(57)【要約】【課題】  異種タンパク質を発現可能な大腸菌の培養液から、エンドトキシン含量の少ない前記タンパク質を取得するための精製方法を提供すること。【解決の手段】  タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物に第四級アンモニウム塩を添加後、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むクロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する方法により、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物から、クロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する方法であって、
前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから前記クロマトグラフィーによる精製を行ない、かつ前記クロマトグラフィーによる精製が陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含む、前記精製方法。
【請求項２】
第四級アンモニウム塩が臭化セチルトリメチルアンモニウム塩である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製が、カルボキシメチル基を導入した担体を用いた精製である、請求項１または２のいずれかに記載の精製方法。
【請求項４】
タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の精製方法。
【請求項５】
ヒトＦｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
請求項４に記載の精製方法。
【請求項６】
ヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物に第四級アンモニウム塩を添加後、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むクロマトグラフィーによる精製を行なうことで得られた、ヒトＦｃ結合性タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載のヒトＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化して得られる、免疫グロブリン吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種タンパク質を発現可能な大腸菌の培養液から、前記タンパク質を精製する方法に関する。特に本発明は、前記培養液からエンドトキシン含量の少ない前記タンパク質を取得するための精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的手法を用いて大腸菌で異種タンパク質を発現させる場合、大腸菌をはじめとするグラム陰性菌には、細胞膜の構成成分であるリポ多糖やタンパク質の複合体からなるエンドトキシンが多く含まれている。エンドトキシンは哺乳類の体内に混入すると、発熱を促すサイトカインを放出したり、細胞死を誘発するなど毒性を示す（非特許文献１）。そのため大腸菌で発現した異種タンパク質を、特に医薬品用途で使用する際は、毒素ショックを避ける意味でも、前記タンパク質へのエンドトキシンの混入を避ける必要がある。
【０００３】
エンドトキシンを除去する従来の方法として、活性炭やエンドトキシンを特異的に吸着する多孔体で吸着除去する方法（特許文献１および２）や、限外ろ過膜やろ過助剤を利用したろ過法（特許文献３）などが知られている。しかしながらこれらの方法は、吸着によるタンパク質の失活や収量の低下が問題であった。また、エンドトキシンを完全に失活する方法として、２５０℃で３０分以上加熱する方法（第十四改正日本薬局方エンドトキシン試験法）や、酸／塩基によりエンドトキシンを分解する方法（特許文献４）が知られているが、これらの方法もタンパク質の失活や分解の問題を有していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−１１６２９８号公報
【特許文献２】特開２０１１−１０１８４６号公報
【特許文献３】特開２００８−０８８３１４号公報
【特許文献４】特開昭５８−０７３３７１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙ．Ｎａｋａｇａｗａ等，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．ＰａｒｔＢ：Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．，６６Ｂ，３４７，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、異種タンパク質を発現可能な大腸菌の培養液から、エンドトキシン含量の少ない前記タンパク質を取得するための精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、異種タンパク質を発現可能な大腸菌の抽出物から前記タンパク質を精製する際に、前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むクロマトグラフィーによる精製を行なうことで、エンドトキシン含量の少ない前記タンパク質を取得できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する： 
（ｉ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物から、クロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する方法であって、前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから前記クロマトグラフィーによる精製を行ない、かつ前記クロマトグラフィーによる精製が陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含む、前記精製方法。
【０００９】
（ｉｉ）第四級アンモニウム塩が臭化セチルトリメチルアンモニウム塩である、（ｉ）に記載の精製方法。
【００１０】
（ｉｉｉ）陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製が、カルボキシメチル基を導入した担体を用いた精製である、（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかに記載の精製方法。
【００１１】
（ｉｖ）タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載の精製方法。
【００１２】
（ｖ）ヒトＦｃ結合性タンパク質が、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、（ｉｖ）に記載の精製方法。
【００１３】
（ｖｉ）ヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物に第四級アンモニウム塩を添加後、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むクロマトグラフィーによる精製を行なうことで得られた、ヒトＦｃ結合性タンパク質。
【００１４】
（ｖｉｉ）（ｖｉ）に記載のヒトＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化して得られる、免疫グロブリン吸着剤。
