(57)【要約】【課題】新生物治療用の大型生物学的作用剤は、腫瘍内の間質圧力及び／又は血管透過性の低下により制限を受ける場合がある。【解決手段】対象体の増殖性障害を治療する方法であって、対象体の間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させること、及び腫瘍崩壊性ウイルスを対象体に投与することを含む方法が本明細書に提供される。そのような方法は、腫瘍崩壊性ウイルスの送達及び分布を向上させる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象体の増殖性障害を治療するための方法であって、
（ａ）前記対象体の間質圧力を減少させるステップと、
（ｂ）１つ又は複数の腫瘍崩壊性ウイルスを前記対象体に投与するステップとを含む方法。
【請求項２】
およそ１０３〜１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）の前記腫瘍崩壊性ウイルスが前記対象体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
およそ１０８〜１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）の前記腫瘍崩壊性ウイルスが前記対象体に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
およそ１０８〜１０１２ＴＣＩＤ５０の前記腫瘍崩壊性ウイルスが前記対象体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）が、間質圧力を減少させる作用剤を前記対象体に投与することにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
およそ５〜１０００ｍｇ／ｍ２の前記間質圧力を減少させる作用剤が、前記対象体に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
体重１ｋｇ当たりおよそ０．００１〜１０，０００ｍｇの前記間質圧力を減少させる作用剤が、前記対象体に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記間質圧力を減少させる作用剤が血管透過性を増加させる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記間質圧力を減少させる作用剤がタキサンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記タキサンが、ラロタキセル、パクリタキセル、及びドセタキセルからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
およそ４０〜３００ｍｇ／ｍ２の前記タキサンが前記対象体に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
およそ１３０〜２２５ｍｇ／ｍ２の前記タキサンが前記対象体に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
およそ１７５〜２００ｍｇ／ｍ２の前記パクリタキセルが前記対象体に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記作用剤が、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターフェロン−Ｋ（ＩＦＮ−Ｋ）、サブスタンスＰ、プロティナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ニトログリセリン、セロトニン、血漿キニン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、ヒスタミン、イマチニブ、閉鎖帯毒素（ＺＯＴ）、インターロイキン−２、一酸化窒素阻害剤、及びヒト成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロティナーゼ阻害剤が、Ｎ−アルファ−トシル−Ｌ−リシル−クロロメチル−ケトン（ＴＬＣＫ）、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、又はロイペプチンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記血漿キニンがブラジキニンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記一酸化窒素阻害剤が、Ｌ−Ｎ−モノメチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）又はＬ−Ｎ−ニトロ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）が、低カルシウムイオン濃度液体を前記対象体に投与することにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記液体が、５０Ｔｍｏｌ／Ｌ〜２００Ｔｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン濃度を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）が、増殖性障害の部位又はその付近の過剰間質液を除去することにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記過剰間質液が、人工リンパ系（ＡＬＳ）により除去される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）が、透過化光線力学療法用薬剤を前記対象体に投与することにより実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）が、ステップ（ｂ）と同時に、ステップ（ｂ）の前に、又はステップ（ｂ）の後で実施される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記間質圧力を減少させる作用剤が、前記腫瘍崩壊性ウイルスの前に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項２５】
前記作用剤が、前記腫瘍崩壊性ウイルスの１〜１２時間前に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスが複数回投与で投与される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記間質圧力を減少させる作用剤が複数回投与で投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項２８】
炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤を前記対象体に投与するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
前記作用剤が炎症促進性サイトカインを阻害するが、ＮＡＲＡの産生を阻害しないか又は最小限にしか阻害しない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤が白金化合物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記白金化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
およそ５〜１０００ｍｇ／ｍ２の前記白金化合物が前記対象体に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
１分当たり２〜７ｍｇ／ｍＬ（ＡＵＣ）の前記カルボプラチンが前記対象体に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
１分当たり５〜６ｍｇ／ｍＬ（ＡＵＣ）の前記カルボプラチンが前記対象体に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記間質圧力を低下させる作用剤がパクリタキセルであり、前記炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤がカルボプラチンであり、前記腫瘍崩壊性ウイルスがレオウイルスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記間質圧力を減少させる作用剤が、前記腫瘍崩壊性ウイルス投与の４時間前の時点で最初に投与され、前記炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤が、前記腫瘍崩壊性ウイルス投与の１時間前の時点で２番目に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスが、前記二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を阻害しないように１つ又は複数の突然変異又は欠失を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍崩壊性ウイルスが、レオウイルス、シンドビスウイルス、Ｄｅｌｔａ２４、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）、ワクシニアウイルス、脳炎ウイルス、帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、及び麻疹ウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記レオウイルスが哺乳動物レオウイルスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記レオウイルスがヒトレオウイルスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒトレオウイルスが、血清型１レオウイルス、血清型２レオウイルス、及び血清型３レオウイルスからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヒトレオウイルスが、血清型３レオウイルスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記レオウイルスが、ＩＤＡＣ寄託番号１９０９０７−０１を有する、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間質圧力の調節並びに腫瘍崩壊性ウイルスの送達及び分布に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍崩壊性ウイルス療法は、ウイルスが大型分子であり、効果的な送達の支援は溶媒牽引に依存するものの、これらの作用剤が、腫瘍標的中で自身を複製し増幅することができ、標的細胞を溶解し、子孫を放出し、隣接する細胞を再び標的とするという意味で特有である。したがって、腫瘍崩壊性ウイルスは、腫瘤全体にわたる送達のための対流に対する完全な依存性を軽減する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Martin et al., Immunology 64(2):301-5 (1988)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
対象体の増殖性障害を治療する方法であって、対象体の間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させること、及び対象体に腫瘍崩壊性ウイルスを投与することを含む方法が本明細書に提供される。そのような方法は、腫瘍崩壊性ウイルスの送達及び分布を向上させる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つ又は複数の態様の詳細は、添付の図面及び下記の説明に示されている。他の特徴、目的、及び利点は、下記の説明、図面、及び特許請求の範囲から明白になろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】Ｂ１６．Ｆ１０細胞に対するレオウイルス及びラパマイシンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を示すグラフである。細胞（１ウエル当たり５×１０３個）を９６ウエルプレートに播種し、終夜接着させた。培地を、以前に決定したＥＤ５０の２、１、０．５、及び０．２５倍に対応する２倍希釈のラパマイシン及び／又はレオウイルスで置換し、新鮮な培地で希釈し、インキュベーションを４８時間継続させた。その後、培地を取り除き、未処理細胞と比較した細胞生存のパーセントをＭＴＳアッセイを使用して決定した。
【図１Ｂ】Ｂ１６．Ｆ１０細胞に対するレオウイルス及びラパマイシンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を示すグラフである。細胞（１ウエル当たり５×１０３個）を９６ウエルプレートに播種し、終夜接着させた。培地を、以前に決定したＥＤ５０の２、１、０．５、及び０．２５倍に対応する２倍希釈のラパマイシン及び／又はレオウイルスで置換し、新鮮な培地で希釈し、インキュベーションを４８時間継続させた。その後、培地を取り除き、未処理細胞と比較した細胞生存のパーセントをＭＴＳアッセイを使用して決定した。
