(57)【要約】【課題】  一般のリポソームの製造時、高温でリポソームが形成され、熱に弱い有効成分が不安定化または破壊することとは異なり、低温工程リポソームは、常温及び低温でリポソームが形成され、有効成分の活性を維持することができ、皮膚美白及び皮膚しわの改善効果が極めて優れた化粧料を提供することにある。【解決手段】  本発明による低温工程リポソームを含有する化粧料は、レシチンと水を、超臨界二酸化炭素を用いて逆ミセルエマルションを形成させてから、超臨界二酸化炭素を減圧気化させてリポソーム懸濁液を誘導し、低温工程リポソームにヒト由来幹細胞培養液抽出物を含有させて製造される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
常温で、レシチンを、ヒト由来幹細胞培養液抽出物が含まれた水相に分散させた分散液の製造段階と、
前記分散液を、超臨界二酸化炭素を用いて逆ミセルエマルションを形成する段階と、
前記逆ミセルエマルションに超臨界二酸化炭素を減圧気化させ、超臨界二酸化炭素相を除去して製造されるリポソーム懸濁液の製造段階とにより、ヒト由来幹細胞培養液抽出物を包接させたリポソームの製造方法。
【請求項２】
ヒト由来幹細胞は、脂肪を起源とする幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載のヒト由来幹細胞培養液抽出物を包接させたリポソームの製造方法。
【請求項３】
常温で、レシチンを、ヒト由来幹細胞培養液抽出物が含まれた水相に分散させた分散液を製造し、前記分散液を、超臨界二酸化炭素を用いて形成させた逆ミセルエマルションに、超臨界二酸化炭素を減圧気化させ、超臨界二酸化炭素相を除去して製造されるヒト由来幹細胞培養液抽出物を包接させたリポソームを含有することを特徴とする化粧料。
【請求項４】
前記化粧料は、皮膚美白効果を有するものであることを特徴とする請求項３に記載の化粧料。
【請求項５】
前記化粧料は、皮膚しわの改善効果を有するものであることを特徴とする請求項３に記載の化粧料。
【請求項６】
前記化粧料は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、アイクリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パウダー、エッセンス、パックの中から選ばれる剤形で製造されることを特徴とする請求項３に記載の化粧料。
【請求項７】
ヒト由来幹細胞培養液抽出物を、常温で、レシチンと一緒に水相に分散させ、これを、超臨界二酸化炭素を用いて逆ミセルエマルションを形成させてから、超臨界二酸化炭素を減圧気化させ、超臨界二酸化炭素相を除去し、ヒト由来幹細胞培養液抽出物を包接させたリポソームを製造することを特徴とするヒト由来幹細胞培養液抽出物の安定化方法。
【請求項８】
ヒト由来幹細胞は、脂肪を起源とする幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載のヒト由来幹細胞培養液抽出物の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来幹細胞培養液抽出物を包接させたリポソームを含有する化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、紫外線、乾燥した冷暖房環境及び大気汚染等のような外部刺激から人体を保護し、体温調節、呼吸及び排泄作用等の様々な役割を行う重要な機能を担当している。
【０００３】
年を取るにつれて、このような機能は次第に弱化し、皮膚の老化が進行する。特に、皮膚障壁の機能を行う脂質層の脂質組成と含量が変化するとともに、その機能が急に低下し、皮膚水分含量が減少すると、皮膚が乾燥し、染み、そばかす、色素沈着、及び様々な皮膚病変が引き起こされる。また、外部からの強い紫外線、ストレス、及び栄養欠乏等のような刺激を受けると、皮膚は、しわ発生、弾力損失、及び角化等のような皮膚の老化がさらに加速化する。
【０００４】
人体の皮膚は、表皮と真皮に分けられ、表皮の最下にある基底層において新たに形成された角質形成細胞は、下層から上層に徐々に移動しながら、約１４日後、角質に変わり、さらに約１４日後は、完全に老化して外皮や垢が剥がれ落ちることになる。基底層と連結されている真皮は、表皮に水分を供給し、皮膚の弾力を維持する役割をする。
