(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＮＫＧ２Ａ抗体、及び該抗体のヒト化バージョン、並びに該抗体の作製方法及び使用方法を提供する。【解決手段】マウス抗体Ｚ２７０に対して実質的に同一の可変重鎖(ＶＨ)および／または可変軽鎖(ＶＬ)ドメインを有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒト化バージョン。前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む製品、並びに、患者の癌やウイルス疾患などの疾患を治療するための前記製品の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス抗体Ｚ２７０の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の抗原結合残基とヒトアクセプターフレームワーク配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２の少なくとも６のＣ末端残基が可変重（ＶＨ）ドメインヒトアクセプター配列のものと同じである、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の細胞傷害性を増強する点でマウス抗体Ｚ２７０可変軽（ＶＬ）（配列番号１）及びＶＨ（配列番号２）配列を含む抗体よりも効果的である請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１と配列番号５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３を含むＣＤＲ−Ｈ１を含み、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号５の残基５０−５９を含むに対応する請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
（ａ）ＶＨドメインの５位のアミノ酸がＶ又はＱであり；
（ｂ）ＶＨドメインの６９位のアミノ酸がＭ又はＬであり；
（ｃ）ＶＨドメインの７１位のアミノ酸がＴ又はＶであり；
（ｄ）ＶＨドメインの７３位のアミノ酸がＴ又はＫであり；あるいは
（ｅ）ＶＨドメインの７５位のアミノ酸がＴ又はＳである、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ＶＨドメインヒトアクセプターフレームワーク配列が如何なる逆突然変異も含まない請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ＶＨドメインが配列番号５の配列を含む請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
非ヒトＣＤＲ残基とヒトＶＨアクセプターフレームワーク配列を含むＶＨドメインを含み、配列番号４の残基２４−３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４の残基５０−５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号４の残基８９−９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ＶＬドメインヒトアクセプターフレームワークが配列番号４を含む請求項１から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
（ａ）配列番号４の残基２４−３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１；
（ｂ）配列番号４の残基５０−５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２；
（ｃ）配列番号４の残基８９−９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列番号５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１；
（ｅ）配列番号５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）配列番号５の残基５０−５９に対応するＣＤＲ−Ｈ２；
（ｇ）ヒトアクセプターフレームワーク配列
を含み、
ＣＤＲ−Ｈ２の残基６０−６５がＶＨヒトアクセプター配列由来であり、
ヒト化抗体が、配列番号１に対応する可変軽（ＶＬ）配列と配列番号２に対応するＶＨ配列を含む抗体より、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する点で、より効果的である、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
非ヒトＣＤＲ残基とヒトＶＨアクセプターフレームワーク配列を含むＶＨドメインを含み、ＶＨドメインが配列番号５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の残基５０−６５に対応するＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３を含む、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ４抗体である請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体断片又は多重特異性抗体である請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の生産方法において、請求項１から１２の何れか一項に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、核酸が発現され抗体が生産されるように培養することを含む方法。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体を含有してなる薬学的組成物。
【請求項１５】
癌、ウイルス疾患、炎症疾患、及び自己免疫疾患から選択される疾患のヒト患者の治療方法において、請求項１４に記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、特にマウスの抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ２７０のヒト化バージョン、並びに該抗体の作製方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-リガンドＨＬＡ-Ｅを発現する細胞の殺傷を制限する、ＮＫ、ＮＫＴおよびＴ細胞のサブセットに見られる細胞障害能阻害性レセプターである(例として国際公報９９／２８７４８参照)。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを阻害する抗体は、腫瘍細胞に対する腫瘍特異性リンパ球の細胞溶解反応を増やしうる。したがって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞を殺さない癌患者でのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを阻害する治療的抗体は、腫瘍増殖を制御しうる。さらに、特定のリンパ腫、例えばＮＫ-リンパ腫は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現に特徴がある。このような患者において、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞を標的として殺傷する治療的抗体は腫瘍細胞を全滅しうる。また、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、自己免疫性疾患又は炎症性疾患の治療での使用が提案されている(米国特許公開２００３００９５９６５Ａ１を参照、国際公報２００６０７０２８６)。
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに対する様々な抗体は従来技術において記述されている。例えば、Sivori等 (Eur J Immunol 1996;26:2487-92)はマウスの抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ２７０に関し、Carretero等 (Eur J Immunol 1997;27:563-7)ではマウスの抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ199(現在Beckman Coulter, Inc., Product No. IM2750, USAから市販される)が記載され、Vance等 (J Exp Med 1999;190: 1801-12)はマウスの抗ＮＫＧ２-抗体２０Ｄ５(現在BD Biosciences Pharmingen, Catalog No. 550518, USAから市販される)に関し、そして、米国特許公開２００３００９５９６５は称するところによればＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅに結合するマウスの抗体３Ｓ９を記載する。
現在利用可能な抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体は非ヒト起源であるため、免疫原性によりほとんどのヒトの治療的適用に適さない。例えばＣＤＲ移植などの簡単なヒト化手法が有用であるのに対して、個々のヒト化手法は一般的に、機能的性質を十分に保持するかまたは向上させつつ、免疫原性を最小化する最適ヒト化変異体を得るために必要である。したがって、ヒト患者の治療に適切である抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体並びに該抗体を含有する組成物、および該抗体の作製方法及び使用方法を提供する。一実施態様では、抗体はマウスの抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ２７０のヒト化バージョンであり、本明細書において「ｈｕｍＺ２７０」を意味する。他の実施態様では、抗体は、Ｚ２７０に対して実質的に同一の可変重鎖(ＶＨ)および／または可変軽鎖(ＶＬ)ドメインを有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒト化バージョンである。
例えば免疫原性が低いなどの改善した特性、改善した抗原結合又は他の機能的特性、及び／又は例えば安全性が良好になるなどの改善した生理化学的特性を有する抗体を作製するための、フレームワーク領域(ＦＲ)のおよび／または該抗体のアミノ酸置換のための例示的な相補性決定領域(ＣＤＲ)残基および／または部位が提供される。一態様では、本発明は、カバットＣＤＲの少なくとも一部がヒトのアクセプター配列の対応する部分と同一であるヒト化抗体を提供する。一実施態様では、ヒトのアクセプターフレームワーク配列は、任意のアミノ酸置換も又は逆突然変異を含まない。他の実施態様では、ヒトのフレームワーク配列は少なくとも一のアミノ酸置換を含んでなる。このような例示的なアミノ酸置換のためのカバット位置は、ＶＨドメインのフレームワーク領域内の５、６６、６７、６９、７１、７３および７５、ＶＬドメインのフレームワーク領域内の４６および４８、及びＣＤＲ-Ｈ２の６０、６３、６４及び６５を含む。
【０００４】
他の態様では、本発明は、前記抗体と担体を含有してなる医薬組成物、及び細胞障害性剤又は検出可能な薬剤にコンジュゲートさせた前記抗体を含有してなるイムノコンジュゲートを提供する。
他の態様では、本発明は、前記抗体をコードする核酸およびベクター、及び該核酸および／またはベクターを含む宿主細胞を提供する。また、核酸が生成するように前記宿主細胞を培養することによる抗ＮＫＧ２Ａ抗体を産生するための組み換え法が提供される。
他の態様では、本発明は、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体を包含する容器と、患者の癌やウイルス疾患などの疾患を治療するための使用を示す指示書とを具備する製造品を提供する。場合によって、製造品は他の薬剤を包含する他の容器を具備し、この指示書は薬剤と組み合わせた抗体によって疾患を治療するための使用を示すものである。
また、本発明は、患者の癌、ウイルス性疾患、炎症性疾患又は自己免疫性疾患などの疾患の治療に、場合によって他の抗癌剤、抗ウイルス疾患剤又は抗炎症剤と組み合わせて、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体を使用する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、選択された生殖系列Ｖ−及びＪ部位を有するＺ２７０ＶＨ及びＺ２７０ＶＬのアラインメント及び典型的なｈｕｍＺ２７０ＶＬ１（配列番号：４）及びｈｕｍＺ２７０ＶＨ１（配列番号：５）配列を示し、カバット・スキームに従うアミノ酸残基番号付けを伴っている（Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, Na-tional Institutes of Health, Bethesda, MD.）。マスク残基は、カバット・スキームにおいて斜線をつけられる；ＣＤＲ残基は、カバット・スキームにおいてボールドで示される；ＶＫＩ＿０２／ＪＫ４（配列番号：９）及びＶＨ１＿１８／ＪＨ６（配列番号：１０）配列において、マウス／生殖系列の相違点は、斜線をつけられている；及び、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ／ＶＬ配列において、潜在的復帰突然変異残基は斜線をつけられている。ＶＬにおける同定された潜在的復帰突然変異は、Ｌ４６Ｆ及びＩ４８Ｖであった。重鎖における同定された潜在的復帰突然変異は、Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓであった。結果として生じるｈｕｍＺ２７０ＶＬコンセンサス（「ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１  ｃｏｎｓ」；配列番号：６）及びｈｕｍＺ２７０ＶＨ１（「ｈｕｍＺ２７０ＶＨ１  ｃｏｎｓ」；配列番号：７）コンセンサス配列もまた、示されている。ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１  ｃｏｎｓにおいて、位置４６のアミノ酸は、ＬまたはＦであり、位置４８のアミノ酸は、ＩまたはＶである。ｈｕｍＺ２７０ＶＨ１  ｃｏｎｓにおいて、位置５のアミノ酸はＶまたはＱである；位置６９のアミノ酸はＭまたはＬである；位置７１のアミノ酸はＴまたはＶである；位置７３のアミノ酸はＴまたはＫである；および／または、位置７５のアミノ酸はＴまたはＳである。別のｈｕｍＺ２７０ＶＨ１（ｈｕｍＺ２７０ＶＨ１ｃｏｎｓ２（配列番号：８））において、位置５のアミノ酸はＶまたはＱである；、位置６０のアミノ酸はＳまたはＡである；、位置６３のアミノ酸はＬまたはＦである；、位置６４のアミノ酸はＱまたはＫである；、位置６５のアミノ酸はＧであるまたはＤ；、位置６６のアミノ酸はＲまたはＫである；、位置６７のアミノ酸はＶまたはＡである；、位置６９のアミノ酸はＭまたはＬである；、位置７１のアミノ酸はＴまたはＶである；、位置７３のアミノ酸はＴまたはＫである；および／または、位置７５のアミノ酸はＴまたはＳである。
【図２】図２は、カバット定義による、典型的なｈｕｍＺ２７０抗体のＣＤＲを示す。マウスＺ２７０ＣＤＲと比較した相違点は、ボールドで示される。
【図３】図３Ａ−Ｈは、実施例において言及するプラスミドを示す。（Ａ）ＴＡクローニングのための  ｐＭＤ１９−Ｔベクターマップ。（Ｂ）一過性発現のためのｐＪＳＶ００２クローニング・ベクターマップ。（Ｃ）軽鎖は、マウスカッパ定常領域を有するｐＪＳＶ００２に挿入される。（Ｄ）マウスのＩｇＧ１定常領域を含むｐＪＳＶ００２−ｍＩｇＧ１変異体。（Ｅ）Ｚ２７０重鎖可変領域及びＩｇＧ１重鎖定常領域を含むｐＪＳＶ００２−ｍＩｇＧ１  Ｚ２７０  Ｈ１。（Ｆ）軽鎖可変領域及びヒト・カッパ鎖定常領域を含むｐＪＳＶ００２−ｈＫａｐｐａ  Ｚ２７０  Ｌ１１。（Ｇ）ｐＪＳＶ００２−ＩｇＧ４−Ｓ２４１Ｐ。（Ｈ）ｐＪＳＶ００２−ＩｇＧ４−Ｓ２４１Ｐ  Ｚ２７０Ｈ１。
【図４】図４は、それぞれＺ２７０（Ａ）から（Ｊ）、配列番号：１４−２３に由来する又は基づく、異なる配列を示す。詳細は実施例２−５を参照。
【図５】図５は、ヒト化Ｚ２７０重鎖の発現のためのベクターの典型的な設計を示す。
【図６】図６は、ヒト化Ｚ２７０軽鎖の発現のためのベクターの典型的な設計を示す。
【図７】図７は、ＨＥＫ２９３細胞のヒト化Ｚ２７０抗体の一過性発現のための手法の典型的な概要を示す。
【図８】図８は、抗原に対するｈｕｍＺ２７０の結合親和性を決定するための典型的なバイアコア分析を示す。
【図９】図９は、キメラＺ２７０（Ａ）及びｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１（Ｂ）のアフィニティ決定を示す。
【図１０】図１０は、軽鎖または重鎖の異なる復帰突然変異を有するｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１のアフィニティ決定を示す。キメラＺ２７０は、比較として用いられた。
【図１１】図１１は、（ｈｕｍＺ２７０Ｈ３）を有さない、又は（ｈｕｍＺ２７０ＶＨ４）復帰突然変異体を有するＶＨ１＿１８／ＪＨ６重鎖アクセプタ・フレームワークへのマウスＺ２７０カバットＣＤＲ  Ｈ１−Ｈ３の標準的なＣＤＲ結合のためのストラテジーを示す。
【図１２】図１２は、異なるヒトアクセプター配列のｈｕｍＺ２７０ＶＨ構築物（全てＣＤＲ−Ｈ２の部分的にヒト部分を有する）間のアラインメントを示す。
【図１３】図１３はｈｕｍＺ２７０変異体ＶＬ１／ＶＨ１及びＶＨ３−ＶＨ８のバイアコア・アフィニティ評価の結果を示す。全てｈＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１のＫＤで標準化している。
【図１４】図１４は、Ｚ２７０  ＶＬ及びＶＨセグメントの重要なパラトープ残基を同定するためのアラニン−スキャン突然変異生成の選択された残基を示す。
【図１５】図１５は、キメラＺ２７０の結合性で標準化されたＺ２７０ＶＨアラニン変異体のバイアコア・アフィニティ評価の結果を示す。
【図１６】図１６は、キメラＺ２７０の結合性で標準化されたＺ２７０ＶＬアラニン変異体のバイアコア・アフィニティ評価の結果を示す。
【図１７】図１７は、フローサイトメトリーを用いて、安定してＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡまたはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃを過剰発現させていているＢａ／Ｆ３細胞に対する様々な組換え型Ｚ２７０変異体の結合性を示す。
【図１８】図１８は、組換え型Ｚ２７０、キメラＺ２７０、ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１及びＺ１９９の、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋  ＮＫＬ細胞による５１Ｃｒ標識化されたＬＣＬ  ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞の死滅を誘導するための能力を評価するアッセイの結果を示しており、ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１が死滅の誘導において効率的だったことを示す。
【図１９】図１９は、ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１が、濃度依存的にＢａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞に効率よく結合することを示す（ダイヤモンド）。しかしながら、細胞をＨＬＡ−Ｅテトラマーと共にプレインキューベートした場合、ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１のＢａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞への結合が阻害された（正方形）。
【図２０】図２０は、ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１及びＶＨのＶ５Ｑ変異を有するｈｕｍＺ２７０変異体の異なる２つの標本が、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ発現細胞でなくＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞に結合するが、Ｖ５Ｑ変異体はわずかに効率が悪かったことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（定義）
本明細書中の「抗体」なる用語は、最も広義の意味で用いられ、特に、所望の生物学的活性を表す限り、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)および抗体断片を包含する。抗体作製に関連する様々な技術は、例えば、Harlow,等, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).)に提供される。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくは抗原結合性又はその可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ)２、Ｆ(ａｂ')２、Ｆ(ａｂ)３、Ｆｖ(一般的に抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメイン)、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片(一般的にＶＨおよびＣＨ1ドメイン)、およびｄＡｂ(一般的にＶＨドメイン)断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨおよびＶ-ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ(例としてIll等, Protein Eng 1997;10: 949-57を参照)；ラクダのＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；及び、抗体断片から形成した多特異性抗体断片、及び一又は複数の単離されたＣＤＲ又は機能的パラトープが含まれ、単離されたＣＤＲないしは抗原結合性残基ないしはポリペプチドは互いに関連又は連結して機能的抗体断片を形成しうる。様々な種類の抗体断片は、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;23, 1126-1136；国際公報２００５０４０２１９、及び公開された米国特許公開２００５０２３８６４６および同２００２０１６１２０１に記載されるか、又は概説されている。
【０００７】
本明細書中で使用される場合の「抗体誘導体」なる用語には、完全長抗体又は、好ましくは少なくとも抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む抗体の断片が含まれ、このとき、例えば第二の分子に抗体を連結させるために、例えばアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって一又は複数のアミノ酸が化学的に修飾されているものである。これには、ペグ化抗体、システイン-ペグ化抗体およびその変異体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「イムノコンジュゲート」には、細胞障害性剤、検出可能試薬などの第二薬剤と結合した又は連結した抗体誘導体が含まれる。
【０００８】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むヒト／非ヒトのキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列の残基である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、場合によって免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。詳しくは、例えばJones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及び、Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、国際公報９２／０２１９０、米国特許公開２００６００７３１３７および米国特許第６７５０３２５号、同第６６３２９２７号、同第６６３９０５５号、同第６５４８６４０号、同第６４０７２１３号、同第６１８０３７０号、同第６０５４２９７号、同第５９２９２１２号、同第５８９５２０５号、同第５８８６１５２号、同第５８７７２９３号、同第５８６９６１９号、同第５８２１３３７号、同第５８２１１２３号、同第５７７０１９６号、同第５７７７０８５号、同第５７６６８８６号、同第５７１４３５０号、同第５６９３７６２号、同第５６９３７６１号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号および同第５２２５５３９号を参照のこと。
【０００９】
本明細書中で用いられる「高頻度可変領域」なる用語は抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；上掲のKabat等, 1991)及び／又は「高度可変ループ」の残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。一般的に、この領域のアミノ酸残基の番号付けは、上掲のカバット等において記述される方法によって行われる。本明細書中の「カバット位置」、「カバット番号付けを使用して」、「カバットに記載の可変ドメイン残基番号付け」、及び「カバットによると」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。カバット番号付けシステムを用いて、実際の直鎖状のペプチドのアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に応じてアミノ酸が減っていても又は増えていてもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入(カバットによると残基５２ａ)を含んでいてもよいし、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによると残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど)を含んでいてもよい。残基のカバット番号付けは、抗体の配列の相同領域に「標準の」カバット番号付けした配列と整列させて所定の抗体について決定してもよい。特に明記しない又は内容に反しない限り、本明細書中に記載したＶＬ又はＶＨ配列中のすべてのアミノ酸残基の位置はカバットに従う。
【００１０】
本明細書において定められるように、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基はＣＤＲ以外のＶＨ又はＶＬ残基である。
ポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチド、一般的に天然又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、天然のアミノ酸配列内の特定の位置に一又は複数のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有してもよい。
「保存的」アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の物理化学的特性を有する側鎖を持つアミノ酸残基に置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で公知であり、塩基性の側鎖(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性の側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性の側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、無極性の側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β枝分れ側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。
【００１１】
