(57)【要約】【課題】筋肉誘導前駆体組成物を利用した骨格筋の強化およびその処置の提供。【解決手段】本発明の目的は、移植後長期間生存性を示す新規な筋肉誘導前駆細胞（ＭＤＣ）およびＭＤＣ組成物を提供することである。本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、早期前駆筋肉細胞、即ちデスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２を包含するがこれらに限定されない前駆細胞マーカーを発現する筋肉誘導幹細胞を含む。さらにまた、これらの早期前駆筋肉細胞はＦｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦ、およびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーは発現しない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は筋肉誘導前駆細胞（ＭＤＣ）およびＭＤＣの組成物ならびに身体組織、特に骨格筋の強化におけるその使用に関する。特に本発明は、骨格筋内への導入後長期間の生存を示す筋肉誘導前駆細胞、ＭＤＣを単離する方法、およびヒトまたは動物の骨格筋の強化のためにＭＤＣ含有組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、美容上または機能上の状態、例えば限定しないが、骨格筋の脆弱化、筋ジストロフィー、筋萎縮症、痙性、ミオクローヌスおよび筋肉痛の治療のための筋肉誘導前駆細胞の新規な使用に関する。本発明はまた、平均以上の骨格筋の質量を必要とする運動家または他の生物における骨格筋の質量の増大のためのＭＤＣの新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋芽細胞、即ち筋線維の前駆体は、単核性の筋細胞であり、これが融合して有糸分裂後の多核性の筋管を形成し、生物活性蛋白の長期の発現および送達を可能とする（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００３】
培養された筋芽細胞は、幹細胞の自己再生特性の一部を示す細胞のサブ集団を含有している（非特許文献６）。このような細胞は融合して筋管を形成することができず、分離して培養しなければ分裂しない（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏ等、非特許文献６）。筋芽細胞の移植の試験（後述参照）は、移植細胞の大半が急速に死滅するが、一部少数が生存して新しい筋肉の形成を媒介することを示している（非特許文献７）。この一部少数の細胞は区別可能な挙動、例えば組織培養物中での緩徐な成長、および移植後の急速な成長を呈し、これらの細胞が筋芽細胞幹細胞である可能性を示している（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐ等、非特許文献７）。
【０００４】
筋芽細胞は、種々の筋肉および非筋肉関連の障害の治療における遺伝子療法のためのベヒクルとして使用されている。例えば、遺伝子的に修飾されたか、または未修飾の筋芽細胞の移植は、デュシェーヌ筋ジストロフィーの治療のために使用されている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。さらにまた、筋芽細胞は１型糖尿病の治療のためのプロインスリン（非特許文献１４）、Ｂ型血友病の治療のための第ＩＸ因子（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）、アデノシンデアミナーゼ不全症候群の治療のためのアデノシンデアミナーゼ（非特許文献１９）、慢性貧血の治療のためのエリスロポエチン（非特許文献２０；非特許文献２１）、および成長遅延の治療のためのヒト成長ホルモン（非特許文献２２）を産生するように遺伝子操作されている。
【０００５】
筋芽細胞は、参照により本明細書に援用されるＬａｗ等への特許文献１、Ｂｌａｕ等への特許文献２、およびＣｈａｎｃｅｌｌｏｒ等による特許文献３に開示されている通り、筋肉組織の損傷または疾患の治療のためにも使用されている。さらにまた、筋芽細胞移植は心筋の機能不全の修復のためにも使用されている（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。
【０００６】
上記にも関わらず、主な筋芽細胞誘導治療は、遊走および／または貪食作用のために移植後の細胞の低い生存率を伴っている。この問題を回避するために、参照により本明細書に援用されるＡｔａｌａ等の特許文献４は、アルギネートのような液体ポリマー中に懸濁された筋芽細胞の使用を開示している。ポリマー溶液は、筋芽細胞が注射後に遊走および／または貪食作用を起こすことを防止するマトリックスとして作用する。しかしながらポリマー溶液は、上記した生物ポリマーと同様の問題を呈する。さらにまた、Ａｔａｌａの特許は他の組織を除く筋肉組織のみにおける筋芽細胞の使用に限定されている。
【０００７】
このように、長時間持続し、広範な宿主組織と適合し、移植部位を包囲する組織の炎症、瘢痕形成、および／または強直を最小限とする他の異なる組織強化物質が必要とされている。したがって、本発明の筋肉誘導前駆細胞（ＭＤＣ）含有組成物は、骨格筋を強化するための改善された新規な物質として提供される。さらに、移植後長期間生存性を示す筋肉誘導前駆細胞組成物を製造する方法、ならびに、種々の美容的および／または機能的な欠陥、例えば限定しないが骨格筋の脆弱化、筋ジストロフィー、筋萎縮症、痙性、ミオクローヌスおよび筋肉痛を治療するためにＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を利用する方法を提供する。同様に、平均以上の骨格筋の質量を必要とする運動家または他の生物における骨格筋の質量の増大のためにＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を使用する方法を提供する。
【０００８】
非筋肉組織の強化のために筋芽細胞を使用する従来の試みは功を奏していないことは明らかである（Ａｔａｌａへの特許文献４）。したがって、本明細書に開示した所見は、本発明の筋肉誘導前駆細胞が非筋肉組織、例えば骨格筋組織内に良好に移植可能であり、長期の生存を呈することを示していることから、予測されなかったものである。その結果、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、骨格筋生成のための一般的な強化用物質として使用できる。さらにまた、本発明の筋肉誘導前駆細胞および組成物は自系源から誘導できるため、宿主における免疫学的な合併症、例えば強化用物質の再吸収、ならびに移植部位を包囲する組織の炎症および／または瘢痕形成の危険性は低下している。
【０００９】
間葉幹細胞は筋肉、骨格筋、軟骨等を包含する身体の種々の結合組織に存在する（非特許文献２６；非特許文献２７）が、間葉という用語は、筋肉からではなく骨格筋の骨髄から精製された幹細胞のクラスを指すために歴史的に使用されてきた。このように、間葉幹細胞は本発明の筋肉誘導前駆細胞とは区別可能である。さらにまた、間葉細胞は、本明細書に記載した筋肉誘導前駆細胞により発現されるＣＤ３４細胞マーカーを発現しない（非特許文献２８）。
【００１０】
既知組成物および方法に関連している不都合な点および問題点の本明細書における記載は、本文書に記載した実施形態の範囲をそれのみに限定する意図はない。実際、特定の実施形態は、そのように記載された不都合な点または問題点に煩わされることなく１つ以上の既知組成物、化合物、または方法を包含してよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，１３０，１４１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３８，７２２号明細書
【特許文献３】米国特許第６，８６６，８４２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６６７，７７８号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ，１９９５，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１：１２３〜１３７
【非特許文献２】Ｊ．Ｄｈａｗａｎ等、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１５０９〜１２
【非特許文献３】Ａ．Ｄ．Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，１９９４，Ｍｙｏｌｏｇｙ  第２版  Ａ．Ｇ．Ｅｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，３０３〜３０４
【非特許文献４】Ｓ．Ｊｉａｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，１９９２，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７５：１４３〜７
