(57)【要約】【課題】  前立腺癌の悪性度の判定や前立腺癌と前立腺肥大の識別を行うために有用なモノクローナル抗体を提供すること。【解決手段】  本発明によれば、ヒトコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１を特異的に認識し、分子量が１４万Ｄａ〜１６万Ｄａであって、免疫グロブリンタイプがＩｇＧ１（κ）であるモノクローナル抗体が提供される。その具体例としては、ハイブリドーマＨＵ１２７（ＮＩＴＥ  Ｐ−１４０９）から産生されるものが挙げられる。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１を特異的に認識し、分子量が１４万Ｄａ〜１６万Ｄａであって、免疫グロブリンタイプがＩｇＧ１（κ）であるモノクローナル抗体。
【請求項２】
ハイブリドーマＨＵ１２７（ＮＩＴＥ  Ｐ−１４０９）から産生される請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むペプチドを用いて免疫した哺乳動物（ヒトを除く）の脾臓細胞と、同種または異種の骨髄腫細胞から作製される、請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＨＵ１２７（ＮＩＴＥ  Ｐ−１４０９）。
【請求項５】
前立腺癌の悪性度の判定および／または前立腺癌と前立腺肥大の識別を行うための請求項１記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項６】
前立腺癌の悪性度の判定および／または前立腺癌と前立腺肥大の識別を行うための請求項１記載のモノクローナル抗体を少なくとも含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌の悪性度の判定や前立腺癌と前立腺肥大の識別を行うために有用な、ヒトコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１を特異的に認識するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：以下「Ｐｃａ」と略す）は男性の主要な死亡原因であることは周知の通りであり、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：以下「ＰＳＡ」と略す）はＰｃａに対する最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている。しかしながら、ＰＳＡを指標にしてＰｃａの悪性度を判定したり、Ｐｃａと前立腺肥大（ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ：以下「ＢＰＨ」と略す）を識別したりすることは困難である。そのため、Ｐｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別を高感度に再現性よく行うための方法の開発が望まれている。
【０００３】
このような背景のもと、本発明者らの研究グループは、ある種の癌細胞の表面に発現し、癌の転移などに関わっていることが知られているＣｏｒｅ２  Ｏ−ｇｌｙｃａｎと呼ばれるＯ−グリカンの生合成のキーとなる糖転移酵素であるコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃｏｒｅ２  β１，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：以下「Ｃ２ＧｎＴ」と略す。図１にＣｏｒｅ２  Ｏ−ｇｌｙｃａｎの構造とＣ２ＧｎＴが触媒する糖転移反応部位を示す）に注目し、Ｃ２ＧｎＴを指標にしてＰｃａの悪性度を判定する方法を特許文献１において提案している。しかしながら、特許文献１においては、ポリクローナル抗体を用いて分析試料中のＣ２ＧｎＴを検出しているため、３種類のアイソフォームが存在するＣ２ＧｎＴに対する特異性の面で改良の余地がある。また、ポリクローナル抗体は均質なものを安定に大量供給することが困難であるといった問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００６−５２０９１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、Ｐｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別を行うために有用なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行い、Ｃ２ＧｎＴの３種類のアイソフォームの１つであるコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（以下「Ｃ２ＧｎＴ１」と略す）を特異的に認識するモノクローナル抗体を調製した。そして、このモノクローナル抗体を用いてＰｃａに罹患している男性やＢＰＨに罹患している男性からの分析試料中のＣ２ＧｎＴ１を検出することで、その存在の有無や存在量に基づいてＰｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別を高感度に再現性よく行うことができることを見出した。
