(57)【要約】【課題】生体由来試料中の、プログラニュリンおよび１種以上のグラニュリンペプチドの含有量を定量するための分析方法を提供する。【解決手段】本発明の分析方法は、生体由来試料を準備するステップ；試料中のタンパク質およびペプチドが、所定のアミノ酸の位置において選択的に切断処理され、複数種のペプチドフラグメントが得られるステップ；切断処理後の試料が質量分析装置により分析され、２種以上の所定のプロダクトイオンが検出され定量されるステップ；および各プロダクトイオンの検出量に基づいて、前記試料中の所定のペプチドフラグメントの含有量が算出されるステップ、を有する。グラニュリンペプチドの含有量は、グラニュリン‐中間配列フラグメント量と末端付加フラグメント量との差に基づいて算出される。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来試料中の、プログラニュリンおよび１種以上のグラニュリンペプチドの含有量を、質量分析装置を用いて定量する分析方法であって、
解析すべきタンパク質および／またはペプチドを含有する生体由来試料を準備するステップ；
前記試料中のタンパク質およびペプチドが、所定のアミノ酸の位置において選択的に切断処理され、複数種のペプチドフラグメントが得られるステップ；
前記切断処理後の試料が、
特定の質量電荷比を有するイオンをプリカーサイオンとして選別する第一質量分離部と、
前記選別されたプリカーサイオンのそれぞれを複数種のプロダクトイオンに開裂するイオン開裂部と、
前記プロダクトイオンを質量電荷比に基づいて選別する第二質量分離部と、
前記第二質量分離部で選別された特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンを検出して定量する検出部と、
を備える質量分析装置により分析され、２種以上の所定のプロダクトイオンが検出され定量されるステップ；および
前記各プロダクトイオンの検出量に基づいて、前記試料中の所定のペプチドフラグメントの含有量が算出されるステップ、を有し、
前記所定のプロダクトイオンが検出され定量されるステップにおいて、
（Ａ）グラニュリンペプチドのアミノ酸配列の連続する少なくとも６個のアミノ酸からなり、かつ前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＮ末端配列部分およびＣ末端配列アミノ酸配列部分のいずれも含まない、グラニュリン‐中間配列フラグメント、ならびに
（Ｂ１）前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側から連続する少なくとも３個のアミノ酸配列のＮ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合したグラニュリン‐Ｎ末端付加フラグメント、および（Ｂ２）前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＣ末端側から連続する少なくとも３個のアミノ酸配列のＣ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合した、グラニュリン‐Ｃ末端付加フラグメント、からなる群から選択される１種以上の末端付加フラグメント；
を含む、２種以上のペプチドフラグメントのそれぞれに由来するプリカーサイオンの開裂により生じたプロダクトイオンが定量され、
前記各プロダクトイオンの量から算出される、グラニュリン‐中間配列フラグメント量と末端付加フラグメント量との差に基づいて、前記試料中の前記グラニュリンペプチドの含有量が算出される、分析方法。
【請求項２】
前記グラニュリンペプチドは、グラニュリン３ペプチドおよびグラニュリン４ペプチドであり、
前記所定のプロダクトイオンが検出され定量されるステップにおいて、
（Ａ１）グラニュリン３ペプチドのアミノ酸配列の連続する少なくとも６個のアミノ酸からなり、かつ前記グラニュリン３ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端配列部分およびＣ末端配列アミノ酸配列部分のいずれも含まない、グラニュリン３‐中間配列フラグメント；
（Ａ２）グラニュリン４ペプチドのアミノ酸配列の連続する少なくとも６個のアミノ酸からなり、かつ前記グラニュリン４ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端配列部分およびＣ末端配列アミノ酸配列部分のいずれも含まない、グラニュリン４‐中間配列フラグメント；ならびに
（Ｂ１）前記グラニュリン３ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側から連続する少なくとも３個のアミノ酸配列のＮ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合したグラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメント、および（Ｂ２）前記グラニュリン４ペプチドのアミノ酸配列のＣ末端側から連続する少なくとも３個のアミノ酸配列のＣ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合したグラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメント、からなる群から選択される１種以上の末端付加フラグメント；
を含む、３種以上のペプチドフラグメントのそれぞれに由来するプリカーサイオンの開裂により生じたプロダクトイオンが定量され、
前記各プロダクトイオンの量から算出される、グラニュリン３‐中間配列フラグメント量と末端付加フラグメント量との差に基づいて、前記試料中の前記グラニュリン３ペプチドの含有量が算出され、
前記各プロダクトイオンの量から算出される、グラニュリン４‐中間配列フラグメント量と末端付加フラグメント量との差に基づいて、前記試料中の前記グラニュリン４ペプチドの含有量が算出される、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記所定のプロダクトイオンが検出され定量されるステップにおいて、前記グラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメント（Ｂ１）、および前記グラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメント（Ｂ２）、のそれぞれに由来するプリカーサイオンの開裂により生じたプロダクトイオンが定量され、
前記各プロダクトイオンの量から算出された、グラニュリン３‐中間配列フラグメント量とグラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメント量との差に基づいて、前記試料中の前記グラニュリン３ペプチドの含有量が算出され、
前記各プロダクトイオンの量から算出された、グラニュリン４‐中間配列フラグメント量とグラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメント量との差に基づいて、前記試料中の前記グラニュリン４ペプチドの含有量が算出される、請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記所定のアミノ酸の位置における選択的な切断処理は、リジン残基およびアルギニン残基のＣ末端側のペプチド結合が選択的に切断される処理である、請求項２または３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記試料がヒトまたはマウス由来の試料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記試料がマウス由来の試料であり、
前記グラニュリン３‐中間配列フラグメント（Ａ１）が、配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列を有し、
