(57)【要約】【課題】新たな肺高血圧症のマーカーを提供する。【解決手段】哺乳動物から採取された生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定することにより、該動物における肺高血圧症の存在、程度、発症予防又は治療効果を評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から採取された生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定することを特徴とする、該動物における肺高血圧症の存在、程度、発症予防又は治療効果の評価方法。
【請求項２】
肺高血圧症が、肺動脈性肺高血圧症である請求項１記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、血液、血清又は血漿である、請求項１又は２項記載の方法。
【請求項４】
生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１濃度が、基準値と比較され、基準値より高いことを、肺高血圧症の存在、程度又は発症予防を評価する指標とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１の濃度を、治療後に変化することをモニターすることで治療の効果判定を評価する指標とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物が膠原病又は左心性心疾患に罹患している、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
膠原病が、全身性エリテマトーデス、強皮症又は混合性結合組織病である、請求項７項記載の方法。
【請求項９】
左心性心疾患が、僧帽弁狭窄症又は僧帽弁閉鎖不全症である、請求項７項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における肺高血圧症の存在や程度の評価方法、さらに発症予防並びに治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺高血圧症（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：以下、ＰＨということがある）は、肺動脈圧の上昇を認める病態の総称であり，様々な要因で肺動脈の血圧が上昇し、その結果心拍出量低下を生じ、進行すると右心不全を引き起こす、未治療の場合、予後が不良の疾患である。２００８年に米国ダナポイントで行われた第４回肺高血圧症ワールドシンポジウムで提案された肺高血圧症の臨床分類では、肺高血圧症は５つのカテゴリーに分類されている。
【０００３】
この５つのカテゴリーのうち、ダナポイント分類の１群に分類され、肺高血圧症の中心的疾患である肺動脈性肺高血圧症（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：以下、ＰＡＨということがある）は、肺小動脈の狭窄によって肺血管抵抗が増加するため肺動脈の血圧が上昇することにより生じると考えられている。ＰＡＨの確定診断には、右心カテーテル検査が必須であり、平均肺動脈圧（ｍｅａｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：以下、ｍＰＡということがある）が２５ｍｍＨｇ以上（肺動脈圧は上昇）であって、肺動脈楔入圧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｗｅｄｇｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：以下、ＰＣＷＰということがある）が１５ｍｍＨｇ以下（左心房圧は正常）である場合をＰＡＨとしている。さらにＰＡＨは、特発性肺動脈性肺高血圧症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：以下、ＩＰＡＨということがある）や、膠原病などの各種疾患に伴う肺動脈性肺高血圧症（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＰＡＨ：以下、ＡＰＡＨということがある）など、５つのカテゴリーに細分類されている。ＩＰＡＨの発症頻度が１００万人に数人であるのに対し、全身性エリテマトーデス、強皮症、混合性結合組織病などの膠原病疾患でのＰＡＨの合併頻度は１０％前後であり、ＰＡＨのハイリスク群と考えられている。
【０００４】
