(57)【要約】      （修正有）【課題】経皮吸収性に優れ、副作用が少なく、且つ安全性の高い炎症性メディエータ産生抑制能及びそれを含有する皮膚外用剤の提供。【解決手段】ニシキギ科Elaeodendron属、トウダイグサ科Euphorbia属、及びムクロジ科Dodonaea属からなる群から選択される植物から抽出物を取得し、これを有効成分とする炎症性メディエータ（例えばＩＬ−６、ＮＯ、及びプロスタグランジンからなる群から選択されるもの）の産生抑制剤を得、さらにこの炎症性メディエータ産生抑制剤を皮膚外用剤に配合して炎症性メディエータ産生抑制用皮膚外用剤とする。【選択図】図１
2014214111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニシキギ科Elaeodendron属、トウダイグサ科Euphorbia属、及びムクロジ科Dodonaea属からなる群から選択される植物の抽出物を有効成分とする、炎症性メディエータ産生抑制剤。
【請求項２】
前記炎症性メディエータがＩＬ−６、ＮＯ（一酸化窒素）、及びプロスタグランジンからなる群から選択されるものである、請求項１記載の炎症性メディエータ産生抑制剤。
【請求項３】
前記炎症性メディエータがＩＬ−６であることを特徴とする、請求項１記載の炎症性メディエータ産生抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の炎症性メディエータ産生抑制剤を含有することを特徴とする、炎症性メディエータ産生抑制用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性メディエータの産生抑制剤に関する。詳しくは、本発明は、Elaeodendron属Celastraceae科、Euphorbia属Euphorbiaceae科、及びDodonaea属Sapindaceae科からなる群から選択される植物の抽出物を有効成分とし、安全性等に優れた炎症性メディエータ産生抑制剤及びそれを含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は生体の最外郭に位置し、化学物質や紫外線などの環境因子の刺激を常に受け、生体防御の最前線であるとともに生体防御反応の場となっている。炎症反応は、本来生体を防御するための反応であるが、その反応が過剰に進行した場合、紅斑（赤み）、血管透過性亢進（腫脹）、発熱（ほてり）を主徴とする症状が現れる。
【０００３】
いわゆる、日焼けと呼ばれる紫外線を浴びた後に惹起される色素沈着は、表皮に存在するメラノサイトにおけるメラニン色素の合成促進がその本態であるが、このメラニン産生亢進も生体防御反応のひとつと考えられる。
【０００４】
しかし、これらの反応が過剰になった場合、特に皮膚ではその反応が身体の浅部で惹起され症状が顕著に発現するために、医療上の問題ばかりでなく、外観への影響といった美容上の問題も含まれる。
【０００５】
近年の研究で、炎症反応およびメラニン合成促進反応に、表皮細胞で産生されるＩＬ−６（インターロイキン−６）、ＩＬ−１α（インターロイキン−１α）、プロスタグランジン、エンドセリンといった化学物質が深く関与することが明らかになってきている。特に、ＩＬ−６が紫外線照射によって表皮細胞から放出されると、皮膚にとどまらずＩＬ−６の血中濃度が上昇し、抑鬱感、集中力の低下、形状認識障害などの全身作用（精神作用）への影響が現れることばかりでなく、例えばトライアスロン選手のランタイムがＩＬ−６の増加に伴って悪化するといった運動能力への影響があることも明らかになった。
【０００６】
従来は、炎症に対しては抗炎症作用を有する物質が、色素沈着に対してはメラニン合成を抑制する作用を有する物質が、全身作用については向精神薬的な物質が投与されてきた。また、運動能力の低下に関しては、筋肉増強剤などのドーピング違反となるような物質以外に適用されているものは無い。
【０００７】
しかしながら、これまで開発されてきた上記の各有効性を示す物質は優れた効果を有するものの、目的とする作用以外に強い生理作用を併有する、また皮膚での局所投与ではその経皮吸収性の問題から期待した効果が得られない場合がある等の課題があることが知られている。さらに、上記の作用に対して網羅的に効果を発揮するものではないため、各作用に対して個々に対応する必要があった。
【０００８】
なお、これまでに天然物由来のＩＬ−６抑制剤としては、特許文献１（特開２００４−１５５７５１号公報）、特許文献２（特開平０８−９９９９６号公報）等が提案されている。また、本発明者は、アルニカ抽出物を有効成分とする炎症性メディエータ産生抑制剤を提案している（特許文献３；特開２０１１−１７８７０５号公報）。
しかしながら、依然として、副作用が少なく且つ安全性の高い新たな炎症性メディエータ産生抑制剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１５５７５１号公報
【特許文献２】特開平０８−９９９９６号公報
【特許文献３】特開２０１１−１７８７０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、経皮吸収性に優れ、副作用が少なく、且つ安全性の高い炎症性メディエータ産生抑制能及びそれを含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、特定の植物群の抽出物が、ＩＬ−６、ＮＯ（一酸化窒素）、及びプロスタグランジンといった炎症性メディエータの産生を抑制する作用に優れる、特にＩＬ−６の産生を抑制する作用に優れること、並びにＩＬ−６の産生を抑制することによって運動能力の低下予防効果が期待できること、同時に生体に対しては安全であることを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２）に示す皮膚外用剤に関する。
