(57)【要約】【課題】本発明は神経芽腫の悪性度を決定する方法又は予後を判定する方法を提供することを目的とする。また、本発明は被験体中の神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、悪性度の高い神経芽腫用の薬剤となりうる化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、被験体から取得されたサンプル中のCDX1の発現レベルを決定することにより神経芽腫の悪性度を決定する、予後を判定する、又は神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出する方法を提供する。さらに本発明は、CDX1の活性を阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。【選択図】図２２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経芽腫の悪性度の決定を補助する方法及び／又は神経芽腫の予後判定を補助する方法であって、
（ａ）被験体から取得されたサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルを決定するステップ、
（ｂ）決定されたCDX1遺伝子の発現レベルを、標準と比較するステップ、
を含み、ここでCDX1遺伝子の発現レベルが標準よりも高い場合は神経芽腫の悪性度が高いと決定する又は予後が不良であると判定することの補助となる、前記方法。
【請求項２】
被験体中の神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出する方法であって、
（ａ）被験体から取得されたサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルを決定するステップ、
（ｂ）決定されたCDX1遺伝子の発現レベルを、標準と比較するステップ、
を含み、ここでサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルが標準よりも高いことは、被験体中の神経芽腫スフェアを形成しうる細胞の存在を示す、前記方法。
【請求項３】
CDX1遺伝子の発現レベルを決定する手段を含む、神経芽腫の悪性度を決定するため、神経芽腫の予後を判定するため、又は神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出するためのキット。
【請求項４】
CDX1遺伝子の発現レベルを決定する手段が、CDX1遺伝子の発現を検出するためのプライマー、CDX1遺伝子のmRNAを標的とする標識された核酸、又は標識された抗CDX1抗体である、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
CDX1を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップ、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物又はCDX1遺伝子を有する核酸構築物と候補化合物とを、神経芽腫スフェアを形成しうる細胞に与え、
（ｂ）神経芽腫スフェアを形成しうる条件下、かつ（ａ）においてCDX1遺伝子を有する核酸構築物を用いた場合は当該核酸構築物中のCDX1遺伝子が発現されうる条件下で、前記細胞を培養し、
（ｃ）形成される神経芽腫スフェアの数を計測すること、及び
（ｄ）前記（ｃ）で計測された数を、陽性対照と比較すること
を含み、
陽性対照は神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を、候補化合物の不在下及びCDX1遺伝子の発現産物又はCDX1遺伝子を有する核酸構築物の存在下で、神経芽腫スフェアを形成しうる条件下かつ（ａ）においてCDX1遺伝子を有する核酸構築物を用いる場合は当該核酸構築物中のCDX1遺伝子が発現されうる条件下で培養したときに形成される神経芽腫スフェアの数であり、
陽性対照と比較して神経芽腫スフェアの形成が抑制されることは、候補化合物がCDX1を阻害することを示す、前記方法。
【請求項６】
CDX1のCD133転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップ、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物と候補化合物とを、レポーター遺伝子と機能的に連結されたCD133のプロモーターP1を有する核酸構築物を含む形質転換細胞又はモデル非ヒト動物に加えること、
（ｂ）前記レポーター遺伝子が発現され得る条件下で前記細胞又はモデル非ヒト動物を培養又は生育すること、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を検出すること、
を含み、レポーター遺伝子の発現が検出されないことは、候補化合物がCDX1のCD133転写促進活性を阻害することを示す、前記方法。
【請求項７】
CD133のプロモーターP1が配列番号３０又は配列番号３８に記載の塩基配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
CDX1のOCT4転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップ、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物と候補化合物とを、レポーター遺伝子と機能的に連結されたOCT4のプロモーター配列を有する核酸構築物を含む形質転換細胞又はモデル非ヒト動物に加えること、
（ｂ）前記レポーター遺伝子が発現され得る条件下で前記細胞又はモデル非ヒト動物を培養又は生育すること、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を検出すること、
を含み、レポーター遺伝子の発現が検出されないことは、候補化合物がCDX1のOCT4転写促進活性を阻害することを示す、前記方法。
【請求項９】
OCT4のプロモーター配列がOCT4のプロモーターA及び／若しくはDの配列を有するものであり、OCT4のプロモーターAが配列番号３２に記載の塩基配列を有し、かつ／又はOCT4のプロモーターDが配列番号３３に記載の塩基配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
CDX1遺伝子が配列番号３４に記載の塩基配列を有するヒトCDX1遺伝子である、請求項５−９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CDX1による神経芽腫の悪性度の決定と予後判定に関する。また、本発明は、被験体中の神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出する方法に関する。さらに、本発明はCDX1の活性を阻害する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療の分野では、癌幹細胞が最近注目されている。癌幹細胞とは、幹細胞の性質を有する癌細胞であり、薬剤耐性があり、癌を再生する能力が高いとされる。化学療法等によって大部分の癌細胞を死滅させても、薬剤耐性を有する癌幹細胞が存在するとそこからまた癌が再発し得る。そこで癌幹細胞を特異的に治療できれば、癌の再発を効果的に防ぐことができ、治療に役立てることができる。
【０００３】
癌幹細胞のマーカーとしていくつか報告がなされており、中でもCD133が癌幹細胞で発現していることが報告されている（非特許文献１−８）。そのため、CD133は癌幹細胞のマーカーであると考えられている。しかしながら大腸癌及び神経膠腫ではCD133陰性癌幹細胞の報告例もあり（非特許文献９−１２）、CD133は大腸癌、脳腫瘍の癌幹細胞マーカーの一つであるが、他の癌幹細胞マーカー（CD44、ALDH、スフェア形成）も存在する。
【０００４】
CD133はAC133抗原として同定されCD34陽性の血液幹細胞で発現が確認された5回膜貫通型タンパクである(非特許文献１３)。CD133(Prominin 1ともいう)の染色体部位はヒト4p15.33、マウス5番染色体である。ヒトのCD133は865アミノ酸、分子量120 kDaである。またProminin 1は形質転換可能な腸幹細胞に発現している（非特許文献１４）。
【０００５】
CD133は網膜の維持に作用することが報告されており、CD133の喪失はディスク異常形態発生及び光受容体変性を引き起こす（非特許文献１５）。また、ヒトCD133でのフレームシフト変異は、ヒト網膜変性を引き起こす（非特許文献１６）。さらに、網膜変性の遺伝病を有する患者にはCD133遺伝子の突然変異がみられた。
しかしながら、これらの報告では、発癌や癌難治化におけるCD133の機能は解明されていない。
【０００６】
CD133の転写調節に関してはいくつかの報告がある。CD133遺伝子の5'-UTR構造は図１に示すとおりであり、CD133発現は異なるプロモーターにより駆動され、主にDNAメチル化により制御されることが報告されている（非特許文献１７−２１）。また、CD133にはP1〜P5のプロモーターがあることが報告されている（非特許文献１７）。
【０００７】
CD133の発現は、幹細胞様の神経芽腫（Neuroblastoma, NB）細胞で報告例がある。WaltonらはCD133が神経芽腫の幹細胞において役割を有する可能性を示唆した（非特許文献２２）。
【０００８】
神経芽腫は、小児癌の一種であり、神経芽細胞が成長の途中で異常に増殖する癌である。神経芽腫は、頭蓋外固形腫瘍では最も頻度が高い難治性腫瘍であり、小児固形悪性腫瘍において脳腫瘍に次いで発症者数が多い悪性腫瘍である。日本国の年間発症者数は200〜250人程度と推測されている。早期例の予後は一般に良好だが、進行例の予後はわが国ではINSS(神経芽細胞腫国際病期分類：International Neuroblastoma Staging System)IV期で30数％程度と未だに不良である。神経芽腫には臨床的に、そして生物学的に異なるサブセットがある。予後が良好な神経芽腫は一般に生後１２月未満が多く、再発性も低い。予後が不良の神経芽腫は生後１２ヶ月以降の症例が多く進行は早い。したがって、神経芽腫の予後が良好か不良かを早期に知ることができれば、治療に役立てることができると考えられる。
【０００９】
Hansfordらは神経芽腫に腫瘍始原細胞が含まれることを報告した（非特許文献２３）。Hansfordらによると、腫瘍から遊離した細胞は特定の条件下でスフェアとして増殖した（同文献）。この神経芽腫スフェアは造腫瘍能が高く、悪性度の高い神経芽腫由来のわずか１０個の継代腫瘍スフェア細胞でもマウスに注射すると神経芽腫を形成することが記載されている。また、神経芽腫スフェアにおいてCD133がアップレギュレートされていることも報告されている（非特許文献２４）。
【００１０】
そこで癌幹細胞マーカーCD133の神経芽腫における機能に興味が持たれていたが、本発明者らはCD133がシグナル伝達経路の改変により神経芽腫細胞分化を抑制することを確認した（非特許文献２５）。CD133は複数の神経芽腫細胞において発現している。また生後１歳以上の小児におけるCD133発現量が高い群と低い群とでは生存率が異なり、CD133発現量が高い群では予後不良である。またCD133は神経芽腫細胞増殖をアップレギュレートしている。逆にCD133をノックダウンすると神経芽腫細胞増殖及び腫瘍成長が抑制され、軟寒天培地上でコロニーを形成しなくなる。さらに、CD133をノックダウンした神経芽腫はマウスに移植しても腫瘍を形成しない。またCD133関連神経芽腫細胞分化とRET抑制は、p38MAPK及びPI3K/AKT経路に依存している（非特許文献２５）。非特許文献２５ではさらに、CD133が神経芽腫におけるRET転写を抑制することが記載されている。RETは交感神経副腎系の発達と分化に関わるGDNF受容体である（非特許文献２６）。
【００１１】
神経芽腫の発癌機構や癌幹細胞の性質を知るには、神経芽腫スフェアに特異的なCD133発現制御機構の解明が必要とされている。またCD133シグナル経路の解明が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Singh et al., Nature. 2004 Nov 18;432(7015):396-401.