前記グラニュリン４‐中間配列フラグメント（Ａ２）が、配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列を有し、
前記グラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメント（Ｂ１）が、配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列を有し、
前記グラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメント（Ｂ２）が、配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記試料が、血液、血清、組織抽出液、細胞抽出液、尿または脳脊髄液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項８】
特定の質量電荷比を有するイオンをプリカーサイオンとして選別する第一質量分離部；前記選別されたプリカーサイオンのそれぞれを複数種のプロダクトイオンに開裂するイオン開裂部；前記プロダクトイオンを質量電荷比に基づいて選別する第二質量分離部；前記第二質量分離部で選別された特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンを検出して定量する検出部；ならびに、前記第一質量分離部、前記イオン開裂部、前記第二質量分離部、および前記検出部を制御して分析を実行するとともに、得られたデータを解析するコンピュータを備える制御部、を備える質量分析装置を用いて、生体由来試料中のプログラニュリンおよび１種以上のグラニュリンペプチドの含有量を定量分析するために用いられるプログラムであって、
前記第一質量分離部において、（Ａ）グラニュリンペプチドのアミノ酸配列の連続する少なくとも６個のアミノ酸からなり、かつ前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＮ末端配列部分およびＣ末端配列アミノ酸配列部分のいずれも含まない、グラニュリン‐中間配列フラグメント、ならびに（Ｂ１）前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側から連続する少なくとも３個のアミノ酸配列のＮ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合したグラニュリン‐Ｎ末端付加フラグメント、および（Ｂ２）前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＣ末端側から連続する少なくとも３個のアミノ酸配列のＣ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合した、グラニュリン‐Ｃ末端付加フラグメント、からなる群から選択される１種以上の末端付加フラグメント、のそれぞれに由来するプリカーサイオンを、各プリカーサイオンに対して予め定められた質量電荷比に基づいて選別するプリカーサイオン選別ステップ；
前記第二質量分離部において、前記プリカーサイオン選別ステップで選別された各プリカーサイオンの開裂により生じたプロダクトイオンが、各プロダクトイオンに対して予め定められた質量電荷比に基づいて選別されるプロダクトイオン選別ステップ；および
前記プロダクトイオン選別ステップで選別された各プロダクトイオンを前記検出部で検出して定量するプロダクトイオン検出ステップ
を、前記コンピュータに実行させることを特徴とする、分析用プログラム。
【請求項９】
さらに、
前記プロダクトイオン検出ステップで定量された、前記グラニュリン‐中間配列フラグメントの開裂により生じたプロダクトイオンの量から、グラニュリン‐中間配列フラグメントの含有量を算出するステップ；
前記プロダクトイオン検出ステップで定量された、前記末端付加フラグメントの開裂により生じたプロダクトイオンの量から、末端付加フラグメントの含有量を算出するステップ；および
前記グラニュリン‐中間配列フラグメントの含有量と前記末端付加フラグメントの含有量との差から、前記試料中の前記グラニュリン４ペプチドの含有量を算出するステップ、
を、前記コンピュータに実行させることを特徴とする、請求項９に記載の分析用プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液等の生体由来試料中の、プログラニュリンおよびグラニュリンペプチドの含有量を、質量分析装置を用いて個別に定量する分析方法に関する。さらに、本発明は当該分析のためのプログラムおよび質量分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
プログラニュリン（Progranulin、PGRN、別名：プロエピセリン（Proepithelin）／PCDGF／PEPI／GEP／GP88）は、グラニュリン（Granulin、GRN、別名：エピセリン（Epithelin）ドメインを持つ前駆体タンパク質である。ＰＧＲＮは、血中の蛋白質分解酵素（例えば、好中球エラスターゼ）によってプロセッシングを受け、７種のＧＲＮペプチドを生じることが知られている。図１は、ＰＧＲＮとＧＲＮペプチドの関係を表す説明図である。図中の数字は、シグナルペプチドを含むＰＧＲＮのＮ末端からのアミノ酸残基数を表し、上段がマウスＰＧＲＮ、下段がヒトＰＧＲＮの配列に対応している。
【０００３】
マウスＰＧＲＮは、全長５８９個のアミノ酸（配列番号１）からなる約６３ｋＤａのタンパク質であり、７種のグラニュリンペプチドのうち、５６個のアミノ酸からなるＧＲＮ３ペプチド（配列番号２）と、５５個のアミノ酸からなるＧＲＮ４ペプチド（配列番号３）が同定されている（非特許文献１）。ヒトＰＧＲＮは、全長５９２個のアミノ酸（配列番号４）からなる約６３ｋＤａのタンパク質であり、５６個のアミノ酸からなるＧＲＮ３ペプチド（配列番号５）と、５５個のアミノ酸からなるＧＲＮ４ペプチド（配列番号６）が同定されている。
【０００４】
ＰＧＲＮは、様々な疾患に関係する蛋白質であることが知られている。例えば、２型糖尿病に特徴的な病態であるインスリン抵抗性では、血中でＰＧＲＮが増加し、インスリン抵抗性を惹起することが報告されている（非特許文献２）。また、近年、ＰＧＲＮのプロセッシング等により生ずるＧＲＮペプチドが、リウマチの発症に関与することが報告され、注目されている（非特許文献３）。このように、ＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドは、様々な疾患と関連しているため、ＰＧＲＮを創薬標的とする薬剤のスクリーニングの開発や、リウマチ、糖尿病等の診断法開発への応用が期待されている。例えば、特許文献１では、ＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドを、インスリン抵抗性マーカーとして用いることが提案されている。ＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドに対する定量技術は、様々な疾患の検出や病態解明に有用であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０４４７５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【特許文献１】Bateman A. et al.,  J. Endocrinol,  vol. 158,  pp.145-151  （１９９８年）
【特許文献２】Matsubara T. et al.,  Cell Metab.,  vol. 15,  pp. 38-59  （２０１２年）
【特許文献３】Tang W. et. al.,  Science,  vol. 332,  pp. 478-484,  （２０１１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＰＧＲＮは、細胞外でプロセッシングを受けてＧＲＮペプチドを生じるため、疾患の検出や病態解明のためには、血液等の生体由来試料中のＰＧＲＮやＧＲＮペプチドを個別に定量する必要がある。しかしながら、従来、ＰＧＲＮやＧＲＮペプチドの定量に用いられている酵素抗体法では、細胞外の生体由来試料中のＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドを個別的かつ選択的に検出することができない。