【図１Ｃ】Ｂ１６．Ｆ１０細胞に対するレオウイルス及びラパマイシンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を示すグラフである。細胞（１ウエル当たり５×１０３個）を９６ウエルプレートに播種し、終夜接着させた。培地を、以前に決定したＥＤ５０の２、１、０．５、及び０．２５倍に対応する２倍希釈のラパマイシン及び／又はレオウイルスで置換し、新鮮な培地で希釈し、インキュベーションを４８時間継続させた。その後、培地を取り除き、未処理細胞と比較した細胞生存のパーセントをＭＴＳアッセイを使用して決定した。
【図２Ａ】レオウイルス及びラパマイシンがｉｎ  ｖｉｖｏで相乗効果を示すことを示すグラフである。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下播種し、１及び４日目に腫瘍内レオウイルスＴ３Ｄ  ５×１０８ＴＣＩＤ５０及び１、４、８、１２日目に腹腔内ラパマイシン  ５ｍｇ／ｋｇの単独又は組み合わせのいずれかで、又は対照治療（腫瘍内ＰＢＳ、腹腔内ＰＢＳ）で治療した。図２Ａは、レオウイルス及びラパマイシンで治療したＣ５７Ｂｌ／ｇマウスのＢ１６．Ｆ１０腫瘍の平均腫瘍直径を示すグラフである。図２Ｂは、レオウイルス及びラパマイシンで治療したＢ１６．Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ／ｇマウスの生存データを示すグラフである。
【図２Ｂ】レオウイルス及びラパマイシンがｉｎ  ｖｉｖｏで相乗効果を示すことを示すグラフである。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下播種し、１及び４日目に腫瘍内レオウイルスＴ３Ｄ  ５×１０８ＴＣＩＤ５０及び１、４、８、１２日目に腹腔内ラパマイシン  ５ｍｇ／ｋｇの単独又は組み合わせのいずれかで、又は対照治療（腫瘍内ＰＢＳ、腹腔内ＰＢＳ）で治療した。図２Ａは、レオウイルス及びラパマイシンで治療したＣ５７Ｂｌ／ｇマウスのＢ１６．Ｆ１０腫瘍の平均腫瘍直径を示すグラフである。図２Ｂは、レオウイルス及びラパマイシンで治療したＢ１６．Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ／ｇマウスの生存データを示すグラフである。
【図３】Ｔｒｅｇ欠乏＋ＩＬ−２が、皮下腫瘍へのレオウイルスの全身性送達を増強することを示すグラフである。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに皮下Ｂ１６腫瘍を播種した。９日後、マウスは、抗ＣＤ２５抗体ＰＣ−６１又は対照ＩｇＧの腹腔内注射を受容した。２４時間後、７５，０００単位／注射の用量で１日３回３日間、ＰＢＳ又は組換えヒトＩＬ−２をマウスに腹腔内注射した。４日目に、ＩＬ−２を単回注射でさらに投与した。この最後のＩＬ−２／ＰＢＳ注射の２時間後、マウスは、レオウイルス（３．７５×１０９ＴＣＩＤ５０）を静脈注射で受容し、その２４時間後に第２の注射で同様にウイルスを受容した。７２時間後、腫瘍を外植及び分離し、示されているように治療したマウスに由来する腫瘍の凍結／解凍溶解産物から回収したウイルス力価を決定した（１群当たり３匹のマウス）。
【図４Ａ】ＩＬ−２及びより低用量レオウイルスによるＣＰＡ媒介性Ｔｒｅｇ修飾が、定着腫瘍に対して治療的であることを示すグラフである。図４Ａの場合、皮下Ｂ１６腫瘍をＣ５７Ｂｌ／６マウスに播種した。９日後、マウスは、ＣＰＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）又は抗ＣＤ２５抗体ＰＣ−６１又はＰＢＳのいずれかを腹腔内注射で受容した。２４時間後、７５，０００単位／注射の用量で１日３回３日間、ＰＢＳ又は組換えヒトＩＬ−２をマウスに腹腔内注射した。４日目に、ＩＬ−２を単回注射でさらに投与した。この最後のＩＬ−２／ＰＢＳ注射の２時間後、マウスは、最大達成可能用量より低い１×１０８ＴＣＩＤ５０のレオウイルスを静脈注射で受容し、その２４時間後に第２の注射で同様にウイルスを受容した。腫瘍播種後の経時的なマウスの生存（腫瘍の任意の直径が１．０ｃｍ未満）が示されている（１群当たりｎ＝７）。レオウイルス単独（生存中央値、２１日）、ＣＰＡ／ＩＬ−２（２３日）、ＰＣ−６１／レオウイルス（２２日）、又はＣＰＡ／レオウイルス（２１日）で治療した群の生存期間中央値には、互いに有意差はなく、これらの治療はいずれも、いかなる長期生存マウスをもたらさなかった。ＩＬ−２／レオウイルス（２５日）、ＰＣ−６１／ＩＬ−２／レオウイルス（２４日）、又はＣＰＡ／ＩＬ−２／レオウイルス（２５日）で治療した群の生存期間中央値は、これら他の群より有意に長期間だった（Ｐ＝０．０４）。ＰＣ−６１／ＩＬ−２／レオウイルス又はＣＰＡ／ＩＬ−２／レオウイルスによる治療は、長期生存に結びつき、これらは両方とも有意により治療的だった。＊＊、Ｐ＜０．０１。図４Ｂは、図４Ａに記載されているように、マウスにウイルスを最後に注射した７〜１０日後のマウスから回収した血清中の、レオウイルスに対する中和抗体を示すグラフである。
【図４Ｂ】ＩＬ−２及びより低用量レオウイルスによるＣＰＡ媒介性Ｔｒｅｇ修飾が、定着腫瘍に対して治療的であることを示すグラフである。図４Ａの場合、皮下Ｂ１６腫瘍をＣ５７Ｂｌ／６マウスに播種した。９日後、マウスは、ＣＰＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）又は抗ＣＤ２５抗体ＰＣ−６１又はＰＢＳのいずれかを腹腔内注射で受容した。２４時間後、７５，０００単位／注射の用量で１日３回３日間、ＰＢＳ又は組換えヒトＩＬ−２をマウスに腹腔内注射した。４日目に、ＩＬ−２を単回注射でさらに投与した。この最後のＩＬ−２／ＰＢＳ注射の２時間後、マウスは、最大達成可能用量より低い１×１０８ＴＣＩＤ５０のレオウイルスを静脈注射で受容し、その２４時間後に第２の注射で同様にウイルスを受容した。腫瘍播種後の経時的なマウスの生存（腫瘍の任意の直径が１．０ｃｍ未満）が示されている（１群当たりｎ＝７）。レオウイルス単独（生存中央値、２１日）、ＣＰＡ／ＩＬ−２（２３日）、ＰＣ−６１／レオウイルス（２２日）、又はＣＰＡ／レオウイルス（２１日）で治療した群の生存期間中央値には、互いに有意差はなく、これらの治療はいずれも、いかなる長期生存マウスをもたらさなかった。ＩＬ−２／レオウイルス（２５日）、ＰＣ−６１／ＩＬ−２／レオウイルス（２４日）、又はＣＰＡ／ＩＬ−２／レオウイルス（２５日）で治療した群の生存期間中央値は、これら他の群より有意に長期間だった（Ｐ＝０．０４）。ＰＣ−６１／ＩＬ−２／レオウイルス又はＣＰＡ／ＩＬ−２／レオウイルスによる治療は、長期生存に結びつき、これらは両方とも有意により治療的だった。＊＊、Ｐ＜０．０１。図４Ｂは、図４Ａに記載されているように、マウスにウイルスを最後に注射した７〜１０日後のマウスから回収した血清中の、レオウイルスに対する中和抗体を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
新生物治療用の大型生物学的作用剤は、腫瘍内の間質圧力及び／又は血管透過性の低下により制限を受ける場合がある。さらに、組織における低分子（つまり、ＭＷが４０００Ｄａ）の受動輸送の最も重要な様式は、拡散であると考えられるが、大型タンパク質（ＭＷ＞４０，０００Ｄａ）の運動に関する主要な機序は、典型的には対流又は溶媒牽引である。
【０００８】
腫瘤内の間質圧力は、動静脈圧力差並びに血流に対する幾何学的抵抗及び粘性抵抗に依存する微小血管圧力（ＭＶＰ）増加の結果（つまり血管径を減少させる固形腫瘍の増殖により血管に引き起こされる物理的ストレスの関数である血管径減少の結果）であり得る。そのため、腫瘍内環境は、間質圧力の増加及び／又は血管透過性の減少に帰着する環境であり、大型分子の送達を阻害する場合がある。
【０００９】
腫瘍の静水圧を減少させる作用剤は、腫瘤外側の静水圧が腫瘍自体の静水圧よりも高い可能性のある状況を作り出す。この状況は、腫瘍崩壊性ウイルスなどの大型分子の送達を支援する。したがって、対象体の増殖性障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象体の間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させること、並びに治療を必要とする対象体に腫瘍崩壊性ウイルスを投与することを含む方法が本明細書で提供される。腫瘍崩壊性ウイルスは、対象体の間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させると同時に、その前に、又はその後で投与してもよい。
【００１０】
対象体の間質圧力は、間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤により低下させてもよい。このように、間質圧力を減少させる作用剤は、同様に血管透過性を増加させてもよい。或いは、間質圧力を減少させる作用剤は、血管透過性を増加させる作用剤と組み合わせて使用することができる。
【００１１】
提供されている方法で使用するに好適な作用剤にはタキサンが含まれる。提供されている方法で使用するための好適なタキサンには、これらに限定されないが、タキソール（パクリタキセル）、ラロタキセル、及びタキソテール（ドセタキセル）が含まれる。他の作用剤には、これらに限定されないが、バソプレシン；ＴＮＦ；インターロイキン−１（ＩＬ−１）；インターフェロン−Ｋ（ＩＦＮ−Ｋ）；サブスタンスＰ；Ｎ−アルファ−トシル−Ｌ−リシル−クロロメチル−ケトン（ＴＬＣＫ）、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、及びロイペプチンなどのプロティナーゼ阻害剤；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ニトログリセリン；セロトニン；ブラジキニンなどの血漿キニン；血小板活性化因子（ＰＡＦ）；プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）；ヒスタミン；イマチニブ；閉鎖帯毒素（ＺＯＴ、zona occludens toxin）；インターロイキン−２；Ｌ−Ｎ−モノメチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）及びＬ−Ｎ−ニトロ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）などの一酸化窒素阻害剤；及びゲフィチニブなどのヒト成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤が含まれる。Martin et al., Immunology 64(2):301-5 (1988)；Zhou et al., Radiat. Res. 168(3):299-307 (2007)；Watanabe et al., Inflammation Research 17(5-6):472-7 9 (1986)；米国特許出願公開第２００５／０１０１５５９号明細書；Moasser et al., J. Magn. Reson. Imaging 26(6):1618-25 (2007)；及びVlahovic et al., Br. J. Cancer 97(6):735-40 (2007)を参照されたい。これらは、少なくともそこに記載されている作用剤及び作用剤の作製法及び使用法に関して、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００１２】
対象体の間質圧力は、細胞外カルシウムイオン濃度を低下させることにより減少させてもよい。低細胞外カルシウムイオン濃度状態を使用して、血管透過性を増強することもできる。例えば、低カルシウムイオン濃度液体を、腫瘍崩壊性ウイルスが投与される組織の脈管構造を通して灌流させることができる。好適な灌流液カルシウムイオン濃度は、約４０又は５０Ｔｍｏｌ／Ｌから約５００Ｔｍｏｌ／Ｌまで、より好ましくは約５０Ｔｍｏｌ／Ｌから約２００Ｔｍｏｌ／Ｌまでに及んでいてもよい。約５０Ｔｍｏｌ／Ｌの灌流液カルシウム濃度が提供される。例えば、カルシウムイオン（例えば、Ｃａ２＋）濃度は、キレート剤、例えば、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又は１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＢＡＰＴＡ）などの好適な緩衝液の使用によっても低下させることができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１０１５５９号明細書を参照されたい。したがって、対象体の増殖性障害を治療する方法であって、間質圧力を減少させる低カルシウムイオン濃度液体及び腫瘍崩壊性ウイルスを対象体に投与することを含む方法が本明細書で提供されている。本方法は、血管透過性を増加させる作用剤の投与をさらに含んでいてもよい。
【００１３】
腫瘍の間質圧力は、過剰間質液の除去により低下させることができてもよい。例えば過剰間質液の除去は、人工リンパ系（ＡＬＳ）によることを含む任意の公知の方法により遂行される。そのような方法は、例えば、米国特許出願公開第２００１／００４７１５２号明細書；米国特許第５，４８４，３９９号明細書；米国特許出願公開第２００５／０１６５３４２号明細書；及び米国特許出願公開第２００３／０１４９４０７号明細書に記載されており、それらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。したがって、対象体の腫瘍を治療する方法であって、対象体において腫瘍の過剰間質液を低減させること、及び対象体に腫瘍崩壊性ウイルスを投与することを含む方法が本明細書で提供されている。腫瘍崩壊性ウイルス投与の前に、過剰間質液を除去してもよい。本方法は、血管透過性を増加させる作用剤の投与をさらに含んでいてもよい。