【非特許文献２】Beier et al., Cancer Res. 2007 May 1;67(9):4010-5.
【非特許文献３】O’Brien et al., Nature. 2007 Jan 4;445(7123):106-10.
【非特許文献４】Ricci-Vitiani et al., Nature. 2007 Jan 4;445(7123):111-5.
【非特許文献５】Collins et al., Cancer Res. 2005 Dec 1;65(23):10946-51.
【非特許文献６】Ito et al., Nature. 2008 Jun 19;453(7198):1072-8.
【非特許文献７】Ma S et al., Gastroenterology. 2007 Jun;132(7):2542-56.
【非特許文献８】Ma S et al., Oncogene. 2008 Mar 13;27(12):1749-58.
【非特許文献９】Shmelkov SV et al. J Clin. Invest. 118, 2021-4 (2008)
【非特許文献１０】Dalerba P et al. Proc. Nat, Acad. Sci. USA 104: 10158-63 (2007)
【非特許文献１１】Chu P et al. Int. J. Cancer 124: 1312-21 (2009)
【非特許文献１２】KELLY JJP et al., STEM CELLS 2009;27:1722-1733
【非特許文献１３】Yin AH et al., Blood. 1997 Dec 15;90(12):5002-12.
【非特許文献１４】Zhu L et al. Nature 457, 603-7 (2009)
【非特許文献１５】S. Zacchigna et al. J. Neuroscience, 2009, 29, 2297-2308
【非特許文献１６】Maw M et al. Human Molecular genetics, 2000, 9, 27-34.
【非特許文献１７】Shmelkov SV et al., Blood. 2004 Mar 15;103(6):2055-61.
【非特許文献１８】Tabu K et al., Cell Res. 2008 Oct;18(10):1037-46.
【非特許文献１９】Baba T et al., Oncogene. 2009 Jan 15;28(2):209-18.
【非特許文献２０】Pleshkan VV et al., Biochim Biophys Acta. 2008 Oct;1779(10):599-605.
【非特許文献２１】Yi JM et al., Cancer Res. 2008 Oct 1;68(19):8094-103.
【非特許文献２２】Walton et al., Neoplasia. 2004 Nov-Dec;6(6):838-45.
【非特許文献２３】Hansford et al., Cancer Res. 2007 Dec 1;67(23):11234-43.
【非特許文献２４】Coulon A et al., Neoplasia. 2011 October; 13(10): 991-1004.
【非特許文献２５】Takenobu H et al., Oncogene. 2011 Jan 6;30(1):97-105
【非特許文献２６】Klein, 1994, FASEB J. 1994 Jul;8(10):738-44.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、神経芽腫の悪性度を決定する方法又は神経芽腫の予後を判定する方法を提供することを目的とする。また、本発明は神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は神経芽腫用の薬剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、神経芽腫スフェアにおいて発現量が増大しているCD133に着目し、神経芽腫スフェアに特異的なCD133発現制御機構の解明について鋭意研究を重ねた結果、CDX1がCD133の発現を調節していることを見出し、本発明を完成させた。さらに本発明者らは、CDX1がOCT4の発現を調節していることも見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１５】
[1]  神経芽腫の悪性度の決定を補助する方法及び／又は神経芽腫の予後判定を補助する方法であって、
（ａ）被験体から取得されたサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルを決定するステップ、
（ｂ）決定されたCDX1遺伝子の発現レベルを、標準と比較するステップ、
を含み、ここでCDX1遺伝子の発現レベルが標準よりも高い場合は神経芽腫の悪性度が高いと決定する又は予後が不良であると判定することの補助となる、前記方法。
[2]  被験体中の神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出する方法であって、
（ａ）被験体から取得されたサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルを決定するステップ、
（ｂ）決定されたCDX1遺伝子の発現レベルを、標準と比較するステップ、
を含み、ここでサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルが標準よりも高いことは、被験体中の神経芽腫スフェアを形成しうる細胞の存在を示す、前記方法。
[3]  CDX1遺伝子の発現レベルを決定する手段を含む、神経芽腫の悪性度を決定するため、神経芽腫の予後を判定するため、又は神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出するためのキット。
[4]  CDX1遺伝子の発現レベルを決定する手段が、CDX1遺伝子の発現を検出するためのプライマー、CDX1遺伝子のmRNAを標的とする標識された核酸、又は標識された抗CDX1抗体である、[3]に記載のキット。
[5]  CDX1を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップ、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物又はCDX1遺伝子を有する核酸構築物と候補化合物とを、神経芽腫スフェアを形成しうる細胞に与え、
（ｂ）神経芽腫スフェアを形成しうる条件下、かつ（ａ）においてCDX1遺伝子を有する核酸構築物を用いた場合は当該核酸構築物中のCDX1遺伝子が発現されうる条件下で、前記細胞を培養し、
（ｃ）形成される神経芽腫スフェアの数を計測すること、及び
（ｄ）前記（ｃ）で計測された数を、陽性対照と比較すること
を含み、
陽性対照は神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を、候補化合物の不在下及びCDX1遺伝子の発現産物又はCDX1遺伝子を有する核酸構築物の存在下で、神経芽腫スフェアを形成しうる条件下かつ（ａ）においてCDX1遺伝子を有する核酸構築物を用いる場合は当該核酸構築物中のCDX1遺伝子が発現されうる条件下で培養したときに形成される神経芽腫スフェアの数であり、
陽性対照と比較して神経芽腫スフェアの形成が抑制されることは、候補化合物がCDX1を阻害することを示す、前記方法。
[6]  CDX1のCD133転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップ、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物と候補化合物とを、レポーター遺伝子と機能的に連結されたCD133のプロモーターP1を有する核酸構築物を含む形質転換細胞又はモデル非ヒト動物に加えること、
（ｂ）前記レポーター遺伝子が発現され得る条件下で前記細胞又はモデル非ヒト動物を培養又は生育すること、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を検出すること、
を含み、レポーター遺伝子の発現が検出されないことは、候補化合物がCDX1のCD133転写促進活性を阻害することを示す、前記方法。
[7]  CD133のプロモーターP1が配列番号３０又は配列番号３８に記載の塩基配列を有する、[6]に記載の方法。
