(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオ燃料の原料となる木質(二次細胞壁)の高生産能力を有する形質転換植物を提供する。【解決手段】イネ由来の「OsNST2遺伝子」又はそのホモログ等を、木質形成細胞特異的に発現を誘導するプロモータ(NST3またはそのオルソログプロモータ)によって発現させるコンストラクトによって形質転換された形質転換植物もしくはその子孫。並びに。前記コンストラクトによって形質転換することで、木質の生産を増加させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
木質形成細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の木質形成の制御活性を有する転写制御因子をコードする核酸が配置されたコンストラクトを用いて植物を形質転換することを特徴とする、植物の木質を増強する方法；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸。
【請求項２】
木質形成細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の木質形成の制御活性を有する転写制御因子をコードする核酸が配置されたコンストラクトを用いて形質転換されたことを特徴とする、木質が増強された形質転換植物もしくはその子孫；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸。
【請求項３】
木質形成細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモータが、NST1又はNST3遺伝子のプロモータである、請求項２に記載の形質転換植物もしくはその子孫。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の形質転換植物もしくはその子孫を用い、その少なくとも１部を取得して硫酸糖化処理を施す工程を含む処理が施されることを特徴とする、単糖類の製造方法。
【請求項５】
請求項２又は３に記載の形質転換植物もしくはその子孫を用い、その少なくとも１部を取得して苛性ソーダによる前処理工程、及びセルラーゼによる糖化工程を含む処理が施されることを特徴とする、グルコースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネまたはその近縁植物の木質形成にかかわる転写制御因子により形質転換された植物における木質の高効率生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、過剰な二酸化炭素の放出による地球温暖化の進行と化石燃料の枯渇に対する危機感、およびそれに伴う化石燃料の価格上昇、などの要因により、再生可能エネルギーの利用が注目を集めている。とくにバイオエタノールやバイオディーゼルなどの植物由来バイオ燃料は燃焼によって生じる二酸化炭素を新たな放出と捉える必要がない(カーボンニュートラル)ことから、内燃機関の燃料として非常に期待されている。しかし、従来のバイオ燃料(第一世代バイオ燃料)はトウモロコシのデンプンやナタネ油など食糧になり得るものを原料として生産されており、世界人口の増加により食糧の需給が逼迫しつつある現況から考えて持続可能なものとは言いがたい。そこで、非可食であるセルロースを原料とした第二世代バイオエタノールの実用化が求められている。セルロースは木質(二次細胞壁、二次壁)を構成する主要な成分の一つであり、グルコースが繰り返しβ-1,4結合したポリマーである。菌類などを由来とするセルラーゼによって処理することによってグルコースが得られるので、それを酵母で発酵させることによりエタノールを得られる。セルロースは木質中に大量に含まれており、植物の木質を増強させることは重要な開発目標となりえる。木質を増強させることができれば、木材としても価値も上げることができる。
植物の木質形成を制御する遺伝子は本発明者らが発見したNST転写因子遺伝子がよく知られている(非特許文献１)。NST転写因子はモデル実験植物シロイヌナズナにおいて発見された遺伝子で、nst1 nst3二重変異体では、道管を除いて木質(二次細胞壁)がまったく形成されなくなる。そのような植物では結晶性の低いセルロースが一次細胞壁にしか含まれず、セルラーゼによる酵素糖化性が高まる(特許文献１、非特許文献２)が、二次細胞壁がないために個体あたりのセルロース量は少なくなり、最終的な糖収量は減少してしまうと想定される。しかも茎の強度が大幅に低下して直立することができない。逆に、NST転写因子を植物体全体で過剰に発現させると、あらゆる細胞で異所的な木質形成が起きてしまい、植物の成長が著しく阻害されてしまう。
バイオ燃料用にバイオマスを増強させる先行技術としては特許文献２および非特許文献３があげられる。この文献ではヒトの糖ヌクレオチド(UDP-ガラクトース)輸送体をタバコに発現させることにより、全体的なバイオマスの増加を実現させているが、木質に焦点を絞ったものではなく、主に一次細胞壁が増加している印象を受ける。
特許文献３および非特許文献４は二次細胞壁を肥厚させる技術をうたっているが、実際に実証されているのは培養細胞での特殊な条件であり、植物体で実証したものではない。
このように木質を選択的に増強するのは容易ではなく、未だ確実な方法が確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５３６７３
