(57)【要約】【課題】所定量の液体試料を量り取るための液体試料計量槽を提供する。【解決手段】微生物夾雑物検出容器５５は、容器本体２と発光検出槽３を備えている。容器本体２は３つの槽に仕切られている。蓋部材５７と中間部仕切り部材５との間に上部仕切り部材（隔壁）５８が設けられ、蓋部材５７と上部仕切り部材５８によって液体試料計量槽５６が形成されている。液体試料計量槽５６に導入された所定量の液体試料は、上部仕切り部材５８を棒等で突き破ることにより、第一試薬設置槽１０に導入される。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定量の液体試料を量り取るための液体試料計量槽であって、
所定の容積を有し、
試薬設置槽と隔壁を介して連結されており、隔壁を破ることにより前記試薬設置槽と連通し、所定量の液体試料を前記試薬設置槽内に導入可能であることを特徴とする液体試料計量槽。
【請求項２】
軟質材料からなる蓋部材を有し、蓋部材に注射針を突き刺して液体試料を液体試料計量槽に導入可能であることを特徴とする請求項１に記載の液体試料計量槽。
【請求項３】
蓋部材の上面に立設された堰壁により、蓋部材の上面は試料導入エリアと試料排出エリアに仕切られており、
試料排出エリアには逆止弁が設けられ、
試料導入エリアに注射針を突き刺して液体試料計量槽の容積を超える量の液体試料を液体試料計量槽内部に導入して前記逆止弁から液体試料を排出することにより、前記容積と等しい量の液体試料を量り取ることができることを特徴とする請求項２に記載の液体試料計量槽。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定量の液体試料を量り取るための液体試料計量槽に関する。また本発明に関連する発明は、微生物夾雑物検出容器、微生物夾雑物検出システム、並びに、微生物夾雑物の検出方法に関し、さらに詳細には、生物発光又は化学発光を利用して液体試料中の微生物夾雑物の存在又は量を決定するための微生物夾雑物検出容器、当該微生物夾雑物検出容器を備えた微生物夾雑物検出システム、並びに、当該微生物夾雑物検出容器を用いた微生物夾雑物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物汚染（例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母、真菌、および糸状菌）は、重篤な疾患の原因となり得るものであり、場合によっては人を死に至らしめることもある。そのため、製薬産業、医療デバイス産業、および食品産業における製造業者は、厳しい基準を満たすために、各製品が基準を超える微生物夾雑物を含まないことを確認しなければならない。これらの産業では、特定の基準、例えば、日本では日本薬局方によって課される基準、米国では米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）又は環境保護局によって課される基準を満たす必要があり、微生物夾雑物の存在に関して、高感度かつ高精度な試験が求められる。例えば、ＵＳＦＤＡは、医薬品および侵襲性医療デバイスの特定の製造業者に、自社製品が、検出可能なレベルのグラム陰性細菌のエンドトキシン（リポ多糖）を含まないことを確証するように求めている。
【０００３】
エンドトキシンの測定方法として、カブトガニの血球細胞抽出物（ＬＡＬ）を用いたリムルス試験が広く行われている。リムルス試験には、ゲル化反応（凝固反応）を利用したゲル化法と比濁法、および合成発色基質を用いる発色法（比色法）が知られている。
【０００４】
リムルス試験におけるゲル化は、以下のカスケード反応により起こる。まず、エンドトキシンとＬＡＬとが接触すると、ＬＡＬ中のファクターＣが活性化される。活性化されたファクターＣはＬＡＬ中のファクターＢを活性化し、さらに活性化されたファクターＢはＬＡＬ中の凝固酵素（Clotting enzyme）を活性化する。そして、活性化された凝固酵素によってコアグローゲン（Coagulogen）がコアグリン（Coagulin）に変換され、コアグリンが重合してゲルを形成する。前記したゲル化法と比濁法は、本カスケード反応によるゲル形成がエンドトキシン濃度に依存することに基づいている。
一方、発色法では、凝固酵素の基質として発色合成基質を用いる。例えば、発色合成ペプチド基質を用い、遊離した発色物質の量を吸光度により測定する。
【０００５】
特許文献１には、ＬＡＬ試薬と合成発色基質を組み合わせた発色法を構成する試薬を内蔵したカートリッジが開示されている。このカートリッジを用いることで、その場でエンドトキシン測定結果を得る「ポイント・オブ・ケア検査」を実現することが可能とされている。しかしながら、この技術は発色法に基づくため、高感度測定には不向きである。
【０００６】
一方、合成発色基質の代わりに、ルシフェリンが結合した合成基質及びルシフェラーゼによる生物発光を組み合わせて高感度化を図る技術が提案されている（特許文献２）。しかしながら、この技術では、高感度測定は可能になるものの、試料とＬＡＬ試薬の混合工程、合成基質の添加工程、発光試薬の添加工程の各工程が求められ、少なくとも２〜３回のピペット操作が必要である。そのため、反応液への外部のエンドトキシンの混入が起こるおそれがあり、高感度測定には不向きであると共に、操作も煩雑である。
【０００７】
なお、ＬＡＬ中の凝固酵素の活性化は、βグルカンとＬＡＬとが接触することによっても起こる。これは、ＬＡＬ中のファクターＧがβグルカンによって活性化されることによるものである。すなわち、活性化されたファクターＧが凝固酵素を活性化する。
【０００８】
