(57)【要約】      （修正有）【課題】脂質分解活性の低減、脂肪消化の遅延、満腹ホルモンの増加による食欲の抑制、体重の減少、及び／又は血中脂質の低下のための、細胞膜を含む組成物又は前記細胞膜に由来する疎水性ペプチドの使用。【解決手段】少なくとも一つの細胞膜又はその部分を含む組成物であって植物から得られるチラコイド膜であり、前記チラコイド膜がクローバ、アブラナ、サトウダイコン、タンポポ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、タバコ、ヒマワリ、サラダ用生野菜、アカザ、ヤマホウレンソウ、ホウレンソウおよび草、またはその混合物から得られる組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物であって、
前記細胞膜またはその部分が植物から得られるチラコイド膜であり、
食欲の抑制、食物摂取の減少、および／または体重の低下に使用するための組成物。
【請求項２】
前記チラコイド膜またはその部分が、クローバ、アブラナ、サトウダイコン、タンポポ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、タバコ、ヒマワリ、サラダ用生野菜、アカザ、ヤマホウレンソウ、ホウレンソウおよび草、またはその混合物から得られる請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、細胞膜タンパク質の少なくとも膜貫通部分を含み、前記膜貫通部分は疎水性アミノ酸残基を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、１５から２５までのアミノ酸残基を有する細胞膜疎水性ペプチドの少なくとも一つを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記疎水性ペプチドが、配列番号：１である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞膜またはその部分が、０．１μｍから５μｍのサイズ分布を有する請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、さらに薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または緩衝液を含む請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物であって、前記細胞膜またはその部分が植物から得られるチラコイド膜であり、
疾患または障害のいずれかとしてのメタボリック症候群および／または肥満症の治療で使用するための組成物。
【請求項９】
前記チラコイド膜またはその部分が、クローバ、アブラナ、サトウダイコン、タンポポ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、タバコ、ヒマワリ、サラダ用生野菜、アカザ、ヤマホウレンソウ、ホウレンソウおよび草、またはその混合物から得られる請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、さらに薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または緩衝液を含む請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
肥満症の治療で使用するための請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質分解活性の低減および／または脂肪消化の遅延、食欲と体重の抑制および／または血中脂質の低下のための、少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物の使用に関する。本発明は、また、食品組成物ならびに医薬品での前記疎水性ペプチドの使用、および前記組成物により哺乳類を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
太り過ぎおよび肥満は、ますます世界的な問題となってきている。肥満は、特定の癌形態ばかりではなく、糖尿病、動脈硬化症、高血圧症等、いくつかの疾病の合併症の増加をもたらす。高脂肪食餌は、それが単独であれ、ショ糖を添加したものであれ、これらの食餌が容易に過食を促すので、肥満をもたらす最も重要な因子の一つである。したがって、食物脂肪に対する食欲コントロールを最適化することにより肥満を減らすことは大変重要である。腸内への脂肪注入により実証されているように、脂肪に対する満腹感（ｓａｔｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｆａｔ）は主として腸からの働きかけによるものであり、この満腹感が食物摂取量を減らすのである（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．Ｐ．，  Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍａｔｉｃ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５８：  ５５９−５６９，  １９９６）。これらの条件下で食物摂取量が抑制される理由は、腸粘膜に脂肪が接触することにより腸内に様々な満腹ペプチドが放出されるからである。食物脂肪の産物である脂肪酸は産生直後に吸収されるので、脂肪消化率の減少が、脂肪に対する満腹感を理論上最適化することになろう。
