(57)【要約】【課題】治療用ペプチドに対する新規の蛋白性キャリアを特定し、当該キャリアを用いた一連の技術を提供する。【解決手段】アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体と、有効成分となる治療用ペプチドとが、ペプチド結合を介して連結してなる融合蛋白質、を含有する医薬が提供される。本発明の医薬は、血中半減期が長く、また抗体産生の可能性が低く、かつ経口投与や経粘膜投与が可能である。前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの部分断片、両親媒性配列を１〜６個含むポリペプチド、アミノ酸変異体、模倣ペプチド、等であり得る。治療用ペプチドの例として、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）が挙げられる。当該融合蛋白質に脂質がさらに結合し、蛋白質・脂質複合体を形成している医薬も提供される。【選択図】図１
2014132832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体と、有効成分となる治療用ペプチドとが、ペプチド結合を介して連結してなる融合蛋白質、を含有する医薬。
【請求項２】
前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの部分断片である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの両親媒性配列を１〜６個含むポリペプチドである請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの全長又は部分断片のアミノ酸変異体である請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの模倣ペプチドである請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
前記改変体は、キュビリン結合性が低下又は欠失したものである請求項１〜５のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
前記アポリポ蛋白質ＡＩは、ヒト由来のものである請求項１〜６のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
前記治療用ペプチドは、細胞表層受容体に対するアゴニストである請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
前記治療用ペプチドは、血糖をコントロールする機能を有するものである請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項１０】
前記治療用ペプチドは、インスリン抵抗性改善機能を有するものである請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項１１】
前記治療用ペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１活性を有するポリペプチドである請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項１２】
前記治療用ペプチドは、エリスロポエチン活性を有するポリペプチドである請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項１３】
前記治療用ペプチドは、サイトカイン又はケモカインに対する可溶性受容体である請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項１４】
前記治療用ペプチドは、免疫グロブリンのＶＨ領域とＶＬ領域のいずれか一方又は両方を含むポリペプチドである請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項１５】
前記融合蛋白質には、前記治療用ペプチドに対する分解酵素の阻害剤がさらに連結されている請求項１〜１４のいずれかに記載の医薬。
【請求項１６】
前記分解酵素は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶである請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
前記融合蛋白質には、第２の治療成分がさらに連結されている請求項１〜１６のいずれかに記載の医薬。
【請求項１８】
前記治療用ペプチドが血糖をコントロールする機能を有するもの又はグルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニストであり、前記第２の治療成分が膵臓疾患治療薬又は肝臓疾患治療薬である請求項１７に記載の医薬。
【請求項１９】
前記第２の治療成分は、炎症抑制剤、抗癌剤、又は肝硬変治療薬である請求項１８に記載の医薬。
【請求項２０】
前記アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体と治療用ペプチドとの間に、リンカーが介在している請求項１〜１９のいずれかに記載の医薬。
【請求項２１】
前記融合蛋白質に脂質がさらに結合し、蛋白質・脂質複合体を形成している請求項１〜２０のいずれかに記載の医薬。
【請求項２２】
前記蛋白質・脂質複合体は、前記治療用ペプチドに対する分解酵素の阻害剤をさらに含んでいる請求項２１に記載の医薬。
【請求項２３】
前記蛋白質・脂質複合体は、第２の治療成分をさらに含んでいる請求項２１又は２２に記載の医薬。
【請求項２４】
前記治療用ペプチドが血糖をコントロールする機能を有するもの又はグルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニストであり、前記第２の治療成分が膵臓疾患治療薬又は肝臓疾患治療薬である請求項２３に記載の医薬。
【請求項２５】
前記第２の治療成分は、炎症抑制剤、抗癌剤、又は肝硬変治療薬である請求項２４に記載の医薬。
【請求項２６】
経口投与用又は経粘膜投与用である請求項１〜２５のいずれかに記載の医薬。
【請求項２７】
請求項１〜２０のいずれかで定義された融合蛋白質又は請求項２１〜２５のいずれかで定義された蛋白質・脂質複合体、を含有する機能性食品。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれかで定義された融合蛋白質を発現する組換え体を有効成分として含有する医薬又は機能性食品。
【請求項２９】
前記組換え体は、前記融合蛋白質を表層に提示可能な微生物又は細胞である請求項２８に記載の医薬又は機能性食品。
【請求項３０】
前記微生物は、酵母である請求項２９に記載の医薬又は機能性食品。
【請求項３１】
目的蛋白質に対して、アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体を連結することを特徴とする目的蛋白質の安定化方法。
【請求項３２】
前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの部分断片である請求項３１に記載の目的蛋白質の安定化方法。
【請求項３３】
前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの両親媒性配列を１〜６個含むポリペプチドである請求項３１に記載の目的蛋白質の安定化方法。
【請求項３４】
前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの全長又は部分断片のアミノ酸変異体である請求項３１に記載の目的蛋白質の安定化方法。
【請求項３５】
前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの模倣ペプチドである請求項３１に記載の目的蛋白質の安定化方法。
【請求項３６】
アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体と、グルカゴン様ペプチド−１活性を有するポリペプチドとが、ペプチド結合を介して連結してなる融合蛋白質。
【請求項３７】
請求項３６に記載の融合蛋白質をコードする核酸。
【請求項３８】
請求項３７に記載の核酸を有する組換え体。
【請求項３９】
細菌、酵母、カビ、藻類、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物、又は動物である請求項３８に記載の組換え体。
【請求項４０】
組換え体が酵母であり、前記融合蛋白質を表層に提示可能である請求項３９に記載の組換え体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポ蛋白質ＡＩ（ＡｐｏＡＩ）又はその改変体と治療用ペプチドとが連結されてなる融合蛋白質を含有する医薬等に関する。また本発明は、当該融合蛋白質の用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン等の生理活性ペプチドは、一般的に、天然アミノ酸配列のままでは血中での安定性は低く、その半減期は数分〜数時間以内である。また抗体工学の手法で作製できるｓｃＦｖ（single chain Fv）やＦａｂ断片も、その半減期は数分から数時間と、上記のような生理活性ペプチドと同様に短い。これらの血中安定化を行う目的で、アミノ酸置換、化学修飾、ＰＥＧ（Polyethylene glycol）化、徐放性マイクロカプセル化、さらには遺伝子組換え技術による安定化ペプチドとの融合化、といった試みがなされてきた（非特許文献１）。
【０００３】
安定化ペプチドとしてこれまでに、血漿蛋白である血清アルブミン、抗体重鎖定常領域（Ｆｃ）、及びトランスフェリン(Ｔｆ）が、幾つかのペプチド医薬に利用されてきた（非特許文献２，３，４）。これらは、その血中濃度が１〜５０ｍｇ／ｍＬと血中に高濃度で存在し、また動物個体での免疫寛容が成立している（余分に投与してもこれらに対する抗体はできない）と考えられるので、安全かつ安定なキャリアとして期待されている。特に注目すべきは、遺伝子組換え血清アルブミンとグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）との融合蛋白質（ｒＨＳＡ／ＧＬＰ−１）である。現在実用化されているＧＬＰ−１アナログ薬は１日あたり１〜２回の投薬が必要であるのに対し、ｒＨＳＡ／ＧＬＰ−１は週に１回の投薬で血糖コントロールが可能とされている（非特許文献５）。
【０００４】
さらに、ＦｃやＴｆに対する取込み受容体が腸粘膜や肺に存在することが知られており、これらとペプチド医薬との融合蛋白質を、経口投与用や経粘膜投与用の医薬として利用する試みもなされて来ている（非特許文献６，７）。現在のところ、ほとんど全ての治療用ペプチドは、注射による投与経路しか実用化されておらず、治療用ペプチドの経口投与や経肺等の経粘膜投与を実現することは、患者のＱＯＬ（Quality of life）及び医療経済の面で極めて重要である。なお、血清アルブミンでは効率的な取込み受容体が粘膜に存在しないことから、経口投与や経粘膜投与への応用は困難と考えられる。
【０００５】
一方、以上のような血漿蛋白と治療用ペプチドとの融合蛋白質を利用する上での安全面での重要な要素は、治療用ペプチドに対する抗体産生の問題である。すなわち、医薬として利用され得る天然由来の生理活性ペプチドは、天然では極めて微量で作用し、また半減期も短い。このことから、これらに対する動物個体の免疫寛容が成立していない可能性がある。そのため、生理活性ペプチドの完全な天然型のアミノ酸配列を利用したとしても、血中滞留時間の長い融合蛋白質がマクロファージ等の抗原提示細胞へ取り込まれた場合、生理活性ペプチド断片が抗原提示され、免疫が誘起される可能性がある。通常、ペプチド医薬は、長い年月に渡って繰り返し投薬されるため、生理活性ペプチドに対する免疫誘起の可能性は、安全性、薬効の両面における重大な負の要素である。
【０００６】
