(57)【要約】【課題】金属陽イオンを用いずにベシクルを展開し、ハイドロゲルが充填された穴部上に脂質二分子膜を配置することが可能なハイドロゲルアレイ基板及びその製造方法、並びに、前記穴部上に脂質二分子膜が配置された脂質二分子膜アレイ基板及びその製造方法の提供。【解決手段】［１］基板１０と、前記基板の表面に配列された複数の穴部２０と、前記穴部に充填された電荷を有するハイドロゲル２１と、が少なくとも備えられているハイドロゲルアレイ基板。［２］正電荷を有するハイドロゲルが充填された前記穴部と、負電荷を有するハイドロゲルが充填された前記穴部と、がそれぞれ同一基板上に配列されている前記ハイドロゲルアレイ基板。［３］前記穴部に充填されている前記ハイドロゲルの電荷とは反対の電荷を有する脂質二分子膜３０が、前記穴部の開口部２５を覆うように配置されている脂質二分子膜アレイ基板４。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板の表面に配列された複数の穴部と、
前記穴部に充填された電荷を有するハイドロゲルと、
が少なくとも備えられていることを特徴とするハイドロゲルアレイ基板。
【請求項２】
正電荷を有するハイドロゲルが充填された穴部と、
負電荷を有するハイドロゲルが充填された穴部と、
がそれぞれ同一基板上に配列されていることを特徴とする
請求項１に記載のハイドロゲルアレイ基板。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のハイドロゲルアレイ基板に脂質二分子膜が備えられた脂質二分子膜アレイ基板であって、
前記穴部に充填されている前記ハイドロゲルの電荷とは反対の電荷を有する脂質二分子膜が、前記穴部の開口部を覆うように配置されていることを特徴とする脂質二分子膜アレイ基板。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のハイドロゲルアレイ基板の製造方法であって、
前記ハイドロゲルを構成するモノマーを含む溶液を前記穴部に充填する充填工程と、
前記溶液中の前記モノマーをゲル化させて、前記穴部内に前記ハイドロゲルを形成するゲル化工程と、
を有することを特徴とするハイドロゲルアレイ基板の製造方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のハイドロゲルアレイ基板の製造方法であって、
第一のハイドロゲルを構成するモノマーを含む第一溶液を前記複数の穴部に充填する第一充填工程と、
前記複数の穴部のうち第一群の穴部において第一溶液中の前記モノマーをゲル化させて、第一群の穴部内に第一のハイドロゲルを形成する第一ゲル化工程と、
前記複数の穴部のうち第一群とは異なる第二群の穴部に、第二のハイドロゲルを構成するモノマーを含む第二溶液を充填する第二充填工程と、
第二群の穴部において第二溶液中の前記モノマーをゲル化させて、第二群の穴部内に第二のハイドロゲルを形成する第二ゲル化工程と、
を有することを特徴とするハイドロゲルアレイ基板の製造方法。
【請求項６】
前記モノマーを含む溶液に光重合開始剤を含有させ、前記溶液が充填された穴部に光を照射することにより、前記モノマーをゲル化させることを特徴とする請求項４又は５に記載のハイドロゲルアレイ基板の製造方法。
【請求項７】
請求項４又は５に記載のハイドロゲルアレイ基板の製造方法が有する各工程と、
前記ハイドロゲルが充填された前記穴部の上に、ベシクルを含む溶液を載せ、前記ベシクルを沈降させ、前記穴部の開口部の上又は近傍で前記ベシクルを展開し、前記開口部を脂質二分子膜で覆う脂質二分子膜形成工程と、
を有することを特徴とする脂質二分子膜アレイ基板の製造方法。
【請求項８】
前記ハイドロゲルの電荷とは反対の電荷を有する脂質分子によって構成される前記ベシクルを用いることを特徴とする請求項７に記載の脂質二分子膜アレイ基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲルアレイ基板及び前記基板の製造方法、並びに脂質二分子膜アレイ基板及び前記基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日までのナノテクノロジーの発展によって、その微細加工レベルは１０ナノメートルオーダーまで到達しており、その微細加工技術を用いて、基板上に生体分子をアレイ化したバイオチップの作製が盛んに行われている。バイオチップの用途である、生体に対する薬剤の影響を確認するための薬剤スクリーニングは、創薬の開発に欠くことのできない技術である。創薬の標的として膜タンパク質が注目されており、様々な病気の発生やその治療に関連する膜タンパク質をアレイ化したバイオチップはハイスループットな薬剤スクリーニング基板として期待できる（非特許文献１）。
【０００３】
生体分子を基板上にアレイ化する方法としては、物理吸着や化学結合を介して生体分子を基板上に固定化する方法がある。しかし、特にタンパク質を基板上に固定化した場合、物理吸着と化学結合の何れの固定化方法であっても、当該タンパク質を変性させてしまうことがあった。特に、膜タンパク質は脂質二分子膜内でその活性を保持するため、脂質二分子膜から単離した膜タンパク質を基板へ固定化することは、その活性を著しく損なわせてしまうという問題があった。そのため、生体分子、特に膜タンパク質の活性を保持したまま、それをアレイ化する（高密度に並べて配置する）技術が求められている。
【０００４】
従来の膜タンパク質を固定化する方法として、脂質分子をｎ−デカンなどの有機溶媒に溶解し、水溶液中で該有機溶媒をプラスチック板等に設けられた小孔に塗りつけることにより形成した黒膜に、膜タンパク質を融合させる方法（非特許文献２）が知られている。この黒膜化法では、形成された黒膜に残る有機溶媒や黒膜の不均一性が、膜タンパク質の機能および形態に影響を与える可能性が指摘されている。
【０００５】
これらの問題を改善するために、本発明者らは、基板上に穴部を備え、前記穴部の開口部にオーバーハング形状を有する基板を用いる方法を提案している（非特許文献３）。具体的には、前記穴部にハイドロゲルを充填し、そのハイドロゲルの上部に、球状の脂質二分子膜であるベシクル（巨大ベシクル）を展開することにより、膜タンパク質を含有する脂質二分子膜を、ハイドロゲルの上部に配置した基板を提案している。
【０００６】
以前に提案した基板においては、穴部に充填したハイドロゲルが脂質二分子膜を支持することができるので、当該脂質二分子膜が浸透圧や温度変化によって受ける影響を低減することができる。また、ベシクルを基板上に展開することによって脂質二分子膜を基板上に配置できるので、従来の黒膜化法では有機溶媒が脂質二分子膜に残留してしまう問題を解決することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Drews J. Science, 287: 1960-1964 (2000)
【非特許文献２】「新パッチクランプ実験技術法」岡田泰伸 編 (2001年，吉岡書店）
【非特許文献３】「細胞質構造を模倣したゲル化マイクロホール配列」田中ら（2012年、第33回応用物理学会秋季学術講演会、講演番号１２ｐ−Ｈ４−５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記穴部に充填されたハイドロゲルの上部に脂質二分子膜を配置させる方法は、当該ハイドロゲルの上部にベシクルを含む水溶液を配置した後、カルシウムイオンやナトリウムイオン等の金属陽イオンを前記水溶液中に加えることによって、ベシクルと基板との間に静電引力を与え、ベシクルを基板表面およびハイドロゲルに密着させた状態でベシクルを展開することにより行われる。 
【０００９】
しかしながら、ハイドロゲルが充填された穴部の上部では、金属陽イオンがハイドロゲル内部を拡散してしまうため、基板表面で得られる静電引力と比べて、ハイドロゲル上で得られる静電引力の方が弱くなる。この結果、ベシクルの展開が起こりにくくなり、脂質二分子膜の形成効率が悪化するという課題があった。さらに、ベシクルを展開するために添加する金属陽イオンは、穴部内のイオン組成を変化させ、更に穴部内のイオン強度を高めてしまうため、当該穴部の上に配置された脂質二分子膜中の膜タンパク質の機能等にも影響を与えるという課題があった。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、金属陽イオンを用いずにベシクルを展開し、ハイドロゲルが充填された穴部上に脂質二分子膜を配置することが可能なハイドロゲルアレイ基板及びその製造方法、並びに、前記穴部上に脂質二分子膜が配置された脂質二分子膜アレイ基板及びその製造方法の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
［１］  基板と、前記基板の表面に配列された複数の穴部と、前記穴部に充填された電荷を有するハイドロゲルと、が少なくとも備えられていることを特徴とするハイドロゲルアレイ基板。
【００１２】
［２］  正電荷を有するハイドロゲルが充填された前記穴部と、負電荷を有するハイドロゲルが充填された前記穴部と、がそれぞれ同一基板上に配列されていることを特徴とする
前記［１］に記載のハイドロゲルアレイ基板。
この構成によれば、異なる電気的性質を有するハイドロゲルを同一基板上にアレイ化することができる。
【００１３】
［３］  前記［１］又は［２］に記載のハイドロゲルアレイ基板に脂質二分子膜が備えられた脂質二分子膜アレイ基板であって、前記穴部に充填されている前記ハイドロゲルの電荷とは反対の電荷を有する脂質二分子膜が、前記穴部の開口部を覆うように配置されていることを特徴とする脂質二分子膜アレイ基板。
【００１４】
前記脂質二分子膜アレイ基板の開口部において、前記ハイドロゲルと前記脂質二分子膜とが接触していることが好ましい。また、前記開口部に露出している前記ハイドロゲルの上面（上部）全体が前記脂質二分子膜に接触していることがより好ましい。この構成であると、前記脂質二分子膜の膜構造を前記ハイドロゲルによって支持することにより、膜構造をより安定に保持することができる。
【００１５】
前記ハイドロゲルは、ポリマー同士が共有結合により架橋された化学ゲルであることが好ましい。前記ハイドロゲルとして化学ゲルを用いることにより、脂質二分子膜をより安定に支持できると共に、化学ゲル内に水分や蛍光物質等を安定に保持することができる。また、化学ゲルには多用な機能及び性質を付与することができるので、同一基板において機能や性質の異なるハイドロゲルをパターニングする（配置する）ことができる。
【００１６】
前記ハイドロゲルには、蛍光分子（蛍光色素）等の蛍光物質が含有されていてもよい。例えば個々の穴部に充填さたハイドロゲルに、異なる種類の蛍光分子を含有させることにより、基板上に配置された穴部及びハイドロゲルのパターンを蛍光観察により確認することができる。さらに、前記穴部及びハイドロゲル上に脂質二分子膜及び膜タンパク質を配置することにより、前記膜タンパク質の機能を蛍光観察により計測することもできる。
【００１７】
前記穴部内に電極が配置されていてもよい。基板上の複数の穴部に対して、個々の電極同士が電気的に独立した電極を個々の穴部に配置してもよいし、個々の電極同士が電気的に接続された電極を個々の穴部に配置してもよい。前記穴部内に電極を配置することにより、穴部内の環境を電気的に計測（モニター）することができる。さらに、前記穴部及びハイドロゲル上に脂質二分子膜及び膜タンパク質を配置することにより、前記膜タンパク質の機能を電気的に計測することもできる。
【００１８】
［４］  前記［１］又は［２］に記載のハイドロゲルアレイ基板の製造方法であって、前記ハイドロゲルを構成するモノマーを含む溶液を前記穴部に充填する充填工程と、前記溶液中の前記モノマーをゲル化させて、前記穴部内に前記ハイドロゲルを形成するゲル化工程と、を有することを特徴とするハイドロゲルアレイ基板の製造方法。
【００１９】
［５］  前記［１］又は［２］に記載のハイドロゲルアレイ基板の製造方法であって、第一のハイドロゲルを構成するモノマーを含む第一溶液を前記複数の穴部に充填する第一充填工程と、前記複数の穴部のうち第一群の穴部において第一溶液中の前記モノマーをゲル化させて（重合させて）、第一群の穴部内に第一のハイドロゲルを形成する第一ゲル化工程と、前記複数の穴部のうち第一群とは異なる第二群の穴部に、第二のハイドロゲルを構成するモノマーを含む第二溶液を充填する第二充填工程と、第二群の穴部において第二溶液中の前記モノマーをゲル化させて（重合させて）、第二群の穴部内に第二のハイドロゲルを形成する第二ゲル化工程と、を有することを特徴とするハイドロゲルアレイ基板の製造方法。
【００２０】
前記製造方法によれば、同一基板上に備えられた複数の穴部のうち、任意の一群（第一群）を構成する例えば１〜１００個の穴部に第一のハイドロゲルを充填し、先の一群とは異なる別の任意の一群（第二群）を構成する例えば１〜５００個の穴部に第二のハイドロゲルを充填することができる。ここでは、基板上に設けられた複数の穴部を第一群と第二群に分けた場合を説明したが、さらに多数の群に分けて、例えば第一群〜第十群に分けてもよい。１０群（１０グループ）に分けた穴部のそれぞれに異なる種類のハイドロゲルを充填すれば、１０種のハイドロゲルを同一基板上にパターニングすることができる。なお、２群よりも多い群に分けた場合の製造方法は、その多数の群の中に前記第一群及び第二群が含まれるため、上記［５］に記載の製造方法に該当する。
【００２１】
［６］  前記モノマーを含む溶液に光重合開始剤を含有させ、前記溶液が充填された穴部に光を照射することにより、前記モノマーをゲル化させる（重合させる）ことを特徴とする前記［４］又は［５］に記載のハイドロゲルアレイ基板の製造方法。
【００２２】
前記ハイドロゲルは、光照射によってゲル化する光硬化性ゲルであることが好ましい。光硬化性ゲルを用いれば、基板上に複数ある前記穴部のうち、任意の穴部内の前記溶液を任意のタイミングでゲル化させることが容易である。また、２種類以上の光硬化性ゲルを用いれば、基板上に高密度で配置された複数の穴部のうち、任意の穴部に任意の種類の光硬化性ゲルを形成することができる。つまり、ハイドロゲルアレイをパターニングすることができる。精度良く高効率で、基板の局所に光を照射するためには、従来のレジスト膜の形成で用いられるようなフォトマスクを使用してもよい。フォトマスクを用いることにより、基板上穴部の全てを一度の光照射でパターニングすることができる。
【００２３】
［７］  前記［４］又は［５］に記載のハイドロゲルアレイ基板の製造方法が有する各工程と、前記ハイドロゲルが充填された前記穴部の上に、ベシクルを含む溶液を載せ、前記ベシクルを沈降させ、前記穴部の開口部の上又は近傍で前記ベシクルを展開し、前記開口部を脂質二分子膜で覆う脂質二分子膜形成工程と、を有することを特徴とする脂質二分子膜アレイ基板の製造方法。
【００２４】
［８］  前記ハイドロゲルの電荷とは反対の電荷を有する脂質分子によって構成される前記ベシクルを用いることを特徴とする前記［７］に記載の脂質二分子膜アレイ基板の製造方法。
【００２５】
ハイドロゲルとベシクルの電荷が互いに異なる場合、基板上で両者間の静電引力（相互作用）が起きるため、ベシクルの展開効率が向上し、脂質二分子膜を穴部及びハイドロゲル上に配置する効率を格段に向上させることができる。
【００２６】
本発明において、ベシクルの大きさは特に制限されない。ここで「ベシクル」という用語は、一般に用いられる「巨大ベシクル」を含む用語であると定義する。一般に、比較的大きい直径のベシクルを巨大ベシクルと呼ぶが、実験者の主観によって巨大であるか否かの判断が分かれるので、本明細書及び特許請求の範囲においては、特に明記しない限り、ベシクルと巨大ベシクルを区別しない。
【００２７】