【０００５】
一般に、皮膚弾力減少、皮膚しわ等の皮膚老化現象は、コラーゲンの破壊、コラーゲン合成の減少、エラスチンの消失等により示され、皮膚の表皮でも生じるが、これよりは、真皮において生じる現象と認められる。
【０００６】
最近、皮膚のしわ生成の原因及び改善方法についての皮膚生理学的な研究が多く行われており、実際、化粧料において皮膚しわの防止のために、紫外線遮断剤、抗酸化剤、細胞活性促進剤等が用いられており、さらに、コラーゲン合成による皮膚しわの改善方法が提示されている。
【０００７】
一方、生化学及び分子生物学の発展につれて、ヒトの生体内に存在する成長因子のような少量の信号物質等が見出され、これに基づく生体の老化理論が再正立されている。また、この信号物質は、年を取るにつれて、生体内において減少するが、この成長因子の減少がヒトの老化と密接な関係があることが明らかになっている。このような成長因子は、各組織の基底に存在する幹細胞から多量生産されている。
【０００８】
人体は、約２１０個の細胞で構成されており、それぞれの細胞は、固有の特性を有しながら、生命活動を担当している。全ての生命体が生命を持っているように、人体のそれぞれの細胞は、寿命があり、絶えず死んで、失われた細胞の代わりに新たな細胞で満たされるようになる。このような過程を可能にすることが幹細胞である。
【０００９】
幹細胞は、組織や器官の分化した細胞間に存在する未分化細胞であって、絶えず自らが増殖する自己再生能力と、身体内のあらゆる種類の組織細胞に分化できる能力を有した万能細胞である。
【００１０】
成体幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経芽細胞、上皮細胞等があるが、造血幹細胞の場合、血球及びリンパ球を生産可能な母細胞として、血液がんを含めた免疫系疾患の治療に役立ち、間葉系幹細胞の場合、骨、軟骨、脂肪及び繊維組織に分化し、各組織が損傷したとき、これらの回復に関与する。
【００１１】
しかしながら、このような成体幹細胞は、それぞれの組織に少量存在し、数年間分裂または増殖を行わず、静かに過ごすこともある。すなわち、幹細胞とは、このような分化能力を有しているが、未だ分化されていない「未分化」細胞である。このような未分化状態において、適切な条件を合わせると、幹細胞は、多様な組織細胞に分化することができる。
【００１２】
幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞に大別される。幹細胞は、出生後から人体にある多種の組織に存在する成体幹細胞と、人間生命の始めとなる受精卵に由来する胚性幹細胞の二種類に分けられる。成体幹細胞は、特定な組織を構成する細胞に、すなわち、骨髄細胞は血球細胞に、皮膚幹細胞は皮膚に、神経幹細胞は神経細胞にのみ分化するように、運命が決まっている細胞である。幹細胞がどのような細胞に分化するかは、その幹細胞をどのような環境で培養するかに左右される。
【００１３】
ヒト由来幹細胞は、胚性幹細胞を除いた成体から得られる幹細胞を意味し、例えば、脂肪、骨髄、臍帯血、及び末梢血液を含めた血液及び組織の基底を起源とするあらゆる幹細胞を含む。特に、ヒト由来脂肪幹細胞培養液抽出物は、脂肪組織から脂肪を除去した細胞を幾世代にわたって培養し、幹細胞を分離した後、幹細胞培養液から幹細胞が作り出したタンパク質が得られる。
【００１４】
このタンパク質混合物には、ｖＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、ＴＧＦ（形質転換成長因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）等の約１５０個の成長因子のタンパク質成分が含まれているものと報告されている。
【００１５】
脂肪幹細胞は、成体幹細胞の一種であり、骨髄幹細胞や臍帯血幹細胞よりも採取しやすく、大量培養が可能であるとともに、幹細胞の含有量が多いため、脂肪幹細胞が最も多く活用されている。
【００１６】
