(57)【要約】      （修正有）【課題】フィチン酸またはフィチン酸塩を含む食餌を消費し、高リン血症を患っている、または、そのリスクがあるヒト対象またはヒト以外の動物対象のリン酸塩吸収を低減する方法の提供。【解決手段】特定の配列番号のアミノ酸のヒト腸アルカリホスファターゼのエピトープに少なくとも１０−７Ｍの親和力で結合することを特徴とする、抗腸アルカリホスファターゼ抗体を、対象に経口投与する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象又はヒト以外の動物対象におけるリン酸塩吸収の低減用の薬剤を製造するための抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用であって、該対象がフィチン酸またはフィチン酸塩を含む食餌を摂取し、かつ高リン血症であるか、あるいは罹患の危険性があるかのいずれかであり、前記対象において血清リン酸塩濃度を低減又は維持するのに有効な量で抗腸アルカリホスファターゼ抗体が前記対象に経口投与され、該抗体が、配列番号１のアミノ酸７２−７９、８３−９０、１２３−１３０、１８１−１８８、２２６−２３３、２６０−２６７、２７１−２７８、３８３−３９０、または４４６−４５３内のヒト腸アルカリホスファターゼのエピトープに少なくとも１０−７Ｍの親和力で結合することを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【請求項２】
請求項１に記載の抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用において、前記対象が腎臓病であることを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【請求項３】
請求項２に記載の抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用において、前記腎臓病が末期腎臓病、急性腎不全、慢性腎不全、多嚢胞性腎臓病、慢性腎臓病、急性腎尿細管壊死、腎機能を低減させる感染症、および、尿管閉塞から選択されることを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【請求項４】
請求項１に記載の抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用において、前記対象がビタミンＤ化合物を摂取していることを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【請求項５】
請求項１に記載の抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用において、前記抗体がＩｇＹ抗体であることを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【請求項６】
請求項１に記載の抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用において、該抗体が鳥類の卵から得られることを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【請求項７】
請求項１に記載の抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用において、該抗体がリン酸塩結合剤とともに投与されることを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【請求項８】
請求項１に記載の抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用において、前記対象がヒト対象であり、該抗体が抗ヒト腸アルカリホスファターゼ抗体であることを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【請求項９】
請求項１に記載の抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用が：
前記抗腸ホスファターゼ抗体が投与された後、前記血清リン酸塩濃度を測定するステップと；
該濃度を、前記抗腸ホスファターゼ抗体が投与される前の濃度と比較するステップと；
を更に具えることを特徴とする抗腸アルカリホスファターゼ抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年１０月２６日に出願された米国仮出願番号６０／８５４，５５０の優先権を主張し、参照することによってその全体を本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦政府の支援を受けた研究または開発に関する宣言
適用なし。
【背景技術】
【０００３】
リン（燐）は、人の栄養における必須の要素であり、生化学、細胞の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）および身体の生理学的プロセスにおいて、必須の構造的役割および機能的役割を果たしている。動物性物質または植物性物質を含む食物において、リンは、胃腸管から容易に吸収される無機リン（Ｐｉ）として（例えば、リン酸（ＰＯ４３−）として酸素と結合した５価の形態で）みることができる。さらに、リン酸は、タンパク質、核酸、脂質および糖などの生体巨大分子の成分としてみることができる。植物性物質には、多くの植物組織（例えば、ブラン（ｂｒａｎ）や種子）において、リン酸（フィチン態リン酸）の主な保存形態であるフィチン酸（Ｃ６Ｈ６［ＯＰＯ（ＯＨ）２］６）が豊富であり、植物におけるリン酸の７０から８０％となる。フィチン酸またはその塩（フィチン酸塩）は、通常、単胃性動物によっては吸収されず、排泄物として排泄される。フィチン酸／フィチン酸塩は、成体の１日の食事によるリン酸摂取の約２５％にのぼる。
【０００４】
成体の約８５％のリン酸は骨や歯などの石灰化した細胞外マトリックス中にあるので、リン酸は骨塩の必須成分である。約１５％のリン酸塩は、細胞内（例えば、柔組織）にあり、約０．１％が細胞外の流体にみられる（Ｔｅｎｅｎｈｏｕｓｅ等，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ，第２版、Ｅｌｓｅｒｉｅｒ，２００５）。細胞性リン酸は、細胞膜の構造体を構成するリン脂質の形状で使用されている。リン酸塩は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸の必須な構成成分であり、エネルギの保存および分子輸送に重要なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、および、細胞のシグナル伝達分子として重要なサイクリックアデノシン一リン酸などのヌクレオチドの必須な構成成分でもある。細胞内リン酸塩のその他の生理学的機能は、（１）多数のタンパク質酵素、ホルモンおよび細胞シグナル伝達分子を活性化するためのリン酸化、（２）生理学的緩衝剤としての酸−塩基のバランスの維持、（３）赤血球中でのリン酸塩含有分子、２，３−ジホスホグリセリン酸塩（２，３−ＤＰＧ）の維持、を含む。平均的なヒトは、約７００乃至１０００ｇのリン酸を有しており（Ｌａｕ  Ｌ．，リン酸塩障害。Ｓａｕｎｄｅｒｓ；１９８６：３９８−４７０）、約１ｇから３ｇのリン酸をＰＯ４３−の形状で消費し、排出する。
【０００５】
ヒトは、少なくとも３つの経路、胃腸管、腎臓および骨によってリン酸塩のホメオスタシスを維持している。胃腸管は、リン酸塩の吸収および排出／再吸収を行う器官として、リン酸塩のホメオスタシスに関係している。骨は、種々の生理学的シグナルに応答して、移動（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）することができるリン酸塩の貯蔵場所として機能する。摂食によるリン酸塩の胃腸管での吸収は効率が非常に良く、吸収の主な部位は、十二指腸および空腸である（Ｄｅｌｍｅｚ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ，１９９２，１９：３０３−３１７）。摂食によるリン酸塩の可変量（摂取量の１０％から８０％）は、食物が植物性由来（ほとんど吸収しづらいリン酸塩）または度物組織由来（ほとんど消化可能）であるかに応じて、排泄物として排泄される。食物中の無機リン酸塩は、２つの経路、すなわち刷子縁膜を介して活性化経細胞（ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ）経路、および、細胞間のタイトジャンクションを介した傍細胞経路（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）で吸収される（Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ  １９９０，１６：１１５−１２４，およびＷａｌｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ  １９７９，５６：４０７−４１２）。ラット研究に基づいたいくつかのレポートは、結腸のリン酸塩輸送は、拡散性傍細胞経路を主に介して仲介されることを示している（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ，１９９７，２３：７−１２およびＰｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ），１９８８，１８８：１３９−１４９）。ラットに基づいたその他のレポートは、経細胞活性化輸送が、小腸に亘ってリン酸塩吸収の主な経路であることを示唆している（Ｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ、２００６，２１：２１７−２２１）。
