抗体組成物またはワクチン組成物による治療の候補者である被験体を同定する一助とするため、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける診断法によるエピトープの検出をさらに提供する。
【０１９９】
所与の任意の試料中におけるミスフォールドタンパク質の存在を検出するため、本発明は、該ミスフォールドタンパク質を含有することが疑われる試料を、そのタンパク質の天然フォールド形態と比べて、該ミスフォールドタンパク質により固有に提示されるエピトープに選択的に結合する抗体または結合断片により処理し、抗原：抗体複合体が形成されたかどうかを判定し、その形成により、試料中における、前記タンパク質のミスフォールド形態の存在が示される検出法を提供する。一実施形態において、エピトープは、本エピトープ予測法を適用することにより同定されたエピトープである。別の実施形態において、エピトープは、配列番号１〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチドであるエピトープであるか、または配列番号１〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチド内に含まれるエピトープである。さらなる実施形態において、抗体は、それが配列番号１、５、７、２７、３０、３７〜４０、または７６ではないという条件で、配列番号１〜８０のうちのいずれか１つを有するペプチドに選択的に結合する抗体である。
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて適用される場合、検出法は、被験体、通常はミスフォールディングした内因性の標的タンパク質を有することが疑われる被験体に由来する体液試料もしくは組織試料、または内臓試料の解析を伴う。例えば、生物学的試料は、脳脊髄液、血液、血漿、リンパ液、血清、尿、または唾液などの体液でありうる。固体または半固体の組織または内臓から得られる試料などの組織試料または内臓試料は、消化するか、抽出するか、または他の形で液体形態にすることができる（このような組織または内臓の例には、それらの癌性形態を含めた、培養細胞、血液細胞、脳、神経組織、皮膚、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、ランゲルハンス島、骨髄、血液、血管、心弁、肺、小腸、大腸、脾臓、膀胱、陰茎、顔面、手掌、骨、筋肉、脂肪、角膜などが含まれる）。１または複数の生物学的試料は、被験体が、タンパク質のミスフォールディングと関連する疾患または障害を有すると診断されるか、またはこれを有することが疑われる以前、その疾患または障害の症状を治療または改善するための治療レジメン期間、被験体の死後（死因または推定死因を問わない）を含めた、任意の適切な時点において、該被験体から採取することができる。代替的に、生物学的試料は、一元化された血液供給機構または血液供給機関に委託された場合の血液、血漿、または血小板など、提供された体液または組織を含みうる。代替的に、生物学的試料は、例えば、食肉処理場における屠殺時に採取された、食用動物に由来する食肉、血液、または組織を含みうる。
【０２０１】
抗体が、検出可能な抗原：抗体複合体を形成すれば、試料中においてミスフォールディングした標的タンパク質の存在が確認される。このような複合体の形成は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、免疫組織化学などを含めた、多種多様なプロトコールを用いて判定することができる。該複合体、またこれにより、試料中におけるエピトープの存在を明らかにするために、目視または測定器の補助により検出可能な薬剤にコンジュゲートさせるかまたは連結することにより、抗体を、標識化抗体として提供することが望ましい。該薬剤または標識は、直接的または間接的に検出可能なシグナルをもたらすことが可能である。例えば、標識は、放射線不透過性物質、もしくは３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどの放射性同位体；イソチオシアン酸フルオレセイン、ロダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光（フルオロフォア）化合物もしくは化学発光（発色団）化合物；アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素；イメージング剤；または金属イオンでありうる。代替的に、エピトープ抗体に結合して、エピトープの存在を間接的に明らかにする標識化抗体など、エピトープ抗体に結合する二次的な標識化試薬を用いて、エピトープを明らかにすることもできる。抗体：抗原複合体の存在は、該２つの試薬が溶液中に存在することを必要としない間接的な手段により検出することができる。例えば、抗体が、完全細胞の表面上に存在するエピトープに結合し、これと共に抗体：抗原複合体を形成するフローサイトメトリーを用いると、該複合体が間接的に検出できる。エピトープの細胞表面形態を検出するために抗体を適用することは、特に、このようなエピトープを提示する癌細胞を検出するのに極めて有用な、本発明の実施形態である。癌細胞を含めたこのような細胞の検出は、十分に確立されたフローサイトメトリー法を用いて達成することができる。抗原：抗体複合体はまた、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析など、サイズ、電荷、および移動性に基づきタンパク質を分類する方法を含めた、抗体ベースではない方法によっても同定しうることもまた理解されるであろう。
【０２０２】
関連の実施形態では、本発明の標識化抗体、またはその結合断片の標識化形態をｉｎ  ｖｉｖｏで用いて、該抗体が結合するミスフォールドタンパク質の存在を画像化することができる。この目的で、本発明は、テクネシウム、ガドリニウムなどの同位体など、ｉｎ
ｖｉｖｏにおける画像化に有用な薬剤に連結した形態にある抗体または断片を提供する。
【０２０３】
本発明はまた、本発明の診断法および治療法を実施するのに有用な構成要素を含む製品ならびにキットも包含する。製品は、包装材料と、タンパク質の天然フォールド形態と比べて、そのタンパク質のミスフォールド形態に固有のエピトープに選択的に結合する抗体または抗血清を含む組成物とを含む。組成物は、生理学的または薬学的に許容される賦形剤を包含し、包装材料は、該組成物の有効成分（例えば、抗血清または抗体）を表示するラベルを包含しうる。ラベルは、例えば、本明細書に記載のキットと共に用いられる診断用試薬としての、組成物の用途をさらに包含しうる。
【０２０４】
包装材料と、本明細書に記載のペプチドまたは１もしくは複数のペプチドを含む組成物とを含む製品もまた提供される。組成物は、生理学的または薬学的に許容される賦形剤を包含し、包装材料は、該組成物の有効成分（例えば、ペプチド）を表示するラベルを包含しうる。ラベルは、例えば、治療的試薬もしくは予防的試薬としての、または本明細書に記載のキットと共に用いられる、哺乳動物のＰｒＰＳｃに対して特異的な抗血清もしくは抗体を生成する目的で、被験体において免疫反応を誘導する組成物としての組成物の用途をさらに包含しうる。
【０２０５】
