(57)【要約】【課題】少なくとも表面がカーボンから成る基板上にカルボキシル基が固定化されたバイオチップ用基板及びその製造方法を提供すること。【解決手段】バイオチップ用基板は、少なくとも表面が炭素から成る基板と、この表面上に固定化された、分子構造中に遊離のカルボキシル基を持つアクリル系ポリマーとを含む。この基板の製造方法は、少なくとも表面が炭素から成る基板に、アクリル系ポリマーを接触させた状態で紫外線照射することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面が炭素から成る基板と、該表面上に固定化された、分子構造中に遊離のカルボキシル基を持つアクリル系ポリマーとを含むバイオチップ用基板。
【請求項２】
前記アクリル系ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、又はアクリル酸若しくはメタクリル酸を含む共重合体である請求項１記載の基板。
【請求項３】
前記アクリル系ポリマーが、ポリアクリル酸である請求項２記載の基板。
【請求項４】
前記アクリル系ポリマーの平均分子量が1000〜100000である請求項１〜３のいずれか１項に記載の基板。
【請求項５】
前記アクリル系ポリマーは、前記炭素と接触させた状態で紫外線照射することにより前記炭素に固定化したものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の基板。
【請求項６】
少なくとも表面が炭素から成る基板に、アクリル系ポリマーを接触させた状態で紫外線照射することを含む、請求項１記載の基板の製造方法。
【請求項７】
前記アクリル系ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、又はアクリル酸若しくはメタクリル酸を含む共重合体である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記アクリル系ポリマーがポリアクリル酸である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記アクリル系ポリマーの平均分子量が1000〜100000である請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板表面に遊離のカルボキシル基を有するバイオチップ用基板及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質チップ、ペプチドチップ、DNAチップ等のバイオチップは、各種疾患の診断や研究用として広く用いられている。従来より広く用いられているバイオチップは、通常、スライドガラス等のガラス基板上にタンパク質、ペプチド又はDNAのような生体関連物質を固定化したものである。
【０００３】
しかしながら、ガラス基板を用いた従来のバイオチップでは、非特異吸着が発生しやすく、測定の正確性に問題があった。また、ガラス基板は自家蛍光を発生するので、近年多く用いられるようになった蛍光標識を利用した測定においては正確性に問題があった。
【０００４】
これらの問題を解決すべく、金属製の基板上に活性基を有する炭素含有層を形成し、この活性基に生体関連物質を結合するバイオチップ用基板が提案されている（特許文献１）。このバイオチップ用基板は、自家蛍光を発生せず、生体関連物質の固定化が容易であり、基板の加工が容易で平坦性と表面精度が高いという優れた性質を有する。また、活性基としてカルボキシル基も例示されている。しかしながら、活性基としてカルボキシル基を採用する方法としては、先ず、アミノ基を炭素含有層に結合後、このアミノ基をジアゾニウムイオンとし、ニトリルに変換した後、これを加水分解する方法が記載されているのみであり、この方法も具体的には記載されていない。
【０００５】
さらに、少なくとも表面がカーボンから成る基板上に、アミノ基含有ポリマーを共有結合で結合して成るバイオチップ用基板も提案されている（特許文献２）。生体関連物質は、このアミノ基に共有結合される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2006-329686号公報