【０００７】
上記の知見に基づいてなされた請求項１記載の発明は、ヒトＣ２ＧｎＴ１を特異的に認識し、分子量が１４万Ｄａ〜１６万Ｄａであって、免疫グロブリンタイプがＩｇＧ１（κ）であるモノクローナル抗体である。
また、請求項２記載の発明は、ハイブリドーマＨＵ１２７（ＮＩＴＥ  Ｐ−１４０９）から産生される請求項１記載のモノクローナル抗体である。
また、請求項３記載の発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むペプチドを用いて免疫した哺乳動物（ヒトを除く）の脾臓細胞と、同種または異種の骨髄腫細胞から作製される、請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
また、請求項４記載の発明は、請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＨＵ１２７（ＮＩＴＥ  Ｐ−１４０９）である。
また、請求項５記載の発明は、Ｐｃａの悪性度の判定および／またはＰｃａとＢＰＨの識別を行うための請求項１記載のモノクローナル抗体の使用である。
また、請求項６記載の発明は、Ｐｃａの悪性度の判定および／またはＰｃａとＢＰＨの識別を行うための請求項１記載のモノクローナル抗体を少なくとも含むキットである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ヒトＣ２ＧｎＴ１を特異的に認識するモノクローナル抗体が提供され、このモノクローナル抗体を用いて分析試料中のＣ２ＧｎＴ１を検出することで、その存在の有無や存在量に基づいてＰｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別を高感度に再現性よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃｏｒｅ２  Ｏ−ｇｌｙｃａｎの構造とＣ２ＧｎＴが触媒する糖転移反応部位を示す図である。
【図２】Ｃ２ＧｎＴの３種類のアイソフォームのアミノ酸配列を示す図である（濃淡が濃いほどアミノ酸残基の共通性が高い。Ｔｉｌｏ  Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．１５，ｐｐ．１１１０６−１１１１３，２０００より）。
【図３】実施例におけるＥＬＩＳＡ法によるＨＵ１２７ｍＡｂのヒトＣ２ＧｎＴ１に対する特異性評価の結果を示すグラフである。
【図４】同、ＨＵ１２７ｍＡｂを用いて行った前立腺癌全摘標本の染色写真である。
【図５】同、Ｃ２ＧｎＴ１の発現の有無とＰＳＡ再発率の関係を示すグラフである。
【図６】同、ドットブロット法によるＨＵ１２７ｍＡｂを用いた前立腺マッサージ尿中のＣ２ＧｎＴ１の検出結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、ヒトＣ２ＧｎＴ１を特異的に認識し、分子量が１４万Ｄａ〜１６万Ｄａであって、免疫グロブリンタイプがＩｇＧ１（κ）である。
【００１１】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むペプチドを用いて免疫した哺乳動物（ヒトを除く）の脾臓細胞と、同種または異種の骨髄腫細胞から、自体公知の方法でこのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製することで調製することができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＮＬＥＴＥＲＭＰＳＨＫＥＥＲＷＫＫＲＹＥＶ）は、ヒトＣ２ＧｎＴ１の２４１〜２６１番目のアミノ酸配列に相当する（図２）。免疫原として用いるペプチドは、化学合成したものであってもよいし、Ｃ２ＧｎＴ１から調製したものであってもよい。
【００１２】
免疫原として用いるペプチドは、必要に応じて適当なアジュバント、例えば、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、Ｒｉｂｉアジュバント、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、コレラトキシン、酸処理したＳａｌｍｏｎｅｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ菌体膜画分などと混合して免疫対象とする哺乳動物（ヒトを除く）、例えば、マウス（ＢＡＬＢ／ｃなど）やラットやウサギなどに投与される。免疫方法は、免疫対象とする哺乳動物の種類、抗原量、アジュバントの有無、免疫回数などを考慮して決定することができる。免疫原として用いるペプチドを投与してから所定の期間経過後、免疫した哺乳動物の脾臓細胞（リンパ球など）を採取し、採取した脾臓細胞を、例えば、ミラーとミルシュタインの常法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）などに従って、同種または異種の骨髄腫細胞と融合させる。骨髄腫細胞としてはマウス由来のＰ３Ｕ１やＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６８３などが挙げられる。細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやＨＶＪ（センダイウイルス）などの公知の細胞融合剤を用いて行うことができる。融合された細胞は、ＨＡＴ培地を用いて選抜することができる。選抜された融合細胞は、融合細胞が産生するモノクローナル抗体のＣ２ＧｎＴ１に対する反応性に基づいて免疫学的にスクリーニングすることができる。こうして作製された本発明によって提供されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの具体例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１４０９として寄託されているハイブリドーマＨＵ１２７が挙げられる。