一つの細胞が増殖し、他の種類に分化するにあたって、最も重要な役割をすることが成長因子である。この成長因子は、細胞が増殖または分化を引き起こす信号を、細胞の内外部に伝達する役割をし、このような信号に基づいて細胞が分裂、分化することにより、皮膚を、生き生きとさせ、いつも新鮮かつ最高のコンディションとして維持させることができる。
【００１７】
幹細胞から作り出されたタンパク質を皮膚の線維芽細胞に処理すると、線維芽細胞から生成する結合組織であるコラーゲンの量が５倍以上増加しており、線維芽細胞自体の増殖も３０％以上増加した。線維芽細胞は、皮膚の真皮層を形成するコラーゲンを生産する細胞であり、コラーゲンの量が少なくなると、皮膚弾力が低減し、しわが増えるという特徴を有している。
【００１８】
幹細胞は、多分化能を有する細胞であって、インビトロだけでなくインビボの条件で、骨、軟骨、靭帯、脂肪、心筋、筋肉等の細胞への分化能力を有している多分化能細胞である。このような多分化能細胞である幹細胞は、各組織細胞への分化機序の研究において、好適なモデルとして用いられるのみならず、現在、多様な細胞治療法の開発に用いられている。
【００１９】
細胞治療の対象細胞としての応用的側面からみて、間葉系幹細胞は、細胞の採取が相対的に容易であり、安全であり、自家移植が可能であることから、胚性幹細胞に比べて多くの長所を有している。
【００２０】
上述した長所により、幹細胞を用いた心筋梗塞、骨折、軟骨損傷、脳卒中等の様々な疾病の治療法が研究されている。しかしながら、幹細胞は胚性幹細胞とは異なり、成体外における培養の際に活用可能な幹細胞は、その寿命が極めて短く、分化能も短期間だけ保有される。このような幹細胞の制限された寿命は、該当細胞の活用において大きな制約となっている。
【００２１】
化粧品分野における幹細胞の利用は、その代謝産物としての成長因子を用いることである。成長因子は、細胞の表面にある受容体と結合して、細胞の増殖と分化を刺激する作用をするタンパク質である。成長因子の機能は、極めて多様であり、様々な細胞への分裂を刺激する作用をするのに対して、ある場合は、特異な細胞型にのみ作用することもある。成長因子は、細胞増殖の刺激のための必須成分として、細胞分化、移住、増殖過程を調節することが明らかになった。特異的受容体に成長因子が結合すると、信号伝達鎖を活性化し、細胞の外部から内部核へ信号が伝達される。信号伝達が継続すると、多量の他の伝達子と一緒に作用し、最終的に新たなタンパク質が合成される。したがって、成長因子は、細胞間相互作用の伝達、機能制御における重要な信号伝達ネットワークを形成するようになる。
【００２２】
また、マウスを対象とした皮膚傷の再生実験結果においても、幹細胞由来タンパク質を適用したときは、適用していない場合よりも、傷のサイズが４０％以上減少することが確認された。また、色素沈着のある人を対象とした美白効果においても、良好な結果を示し、化粧品原料として強い効能効果及び安全性を確保している。
【００２３】
したがって、神経細胞に分化する環境となると、神経細胞となり、皮膚細胞に分化する環境となると、皮膚細胞となり得るものである。このような特性を用いて、化粧品組成物に幹細胞培養抽出物を応用するための研究が進行している。
【００２４】
大韓民国特許出願第２００５‐５５０１７号には、同種由来及び／または自己由来脂肪細胞、同種由来及び／または自己由来脂肪細胞から分離した幹細胞またはこれらから分離した線維芽細胞成長因子を含有するしわ改善及び／または老化防止用の化粧料組成物が公知され、大韓民国特許登録第８４８０５６号発明には、幹細胞培養液またはその培養液から分離したタンパク質を含む美白用化粧料組成物が公知され、大韓民国特許出願第２００７‐１５２１１号には、ヒト脂肪幹細胞を、抗酸化剤、ビタミン、アミノ酸、及び無機質が含まれた無血清培地において１日以上培養し、得られた条件培地を含有し、組織再生用のヒト幹細胞含有注射剤に用いられる注射剤用添加剤が公知されている。
【００２５】
また、大韓民国特許登録第８９９３２９号には、個体から分離したヒトの骨髄、臍帯血、または胎盤組織から間葉系幹細胞を得る段階と、前記幹細胞を血清培地で培養後、無血清培地において継代培養する段階と、培養した幹細胞に低酸素培養の物理的刺激を加える段階と、を含む間葉系幹細胞から塩基性線維芽細胞成長因子またはヒト形質転換成長因子‐ベータを大量生産する方法が公知されている。
