(57)【要約】【課題】  亢進したフィチン酸生合成を示す形質転換植物を得ること。【解決手段】  植物を、２−ホスホグリセレートキナーゼ又はＡＴＰ結合カセット輸送体をコードする遺伝子、またはその双方の遺伝子を過剰発現するように形質転換する。更に、前記の形質転換植物を、ミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ又はイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼをコードする遺伝子、またはその双方の遺伝子を過剰発現するように形質転換する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高フィチン酸合成能及び高リン吸収能を示し、２−ホスホグリセレートキナーゼ又はＡＴＰ結合カセット輸送体をコードする遺伝子、またはその双方の遺伝子を過剰発現する形質転換植物。
【請求項２】
更に、ミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ又はイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼをコードする遺伝子、またはその双方の遺伝子を過剰発現する請求項１に記載の形質転換植物。
【請求項３】
以下の、
１）  ２−ホスホグリセレートキナーゼ及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ、又は
２）  ＡＴＰ結合カセット輸送体、イノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼ及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ
を各々コードする遺伝子を過剰発現する請求項２に記載の形質転換植物。
【請求項４】
前記遺伝子が植物由来の蛋白質をコードする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項５】
前記植物が、イネ、トウモロコシ、大豆又はシロイナズナである請求項４に記載の形質転換植物。
【請求項６】
前記２−ホスホグリセレートキナーゼが配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項７】
前記ＡＴＰ結合カセット輸送体が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項８】
前記ミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼが配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項９】
前記イノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１０】
前記形質転換植物体が単子葉植物である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１１】
記形質転換植物体が双子葉植物である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１２】
富栄養化した表層水の浄化方法であって、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の形質転換植物を、浄化の必要がある表層水の近傍であって、前記形質転換植物が生育可能な地域で生育させ、生育した形質転換植物を回収することを含む、前記方法。
【請求項１３】
フィチン酸の製造方法であって、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の形質転換植物を生育させ、生育した植物体の全部又は一部からフィチン酸を分離することを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
イノシトールの製造方法であって、以下の：
ｉ−ａ）  請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の形質転換植物の全部又はその一部からフィチン酸を分離し、次いで分離したフィチン酸とフィターゼを混合するか、又は
ｉ−ｂ）  請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の形質転換植物の全部またはその一部とフィターゼを混合する工程；
ｉｉ）  上記ｉ−ａ）又はｉ−ｂ）の混合物を、フィターゼがフィチン酸をイノシトールと無機燐酸に分解し得るのに適した条件と時間インキュベートする工程；及び
ｉｉｉ）  上記ｉｉ）でインキュベートした混合物からイノシトールを回収する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記形質転換植物がイネ由来である、請求項１３又は１４に記載の、フィチン酸又はイノシトールの製造方法。
【請求項１６】
前記形質転換植物の一部が種子のぬか層である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の製造方法により得られたイノシトールを原料とすることを特徴とする、キロ−イノシトール又はシロ−イノシトールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体に亢進したフィチン酸合成及びリン吸収を付与する遺伝子組換方法に関する。また、本発明は、当該遺伝子組換植物体を用いた富栄養化環境の浄化方法に関する。更に、当該形質転換体から有益な原料を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
殆どの穀類において、リンは主にフィチン酸（ミオ−イノシトール  １，２，３，４，５，６−ヘキサキスフォスフェート）として貯蔵される。つまり、それらの植物の種子中の総リン量のうちの６０〜８０％がフィチン酸態で存在し、その残りが水溶性無機リン酸（Ｐｉ）及び核酸、リン酸化蛋白質、リン脂質或いはリン酸化糖類であるに過ぎない。ヒトやある種の家畜を含む単胃動物は、フィチン酸を段階的に消化してフィチン酸からリンを放出するための酵素であるフィターゼを持たないので、フィチン酸に結合したリンを効率的に利用することはできない。従って、多くの家畜飼料は、リン欠乏を防止する目的で、リンが強化されている。
【０００３】
しかしながら、そのような家畜飼料へのリンの添加は、フィチン酸自体が消化されないこととも相俟って、表層水、例えば湖沼の富栄養化をもたらす。すなわち、家畜動物等の排泄物中に未消化のフィチン酸及び過剰のリンが含まれる結果、当該排泄物の流入に起因する湖沼等のリン汚染がもたらされるのである。実際に、これが農業による表層水の富栄養化の主因と考えられている。
【０００４】
従って、研究者は、もっぱら、フィチン酸生合成が低下した突然変異体或いは遺伝子組換植物の作出にのみ注目してきた。
【０００５】
非特許文献１は、イネの低フィチン酸（ｌｐａ１）突然変異体について記述している。当該低フィチン酸突然変異体の配列解析により、２−ホスホグリセレートキナーゼ活性、つまり、２−ホスホグリセレートから２，３−ビスホスホグリセレートを合成する酵素の遺伝子の関与が明らかにされた。なお、非特許文献１の突然変異体では、種子中のフィチン酸量が野生型と比べて４５％減少しており、その代わりにフィチン酸減少量に見合ったモル数の無機リンが蓄積していた。