さらなる実施形態では、ミスフォールドタンパク質を同定するための抗体を作製またはスクリーニングするための化合物または組成物の使用についての指示書と共に、本明細書に記載の１または複数のペプチドを含む組成物を含むキットが提供される。キットは、ＰｒＰＳｃ特異的抗体またはＰｒＰＳｃ特異的抗血清の作製および／または同定に有用でありえ、指示書は、例えば、投与濃度、投与間隔、好ましい投与方法、免疫学的スクリーニングまたは免疫学的検査のための方法などを包含しうる。
【０２０６】
別の実施形態では、その使用についての指示書と共に、本明細書に記載の１または複数のペプチドを含む組成物を含む医薬を調製するためのキットが提供される。指示書は、それが投与される被験体において、治療的免疫反応または予防的免疫反応を誘導するのに有用な医薬を調製するための一連のステップを含みうる。キットは、タンパク質のミスフォールディングと関連するか、またはタンパク質のミスフォールディングが関与する、疾患または障害の１または複数の症状を治療、予防、または改善するための処置における医薬の使用についての指示書をさらに含む場合があり、また、例えば、投与濃度、投与間隔、好ましい投与方法などをさらに包含しうる。
【０２０７】
別の実施形態では、タンパク質のミスフォールディングと関連する疾患または障害を診断するためのキットが提供される。キットは、その使用についての指示書と共に、本明細書に記載の１または複数のミスフォールドタンパク質に対して選択的な抗体または抗血清を含む。抗体は、検出用試薬にさらに連結されうる。検出用試薬の例には、抗マウス抗体、抗ウサギ抗体などの二次抗体が含まれる。このような二次抗体は、適切な基質と共に供給されると検出可能な熱量測定反応または化学発光反応をもたらす酵素と連結されうる。キットは、プロテイナーゼＫなどの酵素、ブロッキング緩衝液、ホモジナイゼーション緩衝液、抽出緩衝液、希釈緩衝液などを含め、検出反応を実施するための試薬をさらに含みうる。
【０２０８】
別の実施形態では、生物学的試料中におけるミスフォールドタンパク質の存在を検出するためのキットが提供される。キットは、その使用についての指示書と共に、ミスフォールドタンパク質に特異的に結合する、１または複数の抗体または抗血清を含む。抗体は、検出用試薬にさらに連結されうる。検出用試薬の例には、抗マウス抗体、抗ウサギ抗体などの二次抗体が含まれる。このような二次抗体は、適切な基質と共に供給されると検出可能な熱量測定反応または化学発光反応をもたらす酵素と連結されうる。キットは、プロテイナーゼＫなどの酵素、ブロッキング緩衝液、ホモジナイゼーション緩衝液、抽出緩衝液、希釈緩衝液などを含め、検出反応を実施するための試薬をさらに含みうる。
【実施例】
【０２０９】
（実施例１）
ｈＳＯＤ１
ＷＯ２００７／０９８６０７で説明される通り、Ｃａｓｈｍａｎらは、本エピトープ予測法により、アンフォールディングする傾向を有するｈＳＯＤ１エピトープを構成するものとして本質的に予測される領域である、ｈＳＯＤ１の３５〜４５領域に対してもたらされるｈＳＯＤ１抗体の作製について教示している。予測される３５〜４１の配列は、本質的に、公表されている抗体により標的とされる３５〜４５領域の短縮形である。この特許出願で公表されている抗体の作製および試験作業を以下で再現する。
【０２１０】
抗体の作製には、まず、フロイントの完全アジュバント中において、Ｎ末端に付加したシステインとジスルフィド結合を形成することによりＫＬＨへと連結された、ペプチドＣ−ＩＫＧＬＴＥＧＬＨＧＦ（配列番号８９；ｈＳＯＤ１の残基３５〜４５に対応する）を含む、２５μｇの免疫原を伴う腹腔内注射により、４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。その後、フロイントの不完全アジュバントと共に、３週間の間隔をあけて、上記の通りに４回の追加投与を行った。ＥＬＩＳＡにより決定される血清力価が、前免疫化血清試料の１０倍を超えて上昇した場合は、最も高度に反応したマウス２匹各々の静脈内に、１００μｌの滅菌ＰＢＳ  ｐＨ７．４中において１０μｇずつのタンパク質抗原を追加投与した。３日後、ドナーマウスを屠殺し、脾臓細胞を収集しプールした。ハイブリドーマのワンステップ選択およびクローニングを、Ｃｌｏｎｅ  ＥＺ培地中において実施したことを除き、ＳＰ２／０  ＢＡＬＢ／ｃ親骨髄腫細胞との脾臓細胞の融合は、上記の実施例１において既に説明されている通りに実施した。この半固体培地により、単一のステップにおけるＨＡＴ選択およびクローニングが可能となり、また、増殖の速い、おそらくは望ましくないハイブリドーマの増殖が、増殖の遅い、望ましいクーロンの増殖を凌駕することがなくなる。融合の１１日後にクローンを採取し、９６ウェル組織培養プレートウェル内において、２０％のウシ胎仔血清を含有する、２００μｌのＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に再懸濁させた。４日後、間接的ＥＬＩＳＡにより、１μｇ／ウェルのタンパク質抗原によりコーティングされたプレート上における抗体活性について上清をスクリーニングした。
【０２１１】
ＥＬＩＳＡの条件：
スクリーニングおよび試験についての条件：ｄＨ２Ｏ中１μｇ／ウェルのＨＳＯＤ１−ＢＳＡ抗原をプレート上へとコーティングし、３７℃で一晩にわたり乾燥させた。
【０２１２】
陰性対照抗原に対する試験についての条件：５０μＬ／ウェルのｄＨ２Ｏ中０．５μｇ／ウェルのＨＴ（ヒトトランスフェリン）抗原をプレート上へとコーティングし、３７℃で一晩にわたり乾燥させた。
【０２１３】
ブロッキング：１００μＬ／ウェルのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中３％のスキムミルク粉末によりプレートをブロッキングし、室温で１時間にわたりインキュベートした。
【０２１４】
一次抗体：マウス抗ＨＳＯＤ１ハイブリドーマの組織培養物上清、およびマウスモノクローナル抗体対照を、ウェル当たりそのまま１００μＬずつ添加し、スクリーニングおよび試験を行った。マウス抗ＤＳＥ−１ａ免疫血清と、ＳＰ２／０組織培養物上清中において１／８００に希釈したマウス前免疫化血清とを１００μＬ／ウェルずつ添加し、振とうしながら、室温で１時間にわたりインキュベートした。
【０２１５】
スクリーニングおよび試験に用いた二次抗体：ＨＲＰをコンジュゲートさせた１／１００００のヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃを用いた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．４）中において二次抗体を希釈し、１００μＬ／ウェルで添加し、振とうしながら、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。
【０２１６】
基質：ＴＭＢ緩衝液（ＢｉｏＦｘ社製；型番ＴＭＢＷ−１０００−０１）を、ウェル当たり５０μＬずつ添加し、暗所中室温でインキュベートした。１５分後に、ウェル当たり５０μＬずつの１Ｍ  ＨＣｌにより反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍでリーディングを行った。
【０２１７】
