(57)【要約】【課題】肝細胞癌に対する抗癌作用がより優れた新規な抗癌剤および治療方法の提供。【解決手段】ミリプラチンと他の肝細胞癌治療薬を含む肝細胞癌の治療剤を、肝細胞癌に対するTACEに適用することで、より優れた抗癌作用を可能とする。他の肝細胞癌治療薬としては、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、マイトマイシンＣまたは５−フルオロウラシルが好ましく、このうちマイトマイシンＣが最も好ましい。また、他の肝細胞癌治療薬を併用することにより、ミリプラチンによる白金−ＤＮＡ架橋の形成を促進することも可能とする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミリプラチンと、ドキソルビシンまたはその薬学上許容される塩、エピルビシンまたはその薬学上許容される塩、マイトマイシンＣまたはその薬学上許容される塩および５−フルオロウラシルまたはその薬学上許容される塩からなる群から選択される１または２以上の他の肝細胞癌治療薬を含む、肝細胞癌の治療剤。
【請求項２】
他の肝細胞癌治療薬が、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、マイトマイシンＣまたは５−フルオロウラシルである、請求項１の治療剤。
【請求項３】
他の肝細胞癌治療薬が、マイトマイシンＣである、請求項１または２の治療剤。
【請求項４】
他の肝細胞癌治療薬を併用することによる、ミリプラチンによる白金−ＤＮＡ架橋の形成を促進する方法。
【請求項５】
他の肝細胞癌治療薬が、マイトマイシンＣである、請求項４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌治療法の分野に属し、ミリプラチンと他の肝細胞癌治療薬との併用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌とは、肝臓に発生する腫瘍の一つであり、肝細胞に由来する悪性腫瘍である。肝細胞癌の薬物療法は、肝動脈内注入化学療法と全身化学療法に大別される。肝動脈内注入化学療法とは、肝動注化学療法とも呼ばれ、肝動脈にカテーテルを挿入して直接抗癌剤を投与する治療方法である。肝動注化学療法に用いられる既存の肝細胞癌治療薬としては、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）塩酸塩、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）塩酸塩、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）などが挙げられる。
【０００３】
進行性の肝細胞癌に対する治療方法の一つである肝動脈化学塞栓療法（ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｒｔｅｒ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｃｈｅｍｏ−ｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ、ＴＡＣＥ）とは、進行した肝細胞癌において腫瘍を栄養する肝動脈にカテーテルを挿入し、肝細胞癌治療薬および塞栓物質を注入し、肝動脈を塞栓し、腫瘍細胞を壊死に陥らせる方法である。ＴＡＣＥには、前述のドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、シスプラチンが使用されており、かつてはジノスタチンスチマラマー(Ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ  ｓｔｉｍａｌａｍｅｒ）なども使用されていた。しかし、特に切除不能肝細胞癌に対するＴＡＣＥには、標準治療薬は未だ無い。
【０００４】
癌の薬物療法においては、複数の抗癌剤を投与する多剤併用療法が行われることが一般的である。多剤併用療法においては、抗癌剤を単剤で投与する場合の抗腫瘍効果をより増強させること、副作用を軽減させること、腫瘍細胞による薬剤耐性の獲得を防止することなどを目的とし、作用機序の異なる抗癌剤を２種以上組み合わせて、臨床においても用いられている。しかし、併用する抗癌剤の選択については、漠然と行うだけでは、必ずしも容易に前述の目的を達成できるわけではない。抗腫瘍作用の増強効果や相乗効果を見出すには、併用する抗癌剤の種類、投与量、投与時間などについて、試行錯誤の検討が必要である。２種以上の抗癌剤を併用する臨床研究としては、シスプラチンと５−フルオロウラシルの併用（非特許文献１参照）、シスプラチンとエピルビシン塩酸塩の併用（非特許文献２参照）、エピルビシン塩酸塩とマイトマイシンＣの併用などが報告されている（非特許文献３参照）。しかし、肝細胞癌治療における標準併用療法として確立されたものは未だ無い。
【０００５】
一例として、シスプラチンとマイトマイシンＣの併用に関する研究については、複数の報告がある。例えば、チャイニーズハムスター細胞株Ｖ７９−１７１Ｂを用いた場合には、本併用に相乗効果が確認されたとの報告がある（非特許文献４参照）。一方、同併用について、マウス白血病細胞株Ｐ３８８を用いた場合には、効果が拮抗的であったとの報告もある（非特許文献５参照）。更に、同併用について、ヒト胃癌細胞株を用いた場合には、本併用が相乗的であったとの報告もある（非特許文献６−７参照）。すなわち、シスプラチンとマイトマイシンＣの併用の有用性は、白血病や胃癌では示唆されているが、肝細胞癌に対しては不明である。
【０００６】
