(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた力学的強度を有する束状のゲルファイバー集合体の製造方法の提供。【解決手段】ａ）第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液を調製する工程；ｂ）前記溶液をマイクロ流路に注入する工程；ｃ）前記マイクロ流路中に第１の架橋剤を注入することにより、前記第１のプレゲル剤をゲル化させて、糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成する工程；ｄ）前記鋳型ゲルファイバーを含む溶液に第２の架橋剤を添加することにより、前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持された状態で前記第２のプレゲル剤を架橋させ、前記第２のプレゲル剤が架橋してなるゲルが前記鋳型ゲルファイバーに被覆された構造のゲルファイバー複合体を形成する工程；及びｅ）前記ゲルファイバー複合体を含む溶液にゲル除去剤を添加することによって前記鋳型ゲルファイバーを除去して、束状構造を有するゲルファイバー集合体を得る工程、を含む方法【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーが束状となった構造を有するゲルファイバー集合体の製造方法であって、
ａ）第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液を調製する工程、ここで、前記第１のプレゲル剤は前記溶液中に溶解した状態であり、前記第２のプレゲル剤は前記溶液中に凝集した状態で存在する、当該工程、
ｂ）前記溶液をマイクロ流路に注入する工程、
ｃ）前記マイクロ流路中に第１の架橋剤を注入することによって、流れ場において前記第１のプレゲル剤をゲル化させて、糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成する工程、ここで、前記第２のプレゲル剤は前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持される、当該工程、
ｄ）前記鋳型ゲルファイバーを含む溶液に第２の架橋剤を添加することによって、前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持された状態で前記第２のプレゲル剤を架橋させ、それにより、前記第２のプレゲル剤が架橋してなるゲルが前記鋳型ゲルファイバーに被覆された構造のゲルファイバー複合体を形成する、当該工程、及び
ｅ）前記ゲルファイバー複合体を含む溶液にゲル除去剤を添加することによって前記鋳型ゲルファイバーを除去して、束状構造を有するゲルファイバー集合体を得る工程、
を含む、該方法。
【請求項２】
前記ゲルファイバー集合体が、ハイドロゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のプレゲル剤のゲル化速度が、前記第２のプレゲル剤のゲル化速度よりも速い、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のプレゲル剤が、相転移温度を有する高分子である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記相転移温度を有する高分子が、疎水基と親水基を有する両親媒性高分子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記相転移温度を有する高分子が、糖鎖高分子である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記糖鎖高分子がヒドロキシプロピルセルロースである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の架橋剤が、ジビニルスルホン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、又はグルタルアルデヒドから選択される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のプレゲル剤が、イオン架橋によってゲル化し得る高分子である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記イオン架橋によってゲル化し得る高分子が、アルギン酸ナトリウム又はアルギン酸カリウムであり、及び前記第１の架橋剤が、２価以上の金属イオンの塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲル除去剤が、キレート剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のプレゲル剤がアルギン酸ナトリウムであり、前記第２のプレゲル剤がヒドロキシプロピルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ａ）で調製される第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液が、塩基性の水溶液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩基性の水溶液中におけるアルギン酸ナトリウムの濃度が１．０ｗｔ％であり、及びヒドロキシプロピルセルロースの濃度が４．０ｗｔ％以上である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーが束状となった構造を有するゲルファイバー集合体であって、相転移温度を有する高分子が互いに共有結合で架橋された構造を有する、当該ゲルファイバー集合体。