【００２６】
一方、リポソームが有効成分の皮膚浸透を容易にするので、化粧料組成物に多く用いられているが、リポソームの製造過程において、６０℃以上の熱が発生する高圧流動化装置を使用しなければならない。
【００２７】
そのため、ヒト由来幹細胞培養液抽出物をリポソーム化し、化粧料として用いる場合は、有効成分の皮膚浸透を容易にすることができるが、有効成分のタンパク質である成長因子のような様々な生理活性物質の熱による安定性に問題点が発生する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、ヒト由来幹細胞培養液抽出物の熱安定性を維持してリポソーム化することができる方法を提供することにある。
【００２９】
また、本発明の他の目的は、前記ヒト由来幹細胞培養液抽出物のリポソームを含有する化粧料組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
上述した目的を達成するために、本発明は、ヒト由来幹細胞培養液抽出物を低温工程で包接させることにより、熱安定性を維持してリポソーム化することができる方法を提供する。
【００３１】
本発明において、ヒト由来幹細胞は、胚性幹細胞を除いた成体から得られる幹細胞を意味し、例えば、脂肪、骨髄、臍帯血、及び末梢血液を含む血液及び組織の基底を起源とするあらゆる幹細胞を含み、これに制限されるものではない。
【００３２】
ヒト由来幹細胞の培養液抽出物は、主に細胞の成長を調節するペプチドとタンパク質であり、例えば、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、Ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＫＧＦ（角質細胞成長因子）、ＴＧＦ−β１（形質転換成長因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、コラーゲン、フィブロネクチン、ＳＯＤ（抗酸化酵素）等が含まれる。
【００３３】
前記ヒト由来幹細胞の培養液抽出物については、皮膚構成細胞である線維芽細胞の移動促進、活性化効果、皮膚再生及び抗老化効果、コラーゲン合成の増加、チロシナーゼの活性抑制効果、メラニン合成の抑制、毛髪成長及び収縮した毛包の復元効果が知られている。
【００３４】
本発明は、熱に不安定な有効成分であるヒト由来幹細胞の培養液抽出物を安定化させ、経皮吸収を容易にするために、低温工程で処理し、リポソームに包接して化粧料に含有させることを特徴とする。
【００３５】
本発明のリポソームは、レシチンと水相成分のみからなり、低温工程で処理して、リポソームにヒト由来幹細胞の培養液抽出物を包接させたものである。
【００３６】
本発明において、ヒト由来幹細胞の培養液抽出物を包接させたリポソームは、常温において、レシチンをヒト由来幹細胞の培養液抽出物が含まれた水相に分散させた後、超臨界二酸化炭素を用いて逆ミセルエマルション（水相／低温工程二酸化炭素）を形成させ、反応を中止し、超臨界二酸化炭素を減圧気化させると、超臨界二酸化炭素相が除去されるとともに、ヒト由来幹細胞の培養液抽出物が包接されたリポソーム（以下、これを「低温工程リポソーム」という。）懸濁液が得られる。
【００３７】
本発明による低温工程リポソームは、製造工程が４℃以下で製造されるリポソームであり、既存の高圧流動化装置を用いたリポソーム製造工程が、高温（６０℃以上）でリポソームが形成されるため、温度に敏感な成分の熱安定性を確保できないという短所を補完することができ、有効成分の封入効率が１０％以上と、既存のリポソームよりも３倍以上の封入効率が得られるだけでなく、脂溶性成分の封入効率も、既存のリポソームよりも５０％以上高めることができるという長所がある。
【００３８】
本発明において、低温工程リポソームは、通常のリポソームの形態を有するものであり、平均の小滴サイズが５０〜５００ｎｍであり、好ましくは８０〜３００ｎｍであり、最も好ましくは１００〜２００ｎｍであるナノ化したリポソームを意味する。
【００３９】
前記低温工程リポソームの平均の小滴サイズが５００ｎｍを超過すると、本発明で達成しようとする技術的効果のうち、皮膚浸透及び剤形安定性に極めて劣るようになる。