【００１４】
腫瘍崩壊性ウイルスを全身性に投与する場合、透過化光線力学療法（Ｐ−ＰＤＴ、permeabilizing photodynamic therapeuty）を使用して、血管透過性の増強による腫瘍崩壊性ウイルスの送達を増強することができる。Ｐ−ＰＤＴ誘導性脈管漏出により、治療薬が脈管構造を離れて、透過化ＰＤＴを事前に行わずに達成可能であるよりも高い濃度で、過剰増殖性組織（例えば、腫瘍床）へと分布させることが可能になる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／００１０２１８号明細書を参照されたい。したがって、対象体の増殖性障害を治療する方法であって、透過化光線力学療法用薬剤及び腫瘍崩壊性ウイルスを対象体に投与することを含む方法が本明細書で提供されている。腫瘍崩壊性ウイルス投与の前に、透過化光線力学療法用薬剤を投与してもよい。本方法は、間質圧力を減少させる作用剤を投与することをさらに含んでいてもよい。
【００１５】
提供されている方法は、免疫抑制剤を対象体に投与することをさらに含んでいてもよい。免疫抑制剤は、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤であってもよい。本明細書で使用される場合、炎症促進性サイトカインは、直接的又は間接的に免疫系を刺激するサイトカインを指す。炎症促進性サイトカインには、これらに限定されないが、ＩＬ−ｌＩ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−ｌＩ、及びＲＡＮＴＥＳが含まれる。したがって、対象体の増殖性障害を治療する方法であって、治療を必要性とする対象体に、間質圧力を減少させる作用剤、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤、及び腫瘍崩壊性ウイルスを投与することを含む方法が、本明細書で提供されている。間質圧力を減少させる作用剤を最初に対象体に投与して、その後炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤及び腫瘍崩壊性ウイルスを投与してもよい。その後、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤の後で、腫瘍崩壊性ウイルスを投与してもよい。炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤は、炎症促進性サイトカインの発現又は活性を阻害してもよい。この作用剤は、Ｔ細胞応答を阻止するが、Ｂ細胞活性に対する効果はほとんどか全く示さない。したがって、この作用剤は、炎症促進性サイトカインを阻害するが、ＮＡＲＡの産生は阻害しないか又は最小限にしか阻害しない。この作用剤は白金化合物であってもよい。好適な白金化合物には、これらに限定されないが、シスプラチン、カルボプラチン、メタプラチン（metaplatin）、及びオキサリプラチンも含まれている。間質圧力を低下させる作用剤はパクリタキセルであってもよく、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤はカルボプラチンであってもよく、腫瘍崩壊性ウイルスはレオウイルスであってもよい。
【００１６】
炎症促進性サイトカインを阻害する他の作用剤には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：インフリキシマブ、ＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、及びアダリムマブなどのＴＮＦ−Ｉ抗体；オネルセプト（onercept）などの組換えヒト可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体；エタネルセプトなどの可溶性ＴＮＦ受容体及びＦｃ断片融合タンパク質；セルトリズマブペゴールなどのＴＮＦに対するヒト化抗体のペグ化Ｆａｂ断片；バシリキシマブ又はダクリズマブなどのＩＬ−２受容体の抗Ｉ鎖に対するキメラ抗体；ＡＢＴ−８７４などのＩＬ−１２ｐ４０抗体；ＭＲＡ又はトシリズマブなどのＩＬ−６受容体抗体；フォントリズマブ（fontolizumab）などのＩＦＮ−Ｋ抗体；ＡＭＧ１０８などのＩＬ−１受容体へのＩＬ−１結合を阻害する抗体；ジアリールスルホニルウレネ（diarylsulphonylurene）などのサイトカイン放出を阻害するカスパーゼ−１阻害剤；メポリズマブなどのＩＬ−１５抗体；ＡＢＸ−ＩＬ−８などのＩＬ−８抗体；ＩＬ−９モノクローナル抗体を含むＩＬ−９抗体；４９４Ｃ１０とも呼ばれる組換えヒトＩＬ−２１；ビオフルムセンシチブム（biophylum sensitivum）などのＴＮＦ−Ｉ、ＩＬ−１θ、ＩＬ−６、及び顆粒球単球コロニー刺激因子発現の阻害剤；シンバスタチンなどの炎症促進性サイトカイン発現を阻害するＮＦ−ＰＢシグナル伝達遮断剤；及び（−）−エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）などのＩＬ−６発現及びＮＦ−ＰＢ活性化の阻害剤。
【００１７】
炎症促進性サイトカインを阻害する他の作用剤には、ヒト組換えラクトフェリンが含まれ、それは炎症促進性サイトカイン及び前転移性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及びＴＮＦ−αを含む）の細胞放出を阻害する。ラパマイシン及びサングリフェリンなどの樹状細胞由来ＩＬ−１２及びＩＬ−１８の阻害剤も、提供されている方法での使用に好適である。ラパマイシンは、Ｔ細胞ｍＴＯＲキナーゼ活性化を阻害する免疫抑制剤であり、サングリフェリンＡは、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞増殖も阻害するサイクロフィリン結合免疫抑制剤である。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＧＭ−ＣＳなどの炎症促進性サイトカインの誘導を抑制する食物性ルチンも、提供されている方法での使用に好適である。
【００１８】
提供されている方法は、増殖性障害を有する対象体を選択するステップをさらに含んでいてもよい。したがって、対象体の増殖性障害を治療する方法であって、増殖性障害を有する対象体を選択すること、及び治療を必要性とする対象体に間質圧力を低下させる作用剤及び腫瘍崩壊性ウイルスを投与することを含む方法が提供されている。増殖性障害は、ｒａｓ媒介性増殖障害であってもよい。したがって、提供されている方法は、ｒａｓ媒介性増殖障害を有する対象体を選択するステップをさらに含んでいてもよい。増殖性障害は、インターフェロン耐性、ｐ５３欠乏、又はＲｂ欠乏を特徴とする増殖性障害であってもよい。
【００１９】
対象体は、腫瘍崩壊性ウイルスの送達増強を必要としていてもよい。したがって、増殖性障害を有する対象体に対する腫瘍崩壊性ウイルス送達を増強する方法であって、間質圧力を減少させる作用剤を対象体に投与すること、及び対象体に腫瘍崩壊性ウイルスを投与することを含む方法が、本明細書で提供されている。そのような方法は、増殖性障害を有する対象体を選択するステップも含むことができる。
【００２０】
提供されている方法は、例えば、増殖性障害がｒａｓ媒介性増殖性障害かどうかを決定することにより、増殖性障害の表現型を診断するステップを含んでいてもよい。別の例では、提供されている方法は、増殖性障害が、インターフェロン耐性腫瘍、ｐ５３欠乏腫瘍、又はＲｂ欠乏腫瘍かどうかを決定するステップを含む。増殖性障害が特定の表現型を有するかどうかを決定するためのそのような方法は公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３０６，９０２号明細書を参照されたい。
【００２１】
提供されている方法で使用される腫瘍崩壊性ウイルスには、これらに限定されないが、以下の科のメンバーである腫瘍崩壊性ウイルスが含まれる：ミオウイルス科、シホウイルス科、ポドプウイルス科（podpviridae）、テチウイルス科（teciviridae）、コルチコウイルス科、プラズマウイルス科、リポスリックスウイルス科、フーゼロウイルス科、ポキシイルス科（poxyiridae）、イリドウイルス科、フィコドナウイルス科、バキュロウイルス科、ヘルペスウイルス科、アドノウイルス科（adnoviridae）、パポバウイルス科、ポリドナウイルス科、イノウイルス科、ミクロウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、ヘパドナウイルス科、レトロウイルス科、シクトウイルス科（cyctoviridae）、レオウイルス科、ビルナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レビウイルス科、ピコルナウイルス科、セキウイルス科、コモウイルス科、ポティウイルス科、カリシウイルス科、アストロウイルス科、ノダウイルス科、テトラウイルス科、トムブスウイルス科、コロナウイルス科、グラビウイルス科（glaviviridae）、トガウイルス科、及びバルナウイルス科（barnaviridae）。免疫保護されたウイルス及びそれらの再集合又は組換えウイルス、並びに他の腫瘍崩壊性ウイルスも、提供されている方法により包含される。さらに、少なくとも２つの腫瘍崩壊性ウイルスの組み合わせも、提供されている方法を実施するために使用することができる。少数の腫瘍崩壊性ウイルスが下記で考察されており、当業者であれば、本明細書の開示及び当技術分野で利用可能な知識により、追加的な腫瘍崩壊性ウイルスを使用して同様に本方法を実施することができる。
【００２２】
通常、ウイルスが細胞に進入すると、二本鎖ＲＮＡキナーゼ（ＰＫＲ）が活性化されてタンパク質合成が阻止され、ウイルスはこの細胞で複製することができない。幾つかのウイルスは、ＰＫＲを阻害してウイルスタンパク質合成並びにウイルス複製を促進させる系を生じさせている。例えば、アデノウイルスは、大量の小型ＲＮＡ、ＶＡ１  ＲＮＡを産生する。ＶＡ１  ＲＮＡは、広範な二次構造を有しており、通常ＰＫＲを活性化する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と競合してＰＫＲと結合する。ＰＫＲの活性化には最小限の長さのｄｓＲＮＡが必要であるため、ＶＡ１  ＲＮＡはＰＫＲを活性化しない。その代り、ＶＡ１  ＲＮＡは大量にあるためＰＫＲを封鎖する。結果的に、タンパク質合成は阻止されず、アデノウイルスは細胞中で複製することができる。
【００２３】
Ｒａｓ活性化新生物細胞は、ｒａｓがＰＫＲを不活性化するため、ＰＫＲによるタンパク質合成阻害の影響を受けない。したがって、これらの細胞は、たとえウイルスがＰＫＲ阻害系を有していなくとも、ウイルス感染に感受性である。したがって、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はパラポックスウイルス属オルフウィルスのＰＫＲ阻害剤が、ＰＫＲ機能をもはや阻止しないように突然変異している場合、その結果生じるウイルスは、ＰＫＲによるタンパク質合成阻害のため正常細胞には感染しないが、ＰＫＲ活性を欠失しているｒａｓ活性化新生物細胞では複製する。例として、レオウイルスは選択的に複製し、ｒａｓ活性化新生物細胞を溶解する。
【００２４】
したがって、ＰＫＲ機能を阻害しないように修飾又は突然変異したウイルスは、ｒａｓ活性化新生物細胞で選択的に複製するが、正常細胞は抵抗性である。腫瘍崩壊性ウイルスは、ＶＡ１領域が突然変異したアデノウイルス、Ｋ３Ｌ及び／又はＥ３Ｌ領域が突然変異したワクシニアウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が突然変異したワクシニアウイルス、ワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子が突然変異したワクシニアウイルス、γ１３４．５遺伝子が突然変異したヘルペスウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子が突然変異したパラポックスウイルス属オルフウイルス、ＮＳ−１遺伝子が突然変異したインフルエンザウイルスであってもよい。 
【００２５】
ウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が突然変異したワクシニアウイルスは、ＤＮＡ複製に必要なヌクレオチドを産生することができない。正常細胞では、細胞性ＴＫレベルは通常非常に低く、ウイルスは複製することができない。腫瘍では、腫瘍抑制因子Ｒｂの減少又はサイクリン活性の増加が、Ｅ２Ｆ経路活性化及び高レベルのＴＫ発現に結びつく。したがって、癌細胞は高いＴＫレベルを示し、突然変異したワクシニアウイルスは複製及び伝染することができる。
【００２６】
ワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子は、哺乳動物上皮増殖因子（ＥＧＦ）の相同体であり、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合しそれを活性化することができる。ＶＧＦ遺伝子が突然変異したワクシニアウイルスは、ＥＧＦ経路が活性化された細胞に増殖が限定され、癌ではＶＧＦ遺伝子が一般的に突然変異している。
【００２７】