[8]  CDX1のOCT4転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップ、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物と候補化合物とを、レポーター遺伝子と機能的に連結されたOCT4のプロモーター配列を有する核酸構築物を含む形質転換細胞又はモデル非ヒト動物に加えること、
（ｂ）前記レポーター遺伝子が発現され得る条件下で前記細胞又はモデル非ヒト動物を培養又は生育すること、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を検出すること、
を含み、レポーター遺伝子の発現が検出されないことは、候補化合物がCDX1のOCT4転写促進活性を阻害することを示す、前記方法。
[9]  OCT4のプロモーター配列がOCT4のプロモーターA及び／若しくはDの配列を有するものであり、OCT4のプロモーターAが配列番号３２に記載の塩基配列を有し、かつ／又はOCT4のプロモーターDが配列番号３３に記載の塩基配列を有する、[8]の方法。
[10]  CDX1遺伝子が配列番号３４に記載の塩基配列を有するヒトCDX1遺伝子である、[5]−[9]のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
CDX1遺伝子の発現レベルを測定すると、神経芽腫の悪性度を決定することができ、又は神経芽腫の予後を判定することができ、または被験者中の神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出することができる。
【００１７】
CDX1のCD133又はOCT4転写促進活性を利用することにより、CDX1の活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。これによりCDX1の阻害剤を特定し、神経芽腫の治療に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】CD133遺伝子の5'-UTR構造を示す図である。
【図２】CD133遺伝子とプラスミドpGL4.17-2.5k、pGL4.17-1.8k、pGL4.17-1.1k、pGL4.17-0.6kのインサートの位置関係を示す。
【図３】CD133遺伝子とプラスミドpGL4.17-1.1k、pGL4.17-0.4k及びpGL4.17-0.7kのインサートの位置関係を示す。
【図４】スフェア特異的なCD133プロモーターを探索した結果を示す。
【図５】CD133のプロモーターアッセイの結果を示す。
【図６】より詳細なCD133のプロモーターアッセイの結果を示す。CDX1によりCD133 P1プロモーターが活性化される。
【図７】CD133のP1（1.1k）に存在する転写因子結合部位を示す。CDX1結合部位が多く見られた。
【図８】上段にスフェア特異的に発現が増大している転写因子を調べた結果を示す。転写因子CDX1の発現が増大していることが確認された。下段ではCDX1遺伝子がスフェア特異的に発現していることの定量的な結果を示す。
【図９】定量的PCRを用いてCDX1によるCD133の発現誘導を確認した結果を示す。
【図１０】CDX1によるCD133の発現誘導をウェスタンブロットにより確認した結果を示す。
【図１１】CDX1を導入した場合のCD133 ORF、CD133 exon 1A、CD133 exon 1Bの転写を調べた結果を示す。
【図１２】CDX1をノックダウンしたときのCD133の転写を調べた結果を示す。
【図１３】ChIPアッセイの結果を示す。CDX1がCD133のプロモーターP1に直接結合して作用することを確認した。
【図１４】hCDX1 shRNAを使用してCDX1をノックダウンした場合のスフェア形成をアッセイした結果を示す。図１４の上段は形態観察結果であり、左下はCD133の転写量を比較した結果である。また右下は形成されたスフェアの数である。
【図１５】FACSを用いて神経芽腫細胞のCD133発現を調べた結果を示す。CDX1発現がCD133発現を促進することが確認された。
【図１６】FLAG-hCDX1過剰発現の細胞増殖に対する影響を調べた結果を示す。
【図１７】CDX1発現の腫瘍発育に対する影響を調べた結果を示す。
【図１８】CDX1とCD133の腫瘍初代培養細胞に対する影響を調べた結果を示す。
【図１９】CDX1とCD133の腫瘍初代培養細胞に対する影響を平均した結果を示す。
【図２０】CDX1をノックダウンした場合のスフェアを形成における影響をCD133が部分的にキャンセルすることを確認した結果を示す。
【図２１】CDX1改変細胞を使用し、細胞リプログラミング因子の発現に対する影響を調べた結果を示す。CDX1がOCT4の転写を促進することを確認できた。
【図２２】ChIPアッセイ結果を示す。CDX1はOCT4のプロモーターA及びDに直接結合して作用することを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．神経芽腫の悪性度の決定
本発明者らは、神経芽腫スフェアにおいてCDX1の転写量が増大していること（図８参照）、CDX1を過剰発現させると細胞増殖が促進されること（図１６）やCDX1発現が腫瘍発育を促進すること（図１７）を見出した。逆にCDX1をノックダウンすると神経芽腫のスフェア形成が抑制されることも確認した（図１４）。したがってCDX1遺伝子の発現レベルは神経芽腫スフェア形成の促進、ひいては神経芽腫の悪性度と関連している。これらのことから、CDX1遺伝子の発現レベルを測定して神経芽腫の悪性度を決定することができる。なおCDX1はホメオボックス(homeobox)を持つ転写因子で、ゲノム上の特定の配列、特にTTTATというコア配列を認識して結合する（Nucleic Acids Res. 2003 Sep 15;31(18):5238-46）。CDX1のノックアウトマウスは、脊椎骨等の数が増減することから、生体の発生における骨などの体節形成に重要であることが示唆されている（Cell. 1995 Nov 17;83(4):641-53；Development. 2002 May;129(9):2181-93）。また、同じCDXファミリーであるCDX2との発現量のバランスによって、胃、小腸では発がんに、大腸ではがん抑制に働いていることが近年明らかになりつつある（Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Dec 11;109(50):20584-9；Oncogene. 2008 Jul 24;27(32):4497-502；Int J Cancer. 1997 Feb 20;74(1):35-44；Oncogene. 2003 Sep 11;22(39):7913-21等）。
【００２０】
すなわち、本発明は被験体の神経芽腫の悪性度を決定する方法又は悪性度の決定を補助する方法を提供する。この方法は、（ａ）被験体から取得されたサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルを決定するステップ、及び（ｂ）決定されたCDX1遺伝子の発現レベルを、標準と比較するステップを含む。CDX1遺伝子の発現レベルが標準よりも高い場合は神経芽腫の悪性度が高いと決定する、または決定することの補助となる。
【００２１】
本明細書において用いる神経芽腫の悪性度とは、神経芽腫の転移性・再発性、増殖速度等の諸性質の悪性の度合いをいう。神経芽腫の悪性度が高いほど転移・再発しやすく治療が困難である。逆に神経芽腫の悪性度が低いほど治療は容易であり、治療が不要であったり、症例によっては自然退縮が見られることもあり、転移や再発は希である。また、本明細書において悪性度の高い神経芽腫を高リスク神経芽腫、悪性度の低い神経芽腫を低リスク神経芽腫と呼ぶことがある。
【００２２】
本明細書において神経芽腫の悪性度を決定する、とは、神経芽腫の悪性度が高いか低いかを決定することをいう。本発明に係る方法を用いれば、医師の判断が介在することなしに、神経芽腫の悪性度をin vitroの工程のみで決定することができる。
【００２３】
CDX1遺伝子の発現レベルが神経芽腫スフェア形成の促進、ひいては神経芽腫の悪性度と関連していることから、本発明に係る方法は、神経芽腫の予後判定、又は予後判定の補助に用いることもできる。この方法は、（ａ）被験体から取得されたサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルを決定するステップ、及び（ｂ）決定されたCDX1遺伝子の発現レベルを、標準と比較するステップ、を含む。CDX1遺伝子の発現レベルが標準よりも高い場合は予後が不良であると判定する、又は判定することの補助となる。
【００２４】