またβグルカンとペプチドグリカンの検出技術として、ＳＬＰ法が知られている。ＳＬＰ法は、カイコの体液抽出成分に含まれるフェノール酸化酵素がβグルカンあるいはペプチドグリカンにより活性化される現象を利用したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５０１０２０号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０６３８４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のように、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物の検出において、高感度でかつ簡便・迅速な測定技術が求められている。このような現状に鑑み、本発明は、エンドトキシン等の微生物夾雑物の検出をより高感度でかつ簡便・迅速に行うことができる技術を提供することを目的とする。さらに、所定量の液体試料を量り取るための液体試料計量槽を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１に記載の発明は、所定量の液体試料を量り取るための液体試料計量槽であって、所定の容積を有し、試薬設置槽と隔壁を介して連結されており、隔壁を破ることにより前記試薬設置槽と連通し、所定量の液体試料を前記試薬設置槽内に導入可能であることを特徴とする液体試料計量槽である。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、軟質材料からなる蓋部材を有し、蓋部材に注射針を突き刺して液体試料を液体試料計量槽に導入可能であることを特徴とする請求項１に記載の液体試料計量槽である。
【００１３】
請求項３に記載の発明は、蓋部材の上面に立設された堰壁により、蓋部材の上面は試料導入エリアと試料排出エリアに仕切られており、試料排出エリアには逆止弁が設けられ、試料導入エリアに注射針を突き刺して液体試料計量槽の容積を超える量の液体試料を液体試料計量槽内部に導入して前記逆止弁から液体試料を排出することにより、前記容積と等しい量の液体試料を量り取ることができることを特徴とする請求項２に記載の液体試料計量槽である。
【００１４】
関連の発明は、容器内で液体試料を血球溶解物又は昆虫の体液由来成分に接触させて、液体試料中の微生物夾雑物と血球溶解物又は昆虫の体液由来成分とを反応させ、液体試料中における微生物夾雑物の存在又は量を決定するための微生物夾雑物検出容器であり、容器本体と発光検出槽とを備え、血球溶解物又は昆虫の体液由来成分を少なくとも含有する血球溶解物等含有試薬と、所定の基質と反応して生物発光又は化学発光を発生させる発光用試薬とを内蔵しており、液体試料を容器本体内に導入可能であり、導入された液体試料が前記血球溶解物等含有試薬と前記発光用試薬を溶解し、当該溶解物が発する生物発光又は化学発光を前記発光検出槽にて検出可能であることを特徴とする微生物夾雑物検出容器である。
【００１５】
この発明は、液体試料中における微生物夾雑物の存在又は量を決定するための微生物夾雑物検出容器に関するものである。この発明の微生物夾雑物検出容器は、血球溶解物又は昆虫の体液由来成分（以下、「血球溶解物等」と称することがある。）を少なくとも含有する「血球溶解物等含有試薬」と、所定の基質と反応して生物発光又は化学発光を発生させる「発光用試薬」とを内蔵している。またこの発明の微生物夾雑物検出容器は、容器本体と発光検出槽とを備えており、液体試料を容器本体内に導入可能である。そして、導入された液体試料が血球溶解物等含有試薬と発光用試薬を溶解し、当該溶解物が発する生物発光又は化学発光を前記発光検出槽にて検出可能である。この発明の微生物夾雑物検出容器によれば、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物の生物発光又は化学発光による高感度検出を、簡便かつ迅速に行うことができる。
【００１６】
血球溶解物等含有試薬と発光用試薬は、容器内の同一の場所に配置されてもよく、異なる場所に配置されてもよい。同一の場所に配置する場合には、両試薬を混合した状態で配置することもできる。
【００１７】
「血球溶解物」と「昆虫の体液由来成分」には、本来の生物由来のものの他に、化学合成や遺伝子組換え技術により作製された、血球溶解物あるいは昆虫の体液由来成分の「同等物」も含まれる。
【００１８】
関連の発明は、容器本体と発光検出槽とが隔壁を介して連結されており、隔壁を破ることにより容器本体と発光検出槽とが連通することを特徴とする上記の微生物夾雑物検出容器である。
【００１９】
かかる構成により、液体試料を容器本体内に一旦収容し、その後、隔壁を破ることにより液体試料を発光検出槽に導入することが可能となる。
【００２０】
上記の微生物夾雑物検出容器において、血球溶解物等含有試薬は、容器本体に配置されていることが好ましい。
【００２１】
関連の発明は、発光用試薬は、発光検出槽に配置されていることを特徴とする上記の微生物夾雑物検出容器である。
【００２２】
かかる構成により、生物発光又は化学発光の発光寿命が短い場合であっても、高感度かつ正確に生物発光又は化学発光を検出できる。
【００２３】
関連の発明は、容器本体は隔壁を介して少なくとも２つの槽に仕切られており、隔壁を破ることにより隣接する槽同士が連通することを特徴とする上記の微生物夾雑物検出容器である。
【００２４】
この発明の微生物夾雑物検出容器では、容器本体が隔壁を介して少なくとも２つの槽に仕切られている。そのため、容器本体に導入された液体試料を各槽に収容し待機させることができる。さらに、隔壁を破ることにより、待機中の液体試料を隣接する槽に送ることができる。各槽においては、例えば、収容した液体試料と血球溶解物等含有試薬とを接触させ、反応を行うことができる。
【００２５】
関連の発明は、容器本体の１つの槽に、血球溶解物等含有試薬が配置され、容器本体の別の槽に、発光基質を遊離する発光合成基質が配置され、発光検出槽に、発光用試薬が配置され、発光用試薬には前記発光基質と反応する発光酵素が含まれていることを特徴とする上記の微生物夾雑物検出容器である。
【００２６】
かかる構成により、液体試料と血球溶解物等含有試薬との反応、発光基質の遊離反応、及び発光酵素による発光反応を、隔壁を順次破ることにより連続的に行うことができる。
【００２７】
