(57)【要約】【課題】本発明は、新たな肝臓疾患のマーカーを提供することを課題とする。【解決手段】哺乳動物由来の血液由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定することにより、該動物における肝臓疾患（肝癌を除く）の重篤の程度及び予後予測の評価をする。【選択図】図１
2014167446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の血液由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定することを特徴とする、該動物における肝臓疾患（肝癌を除く）の重篤の程度及び予後予測の評価方法。
【請求項２】
可溶性ＬＲ１１濃度の測定が、血液由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を免疫学的方法により測定し、カットオフ値を設定して、カットオフ値以上になった場合に肝硬変や肝癌へのリスクが高まりつつある肝臓疾患と判定するものである請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
肝臓疾患が、ウイルス性肝炎、肝硬変、アルコール性肝炎、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、又は特発性門脈圧亢進症である請求項１又は２記載の評価方法。
【請求項４】
可溶性ＬＲ１１測定試薬を含有する肝臓疾患（肝癌を除く）の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の新規な肝臓疾患マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓疾患の中でも、ウイルス性肝炎はＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）及びＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）感染によって引き起こされるもので、日本国におけるＢ型肝炎とＣ型肝炎を合わせた感染者数は３００万人前後にも達する。ＨＢＶに感染すると一過性の急性肝炎を発症するが、感染者の約８０〜９０％においてはセロコンバージョンにより、感染したウイルスが増殖性の低いウイルスに変化し、多くの場合、肝炎を発症しない無症候性キャリアに移行する。一方、残りの１０〜２０％の持続感染者は、慢性肝炎へ移行し、さらに肝硬変へと進行する。ＨＣＶ感染者の多くは不顕性感染であり、その後６０〜８０％が慢性化するといわれている。慢性肝炎は、約２０年の経過で、その罹患者の３０〜４０％が肝硬変に移行する。日本国における最近の肝硬変の成因としては、先ずウイルス感染によるものが約７２％（ＨＣＶ感染：約６０％、ＨＢＶ感染：約１２％）を占め、残りの約２８％の半分をアルコール性肝炎が占め、それ以外には、最近増加傾向にある非アルコール脂肪肝炎や自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変などが占めている。
【０００３】
上記したいずれの成因においても、肝硬変まで進行した場合には、治療することが困難で、肝移植による根本治療が必要となる。さらに、肝細胞癌発症のリスクも増大することから、慢性肝炎から肝硬変への進行を防ぐことが重要である。現在、肝機能検査におけるマーカー（以下、肝機能マーカーということがある）としては、肝細胞の障害により肝細胞から逸脱する酵素であるＡＳＴやＡＬＴ、肝細胞のみが産生するアルブミンやコリンエステラーゼ、肝細胞の繊維化に伴い増加するIV型コラーゲンやヒアルロン酸などが臨床応用されている。しかしながら、特にＨＣＶ感染陽性で前記肝機能マーカーの検査数値が基準値以下の症例であっても、肝生検を実施した結果、軽度の肝臓繊維化を認めるケースが多くあり、現在臨床応用されている肝機能マーカーの検査のみでは、肝臓疾患の存在や肝臓疾患の状態（例えば重症度など）の評価が十分になされているとはいえず、既存の肝機能マーカー検査では検出困難な早期の段階で、肝臓疾患の罹患や進行を的確に捉えることができる新しい肝臓疾患マーカーが望まれていた。
【０００４】
一方、肝臓疾患が肝硬変まで進行した場合の重症度分類として、５つの因子（アルブミン及びビリルビン濃度、プロトロンビン時間、腹水及び肝性脳症の度合い）を点数化して算出するＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアが、予後予測に応用されている。また、クレアチニン、ビリルビン及びプロトロンビン時間の３の因子で規定されるＭＥＬＤスコアは、肝移植の予後予測に応用されている。これら既存の予後予測方法に加え、ごく最近、血清中の可溶性ｕＰＡＲ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの略、ＰＬＵＡＲ、ＣＤ８７とも称される。以下、ｓｕＰＡＲということがある）濃度が、慢性肝臓疾患の予後予測因子であることが報告された（非特許文献１）。この報告において、ｓｕＰＡＲ濃度は、肝機能マーカーであるコリンエステラーゼ活性と強い負の相関性を示す一方、繊維化マーカーであるヒアルロン酸とは強い正の相関性を示し、さらに、肝移植の予後予測に有用なＭＥＬＤスコアとも強い正の相関性を示したことより、ｓｕＰＡＲ濃度が肝臓疾患の予後予測の指標として使用できることが記載されている。