【０００６】
非特許文献２は、トウモロコシの低フィチン酸突然変異体において、多剤耐性関連蛋白質（ＭＲＰ）ＡＴＰ結合カセット輸送体の機能が欠損していたことを明らかにした。更に、野生型植物の当該輸送体のプロモーターを交換することで該輸送体の発現を抑制した場合、種子へのフィチン酸の蓄積量が６８〜８７％減少し、無機リンの蓄積量は有意に増加することが示された。また、同様の結果は大豆でも確かめられた。非特許文献３も、イネにおいて多剤耐性関連蛋白質（ＭＲＰ）ＡＴＰ結合カセット輸送体の発現を抑制した形質転換体が、低下したフィチン酸の合成と、増加した無機リンの蓄積といった、非特許文献２と同様の形質を示すことを記述している。
【０００７】
非特許文献４は、イネにおいて、ミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ遺伝子（ＲＩＮＯ１）の発現を、Ｏｌｅ１８プロモーター制御下のアンチセンスｃＤＮＡで抑制すると、種子中のフィチン酸量が野生型に比べて６８％程度も減少し、それに応じた無機リンの蓄積が観察されたことを報告している。また、非特許文献５も、大豆において同様の結果を得ている。
【０００８】
非特許文献６は、シロイナズナにおいてイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼ遺伝子（ＩＰＫ１）の発現を阻害することにより、種子中のフィチン酸量が野生型に比べて顕著に減少し、また、やはりそれに伴って無機リンの蓄積が観察されたことを報告している。
【０００９】
しかしながら、現在でも、植物のフィチン酸生合成経路及び当該経路に含まれる酵素群は、完全に解明されていない（非特許文献４等を参照）。また、これまで、特定の遺伝子を導入することで、植物体の生育や収穫量に影響を与えることなく、フィチン酸の生合成ないし蓄積を増加させた例はない。
【００１０】
更に重要なことに、フィチン酸の生合成を増加させることで、そのような形質転換植物がより多くのリンを吸収できることを予測させる証拠は提示されていなかった。むしろ、前記の先行文献は、いずれも、フィチン酸合成の低下に応じた無機リンの蓄積を観察しており、このことは、フィチン酸の合成量に関わらず、植物体の総リン量（つまり、植物のリン吸収量）が一定値に維持される傾向を強く示唆していた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．１１７，ｐｐ．７６７−７７９（２００８）
【非特許文献２】Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．９３０−９３７（２００７）
【非特許文献３】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．１１９、ｐｐ．７５−８３（２００９）
【非特許文献４】Ｋｕｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．９６−１０５（２００９）
【非特許文献５】Ｎｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，Ｖｏｌ．２２４，ｐｐ．１２５−１３２（２００６）
【非特許文献６】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ−Ｐａｕｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１２６１２−１２６１７（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、亢進したフィチン酸生合成を示す形質転換植物を得ることを課題とする。当該形質転換体は、フィチン酸生合成量の増加を相殺するような無機リン蓄積量の減少を示すべきではない。すなわち、フィチン酸生合成量が増加しても無機リンの蓄積量が減少しない形質転換体は、環境中からより多くのリンを吸収し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、これまで植物のフィチン酸生合成に関与することが知られていた遺伝子の中から特定の遺伝子を選択し、それを単独ないし特定の組合せで過剰発現させることで、フィチン酸の合成量を有意に増加させ得ることを見出した。また、そのような形質転換体は、野生型に匹敵する生育及び収穫量を示した。更に、驚くべきことに、本発明によりフィチン酸の生合成が亢進した形質転換体では、無機リンの蓄積量が減少することがなかった。繰り返すが、いずれの従来技術も、フィチン酸合成量の低下に伴い無機リンの蓄積が起こることを示していたことは特筆に値する。すなわち、無機リンの蓄積量とは独立してフィチン酸の合成量が増加することは予測されていなかった。従って、本発明の第１の局面は：
（１）  高フィチン酸合成能及び高リン吸収能を示し、２−ホスホグリセレートキナーゼ又はＡＴＰ結合カセット輸送体をコードする遺伝子、またはその双方の遺伝子を過剰発現する形質転換植物；
（２）  更に、ミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ又はイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼをコードする遺伝子、またはその双方の遺伝子を過剰発現する（１）に記載の形質転換植物；及び
（３）  以下の、
１）  ２−ホスホグリセレートキナーゼ及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ、又は
２）  ＡＴＰ結合カセット輸送体、イノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼ及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ
を各々コードする遺伝子を過剰発現する（２）に記載の形質転換植物、である。
【００１４】
より特定的な態様に言及すれば、前記（１）乃至(３)の各酵素は、植物由来であり、例えば、公知のイネ、トウモロコシ、大豆、シロイナズナ等に由来する酵素であり得る。特にイネ由来酵素の相同体であることが有利である。従って、本発明の好適な態様は：
（４）  前記遺伝子が植物由来の蛋白質をコードする（１）乃至（３）のいずれかに記載の形質転換植物；
（５）  前記植物が、イネ、トウモロコシ、大豆又はシロイナズナである（４）に記載の形質転換植物；
（６）  前記２−ホスホグリセレートキナーゼが配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、（１）乃至（５）のいずれかに記載の形質転換植物；
（７）  前記ＡＴＰ結合カセット輸送体が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる、（１）乃至（６）のいずれかに記載の形質転換植物；
（８）  前記ミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼが配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる、（１）乃至（７）のいずれかに記載の形質転換植物；及び
（９）  前記イノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる、（１）乃至（８）のいずれかに記載の形質転換植物、である。