【００１５】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物から、クロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する際、前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから前記クロマトグラフィーによる精製を行ない、かつ前記クロマトグラフィーによる精製が陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明における、組換え大腸菌の抽出物は、組換え大腸菌の培養液を遠心分離して得られる菌体を適切な緩衝液で懸濁してから細胞を破砕（物理的破砕、薬剤による破砕等）後、遠心分離により破砕残渣を除去することで取得することができる。破砕に用いる薬剤の一例として、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと６ｍＭ  ＭｇＳＯ４と２５０Ｕ／Ｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）と０．３ｇ／Ｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅと０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）と０．０５％  デオキシコール酸ナトリウムと５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）があげられる。なお、細胞破砕後、ｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下で酸処理すると、破砕液に含まれる夾雑タンパク質が効率的に除去できるため、好ましい（特願２０１２−２４４４３５号）。
【００１８】
本発明の特徴の一つである、組換え大腸菌の抽出物に添加する第四級アンモニウム塩は、負電荷に帯電しているエンドトキシンを吸着除去できることが期待される。第四級アンモニウム塩の例としては、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム塩等のジアルキルジメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジウム等のアルキルピリジウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウムがあげられる。この中でも、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）が本発明で用いる第四級アンモニウム塩として好ましい。
【００１９】
第四級アンモニウム塩の添加濃度については、抽出物中の夾雑物の影響や臨界ミセル濃度などを考慮し、適宜設定すればよく、一例としてＣＴＡＢの場合、終濃度で０．０５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の間、好ましくは終濃度０．１％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の間、特に好ましくは終濃度０．３％（ｗ／ｖ）から０．７％（ｗ／ｖ）の間である。
【００２０】
本発明では、組換え大腸菌の抽出物に第四級アンモニウム塩を添加した後は、クロマトグラフィーによる精製を行なうが、その際、陽イオンクロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むことを特徴としている。陽イオンクロマトグラフィーによる精製で用いる担体の一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０（東ソー製）やＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）といったカルボキシメチル基を導入した担体や、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０（東ソー製）といったスルホプロピル基を導入した担体があげられる。中でも、カルボキシメチル基を導入した担体を用いて陽イオンクロマトグラフィーによる精製を行なうと好ましい。なお陽イオンクロマトグラフィーによる精製において、組換え大腸菌の抽出物や溶出に用いる緩衝液に尿素を添加すると、高純度かつ高い回収率でＦｃ結合性タンパク質を精製することができるため好ましい（特願２０１１−１２６０８４号）。
【００２１】
なお本発明における、クロマトグラフィーによる精製は、陽イオンクロマトグラフィーによる精製を少なくとも含んでいればよく、陽イオンクロマトグラフィー以外の原理を利用したクロマトグラフィーによる精製をさらに行なってもよい。特に、疎水クロマトグラフィーによる精製をさらに行なうと、組換え大腸菌の抽出物に含まれる夾雑物を効率的に除去できるため好ましい。疎水クロマトグラフィーによる精製で用いる担体の一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｅｔｈｅｒ−６５０（東ソー製）といったエーテル基を導入した担体や、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０（東ソー製）といったフェニル基を導入した担体や、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０（東ソー製）といったブチル基を導入した担体があげられる。中でも、フェニル基を導入した担体を用いて疎水クロマトグラフィーによる精製を行なうと好ましい。
【００２２】
クロマトグラフィーによる精製を行なう際は、精製対象溶液に含まれるタンパク量や各クロマトグラフィー用担体が有するタンパク吸着性能を考慮して決定した量の前記担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、クロマトグラフィー用担体は、精製対象溶液を導入する前に、あらかじめ適切な緩衝液（トリス／塩酸緩衝液、グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等）により平衡化しておくとよい。
【００２３】
本発明で精製したタンパク質の分析方法は、従来から知られている安定かつ効率的に定量できる方法の中から適宜選択すればよい。例えば、タンパク質濃度の測定はＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ製）等の市販のキットを用いればよく、精製溶液中に含まれるエンドトキシンの測定もＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（和光純薬製）等の市販のキットを用いればよい。
【００２４】
本発明の方法で精製するタンパク質は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌の菌体内に発現するタンパク質であれば特に限定されない。ここでは前記タンパク質の一例である、ヒトＦｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。
【００２５】
本明細書においてヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域（図１ではＥＣ領域））を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を構成するポリペプチドのうち、少なくとも抗体（免疫グロブリンＧ）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のヒトＦｃ結合性タンパク質があげられる。
