(57)【要約】【課題】本発明は、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤及びその製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】アミノ基２２を有し、酵素分解性および細胞接着ペプチド配列を有するポリペプチド鎖２１と、前記ポリペプチド鎖のアミノ基にアミド結合２３を介して導入された疎水基２４と、を有する疎水化ゼラチンからなることを特徴とする塞栓剤１１によって前記課題を解決できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基を有し、酵素分解性および細胞接着ペプチド配列を有するポリペプチド鎖と、前記ポリペプチド鎖のアミノ基にアミド結合を介して導入された疎水基と、を有する疎水化ゼラチンからなることを特徴とする塞栓剤。
【請求項２】
前記疎水基がコレステリル基、ステアリル基及びオレオイル基の群から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の塞栓剤。
【請求項３】
前記ポリペプチド鎖のアミノ基の７％以上に、前記疎水基が導入されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の塞栓剤。
【請求項４】
前記ポリペプチド鎖の分子量が１万以上１０万以下であることを特徴とする請求項３に記載の塞栓剤。
【請求項５】
更に、脂質集合体が混合されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の塞栓剤。
【請求項６】
前記脂質集合体が、リポソーム、赤血球及び細胞の群から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項５に記載の塞栓剤。
【請求項７】
有機溶媒にゼラチンを溶解させて、ゼラチン混合溶液を調整する工程と、
前記ゼラチン混合溶液に疎水基含有化合物を加えて所定の温度に加熱してから、攪拌混合して、反応溶液を調整する工程と、
前記反応溶液を、０℃以下の有機溶媒中に滴下して、沈殿物を生成する工程と、
前記沈殿物を濾過してから乾燥して、乾燥濾過物からなる塞栓剤を製造する工程と、を有することを特徴とする塞栓剤の製造方法。
【請求項８】
前記ゼラチンがウシ骨ゼラチン、ダチョウ皮ゼラチン、ブタ皮ゼラチン又はティラピア鱗ゼラチンであることを特徴とする請求項７に記載の塞栓剤の製造方法。
【請求項９】
前記ゼラチンがアルカリ処理又は酸処理したものであることを特徴とする請求項７又は８に記載の塞栓剤の製造方法。
【請求項１０】
前記疎水基含有化合物がコレステリルクロロフォーメート、ステアロイルクロライド、オレオイルクロライドの群から選択されるいずれか一の化合物であることを特徴とする請求項７に記載の塞栓剤の製造方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒がＤＭＳＯであることを特徴とする請求項７に記載の塞栓剤の製造方法。
【請求項１２】
前記ゼラチン混合溶液の加熱温度が５０℃以上１００℃以下の温度範囲であることを特徴とする請求項７に記載の塞栓剤の製造方法。
【請求項１３】
前記ゼラチン混合溶液の加熱時間が２４時間以上であることを特徴とする請求項７に記載の塞栓剤の製造方法。
【請求項１４】
前記沈殿物を生成する工程で、沈殿物を崩壊してパウダー状にして、エタノール及び酢酸エチルのいずれか又は両方からなる有機溶媒で分散洗浄することを特徴とする請求項７に記載の塞栓剤の製造方法。
【請求項１５】
前記塞栓剤を製造する工程で、減圧乾燥又は凍結乾燥することを特徴とする請求項７に記載の塞栓剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塞栓剤およびその製造方法に関する。特に、脳動脈瘤の塞栓剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の我が国における死因の第３位は脳疾患である（非特許文献１参照）。脳疾患は、くも膜下出血を主な症例としており、くも膜下出血は脳動脈瘤（Ｂｒａｉｎ  Ａｎｅｕｒｙｓｍ）の破裂に起因している。そのため、脳動脈瘤の破裂を抑制することが現代医学における一つの課題となっている。
【０００３】
脳動脈瘤は、脳動脈の分岐部に形成されるこぶである。
脳動脈瘤の破裂を防止する方法として、「クリッピング術（Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｃｌｉｐｐｉｎｇ）」がある。「クリッピング術」は、こぶの根元を金属製クリップで挟み、脳動脈瘤の破裂を防止する。しかし、このクリッピング術は開頭手術（ｏｐｅｎ  ｈｅａｄ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）であり、侵襲性（ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）が高いという課題があった。
【０００４】
侵襲性の課題を解決するため、「脳動脈瘤塞栓術（Ａｎｅｕｒｙｓｍ  ｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ）」という方法が検討された。この方法では、血管内を通して目的部位である脳動脈瘤内に導入したマイクロカテーテルの先端から、金属ワイヤからなる動脈瘤塞栓剤を流出させ、脳動脈瘤内に充填することにより血液を排出して、脳動脈瘤の破裂を防止する。しかし、この治療法ではプラチナ製の生体材料が用いられており、生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ）、生体吸収性がないという課題があった。
【０００５】
生分解性、生体吸収性の課題を解決する方法として、様々な塞栓剤材料が検討された。
例えば、ゼラチンを塞栓剤材料として用いることが検討された（特許文献１）。ゼラチンとは、化学的には、コラーゲン分子の三重螺旋構造が熱変性によってほどけた高分子である。コラーゲンタンパク質のペプチド鎖を構成するアミノ酸は、グリシンが３残基ごとに繰り返す一次構造を有する。
【０００６】
また、３０％以上の水膨潤率を有し、３７℃のリン酸緩衝生理食塩水中において分解性を有し、平均粒子径が５０μｍ以上である略球状の粒子の形状を有する血管塞栓材料も検討された（特許文献２）。また、フマル酸とプロピレングリコールから合成される非架橋ポリプロピレンフマレートから成る血管塞栓材料も検討された（特許文献３）。更にまた、多糖類のエステル誘導体を含んでなる塞栓剤材料も検討された（特許文献４）。