【０００３】
腸での脂肪消化中の重要な酵素は膵臓リパーゼである。肥満に抗する薬剤としてリパーゼ阻害剤（ゼニカル）を使用することは十分に確立されている（Ｓｊｏｓｔｒｏｍ  Ｌ．  他，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５２：  １６７−１７２，  １９９８）。リパーゼ阻害剤は体重を減らすだけでなく、抗インシュリン性を改善する。したがって、このような知見は、脂肪に対する満腹感およびインシュリン感受性に対する腸の脂肪消化の役割に関する強力な証拠を提供する。このリパーゼ阻害剤の短所は、すべての型のリパーゼを阻害し、大きく損なわれた脂肪消化に起因して脂肪便症を生ずることである。したがって、副作用として脂肪便症（ｓｔｅａｔｏｒｒｈｅａ）をもたらさずに、より穏やかな方法で脂肪消化を遅らせる天然の化合物を開発することが最重要である。本願発明者は、脂肪消化を遅らせて、満腹ホルモンを増すことによって食欲を抑制し、血清トリグルセリドレベルを下げる、高い栄養価の天然の化合物を発見した。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、脂質分解活性の低減および／または脂肪消化の遅延、食欲と体重の抑制および／または血中脂質の低下のための、組成物の使用に関する。脂質分解活性の低下により脂肪消化は遅延し、食欲が抑制され、それによって、例えば肥満を予防する満腹感が促進される。
【０００５】
第一の局面において、本発明は、脂質分解活性の低減、および／または脂肪消化の遅延、食欲と体重の抑制、および／または血中脂質の低下のための、少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物の使用に関する。
【０００６】
第二の局面によれば、本発明は、医薬組成物としての前記組成物の使用に関する。
【０００７】
第三の局面によれば、本発明は、食品組成物としての前記組成物の使用に関する。
【０００８】
本発明の組成物を使用して、例えば、疾患または障害としてのメタボリック症候群の治療のために、食欲を調整してもよい。
【０００９】
定義
本出願および本発明の文脈中、以下の定義を適用する：
用語「細胞膜」は、動物、植物または微生物起源の修飾もしくは未修飾の天然または合成的に作られた生体細胞膜を意味するものとし、そこでの細胞膜は、該細胞膜の疎水性ペプチドまたは疎水性蛋白質のような、細胞膜の部分または部分および完全な細胞膜の混合物、ならびに完全な細胞膜またはその画分を含む。細胞膜の部分は０．１から０．５μｍの間にあり、一つまたは複数の膜貫通ペプチドをもっぱら含むだろう。
【００１０】
用語「疎水性ペプチド」は、アルギニンおよびグルタミン酸のような荷電残基をともなう少数のアミノ酸と共に、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、トリプトファン、メチオニン、グリシン、システインから成る群からの選択された、疎水性アミノ酸残基を少なくとも８５％有するペプチドを意味する。
【００１１】
用語「脂質分解活性」は、リパーゼによる脂質の加水分解率を意味するように意図される。
【００１２】
用語「膜貫通ペプチド」は、少なくともタンパク質の膜貫通部分を形成するアミノ酸残基を意味する。ペプチドは、１５から２５の間のアミノ酸残基で構成される一続きおよびその重複等、一つの膜貫通タンパク質の一つまたは複数の膜貫通部分であってよい。
【００１３】
組成物
本発明は、脂質分解活性の低減および／または脂肪消化の遅延、食欲と体重の抑制および／または血中脂質の低下のための、少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物の使用に関する。脂質分解活性の低減により、脂肪消化を遅延させ、食欲と体重を抑制しおよび／または血中脂質を低下させることが可能である。それによって、効率的に人間または他の動物等の哺乳類の食欲を調整することが初めて可能である。脂質分解活性の調節を可能にすることによって、腸において脂肪酸がゆっくり形成されることで満腹感が促がされ、これが持続することになる。
【００１４】
組成物は、少なくとも生体タンパク質の膜貫通部分を含んでもよく、該膜貫通部分は疎水性アミノ酸残基を含む。したがって、組成物は生体膜またはその一部を含んでおり、該生体膜は少なくとも該疎水性ペプチドを含む。組成物は、同一のタンパク質または異なるタンパク質に由来する２、３、４または５つの疎水性ペプチド等、少なくとも一つの、約１５からの約２５のアミノ酸残基を有する細胞膜疎水性ペプチドを含んでもよく、組成物は構成されてもよい。