【００４０】
本発明において、ヒト由来幹細胞の培養液抽出物の含量は、低温工程リポソームの総重量に対して０．００１〜５０．０重量％であり、好ましくは、総重量に対して０．１〜１０．０重量％である。
【００４１】
低温工程リポソームを構成するレシチンの含量は、低温工程リポソームの総重量に対して０．００１〜１０．０重量％であり、好ましくは、総重量に対して０．０１〜５.０重量％である。
【００４２】
本発明による化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分として、ヒト由来幹細胞の培養液抽出物以外に、生体成分の活性を維持させる様々な成分、化粧品組成物に通常用いられる成分、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の助剤、また担体等が含まれるが、これに制限されるものではない。
【００４３】
本発明による化粧料組成物は、その剤形において、特に限定されるものではないが、例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、アイクリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォータ、パウダー、エッセンス、パック等の剤形を有してもよい。
【００４４】
また、各剤形の化粧料組成物において、皮膚改善原料として、上記したヒト由来幹細胞の培養液抽出物を含み、以外の成分を、化粧料の剤形または使用目的に応じて、当業者が困難無しに適宜選定して配合することができる。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によると、既存のリポソームの製造過程の際に発生する熱により不安定になり得る活性成分であるヒト由来幹細胞の培養液抽出物を、低温工程二酸化炭素を用いて、低温または常温におけるリポソームの製造を可能にすることにより、ヒト由来幹細胞の培養液抽出物を含有した安定した低温工程リポソームを製造することができ、熱に不安定な活性成分の活性を維持することができる。
【００４６】
したがって、本発明による低温工程リポソームに包接された脂肪幹細胞培養液抽出物を含有した化粧料組成物は、温度によるヒト由来幹細胞の培養液抽出物内の活性成分の安定性を確保することにより、既存のリポソームに包接された脂肪幹細胞培養液抽出物を含有した化粧料組成物よりも、極めて優れた皮膚しわの改善や美白効果を示し、化粧料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明による実施例１で製造されたヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を包接させた低温工程リポソームの粒子分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
〈実施例１〉
ヒト脂肪幹細胞培養液抽出物が包接された低温工程リポソームの製造
常温（１５℃）で、レシチン３％を、ヒト脂肪幹細胞培養液抽出物１０％が含まれた水相に分散させた後、超臨界二酸化炭素を用いて逆ミセルエマルション（水相／低温工程二酸化炭素）を形成させてから、反応を中止し、超臨界二酸化炭素を減圧気化させ、超臨界二酸化炭素相を除去し、ヒト脂肪幹細胞培養液抽出物が包接された低温工程リポソーム懸濁液を得た。このとき、反応工程の温度は、４℃以下で進行した。
【００４９】
〈実施例２〉
本発明による低温工程リポソームが包接された化粧料組成物の製造
前記実施例１により製造されたヒト脂肪幹細胞培養液抽出物が包接された低温工程リポソームを用いて、下記表１に記載された組成で、化粧料組成物を製造した。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
〈比較例１〉
ヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を含有するリポソームの製造
