(57)【要約】【課題】ナノサイズの非晶質のＡβ凝集体のみを特異的に検討するための材料を提供することにある。【解決手段】粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、単量体のアミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体に結合せず、粒子径２２０nm以上のアミロイドβタンパク凝集体との反応性が相対的に低い抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、単量体のアミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体に結合せず、粒子径２２０nm以上のアミロイドβタンパク凝集体との反応性が相対的に低い抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ＮＩＴＥ  Ｐ−１４８９として寄託されたハイブリドーマが産生するものである請求項２記載の抗体。
【請求項４】
検体に請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体を反応させることを特徴とする、当該検体中の粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のアミロイドβタンパク凝集体の検出法。
【請求項５】
アミロイドβタンパクの凝集体の一つで水に溶解しやすい非晶質のナノ凝集体を免疫原とする細胞融合法により得られ、粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、アミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体に結合せず、粒子径２２０nm以上のアミロイドβタンパク凝集体との反応性が相対的に低い抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項６】
ＮＩＴＥ  Ｐ−１４８９として寄託されたものである請求項５記載のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβタンパク（Ａβ）の凝集体のうち粒子径がナノサイズの凝集体に特異的に結合する抗体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病の主要な病理変化には老人斑と神経原線維変化があるが、この老人斑は発症の早期から認められ、その主要構成成分がアミロイドβタンパク（Ａβ）である。当該Ａβは、アルツハイマー病の発症と進展に深く関与していることから注目され広く研究されている。
Ａβは、β−アミロイド前駆体からβ−セクレターゼ及びγ−セクレターゼが作用したときに切り出されて産生される４０−４２アミノ酸からなるペプチドであり、Ａβ1-40及びＡβ1-42との２種が同定されている（非特許文献１）。
【０００３】
アルツハイマー病の発症は、Ａβが凝集して脳組織に沈着することにより発症するとの説が有力であることから、その治療薬としてＡβワクチン療法や抗Ａβモノクローナル抗体療法が開発されている（特許文献１、２）。
【０００４】
一方、脳内に沈着するのは、単量体のＡβではなく、繊維状や非晶質のＡβ凝集体であり、32量体以下の小さな非晶質のＡβ凝集体については神経毒性が強いことなどから、研究が進められている（非特許文献２、３）。そしてこの小さな非晶質のＡβ凝集体（非特許文献３）や繊維状のＡβ凝集体（非特許文献４）に対する抗体も作製されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５６６２２号
【特許文献２】特開２０１０−２１５６５１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Human Molecular Genetics, 13, 159-170(2004)
【非特許文献２】Neurol Sci. 2009 December; 30(6): 471-477
【非特許文献３】J. Biol. Chem. (2011) Vol. 286, No.13, pp11555-11562
【非特許文献４】J. Biol. Chem. (2009) Vol. 284, No.47, pp32895-32905
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、Ａβの凝集体のうち、ナノサイズや大きなサイズの非晶質の凝集体については脳組織内にあることは確認されているが、その作用はほとんど解明されていない。また当該ナノサイズの凝集体は抗Ａβ抗体等を使用して検出されているのが実状であり、その検出法及び機能解明については全く検討されていない。
従って、本発明の課題は、ナノサイズの非晶質のＡβ凝集体のみを特異的に検出するための材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、今まで注目されていなかった、ナノサイズの非晶質のＡβ凝集体に着目し、これに特異的な抗体を作製することとし、種々検討したところ、Ａβ凝集体の一つで水に溶解しやすい非晶質のナノ凝集体を抗原として用いることにより、ナノサイズである粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体に特異的に結合する抗体を得ることに成功した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［６］に係るものである。
［１］粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、単量体のアミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドに結合せず、粒子径２２０nm以上のアミロイドβタンパク凝集体との反応性が相対的に低い抗体。
［２］モノクローナル抗体である［１］記載の抗体。
［３］ＮＩＴＥ  Ｐ−１４８９として寄託されたハイブリドーマが産生するものである［２］記載の抗体。
［４］検体に［１］〜［３］のいずれかに記載の抗体を反応させることを特徴とする、当該検体中の粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のアミロイドβタンパク凝集体の検出法。
［５］アミロイドβタンパクの水に溶解しやすい非晶質のナノ凝集体を免疫原とする細胞融合法により得られ、粒子径５０nm以上２２０nm未満のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、単量体のアミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体と結合せず、粒子径２２０nm以上のアミロイドβタンパク凝集体との反応性が相対的に低い抗体を産生するハイブリドーマ。