【０００６】
腎臓は、リン酸塩をろ過、再吸収および排泄する器官として、リン酸塩のホメオスタシスに関係している。腎臓は、リン酸塩のホメオスタシスを維持する主な調節器官である。健康な成人では、毎日の腎臓のリン酸塩排出は、毎日の胃腸のリン酸塩吸収量に等しい。しかしながら、リン酸塩欠損状態では、腎臓は、尿のリン酸排出を実質的にゼロに低減する（Ｋｎｏｘ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７７，２３３：Ｆ２６１−Ｆ２６８）。腎臓のリン酸塩再吸収は、近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌｅ）で主に行われる。リン酸塩の部分的な排出は、０．１％乃至２０％の間で変化し、このように、強力な恒常性機構を示す。慢性腎臓病などによる重度の腎臓欠陥では、高リン血症が、腎臓のリン酸塩排出が不十分であることにより生じる。
【０００７】
リン酸塩ホメオスタシスの主な調節因子は、血清リン酸塩および甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である。血清リン酸塩レベルの上昇は、リン酸塩の尿排出を促進する。ＰＴＨは、小管のリン酸塩再吸収を低減し、尿への可溶性リン酸塩の排出を増加させる。リン酸塩ホメオスタシスに影響を与えるその他の因子は、限定するものではないが、年齢、食物（すなわち、消化されたリン酸塩および／または消化されたリン酸塩の化学的形態の量）、疾患、薬剤および日内変動を含む。
【０００８】
特に、活性形態の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（カルシトリオールとも呼ばれる）など、ビタミンＤは、リン酸塩の腸吸収を直接刺激することによって、リン酸塩のホメオスタシスに影響を与えることができる。さらに、ビタミンＤは、カルシウムおよびリン酸塩をプラズマに移動させることで、骨吸収を促進する（Ａｌｂａａｊ  Ｆ  ＆  Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  Ａ，Ｄｒｕｇｓ  ２００３，６３：５７７−５９６）。
【０００９】
リン酸塩ホメオスタシスの異常の例は、１又はそれ以上の次に挙げる３つの機構によって生じる可能性のある高リン血症である。第１の機構は、過剰なリン酸塩吸収である。第２の機構は、リン酸塩排出の低下である。第３の機構は、リン酸塩が細胞内空間から細胞外空間へと移行することである。重度の高リン血症は、麻痺、痙攣および心停止を引き起こす可能性がある。高リン酸酸塩血症は、死の危険性の高い、５ｍｇ／ｄｌより高い血清リン酸塩濃度で生じる（Ｂｌｏｃｋ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００４，１５：２２０８−２２１８）。正常な生理学的な血清リン酸塩濃度は、一般的に、約２．４ｍｇ／ｄｌから約４．５ｍｇ／ｄｌ血清リン酸塩濃度であると考えられている（Ｂｌｏｃｋ  Ｇ  ＆  Ｐｏｒｔ  Ｆ，Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２０００，３５：１２２６−１２３７）。
【００１０】
腎臓機能が悪化した患者は、腎臓によるリン酸塩の排出が低下することによって、高リン血症になる可能性がある。高リン血症は、腎臓への血管供給が低減した場合、または、糸球体が損傷し、血液からリン酸塩をろ過するのを停止した場合、高リン血症が起こる。このように、高リン血症は、腎臓病の予見可能な結果であり、ほとんどの腎臓病患者は、高リン血症になるか、または、高リン血症が進行する。このような腎臓病の例は、限定するものではないが、末期腎臓病、急性腎不全、慢性腎不全、多嚢胞症腎臓病、慢性腎臓病、急性腎尿細管壊死（例えば、腎動脈狭窄症）、腎機能を低減する感染症（例えば、敗血症または急性腎盂腎炎などの腎臓感染）、腎臓移植拒絶反応、および、尿管閉塞を含む。
【００１１】
慢性腎臓病に関連した高リン血症は、特に、長期に亘る場合、カルシウムおよびリン酸塩のホメオスタシスに関して重度の病態生理学異常となる。このような病態生理学的異常は、限定するものではないが、上皮小体機能亢進症、骨疾患（例えば、腎性骨異栄養症（ｒｅｎａｌ  ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））および関節部、肺、目および血管の石灰化を含む。慢性腎臓病の患者の高リン血症は、死の危険性と独立的に関連しているが、高リン血症が死の危険性を増加する厳密な機構は未解明である。腎不全を患う人にとって、正常範囲内の血清リン酸塩の上昇は、腎不全の進行と関連しており、心血管障害の危険性が上昇する。骨代謝および慢性腎臓病に関する米国国立腎臓財団の腎臓病結果品質の初期治療ガイドライン（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）は、血清リン酸塩を５．５ｍｇ／ｄｌ、リン酸カルシウム（ＣａＸＰ）性生物を５５ｍｇ２／ｄｌ２、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）副甲状腺ホルモン（ｉＰＴＨ）を１５０ｐｇ／ｍｌから３００ｐｇ／ｍｌの間に維持することを推奨している。病因論は十分に示されていないが、高濃度カルシウム−リン酸塩生成物が、柔組織石灰化および心血管疾患の原因とされている。心血管の疾患は、透析患者のほぼ半数が死に到る。
【００１２】
多くの腎不全患者は、活性化ビタミンＤが不足しているので、カルシウムのホメオスタシスを維持し、および／または、低カルシウム血症および／または二次的な上皮小体機能亢進症を治療または予防するために、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３など、ビタミンＤの活性形態で摂取する必要がある。まず、ビタミンＤ３は、肝臓で代謝されて２５ヒドロキシビタミンＤ３（カルシジオールとも呼ばれる）となり、続いて、腎臓で、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３となる。１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、２５ヒドロキシビタミンＤ３よりも反応性がかなり高い。機能不全の腎臓は、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に変換できない。低濃度の１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は副甲状腺を刺激し、より多くのＰＴＨを分泌し、これに上皮小体の過形成および二次的上皮小体機能亢進症が続く。慢性腎臓病を患う人の二次的上皮小体機能亢進症の標準的な治療は、活性化ビタミンＤまたはその類似体を含む。同様に、末期腎臓病または腎不全の約７０％の人は、いくつかの形態のビタミンＤを摂取する。上述したように、ビタミンＤは、リン酸塩の腸吸収を刺激する。従って、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤを摂取する腎臓病患者は、高リン血症の影響を受けやすく、リン酸塩の吸収の上昇と、付随したリン酸塩排出の低下の組み合わせによって高リン血症が悪化する可能性がある。
【００１３】
血清リン酸塩濃度を低下させる治療効果は、限定するものではないが、透析、透析リン酸塩摂取量の低減、ニコチンアミドの投与、不溶性リン酸塩結合剤の経口投与を含む。不溶性リン酸塩結合剤の例は、限定するものではないが、アルミニウム化合物（例えば、Ａｍｐｈｏｊｅｌ（登録商標）アルミニウムヒドロキシドゲル）、カルシウム化合物（例えば、カルシウムカーボネート、ＰｈｏｓＬｏ（登録商標）酢酸カルシウムタブレットなどの酢酸塩、クエン酸塩、アルギン酸塩およびケト酸塩）、陰イオン交換ポリマ（例えば、米国特許第５，９８５，９３８号、第５，９８０，８８１号、第６，１８０，０９４号、第６，４２３，７５４号、および、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９５／０５１８４に記載のアミン機能化ポリマ、塩化物形態のＤｏｗｅｘ（登録商標）陰イオン交換樹脂、ＲｅｎａＧｅｌ（登録商標）、および、グアニジニウム塩酸塩に結合するポリマ）ランタンカーボネート４水和物（ＦｏｓｒｅｎａｌＴＭ）などの無機化合物、クエン酸塩および酢酸塩からなる鉄の塩（ｆｅｒｒｉｃ  ｓａｌｔ）およびランタンベースの多孔性セラミック材料（ＲｅｎａＺｏｒｂＴＭ）を含む。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、一側面において、フィチン酸またはフィチン酸塩を含む食餌を消費し、高リン血症を患っている、または、そのリスクがあるヒト対象またはヒト以外の動物対象のリン酸塩吸収を低減する方法に関する。この方法は、対象の血清リン酸塩濃度を低減または維持するのに有効な量の抗腸アルカリホスファターゼ抗体を、対象に経口投与するステップを具える。この方法は、更に、血清リン酸塩濃度の減少または安定化を観察するステップを具える。例えば、抗体処置の前後で血清リン酸塩濃度を測定し比較することができる。