（１）ニシキギ科Elaeodendron属、トウダイグサ科Euphorbia属、及びムクロジ科Dodonaea属からなる群から選択される植物の抽出物を有効成分とする、炎症性メディエータ産生抑制剤。
（２）前記炎症性メディエータがＩＬ−６、ＮＯ（一酸化窒素）、及びプロスタグランジンからなる群から選択されるものである、（１）記載の炎症性メディエータ産生抑制剤。
（３）前記炎症性メディエータがＩＬ−６であることを特徴とする、（１）記載の炎症性メディエータ産生抑制剤。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の炎症性メディエータ産生抑制剤を含有することを特徴とする、炎症性メディエータ産生抑制用皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ニシキギ科Elaeodendron属、トウダイグサ科Euphorbia属、及びムクロジ科Dodonaea属からなる群から選択される植物の抽出物を有効成分とする炎症性メディエータ産生抑制剤は抗炎症作用に優れ、副作用が少なく、且つ経皮吸収性及び人体への安全性が高い。よって、炎症性メディエータ産生抑制用皮膚外用剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例４の結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例５の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例６の結果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例７の結果を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例８の結果を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例９の結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例１０の結果を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例１１の結果を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施例１２の結果を示すグラフである。
【図１３】本発明の実施例１３、１４、１５の結果を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例１６、１７、１８の結果を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施例１９の結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施例２０の結果を示すグラフである。
【図１７】本発明の実施例２１の結果を示すグラフである。
【図１８】本発明の実施例２２の結果を示すグラフである。
【図１９】本発明の実施例２３の結果を示すグラフである。
【図２０】本発明の実施例２４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（１）植物の抽出物
本発明の炎症性メディエータ産生抑制剤の有効成分は、ニシキギ（Celastraceae）科Elaeodendron属、トウダイグサ（Euphorbiaceae）科トウダイグサ（Euphorbia）属、及びムクロジ（Sapindaceae）科Dodonaea属からなる群から選択される植物の抽出物（以下、単に「植物抽出物」という場合がある）である。
【００１６】
上記植物であれば特に制限されないが、具体的には、ニシキギ科Elaeodendron属に属する植物としてはニシキギ、ツルウメモドキ、マサキ、ツルマサキ、マユミ、ツリバナなどが挙げられる。トウダイグサ科Euphorbia属に属する植物としてはポインセチア，ショウジョウソウ，ハツユキソウ，ハナキリン，ミドリサンゴなどが挙げられる。ムクロジ科Dodonaea属に属する植物としてはレイシ，ガラナ，フウセンカヅラなどが挙げられる。
【００１７】
上記植物において使用する部位は特に限定されず、花、根、葉、枝、茎などから抽出することができる。
【００１８】
前記植物抽出物は通常、乾燥した植物体を必要に応じて細分化し、溶剤に浸漬したのち、濾過して得られる。細分化の程度及び細分化方法は特に制限されず、例えば、乾燥した織物体を従来公知の方法により粉砕して粉体状とする方法が挙げられる。
【００１９】
溶剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の親水性有機溶剤、ジクロロメタン等の有機溶剤、又はこれらの混合物が用いられる。混合溶剤の具体例としては、水/エタノール混液（５０％エタノール、７０％エタノールなど）、水／ブチレングリコール混液（５０％ブチレングリコールなど）が挙げられる。
【００２０】
浸漬処理における溶剤の温度は特に制限されず、通常は室温（２２〜２５℃）で処理されるが、溶剤を沸騰させ環流して抽出することもできる。浸漬時間は特に制限されないが、通常は１日〜１週間程度である。
【００２１】
このようにして得られる植物抽出物の形態は、粉末状、ゲル状、ペースト状などいずれであってもよい。
【００２２】
（２）炎症性メディエータ産生抑制剤
上記植物抽出物は、そのまま炎症性メディエータ産生抑制剤として利用することができる。特に、前記炎症性メディエータとしてＩＬ−６、ＮＯ、プロスタグランジンからなる群から選択されるものに対し、優れた産生抑制作用を有する。さらに、前記炎症性メディエータとしてＩＬ−６に対し、優れた産生抑制作用を有する。そして、ＩＬ−６の産生により引き起こされるとされる抑鬱感、集中力の低下、形状認識障害などの全身作用（精神作用）への影響や、ＩＬ−６の増加に伴って悪化するとされる運動能力の低下を抑制又は予防する作用が期待される。
【００２３】
（３）皮膚外用剤