【０００７】
しかし、これらの材料は、血管内皮細胞の接着・足場としての機能（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持たない、又は持つとしてもそれが非常に弱い機能でしかなく、脳動脈瘤の破裂を十分に抑制できないという課題があった。
【０００８】
また、細胞接着ペプチドを有するエチレンビニルアルコールコポリマーが検討されたが、分解性を有しないという課題があった。（非特許文献２）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１０−８３７８８号公報
【特許文献２】特開２００４−１６７２２９号公報
【特許文献３】特開２００４−１４７９１６号公報
【特許文献４】特開２００２−１１４６８７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】厚生労働省、平成２２年度死因順位の年次推移、インターネット(URL:http://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/jinkou/suikei10/index.html)
【非特許文献２】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５  （２００４）  ３８４５-３８５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記事情を鑑みて、患者の自己血を物理的に架橋し、凝固させ、脳動脈瘤を塞栓する疎水化ゼラチン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｅｌａｔｉｎ（以下、ｈｍ−Ｇｅｌａｔｉｎと略称する場合がある。））が塞栓剤材料として有望ではないかと想到した。そして、疎水化ゼラチンを合成し、リポソームを細胞モデルとして用いた物理化学的評価と、クエン酸加血を用いた血液凝固能評価を行った。その結果、実際に、疎水化ゼラチンが止血、収斂機能を有し、塞栓剤材料として用いることができることを確かめて、本発明を完成した。
本発明は、以下の構成を有する。
【００１３】
（１）  アミノ基を有し、酵素分解性および細胞接着ペプチド配列を有するポリペプチド鎖と、前記ポリペプチド鎖のアミノ基にアミド結合を介して導入された疎水基と、を有する疎水化ゼラチンからなることを特徴とする塞栓剤。
（２）  前記疎水基がコレステリル基、ステアリル基及びオレオイル基の群から選択されるいずれかであることを特徴とする（１）に記載の塞栓剤。
（３）  前記ポリペプチド鎖のアミノ基の７％以上に、前記疎水基が導入されていることを特徴とする（１）又は（２）に記載の塞栓剤。
【００１４】
（４）  前記ポリペプチド鎖の分子量が１万以上１０万以下であることを特徴とする（３）に記載の塞栓剤。
（５）  更に、脂質集合体が混合されていることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の塞栓剤。
（６）  前記脂質集合体が、リポソーム、赤血球及び細胞の群から選択されるいずれかであることを特徴とする（５）に記載の塞栓剤。
【００１５】
（７）  有機溶媒にゼラチンを溶解させて、ゼラチン混合溶液を調整する工程と、前記ゼラチン混合溶液に疎水基含有化合物を加えて所定の温度に加熱してから、攪拌混合して、反応溶液を調整する工程と、前記反応溶液を、０℃以下の有機溶媒中に滴下して、沈殿物を生成する工程と、前記沈殿物を濾過してから乾燥して、乾燥濾過物からなる塞栓剤を製造する工程と、を有することを特徴とする塞栓剤の製造方法。
【００１６】
（８）  前記ゼラチンがウシ骨ゼラチン、ダチョウ皮ゼラチン、ブタ皮ゼラチン又はティラピア鱗ゼラチンであることを特徴とする（７）に記載の塞栓剤の製造方法。
（９）  前記ゼラチンがアルカリ処理又は酸処理したものであることを特徴とする（７）又は（８）に記載の塞栓剤の製造方法。
（１０）  前記疎水基含有化合物がコレステリル酸クロライド、ステアロイルクロライド、オレオイルクロライドの群から選択されるいずれか一の化合物であることを特徴とする（７）に記載の塞栓剤の製造方法。
【００１７】
（１１）  前記有機溶媒がＤＭＳＯであることを特徴とする（７）に記載の塞栓剤の製造方法。
（１２）  前記ゼラチン混合溶液の加熱温度が５０℃以上１００℃以下の温度範囲であることを特徴とする（７）に記載の塞栓剤の製造方法。
（１３）  前記ゼラチン混合溶液の加熱時間が２４時間以上であることを特徴とする（７）に記載の塞栓剤の製造方法。
【００１８】
（１４）  前記沈殿物を生成する工程で、沈殿物を崩壊してパウダー状にして、エタノール及び酢酸エチルのいずれか又は両方からなる有機溶媒で分散洗浄することを特徴とする（７）に記載の塞栓剤の製造方法。
（１５）  前記塞栓剤を製造する工程で、減圧乾燥又は凍結乾燥することを特徴とする（７）に記載の塞栓剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の塞栓剤は、アミノ基を有し、酵素分解性および細胞接着ペプチド配列を有するポリペプチド鎖と、前記ポリペプチド鎖にアミド結合を介して導入された疎水基と、を有する疎水化ゼラチンからなる構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を提供できる。
【００２０】
本発明の塞栓剤の製造方法は、有機溶媒にゼラチンを溶解させて、ゼラチン混合溶液を調整する工程と、前記ゼラチン混合溶液に疎水基含有化合物を加えて所定の温度に加熱してから、攪拌混合して、反応溶液を調整する工程と、前記反応溶液を、０℃以下の有機溶媒中に滴下して、沈殿物を生成する工程と、前記沈殿物を濾過してから乾燥して、乾燥濾過物からなる塞栓剤を製造する工程と、を有する構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を容易に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施形態である塞栓剤の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態である塞栓剤の使用方法の一例を示す模式図である。