【００１５】
本明細書に開示される方法は、高リン血症を減弱または予防するために使用することができる。いくつかの実施例においては、血清リン酸塩濃度は、許容される正常範囲の約１５０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％または１０５％の最大生理学的血清リン酸塩濃度、または、それ以下に低減または維持される。いくつかの実施例においては、血清リン酸濃度は、正常範囲に低減または維持される。ヒト対象に関して、正常血清リン酸塩最大高濃度は、５．０ｍｇ／ｄｌである。好ましい実施例においては、血清リン酸塩濃度は、ヒト対象において、５．５ｍｇ／ｄｌまたはそれ未満、あるいは、５．０ｍｇ／ｄｌまたはそれ未満に低減または維持される。
【００１６】
いくつかの実施例においては、対象（例えばヒト対象）は、腎臓病を患っているか、ビタミンＤ化合物（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）を摂取しているか、またはその両方であり、ここで、ビタミンＤ化合物は、食餌中のフィチン態リン酸塩（ｐｈｙｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を吸収可能とする。いくつかの実施例においては、対象は、ビタミンＤ化合物（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）を摂取するヒト腎臓病患者であり、５．０ｍｇ／ｄｌまたは５．５ｍｇ／ｄｌ以上の血清リン酸塩濃度を有する。腎臓病の例は、末期腎臓病、急性腎不全、多嚢胞性腎臓病、慢性腎臓病、急性腎尿細管壊死、腎機能を低下させる感染症（例えば、敗血症または急性腎盂腎炎など腎臓感染症）、腎臓移植拒絶反応または尿管閉塞を含む。
【００１７】
いくつかの実施例においては、この方法に使用される抗体は、ＩｇＹ抗体である。いくつかの実施例において、抗体は、例えばニワトリなど、特に鳥類の卵（例えば、卵黄）から得られる。
【００１８】
いくつかの実施例においては、配列番号１に規定されるヒト腸アルカリホスファターゼのアミノ酸７２−７９、アミノ酸８３−９０、アミノ酸１２３−１３０、アミノ酸１８１−１８８、アミノ酸２２６−２３３、アミノ酸２６０−２６７、アミノ酸２７１−２７８、アミノ酸３１２−３１９、アミノ酸３６３−３７０、アミノ酸３８３−３９０またはアミノ酸４４６−４５３内のエピトープに結合する抗体である。
【００１９】
いくつかの実施例においては、抗腸アルカリホスファターゼ抗体は、リン酸塩結合剤に付随して投与される。いくつかの実施例においては、抗腸アルカリホスファターゼ抗体は、食物と共に投与されるか、フィチン態リン酸塩など、食餌リン酸塩を有する食物の消化に近い時間（すなわち、一時間前後）である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヒト腸アルカリホスファターゼのアミノ酸配列（配列番号１）および抗体を産生するのに使用されるフラグメント（丸で囲まれたペプチド）を示す。影付のアミノ酸は、ヒト、マウス、ラット、犬、ウシおよびニワトリで保存されていることを示す（Ｎ末端およびＣ末端で同一性がないのは、犬の配列にはこれらの部分が欠けているからである）。小さなフォントは、ニワトリでは保存されていないアミノ酸を示す。下線を引いたアミノ酸は表面にあるもの、または、結晶構造に基づいて重要であることを示す。＊は、グリコシレーションサイトを示す。
【００２１】
【図２−１】図２は、抗腸アルカリホスファターゼ抗体がインビトロで腸アルカリホスファターゼ活性の活性を阻害したことを示す。パネルＡ−Ｉは、抗腸アルカリホスファターゼ抗体の効果は、Ｃａｃｏ−２細胞の腸アルカリホスファターゼの活性に関して、それぞれ、ペプチド１，５，６，２８，３，９，１０，２５および２９を用いて得られる。パネルＪおよびＫは、Ｃａｃｏ−２細胞の腸アルカリホスファターゼの活性に関して、ペプチド５および６の注射の前に得られた卵黄抗体の効果を示す。パネルＧ、ＨおよびＩの反応は、ｐＨ＝９で行われ、他のパネルの反応はｐＨ＝７．４で行われる。ｘ軸は、抗体希釈度を示し、ｙ軸は、実験例２に示されるように、ＯＤ４０５の増加量を示す。パネルＡおよびＢのＬ−ＰＨＥ（Ｌ−フェニルアラニン、５ｍＭ）は、腸アルカリホスファターゼの周知の阻害剤であり、コントロールとして使用した。
【図２−２】図２は、抗腸アルカリホスファターゼ抗体がインビトロで腸アルカリホスファターゼ活性の活性を阻害したことを示す。パネルＡ−Ｉは、抗腸アルカリホスファターゼ抗体の効果は、Ｃａｃｏ−２細胞の腸アルカリホスファターゼの活性に関して、それぞれ、ペプチド１，５，６，２８，３，９，１０，２５および２９を用いて得られる。パネルＪおよびＫは、Ｃａｃｏ−２細胞の腸アルカリホスファターゼの活性に関して、ペプチド５および６の注射の前に得られた卵黄抗体の効果を示す。パネルＧ、ＨおよびＩの反応は、ｐＨ＝９で行われ、他のパネルの反応はｐＨ＝７．４で行われる。ｘ軸は、抗体希釈度を示し、ｙ軸は、実験例２に示されるように、ＯＤ４０５の増加量を示す。パネルＡおよびＢのＬ−ＰＨＥ（Ｌ−フェニルアラニン、５ｍＭ）は、腸アルカリホスファターゼの周知の阻害剤であり、コントロールとして使用した。
【図２−３】図２は、抗腸アルカリホスファターゼ抗体がインビトロで腸アルカリホスファターゼ活性の活性を阻害したことを示す。パネルＡ−Ｉは、抗腸アルカリホスファターゼ抗体の効果は、Ｃａｃｏ−２細胞の腸アルカリホスファターゼの活性に関して、それぞれ、ペプチド１，５，６，２８，３，９，１０，２５および２９を用いて得られる。パネルＪおよびＫは、Ｃａｃｏ−２細胞の腸アルカリホスファターゼの活性に関して、ペプチド５および６の注射の前に得られた卵黄抗体の効果を示す。パネルＧ、ＨおよびＩの反応は、ｐＨ＝９で行われ、他のパネルの反応はｐＨ＝７．４で行われる。ｘ軸は、抗体希釈度を示し、ｙ軸は、実験例２に示されるように、ＯＤ４０５の増加量を示す。パネルＡおよびＢのＬ−ＰＨＥ（Ｌ−フェニルアラニン、５ｍＭ）は、腸アルカリホスファターゼの周知の阻害剤であり、コントロールとして使用した。
【００２２】
【図３Ａ】図３Ａは、種々の抗腸アルカリホスファターゼ抗体をプローブとしたＣａｃｏ−２細胞腸アルカリホスファターゼのウェスタンブロットを示す。分子量は、ウェスタンブロット画像の左側に示す。「Ｒｅｆ」は、販売されている抗ヒト腸アルカリホスファターゼ抗体を示す。「Ａｂ＃」は、表１に示されるように、特定の腸アルカリホスファターゼペプチドを用いて生成した抗体を示す。「Ｐｒｅ＃」は、特定のペプチドを注射する前に得た卵黄抗体を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、種々の抗腸アルカリホスファターゼ抗体をプローブとしたＣａｃｏ−２細胞腸アルカリホスファターゼのウェスタンブロットを示す。分子量は、ウェスタンブロット画像の左側に示す。「Ｒｅｆ」は、販売されている抗ヒト腸アルカリホスファターゼ抗体を示す。「Ａｂ＃」は、表１に示されるように、特定の腸アルカリホスファターゼペプチドを用いて生成した抗体を示す。「Ｐｒｅ＃」は、特定のペプチドを注射する前に得た卵黄抗体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、抗腸アルカリホスファターゼ抗体が、動物の血液プール内に吸収されるフィチン態リン酸酸塩の量を低減することによって、血中リン酸塩濃度を低下することができることを発明者らが見出したことに部分的に基づいている。特に、動物にフィチン態リン酸塩を含む食餌を与え、容易に吸収可能な無機リン酸塩が不足している場合に、動物の血中リン酸塩濃度が低下し、ビタミンＤを食餌に加えることで、低下した血中リン酸塩濃度が上昇する動物モデルにおいて、発明者らは、抗腸アルカリホスファターゼ抗体を、動物に投与するすることで、ビタミンＤによって生じた上昇した血中リン酸塩濃度を低減することができたことを見出した。本発明は、フィチン酸またはフィチン酸塩を含む食品を摂取しており、カルシウムホメオスタシスを維持するために、または、ビタミンＤ化合物が食品中のフィチン態リン酸塩を容易に吸収できるようにする目的のために、ビタミンＤ化合物（例えば、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）を摂取する必要がある腎臓病患者など、ヒト対象およびヒト以外の動物対象でのリン酸塩吸収を低減する新規なツールを提供する。
【００２４】