本発明の脂質二分子膜アレイ基板の製造方法おいて、前記穴部の開口部を効率よく被覆するために直径が大きいベシクル（即ち、巨大ベシクル）を用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のハイドロゲル基板を用いれば、電荷を有するハイドロゲルを穴部内に有しているため、前記穴部の上又は近傍にベシクルを沈降させ、前記ハイドロゲルと前記ベシクルを相互作用させることにより、従来必要であった金属陽イオンを用いることなく、前記ベシクルを展開して、脂質二分子膜を前記穴部上に配置することができる。この結果、穴部内のハイドロゲルに金属陽イオンが浸透して、後の使用に影響を与える問題は生じない。また、電荷を有さないハイドロゲルが充填されている従来品と比べて、本発明にかかるハイドロゲルアレイ基板においてはベシクルを展開する効率が向上しているため、ハイドロゲル基板に脂質二分子膜を配置する効率（脂質二分子膜により穴部を被覆する効率）を向上させることができる。任意の位置にある穴部に任意の種類のハイドロゲルを充填することにより、任意のパターンで基板上にハイドロゲルをアレイ化することができる。
【００２９】
本発明の脂質二分子膜アレイ基板によれば、前記ハイドロゲルが前記脂質二分子膜の膜構造を安定に支持することができる。このため、前記穴部の開口部のサイズ（直径）が従来よりも大きい場合においても、前記開口部を前記脂質二分子膜によって被覆することができる。また、前記ハイドロゲルによって脂質二分子膜を支持することにより、脂質二分子膜の安定性が向上し、浸透圧やｐＨ等の化学的な変化や、振動等の物理的な衝撃に対する脂質二分子膜の耐性を向上させることができる。膜安定性が向上した脂質二分子膜に、例えば膜タンパク質を配置することによって、その膜タンパク質の機能解析を安定に行えるようになり、信頼性の高いデータを得ることができる。
【００３０】
本発明のハイドロゲルアレイ基板の製造方法によれば、穴部内に容易にハイドロゲルを充填することができる。
本発明の脂質二分子膜アレイ基板の製造方法によれば、ハイドロゲルが電荷を有するため、従来よりも効率よくベシクルを展開し、基板上に脂質二分子膜を容易に配置することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明にかかる基板の第一実施形態の模式断面図である。
【図２】本発明にかかる基板の第二実施形態の模式断面図である。
【図３】本発明にかかる基板の第三実施形態の模式断面図である。
【図４】本発明にかかる基板の第四実施形態の模式断面図である。
【図５】本発明にかかる基板の第五実施形態の模式断面図である。
【図６】本発明にかかる基板の第六実施形態の模式断面図である。
【図７】穴部２０からはみ出しているハイドロゲル２１の上部を、基板上面１１ａと平行な方向に押すことにより、前記上部を除去する様子を示す模式断面図である。
【図８】実施例１で作製した脂質二分子膜アレイ基板の上面の蛍光観察像である。（ａ）はカルセインが発した蛍光のみを観察した結果であり、（ｂ）はカルセインとローダミンの両方が発した蛍光を観察した結果である。
【図９】実施例２で作製したハイドロゲルアレイ基板の上面の蛍光観察像である。（ａ）はカルセインが発した蛍光のみを観察した結果であり、（ｂ）はカルセインとローダミンの両方が発した蛍光を観察した結果である。
【図１０】実施例４で作製した脂質二分子膜アレイ基板の上面に形成された、脂質二分子膜アレイの様子を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、好適な実施の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明するが、本発明はかかる実施形態に限定されない。
【００３３】
＜＜ハイドロゲルアレイ基板；第一実施形態＞＞
本発明の第一実施形態の基板として、図１に示すハイドロゲルアレイ基板１を例示する。ハイドロゲルアレイ基板１は、基板本体（基板）１０と、基板の表面１１ａに配列された複数の穴部（マイクロキャビティ）２０と、穴部２０に充填された電荷を有するハイドロゲル２１と、が少なくとも備えられている。
【００３４】
基板本体１０の材料は特に制限されず、例えば、シリコン、ガラス、プラスチックなどが挙げられる。また、基板本体１０の厚みや形状は用途に応じて適宜調整される。基板本体１０の厚みとしては、例えば０．１μｍ〜１０ｍｍとすることができる。基板本体１０の形状としては、例えば平板状が挙げられる。
【００３５】
基板本体１０の材料として疎水性材料を用いた場合、基板本体１０の表面（上面）１０ａに親水性の層（親水層）１１が配置されていることが好ましい。本実施形態のハイドロゲルアレイ基板１には、親水層１１が形成されている。基板本体１０にガラス等の親水性材料を用いた場合、親水層１１は配置されていなくてもよい。
【００３６】
ハイドロゲルアレイ基板１に設けられた穴部２０の開口部２５の形状は、特に限定されない。開口部２５を基板の上面側から見た場合の形状としては、例えば円形、楕円形、三角形、矩形、多角形等の形状が挙げられる。
【００３７】
穴部２０の開口部２５の口径（直径）或いは開口部２５を構成する多角形の対角線のうち最長の長さ又は前記多角形の外接円の直径は、特に制限されないが、０．１μｍ〜１０μｍ程度が好ましい。
上記範囲の下限値０．１μｍ以上とすることにより、穴部２０の内部にハイドロゲル２１を容易に充填することができる。また、後述する第四実施形態において、穴部２０の上部に配置する脂質二分子膜３０内に充分な量の膜タンパク質３１を配置し、当該膜タンパク質の機能をより容易に測定することができる。
上記範囲の上限値１０μｍ以下とすることにより、穴部２０内部にハイドロゲル２１を安定に保持して、穴部２０からハイドロゲル２１が脱落することを確実に抑制できる。
【００３８】
穴部２０の深さは特に制限されず、開口部２５のサイズや穴部２０の内部に充填するハイドロゲル２１の体積に応じて適宜設計すればよい。前記深さは、例えば０．１μｍ〜１０μｍとすることができる。
【００３９】
基板本体１０に設けられた穴部２０の数は特に限定されず、例えば１〜１００００個とすることができる。
【００４０】
穴部２０に充填するハイドロゲル２１は、水溶液中で電荷を有するものであれば特に制限されない。後述する脂質二分子膜３０の形成を阻害しないハイドロゲル２１であることが好ましい。前記電荷は、正電荷であってもよいし、負電荷であってもよい。また、ハイドロゲル２１を構成するポリマーの官能基が有する電荷としては、１〜３価の正電荷又は−１〜−３の負電荷が好ましい。
【００４１】
ハイドロゲル２１は、親水性ポリマーであることが好ましい。前記親水性ポリマーとしては、例えば（メタ）アクリル樹脂が挙げられる。前記アクリル樹脂として、電荷を有するモノマーである、負電荷を有するアクリル酸又は正電荷を有するジメチルアミノプロピルメタアクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）１種類のみを重合させたアクリル樹脂が挙げられる。
【００４２】
また、電荷を有する前記モノマーと、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドまたはＮ−イソプロピルアクリルアミド等の中性のアクリルモノマーを１種類若しくは２種類以上とをモノマーとして併用し、これらのモノマーを共重合させると共に、メチレンビス（メタ）アクリルアミドまたはポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体で架橋したアクリル樹脂をハイドロゲル２１として用いることができる。また、前記モノマーの誘導体を用いてハイドロゲル２１を構成してもよい。
【００４３】
ハイドロゲル２１を構成するモノマーの一つとして、電荷を有さないモノマーを、電荷を有する他のモノマーと共に併用してもよい。
【００４４】
ハイドロゲル２１の含水量は特に制限されず、用途に応じて適宜調整される。ハイドロゲル２１の全重量に対する、当該ハイドロゲル２１に含まれる水の含有量は、例えば１〜９９重量％の範囲で調整すればよい。前記含有量は５０〜９９重量％が好ましく、７０〜９５重量％がより好ましく、８５〜９５重量％がさらに好ましい。これらの好適な含水量であると、ハイドロゲル２１が、生体を構成する細胞の細胞質又は細胞外マトリックスを模することができる。