【非特許文献５】Ｈ．Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ，１９９６，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ７：２１９５〜２２００
【非特許文献６】Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏ等、１９９６，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６０：４７〜５７
【非特許文献７】Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐ等、１９９９，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４４：１１１３〜１１２２
【非特許文献８】Ｅ．Ｇｕｓｓｏｎｉ等、１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３５６：４３５〜８
【非特許文献９】Ｊ．Ｈｕａｒｄ等、１９９２，Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ，１５：５５０〜６０
【非特許文献１０】Ｇ．Ｋａｒｐａｔｉ等、１９９３，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３４：８〜１７
【非特許文献１１】Ｊ．Ｐ．Ｔｒｅｍｂｌａｙ等、１９９３，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２：９９〜１１２
【非特許文献１２】Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔ等、１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４７：９４〜９
【非特許文献１３】Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔ等、１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１３４０〜４６
【非特許文献１４】Ｌ．Ｇｒｏｓ等、１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１０：１２０７〜１７
【非特許文献１５】Ｍ．Ｒｏｍａｎ等、１９９２，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２４７〜５８
【非特許文献１６】Ｓ．Ｎ．Ｙａｏ等、１９９４，Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１：９９〜１０７
【非特許文献１７】Ｊ．Ｍ．Ｗａｎｇ等、１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ９０：１０７５〜８２
【非特許文献１８】Ｇ．Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ等、１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１２８１〜８
【非特許文献１９】Ｃ．Ｍ．Ｌｙｎｃｈ等、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１１３８〜４２
【非特許文献２０】Ｅ．Ｒｅｇｕｌｉｅｒ等、１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１０１４〜２２
【非特許文献２１】Ｂ．Ｄａｌｌｅ等、１９９９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１５７〜６１
【非特許文献２２】Ｋ．Ａｎｗｅｒ等、１９９８，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．９：６５９〜７０
【非特許文献２３】Ｃ．Ｅ．Ｍｕｒｒｙ等、１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２５１２〜２３
【非特許文献２４】Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓ等、１９９９，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６７：１２４〜１２９
【非特許文献２５】Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓ等、１９９９，Ｊ．Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１８：１１７３〜８０
【非特許文献２６】Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇ等、１９９３，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２９Ａ：７２３〜７３６
【非特許文献２７】Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇ等、１９９５，Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２０２：１３７〜１４４
【非特許文献２８】Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ等、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：１４３〜１４７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の概要）
本発明の目的は、移植後長期間生存性を示す新規な筋肉誘導前駆細胞（ＭＤＣ）およびＭＤＣ組成物を提供することである。本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、早期前駆筋肉細胞、即ちデスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２を包含するがこれらに限定されない前駆細胞マーカーを発現する筋肉誘導幹細胞を含む。さらにまた、これらの早期前駆筋肉細胞はＦｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦ、およびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーは発現しない。
【００１４】
本発明の別の目的は、出発筋肉細胞集団から筋肉誘導前駆細胞を単離して富化するための方法を提供することである。この方法は、軟組織の部位内への移植または導入後長期間の生存能力を有するＭＤＣの富化をもたらす。本発明によるＭＤＣ集団はデスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２を包含するがこれらに限定されない前駆細胞マーカーを発現する細胞が特に富化されている。このＭＤＣ集団はまた、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦ、およびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーは発現しない。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、移植のためのポリマー担体または特別な培養基を必要としない、骨格筋を包含する筋肉組織の強化のためのＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を使用する方法を提供することである。そのような方法は例えば組織の表面の内部または上部への直接の注射によるか、または組成物の全身分布による骨格筋への導入によるＭＤＣ組成物の投与を包含する。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は傷害、創傷、手術、外傷、非外傷、または裂溝、開口部、陥没部、創傷等をもたらす他の処置の後の、骨格筋を強化する方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は化学物質、成長培地、および／または遺伝子操作の使用を介して修飾されるＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を提供することである。そのようなＭＤＣおよびその組成物は、生物学的化合物の製造および送達および種々の疾患、状態、傷害、または病気の治療のために有用な化学的または遺伝子的に修飾された細胞を含む。
【００１８】
本発明の別の目的は、化学物質、生育培地、および／または遺伝子操作の使用を介して修飾されたＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を提供することである。そのようなＭＤＣおよびその組成物は、生物学的化合物の製造および送達および種々の疾患、状態、傷害、または病気の治療のために有用な化学的または遺伝子敵に修飾された細胞を含む。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、ＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物を含む医薬組成物を提供することである。医薬組成物は単離されたＭＤＣを含む。このＭＤＣはその後、単離後の細胞培養により増殖してよい。本実施形態の１つの態様において、これらのＭＤＣは医薬組成物を必要とする被験体への送達の前に凍結される。