【図３】赤血球凝固体の一例を示す拡大模式図である。
【図４】アンカリング部分の一例を示す模式図である。
【図５】ゼラチンの一例を示す模式図である。
【図６】コレステリル酸クロライドの化学式を示す図である。
【図７】ゼラチンと疎水基酸クロライドとの反応の一例を示す反応図である。
【図８】（０％、３２％、３４％、６２％、８４％、８２％）コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンのＮＭＲ測定結果である。
【図９】（０％、３２％、３４％、６２％、８４％、８２％）コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンのＦＴ−ＩＲ測定結果である。
【図１０】０％（ｃｏｎｔｏｒｏｌ、ｂｕｆｆｅｒ）、１％、２％、５％，１０％の濃度にした２３％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンのリポソーム架橋能を示す写真（左下側から右上側にこの順で配置した）である。
【図１１】（左）１ｍｌ、４０ｍＭリポソーム溶液であり、（右）１ｍｌ、４０ｍＭリポソーム溶液に１ｍｌの７コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを加え、４０％ＰＢＳ溶液を１ｍｌ加え、３７℃で撹拌したサンプルを示す写真である。
【図１２】コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンのＧ’、Ｇ’’の時間及びコレステリル化濃度依存性を示すグラフである。
【図１３】２３％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの濃度依存性を示す写真である。
【図１４】ｃｏｎｔｒｏｌ、０％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン、７％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン、２５．３％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン、５１．２％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンの溶液１ｍｌを、１ｍｌ赤血球溶液に対して加えた後の状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である塞栓剤およびその製造方法について説明する。
【００２３】
（本発明の第１の実施形態）
＜塞栓剤＞
まず、本発明の第１の実施形態である塞栓剤について説明する。
図１は、本発明の実施形態である塞栓剤の一例を示す模式図である。
図１に示すように、本発明の実施形態である塞栓剤１１は、酵素分解性および細胞接着ペプチド配列を有するポリペプチド鎖２１と、ペプチド鎖２１のアミノ基にアミド結合２３を介して導入された疎水基２４と、を有する疎水化ゼラチンからなる。
酵素分解性および細胞接着ペプチド配列とは、それぞれ、ＬＧＰＡＧ（ロイシン‐グリシン‐プロリン‐アラニン‐グリシン）、ＲＧＤ（アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸）を含む配列である。
【００２４】
ポリペプチド鎖２１の分子量は、１万以上１０万以下であることが好ましく、５万以上１０万以下がより好ましい。これにより、赤血球を容易に絡めることができ、凝固速度を速めることができるとともに、凝固体を堅固にすることができる。
【００２５】
ポリペプチド鎖２１のすべてのアミノ基が疎水基２４で置換される必要はなく、ポリペプチド鎖２１のアミノ基２２の７％以上が、疎水基２４で置換されていればよい。これにより、動脈瘤内に導入した時に、赤血球の細胞膜に容易に疎水基２４をアンカリングさせて、赤血球を堅固に凝固させることができる。
【００２６】
疎水基２４は、コレステリル基、ステアリル基及びオレオイル基の群から選択されるいずれかであることが好ましい。これらの基は赤血球の細胞膜の膜厚程度の長さであるので、疎水基２４を赤血球の細胞膜に堅固に安定してアンカリングできる。
【００２７】
＜塞栓剤の使用方法＞
次に、本発明の実施形態である塞栓剤の使用方法について説明する。
図２は、本発明の実施形態である塞栓剤の使用方法の一例を示す模式図である。
まず、血管３１内にカテーテル５１を入れ、その先端を、動脈瘤３５と血管３１の連通部３５ｃから動脈瘤３５内に導入する。
次に、図２（ａ）に示すように、動脈瘤３５内に本発明の実施形態である塞栓剤１１を流入させ、充填する。塞栓剤１１は、先に記載したように、アミノ基２２を有するポリペプチド鎖２１と、ポリペプチド鎖２１のアミノ基の一部にアミド結合２３を介して導入された疎水基２４と、を有する疎水化ゼラチンからなる。
【００２８】
その後、体温程度で一定時間放置することにより、図２（ｂ）に示すように、塞栓剤１１と赤血球６１が凝集され、凝固されてなる赤血球凝固体１３を形成する。一定時間とは動脈瘤の大きさ、赤血球濃度、疎水基の濃度等に依存するが、１分以上６０時間以下とすればよい。
ポリペプチド鎖２１は酵素分解性および細胞接着ペプチド配列を有するので、生分解性・生体吸収性がある。また、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持ち、連通部３５ｃを塞ぐように、血管内皮細胞１５を容易に形成できる。
【００２９】
図３は、赤血球凝固体の一例を示す拡大模式図である。図３に示すように、塞栓剤１１は、ポリペプチド鎖２１を複数の赤血球に絡めて凝集するとともに、疎水基２４を赤血球に突き刺し、アンカリングすることにより、赤血球凝固体１３を形成する。
図４は、アンカリング部分の一例を示す模式図である。図４に示すように、疎水基２４が赤血球６１の脂質二分子膜に突き刺さり、疎水化ゼラチンは複数の赤血球６１の脂質二分子膜にアンカリングされる。これにより、赤血球凝固体１３が形成される。
【００３０】
＜塞栓剤の製造方法＞
次に、本発明の実施形態である塞栓剤の製造方法について説明する。
本発明の実施形態である塞栓剤の製造方法は、ゼラチン混合溶液調整工程Ｓ１と、反応溶液調整工程Ｓ２と、沈殿物生成工程Ｓ３と、塞栓剤製造工程Ｓ４と、を有する。
【００３１】
［ゼラチン混合溶液調整工程Ｓ１］
まず、有機溶媒にゼラチンを溶解させて、ゼラチン混合溶液を調整する。