上記の微生物夾雑物検出容器において、血球溶解物等含有試薬には発光基質を遊離する発光合成基質が混合されており、発光用試薬には前記発光基質と反応する発光酵素が含まれている構成が好ましい。
【００２８】
上記の微生物夾雑物検出容器において、発光合成基質はルシフェリン又はその誘導体を遊離可能なものであり、発光酵素はルシフェラーゼである構成が好ましい。ここで「ルシフェリンの誘導体」とは、ルシフェリンと同様に、ルシフェラーゼと反応することにより生物発光を発するルシフェリンと構造類似の化合物をいう。
【００２９】
上記の微生物夾雑物検出容器において、容器本体内に連通する試薬収容槽がさらに設けられており、当該試薬収容槽に血球溶解物等含有試薬が配置されていてもよい。
【００３０】
上記の微生物夾雑物検出容器において、試薬収容槽は、容器本体内に設けられていてもよい。
【００３１】
上記の微生物夾雑物検出容器において、容器本体は円筒状であり、その軸線方向における一方の端部に発光検出槽が連結されている構成が好ましい。
【００３２】
関連の発明は、所定の容積を有する液体試料計量槽をさらに備え、所定量の液体試料を液体試料計量槽から容器本体内に導入可能であることを特徴とする上記の微生物夾雑物検出容器である。
【００３３】
この発明の微生物夾雑物検出容器は、所定の容積を有する液体試料計量槽を備えている。かかる構成により、液体試料の計量を容易に行える。
【００３４】
上記の微生物夾雑物検出容器において、液体試料計量槽と容器本体とが隔壁を介して連結されており、隔壁を破ることにより液体試料計量槽と容器本体とが連通する構成が好ましい。
【００３５】
微生物夾雑物は、エンドトキシン、βグルカン、又はペプチドグリカンである構成が好ましい。
【００３６】
血球溶解物は、カブトガニの血球抽出成分である構成が好ましい。
【００３７】
昆虫の体液由来成分は、カイコの体液抽出成分である構成が好ましい。
【００３８】
関連の発明は、上記の微生物夾雑物検出容器と、発光検出器を備えたことを特徴とする微生物夾雑物検出システムである。
【００３９】
この発明は微生物夾雑物検出システムに係るものであり、上記の微生物夾雑物検出容器と、発光検出器を備えている。この発明は微生物夾雑物検出システムによれば、液体試料中の微生物夾雑物を、より簡便かつ迅速に検出することができる。
【００４０】
関連の発明は、上記の微生物夾雑物検出容器を用いて液体試料中の微生物夾雑物の存在又は量を決定することを特徴とする微生物夾雑物の検出方法である。
【００４１】
この発明は微生物夾雑物の検出方法に係るものであり、上記の微生物夾雑物検出容器を用いるものである。この発明によれば、液体試料中の微生物夾雑物を、正確かつ簡便・迅速に検出することができる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の液体試料計量槽によれば、液体試料の計量を容易に行える。
【００４３】
関連の発明の微生物夾雑物検出容器によれば、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物を高感度かつ簡便・迅速に検出することができる。
【００４４】
関連の発明の微生物夾雑物検出システムについても同様であり、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物を高感度かつ簡便・迅速に検出することができる。
【００４５】
関連の発明の微生物夾雑物の検出方法についても同様であり、エンドトキシン、βグルカン、ペプチドグリカン等の微生物夾雑物を高感度かつ簡便・迅速に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の第一実施形態に係る微生物夾雑物検出容器を表す正面図である。
【図２】図１の微生物夾雑物検出容器を表す斜視図である。
【図３】図１の微生物夾雑物検出容器を表す分解斜視図である。
【図４】図１の微生物夾雑物検出容器を表す断面斜視図である。
【図５】図１の微生物夾雑物検出容器の内部構造と内部に配置された試薬を模式的に表す断面図である。
【図６】（ａ）〜（ｇ）は図１の微生物夾雑物検出容器の使用方法を説明する説明図である。
【図７】微生物夾雑物検出容器と発光検出器を表す斜視図である。
【図８】本発明の第二実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【図９】本発明の第三実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【図１０】本発明の第四実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【図１１】試料収容槽を表す斜視図である。
【図１２】（ａ）〜（ｅ）は図１０の微生物夾雑物検出容器の使用方法を説明する説明図である。
【図１３】本発明の第五実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【図１４】（ａ）〜（ｅ）は図１２の微生物夾雑物検出容器の使用方法を説明する説明図である。
【図１５】本発明の第六実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【図１６】第六実施形態における蓋部材と堰壁を表す図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は平面図である。
【図１７】（ａ）〜（ｄ）は図１５の微生物夾雑物検出容器の使用方法を説明する説明図である。
【図１８】第七実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【図１９】第八実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【図２０】第九実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【図２１】第十実施形態に係る微生物夾雑物検出容器の内部構造を模式的に表す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する微生物夾雑物検出容器１は、通常、正面視（図１）における上下方向が鉛直方向となる姿勢（基本姿勢）で使用される。以下の記載において、上下方向は基本姿勢における方向を基準とする。また発明の理解を容易にするために、各図面において、各部材の大きさや厚みについては一部誇張して描かれており、実際の大きさや比率等とは必ずしも一致しないことがある。