【００１５】
なお、前記（６）乃至（９）に記載の各配列番号により示されるアミノ酸配列に関連して、本発明では、それらのアミノ酸配列に対して６０％以上の配列相同性を有し、且つ所望の酵素活性を示す蛋白質をコードする遺伝子を過剰発現してもよい。また、“６０％以上の配列相同性”に関して、本発明のアミノ酸配列の相同性は、プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして定義される。しかるに、それらの好適な例としては、当該配列相同性が８０％以上、９０％以上、９５％以上のものも例示できる。更に、当該アルゴリズムによる配列の同一性パーセンテージが６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％以上のものも本発明において過剰発現されるべき好適な蛋白質である。
【００１６】
また、本発明の好適な態様の１つでは、当該形質転換植物体が単子葉植物である。また、当該形質転換植物体が双子葉植物であることも好ましい別の態様である。従って、本発明は、
（１０）  前記形質転換植物体が単子葉植物である、（１）乃至（９）のいずれかに記載の形質転換植物；及び
（１１）  記形質転換植物体が双子葉植物である、（１）乃至（９）のいずれかに記載の形質転換植物、を意図する。
【００１７】
本発明の形質転換植物では、フィチン酸合成量が有意に増加しているが、予想に反して、無機リンの蓄積量が減少することがなかった。前記のとおり、フィチン酸の合成量が、無機リンの蓄積量と独立して変化し得ることを示唆した先行技術はなかった。しかして、種子中の総リン量のうちの６０〜８０％がフィチン酸態で存在するという知見に照らせば、約３倍程度までもフィチン酸合成量の増加が観察された本発明の形質転換植物体が、野生型よりも顕著に環境からリンを吸収し得、よって、本発明の形質転換植物を、例えば湖沼の近傍で生育させることにより、富栄養化した湖沼の浄化が可能であることを、当業者は明確に理解できるであろう。従って、本発明の第２の局面では：
（１２）  富栄養化した表層水の浄化方法であって、（１）乃至（１１）のいずれかに記載の形質転換植物を、浄化の必要がある表層水の近傍であって、前記形質転換植物が生育可能な地域で生育させ、生育した形質転換植物を回収することを含む前記方法、である。
【００１８】
また、近年、フィチン酸がヒトや動物において様々な生理活性を示し得ることが明らかになってきた。更に、フィチン酸をフィターゼで分解するとイノシトールが生成することは周知であるが、イノシトールは、それ自体が生理活性物質であるばかりでなく、例えばキロ−イノシトール及びシロ−イノシトール等の別の生理活性物質合成の原料となることも周知である。加えて、イネでは、殆どのフィチン酸がぬか層に蓄積することが知られており（非特許文献４等）、従って、米糠からフィチン酸を回収することで資源の有効な活用も可能になる。すなわち、本発明の第３の局面は：
（１３）  フィチン酸の製造方法であって、（１）乃至（１１）のいずれかに記載の形質転換植物を生育させ、生育した植物体の全部又は一部からフィチン酸を分離することを特徴とする、前記方法。
（１４）  イノシトールの製造方法であって、以下の：
ｉ−ａ）  （１）乃至（１１）のいずれかに記載の形質転換植物の全部又はその一部からフィチン酸を分離し、次いで分離したフィチン酸とフィターゼを混合するか、又は
ｉ−ｂ）  （１）乃至（１１）のいずれかに記載の形質転換植物の全部またはその一部とフィターゼを混合する工程；
ｉｉ）  上記ｉ−ａ）又はｉ−ｂ）の混合物を、フィターゼがフィチン酸をイノシトールと無機燐酸に分解し得るのに適した条件と時間インキュベートする工程；及び
ｉｉｉ）  上記ｉｉ）でインキュベートした混合物からイノシトールを回収する工程、を含む前記方法；
（１５）  前記形質転換植物がイネ由来である、（１３）又は（１４）に記載の、フィチン酸又はイノシトールの製造方法；
（１６）  前記形質転換植物の一部が種子のぬか層である、（１５）に記載の製造方法；及び
（１７）  （１４）乃至（１６）のいずれかに記載の製造方法により得られたイノシトールを原料とすることを特徴とする、キロ−イノシトール又はシロ−イノシトールの製造方法、である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、植物のフィチン酸合成量を向上させることができる。また、本発明によれば、植物により多くのリンを吸収、蓄積させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図1は、イネでのフィチン酸生合成経路の概略を示す。図中、ＲＩＮＯ１はミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼを；ＯｓＰＧＫ１は２−ホスホグリセレートキナーゼを；ＯｓＭＩＫはミオ−イノシトールキナーゼを；ＰＬＣはホスホリパーゼＣを；ＯｓＩＰＫ１はイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼを、それぞれ、表す。
【図２】図２は、イネの２−ホスホグリセレートキナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）を表す。
【図３】図３は、イネのＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣトランスポーターのサブファミリーＣに属する。）のアミノ酸配列（配列番号４）を表す。
【図４】図４は、イネのミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼのアミノ酸配列（配列番号６）を表す。
【図５】図５は、イネのイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼのアミノ酸配列（配列番号８）を表す。
【図６】図６は、ＯｓＭＩＫ遺伝子のＯＲＦを示す（配列番号９）。
【図７】図７は、ＯｓＩＴＰ５／６Ｋ−１遺伝子のＯＲＦを示す（配列番号１１）。
【図８】図８は、ｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−Ｇｗベクターの構造を示す。図中、Ａｃｔｉｎはアクチンプロモーターを；３５Ｓは３５Ｓプロモーターを；ｎｏｓＴはＮＯＳターミネーターを；ｎｐｔＩＩはカナマイシン耐性遺伝子を；ｈｐｔはハイグロマイシン耐性遺伝子を表す。
【図９】図９は、Ｐａｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｒ５ベクターの構造を示す。
【図１０】図１０は、イネ（キタアケ）を、２−ホスホグリセレートキナーゼのコード化遺伝子及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼのコード化遺伝子で形質転換した植物の、発芽後２８日目第６葉でのフィチン酸合成量を、野生型キタアケのフィチン酸合成量と比較したクロマトグラムである。図中、実線は形質転換体、破線は野生型。
【図１１】図１１は、イネ（キタアケ）を、ＡＴＰ結合カセット輸送体のコード化遺伝子、イノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼのコード化遺伝子及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼのコード化遺伝子で形質転換した植物の、種子中でのフィチン酸合成量を、野生型キタアケのフィチン酸合成量と比較したクロマトグラムである。図中、実線及び太い破線は各々異なるクローンの形質転換体、細い破線は野生型。