【００２０】
本発明はまた、組成物および単一のプレーティング操作法を用いながらＭＤＣの単離を行う方法を提供する。ＭＤＣは骨格筋の生検から単離される。１つの実施形態において、生検から得られる骨格筋は１〜６日間保存してよい。本実施形態の１つの態様において、生検由来の骨格筋は４℃で保存される。細胞を粉砕し、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、別の酵素または酵素の組み合わせを用いて消化する。細胞から酵素を洗浄した後、細胞を約３０〜約１２０分間培養基中フラスコ内で培養する。この期間、「急速接着細胞」はフラスコまたは容器の壁部に付着するのに対し、「緩徐接着細胞」即ちＭＤＣは懸濁液中に残存する。「緩徐接着細胞」を第２のフラスコまたは容器に移し、そこで１〜３日間培養する。この第２の期間、「緩徐接着細胞」即ちＭＤＣは第２のフラスコまたは容器の壁部に付着する。
【００２１】
本発明の別の実施形態においては、これらのＭＤＣを任意の数量の細胞にまで増殖させる。本実施形態の好ましい態様において、細胞を新しい培養基中、約１０〜２０日間増殖させる。より好ましくは、細胞を１７日間増殖させる。
【００２２】
ＭＤＣは増殖または非増殖に関わらず、輸送のために温存するか、または使用前の期間保存してよい。１つの実施形態において、ＭＤＣは凍結される。好ましくは、ＭＤＣは−２０〜−９０℃で凍結される。より好ましくは、ＭＤＣは約−８０℃で凍結される。この凍結ＭＤＣは医薬組成物として使用される。
【００２３】
凍結されるか医薬組成物として温存されるか、またはそのまま使用されるかのいずれかで、ＭＤＣを多くの骨格筋変性病理状態を治療するために使用してよい。この状態は例えば限定しないが、骨格筋の脆弱化、筋ジストロフィー、筋萎縮症、痙性、ミオクローヌスおよび筋肉痛を包含する。凍結されるか医薬組成物として温存されるか、またはそのまま使用されるかのいずれかで、ＭＤＣを平均以上の骨格筋の質量を必要とする運動家または他の生物における骨格筋の質量の増大のために使用してよい。
【００２４】
追加的な目的および本発明により得られる利点は、以下に記載する詳細な説明および実施例から明らかになる。
例えば、本願発明はいかの項目を提供する。
（項目１）
骨格筋の強化を必要とする哺乳類において骨格筋の強化を行う方法であって、
ａ）ＭＤＣを単離する工程、
ｂ）単離されたＭＤＣを１０〜２０日間培養物中で増殖させる工程、および、
ｃ）増殖されたＭＤＣの治療有効部分を、骨格筋の強化を必要とする哺乳類の骨格筋に投与する工程、
を含むことにより、骨格筋の強化を必要とする哺乳類において骨格筋の強化を行う、方法。
（項目２）
骨格筋の強化を必要としている哺乳類が筋肉の病理学的状態に罹患している、項目１記載の方法。
（項目３）
哺乳類がヒトである、項目１記載の方法。
（項目４）
（ａ）３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中にヒト骨格筋細胞を懸濁する工程、
（ｂ）第２の細胞培養容器に第１の細胞培養容器から培地を移す工程、
（ｃ）第２の細胞培養容器の壁部に培地中の残存細胞を付着させる工程、および、
（ｄ）第２の細胞培養容器の壁部から細胞を単離する工程、ここで単離された細胞はＭＤＣであること、
を含むことにより、ＭＤＣを単離する方法によってＭＤＣが単離される、項目１記載の方法。
（項目５）
（ａ）骨格筋細胞懸濁液の線維芽細胞が接着する第１の容器中で骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁液をプレーティングする工程、
（ｂ）第２の容器中に工程（ａ）由来の非接着細胞を再プレーティングする工程、ここで再プレーティングの工程は細胞の約１５〜約２０％が第１の容器に接着した後であること、および、
（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回反復する工程、
を含むことにより、ＭＤＣを単離する方法によってＭＤＣが単離される、項目１記載の方法。
（項目６）
哺乳類の骨格筋内にＭＤＣを注射することによりＭＤＣが投与される、項目１記載の方法。
（項目７）
哺乳類の筋肉が欠陥を有する、項目１記載の方法。
（項目８）
ＭＤＣを前記欠陥に適用することによりＭＤＣが投与される、項目１記載の方法。
（項目９）
ＭＤＣが注射を介して適用される、項目８記載の方法。
（項目１０）
骨格筋の強化を必要とする哺乳類において骨格筋の強化を行う方法であって、
ａ）ＭＤＣを単離する工程、
ｂ）単離されたＭＤＣを約−２５℃〜−９０℃の温度に凍結する工程、
ｃ）凍結した単離されたＭＤＣを解凍する工程、および、
ｄ）解凍されたＭＤＣを、骨格筋の強化を必要とする哺乳類の骨格筋に投与する工程、
を含むことにより、骨格筋の強化を必要とする哺乳類において骨格筋の強化を行う、方法。
（項目１１）
骨格筋の強化を必要とする哺乳類が筋肉の病理学的状態に罹患している、項目１０記載の方法。
（項目１２）
哺乳類がヒトである、項目１０記載の方法。
（項目１３）
（ａ）３０〜１２０分間、第１の細胞培養容器中にヒト骨格筋細胞を懸濁する工程、
（ｂ）第２の細胞培養容器に第１の細胞培養容器から培地を移す工程、
（ｃ）第２の細胞培養容器の壁部に培地中の残存細胞を付着させる工程、および、
（ｄ）第２の細胞培養容器の壁部から細胞を単離する工程、ここで単離された細胞はＭＤＣであること、
を含むことにより、ＭＤＣを単離する方法によってＭＤＣが単離される、項目１０記載の方法。
（項目１４）
（ａ）骨格筋細胞懸濁液の線維芽細胞が接着する第１の容器中で骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁液をプレーティングする工程、
（ｂ）第２の容器中に工程（ａ）由来の非接着細胞を再プレーティングする工程、ここで再プレーティングの工程は細胞の約１５〜約２０％が第１の容器に接着した後であること、および、
（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回反復する工程、
を含むことにより、ＭＤＣを単離する方法によってＭＤＣが単離される、項目１０記載の方法。
（項目１５）
哺乳類の骨格筋内にＭＤＣを注射することによりＭＤＣが投与される、項目１０記載の方法。
（項目１６）
哺乳類の筋肉が欠陥を有する、項目１０記載の方法。
（項目１７）
ＭＤＣを前記欠陥に適用することによりＭＤＣが投与される、項目１０記載の方法。
（項目１８）
ＭＤＣが注射を介して適用される、項目１７記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
特許または特許出願ファイルはカラーで行われた写真複写少なくとも１つを含有する。カラー写真複写による本特許または特許出願のコピーは、申請および必要料金の支払いにより、米国特許庁から提供されることになる。
【００２６】
添付した図面はその種々の態様の明確化を介して本発明をさらに説明し、かつその理解を容易にするために提示している。
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ヒトジストロフィンと共にマウス筋肉に注射されたヒトＭＤＣ（ｈＭＤＣ）および融合したヒトおよびマウスの筋肉細胞におけるキメラ形成性を示すために染色したマウスＹ染色体を示している。
【図２】図２は、ｈＭＤＣを注射したマウスにおけるジストロフィン陽性線維のパーセンテージを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトＭＤＣおよびそのような細胞を使用することにより、骨格筋組織を形成して損傷した骨格筋を修復または骨格筋の体積および／もしくは強度を野生型レベルより高値に上昇させる方法を提供する。本発明はさらに、骨格筋の障害、例えば限定しないが骨格筋の脆弱化、筋ジストロフィー、筋萎縮症、痙性、ミオクローヌスおよび筋肉痛を治療する方法を提供する。成人組織からのヒト筋肉誘導細胞（ＭＤＣ）の単離によって、これらの細胞を投与されたヒト被験体内で増大した骨格筋密度および骨格筋体積を達成することができる。
【００２８】
筋肉誘導細胞および組成物
本発明は身体組織、好ましくは骨格筋内部への移植の後に長期の生存率を示す初期前駆細胞（本明細書においては筋肉誘導前駆細胞または筋肉誘導幹細胞とも称する）よりなるＭＤＣを提供する。本発明のＭＤＣを得るためには、筋肉の体外移植組織、好ましくは骨格筋を、動物ドナー、好ましくはヒトを包含する哺乳類より得る。この体外移植組織は筋肉前駆細胞の「残余」を包含する構造的および機能的なシンシチウムとして機能する（Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ等、１９７８，Ｎａｔｕｒｅ  ７３：３０６〜８；Ｂ．Ｈ．Ｌｉｐｔｏｎ等、１９７９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０５：１２９２４）。
【００２９】