［６］ＮＩＴＥ  Ｐ−１４８９として寄託されたものである［５］記載のハイブリドーマ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗体は、従来着目されず、その機能も知られていなかった５０nm以上２２０nm未満のナノサイズの非晶質のＡβ凝集体に特異的であり、単量体のＡβ及び繊維状Ａβ凝集体と反応せず、粒子径２２０nm以上のアミロイドβタンパク凝集体との反応性が相対的に低い。従って、本発明の抗体を用いれば、脳内に沈着していることは知られていたが、その機能が解明されていなかったナノサイズの非晶質のＡβ凝集体を特異的に検出できるので、本発明の抗体はナノサイズの非晶質のＡβ凝集体の機能解明、アルツハイマー病の進展原因究明、臨床検査薬等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】凝集体およびモノマーのＡＦＭ画像を示す図である。（Ａ）ナノ凝集体；直径５０nm程度の楕円形のナノ凝集体に混ざって直径２００nm以上の大きな凝集体が見られる。（Ｂ）マイクロ凝集体（ＬＯＡ）（Ｃ）繊維状Ａβ1-42（Ｄ）モノマー
【図２】各凝集体に対する各モノクローナル抗体の反応性を示す図である。
【図３】サイズ分画したナノ凝集体画分に対する各モノクローナル抗体の反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の抗体は、粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβの凝集体（ナノ凝集体ともいう）に特異的に結合し、単量体Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体と結合せず、粒子径２２０nm以上のアミロイドβタンパク凝集体との反応性が相対的に低い。ここで粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体は、従来注目されている単量体Ａβ、繊維状Ａβ凝集体やマイクロサイズのＡβ凝集体（ＬＯＡ）とも相違する。また、反応性が相対的に低いとは、ＥＬＩＳＡによる吸光度で１／２以下、好ましくは１／３以下であることをいう。
【００１３】
本発明の抗体は、前記の特性を有している限り、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、特異性の高いものが得られやすい点でモノクローナル抗体が好ましい。
【００１４】
本発明のポリクローナル抗体は、粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体を抗原として哺乳動物を免疫し、その抗血清を採取し、特異性を確認すればよい。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体は、通常の細胞融合により得られるハイブリドーマを培養して作製することができる。ここでハイブリドーマは、粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体で免疫した哺乳動物の免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞から、５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体と結合し、単量体Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体と結合せず、マイクロ凝集体との反応性が相対的に低いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。
【００１６】
ハイブリドーマを作製するための抗原としては、アミロイドβタンパクの凝集体の一つで水に溶解しやすい非晶質のナノ凝集体、すなわち、粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体を用いる。
【００１７】
ハイブリドーマの作製に使用する動物としては、マウス、ウサギ等が挙げられるが、ハイブリドーマの作製のために最も広く使用されているマウスを用いるのが好ましい。マウスの免疫感作は、前記の５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体を、必要に応じてFreundのアジュバントと共にマウスに注射することにより行う。次に免疫されたマウスから脾細胞を採取し、マウスミエローマセルライン例えば、Ｐ３Ｕ１との細胞融合を常法に従って行う。
【００１８】
ＨＡＴ培地に増殖したハイブリドーマの培養上清を常用のサンドイッチ法により５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体と結合するモノクローナル抗体の存在について試験する。この検定においては、抗原として用いた５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体、Ａβ1-42、Ａβ1-40、Ａβ16-20、Ａβ繊維状凝集体、マイクロ凝集体をサンドイッチ法の抗原として使用して、特異性を確認できる。
【００１９】
この中に、５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体と結合し、単量体Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体と結合せず、マイクロ凝集体との反応性が相互的に低い、モノクローナル抗体を産生する９個のクローンが見出された。このうち、１クローンをＡｎｔｉ−ＬＦＩ  ７９−３と命名し、ＮＩＴＥ  Ｐ−１４８９として独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物受託センターに寄託した。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体を製造するには、例えば上記のハイブリドーマのいずれかを常用の培地中で培養し、培養上清から目的とするモノクローナル抗体を採取すればよい。あるいは、前記ハイブリドーマのいずれかをマウスの腹腔内に接種し、該マウスから腹水を採取し、そして該腹水から目的とするモノクローナル抗体を採取すればよい。培養上清又は腹水からのモノクローナル抗体の採取、すなわち単離・精製は、常法に従って行うことができる。例えば、硫酸アンモニウムにより塩析、５０nm以上２２０nm未満のＡβ凝集体を固定した支持体を用いるアフィニティークロマトグラフィー等を組合せて用いることができる。
【００２１】
本発明の抗体は、その目的に応じてキメラ抗体、ヒト化抗体とすることができる。さらに、蛍光、発光、放射性同位元素、金属コロイド等の標識体とすることもできる。
【００２２】
得られる本発明の抗体は、５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体に結合し、単量体Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体と結合せず、マイクロ凝集体との反応性が相対的に低いので、５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体を特異的に検出するのに有用である。