【図１２】図１２は、各種形質転換体の種子中の無機リン濃度を野生型と比較したグラフである。図中、ＮＴは野生型である。ＰＧＫは２−ホスホグリセレートキナーゼ；ＲＩＮＯはミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ；ＭＲＰはＡＴＰ結合カセット輸送体；ＩＰＫはイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼを意味する。
【図１３】図１３は、各種形質転換体の種子1個あたりの総リン量を、野生型と比較したグラフである。図中、ＮＴは野生型である。ＰＧＫ１は２−ホスホグリセレートキナーゼ；ＲＩＮＯ１はミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
遺伝子
本発明の課題は、少なくとも２−ホスホグリセレートキナーゼ又はＡＴＰ結合カセット輸送体をコードする遺伝子を機能的に過剰発現させることにより解決される。例えば、イネの２−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＯｓＰＧＫ１）は、以下のＣＤＲを有する。
【００２２】
【化１】
2014042516.tif 000002
【００２３】
また、イネのＡＴＰ結合カセット輸送体、すなわち、ＡＢＣトランスポーターのサブファミリーＣ（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＲＰ）に属する輸送蛋白質遺伝子（ＯｓＭＲＰ１３）は、以下のＯＲＦを有する。
【００２４】
【化２】
2014042516.tif 000003
2014042516.tif 000004
【００２５】
なお、トウモロコシ及び大豆のＡＴＰ結合カセット輸送体遺伝子も公知である（非特許文献２）。
【００２６】
更に、本発明の形質転換植物は、ミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ又はイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼをコードする遺伝子も過剰発現することが好ましい。例えば、イネのミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ遺伝子（ＲＩＮＯ１）は、以下のＯＲＦを有する。
【００２７】
【化３】
2014042516.tif 000005
【００２８】
なお、大豆のミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ遺伝子も公知である（非特許文献５）。
【００２９】
また、イネのイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼ遺伝子（ＯｓＩＰＫ1）は、以下のＯＲＦを有する。
【００３０】
【化４】
2014042516.tif 000006
【００３１】
なお、シロイナズナのイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼ遺伝子も公知である（非特許文献６）。
【００３２】
上記の配列番号１、３、５及び７に示したＯＲＦは、それぞれ、配列番号２、４、６及び８のアミノ酸配列をコードするが、前記のように、他の植物種での相同蛋白質も知られているから、本発明では、形質転換すべき植物や目的に応じて、配列番号２、４、６及び８のアミノ酸配列に対して、前記のＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに基づくアミノ配列相同性として６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％以上の陽性のパーセンテージを示し、且つ所望の活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子も利用できる。更にまた、前記したものの修飾蛋白質は、それらが野生型の蛋白質と実質的に類似の活性を有するならば、当該修飾蛋白質分子の一方の構造が野生型蛋白質分子に無くとも、又は２つのアミノ酸配列が完全に同一でなくとも、本発明の相同蛋白質と考えられる。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないこともあり得る。従って、本発明において、配列番号２、４、６及び８に示すアミノ酸配列に対して数個程度のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換を含むアミノ酸配列を有する蛋白質は、所望の触媒活性や輸送活性を保持している限り本発明に利用でき、そしてそのような蛋白質をコードするヌクレオチド配列も本発明に利用し得る事を当業者は理解する筈である。
【００３３】
従ってまた、本発明のために過剰発現される遺伝子は、上記のコード化核酸と相補的なヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸として同定され得、且つその発現産物が所望の各活性を示すのを確認することで容易に入手し得るのを当業者は理解するであろう。なお、本明細書でのストリンジェントな条件は、サケ変性精子ＤＮＡ、６ｘＳＳＣ液と５ｘＤｅｎｈａｒｔ液を含む溶液中、４２℃でハイブリダイゼーション、及び０．１％ＳＤＳと１ｘＳＳＣを含む水溶液中で６８℃での洗浄条件として記載される。更にまた、本発明の目的に利用できる相同遺伝子は、その本来の活性を維持している限り、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型遺伝子配列（例えば配列番号１）に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえストリンジェントな条件下で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１−７２、１９９１等）、宿主に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。
【００３４】
発現ベクター
本発明では、前記した遺伝子が形質転換植物体内で過剰発現させられる。そのような形質転換は、典型的には、外来性の上記遺伝子を含む発現ベクターで植物細胞をトランスフェクトすることにより達成される。なお、本明細書において、「外来性」ないし「外来」という用語は、形質転換前の宿主植物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、その遺伝子によりコードされる蛋白質を実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該蛋白質のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性蛋白質活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子ないしヌクレオチド配列を宿主に導入することを意味するために用いられる。