(57)【要約】      （修正有）【課題】アテローム性動脈硬化、末梢動脈閉塞疾患、冠動脈心疾患または卒中性大脳発作を予防および／または治療するための医薬組成物、並びに該活性を有するペプチドの提供。【解決手段】FGFPAHVFIDWLQSLS若しくはFGFPAHVYIDWLQSLS若しくはFGFPAHVFIDWLQSLNのアミノ酸配列を含む化合物、または該化合物が医薬上許容される担体と結合しているものを含む医薬組成物、または該化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化、アテローム性動脈硬化のリスク疾患およびアテローム性動脈硬化の続発症を予防および/または治療するための医薬を製造するための、コレステロールエステル転送タンパク質(CETP)の 4- から 16-mer のポリペプチド断片でも CETP-エピトープでもないか又はこれらを含まない以下のアミノ酸配列を含む、天然の CETP 糖タンパク質に特異的な抗体への結合能力を有する化合物の使用
(Z1)nX1X2X3X4(Z2)m、
[式中、
Z1 は C 以外のアミノ酸残基であり、
X1 は D、A、R、E、S、N、T および G からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X2 は F、A、W、R、S、L、Q、V および M からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X3 は L、A、S、W、E、R、I および H からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X4 は Q、A、H、D、K、R、S および E からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Z2 は C 以外のアミノ酸残基であり、
n は 0 から 10 の間の整数であり、
m は 0 から 3 の間の整数である]
または
SYHATFL、TMAFPLN、HYHGAFL、EHHDIFL、TGLSVFL、WMPSLFY、SMPWWFF、TMPLLFW、DTWPGLE、SMPPIFY、MPLWWWD、SMPNLFY、RMPPIFY、NPFEVFL、TLPNWFW、SMPLTFY、SPHPHFL、NFMSIGL、SQFLASL、WSWPGLN、IAWPGLD、SKFMDTL、SMPMVFY、YEWVGLM、KGFLDHL、HQSDDKMPWWFF、YVWQDPSFTTFF、YVWQDPSFTTFF、LPQTHPLHLLED、GPVSIYADTDFL、DSNDTLTLAAFL、NGSPALSHMLFL、TDYDPMWVFFGY、IFPLDSQWQTFW、NESMPDLFYQPS、DWGDKYFSSFWN、VSAYNNV および WPLHLWQ からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む化合物の使用。
【請求項２】
化合物が 5 から 16 のアミノ酸残基を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
n が 7、8 または 9 であり、Z1 が C 以外のアミノ酸残基または F、G、A、W、Y、S、G、D、L、E、K、T、P、I、V および M からなる群から、好ましくは F、G、A、P、Y、T、S、G、K および D からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、Z2 が S、L、A、W、N、T、I、Y および H からなる群から選択されることを特徴とする、請求項 1 または 2 に記載の使用。
【請求項４】
X1 が D、A、R、E および L からなる群から選択され、X2 が F、A、W、Q および R からなる群から選択され、X3 が L、A および S からなる群から選択され、X4 が Q、A および H からなる群から選択されることを特徴とする、請求項 3 に記載の使用。
【請求項５】
X1 が D であり、X2 が F、Q および W からなる群から選択され、X3 が L または S であり、X4 が Q または H であることを特徴とする、請求項 4 に記載の使用。
【請求項６】
化合物がアミノ酸配列 FX8(F)oPX9HX10X11X12DX2X3X4X5X6X7 を含むことを特徴とする、請求項 5 に記載の使用
[式中、
X8 は G、A、F、Y および K からなる群から選択され、