有機溶媒は、例えば、ＤＭＳＯを用いる。濃度を調整し、攪拌混合することにより、室温においても、十分溶解させることができる。なお、ゼラチン４５が分解しない温度までであれば、加熱してもよい。
【００３２】
図５は、ゼラチンの一例を示す模式図である。図５に示すように、ゼラチン４５は、アミノ基２２を有するポリペプチド鎖２１である。
ゼラチン４５としては、具体的には、ウシ骨ゼラチン、ダチョウ皮ゼラチン、ブタ皮ゼラチン又はティラピア鱗ゼラチンを用いることができ、このうち、ティラピア鱗ゼラチンが好ましい。
ゼラチン４５は、アルカリ処理又は酸処理したもののどちらでもよい。
【００３３】
［反応溶液調整工程Ｓ２］
次に、ゼラチン混合溶液に疎水基含有化合物を加え、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を加えて所定の温度に加熱してから、攪拌混合して、反応溶液を調整する。
ゼラチン混合溶液の加熱温度は、５０℃以上１００℃以下の温度範囲とすることが好ましい。また、加熱時間は、２４時間以上とすることが好ましい。
【００３４】
疎水基含有化合物４６としては、コレステリル酸クロライド、ステアロイルクロライド、オレオイルクロライドの群から選択されるいずれか一の化合物を用いることができる。図６は、コレステリル酸クロライドの化学式を示す図であり、疎水基はコレステリル基である。
【００３５】
図７は、ゼラチンと疎水基を有する酸クロライドとの反応の一例を示す反応図である。例えば、疎水基Ｒは、図６に示すコレステリル基である。
図７に示すように、ゼラチン４５と疎水基を有する酸クロライド４６が接近すると、疎水基を有する酸クロライド（疎水基含有化合物４６）において、ゼラチン４５のアミノ基の窒素にある電子がカルボニル基の炭素を求核攻撃し、アミド結合を形成する。
この方法を用いることにより、ゼラチン４５のアミノ基の置換割合を、容易に制御することができ、反応物の組成を仕込みとほとんど等しくできる。
【００３６】
［沈殿物生成工程］
次に、反応溶液を、０℃以下の有機溶媒中に滴下して、沈殿物を生成する。
反応溶液を、０℃以下の有機溶媒中に滴下することにより、有機溶媒中で直ちに沈殿物を生成することができる。
滴下速度は、１ｍｌ／分以上１０ｍｌ／分以下とすることが好ましく、３ｍｌ／分以上５ｍｌ／分以下とすることがより好ましい。
【００３７】
［塞栓剤製造工程］
次に、前記沈殿物を濾過してから乾燥して、乾燥濾過物からなる塞栓剤を製造する。濾過後、洗浄してから、乾燥することが好ましい。不純物をより除去できるためである。
濾過・洗浄・乾燥の順番は、この順番に限られる訳ではなく、まず、洗浄してから、濾過し、その後、再び、洗浄してから、乾燥する工程としてもよい。また、洗浄を複数回繰り返してもよい。更にまた、濾過、洗浄、乾燥してから、再び洗浄、濾過して、乾燥してもよい。
洗浄は、例えば、有機溶媒中で沈殿物を生成してから、有機溶媒中で沈殿物をパウダー状に崩壊してから、エタノール及び酢酸エチルのいずれか又は両方からなる有機溶媒で分散洗浄する。
乾燥は、減圧乾燥又は凍結乾燥することが好ましい。これにより、不純物を少なくできる。
以上の工程により、アミノ基を有するポリペプチド鎖と、前記ポリペプチド鎖のアミノ基の一部にアミド結合を介して導入した疎水基を有する疎水化ゼラチンからなる塞栓剤を製造することができる。
【００３８】
前記塞栓剤には、更に、脂質集合体を混合してもよい。これにより、生分解性・生体吸収性を向上させることができる。
前記脂質集合体は、リポソーム、赤血球及び細胞の群から選択されるいずれかであることが好ましい。
【００３９】
本発明の実施形態である塞栓剤１１は、アミノ基２２を有し、酵素分解性および細胞接着ペプチド配列を有するポリペプチド鎖２１と、ポリペプチド鎖２１のアミノ基にアミド結合２３を介して導入された疎水基２４と、を有する疎水化ゼラチンからなる構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を提供できる。
【００４０】
本発明の実施形態である塞栓剤１１は、疎水基２４がコレステリル基、ステアリル基及びオレオイル基の群から選択されるいずれかである構成なので、疎水基を赤血球の脂質二分子膜に突き刺してアンカリングして、複数の赤血球を強固に凝固して赤血球凝固体を形成できる。
【００４１】
本発明の実施形態である塞栓剤１１は、ポリペプチド鎖２１のアミノ基の７％以上に、疎水基２４が導入されている構成なので、疎水基を赤血球の脂質二分子膜に突き刺してアンカリングして、複数の赤血球を強固に凝固して赤血球凝固体を形成でき、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を提供できる。
【００４２】
本発明の実施形態である塞栓剤１１は、ポリペプチド鎖２１の分子量が１万以上１０万以下であるので、ポリペプチド鎖が複数の赤血球を絡めて凝集して赤血球凝固体を形成でき、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を提供できる。
【００４３】
本発明の実施形態である塞栓剤１１は、更に、脂質集合体が混合されている構成なので、生分解性・生体吸収性を向上させることができる。
【００４４】
本発明の実施形態である塞栓剤１１は、前記脂質集合体が、リポソーム、赤血球及び細胞の群から選択されるいずれかである構成なので、生分解性・生体吸収性を向上させることができる。
【００４５】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、有機溶媒にゼラチン４５を溶解させて、ゼラチン混合溶液を調整する工程と、前記ゼラチン混合溶液に疎水基含有化合物を加えて所定の温度に加熱してから、攪拌混合して、反応溶液を調製する工程と、前記反応溶液を、０℃以下の有機溶媒中に滴下して、沈殿物を生成する工程と、前記沈殿物を濾過してから乾燥して、乾燥濾過物からなる塞栓剤を製造する工程と、を有する構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を容易に製造できる。
【００４６】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、ゼラチン４５がウシ骨ゼラチン、ダチョウ皮ゼラチン、ブタ皮ゼラチン又はティラピア鱗ゼラチンである構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を容易に製造できる。