【００４５】
ハイドロゲルアレイ基板１において、穴部２０の全体積に対する、当該穴部内のハイドロゲル２１の体積は５０〜１００％であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましく、９０〜１００％であることが更に好ましい。ハイドロゲル２１は穴部２０の底部から開口部２５（上面１１ａの高さ）まで充填されていることが好ましい。開口部２５まで充填されていることにより、上面１１ａの高さにおいて、ハイドロゲル２１が脂質二分子膜３０を支持することができる。
【００４６】
穴部２０の開口部２５におけるハイドロゲル２１の上面（ハイドロゲル２１が基板の上面１１ａ側に露出する部分）は、平坦であってもよいし、平坦でなくてもよい。例えば前記上面が上方へ膨らんでいてもよい。表面張力等の影響でハイドロゲル２１の上面が上方へ膨らんだり凹んだりする場合がある。その非平坦性の程度が軽微であれば、脂質二分子膜３０をハイドロゲル２１の上に形成する際に問題は殆ど生じない。
【００４７】
ハイドロゲルアレイ基板１に備えられた個々の穴部２０には、同じ種類のハイドロゲル２１が充填されていてもよいし、異なる種類のハイドロゲル２１が充填されていてもよい。例えば、ハイドロゲルアレイ基板１の第一の領域に設けられた穴部２０には正電荷を有するカチオン性のハイドロゲルが充填され、同一基板の第二の領域に設けられた穴部２０には負電荷を有するアニオン性のハイドロゲルが充填された構成を例示できる。
【００４８】
このように、同一基板上において電荷が互いに異なるハイドロゲルが各領域に配置されている又はパターニングされていることにより、異なる種類の脂質二分子膜を各領域にそれぞれ配置することができる。具体的には、単一のハイドロゲルアレイ基板において、正電荷を有するハイドロゲルが充填された第一の穴部の上部には負電荷を有する脂質二分子膜を配置し、負電荷を有するハイドロゲルが充填された第二の穴部の上部に正電荷を有する脂質二分子膜を配置した脂質二分子膜アレイ基板が挙げられる。ハイドロゲル上に脂質二分子膜を配置した脂質二分子膜アレイ基板の詳細については後述する。
【００４９】
＜＜ハイドロゲルアレイ基板の製造方法＞＞
本発明にかかるハイドロゲルアレイ基板の製造方法として、第一実施形態のハイドロゲルアレイ基板１を製造する方法を例示する。
【００５０】
まず、所望の材料からなる基板本体１０の表面１０ａに親水性の層（親水層）１１を形成する。親水層１１の形成方法は特に制限されず、例えば、基板本体１０がシリコン製の場合は熱酸化による酸化シリコン層（親水層）を形成する方法が挙げられ、基板本体１０がプラスチック製の場合はプラズマクリーニングによる親水層の形成が挙げられる。
【００５１】
表面１０ａに親水層１１が形成された基板本体１０に穴部２０を形成する方法は特に制限されず、例えば、フォトリソグラフィ法、電子ビームリソグラフィ法、ドライエッチング法等の微細加工技術を適用することができる。具体的には、親水層１１上に所定のレジストパターンを形成した後、ドライエッチング又はウェットエッチングを行うことにより、所望の大きさの穴部２０を所望の数で形成することができる。図１では説明を簡略化するために１つの穴部２０のみを描いているが、実際には複数の穴部２０が配列したアレイが形成されている。
【００５２】
穴部２０にハイドロゲル２１を充填する方法は特に限定されず、例えば、穴部２０の内部にゲル化する前のハイドロゲル２１のモノマーを含む溶液を充填し、必要に応じて重合開始剤を添加した後、ゲル化する前に前記溶液（ハイドロゲル溶液）を基板の表面１１ａ上に滴下して、穴部２０に前記溶液を充填し、穴部２０内の前記溶液をゲル化させる方法が挙げられる。
【００５３】
前記ハイドロゲル溶液としては、例えば後述するモノマーを含む水溶液が挙げられる。ゲル化後に、穴部２０からはみ出した余剰のハイドロゲル２１を取り除くことにより、第一実施形態のハイドロゲルアレイ基板１が得られる。ハイドロゲル２１が乾燥することを防ぐために、基板の表面１１ａに溶液Ｌを載せておいてもよいし、樹脂フィルム等を貼り付けることにより基板の表面１１ａの全面をシールしてもよい。
【００５４】
前記モノマーを重合させてハイドロゲル２１を合成するための重合反応を開始する方法は特に限定されず、例えば、前記モノマーを含む組成物中に重合開始剤を添加して重合させる方法が挙げられる。重合開始剤とその重合方法としては、例えば、前記モノマーを含む水溶液に、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を添加する方法、ａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｒｏｎｉｔｒｉｌｅ（ＡＩＢＮ）などを前記組成物中で熱分解する方法、リボフラビン等の光反応性重合開始剤を前記組成物に添加して光照射する方法が挙げられる。
【００５５】
水溶液中で重合して得られたポリマーには水が含まれるため、そのままハイドロゲル２１として使用することができる。また、ハイドロゲル２１に含まれる水溶液の組成を変えるために、所望の組成を有する水溶液を前記ポリマーに含浸させて使用してもよい。水を含まない溶液中で重合して得られたポリマーに対しては、所望の溶液を当該ポリマーに含浸させることにより、ハイドロゲル２１として使用することができる。
【００５６】
ハイドロゲルアレイ基板１の個々の穴部２０に対して、異なる種類のハイドロゲル２１を充填する場合には、光照射による重合方法（ゲル化方法）を適用することが好ましい。光照射によるゲル化方法は特に制限されず、例えば、レーザー光とフォトマスクを用いて、任意の穴部のみをゲル化させる方法が挙げられる。
【００５７】
ゲル化方法の具体例としては、まず、複数の穴部２０が設けられた基板表面１１ａの全体に、第一のハイドロゲルを構成するモノマーを含む第一の溶液を滴下し、複数の穴部に第一の溶液を充填する。次に、フォトマスク等を用いて所望の穴部だけに光を照射し、所望の穴部においてのみ第一のハイドロゲルを形成する。続いて、光照射していない穴部内にある第一の溶液を洗い流し、第二のハイドロゲルを構成するモノマーを含む第二の溶液を滴下し、第一のハイドロゲルが形成されていない穴部に第二の溶液を充填する。フォトマスク等を用いて穴部内の第二の溶液に光を照射することにより、第一のハイドロゲルが形成されていない所望の穴部において第二のハイドロゲルを形成する。このように、光照射による段階的な重合方法を適用することにより、複数の穴部が高密度で配列されたアレイにおいても、個々の穴部に種々のハイドロゲルを形成することができる。
【００５８】
ハイドロゲル２１の含水量は、その用途や機能解析する膜タンパク質の種類等に応じて、適宜調整すればよい。ハイドロゲル２１を構成するモノマーの前記溶液における濃度や、その重合方法を検討することによって、用途に応じた最適な含水量のハイドロゲル２１を形成できる。例えば、アクリルアミド及びＤＭＡＰＭＡからなるハイドロゲル２１を穴部２０に充填する場合は、これら２種のモノマーを含む溶液における当該２種のモノマーの合計の濃度は、前記溶液の総質量に対して、１〜３０重量％で調整する方法が挙げられる。この濃度は、好適には３〜２０重量％であり、より好適には５〜１５重量％である。
【００５９】
ハイドロゲル２１を構成するモノマーとして、１種のモノマーを単独で用いてもよいし、２種以上のモノマーを併用してもよい。
【００６０】
ハイドロゲル２１を構成するモノマーが２種類以上である場合、それぞれの配分比（配合比）は特に制限されず、ハイドロゲルに付与する所望の特性に応じて、適宜調整すればよい。後述する脂質二分子膜アレイ基板を作製する目的においては、全モノマーの合計の重量に対する電荷を有するモノマーの重量比が１〜２０重量％とすることが好ましい。
【００６１】
本発明にかかるハイドロゲルアレイ基板の製造方法としては、以下に説明する充填工程とゲル化工程をこの順で行う方法が好ましい。また、本発明の趣旨を逸脱しない限り、ここで挙げた２つの工程以外の、他の工程を追加してもよい。
【００６２】
［充填工程］