２つのアミノ酸配列の関係において「実質的に同一の」なる用語は、例えば初期設定のギャップ加重(default gap weights)を用いたプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって、場合によって整列させた場合に、配列が 少なくともおよそ５０、少なくともおよそ６０、少なくともおよそ７０、少なくともおよそ８０、少なくともおよそ９０、少なくともおよそ９５、少なくともおよそ９８又は少なくともおよそ９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。一実施態様では、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換が異なる。配列同一性は一般的に、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられる類似性の値を用いて類似の配列と適合させる。例えば、公的に利用可能なＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物体からの相同なポリペプチドなどの非常に関連したポリペプチド間、又は野生型タンパク質とその変異体との間の配列相同性または配列同一性を決定するために、初期設定のパラメーターを用いられうる「Ｇａｐ」及び「ＢｅｓｔＦｉｔ」などのプログラムを含む。例としてＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、初期設定又は推奨されたパラメーターを適用したＦＡＳＴＡ又はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて比較されてもよい。ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡ(例えばＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３)により、クエリー配列とサーチ配列が整列され、最も重なり合っている領域のパーセント配列同一性が求められる(Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98；Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219)。ある配列を様々な生物体の複数の配列を含むデータベースと比較する場合、又はそれを推定する場合の他の好適なアルゴニズムは、初期設定のパラメーターを用いたコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐである。例としてAltschul等, J. Mol. Biol. 1990;215:403-410；Altschul等, Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)を参照。これらは各々出典明記によって本明細書に援用される。２つの実質的に同一のアミノ酸配列の「対応する」アミノ酸位は、典型的には初期設定のパラメーターを用いた、本明細書中で言及したいずれかのタンパク質分析ソフトウェアを用いて整列したものである。
【００１２】
参照抗体の「生物学的特性」を有する抗体(例えばＺ２７０)は、同じ抗原(例えばＮＫＧ２Ａ)に結合する他の抗体と区別する一又は複数の抗体の生物学的特性を有するものである。例えば、Ｚ２７０の生物学的特性を有する抗体は、ＮＫＧ２Ａの活性化をブロックするか、及び／又はＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインを結合する際にＺ２７０と交差競合してもよい。
ＮＫＧ２Ａ(ＯＭＩＭ １６１５５５、この全体の公開内容は出典明記によって本明細書中に援用される)はＮＫＧ２Ａグループの転写物のメンバーである(Houchins,等 (1991) J. Exp. Med. 173: 1017-1020)。ＮＫＧ２Ａは２５ｋｂにわたる７つのエクソンによってコードされ、いくつかの異なるスプライシングを示す。ＮＫＧ２Ａは、ＮＫ細胞、α／βＴ細胞、γ／δＴ細胞及びＮＫＴ細胞のサブセットの表面上に見られる阻害性レセプターである。阻害性ＫＩＲレセプターと同様に、その細胞質のドメインにＩＴＩＭを備えている。本明細書中で用いられる「ＮＫＧ２Ａ」は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子の任意の変異体、誘導体又はアイソフォーム又はコードされるタンパク質を指す。また、野生型の完全長ＮＫＧ２Ａと一又は複数の生物学的特性ないし機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の同一性を共有する任意の核酸又はタンパク質配列も包含する。ヒトＮＫＧ２Ａは、３つのドメインに２３３アミノ酸を含み、細胞質ドメインは残基１−７０を含み、膜貫通領域は残基７１−９３を含み、細胞外領域は残基９４−２３３を含む、以下の配列である。
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL(配列番号：１１)
【００１３】
ＮＫＧ２Ｃ(ＯＭＩＭ ６０２８９１、この全体の公開内容は出典明記によって本明細書中に援用される)とＮＫＧ２Ｅ (ＯＭＩＭ ６０２８９２、この全体の公開内容は出典明記によって本明細書中に援用される)は、ＮＫＧ２Ａグループの転写物の他の２つのメンバーである(Gilenke,等 (1998) Immunogenetics 48:163-173)。ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２ＥはＮＫ細胞の表面に見られる活性化レセプターである。
ＨＬＡ-Ｅ(ＯＭＩＭ １４３０１０、この全体の公開内容は出典明記によって本明細書中に援用される)は、細胞表面上に発現され、他のＭＨＣクラスＩ分子のシグナル配列由来のペプチドの結合によって制御される非古典的なＭＨＣ分子である。ＨＬＡ-Ｅはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞といくつかのＴ細胞を結合し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに特異的に結合する(例としてBraud等 (1998) Nature 391:795-799を参照、この全体の公開内容は出典明記によって本明細書中に援用される)。ＨＬＡ-Ｅの表面発現は十分であるので、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋  ＮＫ、Ｔ又はＮＫＴ細胞クローンによる溶解から標的細胞を保護する。本明細書中で用いられる「ＨＬＡ-Ｅ」は、ＨＬＡ-Ｅ遺伝子の任意の変異体、誘導体又はアイソフォーム又はコードされるタンパク質を指す。また、野生型の完全長ＨＬＡ-Ｅと一又は複数の生物学的特性ないし機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の同一性を共有する任意の核酸又はタンパク質配列も包含する。
【００１４】
核酸が他の核酸配列と機能的な関係にある場合、核酸は「作用可能に連結して」いる。例えば、プレシーケンス(presequence)または分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関わっている前駆体タンパク質として発現する場合は、そのポリペプチドのＤＮＡと作用可能に結合している。プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。または、リボソーム結合部は、それが翻訳を促す位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
【００１５】
「単離される」分子は、属する分子の種類に関して見られる組成物中の主な種である分子である(すなわち、それは、組成物中の分子の種類の少なくともおよそ５０％を占め、一般的に組成物中の分子、例えばペプチドの種類の少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％又はより多くを占める)。一般に、抗体分子の組成物は、組成物中に存在するすべてのペプチド種類の関係において、または、少なくとも提案された使用の関係において実質的に活性なペプチド種類に関して、抗体分子の９８％、９８％又は９９％の均一性を表すであろう。
【００１６】
本発明の前後関係において、前後関係によって否定されない限り、「処置」又は「治療する」は、疾患又は疾病の一又は複数の症状又は臨床的に関連する徴候を予防するか、緩和するか、管理するか、治癒するか、または低減することを指す。例えば、症状又は疾患ないし疾病の臨床的に関連する兆候が同定されていない患者の「処置」は予防又は防止的な治療であるのに対して、症状又は疾患ないし疾病の臨床的に関連する兆候が同定されている患者の「処置」は一般的に予防又は防止的な治療を成さない。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明はＮＫＧ２Ａに結合する抗体に関する。一態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ａを特異的に結合するがヒトのＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅには結合しないマウスモノクローナル抗体である抗体Ｚ２７０のヒト化バージョンである。Ｚ２７０はヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの機能をブロックし、濃度に依存して、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球による細胞の殺傷を特異的に誘導することができる。
本発明は、例えば、ＣＤＲ-Ｈ２などの少なくとも一部のＶＨ ＣＤＲがヒトのＶＨアクセプター配列の対応する部分と同一であり、それによってヒト化抗体の免疫原性が低減されているｈｕｍＺ２７０変異体を提供する。驚くべきことに、このようなヒト化変異体は、Ｚ２７０のマウス又はキメラ型よりも、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現する細胞障害性リンパ球の細胞障害能を強化することにより効果を示しうる。他の実施態様では、本発明は、マウス抗体Ｚ２７０と対応する特定の抗原結合残基とヒトのフレームワーク配列を含むＣＤＲを有する抗体を提供する。これらの、そしてまた他の態様は、以下の項目及び実施例において更に詳細に記述される。
【００１８】
ヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来技術において記述されている。通常、ヒト化方法では、マウス抗体の相互作用領域をコードするヌクレオチドをヒトＩｇＧをコードするｃＤＮＡベクターにクローニングして、マウスＣＤＲを保持するヒトＩｇＧ主鎖からなるキメラ抗体が生成されるように行ってもよい。このようなキメラ抗体は、元のマウス抗体と比べて低親和性、低安定性、又は他の望ましくない特徴を表し、免疫原性を持ちうる。したがって、キメラＡｂの個々のアミノ酸は、ヒトの医療に応用するために品質の高い機能的なｍＡｂを得るために最適化する必要があるかもしれない。
一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供与源から導入される一又は複数のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入(import)」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、Winter及び共同研究者(Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332: 323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239: 1534-1536 (1988))の方法に従って、高頻度可変領域配列をヒト「アクセプター」抗体の対応する配列と置換することにより行ってもよい。したがって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位の残基によって置換されたヒト抗体である。
【００１９】
他のヒト化抗体の作製方法は米国特許公開２００３／００１７５３４に記載されており、そこではヒト化抗体及び抗体調整物はトランスジェニック非ヒト動物から産生されている。非ヒト動物に遺伝的操作を加えて、トランスジェニック非ヒト動物で遺伝子再構成及び遺伝子転換が可能になるように一又は複数のヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含有させて、多様なヒト化免疫グロブリンを生成する。
抗原性を低減するために、ヒト化抗体を生成する際に使用する軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ又はヒト生殖系配列のライブラリに対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域として受け入れる(Sims等, J. Immunol. 1993;151:2296 et seq.；Chothia等, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用してもよい(Carter等, PNAS USA, 1992;89:4285 et seq.；Presta等, J Immunol 1993;151:2623 et seq.)。ヒト患者における抗体分子の免疫原性を低減するように設計される他の方法には、ベニヤ抗体(veneered antibody)(例として米国特許第６７９７４９２号及び米国特許公開２００２００３４７６５及び同２００４０２５３６４５を参照)及びＴ細胞エピトープ分析及び除去によって修飾されている抗体(例として米国特許公開２００３０１５３０４３及び米国特許第５７１２１２０号を参照)が含まれる。
【００２０】
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンのその抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原(一又は複数)に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
以下の実施例１にはＮＫＧ２Ａを結合する例示的なヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体の設定が記載されており、その分析の少なくとも一部は図１に示される。図１に示すように、本発明のあるｈｕｍＺ２７０抗体において、ＣＤＲ-Ｈ２のＣ末端部分(カバット残基６１−６５に対応する)はヒトのアクセプター配列の対応する部分と同一である。さらに、図説に記載したように、ｈｕｍＺ２７０ＶＬ配列(配列番号：４)は場合によって、示されたＦＲ残基Ｌ４６およびＩ４８の一方または両方に突然変異を含んでもよいし、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ配列(配列番号：５)は場合によって、示されたＦＲ残基Ｖ５、Ｍ６９、Ｔ７１、Ｔ７３およびＴ７５の一又は複数に突然変異を含んでもよい。アミノ酸の番号付けはカバットに従う。表１に、ｈｕｍＺ２７０ＶＨおよびｈｕｍＺ２７０ＶＬのＦＲ配列に例示的なヒトからマウスへの逆突然変異、並びにＦＲ突然変異の例示的な組合せを含む例示的なｈｕｍＺ２７０ＶＬおよびｈｕｍＺ２７０ＶＨ変異体を記述する。表１及び本明細書中の他の箇所において、アミノ酸位はカバットに従って設定されており、ｈｕｍＺ２７０ＶＨドメインのアミノ酸Ｖ５、Ｍ６９、Ｔ７１、Ｔ７３およびＴ７５は、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８又は本明細書中に記載の他の例示的なｈｕｍＺ２７０ＶＨ配列のアミノ酸Ｖ５、Ｍ７０、Ｔ７２、Ｔ７４およびＴ７６に対応する。
【００２１】
表１  天然又はコンセンサスのｈｕｍＺ２７０ＶＬ(配列番号：４又は６)および／またはｈｕｍＺ２７０ＶＨ(配列番号：５、７又は８)配列に例示的なＦＲ逆突然変異を含むｈｕｍＺ２７０ＶＬおよびｈｕｍＺ２７０ＶＨ変異体。
2014122221.tif 000002
【００２２】
したがって、本発明は、Ｚ２７０ハイブリドーマによって産生される抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒト化型、並びにＺ２７０と生物学的特性及び／又は実質的な配列同一性を共有する非ヒト抗体のヒト化バージョンを提供する。他の実施態様では、モノクローナル抗体又はその断片ないし誘導体は非ヒト霊長類のＮＫＧ２Ａに結合することができる。
本明細書中のヒト化抗体は、ヒトのＶＨおよびＶＬドメインに組み込まれる非ヒト高頻度可変領域又はＣＤＲ残基を含んでなる。
一態様では、本発明は、ヒトのアクセプターフレームワークにマウス抗体Ｚ２７０のＣＤＲ由来の抗原結合性残基を含むヒト化抗体であって、ＣＤＲ-Ｈ２の少なくとも６つのＣ末端アミノ酸残基はヒトのアクセプター配列のものと同じであるヒトか抗体を提供する。このようなヒト化抗体は、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現する細胞障害性リンパ球、例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、α／βＴ細胞、及び／又はγ／δＴ細胞などの細胞障害活性、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現する細胞障害性リンパ球の集団の細胞障害活性を高めるなどの際に、元のマウスＺ２７０抗体ないしそのキメラバージョンよりも有効であるかもしれない。
【００２３】
本発明の典型的な抗体は、配列番号：２又は配列番号：５の残基Ｄ５２、Ｄ５４、Ｒ９４、Ｆ９９、Ｔ(１００Ｃ)およびＷ(１００Ｆ)を含む、Ｚ２７０ ＣＤＲ-Ｈ２およびＣＤＲ-Ｈ３に対応する抗原結合残基、又はその一部を含む。これらは実施例において抗原結合に重要であることが示されている。また場合によって、抗体はＶＨ残基Ｎ３５、Ｙ５３、Ｅ５６、Ｄ９８、Ｖ(１００Ａ)及びＬ(１００Ｄ)を含む。
他の態様では、ヒト化抗体は、配列番号：５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ-Ｈ1配列と、配列番号：５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ-Ｈ３配列とを含み、このときＣＤＲ-Ｈ２配列は配列番号：５の残基５０−５９を含む。このようなヒト化抗体において、ＶＨ領域は、配列番号：５に対して例えば５０％以上の配列同一性、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％又は少なくとも７５％の配列同一性を有しうる。このような配列を有する例示的なヒト化ＶＨドメインを、実施例および下記に記載する。
一実施態様では、このようなヒト化抗体では、ＶＨ領域の位置５のアミノ酸はＶ又はＱであってもよく、ＶＨ領域の位置６９のアミノ酸はＭ又はＬであってもよく、ＶＨ領域の位置７１のアミノ酸はＴ又はＶであってもよく、ＶＨ領域の位置７３のアミノ酸はＴ又はＫであってもよく、および／または、ＶＨ領域の位置７５のアミノ酸はＴ又はＳであってもよい。異なる実施態様では、ＶＨ領域は、Ｖ５又はＱ５、Ｍ６９又はＬ６９、Ｔ７１又はＶ７１、Ｔ７３又はＫ７１、および／またはＴ７５又はＳ７５残基を含む。他の実施態様では、位置６９のアミノ酸はＬである。他の更なる又は代替的な実施態様では、位置７１のアミノ酸はＶである。
【００２４】
ヒト化抗体は、例えば、ＶＨ１＿１８、ＶＨ５＿ａ、ＶＨ５＿５１、ＶＨ１＿ｆおよびＶＨ１＿４６から選択されるヒトアクセプター配列のＶＨヒトアクセプターフレームワークを含んでもよく、そしてＪセグメントは例えばＶＨ１＿１８、ＶＨ５＿ａ、ＶＨ５＿５１又はＶＨ１＿ｆなどのＪＨ６、又は当分野で公知の他のヒトの生殖系ＶＨフレームワーク配列である。一実施態様では、ＶＨ部分はＶＨ１＿１８である。特定の実施態様では、ＶＨ領域は配列番号：８の配列を含む。他の具体的な実施態様では、ＶＨ領域は配列番号：７の配列を含む。例えば、ＶＨ領域は配列番号：５の配列を含んでもよい。
ＶＬ領域ヒトアクセプター配列は、例えばＶＫＩ＿Ｏ２／ＪＫ４であってもよい。特定の実施態様では、ＶＬ領域は配列番号：４を含む。
一態様では、本発明のヒト化抗体は、好適なＦＲ配列を介して配列番号：２の残基９５−１０２からなるＣＤＲ-Ｈ３に連結される配列番号：２の残基５０−５９からなるマウス部分を含むＣＤＲ-Ｈ２を含む。
【００２５】
本明細書中に記載のように、ある実施態様では、ヒト化抗体はＶＨドメインにＦＲ置換を含まない。他の実施態様では、ヒト化抗体は、カバットによる可変ドメイン番号付けシステムを用いて、５、６９、７１、７３および７５から選択される一又は複数の位置にＶＨドメインＦＲ置換を含む。他の実施態様では、ヒト化抗体は、位置５、６９、７１、７３および７５のうちの２以上にＶＨドメインＦＲ置換を含み、他の実施態様では、これらの３つ、４つ又はすべての位置に置換を含む。異なる独立した実施態様では、ヒト化抗体は、５、６９、７１、７３および７５から選択される位置に１つのＶＨドメインＦＲ置換を含む。他の異なる独立した実施態様では、ヒト化抗体は、位置５および６９、又は５および７１、又は５および７３、又は５および７５、又は６９および７１、６９および７３、又は６９および７５、又は７１および７３、又は７１および７５、又は７３および７５、又は５、６９および７１、又は５、６９および７３、又は５、６９および７５、又は６９、７１および７３、又は６９、７１および７５、又は７１、７３および７５、又は５、６９、７１および７３、又は５、６９、７１および７５、又は５、７１、７３および７５、又は６９、７１、７３および７５、又は５、６９、７１、７３および７５にＶＨドメインＦＲ置換を含む。より多くであるというよりはむしろより少ないフレームワーク置換により免疫原性が最小化しうるが、結合効果は用途によって重要な考慮すべき点であるかもしれない。ゆえに、好適な置換は逆突然変異、すなわちヒトＦＲの特定の位置のアミノ酸を非ヒトドナーＦＲの対応する位置のアミノ酸で置換する突然変異である。ゆえに、異なる独立した実施態様では、位置５のＶＨドメインアミノ酸置換はＶ５Ｑであり、位置６９のアミノ酸置換はＭ６９Ｌであり、位置７１のアミノ酸置換はＴ７１Ｖであり、位置７３のアミノ酸置換はＴ７３Ｋであり、位置７５のアミノ酸置換はＴ７５Ｓである。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、位置７１にＶおよび／または位置６９にＬを含む。
【００２６】
また、本明細書中のヒト化抗体は、ヒトＶＬドメインに組み込まれる非ヒト高頻度可変領域残基を含む。ある実施態様では、ヒト化抗体はＶＬドメインにＦＲ置換を含まない。他の実施態様では、ヒト化抗体は、カバットによる可変ドメイン番号付けシステムを用いて、位置４６および４８のいずれか一つにＶＬドメインＦＲ置換を含む。他の実施態様では、ヒト化抗体は、位置４６および４８の両方にＶＬドメインＦＲ置換を含む。好適な置換は逆突然変異、すなわちヒトＦＲの特定の位置のアミノ酸を非ヒトドナーＦＲの対応する位置のアミノ酸で置換する突然変異である。ゆえに、異なる独立した実施態様では、位置４６のＶＬドメインアミノ酸置換はＬ４６Ｆであり、位置４８のＶＬドメインアミノ酸置換はＩ４８Ｖである。
【００２７】
例示的なヒト化抗体は、配列番号：５又は７の残基３１−３５に対応するＣＤＲ-Ｈ1配列と、配列番号：５又は７の残基５０−６６に対応するＣＤＲ-Ｈ２配列と、配列番号：５又は７の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ-Ｈ３配列とを含むＶＨドメインを含む。ヒト化抗体はさらに、ＶＨドメインに、Ｖ又はＱであるカバット位置５のアミノ酸、Ｍ又はＬであるカバット位置６９のアミノ酸、Ｔ又はＶであるカバット位置７１のアミノ酸、Ｔ又はＫであるカバット位置７３のアミノ酸、及び／又はＴ又はＳであるカバット位置７５のアミノ酸を含む。一実施態様では、ＶＨドメインは、例えばＶＨ ＦＲ置換のいずれかに対応する、５、６９、７１、７３および７５か、又は表１に挙げたこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのカバット位置にフレームワーク領域置換を含む。一実施態様では、ＶＨドメインは配列番号：７の配列を含む。他の実施態様では、ＶＨドメインは配列番号：５の配列を含む。
またないしはあるいは、例示的なヒト化抗体は、配列番号：４の残基２４−３４に対応するＣＤＲ-Ｌ1配列と、配列番号：４の残基５０−５６に対応するＣＤＲ-Ｌ2配列と、配列番号：４の残基８９−９７に対応するＣＤＲ-Ｌ３配列とを含むＶＬドメインを含む。ヒト化抗体は、Ｌ又はＦであるカバット位置４６のアミノ酸および／またはＩ又はＶであるカバット位置４８のアミノ酸を更に含んでもよい。一実施態様では、ＶＬドメインは、例えばＶＬ ＦＲ置換のいずれかに対応する、４６および４８か、又は表１に挙げたこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのカバット位置にフレームワーク領域置換を含む。一実施態様では、ＶＬドメインは配列番号：４のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ＶＬドメインは配列番号：６の配列を含む。
【００２８】
他の態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａを結合するヒト化抗体であって、場合によってカバット位置５、６９、７１、７３及び／又は７５に一又は複数のＦＲ置換を有する配列番号：５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含むヒト化抗体を提供する。任意のＦＲ置換は、例えばＶ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ及び／又はＴ７５Ｓ、並びにそのいずれかの組み合わせから選択されうる。またないしはあるいは、このようなヒト化抗体は、場合によってカバット位置４６及び／又は４８に一又は複数のＦＲ置換を有する配列番号：４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。任意のＦＲ置換は例えばＬ４６Ｆ及び／又はＩ４８Ｖから選択されうる。
場合によって、特定の態様では、ＶＨドメインは、例えば修飾が本質的に抗体の親和性を維持するかまたは向上するような、一又は複数のＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含む。例えば、抗体変異体は、上記のＶＨ ＣＤＲ配列に１つ、２つ、３つ又は１からおよそ７つのアミノ酸置換を有しうる。
【００２９】
特定の態様では、非ヒトドナーＶＨ ＣＤＲの対応する位置のアミノ酸と異なるヒト化抗体ＶＨ ＣＤＲのアミノ酸が置換されて、ヒト化抗体の結合特性および／または安定性が改善しうる。例えば、これら一又は複数のアミノ酸は、非ヒトドナーＶＨ ＣＤＲの対応する位置(一又は複数)のアミノ酸に置換されてもよい。一実施態様では、変異抗体は、カバットに従うところの、６０、６３、６４および６５から選択される一又は複数の位置(配列番号：５又は７の位置６１、６４、６５および６６に対応する)に、ＣＤＲＨ2置換を含む。異なる独立した実施態様では、抗体変異体は、６０、６３、６４および６５から選択される１つの位置にＣＤＲＨ２アミノ酸置換を含む。他の異なる独立した実施態様では、抗体変異体は、位置６０および６３、又は６０および６４、又は６０および６５、又は６３および６４、又は６３および６５、又は６４および６５、又は６０、６３および６４、又は６０、６３および６５、又は６０、６４および６５、又は６３、６４および６５、又は６０、６３、６４および６５にＣＤＲＨ２アミノ酸置換を含む。好適な置換は逆突然変異、すなわちヒト化ＣＤＲの特定の位置のアミノ酸を非ヒトドナーＣＤＲの対応する位置のアミノ酸で置換する突然変異である。ゆえに、異なる独立した実施態様では、位置６０のＣＤＲＨ２アミノ酸置換はＡ６０Ｓであり、位置６３のアミノ酸置換はＬ６３Ｆであり、位置６４のアミノ酸置換はＱ６４Ｋであり、位置６５のアミノ酸置換はＧ６５Ｄである。抗体変異体がＣＤＲＨ２アミノ酸置換Ａ６０Ｓ、Ｌ６３Ｆ、Ｑ６４ＫおよびＧ６５Ｄの一又は複数を含む態様において、抗体変異体は、場合によって既に記載したＶＨ ＦＲ置換の一又は複数ともに、カバットによる位置６６および６７に、ＶＨ ＦＲアミノ酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換はＲ６６ＫおよびＶ６７Ａである。例えば、一実施態様では、抗体変異体は、配列番号：５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ-Ｈ１配列と、配列番号：５の残基５０−６６に対応するＣＤＲ-Ｈ２配列と、配列番号：５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ-Ｈ３配列を、Ａ６０Ｓ、Ｌ６３Ｆ、Ｑ６４Ｋ、Ｇ６５Ｄ、Ｒ６６ＫおよびＶ６７Ａの「逆突然変異」を有して、場合によって更なるアミノ酸修飾とともに含むＶＨドメインを含む。
【００３０】
他の特定の態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａを結合するヒト化抗体であって、ヒトＶＨドメインに非ヒトＣＤＲ残基の組み込みを含むＶＨドメインを含み、このＶＨドメインが配列番号：８の残基３１−３５に対応するＣＤＲ-Ｈ１配列と、配列番号：８の残基５０−６６に対応するＣＤＲ-Ｈ２配列と、配列番号：８の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ-Ｈ３配列とを含み、カバット位置６３、６４、６５、６６及び６７のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｋ、Ｄ、Ｋ、Ａであるヒト化抗体を提供する。一実施態様では、ＶＨドメインは配列番号：８のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、カバット位置６０の残基はＡである。他の実施態様では、カバット位置６０の残基はＳであり、ヒト化抗体は、Ｚ２７０のＣＤＲ-Ｈ１、-Ｈ２、及びＨ３配列、並びにＣＤＲ-Ｈ２のＣ末端端に隣接する２つのアミノ酸にＦＲ逆突然変異を含む。本明細書において記述されるように、本項目に記載のヒト化抗体は、他の残基、例えばカバット位置５、６９、７１、７３および／または７５にＦＲ逆突然変異をさらに含んでもよい。
他の態様では、本発明は、ＶＨ領域のカバットＣＤＲがすべてマウスＺ２７０ＶＨ(配列番号：２)に由来しており、さらにＳ６０Ａ、Ｆ６３Ｌ、Ｋ６４Ｑおよび／またはＤ６５Ｇ突然変異を含むヒト化抗体を提供する。一実施態様では、ヒト化抗体は、突然変異Ｓ６０Ａ、Ｆ６３Ｌ、Ｋ６４Ｑおよび／またはＤ６５Ｇのすべてを含む。