【００１５】
生体細胞膜は、例えばすべての生細胞の中に生じて、細胞量の大部分を構成する。本発明に記載の細胞膜画分の例は、動物、植物、藻類、微生物からの得られた細胞膜画分、またはそれらの部分の細胞膜画分であり、それらは合成物またはその混合物である。原核生物では一重または二重の細胞膜があり、光合成細菌では光合成膜であるチラコイドもある。真核生物では、膜は細胞膜、小胞体、ゴルジ膜、核膜、リソソーム膜、ミトコンドリア膜を含み、緑藻類および植物については、２つのエンベロープ膜および光合成膜（チラコイド）を含む葉緑体膜も有する。生体膜はタンパク質および脂質からなる。生体膜はすべて、疎水性アミノ酸からなる一つまたはいくつかの膜貫通ポリペプチド鎖を伴う内在性膜タンパク質を含んでいる。リン脂質およびガラクトリピドのようなほとんどの脂質は、内在性の膜／膜貫通タンパク質が包埋される二重層を形成する。さらに、表在性蛋白質は膜の表面へ付着されている。チラコイドは植物、緑藻類で、および藍色細菌および紅色細菌のような光合成細菌で光合成を担う。チラコイド膜は、約７０／３０パーセントの比率でタンパク質および脂質を含む。膜中には１００種類を超えるタンパク質が存在している。脂質画分は、オメガ−３型を主要脂肪酸とするガラクトリピドが占めている。さらに、チラコイド膜はいくつかの異なる色素である、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、プラストキノン、カロテノイド類のβ−カロチン、ルテイン、ビオラキサンチンおよびネオキサンチンを含んでいる。これはチラコイドが高い栄養価の組成物を有していることを意味し、同じことがチラコイドと同一または実質的に同一の組成物を有している合成膜にも当てはまる。すなわち、チラコイドだけでなく葉緑体も、本発明の食品製品でも食品添加物でも使用されてよい。生体膜の例は葉緑体またはチラコイド膜であり、これらの膜は、クローバ、アブラナ、サトウダイコン、タンポポ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、タバコ、ヒマワリ、サラダ用生野菜、アカザ、ヤマホウレンソウ、ホウレンソウおよび草、またはその混合物から得られてもよい。
【００１６】
したがって、組成物が少なくとも一つの疎水性ペプチドを含む場合、該ペプチドは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２４アミノ酸残基長を有していてもよい。ペプチドの例は、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３またはその混合物で示され、ペプチドはお互いに操作しやすく結合されてもよい。アミノ酸残基は、アルギニンおよびグルタミン酸のような荷電残基を伴う少数のアミノ酸と共に、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、システインから成る群から選択されてもよい。アミノ酸残基およびペプチドは合成または天然存在物であってもよいし、同じことはアミノ酸残基に当てはまる、すなわち、それらが疎水性残基または荷電残基を伴う限り、それらは天然か合成アミノ酸残基であってもよい。膜画分は細胞膜画分であってもよく、より小さい断片の細胞膜を供給するために、一つまたは複数の酵素により処理される。
【００１７】
本発明の該生体膜またはその部分のサイズ分布は、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５または１．０μｍ等、０．１μｍから約５μｍであってよい。
【００１８】
さらに、疎水性ペプチドは約１から約５０までの追加アミノ酸残基を有してよく、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、ＰＥＧ化またはアルキル化によって修飾されてもよい。
【００１９】
光合成膜は、すべての生体膜で量に関しては地球上で最も豊富である。植物からの緑葉は、本発明の目的のための葉緑体膜の大量の単離および調製のために便利で豊富な材料源である。
【００２０】
生体膜は、各実施例において述べたような様々な方法で単離できる。最も一般的な方法は、最初に機械的に細胞を崩壊させることであり、異なる大きさおよび組成を持った膜小胞をもたらす。大きな細胞残屑を低速度遠心分離によって取り除き、次に上清の膜小胞を分画遠心分離または勾配遠心分離によって集める。代替としては、大きな細胞残屑がろ過によって取り除き、膜小胞は遠心分離によって集める。
【００２１】
遠心分離を含まない方法を計画することも可能である。この場合、大きな細胞残屑をろ過によって最初に取り除く。そして細胞膜を凝集させることができる。すなわち、以下に示すような異なる手順によって沈殿させた：