このウイルスは、ウイルス性ＰＫＲ阻害剤の公知の構造機能相関性により修飾又は突然変異させることができる。例えば、Ｅ３タンパク質のアミノ末端領域は、ＰＫＲのカルボキシ末端領域ドメインと相互作用するため、このドメインの欠失又は点突然変異は、抗ＰＫＲ機能を妨げる（Chang et al., PNAS 89:4825-4829 (1992)；Chang, H. W. et al., Virology 194:537-547 (1993)；Chang et al., J. Virol. 69:6605-6608 (1995)；Sharp et al., Virol. 250:301-315 (1998)；及びRomano et al., Mol. and Cell. Bio. 18:7304-7316 (1998)）。ワクシニアウイルスのＫ３Ｌ遺伝子は、ｐＫ３、ＰＫＲの偽基質をコードする。ｅＩＦ−２の残基７９〜８３に相同的なＫ３Ｌタンパク質のＣ末端部分内の短縮又は点突然変異は、ＰＫＲ阻害活性を消滅させる（Kawagishi-Kobayashi, M., et al., Mol. Cell. Biology 17:4146-4158 (1997)）。
【００２８】
別の例は、Ｄｅｌｔａ２４ウイルスであり、これはＥ１Ａ領域に２４塩基対の欠失を保持する突然変異アデノウイルスである（Fueyo, J., et al., Oncogene 19(1):2-12 (2000)）。この領域は、細胞性腫瘍抑制因子Ｒｂへの結合及びＲｂ機能の阻害に関与しており、これにより細胞増殖機構、したがってウイルス複製が抑制されない様式で進行することが可能になる。Ｄｅｌｔａ２４は、Ｒｂ結合領域に欠失を有しており、Ｒｂに結合しない。したがって、正常細胞では、突然変異ウイルスの複製はＲｂにより阻害される。しかしながら、Ｒｂが不活化され、細胞が新生物性になる場合、Ｄｅｌｔａ２４はもはや阻害されない。その代りに、突然変異ウイルスは効率的に複製し、Ｒｂ欠乏細胞を溶解する。
【００２９】
加えて、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、新生物細胞を選択的に死滅させる（及びインターフェロンを加えることができる）。リボヌクレオチドレダクターゼ発現を欠失している単純疱疹ウイルス１（ＨＳＶ−１）突然変異体、ｈｒＲ３は、結腸癌細胞で複製するが、正常肝細胞では複製しない（Yoon, S. S., et al., FASEB J. 14:301-311(2000)）。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、悪性細胞で優先的に複製し、最も一般に使用される菌株は、７３−Ｔである（Reichard, K. W., et al., J. of Surgical Research 52:448-453 (1992)；Zorn, U. et al., Cancer Biotherapy 9(3):22-235 (1994)；Bar-Eli, N., et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122: 409-415 (1996)）。ワクシニアウイルスは、幾つかの悪性腫瘍細胞系統で増幅する。脳炎ウイルスは、マウス肉腫腫瘍に腫瘍崩壊効果を有するが、正常細胞での感染力を低減させるためには弱毒化が必要な場合がある。帯状疱疹、肝炎ウイルス、インフルエンザ、水痘、及び麻疹ウイルスに感染した腫瘍患者での腫瘍退縮が記録されている（概説は、Nemunaitis, J. , Invest. New Drugs 17:375-386 (1999)を参照）。
【００３０】
腫瘍崩壊性ウイルスはレオウイルスであってもよい。レオウイルスは、天然か、修飾か、又は組換えかに関わらず、レオウイルス属に分類される任意のウイルスを指す。レオウイルスは、二本鎖のセグメント化ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。そのビリオンは、直径が６０〜８０ｎｍであり、各々が二十面体である２つの同心円状のカプシドシェルを有する。このゲノムは、１６〜２７ｋｂｐの総ゲノムサイズを有する１０〜１２本の別々のセグメントの二本鎖ＲＮＡで構成される。個々のＲＮＡセグメントはサイズが異なる。異なるが関連している３つのタイプのレオウイルスが、多くの種から回収されている。３つのタイプは全て、共通の補体結合抗原を共有する。
【００３１】
ヒトレオウイルスは、３つの血清型：１型（Ｌａｎｇ菌株又はＴ１Ｌ）、２型（Ｊｏｎｅｓ菌株、Ｔ２Ｊ）、及び３型（Ｄｅａｒｉｎｇ菌株又はＡｂｎｅｙ菌株、Ｔ３Ｄ）を含む。この３つの血清型は、中和アッセイ及び赤血球凝集素阻害アッセイに基づいて容易に識別可能である。本開示によるレオウイルスは、３型哺乳動物オルトレオウイルスであり得る。３型哺乳動物オルトレオウイルスには、限定ではないが、Ｄｅａｒｉｎｇ及びＡｂｎｅｙ菌株（それぞれＴ３Ｄ又はＴ３Ａ）が含まれる。例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−２３２及びＶＲ−８２４を参照されたい。以前に記述されているように、レオウイルスは、宿主細胞のｒａｓ経路機構を使用して、二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）及びしたがって細胞での複製を下方制御する。例えば、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１１０，４６１号明細書；第６，１３６，３０７号明細書；第６，２６１，５５５号明細書；第６，３４４，１９５号明細書；第６，５７６，２３４号明細書；及び第６，８１１，７７５号明細書を参照されたい。
【００３２】
レオウイルスは、天然でもよく又は修飾されていてもよい。レオウイルスは、自然界の供給源から単離することができ、実験室でヒトにより意図的に修飾されていない場合、天然である。例えば、レオウイルスは、フィールド供給源に由来し、すなわちレオウイルスに感染したヒト由来であり得る。レオウイルスは、腫瘍崩壊活性の増強に関して選択することもでき、又は突然変異誘発させることもできる。
【００３３】
レオウイルスは、修飾されてもよいが、それでもなお活性ｒａｓ経路を有する哺乳動物細胞に感染して細胞を溶解することができる。レオウイルスは、増殖細胞への投与前に化学的又は生化学的に前処理されていてもよい（例えば、キモトリプシン又はトリプシンなどのプロテアーゼでの処理により）。プロテアーゼでの前処理により、ウイルスの外被又はカプシドが取り除かれ、ウイルスの感染力が増加する場合がある。レオウイルスは、リポソーム又はミセルに被膜されていてもよい（Chandran and Nibert, J. of Virology 72(1):467-75 1998）。例えば、新しい伝染性サブウイルス粒子（ＩＳＶＰ）を生成するために、ミセル形成濃度のアルキル硫酸塩界面活性剤の存在下で、ビリオンをキモトリプシンで処理してもよい。
【００３４】
レオウイルスは、組換えレオウイルスであってもよい。例えば、組換えレオウイルスは、２つ以上の遺伝学的に異なるレオウイルスに由来するゲノムセグメントを含む再集合レオウイルスであり得る。レオウイルスのゲノムセグメントの組換え／再集合は、少なくとも２つの遺伝学的に異なるレオウイルスが宿主生物に感染した後で生じる場合がある。組換え／再集合ウイルスは、例えば、遺伝学的に異なるレオウイルスを許容宿主細胞に同時感染させることにより、細胞培養で生成することができる。したがって、提供されている方法は、１型（例えば、Ｌａｎｇ菌株）、２型（例えば、Ｊｏｎｅｓ菌株）、及び３型（例えば、Ｄｅａｒｉｎｇ菌株又はＡｂｎｅｙ菌株）などのヒトレオウイルス；非ヒト哺乳動物レオウイルス；又はトリレオウイルスが含まれるがこれらに限定されない２つ以上の遺伝学的に異なるレオウイルスに由来するゲノムセグメントの再集合に起因する組換えレオウイルスの使用を含む。提供されている方法は、少なくとも１つの親のウイルスが、遺伝子操作されているか、１つ又は複数の化学的に合成されたゲノムセグメントを含むか、化学的又は物理的な突然変異誘発物質で処理されているか、又はそれ自体が組換え事象の結果である２つ以上の遺伝学的に異なるレオウイルスに由来するゲノムセグメントの再集合に起因する組換えレオウイルスの使用を含んでいてもよい。提供されている方法は、硫酸ジメチル及び臭化エチジウムを含むがそれらに限定されない化学的突然変異誘発物質、又は紫外線及び他の形態の放射線を含むがそれらに限定されない物理的突然変異誘発物質の存在下組換えを起こした組換えレオウイルスの使用を含んでいてもよい。
【００３５】
提供されている方法は、１つ又は複数のゲノムセグメントに突然変異（挿入、置換、欠失、又は重複を含む）を有するレオウイルスの使用を含んでいてもよい。そのような突然変異は、宿主細胞ゲノムとの組換えの結果としての追加的な遺伝情報を含んでいてもよく、又は合成遺伝子を含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載の突然変異レオウイルスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／１２４，５２２号明細書に記載のように、ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの発現を低減又は本質的に除去するか、又は機能的ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの非存在に帰着する突然変異を含有していてもよい。ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの発現を除去するか、又は機能的ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの非存在に帰着する突然変異は、ｓｉｇｍａ３ポリペプチドをコードする核酸（つまり、Ｓ４遺伝子）、又はｓｉｇｍａ３ポリペプチドの発現若しくは機能を制御するポリペプチドをコードする核酸に存在していてもよい。
【００３６】
本明細書で使用される場合、ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの発現を低減する突然変異とは、野生型レベルのｓｉｇｍａ３ポリペプチドを発現するレオウイルスと比較して、ｓｉｇｍａ３ポリペプチド量の少なくとも３０％（例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）減少に帰着する突然変異を指す。本明細書で使用される場合、ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの発現を本質的に除去する突然変異とは、野生型レオウイルスにより産生されるｓｉｇｍａ３ポリペプチド量と比べて、ｓｉｇｍａ３ポリペプチド量の少なくとも９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）減少に帰着する突然変異を指す。本明細書で使用される場合、機能的ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの減少又は非存在に帰着する突然変異とは、ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの発現を可能にするが、ウイルスカプシドに集合又は組み込むことができないｓｉｇｍａ３ポリペプチドに帰着する突然変異を指す。ｓｉｇｍａ３ポリペプチドは、突然変異レオウイルスが増殖能力を保持するために、他の機能性（例えば、ＲＮＡに結合する能力）を保持することが望ましい又は必要な場合があることが理解されるだろう。
【００３７】
本明細書に記載のｓｉｇｍａ３ポリペプチドの突然変異は、突然変異を含有していないｓｉｇｍａ３ポリペプチド（例えば、野生型ｓｉｇｍａ３ポリペプチド）と比べて低いレベルでカプシドに組み込まれるｓｉｇｍａ３ポリペプチドに帰着し得る。本明細書に記載のｓｉｇｍａ３ポリペプチドの突然変異は、ウイルスカプシドに組み込むことができないｓｉｇｍａ３ポリペプチドに帰着する場合もある。いかなる特定の機序にも束縛されないが、ｓｉｇｍａ３ポリペプチドは、例えば、ｓｉｇｍａ３ポリペプチド及びｍｕ１ポリペプチドが適切に結合できないことにより、又はカプシドへのｓｉｇｍａ３ポリペプチドの組み込みを低減又は防止する立体構造的変化により、機能低下又は機能欠如を示す場合がある。
【００３８】
ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの発現を消滅又は低減するか、又は非機能的な若しくは機能が低下したｓｉｇｍａ３ポリペプチドに帰着する突然変異に加えて、本明細書に記載の突然変異レオウイルスは、他のレオウイルスカプシドポリペプチド（例えばｍｕ１、ｌａｍｂｄａ２、及び／又はｓｉｇｍａ１）の１つに、１つ又は複数のさらなる突然変異（例えば、第２、第３、又は第４の突然変異）を含有している場合もある。ｓｉｇｍａ３ポリペプチドに影響を与える突然変異、及び他の外側カプシドタンパク質のいずれか又は全てにさらなる突然変異を含有していてもよいレオウイルスは、そのような突然変異レオウイルスが感染し細胞溶解を引き起こす能力についてスクリーニングすることができる。例えば、野生型レオウイルスによる溶解に耐性である新生物細胞を使用して、本明細書に記載されている有効な突然変異レオウイルスをスクリーニングすることができる。
【００３９】