また、ヒト化抗体は、例えば上記のＶＨドメインＣＤＲに加えて、配列番号：６の残基２４−３４に対応するＣＤＲ-Ｌ1配列と、配列番号：６の残基５０−５６に対応するＣＤＲ-Ｌ2配列と、配列番号：６の残基８９−９７に対応するＣＤＲ-Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む。一実施態様では、ヒト化抗体のＶＬドメインは配列番号：６のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ヒト化抗体のＶＬドメインは配列番号：４のアミノ酸配列を含む。場合によって、ヒト化抗体は、例えば修飾によって抗体の親和性が本質的に維持されるか又は改善される、一又は複数のＶＬ ＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含む。例えば、抗体変異体は、上記のＶＬ ＣＤＲ配列に１つ、２つ、３つ又は１からおよそ７つのアミノ酸置換を有しうる。
【００３１】
また、本出願では、抗体に対するヒト化抗体の親和性を改善する付加的なＣＤＲ又はＦＲの突然変異を含む、抗ＮＫＧ２Ａを結合する親和性成熟抗体を考慮する。このような親和性成熟された抗体を調製する方法は当分野で公知である。親抗体は、例えば、配列番号：４及び５のＶＬ／ＶＨ配列を含むヒト化抗体(場合によって、本明細書中に記載の一又は複数のＣＤＲＨ２および／またはＦＲ置換を有する)、又は配列番号：６及び７それぞれのコンセンサスＶＬ／ＶＨ配列を含むヒト化抗体であってもよい。親和性成熟抗体は、例えば以下に記載の結合アッセイを用いて評価するところの、マウスＺ２７０の親和性と同等ないしはそれより優れた親和性、例えば少なくともおよそ１倍、およそ２倍又はおよそ４倍からおよそ１００倍又はおよそ１０００倍の改善された親和性でＮＫＧ２Ａに結合するのが好ましい。
他の態様では、本発明は、Ｚ２７０、ｈｕｍＺ２７０、ｈｕｍＺ２７０ｃｏｎｓおよび／またはｈｕｍＺ２７０ｃｏｎｓ２(それぞれ配列番号：２、５、７および８)のＶＨドメインに対して少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ８０％の配列同一性(例えば少なくともおよそ８５％、９０％、９５％、９７％又はそれ以上の同一性)を有するＶＨドメインを含むヒト化抗体を提供する。他の特定の態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ａを結合するヒト化抗体であって、ヒトＶＨドメインに非ヒトＣＤＲ残基の組み込みを含むＶＨドメインを含み、このＶＨドメインがｈｕｍＺ２７０ＶＨ１(配列番号：５)に対して少なくともおよそ５０％同一であるヒト化抗体を提供する。一実施態様では、ＶＨドメインは配列番号：５に対して少なくとも９０％同一である。例えば、ヒト化抗体は、配列番号：５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ-Ｈ１配列と、配列番号：５の残基５０−６６に対応するＣＤＲ-Ｈ２配列と、配列番号：５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ-Ｈ３配列とを含んでもよい。またないしはあるいは、ヒト化抗体は、ＶＨドメインの、カバット位置５にＶ又はＱ、カバット位置６９にＭ又はＬ、カバット位置７１にＴ又はＶ、カバット位置７３にＴ又はＫ、及びカバット位置７５にＴ又はＳを含む。
【００３２】
他の態様では、本発明は、またないしはあるいは、Ｚ２７０、ｈｕｍＺ２７０、および／またはｈｕｍＺ２７０ｃｏｎｓ(それぞれ配列番号：１、４および６)のＶＬドメインに対して少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ８０％の配列同一性(例えば少なくともおよそ８５％、９０％、９５％、９７％又はそれ以上の同一性)を有するＶＬドメインを含む抗体分子を提供する。他の特定の態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ａを結合するヒト化抗体であって、ヒトＶＬドメインに非ヒトＣＤＲ残基の組み込みを含むＶＬドメインを含み、このＶＨドメインが配列番号：４に対して少なくともおよそ５０％同一であるヒト化抗体を提供する。一実施態様では、ＶＬ領域は配列番号：４と少なくとも９０％同一である。例えば、ヒト化抗体は、配列番号：４の残基２４−３４に対応するＣＤＲ-Ｌ１配列と、配列番号：４の残基５０−５６に対応するＣＤＲ-Ｌ２配列と、配列番号：４の残基８９−９７に対応するＣＤＲ-Ｌ３配列とを含んでもよい。またないしはあるいは、ヒト化抗体は、ＶＬドメインの、カバット位置４６にＬ又はＦおよび／またはカバット位置４８にＩ又はＶを含んでもよい。
【００３３】
他の態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ａを特異的に結合する単離されたヒト化抗体であって、(a) Ｚ２７０ ＶＬ(配列番号：１)、ｈｕｍＺ２７０ ＶＬ(配列番号：４)又はｈｕｍＺ２７０ ＶＬ ｃｏｎｓ(配列番号：６)のＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及び／又はＣＤＲ-Ｌ３配列、又は(b) Ｚ２７０ ＶＨ(配列番号：２)、ｈｕｍＺ２７０(配列番号：５)、ｈｕｍＺ２７０ ｃｏｎｓ(配列番号：７)又はｈｕｍＺ２７０ ｃｏｎｓ２(配列番号：８)のＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及び／又はＣＤＲ-Ｈ３のいずれかを含む単離されたヒト化抗体を提供する。他の態様では、本発明は、Ｚ２７０、ｈｕｍＺ２７０又はｈｕｍＺ２７０ｃｏｎ由来のＶＨ ＣＤＲの少なくとも一の完全なセットを含む抗体分子であって、６つのＣ末端アミノ酸がヒトのアクセプター配列のものと同一である抗体分子を提供する。特定の態様では、本発明は、Ｚ２７０、ｈｕｍＺ２７０又はｈｕｍＺ２７０ｃｏｎのＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２(または、そのＮ末端部)およびＣＤＲ-Ｈ３と、Ｚ２７０、ｈｕｍＺ２７０又はｈｕｍＺ２７０ｃｏｎのＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２およびＣＤＲ-Ｌ３の少なくともいくつかを含む抗体分子を提供する。より特定の態様では、本発明は、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２および、Ｚ２７０、ｈｕｍＺ２７０又はｈｕｍＺ２７０ｃｏｎのＣＤＲ-Ｌ３、ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２およびＣＤＲ-Ｈ３を含む抗体分子であって、このとき適切なＦＲ配列を介して、ＣＤＲ-Ｌ１はＣＤＲ-Ｌ２に連結され、ＣＤＲ-Ｌ２はＣＤＲ-Ｌ３に連結され、ＣＤＲ-Ｈ１はＣＤＲ-Ｈ２に連結され、ＣＤＲ-Ｈ２はＣＤＲ-Ｈ３に連結される抗体分子を提供する。
特定の態様では、本発明は、ｈｕｍＺ２７０、ｈｕｍＺ２７０ｃｏｎｓ又はｈｕｍＺ２７０ｃｏｎｓ２の本質的にすべてのＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む抗体分子を提供する。
【００３４】
本発明に係るヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体は本明細書中に記載のｈｕｍＺ２７０ＶＨを含む任意の完全長ないしは部分的な重鎖(ＨＣ)を含んでよく、及び／又はｈｕｍＺ２７０ＶＨを含む任意の完全長ないしは部分的なＨＣは本明細書中に記載の任意のｈｕｍＺ２７０ＶＬと組み合わせてもよく、結果として生じる抗体ないしは断片は、抗原結合、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞に対する機能的作用、及び／又は免疫原性について試験される。
ヒト化抗体の様々な形状が考慮される。例えば、ヒト化抗体は、抗体断片、例えば本明細書中に記載のＦａｂ又は他のタイプの断片であってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、完全長ないしはインタクトな抗体、例えば完全長又はインタクトなＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体であってもよい。一実施態様では、ヒト化抗体は完全長ＩｇＧ４抗体ないしはその断片である。
【００３５】
一態様では、本発明は、a) ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する、b) Ｆｃレセプターに特異的に結合しない、そしてc) ヒトＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合した場合に、標的細胞がＮＫ細胞と接触すると、該ＮＫ細胞に標的細胞表面上にＨＬＡ-Ｅを有する標的ヒト細胞を溶解させる、という特徴を持つヒト化抗体を提供する。一実施態様では、ヒト化抗体は、Ｆｃレセプターへの結合を妨げるように修飾してあるマウス又はヒトのＩｇＧ1定常領域、又はヒトのＩｇＧ4定常領域を含む。このような抗体並びにＦｃレセプターを結合しない抗体断片は、抗体依存性細胞障害能によって媒介されうるので、ＮＫ細胞自体を減少させることなく、ＮＫ細胞を活性化しようとする用途(例えば癌、感染性疾患)に特に有用であり、「減少させない(non-depleting)」抗体と称されうる。
他の態様では、ヒト化抗体は、Ｆｃレセプターを結合するマウス又はヒトのＩｇＧ１定常領域、又はＦｃレセプターを結合するかまたはＦｃレセプターへの結合を亢進するように修飾されているヒトのＩｇＧ１、２、３又は４の定常領域、又はヒトＩｇＧ４定常領域を含む。他の実施態様では、モノクローナル抗体ないしその断片は、抗体が結合している細胞に対して毒性がある部分に連結される。このような抗体は、ＮＫ細胞を減少させようとする用途に特に有用であり、ＮＫ-ＬＤＧＬ(顆粒リンパ球のＮＫ型リンパ球増殖性疾患；ＮＫ-ＬＧＬとも言う)などの特定の用途に有用であり、「減少させる(depleting)」抗体とも称されうる。
【００３６】
ヒト化抗体の組み換え産生のために、ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域ないしはその変異体バージョンを、標準的な組み換え方法に従って、ヒト抗体の完全長ないしは切断型の定常領域をコードする発現ベクターにクローニングすることができる(例としてSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照)。その結果、選択されたＶＨおよびＶＬ領域および定常領域を含む対象のヒト化抗体分子を発現して、分泌する形質移入した細胞株となる。ヒト抗体の定常領域をコードするｃＤＮＡ配列は公知である。例示的なｃＤＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋによって利用可能であり、それぞれは出典明記によってその全体に援用させ、以下の通りである。
ヒトＩｇＧ１定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：  Ｊ００２２８、
ヒトＩｇＧ２定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：  Ｊ００２３０、
ヒトＩｇＧ３定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：  Ｘ０４６４６、
ヒトＩｇＧ４定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：  Ｋ０１３１６、そして、
ヒトκ軽鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：  Ｊ００２４１。
【００３７】
必要に応じて、ヒト化抗体の分類が公知の方法によって「切り換えられ(switched)」てもよい。例えば、ＩｇＭ分子として本来産生される抗体はＩｇＧ抗体に分類切り替えされてもよい。また、分類の切替え技術を用いて、ＩｇＧサブクラスから他へ、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換してもよい。ゆえに、本発明の抗体のエフェクター機能は、例えば、様々な治療的用途のためにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体へアイソタイプを切り換えることによって変化してもよい。
さらに、定常領域は公知の方法に従って修飾されてもよい。例えば、ＩｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２４１をプロリン(Ｐ)残基に突然変異させて、ヒンジで完全なジスルフィド架橋を形成させてもよい(例としてAngal等, Mol Immunol. 1993;30:105-8を参照)。
【００３８】
抗体断片
本発明のヒト化抗体は抗体断片として調製されてもよいし、抗体断片がヒト化完全長抗体から調製されてもよい。
ヒト化抗体の抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全長抗体のタンパク質分解性消化によって誘導された(例としてMorimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)；及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的にカップリングさせてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology, 10:163-167 (1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養物から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開１９９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。 
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知であり、完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は通常２つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づいており、ここで２つの鎖は異なる特異性を持つものである(Millstein等, Nature, 305: 537-539 (1983))。本発明に係る二重特異性抗体では、少なくとも一方の結合エピトープはＮＫＧ２Ａタンパク質上にある。抗ＮＫＧ２Ａ結合「アーム」は、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)、又はＩｇＧのためのＦｃレセプター(Ｆｃγ-Ｒ)、例としてＦｃ-γ-ＲI(CD64)、Fc-γ-RII(CD32)及びFc-γ-RIII(CD16)などの白血球上のトリガー分子に結合する「アーム」と組み合わせて、ＮＫＧ２Ａ発現細胞に対して細胞の防御機構を集中させてもよい。また、二重特異性抗体を用いて細胞障害性剤をＮＫＧ２Ａを発現する細胞に局在化させてもよい。これら抗体は、ＮＫＧ２Ａ結合アームと、細胞障害性剤(例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)を結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体ないし抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製されてもよい。２以上の結合価を有する抗体が考慮される。例えば、三重特異性抗体が調製されてもよい。Tutt等, J. Immunol, 147: 60 (1991)。
【００３９】
本発明の典型的な抗体、抗体断片および多特異性抗体は、配列番号：２又は配列番号：５の残基Ｄ５２、Ｄ５４、Ｒ９４、Ｆ９９、Ｔ(１００Ｃ)およびＷ(１００Ｆ)を含むＣＤＲ-Ｈ３とＣＤＲ-Ｈ２の部分を含む。これらの領域は抗原結合に重要であることが示されている(実施例を参照)。場合によって、ヒト化抗体断片と二重特異性抗体もＺ２７０重鎖残基Ｎ３５、Ｙ５３、Ｅ５６、Ｄ９８、Ｖ(１００Ａ)及びＬ(１００Ｄ)を含む。一態様では、本発明のヒト化抗体断片又は多特異性抗体は、配列番号：２又は配列番号：５のＣＤＲ-Ｈ２の残基５０−５９とＣＤＲ-Ｈ３の残基９５−１０２を含む。一実施態様では、ヒト化抗体断片又は多特異性抗体は、１、２、又はすべてのＺ２７０ ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２およびＣＤＲ-Ｌ３を含まない。更なる又は代替的な実施態様では、抗体断片又は多特異性抗体はＺ２７０ ＣＤＲ-Ｈ１を含まない。
【００４０】
抗体誘導体
本発明の範囲内の抗体誘導体には、第二薬剤にコンジュゲートさせた又は共有結合させたヒト化抗体が含まれる。
例えば、一態様では、本発明は、細胞障害性剤にコンジュゲートさせた又は共有結合させたヒト化抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。本明細書中で用いる「細胞障害性剤」なる用語は、細胞表面上にＮＫＧ２Ａレセプターを有する細胞を殺傷することができる分子である。細胞障害作用又は細胞抑制作用を有する任意の種類の部分は、本発明の抗体にコンジュゲートさせて、本発明の細胞障害性コンジュゲートを形成させ、特定のＮＫレセプター発現細胞を阻害ないしは殺傷させることができ、治療用放射性同位体、毒性タンパク質、毒性小分子、例えば薬剤、毒素、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、治療用放射性核種、血管形成阻害剤、化学療法剤、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ-２阻害剤、ＳＮ-３８、抗有糸分裂剤、抗血管形成及びアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ-１１、カンプトテカン、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、緑膿菌外毒素、リシン、アブリン、５-フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ(ＲＮアーゼ)、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン-Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン(gelonin)、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、及び緑膿菌内毒素及び他のものが含まれる(例として、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)；Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001)；Pastan等 (1986) Cell 47:641；Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43；米国特許第6077499号；その全ての開示が出典明示によりここに援用される)。毒素は、動物、植物、真菌又は微生物由来のものであってよく、又は化学合成により新たに作製することもできると解されるであろう。
【００４１】
他の実施態様では、抗体は、放射性同位体、例えば治療用放射性核種又は検出目的のために適切な放射性核種によって誘導体化される。多くの適切な放射性同位体の任意のものを使用することができ、限定されるものではないが、インジウム-１１１、ルテチウム-１７１、ビスマス-２１２、ビスマス-２１３、アスタチン-２１１、銅-６２、銅-６４、銅-６７、イットリウム-９０、ヨード-１２５、ヨード-１３１、リン-３２、リン-３３、スカンジウム-４７、銀-１１１、ガリウム-６７、プラセオジミウム-１４２、サマリウム-１５３、テルビウム-１６１、ジスプロシウム-１６６、ホルミウム-１６６、レニウム-１８６、レニウム-１８８、レニウム-１８９、鉛-２１２、ラジウム-２２３、アクチニウム-２２５、鉄-５９、セレン-７５、ヒ素-７７、ストロンチウム-８９、モリブデン-９９、ロジウム-１０５、パラジウム-１０９、プラセオジミウム-１４３、プロメチウム-１４９、エルビウム-１６９、イリジウム-１９４、金-１９８、金-１９９、及び鉛-２１１が含まれる。一般的に、放射性核種は、オージェエミッターで好ましくは２０〜６０００ＫｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ＫｅＶの範囲、ベータエミッターで１００〜２５００ＫｅＶ、アルファエミッターで４０００〜６０００ＫｅＶの崩壊エネルギーを有する。また、アルファ粒子の生成を伴い、実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。
【００４２】
他の実施の形態では、第二薬剤は検出可能な部分であり、それは量的ないしは質的に観察されるかまたは測定されうる任意の分子であってもよい。本発明のコンジュゲート抗体に有用な検出可能なマーカーの例は、放射性同位体、蛍光色素、又は相補的に結合する対のいずれか、例えば抗原／抗体(ＮＫＧ２Ａに対する抗体以外)、レクチン／糖質；アビジン／ビオチン；レセプター／リガンド；または、分子的にインプリントされたポリマー／プリント分子システムのいずれか一のいずれかである。
またないしはあるいは、第二薬剤は、例えば、ヒト化抗体の循環半減期を増やすことを目的とするポリマーであってもよい。例示的なポリマーおよび、該ポリマーをペプチドに接着させる方法は、例えば米国特許第４７６６１０６号；同第４１７９３３７号；同第４４９５２８５号；及び同第４６０９５４６号に例示される。更なる例示的なポリマーには、ポリオキシエチラート化ポリオール及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分が含まれる(例えば、完全長抗体ないし抗体断片は、およそ１０００〜およそ４００００、例えばおよそ２０００〜およそ２００００、例としておよそ３０００〜１２０００の間の分子量を有する一又は複数のＰＥＧ分子にコンジュゲートさせてもよい)。
【００４３】
細胞障害性剤又は他の化合物は、多数の利用可能な方法の任意のものを使用し、直接的又は間接的に、抗体に結合させることができる。例えば、薬剤は、Ｎ-スクシニル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)等の架橋剤を使用し、ジスルフィド結合形成を介して、又は抗体のＦｃ領域内の糖質部分を介して、還元された抗体成分のヒンジ領域に接着させることができる(例として、Yu等 (1994) Int. J. Cancer 56: 244；Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis等, "Modification of Antibodies by Chemical Methods,", Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch等 (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,", Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter等 (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)、Cattel等 (1989) Chemistry today 7:51-58、Delprino等 (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704；Arpicco等 (1997) Bioconjugate Chernistry 8:3；Reisfeld等 (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217を参照；それぞれの全ての開示は、出典明示によりここに援用される)。
別法として、抗ＮＫＧ２Ａ抗体と第二(細胞障害性又は他の)ポリペプチド薬剤を含む融合タンパク質は、例えば組み換え技術又はペプチド合成によって作製されてもよい。
【００４４】
結合アッセイ
本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａを結合する抗体、特にＺ２７０ハイブリドーマによって産生される抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒト化バージョンを提供する。
多種多様なアッセイのいずれかを用いてヒトＮＫＧ２Ａに対する抗体の結合を評価することができる。とりわけ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、ＢＩＡＣＯＲＥおよび他の競合アッセイに基づくプロトコールが用途に適しており、公知技術である。 
例えば、試験抗体を標的タンパク質又はエピトープ(例えばＮＫＧ２Ａないしはその一部)の存在下でインキュベートし、結合しなかった抗体を洗い流し、例えば放射性標識、質量分析などの物理学的方法、又は細胞蛍光測定分析法(例えばＦＡＣスキャン)などを用いて直接ないし間接的に蛍光標識を検出することによって結合した抗体の存在を評価する、単純結合アッセイを用いることができる。このような方法は当業者にとって周知である。コントロールである非特異的な抗体で見られる量を上回る任意の結合量は、抗体が標的に特異的に結合することを示す。
【００４５】
このようなアッセイでは、試験抗体の標的細胞又はヒトＮＫＧ２Ａに結合する能力を、(ネガティブ)コントロール抗体、例えば構造的に関係のない抗原に対する抗体又はＩｇペプチドないしはタンパク質の同じ標的に結合する能力と比較することができる。任意の好適なアッセイを用いたときの抗体ないし断片の標的細胞又はＮＫＧ２Ａへの結合親和性がコントロールタンパク質よりも２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％ないしそれ以上に増加している場合に、標的「に特異的に結合する」又は「と特異的に相互作用する」と言い、以下に記載の標的方法への使用に好ましい。また、ＮＫＧ２Ａ、例えばＺ２７０ないしはその誘導体に対する(ポジティブ)コントロール抗体の結合に影響する試験抗体の能力を評価してもよい。
ヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体はヒトＮＫＧ２Ｃを結合してもしなくともよく、ヒトＮＫＧ２Ｅを結合してもしなくともよく、ヒトＮＫＧ２Ｃ及びＥのいずれかを結合してもしなくともよい。特定の実施態様では、モノクローナル抗体ないしその断片は、他のヒトＮＫＧ２レセプター、特に活性化レセプターＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅに結合しない。本発明の抗体のＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｅ結合特性は、単にＮＫＧ２Ａを他の対象の分子と交換する、上記の類似のアッセイで評価することができる。
【００４６】
一態様では、本発明は、生物学的特徴および／または実質的な配列同一性をＺ２７０と共有している非ヒト抗体のヒト化バージョンを提供する。ある例示的な生物学的特徴は、Ｚ２７０エピトープ、すなわちＺ２７０抗体が結合するＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインの領域への結合である。Ｚ２７０エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のような常法の交差ブロックアッセイを行うことができる。
例示的な交差ブロックないし競合アッセイでは、Ｚ２７０(コントロール)抗体と試験抗体は混合され(又は予め吸着され)、ＮＫＧ２Ａを含む試料にアプライされる。特定の実施態様では、ＮＫＧ２Ａ含有試料にアプライする前の一定時間、コントロール抗体を様々な量の試験抗体(例えば１：１０又は１：１００)と混合してもよい。他の実施態様では、コントロールと様々な量の試験抗体は、抗原／標的試料への曝露の間に単に混合されてもよい。遊離した抗体と結合した抗体(例えば、分離法又は洗浄技術を用いて結合していない抗体を取り除くことによって)、そして、コントロール抗体と試験抗体(例えば、種-ないしはアイソタイプ-特異的な二次抗体を用いることによって、コントロール抗体を検出可能な標識にて特異的に標識することによって、または、異なる化合物を区別するための質量分析のような物理的な方法を用いることによって)を区別することができる限りにおいて、試験抗体が抗原へのコントロール抗体の結合を低減するかどうかを決定することができ、この場合に該試験抗体はコントロールと実質的に同じエピトープを認識することが示されるであろう。このアッセイにおいて、完全に無関係な抗体がある場合で(標識した)コントロール抗体が結合すると、コントロール値は高い。低いコントロール値は、標識した(ポジティブ)コントロール抗体(Ｚ２７０)を標識していないコントロール抗体とインキュベートし、このとき競合が生じて標識した抗体の結合が低減することによって得られる。
【００４７】
試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で標識した抗体の反応が有意に低減した場合、試験が抗体が同じエピトープを認識する、すなわち標識したコントロール抗体と「交差反応する」ことを表す。およそ１：１０からおよそ１：１００の間のコントロール：試験抗体ないし化合物のいずれかの比率で、抗原／標的への標識したコントロールの結合を少なくとも５０％又はより好ましくは７０％低減する任意の試験抗体ないし化合物は、コントロールと実質的に同じエピトープないしは決定基に結合する抗体ないし化合物であると考えられる。好ましくは、このような試験抗体ないし化合物は、抗原／標的へのコントロールの結合を少なくとも９０％低減するであろう。にもかかわらず、コントロール抗体ないし化合物の結合を測定可能な程度に低減する任意の化合物ないし抗体が、本発明で用いられてもよい。