本明細書において神経芽腫の「予後が良好である」とは、神経芽腫が限局的に存在するか、自然退縮して良性腫瘍となった状態、神経芽腫の転移や再発の可能性がほとんど若しくは全くない状態又は治療をほとんど必要としない状態をいう。一般に、神経芽腫の悪性度が低いと、予後は良好である。
【００２５】
本明細書において神経芽腫の「予後が不良である」とは、神経芽腫の腫瘍に進行が認められ、公知の診断マーカーなどから悪性度が高いと判断される状態をいう。一般に、神経芽腫の悪性度が高いと、再発や転移のリスクが高く、予後は不良である。
【００２６】
本明細書において遺伝子という場合、これは転写産物に対応する構造遺伝子やエキソンのみならず、プロモーターなどの調節領域、非転写領域、及びイントロンなどの非翻訳領域も含むものとする。したがってある遺伝子の発現レベルとは、当該遺伝子がタンパク質をコードする場合、当該遺伝子の転写量又は当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量を意味し、転写産物(mRNA)の量又は当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量を測定することにより決定できる。遺伝子の発現レベルが標準よりも高いとは、標準と比較したときに、統計的に有意な差があり当該遺伝子の発現レベルが有意に高いことをいう。当業者であれば標準偏差や標準誤差などから統計的に有意な差を適宜決定することができる。また、当業者であれば、標準と比較したときに低い発現レベルを適宜決定することができる。
【００２７】
一実施形態において、標準は、健康な被験体におけるCDX1遺伝子の発現レベル、又は試験される同じ被験体の非癌性組織中のCDX1遺伝子の発現レベルに対応する。CDX1遺伝子の標準的な発現レベルは、慣用の実験と統計的分析によって確立することができる。当業者であれば所定の標準的発現レベル、例えば健常な被験体中での標準的CDX1発現レベルを周知の方法を用いて決定することができる。
【００２８】
本明細書において健常な被験体とは、神経芽腫と診断されていないか、又は癌と診断されていない被験体又は被験者をいう。別の実施形態において、健常な被験体とは、神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を有しない又は神経芽腫癌幹細胞を有しない被験体又は被験者をいう。
【００２９】
本発明に係る方法は、被験体から取得されたサンプルが、悪性度の高い神経芽腫を有する被験体に由来するものであるか否かを決定するために用いることができる。この場合、CDX1の発現レベルが標準よりも高い場合はサンプルが悪性度の高い神経芽腫を有する被験体に由来すると決定できる。
【００３０】
２．神経芽腫スフェアを形成しうる細胞の検出
本発明者らは、神経芽腫スフェアにおいてCDX1遺伝子の転写量が増大していること（図８）、CDX1をノックダウンすると神経芽腫のスフェア形成が抑制されること（図１４）、CDX1がスフェア形成を促進すること（図１８、１９）を見出した。こうしたことから、CDX1遺伝子の発現レベルが高い神経芽腫細胞は強いスフェア形成性を示す。このことを利用してCDX1遺伝子の発現レベルを測定することにより、神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出することができる。
【００３１】
すなわち本発明は、被験体における神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出する方法を提供する。この方法は（ａ）被験体から取得されたサンプル中のCDX1遺伝子の発現レベルを決定するステップ、及び（ｂ）決定されたCDX1遺伝子の発現レベルを、標準と比較するステップを含む。CDX1遺伝子の発現レベルが標準よりも高いことはサンプル中の神経芽腫スフェアを形成しうる細胞の存在を示す。
【００３２】
神経芽腫の悪性度に関連して、神経芽腫スフェア及び神経芽腫中の癌幹細胞の存在について説明する。神経芽腫スフェアを形成しうる細胞が存在すると転移の発生率が高くなるなど当該神経芽腫は高リスクであり、神経芽腫の悪性度は高い。また神経芽腫中に癌幹細胞が存在すると、当該神経芽腫は治療後再発する可能性が高く、高リスク神経芽腫であり、神経芽腫の悪性度は高い。逆に神経芽腫スフェアを形成しうる細胞が存在せずかつ／又は神経芽腫癌幹細胞が存在しないと、当該神経芽腫のリスクは低く、悪性度は低いといえる。
【００３３】
一実施形態において、本発明に係る方法は、神経芽腫の悪性度を決定する、又は予後を判定するための追加のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップをさらに含みうる。そのような追加のバイオマーカーとしては、例えばMYCN、TRKA、ALK、CD133等が挙げられる。
【００３４】
本発明に係る方法に用いる、被験体から取得されるサンプルは被験体由来であればどのようなものでもよいが、例えば組織、特に生検組織、腫瘍組織、脳腫瘍組織、神経芽腫を含むことが疑われる組織、あるいは神経芽腫スフェアであることが疑われる細胞塊、体液、血液、血清、血漿に由来するサンプル等が挙げられる。
【００３５】
本発明に係るCDX1遺伝子は、哺乳動物、ヒト、サル、マウス、ラット等に由来するものであり得る。好ましくはCDX1遺伝子はヒト由来である。
【００３６】
３．キット
本発明はCDX1遺伝子の発現レベルを決定する手段を含む、神経芽腫の悪性度を決定するため、神経芽腫の予後を判定するため又は神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を検出するためのキットを提供する。CDX1遺伝子の発現レベルを決定する手段としては、例えばCDX1遺伝子の発現を検出するためのプライマー、CDX1遺伝子のmRNAを標的とする標識された核酸、又は標識された抗CDX1抗体が挙げられる。CDX1遺伝子の発現を検出するためのプライマーはCDX1遺伝子のエクソンやCDX1遺伝子のmRNA配列、CDX1遺伝子のcDNA配列等が鋳型となるよう設計することができる。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、また、抗体の抗原結合ドメインを用いることもできる。
【００３７】
また、本発明は神経芽腫の悪性度を決定するため、神経芽腫スフェアを形成しうる細胞の検出のため及び／又は神経芽腫の予後判定を補助するためのキットの製造における、CDX1のプライマー、CDX1遺伝子のmRNAを標的とする標識された核酸、又は標識された抗CDX1抗体の使用を提供する。
【００３８】
本発明に係るキットは、適当に緩衝剤、防腐剤、タンパク質安定化剤等の他の成分、試薬や使用説明書を含みうる。
【００３９】
CDX1遺伝子の発現レベルを測定する手段としては、組織や血液等の生物学的材料に含まれるCDX1遺伝子の発現量が特定できるものであれば、どのようなものでもよく、例えばCDX1遺伝子の発現を検出するためのプライマー、CDX1遺伝子のmRNAを標的とする標識された核酸、又は標識された抗CDX1抗体等が挙げられる。
【００４０】
CDX1遺伝子の発現を検出するためのプライマーは、CDX1遺伝子の転写産物からcDNAを合成し、当該cDNAに対して例えば定量的PCRを行うことによりCDX1遺伝子の発現レベルを測定することができる。CDX1遺伝子のmRNAを標的とする標識された核酸は、例えばCDX1遺伝子のmRNAとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸であり得る。本明細書においてストリンジェントな条件下とは、例えばMolecular cloning, a Laboratory manual 2ndedition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (J. Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、6×SSC(1×SSCの組成：0.15 M塩化ナトリウム、0.015 Mクエン酸ナトリウム、pH 7.0）、0.5% SDS、5×デンハート及び100 mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブと共に完全ハイブリッドの融解温度（Tm）より約5℃-30℃、好ましくは約10℃-25℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる条件をいう。このようなCDX1遺伝子のmRNAとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸を使用すると、サンプル中に含まれるCDX1遺伝子のmRNAを検出、測定又は定量することができる。標識された抗CDX1抗体用いると、CDX1遺伝子によりコードされるタンパク質を検出することができる。あるいは非標識の抗CDX1抗体と、当該抗体に結合する標識された二次抗体を用いることもできる。このような二次抗体を使用する系も、本明細書において広く、標識された抗CDX1抗体に包含されるものとする。