本明細書に開示される発明者らの研究は、先行技術のいくつかの証拠が逆のことを示唆しているのにもかかわらず、抗腸アルカリホスファターゼ抗体が、ビタミンＤによって上昇した血中リン酸塩濃度を低減するのに有効であることを示した。第１に、先行技術が示唆していることは、無機リン酸塩欠乏食餌にビタミンＤを加えると、ビタミンＤが腸アルカリホスファターゼ活性を増大させたラットと、ビタミンＤが腸アルカリホスファターゼ活性に効果がなかったニワトリと、の双方で、血中リン酸塩濃度が上昇するので、腸アルカリホスファターゼと独立した機構が、血中リン酸塩濃度を上昇させるという理由であるということである（Ｂｉｅｈｌ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｊ  Ｎｕｔｒ  １９９７，１２７：２０５４−２０５９；および、Ｐｉｌｅｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９５，５８：１９４−２０４）。第２に、腸アルカリホスファターゼは、腸刷子縁膜と関連している（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｈｉｓｔｏｌ  Ｃｙｔｏｌ２００１，６４：４８３−４９１）。 先行技術が示唆するのは、腸内腔（ルーメン）内の分解性酵素による分解から粘膜表面を保護するために、低分子量の溶質のみを透過させ、大きな巨大分子（例えば、抗体／タンパク質）を透過させない粘膜層で腸刷子縁膜がコーティングされているので、抗腸アルカリホスファターゼ抗体は、インビボで腸アルカリホスファターゼ活性を阻害するのに有効ではないということである（Ａｔｕｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１，２８０：９２２；および、Ｍ．Ｍａｎｔｌｅ  ａｎｄ  Ａ．Ａｌｌｅｎ，１９８９，Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｕｓ，ｐｐ２０２−２２９  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｓ．Ｄａｖｉｓｏｎ，ｅｄ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ）。さらに、経口投与される特定の抗体は、胃の酸性環境に耐え、活性を維持することができるかどうかは、不確かである。上述の先行技術の証拠にもかかわらず、発明者らは、ここでは、抗腸アルカリホスファターゼ抗体が、ビタミンＤによって上昇した血中リン酸塩濃度を低減するために使用可能であることを示している。理論に拘束されることを意図しなければ、本発明者は、抗腸アルカリホスファターゼ抗体は、腸アルカリホスファターゼによるリン酸塩吸収を低減し、リン酸塩の放出を触媒するように、酵素とその基質（フィチン酸／フィチン酸塩）との間の相互作用を妨害すると考えている。
【００２５】
特段の指定がない場合、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または均等である方法および材料を、本発明の実施又は検査に使用することができるが、好適な方法および材料をこれから記載する。
【００２６】
実施例の記載および本発明の特許請求の範囲において、次の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応するイミュノグロブリン分子を含み、ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体の双方を含む。この用語は、さらに、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異抗体）などの一般的な工学処理をした形態を含む。この用語は、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、および、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）を具える。二価および二重特異性分子は、例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９２，１４８：１５４７；Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２，３１：１５７９；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９７，６：７８１；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６，５６：３０５５；Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９３，５３：４０２６；および、ＭｃＣａｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９５，８：３０１に記載されている。用語「抗体」は、さらに、抗体結合能力を有するフラグメントなど（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）抗体の抗原結合形体を具える。この用語は、リコンビナント一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を意味する。さらに、用語「抗体」は、抗体をより安定にするために、共有結合した安定化基を有する抗体を包含する。親和定数Ｋｄが１０−４Ｍまたはそれ未満の抗体を本発明に使用することができる。好ましくは、親和定数Ｋｄが１０−５Ｍ以下または１０−６以下の抗体を使用する。より好ましくは、親和定数Ｋｄが１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下または１０−９Ｍ以下の抗体を使用する。
【００２８】
本明細書で使用されるように、用語「高リン血症（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ）」は、対象の症状を示すために広く使用されており、血清リン酸塩は、医学的に許容される正常範囲よりも高い濃度を示す。
【００２９】
本明細書で使用されるように、用語「減弱」または「予防」は、治療効果または予防効果を得ることを意味する。治療効果は、治療した潜在的障害の改善または完治（ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ）を意味する。例えば、高リン血症の対象において、治療効果は、潜在的な高リン血症の改善または完治を含む。さらに、治療効果は、潜在的な障害に関連した１又はそれ以上の病態生理学的な症状の改善または完治を具え、潜在的な疾患を依然として患っているものの、対象では改善がみられるものを具える。例えば、腎不全および／または高リン血症で苦しんでいる患者では、治療効果は、患者の血清リン酸塩濃度を低下させるだけでなく、異所性石灰化および腎不全および／または高リン血症を伴う他の障害に関して、患者における改善を意味する。予防効果に関して、本発明による抗体は、高リン血症を発症する危険のある患者、または、高リン血症の診断がなされていない場合であっても１又はそれ以上の高リン血症の病態生理学的徴候を示す患者に投与される。例えば、本発明による抗体は、高リン血症と診断されていない慢性腎臓病を患う患者に投与することができる。予防効果は、高リン血症の予防または遅延を含む。
【００３０】
本明細書で使用されるように、有効量の抗体は、高リン血症を患う患者の血清リン酸塩よりも低濃度の量であり、これは、高リン血症を患っている患者またはその危険性のある患者で血清リン酸塩が上昇するのを予防するか、または、食物からのリン酸塩の吸収を低下させ、このことは、例えば、排泄リン酸塩の上昇、あるいは、血清リン酸塩濃度の低下または安定化によって測定可能である。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「腎臓病」は、リン酸塩のろ過機能の低下となる腎臓病を含む腎臓機能に影響を及ぼす疾患または障害、ならびに、腎臓に供給される血液および腎臓における機能的欠陥および構造的欠陥に影響を与える疾患を具える。腎臓病の例は、限定するものではないが、末期腎臓病、急性腎不全、慢性腎不全、多嚢胞性腎臓病、慢性腎臓病（例えば、腎不全および末期腎不全について明示している米国国立腎臓財団の腎臓病結果品質の初期治療ガイドラインの下で分類された慢性腎臓病のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶステージ）、急性腎尿細管壊死（ａｃｕｔｅ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）（例えば、腎臓動脈狭窄）、腎機能を低下させる感染症（例えば、敗血症または急性腎盂腎炎などの腎臓感染症）、腎臓移植の拒絶反応、尿管閉塞を具える。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「ビタミンＤ」は、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ４などと命名された有機化合物を広く意味し、カルシウムおよびリン酸塩のホメオスタシスに影響を与える代謝物およびホルモン形態を意味する。ビタミンＤの例は、限定するものではないが、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、上記のいずれかの類似体、または、細胞内ビタミンＤレセプタを実質的に占有することができる類似体、参照することで本明細書に組み込むＢｏｕｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９５，１６：２００−２５７に記載されたもの、を含む。ビタミンＤの化合物は、現在購入可能または臨床試験中のものであり、限定するものではないが、１９−ｎｏｒ−１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ２（パリカルシトール）、１α−ジヒドロキシビタミンＤ２（ドキセルカルシフェロール）、１α−ジヒドロキシビタミンＤ３（アルファカルシドール）、Ｌｅｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌからの試験検査中の薬（ＥＢ１０８９（セオカルシトール）、ＫＨ１０６０（２０−ｅｐｉ−２２−ｏｘａ−２４ａ，２６ａ，２７ａ−ｔｒｉｈｏｍｏ−１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３）、ＭＣ１２８８およびＭＣ９０３（カルシポートリオール））、ロシュ製薬の薬（１，２５−ジヒドロキシ−１６−ｅｎｅ−Ｄ３、１，２５−ジヒドロキシ−１６−ｅｎｅ−２３−ｙｎｅ−Ｄ３、および、２５−ジヒドロキシ−１６−ｅｎｅ−２３−ｙｎｅ−Ｄ３）、中外製薬の薬（２２−オキサカルシトリオール（２２−ｏｘａ−１α，２５−ジヒドロキシ−Ｄ３））、イリノイ州立大学の１αヒドロキシＤ５、シェリング社の医化学研究所の薬（ＺＫ１６１４２２およびＺＫ１５７２０２）を具える。