シスプラチンは、その化学構造から、プラチナ含有抗悪性腫瘍薬に属する。他のプラチナ含有抗悪性腫瘍薬としては、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチンなどが挙げられる。しかし、カルボプラチンとマイトマイシンＣの併用効果、ネダプラチンとマイトマイシンＣの併用効果、またはオキサリプラチンとマイトマイシンＣの併用効果については、未だ報告されていない。
【０００７】
ミリプラチンは、２００９年に日本において、水和物を有効成分とし肝細胞癌におけるリピオドリゼーションの効能・効果で承認された新しい肝細胞癌治療薬である（特許文献１参照）。リピオドリゼーションとは、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁した肝細胞癌治療薬の肝動脈内投与を意味する。ミリプラチンの化学名は（ＳＰ−４−２）−［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’］ビス（テトラデカノアト−Ｏ）白金である。この化学構造から、ミリプラチンもプラチナ含有抗悪性腫瘍薬に属する。新規な肝細胞癌治療薬であるミリプラチンについても、更なる効果増強に繋がる併用薬の発見や開発が望まれている。しかしながら、肝動注化学療法に用いられる既存の肝細胞癌治療薬などとミリプラチンの併用、および本併用によって得られる効果についての報告は未だ無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−３１５０８８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００２；８０；１４３−８
【非特許文献２】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１；４１；３０３−９
【非特許文献３】Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２０１２；３０；２６３−７０
【非特許文献４】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１９８９；４４；９１１−７
【非特許文献５】Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９８９；１６；２２７５−８２
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９３；５４；９８−１０２
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９４；５６；２４２−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、肝細胞癌に対する新規な抗癌剤および治療方法を提供することにあり、従来の肝細胞癌治療薬とミリプラチンとの併用により、抗腫瘍作用の相加効果や相乗効果を有する治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ミリプラチンと従来の肝細胞癌治療薬との組み合わせについて、ラットまたはヒトの肝癌細胞株を用いたモデルにおいてｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ法で併用効果を試験した結果、ミリプラチンと従来の肝細胞癌治療薬とを組み合わせることにより、抗腫瘍作用の相加または相乗効果があることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下のものに関する。
【００１３】
項１．ミリプラチンと、ドキソルビシンまたはその薬学上許容される塩、エピルビシンまたはその薬学上許容される塩、マイトマイシンＣまたはその薬学上許容される塩および５−フルオロウラシルまたはその薬学上許容される塩からなる群から選択される１または２以上の他の肝細胞癌治療薬を含む、肝細胞癌の治療剤。
【００１４】
項２．他の肝細胞癌治療薬が、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、マイトマイシンＣまたは５−フルオロウラシルである、項１の治療剤。
【００１５】
項３．他の肝細胞癌治療薬が、マイトマイシンＣである、項１または２の治療剤。
【００１６】
項４．他の肝細胞癌治療薬を併用することによる、ミリプラチンによる白金−ＤＮＡ架橋の形成を促進する方法。
【００１７】
項５．他の肝細胞癌治療薬が、マイトマイシンＣである、項４の方法。
【００１８】
本発明の一つの態様において、本発明は、他の肝細胞癌治療薬を併用することを含む、ミリプラチンの治療上の有効量を治療が必要なヒトや哺乳動物に投与することを含む、肝細胞癌の治療方法に関する。
【００１９】
本発明の別の態様において、本発明は、ミリプラチンの治療上の有効量、および他の肝細胞癌治療薬の治療上の有効量を、治療が必要なヒトや哺乳動物に投与することを含む、肝細胞癌の治療方法に関する。
【００２０】
本発明の別の態様において、本発明は、ミリプラチンおよび他の肝細胞癌治療薬を含む、肝細胞癌の治療のための薬学製品に関する。
【００２１】
本発明の別の態様において、本発明は、ミリプラチンおよび他の肝細胞癌治療薬を含む、肝細胞癌の治療のためのキットに関する。
【００２２】
本発明の別の態様において、本発明は、肝細胞癌の治療用医薬組成物を製造するための、ミリプラチンおよび他の肝細胞癌治療薬の使用に関する。
【００２３】
本発明の別の態様において、本発明は、肝細胞癌の治療に使用するための、ミリプラチンおよび他の肝細胞癌治療薬を含む医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明の別の態様において、本発明は、他の肝細胞癌治療薬と併用することを特徴とする肝細胞癌の治療用医薬組成物を製造するための、ミリプラチンの使用に関する。
