(57)【要約】【課題】核酸の送達のための改善された組成物および方法の提供。【解決手段】本発明は、治療剤を細胞に送達するための組成物および方法を提供する。特に、これらは、核酸の効率的な被包および被包された核酸のインビボにおける細胞への効率的な送達を提供する、新規の脂質および核酸−脂質粒子を含む。本発明の組成物は、非常に強力であり、それにより、特異的な標的タンパク質の効果的なノックダウンが比較的低用量で可能になる。さらに、本発明の組成物および方法は、毒性が低く、以前から当該分野で公知の組成物および方法よりも高い治療指数をもたらす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６２７号、２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号、および２００８年５月１日に出願された米国仮特許出願第６１／０４９，５６８号の利益を、米国特許法§１１９（ｅ）のもとに主張する。これら（４つ）の仮特許出願は、それらの全体が、参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
（配列表に関する申告）
本願に関連する配列表は、紙の写しの代わりにテキストファイルフォーマットで提供され、そして本明細書中に参考により援用される。その配列表を含むテキストファイルの名称は、４８０２０８＿４５７ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。そのテキストファイルは、８ＫＢであり、２００８年１２月３１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に出願されている。
【０００３】
背景
技術分野
本発明は、脂質粒子を用いる治療剤送達の分野に関する。特に、本発明は、陽イオン性脂質、およびこれらの脂質を含む脂質粒子（これらは、核酸のインビボ送達にとって有益である）ならびにインビボでの治療的な用途に適した核酸−脂質粒子組成物を提供する。さらに、本発明は、これらの組成物を調製する方法、ならびにこれらの組成物を用いて、例えば、様々な疾患状態の処置のために、核酸を細胞に導入する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
治療的な核酸としては、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミドおよび免疫刺激核酸が挙げられる。これらの核酸は、種々の機序を介して作用する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの場合、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを介して特定のタンパク質の細胞内レベルをダウンレギュレートし得る。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを細胞質に導入した後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物は、ＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合し得る。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体からはずされ、その結合されているｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡを認識し得、それに結合し得る鋳型をＲＩＳＣ内に提供する。ＲＩＳＣ複合体は、相補的なｍＲＮＡと結合すると、そのｍＲＮＡを切断し、切断した鎖を放出する。ＲＮＡｉは、タンパク質合成のためにコードする対応するｍＲＮＡの特異的な破壊を標的化することによって、特定のタンパク質のダウンレギュレーションをもたらし得る。
【０００５】
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ構築物が、標的タンパク質に対する任意のヌクレオチド配列を用いて合成され得るので、ＲＮＡｉの治療的な用途は、極めて広い。現在までに、ｓｉＲＮＡ構築物は、インビトロとインビボの両方のモデルにおいて標的タンパク質を特異的にダウンレギュレートする能力を示している。さらに、ｓｉＲＮＡ構築物は、現在、臨床研究において評価されている。
【０００６】
しかしながら、現在、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ構築物が直面している２つの問題は、第１に、血漿中のヌクレアーゼ消化に対する感受性、第２に、遊離ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして全身投与されたときにそれらがＲＩＳＣに結合し得る細胞内コンパートメントに接近する能力の限界である。これらの二本鎖構築物は、分子内の化学修飾されたヌクレオチドリンカー、例えば、ホスホチオエート基の組み込みによって安定化され得る。しかしながら、これらの化学修飾は、ヌクレアーゼ消化からの限定された保護を提供するだけであり、構築物の活性を低下させ得る。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの細胞内送達は、ポリマー、陽イオン性リポソームなどのキャリア系を使用することによって、または構築物の化学修飾、例えば、コレステロール分子の共有結合によって、促進され得る［参考文献］。しかしながら、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子の効力を高めるため、ならびに化学修飾の必要性を低下させるか、または排除するために、改善された送達系が必要とされている。
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムもまた、タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害し得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に対する相補的配列を有し、そしてワトソン−クリック塩基対形成によってそのｍＲＮＡに結合し得る。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げ、そして／またはｍＲＮＡ転写物のＲＮａｓｅＨ分解の引き金を引く。その結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用の特異性（すなわち、特異的な疾患関連タンパク質のダウンレギュレーション）についておびただしい能力を有する。現在までに、これらの化合物は、炎症性疾患、癌およびＨＩＶのモデルをはじめとしたいくつかのインビトロおよびインビボのモデルにおいて見込みを示している（非特許文献１に概説されている）。アンチセンスは、染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることによって細胞活性にも影響を及ぼし得る。いくつかのアンチセンス薬物のヒトにおける高度な臨床上の評価が、現在進行中である。これらの薬物に対する標的には、ｂｃｌ２遺伝子およびアポリポタンパク質Ｂ遺伝子ならびにｍＲＮＡ産物が含まれる。
【０００８】
免疫刺激核酸には、デオキシリボ核酸およびリボ核酸が含まれる。デオキシリボ核酸の場合、ある特定の配列またはモチーフが、哺乳動物において免疫刺激を誘発すると示されている。これらの配列またはモチーフとしては、ＣｐＧモチーフ、ピリミジンリッチ配列およびパリンドローム配列が挙げられる。デオキシリボ核酸におけるＣｐＧモチーフは、エンドソームのレセプターであるｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ−９）（これは、その後、生得免疫刺激経路と獲得免疫刺激経路の両方の引き金を引く）によって特異的に認識されると考えられている。ある特定の免疫刺激リボ核酸配列もまた報告されている。これらのＲＮＡ配列は、ｔｏｌｌ様レセプター６および７（ＴＬＲ−６およびＴＬＲ−７）に結合することによって、免疫の活性化の引き金を引くと考えられている。さらに、二本鎖ＲＮＡは、免疫刺激性であるとも報告されており、ＴＬＲ−３への結合を介して活性化すると考えられている。
【０００９】
治療的な核酸の使用に伴う１つの周知の問題は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合の安定性およびこのリンカーのヌクレアーゼに対する感受性に関するものである。血清中にエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが存在することにより、ホスホジエステルリンカーを有する核酸は迅速に消化され、それゆえ、治療的な核酸は、血清の存在下または細胞内において非常に短い半減期を有し得る（非特許文献２；および非特許文献３）。これらの問題および他の公知の問題のために、現在開発されている治療的な核酸は、天然の核酸に見られる基本的なホスホジエステル化学を使用していない。
【００１０】
この問題は、血清または細胞内の分解を減少させる化学修飾によって部分的に克服されている。ヌクレオチド間のホスホジエステル架橋（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはホスホルアミデート結合を用いる）、ヌクレオチド塩基（例えば、５−プロピニル−ピリミジン）または糖（例えば、２’−修飾された糖）において、修飾が試験されている（非特許文献４）。他のものは、２’−５’糖結合を用いて安定性を改善するように試みている（例えば、米国特許第５，５３２，１３０号を参照のこと）。他の変更が試みられている。しかしながら、これらの解決策のいずれもが、完全に十分であると証明されておらず、インビボにおける遊離治療的核酸は、なおも限定的な有効性しか有していない。
【００１１】
さらに、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関して上で述べたように、治療的核酸が細胞膜を通過する能力が限定されているという問題（非特許文献５を参照のこと）および全身性の毒性（例えば、補体媒介性のアナフィラキシー、凝固特性の変化および血球減少症）（非特許文献６）に関連する問題が残っている。
【００１２】
有効性を改善するように試みるために、研究者らは、化学修飾された、または未改変の、治療的核酸を送達するために、脂質ベースのキャリア系を使用した。非特許文献７では、この著者らは、陰イオン性（従来の）リポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポゾーム、融合性リポソームおよび陽イオン性脂質／アンチセンス凝集物の使用について言及している。同様に、ｓｉＲＮＡを、陽イオン性リポソーム内において全身投与しており、そしてこれらの核酸−脂質粒子は、非ヒト霊長類を含む哺乳動物において標的タンパク質の改善されたダウンレギュレーションをもたらすと報告されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ａｇｒａｗａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３７６−３８７（１９９６）
【非特許文献２】Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：３２３−３３８（１９９３）
【非特許文献３】Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ａ．Ｒ．ら、ｐｐ１４７−１６１  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ（Ｅｄｓ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，ＲＰ  ａｎｄ  Ｉｚａｎｔ，ＪＧ；Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）
【非特許文献４】Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．Ｘ．，ｐｐ  ６４−８１  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９７）
【非特許文献５】Ｖｌａｓｓｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８２（１９９４）
【非特許文献６】Ｇａｌｂｒａｉｔｈら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．４：２０１−２０６（１９９４）
【非特許文献７】Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ  ａｎｄ  Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．４１：９９−１１９（１９９６）
【非特許文献８】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１１１−１１４（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
この発展にもかかわらず、全般的な治療的用途に適した脂質−治療的核酸組成物の改善が、当該分野においてなおも必要とされている。好ましくは、これらの組成物は、高効率で核酸を被包し得、高い薬物：脂質比を有し得、被包された核酸を血清中での分解およびクリアランスから保護し得、全身性送達に適し得、そして被包された核酸の細胞内送達をもたらし得る。さらに、これらの脂質−核酸粒子は、核酸の有効量での患者の処置がその患者に対して有意な毒性および／またはリスクを伴わないように、良好な耐容性を示すべきであり、適切な治療指数をもたらすべきである。本発明は、そのような組成物、その組成物を調製する方法、およびその組成物を使用して核酸を細胞に導入する方法（疾患の処置のための方法を含む）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
簡単な要約
本発明は、新規のアミノ脂質、ならびにそれらを含む脂質粒子を提供する。これらの脂質粒子は、活性な薬剤をさらに含み得、そして本発明の関連する方法に従って使用されることにより、その活性な薬剤を細胞に送達し得る。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、以下：
【００１７】
【化１】
2014132014.tif 000002
【００１８】
【化２】
2014132014.tif 000003
からなる群から選択される構造を有するアミノ脂質を提供する。
【００１９】
関連する実施形態において、本発明は、以下の構造（Ｉ）：
【００２０】
【化３】
2014132014.tif 000004
または塩を有するアミノ脂質を含み、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、同じであるか、または異なり、そして独立して、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルキル、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルケニル、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルキニルまたは必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アシルであり；
Ｒ３およびＲ４は、同じであるか、もしくは異なり、そして独立して、必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルケニルもしくは必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルキニルであるか、またはＲ３およびＲ４は、結合することにより、４〜６個の炭素原子、ならびに窒素および酸素から選択される１または２個のヘテロ原子の必要に応じて置換される複素環式環を形成し得；
Ｒ５は、存在しないか、または第４級アミンをもたらすために水素もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ｍ、ｎおよびｐは、同じであるか、または異なり、そして独立して０または１であるが、但し、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
ｑは、０、１、２、３または４であり；そして
ＹおよびＺは、同じであるか、または異なり、そして独立してＯ、ＳまたはＮＨである。
【００２１】
１つの特定の実施形態において、アミノ脂質は、以下の構造：
【００２２】
【化４】
2014132014.tif 000005
を有する。
【００２３】
関連する実施形態において、アミノ脂質は、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの（Ｒ）または（Ｓ）エナンチオマーである。
【００２４】
さらに関連する実施形態において、本発明は、本発明の上記アミノ脂質の１つ以上を含む脂質粒子を含む。ある特定の実施形態において、粒子は、１つ以上の中性脂質および粒子凝集を減少させることができる１つ以上の脂質をさらに含む。１つの特定の実施形態において、脂質粒子は、約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で：（ｉ）ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡから本質的になるか、またはそれらからなる。
【００２５】
追加の関連する実施形態において、本発明は、１つ以上の活性な薬剤または治療剤をさらに含む本発明の脂質粒子を含む。１つの実施形態において、本発明の脂質粒子は、核酸である活性な薬剤または治療剤を含む。様々な実施形態において、その核酸は、プラスミド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。
【００２６】
なおも別の関連する実施形態において、本発明は、本発明の脂質粒子および薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。１つの実施形態において、その薬学的組成物は、本発明の上記アミノ脂質、１つ以上の中性脂質、粒子凝集を減少させることができる１つ以上の脂質、および選択されたポリペプチドの発現を減少させることができる１つ以上のｓｉＲＮＡのうちの１つ以上を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる脂質粒子から本質的になる。１つの特定の実施形態において、その脂質粒子は、約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で：（ｉ）ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡから本質的になるか、またはそれらからなる。
【００２７】
本発明は、他の関連する実施形態において、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法をさらに含み、その方法は、本発明の脂質粒子または薬学的組成物を細胞に提供する工程を包含する。ある特定の実施形態において、その脂質粒子は、本発明の上記アミノ脂質、１つ以上の中性脂質、粒子凝集を減少させることができる１つ以上の脂質、および選択されたポリペプチドの発現を減少させることができる１つ以上のｓｉＲＮＡのうちの１つ以上を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。１つの特定の実施形態において、その脂質粒子は、約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で：（ｉ）ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡから本質的になるか、またはそれらからなる。特定の実施形態において、その脂質粒子は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される治療剤を含み、ここで、そのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドの発現を減少させるような、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む。別の実施形態では、その核酸は、そのポリペプチドまたはその機能的なバリアントまたはフラグメントの発現を増加させるような、そのポリペプチドまたはその機能的なバリアントもしくはフラグメントをコードするプラスミドである。
【００２８】
なおもさらに関連する実施形態において、本発明は、被験体内のポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を処置する方法を含み、その方法は、本発明の脂質粒子または薬学的組成物をその被験体に提供する工程を包含し、ここで、その治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、そのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む。
【００２９】
別の関連する実施形態では、本発明は、被験体内のポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を処置する方法を含み、その方法は、本発明の薬学的組成物をその被験体に提供する工程を包含し、ここで、その治療剤は、そのポリペプチドまたはその機能的なバリアントもしくはフラグメントをコードするプラスミドである。
【００３０】
さらなる実施形態において、本発明は、被験体において免疫応答を誘導する方法を含み、その方法は、本発明の薬学的組成物をその被験体に提供する工程を包含し、ここで、その治療剤は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、その薬学的組成物は、ワクチンまたは抗原と併用して患者に提供される。
【００３１】
関連する実施形態において、本発明は、本発明の脂質粒子および疾患または病原体に関連する抗原を含むワクチンを含む。１つの実施形態において、その脂質粒子は、免疫賦活性の核酸またはオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、その抗原は、腫瘍抗原である。別の実施形態では、その抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生生物抗原である。
【００３２】
本発明は、本発明の脂質粒子および薬学的組成物を調製する方法、ならびにこれらの脂質粒子および薬学的組成物の調製において有用なキットをさらに含む。
【００３３】
本発明は、約２０〜６０％アミノ脂質：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧというモル比で：陽イオン性脂質またはアミノ脂質（本発明のそれらのうちのいずれかを含む）；必要に応じてＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択され得る中性脂質；コレステロール；およびＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを含む脂質粒子も含む。１つの実施形態において、その脂質粒子は、アミノ脂質ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを含む。関連する実施形態において、その脂質粒子は、治療剤をさらに含む。１つの実施形態において、その治療剤は、核酸である。１つの特定の実施形態において、その核酸は、ｓｉＲＮＡである。本発明は、脂質粒子および薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物、ならびに細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法、またはその脂質粒子を細胞または被験体に提供する工程を包含する疾患を処置もしくは予防する方法をさらに企図する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
以下の構造（Ｉ）：
【化７２】
2014132014.tif 000006
を有するアミノ脂質であって、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、同じであるか、または異なり、そして独立して、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルキル、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルケニル、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルキニルまたは必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アシルであり；
Ｒ３およびＲ４は、同じであるか、もしくは異なり、そして独立して、必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルケニルもしくは必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルキニルであるか、またはＲ３およびＲ４は、結合することにより、４から６個の炭素原子、ならびに窒素および酸素から選択される１または２個のヘテロ原子の必要に応じて置換される複素環式環を形成し得；
Ｒ５は、存在しないか、または存在し、存在するときは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ｍ、ｎおよびｐは、同じであるか、または異なり、独立して０または１であるが、但し、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
ｑは、０、１、２、３または４であり；そして
ＹおよびＺは、同じであるか、または異なり、独立してＯ、ＳまたはＮＨである、
アミノ脂質。
（項目２）
以下の構造：
【化７３】
2014132014.tif 000007
を有する、項目１に記載のアミノ脂質。
（項目３）
以下：
【化７４】
2014132014.tif 000008
【化７５】
2014132014.tif 000009
からなる群から選択される構造を有するアミノ脂質。
（項目４）
項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ脂質を含む脂質粒子。
（項目５）
項目２に記載のアミノ脂質を含む、項目４に記載の脂質粒子。
（項目６）
中性脂質および粒子凝集を減少させることができる脂質をさらに含む、項目４に記載の脂質粒子。
（項目７）
約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡのモル比で：
（ｉ）ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ；
（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質；
（ｉｉｉ）コレステロール；および
（ｉｖ）ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡから本質的になる、項目６に記載の脂質粒子。
（項目８）
約２０〜６０％陽イオン性脂質またはアミノ脂質：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％コレステロール：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧのモル比で：
（ｉ）１つ以上の陽イオン性脂質またはアミノ脂質；
（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される１つ以上の中性脂質；（ｉｉｉ）コレステロール；および
（ｉｖ）ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ
を含む、脂質粒子。
（項目９）
前記アミノ脂質が、項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ脂質である、項目８に記載の脂質粒子。
（項目１０）
治療剤をさらに含む、項目４〜９のいずれか１項に記載の脂質粒子。
（項目１１）
前記治療剤が、核酸である、項目１０に記載の脂質粒子。
（項目１２）
前記核酸が、プラスミドである、項目１１に記載の脂質粒子。
（項目１３）
前記核酸が、免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、項目１１に記載の脂質粒子。
（項目１４）
前記核酸が：ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群から選択される、項目１１に記載の脂質粒子。
（項目１５）
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、項目１４に記載の脂質粒子。
（項目１６）
項目１０〜１５のいずれか１項に記載の脂質粒子および薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
（項目１７）
細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法であって、項目１０〜１５のいずれか１項に記載の脂質粒子を細胞に提供する工程を包含する、方法。
（項目１８）
治療剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ここで、該ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡが、ポリペプチドの発現を低下させるように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む、項目１７に記載の方法。（項目１９）
核酸が、ポリペプチドまたはその機能的なバリアントもしくはフラグメントの発現を増加させるような、ポリペプチドまたはその機能的なバリアントもしくはフラグメントをコードするプラスミドである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を処置する方法であって、項目１６に記載の薬学的組成物を被験体に提供する工程を包含し、ここで、治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ここで、該ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む、方法。
（項目２１）
被験体におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を処置する方法であって、項目１６に記載の薬学的組成物を被験体に提供する工程を包含し、ここで、治療剤は、ポリペプチドまたはその機能的なバリアントもしくはフラグメントをコードするプラスミドである、方法。
（項目２２）
被験体において免疫応答を誘導する方法であって、項目１６に記載の薬学的組成物を被験体に提供する工程を包含し、ここで、治療剤は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、方法。
（項目２３）
薬学的組成物が、ワクチンまたは抗原と併用して患者に提供される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
項目１３に記載の脂質粒子および疾患または病原体に関連する抗原を含むワクチン。
（項目２５）
前記抗原が、腫瘍抗原である、項目２４に記載のワクチン。
（項目２６）
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生生物抗原である、項目２４に記載のワクチン。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
図面のいくつかの図の簡単な説明
【図１】図１は、核酸の被包および得られるベシクルの安定性に対する様々なエタノール濃度の影響を図示している。図１Ａは、３２、３４および３６％エタノールの存在下におけるＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ（４０：１０：４８：２モル比）ベシクル内の１６ｍｅｒホスホジエステルオリゴヌクレオチドの被包の量を示すグラフである。図１Ｂは、３２、３４および３６％エタノールにおける負荷前および負荷の３０分後および６０分後のベシクルのサイズを示す棒グラフである。
【図２】図２は、核酸の被包に対する時間および温度の影響を示している。図２Ａは、記載されたインキュベーション時点での３０℃および４０℃におけるＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧベシクル内の１６ｍｅｒホスホジエステルオリゴヌクレオチドの被包の量を示すグラフである。図２Ｂは、インキュベーション前ならびに４０℃におけるインキュベーションの１５分後、３０分後および６０分後のベシクルのサイズを示す棒グラフである。
【図３】図３は、インビボにおいて第ＶＩＩ因子の発現を減少させる第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の様々な脂質処方物の能力を示すグラフである。ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡまたはＤＬｉｎＤＡＰを含む粒子内の様々な第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡ投薬量で処置した後の第ＶＩＩ因子レベルが示されている。
【図４】図４は、記載される様々なＰＥＧ−脂質を含む様々な濃度のＤＬｉｎ−ＤＭＡ脂質粒子処方物を投与した後の残留ＦＶＩＩの量を比較しているグラフである。
【図５】図５は、記載される様々なＰＥＧ−脂質を含む様々な濃度のＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ脂質粒子処方物を投与した後の残留ＦＶＩＩの量を比較しているグラフである。
【図６】図６は、記載される脂質処方物を様々なｓｉＲＮＡ投薬量で投与した後に存在する血清ＡＬＴレベルを示すグラフである。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧを含むＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ脂質粒子の相対的な耐容性を証明している。図７Ａは、様々なｓｉＲＮＡ投薬量で脂質粒子を用いて処置した後の血清ＡＬＴレベルを示しており、図７Ｂは、様々なｓｉＲＮＡ投薬量で脂質粒子を用いて処置した後の動物の体重の変化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本発明は、治療剤などの活性な薬剤のインビボ送達のために脂質粒子内で使用されるときに利点を提供する陽イオン性脂質の発見に一部基づく。特に、添付の実施例によって説明されるように、本発明は、インビボにおける核酸の高活性および組成物の改善された耐容性を提供することにより、以前に報告された脂質−核酸粒子組成物と比べて有意に高い治療指数をもたらす、本発明に記載の陽イオン性脂質を含む核酸−脂質粒子組成物を提供する。さらに、ある特定の治療的な核酸−脂質粒子を用いた際に観察される毒性の改善をもたらす組成物および使用方法が開示される。
【００３６】
ある特定の実施形態において、本発明は、詳細には、ｓｉＲＮＡ分子を送達するための改善された組成物を提供する。これらの組成物が、標的タンパク質のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルのダウンレギュレートにおいて有効であることが本明細書中で示される。さらに、これらの改善された組成物の活性は、ある特定の陽イオン性脂質の存在に依存し、そして処方物中の陽イオン性脂質のモル比は、活性に影響し得ることが示される。
【００３７】
本発明の脂質粒子および組成物は、インビトロまたはインビボの両方における会合または被包された治療剤の細胞への送達をはじめとした種々の目的のために使用され得る。したがって、本発明は、疾患または障害を処置する必要のある被験体を、適当な治療剤と会合された本発明の脂質粒子と接触させることによって、その被験体におけるその疾患または障害を処置する方法を提供する。
【００３８】
本明細書中に記載されるように、本発明の脂質粒子は、例えば、ｓｉＲＮＡ分子およびプラスミドを含む核酸の送達に特に有用である。ゆえに、本発明の脂質粒子および組成物は、標的遺伝子の発現を減少させる核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）または所望のタンパク質の発現を増加させるために使用され得る核酸（例えば、その所望のタンパク質をコードするプラスミド）と会合された本発明の脂質粒子と細胞を接触させることによって、インビトロとインビボの両方において標的遺伝子および標的タンパク質の発現を調節するために使用され得る。
【００３９】
本発明の陽イオン性脂質、ならびに脂質粒子およびそれを含む組成物、そして治療剤を送達するため、ならびに遺伝子およびタンパク質の発現を調節するためにそれらを使用することに関する様々な例示的な実施形態が、以下でさらに詳細に説明される。
【００４０】
Ａ．アミノ脂質
本発明は、治療剤を細胞にインビボ送達するために本発明の脂質粒子において有利に使用される新規アミノ脂質を提供し、それらとしては、以下の構造：
【００４１】
【化５】
2014132014.tif 000010
【００４２】
【化６】
2014132014.tif 000011
【００４３】
【化７】
2014132014.tif 000012
【００４４】
【化８】
2014132014.tif 000013
を有するアミノ脂質（それらの（Ｒ）および（Ｓ）エナンチオマーを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の１つの実施形態において、アミノ脂質は、以下の構造（Ｉ）：
【００４６】
【化９】
2014132014.tif 000014