ＦｃやＴｆに対する取込み受容体は、マクロファージ、樹状細胞といった抗原提示細胞に存在する（非特許文献８，９）。抗体医薬の分野において、ヒト型モノクローナル抗体医薬の超可変領域に対する抗体産生が問題となっている（非特許文献１０，１１）。実際、モノクローナル抗体医薬のみならず、Ｆｃ融合蛋白質の免疫応答においても治療ペプチド部分に対する抗体産生（Human Anti-Drug Antibodeis；ＨＡＤＡ）の可能性が指摘されている（非特許文献１２）。これらのことから、従来技術であるＦｃ融合蛋白質やＴｆ融合蛋白質においても、治療用ペプチド部分に対する抗体産生の可能性は無視できない。また、粘膜近傍にも抗原提示細胞は多数存在するので、経口投与用医薬や経粘膜投与用医薬においても、この問題は安全上重要な課題である。
【０００７】
また、上記のように、ペプチド医薬は長い年月に渡って繰り返し投与されることが多いので、安価に製造できるものであることが好ましい。ここで、例えばＦｃ融合蛋白質において、血中での安定化のためにはＦｃ領域に糖鎖が必要である。しかし、生体に安全上問題のない糖鎖構造をＦｃ領域に付加させるには、現在のところ、ＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いて製造する必要があり、これは高価である。
なおｒＨＳＡ／ＧＬＰ−１は、現在酵母で生産されており、動物細胞に比べて安価に製造が可能である。しかしながら、組換え蛋白質の生産効率には、蛋白質の分子サイズも影響する。ここで、血清アルブミンの分子量は約６６０００、Ｔｆの分子量は約７８０００であり、いずれも分子サイズが大きく、遺伝子組換え技術による生産に有利とはいえない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】John M. et al., Drug discovery today (2006) 3(1),87-94
【非特許文献２】Rustgi VK, Curr. Med. Res. Opin. (2009) 25(4), 991-1002
【非特許文献３】Sathyanarayana P. et al., Blood (2009) 113, 4955-4962
【非特許文献４】Kim BJ et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2010) 334(3), 682-692
【非特許文献５】Christensen M. et al., Curr. Diab. Rep. (2010) 10(2), 124-132
【非特許文献６】Bitoni AJ et al., PNAS (2004) 101(26), 9763-9768
【非特許文献７】Bay Y. et al., PNAS (2005) 102(20), 7292-7296
【非特許文献８】Pasquier B. et al., J. Leukocyte Biology (2004) 76, 1134-1141
【非特許文献９】Nishisato T. et al., Br. J. Haematol (1982) 52(4), 631-640
【非特許文献１０】Harding FA et al., MAbs (2010) 2(3), 256-265
【非特許文献１１】Gonzales NR et al., Tumour Biol. (2005) 26(1), 31-43
【非特許文献１２】Niebecker R et al., Curr. Drug Saf. (2010) 5(4), 275-286
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、医薬ペプチド（治療用ペプチド）の蛋白キャリアによる血中安定化、及び経口投与用医薬や経粘膜投与用医薬への応用において、
（１）免疫寛容が成立している、
（２）抗原提示細胞での取込受容体が存在しない、
（３）分子サイズが小さく大腸菌や酵母で生産可能、
さらには、
（４）粘膜上に効率的な取込み機構が存在し、経口投与や経粘膜投与に応用できる、
などの要素を満たす蛋白性キャリアの利用が期待される。しかしながら、上述した血清アルブミン、抗体Ｆｃ、トランスフェリン以外のキャリア分子の利用については、これまであまり検討されておらず、さらに優れたキャリア分子が求められている。
【００１０】
上記した現状に鑑み、本発明は、治療用ペプチドに対する新規の蛋白性キャリアを特定し、当該キャリアを用いた一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために検討を重ねた結果、アポリポ蛋白質ＡＩ（ＡｐｏＡＩ）をキャリア蛋白質として採用し、ＡｐｏＡＩと治療用ペプチドとを連結した融合蛋白質を用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。上記課題を解決するために提供される本発明は、以下のとおりである。
【００１２】
本発明の１つの様相は、アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体と、有効成分となる治療用ペプチドとが、ペプチド結合を介して連結してなる融合蛋白質、を含有する医薬である。
【００１３】
ここで「治療用ペプチド」とは、医薬の有効成分として機能するペプチドを指す。したがって、治療用ペプチドには、投与後の組織指向性のみに関与するものや、有効成分の安定化のみに関与するものは含まれない。
【００１４】
ここでアポリポ蛋白質ＡＩの「改変体」とは、アポリポ蛋白質ＡＩに類似の蛋白質であり、アポリポ蛋白質ＡＩとしての機能を保持しているものを指す。アポリポ蛋白質ＡＩとしての機能を保持している限り、当該改変体には、少なくとも以下の蛋白質・ポリペプチドが含まれる。
・アポリポ蛋白質ＡＩの部分断片、
・アポリポ蛋白質ＡＩの機能ドメインを有する蛋白質・ポリペプチド、
・アポリポ蛋白質ＡＩの１次構造において数個〜十数個程度のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された蛋白質・ポリペプチド（アミノ酸変異体）。
【００１５】
好ましくは、前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの部分断片である。
【００１６】
好ましくは、アポリポ蛋白質ＡＩの両親媒性配列を１〜６個含むポリペプチドである。
【００１７】
好ましくは、前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの全長又は部分断片のアミノ酸変異体である。
【００１８】
好ましくは、前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの模倣ペプチドである。
【００１９】
好ましくは、前記改変体は、キュビリン結合性が低下又は欠失したものである。
【００２０】
好ましくは、前記アポリポ蛋白質ＡＩは、ヒト由来のものである。
【００２１】
好ましくは、前記治療用ペプチドは、細胞表層受容体に対するアゴニストである。
【００２２】
好ましくは、前記治療用ペプチドは、血糖をコントロールする機能を有するものである。
【００２３】
好ましくは、前記治療用ペプチドは、インスリン抵抗性改善機能を有するものである。
【００２４】
好ましくは、前記治療用ペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１活性を有するポリペプチドである。
【００２５】
好ましくは、前記治療用ペプチドは、エリスロポエチン活性を有するポリペプチドである。
【００２６】
好ましくは、前記治療用ペプチドは、サイトカイン又はケモカインに対する可溶性受容体である。
【００２７】
好ましくは、前記治療用ペプチドは、免疫グロブリンのＶＨ領域とＶＬ領域のいずれか一方又は両方を含むポリペプチドである。
【００２８】
好ましくは、前記融合蛋白質には、前記治療用ペプチドに対する分解酵素の阻害剤がさらに連結されている。
【００２９】
好ましくは、前記分解酵素は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶである。
【００３０】
好ましくは、前記融合蛋白質には、第２の治療成分がさらに連結されている。
【００３１】
好ましくは、前記治療用ペプチドが血糖をコントロールする機能を有するもの又はグルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニストであり、前記第２の治療成分が膵臓疾患治療薬又は肝臓疾患治療薬である。
【００３２】
好ましくは、前記第２の治療成分は、炎症抑制剤、抗癌剤、又は肝硬変治療薬である。
【００３３】
好ましくは、前記アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体と治療用ペプチドとの間に、リンカーが介在している。
【００３４】
好ましくは、前記融合蛋白質に脂質がさらに結合し、蛋白質・脂質複合体を形成している。
【００３５】
好ましくは、前記蛋白質・脂質複合体は、前記治療用ペプチドに対する分解酵素の阻害剤をさらに含んでいる。
【００３６】
好ましくは、前記蛋白質・脂質複合体は、第２の治療成分をさらに含んでいる。
【００３７】
好ましくは、前記治療用ペプチドが血糖をコントロールする機能を有するもの又はグルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニストであり、前記第２の治療成分が膵臓疾患治療薬又は肝臓疾患治療薬である。
【００３８】
好ましくは、前記第２の治療成分は、炎症抑制剤、抗癌剤、又は肝硬変治療薬である。
【００３９】
上記医薬は、経口投与用又は経粘膜投与用であることが好ましい。
【００４０】
本発明の他の様相は、上記で定義された融合蛋白質又は上記で定義された蛋白質・脂質複合体、を含有する機能性食品である。
【００４１】
本発明の他の様相は、上記で定義された融合蛋白質を発現する組換え体を有効成分として含有する医薬又は機能性食品である。
【００４２】
好ましくは、前記組換え体は、前記融合蛋白質を表層に提示可能な微生物又は細胞である。
【００４３】
好ましくは、前記微生物は、酵母である。
【００４４】
本発明の他の様相は、目的蛋白質に対して、アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体を連結する目的蛋白質の安定化方法である。
【００４５】
好ましくは、前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの部分断片である。
【００４６】
好ましくは、前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの両親媒性配列を１〜６個含むポリペプチドである。
【００４７】
好ましくは、前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの全長又は部分断片のアミノ酸変異体である。
【００４８】
好ましくは、前記改変体は、アポリポ蛋白質ＡＩの模倣ペプチドである。
【００４９】
本発明の他の様相は、アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体と、グルカゴン様ペプチド−１活性を有するポリペプチドとが、ペプチド結合を介して連結してなる融合蛋白質である。
【００５０】
本発明の他の様相は、前記融合蛋白質をコードする核酸である。
【００５１】
本発明の他の様相は、前記核酸を有する組換え体である。
【００５２】
好ましくは、前記組換え体が、細菌、酵母、カビ、藻類、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物、又は動物である。
【発明の効果】
【００５３】
本発明の医薬は、体内安定性が高く、かつ粘膜透過性に優れている。さらに、治療用ペプチドに対する抗体産生の可能性が低いので、生体に対する安全性が高い。さらに、有効成分である融合蛋白質の分子サイズが小さいので、組換え技術による生産に有利である。さらに、経口投与が可能であるので、機能性食品としても利用できる。
【００５４】
本発明の目的蛋白質の安定化方法によれば、治療用ペプチド等の体内安定性を容易に高めることができる。
【００５５】
本発明の融合蛋白質によれば、体内安定性が高く、投与量及び投与頻度が少ない糖尿病治療薬を提供することができる。
【００５６】