X9 は E、Y、A、Q、K および S からなる群から選択され、
X10 は H、V、L、F および I からなる群から選択され、
X11 は L、W、S、I、F および Y からなる群から選択され、
X12 は V、T、F または I であり、
X5 は S または Y であり、
X6 は L、A または I であり、
X7 は S、N または T であり、および
o は 0 または 1 である]。
【請求項７】
化合物がアミノ酸配列 X1X2X3X4X5X6X7 を含むことを特徴とする、請求項 1 または 2 に記載の使用 [式中、X1 は D、S、N、T および G からなる群から選択され、X2 は F であり、X3 は L であり、X4 は Q、D、K、R、S および E からなる群から選択され、X5 は S または T であり、X6 は L であり、X7 は C 以外のアミノ酸残基、好ましくは S、T、A、M、F および W からなる群から選択されるアミノ酸残基である]。
【請求項８】
アミノ酸配列が SSLELFL、SFLDTLT、NFLKTLS、DFLRTLT、AFLDTLV、TFLSSLA、GFLDSLM、SPHPHFL、SNFLKTL、TGFLATL、SDFLRAL、SANPRDFLETLF、RMFPESFLDTLW、TIYDSFLDSLAS、KPYLLKDFLEAL、AMGPYDALDLFL、TWNPIESFLESL、QYQTPLTFLEAL、RHISPATFLEAL、HTDSFLSTFYGD、ADSTFTSFLQTL、GPVSIYADTDFL、DSNDTLTLAAFL、TPTHYYADFSQL、LPGHLIWDSLHY、LPQTHPLHLLED、IPYHHLVDQLHH、YPYHVQVDVLQN、IPSHHLQDSLQL、EYAHHTSLDLRQ、EPLHFRSDRIQA、ATPSHLIIDRAQ、APKHLYADMSQA、FKPAHVSIDWLQ、MPAHLSRDLRQS、NPKHYSIDRHQA、SPQHLTTDRAQA、TPFHFAQDSWQW、TPTHYYADFSQLLS、TPTHYYADFSQSLS、GTPTHYYADFSQLL、GTPTHYYADFSQSL、FGTPTHYYADFSQSLS、FGFPTHYYADFSQSLS、LPGHLIWDSLHY、LPGHLIWDSLHYL、LPGHLIWDSLHYLS、LPGHLIWDSLHSL、LPGHLIWDSLHSLS、GLPGHLIWDSLHYL、GLPGHLIWDSLHSL、FGLPGHLIWDSLHSLS、FGFPGHLIWDSLHSLS、LPQTHPLHLLED、IPYHHLVDQLHH、IPYHHLVDQLHLS、IPYHHLVDQLHSLS、FGIPYHHLVDQLHHLS、FGFPYHHLVDQLHSLS、YPYHVQVDVLQN、YPYHVQVDVLQNLS、YPYHVQVDVLQSLS、FGYPYHVQVDVLQNLS、FGFPYHVQVDVLQSLS、IPSHHLQDSLQL、IPSHHLQDSLQLLS、IPSHHLQDSLQSLS、GIPSHHLQDSLQLL、FGIPSHHLQDSLQLLS、FGFPSHHLQDSLQSLS、EYAHHTSLDLRQ、EPLHFRSDRIQA、EPLHFRSDRIQALS、EPLHFRSDRIQSLS、GEPLHFRSDRIQAL、FGEPLHFRSDRIQALS、FGFPLHFRSDRIQSLS、APKHLYADMSQA、APKHLYADMSQALS、APKHLYADMSQSLS、GAPKHLYADMSQAL、FGFPKHLYADMSQSLS、MPAHLSRDLRQS、MPAHLSRDLRQSL、MPAHLSRDLRQSLS、GMPAHLSRDLRQSL、FGFPAHLSRDLRQSLS、NPKHYSIDRHQA、TPFHFAQDSWQW、TPFHFAQDSWQWLS、TPFHFAQDSWQSLS、GTPFHFAQDSWQWL、FGFPFHFAQDSWQSLS、ACSFAYLYRC、ACFMGDKWVC、ACVLYPKAIC、ACYMGQQFVC、ACLTAYLHWC、ACTLFPVAYC、ACWLFPYAHC、ACKSINMWLC、ACQTINRWLC、FGFPEHLLVDFLQSLS、FGFPEHLLVDFLQSLS、FPEHLLVDFLQSL、AGFPEHLLVDFLQSLS、FAFPEHLLVDFLQSLS、FGAPEHLLVDFLQSLS、FGFAEHLLVDFLQSLS、FGFPAHLLVDFLQSLS、FGFPEALLVDFLQSLS、FGFPEHALVDFLQSLS、FGFPEHLAVDFLQSLS、FGFPEHLLADFLQSLS、FGFPEHLLVAFLQSLS、FGFPEHLLVDALQSLS、FGFPEHLLVDFAQSLS、FGFPEHLLVDFLASLS、FGFPEHLLVDFLQALS、FGFPEHLLVDFLQSAS、FGFPEHLLVDFLQSLA、FAFPAHLLVDFLQALA、AAFPAHLLADFLQALA、SPQHLTTDRAQA、SPQHLTTDRAQALS、SPQHLTTDRAQSLS、GSPQHLTTDRAQAL、FGFPQHLTTDRAQSLS、FGFPQHLTTDWAQSLS、FGFPQHLTTDRLQSLS、FGFPQHLTTDWLQSLS、ATPSHLIIDRAQ、ATPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDWAQSLS、FGFPSHLIIDWLQSLS、FGFPSHLIIDWSQSLS、FATPSHLIIDWLQSLS、FKPAHVSIDWLQ、FKPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQSLS、AGFPAHVSIDWLQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FGAPAHVSIDWLQSLS、FGFAAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQALS、FGFPAHVSIDWLQSLA、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFAAHVSIDWLQSLS、FGFFAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIRWLQSLS、FGFPAHVSIEWLQSLS、FGFPAHVSIDWLNSLS、FGFPAHVSIDWLHSLS、AGFPAHVSIDWLQSLS、PGFPAHVSIDWLQSLS、WGFPAHVSIDWLQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FSFPAHVSIDWLQSLS、FYFPAHVSIDWLQSLS、FDFPAHVSIDWLQSLS、FGAPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQLLS、FGFPAHVSIDWLQWLS、FGFPAHVSIDWLQNLS、FGFPAHVSIDWLQTLS、FGFPAHVSIDWLQYLS、FGFPAHVSIDWLQSIS、FGFPAHVSIDWLQSLT、FGFPAHVSIDWLQSLY、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFPAHVSIDRAQSLS、FGFPTHVSIDWLQSLS、FGFPFHVSIDWLQSLS、FGFPAHISIDWLQSLS、FGFPAHIIIDWLQSLS、FGFPAHLTTDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVSLDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、TPTHYYADFSQSLS、FGFPAHVWIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLN、FGFPAHFSIDWLQSLS、FGFPAHVSFDWLQSLS、FGFPEHVFIDWLQSLS、DFGFPAHVFIDWLQSLS、DFGFPSHLIIDWLQSLS、DFGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPQHLFTDWLQSLS、FGFPKHLLVDFLQSLS、FGFPAHVSIDWSQSLS、FGFPAHVSIDFSQSLS、FGFPSHIIIDWLQSLS、FGFPSHLIIEWLQSLS、AAFPAHLLADAAQALA、AAFPAHAAADFLQALA、AAFAAHLLADFLQAAA、AAAPAHLLVDAAQAAA、FAFPAHVFIDWLQSLS; FGFPAHVFIDWLQALS、FGFPAHVFIDWLQSLA、GFPAHVFIDWLQSLS、FPAHVFIDWLQSLS、PAHVFIDWLQSLS、FAFPAHVFIDWLQALA、FGFPEHLFVDFLQSLS、FGFPAHVHIDWLQSLS、FGFPAHVPIDWLQSLS、FGFPSHLFIDWAQSLS、PGFPAHVFIDWLQLIT、PAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQ、FGFPAHVFIDWLQ、DFGFPSHLIIDWLQSLS、DFGFPAHVFIDWLQSLN、PSHLIIDWLQ、PAHVFIDWLQ、DFGFPAHVTIDWLQSLN、DFGFPAHVLIDWLQSLN、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLN および FGFPAHVFIDWLQSLA からなる群から選択されることを特徴とする、請求項 1 から 7 のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
化合物が医薬上許容される担体、好ましくは KLH (キーホールリンペットヘモシアニン) と結合することを特徴とする、請求項 1 から 8 のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
化合物が静脈内、皮下または筋肉内投与のために製剤されることを特徴とする、請求項 1 から 9 のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
化合物がアジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムと共に製剤されることを特徴とする、請求項 1 から 10 のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
化合物が 0.1 ng から 10 mg、好ましくは 10 ng から 1 mg、特に 100 ng から 10 μg の量で含有されることを特徴とする、請求項 1 から 11 のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
SYHATFL、TMAFPLN、HYHGAFL、EHHDIFL、SSLELFL、TGLSVFL、WMPSLFY、SMPWWFF、TMPLLFW、DTWPGLE、SMPPIFY、MPLWWWD、SMPNLFY、RMPPIFY、NPFEVFL、TLPNWFW、SMPLTFY、SFLDTLT、NFLKTLS、DFLRTLT、AFLDTLV、TFLSSLA、GFLDSLM、SPHPHFL、NFMSIGL、SQFLASL、SNFLKTL、TGFLATL、WSWPGLN、IAWPGLD、SKFMDTL、SDFLRAL、SMPMVFY、YEWVGLM、KGFLDHL、SANPRDFLETLF、RMFPESFLDTLW、TIYDSFLDSLAS、HQSDDKMPWWFF、KPYLLKDFLEAL、AMGPYDALDLFL、TWNPIESFLESL、YVWQDPSFTTFF、QYQTPLTFLEAL、RHISPATFLEAL、HTDSFLSTFYGD、YVWQDPSFTTFF、ADSTFTSFLQTL、GPVSIYADTDFL、DSNDTLTLAAFL、NGSPALSHMLFL、TDYDPMWVFFGY、IFPLDSQWQTFW、NESMPDLFYQPS、DWGDKYFSSFWN、VSAYNNV、WPLHLWQ、TPTHYYADFSQL、LPGHLIWDSLHY、LPQTHPLHLLED、IPYHHLVDQLHH、YPYHVQVDVLQN、IPSHHLQDSLQL、EYAHHTSLDLRQ、EPLHFRSDRIQA、ATPSHLIIDRAQ、APKHLYADMSQA、FKPAHVSIDWLQ、MPAHLSRDLRQS、NPKHYSIDRHQA、SPQHLTTDRAQA、TPFHFAQDSWQW、TPTHYYADFSQLLS、TPTHYYADFSQSLS、GTPTHYYADFSQLL、GTPTHYYADFSQSL、FGTPTHYYADFSQSLS、FGFPTHYYADFSQSLS、LPGHLIWDSLHY、LPGHLIWDSLHYL、LPGHLIWDSLHYLS、LPGHLIWDSLHSL、LPGHLIWDSLHSLS、GLPGHLIWDSLHYL、GLPGHLIWDSLHSL、FGLPGHLIWDSLHSLS、FGFPGHLIWDSLHSLS、LPQTHPLHLLED、IPYHHLVDQLHH、IPYHHLVDQLHLS、IPYHHLVDQLHSLS、FGIPYHHLVDQLHHLS、FGFPYHHLVDQLHSLS、YPYHVQVDVLQN、YPYHVQVDVLQNLS、YPYHVQVDVLQSLS、FGYPYHVQVDVLQNLS、FGFPYHVQVDVLQSLS、IPSHHLQDSLQL、IPSHHLQDSLQLLS、IPSHHLQDSLQSLS、GIPSHHLQDSLQLL、FGIPSHHLQDSLQLLS、FGFPSHHLQDSLQSLS、EYAHHTSLDLRQ、EPLHFRSDRIQA、EPLHFRSDRIQALS、EPLHFRSDRIQSLS、GEPLHFRSDRIQAL、FGEPLHFRSDRIQALS、FGFPLHFRSDRIQSLS、APKHLYADMSQA、APKHLYADMSQALS、APKHLYADMSQSLS、GAPKHLYADMSQAL、FGFPKHLYADMSQSLS、MPAHLSRDLRQS、MPAHLSRDLRQSL、MPAHLSRDLRQSLS、GMPAHLSRDLRQSL、FGFPAHLSRDLRQSLS、NPKHYSIDRHQA、TPFHFAQDSWQW、TPFHFAQDSWQWLS、TPFHFAQDSWQSLS、GTPFHFAQDSWQWL、FGFPFHFAQDSWQSLS、ACSFAYLYRC、ACFMGDKWVC、ACVLYPKAIC、ACYMGQQFVC、ACLTAYLHWC、ACTLFPVAYC、ACWLFPYAHC、ACKSINMWLC、ACQTINRWLC、FGFPEHLLVDFLQSLS、FGFPEHLLVDFLQSLS、FPEHLLVDFLQSL、AGFPEHLLVDFLQSLS、FAFPEHLLVDFLQSLS、FGAPEHLLVDFLQSLS、FGFAEHLLVDFLQSLS、FGFPAHLLVDFLQSLS、FGFPEALLVDFLQSLS、FGFPEHALVDFLQSLS、FGFPEHLAVDFLQSLS、FGFPEHLLADFLQSLS、FGFPEHLLVAFLQSLS、FGFPEHLLVDALQSLS、FGFPEHLLVDFAQSLS、FGFPEHLLVDFLASLS、FGFPEHLLVDFLQALS、FGFPEHLLVDFLQSAS、FGFPEHLLVDFLQSLA、FAFPAHLLVDFLQALA、AAFPAHLLADFLQALA、SPQHLTTDRAQA、SPQHLTTDRAQALS、SPQHLTTDRAQSLS、GSPQHLTTDRAQAL、FGFPQHLTTDRAQSLS、FGFPQHLTTDWAQSLS、FGFPQHLTTDRLQSLS、FGFPQHLTTDWLQSLS、ATPSHLIIDRAQ、ATPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDWAQSLS、FGFPSHLIIDWLQSLS、FGFPSHLIIDWSQSLS、FATPSHLIIDWLQSLS、FKPAHVSIDWLQ、FKPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQSLS、AGFPAHVSIDWLQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FGAPAHVSIDWLQSLS、FGFAAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQALS、FGFPAHVSIDWLQSLA、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFAAHVSIDWLQSLS、FGFFAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIRWLQSLS、FGFPAHVSIEWLQSLS、FGFPAHVSIDWLNSLS、FGFPAHVSIDWLHSLS、AGFPAHVSIDWLQSLS、PGFPAHVSIDWLQSLS、WGFPAHVSIDWLQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FSFPAHVSIDWLQSLS、FYFPAHVSIDWLQSLS、FDFPAHVSIDWLQSLS、FGAPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQLLS、FGFPAHVSIDWLQWLS、FGFPAHVSIDWLQNLS、FGFPAHVSIDWLQTLS、FGFPAHVSIDWLQYLS、FGFPAHVSIDWLQSIS、FGFPAHVSIDWLQSLT、FGFPAHVSIDWLQSLY、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFPAHVSIDRAQSLS、FGFPTHVSIDWLQSLS、FGFPFHVSIDWLQSLS、FGFPAHISIDWLQSLS、FGFPAHIIIDWLQSLS、FGFPAHLTTDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVSLDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、TPTHYYADFSQSLS、FGFPAHVSIDWSQSLS、FGFPAHVSIDFSQSLS、FGFPSHIIIDWLQSLS、FGFPSHLIIEWLQSLS、AAFPAHLLADAAQALA、AAFPAHAAADFLQALA、AAFAAHLLADFLQAAA、AAAPAHLLVDAAQAAA、FAFPAHVFIDWLQSLS; FGFPAHVFIDWLQALS、FGFPAHVFIDWLQSLA、GFPAHVFIDWLQSLS、FPAHVFIDWLQSLS、PAHVFIDWLQSLS、FAFPAHVFIDWLQALA、FGFPEHLFVDFLQSLS、FGFPAHVHIDWLQSLS、FGFPAHVPIDWLQSLS、FGFPSHLFIDWAQSLS、PGFPAHVFIDWLQLIT、PAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQ、FGFPAHVFIDWLQ、DFGFPSHLIIDWLQSLS、DFGFPAHVFIDWLQSLN、PSHLIIDWLQ、PAHVFIDWLQ、DFGFPAHVTIDWLQSLN、DFGFPAHVLIDWLQSLN、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLN および FGFPAHVFIDWLQSLA からなる群から選択される少���くとも１つのアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１４】
請求項 13 に記載の少なくとも１つのペプチドを含む医薬製剤。
【請求項１５】
ペプチドが医薬上許容される担体、好ましくは KLH (キーホールリンペットヘモシアニン) と結合していることを特徴とする、請求項 14 に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化、アテローム性動脈硬化のリスク疾患(risk disease)およびアテローム性動脈硬化の続発症の予防および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化の続発症、例えば末梢動脈閉塞疾患、冠動脈心疾患および卒中性大脳発作は、未だ米国、欧州、およびアジアの大部分における主要な死因である。アテローム性動脈硬化の発生は、増殖因子、サイトカインおよび細胞相互作用の複雑な相互作用によって特徴付けられる、動脈の血管壁の慢性進行性炎症であると考えられる。“傷害に対する応答”仮説によれば、内皮の“傷害”が該疾患の最初の現象を構成し、細胞相互作用のカスケードを始動させる内皮の機能障害をもたらし、結果的にアテローム性動脈硬化の病変の形成に至る。かかる“傷害”を促進する危険因子として、アテローム性動脈硬化と統計的に有意に相関する外因性および内因性の影響が挙げられる。例えば、増大したおよび改変された LDL、Lp(a)、動脈の高血圧、糖尿病および高ホモシステイン血症が、これら内皮障害性因子のうち最も重要なものに数えられる。内皮は強固な障壁を構成しないが、むしろ極めて動的な障壁を構成するため、内皮の機能障害の過程において、リポタンパク質に対する透過性の増大に加えて複数の分子の変化が起こり、該分子の変化は単球、T-リンパ球および内皮細胞の相互作用に対して決定的な影響を有する。E、L および P セレクチン、インテグリン、ICMA-1、VCAM-1 ならびに血小板内皮細胞接着分子-1 の型の内皮接着分子の発現によって、単球および T-リンパ球の接着が内腔側において起こる。その後の、内皮を超える白血球の遊走は、MCP-1、インターロイキン-8、PDGF、M-CSF およびオステオポンチンによって媒介される。いわゆるスカベンジャー受容体を介して、内膜中に内在するマクロファージおよび単球は、浸透した(penetrated) LDL 粒子を取り込み、それらを細胞質内におけるコレステロールエステルの空胞として貯蔵(deposit)することができる。この様にして形成される泡沫細胞が、主に集団となって血管内膜の領域中において蓄積し、既に小児期において生じている“脂肪線条”病変を形成する。