【特許文献２】特開2010-008378号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アミノ基と結合しない生体関連物質も存在しており、基板表面に、カルボシル基を結合するバイオチップが必要とされている。しかしながら、少なくとも表面がカーボンから成る基板上においては、適切にカルボシル基が結合されたものが存在しない。
【０００８】
従って、本発明の目的は、少なくとも表面がカーボンから成る基板上にカルボキシル基が固定化されたバイオチップ用基板及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、基板表面を構成するカーボンにアクリル系ポリマーを接触させた状態で紫外線を照射することにより、アクリル系ポリマーをカーボンに固定化すると共にアクリル系ポリマーのカルボキシル基を遊離の状態で基板表面に露出することが可能であり、さらに、このカルボキシル基に生体関連物質を結合させることが可能であることを実験的に確認して本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、少なくとも表面が炭素から成る基板と、該表面上に固定化された、分子構造中に遊離のカルボキシル基を持つアクリル系ポリマーとを含むバイオチップ用基板を提供する。また、本発明は、少なくとも表面が炭素から成る基板に、アクリル系ポリマーを接触させた状態で紫外線照射することを含む、上記本発明の基板の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、表面がカーボンから成り、表面に遊離のカルボキシル基を持つバイオチップ用基板及びその製造方法が新たに提供された。本発明のバイオチップ用基板は、表面がカーボンから成るので、自家蛍光を発生せず、基板の加工が容易で平坦性と表面精度が高いという優れた利点を有し、かつ、表面に遊離のカルボキシル基を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のバイオチップ用基板（以下、単に「基板」と略すことがある）では、基板表面にアクリル系ポリマーが固定化されている点に特徴がある。なお、後述の通り、アクリル酸又はメタアクリル酸は、紫外線照射によりカーボンに固定化されること、及び下記実施例に具体的に記載する通り、揺動しながら洗浄しても離脱しないことから、共有結合によりカーボンに結合しているものと考えられる。
【００１３】
アクリル系ポリマーのうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、又はアクリル酸若しくはメタクリル酸を含む共重合体が好ましく、特にポリアクリル酸がより好ましい。なお、アクリル系ポリマーが共重合体である場合、アクリル酸又はメタクリル酸以外の共重合成分としては、特に限定されず、例えば、ポリ(アクリル酸-co-スチレン)、ポリ(アクリル酸-co-メタクリル酸)やポリ(アクリル酸-co-エチレン)を挙げることができる。共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体のいずれでもよい。共重合体中のアクリル酸又はメタクリル酸成分の含量は、モル基準で通常、２０〜９９％、好ましくは、５０〜９９％程度である。アクリル系ポリマーの平均分子量（重量基準）は、特に限定されないが、本発明の効果をより良く達成する観点から１０００以上が好ましく、さらに好ましくは２０００以上である。一方、アクリル系ポリマーの分子量の上限は、特に限定されず、溶解性及び塗布液の安定性等の取扱い性に問題がない範囲であればよく、６万以下が好ましく、さらには６０００以下が好ましい。
【００１４】
本発明のバイオチップ用基板において、少なくとも基板表面は、カーボンから成る。カーボンとしては、アモルファスカーボンやダイヤモンドライクカーボンが好ましい。また、バイオチップとして用いる際の測定の精度を高くするため、基板表面はできるだけ平坦であることが好ましく、必要に応じ表面を研磨することができる。表面粗さRaは、2nm以下が好ましく、1nm程度がさらに好ましい。
【００１５】