本発明の核酸と組換え体によれば、本発明の融合蛋白質を容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＧＬＰ−１／ＡｐｏＡＩ融合蛋白質の精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２】ＧＬＰ−１／ＡｐｏＡＩ融合蛋白質・脂質複合体のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３】ＧＬＰ−１／ＡｐｏＡＩ融合蛋白質及びＧＬＰ−１／ＡｐｏＡＩ融合蛋白質・脂質複合体の、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【図４】既知のＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを用いた、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【図５】ＤＤＰＩＶで処理した天然型ＧＬＰ−１の、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【図６】ＤＤＰＩＶで処理したＧＬＰ−１／ＡｐｏＡＩ融合蛋白質の、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【図７】ＤＤＰＩＶで処理したＧＬＰ−１／ＡｐｏＡＩ融合蛋白質・脂質複合体の、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【図８】マウスにおける血糖上昇抑制効果の試験結果を表すグラフである。
【図９】ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩ部分断片との融合ペプチド（ＡＣＧＬ１）の精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図１０】ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩ部分断片との融合ペプチド（ＡＣＧＬ１）の精製過程におけるウエスターンブロッティングの結果を表す写真である。
【図１１】脂質結合型ＡＣＧＬ１のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図１２】脂質非結合型ＡＣＧＬ１及び脂質結合型ＡＣＧＬ１の、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【図１３】既知のＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを用いた、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【図１４】ＤＤＰＩＶで処理した天然型ＧＬＰ−１とＡＣＧＬ１の、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【図１５】ＤＤＰＩＶで処理した脂質結合型ＡＣＧＬ１の、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の測定結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明は「アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体と、有効成分となる治療用ペプチドとが、ペプチド結合を介して連結してなる融合蛋白質」を主要な構成としている。以下、本発明の実施形態について、当該融合蛋白質の構成を中心として順次説明する。なお、本明細書においては特に断らない限り、蛋白質、ポリペプチド、及びペプチドという用語については厳密な区別をせず、同義の用語として用いる。
【００５９】
（アポリポ蛋白質ＡＩ）
アポリポ蛋白質ＡＩ（ＡｐｏＡＩ）は、小腸及び肝臓で合成され、通常血中に１．２〜１．７ｍｇ／ｍＬと高濃度で存在し、主に高比重リポ蛋白（High Density Lipoprotein；ＨＤＬ）粒子の主要構成蛋白質として機能する。ヒト成熟型ＡｐｏＡＩは２４３アミノ酸残基（配列番号１）から成り、その分子量は約２８０００である。また、その脂質複合体であるＨＤＬ粒子の直径は約７〜１０ｎｍである。最もコンパクトなＨＤＬ粒子は、脂質二重層にＡｐｏＡＩが二分子結合したディスク状構造を有する。
【００６０】
血中でのＨＤＬの主な機能は、末梢細胞の表層の受容体と結合することで、細胞内に蓄積したコレステロールを引き抜き、これを肝臓へ運び、コレステロール排出を行うことである。腎臓では、ＡｐｏＡＩは糸球体で濾過された後、キュビリン（Cubilin）と呼ばれる受容体との結合を介して腎臓近位曲尿細管（Renal proximal convoluted tubule）の上皮細胞へ侵入し、代謝される。ＡｐｏＡＩの体内半減期は約４日である。ＡｐｏＡＩ及びＨＤＬのキュビリンに対する親和性は極めて高い（Kozyraki R. et al., Nat. Med. (1999) 5(6), 656-661）。
【００６１】
また、ＨＤＬ粒子の細胞透過には、その受容体であるＳＲ−Ｂ１（Scavenger receptor B1）やＡＢＣＡ１（ATP-binding cassette transporter A1）、及びＡＢＣＧ１（ATP-binding cassette transporter G1）が関与していると考えられている（Rohrer L．et al., Nat. Med. (2009) 104, 1142-1150）。
【００６２】
（アポリポ蛋白質ＡＩの改変体）
本発明における融合蛋白質は、「アポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体」を含んでいる。ここで、上述したように、アポリポ蛋白質ＡＩの「改変体」とは、アポリポ蛋白質ＡＩに類似の蛋白質であり、アポリポ蛋白質ＡＩとしての機能を保持しているものを指す。アポリポ蛋白質ＡＩとしての機能を保持している限り、当該改変体には、少なくとも以下の蛋白質・ポリペプチドが含まれる。
・アポリポ蛋白質ＡＩの部分断片、
・アポリポ蛋白質ＡＩの機能ドメインを有する蛋白質・ポリペプチド、
・アポリポ蛋白質ＡＩの１次構造において数個〜十数個程度のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された蛋白質・ポリペプチド（アミノ酸変異体）。
【００６３】
アポリポ蛋白質ＡＩの改変体は、融合蛋白質の血中安定性の向上、粘膜や脳関門の透過性の改善等、目的に応じて設計することができる。これらの例示した目的は、例えば、ＡｐｏＡＩやＨＤＬにおける体内受容体との相互作用の欠損もしくは増強、融合蛋白質を含有するＨＤＬ粒子径の制御、等により達成できる。
【００６４】
例えば、キュビリン結合性が低下又は欠損したＡｐｏＡＩの改変体の使用は、好ましい実施形態の１つである。すなわち、ＡｐｏＡＩ及びＨＤＬはキュビリンとの結合を介して腎臓より排泄される（Kozyraki R. et al., Nat. Med. (1999) 5(6);656-661）。したがって、キュビリン結合性が低下又は欠損したＡｐｏＡＩの改変体は、腎臓での濾過効率が低くなり、天然型ＡｐｏＡＩよりも血中半減期が長くなる。
【００６５】
また、融合蛋白質に脂質を結合させた「蛋白質・脂質複合体」を用いる実施形態において、蛋白質・脂質複合体の粒径を大きくすることによって、腎臓での濾過効率を低化させ、その血中半減期を延ばすことが可能である。例えば、ヒト成熟型ＡｐｏＡＩのアミノ酸配列（配列番号１）における、１７３―２４３番目の７１残基のみで構成される部分断片の脂質複合体の直径は平均１２ｎｍであり、天然型ＨＤＬのそれよりも１．５倍程度大きくなることが知られている（Sivashanmugam A et al., Methods Cell Biol. (2008) 90, 327-364）。また、１７３番目のアルギニンがシステインに置換したＡｐｏＡＩのアミノ酸変異体（Apolipoprotein A-I milano）は、システインを介してダイマー構造を形成し、その血中半減期は天然型ＡｐｏＡＩの約２倍に延びることが知られている（Roma P. et al., J. Clin. Invest. (1993) 91, 1445-1452； Chiesa G. et al., Circ. Res. (2002) 90, 974-980）。
このように、血中半減期を延ばすための技術は、ＡｐｏＡＩの改変体を設計する際に利用可能であり、本発明の医薬を注射剤として使用する場合、特に重要である。
【００６６】
アポリポ蛋白質ＡＩの改変体には、アポリポ蛋白質ＡＩの両親媒性配列を有するポリペプチドも含まれる。すなわち、ヒト成熟型ＡｐｏＡＩは、１１〜２２個のアミノ酸からなる両親媒性ヘリックス構造のペプチド配列（両親媒性配列）が１０回繰り返された構造を有する（Segrest JP et al., FEBS Lett. (1974) 38, 247-253）。具体的には、配列番号１において、各両親媒性配列は、それぞれ、アミノ酸番号で４４〜６５番目、６６〜８７番目、８８〜９８番目、９９〜１２０番目、１２１〜１４２番目、１４３〜１６４番目、１６５〜１８６番目、１８７〜２０８番目、２０９〜２１９番目、及び２２０〜２４１番目の配列に相当する。
【００６７】
一方、ＡｐｏＡＩ様の両親媒性ヘリックス構造を含むペプチドは経口投与が可能であり、ＡｐｏＡＩと同様の動脈硬化抑制作用を示すことが知られている（国際公開０２／１５９２３号； Navab M. et al.,Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2010) 30, 164-168）。このことは、ＡｐｏＡＩ由来両親媒性ヘリックス配列は、細胞膜（脂質二重層）と親和性があり、さらに細胞膜を透過できることを示す。したがって、アポリポ蛋白質ＡＩの両親媒性配列を有するポリペプチドと治療用ペプチドとの融合蛋白質は、経口投与が可能である。
【００６８】
例えば、配列番号１のアミノ酸番号１〜４３番目の配列は脂質結合に関与しない。したがって、この領域が削除された２００アミノ酸のみから成るＡｐｏＡＩの部分断片は、脂質結合性を保持するため、本発明に適用可能である。また、上記１０種類の両親媒性配列のいずれか１種又は２種以上、好ましくは１〜６種の配列の組み合わせも、本発明に適用可能である。さらには１種類の両親媒性配列が複数回繰り返された配列を利用してもよい。
【００６９】
また、上記１０種類の両親媒性配列のうち、４４〜６５番目と２２０〜２４１番目の配列は、他の８種に比べてリン脂質により強く結合し、リン脂質を可溶化することができる（Palgunachari NN et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1996) 16(2), 328-338）。したがって、これらの配列を１回以上含む配列を用いることは有用である。
【００７０】
隣接する２種類の両親媒性配列を利用する場合は、４４〜６５番目と６６〜８７番目の配列を組み合わせた４４アミノ酸の配列や、２０９〜２１９番目と２２０〜２４１番目の配列を組み合わせた３３アミノ酸の配列が、特に好ましい。これらの配列は、他の隣接する２種類の配列の組み合わせより強いリン脂質結合性と可溶化能を示す（Mishra VK et al., Biochemistry (1998) 37, 10313-10323）。
【００７１】