【００２３】
本発明の抗体を用いて５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体を検出するには、検体に本発明の抗体を反応させ、当該検体中の粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のアミロイドβタンパク凝集体を検出することができる。
検出手段としては、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色、蛍光免疫染色、免疫沈降等が挙げられる。
また検体としては、摘出組織、脳切片等の組織切片、培養細胞等が挙げられる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
実施例１
［モノクローナル抗体の作成方法］
（１）抗原の作製
【００２６】
（ナノ凝集体）
Ａβ1-42（AnyGen Co.Ltd, Korea）を０．２２ｍＭとなるように１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに溶解し、４℃で１６時間静置、３７℃で３時間静置したのち、減圧乾燥させた。この溶解と減圧乾燥の操作を２回繰り返し、水に溶解しやすい非晶質のナノ凝集体を作製した。この画分には様々な大きさの凝集体が含まれているため、０．２２μｍ、３００ｋＤａ（約５０nm）および、１００ｋＤａのフィルターでろ過することによりサイズ分画を行った。
【００２７】
（マイクロ凝集体）
リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's  ＰＢＳ）中に０．２２ｍＭ  Ａβ1-42（AnyGen Co.Ltd, Korea）と繊維状凝集体の形成を抑制する２．２ｍＭ  Ａβ16-20（ＫＬＶＦＦ）を加え３７℃、３ｒｐｍで１６時間攪拌した。この溶液を０．２２μｍのフィルターでろ過した残渣をマイクロ凝集体（ＬＯＡ）とした。
【００２８】
（繊維状Ａβ凝集体）
マイクロ凝集体の作成においてＡβ16-20を加えずに調整した後３７℃１６時間静置して繊維状Ａβ凝集体を作製した。
【００２９】
（モノマー）
Ａβ1-42を５０μＭになるように１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに加え、超音波処理で懸濁後、３０℃で１６時間放置し完全に溶解させた。減圧乾燥により溶媒を除いたものをモノマーとして用いた。
【００３０】
上記により作製したナノ凝集体、マイクロ凝集体（ＬＯＡ）、繊維状Ａβ凝集体及び、モノマーの形状を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ、JSPM-5200,JEOEL）を用いて観察した。Ａβ1-42の各凝集体もしくはモノマーを１μｇ／ｍｌに調整し、１０μｌを雲母片上に滴下し減圧乾燥させた。測定はＡＣモードで、共振周波数１９０ ｋＨｚで行った。図１に、ＡＦＭの画像を示す。
【００３１】
（２）抗体の作製
上記により作製したナノ凝集体（０．１ｍｇ）を完全もしくは非完全フロイントアジュバントと混合し、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、８週目、雌）に免疫した。免疫は、２週おきに３回行った。免疫したマウスの脾臓を摘出し、その細胞数の２割のマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を混合後、この混合細胞にＰＥＧ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）１ｍｌを１分間かけて攪拌しながらゆっくり加えた。１分間攪拌後、無血清培地ＦＣＳ３ｍｌを３分間かけて攪拌しながらゆっくり加えた。続けて無血清培地１０ｍｌを３分間かけて攪拌しながらゆっくりと加えた。その後、５分間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ2）を行い、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により上清を捨てた。ＨＡＴ培地で希釈することで細胞を解して培養した。
【００３２】
この培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法によりナノ凝集体に反応する抗体を生産する細胞のスクリーニングを行った。陽性が得られた細胞を限界希釈しハイブリドーマの単一化を行った。
【００３３】
ＥＬＩＳＡ法はＮｕｎｃイムノプレートマキシソープ（Thermo scientific Inc.）を用いて４℃、１６時間インキュベートして各抗原を非共有結合で固定した。Dulbecco's  ＰＢＳに０．０５％  Tween２０を加えた溶液（ＰＢＳ−Ｔ）により洗浄を行った後、ブロッキングバッファー（イムノブロック、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）添加し、３７℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２次抗体としてＨＲＰを標識した抗マウスＩｇＧヤギ由来（Sigma-Aldrich）を加え、３７℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（Sigma-Aldrich）の説明に従って発色させ、４９２nmで測定した。
【００３４】
各濃度のナノ凝集体、繊維状Ａβ1-42、モノマーＡβ1-42及び、マイクロ凝集体を抗原として本発明抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った。
図２及び図３に、ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００３５】
図２に示す様に本発明のモノクローナル抗体はナノ凝集体画分に高い反応性を示した。弱いながらＬＯＡにも反応性が見られ、繊維状及びモノマーＡβ1-42とはほとんど反応せずナノ凝集体にのみ高い反応性を示した。一方、ＬＯＡに対する抗体３１−２（特許文献３）はナノ凝集体画分及びＬＯＡに同等の反応性が見られた。
得られたハイブリドーマ９個のうち、相対的にナノ凝集体画分に反応性が高く、繊維状およびモノマーに対する反応性が低い１個をＡｎｔｉ−ＬＦＩ  ７９−３と命名した。
【００３６】
図３に示す様に本発明のモノクローナル抗体はナノ凝集体画分の中で、２２０nmのフィルターを通過するが３００ｋＤａのフィルターを通過しない凝集体と最も良く反応する。この凝集体よりも大きな２２０nmのフィルターを通過しない凝集体とは若干反応するが、３００ｋＤａ以下の凝集体とはほとんど反応しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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