１．  沈殿時のｐＨに達するように、酸または塩基を追加する
２．  沈殿を誘導する、多かれ少なかれ荷電した異なる基を有するポリマーを追加する、
３．  小胞懸濁液を、例えば４０〜１００の℃間で加熱する。
【００２２】
４．  小胞を少容量相中へ濃縮する水性の二相系での分配により小胞を回収する  （Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ  Ｐ．Ａ．  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８６）。
【００２３】
５．  上記４）で与えられた相系のような液−液二相系の境界面または水−油相系で回収する。
【００２４】
６．  エマルジョンをもたらす水−油相系の境界面で回収する。
【００２５】
７．  リン酸カルシウム、シリカ、様々なイオン交換樹脂等の固形物質上へ吸着する。
【００２６】
８．  凍結および融解。凝集物を融解させた後、生じた水結晶により小胞が凝集体へと濃縮される。
【００２７】
疎水性ペプチドは、自動化手順による合成を含む標準的な化学的手法によって合成されてもよい。一般に、ペプチドアナログは、結合剤としてＨＡＴＵ（Ｎ  −［ジメチルアミノ−１Ｈ−１．２．３−トリアゾロ［４，５−Ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファートＮ−オキシド）またはＨＯＡｔ−１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール等の他の結合剤による標準固相Ｆｍｏｃ保護方法に基づいて合成される。ペプチドは、適切な捕捉剤を含むトリフルオロ酢酸（側鎖官能基の脱保護もする）により固相樹脂から切断される。粗精製ペプチドは調製的逆相クロマトグラフィを使用してさらに精製される。分配クロマトグラフィ、ゲル濾過、ゲル電気泳動法またはイオン交換クロマトグラフィのような他の精製方法を使用してもよい。ｔＢｏｃ保護方法のような当該技術分野において公知である他の合成技術または異なる結合試薬または同種を使用して、同等のペプチドを生じさせることができる。
【００２８】
ペプチドを、代替として、組換体産生により合成してもよい（例えば米国特許第５，５９３，８６６号を参照）。大腸菌のような細菌、出芽酵母またはピチア属のような酵母、  Ｓｆ９のような昆虫、  およびＣＨＯまたはＣＯＳ−７のような哺乳動物細胞を含む、様々な宿主系はペプチドアナログの産生に適している。ベクターおよび宿主が抗菌ペプチドを生産することができる限り宿主の各々について使用できる多くの発現ベクターがあり本発明はそれらのいずれも制限しない。大腸菌におけるクローニングおよび発現のためのベクターおよび手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．，  １９８７）およびＡｕｓｕｂｅｌ  他（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  １９９５）に見出すことができる。
【００２９】
本発明の組成物は、乾燥、冷凍、または冷凍乾燥されるだけではなく、以下に述べるうちの一つのような従来方法によって得られた天然抽出物等の任意な形態であってよい。
【００３０】
本発明の組成物は、食品添加物として使用されてもよく、食品製品に加えられる前、または食品製品への添加の途中のどちらかで、脂肪、バター、マーガリン、油、クリーム、牛乳、チーズ、ブリーチーズ、小麦粉、ジュース、ソフトドリンク、茶等、他の構成要素と混合されてもよい。
【００３１】
前記組成物を含む前記食品添加物または食品組成物は、固形、半固形、または液体の形態であってよい。さらにそれは冷凍乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥されたものであってもよい。本発明の食品添加物は、単独で使用するだけでなく、任意の種類の食品製品に使用してもよい。食品製品例は、脂肪、バター、マーガリン、油、クリーム、牛乳、チーズ、ブリーチーズ、小麦粉、ジュース、ソフトドリンク、茶である。その他の例はヨーグルト、アイスクリーム、ケーキ、パンおよびドレッシングである。
【００３２】
本発明の組成物を医薬組成物として使用してもよい。医薬組成物は、薬学的に許容される緩衝液、賦形剤、担体または希釈剤、そして本発明の組成物を含む。治療疾患例は、疾患または障害のいずれかとしての高血圧症、動脈硬化症、痛風、１型および２型糖尿病、癌および異脂肪血症のようなメタボリック症候群である。
【００３３】
「薬学的に許容される」とは、有効成分（すなわち抗菌ペプチド）の生物活性の有効性を減少させない、無毒な材料を意味する。そのような薬学的に許容される緩衝液、担体または添加剤は当該技術分野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９９０）およびｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｋｉｂｂｅ，  Ｅｄ  ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００）を参照）。