【０００５】
一方、ＬＲ１１（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  １１  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔｓ）は、ＬＤＬ受容体ファミリーに特徴的な構造を有する新規なＬＤＬ受容体類似タンパク質として同定された（特許文献１、非特許文献２）。ＬＲ１１は、アポＥを共通のリガンドとする１１回の繰り返し構造のリガンド結合領域を有し、正常血管壁細胞ではほとんど発現が認められないが、肥厚内膜平滑筋細胞には特異的に発現が認められることが知られている（非特許文献３）。さらに、培養平滑筋細胞を用いた検討から、平滑筋細胞の細胞増殖に伴いＬＲ１１の発現量が亢進し、培養液中への分泌が認められ、また、カフ傷害マウスモデルにおいて、抗ＬＲ１１抗体を腹腔内投与することにより、平滑筋細胞の遊走及び増殖によって引き起こされる血管内膜の肥厚が阻害されたことが知られている（非特許文献４）。
【０００６】
本発明者らは、ごく最近、悪性腫瘍患者の血液中の可溶性ＬＲ１１（ｓｏｌｕｂｌｅ  ＬＲ１１。以下、ｓＬＲ１１ということがある）濃度が、健常者と比較して有意に増加していることを見出し、その濃度が治療により正常化することや、再発時には再び上昇している等の知見を得、悪性腫瘍の存在、重篤度、治療方法の選択若しくは効果判定、再発の危険性又は再発の有無を判定するための腫瘍マーカーとして有用であることを見出し、特許出願した（特許文献２）。当該出願においては、腫瘍マーカーとしての適用対象となる悪性腫瘍として、上皮性悪性腫瘍である胃癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、結腸癌、大腸癌、胆嚢癌などが挙げられ、肝臓疾患の一つである肝癌患者検体由来血清中の可溶性ＬＲ１１濃度が高値化していることが確認されている。しかしながら、癌を発症していない肝臓疾患患者血清中の可溶性ＬＲ１１濃度の変動については記載されておらず、癌以外の肝臓疾患において血液中の可溶性ＬＲ１１濃度が高値化し、この濃度変動が肝細胞の障害の状態ならびに肝臓疾患の予後予測に応用できることは知られていなかった。
また、血管平滑筋におけるＬＲ１１の機能は、ｕＰＡＲを介して細胞内にシグナルが伝達される経路が解析されており、ＬＲ１１はｕＰＡＲのリガンドになることが、報告されている（非特許文献５）が、直接この２つのマーカーの関係を検討した報告はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−１６３９８８号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０７４５９４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ．２０１２；３２，５００−５０９
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣｈＥｍ．１９９６；２７１，２４７６１−２４７６８
【非特許文献３】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９，２６８７−２６９５
【非特許文献４】ＣｉｒＣｒｅｓ．２００４；９４；７５２−７５８
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８；２７３３−２７４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、新たな肝臓疾患のマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、治療中の各種肝臓疾患患者から、血清検体の提供を受け、血清中の可溶性ＬＲ１１濃度及びｕｓＰＡＲ濃度を測定し、各種肝機能マーカーとの関係を検証した結果、可溶性ＬＲ１１及びｕｓＰＡＲ共に、各種肝機能マーカーと有意に相関関係があることを見出した。さらに、健常者の濃度レベルを求め、各種肝臓疾患での濃度と比較した結果、可溶性ＬＲ１１濃度はほとんどの肝臓疾患で有意に高値化しているのに対して、ｓｕＰＡＲ濃度は意外にも肝硬変群以外の肝臓疾患では、有意差を認めなかった。さらに、健常者の濃度レベルから参考基準範囲を設定し、その上限を超えた検体を陽性として、各種肝臓疾患別に、可溶性ＬＲ１１及びｓｕＰＡＲ、さらに肝繊維化のマーカーであるIV型コラーゲンを加えた３項目での陽性率の比較を行った。その結果、ｓｕＰＡＲは有意差が認められないことから陽性率も非常に低かったが、可溶性ＬＲ１１は肝硬変群ではほぼ１００％となった他、その他の肝臓疾患においても高い陽性率となった。さらに意外なことに、その陽性率はIV型コラーゲンと同等であった。また、可溶性ＬＲ１１とIV型コラーゲンを組合わせた陽性率は、さらに大きく向上することを見出した。