またはその塩を有し、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、同じであるか、または異なり、そして独立して、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルキル、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルケニル、必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アルキニルまたは必要に応じて置換されるＣ１２−Ｃ２４アシルであり；Ｒ３およびＲ４は、同じであるか、もしくは異なり、そして独立して、必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルケニルもしくは必要に応じて置換されるＣ１−Ｃ６アルキニルであるか、またはＲ３およびＲ４は、結合することにより、４〜６個の炭素原子、ならびに窒素および酸素から選択される１または２個のヘテロ原子の必要に応じて置換される複素環式環を形成し得；
Ｒ５は、存在しないか、または第４級アミンをもたらすために水素もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ｍ、ｎおよびｐは、同じであるか、または異なり、そして独立して０または１であるが、但し、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
ｑは、０、１、２、３または４であり；そして
ＹおよびＺは、同じであるか、または異なり、そして独立してＯ、ＳまたはＮＨである。
【００４７】
「アルキル」とは、１〜２４個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の非環式または環式の飽和脂肪族炭化水素のことを意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられる；一方、飽和分枝鎖アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる；一方、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
【００４８】
「アルケニル」とは、隣接炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含む、上で定義されたようなアルキルのことを意味する。アルケニルは、ｃｉｓとｔｒａｎｓの両方の異性体を含む。代表的な直鎖および分枝鎖のアルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられる。
【００４９】
「アルキニル」とは、隣接炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含む、上で定義されたような任意のアルキルまたはアルケニルのことを意味する。代表的な直鎖および分枝鎖のアルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどが挙げられる。
【００５０】
「アシル」とは、接着点における炭素が、以下で定義されるようなオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニルまたはアルキニルのことを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニルおよび−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。
【００５１】
「複素環」とは、飽和、不飽和または芳香族であり、かつ、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１または２個のヘテロ原子（その窒素および硫黄ヘテロ原子は、必要に応じて酸化され得、窒素ヘテロ原子は、必要に応じて四級化され得る）を含む５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式環のことを意味し、それには、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に融合された二環式の環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。複素環には、以下で定義されるようなヘテロアリールが含まれる。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
【００５２】
用語「必要に応じて置換されるアルキル」、「必要に応じて置換されるアルケニル」、「必要に応じて置換されるアルキニル」、「必要に応じて置換されるアシル」および「必要に応じて置換される複素環」とは、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が、ある置換基で置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置き換えられる。この点において、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、ここで、ｎは、０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じであるか、または異なり、そして独立して、水素、アルキルまたは複素環であり、そして前記アルキル置換基および複素環置換基の各々は、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つ以上でさらに置換され得る。
【００５３】
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードのことを意味する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法論は、当業者に周知である（例えば、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ
ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ら、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，１９９９を参照のこと）。簡潔には、本発明の文脈内の保護基は、官能基の望まれない反応性を減少させるか、または排除する任意の基である。保護基は、官能基に付加されることにより、ある特定の反応中における反応性を遮蔽し、次いで、除去されることにより、もとの官能基が現れ得る。いくつかの実施形態において、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望まれない反応性を減少させるか、または排除する任意の基である。保護基は、当該分野で周知の手法を用いて、付加および除去され得る。
【００５５】
本発明の化合物は、実施例においてより詳細に説明される方法を含む公知の有機合成手法によって調製され得る。通常、上記の構造（Ｉ）の化合物は、以下の反応スキーム１または２によって生成され得、ここで、別段示されない限り、すべての置換基は、上で定義されたとおりである。
【００５６】
構造（Ｉ）の化合物（ｍは１であり、ｐは０である）は、反応スキーム１に従って調製され得る。ケトン１およびグリニャール試薬２（Ｐは、トリチルなどのアルコール保護基である）は、購入され得るか、または当業者に公知の方法に従って調製され得る。１と２との反応によって、アルコール３が得られる。例えば弱酸（ｍｉｌｄ  ａｃｉｄ）での処理による、３の脱保護の後、適切な臭素化試薬、例えば、三臭化リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｔｒｉｂｒｏｍｉｄｅ）を用いる臭素化によって、それぞれ４および５が得られる。臭化物５を６で処理することによって、複素環式化合物７が得られる。次いで、７をアミン８で処理することによって、ｍが１であり、Ｒ５が存在しない、構造（Ｉ）の化合物が得られる（９）。さらに９を塩化物１０で処理することによって、ｍが１であり、Ｒ５が存在する、構造（Ｉ）化合物が得られる。
【００５７】
１．反応スキーム１
【００５８】
【化１０】
2014132014.tif 000015
ｍおよびｐが０である構造（Ｉ）の化合物は、反応スキーム２に従って調製され得る。ケトン１および臭化物６は、購入され得るか、または当業者に公知の方法に従って調製され得る。１と６との反応によって、複素環１２が得られる。１２をアミン８で処理することによって、ｍが０であり、Ｒ５が存在しない、構造（Ｉ）の化合物が得られる（１３）。１３を１０でさらに処理することにより、ｗが０であり、Ｒ５が存在する、構造（Ｉ）の化合物が生成される。
【００５９】
２．反応スキーム２
【００６０】
【化１１】
2014132014.tif 000016
ｍおよびｐが１であり、ｎが０である、ある特定の実施形態において、本発明の化合物は、反応スキーム３に従って調製され得る。化合物１２および１３は、購入され得るか、または当業者に公知の方法に従って調製され得る。１２と１３との反応によって、Ｒ５が存在しない構造（Ｉ）の化合物が得られる（１４）。Ｒ５が存在する他の実施形態において、１３を、１０で処理することにより、構造１５の化合物を得ることができる。
【００６１】
３．反応スキーム３
【００６２】
【化１２】
2014132014.tif 000017
ｍまたはｐが１であり、ｎが０である、ある特定の他の実施形態において、本発明の化合物は、反応スキーム４に従って調製され得る。化合物１６は、購入され得るか、または当業者に公知の方法に従って調製され得、そして１３と反応することにより、Ｒ５が存在しない構造（Ｉ）の化合物が得られる（１７）。Ｒ５が存在する構造（Ｉ）の他の実施形態は、１７を１０で処理することによって調製されることにより、構造１８の化合物を得ることができる。
【００６３】
４．反応スキーム４
【００６４】
【化１３】
2014132014.tif 000018
ｎが１であり、ｍおよびｐが０である、構造（Ｉ）のある特定の実施形態において、本発明の化合物は、反応スキーム５に従って調製され得る。化合物１９は、購入され得るか、または当業者に公知の方法に従って調製され得る。１９をホルムアルデヒドと反応させた後、任意のアルコール保護基（Ｐ）を除去することによって、アルコール２０が得られる。２０を臭素化した後、アミン８で処理することによって、２２が得られる。次いで、化合物２２をｎ−ブチルリチウムおよびＲ１Ｉで処理した後、ｎ−ブチルリチウムおよびＲ２Ｉでさらに処理することにより、Ｒ５が存在しない構造（Ｉ）の化合物を得ることができる（２３）。２３を１０でさらに処理することによって、Ｒ５が存在する構造（Ｉ）の化合物が得られる（２４）。
【００６５】
５．反応スキーム５
【００６６】
【化１４】
2014132014.tif 000019
特定の実施形態において、本発明のアミノ脂質は、陽イオン性脂質である。本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ脂質」は、１または２つの脂肪酸または脂肪アルキル鎖、およびプロトン化されることにより生理学的ｐＨにおいて陽イオン性脂質を形成し得るアミノ頭部基（アルキルアミノまたはジアルキルアミノ基を含む）を有する脂質を含むと意味される。
【００６７】
他のアミノ脂質は、代替の脂肪酸基および他のジアルキルアミノ基（アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−など）を含む）を有するアミノ脂質を含み得る。Ｒ１１およびＲ１２の両方が長鎖アルキル基またはアシル基である実施形態の場合、それらは、同じであり得るか、または異なり得る。一般に、特に、濾過滅菌のために複合体を約０．３ミクロン未満のサイズに揃えなければならないとき、より飽和の少ないアシル鎖を有するアミノ脂質のほうが、より容易にサイズが揃えられる。Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する不飽和脂肪酸を含むアミノ脂質が、好ましい。他の骨格を使用することによっても、アミノ脂質のアミノ基と、脂肪酸部分または脂肪アルキル部分とを引き離すことができる。適当な骨格は、当業者に公知である。
【００６８】
ある特定の実施形態において、本発明のアミノ脂質または陽イオン性脂質は、少なくとも１つのプロトン化可能な基または脱プロトン化可能な基を有し、その脂質は、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のあるｐＨにおいて、正に帯電し、そして第２のｐＨにおいて、好ましくは生理学的ｐＨ以上において中性である。当然のことながら、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は、平衡過程であり、および帯電している脂質または中性の脂質に対する言及は、優勢な種の性質のことを指し、その脂質のすべてが帯電しているか、または中性の形態で存在する必要はないことが理解される。２つ以上のプロトン化可能もしくは脱プロトン化可能な基を有するか、または双性イオン性である脂質は、本発明における使用から排除されない。
【００６９】
ある特定の実施形態において、本発明に記載のプロトン化可能な脂質は、約４〜約１１の範囲の、プロトン化可能な基のｐＫａを有する。これらの脂質が、より低ｐＨの製剤化段階において陽イオン性であるので、最も好ましいのは、約４〜約７のｐＫａであるが、粒子は、およそｐＨ７．４の生理学的ｐＨにおいて、大部分は（完全ではないが）表面中和される。このｐＫａの利点の１つは、粒子の外表面と会合された少なくともいくらかの核酸が、生理学的ｐＨにおいてその静電相互作用を失い、単純透析によって除去され；ゆえに、クリアランスに対する粒子の感受性を大きく減少させる点である。
【００７０】
Ｂ．脂質粒子
本発明は、上に記載したアミノ脂質のうちの１つ以上を含む脂質粒子も提供する。脂質粒子としては、リポソームが挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用されるとき、リポソームは、水性内部を囲い込む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、１つ以上の脂質膜を有し得る。本発明は、単層と称される単層状リポソームと、多層と称される多層状のリポソームの両方を企図する。脂質粒子は、核酸と複合体形成されるとき、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎに記載されているようにＤＮＡ層の間に挟まれた陽イオン性脂質二重層から構成されるリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ）でもあり得る。
【００７１】
本発明の脂質粒子は、１つ以上の追加の脂質および／またはコレステロールなどの他の成分をさらに含み得る。他の脂質は、種々の目的のために（例えば、脂質の酸化を防止するため、またはリポソーム表面上にリガンドを接着させるために）本発明のリポソーム組成物に含められ得る。両親媒性、中性、陽イオン性および陰イオン性の脂質を含むいくつかの脂質のうちのいずれかが、本発明のリポソームに存在し得る。そのような脂質は、単独で、または組み合わせて、使用され得る。存在し得る追加の脂質成分の特定の例は、以下に記載される。
【００７２】
本発明の脂質粒子に存在し得る追加の成分としては、ポリアミドオリゴマーなどの二重層安定化成分（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号を参照のこと）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体（例えば、ホスファチジルエタノールアミンに結合されたＰＥＧおよびセラミドに結合体化されたＰＥＧ（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと））が挙げられる。
【００７３】
特定の実施形態において、脂質粒子は、第２のアミノ脂質または陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、および形成中に脂質粒子の凝集を減少させるために選択される脂質のうちの１つ以上を含み、その凝集の減少は、形成中の電荷誘導性の凝集を防止する粒子の立体的安定化に起因するものであり得る。
【００７４】
形成中の粒子の凝集を減少させる脂質の例としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１およびポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）（米国特許第６，３２０，０１７号に記載されている）が挙げられる。ＰＥＧ、Ｇｍ１またはＡＴＴＡのような製剤化中の凝集を防止する、無電荷で親水性で立体障害性の部分を有する他の化合物も、本発明の方法および組成物におけるように使用するために脂質に結合され得る。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ−脂質結合体は、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号および同第５，８８５，６１３号に記載されている。代表的には、凝集を減少させるために選択される脂質成分の濃度は、約１〜１５％（脂質のモルパーセント基準）である。
【００７５】
本発明において有用なＰＥＧ修飾脂質（または脂質−ポリオキシエチレン結合体）の特定の例は、ＰＥＧ部分を脂質ベシクルの表面に固定する種々の「アンカー」脂質部分を有し得る。適当なＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、本明細書中で参考として援用される同時係属中のＵＳＳＮ０８／４８６，２１４に記載されているＰＥＧ−セラミド結合体（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。特に好ましいのは、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールである。
【００７６】
特定の実施形態において、ＰＥＧ−脂質は、以下：
【００７７】
【化１５】
2014132014.tif 000020
から選択される。
【００７８】
ＰＥＧまたはＡＴＴＡなどの立体的に大きい部分が脂質アンカーに結合体化される実施形態において、脂質アンカーの選択は、その結合体が脂質粒子と有する会合のタイプに依存する。ｍｅＰＥＧ（ｍｗ２０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）が、その粒子が循環から取り除かれるまで（おそらくおよそ数日間）リポソームと会合されたままであることは、周知である。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０などの他の結合体は、類似の滞留能力を有する。しかしながら、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清に曝露されたときに、いくつかのアッセイでは６０分未満のＴ１／２で、迅速に処方物から放される。米国特許出願ＳＮ０８／４８６，２１４において説明されているように、少なくとも３つの特徴：アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和、および立体障害頭部基のサイズが、放出の速度に影響する。これらの特徴の適当なバリエーションを有する化合物が、本発明にとって有用であり得る。いくつかの治療的な用途のために、ＰＥＧ修飾脂質が、インビボにおいて核酸−脂質粒子から迅速に失われることが好ましいことがあり、ゆえに、ＰＥＧ修飾脂質は、比較的短い脂質アンカーを有し得る。他の治療的な用途では、核酸−脂質粒子が、より長い血漿循環残存時間を示すことが好ましいことがあり、ゆえに、ＰＥＧ修飾脂質は、比較的長い脂質アンカーを有し得る。
【００７９】
適切に機能するために、凝集防止化合物が必ずしも脂質の結合体化を必要とするわけではないことに注意するべきである。溶液中の遊離ＰＥＧまたは遊離ＡＴＴＡは、凝集を防止するのに十分であり得る。粒子が製剤化後に安定である場合、ＰＥＧまたはＡＴＴＡは、被験体に投与する前に透析して除去され得る。
【００８０】
中性脂質は、脂質粒子内に存在するとき、生理学的ｐＨにおいて無電荷型または中性の双性イオン型で存在するいくつかの脂質種のうちの任意のものであり得る。そのような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリンおよびセレブロシドが挙げられる。本明細書中に記載される粒子において使用するための中性脂質の選択は、一般に、例えば、リポソームのサイズおよび血流中のリポソームの安定性を考慮することによって導かれる。好ましくは、中性脂質成分は、２つのアシル基を有する脂質（すなわち、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。様々な鎖の長さおよび飽和度の種々のアシル鎖基を有する脂質が、利用可能であるか、または周知の手法によって単離もしくは合成され得る。１つの群の実施形態において、Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含む脂質が、好ましい。別の群の実施形態では、Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有するモノまたはジ不飽和脂肪酸を有する脂質が、使用される。さらに、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖との混合物を有する脂質が、使用され得る。好ましくは、本発明において使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣまたは任意の関連するホスファチジルコリンである。本発明において有用な中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンおよびイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質からも構成され得る。
【００８１】
脂質混合物のステロール成分は、存在するとき、リポソーム、脂質ベシクルまたは脂質粒子の調製の分野において従来から使用されているステロールのいずれかであり得る。好ましいステロールは、コレステロールである。
【００８２】
ほぼ生理学的ｐＨにおいて正味の正電荷を有する他の陽イオン性脂質もまた、上で具体的に説明したものに加えて、本発明の脂質粒子に含められ得る。そのような陽イオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオルアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、陽イオン性脂質のいくつかの市販の調製物（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む））が使用され得る。特定の実施形態において、陽イオン性脂質は、アミノ脂質である。
【００８３】
本発明の脂質粒子における使用に適した陰イオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロールおよび中性脂質に結合される他の陰イオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
数多くの実施形態において、両親媒性脂質が、本発明の脂質粒子に含められる。「両親媒性脂質」とは、脂質材料の疎水性部分が疎水性相に向きつつ、親水性部分が水性相に向かっている、任意の適当な材料のことを指す。そのような化合物としては、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロールおよびβ−アシルオキシ酸などのリンを欠く他の化合物もまた使用され得る。さらに、そのような両親媒性の脂質は、トリグリセリドおよびステロールなどの他の脂質と容易に混合され得る。
【００８５】
プログラム可能な融合脂質もまた、本発明の脂質粒子に含めるのに適している。そのような脂質粒子は、細胞膜と融合する傾向が低く、所与のシグナル事象が生じるまで積載物を送達する。このことにより、生物または疾患部位への注射後、細胞との融合を開始する前に、その脂質粒子がより均等に分配されることが可能になる。そのシグナル事象は、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境の変化または時間であり得る。後者の場合、融合遅延成分または融合「覆い隠し（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」成分（例えば、ＡＴＴＡ−脂質結合体またはＰＥＧ−脂質結合体）は、単純に時間とともに脂質粒子膜から放され得る。脂質粒子が適切に身体に分配されるまでに、その脂質粒子は、融合性になるために十分な覆い隠し剤を失う。他のシグナル事象では、疾患部位または標的細胞と関連するシグナル（例えば、炎症の部位における高温）を選択することが望ましい。
【００８６】
ある特定の実施形態において、細胞型または組織に特異的な標的化部分を用いて、本発明の脂質粒子を標的化することが望ましい。種々の標的化部分（例えば、リガンド、細胞表面レセプター、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）およびモノクローナル抗体）を用いる脂質粒子の標的化は、以前に報告されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照のこと）。標的化部分は、タンパク質全体またはそのフラグメントを含み得る。標的化の機序は、一般に、標的化部分が、標的、例えば、細胞表面レセプターと相互作用するのに利用可能であるような様式においては、標的化剤が脂質粒子の表面上に位置することを必要とする。種々の異なる標的化剤および標的化方法が、当該分野において公知であり、利用可能であり、それらには、例えば、Ｓａｐｒａ，Ｐ．ａｎｄ  Ａｌｌｅｎ，ＴＭ，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４２（５）：４３９−６２（２００３）；およびＡｂｒａ，ＲＭら、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ
Ｒｅｓ．１２：１−３，（２００２）に記載されているものが含まれる。
【００８７】
標的化のためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などの親水性ポリマー鎖の表面コーティングを有する脂質粒子、すなわち、リポソームを使用することが提案されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３７：９９−１０８（１９９５）；ＤｅＦｒｅｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１８：６１０１−６１０４（１９９６）；Ｂｌｕｍｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１４９：１８０−１８４（１９９３）；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：３２１−３３４（１９９２）；米国特許第５，０１３５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：２９６−２９９（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５３：７１−７４（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９（Ｌａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｅｄｓ）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＩ（１９９５）。１つのアプローチでは、脂質粒子を標的化するための抗体などのリガンドが、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に連結される。別のアプローチでは、標的リガンドが、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位末端に結合される（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：３２１−３３４（１９９２）；Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８８：１１５−１１８（１９９６））。
【００８８】
標的化剤を結合するために標準的な方法が用いられ得る。例えば、標的化剤の結合にために活性化され得るホスファチジルエタノールアミン、または脂質誘導体化ブレオマイシンなどの誘導体化された脂肪親和性化合物が、使用され得る。抗体によって標的化されたリポソームは、例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを用いて構築され得る（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３３７−１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：２４４８−２４５１（１９９０）を参照のこと）。抗体結合体化の他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号（その教示が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。標的化部分の例としては、新生物または腫瘍に関連する抗原を含む細胞成分に特異的な他のタンパク質も挙げられ得る。標的化部分として使用されるタンパク質は、共有結合を介してリポソームに結合され得る（Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，１４９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１１−１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照のこと）。他の標的化方法としては、ビオチン−アビジン系が挙げられる。
【００８９】
１つの例示的な実施形態において、脂質粒子は、本発明のアミノ脂質と、中性脂質（アミノ脂質以外）と、ステロール（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）との混合物を含む。ある特定の実施形態において、その脂質混合物は、本発明のアミノ脂質、中性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ修飾脂質からなるか、またはそれらから本質的になる。さらに好ましい実施形態において、脂質粒子は、約２０〜７０％アミノ脂質：５〜４５％中性脂質：２０〜５５％コレステロール：０．５〜１５％ＰＥＧ修飾脂質というモル比での上記の脂質混合物からなるか、またはそれらから本質的になる。
【００９０】
特定の実施形態において、脂質粒子は、例えば、約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％ＤＳＰＣ：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなるか、またはそれらから本質的になる。特定の実施形態において、その脂質モル比は、約４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧまたはＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＡ）または３５／１５／４０／１０ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＡである。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭで置き換えられる。
【００９１】
Ｃ．治療剤−脂質粒子組成物および処方物
本発明は、本発明の脂質粒子および活性な薬剤を含む組成物を含み、ここで、その活性な薬剤は、その脂質粒子と会合されている。特定の実施形態において、活性な薬剤は、治療剤である。特定の実施形態において、活性な薬剤は、脂質粒子の水性の内部の中に被包されている。他の実施形態において、活性な薬剤は、脂質粒子の１つ以上の脂質層の中に存在する。他の実施形態において、活性な薬剤は、脂質粒子の外部または内部の脂質表面に結合されている。
【００９２】
「完全に被包された」は、本明細書中で使用されるとき、粒子内の核酸が、遊離ＤＮＡまたは遊離ＲＮＡを著しく分解し得る血清またはヌクレアーゼアッセイに曝露された後に著しく分解されないことを示す。完全に被包された系では、通常１００％の遊離核酸を分解し得る処理において、好ましくは２５％未満の粒子核酸が分解され、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の粒子核酸が分解される。あるいは、完全な被包は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイによって判定され得る。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡを定量するための超高感度の蛍光核酸染色である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）。完全に被包されたとは、その粒子が、血清安定性であること、すなわち、その粒子が、インビボ投与された際にその構成要素に迅速に分解しないことも示唆する。
【００９３】
活性な薬剤は、本明細書中で使用されるとき、細胞、組織、器官または被験体に対して所望の効果を発揮することができる任意の分子または化合物を包含する。そのような効果は、例えば、生物学的、生理学的、または美容的であり得る。活性な薬剤は、任意のタイプの分子または化合物であり得、それらとしては、例えば、核酸、ペプチドおよびポリペプチド（例えば、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体およびＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ商標抗体）を含む）、サイトカイン、成長因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面レセプターおよびそのリガンド；ホルモン；ならびに有機小分子または有機小化合物を含む小分子が挙げられる。
【００９４】
１つの実施形態において、活性な薬剤は、治療剤またはその塩もしくは誘導体である。治療剤の誘導体は、治療的に活性なそれ自体であってもよいし、さらに改変された際に活性になるプロドラッグであってもよい。したがって、１つの実施形態において、治療剤の誘導体は、未改変の薬剤と比べて、治療活性のうちのいくつか、またはすべてを保持するが、別の実施形態では、治療剤の誘導体は、治療活性を欠く。
【００９５】
様々な実施形態において、治療剤には、任意の治療的に有効な薬剤または薬物（例えば、抗炎症性化合物、抗うつ薬、刺激剤、鎮痛薬、抗生物質、受胎調節剤、解熱薬、血管拡張薬、抗血管新生薬、細胞血管作動薬（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅｎｔｓ）、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬、例えば、抗不整脈剤、血管収縮薬、ホルモンおよびステロイド）が含まれる。
【００９６】
ある特定の実施形態において、治療剤は、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、抗悪性腫瘍剤などとも称されることがあるオンコロジー薬である。本発明に従って使用され得るオンコロジー薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン（ａｌｋｅｒａｎ）、アロプリノール、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、アミホスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、ブスルファン静注、ブスルファン経口、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ゲムツズマブ−オゾガミシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア（ｈｙｄｒｅａ）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミゾール、アリトレチノイン、メゲストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ（ｍｅｓｎａ）、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテール、テモゾロミド、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６およびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用され得るオンコロジー薬の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシンアナログまたは誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼインヒビターならびにカンプトテシンである。
【００９７】
１．核酸−脂質粒子
ある特定の実施形態において、本発明の脂質粒子は、核酸と会合されることにより、核酸−脂質粒子を生じる。特定の実施形態において、核酸は、脂質粒子内に完全に被包される。本明細書中で使用されるとき、用語「核酸」は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むと意味される。最大５０ヌクレオチドを含むフラグメントが、一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、それよりも長いフラグメントは、ポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、２０〜５０ヌクレオチド長である。
【００９８】
本発明の文脈において、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖および糖間（バックボーン）結合からなるヌクレオチドモノマーまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーのことを指す。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同様に機能する天然に存在しないモノマーまたはその一部を含むポリマーまたはオリゴマーも含む。そのような修飾オリゴヌクレオチドまたは置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞の取り込みが高く、ヌクレアーゼの存在下において安定性が高いという特性を有するので、天然型よりも好ましいことが多い。