【００４８】
本発明の第一実施形態に係る微生物夾雑物検出容器１は、液体試料中のエンドトキシン（微生物夾雑物）を検出するためのものである。微生物夾雑物検出容器１は、図１〜図４に示すように、外観が細長い棒状である。微生物夾雑物検出容器１は、容器本体２と発光検出槽３とを有する。
【００４９】
容器本体２は細長い円筒状の部材からなる。容器本体２の全長は１００ｍｍ〜２００ｍｍ程度、内径は５ｍｍ〜２０ｍｍ程度、肉厚は０．２〜１ｍｍ程度である。容器本体１はポリプロピレン等の樹脂製であり、透明又は半透明である。
【００５０】
発光検出槽３は、円筒状の部材の一方の端部が閉塞された細長いカップ状の部材からなる。発光検出槽３の外径は容器本体２の内径と略等しい。そのため、発光検出槽３は隙間なく容器本体２に挿入できる。そして、発光検出槽３は、その開放端側の一部が容器本体２の一方の端部に挿入され、密封処理されている（図４）。発光検出槽３の全長は２０ｍｍ〜５０ｍｍ程度、肉厚は０．２〜１ｍｍ程度である。発光検出槽３は、容器本体１と同様にポリプロピレン等の樹脂製であり、透明又は半透明である。
発光検出槽３は、光学セルとして機能する。すなわち、発光検出槽３内で生じた生物発光又は化学発光は、外部の発光検出器によって検出することができる。
【００５１】
容器本体２の長手方向の略中央には、中間部仕切り部材（隔壁）５が設けられている。中間部仕切り部材５は薄い円盤状であり、その外径は容器本体２の内径と略同じである。中間部仕切り部材５は、容器本体２の内部を閉塞して上下２つの空間に仕切っている。中間部仕切り部材５は、ある程度の強度を有するが、針や棒を押し付けることで容易に突き破ることができる。中間部仕切り部材５は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、塩化ビニル等の樹脂膜、アルミ箔、ゴム、などの耐水性の材料からなる。
【００５２】
容器本体２と発光検出槽３の境界部分には、発光検出槽側仕切り部材（隔壁）６が設けられている。発光検出槽側仕切り部材６は、中間部仕切り部材５と同様の薄い円盤状であり、その外径は容器本体２の内径と略同じである。発光検出槽側仕切り部材６は、容器本体２と発光検出槽３との間を閉塞して両者を仕切っている。発光検出槽側仕切り部材６は、中間部仕切り部材５と同様に、ある程度の強度を有するが、針や棒を押し付けることで容易に突き破ることができる。発光検出槽側仕切り部材６は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、塩化ビニル等の樹脂膜、アルミ箔、ゴム、などの耐水性の材料からなる。
【００５３】
容器本体２における発光検出槽３と反対側の端部は、蓋部材７で閉塞されている。蓋部材７はゴム等の柔軟材料からなり、注射針等を容易に貫通させることができるものである。
【００５４】
容器本体２は、中間部仕切り部材５によって上下２つの空間に仕切られている。これらの空間により、密閉された２つの槽、すなわち第一試薬設置槽１０と第二試薬設置槽１１が形成されている。
第一試薬設置槽１０は、蓋部材７と中間部仕切り部材５で仕切られた空間（上側の空間）により形成されている。図５に示すように、第一試薬設置槽１０には、血球溶解物等含有試薬１５が設置されている。基本姿勢において、血球溶解物等含有試薬１５は中間部仕切り部材５の上にある。
一方、第二試薬設置槽１１は、中間部仕切り部材５と発光検出槽側仕切り部材６で仕切られた空間（下側の空間）により形成されている。図５に示すように、第二試薬設置槽１１には、発光合成基質１６が設置されている。基本姿勢において、発光合成基質１６は発光検出槽側仕切り部材６の上にある。
【００５５】
また図５に示すように、発光検出槽３には、発光用試薬１７が設置されている。基本姿勢において、発光用試薬１７は発光検出槽３の底部にある。
【００５６】
なお図４では血球溶解物等含有試薬１５と発光用試薬１７の図示を省略している。
【００５７】
本実施形態において、血球溶解物等含有試薬１５はカブトガニの血球抽出物（ＬＡＬ）の凍結乾燥物である。
また発光合成基質１６は、ＬＡＬ中の活性化凝固酵素の作用によってルシフェリン（又はその誘導体）を遊離することができる合成基質、例えば、ベンゾイルＬｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンである。ベンゾイルＬｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンによれば、活性化凝固酵素によってアミノルシフェリンが遊離される。
なお、発光合成基質１６の他の例としては、Ｌｅｕ−Ｇｒｙ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンが挙げられる。さらに、これらのＮ末端は保護基で保護されていてもよい。当該保護基としては、Ｎ−スクシニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、などが挙げられる。
発光用試薬１７は、ルシフェリン（発光酵素）とＡＴＰとの混合物である。
【００５８】
次に、微生物夾雑物検出容器１の使用方法について、図６を参照しながら説明する。
まず、微生物夾雑物（本実施形態ではエンドトキシン）の検出対象となる液体試料２０を注射器２１に量り取る。注射針２２を蓋部材７に突き刺して、第一試薬設置槽１０内に所定量の液体試料２０を導入する（図６（ａ））。
【００５９】
所定量の液体試料２０を導入したら、第一試薬設置槽１０内で液体試料２０に血球溶解物等含有試薬１５をよく溶解させる。この状態で、一定時間保持する（図６（ｂ））。