一次筋肉組織から単離した細胞は線維芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、造血前駆細胞および筋肉誘導前駆細胞の混合物を含有する。筋肉誘導集団の前駆細胞は、参照により本明細書に援用されるＣｈａｎｃｅｌｌｏｒ等への米国特許６，８６６，８４２号に記載のようなコラーゲンコーティング組織フラスコ上の一次筋肉細胞の示差的な接着特性を用いながら富化することができる。接着が緩徐である細胞は形態学的に丸型であり、高レベルのデスミンを発現し、融合して多核の筋管に分化する能力を有している（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ等の米国特許６，８６６，８４２号）。これらの細胞のサブ集団はアルカリホスファターゼ、副甲状腺ホルモン依存性３’，５’−ｃＡＭＰ、ならびに骨形成性および筋原性の系列の他のマーカーを高レベルで発現することによりインビトロで組み換えヒト骨格筋形態形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ−２）に応答することがわかっている（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ等への米国特許６，８６６，８４２号；Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ等、１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２７：１７５５〜１７６６）。
【００３０】
本発明の１つの実施形態においては、予備プレーティング操作を用いることにより緩徐接着細胞（ＭＤＣ）から急速接着細胞に分化させてよい。本発明によれば、急速接着ＭＤＣ（ＰＰ１−４）および緩徐接着丸型ＭＤＣ（ＰＰ６）の集団を単離し、骨格筋体外移植組織から富化して免疫組織化学的方法を用いながら種々のマーカーの発現に関して試験することにより、緩徐接着細胞のうちの多能性細胞の存在を調べた（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ等への米国特許６，８６６，８４２号の実施例１）。本明細書の実施例１の表１に示す通り、ＰＰ６細胞は筋原性のマーカー、例えばデスミン、ＭｙｏＤ、およびミオゲニンを発現していた。ＰＰ６細胞はまた、筋肉形成の早期の段階において発現される２つの遺伝子であるｃ−ｍｅｔおよびＭＮＦも発現していた（Ｊ．Ｂ．Ｍｉｌｌｅｒ等、１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３：１９１〜２１９；表３参照）。ＰＰ６では、衛星細胞特異的マーカーであるＭ−カドヘリンを発現する細胞のパーセンテージはより低値であった（Ａ．Ｉｒｉｎｔｃｈｅｖ等、１９９４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  １９９：３２６〜３３７）が、筋肉形成の早期の段階の細胞に限定されるマーカーであるＢｃｌ−２を発現する細胞のパーセンテージはより高値であった（Ｊ．Ａ．Ｄｏｍｉｎｏｖ等、１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４２：５３７〜５４４）。ＰＰ６細胞はまた、ヒト造血前駆細胞、並びに骨格筋骨髄中の間質細胞前駆体で同定されたマーカーであるＣＤ３４を発現している（Ｒ．Ｇ．Ａｎｄｒｅｗｓ等、１９８６，Ｂｌｏｏｄ６７：８４２〜８４５；Ｃ．Ｉ．Ｃｉｖｉｎ等、１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１５７〜１６５；Ｌ．Ｆｉｎａ等、１９９０，Ｂｌｏｏｄ７５：２４１７〜２４２６；Ｐ．Ｊ．Ｓｉｍｍｏｎｓ等、１９９１，Ｂｌｏｏｄ７８：２８４８〜２８５３；表３参照）。ＰＰ６細胞はまた、幹細胞様特徴を有する造血細胞のマーカーとして最近同定されたヒトＫＤＲ遺伝子のマウス相同体であるＦｌｋ−１を発現していた（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒ等、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１５５３〜１５５８；表３参照）。同様に、ＰＰ６細胞は幹細胞様特徴を有する造血細胞に存在するマーカーであるＳｃａ−１を発現していた（Ｍ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｒｉｊｎ等、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４６３４〜８；Ｍ．Ｏｓａｗａ等、１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３２０７〜１４；表３参照）。しかしながら、ＰＰ６細胞はＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ造血幹細胞マーカーを発現していなかった（Ｌ  Ｋ．Ａｓｈｍａｎ，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：１０３７〜５１；Ｇ．Ａ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，１９９３，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：４２０〜４２６にお掲載；表３参照）。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、本明細書に記載した特徴を有する筋肉誘導前駆細胞のＰＰ６集団が提供される。これらの筋肉誘導前駆細胞はデスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２細胞マーカーを発現する。本発明によれば、ＰＰ６細胞を本明細書に記載した技術（実施例１）で単離することにより、移植後長期間の生存性を有する筋肉誘導前駆細胞の集団を得る。ＰＰ６筋肉誘導前駆細胞集団は、例えば限定しないがデスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２を包含する前駆細胞マーカーを発現する細胞の多大なパーセンテージを含んでいる。さらにまた、ＰＰ６細胞はＦｌｋ−１およびＳｃａ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５やｃ−Ｋｉｔマーカーは発現しない。好ましくは、ＰＰ６細胞の９５％超がデスミン、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１マーカーを発現するが、ＣＤ４５やｃ−Ｋｉｔマーカーは発現しない。ＰＰ６細胞は、最後のプレーティングの後約１日または約２４時間以内に使用することが好ましい。
【００３２】
好ましい実施形態においては、急速接着細胞および緩徐接着細胞（ＭＤＣ）は単一プレーティング技術を用いて相互から分離される。１つのそのような技術を実施例２に示す。先ず、細胞を骨格筋の生検試料から準備する。生検試料は細胞約１００ｍｇを含有すればよい。約５０ｍｇ〜約５００ｍｇのサイズ範囲の生検試料を本発明の予備プレーティング法および単一プレーティング法の両方に従って使用する。さらに、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、４００および５００ｍｇの生検試料を本発明の予備プレーティング法および単一プレーティング法の両方に従って使用する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態においては、次に生検試料由来の組織を１〜７日間保存する。この保存は概ね室温〜約４℃の温度で行う。この待機期間により生検された骨格筋の組織にストレスを与える。このストレスは単一プレーティング技術を用いたＭＤＣの単離には必要ではないが、待機期間を使用すると一般的にＭＤＣのより高値の収率が得られる。
【００３４】
好ましい実施形態によれば、生検試料由来の組織を粉砕し、遠心分離する。ペレットを再懸濁し、消化酵素を用いて消化する。使用し得る酵素は、例えば限定しないがコラゲナーゼ、ジスパーゼまたはこれらの酵素の組み合わせを包含する。消化後、酵素を細胞から洗浄除去する。細胞は急速接着細胞の単離用の培養基中のフラスコに移す。多くの培養基を使用してよい。特に好ましい培養基はＣａｍｂｒｅｘ内皮成長培地を包含する内皮細胞の培養のために設計されたものを包含する。この培地はウシ胎児血清、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、および／またはアスコルビン酸を包含する他の成分が補給されていてよい。単一プレーティング技術において使用し得る他の培地は、ＩｎＣｅｌｌ  Ｍ３１０Ｆ培地を包含する。この培地は上記した通り補給されているか、または未補給のまま使用してよい。
【００３５】
急速接着細胞の単離のための工程は約３０〜約１２０分間、フラスコ中で培養することを必要とする場合がある。急速接着細胞は３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０分内にフラスコに接着する。細胞が接着した後、緩徐接着細胞は、急速接着細胞が付着しているフラスコから培養基を取り出すことにより急速接着細胞から分離される。
【００３６】