【００９９】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、この糖の５’および３’炭素においてホスフェートに共有結合したデオキシリボースと呼ばれる５−炭素糖からなり、交互の非分枝鎖ポリマーを形成する。リボオリゴヌクレオチドは、５−炭素糖がリボースである同様の繰り返し構造からなる。
【０１００】
本発明に記載の脂質−核酸粒子内に存在する核酸は、知られている任意の形態の核酸を含む。本明細書中で使用される核酸は、一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、遺伝子（調節領域および終結領域を含む）および自己複製系（例えば、ウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉剤が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡおよび三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１０１】
本発明の核酸は、通常、核酸の特定の形態に依存する様々な長さであり得る。例えば、特定の実施形態において、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００〜１００，０００ヌクレオチド残基長であり得る。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０〜１００ヌクレオチド長の範囲であり得る。様々な関連する実施形態において、一本鎖、二本鎖および三本鎖のすべてのオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、約１５〜約３０ヌクレオチド長、約２０〜約３０ヌクレオチド長の長さの範囲であり得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするか、または相補的である。「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定かつ特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解される。標的へのオリゴヌクレオチドの結合が、標的分子の正常な機能を妨害することにより、有用性またはそのオリゴヌクレオチドからの発現が失われ、そして特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的な処置の場合は生理学的条件下、またはインビトロアッセイの場合はそのアッセイが行われる条件下において、非標的配列へのそのオリゴヌクレオチドの非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在するとき、そのオリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、それが標的化しているか、またはそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比べて、１、２または３塩基の置換を含む。
【０１０３】
ＲＮＡ干渉核酸
特定の実施形態において、本発明の核酸−脂質粒子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子と会合される。ＲＮＡｉ分子を用いるＲＮＡ干渉法は、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を破壊するために使用され得る。最近５年間で、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、本質的に、開発中の次世代の標的化オリゴヌクレオチド薬物としてアンチセンスＯＤＮおよびリボザイムに取って代わった。ＳｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる細胞質の多タンパク質複合体と会合し得る通常２１〜３０ヌクレオチド長のＲＮＡ二重鎖である。ｓｉＲＮＡを搭載したＲＩＳＣは、相同なｍＲＮＡ転写物の分解を媒介するので、ｓｉＲＮＡは、高い特異性でタンパク質発現をノックダウンするように設計され得る。他のアンチセンス技術とは異なり、天然のメカニズムを介するｓｉＲＮＡ機能は、非コードＲＮＡを介して遺伝子発現を調節するように進化した。このことは、一般に、それらの活性が、アンチセンスＯＤＮまたはリボザイムよりも、インビトロおよびインビボにおいてより強力である理由であると考えられている。種々のＲＮＡｉ試薬（臨床的に関連性のある標的を標的化するｓｉＲＮＡを含む）が、例えば、ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６：４４３−４５３（２００７）に記載されているように、現在、医薬開発中である。
【０１０４】
初めて報告されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンス鎖とＲＮＡアンチセンス鎖の両方を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドだったが、現在、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスハイブリッド、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが、ＲＮＡｉを媒介することができると証明されている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ａ．Ｔ．，（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１１１−１１９）。したがって、本発明は、これらの様々なタイプの二本鎖分子のいずれかを含むＲＮＡｉ分子の使用を含む。さらに、ＲＮＡｉ分子が、種々の形態で使用され得、そして細胞に導入され得ることが理解される。したがって、本明細書中で使用されるとき、ＲＮＡｉ分子は、細胞においてＲＮＡｉ応答を誘導することができる任意およびすべての分子を包含し、それらとしては、２本の別々の鎖、すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；二本鎖領域を形成する相補的配列のヘアピンループを含むポリヌクレオチド、例えば、ｓｈＲＮＡｉ分子、および単独で、または別のポリヌクレオチドと組み合わせて、二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる１つ以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害するために使用され得る。遺伝子および核酸の発現の二本鎖ＲＮＡ媒介性の抑制は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを細胞または生物に導入することによって、本発明に従って達成され得る。ＳｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、すなわち、ＲＮＡとＤＮＡの両方、例えば、１本のＲＮＡ鎖および１本のＤＮＡ鎖を含むハイブリッド分子であり得る。ｓｉＲＮＡを細胞に直接導入することにより、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉが引き起こされ得ることが証明されている（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１））。さらに、哺乳動物細胞における抑制は、ＲＮＡレベルで生じ、そして標的化遺伝子に特異的であり、ＲＮＡ抑制とタンパク質抑制との間には強い相関があった（Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４６−９７４７（２００１））。さらに、ＨｅＬａＳ３、ＣＯＳ７、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＣＨＯ−ＫＩおよびＭＣＦ−７細胞を含む多岐にわたる細胞株が、いくらかのレベルのｓｉＲＮＡサイレンシングに感受性であることが示されている（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．ら、ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ  ９（１）：１−７、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｔ．ａｍｂｉｏｎ．ｄｏｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌにおいて入手可能（９／１／０２））。
【０１０６】
特定のポリヌクレオチドを標的化するＲＮＡｉ分子は、当該分野で公知の手順に従って容易に調製され得る。有効なｓｉＲＮＡ分子の構造上の特徴は、同定されている。Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８およびＥｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１），ＥＭＢＯ  ２０：６８７７−６８８８。したがって、当業者は、多岐にわたる様々なｓｉＲＮＡ分子が、特定の遺伝子または転写物を標的化するために使用され得ることを理解するだろう。ある特定の実施形態において、本発明に記載のｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖であり、１６〜３０または１８〜２５ヌクレオチド長（その中間の各整数を含む）である。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、０〜７ヌクレオチドの３’オーバーハングまたは０〜４ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する２１ヌクレオチド長である（すなわち、それらは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に１９ヌクレオチドの相補的領域を含む）。ある特定の実施形態において、オーバーハングは、ＵＵまたはｄＴｄＴの３’オーバーハングである。
【０１０７】
１塩基対のミスマッチでさえも、サイレンシングを減少させると示されているので、一般に、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ分子の一方の鎖に完全に相補的である。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば、２’−デオキシ−または２’−Ｏ−メチル修飾などの修飾されたバックボーン組成を有し得る。しかしながら、好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡの鎖全体が、２’デオキシまたは２’−Ｏ−修飾塩基を用いて作製されたものではない。
【０１０８】
１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡ標的部位は、ＡＡジヌクレオチド配列の出現について標的ｍＲＮＡ転写物配列をスキャンすることによって選択される。３’隣接の約１９ヌクレオチドと組み合わされた各ＡＡジヌクレオチド配列は、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位である。１つの実施形態において、調節領域に結合するタンパク質がｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得るので、ｓｉＲＮＡ標的部位は、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）または開始コドン付近（約７５塩基以内）の領域内に優先的に配置しない（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７−６８８８（２００１））。さらに、潜在的な標的部位は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍにおけるＮＣＢＩサーバー上で利用可能なＢＬＡＳＴＮ２．０．５などの適切なゲノムデータベースと比較され得、そして他のコード配列と著しく相同な潜在的標的配列が除外され得る。
【０１０９】
特定の実施形態において、短いヘアピンＲＮＡは、本発明の核酸−脂質粒子の核酸成分を構成する。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現を配列特異的に減少させることができるヘアピンＲＮＡの形態である。短いヘアピンＲＮＡは、一般に、細胞環境における分解に対してより安定であり、かつ感受性が低いので、遺伝子発現の抑制の際にｓｉＲＮＡよりも利点をもたらし得る。そのような短いヘアピンＲＮＡに媒介される遺伝子サイレンシングは、種々の正常細胞株および癌細胞株、ならびに哺乳動物細胞（マウスおよびヒトの細胞を含む）において機能することが確認されている。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８（２００２）。さらに、操作されたｓｈＲＮＡをコードする染色体遺伝子を有するトランスジェニック細胞株が、作製されている。これらの細胞は、ｓｈＲＮＡを恒常的に合成することができ、それにより、子孫細胞に受け継がれ得る持続的または構成的な遺伝子サイレンシングが促進される。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（３）：１４４３−１４４８（２００２）。
【０１１０】
ＳｈＲＮＡは、ステムループ構造を含む。ある特定の実施形態において、それらは、代表的には１９〜２９ヌクレオチド長またはその中間の任意の数の、不定のステム長を含み得る。ある特定の実施形態において、ヘアピンは、１９〜２１ヌクレオチドのステムを含むが、他の実施形態では、ヘアピンは、２７〜２９ヌクレオチドのステムを含む。ある特定の実施形態において、ループサイズは、４〜２３ヌクレオチド長であるが、ループサイズは、サイレンシング活性に著しく影響しなければ２３ヌクレオチドより長くてもよい。ＳｈＲＮＡ分子は、効力を低下させなければ、ｓｈＲＮＡのステムの２本の鎖の間にミスマッチ、例えば、Ｇ−Ｕミスマッチを含んでもよい。実際に、ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、例えば、細菌内での増殖中にヘアピンを安定化させるために、ヘアピンステムにおいて１つまたはいくつかのＧ−Ｕ対形成を含むように設計される。しかしながら、代表的には、標的ｍＲＮＡ（アンチセンス鎖）に結合するステムの部分とそのｍＲＮＡとの間の相補性が必要とされ、この領域内の１塩基対のミスマッチでさえも、サイレンシングを無効にし得る。５’および３’オーバーハングは、ｓｈＲＮＡ機能にとって重大ではないらしいので、それらは必要ではないが、存在してもよい（Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８）。
【０１１１】
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノム内のＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない、高度に保存されたクラスの小ＲＮＡ分子である。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる一本鎖の約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡ分子であり、発生、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の鍵となる制御因子として同定されている。それらは、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合することによって遺伝子発現の制御に関与すると考えられている。ＲＩＳＣは、翻訳の阻害、転写物の切断、またはその両方を介して、遺伝子発現のダウンレギュレーションを媒介する。ＲＩＳＣは、広範囲の真核生物の核における転写性のサイレンシングにも関わる。
【０１１２】
現在までに同定されているｍｉＲＮＡ配列の数は、多く、かつ増加しており、それらの例示的な例は、例えば：“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ  ＲＪ，ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ  ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；“Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１；およびｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／に見られる。
【０１１３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
１つの実施形態において、核酸は、標的ポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」は、標的化ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むと意味される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡの場合、それらは、相補的なＲＮＡ鎖に結合することによって、その翻訳を妨げる。アンチセンスＤＮＡを使用することにより、特異的で相補的な（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的化することができる。結合が生じる場合、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素のＲＮａｓｅＨによって分解され得る。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチドを含む。この用語は、所望の標的遺伝子に対して正確に相補的でないかもしれないアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、標的非特異的な活性がアンチセンスにおいて見られる場合、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途にとって最も好ましい場合に、本発明が、利用され得る。
【０１１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の標的化された有効なインヒビターであると証明されており、その結果として、それを用いることにより、標的化された遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼおよびムスカリン２型アセチルコリンレセプターの合成は、それらのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質のサイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体のＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて証明されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８  Ｊｕｎ  １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｈｍｅｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｊｕｎ  １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号および米国特許第５，６１０，２８８号）。さらに、アンチセンス構築物は、種々の異常な細胞増殖、例えば、癌を阻害すること、そしてそれを処置するために使用され得ることも報告されている（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７号および米国特許第５，７８３，６８３号）。
【０１１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製する方法は、当該分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために容易に適応され得る。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の解析、ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギーおよび相対的な安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ダイマー、ヘアピン、または宿主細胞における標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少させ得るかもしくは妨げ得る他の二次構造を相対的に形成することができないことに基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの高度に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンにおける領域またはその付近の領域、およびそのｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造解析および標的部位の選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）および／またはＢＬＡＳＴＮ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を用いて、行われ得る。
【０１１６】
リボザイム
本発明の別の実施形態によると、核酸−脂質粒子は、リボザイムと会合される。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ−タンパク質複合体である（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７  Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７  Ａｐｒ  ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、たくさんのリボザイムが、しばしばオリゴヌクレオチド基質内のいくつかのリン酸エステルのうちの１つだけを切断する高度の特異性によって、リン酸エステル転移反応を加速させる（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９８１  Ｄｅｃ；２７（３Ｐｔ２）：４８７−９６；Ｍｉｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｄｅｃ  ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ  ａｎｄ  Ｓｈｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９２  Ｍａｙ  １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、特異的な塩基対形成相互作用を介して、化学反応前に基質がリボザイムの内部のガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合する必要があることに起因している。
【０１１７】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの少なくとも６つの基本的な多様性が現在知られている。各々は、生理学的条件下においてイントランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（ゆえに、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することによって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分と近位に保持されている酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的な塩基対形成によってそれに結合し、いったん正確な部位に結合したら、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。そのような標的ＲＮＡの戦略的な切断は、コードされるタンパク質の合成を指示する能力を破壊する。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的に結合し、切断した後、その核酸がそのＲＮＡから放出されることにより、別の標的を捜し、そして繰り返し新しい標的に結合して切断し得る。
【０１１８】
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、δ肝炎ウイルス、グループＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と会合した状態）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフとして形成され得る。ハンマーヘッド型モチーフの特定の例は、Ｒｏｓｓｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  Ｓｅｐ  １１；２０（１７）：４５５９−６５に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（Ｅｕｒ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＥＰ０３６０２５７）、Ｈａｍｐｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９  Ｊｕｎ
１３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１９９０  Ｊａｎ  ２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。δ肝炎ウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ
ａｎｄ  Ｂｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２  Ｄｅｃ  １；３１（４７）：１１８４３−５２によって報告されており；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｃｅｌｌ．１９８３  Ｄｅｃ；３５（３Ｐｔ２）：８４９−５７によって報告されており；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０  Ｍａｙ  １８；６１（４）：６８５−９６；Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｏｃｔ  １；８８（１９）：８８２６−３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３  Ｍａｒ  ２３；３２（１１）：２７９５−９）によって報告されており；そしてグループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明に従って使用される酵素的核酸分子の重要な特徴は、それらが、標的遺伝子のＤＮＡ領域またはＲＮＡ領域の１つ以上に相補的である特異的な基質結合部位を有すること、およびその分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を基質結合部位内または基質結合部位周辺に有することである。したがって、リボザイム構築物は、本明細書中で述べられる特定のモチーフに限定される必要はない。
【０１１９】
任意のポリヌクレオチド配列に対して標的化されたリボザイムを作製する方法は、当該分野で公知である。リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ９４／０２５９５（各々が、明確に本明細書中で参考として援用される）に記載されているように設計され得、そして合成され得ることにより、それらに記載されているようにインビトロおよびインビボにおいて試験される。
【０１２０】
リボザイム活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更すること、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防止する修飾を有するリボザイムを化学的に合成すること（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９２／０７０６５；国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際特許出願公開番号ＷＯ９４／１３６８８を参照のこと。これらは、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分になされ得る様々な化学修飾を記載している）、細胞内でのそれらの有効性を高める修飾、およびＲＮＡ合成時間を短縮し、化学的必要性を低下させるステムＩＩ塩基の除去によって、最適化され得る。
【０１２１】
免疫賦活性オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子に会合される核酸は、免疫賦活性であり得、それらは、哺乳動物または他の患者であり得る被験体に投与されたときに免疫応答を誘導することができる免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）を含む。ＩＳＳとしては、例えば、ヘアピン二次構造（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓ．ら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６を参照のこと）またはＣｐＧモチーフ、ならびに他の公知のＩＳＳの特徴（例えば、マルチＧドメイン、ＷＯ９６／１１２６６を参照のこと）をもたらすある特定のパリンドロームが挙げられる。
【０１２２】
その免疫応答は、生得免疫応答であってもよいし、獲得免疫応答であってもよい。免疫系は、脊椎動物のより先天性の免疫系および後天性の獲得免疫系に分けられ、後者は、体液性細胞性構成要素にさらに分けられる。特定の実施形態において、免疫応答は、粘膜性であり得る。
【０１２３】
特定の実施形態において、免疫賦活性核酸は、脂質粒子と併用して投与されるときは単なる免疫賦活性であり、そして「遊離型」で投与されるときは免疫賦活性でない。本発明によると、そのようなオリゴヌクレオチドは、免疫賦活性であると考えられる。
【０１２４】
免疫賦活性核酸は、免疫応答を惹起するために、それらが、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そしてその発現を低下させる必要がないとき、配列特異的でないと考えられる。したがって、ある特定の免疫賦活性核酸は、天然に存在する遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含み得るが、それらは、なおも配列特異的でない免疫賦活性核酸と考えられ得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、免疫賦活性の核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。そのオリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていなくてもよいし、メチル化されていてもよい。別の実施形態では、免疫賦活性核酸は、メチル化されたシトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、その核酸は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、前記ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンは、メチル化されている。特定の実施形態において、その核酸は、配列５’ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ３’（配列番号２）を含む。代替の実施形態では、その核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、そのＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１つのシトシンは、メチル化されている。さらなる実施形態において、その配列内に存在するＣｐＧジヌクレオチド中の各シトシンは、メチル化されている。別の実施形態では、その核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここで、前記ＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、メチル化されたシトシンを含む。
【０１２６】
１つの特定の実施形態において、その核酸は、配列５’ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ３’（配列番号３３）を含む。別の特定の実施形態において、その核酸配列は、配列５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ３’（配列番号３１）を含み、ここで、太字で示されている２つのシトシンは、メチル化されている。特定の実施形態において、ＯＤＮは、以下に示されるようなＯＤＮ＃１、ＯＤＮ＃２、ＯＤＮ＃３、ＯＤＮ＃４、ＯＤＮ＃５、ＯＤＮ＃６、ＯＤＮ＃７、ＯＤＮ＃８およびＯＤＮ＃９からなるＯＤＮの群から選択される。
【０１２７】
【表１−１】
2014132014.tif 000021
【０１２８】
【表１−２】
2014132014.tif 000022
【０１２９】
【表１−３】
2014132014.tif 000023
【０１３０】
【表１−４】
2014132014.tif 000024
本発明の組成物および方法において使用するために適したオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の追加の特定の核酸配列は、米国特許出願６０／３７９，３４３、米国特許出願番号０９／６４９，５２７、国際公開ＷＯ０２／０６９３６９、国際公開番号ＷＯ０１／１５７２６、米国特許第６，４０６，７０５号およびＲａｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９８：１１８５−１１９２（２００１）に記載されている。ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法において使用されるＯＤＮは、ＣｐＧモチーフ内にホスホジエステル（「ＰＯ」）バックボーンもしくはホスホロチオエート（「ＰＳ」）バックボーンおよび／または少なくとも１つのメチル化されたシトシン残基を有する。
【０１３１】
核酸修飾
１９９０年代において、ＤＮＡベースのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）およびリボザイム（ＲＮＡ）が、薬物のデザインおよび開発に対して興奮させる新しいパラダイムをもたらしたが、それらのインビボでの適用は、エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼ活性ならびに首尾よい細胞内送達の喪失によって妨害された。この分解の問題は、オリゴヌクレオチド（オリゴ）薬物がヌクレアーゼ酵素によって認識されるのを妨害するがそれらの作用機序を阻害しない化学修飾に対する大規模な研究の後、効果的に克服された。この研究は、現在開発過程のアンチセンスＯＤＮ薬物が、未修飾分子における数分間に対して、インビボにおいて数日間インタクトなままであるほど、成功した（Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．２００３．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０：１６２８−４４）。しかしながら、細胞内送達および作用機序の問題は、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムが臨床的な製品になることを非常に限定している。
【０１３２】
ＲＮＡ二重鎖は、本質的に、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡよりもヌクレアーゼに対して安定性であり、そしてアンチセンスＯＤＮとは異なり、未修飾ｓｉＲＮＡは、いったん細胞質に到達すると良好な活性を示す。たとえそうであっても、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムを安定化させるために開発された化学修飾は、ｓｉＲＮＡに意図的に適用されることにより、どれくらいの化学修飾が耐性を示し得るか、薬物動態学的および薬力学的な活性が高められ得るか否かも判定される。ｓｉＲＮＡ二重鎖によるＲＮＡ干渉には、異なる機能を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖が必要である。その両方が、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの侵入を可能にするために必要であるが、いったん負荷されると、２本の鎖は分離し、そしてセンス鎖は分解されるのに対し、アンチセンス鎖は残留することにより、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡに導く。ＲＩＳＣへの侵入は、標的ｍＲＮＡの認識および切断よりも構造的に厳格性の低いプロセスである。その結果として、センス鎖の多くの異なる化学修飾が可能であるが、限られた変更だけがアンチセンス鎖によって許容される（Ｚｈａｎｇら、２００６）。