上記ヒトＡｐｏＡＩ由来ペプチド配列以外にも、これらを模倣したクラスＡの両親媒性ペプチドモチーフ（Segrest JP et al., Proteins (1990) 8, 103-117）である人工配列（模倣ペプチド）も、ヒトでの副作用が低く臨床応用が可能なものであれば使用可能である。当該模倣ペプチドの例としては、脂質結合性を有する両親媒性ペプチドであるＡｃ−１８Ａ−ＮＨ２、及びその関連ペプチド配列（Datta G et al., J. Lioid Res. (2001) 42, 1096-1104； Navab M. et al., Curr. Opin. Invest. Drugs (2003) 4(9), 1100-1104）等が挙げられる。具体的には、配列番号１０〜１６に示すアミノ酸配列からなる各ペプチドが挙げられる。配列番号１０は、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ２のアミノ酸配列である。配列番号１１〜１６はＡｃ−１８Ａ−ＮＨ２の関連ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号１１は、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ２の３番目のアミノ酸をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換した配列に相当する。配列番号１２は、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ２の１４番目のアミノ酸をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換した配列に相当する。配列番号１３は、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ２の３番目と１４番目のアミノ酸をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換した配列に相当する。配列番号１４は、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ２の１１番目、１４番目、１７番目のアミノ酸をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換した配列に相当する。配列番号１５は、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ２の１０番目、１１番目、１４番目、１７番目のアミノ酸をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換した配列に相当する。配列番号１６は、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ２の３番目、１０番目、１１番目、１４番目、１７番目のアミノ酸をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換した配列に相当する。
【００７２】
（治療用ペプチド）
本発明における融合蛋白質は、治療用ペプチドを含んでいる。治療用ペプチドとしては特に限定はなく、医薬の有効成分となり得る全ての蛋白質やペプチドが対象となる。例えば、細胞表層受容体に対するアゴニスト、血糖をコントロールする機能を有する蛋白質・ペプチド、及びインスリン抵抗性改善機能を有する蛋白質・ペプチド、サイトカイン又はケモカインに対する可溶性受容体は、本発明における治療用ペプチドとして好適である。
具体例としては、グルカゴン様ペプチド-1（ＧＬＰ−１）、グルカゴン、ＥＸＥＮＤＩＮ、エリスロポエチン、インターフェロン、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ケモカイン受容体、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺ホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ナトリウム利尿ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、脂肪動員ホルモン阻害因子（ＡＧＩＦ）、成長ホルモン放出因子、神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、血管形成阻害因子（Angiostatin）、アポリポ蛋白Ｂ可溶性受容体、ニューロペプチドＢ（ＮＰＢ）、ペプチドチロシンチロシン（ＰＹＹ）、ケマリン（Chemerin）、レプチン、アペリン（Apelin）、ネスファチン、オキシトシン、メラノコルチン、アミリン、オレキシン、アディポネクチン、グレリン、等が挙げられる。さらに、これらの蛋白質・ペプチドと同一機能（同一活性）を有するアナログ、変異体、人工ペプチドが挙げられる。さらに、免疫グロブリンのＶＨ領域とＶＬ領域のいずれか一方又は両方を含むポリペプチドであって、前記した蛋白質・ペプチドと同一機能（同一活性）を有するものも、治療用ペプチドとなり得る。また、線維症治療薬の候補であるスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）のような酵素蛋白も、治療用ペプチドとなり得る。
【００７３】
（他の構成要素：蛋白質分解酵素の阻害剤）
本発明で用いる融合蛋白質には、治療用ペプチドとは別に、治療用ペプチドに対する分解酵素の阻害剤がさらに連結されていてもよい。当該阻害剤を連結させることにより、治療用ペプチドの分解が抑えられ、血中半減期が長くなり、治療用ペプチドの生体内での効果をさらに高めることができる。これにより、投薬量と投薬頻度を減らすことも可能となる。例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）の阻害剤は、治療用ペプチドがＧＬＰ−１である場合に好適である。
【００７４】
（他の構成要素：第２の治療成分）
本発明で用いる融合蛋白質には、治療用ペプチドとは別に、第２の治療成分がさらに連結されていてもよい。１つの実施形態では、治療用ペプチドが血糖をコントロールする機能を有するもの又はＧＬＰ−１アゴニストであり、第２の治療成分が膵臓疾患治療薬又は肝臓疾患治療薬である。この場合、第２の治療成分は、炎症抑制剤、抗癌剤、又は肝硬変治療剤であってもよい。
例えば、ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩとの融合蛋白質の場合、膵臓にはＧＬＰ−１受容体が存在し、肝臓にはＡｐｏＡＩ受容体が存在するので、この融合蛋白質は膵臓と肝臓に対して指向性を有する。そのため、この融合蛋白質によって膵臓や肝臓疾患に有効な治療薬を運ばせることも可能となる。一方、糖尿病患者の中には、膵炎、膵臓癌等の膵臓疾患を基礎疾患としていたり、肝硬変、肝線維症、肝臓癌、肝炎を併発するケースが多々ある。したがって、ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩとの融合蛋白質の場合、ＧＬＰ−１が治療用ペプチド（糖尿病治療用）となるが、上記のような膵臓、肝臓の疾患治療薬を第２の治療成分としてこの融合蛋白質に結合させることは有用である。このように、糖尿病に併発する膵臓、肝臓疾患の治療薬も組織指向性を持たせて効率的に利用することは、糖尿病の治療には重要である。
【００７５】
（他の構成要素：リンカー）
本発明で用いる融合蛋白質において、ＡｐｏＡＩ又はその改変体と治療用ペプチドとの間に、リンカーを介在させてもよい。リンカーは、できるだけヒトでの免疫応答を誘発しないものが好ましい、人工配列であれば、例えば、グリシン及びセリンから成る５アミノ酸配列である（ＧＧＧＧＳ；配列番号９）の１〜４回繰り返し配列、もしくはこれに類似する配列が使用可能である。また、ヒト血中に、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で存在する蛋白質、例えば免疫グロブリンのヒンジ配列をリンカーとして使用することができる。ヒト血中に大量に存在する蛋白質由来の配列であれば、ヒトでの免疫応答を誘発させる可能性は低い。
【００７６】
（治療用ペプチドの連結様式等）
上記融合蛋白質においては、ＡｐｏＡＩの機能に影響を与えない限り、同種の治療用ペプチドを２回以上繰り返して連結してもよい。なお、この場合は、治療用ペプチド自身がリンカーの役割も兼ねることができる。
治療ペプチドの部分配列をリンカーとして用いてもよい。
【００７７】
治療用ペプチドの連結位置は、ＡｐｏＡＩ又はその改変体のＮ末端、Ｃ末端のいずれでもよく、両末端でもよい。
【００７８】
（治療用ペプチドの例：グルカゴン様ペプチド−１）
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は小腸Ｌ細胞から分泌される３０〜３１アミノ酸から成るペプチドホルモンであり、膵臓β細胞においてグルコース依存的なインスリン分泌の亢進作用を示す。このことから、ＧＬＰ−１受容体アゴニストによる血糖コントロールは、インスリンによるそれに比べて、低血糖になるリクスが極めて少ないと考えられている（Halimi S. et al., Diabetes and Metabolism (2003) 34, S91-S95）。また、ＧＬＰ−１は血糖コントロールのみならず、食欲低下、膵β細胞の分化・増殖促進及びアポトーシス抑制、さらには神経保護等の作用があり、ＧＬＰ−１作用を示す治療薬は、ＩＩ型糖尿病や肥満等の新しい機能の治療薬として期待されている。
【００７９】
しかしながら、ＧＬＰ−１は、生体内でジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって速やかに分解されてしまうため、その半減期は１〜２分であり（Kieffer TJ et al., Endocrinology (1995) 136(8), 3585-3596）、そのまま治療薬として利用することは困難である。そのためＤＰＰＩＶ阻害剤、及び、血中半減期が増大したＧＬＰ−１アナログの両方向の開発が進められてきた（Halimi S. et al., Diabetes and Metabolism (2003) 34, S91-S95）。ＧＬＰ−１アナログとして、現在、Exenatide及びLiraglutideが実用化されている。ExenatideはＧＬＰ−１とのアミノ酸配列の相同性が５３％と低い。一方、Liraglutideは、天然型ＧＬＰ−１に対して１アミノ酸の置換による変異、及び１アミノ酸の脂肪酸修飾が施されている。しかしながら、これらの体内安定性はまだ低く、１日に１〜２回の注射が必要である。
【００８０】
また、Exenatideの抗体産生率は４０〜４５％、Liraglutideの抗体産生率は９〜１３％であったと報告されている（De Block CE et al., Lancet (2009) 374, 4-6； Klonoff DC et al., Curr. Med. Res. Opin. (2008) 24, 275-286）。これらのＧＬＰ−１アナログ薬に対する抗体産生は、その薬効を低減させるのみならず、重篤な免疫疾患を誘発する可能性がある。
【００８１】
本発明では、治療用ペプチドとして、ＧＬＰ−１、並びに、ＧＬＰ−１と同一機能（同一活性）を有するアナログ、変異体、人工ペプチド、及び免疫グロブリンのＶＨ領域とＶＬ領域のいずれか一方又は両方を含むポリペプチド、等（これらを総称して、「ＧＬＰ−１活性を有するポリペプチド」と称する）の全てが利用可能である。好ましくは、ＧＬＰ−１に対するアミノ酸配列の相同性が９３％以上で、かつＧＬＰ−１活性を有するポリペプチドを利用する。ＧＬＰ−１としては、配列番号２に示す３１アミノ酸からなる配列のポリペプチド（天然型ＧＬＰ−１のアミノ酸番号７〜３７に相当）の他、配列番号２のアミノ酸番号１〜３０、１〜２９、又は１〜２８に相当するポリペプチドを利用することができる。具体的には、例えば、ＧＬＰ−１とアミノ酸相同性が１００％の配列、配列番号２のアミノ酸番号２（天然型ＧＬＰ−１の８番目）のアミノ酸であるアラニンがグリシン又はセリンに変換された配列、或いは、これらのＮ末端にメチオニン又はリジンが１残基付加された配列、等を有する治療ペプチドを使用する。
ＤＰＰＩＶは、ＧＬＰ−１アミノ酸配列の８番目のアラニンと９番目のグルタミン酸の間を切断する作用があり、また７番目のヒスチジン及び９番目のグルタミン酸はＧＬＰ−１機能に重要である。このことから、疎水性アミノ酸である８番目のアラニンをセリン等の親水性アミノ酸もしくは、最も分子サイズの小さいアミノ酸であるグリシンに変換することで、ＧＬＰ−１機能を極端に低下させることなく、ＤＰＰＩＶに対する感受性をある程度低下させることが可能である。
【００８２】