【特許文献２】特開２０１０−５１２５２号公報
【特許文献３】特開２０１０−２３３５３６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】The Plant Cell,2007 19,270-280
【非特許文献２】Journal of Biotechnology,2009 142,279-284
【非特許文献３】Journal of Bioscience and Bioengineering,2010 109,159-169
【非特許文献４】The Plant Cell,2007 21,1155-1165
【非特許文献５】Plant Biotechnology Journal,2006 4,325-332
【非特許文献６】Tappi,1961 44,793-798
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明においては、植物本来の二次細胞壁(木質)形成能力を増強して、栽培個体あたりの木質の生産量を増やす技術を提供することを目的とする。木質は第二世代バイオエタノールの原料であるセルロースを大量に含んでいるので木質を増強することができれば一般にバイオエタノール生産量も増加させることができ、低炭素化社会の実現に向けて貢献できる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
二次細胞壁からなる木質を選択的に増強させるためには、木質の形成を根本的に制御する遺伝子を強化するなどして木質繊維細胞でのみ選択的に発現させる必要があると考えられる。本発明者らは植物特異的な転写因子であるNACファミリー転写因子群をシロイヌナズナにおいて網羅的に機能解析する過程で、木質形成を根本的に制御する転写因子遺伝子として、NST転写因子群(NST1、NST2、NST3)を発見した(非特許文献１)。
これらのうちシロイヌナズナのnst1 nst3二重変異体では花茎や胚軸の木質繊維細胞で木質がまったく形成されなくなり、花茎の強度が大幅に低下するほか、直立することができなかった。しかし同様に木質が形成される道管においては木質の欠損が起こることはなく、植物の生存には影響がなかった(非特許文献１)。また、逆にこれらの遺伝子を植物体全体で過剰に発現させると、あらゆる細胞で異所的な木質形成が起きてしまい、植物の成長が著しく阻害された(非特許文献１)。
本発明者らはNST転写因子の木質形成能に着目し、広くそのオルソログ遺伝子について検討するなかで、イネにおいてNST転写因子のオルソログ遺伝子として同定されたOsNST1、OsNST2遺伝子の機能解析を行ったところ、シロイヌナズナのNST転写因子と同様に、イネにおいてその機能を抑制すると二次細胞壁が減少して垂れ葉形質を示した。また、双子葉植物であるシロイヌナズナにおいても、過剰に異所発現させたところ、異所的な木質形成が起き、シロイヌナズナの成長を著しく阻害させることが確認された。しかも、このとき起きた木質の異所形成はシロイヌナズナのNST転写因子を異所発現させたときよりもはるかに顕著であり(図１)、NST結合配列に対しての転写活性化能力を比較したところ、OsNST2転写因子はシロイヌナズナNST3転写因子よりも有意に高かった(図２)。
そこで、シロイヌナズナのNST転写因子をイネのOsNST転写因子に置き換えることで、二次細胞壁が増強できるのではないかと考え、OsNST2転写因子を木質で特異的に遺伝子発現を誘導するNST3プロモータに繋ぎ、nst1 nst3二重変異体に導入してOsNST2転写因子を発現させた(以下この植物をOsNST2相補ラインと呼ぶ)。その結果二重変異体の表現型(直立できない)が回復しただけでなく、花茎の下部10cmをサンプリングしたところ乾燥重量が増加しており、曲げ強度が野生株よりも強くなっていることがわかった(図３)。
さらに、通常では木化しない花茎の中心部分までリグニン様物質の沈着に代表されるような木化が起きていることがわかった(図３)。単子葉植物由来のNST転写因子であるOsNST転写因子が双子葉植物で発揮するこのような顕著な木質形成能又は細胞壁増強能は、本発明者らにとっても意外なものであり、OsNST転写因子の特殊性を表している。そして、木質バイオマスとしては圧倒的に利用価値の高い樹木資源を含む双子葉植物で観察されたこのような特性は、きわめて大きな有用性が期待できる。得られたOsNST2相補ライン(ProNST3：OsNST2 nst1 nst3)について、花茎の基部から3cmから10cmの部分を取得して硫酸糖化処理を行い、鮮重量あたりで得られるグルコース、キシロースの量を比較したところ、野生株に比べて鮮重量あたりのグルコースは約45％、キシロースでは約77％も多くの単糖を得られることがわかった(図４)。また、当該OsNST2相補ラインに対して、バイオエタノール生産に一般的な「苛性ソーダ前処理＋セルラーゼ糖化」を施したところ、野生株よりも約20％多くのグルコースを得られることがわかった(図４)。
以上の知見を得たことから、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  木質形成細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の木質形成の制御活性を有する転写制御因子をコードする核酸が配置されたコンストラクトを用いて植物を形質転換することを特徴とする、植物の木質を増強する方法；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸。