充填工程は、親水層１１を配置した基板１０の上面１１ａにハイドロゲル２１を構成するモノマーを含む溶液を注いで、基板の上面１１ａに設けられた穴部２０の中に前記溶液を充填する工程である。
【００６３】
ハイドロゲル２１を構成するモノマーは、重合前の（未重合の）モノマーである。前記モノマーを溶解又は分散させる溶媒は特に制限されず、水系溶媒が好ましい。モノマーの濃度は、ハイドロゲル２１の硬度及び含水量に応じて適宜調整される。
【００６４】
基板１０の上面１１ａに注ぐ前記溶液の量は、穴部２０を充填できる量であれば特に制限されないが、上面１１ａの上方にも溢れさせることができる量、すなわち上面１１ａの上方に当該溶液が溜まる状態にしうる量を注ぐことが好ましい。
【００６５】
基板１０の上面１１ａに前記溶液を注ぐ方法は特に制限されず、ピペット等で上面１１ａに前記溶液を滴下した後、必要に応じて当該基板および溶液を超音波処理又は真空処理等することによって、穴部２０から気泡を排出させて、穴部２０に当該溶液を充填することが可能である。
【００６６】
［ゲル化工程］
ゲル化工程は、前記溶液中のハイドロゲル２１のモノマーをゲル化させて、穴部２０内にハイドロゲル２１を形成する工程である。
モノマーを重合させる方法は、前述のとおりである。充填工程の後、ハイドロゲル２１のモノマーを含む溶液が穴部２０の外部にある場合、次の２つの方法（方法Ａ，Ｂ）を例示できる。方法Ａは、穴部２０の外部にある前記溶液を除去して、穴部２０の内部のみでハイドロゲル２１のモノマーをゲル化させる方法である。方法Ｂは、穴部２０の外部にあるハイドロゲル２１のモノマーを含む溶液を除去せずに、穴部２０の内外でハイドロゲル２１のモノマーをゲル化させる方法である。前者の場合（方法Ａの場合）には、穴部２０の外部溶液を、例えばハイドロゲル２１のモノマーと水が溶解しない（穴部２０から流出しない）溶媒で置換した後で、穴部２０内に残された前記溶液をゲル化する方法を例示できる。後者の場合（方法Ｂの場合）、穴部２０の外部（上方）でゲル化したハイドロゲル２１の上部を、ゆっくり剥がす等の適当な方法により除去し、穴部２０の内部にだけハイドロゲル２１を残すことができる（図７参照）。ハイドロゲル２１の前記上部の除去は、基板の上面１１ａを生理的塩類溶液等の適当な外部溶液Lで覆った状態で行うことが好ましい。
【００６７】
＜＜ハイドロゲルアレイ基板；第二実施形態＞＞
図２に示すように、本発明の第二実施形態として、ハイドロゲルアレイ基板２が挙げられる。ハイドロゲルアレイ基板２は、第一実施形態の構成に加えて、穴部２０の内部のハイドロゲル２１に蛍光物質２２（蛍光分子２２）が含まれている。
この構成以外は、前述した第一実施形態のハイドロゲルアレイ基板１と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。
【００６８】
蛍光物質２２は、穴部２０の内部の状態変化が起こった場合に蛍光を発する水溶性の蛍光分子であることが好ましい。前記蛍光分子としては、穴部２０の内部のイオン濃度の変化に伴って、その蛍光強度が変化する蛍光分子がより好ましい。具体的には、例えば、カルシウムイオン濃度変化を検出可能なＦｌｕｏ‐４、Ｆｕｒａ‐２、Ｆｌｕｏ‐３等を例示できる。
【００６９】
＜＜ハイドロゲルアレイ基板；第三実施形態＞＞
図３に示すように、本発明の第三実施形態として、ハイドロゲルアレイ基板３が挙げられる。ハイドロゲルアレイ基板３は、第一実施形態の構成に加えて、穴部２０の中に電極４０を備え、穴部２０の外部溶液Ｌの中に対向電極４１を備えている。
この構成以外は、前述した第一実施形態のハイドロゲルアレイ基板１と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。
【００７０】
電極４０の配置方法としては、例えば、ハイドロゲルアレイ基板３の製造時に、スパッタリング等の成膜法によって金属層４０ａを形成し、エッチング等により金属層４０ａを適宜パターニングして、当該金属層４０ａのうち穴部２０の内部に露出する部分を除く領域を絶縁層１３（第二の絶縁層１３）で被覆することによって、電極４０を穴部２０の内部に露出するように埋め込んで配置することができる。
【００７１】
金属層４０ａを基板本体１０に埋め込んで形成する場合、金属層４０ａを電気的に絶縁する必要がある。絶縁する方法として、例えばシリコン酸化物やシリコン窒化物、アルミナ、酸化タンタル、樹脂等の絶縁体を基板本体の材料として用いる方法が挙げられる。また、基板本体１０が半導体又は導電体である場合は、当該基板本体１０の上面１０ａに第一の絶縁層１２（基板絶縁層１２）を形成し、その第一の絶縁層の上面に金属層４０を配置すればよい。第一の絶縁層１２及び第二の絶縁層１３の材料は特に制限されず、例えばシリコン酸化物やシリコン窒化物、アルミナ、酸化タンタル等が挙げられる。第一の絶縁層１２と第二の絶縁層１３を構成する材料は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。金属層４０ａ（電極４０）の材料としては、銀、塩化銀や、金、白金などが例示できる。
【００７２】
＜＜脂質二分子膜アレイ基板；第四実施形態＞＞
図４に示すように、本発明の第四実施形態として、脂質二分子膜アレイ基板４が挙げられる。脂質二分子膜アレイ基板４は、第一実施形態の構成に加えて、穴部２０に充填されたハイドロゲル２１の上部を覆うように脂質二分子膜３０が配置されている。
この構成以外は、前述した第一実施形態のハイドロゲルアレイ基板１と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。
以下に、第四実施形態の脂質二分子膜アレイ基板４が第一実施形態のハイドロゲルアレイ基板１と相違する点を説明する。
【００７３】
脂質二分子膜３０を構成する脂質分子の種類は、脂質二分子膜（脂質二重膜）を形成できるものであれば特に制限されず、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。これらの脂質は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００７４】
脂質二分子膜３０は、穴部２０内のハイドロゲル２１が有する電荷と反対の電荷を有する脂質分子によって構成された脂質二分子膜であることが好ましい。具体的には、ハイドロゲル２１が正電荷を有する場合には、負電荷を有する脂質二分子膜を当該ハイドロゲル２１の上部に配置することが好ましく、ハイドロゲル２１が負電荷を有する場合には、正電荷を有する脂質二分子膜を当該ハイドロゲル２１の上部に配置することが好ましい。このようにハイドロゲル２１と脂質二分子膜３０の電荷が反対であると、両者の静電相互作用によって、ハイドロゲル２１上に脂質二分子膜３０を容易に配置することが可能となり、更に、ハイドロゲル２１上に脂質二分子膜３０をより安定に保持することができる。
【００７５】
前記静電相互作用による脂質二分子膜の配置及び安定化を利用すれば、複数の穴部を有する単一の基板において、正電荷を有するハイドロゲルと負電荷を有するハイドロゲルがそれぞれ任意の穴部に充填され、更に、各穴部のハイドロゲルの電荷とは反対の電荷を有する脂質二分子膜が各穴部のハイドロゲルの上に配置された脂質二分子膜アレイ基板が得られる。この際、互いに異なる電荷を有する脂質二分子膜毎に、それぞれ異なる種類の膜タンパク質を含有させることにより、複数種類の膜タンパク質が所定の位置に配置された（固定化された）膜タンパク質アレイ基板が得られる。
【００７６】
水溶液等の溶液中で正電荷を有する脂質二分子膜としては、例えばＮ‐（１‐（２、３‐ジオレイオキシ）プロピル）‐Ｎ、Ｎ、Ｎ‐トリメチル‐アンモニウムクロライドなどの合成カチオン性脂質、ジフィタニルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）等によって構成された脂質二分子膜が挙げられる。
水溶液等の溶液中で負電荷を有する脂質二分子膜としては、例えばホスファチジルセリン（ＰＳ）等によって構成された脂質二分子膜が挙げられる。