血球溶解物等含有試薬１５が液体試料２０に溶解すると、液体試料２０中に存在するエンドトキシンが血球溶解物等含有試薬１５中のＬＡＬとカスケード反応を起こして凝固酵素を活性化する（ＬＡＬ反応、凝固酵素の活性化反応）。
凝固酵素を確実に活性化するために、必要に応じて、微生物夾雑物検出容器１を所定温度（例えば３７±１℃）にインキュベートする。インキュベートは、例えば、微生物夾雑物検出容器１全体を恒温器内に入れて行うことができる。その他、各種ヒーター、温度コントローラー、ペルチェ素子等を用いることもできる。
【００６０】
一定時間経過後、中間部仕切り部材５を棒２７で突き破る（図６（ｃ））。これにより、液体試料２０（活性化された凝固酵素を含んでいる）が第二試薬設置槽１１に導入される。棒２７の代わりに針を用いてもよい。
【００６１】
液体試料２０が導入されたら、第二試薬設置槽１１内で液体試料２０に発光合成基質１６（ベンゾイルＬｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン）をよく溶解させる。この状態で、一定時間保持する（図６（ｄ））。
発光合成基質１６が液体試料２０に溶解すると、活性化された凝固酵素が発光合成基質たるベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンに作用し、アミノルシフェリンが遊離される（ルシフェリン遊離反応）。
ルシフェリン遊離反応を確実に行うために、必要に応じて、微生物夾雑物検出容器１を所定温度（例えば３７±１℃）にインキュベートする。インキュベートは、例えば、微生物夾雑物検出容器１全体を恒温器内に入れて行うことができる。その他、各種ヒーター、温度コントローラー、ペルチェ素子等を用いることもできる。
【００６２】
一定時間経過後、発光検出槽側仕切り部材６を、棒２７を用いて突き破る（図６（ｅ））。これにより、液体試料２０（遊離アミノルシフェリンを含んでいる）が発光検出槽３に導入される。
【００６３】
液体試料２０が導入されたら、発光検出槽３内で液体試料２０に発光用試薬１７をよく溶解させる（図６（ｆ））。発光用試薬１７が液体試料２０に溶解すると、液体試料２０中に存在する遊離アミノルシフェリンが、発光用試薬１７中のルシフェラーゼ（発光酵素）及びＡＴＰと反応して生物発光を発する。
【００６４】
最後に、発光検出槽３内で生じた生物発光を、発光検出器２３によって検出する（図６（ｇ））。得られた発光強度の値から、液体試料２０中のエンドトキシン量を算出する。
【００６５】
なお、発光検出槽３からの生物発光を検出する工程（図６（ｇ））において、図７に示すような発光検出器２３を用いることで、発光測定を容易に行うことができる。発光検出器２３はいわゆるルミノメーターであり、円形の挿入口２５を備えている。発光測定の際には、微生物夾雑物検出容器１の発光検出槽３部分を挿入口２５に挿入する。すると、発光検出槽３から発せられる生物発光は、発光検出器２３が備える発光検出系により検出・解析され、結果が表示部２６に表示される。
【００６６】
また、微生物夾雑物検出容器１と発光検出器２３とを組み合わせることにより、微生物夾雑物検出システム２８を構築することができる（図７）。微生物夾雑物検出システム２８を用いることにより、微生物夾雑物の検出をより簡便・迅速に行うことができる。
【００６７】
次に、他の実施形態について順次説明する。なお、以下の説明において、第一実施形態と共通する部材等については同一の符号を付し、詳しい説明を省略する。
【００６８】
上記した第一実施形態では、容器本体２が２つの槽（第一試薬設置槽１０と第二試薬設置槽１１）に仕切られているが、仕切らない実施形態も可能である。図８に示す第二実施形態に係る微生物夾雑物検出容器３１では、容器本体２が仕切られておらず、容器本体２全体で１つの試薬設置槽３２を構成している。試薬設置槽３２と発光検出槽３とは、仕切り部材（隔壁）３３を介して連結されている。仕切り部材（隔壁）３３の構成は、第一実施形態における発光検出槽側仕切り部材（隔壁）６と同じである。
試薬設置槽３２には、血球溶解物等含有試薬３５が設置されている。第一実施形態とは異なり、血球溶解物等含有試薬３５には発光合成基質が混合されている。換言すれば、本実施形態では、血球溶解物等含有試薬３５がＬＡＬとベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンとの混合物である。
微生物夾雑物検出容器３１の他の構成は、第一実施形態と同じである。例えば、発光検出槽３には、発光用試薬１７（ルシフェラーゼとＡＴＰの混合物）が設置されている。
本実施形態の微生物夾雑物検出容器３１によれば、凝固酵素の活性化とルシフェリン遊離反応とを１つの系で同時に行うことができ、操作を簡略化できる。
【００６９】
微生物夾雑物検出容器３１の使用方法は、第一実施形態の微生物夾雑物検出容器１の使用方法と基本的に同じである。すなわち、蓋部材７側から注射器等を用いて液体試料２０を試薬設置槽３２に導入し、必要な反応を行った後、仕切り部材３３を破壊すればよい。なお、液体試料２０が試薬設置槽３２に導入されて、血球溶解物等含有試薬３５を溶解すると、試薬設置槽３２内でＬＡＬ反応（凝固酵素の活性化反応）とルシフェリン遊離反応の両方が起こり、アミノルシフェリンが遊離される。
【００７０】
さらに、血球溶解物等含有試薬、発光合成基質、及び発光用試薬の混合物（すなわち、全ての試薬の混合物）を一箇所に設置することもできる。図９に示す第三実施形態に係る微生物夾雑物検出容器３６では、容器本体２と発光検出槽３との間に仕切り部材がなく、最初から連通している。容器本体２は、液体試料２０が発光検出槽３へ到達するまでの通路として機能するのみである。そして、発光検出槽３には、血球溶解物等含有試薬３５（ＬＡＬ＋発光合成基質）と発光用試薬１７（ルシフェラーゼ＋ＡＴＰ）とが予め混合された状態で設置されている。