【００４１】
４．CDX1阻害化合物のスクリーニング
本発明者らは、神経芽腫スフェアにおいてCDX1の転写量が増大していることを見出した（図８参照）。また、CDX1を過剰発現させると細胞増殖が促進されること（図１６）やCDX1発現が腫瘍発育を促進すること（図１７）を見出した。逆にCDX1をノックダウンすると神経芽腫のスフェア形成が抑制されることも確認した（図１４）。したがってCDX1の活性を阻害すると神経芽腫スフェアの形成が抑制される。このことを利用して、CDX1の活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明はCDX1の活性を阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物又はCDX1遺伝子を有する核酸構築物と候補化合物とを、神経芽腫スフェアを形成しうる細胞に与えること、
（ｂ）神経芽腫スフェアを形成しうる条件下、かつ（ａ）においてCDX1遺伝子を有する核酸構築物を用いた場合は当該核酸構築物中のCDX1遺伝子が発現されうる条件下で、前記細胞を培養すること、
（ｃ）形成される神経芽腫スフェアの数を計測すること、及び
（ｄ）前記（ｃ）で計測された数を、陽性対照と比較すること
を含む。陽性対照は神経芽腫スフェアを形成しうる細胞を、候補化合物の不在下及びCDX1遺伝子の発現産物又はCDX1遺伝子を有する核酸構築物の存在下で、神経芽腫スフェアを形成しうる条件下かつ（ｂ）においてCDX1遺伝子を有する核酸構築物を用いる場合は当該核酸構築物中のCDX1遺伝子が発現されうる条件下で培養したときに形成される神経芽腫スフェアの数である。神経芽腫スフェアの形成が抑制されることは、候補化合物がCDX1を阻害することを示す。
【００４２】
本発明に係るスクリーニング方法に用いることのできる細胞としては、種々の神経芽腫細胞株、例えば脳腫瘍細胞株、肝芽腫細胞株等が挙げられる。神経芽腫スフェアを形成しうる細胞としては、IMR32、SMS-SAN、NGP等が挙げられる。好ましくは、神経芽腫スフェアを形成しうる細胞として、CDX1遺伝子の転写が増大しているものを使用することができる。神経芽腫スフェアを形成しうる条件とは、SFMという培養液を使用し、無血清培地にEGF、FGFを含む条件下で神経芽腫細胞を培養することをいう。培養条件については、Takenobu et al., 2011, Oncogene, 30, 97-105（非特許文献２５）も参照されたい。神経芽腫スフェアの形成は、適当な液体培養液中で、必要に応じて顕微鏡を使用し、形態観察により確認することができ、これにより形成される芽腫スフェアの数を計測することができる。本明細書において、神経芽腫スフェアの形成が抑制されるとは、神経芽腫スフェアを形成することが確認されている細胞を神経芽腫スフェアが形成される条件下で培養した場合（本明細書においてこれを陽性対照と呼ぶことがある）と比較して、形成される神経芽腫スフェアの数が少ないことをいう。形成される神経芽腫スフェアの数が少ないとは、統計的に有意な差があり、陽性対照のスフェアの数よりも、観察されるスフェアの数が有意に少ないことをいう。
【００４３】
４．１  CDX1のCD133転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニング
本発明者らは、CDX1がCD133遺伝子の転写を促進すること及びCD133遺伝子の発現を誘導することを見出した（図９及び１０）。また、その際、CDX1がCD133のプロモーターP1を介してCD133の転写を誘導すること（図１１）、及びCDX1がCD133のプロモーターP1に直接結合して作用することを確認した（図１３）。このことを利用して、CDX1のCD133転写促進活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明はCDX1のCD133転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、以下のステップ、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物と候補化合物とを、レポーター遺伝子と機能的に連結されたCD133のプロモーターP1を有する核酸構築物を含む形質転換細胞又はモデル非ヒト動物に加えること、
（ｂ）前記レポーター遺伝子が発現され得る条件下で前記細胞又はモデル非ヒト動物を培養又は生育すること、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を検出すること、
を含む。レポーター遺伝子の発現が検出されないことは、候補化合物がCDX1のCD133転写促進活性を阻害することを示す。
【００４４】
ある実施形態においてCD133のプロモーターP1は配列番号３０の塩基配列又は配列番号３８の塩基配列を有する。配列番号３８は配列番号３０の一部であり、推定上のCDX1結合配列を複数有する。CDX1結合サイトの推定は、公知の検索ソフトウェア、例えばTF Search等を用いて行うことができる。当業者であれば、そのようなソフトウェアを使用し、慣用の実験を行うことでCDX1の結合に必要な塩基配列を特定し、本発明に係るスクリーニング方法に用いることができる。
【００４５】
４．２  CDX1のOCT4転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニング
さらに本発明者らは、CDX1がOCT4の転写を促進すること及びOCT4の発現を誘導することを見出した（図２１）。また、その際、CDX1がOCT4のプロモーターに直接結合して作用することをChIPアッセイにより確認した（図２２）。このことを利用して、CDX1のOCT4転写促進活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。OCT4 (OCT3/4, POU5F1)はホメオドメインを持つ転写因子であり、ES細胞およびiPS細胞の維持と作成において、もっとも重要な因子である。OCT4はNanog等の様々なES関連遺伝子の発現を直接誘導し、細胞の多能性を維持することがわかっており、OCT4の発現量を減少させると、ES細胞はすみやかに分化を起こしてその性質を失う（Nat Genet. 2000 Apr;24(4):372-6）。また近年は、種々の癌においてもOCT4の発現上昇が報告されており、がん幹細胞の性質への関与が示唆されている（Oncogene. 2001 Dec 6;20(56):8085-91；Cancer Res. 2009 Mar 1;69(5):1776-81；）。なお、OCT4については、Mol Biol Cell. 2007 May; 18(5): 1543-1553も参照されたい。
【００４６】
すなわち、本発明はCDX1のOCT4転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、以下のステップ、
（ａ）CDX1遺伝子の発現産物と候補化合物とを、レポーター遺伝子と機能的に連結された、OCT4のプロモーターを有する核酸構築物を含む形質転換細胞又はモデル非ヒト動物に加えること、
（ｂ）前記レポーター遺伝子が発現され得る条件下で前記細胞又はモデル非ヒト動物を培養又は生育すること、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を検出すること、
を含む。レポーター遺伝子の発現が検出されないことは、候補化合物がCDX1のOCT4転写促進活性を阻害することを示す。
【００４７】
ある実施形態においてOCT4のプロモーターはOCT4プロモーター領域である。hOCT4プロモーター領域の塩基配列を配列番号３７に示す。OCT4のプロモーターとして配列番号３７の塩基配列の全部又は一部、例えば配列番号３２に示されるOCT4プロモーターAかつ／又は配列番号３３に示されるOCT4プロモーターDあるいはその周辺領域を含む塩基配列を用いることができる。言い換えると本明細書においてOCT4のプロモーターというとき、これは配列番号３７の塩基配列の全部又は一部、例えば配列番号３２に示される配列かつ／又は配列番号３３に示される配列、あるいはその周辺領域を含む塩基配列を含みうる。周辺領域は好ましくは１以上のCDX1結合サイトを含む。