【００７７】
前記脂質二分子膜にはコレステロール分子が含有されていてもよい。また、前記脂質二分子膜を構成する脂質分子は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。また、前記脂質二分子膜には、溶液中で電荷を有さない中性の脂質分子が含まれていてもよい。中性の脂質分子としては、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。
【００７８】
脂質二分子膜３０の形成方法としては、例えば、その直径が１０μm以上のベシクル（巨大ベシクル（巨大脂質ベシクル））をハイドロゲル２１及び基板の表面１１ａ上で展開する方法が挙げられる。
【００７９】
ベシクルを形成する代表的な手法としては、静置水和法やエレクトロスウェリング法（電界形成法）が例示できる。ベシクルの作製手法は特に限定されないが、巨大ベシクルを作製しやすく、反応時間や反応プロセスが簡易であるという観点から、電界形成法を採用することが好ましい。電界形成法は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）などの電極上に、リン脂質を薄膜化した後、交流電場をかけて水溶液中にベシクルを形成する手法である。サイズのそろったベシクルを得るためには、ＩＴＯ基板上に厚さ数十ｎｍ〜数μｍの均一なリン脂質分子からなる膜を形成することが好ましい。
【００８０】
ハイドロゲル２１に含まれる水には、脂質二分子膜３０が安定に維持される範囲であれば、ｐＨ緩衝剤、各種イオン、酸化防止剤、界面活性剤等が含まれていてもよい。ハイドロゲル２１に含まれる水には、膜タンパク質３１の機能が最適に発揮されるために必要な成分を含有させることが好ましい。
【００８１】
本実施形態においては、穴部２０に充填されたハイドロゲル２１の上部（上面）を被覆する脂質二分子膜３０に、膜タンパク質３１が配置されている。したがって、本発明にかかる「脂質二分子膜アレイ基板４」は、「膜タンパク質アレイ基板４」と読み換えることができる。脂質二分子膜３０は穴部２０の外部にある外部溶液Ｌによって覆われている。例えば、外部溶液Ｌに医薬候補物質等を添加することにより、膜タンパク質３１の機能を解析することができる。
【００８２】
脂質二分子膜３０に、機能測定対象となる膜タンパク質３１を再構成する方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、ベシクルフュージョン法が挙げられる。具体的には、プロテオリポソームと呼ばれる膜タンパク質を含有するベシクルを、脂質二分子膜３０上に添加することにより、プロテオリポソームと脂質二分子膜３０が融合し、膜タンパク質３１が脂質二分子膜３０中に再構成される。
【００８３】
脂質二分子膜３０に融合する膜タンパク質３１としては、脂質二分子膜３０に保持され、かつ、当該脂質二分子膜３０が境界になり、穴部２０の内部と外部のイオン濃度を変化させる機能を有する膜タンパク質が好ましい。このような膜タンパク質３１としては、例えば、イオンチャネル型受容体が挙げられる。
【００８４】
イオンチャネル型受容体としては、例えば、細胞間情報伝達や温度の感受、炎症や痛みに関与するＴＲＰ（transient receptor potential）チャネル、細胞間情報伝達や痛みに関与するＡＴＰ受容体、細胞間情報伝達や情動に関与するセロトニン受容体、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するＮＭＤＡ受容体、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するＡＭＰＡ受容体、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するカイニン酸受容体、細胞間情報伝達や抑制性神経伝達に関与するＧＡＢＡ受容体等が挙げられる。
【００８５】
穴部２０の内部および外部に電解質溶液を配置する場合、その電解質溶液は、膜タンパク質３１を埋め込んだ脂質二分子膜３０が安定に保持されるものが好ましい。前記電解質溶液としては、例えば、100mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 10mM Tris-HCl (pH7.4)を含む水溶液などが挙げられる。前記内部と外部に配置する電解質溶液の組成は、同じ組成であってもよく、異なる組成であってもよい。
【００８６】
＜＜脂質二分子膜アレイ基板の製造方法＞＞
本発明にかかる脂質二分子膜アレイ基板の製造方法として、図４に示す第四実施形態の脂質二分子膜アレイ基板４を製造する方法を例示する。
その製造方法としては、充填工程、ゲル化工程、及び脂質二分子膜形成工程、をこの順で行う方法が好ましい。また、本発明の趣旨を逸脱しない限り、ここで挙げた３つの工程以外の、他の工程を追加しても良い。
【００８７】
脂質二分子膜アレイ基板の製造方法における充填工程とゲル化工程は、前述したハイドロゲルアレイ基板の製造方法の充填工程とゲル化工程と同じであるため、ここではその説明を省略する。
【００８８】
［脂質二分子膜形成工程］
脂質二分子膜形成工程は、基板１０の上面１１ａ上にある溶液Ｌにベシクルを添加し、前記ベシクルを基板１０の上面１１ａに沈降させ、穴部２０の近傍において前記ベシクルを展開し、穴部２０の開口部２５を脂質二分子膜３０で覆う工程である。
【００８９】
ベシクルは、前述した方法で調製したものを使用できる。ベシクルの大きさ（直径）は、開口部２５よりも充分に大きいものであることが好ましい。例えば、１０μｍ〜１００μｍの大きさのベシクル（巨大ベシクル）を使用することができるが、この大きさの範囲に限定されず、他の大きさのベシクルを使用しても構わない。
【００９０】
ベシクルを基板１０の上面１１ａの上にある溶液Ｌに添加する方法は特に制限されず、例えば、ベシクルを含むベシクル分散液を調製して、前記ベシクル分散液を溶液Ｌに添加する方法が挙げられる。
【００９１】
溶液Ｌに添加したベシクルを上面１１ａに接触するように沈降させる方法は特に制限されない。通常、溶液Ｌよりもベシクルの比重が重いため、ベシクルを溶液Ｌに添加した後、自然に沈降するのを待てば、ベシクルを基板の上面１１ａに沈降させることができる。
【００９２】
前記ベシクル分散液におけるベシクルの濃度の目安としては、添加したベシクルが、基板１０の上面１１ａの広い領域、例えば上面１１ａの８０％以上の領域、を占有して拡がる程度の濃度であることが好ましい。前記ベシクル分散液の濃度は、例えば、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度に調整して使用することができるが、この濃度範囲に限定されず、他の濃度で使用しても構わない。
【００９３】
＜＜脂質二分子膜アレイ基板；第五実施形態＞＞
図５に示すように、本発明の第五実施形態として、脂質二分子膜アレイ基板５が挙げられる。脂質二分子膜アレイ基板５は、第四実施形態の構成に加えて、穴部２０の内部のハイドロゲル２１に蛍光物質２２（蛍光分子２２）が含まれている。
この構成以外は、前述した第四実施形態のハイドロゲルアレイ基板４と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。なお、第一実施形態のハイドロゲルアレイ基板１の脂質二分子膜の下面と同様に、本実施形態の脂質二分子膜の下面３０ａはハイドロゲル２１の上面に接触している。
【００９４】
本実施形態の脂質二分子膜アレイ基板５を用いれば、例えばイオン透過性の膜タンパク質３１を脂質二分子膜３０に配置して、その膜タンパク質３１を介して、穴部２０内のハイドロゲル２１へイオンが流入した際に又はハイドロゲル２１からイオンが流出した際に、ハイドロゲル２１内に含まれる蛍光分子２２の蛍光強度が変化したことを蛍光顕微鏡等によって検出することができる。すなわち、膜タンパク質３１の機能をハイドロゲル２１内の蛍光分子の蛍光強度の変化として検出することができる。
【００９５】
＜＜脂質二分子膜アレイ基板；第六実施形態＞＞