【００１３】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、Ｐｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別を行うために用いることができる。その利用方法は特段限定されるものではなく、例えば、このモノクローナル抗体を用いて分析試料中のＣ２ＧｎＴ１を検出することで、その存在の有無や存在量に基づいて行う方法が挙げられる。分析試料としては、血清、尿、前立腺組織やその抽出液、精液、膀胱洗浄液などが挙げられる。その調製は自体公知の方法によって行えばよい。
【００１４】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体を用いて分析試料中のＣ２ＧｎＴ１を検出する工程は、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）サンドイッチ法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、フローサイトメトリー法などの免疫学的な方法によって行うことができる。こうした方法は、本発明によって提供されるモノクローナル抗体をＣ２ＧｎＴ１に結合させた後、酵素標識を行った二次抗体を結合させてから酵素基質を加えて酵素反応生成物を測定したり、ビオチン標識を行った二次抗体を結合させてから酵素標識を行ったアビジンやストレプトアビジンを結合させた後、酵素基質を加えて酵素反応生成物を測定したり、蛍光標識を行った二次抗体を結合させて蛍光を測定したり、放射線標識を行った二次抗体を結合させて放射線を測定したりして行うことができる。しかしながら、本発明によって提供されるモノクローナル抗体を酵素標識したりビオチン標識したり蛍光標識したり放射線標識したりして二次抗体を用いずに行ってもよい。なお、Ｃ２ＧｎＴ１の検出の際に必要に応じて、洗浄、精製、分画といった操作を行ってもよいことは言うまでもない。また、本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、Ｐｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別を容易かつ簡便に行うことができるように、二次抗体、酵素基質、反応停止液、洗浄液などとともにキット化してもよい。
【００１５】
分析試料中のＣ２ＧｎＴ１の存在の有無や存在量に基づいて行うＰｃａの悪性度の判定は、例えば、Ｃ２ＧｎＴ１が存在すると悪性度が高いかその蓋然性が高い、および／または、Ｃ２ＧｎＴ１が存在しないと悪性度が低いかその蓋然性が高いと判断することができる。また、分析試料中のＣ２ＧｎＴ１の存在量を予め設定したＰｃａの悪性度についてのカットオフ値と比較することにより、カットオフ値よりも多い場合は悪性度が高いかその蓋然性が高い、および／または、少ない場合は悪性度が低いかその蓋然性が高いと判断することができる。この場合、カットオフ値はＰｃａに罹患している男性群からの分析試料中のＣ２ＧｎＴ１の存在量をもとに設定することができる。一方、分析試料中のＣ２ＧｎＴ１の存在の有無や存在量に基づいて行うＰｃａとＢＰＨの識別は、例えば、Ｃ２ＧｎＴ１が存在するとＰｃａであるかその蓋然性が高い、および／または、Ｃ２ＧｎＴ１が存在しないとＢＰＨであるかその蓋然性が高いと判断することができる。また、分析試料中のＣ２ＧｎＴ１の存在量を予め設定したＰｃａとＢＰＨの間のカットオフ値と比較することにより、カットオフ値よりも多い場合はＰｃａであるかその蓋然性が高い、および／または、少ない場合はＢＰＨであるかその蓋然性が高いと判断することができる。この場合、カットオフ値はＰｃａに罹患している男性群とＢＰＨに罹患している男性群からの分析試料中のＣ２ＧｎＴ１の存在量をもとに設定することができる。
【００１６】
なお、本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、前述したようなＰｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別の他、膀胱癌の診断などにも用いることができる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１８】
実施例１：ヒトＣ２ＧｎＴ１を特異的に認識するモノクローナル抗体の調製
（１）抗原の調製
ヒトＣ２ＧｎＴ１の２４１〜２６１番目のアミノ酸配列に相当する配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＮＬＥＴＥＲＭＰＳＨＫＥＥＲＷＫＫＲＹＥＶ）を有するペプチドを化学合成し、免疫原として用いた。