本発明の炎症性メディエータ産生抑制剤はそのまま、あるいは皮膚外用剤へ配合して使用することができる。
皮膚外用剤中の前記植物抽出物の配合量は、特に限定されるものではないが、乾燥固形物重量で、総量を基準として０．０００１〜１０．０重量％が好ましく、更に好ましくは０．０００５〜５．０重量％、特に好ましくは０．０１〜５重量％である。該配合量が０．０００１重量％未満であると、本発明の効果が充分に得られず、一方１０．０重量％を超えても、その増量に見合った効果の向上は認められない。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤は、例えばローション類、乳液類、クリーム類、軟膏類、パック類等の剤型とすることができる。
また、本発明の皮膚外用剤には、上記炎症性メディエータ産生抑制剤に加え、本発明の効果を損なわない範囲で必要に応じて医薬品類、医薬部外品類、化粧品類などの製剤に使用される成分や添加剤、例えば色素（着色剤）、防腐剤、界面活性剤、香料、顔料等を任意成分として適宜配合することができる。
【００２５】
そのような任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ、鉱物油（ミネラルオイル）等のオイル、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；
【００２６】
イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット、水添ココグリセリル、ステアリン酸ポリグリセリル、パラオキシ安息香酸メチル（メチルパラベン）等のエステル類；
【００２７】
ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類；
【００２８】
脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類等の界面活性剤類；
【００２９】
ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；
ステアリン酸等の高級脂肪酸類；
ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；
【００３０】
グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸、キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、ポリアクリル酸ナトリウム等のポリアクリル酸及び／又はその塩、ポリエチレングリコール、ベントナイト、微粒子セルロースゲル等の増粘剤；
【００３１】
表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類；  表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；
【００３２】
パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；
エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類；などが好ましく例示できる。
【００３３】
本発明の炎症性メディエータ産生抑制剤は、上述した皮膚外用剤以外に、サプリメントや栄養剤などの経口剤へ配合して使用することもできる。
【実施例】
【００３４】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する。ただし本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の調製例及び実施例中％とあるのは、特に指定がない場合ｗ／ｗ％である。
【００３５】
＜製造例１＞（植物抽出物含有サンプルの製造）
乾燥植物粉末１ｇを１０ｍｌのジクロロメタンに浸漬けし、室温（２２〜２５℃）で１日静置した後、溶媒を留去した。残渣に１ｍｌのジメチルスルフォキシドを添加して１ｇ植物体相当（1ge: 1gram equivalent）の植物抽出物を取得した。この植物抽出物を各試験に使用する細胞培養用培地で希釈して試験に供した。
【００３６】
なお、使用した乾燥植物は、以下の３種類である。
植物抽出物Ａ：ニシキギ（Celastraceae）科Elaeodendron属；グリフィス大学エスカイティス研究所ネイチャーバンク：サンプル番号「QID0.0902」
植物抽出物Ｂ：トウダイグサ（Euphorbiaceae）科Euphorbia属；グリフィス大学エスカイティス研究所ネイチャーバンク：サンプル番号「12721.8」
植物抽出物Ｃ：ムクロジ（Sapindaceae）科Dodonaea属；グリフィス大学エスカイティス研究所ネイチャーバンク：サンプル番号「10395.2」
【００３７】
＜実施例１〜３＞（植物抽出物のＩＬ−６産生抑制効果）
マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を２４ウェル培養プレート（Corning）に５．０×１０４cells/wellになるように細胞を播種した。培地には１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清及び１ｖ／ｖ％非必須アミノ酸溶液を含むMinimum Essential Medium Eagle (Invitrogen)を使用し、２４時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、１．０ｍｇｅ／ｍｌ、０．５ｍｇｅ／ｍｌ、０．２ｍｇｅ／ｍｌ、及び０．１ｍｇｅ／ｍｌの植物抽出物、及び１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポサッカライド；Sigma社製）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換２４時間後、培養上清を回収し、該上清中のＩＬ−６量（単位；pg/ml）を、IL-6 mouse antibody pair (Invitrogen)を用いて測定した。結果を表１、及び図１（実施例１）、図２（実施例２）、並びに図３（実施例３）に示す。