【００４７】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、ゼラチン４５がアルカリ処理又は酸処理したものである構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を容易に製造できる。
【００４８】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、前記疎水基含有化合物がコレステリルクロロフォーメート、ステアロイルクロライド、オレオイルクロライドの群から選択されるいずれか一の化合物である構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を、アミノ基に対する疎水基の導入割合を精密に制御して、容易に製造できる。
【００４９】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、前記有機溶媒がＤＭＳＯである構成なので、ゼラチンを均一に分散させたゼラチン混合溶液を容易に調製できる。
【００５０】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、前記ゼラチン混合溶液の加熱温度が５０℃以上１００℃以下の温度範囲である構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を容易に製造できる。
【００５１】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、前記ゼラチン混合溶液の加熱時間が２４時間以上である構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を容易に製造できる。
【００５２】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、前記沈殿物を生成する工程で、沈殿物を崩壊してパウダー状にして、エタノール及び酢酸エチルのいずれか又は両方からなる有機溶媒で分散洗浄する構成なので、不純物を低減して、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を製造できる。
【００５３】
本発明の実施形態である塞栓剤１１の製造方法は、前記塞栓剤を製造する工程で、減圧乾燥又は凍結乾燥する構成なので、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤を容易に製造できる。
【００５４】
本発明の実施形態である塞栓剤およびその製造方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
まず、表１に示すゼラチン及び表２に示す試薬（疎水基含有化合物）を準備した。
【００５６】
【表１】
2014004201.tif 000003
【００５７】
【表２】
2014004201.tif 000004
【００５８】
次に、これらのゼラチン及び試薬（疎水基含有化合物）を用いて、以下の疎水化ゼラチンを合成した。
【００５９】
（実施例１）
＜コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの合成＞
・  まず、アルカリ処理ブタ皮ゼラチンを４０ｇ（仕込み量）秤量し、あらかじめＤＭＳＯを４９５ｍｌ入れたナスフラスコに入れ、アルカリ処理ブタ皮ゼラチン溶解した。これにより、ＤＭＳＯ：アルカリ処理ブタ皮ゼラチン＝４９５ｍｌ：４０ｇで全体（系）が５００ｍｌとなる溶液を調整した。
・  次に、５ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加え、よく撹拌した。
・  次に、ゼラチン中に含まれるアミノ基の総数に対して疎水基の総数が２％となるように所定量のコレステリルクロロフォーメート（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）を加え、一昼夜（２４時間）８０℃下にて撹拌した。
・  次に、１５００ｍｌの氷冷エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）に反応溶液を滴下し、再沈殿させた。
・  次に、十分に撹拌し、滴下時の塊を崩壊させ、パウダー状とした。
・  次に、１５００ｍｌのエタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）にて３度、分散洗浄を行った。
・  次に、１５００ｍｌの酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ  Ａｃｅｔａｔｅ）にて３度、分散洗浄を行った。
・  次に、濾取物を、室温下において減圧乾燥した。
以上の工程により、コレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチンを合成した。
【００６０】
これにより、実施例１−１として、１４％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンを合成した。
コレステリルクロロフォーメート量を変えた他は同様にして、実施例１−２〜１−９として、それぞれ（２３％、３２％、３４％、４１％、５６％、６２％、８１％、８４％）コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンを合成した。
【００６１】
（実施例２）
＜コレステリル化アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンの合成＞
アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの代わりにアルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを用いた他は実施例１と同様にして、コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。実施例２−１〜２−５として、それぞれ（７％、２３％、２５％、５１％、５２％）コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
【００６２】
（実施例３）
＜ステアリル化酸処理ティラピア鱗ゼラチン（Ｓｔｅ−酸処理ティラピア鱗ゼラチン）の合成＞
アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの代わりに酸処理ティラピア鱗ゼラチンを用い、コレステリルクロロフォーメートの代わりにステアロイルクロライド（Ｓｔｅａｒｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いた他は実施例１と同様にして、Ｓｔｅ−酸処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
実施例３−１〜３−３として、それぞれ（１８％、１０％、３５％）Ｓｔｅ−酸処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
【００６３】
（実施例４）
＜ステアリル化アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン（Ｓｔｅ−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン）の合成＞
アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの代わりにアルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを用い、コレステリルクロロフォーメートの代わりにステアロイルクロライドを用いた他は実施例１と同様にして、Ｓｔｅ−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
実施例４として、４４％Ｓｔｅ−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
【００６４】
（実施例５）
＜オレイル化酸処理ティラピア鱗ゼラチン（Ｏｌｅ−酸処理ティラピア鱗ゼラチン）の合成＞
アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの代わりに酸処理ティラピア鱗ゼラチンを用い、コレステリルクロロフォーメートの代わりにオレオイルクロライド（Ｏｌｅｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いた他は実施例１と同様にして、Ｏｌｅ−酸処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
実施例５−１〜５−２として、それぞれ（６％、８％）Ｏｌｅ−酸処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
【００６５】
（実施例６）
＜オレイル化アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン（Ｏｌｅ−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン）の合成＞
アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの代わりにアルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを用い、コレステリルクロロフォーメートの代わりにオレオイルクロライドを用いた他は実施例１と同様にして、Ｏｌｅ−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
実施例６として、７８％Ｏｌｅ−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
【００６６】
（実施例７）
＜コレステリル化−酸処理ティラピア鱗ゼラチンの合成＞
アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの代わりに酸処理ティラピア鱗ゼラチンを用いた他は実施例１と同様にして、コレステリル化−酸処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
実施例７−１〜７−２として、それぞれ（４２％、２２％）コレステリル化−酸処理ティラピア鱗ゼラチンを合成した。
【００６７】
以上のようにして、合成した疎水化ゼラチンのサンプル番号、略称及び収率（Ｙｉｅｌｄ）を表１に示す。
【００６８】
【表３】
2014004201.tif 000005
【００６９】
＜１．合成した疎水化ゼラチンの疎水基導入率評価＞
・  まず、９６個のｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用意した。
・  次に、０．１％ｈｍ−ＦｉｓｈＧｅｌａｔｉｎ／ＤＭＳＯ、検量線用２−Ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｏｌを５０μｌ／ｗｅｌｌ準備した。
・  次に、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／ＤＭＳＯを２５μｌ／ｗｅｌｌ加えた。
・  次に、０．１％ＴＥＡ／ＤＭＳＯを５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。
・  次に、０．１％トリニトロベンゼンスルホンサン（ＴＮＢＳ）／ＤＭＳＯを５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。
・  次に、２ＮのＨＣｌ／ＤＭＳＯを２５μｌ加えて反応を止め、３４０ｎｍで吸光度を測定した。
これにより、合成した疎水化ゼラチンの疎水基導入率（Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を算出した（表１）。
【００７０】
＜２．合成した疎水化ゼラチンの１Ｈ−ＮＭＲによるキャラクタリゼーション＞
（０％、３２％、３４％、６２％、８４％、８２％）コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチン（比較例１、実施例１−３、１−４、１−７、１−８、１−９）を用いて、０．１％ＤＭＳＯ−ｄ６溶液を調整し、そのＮＭＲ測定を行った。
【００７１】
図８は、（０％、３２％、３４％、６２％、８４％、８２％）コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンのＮＭＲ測定結果である。