微生物夾雑物検出容器３６の使用方法は、第一実施形態の微生物夾雑物検出容器１の使用方法と基本的に同じである。すなわち、蓋部材７側から注射器等を用いて液体試料２０を導入し、発光検出槽３で全ての反応を行えばよい。なお、液体試料２０が発光検出槽３に導入されて、血球溶解物等含有試薬３５と発光用試薬１７を溶解すると、試薬設置槽３２内でＬＡＬ反応（凝固酵素の活性化反応）とルシフェリン遊離反応が起こり、さらにルシフェラーゼによる発光反応が起こる。
【００７１】
図１０に示す第四実施形態に係る微生物夾雑物検出容器３８では、容器本体２内に試薬収容槽４０を備えている。試薬収容槽４０は、容器本体２の長手方向における中央付近に設けられている。図１１に示すように、試薬収容槽４０は、容器本体２の内壁から張り出して設けられたカップ状の槽であり、蓋部材７に向かって開口する半円状の開口部４１と、長方形状の側壁部４２と、曲面壁部４３と、底部４５を有する。曲面壁部４３は容器本体２の内壁の一部で構成されており、当該内壁と一体化している。側壁部４２と容器本体２の内壁との間には隙間４６があり、液体試料２０が隙間４６を通過可能である。試薬収容槽４０の上下方向の長さは容器本体２のそれよりも短く、開口部４１と蓋部材７との間ならびに底部４５と発光検出槽３との間にも、それぞれ隙間がある。
第三実施形態と同様に、微生物夾雑物検出容器３８は仕切り部材を備えておらず、容器本体２と発光検出槽３とが最初から連通している。
【００７２】
試薬収容槽４０の底部４５には血球溶解物等含有試薬１５（ＬＡＬ）が設置されている。
蓋部材７の裏側（容器本体２内）には、発光合成基質１６（ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン）が設置されている。発光合成基質１６は、試薬収容部４０の開口部４１に対向する位置を外して設けられている。換言すれば、容器本体２の隙間４６のちょうど上の位置に設けられている。
発光検出槽３内には発光用試薬１７（ルシフェリン＋ＡＴＰ）が設置されている。
試薬収容槽４０内に設置された血球溶解物等含有試薬１５、蓋部材７の裏側に設置された発光合成基質１６、および発光検出槽３に設置された発光用試薬１７は、いずれも微生物夾雑物検出容器３８を天地逆方向にしても落ちないように（剥がれないように）各設置箇所に固着させてある。
【００７３】
微生物夾雑物検出容器３８の使用方法について、図１２を参照しながら説明する。微生物夾雑物検出容器３８の使用方法は、図６に示した微生物夾雑物検出容器１の使用手順を基本としつつ、転倒操作がさらに加わるものである。
【００７４】
まず、微生物夾雑物（本実施形態ではエンドトキシン）の検出対象となる液体試料２０を注射器２１に量り取る。次に、蓋部材７における試薬収容槽４０の真上の位置に注射針２２を突き刺して、試薬収容槽４０内に所定量の液体試料２０を導入する（図１２（ａ））。試薬収容槽４０内で血球溶解物等含有試薬１５を溶解する。この状態で、一定時間保持する（図１２（ｂ）、ＬＡＬ反応、凝固酵素の活性化反応）。必要に応じて、微生物夾雑物検出容器３８を所定温度（例えば３７±１℃）に維持する。
【００７５】
一定時間経過後、微生物夾雑物検出容器３８を天地逆になるように１８０度転倒させる。ここで、転倒させる際の回転方向は、図１２（ｂ）の矢印に示す方向とする。すなわち、図１２（ｂ）のように蓋部材７が上側にあり且つ試薬収容槽４０が右側にある姿勢（基本姿勢）から、時計回りに回転させる。これにより、液体試料２０が曲面壁部４３を伝って蓋部材７の裏側に到達する（図１２（ｂ）から（ｃ））。
【００７６】
微生物夾雑物検出容器３８を１８０度転倒させると、液体試料２０（活性化された凝固酵素を含んでいる）が蓋部材７の裏側に設置された発光合成基質１６に接触し、発光合成基質１６を溶解させる。この状態で、一定時間保持する（図１２（ｃ）、ルシフェリン遊離反応）。必要に応じて、微生物夾雑物検出容器３８を所定温度（例えば３７±１℃）に維持する。
【００７７】
一定時間経過後、再び、微生物夾雑物検出容器３８を天地逆になるように１８０度転倒させ、基本姿勢に戻す。ここで、転倒させる際の回転方向は、図１２（ｃ）の矢印に示す方向とする。すなわち、図１２（ｃ）のように蓋部材７が下側にあり且つ試薬収容槽４０が左側にある姿勢（転倒姿勢）から、時計回りに回転させる。これにより、液体試料２０が隙間４６を通って発光検出槽３に到達する（図１２（ｃ）から（ｄ））。
【００７８】
微生物夾雑物検出容器３８を基本姿勢に戻すと、液体試料２０（遊離アミノルシフェリンを含んでいる）が発光検出槽３に導入される。
【００７９】
液体試料２０が導入されたら、発光検出槽３内で液体試料２０に発光用試薬１７をよく溶解させる（図１２（ｄ））。発光用試薬１７が液体試料２０に溶解すると、液体試料２０中に存在する遊離アミノルシフェリンが、発光用試薬１７中のルシフェラーゼ（発光酵素）及びＡＴＰと反応して生物発光を発する。
【００８０】
最後に、発光検出槽３内で生じた生物発光を、発光検出器２３によって検出する（図１２（ｅ））。得られた発光強度の値から、液体試料２０中のエンドトキシン量を算出する。
【００８１】
なお、微生物夾雑物検出容器３８の転倒操作は、手動で行ってもよいが、自動で行うことにより操作がより確実となる。
【００８２】
図１３に示す第五実施形態に係る微生物夾雑物検出容器５１は、第四実施形態（図１０）をより簡略化したものである。微生物夾雑物検出容器５１は、図１０の微生物夾雑物検出容器３８とほぼ同様の構成を備えているが、試薬類の設置の仕方が異なる。すなわち微生物夾雑物検出容器５１では、試薬収容槽４０に発光合成基質が混合された血球溶解物等含有試薬３５（ＬＡＬ＋ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン）、蓋部材７の裏側に発光用試薬１７（ルシフェリン＋ＡＴＰ）がそれぞれ設置されている。発光検出槽３には試薬類は設置されておらず、空である。
【００８３】
微生物夾雑物検出容器５１の使用方法について、図１４を参照しながら説明する。微生物夾雑物検出容器５１は、図１２に類似した転倒操作を伴う方法により使用することができる。
【００８４】