また、本明細書において、「発現ベクター」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写及び翻訳をレギュレートするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現ベクターは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主植物細胞に発現可能に導入される。具体的に、本発明で好適に利用できる植物導入用（組換）発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿入することにより得ることができる。クローニング用ベクターとしては、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ、ｐＧｒｅｅｎ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００等の中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ）間に目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・チュメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質導入用に用いる。特に好ましい植物形質転換用ベクターとして、ｐＢＩ１０１を基にして、ｈｐｔＩＩ遺伝子とイネのアクチンプロモーターを導入した後、インビトロゲン社のｇａｔｅｗａｙ（商標）カセットを入れたもの（ｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−Ｇｗとして図８に記載。）や、Ｐａｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｒ５（クミアイ化学工業社）が例示される。
【００３５】
前述のとおり、植物体内で外来遺伝子などを発現させるためには、構造遺伝子の前後それぞれに、植物用のプロモーターやターミネーターなどを配置させる必要がある。本発明において利用可能なプロモーターとしては、例えば、アクチンプロモーターや、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ転写物［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．６，ｐｐ.３９０１−３９０７（１９８７）］、トウモロコシのユビキチン［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ.６７５−６８９（１９９２）］、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成遺伝子のプロモーターなどが挙げられ、ターミネーター配列としては、例えば、カリフラワーモザイクウィルス由来のノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターなどが挙げられる。但し、植物内で機能することが知られているプロモーターやターミネーターであれば、これらのものに限定されるものではない。
【００３６】
また、必要に応じて、プロモーター配列と本発明の遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）のイントロン［Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ.１１８３−１２００（１９８７）］を導入することができる。さらに、効率的に目的の形質転換細胞を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を本発明の遺伝子と併用することが好ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子、及びビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができる。本発明の遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに共に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いても良い。
【００３７】
形質転換
本発明の形質転換植物の作出にあたっては、先ず、植物培養細胞、カルス、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、或いは植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）を形質転換すればよい。植物種は限定されず、大豆やシロイヌナズナ等の双子葉植物及びイネ、トウモロコシ、コムギ等の単子葉植物を用いることもできる。植物培養細胞、カルス、植物器官又は植物組織に形質導入する場合、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、又はポリエチレングリコール法などで導入して、植物宿主を形質転換することができる。或いは、プロトプラストにエレクトロポレーション法で導入して、形質転換植物を作出することもできる。
【００３８】
例えば、アグロバクテリウム感染法により遺伝子を導入する場合、目的の遺伝子を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムを植物にトランスフェクトさせる工程が必須であるが、これは、例えば形質転換すべき植物から誘導したカルスに、本発明の遺伝子を含むプラスミドを有するアグロバクテリウムを感染させ、その後、カルスを再分化させることで行えばよい。詳細に言うと、イネの場合では、その完熟種子の外頴と内頴を除去した後に次亜塩素酸や過酸化水素水等を用いて滅菌し、一定期間培養する。培養後に胚乳や芽を取り除き、膨らんだ胚盤のみを採取して更に培養し、健常なカルスを選抜してカルスを細かい塊に分け更に培養する。一方、感染させるアグロバクテリウムを適当な条件下で培養し、培養物からアグロバクテリウムの希釈液を調製する。当該希釈液内で振とうすることによってカルスを感染させ、共存培地中で培養した後、除菌する。除菌後のカルスを更に培養し、成長した新しいカルスを再分化培地に移して培養する。再分化個体を発根培地に移して植物体を育成させる。或いは、トランスフェクトは、Ｃｌｏｕｇｈらの花序浸し法［Ｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ.７３５−７４３（１９９８）］に準じて行うことができる。詳細に言うと、本発明の遺伝子を含むプラスミドを有するアグロバクテリウムを懸濁した菌液に植物の蕾を直接浸した後、蕾をそのまま生育させて、種子を収穫する。次いで、種子から目的の遺伝子を有する個体を選択するために、適切な抗生物質を加えた寒天培地に播種する。この培地で生育した植物を鉢に移し生育させることにより、本発明の遺伝子が導入された形質転換植物の種子を得ることができる。
【００３９】
本発明の遺伝子を導入した形質転換植物及びその次世代に目的の遺伝子が組み込まれていることを確認するには、当該植物の細胞或いは組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法又はサザン法を用いて導入した遺伝子を検出すればよい。なお、一般に、導入遺伝子は、宿主植物のゲノム中に導入されるが、その導入場所が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションエフェクトと呼ばれる現象が知られている。従って、プローブとして導入遺伝子のＤＮＡ断片を用いたノーザン法で検定することによって、導入遺伝子がより強く発現している形質転換体を選抜することができる。