レシチン３％、プロピレングリコール１０％、エチルアルコール１０％、ミネラルオイル３％を混合した後、約６０℃まで加温して溶解してから、ヒト脂肪幹細胞培養液抽出物１０％が含まれた水相を、前記レシチンを含んでいる容器に注いで攪拌した後、高圧流動化均質機で１０００ｂａｒの圧力下に２回通過させてリポソームを得た。
【００５２】
〈比較例２〉
一般の既存のリポソームを含有する化粧料組成物の製造
前記比較例１により製造されたリポソームを用いて、下記表２に記載の組成で化粧料組成物を製造した。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
〈実験例１〉
本発明におけるリポソーム粒子の粒度分布による安定性評価
前記実施例１で得た低温工程リポソームを、１０％‐Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ Ｈｙｏｐｎｅｍｏｎｉａｅ ＯＤ４１０＝０．１緩衝溶液に適当な濃度に希釈した後、リポソーム粒子の粒度を測定した。
【００５５】
前記実施例１の粒子の粒度は、ゼータサイザーＮＳ装備を用いて、光散乱方式を分析し、その結果を図１に示した。
【００５６】
図１に示すように、本発明による実施例１の低温工程リポソームは、粒子サイズが１７８．７±２１．３ｎｍであり、粒度均質性に優れ、本発明では、低温工程により脂肪幹細胞培養液抽出物が安定して包接され、リポソームを形成させることが分かった。
【００５７】
〈実験例２〉
皮膚しわの改善効果
１．機器的評価
上記した本発明による実施例２及び比較例２により製造された化粧料組成物に対する皮膚しわの改善効果（機器的評価）を測定するために、２０歳以上の女性２０名（平均年齢２８．５歳）を、それぞれＡ、Ｂ群に分け、本発明による実施例２により製造された化粧料組成物はＡ群を対象とし、比較例２により製造された化粧料組成物はＢ群を対象として適用した。
【００５８】
Ａ、Ｂ群のそれぞれの対象において、腕の上膊の２×２ｃｍ２の面積に（２回／日、０．２ｇ／回）６週間塗布しながら、透明なシリコン材質の溶液を用いて、皮膚しわのレプリカを作って皮膚しわ測定器（ＳＫＩＮ  ＶＩＳＩＯＭＥＴＥＲ  ＳＶ４００，  Ｃ＋Ｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｇｍｂｈ．  Ｇｅｒｍａｎｙ）で皮膚しわの変化を測定した。
【００５９】
レプリカの像をＣＣＤカメラで３次元的分析し、それぞれのしわの粗さ（Ｒｍ：ｍは、１以上の整数）の和をしわの個数で割った値である、下記式１の平均しわ粗さ（Ｒｚ）でしわ改善効果を分析した。試験結果を下記表３に示す。 
【式１】
【００６０】
しわの個數
2014214094.tif 000005
【００６１】
【表３】
2014214094.tif 000006
【００６２】
表３に示すように、６週間後、本発明による実施例２は、平均しわ粗さ（Ｒｚ）は８６．４μｍ（ｐ＜０．０１）であり、比較例１は、５７．０μｍ（ｐ＜０．０１）であって、本発明による化粧料では、比較例２よりも約５１．６％のしわがさらに改善された。
【００６３】
したがって、本発明による低温工程リポソームを含有する化粧料は、しわ改善効果が極めて効果的に相乗したことが分かる。
【００６４】
２．目視評価
上記した本発明による実施例２及び比較例２により製造された化粧料組成物に対する皮膚しわの改善効果（目視評価）を測定するために、２０歳以上の女性２０名（平均年齢２８．５歳）をそれぞれＡ、Ｂ群に分け、本発明による実施例２により製造された化粧料組成物はＡ群を対象とし、比較例２により製造された化粧料組成物はＢ群を対象として適用した。
【００６５】
Ａ、Ｂ群のそれぞれの対象に対し、しわのある目元を中心として、１２週間塗布（２回／日）した後、熟練者の客観的評価と被検者の主観的評価を、以下の６級に分けて評価することにより、皮膚しわの改善程度（ΔＷ）を測定した。
【００６６】
その結果を下記の表４及び表５に示す。
〈皮膚しわ改善の評価基準〉
−３：極めて酷く悪化した。
−２：悪化した。
−１：少し悪化した。
０：変化がなかった。
１：少し改善した。
２：改善した。
３：極めて改善した。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
【表５】
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【００６９】