【００２５】
本発明の別の態様において、本発明は、ミリプラチンと併用することを特徴とする肝細胞癌の治療用医薬組成物を製造するための、他の肝細胞癌治療薬の使用に関する。
【００２６】
本発明の別の態様において、本発明は、肝細胞癌の治療における他の肝細胞癌治療薬の効果を向上させるための、ミリプラチンの使用に関する。
【００２７】
本発明の別の態様において、本発明は、肝細胞癌の治療におけるミリプラチンの効果を向上させるための、他の肝細胞癌治療薬の使用に関する。
【００２８】
本発明の別の態様において、本発明は、肝細胞癌の治療における他の肝細胞癌治療薬の効果を増強および／または改善した薬剤を製造するための、ミリプラチンの使用に関する。
【００２９】
本発明の別の態様において、本発明は、肝細胞癌の治療におけるミリプラチンの効果を増強および／または改善した薬剤を製造するための、他の肝細胞癌治療薬の使用に関する。
【００３０】
前記の本発明の各態様において、他の肝細胞癌治療薬としては、ドキソルビシンまたはその薬学上許容される塩、エピルビシンまたはその薬学上許容される塩、マイトマイシンＣまたはその薬学上許容される塩および５−フルオロウラシルまたはその薬学上許容される塩からなる群から選択される１または２以上の薬物が挙げられ、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、マイトマイシンＣまたは５−フルオロウラシルが好ましく、マイトマイシンＣが最も好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、ミリプラチンを、単剤で投与するよりも、他の肝細胞癌治療薬と併用投与することにより、肝細胞癌治療効果の更なる増強が可能となった。また本併用により、他の肝細胞癌治療薬およびミリプラチンの投与量を減少できること、およびその結果従来の肝細胞癌治療薬の有していた副作用を軽減できることが期待される。さらには、従来の肝細胞癌治療薬に対する腫瘍細胞による薬剤耐性の獲得が本併用により防止され得ることも期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、実施例１において、ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでミリプラチンとドキソルビシン塩酸塩との併用効果を試験した結果を示す図である。本併用の薬剤の混合比は、培地中のドキソルビシン（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１００である。横軸のｆａとは、式：ｆａ＝１−ｆ＝１−｛（各薬剤濃度での平均蛍光強度）／（薬剤無添加時の平均蛍光強度）｝から計算される値である。縦軸のｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）とは、併用薬の用量と細胞増殖率をロジスティック曲線にあてはめて得られたＩＣ５０値（細胞増殖を５０％抑制する薬剤濃度）と曲線の傾きから計算される値である。
【図２】図２は、図１と同様に、実施例１において、ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用効果を試験した結果を示す図である。本併用の薬剤の混合比は、培地中のマイトマイシンＣ（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１０である。
【図３】図３は、図１と同様に、実施例１において、ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでミリプラチンとエピルビシン塩酸塩との併用効果を試験した結果を示す図である。本併用の薬剤の混合比は、培地中のエピルビシン（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１００である。
【図４】図４は、図１と同様に、実施例１において、ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでミリプラチンと５−フルオロウラシルとの併用効果を試験した結果を示す図である。本併用の薬剤の混合比は、培地中の５−フルオロウラシル濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１である。
【図５】図５は、実施例２において、ラット肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用効果を試験した結果を示す図である。本併用の薬剤の混合比は、培地中のマイトマイシンＣ（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：５０である。横軸のｆａおよび縦軸のＣＩについては、図１において前述したものと同じである。
【図６】図６は、図５と同様に、実施例２において、ヒト肝癌細胞株Ｌｉ−７を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用効果を試験した結果を示す図である。本併用の薬剤の混合比は、培地中のマイトマイシンＣ（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１５０である。
