(57)【要約】      （修正有）【課題】犬及び猫を含む愛玩動物における異常な骨関節炎、リウマチ性関節炎及び局所関節炎症を含む異常な筋骨格関節状態の処置、並びにその様な異常な筋骨格関節状態に関連する症状を処置する為の組成物及び方法の提供。【解決手段】アルファ−リノール酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）から選択されるオメガ−３脂肪酸と、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸及びヒアルロナンから選択されるグリコサミノグリカンと、ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸及びＮ−アセチルグルコサミンから選択されるアミノ糖と、ビタミンＣ、トコフェロール類、トコトリエノール類、グルタチオン、リポ酸、メラトニン及びベータ−カロテンから選択される抗酸化剤と、カルニチン又はアセチルカルニチンと、を含有する組成物、及び該使用方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のものを含む組成物：
ａ）少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、
ｂ）少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、
ｃ）少なくとも１種類のアミノ糖、
ｄ）少なくとも１種類の抗酸化剤、および
ｅ）カルニチンまたはアセチルカルニチン。
【請求項２】
オメガ−３脂肪酸が、アルファ−リノール酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）
およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組
成物。
【請求項３】
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパ
リン、ヘパラン硫酸およびヒアルロナンからなる群から選択される、請求項１に記載の組
成物。
【請求項４】
アミノ糖が、ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸およびＮ−アセチルグルコサミ
ンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
抗酸化剤が、ビタミンＣ、トコフェロール類、トコトリエノール類、グルタチオン、リ
ポ酸、メラトニンおよびベータ−カロテンからなる群から選択される、請求項１に記載の
組成物。
【請求項６】
さらに、少なくとも１種類の食物無機質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の
組成物。
【請求項７】
食物無機質が、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コ
バルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜
鉛およびバナジウムからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
さらに、少なくとも１種類の必須アミノ酸を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
対象において異常な関節状態を処置する方法であって、その必要がある対象に請求項１
に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
【請求項１０】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項
９に記載の方法。
【請求項１１】
対象において異常な関節状態の発症を遅延させる方法であって、その必要がある対象に
請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項
１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象において対象が異常な関節状態に罹患するリスクを低下させる方法であって、その
必要がある対象に請求項１に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項
１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象において１種類以上の遺伝子の発現を変化させる方法であって、その必要がある対
象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含み、１種類以上の遺伝子がア
ネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、Ｉ
Ｌ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ
−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−
１７受容体からなる群から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、動物において異常な関節状態を処置するための組成物および方法に
関するものであり、その際、異常な関節状態は動物の筋骨格関節に関係する。特に、本発
明は異常な骨関節炎、リウマチ性関節炎および局所関節炎症を含む異常な筋骨格関節状態
の処置、ならびにそのような異常な筋骨格関節状態に関連する症状の軽減に関する。本発
明は、動物に差次発現する遺伝子、たとえば関節炎ではない動物と比較して関節炎の動物
に差次発現する遺伝子を、本発明組成物の投与により調節することをも包含する。本発明
は、それに関係する、イヌおよびネコを含む愛玩動物における新規バイオマーカーの同定
、診断方法、組成物およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  遺伝子は動物の発達に際して役割を果たすこと、また遺伝子発現の調節は動物
の健康状態および健全性に影響を及ぼすある疾患または状態の発症に際して重要な役割を
果たすことは、科学分野で一般に受け入れられている。また、遺伝子の差次発現がそのよ
うな疾患および状態の発症における一因であり、遺伝子発現パターンの評価はそのような
疾患および状態の発症および制御を分子レベルで理解するためにきわめて重要なものとし
て広く認識されるようになった。遺伝子およびそれらと疾患の関係の理解を進めるために
、差次遺伝子発現を研究するための多数の方法が開発された；たとえばＤＮＡマイクロア
レイ、発現遺伝子タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｔａｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＥＳＴ）
）、遺伝子発現の一連の解析（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ））、ｍＲＮＡに関するサブトラクティブハイブリダイゼー
ション、サブトラクティブクローニングおよびディファレンシャルディスプレー（ＤＤ）
、ＲＮＡ−ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ（ＲＡＰ−ＰＣＲ）、Ｒｅｐ
ｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＤＡ）、二
次元ゲル電気泳動、質量分析、ならびにタンパク質マイクロアレイベースのタンパク質に
対する抗体結合。
【０００３】
[0003]  哺乳動物の身体の実質的にすべての関節に軟骨がある。軟骨は身体の支持構造
であり、線維状タンパク質（コラーゲン）の厚い束から構成され、これらが織成されて関
節表面を形成している。プロテオグリカンは、コラーゲンが占めていない細胞外間隙を充
填する。そのようなプロテオグリカンはタンパク質と糖の組合わせから構成される。各プ
ロテオグリカンサブユニットは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として知られる修飾さ
れた糖の長い鎖からなるタンパク質コアを含む。グルコサミンはＧＡＧの最も重要な１成
分であり、かつ前駆物質である。身体によるコラーゲンの合成は、ＧＡＧ合成に依存する
。軟骨中の軟骨細胞はグルコサミンを利用してＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およ
びグルクロン酸を生成し、これらは身体によりヒアルロンの形成に利用される。ヒアルロ
ンは動物の身体の関節に潤滑性を与える。
【０００４】
[0004]  軟骨は動物の身体において、関節内における柔軟性、加圧下での圧縮性、クッ
ション性、引張り強さ、動作の範囲、および動きの滑らかさ付与するために重要である。
軟骨を含む関節の例には、手指および足指、首、膝、股関節、肩などが含まれる。動物は
軟骨が分解する多くの状態に罹患する可能性があり、それにより関節の柔軟性、圧縮性の
低下が生じ、その結果しばしば関節および／または関節周囲組織の全体的炎症、ならびに
場合により骨関節炎およびリウマチ性関節炎などの状態が発症する。その際、そのような
動物は関節機能が著しく損なわれ、かつ痛みを感じる。
【０００５】
[0005]  関節炎は筋骨格障害である。骨関節炎は、動物およびヒトにおいて最も一般的
なタイプの関節炎である。骨関節炎はヒトおよび愛玩動物に一般的に起きる変性性の関節
疾患であり、この疾患は関節軟骨の変性性変化を特徴とし、プロテオグリカンおよびコラ
ーゲンの損失ならびに軟骨周縁における新生骨の増殖を伴う。これらの変化には、滑膜内
の変動性炎症反応が付随する。関節表面のヒアリン軟骨の主な欠損は、マトリックスのグ
リコサミノグリカンとコラーゲン線維の含量比の変化である。関節の軟骨直下にある骨は
軟骨下骨と呼ばれる。これらの軟骨下骨は、それを覆う、それ自体は血管、神経またはリ
ンパ組織をもたない軟骨に栄養を供給する。
【０００６】
[0006]  自然な軟骨侵食は加齢に伴って起きるが、関節に過度の負荷を与えることによ
っても生じる可能性があり、肥満症、遺伝、外傷、循環低下、骨配列不良および反復スト
レスが関節の状態を増悪させる可能性がある。フリーラジカル損傷は骨関節炎の発症に関
与する可能性があると推定されている。
【０００７】
[0007]  軟骨細胞として知られるヒアリン軟骨細胞は周囲の細胞外マトリックスを産生
および維持する。軟骨マトリックスの恒常性の維持は、マトリックスタンパク質、たとえ
ばＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンの異化作用に依存する。これらのタンパク質は消化
されて、軟骨細胞により合成される新たなタンパク質で置き換えられる。異化作用は、一
部はタンパク質分解酵素、たとえばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）および
アグリカナーゼなどのタンパク質により行われる。正常な動物では合成と分解の間にバラ
ンスが達成され、これによって健康な軟骨が維持される。このバランスが分解の方へシフ
トすると、続いて異常発生が起き、結果的に関節の炎症および骨関節炎が生じる可能性が
ある。
【０００８】
[0008]  軟骨の恒常状態は、軟骨細胞間の細胞間シグナル伝達を介した調節に依存する
。したがって、軟骨細胞はシグナル伝達分子を産生し、かつ応答する。そのようなシグナ
ル伝達分子には、細胞の代謝に直接作用することができるサイトカインおよび増殖因子を
含めることができる。細胞間シグナル伝達は複雑であり、完全には解明されていない。Ｔ
ＧＦ−ベータなどの増殖因子分子が関係しており、それらはＩＩ型コラーゲンの産生を促
進しかつコラーゲン開裂を阻害すると考えられる。サイトカイン、たとえばＴＮＦ−アル
ファおよびＩＬ−１−ベータも役割を果たす。これらのサイトカインは、軟骨を分解する
ことができるプロテアーゼの産生を促進すると考えられる。細胞間シグナル伝達の結果と
して他の多数の複雑な相互作用が起きていると考えられる。
【０００９】
[0009]  細胞間シグナル伝達プロセスの複雑さのため、起きている相互作用を遺伝子レ
ベルで理解することがきわめて望ましい。前関節炎または関節炎状態における調節異常な
遺伝子の検出は、異常な筋骨格関節障害の生態を特にゲノム範囲で理解するのに役立つ。
関係する生物学的経路を遺伝子発現プロファイリングよってより詳細に理解することは、
保健医薬、栄養医薬（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）および栄養（食事）による疾患経路
への介入法を開発するのに役立つであろう。これらの方法は、基礎疾患である異常な筋骨
格関節状態の予防、早期検出および治療、ならびにそのような異常な筋骨格関節障害、特
に骨関節炎の予後のモニタリングを可能にするであろう。そのような障害の病理に関係す
る調節異常な遺伝子は、適切な医薬、栄養医薬および栄養（食事）による介入法の選択を
最適化するための重要なバイオマーカーとして利用できる。
【００１０】
[0010]  さらに、骨関節炎の経過を反転させる薬物を同定すべきである。現在使用でき
る療法薬は、炎症を軽減し、および／または痛みを緩和するために用いられる。現在の療
法は、骨関節炎などの筋骨格関節障害を処置するために非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡ
ＩＤ）として知られるクラスの薬物を用いるが、これらの療法は特に消化器障害を含めた
さまざまな欠点をもち、またそれらは軟骨形成を阻害する可能性もある。
【００１１】
[0011]  大型犬はそれらの加齢に伴って関節炎を発症する場合がある。大型品種犬はそ
れらの大きな体格および／または遺伝的素因のため関節炎を発症しやすい。大型犬が関節
炎その他の軟骨状態のリスクをもつ唯一の動物ではない。関節炎その他の変性性関節疾患
はイヌに普通に認められており、そのような状態がネコに一般にみられることが示されて
いる。ネコ類の骨関節炎は、主に１０歳以上の高齢のネコ類が罹患する疾患である。軟骨
を冒す異常な筋骨格関節障害を発症するリスクをもつ動物には、哺乳動物、たとえばイヌ
類、ネコ類、ウマ類、ヤギ類、ヒツジ類、ブタ類、ウシ類、ヒトおよび霊長類の種、なら
びにシチメンチョウおよびニワトリを含めた鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
【００１２】
[0012]  食事は代謝に根本的に関係するので、疾患の原因および進行において重要な役
割を果たす。疾患調節遺伝子は、栄養因子によってある程度調節される。したがって、食
物中に栄養素として存在する食事成分は、遺伝子発現を転写および翻訳のレベルで、なら
びに特定の翻訳後修飾において調節する可能性がある。それらは分解および酵素活性にも
関係する可能性がある。栄養素レベルは代謝経路の平衡に影響を及ぼす可能性がある。代
謝経路はしばしば複雑であり、異なる代謝経路間で多くの重複および相互作用を伴う場合
がある。１種類の酵素、増殖因子、サイトカインまたは代謝産物の濃度の変化が、疾患関
連の生理に関係する多数の代謝経路に影響を及ぼす可能性がある。ホルモンおよび他の細
胞シグナル伝達分子が食事により調節されることは十分に理解されており、疾患の発症お
よび進行に関与することも知られている。
【００１３】
[0013]  同じ疾患表現型が異なる代謝経路の障害から生じる場合があり、かつ各動物の
遺伝子構成は異なっており、これらにより栄養因子および環境因子を含めた同じ因子に対
する応答に変動が生じる。遺伝因子、栄養因子および環境因子の相互関係は、動物の疾患
の病因、予防、治療および進行を理解する際に重要である。種々の疾患および障害に関連
する栄養素に対する遺伝子発現応答を見いだすことにより、異常な筋骨格関節障害などの
疾患に対して罹病性である動物のための食事を処方することができ、さらに基礎疾患の診
断、治療および予後モニタリングが可能になる。
【００１４】
[0014]  栄養成分は、ｍＲＮＡ産生（転写）、ｍＲＮＡプロセシング、タンパク質産生
（翻訳）および翻訳後修飾を含めた遺伝子発現に影響を及ぼし、これにより動物の代謝状
態全体に影響を及ぼす。したがって、疾患の早期検出および疾患進行のモニタリングのた
めのバイオマーカーの利用、ならびに／あるいは遺伝子型に基づく食事は、動物、特に愛
玩動物の疾患の予防または治療および新規療法の開発を可能にするであろう。食事は、議
論の余地なく、疾患に対する罹病性を含めた動物の表現型に影響を及ぼす最も重要な環境
因子である。
【００１５】
[0015]  遺伝子発現は、遺伝子機能の活性化因子および抑制因子により制御される不安
定なプロセスにより調節されている可能性がある。栄養状態は、遺伝子転写速度に著しい
変化を引き起こす可能性がある。多量栄養素、たとえばグルコース、脂肪酸およびアミノ
酸、ならびに微量栄養素、たとえば鉄、亜鉛およびビタミンが、遺伝子発現を調節するこ
とができる。種々の生物活性食物成分、たとえばカロテノイド、フラボノイド、モノテル
ペンおよびフェノール系の酸は、遺伝子発現に影響を及ぼす転写因子として作用する可能
性がある。これらの物質は遺伝子発現に直接的な作用をもつ傾向がある。他の状況では、
腸内で細菌により発酵する食物繊維などの物質が短鎖脂肪酸などの栄養素の産生をもたら
す可能性がある。そのような物質は、遺伝子発現の間接的な活性化因子または抑制因子と
して作用する可能性がある。
【００１６】
[0016]  転写および翻訳における栄養素に関係した変化の同定は、本明細書に記載する
タイプの実験で検出することができる。本明細書の実施例においてプロファイリングした
遺伝子の広範なアレイからみて、遺伝子の発現および量の変化は本明細書に教示する方法
で容易に検出される。したがって、食事および代謝による遺伝子発現シグネチャーは、本
明細書の実施例に教示する技術を用いて容易に確認できる。本発明のバイオマーカーは、
動物に差次発現するタンパク質および／または核酸である。バイオマーカーの発現は、タ
ンパク質または核酸のレベルで、当業者に既知の多様な方法を用いて評価することができ
る。
【００１７】
[0017]  イヌ類およびネコ類のゲノムのスクリーニングに際し、これらの愛玩動物の食
事の栄養成分に応答した遺伝子発現プロフィールについては現在までごく限られた研究が
行われたにすぎない。癌の領域では、腫瘍のＣＧ分析のためにイヌ類の遺伝子マイクロア
レイを用いた研究が行われている。Thomas R. et al. A canine cancer gene microarray
for CGH analysis tumors, Cyrogenet. Genome Res., 2003; 102: 254-260。他の研究が
拡張型心筋症の分野で行われた。Oyayma, M. A. et al., Genomic expression patterns 
of cardiac tissue from dogs with dilated cardiomyopathy, Am. J. Vet. Res. 2005; 
66: 1140-1155。現在のところ、骨関節炎に関するイヌ類のゲノムの研究はごく限られて
いる。１研究において、ＭＩＧ−６遺伝子が骨関節炎の高リスクグループのイヌにおいて
増加することが見いだされ、この遺伝子がイヌの軟骨分解および軟骨生成に関与する可能
性があるという仮説が立てられた。Mateescu, R.G. et al., Increased MIG-6 mRNA tran
scipts in osteoarthritic cartilage. Biochem. Biophy. Res. Commun. 2005; 332: 482
-486。
【００１８】
[0018]  本明細書に記載するように健康な動物集団を異常な筋骨格関節障害などの疾患
を伴う集団と対比した研究は、これまで広範には実施されていない。イヌ類のゲノムに関
して入手できるデータはほとんどなく、ネコ類のゲノムに関してはこれよりはるかに少な
い。本明細書に含まれる遺伝子発現データにより、イヌおよびネコの軟骨分解に関連する
遺伝子が同定される。そのような遺伝子発現データは、そのような遺伝子の発現を好まし
い様式で調節することができる栄養組成物の同定を可能にする。これは、炎症に一般に関
連する遺伝子に関しても当てはまる。ネコ類における同様なデータをさらに本明細書、図
面、および本明細書中の実施例に示す。
【００１９】
[0019]  本明細書および実施例に含まれる遺伝子発現データは、ここに記載する遺伝子
発現プロフィールに基づく多様な望ましい発明を可能にする。これらのデータにより、栄
養供給のバイオマーカーとしての遺伝子発現生成物を同定および定量し、基礎疾患である
異常な筋骨格関節障害を予防、同定および治療することができる。本発明方法の実施の結
果として誘導される遺伝子発現データにより、そのような異常な筋骨格関節障害の進行を
モニターすることもできる。これらの発明はさらに、基礎疾患および炎症を処置するため
に、本明細書に示す知見に基づいて、そのような異常な筋骨格関節障害に罹患しやすい罹
病性動物亜集団を同定し、そのような障害を予防または治療するのに最適な食事を同定し
、かつ医薬、栄養医薬および栄養（食事）介入法を同定するための、遺伝子検査を含む。
本発明は、そのような異常な筋骨格関節障害に罹病性であるかまたはそれらを伴う動物か
らの組織および血液試料を分析するための、早期疾患検出用バイオマーカー、標的療法薬
、診断試薬およびキットをも含む。
【００２０】
[0020]  動物、たとえば愛玩動物、たとえばネコおよびイヌのための食物を設計する際
には、良好な栄養供給による動物の最適な健康およびウェルネスが重要な目標である。し
かし、動物がその食物をおいしくないと知ったため、動物がその食物を食べることを拒絶
もしくは拒否し、または動物によるその食物の摂取量が限られるならば、最も栄養のある
動物用食物ですらほとんど役立たない。したがって本明細書中に述べる発明はさらに、そ
のような異常な筋骨格関節障害に罹病性であるかまたはそれらを伴う動物の健康およびウ
ェルネスを増進できる栄養組成物を含む。したがって本発明には、愛玩動物が食べられる
食物組成物であって、治療および予防効力をもち、かつ現在市販されている愛玩動物用食
品より高い嗜好性をもつ組成物が包含される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Thomas R. et al. A canine cancer gene microarray for CGH analysis tumors, Cyrogenet. Genome Res., 2003; 102: 254-260
【非特許文献２】Oyayma, M. A. et al., Genomic expression patterns of cardiac tissue from dogs with dilated cardiomyopathy, Am. J. Vet. Res. 2005; 66: 1140-1155
【非特許文献３】Mateescu, R.G. et al., Increased MIG-6 mRNA transcipts in osteoarthritic cartilage. Biochem. Biophy. Res. Commun. 2005; 332: 482-486
【発明の概要】
【００２２】
[0021]  本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくとも１種類のグリコ
サミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗酸化剤、およびカ
ルニチンまたはアセチルカルニチンを含む組成物に関する。本発明は、動物、特に愛玩動
物に投与するための栄養組成物、食事サプリメント、栄養医薬、およびおやつ（ｔｒｅａ
ｔ）を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
[0022]  本発明は、異常な筋骨格関節状態を伴う動物を処置する方法であって、その対
象に少なくとも１種類の本発明組成物を投与することを含む方法にも関する。
[0023]  本発明はさらに、異常な筋骨格関節状態を伴う動物において発症を遅延させ、
または動物の痛みを軽減する方法であって、その対象に少なくとも１種類の本発明組成物
を投与することを含む方法に関する。
【００２４】
[0024]  １態様において本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくとも
１種類のグリコサミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗酸
化剤、およびカルニチンまたはアセチルカルニチンを含む、イヌ用ペットフード組成物を
包含する。
【００２５】
[0025]  他の態様において本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくと
も１種類のグリコサミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗
酸化剤、およびカルニチンまたはアセチルカルニチンを含む、ネコ用ペットフード組成物
を包含する。
【００２６】
[0026]  他の態様は、その必要がある動物において、異常な筋骨格関節障害を本発明組
成物により治療または予防する方法を包含する。
[0027]  さらに他の態様は、その必要がある動物において、骨関節炎、リウマチ性関節
炎、および局所関節炎症からなる群から選択される異常な筋骨格関節障害を、本発明組成
物により治療または予防する方法を包含する。
【００２７】
[0028]  本発明のさらに他の態様は、その必要がある愛玩動物において、骨関節炎、リ
ウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発
明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００２８】
[0029]  本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、骨関節炎、リウマチ性
関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発明組成物
により治療または予防する方法を包含する。
【００２９】
[0030]  本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、骨関節炎、リウマチ性
関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発明組成物
により治療または予防する方法を包含する。
【００３０】
[0031]  本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、骨関節炎を本発明組成
物により治療または予防する方法を包含する。
[0032]  本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、骨関節炎を本発明組成
物により治療または予防する方法を包含する。
【００３１】
[0033]  本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、リウマチ性関節炎を本
発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0034]  本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、リウマチ性関節炎を本
発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３２】
[0035]  本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、関節の炎症を本発明組
成物により治療または予防する方法を包含する。
[0036]  本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、関節の炎症を本発明組
成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３３】
[0037]  本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性
関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常
な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する、１種類以上の遺伝子または遺
伝子セグメントを包含する。
【００３４】
[0038]  本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性
関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常
な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する、２種類以上のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの組合わせを包含する。
【００３５】
[0039]  本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性
関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常
な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する遺伝子の発現を検出するのに適
切な、２種類以上のポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブの組成物を包
含する。
【００３６】
[0040]  本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性
関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常
な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する１種類以上の遺伝子の差次発現
を検出するための、方法および組成物を包含する。
【００３７】
[0041]  本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性
関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常
な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する１種類以上の遺伝子の発現プロ
フィールに対する被験物質の作用を測定するための方法であって、被験物質がそれらの動
物においてそのような障害を調節するのに有用な可能性があるかどうかを判定するための
被験物質のスクリーニング方法としての方法を包含する。
【００３８】
[0042]  本発明の他の態様は、動物が異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウ
マチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を発症する可能性がある予後
を明確にするための方法、または動物がそのような筋骨格関節障害を伴うという診断法を
開発する際の方法を包含する。
【００３９】
[0043]  本発明のさらに他の観点は、本発明が、動物、特に愛玩動物における異常な筋
骨格関節障害、特に骨関節炎の新規バイオマーカーの同定、およびインビボでのそのよう
なバイオマーカーの特徴的な遺伝子発現パターンに基づいてそのような動物における異常
な筋骨格関節障害を検出する方法に関するということである。具体的には本発明は、身体
試料、好ましくは血液試料において、対照発現レベルと比較した少なくとも１種類のバイ
オマーカーの差次発現を検出することを含み、その際、そのようなバイオマーカーの差次
発現の検出により、異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎を伴う動物が特異的に同定され
る。したがってそのような方法は、正常な動物または対照動物からの細胞と比較して異常
な筋骨格関節障害において差次発現する少なくとも１種類のバイオマーカーの検出に依存
する。
【００４０】
[0044]  異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎
症状態に関係する種々のイヌ類バイオマーカーを調節する必要がある動物にバイオマーカ
ーの調節に有効な量の本発明組成物を投与することによりそのバイオマーカーを調節する
ことも本発明の態様である。異常な筋骨格関節障害に関係する調節可能なバイオマーカー
の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アネキシンＡｌ、カテプシン
Ｄ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢｌ、ＩＬ−ｌβ、ＴＮＦα、ＴＮ
Ｆβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭ
Ｐ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体、ＣＯＬ２Ａ１
、ＣＯＬ１Ａ２、Ｃ０Ｌ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−
２、Ｃ２Ｃ、Ｃ１，２Ｃ、ＦＬＡＰ、ＰＬＡ２、ＭＡＰＫｌ、ＭＡＰＫ２ならびにアグリ
カン。
【００４１】
[0045]  本発明のバイオマーカーは、異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ
性関節炎、または局所関節炎症状態を伴うかまたは発症する可能性のある動物に差次発現
するタンパク質および／または核酸である。
【００４２】
[0046]  本発明においてはさらに、変性性筋骨格関節疾患の身体的および形態的特徴を
検出できる伝統的な診断法と組み合わせて本発明方法を使用できるものとする。たとえば
骨関節炎の診断を裏付けるために、動物の血液試料から得た細胞における骨関節炎バイオ
マーカーに関する遺伝子の差次発現の解明を一般的な診断（たとえば放射線）技術と組み
合わせることができる。
【００４３】
[0047]  さらに他の観点において、本発明は、本発明のバイオマーカーをコードする核
酸またはそのフラグメントに特異的にハイブリダイズする１種類以上の核酸プローブを含
む組成物に関する。
【００４４】
[0048]  他の観点において、本発明は、本発明のバイオマーカーを発現する遺伝子によ
りコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む組成物に関する。
[0049]  本発明は、動物において異常な筋骨格関節障害を診断するためのキットであっ
て、本発明のバイオマーカーの発現を検出するのに使用できる構成要素（本明細書に記載
する組成物およびマイクロアレイが含まれるが、これらに限定されない）を含むキットに
も関する。
【００４５】
[0050]  他の観点において、本発明は動物において変性性筋骨格関節状態を治療または
改善するそれらの能力を試験することができる生物活性食事成分または他の天然化合物（
以下において“食事成分”または“成分”と呼ぶ）を同定するための下記を含む方法に関
するものであることも本発明に含まれるものとする：（ａ）表２および／または表３に開
示する１種類以上のバイオマーカーのＲＮＡまたはタンパク質生成物を発現することがで
きる細胞を、被験成分と接触させ；（ｂ）被験成分と接触させた細胞において産生された
該ＲＮＡおよび／または生成物の量を測定し；そして（ｃ）被験成分と接触させた細胞内
の該ＲＮＡおよび／またはタンパク質生成物の量を、被験成分と接触させなかった対応す
る対照細胞内に存在する同じＲＮＡまたはタンパク質生成物の量と比較し；その際、対照
における量と対比して該ＲＮＡまたはタンパク質生成物の量が変化した場合、その成分は
異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症状態を治
療または改善するそれらの能力について試験すべきものであると同定される。
【００４６】
[0051]  本発明の他の観点は、動物において骨関節炎を診断および／または予後判定す
るための方法であり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１つの組織試料
または体液検体を動物から採取し；動物から採取したその少なくとも１つの試料または検
体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマーカーの量を測
定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌク
レオチドまたはその代謝産物である。さらに他の態様は、そのような１種類以上のバイオ
マーカーがアネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、Ｈ
ＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８  ＭＡＰ
Ｋ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５
およびＩＬ−１７受容体からなる群から選択される、前記方法である。
【００４７】
[0052]  本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を診断および／または予後
判定するためのキット、特に動物において骨関節炎を診断および／または予後判定する方
法を実施するためのキットであり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１
つの組織試料または体液検体を動物から採取し；動物から採取したその少なくとも１つの
試料または検体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマー
カーの量を測定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮ
Ａ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物でり、場合によりさらにバイオマーカーに連結
した検出可能な作用剤を含む。
【００４８】
[0053]  本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を診断および／または予後
判定するための試薬、特に動物において骨関節炎を診断および／または予後判定する方法
を実施するための試薬であり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１つの
組織試料または体液検体を動物から採取し；動物から採取したこの少なくとも１つの試料
または検体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマーカー
の量を測定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、
ポリヌクレオチドまたはその代謝産物であり、場合によりさらにバイオマーカーに連結し
た検出可能な作用剤を含む。
【００４９】
[0054]  本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害を診断および／または予後判定す
るためのバイオマーカーとしての、特に異常な筋骨格関節障害を診断および／または予後
判定するキットの作製のための、表２および／または表３に同定した１種類以上のポリペ
プチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の使用であ
る。さらに他の態様は、そのような１種類以上のバイオマーカーが、アネキシンＡ１、カ
テプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦ
α、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−
２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体からな
る群から選択されるキットである。さらに他の態様は、そのようなキットであって、試薬
および装置がオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｃ−ＤＮＡマイクロアレイ、およびフ
ォーカスト遺伝子チップ、またはその組合わせを含めたＤＮＡマイクロアレイ分析材料を
含むものである。
【００５０】
[0055]  本発明の他の態様は、動物において骨関節炎を検出する方法であり、この方法
は、その動物に由来する組織試料または体液検体を含む試料を用意し；試料または検体に
おける表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク
質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物のレベルを検出し；そして試
料または検体中のバイオマーカーのレベルを対照試料中のそれらのバイオマーカーのレベ
ルと比較することを含み；その際、バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現
と比較して少なくとも１倍以上の遺伝子発現差をもつ。
【００５１】
[0056]  本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を検出する方法であり、こ
の方法は、前記方法の試料または検体を、前記バイオマーカーに選択的にハイブリダイズ
するポリヌクレオチド配列を含む第１プライマー、および前記バイオマーカーポリヌクレ
オチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む第２プライマーと接触
させ、増幅反応を実施し、そして試料または検体中のバイオマーカーポリヌクレオチドの
増幅生成物を定量することを含む。
【００５２】
[0057]  本発明の他の態様は、骨関節炎に罹患している動物に対する処置または栄養管
理の経過の有効性を評価する方法であり、この方法は、（ａ）その動物に由来する組織試
料または体液検体における表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリ
ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の第１レ
ベルを、処置経過期間中の第１時点で測定し；（ｂ）その動物に由来する試料または検体
における該バイオマーカーの第２レベルを、処置経過期間中の第２時点で測定し；そして
（ｃ）第１時点および第２時点における該バイオマーカーの測定値を比較することを含み
；その際、該バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも
１倍以上の遺伝子発現差をもつ。
【００５３】
[0058]  本発明の他の態様は、骨関節炎に罹患している動物に対する処置または栄養管
理の経過の進行を評価する方法であり、この方法は、（ａ）その動物に由来する組織試料
または体液検体における表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペ
プチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の第１レベ
ルを、処置経過期間中の第１時点で測定し；（ｂ）その動物に由来する試料または検体に
おける該バイオマーカーの第２レベルを、処置経期間中の第２時点で測定し；そして（ｃ
）第１および第２時点における該バイオマーカーの測定値を比較することを含み；その際
、該バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上
の遺伝子発現差をもつ。
【００５４】
[0059]  本発明の他の態様は、動物において骨関節炎を診断するための分子を同定する
方法であり、この方法は、（１）その動物に由来する組織試料または体液検体であって、
表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、Ｒ
ＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物を含む試料を用意し；（２）試料ま
たは検体を被験分子と接触させ；（３）被験分子が該バイオマーカーに結合するかまたは
それにより結合されるかを判定することを含み；その際、バイオマーカーの発現が対照動
物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の発現差をもつ。
【００５５】
[0060]  本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎をスクリーニングするため
の、下記の段階を含む方法である：ｉ）組織試料または体液検体を動物から採取し、試料
における１種類以上のバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ
、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の遺伝子発現プロフィールを決定し；そしてｉｉ
）試料における１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィールを、骨関節炎の症
状を示す動物に由来する複数の基準試料における平均的な遺伝子発現レベルの１種類以上
のバイオマーカーを含む陽性対照と比較して、試料と陽性対照の間の差次遺伝子発現を判
定し、その際、試料と陽性対照において１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフ
ィール間に統計的に有意の差次遺伝子発現がない場合には骨関節炎の存在が指摘される；
その際、バイオマーカーは表２および／または表３の１種類以上の遺伝子を含む。
【００５６】
[0061]  本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎をスクリーニングするため
の、下記の段階を含む方法である：ｉ）組織試料または体液検体を動物から採取し、試料
における１種類以上のバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ
、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の遺伝子発現プロフィールを決定し；そしてｉｉ
）試料における１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィールを、骨関節炎の症