【０００８】
生体由来試料等の様々な夾雑物を含有する試料中のタンパク質やペプチドを個別に定量する方法として、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とタンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）とを組み合わせたＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたマルチプル・リアクション・モニタリング（ＭＲＭ）分析の応用が進んでいる。ＭＲＭ分析では、試料中の各成分がＬＣで時間的に分離されて質量分析装置に導入される。質量分析装置に導入された試料は、イオン化プローブでイオン化され、様々なイオンを生じる。プローブで発生したイオン（プリカーサイオン）は、前段の第一質量分離部で、質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて検出対象となる特定のイオンが選択され、イオン開裂部で、衝突誘起解離（ＣＩＤ）により複数種のイオン（プロダクトイオン）に開裂される。後段の第二質量分離部で、ｍ／ｚに基づいて特定のプロダクトイオンが検出器へ透過され、検出器でプロダクトイオンが定量される。ＭＲＭ分析では、分析対象となる各成分について、第一質量分離部で選別される１種以上のプリカーサイオンのｍ／ｚと、各プリカーサイオンについて、第二質量分離部で選別される１種以上のプロダクトイオンのｍ／ｚを予め定めておく必要がある。
【０００９】
蛋白質やペプチドは高分子量であるため、ＭＲＭ分析では、試料中のタンパク質をプロテアーゼ処理により、特定のアミノ酸配列位置で切断して低分子量化したペプチドフラグメントを分析対象として分析が行われる。様々な夾雑物を含有する試料のＭＲＭ分析では、分析対象以外のタンパク質やペプチドが、分析対象のタンパク質やペプチドと同一のプリカーサイオンやプロダクトイオンを生じる可能性がある。そのため、生体由来試料中の蛋白質やペプチドのＭＲＭ分析では、分析対象のタンパク質やペプチドに特有のプリカーサイオンとプロダクトイオンの組合せ（ＭＲＭ条件）を適切に選択することが重要となる。
【００１０】
また、１つの試料中に含まれる複数種の蛋白質やペプチドを個別に定量するためには、各分析対象に特有のプリカーサイオンとプロダクトイオンの組合せを選択する必要がある。しかしながら、ＰＧＲＮはＧＲＮペプチドの前駆体であるため、両者は共通のプリカーサイオンやプロダクトイオンを生じる。すなわち、ＧＲＮペプチドのアミノ酸配列は、ＰＧＲＮのアミノ酸配列の一部と共通しているため、ＰＧＲＮとＧＲＮペプチドが混在する生体由来試料をプロテアーゼにより断片化すると、両者は同一のフラグメントを生じ得る。そのため、ＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドのそれぞれに特有のプリカーサイオンとプロダクトイオンの組合せ（ＭＲＭ条件）を選択することは、一般に困難である。
【００１１】
また、７種類のＧＲＮペプチドのうち、ＰＧＲＮからの切断位置が特定されているのは、ＧＲＮ３およびＧＲＮ４の２種類のみであり、その他のＧＲＮの切断位置は、現段階では特定されていない。さらに、ＰＧＲＮやＧＲＮペプチドの糖鎖修飾構造等は、未だ未解明の部分が多い。そのため、アミノ酸配列から予測されるｍ／ｚの値と、実際に得られるプリカーサイオンやプロダクトイオンのｍ／ｚの値とは必ずしも一致するとは限らず、同定が容易ではない。このような事情から、生体由来試料中のＧＲＮペプチドとその前駆体であるＰＧＲＮの個別定量を試みた例はなく、血液等の細胞外の生体由来試料中のＰＧＲＮやＧＲＮを個別に定量する方法は確立されていない。
【００１２】
上記現状に鑑み、本発明は、血液等の生体由来試料中のＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドを個別に定量するための定量分析方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、生体由来試料中のプログラニュリンおよび１種以上のグラニュリンペプチドの含有量を、質量分析装置を用いて定量する分析方法に関する。生体由来試料としては、血液、血清、組織抽出液、細胞抽出液、尿、脳脊髄液等が挙げられる。これらの生体由来試料は、例えばヒトやマウス由来の試料である。
【００１４】
本発明の分析方法は、解析すべきタンパク質および／またはペプチドを含有する生体由来試料を準備するステップ；試料中のタンパク質およびペプチドが、所定のアミノ酸の位置において選択的に切断処理され、複数種のペプチドフラグメントが得られるステップ；切断処理後の試料が、質量分析装置を用いて分析され、２種以上の所定のプロダクトイオンが検出され定量されるステップ；および各プロダクトイオンの検出量に基づいて、試料中の所定のペプチドフラグメントの含有量が算出されるステップ、を有する。
【００１５】
試料中のタンパク質およびペプチドを、所定のアミノ酸の位置において選択的に切断処理するためには、トリプシン等のプロテアーゼを用いた処理が好適である。一実施形態において、切断処理は、リジン残基およびアルギニン残基のＣ末端側のペプチド結合が選択的に切断される処理である。
【００１６】
切断処理後の試料の分析は、第一質量分離部と、イオン開裂部と、第二質量分離部と、検出器とを備える質量分析装置によって行われる。質量分析装置としては、例えば、三連四重極型質量分析装置が用いられる。生体由来試料は、種々の夾雑物を含有しているため、試料が質量分析装置に導入される前に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により、試料中の各成分が時間的に分離されることが好ましい。すなわち、本発明の分析方法では、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とタンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）とを組み合わせたＬＣ／ＭＳ／ＭＳが好適に用いられる。
【００１７】
質量分析装置の第一質量分離部、イオン開裂部、第二質量分離部、および検出器の動作は、制御部により制御され得る。制御部は、上記分析を実行するとともに、得られたデータを解析する、コンピュータを備える。
【００１８】
質量分析装置に導入された試料は、イオン化プローブでイオン化された後、第一質量分離部において、特定の質量電荷比を有するイオンがプリカーサイオンとして選別される。選別されたプリカーサイオンのそれぞれは、イオン開裂部において、複数種のプロダクトイオンに開裂される。プロダクトイオンは、第二質量分離部において質量電荷比に基づいて選別され、特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンが検出部で検出され、定量される。
【００１９】
第一質量分離部で選別されるプリカーサイオンの質量電荷比、および第二質量分離部で選別されるプリカーサイオンの質量電荷比は、いずれも、定量対象となるペプチドフラグメントの種類に対応して、予め定められている。質量分析装置では、（Ａ）グラニュリンペプチドのアミノ酸配列の連続する少なくとも６個のアミノ酸からなり、かつ前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＮ末端配列部分およびＣ末端配列アミノ酸配列部分のいずれも含まない、グラニュリン‐中間配列フラグメント、ならびに（Ｂ１）前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側から連続する少なくとも３個のアミノ酸配列のＮ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合したグラニュリン‐Ｎ末端付加フラグメント、および（Ｂ２）前記グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＣ末端側から連続する少なくとも３個のアミノ酸配列のＣ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合した、グラニュリン‐Ｃ末端付加フラグメント、からなる群から選択される１種以上の末端付加フラグメント；を含む、２種以上のペプチドフラグメントのそれぞれに由来するプリカーサイオンの開裂により生じたプロダクトイオンが定量される。
