(57)【要約】      （修正有）【課題】癌治療薬の提供。【解決手段】インスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤を含む組成物。ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストが、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体及び／又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である組成物。モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である組成物。ヒト化モノクローナル抗体が、ＩＭＣ−Ａ１２（シクスツムマブ）、Ｒ１５０７、ＭＫ−０６４６、ＡＭＧ４７９、ＡＶＥ１６４２、ＣＰ−７５１，８７１（フィギツムマブ）及びそれら組合せからなる群から選択される組成物。ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストが、ＥＲ阻害剤（タモキシフェン又はレトロゾール）又は抗糖尿病薬（メトホルミン）と組み合わせた小分子ＴＫＩ（たとえば、ＰＰＰ）又はＩＧＦ−１Ｒ  ＴＫＩ（たとえば、ＢＭＳ−７５４８０７）である組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストが、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体及び／又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ＩＭＣ−Ａ１２（シクスツムマブ）、Ｒ１５０７、ＭＫ−０６４６、ＡＭＧ４７９、ＡＶＥ１６４２、ＣＰ−７５１，８７１（フィギツムマブ）及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストが、ＥＲ阻害剤（タモキシフェン又はレトロゾール）又は抗糖尿病薬（メトホルミン）と組み合わせた小分子ＴＫＩ（たとえば、ＰＰＰ）又はＩＧＦ−１Ｒ  ＴＫＩ（たとえば、ＢＭＳ−７５４８０７）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が、Ｒａｓ若しくはＲａｆ（ラット肉腫／急速増殖性線維肉腫）キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）阻害剤及び／又はＭＥＫ阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｒａｓ阻害剤が、ティピファニブ（ザーネストラ（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ）（商標）、Ｒ１１５７７７）及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｒａｆ阻害剤が、ＲＡＦ２６５、ＸＬ２８１、ＰＬＸ−４０３２、ＢＡＹ４３−９００６（ネクサバール（登録商標）、トシル酸ソラフェニブ）、ＡＡＬ−８８１、ＬＢＴ−６１３、ＳＢ−５９０８８５、ＰＬＸ−４７２０、Ｌ−７７９，４５０、ＳＢ−６９９３９３及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＭＥＫ阻害剤が、ＣＩ−１０４０（ＰＤ−１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＸＬ５１８、セルメチニブ（Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）（ＡＺＤ６２４４、ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６９７６６）、ＰＤ０９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ−３２７及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１から９までに記載の組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
癌治療用組成物を製造するための少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤の使用。
【請求項１３】
癌治療に使用する組成物を製造するためのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤であって、
該癌治療は、それを必要とする対象に少なくとも１つのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及び少なくとも１つのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を投与することを含み、
該ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が該ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストと実質的に同時に投与され、該ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が該ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストに先立って投与され、及び／又は該ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が該ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの後で投与される、アンタゴニスト及び阻害剤。
【請求項１４】
前記ＩＧＦ−１ＲアンタゴニストがＩＧＦ−１Ｒに対する抗体及び／又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤がＲａｓ若しくはＲａｆ（ラット肉腫／急速増殖性線維肉腫）キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）阻害剤及び／又はＭＥＫ阻害剤である、請求項１２又は請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ＩＭＣ−Ａ１２（シクスツムマブ）、Ｒ１５０７、ＭＫ−０６４６、ＡＭＧ４７９、ＡＶＥ１６４２、ＣＰ−７５１，８７１（フィギツムマブ）及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストが、ＥＲ阻害剤（タモキシフェン又はレトロゾール）又は抗糖尿病薬（メトホルミン）と組み合わせた小分子ＴＫＩ（たとえば、ＰＰＰ）又はＩＧＦ−１Ｒ  ＴＫＩ（たとえば、ＢＭＳ−７５４８０７）である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が、Ｒａｓ若しくはＲａｆ（ラット肉腫／急速増殖性線維肉腫）キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）阻害剤及び／又はＭＥＫ阻害剤である、請求項１２又は請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
前記Ｒａｓ阻害剤が、ティピファニブ（ザーネストラ（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ）（商標）、Ｒ１１５７７７）及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記Ｒａｆ阻害剤が、ＲＡＦ２６５、ＸＬ２８１、ＰＬＸ−４０３２、ＢＡＹ４３−９００６（ネクサバール（登録商標）、トシル酸ソラフェニブ）、ＡＡＬ−８８１、ＬＢＴ−６１３、ＳＢ−５９０８８５、ＰＬＸ−４７２０、Ｌ−７７９，４５０、ＳＢ−６９９３９３及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＭＥＫ阻害剤が、ＣＩ−１０４０（ＰＤ−１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＸＬ５１８、セルメチニブ（Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）（ＡＺＤ６２４４、ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６９７６６）、ＰＤ０９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ−３２７及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
前記癌がＩＧＦ−１Ｒを産生する細胞を含む、請求項１２から２１までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記癌が請求項２１に記載の方法からなる群から選択され、前記癌がユーイング肉腫、小児肉腫、大腸癌、黒色腫、乳癌、乳癌、肝癌、癌の肝転移、ブドウ膜黒色腫の肝転移、大腸癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、ブドウ膜黒色腫、卵巣癌及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤によるＩＧＦ−１Ｒ受容体の下方制御の増強を阻害するための医薬組成物を製造するための少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には癌治療の分野に関する。より具体的には、本発明はＩＧＦ−１ＲアンタゴニストをＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤と組み合わせる併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の大半の種類は、細胞のクローン及びサブクローンの増殖を選択する進化過程を通じて生じ、これらの細胞は正常な細胞内及び細胞外増殖制御機構に次第に応答しなくなる。多段階又は連続的発達はゲノムレベルでの変化（癌遺伝子活性化、腫瘍抑制遺伝子の機能喪失、腫瘍形成能を有するキメラタンパク質をコードする融合遺伝子を生じる転座、等）を伴うことが分かっている。しかし、体細胞組織において癌をもたらす選択では、癌細胞は増殖及び／又は抗アポトーシスのための正常な細胞外シグナル伝達を利用して正常細胞に対する増殖優位性を作り出す。これらのシグナルの大半は、成長因子により媒介される。蓄積された証拠によれば、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）リガンドファミリーのメンバーは癌の発生及び進行に重要な役割を果たしていることが示唆されている。これらの成長因子は、成長、増殖、分化及びアポトーシス又は老化のような重要な細胞活動を調節しており、これらの成長因子は膜貫通受容体に結合してこれを活性化することにより生物学的応答を媒介し、次にその受容体はシグナルを細胞内部に伝達する。
【０００３】
インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）は、ヒト細胞の表面に存在するタンパク質である。ＩＧＦ−１Ｒ経路は多くの癌の開始、進行及び転移に不可欠である。癌に関与している他の受容体型チロシンキナーゼとは対照的に、ＩＧＦ−１Ｒは頻繁に変異したり、増幅されることはない。
【０００４】
様々な証拠が、ＩＧＦ−１Ｒ並びにその「古典的」リガンドであるＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２、或いはつい最近発見された抗菌ペプチドＬＬ−３７は悪性形質転換に関係することを示している。肺、乳房、甲状腺、消化管及び前立腺の癌腫、並びに神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、横紋筋肉腫及び白血病を含む多くのヒト悪性腫瘍に関して、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ又はこの両方の発現の増加が記述されている。予防疫学的研究では、いくつかの悪性腫瘍に対する潜在的危険因子として高血漿レベルのＩＧＦ−１が同定された。さらに、ＩＧＦは、インビトロでは広範囲な型の腫瘍細胞に対する強力なマイトジェンである。そのうえ、いくつかの癌遺伝子はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１Ｒ発現に影響を及ぼすことが現在では明らかにされている。ＩＧＦ−１Ｒは細胞形質転換の誘導だけではなく、形質転換された表現型の維持にも関与している。ＩＧＦ−１Ｒは、浸潤性／転移性表現型の正の調節因子としても同定され、ＩＧＦ−１は肝転移に対するパラクリン増殖促進因子としても同定された。
【０００５】
リガンド、受容体及び結合タンパク質のＩＧＦ系が、正常な細胞増殖及び分化、並びに腫瘍性疾患において見られる異常増殖における主要プレーヤーである。ＩＧＦ及びＩＧＦ−１Ｒはそれだけでは癌遺伝子ではないが、実験的及び疫学的証拠によれば、ＩＧＦ及びＩＧＦ−１Ｒは、前腫瘍細胞及び腫瘍細胞の増殖を増強し得ることが示唆されている。
【発明の概要】
【０００６】
現在開発されているＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは、臨床的には有効でないことが明らかにされている。
【０００７】