【請求項１６】
前記ゲルファイバー集合体が、ハイドロゲルである、請求項１５に記載のゲルファイバー集合体。
【請求項１７】
１００〜５００μｍの外径を有する、請求項１５又は請求項１６に記載のゲルファイバー集合体。
【請求項１８】
前記相転移温度を有する高分子が、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する高分子である、請求項１５乃至１７のいずれか１項に記載のゲルファイバー集合体。
【請求項１９】
前記相転移温度を有する高分子が、ヒドロキシプロピルセルロースである、請求項１８に記載のゲルファイバー集合体。
【請求項２０】
３ｋＰａ以上のヤング率を有する、請求項１５乃至１９のいずれか１項に記載のゲルファイバー集合体。
【請求項２１】
５ｋＰａ以上の単位断面積あたりの破断荷重を有する、請求項１５乃至１９のいずれか１項に記載のゲルファイバー集合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、束状構造を有するゲルファイバー集合体の製造方法、及び、当該方法により得られる束状構造を有するゲルファイバー集合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲルは、３次元的に架橋した網状構造の親水性ポリマーを含むゲル状の材料であり、その内部に水を保持できる能力及び優れた生体適合性等の特性から、生体組織の癒着防止、シーリング、ドラッグデリバリー、コンタクトレンズなどの医療目的に加えて、センサーや表面コーティングなどの様々な用途への応用が期待されている材料である（例えば、特許文献１及び２）。
【０００３】
近年、上記の用途に応じて様々な形状のゲルを形成することが試みられており、例えば、一定の方向に直線的に伸長した繊維状のゲルファイバー、さらにそのようなゲルファイバーを複数整列させて束状にしたゲルファイバーの集合体が注目されている。一般に、糸などの束状物質を得るためには、１本１本の繊維を複数本撚り合わせ手法が用いられる。同様の手法によって束状のゲルファイバーを得るためには、高強度なゲルファイバーを大量に調製し単離すること、及び当該ゲルファイバーを安定に撚る技術が必要となる。しかしながら、束の構成単位となる１本のゲルファイバーの強度は十分ではなく、また、ゲルファイバーの単離や外力によって撚ることも非常に困難であるうえ、その間ゲルが乾燥してしまうという問題があった。従って、一定の方向に直線的に伸長した複数のゲルファイバーを束状とした構造を有するゲルファイバーを得る方法が確立されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１８９６２６号公報
【特許文献２】特開２００５−６０５７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーを束状とすることで優れた力学的強度を有する束状のゲルファイバー集合体を簡便に作製可能な新規な方法、及び当該方法により得られる束状構造を有するゲルファイバー集合体を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、動的な流れ中の反応場と分子の凝集効果を組み合わせることにより、溶液中で相分離し凝集しているプレゲル剤マイクロ流路中において架橋させて束状構造を有するゲルファイバー集合体を簡便な工程によって得ることができることを見出した。より詳細には、マイクロ流路を反応場として、まず、短時間でゲル化可能な第１のプレゲル剤によって糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成させ；相分離して凝集している第２のプレゲル剤を、流路のシェアストレスによって鋳型ゲルファイバーの骨格内部に取り込ませ、そこに保持させた状態でゲル化させて異なる２種類のゲルファイバーからなる複合体を形成させ；その後、鋳型ゲルファイバーを除去することによって、マイクロオーダーの外径を有する束状構造のゲルファイバー集合体が得られることを見出した。かかる知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、一態様において、