状を示さない対照動物に由来する複数の基準試料における平均的な遺伝子発現レベルの１
種類以上のバイオマーカーを含む陽性対照と比較して、試料と対照動物の基準試料との間
の差次遺伝子発現を判定し、その際、試料と陽性対照において１種類以上のバイオマーカ
ーの遺伝子発現プロフィール間に１倍の差次遺伝子発現がある場合には骨関節炎の存在が
指摘される；その際、バイオマーカーは表２および／または表３の１種類以上の遺伝子を
含む。
【００５７】
[0062]  本発明の他の態様は、ある作用剤が骨関節炎の１以上の症状を治療または予防
する能力をスクリーニングするための、下記の段階を含むアッセイ法である：ｉ）骨関節
炎に典型的な差次遺伝子発現プロフィールを示す動物に由来する組織試料から核酸対照試
料を単離し、この対照試料における遺伝子発現レベルを測定し；ｉｉ）この組織試料を作
用剤に付与し；ｉｉｉ）組織試料を作用剤に付与した後の段階ｉｉ）の組織試料から核酸
試験試料を単離し、この試験試料における遺伝子発現レベルを測定し；ｉｖ）対照試料と
試験試料の間で遺伝子発現の生成、安定性、分解および／または活性化を比較して、試験
試料と対照試料の間の差次遺伝子発現プロフィールを求め；その際、対照試料と比較した
試験試料の差次遺伝子発現プロフィールは、その作用剤が骨関節炎の１以上の症状を治療
または予防する能力の指標となる。
【００５８】
[0063]  本発明のさらに他の態様は、インフォーマティブアレイ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｖｅ  ａｒｒａｙ）に使用するために組織試料間で差次発現する複数の遺伝子を同定する
ための、下記を含む方法である：第１組織試料に由来する第１セットの不均一核酸プロー
ブを用意し；第２組織試料に由来する第２セットの不均一核酸プローブを用意し；ある生
物学的プロセスの遺伝子に由来する複数の配列を含む核酸アレイを第１セットのプローブ
とハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第１発現レベルを測定し；該アレイを
第２セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第２発現レベル
を測定し；ハイブリダイズした配列について第１発現レベルを第２発現レベルと比較する
ことにより、前記の生物学的プロセスにおいて差次発現する複数の遺伝子を同定し；そし
て同定した遺伝子のランキングを、下記からなる段階群から選択される段階により確立す
る：第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の絶対値を判定し、より高い差をもつ遺伝
子をより低い差をもつ遺伝子より高くランキングし；そして第１発現レベルと第２発現レ
ベルの間の差の標準偏差を決定し、より高い標準偏差をもつ遺伝子をより低い標準偏差を
もつ遺伝子より高くランキングする；その際、遺伝子は表２および／または表３の１種類
以上の遺伝子を含む。
【００５９】
[0064]  本発明の他の態様は、核酸アレイをインフォーマティブアレイに変換するため
の、下記を含む方法である：第１組織試料に由来する第１セットの不均一核酸プローブを
用意し；第２組織試料に由来する異なる第２セットの不均一核酸プローブを用意し；複数
の配列を含む核酸アレイを第１セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配
列について第１発現レベルを測定し；このアレイを第２セットのプローブとハイブリダイ
ズさせ、そのアレイの配列について第２発現レベルを測定し；同定した遺伝子に関する第
１発現レベルと第２発現レベルの差に基づいて、下記からなる段階群から選択される段階
により、前記の生物学的プロセスにおいて差次発現する複数の遺伝子を同定し：第１発現
レベルと第２発現レベルの間の差の絶対値を判定し、より高い差をもつ遺伝子をより低い
差をもつ遺伝子より高くランキングし；そして第１発現レベルと第２発現レベルの間の差
の標準偏差を決定し、より高い標準偏差をもつ遺伝子をより低い標準偏差をもつ遺伝子よ
り高くランキングする；そして同定した複数の差次発現遺伝子からインフォーマティブア
レイに収容する遺伝子を選択する；その際、遺伝子は表２および／または表３に挙げた遺
伝子から選択される。
【００６０】
[0065]  本発明のさらに他の態様は、骨関節炎をスクリーニングするために遺伝子発現
を分析するための、下記の段階を含むコンピューター処理方法である：ｉ）組織試料のオ
リゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、ｃ−ＤＮＡマイクロアレイ分析およびフォーカス
ト遺伝子チップ分析、またはその組合わせからなる群から選択される核酸マイクロアレイ
分析から得られる複数の遺伝子発現信号の測定値を含むデータを、コンピューターベース
の分析に適切な形態にコンパイルし；そしてｉｉ）コンパイルしたデータを分析し、その
際、分析は多数のアップレギュレートされたバイオマーカー遺伝子およびダウンレギュレ
ートされたバイオマーカー遺伝子から遺伝子ネットワークを同定することを含み、その際
、バイオマーカー遺伝子は骨関節炎の存在または重症度に関連すると同定された遺伝子で
あり、それらの遺伝子は表２および／または表３に挙げた遺伝子を含む。
【００６１】
[0066]  本発明の他の態様は、薬物候補をインビトロでスクリーニングする方法であり
、この方法は、選択した遺伝子の発現または選択した遺伝子発現生成物の活性をその候補
が調節する能力を測定することを含み、その際、選択した遺伝子または遺伝子発現生成物
は、表２および／または表３に挙げた遺伝子または遺伝子生成物からなる群から選択され
る骨関節炎のバイオマーカーまたは遺伝子発現生成物である。
【００６２】
[0067]  本発明の他の態様は、栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつを
インビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、選択した遺伝子の発現または
選択した遺伝子発現生成物の活性をその候補が調節する能力を測定することを含み、その
際、選択した遺伝子または遺伝子発現生成物は、表２および／または表３に挙げた遺伝子
または遺伝子生成物からなる群から選択される骨関節炎のバイオマーカーまたは遺伝子発
現生成物である。
【００６３】
[0068]  本発明の他の態様は、薬物候補をインビトロでスクリーニングする方法であり
、この方法は、ａ）少なくとも２つの生物試料を採集し；その際、第１試料は骨関節炎を
模倣し、第２試料は健康な状態を模倣し；ｂ）少なくとも１つの試料または試料混合物を
１種類以上の被験薬物候補と接触させ；ｃ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物におい
て、表２および／または表３に挙げた遺伝子の遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベ
ルまたは活性を測定し；そしてｄ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において測定し
た遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を調節することができる薬物候
補を選択し、そのレベルを薬物候補と混合していない試料と比較する。
【００６４】
[0069]  本発明の他の態様は、栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつを
インビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、ａ）少なくとも２つの生物試
料を採集し；その際、第１試料は骨関節炎を模倣し、第２試料は健康な状態を模倣し；ｂ
）少なくとも１つの試料または試料混合物を１種類以上の被験栄養食物、食事サプリメン
ト、栄養医薬またはおやつと接触させ；ｃ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物におい
て、表２および／または表３に挙げた遺伝子の遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベ
ルまたは活性を測定し；そしてｄ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において測定し
た遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を調節することができる栄養食
物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつを選択し、そのレベルを栄養食物、食事サ
プリメント、栄養医薬またはおやつと混合していない試料と比較する。
【００６５】
[0070]  本発明の他の態様は、骨関節炎に対する動物の感受性をインビトロで判定する
方法であり、この方法は、表２および／または表３に挙げた遺伝子および遺伝子生成物か
らなる群から選択されるバイオマーカーの遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルま
たは活性を比較することを含む。
【００６６】
[0071]  本発明の他の態様は、骨関節炎を処置するための組成物を調製する方法であり
、この方法は、表２および／または表３に挙げた遺伝子および遺伝子生成物からなる群か
ら選択される骨関節炎バイオマーカーの調節剤を含む組成物を調製することを含む。
【００６７】
[0072]  本発明の他の態様は、骨関節炎に対する処置の有効性を判定するための、下記
の段階を含む方法である：（ａ）骨関節炎に罹患しておりかつその処置を受けていた動物
に由来する生物試料を用意し、（ｂ）その試料における骨関節炎に関する１種類以上のバ
イオマーカーのレベルを測定して、その動物に関する発現プロフィールを作製し、そして
（ｃ）その発現プロフィールを下記のものと比較する：ｉ）その被験動物から処置開始前
に得た比較可能な発現プロフィール、および／またはｉｉ）その被験動物から処置のより
早い時期に得た比較可能な発現プロフィール、および／またはｉｉｉ）骨関節炎に罹患し
ていない対象に特徴的な比較可能な発現プロフィール；その際、骨関節炎に関する１種類
以上のバイオマーカーは表２および／または表３に示す１種類以上の遺伝子の発現生成物
を含む。
【００６８】
[0073]  本発明の他の態様は、骨関節炎の１以上の症状を治療または予防する能力につ
いて動物用食物組成物を選択するための、下記の段階を含む方法である：ｉ）骨関節炎を
伴う動物に由来する組織試料または生物体液検体の遺伝子発現プロフィールに関する第１
データセットを含む少なくとも１つのデータベースにアクセスし；ｉｉ）生物活性食事成
分が前記の遺伝子発現プロフィールに及ぼす影響に関する第２データセットを含む少なく
とも１つのデータベースにアクセスし；そしてｉｉｉ）第１および第２データセットを用
いる第１アルゴリズムの使用により第１データセットおよび第２データセットを処理して
、その動物のための食物組成物を選択および調製するのに有用な栄養処方を導き出し；そ
してｉｖ）その栄養処方をユーザー可読フォーマットに保存または使用する。
【００６９】
[0074]  本発明のさらに他の目的、特徴および利点は当業者に容易に認識されるであろ
う。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】[0075]  図１は、イヌ用組成物ｊ／ｄとして同定された少なくとも１種類の本発明組成物を与えた後のイヌにおける軟骨分解に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現低下を示す。
【図２】[0076]  図２は、イヌ用組成物ｊ／ｄとして同定された少なくとも１種類の本発明組成物を与えた後のイヌにおける軟骨分解に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現低下を示す。
【図３】[0077]  図３は、関節炎ではないネコと比較した関節炎のネコの炎症に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現増大を示す。
【図４】[0078]  図４は、組成物ｊ／ｄとして同定された本発明組成物の１態様を示す。
【図５】[0079]  図５は、正常なイヌと比較した関節炎のイヌにおける遺伝子Ｃ２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図６】[0080]  図６は、関節炎ではない（非関節炎）イヌと比較した関節炎のイヌにおける遺伝子Ｃ１，２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図７】[0081]  図７は、イヌにおける関節炎ではない軟骨と対比して関節炎の軟骨に関連するタンパク質を発現する特定の遺伝子を示す。
【図８】[0082]  図８は、イヌにおける関節炎ではない軟骨と対比して関節炎の軟骨に関連するタンパク質を発現する特定の遺伝子を示す。
【図９】[0083]  図９は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄをそれぞれ１４および１８日間イヌに与えた後のＥＰＡおよびＤＨＡの血清レベルを示す。
【図１０】[0084]  図１０は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子Ｃ２Ｃの発現調節を示す。
【図１１】[0085]  図１１は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子Ｃ１，２Ｃの発現調節を示す。
【図１２】[0086]  図１２は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子ＣＸＴ−ＩＩの発現調節を示す。
【図１３】[0087]  図１３は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける遺伝子Ｃ２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図１４】[0088]  図１４は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける遺伝子ＣＸＴ−ＩＩのアップレギュレーションを示す。
【図１５】[0089]  図１５は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける軟骨修復に関連する種々の遺伝子のアップレギュレーションを示す。
【図１６】[0090]  図１６は、ネコ用組成物ｊ／ｄを与えた後のネコの運動性の増大を示す。
【図１７】[0091]  図１７は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを与えたイヌの慰安の改善の指標となる、イヌの夜間活動度低下を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
[0092]  本発明は動物における異常な状態を処置する組成物および方法に関連し、その
際、異常な状態は動物の筋骨格関節に影響を及ぼす。本発明組成物は経口投与用として配
合することができ、これには動物用飼料が含まれるが、これらに限定されない。動物用飼
料は、その組成物をそのために配合したいずれかのタイプの動物に与えることができる。
たとえば、飼料は愛玩動物用に配合することができ、これにはイヌまたはネコが含まれる
が、これらに限定されない。
【００７２】
[0093]  本明細書中で用いる異常な動物は、動物の筋骨格関節に影響を及ぼす状態に罹
患していると診断された、もしくは罹患していると思われる動物、または本発明に含まれ
る遺伝子発現データからそのような状態に対する素因が示唆される動物である。たとえば
、骨関節炎に罹患していると診断された、もしくは罹患していると思われるイヌまたはネ
コは、異常な動物とみなされる。
【００７３】
[0094]  本発明組成物は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸を含む。オメガ−３脂
肪酸は当技術分野で周知である。オメガ−３脂肪酸は動物の健康に必須の栄養素であり、
動物はそのような脂肪酸を形成できないか、または十分な量では形成できない。そのよう
な脂肪酸は、本発明により教示される組成物および方法において食事成分（単数または複
数）として用いられる。本発明に含まれる栄養組成物の配合は、一部はそのような栄養組
成物が本明細書に記載するタイプの筋骨格関節障害に罹患している動物の遺伝子発現に及
ぼす影響に基づく。オメガ−３脂肪酸の例には、アルファ−リノール酸（ＡＬＡ）、ドコ
サヘキサン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が含まれるが、これらに
限定されない。本発明の１態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡのうち１
種類を含む。他の態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡのうち少なくとも
２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡ
の３種類すべてを含む。
【００７４】
[0095]  本発明組成物は、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）をも含
む。ＧＡＧは当技術分野で周知であり、反復二糖単位から構成される枝分かれしていない
多糖類であるとみなされる。多糖類が枝分かれしておらずかつ反復二糖単位から構成され
る限り、その分子またはポリマーはＧＡＧとみなされる。ＧＡＧの例には、コンドロイチ
ン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヒアルロナンが
含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はコンドロイチン
硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのう
ち少なくとも１種類を含む。本発明の他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのうち少な
くとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのうち少な
くとも３種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、
デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸および／またはヒアルロナンの
うち少なくとも４、５種類またはすべてを含む。
【００７５】
[0096]  本発明組成物は、少なくとも１種類のアミノ糖をも含む。アミノ糖は当技術分
野で十分に理解されており、簡単には、糖部分にヒドロキシル基のほかにアミン基が置換
または存在するものを意味する。アミノ糖の例には、ガラクトサミン、グルコサミン、シ
アル酸およびＮ−アセチルグルコサミンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の
１態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチル
グルコサミンのうち少なくとも１種類を含む。本発明の他の態様において、組成物はガラ
クトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンのうち少なくとも
２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミ
ン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンのうち少なくとも３種類を含む。本発明の
さらに他の態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−
アセチルグルコサミンの４種類すべてを含む。
【００７６】
[0097]  本発明組成物は、少なくとも１種類の抗酸化剤をも含む。抗酸化剤は当技術分
野で周知である。抗酸化剤の例には、ビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および
／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニン、カルニチンおよび
ベータ−カロテンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成
物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、
グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも１種類を含
む。本発明の他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類お
よび／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−
カロテンのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はビ
タミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタ
チオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも３種類を含む。本
発明のさらに他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類お
よび／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−
カロテンのうち少なくとも４種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はビ
タミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタ
チオン、リポ酸、メラトニンおよび／またはベータ−カロテンのうち少なくとも５種類ま
たはそれ以上を含む。
【００７７】
[0098]  本発明組成物はカルニチンまたはアセチルカルニチンをも含み、これらは抗酸
化作用をもつ第四級アンモニウム化合物である。
[0099]  特定の態様において、本発明組成物はさらに少なくとも１種類の食物無機質お
よび／または少なくとも１種類の天然アミノ酸を含む。食物無機質および天然アミノ酸の
例は周知である。食物無機質の例には、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリ
ウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケ
ル、セレン、硫黄、亜鉛およびバナジウムが含まれるが、これらに限定されない。１態様
において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、
コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、
亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも１種類を含む。他の態様において、組成物はカル
シウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、
ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムの
うち少なくとも２種類を含む。さらに他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、
マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マン
ガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも３
種類を含む。さらに他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リ
ン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン
、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも４種類を含む。さら
に他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナ
トリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレ
ン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも５種類またはそれ以上を含む。
【００７８】
[00100]  天然アミノ酸は当技術分野で周知であり、タンパク質中にみられるアミノ酸
である。特定の１態様において、組成物は必須アミノ酸を含み、その際、必須アミノ酸と
いう用語は対象の種に関係する。たとえば、イヌおよびネコにとっての必須アミノ酸には
、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、イソロイシン、トレオニン
、ロイシン、トリプトファン、リジンおよびバリンが含まれる。タウリンもネコにおいて
は必須アミノ酸であるとみなすことができる。
【００７９】
[00101]  １態様において、イヌ用食物組成物ｊ／ｄは、一般に図４に示す組成をもち
、コンドロイチン硫酸の形のグリコサミノグリカン、および塩酸グルコサミンの形のアミ
ノ糖、ならびにカルニチンおよび少なくとも１種類の抗酸化剤を含有する。この組成物は
追加の栄養素源、たとえば下記のものをも含有することができる：粉砕全粒トウモロコシ
、チキン副産物ミール、亜麻仁、大豆ミルラン（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｍｉｌｌ  Ｒｕｎ）、
醸造米（Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｒｉｃｅ）、大豆ミール、豚脂（トコフェロールとクエン酸の
混合物で保存）、チキンレバーフレーバー、粉末セルロース、魚油、塩化カリウム、Ｌ−
リジン、炭酸カルシウム、コリン塩化物、ヨード添加食塩、ＤＬ−メチオニン、ビタミン
Ｅサプリメント、ビタミン類（Ｌ−アスコルビル−２−ポリホスフェート（ビタミンＣ源
）、ビタミンＥサプリメント、ナイアシン、一硝酸チアミン、ビタミンＡサプリメント、
パントテン酸カルシウム、ビオチン、ビタミンＢ１２サプリメント、塩酸ピリドキシン、
リボフラビン、葉酸、ビタミンＤ３サプリメント）、Ｌ−トレオニン、タウリン、大豆レ
シチン、塩酸グルコサミン、無機質（硫酸鉄（ＩＩ）、酸化亜鉛、硫酸銅、酸化マンガン
、ヨウ素酸カルシウム、亜セレン酸ナトリウム）、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−カルニチン
（トコフェロールとクエン酸の混合物で保存）、コンドロイチン硫酸、ベータ−カロテン
、ローズマリーエキス。
【００８０】
[00102]  実施例中で用いた本発明のネコ用ｊ／ｋ食物組成物は、オメガ−３脂肪酸、
オメガ−６脂肪酸を含有し、アルファ−リノレン酸をも含有していた。この組成物は、コ
ンドロイチン硫酸の形のグリコサミノグリカン、および塩酸グルコサミンの形のアミノ糖
を含有していた。さらにこの組成物は、カルニチン、および少なくとも１種類の抗酸化剤
、たとえばビタミンＣおよびベータ−カロテンを含有していた。
【００８１】
[00103]  用語“動物”は、ヒトまたはヒト以外の動物を意味し、鳥類、ウシ類、イヌ
類、ウマ類、ネコ類、ヤギ類、ネズミ類、ヒツジ類、霊長類、およびブタ類などの動物を
含む。
【００８２】
[00104]  用語“抗体”は、特異的抗原に結合するいずれかの免疫グロブリンを意味し
、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む。この用語には、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、ポ
リエピトープ特異性をもつ抗体組成物、キメラ抗体、二重特異性抗体、ジアボディー（ｄ
ｉａｂｏｄｉｙ）、一本鎖抗体、および抗体フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、
Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ、または他の抗原結合性フラグメントが含まれる。
【００８３】
[00105]  用語“アレイ”は、支持体上における少なくとも２つのプローブの秩序配置
を意味する。プローブのうち少なくとも１つは対照または基準品であり、プローブのうち
少なくとも１つは診断用プローブである。支持体上における約２から約４０，０００まで
のプローブの配置によって、プローブと試料のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間
に形成された標識複合体それぞれのサイズおよび信号強度を確実に個々に識別できる。
【００８４】
[00106]  用語“差次発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）”ま
たは“差次発現した（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）”は、増大
または無調節な遺伝子発現を意味し、あるいは低下またはダウンレギュレートされた遺伝
子発現を意味し、試料中の転写されたメッセンジャーＲＮＡまたは翻訳されたタンパク質
の存在、不存在、または少なくとも２倍、または少なくとも１．５、１．４、１．３、１
．２、１．１もしくは１倍の量の変化により検出される。
【００８５】
[00107]  差次遺伝子発現の尺度として用いる用語“倍”は、ある動物における遺伝子
発現量が、比較動物における遺伝子発現量と比較して倍量または部分量の遺伝子発現であ
ることを意味する；たとえば、関節炎の動物を関節炎ではない動物と比較。たとえば、そ
の動物において比較動物より３倍の量で発現する遺伝子は３倍の差次遺伝子発現をもち、
その動物において比較動物より１／３の量で発現する遺伝子も３倍の差次遺伝子発現をも
つ。
【００８６】
[00108]  用語“フラグメント”は下記のものを意味する：（１）完全配列の一部であ
って特定の用途について完全ポリヌクレオチド配列と同一もしくは類似の活性をもつ、オ
リゴヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド配列、または（２）完全配列の一部であ
って特定の用途について完全ポリペプチド配列と同一もしくは類似の活性をもつ、ペプチ
ドもしくはポリペプチド配列。そのようなフラグメントは、特定の用途に適切であると思
われる任意数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる。一般にオリゴヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチドのフラグメントは完全配列に由来する少なくとも約１０、５
０、１００または１０００個のヌクレオチドを含み、ポリペプチドフラグメントは少なく
とも約４、１０、２０または５０個の連続アミノ酸を含む。この用語には、これらのフラ
グメントのポリヌクレオチドバリアントおよびポリペプチドバリアントが含まれる。
【００８７】
[00109]  用語“遺伝子（単数）”または“遺伝子（複数）”は、ポリペプチドの産生
に関係するＤＮＡの完全または部分セグメントを意味し、コード領域の前および後の領域
（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在
配列（イントロン）を含む。この用語には、遺伝子コード配列の相補体にハイブリダイズ
するいずれかのＤＮＡ配列が含まれる。
【００８８】
[00110]  用語“ホモログ”は、下記のものを意味する：（１）ポリヌクレオチド：同
一もしくは異なる動物種に由来するポリヌクレオチドであって、あるポリヌクレオチドに
対して３０％、５０％、７０％もしくは９０％を超える配列類似性をもち、かつ完全ポリ
ヌクレオチドと同一もしくは実質的に同一の特性をもち、同一もしくは実質的に同一の機
能を行なうもの、またはあるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で特異的にハ
イブリダイズする能力をもつものが含まれる、あるいは（２）ポリペプチド：同一もしく
は異なる動物種に由来するポリペプチドであって、ポリヌクレオチドの発現により同定さ
れるあるポリペプチドに対して３０％、５０％、７０％もしくは９０％を超える配列類似
性をもち、かつ完全ポリペプチドと同一もしくは実質的に同一の特性をもち、同一もしく
は実質的に同一の機能を行なうもの、またはポリヌクレオチドの発現により同定されるあ
るポリペプチドに特異的に結合する能力をもつものが含まれる。２つのポリペプチド配列
または２つのポリヌクレオチド配列の配列同一性は、当業者に既知の方法、たとえばKarl
in and Altschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990))を
用いて決定される。そのアルゴリズムを、Altschul et al. (J. MoI. Biol. 215:403-410
(1990))のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。比較の目的でギャッ
プ付きアラインメントを得るために、Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-340
2 (1997))に記載のＧａｐｐｅｄ  Ｂｌａｓｔを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐ
ｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよ
びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いる。参照：http://ww.ncbi.nlm.nih.g
ov。
【００８９】
[00111]  用語“ハイブリダイゼーション複合体”は、１つのポリヌクレオチドのプリ
ン類が相補的ポリヌクレオチドのピリミジン類と水素結合した際に試料ポリヌクレオチド
間に形成される複合体を意味する；たとえば、５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’は３’−Ｔ−
Ｃ−Ａ−Ｇ−５’と塩基対合する。相補性の程度およびヌクレオチド類似体の使用がハイ
ブリダイゼーション反応の効率およびストリンジェンシーに影響を及ぼす。
【００９０】
[00112]  用語“併せて（ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）”は、薬物、食物または他
の物質を、（１）組成物、特に食物組成物中で一緒に、または（２）個別に、同一もしく
は異なる頻度で、同一もしくは異なる投与経路を用いて、ほぼ同時もしくは周期的に、投
与することを意味する。“周期的に”は、物質を特定の物質に許容できる投与計画で投与
することを意味する。“ほぼ同時に”は、一般に物質（食物または薬物）を同時に、また
は互いに約７２時間以内に投与することを意味する。“併せて”は、具体的には薬物など
の物質を処方期間投与し、本発明組成物を不定に投与する投与計画を含む。
【００９１】
[00113]  用語“ポリヌクレオチド”または“オリゴヌクレオチド”は、ヌクレオチド
のポリマーを意味する。この用語には、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤ
ＮＡおよびｍＲＮＡを含む）分子、ならびに一本鎖の場合にはそれの線状または環状の相
補配列が含まれる。この用語には、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同
一または実質的に同一の機能を行なうフラグメント、バリアント、ホモログ、および対立
遺伝子（その配列に応じて）も含まれる。これらの配列は、アラインさせた際に完全相補
的（不適正塩基対合がない）であってもよく、あるいは約３０％までの配列不適正塩基対
合をもつこともできる。好ましくは、ポリヌクレオチドに関して、その鎖は約５０から１
０，０００個までのヌクレオチド、より好ましくは約１５０から３，５００個までのヌク
レオチドを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドに関して、その鎖は約２から１００個
までのヌクレオチド、より好ましくは約６から３０個までのヌクレオチドを含む。ポリヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、多様な要因、ならびにポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドの個々の用途および使用に依存するであろう。この用
語には、合成されたヌクレオチドポリマー、ならびに天然源から単離および精製されたも
のが含まれる。用語“ポリヌクレオチド”には“オリゴヌクレオチド”が含まれる。
【００９２】
[00114]  用語“ポリペプチド”、“ペプチド”または“タンパク質”は、アミノ酸の
ポリマーを意味する。この用語には、天然ポリマー、および天然に存在しない（合成）ポ
リマー、および１個以上のアミノ酸が人為的な化学模倣体で置換されたポリマーが含まれ
る。この用語には、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的
に同一の機能を行なうフラグメント、バリアントおよびホモログも含まれる。この用語に
は、任意長さのポリマー、好ましくは約２から１０００個までのアミノ酸、より好ましく
は約５から５００個までのアミノ酸を含むポリマーが含まれる。。この用語には、合成さ
れたアミノ酸ポリマー、ならびに天然源から単離および精製されたものが含まれる。
【００９３】
[00115]  用語“プローブ”は下記のものを意味する：（１）ＲＮＡまたはＤＮＡのい
ずれかのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり、精製された制限酵素消化物
中などに天然に存在するもの、または合成により製造されるものであって、そのプローブ
に相補的な配列をもつポリヌクレオチドへのアニーリングまたは特異的ハイブリダイゼー
ションが可能なもの、あるいは（２）実質的に他のタンパク質またはタンパク質フラグメ
ントを排除して特定のタンパク質またはタンパク質フラグメントを特異的に結合すること
ができるペプチドまたはポリペプチド。オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオ
チドプローブは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。プローブの厳密な長さは
、温度、供給源および用途を含めた多数の要因に依存するであろう。たとえば診断用途に
ついては、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは一般に約１０〜１
００、１５〜５０、または１５〜２５個のヌクレオチドを含む。特定の診断用途において
は、ポリヌクレオチドプローブは約１０〜１０００、３００〜６００個のヌクレオチド、
好ましくは３００個のヌクレオチドを含む。本発明におけるプローブは、特定の標的配列
の種々の鎖に“実質的に”相補的になるように選択される。これは、一組の予め定めた条
件下でプローブがそれらの各標的配列と特異的にハイブリダイズまたはアニールするのに
十分なほど相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は標的
の厳密な相補配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的なヌクレオチドフラグメン
トをプローブの５’または３’末端に結合させ、残りのプローブ配列が標的配列に相補的
であってもよい。あるいは、プローブ配列が標的ポリヌクレオチドに特異的にアニールす
るのに十分なほど標的ポリヌクレオチドの配列との相補性をもつ限り、非相補的な塩基類
または比較的長い配列をプローブに挿入することができる。ペプチドプローブまたはポリ
ペプチドプローブは、それにタンパク質またはペプチドが特異的に結合するいかなる分子
であってもよく、これにはＤＮＡ（ＤＮＡ結合タンパク質について）、抗体、細胞膜受容
体、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、細胞小器官および細胞
小器官膜が含まれる。
【００９４】
[00116]  用語“試料”は、たとえばポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、代謝産
物などを含有するいずれかの動物組織または体液を意味し、これにはＤＮＡおよびＲＮＡ
を含有する細胞および他の組織が含まれる。例には、血液、軟骨、結合組織、上皮、リン
パ球、筋肉、神経、喀痰などが含まれる。試料は固体または液体であってもよく、ＤＮＡ
、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、体液、たとえば血液または尿、細胞、細胞調製物、またはその可溶
性画分もしくは培地の一部、染色体、細胞小器官などであってもよい。
【００９５】
[00117]  用語“単一パッケージ”は、キットの構成要素が１以上の容器内で、または
１以上の容器によって物理的に関連づけられており、製造、流通、販売または使用のため
のユニットとみなされることを意味する。容器にはバッグ、ボックス、ボトル、収縮ラッ
プパッケージ、ステープラー止めその他の様式で固定した構成要素、またはその組合わせ
が含まれるが、これらに限定されない。単一パッケージは、製造、流通、販売または使用
のためのユニットとみなされる状態で物理的に関連づけられた個別の食物組成物の容器で
あってもよい。
【００９６】
[00118]  用語“有用なバリエーション”は下記のことを意味する：（１）ポリヌクレ
オチドについては、そのポリヌクレオチドの相補体；そのポリヌクレオチドおよびそれの
相補体のホモログ；そのポリヌクレオチド、それの相補体およびそれのホモログのバリア
ント；ならびにそのポリヌクレオチド、それの相補体、それのホモログおよびそれのバリ
アントのフラグメント；ならびに（２）ポリペプチドについては、そのポリペプチドのホ
モログ；そのポリペプチドおよびそれのホモログのバリアント；ならびにそのポリペプチ
ド、それのホモログおよびそれのバリアントのフラグメント。
【００９７】
[00119]  用語“仮想パッケージ”は、キットの構成要素が、ユーザーに他の構成要素
の入手方法を指令する１以上の物理的または仮想的なキット構成要素上の指示によって関
連づけられていることを意味する；たとえばバッグ内に、１つの構成要素、およびキット
の使用方法に関する指示を入手するためにウェブサイトを訪れる、記録されたメッセージ
とコンタクトをとる、ビジュアルメッセージを見る、または介護者もしくはインストラク
ターとコンタクトをとるようにユーザーに指令する指示を収容したもの。
【００９８】
[00120]  用語“基準品”は下記のものを意味する：（１）対照試料であって、たとえ
ば関節炎の動物を試験する場合には正常な動物に由来する組織を含むもの、または正常な
動物を試験する場合にはたとえば関節炎の動物に由来する組織を含むもの、あるいは（２
）対照試料であって、その用途の状況に応じて、被験物質が差次遺伝子発現を引き起こす
かどうかを判定するためには、対応する正常動物またはたとえば関節炎の動物において試
験すべき被験物質に曝露されていない正常動物またはたとえば関節炎の動物に由来する組
織を含むもの。
【００９９】
[00121]  用語“ストリンジェントな条件”は下記のものを意味する：（１）０．１％
ウシ血清アルブミンを有する５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、０．１％  Ｆｉｃ
ｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、７５０ｍＭ  ＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、７５ｍＭクエン酸ナトリウム中、４２℃でのハイブリダイ
ゼーション、（２）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０７
５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリ
ン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／
ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸中、４２℃でのハイブリダイ
ゼーション；ならびに４２℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中での洗浄、ま
たは０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％  Ｎａ２Ｓ
Ｏ４中、５０℃での洗浄、あるいは同様な低いイオン強度および高温の洗浄剤および同様
な変性剤を用いる同様な操作。
【０１００】
[00122]  用語“物質”は、元素、化合物、分子、もしくはその混合物、または動物に
おいて異常な関節状態の発症もしくは重症度を診断、予後判定もしくは調節するのに有用
な可能性がある他のいずれかの物質を意味し、これにはいずれかの薬物、化学物質または
生物学的物質が含まれる。
【０１０１】
[00123]  用語“ｓｉＲＮＡ”は、そのｓｉＲＮＡが遺伝子と同一細胞内で発現した場
合にその遺伝子の発現を低下させまたは阻害する二本鎖ＲＮＡを形成するポリヌクレオチ
ドを意味する。この用語には、相補鎖により形成された二本鎖ＲＮＡが含まれる。ハイブ
リダイズして二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡ相補部分は、一般に実質的または完全な同
一性をもつ。一般にｓｉＲＮＡは少なくとも約１５〜５０個のヌクレオチドを含み、二本
鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜５０の塩基対、好ましくは約２０〜３０個のヌクレオチドおよび
塩基対を含む。
【０１０２】