【０１３３】
当該分野で公知のとおり、ヌクレオシドは、塩基と糖の組み合わせである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、その糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合され得る。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合することにより、線状の重合体化合物を形成する。そして、この線状の重合体構造のそれぞれの末端がさらに結合されることにより、環状構造が形成され得る。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合またはバックボーンは、３’−５’ホスホジエステル結合である。
【０１３４】
本発明に記載の脂質−核酸粒子において使用される核酸は、公知である任意の形態の核酸を含む。したがって、その核酸は、ヌクレアーゼ耐性および血清安定性を高めるために以前に使用されたタイプの修飾された核酸であり得る。驚いたことに、しかしながら、許容可能な治療的な生成物は、天然の核酸ポリマーのホスホジエステル結合に対する修飾を有しない核酸から脂質−核酸粒子を製剤化する本発明の方法を用いても調製され得、そして未修飾のホスホジエステル核酸（すなわち、すべての結合がホスホジエステル結合である核酸）を使用することが、本発明の好ましい実施形態である。
【０１３５】
ａ．バックボーン修飾
本発明において有用なアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび他のオリゴヌクレオチドとしては、修飾されたバックボーンまたは非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。修飾されたバックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーン内にリン原子を保持するオリゴヌクレオチドおよびバックボーン内にリン原子を有しないオリゴヌクレオチドを含む。ヌクレオシド間バックボーン内にリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと考えられ得る。修飾されたオリゴヌクレオチドバックボーンとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ−エステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホロセレネート、メチルホスホネートまたはＯ−アルキルホスホトリエステル結合、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、および反転した極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接する対では、３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’とが結合する）が挙げられる。本発明に記載の核酸内に存在し得る特定の修飾の特定の非限定的な例を表２に示す。
【０１３６】
様々な塩、混合塩および遊離酸型もまた含まれる。上記結合の生成を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
ある特定の実施形態において、その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合の混合、または１つ以上の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合によって形成されるバックボーンを有する。これらとしては、例えば、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；ならびに混成されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他のものが挙げられる。上記のオリゴヌクレオシドを記載している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
ホスホロチオエートバックボーン修飾（表２，＃１）（ホスホジエステル結合内の非架橋酸素が硫黄で置換されている）は、ヌクレアーゼ分解に対して核酸薬物を安定化させるために配備された最も古く最も一般的な手段の１つである。通常、ＰＳ修飾は、活性に対して大きく影響せずに、両方のｓｉＲＮＡ鎖に対して広範になされ得るらしい（Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８−４４，２００３）。しかしながら、ＰＳオリゴは、熱心にタンパク質と非特異的に会合すると知られており、その結果、特にｉ．ｖ．投与の際に毒性が生じる。ゆえに、ＰＳ修飾は、通常、３’および５’末端における１つまたは２つの塩基に制限される。ボラノホスフェートリンカー（表２，＃２）は、ＰＳよりも明らかに安定性であり、ｓｉＲＮＡ活性を高め、そして低毒性を有する、最近の修飾である（Ｈａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：５９９１−６０００，２００４）。
【０１３９】
【表２−１】
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【０１４０】
【表２−２】
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【０１４１】
【表２−３】
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【０１４２】
【表２−４】
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他の有用な核酸誘導体としては、架橋酸素原子（リン酸エステル結合を形成するもの）が−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＨ２−などで置換されている核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態において、使用されるアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸への変更は、核酸と会合される負電荷に完全に影響を及ぼさないだろう。したがって、本発明は、結合の部分が、例えば、中性のメチルホスホネートまたはホスホルアミデート結合で置換されている、アンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび他の核酸の使用を企図する。中性の結合が使用されるとき、ある特定の実施形態において、８０％未満の核酸結合が、そのように置換されるか、または５０％未満の結合がそのように置換される。
【０１４３】
ｂ．塩基修飾
塩基修飾は、バックボーンおよび糖に対する修飾よりも一般的ではない。０．３−６に示される修飾のすべてが、ヌクレアーゼに対してｓｉＲＮＡを安定化させ、そして活性に対してほとんど影響を有しないらしい（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｄｕ，Ｑ．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．２００６．ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６：８９３−９００）。
【０１４４】
したがって、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該分野では単に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用されるとき、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基としては、他の合成および天然の核酸塩基（例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃまたはｍ５ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。
【０１４５】
ある特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物（５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）を含む）の結合親和性を増加させるために特に有用である。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させると示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐａｇｅｓ  ２７６−２７８）。これらは、特定の実施形態において、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされ得る。これらの修飾された核酸塩基ならびに他の修飾された核酸塩基のある特定のものの生成を教示する米国特許としては、上で述べた米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
ｃ．糖修飾
糖基におけるほとんどの修飾は、化学的に反応性の便利な部位を提供する、ＲＮＡ糖環の２’−ＯＨにおいて生じる。Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．２００４．ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８：５７０−９；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｄｕ，Ｑ．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．２００６．ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６：８９３−９００）。２’−Ｆおよび２’−ＯＭＥ（０．７および８）が、一般的であり、その両方が、安定性を高め、２’−ＯＭＥ修飾は、１本の鎖あたり４ヌクレオチド未満に制限される限り、活性を低下させない（Ｈｏｌｅｎ，Ｔ．，Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，Ｍ．，Ｂａｂａｉｅ，Ｅ．，Ｐｒｙｄｚ，Ｈ．２００３。一本鎖および二本鎖ｓｉＲＮＡの同様の挙動は、それらが共通のＲＮＡｉ経路を介して作用することを示唆する。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：２４０１−７）。修飾塩基がその分子の中央領域に限定されるとき、２’−Ｏ−ＭＯＥ（０．９）は、ｓｉＲＮＡにおいて最も有効である（Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ａｌｌｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｄａｎｄｅ，Ｐ．，Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｔ．Ａ．，Ｓｉｏｕｆｉ，Ｎ．，Ｊａｒｒｅｓ，Ｒ．，Ｂａｋｅｒ，Ｂ．Ｆ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．，Ｇｒｉｆｆｅｙ，Ｒ．Ｈ．，Ｂｈａｔ，Ｂ．２００５．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：４２４７−５３）。活性を失わせることなくｓｉＲＮＡを安定化させると見出されている他の修飾を、０．１０−１４に示す。
【０１４７】
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の置換された糖部分も含み得る。例えば、本発明は、以下のもののうちの１つを２’位に含むオリゴヌクレオチドを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニルまたはＯ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル（ここで、そのアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ｎおよびｍは１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のもののうちの１つを２’位に含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基。１つの修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の修飾としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）が挙げられる。
【０１４８】
追加の修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合されたオリゴヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても行われ得る。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物も有し得る。そのような修飾された糖構造の生成を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
他のオリゴヌクレオチド模倣物において、糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位のバックボーンは、新規の基で置換されるが、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンは、アミド含有バックボーン、特に、アミノエチルグリシンバックボーンで置換される。その核酸塩基は、保持され、そのバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の生成を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００）に見られる。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドならびにヘテロ原子バックボーン、特に、上で参照された米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンと称される）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、天然のホスホジエステルバックボーンは、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−と表現される）および上で参照された米国特許第５，６０２，２４０号アミドバックボーンを有するオリゴヌクレオシドである。上で参照された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【０１５１】
ｄ．キメラオリゴヌクレオチド
所与の化合物におけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、上述の修飾のうちの２つ以上が、１つの化合物、またはオリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドにさえ組み込まれ得る。本発明のある特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は、本発明の文脈において、２つ以上の化学的に異なる領域（各々が、少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている）を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的には、１つ以上の有益な特性（例えば、高いヌクレアーゼ耐性、細胞への多くの取り込み、ＲＮＡ標的に対する高い結合親和性）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域、およびＲＮａｓｅＨ切断に対する基質である領域を含む。
【０１５２】
１つの実施形態において、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増加させるために修飾された少なくとも１つの領域を含む。標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチド／標的対のＴｍ（オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度であり；解離は、分光光度的に検出される）を測定することによって通例の通りに判定される。Ｔｍが高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が高い。１つの実施形態において、標的ｍＲＮＡ結合親和性を増加させるために修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位において修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。そのような修飾は、オリゴヌクレオチドに通例の通りに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有すると示されている。そのような高い親和性の影響は、標的遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害を非常に高めることになる。
【０１５３】
別の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅＨに対する基質として作用する領域を含む。当然のことながら、オリゴヌクレオチドが、本明細書中に記載される様々な修飾の任意の組み合わせを含み得ることが理解される。
【０１５４】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞取り込みを高める、１つ以上の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに化学的に結合することを含む。そのような結合体およびそれを調製する方法は、当該分野で公知である。
【０１５５】
治療的有効性などのインビボでの有用性について、合理的な経験則は、チオ化された（ｔｈｉｏａｔｅｄ）バージョンの配列が遊離型で働く場合、同じ配列の任意の化学の被包された粒子も有効であるということを当業者は理解するだろう。被包された粒子は、アンチセンス治療に対して別段応答性であると知られていない状態およびモデルにおいて有効性を示す、より広範囲のインビボ有用性も有し得る。本発明を適用することにより、現在アンチセンス治療に対して応答する古いモデルを見出し得ることを当業者は承知している。さらに、当業者らは、本発明を使用することによって、見捨てられたアンチセンス配列または化学を再考し得、そして有効性を見出し得る。
【０１５６】
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の手法によって便利に、かつ通例の通りに、作製され得る。そのような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかのベンダーによって販売されている。そのような合成のための他の任意の手段も使用され得る；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に、業務従事者の能力の範囲内である。ホスホロチオエートおよびアルキル化された誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の手法を使用することも周知である。
【０１５７】
核酸−脂質粒子の特徴
ある特定の実施形態において、本発明は、脂質に被包された核酸粒子を生成するための方法および組成物に関し、ここで、核酸が、脂質層内に被包される。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み込んでいるそのような核酸−脂質粒子は：（１）薬物と脂質との比；（２）被包効率；および（３）粒径をはじめとした種々の生物物理学的パラメータを用いて特徴付けられる。高い薬物と脂質との比、高い被包効率、良好なヌクレアーゼ耐性および血清安定性、ならびに調節可能な粒径（一般に２００ｎｍ未満の直径）が望ましい。さらに、ヌクレアーゼ耐性を与えるための核酸の修飾が、治療薬のコストに加えられるが、多くの場合において単に限られた耐性を提供するだけであるので、核酸ポリマーの性質が、重要である。別段述べられない限り、これらの基準は、以下のとおり本明細書中で計算される：
薬物と脂質との比は、規定された体積の調製物中の核酸の量を、同じ体積中の脂質の量で除算したものである。これは、モルあたりのモル基準または重量あたりの重量基準またはモルあたりの重量基準に基づき得る。最終的な投与の準備のできた処方物の場合、透析、クロマトグラフィおよび／または酵素（例えば、ヌクレアーゼ）消化を用いることにより、できるだけ多くの外部核酸を除去した後に核酸：脂質比を計算する；
被包効率とは、出発混合物の薬物と脂質との比を、最終的な投与に適格な処方物の薬物と脂質との比で除算したもののことを指す。これは、相対的な効率の尺度である。絶対的な効率の尺度のために、投与に適格な処方物に最終的になる、出発混合物に加えられた核酸の総量もまた計算され得る。製剤化のプロセス中に失われる脂質の量もまた計算され得る。効率は、処方物の消耗量（ｗａｓｔａｇｅ）および実質量（ｅｘｐｅｎｓｅ）の尺度であり；そして
サイズは、形成される粒子のサイズ（直径）を示す。サイズ分布は、Ｎｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ３７０サブミクロン粒子寸法測定器において準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を用いて測定され得る。２００ｎｍ未満の粒子が、新生物および炎症部位などの新生血管形成された（漏出性）組織への分配のために好ましい。
【０１５８】
薬学的組成物
特に治療剤と会合されているときの、本発明の脂質粒子は、例えば、投与経路および標準的な薬務に従って選択される、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリア（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）をさらに含む薬学的組成物として製剤化され得る。
【０１５９】
特定の実施形態において、本発明の脂質−核酸粒子を含む薬学的組成物は、標準的な手法に従って調製され、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む。一般に、通常の食塩水が、薬学的に許容可能なキャリアとして使用される。他の適当なキャリアとしては、例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシンなど（安定性を高めるための糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を含む）が挙げられる。食塩水または他の塩含有キャリアを含む組成物において、キャリアは、好ましくは、脂質粒子形成後に加えられる。したがって、脂質−核酸組成物が形成された後に、その組成物が、通常の食塩水などの薬学的に許容可能なキャリアに希釈され得る。
【０１６０】
得られる薬学的調製物は、従来の周知の滅菌手法によって滅菌され得る。次いで、水溶液は、使用にむけて包装され得るか、または無菌条件下で濾過され、凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水溶液と組み合わされる。本組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて薬学的に許容可能な補助剤物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含み得る。さらに、脂質懸濁液は、保存時のフリーラジカルおよび脂質過酸化傷害に対して脂質を保護する脂質保護剤を含み得る。脂肪親和性フリーラジカルクエンチャー（例えば、α−トコフェロールおよびフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレート剤）が適当である。
【０１６１】
薬学的処方物中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は、大きく変動し得、すなわち、約０．０１％未満、通常、約０．０５〜５％または少なくとも約０．０５〜５％から、ほぼ１０〜３０重量％に変動し得、そしてその濃度は、選択される特定の投与様式に従って、主に液量、粘性などによって選択される。例えば、処置に関連する体積負荷を低下させるためにその濃度を上昇させてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症関連のうっ血性心不全または重篤な高血圧症を有する患者において特に望ましいことがある。あるいは、刺激性の脂質から構成される複合体を希釈して、濃度を低下させることにより、投与部位における炎症が和らげられ得る。１つの群の実施形態において、核酸は、付着された標識を有し、そして診断のために使用され得る（相補的な核酸の存在を示すことによって）。この例において、投与される複合体の量は、使用される特定の標識、診断される疾患状態、および臨床医の判断に依存するが、一般に、約０．０１〜約５０ｍｇ／キログラム体重、好ましくは、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１６２】
上で述べたように、本発明の脂質−治療剤（例えば、核酸）粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたリン脂質、ＰＥＧ−セラミドもしくはガングリオシドＧＭ１で修飾された脂質、または凝集を防止するかもしくは限定するのに有効な他の脂質を含み得る。そのような成分の添加は、単に複合体の凝集を防止するだけではない。むしろ、それは、循環中の残存時間を延長するため、および標的組織への脂質−核酸組成物の送達を増加させるための手段も提供し得る。
【０１６３】
本発明は、キットの形態でも脂質−治療剤組成物を提供する。キットは、代表的には、そのキットの様々なエレメントを保持するために区画化された容器を備える。キットは、本発明の粒子または薬学的組成物を好ましくは脱水された形態または濃縮された形態で、その再水和または希釈および投与についての指示書とともに含む。ある特定の実施形態において、粒子は、活性な薬剤を含むが、他の実施形態では、含まない。
【０１６４】
Ｄ．製造方法
本発明の方法および組成物は、ある特定の陽イオン性脂質を利用し、その脂質の合成、調製および特徴づけは、以下および添付の実施例において説明される。さらに、本発明は、脂質粒子（治療剤、例えば、核酸と会合された脂質粒子を含む）を調製する方法を提供する。本明細書中に記載される方法において、脂質の混合物は、核酸の緩衝水溶液と混合されることにより、脂質粒子内に被包された核酸を含む中間体混合物が生成され、ここで、その被包された核酸は、約３ｗｔ％〜約２５ｗｔ％、好ましくは５〜１５ｗｔ％という核酸／脂質比で存在する。その中間体混合物は、脂質で被包された核酸粒子を得るために、必要に応じて大きさが揃えられ得、ここで、その脂質部分は、好ましくは３０〜１５０ｎｍの直径、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単層ベシクルである。次いで、ｐＨを上げることにより、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、ゆえに、少なくとも部分的に表面が中和された脂質で被包された核酸組成物が提供される。
【０１６５】
上に記載したように、これらの陽イオン性脂質のいくつかは、アミノ基のｐＫａ未満のｐＨにおいて帯電しており、ｐＫａより高いｐＨにおいて実質的に中性である、アミノ脂質である。これらの陽イオン性脂質は、滴定可能な陽イオン性脂質と呼ばれ、２工程プロセスを用いて本発明の処方物において使用され得る。第１に、核酸の存在下において、滴定可能な陽イオン性脂質および他のベシクル成分を用いて、低ｐＨにおいて脂質ベシクルを形成し得る。この様式において、ベシクルが、核酸を被包し、捕捉する。第２に、媒質のｐＨを、存在する滴定可能な陽イオン性脂質のｐＫａより高いレベルに、すなわち、生理学的ｐＨまたはそれ以上に上昇させることによって、新しく形成されたベシクルの表面電荷を中和し得る。このプロセスの特に有益な局面は、任意の表面に吸着された核酸の容易な除去と、中性の表面を有する結果として生じる核酸送達ビヒクルとの両方を含む。中性の表面を有するリポソームまたは脂質粒子が、循環からの迅速なクリアランスを妨害し、そして陽イオン性リポソーム調製物に関連するある特定の毒性を回避すると予想される。核酸−脂質粒子の製剤化におけるそのような滴定可能な陽イオン性脂質のこれらの使用に関する追加の詳細は、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号（本明細書中で参考として援用される）に提供されている。
【０１６６】
この様式で形成されたベシクルは、高含有量の核酸を有する一様なベシクルサイズの処方物を提供することがさらに述べられる。さらに、それらのベシクルは、約３０〜約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０〜約９０ｎｍのサイズ範囲を有する。
【０１６７】
いかなる特定の理論にも拘束されるつもりはないが、核酸被包の非常に高い効率は、低ｐＨにおける静電相互作用の結果であると考えられる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）において、ベシクル表面は、帯電しており、静電相互作用を介して核酸の一部に結合する。外部の酸性緩衝液が、より中性の緩衝液（例えば、ｐＨ７．５）に交換されるとき、脂質粒子またはリポソームの表面が中和され、任意の外部の核酸の除去が可能になる。製剤化プロセスに対するより詳細な情報は、様々な刊行物（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号）に提供されている。
【０１６８】
上記のことを考慮して、本発明は、脂質／核酸処方物を調製する方法を提供する。本明細書中に記載される方法において、脂質の混合物は、核酸の緩衝水溶液と混合されることにより、例えば脂質粒子内に被包された核酸を含む中間体混合物が生成され、ここで、その被包された核酸は、約１０ｗｔ％〜約２０ｗｔ％という核酸／脂質比で存在する。その中間体混合物は、脂質で被包された核酸粒子を得るために、必要に応じて大きさが揃えられ得、ここで、その脂質部分は、好ましくは３０〜１５０ｎｍの直径、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単層ベシクルである。次いで、ｐＨを上げることにより、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、ゆえに、少なくとも部分的に表面が中和された脂質で被包された核酸組成物が提供される。
【０１６９】
ある特定の実施形態において、脂質の混合物は、少なくとも２つの脂質成分：その脂質が、ｐＫａより低いｐＨにおいて陽イオン性であり、ｐＫａより高いｐＨにおいて中性であるようなｐＫａを有する脂質から選択される本発明の第１アミノ脂質成分、および脂質−核酸粒子形成中の粒子凝集を防止する脂質から選択される第２脂質成分を含む。特定の実施形態において、アミノ脂質は、本発明の新規の陽イオン性脂質である。
【０１７０】
本発明の核酸−脂質粒子を調製する際、脂質の混合物は、代表的には有機溶媒中の脂質の溶液である。次いで、この脂質の混合物は、乾燥されることにより薄膜を形成し得るか、または凍結乾燥されることにより粉末を形成し、その後水性緩衝液で水和されることにより、リポソームが形成され得る。あるいは、好ましい方法において、脂質混合物は、エタノールなどの水混和性アルコール中に可溶化され得、そしてこのエタノール性溶液を水性緩衝液に加えることにより、自発的なリポソーム形成がもたらされる。ほとんどの実施形態において、アルコールは、市販されている形態で使用される。例えば、エタノールは、無水エタノール（１００％）または９５％エタノール（残りの部分は水である）として使用され得る。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号により詳細に記載されている。
【０１７１】
１つの例示的な実施形態において、脂質の混合物は、アルコール溶媒中の、陽イオン性アミノ脂質と、中性脂質（アミノ脂質以外）と、ステロール（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）との混合物である。好ましい実施形態において、脂質混合物は、アルコール中、より好ましくはエタノール中の、陽イオン性アミノ脂質、中性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ修飾脂質から本質的になる。さらに好ましい実施形態において、第１の溶液は、約２０〜７０％アミノ脂質：５〜４５％中性脂質：２０〜５５％コレステロール：０．５〜１５％ＰＥＧ修飾脂質というモル比の上記の脂質混合物からなる。なおもさらに好ましい実施形態において、第１の溶液は、より好ましくは約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％ＤＳＰＣ：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡから本質的になる。別の群の好ましい実施形態において、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭで置き換えられる。
【０１７２】
本発明によると、脂質混合物は、核酸を含み得る緩衝水溶液と混合される。その緩衝水溶液は、代表的には、その緩衝液が脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のｐＫａ未満のｐＨを有する溶液である。適当な緩衝液の例としては、クエン酸、リン酸、酢酸およびＭＥＳが挙げられる。特に好ましい緩衝液は、クエン酸緩衝液である。好ましい緩衝液は、被包される核酸の化学に応じて１〜１０００ｍＭの陰イオンの範囲であり、緩衝液濃度の最適化は、高い負荷レベルを達成するために重要であり得る（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号を参照のこと）。あるいは、塩化物、硫酸塩などでｐＨ５〜６に酸性化された純水が、有用であり得る。この場合、５％グルコースを加えること、または粒子が、エタノールを除去するため、ｐＨを上げるために透析されるか、もしくは通常の食塩水などの薬学的に許容可能なキャリアと混合されるとき、その粒子膜を超えて浸透ポテンシャルを釣り合わせる別の非イオン性溶質を加えることが、適当であり得る。緩衝液中の核酸の量は、変動し得るが、代表的には、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬである。
【０１７３】
脂質の混合物と治療的核酸の緩衝水溶液とを混合することにより、中間体混合物が得られる。その中間体混合物は、代表的には、被包された核酸を有する脂質粒子の混合物である。さらに、その中間体混合物は、負に帯電した核酸のイオン性引力および脂質粒子表面上の正に帯電した脂質（アミノ脂質、またはプロトン化可能な第１脂質成分を構成している他の脂質は、その脂質上のプロトン化可能な基のｐＫａ未満のｐＨを有する緩衝液中で正に帯電している）に起因して、脂質粒子（リポソームまたは脂質ベシクル）の表面に付着されたいくらかの核酸も含み得る。１つの群の好ましい実施形態において、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、その溶液の各々の体積は、混合されるときに、得られるアルコール含有量が約２０体積％〜約４５体積％になるように調整される。混合物を混合する方法は、しばしば、生成される処方物の規模に応じて、種々のプロセスのいずれかを含み得る。例えば、総体積が約１０〜２０ｍＬ以下であるとき、その溶液は、試験管内で混合され得、そしてボルテックスミキサーを用いて共に撹拌され得る。大規模プロセスは、適当な生成規模のガラス製品内において行われ得る。
【０１７４】
必要に応じて、脂質混合物と治療剤（核酸）の緩衝水溶液とを混合することによって生成される、脂質に被包された治療剤（例えば、核酸）の複合体は、所望のサイズの範囲および比較的狭い分布の脂質粒径を達成するために、大きさを揃えられ得る。好ましくは、本明細書中に提供される組成物は、約７０〜約２００ｎｍ、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍの平均直径の大きさに揃えられる。所望のサイズにリポソームの大きさを揃えるために、いくつかの手法が利用可能である。大きさを揃える１つの方法は、本明細書中で参考として援用される米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。バスまたはプローブ超音波処理によってリポソーム懸濁液を超音波処理することにより、サイズが約０．０５ミクロン未満の小型の単層ベシクル（ＳＵＶ）まで、漸進的にサイズが縮小される。均質化は、大きなリポソームをより小さなリポソームに断片化する剪断エネルギーに依存する別の方法である。代表的な均質化手順では、選択されたリポソームサイズ、代表的には約０．１〜０．５ミクロンが観察されるまで、多層ベシクルを標準的なエマルジョンホモジナイザーに通して再循環する。両方の方法において、粒径分布は、従来のレーザービーム粒径測定によってモニターされ得る。本明細書中のある特定の方法の場合、押出しを用いることにより、均一なベシクルサイズが得られる。
【０１７５】
小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を介するリポソーム組成物の押出しによって、比較的明確に限定されたサイズ分布がもたらされる。代表的には、所望のリポソーム複合体のサイズ分布が達成されるまで、懸濁液を、膜を介して１回以上循環させる。そのリポソームは、連続的により小孔の膜を介して押し出されることにより、徐々に小さいサイズのリポソームが達成され得る。いくつかの場合において、形成される脂質−核酸組成物は、いかなるサイズ揃えもせずに、使用され得る。