（１）１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーが束状となった構造を有するゲルファイバー集合体の製造方法であって、ａ）第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液を調製する工程、ここで、前記第１のプレゲル剤は前記溶液中に溶解した状態であり、前記第２のプレゲル剤は前記溶液中に凝集した状態で存在する、当該工程；ｂ）前記溶液をマイクロ流路に注入する工程；ｃ）前記マイクロ流路中に第１の架橋剤を注入することによって、流れ場において前記第１のプレゲル剤をゲル化させて、糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成する工程、ここで、前記第２のプレゲル剤は前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持される、当該工程；ｄ）前記鋳型ゲルファイバーを含む溶液に第２の架橋剤を添加することによって、前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持された状態で前記第２のプレゲル剤を架橋させ、それにより、前記第２のプレゲル剤が架橋してなるゲルが前記鋳型ゲルファイバーに被覆された構造のゲルファイバー複合体を形成する、当該工程；及び、ｅ）前記ゲルファイバー複合体を含む溶液にゲル除去剤を添加することによって前記鋳型ゲルファイバーを除去して、束状構造を有するゲルファイバー集合体を得る工程、を含む、該方法
に関する。
【０００８】
好ましい態様では、本発明は、
（２）前記ゲルファイバー集合体が、ハイドロゲルである、上記（１）に記載の方法、
（３）前記第１のプレゲル剤のゲル化速度が、前記第２のプレゲル剤のゲル化速度よりも速い、上記（１）又は（２）に記載の方法、
（４）前記第２のプレゲル剤が、相転移温度を有する高分子である、上記（１）乃至（３）のいずれか１に記載の方法、
（５）前記相転移温度を有する高分子が、疎水基と親水基を有する両親媒性高分子である、上記（４）に記載の方法、
（６）前記相転移温度を有する高分子が、糖鎖高分子である、上記（４）又は（５）に記載の方法、
（７）前記糖鎖高分子がヒドロキシプロピルセルロースである、上記（６）に記載の方法、
（８）前記第２の架橋剤が、ジビニルスルホン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、、エチレングルコールジメタクリレート、又はグルタルアルデヒドから選択される、上記（１）乃至（７）のいずれか１に記載の方法、
（９）前記第１のプレゲル剤が、イオン架橋によってゲル化し得る高分子である、上記（１）乃至（８）のいずれか１に記載の方法、
（１０）前記イオン架橋によってゲル化し得る高分子が、アルギン酸ナトリウム又はアルギン酸カリウムであり、及び前記第１の架橋剤が、２価以上の金属イオンの塩である、上記（９）に記載の方法、
（１１）前記ゲル除去剤が、キレート剤である、上記（１０）に記載の方法、
（１２）前記第１のプレゲル剤がアルギン酸ナトリウムであり、前記第２のプレゲル剤がヒドロキシプロピルセルロースである、上記（１）に記載の方法、
（１３）前記工程ａ）で調製される第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液が、塩基性の水溶液である、上記（１２）に記載の方法、
（１４）前記塩基性の水溶液中におけるアルギン酸ナトリウムの濃度が１．０ｗｔ％であり、及びヒドロキシプロピルセルロースの濃度が４．０ｗｔ％以上である、上記（１３）に記載の方法、
に関する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
（１５）１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーが束状となった構造を有するゲルファイバー集合体であって、相転移温度を有する高分子が互いに共有結合で架橋された構造を有する、当該ゲルファイバー集合体、
に関する。
【００１０】
当該ゲルファイバー集合体の好ましい態様として、本発明は、
（１６）前記ゲルファイバー集合体が、ハイドロゲルである、上記（１５）に記載のゲルファイバー集合体、
（１７）１００〜５００μｍの外径を有する、上記（１５）又は（１６）に記載のゲルファイバー集合体、
（１８）前記相転移温度を有する高分子が、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する高分子である、上記（１５）乃至（１７）のいずれか１に記載のゲルファイバー集合体、
（１９）前記相転移温度を有する高分子が、ヒドロキシプロピルセルロースである、上記（１８）に記載のゲルファイバー集合体、
（２０）３ｋＰａ以上のヤング率を有する、上記（１５）乃至（１９）のいずれか１に記載のゲルファイバー集合体、
（２１）５ｋＰａ以上の単位断面積あたりの破断荷重を有する、上記（１５）乃至（１９）のいずれか１に記載のゲルファイバー集合体、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、外径がマイクロサイズの束状構造を有するゲルファイバー集合体を簡素なプロセスで容易に作製することができる。また、束状の構造を有することで力学的強度に優れたゲルファイバー集合体、特にハイドロゲルファイバーの集合体を得ることが可能となる。
【００１２】
加えて、本発明は、第１及び第２のプレゲル剤の疎水性と親水性のバランスに応じて、当該プレゲル剤を含む溶液中における二成分系相分離の形態を様々なパターンとすることができるため、それに応じて、最終的に得られるゲルの形状を制御することができる。
【００１３】