[00124]  用語“特異的に結合する”は、２分子間の特別かつ厳密な相互作用を意味し
、これはそれらの構造、特にそれらの分子側鎖基に依存する。たとえば、ＤＮＡ分子の主
溝内への調節タンパク質のインターカレーション、２つの一本鎖核酸間の主鎖に沿った水
素結合、またはタンパク質のエピトープとアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体との間
の結合。
【０１０３】
[00125]  用語“特異的にハイブリダイズする”は、当技術分野で一般に用いられる予
め定めた条件下でそのようなハイブリダイゼーションが可能なほど十分に相補的な（時に
は“実質的に相補的な”と言う）配列の２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の会合を意味す
る。たとえば、この用語は、本発明の観点に従った、ポリヌクレオチドプローブと一本鎖
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーション
であって、そのポリヌクレオチドプローブと相補的ではない配列の一本鎖ポリヌクレオチ
ドとのハイブリダイゼーションを実質的に除外したものを表わすことができる。
【０１０４】
[00126]  用語“バリアント”は下記のものを意味する：（１）ポリヌクレオチド配列
の１個以上のヌクレオチドのいずれかの置換、変更、修飾、交換、欠失または付加を含み
、かつ元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能
を行なうポリヌクレオチド配列、および（２）ポリペプチド配列の１個以上のアミノ酸の
いずれかの置換、変更、修飾、交換、欠失または付加を含み、かつ元の配列と同一または
実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうポリペプチド配列。
したがってこの用語には、一塩基多型（ＳＮＰ）および対立遺伝子バリアントが含まれ、
またポリペプチドにおける保存的および非保存的アミノ酸置換が含まれる。この用語には
、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの化学的誘導体化、およびそれぞれ自然界には存
在しないヌクレオチドまたはアミノ酸によるヌクレオチドまたはアミノ酸の置換も含まれ
る。
【０１０５】
[00127]  本明細書に記載する特定の方法、プロトコルおよび試薬は変更できるので、
本発明はそれらに限定されない。さらに、本明細書中で用いる専門用語は特定の態様を記
述するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。本明細書およ
び付随する特許請求の範囲で用いる単数形（“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”）には、そう
でないことが状況から明らかに示されない限り複数表記が含まれる；たとえば”バリアン
ト”という表記は複数のバリアントを含む。さらに、定義した用語には、適正な文法状況
で用いられるそれらの用語の変形が含まれる；たとえば、用語“特異的に結合する”には
“特異的結合”およびその用語の他の形態が含まれる。同様に、用語“含む（ｃｏｍｐｒ
ｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”は除外ではなく包括として解釈
すべきである。
【０１０６】
[00128]  別途定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語
ならびにいずれかの頭字語は、本発明の技術分野の当業者に一般的に理解されているもの
と同じ意味をもつ。本明細書に記載したものと類似または均等な組成物、方法、製品、ま
たは他の手段もしくは材料をいずれも本発明の実施に使用できるが、好ましい組成物、方
法、製品、または他の手段もしくは材料を本明細書に記載する。
【０１０７】
[00129]  本明細書中で引用または参照したすべての特許、特許出願、刊行物および他
の参考文献を、法律が許す範囲で本明細書に援用する。それらの参考文献の考察はそれら
においてなされた主張をまとめるためのものにすぎない。それらの特許、特許出願、刊行
物もしくは他の参考文献のいずれか、またはそれらのいずれかの部分が本発明に関係する
先行技術であると認めるわけではなく、それらの特許、特許出願、刊行物もしくは他の参
考文献の正確さおよび妥当性に意義を唱える権利は明確に保持する。
【０１０８】
[00130]  １態様において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現す
る１種類以上の遺伝子または遺伝子セグメント（本明細書中で定義する“遺伝子”）を包
含する。本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するポリヌクレオチドを
見いだしたことに基づく。これらの遺伝子は、異常であると診断された動物に由来するリ
ンパ球における遺伝子の発現と、正常であると診断された動物に由来するリンパ球におけ
る遺伝子の発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）技術を用いて
比較することにより同定された。
【０１０９】
[00131]  本発明のポリヌクレオチドおよび遺伝子は、異常であると診断されたイヌ類
に由来するリンパ球からの遺伝子発現と正常であると診断されたイヌ類に由来するリンパ
球における遺伝子発現の差を測定することにより同定された。遺伝子発現の変化は、当業
者に既知であるいずれかの方法により判定できる。一般に、遺伝子発現の変化は転写の測
定（遺伝子により産生されるｍＲＮＡの量を判定する）、または翻訳の測定（遺伝子によ
り産生されるタンパク質の量を判定する）により判定される。遺伝子により産生されるＲ
ＮＡまたはタンパク質の量は、当業者に既知であるポリヌクレオチドおよびタンパク質の
定量のためのいずれかの方法を用いて判定できる。一般に、ＲＮＡ発現はポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）（限定ではないが、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）および定量リアルタ
イムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が含まれる）、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロット法、および他
のハイブリダイゼーション法により判定される。測定するＲＮＡは一般にｍＲＮＡまたは
逆転写されたｍＲＮＡの形である。タンパク質またはポリペプチドの発現は、種々の比色
アッセイおよび分光アッセイ、ならびにローリーアッセイ（ｌｏｗｒｙ  ａｓｓａｙ）、
ビウレットアッセイ、蛍光アッセイ、比濁法、ビシンコニン酸アッセイ（ｂｉｃｉｎｃｈ
ｏｎｉｎｉｃ  ａｓｓａｙ）、プロテインチップ技術、赤外線吸収、ニンヒドリン、ブラ
ッドフォードアッセイ（ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ）、および紫外線吸収などの方法
を用いて判定される。好ましい方法においては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．から購
入できるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃａｎｉｎｅ−１およびＣａｎｉｎｅ−２遺伝子チップ
、ならびにそれらのチップを用いて遺伝子発現を判定するための指示を用いて、遺伝子発
現の変化を判定する。
【０１１０】
[00132]  一般に、正常な動物と比較した異常な動物における差次遺伝子発現は、少な
くとも１種類の遺伝子の発現を測定することにより判定される。好ましくは、２種類以上
の差次発現遺伝子の発現を測定して、遺伝子発現パターンまたは遺伝子発現プロフィール
を得る。より好ましくは、複数の差次発現遺伝子の発現を測定して、より有意の遺伝子発
現パターンまたはプロフィールのための追加情報を得る。
【０１１１】
[00133]  他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現
する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスを提供する。このデバイスは、支
持体の既知の位置に固定された本発明の複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ドプローブを備えた支持体を含む。このデバイスは、本質的に、本明細書に記載したオリ
ゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブの固定化バージョンである。こ
のデバイスは、遺伝子およびポリヌクレオチドならびにそれらの発現パターンおよびプロ
フィールを迅速かつ特異的に検出するために有用である。一般に、そのようなプローブを
支持体またはそれに類する固体担体に結合させ、そして１種類以上のポリヌクレオチド（
たとえば遺伝子、ＰＣＲ生成物、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）生成物、増幅技術を用いて
合成したＤＮＡ配列、またはその混合物）を含有する試料を、試料ポリヌクレオチド（単
数または複数）がプローブにハイブリダイズできる状態でそれらのプローブに曝露する。
プローブ、試料ポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を、一般に蛍
光体、または他のタグ、たとえばストレプトアビジンで標識し、そして当業者に既知の方
法を用いて検出する。試料ポリヌクレオチド（単数または複数）を標識する場合、結合し
た蛍光の検出によりハイブリダイゼーションを検出することができる。プローブを標識す
る場合、一般に標識の消失によりハイブリダイゼーションを検出する。プローブと試料ポ
リヌクレオチド（単数または複数）の両方を標識する場合、一般に２種類の標識の接近か
ら生じる色ずれをモニターすることによりハイブリダイゼーションを検出する。特に蛍光
標識については、多様な標識方法および標識が当業者に知られている。好ましくは、当技
術分野で既知のものに匹敵するアレイ（ＤＮＡマイクロアレイ、遺伝子チップ、バイオチ
ップ、ＤＮＡチップおよび遺伝子アレイを含めた幾つかの名称で知られている）の形成に
適切な支持体上にプローブを固定化する。
【０１１２】
[00134]  ポリペプチドプローブは、一般的な方法に従って、たとえば本発明のポリヌ
クレオチドについて提示したヌクレオチド配列データおよび当技術分野で既知の方法を用
いて作製できる。そのような方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
ポリペプチドを細胞から直接単離する、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを
単離または合成し、それらのＤＮＡまたはＲＮＡを用いて組換え生成物を調製する、個々
のアミノ酸からポリペプチドを化学合成する、および既存のポリペプチドの化学的開裂に
よりポリペプチドフラグメントを調製する。
【０１１３】
[00135]  他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現
する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスを提供する。このデバイスは、支
持体の既知の位置に固定された本発明の複数のペプチドプローブまたはポリペプチドプロ
ーブを備えた支持体を含む。このデバイスは、本質的に、本明細書に記載したペプチドプ
ローブまたはポリペプチドプローブの固定化バージョンである。このデバイスは、タンパ
ク質およびそれらの発現パターンを迅速かつ特異的に検出するために有用である。一般に
、そのようなプローブを支持体に結合させ、そして１種類以上のタンパク質を含有する試
料を、試料タンパク質がプローブにハイブリダイズできる状態でそれらのプローブに曝露
する。特定の態様において、プローブ、試料タンパク質、または両方を、一般に蛍光体、
または当業者に既知の他の試薬で標識し、検出する。一般に、ポリヌクレオチドマイクロ
アレイの読取りに用いるものと同じ方法および計測器をタンパク質アレイに適用できる。
好ましくは、アレイの形成に適切な支持体上にプローブを固定化する。
【０１１４】
[00136]  試料中のタンパク質の量または濃度を測定するための方法は当業者に既知で
ある。そのような方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロ
ット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。抗体を使用する方法には、ポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体が適切である。そのような抗体は、タンパク質、タン
パク質エピトープまたはタンパク質フラグメントに対して免疫学的に特異性であってよい
。
【０１１５】
[00137]  本発明のある態様は、本発明のポリヌクレオチドの発現により生成したタン
パク質の検出および定量のために抗体を使用する。タンパク質は免疫沈降法、アフィニテ
ィー分離、ウェスタンブロット分析、タンパク質アレイなどにより検出できるが、好まし
い方法はＥＬＩＳＡ技術を利用する；この場合、抗体を固体支持体上に固定化し、標的で
あるタンパク質またはペプチドをこの固定化抗体に曝露する。プローブもしくは標的のい
ずれかまたは両方を、既知の方法で標識することができる。
【０１１６】
[00138]  ある態様において、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数の
遺伝子の発現パターンまたはプロフィールは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検
出のためのプローブのアレイを用いて観察される。１態様においてはオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドのアレイを使用でき、一方、他の態様には本発明の差次発現した
遺伝子生成物に特異的に結合する抗体または他のタンパク質のアレイを使用できる。その
ようなアレイは市販されており、あるいはそれらを当業者に既知の方法、たとえば固体支
持体上でのインサイチュー合成により、または予め合成したプローブをマイクロプリンテ
ィング技術で固体支持体に付着させることにより、特注作製することができる。多様な態
様において、本発明の差次発現遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的
に検出するために、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特
注作製する。
【０１１７】
[00139]  １態様において、表２および／または表３に同定した２種類以上のポリヌク
レオチドまたは遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的に検出するため
に、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特注作製する。こ
れらのプローブは、動物において脂質およびグルコースの代謝経路に関連する遺伝子を検
出するために設計される。他の態様において、表３に同定した２種類以上のポリヌクレオ
チドまたは遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的に検出するために、
ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特注作製する。これら
のプローブは、正常な動物と比較して異常な動物に特に関連する遺伝子を検出するために
設計される。
【０１１８】
[00140]  他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現
する１種類以上の遺伝子の差次発現を試料中で検出する方法を提供する。この方法は、下
記を含む：（ａ）正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリヌクレオチ
ドプローブを含む組合わせを、試料中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以
上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；（ｂ）場合により、正常な動物と比較して
異常な動物に差次発現する複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、基準品中
のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を
形成し；（ｃ）試料に由来する、および場合により段階（ｂ）からの基準品に由来するハ
イブリダイゼーション複合体を検出し；そして（ｄ）試料に由来するハイブリダイゼーシ
ョン複合体を基準品に由来するハイブリダイゼーション複合体と比較し、その際、基準品
と試料の間のハイブリダイゼーション複合体の量の差は、正常な動物と比較して異常な動
物に差次発現する遺伝子がその試料中で差次発現したことの指標となる。
【０１１９】
[00141]  段階（ｂ）、および段階（ｃ）の一部は任意であり、２以上の試験系の比較
を比較的同時に実施すべき場合に採用される。しかし、好ましい態様において、比較のた
めに用いる基準品はそれ以前にこの方法を用いて得られたデータに基づく。
【０１２０】
[00142]  これらのプローブを試料に曝露してハイブリダイゼーション複合体を形成し
、これらを検出して基準品のものと比較する。試料と基準品に由来するハイブリダイゼー
ション複合体間の差は、試料中のポリヌクレオチドの差次発現、したがって正常な動物と
比較して異常な動物に差次発現する遺伝子の指標となる。好ましい態様において、プロー
ブは、本発明により同定された１種類以上の遺伝子または遺伝子フラグメントにより提示
されるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを特異的に検出するように作製される。
ハイブリダイゼーション複合体を検出するための方法は、当業者に既知である。
【０１２１】
[00143]  １態様において、この方法はさらに、ハイブリダイゼーションの前に動物ま
たは試料を被験物質に曝露することを含む。その場合、この比較は、正常な動物と比較し
て異常な動物に差次発現する遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現を、試料中で被験物質が
変化させたかどうかの指標となる。
【０１２２】
[00144]  他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現
する遺伝子の差次発現を試料中で検出するための方法を提供する。この方法は、下記を含
む：（ａ）正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリペプチドプローブ
を含む組合わせと試料中のタンパク質とを、これらのプローブとタンパク質の間に特異的
結合が生じうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合したタンパク質は正常な動物
と比較して異常な動物に差次発現するものであり；（ｂ）場合により、正常な動物と比較
して異常な動物に差次発現する複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと基準品中の
タンパク質とを、これらのプローブとタンパク質の間に特異的結合が生じうる条件下で反
応させ、その際、プローブが結合したタンパク質は正常な動物と比較して異常な動物に差
次発現するものであり；（ｃ）試料および場合により段階（ｂ）からの基準品における特
異的結合を検出し；そして（ｄ）試料における特異的結合を基準品におけるものと比較し
、その際、基準品と試料における特異的結合間の差は、正常な動物と比較して異常な動物
に差次発現する遺伝子がその試料中で差次発現したことの指標となる。
【０１２３】
[00145]  これらのプローブを試料に曝露して特異的結合を形成させ、これを検出し、
基準品のものと比較する。試料と基準品からの特異的結合間の差は、その試料における正
常な動物と比較して異常な動物に差次発現するタンパク質の差次発現、したがって遺伝子
、特に異常関連遺伝子の差次発現の指標となる。好ましい態様において、プローブは、本
発明により同定された１種類以上の遺伝子または遺伝子フラグメントにより産生されるタ
ンパク質またはそのフラグメントを特異的に検出するように作製される。
【０１２４】
[00146]  １態様において、この方法はさらに、ポリペプチドをタンパク質と反応させ
る前に動物または試料を被験物質に曝露することを含む。その場合、この比較は、正常な
動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現を、試料中
で被験物質が変化させたかどうかの指標となる。
【０１２５】
[00147]  他の態様においては、動物のたとえば関節炎の組織の量を調節することを試
みる際に、軟骨組織調節プログラムに応答した動物の進行状況をモニターするために、正
常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子の発現を試料中で検出する前記方法
を用いる。この方法は、調節プログラム期間中、間隔をおいて、好ましくは設定した間隔
をおいて実施され、調節プログラム期間中の２以上の時点でのこの方法の結果を比較する
ことにより、動物の進行状況をモニターする。比較により得られた、正常な動物と比較し
て異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現もしくは遺
伝子発現パターンの変化、または無変化は、その調節プログラムの有効性の指標となる。
【０１２６】
[00148]  被験物質は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するポリヌクレオ
チドまたは遺伝子、特に異常関連遺伝子に影響を及ぼす可能性のあるいかなる物質であっ
てもよい。被験物質には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アミノ酸；タ
ンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低
分子、高分子、ビタミン、無機質、単純な糖類；複雑な糖類；多糖類；炭水化物；中鎖ト
リグリセリド（ＭＣＴ）；トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）；下記を含むｎ−３（オメガ
−３）脂肪酸：ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＡＬＡ；下記を含むｎ−６（オメガ−６）脂肪酸：ＬＡ
、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびＡＲＡ；ＳＡ、共役型リノール酸（ＣＬＡ）；コリン
源、たとえばレシチン；下記を含む脂溶性ビタミン：ビタミンＡおよびその前駆物質、た