例えば、さらなる突然変異は、ｍｕ１ポリペプチドの発現を低減又は本質的に除去するか、又は機能的ｍｕ１ポリペプチドの非存在に帰着し得る。ｍｕ１ポリペプチドは、Ｍ２遺伝子によりコードされており、細胞透過に関与している可能性が高く、転写酵素活性化に役割を果たしている可能性がある。各ビリオンは、ｓｉｇｍａ３ポリペプチドとの１：１複合体の形態で存在する約６００コピーのｍｕ１ポリペプチドを含有している。ｍｕ１ポリペプチドは、そのＮ末端がミリストレート化（myristolated）され、その後、ミリストレート化されたＮ末端４２残基は、切断されてＣ末端断片（ｍｕ１Ｃ）に帰着する。それに加えて又は或いは、さらなる突然変異は、ｌａｍｂｄａ２ポリペプチドの発現を低減又は本質的に除去するか、又は機能的ｌａｍｂｄａ２ポリペプチドの非存在に帰着する場合があり、及び／又はさらなる突然変異は、ｓｉｇｍａ１ポリペプチドの発現を低減又は本質的に除去するか、又は機能的ｓｉｇｍａ１ポリペプチドの非存在に帰着する場合がある。ｌａｍｂｄａ２ポリペプチドは、Ｌ２遺伝子によりコードされており、粒子構築に関与し、グアニリルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼ活性を示す。ｓｉｇｍａ１ポリペプチドは、Ｓ１遺伝子によりコードされており、細胞結合に関与し、ウイルス性赤血球凝集素として機能する。
【００４０】
例えば、レオウイルスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／０４６，０９５号明細書に記載されているように、１つ又は複数のアミノ酸修飾を有するｌａｍｂｄａ−３ポリペプチド、１つ又は複数のアミノ酸修飾を有するｓｉｇｍａ−３ポリペプチド、１つ又は複数のアミノ酸修飾を有するｍｕ−１ポリペプチド、及び／又は１つ又は複数のアミノ酸修飾を有するｍｕ−２ポリペプチドを有する。例として、ｌａｍｂｄａ−３ポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸修飾は、残基２１４のＶａｌ、残基２６７のＡｌａ、残基５５７のＴｈｒ、残基７５５のＬｙｓ、残基７５６のＭｅｔ、残基９２６のＰｒｏ、残基９６３のＰｒｏ、残基９７９のＬｅｕ、残基１０４５のＡｒｇ、残基１０７１のＶａｌ、又はそれらの任意の組み合わせであり、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２４７３４．１と比べてである。アミノ酸配列の残基２１４がＶａｌ又は残基１０７１がＶａｌである場合、そのアミノ酸配列は、少なくとも１つの追加的変化をそのアミノ酸配列にさらに含むことに留意されたい。ｌａｍｂｄａ−３ポリペプチドは、配列番号１８に示されている配列を含んでいてもよい。さらに、例として、ｓｉｇｍａ−３ポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸修飾は、残基１４のＬｅｕ、残基１９８のＬｙｓ、又はそれらの任意の組み合わせであり、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｋ０２７３９と比べてである。アミノ酸配列の残基１４がＬｅｕである場合、そのアミノ酸配列は、少なくとも１つの追加的変化をそのアミノ酸配列にさらに含むことに留意されたい。ｓｉｇｍａ−３ポリペプチドは、配列番号１４に示されている配列を含んでいてもよい。さらに、例として、ｍｕ−１ポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸修飾は、残基７３のＡｓｐであり、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２０１６１．１と比べてである。ｍｕ−１ポリペプチドは、配列番号１６に示されている配列を含んでいてもよい。また、例として、ｍｕ−２ポリペプチドのアミノ酸修飾は、残基５２８のＳｅｒであり、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４６１６８４．１と比べてである。ｍｕ−１ポリペプチドは、配列番号１５に示されている配列を含んでいてもよい。１つ又は複数の修飾を有する本明細書に記載のレオウイルスは、レオウイルスｓｉｇｍａ−２ポリペプチドをさらに含むことができる。そのようなｓｉｇｍａ−２ポリペプチドは、７０、１２７、１９５、２４１、２５５、２９４、２９６、又は３４０位の１つ又は複数にＣｙｓを有しており、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿６９４６８４．１と比べてである。ｓｉｇｍａ−２ポリペプチドは、配列番号１２に示されている配列を含んでいてもよい。
【００４１】
レオウイルスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／０４６，０９５号明細書に記載されているように、１つ又は複数の核酸修飾を有するＬ１ゲノムセグメント、１つ又は複数の核酸修飾を有するＳ４ゲノムセグメント、１つ又は複数の核酸修飾を有するＭ１ゲノムセグメント、及び／又は１つ又は複数の核酸修飾を有するＭ２ゲノムを有していてもよい。例として、Ｌ１ゲノムセグメントの１つ又は複数の核酸修飾は、６６０位のＴ、８１７位のＧ、１６８７位のＡ、２２８３位のＧ、２２８４〜２２８６位のＡＴＧ、２７９４位のＣ、２９０５位のＣ、２９５３位のＣ、３１５３位のＡ、又は３２３１位のＧであり、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２４７３４．１と比べてである。Ｌ１ゲノムセグメントは、配列番号８に示されている配列を含んでいてもよい。さらに、例として、Ｓ４ゲノムセグメントの１つ又は複数の核酸修飾は、７４位のＡ及び６２４位のＡであり、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｋ０２７３９と比べてである。Ｓ４ゲノムセグメントは、配列番号４に示されている配列を含んでいてもよい。さらに、例として、Ｍ２ゲノムセグメントの核酸修飾は、２４８位のＣであり、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２０１６１．１と比べてである。Ｍ２ゲノムセグメントは、例えば、配列番号６に示されている配列を含む。また、例として、Ｍ１ゲノムセグメントの核酸修飾は、１５９５位のＴであり、付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４６１６８４．１と比べてである。Ｍ１ゲノムセグメントは、配列番号５に示されている配列を含んでいてもよい。本明細書に記載のレオウイルスは、本明細書に開示されている任意の修飾又は修飾の組み合わせを含むことができる。本明細書に記載のレオウイルスは、配列番号１〜１０に示されている配列を有するゲノムセグメント、又は配列番号１１、１２、１６〜２１、及び配列番号１３又は１４のいずれか又は両方に示されているポリペプチドを含んでいてもよい。本明細書に開示されているレオウイルスは、ＩＤＡＣ寄託番号１９０９０７−０１であると特定されてもよい。
【００４２】
シンドビスウイルス（ＳＩＮ）を、本明細書に記載の方法で使用することができる。シンドビスウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属のメンバーである。シンドビスウイルスゲノムは、５’末端でキャッピングされており、３’末端でポリアデニル化されている１１７０３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡである。このゲノムは、４９Ｓ非翻訳領域（ＵＴ）、非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４、その後のプロモーターで構成されている。このプロモーターの後には、２６Ｓ  ＵＴ、構造タンパク質Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、及びＥ１、並びに最後には３’ＵＴ及びポリアデニル化末端が続く。このゲノムの４９Ｓ  ＲＮＡは、プラスセンスであり、感染性であり、感染細胞のｍＲＮＡとして機能する。
【００４３】
シンドビスベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで転移腫瘍を全身性及び特異的に感染／検出及び死滅させ、腫瘍増殖の著しい抑制及び生存の向上に結びつく（Hurtado et al. , Rejuvenation Res. 9(1):36-44 (2006)）。シンドビスウイルスは、正常細胞より腫瘍中で上昇するＭｒ６７，０００ラミニン受容体を使用して哺乳動物細胞に感染する。ラミニン受容体の腫瘍過剰発現は、シンドビスベクターがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞に対して実証する特異性及び効能を説明することができる。シンドビスは、癌細胞を標的とするか又は腫瘍に直接注射されるように遺伝子操作を受ける必要はない。シンドビスは、対象体の何処に注射しても、血流により標的区域へ移動する（Tseng et al., Cancer Res. 64(18):6684-92 (2004)）シンドビスは、ウイルスに対する免疫応答を抑制する１つ又は複数の遺伝子、並びに／又は例えばインターロイキン１２及びインターロイキン１５遺伝子などの抗腫瘍サイトカイン遺伝子などの腫瘍に対する免疫応答を刺激する遺伝子を保持するように遺伝子操作することもできる。
【００４４】
腫瘍崩壊性ウイルスは、天然であってもよく又は修飾されていてもよい。このウイルスは、新生物細胞への投与前に化学的又は生化学的に（例えば、キモトリプシン又はトリプシンなどのプロテアーゼでの処理により）前処理されていてもよい。プロテアーゼでの前処理により、ウイルスの外被又はカプシドが取り除かれ、ウイルスの感染力が増加する場合がある。ウイルスは、ウイルスに対する免疫を誘発した哺乳動物からの免疫応答を低減又は防止するために、リポソーム又はミセルに被膜されていてもよい（Chandran and Nibert, J. of Virology 72(1):467-75 (1998)）。例えば、新しい伝染性サブウイルス粒子を生成するために、ミセル形成濃度のアルキル硫酸塩界面活性剤の存在下で、ビリオンをキモトリプシンで処理してもよい。また、腫瘍崩壊性ウイルスは、再集合体ウイルス又はＩＳＶＰであってもよい。
【００４５】
本方法は、本明細書の開示及び当技術分野で利用可能な知識による任意の腫瘍崩壊性ウイルスの使用を含む。レオウイルスは、天然であってもよく又は修飾されていてもよい。腫瘍崩壊性ウイルスは、自然界の供給源から単離することができ、実験室でヒトにより意図的に修飾されていない場合、天然である。例えば、腫瘍崩壊性ウイルスは、フィールド供給源に由来、すなわちレオウイルスに感染したヒト由来であり得る。
【００４６】
腫瘍崩壊性ウイルスは、組換え腫瘍崩壊性ウイルスであってもよい。例えば、組換え腫瘍崩壊性ウイルスは、２つ以上の遺伝学的に異なる腫瘍崩壊性ウイルスに由来するゲノムセグメントの再集合に起因しており、本明細書では再集合体とも呼ばれる。腫瘍崩壊性ウイルスゲノムセグメントの再集合体は、少なくとも２つの遺伝学的に異なる腫瘍崩壊性ウイルスが宿主生物に感染した後で生じる場合がある。再集合ウイルスは、例えば、遺伝学的に異なる腫瘍崩壊性ウイルスを許容宿主細胞に同時感染させることにより、細胞培養で生成することができる。本方法は、少なくとも１つの親のウイルスが、遺伝子操作されているか、１つ又は複数の化学的に合成されたゲノムセグメントを含むか、化学的又は物理的な突然変異誘発物質で処理されているか、又はそれ自体が組換え事象の結果である２つ以上の遺伝学的に異なる腫瘍崩壊性ウイルスに由来するゲノムセグメントの再集合に起因する組換え腫瘍崩壊性ウイルスの使用を含んでいてもよい。本方法は、硫酸ジメチル及び臭化エチジウムを含むがそれらに限定されない化学的突然変異誘発物質、又は紫外線及び他の形態の放射線を含むがそれらに限定されない物理的突然変異誘発物質の存在下で組換えを起こした組換え腫瘍崩壊性ウイルスの使用を含んでいてもよい。
【００４７】
本方法は、１つ又は複数のゲノムセグメントに（挿入、置換、欠失、又は重複）を含む突然変異を有する腫瘍崩壊性ウイルスの使用を含んでいてもよい。そのような突然変異は、宿主細胞ゲノムとの組換えの結果としての追加的な遺伝情報、又は例えば抗ウイルス免疫応答を抑制する作用剤をコードする遺伝子などの合成遺伝子を含む追加的な遺伝情報を含むことができる。
【００４８】
腫瘍崩壊性ウイルスは、突然変異腫瘍崩壊性ウイルスであってもよい。例えば、腫瘍崩壊性ウイルスは、例えばビリオン外側カプシドなどへの突然変異外殻タンパク質の組み込みにより修飾されていてもよい。突然変異腫瘍崩壊性ウイルスは、突然変異レオウイルスであってもよい。本明細書に記載の突然変異レオウイルスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／１２４，５２２号明細書に記載されているように、ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの発現を低減又は本質的に除去するか、又は機能的ｓｉｇｍａ３ポリペプチドの非存在に帰着する突然変異を含有することができる。提供されている方法で使用される突然変異レオウイルスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／０４６，０９５号明細書に記載のように突然変異していてもよい。
【００４９】