【００４０】
また、本発明の別の方法としては、上記した植物の内因性遺伝子の発現を有意に活性化する方法も挙げられる。具体的には、当該内因性遺伝子の調節領域、例えばプロモーターを、前記したアクチンプロモーターや、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ転写物、トウモロコシのユビキチン、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成遺伝子のプロモーターなどの外来性の調節エレメントで置換すればよい。そして、そのような方法により内因性遺伝子の発現が有意に活性化している形質転換植物は、プローブとして当該内因性遺伝子のＤＮＡ断片を用いたノーザン法で検定することにより、該遺伝子がより強く発現している個体を選抜することで入手できる。つまり、本発明の遺伝子を導入した形質転換植物における該遺伝子の発現レベルの分析は、当該植物の細胞或いは組織から常法に従ってＲＮＡを抽出し、公知のＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザン法を用いて、導入した遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行うことができるのである。或いは、更に別の方法として、本発明の遺伝子産物を、該遺伝子産物に体する抗体を用いたウェスタン分析等により、直接分析することも可能である。そのようなプロモーターの置換方法については、非特許文献２を参照することもできる。
【００４１】
表層水の浄化方法
上記の説明及び以下の実施例のとおり、本発明の形質転換植物は顕著に亢進したフィチン酸生合成能に伴う、強力なリン吸収能を有する。殊に、種子中の総リン量の８０％程度までがフィチン酸態のリンであり得るので、およそ２〜３倍ものフィチン酸を合成できる形質転換植物は、実質的に有意なリンを環境から吸収し得る。更に本発明の形質転換植物は、種子のみならず植物体全体において、フィチン酸の生合成が亢進している。また、本発明の形質転換植物は、野生型と同等の生育を示す。従って、本発明の形質転換植物は、富栄養化した表層水、典型的には湖沼の近傍で生育させることにより、当該湖沼からリンを吸収して、富栄養化した表層水を浄化できる。
【００４２】
形成転換植物を用いたフィチン酸、イノシトール及び他の生理活性物質生産
フィチン酸は、様々な生理活性を示すことが明らかにされてきている。例えば、フィチン酸は抗酸化作用を有することが知られている（特開平７-５９５４８号公報等）。更に近年では、フィチン酸が、癌、心疾患、糖尿病及び結石の治療に有用であるとされている（特開平１１−２６６８４６号公報等）。
【００４３】
また、フィターゼは、フィチン酸をイノシトールと無機リン酸に分解する酵素である。従って、本発明の形質転換植物又はそこから抽出したフィチン酸をフィターゼで処理することで、イノシトールを得ることができる。例えば、カビ由来のフィターゼが商業的に入手可能であり、そのようなフィターゼは、通常、ｐＨ５〜６の範囲で、２０〜３０℃において最大の酵素活性を示す。よって、当該条件下で、フィターゼと本発明の形質転換植物又はそこから抽出したフィチン酸を、例えば数時間〜数日間インキュベートすることにより、イノシトールを得ることができる。特に、本発明の形質転換植物がイネである場合、フィチン酸は種子のぬか層に蓄積するので、普通は廃棄されることの多い米糠を利用し、米糠をそのまま或いはそこからフィチン酸を抽出した後、前記のフィターゼで処理すればよい。
【００４４】
もとよりイノシトール（ミオ−イノシトール）は、多くの高等動物にとって必要不可欠な物質であるため、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている（特開平８−３８１８８号公報等）。加えて、イノシトールからキロ−イノシトールやシロ−イノシトールなどの生理活性物質を製造できる。キロ−イノシトール（Ｄ−キロ−イノシトール）は、例えば、インスリン抵抗性を改善する作用を持ち、インスリン非依存性糖尿病等の治療に有効であるとされている（国際公開第９０／１０４３９号パンフレット）。更に、イノシトールからＤ−キロ−イノシトールを効率的に生産する酵素的方法も公知である（特開２００５−８７１４９号公報）。一方、シロ−イノシトールは、アミロイドβ蛋白質凝集抑制作用を有するとされ、アルツハイマー病治療における潜在的有用性が示唆されている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２７５、Ｎｏ．２４、ｐｐ．１８４９５〜１８５０２（２０００））。イノシトールからシロ−イノシトールを生産する方法も多くの文献に記載されている（薬学雑誌、８９巻、１３０２〜１３０５頁（１９６９）及びＬｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．,８６６〜８６８頁（１９８５）等）。従って、フィチン酸を多量に生産することができる本発明の形質転換植物体は、イノシトールやキロ−イノシトール、シロ−イノシトール等の生産にも有用であることは明白である。
【００４５】
以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は、フィチン酸生合成に関連する特定の遺伝子を過剰発現させることで、植物体に高フィチン酸合成能を付与できることを示す。従って、以下では、２−ホスホグリセレートキナーゼ（ＯｓＰＧＫ１）、ＡＴＰ結合カセット輸送体（ＯｓＭＲＰ１３）、ミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ（ＲＩＮＯ１）及びイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼ（ＯｓＩＰＫ１）が本発明の実施例であり、ミオ−イノシトールキナーゼ（ＯｓＭＩＫ）及びイノシトール１,３,４−トリスキスフォスフェート  ５／６−キナーゼ−１（ＯｓＩＴＰ５／６Ｋ−１）は参考例である。なお、それぞれの遺伝子のＲＡＰ  ＩＤはＲＩＮＯ１（Ｏｓ０３ｇ０１９２７００），ＯｓＰＧＫ１（Ｏｓ０２ｇ０８１９４００），ＯｓＭＩＫ（Ｏｓ０３ｇ０７３７７０１），ＯｓＩＴＰ５／６Ｋ−１（Ｏｓ０９ｇ０５１８７００），ＯｓＩＰＫ１（Ｏｓ０４ｇ０６６１２００）、及びＯｓＭＲＰ１３（Ｏｓ０３ｇ０１４２８００）である。
【００４７】
［実施例１］  形質転換植物の作出
ａ．導入コンストラクトの構築
すべてのコンストラクトの構築にはＧａｔｅｗａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、目的遺伝子の配列を含むエントリークローンとデスティネーションベクター（アクチンプロモーター、Ｎｏｓターミネーターを含むｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−ＧｗまたはＰａｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｒ５（クミアイ化学工業社））の間でＬＲ反応を行わせることで、目的のコンストラクトを完成させた（図８及び図９）。
【００４８】
より詳細には：
ＲＩＮＯ１