【図７】図７は、実施例３において、ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１を用いた白金−ＤＮＡアダクト形成モデルでミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用効果を試験した結果を示す図である。横軸のマイトマイシン濃度は、１００  μｇ／ｍＬのミリプラチンと併用したマイトマイシンの濃度（μｇ／ｍＬ）を表す。縦軸のＰｔ−ＤＮＡ  ａｄｄｕｃｔｓとは、白金−ＤＮＡアダクトの形成量（ｐｇ／μｇ  ＤＮＡ）を表し、３回の実験の平均値±標準偏差で示される。ダネットの多重比較検定によってミリプラチン単剤と比較し、有意に白金−ＤＮＡアダクトの形成量が高い併用群に＊を付した。
【図８】図８は、図７と同様に、実施例３において、ラット肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを用いた白金−ＤＮＡアダクト形成モデルでミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用効果を試験した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００３４】
本発明における「ミリプラチン」とは、（ＳＰ−４−２）−［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’］ビス（テトラデカノアト−Ｏ）白金であり、その水和物や溶媒和物も含むが、水和物または無水物が好ましい。
【００３５】
ミリプラチンは、前記の化学名が表す構造から、プラチナ含有抗悪性腫瘍薬に属し、担体配位子に１，２−ジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨ）を、脱離基としてミリスチン酸を、配位した脂溶性白金錯体である。ミリプラチンは、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルへの親和性が高く、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して肝動脈内投与（リピオドリゼーション）されることで、腫瘍局所に滞留し、白金成分を徐放する特徴を持つ。ミリプラチンの作用部位・作用機序としては、ミリプラチンは、生体内で脱離基が主に塩素イオンに置換されたジクロロ  １，２−ジアミノシクロヘキサン白金（ＤＰＣ）に変換され、次いで癌細胞内のＤＮＡ鎖と共有結合した白金−ＤＮＡ架橋（アダクト）が形成され、アポトーシスが誘導されることにより、抗癌剤として作用すると考えられている。本発明における「白金−ＤＮＡ架橋の形成」とは、上記の作用機序を意味する。
【００３６】
本発明における「他の肝細胞癌治療薬」とは、ミリプラチンを除く肝細胞癌治療薬であり、すなわちミリプラチンを除いて肝細胞癌の治療に用いられる薬剤を意味する。「他の肝細胞癌治療薬」として具体的には、ドキソルビシンまたはその薬学上許容される塩、エピルビシンまたはその薬学上許容される塩、マイトマイシンＣまたはその薬学上許容される塩および５−フルオロウラシルまたはその薬学上許容される塩が挙げられ、さらにこれらの中から２つ以上を組み合わせることもできる。「他の肝細胞癌治療薬」として、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、マイトマイシンＣまたは５−フルオロウラシルが好ましく、このうちマイトマイシンＣが最も好ましい。
本発明における「肝細胞癌」とは、肝臓に発生する腫瘍の一つであり、肝細胞に由来する悪性腫瘍である。
【００３７】
本発明における「ドキソルビシン」とは、（２Ｓ，４Ｓ）−４−（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシルオキシ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−２−ヒドロキシアセチル−７−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロテトラセン−６，１１−ジオンである。その薬学上許容される塩も本発明に用いることができ、ＣＡＳ番号が２５３１６−４０−９で表されるドキソルビシン塩酸塩が好ましい。ドキソルビシンは、アントラサイクリン系抗腫瘍薬に属し、ドキソルビシンの抗腫瘍効果はトポイソメラーゼＩＩ活性阻害に基づく。ドキソルビシン塩酸塩は、協和発酵キリン株式会社などから購入可能である。
【００３８】
本発明における「エピルビシン」とは、（２Ｓ，４Ｓ）−４−（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−アラビノ−ヘキソピラノシルオキシ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−２−ヒドロキシアセチル−７−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロテトラセン−６，１１−ジオンである。その薬学上許容される塩も本発明に用いることができ、ＣＡＳ番号が５６４２０−４５−２で表されるフリー体またはＣＡＳ番号が５６３９０−０９−１で表されるエピルビシン塩酸塩が好ましく、エピルビシン塩酸塩が更に好ましい。エピルビシンは、アントラサイクリン系抗腫瘍薬に属し、エピルビシンの抗腫瘍効果はトポイソメラーゼＩＩ活性阻害に基づく。エピルビシン塩酸塩は、協和発酵キリン株式会社などから購入可能である。
【００３９】