本明細書で引用されたような突然変異は、１つ又は複数のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失であり得る。点突然変異には、例えば単一ヌクレオチド転移（プリンからプリン又はピリミジンからピリミジン）又は転換（プリンからピリミジン、又はその逆）、及び単一又は複数ヌクレオチド欠失又は挿入が含まれる。核酸の突然変異は、立体構造変化又は機能の喪失若しくは部分的な喪失に帰着する場合があるコードポリペプチドにおける１つ又は複数の保存的又は非保存的アミノ酸置換、全く異なるポリペプチドがその地点からコードされることに帰着する翻訳リーディングフレームのシフト（フレームシフト）、短縮ポリペプチド（短縮）に帰着する早期終止コドン、又はコードポリペプチドを全く変化させない場合があるウイルス核酸の突然変異（サイレント又はナンセンス）に帰着し得る。保存的及び非保存的アミノ酸置換に関する開示は、例えば、Johnson and Overington, 1993, J. Mol. Biol. 233:716-38；Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19；及び米国特許第４，５５４，１０１号明細書を参照されたい。
【００５０】
当技術分野で公知の任意の数の方法を使用して、腫瘍崩壊性ウイルスの核酸に突然変異を生成することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発を使用して、レオウイルス核酸配列を修飾することができる。部位特異的突然変異誘発の最も一般的な方法の１つは、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発である。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発では、所望の変化（複数可）をコードするオリゴヌクレオチドは、目的ＤＮＡの一方の鎖とアニーリングし、ＤＮＡ合成開始のプライマーとして機能する。このようにして、配列変化を含有するオリゴヌクレオチドが、新しく合成される鎖に組み込まれる。例えば、Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488；Kunkel et al., 1987, Meth. Enzymol. 154:367；Lewis and Thompson, 1990, Nucl. Acids Res. 18:3439；Bohnsack, 1996, Meth. Mol. Biol. 57:1；Deng and Nickoloff, 1992, Anal. Biochem. 200:81；及びShimada, 1996, Meth. Mol. Biol. 57:157を参照されたい。当技術分野では、タンパク質又はポリペプチドの配列を修飾するために、他の方法が日常的に使用されている。例えば、突然変異を含有する核酸は、ＰＣＲ又は化学合成を使用して生成してもよく、又はアミノ酸配列に所望の変化を有するポリペプチドは化学的に合成してもよい。例えば、Bang and Kent, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5014-9及びその中の文献を参照されたい。
【００５１】
ウイルスは、標準的方法を用いて精製することができる。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるSchiff et al., “Orthoreoviruses and Their Replication,” Ch 52, in Fields Virology, Knipe and Howley, eds., 2006, Lippincott Williams and Wilkins；Smith et al., 1969, Virology 39(4):791-810；並びに米国特許第７，１８６，５４２号明細書；第７，０４９，１２７号明細書；第６，８０８，９１６号明細書；及び第６，５２８，３０５号明細書を参照されたい。本明細書で使用される場合、精製ウイルスとは、それらに自然に付随している細胞構成要素から分離されたウイルスを指す。典型的には、ウイルスは、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％）が、自然に付随しているタンパク質及び他の細胞構成要素を含んでいない場合、精製されたとみなされる。
【００５２】
腫瘍崩壊性ウイルスを含む医薬組成物が、本明細書で提供されている。治療薬、例えば間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤を含む医薬組成物も本明細書で提供されている。医薬組成物は、腫瘍崩壊性ウイルス並びに間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、腫瘍崩壊性ウイルス、間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤、及び炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤を含んでいてもよい。したがって、提供されている医薬組成物は、１つの作用剤又は複数の作用剤を含むことができる。例えば、腫瘍崩壊性ウイルスの各々、間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤、及び炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤は、別々の医薬組成物内に含まれていてもよく、又は同一の組成物内に含まれていてもよい。腫瘍崩壊性ウイルス及び作用剤が別々の医薬組成物内に含まれている場合、組成物は、同時に又は順次投与することができる。
【００５３】
本明細書で提供される組成物は、薬学的に許容される担体中にあり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで投与される。薬学的に許容される担体は、レオウイルス用の媒体、担体、又は媒質として機能することができる固形、半固形、又は液体物質であり得る。したがって、レオウイルス及び／又は提供されている作用剤の１つ又は複数を含有する組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ、サシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアゾール剤（固体として、又は液体媒質中）、例えば１０重量％までの活性化合物を含有する軟膏剤、軟ゼラチンカプセル及び硬ゼラチンカプセル、坐剤、無菌注射剤、及び無菌包装散剤の形態であり得る。
【００５４】
腫瘍崩壊性ウイルスを含有する組成物は、点滴に好適であってもよい。静脈内点滴の場合、一般的に使用される液体には、晶質及びコロイドの２つのタイプがある。晶質とは、無機塩又は他の水溶性分子の水溶液である。コロイドとは、ゼラチンなどのより大型の不溶性分子を含有しており、血液自体はコロイドである。最も一般的に使用される晶質液は、通常の生理食塩水、０．９％濃度の塩化ナトリウム溶液であり、それは血液中の濃度に近い（等張性）。乳酸リンガー液又は酢酸リンガー液は、大量補液に使用されることが多い別の等張液である。患者に低血糖又は高ナトリウムのリスクがある場合、Ｄ５Ｗと呼ばれることがある５％デキストロース水溶液が、代りに使用されることが多い。
【００５５】
好適な担体の幾つかの例には、リン酸緩衝生理食塩水又は別の生理学的に許容される緩衝液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、及びメチルセルロースが含まれる。加えて、医薬組成物には、限定ではないが、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などの潤滑剤；湿潤剤；乳化剤及び懸濁化剤；メチルベンゾアート及びプロピルヒドロキシベンゾアートなどの保存剤；甘味料；及び香料が含まれ得る。医薬組成物は、当技術分野で公知の手順を使用して投与した後で、突然変異レオウイルスの急速放出、持続的放出、又は遅延放出を提供するように製剤化することができる。下記に記載されている代表的な製剤に加えて、医薬組成物で使用するための他の好適な製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21th ed.) ed. David B. Troy, Lippincott Williams & Wilkins, 2005に見出すことができる。錠剤などの固形組成物を調製するために、突然変異レオウイルスを医薬担体と混合し、固形組成物を形成することができる。錠剤又は丸剤を被膜又はそうでなければ調合して、持続性作用の利点をもたらす剤形を提供することができてもよい。例えば、錠剤又は丸剤は、内側用量成分及び外側用量成分を含むことができ、後者は前者を覆う包膜の形態である。２つの成分は、胃の中で崩壊し難くなるように機能する腸溶層で分離することができ、内側成分が完全性を保ったまま十二指腸へと通過することを可能にするか、又は放出の遅延を可能にする。様々な物質を、そのような腸溶層又は被膜に使用することができ、そのような物質は、多数のポリマー酸、及びポリマー酸とシェラック、セチルアルコール、及び酢酸セルロースなどの物質との混合物を含む。
【００５６】
レオウイルス及び／又は経口投与用若しくは注射用の作用剤を含む液体製剤には、一般的に、水溶液、好適に風味付けられたシロップ剤、水性又は油性懸濁剤、及びトウモロコシ油、綿実油、胡麻油、やし油、又は落花生油などの食用油を有する風味付けられた乳剤、並びにエリキシル剤、及び類似の医薬媒体が含まれる。
【００５７】
吸入又は通気用の組成物には、薬学的に許容される水性若しくは有機溶媒又はそれらの混合物中の液剤及び懸濁剤、並びに散剤が含まれる。これらの液状又は固形組成物は、本明細書に記載の好適な薬学的に許容される賦形剤を含有していてもよい。そのような組成物は、局所的又は全身性効果のために経口又は経鼻呼吸経路により投与することができる。薬学的に許容される溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により霧状化されてもよい。霧状化した溶液は、噴霧デバイスから直接吸入されてもよく、噴霧デバイスは、フェイスマスクテント又は間欠的陽圧呼吸器に装着されていてもよい。液剤、懸濁剤、又は散剤組成物は、適切な様式で製剤を送達するデバイスから、経口又は経鼻で投与されてもよい。
【００５８】
本開示の方法で使用されてもよい別の製剤には、経皮的送達デバイス（例えば、貼付剤）が含まれる。そのような経皮的貼付剤は、本明細書に記載のウイルス及び作用剤の連続的又は不連続注入を提供するために使用することができる。医薬品送達用の経皮的貼付剤の作製及び使用は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号明細書を参照されたい。そのような貼付剤は、突然変異レオウイルスの連続的送達、拍動性送達、又はオンデマンド送達用に作製することができる。
【００５９】
上記に記載のように、ウイルス及び／又は他の作用剤は、必要に応じて、リポソーム又はミセルで被膜して、ウイルス又は作用剤に対する免疫を誘発した哺乳動物での免疫応答を低減又は防止することができる。そのような組成物は、免疫保護ウイルス又は作用剤と呼ばれる。例えば、米国特許第６，５６５，８３１号明細書及び第７，０１４，８４７号明細書を参照されたい。
【００６０】
提供されている方法では、腫瘍崩壊性ウイルスを、標的腫瘍又は腫瘍細胞と最終的に接触することができる様式で、例えば全身性に投与する。ウイルスが投与される経路、並びに製剤、担体、又は媒体は、標的細胞の位置並びにタイプに依存する。多種多様な投与経路を使用することができる。例えば、接近可能な固形腫瘍の場合、腫瘍への直接注射によりウイルスを投与することができる。造血器腫瘍の場合、例えば、静脈内又は血管内にウイルスを投与することができる。転移など体内で容易に接近可能でない腫瘍の場合、哺乳動物の体内を通して全身性に輸送し、それにより腫瘍（例えば、静脈内又は筋肉内）に到達することができるような様式で、ウイルスを投与する。或いは、ウイルスを単一の固形腫瘍に直接投与してもよく、その後ウイルスは体内を通して全身性に転移部位へと運ばれる。ウイルスは、皮下、腹腔内、髄腔内、又は脳室内（例えば、脳腫瘍の場合）、局所的（例えば、メラノーマの場合）、経口（例えば、口腔癌又は食道癌の場合）、直腸性（例えば、結腸直腸癌の場合）、経膣的に（例えば、子宮頸癌又は膣癌の場合）、吸入スプレー又はエアロゾル製剤（例えば、肺癌の場合）により経鼻的に投与することもできる。
【００６１】
ウイルスは、連続的に少なくとも１日１回、又はある期間中の連続する日の終日にわたって断続的に又は連続的に対象体に投与してもよい。したがって、ウイルスは、例えば、任意の薬理学的に許容される溶液中で又は点滴剤として、ある期間にわたって静脈内投与により対象体に投与される。例えば、本物質は、注射（例えば、ＩＭ又は皮下）により全身投与されてもよく、又は少なくとも１日１回経口摂取されてもよく、又は対象体の組織又は血流への連日送達に帰着する様式で点滴により投与されてもよい。ウイルスがある期間にわたって点滴により投与される場合、その期間は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、若しくは２４時間であるか、又は１時間以上２４時間以内の間の任意の期間、又はそれを超える期間である。その期間は、５、１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、若しくは１８０分間であるか、又は５分以上１８０分以内の間の任意の期間、又はそれを超える期間であってもよい。したがって、例えば、ウイルスは、点滴により６０分間投与される。投与は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、２１、２８日間、又は２日以上２８日以内の間の任意の日数、又はそれを超える日数の間、毎日繰り返すことができる。