表２は、配列番号３０のエピトープＩＫＧＬＴＥＧの伸長体である、ｈＳＯＤ１エピトープ（ＩＫＧＬＴＥＧＬＨＧＦ；配列番号８９）を指向する抗体のためのハイブリドーマクローンに対するＥＬＩＳＡスクリーニングを示す。該ハイブリドーマクローンのうちのいくつかにより生成される抗体は、該エピトープに対応するペプチドに対して高度に特異的であり、対照抗原であるＨＴ（ヒトトランスフェリン）を検出可能な形で認識することはなかった。これらの結果は、ＳＯＤ１のミスフォールド形態上において選択的に提示されるか、または結合可能であるものとして同定されるエピトープに対応するペプチドに対して、モノクローナル抗体を作製しうることを示す。
【０２１８】
【表２】
2014167025.tif 000025
（実施例２）
ＥＧＦＲ
本明細書の表１で言及した通り、ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）の構造に本エピトープ予測法を適用することにより、アンフォールディングする傾向を有するエピトープが残基２８８〜３０１に常在し、ペプチド配列ＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫ（配列番号７６）を有することが示される。ＥＧＦＲ自体は、市販されている（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）として市販されているセツキシマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）として市販されているパニツムマブ）か、または臨床開発中である（ニモツズマブ）、各種の抗体により治療的介入の標的とされるタンパク質である。これらの抗体は、頭頚部の充実性腫瘍のほか、小児性神経膠腫を含めた、各種の充実性腫瘍を治療するのに有効である。ニモツズマブを例外として、ＥＧＦＲを標的とする抗体は、ケラチノサイトとのそれらの相互作用と特に関連する、著明な毒性をもたらす（腫瘍増殖の静止または退縮において改善が示されうる一方、レシピエントは、重篤な発疹を含めた各種の皮膚障害を示す）。これは、該抗体が、癌細胞により提示されるＥＧＦＲだけでなく、皮膚細胞および他の細胞により提示されるＥＧＦＲにも非選択的に結合することから生じる。本エピトープ予測法を適用することにより、他の細胞と比べて癌細胞に固有のエピトープを同定することは、疾患細胞に対して選択的なＥＧＦＲ標的化薬を開発するのに極めて有用でありうる。
【０２１９】
本エピトープ予測法が、そのミスフォールド状態にあるＥＧＦＲに結合する有用な標的を予測する能力は、上記で言及したペプチド２８８〜３０１と実質的に同じ配列を有するペプチドに対する抗体を作製することにより裏付けられている。特に、Ｇａｒｒｅｔｔら（ＰＮＡＳ、２００９年、１０６巻（１３号）、５０８２〜５０８７頁（参照により本明細書に組み込まれる））は、残基２８７〜３０２を含む、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン内における短いシステインループに結合する抗体の作製および試験について説明している。言い換えれば、この抗体（ＩｇＧ２ｂであるｍＡｂ８０６）は、本エピトープ予測法により予測される、ＥＧＦＲの領域２８８〜３０１に結合する。Ｇａｒｒｅｔｔらにより示される通り、ｍＡｂ８０６が正常細胞に対して示す結合は無視しうるものであり、ＥＧＦＲを過剰発現および／または活性化した腫瘍細胞に対して示す結合は、実質的により高度のレベルにある。さらに、Ｇａｒｒｅｔｔらによる研究は、前立腺細胞株であるＤＵ１４５に対して調べた場合における、該抗体の殺腫瘍効果を裏付けている。したがって、本発明のエピトープ予測法は、治療的目的で通常標的とされうるエピトープを同定するのに有用であることが理解されるであろう。
【０２２０】
（実施例３）
さらなるＥＧＦＲエピトープ
本エピトープ予測法により、アンフォールディングする傾向を有すると予測されたＥＧＦＲペプチドによりウサギを免疫化し、固有のエピトープ（表１を参照されたい）を提示させた。簡便のため、８つのペプチド、すなわち、配列番号６７、６９、７０、７２、７３、７５、および７８を有するペプチドにより、ウサギＥ１を免疫化した。ウサギＥ２は、７つのペプチド、すなわち、配列番号６６、７１、７４、７６、７７、７９、および８０を有するペプチドにより免疫化した。
【０２２１】
これらのウサギに由来する抗血清を、それらが１つの正常細胞（ＨＵＶＥＣ）および１４の腫瘍細胞に結合する能力について調べた。前免疫化ウサギ血清を、結合についての対照として用いた。アイソタイプの対照抗体と比較される、市販の抗ＥＧＦＲ抗体を用いて、各細胞を、そのＥＧＦＲ発現レベルについても評価した。
【０２２２】
結果を解析したところ、正常細胞（ＨＵＶＥＣ）が発現するＥＧＦＲレベルは低く、ウサギＥ１またはＥ２に由来する抗血清には結合しないことが観察された。被験対象の腫瘍のうちの２つ（ヒトＧＩ間質性結腸癌細胞であるＬＴＬ−２５７、およびヒト子宮頚癌細胞株であるＳｉＨａ）は、ＥＧＦＲを発現するが、ウサギＥ１またはＥ２に由来する抗血清のいずれにも結合しない。被験対象の腫瘍のうちの３つ（マウス神経芽腫細胞株であるＮＳｃ３４、マウス黒色腫細胞株であるＢ１６、およびヒト骨髄細胞株であるＨＬ６０）は、ＥＧＦＲを発現せず、ウサギＥ１またはＥ２に由来する抗血清のいずれにも結合しない。被験対象の腫瘍のうちの６つ（ヒト前立腺癌細胞であるＬＴＬ−２２０ａ、ヒト肺癌細胞であるＬＴＬ−６５７、ヒト結腸腺癌細胞であるＬＴＬ−２８９、ヒト黒色腫細胞であるＬＴＬ−３２３、ヒト膵臓癌細胞であるＬＴＬ−２４９、およびヒト肺癌細胞であるＬＴＬ−６１８）は、ＥＧＦＲを発現し、ウサギＥ１およびＥ２のいずれに由来する抗血清にも結合する。被験対象の腫瘍のうちの３つ（ヒト希突起膠細胞株であるＭｏ３．１３、ヒト卵巣癌細胞であるＬＴＬ−３２１、およびヒトリンパ腫細胞であるＬＴＬ−０１３）は、ＥＧＦＲを発現し、ウサギＥ２に由来する抗血清には結合するが、ウサギＥ１に由来する抗血清には結合しない。
【０２２３】
これらのデータは、ＥＧＦＲが、選択されたヒト腫瘍細胞およびマウス腫瘍細胞の細胞表面においてミスフォールディングするが、正常細胞（ＨＵＶＥＣ）上ではミスフォールディングしないことを示す。被験対象である、免疫化したウサギによる２つの血清との、腫瘍による免疫反応性の差違は、異なる腫瘍の細胞表面において、特定のパターンのＥＧＦＲミスフォールディングが提示されうることを示唆する；これらの差違は、免疫化したウサギから派生するモノクローナル抗体により確認し、特徴づけすることができる。このようにして派生するモノクローナル抗体は、特定の腫瘍の種類に対する診断用試薬として用いることができ、また、該当する腫瘍に対する受動的免疫療法用にヒト化することができる。
【０２２４】
（実施例４）
ヒトＰｒＰ−ＹＹＲ
本エピトープ予測法により、ミスフォールドＰｒＰＣ上においては固有の形で露出するが、天然に構造化されたＰｒＰＣ上では露出しないエピトープは、ペプチドＲＹＹＲＥＮＭＨおよびＱＶＹＹＲＰＶ（それぞれ、配列番号５および７）内に常在することが予測されている。上記で述べた、ＹＹＲと称する３アミノ酸のエピトープが、これらのペプチドの各々の内に常在する。ＰｒＰのＹＹＲエピトープに対する抗体は、Ｃａｓｈｍａｎによる文献（参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，０４１，８０７を参照されたい）中で説明されている。この研究は、以下で再現される。「結果」において言及される通り、ＹＹＲに対する抗体は、疾患によるＰｒＰＣのミスフォールド形態には選択的に結合するが、天然フォールド形態には結合しない。