さらに、本発明を用いて、生体適合性の高分子で束状ゲルファイバー集合体を構築することによって、軟骨、腱、平滑筋層などの比較的強度の高い力学的強度を有する生体組織の模倣への応用、或いは、刺激応答性の高分子でゲルファイバー集合体を構築することによって、外部刺激に応答して性質が変化するマイクロアクチュエーターの形成などへの応用が可能である。また、セルロース誘導体等でゲルを構築した場合には、セルラーゼ等の酵素で容易に分解することができるため、本発明のゲルファイバー集合体を鋳型として、更なる化学架橋ゲルを形成し、形成後に分解除去することによってマイクロ細孔を有するゲルを得ることできる。従って、神経や血管等の細胞足場材料、及びドラッグデリバリーシステムへの応用も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明による束状ゲルファイバー集合体の作製工程を示す模式図である。
【図２】図２は、下限臨界溶液温度を有する高分子における状態変化を説明するものである。
【図３】図３は、代表的な同軸フロー型マイクロ流路デバイスの構造及び流路内の流れを説明する図である。
【図４】図４は、Ｎａ−Ａｌｇ存在下及び非存在下における、ＨＰＣ溶液の光学密度（Ｏ．Ｄ．）のｐＨ依存性及びＨＰＣ濃度依存性を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｎａ−Ａｌｇの存在下、種々のＨＰＣ濃度における光学密度（Ｏ．Ｄ．）の温度依存性を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例で用いた同軸フロー型のマイクロ流路デバイスの図である。
【図７】図７は、本発明の実施例における工程を示すフロー図である。
【図８】図８は、種々のＨＰＣ濃度条件において得られたアルギン酸ゲル及びゲルファイバー複合体の光学顕微鏡画像である。
【図９】図９は、本発明の束状のゲルファイバー集合体を示す光学顕微鏡画像である。
【図１０】図１０は、本発明の束状のゲルファイバー集合体について、引張試験によって得られたヤング率及び単位断面積あたりの破断荷重を示すグラフである。ここで、「ＢＦ」は本発明の束状ゲルファイバー集合体、「ＮＦ」はシリコーンチューブ内で形成したＨＰＣのみから構成される比較例の非束状ゲルである。
【図１１】図１１は、本発明の束状のゲルファイバー集合体による細胞の接着状況を示す倒立顕微鏡画像である。ここで、「ＢＦ」は本発明の束状ゲルファイバー集合体、「ＮＦ」はシリコーンチューブ内で形成したＨＰＣのみから構成される比較例の非束状ゲルである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１６】
図１は、本発明の代表的な態様によって束状構造のゲルファイバー集合体製造工程の概略を示すものである。第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液（プレゲル溶液）を調製し、これをマイクロ流路に射出する（図１ａ）。当該マイクロ流路が反応場となる。ここで、当該プレゲル溶液中において、第２のプレゲル剤（図では、ＨＰＣで示されている）は、図１ａに示されるように相転移により溶液中で凝集した状態となっている。まず、短時間でゲル化可能な第１のプレゲル剤に第１の架橋剤を注入し、流路の流れによって発生するシェアストレスによって糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成させる。（図１ｂ）ここで、溶液中で相分離して凝集していた第２のプレゲル剤は、シェアストレスによって鋳型ゲルファイバーの骨格内の空間に取り込まれ、鋳型ゲルファイバーの骨格内部の束状に伸長した空間内に保持される。
【００１７】
次に、第２のプレゲル剤が鋳型ゲルファイバーの骨格内に保持された状態で第２の架橋剤を添加し、第２のプレゲル剤を鋳型ゲルファイバー内部において架橋させて、ゲル化させる（図１ｃ）。当該第２の架橋剤は、上記第１の架橋剤と同様に、マイクロ流路中に添加されてもよいし、或いは、第２のプレゲル剤が鋳型ゲルファイバーの骨格内部に取り込まれた後であれば、マイクロ流路から流出した溶液を別の容器等に捕集し、当該容器中に添加することもできる。これによって、異なる２種類のゲルファイバーから構成される複合体が得られる。当該複合体は、図１に示すように、第２のプレゲル剤が架橋して形成されたゲルを鋳型ゲルファイバーが被覆する構造となっている。
【００１８】
その後、ゲル除去剤を添加して、鋳型ゲルファイバーを除去することによって、マイクロオーダーの外径を有する本発明の束状構造のゲルファイバー集合体が得られる（図１ｄ）。図１中では、３本のゲルファイバーが束になった構造が例示されているが、言うまでもなく、実際にはより多くの本数のゲルファイバーによって束が形成される。
【００１９】
（１）第１のプレゲル剤及び第１の架橋剤