まず、微生物夾雑物（本実施形態ではエンドトキシン）の検出対象となる液体試料２０を注射器２１に量り取る。次に、蓋部材７における試薬収容槽４０の真上の位置に注射針２２を突き刺して、試薬収容槽４０内に所定量の液体試料２０を導入する（図１４（ａ））。試薬収容槽４０内で血球溶解物等含有試薬３５を溶解する。この状態で、一定時間保持する（図１２（ｂ）、ＬＡＬ反応→ルシフェリン遊離反応）。必要に応じて、微生物夾雑物検出容器３８を所定温度（例えば３７±１℃）に維持する。
【００８５】
一定時間経過後、微生物夾雑物検出容器５１を天地逆になるように１８０度転倒させる（図１４（ｃ）、転倒姿勢）。このとき、回転方向については特に制限はない。これにより、液体試料２０（遊離アミノルシフェリンを含んでいる）が試薬収容槽４０から排出されて蓋部材７の裏側に到達する。そして、蓋部材７の裏側に設置された発光用試薬１７に接触し、発光用試薬１７を溶解させる。
【００８６】
発光用試薬１７の溶解後、直ちに微生物夾雑物検出容器５１を天地逆になるように１８０度転倒させ、基本姿勢に戻す（図１４（ｄ））。ここで、転倒させる際の回転方向は、図１４（ｃ）の矢印に示す方向とする。すなわち、図１４（ｃ）のように蓋部材７が下側にあり且つ試薬収容槽４０が左側にある姿勢（転倒姿勢）から、時計回りに回転させる。これにより、生物発光を発する液体試料２０が発光検出槽３に導入される。
【００８７】
最後に、発光検出槽３から発せられる生物発光を、発光検出器２３によって検出する（図１４（ｅ））。得られた発光強度の値から、液体試料２０中のエンドトキシン量を算出する。
【００８８】
上記した実施形態は、注射器等を用いて所定量の液体試料を量り取り、微生物夾雑物検出容器に導入するものであった。一方、以下に説明する第六実施形態から第十実施形態では、所定量の液体試料２０を量り取るための液体試料計量槽５６を備えている。
【００８９】
第六実施形態は、第一実施形態の微生物夾雑物検出容器１に液体試料計量槽５６を追加したものである。図１５に示す第六実施形態に係る微生物夾雑物検出容器５５では、容器本体２が３つの槽に仕切られている。すなわち、蓋部材５７と中間部仕切り部材５との間に上部仕切り部材（隔壁）５８がさらに設けられており、蓋部材５７と上部仕切り部材（隔壁）５８によって液体試料計量槽５６が形成されている。
【００９０】
蓋部材５７は、第一実施形態の蓋部材７と同様にゴム等の軟質材料からなり、注射針等を容易に貫通させることができるものである。蓋部材５７には、逆止弁６０と堰壁６１が設けられている。
図１６に示すように、堰壁６１は、蓋部材５７の上面と容器本体２の内壁とで構成される空間を縦に仕切るものである。堰壁６１は長方形状の板体であり、蓋部材５７の上面に鉛直方向に立設されている。堰壁６１の底辺６１ａは蓋部材５７の上面に接触しており、左右の辺６１ｂ，６１ｃは容器本体２の内壁に接触している。
堰壁６１によって、蓋部材５７の上面は２つのエリア、すなわち試料導入エリア６２と試料排出エリア６３に分けられている。試料排出エリア６３には逆止弁６０が設けられている。逆止弁６０は、液体試料計量槽５６から試料排出エリア６３に向かう方向のみに流体を通過させるものである。試料導入エリア６２には特に何も設けられておらず、注射針等を容易に貫通させる構成となっている。
【００９１】
第六実施形態における上記以外の構成、例えば、中間部仕切り部材５、発光検出槽側仕切り部材６、第１試薬設置槽１０、第２試薬設置槽１１、発光検出槽３、血球溶解物等含有試薬１５、発光合成基質１６、発光用試薬１７等については、第一実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００９２】
微生物夾雑物検出容器５５の使用方法について、液体試料計量槽５６の使用方法を中心に説明する。
まず、微生物夾雑物の検出対象となる液体試料２０を注射器２１に量り取る。量り取る量は、液体試料計量槽５６の容積を超える量とする。次に、蓋部材５７の試料導入エリア６２から注射針２２を突き刺して、液体試料計量槽５６内に液体試料２０を導入していく（図１７（ａ））。
【００９３】
導入量が液体試料計量槽５６の容量を超えると、余剰分が逆止弁６０を通じて試料排出エリア６３に溢れ出る（図１７（ｂ））。これにより、液体試料計量槽５６が液体試料２０で満たされ、液体試料計量槽５６の容積に等しい量の液体試料２０が量り取られる。
【００９４】
次に、上部仕切り部材５８を棒２７を用いて突き破る（図１７（ｃ））。これにより、液体試料２０が第一試薬設置槽１０に導入される。第一試薬設置槽１０内で液体試料２０に血球溶解物等含有試薬１５をよく溶解させる（図１７（ｄ））。
以降の操作は図６（ｃ）〜図６（ｇ）に示す操作と同じである。
【００９５】
図１８に示す第七実施形態に係る微生物夾雑物検出容器７１は、図８の微生物夾雑物検出容器３１に液体試料計量槽５６を追加したものである。図１９に示す第八実施形態に係る微生物夾雑物検出容器７２は、図９の微生物夾雑物検出容器３６に液体試料計量槽５６を追加したものである。図２０に示す第九実施形態に係る微生物夾雑物検出容器７３は、図１０の微生物夾雑物検出容器３８に液体試料計量槽５６を追加したものである。図２１に示す第十実施形態に係る微生物夾雑物検出容器７４は、図１３の微生物夾雑物検出容器５１に液体試料計量槽５６を追加したものである。
【００９６】
上記した実施形態では容器本体２と発光検出槽６が円筒状であったが、他の形状でもよい。例えば、断面が長方形の筒状であってもよい。
【００９７】
上記した実施形態において、微生物夾雑物検出容器１,３１,３６,３８,５１，５５，７１，７２，７３，７４のサイズについては、液体試料２０の量などによって適宜選択でき、例示したに限定されるものではない。各部材のサイズについても同様である。
【００９８】
上記した実施形態では、ルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせによる生物発光を利用しているが、他の生物発光・化学発光の系を利用してもよい。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとルミノール、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとイソルミノール、ペルオキシダーゼとルミノール、ペルオキシダーゼとイソルミノール、などの各組み合わせによる生物発光・化学発光を利用することができる。