【００２０】
各フラグメントの量は、質量分析により得られたプロダクトイオン量に基づいて、予め求められた検量線との関連付けや、試料中に添加された内部標準試料に由来するプロダクトイオンのピーク面積との関連付け等によって算出される。グラニュリンペプチドの含有量は、グラニュリン‐中間配列フラグメント量と末端付加フラグメント量との差に基づいて、算出される。
【００２１】
本発明の一形態において、定量対象となるグラニュリンペプチドは、グラニュリン３ペプチドおよびグラニュリン４ペプチドである。この場合、質量分析装置では、グラニュリン３‐中間配列フラグメントおよびグラニュリン４‐中間配列フラグメントのそれぞれに由来するプリカーサイオンの開裂により生じたプロダクトイオン、ならびにグラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメントおよびグラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメントからなる群から選択される１種以上の末端付加フラグメントの開裂により生じたプロダクトイオンを含む、３種以上のペプチドフラグメントの量が算出される。グラニュリン３ペプチドの含有量は、グラニュリン３‐中間配列フラグメント量と末端付加フラグメント量との差に基づいて算出される。グラニュリン４ペプチドの含有量は、グラニュリン４‐中間配列フラグメント量と末端付加フラグメント量との差に基づいて算出される。
【００２２】
定量の正確性を期する観点からは、グラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメント量およびグラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメント量の両方が定量されることが好ましい。この場合、グラニュリン３ペプチドの含有量は、グラニュリン３‐中間配列フラグメント量とグラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメント量との差に基づいて算出される。グラニュリン４ペプチドの含有量は、グラニュリン４‐中間配列フラグメント量とグラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメント量との差に基づいて算出される。
【００２３】
さらに、本発明は、質量分析装置の制御部内のコンピュータに上記分析を実行させるためのプログラム、および当該プログラムがインストールされたコンピュータを備える質量分析装置に関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、生体由来試料中のＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドが個別に定量できる。そのため、ＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドが関連する様々な疾患の検出のための検査や、これらの疾患の病態解明のための研究等への応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】プログラニュリン（ＰＧＲＮ）とグラニュリン（ＧＲＮ）ペプチドの関係を説明するための図である。
【図２】ＰＧＲＮおよびＧＲＮの、プロテアーゼによる断片化を説明するための模式図である。
【図３Ａ】マウスＰＧＲＮのＧＲＮ３ペプチドおよびその近傍のアミノ酸配列におけるプロテアーゼによる切断位置の一例を示す図である。
【図３Ｂ】マウスＰＧＲＮのＧＲＮ４ペプチドおよびその近傍のアミノ酸配列におけるプロテアーゼによる切断位置の一例を示す図である。
【図４Ａ】ヒトＰＧＲＮのＧＲＮ３ペプチドおよびその近傍のアミノ酸配列におけるプロテアーゼによる切断位置の一例を示す図である。
【図４Ｂ】ヒトＰＧＲＮのＧＲＮ４ペプチドおよびその近傍のアミノ酸配列におけるプロテアーゼによる切断位置の一例を示す図である。
【図５】本発明の分析方法の一例を示すフローチャートである。
【図６】タンデム型質量分析装置の構成図である。
【図７】精製マウスプログラニュリンのプリカーサスキャン結果を表すクロマトグラムである。
【図８Ａ】フラグメント１（配列番号７）のプリカーサスキャン結果を表すＭＳスペクトルである。
【図８Ｂ】フラグメント２（配列番号８）のプリカーサスキャン結果を表すＭＳスペクトルである。
【図８Ｃ】フラグメント３（配列番号９）のプリカーサスキャン結果を表すＭＳスペクトルである。
【図８Ｄ】フラグメント４（配列番号１０）のプリカーサスキャン結果を表すＭＳスペクトルである。
【図９Ａ】フラグメント１（配列番号７）のプロダクトイオンスキャン結果を表すＭＳスペクトルである。
【図９Ｂ】フラグメント２（配列番号８）のプロダクトイオンスキャン結果を表すＭＳスペクトルである。
【図９Ｃ】フラグメント３（配列番号９）のプロダクトイオンスキャン結果を表すＭＳスペクトルである。
【図９Ｄ】フラグメント４（配列番号１０）のプロダクトイオンスキャン結果を表すＭＳスペクトルである。
【図１０Ａ】フラグメント１のペプチド含有量とプロダクトイオン量から求められた検量線、およびプロダクトイオンのＭＲＭクロマトグラムである。
【図１０Ｂ】フラグメント２のペプチド含有量とプロダクトイオン量から求められた検量線、およびプロダクトイオンのＭＲＭクロマトグラムである。
【図１０Ｃ】フラグメント３のペプチド含有量とプロダクトイオン量から求められた検量線、およびプロダクトイオンのＭＲＭクロマトグラムである。
【図１０Ｄ】フラグメント４のペプチド含有量とプロダクトイオン量から求められた検量線、およびプロダクトイオンのＭＲＭクロマトグラムである。
【図１１Ａ】フラグメント１のヒト血清へのスパイクテスト結果を表すクロマトグラムである。
【図１１Ｂ】フラグメント２のヒト血清へのスパイクテスト結果を表すクロマトグラムである。
【図１１Ｃ】フラグメント３のヒト血清へのスパイクテスト結果を表すクロマトグラムである。
【図１１Ｄ】フラグメント４のヒト血清へのスパイクテスト結果を表すクロマトグラムである。
【図１２】本発明の分析方法により、マウス血清のＭＲＭ分析を行った際の各プロダクトイオンのクロマトグラムである。
【図１３】本発明の分析方法により、マウス血清のＭＲＭ分析を行った際の、（Ａ）各フラグメント濃度、および（Ｂ）フラグメント濃度から求められたＧＲＮペプチド濃度を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の分析方法は、解析すべきタンパク質および／またはペプチドを含有する生体由来試料を準備するステップ；試料中のタンパク質およびペプチドが、所定のアミノ酸の位置において選択的に切断処理され、複数種のペプチドフラグメントが得られるステップ；切断処理後の試料が、質量分析装置により分析され、２種以上の所定のプロダクトイオンが検出され定量されるステップ；および各プロダクトイオンの検出量に基づいて、前記試料中の所定のペプチドフラグメントの含有量が算出されるステップ、を有する。
まず、本発明により、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）およびグラニュリン（ＧＲＮ）ペプチドが個別に定量される原理について説明する。
【００２７】