【０２２５】
ミスフォールドＰｒＰＣにより提示されるが、天然フォールドＰｒＰＣによっては提示されないＹＹＲエピトープに対する抗体を開発するため、アミノ酸配列アセチル−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＮＨ２（ＹＹＲ）を有するペプチドを合成し、ＫＬＨにコンジュゲートさせ、周知の技法を用いてウサギへと筋肉内注射した。該ペプチドのアミノ末端にはシステイン残基を付加して、該ペプチドを、タンパク質担体とコンジュゲートさせた。該ペプチドのアミノ基はアセチル化により保護し、そのカルボキシル基はアミド化により保護した。
【０２２６】
手動または自動（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社製、ＭＰＳ３９６型ペプチド合成器）による固相ペプチド合成法を用いて、ペプチドを合成した。アミノ酸残基の連結は、Ｆｍｏｃ基によるペプチド合成化学反応（Ｆｉｅｌｄｓら、１９９０年、ＩＪＰＰＲ
３５巻、１６１頁）を用いて達成した。合成は、Ｗａｎｇ樹脂またはアミドＲｉｎｋ樹脂上において、アミノ酸側鎖を完全に保護して実施した。アミノ酸のアルファ−ＮＨ２基は、Ｆｍｏｃ基により保護したので、三官能性アミノ酸の側鎖には、以下の保護基：
システイン：５−トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）
アルギニン：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５スルホニル（Ｐｂｆ）
チロシン：ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｔＢｕ）
を選択した。
【０２２７】
連結反応の化学的内容および難度に応じて、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、またはＴＢＴＵを活性化剤として用いた。すべての化学物質は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ社、Ｂａｃｈｅｍ社、およびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から購入した。３〜６倍超過の連結試薬を用いることにより、また、いわゆる二重連結により、配列の残基間における各ペプチド結合の形成を確実なものとした；これは、伸長するペプチド鎖に付加される各アミノ酸について、連結反応が繰り返されたことを意味する。
【０２２８】
合成後、試薬Ｋ：水（２．５％）、ＴＩＳ（２．５％）、ＥＤＴ（２．５％）、ＴＦＡ（９２．５％）を切断用混合物として用いて、ペプチドを樹脂から切断した。次いで、ペプチドを、低温のジエチルエーテルにより沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、ジエチルエーテルにより３回にわたり洗浄し、２０％〜５０％のＡｃＣＮ／水混合物中において溶解させ、凍結乾燥させた。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーＭＳを用いて、粗生成物に対する解析を実施した。
【０２２９】
２１５ｎｍおよび２５４ｎｍのＵＶによりモニタリングしながら、０．０６％ＴＦＡを伴う水中に１０〜５０％アセトニトリルの直線勾配（１％／分の勾配、１０ｍｌ／分の流速）を用いる、２．５×２５ｃｍのＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラム上におけるＲｐ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）により、粗ペプチドを精製した。分析用ＨＰＬＣを用いて、画分の純度を評価した。分析用ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、０．４６×２５ｃｍ、水、０．１％ＴＦＡ中の直線勾配が１０〜６０％のアセトニトリル、１％／分、１ＭＬｌ／分の流速、２１５ｎｍおよび２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収による検出）により推定される、少なくとも９５％の純度を有する凍結乾燥ペプチドとして、最終生成物を得た。標準的な手順に従い、ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  ＩＩＩ質量分析器を用いる、分子量解析により、純粋なペプチドを同定した。
【０２３０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ上におけるペプチドの保持時間は、２１．２１５分間であった。ペプチドの理論的分子量は、６４４．７４と計算され、実際の分子量は、分子量解析により、６４６．５（ＭＷ＋Ｈ＊）であることが判明した。
【０２３１】
ペプチドは、担体、この場合、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）へと連結した。このような連結に有用な他の担体には、アルブミン、もしくはオボアルブミン、８ｍａｐ、またはライソザイムが含まれるがこれらに限定されない。連結は、システインのメルカプト基へのチオエーテル結合により実施した。この種の結合は、ペプチドが、明確な形で担体タンパク質へと連結される利点を有する。
【０２３２】
ＫＬＨへの連結は、以下の通りに実施した。１０ｍｇのペプチドを、２ｍｌのリン酸緩衝液（１倍濃度のＰＢＳ）中に溶解させた。１ｍｌのＫＬＨ（ｐｉｅｒｃｅ社製；型番７７１００）を、該ペプチド溶液に添加し、撹拌した（１モルのペプチド／５０アミノ酸）。ＫＬＨ濃度は、１０ｍｇ／ｍｌであった。２０ｕｌのグルタルアルデヒド（２５％水溶液）を、一定速度で撹拌しながらペプチド／担体溶液に添加し、１時間にわたりインキュベートした後で、グリシンによる停止溶液を添加した。ＰＢＳに対する透析により、ペプチドから、ペプチド／担体コンジュゲートを分離した。
【０２３３】
標準的な方法、例えば、本明細書で説明する方法に従い、さらなるＹＹＲペプチド（例えば、ＣＹＹＲＲＹＹＲＹＹおよびＣＫＹＥＤＲＹＹＲＥ；配列番号９０および９１）を合成することができる。上記で説明した合成法を適切な形で改変することにより、他の合成ペプチドを調製することができる。当技術分野で知られる標準的な方法（例えば、本明細書で説明する方法）のうちのいずれかを用いて、このようなペプチドもまた特徴づけることができる。
【０２３４】