少なくとも基板表面がカーボンで形成されていれば、基板本体の材質は何ら限定されない。基板全体を、アモルファスカーボン等のカーボンで構成することもできるし、基板本体上にダイヤモンドカーボン等をコーティングすることもできる。基板本体は、例えば、カーボン、金属、ガラス、セラミックス、プラスチック、の何れか１種、またはこれらの複合体等で形成することができ、カーボン以外の場合には、その表面にカーボン層を設ける処理を行った後、アクリル系ポリマーを固定化することができる。これらのうち、基板全体をカーボンで形成することは、耐薬品性、耐熱性、自家発光が無いことから特に好ましい。また、金属は、アルミニウム、ステンレス鋼、鉄鋼、銅等の単体、またはこれらの合金の表面にポリマーとの共有結合を確保するために、スパッタリング、ＣＶＤ、ＰＶＤ等の処理方法により、カーボンまたはダイヤモンドライクカーボンの層を設けたものを基板材料として使用することができる。アルミニウムは耐食性、表面硬度を改善するためにニッケル−リンめっきなどの表面処理を施した後、さらに上記カーボン層を表面に設けた後に基板材料に供することも可能である。ガラス、セラミックスはバイオチップ基板の素材として一般的に用いられる材料である。ポリマーとの共有結合を確保する目的と、タンパク質検体の余分な吸着を防止する目的のために、さらに表面にスパッタリング、ＣＶＤ、ＰＶＤ等の処理方法により、カーボンまたはダイヤモンドライクカーボンの層を設けて基板材料とすることができる。
【００１６】
アクリル系ポリマーのカーボンへの固定化は、アクリル系ポリマー溶液をカーボン上に塗布し、乾燥後、紫外線照射することにより行うことができる。アクリル系ポリマー溶液の溶媒としては、アクリル系ポリマーを溶解できるものであれば特に限定されないが、溶解性の観点から極性溶媒が好ましく、中でも、取扱性の観点からエタノール及び水が好ましい。溶液中のアクリル系ポリマーの濃度は、特に限定されないが、0.5〜３%(w/v)程度が好ましい。アクリル系ポリマーの基板表面への塗布は、一般的な手法を用いることができ、アクリル系ポリマーの塗布量を制御できる手法であれば、特にその方法を限定するものではない。例えば、ロールコート、スプレーコート、スピンコート、ディップコート等から選択し実施可能である。
【００１７】
照射する紫外線としては、波長１５０ｎｍ〜２６０ｎｍ程度、例えば波長１８４ｎｍや２５４ｎｍ等の紫外線を使用することができる。この波長の光によりＣ−Ｃ、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｈ結合が切断され、ラジカルが発生する。このとき空気中の酸素分子、水分子も分解されて酸素ラジカル、オゾンが発生し基板材料カーボンとポリマーの酸化分解も同時に起こり共有結合生成阻害の原因となる。これを防止するため本製造方法は減圧下または、不活性ガス雰囲気下で光照射を実施することが好ましい。減圧は大気圧を基準（０ＭＰａ）として−０．０５ＭＰａ以下、より好ましくは−０．０８ＭＰａ以下の真空度で実施する。不活性ガスはアルゴン、ヘリウム等の光照射を受けてもラジカル化しにくい希ガス元素を使用する。光の照射量は、ポリマーを共有結合するのに必要な量であればよく、エネルギー量として、基板表面１ｃｍ２当たり通常、約１〜６ジュール、好ましくは約２〜４ジュール程度である。例えば、基板表面１ｃｍ２当たり１８．５ｍＷの紫外線を通常１〜５分、好ましくは２〜４分照射する。照射後、基板を洗浄し、さらに、非特異吸着を防止するために、市販のブロッキング剤を用いて常法によりブロッキングを行うことが好ましい。
【００１８】
上記のようにして得られる本発明の基板は、表面に均一かつ高密度にカルボキシル基を有する。このカルボキシル基を利用して、生体関連物質を共有結合により固定化することによりバイオチップを構成することができる。生体関連物質としては、バイオチップにおいてプローブとして用いられているいずれの物質であってもよく、任意のポリペプチド（天然又は合成のタンパク質、オリゴペプチドを包含）、核酸（DNA及びRNA並びに人工核酸を包含）、糖、脂質、これらの複合体（糖タンパク質等）並びに誘導体（修飾タンパク質や核酸等）が挙げられる。
【００１９】
生体関連物質とカルボキシル基との結合は、生体関連物質中のアミノ基とカルボキシル基とをアミド結合させることにより容易に行うことができる。生体関連物質中の所望の部位（例えば末端等）にアミノ基が存在しない場合には、アミノ化剤等を用いる常法により、所望の部位にアミノ基を付与することができる。アミド結合は、例えば、常法に従い、縮合剤等を用いることにより容易に形成することができる。