イネの培養細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーからＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ法により再分化特異的クローンを同定した（ｐＲＩＮＯ１クローン）。ｐＲＩＮＯ１クローンをもとに下記のプライマーペアを用いて、ＰＣＲによりミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼのＯＲＦを含む領域を増幅し、ｇａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，植物形質転換用ベクターｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−ＧＷまたはＰａｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｒ５に導入した。
【化５】
2014042516.tif 000007
【００４９】
ＯｓＩＰＫ１
イネの未熟胚から調製したｃＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーペアを用いて、ＰＣＲによりイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼのＯＲＦを含む領域を増幅し、ｇａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，植物形質転換用ベクターｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−ＧＷに導入した。
【化６】
2014042516.tif 000008
【００５０】
ＯｓＩＴＰ５／６Ｋ−１
イネのｃＤＮＡクローン（ＡＫ１０２５７１）を鋳型として、下記のプライマーペアを用いて、ＰＣＲによりイノシトール１,３,４−トリスキスフォスフェート  ５／６−キナーゼ−１のＯＲＦを含む領域を増幅し、ｇａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，植物形質転換用ベクターｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−ＧＷに導入した。
【化７】
2014042516.tif 000009
【００５１】
ＯｓＭＩＫ
イネのｃＤＮＡクローン（ＡＫ２４３４４４）を鋳型として、下記のプライマーペアを用いて、ＰＣＲによりミオ−イノシトールキナーゼのＯＲＦを含む領域を増幅し、ｇａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，植物形質転換用ベクターｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−ＧＷに導入した。
【化８】
2014042516.tif 000010
【００５２】
ＯｓＰＧＫ１
イネの未熟胚から調製したｃＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーペアを用いて、ＰＣＲにより２−ホスホグリセレートキナーゼのＯＲＦを含む領域を増幅し、ｇａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，植物形質転換用ベクターｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−ＧＷに導入した。
【化９】
2014042516.tif 000011
【００５３】
ＯｓＭＲＰ１３
イネのｃＤＮＡクローン（ＡＫ１２１４５１）を鋳型として、下記のプライマーペアを用いて、ＰＣＲによりＡＢＣトランスポーターのＯＲＦを含む領域を増幅し、ｇａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，植物形質転換用ベクターｐＡｃｔｎｏｓ／Ｈｍ２−ＧＷまたはＰａｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｒ５（クミアイ化学工業）に導入した。
【化１０】
2014042516.tif 000012
【００５４】
目的のコンストラクトを持つプラスミドをＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  （ＥＨＡ１０５）に導入した。形質転換体の作出は  Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．４７，ｐｐ.９６９−９７６（２００６）の方法に準じて行われた。
【００５５】
ｂ．アグロバクテリウムを用いた形質転換体の作出
イネ品種キタアケを対象として形質転換を行った。各植物の完熟種子の外頴と内頴を除去し、２倍希釈次亜塩素酸中で３０分撹拌の後、水で洗浄し１％過酸化水素水で３時間撹拌しながら滅菌した。これをさらに水で洗浄し、２倍希釈次亜塩素酸溶液で１０分処理後、滅菌水で十分に洗浄して、Ｎ６Ｄ培地（表１及び２）に置床した。７日後、胚乳や芽を取り除き、膨らんだ胚盤のみを新しいＮ６Ｄ培地に置床した。２１日後、塊１ｍｍ程度の大きさの鮮やかな黄色のカルスを選抜して、カルスを細かい塊に分け、新しいＮ６Ｄ培地に置床し、３日間培養した。ここまでの培養は、２８℃、１４時間明期で行った。感染させるアグロバクテリウムは、抗生物質（デスティネーションベクターにＰａｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｒ５を用いた場合はｋａｎａｍｙｃｉｎ（５０ｍｇ／ｌ）とｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ（４０ｍｇ／ｌ）、その他の場合は全てｋａｎａｍｙｃｉｎ（５０ｍｇ／ｌ）とｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ（５０ｍｇ／ｌ）；括弧内は最終濃度を表す。）を加えたＬＢ液体培地で１８０ｒｐｍ，２８℃，暗黒下で一晩培養した後、ＬＢ固体培地で２８℃，暗黒下で３日間前培養させた。ミクロスパーテルでかき取ったアグロバクテリウムをＡＡＭ培地（表１及び２）に溶解させ、ＯＤ６００が０．１になるようにその希釈液を調製した。感染は希釈液２０ｍｌにカルスを入れ、９０秒間室温で振とうすることによって行った。感染させたカルスはキムタオル（商品名）で十分に液を除いた後、共存培地（表１及び２）５．５ｍｌを含んだ直径９０ｍｍの定性濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ，９０３２７１６１）に置床し、２５℃、暗所で３日間培養した後、除菌した。除菌はＭｅｒｏｐｅｎ（商品名：２５ｍｇ／ｌ）を含んだ滅菌水でカルスを３回洗うことにより行った。除菌後のカルスはＮ６Ｄ選抜培地（表１及び２）に置床し、２８℃、１４時間明期で２週間培養させた後、すべてのカルスを新しいＮ６Ｄ選抜培地に移した。さらに１０日後、成長した新しいカルスを新しいＮ６Ｄ選抜培地に移した。７日後、活発に増殖したカルスを再分化培地（表２）に移して同じ条件で３週間程度培養し、再分化個体を発根培地（表１及び２）に移して植物体を育成した。なお、Ｎ６Ｄ選抜培地及び再分化培地に加える抗生物質として、デスティネーションベクターにＰａｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｒ５を用いた場合はＭｅｒｏｐｅｎ（２５ｍｇ／ｌ）とビスピリバックナトリウム塩（０．２５μＭ）、その他の場合は全てＭｅｒｏｐｅｎ（２５ｍｇ／ｌ）とｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ（５０ｍｇ／ｌ）を使用した。