標準的な方法に従いポリクローナル抗体を調製し、３〜８週間の間隔で、追加投与の注射を繰り返すことにより、免疫反応を増強した。ウェスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡ、またはこれらの両方において抗体の濃度を決定することにより、免疫化の成功を検証した。より具体的に述べると、ミスフォールドＰｒＰＣ（またはＰｒＰＳｃ）に対するポリクローナル抗体を作製するため、１６４日間にわたる免疫化レジメンに従い、ＫＬＨにコンジュゲートさせたトリペプチドＹＹＲを、ウサギへと注射した後で、特異的抗体を生成した動物から採血した。
【０２３５】
免疫化前の血清をサンプリングするため、ウサギ１匹当たり１０ｍｌずつの血液を、前免疫化対照として採取した。初回の免疫化は、フロイントの完全アジュバントにより実施し、その後の追加投与は、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ０（ウサギ１匹当たり１ｍｌ、大腿筋１カ所当たり０．５ｍｌ））により実施した。各注射は、約２００ｕｇの精製ペプチドからなった。２１、４２、および７０日目には、ＩＦＡにより追加投与の注射を施した。３１、４２、および８０日目には、耳介中心動脈から１０ｍｌずつの血液を採取し、力価の決定（６ｍｌ／ｋｇ／ウサギ１匹）を行った。８０日目に、血清の力価を確認し、４週間間隔でさらに３回の注射を施し（ＩＦＡ）、その１０日後に血液サンプリングを行った。最終回の追加投与の１０日後において、安楽死させたウサギを、心臓穿刺により放血させ、抗血清を採取した。
【０２３６】
標準的な方法に従い、ヤギポリクローナル抗体を作製した。以下の通りに、３頭のヤギを免疫化した。１日目に、すべてのヤギに、フロイントの完全アジュバント中に１ｍｇのＹＹＲ−ＫＬＨコンジュゲートによる初回免疫化を施した。３頭のヤギのうち２頭に対して、フロイントの不完全アジュバント中に１ｍｇのＹＹＲ−ＫＬＨを注射することにより追加投与を行う一方、３頭目のヤギには、フロイントの不完全アジュバント中１ｍｇのＹＹＲ−８ｍａｐコンジュゲートを施した。ＥＬＩＳＡにより、３つの採取血の各々に由来する血清試料を、ＹＹＲ−ＢＳＡコンジュゲートに対する反応性について調べた。硫酸アンモニウム沈殿により、採取血の第３のセットから全ＩｇＧを精製し、ＹＹＲアフィニティーカラムを用いて、ＹＹＲ反応性ＩｇＧを精製した。本明細書で説明する通りに、ＩｇＧ画分を、ＰｒＰＳｃに対する反応性について調べた。正確な免疫化のスケジュールは、以下の通りであった：１日目：初回の免疫化；２１日目：初回の追加投与による免疫化；３０日目：初回の採血；４６日目：２回目の追加投与による免疫化；５３日目：２回目の追加投与による免疫化；６０日目：２回目の採血；７６日目：３回目の追加投与による免疫化；８３日目：３回目の追加投与による免疫化；および９０日目：３回目の採血。
【０２３７】
代替的に、本明細書および標準的なハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、１９７５年；  Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：５１１頁、１９７６年；  Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：２９２頁、１９７６年；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｄｒｉｄｏｍａｓ」、ニューヨーク、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社、１９８１年；  Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ニューヨーク、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社を参照されたい）で説明される合成ペプチドを用いて、モノクローナル抗体を調製することもできる。作製したら、免疫沈降およびウェスタンブロット解析により、モノクローナル抗体もまた、特異的なＰｒＰ認識について調べることができる。
【０２３８】
モノクローナル抗体の作製は、以下の通りに実施した。フロイントの完全アジュバント中にマウスＰｒＰ−ＡＰ融合タンパク質を含有するバキュロウイルス上清によりマウスを免疫化し、次いで、フロイントの不完全アジュバント中の同じ抗原により、２週間後に追加投与を行った。この免疫化の２週間後、ＰｒＰ−ＡＰ上清に、１００ｕｇのＫＬＨ−ＣＹＹＲＲＹＹＲＹＹ（配列番号９０）コンジュゲート、および１０ｕｇのＫＬＨ−ＣＫＹＥＤＲＹＹＲＥ（配列番号９１）コンジュゲートを加えた混合物により、マウスに追加投与を施した。これらのマウスに由来する脾臓細胞を、ＦＯマウスのＢ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）と融合させて、特異的なハイブリドーマクローンを作製した。ＥＬＩＳＡにより、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ＹＹＲ−８ｍａｐコンジュゲートに対して反応性のクローンは存在したが、ＰｒＰ−ＡＰまたはＣＫＹＥＤＲＹＹＲＥ（配列番号９１）配列に対して反応性の上清は存在しなかった。
【０２３９】
製造元の推奨に従い、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のプロテインＡ  ＨｉＴｒａｐカラムを用いて、血清から全ウサギＩｇＧを精製した。略述すると、３カラム容量の開始緩衝液（０．２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）により、ＨｉＴｒａｐカラムを平衡化した。ルアーアダプターを介するシリンジを用いて、血清をカラム上へと適用した。その後、５ｍｌの開始緩衝液によりカラムを洗浄した。０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０により、結合したタンパク質を溶出させ、１Ｍトリスｐｈ８．０（５０ｕｌ／試料５００ｕｌ）を含有するエッペンドルフ管内に回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＡ−ＰＡＧＥ）により、画分を解析した。
【０２４０】
上記で説明した通りに、血清試料からヤギポリクローナル抗体を精製した。
【０２４１】
マウスモノクローナル抗体は、腹水として作製し、製造元の指示書に従い、プロテインＡカラムキット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて精製した。
【０２４２】
略述すると、腹水試料を、結合緩衝液により、１：１の最終比率で希釈した。次いで、試料を、結合緩衝液によりあらかじめ平衡化しておいたカラムの上部に添加し、マトリックス中にこれを流過させた。流過物を回収し、カラム５本分の容量の結合緩衝液によりカラムを洗浄した。軽度の溶出緩衝液をカラムに添加し、結合したＩｇＧをマトリックスから放出した。ＩｇＧ溶出緩衝液へと切り替えることにより、他の抗体アイソタイプを回収した。１ｍｌの画分にすべての抗体を回収し、ＢＣＡによりこれを解析し、総タンパク質含量を決定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、抗体純度を確立した。Ｄ−塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ社製）中にそれを通過させることにより、大半のＩｇＧ収量を含有する画分を脱塩化した。抗体画分の位置を特定し、ＰＢＳ中−８０℃で保管した。