また、類似の交差ブロックアッセイを用いて、Ｚ２７０をＨＬＡ-Ｅの好適な形態と交換して、試験(ヒト化)抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａの天然のリガンドであるＨＬＡ-ＥのＮＫＧ２Ａへの結合に影響するか否かを評価することができる。例えば、ヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体調製物がＨＬＡ-ＥとのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ相互作用を低減又はブロックするか否かを決定するために、以下の試験を行った。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、例としてＢａ／Ｆ３-ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＬ又はＮＫ９２を発現する細胞株を３０分間氷上でインキュベートし、試験抗ＮＫＧ２Ａ抗体の濃度を上げる。次いで、細胞を、標準的な方法によって、ＰＥ標識したＨＬＡ-Ｅテトラマーと氷上で３０分間インキュベートし、再度洗浄して、フローサイトメーター(ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Beckton Dickinson)にてＨＬＡ-Ｅテトラマー結合を分析する。試験抗体がない場合、ＨＬＡ-Ｅテトラマーは細胞に結合する。ＨＬＡ-ＥへのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-結合をブロックする抗体調製物がある場合には、細胞へのＨＬＡ-Ｅテトラマーの結合が低減し、このようなｍＡｂは「遮断(ブロッキング)抗体」と称される。
【００４８】
ＮＫＧ２Ａ発現細胞を殺傷することを望まないなどの本発明のある態様では、本発明のヒト化抗体はＦｃレセプターに対して実質的に特異的な結合を示さないのが好ましい。このような抗体は、Ｆｃレセプターを結合しないことが分かっている様々な重鎖の定常領域を含んでもよい。ＩｇＧ4定常領域がその一例である。あるいは、定常領域を含まない抗体断片、例えばＦａｂ又はＦ(ａｂ')２断片を、Ｆｃレセプター結合を避けるために用いてもよい。Ｆｃレセプター結合は、例えばＢＩＡＣＯＲＥアッセイでのＦｃレセプタータンパク質に対する抗体の結合を試験することを含む当分野で公知の方法に従って評価されてもよい。また、Ｆｃ部分がＦｃレセプターへの結合を最小化する又は避けるように修飾されているいずれか他の抗体タイプも用いられてよい(例として国際公開０３１０１４８５を参照、その開示内容は出典明記によってここに援用される)。例えばＦｃレセプター結合を評価するための細胞ベースのアッセイなどのアッセイは当分野で周知であり、例えば、国際公開０３１０１４８５において記述される。
【００４９】
細胞障害性アッセイ
抗ＮＫＧ２Ａ抗体がＨＬＡ-ＥとのＣＤ９４／ＮＫＧ２A相互作用を低減又はブロックする場合、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞障害能を亢進しうる。これは、典型的な細胞障害性アッセイによって評価され、その例を以下に記載する。
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-媒介性シグナル伝達を低減させる抗体の能力は、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫＬ細胞、及びＨＬＡ-Ｅを発現する標的細胞を使用する、標準的な４時間インビトロ細胞毒性アッセイにおいて試験することができる。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡがＨＬＡ-Ｅを認識して、リンパ球媒介性細胞溶解を防止する阻害シグナル伝達の開始及び伝播を引き起こすので、このようなＮＫＬ細胞は、ＨＬＡ-Ｅを発現する標的を効果的に死滅させない。例えば、Coligan等編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y.,(1992, 1993)に記載されているように、このようなインビトロ細胞毒性アッセイは、当該分野でよく知られている標準的な方法で実施可能である。標的細胞は、ＮＫＬ細胞の添加前に５１Ｃｒで標識され、ついで、死滅の結果として、死滅度は、細胞から培地への５１Ｃｒの放出度合いに対する比率として推定される。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ-Ｅへの結合を阻害する抗体を添加すると、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介して阻害シグナル伝達の開始及び伝播が阻害される。よって、このような薬剤が添加されると、標的細胞のリンパ球-媒介性死滅度が増加する。この工程により、例えばリガンド結合をブロックすることで、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-誘発性ネガティブシグナル伝達を阻害する薬剤が同定される。特定の５１Ｃｒ-放出細胞障害性アッセイにおいて、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-発現ＮＫＬエフェクター-細胞は、ＨＬＡ-Ｅ-ネガティブＬＣＬ７２１.２２１標的細胞を死滅させることが可能であるが、ＨＬＡ-Ｅ-発現ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３コントロール細胞に対してはあまり効果的ではない。これに対し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを欠くＹＴＳエフェクター-細胞は、双方の細胞系を効果的に死滅させる。よって、ＮＫＬエフェクター細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介したＨＬＡ-Ｅ-誘発性阻害シグナル伝達のため、ＨＬＡ-Ｅ＋ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３細胞の死滅にはあまり効果的ではない。このような５１Ｃｒ-放出細胞障害性アッセイにおいて、ＮＫＬ細胞が、本発明に係るブロッキング抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体とともにプレインキュベートされる場合、ＨＬＡ-Ｅ-発現ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３細胞は、抗体-濃度依存的な様式で効果的に死滅される。
【００５０】
本発明の抗体の阻害又は増強活性は、例えばその開示が出典明示によりここに援用される、Sivori等, J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136に記載されるような、細胞内の遊離のカルシウムへの影響等による、任意の多くの他の方法で評価することができる。ＮＫ、Ｔ又はＮＫＴ細胞活性もまた、例えばクロム放出ないしは他のパラメーターを測定して、Ｐ８１５細胞、Ｋ５６２細胞、又はその開示が出典明示によりここに援用される、Sivori等, J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136；Vitale等, J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072；Pessino等 J. Exp. Med. 1998;188:953-960；Neri等 Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135；Pende等 J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516に開示される好適な腫瘍細胞を殺傷するようにＮＫ細胞を刺激する抗体の能力を評価する、細胞ベースの細胞障害性アッセイを用いて評価することができる。
一実施態様では、抗体調製物によって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞障害能が少なくとも１０％増強、好ましくはＮＫ細胞障害能が少なくとも４０％又は５０％増強、又はより好ましくはＮＫ細胞障害能が少なくとも７０％増強する。
【００５１】
また、細胞障害性リンパ球の活性は、ＮＫ細胞を抗体とインキュベートしてＮＫ細胞のサイトカイン産生(例えばＩＦＮ-ｙおよびＴＮＦ-α産生)を刺激する、サイトカイン-放出アッセイを使用して調べることができる。例示的なプロトコールにおいて、ＰＢＭＣからのＩＦＮ-ｙ産生は、培養の４日後に、フローサイトメトリーによって細胞表面および細胞質内を染色して分析することによって評価される。簡単に述べると、培養の最後４時間に、５μｇ／ｍｌの最終濃度でブレフェルジンＡ(Sigma Aldrich)を添加する。次いで、細胞を、透過処理前に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６ｍＡｂ(IntraPrepTM; Beckman Coulter)と共にインキュベートし、ＰＥ-抗ＩＦＮ-ｙ又はＰＥ-ＩｇＧ１(Pharmingen)にて染色する。ポリクローナル活性化ＮＫ細胞からのＧＭ-ＣＳＦ及びＩＦＮ-ｙ生産を、ＥＬＩＳＡ(GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-: OptElA set, Pharmingen)を使用し、上清において測定する。
特定の態様では、本発明は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞障害能を亢進する、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞障害活性を高める、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介性のシグナル伝達を低減ないし阻害する際に、機能するか、又は元の非ヒト化抗体及び／又はそのキメラ型よりも有効である抗体を提供する。このような抗体は、元の非ヒト化抗体及び／又はそのキメラ型よりも、例えば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％以上可能か、又は有効である。
【００５２】
組換え方法
また、本発明は、本明細書中に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする単離された核酸、並びに該核酸を含むベクター及び宿主細胞を提供する。また、例えば核酸又はベクターを含む好適な宿主細胞を培養して核酸を発現させ、ヒト化抗体を産生されるなどの、組み換え技術を用いて前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体を生成する方法を提供する。培養する前に、可変重鎖ドメインをコードする核酸を含むベクターと、可変軽鎖ドメインをコードする核酸を含むベクターとを宿主細胞に同時に形質移入してもよい。さらに、公知の技術を用いて抗体を宿主細胞から回収し、及び／又は精製してもよい。有用なベクター、宿主細胞及び技術を以下及び実施例に記載する。さらに、ヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体を発現させるための方策を図４〜６に概説する。
一般に、抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸は、単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター中に挿入され、典型的には一又は複数のコントロールエレメントに作用可能に連結される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって）配列決定される。多くのベクターが公知であり入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【００５３】
シグナル配列成分
本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。例えば、ヒト化Ｚ２７０抗体などの抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒト化重鎖及び／又は軽鎖の発現のための例示的なシグナル配列については実施例２を参照のこと。
天然抗ＮＫＧ２Ａ抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第１９９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードするＤＮＡのリーディングフレームにライゲートする。
【００５４】
複製起点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、ＥＢＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
【００５５】
選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。
【００５６】
あるいは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【００５７】
プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対しても様々なプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００５８】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００５９】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００６０】
エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００６１】
転写終結成分
真核生物宿主細胞(例えば酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'末端、時には３'末端の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【００６２】
宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００６３】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードするベクターに適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００６４】
グリコシル化抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウイルスは本発明においてここに記載したウイルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００６５】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓(ＨＥＫ)株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))、例えばＤＧ４４(Urlaub等, Som. Cell and Mol. Gen., 12: 555-566 (1986))及びＤＰ１２細胞株；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００６６】
宿主細胞の培養
本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ),(Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ(Cibco)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ), Sigma)が宿主細胞の培養に好適である。また、例えばHam等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００６７】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、又は細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎＴＭ又はＰｅｌｌｉｃｏｎＴＭの限外濾過装置を用いて濃縮する。フェニルメチルスルホニルフルオライド(ＰＭＳＦ)などのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００６８】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
Ｚ２７０又はそのヒト化バージョンの例示的なプロテインＡベースの精製方法を実施例６に記載する。
【００６９】
製剤
一実施態様では、本発明は、一又は複数の担体とともに本明細書中に記載の抗体を含有してなる薬学的製剤を提供する。
したがって、本発明の他の目的は、前記の抗体を、１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在しているものを含有する薬学的製剤を提供することであり、該製剤は２．０〜１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存料(類)、等張化剤(類)、キレート剤(類)、安定剤及び界面活性剤を更に含有する。一実施態様では、薬学的製剤は水性製剤、すなわち水分を含有する製剤である。このような製剤は典型的には溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる実施態様では、薬学的製剤は水溶液である。「水性製剤」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している製剤として定義される。同様に、「水溶液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している溶液として定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している懸濁液として定義される。
【００７０】
他の実施態様では、薬学的製剤は凍結乾燥製剤であり、これに医師又は患者が使用前に溶剤及び／又は希釈液を添加する。
他の実施態様では、薬学的製剤は、何ら事前溶解させることのない使用準備が整った乾燥製剤(例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥されたもの)である。
更なる態様では、薬学的製剤は前記抗体の水溶液とバッファを含み、該抗体は１ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在し、該製剤は約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
他の実施態様では、製剤のｐＨは、およそ２．０からおよそ１０．０、およそ３．０からおよそ９．０、およそ４．０からおよそ８．５、およそ５．０からおよそ８．０、及びおよそ５．５からおよそ７．５からなる列挙から選択される範囲である。
更なる実施態様では、バッファは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物から選択されうる。これらの特定のバッファーがそれぞれ別の態様を構成する。
【００７１】
更なる実施態様では、製剤は、製薬的に許容可能な保存料を更に含有可能である。保存料は、例えばフェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ；又は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の保存料の各一が、本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００７２】
更なる実施態様では、製剤は等張化剤を更に含有しうる。等張化剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択してよい。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、固定された限界値があるものではない。糖又は糖アルコールの濃度は、例えば約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。等張化剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ；１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌ；８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌ；又は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の等張化剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に等張化剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００７３】
更なる実施態様では、製剤はキレート剤も更に含有しうる。キレート剤は、例えばエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択されうる。キレート剤は例えば０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ；又は２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物にキレート剤を使用することは当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００７４】
本発明の更なる実施態様では、製剤は安定剤を更に含有しうる。製薬用組成物に安定剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。より具体的には、本発明の組成物は安定した液状製薬用組成物であり、その治療的活性化合物は、液状薬学的製剤の保存中に、凝集体の形成を示す可能性のあるポリペプチドを含む。「凝集体形成」とは、オリゴマーを形成するポリペプチド分子間の物理的相互作用を意図しており、これは、可溶性か、又は溶液から沈殿する大きな可視できる凝集体として残る。「保存中」とは、液状製薬用組成物又は調製されて直ぐの製剤が、被験者に直ぐ投与されるものではないことを意図している。むしろ、調製後に、液状の形態、凍結状態、液状形態に後で再構成される乾燥した形態、又は被験者への投与に適した他の形態で、包装又は保存されている。「乾燥した形態」とは、液状製薬用組成物又は製剤が、フリーズドライ(すなわち凍結乾燥；例えばWilliams及びPolli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59を参照)、噴霧乾燥(Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676；Broadheadら, (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18：1169-1206；及びMumenthalerら, (1994) Pharm. Res. 11：12-20)、又は空気乾燥(Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25：459-470；及びRoser (1991) Biopharm. 4：47-53)により乾燥されることを意図している。液状製薬用組成物の保存中におけるポリペプチドによる凝集体形成は、ポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼすおそれがあり、製薬用組成物の治療効果が損なわれる。更に凝集体形成は、例えばチューブ、膜、又はポリペプチド含有製薬用組成物が注入システムを使用して投与される場合はポンプの閉塞のような、他の問題を生じさせうる。
【００７５】
本発明の製薬用組成物は、組成物の保存中、ポリペプチドによる凝集体形成を低減させるのに十分な量のアミノ酸塩基を更に含有しうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せを意図しており、任意の与えられたアミノ酸が、その遊離塩基の形態又はその塩の形態の何れかで存在している。アミノ酸の組合せを使用する場合、全てのアミノ酸が遊離塩基の形態で存在していてもよく、全てが塩の形態で存在していてもよく、又は幾つかが遊離塩基の形態で存在していてもよく、残りが塩の形態で存在していてもよい。一実施態様では、本発明の組成物の調製に使用されるアミノ酸は、帯電側鎖を担持しているもの、例えばアルギニン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸である。特定のアミノ酸(例えば、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物)の任意の立体異性体(すなわち、Ｌ、Ｄ、又はそれらの混合物)、又はこれらの立体異性体の組合せが、該特定のアミノ酸が遊離塩基の形態又は塩の形態の何れかで存在している限り、本発明の製薬用組成物中に存在していてもよい。一実施態様では、Ｌ-立体異性体が使用される。また本発明の組成物は、これらのアミノ酸の類似体と共に製剤化されてもよい。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液状製薬用組成物の保存中に、ポリペプチドによる凝集体形成を低減させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体を意図している。適切なアルギニン類似体は、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチル-Ｌ-アルギニンを含み、適切なメチオニン類似体はエチオニン及びブチオニンを含み、適切なシステイン類似体はＳ-メチル-Ｌ-システインを含む。他のアミノ酸と同様、アミノ酸類似体は、遊離塩基の形態又は塩の形態の何れかで組成物中に導入される。本発明の更なる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止し又は遅延化させるのに十分な濃度で使用される。
【００７６】
本発明の更なる実施態様では、メチオニン(又は他の硫黄含有アミノ酸又はアミノ酸類似体)は、治療剤として作用するポリペプチドが酸化を受けやすい少なくとも一のメチオニン残基を有するポリペプチドである場合、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために添加されうる。「阻害」とは、経時的なメチオニン酸化種の蓄積を最小にすることを意図している。メチオニン酸化を阻害すると、適切な分子形態でのポリペプチドの保持が更に高まる。メチオニン(Ｌ又はＤ)の任意の立体異性体又はそれらの任意の組合せを使用することができる。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関にとって許容可能であるような、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量とするべきである。典型的には、これは、組成物が約１０％〜約３０％を越えるメチオニンスルホキシドを含まないことを意味する。一般的に、これは、メチオニン残基に添加されるメチオニンの比率が、約１：１〜約１０００：１、例えば１０：１〜約１００：１の範囲になるようにメチオニンを添加することで、達成することができる。
【００７７】
更なる実施態様では、本発明の製剤は高分子量ポリマー又は低分子量化合物の群から選択される安定剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ３３５０)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの誘導体(例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ及びＨＰＭＣ)、シクロデキストリン類、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノール、及び異なった塩(例えば塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【００７８】
製薬用組成物は、その中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に高める、付加的な安定剤をまた含有しうる。本発明にとって特に関心のある安定剤は、限定されるものではないが、メチオニンの酸化に対してポリペプチドを保護するＥＤＴＡ及びメチオニン、及び凍結-解凍又は機械的剪断に関連する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含む。