【００３３】
一側面においては、本発明は、高リン血症を発症する危険性のある、または、発症している、ヒト対象またはヒト以外の動物対象でリン酸塩の吸収を低減する方法に関連しており、対象は、フィチン酸またはフィチン酸塩を含む食餌を消費し、高リン血症を発症するリスクがある。この方法は、対象の血清リン酸塩濃度を減少または維持するのに有効な量の抗腸アルカリホスファターゼ抗体を対象に経口投与するステップを具える。この方法は更に、血清リン酸塩濃度の低下または安定化を観察するステップを具える。例えば、抗体治療前後の血清リン酸塩濃度を測定し比較することができる。
【００３４】
ここで開示される方法は、高リン血症を減弱又は予防するために使用することができる。いくつかの実施例においては、血清リン酸塩濃度を、許容される正常範囲の生理学的血清リン酸塩の最大濃度の約１５０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％または１０５％の濃度またはそれ以下に低減するか、維持される。いくつかの実施例においては、血清リン酸塩濃度は、正常範囲内に低減または維持される。ヒト対象に関して、正常血清リン酸塩の最大高濃度は、５．０ｍｇ／ｄｌである。好適な実施例においては、血清理リン酸塩濃度は、ヒト対象において、５．５ｍｇ／ｄｌまたはそれ以下、あるいは、５．０ｍｇ／ｄｌまたはそれ以下に低減されるか、維持される。
【００３５】
高リン血症の発症する危険性のある患者、または、既に発症している患者は、限定するものではないが、ビタミンＤ化合物の過剰摂取によるビタミンＤ中毒；リン酸含有の下剤または浣腸の過剰使用など、過剰なリン酸塩摂取；本明細書で記載されるように、急性または慢性の腎不全などの腎臓病または機能不全；第一次上皮小体機能亢進症；ＰＴＨ分泌を低下させ、末梢性ＰＴＨ耐性（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ＰＴＨ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を生じさせる種々の種類の偽性副甲状腺機能低下症（１ａ、１ｂ、１ｃおよび２）または重度の低マグネシウム血症など、ＰＴＨに耐性のある尿細管の徴候などＰＴＨ耐性状態；および／または、横紋筋融解症、腫瘍崩壊症、インスリン欠乏または急性アシドーシスなど、細胞内リン酸塩が細胞外空間に移行する症状、を含む。
【００３６】
いくつかの実施例においては、本発明の方法は、腎臓病を患っているか、ビタミンＤ化合物（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）を摂取しているか、またはその両方であるヒト対象またはヒト以外の対象でリン酸塩の吸収を低下させるために使用される。
【００３７】
様々な種に由来する腸アルカリホスファターゼのアミノ酸配列が知られている。例えば、ヒト腸アルカリホスファターゼのアミノ酸配列（配列番号１）、マウス腸アルカリホスファターゼ（配列番号２）、ラットのタイプＩ腸アルカリホスファターゼ（配列番号３）、ラットのタイプＩＩ腸アルカリホスファターゼ（配列番号４）は、それぞれ、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＡＡ５１０７３、ＡＡＡ３７８７３、ＡＡＦ３６７１７およびＮＰ＿０７３１７１から得ることができる。列挙した異なる腸アルカリホスファターゼ間の同一性の割合は、高い（７６．５％以上）。
【００３８】
いくつかの実施例においては、次に挙げる腸アルカリホスファターゼフラグメント内のエピトープに結合する抗体を使用して、本発明を実施することができる：ヒト腸アルカリホスファターゼ（配列番号１）のアミノ酸７２−７９、８３−９０、１２３−１３０、１８１−１８８、２２６−２３３、２６０−２６７、２７１−２７８、３１２−３１９、３６３−３７０、３８３−３９０または４４６−４５３；上記ヒト腸アルカリホスファターゼフラグメントに対応するマウス腸アルカリホスファターゼ（配列番号２）のフラグメント；上記ヒト腸アルカリホスファターゼフラグメントに対応するラットのタイプＩ腸アルカリホスファターゼ（配列番号３）のフラグメント；または、上記ヒト腸アルカリホスファターゼフラグメントに対応するラットのタイプＩＩ腸アルカリホスファターゼ（配列番号４）。対応するフラグメントは、当分野の当業者に周知なアライメントプログラムによって容易に同定することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるように（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２，１９９７）、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用してもよい。Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴはＮＣＢＩのウェブサイトから入手可能である。Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、プログラムのデフォルトのパラメータを使用してもよい。
【００３９】
好ましい実施例においては、次に挙げるヒト腸アルカリホスファターゼ（配列番号１）フラグメントの１つにあるエピトープに結合する抗体を使用して本発明を実施することができる。アミノ酸７２−７９、１８１−１８８、２２６−２３３、２６０−２６７、２７１−２７８、３８３−３９０または４４６−４５３。別の好適な実施例においては、次に挙げるヒト腸アルカリホスファターゼ（配列番号１）フラグメントの１つにあるエピトープに結合する抗体を使用して本発明を実施することができる：アミノ酸８３−９０、１８１−１８８、２２６−２３３または２６０−２６７。
【００４０】
ＩｇＹ抗体または腸アルカリホスファターゼフラグメント内のエピトープに結合する抗体など、抗腸アルカリフォスファターゼ抗体を作成することは、明らかに当分野の当業者の能力の範囲内である。いくつかの実施例にこの方法で使用される抗体は、特に、ニワトリの卵など鳥類の卵など、卵（例えば黄身）に由来する。参照することでその全体を本明細書に組み込む、Ｐｏｌｓｏｎ，Ａ．，Ｍ．Ｂ．ｖｏｎ  Ｗｅｃｈｍａｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌの方法「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  ＩｇＹ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｙｏｌｋｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  Ｈｅｎｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ９：４７５−４９３（１９８０）を使用して、卵黄抗体の製剤を生成できる。産卵する雌鳥に、腸アルカリホスファターゼまたはその免疫フラグメントを播種することができる。好ましくは、適切なアジュバントを、免疫処置を促進するために播種とともに投与することができる。この目的に有用なアジュバントは、完全なＦｒｅｕｎｄ（フロイント）のアジュバントなど、油中水滴エマルジョンアジュバントである。腸アルカリホスファターゼまたはその免疫原フラグメントは、雌鳥に、雌鳥が産んだ卵の卵黄に受動的に移行する抗腸アルカリホスファターゼ抗体を産生させる。抗体を含む黄身または全卵が収集され、ホモジナイズされてエマルジョンが形成される。得られたエマルジョンを乾燥して、抗体を含む粉末を得ることができる。この粉末は、次いで、経口投与に適した様態に製剤化することができ、ヒト対象またはヒト以外の動物対象に経口投与することができる。この製剤を食品または食物サプリメントとして経口投与してもよい。
【００４１】
イソタイプクラスまたはサブクラスの抗体（例えば、ＩｇＹ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）ならびにそのフラグメント（上記抗体の酵素消化または化学消化によって生成される）、および、合成手段による上記抗体の製剤、または、上記抗体またはそのフラグメントをコードしている遺伝子配列の発現による上記抗体の製剤、が含まれる。ＩｇＹの一実施例においては、鳥類動物（例えば、ニワトリ、キジ、アヒル、七面鳥、ガチョウなど）の卵黄の抗体を、本発明を実施するために使用する（参照することで全体を組み込む、米国特許第５，０８０，８９５号、第５，９８９，５８４号、および、第６，２１３，９３０号参照）。ＥＧＧｓｒａｃｔ（登録商標）ＩｇＹ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または、Ｅｇｇｃｅｌｌｅｎｔ（登録商標）ニワトリＩｇＹ精製（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）など、商業的に入手可能な卵抗体精製キットを使用して抗体を精製できる。抗体を、親和精製のための標準的手段を用いて、ペプチドまたはタンパク質フラグメントに対する親和力に基づいて精製することができる。代替としては、抗体を含む卵、卵黄または乾燥卵黄粉末を、経口摂取のために食品と直接混ぜて、ピル、タブレットまたはカプセルに容易に導入することができる。抗体などをコーディングする遺伝子を、確立した分子クローニング技術またはファージ提示法を介して上記抗体などを使用して同定することができ、単独または組み合わせて使用可能な、上記抗体の全または部分モノクロナール形態を得ることができる。