図６に示すように、本発明の第六実施形態として、脂質二分子膜アレイ基板６が挙げられる。脂質二分子膜アレイ基板６は、第三実施形態の構成に加えて、穴部２０及びハイドロゲル２１の上に、膜タンパク質３１を含む脂質二分子膜３０が配置されている。
この構成以外は、前述した第三実施形態のハイドロゲルアレイ基板３と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。
【００９６】
本実施形態の脂質二分子膜アレイ基板６を用いれば、例えば、膜タンパク質３１としてイオンチャンネル型タンパク質を配置した場合には、イオンチャンネル型タンパク質を透過したイオン電流を、電極４０及び／又は対向電極４１に接続された電気計測計で計測することにより、膜タンパク質３１の機能測定を電気生理学的手法によって行うことができる。すなわち、膜タンパク質３１の機能を穴部２０内外の電位差又は電流値の変化として検出することができる。
【００９７】
以上で説明したとおり、本発明の脂質二分子膜アレイ基板を作製する際、脂質二分子膜とハイドロゲル間に静電引力を働かせることにより、金属陽イオンを添加すること無しに、ハイドロゲルが充填された穴部の上に脂質二分子膜を容易に形成することができる。この結果、脂質二分子膜によって隔離される穴部２０内のイオン組成及び外部溶液Ｌのイオン組成を任意に設定することができる。加えて、光硬化性ゲルとフォトマスクを用いることにより、正電荷を有するハイドロゲルと負電荷を有するハイドロゲルを、任意のパターンで同一基板上にアレイ化したハイドロゲルアレイ基板を作製することができる。このハイドロゲルアレイ基板を用いれば、正電荷を有する脂質二分子膜と負電荷を有する脂質二分子膜のアレイを簡便に作製することができる。また、脂質二分子膜アレイを形成させる際に、膜タンパク質を導入したベシクルを用いることによって、薬剤スクリーニングに有用な膜タンパク質アレイ基板の簡便かつ効率的な提供が可能である。
【実施例】
【００９８】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００９９】
《実施例１》
以下に、図４に示す脂質二分子膜アレイ基板４の作製の具体例を示す。
＜穴部の形成＞
基板本体１０には、シリコン基板を用いた。基板本体１０の上面１０ａに、１２０ｎｍの厚さのシリコン酸化膜層（親水層）１１を、熱酸化法により形成した。さらに、フォトリソグラフィ法とドライエッチング法を用いて、円形状の開口部２５（直径４μｍ）を有する穴部２０を複数形成した。各穴部２０の深さは、１μｍとした。
【０１００】
＜巨大ベシクルの準備＞
脂質二分子膜３０は以下のようにして形成した。
ジフィタニルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）とジオレイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）とコレステロールの合計濃度が２．５ｍＭとなるように、ＤＰｈＰＣ：ＤＯＰＳ：コレステロール＝７：２：１（モル比）の割合で、クロロホルムに溶かした混合クロロホルム溶液を得た。さらに、この混合クロロホルム溶液に、蛍光ラベル剤であるローダミン‐ジヘキサデカニルホスファチジルエタノールアミン（Ｒｈｏｄ−ＤＨＰＥ）を２５μＭとなるように溶かした混合クロロホルム溶液を調製した。
【０１０１】
続いて、ＳｉＯ２上に膜厚１００ｎｍの酸化インジウムスズからなる薄膜が成膜された基板（ＩＴＯ基板）（サイズ：４０×４０ｍｍ、抵抗：５０〜１００Ω／ｓｑ）上に、前記混合クロロホルム溶液２００μＬを均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、溶媒のクロロホルムを完全に除去することによって、均一なリン脂質薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。そのリン脂質薄膜上に、窓部を有するシリコーンゴムを密着して配置し、窓部の内側に２００ｍＭのスクロース水溶液を４００μＬ滴下した。さらに、シリコーンゴムの上部に別のＩＴＯ基板を載せて、シリコーンゴムの窓部の内側にあるスクロース水溶液を２枚のＩＴＯ基板で挟み込んで密閉した。前記窓部を有するシリコーンゴムは、外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いて形成された窓部を備えている。
【０１０２】
次に、各ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、６０℃のホットプレート上で、交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することよって、電界形成法により負の電荷を有する巨大ベシクル（以下、アニオン性巨大ベシクルと呼ぶ。）を含む分散液を作製した。
【０１０３】
＜ハイドロゲルの形成＞
ハイドロゲル２１のモノマー水溶液として、第一のモノマーであるアクリルアミド（１２重量％）、第二のモノマーであるジメチルアミノプロピルメタアクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）（３重量％）、ビスアクリルアミド（前記２種のモノマーの合計の重量に対して１／２９重量％）、及び、カルセイン（１００μＭ）を、それぞれ括弧内の濃度になるように２００ｍＭグルコース水溶液に溶解して得たモノマー水溶液（以下、カチオン性モノマー水溶液と呼ぶ。）を調製した。その後、使用する直前に、更に、ＡＰＳとＴＥＭＥＤを微量添加して、充填用水溶液を準備した。
【０１０４】
この充填用水溶液を基板１０の上面１１ａに滴下し、複数の穴部２０内に充填すると共に、上面１１ａの上方にも充分に溢れさせた。１５分以上静置して、モノマーが重合し、更に共有結合によって架橋されたポリマーからなるハイドロゲル２１を形成した。その後、外部溶液Ｌを２００ｍＭグルコース水溶液に置換し、図７の模式図に示すように、穴部２０の外部でゲル化した余剰なハイドロゲル２１を、基板と水平方向（図７の矢印の方向）に軽く押すことによって、余剰のハイドロゲルを除去し、穴部２０の内部にだけハイドロゲル２１が充填された状態にした。次に、アニオン性巨大ベシクルを含む前記分散液を外部溶液Ｌに添加し、金属陽イオンを含まない環境（外部溶液Ｌ）で１０分以上室温に静置した後、余剰のアニオン性巨大ベシクルを取り除いた。この状態における脂質二分子膜アレイ基板の蛍光観察結果を図８に示す。
【０１０５】
図８ａはカルセイン由来の蛍光のみ、図８ｂはカルセインとローダミンの両方からの蛍光を示している。図８ａと図８ｂは同一視野である。図８ａの蛍光像において、ハイドロゲル２１が充填されていて且つ脂質二分子膜３０に覆われている穴部２０ｂ（２０）からだけでなく、ハイドロゲル２１が充填されていて且つ脂質二分子膜３０に覆われていない穴部２０ａ（２０）からも、ハイドロゲルに含有されたカルセイン由来の蛍光が観察されている。この結果から、ハイドロゲル２１が脂質二分子膜３０によって覆われていない場合でも、ハイドロゲル２１内では蛍光分子２２が安定に保持され、穴部２０の内部から外部溶液へ蛍光分子２２が拡散することが抑制されていることが分かる。
【０１０６】
図８ｂの蛍光像から、脂質二分子膜３０が穴部２０ｂ（２０）を覆うように形成されていることが分かる。また、穴部２０ｂから発せられた蛍光は穴部２０ａから発せられた蛍光よりも強い強度を有することが観察された。この結果から、穴部２０ａ及び穴部２０ｂの内部にハイドロゲル２１が充填され、穴部２０ａの開口部は脂質二分子膜３０に覆われておらず、穴部２０ｂの開口部は脂質二分子膜３０によって覆われていることが分かる。
【０１０７】
上記方法で作製した脂質二分子膜アレイ基板４において、脂質二分子膜３０に、膜タンパク質３１を配置することによって、本発明にかかる脂質二分子膜アレイ基板を膜タンパク質アレイ基板とすることができる。膜タンパク質３１を脂質二分子膜３０へ配置する方法は、ベシクルフュージョン法等の公知の方法を適用できる。
【０１０８】
《実施例２》