【００１９】
（２）ハイブリドーマの作製
免疫原として用いる２１アミノ酸残基からなるペプチド２２８μｇをＥｔＯＨ１１４μｌに溶かし、超音波処理後、ＰＢＳ１８２０μｌを加えて、３７℃に加温した。その後、アジュバントとして酸処理したＳａｌｍｏｎｅｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ菌体膜画分をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに懸濁した溶液５６８μｌを加えて３７℃で１０分間静置させた。この混合溶液２００μｌを０，４，７，１１，２１，２５日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した。最終投与後３日目に、免疫したマウスの脾臓から調製したリンパ球をケーラーとミルシュタインの常法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）に従って、細胞融合に供した。融合相手の親細胞に、マウス骨髄腫細胞株であるＰ３Ｕ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）を用い、融合剤としてはポリエチレングリコール４０００（メルク社）を用いた。このようにして融合した細胞は、ＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。約２週間後、コロニー陽性ウェルの培養上清中の抗体産生を、前立腺癌細胞株ＰＣ３の細胞破壊液を抗原とするドットブロット法、および大腸菌大量発現系を用いて作製した組み換えヒトＣ２ＧｎＴ１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。ドットブロット法によるスクリーニングは次のようにして行った。前立腺癌細胞株ＰＣ３の細胞破壊液を、２０６００ｘｇで５分間遠心し、上清２０μｌを採取した。ニトロセルロース膜に各検体をブロット後、室温でよく乾燥させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）にて膜を洗浄後、５％スキムミルク−ＰＢＳにて室温で１時間ブロッキング処理を行った。ＰＢＳＴ洗浄後、コロニー陽性ウェルの培養上清１００μｌ／ｓｐｏｔを室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ洗浄後、０．１％スキムミルク−ＰＢＳにより２５００倍に希釈したＨＲＰ標識Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ洗浄後、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により化学発光させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により発光を検出した。ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングは９６穴マイクロタイタープレート（ダイナテック社、ＩＭＭＵＬＯＮ  １Ｂ）を用いて次のようにして行った。組み換えヒトＣ２ＧｎＴ１タンパク質をＰＢＳで５ｎｇ／ｍｌに調整し、７５μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えた。ブランクとなるウェルにはＰＢＳ７５μｌを入れた。４℃で一晩静置し、組み換えヒトＣ２ＧｎＴ１タンパク質を固相化後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ＰＢＳ−１）を２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温で１時間放置した。ＰＢＳ−１を除去後、コロニー陽性ウェルの培養上清を７５μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温にて１時間反応させた。培養上清を除去後、ＰＢＳ１００μｌ／ｗｅｌｌでウェルを１回洗浄した。ＰＢＳ−１で２０００倍希釈した二次抗体（ＨＲＰ標識Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社））を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温にて１時間反応させた。二次抗体溶液を除去後、ウェルをＰＢＳ１���０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質としてＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７４３１）を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えた。遮光放置して発色が見られたところで１Ｍ  ＨＣｌ１００μｌ／ｗｅｌｌを加えて発色を停止させた。その後、測定波長４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した（対照波長は設定なし）。以上の方法によって高い抗体産生能と良好な増殖能をもつハイブリドーマクローンとしてＨＵ１２７を得た。このクローンＨＵ１２７由来のモノクローナル抗体は、大腸菌大量発現系を用いて作製した組み換えヒトＣ２ＧｎＴ１タンパク質と特異的に反応し、組み換えヒトＣ２ＧｎＴ２タンパク質と組み換えヒトＣ２ＧｎＴ３タンパク質とは交差反応性を示さなかった（ウエスタンブロット法による）。このクローンＨＵ１２７は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１４０９として寄託されている。