【００４８】
本明細書において、「機能的に連結された」とは、プロモーターや遺伝子等がそれぞれの機能を発揮し、目的遺伝子が発現されるように相互に連結されていることをいう。プロモーターや遺伝子がそれぞれの機能を発揮するには、塩基配列における5'から3'への方向性を一致させる必要がある。例えばコーディング配列がプロモーターに機能的に連結された、とは当該コーディング配列の転写又は発現が当該プロモーターの制御下又は影響下にあるように、コーディング配列とプロモーターが互いに連結していることをいう。また、２つの遺伝子の産物を融合タンパク質として発現させる場合にも、当該２つの遺伝子は機能的に連結された、といえる。この場合、２つの遺伝子のコーディング配列を連結するときにフレームシフトがあってはならず、一方の遺伝子の発現産物のC末端が他方の遺伝子の発現産物のN末端と直接連結されるか、又は適当なリンカーを介して連結されるように、それぞれの遺伝子の塩基配列を配置する必要がある。
【００４９】
レポーター遺伝子は、目的遺伝子の発現を検出できるものであればどのようなものでもよいが、例えばルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、抗生物質耐性遺伝子等が挙げられる。複数のレポーターを組み合わせてもよい。形質転換に用いる発現ベクターや、形質転換手法は当業者であれば適宜設計することができる。レポーター遺伝子は、CD133若しくはOCT4の下流に配置してもよく、又はCD133若しくはOCT4との融合タンパク質として発現させてもよい。そのような融合タンパク質におけるレポータータンパク質とCD133若しくはOCT4の発現産物は、場合によりペプチドリンカーを介して連結されていてよい。さらに、レポーター遺伝子はCD133のプロモーターP1若しくはOCT4のプロモーター、例えばOCT4のプロモーターA若しくはDの下流に、当該プロモーターと機能的に連結されるように配置してもよい。また、レポーター遺伝子をCDX1認識配列の下流に配置することもできる。
【００５０】
CDX1のCD133又はOCT4転写促進活性を阻害する化合物のスクリーニングに用いることができる細胞は、形質転換に適した細胞であればどのようなものでもよいが、例えば、原核細胞、大腸菌、真核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。また神経芽腫細胞、例えばIMR32、SMS-SAN、NGP等を使用してもよい。
【００５１】
本発明に係るスクリーニング方法に用いることのできるモデル非ヒト動物としては、ヒトを除いた哺乳動物、サル、マウス、ラット等および、線虫、昆虫等が挙げられるがこれらに限られない。
【００５２】
候補化合物としては、低分子化合物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、転写因子、融合タンパク質、核酸（DNA、RNA、shRNA、siRNA等）などが挙げられるがこれらに限られない。スクリーニングには、適当な化合物ライブラリーやコンビナトリアルライブラリーに含まれる化合物を用いてもよい。細胞の培養条件や候補化合物の添加条件は、当業者であれば適宜設定することができる。
【００５３】
本発明に用いることのできる核酸構築物としては、プラスミドベクターやウイルスベクター、特に宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスベクターが挙げられる。ある実施形態において核酸構築物はレンチウイルスベクターに基づく。当業者であればスクリーニングの目的に応じて、用いるベクターやプロモーター、シグナル配列等を決定し、それらを適当に配置し、核酸構築物を作製することができる。
【００５４】
ある実施形態においてCDX1、CD133、CD133のプロモーターP1、OCT4、又はOCT4のプロモーターA若しくはDは、ヒト由来である。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００５６】
材料や試薬は特に断らない限り、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製したものである。
【００５７】
一般的実験方法
トランスフェクション
神経芽腫又は293T細胞を2.5×105個(6 cmプレート)又は1×106個(10 cmプレート)に播種し、翌日2μg(6 cmプレート)又は5μg(10 cmプレート)のpcDNA3(mock)又はpcDNA3-FLAG-hCDX1(FLAG-hCDX1)をLipofectamin 2000(Life Technologies)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション48時間後に細胞を回収し、ウェスタンブロット, RT-PCR, qPCR又はChIPアッセイを行った。
【００５８】
hCDX1の検出
hCDX1は特異的な半定量RT-PCRプライマー (F: TCGGACCAAGGACAAGTACC(配列番号３), R: TGTTGCTGCTGCTGTTTCTT(配列番号４))及び、qPCRプライマー (F: CGGCAGGTGAAGATCTGGTT(配列番号５), R: GGCTGTTGCTGCTGCTGTT(配列番号６))によって検出した。
【００５９】
定量的PCR
定量的PCR（qPCR）は簡単に説明すると、SYBR(登録商標)Premix DimerEraser(登録商標)(Perfect Real Time) (タカラバイオ社)を用いて7500 リアルタイムPCRシステム (アプライドバイオシステムズ社)により行った。定量的PCRに使用したプライマーは以下のとおりである（F:フォワード、R:リバース）。
CD133プロモーターP1 A
F: TGGGAGCGAATATGGCTTTATG      配列番号７
R: CTTAGTGTGCAGCAGTACCAATGC    配列番号８
CD133プロモーターP1 B
F: CAGCTCAGCCGGTCCAAT          配列番号９
R: GGATCTGCCTCAGTCACTTAAAGAT  配列番号１０
OCT4プロモーターA
F: GAGGATGGCAAGCTGAGAAA        配列番号１１
R: CTCAATCCCCAGGACAGAAC        配列番号１２
OCT4プロモーターD
F: GTTGGGGAGCAGGAAGCA          配列番号１３
R: GGGGCAGCTCTAACCCTAAA        配列番号１４
GAPDH プロモーター
F: TGAGCAGTCCGGTGTCACTA        配列番号１５
R: ACGACTGAGATGGGGAATTG        配列番号１６。
【００６０】
RT-PCR
RT-PCRは慣用の方法に従って行った。簡単に説明すると、リコンビナントTaq (タカラバイオ社)を用いてサーマルサイクラーにより行った。RT-PCRに用いたプライマーは以下のものである。
hOCT4
F: AGGCGGCTTGGAGACCT          配列番号１７
R: GATGTGGCTGATCTGCTGC        配列番号１８
hNANOG
F: AGATGCCTCACACGGAGACT      配列番号１９
R: GAGTGGTTGCTCCAGGACT        配列番号２０
hKLF4
F: ACCCTGGGTCTTGAGGAAGT      配列番号２１
R: ACGATCGTCTTCCCCTCTTT      配列番号２２
hSOX2
F: CACAACTCGGAGATCAGCAA      配列番号２３
R: GTTCATGTGCGCGTAACTGT      配列番号２４
hBMI1
F: TCTGCTGATGCTGCCAATGG      配列番号２５
R: CTCCTCATACATGACATCAATCTG  配列番号２６
GAPDH
F: ACCACAGTCCATGCCATCAC      配列番号２７
R: TCCACCACCCTGTTGCTGTA      配列番号２８。
【００６１】
なお、hOCT4プロモーター領域については、Gerrard L, et al., Stem Cells. 2005;23(1):124-33及びTakahashi K, et al., Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72に報告されている。また、hOCT4プロモーターのChIPアッセイ用プライマーOCT4 ChIP A, B,C, D,EについてはFreberg CT et al., Mol Biol Cell. 2007 May;18(5):1543-53に報告されている。