【０１７６】
特定の実施形態において、本発明の方法は、脂質−核酸組成物の脂質部分上の表面電荷の少なくともいくらかを中和する工程をさらに包含する。表面電荷を少なくとも部分的に中和することによって、被包されていない核酸が、脂質粒子表面から解放され、そして従来の手法を用いて組成物から除去され得る。好ましくは、被包されていない核酸および表面に吸着された核酸が、緩衝溶液を交換することによって、得られる組成物から除去される。例えば、クエン酸緩衝液（ｐＨ約４．０、組成物を形成するために使用される）をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ  ｐＨ約７．５）溶液で置換することによって、リポソーム表面の中和およびその表面からの核酸の放出がもたらされる。次いで、放出された核酸は、標準的な方法を用いるクロマトグラフィを介して除去され得、次いで、使用される脂質のｐＫａより高いｐＨを有する緩衝液に切り換えられ得る。
【０１７７】
必要に応じて、脂質ベシクル（すなわち、脂質粒子）は、水性緩衝液中の水和によって形成され得、そして核酸を加える前に上に記載された方法のいずれかを用いて一定の大きさに揃えられ得る。上に記載されたように、水性緩衝液は、アミノ脂質のｐＫａよりも低いｐＨであるべきである。次いで、これらの一定の大きさに揃えられ、予め形成されたベシクルに核酸の溶液が加えられ得る。そのような「予め形成された」ベシクル内への核酸の被包を可能するために、混合物は、エタノールなどのアルコールを含むべきである。エタノールの場合、それは、約２０％（ｗ／ｗ）〜約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在するべきである。さらに、脂質ベシクルの組成および核酸の性質に応じて、水性緩衝液−エタノール混合物中の予め形成されたベシクルと核酸との混合物を約２５℃〜約５０℃の温度に温める必要があることがある。脂質ベシクル中の核酸の所望のレベルを達成するための被包プロセスの最適化は、エタノール濃度および温度などの変量の操作が必要であることは、当業者に明らかであろう。核酸の被包のための適当な条件の例は、実施例に提供される。いったん核酸が予め形成されたベシクル内に被包されたら、外部のｐＨを上げることにより、少なくとも部分的に表面電荷を中和し得る。次いで、被包されていない核酸および表面に吸着されている核酸は、上に記載されたように除去され得る。
【０１７８】
Ｅ．使用方法
本発明の脂質粒子は、インビトロまたはインビボにおいて治療剤を細胞に送達するために使用され得る。特定の実施形態において、治療剤は、本発明の核酸−脂質粒子を用いて細胞に送達される核酸である。本発明の脂質粒子および関連する薬学的組成物を使用する様々な方法の以下の説明は、核酸−脂質粒子に関する説明によって例証されるが、これらの方法および組成物が、その処置の恩恵を受け得る任意の疾患または障害を処置するための任意の治療剤を送達するために容易に適応され得ることが理解される。
【０１７９】
ある特定の実施形態において、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法を提供する。細胞に導入するための好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンスおよびリボザイムである。これらの方法は、細胞内送達が生じるのに十分な時間にわたって、本発明の粒子または組成物を細胞と接触させることによって行われ得る。
【０１８０】
本発明の組成物は、ほとんどの任意の細胞型に吸着され得る。核酸−脂質粒子は、いったん吸着されると、細胞の一部によってエンドサイトーシスによって取り込まれ得るか、脂質を細胞膜と交換し得るか、または細胞と融合し得る。その複合体の核酸部分の移入または取り込みが、これらの経路のうちのいずれかを介して生じ得る。本発明の範囲に関して限定する意図はないが、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる粒子の場合、その粒子は、次いで、エンドソーム膜と相互作用し、おそらく非二重層の相の形成によってエンドソーム膜の不安定化をもたらし、被包された核酸が細胞質に導入されると考えられる。同様に、粒子と細胞の原形質膜との直接的な融合の場合、融合が生じる際、リポソーム膜は、細胞膜に統合され、そしてリポソームの内容物が細胞内の液体と混合される。インビトロにおいて行われるとき、細胞と脂質−核酸組成物との接触は、生物学的に適合性の媒質中で生じる。組成物の濃度は、特定の用途に応じて広く変動し得るが、一般に、約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。ある特定の実施形態において、脂質−核酸組成物による細胞の処置は、一般に、生理学的温度（約３７℃）において、約１〜２４時間、好ましくは、約２〜８時間行われる。インビトロでの適用では、核酸の送達は、起源が植物であるか動物であるか、脊椎動物の細胞あるか無脊椎動物であるか、およびどの組織またはタイプであるかに関係なく、培地中で生育されている任意の細胞への送達であり得る。好ましい実施形態において、細胞は、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【０１８１】
１つの群の実施形態において、約１０３〜約１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍＬの細胞密度を有する６０〜８０％コンフルエントでプレーティングされた細胞に脂質−核酸粒子懸濁液を加える。細胞に加えられる懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬである。
【０１８２】
代表的な適用法は、ｓｉＲＮＡの細胞内送達をもたらすことにより、特定の細胞標的をノックダウンするか、またはサイレンシングするための周知の手順を用いることを含む。あるいは、適用法は、治療的に有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。この様式では、欠損しているか、または存在しない遺伝子産物を補給することによって、遺伝性疾患に対する治療が提供される（すなわち、Ｄｕｃｈｅｎｎｅジストロフィーの場合は、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４５（３）：６３０−６４３（１９８９）を参照し、嚢胞性線維症の場合はＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：１０２−１０３（１９８９）を参照すること）。本発明の組成物に対する他の用途は、細胞内へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入を含む（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４１：１０２３−１０３３（１９９２）を参照のこと）。
【０１８３】
本発明の方法は、インビトロ、エキソビボまたはインビボにおいて実施され得る。例えば、本発明の組成物は、当業者に公知の方法を用いて、インビボにおいて核酸を細胞に送達するためにも使用され得る。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を送達するための本発明の適用法に関して、本明細書中で参考として援用されるＺｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２０９−２１１（１９９３）には、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を用いたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達が記載されている。本明細書中で参考として援用されるＨｙｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５０−２５６（１９９３）には、リポソームを用いた、マウスの気道の上皮および肺の中の肺胞への嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達が記載されている。本明細書中で参考として援用されるＢｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１（１９８９）には、細胞内の酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能性原核生物遺伝子によるマウスの肺のインビボトランスフェクションが記載されている。したがって、本発明の組成物は、感染症の処置において使用され得る。
【０１８４】
インビボ投与の場合、薬学的組成物は、好ましくは、非経口的に、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内に投与される。特定の実施形態において、薬学的組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内に投与される。１つの例として、本明細書中で参考として援用されるＳｔａｄｌｅｒらの米国特許第５，２８６，６３４号を参照のこと。細胞内の核酸送達は、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１０１：５１２−５２７（１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０（１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．６：２３９−２７１（１９８９）およびＢｅｈｒ，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−２７８（１９９３）においても論じられている。脂質ベースの治療薬を投与するなおも他の方法は、例えば、Ｒａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ，米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；およびＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号に記載されている。
【０１８５】
他の方法において、薬学的調製物は、調製物を組織に直接適用することによって標的組織と接触され得る。その適用法は、局所的な「開放系（ｏｐｅｎ）」または「閉鎖系（ｃｌｏｓｅｄ）」の手技によって行われ得る。「局所的」とは、その環境（例えば、皮膚、中咽頭、外耳道など）に露出される組織への薬学的調製物の直接的な適用のことを意味する。「開放系」の手技は、患者の皮膚を切開する工程、およびその下にある、薬学的調製物が適用される組織を直接明視化する工程を包含する手技である。これは、一般に、外科的手順（例えば、肺に到達する開胸術、腹部の内臓に到達する開腹術、または標的組織に対する他の直接的な外科的アプローチ）によって達成される。「閉鎖系」の手技は、内部の標的組織を直接明視化しないが、皮膚の小さい創傷を通じて器具を挿入することによって到達する、侵襲性の手技である。例えば、調製物は、洗浄針によって腹膜に投与され得る。同様に、脊髄麻酔または脊髄のメトリザマイドイメージングのために通常行われるような、腰椎穿刺中の注入後に患者を適切な位置にすることによって、薬学的調製物が髄膜または脊髄に投与され得る。あるいは、調製物は、内視鏡デバイスを介して投与され得る。
【０１８６】
脂質−核酸組成物は、肺に吸入されるエアロゾルとして（Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．２９８（４）：２７８−２８１（１９８９）を参照のこと）または疾患部位における直接的な注射によって（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＭａｒｙＡｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４））も投与され得る。
【０１８７】
本発明の方法は、種々の被験体または宿主において実施され得る。好ましい被験体または宿主としては、哺乳動物種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなど）が挙げられる。特定の実施形態において、被験体は、疾患または障害の処置または予防の必要のあるヒトなどの哺乳動物、例えば、疾患もしくは障害と診断されている被験体、または疾患もしくは障害に対してリスクがあると考えられる被験体である。
【０１８８】
本発明の脂質−治療剤粒子に対する投薬量は、治療剤と脂質との比、ならびに患者の年齢、体重および状態に基づく投与する医師の見解に依存する。
【０１８９】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般に、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を調節することができる核酸と会合されている本発明の脂質粒子と細胞とを接触させる工程を包含する。本明細書中で使用されるとき、用語「調節する」とは、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を変化させることを指す。様々な実施形態において、調節するとは、増加させることもしくは増強することを意味し得るか、または減少させることもしくは低下させることを意味し得る。標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現のレベルを測定する方法は、当該分野において公知であり、利用可能であり、それらとしては、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用する方法および免疫組織化学的手法が挙げられる。特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現のレベルは、適切なコントロール値と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％超、上昇するか、または低下する。
【０１９０】
例えば、所望のポリペプチドの発現を増加させる場合、核酸は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであり得る。他方で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の低下が望まれる場合、核酸は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることによって標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を妨害するポリヌクレオチド配列を含む、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡであり得る。あるいは、その核酸は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドであり得る。
【０１９１】
１つの特定の実施形態において、本発明は、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法を提供し、この方法は、例えば、約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％ＤＳＰＣ：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなるか、またはそれらから本質的になる脂質粒子を細胞に提供する工程を包含し、ここで、その脂質粒子は、そのポリペプチドの発現を調節することができる核酸と会合されている。特定の実施形態において、脂質モル比は、約４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭで置き換えられる。
【０１９２】
特定の実施形態において、核酸活性薬剤または治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ここで、そのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡが、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含み、その結果、ポリペプチドの発現が減少する。
【０１９３】
他の実施形態において、核酸は、ポリペプチドまたはその機能的なバリアントもしくはフラグメントをコードするプラスミドであり、その結果、そのポリペプチドまたはその機能的なバリアントもしくはフラグメントの発現が増加する。
【０１９４】
関連する実施形態において、本発明は、被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を処置する方法を提供し、この方法は、その被験体に本発明の薬学的組成物を提供する工程を包含し、ここで、その治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ここで、そのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む。
【０１９５】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、例えば、約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％ＤＳＰＣ：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなるか、またはそれらから本質的になる脂質粒子を含み、ここで、その脂質粒子は、治療的核酸に会合されている。特定の実施形態において、脂質モル比は、約４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換えられる。
【０１９６】
別の関連する実施形態では、本発明は、被験体におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を処置する方法を含み、この方法は、その被験体に本発明の薬学的組成物を提供する工程を包含し、ここで、その治療剤は、そのポリペプチドまたはその機能的なバリアントもしくはフラグメントをコードするプラスミドである。
【０１９７】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、例えば、約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％ＤＳＰＣ：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなるか、またはそれらから本質的になる脂質粒子を含み、ここで、その脂質粒子は、治療的核酸に会合されている。特定の実施形態において、脂質モル比は、約４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換えられる。
【０１９８】
本発明は、被験体において免疫応答を誘導する方法をさらに提供し、この方法は、その被験体に本発明の薬学的組成物を提供する工程を包含し、ここで、その治療剤は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、免疫応答は、体液性免疫応答または粘膜免疫応答である。１つの実施形態において、薬学的組成物は、例えば、約２０〜６０％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ：５〜２５％ＤＳＰＣ：２５〜５５％Ｃｈｏｌ：０．５〜１５％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比で、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなるか、またはそれらから本質的になる脂質粒子を含み、ここで、その脂質粒子は、治療的核酸と会合されている。特定の実施形態において、脂質モル比は、約４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換えられる。
【０１９９】
さらなる実施形態において、薬学的組成物は、ワクチンまたは抗原と併用して被験体に提供される。したがって、本発明自体が、免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含み、また、免疫応答が望まれる抗原と会合されている、本発明の脂質粒子を含むワクチンを提供する。特定の実施形態において、その抗原は、腫瘍抗原であるか、または感染物質、例えば、ウイルス、細菌または寄生生物と会合されている。
【０２００】
種々の腫瘍抗原、感染物質抗原、および他の疾患に関連する抗原が、当該分野で周知であり、これらの例は、本明細書中で引用される参考文献に記載されている。本発明における使用に適した抗原の例としては、ポリペプチド抗原およびＤＮＡ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。抗原の特定の例は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、痘瘡、ポリオ、炭疽、インフルエンザ、チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核および風疹の抗原である。好ましい実施形態において、抗原は、Ｂ型肝炎組換え抗原である。別の局面では、抗原は、Ａ型肝炎組換え抗原である。別の局面では、抗原は、腫瘍抗原である。そのような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原およびバーキットリンパ腫に関連する抗原である。さらなる局面では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原組換え抗原である。当業者は、本発明における使用に適した他の抗原を承知しているだろう。
【０２０１】
本発明における使用に適した腫瘍関連抗原は、単一の腫瘍タイプを示唆し得、いくつかのタイプの腫瘍間で共有され得、そして／または正常細胞と比較して腫瘍細胞においてもっぱら発現され得るか、もしくは過剰発現され得る、変異した分子と変異していない分子の両方を含む。タンパク質および糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質およびムチンの発現の腫瘍特異的パターンもまた考証されている。本癌ワクチンにおいて使用するための例示的な腫瘍関連抗原としては、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、および腫瘍細胞に特有の変異または再配列を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚性遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的（しかしながら腫瘍特異的でない）分化抗原、成長因子レセプター、細胞表面炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、ならびにいくつかのその他の自己タンパク質が挙げられる。
【０２０２】
腫瘍関連抗原の特定の実施形態としては、例えば、変異した抗原（例えば、Ｒａｓ  ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３およびＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子のタンパク質産物ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８およびベータカテニン）；過剰発現される抗原（例えば、ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２およびＫＳＡ）、癌胎児抗原（例えば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ））；自己抗原（例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）およびメラノサイト分化抗原（例えば、Ｍａｒｔ１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１およびＴＲＰ２））；前立腺関連抗原（例えば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１およびＰＳＭ−Ｐ２）；再活性化された胚性遺伝子産物（例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥおよび他の癌精巣抗原（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２およびＳＣＰ１））；ムチン（例えば、Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２）；ガングリオシド（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２およびＧＤ３）、中性の糖脂質および糖タンパク質（例えば、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）およびグロボ−Ｈ）；および糖タンパク質（例えば、Ｔｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）およびｓＴｎ）が挙げられる。細胞全体および腫瘍細胞可溶化物ならびにその免疫原性部分、ならびにＢ細胞リンパ腫に対して使用するためのＢリンパ球のモノクローナル増殖時に発現される免疫グロブリンイディオタイプもまた、本明細書中で腫瘍関連抗原として含められる。
【０２０３】
病原体としては、感染物質、例えば、哺乳動物、より詳細にはヒトに感染するウイルスが挙げられるが、これに限定されない。感染性ウイルスの例としては：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される）またはＨＩＶ−ＩＩＩ）；およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離されたもの；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす系統）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタンウイルス、ブニアウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳障害の病原学的物質、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部伝染性；クラス２＝非経口伝染性（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルスならびにアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
また、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌は、脊椎動物において抗原として働く。そのようなグラム陽性細菌としては、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられるが、これらに限定されない。感染性の細菌の特定の例としては：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌属）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌属）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス型）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２０５】
病原体の追加の例としては、哺乳動物、より詳細にはヒトに感染する感染性の真菌が挙げられるが、これに限定されない。感染性の真菌の例としては：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられるが、これらに限定されない。感染性の寄生生物の例としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｖｉｖａｘ）が挙げられる。他の感染性の生物（すなわち、原生生物）としては、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。
【実施例】
【０２０６】
実施例１
２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
以下の概略図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを合成した。
【０２０７】
【化１６】
2014132014.tif 000029
臭化リノレイル（ＩＩ）の合成
無水エーテル（３００ｍＬ）中の、リノレイルメタンスルホネート（６．２ｇ，１８ｍｍｏｌ）とマグネシウムブロミドエーテレート（１７ｇ，５５ｍｍｏｌ）との混合物をアルゴン下で一晩（２１時間）撹拌した。得られた懸濁液を３００ｍＬの冷水に注ぎ込んだ。振盪した後、有機相を分離した。水相をエーテル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。併せたエーテル相を水（２×１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、６．５ｇの無色油状物を得た。その粗生成物を、ヘキサン類で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，３００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、６．２ｇ（約１００％）の臭化リノレイル（ＩＩ）が得られた。
【０２０８】
【化１７】
2014132014.tif 000030
ジリノレイルメタノール（ＩＩＩ）の合成
窒素下の２００ｍＬの無水エーテル中の、１つの結晶のヨウ素を含むＭｇ回転物（０．４５ｇ，１８．７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温において５０ｍＬの無水エーテル中の臭化リノレイル（ＩＩ）の溶液を加えた。得られた混合物を窒素下で一晩還流した。その混合物を室温に冷却した。窒素下のその濁った混合物に、３０ｍＬの無水エーテル中のギ酸エチル（０．６５ｇ，１８．７ｍｍｏｌ）の溶液を室温において滴下した。滴下の後、その混合物を室温において一晩（２０時間）撹拌した。エーテル層を１０％Ｈ２ＳＯ４水溶液（１００ｍＬ）、水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、５．０ｇの青白色油状物を得た。溶出剤としてヘキサン類中の０〜７％エーテル勾配を用いるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，３００ｍＬ）におけるカラムカラムクロマトグラフィによって、２つの生成物、ジリノレイルメタノール（２．０ｇ，ＩＩＩ）およびジリノレイルメチルホルメート（１．４ｇ，ＩＶ）を得た。
【０２０９】
【化１８】
2014132014.tif 000031
ジリノレイルメチルホルメート（ＩＶ，１．４ｇ）およびＫＯＨ（０．２ｇ）を窒素下、室温において一晩、８５％ＥｔＯＨ中で撹拌した。反応が完了した後、溶媒の半分を蒸発させた。得られた混合物を１５０ｍＬの５％ＨＣＬ溶液に注ぎ込んだ。水相をエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した。併せたエーテル抽出物を水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、１．０ｇのジリノレイルメタノール（ＩＩＩ）を無色油状物として得た。全体として、３．０ｇ（６０％）のジリノレイルメタノールが得られた。ジリノレイルメタノール（ＩＩＩ）に対する１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：ｐｐｍ。
【０２１０】
ジリノレイルケトン（Ｖ）の合成
１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の、ジリノレイルメタノール（２．０ｇ，３．８ｍｍｏｌ）および無水炭酸ナトリウム（０．２ｇ）との混合物に、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ，２．０ｇ，９．５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた懸濁液を室温において６０分間撹拌した。次いで、エーテル（３００ｍＬ）をその混合物に加え、得られた茶色懸濁液をシリカゲルのパッドで濾過した（３００ｍＬ）。そのシリカゲルパッドをエーテルでさらに洗浄した（３×２００ｍＬ）。そのエーテル濾液と洗浄液とを混合した。溶媒を蒸発させることにより、３．０ｇの油性残渣を粗生成物として得た。その粗生成物を、ヘキサン類中の０〜３％エーテルで溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，２５０ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、１．８ｇ（９０％）のジリノレイルケトン（Ｖ）が得られた。
【０２１１】
【化１９】
2014132014.tif 000032
２，２−ジリノレイル−４−ブロモメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＶＩ）の合成
２００ｍＬのトルエン中の、ジリノレイルメタノール（Ｖ，１．３ｇ，２．５ｍｍｏｌ）と、３−ブロモ−１，２−プロパンジオール（１．５ｇ，９．７ｍｍｏｌ）と、ｐ−トルエンスルホン酸水和物（０．１６ｇ，０．８４ｍｍｏｌ）との混合物を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋチューブを用いて窒素下において３日間還流することにより、水を除去した。得られた混合物を室温に冷却した。有機相を水（２×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、黄色がかった油性残渣が得られた。溶出剤としてヘキサン類中の０〜６％エーテル勾配を用いるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，１００ｍＬ）におけるカラムカラムクロマトグラフィによって、０．１ｇの純粋ＶＩおよび１．３ｇのＶＩと出発物質との混合物が得られた。
【０２１２】
【化２０】
2014132014.tif 000033
２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
無水ジメチルアミンを、２，２−ジリノレイル−４−ブロモメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＶＩ）およびジリノレイルケトン（Ｖ）との１．３ｇの混合物を含む無水ＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）中に、０℃において１０分間泡立てて流した。次いで、その反応フラスコを密閉し、その混合物を室温において６日間撹拌した。溶媒を蒸発させることにより、１．５ｇの残渣が残った。その粗生成物を、ジクロロメタン中の０〜５％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，１００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、０．８ｇの所望の生成物であるＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡが得られた。
【０２１３】
【化２１】
2014132014.tif 000034
実施例２
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）の合成
ＤＬｉｎＤＭＡを以下に記載されるように合成した。
【０２１４】
【化２２】
2014132014.tif 000035
１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）
１２０ｍＬの無水ベンゼン中のＮａＨ（９５％，５．２ｇ，０．２０６ｍｏｌ）の懸濁液に、アルゴン下の４０ｍＬの無水ベンゼン中のＮ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン−１，２−ジオール（２．８ｇ，０．０２３５ｍｏｌ）を滴下した。滴下の後、得られた混合物を室温において１５分間撹拌した。７５ｍＬの無水ベンゼン中のリノレイルメタンスルホネート（９９％，２０ｇ，０．０５８ｍｏｌ）をアルゴン下、室温において上記混合物に滴下した。室温において３０分間撹拌した後、その混合物をアルゴン下で一晩還流した。冷却した後、得られた懸濁液を、２５０ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼン溶液で滴下して処理した。有機相を水（１５０ｍＬ）、ブライン（２×２００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空中で蒸発させることにより、１７．９ｇの淡色油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、塩化メチレン中の０〜５％メタノール勾配を用いるシリカゲルにおけるカラムカラムクロマトグラフィによって２回精製したところ、１０．４ｇの純粋なＤＬｉｎＤＭＡが得られた。
【０２１５】
【化２３】
2014132014.tif 000036
実施例３
１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．ＣＬ）の合成
概略図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌを合成した。
【０２１６】
【化２４】
2014132014.tif 000037
１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）の合成
リノレイルメタンスルホネートによる３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオールのエーテル化に基づいて、実施例２に記載されたようにＤＬｉｎ−ＤＭＡを調製した。
【０２１７】