【００６２】
提供されている方法の間質圧力及び／又は血管透過性を減少させる作用剤、又は他の治療薬（つまり、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤）も、多種多様な投与経路経由で投与される。したがって、作用剤は、局所的、経口、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、肝内、頭蓋内、噴霧／吸入、又は気管支鏡による滴下を含む幾つかの投与経路のいずれででも投与される。治療薬は、腫瘍崩壊性ウイルスに関する上記の説明に示されている様式で、連続的に投与されてもよい。したがって、例えば、作用剤は、任意の薬理学的に許容される溶液中で又は点滴剤として、ある期間にわたって静脈内投与により対象体に投与される。作用剤は、腫瘍部位に又はその付近に局所投与されてもよい。或いは、作用剤は全身投与される。間質圧力及び／又は血管透過性を減少させる作用剤は、間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させるのに十分な量（つまり、有効量）で投与される。炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤は、１つ又は複数の炎症促進性サイトカインを阻害するのに十分な量（つまり、有効量）で投与される。例として、タキサンの有効量には、腫瘍容積１ｍ２当たり約４０〜３００ｍｇ、又は４０以上３００ｍｇ／ｍ２以内の間の任意の量が含まれる。したがって、タキサンの有効量には、１３０〜２２５ｍｇ／ｍ２が含まれる。別の例では、白金化合物の有効量には、約５〜１０００ｍｇ／ｍ２、又は５以上１０００ｍｇ／ｍ２以内の間の任意の量が含まれる。したがって、例えば、シスプラチンの有効量には、約１７５〜２００ｍｇ／ｍ２が含まれ、カルボプラチンの有効量には、約２００〜６００ｍｇ／ｍ２が含まれる。他の作用剤の有効量は、体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０，０００ｍｇ、又は体重１ｋｇ当たり０．００１以上１０，０００ｍｇ以内の間の任意の量に及ぶ。白金化合物の有効量には、カルバートの式により計算されるような１分当たりおよそ２〜７ｍｇ／ｍＬ（ＡＵＣ）が含まれていてもよい。白金化合物の有効量には、カルバートの式により計算されるような１分当たりおよそ５又は６ｍｇ／ｍＬ（ＡＵＣ）が含まれていてもよい。白金化合物は、３０分間にわたって静脈内点滴として投与されてもよい。
【００６３】
本明細書で開示されているウイルスは、増殖性障害の治療に十分な量（つまり、有効量）で投与される。増殖細胞へのウイルス投与が、罹患細胞の溶解（例えば、腫瘍崩壊）に効果を示し、異常増殖細胞数の低減、新生物のサイズの縮小、及び／又は増殖性障害に関連した症状（例えば、疼痛）の軽減若しくは除去に帰着する場合、増殖性障害は治療されている。本明細書で使用される場合、腫瘍崩壊という用語は、増殖細胞の少なくとも１０％が溶解されることを意味する（例えば、細胞の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、又は７５％が溶解される）。溶解の割合は、例えば、哺乳動物中で新生物のサイズ又は増殖細胞数の減少を測定することにより、又は細胞溶解の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、増殖細胞の生検から）測定することにより決定することができる。ウイルスの有効量は、個別の基準で決定されることになり、少なくとも部分的には、使用する特定のウイルス；個体のサイズ、年齢、性別；並びに異常増殖細胞のサイズ及び他の特徴に基づいていてもよい。例えば、ヒト治療の場合、存在する増殖細胞又は新生物のタイプ、サイズ、及び数に依存して、およそ１０３〜１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）のウイルスが使用される。有効量は、例えば、体重１ｋｇ当たり約１．０ＰＦＵから体重１ｋｇ当たり約１０１５ＰＦＵまでであり得る（例えば、体重１ｋｇ当たり約１０２ＰＦＵから体重１ｋｇ当たり約１０１３ＰＦＵまで）。有効量は、約１×１０８〜約１×１０１２ＴＣＩＤ５０であってもよい。有効量は、約１×１０１０ＴＣＩＤ５０であってもよい。
【００６４】
例として、パクリタキセルなどの間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤が、１７５ｍｇ／ｍ２で対象体に投与され、３×１０１０ＴＣＩＤ５０又は１×１０１０ＴＣＩＤ５０のレオウイルスが対象体に投与される。パクリタキセルなどの間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤が、２００ｍｇ／ｍ２で対象体に投与され、３×１０１０ＴＣＩＤ５０又は１×１０１０ＴＣＩＤ５０のレオウイルスが対象体に投与されてもよい。間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤は、３時間の静脈内点滴として投与されてもよい。レオウイルスは１時間の静脈内点滴として投与されてもよい。
【００６５】
別の例として、パクリタキセルなどの間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤が、１７５ｍｇ／ｍ２で対象体に投与され；カルボプラチンなどの炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤が、１分当たり５ｍｇ／ｍｌ（カルバートの式により計算されるＡＵＣ）で対象体に投与され；及び３×１０１０ＴＣＩＤ５０又は１×１０１０ＴＣＩＤ５０のレオウイルスが対象体に投与される。パクリタキセルなどの間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤が、２００ｍｇ／ｍ２で対象体に投与され；炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤が、１分当たり６ｍｇ／ｍｌで対象体に投与され；及び３×１０１０ＴＣＩＤ５０又は１×１０１０ＴＣＩＤ５０のレオウイルスが対象体に投与されてもよい。間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤は、３時間の静脈内点滴として投与されてもよい。炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤は、３０分間の静脈内点滴として投与されてもよい。レオウイルスは１時間の静脈内点滴として投与されてもよい。
【００６６】
ウイルス及び治療薬並びにウイルスと作用剤とを含む組成物の至適用量は、様々な要因に依存する。必要とされる正確な量は、対象体の種、年齢、体重、及び一般的状態、治療する疾患の重症度、特定のウイルス又はベクター、並びに投与経路に依存して、対象体毎に変動するだろう。したがって、あらゆる組成物について正確な量を指定することは可能ではない。しかしながら、適正な量は、当業者であれば、本明細書で提供される手引きが与えられれば、単に日常的な実験作業を使用して決定することができる。
【００６７】
組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよい。例えば、様々な増殖性障害の動物モデルは、Jackson Laboratory社、６００  メインストリート、バーハーバー、メーン州  ０４６０９  アメリカ合衆国から取得することができる。直接的測定（例えば、腫瘍の組織学的検査）及び機能的測定（例えば、対象体の生存又は腫瘍のサイズ）は両方とも、療法に対する応答をモニターするために使用することができる。これらの方法は、代表的な動物の犠牲にして集団を評価することを伴い、実験に必要な動物数を増加させる。腫瘍中のルシフェラーゼ活性の測定は、動物を犠牲にせずに腫瘍容積を評価する代替方法を提供し、縦断的集団に基づいて療法を分析することが可能になる。
【００６８】
組成物投与の用量範囲は、疾患の症状が影響を受ける所望の効果を生じさせるほどの量の用量である。用量は、望ましくない交差反応及びアナフィラキシー反応などの有害副作用を引き起こさない程度の量であるべきである。任意の逆の兆候（counterindication）が生じた場合には、個々の医師は用量を調節することができる。
【００６９】
用量は変動し、１つ又は複数の用量投与で１日又は数日間毎日投与される。提供されているウイルス及び治療薬は、単回投与又は複数回投与で投与される（例えば、２、３、４、又は６用量以上）。例えば、投与が点滴による場合、点滴は単回の持続的用量であってもよく、又は複数の点滴により送達してもよい。治療は、数日から数か月まで継続してもよく、又は疾患の軽減が達成されるまで継続してもよい。
【００７０】
提供されているウイルス及び治療薬の組み合わせは、付随的に（例えば、混合物として）、別々だが同時に（例えば、別々の静脈ラインにより同一対象体に）、又は順次（例えば、化合物又は作用剤のうちの１つが最初に投与され、その後第２の化合物又は作用剤が投与される）のいずれかで投与される。したがって、組み合わせという用語は、２つ以上の作用剤の付随的投与、同時的投与、又は順次投与のいずれかを指すために使用される。例として、間質圧力を減少させる作用剤は、腫瘍崩壊性ウイルスの前に又は同時に投与される。別の例では、間質圧力を減少させる作用剤が最初に又は２番目に投与され、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤が最初に又は２番目に投与され、腫瘍崩壊性ウイルスが３番目に投与される。間質圧力を低下させる作用剤が最初に投与され、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤が、腫瘍崩壊性ウイルスと同時に投与されてもよい。ある化合物が別の化合物の前に投与される場合、第１の化合物は、第２の化合物を投与する数分、数時間、数日、又は数週間前に投与される。例えば、第１の化合物は、第２の化合物を投与する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、３６、４８、６０、又は７２時間前に投与してもよく、又は１時間以上〜７２時間以内の間の任意の時点で投与してもよい。第１の化合物は、第２の化合物の７２時間より前に投与されてもよい。別の例では、第１の化合物は、第２の化合物を投与する１、５、１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、又は１８０分前に投与してもよく、又は１分以上〜１８０分以内の間の任意の時点で投与してもよい。第１の化合物は、第２の化合物を投与する１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、又は２８日前に投与してもよく、又は１日以上〜２８日以内の間の任意の時点で投与してもよい。第１の化合物は、第２の化合物の２８日より前に投与されてもよい。例えば、間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤（複数可）は、腫瘍崩壊性ウイルスを投与する約１〜８時間前に投与される。別の例では、間質圧力を減少及び／又は血管透過性を増加させる作用剤（複数可）が、腫瘍崩壊性ウイルスを投与する４、６、８、又は１０時間前に最初に投与され、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤が、腫瘍崩壊性ウイルスを投与する１時間前の時点で２番目に投与され、腫瘍崩壊性ウイルスが３番目に（つまり、炎症促進性サイトカインを阻害する作用剤を投与した１時間後に）投与される。
【００７１】
腫瘍崩壊性ウイルス又はそのようなウイルスを含む医薬組成物は、キットに包装されていてもよい。キットは、１つ又は複数の作用剤、又は間質圧力を減少及び／若しくは血管透過性を増加させるような作用剤を含む医薬組成物も含む。キットは、炎症促進性サイトカインを阻害する１つ又は複数の作用剤、１つ又は複数の化学療法剤、１つ又は複数の免疫抑制剤、及び／又は１つ若しくは複数の抗抗ウイルス抗体も含んでいてよい。医薬組成物は、単位剤形で製剤化することができる。「単位剤形」という用語は、ヒト対象体及び他の哺乳類用の単位用量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、好適な薬学的に許容される担体との併用で所望の治療効果を生じるように計算された所定量の突然変異レオウイルスを含有する。
【００７２】
提供されている方法は、化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、及び／又は免疫療法などの他の腫瘍療法と組み合わせてもよい。したがって、腫瘍崩壊性ウイルスは、新生物の外科手術又は摘出と併せて投与されてもよい。したがって、固形新生物を治療するための方法であって、新生物を外科的に摘出すること、及び腫瘍崩壊性ウイルスを新生物の部位又はその付近に投与することを含む方法が、本明細書と共に提供される。
【００７３】
提供されている方法の組成物は、公知の抗癌性化合物又は化学療法剤と併せて又はそれらに加えて投与されてもよい。化学療法剤とは、腫瘍の増殖を阻害することができる化合物である。そのような作用剤には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：５−フルオロウラシル；マイトマイシンＣ；メトトレキサート；ヒドロキシ尿素；シクロホスファミド；ダカルバジン；ミトキサントロン；アントラサイクリン（エピルビシン及びドクスルビシン（doxurubicin））；ハーセプチンなどの受容体に対する抗体；エトポシド；プレグナソーム（pregnasome）；タモキシフェン及び抗エストロゲンなどのホルモン療法；インターフェロン；アロマターゼ阻害剤；プロゲステロン作用剤；及びＬＨＲＨ類似体。