本発明者は、上述した知見を基に、ガラクトサミンによる急性肝障害モデルラットでの動物実験を行った結果、ガラクトサミン投与による肝障害が引き起こされたと同時に血中の可溶性ＬＲ１１濃度が増加し、肝細胞障害が収束した後も増加傾向が続くことが確認され、可溶性ＬＲ１１が肝繊維化を呈する初期の段階の肝臓疾患においても、病態を的確に捉えうるマーカーになりうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕哺乳動物由来の血液由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定することを特徴とする、該動物における肝臓疾患（肝癌を除く）の重篤の程度及び予後予測の評価方法。
〔２〕可溶性ＬＲ１１濃度の測定が、血液由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を免疫学的方法により測定し、カットオフ値を設定して、カットオフ値以上になった場合に肝硬変や肝癌へのリスクが高まりつつある肝臓疾患と判定するものである〔１〕記載の評価方法。
〔３〕肝臓疾患が、ウイルス性肝炎、肝硬変、アルコール性肝炎、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、特発性門脈圧亢進症である〔１〕又は〔２〕記載の評価方法。
〔４〕可溶性ＬＲ１１測定試薬を含有する肝臓疾患（肝癌を除く）の診断キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新たな肝臓疾患のマーカーが提供され、肝繊維化を呈する初期の段階の肝臓疾患においても、病態を的確に捉えることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】健常者の血清及び肝癌を除く各種肝臓疾患患者の血漿中のｓＬＲ１１濃度を比較した図である。
【図２】健常者の血清及び肝癌を除く各種肝臓疾患患者の血漿中のｓｕＰＡＲ濃度を比較した図である。
【図３】ガラクトサミン投与又は非投与による急性肝炎モデルラットの血清中のｓＬＲ１１濃度の変動を示した図である。
【図４】ガラクトサミン投与又は非投与による急性肝炎モデルラットの血清中のＡＳＴ活性の変動を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明における被検対象である哺乳動物由来の血液は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどから採取したものを使用できるが、ヒトが好ましい。可溶性ＬＲ１１を測定を行う場合の血液由来試料としては、測定系の特性にあわせ、全血、血清又は血漿のいずれかを使用することができる。
【００１５】
血液由来試料中の可溶性ＬＲ１１の測定は、可溶性ＬＲ１１に親和性のある物質を用いて行われる。該親和性物質は、可溶性ＬＲ１１に結合能を有する物質であれば特に制限されず、例えば、ａｐｏ  Ｅ、β−ＶＬＤＬ、ＲＡＰ、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、それらの複合体（ｕＰＡ−ＰＡＩ−１）、及び抗可溶性ＬＲ１１抗体等が挙げられるが、ＲＡＰ及び抗可溶性ＬＲ１１抗体が好ましく、抗可溶性ＬＲ１１抗体がより好ましい。
【００１６】
抗可溶性ＬＲ１１抗体としては、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれでも良く、当該抗体は、周知の方法にて作製できる。また、これらの抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明にも利用できる。例えば、Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＬＲ１１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＬＲ１１  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）、国際公報第２００９／１１６２６８号公報記載の抗ＬＲ１１抗体などが挙げられる。
【００１７】
本発明における可溶性ＬＲ１１の測定方法としては、抗ＬＲ１１抗体を使用した免疫学的測定方法が好ましい。免疫学的方法としては、例えば免疫染色（ウエスタンブロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡやＬＴＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどが挙げられるが、ＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡキットとしては、積水メディカル社から市販されているものを用いることができる。
【００１８】
本発明における重篤の程度及び予後予測の評価の対象となる、肝臓疾患としてはウイルス性肝炎（Ｂ型、Ｃ型）、肝硬変、アルコール性肝炎、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及び特発性門脈圧亢進症などが挙げられる。
【００１９】