このフラスコから取り出した培養基を、次に、第２のフラスコに移す。細胞を遠心分離し、培養基中に再懸濁した後に、第２のフラスコに移す。細胞をこの第２のフラスコ中で１〜３日間培養する。好ましくは、細胞は２日間培養する。この期間中、緩徐接着細胞（ＭＤＣ）はフラスコに接着する。ＭＤＣが接着した後、ＭＤＣの増殖を促進するために培養基を取り出し、新しい培養基を添加する。ＭＤＣは約１０〜約２０日間培養することによりその数を増やしてよい。ＭＤＣは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日培養することによりその数を増やしてよい。好ましくは、ＭＤＣは１７日間の増殖培養に付す。
【００３７】
予備プレーティング法および単一プレーティング法の代替法として、本発明のＭＤＣは、ＭＤＣにより発現される細胞表面マーカー１つ以上に対して標識された抗体を用いる蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により単離できる（Ｃ．Ｗｅｂｓｔｅｒ等、１９８８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１７４：２５２〜６５；Ｊ．Ｒ．Ｂｌａｎｔｏｎ等、１９９９，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ２２：４３〜５０）。例えばＦＡＣＳ分析は、宿主組織内に導入された場合に、長期の生存性を示すＰＰ６様細胞の集団を選択するためにＣＤ３４、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、および／または本明細書に記載した他の細胞表面マーカーに特異的に結合する標識された抗体を用いて実施できる。本発明によりまた包含されるものは、異なる細胞マーカータンパク質の抗体検出のための、例えばフルオレセインまたはローダミンのような蛍光検出標識１つ以上の使用である。
【００３８】
上記した、または当該分野で知られた任意のＭＤＣ単離方法を用いて、輸送すべき、またはある期間中は使用されないＭＤＣを当該分野で知られた任意の方法を用いて温存してよい。例えば、単離されたＭＤＣは約−２５〜約−９０℃の範囲の温度で凍結してよい。好ましくは、ＭＤＣは遅延した使用または輸送のためにドライアイスで約−８０℃にて凍結する。凍結は当該分野で知られた任意の低温保存媒体中で行ってよい。
【００３９】
筋肉誘導細胞に基づく治療
本発明の１つの実施形態において、ＭＤＣは骨格筋源から単離され、目的の筋肉もしくは非筋肉の軟組織内に、または骨格筋内に導入または移植される。好都合には、本発明のＭＤＣは単離され、移植後長期の生存を示す前駆細胞を多数含有するように富化される。さらにまた、本発明の筋肉誘導前駆細胞はデスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２のような特徴的な細胞マーカーを多数発現する。さらにまた、本発明の筋肉誘導前駆細胞はＳｃａ−１、およびＦｌｋ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない（実施例１参照）。
【００４０】
本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物は、骨格筋の強化を介して種々の美容上または機能上の状態（例えば欠陥）を修復、治療、または緩解するために使用できる。特に、そのような組成物は骨格筋の障害を治療するために使用できる。多数回および連続したＭＤＣ投与もまた本発明に包含される。
【００４１】
ＭＤＣに基づく治療に関しては、骨格筋体外移植組織は好ましくは自系または異系のヒト源または動物源から得られる。自系の動物源またはヒト源がより好ましい。次にＭＤＣ組成物を本明細書に記載する通り調製して単離する。ヒトまたは動物のレシピエント内に本発明に従ってＭＤＣおよび／またはＭＤＣを含む組成物を導入または移植するために、単核筋肉細胞の懸濁液を調製する。そのような懸濁液は生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤中に本発明の筋肉誘導前駆細胞の濃縮物を含有する。例えば、被験体に投与するためのＭＤＣの懸濁液は、ウシ胎児血清の代わりに被験体の血清を含有するように変性された完全培地の滅菌溶液中に１０８〜１０９細胞／ｍｌを含むことができる。あるいは、ＭＤＣ懸濁液は無血清の滅菌溶液、例えば低温保存溶液（Ｃｅｌｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）であることができる。次にＭＤＣ懸濁液を例えば注射を介してドナー組織の１つ以上の部位内に導入できる。
【００４２】
記載した細胞は、生理学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤を含有する製薬上または生理学上許容しうる調製品または組成物として投与し、ヒトまたは非ヒト動物を包含する目的のレシピエント生物の組織に投与できる。ＭＤＣ含有組成物は、滅菌生理食塩水または他の生理学的に許容される注射用の水性液体のような適当な液体または溶液中に細胞を再懸濁することにより調製できる。当業者は通常、そのような組成物中に使用される成分の量を決定できる。
【００４３】
ＭＤＣまたはその組成物は、吸収性または接着性の物質、例えばコラーゲンスポンジマトリックス上へのＭＤＣ懸濁液の添加、および目的の部位の内部または上部へのＭＤＣ含有物質の挿入により投与できる。あるいは、ＭＤＣは皮下、静脈内、筋肉内、および胸骨内を包含する非経口経路の注射により投与できる。他の投与様式は、例えば限定しないが鼻内、髄腔内、皮内、経皮、経腸、および舌下を包含する。本発明の１つの実施形態において、ＭＤＣの投与は内視鏡手術により媒介できる。
【００４４】
注射投与の場合、組成物は滅菌された溶液もしくは懸濁液として存在するか、または製薬上および生理学上許容しうる水性もしくは油性のベヒクル中に再懸濁でき、これは保存料、安定化剤、および溶液または懸濁液をレシピエントの体液（即ち血液）と等張にするための物質を含有してよい。使用に適する賦形剤の非限定的な例は、水、リン酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセロール、希薄エタノール等およびこれらの混合物を包含する。例示される安定化剤はポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸、および有機酸であり、これらは単独または混合物として使用してよい。使用する量並びに投与経路は個々に決定され、当業者に知られた同様のタイプの用途または適応において使用されている量に相当する。
【００４５】
移植の結果を最適化するためには、ドナーとレシピエントの間の可能な限り最も緊密な免疫学的な一致が望ましい。自系源を使用できない場合は、ドナーおよびレシピエントのクラスＩおよびクラスＩＩの組織適合性抗原を分析することにより使用できる最も緊密な一致を決定できる。これにより免疫拒絶が最小限化または排除され、免疫抑制剤または免疫調節剤による治療の必要性を低減できる。所望により免疫抑制剤または免疫調節剤による治療を移植操作の前、最中、および／または後に開始できる。例えば、シクロスポリンＡまたは他の免疫抑制剤を移植片レシピエントに投与できる。免疫学的耐容性もまた当該分野で知られた代替法による移植の前に誘導してよい（Ｄ．Ｊ．Ｗａｔｔ等、１９８４，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４１９；Ｄ．Ｆａｕｓｔｍａｎ等、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１７０１）。
【００４６】
本発明と合致して、ＭＤＣは骨格筋を包含する身体組織に投与できる。ＭＤＣ懸濁液中の細胞の数および投与の様式は治療すべき部位および状態に応じて変動してよい。約１．０×１０５〜約１×１０８のＭＤＣを本発明に従って投与してよい。非限定的な例として、本発明によれば、約０．５〜２．０×１０６ＭＤＣを、頭蓋欠陥の約５ｍｍ領域の治療のためにコラーゲンスポンジマトリックスを介して投与する（実施例３参照）。
【００４７】
骨格筋の強化または骨格筋障害の治療のためには、ＭＤＣを上記した通り調製し、例えば骨格筋上、内部、または周囲への注射を介して投与することにより、追加的な骨格筋の強度および／または体積を得ることができる。導入されるＭＤＣの数は必要に応じて骨格筋の密度および／または骨格筋の体積の変動する量が与えられるように調節されるもしくは骨格筋の体積の増強における本発明のＭＤＣの使用を包含する。骨格筋の障害は、例えば限定しないが骨格筋の脆弱化、筋ジストロフィー、筋萎縮症、痙性、ミオクローヌスおよび筋肉痛を包含する。本発明はまた、平均を超えた骨格筋の質量を必要とする運動家または他の生物における骨格筋の質量の増大のためのＭＤＣの新規な使用に関する。
【００４８】
遺伝子操作された筋肉誘導細胞
本発明の別の態様において、本発明のＭＤＣは活性な生物学的分子１つ以上をコードする核酸配列を含有し、かつその生物学的分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホルモン、代謝産物、薬剤、酵素等を発現するために、遺伝子操作してよい。そのようなＭＤＣはヒトを包含するレシピエントに対して組織適合性（自系）であるか非組織適合性（同種異系）であってよい。この細胞は、種々の治療のため、例えば限定しないが骨格筋の脆弱化、筋ジストロフィー、筋萎縮症、痙性、ミオクローヌスおよび筋肉痛を包含する骨格筋の疾患ならびに病理状態の治療のための長期間の局所送達系として機能できる。
【００４９】