治療用ペプチドがＧＬＰ−１活性を有するポリペプチドである場合も、上記融合蛋白質において、ＡｐｏＡＩ又はその改変体とＧＬＰ−１活性を有するポリペプチドとの間にリンカーを介在させてもよい。また、ＡｐｏＡＩの機能に影響を与えない限り、ＧＬＰ−１活性を有するポリペプチドを２回以上繰り返して連結させてもよい。この場合は、ＧＬＰ−１活性を有するポリペプチド自身が、リンカーの役割も兼ねることができる。
【００８３】
配列番号７，８に、ＡｐｏＡＩとＧＬＰ−１活性を有するポリペプチドとの融合蛋白質の一例を示す。この融合蛋白質は、Ｎ末端から順に、ＧＬＰ−１（アミノ酸番号２〜３１；３０アミノ酸）、リンカー（アミノ酸番号３２〜４６；１５アミノ酸）、及びＡｐｏＡＩ（アミノ酸番号４７〜２８９；２４３アミノ酸）が連結された基本構造を有している。ＡｐｏＡＩの部分（２４３アミノ酸）のアミノ酸配列は、配列番号１に示したものと同じである。
【００８４】
（治療用ペプチドの例：エリスロポエチン）
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、成熟赤血球細胞の生産に必要な天然に生じる造血成長因子である。成熟型Ｅｐｏは、１６５アミノ酸から成る１８．４ｋＤのポリペプチドに糖鎖が付加された、約３５ｋＤの糖蛋白質である。Ｅｐｏは、初期および後期の赤血球特異的前駆細胞の増殖ならびに前赤芽球のヘモグロビン化および成熟赤血球へのそれらの分化を刺激する（Roberts D. et al., J. Mol. Ｊ． Endocrinology (1994) 12(2), 131-148）。Ｅｐｏ受容体は脳にも存在し、Ｅｐｏは脳の機能、発達にも重要であることが知られている（Lappin T., The Oncologist (2003) ８ (suppl. 1), 15-18）。
【００８５】
現在では、組換えヒトＥｐｏ（ｒＥｐｏ）は、腎不全患者の腎性貧血の治療に用いられており、確立された市場を有している。しかしながら、ｒＥｐｏの血中半減期は６〜８時間と短く、週に２〜３回の注射が必要である（Macdougall IC, Clin. J. Am. Soc. Nephrol. (2008) 3, 200-207）。腎不全患者は年々増加しており、腎性貧血を治療・予防するためのｒＥｐｏ注射の頻度をより低減することや、Ｅｐｏ製剤の経口投与化や経粘膜投与化によって通院頻度を低減することは、患者のＱＯＬ及び医療経済の面から重要な課題である。
【００８６】
一般に、免疫グロブリンは血中半減期が約２０日と非常に安定している。そのため、ｒＥｐｏの代替としてのＥＰＯ受容体アゴニスト抗体の開発も行われて来た（国際公開００／６１６３７号；国際公開２００７／１２０７６６号）。しかしながら、ｒＥｐｏに匹敵するアゴニスト活性を有する抗体はまだ得られていない。
一方、近年、Ｅｐｏ受容体アゴニストである人工ペプチド「Ｈｅｍａｔｉｄｅ」が開発されている。これはファージディスプレイペプチドライブラリーから、Ｅｐｏ受容体アゴニストとして選抜された人工ペプチドが、ＰＥＧ化によって安定化されたものである。この薬剤は、４週に１回の注射で貧血を抑制できる（Macdougall IC et al., N. Engl．J. Med. (2009) 361, 1848-1855）。しかしながら、腎性貧血患者にとっては、ＥＰＯ受容体アゴニスト療法は、生涯必要とされる。長年に渡るＰＥＧ等の化学物質投与の安全性は、現時点で保証されているわけではない。また、「Ｈｅｍａｔｉｄｅ」は完全な人工アミノ酸配列を有するため、これに対する抗体産生も起こり得る。
【００８７】
そこで、Ｅｐｏの新規キャリアとしてＡｐｏＡＩ又はその改変体を使用すれば、上記課題を解決することができる。すなわち、上記融合蛋白質において、治療用ペプチドとしてＥｐｏ活性を有するポリペプチドを採用することで、安全かつ有効な治療薬を提供することができる。Ｅｐｏ活性を有するポリペプチドとしては、天然型Ｅｐｏ、並びに、Ｅｐｏと同一機能（同一活性）を有するアナログ、変異体、人工ペプチド、及び「免疫グロブリンのＶＨ領域とＶＬ領域のいずれか一方又は両方を含むポリペプチド」、等が挙げられる。
【００８８】
（治療用ペプチドの例：ヒト成長ホルモン）
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は脳下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞（Somatotroph）から分泌される、１９１アミノ酸からなる２２ｋＤａのペプチドである。ｈＧＨは小児におけるｈＨＧ分泌不全症、ターナー症候群、及びプラダーウィリー症候群等の治療に用いられている。さらに近年では、成人における重症ｈＧＨ分泌不全症に適用されている他、抗老化、美容医学における応用も期待されている。
本発明において、上記融合蛋白質の治療用ペプチドとして、ｈＧＨ活性を有するポリペプチドを採用することができる。ｈＧＨ活性を有するポリペプチドとしては、天然型ｈＧＨ、並びに、ｈＧＨと同一機能（同一活性）を有するアナログ、変異体、人工ペプチド、及び「免疫グロブリンのＶＨ領域とＶＬ領域のいずれか一方又は両方を含むポリペプチド」、等が挙げられる。
【００８９】
（蛋白質・脂質複合体）
上記融合蛋白質は、脂質との複合体を形成させることなく、そのまま医薬等として使用することができる。すなわち、上記融合蛋白質をそのまま「脂質非結合型」として生体内に投与した場合、この融合蛋白質は、血流を循環する間に、細胞膜を形成するリン脂質やコレステロール（ＣＯ）と結合し、ＨＤＬ様粒子を形成する。さらに、血中に存在するＬＣＡＴ（Lecithin cholesterol acyltransferase）の作用によってＣＯはコレステロールエステル（ＣＥ）に変換され、融合蛋白質を含むＨＤＬ粒子の内部にＣＥは蓄積する。ＣＯやＣＥを保持した上記融合蛋白質を含有するＨＤＬ様粒子は、肝臓で受容体を介して、ＣＯ及びＣＥを排泄するが、この際、融合蛋白質は天然のＡｐｏＡＩ同様、ＨＤＬ粒子として再利用されるか、もしくはエンドサイトーシスによって取り込まれ、分解を受ける。このような体内動態の過程で、上記融合蛋白質は、自身が有する治療用ペプチドの作用を標的組織で発揮する。
【００９０】
一方、上記融合蛋白質は、脂質と結合させた「脂質結合型」として使用することもできる。すなわち本発明は、上記融合蛋白質に脂質がさらに結合し、蛋白質・脂質複合体を形成している態様、換言すれば、上記融合蛋白質に脂質が結合してなる蛋白質・脂質複合体を含有する医薬、も包含する。
この蛋白質・脂質複合体は、脂質二重層の安定構造をとる。二重層を形成する脂質としては、一般的にはリン脂質であるが、その他にスフィンゴ脂質、糖脂質、アルキルホスホリピド、エーテル脂質、及びプラズマローゲン等がある。これらの内の１種類を使用するか、もしくは２種類以上を混合して使用する。適当なリン脂質としては、例えば、ＤＭＰＣ（dimyristoyl phosphatidylcholine）、ＤＭＰＧ（dimyristoyl phosphatidylglycerol）、ＰＯＰＣ（palmitoyloleoyl phosphatidylcholine）、ＤＰＰＣ（dipalmitoyl phosphatidylcholine）、ＤＰＰＳ（dipalmitoyl phosphatidylserine）、カルジオリピン、ＤＰＰＧ（dipalmitoyl phosphatidylglycerol）、ＤＳＰＧ（distearoyl phosphatidylglycerol）、ＤＳＰＣ（distearoyl phosphatidylcholine）、卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカチオン性リン脂質、等が使用可能である。これらのリン脂質用いて、例えば、「Reconstitution of High-Density Lipoproteins; Jonas A., Methods in Enzymology (1986) 128, 553-582」に記載の方法に従って、上記融合蛋白質とリン脂質との複合体（蛋白質・脂質複合体）を調製することができる。上記融合蛋白質は単独で、二重層を形成しない脂質と会合させてもよく、また融合蛋白質と上記のような二重層を形成するリン脂質との複合体に、さらに、二重層を形成しない脂質を含ませてもよい。このような二重層を形成しない脂質として、例えば、コレステロール、トリグリセリド、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン、オキシステロール、植物ステロール、エルゴステロール、シトステロール、カチオン系脂質、セレブロシド、スフィンゴシン、セラミド、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、オリアシルグリセロール、ガングリオシド、エーテル脂質、アルキルリン脂質、プラズマローゲン、プロスタグランジン、リゾリン脂質、等がある。
【００９１】
上記蛋白質・脂質複合体において、治療用ペプチドに対する分解酵素の阻害剤をさらに含ませてもよい。具体的には、脂質二重層の内部に当該阻害剤を封入することができる。なお、ＤＰＰＩＶのような蛋白質分解酵素に対する阻害剤は脂溶性のものが多く、この場合には、上記蛋白質・脂質複合体は当該阻害剤の好適な溶解剤となり得る。
【００９２】
同様に、上記蛋白質・脂質複合体において、第２の治療成分をさらに含ませてもよい。具体的には、脂質二重層の内部に当該第２の治療成分を封入することができる。
【００９３】
（投与方法、製剤化）
本発明の医薬の投与方法としては特に限定はなく、経口投与と非経口投与の両方が適用できる。非経口投与としては、静脈内、皮下、筋肉、局所、腹腔内、経皮、経鼻、経肺、等の各投与方法が挙げられる。好ましくは、経口投与と経粘膜投与（経肺投与等）が採用される。
【００９４】
ＡｐｏＡＩ（ＨＤＬ）受容体は、腸管上皮細胞、肺胞上皮細胞や血液脳関門にも存在することが知られている（Kolleck K. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (2002) 27, 57-63； Kozyraki R et al., J. Mol. Med. (2001) 79, 161-167； Goti D. et al., Eur. J. Neurochem. (2001) 76, 498-508）。また、腸管上皮細胞のモデル細胞であるＣａｃｏ−２培養細胞においてクラスリン依存型エンドサイトーシスでＨＤＬが細胞内へ侵入することが報告されている（Klinger A. et al., Biochim. Biophys. Acta. (1997) 1345， 65-70）。したがって、経口投与された上記融合蛋白質又は上記蛋白質・脂質複合体は、受容体を介して腸管上皮細胞へ侵入することが可能である。
【００９５】
細胞内に侵入した上記融合蛋白質又は上記蛋白質・脂質複合体は、中性脂質、他のアポリポ蛋白質とともにカイロミクロン（Chylomicron）様粒子、あるいは単独もしくは内在性ＡｐｏＡＩとともにＨＤＬ様粒子を形成する。上記融合蛋白質を含む、これらのカイロミクロン様もしくはＨＤＬ様粒子は、基底膜側へ分泌され、リンパ管に移行し、その後、胸管リンパ、鎖骨下静脈を経て血液大循環に入る。血中では、上記融合蛋白質は酵素反応によってカイロミクロン様粒子から遊離し、ＨＤＬ様粒子として循環する。以上のように、上記融合蛋白質又は上記蛋白質・脂質複合体は、注射薬のみならず経口薬としても使用可能である。
【００９６】
肺胞上皮細胞も、キュビリン依存的にＨＤＬ粒子を取込むことが示唆されている（Kolleck I. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (2002) 27, 57-63）。このことは、上記融合蛋白質又は上記蛋白質・脂質複合体が、経肺投与をもできる可能性を示す。
【００９７】
さらには、天然型ＨＤＬは受容体ＳＲ−ＢＩを介して血液脳関門を透過することが知られている（Balazs Z. et al., J. Neurochemistry (2004) 89, 939-950）。このことから、上記融合蛋白質又は上記蛋白質・脂質複合体は脳内においても作用可能であることを示す。
【００９８】
本発明の医薬の投与量は、有効成分となる治療用ペプチドの種類、投与経路、疾病の進行度や重篤度、投与対象者の年齢や体重、等により適宜設定することができる。
【００９９】