図８に示すように、３２％、３４％、６２％、８４％、８２％のコレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンについてはいずれも、０％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチン（ＡｌＧｅｌａｔｉｎ）では見られなかったコレステリル基の炭素番号１８および２１に由来するピークを確認した。これにより、アルカリ処理ブタ皮ゼラチンに対してコレステリル基の導入を確認した。
【００７２】
＜３．合成した疎水化ゼラチンのＦＴ−ＩＲによるキャラクタリゼーション＞
（０％、３２％、３４％、６２％、８４％、８２％）コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチン（比較例１、実施例１−３、１−４、１−７、１−８、１−９）を用いて、０．１％ＤＭＳＯ−ｄ６溶液を調整し、そのＦＴ−ＩＲ測定を行った。
【００７３】
図９は、（０％、３２％、３４％、６２％、８４％、８２％）コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンのＦＴ−ＩＲ測定結果である。図９では、アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの名称の代わりにＡｌＧｅｌａｔｉｎを用いている。ｐｕｒｅ―ＡｌＧｅｌａｔｉｎは、疎水化する前のアルカリ処理ブタ皮ゼラチンである。また、比較のために、コレステリルクロロフォーメートの結果も合わせて示している。
３３５２ｃｍ−１付近においてアミノ基に由来するピークがコレステリル基の導入率の増加に従って減少した。これにより、アルカリ処理ブタ皮ゼラチンのアミノ基に対してコレステリル基が導入されていることが判明した。
【００７４】
＜４．合成した疎水化ゼラチンのリポソームに対する架橋能評価＞
［ＤＯＤＡＢリポソームの調製］
まず、１００ｍｌのナスフラスコ中でＤｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＤＯＤＡＢ）を１００ｍｇ、１０ｍｌのクロロホルムに溶解させた。
次に、エバポレーターを用い減圧乾燥してクロロホルムを揮発させ、ＤＯＤＡＢ脂質二分子膜をフラスコ壁面に形成させた。
次に、その後さらに減圧乾燥機にて一昼夜（２４時間）乾燥してクロロホルムを排除した。
【００７５】
次に、そこに所定の脂質濃度となるように５０℃以上に加熱したＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）を加え、十分にボルテックス処理を行うことで脂質膜をフラスコ壁面から剥がした。
次に、５０℃の水中で超音波処理を行った。
次に、ドライヤーにてシリンジ及び１００ｎｍのメンブレン部分を高温環境とした。
次に、そのメンブレンに超音波処理を行ったリポソーム懸濁液を透過させ、エクストルージョン法により粒径の調製を行い、粒径２２１ｎｍ程度のＤＯＤＡＢリポソームを得た。
【００７６】
［リポソームゲルの形成の確認］
まず、粉末の２３％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、０％（ｃｏｎｔｏｒｏｌ、ｂｕｆｆｅｒ）、１％、２％、５％，１０％の濃度にした２３％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチン溶液を調製した。得られたコレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチン溶液１ｍｌを、２０ｍＭリポソーム溶液１ｍｌに添加し、３７℃で緩やかに撹拌した。
【００７７】
図１０は、０％（ｃｏｎｔｏｒｏｌ、ｂｕｆｆｅｒ）、１％、２％、５％，１０％の濃度にした２３％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンのリポソーム架橋能を示す写真である。
図１０からわかるように、２０ｍＭリポソーム溶液に添加する２３％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチン溶液の濃度が上昇するに従って粘度が上昇した。これにより、２３％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチン濃度が上昇するに従ってリポソーム架橋能が向上したことが示された。
【００７８】
図１１は、４０ｍＭリポソーム溶液に１ｍｌに４０％濃度の７％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン  ＰＢＳ溶液１ｍｌを添加前後のサンプルを示す写真である。
図１１に示すように、７％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン添加前（図１１左）は、ゾル状であったが、添加後（図１１右）にはゲル状となった。このことから、７％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンはリポソーム架橋能を持つことが定性的に示めされた。
【００７９】
［リポソームゲルのレオロジー測定］
レオメーター（Ｐｈｙｓｉｃａ  ＭＣＲ３０１、Ａｎｔｏｎ  Ｐｅｅｒ）を用いて、レオロジー測定を行った。測定ギャップは１ｍｍ、測定時の周波数は１Ｈｚとした。
【００８０】
［コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンのリポソーム架橋能時間依存性測定］
コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンのゲル化能の時間依存性を測定した。測定環境はリポソーム架橋能評価に準じた。
図１２は、コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンのＧ’、Ｇ’’の時間及びコレステリル化濃度依存性を示すグラフである。
図１２からわかるように、７％コレステリル化−，２５％コレステリル化−，５１％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンはすべての時間においてはＧ’がＧ’’よりも優位であり、ゲル化していることが示された。
一方で、コレステリル化基を導入していない０％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンはＧ’’がＧ’よりも優位であり、ゲル化していないことが示された。