本発明で好ましいものは、レシピエントに対して異物と認識されない、自系の筋肉誘導前駆細胞である。この点に関し、細胞媒介の遺伝子の転移または送達のために使用されるＭＤＣは、望ましくは主要組織適合性遺伝子座（ヒトにおけるＭＨＣまたはＨＬＡ）に関して一致するものとなる。そのようなＭＨＣまたはＨＬＡ一致細胞は自系である。或いは、細胞は同じか同様のＭＨＣまたはＨＬＡ抗原プロファイルを有する個人に由来するものであってよい。患者はまた、同種異系のＭＨＣ抗原に対して耐容性付与されていてよい。本発明はまた、参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，５３８，７７２号に記載されているようなＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩを欠いている細胞の使用を包含する。
【００５０】
ＭＤＣは当業者に知られた種々の分子技術および方法、例えばトランスフェクション、感染、またはトランスダクションにより遺伝子操作してよい。本明細書において使用するトランスダクションは一般的には細胞内へのウィルス性ベクターまたは非ウィルス性ベクターの導入を介して外来性または非相同の遺伝子を含有するように遺伝子操作されている細胞を指す。トランスフェクションは、より一般的にプラスミドまたは非ウィルス性のベクター中に保有されている外来性遺伝子を含有するように遺伝子操作されている細胞を指す。ＭＤＣは異なるベクターによりトランスフェクトまたは形質導入されており、そのため、筋肉内に発現産物を転移するための遺伝子送達ベヒクルとして機能できる。
【００５１】
ウィルスベクターが好ましいが、当業者は、所望のタンパク質またはポリペプチド、サイトカイン等をコードする核酸配列を含有するための細胞の遺伝子操作が当該分野で知られた方法、例えば米国特許５，５３８，７２２号に記載の方法、例えば融合、トランスフェクション、リポソームの使用により媒介されるリポフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウムによる沈殿、核酸コーティング粒子（例えば金粒子）を用いた粒子衝突（バイオリスティックス）、マイクロインジェクション等により実施してよいことを理解されたい。
【００５２】
生物学的に活性な産物の発現のために、筋肉細胞内に非相同（即ち外来性）核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するためのベクターは当該分野で良く知られている。そのようなベクターはプロモーター配列、好ましくは、細胞特異的であり、発現すべき配列の上流に位置しているプロモーターを保有する。ベクターはまた、場合により、ベクター内に含有される核酸配列の良好なトランスフェクションおよび発現の指標としての発現に関する発現可能なマーカー遺伝子１つ以上を含有してよい。
【００５３】
本発明の筋肉誘導細胞のトランスフェクションまたは感染のためのベヒクルまたはベクターコンストラクトの代表例は、複製欠損ウィルスベクター、ＤＮＡウィルスまたはＲＮＡウィルス（レトロウィルス）ベクター、例えば限定しないが、アデノウィルス、単純疱疹ウィルスおよびアデノ関連ウィルスベクターを包含する。アデノ関連ウィルスベクターは１本鎖であり、細胞の核への核酸の多コピーの効率的送達を可能にする。好ましいものはアデノウィルスベクターである。ベクターは通常は任意の原核生物のＤＮＡを実質的に含有しておらず、多くの異なる種類の機能的核酸配列を含んでよい。そのような機能的配列の例はポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、転写および翻訳の開始および終止の調節配列を含む配列、例えば筋肉細胞において活性であるプロモーター（例えば強力プロモーター、誘導プロモーター等）およびエンハンサーを包含する。機能的配列の一部として、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ポリヌクレオチド配列）もまた包含され、フランキング配列もまた部位指向性組み込みのために包含されてよい。一部の状況においては、５’−フランキング配列は相同組み換えを可能にすることにより、例えば転写のレベルを上昇または低下させるための誘導または非誘導性の転写をもたらすために転写開始領域の性質を変えることができる。
【００５４】
一般的に、筋肉誘導前駆細胞により発現されることが望まれる核酸配列は、例えば筋肉誘導前駆細胞に対して非相同であり、所望のタンパク質またはポリペプチド産物をコードする、構造遺伝子、または遺伝子の機能的フラグメント、セグメントもしくは部分である。コードされ、かつ発現される産物は、細胞内、即ち細胞質、核、もしくは細胞内小器官内に保持されてよく、または、細胞により分泌されてもよい。分泌のためには、構造遺伝子内に存在する天然のシグナル配列を保持してもよく、または、構造遺伝子内に天然に存在しないシグナル配列を使用してよい。ポリペプチドまたはペプチドがより大型のタンパク質のフラグメントである場合、分泌およびプロセシング部位におけるプロセシングの際に所望のタンパク質が天然の配列を有するようになるようなシグナル配列が与えられてよい。本発明に従って使用するための目的の遺伝子の例は、細胞成長因子、細胞分化因子、細胞シグナリング因子およびプログラムされた細胞死因子をコードする遺伝子を包含する。特定の例は限定しないが、ＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＩＬ−１Ｒａ、第ＩＸ因子、およびコネキシン４３をコードする遺伝子を包含する。
【００５５】
上記した通り、ベクターコンストラクトを含有する細胞の選択のためにマーカーを存在させてよい。マーカーは誘導または非誘導遺伝子であってよく、一般的には、それぞれ誘導下、または誘導を行うことなく、陽性選択を可能にする。一般的に使用されているマーカー遺伝子の例は、ネオマイシン、ジヒドロフォレート還元酵素、グルタミン合成酵素等を包含する。
【００５６】
使用されるベクターは一般的に、当業者により通常使用されている複製起点および宿主細胞における複製のために必要な他の遺伝子を包含する。一例として、複製起点および特定のウィルスによりコードされる複製に関連する任意のタンパク質を含む複製系は、コンストラクトの部分として包含されてよい。複製系は、複製に必要な産物をコードする遺伝子が最終的に筋肉誘導細胞を形質転換しないように選択しなければならない。そのような複製系は例えばＧ．Ａｃｓａｄｉ等、１９９４，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ３：５７９〜５８４により記載される通り構築される複製欠損アデノウィルス、またエプスタインバールウィルスにより示される。複製欠損ベクター、特に複製欠損であるレトロウィルスベクターの例は、Ｐｒｉｃｅ等、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：１５６、およびＳａｎｅｓ等、１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：３１３３により記載されているＢＡＧである。最終遺伝子コンストラクトは１つ以上の目的の遺伝子、例えば生物学的に活性な代謝分子をコードする遺伝子を含有してよいことを理解されたい。さらにまた、ｃＤＮＡ、合成により製造されたＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを、当業者に公知でかつ実施される方法およびプロトコルを用いながら使用してよい。
【００５７】
所望により、感染性の複製欠損ウィルスベクターを使用することにより細胞のインビボ注射の前に細胞を遺伝子操作してよい。この点に関し、ベクターはアンホトロピックパッケージングのためにレトロウィルスプロデューサー細胞内に導入してよい。筋肉誘導前駆細胞の隣接領域への天然の増殖によって、目的の部位内部または目的の部位における多数回の注射が不要になる。
【００５８】
別の態様において、本発明は、ＭＤＣ、例えば所望の遺伝子産物をコードする非相同遺伝子を含有するように操作されたアデノウィルスベクターを用いてウィルス的に形質導入されている早期前駆筋肉細胞の使用を介して、ヒトを包含するレシピエント哺乳類宿主の細胞および組織へのエクスビボの遺伝子送達を提供する。そのようなエクスビボの手順は、直接の遺伝子転移の手順よりも優れた効率的なウィルス遺伝子転移の利点を与える。エクスビボの操作法では筋肉組織の単離された細胞に由来する筋肉誘導前駆細胞を使用する。筋肉誘導前駆細胞源として機能する筋肉生検試料は、傷害部位より、または臨床医からより容易に得られる場合がある別の領域より得ることができる。
【００５９】
本発明によれば、クローン単離株は、当該分野で知られた種々の操作法、例えば組織培養基中の限界希釈プレーティングを用いながら筋肉誘導前駆細胞（即ち単一プレーティング操作法を用いるＰＰ６細胞または「緩徐接着」細胞）の集団から誘導できる。クローン単離株は単一の孤立性細胞を起源とする遺伝子的に同一の細胞を含む。さらにまた、クローン単離株は上記した通りＦＡＣＳ分析を使用し、その後限界希釈により１ウェル当たりの単細胞を達成し、クローン的に単離された細胞系統を樹立することにより誘導することができる。ＰＰ６細胞集団から誘導されたクローン単離株の例は、実施例１に記載するｍｃ１３である。好ましくは、ＭＤＣクローン単離株は、本発明の方法において、並びに１つ以上の生物学的に活性な分子の発現のための遺伝子操作のために、または遺伝子置換治療において、利用される。