一方、ダナポイント分類の２群に分類される左心性心疾患による肺高血圧症（ＰＨ  ｏｗｉｎｇ  ｔｏ  ｌｅｆｔ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｅｓｅａｓｅ）は、ｍＰＡが２５ｍｍＨｇ以上であって、ＰＣＷＰが１５ｍｍＨｇより高い（左心房圧も上昇）と定義されている。左心性心疾患による肺高血圧症は、急性心不全などの後天性左心疾患に伴う二次性の肺高血圧症であり、前述したダナポイント分類の１群と区別されている。左心性心疾患による肺高血圧症の機序は、肺静脈圧の上昇に起因し肺小動脈と肺静脈の中膜の肥厚が出現し、やがて肺小動脈、肺静脈の双方に肥厚が起こることによると考えられている。このようにして、肺高血圧症が進行した状態はｏｕｔ  ｏｆ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎと呼ばれ、ｍＰＡとＰＣＷＰの差が１２ｍｍＨｇ以上と定義されている。左心性心疾患による肺高血圧症は、その成因より、収縮不全、拡張不全及び弁膜症の３つに分類されるが、具体的な左心性心疾患としては、左房圧の上昇をきたす僧帽弁狭窄症や僧帽弁閉鎖不全症などが代表的である。
【０００５】
近年、肺高血圧症に対する治療薬が開発されたことによりＱｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅの改善、生存率の改善が期待できるようになっており、可逆的な変化にとどまっている、罹患の早期段階で診断をし、治療を開始することが重視されている。肺高血圧症の非侵襲的スクリーニング検査として、心臓エコー検査を用いた推定右室圧測定が実施され、右心系の拡大や左室中隔の扁平化など、右心系負荷の検出を行っているが、肺高血圧症に特異的ではなく擬陽性も多いとされている（非特許文献２など）。前述したように肺高血圧症の確定診断には、右心カテーテル検査が不可欠であるが、侵襲的検査であり、必要最小限に実施されることが望まれる。ＰＡＨでは、血液検査として、低酸素状態であることを表す尿酸や心機能（特に心臓への負荷の有無）を表すＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）が測定されるが、いずれも二次的な指標であり、これらのマーカーの測定においても、未だ肺動脈病変を伴う肺高血圧症の存在・程度の評価、予防、治療効果の評価が十分になされているとは言えなかった。従って、早期の段階で肺動脈病変を伴う肺高血圧症のリスクが高い患者を正確に検出できる簡易な検査が望まれていた。
【０００６】
一方、ＬＲ１１（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  １１  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔｓ）は、ＬＤＬ受容体ファミリーに特徴的な構造を有する新規なＬＤＬ受容体類似タンパク質として同定された（特許文献１、非特許文献３）。ＬＲ１１は、アポＥを共通のリガンドとする１１回の繰り返し構造のリガンド結合領域を有し、正常血管壁細胞ではほとんど発現が認められないが、肥厚内膜平滑筋細胞には特異的に発現が認められている（非特許文献４）。さらに、培養平滑筋細胞を用いた検討から、平滑筋細胞の細胞増殖に伴いＬＲ１１の発現量が亢進し、培養液中への分泌が認められ、また、カフ傷害マウスモデルにおいて、抗ＬＲ１１抗体を腹腔内投与することにより、平滑筋細胞の遊走及び増殖によって引き起こされる血管内膜の肥厚が阻害されたことが知られている（非特許文献５）。従って、ＬＲ１１が血管平滑筋細胞の増殖の指標として利用できる可能性が示唆されていた。最近、血液中の可溶性ＬＲ１１濃度が、動脈硬化性疾患患者の冠動脈狭窄病変と有意な相関関係があることが報告された（特許文献２）。通常、動脈硬化は、血管内皮にＬＤＬコレステロールが沈着すると共に沈着部位へマクロファージが遊走され、ＬＤＬコレステロールを貪食したマクロファージが血管に蓄積することにより生じるが、その過程で血管平滑筋細胞も遊走されて内膜肥厚を起こす全身の病態である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−１６３９８８号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１５５８９１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００９；５４（１  ｓｕｐｐｌ  Ｓ），Ｓ４３−Ｓ５４
【非特許文献２】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．２００５；５２，３７９２−３８００
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１，２４７６１−２４７６８