実施例１では、ハイドロゲル２１が正電荷を有し、脂質二分子膜３０が負電荷を有する場合を例示した。実施例２においては、ハイドロゲル２１と脂質二分子膜３０の電荷が同じ場合を例示する。
ハイドロゲル２１の材料であるカチオン性モノマー水溶液における、前記第一のモノマーと前記第二のモノマーの合計の濃度を１５重量％に変更し、ＤＯＰＳをエチルジオレイルフォスファチジルコリン（ＥＤＯＰＣ）に変更した以外は、実施例１と同様の方法によって、脂質二分子膜アレイ基板の作製を試みた。
【０１０９】
基板上にカチオン性巨大ベシクルを沈殿させたハイドロゲルアレイ基板の蛍光観察結果を図９に示す。図９ａはカルセイン由来の蛍光のみ、図９ｂはカルセインとローダミンの両方からの蛍光を示している。図９ａと図９ｂは同一視野である。図９ａの蛍光像において、実施例１と同様に、ハイドロゲル２１が充填されている穴部２０ａ（２０）から、カルセイン由来の蛍光が観察されている。
【０１１０】
図９ｂの蛍光像において、カチオン性巨大ベシクルＶは、穴部２０ａの上に配置されているにも関わらず、ベシクルの形状で基板上に存在している。つまり、カチオン性巨大ベシクルＶは展開されず、脂質二分子膜として基板上に配置されていなかった。カチオン性ハイドロゲルとカチオン性巨大ベシクルは同じ電荷を有しているので、両者間で静電反発が起こり、巨大ベシクルが基板上に展開できなかったためであると考えられる。この結果から、金属陽イオンが存在しない環境下においては、巨大ベシクルを展開して基板上に脂質二分子膜を配置するためには、ハイドロゲルと巨大ベシクル間の静電引力が必要であることが分かる。
【０１１１】
《実施例３》
図６に示す脂質二分子膜アレイ基板６の作製例を以下に具体的に説明する。
【０１１２】
まず、厚さ２００ｎｍの熱酸化膜からなる絶縁層で被覆されたＳｉウエハー１０の上に、チタン、金、白金の順に金属層４０ａを堆積して、この金属層４０ａをフォトリソグラフィ法によりパターニングすることにより、厚さ約６０ｎｍの電極４０を形成した。この電極４０は、例えば３００μｍ四方の大きさのパッド部（不図示）に接続され、外部の電気生理測定装置へ接続することが可能である。
【０１１３】
つぎに、金属層４０ａを形成したＳｉウエハー１０の上に、絶縁層１３としてシリコン窒化膜をプラズマＣＶＤ法により１μｍ堆積した。この絶縁層１３の上に、スパッタ法を用いてシリコン酸化膜１１を厚さ２００ｎｍで堆積した。
このように形成した基板本体１０に、フォトリソグラフィ法とドライエッチング法により穴部２０を形成した。このエッチングは、穴部２０の底面に電極４０（金属層４０ａ）が露出するまで行った。穴部２０の形成後に、レジスト膜を除去して洗浄することにより、電極４０を穴部２０に備えた基板を得た。
【０１１４】
この実施例において、穴部２０と電極４０の個数比は、１：１とすることが望ましい。１つの電極４０に対して複数の穴部２０を設けてもよいが、この構成の場合、当該１つの電極４０で測定する際に、全ての穴部２０を脂質二分子膜３０で覆う必要があるため、測定準備や測定条件が煩雑となる。よって、一つの穴部２０には、他の電極とは電気的に独立した一つの電極４０を形成することが望ましい。
【０１１５】
電極４０を穴部２０に備えた基板の上に、実施例１の場合と同様に、カチオン性ハイドロゲル２１を充填し、アニオン性巨大ベシクルを展開して脂質二分子膜３０を配置することにより、穴部２０の開口部を脂質二分子膜３０で覆った。すなわち、金属陽イオンを使用せずに巨大ベシクルを展開することができた。脂質二分子膜の下面３０ａはハイドロゲル２１の上面に接触していた。さらに、脂質二分子膜３０に膜タンパク質３１としてα−ヘモリシンを配置し、電極４０と対向電極４１の間に電圧を印加した時にその間に流れる電流を計測することにより、α−ヘモリシンを介したイオンの膜透過を定量的に検出することができる。
【０１１６】
《実施例４》
カチオン性モノマー水溶液として、実施例１と同じ水溶液を準備した。また、実施例１のカチオン性水溶液を構成する第二のモノマーであるＤＭＡＰＭＡをアクリル酸に変更した以外は当該カチオン性水溶液と同じ組成を有する、アニオン性モノマー水溶液を調製した。各モノマー水溶液を用いて、カチオン性ハイドロゲルが充填された複数の穴部とアニオン性ハイドロゲルが充填された複数の穴部を、同一基板上にアレイ化した。
【０１１７】
前述した電界形成法により、カチオン性巨大ベシクルを分散した分散液Ａと、アニオン性巨大ベシクルを分散した分散液Ｂをそれぞれ調製した。
各分散液に含まれる巨大ベシクルを、同一基板における複数の穴部に充填されたアニオン性ハイドロゲルとカチオン性ハイドロゲルの上にそれぞれ展開することにより、ハイドロゲルの電荷と脂質二分子膜の電荷を静電相互作用により引き合わせた。この方法により、アニオン性ハイドロゲルが充填された穴部の上にカチオン性脂質二分子膜を配置し、カチオン性ハイドロゲルが充填された穴部の上にアニオン性脂質二分子膜を配置した脂質二分子膜アレイ基板（以下、パターン化アレイ基板と呼ぶことがある。）を、簡便に作製することができた。以下、更に詳細に説明する。
【０１１８】
まず、実施例１と同様に、穴部を形成した基板を準備した。この基板上に、カチオン性モノマー水溶液に最終濃度で１０μｇ／ｍｌとなるようにリボフラビンを加えた水溶液を滴下した。次に、共焦点顕微鏡を用いて、基板上の任意の箇所に局所的にＵＶ光を照射して、照射部をゲル化させた。この後、２００ｍＭグルコース水溶液を用いて基板上をリンスして、未反応のカチオン性モノマー水溶液を取り除いた。
【０１１９】
次に、この基板上に、アニオン性モノマー水溶液に最終濃度で１０μｇ／ｍｌとなるようにリボフラビンを加えた水溶液を滴下し、ＵＶ光を任意の箇所に局所的に照射して、アニオン性モノマーをゲル化し、カチオン性ハイドロゲルが充填されていない穴部に、アニオン性ハイドロゲルを形成した。その後、２００ｍＭグルコース水溶液で基板上をリンスして、未反応のアニオン性モノマーを取り除いた。
【０１２０】
得られたハイドロゲル基板上の外部溶液にアニオン性巨大ベシクルを含む分散液Ｂを添加して、１０分以上放置した。その後、２００ｍＭグルコース水溶液で外部溶液Ｌを置換した後、カチオン性巨大ベシクルを含む分散液Ａを添加して、１０分以上室温で静置した。その後、所定の組成を有する外部溶液Ｌに置換し、基板上をリンスした。この結果、ハイドロゲルと巨大ベシクルの静電引力により、カチオン性ハイドロゲルが充填された穴部上にはアニオン性脂質二分子膜が配置され、アニオン性ハイドロゲルが充填された穴部上にはカチオン性脂質二分子膜が配置された、脂質二分子膜アレイ基板を作製することができた。すなわち、金属陽イオンを使用せずに巨大ベシクルを展開することができた。図１０に当該基板の模式図を示す。
【０１２１】
このような脂質二分子膜アレイ基板において、アニオン性巨大ベシクルとカチオン性巨大ベシクルにそれぞれ異なる膜タンパク質を挿入しておくことにより、簡便に膜タンパク質アレイ基板を作製することができる。
【０１２２】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明にかかる基板は、生体分子の機能測定の分野に広く適用可能である。
【符号の説明】
【０１２４】
１〜３…ハイドロゲルアレイ基板、４〜６…脂質二分子膜アレイ基板（膜タンパク質アレイ基板）、１０…基板本体、１０ａ…基板本体の上面、１１…親水層、１１ａ…親水層の上面（基板の上面）、１２…第一の絶縁層、１３…第二の絶縁層、２０…穴部、２０ａ…脂質二分子膜で覆われていない穴部，２０ｂ…脂質二分子膜で覆われている穴部、２１…ハイドロゲル、２２…蛍光分子、３０…脂質二分子膜（脂質二重膜）、３０ａ…脂質二分子膜の下面、３１…膜タンパク質、４０…電極、４０ａ…金属層（電極層）、４１…対向電極、Ｌ…外部溶液、Ｖ…カチオン性巨大ベシクル、Ｐ…ゲルを押す方向
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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