本発明の医薬は、薬学的に許容される担体と組み合わせたものであり得る。当該担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、滑剤、懸濁剤、分散剤、希釈剤、等が挙げられる。これらの担体は、公知のものがそのまま適用できる。
【０１００】
例えば、本発明の医薬を経口投与した場合、その大部分が胃内で容易にペプシンにより消化分解される可能性が高い。そのため、融合蛋白質の効果を十分に発揮させるには、胃での消化分解を免れるような製剤的な工夫、いわゆる腸溶化製剤により、融合蛋白質が腸まで届いて働くようにすることが好ましい。ＡｐｏＡＩ融合蛋白質を腸溶性にする製剤的な工夫としては、いくつかの方法が考えられる。例えば、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル或いは顆粒を腸溶性にするために被覆するコーティング剤としては、ｐＨ４以下の酸性条件では溶けにくく、ｐＨ５以上で溶解しやすいヒドロキシプロピルメチルセルローズフタレート、カルボキシメチルエチルセルローズ、酢酸フタール酸セルローズ、メタクリル酸コポリマーや、トウモロコシ由来の蛋白質であるツェイン（ゼイン）、や天然油脂由来のシェラックなどが適宜用いられる。或いは、単純に胃内のｐＨを高くしてペプシンが作用しなくなるようにしても実質的に有効である。
【０１０１】
（抗体産生）
動脈硬化の誘発、悪化の原因として、低密度リポ蛋白質（Low density lipoprotein；ＬＤＬ）を取り込んでコレステロールを蓄積し、泡沫化したマクロファージが、血管内皮細胞に集積することが考えられている。ＨＤＬは泡沫化マクロファージ（Macrophage foam cells）からコレステロールを引き抜く作用があり、組換えＡｐｏＡＩ、もしくはこれと同等機能を有する薬物を投与することで、動脈硬化を予防、治療できると考えられてきた（Scanu AM et al., FASEB J. (2008) 22, 4044-4054）。そのため、従来より、マクロファージとＡｐｏＡＩの相互作用が詳細に研究されてきた。上記融合蛋白質がマクロファージ内のエンドソームで分解されると、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に抗原提示される可能性があるが、ＡｐｏＡＩやＨＤＬがマクロファージに取り込まれてエンドソームで分解されるという事実はない。
ＡｐｏＡＩは主として、その受容体であるＡＢＣＡ１、ＳＲ−Ｂ１等を介して泡沫化マクロファージから蓄積したコレステロールを引き抜き、最終的に成熟ＨＤＬ粒子として肝臓へ運搬するコレステロール逆輸送（Reverse cholesterol transport）を担っている（Rothblat GH et al., Curr. Opin. Lipidol. (2010) 21(3), 229-238）。
以上のように、上記融合蛋白質がマクロファージで抗原提示される可能性はないので、上記融合蛋白質又は上記蛋白質・脂質複合体を投与した際に、治療用ペプチドに対する抗体が産生する可能性はない。このことから、本発明が提供する上記融合蛋白質又は上記蛋白質・脂質複合体は、安全に医薬品等として使用することが可能である。
【０１０２】
（機能性食品）
経口投与可能な実施形態に係る本発明の医薬は、そのまま機能性食品として利用することができる。すなわち本発明は、上記した融合蛋白質又は蛋白質・脂質複合体を含有する機能性食品も包含する。
【０１０３】
（融合蛋白質の組換え生産）
上記融合蛋白質は、ＡｐｏＡＩ又はその改変体をコードする遺伝子（核酸）と治療用ペプチドをコードする遺伝子（核酸）とが連結された融合遺伝子を発現させることにより、生産することができる。
ＡｐｏＡＩは肝臓及び小腸で産生されるため、ヒトＡｐｏＡＩ遺伝子は、ヒト肝臓や小腸由来のＲＮＡやｃＤＮＡライブラリーより調製することができる。治療用ペプチドの遺伝子も、当該ペプチドが発現している組織由来のＲＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーより調製できる。治療用ペプチドが４０アミノ酸程度である場合は、化学合成によっても、治療用ペプチドの遺伝子を調製することができる。
遺伝子同士の連結は、制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＰＣＲ等を使用した一般的な遺伝子操作法によって行うことができる。
融合蛋白質の遺伝子のコドンとして、それを発現させようとする宿主に適したものを使用すれば、宿主での大量発現が可能となる。融合遺伝子を宿主内で発現させる際には、例えば、融合遺伝子を宿主に適したプラスミド等の発現ベクターに挿入する。そして、発現ベクターを宿主内に導入する。宿主内において、融合遺伝子はプラスミド等のベクター上に存在しても良く、相同組み換え等によって染色体に組み込まれてもよい。
【０１０４】
一方、組換え蛋白質を生産する際に宿主プロテアーゼによって分解を受ける場合がしばしばある。このような場合は、分子シャペロンとの融合発現や共発現の手法を用いてもよい。特に、上記したＡｐｏＡＩの部分断片や模倣ペプチドは分子量が小さく、プロテアーゼによる分解を受けやすいので、分子シャペロンとの融合発現や共発現は有効である。分子シャペロンの例としては、ペプチジル・プロリル・シス−トランス・イソメラーゼ（Peptidyl prolyl cis-trans isomerase；ＰＰＩａｓｅ）(Maruyama t. et al., Front. Biosci. (2004) 9, 1680-1720）や、ＧｒｏＥＬ（バクテリアのＩ型シャペロニン）等の各種ヒートショックプロテイン（heat shock protein；ＨＳＰ）（Houry WA., Curr. Protein Pept. Sci. (2001) 2-3, 227-244）が挙げられる。
【０１０５】
ＡｐｏＡＩは糖鎖付加等の翻訳後修飾がない蛋白質である。そのため、治療用ペプチドが翻訳後修飾を必要としないものである場合は、細菌や酵母を宿主として用いることができる。細菌で発現させた組換え蛋白質のＮ末端にはメチオニンが付加されるが、これが融合蛋白質の機能を阻害するのであれば、酵母等の真核細胞を用いることが好ましい。真核生物で融合蛋白質を発現させる場合には、融合蛋白質配列の上流に適当なシグナル配列を設置して、融合蛋白質を分泌発現させることが好ましい。
治療用ペプチドの機能発現に糖鎖修飾等の天然に近い翻訳後修飾が必要な場合は、宿主として動物細胞を用いることが好ましい。
宿主の具体例としては、大腸菌、枯草菌、乳酸菌等の細菌；Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Phichia属等の酵母；Dorosophila S2、Spodoptera Sf9等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＯＳ、ＨＥＫ２９３、Bowes melanoma等の動物細胞が、それぞれ挙げられる。上記の他に、トウモロコシ、大豆等の組換え植物や、カイコ、ニワトリ、羊、牛等の組換え動物を宿主として使用してもよい。
【０１０６】
（融合蛋白質の精製）
融合蛋白質の単離と精製は、融合蛋白質を発現させた細胞や生物組織を破砕し、その上清又は沈殿物から行うことができる。上清に発現した場合は、イオン交換クロマト、疎水クロマト、逆相クロマト、ゲル濾過等の一般的な担体を用いるクロマトグラフィーによって分離精製が可能である。なお、脂質非結合型のＡｐｏＡＩは、硫安等の塩が存在しなくとも、フェニル基固定化担体に強く結合する（McGuire KA et al., J. Lipid Res. (1996) 37, 1519-1528）。したがって、この工程を精製過程に組み込むことで、融合蛋白質を効率良く精製することができる。
【０１０７】
融合蛋白質の末端にヒスチジンタグ等のアフィニティタグを付加して、アフィニティクロマトグラフィーによって精製してもよい。必要に応じて、アフィニティタグ配列の近隣に限定分解型プロテアーゼの切断配列を設置することで、アフィニティタグは、限定分解型のプロテアーゼによって切断できる。また、適当な２個程度のアミノ酸配列をアフィニティタグの近隣に付加することで、蟻酸等による化学的な分解によっても切断可能である。例えば、Ｃ末端方向にアスパラギン酸（Ｄ）、プロリン（Ｐ）が続く場合、これらのアミノ酸の間を蟻酸で効率良く切断することも可能である（Ryan RO et al., Protein  Exp. Purif. (2003) 27, 98-103）。
【０１０８】
融合蛋白質が沈殿画分に生産された場合、適当な濃度のグアニジン塩酸や尿素等の蛋白変性剤に溶解した後、これらの変性剤の存在下で、イオン交換クロマト、ゲル濾過等によって精製することができる。またヒスチジンタグが付与されている場合は、変性剤の存在下で金属キレートクロマトグラフィーを行うことが可能である。変性剤存在下である程度精製できた時点で適当な溶媒条件で、透析、希釈等の方法によってリフォールディングを行う。この時、１００〜５００ｍＭ程度のアルギニン塩酸塩を添加しておくと、効率良くリフォールディングが進行する。リフォールディング終了後、適当な緩衝液に透析した後、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びゲル濾過等の手法によって、融合蛋白質を精製することができる。
【０１０９】
精製された融合蛋白質は、透析等によって保存に適した緩衝液に溶解し、冷蔵保存又は冷凍保存できる。好ましくは、凍結乾燥後、冷蔵もしくは冷凍で保存する。
【０１１０】
本発明は、目的蛋白質に対してアポリポ蛋白質ＡＩ又はその改変体を連結する目的蛋白質の安定化方法、も包含する。目的蛋白質としては特に限定はなく、例えば、上述した治療用ペプチドがそのまま採用され得る。アポリポ蛋白質ＡＩの改変体についても同様である。
【０１１１】
本発明は、上記融合蛋白質を発現する組換え体を有効成分として含有する医薬又は機能性食品を包含する。すなわち、「融合蛋白質の組換え生産」の項で説明したように、本発明における融合蛋白質を発現する組換え体を作製することができる。この組換え体を、そのまま医薬や機能性食品の有効成分として利用することができる。好ましい実施形態において、前記組換え体は、前記融合蛋白質を表層に提示可能な微生物又は細胞であり、さらに好ましくは酵母である。
【０１１２】
発現した目的蛋白質を細胞表層に提示させる方法は、例えば、Molecular display technology using yeast-arming technology; Shibasaki S. et al., Anal. Sci. (2009) 25-1, 41-49 に記載されている。すなわち、αアグルチニン（Agglutinin）等の細胞間接着因子のＣ末端領域（Ａｇｇ−Ｃ）にはＧＰＩ（glycosyl phosphatidyl inositol）アンカー付着シグナルが存在する。上記融合蛋白質のＣ末端に、腸管プロテアーゼ切断配列、次いでＡｇｇ−Ｃを付加し、Ｎ末端に分泌シグナル配列を付加した組換え蛋白質を酵母に産生させると、トランスアミダーゼによるＧＰＩアンカー付着シグナル配列の切断反応を経て、目的蛋白質は酵母の細胞膜上にＧＰＩアンカーとの結合を介して蓄積する。その後、酵母の表層に存在するＰＩ-ＰＬＣ（Phosphatidyl inositol-specific-phospholipase C）によりＧＰＩアンカーとの結合は切断され、目的蛋白質は細胞壁の最外層に提示される。
このようにして作製された上記融合蛋白質を表層提示する酵母は、未破砕の状態で服用しても、腸管プロテアーゼの作用によって融合蛋白質が酵母の表層から遊離し、腸管上皮細胞から吸収され得る。
酵母以外の微生物・細胞としては、乳酸菌、枯草菌等の食品に使用されているものが好適に使用される。
【０１１３】
本発明の医薬又は機能性食品は、ヒト用に限定されず、ヒト以外の動物にも適用できる。
【０１１４】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１１５】
（１）ＧＬＰ−１／ＡｐｏＡＩ融合蛋白質（ＡＧＬ１）の発現と精製