【００９９】
上記した実施形態では、微生物夾雑物としてエンドトキシンを検出する例を示したが、βグルカンやペプチドグリカンの検出も同様の実施形態をもって検出することができる。
【０１００】
上記した実施形態では、血球溶解物等含有試薬１５，３５に含まれる血球溶解物としてカブトガニの血球抽出成分（ＬＡＬ）を用いたが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、生体由来成分から単離精製されたファクターＣ等（ファクターＣ、ファクターＧ、凝固酵素等）や遺伝子組換え技術によって作製された組換えファクターＣ等を適宜使用して作製した「ＬＡＬの同等物」を用いることができる。また、βグルカンあるいはペプチドグリカン測定用として、血球溶解物に代えてカイコの体液抽出成分を使用することができる。カイコの体液抽出成分についても、生体由来成分から単離精製されたフェノール酸化酵素や組換え型のフェノール酸化酵素を用いて作製した「カイコの体液抽出成分の同等物」を用いることができる。
【０１０１】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１０２】
図１５に示す第六実施形態の微生物夾雑物検出容器５５を用いて、以下の実験を行った。
【０１０３】
リムルス試薬（ＬＡＬ）、エンドトキシン標準液（大腸菌0111:B4由来エンドトキシン)、およびパイロジェンフリー水は、エンドトキシン測定試薬ＱＣＬ−１０００（ロンザ社）に付属のものを使用した。べンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン（発光合成基質）とルシフェラーゼ（発光酵素）は、Proteasome-GloTM Assay（プロメガ社）に付属のものを使用した。
【０１０４】
血球溶解物等含有試薬１５として、１００μＬのリムルス試薬を用いた。発光合成基質１６として、１００μＬの１５０μＭ べンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン溶液（１ｍＭ ＭｇＣｌを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解）を用いた。発光用試薬１７として、１０μＭ ＡＴＰを含むルシフェラーゼ（０．１ｍＭ ＭｇＣｌと２０ｍＭＣaＣｌ2を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）に溶解）混合溶液１００μＬを用いた。
血球溶解物等含有試薬１５を中間部仕切り部材５上に、発光合成基質１６を発光検出槽側仕切り部材６上に、発光用試薬２７を発光検出槽３の底にそれぞれ置き、凍結乾燥させた。
【０１０５】
液体試料２０として、エンドトキシン標準液をパイロジェンフリー水で希釈して得た０．５ＥＵ／ｍＬ、０．１ＥＵ／ｍＬ、または０．０５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液を用いた。
液体試料計量槽５６の容積は０．５ｍＬとした。
【０１０６】
図１７（ａ）〜図１７（ｄ）に示した操作によって、０．５ｍＬの液体試料２０を液体試料計量槽５６に量り取り、その後、上部仕切り部材５８を突き破って第一試薬設置槽１０に導入した。第一試薬設置槽１０で液体試料２０に血球溶解物等含有試薬１５をよく溶解させた。周囲温度を３７℃にし、１０分間反応させた（図６（ｂ）、凝固酵素の活性化反応）。
【０１０７】
その後、図６（ｂ）〜図１６（ｇ）に示す操作を行った。すなわち、凝固酵素の活性化反応の終了後、中間部仕切り部材５を突き破り、液体試料２０を第二試薬設置槽１１に導入し、発光合成基質１６を溶解させた。周囲温度を３７℃にし、１０分間反応させた（図６（ｄ）、ルシフェリン遊離反応）。続いて、発光検出槽側仕切り部材６を突き破り、液体試料２０を発光検出槽３に導入し、発光検出槽３内で発光用試薬１７を溶解させた（発光反応）。速やかに、生じた生物発光をルミノメーターで検出し、発光強度（相対発光量、ＲＬＵ）を測定した。
結果を表１に示す。すなわち、エンドトキシン濃度が０〜０．５ＥＵ／ｍＬの範囲において、エンドトキシン濃度に応じた発光強度が得られた。また、０．０５ＥＵ／ｍＬの低濃度でも発光が検出され、エンドトキシンを高感度で検出できることが示された。
【０１０８】
【表１】
2014132279.tif 000003
【符号の説明】
【０１０９】
１  微生物夾雑物検出容器
２  容器本体
３  発光検出槽
５  中間部仕切り部材（隔壁）
６  発光検出槽側仕切り部材（隔壁）
１０  第一試薬設置槽（槽）
１１  第二試薬設置槽（槽）
１５  血球溶解物等含有試薬
１６  発光合成基質
１７  発光用試薬
２０  液体試料
２３  発光検出器
２８  微生物夾雑物検出システム
３１  微生物夾雑物検出容器
３２  試薬設置槽（槽）
３３  仕切り部材（隔壁）
３５  血球溶解物等含有試薬
３６  微生物夾雑物検出容器
３８  微生物夾雑物検出容器
４０  試薬収容槽
５１  微生物夾雑物検出容器
５５  微生物夾雑物検出容器
５６  液体試料計量槽
５８  上部仕切り部材（隔壁）
７１  微生物夾雑物検出容器
７２  微生物夾雑物検出容器
７３  微生物夾雑物検出容器
７４  微生物夾雑物検出容器
【図１】
2014132279.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2014132279.tif 000019
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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