本願の発明者らは、驚くべきことに、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト治療をＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤と組み合わせると、少なくとも治療の初期段階において、癌の治療が改善されることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、ＩＧＦ−１ＲアンタゴニストがＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤と組み合わされる併用療法を含む癌の治療のための方法及び組成物を開示する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤を含む組成物を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明は、本医薬組成物の使用も開示する。
【００１１】
本発明は、それを必要とする対象において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤を該対象に投与することを含む、方法をさらに提供する。
【００１２】
さらに他の実施形態では、癌の治療を必要とする対象における、治療的有効量のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を用いる癌の治療により、ＩＧＦ−１Ｒ発現に依存するあらゆる種類の癌に対する抗ＩＧＦ−１Ｒ療法での応答が増強される。
【００１３】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を含む治療的組合せ及び投与計画、並びに患者に対して制癌効果をもたらし、それによって患者における癌の治療に有用である制癌効果を生じさせるための方法に関する。さらに具体的には、様々な実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を含む治療的組合せ；ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を含む組合せ品；ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を含むキット（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）；癌治療における治療的組合せ、組合せ品又はキットの使用；患者に、治療的組合せ、治療計画、組合せ品又はキットを使用することを含む癌を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１はＥＳ細胞系における細胞生存率に対するフィギツムマブ（ＣＰ−７５１８７１（ＣＰ））処理の効果の図である。（図１Ａ）細胞溶解物は表示されている細胞系から調製し、全ＩＧＦ−１Ｒ発現及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＣＡＤＯ細胞系における総ＩＧＦ−１Ｒレベルの百分率として表示した。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。（図１Ｂ）ＩＧＦ−１Ｒ活性は、ＩＧＦ−１誘導受容体自己リン酸化並びにそれに続くＩＧＦ−１Ｒ下流シグナル伝達経路ＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの活性化を測定することにより、表示されている細胞系において解析した。１２時間血清飢餓におかれた細胞は、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて１０分間刺激し又は刺激せず、タンパク質溶解物はリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒ（Ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ）、リン酸化されたＥＲＫ（Ｐ−ＥＲＫ）、リン酸化されたＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）、ＥＲＫ、ＡＫＴ、ＩＧＦ−１Ｒ及びＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。（図１Ｃ）表示されている細胞は、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｅｒｕｍ）の非存在下（ＳＦＭ）又は存在下で、１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰを用い又はＣＰなしで、４８時間処理され、細胞生存率はＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬によりアッセイされた。ＣＰ処理後の生存細胞数は未処理対照の百分率として表示されている。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。統計解析はＳＫＢＲ３と比較して行った：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１．
【図２】図２はＣＰで誘導されたＩＧＦ−１Ｒの下方制御機構：β−アレスチン１動員及び受容体ユビキチン化を示す図である。（図２Ａ）１２時間無血清培地においてインキュベートされた細胞は、２４時間、０、０．１又は１μｇ／ｍｌ  ＣＰで処理した。タンパク質溶解物は、ＩＧＦ−１Ｒ及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。（図２Ｂ）細胞は、１２時間無血清培地においてインキュベートし、指摘する時間１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰ又は５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１で刺激した。タンパク質溶解物は、ＩＧＦ−１Ｒ及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、０時間でのＩＧＦ−１Ｒの百分率として表した。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。（図２Ｃ）細胞は、１２時間無血清培地においてインキュベートされ、１０分間ＩＧＦ−１又はＣＰで刺激し、或いは刺激しなかった。ＩＧＦ−１Ｒは溶解物から免疫沈降され、ユビキチン化（Ｕｂ）及びローディングコントロールとしてのＩＧＦ−１ＲについてＷＢ（ＩＢ）により解析した。ＫＤａでの分子量マーカーはパネルの左側に表示されている。（図２Ｄ）β−アレスチン１（β−ａｒｒ１）は（Ｃ）と同じように調製された細胞溶解物から免疫沈降された。免疫沈降されたタンパク質はＩＧＦ−１ＲについてＷＢにより解析した。全溶解物はローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。
【図３】図３はＣＰ誘導ＩＧＦ−１Ｒ分解のβ−アレスチン１依存性を示す図である。ＭＥＦ、並びにβ−アレスチン１ノックアウト（β１ＫＯ）、β−アレスチン２ノックアウト（β２ＫＯ）及びこの両方（β１／２ＫＯ）をノックアウトしたＭＥＦ（Ａ、Ｂ）、並びにＭＥＦ及びβ−ａｒｒ１への結合に欠陥のある切断型ＩＧＦ−１Ｒ（Δ１２４５）を発現しているＭＥＦ（Ｃ、Ｄ）をＣＰの効果について解析した。（図３Ａ、Ｃ）細胞は、１２時間無血清培地においてインキュベートし、２４時間１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰ又は５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１で刺激し、或いは刺激しなかった（ＳＦＭ）。タンパク質溶解物は、ＩＧＦ−１Ｒ及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、０時間でのＩＧＦ−１Ｒの百分率として表示した。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。（図３Ｂ、Ｄ）血清の非存在下（ＳＦＭ）又は存在下で４８時間ＣＰ処理細胞の細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬により評価した。ＣＰ処理後の生存可能細胞の数は未処理対照の百分率として表示している。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。
【図４】図４はβ−アレスチン１がＣＰで誘導されたＩＧＦ−１Ｒの下方制御及び細胞増殖阻害を増強することを示す図である。（図４Ａ）図に示すように、β−アレスチン１−フラグ（β１−フラグ）をコードする異なる量のプラスミドをトランスフェクトした細胞は、２４時間ＣＰなしで又は１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰで処理した。タンパク質溶解物は、ＩＧＦ−１Ｒ、β−アレスチン１（β−ａｒｒ１）及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、擬似トランスフェクトし刺激しない対照の百分率として表わされた。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。（図４Ｂ）（Ａ）の通りにトランスフェクトされた細胞は、４８時間１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰで処理した。生存可能細胞の数は擬似トランスフェクトし刺激しない対照の百分率として表示している。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。
【図５】図５はＣＰ誘導β−アレスチン１媒介ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達活性化を示す図である。（図５Ａ）細胞は、１２時間無血清培地においてインキュベートし、次に０、２、５、１０、３０又は６０分間５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１又は１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰで処理した。タンパク質溶解物は、リン酸化されたＥＲＫ（Ｐ−ＥＲＫ）、リン酸化されたＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒ（Ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ）及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。（図５Ｂ）ＭＥＦ、並びにβ−アレスチン１ノックアウト（β１ＫＯ）、β−アレスチン２ノックアウト（β２ＫＯ）及びこれら両方のノックアウト（β１／２ＫＯ）ＭＥＦ、或いは切断型ＩＧＦ−１Ｒ（Δ１２４５）を有するＭＥＦを１２時間無血清培地においてインキュベートし、次に１０分間５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１又は１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰで刺激し、或いは刺激しなかった（ＳＦＭ）。タンパク質溶解物は、リン酸化されたＥＲＫ（Ｐ−ＥＲＫ）及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、野生型（ＷＴ）ＭＥＦに対するＥＲＫ活性化の百分率として表わした。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６】図６はＣＰ誘導細胞生存率減少に対するβ−アレスチン１  ｓｈＲＮＡ及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、Ｕ０１２６）の効果を示す図である。（図６Ａ）表示されている細胞は、ドキシサイクリン誘導性β−アレスチン１  ｓｈＲＮＡで安定的にトランスフェクトし、４日間ドキシサイクリンで処理した。細胞生存率はＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬により測定し、ドキシサイクリン未処理細胞の百分率として表示した。細胞溶解物は同一試料から調製し、β−アレスチン１（βａｒｒ１）及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、ドキシサイクリン未処理細胞の百分率として示した。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。（図６Ｂ）（Ａ）の通りに調製した細胞を、４８時間ＣＰなしで又は１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰで処理し、細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬によりアッセイした。阻害率（ＣＰ処理された細胞とＣＰ未処理細胞間の比率）をドキシサイクリン用量ごとに計算し、ＣＰ未処理細胞の百分率として表示した。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。実験中、細胞溶解物はＣＰ刺激後１０分で収集し、Ｐ−ＥＲＫ及びローディングコントロールとしての全ＥＲＫについてＷＢにより解析し、ＣＰ刺激後１２時間でＩＧＦ−１Ｒ及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、ローディングコントロールに対して正規化し、ＣＰ未処理細胞の百分率として提示した。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。（図６Ｃ）表示されている細胞は、ＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６なしで又はこれを用いて６０分間前処理し、１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰなしで又はこれを用いて刺激した。ＣＰ処理の４８時間後にアッセイした細胞生存率は未処理対照と比べて表示している。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。ＣＰ処理されたもののパーセント阻害はＣＰ未処理細胞との比較で表示している。