更なる実施態様では、製剤は更に界面活性剤を含有しうる。界面活性剤は、例えば、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンのブロックポリマー(例えばポロキサマー、例えばプルロニック(Pluronic)(登録商標)Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトンＸ-１００)、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレンの誘導体、例えばアルキル化されアルコキシル化された誘導体(トゥイーン類(tweens)、例えばトゥイーン-２０、トゥイーン-４０、トゥイーン８０及びビリジ(Brij)-３５)、モノグリセリド類又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド類又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチン及びリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン)、リン脂質の誘導体(例えばホスファチジン酸ジパルミトイル)及びリゾリン脂質(例えばパルミトイル-リゾホスファチジル-Ｌ-セリン、及びエタノールアミン、コリン、セリン又はスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファートエステル)、及びリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)-誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン及び極性頭部基の修飾体、コリン類、エタノールアミン類、ホスファチジン酸、セリン類、スレオニン類、グリセロール、イノシトール、及び正に帯電したＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン、及びリゾホスファチジルスレオニン、及びグリセロリン脂質(例えばセファリン類)、グリセロ糖脂質(例えばガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えばセラミド類、ガングリオシド類)、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体-(例えばタウロ-ジヒドロフジシン酸ナトリウム等)、長鎖脂肪酸及びそれらのＣ６-Ｃ１２塩(例えばオレイン酸及びカプリル酸)、アシルカルニチン類及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含有するジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と２つの帯電したアミノ酸の任意の組合せを含有するトリペプチドのＮα-アシル化誘導体、ＤＳＳ(ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号[５７７-１１-７])、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号[１２８-４９-４])、ドキュセートカリウム、ＣＡＳ登録番号[７４９１-０９-０])、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩、及びグリシン又はタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホナート、アニオン性(アルキル-アリール-スルホナート類)の一価の界面活性剤、双性イオン性界面活性剤(例えば、Ｎ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、カチオン性界面活性剤(第４級アンモニウム塩基)(例えばセチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシル-β-Ｄ-グルコピラノシド)、ポロキサミン類(例えばテトロニックス(Tetronic's))で、エチレンジアミンにプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを逐次付加することにより誘導された四官能性ブロックコポリマーから選択され、又は界面活性剤は、イミダゾリン誘導体又はそれらの混合物の群から選択されてもよい。これらの特定の界面活性剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
製薬用組成物に界面活性剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００７９】
更なる実施態様では、製剤は、プロテアーゼインヒビター、例えばＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)及びベンズアミジンＨＣｌを更に含有し、他の商業的に入手可能なプロテアーゼインヒビターを使用することもできる。プロテアーゼインヒビターを使用することは、自己触媒を阻害するため、プロテアーゼのチモーゲンを含有する製薬用組成物に特に有用である。
他の成分が本発明のペプチド薬学的製剤中に存在していてもよい。このような付加的な成分は、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、張力修正剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質)及び双性イオン(例えばアミノ酸、特にベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジン)を含みうる。もちろん、このような付加的な成分は、本発明の薬学的製剤の全体的な安定性に悪影響がないようにすべきである。
【００８０】
本発明の一又は複数の抗体を含む製薬用組成物は、幾つかの部位、例えば局所的部位、特に皮膚及び粘膜部位、動脈、静脈、心臓への投与等、バイパス吸収がなされる部位、例えば皮膚、皮下、粘膜又は腹部への投与等、吸収に関連する部位において、このような治療が必要とされる患者に投与されうる。
本発明の製薬用組成物は、幾つかの投与経路、例えば皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬、口、経口、胃、及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞及び／又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼球を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、このような治療を必要としている患者に投与されうる。
本発明の組成物は、幾つかの投与形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、被覆錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼球用軟膏、眼球用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注入溶液、インサイツ形質転換溶液、例えばインサイツゲル化、インサイツセット用、インサイツ沈殿化、インサイツ結晶化のもの、注入液、及び移植片として投与されうる。
【００８１】
本発明の組成物は、更に、抗体の安定性を更に高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤送達系、及び進化した薬剤送達系において配合し、又は付加させてもよい。担体、薬剤送達系及び進化した薬剤送達系の例は、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリラート及びメタクリラートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、及びそれらのブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶、及びそれらの分散液、Ｌ２相、及び脂質-水系における相挙動が当業者によく知られているそこでの分散液、ポリマー性ミセル、多相エマルション、自己乳化剤、自己-マイクロ乳化剤、シクロデキストリン及びそれらの誘導体、及びデンドリマーを含む。
本発明の組成物は、全て当業者によく知られたデバイスである、定量吸入器、乾燥パウダー吸入器、及び噴霧器等を使用し、抗体を肺に投与するための、固形、半固形、パウダー及び溶液の製剤に有用である。
【００８２】
本発明の組成物はまた、制御、徐放性、持続性、遅延性及び低速放出性の薬剤送達系の製剤に有用である。特に限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出性及び徐放性系(双方の系とも、投与の数が何倍も低下する)製剤に有用である。更に好ましいのは、皮下投与される制御放出性及び徐放性系のものである。本発明の範囲を限定することなく、有用な制御放出性及び組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマー性ミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
本発明の組成物に有用な制御放出性系の作製方法は、限定されるものではないが、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界流体プロセスを含む。一般的には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L.編. Marcel Dekker, New York, 2000)及びDrug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Formulation and Delivery(MacNally, E.J.編. Marcel Dekker, New York, 2000)を参照。
【００８３】
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施されうる。あるいは、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。更なる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態で抗体化合物を投与するための溶液又は懸濁液であってよい組成物にある。更なる選択肢としては、本発明の抗体を含む製薬用組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与用、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
抗体は、肺薬剤送達系に適した任意の既知のタイプのデバイスを使用し、ビヒクル、例えば溶液、懸濁液又は乾燥パウダーとして、肺経路を介して投与することができる。これらの例には、限定されるものではないが、肺薬剤送達用の３種類のエアゾール発生の一般的タイプが含まれ、ジェット又は超音波噴霧器、定量吸入器、又は乾燥パウダー吸入器が含まれうる(Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453を参照)。
【００８４】
標準化された試験法に基づき、粒子の空気動力学的直径(ｄａ)を、単位密度(１ｇ／ｃｍ３)の参照基準球形粒子の幾何学的相当直径として定義する。最も単純な場合、球形粒子に対して、ｄａは：
2014122221.tif 000003
に記載されるような密度比の平方根の関数として、参照直径(ｄ)に関連している。
【００８５】
この関係は非球形粒子に対しては修正される(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。「ＭＭＡＤ」及び「ＭＭＥＡＤ」なる用語は、詳しく記載されており、当該分野で知られている(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R、及び空気動力学的粒子径分布の中央値の測定値を表す。Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385を参照)。空気動力学的中央粒子径(ＭＭＡＤ)及び有効空気動力学的中央粒子径(ＭＭＥＡＤ)(mass median effective aerodynamic diameter)は、交換可能に使用され、統計パラメータであり、実際の形状、サイズ又は密度に無関係に、肺中に沈着するそれらの可能性に関連して、エアゾール粒子のサイズが経験的に記載されている(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。通常、ＭＭＡＤは、空気中における粒子の慣性挙動を測定する装置、衝突体を用いてなされる測定から算出される。
【００８６】
更なる実施態様では、製剤は、１０μｍ、好ましくは１−５μｍ、最も好ましくは１−３μｍ未満のエアゾール粒子のＭＭＡＤを達成するために、任意の既知のエアゾール化技術、例えばネブライゼーションによりエアゾール化することができる。好ましい粒子径は、肺の奥深くまで薬剤を送達せしめるのに最も効果的なサイズに基づいており、タンパク質が最適に吸収されるようになされる (例えば、Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。抗体を含有する肺用製剤を肺の奥深くに付着させることは、吸入技術、例えば限定されるものではないが：低吸入速度(例えば３０Ｌ／分)、呼吸停止及び作動のタイミングを修正して最適化されうる。
【００８７】
「安定化された製剤」なる用語は、物理的安定性が増した、化学的安定性が増した、又は物理的及び化学的安定性が増した製剤を意味する。
ここで使用される場合、タンパク質製剤の「物理的安定性」なる用語は、タンパク質が熱-機械的ストレスに暴露され、及び／又は不安定な表面及び界面、例えば疎水性表面及び界面と相互作用する結果として、タンパク質が生物学的に不活性になり及び／又は不溶性の凝集体が形成されるというタンパク質の傾向を意味する。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)に充填された製剤を、様々な時間、異なる温度で機械的／物理的ストレス(例えば攪拌)に暴露した後に、視覚検査及び／又は濁度測定することで評価される。製剤の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライト下において実施される。製剤の濁度は、例えば０〜３のスケールで、濁りの程度をランク付けする視覚スコア(濁りのない製剤は視覚スコア０に相当し、日光下で視覚的に濁りのある製剤は視覚スコア３に相当する)により特徴付ける。製剤は、日光下で視覚的濁りを示す場合に、タンパク質会合に関して物理的に不安定であると分類される。また製剤の濁度は、当業者によく知られている簡単な濁度測定法により評価することもできる。また水性タンパク質製剤の物理的安定性は、タンパク質の構造状態のプローブ又は分光剤を使用して評価することもできる。プローブは、好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴは、アミロイド原繊維の検出に広範囲に使用されている蛍光染料である。原繊維、おそらく他のタンパク質立体配置が存在すると、チオフラビンＴが約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、原繊維タンパク質形態に結合した時に、約４８２ｎｍで増強発光する。未結合のチオフラビンＴは、本質的にはその波長で非蛍光性である。
【００８８】
天然から非天然状態までのタンパク質構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の暴露された疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、その天然状態にあるタンパク質の３次構造内に一般的に埋められているが、タンパク質の展開及び変性が始まると、暴露されるようになる。これらの小分子の例、分光プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光プローブは金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン等のコバルト金属錯体である。
【００８９】
ここで使用される場合、タンパク質製剤の「化学的安定性」なる用語は、天然のタンパク質構造と比較して、免疫原性の潜在的増加及び／又は生物学的有効性の潜在的低下を伴う、化学的な分解産物の形成に至るタンパク質構造における化学的共有変化を意味する。種々の化学的な分解産物は、天然タンパク質の性質及び種類、及びタンパク質が暴露される環境に応じて形成されうる。化学的分解の排除は、多くの場合、完全に回避することはできず、当業者によく知られているように、タンパク質製剤の保存及び使用中に、化学的な分解産物の量の増加が見られる。殆どのタンパク質は、脱アミド化する傾向にあり、グルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を形成する。他の分解経路は高分子量の形質転換産物の形成に関与しており、２又はそれ以上のタンパク質分子は、アミド転移及び／又はジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及びポリマーの分解産物の形成に至る(Stability of Protein Phramaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。(例えばメチオニン残基の)酸化も、化学的分解の他の変形例として挙げることができる。タンパク質製剤の化学的安定性は、異なる環境条件に暴露させた後、種々の時点での化学的な分解産物の量を測定することにより評価することができる(分解産物の形成は、多くの場合、例えば温度上昇により促進される)。個々の分解産物の各々の量は、多くの場合、様々なクロマトグラフィー技術(例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ)を使用し、分子サイズ及び／又は電荷に応じて、分解産物を分離することにより測定される。
【００９０】
よって、上に概要を述べたように、「安定化された製剤」とは、物理的安定性が増加、化学的安定性が増加、又は物理的及び化学的安定性が増加した製剤を意味する。一般的に、製剤は、有効期限に到達するまで、使用及び保存中に(推奨される用途及び保存条件で)安定していなければならない。
【００９１】
本発明の一実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、６週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の他の実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、４週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、４週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、該化合物を含有する製剤組成物は、２週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
【００９２】
適した抗体製剤は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体の場合の経験を調べることによってまた決定できる。例えばリツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ベキサール（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリムのような数種のモノクローナル抗体が臨床現場で効果的なことが証明されており、同様の製剤を本発明の抗体について使用することができる。例えば、モノクローナル抗体は、塩化ナトリウム９．０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム二水和物７．３５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート０．７ｍｇ／ｍＬ、注射用滅菌水に静脈内投与用に処方された１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアルの何れかで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供されうる。ｐＨは６．５に調整される。他の実施態様では、抗体は約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含みｐＨが約６．０の製剤で供給される。
【００９３】
治療用途
ここに記載された抗ＮＫＧ２Ａ抗体を使用する患者の治療方法がまた提供される。一実施態様では、本発明は、ヒト患者に投与するための薬学的組成物の調製におけるここに記載された抗体の使用を提供する。典型的には、患者は癌、ウイルス疾患、炎症疾患、又は自己免疫疾患に罹患しているか又はそのリスクを有している。あるいは、本発明の抗体は患者における骨髄移植を改善するために使用される。
例えば、一態様では、本発明は、それを必要とする患者においてＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の活性を増強する方法であって、ヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体を上記患者に投与する工程を含み、該抗体がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体レセプターのＨＬＡ−Ｅ媒介活性化を低減し又は防止する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、増加したＮＫ、Ｔ、及び／又はＮＫＴ細胞活性が有益であり、ＮＫ、Ｔ、又はＮＫＴ細胞による溶解を受けやすい細胞を含み、該細胞に影響を及ぼし、又は該細胞によって引き起こされる疾患、例えば癌、感染症又は免疫疾患を有する患者におけるリンパ球の活性を増加させるものである。
【００９４】
より詳細には、本発明の方法と組成物は、限定するものではないが、癌、例えば膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺及び皮膚の癌、例えば扁平上皮癌；リンパ系の造血器腫瘍、例えば白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫及びバーケットリンパ腫、及び多発性骨髄腫；骨髄系の造血器腫瘍、例えば急性及び慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、及び骨髄異形成症候群；間葉系由来の腫瘍、例えば線維肉腫及び横紋筋肉腫；他の腫瘍、例えばメラノーマ、セミノーマ、テラトカルシノーマ、ニューロブラストーマ及びグリオーマ；中枢及び末梢神経系の腫瘍、例えばアストロサイトーマ、ニューロブラストーマ、グリオーマ、及びシュワン細胞腫；間葉系由来の腫瘍、例えば線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫；及び他の腫瘍、例えばメラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性癌及びテラトカルシノーマを含む様々な癌及び他の増殖性疾患の治療に対して利用される。
【００９５】
本発明に従って治療することができる特定の疾患には、リンパ系の造血器腫瘍、例えばＴ細胞及びＢ細胞腫瘍、例えば限定するものではないがＴ細胞疾患、例えば小細胞及びＴ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、例えば脳状細胞型のもの；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人T細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／後胸腺(peripheral/post-thymic)Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽細胞サブタイプ）；血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ１＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞性リンパ腫；Ｔリンパ芽球性；リンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）、多発性骨髄腫が含まれる。
例えば過形成、線維症（特に肺、但し腎臓線維症のような他のタイプの線維症も）、血管新生、乾癬、アテローム性動脈硬化症及び血管中の平滑筋増殖、例えば血管形成術後の狭窄症又は再狭窄等の他の増殖性疾患もまた本発明によって治療することができる。
【００９６】
特定の態様では、本発明の抗体は、ＮＫ細胞又はＮＫ様細胞、つまり表面抗原発現の特徴的な組合せを示す大顆粒リンパ球（例えばＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋等； 例えばLoughran (1993) Blood 82:1を参照）のクローン増殖によって引き起こされる増殖性疾患の一クラスを意味するＮＫ−ＬＧＬとも呼ばれる顆粒リンパ球のＮＫ型リンパ球増殖性疾患を治療するために使用される。これらの疾患の根底にある細胞増殖は、ある患者に見られる穏やかな症状からしばしばＮＫ−ＬＤＧＬ白血病と呼ばれる疾患の侵襲性の致命的な形態までの範囲の様々な効果を持ちうる。このクラスの疾患の徴候は、発熱、穏やかな好中球減少、血小板減少、貧血、リンパ球増加、脾腫大、肝腫大、リンパ節腫大、骨髄浸潤等々を含みうる（例えばZambello等(2003) Blood 102:1797; Loughran (1993) Blood 82:1；Epling-Burnette等 (2004) Blood-2003-02-400を参照）。
【００９７】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体ベースの治療はまた感染症、例えば好ましくはウイルス、細菌、原虫、カビ又は真菌による感染によって引き起こされる任意の感染を治療し又は予防するために使用することもできる。かかるウイルス感染性生物には、限定されるものではないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エチノウイルス(echinovirus)、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス及びヒト免疫不全症ウイルス１型又は２型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）が含まれる。細菌は感染性生物の他の好ましいクラスを構成し、限定されるものではないが、次のものを含む：ブドウ球菌；連鎖球菌、例えば化膿性連鎖球菌；腸球菌；バチルス、例えば炭疽菌、及びラクトバシラス；リステリア；ジフテリア菌；ガードネレラ菌、例えばガードネレラ・バギナリス；ノカルジア；ストレプトマイセス；サーモアクチノミセス・ブルガリス；トレポネーマ；カンピロバクター；シュードモナス、例えば緑膿菌；レジオネラ；ナイセリア、例えば淋菌及び髄膜炎菌；フラボバクテリウム、例えばフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム及びフラボバクテリウム・オドラツム；ブルセラ；ボルデテラ、例えば百日咳菌及びボルデテラ・ブロンキセプチカ； 大腸菌類、例えば大腸菌、クレブシエラ；エンテロバクター、セラチア、例えば 霊菌及びセラチア・リクファシエンス；エドワージエラ；プロテウス、例えばプロテウス・ミラビリス及びプロテウス・ブルガリス；ストレプトバチルス；リケッチア科、例えば リケッチア・フィッケツフィ(fickettsfi）、クラミジア、例えばオウム病クラミジア及びトラコーマクラミジア；マイコバクテリウム、例えば結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・フォーチュイタム、ライ菌、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・ボビス 、マイコバクテリウム・アフリカヌム、カンサシ菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、及びマイコプラズマ・レプラムリウム；及びノカルジア。原虫（原生動物）には、限定されるものではないが、リーシュマニア、kokzidioa及びオリパノソーマが含まれる。寄生虫には、限定されるものではないが、クラミジア及びリケッチアが含まれる。感染症の完全なリストは、疾病管理センター(CDC) の感染症国立センター(National Center for Infectious Disease (NCID))のウェブサイト(World-Wide Web (www) address cdc.gov/ncidod/diseases/)に見出すことができ、このリストは出典明示にここに援用する。,これらの疾患の全てが本発明の阻害性抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体を使用した治療の候補である。
【００９８】
他の態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば癌性細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現によって特徴付けられる癌、例えばＮＫリンパ腫に罹患している患者における、ＮＫＧ２Ａ発現細胞を標的としそれを死滅させるために使用される。一実施態様では、ヒト化抗体が、ヒト化抗体と細胞傷害剤を含む免疫複合体の形態で投与される。
他の態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は自己免疫又は炎症疾患を治療し又は予防するために使用される。本方法を使用して治療することができる自己免疫疾患の例には、とりわけ、溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、 強皮症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ブドウ膜炎、グレーブス病、アルツハイマー病、甲状腺炎、心筋炎、リウマチ熱、強皮症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡／類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、橋本甲状腺炎、乾癬、及び白斑が含まれる。
【００９９】
これらの方法によって治療することができる炎症疾患の例には、限定されるものではないが、副腎炎、肺胞炎、胆管胆嚢炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液包炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮頚管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛殻炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合織炎、毛包炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、鼓膜炎、腎炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、灰白脊髄炎、前立腺炎、 歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、セレロ脈絡膜炎(selerochoroiditis)、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、 耳管炎、腱炎、扁桃腺炎、尿道炎、及び膣炎が含まれる。