本発明における「マイトマイシンＣ」とは、（１ａＳ，８Ｓ，８ａＲ，８ｂＳ）−６−アミノ−４，７−ジオキソ−８ａ−メトキシ−５−メチル−１−１ａ，２，８，８ａ，８ｂ−ヘキサヒドロアジリノ［２，３：３，４］ピロロ［１，２−α］インドル−８−イルメチル  カルバメートである。その薬学上許容される塩も本発明に用いることができるが、ＣＡＳ番号が５０−０７−７で表されるフリー体が好ましい。マイトマイシンＣは、アルキル化薬に属し、マイトマイシンＣの抗腫瘍効果は癌細胞のＤＮＡに結合し、ＤＮＡの複製を阻害し、癌細胞の分裂を抑制することに基づく。マイトマイシンＣは、協和発酵キリン株式会社などから購入可能である。
【００４０】
本発明における「５−フルオロウラシル」（５−ＦＵ）とは、５−フルオロ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンであり、ＣＡＳ番号は５１−２１−８で表される。その薬学上許容される塩も本発明に用いることができるが、フリー体が好ましい。５−ＦＵは、代謝拮抗薬のピリミジン代謝拮抗薬のうちフッ化ピリミジン類に属し、５−ＦＵの抗腫瘍効果は、ＤＮＡ前駆体の合成阻害に基づく。５−ＦＵは、協和発酵キリン株式会社などから購入可能である。
【００４１】
本発明における「治療上の有効量」とは、組織、系、動物またはヒトにおいて、研究者または医師によって要求される生物学的または医薬的応答を誘発する薬物または医薬の量を意味する。
【００４２】
本発明における「治療」とは、疾患のあらゆる治療（例えば、症状の改善、症状の軽減、症状の進行の抑制など）および疾患のあらゆる予防（例えば、疾患の発症および／または進行の抑制、再発の抑制など）を意味する。また本発明における「増強」および「改善」とは、肝細胞癌治療薬としての治療の効果の増大、肝細胞癌治療薬としての副作用の軽減、肝細胞癌治療薬に対する腫瘍細胞による薬剤耐性の獲得の防止や抑制を意味する。
【００４３】
本発明における「医薬製品」とは、特定の量で特定の成分を含む製品、および特定の量で特定の成分の組み合わせから直接的または間接的に生じるあらゆる製品を包含することを意図している。
【００４４】
本発明のミリプラチンと、他の肝細胞癌治療薬との組み合わせや併用においては、両剤を別々に投与してもよいし、一つの医薬組成物として一緒に投与してもよい。また本発明の組み合わせの一方の成分を他方の成分に対して、先に、同時に、または後に投与してもよい。これらの成分は、単一製剤形または分離した製剤形での医薬製品に調製してもよい。ミリプラチンについては、例えば国際公開第ＷＯ２００３／０２６６４２号パンフレットを参考にして、その凍結乾燥製剤を、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁させた注射製剤として使用できる。ヒトの場合、ＴＡＣＥで投与されることが望ましい。本発明の組み合わせの成分は、ヒトの場合、ＴＡＣＥで投与することが望ましい。
【００４５】
本発明のミリプラチンと、他の肝細胞癌治療薬との組み合わせや併用において、ミリプラチンの投与量は、患者の症状、年齢、体重などによって異なるが、例えば無水物を投与する場合ヒト成人一人当たり一日当たり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲、好ましくは約５ｍｇ〜約３００ｍｇの範囲、より好ましくは約１０ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲、更に好ましくは約５０ｍｇ〜約１２０ｍｇの範囲が挙げられる。他の肝細胞癌治療薬の投与量も、薬剤の種類、患者の症状、年齢、体重などによって異なるが、ヒト成人一人当たり一日当たり約２ｍｇから約３０ｍｇの範囲や約９ｍｇ/ｍ２から約２６００ｍｇ/ｍ２の範囲が挙げられる。例えば、他の肝細胞癌治療薬がドキソルビシン塩酸塩である場合約９ｍｇ/ｍ２〜８０ｍｇ/ｍ２の範囲が好ましく、エピルビシン塩酸塩である場合約１５ｍｇ/ｍ２〜１００ｍｇ/ｍ２の範囲が好ましく、マイトマイシンＣである場合約２ｍｇ〜約３０ｍｇの範囲が好ましく、５−ＦＵである場合約５ｍｇ/ｋｇ〜２０ｍｇ/ｋｇの範囲が好ましい。より好ましくは、他の肝細胞癌治療薬がドキソルビシン塩酸塩である場合約１０ｍｇ（０．２ｍｇ/ｋｇ）〜３０ｍｇ（０．６ｍｇ/ｋｇ）の範囲、エピルビシン塩酸塩である場合約６０ｍｇ、マイトマイシンＣである場合約２ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲、５−ＦＵである場合約５ｍｇ/ｋｇ〜１０ｍｇ/ｋｇの範囲が挙げられる。
【００４６】
本発明のミリプラチンと、他の肝細胞癌治療薬との組み合わせや併用において、ミリプラチンの投与回数は、患者の症状、年齢、体重などによって異なるが、１日１回、繰り返し投与する場合には４週間以上の観察期間をおくことが望ましい。他の肝細胞癌治療薬の投与回数も、薬剤の種類、患者の症状、年齢、体重などによって異なるが、１日１回、繰り返し投与する場合には約１週間から４週間以上の観察期間が挙げられる。例えば、他の肝細胞癌治療薬がドキソルビシン塩酸塩である場合、１日１回、繰り返し投与する場合には単回〜６日間連日、７日〜４週間の休薬が好ましく、エピルビシン塩酸塩である場合、１日１回、繰り返し投与する場合には単回〜７日間連日、４日〜４週間の休薬が好ましく、マイトマイシンＣである場合、１日１回、繰り返し投与する場合には単回〜連日が好ましく、５−ＦＵである場合、１日１回、繰り返し投与する場合には単回〜２０日間連日、１〜３週間の休薬が好ましい。より好ましくは、他の肝細胞癌治療薬がドキソルビシン塩酸塩である場合、１日１回で２〜６日間連日、７日〜１８日間の休薬、エピルビシン塩酸塩である場合、１日１回で単回、３週間〜４週間の休薬、マイトマイシンＣである場合、１日１回で週１回〜連日、１週間〜３週間の休薬、５−ＦＵである場合、１日１回で週１〜２回が挙げられる。
【実施例】
【００４７】