〔２〕  木質形成細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の木質形成の制御活性を有する転写制御因子をコードする核酸が配置されたコンストラクトを用いて形質転換されたことを特徴とする、木質が増強された形質転換植物もしくはその子孫；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸。
〔３〕  木質形成細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモータが、NST1又はNST3 遺伝子のプロモータである、前記〔２〕に記載の形質転換植物もしくはその子孫。
〔４〕  前記〔２〕又は〔３〕に記載の形質転換植物もしくはその子孫を用い、その少なくとも１部を取得して硫酸糖化処理を施す工程を含む処理が施されることを特徴とする、単糖類の製造方法。
〔５〕  前記〔２〕又は〔３〕に記載の形質転換植物もしくはその子孫を用い、その少なくとも１部を取得して苛性ソーダによる前処理工程、及びセルラーゼによる糖化工程を含む処理が施されることを特徴とする、グルコースの製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の「OsNST2遺伝子」を用いて作出した木質増強植物により、１個体あたりから生産できる木質の量を増加させられる。木質を増加できればバイオエタノール生産量を増やすことができるだけでなく、木材としての価値を高めることもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】シロイヌナズナおよびイネのNST転写因子をシロイヌナズナにおいて過剰に異所発現させたときの様子。OsNST2遺伝子の過剰発現(b)はシロイヌナズナNST1遺伝子の過剰発現(a)より、より顕著に木質の異所形成を引き起こす。
【図２】シロイヌナズナおよびイネのNST転写因子のNST結合配列(SNBE)に対する転写活性化能力の違い。OsNST2はシロイヌナズナNST3にくらべて高い転写活性化能力をもつ。
【図３】OsNST2相補ラインにおける乾燥重量、曲げ強度、繊維細胞の様子、リグニン量
【図４】OsNST2相補ラインにおける硫酸糖化性、酵素糖化性
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
１．本発明における木質を増強した植物について
（１）本発明における木質を増強する遺伝子について
本発明において植物に対して高い木質生産能を付与する遺伝子は、典型的にはイネ由来の配列番号２で表される「OsNST2遺伝子」であり、対応するアミノ酸配列は配列番号１で表される。当該遺伝子は、そのシロイヌナズナオルソログ遺伝子が木質形成のマスター転写制御因子であることが証明されている。
本発明では、イネ由来の当該「OsNST2遺伝子」を、典型的な双子葉植物であるシロイヌナズナにおいて過剰に異所発現させた場合に、異所的な木質形成を引き起こす能力が飛び抜けて高いことをはじめて見出した。そして、当該遺伝子を、木質細胞特異的なプロモータ、とりわけ双子葉植物由来の木質特異的に働くプロモータにつなげて発現させることで、その顕著に高い木質形成能を有効に制御でき、細胞壁増強効果を存分に発揮できることを見出したことに基づく。「OsNST2遺伝子」は、双子葉植物のシロイヌナズナなどのNST遺伝子群とはホモロジーが約70％と低いから、他の植物ゲノム好ましくはイネ科植物中の相同遺伝子、又は一部に変異が導入された遺伝子のうちでも「OsNST2遺伝子」と80％以上、好ましくは90％のホモロジーを有する類似遺伝子であれば同様に用いられることが明らかである。また同一機能を保持している限り、そのフラグメントでもよい。そのような遺伝子は、塩基配列では配列番号２とは80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上のホモロジーを有し、それがコードするアミノ酸配列では配列番号１と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上のホモロジーを有する。
すなわち、本発明の木質増強形質を発現する遺伝子は、一般的には以下のように表現することができる。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子、
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子。
ここで、1若しくは数個とは、1〜50個，好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個の変異が存在することを指す。また、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号２に示す塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。このようなストリンジェントな条件については、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989）Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作におけるTm値を高めた条件として当業者には自明である。例えば、0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s,0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、50℃で4時間〜一晩保温を行う条件などである。