【図７】図７はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤（ＭＥＫ阻害剤、Ｕ０１２６）によるＣＰ誘導ＥＲＫ活性化の消滅を示す図である。細胞は無血清培地で１２時間、次にＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６と一緒に６０分間インキュベートし、その後１０分間１００ｎｇ／μｌ  ＣＰなしで及びこれを用いて処理した。タンパク質溶解物は、Ｐ−ＥＲＫ及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨについてＷＢにより解析した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
癌におけるその同定された役割により、インスリン様成長因子１型受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）標的療法は、癌治療のための非常に興味深いアプローチである。ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストを用いて治療すれば最終的には腫瘍細胞は死滅するであろうとの考えに基づいて、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは有望な癌療法と見なされてきた。しかし、臨床試験に移されると、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体は期待に応えていない。
【００１６】
癌治療について抗ＩＧＦ−１Ｒの使用はかなり期待されていたにも拘らず、第三相臨床試験の結果はむしろに失望させるものであった。たとえば、ユーイング肉腫の場合では、いくつかの臨床試験が、有効性の明らかな欠如のために停止され、一部の製薬会社は癌療法において使用するためのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの開発計画を中止しようとしている。さらに、ターゲティング抗体についての臨床試験結果に基づいて、癌治療の標的としてのＩＧＦ−１Ｒの価値は現在、疑問視されている。
【００１７】
本発明は、小児肉腫、黒色腫、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵癌並びに任意の癌型の肝転移を含む、あらゆる種類の癌に対する抗ＩＧＦ−１Ｒ療法に対する対象の応答を増強する驚くべき実用的な治療戦略を開示する。そのような癌治療において使用するための組成物も本明細書で開示する。
【００１８】
本発明の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他の方法で明確に指示していなければ、複数形も同様に含むことが意図されている。たとえば、「１つ（ａ）」の細胞は単一細胞又は多数の細胞を意味すると理解できる。
【００１９】
さらに本明細書で使用されるように、「及び／又は」とは、関連するリストの項目のうちの１つ又は複数の任意の又は総ての組合せ、並びに択一的に（「又は（ｏｒ）」）解釈される際の組合せを欠く場合を包含する。
【００２０】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、本明細書で使用される際、投与量（たとえば、化合物の量）などの測定可能な値に言及する場合、特定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％又は±０．１％の変動までを包含することが意味する。
【００２１】
本明細書で使用される際、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述されている特徴、整数、ステップ、操作、要素及び／又は成分の存在を特定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しない。
【００２２】
本明細書で使用される際、移行句「から本質的になる」は、ある請求項の範囲が、当該請求項に記載されている特定の材料又はステップ並びに当該請求項に係る発明の「基本的な新規の特徴（単数又は複数）に実質的に影響を与えない材料又はステップ」を包含すると解釈されるべきことを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ、５３７Ｆ．２ｄ  ５４９、５５１〜５２、１９０  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１、４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（原本では太字）を参照されたい。ＭＰＥＰ  §２１１１．０３も参照されたい。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明の特許請求の範囲又は本発明の説明において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅｓ）」、「増加された（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加している（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」、「増強している（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」、「改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）」、「改善する（ｉｍｐｒｏｖｅｓ）」、「改善された（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）」、「改善している（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）」及び類似する用語は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％など又はそれよりも多い上昇を示す。
【００２４】
本明細書で使用される際、用語「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「減少された（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」及び類似する用語は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又はそれよりも多い減少を意味する。特定の実施形態では、減少により検出可能な活性又は量がゼロ又は本質的にゼロ（すなわち、無意義な量、たとえば、約１０％未満又はさらには５％未満）になる。
【００２５】
用語「ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト」とは、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達により媒介される下流経路を含むＩＧＦ−１Ｒの生物学的活性を遮断する、抑制する、阻害する又は減少する任意の分子のことである。用語「アンタゴニスト」は、それが何であれ生物学的作用の特定の機構を意味してはおらず、ＩＧＦ−１Ｒとの可能なあらゆる薬理学的、生理学的及び生化学的相互作用を明確に包含する。ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの例は、（１）ＩＧＦ−１Ｒのそのリガンドへの結合の競合的阻害剤又は非競合的阻害剤であり、したがって、ＩＧＦ−１Ｒとそのリガンドとの結合を妨げる物質；（２）ＩＧＦ−１Ｒとその天然のリガンドとの結合を妨げないが、代わりに、ＩＧＦ−１Ｒのそのリガンドへの結合により引き起こされる活動を増強する、改変する、阻害する又は減少する物質；（３）ＩＧＦ−１Ｒの発現を減少する物質が含まれる。そのような物質の例には、抗体（その抗原結合部分を含む）、核酸分子（たとえば、アンチセンス又は干渉ＲＮＡ分子及びアプタマー）、ペプチド、非ペプチド小有機分子などが含まれる。
【００２６】
用語「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ）経路阻害剤」は、本明細書では、ＥＲＫ１／２（細胞外シグナル調節キナーゼ）の発現レベル、細胞内分布及び／又は活性を阻害する物質に言及するのに使用される。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路は、ＥＲＫ経路（細胞外シグナル調節キナーゼ経路）、ＭＡＰＫ経路（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路）及びＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路とも呼ばれてきた。経路の構成には、以下のものが含まれる。（１）Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ及びＫ−ｒａｓという典型的なメンバーを有するＲａｓ（ラット肉腫）。Ｒａｓはすべての癌の約２０〜３０％において変異している。活性化されたＲａｓは次にＲａｆを活性化する。（２）Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ及びＣ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）という典型的なメンバーを有するＲａｆ（急速増殖性線維肉腫）。（ＲａｆはＲａｓにより又は変異により活性化される。活性化されたＲａｆは次にＭＥＫを活性化する。（３）Ｍｅｋ１（ＭＡＰ２Ｋ１）及びＭｅｋ２（ＭＡＰ２Ｋ２）という典型的なメンバーを有するＭＥＫ。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ、ＭＡＰ２Ｋとしても知られる。ＭｅｋはＥＲＫを活性化する。（４）ＥＲＫ１（遺伝子ＭＡＰＫ３）及びＥＲＫ２（遺伝子ＭＡＰＫ１）という典型的なメンバーを有するＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）。ＭＡＰＫとしても知られる。
【００２７】
用語「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤」は、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路においてそのエフェクターを通じてＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達を阻害する任意の物質並びにそれらの任意の変異体(mutants)及び遺伝的異型(variants)を包含する。一部の実施形態では、適切なＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤はＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼＭＡＰＫＫ）活性を選択的に阻害する阻害剤であり、たとえば、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤はＭＥＫポリペプチドによるＥＲＫポリペプチドのリン酸化を選択的に阻害するが、「選択的阻害」とは阻害剤がＭＥＫポリペプチド以外のポリペプチドの活性を実質的には阻害しないことを意味する（たとえば、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２阻害剤）。したがって、一部の特定の実施形態では、用語「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤」には、（１）ＭＥＫ（たとえば、Ｍｅｋ１及びＭｅｋ２）阻害剤；（２）Ｒａｓ（たとえば、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ）阻害剤；（３）Ｒａｆ（たとえば、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ）阻害剤；（４）ＥＲＫ（ＥＲＫ１及びＥＲＫ２）阻害剤；それらの任意の変異体及び遺伝的異型並びにそれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用される際、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害された（ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）」及び「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」とは、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤により活性化されたＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を減少する又は阻害し、それによって癌細胞生存率に対するＩＧＦ−１Ｒ阻害剤の保護的効果を減少させ、癌細胞を死滅させることにおけるＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの有効性を増加させるためのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤の使用のことである。
【００２９】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ）」（及びその文法的変化形）は、対象の状態の重症度が減少される、少なくとも部分的に改善される若しくは寛解される、及び／又は少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和若しくは減少が達成される、及び／又は疾患若しくは障害の進行が遅延することを意味する。