以下に、実施例、参考例、試験例などを挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４８】
実施例１
ミリプラチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ併用効果
【００４９】
ラット肝癌細胞株を用いて、既存の肝癌治療薬４剤（ドキソルビシン塩酸塩、マイトマイシンＣ、エピルビシン塩酸塩、５−フルオロウラシル）とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ併用効果を調べた。併用効果は、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの方法により（Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ  １９８４；２２；２７−５５）、ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）を算出することで判定した。
ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１をＤＳファーマバイオメディカルより入手し、ウシ胎児血清を１０％と、抗生物質としてｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎとｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地にて継代培養した。培養は、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベータ中で実施した。以後の実験にも、本培地を用いた。
【００５０】
継代中のラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１を１×１０３  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁し、２４ウェルプレートに０．２５ｍＬずつ播種した（Ｄａｙ  ０）。播種後、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベータ中で一晩培養した。
【００５１】
翌日に（Ｄａｙ  １）、被験物質を以下のように調製した。ドキソルビシン塩酸塩は、協和発酵キリン株式会社から入手した１０  ｍｇバイアルに、２ｍｇ／ｍＬになるように生理食塩液に溶解して保存液とした。マイトマイシンＣは協和発酵キリン株式会社から入手した２  ｍｇバイアルに、０．４ｍｇ／ｍＬになるように生理食塩液に溶解して保存液とした。エピルビシン塩酸塩および５−フルオロウラシルは、それぞれ協和発酵キリン株式会社から入手した２ｍｇ／ｍＬおよび５０ｍｇ／ｍＬの溶液を使用した。これらを培地で段階希釈して、ウェルあたり０．２５  ｍＬずつ添加した。なお、ミリプラチン単剤群には培地のみを０．２５  ｍＬ添加した。各被験物質の終濃度は、Ｎ１−Ｓ１細胞株に対するそれぞれの被験物質単独のＩＣ５０値に基づき、ドキソルビシン塩酸塩とエピルビシン塩酸塩では力価として０．１〜３３  ｎｇ／ｍＬ、マイトマイシンＣでは力価として０．３３〜１００  ｎｇ／ｍＬ、５−フルオロウラシルでは０．０１〜３．３  μｇ／ｍＬとした。更に、ミリプラチンは、７０  ｍｇバイアルに２０  ｍｇ／ｍＬになるようにヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（以下、懸濁用液とも略す）に懸濁した。これを懸濁用液で段階希釈して、ウェル上に置いたセルカルチャーインサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）内に、０．５  ｍＬずつ添加した。ミリプラチンの終濃度は０．００３３〜１００  μｇ／ｍＬとした。なお、各被験物質単剤群には、懸濁用液のみをセルカルチャーインサート内に０．５  ｍＬずつ添加した。Ｄａｙ  ８まで、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベータ中で培養した。
【００５２】
Ｄａｙ  ８に、セルカルチャーインサートを取り外し、各ウェルにａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（和光純薬工業）を４０  μＬずつ添加した。その後、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベータ中で約３時間培養し、蛍光マイクロプレートリーダーＦｌｘ８００ＴＢＩ（Ｂｉｏ−ＴＥＫ社製）で蛍光強度を測定した。測定条件は励起波長を５４０ ｎｍ、蛍光波長を５９０  ｎｍとした。
【００５３】
薬剤用量と細胞増殖率をロジスティック曲線にあてはめ、得られたＩＣ５０（細胞増殖を５０％抑制する薬剤濃度）と曲線の傾きを用いて、ｆａが０．１〜０．９の範囲についてｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）を計算した。ここで、ｆａ＝１−ｆ、ｆ＝（各薬剤濃度での平均蛍光強度）／（薬剤無添加時の平均蛍光強度）とした。ｆａの値が、大きいほど細胞増殖抑制作用が強いことを意味し、小さいほど細胞増殖抑制作用が弱いことを意味する。すなわち、高いｆａ範囲は、高い薬剤処理濃度範囲を意味し、低いｆａ範囲は、低い薬剤処理濃度範囲に相当する。ｆａが、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８および０．９である際の、３回の実験の平均値±９５％信頼区間として算出されたＣＩについて、通常の方法に従い、ＣＩが１未満である場合には併用効果が相乗であり、ＣＩが１である場合には併用効果が相加であり、ＣＩが１より大きい場合には併用効果が拮抗であると判定した。