【００２０】
（３）ヒトＣ２ＧｎＴ１を特異的に認識するモノクローナル抗体の調製
（２）において得られたハイブリドーマ（クローンＨＵ１２７）を、７５ｃｍ２フラスコ（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、５％（ｖ／ｖ）ＨＬＣＭ含有Ａｌｙｓ  Ａｂ  Ｐｒｏ培地（細胞科学研究所社）２０ｍｌ中、３７℃、５％ＣＯ２存在下で７日間培養した。この培養液中にヒトＣ２ＧｎＴ１を特異的に認識するモノクローナル抗体が高濃度に含まれていた。クローンＨＵ１２７由来の培養液は、プロテインＧセファロースによるアフニティクロマトグラフィーで精製した。こうしてクローンＨＵ１２７から調製したＨＵ１２７モノクローナル抗体（以下「ＨＵ１２７ｍＡｂ」と略す）は、分子量が約１５万Ｄａであって、免疫グロブリンのタイプがＩｇＧ１（κ）であった。ＥＬＩＳＡ法によるＨＵ１２７ｍＡｂのヒトＣ２ＧｎＴ１に対する特異性評価の結果を図３に示す（ＥＬＩＳＡ法のプロトコルは前述の通り）。図３から明らかなように、ＨＵ１２７ｍＡｂは抗体濃度依存的にシグナルを増強した。
【００２１】
実験例１：前立腺癌全摘標本のＨＵ１２７ｍＡｂによる染色とその臨床的意義
前立腺全摘除術を施行された２５０例のＰｃａ患者の前立腺組織標本を、ＨＵ１２７ｍＡｂを用いて免疫組織染色し、その臨床的意義を調べた。
【００２２】
免疫組織染色は以下に示す方法にて行った。前立腺全摘除術施行後、組織をホルマリン固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片を作製後、脱パラフィン処理を施した。脱パラフィン処理はキシレンで５分間×２回、１００％ＥｔＯＨで１０分間×２回、その後、９０％ＥｔＯＨ、８０％ＥｔＯＨ、ＭｉｌｌｉＱ水の順に５分間ずつスライドグラスを浸す方法で行った。脱パラフィン処理後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液にスライドグラスを浸し、９５℃で２０分間、抗原賦活化処理を行った。抗原賦活化処理後、ＰＢＳに置換し、３％ＢＳＡ−ＰＢＳにより室温で３０分間ブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより５μｇ／ｍｌに調整したＨＵ１２７ｍＡｂを４℃で一晩反応させた。ＰＢＳにより洗浄し、ＭｉｌｌｉＱ水に置換後、０．３％過酸化水素含有ＭｅＯＨに１０分間浸し、細胞内ペルオキシダーゼの不活化処理を施した。ＭｉｌｌｉＱ水により洗浄し、ＰＢＳに置換後、５％ヤギ血清含有ＰＢＳにより室温で３０分間ブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、２％ヤギ血清含有ＰＢＳにより２００倍に希釈したＨＲＰ標識Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を室温で２時間反応させた。ＰＢＳにより洗浄し、ＭｉｌｌｉＱ水に置換後、ダコＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ＤＡＫＯ社）を用いて発色させた。ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄後、カウンターステインとしてヘマトキシリン染色を行った。染色操作後、ＥｔＯＨからキシレンへと透徹を行い、油系封入剤にて封入して光学顕微鏡による観察を行った。前立腺組織標本におけるＣ２ＧｎＴ１の発現の有無により患者を２群に分け、患者の年齢、ＰＳＡ値、臨床病期、Ｐｃａのリスク層別化、病理組織学的悪性度分類、神経周囲浸潤の有無などとの関係について解析を行った。結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
表１から明らかなように、Ｃ２ＧｎＴ１の発現がある場合（Ｃ２ＧｎＴｐｏｓｉｔｉｖｅ）と発現がない場合（Ｃ２ＧｎＴｎｅｇａｔｉｖｅ）を比較すると、臨床病期（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｇｅ）、Ｐｃａのリスク層別化（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、病理組織学的悪性度分類（Ｆｉｎａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｇｅ）、神経周囲浸潤の有無（Ｐｅｒｉｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ）において、Ｃ２ＧｎＴ１の発現がある場合の方が発現がない場合よりも悪性度が高く（例えば癌が前立腺外に浸潤していることを示すｐＴ３の割合についてみるとＣ２ＧｎＴ１の発現の有無は癌の浸潤度と密接に関連する（ｐ＝０．００３，Ｘ２−ｔｅｓｔ））、前立腺組織標本におけるＣ２ＧｎＴ１の発現の有無に基づいてＰｃａの悪性度を判定できることがわかった。染色結果の一例を図４に示す（Ｃ２ＧｎＴ１陽性のＰｃａでは矢印で示した部位において細胞の核付近にあるゴルジ体の染色が認められる）。