【００３４】
用語「緩衝液」は、ｐＨを安定させる目的を持つ、酸−塩基混合物を含む水溶液を意味する。緩衝液の例は、トリズマ、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯおよびＴＥＳである。
【００３５】
用語「希釈剤」は、医薬の調製においてペプチドを希釈する目的をともなう水溶液または非水溶液を意味する。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油（サフラワー油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油または胡麻油等）の一つまたは複数であってもよい。
【００３６】
用語「アジュバント」は、ペプチドの生物学的作用を増すために製剤に加えられた任意の化合物を意味する。アジュバントは異なる陰イオンをともなう、亜鉛塩、銅塩または銀塩の一つまたは複数であってもよく、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩（ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および異なるアシル組成物の酢酸塩であるが、これらに限定されない。
【００３７】
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質および無機物の一つまたは複数であってもよい。炭水化物の例はラクトース、ショ糖、マンニトールおよびシクロデキストリンを含み、例えば組成物に凍結乾燥の促進のために加えられる。ポリマーの例は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシド共重合体、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニル、およびポリビニルピロリドンであり、異なる分子量のすべてのものは、生体接着が行なわれるようにするために、または化学的分解および蛋白質分解から脂質を保護するために、例えば粘度調節のために、組成物に加えられる。脂質の例は脂肪酸である、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質および糖脂質、異なるアシル鎖長および飽和度のすべてのもの、卵レシチン、ダイズレシチン、水素化した卵およびダイズレシチンであり、ポリマーのための理由に類似する理由で組成物に加えられる。無機物の例はタルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、液体の蓄積の減少または都合のよい色素特性のような利点を得るために組成物に加えられる。
【００３８】
デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリ酸化プロピレン共重合体、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルおよびポリビニルピロリドンのようなポリマーが、ペプチドを含んでいる溶液の濃厚化のために使用される場合、本発明の組成物はポリマーゲルの形であってもよい。
【００３９】
例えば本明細書の他の部分で開示するように、医薬組成物を殺菌のような従来の製薬工程にさらしてもよく、および／または、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、増量剤などのような従来のアジュバントを含んでいてもよい。
【００４０】
適切な調製形態には例えば：顆粒；粉末；錠剤；コーティング錠；（マイクロ）カプセル；シロップ；エマルジョン；水、油および界面活性剤からなる光学等方性の熱力学的に安定した系として定義されたマイクロエマルジョン；長距離秩序はあるが短距離秩序の無いことによって特徴づけられる系として定義された液晶相（例えば、水相または油相のいずれかのラメラ相、六方相、および立方相を含む）またはそれらの分散した相当物であるゲル剤；軟膏剤；分散液；懸濁液；クリーム；エアゾール；小滴またはアンプル形態の注射剤；および活性化合物の徐放をともなう調製：があり、その調製においては、上で説明したように、添加剤、希釈剤、アジュバントまたは担体が慣習的に使用される。
【００４１】
患者には、薬学的有効量の医薬組成物が投与されることになる。「薬学的有効量」は、投与される条件に関して所望の効果をもたらすのに十分な用量を意味している。正しい用量は、化合物の活性、投与の様式、疾患の性質および重症度、患者の年齢および体重に依存し、異なる用量が必要となろう。投与量は、個々の用量単位または他の場合には数回のより少ない用量単位の形態での単一投与、および特定間隔で細分された用量の複数回の投与、という両方によって行なうことができる。
【００４２】