ヒト肝臓ＲＮＡ（クロンテック社）、オリゴｄＴプライマー、及び配列番号３と配列番号４に示す各プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、成熟型ＡｐｏＡＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＡｐｏＡＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２４ａ（Novagen社）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に導入した。配列番号５と配列番号６で示す各合成ＤＮＡから得られる二本鎖ＤＮＡを、上記ベクターのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ切断部位に導入した。以上の工程によって、ＡｐｏＡＩとＧＬＰ−１との融合蛋白質（配列番号７，８）をコードする遺伝子（配列番号７）を有するプラスミドベクターｐＴ２４ＡＧＬ１を構築した。
【０１１６】
上記ｐＴ２４ＡＧＬ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Invitrogen社）に導入し、組換え体を作製した。この組換え体をＬＢ培地にて培養し、ＯＤ６００が０．６の時点で１ｍＭＩＰＴＧを添加し、Ｃ末端にヒスチジンタグが付加されたＡＧＬ１の発現を誘導し、さらに３７℃で５時間培養し、菌体を回収した。
【０１１７】
回収した菌体を６Ｍ ＧｄｍＨＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／２５ｍＭ イミダゾール（以下、「緩衝液Ａ」と称する。）に懸濁し、超音波破砕によって細胞を破砕した。細胞破砕後、４℃で一昼夜インキュベートした。得られた細胞破砕液に対して４００００ｇで１時間超遠心分離を行い、上清を得た。この上清を、予め緩衝液Ａで平衡化されたＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ社）と混合し、４℃で一昼夜インキュベートした。本混合液を２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを回収した。回収したビーズを、８Ｍ 尿素／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／２５ｍＭ イミダゾール（以下、「緩衝液Ｂ」と称する。）で２回洗浄した後、８Ｍ 尿素／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／１Ｍ イミダゾール（以下、「緩衝液Ｃ」と称する。）でＡＧＬ１を溶出した。溶出したＡＧＬ１画分を、０．４５Ｍ アルギニン塩酸塩／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（以下、「緩衝液Ｄ」と称する。）に対して４℃で一昼夜透析を行った。さらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１５Ｍ ＮａＣｌ（以下、「緩衝液Ｅ」と称する。）、次いで１０ｍＭ 重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．４）に対して透析を行い、アルギニンを除去した。透析内液を凍結乾燥し、融合蛋白質ＡＧＬ１の粉末を得た。
【０１１８】
得られたＡＧＬ１粉末とクロロホルム／メタノール（２／１）を３０分間、４℃で混合した後、７倍量のメタノールを添加し、８０００ｇで３０分間遠心分離を行い、上清を除去した後、真空乾燥を行った。乾燥物を３Ｍ Ｇｄｍ−ＨＣｌで溶解した後、緩衝液Ｄ、次いで緩衝液Ｅで透析を行った。透析内液に１ｍＭ ＥＤＴＡを添加した後、予め５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ（以下、「緩衝液Ｆ」と称する。）で平衡化されたＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ社）と混合し、ＡＧＬ１をビーズへ吸着させた。ビーズを緩衝液Ｆで洗浄後、さらに２０％ エチレングリコール／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した。洗浄したビーズに７５％ プロピレングリコール／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、ＡＧＬ１を溶出した。溶出されたＡＧＬ１溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し、精製ＡＧＬ１標品を得た。以上の精製過程のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１に示す。
【０１１９】
（２）脂質結合型ＡＧＬ１の調製と分散性の検定
クロロホルムに溶解させた１０ｍｇ／ｍＬの１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＭＰＣ；日本油脂社  ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−４０４０）溶液５００μＬを、ガラス管内で窒素ガスにより乾燥させた。その後、２ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、超音波によってＤＭＰＣを分散させ、白色懸濁液を得た。本ＤＭＰＣ懸濁液に、上記（１）で得られた１ｍｇ／ｍＬの精製ＡＧＬ１溶液２ｍＬを加えて混合し、室温で３時間以上放置し、清澄なＤＭＰＣ結合型ＡＧＬ１（脂質結合型ＡＧＬ１；蛋白質・脂質複合体）の溶液を得た。
【０１２０】
得られたＤＭＰＣ結合型ＡＧＬ１の分散性を、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって調べた（図２）。図２に示すように、ＤＭＰＣ結合型ＡＧＬ１（レーン４）は天然型ＨＤＬ（Biomedical Technologies社  ＃ＢＴ−９１４）（レーン２）と同様の均一粒子であることがわかった。また移動度の相違から、ＤＭＰＣ結合型ＡＧＬ１は、天然型ＨＤＬの１．５倍程度の粒径であると推測できた。また（１）で得られた脂質非結合型のＡＧＬ１（レーン３）も均一に分散しており、天然型ヒトＡｐｏＡＩ（Biomedical Technologies社  ＃ＢＴ−９２７）（レーン１）とＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいて同一の挙動を示すことも確認された。
図２中の数字は、分子量マーカー（中央のレーン）の各分子量（ｋＤａ）である。
【０１２１】
（３）ＡＧＬ１のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニスト活性
グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）遺伝子（Genbank No. NM002062）を、哺乳動物用発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ３（クロンテック社）のＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩサイトに導入し、発現ベクターｐＩＧＬＲを構築した。発現ベクターｐＩＧＬＲをＧ４１８の存在下でLipofectamine 2000（Invitrogen社）を用いてＣＨＯ−Ｋ１株に導入した。受容体ＧＬＰ−１Ｒの安定発現株は、６００μｇ／ｍＬのＧ４１８が含有された１０％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地で単離し、ＧＬＰ−１Ｒ安定発現株ＧＬＰ−１Ｒ／ＣＨＯを樹立した。
【０１２２】
上記ＧＬＰ−１Ｒ／ＣＨＯ及び「CatchPoint Cyclic-AMP Fluorescent Assay Kit」（Molecular Devices社：Ｒ８０８８）を用い、（１）で作製した脂質非結合型ＡＧＬ１（融合蛋白質）と、（２）で作製した脂質結合型ＡＧＬ１（蛋白質・脂質複合体）について、受容体アゴニスト活性を測定した（図３、図４）。実験操作は、Molecular Devices社のマニュアルに従って行った。コントロール試験として、天然型ＧＬＰ−１（ペプチド研究所社；４３４４−ｖ）をリガンドとする実験も行った。また、作用特異性の検定のために、ＧＬＰ−１ＲアンタゴニストであるExcendin (5-39)（ペプチド研究所：４３４５−ｖ）による阻害実験も行った（図４）。
【０１２３】
図３に示すように、脂質結合型ＡＧＬ１（■；＋ＤＭＰＣ）のＥＣ５０値は６．１ｎＭ、脂質非結合型ＡＧＬ１（○；−ＤＭＰＣ）のＥＣ５０値は４．５ｎＭであった。シングルナノモルオーダーの濃度で機能することから、脂質結合型ＡＧＬ１と脂質非結合型ＡＧＬ１は、いずれも医薬として使用可能であることがわかった。
また、図４に示すように、ＡＧＬ１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性は、ＧＬＰ−１ＲアンタゴニストであるExcendin (5-39)によってほぼ完全に阻害されることがわかった。このことから上記アゴニスト活性は、天然型ＧＬＰ−１と同様の、ＡＧＬ１の特異的作用によることが証明された。
【０１２４】
（４）ＡＧＬ１のプロテアーゼ耐性
５０μＬのＰＢＳ溶液中で、天然型ＧＬＰ−１（ペプチド研究所社；４３４４−ｖ）又は（１）で作製した脂質非結合型ＡＧＬ１に、３ｍＵ（１０-6Ｍ濃度）のヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）を３７℃で３時間反応させた。その後、（３）と同様の方法で、受容体アゴニスト活性を測定した（図５、図６）。
図５に示すように、天然型ＧＬＰ−１は、ＤＰＰＩＶ処理によってＥＣ５０値が２．６×１０-11Ｍ（●；−ＤＰＰＩＶ）から９．７×１０-10Ｍ（○；＋ＤＰＰＩＶ）に明らかに上昇した。一方、図６に示すように、ＡＧＬ１は、ＥＣ５０値がＤＰＰＩＶ未処理（▲；−ＤＰＰＩＶ）では２．２×１０-9Ｍ（２．２ｎＭ）、ＤＰＰＩＶ処理後（△；＋ＤＰＰＩＶ）では１．７×１０-9Ｍ（１．７ｎＭ）であり、殆ど変化しなかった。このことは、天然型ＧＬＰ−１はＤＰＰＩＶ感受性が極めて高いのに対し、ＡＧＬ１はＤＰＰＩＶ感受性が殆どないことを示していた。以上より、ＧＬＰ−１にＡｐｏＡＩを融合させることによって、ＧＬＰ−１にプロテアーゼ耐性を付与できることが示された。
【０１２５】
（２）で調製したＤＭＰＣ結合型ＡＧＬ１（脂質結合型ＡＧＬ１）についても、同様にしてプロテアーゼ耐性を評価した（図７）。図７に示すように、ＥＣ５０値がＤＰＰＩＶ未処理（▲；−ＤＰＰＩＶ）では２．３×１０-9Ｍ（２．３ｎＭ）、ＤＰＰＩＶ処理後（△；＋ＤＰＰＩＶ）では３．９×１０-9Ｍ（３．９ｎＭ）であり、ＤＭＰＣ結合型の場合でもＥＣ５０値は殆ど変化しなかった。これにより、脂質結合型ＡＧＬ１も、脂質非結合型ＡＧＬ１と同様に、プロテアーゼ耐性を獲得したことが判明した。
【０１２６】
以上より、ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩとの融合蛋白質であるＡＧＬ１が、in vivoにおいて作用が長期間に渡って持続するＧＬＰ−１Ｒ作動薬として使用可能であることが示された。
【０１２７】
（５）ＡＧＬ１のマウスでの血糖上昇抑制効果の検証
７週齢のマウス（雄：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を、被験物質投与前日より１６時間以上絶食させた。被験物質を尾静脈から投与後（１ｍｇ／ｋｇ）して３０分後に、２０％グルコース溶液（大塚製薬）を経口投与（１０ｍＬ／ｋｇ）した。経口投与後１０、３０、６０および１２０分の時点で尾静脈から約５０μＬ採血した。グルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬）を用いて血漿中グルコース濃度を測定した。被験物質としては、
Ａ：１×ＰＢＳ（インビトロジェン社）
Ｂ：天然型ヒトＡｐｏＡＩ（Biomedical Technologies社；＃ＢＴ−９２７）