評価方法としては、例えば、血液由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を免疫学的方法により測定し、カットオフ値を設定して、カットオフ値以上になった場合に肝硬変や肝癌へのリスクが高まりつつある肝臓疾患と判定する方法を挙げることができる。
【００２０】
また、本発明の血液由来試料中の可溶性ＬＲ１１濃度による評価と、IV型コラーゲンによる評価とを併せて評価すれば、肝臓疾患重篤化の程度及び予後予測の評価方法として有用である。特に、肝線維化の評価方法として有用である。
【００２１】
また、可溶性ＬＲ１１測定試薬は、肝臓疾患（肝癌を除く）の診断キットとして有用である。当該診断キットが、ＥＬＩＳＡキットである場合には、抗可溶性ＬＲ１１抗体を固定化させたイムノアッセイ用プレート、固定化させた抗可溶性ＬＲ１１抗体とは抗原認識部位が異なる抗可溶性ＬＲ１１抗体（酵素やビオチンなどで標識されていてもよい。以下、検出用抗体ということがある）を含有する試薬を主要な構成要素として、血液由来試料を希釈あるいは前処理等するための緩衝液、抗可溶性ＬＲ１１抗体を固定化させたイムノアッセイ用プレートを洗浄するための洗浄液、検出用抗体と結合する成分（検出用抗体を認識する酵素標識された抗体や酵素標識されたアビジンなど）、酵素反応を検出するための成分を含有する検出試薬（基質剤、発色剤などの名称で呼ばれることがある）、可溶性ＬＲ１１濃度を換算・算出するための較正基準物質（精製された可溶性ＬＲ１１や可溶性ＬＲ１１濃度既知の血清などを含有する）が適宜に組み合わされて構成される。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
〔実施例１〕各種肝臓疾患における血中可溶性ＬＲ１１の検出
１．材料と方法：
（１）治療中の各種肝臓疾患患者、ウイルス性肝炎［ＣＨ］（Ｂ型４２名、Ｃ型２０４名）、肝硬変［ＬＣ］４３名、アルコール性肝炎［ＡＬ］１０名、脂肪肝［ＦＬ］２１名、非アルコール性脂肪肝炎［ＮＡＳＨ］１２名、自己免疫性肝炎［ＡＩＨ］４４名、原発性胆汁性肝硬変［ＰＢＣ］８８名、原発性硬化性胆管炎［ＰＳＣ］３名、及び特発性門脈圧亢進症［ＩＰＨ］４名から採取された血漿中の可溶性ＬＲ１１（ｓＬＲ１１）濃度を、可溶性ＬＲ１１測定試薬（積水メディカル社製）を用いて測定した。比較として、健常者ボランティア５７名の血清中の可溶性ＬＲ１１濃度も測定した。さらに、これら検体中の可溶性ｕＰＡＲ（ｓｕＰＡＲ）濃度を、以下のＥＬＩＳＡ法で測定した。その他の肝機能マーカーの測定は、臨床検査結果より引用した。
【００２４】
（２）ｓｕＰＡＲ濃度測定方法
９６穴ＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトｕＰＡＲモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ８０７）を１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で２時間放置し、抗体を固相した。その後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）にてプレートを洗浄後、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）を、１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温で１時間放置して、プレートをＢＳＡでブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、検体をＢＳＡ−ＰＢＳＴで５倍希釈した液を、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。別に、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ｕＰＡＲ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、８０７−ＵＫ）を用いてＢＳＡ−ＰＢＳＴにて希釈系列を作成してキャリブレーターとし、検体と同じ条件で反応させた。ＰＢＳＴにてプレートを洗浄後、抗ヒトｕＰＡＲポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＦ８０７）にビオチン標識した標識抗体をＢＳＡ−ＰＢＳＴにて０．１μｇ／ｍＬとなるように希釈した液を、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴにてプレートを洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２１１２６）をＢＳＡ−ＰＢＳＴにて０．５μｇ／ｍＬとなるように希釈した液を、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳＴにてプレートを洗浄後、過酸化水素を含むクエン酸緩衝液を用いて、テトラメチルベンチジンを０．３ｍｇ／ｍＬになるように溶解した基質液を、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で１０分間反応させた後、希硫酸液を１ウェルあたり５０μＬ添加し、反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度を測定し、キャリブレーターの希釈系列より作成された検量線を用いて、検体中のｓｕＰＡＲの濃度を算出した。