【００５６】
【表１】
2014042516.tif 000013
【００５７】
【表２】
2014042516.tif 000014
【００５８】
ｃ．植物体の育成
形質転換体の育成は、東京大学農学部閉鎖系バイオトロン内で、長日条件で自然光の下、短日条件で人工光の下、昼３０℃夜２５℃の条件で行った。全ての形質転換植物は、野生型と同等に生育した。
【００５９】
［実施例２］  リンの定量
上記のようにして作出し、育成した形質転換植物（Ｔ１〜Ｔ４）について、フィチン酸及び無機リンを測定した。
ｄ．サンプルの調製
実験に用いる全ての器具は、リンを除去する目的で０．４Ｎ硝酸に一晩浸漬し、水洗後乾燥させて用いた。種子は外頴と内頴を取り除き、６０℃で４８時間乾燥させた。乾燥種子の重さを測定した後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪、日本）を用いて種子を破砕した。葉、根については重さを測定した後、液体窒素で凍結させマルチビーズショッカーで破砕した。
ｅ．フィチン酸及び無機リンの定量
フィチン酸やイノシトールリン酸類、及び無機リンの測定のため、イオンクロマトグラフィーを行った。マルチビーズショッカーで粉砕後、種子はサンプル１ｍｇに対して１８μｌの２．４％ＨＣｌを加え、さらに乳棒乳鉢を用いてすり潰して調製した。調製したサンプルは９７℃１０分間の熱処理後、４℃１５０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、上清３００μｌを５μｍフィルターチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳＡ）に入れ、７４００ｒｐｍで５分間遠心を行い濾過した。得られた濾液１００μｌを、１００００ＭＷフィルターチューブ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて１２９００ｒｐｍ、３０分の遠心で限外濾過を行った。その後、濾液２μｌに水２３４μｌ、２．４％ＨＣｌ  ４μｌを加えて１２０倍希釈とした。種子に大量に含まれる油脂を除去する目的で、２５０μｌのヘキサンを加えて１０分間振とうし、１５０００ｒｐｍで１０分間の遠心を行い、下層（水層）２００μｌを回収した。それをさらに５分間遠心し、下層１５０μｌを回収して試料とした。葉からも上記に準じて資料を作製した。イオンクロマトグラフィーはＭｉｔｓｕｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３８，ｐｐ．１６０７−１６１４（２００５）の方法に従い、５〜８０ｍＭ  ＫＯＨ  ９０ｍｉｎのグラジェント溶出で、陰イオン交換カラムＤｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ２０（商品名）を用いて行った。
【００６０】
図１０に、２−ホスホグリセレートキナーゼのコード化遺伝子（ＯｓＰＧＫ1）及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼのコード化遺伝子（ＲＩＮＯ１）で形質転換した植物の、発芽後２８日目第６葉でのフィチン酸合成量を、野生型キタアケのフィチン酸合成量と比較した典型的なクロマトグラムを示した。また。図１１に、ＡＴＰ結合カセット輸送体のコード化遺伝子（ＯｓＭＲＰ１３）、イノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼのコード化遺伝子（ＯｓＩＰＫ１）及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼのコード化遺伝子（ＲＩＮＯ１）で形質転換した植物（２クロ−ン）の種子中でのフィチン酸合成量を、野生型キタアケのフィチン酸合成量と比較したクロマトグラムを示した。なお、これらの多重形質転換体は、実施例１の方法により予め作出したＲＩＮＯ１及び／又はＯｓＩＰＫ１導入系統（品種キタアケ、Ｔ３またはＴ４種子を使用）を用いて更に形質転換することで作出した。それらの図に示した結果から、当該形質転換体は、種子だけではなく植物体全体で、有意に多量のフィチン酸を合成することが判明した。
【００６１】
更に、作出した形質転換植物の種子中でのフィチン酸合成量を非組換体植物のフィチン酸合成量と比べた結果を表３に示した。値は、各々の形質転換体のクローンのうちで最も高いフィチン酸合成能を示した形質転換体の値と非組換体の平均値を比較したものである。表から、２−ホスホグリセレートキナーゼ又はＡＴＰ結合カセット輸送体をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体では、フィチン酸合成が２倍以上も活性化され得ることがわかった。更に、それらの遺伝子に加えてミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼ又はイノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼをコードする遺伝子を過剰発現させた場合も、やはりフィチン酸合成が２倍以上も活性化され得ることがわかった。もっとも高い活性化を示したのは、２−ホスホグリセレートキナーゼのコード化遺伝子（ＯｓＰＧＫ1）及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼのコード化遺伝子（ＲＩＮＯ１）で形質転換した植物、及びＡＴＰ結合カセット輸送体のコード化遺伝子（ＯｓＭＲＰ１３）、イノシトール  １，３，４，５，６−ペンタキスフォスフェート  ２−キナーゼのコード化遺伝子（ＯｓＩＰＫ１）及びミオ−イノシトール  ３−フォスフェートシンターゼのコード化遺伝子（ＲＩＮＯ１）で形質転換した植物であった（約２．６倍）。しかしながら、ミオ−イノシトールキナーゼのコード化遺伝子（ＯｓＭＩＫ）及びイノシトール１,３,４−トリスキスフォスフェート  ５／６−キナーゼ−１のコード化遺伝子（ＯｓＩＴＰ５／６Ｋ−１）を過剰発現させてもフィチン酸合成は活性化されなかった。
【表３】
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【００６２】
一方、図１２に示したように、上記のとおりフィチン酸合成が活性化された形質転換植物の種子中の無機リン量は、非形質転換体のものと変わりがなかった。従って、本発明の形質転換植物は、野生型植物よりも顕著に高いリン吸収能を示すことが判明した。
【００６３】
更に、図１３では、本発明の形質転換植物が、より多量のリンを環境から吸収する能力を、形質転換植物と野生型植物の種子１個あたりの総リン量を比較することで示した。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
したがって、本発明は、環境浄化のために利用できる。更に本発明は、イノシトール及び関連する生理活性物質の生産に利用できる。従って、本発明は、環境事業や医薬品等の製造業において有用であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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