【０１００】
樹状細胞のアロ反応性ＮＫ細胞死滅化は骨髄移植における造血細胞の生着を改善したことがまた示されている（L. Ruggeri等, Science, 2002, 295:2097-2 100）。よって、他の実施態様では、本発明は、患者における造血細胞の生着を改善する方法であって、活性化抗体を含む本発明の組成物を上記患者に投与する工程を含む方法を提供する。移植の改善は、移植片対宿主病の発症又は重篤度の低減、移植片の長い生存、又は移植によって治療される疾患の徴候（例えば造血器癌）の低減又は除去の何れかから明らかになる。この方法は好ましくは白血病の治療に使用される。
【０１０１】
併用
多くの治療剤を癌治療に利用できる。よって、本発明の抗体組成物と方法は、特定の疾患、特に腫瘍、癌疾患、又は患者が示す他の疾病又は疾患の治療に一般的に用いられる任意の他の方法と組み合わせることもできる。特定の治療アプローチ法がその患者の症状自体に致命的であることが知られておらず、抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体ベースの治療法と有意には反対の作用をしない限り、その本発明との併用が考えられる。
固形腫瘍の治療に関しては、本発明は、伝統的なアプローチ法、例えば、外科治療、放射線療法、化学療法等と併用されうる。従って、本発明は、本発明に係る抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体が外科又は放射線治療と同時に、その前に、又はその後に使用され；あるいは他の抗癌剤の投与と共に、その前に、又はその後に患者に投与される併用療法を提供する。本発明の組成物中の活性剤と併用される外科、放射線療法、又は抗癌剤は、癌に対して有利な併用効果を奏することが担保されるであろう。
【０１０２】
例示的な抗癌剤には、化学療法剤、ホルモン剤、抗血管新生剤、抗転移薬、抗癌抗体（例えばリツキシマブ）、抑制性ＫＩＲ分子に対する抗体、増殖因子阻害剤、アポトーシス促進化合物、サイトカイン及び他の免疫調節剤、毒素又は放射性核種が結合した腫瘍標的化剤、ＤＮＡ複製を妨害する化合物、有糸分裂及び染色体分離、及びポリヌクレオチド前駆体の合成とフィデリティーを乱す薬剤が含まれる。
自己免疫又は炎症疾患では、とりわけ、免疫抑制剤、例えばアザチオプリン（例えばイムラン）、クロラムブシル（例えばロイケリン）、シクロホスファミド（例えばシトキサン）、シクロスポリン（例えばサンディミュン、ネオーラル）、メトトレキセート（例えばリウマトレックス）、コルチコステロイド、プレドニゾン（例えばデルタゾン、メチコルテン(Meticorten)）、エタネルセプト（例えばエンブレル）、インフリキシマブ（例えばレミケード）、ＴＮＦ阻害剤、ＦＫ-５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、抗リンパ球グロブリン、デオキシスパガリン又はＯＫＴを含む、一又は複数のタイプの自己免疫又は炎症疾患あるいは自己免疫又は炎症疾患のあらゆる徴候又は特徴に対して、効果的であることが知られている任意の他の化合物である。
【０１０３】
免疫調節化合物の好ましい例にはサイトカインが含まれる。他の例には、効果、好ましくはＮＫ細胞活性の活性化又は増強効果を有するか、又はＮＫ細胞の増殖を誘導し又は支援する化合物が含まれる。本発明の薬剤を含む組成物の前、それと同時に、又はその後に投与される他の化合物は補助化合物（例えば制吐薬及び鎮痛薬）及び抗ウイルス薬である。
当業者によって理解されるように、抗癌剤の適切な用量は、抗癌剤が単独で又は他の薬剤と併用して投与される臨床治療に既に用いられているものに近似する。用量の変動は治療されている症状に応じて生じる可能性がある。治療薬を投与する医師は個々の被験者に対して適当な用量を決定することができる。
【０１０４】
製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を含む製造品が提供される。例えば、該製造品は、ここに記載された抗体を含む容器を、哺乳動物における癌又はウイルス疾患のような疾患を有効量の抗体で治療する指示を使用者に与える指示書と共に含みうる。好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。該製造品は典型的には容器と該容器上に又は該容器に付随せしめられたラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも一種の活性剤はここでのヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はかかるヒト化抗体を含む抗体誘導体（例えば免疫複合体）である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が、選択した症状、例えば癌又はウイルス疾患の治療に使用されることを示している。
【０１０５】
更に、製造品は、（ａ）組成物がそこに収容され、該組成物がここに記載された抗体を含む第一の容器と、（ｂ）組成物がそこに収容され、該組成物が第一の抗体以外の治療剤を含む第二の容器を含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の組成物が癌又はウイルス疾患の治療のために併用できることを示すパッケージ挿入物を更に含みうる。かかる治療剤は先のセクションに記載した補助療法剤の任意のものでありうる（例えば、化学療法剤、抗血管新生薬、抗ホルモン化合物、心臓保護薬、及び／又は]サイトカインを含む哺乳動物における免疫機能調節剤）。あるいは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含有する第二（又は第三）の容器を更に含みうる。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
【０１０６】
投与
上述のように、数種のモノクローナル抗体が臨床現場で効果的であることが証明されており（例えばリツキサン（リツキシマブ）等々）、同様な投与計画（つまり、用量及び／又は投与プロトコル）を本発明の抗体について使用することができる。投与のスケジュール及び投薬量は、例えば製造者の指示書を使用し、これらの製品に対して知られた方法に従って決定することができる。例えば、抗体製剤は１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアルの何れかで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供されうる。本発明の抗体の場合の例示的な好ましい投薬量範囲は約１０ｍｇ／ｍ２と５００ｍｇ／ｍ２の間である。例えば細胞を２４時間、４８時間、７２時間、又は１週間又は１ヶ月飽和させる抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量及びスケジュールは抗体の親和性とその薬物動態パラメータを考慮して決定することができる。しかしながら、これらのスケジュールは例示的なものであり、最適なスケジュール及び治療計画及び抗体の耐容性は臨床試験において決定されなければならない。
【０１０７】
非治療的な用途
また、本発明の抗体(例えばヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体)は被治療的な用途を有する。
例えば抗体を親和性精製作用剤として用いてもよい。この過程において、当分野で公知の方法を用いて抗体をセファデックスＴＭ樹脂又は濾紙などの固相に固定する。固定された抗体はＮＫＧ２Ａタンパク質(又はその断片)を含む試料に接触させて精製し、その後、固定した抗体に結合するＮＫＧ２Ａタンパク質以外の試料中の実質的に全ての材料を除去するような適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、支持体を、他の適切な溶媒、例えば、ＮＫＧ２Ａタンパク質を抗体から放出させるグリシン緩衝液、ｐＨ５．０によって洗浄する。
また、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、特異的な細胞、組織又は血清中の発現を検出するＮＫＧ２Ａタンパク質についての診断アッセイに有用であるかもしれない。
【０１０８】
診断用の使用のために、一般的に抗体を検出可能な成分で標識するであろう。多くの標識が利用可能であり、通常、以下のカテゴリに分類することができる：
（ａ）ラジオアイソトープ、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ。抗体は例えばImmunology, Volumes 1 and 2, Coligen等, Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を用いて放射性同位体にて標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
（ｂ）希有土類キレート（ユウロピウムキレート）又はフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリンおよびテキサス赤のような蛍光性の標識が利用できる。蛍光標識は、例えば、上記のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
（ｃ）様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４,２７５,１４９号にはこの概説がある。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる（例えばｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて）か、またはエネルギーを蛍光受容基に与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４,７３７,４５６号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸酵素、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環のオキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivanら., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０１０９】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆（例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン（ＯＰＤ）又は3,3',5,5'テトラメチルのベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び
（ｉｉｉ）色素生産性基質（例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質４-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-ｐ-β-ガラクトシダーゼを有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）。
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４２７５１４９号および４３１８９８０を参照。
【０１１０】
標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は当分野の技術者に公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな３つの分類のうちの何れかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。したがって、抗体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる。
本発明の他の実施態様において、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は標識する必要がなく、その存在をＮＫＧ２Ａ抗体と結合する標識した二次抗体を用いて検出することができる。
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイに用いられうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
免疫組織化学において、腫瘍サンプルは新鮮なものでも、凍結されたものでも、パラフィン包埋されていても、防腐剤、例えばホルマリンなどで固定されていてもよい。
【０１１１】
また、抗体はインビボ診断用アッセイにも使用されてよい。一般に、抗体は、例えば核磁気共鳴法ないしは当分野で公知の他の方法によって検出可能な放射性核種ないしは非放射性活性の指標にて標識される。好ましくは、標識は、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ又は１１１Ｉｎなどの放射性標識である。標識された抗体は、好ましくは血流を介して宿主に投与され、宿主中の標識した抗体の存在や位置がアッセイされる。腫瘍の検出、ステージ分類及び治療には画像技術が好適に用いられる。放射性同位体は、金属キレート化合物ないしはラクトペルオキシダーゼ、又はヨウ素化のためのｉｏｄｏｇｅｎ技術を含む任意の手段によってタンパク質にコンジュゲートされる。
【０１１２】
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち診断検査法を実行するための指示書とともに予め定められた総計でパッケージされ組み合わされた試薬で提供することができる。抗体を酵素で標識する場合、キットには、基質と、酵素に必要な補助因子（例えば検出可能な発色基又は蛍光体を提供する基質前駆）が含まれるであろう。加えて、安定剤、緩衝液（例えばブロックバッファ又は溶解緩衝液）などの他の添加物が含まれうる。様々な試薬の相対量は、実質的にアッセイの感受性を最適化する試薬の溶液濃度が得られるように、広範囲に変化していてもよい。特に、溶解して好適な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥として試薬が提供されうる。
【０１１３】
寄託
Ｚ２７０ハイブリドーマは、２００５年１２月２２日に寄託番号Ｉ−３５４９でCollection Nationale de Culture de Microorganismes, Institute Pasteur(25, Rue du Docteur Roux, F-75725 Paris, France)に寄託された。
【実施例】
【０１１４】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例により例示される。
【０１１５】
実施例１−親ｈｕｍＺ２７０ＶＬ及びｈｕｍＺ２７０ＶＨ  配列の選択
この実施例は、ｈ２７０ＶＬ及びｈｕｍＺ２７０ＶＨ変異体配列の選択的な復帰突然変異と同様に、親ｈｕｍＺ２７０ＶＬ及びｈｕｍＺ２７０ＶＨ配列の選択について記載する。
実施例２において説明したように、Ｚ２７０ハイブリドーマは、クローニングされ、対応する抗体のＺ２７０ＶＨ及びＶＬ鎖配列が決定された：
Ｚ２７０ＶＬ：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQFLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPRTFGGGTKLEIK(配列番号：１)(カバット(Kabat)位置１０８に選択的なアルギニン(Ｒ)残基を有する)。
Ｚ２７０ＶＨ：
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPEQGLQWIGRIDPYDSETHYSQKFKDKAILTVDKSSSTAYMRLSSLTSEDSAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGAGTTVTVS(配列番号：２)(選択的なＣ末端のセリン(Ｓ)残基を有する)。
第２の軽鎖(Ｚ２７０ＶＬ−ＮＢ)もまた、同定された。しかしながら、これは、一般的なミエローマ軽鎖であった。
Ｚ２７０ＶＬ−ＮＢ：
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKRA(配列番号：３)(カバット位置１０８に選択的なアルギニン(Ｒ)残基及びカバット位置１０９に選択的なアラニン(Ａ)残基を有する)。
マウスのＺ２７０配列の分析から、カバット定義による相補性決定領域(ＣＤＲ)は、決定された：
ＣＤＲ−Ｌ１：RASENIYSYLA(配列番号：１の残基２４−３４)
ＣＤＲ−Ｌ２：NAKTLAE(配列番号：１の残基５０−５６)
ＣＤＲ−Ｌ３：QHHYGTPRT(配列番号：１の残基８９−９７)
ＣＤＲ−Ｈ１：SYWMN(配列番号：２の残基３１−３５)
ＣＤＲ−Ｈ２：RIDPYDSETHYSQKFKD(配列番号：２の残基５０−６６)
ＣＤＲ−Ｈ３：GGYDFDVGTLYWFFDV(配列番号：２の残基９５−１０２)。
【０１１６】
三次元タンパク質構造モデルは、プロテインデータベースバンク(ＰＤＢ)：１ＯＰＧ及び１ＸＦ４の構造的テンプレートを用いて、ＭＯＥ(モレキュラーオペレーティングエンバイアロンメント(molecular Operating Environment); www.chemcomp.comで利用可能)を使用して造られた。ＰＤＢは、バーマン等(Nucl Acids Res 2000;28:235-242)に記載されており、www.rcsb.org/pdbで利用可能である。ＰＤＢデータベースの２０１の抗体-抗原複合体の統計解析に基づいてパラトープにおいて最も可能性が高い残基が決定された：
Ｚ２７０ＶＬ：配列番号：１の残基２４−３４、４９−５６、８９−９７
Ｚ２７０ＶＨ：配列番号：２の残基２３−３５、４９−５８、９３−１０２。
ＭＯＥを用いて、パラトープと相互作用している(疎水、水素結合又は電荷)残基が同定され、残基と組み合わせたセット(パラトープ＋相互作用残基)をＺ２７０のマスクとした。
Ｚ２７０ＶＬ及びＺ２７０ＶＨについて生殖系列Ｖデータベース(Ｖ−ベース；vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/で利用可能)を検索することにより、以下の潜在的フレームワーク・テンプレート(括弧内のＥ値)がもたらされた：
重鎖：ＶＨ１＿４６(２ｅ−０３６)，ＶＨ１＿ｆ(２ｅ−０３５)，ＶＨ１＿０２(３ｅ−０３５)，ＶＨ１＿１８(４ｅ−０３５)，ＶＨ１＿０３(６ｅ−０３５)；及び
軽鎖：ＶＫＩ＿Ｏ２(１ｅ−０３９)，ＶＫＩ＿Ｏ１２(１ｅ−０３９)，ＶＫＩ＿Ｌ１２(９ｅ−０３８)，ＶＫＩ＿Ｌ８(９ｅ−０３８)，ＶＫＩ＿Ａ２０(９ｅ−０３８)。
マスクについて生殖系列データベースを検索することにより、以下の潜在的フレームワーク・テンプレート(括弧において与えられるＥ値)がもたらされた：
重鎖：ＶＨ５＿ａ(４ｅ−０１３)，ＶＨ５＿５１(３ｅ−０１１)ＶＨ１＿ｆ(１ｅ−０１０)，ＶＨ１＿１８(２ｅ−０１０)，ＶＨ１＿４６(４ｅ−０１０)：及び
軽鎖：ＶＫＩ＿Ｌ９(２ｅ−０１２)，ＶＫＩ＿Ｏ２(３ｅ−０１２)，ＶＫＩ＿Ｏ１２(３ｅ−０１２)，ＶＫＩ＿Ｌ２４(２ｅ−０１１)，ＶＫＩ＿Ａ２０(２ｅ−０１１)。
アランメント及びヒットのマニュアル調査の後、ＶＨ１＿１８及びＶＫＩ＿Ｏ２は、人間の骨格として選択された。ＪＨ６及びＪＫ４は、生殖系列Ｊ部位として選ばれた。
ヒト化は、現在以下の規則によって設計された：
・  マスクの外側の残基は、ヒトとして考えられる。
・  マスク内部の及びカバットＣＤＲ内部の残基は、マウスとして考えられる。
・  マスク内部及びカバットＣＤＲの外側においてマウス／生殖系列共通の残基は、共通配列として考えられる。
・  マスク内部及びカバットＣＤＲの外側においてマウス／生殖系列で相違する残基は、潜在的に復帰突然変異する傾向がある。
Ｚ２７０ＶＬ及びＺ２７０ＶＨの分析は、図１において例示されており、マスク残基はカバット・スキームにおいて斜線がついている；ＣＤＲ残基は、カバット・スキームにおいてボールドで示される；及び、マウス／生殖系列の相違点は、ＶＫＩ＿０２／ＪＫ４及びＶＨ１＿１８／ＪＨ６配列において斜線がついている。Ｚ２７０ＶＬ及びｈｕｍＺ２７０ＶＬ１、及びｈｕｍＺ２７０ＶＬ１  ｃｏｎｓは、カバット位置１０８でアルギニン(Ｒ)残基を選択的に含む場合がある。  
結果として生じる配列(ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１及びｈｕｍＺ２７０ＶＨ１)は、ヒトのように潜在的復帰突然変異残基が与えられる。
カバット定義によるヒト化Ｚ２７０抗体のＣＤＲは、図２に示される。ｈｕｍＺ２７０ＣＤＲの中で、ＣＤＲ−Ｈ２配列だけは対応するマウスのＣＤＲのそれとは異なり、４つの位置で異なっている。しかしながら、実質的に、これはカバットＣＤＲ−Ｈ２残基６０−６５がヒトアクセプター配列に同一であることを意味し、より多くのヒト分子及び免疫原性に対するより小さいリスクを提供した。図２において、相違点は、ボールドのテキストにおいて示される。
【０１１７】
実施例２−Ｚ２７０  ＩｇＧ１  ＶＨ及びＶＬ領域のクローニング
この実施例は、マウスのＺ２７０ＶＨ及びＶＬ領域のクローニング及び配列決定について記載する。
トータルＲＮＡ抽出のためのＺ２７０ハイブリドーマ細胞培養
Ｚ２７０ハイブリドーマは、１０％ＦＣＳ  (Biochrom Cat#S0115)添加ＲＰＭＩ１６４０(Hyclone Cat# SH30011.04)で培養された。５ｘ１０６から１ｘ１０７個の細胞は、トータルＲＮＡ抽出のために収集された。
抗体産生のＺ２７０ハイブリドーマ細胞培養
１週間バッチ式培養ストラテジーが、Ｚ２７０  ｍＡｂの生産のために採用された。培地は、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０であった。上清は、７日ごとに採取された。ＣＬ−１０００フラスコ(INTEGRA Biosciences, Item No. 90005, Lot No. 08541150)培養チャンバー内の開始時の細胞密度は、２ｘ１０６細胞／ｍｌであった。培養の間、細胞密度及び生存度は、定期的に確認された。ＣＬ−１０００フラスコで３日間培養後、密度は１ｘ１０７以上であり、生存度は約８５％であった。次の４日間において、細胞密度は１．５−２．５ｘ１０７  細胞／ｍｌの間を変化し、生存度は６０−７０％と段階的に減少した。７日目に、上清は回収され、抗体濃度を推定するために、定量化対照標準(Ａ−ＴＮＰ  ２００５０１１８  ２ｍｇ／ｍｌ)と共に還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動が用いられた。
Ｚ２７０トータルＲＮＡの抽出
製造業者の指示に従って、ＴＲＩＺＯＬ試薬(Invitrogen, Cat. No. 15596-026)を用いて行われた。
５’−ＲＡＣＥ(ｃＤＮＡ端の迅速な増幅)
以下の遺伝子特異的プライマー(ＧＳＰｓ)の設計と共に、プロトコルは、Clontech, Catalog no. 634914のＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット製品の製造業者の使用説明書を変更して作られた：
ＩｇＧ１重鎖可変領域の増幅のためのＧＳＰ１
Ｒａｃｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｈｅａｖｙ：５’−GCCAGTGGATAGACAGATGG−３’(配列番号：１２)
ＩｇＧ１カッパ鎖可変領域の増幅のためのＧＳＰ２
Ｒａｃｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｋａｐｐａ：５’−GATGGATACAGTTGGTGCAGC−３’(配列番号：１３)。
１．５％アガロースゲル上の結果として生じるサンプルの第一鎖ｃＤＮＡ合成、ＲＡＣＥ及び分析の後、ＲＡＣＥ  ＤＮＡバンドは切り取られ、Ｇｅｌ精製キット(QIAGEN QIAquick Cat#28706)で精製され、ＴＡクローニングによりＤＮＡライゲーションキット(TAKARA、Cat#D6022)バージョン２．０を用いてｐＭＤ−１９にクローニングされた(図３Ａ)。陽性クローンは、ＤＮＡ塩基配列決定のために発送された。
軽鎖及び重鎖のいくつかのクローンは、図４Ａ−Ｄに示すように、同一配列を用いて配列決定された(ボールドのテキストでシグナルペプチド配列を示している)：
Ｚ２７０  ＶＬ  ｃＤＮＡ：(配列番号：１４)
Ｚ２７０  ＶＬタンパク質(配列番号：１５)
Ｚ２７０  ＶＨ  ｃＤＮＡ(配列番号：１６)
Ｚ２７０  ＶＨタンパク質(配列番号：１７)。
【０１１８】
実施例３−ｐＪＳＶ００２へのマウスのＩｇＧ１軽鎖及び重鎖のクローニング
抗体アフィニティを試験し、ポジティブコントロールとして用いるために、Ｚ２７０抗体軽鎖及び重鎖は、マウス抗体ＩｇＧ１として、ｐＪＳＶ００２に挿入された。ｐＪＳＶ００２は、Ｚ２７０の一過性の発現のために、ＨＥＫ２９３  ６Ｅ細胞と組み合わせて用いるための一次発現ベクターである(図３Ｂ)。  
Ｚ２７０ＶＬ及びＩｇＧ１定常領域は、ｐＪＳＶ００２のＥｃｏＲＩ及びＮｈｅ  Ｉサイトにクローニングされる。結果として得られたプラスミドは、図３Ｃに示される。両端のＥｃｏＲＩ及びＮｈｅ  Ｉを含む挿入配列(英大文字)は、図４Ｅ(配列番号：１８)に示される。
Ｈ１可変領域及びＩｇＧ１定常領域は、ｐＪＳＶ００２−ｍＩｇＧ１−変異体のＥｃｏＲＩ及びＮｈｅ  Ｉサイトにクローニングされる(図３Ｄ)。ｐＪＳＶ００２−ｍＩｇＧ１−変異体は、マウスのＩｇＧ１重鎖定常領域を含む(図３Ｅ)。挿入配列は、制限酵素認識部位と共にＥｃｏＲＩ及びＮｈｅ  Ｉ(ｇｃｔａｇｃ)サイト間にあり、英小文字に示すマウスのＩｇＧ１定常領域は、図４Ｆ(配列番号：１９)に示される。
【０１１９】
実施例４−キメラＺ２７０抗体のためのプラスミド構築
抗体アフィニティを試験し、ポジティブコントロールとして用いるために、マウスのＺ２７０抗体軽鎖及び重鎖は、ヒト・キメラ抗体ＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐとして、ｐＪＳＶ００２に挿入される。抗体は、重鎖にＳ２４１Ｐ突然変異を含むヒトＩｇＧ４定常領域及びマウス可変領域を含む。
キメラＺ２７０抗体(ｃｈｉｍＺ２７０)の発現のために、Ｚ２７０ＶＬ配列及びヒト軽鎖(カッパ)定常領域は、ｐＪＳＶ００２(図３Ｆ)のＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉサイトに挿入される。図４Ｇに示される配列が用いられ、英大文字は制限酵素認識部位(配列番号：２０)を示す。
Ｚ２７０ＶＨ及びヒト重鎖定常領域はｐＪＳＶ００２−ＩｇＧ４−Ｓ２４１ＰのＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉサイトに挿入される(図３Ｇ及び３Ｈ)。ＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉ(ｇｃｔａｇｃ)サイト間に存在する実際の挿入配列と共に、図４Ｈに示される配列は用いられ、大文字は制限酵素認識部位(配列番号：２１)を示す。
【０１２０】
実施例５−ヒト化Ｚ２７０の発現
実施例１において記載されるＺ２７０ヒト化ストラテジーによれば、Ｚ２７０軽鎖ＣＤＲは、ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１を用意するために、ＶＫＩ＿０２／ＪＫ４テンプレートに結合する。図４Ｉに示される配列は、英大文字のＣＤＲ−コード化配列及びボールドテキストの制限酵素認識部位と共に、ＥｃｏＲＩ及びＫａｓＩサイト間の配列合成及びｐＪＳＶ００２−ｈＫａｐｐａＣ(ｐＪＳＶ００２のヒトカッパ定常領域を含む)の挿入から得られる(配列番号：２２)。
重鎖のヒト化のために、Ｚ２７０重鎖ＣＤＲ(選択的に最適化されたＣＤＲ−Ｈ２を有する)は、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ１を用意するために、ＶＨ１＿１８／ＪＫ６テンプレートに結合する。英大文字のＣＤＲ−コード化配列及びボールドのテキストの制限酵素認識部位と共に、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩサイト間の配列は、合成され、ｐＪＳＶ００２−ｈＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ(ｐＪＳＶ００２におけるヒトＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ定常領域、図３Ｇ)にクローニングされた(図４Ｊ、配列番号：２３)。
以下の各々のｈｕｍＺ２７０ＶＬ及びｈｕｍＺ２７０ＶＨにおけるフレームワーク復帰突然変異の組み合わせを伴って、突然変異した構築物は、同様に対応するＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ定常領域及びヒト・カッパ鎖定常領域を含むｐＪＳＶ００２にクローニングされる：  
ｈｕｍＺ２７０ＶＬ：Ｗｔ(すなわち復帰突然変異でない)、Ｌ４６Ｆ、Ｉ４８Ｖ、Ｌ４６Ｆ＿Ｉ４８Ｖ