図２は、ＰＧＲＮおよびＧＲＮの、プロテアーゼによる断片化を説明するための模式図であり、上段がＧＲＮペプチド、下段がＰＧＲＮを表す。図示例において、ＧＲＮペプチドは、プロテアーゼ処理によって所定の切断箇所I〜IIIで切断され、４種類のフラグメント（ＧＲＮ‐ａ，ＧＲＮ‐ｂ，ＧＲＮ‐ｃ，およびＧＲＮ‐ｄ）に断片化される。ＰＧＲＮは、プロテアーゼ処理によって、ＧＲＮと同様の切断箇所I〜III、ならびに、ＧＲＮペプチド配列のＮ末端よりもさらにＮ末端側の切断箇所Ｘ、およびＧＲＮペプチド配列のＣ末端よりもさらにＣ末端側の切断箇所Ｙで切断され、４種類のフラグメント（Ｎ‐Ｌｉｎｋｅｒ＋ＧＲＮ，ＧＲＮ‐ｂ，ＧＲＮ‐ｃ，およびＧＲＮ＋Ｃ‐Ｌｉｎｋｅｒ）に断片化される。
【００２８】
ＧＲＮとＰＧＲＮが混在する試料をプロテアーゼ処理した場合、ＧＲＮ‐ｂフラグメントあるいはＧＲＮ‐ｃフラグメントのように、ＧＲＮペプチドのアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端のいずれも含まないペプチドフラグメント（以下、「ＧＲＮ‐中間配列フラグメント」と称する場合がある）は、ＧＲＮおよびＰＧＲＮの両者から生成しする。そのため、プロテアーゼ処理後の試料中のＧＲＮ‐中間配列フラグメントの含有量を定量すれば、ＧＲＮとＰＧＲＮの合計量が求められる。
【００２９】
ＧＲＮのプロテアーゼ処理により得られるＧＲＮのＮ末端のフラグメント（ＧＲＮ‐ａ）、およびＣ末端のフラグメント（ＧＲＮ‐ｄ）は、ＰＧＲＮの断片化により得られるフラグメント（Ｎ‐Ｌｉｎｋｅｒ＋ＧＲＮ、およびＧＲＮ＋Ｃ‐Ｌｉｎｋｅｒ）と異なっている。Ｎ‐Ｌｉｎｋｅｒ＋ＧＲＮフラグメントは、ＧＲＮの断片化により得られるＮ末端のフラグメント（ＧＲＮ‐ａ）のＮ末端側にさらに複数のアミノ酸からなる配列が付加されたものである（以下、「ＧＲＮ‐Ｎ末端付加フラグメント」と称する場合がある）。ＧＲＮ＋Ｃ‐Ｌｉｎｋｅｒフラグメントは、ＧＲＮの断片化により得られるＣ末端のフラグメント（ＧＲＮ‐ｄ）のＣ末端側にさらに複数のアミノ酸からなる配列が付加されたものである（以下、「ＧＲＮ‐Ｃ末端付加フラグメント」と称する場合がある）。
【００３０】
これらのＧＲＮ‐Ｎ末端付加フラグメントおよびＧＲＮ‐Ｃ末端付加フラグメント（以下、これらをまとめて「末端付加フラグメント」と称する場合がある）は、ＧＲＮペプチドからは生じず、ＰＧＲＮに固有のフラグメントである。末端付加フラグメント由来のイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳによるプロダクトイオン分析を行うと、ＧＲＮには含まれないアミノ酸配列を含有するプロダクトイオンが得られうる。そのため、これらの末端付加フラグメントは、ＧＲＮペプチド由来のＮ末端のフラグメント（ＧＲＮ‐ａ）やＧＲＮペプチド由来のＣ末端のフラグメント（ＧＲＮ‐ｄ）と区別して、ＭＳ／ＭＳによる個別定量が可能である。
【００３１】
上記のように、中間配列フラグメントの含有量からＧＲＮとＰＧＲＮの含有量の合計が求められ、末端付加フラグメントの含有量からＰＧＲＮの含有量が求められる。両者の差を算出することによって、ＧＲＮペプチドの含有量が求められる。
【００３２】
前述のように、生体由来試料のＭＲＭ分析では、分析対象以外のタンパク質やペプチドが、分析対象と同一のプリカーサイオンやプロダクトイオンを生じる可能性があるため、分析対象に特有のプリカーサイオンとプロダクトイオンの組合せ（ＭＲＭ条件）を適切に選択することが重要となる。プリカーサイオンの特異性を担保するために、分析対象となる中間配列フラグメントおよび末端付加フラグメントは、いずれも６以上のアミノ酸残基からなるペプチドが選択されることが好ましい。ペプチドフラグメントの長さの上限は特に限定されないが、イオン化の容易性の観点からは３５アミノ酸残基以下が好ましい。分析対象のフラグメントのアミノ酸残基数は、８〜２５程度が好ましく、１０〜２０程度がより好ましい。
【００３３】
また、プロダクトイオンの特異性を持たせる観点から、分析対象となるＮ末端付加フラグメントは、グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＮ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合したものが好ましい。同様に、分析対象となるＣ末端付加フラグメントは、グラニュリンペプチドのアミノ酸配列のＣ末端にさらに３個以上のアミノ酸が結合したものが好ましい。
【００３４】
ＭＲＭ分析におけるプリカーサイオンおよびプロダクトイオンの組の選択に際しては、上記のように、特異性の高いアミノ酸配列に基づいてプリカーサイオンを選択するとともに、定量性および再現性の良いプロダクトイオンを選択することが好ましい。
【００３５】
質量分析装置を用いた定量分析では、ペプチド配列が未知の場合は、質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づくイオンの同定が困難である。そのため、現段階では、７種のＧＲＮペプチドのうち、ＰＧＲＮからの切断位置が特定されているＧＲＮ３およびＧＲＮ４の２種類が、上記方法により定量可能である。なお、今後、他のＧＲＮの配列が明らかとなった場合には、同様の原理によって、ＧＲＮ‐中間配列フラグメント量と末端付加フラグメント量の差から、他のＧＲＮペプチドが定量され得る。
【００３６】
以下、本発明の分析方法を、図５のフローチャートに示す各ステップに即してより詳細に説明する。
［試料の準備］
まず、分析対象となる生体由来試料が準備される（試料準備ステップＳ１００）。本発明の分析対象となる試料は、血液、血清、血漿、組織抽出液、細胞抽出液、尿、脳脊髄液等の生体由来試料である。これらの試料中には、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）および／またはグラニュリン（ＧＲＮ）ペプチドが含まれている。前述のように、ＰＧＲＮは、血中のプロテアーゼによりプロセシングを受け、ＧＲＮペプチドを生じ得る。本発明では、試料中のＰＧＲＮおよびＧＲＮ（特にＧＲＮ３およびＧＲＮ４）が定量される。
【００３７】
［試料調製］
（プロテアーゼによる選択的断片化）
試料中のタンパク質およびペプチドが、所定の配列位置で選択的に切断され、複数のペプチドフラグメントが得られる（ステップＳ２０２）。タンパク質およびペプチドを所定の配列位置で選択的に切断するために、プロテアーゼ処理が行われることが好ましい。通常、プロテアーゼは、アミノ酸配列を認識し、特定の配列の特定の結合を選択的に切断する。
【００３８】
プロテアーゼとしては、トリプシン（塩基性アミノ酸残基（ＡｒｇおよびＬｙｓ）のＣ末端側でペプチドを切断する）、リシルエンドペプチターゼ（Ｌｙｓ残基のＣ末端側でペプチドを切断する）、アルギニンエンドペプチダーゼ（Ａｒｇ残基のＣ末端側でペプチドを切断する）、キモトリプシン（芳香族アミノ酸残基（Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）のＣ末端側でペプチドを切断する）、ペプシン（芳香族残基（Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）のＮ末端側でペプチドを切断する）等が用いられる。
【００３９】
本発明では、分析対象であるＰＧＲＮやＧＲＮに特有のプリカーサイオンとプロダクトイオンの組合せを生じるフラグメントが得られるように、プロテアーゼによる切断位置が決定される。後の実施例で示すように、リジン残基およびアルギニン残基のＣ末端側のペプチド結合を選択的に切断する処理を行えば、ＰＧＲＮとＧＲＮ３およびＧＲＮ４の個別定量分析に必要なプリカーサイオンとプロダクトイオンの組を得られることが確認されている。そのため、プロテアーゼとしては、トリプシンが好適に用いられる。
【００４０】
なお、プロテアーゼは２種以上を組み合わせて用いることもできる。例えば、リシルエンドペプチターゼとアルギニンエンドペプチダーゼを併用すれば、リジン残基およびアルギニン残基のＣ末端側のペプチド結合を選択的に切断できる。また、プロテアーゼによる選択積切断をより完全なものとするために、トリプシンとリシルエンドペプチターゼおよび／またはアルギニンエンドペプチダーゼを併用してもよい。