【００３０】
用語「癌を治療する」又は「癌の治療」とは、癌を罹っていると診断された患者において望ましい又は有益な効果を引き起こすことである。望ましい又は有益な効果には、（１）癌細胞のさらなる増殖若しくは拡散の阻害、（２）癌細胞の死滅、（３）癌の再発の阻害、（４）癌に付随する症状（たとえば、苦痛）の軽減、減少、緩和、阻害若しくは頻度の減少、又は（５）患者の生存の改善が含まれ得る。癌の再発の阻害には、すでに放射線、化学療法、手術又は他の技法により治療されている初期癌部位及び周辺組織での癌増殖の阻害並びに新しい遠隔部位での癌増殖の非存在が含まれる。望ましい又は有益な効果は、患者の主観によるものでも、客観的なものでもよい。たとえば、患者がヒトである場合、ヒトは、治療に対する改善又は応答で患者が感じる特徴的症状として改善した気力若しくは体力又は減少した苦痛に気付くことがある。他方、臨床医は、身体検査、検査値、腫瘍マーカー又はＸ線所見に基づいて腫瘍サイズ又は腫瘍量の減少に気付くことがある。治療に対する応答として臨床医が観察することがあるいくつかの臨床徴候には、白血球数、赤血球数、血小板数、赤血球沈降速度及び様々な酵素レベルなどの試験の正常化が含まれる。さらに、臨床医は、検出可能な腫瘍マーカーの減少を観察することがある。また、他の試験を使用して、超音波画像、核磁気共鳴試験及びポジトロン放出試験などの客観的改善を評価することが可能である。
【００３１】
本明細書で使用される「有効量」とは、治療的及び／又は有益な効果である所望の効果を生み出すのに十分である本発明の化合物、組成物及び／又は製剤の量のことである。有効量は、対象の年齢、全身状態、治療されている状態の重症度、投与されている特定の薬剤、治療期間、任意の併用療法の性質、使用される薬学的に許容される担体及び当業者の知識及び専門知識の範囲内の類似の要因と共に変化する。必要に応じて、任意の個々の場合の「有効量」は、関連するテキスト及び文献を参考にすることにより並びに／或いは日常的実験をすることにより当業者が決定できる。
【００３２】
本明細書で使用される際、「治療有効」量は、対象を治療する（本明細書で定義されている）のに十分な量である。当業者であれば、ある程度の利益が対象に与えられる限り治療効果は完全である又は治癒的である必要はないことは認識するであろう。
【００３３】
用語「ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤併用療法」とは、医学的状態を取り扱うためにＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を患者に投与することである。
【００３４】
本明細書で使用される際、用語「医薬組成物」とは、特定の状態（たとえば、癌）を治療するために患者（たとえば、それを必要とする対象）に有効量を投与した場合、所望の治療効果を誘導することができる化合物又は組成物のことである。
【００３５】
「薬学的に許容される」とは、組成、処方、安定性、患者の承諾、生物学的利用能及び他の成分との適合性に関して、薬理学的若しくは毒物学的観点から患者に、又は物理的若しくは化学的観点から薬剤を製造する化学者に許容される特性又は物質のことである。
【００３６】
「薬学的に許容される賦形剤」は、それ自体は治療物質ではないが、治療物質の対象への送達のための担体、希釈剤、結合剤若しくは媒体として使用される、或いはその取扱い若しくは貯蔵特性を改善するために又は投与のための単位剤形への化合物若しくは組成物の製剤化を可能にする若しくは容易にするために医薬組成物に添加される任意の物質を意味することが可能である。薬学的に許容される賦形剤は、製薬技術では周知であり、たとえば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｉｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ（たとえば、第２０版、２０００）及び「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、（たとえば、第１版、第２版及び第３版、それぞれ１９８６、１９９４及び２０００）に記載されている。賦形剤は種々の機能を提供し得、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香味剤及び甘味剤として記載されることがある。薬学的に許容される賦形剤の例には、（１）乳糖、ブドウ糖及びショ糖などの糖；（２）コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース及びその誘導体；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバター及び坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油などのオイル；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質除去水；（１７）等張性食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート又はポリ酸無水物；並びに（２２）医薬製剤中で用いられる他の無毒性適合物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用される際、「薬学的に許容される担体」とは、一緒に処方される化合物の薬理活性を破壊しない無毒性担体又は媒体のことである。本発明の組成物において使用し得る薬学的に許容される担体又は媒体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩又は硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの電解質、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン‐ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
「対象」又は「患者」には、本明細書で使用される際、癌に罹っている又は癌に罹っていると疑われている任意の動物が含まれる。そのような対象は、一般的には哺乳動物対象（たとえば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、霊長類等などの実験動物）、農業用若しくは商業用動物（たとえば、ウシ、ウマ、ヤギ、ロバ、ヒツジ等）、又は家畜（たとえば、ネコ、イヌ、フェレット等）である。特定の実施形態では、対象は霊長類対象、非ヒト霊長類対象（たとえば、チンパンジー、ヒヒ、サル、ゴリラ、等）又はヒトである。ある種の実施形態では、本発明の対象は癌に罹っていることが分かっている又は癌に罹っていると考えられる対象であり得る。本発明の対象は、癌を発症する危険があると分かっている又は考えられる対象であることがある。また、本発明による対象は、癌に罹っていると以前は分かっていなかった又は疑われていなかった対象を含むこともある。対象には、新生児、青少年、成人及び老人対象を含む、いかなる年齢の男性及び／又は女性が含まれる。「対象」は、インビトロ又はインビボの、動物又はヒトの細胞又は組織を指すこともある。
【００３９】
本発明の方法を「必要とする対象」は、癌に罹っていると分かっている、癌に罹っていると疑われる、又は癌を発症する危険が増大している対象であり得る。
【００４０】
本発明者らは、驚くべきことに、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストが、ＩＧＦ−１受容体を下方制御もするが、それによってＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を刺激し、引いてはＥＲＫシグナル伝達を刺激することを見出した。この刺激を介して、ＩＧＦ−１Ｒ治療は実際には癌細胞が生き延びるのを助けている。したがって、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストにより引き起こされるＥＲＫシグナル伝達刺激を抑えるためにＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストを少なくとも１つのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤と一緒に投与することにより、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト療法を使用する癌の治療を増強することが本発明の目的である。
【００４１】
本療法はＩＧＦ−１Ｒを発現している癌細胞を有する患者に対して使用することが可能であり、このＩＧＦ−１Ｒ発現は、タンパク質の発現を検出するための当技術分野で公知のいかなる手段によっても検出し得る。これらの方法には、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質発現の検出（免疫組織化学、ウェスタンブロット、クロマトグラフィー、タンパク質配列決定、ＥＬＩＳＡ）、ＩＧＦ１Ｒ転写又はＩＧＦ１Ｒ遺伝子発現の検出（ＰＣＲ、配列決定、ＦＩＳＨ）が含まれるが、これらに限定されない。本療法は、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路内において活性化している変異に拘らずＩＧＦ−１Ｒを発現している癌細胞を有するいかなる患者に対しても使用することが可能である。本発明の治療は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの負の副作用を遮断する、すなわち、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路への刺激を遮断するために、１つ又は複数のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が１つ又は複数のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストと同時投与される「ワンヒット治療」ということができる。他の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与に先立って投与することが可能である。
【００４２】
受容体の下方制御を誘導するいかなるＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストでも本発明に従って使用し得る。可能なＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストには、表１に提示されるアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。受容体を下方制御するＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を活性化し、引いてはＥＲＫシグナル伝達を活性化する。この点、本発明によれば、ＩＧＦ−１ＲアンタゴニストをＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤と組み合わせて、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路シグナル伝達を低減させることができる。いかなるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤でも本発明に従って使用し得る。可能なＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤には、表２に提供される阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【表１】
2014237592.tif 000002
【表２−１】
2014237592.tif 000003
【表２−２】
2014237592.tif 000004
【００４３】
任意のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストと任意のＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤の組合せは本発明に従って使用し得る。代表的実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体を、少なくとも１つのＭＥＫ阻害剤（たとえば、Ｕ０１２６、ＰＤ０９８０５９、ＳＬ−３２７及びＰＤ０３２５９０１）と組み合わせて投与することができる。他の実施形態では、小分子ＴＫＩを、少なくとも１つのＭＥＫ又はＲａｆ（たとえば、Ｂ−Ｒａｆ）阻害剤と組み合わせて投与することができる。さらに他の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＴＫＩ（たとえば、ＢＭＳ−７５４８０７）を、エストロゲン受容体（ＥＲ）阻害剤（タモキシフェン又はレトロゾール）及びＭＥＫ阻害剤（Ｕ０１２６、ＰＤ０９８０５９、ＳＬ−３２７及びＰＤ０３２５９０１）と組み合わせて投与することができる。
【００４４】
したがって、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤を含む組成物を提供する。
【００４５】
追加の態様では、本発明は本明細書に記載される少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
本発明の追加の態様では、少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）阻害剤を含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。
【００４７】
本発明は、それを必要とする対象において癌を治療する方法であって、治療的有効量の少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤を該対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００４８】