ｈｕｍＺ２７０ＶＨ：Ｗｔ(すなわち復帰突然変異でない)、Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿Ｍ６９Ｌ、Ｖ５Ｑ＿Ｔ７１Ｖ、Ｖ５Ｑ＿Ｔ７３Ｋ、Ｖ５Ｑ＿Ｔ７５Ｓ、Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７１Ｖ、Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７３Ｋ、Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７５Ｓ、Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７３Ｋ、Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７５Ｓ、Ｔ７３Ｋ＿Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７３Ｋ＿Ｔ７５Ｓ、Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７３Ｋ＿Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿  Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７３Ｋ＿Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７３Ｋ＿Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７１Ｖ＿  Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７３Ｋ、Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７３Ｋ＿Ｔ７５Ｓ、Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７３Ｋ＿Ｔ７５Ｓ、Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７５Ｓ、Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７３Ｋ、Ｖ５Ｑ＿Ｔ７３Ｋ＿Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿Ｔ７１Ｖ＿Ｔ７３Ｋ、Ｖ５Ｑ＿Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７５Ｓ、Ｖ５Ｑ＿Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７３Ｋ、Ｖ５Ｑ＿Ｍ６９Ｌ＿Ｔ７１Ｖ。重鎖(ＨＣ)の典型的なベクター設計は、図５において例示され、軽鎖(ＬＣ)の典型的なベクター設計は、図６において提供される。
プラスミドは、２９３ｆｅｃｔｉｎを用いて、一過性発現のためにＨＥＫ２９３  ６Ｅにトランスフェクションする。材料：細胞：ＨＥＫ  ２９３  ６Ｅ  (２９３−６Ｅ)細胞は、指数増殖期において増殖する(０．８から１．２ｘ１０６細胞／ｍｌ)。培養培地：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ(Cat. No. 12338-018 from Gibco)；２５μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  ４１８(Cat. No. 10131-019 from Gibco)；０．１％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８(Cat. No. 24040-032 from Gibco)。トランスフェクション培地：Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ(Cat. No. 51985-026 from Gibco)；２９３ｆｅｃｔｉｎ(Cat. No. 12347019 from Invitrogen)。プラスミドＤＮＡ：精製された関心のあるプラスミドＤＮＡ(上記参照)。
【０１２１】
細胞数及び播種
トランスフェクションの２日前に、７．５ｘ１０６細胞を得るために必要な体積が１２５ｍｌのフラスコに移され、新しいＦｒｅｅｓｔｙｌｅメディウムが３０ｍｌとなるように加えられる(最終的な細胞密度は、０．２５ｘ１０６  細胞／ｍｌ)。２日間後に(トランスフェクションの日)、細胞密度は、１から１．２ｘ１０６細胞／ｍｌの間となる。あるいは、トランスフェクションの１日前に、１．５ｘ１０７細胞を得るために必要な体積が１２５ｍｌフラスコに移され、新しいＦｒｅｅｓｔｙｌｅメディウムが、３０ｍｌとなるように加えられる(最終的な細胞密度は、０．５０ｘ１０６細胞／ｍｌ)。２４時間後に(トランスフェクションの日)、細胞密度は、０．９から１．２ｘ１０６細胞／ｍｌの間となる。
２９３ｆｅｃｔｉｎ−ＤＮＡ複合体の準備
ＤＮＡ溶液の用意をするために、３０μｇのＤＮＡは、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭの総容積で希釈される。２９３ｆｅｃｔｉｎ溶液を用意するために、４０μｌは、９６０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈される。室温で、５分のインキュベーションの後、２９３ｆｅｃｔｉｎ溶液及びＤＮＡ溶液は、混合され、室温で２５分インキューベートされた。細胞は、それから２ｍｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ−ＤＮＡ混合液でトランスフェクションし、５％ＣＯ２を含む加湿されたインキュベーター(オービタルシェーカー)において３７℃で４〜６日間インキューベートする。図７は、ＨＥＫ２９３細胞、例えばＨＥＫ６９３  ６Ｅ細胞などにおける一過性発現のための一般的な手順を概説する。
【０１２２】
実施例６−Ｚ２７０ハイブリドーマ培養からのＩｇＧ１の精製
ＩｇＧ１  Ｚ２７０抗体は、３Ｍ塩化ナトリウム５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５で平衡化されたＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ(１ｍｌ)カラム上に、流速１．０ｍｌ／分でサンプルを加えることにより、及び、２５ｍＭクエン酸、４．５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０を用いて抗体を溶出させることにより、Ｚ２７０ハイブリドーマ細胞培養液から精製される。
【０１２３】
実施例７−抗体の定量及びアフィニティの決定
軽鎖及び当量の重鎖発現構築物を含んでいるプラスミドは一対ずつ混合され、プラスミドはＨＥＫ６Ｅ細胞をトランスフェクションさせるために用いられる。培地上清は、回収される。
マウスＩｇＧ１(又はＩｇＧ４)抗体を定量化するために、ＥＬＩＳＡプレートは、ヤギポリ抗マウスＩｇＧ１(又はＩｇＧ４)Ｆｃ特異的補足抗体でコーティングされている。抗体発現上清に続いてＨＲＰ−ヤギ・ポリ抗マウスカッパ又はＦａｂ二次抗体が用いられる。ＨＲＰ基質が用いられ、ＯＤ４５０で検出される。
ヒト化Ｚ２７０抗体の抗原結合性を分析するために、以下のバイアコア分析(図８において例示される)が、用いられる。抗原−捕捉抗体は、バイアコアチップに固定される。抗原及び培養液上清が用いられる。ｏｎ−ｒａｔｅ及びｏｆｆ−ｒａｔｅｓは、アフィニティを算出するために分析される。
【０１２４】
実施例８−Ｚ２７０のキメラ、ヒト化及び復帰突然変異変異体のＢｉｏｃｏｒｅ分析
材料及び方法
ＶＫＩ＿Ｏ２／ＪＫ４軽鎖及びＶＨ１＿１８／ＪＨ６重鎖アクセプターフレームワークにおけるキメラＺ２７０及びｈｕｍＺ２７０は、実施例４及び５において記載される方法に従って製造された。キメラＺ２７０、ｈｕｍＺ２７０及び復帰突然変異変異体の抗原結合特性は、バイアコアＴ１００(Biacore AB, Uppsala, Sweden)で分析された。抗原は、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド(ＮＨＳ)を用いて、アミン基を経てセンサーＣＭ５チップ(Biacore AB, Uppsala, Sweden)に共有結合して固定される単鎖ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃ構築物の形態であった。固定化レベルは、３００ＲＵを目標とした。Ｚ２７０抗体変異体は、ランニング・バッファＨＢＳ−ＥＰ(１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０)の濃度系列(０．１５７、０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５ｎＭ)に希釈された。全てのサンプルは、４０ｕｌ／分の流速で２分間、固定された抗原上に注入された。その後、ランニング・バッファは、抗体解離分析のために４０ｕｌ／分で３分間注入された。各実行の後、再生バッファ(１０ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ)は、抗原から残留する抗体を完全に解離させるために、注入された(３０秒、１０ｕｌ／分)。データは、バイアコアＴ１００評価用ソフトを用いて評価された。
【０１２５】
結果
ｈｕｍＺ２７０のアフィニティは、６７ｐＭと決定された。このＫＤ値は、キメラＺ２７０(５０ｐＭ)のそれより高かった(図９及び表２)。ＶＫＩ＿Ｏ２／ＪＫ４軽鎖及びＶＨ１＿１８／ＪＨ６重鎖アクセプターフレームワークにおけるｈｕｍＺ２７０への復帰突然変異の導入は、そのアフィニティを実質的に改善しなかった(図１０)。
表２
2014122221.tif 000004
【０１２６】
実施例９−全長ＣＤＲ−Ｈ２を有するｈｕｍＺ２７０の生成
代替的なストラテジー(図１１に示される)において、全長のカバットＣＤＲ(全長のＣＤＲ−Ｈ２を有する)がＶＫＩ＿Ｏ２／ＪＫ４軽鎖及びＶＨ１＿１８／ＪＨ６重鎖アクセプターフレームワークにおけるｈｕｍＺ２７０のアフィニティを改善するかどうかが調査された。ｈｕｍＺ２７０ＶＨ３(配列番号：２４)は、ＣＤＲの定義の相違に従って、結果として、基本的にカバットＣＤＲを結合したヒト化Ｚ２７０抗体となった。ｈｕｍＺ２７０ＶＨ４(配列番号：２５)は、Ｋ３８、Ｑ４６、Ｗ４７、Ｉ４８、Ｇ４９、Ｙ５９、Ｑ６１、Ｋ６２、Ｋ６６及びＡ６７がＳ６０、Ｆ６３、Ｋ６４、Ｄ６５の側鎖に近接しているという観察に従って、結果としてＲ３８Ｋ、Ｅ４６Ｑ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６６Ｋ及びＶ６７Ａ復帰突然変異を伴うＣＤＲを結合するヒト化Ｚ２７０抗体となった。
【０１２７】
実施例１０−他のヒトアクセプターフレームワークにおけるｈｕｍＺ２７０の生成
異なるヒト重鎖アクセプターフレームワーク配列を伴う多くの異なるヒト化構築物は、フレームワークの選択を調査するために実行された。
図１２は、用意をされた異なるヒト化Ｚ２７０ＶＨ構築物間のアラインメントを示す。  ｈｕｍＺ２７０ＶＨ５(配列番号：２６)はＶＨ５＿ａに基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ６(配列番号：２７)はＶＨ５＿５１に基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ７(配列番号：２８)はＶＨ１＿ｆに基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ８(配列番号：２９)はＶＨ１＿４６に基づいており、全てＪＨ６Ｊ−セグメントを伴う。全てのヒト化構築物のカバットＣＤＲ−Ｈ２の６つのＣ末端アミノ酸残基は、ヒトアクセプターフレームワークと同一だった。
アラインメント・プログラムＶｅｃｔｏｒＮＴＩを用いて、以下のｈｕｍＺ２７０ＶＨ１及びｈｕｍＺ２７０ＶＨ５、−６、−７及び−８間の配列同一性が得られた：７８，２％(ＶＨ１対ＶＨ５)、７９，０％(ＶＨ１対ＶＨ６)、８８，７％(ＶＨ１対ＶＨ７)及び９６，０％(ＶＨ１対ＶＨ８)。
【０１２８】
実施例１１−異なるｈｕｍＺ２７０変異体のバイアコア分析
ｈｕＺ２７０変異体(全てｈｕｍＺ２７０ＶＬ１配列を含んでいるが、ＶＨ配列ヒト化のために異なるストラテジーを用いている)のアフィニティは、分析された。
材料及び方法
バイアコアＴ１００(Biacore AB, Uppsala, Sweden)が用いられた。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗原は、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド(ＮＨＳ)を用いて、アミン基を経てセンサーＣＭ５チップ(Biacore AB, Uppsala, Sweden)に共有結合で固定された単鎖ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃ構築物の形態で用いられた。固定化レベルは、３００のＲＵに目標とした。
ｈｕｍＺ２７０抗体変異体は、ランニング・バッファＨＢＳ−ＥＰの濃度系列(０．１５７、０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５ｎＭ)に希釈された。全てのサンプルは、それから４０ｕｌ／分の流速で、２分間、固定された抗原上に注入された。その後、ランニング・バッファは、抗体解離分析のために４０ｕｌ／分で３分間注入された。各実行の後、再生バッファ(１０ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ)は、抗原から残留する抗体を完全に解離させるために、注入された(４０秒、１０ｕｌ／分)。データは、バイアコアＴ１００評価用ソフトを用いて評価された。各変異体のＫＤ値は、相対的ＫＤ値倍率変化を得るために、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ１重鎖を有するｈｕＺ２７０の値で割られた。
【０１２９】
結果及び結論
結果は図１３に示され、各変異体のＫＤ値はＫＤの相対的変化を得るためにｈｕｍＺ２７０ＶＨ１重鎖を有するｈｕＺ２７０の値で標準化された。図１３に示すように、ＣＤＲ−Ｈ２セグメント(ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１)においてより少ないマウス残基を含むｈｕｍＺ２７０変異体及びＣＤＲを結合した変異体(ＶＨ３、ＶＨ４)間に有意差はなかった。また、異なるヒトアクセプターフレームワークにおける「ヒト化ＣＤＲ−Ｈ２」変異体間に実質的な相違もみられなかった。より多くのヒトｈｕｍＺ２７０抗体がヒト患者において免疫原性反応がより低いという利点を有するので、ＶＨ１、ＶＨ５、ＶＨ６及びＶＨ７のようなヒト化ＣＤＲ−Ｈ２変異体は、標準のＣＤＲを結合するｈｕｍＺ２７０抗体と比較して、有意に低いアフィニティの危険性を伴わなず、より低い宿主免疫反応の可能性を有する、医療用途として選択され得る。
【０１３０】
実施例１２−Ｚ２７０ＶＬ及びＶＨの重要な残基の同定
Ｚ２７０のパラトープを同定するために、アラニンスキャン突然変異の生成が、マウス抗体のＣＤＲで行われた。以下のアミノ酸は、アラニン突然変異の生成(図１４)のために選択された：
Ｚ２７０ＶＬ：Ｒ２４Ａ、Ｓ２６Ａ、Ｅ２７Ａ、Ｎ２８Ａ、Ｙ３０Ａ、Ｓ３１Ａ、Ｎ５０Ａ、Ｋ５２Ａ、Ｔ５３Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｙ９２Ａ、Ｔ９４Ａ
Ｚ２７０ＶＨ：Ｋ２３Ａ、Ｓ２５Ａ、Ｔ２８Ａ、Ｔ３０Ａ、Ｓ３１Ａ、Ｎ３５Ａ、Ｄ５２Ａ、Ｙ５３Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｒ９４Ａ、Ｄ９８Ａ、Ｆ９９Ａ、Ｄ１００Ａ、Ｖ(１００Ａ)Ａ、Ｔ(１００Ｃ)Ａ、Ｌ(１００Ｄ)Ａ、Ｗ(１００Ｆ)Ａ、Ｄ１０１Ａ。
材料及び方法
アラニン変異体の抗原結合特性は、バイアコアＴ１００(Biacore AB, Uppsala, Sweden)で分析された。ｓｃ−ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃの形態の抗原は、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド(ＮＨＳ)を用いて、アミン基を経てセンサーＣＭ５チップ(Biacore AB, Uppsala, Sweden)に、共有結合して固定された。固定化レベルは、３００のＲＵを目標とした。精製されたＺ２７０アラニン変異体は、ランニング・バッファＨＢＳ−ＥＰで０．７５ｎＭ又は１．５ｎＭに希釈された。全てのサンプルは、それから１０ｕｌ／分の流速で、３分間、固定された抗原上に注入された。その後、ランニング・バッファは、抗体の結合安定性解析のために１０ｕｌ／分で１分間注入された。各実行の後、再生バッファ(１０ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ)は、抗原から残留する抗体を完全に解離させるために、注入された(３５秒、１０ｕｌ／分)。データは、バイアコアＴ１００評価用ソフトを用いて評価された。各変異体の相対的結合は、バイアコアから得られるその結合レベル(ＲＵ)をｃｈｉｍＺ２７０の値により割ることによって算出された。
【０１３１】
結果及び結論
図１５に示すように、Ｚ２７０ＶＨアラニン変異体Ｄ５２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｆ９９Ａ、Ｔ(１００Ｃ)Ａ及びＷ(１００Ｆ)Ａは、完全にそれらの抗原結合性特性を失った。重鎖変異体Ｒ９４には、２０％前後の抗原結合能が残っていた。重鎖変異体Ｎ３５Ａ、Ｙ５３Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｄ９８Ａ、Ｖ(１００Ａ)Ａ及びＬ(１００Ｄ)Ａの相対的結合レベルは、４０−７０％であった(図１)。したがって、Ｚ２７０重鎖ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３におけるアミノ酸Ｄ５２、Ｄ５４、Ｒ９４、Ｆ９９、Ｔ(１００Ｃ)及びＷ(１００Ｆ)は、抗原を認識する重要な残基である。一方、重鎖のアミノ酸Ｎ３５、Ｙ５３、Ｅ５６、Ｄ９８、Ｖ(１００Ａ)及びＬ(１００Ｄ)は、適度に抗原結合性に影響を及ぼす。興味深いことに、全てのＺ２７０軽鎖アラニン変異体は、キメラＺ２７０の結合特性に相当する抗原結合特性を保持する(図１６)。従って、Ｚ２７０軽鎖のアミノ酸は、抗原認識に対して有意に寄与しない。
【０１３２】
実施例１３−ＨｕｍＺ２７０は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現している細胞に特異的に結合する
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合するｈｕｍＺ２７０の強さ及び特異性は、ＨＥＫ２９３細胞が産生した野生型Ｚ２７０(ｒｅｃＺ２７０)、ヒトＩｇＧ４を有するキメラＺ２７０(ｃｈｉｍＺ２７０)又はヒト化Ｚ２７０(ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１)の、安定してＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃを過剰発現しているＢａ／Ｆ３細胞に対する結合を分析することにより、フローサイトメトリーで試験された。このために、Ｂａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ及び−Ｃ細胞は、氷上で少なくとも３０分間、Ｚ２７０変異体の様々な濃度において、２％ＦＣＳを含む組織培養培地でインキュベートされた。その後、細胞は洗浄され、再び氷上で少なくとも３０分間、ＡＰＣが結合した二次抗体を含む同様のメディウムにおいてインキューベートした。氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞へのｍＡｂ結合を、ＢＤバイオサイエンスＦＡＣＳアレイを用いて視覚化した。
図１７に示すように、全てのＺ２７０変異体は、Ｂａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞に対して用量依存的に結合したが、Ｂａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ細胞ではみられなかった。したがって、ｃｈｉｍＺ２７０のようなｈｕｍＺ２７０のＮＫＧ２Ａに対する同様の効率での結合と共に、全ての変異体は特異的にＮＫＧ２Ａと結合するが、ｒｅｃＺ２７０は効率的にわずかにより強く結合する。
【０１３３】
実施例１４−ｈｕｍＺ２７０は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現しているＮＫＬ細胞によってＨＬＡ−Ｅ＋標的細胞の死滅を誘導する
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋  ＮＫＬ細胞によって５１Ｃｒ標識化されたＬＣＬ  ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞の死滅を誘導するｒｅｃＺ２７０、ｃｈｉｍＺ２７０、ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１及びＺ１９９の能力が、研究された。この分析において、５１Ｃｒ標識化されたＬＣＬ  ７２１．２２１−Ｃｗ３標的細胞(ＨＬＡ−Ｅ＋)は、抗ＮＫＧ２Ａ  ｍＡｂの様々な濃度の存在下又は非存在下において、５％ＣＯ２を含む加湿されたインキュベーターで、３７℃(Ｅ：Ｔ比＝  ６：１)、４時間、ＮＫＬ細胞と共にインキューベートされた。標的細胞の死滅は組織培養培地の５１Ｃｒの量を測定することによって分析され、それは標的細胞の死によって放出された。
図１８において、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の濃度増大がＮＫＬ細胞によるＬＣＬ  ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞の死滅を誘導したことを明らかにした。Ｚ１９９、ｃｈｉｍＺ２７０及びｒｅｃＺ２７０は全て等しい効率であったのに対し、ｈｕｍＺ２７０はＮＫＬ細胞によりＬＣＬ  ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞のより多くの死滅を誘導した。したがって、ｈｕｍＺ２７０は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現している細胞障害性リンパ球(例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ−細胞、α／βＴ細胞及びγ／δＴ細胞の一部)上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの阻害機能を効率的にブロックすることができ、試験された他の組換え変異体よりも効率的であった。
【０１３４】
実施例１５−ｈｕｍＺ２７０は、競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストである
ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１がリガンド(すなわちＨＬＡ−Ｅ)のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合を阻害するかどうか試験するために、我々は、ｈｕｍＺ２７０がＨＬＡ−Ｅテトラマーの、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを過剰発現しているＢａ／Ｆ３細胞(Ｂａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ)への結合を阻害する可能性があるかどうかを分析した。このために、Ｂａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、１)様々な濃度のｈｕｍＺ２７０でインキューベートされ、又は２)最初に、ＨＬＡ−Ｅテトラマの飽和濃度(４．７μｇ／ｍｌ)でインキューベートし、それから様々な濃度のｈｕｍＺ２７０でインキューベートした全てのインキュベーションは、２％ＦＣＳを含む組織培養培地において、氷上で行われた。その後、細胞はマウスＡｂ’ｓ特異的なＡＰＣ結合二次抗体と共にインキューベートされ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉ−ｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳａｒｒａｙを用いたフローサイトメトリーによって分析された。
図１９に示すように、ｈｕｍＺ２７０は、濃度依存的に、Ｂａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞に効率的に結合する(ダイヤモンド)。しかしながら、細胞がＨＬＡ−Ｅテトラマでプレインキュベートされた場合、ｈｕｍＺ２７０はＢａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞への結合が阻害された。したがって、ＨｕｍＺ２７０及びＨＬＡ−Ｅは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ上の重複するエピトープに結合する。したがって、ＮＫ−細胞障害性分析におけるｈｕｍＺ２７０のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ−阻害作用は、おそらく、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを経て細胞障害性リンパ球に対してネガティブ・シグナルを誘導しているＨＬＡ−Ｅの能力を阻害する結果である。このように、ｈｕｍＺ２７０は、競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストと考えることができる。
【０１３５】
実施例１６−ｈｕｍＺ２７０は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する
ｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１及び可変軽鎖(ＶＬ)又は可変重鎖(ＶＨ)領域において復帰突然変異を伴う様々なｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１変異体の特異性及び効率は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合についてフローサイトメトリーを用いて試験された。これのために、Ｂａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞は、ｈｕｍＺ２７０−Ｌ４６Ｆ(ＶＬ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｉ４８Ｖ(ＶＬ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｌ４６Ｆ／Ｉ４８Ｖ(ＶＬ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｖ５Ｑ(ＶＨ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｍ６９Ｌ(ＶＨ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｔ７１Ｖ(ＶＨ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｔ７３Ｋ(ＶＨ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｔ７５Ｓ(ＶＨ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｖ５Ｑ／Ｍ６９Ｌ／Ｔ７１Ｖ／Ｔ７３Ｋ／Ｔ７５Ｓ(ＶＨ)、ｈｕｍＺ２７０−Ｍ６９Ｌ／Ｔ７１Ｖ／Ｔ７３Ｋ／Ｔ７５Ｓ(ＶＨ)又は復帰突然変異を有さないｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＶＨ１の２つの異なるバッチと共にインキューベートされた。このために、Ｂａ／Ｆ３ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又は−Ｃ細胞は、２％ＦＣＳを含む組織培養培地においてｈｕｍＺ２７０変異体の様々な濃度で、少なくとも氷上で３０分間インキューベートした。細胞は、それから洗浄されて、ヒト抗体に対して特異的なＡＰＣ結合二次抗体を含む同様の培地において、再び氷上で少なくとも３０分間インキューベートした。氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞への二次抗体の結合を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳａｒｒａｙを用いて視覚化した。
全ての変異体はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに特異的に結合したが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃには特異的に結合しなかった。全ての変異体は、わずかに低い効率で結合するＶ５Ｑ(ＶＬ)突然変異を含む変異体を除いて、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに同様の効率で結合した(図２０を参照)。
【０１３６】
例示的実施態様
次の段落は本発明の例示的な実施態様を記載するものである。
１．マウス抗体Ｚ２７０の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の抗原結合残基とヒトアクセプターフレームワーク配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２の少なくとも６のＣ末端残基が可変重（ＶＨ）ヒトアクセプター配列のものと同じである、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗体。
２．マウス抗体Ｚ２７０可変軽（ＶＬ）及びＶＨ配列を含む抗体より、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の細胞傷害性活性の増強において効果的である実施態様１に記載の抗体。