【００４１】
プロテアーゼ処理の条件は特に限定されず、用いられるプロテアーゼに応じた適宜のプロトコールが採用される。例えば、プロテアーゼの至適ｐＨ近傍に調整された緩衝溶液中で、通常３７℃程度の温度で、４時間〜２０時間程度インキュベートすることが好ましい。
【００４２】
（選択的断片化の具体例）
マウスＧＲＮ３ペプチドおよびその近傍のアミノ酸配列、ならびにＧＲＮ４ペプチドおよびその近傍のアミノ酸配列の、トリプシン消化による切断位置を、図３Ａおよび図３Ｂに示す。
【００４３】
図３Ａにおいて、フラグメント１（１９８−２１１、配列番号７）は、グラニュリン３ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側から連続する７個のアミノ酸配列（ＶＶＣＰＤＡＫ）のＮ末端にさらに７個のアミノ酸（ＡＶＳＬＰＦＳ）が結合したグラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメントである。フラグメント２（２１２−２２７、配列番号８）は、グラニュリン３ペプチドのアミノ酸配列の連続する１６個のアミノ酸（ＴＱＣＰＤＤＳＴＣＣＥＬＰＴＧＫ）からなり、グラニュリン３ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端配列部分およびＣ末端配列アミノ酸配列部分のいずれも含まない、グラニュリン３‐中間配列フラグメントである。
【００４４】
図３Ｂにおいて、フラグメント３（２９７−３０９、配列番号９）は、グラニュリン４ペプチドのアミノ酸配列の連続する１３個のアミノ酸（ＬＮＴＧＡＷＧＣＣＰＦＡＫ）からなり、グラニュリン４ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端配列部分およびＣ末端配列アミノ酸配列部分のいずれも含まない、グラニュリン４‐中間配列フラグメントである。フラグメント４（３３１−３４４、配列番号１０）は、グラニュリン４ペプチドのアミノ酸配列のＣ末端側から連続する４個のアミノ酸配列（ＧＴＣＥ）のＣ末端にさらに１０個のアミノ酸（ＭＧＩＬＱＶＰＷＭＫ）が結合したグラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメントである。
後の実施例では、これら４つのフラグメントの量から、ＧＲＮ３，ＧＲＮ４およびＰＧＲＮを個別に定量する例を説明する。
【００４５】
ヒトＧＲＮ３ペプチドおよびＧＲＮペプチドのトリプシン消化による切断位置を、図４Ａおよび図４Ｂに示す。これらの各図中、矩形で囲まれている領域が、グラニュリンペプチドである。図４Ａにおけるグラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメント（１９９−２１２、配列番号１１）、および図４Ｂにおけるグラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメント（３３３−３４７、配列番号１２）は、それぞれ、マウスのグラニュリン３‐Ｎ末端付加フラグメントおよびグラニュリン４‐Ｃ末端付加フラグメントと配列の相同性が高く、フラグメントのアミノ酸残基数も略同等である。そのため、これらの末端付加フラグメントは、ヒトの生体由来試料中のＰＧＲＮおよびＧＲＮ定量のためのＭＲＭ分析対象として適していることが理解できる。
【００４６】
（断片化前処理）
一般には、プロテアーゼ処理に先だって、試料中のタンパク質およびペプチドの変性処理、ならびにアルキル化処理が行われる（ステップＳ２０１）。変性処理およびアルキル化処理の条件も特に限定されず、公知の条件が適宜に採用される。また、質量分析によるプロダクトイオン量と、内部標準試料に由来するプロダクトイオンのピーク面積との関連付けによって、フラグメント量が算出される場合は、プロテアーゼ処理に先だって、濃度既知の内部標準試料が添加されることが好ましい。
【００４７】
（断片化後処理）
プロテアーゼ処理後の試料は、必要に応じて脱塩、可溶化、濃縮、乾燥等の処理が行われても良い。例えば、脱塩および濃縮は、固相抽出用のスピンカラム等を用いて行うことができる。（ステップＳ２０３）
【００４８】
［質量分析装置による分析］
プロテアーゼによる断片化後の試料は、質量分析装置を用いて分析される。生体由来試料は、種々の夾雑物を含有しているため、試料が質量分析装置に導入される前に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により、試料中の各成分が時間的に分離されることが好ましい（ＬＣ分析Ｓ３０１）。すなわち、本発明の分析方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とタンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）とを組み合わせたＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて行われることが好ましい。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでは、試料中の各成分が、質量分析の前段のＬＣで時間的に分離される。そのため、各成分の保持時間に従って所定のプリカーサイオンとプロダクトイオンの質量電荷比の組をそれぞれ切り替えることにより、分析対象フラグメント由来のプロダクトイオンが高精度かつ高感度で検出できるため、定量分析の精度が高められる。
【００４９】
図６は、本発明に用いられるタンデム型（ＭＳ／ＭＳ型）質量分析装置の構成例を模式的に示す図である。この質量分析装置は、真空ポンプ（不図示）により真空排気される分析室３０の内部に、分析対象の試料をイオン化するためのイオン源２、それぞれ４本のロッド電極から成る３段の四重極３，４，５、およびイオンを検出してイオン量に応じた検出信号を出力する検出器６、を備える三連四重極型質量分析装置である。第一段四重極３および第三段四重極５は四重極マスフィルタである。第二段四重極４は単なる四重極（または多重極）のイオンガイドであり、質量分離の機能を有していない。
【００５０】
第一段四重極３には、直流電圧と高周波電圧とを合成した電圧が印加され、これにより発生する電場の作用により、イオン源２で生成された各種イオンの中で特定の質量電荷比を有する目的イオンのみがプリカーサイオンとして選別される（第一質量分離：プリカーサイオン選別ステップＳ３０３）。
【００５１】
第二段四重極４は、密閉性が高いコリジョンセル９に収納されている。このコリジョンセル９内には、アルゴン等のＣＩＤガスが導入される。第一段四重極３から第二段四重極４に送られたプリカーサイオンは、コリジョンセル９内でＣＩＤガスと衝突し、衝突誘起解離による開裂を生じてプロダクトイオンが生成される（イオン開裂ステップＳ３０４）。この開裂の態様は様々であるため、通常、一種のプリカーサイオンから質量電荷比の異なる複数種のプロダクトイオンが生成される。これら各種のプロダクトイオンがコリジョンセル９を出て、第三段四重極５に導入される。通常、第二段四重極４には、高周波電圧のみが印加されるか、または高周波電圧に直流バイアス電圧を加算した電圧が印加され、この第二段四重極４はイオンを収束させつつ後段の第三段四重極５に輸送するイオンガイドとして機能する。
【００５２】
第三段四重極５には、第一段四重極３と同様に、直流電圧と高周波電圧とを合成した電圧が印加される。これにより発生する電場の作用により、第三段四重極５では特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンのみが選別され、検出器６に透過される（プロダクトイオン選別ステップＳ３０５）。第３段四重極５に印加する直流電圧および高周波電圧を適宜変化させることで、第三段四重極５を通過し得るイオンの質量電荷比を走査（プロダクトイオンスキャン）することができる。
【００５３】