本発明において用いられる第１のプレゲル剤は、ゲル化して鋳型ゲルファイバーを形成するものである。第１のプレゲル剤は、マイクロ流路の流れによって発生するシェアストレスによって、流路の流れ方向に配向して糸状に伸長した形状を有するゲルを形成し得るものであれば、人工物及び天然物のいずれであっても良く、親水性高分子、糖鎖高分子、多糖類などを含む当該技術分野において公知のプレゲル剤を用いることができる。しかしながら、マイクロ流路中でゲル化し得るためには、架橋剤の添加によって短時間で、好ましくは瞬時にゲル化し得るものであることが望ましい。好ましくは、第１のプレゲル剤は、イオン架橋によってゲル化し得る高分子であり、そのような高分子としては、例えば、２価の金属イオンの添加によって瞬時にゲル化する性質を有する、アルギン酸ナトリウムやアルギン酸カリウム等のアルギン酸塩が挙げられる。これらのなかでも、アルギン酸ナトリウムが好ましい。
【００２０】
第１のプレゲル剤をゲル化するための第１の架橋剤は、上記第１のプレゲル剤の種類に応じて当業者であれば適宜選択することができるであろう。例えば、第１のプレゲル剤がアルギン酸塩である場合には、第１の架橋剤は、２価以上の金属イオンの塩であることができ、好ましくは、カルシウム塩又はマグネシウム塩であり、より好ましくは、塩化カルシウムである。
【００２１】
また、ゲルファイバー複合体が得られた後、最終段階において、第１のプレゲル剤による鋳型ゲルファイバーを除去するために用いられるゲル除去剤は、第２のプレゲル剤によって形成された束状ゲルファイバーには影響を与えることなく、鋳型ゲルファイバーのゲル化のみを解消できるものであれば、特に限定されない。例えば、鋳型ゲルファイバーがアルギン酸ゲルである場合（すなわち、第１のプレゲル剤がアルギン酸塩である場合）、第１のプレゲル剤の分子間を架橋させているカルシウムイオン（Ｃａ２＋）等を除去できるものであればよい。そのようなゲル除去剤の例としては、クエン酸ナトリウム、或いは、ＥＤＴＡ等の任意のキレート剤が挙げられる。好ましくは、クエン酸ナトリウムである。
【００２２】
（２）第２のプレゲル剤及び第２の架橋剤
本発明において用いられる第２のプレゲル剤は、ゲル化して、最終的に束状構造のゲルファイバー集合体を構成することとなる個々のゲルファイバーとなるものである。また、第２のプレゲル剤は、ハイドロゲルを形成し得ることが好ましく、特に、細胞培養用足場などに用いる場合は生分解性であることが好ましい。
【００２３】
別の側面において、本発明において用いられる第２のプレゲル剤は、上記のようにマイクロ流路に射出されるプレゲル溶液中において、相転移により凝集した状態であることが必要である。これは、第２のプレゲル剤が、マイクロ流路のシェアストレスによって、鋳型ゲルファイバーの骨格内の空間に取り込ませることによって、そのゲル化の前に鋳型ゲルファイバーと同様に糸状に伸長した複数のパターンの形状に保持させるためである。
【００２４】
従って、第２のプレゲル剤は、プレゲル溶液中で相分離し得るもので化合物であることが望ましい。そのような化合物であれば、人工物及び天然物のいずれであっても良く、疎水基と親水基を有する両親媒性高分子、糖鎖高分子、多糖類などを含む当該技術分野において公知のプレゲル剤を用いることができる。好ましくは、相転移温度を有する化合物であり、特に、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）又は上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有する高分子（天然物及び合成高分子のいずれも含まれる）であることが好ましい。ここで、「下限臨界溶液温度を有する高分子」は、図２に示すように、可逆的にある温度以上において分子内で収縮して或いは分子間で凝集して水等の溶媒に不溶化するが、当該温度以下では当該溶媒に可溶化する性質を有する。好ましくは、第２のプレゲル剤は、セルロース誘導体、ペクチン、又はポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であり、より好ましくは、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）である。ヒドロキシプロピルセルロースは、水中で約４５℃の下限臨界溶液温度を有する。
【００２５】
また、第２のプレゲル剤をゲル化するための第２の架橋剤は、上記第２のプレゲル剤の種類に応じて当業者であれば適宜選択することができるであろう。第２の架橋剤は、共有結合によって第２のプレゲル剤の分子間を架橋するものであることが好ましく、水溶性であることが好ましい。そのような水溶性の架橋剤例としては、ジビニルスルホン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、又はグルタルアルデヒドが挙げられ、好ましくはジビニルスルホンである。さらに、カップリングのためのスペーサーおよび反応性基を両端に含有する二官能性架橋剤を使用してもよい。適切な二官能性架橋剤は当該技術分野で広く知られており、１,６−ジアミノヘキサンなどのジアミン、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド、エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ジスクシンイミジルグルタラート、ジスクシンイミジルスベラート、およびエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシナート）などのビスＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのジイソシアネート、１,４ブタンジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシラン、及び、スクシニルジサリチレートなどのジカルボン酸などが挙げられるが、これに限定されるものではない。