【００４２】
本発明による抗腸アルカリホスファターゼ抗体を含む組成物は、例えば、１日に１回、２回または３回で投与されてもよい。処方される量の一部が、食物または飲料の消費の前に消化され、他の部分は、食品または飲料とともに消化され、さらに他の部分は、食物または飲料の消化後近辺で消費されるように、投与は、数回に分けられてもよい。活性成分を、食品の上に、または、食品中に散在または分散させた；飲料中に溶解したまたは懸濁した；タブレット、カプセルおよび粉末など医薬固形製剤、または、エリキシル剤、シロップおよび懸濁液など液状製剤中にある；粒子または粉末として経口経路で投与することができる。いくつかの実施例においては、食物と同時に、または、食物中のリン酸塩を有する食物の消費に近接した時間で（約１時間前後以内）抗体を投与する。いくつかの実施例においては、抗体をリン酸塩結合剤とともに投与する。
【００４３】
本発明による例示的な医薬組成物は、選択可能な付加的な安定剤または薬学的に許容される賦形剤と共に、ＩｇＹおよび選択可能な卵成分、または、ＩｇＹおよび選択可能な卵黄成分を具える。液体が部分的にまたは大半が除去された全卵、卵黄、または、卵黄を乳化して、選択的に、カプセル化用化合物またはリオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）とともに混合し、粉末を形成するようにスプレードライまたはフリーズドライを行ってもよい。
【００４４】
例えば、大量の液体を除去するために卵黄抗体を部分的に精製することができる。Ｃａｍｅｎｉｓｃｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９９，１３：８１−８８；Ａｋｉｔａ  Ｅ  ＆  Ｎａｋａｉ  Ｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９３、１６０：２０７−２１４参照。この文献は、参照することによって、全体が記載されているように、本明細書に組み込まれ、米国特許出願公開第２００４／００８７５２２も、参照することで、全体が記載されるように、本明細書に組み込まれる。
【００４５】
カプセルまたはタブレットは、放出調節製剤（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を含み、この放出調節製剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散剤として提供されるか、または、活性因子の放出速度を変化させるものとして周知な物質に関連している。固形製剤は、周知な製薬技術を用いて所定時間に亘り、継続的な医薬品の放出を提供するように、徐放性製剤として製造可能である。圧縮錠剤は、不快な味を遮断し、周辺空気からタブレットを保護するために糖でコーティング、またはフィルムコーティング可能であり、胃腸管での選択的に分解されるように腸溶性にコーティングできる。固形および液状の経口投与形態の双方は、患者の許容性を向上させるために、着色剤および香料を含めることができる。
【００４６】
安定化剤は、熱や酸など、変性条件下で、抗体の結合能力を維持する保護因子である。この安定剤は、標的抗原を有する抗体の相互作用を阻害せず、所望の生物学的効果も得られる。例示的な安定化剤は、卵白、アルブミンまたはサッカライド化合物を具える。好ましくは、サッカライド化合物は、全卵白液の約５％乃至３０％（重量％）であり、より好ましくは、１０％乃至２０％（重量％）である。液体懸濁液中に抗体をサッカライド化合物とともに混合し、次いで、この懸濁液を乾燥し、タンパク質とサッカライドを含む固体を得た。安定化剤として有用なサッカライド化合物は、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、アルキル化モノサッカライド、アルキル化ジサッカライド、アルキル化ポリサッカライド、モノサッカライドアルコールおよびアルキル化モノサッカライドアルコールを具える。好ましくは、このようなサッカライド化合物は、５または６の炭素のモノサッカライドユニットから構成される、または、基づいている。モノサッカライドは、ｎが３以上の式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有する単糖残基である。モノサッカライドの例は、限定するものではないが、グルコース、リボース、フルクトース、ガラクトース、タロース（ｔａｌｏｓｅ）、アラビノース、フコース、マンノース、キシロースおよびエリスロースを含む。α異性体、β異性体、Ｄ異性体およびＬ異性体など全ての異性体形態におけるモノサッカライドは活性を有する。ジサッカライドは、グリコシド結合によって結合された２つのモノサッカライド残基を有する分子である。本発明で使用できるジサッカライドの例は、限定するものではないが、トレハロース、マルトース、スクロース、ラクトース、マルトースおよびラクツロースを含む。ポリサッカライドは、直線状の未分岐鎖または分岐鎖の状態で、３又はそれ以上のモノサッカライドが結合された分子である。スターチ（デンプン）、グリコーゲンおよびセルロースは、数百または数千のモノサッカライド残基を有するポリサッカライドの例である。スターチは、直線状の未分岐鎖（アミロース）または高度に分岐した鎖（アミロペクチン）を含む。グリコーゲンは、分岐鎖を含み、セルロースは、直線状の未分岐鎖を含む。アルキル化モノサッカライド、アルキル化ジサッカライドおよびアルキル化ポリサッカライドは、アルキル基によって少なくとも１つの水素基が置換された、モノサッカライド、ジサッカライドおよびポリサッカライドである。モノサッカライドアルコールは、３又はそれ以上のヒドロキシル基を含むアクリルポリマである。これらは、モノサッカライドのケトン基またはアルデヒド基を、ヒドロキシル基に変換することで形成される。モノサッカライドアルコールの例は、限定するものではないが、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、イソマルト、マルチトールおよび水素添加デンプン加水分解物である。アルキル化モノサッカライドアルコールは、少なくとも１つの水素基がアルキル基で置換されたモノサッカライドアルコールである。
【００４７】
抗体は、抗体の効力または安定性を向上するためにマトリックス（ポリマ性または非ポリマ性）物質に結合可能であり、次いで、投与される。
【００４８】
本発明は、以下の非限定的な例を検討することで、より完全に理解されるであろう。
【００４９】
実験例１：ビタミンＤ３により上昇した血清リン酸塩濃度の低減
【００５０】
材料および方法
抗体生成に使用される動物：単冠白色レグホーンの産卵性雌鳥を抗体生成に使用した（ペプチド抗原当たり３羽の雌鳥）。各ペプチド抗原（配列に関して表１参照、配列および他の特徴に関して図１参照）を、標準グルタルアルデヒド法を用いて、ペプチドをウシガンマグロブリンに接合することによって調製した。いくつかの実験において、全酵素を購入することができ、コンジュゲートせずに使用できる。全酵素（表２）を用いた調製において、ワクチンの調製および注射のスケジュールは、コンジュゲートペプチドに記載されたものと同一であった（下記参照）。
表１．卵抗体を生成するのに使用されるペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸配列は、動物種間の腸アルカリホスファターゼの予測される保存領域に基づいている。対象となる領域は、親水性表面、活性部位の入口、ダイマーインターフェースおよび金属結合ドメインを含む。
2014237591.tif 000003
表２．卵抗体を作成するためのワクチンとして使用される商業的に入手可能なリン酸塩酵素
2014237591.tif 000004
【００５１】
コンジュゲートの調製：運搬体タンパク質に対するペプチドのコンジュゲートに関する処置および運搬体タンパク質の性質は、大幅に変更可能であり（多数のコンジュゲート用キットは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得ることができる）、この実験例に記載される研究に使用される方法は、運搬体タンパク質ウシガンマグロブリン（ＢｇＧ）との所望のペプチドのコンジュゲートに関するグルタルアルデヒド法の使用を含む。０．８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）中のＢｇＧ（４ｍｇ）を４ｍｇの所望のペプチドと混合した（下記表１参照）。０．５２ｍｌの０．０２Ｍグルタルアルデヒド（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中）をペプチド運搬体タンパク質混合液に滴下した（発泡しないように）。この混合液を２時間撹拌した。次いで、２０ｍｇグリシンを加えて反応を止めた。この混合液を１時間放置し、次いで、リン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ＝７）に対して一晩透析した（ＭＷ＝６０００−８０００）。透析したコンジュゲートを使用するまで−８０℃で凍結した。