なお、以下の本発明の説明にあたっては、本発明の「木質増強形質」を付与する遺伝子として典型的な「OsNST2遺伝子」の名称を用いて説明する。
【００１１】
（２）本発明における木質増強形質を有する植物の作出方法
本発明において用いられる転写制御因子のOsNST2遺伝子を発現させるためのプロモータは、「木質形成細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモータ」であり、具体的には、NST3プロモータもしくはそのオルソログ遺伝子のプロモータ、NST結合配列(SNBE)を繰り返してコアプロモーターの上流に配置した人工プロモータ、二次細胞壁セルロース合成酵素のプロモータ、リグニン合成に関与する酵素類のプロモータ、キシラン合成に関与する酵素類のプロモータである。特に、シロイヌナズナ由来のNST1及びNST3遺伝子のプロモータが好ましい。
OsNST2遺伝子を木質形成細胞特異的に発現するプロモータの下流に配置したコンストラクト(組換えベクター)を構築し、野生株もしくはNST転写因子もしくはそのオルソログ転写因子遺伝子の機能が抑制された植物に形質転換して作製する。
遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法が典型的であるが、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が適用できる。
【００１２】
（３）対象となる植物の種類
本発明において用いる「OsNST2遺伝子」は、種を越えて発現でき「木質増強形質」を発現できる遺伝子であることが本発明において実証された。その対象となる植物は、イモ類、豆類、ナス科類などの双子葉植物一般に適用できるが、特にバイオマス資源の観点からは、ポプラ、ユーカリ、アカシアなどの双子葉木本植物が好ましい。ただし、本発明は、これらの植物に限定されるものではなく、ミスカンザス、エリアンサス、ダンチク、ソルガム、ススキなどの単子葉エネルギー植物の育種一般にも適用できる。
【００１３】
（４）「OsNST2遺伝子」による形質転換植物の形質的特徴
（４−１）乾燥重量の増加
「OsNST2遺伝子」を用いて形質転換したOsNST2相補ラインシロイヌナズナ植物の花茎の下部10cmをサンプリングして分析した結果、野生株に比べて乾燥重量が約50重量％も増加しており、曲げ強度が野生株よりも強くなっていった(図３)。
【００１４】
（４−２）リグニン量の増加
さらに、図３からは、通常では木化しない花茎の中心部分までリグニン様物質の沈着が起きていることがわかる(図３)。
「リグニン量の定量」は、一般的な「臭化アセチル法(Johnsonらの手法、非特許文献６)」でおこなった。具体的には、アミラーゼ、アミログルコシダーゼによる除デンプン処理後リグニンを酸加水分解して分光光度計によりリグニン量を測定する。その結果、OsNST2相補ラインにおいて野生株よりも約40％有意に高かった(図３)。
【００１５】
（４−３）硫酸糖化処理による単糖類の製造
「硫酸糖化処理」は、細胞壁成分から大半の中性糖を抽出するための周知の手法であり、硫酸存在下で加熱炭化した後加水分解して単糖類を取得し、バイオエタノールなどの原料とする。
得られた形質転換植物の花茎の下部10cmを取得して細胞壁精製粉末を得た後、硫酸糖化処理を行い、鮮重量あたりで得られるグルコース、キシロースの量を比較したところ、OsNST2相補ラインでは野生株よりもグルコースは約45％、キシロースでは約80％もそれぞれ多く得られることがわかった(図４)。
【００１６】
（４−４）「苛性ソーダ前処理＋セルラーゼ糖化」によるグルコースの製造
バイオエタノール生産のための一般的な方法として「苛性ソーダ前処理＋セルラーゼ糖化」法が周知であり、具体的には苛性ソーダ処理によってリグニン細胞壁を除去した残渣に対してセルラーゼによる酵素糖化反応を施す。
この酵素糖化で得られるグルコース含有溶液は、酵母を添加することでバイオエタノール原料となる。
実施例では、花茎の下部10cm部の細胞壁精製粉末を得た後、当該「苛性ソーダ前処理＋セルラーゼ糖化」処理を施した結果、野生株よりも約20％多くのグルコースを得られることがわかった(図４)。
【００１７】
２．その他
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学的技術はJ.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D.M.Glover et al. ed.，DNA Cloning，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)などに記載の方法により、またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http：//www.arabidopsis.org/またはhttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed等)から入手することができる。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（実施例１）ProNST3：OsNST2で形質転換したnst1 nst3二重変異体シロイヌナズナ植物体の作成