本発明は、とりわけヒトと、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ラクダ等の他の哺乳類との両方に関係する。したがって、本方法は、ヒトの治療および獣医学用途の両方に適用可能である。そのような治療に適している対象は、確立した特徴によって同定されるだろう。
【００４３】
以下に、本発明の実施例として、ホウレンソウからの葉緑体膜であるチラコイドの単離、ならびに膵臓リパーゼ活性の阻害および食物摂取量の減少におけるそれらの適用について説明する。次の実施例は、任意の様式、姿、または形態で本発明を明示的かつ黙示的に説明するが、それらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
膜および膜蛋白質の調製
Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ  他  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６０８，  ５３−６１  （２００４）  に記載されているように、リパーゼ分析で使用するためのチラコイドを単離した。食品調製のために、チラコイドを以下のように単離した：葉を破砕器でホモジネートし、ナイロンメッシュ（２０μｍ）の４層を通して濾過した。チラコイドを集めるために、濾液を５０００ｇで１０分間、遠心分離機にかけた。これらを水中での再懸濁によって洗浄し、前のように再度遠心分離機にかけた。脂質抽出：  ４０ｍＬクロロホルム／メタノールと混合した４ｍｌのチラコイド懸濁液（３．８ｍｇクロロフィル／ｍＬ）を、氷上で１時間インキュベートした。４０００ｇで１０分間の遠心分離後、ペレットの第２回目の抽出を行い、前のように遠心分離機にかけた。ペレットを空気中で乾燥し、水溶性蛋白質を取り除くために、チラコイド単離に使用した緩衝液溶液１０  ｍＬによって氷上で抽出した。混合物を４０００ｇで１０分間の遠心分離機にかけ、ペレットを集めた。これを「膜蛋白質画分」と命名する（図１）。トリプシン処理は、チラコイドを、３００μｇトリプシン（ＩＩＩ型Ｓｉｇｍａ）／ｍｇクロロフィルにより、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ  ７．４）中で３７℃、４５分間のインキュベーションにより行なった。トリプシンを阻害するために１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を加えた後に、チラコイドを９００ｇで１０分間の遠心分離によって集めた。上記  （Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６０８，  ５３−６１  （２００４））  のようにクロロフィルを測定し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  （Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．  Ｍ．．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２，２４８−５４  （１９７６）  にしたがい蛋白質を測定した。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｂ．  ＆  Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，  Ｐ．−Ａ．  Ｊ．  Ｃｌｉｒｏｍａｔｏｇｒ．  ８９０，  １３１−１４１  （１９８１）に記載されているようにして、集光性複合体ＩＩ（ＬＨＣＩＩ）を調製した。（Ｐｅｔｉｔ，  Ｐ．  Ｘ．，  Ｅｄｍａｎ，  Ｐ．，  Ｇａｒｄｅｓｔｒｏｍ，  Ｐ．  ＆  Ｅｒｉｃｓｏｎ，  Ｉ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８９０，  ３７７−３８６  （１９８７））にしたがって、バレイショ塊茎からミトコンドリアを調製した。  （Ｋｊｅｌｌｂｏｍ，  Ｐ．  ＆  Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ６２，  ５０１−５０９  （１９８４））にしたがって、ホウレンソウ葉から細胞膜を調製した。  （Ｎｏｒｌｉｎｇ，  Ｂ．，  Ｚａｋ，  Ｅ．，  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｂ．  ＆  Ｐａｋｒａｓｉ，  Ｈ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４３６，  １８９−９２  （１９９８））にしたがって、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）から膜を調製した。  （Ｗａｎｇ，  Ｈ．，  Ｆｒａｎｋｅ，  Ｃ．  Ｃ，  Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，  Ｓ．  ＆  Ｎｏｒｅｎ，  Ａ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２５３：  ２７３−２７９  （２００５））にしたがって、ロドスピリルム・ルブルムから色素胞を調製した。  （Ｗａｎｇ，  Ｈ．，  Ｆｒａｎｋｅ，  Ｃ．  Ｃ，  Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，  Ｓ．  ＆  Ｎｏｒｅｎ，  Ａ．  ＦＥＭＳ  ��ｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２５３：  ２７３−２７９  （２００５））にしたがって、使用前に、０．５ＭＮａＣｌ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．８で洗浄、続いてトリス緩衝液単独で２回洗液して、表在性水溶性蛋白質を取り除いた。  （Ａｌｔｈａｇｅ，  Ｍ．  他  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６５９，  ７３−８２  （２００４））にしたがって、大腸菌からトランスヒドロゲナーゼを調製した。  （Ｒｏｍａｎｏｗｓｋａ，  Ｅ．  ＆  Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，  Ｐ．−Å．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３５，  ５５７−５６８  （１９９４））にしたがって、ホウレンソウ葉からシトクロムｂ６ｆを調製した。
【実施例２】
【００４５】
細胞膜（チラコイド）の粗調製
新鮮な、または冷凍のホウレンソウ葉を小片に裁断した。これら小片を水中に懸濁させ、ほとんどの細胞が破壊されるまで機械的ミンサーを用いて崩した。次に、このスラリをポアサイズ２０μｍのナイロンネットによって濾過した。濾液を２０００ｘｇで５分間、遠心分離機にかけた。このペレットを水中に再懸濁させ、２０００ｘｇで５分間、再度遠心分離機にかけた。これを冷凍または乾燥状態で保存した。代替として、沈澱剤を濾液に加えた。膜が沈殿するように、例えばｐＨ  ４〜５のような低ｐＨになるまで酸を添加することにより、濾液を酸性化した。沈殿物をｐＨ  ４〜５の水中での再懸濁させて、これを再沈降させることにより洗浄した。沈殿物は回収される。
【実施例３】
【００４６】
粗精製細胞膜画分の調製
ほとんどの細胞が破壊されるまで、水中に懸濁させた細胞をさらにミンサーによって機械的に崩した。破壊されていない細胞および細胞壁の大きな断片を除去するために、このスラリを濾過した。濾液を１００００ｘｇで１０分間、遠心分離機にかけた。ペレットを再懸濁させ、１００００ｘｇで１０分間、再度遠心分離機にかけた。このペレットを回収し、冷凍または乾燥状態で保存した。
【実施例４】
【００４７】
もっぱら濾過の使用によるホウレンソウからのチラコイドの調製。
【００４８】
新鮮または冷凍のホウレンソウ葉を小片に裁断した。これら小片を水中に懸濁させ、ほとんどの細胞が破壊されるまで機械的ミンサーによって崩した。次に、このスラリをポアサイズ２０μｍのナイロンネットによって濾過した。凝集を誘導するために、ｐＨが４．７に達するまで濾液に酢酸を追加した。凝集物が容器の底に沈降した時に、上清を静かに移して取り除く。次に凝集物をポアサイズ２０μｍのフィルタ上に載せる。凝集したチラコイドはフィルタにとどまり、ｐＨ  ４．７の水で洗浄することができる。洗浄されたチラコイドを回収し、所望のｐＨに調節した後に、それらを冷凍または乾燥状態で保存する。
【実施例５】
【００４９】
リパーゼ活性の測定
リパーゼ活性を以下にしたがって測定した（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｅｒｌａｎｓｏｎ  Ｃ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：  ６０−６８，  １９７３）：ｐＨ  ７．０の  １ｍＭトリス緩衝液と、１ｍＭ塩化カルシウムと、１５０ｍＭ塩化ナトリウムと、４ｍＭタウロデオキシコール酸ナトリウムと、０．５μｇリパーゼと、１μｇコリパーゼとを含む１５ｍｌ水溶液。
【００５０】
この混合物に、０．５ｍｌトリブチリンを膜の量を増すと共に加え、放出された脂肪酸をｐＨスタットを使用して測定した。
【００５１】
リパーゼ活性に対する生体膜の効果を図１〜２に示す。膜蛋白質および合成ポリペプチドの効果を図３にさらに示す。
【実施例６】
【００５２】
食品製品の調製および食物摂取量に与える効果
ケーキ（５００ｇ、エネルギーの４２％が脂肪）を以下の方法で調製した：
【００５３】
【表Ａ】
2014237646.tif 000002
【００５４】
３０ｇの水中で懸濁した葉緑体膜（１０００ｍｇクロロフィルを含むチラコイド）
手順：