第三段四重極５で選別されたプロダクトイオンは、検出器で検出され、検出されたプロダクトイオン量に応じた電気信号がデータ処理部４０に送信される。データ処理部４０は、プロダクトイオンのマススペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を作成することができ、プロダクトイオンのピーク面積から、プロダクトイオン量が定量される（プロダクトイオン検出・定量ステップＳ３０６）。
【００５４】
これらの第一段四重極３、第二段四重極４およびコリジョンセル９、第三段四重極５、検出器６、ならびにデータ処理部４０は、コンピュータを備える制御部５０の制御の下で動作する。制御部５０は、制御プログラムが格納された記憶部６０と関連付けられている。記憶部６０に記憶されたプログラムをＣＰＵが実行することにより、制御部５０は、第一段四重極３，第二段四重極４およびコリジョンセル９，第三段四重極５，ならびに検出器６およびデータ処理部４０のそれぞれを、第一質量分離部，イオン開裂部，第二質量分離部，ならびに検出部として機能させる。
【００５５】
上記分析を行うためのプログラムは、検出対象となるフラグメントに関する情報を含んでいる。フラグメント情報は、検出対象となるフラグメントのそれぞれについての、プリカーサイオンの質量電荷比およびプロダクトイオンの質量電荷比を含んでいる。さらに、質量分析装置の前段に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）が接続されている場合、フラグメント情報には、保持時間が含まれていることが好ましい。また、フラグメント情報は、質量電荷比や保持時間の他に、試料名や定量のためのパラメータ（例えば検量線の回帰式や、内部標準の濃度等の関連付けデータ）等を含んでいてもよい。これらのフラグメント情報は、例えば図６に示すように、ＭＲＭ条件テーブル６１として記憶部６０に格納されていてもよい。
【００５６】
上記プログラムは、質量分析装置とは別個に提供されてもよく、記憶媒体に記憶した状態で提供することや、インターネット回線等の通信手段を介して提供することもできる。質量分析用の既存の制御プログラムに、検出対象となるフラグメントに関する情報を追加することにより、上記分析を行うためのプログラムを完成させてもよい。また、ユーザが操作部５１より、検出対象となるフラグメントに関する情報を入力することによって、上記分析を行うためのプログラムを完成させることもできる。ユーザによる情報の入力は、検出対象となるフラグメントに関する情報をキーボード等から手入力する方法の他、表示部５２の画面上に表示されたものの中から選択する方法でもよい。さらに、ユーザが検出対象となるフラグメント情報の一部（例えばフラグメント名やアミノ酸配列等）を入力することにより、制御部５０が、予め用意されたデータベースを参照して、他のフラグメント情報（例えば、質量電荷比や保持時間）を取得してもよい。
【００５７】
上記分析プログラムからの指示に従って、制御部５０は、第一段四重極３で選別されるプリカーサイオンの質量電荷比、および第三段四重極５で選別されるプロダクトイオンの質量電荷比を切り替える。ＬＣの保持時間に応じて、プリカーサイオンの質量電荷比、および第三段四重極５で選別されるプロダクトイオンの質量電荷比が切り替えられることにより、検出対象となるフラグメントに由来するプロダクトイオンが、選択的に検出器６に到達し、定量される。
【００５８】
［含有量の算出］
上記質量分析装置により定量されたプロダクトイオン量に基づいて、生体由来試料中のＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドの含有量（濃度）が算出される。まず、プロダクトイオン量に基づいて、検出対象の各フラグメントの含有量が算出される（ステップＳ４０１，４０２）。プロダクトイオン量とフラグメントの量とは、予め所定のパラメータにより関連付けられている。
【００５９】
両者を関連付ける方法としては、例えば、外部標準による検量線（較正曲線）を用いる方法が挙げられる。検量線は、本分析（生体由来試料の分析）と同一の条件で、濃度既知のペプチドフラグメント（外部標準）の分析を行い、濃度とプロダクトイオンのピーク面積（あるいはピーク強度）とをプロットすることによって得られる。
【００６０】
また、分析対象となる生体由来試料に予め内部標準を加えて測定を行い、内部標準に由来するプロダクトイオン量と、定量対象のフラグメントに由来するプロダクトイオン量とを関連付けることもできる。両者の関連付けは、例えばプロダクトイオンのピーク面積比により行われる。内部標準としては、例えば、分析対象のフラグメントと同一のアミノ酸配列を有し、かつ一部または全部の炭素および／または窒素が重原子（１３Ｃまたは１５Ｎ）に置換された重ペプチドが用いられる。このような重ペプチドに由来するフラグメントは、プロテアーゼによる消化率や質量分析におけるイオン化率が、生体試料中のタンパク質やペプチドと同一である一方で、プロダクトイオンおよびプリカーサイオンの質量電荷比が、生体由来試料のものより大きい。生体試料由来のフラグメントと重ペプチド内部標準由来のフラグメントの相対比は常に同一であり、かつ両者は個別に定量可能であるから、内部標準の濃度と両者のピーク面積比から、生体由来試料中のフラグメント濃度が算出できる。
【００６１】
分析対象の末端付加フラグメントおよび中間配列フラグメントのそれぞれの濃度に基づいて、ＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドの濃度が算出される（ステップＳ４０３）。前述のように、ＧＲＮペプチドの濃度は、中間配列フラグメント濃度と末端付加フラグメント濃度の差に等しい。また、ＰＧＲＮ濃度は、末端付加フラグメント濃度に等しい。
【００６２】
ＧＲＮ３とＧＲＮ４の両方の濃度を算出する場合、ＧＲＮ３‐中間配列フラグメント濃度とＧＲＮ３‐Ｎ末端付加フラグメント濃度の差からＧＲＮ３ペプチドの濃度を算出し、ＧＲＮ４‐中間配列フラグメント濃度とＧＲＮ４‐Ｃ末端付加フラグメント濃度の差からＧＲＮ４ペプチドの濃度を算出することが好ましい。ＰＧＲＮがホモに切断されて、１分子からＧＲＮペプチドを１〜７を１つずつ生成する場合、ＧＲＮ３‐Ｎ末端付加フラグメント濃度とＧＲＮ４‐Ｃ末端付加フラグメント濃度は等しくなる。一方、ＰＧＲＮがヘテロに切断されると、試料中のＧＲＮ‐３ペプチドとＧＲＮ‐４の濃度が異なり、ＧＲＮ３‐Ｎ末端付加フラグメント濃度とＧＲＮ４‐Ｃ末端付加フラグメント濃度が異なる場合がある。この場合でも、上記方法によれば、各ＧＲＮの濃度を正確に算出できる。
【００６３】
ユーザは、質量分析により得られたデータに基づいて、プロダクトイオン量に基づくフラグメントの含有量の算出（ステップＳ４０１，４０２）、および各フラグメント含有量からのＰＧＲＮ含有量およびＧＲＮペプチド含有量の算出（ステップＳ４０３）を行うことができる。これらの算出は、プログラムからの指示により、自動的に行われてもよい。例えば、前述のように、ＭＲＭ条件テーブル中のフラグメント情報に、検量線の回帰式や、内部標準の濃度等の関連付けデータを含めておけば、記憶部６０に記憶されたプログラムをＣＰＵが実行することにより、データ処理部４０が上記の演算を行う。得られた結果は、プログラムからの指示により、表示部５２に表示させることや、記憶部６０に格納することができる。
【実施例】
【００６４】
以下に、マウス血清中のＰＧＲＮ，ＧＲＮ３ペプチド、およびＧＲＮ４ペプチドの定量に関わる実験例および実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、％の記載は、特に断りが無い限り重量％を表す。
【００６５】
［測定試料の調製］
（変性および還元アルキル化処理）
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、試料２０μＬを分注し、還元アルキル化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８，  ８Ｍ尿素）を、合計が１００μＬとなるように添加し、攪拌した。さらに、１０μＬの還元剤溶液(１Ｍ  ジチオスレイトール）を添加・攪拌し、５６℃で６０分間インキュベートした。溶液を常温に戻した後、３０μＬのアルキル剤溶液（０．５Ｍ  ヨードアセトアミド）を添加・攪拌し、室温の暗所で４５分間インキュベートした。