一部の実施形態では、本発明は、癌治療用組成物を製造するための少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤の使用を提供する。
【００４９】
他の態様では、本発明は、それを必要とする対象に（少なくとも１つの）ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及び（少なくとも１つの）ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を投与することを含む癌治療に使用する組成物を製造するためのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤を提供し、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤はＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストと実質的に同時に投与され、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤はＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストに先立って投与され、及び／又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤はＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの後に投与される。
【００５０】
さらに他の実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤によるＩＧＦ−１Ｒ受容体の下方制御の増強を阻害するための医薬組成物を製造するための少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）阻害剤の使用を提供する。
【００５１】
一部の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体及び／又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であってもよいが、これらに限定されない。他の実施形態では、モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体でもよい。特定の実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体は、ＩＭＣ−Ａ１２（シクスツムマブ）、Ｒ１５０７、ＭＫ−０６４６、ＡＭＧ４７９、ＡＶＥ１６４２、ＣＰ−７５１，８７１（フィギツムマブ）、又はそれらの任意の組合せとすることができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＩＧＦ−１ＲアンタゴニストはＣＰ−７５１，８７１（フィギツムマブ）である。
【００５２】
本発明の他の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは、エストロゲン受容体（ＥＲ）阻害剤、アロマターゼ阻害剤及び／又はＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）阻害剤、又はＩＧＦ−１Ｒの下方制御を増強若しくは増加させる他の任意の薬物の組合せと組み合わせる小分子阻害剤であり得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、それぞれ、小分子ＴＫＩ阻害剤は、ＰＰＰ及び／若しくはＢＭＳ−７５４８０７であり得、エストロゲン受容体阻害剤及び／又はアロマターゼ阻害剤は、タモキシフェン及び／又はメトホルミンであり得る。
【００５３】
本発明の他の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、Ｒａｓ（たとえば、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳ遺伝子並びにその変異体及び遺伝的異型の産物）（ラット肉腫）阻害剤、Ｒａｆ（急速増殖性線維肉腫）（たとえば、Ｃ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ及びＡ−Ｒａｆ遺伝子並びにその変異体及び遺伝的異型の産物）阻害剤、ＥＲＫ（たとえば、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２）（細胞外シグナル調節キナーゼ）阻害剤及び／又はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰ２Ｋとしても知られる）（ＭＥＫ）（たとえば、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２）阻害剤であることが可能であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤はＭＥＫ阻害剤である。
【００５４】
本発明のさらに他の実施形態では、Ｒａｓ阻害剤は、ティピファニブ（ザーネストラ（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ）（商標）、Ｒ１１５７７７）であり得るが、これに限定されない。本発明の追加の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、ＢＡＹ４３−９００６（ネクサバール（登録商標）、トシル酸ソラフェニブ）、ＡＡＬ−８８１、ＬＢＴ−６１３、ＳＢ−５９０８８５、ＰＬＸ−４７２０、Ｌ−７７９，４５０、ＳＢ−６９９３９３又はそれらの任意の組合せとすることができるが、これらに限定されない。
【００５５】
他の実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、ＢＡＹ４３−９００６（ネクサバール（登録商標）、トシル酸ソラフェニブ）、ＡＡＬ−８８１、ＬＢＴ−６１３、ＳＢ−５９０８８５、ＰＬＸ−４７２０、Ｌ−７７９，４５０、ＳＢ−６９９３９３であってもよいが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明のさらなる実施形態では、Ｒａｆ阻害剤は、ＲＡＦ２６５、ＸＬ２８１、ＰＬＸ−４０３２又はそれらの任意の組合せであってもよいが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の他の実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、ＣＩ−１０４０（ＰＤ−１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＸＬ５１８、セルメチニブ（Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）（ＡＺＤ６２４４、ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６９７６６）、ＰＤ０９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ−３２７又はそれらの任意の組合せとすることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１である。他の実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はＵ０１２６である。さらに他の実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０９８０５９である。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において癌を治療するための組成物及び方法であって、それを必要とする該対象は、ＩＧＦ−１Ｒを発現している細胞を含む癌に罹っている、組成物及び方法を提供する。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明は、癌を治療するための組成物及び方法であって、癌がユーイング肉腫、小児肉腫、大腸癌、黒色腫、乳癌、乳癌、肝癌、癌の肝転移、ブドウ膜黒色腫の肝転移、大腸癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、ブドウ膜黒色腫、卵巣癌、胃癌及び（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒａｎｄ）それらの任意の組合せであり得るが、これらに限定されない、組成物及び方法を提供する。
【００６０】
少なくとも１つのインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）アンタゴニスト及び少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路阻害剤は、同時に又は並行してだけではなくいかなる順序でもそれを必要とする患者に投与することが可能である。したがって、一実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤はＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストと実質的に同時に投与することが可能である。別の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤はＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストに先立って投与することが可能である。さらなる実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤はＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの後で投与される。
【００６１】
本明細書で使用されるように、用語「並行して(concurrently)」又は「実質的に同時に(substantially the same time)」は、併用効果を生み出すのに十分に時間が接近している（すなわち、並行してとは、同時（simultaneously）のこともあるし、又は互いの前若しくは後の短時間内に生じる２つ以上の事象であることもある）ことを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される際、本発明の治療剤（たとえば、ＩＧＦ−１ＲとＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤）の「併用投与」又は「組合せ投与」という用語は、治療剤がそれぞれ治療効果を有するような時間での該薬剤の投与を意味する。一部の実施形態では、この治療効果は相乗的になる。そのような併用投与は、互いに対して薬剤の並行（すなわち、一緒に）、事前又は事後の投与を伴い得る。当業者であれば、本発明の特定の治療剤及び組成物のための投与の適切なタイミング、順序及び投与量を困難なく決定できるであろう。
【００６３】
さらに、一部の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、それを必要とする患者又は対象に脱力発作の治療を施すための薬物を製造するために、単独で又は互いに組み合わせて又は上記の１つ若しくは複数の他の治療薬、又はその塩若しくはエステルと組み合わせて使用される。
【００６４】
用語「組合せ(combination)」は、一投与単位剤形の固定された組合せ或いはＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤を、特に、組合せパートナーが共同的な、たとえば、相加的若しくは相乗的な効果又はそれらの任意の組合せを示すことを可能にする時間間隔内に独立して、同時に又は別々に投与し得る併用投与のためのキットを意味する。
【００６５】
一部の特定の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、それを必要とする対象における癌治療の開始時に一度に投与される。他の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、癌に対する一連の治療中、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストが投与されるたびに投与される。
【００６６】
一部の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤がＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストに先立って投与される場合、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤はＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約４８時間の範囲で投与することが可能である。特定の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約６０分、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約２時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約４時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約６時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約８時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約１０時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約１２時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約１５時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約２０時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約２４時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約３０時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約３６時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約４０時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の約１分から約４４時間などの範囲で投与することが可能である。