各末端に異なる反応性基を含有するヘテロ二官能性架橋剤もまた使用することができる。ヘテロ二官能性架橋剤の非限定的な例としては、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが挙げられる。これらの試薬のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、アミンまたはアルコール基と反応するのに対し、マレイミド基はチオール基と反応する。なお、これら架橋剤を用いて、共有結合によって第２のプレゲル剤をゲル化させる手法以外にも、光重合や電子線架橋など、当該技術分野において周知の架橋手法を用いて第２のプレゲル剤をゲル化させてもよい。
【００２６】
第１のプレゲル剤と第２のプレゲル剤の好ましい組み合わせは、アルギン酸ナトリウムとヒドロキシプロピルセルロースである。
【００２７】
（３）プレゲル溶液
上記のように、マイクロ流路の内流として射出される溶液（プレゲル溶液）は、第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液である。プレゲル溶液は、好ましくは水溶液であるが、水と混じりあう性質を有する水性有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルホルムアミド、又はジメチルスルホキシドなどを含むこともできる。溶媒の組成は、用いる第１及び第２のプレゲル剤の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００２８】
また、プレゲル溶液において、第１のプレゲル剤は溶液中に溶解した状態であり、第２のプレゲル剤は溶液中に凝集した状態で存在する。従って、プレゲル溶液は、第２のプレゲル剤が、相分離により凝集した状態となるような条件、例えば、温度、ｐＨ、各プレゲル剤の濃度、塩濃度、溶媒組成等について適宜設定することができる。
【００２９】
例えば、第１のプレゲル剤と第２のプレゲル剤が、アルギン酸ナトリウムとヒドロキシプロピルセルロースの組み合わせである場合、プレゲル溶液は、塩基性の水溶液であることが好ましく、ｐＨ１３の水溶液であることがより好ましい。また、各プレゲル剤の濃度は、アルギン酸ナトリウムが１．０ｗｔ％において、ヒドロキシプロピルセルロースの濃度が４．０ｗｔ％以上であることができる。好ましくは、ヒドロキシプロピルセルロースの濃度が４．０〜１０ｗｔ％、より好ましくは、４．０〜７．０ｗｔ％である。
【００３０】
（４）マイクロ流路デバイス
本発明において用いられるマイクロ流路デバイスは、特に限定されず、当該技術分野において公知のものを用いることができるが、流路中で２層の流体流れを形成し得る同軸フロー型のマイクロ流路デバイスが好ましい。同軸フロー型マイクロ流路デバイスの構造は、例えば、Ｋｉｒｉｙａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１２，５１，１５５３−１５５７等で具体的に説明されている。かかるマイクロ流路デバイスによれば、図３に示すように、２つの成分の異なる流体を同軸となるように内流及び外流に分けて射出することができる。マイクロ流路デバイスの内径は、１００〜１０００μｍの範囲であることが好ましい。
【００３１】
このような構造のマイクロ流路デバイスを用いることにより、例えば、内流に第１のプレゲル剤を含むプレゲル溶液、及び外流に第１の架橋剤を用い、その内流と外流の流量比を適宜調製することによって、これらの混合により流路中で形成される鋳型ゲルファイバーの直径の大きさを制御することが可能となる。
【００３２】
マイクロ流路内の流速は、第１のプレゲル剤を糸状に伸長した形状の鋳型ゲルファイバーとするため、及び溶液中で凝集している第２のプレゲル剤を鋳型ゲルファイバー骨格内部に取り込ませるために十分なシェアストレスが流路内を生じさせるように、適宜選択されるべきものである。代表的な例として、第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含むプレゲル溶液の射出速度（内流）は、１００〜５００μＬ／分の流速であることができ、また、第１の架橋剤を含む溶液（外流）は、１〜１０ｍｌ／分であることができるが、当該内流と外流は任意の比率とすることができる。また、上記のように、これらの流速の比によって、鋳型ゲルファイバーの直径を制御することができ、結果として、最終的に得られる束状ゲルファイバー集合体の本数や外径を制御することができる。
【００３３】
（５）束状構造ゲルファイバー
本発明のゲルファイバー集合体は、１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーが束状となった構造を有することを特徴とする。上記のように、好ましくは、ゲルファイバー集合体はハイドロゲルで構成される。「束状となった構造」とは、整列した２以上のゲルファイバーを含む集合体を形成していることを意味する。「整列した」という用語は、複数のゲルファイバーが全体として概ね平行関係を維持していることが好ましいが、２以上のゲルファイバーにおいて部分的に平行関係が失われている場合や、複数のゲルファイバーの一部又は全体がねじれて重なり合う場合なども含まれると解釈されるべきである。