【００２５】
また、前立腺組織標本におけるＣ２ＧｎＴ１の発現の有無とＰＳＡ再発率の関係をカプランマイヤー法により解析した結果を図５に示す。図５から明らかなように、Ｃ２ＧｎＴ１陽性のＰｃａ（Ｃ２ＧｎＴ（＋））では前立腺全摘後のＰＳＡ再発率が有意に高く（ｐ＝０．００００１５，ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）、ＰＳＡ再発率の点においても前立腺組織標本におけるＣ２ＧｎＴ１の発現の有無に基づいてＰｃａの悪性度を判定できることがわかった。
【００２６】
さらに、ＰＳＡ再発に関連する危険因子をＣＯＸの比例ハザード分析により単変量解析と多変量解析した結果を表２に示す。表２から明らかなように、単変量解析と多変量解析いずれにおいてもＨＵ１２７ｍＡｂを用いた免疫組織染色で検出されたＣ２ＧｎＴ１の発現がＰＳＡ再発に対する危険因子であることが確認された。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
実験例２：ドットブロット法によるＨＵ１２７ｍＡｂを用いた前立腺マッサージ尿中のＣ２ＧｎＴ１の検出
泌尿器科を受診し、ＰＳＡが高値のため前立腺マッサージ尿を採取された検体４８例をニトロセルロース膜にブロットし、ＨＵ１２７ｍＡｂを用いてＣ２ＧｎＴ１の検出を行った。前立腺マッサージ尿は、Ｐｃａ検診の一つとして利用される、直腸から前立腺をマッサージすることにより得られる前立腺タンパク質を高濃度に含む尿検体であり、通常の検査に使用した残りの検体を凍結し保存していたものを用いた。マッサージ尿検体を自然解凍後、よく混和し、２０００ｘｇで５分間遠心し、上清２０μｌを採取した。ニトロセルロース膜に各検体をブロット後、室温でよく乾燥させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）にて膜を洗浄後、５％スキムミルク−ＰＢＳにて室温で１時間ブロッキング処理を行った。ＰＢＳＴ洗浄後、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（ＴＯＹＯＢＯ社）により２μｇ／ｍｌに調整したＨＵ１２７ｍＡｂを室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ洗浄後、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（ＴＯＹＯＢＯ社）により２５００倍に希釈したＨＲＰ標識Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ洗浄後、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により化学発光させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により発光を検出した。ブロッテイング結果とＰｃａまたはＢＰＨの関係を図６と表３に示す。図６と表３から明らかなように、ＰｃａにおいてはＣ２ＧｎＴ１の発現がある場合（Ｃ２ＧｎＴｐｏｓｉｔｉｖｅ）と発現がない場合（Ｃ２ＧｎＴｎｅｇａｔｉｖｅ）が併存するが、ＢＰＨにおいてはほとんどの場合においてＣ２ＧｎＴ１の発現がないので、Ｃ２ＧｎＴ１の発現がある場合にはＰｃａであるかその蓋然性が高いと判断できることから、前立腺マッサージ尿中のＣ２ＧｎＴ１の存在の有無に基づいてＰｃａとＢＰＨを識別できることがわかった。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
まとめ：
以上の結果から、本発明によって提供されるモノクローナル抗体であるＨＵ１２７ｍＡｂを用いて分析試料中のＣ２ＧｎＴ１を検出することで、その存在の有無や存在量に基づいてＰｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別を高感度に再現性よく行うことができることがわかった。現在のところ、こうした判定や識別には、前述の通り、ＰＳＡを指標にして行うことが困難なため、前立腺に針を刺入する生検が必要となる。しかしながら、針生検は侵襲的であり、出血や感染症などの重篤な有害事象を伴うことが懸念される。本発明によれば、Ｐｃａの悪性度の判定やＰｃａとＢＰＨの識別を少ない分析試料で高感度に再現性よく行うことができるので、針生検の施行を必要とする症例の絞り込みが可能になるため、これまで困難であった非侵襲的な診断の実施ができる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、前立腺癌の悪性度の判定や前立腺癌と前立腺肥大の識別を行うために有用な、ヒトＣ２ＧｎＴ１を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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