【非特許文献４】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９，２６８７−２６９５
【非特許文献５】Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００４；９４；７５２−７５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、新たな肺高血圧症のマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、動脈硬化性疾患を罹患していない患者の中で、右心カテーテル検査で肺高血圧症と診断され、器質化血栓により肺動脈が慢性的に狭窄・閉塞して肺血管のリモデリングが進行した状態である慢性血栓塞栓性肺高血圧症（ＣＴＥＰＨ）と分類された患者の血中の可溶性ＬＲ１１濃度は、健常者の血中濃度と有意差がないが、ＰＡＨと分類された患者の血中の可溶性ＬＲ１１の濃度は、健常者群及びＣＴＥＰＨ群と比較して、有意に高値化していることを見出した。この知見は、肺高血圧症の発症機序による違い、すなわちＰＡＨが肺動脈の肥厚を伴う疾患に当てはまることを示唆するものである。本発明者らは、この知見を基に、肺動脈肥厚に起因する肺高血圧症を発症する疾患の一つである僧帽弁閉鎖不全症患者の血中の可溶性ＬＲ１１の濃度を測定した結果、肺高血圧症を発症している群では、発症していない群より有意に高値化していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
〔１〕哺乳動物から採取された生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定することを特徴とする、該動物における肺高血圧症の存在、程度、発症予防又は治療効果の評価方法。
〔２〕肺高血圧症が、肺動脈性肺高血圧症である〔１〕記載の方法。
〔３〕生物学的試料が、血液、血清又は血漿である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１濃度が、基準値より高いことを、肺高血圧症の存在、程度又は発症予防を評価する指標とする〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１の濃度を、治療後に変化することをモニターすることで治療の効果判定を評価する指標とする、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕哺乳動物がヒトである、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕哺乳動物が膠原病又は左心性心疾患に罹患している、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕膠原病が、全身性エリテマトーデス、強皮症又は混合性結合組織病である、〔７〕記載の方法。
〔９〕左心性心疾患が、僧帽弁狭窄症又は僧帽弁閉鎖不全症である、〔７〕記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、肺高血圧症のうち、予後不良とされる肺動脈性肺高血圧症、膠原病や左心性心疾患による肺高血圧症等の存在、程度だけでなく、発症予防、治療効果の評価が可能である。特に、肺動脈性肺高血圧症、膠原病による肺高血圧症、左心性心疾患による肺高血圧症の存在、程度、発症予防、治療効果が正確かつ簡易に評価できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明方法において可溶性ＬＲ１１濃度の測定対象は、哺乳動物から採取された生物学的試料である。哺乳動物としては、ヒトを含む哺乳動物、例えばヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、モルモット、マウス等が挙げられるが、ヒトが好ましい。生物学的試料としては、例えば血液、血漿、血清等のほか、髄液や尿が挙げられるが、血液、血清又は血漿が好ましい。
【００１４】
本発明方法の測定対象となる哺乳動物は、肺動脈病変を伴う肺高血圧症が疑われる又は治療中の哺乳動物であることが好ましい。
【００１５】
生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１濃度の測定は、可溶性ＬＲ１１に親和性のある物質を用いて行われる。該親和性物質は、可溶性ＬＲ１１に結合能を有する物質であれば特に制限されず、例えば、ａｐｏ  Ｅ、β−ＶＬＤＬ、ＲＡＰ、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、それらの複合体（ｕＰＡ−ＰＡＩ−１）、及び抗可溶性ＬＲ１１抗体等が挙げられるが、ＲＡＰ及び抗可溶性ＬＲ１１抗体が好ましく、抗可溶性ＬＲ１１抗体がより好ましい。