上記した表４及び表５に示すように、本発明による実施例２では、熟練者の客観的評価と被検者の主観的評価がそれぞれ２．５、２．４と、比較例２に比べて、熟練者の客観的評価では２５％、被検者の主観的評価では３３％増加したものと示され、本発明による低温工程リポソームにヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を含有した化粧料が、既存のリポソームにヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を含有した化粧料よりも極めて効果的にしわを改善させることが分かった。
【００７０】
〈実験例３〉
皮膚美白効果：メラノサイトにおけるメラニン生成に対する阻害効果
メラノサイトは、マウス由来Ｂ‐１６メラノーマ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ６３２３）細胞株を購入して使用した。メラノーマ細胞株を、ブドウ糖４．５ｇ／Ｌ、１０％血清、１％抗生剤が含有されたＤＭＥＭ培地に接種し、５０ｍｌ Ｔ‐フラスコにおいて３７℃で培養する。
【００７１】
５％ＣＯ２条件下で、２４時間培養した後、０．０２％ＥＤＴＡが含有された０．０５％トリプシンを処理し、細胞を分離した後、５０ｍｌ Ｔ‐フラスコに接種し、４８時間培養する。
【００７２】
この際、細胞数は、５．７６×１０６細胞／フラスコである。
【００７３】
ここに、適当濃度の本発明による実施例１の低温工程リポソームと、比較例１の一般のリポソームを、ＤＭＥＭ培地に希釈させ、培養されたメラノーマ細胞に処理して３７℃で５日間培養する。
【００７４】
培養後、培地を全て除去し、０．０２％ＥＤＴＡと０．０５％トリプシンを含有したサリン‐ホスフェート緩衝溶液（ＰＢＳ）を１ｍｌ処理し、細胞を分離した後、５分間遠心分離して細胞のみを収集する。
【００７５】
５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を処理して攪拌し、遠心分離して沈殿されたメラニンをサリン‐ホスフェート緩衝溶液で洗浄する。
【００７６】
沈殿されたメラニンに１Ｎ ＮａＯＨを処理して溶解させた後、４７５ｎｍで吸光度を測定する。メラニン濃度は、合成メラニン（シグマ社）の標準濃度曲線から決定した。実験結果を表６に示す。
【００７７】
【表６】
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【００７８】
表６に示すように、本発明による実施例１の低温工程リポソームに包接されたヒト脂肪幹細胞培養液抽出物が、比較例１の一般のリポソームに包接されたヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を処理したときよりも、メラニン合成抑制効果がさらに高く、本発明は、メラノサイトのメラニン生成を抑制して皮膚美白効果が示されることが分かった。
【００７９】
これは、低温工程リポソームが低温工程（４℃以下）で製造されるのに対して、既存の一般のリポソームは、製造工程において、高圧流動化装置を通過するとき、高温（６０℃以上）工程を経ながら、成長因子のような温度に敏感な成分が、発生した熱により活性が下がりまたは変性され、メラニン合成阻害効果に劣ったものと認められる。
【００８０】
〈実験例４〉
皮膚安全性試験
上記した本発明による実施例２のヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を含有した低温工程リポソームが含まれた化粧料に対する皮膚安全性試験を実施した。
【００８１】
被検者２０名（平均年齢２６．７歳、年齢分布１８〜３０歳）を対象として、Ｈａｙｅ’ｓ Ｔｅｓｔ Ｃｈａｍｂｅｒを用いて、上膊に皮膚貼布試験を実施した。
【００８２】
但し、幹線、湿疹、その他皮膚病変保有者や妊産婦、授乳婦、または避妊剤や抗ヒスタミン剤等を服用している人は、本実験の被検者から除外した。
【００８３】
試験部位を７０％エタノールで拭き取ってから乾燥させ、本発明による実施例２及び比較例２で製造された化粧料を、それぞれ１５μｇずつチェンバーに滴下した後、試験部位である上膊部位に載せて固定する。