【００３４】
束状の集合体に含まれるゲルファイバーの数は２以上であれば特に限定されないが、一般的には５以上、好ましくは１０以上、さらに好ましくは２０以上である。上限も特に限定されないが、好ましくは１００００以下、より好ましくは１００以下、さらに好ましくは５０以下である。   
【００３５】
ゲルファイバー集合体を形成する各ゲルファイバーの外径は特に限定されないが、一般的には１０〜５０００ｎｍ程度であり、概ね同一の外径を有するが、それぞれ異なった外径を有していてもよい。各ゲルファイバーの断面は概ね円形であるが、用いるプレゲル剤の種類などに応じて円形以外の断面を与える場合もある。複数のゲルファイバーは一般的には概ね同一の外径を有するが、それぞれ異なった外径を有していてもよい。
【００３６】
束状ゲルファイバー集合体の断面形状としては、円形、楕円系、又は四角形や五角形などの多角形など多様な形状であってもよいが、断面形状としては円形が好ましい。束状ゲルファイバー集合体の外径も特に限定されず、ファイバーの本数に応じて適宜選択することができ、例えば１００ｎｍ〜５００μｍであることができるが、外径は用途によって適宜選択可能である。当該外径は、マイクロ流路の流速によって鋳型ゲルファイバーの直径を制御することによって、選択することができる。当該束状のゲルファイバー集合体の長さは特に限定されないが、数百マイクロメートル以上、好ましくは数ミリメートル以上であり、数センチメートル程度の長さを有する場合もある。
【００３７】
本発明の束状ゲルファイバー集合体は、優れた力学的強度を有し、例えば、３ｋＰａ以上、好ましくは４ｋＰａ以上のヤング率を有する。また、５ｋＰａ以上、好ましくは１０ｋＰａ以上の単位断面積あたりの破断荷重を有する。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００３９】
１．プレゲル溶液の調製
第１のプレゲル剤としてアルギン酸ナトリウム（Ｎａ−Ａｌｇ）、第２のプレゲル剤としてヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を用いて、マイクロ流路の内流として射出するプレゲル溶液の調製を行った。
【００４０】
まず、当該プレゲル溶液の調製にあたり、第２のプレゲル剤であるＨＰＣが凝集状態となる条件の検討を行った。図４に示すように、ＨＰＣは、Ｎａ−Ａｌｇの非存在下ではいずれのｐＨでも白濁しないが、１ｗｔ％のＮａ−Ａｌｇの存在下では、ＨＰＣが３ｗｔ％以上かつｐＨが１３では溶液が白濁し、すなわちＨＰＣが凝集体を形成することが確認された。また、Ｎａ−Ａｌｇの存在下、種々のＨＰＣ濃度における白濁の温度依存性を図５に示す。ｐＨ７の条件ではＨＰＣ濃度にかかわらず室温では白濁を示さないが、ｐＨ１３の条件では白濁を示した。この結果は、Ｎａ−Ａｌｇの存在下のｐＨ１３以上のアルカリ溶液とすることによって、ＨＰＣのＬＣＳＴが室温以下に制御できることを示すものであり、このことから上記のＨＰＣ凝集体の形成が理由付けられる。
【００４１】
２．束状構造を有するゲルファイバー集合体の作製
図６に示す同軸フロー型のマイクロ流路デバイスを用いて、上記のように調製したＮａ−Ａｌｇ及びＨＰＣを含むプレゲル溶液を内流として射出し、ＨＰＣゲルファイバー集合体を作製した。プレゲル溶液は，所定量の蒸留水中にＮａ−Ａｌｇが１．０ｗｔ％でかつＨＰＣが２．０〜７．０ｗｔ％となるように溶解後、ＮａＯＨによってｐＨを１３以上としたものを用いた。Ｎａ−Ａｌｇをイオン架橋によってゲル化するための架橋剤として、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を用いた。また、ＨＰＣを共有結合によって架橋しゲル化させるための架橋剤として、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）水溶液を用いた。また、アルギン酸ゲルを除去するための除去剤として、クエン酸ナトリウム水溶液を用いた。
【００４２】
具体的な操作手順としては、図７に示すように、マイクロ流路中にプレゲル溶液を内流として射出し（流速：３００μＬ／分）、次いで、外流としてＣａＣｌ２水溶液を注入し（流速：２．５ｍＬ／分）、鋳型となるアルギン酸ゲルのゲルファイバーを形成させた。マイクロ流路から流出したゲルファイバーを容器に捕集し、ＤＶＳ水溶液を添加してＨＰＣをゲル化した。これにより、アルギン酸ゲルの骨格内部にＨＰＣがゲル化したゲルファイバー複合体を得た。
【００４３】
プレゲル中のＨＰＣ濃度が２．０、３．０、４．０、５．０、及び７．０ｗｔ％の各条件において、得られたアルギン酸ゲル及びゲルファイバー複合体の光学顕微鏡画像を図８に示す。これによれば、ＨＰＣ濃度が４．０ｗｔ％以上において、ＨＰＣがアルギン酸ゲルの骨格内部に繊維状の形状に保持された状態でゲル化されていることが分かった。複合体の直径は、いずれも４００μｍ程度であった。
【００４４】