【００６７】
したがって、特定の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与前の１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、７５分、９０分、２時間、２．２５時間、２．５時間、２．７５時間、３時間、３．２５時間、３．５時間、３．７５時間、４時間、４．２５時間、４．５時間、４．７５時間、５時間、５．２５時間、５．５時間、５．７５時間、６時間、６．２５時間、６．５時間、６．７５時間、７時間、７．２５時間、７．５時間、７．７５時間、８時間、８．２５時間、８．５時間、８．７５時間、９時間、９．２５時間、９．５時間、９．７５時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、など、及びそのなかの任意の範囲で投与することが可能である。
【００６８】
他の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤がＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの後で投与される場合、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤はＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約４８時間の範囲で投与することが可能である。特定の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約６０分、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約２時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約４時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約６時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約８時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約１０時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約１２時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約１５時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約２０時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約２４時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約３０時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約３６時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約４０時間、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の約１分から約４４時間などの範囲で投与することが可能である。
【００６９】
したがって、特定の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの投与後の１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、７５分、９０分、２時間、２．２５時間、２．５時間、２．７５時間、３時間、３．２５時間、３．５時間、３．７５時間、４時間、４．２５時間、４．５時間、４．７５時間、５時間、５．２５時間、５．５時間、５．７５時間、６時間、６．２５時間、６．５時間、６．７５時間、７時間、７．２５時間、７．５時間、７．７５時間、８時間、８．２５時間、８．５時間、８．７５時間、９時間、９．２５時間、９．５時間、９．７５時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、など、及びそのなかの任意の範囲で投与することが可能である。
【００７０】
したがって、一部の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤及びＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは一単位投与剤形で投与することができる。他の実施形態では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤及びＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは、複数の個別の単位剤形で投与することができる。
【００７１】
さらに、一部の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、それを必要とする患者又は対象に癌の治療を施すための薬物を製造するために、単独で及び／又は互いに組み合わせて及び／又は上記の１つ若しくは複数の他の治療薬、又はその塩若しくはエステルと組み合わせて使用することが可能である。
【００７２】
当業者であれば、過度の実験をしなくても、その技能及び本開示を考慮して、本発明を実行するために、本発明のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤及び他の任意の活性薬剤（たとえば、小分子ＴＫＩ阻害剤、ＥＲ阻害剤など）の治療的有効量を決定することができる（たとえば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（Ｖｏｌ．１〜３、１９９２）；Ｌｌｏｙｄ、１９９９、Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ；及びＰｉｃｋａｒ、１９９９、Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ参照）。治療的有効量は、活性物質のいかなる毒性又は有害な副作用よりも治療的に有益な効果のほうが臨床的に勝っている量でもある。特定の対象ごとに特定の投与計画が、個人の必要性並びにＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤及びＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストを投与する又はこの投与を監督する人間の専門的判断に従って時間と伴に評価され調整されるべきであることにさらに留意すべきである。
【００７３】
このようなことから、生物学的に活性な薬剤（単数又は複数）（たとえば、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト）の治療的有効量は、癌を治療するために臨床的に重要な結果をもたらす長期の治療計画内での反復投与を含み得る。このような意味での有効量の決定は、典型的には動物モデル実験とそれに続くヒト臨床試験に基づいており、対象における標的にされる暴露徴候又は状態の発生又は重症度を著しく減少させる有効量及び投与プロトコールを決定することにより導かれる。この点に関する適切なモデルには、たとえば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、非ヒト霊長類及び当技術分野で公知の他の容認された動物モデル対象が含まれる。代わりに、有効量はインビトロモデル（たとえば、免疫学的及び病理組織学的アッセイ）を使用して決定することが可能である。
【００７４】
そのようなモデルを使用すれば、典型的には、生物学的に活性な薬剤（単数又は複数）の治療的有効量（たとえば、所望の応答を誘発するのに経口的に有効である、鼻腔内に有効である、経皮的に有効である、静脈内に有効である又は筋肉内に有効である量）を投与するのに適切な濃度及び用量を決定するのに必要なのは普通の計算及び調整のみである。しかし、有効量は、使用される特定の化合物、投与様式、調製物の濃度、投与様式及び病状の進展に応じて変わり得る。さらに、患者の年齢、体重、食事及び投与時間を含む、治療されている特定の患者に関連する要因により、投与量を調整する必要性が生じる。
【００７５】
本発明の典型的実施形態では、ＩＧＦ−１ＲアンタゴニストとＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤の組成物の単位剤形が、標準投与計画のために調製される。この場合、この組成物（単数又は複数）は、医師の指示でもっと少量に容易に細分することが可能である。たとえば、単位投与量は、小包に分けられた粉末、バイアル又はアンプルに調合することが可能である。
【００７６】
したがって、必要に応じて、いかなる個人の場合でも、治療有効量は、関連原文及び文献を参照することにより及び／又は日常的実験を行うことにより、当業者により決定することができる（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版  ２００５参照）。一実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤及び他の任意の活性物質は、約０．００１から約１０ｍｇ／ｋｇ体重、たとえば、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の例では、用量ははるかに低く、たとえば、わずか０．０００５若しくは０．０００１ｍｇ／ｋｇ又はそれよりも低いことがある。一部の例では、用量ははるかに高く、たとえば、２０、５０、１００、５００若しくは１０００ｍｇ／ｋｇにも、又はそれよりも高いことがある。本発明は、前述の範囲及び量内のあらゆる部分的範囲を包含する。
【００７７】
代表的実施形態では、本発明の組成物の効果的投与は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストで約１ｍｇ／ｋｇ／用量から約２０ｍｇ／ｋｇ／用量（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｇ／ｋｇ／用量など、及びそのうちの任意の範囲）の経口又は非経口用量とすることができ、投与計画はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤で、たとえば、約１ｍｇ１日２回（ＢＩＤ）／用量から約１００ｍｇ１日２回（ＢＩＤ）／用量（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｍｇ／ｋｇ／用量など、及びそのうちの任意の範囲）とすることができる。したがって、活性成分の治療的有効量は、たとえば、平均体重が７０ｋｇの対象では、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストで、たとえば、約７０ｍｇ／３週間１服用、から約１４００ｍｇ／３週間１服用又はそのうちの任意の範囲とすることができ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤で、約１ｍｇ／日から約５０ｍｇ／日又はそのうちの任意の範囲とすることができる。
【００７８】
本発明のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤及び他の活性物質は、医学的に適切ないかなる手順によって投与してもよい（たとえば、経口、直腸、口腔内（たとえば、舌下）、膣、非経口（たとえば、皮下、筋肉内、皮内又は静脈内）、局所（すなわち、気道表面を含む、皮膚と粘膜表面の両方及び経皮投与）。代表的実施形態では、本発明の薬剤は、経口、直腸、口腔（たとえば、舌下）、膣、非経口（たとえば、皮下、筋肉内、皮内又は静脈内）、局所（すなわち、気道表面を含む、皮膚と粘膜表面の両方及び経皮投与法）を介して対象に送達される。選択される特定の投与法は、送達される薬剤、送達される薬剤の組合せ並びに治療されている特定の状態に依拠する。
【００７９】
本発明の方法は、癌の治療を施すのに使用するためのキットも提供する。１つ又は複数のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト及び１つ又は複数のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を含む医薬組成物が調製された後、その組成物は、癌の治療を施すために適切な容器に入れられラベルが貼られる。代わりに、治療化合物／薬剤（たとえば、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤）は、それぞれ個別の医薬組成物として適切な容器に入れることが可能である。さらに、少なくとも１つの他の治療剤を含む別の医薬を容器に入れ、指示された疾患の治療のためのラベルを貼ることが可能である。そのようなラベリングには、たとえば、それぞれの医薬の量、頻度及び投与法に関する使用説明書を含むことができる。