【００５４】
結果を図１〜４に示した。図１はミリプラチンとドキソルビシン塩酸塩との併用（薬剤混合比は、培地中のドキソルビシン（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１００）、図２はミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用（薬剤混合比は、培地中のマイトマイシンＣ（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１０）、図３はミリプラチンとエピルビシン塩酸塩との併用（薬剤混合比は、培地中のエピルビシン（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１００）、図４はミリプラチンと５−ＦＵとの併用（薬剤混合比は、培地中の５−フルオロウラシル濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１）の各効果の試験結果を表す。各図において、平均値±９５％信頼区間が１未満であるＣＩを●で示した。ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１において、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩または５−フルオロウラシルとミリプラチンの併用は、いずれも相加効果であったが、マイトマイシンＣとの併用は、高いｆａ範囲では相乗効果が認められた。
【００５５】
実施例２
ミリプラチンとマイトマイシンＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ併用効果
【００５６】
実施例１で、ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１を用いた場合、既存の肝癌治療薬４剤のうち、マイトマイシンＣとミリプラチンとの併用で相乗効果が認められたことから、他の肝癌細胞株についても本併用を調べた。
【００５７】
ラット肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａおよびヒト肝癌細胞株Ｌｉ−７は、それぞれ熊本大学および東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより入手し、ウシ胎児血清を１０％と、抗生物質としてｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎとｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＲＰＭＩ  １６４０（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０）培地にて継代培養した。培養は、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベータ中で実施した。以後の実験にこれらの培地を用いた。
【００５８】
継代中のラット肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａまたはヒト肝癌細胞株Ｌｉ−７を、それぞれ４×１０３  ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは２×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁し、２４ウェルプレートに０．２５ｍＬずつ播種した（Ｄａｙ  ０）。播種後、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベータ中で一晩培養した。
【００５９】
翌日に（Ｄａｙ  １）、０．４  ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ保存液を培地で段階希釈して、ウェルあたり０．２５  ｍＬずつ添加した。マイトマイシンＣの終濃度は力価として０．２〜６６  ｎｇ／ｍＬとした。更に、２０  ｍｇ／ｍＬのミリプラチンを懸濁用液で段階希釈して、ウェル上に置いたセルカルチャーインサート内に、０．５  ｍＬずつ添加した。ミリプラチンの終濃度は、それぞれの細胞株に対するミリプラチン単独のＩＣ５０値に基づき、ＡＨ１０９Ａ株の場合は０．０１〜３．３  μｇ／ｍＬ、Ｌｉ−７株の場合は０．０３３〜１０  μｇ／ｍＬとした。
【００６０】
Ｄａｙ  ８に、セルカルチャーインサートを取り外し、各ウェルにａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を５０  μＬずつ添加した。その後、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベータ中で２〜６時間培養し、蛍光マイクロプレートリーダーＦｌｘ８００ＴＢＩで蛍光強度を測定した。実施例１と同様に、ＩＣ５０とロジスティック曲線の傾きを用いて、ｆａが０．１〜０．９の範囲についてｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）を計算した。
【００６１】