【００６２】
ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロットは慣用の方法で行った。簡単に説明すると、1% NP-40を含む緩衝液中で細胞を溶解させ、細胞抽出液を調製した。30μgの細胞抽出液をSDS-ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した後、ナイロン膜へ転写を行った。FLAGタグ付加蛋白質は抗FLAG-M2抗体(シグマ・アルドリッチ社)、CDX1は抗CDX1抗体(アブカム社)、CD133はCD133/2抗体(ミルテニーバイオテク社)を用いて検出を行った。内部コントロールとしては抗チューブリン抗体(Lab Vision社)を用いた。
【００６３】
[実施例１]
ヒトCDX1のクローニング
ヒト正常大腸由来のcDNAから、hCDX1 103F-EcoRI(GAATTCGTGGGCTATGTGCTGGACAAG、配列番号１)、hCDX1 899R(TGGGGCTATGGCAGAAACTCC、配列番号２)の各プライマーを用いてhCDX1遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子は、ベクターpcDNA3-FLAGのタグ下流に連結した(pcDNA3-FLAG-hCDX1)。また、FLAG-hCDX1はレンチウイルスベクター(pHR-SIN-CSGW)にサブクローニングを行った(pHR-SIN-FLAG-hCDX1)。
【００６４】
[実施例２]
CD133プロモーターベクターの構築
CD133のプロモーターP1は、PCR法でクローニングを行った。ヒトゲノムDNAを鋳型に、ヒト4番染色体のCD133遺伝子のexon1A上流を含む16087537 - 16084979領域を増幅し、pGL4.17ベクター(プロメガ)のルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結し、pGL4.17-2.5k (-1890 +668)とした。pGL4.17-2.5kを鋳型にし、pGL4.17-1.8k (-1890, +10), pGL4.17-1.1k (-1188, +10), pGL4.17-0.4k(-1188, -752), pGL4.17-0.7k (-755, -34), pGL4.17-0.6k (+22, +668)を作製した。
【００６５】
pGL4.17-2.5k、pGL4.17-1.8k、pGL4.17-1.1k、pGL4.17-0.6kのインサートの位置関係を図２に示す。pGL4.17-2.5kはプロモーターP1、P2、P3を含む。pGL4.17-1.8kはCD133遺伝子のexon1A上流1.8kの配列を含む。pGL4.17-1.1kはCD133遺伝子のexon1A上流1.1kの配列を含む。pGL4.17-0.6kはプロモーターP2及びP3を含むが、P1は含まない。
【００６６】
また、プラスミドpGL4.17-1.1k、pGL4.17-0.4k及びpGL4.17-0.7kのインサートの位置関係を図３に示す。CD133のexon1Aの上流の1.1kの配列を有するのがプラスミドpGL4.17-1.1kであり、当該1.1kの領域のうちのexon1Aに近接する側の0.7kの配列を有するのがプラスミドpGL4.17-0.7kであり、当該1.1kの領域のexon1Aから遠い側の0.4kの配列を有するのがプラスミドpGL4.17-0.4kである。
【００６７】
[実施例３]
神経芽腫スフェア特異的なCD133プロモーターの探索
無血清培地中でスフェアを形成させた神経芽腫細胞を回収し、ISOGEN (ニッポンジーン)を用いて全RNAを抽出した。1〜5μgの全RNAから、リバトラエースα(東洋紡)を用いてcDNAを合成し、RT-PCRを行った。CD133のORF(exon 2-7)及び、GAPDHを検出するプライマーはTakenobu (Takenobu H et al., Oncogene. 2011 Jan 6;30(1):97-105.)既報のものを使用した。CD133 exon 1A, 1B, 1C, 1D及び1Eの検出には、Tabuらの論文(Tabu K et al, Cell Res. 2008 Oct;18(10):1037-46)のプライマーを使用した。
【００６８】
結果を図４に示す。exon1Aはスフェアで強く発現していた。このことから、神経芽腫スフェアでは、exon 1A上流のプロモーターP1を利用してCD133発現が誘導されていることが確認された。
【００６９】
[実施例４]
CD133プロモーターアッセイ
以下の手順でCD133プロモーターアッセイを行った。SK-N-BE, SK-N-DZ又はSH-SY5Y神経芽腫細胞を、12ウェルプレートへ5×104個ずつ播種し、一晩接着させた後、各プラスミド0.4 μg, pRL-TK(Promega) 10 ng、pcDNA3-FLAG-hCDX1(0〜100 ng)をLipofectamine 2000(Life Technologies)を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクション48〜72時間後に細胞を回収し、Dual-Luciferase Reporter assay kit(Promega)を用いて、プロモーターの活性を定量した。
【００７０】
プロモーターアッセイの結果を図５及び図６に示す。図５に示すように、プロモーターP1（1.1k）について最も強いルシフェラーゼ活性が見られた。用いたベクターはpGL4.17であり、細胞はSK-N-DZであった。さらに、この1.1k領域について解析した結果を図６に示す。神経芽腫細胞SH-SY5Yでは0.4kの配列を有するプラスミドpGL4.17-0.4kからのルシフェラーゼ活性が最も強かった。また神経芽腫細胞SK-N-BEにおいても同様の結果となった。この0.4k領域は６つのCDX1結合部位を有する（図７参照）。
【００７１】
[実施例５]
神経芽腫細胞株IMR32、SMS-SAN、及びNGPにおける種々の転写因子の発現レベルを調べた。発現レベルは定量的PCR（qPCR）およびRT-PCRにより決定した。
【００７２】
結果を図８に示す。種々の転写因子の中でも、CDX1の発現がスフェア特異的に増大していることが確認された。こうした結果からCDX1がCD133の発現を調節していると考え、CDX1を形質導入又はノックダウンした場合の影響を調べた。
【００７３】
[実施例６]
神経芽腫細胞中のレンチウイルス仲介hCD133及びhCDX1発現又はノックダウン
レンチウイルスによるpHR-SIN-hCD133 及びpHR-SIN-CSGW-FLAG-hCDX1の発現又はpLKO.1に組み込まれたhCDX1 shRNAの発現方法は、Takenobu及びOchiai論文(Ochiai et al., Oncogene. 2010 May 6;29(18):2681-90) と同様の方法で行った。簡単に説明すると、293T細胞に非増殖型レンチウイルス骨格をコードしたプラスミドと上記プラスミドを共導入し、導入後48時間および72時間にウイルスを含む培養上清を回収した。その培養上清を標的となる細胞の培地に加えることで、当該レンチウイルスの感染を行った。ピューロマイシン耐性を持つshRNAを発現するレンチウイルスを感染した細胞は、1μg/mlピューロマイシン存在下で選択し、ウイルス感染細胞のみを回収した。
【００７４】
CDX1を形質導入した細胞におけるCD133発現をqPCR及びウェスタンブロット解析により調べた。qPCRの結果を図９に示す。mockトランスフェクトと比較してCDX1形質導入細胞においてCD133の発現が増大しており、CDX1はCD133の発現を誘導することを確認した。
また、ウェスタンブロット解析の結果を図１０に示す。CDX1の発現産物が確認された。
【００７５】
さらにCDX1を発現させたときのCD133の発現を調べた結果を図１１に示す。神経芽腫細胞SK-N-BEについては、Mockトランスフェクトしたときと比較してCDX1でトランスフェクトした細胞では、CD133 ORF及びCD133のexon1Aの転写が誘導された。この傾向はNGP及び293T細胞についても同様であった。
【００７６】
CDX1をノックダウンしたときのCD133の発現を調べた結果を図１２に示す。NGPスフェアでは、CDX1をノックダウンすると、Mockトランスフェクトと比較して、CD133の発現が低下した。
【００７７】
[実施例７]
ChIPアッセイ