【実施例】
【００８０】
（例１）
試薬  ユビキチン（Ｐ４Ｄ１）、ＧＲＫ２（Ｃ−９）、ＧＲＫ６（ＸＸ−４）に対するモノクローナル抗体並びにＩＧＦ−１Ｒ（Ｈ−６０）、β−アレスチン１（Ｋ−１６）及びＧＡＰＤＨ（ＦＬ−３３５）に対するポリクローナル抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．製であった。モノクローナルβ−ａｒｒ１抗体はＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）製であった。リン酸化された（Ｐ−）ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ、Ｐ−ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、Ｐ−ＩＧＦ１Ｒ及びＩＧＦ−１Ｒに対するポリクローナル抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）製であった。
【００８１】
細胞培養  本試験で使用されるユーイング肉腫細胞系（ＳＫＥＳ、ＲＤＥＳ、ＣＡＤＯ及びＡ６７３）は市販されている。ユーイング肉腫細胞系ＬＡＰ３５、ＳＫＮＭＣ及び乳癌細胞系ＳＫＢＲ３は、Ｄｒ  Ｋａｔｉａ  Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ（Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｏｒｔｏｐｅｄｉｃｏ  Ｒｉｚｚｏｌｉ  ｄｉ  Ｂｏｌｏｇｎａ、Ｉｔａｌｙから提供された（１）。マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子（Ｒ−）が標的破壊されヒトＩＧＦ−１Ｒ遺伝子（Ｒ＋）が安定的にトランスフェクトされているＭＥＦ、Δ１２４５細胞系（ＩＧＦ−１Ｒ  ＫＯ細胞、Ｃ末端が１２４５位で切断されているＩＧＦ−１Ｒが安定的にトランスフェクトされている）は、Ｄｒ．Ｒｅｎａｔｏ  Ｂａｓｅｒｇａ（Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）から寄贈された（２）。β−アレスチン１、β−アレスチン２のノックアウトＭＥＦ及びβ−アレスチン１と２両方のノックアウトＭＥＦは、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ／Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）より快く提供された（３）。
【００８２】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びトランスフェクション  化学的に合成された二本鎖ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）より購入した。内在性β−アレスチン１を枯渇させるために使用されたｓｉＲＮＡ配列は、５’−ＡＡＡＧＣＣＵＵＣＵＧＵＧＣＵＧＡＧＡＡＣ２０−３’であった（３）。非ターゲティングＲＮＡ二重鎖（５’−ＡＡＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’）は対照として使用された。細胞は、製造業者の使用説明書に従ってＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１トランスフェクション試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）を使用して６ウェルプレートにおいて４０〜５０％の培養密度でトランスフェクトされた。
【００８３】
プラスミド及びトランスフェクション  β−アレスチン１−フラグを発現しているプラスミドはＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ／Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）より寄贈された。細胞は６ウェルプレートにおいて９０％の培養密度で培養され、製造業者の使用説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してプラスミドでトランスフェクトされた。
【００８４】
誘導性β−アレスチン１  ｓｈＲＮＡ安定細胞系の作製
安定的にトランスフェクトされた細胞系は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、Ａ６７３、ＣＡＤＯ、ＲＤＥＳ、ＳＫＥＳ及びＳＫＮＭＣユーイング肉腫細胞系について作製された。使用されたオリゴヌクレオチド：センス：５’−ＴＣＧＡＧＧＴＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴＡ−３’及びアンチセンス：５’−ＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＡＣＣ−３’（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）。
【００８５】
免疫沈降  細胞は５００μｌの溶解バッファー（１１０ｍＭ  ＫＯＡｃ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ）、緩衝塩  ｐＨ７．４）を用いて溶解された。５００μｇのタンパク質は、回転プラットフォーム上、４℃で一晩Ｄｙｎａｂｅａｄｓタンパク質Ｇ（１０μｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）及び１μｇの抗体と一緒にインキュベートされた。免疫沈殿物は磁気ホルダー上に収集され、上清は廃棄され、ビーズは溶解バッファーで３回洗浄され、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料バッファー中に溶解された。
【００８６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング  タンパク質試料はＬＤＳ試料バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に溶解され、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。分離後、該タンパク質は適切な電圧で１時間ニトロセルロース膜に移された。次に、膜は、Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水（ＴＢＳ）中に５％（ｗ／ｖ）脱脂乳粉及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む、ｐＨ７．５の溶液（ＴＢＳ−Ｔ）中で、室温で１時間ブロックされた。適合する一次抗体が４℃で一晩インキュベートされた。ＴＢＳ−Ｔでの３回洗浄に続いて、膜は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）と一緒に１時間インキュベートされた。検出はＥＣＬ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）及びＸ線フィルムへの露光を用いて実施された。
【００８７】
細胞生存率アッセイ  細胞は９６ウェル組織培養プレートでインキュベートされ、細胞生存率は製造業者の使用説明書に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存率アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定された。蛍光は励起５６０ｎｍ及び発光５９０ｎｍで測定された。細胞数は既知の細胞数に基づく蛍光測定の標準曲線から計算された。すべての実験で３重の培養が実施された。
【００８８】
デンシトメトリー解析  バンド強度はＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定され、規定のローディングコントロールのバンド強度に対して表示された。
【００８９】
ＩＧＦ−１Ｒを標的にする抗体は、同時にＥＲＫシグナル伝達活性化を刺激するバイアスＩＧＦ−１Ｒアゴニストとして作用する。
ユーイング肉腫細胞系における細胞生存率に対するＣＰ−７５１，８７１処理の効果。
第１セットの実験では、ＩＧＦ−１Ｒの発現、ＩＧＦ−１シグナル伝達を媒介する能力並びにＣＰ−７５１，８７１（Pfizer）に対する感受性に関して実験モデルの特徴付けを行った。ＩＧＦ−１Ｒ発現は、確証されているユーイング肉腫（ＥＳ）細胞系のパネル：ＳＫＥＳ、ＲＤＥＳ、ＣＡＤＯ、Ａ６７３及びＳＫＮＭＣにおいて調査された。ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルが低い乳癌細胞系ＳＫＢＲ３及びＩＧＦ−１ＲノックアウトＭＥＦ細胞（Ｒ−）はネガティブコントロールとして使用された。野生型ヒトＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ＋）を安定的にトランスフェクトされたＲ−細胞はポジティブコントロールとして使用された。図１Ａに示すように、試験されたＥＳ細胞系はすべてＩＧＦ−１Ｒを発現していた。活性化ループにおけるＩＧＦ−１に誘導された受容体自己リン酸化並びにそれに続く２つの主要なＩＧＦ−１Ｒの下流シグナル伝達経路：ＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの活性化を解析することによりＩＧＦ−１Ｒの機能も試験した。血清飢餓細胞は１０分間ＩＧＦ−１で刺激され、リン酸化された（Ｐ−）ＩＧＦ−１Ｒ、Ｐ−ＥＲＫ及びＰ−ＡＫＴのレベルはウェスタンブロッティング解析（ＷＢ）により検出された（図１Ｂ）。全ＩＧＦ−１Ｒ、ＡＫＴ、ＥＲＫ及びＧＡＰＤＨは対照として使用された。ＥＳ細胞系すべてにおいて、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１を用いた刺激により、チロシン残基での受容体リン酸化並びにそれに続くＥＲＫ及びＡＫＴ経路を通じたシグナル伝達の活性化が誘導され、機能的なＩＧＦ−１Ｒ応答が実証された。最後に、ＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体に対する感受性を、ＣＰ−７５１，８７１処理後のＥＳ細胞系の細胞生存率を測定することによって調べた。１００ｎｇ／ｍｌのＣＰ−７５１，８７１（５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１と比べて１０分の１のＣＰ−７５１，８７１モル濃度）が細胞に添加され、細胞は血清の存在下又は非存在下で４８時間培地でインキュベートされた。図１Ｃに示されるように、ネガティブコントロール細胞は影響を受けず、ＥＳ細胞系はすべてＣＰ−７５１，８７１処理に応答し細胞数は減少した。特に、ＣＰ−７５１，８７１のみ、ＥＳ細胞系すべてにおいて血清の非存在下で細胞増殖を一貫して減少させ、細胞増殖に対するＣＰ−７５１，８７１の阻害効果は本質的にリガンドとの競合に依存していないことが示唆された。
【００９０】
ＣＰ−７５１，８７１で誘導されたＩＧＦ−１Ｒの下方制御機構：β−アレスチン１動員及び受容体ユビキチン化
次の実験は、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御に対するＣＰ−７５１，８７１の効果を詳細に調べるために設計された。１２時間血清飢餓にしたＥＳ細胞系は、２４時間１００ｎｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌのＣＰ−７５１，８７１で処理され、細胞溶解物はＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用してＩＧＦ−１Ｒ発現について解析された。図２Ａに示すように、ＥＳ細胞系すべてがＣＰ−７５１，８７１に応答して用量依存的にＩＧＦ−１Ｒを下方制御する。時間応答試験において、受容体の下方制御に対するＣＰ−７５１，８７１とＩＧＦ−１の効果を比較すると（ＣＰ−７５１，８７１のモル濃度はＩＧＦ−１のほぼ１０分の１）、ＣＰ−７５１，８７１は４種のＥＳ細胞系：ＳＫＥＳ、ＲＤＥＳ、ＣＡＤＯ及びＳＫＮＭＣにおいて受容体分解を誘導するのにより効率的であることが証明された。ＣＰ−７５１，８７１とＩＧＦ−１の両方による類似する非常に急な受容体分解速度は、Ａ６７３において観察された。これらの傾向は、複数の実験でのデンシトメトリーによる定量で確かめられた（図２Ｂ、グラフ）。ＩＧＦ−１Ｒへのリガンドの結合による主要な結果は、受容体のユビキチン化、すなわち分解のための受容体の「タグ付け」であるので、ＩＧＦ−１Ｒ分解に対するＣＰ−７５１，８７１の効果の基礎となるメカニズムを確認するため、受容体のユビキチン化を調査した。ＩＧＦ−１Ｒは、ＣＰ−７５１，８７１又はＩＧＦ−１で短時間（１０分間）すでに刺激を受けている又は受けていない血清飢餓ＥＳ細胞から免疫沈降され、ユビキチン化された受容体はＷＢにより検出された。ＩＧＦ−１Ｒのリガンド依存性ユビキチン化は明確に検出され、調査された細胞系すべてにおいてＣＰ−７５１，８７１のほうが受容体ユビキチン化を生じるのにより強力であり（図２Ｃ）、受容体の下方制御実験と一致していた（図２Ｂ）。β−アレスチン１（β−ａｒｒ１）がＩＧＦ−１Ｒユビキチン化に関与している重要なタンパク質であることを考慮して、リガンドに誘導されたＩＧＦ−１Ｒ／β−ａｒｒ１会合も調べた。図２Ｄに示されるように、ＣＰ−７５１，８７１は、ＥＳ細胞系すべてにおいて、受容体へのβ−ａｒｒ１の動員においてＩＧＦ−１よりもはるかに強力であった。総合すれば、これらの実験により、ＣＰ−７５１，８７１が受容体へのβ−ａｒｒ１動員を刺激して、それに続いて受容体がユビキチン化され分解されることが実証されている。
【００９１】