デンプンおよび油をフードプロセッサ（Ｂｏｓｃｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）で混合した。残りの固形成分、続いてゼラチン溶液を加えた。完全に混合した後、葉緑体膜（チラコイド）を含む水、または葉緑体膜（チラコイド）を含まない水を最終的に加えた。ケーキを２日間、７０℃でオーブンで焼いた。
【００５５】
図４に示す実験を以下の方法で行なった。
【００５６】
メスのスプレーグドーリーラット（２００ｇ）（Ｂ＆Ｋ，  Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ，  Ｓｗｅｄｅｎから）を、１２時間明期（６：００〜１８：００）／１２時間のサイクル下の恒温室（２２±１℃）で飼育し、自由給水と、高脂肪食実験中の特別の指定のない限り標準餌の不断給餌とが行なわれた。動物を使用するすべての手順は、Ｌｏｃａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｌｕｎｄ，  Ｌｕｎｄ，  Ｓｗｅｄｅｎによる承認を受けた。
【００５７】
給餌手順
食餌消費を測定するために、ラットをケージで個別に飼育し、研究開始前に１週間高脂肪食を与えた。説明したように、与えた飼料は、高脂肪食のカロリー密度は４．７ｋｃａｌ／ｇで、エネルギーの４２．１％は脂肪、２３．９％はタンパク質、３４．０％は炭水化物であった（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ他  Ｒｅｇｕｌ．  Ｐｅｐｔ．  １３０：  １２３−１３２  （２００５））。チラコイドを含む高脂肪食は、食品グラム当たり２ｍｇのクロロフィル濃度で、精製チラコイドを添加した高脂肪食として調製した。食物摂取量を毎日測定し、飼育期間の開始時および終了時に体重を測定した。
【００５８】
食餌のこぼれた量の形跡について、ケージを注意深く監視した。
【００５９】
【表１】
2014237646.tif 000003
【００６０】
値は平均値±標準誤差であり、対照飼料およびチラコイド投与間で＊  Ｐ＜０．０５の有意水準および＊＊Ｐ＜０．０１の有意水準である。ＴＧ＝トリグリセリド、ＣＣＫ＝コレシストキニン
実施例７
食品エマルジョン
家庭用ミキサで完全に処理する前に、野菜（３００ｇ）を室温で０．５時間解凍した。家庭用ジュース遠心機に細かくカットした野菜を入れて、野菜ジュースを作った。
【００６１】
野菜ジュース（６０ｇ）とトリグリセリド油（３０ｇ）を、ステンレス鋼切断刃を装備した携帯型ミキサでホモジネートすることによって、滑らかで美味なエマルジョンを得た。ブロッコリおよびホウレンソウジュースから作ったエマルジョンを、０．５時間（室温保存）および１０時間（冷蔵庫保存）の後に、遊離油および／または水相の有無について視覚検査を行った。
【００６２】
【表Ｂ】
2014237646.tif 000004
【００６３】
検査の結果を上記の表に要約するが、癒着が観察されないことから、エマルジョン中の油小滴が非常に安定していることが分かる（遊離油相が無い）。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】葉からの生体膜による膵臓リパーゼの阻害を示す。ホウレンソウ（黒円）；クローバ（黒正方形）；シロイヌナズナ（三角形）；アブラナ（円）およびサトウダイコン（十字形）からの葉緑体膜。
【図２】生体膜による膵臓リパーゼの阻害を示す。バレイショ塊茎からのミトコンドリア（正方形）、ニワトリ心臓からのミトコンドリア（黒円）、ホウレンソウ葉からの細胞膜（菱形）、シネコシスティスからの膜（十字形）およびロドスピリルム・ルブルムの色素胞（三角形）。
【図３】単離された膜タンパク質による膵臓リパーゼの阻害を示す。集光性クロロフィルａ／ｂ複合体、ＬＨＣ  ＩＩ（三角形）、ＬＨＣＩＩのαヘリックスの一つと同じアミノ酸配列（すなわちＶＩＨＣＲＷＡＭＬＧＡＬＧＣＶＦＰＥＬＬ）をともなう合成ポリペプチド（十字形）、トランスヒドロゲナーゼ（菱形）およびチトクロムｂ６ｆ複合体（正方形）。
【図４】高脂肪食実施中のスプレーグドーリーラットにおける１１日間の葉緑体膜（チラコイド）による治療効果を示す。葉緑体膜有り（正方形）および無し（三角形）での食物摂取量。毎日の食物摂取量は、各群における８匹の動物からの平均値±ＳＥＭとして与えられる（ｎ＝８）。チラコイド治療開始後の体重増加量、血清トリグリセリドおよび血漿コレシストキニンについてのデータを表１に示す。
【図１】
2014237646.tif 000005
【図２】
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【図３】
2014237646.tif 000007
【図４】
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【配列表】
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