１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンヨウ化物（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｉ）の合成
２０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２中の、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ，５．５ｇ，８．９ｍｍｏｌ）と、ＣＨ３Ｉ（７．５ｍＬ，１２０ｍｍｏｌ）との混合物を窒素下、室温において７日間撹拌した。溶媒および過剰量のヨードメタンを蒸発させることにより、７．０ｇの黄色シロップ状物を粗ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｉとして得て、それをさらに精製することなく以下の工程において使用した。
【０２１８】
１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）の調製
上記粗１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンヨウ化物（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｉ，７．０ｇ）を分液漏斗において１５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。４０ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌメタノール溶液を加え、得られた溶液を十分に振盪した。その溶液に、５０ｍＬのブラインを加え、その混合物を十分に振盪した。有機相を分離した。水相を１５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。次いで、有機相および抽出物を混合した。これにより、イオン交換の第１工程が完了した。このイオン交換工程を、さらに４回繰り返した。最後の有機相をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、６．０ｇの黄色油状物として得た。その粗生成物を、クロロホルム中の０〜１５％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，２５０ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、２．３ｇの１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ．Ｃｌ）を無色シロップ状物として得た。
【０２１９】
【化２５】
2014132014.tif 000038
実施例４
１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）の合成
以下に示されるようにＤＯＤＭＡを合成した。
【０２２０】
【化２６】
2014132014.tif 000039
１，２−ジオレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）
オレイルメシレートをリノレイルメシレートに置き換えたことを除いて、同じ様式でＤＬｉｎＤＭＡを合成した。
【０２２１】
ベンゼン（８００ｍＬ）を、スターバーを含むアルゴン下の３Ｌナシ形丸底フラスコ中の水素化ナトリウム（５２ｇ，９５％，２．０６ｍｏｌ）に加えた。そのアルゴン下の反応フラスコに、ベンゼン（２００ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン−１，２−ジオール（２８．１ｇ，２３４．８ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり加え、さらに５０ｍＬのベンゼンですすぎ、１０分間撹拌した。
【０２２２】
アルゴン下のその反応混合物に、ベンゼン（２００ｍＬ）中のオレイルメシレート（２００．３ｇ，５７８．９ｍｍｏｌ）を加え、１２００ｍＬのベンゼンでさらにすすいだ。その反応混合物をアルゴン下で一晩還流した。
【０２２３】
その反応混合物を４Ｌエルレンマイヤーフラスコに移し、エタノール（１００ｍＬ）をアルゴン下でゆっくり加えることにより、未反応の水素化ナトリウムをクエンチした。さらなるエタノール（１３００ｍＬ）を加えることにより、ベンゼン：エタノールが１：１となるように総エタノール含有量を１４００ｍＬにした。その反応混合物（８００ｍＬ）を２Ｌ分液漏斗に等分し、２４０ｍＬの水を加えた（ベンゼン：エタノール：水１：１：０．６ｖ／ｖ）。有機相を回収し、水層をベンゼン（１００ｍＬ）で再抽出した。
【０２２４】
アルゴン下のその反応混合物にベンゼン（２００ｍＬ）中のオレイルメシレート（２００．３ｇ，５７８．９ｍｍｏｌ）を加え、さらなる１２００ｍＬのベンゼンですすいだ。その反応混合物をアルゴン下で一晩還流した。この工程を再度繰り返した。
【０２２５】
併せた有機画分を無水硫酸マグネシウム（３０ｇ）で乾燥し、焼結ガラス漏斗を用いて真空下で濾過した。ｒｏｔｏｖａｐ（水浴５０〜６０□Ｃ）において溶媒を除去した。粘稠性の油性生成物をジクロロメタン（３００ｍＬ）に再溶解し、濾紙およびシリカゲル６０（８０ｇ，２３０〜４００メッシュ）を用いて焼結ガラス漏斗で真空濾過した。ｒｏｔｏｖａｐにおいてジクロロメタンを５０〜６０□Ｃにおいて除去した。
【０２２６】
その生成物をカラムカラムクロマトグラフィで精製した。合計１５１ｇの生成物を２つの約７５ｇのアリコートに分割し、２本の６００ｇのシリカゲル６０カラム上に充填した。カラムに充填する前に、その生成物をジクロロメタン中の２％ＭｅＯＨ（約１：１ｗ／ｖ）に溶解した。生成物が出現するまで、ジクロロメタン中の２％ＭｅＯＨ（約１Ｌ）を使用した。ジクロロメタン中の約１Ｌの５％、７．５％、次いで１０％ＭｅＯＨを用いて、カラムを溶出し、約２００ｍＬの画分を回収した。
【０２２７】
ＴＬＣにおける上または下のスポットの画分（不純物）および生成物を、純粋な画分と別々にｒｏｔｏｖａｐに供した。不純なＤＯＤＭＡを他のバッチから回収し、それらを併せて、２回目のカラムに入れて精製した。ＤＯＤＭＡの収量は、９５ｇだった。
【０２２８】
実施例５
１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）の合成
模式図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−ＭＰＺを合成した。
【０２２９】
【化２７】
2014132014.tif 000040
３−（Ｎ−メチルピペラジノ）−１，２−プロパンジオール（ＩＩＩ）の合成
無水ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の、１−メチルピペラジン（１．０２ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、グリシドール（０．７５ｇ，９．７ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温において２日間撹拌した。溶媒を蒸発させることにより、油性残渣を得た。その残渣を１００ｍＬのベンゼンに再溶解した。溶媒を蒸発させた後に、１．８ｇの粘稠性油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、さらに精製することなく、以下の工程において使用した。
【０２３０】
１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ−メチルピペラジノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）の合成
窒素下の１００ｍＬの無水ベンゼン中のＮａＨ（２．０ｇ，６０％，５０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、５ｍＬの無水ベンゼン中の３−（Ｎ−メチルピペラジノ）−１，２−プロパンジオール（ＩＩＩ，０．７４ｇ，４．２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において２０分間撹拌した。次いで、２０ｍＬの無水ベンゼン中のリノレイルメタンスルホネート（３．２ｇ，９．３ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。室温において２０分間撹拌した後、その混合物を窒素下で一晩還流した。冷却した後、その混合物に４０ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼンをゆっくり加えた後、さらに６０ｍＬのベンゼンおよび１００ｍＬのＥｔＯＨを加えた。有機相を水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、３．０ｇの黄色油状物を粗生成物として得た。クロロホルム中の０〜８％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，２５０ｍＬ）におけるカラムカラムクロマトグラフィを繰り返すことによって、その粗生成物を精製した。これにより、１．１ｇ（３９％）の１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ−メチルピペラジノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）を黄色がかった油状物として得た。
【０２３１】
【化２８】
2014132014.tif 000041
実施例６
３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）の合成
【０２３２】
【化２９】
2014132014.tif 000042
ＤＯＡＰを合成した後に以下に記載される手順を行い、オレイルＢｒの代わりにリノレイルメタンスルホネートを用いたことを除いて同じ様式で、ＤＬｉｎＡＰを合成した。
【０２３３】
工程１：
【０２３４】
【化３０】
2014132014.tif 000043
（±）−３−アミノ−１，２−プロパンジオールを、窒素下において３．０ｍｏｌ等量過剰な第１級アミンを用いて、アセトニトリル中のオレイルブロミドで室温においてアルキル化した。その反応をＴＬＣによってモニターした。オレイルブロミドの喪失は、反応完了の示唆であった。その生成物を臭化水素酸塩として沈殿させた。
【０２３５】
工程２：
工程１からの第二級アミン（０．９ｇ，１ｍｏｌ当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ヒューニッヒ塩基）（０．５ｇ，１．５ｍｏｌ当量）、オレイルブロミド（１．０ｇ，１．１ｍｏｌ当量）および２０ｍＬのアセトニトリルを丸底フラスコに入れ、室温で撹拌した。反応が完了した後、ＴＬＣを行った。その反応混合物をｒｏｔｏｖａｐにおいて乾燥させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１０〜２０ｍＬ）に溶解し、蒸留水（１０〜２０ｍＬ）で洗浄した。水層を３×ＣＨ２Ｃｌ２（１０〜２０ｍＬ）で洗浄した。併せた有機画分をＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を、ｒｏｔｏｖａｐを用いて除去し、カラムカラムクロマトグラフィで精製した。
【０２３６】
【化３１】
2014132014.tif 000044
実施例７
２−リノレオイルオキシル（ＬＩＮＯＬＥＹＯＬＯＸＹＬ）−３−リノレイルオキシル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）の合成
模式図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰを合成した。
【０２３７】
【化３２】
2014132014.tif 000045
１−トリフェニルメチルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−２−プロパノール（ＤＭＡＰ−Ｔｒ）の合成
乾燥ピリジン（１００ｍＬ）中の、３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（３．０ｇ，２５ｍｍｏｌ）と、トリフェニルメチルクロリド（７．７５ｇ，２７．８ｍｍｏｌ）との混合物を３０分間還流した。冷却した後、溶媒のほとんどを真空中で蒸発させ、得られた残渣を４００ｍＬのジクロロメタンに再溶解した。有機相を水（３×２００ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、６．３ｇの黄色油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ジクロロメタン中の０〜１０％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，５００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、４．０ｇの生成物（ＤＭＡＰ−Ｔｒ）を黄色油状物として得た。
【０２３８】
１−トリフェニルメチルオキシ−２−リノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（Ｌｉｎ−２−ＤＭＡＰ−Ｔｒ）の合成
ＮａＨ（６０％，２．１７ｇ，５４ｍｍｏｌ）を窒素下においてヘキサン類（３×４０ｍＬ）で洗浄し、次いで、無水ベンゼン（６０ｍＬ）に懸濁した。その懸濁液に、２０ｍＬの無水ベンゼン中のＤＭＡＰ−Ｔｒ（４．０ｇ，１１ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、室温において２０分間撹拌した後、４０ｍＬの無水ベンゼン中のリノレイルメタンスルホネート（４．５ｇ，１３ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下において滴下した。その混合物を室温において３０分間撹拌し、次いで、一晩還流した。室温に冷却した後、３０ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼン溶液を窒素下において滴下した後、１００ｍＬのベンゼンおよび１００ｍＬの水を滴下した。振盪した後、水相を分離した。有機相をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、６．８ｇの黄色がかった油状物を得た。その粗生成物を、クロロホルム中の０〜３％メタノール勾配で溶出されるシリカゲルカラム（２３０〜４００メッシュ，４００ｍＬ）におけるクロマトグラフィに供した。５．８ｇ（８４％）の所望の生成物（Ｌｉｎ−２−ＤＭＡＰ−Ｔｒ）を黄色がかった油状物として得た。
【０２３９】
２−リノレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−プロパノール（Ｌｉｎ−２−ＤＭＡＰ）の合成
Ｌｉｎ−２−ＤＭＡＰ−Ｔｒ（５．８ｇ，９．２ｍｍｏＬ）を、窒素下において１０分間、８０％ＨＯＡｃ（２５ｍＬ）中で還流した。室温に冷却した後、その混合物を水（１００ｍＬ）で希釈した。得られた水溶液を、０．５％ＮａＯＨ溶液を用いて約ｐＨ６に中和した。次いで、水相をジクロロメタン（４×１００ｍＬ）で抽出した。併せた有機相を０．１％ＮａＯＨ溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、生成物と出発物質との５．６ｇの混合物を黄色がかった油状物として得た。その混合物を、クロロホルム中の０〜１０％メタノール勾配で溶出されるシリカゲルカラム（２３０〜４００メッシュ，４００ｍＬ）におけるクロマトグラフィに供した。２．２ｇ（６２％）の所望の生成物（Ｌｉｎ−２−ＤＭＡＰ）を黄色がかった油状物として得た。
【０２４０】
【化３３】
2014132014.tif 000046
２−リノレオイルオキシル−３−リノレイルオキシル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）の合成
無水ベンゼン（５０ｍＬ）中のリノール酸（２．３６ｇ，８．４ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下において塩化オキサリル（１．４５ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温において４時間撹拌した。溶媒および過剰量の塩化オキサリルを真空中で除去することにより、リノレオイルオキシルクロリドを淡い黄色がかった油状物として得た。
【０２４１】
上記リノレオイルオキシルクロリドを無水ベンゼン（８５ｍＬ）に再溶解した。得られた溶液に、１５ｍＬの無水ベンゼン中の、Ｌｉｎ−２−ＤＭＡＰ（２．９ｇ，７．５ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（１ｍＬ）の溶液を滴下した。次いで、その混合物を窒素下、室温において２日間撹拌し、懸濁液を得た。その混合物をベンゼン（１００ｍＬ）で希釈した。有機相を３：５（Ｖ：Ｖ）エタノール−水の溶液（３２０ｍＬ）、ブライン（２×７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を真空中で除去することにより、５．２ｇの油状物を得た。その粗生成物を、クロロホルム中の０〜４％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，４５０ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、３．９ｇ（８０％）のＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰを黄色がかった油状物として得た。
【０２４２】
【化３４】
2014132014.tif 000047
実施例８
１，２−ジリノレイルオキシ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）の合成
模式図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡを合成した。
【０２４３】
【化３５】
2014132014.tif 000048
１，２−ジリノレイルオキシ−３−アリルオキシプロパン（ＤＬｉｎＰＯ−アリル）の合成
ＮａＨ（１０ｇ，６０％，２５０ｍｍｏｌ）を、窒素下においてヘキサン類（３×７５ｍＬ）で３回洗浄し、次いで、２００ｍＬの無水ベンゼンに懸濁した。そのＮａＨ懸濁液に、１０ｍＬの無水ベンゼン中の３−アリルオキシ−１，２−プロパンジオール（４．２ｇ，３２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において１５分間撹拌した。次いで、９０ｍＬの無水ベンゼン中のリノレイルメタンスルホネート（２５．８ｇ，７４．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を窒素下、室温において３０分間撹拌し、そして一晩還流した。冷却した後、その混合物に１００ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼンをゆっくり加え、その後、さらに３００ｍＬのベンゼンを加えた。有機相を水（３００ｍＬ）、ブライン（２×３００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、２２．２ｇの黄色油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ヘキサン類中の０〜８％エーテル勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，１２００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、１２．４ｇ（６２％）の１，２−ジリノレイルオキシ−３−アリルオキシプロパン（ＤＬｉｎＰＯ−アリル）を無色油状物として得た。
【０２４４】
１，２−ジリノレイルオキシ−３−ヒドロキシプロパン（ＤＬｉｎＰＯ）の合成
エタノール（８０ｍＬ）中の、１，２−ジリノレイルオキシ−３−アリルオキシプロパン（ＤＬｉｎＰＯ−アリル，４．８ｇ，７．６ｍｍｏｌ）と、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１．２ｇ，触媒）と、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）との混合物を、窒素下、暗黒中で一晩（２５時間）還流した。茶色がかった溶液が得られた。溶媒を蒸発させることにより、その混合物の体積を半分減少させ、得られた残渣を２００ｍＬの酢酸エチルに溶解した。有機相を水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、５．５ｇの黄色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ジクロロメタン中の０〜２％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，１００ｍＬ）におけるカラムカラムクロマトグラフィを繰り返すことによって精製した。これにより、２．８ｇ（６３％）の１，２−ジリノレイルオキシ−３−ヒドロキシプロパン（ＤＬｉｎＰＯ）を黄色がかった油状物として得た。
【０２４５】
【化３６】
2014132014.tif 000049
１，２−ジリノレイルオキシ−３−メチルスルホニルオキシプロパン（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ）（ＤＬｉｎＰＯ−Ｍｓ）の合成
窒素下の１００ｍＬの無水ジクロロメタン中の、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ヒドロキシプロパン（ＤＬｉｎＰＯ，３．６ｇ，６．１ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（１．６ｍＬ，１１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メチルスルホニル（０．８ｍＬ，９．１ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温において一晩（２３時間）撹拌した。その反応混合物を１００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。有機相を水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、４．１ｇの茶色がかった油状物を粗生成物ＤＬｉｎＰＯ−Ｍｓとして得た。その粗生成物を、さらに精製することなく、以下の工程において使用した。
【０２４６】
１，２−ジリノレイルオキシ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）の合成
ＮａＨ（１．３７ｇ，６０％，３４．２ｍｍｏｌ）を窒素下においてヘキサン類（２×１５ｍＬ）で２回洗浄し、次いで、１２０ｍＬの無水ベンゼンに懸濁した。そのＮａＨ懸濁液に、１０ｍＬの無水ベンゼン中のジメチルアミノエタノール（０．４４ｇ，４．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において２０分間撹拌した。次いで、２０ｍＬの無水ベンゼン中の１，２−ジリノレイルオキシ−３−メチルスルホニルオキシプロパン（ＤＬｉｎＰＯ−Ｍｓ，３．４ｇ，５．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を窒素下、室温において２０分間撹拌し、一晩還流した。冷却した後、その混合物に１００ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼンをゆっくり加え、その後、さらに５０ｍＬのベンゼンおよび７０ｍＬのエタノールを加えた。有機相を水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、３．２ｇの黄色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、クロロホルム中の０〜６％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，３００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、０．３４ｇ（１１％）の１，２−ジリノレイルオキシ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）を青白色油状物として得た。
【０２４７】
【化３７】
2014132014.tif 000050
実施例９
１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）の合成
模式図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−ＤＡＣを合成した。
【０２４８】
【化３８】
2014132014.tif 000051
１，２−ジリノレイルオキシ−３−アリルオキシプロパン（ＤＬｉｎＰＯ−アリル）の合成
ＮａＨ（６０％，１０ｇ，２５０ｍｍｏｌ）を窒素下においてヘキサン類（３×７５ｍＬ）で洗浄し、次いで、無水ベンゼン（２００ｍＬ）に懸濁した。その懸濁液に、１０ｍＬの無水ベンゼン中の３−アリルオキシ−１，２−プロパンジオール（４．２ｇ，３２ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温において１０分間撹拌した後、９０ｍＬの無水ベンゼン中のリノレイルメタンスルホネート（２５．８ｇ，７４．９ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下において滴下した。その混合物を室温において３０分間撹拌し、次いで、一晩還流した。室温に冷却した後、１００ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼン溶液を窒素下において滴下し、その後、３００ｍＬのベンゼンを滴下した。有機相を水（３００ｍＬ）、ブライン（２×３００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、２２．２ｇの黄色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物のカラム精製（１２００ｍＬシリカゲル、２３０〜４００メッシュ、ヘキサン類中の０〜８％ジエチルエーテル勾配で溶出される）によって、１２．４ｇ（６２％）の無色油状物ＤＬｉｎＰＯ−アリルが得られた。
【０２４９】
２，３−ジリノレイルオキシ−１−プロパノール（ＤＬｉｎＰＯ）の合成
１８０ｍＬのエタノール中のＤＬｉｎＰＯ−アリル（１２．４ｇ，１９．７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１３ｍＬ）を加えた後、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（３．１ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた懸濁液を窒素下、暗黒中において一晩還流した。溶媒を蒸発させた後、酢酸エチル（４００ｍＬ）をその残渣に加えた。有機相を水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去したところ、１２ｇの黄色がかった油状物が得られた。その油性材料を、ジクロロメタン中の０〜１．５％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，５００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、５．８ｇ（５０％）の生成物ＤＬｉｎＰＯを得た。
【０２５０】
１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンハイドロクロライド（１．０ｇ，６．７ｍｍｏｌ）を５ｍＬの塩化オキサリル中で６０分間還流した。過剰量の塩化オキサリルを真空中で除去した。その残渣に、５０ｍＬの無水ベンゼンを加え、溶媒を蒸発させることにより、わずかに茶色がかった固体を得た。その粗Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンアシルクロリド塩を以下の工程において直接用いた。
【０２５１】
上記粗アシルクロリドを、窒素下において５０ｍＬの無水ジクロロメタンに懸濁した。その懸濁液に、２０ｍＬの無水ジクロロメタン中の、ＤＬｉｎＰＯ（１．０ｇ，１．７ｍｍｏｌ）および乾燥トリエチルアミン（１．４ｍＬ，１１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を窒素下、室温において一晩撹拌した。次いで、１００ｍＬのジクロロメタンを加えた。有機相を水（２×７５ｍＬ）、ブライン（７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、１．１ｇの淡い茶色がかった油状物を出発物質と生成物との混合物として得た。所望の生成物ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、０．２４ｇ（２０％）を、ヘキサン類中の０〜４０％酢酸エチル勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，２００ｍＬ）におけるカラムカラムクロマトグラフィによって単離した。
【０２５２】
【化３９】
2014132014.tif 000052
実施例１０
１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパンの合成
１，２−ジリノレオイル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＰ）を以下に記載されるように合成した。
【０２５３】
８００ｍＬの無水ベンゼン中のリノール酸（９９％，４９．７ｇ，０．１７７ｍｏｌ）の溶液に、塩化オキサリル（９９％，２９．８ｇ，０．２３５ｍｏｌ）をアルゴン下で滴下した。滴下の後、得られた混合物を、気泡が放出されなくなるまで、室温において２時間撹拌した。溶媒および過剰量の塩化オキサリルを真空中で除去した。その残渣に、無水ベンゼン（１Ｌ）を加えた後、無水ベンゼン（１００ｍＬ）中の、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオールおよび乾燥ピリジンの溶液を滴下した。得られた混合物を室温において２日間撹拌した。溶媒を蒸発させると、６４ｇの黄色がかったシロップ状物が得られた。粗生成物を、クロロホルム中の０〜５％メタノール勾配を用いるシリカゲルにおけるカラムカラムクロマトグラフィによって３回精製することによって、１９ｇの純粋なＤＬｉｎＤＡＰを得た。
【０２５４】
【化４０】
2014132014.tif 000053
実施例１１
ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰの合成
模式図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰを合成した。
【０２５５】
【化４１】
2014132014.tif 000054
リノレイルフタルイミドの調製
２５０ｍＬの無水ＤＭＦ中の、カリウムフタルイミド（１１．２ｇ，５９．５ｍｍｏｌ）と、リノレイルメタンスルホネート（９．３ｇ，２７ｍｍｏｌ）との混合物を、窒素下、７０℃において一晩撹拌した。得られた懸濁液を５００ｍＬの冷水に注ぎ込んだ。水相をＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）で抽出した。併せた抽出物を水（２００ｍＬ）、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、固体と油性材料との混合物を得た。その混合物に、３００ｍＬのヘキサン類を加えた。固体を濾過し、ヘキサン類（２×２５ｍＬ）で洗浄した。その濾液および洗浄液を混合し、溶媒を蒸発させることにより、１１ｇの黄色油状物を粗生成物として得た。その粗生成物をさらに精製することなく、次の工程において使用した。
【０２５６】
リノレイルアミンの調製
上記粗リノレイルフタルイミド（１１ｇ，約２７ｍｍｏｌ）およびヒドラジン（１０ｍＬ）を、窒素下において一晩、３５０ｍＬのエタノール中で還流した。その混合物を約４０〜５０℃に冷却した後、得られた白色固体を濾過し、固体を温ＥｔＯＨ（２×３０ｍＬ）で洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、溶媒を蒸発させた。その残渣に４００ｍＬのクロロホルムを加えたところ、白色固体が沈殿した。その固体を再度濾過した。得られた濾液の有機相を水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を真空中で除去することにより、７．３ｇの黄色油状物を粗生成物として得た。この粗生成物をさらに精製することなく、次の工程で使用した。純粋なリノレイルアミンを、クロロホルム中の０〜２０％メタノール勾配で溶出されるシリカゲルにおけるカラムカラムクロマトグラフィによって得た。
【０２５７】
【化４２】
2014132014.tif 000055
リノレイルイソシアネートの調製
無水炭酸ナトリウム（１１ｇｇ）を、十分に撹拌しながら窒素下において無水ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中のリノレイルアミン（７．３ｇ，約２７ｍｍｏｌ）の溶液に懸濁した。その懸濁液を、氷浴を用いて０〜５℃に冷却した。その懸濁液に、１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２中のジホスゲン（８．２ｇ，４１ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら加えた。加えた後、得られた懸濁液を窒素下、０〜５℃において６０分間、次いで、室温において２時間撹拌した。反応が完了した後、その混合物に１００ｍＬの水を加え、その混合物を室温において３０分間撹拌した。有機層を分離し、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を蒸発させることにより、７．６ｇの黄色油状物を粗生成物として得た。その粗生成物をさらに精製することなく、以下の工程において使用した。
【０２５８】
３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオールを用いたリノレイルイソシアネートの縮合
窒素下の１５０ｍＬの無水ベンゼン中の上記粗リノレイルイソシアネート（７．６ｇ，約２５ｍｍｏｌ）の溶液に、２０ｍＬの無水ベンゼン中の３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（０．９９ｇ，８．３ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において６０分間撹拌し、次いで、４時間還流した後、室温において一晩撹拌した。その混合物を１５０ｍＬのベンゼンで希釈した後、有機相を水（３×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、８．４ｇの黄色油状物を得た。その油性材料のカラム精製（５００ｍＬシリカゲル、２３０〜４００メッシュ、クロロホルム中の０〜３％メタノール勾配で溶出される）によって、２．２ｇ（３８％）の黄色がかった油状物を生成物ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰとして得た。
【０２５９】
【化４３】
2014132014.tif 000056
実施例１２
１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）の合成
模式図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−ＭＡを合成した。
【０２６０】
【化４４】
2014132014.tif 000057
窒素下の１５０ｍＬの無水ベンゼン中のＮａＨ（７．６ｇ，９５％，０．３０ｍｏｌ）の懸濁液に、１０ｍＬの無水ベンゼン中の３−（Ｎ−モルホリノ）−１，２−プロパンジオール（１．０２ｇ，６．３ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において２０分間撹拌した。次いで、２０ｍＬの無水ベンゼン中のリノレイルメタンスルホネート（５ｇ，１４．５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。室温において２０分間撹拌した後、その混合物を窒素下で一晩還流した。冷却した後、その混合物に１００ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼンをゆっくり加え、その後、９０ｍＬのＥｔＯＨを加えた。有機相を水（２４０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、黄色油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ジクロロメタン中の０〜８％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、２ｇの１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）を黄色がかった油状物として得た。
【０２６１】
【化４５】
2014132014.tif 000058
実施例１３
１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）の合成
概略図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡを合成した。
【０２６２】
【化４６】
2014132014.tif 000059
リノレイルチオアセテート（ＩＩ）の合成