ＣＰで誘導されるＩＧＦ−１Ｒ分解のβ−アレスチン１依存性
ＣＰ−７５１，８７１がβ−ａｒｒ１／ＩＧＦ−１Ｒ会合をもたらすことが明らかになったので、次にこのプロセスと受容体分解の間に因果関係があるのかどうかが問題である。この問題を解決するために、β−ａｒｒ１（β１ＫＯ）、β−ａｒｒ２又は両方を発現している又はしていないＭＥＦ細胞を使用した。細胞は血清飢餓にされＩＧＦ−１Ｒ分解及び細胞生存に対するＣＰ−７５１，８７１又はＩＧＦ−１刺激の効果がそれぞれ２４時間後及び４８時間後に測定された（図３Ａ）。両β−ａｒｒアイソフォームを発現している対照細胞並びにβ−ａｒｒ１アイソフォーム（β２ＫＯ）のみを発現している細胞では、ＣＰ−７５１，８７１又はＩＧＦ−１処理により受容体は強力に下方制御され、β−ａｒｒ１のない（β１ＫＯ又は二重ノックアウト、β１／２ＫＯ）ＭＥＦ細胞ではこの効果はほぼ完全に消滅していた。このβ−ａｒｒ１依存性は細胞生存実験でも示され、β１ＫＯ又はβ１／２ＫＯ細胞はＣＰ−７５１，８７１処理に非感受性であり、β−ａｒｒ１を含有する対応するＷＴ又はβ２ＫＯ細胞は、血清の存在又は非存在とは無関係に３０〜４０％阻害率で応答した（図３Ｂ）。
【００９２】
以前のデータは、１２４５位で切断されたＩＧＦ−１Ｒ（Δ１２４５）はβ−ａｒｒに結合する能力を欠くことを示している。β−ａｒｒ１をＣＰ−７５１，８７１で誘導されるＩＧＦ−１Ｒの下方制御の重要な媒介物として完全に確認するために、完全長野生型ＩＧＦ−１Ｒを発現しているＭＥＦ細胞及びＣ末端切断型Δ１２４５  ＩＧＦ−１Ｒを安定的にトランスフェクトされたＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ−）ノックアウトＭＥＦ細胞の別の実験モデルを使用した（図３Ｃ）。４８時間にわたり、β−ａｒｒ１への結合に欠陥のある切断型ＩＧＦ−１ＲはＣＰ−７５１，８７１又はＩＧＦ−１誘導分解に抵抗性であり、同じ細胞背景で発現される完全長ＩＧＦ−１Ｒは、１０分の１のモル濃度であるにもかかわらず、ＣＰ−７５１，８７１よってＩＧＦ−１よりも効率的な時間依存性分解速度を示した。ＥＳモデルにおいて記載される結果と一致して、細胞数の減少はＣＰ−７５１，８７１で誘導されたＩＧＦ−１Ｒの下方制御に対応しており、切断型ＩＧＦ−１Ｒを発現しているＭＥＦ細胞は基本的に無応答性である（図３Ｄ）。総合すると、これらの実験により、β−ａｒｒ１がＣＰ−７５１，８７１に誘導されたＩＧＦ−１Ｒの下方制御を制御している重要な分子であることが確証される。
【００９３】
β−アレスチン１はＣＰ−７５１，８７１で誘導されたＩＧＦ−１Ｒの下方制御及び細胞増殖の阻害を増強する
β−ａｒｒ１はＣＰ−７５１，８７１で誘導されるＩＧＦ−１Ｒの下方制御に不可欠な役割を果たしているので、次にβ−ａｒｒ１過剰発現が、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御及び全細胞生存に関して、ＥＳ細胞に対するＣＰ−７５１，８７１効果を増強することができるのかどうかを調査した。これは、異なる量のβ−ａｒｒ１フラグプラスミドを一過性にトランスフェクトされた細胞のＣＰ−７５１，８７１処理により行われた。図４Ａに示すように、リガンドの非存在下では、β−ａｒｒ１過剰発現はＩＧＦ−１Ｒ発現を用量依存的に下方制御する。にもかかわらず、β−ａｒｒ１発現の増加はＣＰ−７５１，８７１に誘導された受容体分解を増強し、ＣＰ−７５１，８７１に誘導された細胞増殖／生存の阻害を増強する（図４Ｂ）。興味深いことに、ＣＰ−７５１，８７１によるＩＧＦ−１Ｒ発現及び細胞増殖の明白なβ−ａｒｒ１用量依存性減少は、最低量の外因性β−ａｒｒ１を発現している細胞においては観察されず、β−ａｒｒ１レベルのわずかな増加後にＣＰ−７５１，８７１による増殖が増加する可能性を示している。
【００９４】
ＣＰ−７５１，８７１で誘導されβ−アレスチン１が媒介するＩＧＦ−１Ｒ  ＥＲＫシグナル伝達の活性化
次の実験では、２つの重要な下流ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達経路、すなわちＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、のＩＧＦ−１又はＣＰ−７５１，８７１に媒介された活性化のダイナミクスを調べることにより、β−ａｒｒ１動員に引き続きくＣＰ−７５１，８７１の考え得るアゴニスト特性を調査した。血清飢餓細胞はＷＢにより解析する前に最大６０分間ＩＧＦ−１又はＣＰ（１０対１モル比）で刺激された。ＩＧＦ−１で刺激すると、ＩＧＦ−１Ｒ活性化ループは２分以内にリン酸化され、そのキナーゼ活性が増加した。したがって、両方の主要下流シグナル伝達経路は、ＥＲＫ及びＡＫＴリン酸化により示される通りに活性化された（図５Ａ）。ＣＰ−７５１，８７１刺激の場合では、ＩＧＦ−１Ｒ及びＡＫＴリン酸化は検出できなかったが、ＣＰ−７５１，８７１により誘導される明白なＥＲＫリン酸化シグナルはＥＳ細胞系すべてにおいて示された。ＥＲＫ活性化レベルは一般にはＩＧＦ−１に媒介されたシグナル伝達の活性化に比べて低く、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ活性から独立した、おそらくβ−ａｒｒ媒介機構を通じたＥＲＫリン酸化を示唆している。この可能性を確かめるために、２つのβ−ａｒｒアイソフォームを発現している又はしていないＭＥＦ細胞並びにβ−ａｒｒ結合欠損ＩＧＦ−１Ｒを発現しているＭＥＦを再び使用した。図５Ｂに示されるように、ＣＰ−７５１，８７１はβ−ａｒｒ１の非存在下ではＥＲＫリン酸化を活性化することはできず、同じ経路はＷＴ及びβ２ＫＯ細胞では明確に活性化された。β−ａｒｒ１に結合することができない切断型ＩＧＦ−１Ｒを発現しているＲ−細胞はＣＰ−７５１，８７１に誘導されたＥＲＫ活性化には非感受性であった。総合すると、これらの実験により、ＩＧＦ−１Ｒ及びβ−ａｒｒ１により媒介されるＣＰ−７５１，８７１の部分的アゴニスト特性が実証された。
【００９５】
細胞増殖／生存に対するＣＰ−７５１，８７１効果の媒介におけるβ−アレスチン１の二律性：治療的意義
ＣＰ−７５１，８７１に誘導されるＩＧＦ−１Ｒの下方制御及び細胞生存の減少に対するβ−ａｒｒ１の保護効果を確認するために、我々の細胞系のパネルにおいてβ−ａｒｒ１レベルを減少させることによりレスキュー実験を実施した。ＥＳ細胞系はドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ  β−ａｒｒ１ノックダウン系を安定的にトランスフェクトされ、様々な用量のドキシサイクリンと一緒に４日間インキュベートされ、次に１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＰ−７５１，８７１なしで及びこれを用いて処理された。実験データは、以下の通り異なる時間に収集された：Ｔ０−  ＣＰ−７５１，８７１処理前、細胞数とβ−ａｒｒ１発現を解析する。Ｔ１０ｍ−  ＣＰ−７５１，８７１添加１０分後にＥＲＫ活性化について解析する。Ｔ１２ｈ−  ＣＰ−７５１，８７１処理１２時間後にＩＧＦ−１Ｒ発現について解析する。Ｔ４８ｈ−  細胞生存率について解析する。Ｔ０で収集されたデータは、系の有効性を確証しβ−ａｒｒ１のドキシサイクリン用量依存性減少を裏付けた（図６Ａ）。さらに、Ｔ０での前記系の特性解析により、β−ａｒｒ１の減少は細胞生存率の総合的な用量依存性消失を誘導することが実証された（図６Ａ）。
【００９６】
ＣＰ−７５１，８７１比（ＣＰ−７５１，８７１処理ｖｓ未処理）により表わされるＴ４８ｈでのＣＰ−７５１，８７１処理により阻害される細胞の割合は、我々の仮説を実証しており、あるレベルまでのβ−ａｒｒ１の低下では、細胞はＣＰ−７５１，８７１に対する抵抗性がより大きくなることを示した（図６Ｂ）。しかし、β−ａｒｒ１のさらなる減少はこの保護を逆転させ、５つの細胞系すべてにおいてβ−ａｒｒ１レベルの減少を通じて細胞生存率が吊り鐘型曲線を示した。ＩＧＦ−１Ｒ発現についてＴ１２ｈで収集されたデータ（図６Ｂ）は、β−ａｒｒ１の下方制御がＣＰ−７５１，８７１で誘導されたＩＧＦ−１Ｒ分解を妨げることを実証し、Ｔ１０ｍで収集された結果はβ−ａｒｒ１阻害に従ってＣＰ−７５１，８７１で誘導されたＥＲＫ活性化がより低下することを実証した（図６Ｂ）。Ｐ−ＥＲＫとＩＧＦ−１Ｒレベル間の相対的変化は、ＣＰ−７５１，８７１細胞生存率阻害率のピークと相関していると思われ（図６Ｂ）、β−ａｒｒ１の二重の役割、すなわち受容体の下方制御及びシグナル伝達活性化を際立たせる。これにより、ＣＰ−７５１，８７１によるＥＲＫ経路の偏った活性化が、ＣＰ−７５１，８７１によるＩＧＦ−１Ｒ発現及び細胞生存率の減少をある程度妨げていることが示される。この機構を立証するために、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（［１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス（２−アミノフェニルチオブタジエン）］ＭＥＫ１／２阻害剤（［１，４−ｄｉａｍｉｎｏ−２，３−ｄｉｃｙａｎｏ−１，４−ｂｉｓ（２−ａｍｉｏｎｐｈｅ−ｎｙｌｔｈｉｏｂｕｔａｄｉｅｎｅ）］  ＭＥＫ  １／２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）をＣＰ−７５１，８７１刺激と組み合わせて添加して、有害なＩＧＦ−１Ｒの下方制御からＥＲＫ活性化の保護的効果を切り離すことにより、ＥＲＫ活性化を選択的に阻害した。ＭＥＫ阻害剤はＣＰ−７５１，８７１に誘導されたＥＲＫ活性化を効果的に阻害した（図７）。ＣＰ−７５１，８７１の処理とＭＥＫ阻害剤とを組み合わせることにより、ＣＰ−７５１，８７１単独よりも感受性が増加することが示され、ＣＰ−７５１，８７１の偏ったアゴニスト作用の保護的役割が裏付けられ、それを回避する１つのアプローチが確認された（図６Ｃ）。
【００９７】
（例２）
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＥＲＫ経路の偏った活性化がＩＧＦ−１Ｒ抗体による細胞生存率の減少を防ぎ得ることを確認するため、ＭＥＫ  Ｕ０１２６を抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体と組み合わせて添加することによりＥＲＫ活性化が選択的に阻害される試験を、異なる癌細胞系で実施した。実験は有害なＩＧＦ−１Ｒの下方制御からＥＲＫ活性化の保護的効果を切り離すように計画された。
【００９８】
異なる種類の腫瘍細胞の生存率に対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体／ＭＥＫ阻害剤併用治療の効果は、製造業者の使用説明書に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存率アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して調べられた（表３）。
【００９９】
細胞は無血清培地において１２時間インキュベートされ、続いて０．５、１、３又は５μＭのＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６なしで又はこれを用いて６０分間前処理され、次に１００ｎｇ／ｍｌの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（フィギツムマブ又はαＩＲ−３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳ））なしで又はこれを用いて処理された。細胞は９６ウェル組織培養プレートにおいて４８時間インキュベートされ、細胞生存率はＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存率アッセイにより測定された。蛍光は励起５６０ｎｍで及び発光は５９０ｎｍで測定された。細胞数は、既知の細胞数に基づく蛍光測定の標準曲線から計算された。すべての実験で３重の培養が実施された。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体処理細胞により誘導される阻害は未処理細胞の百分率として計算された。
【０１００】
１８の異なる癌細胞系の４８時間インキュベーション後の生存率により決定される抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体／ＭＥＫ阻害剤併用のパーセント阻害値は表３にまとめられている。ＭＥＫ阻害剤の濃度の増加は、細胞系すべてにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ療法に対する応答を増強し、この効果が癌型非依存性であることを示した。さらに、フィギツムマブ又はαＩＲ−３抗体の両方で類似の効果が観察され、偏ったＭＡＰＫ／ＥＲＫ活性化による保護が受容体を下方制御する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の一般的特徴であることが示唆された。
【０１０１】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、これらの結果は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体組合せの悪性細胞の細胞増殖及び細胞生存率に対する増強された効果が、ＩＧＦ−１Ｒによる偏ったＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達が不活化された結果であり得ることを強く示唆している。細胞系間の応答の違いはＩＧＦ−１Ｒ依存性又は阻害剤の細胞取り込みの違いに起因するかもしれないが、試験された癌型すべてにおいて、併用療法は応答を大幅に増強させた。
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2014237592000001.app
【外国語明細書】
2014237592000001.pdf