得られた複合体にクエン酸ナトリウム水溶液を添加し、鋳型のアルギン酸ゲルを分解除去した結果、４．０ｗｔ％以上のＨＰＣ濃度においてＨＰＣを主骨格とする束状のゲルファイバー集合体が得られることが確認された。ＨＰＣ濃度が、２．０ｗｔ％と７．０ｗｔ％の光学顕微鏡像を図９に示す。７．０ｗｔ％ではきれいな束状の形成が確認できるのに対し、２．０ｗｔ％ではそのような構造は認識されなかった。
【００４５】
３．ゲルファイバー集合体の力学的特性の評価
本発明の束状ゲルファイバー集合体の力学的特性を評価するため、水中における引張試験を行った。具体的には，最終濃度で１％のＡｌｇと７％のＨＰＣよりなる混合水溶液から調製した本発明の束状ゲルファイバー集合体（ＢＦ）、及びシリコーンチューブ内（７％ＨＰＣ水溶液）で形成したＨＰＣのみから構成される比較例の非束状ゲルを水中にて垂直方向に引き上げることで各ゲルが持つヤング率、破断強度を算出した。ファイバーの断面積は、ＮＦでは調製の際に用いたシリコンチューブの内径（５００μｍ）を、ＢＦでは使用したマイクロ流路デバイスから作成される典型的なファイバーの直径（４００μｍ）を用いた。
結果を図１０に示す。
【００４６】
図１０に示すように、本発明のＢＦは、比較例ＮＦの約２倍のヤング率を有し、ＮＦよりも著しく大きい単位断面積あたりの破断荷重を有することが明らかとなった。また、ＢＦは、破断までに初期値の３〜５倍程度の伸びを示し（ＮＦは１．５倍程度）、かつ段階的に破断することが観測された。これらの結果は、本発明の束状ゲルファイバー集合体は、非束状のＨＰＣゲルに比して、伸びやすく、かつ切れ難いという優れた力学的特性を有することを示すものである。
【００４７】
４．ゲルファイバー集合体における細胞接着評価
本発明の束状構造を有するゲルファイバー集合体の細胞培養の足場材料への適性を評価した。具体的には，ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を本発明の束状ゲルファイバー集合体（ＢＦ）及びシリコーンチューブ内で形成したＨＰＣのみから構成される比較例の非束状ゲル（ＮＦ）へそれぞれ播種し、培養２時間後及び４８時間後の細胞の接着状況を観察した。
【００４８】
材料は、
・ヒト臍帯静脈由来内皮細胞，ＥＧＭ２培地
・リピジュア（細胞非接着性ポリマー）
・３５ｍｍ  ペトリディッシュ
・Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ，Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（核染色）
を用いた。実験手順は、以下のとおりである。
1）  リピジュア（10 w/v% in ethanol）を３５ｍｍペトリディッシュに上に５０μＬ滴下し、クリーンベンチ内で風乾させた。
２）  １にＥＧＭ−２を加えＢＦ及びＮＦファイバーを入れた。
３）  ２に細胞を最終濃度１０００００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２となるように加えた。
４）  シェーカー上でゆっくりと振とうさせながら培養を行った。
５）  倒立顕微鏡を用いて、２時間後、４８時間後の細胞を観察した。４８時間後については，核をＨｏｅｃｓｈｔ３３３４２及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬で染色し、細胞の生死と接着形態を評価した。
【００４９】
結果を図１１に示す。培養２時間後、ＨＵＶＥＣｓはＢＦ上へ接着性（丸い形態）を示した。４８時間後、接着細胞は減少し、形態は丸い状態で伸展細胞はみられなかった。一方で，ＮＦにおいては，培養４８時間後も細胞接着は観察されなかった。以上より，ＢＦは細胞接着性を示したことから細胞足場へ応用可能であることが明らかとなった。
【００５０】
以上の実施例の結果は、同軸フロー型のマイクロ流路デバイスにおいて、流路中の動的流れによるシェアストレスを利用することにより、まず鋳型となるゲルファイバーを形成させたうえ、その骨格中に更なるゲルファイバーを形成させるという２−Ｓｔｅｐのゲル化法を用いて、異なる２種のゲルファイバーによって構成される複合体が得られること、そして、当該複合体から鋳型ゲルファイバーを除去することにより、複数のゲルファイバーが束状に集まった新規ゲルファイバー集合体が得られることを実証するものである。また、かかるゲルファイバー集合体が、鋳型ゲルを用いずに作成した非束状のゲルに対して、優れた力学的強度を有し、細胞培養のための足場材料として有用であることを示すものである。従って、本発明のゲルファイバー集合体は、ドラッグデリバリーシステム等の生体材料、或いは刺激応答性のマイクロアクチュエーターへの応用も期待できる。
【００５１】
以上、本発明の具体的態様を詳細に説明したが、これらは例示に過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。また、特許請求の範囲に記載の発明には、以上の例示した具体的態様を種々変更したものが含まれ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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