窒素下、０〜５℃の２５０ｍＬの無水ＴＨＦ中のトリフェニルホスフィン（１８．０ｇ，６８．２ｍｍｏｌ）の溶液に、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ，１４．７ｍＬ，６８ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下の後、得られた混合物を０〜５℃において４５分間撹拌した。黄色懸濁液が得られた。次いで、その黄色懸濁液に、リノレイルアルコール（Ｉ，９．１ｇ，３４ｍｍｏｌ）およびチオール酢酸（５．１ｍＬ，６８ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下、０〜５℃において３０分間にわたって滴下した。得られた混合物を０〜５℃において１時間撹拌し、次いで、室温に温めた。室温において６０分間撹拌した後、茶色溶液が得られた。溶媒を蒸発させることにより、茶色がかった油性残渣を得た。その残渣を６００ｍＬのエーテルに再溶解した。エーテル相を水（２×２５０ｍＬ）、ブライン（２５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、３１ｇの茶色油状物が得られ、それは、一晩で部分的に凝固した。この粗混合物を１００ｍＬのヘキサン類で処理した。固体を濾過し、ヘキサン類（２×３０ｍＬ）で洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、溶媒を蒸発させることにより、１３ｇの茶色油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ヘキサン類中の０〜３％エーテル勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，６００ｍＬ）におけるカラムカラムクロマトグラフィによって２回精製した。これにより、１０．０ｇ（９１％）のリノレイルチオアセテート（ＩＩ）を黄色がかった油状物として得た。
【０２６３】
【化４７】
2014132014.tif 000060
リノレイルメルカプタン（ＩＩＩ）の合成
窒素下、０〜５℃の１５０ｍＬの無水エーテル中のＬｉＡｌＨ４（４．７ｇ，１２４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、窒素下の２００ｍＬの無水エーテル中に１つの結晶のヨウ素を含む溶液を滴下し、１００ｍＬの無水エーテル中のリノレイルチオアセテート（ＩＩ，１０．０ｇ，３０．８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。加えた後、その懸濁液を室温に温め、次いで、室温において４時間を撹拌した。得られた混合物を０〜５℃に冷却し、１０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液を非常にゆっくり加えた。室温において６０分間撹拌した後、その懸濁液を珪藻土のパッドで濾過した。固体をエーテル（３×１００ｍＬ）で洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、溶媒を蒸発させることにより、７．２ｇ（８３％）のリノレイルメルカプタン（ＩＩＩ）を無色油状物として得た。
【０２６４】
【化４８】
2014132014.tif 000061
【０２６５】
【化４９】
2014132014.tif 000062
１−トリフェニルメチルオキシ−２−ヒドロキシ−３−ジメチルアミノプロパン（Ｖ）の合成
無水ピリジン（２００ｍＬ）中の、３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＩＶ，６．３ｇ，５３ｍｍｏｌ）と、トリフェニルメチルクロリド（１５．５ｇ，５５．６ｍｍｏｌ）との混合物を４０分間還流した。室温に冷却した後、溶媒のほとんどを真空中で除去した。得られた油性残渣に、４００ｍＬの酢酸エチルを加えた。大量の固体が形成された。その固体を濾過し、風乾した。濾液相を水（２×１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、８．５ｇの茶色油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、クロロホルム中の０〜１０％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，５００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、４．１ｇ（２１％）の１−トリフェニルメチルオキシ−２−ヒドロキシ−３−ジメチルアミノプロパン（Ｖ）を黄色がかった固体として得た。
【０２６６】
１−トリフェニルメチルオキシ−２−メチルスルホニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩ）の合成
窒素下の１５０ｍＬの無水ジクロロメタン中の、１−トリフェニルメチルオキシ−２−ヒドロキシ−３−ジメチルアミノプロパン（Ｖ，４．２ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（２．５ｍＬ，１７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、氷水冷浴を用いて塩化メチルスルホニル（１．０ｍＬ，１３ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下の後、冷浴を取り除き、混合物を窒素下、室温において一晩（２０時間）撹拌した。得られた混合物を１００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。有機相を水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、４．３ｇの黄色がかった油状物を粗生成物として得た（ＶＩ）。その粗生成物をさらに精製することなく、次の工程で使用した。
【０２６７】
１−トリフェニルメチルオキシ−２−リノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩＩ）の合成
窒素下の１００ｍＬの無水ベンゼン中のＮａＨ（２．０ｇ，９５％，７９ｍｍｏｌ）の懸濁液に、３０ｍＬの無水ベンゼン中のリノレイルメルカプタン（ＩＩＩ，３．１ｇ，１１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において２０分間撹拌した。次いで、３０ｍＬの無水ベンゼン中の１−トリフェニルメチルオキシ−２−メチルスルホニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩ，４．５ｇ，１０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。室温において１５分間撹拌した後、その混合物を窒素下において３日間、穏やかに還流した。冷却した後、その混合物に３０ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼンをゆっくり加えた。有機相を１：２エタノール−水（３６０ｍＬ）で１回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、７．１ｇの黄色がかった油状物を粗生成物として得た（ＶＩＩ）。その粗生成物を、クロロホルム中の０〜５％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，２５０ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、５．５ｇ（８８％）の１−トリフェニルメチルオキシ−２−リノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩＩ）を黄色がかった油状物として得た。
【０２６８】
１−ヒドロキシ−２−リノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩＩＩ）の合成
１−トリフェニルメチルオキシ−２−リノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩＩ，５．５ｇ，８．８ｍｍｏｌ）を、窒素下、１５０ｍＬの８０％ＨＯＡｃにおいて７時間還流した。冷却した後、溶媒を除去することにより、淡色の半固体を得た。その材料を２００ｍＬの酢酸エチルに再溶解した。続いて、有機相を０．５％ＮａＯＨ水溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を蒸発させた。５．１ｇの青白色固体が得られた。クロロホルム中の０〜７％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，２５０ｍＬ）における粗生成物のカラムカラムクロマトグラフィにより、１．３ｇ（３９％）の１−ヒドロキシ−２−リノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩＩＩ）を得た。
【０２６９】
【化５０】
2014132014.tif 000063
１−メチルスルホニルオキシキシ−２−リノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩＶ）の合成
窒素下の５０ｍＬの無水ジクロロメタン中の、１−ヒドロキシ−２−リノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩＩＩ，１．３ｇ，３．２ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（０．７ｍＬ，５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メチルスルホニル（０．５ｇ，４．３ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温において一晩（１９時間）撹拌した。その反応混合物を５０ｍＬのジクロロメタンで希釈した。有機相を水（２×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、１．４ｇの黄色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物をさらに精製することなく、以下の工程において使用した。
【０２７０】
１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）の合成
ＮａＨ（０．８９ｇ，６０％，２２ｍｍｏｌ）を窒素下においてヘキサン類（２×１５ｍＬ）で２回洗浄し、次いで、７０ｍＬの無水ベンゼンに懸濁した。その懸濁液に、１５ｍＬの無水ベンゼン中のリノレイルメルカプタン（ＩＩＩ，１．１ｇ，３．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において２０分間撹拌した。次いで、１５ｍＬの無水ベンゼン中の１−メチルスルホニルオキシ−２−リノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＶＩＶ，１．４ｇ，３．０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。室温において２０分間撹拌した後、混合物を窒素下において２日間穏やかに還流した。冷却した後、その混合物に２００ｍＬの１：１（Ｖ：Ｖ）エタノール−ベンゼンをゆっくり加えた。有機相を水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、２．５ｇの黄色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、クロロホルム中の０〜３％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，２５０ｍＬ）におけるカラムカラムクロマトグラフィによって繰り返し精製した。これにより、０．４ｇ（２０％）の１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）を黄色がかった油状物として得た。
【０２７１】
【化５１】
2014132014.tif 000064
実施例１４
１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．ＣＬ）の合成
模式図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌを合成した。
【０２７２】
【化５２】
2014132014.tif 000065
１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＰ）の合成
リノレオイルクロリドによる３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオールのエステル化に基づいて、実施例１０に記載されている手順に従ってＤＬｉｎ−ＤＡＰを調製した。
【０２７３】
１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンヨウ化物（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｉ）の合成
２０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２中の、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＰ，５．５ｇ，８．８ｍｍｏｌ）とＣＨ３Ｉ（７．５ｍＬ，１２０ｍｍｏｌ）との混合物を窒素下、室温において１０日間撹拌した。溶媒および過剰量のヨードメタンを蒸発させることにより、６．４ｇの黄色シロップ状物を粗ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｉとして得て、それをさらに精製することなく以下の工程において使用した。
【０２７４】
１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）の調製
上記１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンヨウ化物（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｉ，６．４ｇ）を、分液漏斗において１５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。３５ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌメタノール溶液を加え、得られた溶液を十分に振盪した。その溶液に、５０ｍＬのブラインを加え、その混合物を十分に振盪した。有機相を分離した。水相を１５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。次いで、有機相および抽出物を混合した。これにより、イオン交換の第１工程が完了した。このイオン交換工程をさらに４回繰り返した。最後の有機相をブライン（７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、茶色がかった油状物を得た。その粗生成物を、クロロホルム中の０〜２５％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，２５０ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、２．２ｇの１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）を白色蝋状物として得た。
【０２７５】
【化５３】
2014132014.tif 000066
実施例１５
２，３−ジミリストレオロキシル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＭＤＡＰ）の合成
概略図に示され、以下に記載されるように、ＤＭＤＡＰを合成した。
【０２７６】
【化５４】
2014132014.tif 000067
２，３−ジミリストレオロキシル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＭＤＡＰ）の合成
無水ベンゼン（６０ｍＬ）中のミリストレイン酸（５．１ｇ，２２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン下で塩化オキサリル（３．９３ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温において２時間撹拌した。溶媒および過剰量の塩化オキサリルを真空中で除去し、残渣を無水ベンゼン（７５ｍＬ）に溶解した。得られた溶液に、１０ｍＬの無水ベンゼン中の、３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（１．２８ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（１．３ｍＬ）の溶液を滴下した。次いで、その混合物をアルゴン下、室温において３日間撹拌し、懸濁液が得られた。固体を濾過し、ベンゼンで洗浄した。その洗浄液を濾液と混合した。併せた有機相をベンゼンで約２５０ｍＬに希釈し、次いで、水（１００ｍＬ）、希ＮａＯＨ水溶液（約０．０１％）およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。各洗浄液中の水相をベンゼンで逆抽出した。最後に、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を真空中で除去することにより、６．５ｇの無色油状物を得た。その粗生成物を、ヘキサン類中の０〜３０％酢酸エチル勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，３００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、３．４ｇ（５９％収率）のＤＭＤＡＰが得られた。
【０２７７】
【化５５】
2014132014.tif 000068
実施例１６
１，２−ジオレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ）の合成
概略図に示され、以下に記載されるように、ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰを合成した。
【０２７８】
【化５６】
2014132014.tif 000069
オレイルイソシアネートの調製
無水炭酸ナトリウム（５ｇ，４７ｍｍｏｌ）を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中のオレイルアミン（３．８３ｇ，１４．３ｍｍｏｌ）の溶液に、十分に撹拌しながら窒素下において懸濁した。その懸濁液を、氷浴を用いて０〜５℃に冷却した。その懸濁液に、５ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２中のジホスゲン（３．８６ｇ，１９．５ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら加えた。加えた後、得られた懸濁液を窒素下、０〜５℃において６０分間、次いで、室温において２時間撹拌した。反応が完了した後、水相のｐＨが約６になるまで有機相をはじめに水（６×１００ｍＬ）で洗浄し、次いでブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を蒸発させることにより、４．４ｇのわずかに茶色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、さらに精製することなく以下の工程において使用した。
【０２７９】
３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオールを用いたオレイルイソシアネートの縮合
窒素下の６０ｍＬの無水ベンゼン中の上記粗オレイルイソシアネート（４．４ｇ，約１５ｍｍｏｌ）の溶液に、１０ｍＬの無水ベンゼン中の３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（０．５９ｇ，５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において９０分間撹拌し、次いで、４時間還流した後、室温において一晩撹拌した。その混合物を１００ｍＬのベンゼンで希釈した後、有機相を水（４×７５ｍＬ）、ブライン（７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、５．０ｇの黄色油状物を得た。その油性材料のカラム精製（４００ｍＬシリカゲル、２３０〜４００メッシュ、クロロホルム中の０〜４％メタノール勾配で溶出される）によって、１．４ｇ（３９％）の黄色がかった油状物を生成物ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰとして得た。
【０２８０】
【化５７】
2014132014.tif 000070
実施例１７
１−ジリノレイルメチルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡ）の合成
概略図に示され、以下に記載されるように、ＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡを合成した。
【０２８１】
【化５８】
2014132014.tif 000071
ジリノレイルメタノール（ＤＬｉｎ−ＭｅＯＨ）の合成
上に記載されたようにジリノレイルメタノール（ＤＬｉｎ−ＭｅＯＨ）を調製した。
【０２８２】
ジリノレイルメチルメタンスルホネート（ＤＬｉｎ−ＭｅＯＭｓ）の合成
窒素下の１００ｍＬの無水ジクロロメタン中の、ジリノレイルメタノール（ＤＬｉｎ−ＭｅＯＨ，１．０ｇ，１．９ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（０．４ｍＬ，２．９ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メチルスルホニル（０．２０ｍＬ，２．６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温において一晩（２１時間）撹拌した。その反応混合物を５０ｍＬのジクロロメタンで希釈した。有機相を、水（５０ｍＬ）、ブライン（７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、１．２６ｇの黄色がかった油状物を粗生成物としてＤＬｉｎ−ＭｅＯＭｓを得た。その粗生成物を、ヘキサン類中の０〜７％エーテル勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，１００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、１．１８ｇのジリノレイルメチルメタンスルホネートを青白色油状物として得た。
【０２８３】
【化５９】
2014132014.tif 000072
ジリノレイルメチルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡ）の合成
ＮａＨ（０．５０ｇ，６０％，１２．５ｍｍｏｌ）を窒素下においてヘキサン類で２回洗浄し（２×１５ｍＬ）、次いで、７５ｍＬの無水ベンゼンに懸濁した。そのＮａＨ懸濁液に、５ｍＬの無水ベンゼン中のジメチルアミノエタノール（０．１７ｇ，１．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を室温において３０分間撹拌した。次いで、２０ｍＬの無水ベンゼン中のジリノレイルメチルメタンスルホネート（ＤＬｉｎ−ＭｅＯＭｓ，１．１５ｇ，１．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。得られた混合物を窒素下、室温において２０分間撹拌し、次いで、一晩還流した。冷却した後、その混合物に５０ｍＬのエタノールをゆっくり加えた。有機相を水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることにより、１．０６ｇの黄色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ジクロロメタン中の０〜５％メタノール勾配で溶出されるシリカゲル（２３０〜４００メッシュ，１００ｍＬ）におけるカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、６０ｍｇ（５％）のジリノレイルメチルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡ）を青白色油状物として得た。
【０２８４】
【化６０】
2014132014.tif 000073
実施例１８
キラル型の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）の合成
以下に記載され、以下の図に示されるように、（Ｒ）−および（Ｓ）−ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを合成した。
【０２８５】
【化６１】
2014132014.tif 000074
臭化リノレイルの合成
【０２８６】
【化６２】
2014132014.tif 000075
リノレイルメシレート（１００ｇ，０．２９ｍｏｌ）を、アセトン（１２５０ｍＬ）中の臭化リチウム（１１３．４ｇ，１．３０６ｍｏｌ）の撹拌混合物に室温において少しずつ加えた。その反応混合物を室温において１６時間継続した。固体を減圧下で濾過し、アセトンで洗浄した。濾液を真空中で蒸発させ、得られた黄色液体を、ヘキサン類で溶出するフラッシュクロマトグラフィによって精製することにより、臭化リノレイル（９０ｇ，９５％）を無色液体として得た。
【０２８７】
ジリノレイルメタノールの合成
【０２８８】
【化６３】
2014132014.tif 000076
無水エーテル（５００ｍＬ）中の臭化リノレイル（７８ｇ，０．２３７ｍｏｌ）の溶液を、無水エーテル（１０００ｍＬ）中にヨウ素の結晶を含むマグネシウム回転物（６．９ｇ，０．２８４ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下、室温において滴下した。得られた混合物を１０時間還流し、次いで、室温に冷却した。その灰色混合物にギ酸メチル（１４．５ｇ，０．２４１ｍｏｌ）を滴下し、その反応を一晩継続した。その反応混合物に硫酸（５％，１０００ｍＬ）を慎重に加えた。エーテル相を分離し、水層をジエチルエーテルで洗浄した。併せた有機相を水およびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた油状物を、ヘキサン類中の０〜５％エーテルで溶出するフラッシュクロマトグラフィによって精製することにより、ジリノレイルメチルホルメート（４２ｇ）を得た。
【０２８９】
ジリノレイルメチルホルメート（４２ｇ）と水酸化カリウム（９ｇ）との混合物を、８５％エタノール（２５０ｍＬ）中で室温において２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、水性残渣を２Ｍ塩酸で中和した。その水性残渣をエーテルで抽出した。併せた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮することにより、ジリノレイルメタノール（３８ｇ）を淡黄色油状物として得た。
【０２９０】
ジリノレイルケトンの合成
【０２９１】
【化６４】
2014132014.tif 000077
ピリジニウムクロロクロメート（４６．３ｇ，０．２１５５ｍｏｌ）をジクロロメタン（７５０ｍＬ）中のジリノレイルメタノール（３８ｇ，０．０７１８ｍｏｌ）の撹拌混合物に、室温において２時間にわたって少しずつ加えた。エーテルを加えることにより、その反応をクエンチした。得られた茶色混合物を、エーテルで溶出するＦｌｏｈｓｉｌで濾過した。溶媒を減圧下で除去することにより、ジリノレイルケトン（３６ｇ）を淡黄色油状物として得た。
【０２９２】
２，２−ジリノレイル−４−クロロメチル−［１，３］−ジオキソランの合成
【０２９３】
【化６５】
2014132014.tif 000078
（Ｓ）−２，２−ジリノレイル−４−クロロメチル−［１，３］−ジオキソラン
ジリノレイルケトン（７ｇ）と、（Ｓ）−（＋）−３−クロロ−１，２−プロパンジオール（５ｇ）と、ｐ−トルエンスルホン酸（０．０５ｇ）と、トルエン（２００ｍＬ）との混合物を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用いて２０時間加熱還流した。その反応混合物を室温に冷却し、飽和炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。溶媒を真空中で除去し、その残渣をヘキサン類中の２％酢酸エチルで溶出するフラッシュクロマトグラフィによって精製した。その生成物を淡黄色油状物として単離した（７ｇ）。
【０２９４】
（Ｒ）−２，２−ジリノレイル−４−クロロメチル−［１，３］−ジオキソラン
ジリノレイルケトン（８ｇ）と、（Ｒ）−（−）−３−クロロ−１，２−プロパンジオール（５ｇ）と、ｐ−トルエンスルホン酸（０．０５ｇ）と、トルエン（２００ｍＬ）との混合物を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用いて２０時間加熱還流した。その反応混合物を室温に冷却し、飽和炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、その残渣を、ヘキサン類中の２％酢酸エチルで溶出するフラッシュクロマトグラフィによって精製した。その生成物を淡黄色油状物として単離した（８ｇ）。
【０２９５】
キラルＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの合成
【０２９６】
【化６６】
2014132014.tif 000079
（Ｒ）−ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの合成
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の、上記（Ｓ）−ケタール（７ｇ）およびジメチルアミン（ＥｔＯＨ中３３％，５００ｍＬ）の溶液を３０ｐｓｉの圧力下で１週間、９０℃において加熱した。その溶液を減圧下で除去し、その残渣を、ヘキサン類中の３〜７５％酢酸エチルで溶出するフラッシュクロマトグラフィによって精製した。（Ｒ）−ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを薄茶色液体として単離した（６ｇ）。
【０２９７】
（Ｓ）−ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡの合成
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の上記（Ｒ）−ケタール（３．５ｇ）およびジメチルアミン（ＥｔＯＨ中３３％，５００ｍＬ）の溶液を３０ｐｓｉの圧力下で１週間、８５℃において加熱した。その溶液を真空中で除去することにより、その残渣を、ヘキサン類中の３〜７５％酢酸エチルで溶出するフラッシュクロマトグラフィによって精製した。（Ｓ）−ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを薄茶色液体として単離した（２ｇ）。
【０２９８】
実施例１９
ＭＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ＳＮ３−カルボモイルグリセリドの合成
ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）などのＰＥＧ−脂質を、概略図に示され、以下に記載されるように合成した。
【０２９９】
【化６７】
2014132014.tif 000080
ＩＶａの合成
１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリドＩａ（３０ｇ，６１．８０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−スクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ，２３．７６ｇ，１．５当量）をジクロロメタン（ＤＣＭ，５００ｍＬ）に入れ、氷水混合物上で撹拌した。その撹拌溶液にトリエチルアミン（ＴＥＡ，２５．３０ｍＬ，３当量）を加え、続いて、その反応混合物を外界温度において一晩撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニターした。その反応混合物をＤＣＭ（４００ｍＬ）で希釈し、有機層を水（２×５００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）で洗浄した後、標準的なワークアップを行った。得られた残渣を、高真空下、外界温度において一晩乾燥した。乾燥した後、そのようにして得られた粗カーボネートＩＩａをジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解し、氷浴上で撹拌した。その撹拌溶液に、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（ＩＩＩ，１０３．００ｇ，４７．２０ｍｍｏｌ，ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入したもの）および無水ピリジン（Ｐｙ，８０ｍＬ，過剰量）をアルゴン下で加えた。いくつかの実施形態において、化合物ＩＩＩ中のｘは、４５〜４９、好ましくは４７〜４９、より好ましくは４９の値を有する。次いで、その反応混合物を外界温度において一晩撹拌した。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、その残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル中に充填されたシリカゲルのカラムに投入した。そのカラムを、まず酢酸エチルで溶出し、その後、ジクロロメタン中の５〜１０％メタノールの勾配で溶出することにより、所望のＰＥＧ−脂質ＩＶａを白色固体として得た（１０５．３０ｇ，８３％）。
【０３００】
【化６８】
2014132014.tif 000081
ＩＶｂの合成
１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリドＩｂ（１．００ｇ，１．８４８ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（０．７１０ｇ，１．５当量）を共にジクロロメタン（２０ｍＬ）中に入れ、氷水混合物において０℃に冷却した。トリエチルアミン（１．００ｍＬ，３当量）を加え、その反応物を一晩撹拌した。その反応物をＴＬＣによって追跡し、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、ＩＩｂの得られた残渣を高真空下において一晩維持した。この化合物を、さらに精製することなく次の反応に直接使用した。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２ＩＩＩ（１．５０ｇ，０．６８７ｍｍｏｌ，ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入したもの）およびＩＩｂ（０．７０２ｇ，１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した。いくつかの実施形態において、化合物ＩＩＩ中のｘは、４５〜４９、好ましくは４７〜４９、より好ましくは４９の値を有する。その反応物を０℃に冷却した。ピリジン（１ｍＬ，過剰量）を加え、その反応物を一晩撹拌した。その反応をＴＬＣによってモニターした。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、その残渣をクロマトグラフィ（まず酢酸エチル、その後、勾配溶出として５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製することにより、必要とされる化合物ＩＶｂを白色固体として得た（１．４６ｇ，７６％）。
【０３０１】
【化６９】
2014132014.tif 000082
ＩＶｃの合成
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリドＩｃ（４．００ｇ，６．７０ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（２．５８ｇ，１．５当量）を共にジクロロメタン（６０ｍＬ）に入れ、氷水混合物中で０℃に冷却した。トリエチルアミン（２．７５ｍＬ，３当量）を加え、その反応物を一晩撹拌した。その反応物をＴＬＣによって追跡し、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、その残渣を高真空下において一晩維持した。この化合物を、さらに精製することなく次の反応のために直接使用した。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２ＩＩＩ（１．５０ｇ，０．６８７ｍｍｏｌ，ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入したもの）およびＩＩｃ（０．７６０ｇ，１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した。いくつかの実施形態において、化合物ＩＩＩにおけるｘは、４５〜４９、好ましくは４７〜４９、より好ましくは４９の値を有する。その反応物を０℃に冷却した。ピリジン（１ｍＬ，過剰量）を加え、その反応物を一晩撹拌した。その反応をＴＬＣによってモニターした。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、その残渣を、クロマトグラフィ（酢酸エチルの後、勾配溶出として５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製することにより、所望の化合物ＩＶｃを白色固体として得た（０．９２ｇ，４８％）。
【０３０２】
【化７０】
2014132014.tif 000083
実施例２０
核酸−脂質粒子の調製および特徴づけ
第ＶＩＩ因子を標的化するｓｉＲＮＡを含む核酸脂質粒子を、以下に記載されるように調製し、特徴づけた。
【０３０３】
材料および方法：
脂質
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）およびパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。１，２−ジオレオイルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）またはＳｏｌｖａｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｗｅｅｓｐ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを、本明細書中に記載されているように合成した。ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧおよびＰＥＧ−ＤＭＡを、Ｈｅｙｅｓら（２００６）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｉｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１２：２８０−２９０に記載されているように合成した。