結果を図５および６に示した。図５はラット肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａに対するミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用（薬剤混合比は、培地中のマイトマイシンＣ（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：５０）、図６はヒト肝癌細胞株Ｌｉ−７に対するミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用（薬剤混合比は、培地中のマイトマイシンＣ（力価として）濃度：懸濁用液中のミリプラチン濃度＝１：１５０）の各効果の試験結果を表す。ラット肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａにおいても、ヒト肝癌細胞株Ｌｉ−７においても、マイトマイシンＣとミリプラチンの併用は相乗効果であった。従って、肝癌細胞株の違いによらず、本併用では相乗効果が得られることが示唆された。
【００６２】
実施例３
マイトマイシンＣ併用による白金−ＤＮＡアダクト形成作用の増強
【００６３】
ミリプラチンの白金−ＤＮＡアダクト形成作用に対するマイトマイシンＣ併用の影響を調べるために、ミリプラチンとマイトマイシンＣとの併用処理を３日間行った細胞からＤＮＡを精製し、ＤＮＡ中に含まれる白金量を定量した。
【００６４】
継代中のラット肝癌細胞株ＡＨ１０９ＡまたはＮ１−Ｓ１を、それぞれ３×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁し、６ウェルプレートに１．０  ｍＬずつ播種した（Ｄａｙ  ０）。播種後、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベータ中で一晩培養した。
【００６５】
翌日に（Ｄａｙ  １）、０．４  ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ保存液を培地で段階希釈して、ウェルあたり１．０  ｍＬずつ添加した。マイトマイシンＣの終濃度はＡＨ１０９Ａ株の場合には力価として０．６７および２  μｇ／ｍＬ、Ｎ１−Ｓ１株の場合には力価として１および１０  μｇ／ｍＬとした。更に、２０  ｍｇ／ｍＬのミリプラチンを懸濁用液で段階希釈して、ウェル上に置いたセルカルチャーインサート内に、２．０  ｍＬずつ添加した。ミリプラチンの終濃度は、いずれの細胞株の場合にも１００  μｇ／ｍＬとした。
【００６６】
Ｄａｙ  ４に、セルカルチャーインサートを取り外し、細胞を回収した。リン酸緩衝生理食塩液で細胞を洗浄した後、ＤＮＡｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてＤＮＡを精製し、トリス緩衝ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ  ８．０）に溶解した。ＤＮＡ濃度を２本鎖ＤＮＡと蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８のｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅ反応を利用して定量するとともに、白金濃度を原子吸光光度計Ｚ−９０００またはＺ−２７１０（日立ハイテク社製）を用いて測定した。得られたＤＮＡ濃度と白金濃度に基づいて、白金−ＤＮＡアダクト形成量は、精製ＤＮＡ  １  μｇに含まれる白金量（ｐｇ）として算出した。
【００６７】
結果を図７および８に示した。図７はラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１を用いた試験、図８はラット肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを用いた試験の各結果を表す。いずれのラット肝癌細胞株においても、ミリプラチンによる白金−ＤＮＡアダクト形成量は、マイトマイシンＣ濃度依存的に増加した。また、相乗効果が認められた薬剤混合比に相当する高用量のマイトマイシンＣ併用では、ミリプラチン単独の場合と比較して、白金−ＤＮＡアダクト形成量が有意に増加した。これらのことから、マイトマイシンＣ併用は、ミリプラチンによる白金−ＤＮＡアダクト形成作用を増強することにより、相乗効果を発揮していることが示唆された。
【００６８】
実施例４
ミリプラチンとマイトマイシンＣのｉｎ  ｖｉｖｏ併用効果
【００６９】
ラット肝癌細胞株Ｎ１−Ｓ１またはヒト肝癌細胞株Ｌｉ−７をラット肝臓内に移植することで作成される肝癌モデル動物を用いて、マイトマイシンＣとミリプラチンとのｉｎ  ｖｉｖｏ併用効果を検討する。
【００７０】
ミリプラチンは、７０  ｍｇバイアルに２０  ｍｇ／ｍＬになるように懸濁用液で懸濁する。マイトマイシンＣは生理食塩液または水溶性造影剤に溶解する。その後、ミリプラチン懸濁液とマイトマイシンＣ水溶液を混合し、担癌ラットの肝動脈内に単回投与する。
【００７１】
投与時の腫瘍サイズと投与１〜２週間後の腫瘍サイズに基づき、抗腫瘍効果を評価する。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のミリプラチンと他の肝細胞癌治療薬との組み合わせや併用により、他の肝細胞癌治療薬またはミリプラチンを単剤で投与するよりも、肝細胞癌治療効果の更なる増強が可能となった。また本併用により、従来の肝細胞癌治療薬の有していた副作用の軽減や、従来の肝細胞癌治療薬に対する腫瘍細胞による薬剤耐性獲得の防止が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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