CDX1がCD133のプロモーターP1に直接結合するか否かを調べるためにChIPアッセイを行った。このChIPアッセイは、以前に報告された方法により行った(Orlando et al., 1997, Methods,11, 205-214、Fujimura et al., 2006, Development, 133, 2371-2381)。簡単に説明すると、細胞にFLAG-CDX1を発現させ、ホルマリン固定によって蛋白とDNAを架橋した。抗体でCDX1を沈降し、クロマチン免疫沈降を行った。CD133のプロモーターP1ゲノムを定量的PCR法で検出した。具体的な条件や手順は次のとおりである。
【００７８】
細胞をトランスフェクションから48時間後に回収した。標識細胞から調製した架橋クロマチンを、正常マウスIgG (eBioscience, San Diego, CA, USA)または、モノクローナル抗Flag抗体(M2; Sigma-Aldrich)で沈殿させた。全DNA(または、インプットDNA)は初期溶解物から単離した。それぞれの画分から抽出したDNAは、qPCRによって解析を行った。
【００７９】
結果を図１３に示す。ChIP(1)ではmockと比較してFLAG-CDX1の値が有意に高く、CDX1はCD133のプロモーターP1に直接結合することが確認された。
【００８０】
[実施例８]
スフェア形成アッセイ
スフェア形成アッセイに用いた培地は既報の通りである(Takenobu et al., 2011, Oncogene, 30, 97-105)。簡単に説明すると、培地はEGF、FGFおよびB27添加剤を含む無血清培地、SFMというものである。hCDX1を発現又はノックダウンした細胞は1 x 105細胞を6ウェルプレートに、また100細胞を96ウェルプレートに播種し、7日ごとに培地を交換した。培地交換2週間〜1ヶ月後に顕微鏡下でスフェアの個数の計測を行った。
【００８１】
hCDX1 shRNAを使用し、CDX1をノックダウンした場合のスフェア形成をアッセイした。結果を図１４に示す。Mockトランスフェクトした場合の相対的スフェア数を100とすると、CDX1をノックダウンしたときの形成されたスフェア数は40未満であった（図１４右下）。つまり、CDX1のノックダウンによりスフェア形成が抑制された。なお、この実験条件下でCD133の転写量が低下していたことも確認した（図１４左下）。
【００８２】
[実施例９]
FACS（Fluorescence Assisted Cell Sorting）解析
FACS解析は以下の手順で行った。まず、ヒトCDX1を発現するレンチウイルス（pHR-FLAG-hCDX1を導入して調製したウイルス）を神経芽腫細胞NGPに感染させ、ウイルス感染1週間後に細胞を回収した。回収した細胞または未感染のNGP細胞をPEラベルされたマウスコントロールIgG(eBioscience)またはCD133/2 PE (clone 293C3, Miltenyi Biotec)で染色し、PE蛍光の強度をFACS Calibur (BD)で解析した。
FACSを用いて神経芽腫細胞のCD133発現を調べた結果を図１５に示す。CDX1がCD133の発現を促進することがFACSからも確認された。
【００８３】
[実施例１０]
CDX1の過剰発現による影響
実験手順は、簡単に説明するとWST法および軟寒天コロニー形成法を用いた。WST法は96穴プレートへ750個の細胞を蒔き、24時間ごとにCell Counting Kit-8試薬 (同仁化学社)を用いて、マイクロプレートリーダー(コロナ社)によって、細胞の増殖を検討した。軟寒天コロニー形成は、5,000個の細胞を0.3 % 寒天 (ディフコ社)を含む培地に懸濁し、3.5 cm細胞培養ディッシュへ加えた。コロニーは播種3週間後に0.05 % MTT溶液 (ナカライテスク社)で一晩染色し、写真を撮影してコロニー数を計測した。
【００８４】
FLAG-hCDX1を過剰発現させたときの、細胞増殖に対する影響を調べた結果を図１６に示す。mockトランスフェクトと比較してhCDX1を導入した形質転換細胞（SH-SY5Y CDX1）では、細胞増殖が促進され（図１６、左上）、寒天培地上のコロニー形成数もmockトランスフェクト（EGFP）と比較して増大した（図１６、右）。
【００８５】
[実施例１１]
CDX1の腫瘍発育に対する影響
実験手順は、簡単に説明するとヌードマウスへ細胞の皮下導入というものであった。使用した実験動物は、BALB/c Ajcl-nu/nu、雌、5週令であり、ベクターはpHR-SIN-CSGW-FLAG-hCDX1であった。
【００８６】
CDX1発現の腫瘍発育に対する影響を調べた結果を図１７に示す。mockトランスフェクト（GFP）では接種から40日後に腫瘍の大きさが1000 mm3であったのに対してCDX1を過剰発現させた場合は接種から40日後に腫瘍の大きさが約2000 mm3であった。
【００８７】
[実施例１２]
CDX1又はCD133の腫瘍初代培養細胞に対する影響
培養細胞にCDX1又はCD133を形質導入した。1×106細胞（スフェア）にレンチウイルスを感染させた（レンチ-X濃縮、無血清、×２回）。２日間インキュベート後、GFP陽性により感染を確認し、細胞どうしをピペッティングにより解離させた。生存細胞をカウントし、96ウェルプレートを使用して100個の細胞を各ウェルに播種した。これを１１日インキュベート後、観察を行った。使用した細胞は、2209BM、2302BM、2338BMであった。
【００８８】
CDX1又はCD133の腫瘍初代培養細胞に対する影響を調べた結果を図１８に示す。CDX1も、CD133も、共にスフェア形成を促進した。また、これらの値を平均したものを図１９に示す。
【００８９】
[実施例１３]
CDX1ノックダウンの影響
shRNA技法を用いてCDX1の発現をノックダウンした。用いた細胞はNGP又はIMR32であった。用いたCDX1のノックダウン用shRNAの配列は配列番号３５及び配列番号３６に示す。なお、配列番号３５及び３６に示されるのはレンチウイルスを介して組込まれたDNA配列であり、同DNA配列に基づいて合成されるRNA配列がshRNAとしてノックダウンに与る。CDX1をノックダウンした場合のスフェア形成における影響をCD133が部分的にキャンセルすることを確認した結果を図２０に示す。
【００９０】
[実施例１４]
CDX1改変細胞における細胞リプログラミング因子遺伝子発現
CDX1改変細胞を使用し、細胞リプログラミング因子の発現に対するCDX1の影響を調べた。過剰発現に用いた細胞株は、SH-SY5Y、SK-N-BE、293Tであり、ノックダウンに用いたスフェア細胞はNGP(1)、NGP(2)、Huh6であった。CDX1を過剰発現させるために細胞にFLAG-CDX1を発現させた。またCDX1のノックダウンにはshRNAを使用した。これらの改変細胞について、山中4因子をはじめ、幹細胞性に関わる分子の発現を半定量的RT-PCR法で検出した。
結果を図２１に示す。CDX1はOCT4の転写を促進することが確認された。
【００９１】
また、CDX1のOCT4プロモーターへの結合を調べたChIPアッセイ結果を図２２に示す。CDX1はOCT4のプロモーター部位A若しくはDに直接結合することが確認された。実験条件などは、CD133をOCT4に置き換えた以外は上記とほぼ同じであった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
被験体から取得されたサンプル中のCDX1遺伝子の発現量を測定することにより、被験体の神経芽腫の悪性度を決定することができ、また、予後を判定することができる。さらに、CDX1の活性を阻害する化合物をスクリーニングすることにより、神経芽腫の治療薬となり得る候補化合物を同定することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号１〜２８  実施例のとおりである。
配列番号２９  hCD133
配列番号３０  hCD133のプロモーターP1
配列番号３１  hOCT4
配列番号３２  hOCT4のプロモーターA
配列番号３３  hOCT4のプロモーターD
配列番号３４  hCDX1
配列番号３５  CDX1ノックダウン用shRNA、shCDX1 A
配列番号３６  CDX1ノックダウン用shRNA、shCDX1 B
配列番号３７  hOCT4のプロモーター領域
配列番号３８  hCD133のプロモーターP1の部分配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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