【００６６】
（トリプシン消化処理）
上記溶液に、酵素消化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ７．６））を、合計が９００μＬとなるように添加した。この溶液に、トリプシン溶液（プロメガ製、Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＧＯＬＤ、質量分析グレード）を、試料中のタンパク質とトリプシンとの比（重量比）が、１：１００となるように添加した後、３７℃で１６時間以上インキュベートした。
【００６７】
（脱塩および濃縮処理）
断片化処理後の溶液に、１０％蟻酸水溶液を、蟻酸の終濃度が約０．１％となるように添加し、攪拌した。スピンカラム（ＧＬサイエンス製、ＭｏｎｏＳｐｉｎ  Ｃ１８）を用いて、試料を固相抽出し、遠心濃縮機を用いて乾固した。得られた乾固試料は、測定時まで−８０℃で凍結保存した。
【００６８】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析］
上記乾固試料を、２０μＬの移動相溶媒（５ｍＭ蟻酸アンモニウム＋０．１％蟻酸  水溶液）で再溶解した。溶解後の試料を分析用バイアルに移し、三連四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（島津製作所製、ＬＣＭＳ−８０８０）により、以下に示す条件で分析を行った。
【００６９】
＜ＬＣ条件＞
分析カラム：  島津製作所製  Shim-pack XR-ODS II (カラム内径：２．０ｍｍ×カラム長：１５０ｍｍ、粒子径：２．２μｍ）
流速：  ０．３ｍＬ／分
サンプル注入量：  ５μＬ
カラム温度：  ４０℃
移動相：（Ａ）５ｍＭ蟻酸アンモニウム＋０．１％蟻酸  水溶液
（Ｂ）０．１％蟻酸  アセトニトリル溶液
グラジエントプログラム：以下の表１に示す通り
【００７０】
【表１】
2014238343.tif 000003
【００７１】
＜ＭＳ条件＞
ネブライザガス流量：  ３Ｌ／分
ドライイングガス流量：  １２Ｌ／分
カーテンガス流量：  ３Ｌ／分
印加電圧  ＋４．５ｋＶ
プローブ温度：  ３５０℃
ＨＳＩＤ温度：  ２５０℃
イオン化モード：  ＥＳＩ（＋）
【００７２】
［実験例１］  精製タンパク質溶液を用いた検証および検量線の作成
＜ＭＲＭ条件の検討＞
（プリカーサスキャン）
精製されたマウス由来ＰＧＲＮの蛋白質溶液を用いて、上記手順により測定試料を調製し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳ分析によって、トリプシン消化フラグメントの検出を試みた。図３Ａおよび図３Ｂに示す、中間配列フラグメントおよび末端付加フラグメントのうち、表２に示す４種類のフラグメントが同定された。図７にプリカーサスキャンのクロマトグラム、図８Ａ〜Ｄにプリカーサスキャンのマススペクトルを示す。図８Ａ〜Ｄでは、それぞれ、表２に示すフラグメント１〜４に由来するプリカーサイオンが検出されていることが分かる。なお、他のフラグメントが同定できなかった理由としては、試料中のペプチドが翻訳後修飾（例えば、糖鎖修飾等）されているために、アミノ酸配列から予測されるｍ／ｚと、実際の試料のｍ／ｚが異なっていたこと等が考えられる。
【００７３】
【表２】
2014238343.tif 000004
【００７４】
（プロダクトイオンスキャン）
表２に示す４つのフラグメントをプリカーサイオンとして選択し、プロダクトイオンスキャンを行った。ＭＳスペクトル（ＭＳ２）を、図９Ａ〜Ｄに示す。図９Ａ〜Ｄには、ＭＳスペクトルから帰属されたプロダクトイオンの情報（開裂位置）も併せて示されている。これらの結果から、プロダクトイオンスキャンに供された４つのプリカーサイオンは、いずれもＰＧＲＮ由来のフラグメントであることが確認された。
【００７５】
（ＭＲＭ条件の導出および検量線の作成）
図８Ａ〜ＤのそれぞれのＭＳスペクトルにおいて、フラグメント１〜４由来と帰属されたプリカーサイオンのうち、各ＭＳスペクトルにおいてピーク強度の大きいものから３つを選択し、それぞれのプリカーサイオンに対してプロダクトイオンスキャンを行った。また、各プロダクトイオンスキャンで帰属されたプロダクトイオンのうち、各ＭＳスペクトルにおいてピーク強度の大きいものから３つを選択して、ピーク強度の再現性およびＰＧＲＮ濃度に対するピーク面積の線形性を確認した。その結果、フラグメント１〜４のそれぞれに対して、信頼度の高い定量性が得られるプロダクトイオンを選択することにより、表３に示すプリカーサイオンおよびプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）の組合せ（ＭＲＭ条件）を得た。
【００７６】
【表３】
2014238343.tif 000005
【００７７】
＜検量線の作成＞
ＰＧＲＮ濃度を変化させて、表３に示す条件でＭＲＭ分析を行った。フラグメントの濃度に対するプロダクトイオンのピーク面積をプロットしたところ、図１０Ａ〜Ｄに示すように、ＰＧＲＮ濃度とピーク面積との間に線形関係がみられ、各プロダクトイオンの検量線が得られた。
【００７８】
［実験例２］  スパイクテスト
精製されたマウスＰＧＲＮの精製物をヒト血清に添加し、上記手順により測定試料を調製し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳにより、表３に示す条件でＭＲＭ分析を行った。ヒト血清に添加するマウスＰＧＲＮの量を、０μｇ／ｍＬ（添加なし）、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬとして分析を行ったところ、図１１Ａ〜Ｄに示すように、各ペプチドに対応するピークが、ＰＧＲＮ添加量に依存した強度変化を示した。ヒトＰＧＲＮや、その他の種々の夾雑を含むヒト血清へのスパイクテストにおいて、マウスＰＧＲＮの添加量に依存した面積強度変化がみられたことから、上記表３のＭＲＭ分析条件が、生体由来試料中のマウスＰＧＲＮおよびＰＧＲＮ由来ペプチドの定量に有効であることが確認された。
【００７９】
［実施例１］  マウス血清中のＰＧＲＮおよびＧＲＮペプチドの定量
正常マウス血清を試料として、上記手順により測定試料を調製し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳにより、表３に示す条件でＭＲＭ分析を行ったところ、図１２（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、マウスＰＧＲＮ由来のトリプシン消化ペプチドのピークが確認された。各ピーク面積から、図１０Ａ〜Ｄの検量線に基づいて、ペプチド濃度を算出した結果を図１３（Ａ）に示す。また、下記式（１）、（２）により算出された、マウス血清中のＧＲＮ３ペプチド濃度およびＧＲＮ４ペプチド濃度を、図１３（Ｂ）に示す。
（１）  ＧＲＮ３濃度＝［フラグメント２の濃度］−［フラグメント１の濃度］
（２）  ＧＲＮ４濃度＝［フラグメント３の濃度］−［フラグメント４の濃度］
【００８０】
上記実施例に示したように、表３に示すＭＲＭ条件を用いた本発明の分析方法により、マウス血清中のＧＲＮ３ペプチドおよびＧＲＮ４ペプチドの濃度が個別に定量可能であることがわかる。
【符号の説明】
【００８１】
１      ＬＣ
２      イオン源
３      第一段四重極
４      第二段四重極
９      コリジョンセル
５      第三段四重極
６      検出器
３０      分析室
４０      データ処理部
５０      制御部
５１      操作部
５２      表示部
６０      記憶部
６１      ＭＲＭ条件テーブル
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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