とえばカロテノイド（たとえばβ−カロテン）、ビタミンＤ源、たとえばビタミンＤ２（
エルゴカルシフェロール）およびビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＥ源
、たとえばトコフェロール（たとえばα−トコフェロール）およびトコトリエノール、な
らびにビタミンＫ源、たとえばビタミンＫｌ（フィロキノン）およびビタミンＫ２（メナ
ジオン）；下記を含む水溶性ビタミン：Ｂ系列ビタミン、たとえばリボフラビン、ナイア
シン（ニコチンアミドおよびニコチン酸を含む）、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、
ビオチンおよびコバラミン；ならびにビタミンＣ（アスコルビン酸）；下記を含む抗酸化
剤：前記ビタミンのうちのあるもの、特にビタミンＥおよびＣ；ならびにビオフラボノイ
ド、たとえばカテキン、ケルセチンおよびテアフラビン；キノン類、たとえばユビキノン
；カロテノイド、たとえばリコペンおよびリコキサンチン；レスベラトロール；ならびに
α−リポ酸；Ｌ−カルニチン；Ｄ−リモネン；グルコサミン；Ｓ−アデノシルメチオニン
；ならびにキトサン。好ましい態様において、被験物質は栄養素であり、これらを食物に
添加するか、あるいはサプリメントとして摂取することができる。例には、脂肪酸、たと
えばオメガ−３脂肪酸（たとえばＤＨＡおよびＥＰＡ）およびオメガ−６脂肪酸（たとえ
ばＡＲＡ）、カルニチン、メチオニン、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびビタミンＤが含ま
れるが、これらに限定されない。
【０１２７】
[00149]  好ましい態様において、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺
伝子、特に異常関連遺伝子の発現に影響を及ぼすのに有用な物質は、出願中の米国仮特許
出願Ｎｏ．６０／６５７９８０、２００５年３月２日出願、およびそれに基づく優先権を
主張する後続の米国特許出願または外国特許出願に開示された方法を用いて同定すること
ができる。
【０１２８】
[00150]  比較に際して用いる正常な動物に関する発現プロフィールは、被験動物に関
する発現プロフィールと同時に１匹以上の正常な動物から、または正常な動物の発現プロ
フィールのデータベースから、得ることができる。好ましくは、長年蓄積された正常な動
物に関する発現プロフィールのデータベースを、基準として使用するために入手できる。
【０１２９】
[00151]  ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが差次発現するかどうかの判定は、当
業者に既知の方法を用いてそれらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出すること
により達成でき、それらの方法のうち若干を本明細書に記載する。
【０１３０】
[00152]  他の観点において、本発明は動物のゲノムを操作するのに適切な組成物を提
供する。この組成物は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺
伝子、特に異常関連遺伝子の発現に干渉する１種類以上の物質を含む。
【０１３１】
[00153]  他の態様において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関節障害
を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連する遺
伝子の発現を調節する方法を包含する。好ましい態様において、本発明組成物は下記のも
のを含む：ミリグラム／キログラム／日（ｍｇ／ｋｇ／日）：ＤＨＡを、約１から約３０
まで、好ましくは約３から約１５までの量；ＥＰＡを、約１から約３０まで、好ましくは
約３から約１５までの量；ＥＰＡ／ＤＨＡ  Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）を、約４／
２から約３０／４５まで、好ましくは約９／６から約１８／１２までの量；ＡＬＡを、約
１０から約１００まで、好ましくは約３０から約６０までの量；ＬＡを、約３０から約６
００まで、好ましくは約６０から約３００までの量；ＡＲＡを、約５から約５０まで、好
ましくは約１５から約３０までの量；ＳＡを、約３から約６０まで、好ましくは約６から
約３０までの量；およびＣＬＡ（対照として）を、約６から約１２０まで、好ましくは約
１２から約６０までの量。組成物をその組成物に適切ないずれかの方式または形態で動物
に投与することができる。好ましくは、組成物を食物組成物またはサプリメントの形態で
動物に経口投与する。食物組成物はいかなる形態であってもよい：たとえば、動物、特に
愛玩動物、たとえばネコ類およびイヌ類のための当技術分野で既知である栄養バランスの
とれた食物組成物、たとえば乾燥食物、半湿潤食物、および湿潤食物。サプリメントには
、錠剤、カプセル剤などの剤形、およびこれらに類する形態が含まれる。さらに他の観点
において、動物の軟骨組織の量を調節する１種類以上の他の物質と組み合わせて本発明組
成物を投与することができる。
【０１３２】
[00154]  他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関節障害
を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連する遺
伝子の発現を調節するのに適切な、または動物の軟骨組織の量を調節するのに適切な、組
成物を提供する。この組成物は、遺伝子発現または組織を調節する量の、ＤＨＡ、ＥＰＡ
、ＥＰＡおよびＤＨＡ、ＡＬＡ、ＬＡ、ＡＲＡ、ならびにＳＡのうち１種類以上を含む。
多様な態様において、この組成物は下記のものを含む：ｍｇ／ｋｇ／日：ＤＨＡを、動物
に約１から約３０まで投与するのに十分な量；ＥＰＡを、動物に約１から約３０まで投与
するのに十分な量；ＥＰＡ／ＤＨＡ  Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）を、動物に約４／
２から約３０／４５まで投与するのに十分な量；ＡＬＡを、動物に約１０から約１００ま
で投与するのに十分な量；ＬＡを、動物に約３０から約６００まで投与するのに十分な量
；ＡＲＡを、動物に約５から約５０まで投与するのに十分な量；ＳＡを、動物に約３から
約６０まで投与するのに十分な量；およびＣＬＡ（対照として）を、動物に約６から約１
２０まで投与するのに十分な量。そのような物質は、動物の軟骨組織の量を調節するため
に有用となることができる。好ましくは、これらの物質は複数のそれらの遺伝子の発現に
影響を及ぼす。１態様において、組成物はさらに、動物の軟骨組織の量を調節する１種類
以上の薬物または他の物質を含む。
【０１３３】
[00155]  さらに他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関
節障害を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連
する遺伝子の差次発現を被験系において判定するのに適切なキットを提供する。
【実施例】
【０１３４】
[00156]  実施例１：種々の物質または成分がイヌ類の細胞系における遺伝子発現に及
ぼす影響の判定
[00157]  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘイヌ類遺伝子チップＣａｎｉｎｅ  Ｇｅｎｏｍｅ−１
およびＣａｎｉｎｅ  Ｇｅｎｏｍｅ−２を用いて、種々の被験物質または成分、たとえば
下記のものが、４種類のイヌ細胞系および適切な対照における遺伝子発現に及ぼす影響を
判定する：ＭＣＴ類；ＴＡＧ類；ＡＬＡ；ＥＰＡ；ＤＨＡ；リノール酸；ステアリン酸（
ＳＡ）、共役型リノール酸（ＣＬＡ）、ＧＬＡ；アラキドン酸；レシチン；ビタミンＡ、
ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、パン
トテン酸、葉酸、ビオチン、ビタミンＣ、カテキン、ケルセチン、テアフラビン；ユビキ
ノン；リコペン、リコキサンチン；レスベラトロール；α−リポ酸；Ｌ−カルニチン；Ｄ
−リモネン；グルコサミン；Ｓ−アデノシルメチオニン；キトサン、これらの化合物を１
種類以上含有する種々の材料、およびその多様な組合わせ。各成分を、表１に示す選択し
た試料成分について指示した２種類の濃度で試験する。２種類のうち高い方の濃度の溶媒
を対照として用いる。４種類のイヌ細胞系を用いる：ＣＣＬ３４（腎臓）、ＣＲＬ１４３
０（胸腺）、ＣＣＬ１８３（骨）（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）およびＣＴＡＣ（甲状腺）(参照：Measurement
of NK Activity in Effector Cells Purified from Canine Peripheral Lymphocytes, V
eterinary Immunology and Immunopathology, 35 (1993) 239-251)。特定濃度のある成分
で処理した細胞系を“処理”と表記し、非処理試料を“対照”と表記する。“遺伝子”お
よび“プローブ”という語をこの方法においては同義に使用する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ
チップに備えられた指示を用いて、遺伝子発現を処理細胞系と対照細胞について測定する
。各ユニークプローブ識別番号についての詳細な情報は製造業者から入手できる。
【０１３５】
[00158]  遺伝子発現データを前記のいずれかの処理について“アップ（ｕｐ）”また
は“ダウン（ｄｏｗｎ）”レギュレートされたと判定する。遺伝子が“アップ”または“
ダウン”のいずれであるかの決定は変化倍率に基づき、これは各プローブについて、処理
における強度／対照における強度として計算される。その数値が＜１／１．５（４種類の
細胞系すべてにわたる分析について）または＜１／２（細胞系内の分析について）である
場合にはその変化倍率をダウンレギュレートされたとみなし、その数値が＞１．５（４種
類の細胞系すべてにわたる分析について）または＞２（細胞系内の分析について）である
場合にはその変化倍率をダウンレギュレートされたとみなす。また、使用したソフトウェ
アに従って、あるプローブが比較される条件（処理または対照）のうち一方においてのみ
存在と呼出され、他方においては“不存在”または“境界”であり、かつ変化倍率が有意
である場合、それを以後の精査のために有意とみなす。２つの処理において反対方向に調
節されると思われるプローブを以後の分析から除外する。
【０１３６】
[00159]  生データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．０（ＧＳ）ソフト
ウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により分析し、Ｒ−Ｂｉｏｃｏｎｄ
ｕｃｔｏｒ（ＲＢ）フリーウェアにより確認する。両方のソフトウェアパッケージを用い
て、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにより作製されたＣＥＬファイルから
プローブ強度を計算する。プローブ毎の存在／不存在／境界の呼出、およびＰ−値は、Ｒ
−ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒおよびＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアを個別に用いて計
算される。
【０１３７】
[00160]  ２つのスキームをデータ解析に用いる。第１；“細胞系間”、および“個々
の細胞系内”。第１スキームでは、遺伝子がすべての細胞系にわたって有意かつ共通であ
ると認められた場合、それらを採点のために選択する。この“細胞系間”は、最小のノイ
ズで最高の信頼データを与え、どの遺伝子が個々の成分により影響を受けるかについて可
能な最良の手掛かりを提供することができる。第２スキームでは、２つの処理において個
々の細胞系内で両方のソフトウェアパッケージに従って有意倍率の変化を示す遺伝子のみ
を採点する。これらの実験から得られたデータのサンプルを表２に示す。表２は、処理物
質（Ｃｏｌｕｍｎ  １）、プローブ（データリンク）（Ｃｏｌｕｍｎ  ２）、方向（Ｃｏ
ｌｕｍｎ  ３）、最良ＢＬＡＳＴ標記（統計的に判定）（Ｃｏｌｕｍｎ  ４）、およびヒ
ト寄託番号（Ｃｏｌｕｍｎ  ５）を示す。すべての被験成分の情報を参考のためにデータ
ベースに保存する。
【０１３８】
[00161]  イヌ類の生理的状態（異常としての診断）および表１〜２からの情報の比較
に基づいて、すなわち被験物質または被験成分により影響を受けかつ正常な動物と比較し
て異常な動物に差次発現する遺伝子に注目して、異常なイヌ類のための食物組成物の選択
および調製に有用な栄養処方は、下記の成分のうち１種類以上を下記の量で含有すると考
えられる（インビボ量ミリグラム／キログラム／日（ｍｇ／ｋｇ／日）はインビトロで用
いた量からの外挿に基づく）：たとえばＤＨＡ−約１から約３０まで；ＥＰＡ−約１から
約３０まで；ＥＰＡ／ＤＨＡ  Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）−約４／２から約３０／
４５まで；ＡＬＡ−約１０から約１００まで；ＬＡ−約３０から約６００まで；ＡＲＡ−
約５から約５０まで；およびＳＡ−約３から約６０まで。これらのデータに基づいて、こ
れらの成分のうち１種類以上を含有する食物組成物および関連の食事を調製し、正常な動
物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子を調節するために用いることができる。そ
のような成分は、動物において異常な筋骨格関節障害の調節を生じ、したがって１態様に
おいては望ましい状態または正常な状態への移行を促進し、動物のより良好な健康および
ウェルネスを促進するであろう。
【０１３９】
[00162]  実施例２：ＲＮＡ単離操作
[00163]  材料および方法：本明細書の実施例にさらに記載するように、下記の一般法
を用い、遺伝子チップを利用して、イヌおよびネコの組織試料から遺伝子発現プロファイ
リング用のＲＮＡを単離することができる。これらの方法または当技術分野で認識されて
いるその変法を適用して、当業者が利用できる種々の分析法、特にマイクロアレイ技術を
用いてさらに遺伝子発現を分析するためのＲＮＡを組織または体液試料から単離すること
ができるのは、当業者に明らかであろう。
【０１４０】
組織からのリボ核酸（ＲＮＡ）の単離
[00164]  組織試料を採集し、液体窒素中で凍結させ、融解し、次いでホモジナイズし
、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡ抽出法を用いて処理して、良質のＲＮＡを調製するこ
とができ、次いでこれをさらにゲノム分析する。
【０１４１】
[00165]  材料：氷、液体窒素、イヌ類またはネコ類の凍結組織、ＴＲＩｚｏｌ（登録
商標）細胞溶解試薬、最低９９％のクロロホルム、イソプロピルアルコール、７０％エタ
ノール（無水エタノールおよび脱イオン無ＲＮａｓｅ水を用いて調製）、ＲＮａｓｅ  Ｚ
ａｐ（登録商標）、脱イオン水、ＲＮＡ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標
）：Ａｍｂｉｏｎから。
【０１４２】
[00166]  装置：Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５パワーホモジナイザー、Ｂｅｃｋ
ｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ２５Ｒ遠心機、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機、
鉗子、メス、硬質カッティング面、すなわちカッティングボード、１．５ｍＬ無ＤＮａｓ
ｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ミクロ遠心管、５０ｍＬ無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ディスポ
ーザブルポリプロピレン試験管、Ｐｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２  Ｒ
ａｉｎｉｎ  Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌のＰｌ０００
、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ピペット用フィルター付きピペットティップ、な
らびに糸屑を含まない拭布。
【０１４３】
[00167]  調製：４ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を入れた５０ｍＬポリプロピレン
試験管を用意する（ＲＮＡ単離のために選択した各組織につき１本の試験管）。
[00168]  組織ホモジナイゼーション：液体窒素を保持できる容器に３〜４匙の液体窒
素を装入する。一片の凍結組織を直ちに上記の容器に入れ（組織はほぼ豆の大きさとすべ
きである）、この組織を適宜ラベルを付けた５０ｍＬポリプロピレン試験管（既に４ｍＬ
のＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を入れたもの）に入れる。直ちにＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ
Ｔ２５パワーホモジナイザーを用いてホモジナイゼーションを開始する。最高設定（６
）で１０〜１５秒間ホモジナイズする。試料を氷上でさらに１０〜１５秒間冷却し、次い
で繰り返す。組織が完全にホモジナイズされて溶液が混濁するまで続ける。完全にホモジ
ナイズされると、５０ｍＬ試験管に蓋をして氷へ戻す。ホモジナイズされた組織を室温で
５分間インキュベートした後、単離操作を進める。
【０１４４】
[00169]  実施例３：ＲＮＡ調製操作
[00170]  ＲＮＡの単離：ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬に備えられたＩｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎの指示に示された操作法に全般的に従う。ホモジナイズした試料を４つの１ｍＬ部
分試料に分けて４本の１．５ｍＬミクロ遠心管に入れる。１ｍＬ部分試料それぞれに２０
０ｕＬのクロロホルムを添加する。遠心管に蓋をし、１５秒間ボルテックス撹拌し、次い
で上下に振とうする。桃色の乳濁液になるはずである。遠心管を室温で２〜３分間インキ
ュベートする。遠心管を１４，０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心する。水相（上層
）を無菌の１．５ｍＬミクロ遠心管へ移す。新たな遠心管へ移すべき水相の一般的な体積
は約５００ｕＬである。中間相または下相を移さないことを確認する。水層を入れた各ミ
クロ遠心管に５００ｕＬのイソプロピルアルコールを添加することにより、溶液からＲＮ
Ａを沈殿させる。遠心管を少なくとも２０秒間、上下に振とうする。試料を室温で１０分
間インキュベートする。試料を１４，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心する。ペレ
ットを失わないことを確認しつつ、液体の吸引除去により上清を慎重に除去する。１ｍＬ
の７０％エタノールを添加してペレットを洗浄する。遠心管を揺らす（または遠心管を台
上で軽く叩く）ことによりペレットを剥離させ、振とう混合する。８，２００ｒｐｍ、４
℃で５分間遠心する。ペレットを失わないことを確認しつつ、液体の吸引除去により上清
を慎重に除去する。糸屑を含まない拭布を用いて過剰のエタノールを慎重に吸い上げて、
ペレットを確実に乾燥させる。各ペレットを３０ｕＬのＲＮＡ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎに再懸濁する。ＲＮＡが再び溶解するまで穏やかにピペッティングにより混合
し、次いで−８０℃で保存する。ＲＮＡの再懸濁を容易にするために試料を数秒間、低速
でボルテックス撹拌することが必要な場合がある。必要であれば、凍結前に試料をミクロ
遠心機により遠心沈殿させる。
【０１４５】
[00171]  ＲＮＡの清浄処理：ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ
に示された操作に従う。
ＯｐｔｉＣｅｌｌチャンバー内で培養した細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを
用いたＲＮＡの単離
[00172]  哺乳動物細胞系由来の培養細胞を用いて良質のＲＮＡを単離し、次いでこれ
を以後のゲノム分析に用いる。細胞の培養に関係するすべての作業を厳密な無菌条件下で
実施すべきである。
【０１４６】
[00173]  試薬：１０×ＰＢＳ、脱イオンＨ２Ｏ、無水エタノール、ＲＮＡ  Ｓｔｏｒ
ａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、β−メルカプトエタノール、ＲＮａｓｅ  Ｚａｐ（登録商標
）、緩衝液ＲＬＴおよび緩衝液ＲＷ  ｌおよび緩衝液ＲＰＥ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  
Ｋｉｔ中に備えられている）。
【０１４７】
[00174]  装填／材料：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒス
ピンカラム、ＯｐｔｉＣｅｌｌナイフ、２０ｍＬ無菌注射器、ＯｐｔｉＣｅｌｌティップ
、細胞スクレーパー、Ｐｌ０００  Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット，Ｒａｉｎｉｎ、Ｐ２００
Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット，Ｒａｉｎｉｎ、１００〜ｌ００ｕＬフィルター付きピペッ
トティップ、１〜２００ｕＬフィルター付きピペットティップ、無菌トランスファーピペ
ット、５５ｍＬ無菌溶液皿、１．５ｍＬ無菌ミクロ遠心管、およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆミ
クロ遠心機。
【０１４８】
[00175]  溶液：緩衝液ＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔに備えられた原液）
；−プロトコルを開始する前に、１０ｍＬの緩衝液ＲＴＬにつきｌ００ｕＬのβ−メルカ
プトエタノールを添加する。７０％エタノール：３５ｍＬの無水エタノールを１５ｍＬの
脱イオン無ＲＮａｓｅ水に添加することにより５０ｍＬの７０％エタノールを調製する。
１×ＰＢＳ：−無ＲＮａｓｅ水。この溶液を．２２ｕｍのフィルターにより濾過する。
【０１４９】
[00176]  操作：細胞をＯｐｔｉＣｅｌｌチャンバーから取り出す（一度に１つのＯｐ
ｔｉＣｅｌｌを処理する）。細胞を顕微鏡下で検査して、細胞がＲＮＡ単離前に生存して
いることを確認する。細胞培養培地を分離し、廃棄する。ＯｐｔｉＣｅｌｌナイフを用い
て上側の膜を切り取り、下側の膜上の細胞を露出させる。細胞が付着している膜を１×Ｐ
ＢＳで３回洗浄する。６００ｕＬの緩衝液ＲＬＴ（β−メルカプトエタノールを含有する