【００５２】
ワクチンの調製および使用：各雌鳥用のワクチンを調製するために、０．５ｍｇのコンジュゲートを０．５ｍｌＰＢＳの終濃度に希釈し、０．５ｍｌのフロイントの完全アジュバント（最初の注射）または不完全アジュバント（追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）ワクチン）と混合し、氷水の上にドリップする場合、ビーズを保持することができる油中水型乳化剤を形成した。次いで、雌鳥の４つの部位（両脚および両胸（ｂｒｅａｓｔ））に、０．２５ｍｌのワクチンエマルジョンを筋肉内注射した。不完全アジュバントの追加免疫注射は７日後であった。表１に示されているペプチドの各々をＢｇＧと別々にコンジュゲートして、３羽の産卵する雌鳥に注射した。
【００５３】
抗体サンプルの調製：抗体のピークは、２１日で得られたので、卵を２１日目から１１０日目にかけて回収した。おおよそ３０日目のロットにおいて、各雌鳥からの黄身を全卵から分離して、混合して凍結乾燥した。抗体を含む乾燥卵黄粉末を、動物給餌実験に使用するまで室温で保存した。各雌鳥からの卵のサンプルを採取し、黄身を分離して、ＩｇＹは、Ｐｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８０，９：４７５−４９３に記載された方法を用いてポリエチレン精製した。
【００５４】
動物モデル：無機リン酸塩の食餌供給源は、大半が、動物組織および製品（牛乳および卵）からの無機（ｍｉｎｅｒａｌ）リン酸塩またはリン酸塩である。これらのＰｉ源は、単胃性動物によって容易に吸収される。リンの摂取に調整（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）を必要とする場合の疾患では、患者は、通常、食物を避け、Ｐｉ結合剤を摂取する必要がある。これは、Ｐｉの吸収を低減するのに有用な戦略である一方、代替の食物（例えば、植物性食品）を摂取する患者は、末期腎臓病などの疾患の治療中、吸収用のＰｉのプールとなる別のリン酸塩供給源に晒される。フィチン態リン（ＰＰ）は、植物性食品における全てのリンの７０−８０％を示す。ＰＰは、消化して、排出部とともに排出される場合、単胃性動物には、通常、吸収されない。
【００５５】
この実験例に使用される動物モデルはニワトリであり、ニワトリは、Ｐｉ欠乏食餌を与えられ、血清リン酸塩濃度が低くなる。１α−ヒドロキシビタミンＤ３を、Ｐｉ欠乏食餌を与えたニワトリに供給することで、血清リン酸塩濃度が上昇した。従って、このモデルは、抗腸アルカリホスファターゼ抗体が１α−ヒドロキシビタミンＤ３によって生じるフィチン開始点から上昇した血清リン酸塩濃度を低減させるのに有効であるかを試験するために使用することができる。
【００５６】
動物実験：この実験で使用したニワトリモデルは、腸アルカリホスファターゼペプチドおよび製品化された酵素を除いて、Ｂｉｅｈｌ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９７，１２７：２０５４−２０５９によって記載されている。この実験に使用したネガティブコントロールは、Ｐｉ欠乏食餌（Ｐｉ＝無機リン酸塩、牛乳や卵など、大半が、動物組織や製品からの無機（ｍｉｎｅｒａｌ）リン酸塩またはリン酸塩である）であり、ここで、使用される食餌のリンは、フィチン酸リン酸塩だった。以下の結果に示されるように、この食餌処置は、低血漿リンとなる。ポジティブコントロールは、１α−ヒドロキシビタミンＤ３（２０μｇ／ｋｇ食餌、Ｓｉｇｍａ）を追加した点を除き、ネガティブコントロールの食餌と同一とした。下記の結果に示されるように、この食餌処置は、ネガティブコントロールと比較して、フィチン態リンの遊離を介して、血中リン濃度を上昇させた。残りの食餌処置の全ては、抗体（上述した１ｇの乾燥卵黄粉末）を加えたポジティブコントロールとした（ペプチドに対して１７、完全な酵素に対して５）。ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールを、アジュバント注射した雌鳥から得た１ｇ／ｋｇ乾燥卵黄粉末の食餌に加えた。これらの卵黄粉末は特定の抗体はなかった。
【００５７】
合計で２４の処置を使用した（ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、１７の抗ペプチド抗体の各々を加えたポジティブコントロール、５の抗リン酸塩酵素抗体の各々を加えたポジティブコントロール）。６羽の１日齢の単冠白色レグホーンの雛を食餌処置の各々に分配した。１０日間、雛に食餌処置を与え、体重を測定し、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ分析器（モリブデン酸アンモニウムとリン酸塩の反応に基づき、還元（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）なしで、リン酸アンモニウムを形成する）を用いて、血漿リン濃度を測定するために血液サンプルを採取した。雛を安楽死させ、各雛の右側頸骨を回収し、乾燥し、エーテル抽出して灰化して、脂肪フリーの乾燥骨の骨石灰化量を決定した。
【００５８】
予め計画していた相違点の比較は、抗体がポジティブコントロールに対してエンドポイントを低下させるか否かを試験することだったので、統計分析として、ｔ検定を用いて、測定されたパラメータとポジティブコントロールの比較を行った。＊ｐ＜０．１または＊＊ｐ＜０．０５の場合に有意性があるとして値を作成する。
【００５９】
結果
【００６０】
腸アルカリホスファターゼの多数の部位に関する抗体は、活性ビタミンＤ（表３）によって生じる血漿リンの上昇を阻害することに有効だった。酵素表面および触媒部位の入口に対する抗体は、有効であると考えられる（表３）。
表３．活性ビタミンＤ１の存在下で、抗腸アルカリホスファターゼ抗体に与えられたニワトリの血漿リン
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１１日齢のレグホーンの雛（ｎ＝６）に、１α−ヒドロキシビタミンＤ３（活性ビタミンＤ、２０μｇ／ｋｇ食餌）のみ、または、１α−ヒドロキシビタミンＤ３と腸アルカリホスファターゼのペプチドに対する卵抗体（１ｇ／ｋｇの乾燥卵黄抗体粉末の食餌）、を加えたフィチン態リン含有Ｐｉ欠乏食餌を与えた。食餌を与えて１０日後に血漿リンを測定した。
２活性ビタミンＤ食餌（１α−ヒドロキシビタミンＤ３）を与えたニワトリは、Ｐｉ欠乏食餌（ｐ＝０．０００４）のニワトリと比べて血漿リンが上昇する。
＊または＊＊上記ペプチドに対する抗体を加えた活性ビタミンＤ食餌を与えたニワトリ（１α−ヒドロキシビタミンＤ３）は、活性ビタミンＤのみの処置と比べて、＊ｐ＜０．１または＊＊ｐ＜０．０５で、血漿リンが低下した。
【００６１】
ニワトリ腸アルカリホスファアターゼおよびフィターゼではないＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼ、子牛腸アルカリホスファターゼまたはヒト胎盤アルカリホスファターゼは、ビタミンＤによって上昇した血漿リン濃度を低減するのに有効だった（表４）。
表４．活性ビタミンＤ１の存在下で、抗腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）抗体を与えたニワトリの血漿リン
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１１日齢のレグホーンの雛（ｎ＝６）に、１α−ヒドロキシビタミンＤ３のみ（活性ビタミンＤ、２０μｇ／ｋｇ食餌）、または、１α−ヒドロキシビタミンＤ３とホスファターゼ酵素に対する卵抗体（１ｇ／ｋｇの乾燥卵黄抗体粉末の食餌）、を加えたフィチン態リン含有Ｐｉ欠乏食餌を与えた。食餌を与えて１０日後に血漿リンを測定した。
２活性ビタミンＤ食餌（１α−ヒドロキシビタミンＤ３）を与えたニワトリは、Ｐｉ欠乏食餌を与えたニワトリと比べて、血漿リンが上昇した（ｐ＝０．０００４）。
＊＊上記ホスファターゼに対する抗体を加えた活性ビタミンＤ食餌（１α−ヒドロキシビタミンＤ３）を与えた雛は、活性ビタミンＤのみの処置と比べて、ｐ＜０．０５で、血漿リンが低減した。
【００６２】
さらに、この実験において、骨灰を測定した。１α−ヒドロキシビタミンＤ３の添加は、ネガティブコントロールのＰｉ欠乏食餌を与えたニワトリのものと比べた場合、骨灰を８％上昇させた（それぞれ、３７．４％と３４．６％）。ペプチドまたはホスファターゼに対する抗体で、１α−ヒドロキシビタミンＤ３に関連した骨灰の上昇を阻止するものはなかった。このことは、骨石灰化に悪影響を与えずに、血中リン濃度が抗体で低減可能なことを示している。
【００６３】
この実験例で提示されたデータは、腸アルカリホスファターゼおよび選択したアルカリホスファターゼペプチドに対する抗体が、動物の血液プール内への上昇したフィチン態リンの流量を低減するために使用可能であることを示している。従って、これらの抗体を使用して、ビタミンＤを摂取している腎臓病患者などの患者のリン酸塩吸収を低減させることができる。
【００６４】
実験例２：抗腸アルカリホスファターゼ抗体は結合して、腸アルカリホスファターゼの活性を阻害する。