【００２５】
２．結果及び考察
（１）解析１：肝機能マーカーとの相関性
一般的な肝機能マーカーの検査、７項目（ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリフォスファターゼ［ＡＬＰ］、コリンエステラーゼ［ＣｈＥ］、アルブミン［Ａｌｂ］、血小板［ＰＬＴ］、IV型コラーゲン［IVｃ］）に加えて、腎機能検査２項目（尿素窒素［ＵＮ］、クレアチニン［Ｃｒ］）について、ｓＬＲ１１及びｓｕＰＡＲ濃度との相関関係を確認した。表１には、算出された相関係数並びに回帰分析結果を示した。
【００２６】
【表１】
2014167446.tif 000003
【００２７】
ｓＬＲ１１濃度は、肝細胞の障害を反映するＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰと有意な正の相関関係を認める一方、肝臓でのタンパク質合成機能を反映するＣｈＥ、ＡｌｂそしてＰＬＴとは負の相関関係を認めた。ここで興味深いことに、肝繊維化のマーカーであるIVｃと一番強い正の相関関係があることが見いだされた。ｓｕＰＡＲ濃度と各肝機能マーカーとの関係は、ＡＬＴを除き、ｓＬＲ１１濃度と同様であった。
これに対して、ｓｕＰＡＲ濃度は腎機能マーカーと有意な正の相関関係を認めたが、ｓＬＲ１１濃度は全く相関関係を認めないことから、腎機能の影響を受けにくいことが新たに判明した。
また、ｓＬＲ１１濃度とｓｕＰＡＲ濃度の間でも、比較的強い正の相関関係を認め、ｓＬＲ１１濃度とｓｕＰＡＲ濃度のいずれもが肝臓疾患の有用なマーカーとなることが示された。
【００２８】
（２）解析２：健常者におけるｓＬＲ１１及びｓｕＰＡＲ濃度の参考基準値の設定
ｓＬＲ１１及びｓｕＰＡＲの参考基準値は、健常者ボランティア５７名の血清中の濃度の平均値±２×標準偏差（２ＳＤ）として算出した。ｓＬＲ１１は７．８±３．２ｎｇ／ｍＬ（４．６〜１１．０ｎｇ／ｍＬ）、ｓｕＰＡＲは２．４±０．７ｎｇ／ｍＬ（１．０〜３．８ｎｇ／ｍＬ）と算出された。
【００２９】
（３）解析３：肝臓疾患別のｓＬＲ１１及びｓｕＰＡＲ濃度比較
各種肝臓疾患検体中のｓＬＲ１１及びｓｕＰＡＲ濃度測定結果を、疾患別に解析２で得られた健常者ボランティア（ｎｏｒｍａｌ）のそれぞれの濃度と比較した。その結果を表２、図１並びに表３、図２に示す。
【００３０】
【表２】
2014167446.tif 000004
【００３１】
表２の結果より、ｓＬＲ１１濃度は、ＡＬ及びＦＬ以外の肝臓疾患群では、ｎｏｒｍａｌ群と比較して有意に高値化していることが確認された。
【００３２】
【表３】
2014167446.tif 000005
【００３３】
表３の結果より、ｓｕＰＡＲ濃度は、意外にもＬＣ以外の肝臓疾患群では、ｎｏｒｍａｌ群と比較して有意に高値化していないことが確認された。
【００３４】
（４）解析４：肝臓疾患別のｓＬＲ１１、ｓｕＰＡＲ、IVｃの陽性率比較
解析１で得られたｓＬＲ１１及びｓｕＰＡＲの参考基準範囲（４．６〜１１．０ｎｇ／ｍＬ、１．０〜３．８ｎｇ／ｍＬ）、加えて、解析で強い正の相関関係を認めたIVｃのカットオフ値を１５０ｎｇ／ｍＬと定め、それぞれその上限を超えた検体を陽性として、肝臓疾患別に各検査項目の陽性率を算出した（表４）。さらに、ｓＬＲ１１とIVｃを組合わせた場合（いずれかが陽性である場合）の陽性率も求めた。
【００３５】
【表４】
2014167446.tif 000006
【００３６】
表４の結果より、ｓｕＰＡＲと比較して、ｓＬＲ１１及びIVｃの陽性率が格段に高いことが確認された。一方、ｓＬＲ１１とIVｃの陽性率は、各種疾患群で同等であったが、興味深いことに、この２つの項目を組合わせ、いずれかが陽性である場合を陽性であるとする、陽性率が大きく向上することが新たに判明した。さらに、慢性ウイルス性肝炎群の陽性率が、ｓＬＲ１１及びIVｃともに５０％前後であったのに対して、慢性肝炎が繊維化を伴い進行した肝硬変群ではほぼ１００％となり、ｓＬＲ１１が繊維化マーカーとして臨床応用されているIVｃと同等の検出性能を有するだけでなく、IVｃを補完できる、すなわちIVｃのみでは見落としていた患者を発見することができる、新たな肝臓疾患マーカーになりうることが判明した。
【００３７】
〔実施例２〕ガラクトサミン投与肝炎モデルラットでのｓＬＲ１１濃度変化についての検討
１．材料と方法：
（１）Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（体重１００〜１１０ｇ）４匹を４時間絶食させた後、その内の２匹に、ＰＢＳに溶解させたＤ（＋）−ガラクトサミン塩酸塩（和光純薬工業社、０７５−０５０１３）を、８００ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔内に投与した。残りの２匹には、ＰＢＳを同量（約１ｍＬ）腹腔内投与し、対照群とした。投与後、さらに４時間絶食させた後、通常の飼育に切り替えた。ガラクトサミン投与前及び投与後３、６、９、２４、４８、７２時間及び１３日間経過時点で尾静脈から採血し、血清を得た。その血清中のｓＬＲ１１は、以下のＥＬＩＳＡ法にて測定した。肝臓細胞の障害の程度は、オートセラＡＳＴ試薬（積水メディカル社）を用いて、ラット血清中のＡＳＴを測定することで確認した。それぞれの結果を、図３及び図４に示す。