【００８４】
貼布は、２４時間塗布し、貼布を除去した後は、マーカーで試験部位を表示し、それぞれ２４時間、４８時間後に試験部位を観察する。
【００８５】
判定は、貼布除去２４時間、４８時間後に行い、皮膚反応は、下記の表７の国際接触皮膚炎研究会（International Contact Dermatitis Research Group：ICDRG）の規定により判定した。試験結果を下記の表８に示す。
【００８６】
【表７】
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【００８７】
【表８】
2014214094.tif 000011
【００８８】
表８に示すように、皮膚安全性試験結果、本発明による実施例２及び比較例２は、両方とも平均刺激程度が０であり、皮膚に刺激のない安全な化粧料であることが分かった。
【００８９】
〈実験例５〉
製剤安定性試験
上記した本発明によるヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を含有した低温工程リポソームが含まれた化粧料に対する安定性試験を行った。
【００９０】
化粧料の安定性を試験するために、上記した実施例２及び比較例２によるヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を４５℃に一定に維持される恒温槽において、不透明の硝子容器に入れて１２週間保管し、さらに４℃に一定に維持される完全遮光された冷蔵庫内において、不透明の硝子容器に入れて１２週間保管した後、分離程度及び変色程度を比較測定した。
【００９１】
その結果を下記の表９に示す。
この際、製品の分離及び変色程度を以下の６級に分けて評価した。
製品変色の評価基準：
０：変化がなかった。
１：極めて少し分離（変色）した。
２：少し分離（変色）した。
３：少し酷く分離（変色）した。
４：酷く分離（変色）した。
５：極めて酷く分離（変色）した。
【００９２】
【表９】
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【００９３】
表９に示すように、本発明による低温工程リポソームが包含された化粧料である実施例２は、４℃と４５℃において全部変色や分離症状がなく安定しているのに対して、一般のリポソームを含有した比較例２は、４℃では変色や分離症状がないが、４５℃では分離症状を生じた。
【００９４】
そのため、本発明によるヒト脂肪幹細胞培養液抽出物を含有した低温工程リポソームが含まれた化粧料は、極めて安定した組成物であることが分かった。
【００９５】
以下、本発明によるヒト由来脂肪幹細胞培養液抽出物を包接した低温工程リポソームを含む化粧料を組成して提示する。
【００９６】
〈製造例１〉柔軟化粧水（スキンローション）
下記表に記載された組成成分で、通常の製造方法により、柔軟化粧水を製造する。
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【００９７】
〈製造例２〉栄養化粧水（ミルクローション）
下記表に記載された組成成分で、通常の製造方法により、栄養化粧水を製造する。
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【００９８】
〈製造例３〉栄養クリーム
下記表に記載された組成成分で、通常の製造方法により、栄養クリームを製造する。
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【００９９】
〈製造例４〉マッサージクリーム
下記表に記載された組成成分で、通常の製造方法により、マッサージクリームを製造する。
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【０１００】
〈製造例５〉パック
下記表に記載された組成成分で、通常の製造方法により、パックを製造する。
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【図１】
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