Ｃ：天然型ヒトＨＤＬ（Biomedical Technologies社；＃ＢＴ−９１４）
Ｄ：ＤＭＰＣ非結合型ＡＧＬ１
Ｅ：ＤＭＰＣ結合型ＡＧＬ１
の５種類を用いた。被験物質Ｂ〜Ｅは、全て１×ＰＢＳ（インビトロジェン社）に対して透析したものを使用した。各試験群につきマウス８匹を用い、Ａ投与群とその他の群との間で、それぞれstudentのｔ−検定により平均値の差の検定を行った。有意差の検定は，有意水準を両側５％として行った。統計学的検定はＥＸＳＵＳ（Version 7.7.1，SAS Institute Japan Inc.）を用いて行った。結果を図８に示す。
【０１２８】
図８に示すように、天然型ヒトＡｐｏＡＩ投与群（○）と天然型ヒトＨＤＬ投与群（●）では全く血糖上昇抑制効果は見られなかったが、ＤＭＰＣ結合型ＡＧＬ１投与群（▲）とＤＭＰＣ非結合型ＡＧＬ１投与群（△）の双方で、糖負荷３０分以後に有意な血糖上昇抑制効果が見出された（Ｐ＜０．０１）。
【０１２９】
以上より、ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩとの融合蛋白質であるＡＧＬ１が、in vivoで血糖上昇抑制効果を有し、糖尿病治療薬として使用可能であることが示された。
【０１３０】
（６）ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩ部分断片の融合ペプチド（ＡＣＧＬ１）の発現と精製
（１）で作製したｐＴ２４ＡＧＬ１を鋳型として、配列番号１７と配列番号１８に示す各プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｐｏＡＩのＣ末端領域（配列番号１のアミノ酸番号２０９〜２４１の部分）に相当する遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅させた。得られたＤＮＡ断片をpT7Blue-T vector（タカラバイオ社）にクローニングした後、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出した。切り出したＤＮＡ断片を、ｐＴ２４ＡＧＬ１のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入し、ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩのＣ末端部分との融合ペプチド（ＡＣＧＬ１）をコードする発現ベクターｐＴ２４ＡＣＧＬ１を作製した。
【０１３１】
一方、配列番号１９に示したThermococcus sp KS-1株由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫ）遺伝子（GenBank No. AB012209）に相当する合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２０及び配列番号２１に示す各プライマーを用いてＰＣＲを行い、pT7Blue-T vectorへクローニングした。ＴｃＦＫ遺伝子をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切り出し、ｐＥＴ２４ａ(ノバジェン社)のＮｄｅＩ−ＳａｃＩ部位へ挿入し、ｐＴ２４ＴｃＦＫを構築した。
【０１３２】
ｐＴ２４ＡＣＧＬ１を鋳型とし、配列番号２２及び配列番号２３に示す各プライマーを用いてＰＣＲを行ってＡＣＧＬ１遺伝子を増幅し、pT7Blue-T vectorに導入後、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切り出した。切り出したＡＣＧＬ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＴ２４ＴｃＦＫのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ＴｃＦＫとＡＣＧＬ１との融合蛋白質（ＦＫＡＣＧＬ１）をコードするｐＴ２４ＦＫＡＣＧＬ１を構築した。ＦＫＡＣＧＬ１（２７ｋＤａ）の遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号２４に、アミノ酸配列のみを配列番号２５に示す。なお配列番号２４，２５に示すように、ＦＫＡＣＧＬ１のＣ末端には６残基からなるヒスチジンタグが付加されている。
【０１３３】
上記ｐＴ２４ＦＫＡＣＧＬ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Invitrogen社）に導入し、組換え体を作製した。この組換え体を２ＸＹ．Ｔ培地にて２６℃で４０時間培養した。回収した菌体を「緩衝液Ａ」に懸濁し、超音波破砕によって細胞を破砕した。細胞破砕後、４℃で一昼夜インキュベートした。得られた細胞破砕液に対して４００００ｇで１時間超遠心分離を行い、上清を得た。この上清を、予め緩衝液Ａで平衡化されたＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ社）と混合し、４℃で一昼夜インキュベートした。本混合液を２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを回収した。回収したビーズを「緩衝液Ｂ」で２回洗浄した後、「緩衝液Ｃ」でＦＫＡＣＧＬ１を溶出した。溶出したＦＫＡＣＧＬ１画分を、「緩衝液Ｄ」に対して４℃で一昼夜透析を行った。さらに「緩衝液Ｅ」、脱イオン水で透析を行った。
【０１３４】
６ｍＬの透析内液に、臭化シアン１００ｍｇを溶解させた蟻酸を１４ｍＬ添加し、窒素雰囲気下で室温・暗所で１６時間インキュベートした。臭化シアンによる断片化処理したＦＫＡＣＧＬ１溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ２．８に調整した後、２Ｍトリス塩酸溶液に対して２回透析を行った。透析内液へ終濃度８Ｍになるように尿素を溶解させ、ｐＨ７．８に調整した。本溶液を「緩衝液Ａ」で平衡化されたＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ社）と混合し、４℃で一昼夜インキュベートした。本混合液を２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを回収した。回収したビーズを、「緩衝液Ｂ」で２回洗浄した後、「緩衝液Ｃ」でＴｃＦＫから遊離したＡＣＧＬ１を溶出した。ＡＣＧＬ１溶液を「緩衝液Ｄ」に対して、一昼夜４℃で透析した後、さらにＰＢＳに対して５回透析を行った。
各精製工程における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＧＬＰ−１抗体（フナコシ社：ABB-2506-69）を用いたウエスターンブロッティングの結果を、それぞれ図９と図１０に示す。
【０１３５】
（７）脂質結合型ＡＣＧＬ１の調製と分散性の検定
（６）で得られたＡＣＧＬ１と、その１倍、２．５倍、又は１０倍重量のＤＭＰＣを混合し、ＡＣＧＬ１及びＤＭＰＣの複合体形成を調べた。具体的には、クロロホルムに溶解させた２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、又は２０ｍｇ／ｍＬのＤＭＰＣ溶液２５０μＬを、ガラス管内で窒素ガスにより乾燥させた。その後、１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、超音波によってＤＭＰＣを分散させ、白色懸濁液を得た。本ＤＭＰＣ懸濁液に、上記（６）で得られた０．５ｍｇ／ｍＬの精製ＡＣＧＬ１溶液１ｍＬを加えて混合し、室温で３時間以上放置した。これにより、ＤＭＰＣ結合型ＡＣＧＬ１（脂質結合型ＡＣＧＬ１）が得られた。得られたＤＭＰＣ結合型ＡＣＧＬ１の分散性を、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって調べた（図１１）。図１１のレーン３に示されるように、２．５倍重量のＤＭＰＣと混合させたＡＣＧＬ１は、ＤＭＰＣ結合型ＡＧＬ１（図２のレーン４参照）と同様の分子量２５０ｋＤａ程度の均一粒子を形成していることがわかった。
【０１３６】
（８）ＡＣＧＬ１のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニスト活性
（６）で調製されたＡＣＧＬ１（脂質非結合型ＡＣＧＬ１）と（７）で調製された脂質結合型ＡＣＧＬ１について、（３）と同様の方法で、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を測定した（図１２）。またExendin (5-39)を用いた阻害実験も同様にして行った（図１３）。
図１２に示すように、天然型ＧＬＰ−１（●）のＥＣ５０値が２．７×１０-11Ｍであったのに対し、脂質結合型ＡＣＧＬ１（◆；＋ＤＭＰＣ）のＥＣ５０値は１．４×１０-9Ｍ（１．４ｎＭ）、脂質非結合型ＡＣＧＬ１（○；−ＤＭＰＣ）ＥＣ５０値は２．７×１０-9Ｍ（２．７ｎＭ）であった。いずれもシングルナノモルオーダーの濃度で機能することから、脂質結合型ＡＣＧＬ１と脂質非結合型ＡＣＧＬ１は、いずれも医薬として使用可能であることがわかった。
【０１３７】
また図１３に示すように、脂質非結合型ＡＣＧＬ１（●）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性（ＥＣ５０＝１．１ｎＭ）は、ＧＬＰ−１ＲアンタゴニストであるExendin (5-39)によって著しく抑制された（○）。このことから、上記アゴニスト活性は、天然型ＧＬＰ−１と同様の、ＡＣＧＬ１の特異的作用によることが証明された。
【０１３８】
（９）ＡＣＧＬ１のプロテアーゼ耐性
（６）で調製されたＡＣＧＬ１（脂質非結合型ＡＣＧＬ１）と（７）で調製された脂質結合型ＡＣＧＬ１について、（４）と同様の方法で、ＤＰＰＩＶ耐性を調べた（図１４、図１５）。図１４に示すように、天然型ＧＬＰ−１は、ＤＰＰＩＶ処理によってＥＣ５０値は２．２×１０-11Ｍ（●：−ＤＰＰＩＶ）から１．１×１０-9Ｍ（○：＋ＤＰＰＩＶ)に明らかに上昇した。一方、ＡＣＧＬ１は、ＥＣ５０値がＤＰＰＩＶ未処理（▲；−ＤＰＰＩＶ）では３．１×１０-9Ｍ（３．１ｎＭ）、ＤＰＰＩＶ処理後（△；＋ＤＰＰＩＶ）では２．３×１０-9Ｍ（２．３ｎＭ）であり、殆ど変化しなかった。このことは、ＡｐｏＡＩの部分断片配列と融合させたＧＬＰ−１も、ＡＧＬ１と同様に、ＤＰＰＩＶ耐性を獲得したことを示していた。以上より、ＧＬＰ−１にＡｐｏＡＩ部分断片を融合させることによって、ＧＬＰ−１にプロテアーゼ耐性を付与できることが示された。
【０１３９】
また図１５に示すように、ＤＭＰＣ結合型ＡＣＧＬ１についても、ＥＣ５０値がＤＰＰＩＶ未処理（▲；−ＤＰＰＩＶ）では２．８×１０-9Ｍ（２．８ｎＭ）、ＤＰＰＩＶ処理後（△；＋ＤＰＰＩＶ）では２．２×１０-9Ｍ（２．２ｎＭ）であり、ＤＭＰＣ結合型の場合でもＥＣ５０値は殆ど変化しなかった。このことは、ＤＭＰＣ結合型ＡＣＧＬ１も、ＤＭＰＣ非結合型ＡＣＧＬ１と同様にＤＰＰＩＶ耐性を獲得したことを示していた。
【０１４０】
以上より、ＧＬＰ−１とＡｐｏＡＩ部分断片との融合ペプチドであるＡＣＧＬ１が、in vivoにおいて作用が長期間に渡って持続するＧＬＰ−１Ｒ作動薬として使用可能であることが示された。
【図３】
2014132832.tif 000003
【図４】
2014132832.tif 000004
【図５】
2014132832.tif 000005
【図６】
2014132832.tif 000006
【図７】
2014132832.tif 000007
【図８】
2014132832.tif 000008
【図１２】
2014132832.tif 000009
【図１３】
2014132832.tif 000010
【図１４】
2014132832.tif 000011
【図１５】
2014132832.tif 000012
【図１】
2014132832.tif 000013
【図２】
2014132832.tif 000014
【図９】
2014132832.tif 000015
【図１０】
2014132832.tif 000016
【図１１】
2014132832.tif 000017
【配列表】
2014132832000001.app