【００３８】
【表１】
2014214111.tif 000003
【００３９】
＜実施例４〜６＞（植物抽出物の一酸化窒素ラジカル産生抑制効果）
マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を２４ウェル培養プレート（Corning）に５．０×１０４cells/wellになるように細胞を播種した。培地には１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清及び１ｖ／ｖ％非必須アミノ酸溶液を含むMinimum Essential Medium Eagle (Invitrogen)を使用し、２４時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．５ｍｇｅ／ｍｌの植物抽出物、及び１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポサッカライド；Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換２４時間後、培養上清を回収し、該上清中の一酸化窒素ラジカル量（単位；Ｍ）を、Nitric Oxide Quantitation kit (Active Motif)を用いて測定した。結果を表２、及び図４（実施例４）、図５（実施例５）、並びに図６（実施例６）に示す。
【００４０】
【表２】
2014214111.tif 000004
【００４１】
＜実施例７〜９＞（植物抽出物のプロスタグランジン産生抑制効果）
マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を２４ウェル培養プレート（Corning）に５．０×１０４cells/wellになるように細胞を播種した。培地には１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清及び１ｖ／ｖ％非必須アミノ酸溶液を含むMinimum Essential Medium Eagle(Invitrogen)を使用し、２４時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．５ｍｇｅ／ｍｌの植物抽出物、及び１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポサッカライド；Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換２４時間後、培養上清を回収し、該上清中のプロスタグランジン量（単位；pg/ml）をPGE2 Parameter（R&D Systems）を用いて測定した。結果を表３、及び図７（実施例７）、図８（実施例８）、並びに図９（実施例９）に示す。
【００４２】
【表３】
2014214111.tif 000005
【００４３】
＜実施例１０〜１２＞（植物抽出物の前処理によるＩＬ−６産生抑制効果）
マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を２４ウェル培養プレート（Corning）に２．５×１０４cells/wellになるように細胞を播種した。培地には１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清及び１ｖ／ｖ％非必須アミノ酸溶液を含むMinimum Essential Medium Eagle(Invitrogen)を使用し、２４時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．５ｍｇｅ／ｍｌ、０．２ｍｇｅ／ｍｌ、０．１ｍｇｅ／ｍｌ、及び０．０５ｍｇｅ／ｍｌの植物抽出物を添加し、さらに２４時間培養した後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポサッカライド；Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換２４時間後、培養上清を回収し、該上清中のＩＬ−６量（単位；pg/ml）をIL-6 mouse antibody pair（Invitrogen）を用いて測定した。結果を表４、及び図１０（実施例１０）、図１１（実施例１１）、並びに図１２（実施例１２）に示す。
【００４４】
【表４】
2014214111.tif 000006
【００４５】
＜実施例１３〜１５＞（植物抽出物の前処理によるＩＬ−６・ｍＲＮＡ発現抑制効果）
マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を、直径６ｃｍ培養ディッシュ（Corning）に、５×１０５cells/wellになるように細胞を播種した。培地には１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清及び１ｖ／ｖ％非必須アミノ酸溶液を含むMinimum Essential Medium Eagle(Invitrogen)を使用し、２４時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．２ｍｇｅ／ｍｌの植物抽出物を添加し、さらに２４時間培養した後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポサッカライド；Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換２４時間後、培地を吸引除去し、リン酸緩衝液で細胞を３回洗浄した後、細胞を回収した。
【００４６】