【００１６】
抗可溶性ＬＲ１１抗体としては、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれでも良く、当該抗体は、周知の方法にて作製できる。また、これらの抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明にも利用できる。例えば、Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＬＲ１１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＬＲ１１  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）、国際公開第２００９／１１６２６８号公報記載の抗ＬＲ１１抗体などが挙げられる。
【００１７】
本発明における可溶性ＬＲ１１の測定方法としては、抗ＬＲ１１抗体を使用した免疫学的測定方法が好ましい。免疫学的方法としては、例えば免疫染色（ウエスタンブロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡやＬＴＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどが挙げられるが、ＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡキットとしては、積水メディカル社から市販されているものを用いることができる。
【００１８】
本発明においては、生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１濃度により、肺高血圧症の存在、程度、さらに発症予防、治療効果を評価することができる。ここで、「存在、程度の評価」とは、既に肺高血圧症に罹患している場合に限らず、将来的に罹患する可能性があるか否かを判定する場合も包含する概念である。
【００１９】
本発明の肺高血圧症の存在・程度の評価方法としては、例えば、肺高血圧症が疑われる哺乳動物から生物学的試料を採取し可溶性ＬＲ１１濃度を測定し、別に予め肺高血圧症の疑いのない健常哺乳動物集団から同様に採取した生物学的試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を算出しておき（基準値）、両者の濃度レベルを比較することによって、肺高血圧症の存在・程度の評価を行うことが望ましい。さらに、例えば、肺高血圧症を患っている哺乳動物から、生物学的試料を経時的に採取し、可溶性ＬＲ１１濃度の経時変化をモニターすることによって、治療の効果判定を行うことも可能である。判定は、可溶性ＬＲ１１の濃度変化によってすることが出来、例えば、増加傾向を示す場合は肺高血圧症が進展していると考えられ、また減少又は横ばい傾向を示す場合は肺高血圧症の進展が抑制されていると考えられる。
【００２０】
ここで、「健常」とは、肺高血圧症を有さない個体をいう。肺高血圧症は、前述の第４回肺高血圧症ワールドシンポジウムで提案された基準により５カテゴリーに分類されるが、それぞれの分類診断方法は以下である。先ず、臨床症状、胸部レントゲン、心電図、心エコーなどから肺高血圧症が疑われた場合、右心カテーテルにより肺動脈圧を測定する。ここでｍＰＡが２５ｍｍＨｇ以上であれば肺高血圧と診断される。さらにｍＰＡが２５ｍｍＨｇ以上で、かつＰＣＷＰが１５ｍｍＨｇ以下であれば前毛細血管性肺高血圧症に区分され、ｍＰＡが２５ｍｍＨｇ以上であって、ＰＣＷＰが１５ｍｍＨｇより高い場合、後毛細血管性肺高血圧症（ダナポイントの２群の左心性心疾患による肺高血圧症）と診断される。前毛細血管性肺高血圧症において、肺疾患や、それに基づく低酸素症が存在する場合、ダナポイント３群の肺疾患及び／又は低酸素症による肺高血圧症に区分し、肺疾患が否定された場合には、ＣＴ、肺換気血流シンチグラム、肺動脈楔入造影、光干渉断層撮像法（ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）などで肺動脈内血栓の存在を証明する。血栓が証明されればダナポイント４群のＣＴＥＰＨである。また同時に代謝性疾患、血液疾患など多因子によるダナポイント５群、その他の肺高血圧症を鑑別し、残るダナポイント１群の肺動脈性肺高血圧症は基本的に除外診断となる。
【００２１】