【００６０】
ＭＤＣを先ず所望の遺伝子産物をコードする非相同遺伝子を少なくとも１つを含有する操作されたウィルスベクターに感染させ、生理学的に許容される担体または賦形剤、例えば食塩水またはリン酸塩緩衝食塩水に懸濁し、次に宿主の適切な部位に投与する。本発明と合致して、ＭＤＣは上記した通り骨格筋を包含する身体組織に投与できる。所望の遺伝子産物は注射された細胞により発現され、これにより宿主内に遺伝子産物が導入される。これにより、導入され発現された遺伝子産物は宿主内で長期間生存する本発明のＭＤＣにより長期間にわたって発現されるため、傷害、機能不全、または疾患を治療、修復または緩解するために利用され得る。
【００６１】
筋芽細胞媒介遺伝子療法の動物モデル試験において、筋肉酵素欠損の部分的補正のために１００ｍｇ筋肉当たり１０６個の筋芽細胞の移植が必要であった（Ｊ．Ｅ．Ｍｏｒｇａｎ等、１９８８，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｓｃｉ．８６：１３７；Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ等、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１７６参照）。このデータから類推すると、７０ｋｇのヒトに対する遺伝子療法のためには生理学的に適合性のある培地中に懸濁された約１０１２ＭＤＣが筋肉組織に移植できることになる。本発明のＭＤＣのこの数は、ヒト源由来の単一の１００ｍｇ骨格筋生検試料から製造できる（後述参照）。特定の傷害部位の治療のために、傷害の所定の組織または部位内への遺伝子操作されたＭＤＣの注射は、溶液または懸濁液中の細胞の治療有効量、好ましくは、生理学的に許容される培地中で、治療すべき組織の１ｃｍ３当たり約１０５〜１０６細胞を含む。
【実施例】
【００６２】
実施例１．予備プレーティング法によるＭＤＣの富化、単離および分析
ＭＤＣは記載されている通り調製した（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ等の米国特許６，８６６，８４２号）。筋肉の体外移植組織は多くの源、即ち、３週齢のｍｄｘ（ジストロフィー）マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ  ｍｄｘ／ｍｄｘ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４〜６週齢の正常雌性ＳＤ（スプラーグドーリー）ラット、またはＳＣＩＤ（重度複合免疫不全）マウスの後肢から得た。動物源の各々に由来する筋肉組織を切開して骨があれば除き、粉砕してスラリーとした。次にスラリーを３７℃において０．２％ＸＩ型コラゲナーゼ、ジスパーゼ（ＩＩ等級、２４０単位）および０．１％トリプシンと共に１時間連続インキュベートすることにより消化した。得られた細胞懸濁液を１８，２０および２２ゲージの針を通過させ、５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、細胞を生育培地（ＤＭＥＭに１０％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、０．５％ニワトリ胚抽出液、および２％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したもの）中に懸濁した。次に細胞をコラーゲンコーティングフラスコ（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ等の米国特許６，８６６，８４２号）中に予備プレーティングした。約１時間後、上澄みをフラスコから取り出し、新しいコラーゲンコーティングフラスコ内に再プレーティングした。この１時間のインキュベーション内で急速に接着した細胞は、大部分が線維芽細胞であった（上出のＺ．Ｑｕ等；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ等の米国特許６，８６６，８４２号）。細胞の３０〜４０％が各フラスコに接着した後に上澄みを取り出し、再プレーティングした。約５〜６回の連続プレーティングの後、培養物は小型丸型の細胞、即ちＰＰ６細胞と命名されるものが富化されており、これを出発細胞集団から単離し、その後の試験に使用した。早期のプレーティングにおいて単離された接着細胞をプールし、ＰＰ１−４細胞と命名した。
【００６３】
ｍｄｘＰＰ１−４、ｍｄｘＰＰ６、正常ＰＰ６、および線維芽細胞の集団を細胞マーカーの発現に関して免疫組織化学的分析により検査した。この分析の結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
2014040485.tif 000002
ｍｄｘＰＰ１−４、ｍｄｘＰＰ６、正常ＰＰ６、および線維芽細胞は予備プレーティング技術により誘導し、免疫組織化学的分析により検査した。「−」は細胞の２％未満が発現を示したことを示し、「（−）」、「−／＋」は細胞の５〜５０％が発現を示したことを示し、「＋／−」は細胞の約４０〜８０％が発現を示したことを示し、「＋」は細胞の９５％超が発現を示したことを示し、「ｎｏｒ」は正常細胞を示し、「ｎａ」は免疫組織化学的データが得られなかったことを示す。
【００６５】
ｍｄｘおよび正常なマウスの両方が本アッセイにおいて試験した細胞マーカーの全ての同一な分布を示していたことを理解されたい。即ち、ｍｄｘ突然変異の存在は、単離されたＰＰ６筋肉細胞誘導集団の細胞マーカー発現に影響していない。
【００６６】
ＭＤＣをＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地）と１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１０％ＨＳ（ウマ血清）、０．５％ニワトリ胚抽出液、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を含有する増殖培地、または、ＤＭＥＭに２％ウシ胎児血清および１％抗生物質溶液を補給したものを含有する融合培地中で生育させた。全ての培地材料はＧｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）から購入した。
【００６７】
実施例２．単一プレーティング法によるＭＤＣの富化、単離および分析
急速接着ＭＤＣおよび緩徐接着ＭＤＣの集団を哺乳類被験体の骨格筋から単離した。被験体はヒト、ラット、イヌまたは他の哺乳類であってよい。生検試料サイズは４２〜２４７ｍｇの範囲であった。
【００６８】
骨格筋生検組織は即座に寒冷培地（硫酸ゲンタマイシン（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）を補給したＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ））中に入れ、４℃で保存する。３〜７日の後、生検組織を保存場所から取り出し、生成を開始する。結合組織または非筋肉組織がある場合は、生検試料から切除する。単離のために使用する残存筋肉組織を計量する。組織をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で粉砕し、三角試験管に移し、遠心分離（２５００×ｇ、５分間）する。次にペレットを消化酵素溶液（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ４（０．４〜１．０Ｕ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁する。消化酵素溶液２ｍＬを生検組織１００ｍｇ当たり使用し、回転プレート上３７℃で３０分間インキュベートする。次に試料を遠心分離（２５００×ｇ、５分間）する。ペレットを培養基中に再懸濁し、７０μｍの細胞ストレーナーを通過させる。本実施例に記載した操作法のために使用した培養基は、Ｃａｍｂｒｅｘ内皮生育培地ＥＧＭ−２基礎培地に、以下の成分、即ち（ｉ．）１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、および（ｉｉ．）Ｃａｍｂｒｅｘ  ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキットであってインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、およびアスコルビン酸を含有するもの、を補給したものとした。次に濾過した細胞溶液をＴ２５培養フラスコに移し、５％ＣＯ２下に３７℃で３０〜１２０分インキュベートした。このフラスコに付着する細胞は「急速接着細胞」である。
【００６９】
インキュベーションの後、細胞培養物の上澄みをＴ２５フラスコから取り出し、１５ｍＬの三角試験管中に入れる。Ｔ２５培養フラスコを加温した培養基２ｍＬで濯ぎ、上記した１５ｍＬの三角試験管に移す。１５ｍＬの三角試験管を遠心分離（２５００×ｇ、５分間）する。ペレットを培養基に再懸濁し、新しいＴ２５培養フラスコに移す。フラスコを５％ＣＯ２下に３７℃で約２日間インキュベートする（このフラスコに付着する細胞は「緩徐接着細胞」である）。インキュベーションの後、細胞培養上澄みを吸引し、新しい培養基をフラスコに添加する。次にフラスコをインキュベーターに戻し、増殖させる。標準的な培養継代をここから行うことにより、培養フラスコ中の細胞コンフルエンシーを５０％未満に維持する。トリプシンＥＤＴＡ（０．２５％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて継代中フラスコから接着細胞を脱着させる。「緩徐接着細胞」の典型的な増殖が３７００万細胞の平均総生存細胞数を達成するためには、平均で１７日間を要する（生成を開始した日から起算）。