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
１．  バイオチップ用基板の作製
(1)  表面がカーボンである基板の作製
表面粗さＲａが1ｎｍになるように研磨したアモルファスカーボン板（25.0×75.0ｍｍ公差± 0.1ｍｍ板厚1.000ｍｍ公差±0.025ｍｍ）を基板材料とし、紫外線照射装置（セン特殊光源株式会社、フォト・サーフェイス・プロセッサーＰＬ１６-１１０）で15分間紫外線照射（18.5ｍＷ／ｃｍ２、254ｎｍ）を行った。
【００２２】
(2)  ポリアクリル酸の固定化
重量平均分子量５０００のポリアクリル酸を2w/v%の濃度でエタノールに溶解した。得られたポリアクリル酸溶液を、上記基板のカーボン表面にコーティングした。すなわち、コーティング液を適量ピペットで分取し、基板材料表面に滴下した後、ポリアクリル酸塗布量が２０μｇ／ｃｍ２になるように塗工厚さを２ｍｉｌ(約0.051mm)に設定したベーカー式アプリケーターにより基板材料表面全体にコーティング液を塗り広げた。溶媒が揮発してからさらに1時間真空乾燥した（真空度-0.098ＭＰａ）のち、そのまま真空下で４分間紫外線を照射（18.5ｍＷ／ｃｍ２，254ｎｍ）しポリアクリル酸を固定化した。さらに超純水で1時間振とう洗浄して未反応のポリアクリル酸を除去してからスピン乾燥させ本発明のバイオチップ用基板を得た。
【００２３】
実施例２  末端アミノ化ＤＮＡの固定化及び性能評価
(1)   末端アミノ化ＤＮＡの固定化及びブロッキング
末端アミノ化ＤＮＡは理科研より購入した鎖長が50塩基対の末端アミノ化DNAにPBSを加えて10μMに調整した。１０μＭの末端アミノ化ＤＮＡ水溶液をスポットした後、基板をハイブリチャンバーに入れ、ハイブリチャンバー両端の溝に純水１００μＬづつ入れ蓋を閉め密閉した。ハイブリチャンバーを９５％ＲＨの恒湿度槽に入れ５時間インキュベーションした。取り出した基板は自然乾燥させた。
【００２４】
市販のブロッキング剤（10xブロッキングエージェント、agilent社製）を０．５μＬの純水で溶解し１０ｘブロッキング液とし、さらに１０倍に希釈し１ｘブロッキング液とした。基板をハイブリチャンバーに入れ、スポット部分を覆うように２０μｍのＧａｐ付きカバーグラスを被せ、隙間から１ｘブロッキング液を３０μＬ流し込んだ。ハイブリチャンバー両端の溝に純水を１００μＬづつ入れ密閉しＲＴ  ３０分間静置した。純水で５分間揺動洗浄後、４℃のエタノールに５分間浸漬しスピン乾燥した。
【００２５】
(2)  ハイブリダイゼーション
１００μＭのＣｙ３標識ＤＮＡ（固定化したＤＮＡの相補鎖）３．０９μＬ，１０ｘブロッキング液  ３３μＬ，ハイブリバッファー  １６５μＬを純水  １２８．９μＬに溶解しハイブリ溶液とした。基板をハイブリチャンバーに入れプローブスポット部を覆うように２０μｍＧａｐ付きカバーグラスを被せ、隙間からハイブリ溶液を３０μＬ流し込んだ。ハイブリチャンバー両端の溝に純水を１００μＬづつ入れ密閉し、さらにアルミラミネート袋に入れて遮光状態にした。６５℃の乾燥器中で一晩ハイブリダイゼーション実施した。乾燥器からハイブリチャンバーを取り出し、直ちにスライドウォッシャーを用い２ｘ  ＳＳＣ，０．１ｗｔ％ＳＤＳで５分間揺動洗浄した。洗浄初期にカバーグラスが外れるのでカバーグラスはホルダーの別の溝に移動させ基板と一緒に洗浄を続けた。洗浄は、０．２ｘ  ＳＳＣ，０．１ｗｔ％  ＳＤＳで５分間、次いで、０．２ｘ  ＳＳＣで５分間、次いで純水でリンスを５分間後スピン乾燥することにより行った。
【００２６】
(3)  蛍光強度測定
励起光５３２ｎｍ、蛍光フィルター５７０ｎｍ、解像度１０μｍ，ＰＭＴ  ５０％で全面スキャンを行った。
【００２７】
(4)  結果
結果を下記表１に示す。表中、PAcはポリアクリル酸、U4は紫外線４分間照射、LAUは任意単位(linear arbitrary unit)、SNはシグナルノイズ比(signal-noise ratio)、BGはバックグランド（ＤＮＡを固定化していない部位の蛍光）を意味する。
【００２８】
【表１】
2014134406.tif 000002
【００２９】
表１に示される通り、SN比は平均で3.9であり、本発明のバイオチップ用基板上にＤＮＡを固定化したバイオチップを用いて、固定化したＤＮＡの相補鎖が検出可能であることが証明された。