）を、細胞が付着している膜の中央にピペットで添加する。細胞スクレーパーを用いて、
緩衝液ＲＬＴを穏やかに膜の全面に広げ、次いで液体を１隅に集める。緩衝液ＲＬＴの全
体積をピペットで吸い取り、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに入れる。
【０１５０】
[00177]  ＲＮＡの単離：ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを１４，０００ｒｐｍ
で２分間遠心する。スピンカラムを廃棄し、ただし採集管とその内容物は残しておく。６
００ｕＬの７０％エタノールを採集管に添加し、ピペッティングによって十分に混合する
（この時点での全体積＝１．２ｍＬ）。６００ｕＬの細胞溶解物をＲＮｅａｓｙミニカラ
ムへ移し、１４，０００ｒｐｍで１５秒間遠心する。フロースルーを廃棄し、ただし採集
管およびスピンカラムは残しておく。残りの体積の細胞溶解物（約６００ｕＬ）をスピン
カラムへ移し、遠心を繰り返す。フロースルーを廃棄し、ただし採集管およびスピンカラ
ムは残しておく。７００ｕＬの緩衝液ＲＷｌをスピンカラムに添加する。１４，０００ｒ
ｐｍで１５秒間遠心してカラムを洗浄する。フロースルーおよび採集管を廃棄する。スピ
ンカラムを新たな２ｍＬ採集管へ移し、５００ｕＬの緩衝液ＲＰＥをカラムに添加する。
１４，０００ｒｐｍで１５秒間遠心する。フロースルーを廃棄し、ただし採集管／カラム
を残しておく。さらに５００ｕＬの緩衝液ＲＰＥをカラムに添加する。１４，０００ｒｐ
ｍで２分間遠心する。スピンカラムを１．５ｍＬ採集管へ移す。３０ｕＬのＲＮＡ  Ｓｔ
ｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎをシリカゲル膜に直接添加し、１４，０００ｒｐｍで１分
間遠心してＲＮＡを溶離する。最終ＲＮＡを−７０℃で保存する。
【０１５１】
ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏアッセイ
[00178]  Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒおよびＲＮＡ  ６００
０  Ｎａｎｏアッセイを用いて、哺乳動物の培養細胞、リンパ球または組織から単離した
ＲＮＡを定量のために分析する。
【０１５２】
[00179]  試薬：ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏゲルマトリックス、ＲＮＡ  ６０００  
Ｎａｎｏ濃縮色素、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏマーカー（以上の試薬はすべてＲＮＡ  
６０００  Ｎａｎｏアッセイキットに収容されている，Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＲＮＡ  ６０
００ラダー（ｌａｄｄｅｒ）、ＲＮａｓｅ  Ｚａｐ、および無ＲＮａｓｅ水：Ａｍｂｉｏ
ｎから。
【０１５３】
[00180]  装置／他の材料：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｉｐ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｔａｔｉ
ｏｎ，Ａｇｉｌｅｎｔ、ＲＮＡ  ６０００チップ，Ａｇｉｌｅｎｔ、電極クリーナー、Ｐ
２、Ｐｌ０、Ｐ２００およびＰｌ０００  Ｒａｉｎｉｎ  Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無
菌無ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフィルター付きピペットティップ、無菌１．５ｍＬミクロ遠
心管、ボルテックス、ＩＫＡボルテックスミキサー、ミクロ遠心機、および加熱ブロック
。
【０１５４】
[00181]  操作：操作法は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＲｅａ
ｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｇｕｉｄｅ，ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ａｓｓａｙ，Ｅｄｉｔｉ
ｏｎ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００３に示されている。この説明書に示された操作法に従い
、ただし下記の変更を伴う：１７頁のゲル調製−濾過したゲルをそれぞれ６５ｕＬの部分
に分けるのではなく、濾過したゲルの原液を元のミクロ遠心管内に保持しておき、必要に
応じて６５ｕＬを分取する。２２頁のＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏマーカーの装填−試料
を入れない予定の各試料ウェルに１ｕＬの無ＲＮａｓｅ水を（ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎ
ｏマーカーの代わりに）添加する。これはマーカーの使用量を節約するだけでなく、無Ｒ
Ｎａｓｅ水を含めていずれの試薬も汚染されていないことを知るための陰性対照としても
役立つ。２３頁のラダーおよび試料の装填−試料およびＲＮＡ  ６０００ラダーを、さら
に３０秒間（合計２．５分間）、７１℃で熱変性させる。２６頁−チップ操作の開始−ア
ッセイメニューから“Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏ”オプション
を選択する。
【０１５５】
実施例４：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析
[00182]  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃａｎｉｎｅ  １およびＣａｎｉｎｅ  ２  Ｇｅｎ
ｅＣｈｉｐ（登録商標）を用いて遺伝子発現を分析する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ
．（９５０５１カリフォルニア州サンタクララ）から市販されているアレイ。全ＲＮＡを
ｃＤＮＡに逆転写する。このｃＤＮＡを用いてｃＲＮＡを生成させ、これをフラグメント
化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いる。遺伝子
チップを洗浄し、ハイブリダイゼーション信号をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘレーザースキャナ
ーで測定する。次いでハイブリダイゼーションデータを確認し、以後の分析のために規準
化する。
【０１５６】
[00183]  材料：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが大部分の試薬およびキットを提供する。Ａｆ
ｆｙｍｅｔｒｉｘのマニュアルに挙げてあるがキット中に供給されていない他の試薬は、
別個に入手できる（詳細についてはＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（７０１０２１  Ｒｅｖ．４）を参照）。
ＲＮａｓｅ  Ｚａｐ（登録商標）および脱イオン水。
【０１５７】
[00184]  装置：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆミクロ遠心機、１．５ｍＬ無ＤＮａｓｅ無菌ＲＮ
ａｓｅ／無菌ミクロ遠心管、５０ｍＬ無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ディスポーザブル
ポリプロピレン試験管、Ｐｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２  Ｒａｉｎｉ
ｎ  Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌のＰｌ０００、Ｐ２０
０、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ピペット用フィルター付きピペットティップ、ならびにＰ
ｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００。
【０１５８】
[00185]  操作法：すべての操作をＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃｏｐｙｒ
ｉｇｈｔ  １９９９−２００３）に記載されたものに厳密に従う。５マイクログラムの全
ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡ合成に用いる。Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ
ＰＴＣ−２００または加熱ブロックを、反応およびプローブ変性に際しての温度制御に
用いる。ＲＮＡ  ＮａｎｏＤｒｏｐチップをＢｉｏＡｎａｌｙｅｒ  ２１００と共に用い
て品質管理を行なう。イヌ類の遺伝子チップには１００  Ｆｏｒｍａｔ（Ｍｉｄｉ  Ａｒ
ｒａｙ）を用いる。
【０１５９】
[00186]  実施例５：ネコにおけるアッセイ操作
[00187]  ここに示す試験においては、以下に詳述する方法に従って、ＰＡＸｇｅｎｅ
（商標）ＲＮＡ試験管を用いてネコから全血を採取し、全血試料からＰＡＸｇｅｎｅ（商
標）ＲＮＡ単離キットを用いて全ＲＮＡを単離する。
【０１６０】
[00188]  ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）による血液ＲＮＡの単離：以下に示すように、ＰＡ
Ｘｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管およびＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキット（
Ｑｕｉａｇｅｎ）を一緒に用いて、ネコ類から得た全血から細胞内ＲＮＡを単離および精
製する（ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｐ
ｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｊｕｎｅ  ２００５も参照）。要約すると、Ｖａｃｕｔａｉｎｅ
ｒ（登録商標）注射針を用いて血液をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管内へ直接
採集し、次いで遠心、洗浄および精製の工程を数ラウンド行なうと、最終的に高品質のＲ
ＮＡが得られる。次いでこのＲＮＡは品質管理工程を経由し、次いでＡｆｆｙｍｅｔｒｉ
ｘプラットフォーム上に特注作製された専売ネコ遺伝子チップを用いて実施するその後の
定量リアルタイムＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ分析に使用される。
【０１６１】
[00189]  アッセイ調製物：アッセイ開始前に、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管（血液
を入れたもの）を室温で最低２時間インキュベートする。試験管が凍結されており、凍結
前に２時間インキュベートされていない場合、それらを室温にさらに２時間放置して融解
させる必要があろう。１回目の遠心前に、各ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管を８〜１０回
反転させる。最初に緩衝液ＢＲ４を用いる場合（緩衝液はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液Ｒ
ＮＡキットに含まれる）、４体積の９６〜１００％エタノールを濃縮緩衝液に添加して作
業溶液を得る。アッセイ開始前に２つの加熱ブロックを予熱する―６５℃および５５℃。
ＤＮａｓｅ  Ｉ原液を調製する（ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ  ＳｅｔはＰＡＸｇｅ
ｎｅ（商標）血液ＲＮＡキットに含まれる）。固体ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素を、キットに備え
られた５５０μＬの無ＲＮａｓｅ水に溶解する。蓋をとる際にＤＮａｓｅ  Ｉを失わない
ことを確認する。試験管を反転させることにより穏やかに混合する。ボルテックスまたは
遠心機を使用しない。ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素と緩衝液ＲＤＤ（キット構成要素）の混合物を
調製する（バッチ当たり処理する試料の数に十分な体積）。各試料に７０μＬの緩衝液Ｒ
ＤＤおよびｌ０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉが必要である（すなわち、２０個の試料には１．４
ｍＬの緩衝液ＲＤＤと２００μＬのＤＮａｓｅ  Ｉとのカクテルが必要であろう）。この
カクテルは必要になるまで２〜８℃で保存すべきである。再構成した酵素は２〜８℃で最
高６週間は品質良好である。
【０１６２】
[00190]  試料の保存：ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管（血液を入れたもの）は、処理
前に室温で最高３日間保存できる。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管に備えられ
た製品挿入説明書によれば、細胞ＲＮＡプロフィールはこれらの条件下で最高３日間安定
である。しかし、これは種間で異なる可能性がある。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管は４
℃で最高５日間保存することもできる。長期保存が必要な場合、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）
試験管を−２０℃または−７０℃で最高６カ月間保存することができる。試験管をゆるい
ワイヤリックに入れて垂直位置で凍結すべきである。試験管を−７０℃で保存する場合、
まず−２０℃で凍結させ、次いで−７０℃へ移ことを推奨する。試験管をフリーザーから
取り出す際には、それらを室温（２２℃を超えない温度）で融解すべきである。アッセイ
を進める前に、各試験管を１０回反転させるべきである。
【０１６３】
[00191]  全血からのＲＮＡの単離：ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管を４０
００×ｇで１０分間遠心する。デカントにより上清を分離して廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ
（商標）の縁に残っている過剰の上清を吸い取る。４ｍＬの無ＲＮａｓｅ水をペレットに
添加し、新たなＨｅｍｏｇａｒｄクロージャーで蓋をする。ボルテックス撹拌によりペレ
ットを再懸濁し、次いで４０００×ｇで１０分間遠心する。デカントにより上清を分離し
て廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）の縁に残っている過剰の上清を吸い取る。３６０μ
Ｌの緩衝液ＢＲｌ（キット構成要素）をペレットに添加し、ペレットが完全に再懸濁する
まで穏やかにピペッティングする。試料を無菌１．５ｍＬミクロ遠心管へ移し、３００μ
Ｌの緩衝液ＢＲ２（キット構成要素）および４０μＬのプロテイナーゼＫを添加する（試
料に添加する前に緩衝液ＢＲ２とプロテイナーゼＫを混合してはならない）。各試験管を
ボルテックス撹拌によって十分に混合し、５５℃に予熱したサーモミキサーに入れる。試
験管を１４００ｒｐｍで１０分間、インキュベート／振とうする。細胞溶解物を、２ｍＬ
の採集管に入れたＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム内へピペットで装入する。１４，
０００ｒｐｍで３分間遠心する。フロースルー画分の上清を無菌１．５ｍＬミクロ遠心管
へ移す。３５０μＬの９６〜１００％エタノールを添加し、ピペッティングによって穏や
かに混合する。７００μＬの試料を、２ｍＬ採集管に入れたＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピ
ンカラムに添加し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピ
ンカラムを新たな２ｍＬ採集管へ移し、フロースルーおよび古い採集管を廃棄する。残り
の体積の試料をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで
１分間遠心する。
【０１６４】
[00192]  上記のスピンカラムの遠心からの古い採集管およびフロースルーを廃棄する
。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管に入れる。３５０μＬの緩
衝液ＢＲ３（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加し、１４，
０００ｒｐｍで１分間遠心する。フロースルーおよび採集管を廃棄する。カラムを新たな
２ｍＬ採集管に入れ、８０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ／緩衝液ＲＤＤカクテル（参照：“アッ
セイ調製物”）をカラム膜に直接添加し、室温で１５分間インキュベートする。さらに３
５０μＬの緩衝液ＢＲ３をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，００
０ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管
へ移し、古い採集管およびフロースルーを廃棄する。
【０１６５】
[00193]  ５００μＬの緩衝液ＢＲ４（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）ス
ピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）
スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管に入れ、古い採集管およびフロースルーを廃棄する。
さらに５００μＬの緩衝液ＢＲ４をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１
４，０００ｒｐｍで３分間遠心して、スピンカラム膜を乾燥させる。採集管およびフロー
スルーを廃棄し、カラムを新たな２ｍＬ採集管に入れる。試料を再び１４，０００ｒｐｍ
でさらに１分間遠心して、カラム膜をさらに乾燥させる。フロースルーおよび採集管を廃
棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを１．５ｍＬ溶離管へ移す。４０μＬの緩
衝液ＢＲ５（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラム膜に直接添加する
。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを取り出
し、１．５ｍＬ溶離管内の溶出液を同じＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラム上へピペッ
トで移す。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを同じ溶離管へ戻し、１４，０００ｒｐ
ｍで１分間遠心する。最終溶出液を６５℃で５分間インキュベートし、直ちに氷上で冷却
する。最終ＲＮＡ試料を、その後の使用のために−８０℃で保存する。
【０１６６】
実施例６：対照ネコと比較した骨関節炎を伴うネコにおける遺伝子発現
[00194]  実施例５に従って関節炎ではないネコおよび骨関節炎を伴うネコを用いて試
験を実施して、関節炎ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定
する。第１試験においては、２グループのネコ間のベースライン比較を行なって、関節炎
ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定する。組織および体液
の試料を調製するために、本明細書中の実施例に全般的に記載した操作法を使用できる。
【０１６７】
[00195]  ここに示す試験に関して、骨関節炎を伴うネコにこれまでに公開されている
方法に従ってグレードを付ける；すなわち、関節炎ではないすべてのネコを“グレード０
”とし、これは関節が正常と思われることを示す；骨関節炎を伴うネコは１（小さな腱（
靭帯）増殖体（ｅｎｔｈｅｓｏｐｈｙｔｅ）または小さな骨増殖体（ｏｓｔｅｏｐｈｙｔ
ｅ））または２（より顕著な腱（靭帯）増殖体または骨増殖体）のいずれかのグレードを
もつ。重篤な骨関節炎（グレード３）をもつネコはこの試験には含まれない。
【０１６８】
[00196]  専売の特注ネコ遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、骨関節炎
を伴うネコおよび伴わないネコ（正常な動物１０匹、関節炎の動物１０匹）においてベー
スライン遺伝子発現を評価する。前記に示したように、２グループ間のベースライン比較
を行なって関節炎ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定する
ために、常法を用い、製造業者の指示に従って、遺伝子チップ分析を実施する。
【０１６９】
[00197]  生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍ
ｕｌｔｉａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ）（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al
., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクタ
ーマシーン（Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）（ＳＶＭ）アルゴリズム
（Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６）を用いる統計分析
を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。
ＯＡバイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ｆｏｌ
ｄ  ｃｈａｎｇｅ）（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１７０】
[00198]  関節炎の動物および関節炎ではない動物において遺伝子発現プロファイリン
グを決定し、図３および１５に報告する。関節炎のネコにおいて１倍より大きくアップレ
ギュレートされることが見いだされた遺伝子は下記のものである：ＩＬ−ｌベータ、ＴＮ
Ｆ、ＨＭＧＢｌ、ｐ３８、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４。これらの遺伝子およびそれらの遺伝
子生成物は炎症プロセスに関連し、異常な筋骨格障害、特に骨関節炎のマーカーとみなさ