３．細胞傷害性リンパ球の表面に発現されるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性の中和においてマウス抗体Ｚ２７０可変軽（ＶＬ）及びＶＨ配列を含む抗体より効果的である実施態様１に記載の抗体。
４．ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の細胞傷害性活性のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介性阻害の低減においてマウス抗体Ｚ２７０可変軽（ＶＬ）及びＶＨ配列を含む抗体よりも効果的である実施態様１に記載の抗体。
５．ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球によるＣｗ３発現標的細胞の死滅の誘導においてマウス抗体Ｚ２７０可変軽（ＶＬ）及びＶＨ配列を含む抗体よりも効果的である実施態様１に記載の抗体。
６．ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球がＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、α／β  Ｔ細胞、又はγ／δ  Ｔ細胞である実施態様２−５の何れかに記載の抗体。
７．ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球がＮＫ細胞である実施態様６に記載の抗体。
８．抗体ＶＨドメインがマウス抗体Ｚ２７０のＶＨ ＣＤＲ由来の残基Ｄ５２、Ｄ５４、Ｆ９９、Ｔ（１００Ｃ）、及びＷ（１００Ｆ）を含む実施態様１−７の何れかに記載の抗体
９．抗体ＶＨドメインがマウス抗体Ｚ２７０のＶＨ ＣＤＲ由来の残基Ｎ３５、Ｙ５３、Ｅ５６、Ｄ９８、Ｖ（１００Ａ）、及びＬ（１００Ｄ）を更に含む実施態様８に記載の抗体。
１０．配列番号５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１と配列番号５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号５の残基５０−５９を含む実施態様１−９の何れかに記載の抗体。
１１．ＶＨドメインヒトアクセプターフレームワークが配列番号５と７０％以上の配列同一性を有している実施態様１−１０の何れかに記載の抗体。
１２．ＶＨヒトアクセプターフレームワークのＶＨセグメントがＶＨ１＿１８、ＶＨ５＿ａ、ＶＨ５＿５１、ＶＨ１＿ｆ、又はＶＨ１＿４６であり、Ｊ−セグメントがＪＨ６である実施態様１−１１の何れかに記載の抗体。
１３．ＶＨセグメントがＶＨ１＿１８、ＶＨ５＿ａ、ＶＨ５＿５１、又はＶＨ１＿ｆである実施態様１２に記載の抗体。
１４．ＶＨセグメントがＶＨ１＿１８である実施態様１３に記載の抗体。
１５．ＶＨドメインヒトアクセプター配列が如何なる逆変異も含まない実施態様１−１４の何れかに記載の抗体。
１６．（ａ）ＶＨドメインの５位のアミノ酸がＶ又はＱであり；
（ｂ）ＶＨドメインの６９位のアミノ酸がＭ又はＬであり；
（ｃ）ＶＨドメインの７１位のアミノ酸がＴ又はＶであり；
（ｄ）ＶＨドメインの７３位のアミノ酸がＴ又はＫであり；あるいは
（ｅ）ＶＨドメインの７５位のアミノ酸がＴ又はＳである、
実施態様１−１４の何れかに記載の抗体。
１７．６９位のアミノ酸がＬである実施態様１６に記載の抗体。
１８．７１位のアミノ酸がＶである実施態様１６に記載の抗体。
１９．ＶＨドメインが配列番号５の配列を含む実施態様１−１５の何れかに記載の抗体。
２０．配列番号４の残基２４−３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４の残基５０−５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号４の残基８９−９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３を含む実施態様１−１９の何れかに記載の抗体。
２１．ＶＬドメインヒトアクセプター配列が如何なる逆変異も含まない実施態様２０に記載の抗体。
２２．ＶＬドメインヒトアクセプターフレームワークがＶＫＩ＿Ｏ２／ＪＫ４由来である実施態様２０−２１の何れかに記載の抗体。
２３．ＶＬドメインヒトアクセプターフレームワークが配列番号４を含む実施態様２０−２２の何れかに記載の抗体。
２４．（ａ）配列番号４の残基２４−３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１；
（ｂ）配列番号４の残基５０−５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２；
（ｃ）配列番号４の残基８９−９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列番号５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１；
（ｅ）配列番号５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）配列番号５の残基５０−５９に対応するＣＤＲ−Ｈ２；
（ｇ）ヒトアクセプターフレームワーク配列
を含み、
ＣＤＲ−Ｈ２の残基６０−６５がＶＨヒトアクセプター配列由来であり、
ヒト化抗体が、配列番号１に対応する可変軽（ＶＬ）配列と配列番号２に対応するＶＨ配列を含む抗体よりもＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞の細胞傷害性活性を増強する点でより効果的である、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合するヒト化抗体又は抗体断片。
２５．非ヒトＣＤＲ残基とヒトＶＨアクセプターフレームワークを含むＶＨドメインを含み、ＮＨドメインが配列番号５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の残基５０−６６に対応するＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３を含む、ヒトＮＫＧ２Ａに結合するヒト化抗体。
２６．ヒトＶＨアクセプターフレームワークが如何なる逆変異も含まない実施態様７９に記載５に記載のヒト化抗体。
２７．ＶＨドメインのカバットの５位のアミノ酸がＶ又はＱである実施態様２５に記載のヒト化抗体。
２８．ＶＨドメインのカバットの６９位のアミノ酸がＭ又はＬである実施態様２５に記載のヒト化抗体。
２９．ＶＨドメインのカバットの７１位のアミノ酸がＴ又はＶである実施態様２５に記載のヒト化抗体。
３０．ＶＨドメインのカバットの７３位のアミノ酸がＴ又はＫである実施態様２５に記載のヒト化抗体。
３１．ＶＨドメインのカバットの７５位のアミノ酸がＴ又はＳである実施態様２５に記載のヒト化抗体。
３２．ＶＨドメインが、５、６９、７１、７３、７５からなる群から選択される少なくとも一つのカバット位置にフレームワーク領域置換を含む実施態様２５に記載のヒト化抗体。
３３．ＶＨドメインが、次の選択肢：
（ａ）なし
（ｂ）Ｖ５Ｑ
（ｃ）Ｍ６９Ｌ
（ｄ）Ｔ７１Ｖ
（ｅ）Ｔ７３Ｋ
（ｆ）Ｔ７５Ｓ
（ｇ）Ｖ５Ｑ及びＭ６９Ｌ
（ｈ）Ｖ５Ｑ及びＴ７１Ｖ
（ｉ）Ｖ５Ｑ及びＴ７３Ｋ
（ｊ）Ｖ５Ｑ及びＴ７５Ｓ
（ｋ）Ｍ６９Ｌ及びＴ７１Ｖ
（ｌ）Ｍ６９Ｌ及びＴ７３Ｋ
（ｍ）Ｍ６９Ｌ及びＴ７５Ｓ
（ｎ）Ｔ７１Ｖ及びＴ７３Ｋ
（ｏ）Ｔ７１Ｖ及びＴ７５Ｓ
（ｐ）Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓ
（ｑ）Ｖ５Ｑ、Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓ
（ｒ）Ｖ５Ｑ、Ｔ７１Ｖ及びＴ７５Ｓ
（ｓ）Ｖ５Ｑ、Ｔ７１Ｖ及びＴ７３Ｋ
（ｔ）Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ及びＴ７５Ｓ
（ｕ）Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ及びＴ７３Ｋ
（ｖ）Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ及びＴ７１Ｖ
（ｗ）Ｔ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓ
（ｘ）Ｍ６９Ｌ、Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓ
（ｙ）Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ及びＴ７５Ｓ
（ｚ）Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ及びＴ７３Ｋ
（ａａ）Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ及びＴ７３Ｋ
（ｂｂ）Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ及びＴ７５Ｓ
（ｃｃ）Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓ
（ｄｄ）Ｖ５Ｑ、Ｔ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓ
（ｅｅ）Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓ、及び
（ｆｆ）Ｖ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ及びＴ７５Ｓ
の一つによるフレームワーク置換を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む実施態様３２に記載のヒト化抗体。
３４．ヒトアクセプターフレームワークに導入された非ヒトＣＤＲ残基を含むＶＬドメインを含み、ＶＬドメインが配列番号４の残基２３−３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４の残基５０−５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号４の残基８９−９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３を含む実施態様２５−３２の何れかに記載のヒト化抗体。
３５．ヒトＶＬアクセプターフレームワークが如何なる逆変異も含まない実施態様３４に記載のヒト化抗体。
３６．ＶＬドメインのカバットの４６位のアミノ酸がＬ又はＦである実施態様３４に記載のヒト化抗体。
３７．ＶＬドメインのカバットの４８位のアミノ酸がＩ又はＶである実施態様３４に記載のヒト化抗体。
３８．ＶＬドメインが、４６及び４８から選択される少なくとも一のカバット位置にフレームワーク領域置換を含む実施態様３４に記載のヒト化抗体。
３９．ＶＬドメインが、次の選択肢：
（ａ）なし
（ｂ）Ｌ４６Ｆ
（ｃ）Ｉ４８Ｖ
（ｄ）Ｌ４６及びＩ４８Ｖ
の一つによるフレームワーク置換を持つ、配列番号６のアミノ酸配列を含む実施態様３８に記載のヒト化抗体。
４０．ヒトＮＫＧ２Ａに結合するヒト化抗体であって、ヒトＶＨドメインに導入された非ヒトＣＤＲ残基を含むＶＨドメインを含み、該ＶＨドメインが、５、６９、７１、７３、及び７５からなる群から選択される配列番号７の少なくとも一つのカバット位置にフレームワーク領域置換を含む抗体。
４１．Ｖ５Ｑ置換を含む実施態様４０に記載のヒト化抗体。
４２．Ｍ６９Ｌ置換を含む実施態様４０に記載のヒト化抗体。
４３．Ｔ７１Ｖ置換を含む実施態様４０に記載のヒト化抗体。
４４．Ｔ７３Ｋ置換を含む実施態様４０に記載のヒト化抗体。
４５．Ｔ７５Ｓ置換を含む実施態様４０に記載のヒト化抗体。
４６．ヒトＶＬドメインに導入された非ヒトＣＤＲ残基を含むＶＬドメインを含み、ＶＬドメインが４６及び４８から選択される配列番号６の少なくとも一のカバット位置にフレームワーク領域置換を含む実施態様４０に記載のヒト化抗体。
４７．Ｌ４６Ｆ置換を含む実施態様４０に記載のヒト化抗体。
４８．Ｉ４８Ｖ置換を含む実施態様４０に記載のヒト化抗体。
４９．配列番号５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の残基５０−６６に対応するＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３を含む実施態様４０から４８の何れかに記載のヒト化抗体。
５０．配列番号７の配列を含むＶＨドメインを含む実施態様４０−４９の何れかに記載のヒト化抗体。
５１．配列番号６の残基２３−３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６の残基５０−５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号６の残基８９−９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３を含む実施態様４０−５０の何れかに記載のヒト化抗体。
５２．配列番号６の配列を含むＶＬドメインを含む実施態様４０−５２の何れかに記載のヒト化抗体。
５３．カバットの５、６９、７１、７３、及び／又は７５位に一又は複数のＦＲ置換を任意に有していてもよい、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、ヒトＮＫＧ２Ａに結合するヒト化抗体。
５４．任意のＦＲ置換がＶ５Ｑ、Ｍ６９Ｌ、Ｔ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、及び／又はＴ７５Ｓである実施態様５３に記載のヒト化抗体。
５５．カバットの４６及び／又は４８位に一又は複数の任意のＦＲ置換を含む、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを更に含む実施態様５２に記載のヒト化抗体。
５６．任意のＦＲ置換がＬ４６Ｆ及び／又はＩ４８Ｖである実施態様５５に記載のヒト化抗体。
５７．ヒトＶＨドメインに導入された非ヒトＣＤＲ残基を含むＶＨドメインを含み、ＶＨドメインが配列番号５と少なくとも５０％同一である、ＮＫＧ２Ａに結合するヒト化抗体。
５８．ＶＨドメインが配列番号５と少なくとも９０％同一である実施態様４６に記載のヒト化抗体。
５９．配列番号５の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の残基５０−６６に対応するＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号５の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３を含む実施態様５７及び５８の何れかに記載のヒト化抗体。
６０．ＶＨドメインにおいて、カバットの５位にＶ又はＱを、カバットの６９位にＭ又はＬを、カバットの７１位にＴ又はＶを、カバットの７３位にＴ又はＫを、カバットの７５位にＴ又はＳを含む実施態様５７−５９の何れかに記載のヒト化抗体。
６１．ヒトＶＬドメインに導入された非ヒトＣＤＲ残基を含むＶＬドメインを含み、ＶＬドメインが配列番号４と少なくとも５０％同一である実施態様５７−６０の何れかに記載のヒト化抗体。
６２．配列番号４と少なくとも９０％同一のＶＬドメインを含む実施態様５７−６１の何れかに記載のヒト化抗体。
６３．配列番号４の残基２３−３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号４の残基５０−５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４の残基８９−９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３配列を含む実施態様５７−６２の何れかに記載のヒト化抗体。
６４．カバットの４６位にＬ又はＦ、及び／又はカバットの４８位にＩ又はＶを含む実施態様５７−６３の何れかに記載のヒト化抗体。
６５．ヒトＮＫＧ２Ａに結合するヒト化抗体であって、ヒトＶＨドメインに導入された非ヒトＣＤＲ残基を含むＶＨドメインを含み、該ＶＨドメインは配列番号８の残基３１−３５に対応するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８の残基５０−６６に対応するＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号８の残基９５−１０２に対応するＣＤＲ−Ｈ３を含み、カバットの６３、６４、６５、６６、及び６７位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｋ、Ｄ、Ｋ、Ａである抗体。
６６．カバットの６０位のアミノ酸がＡである実施態様６５に記載のヒト化抗体。
６７．ＶＨドメインが配列番号８のアミノ酸配列を含む実施態様６５及び６６の何れかに記載のヒト化抗体。
６８．配列番号６の残基２３−３４に対応するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６の残基５０−５６に対応するＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号６の残基８９−９７に対応するＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを更に含む実施態様６５−６７の何れかに記載のヒト化抗体。
６９．ＶＬドメインが配列番号６のアミノ酸配列を含む実施態様６５−６８の何れかに記載のヒト化抗体。 
７０．Ｚ２７０ハイブリドーマによって生産される抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒト化型。
７１．多特異性抗体ないし抗体断片である、実施態様１−７０の何れかに記載の抗体。
７２．Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片、ｄＡｂ断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、カッパボディ；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；及び多重特異性抗体断片から選択される抗体断片である実施態様７１に記載の抗体。
７３．二重特異性抗体である実施態様７２に記載の抗体。
７４．完全長ＩｇＧ４抗体又はその断片である実施態様１−７０の何れか一項に記載の抗体。
７５．重鎖定常ドメインがＳ２４１Ｐ変異を含む実施態様７４に記載の抗体。
７６．先の実施態様の何れかに記載の抗体をコードする単離核酸。
７７．実施態様７６に記載の核酸を含むベクター。
７８．実施態様７６に記載のベクターを含む宿主細胞。
７９．実施態様７８に記載の宿主細胞を、核酸が発現され抗体が生産されるように培養することを含む抗体の生産方法。
８０．抗体を宿主細胞培養物から回収することを更に含む実施態様７９に記載の方法。
８１．培養前に、可変重ドメインをコードする核酸を含むベクターと可変軽ドメインをコードする核酸を含むベクターを宿主細胞に同時形質移入する実施態様７９に記載の方法。
８２．実施態様１−７５の何れか一項に記載の抗体と第二薬剤を含む免疫複合体。
８３．第二薬剤が細胞傷害剤である実施態様８２に記載の免疫複合体。
８４．第二薬剤がＰＥＧ分子である実施態様８２に記載の免疫複合体。
８５．実施態様１−７５の何れか一項に記載の抗体又は実施態様８２−８４の何れか一項に記載の免疫複合体と、担体を含有する薬学的組成物。
８６．約６．０から約７．５のｐＨを有する、クエン酸塩、リン酸塩、及びその組合せから選択されるバッファーを含有する実施態様７４に記載の薬学的組成物。
８７．実施態様１−７５の何れか一項に記載の抗体と、有効量の抗体を用いて哺乳動物における癌、ウイルス疾患、炎症疾患、及び自己免疫疾患から選択される疾患を治療するために使用者に指示する指示書を含む容器を含む製造品。
８８．哺乳動物がヒトである実施態様８７に記載の物品。
８９．ヒト患者において細胞傷害性リンパ球の表面に発現されるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を中和するために使用される実施態様１−７５の何れか一項に記載の抗体。
９０．ヒト患者においてＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の細胞傷害性のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介性阻害を低減するために使用される実施態様１−７５の何れか一項に記載の抗体。
９１．ヒト患者においてＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の細胞傷害性を増強するために使用される実施態様１−７５の何れか一項に記載の抗体。
９２．ヒト患者におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球によってＣｗ３発現標的細胞の死滅を誘導するために使用される実施態様−７５の何れか一項に記載の抗体。
９３．ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球がＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、α／β  Ｔ細胞、又はγ／δ  Ｔ細胞である実施態様８９−９２の何れか一項に記載の抗体。
９４．癌、ウイルス疾患、炎症疾患、及び自己免疫疾患から選択される疾患のヒト患者の治療方法において、実施態様８５又は８６に記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
９５．癌、ウイルス疾患、炎症疾患、及び自己免疫疾患から選択される疾患のヒト患者への投与のための医薬の調製における実施態様１から７５の何れか一項に記載の抗体の使用。
９６．癌、ウイルス疾患、炎症疾患、及び自己免疫疾患から選択される疾患のヒト患者の治療における使用のための実施態様１から７５の何れか一項に記載の抗体。
９７．患者が、扁平上皮癌、白血病、急性のリンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、線毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、急性又は慢性の骨髄性白血病、前骨髄球白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫；メラノーマ、精上皮腫、テラトカルシノーマ、神経芽細胞腫、膠腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、膠腫、シュワン細胞腫；線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺の濾胞性癌、テラトカルシノーマ、膀胱、胸部、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸管、甲状腺又は皮膚の他のカルシノーマ、リンパ系統の他の造血性腫瘍、骨髄系統の他の造血性腫瘍、間充織起源の他の腫瘍、中枢又は末梢神経系の他の腫瘍、又は間葉系起源の他の腫瘍に罹患している、実施態様８９−９６の何れか一項に記載の方法、使用又は抗体。
９８．患者が多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、又は急性骨髄性リンパ腫に罹患している実施態様９７に記載の使用。
【０１３７】
ここに引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体がここに記載されているのと同じ程度に、出典明示によりここに援用される。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解してはならない。
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、すべての考えられる変更において上記の要素のいずれの組み合わせも本発明に包含される。
【０１３８】
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、本明細書中の「又は」なる用語は「及び／又は」の意味を含めて用いられ、したがって、本用語が「いずれか」という排他的な意味で解釈される実施態様又は態様も暗にサポートするものである。
発明を記述する際に使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる用語及び同様の指示対象は、ここで別の記載がなされていないか、文脈上はっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーしていると解されるものである。
本明細書中の値の記載は単に、その範囲内にあるそれぞれ別々の値を個々に示す方法を短縮して示すことを意図しているだけであって、本明細書中で明記されない限り、それぞれ別々の値は、個別に挙げられているものとして本明細書中に組み込まれている。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、本明細書中に記載のすべての方法は任意の好適な順序で行われうる。
【０１３９】
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に別段の記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も、明示的に記載していない限り、如何なる要素も本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
他に言及しない又は前後関係ではっきりと矛盾していない限りは、要素又は要素群に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含んでいる」等の用語を使用する本発明の任意の態様又は実施態様のここでの記載は、その特定の要素又は要素群「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含む」本発明の類似した態様又は実施態様をサポートすることを意図したものである(例えば、特定の要素を含むものとしてここに記載されている組成物は、他に言及しない限り又は前後関係ではっきりと矛盾していないならば、その要素からなる組成物をまた記載しているものと理解すべきである)。
本発明は、適用される法律によって許容される最大の範囲で、ここに提示された態様又は特許請求の範囲に記載された主題事項のあらゆる変形例及び均等物を含む。
【図１】
2014122221.tif 000005
【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図３Ｇ−Ｈ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図４Ｇ−Ｈ】
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【図４Ｉ−Ｊ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月4日(2014.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＬドメインが配列番号４の配列を含み、ＶＨドメインが配列番号５の配列を含み、マウス抗体Ｚ２７０の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列（配列番号１）と重鎖可変領域（ＶＨ）配列（配列番号２）を含む抗体より、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を増強する点でより効果的である、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
細胞傷害性リンパ球の表面上に発現したＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を中和する点で、マウス抗体Ｚ２７０の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列（配列番号１）と重鎖可変領域（ＶＨ）配列（配列番号２）を含む抗体より効果的である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介性阻害を低減する点で、マウス抗体Ｚ２７０の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列（配列番号１）と重鎖可変領域（ＶＨ）配列（配列番号２）を含む抗体より効果的である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球によるＣｗ３発現標的細胞の死滅を誘導する点で、マウス抗体Ｚ２７０の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列（配列番号１）と重鎖可変領域（ＶＨ）配列（配列番号２）を含む抗体より効果的である、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球が、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、α／β Ｔ細胞、または、γ／δ Ｔ細胞である、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球がＮＫ細胞である、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ４抗体である、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
抗体断片又は多重特異性抗体である、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の生産方法において、請求項１から８の何れか一項に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、核酸が発現され抗体が生産されるように培養することを含む方法。
【請求項１０】
請求項１から８の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体を含有してなる薬学的組成物。
【外国語明細書】
2014122221000001.pdf