（１−１）形質転換ベクターProNST3：OsNST2の構築
以下のように形質転換ベクターを構築した。
非特許文献５に記載のp35SSRDXGベクターにおいてSRDXを省いて、attL1，attL2サイトの外側にあるHindIII認識配列およびEcoRI認識配列に変異を導入したものを、p35SG v2とした。このベクターをHindIIIおよびSalIで切断し、下記のオリゴヌクレオチドをアニーリングして挿入する。
5’-AGCTTAATTAAGGCGCGCCGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGGGTACCG-3’（配列番号３）
5’-TCGACGGTACCCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCGGCGCGCCTTAATTA-3’（配列番号４）
この工程でできたプラスミドをpNOS_Entryとした。つぎにNST3プロモータを下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、pNOS_EntryベクターをAscIおよびBamHIで切断して挿入した。
5’-TAACAAGGCGCGCCGATTCTACACATTCACAAAGTTTACTAC-3’（配列番号５）
5’-ATTCCTGGATCCATTAACGAAGATAGCAATATATTTTTGGG-3’（配列番号６）
この工程でできたプラスミドをpNST3_NOS_Entryとした。つぎにこのベクターをSmaIで切断し、下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRでOsNST2遺伝子を増幅して挿入した。
5’-GATGAGCATATCGGTGAACGGGCAGTCGGT-3’（配列番号７）
5’-TTATACGTTATTCATGGTCGTCAAGTCTGC-3’（配列番号８）
【００２０】
（１−２）フローラルディップ法を用いたProNST3：OsNST2によるシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体の形質転換
上記実施例(１−１)で得られたプラスミドを、土壌細菌(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Schell 1986))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を200ミリリットルのLB培地で2日間培養した。
次いで、培養液から菌体を回収し、500ミリリットルの浸潤培地に懸濁し、これにシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体を2分間浸して感染させた後、通常通り育成しT1種子を収穫した。そののち、T1種子を50％ブリーチ、0.02％Triton X-100溶液で7分間滅菌した後、滅菌水で3回リンスし、30mg/lのハイグロマイシンを含むMS選択培地に播種した。
上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体(ProNST3：OsNST2 nst1 nst3，T1)を選抜し、土壌に植え換えて生育し、種子を採取して播種し、次世代(T2)のシロイヌナズナ植物を得た。
【００２１】
（実施例２）ProNST3：OsNST2 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の形質評価
（２−１）ProNST3：OsNST2 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の花茎の強度測定
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：OsNST2 nst1 nst3シロイヌナズナT2植物において播種後約70日で花茎の下部3cmを採取し、メタノール溶液に浸し、80℃で10分間煮沸した後、蒸留水で3回リンスした。その後、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)、5％エタノール0.02％プロナーゼ溶液37℃で18時間、花茎内のタンパク質を分解した後に、曲げ試験機で破断荷重の測定を行った。その結果ProNST3：OsNST2 nst1 nst3(サンプル数：70)では野生株(サンプル数：70)にくらべて破断荷重が約2倍に高まっていることを発見した(図３)。
【００２２】
（２−２）ProNST3：OsNST2 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の花茎の切片観察
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：OsNST2 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約40日で花茎を採取し、地上高約5cmのところで50μm厚の横断切片をバイブレーションミクロトームを用いて作成し、2％フロログルシノール塩酸でリグニンを染色した。その結果、野生株では維管束管繊維細胞と維管束細胞でしか染色が観察されないのに対し、ProNST3：OsNST2 nst1 nst3シロイヌナズナでは内部の柔細胞でも明らかな染色が認められリグニン様物質が異所蓄積していることがわかった(図３)。
【００２３】