【０３０４】
緩衝液および溶媒
エタノール（１００％）、メタノール、クロロホルム、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム脱水物、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌおよびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のすべてを、商業的供給源から購入した。
【０３０５】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡを、Ｊｏｈｎら（Ｊｏｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２６  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００７（ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６１７９）に記載されているように、化学的に合成した。これらの研究に使用されるｓｉＲＮＡの配列は、以下のとおりだった：
【０３０６】
【化７１】
2014132014.tif 000084
小文字は、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾されたヌクレオチドを示し；太字の文字は、２’−Ｆ修飾されたヌクレオチドを示す。すべてのｓｉＲＮＡが、各鎖の３’末端の２つのチミジン（Ｔ）間にホスホロチオエート結合を含んだ。
【０３０７】
リポソーマル（Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ）ｓｉＲＮＡ処方物の調製
４０％陽イオン性脂質：１０％ＤＳＰＣ：４０％コレステロール：１０％ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧという適切な比（ｍｏｌ％）において、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧとともに様々な陽イオン性脂質を含むリポソーマルｓｉＲＮＡ処方物を、修飾を用いて、Ｍａｕｒｅｒら（Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．，２００１）に記載されているように調製した。各脂質の原液を無水エタノール中に調製した。あるいは、脂質を化学天秤上で秤量し、ＲＮａｓｅフリーの容器内で所望の比で混合し、無水エタノールを加えることにより、その脂質を溶解した。いくつかの場合において、その脂質または脂質混合物を完全に溶解するために加温（例えば、５０℃）が必要である。いったん、その脂質をエタノールに溶解したら、混合しながら適切な体積の脂質を５０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．０に加えることにより、８〜１０ｍＭの脂質濃度および３０〜４０体積％（代表的には、３４％）の最終エタノール濃度でリポソームを形成した。
【０３０８】
これらの予め形成されたベシクル（ＰＦＶ）を、以前に報告されているように（Ｈｏｐｅら、１９８６）２枚の積層８０ｎｍフィルターから３回押し出した。いくつかの場合において、脂質組成に応じて、リポソームを押し出すために加温が必要である。そのＰＦＶの平均粒径は、ＱＥＬＳによって測定され、使用される脂質組成および製剤化条件に応じて、一般に５０〜１２０ｎｍ（より代表的には、７０〜８０ｎｍ）だった。
【０３０９】
ｓｉＲＮＡの原液を１０ｍＭクエン酸塩、３０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に溶解し、使用するまで４℃において保存した。製剤化する直前に、ｓｉＲＮＡ原液のアリコートを、エタノールと５０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．０との混合物に加えることにより、特定のＰＦＶ組成物において使用される濃度と等価な最終的なエタノール濃度、代表的には、３４体積％エタノールを達成した。
【０３１０】
ｓｉＲＮＡを調製した後、ｓｉＲＮＡとＰＦＶの両方を、所望のインキュベーション温度（使用される脂質組成に応じて２５〜４５℃）において１０分間平衡化した後、混合した。次いで、混合し続けながら、そのＰＦＶにｓｉＲＮＡをすぐに加え、得られた混合物を、選択された温度において３０分間インキュベートした（混合し続けた）。インキュベーションが完了した後、そのサンプルを代表的には、５０ｍＭクエン酸塩またはＰＢＳ（またはＨＢＳ），ｐＨ７．４中に２〜３倍希釈し、タンジェンシャルフロー・ダイアフィルトレーションによってもとの体積に濃縮し、次いで、１０〜１５体積のＰＢＳ（またはＨＢＳ），ｐＨ７．４で洗浄することにより、残渣エタノールを除去し、外部緩衝液を交換した。いくつかの場合において、一般に、小さい処方物体積に関しては、インキュベーション混合物を、予め洗浄された透析チューブ（１００Ｋ  ＭＷｔカットオフ）に入れ、そのサンプルを、ＰＢＳ（またはＨＢＳ），ｐＨ７．４に対して一晩透析した。緩衝液の交換およびエタノールの除去が完了した後、サンプルをタンジェンシャルフロー・ダイアフィルトレーションによって所望のｓｉＲＮＡ濃度に濃縮した。
【０３１１】
粒径解析
リポソーマルｓｉＲＮＡ処方物のサイズ分布を、ＮＩＣＯＭＰ  Ｍｏｄｅｌ３８０サブミクロン粒子寸法測定器（ＰＳＳ  ＮＩＣＯＭＰ，Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて測定した。粒子の平均直径は、通常、使用される脂質組成に応じて、５０〜１２０ｎｍの範囲だった。リポソーマルｓｉＲＮＡ処方物は、通常均一であり、使用される脂質組成および製剤化条件に応じて、２０〜５０ｎｍの標準偏差（平均粒径からの）を有した。
【０３１２】
被包されていない（遊離）ｓｉＲＮＡを定量するためのイオン交換クロマトグラフィ
ＤＥＡＥセファロースカラムまたは市販の遠心分離デバイス（Ｖｉｖａｐｕｒｅ  Ｄ  Ｍｉｎｉカラム，カタログ番号ＶＳ−ＩＸ０１ＤＨ２４）を使用する陰イオン交換クロマトグラフィを用いて、リポソーム処方物中の遊離ｓｉＲＮＡの量を測定した。ＤＥＡＥセファロースカラムの場合、ｓｉＲＮＡ含有処方物を、ＨＢＳ（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）で平衡化されたカラム（約２．５ｃｍの床の高さ，１．５ｃｍの直径）から溶出した。最初のサンプルおよび溶出サンプルのアリコートを、それぞれＨＰＬＣおよびＡ２６０によって脂質およびｓｉＲＮＡの含有量についてアッセイした。被包パーセントを、カラム前およびカラム後のサンプルのｓｉＲＮＡと脂質との相対的な比に基づいて計算した。
【０３１３】
Ｖｉｖａｐｕｒｅ遠心デバイスの場合、ｓｉＲＮＡ含有処方物のアリコート（０．４ｍＬ，＜１．５ｍｇ／ｍＬ  ｓｉＲＮＡ）を、遠心分離（２０００×ｇ、５分間）によって正に帯電した膜を通して溶出した。カラム前およびカラム後のサンプルのアリコートを、上に記載されたように解析することにより、サンプル中の遊離ｓｉＲＮＡの量を測定した。
【０３１４】
ｓｉＲＮＡ濃度の測定
脂質を可溶化した後の２６０ｎｍにおける吸光度を計測することによってｓｉＲＮＡ濃度を測定した。ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（Ｂｌｉｇｈら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−９１７（１９５９）によって概説された手順に従って、脂質を可溶化した。簡潔には、リポソーマルｓｉＲＮＡ処方物のサンプルを、１：２．１：１（水性サンプル：メタノール：クロロホルム）という体積比でクロロホルム／メタノールと混合した。その溶液が、混合した後に、完全に透き通らない（すなわち、単一の透き通らない相である）場合、さらに５０〜１００ｍＬ（体積を記録した）のメタノールを加え、そのサンプルを再混合した。いったん、透き通った単相が得られたら、そのサンプルを、分光光度計を用いて２６０ｎｍにおいてアッセイした。約４５μｇ／ｍＬ＝１．０ＯＤという換算係数を使用し、１．０ｃｍのパス長を使用して、Ａ２６０の読み出しからｓｉＲＮＡ濃度を決定した。クロロホルム／メタノール／水単相における換算係数は、各脂質組成物に対して変動し（３５〜５０μｇ／ｍＬ＝１．０ＯＤ）、新規脂質処方物の各々に対しては、既知量のｓｉＲＮＡを使用して経験的に決定される。
【０３１５】
脂質の濃度および比の測定
Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（オートサンプラー、ＨＰＬＣポンプおよびカラムヒーター）、Ｗａｔｅｒｓ  ２４２４  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＥＬＳＤ）およびＷａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ  ＨＰＬＣソフトウェア（バージョン５．００．００．００，ビルド番号１１５４；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）からなるＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムを使用して、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ−脂質（例えば、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）および陽イオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）を、標準試料に対して測定した。９０％エタノール中に０．８ｍｇ／ｍＬの総脂質を含むサンプル（１５μＬ）を、５５℃に加熱された２．５μｍ充填材，２．１ｍｍ×５０ｍｍを有する逆相ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に注入し、そして０．５ｍＬ／分という一定の流速の勾配溶出によってクロマトグラフィに供した。移動相の組成を、１６分間にわたって、１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３：メタノール（２０：８０）からＴＨＦ：１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３：メタノール（１６：４：８０）に変化させた。ＥＬＳＤにおけるガス圧を２５ｐｓｉに設定し、噴霧器の加熱器−冷却器の設定値およびドリフト管温度の設定値を、それぞれ１００％および８５℃に設定した。測定された脂質濃度（ｍｇ／ｍＬ）をモル濃度に変換し、相対的な脂質比を処方物中の総脂質についてのｍｏｌ％として表した。
【０３１６】
被包効率の決定
タンジェンシャルフロー・ダイアフィルトレーションまたは陰イオン交換クロマトグラフィによって外部のｓｉＲＮＡを除去した後に、捕捉効率を決定した。最初の処方物インキュベーション混合物中の、およびタンジェンシャルフロー・ダイアフィルトレーションの後の、ｓｉＲＮＡおよび脂質の濃度を測定した（上に記載されたように）。ｓｉＲＮＡと脂質との比（ｗｔ／ｗｔ）をそのプロセス中の両方の点において測定し、ｓｉＲＮＡと脂質との比の最後と最初との比を得て、その結果に１００を乗算することにより、パーセンテージを得ることによって、被包効率を決定した。
【０３１７】
これらの研究の結果を表５に提供する。
【０３１８】
実施例２１
核酸−脂質粒子を用いた哺乳動物の遺伝子発現の制御
凝固カスケードにおいて重要なタンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、肝臓（肝細胞）において合成され、血漿中に分泌される。血漿中のＦＶＩＩレベルは、単純なプレートベースの比色定量アッセイによって測定され得る。このように、ＦＶＩＩは、肝細胞由来タンパク質のｓｉＲＮＡ媒介性のダウンレギュレートを測定するため、ならびに核酸脂質粒子およびｓｉＲＮＡの血漿濃度および組織分布のモニタリングのための簡便なモデルである。
【０３１９】
マウスにおける第ＶＩＩ因子のノックダウン
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内（ボーラス）注射した２４時間後のＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡで処置された動物において、ＦＶＩＩ活性を評価した。マイクロプレートスケールにおいて、市販のキット（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩ  Ｋｉｔ商標；Ａｎｉａｒａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｓｏｎ，ＯＨ）を製造者の指示書に従って使用して、ＦＶＩＩを測定した。未処置コントロールマウスに対するＦＶＩＩの減少を測定し、その結果を、％残留ＦＶＩＩとして表した。４つの用量レベル（２、５、１２．５、２５ｍｇ／ｋｇのＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ）を、各新規リポソーム組成物の最初のスクリーニングにおいて使用し、そして最初のスクリーニングにおいて得られた結果に基づいて、その後の研究においてこの投薬を広げた。
【０３２０】
耐容性の測定
各新規リポソーマルｓｉＲＮＡ処方物の耐容性を、体重の変化、ケージサイド観察、臨床化学、およびいくつかの場合では血液学をモニターすることによって評価した。処置前および処置の２４時間後に動物の体重を記録した。データは、体重の％変化として記録した。体重測定に加えて、肝臓機能マーカーを含む完全な臨床化学パネルを、ＦＶＩＩ解析のために採取された血清のアリコートを用いて、注射の２４時間後に各用量レベル（２、５、１２．５および２５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡ）において得た。解析のために、サンプルをＣｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ（Ｌａｎｇｌｅｙ，ＢＣ）に送付した。いくつかの場合において、血液学解析に向けて、全血を採取するために追加のマウスを処置群に含めた。
【０３２１】
治療指数の決定
治療指数（ＴＩ）は、毒性の測定値と活性の測定値とを比較することによって生成される任意パラメータである。これらの研究の場合、ＴＩは：
ＴＩ＝ＭＴＤ（最大耐用量）／ＥＤ５０（５０％ＦＶＩＩノックダウンのための用量）
として決定した。
【０３２２】
これらの研究に対するＭＴＤは、体重の＞７％減少、およびげっ歯類における肝臓損傷に対して良好な特異性を有する臨床化学マーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の＞２００倍増加をもたらす、最小用量として設定した。ＥＤ５０は、ＦＶＩＩ用量−活性曲線から決定された。
【０３２３】
ｓｉＲＮＡ血漿レベルの測定
蛍光標識されたｓｉＲＮＡ（Ｃｙ−３標識ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ）を使用して、Ｃｙ３蛍光の血漿レベルを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＶ注射の０．５および３時間後に評価した。まず、タンパク質含有生物学的マトリックスからＣｙ３−ｓｉＲＮＡを抽出し、次いで、その抽出物中のＣｙ−３標識の量を蛍光によって解析することによって、測定を行った。血液をＥＤＴＡ含有Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ内に回収し、２〜８℃、２５００ｒｐｍにおいて１０分間遠心することにより、血漿を単離した。その血漿をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、すぐにアッセイしたか、または−３０℃の冷凍庫内で保存した。その血漿のアリコート（最大１００μＬ）をＰＢＳ（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩，ｐＨ７．５）で５００μＬに希釈し、次いで、メタノール（１．０５ｍＬ）およびクロロホルム（０．５ｍＬ）を加え、そしてサンプルをボルテックスすることにより、透き通った単相溶液を得た。さらに水（０．５ｍＬ）およびクロロホルム（０．５ｍＬ）を加え、得られたエマルジョンを、最低でも３分間、定期的に混合することによって持続した。その混合物を３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、Ｃｙ−３標識を含む水（上）相を新しいチューブに移した。その溶液の蛍光を、５５０ｎｍの励起波長（２ｎｍ帯域幅）および６００ｎｍの発光波長（１６ｎｍ帯域幅）においてＳＬＭ蛍光光度計を用いて測定した。未処置動物からの血漿のアリコートを、Ｃｙ−３−ｓｉＲＮＡ（０〜１５μｇ／ｍＬ）を含む処方物および上に示されたように処理されたサンプルと組み合わせることによって、検量線を生成した。データを、血漿Ｃｙ−３濃度（μｇ／ｍＬ）として表した。
【０３２４】
ｓｉＲＮＡ体内分布の測定
Ｃｙ３蛍光の組織（肝臓および脾臓）レベルを、各新規リポソーマルｓｉＲＮＡ処方物について、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＶ注射の０．５および３時間後に評価した。市販のフェノール／クロロホルム（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬）抽出の後に、各組織の一部を総蛍光について解析し、細胞内送達を評定するために他の部分を共焦点顕微鏡によって評価した。各組織を回収した後、重量を量り、２片に分けた。
【０３２５】
食塩水で灌流された動物から得られた肝臓の切片（４００〜５００ｍｇ）をＦａｓｔｐｒｅｐチューブに正確に量り入れ、そしてＦａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０装置を用いて１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中でホモジナイズした。そのホモジネートのアリコート（代表的には、５０ｍｇの組織と等価）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、Ｔｒｉｚｏｌをさらに加えることにより、最終体積１ｍＬを達成した。クロロホルム（０．２ｍＬ）を加え、その溶液を混合し、２〜３分間インキュベートした後、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。Ｃｙ３を含む水（上）相のアリコート（０．５ｍＬ）を０．５ｍＬのＰＢＳで希釈し、そのサンプルの蛍光を上に記載されたように測定した。
【０３２６】
食塩水で灌流処置された動物からの脾臓を、Ｆａｓｔｐｒｅｐチューブを用いて１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中でホモジナイズした。そのホモジネートにクロロホルム（０．２ｍＬ）を加え、２〜３分間インキュベートし、２〜８℃、１２０００×ｇで１５分間遠心した。上の水相のアリコートを０．５ｍＬのＰＢＳで希釈し、そのサンプルの蛍光を上に記載されたように測定した。そのデータを、注射された用量の％（各組織において）および組織Ｃｙ−３濃度（μｇ／ｍＬ）として表した。
【０３２７】
共焦点顕微鏡観察用の調製では、食塩水で灌流された動物から回収された組織の全部または一部を市販の１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。組織をＰＢＳ，ｐＨ７．５中ですすぎ、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｔｅｍ．ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ．ｄｅ／ｒｅｎｉ／ｔｒｉｍｍｉｎｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）において入手可能なＲＥＮＩ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒｉｍｍｉｎｇに従って解剖した。それらの検体をＨｉｓｔｏＰｒｅｐ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｔｔａｗａ  ＯＮ，ＳＨ７５−１２５Ｄ）で満たされた型の中に切断面を下にして置き、平衡点に達するまで液体窒素中で冷却して２−メチルブタン中で凍結した。次に、凍結ブロックを、クライオチャンバー（−１８℃）内のクライオミクロトーム（ＣＭ１９００；Ｌｅｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に固定し、そして２．５°のすきま角を有する使い捨てステンレス鋼刃（Ｆｅａｔｈｅｒ  Ｓ３５，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｔｔａｗａ  ＯＮ）で切断した。次いで、そのサンプルを１０μｍの厚さに切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｔｔａｗａ  ＯＮ，１２−５５０−１５）上に回収し、室温において１分間乾燥し、−２０℃で保存した。スライドをＰＢＳ中で３回すすぐことにより、ＨｉｓｔｏＰｒｅｐを除去し、Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄハードセット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ，Ｈ−１４００）でマウントし、顕微鏡解析の間、凍結した。いくつかの場合において、ＴＯＴＯ−３（１：１０，０００希釈）を用いて核を染色した。
【０３２８】
適切な蛍光色素の励起のために４８８ｎｍ（緑色）５６８ｎｍ（赤色）および６３３ｎｍ（青色）のレーザー線を使用する１０×および６０×倍率のＮｉｋｏｎ免疫蛍光共焦点顕微鏡Ｃ１を用いて、蛍光を可視化し、像を捕捉した。生データを、ＩｍａｇｅＪ．１．３７ｖを用いてインポートすることにより、Ｚ積層型の複数（２〜３つ）の切片を選択し、生成し、そしてＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ９．０によって、異なるチャネルから得られた蛍光色素の励起の際に捕捉された像をマージした。
【０３２９】
これらの実験の結果を表６に提供する。本発明のマウスモデルにおける有用性を証明する処置は、同様の投与量および投与様式においてヒト疾患の条件に対して試験するための優秀な候補である。
【０３３０】
実施例２２
核酸負荷および粒子安定性に対する負荷条件の影響
オリゴヌクレオチド負荷およびベシクル安定性に対する様々な負荷条件（エタノール濃度、時間、温度および核酸：脂質比を含む）の影響を測定した。
【０３３１】
オリゴヌクレオチド負荷およびベシクル安定性に対するエタノール濃度の影響
被包プロセス中のエタノールの存在は、脂質の再配列およびポリヌクレオチドの被包を促進するために必要である。しかしながら、エタノールの濃度が高すぎると、膜不安定性をもたらし得るので、必要なエタノールの量は、様々な脂質組成物に対して変動する。
【０３３２】
１６ｍｅｒのホスホジエステルオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）をＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ（４０：１０：４８：２モル比）ベシクル内に被包するために３２、３４および３６％エタノールを用いる影響を、図１Ａに示す。２３℃におけるインキュベーションの３０分後、３２および３４％エタノール含有混合物は、７５〜８５％の被包をもたらしたのに対し、３６％エタノールを含む混合物は、たった２８％の被包を有しただけであり、これは、６０分まで増加しなかった（図１Ａ）。３６％エタノールサンプルにおいて見られた低い被包は、Ｎｉｃｏｍｐ粒子寸法測定器を用いて準弾性光散乱によって測定される、大きいベシクルサイズの増加と相関したことから（図１Ｂ）、そのベシクル膜が不安定化され、そして著しいベシクル間融合が生じたことが示唆される。このベシクル不安定性は、３２および３４％エタノール含有サンプルを用いてインキュベーション時間を６０分に延長するときにも生じ得（図１Ｂ）、そしてＯＤＮ被包の喪失とも相関し得る（図１Ａ）。
【０３３３】
オリゴヌクレオチド負荷ベシクル安定性に対する時間および温度の影響
ＯＤＮ被包の程度および動態に対する温度の影響を、ＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ（４０：１０：４２：８，モル比）ベシクルを用いて特徴づけた。ベシクルを、３４％エタノールを含む５０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４緩衝液中において、ＯＤＮとともに０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の初期比でインキュベートした。３０℃のインキュベーション温度を用いたとき、７０％の最大被包が得られ、その３０分後、被包効率は、測定値の誤差範囲内で変化しないままだった（図２Ａ）。４０℃では、８０〜９０％の被包効率が、１５〜６０分間にわたって観察された（図２Ａ）。準弾性光散乱によって、ベシクルサイズの変化もモニターした。３０℃（データ示さず）と４０℃（図３Ｂ）の両方において、ベシクルサイズは、安定したままだった。
【０３３４】
被包効率に対するｓｉＲＮＡと脂質との比および製剤化プロセスの影響
陽イオン性脂質含有ベシクルによって被包され得るｓｉＲＮＡの量（被包されたｓｉＲＮＡと脂質との比として測定される）は、所与の脂質組成および／または製剤化プロセスについて、飽和レベルに達し得る。
【０３３５】
予め形成されたベシクル法（ＰＦＶ）を用いたとき、被包されたｓｉＲＮＡと脂質との最大比が、約０．０５０（ｗｔ／ｗｔ）において観察された。表１に示されるように、０．０６１（ｗｔ／ｗｔ）というｓｉＲＮＡと脂質との初期比をインキュベーション混合において使用したとき、ＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）ベシクルにおいて０．０４９という最終被包比が得られ、これは、８０％被包と相関した。しかしながら、０．２４４というより高いｓｉＲＮＡ／脂質初期比では、０．０５２という同様の最終被包比が観察され、これは、２１％被包と相関した。得られた最大ｓｉＲＮＡ／脂質比は、ｓｉＲＮＡの負に帯電したバックボーンと相互作用するために利用可能な正電荷の量によって限定され得る。しかしながら、０．０６０というｓｉＲＮＡ／脂質比では、負電荷に対して約３倍過剰量の正電荷がなおも存在することから、これらの条件下での被包が、電荷相互作用によって制限されないことが示唆される。
【０３３６】
Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５１０：１５２−６６（２００１）およびＳｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃら、Ｍｅｈｔｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１３：３２２−４１（２０００）に記載されているような代替の製剤化方法（「従来法」）を用いると、より高い被包ｓｉＲＮＡ／脂質比が得られた。簡潔には、陽イオン性ベシクルをｓｉＲＮＡとともにインキュベートすることによって脂質再配列およびｓｉＲＮＡ被包を誘導する（ＰＦＶ法）代わりに、脂質を１００％エタノール中に可溶化し、ｐＨ４においてｓｉＲＮＡを含む水溶液に直接加える（最終的に３４％エタノール）。この方法を用いると、より高いインキュベーションｓｉＲＮＡ／脂質比を使用したとき、被包ｓｉＲＮＡ／脂質比の漸進的な増加が観察された（表１）。０．０６０および０．１２０というｓｉＲＮＡ／脂質の初期比では、ほぼ完全な被包が観察された；しかしながら、０．２４０というｓｉＲＮＡ／脂質の初期比では、たった６１％の被包しか得られなかったことから、プラトーに達したことが示唆される。このプラトーは、ｓｉＲＮＡの陰イオン性バックボーンと相互作用するために利用可能な正電荷（すなわち、陽イオン性脂質）の飽和を反映し得る。得られた０．１４７というｓｉＲＮＡ／脂質比（ｗｔ／ｗｔ）（表３）は、０．１７８という理論上の電荷中和比に近い。
【０３３７】
ＰＦＶ手法を用いるとき、ＤＬｉｎＤＭＡ／ＣＨ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧから構成される処方物中の陽イオン性脂質のモル％を増加させることによってｓｉＲＮＡ／脂質比は増加されず、そして７０モル％のＤＬｉｎＤＭＡでは、ｓｉＲＮＡと脂質との比は、５０および６０モル％のＤＬｉｎＤＭＡにおいて得られた比から有意に低下した（表４）。
【０３３８】
【表３】
2014132014.tif 000085
【０３３９】
【表４】
2014132014.tif 000086
実施例２３
核酸−脂質粒子の薬物動態、体内分布および生物学的活性に対する陽イオン性脂質の影響
様々な核酸−脂質粒子のインビボにおける特徴に対する様々な陽イオン性脂質処方物の影響を、本質的には実施例２１に記載されたように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを用いて調べた。試験された様々な脂質組成物を表５に記載する。
【０３４０】
４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％アミノ脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）という名目上の脂質比で、処方物を生成した。血漿、肝臓および脾臓中のＣｙ−３蛍光を、実施例２１に記載されたように評価した。いくつかの例外が存在するが、概して、ＦＶＩＩ特異的ｓｉＲＮＡとともに製剤化されたとき、ＩＶ注射の０．５時間後にＣｙ−３蛍光の最低血漿レベルおよび最高肝臓レベルを有する処方物が、第ＶＩＩ因子モデルにおいて最大の活性を示した。これらの研究の結果を表６に要約する。
【０３４１】
アミノ脂質リンカー化学の影響を評価するために、様々な脂質処方物が第ＶＩＩ因子の発現をノックダウンする能力を、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを用いる肝臓モデルにおいて測定した。各脂質における頭部基の構造は、同じだった。各処方物は、４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％アミノ脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）という名目上の脂質比において生成された。サンプルを、図３に示される用量でＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に注射した。血清中の第ＶＩＩ因子レベルを、注射の２４時間後に、コントロールマウスに対して測定した。５０％の第ＶＩＩ因子減少を達成する用量（ｍｇ／ｋｇ）は、ケタール結合（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ脂質）を用いるとき、エーテル結合（ＤＬｉｎＤＭＡ脂質）と比べて約１０倍、エステル結合（ＤＬｉｎＤＡＰ脂質；図３）と比べて約１００倍改善された。
【０３４２】
【表５】
2014132014.tif 000087
【０３４３】
【表６】
2014132014.tif 000088
実施例２４
核酸−脂質粒子の耐容性および治療指数に対する陽イオン性脂質の影響
実施例２０において概説されたように、様々な核酸−脂質処方物を調製した。各処方物に対する名目上の脂質比は、４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％アミノ脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）であり、ｓｉＲＮＡと脂質との名目上の比は、０．０４６６（μｇｓｉＲＮＡｓｉＲＮＡ／μｍｏｌ総脂質）だった。死亡率／罹患率、体重の変化およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；肝臓損傷に対する血漿マーカー）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＩＶ注射の２４時間後に、様々なｓｉＲＮＡ用量（２、５、１２．５および２５ｍｇ／ｋｇ）に対して測定した。２５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量における平均体重減少に基づいて、処方物を選別した。これらの研究の結果を表７に要約する。
【０３４４】
治療指数の推定値を、第ＶＩＩ因子用量反応曲線（例えば、実施例２３、図２）におけるＥＤ５０値および最大耐用量（ＭＴＤ）を決定する耐容性の評価から導くことによって、ある特定の処方物について決定した。これらの処方物に対するＭＴＤを最低用量として設定することにより、≧７％体重減少、ＡＬＴの２００倍増加および重篤な臨床的徴候無しがもたらされた。これらの研究の結果を表８に示す。
【０３４５】
【表７】
2014132014.tif 000089
【０３４６】
【表８】
2014132014.tif 000090
実施例２５
ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを含むリポソーマルＳＩＲＮＡ処方物の耐容性の増強
陽イオン性脂質およびＰＥＧ−脂質の様々な組み合わせを含むリポソーマル処方物の活性および耐容性を試験した。ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡとも称される）とともにＤＬｉｎ−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを含むリポソーマル処方物を、実施例２０および２１に記載されたように調製し、評価した。評価された特定の処方物の組成および特徴を表９に要約する。
【０３４７】
【表９】
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これらの様々な処方物がＦＶＩＩレベルを低下させる能力およびそれらの耐容性を、実施例２１に記載されたように調べた。
【０３４８】
図４に示されるように、試験されたＰＥＧ−脂質のいずれかとともに陽イオン性脂質ＤＬｉｎ−ＤＭＡを含む処方物は、ＦＶＩＩにおいて同様の用量依存的減少をもたらした。詳細には、ＤＬｉｎ−ＤＭＡを含む処方物は、試験された３つすべてのＰＥＧ−脂質に対してほぼ等しいＥＤ５０を有した。
【０３４９】
対照的に、図５に示されるように、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを含む処方物は、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧとともにより高い活性、およびＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）とともにより低い活性を示した。
【０３５０】
しかしながら、様々な処方物の毒性に劇的な違いが観察された。図６に示されるように。ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡを含む処方物は、以下の毒性のランク順で、等価なＤＬｉｎ−ＤＭＡ処方物よりも毒性が低かった：
ＤＭＡ処方物：ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ＞＞ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ＞ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ  
ＫＤＭＡ処方物：ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ＞＞ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ＝ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ。さらに比較すると、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを含むＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ処方物は、図７Ａおよび７Ｂに示されるように、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧを含むＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ処方物よりも有意に高い耐容性を示した。
【０３５１】
上に記載された様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本明細書において言及された、および／またはＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔに列挙された、米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべてが、本明細書中でそれらの全体が参考として援用される。実施形態の局面は、なおもさらなる実施形態を提供するために、必要であれば様々な特許、出願および公報の概念を使用するために改変され得る。
【０３５２】
上記の詳細な説明に鑑みて、これらの変更および他の変更が、実施形態に対してなされ得る。通常、以下の請求項において、使用される用語は、本明細書および請求項に開示される特定の実施形態に請求項を限定すると解釈されるべきでなく、そのような請求項が権利を与える等価物の全範囲とともにすべてのあり得る実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、請求項は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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