【００２６】
本発明の精製方法で得られたタンパク質は、宿主（大腸菌）に多く含まれるエンドトキシンの含有量が大幅に削減されている。そのため、本発明の精製方法により得られたヒトＦｃ結合性タンパク質は、医薬品、バイオセンサー、臨床検査薬等の医薬品用途での利用が可能となる。特に本発明の精製方法で得られたヒトＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化すると、抗体医薬といった、医薬品用途で利用する免疫グロブリンを精製するための吸着剤としての利用ができるため好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物から、クロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する方法において、前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから前記クロマトグラフィーによる精製を行ない、かつ前記クロマトグラフィーによる精製が陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むことを特徴とする。本発明の精製方法は、組換え大腸菌の抽出物に多く含まれる、リポ多糖やタンパク質の複合体等のエンドトキシンを効果的に削減することができる。そのため、本発明の精製方法により得られた前記タンパク質は、医薬品用途目的に利用することができる。また本発明の精製方法は、スケールに関係なく実施できることから、前記タンパク質を工業的に生産する場合においても有用である。
【００２８】
特に、前記タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、本発明の精製方法で得られたヒトＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化することで、抗体医薬等医薬品用途で使用する免疫グロブリン吸着剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒト型ＦｃγＲＩの構造を示す図。
【実施例】
【００３０】
以下、ヒトＦｃ結合性タンパク質の精製を例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
（１）ヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、特開２０１２−０３４５９１号公報に記載の方法で培養することで、前記タンパク質を発現させた。
（２）組換え大腸菌の培養液より菌体を回収後、抽出液（６５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５０Ｕ／Ｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）、０．０５ｇ／Ｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を添加して回収した菌体を懸濁させ、さらに臭化セチルトリメチルアンモニウム塩（ＣＴＡＢ）を終濃度で０．５％（ｗ／ｖ）添加して撹拌することで、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
（３）（２）で得られた菌体抽出液に、酢酸を、液のｐＨが３．５となるよう、撹拌しながら滴下することで酸処理を行ない、遠心分離により回収した上清を酸処理液とした。
（４）酸処理液に尿素を終濃度１ｍｏｌ／Ｌとなるよう添加後、あらかじめ平衡化緩衝液Ａ（１ｍｏｌ／Ｌ  尿素を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０））で平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィー用ゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０、東ソー製）を充填したカラムに添加し、平衡化緩衝液Ａで十分洗浄後、１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液ＡでＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（５）（４）の溶出液を、特開２０１１−１２６８２７号に記載の疎水クロマトグラフィーを用いた方法によりヒトＦｃ結合性タンパク質を精製した。
（６）あらかじめ平衡化緩衝液Ｂ（脱エンドトキシン化した２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィー用ゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０、東ソー製）を充填したカラムに、（５）で精製したＦｃ結合性タンパク質溶液を添加した。
（７）平衡化緩衝液Ｂで十分量洗浄後、脱エンドトキシン化した１Ｍ  ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液Ｂで溶出することで、高度に精製したヒトＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を得た。
（８）タンパク質濃度をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド社製）で、エンドトキシン濃度をＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（和光純薬社製）で、それぞれ測定したところ、タンパク質あたりのエンドトキシン含有量は３．４ＥＵ／ｍｇであった（ＥＵ：エンドトキシン活性単位）。
【００３２】
実施例２
実施例１の（２）で添加するＣＴＡＢを終濃度で０．１％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、７．５ＥＵ／ｍｇであった。
【００３３】
実施例３
実施例１の（２）で添加するＣＴＡＢを終濃度で１％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、５．９ＥＵ／ｍｇであった。
【００３４】
比較例１
実施例１（２）でＣＴＡＢを添加しない他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、エンドトキシン含有量は＞１００ＥＵ／ｍｇであった。
【００３５】
比較例２
実施例１（４）および実施例１（６）に記載の陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行なわない他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、エンドトキシン含有量は＞１００００ＥＵ／ｍｇであった。
【００３６】
実施例および比較例の結果をまとめたものを表１に示す。タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物からクロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する際、前記抽出物に第四級アンモニウム塩であるＣＴＡＢを添加後、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を含むクロマトグラフィーによる精製を行なうことで、組換え大腸菌により得られた異種タンパク質であっても、エンドトキシンの含有がほとんどない異種タンパク質を製造することができることがわかる。
【００３７】
【表１】
2014118402.tif 000002
【図１】
2014118402.tif 000003
【配列表】
2014118402000001.app