（実施例３）ProNST3：OsNST2 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の細胞壁成分分析
（３−１）細胞壁成分の乾燥重量の比較
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：OsNST2 nst1 nst3シロイヌナズナT2植物において播種後約80日で基部より3cmから10cmの部分を採取し、鮮重量を測定した。その次に、直ちに1cm以下の長さになるよう花茎を刻み、メタノールに浸し80℃で10分間煮沸した後、蒸留水で3回リンスした。その次に、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)、5％エタノール0.02％プロナーゼ溶液で18時間、37℃で18時間、タンパク質を分解した。その次に、50％クロロホルム、50％メタノール溶液に浸し70℃で煮沸した後、新しい50％クロロホルム、50％メタノール溶液に交換した。この操作を3回繰り返した後、アセトン溶液に浸し、70℃で煮沸した後、新しいアセトン溶液に交換した。この操作を3回繰り返した後、100％エタノール溶液で3回リンスした後、70℃で2日間乾燥させて、乾燥重量を測定した。その結果ProNST3：OsNST2 nst1 nst3では野生株に比べて細胞壁成分の乾燥重量が鮮重量あたり約50％増加していることがわかった(図３)。
【００２４】
（３−２）リグニン含量の比較
乾燥した細胞壁残渣はシェイクマスターネオを用いて2000rpm 10分間の粉砕処理を行い、細胞壁粉末を得た。得られた細胞壁粉末100mgを1ミリリットルの50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液に懸濁し、70℃で10分間デンプンを糊化した後、4ミリリットルの50mMマレイン酸、2 mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を加えて、室温で10分間静置した。その次に、500U α-アミラーゼ(E-PANAA)、0.33Uアミログルコシダーゼ(E-AMGIF)、50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を1ミリリットル加えた後、37℃で18時間、デンプンを加水分解し、除デンプンを行った。除デンプンを行った細胞壁粉末懸濁液は、10ミリリットルの蒸留水で3回、100％エタノールで2回リンスした後、70℃で2日間乾燥させ、細胞壁精製粉末を得た。得られた細胞壁精製粉末2mgを、1ミリリットルの75％酢酸、25％臭化アセチル溶液で懸濁した後、50℃で2時間リグニンを加水分解した。その次に、3ミリリットルの100％酢酸を加えて撹拌した後、2000×g、15分間遠心し、上清と残渣を分離した。得られた上清0.4ミリリットルに、0.5ミリリットルの100％酢酸と0.3ミリリットルの0.3M NaOH溶液をそれぞれ加えて撹拌した後、0.1ミリリットルの0.5M塩化ヒドロキシアンモニウム溶液を加えて撹拌した後、分光光度計にて吸光度280nmを測定し、リグニン含量を測定した。その結果、ProNST3：OsNST2 nst1 nst3では野生株に比べて乾燥重量あたり約40％リグニン量が増加していた(図４)。
【００２５】
（３−３）硫酸糖化処理による単糖類の製造
前記(３−２)と同様の処理により得られた細胞壁精製粉末10mgを0.2ミリリットルの72％硫酸溶液で懸濁し、15分後毎に撹拌しながら、1時間室温で細胞壁を炭化させた。その次に、5.6ミリリットルの蒸留水を加えて硫酸濃度を4％に希釈した後、120℃、60分間細胞壁の加水分解を行った。加水分解後の懸濁液は、2000×g、15分間遠心し、上清と残渣を分離し、得られた上清は炭酸カルシウムでpHが5から7になるよう調整した後、溶液中に含まれるグルコース量、キシロース量をグルコーステストキット、キシローステストキットにより調べた。その結果、ProNST3：OsNST2 nst1 nst3では野生株に比べて鮮重量あたりグルコースでは45％、キシロースでは約80％も多くの単糖を得られることがわかった(図４)。
【００２６】
（３−４）「苛性ソーダ前処理＋セルラーゼ糖化」によるグルコースの製造
前記(３−２)と同様の処理により得られた細胞壁精製粉末2mgを0.5ミリリットルの2％NaOH溶液に懸濁し、95℃ 10分間の前処理を行った。その次に、1ミリリットルの蒸留水で3回、1ミリリットルの100％エタノールで2回リンスを行った後、70℃で24時間乾燥させ、脱リグニン細胞壁残渣を得た。得られた脱リグニン細胞壁残渣に1ミリリットルの5mMクエン酸緩衝液(pH4.8)、0.02％アジ化ナトリウム、10μg Accellulase 1500溶液を加えて、50℃、200rpmで24時間振盪しながら、酵素糖化反応を行い得られるグルコース量を調べた。その結果、ProNST3：OsNST2 nst1 nst3では野生株に比べて鮮重量あたり約20％多くのグルコースを得られることがわかった(図４)。これらのことから、本発明で開発したOsNST2を発現させた植物は、二次細胞壁量が増加しており木質が増強されたバイオ燃料の原料植物として優れた植物であることが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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