【０２４３】
その後、上述の手順を用いて作製した抗体を、以下の通りに、高アフィニティー結合について調べた。
【０２４４】
１０ｕｌの脳抽出物を、９５０ｕｌの免疫沈降緩衝液（ＰＢＳ、３％ＮＰ−４０、３％Ｔｗｅｅｎ−２０）に添加し、３７℃で３０または６０分間にわたりインキュベートした。ビーズとのＰｒＰ２７〜３０コンジュゲートの反応性を評価する実験を行うため、インキュベーションの前に、５０ｕｌの１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを添加した。プロテイナーゼＫにより処理しなかった試料もやはり、３７℃で、適切な時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、６０ｕｌの１００ｍＭ  ＰＭＳＦ溶液を、両方の試験管セットに添加した。次いで、再懸濁させたビーズコンジュゲート１００ｕｌを混合物に添加し、回転させながら室温で２時間にわたりインキュベートした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ、２％ＮＰ−４０、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）により３回にわたりビーズを洗浄し、各洗浄後にボルテックスにより再懸濁させた。最後の洗浄後に、２倍濃度のローディング緩衝液（１００ｍＭトリスｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、０．０１５％ブロムフェノールブルー、２０％グリセロール）２０ｕｌ中にビーズを再懸濁させ、９５℃で３分間にわたり加熱した。
【０２４５】
標準的な方法に従うウェスタンブロット法により、脳ホモジネートのＰｒＰＳｃ含量を決定した。タンパク質試料を、１：１の比率で、２倍濃度の試料緩衝液と共に混合し、１００℃で５分間にわたり煮沸した。標準的な方法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。あらかじめ染色された分子量マーカー（Ｂｉｏｒａｄ社製）と共に、試料を、１５％プレキャストアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ社製）へと適用した。ブロモフェノールブルー色素がゲルの底部に達するまで、１００Ｖでゲルを泳動させた。次いで、分離されたタンパク質を、１００Ｖで１時間にわたり、ＰＶＤＦ膜上へと転写した。上記で説明した通りに膜を洗浄した後、アルカリホスファターゼをコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＴＢＳＴ中において１：５０００）と共に、室温で１時間にわたりインキュベートした。洗浄後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒによりシグナルを発生させ、ｘ線フィルムへと露光した。
【０２４６】
ワイヤーメッシュ中に組織を通すことにより、Ｂａｌｂ／ｃマウスから、脾臓細胞懸濁液を調製した。Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を伴わない低温のダルベッコＰＢＳにより細胞を１回洗浄し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社製）および１３００ｇで２０分間にわたる遠心分離により、細胞懸濁液の下層を層別化することにより、生細胞を単離した。Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を伴わない低温のダルベッコＰＢＳ、２．５％ウシ胎仔血清により細胞を１回洗浄し、丸底の９６ウェルプレート内に、ウェル当たり０．５×１０６個の細胞をアリコートした。細胞を遠心分離し、氷上のＣａ２＋またはＭｇ２＋を伴わない低温のダルベッコＰＢＳ、２．５％ウシ胎仔血清中に１／１０の最終濃度の抗体−ＦＩＴＣコンジュゲート５０ｕｌ中において、１５分間にわたり再懸濁させた。次いで、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を伴わない低温のダルベッコＰＢＳ、２．５％ウシ胎仔血清により細胞を２回にわたり洗浄し、１ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有する同じ培地中に再懸濁させた。Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｅｐｉｃｓフローサイトメーター上において細胞を解析し、サイズ、粒度（前方散乱および側方散乱）、および生存能力（ヨウ化プロピジウムによる蛍光発光の除外）によりふるい分けした。
【０２４７】
製造元の指示書に従い、Ｆｌｕｏｒｏｔａｇキット（Ｓｉｇｍａ社製）を用いることにより、フルオレセイン化ｍＡｂを作製した。略述すると、濃縮した重炭酸緩衝液により、０．５ｍｇの各抗体をｐＨ９とし、ＦＩＴＣ原液を添加して、ＦＩＴＣ：抗体比を２０：１とした。次いで、バイアルを、室温で２時間にわたりインキュベートした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム上に混合物を通過させることにより、遊離ＦＩＴＣから標識化抗体を分離した。ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＡｎａｌｙｓｔを用いて、３５ｎｍにおけるそれらのＦＩＴＣ発光を測定することにより、コンジュゲートした抗体をフルオレセイン化の成功について調べ、ＥＬＩＳＡにより、ＹＹＲ−８ｍａｐコンジュゲートに対するそれらの結合活性の保持について抗体を調べた。
【０２４８】
ウシ脳抽出物に由来するＰｒＰＳｃを特異的に認識するのに、組換えＰｒＰ（ｒｂＰｒＰ）を用いるＰｒＰＣと比較して、ｐＡｂＣ２が有用であるかどうかを判定するため、ＥＬＩＳＡ法を用いた。脳抽出物を含有するＰｒＰＳｃまたはｒｂＰｒＰのプールを用いて、ＰｒＰＳｃに対するｐＡｂＣ２の特異性を調べた。５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＮａＣ１）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＣａＣ１２）を含有するＴＢＳ緩衝液中に培養物上清を含有するＰＣ２により、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ社製）のウェルを、４℃で一晩にわたりコーティングした。ＢＳＥ脳抽出物実験では、Ｍｅｋ−４を含有する上清により対照ウェルをコーティングし、ｒｂＰｒＰ実験では、ミルクを対照として用いて、ウェルに対する抗体の非特異的結合を決定した。可溶性ＰＣ２によるＥＬＩＳＡプレートのコーティングは、抗ＰＣ２モノクローナル抗体により確認した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴＢＳを伴う、ＳＬＴ社製の「Ｃｏｌｕｍｂｕｓ」マイクロプレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ社製）を用いて、４回にわたりウェルを洗浄し、ＴＢＳＴ中に０．