これらの結果から、リポソームゲルがコレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンのコレステリル基の影響によってゲル化していることが示唆され、コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンのリポソーム架橋能が定量的に示された。
【００８１】
＜５．合成した疎水化ゼラチンの血液凝固能評価＞
［疎水化ゼラチンの血液凝固能評価］
疎水化ゼラチンは、粉末状、もしくはＰＢＳ溶液にしたものを血液に添加し、３７℃にて緩やかに撹拌したものを目視によって確認した。
【００８２】
［コレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの血液凝固能評価］
まず、合成した粉末状のコレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンを１ｍｌクエン酸加血に添加し、３７℃インキュベータにて緩やかに撹拌した。コレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチン濃度はそれぞれ、１％、２％、５％、１０％とした。
【００８３】
図１３は、２３％コレステリル化−アルカリ処理ブタ皮ゼラチンの濃度依存性を示す写真である。コレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチン濃度は、それぞれ、０％（図でｃｏｎｔｒｏｌのラベルを付している、ｂｕｆｆｅｒ）、１％（図の（ｉ））、２％（図の（ｉｉ））、５％（図の（ｉｉｉ））、１０％（図の（ｉｖ））である。なお、（ｉ）〜（ｉｖ）のラベルは８％を付している。コレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチン濃度が増加するにしたがって、血液凝固能が向上した。
【００８４】
また、コレステリル基導入量を変化させた場合のコレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチン濃度１０％における血液凝固能の変化を検討した結果、コレステリル基導入率が０％、１４％、２３％と増加するにしたがって、血液凝固能が向上した。
【００８５】
［コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンの血液凝固能評価］
コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンは０．１ＭのｐＨ７．４ＰＢＳに溶解させ、溶液としたものを用いた。コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン溶液はクエン酸加血１ｍｌに対して１ｍｌを加え、３７℃で緩やかに撹拌、凝固の有無を確認した。血液凝固を目視により観察した。
表４は、コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンの血液凝固の状態をコレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチン濃度とコレステリル化導入率をパラメータとして示す表である。色の濃い部分は血液凝固能が高かったものである。
【００８６】
【表４】
2014004201.tif 000006
【００８７】
コレステリル化アルカリ処理ブタ皮ゼラチン濃度の上昇、およびコレステリル化基導入率の増加に従って血液凝固能は向上していた。
７％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンは全体として血液凝固を示していなかったものの、溶液中に血球凝集塊を形成していた。
図１４は、ｃｏｎｔｒｏｌ、０％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン、７％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン、２５．３％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチン、５１．２％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンの溶液１ｍｌを、１ｍｌ赤血球溶液に対して加えた後の状態を示す写真である。
【００８８】
図１４からわかるように、コレステリル化基導入率が上昇するにしたがって赤血球の凝集能は向上していることが示された。
特に、５１．２％コレステリル化−アルカリ処理ティラピア鱗ゼラチンでは、流動性の低い、比較的強固な血球凝集塊が形成されていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の塞栓剤およびその製造方法は、生分解性・生体吸収性があり、血管内皮細胞の接着・足場としての機能を持つ生体材料からなる塞栓剤に関するものであり、動脈瘤を防止する塞栓剤製造産業等において利用可能性がある。
【符号の説明】
【００９０】
１１…疎水化ゼラチン（塞栓剤）、１３…赤血球凝固体、１５…血管内皮細胞、２１…ポリペプチド鎖（ゼラチン、ゼラチン高分子鎖）、２２…アミノ基、２３…アミド結合、２４…疎水基、３１…血管、３５…動脈瘤、３５ｃ…連通部、４１…皮膚、４５…ゼラチン、４６…疎水基含有化合物、５１…マイクロカテーテル、６１…赤血球（赤血球細胞：ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）、６１ｄ…脂質二分子膜。
【図１】
2014004201.tif 000007
【図２】
2014004201.tif 000008
【図３】
2014004201.tif 000009
【図４】
2014004201.tif 000010
【図５】
2014004201.tif 000011
【図６】
2014004201.tif 000012
【図７】
2014004201.tif 000013
【図８】
2014004201.tif 000014
【図９】
2014004201.tif 000015
【図１０】
2014004201.tif 000016
【図１１】
2014004201.tif 000017
【図１２】
2014004201.tif 000018
【図１３】
2014004201.tif 000019
【図１４】
2014004201.tif 000020