【００３８】
（２）ラット血清中のｓＬＲ１１測定方法
特異抗体の作製：
大阪大学蛋白質研究所より供与されたＬＲ１１部分蛋白質（Ａｃｔａｃｒｙｓｔ．  ２０１１，  Ｆ６７，  １２９−１３２）を、千葉大学から提供を受けたＬＲ１１ノックアウトマウス（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００８、１１８：２７３３−２７４６）に免疫後、通常の方法に基づいて、特異抗体を作製した。その中から、ラットを含めた動物由来のＬＲ１１に反応する抗体を選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡ系が成立する組み合わせで、ラット血清中のｓＬＲ１１を定量できる測定系を構築した。測定条件の詳細を以下に示す。
サンドイッチＥＬＩＳＡ：
９６穴ＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（クローンＮｏ．９３２２２）を１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で２時間放置し、抗体を固相した。その後、ＰＢＳＴにてプレートを洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを、１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温で１時間放置して、プレートをＢＳＡでブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、検体をＢＳＡ−ＰＢＳＴで５倍希釈した液を、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で２時間反応させた。別に、キャリブレーターとして、市販ウサギ血清（ジャパンバイオシーラム社）のＢＳＡ−ＰＢＳＴによる希釈系列を作成し、検体と同じ条件で反応させた。ＰＢＳＴにてプレートを洗浄後、抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（クローンＮｏ．９３２１３）にビオチン標識したものを調製し、ＢＳＡ−ＰＢＳＴにて１μｇ／ｍＬとなるように希釈した液を、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴにてプレートを洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２１１２６）をＢＳＡ−ＰＢＳＴにて０．５μｇ／ｍＬとなるように希釈した液を、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳＴにてプレートを洗浄後、過酸化水素を含むクエン酸緩衝液を用いて、テトラメチルベンチジンを０．３ｍｇ／ｍＬになるように溶解した基質液を、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で１０分間反応させた後、希硫酸液を１ウェルあたり５０μＬ添加し、反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度を測定し、キャリブレーターの希釈系列より作成された検量線を用いて、ラット血清中のｓＬＲ１１の濃度を算出した。
【００３９】
２．結果と考察
図４の結果より、ガラクトサミン投与ラットの血清ＡＳＴ活性の著明な増加が認められ、２４時間後でピークとなった。一方、血清中のｓＬＲ１１濃度は、投与後２４時間から序々に増加しはじめ、ＡＳＴ活性を指標とした肝臓細胞障害がほぼ収束した７２時間後でも、まだ増加傾向にあった。その後、１３日を経過した段階では、ｓＬＲ１１濃度は初期値まで戻っていた（図３）。この結果から、急性期の状態において、血液中のｓＬＲ１１濃度増加を認めることから、肝繊維化を呈する初期の段階の肝炎においても、病態を的確に捉えうる優れたマーカーになりうることが示唆された。
ガラクトサミン誘発肝障害ラットは、ヒトのウイルス性肝炎に類似した病態を呈するモデルと言われている。ウイルス性肝炎では、ウイルスが感染した肝細胞を宿主のリンパ球が破壊して、ウイルスを排除する状態が継続する。破壊された細胞は直ぐに再生されるが、上記データよると肝細胞が再生される状態とｓＬＲ１１濃度の上昇がほぼ一致していることから、血液中のｓＬＲ１１濃度は、肝細胞の障害並びに修復再生状況を反映する指標となる可能性が考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、新たな肝臓疾患のマーカーが提供される。
【図１】
2014167446.tif 000007
【図２】
2014167446.tif 000008
【図３】
2014167446.tif 000009
【図４】
2014167446.tif 000010