２％のＩ−Ｂｌｏｃｋ（Ｔｒｏｐｉｘ社製）でウェルを満たすことによりブロッキングし、３７℃で１時間にわたりプレートをインキュベートした。プレートを洗浄し、ウシ脳ホモジネート（ＴＢＳ中において１％Ｗ／ｖまで希釈した）、またはｒｂＰｒＰを、指定されたウェルに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。ＴＢＳＴにより４回にわたりウェルを洗浄した。適切なウェルにｐＡｂＣ２を添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした後、１％脱脂乳を含有するＴＢＳＴ中に１００ｕｌの抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ／西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（１：５０００）と共に、さらに４５分間にわたりインキュベートした。ＴＢＳＴにより４回にわたりウェルを洗浄した。ペルオキシダーゼに対する基質としてのＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２により、シグナルを発生させた。１５分後において、１００ｕｌの２Ｍリン酸を添加することにより、反応を停止させた。ＳＬＴ社製のマイクロプレートリーダーを用いて、６２０ｎｍを基準とする４５０ｎｍでシグナルをモニタリングした。ＰＣ２に対するＰｒＰの結合を、陰性対照であるＭｅｋ−４またはミルクに対するＰｒＰの結合と比較することにより、特異的な陽性シグナルを決定した。前免疫化対照は、結合を示さなかった。
【０２４９】
したがって、まず、本エピトープ予測法を適用して有用なエピトープを同定し、次いで、これらの目的で十分に確立されている標準的な実施法に従い、これらのエピトープに対する抗体を作製することにより、ミスフォールドＰｒＰＣ（本明細書の上記では、ＰｒＰＳｃとして公知の凝集形態を用いて示す）に固有のＹＹＲエピトープを認識し、これに選択的に結合する各種の抗体を得られることが理解されるであろう。
【０２５０】
（実施例５）
ヒトＰｒＰ−ＹＭＬ
表１に示す通り、本エピトープ予測法により、それぞれ、配列番号１および２のペプチドＬＧＧＹＭＬおよびＧＧＹＭＬＧＳにより示される、ＹＭＬと称するエピトープを含有する領域である、ヒトプリオンタンパク質ＰｒＰＣ内のベータ鎖１領域のアンフォールディングが予測される。以下の実験では、抗原／免疫原として、配列ＧＧＹＭＬＧＳ（Ｎ末端およびＣ末端を挟み込む２つの残基を伴うベータ鎖１；配列番号２）を有するペプチドを用いて、ＹＭＬエピトープに対して特異的なモノクローナルＩｇＭ抗体１Ａ１を作製する。
【０２５１】
一般的な参考文献：２６３Ｋハムスター適合型プリオンは、Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎら、１９７８年により説明されている。ＲＭＬマウス適合型プリオンは、Ｃｈａｎｄｌｅｒ，Ｒ．Ｌ．（１９６１年）（Ｌａｎｃｅｔ、１巻、１３７８〜１３７９頁）により説明されている。これらは、当技術分野で公知の方法、例えば、Ｂｕｅｌｅｒ  Ｈら、１９９３年（Ｃｅｌｌ、７３巻：１３３９〜１３４７頁）；Ｏｌｄｓｔｏｎｅら、２００２年；またはＭｅａｄｅ−Ｗｈｉｔｅら、２００９年による方法を用いて、マウスまたはハムスターに感染させるのに用いることができる。Ｂｏｌｔｏｎら、１９８７年は、スクラピー病原体の単離および精製に用いうる方法について説明している。Ｃａｒｌｓｏｎら、１９８６年（Ｃｅｌｌ、４６巻：５０３〜５１１頁）は、マウスおよびハムスターにおけるスクラピーの臨床診断に用いうる方法について説明している。ＰｒＰを過剰発現するか、部分発現するか、またはその発現を欠く、各種のトランスジェニックマウスは、Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９６年（ＥＭＢＯ  Ｊ、１５巻：１２５５〜１２６４頁）；およびＷｅｉｓｓｍａｎｎら、２００３年（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、６６巻：４３〜６０頁）により説明されている。
【０２５２】
脳および脾臓のホモジネート調製物
Ｆｉｓｃｈｅｒら、２０００年（Ｎａｔｕｒｅ、４０８巻：４７９〜４８３頁）から改変した方法の通りに、脳組織（正常マウスまたは正常ハムスター、およびスクラピー感染したマウスまたはハムスター）を加工および分析した。略述すると、ＰＢＳ、０．５％デオキシコール酸（Ｓｉｇｍａ社製）、０．５％ＮＰ−４０中に１０％のホモジネートを作製した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）によりホモジネート中の総タンパク質濃度を決定し、ホモジナイゼーション緩衝液により５ｍｇ／ｍｌへと調整した。ＰＫ耐性物質を検出するために、１．５μｌのホモジネートを、０．１５μｇのＰＫ（Ｓｉｇｍａ社製）を伴うかまたは伴わずに、３７℃で６０分間にわたりインキュベートした。２０ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加することにより、消化を停止させた。
【０２５３】
磁気ビーズによる抗体のコンジュゲーションおよび免疫沈降
抗体を磁気ビーズにコンジュゲートさせ、Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓ、２００３年から改変した方法の通りに、免疫沈降実験に用いた。略述すると、製造元の指示書に従い、７×１０８個の磁気ビーズ（１ｍｌのＰＢＳ中）（ニューヨーク州、レイクサクセス、Ｄｙｎａｌ社製）を、１Ａ１、８Ｂ４、４Ｅ４、またはＩｇＭアイソタイプ対照へと連結した。製造元の推奨に従い、コンジュゲートさせたビーズを洗浄およびブロッキングし、次いで、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。
【０２５４】
抗体を連結したビーズ１０μＬを、６％洗浄剤（ＰＢＳ中における３％Ｔｗｅｅｎ２０および３％ＮＰ４０）中に１μＬの１０％脳ホモジネートと共に、室温で３時間にわたりインキュベートした。磁石により捕捉した免疫複合体を、４％洗浄剤（ＰＢＳ中における２％Ｔｗｅｅｎ  ２０および２％ＮＰ４０）により３回にわたり洗浄し、４％ＳＤＳ中において薬剤を還元せずに煮沸し、１５％トリスグリシンまたは４〜１２％ビス−トリスアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上において分解した。
【０２５５】
免疫ブロッティング
説明される通り（Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓら、２００３年）に、免疫ブロッティングを実施した。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上に転写した。５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳により、膜をブロッキングした。ＴＢＳＴ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中において、すべてのインキュベーションを行った。化学発光、増強ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、またはｓｕｐｅｒＷｅｓｔ  Ｄｕｒａ（イリノイ州、ロックフォード、Ｐｉｅｒｃｅ社製）により、ペルオキシダーゼ活性を検出した。