【００７０】
所望の細胞数が達成された後、細胞をトリプシンＥＤＴＡを用いてフラスコから採取し、遠心分離（２５００×ｇ、５分間）する。ペレットをＢＳＳ−Ｐ溶液（ヒト血清アルブミン（２％ｖ／ｖ、Ｓｅｒａ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ）を補給したＨＢＳＳ）中に再懸濁し、計数する。次に細胞溶液を再度遠心分離（２５００×ｇ、５分間）し、低温保存培地（ヒト血清アルブミン（２％ｖ／ｖ、Ｓｅｒａ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補給したＣｒｙｏＳｔｏｒ（Ｂｉｏｌｉｆｅ））を用いて所望の細胞濃度となるように再懸濁し、低温保存用の適切なバイアル中に充填する。低温バイアルは凍結容器内におき、−８０℃の冷凍庫中に入れる。細胞を、等容量の生理食塩水で室温において凍結細胞懸濁液を解凍することにより投与し、直接注射する（その他の操作は行わない）。緩徐接着細胞集団の系列特徴は筋原性（８７．４％ＣＤ５６＋、８９．２％デスミン＋）、内皮（０．０％ＣＤ３１＋）、造血系（０．３％ＣＤ４５＋）、および線維芽細胞（６．８％ＣＤ９０＋／ＣＤ５６−）を示す。
【００７１】
骨格筋生検組織の解離後、細胞の２画分を、培養フラスコへの急速または緩徐な接着に基づいて収集した。次に細胞を生育培地を用いた培養において増殖させ、次に１．５ｍＬ容のエッペンドルフ試験管の低温保存培地中に凍結した（１５μＬ中３×１０５細胞）。対照群として、低温保存培地単独１５μＬを試験管内に入れた。これらの試験管を−８０℃で注射時まで保存した。注射直前に、試験管を保存場所から取り出し、室温で解凍し、０．９％塩化ナトリウム溶液１５μｌに再懸濁した。次に得られた３０μＬの溶液を３０ゲージ針を有する０．５ｃｃインスリンシリンジ内に吸引した。手術および注射を行った試験者は、試験管の内容物に関して盲検状態とした。
【００７２】
細胞数および生存性をＧｕａｖａフローサイトメーターおよびＶｉａｃｏｕｎｔアッセイキット（Ｇｕａｖａ）を用いながら計測した。ＣＤ５６は、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ５６抗体（１：５０、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＰＥコンジュゲートアイソタイプ対照モノクローナル抗体（１：５０、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いながら、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）により計測した。デスミンは、モノクローナルデスミン抗体（１：１００、Ｄａｋｏ）およびアイソタイプ対照モノクローナル抗体（１：２００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いながら、パラホルムアルデヒド固定細胞（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）により計測した。蛍光標識は、Ｃｙ３−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０、Ｓｉｇｍａ）を用いながら実施した。工程間、細胞を透過性付与緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で洗浄した。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイに関しては、分化誘導培地中１２穴プレート内の１ウェル当たり１×１０５細胞をプレーティングした。４〜６日後、細胞をトリプシン処理により採取し、遠心分離してペレット化した。細胞溶解上澄みは、ＣＫ
Ｌｉｑｕｉ−ＵＶキット（Ｓｔａｎｂｉｏ）を用いながらＣＫ活性に関してアッセイした。
【００７３】
実施例３．ＭＤＣを用いた骨格筋の強化
予備プレーティング技術を用いてヒト筋肉生検試料から単離したヒト筋肉誘導細胞（ｈＭＤＣ）の集団を試験することにより、ｈＭＤＣがそのネズミ相応物と同様の筋原性特徴および再生特徴を有することを示した。
【００７４】
方法
予備プレーティング技術：この技術は出願全体を通して、特に上記実施例１において開示している。
【００７５】
単離および細胞培養：候補集団は予備プレーティング技術を用いて得た。これらの細胞を６００細胞／ｃｍ２の密度でＥＧＭＴＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で生育させ、標準的条件下（５．０％ＣＯ２、３７℃）でコンフルエンスに達するまで７２〜９６時間毎に継代した。
【００７６】
フローサイトメトリー：ｈＭＤＣを、分化マーカーＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ１４４、およびＣＤ１４６の細胞表面クラスターの存在に関して分析した。
【００７７】
免疫化学：ｈＭＤＣをデスミン、ミオシン重鎖、およびジストロフィンで染色した。
【００７８】
バイオインフォマティック生細胞画像化：細胞を動的画像撮影できる細胞培養システム中で生育させた。画像は１０分間隔で撮影した。本発明者等は多くのパラメーター、例えば倍化速度、生育速度、総細胞数、伸長度、面積、および周囲を、種々の集団に関して、早期継代および後期継代時に計測した。本発明者等はヒトＭＤＣ表現型プロファイルを種々の予備プレーティング画分の間で比較することにより、インビボの再生効率を予測すると考えられる分子特徴および挙動特徴の両方を同定した。
【００７９】
インビボの再生：本発明者等はｍｄｘ／ＳＣＩＤマウスの腓腹筋内に早期継代ヒト集団を移植した。本発明者等は移植後２週間に筋肉を採取した。筋肉を凍結し、１０μｍの切片に切り出した。免疫組織化学的分析のために、本発明者等はマウス抗ヒトジストロフィンまたは抗マウスジストロフィン（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ，ＤＹＳ３／２，１：５０）、ビオチニル化ヤギ抗マウス二次Ａｂ（Ｖｅｃｔｏｒ，１：５００）およびストレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ，１：５００）を使用した。本発明者等は骨格筋切片におけるヒト核を標識するためにヒト核抗原抗体を使用した。
【００８０】
結果
本発明者等は３つの予備プレーティング画分、即ち予備プレーティング１および２（ｐｐ１−２）および予備プレーティング２〜３（ｐｐ２〜３）および予備プレーティング５〜６）を検査した。全ての集団はＣＤ３４およびＣＤ１４４に対して陰性であり、ＣＤ５６およびＣＤ１４６に対して陽性であった。経時的にＣＤ５６およびＣＤ１４６の低下が観察された。免疫染色によれば、細胞は多核筋管内に融合する能力を呈し、デスミン、ミオシン、およびジストロフィンの発現を示したことから、その筋原性能力が明らかになった。
【００８１】
経時的撮像によれば細胞分裂時間、集団倍化時間、細胞運動性挙動、および形態学的なパラメーターのようなパラメーターにおいて、多大な変動性が観察された。本発明者等は形態学上の培地特異的な変化を観察した。ＥＧＭ２中で生育させた細胞は、細胞が増殖するにしたがって増殖速度の低下を示した。これまでの本発明者等の分析によれば、予備プレーティング画分に関するこのような挙動の相違は全く観察されていない。
【００８２】
本発明者等は数種の予備プレーティング集団、即ちｐｐ２（ｎ＝１１  筋肉）、ｐｐ４（ｎ＝１９）、ｐｐ６（ｎ＝２０）を注射した。宿主ｍｄｘ−ｓｃｉｄ筋肉へのｈＭＤＣの性別交差性の移植は、ドナー細胞から宿主骨格筋線維への融合およびその後の宿主におけるジストロフィンの送達および発現をもたらした。キメラ発生性がヒト特異的抗体およびドナー特異的Ｙ染色体の使用により測定された（図１）。ジストロフィン陽性線維の再生数は、ｐｐ２画分と比較してｐｐ６画分を使用した移植において有意に高値であった（Ｐ＝０．０３７、両側２検定、図２）。しかしながら、ｐｐ２とｐｐ４移植の間には再生のレベルに有意差はなかった。全ての群がＰＢＳシャム対照より高値のジストロフィンレベルを有していた（図２）。
【００８３】
本試験はヒト筋肉生検試料から得られたｐｐ２とは異なると思われるｐｐ６からｈＭＤＣが同様に得られることを示している。移植試験においては、ジストロフィン陽性の再生筋肉線維の数はマウスＭＤＣで観察されたものより低値であったものの、本発明者等はヒトジストロフィン発現を観察している。初期の結果は、ＳｋＧＭ中の培養は、ＥＧＭ−２またはＤＭＥＭのいずれかにおける培養よりも高値のｈＭＤＣ増殖をもたらすことを示している。現在進行中の撮像試験は、この生育上昇がより高い治療薬効および異なる細胞表現型と関連するかどうかを決定することになる。
【図１】
2014040485.tif 000003
【図２】
2014040485.tif 000004
【外国語明細書】
2014040485000001.pdf