SV Total RNA System (Promega)を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡをReverse Transcriptase system (Promega)を用いてＤＮＡに逆転写した。beta-actinに対するforward-primerとしてCTA CAG CTT CAC
CAC CAC AG、reverse primerとしてTTC CAT ACC CAA GAA GGA AGを、ＩＬ−６に対するorward-primerとしてAGG ATA CCA CTC CCA ACA GA、reverse primerとしてCTC CAG AAG ACC AGA GGA AAを用いて、通常のreal time PCR法でＤＮＡを増殖させた。数値は各群のbeta-actin mRNA発現量でＩＬ−６・ｍＲＮＡ発現量を除した相対発現量を算出し、さらに対照群の相対発現量を１とした時の比率で表した。結果を表５及び図１３に示す。
【００４７】
【表５】
2014214111.tif 000007
【００４８】
＜実施例１６〜１８＞（植物抽出部の細胞毒性（遊離乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ））
マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を９６ウェル培養プレート（Corning）に５．０×１０４cells/wellになるように細胞を播種した。培地には１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清及び１ｖ／ｖ％非必須アミノ酸溶液を含むMinimum Essential Medium Eagle(Invitrogen)を使用し、２４時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、１．０ｍｇｅ／ｍｌの植物抽出物、及び１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポサッカライド；Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換２４時間後、培養上清を回収し、該上清中に放出されたＬＤＨをLDH assay kit (Sigma)で定法に従って測定した。データはサンプルの吸光度から細胞培養に使用していない当該培地の吸光度を差し引いた数値で示した。結果を表６及び図１４に示す。
【００４９】
【表６】
2014214111.tif 000008
【００５０】
＜実施例１９〜２１＞（植物抽出部の細胞毒性（MTT assay法））
マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を２４ウェル培養プレート（Corning）に２．５×１０４cells/wellになるように細胞を播種した。培地には１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清及び１ｖ／ｖ％非必須アミノ酸溶液を含むMinimum Essential Medium Eagle(Invitrogen)を使用し、２４時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．５ｍｇｅ／ｍｌ、０．２ｍｇｅ／ｍｌ、０．１ｍｇｅ／ｍｌ、及び０．０５ｍｇｅ／ｍｌの植物抽出物を添加し、さらに２４時間培養した後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポサッカライド；Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換２４時間後、培養上清を除去し、MTT assay kit (Sigma)で定法に従って測定した。結果を表７及び図１５（実施例１９）、図１６（実施例２０）、並びに図１７（実施例２１）に示す。
【００５１】
【表７】
2014214111.tif 000009
【００５２】
＜実施例２２〜２４＞（植物抽出部の細胞毒性（細胞増殖））
マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を９６ウェル培養プレート（Corning）に２．０×１０４cells/wellになるように細胞を播種した。培地には１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清及び１ｖ／ｖ％非必須アミノ酸溶液を含むMinimum Essential Medium Eagle(Invitrogen)を使用し、２４時間培養した。細胞の状態を確認した後、培地を吸引除去し、０．２ｍｇｅ／ｍｌ植物抽出物及び１００ｎｇ／ｍｌ・ＬＰＳ（リポサッカライド；Sigma）を含有する上記培地に培地を交換した。培地交換４８時間後、培養上清を除去し、BrdU Cell Proliferation assay kit (Cell Signaling)で定法に従って測定した。結果を表８、及び図１８（実施例２２）、図１９（実施例２３）、並びに図２０（実施例２４）に示す。
【００５３】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、ニシキギ科Elaeodendron属、トウダイグサ科Euphorbia属、及びムクロジ科Dodonaea属からなる群から選択される植物の抽出物を有効成分とする炎症性メディエータ産生抑制剤は抗炎症作用に加え、メラニン合成抑制作用、向精神作用、運動能力の低下予防作用などに優れ、副作用が少なく、且つ経皮吸収性及び人体への安全性が高く、炎症性メディエータ産生抑制用皮膚外用剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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