【０２５６】
ＰｒＰＳｃの免疫沈降
一次抗体としての６Ｄ１１−ビオチン（１：５０００）、および二次抗体としてのＳｔｒｅｐ−ＨＲＰ（１：５０００）を伴うウェスタンブロット法（図１）により、免疫沈降させた試料を解析した。８Ｂ４−ビーズを陽性対照として作用させたが、これにより、ＰｒＰノックアウトマウス（Ｋ／Ｏ）を除き、すべての脳ホモジネート試料から、ＰｒＰを免疫沈降させることができた。ビーズだけ、ＩｇＭアイソタイプ−ビーズ、および４Ｅ４−ビーズを陰性対照として作用させたところ、また、予測される通り、４Ｅ４により免疫沈降した、ＲＭＬレーンおよび２６３Ｋレーン内における２つの極めて希薄なバンドを除き、ＰｒＰは免疫沈降しなかった。ＰｒＰのベータ１鎖に対して作製されたＩｇＭ抗体である１Ａ１により、ＲＭＬ（マウススクラピー細胞株）および２６３Ｋ（ハムスタースクラピー細胞株）の両方に由来するスクラピープリオンタンパク質を免疫沈降させることができた。このＰｒｎｐを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳内における、小含量のミスフォールドＰｒＰにおそらく起因して、Ｔｇ２０レーン内には希薄なバンドが見られた。本発明者らのデータは、１Ａ１により認識できるのはスクラピーＰｒＰだけであり、マウス脳およびハムスター脳のいずれにおいても、野生型ＰｒＰは認識できないことを示した。
【０２５７】
（実施例６）
腫瘍細胞表面上における、また、癌免疫療法の治療標的としてのＹＭＬ露出
それが正常細胞および腫瘍細胞の両方に結合する能力について、１Ａ１抗体を調べた。対照としては、抗ＰｒＰＣ抗体である６Ｄ１１を用いて、各細胞型上におけるＰｒＰの発現レベルを同定した。細胞に結合する抗体の能力は、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を正常細胞型として用いるフローサイトメトリーにより観察した。８つの腫瘍細胞型に対する結合について、データを示す。被験癌細胞のうちの５つは、マウスに由来する不死化細胞株（Ｂ１６：黒色腫細胞株、ＮＳＣ３２４：運動ニューロン／神経芽腫細胞のハイブリッド）、およびヒトに由来する不死化細胞株（ＨＬ６０：前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｌｏｃｙｔｉｃ）白血病細胞株、ＭＯ３．１３：希突起膠細胞／筋細胞のハイブリッド、ＳｉＨａ：子宮頚癌細胞株）である。残りの被験癌細胞は、カナダブリティッシュコロンビア州癌研究所内の生体腫瘍研究所（ＬＴＬ）が増殖させた原発性腫瘍細胞である。知財化された技法を用いて、免疫欠損マウスの腎被膜下において、原発性ヒト腫瘍を増殖させた。これにより、本来の腫瘍構造および腫瘍表現型が、採取時本来の腫瘍との一致を保つことが可能となる。１Ａ１抗体に対する結合について調べた３つの腫瘍は、ＬＴＬ−０１３（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、ＬＴＬ−２５７（結腸直腸肉腫）、およびＬＴＬ−３２３（黒色腫）である。
【０２５８】
フローサイトメトリーによれば、１Ａ１  ＹＭＬモノクローナル抗体は、アイソタイプのＩｇＭ対照と比較して、正常ＨＵＶＥＣ細胞に対して示す結合が微弱である。１Ａ１はまた、アイソタイプのＩｇＭ対照と比較して、ＨＬ６０骨髄性白血病細胞に対する検出可能な結合を示さない。ＨＵＶＥＣ細胞およびＨＬ６０細胞が、それぞれ、６Ｄ１１に対して中レベルおよび高レベルの免疫反応性を示すことは、ＹＭＬの露出が、プリオンタンパク質発現の単純な関数ではないことを示す。１Ａ１抗体はまた、他の７つのヒト腫瘍細胞株およびマウス腫瘍細胞株、ならびにＬＴＬヒト腫瘍に対する検出可能な結合も示し、これらのすべてはまた、細胞表面における６Ｄ１１プリオンタンパク質に対する検出可能な免疫反応性も示す。
【０２５９】
腫瘍モデルにおける抗体の有効性
抗ＤＳＥ抗体により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖を変化させうるかどうかを判定するため、１Ａ１抗体を、それが、雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるマウス黒色腫（Ｂ１６）細胞の増殖を変化させる能力について調べた。試験の０日目において、マウス１２匹の脇腹に、３×１０５個の腫瘍細胞を皮下移植した。マウスは、２つの治療群に無作為に割りつけた。第１群は、ＰＢＳにより治療した。第２群は、１０ｍｇ／ｋｇの１Ａ１抗体により治療した。マウスは、−１、２、および５日目に治療した。
【０２６０】
２日目以降、カリパーで腫瘍の大きさを測定することにより、腫瘍増殖をモニタリングした。腫瘍の長さおよび幅の測定値を得、また、式Ｌ×Ｗ２／２［式中、長さ（ｍｍ）とは、腫瘍の長軸である］に従い、腫瘍容量を計算した。標準的な動物保護手順に従い、腫瘍負荷が高度となったら、マウスを屠殺した。図５は、両方の治療群における腫瘍増殖の進行を示すが、この場合、終了前の腫瘍容量を、終了時まで持ち越した。２つの群間では腫瘍増殖に有意差が見られた（対応のあるｔ検定＝０．０１２；ウィルコクソン検定＝０．００７）ことは、１Ａ１抗体の治療効果が生じたことを示す。
【０２６１】
すべての引用は、各個別の刊行物が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に指示されたと仮定した場合と同様に、また、それが、本明細書において完全に記載されたと仮定した場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の引用は、このような参考文献が、本発明に対する先行技術であることの容認として解釈されるものでも、そのようなものとして考えられるものでもない。
【０２６２】
例を目的として、本発明の１または複数の実施形態について説明してきた。本発明は、本明細書の前述において、また、実施例および図面を参照しながら実質的に説明した、すべての実施形態、改変、および変更を包含する。特許請求の範囲において規定される本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、多数の変更および改変を行いうることは、当業者に明らかであろう。このような改変の例には、実質的に同じ方法で同じ結果を達成することを目的とする、本発明の任意の態様について公知の同等物による置換が含まれる。
【図４】
2014167025.tif 000026
【図１】
2014167025.tif 000027
【図２】
2014167025.tif 000028
【図３】
2014167025.tif 000029
【図５】
2014167025.tif 000030
【配列表】
2014167025000001.app
【外国語明細書】
2014167025000001.pdf