また、本発明で評価できる肺高血圧症には、肺動脈性肺高血圧症、あるいは膠原病又は左心性心疾患による肺高血圧症が挙げられる。ここで膠原病には、全身性エリテマトーデス、強皮症、混合性結合組織病が挙げられる。左心性心疾患には、僧帽弁狭窄症、僧帽弁閉鎖不全症が挙げられる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
〔実施例１〕  肺動脈性肺高血圧症並びに慢性血栓塞栓性肺高血圧症に罹患している患者における可溶性ＬＲ１１濃度の測定
１．材料と方法：
右心カテーテル検査でｍＰＡが２５ｍｍＨｇ以上であった肺高血圧症患者の内、ＰＡＨに分類された３３名（特発性１４名、膠原病性１５名、遺伝性３名、先天性心疾患１名）及びＣＴＥＰＨに分類された１４名の血清中の可溶性ＬＲ１１濃度を、可溶性ＬＲ１１測定試薬（積水メディカル社製）を用いて測定した。比較として、健常者ボランティア５７名の血清中の可溶性ＬＲ１１濃度も測定した。
２．結果：
ＰＡＨ患者及びＣＴＥＰＨ患者の血清中の可溶性ＬＲ１１濃度は、それぞれ１１．５±４．７ｎｇ／ｍＬ、７．６±２．４ｎｇ／ｍＬであり、ＰＡＨ患者群はＣＴＥＰＨ患者群と比較して、有意に（ｐ＜０．００５）に高値であった。又、健常者ボランティア群の血清中の可溶性ＬＲ１１濃度は７．８±１．６ｎｇ／ｍＬであり、ＣＴＥＰＨ患者の場合は、有意差は認めないが、ＰＡＨ患者の場合は、健常者ボランティアより、有意に（ｐ＜０．００１）血液中のＬＲ１１濃度が上昇していることが判明した。
【００２４】
〔実施例２〕  肺高血圧症非合併・合併膠原病に罹患している患者における可溶性ＬＲ１１濃度の測定
１．材料と方法：
膠原病の患者で、肺高血圧症を合併している１５症例と合併していない（心エコー法）２９症例について、血清中の可溶性ＬＲ１１濃度を、可溶性ＬＲ１１測定試薬（積水メディカル社製）を用いて測定した。
２．結果：
肺高血圧症を合併している患者及び合併していない患者の血清中の可溶性ＬＲ１１濃度は、それぞれ１１．６±４．９ｎｇ／ｍＬ、８．１±２．１ｎｇ／ｍＬであり、肺高血圧症合併群は非合併症患者群と比較して、有意に（ｐ＜０．００５）に高値であったことから、膠原病患者の肺高血圧症合併症リスクの評価に役に立つことが期待される。
【００２５】
〔実施例３〕  肺高血圧症非合併・合併僧帽弁閉鎖不全症に罹患している患者における可溶性ＬＲ１１濃度の測定
１．材料と方法：
僧帽弁閉鎖不全症の患者で、肺高血圧症を合併していない８症例と合併している６症例について、血清中の可溶性ＬＲ１１濃度を、可溶性ＬＲ１１測定試薬（積水メディカル社製）を用いて測定した。
２．結果：
肺高血圧症を合併している患者及び合併していない患者の血清中の可溶性ＬＲ１１濃度は、それぞれ１０．０±４．３ｎｇ／ｍＬ、５．５±１．８ｎｇ／ｍＬであり、肺高血圧症合併群は非合併症患者群と比較して、有意に（ｐ＜０．０５）に高値であった。
一方、低酸素状態を表す尿酸濃度や心機能を表すＢＮＰ濃度では、この２群間では有意差は認めなかった（尿酸値：６．７±２．２ｍｇ／ｄＬ  ｖｓ  ６．４±１．１ｍｇ／ｄＬ、ｐ＝０．４６、ＢＮＰ値：１９８±２５０ｐｇ／ｍＬ  ｖｓ  １８９±１２５ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．３９）。
【００２６】
〔実施例４〕  肺高血圧症治療と可溶性ＬＲ１１濃度の推移
１．材料と方法、並びに結果：
膠原病（ＳＬＥ）増悪時、肺高血圧症と診断され、ＳＬＥ治療としてプレドニゾロン及びエンドキサンハルス療法施行中であり、膠原病（ＳＬＥ）性肺高血圧症に対してはレバチオ（ホスホジエステラーゼ５阻害剤）投与後、追加薬剤として血小板凝集抑制作用および血管拡張作用を有するフローランを投与した患者について、フローラン投与前後の可溶性ＬＲ１１濃度変化をモニターした。フローラン投与前の右心カテーテル検査で平均肺動脈圧４５ｍｍＨｇ、心エコーによる推定右室圧の推定値は７０ｍｍＨｇであった。フローランの投与量を約３週間にわたり段階的に増加（０．５→９ｎｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）させて治療した結果、推定右室圧は５０ｍｍＨｇまで緩やかに改善した。一方、可溶性ＬＲ１１濃度に関しても、フローラン投与前の濃度が１２．７ｎｇ／ｍＬであったのに対して、フローラン投与３週間後には７．２ｎｇ／ｍＬまで緩やかに低下していた（表１）。この結果から、肺高血圧症の治療効果の推定に、可溶性ＬＲ１１濃度の測定が有用であることが確認された。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
これら実施例１〜４の結果は、肺動脈肥厚を伴う肺高血圧症の危険性が高い基礎疾患に罹患している患者の血清中の可溶性ＬＲ１１を検出することで、肺高血圧症の存在や程度の評価、さらに発症予防並びに治療効果の評価を可能にすることを支持するものである。