【００７４】
本明細書で使用される場合、増殖性障害という用語は、細胞が正常組織増殖より急速に増殖するあらゆる細胞性障害を指す。増殖性障害には、これらに限定されないが、腫瘍とも呼ばれている新生物が含まれている。新生物には、これらに限定されないが、膵臓癌、乳癌、脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、腎癌、副腎癌、肝臓癌、神経線維腫症１、及び白血病が含まれ得る。新生物は、固形新生物（例えば、肉腫又はカルシノーマ）、又は造血系に影響を与える癌性増殖（例えば、リンパ腫又は白血病）であり得る。他の増殖性障害には、これらに限定されないが、神経線維腫症が含まれる。
【００７５】
腫瘍崩壊性ウイルスが治療として使用される増殖性障害では、一般的に、障害に関連する増殖細胞の１つ又は複数は、ｒａｓ遺伝子（又はｒａｓシグナル伝達経路のエレメント）が、直接的（例えば、ｒａｓの活性化突然変異により）又は間接的（例えば、ｒａｓシグナル経路の上流又は下流エレメントの活性化により）のいずれかで活性化される突然変異を有している場合がある。ｒａｓ経路の上流エレメントの活性化は、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）又はＳｏｓによる形質転換を含む。例えば、Wiessmuller and Wittinghofer, 1994, Cellular Signaling 6(3):247-267；及びBarbacid, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 779-827を参照されたい。ｒａｓ経路の下流エレメントの活性化は、例えば、Ｂ−Ｒａｆ内の突然変異を含む。例えば、Brose et al., 2002, Cancer Res. 62:6997-7000を参照されたい。少なくとも部分には、ｒａｓ、ｒａｓの上流エレメント、又はｒａｓシグナル経路のエレメントの活性化により生じる増殖性障害を、本明細書ではｒａｓ媒介性増殖障害と呼ぶ。加えて、腫瘍崩壊性ウイルスは、ＰＫＲの突然変異又は調節異常により引き起こされる増殖性障害の治療に有用である。例えば、Strong et al. , 1998, EMBO J. 17:3351-62を参照されたい。
【００７６】
本明細書で使用される場合、治療、治療する、治療している、又は寛解するという用語は、疾患若しくは状態の影響又は疾患若しくは状態の症状を軽減する方法を指す。したがって、本開示の方法では、治療とは、罹患している疾患若しくは状態の重症度又は疾患若しくは状態の症状の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の軽減又は寛解を指すことができる。例えば、癌を治療する方法は、対象体の疾患の１つ又は複数の症状に、対照と比較して１０％の軽減がある場合に、治療であるとみなされる。したがって、軽減は、天然レベル又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、又は１０から１００までの任意のパーセントの軽減であり得る。治療は、疾患、状態、又は疾患若しくは状態の症状の治癒又は完全な消失を必ずしも意味しないことが理解される。
【００７７】
本明細書で使用される場合、対象体という用語は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット、又はげっ歯動物）、魚類、鳥類、又は爬虫類、又は両生類であり得る。この用語は、特定の年齢及び性別を指定しない。したがって、成体及び生まれたばかりの対象体は、雄か雌かに関わらず、包含されることが意図されている。本明細書で使用される場合、患者又は対象体は同義的に使用される場合があり、疾患又は障害を有する対象体を参照することができる。患者又は対象体という用語は、ヒト及び獣医学的対象体を含む。
【００７８】
本開示の方法及び組成物用に使用することができる、本開示の方法及び組成物と併せて使用することができる、又は本開示の方法及び組成物の調製に使用することができる物質、組成物、及び成分、又は本開示の方法及び組成物の産物が開示されている。これらの物質及び他の物質が本明細書で開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の種々の各個別的な及び集団的な組み合わせに対する特定の参照は、明示的に開示されていない場合があるが、各々は本明細書で企図されており、記載されていることが理解される。例えば、阻害剤が開示及び考察される場合、及び阻害剤を含む多数の分子へと作製することができる多数の改変が考察される場合、そうではないと特に指示のない限り、阻害剤及び可能な改変のありとあらゆる組み合わせ及び順列が具体的に企図されている。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも具体的に企図及び開示されている。この概念は、本開示の組成物を使用する方法のステップを含むがそれらに限定されない本開示の全ての態様に適用される。したがって、実施することができる様々な追加的ステップが存在する場合、これら追加的ステップの各々は、本開示の方法における任意の特定の方法ステップ又は方法ステップの組み合わせと共に実施することができ、そのような組み合わせの各々又は組み合わせのサブセットが具体的に企図されており、開示されているとみなされるべきであると理解される。
【００７９】
本出願の全体にわたって、種々の出版物が参考文献として参照されている。これら出版物の開示は、これによってそれらの全体が参照により本出願に組み込まれる。
【００８０】
多数の態様が記載されている。しかしながら、改変は種々作製することができることが理解されるだろう。さらに、ある特徴又はステップが記載されている場合、その組み合わせが明示的に述べられなくても、それは、本明細書の他の任意の特徴又はステップと組み合わせることができる。したがって、他の態様は特許請求の範囲内にある。
【００８１】
（実施例）
実施例１  レオウイルス、パクリタキセル、及びカルボプラチンのヒト用プロトコール。
これは、レオウイルスをパクリタキセル及びカルボプラチンと共に３週毎に静脈内投与する研究計画である。 
【００８２】
パクリタキセルを、１７５ｍｇ／ｍ２又は２００ｍｇ／ｍ２の用量で３時間の静脈内点滴として投与する。その後、カルボプラチンを、カルバートの式で計算した用量で（ＧＦＲを５１Ｃｒ  ＥＤＴＡにより測定した、ＡＵＣ  １分当たり５ｍｇ／ｍＬ又は１分当たり６ｍｇ／ｍＬ）３０分間の静脈内点滴として投与する。その後、パクリタキセル及びカルボプラチン投与後に、レオウイルスを１×１０１０又は３×１０１０ＴＣＩＤ５０の用量で１時間の静脈内点滴として投与する。
２〜５日目に、レオウイルスのみを、１日目に使用したのと同じ用量及び方法を使用して投与するだろう。
【表１】
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【００８３】
実施例２  レオウイルス及びｍＴＯＲ阻害剤。
Chou及びTalalayの中央値効果原理（median-effect principle）（Chou and Talalay, Trends Pharmacol. Sci. 4:450-454 (1983)）に基づく定率組み合わせ設計及び組み合わせ示標法（constant ratio combination design and combination index method）を使用して、ラパマイシンと組み合わせたレオウイルスのＢ１６．Ｆ１０細胞に対する効果を評価した。
【００８４】
細胞（１ウエル当たり５×１０３個）を９６ウエルプレートに播種し、終夜接着させた。培地を、以前に決定したＥＤ５０の２、１、０．５、及び０．２５倍に対応する２倍希釈のラパマイシン及び／又はレオウイルスで置換し、新鮮な培地で希釈し、インキュベーションを４８時間継続させた。この時に、培地を取り除き、ＭＴＳアッセイを使用して未処理細胞と比較した細胞生存のパーセントを決定した。ＣａｌｃｕＳｙｎプログラムを使用してデータを分析した。
【００８５】
レオウイルスの２４時間前に又は後にラパマイシンを添加することにより、順序の影響を評価した。特筆すべきことに、２４時間の時点でレオウイルスによる細胞死は、あったとしてもわずかしか見られなかった。ラパマイシンがレオウイルスより先行するか又はレオウイルスと同時に投与した場合、相互作用は拮抗的であった（１を超える組み合わせ指標値（ＣＩＶ））（それぞれ図１ａ及び１ｂ）。ラパマイシンをレオウイルスの後に投与した場合のみ、レオウイルスとラパマイシンとの間に相乗効果的相互作用（１未満のＣＩＶ）が観察された（図１ｃ）。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｖｏの設定で、レオウイルス及びラパマイシンの併用療法は、皮下移植腫瘍の増殖を低減し、マウスの生存期間中央値を延長した。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下播種し、１及び４日目に腫瘍内レオウイルスＴ３Ｄ  ５×１０８ＴＣＩＤ５０及び１、４、８、１２日目に腹腔内ラパマイシン５ｍｇ／ｋｇの単独又は組み合わせのいずれかで、又は対照治療（腫瘍内ＰＢＳ、腹腔内ＰＢＳ）で治療した。
【００８７】
各腫瘍の直径を測定し、各群の平均を計算した。レオウイルスＴ３Ｄ／ラパマイシンの併用治療は、単一の作用剤治療又は対照治療と比較して、腫瘍増殖の著しい低減に帰着した（図２Ａ）。
【００８８】
生存率をカプラン−マイヤー曲線としてプロットした。対照治療マウスの生存期間中央値は７日だった。ラパマイシン単独による生存中央値には改善がなかった。レオウイルス単独では、生存期間中央値が９日に延長された。併用療法では、生存期間が１５日超に延長された（ログランク検定ｐ＝０．０２１６）（図２Ｂ）。
【００８９】
実施例３  レオウイルス、シクロホスファミド（ＣＰＡ）、及びＩＬ−２。
Ｔｒｅｇ欠乏（ＰＣ−６１）及び／又はＩＬ−２を用いたＣ５７Ｂｌ／６マウスのプレコンディショニングは、静脈内送達したレオウイルスの皮下定着Ｂ１６腫瘍への局在化を増強した（図３）。しかしながら、この実験に使用した高用量のレオウイルス（３．７５×１０９ＴＣＩＤ５０）は、毒性をもたらした。したがって、レオウイルスのウイルス用量を１回の注射当たり１×１０８ＴＣＩＤ５０に低減して、ＰＣ−６１又はＣＰＡ（ＰＣ−６１の効果を模倣する）＋ＩＬ−２＋レオウイルスの治療効能を試験した。これらの条件下で、ＰＣ−６１＋ＩＬ−２又はＣＰＡ＋ＩＬ−２のいずれかを使用した皮下Ｂ１６腫瘍の同様の療法が、どの対照治療よりも有意に良好なレベルであったことを観察した（Ｐ＜０．０１；図４Ａ）。プレコンディショニング投薬計画及び静脈内レオウイルスで治療したマウスはいずれも、毒性を発生させなかった。しかしながら、観察可能な毒性の欠如にも関わらず、ＣＰＡ＋ＩＬ−２＋レオウイルスで治療したマウスの肺及び心臓の両方から、レオウイルスが回収された。これは、ウイルスが肺からのみ回収され、心臓からは回収されなかった、ＰＣ−６１＋ＩＬ−２＋レオウイルスで治療したマウスと対照的である。したがって、ＣＰＡ＋ＩＬ−２によるプレコンディショニングは、静脈内送達したレオウイルスの全身性送達によりもたらされた療法を、ＰＣ−６１＋ＩＬ−２により誘導されたものと判別不能なレベルへと増強した。
【００９０】
より高用量のＣＰＡ（１５０ｍｇ／ｋｇ）は、レオウイルスに対するＮＡｂのレベルを調節することができ、ウイルスの反復投与を可能にすることが以前に示されていた（Qiao et al., Clin. Cancer Research 14:259-69 (2008)）。したがって、レオウイルスに対するＮＡｂは、図４Ａでウイルス未処理Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに見られた治療効果にいかなる阻害性の役割も有していないことが示されているが、それらの血清をＮＡｂレベルについて検査した。予想通り、レオウイルス単独で治療したマウスに由来する血清は、レオウイルスに対する高レベルの中和活性を含有していた（図４Ｂ）。これらの値は非常にばらついているが、ＩＬ−２又はＰＣ−６１のいずれかによる前処理は、血清中の中和活性のレベルを増加させる傾向を示した。レオウイルス投与前にＣＰＡで前処理すると、この中和活性が有意に低減され（Ｐ＜０．０１）、それはＣＰＡ＋ＩＬ−２の組み合わせで維持された（図４Ｂ）。ＰＣ−６１＋ＩＬ−２によるＴｒｅｇ欠乏の組み合わせは、レオウイルス単独で治療したマウスで観察されたレベルの中和レベルを維持した（図４Ｂ）。したがって、ＩＬ−２＋レオウイルスと組み合わせたＣＰＡの使用は、抗腫瘍療法を増強する（図４Ａ）だけでなく、抗レオウイルス抗体のレベルも調節する。
【００９１】
要約すると、これらのデータは、ＰＢＳ／レオウイルス単独で治療したマウスと比較して、ＰＣ−６１＋ＩＬ−２が、全身性送達したレオウイルスの腫瘍内局在化を２〜３ｌｏｇ分だけ増強したことを示す。これは、腫瘍部位でのＩＬ−２誘導性脈管漏出によるものであり、全身性送達したウイルスが定着腫瘍へと局所化する能力を増加させた。さらに、本データは、ＣＰＡ媒介性Ｔｒｅｇ修飾が、ＩＬ−２及びレオウイルスと共に、定着腫瘍に対する治療薬であることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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