【００６５】
材料および方法
抗体：抗腸アルカリホスファターゼ抗体の産生は、種々の腸アルカリホスファターゼペプチドを用いて、上記実験例１に記載されている。
【００６６】
腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）アッセイ：Ｃａｃｏ−２  Ｃ２ＢＢｅｌ（＃ＣＲＬ−２１０２、ＡＴＣＣ、直腸結腸腺癌細胞系）からの細胞抽出物を、１００％コンフルーエントに達した培養細胞から得た。細胞をアッセイ用緩衝液（１９ｍＭ、トリスＨＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に再懸濁し、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ）の存在下でソニケーションすることで、溶解した。凍結乾燥してＰＥＧ沈殿させた抗体（卵黄）を０．９％食塩水で溶解した。０、２、１、０．２、０．０４、０．０８、０．００１６および０．０００３２ｍｇ／ｍｌで、２００μｌの抗体をそれぞれ、５０μｌの細胞抽出物、ｐＨ７．４またはｐＨ９．０で、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む４５０μｌのアッセイ用緩衝液、０．２Ｍのトリス緩衝液に溶解した３００μｌの１．０ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルリン酸塩と、混合した。０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０分間、酵素反応を３７℃で行った。各時間点で、４０５ｎｍの光学的密度を測定した。抗体を含む培養に関してＯＤ４０５の上昇を計算した。
【００６７】
ウェスタンブロット：ヒト腸のタンパク質を１０％アクリルアミドゲルに充填して、一時間、１２０Ｖで作動させた。次いで、１２時間、４℃で、２０Ｖを使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に転写して、一次抗体の１／１０００希釈に晒した（＃５は１／５００希釈）。３時間後、膜を数回洗浄して、１／５０００希釈の二次抗体（セイヨウワサビのコンジュゲートペルオキシダーゼ）で９０分間インキュベートした。Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＥＣＬキットを用いて信号を検出した。
【００６８】
結果
【００６９】
ペプチド１、３、５、６、９、１０、２５、２８および２９を用いて作製された抗腸アルカリホスファターゼ抗体を、腸アルカリホスファターゼの活性の効果に関して、インビトロで試験した。図２に示されるように、試験した全ての抗体は、Ｃａｃｏ−２細胞の腸アルカリホスファターゼの活性をブロックすることができ、ペプチド５および６の免疫前（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）コントロールは、ホスファターゼの活性の効果があった。さらに、ウェスタンブロット分析は、実験例１に記載される腸アルカリホスファターゼペプチドを用いて作製された抗体は、酵素を認識し、免疫前のコントロールは認識しなかった（図３）。
【００７０】
実験例３：アデニン誘導尿毒症動物の血清リン酸塩濃度の低減
この実験例に使用された動物モデルは、アデニン誘導尿毒症ラットモデルである（例えば、Ｙｏｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｎ  １９８６，４４：２３０−２３４；Ｋａｔｓｕｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄ  Ｉｎｔｌ  ２００３，６４：４４１−４５０；およびＬｅｖｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２００６，１７：１０７−１１２、各々は、ここで参照することでその全体を組み込む）。
【００７１】
ラット（例えば、約１７５−２５０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット、１群あたり最大１０匹のラット）に、数週間に亘り（例えば、３乃至５週間またはそれ以上）、コントロール食餌または尿毒症誘導アデニン食餌（例えば、０．７５％アデニン含有）を与えた。一実施例においては、食餌は、フィチン態リン酸塩、または、無機リン酸塩とフィチン態リン酸塩との両方、を含むことができる。アデニン食餌を与えられたラットは、４．４ｍｍｏｌ／Ｌより高い血清リン酸塩濃度の抗リン酸塩血症を発症する。これらのラットは、さらに、ビタミンＤ３（１α−ヒドロキシビタミンＤ３、および、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）不足となる。実験例１に示されるものなどの、抗腸アルカリホスファターゼ抗体の量を増大させながら、アデニン食餌を与えたラットの毎日の経口投与処置によって、投与量に相関して血清リン酸塩濃度が低減する。これらの抗体がアデニン処置の最初の４週間およびその後に与えられる場合、これらの抗腸アルカリホスファターゼ抗体は、上記ラットの抗リン酸塩血症の発症を予防、遅延、または、後退（ｒｅｖｅｒｓｅ）させる。
【００７２】
他の群において、アデニン食餌を与えられたラットに、活性ビタミンＤ欠乏を予防または改善するために、ビタミンＤ形態（例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤまたはその誘導体、あるいは、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３など、活性ビタミンＤ剤）で給餌した。一実施例においては、食餌は、フィチン態リン酸塩、または、無機リン酸塩とフィチン態リン酸塩との両方、を含むことができる。ビタミンＤ処置によって、ラットは高リン血症になりやすく、一旦発症すると、上記ラットの高リン血症は悪化する。実験例１に記載されたものなど、抗腸アルカリホスファターゼ抗体の投与量を増加させながら、ビタミンＤ（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）を経口摂取させている上記ラットを処置することで、投与量に相関して上記ラットの血清リン酸塩濃度が低下する。後退を、アデニン処置の最初の４週間内およびその後に与えた場合、上記抗腸アルカリホスファターゼ抗体は、高リン血症の発症または悪化を予防または遅延する。
【００７３】
同様の実験を、犬、豚および猿など、その他のアデニン誘導尿毒症動物を用いて行った。
【００７４】
実験例４：５／６腎摘出ラットの血清リン酸塩濃度の低減
５／６腎摘出に関して（例えば、Ｃｏｚｚｏｌｉｎｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００３，６４：１６５３−６１参照）、左側腎動脈のいくつかの分岐を縛り、右側の腎臓を摘出した。５／６腎摘出したラット（例えば、雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｒｙラット、約１７５−２５０ｇ、１群あたり最大１０ラット）に高リン酸塩食餌（例えば、０．９％リン酸塩）を与える。これらのラットは、手術後数週間で（４乃至８週間）尿毒症になり、腎不全、高リン血症および活性ビタミンＤ３（１α−ヒドロキシビタミンＤ３および１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）不足を発症する。実験例１に記載されたものなど、抗腸アルカリホスファターゼ抗体の量を増やしながら、高リン酸塩食餌を与えた上記５／６腎摘出ラットに毎日の経口投与処置することによって、上記ラットにおいて、投与量に相関して血清リン酸塩濃度が低減した。実験例１に記載された抗体など、抗体を、手術後最初の数週間内、および、その後に与える場合、これらの抗体は、上記ラットの高リン酸塩血漿の発症を予防または遅延する。
【００７５】
その他の群において、高リン酸塩食餌を与えられた５／６腎摘出ラットに、活性ビタミンＤ不足を予防または改善するために、ビタミンＤの形態（例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ３またはその誘導体、あるいは、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３など活性ビタミンＤ剤）を与えた。しかしながら、この処置によって、ラットはより高リン血症の感受性が高くなり、一度発症した上記ラットでは、高リン血症が悪化した。実験例１に記載したものなど、抗腸アルカリホスファターゼの投与量を増やしながら、ビタミンＤ（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）を経口摂取している上記ラットを処置することで、血清リン酸塩濃度が低減する。抗体が、手術の最初の数週間内またはその後で与えられる場合、上記抗腸アルカリホスファターゼ抗体は、上記ラットで、高リン酸塩血漿の発症または悪化を予防または遅らせる。
【００７６】
本発明は、上述の実験例に限定することを意図せず、添付の特許請求の範囲内となる修正や変形など全てを包含する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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