れるであろう。さらに、下記の遺伝子が関節炎のネコにおいて１倍より大きくアップレギ
ュレートされることが見いだされた：ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯ
Ｌ４Ａ１およびアグリカン。これらの遺伝子およびそれらの遺伝子生成物は軟骨分解に関
連し、異常な筋骨格障害、特に骨関節炎のマーカーとして役立つであろう。
【０１７１】
[00199]  実施例６に従って実施した試験の結果は、遺伝子発現を利用して正常なネコ
と骨関節炎を伴うネコを識別できることを指摘する。関節炎のネコにおいて炎症に関連し
て差次発現する遺伝子を図３および１５に示す。したがって、これらの同定した遺伝子は
ネコにおいて本明細書に記載する発明のためのバイオマーカーとして使用でき、下記の遺
伝子を含む：ＩＬ−ｌベータ、ＴＮＦ、ＨＭＧＢｌ、ｐ３８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＣＯ
Ｌ２Ａ１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１およびアグリカン。
【０１７２】
[00200]  実施例７：ネコ用食物組成物ｊ／ｄ投与後の関節炎のネコの平均活動度
[00201]  実施例６に記載した関節炎のネコおよび関節炎ではないネコに関する栄養試
験から得られた臨床データは、食事介入が関節炎のネコに影響を及ぼし、その運動性を向
上させることをを指摘する。本発明のネコ用食物組成物ｊ／ｄの食事を与えたネコは、対
照食を与えたネコを上回る統計的に有意の活動度向上を証明した。臨床試験の結果を図１
６に報告する。観察データに基づけば、本発明のネコ用食物組成物ｊ／ｄを与えたネコは
、３０％を超える運動性向上を示した；これは、本発明の被験食の投与により、基礎疾患
である骨関節炎の総体的症状の改善が達成されたことを証明する。図１６に示したデータ
から、当業者は、被験食である食物組成物ｊ／ｄの投与の結果として、ネコがより大きい
運動性をもち、痛みおよび炎症がより少ないことを推測できる。
【０１７３】
[00202]  実施例８：組成物ｊ／ｄ投与後のイヌの夜間活動度
[00203]  本発明のイヌ用食物組成物ｊ／ｄの投与を伴う臨床試験をイヌにおいて実施
した。食物組成物ｊ／ｄを与えた関節炎のイヌの夜間活動の観察を実施し、対照食を与え
たイヌおよび投薬を受けなかったイヌと対比して記録した。測定はＡＣＴＩＷＡＴＣＨ（
登録商標）装置で行なわれた。これらの装置は、肉眼的運動活動度のディジタル積分測定
値を記録するアクチグラフィー（ａｃｔｉｇｒａｐｈｙ）ベースのデータロガー（ｄａｔ
ａ  ｌｏｇｇｅｒ）である。各装置はアクチグラフィー原理を用いて、睡眠スケジュール
変動度、睡眠の量および質の統計値、ならびに昼間活動パターンを提供する。これらの装
置は、動物の移動環境に関する客観的データを収集する。この臨床試験の結果により関節
炎のイヌの夜間活動度の有意の低下が証明され、これにより、食物組成物ｊ／ｄを与えた
イヌは、関節の硬直および痛みを含めた基礎関節炎の総体的症状のより大幅な軽減および
慰安を受けたことが証明される。この臨床試験からのデータを図１７に報告する。
【０１７４】
[00204]  実施例９：イヌ用食物組成物ｊ／ｄを与えた後のイヌにおけるタンパク質マ
ーカーレベル
[00205]  関節炎のイヌおよび関節炎ではないイヌにおいて、イヌの軟骨分解に関連す
る２種類のタンパク質マーカーＣ２ＣおよびＣ１，Ｃ２のベースラインレベルを求めた。
動物の血液試料を採取し、本明細書に記載する常法により検査した。この検査結果により
、これらのマーカーの遺伝子生成物は関節炎のイヌにおいて増加し、遺伝子発現に対する
食事成分の有効性を判定するためのマーカーとして使用できることが証明された。ベース
ラインデータを図５および６に示す。
【０１７５】
[00206]  関節炎のイヌおよび関節炎ではないイヌに関する栄養試験から臨床データを
求めた。この実施例に記載する被験イヌに、図４の食物組成物として同定される本発明の
食事を与えた。Ｃ２ＣおよびＣ１，Ｃ２関節炎マーカーのレベル、ならびに異常な筋骨格
関節障害に関係することが知られている他のタンパク質マーカー、すなわち、コラーゲン
ＣＴＸ−ＩＩのレベルの評価を行なった。図１０、１１および１２に示すデータは、被験
動物および対照動物の血液において測定したタンパク質マーカーレベルを表わす。図４に
示すイヌ用食物組成物ｊ／ｄの食事を与えたイヌは、図１０、１１および１２に示すよう
に統計的に有意の血漿Ｃ２Ｃ、Ｃ１，Ｃ２およびＣＴＸ−ＩＩレベル低下を証明した。こ
のバイオマーカーデータが、本発明の食事組成物、特にこの実施例に示した食物組成物ｊ
／ｄを与えたイヌが基礎疾患プロセス（この場合は骨関節炎）の総体的臨床症状の改善を
示すという臨床所見を支持することは、当業者に認識されるであろう；これは、骨関節炎
を含めた軟骨分解および局所関節炎症状態に関連する特定の遺伝子のダウンレギュレーシ
ョンおよび特定の遺伝子生成物の発現低下と相関する。
【０１７６】
[00207]  実施例１０：関節炎のイヌ類および関節炎ではないイヌ類においてアップレ
ギュレートおよびダウンレギュレートされるイヌ類遺伝子の遺伝子チップ分析
[00208]  市販のイヌ類遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）
を用いて、当技術分野で知られている標準臨床診断基準に従って判定された関節炎を伴う
イヌおよび伴わないイヌの２グループにおいて、ベースライン遺伝子発現を評価した。遺
伝子チップ分析は、常法を用い、製造業者の指示に従って実施された。実施例１の一般的
なプロファイリング法および本明細書に述べる他の実施例に概説した分析技術を用いて遺
伝子発現プロファイリングを実施し、２グループ間のベースライン比較を求めて、関節炎
ではないイヌ類とイヌ類との基礎遺伝子発現差を判定した。
【０１７７】
[00209]  当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法に従って、関節炎のイヌおよび
正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される食物組成物を含む被験食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣ
Ｒを用いて動物の遺伝子発現の変化を分析した。
【０１７８】
[00210]  生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化ア
ルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準
化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎ
ｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動
物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。関節炎バイオマーカーと
して同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１７９】
[00211]  生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化ア
ルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準
化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎ
ｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動
物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。ＯＡバイオマーカーとし
て同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１８０】
[00212]  これらの試験の結果により、遺伝子発現を利用して正常なイヌと関節炎を伴
うイヌを識別できることが指摘される。関節炎のイヌにおける炎症に関連する差次発現遺
伝子を、図１、２、７および８に示す。本明細書に述べる開示内容の一般原理を限定する
ものではなく、図１、２、７および８に示す遺伝子は本明細書に記載する発明のバイオマ
ーカーとして使用でき、これにはアネキシンＡｌ、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプ
シンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１５、１Ｌ−１７受容体、ＴＬＲ４、ＣＯＬ２Ａ
１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ４Ａ１、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２、ＦＬＡＰ
、ＰＬＡ２、ＭＡＰＫｌ、ＭＡＰＫ２が含まれる。
【０１８１】
[00213]  実施例１１：食物組成物ｊ／ｄの食事を与えた関節炎のイヌ類および関節炎
ではないイヌ類においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされるイヌ類遺伝
子の遺伝子チップ分析
[00214]  市販のイヌ類遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）
を用いて、骨関節炎を伴うイヌおよび伴わないイヌの２グループにおいて、遺伝子発現を
評価した。合計３０匹の関節炎のイヌおよび３１匹の関節炎ではないイヌを試験した。遺
伝子チップ分析は、常法を用い、製造業者の指示に従って実施された。実施例１の一般的
なプロファイリング法および本明細書に述べる他の実施例に概説した分析技術を用いて遺
伝子発現プロファイリングを実施した。第１グループ３０匹の被験動物は、当技術分野で
周知の臨床診断法に従って関節炎と判定された。第２グループのイヌ類は、同じ臨床診断
基準に従って関節炎ではないとみなされた。当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法
に従って、関節炎のイヌおよび正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される食物組成物を含む被験
食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣＲを用いて動物の遺伝子発現の変化を分析した。
【０１８２】
[00215]  当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法に従って、関節炎のイヌおよび
正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される被験食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣＲを用いて動物の
遺伝子発現の変化を分析した。
【０１８３】
[00216]  ｑＲＴ−ＰＣＲに関して、Ｔａｑｍａｎプローブ技術を用い、すべての分析
をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００リアルタイムＰＣＲ機器により実施
する。製造業者が提供する配列検出ソフトウェアパッケージ、バージョン１．２．２．を
用いてデータを分析する。
【０１８４】
[00217]  前記の実施例の記載に従って調製した組織試料を用い、市販のイヌ類遺伝子
チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）を用いて、関節炎を伴うイヌおよ
び伴わないイヌにおいて遺伝子発現を評価した。生の遺伝子チップデータを、ロバストマ
ルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 
Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）ア
ルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６）を用い
る統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を
判定する。関節炎および炎症のバイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオ
フおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１８５】
[00218]  この実施例からのデータを表３に示す。それらのデータは、変化倍率カット
オフ１．１、ｐ値カットオフ０．０５、およびＱ値カットオフ０．３を採用した場合の２
３８３の記録を含む。これらの分析基準を用いると、１を超える変化倍率は、関節炎のイ
ヌグループから採取した試料においてそれらのプローブがアップレギュレートされている
ことの指標となる。表３に示すデータは、第１カラムにユニークＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプ
ローブ識別番号、以下それぞれｐ値、ｑ値、変化倍率、１／変化倍率の値、Ｔｏｐ  ＢＬ
ＡＳＴ注釈、一致率パーセント、ヒト寄託番号、トップヒット寄託番号、遺伝子記号、お
よび遺伝子の説明を記載する。当業者はこのデータから、通常の実験分析のみを用いて下
記の情報を演繹するであろう：変化倍率カットオフ基準、アップまたはダウンレギュレー
トされた目的遺伝子、およびＢＬＡＳＴ注釈によるそのような遺伝子の同定、関係するヒ
ト寄託番号、および同定されたそのような各遺伝子の配列、ならびに対応する遺伝子生成
物、およびそのような遺伝子生成物の配列；これらは、製造業者から入手できる情報、お
よび当業者が容易に入手できる遺伝子配列データベースから入手できる情報に基づく。さ
らに、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイに用いられたユニークプローブに関する配列は、製造
業者の公開情報源を参照することにより一般に入手できる。同様に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉ
ｘチップのバージョン１および２に用いられた各プローブの公開された配列情報および同
定は、製造業者から、およびプローブセット相互の比較により、容易かつ一般に入手でき
る。本発明の組成物および製品の製造および使用を実施する際に、ならびに本明細書に教
示される発明の製造方法および使用方法を実施する際に、当業者はそのような遺伝子発現
データ、同定した調節異常な遺伝子、およびそれらに対応する遺伝子生成物を、このデー
タから同定して利用することができる。本明細書および特許請求の範囲に開示した本発明
の範囲を限定することなく、特定の当該遺伝子および遺伝子生成物がイヌおよびネコの関
節炎状態に高度に関係すると同定することができる。表３に述べたデータ中に教示される
これらおよび他の遺伝子および遺伝子生成物は、表３に述べた当該遺伝子を調節する本発
明組成物、特にｊ／ｄと表記する食物組成物を動物に与えた場合、イヌおよびネコが罹患
する、基礎疾患である異常な筋骨格関節障害、特に関節炎状態に対して有益な作用をもつ
と推測することができる。
【０１８６】
【表１】
2014237709.tif 000002
【０１８７】
【表２−１】
2014237709.tif 000003
【０１８８】
【表２−２】
2014237709.tif 000004
【０１８９】
【表２−３】
2014237709.tif 000005
【０１９０】
【表２−４】
2014237709.tif 000006
【０１９１】
【表２−５】
2014237709.tif 000007
【０１９２】
【表２−６】
2014237709.tif 000008
【０１９３】
【表２−７】
2014237709.tif 000009
【０１９４】
【表２−８】
2014237709.tif 000010
【０１９５】
【表２−９】
2014237709.tif 000011
【０１９６】
【表２−１０】
2014237709.tif 000012
【０１９７】
【表２−１１】
2014237709.tif 000013
【０１９８】
【表２−１２】
2014237709.tif 000014
【０１９９】
【表２−１３】
2014237709.tif 000015
【０２００】
【表２−１４】
2014237709.tif 000016
【０２０１】
【表２−１５】
2014237709.tif 000017
【０２０２】
【表２−１６】
2014237709.tif 000018
【０２０３】
【表２−１７】
2014237709.tif 000019
【０２０４】
【表２−１８】
2014237709.tif 000020
【０２０５】
【表２−１９】
2014237709.tif 000021
【０２０６】
【表２−２０】
2014237709.tif 000022
【０２０７】
【表２−２１】
2014237709.tif 000023
【０２０８】
【表２−２２】
2014237709.tif 000024
【０２０９】
【表２−２３】
2014237709.tif 000025
【０２１０】
【表２−２４】
2014237709.tif 000026
【０２１１】
【表２−２５】
2014237709.tif 000027
【０２１２】
【表２−２６】
2014237709.tif 000028
【０２１３】
【表２−２７】
2014237709.tif 000029
【０２１４】
【表２−２８】
2014237709.tif 000030
【０２１５】
【表２−２９】
2014237709.tif 000031
【０２１６】
【表２−３０】
2014237709.tif 000032
【０２１７】
【表２−３１】
2014237709.tif 000033
【０２１８】
【表２−３２】
2014237709.tif 000034
【０２１９】
【表２−３３】
2014237709.tif 000035
【０２２０】
【表２−３４】
2014237709.tif 000036
【０２２１】
【表２−３５】
2014237709.tif 000037
【０２２２】
【表２−３６】
2014237709.tif 000038
【０２２３】
【表２−３７】
2014237709.tif 000039
【０２２４】
【表２−３８】
2014237709.tif 000040
【０２２５】
【表３−１】
2014237709.tif 000041
【０２２６】
【表３−２】
2014237709.tif 000042
【０２２７】
【表３−３】
2014237709.tif 000043
【０２２８】
【表３−４】
2014237709.tif 000044
【０２２９】
【表３−５】
2014237709.tif 000045
【０２３０】
【表３−６】
2014237709.tif 000046
【０２３１】
【表３−７】
2014237709.tif 000047
【０２３２】
【表３−８】
2014237709.tif 000048
【０２３３】
【表３−９】
2014237709.tif 000049
【０２３４】
【表３−１０】
2014237709.tif 000050
【０２３５】
【表３−１１】
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【０２３６】
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【０４４２】
【表３−２１８】
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【０４４３】
【表３−２１９】
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【０４４４】
【表３−２２０】
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【０４４５】
【表３−２２１】
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【０４４６】
【表３−２２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年9月18日(2014.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のものを含む組成物：
ａ）少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、
ｂ）少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、
ｃ）ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される、少なくとも１種類のアミノ糖、
ｄ）少なくとも１種類の抗酸化剤、および
ｅ）カルニチンまたはアセチルカルニチン。
【請求項２】
オメガ−３脂肪酸が、アルファ−リノール酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヒアルロナンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗酸化剤が、ビタミンＣ、トコフェロール類、トコトリエノール類、グルタチオン、リポ酸、メラトニンおよびベータ−カロテンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
さらに、少なくとも１種類の食物無機質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
食物無機質が、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛およびバナジウムからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
さらに、少なくとも１種類の必須アミノ酸を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ヒトを除く対象において異常な関節状態を処置する方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
【請求項９】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトを除く対象において異常な関節状態の発症を遅延させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
【請求項１１】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトを除く対象において対象が異常な関節状態に罹患するリスクを低下させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１３】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトを除く対象において１種類以上の遺伝子の発現を変化させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含み、１種類以上の遺伝子がアネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体からなる群から選択される方法。