LDL は、低密度のリポタンパク質であり、トリグリセリドに富む VLDL 粒子から脂肪分解酵素の異化作用によって形成される。内皮細胞および中膜の平滑筋細胞に対する傷害特性のほかに、LDL はさらに単球に対して走化性作用を有し、遺伝子増幅を介して内皮細胞の MCSF および MCP-1 の発現を増大させることができる。LDL とは対照的に、HDL は、いわゆる HDLc 複合体の形成の下に、アポリポタンパク質 E によって媒介されながら、ロードされた(loaded)マクロファージからコレステロールエステルを回収することができる。SR-B1 受容体の相互作用によって、これらのコレステロールエステルがロードされた(cholesterol ester-loaded)粒子は、肝細胞または副腎皮質の細胞に結合することができ、それぞれ胆汁酸およびステロイドの産生のためにコレステロールを送達することができる。このメカニズムは逆コレステロール輸送と呼ばれ、HDL の保護的機能を明らかにする。活性化されたマクロファージは、HLA-DR を介して抗原を提示することができ、それにより CD4 および CD8 リンパ球を活性化し、その結果該リンパ球はサイトカイン、例えば IFN-ガンマおよび TNF-アルファを分泌するよう刺激され、さらには、炎症反応を増大させることに寄与する。疾患のさらなる過程において、中膜の平滑筋細胞が、炎症によって変化した内膜の領���に増殖し始める。これにより、この段階において中間段階(intermediary)病変が形成される。中間段階病変から始まり、内腔の側面上において、壊死性コア、細胞堆積物(cellular detritus)およびコラーゲンに富む線維性キャップ(fibrinous cap)によって形態的に特徴付けられる進行性かつ複雑な病変が、時間と共に発達する。細胞数および類脂質の部分が増大し続けると、内皮における断裂が起こり、血栓性の特性を有する表面が露出する。これらの断裂部位における血小板の接着および活性化に起因して、サイトカイン、増殖因子およびトロンビンを含有する顆粒が放出される。マクロファージのタンパク質分解酵素は、最後には継続的血栓症を伴うプラークの破裂および血管の狭窄および末端血管の急性虚血につながる、繊維素性キャップ(fibrinous cap)の菲薄化の原因である。
【０００３】
様々な危険因子が、アテローム性動脈硬化の病変形成に関与すると考えられている。高リポタンパク質血症、動脈高血圧およびニコチンの乱用は、この点において特に重要である。総コレステロールおよび LDL コレステロールの過剰な増大を含む疾患は、家族性高コレステロール血症(hypercholesterinemia)(FH)である。それは、最もよくみられる単一遺伝子遺伝する(monogenetically inherited)代謝疾患に属する。穏やかなヘテロ接合性形態は 1:500 の頻度で起こり、ホモ接合性形態は明らかに希な 1:100万の頻度でしか起こらない。家族性高コレステロール血症の原因は、第19番染色体の短腕上の LDL 受容体遺伝子における突然変異である。これらの突然変異は、欠失、挿入または点突然変異であり得る。家族性高コレステロール血症におけるリポタンパク質の特徴的な知見は、ほぼ正常なトリグリセリドおよび VLDL の濃度における、総コレステロールおよび LDL コレステロールの増大である。HDL が低下することがしばしばある。表現型的には、IIAa型高リポタンパク質血症が存在する。総コレステロールは、正常レベルと比較して、ヘテロ接合性形態において２から３倍増大し、ホモ接合性形態においては５から６倍増大する。臨床的には、家族性高コレステロール血症は、初期の冠動脈硬化症によって自然に現れる。一般に、ヘテロ接合性の男性においては、冠動脈心疾患(CHD)の最初の症状は 30歳から 40歳の間に生じ、女性においては平均してそれよりも 10 年遅い。罹患している男性の 50% が、50 歳になる前に冠動脈硬化症によって死亡する。大規模に増大した LDL レベルに加えて、低下した HDL 濃度もまたアテローム性動脈硬化の急速な進行の原因である。アテローム性動脈硬化の変化は、心外性の血管、例えば大動脈、頸動脈および末梢動脈上においても出現し得る。該疾患のホモ接合性形態を伴うと、冠動脈硬化症は早くも幼児期には発生する。最初の心筋梗塞がしばしば 10 歳よりも前に起こり、ほとんどの場合、罹患している人は 20 歳になる前に死亡する。黄色腫の発生は、血清コレステロールのレベルおよび疾患の持続期間の関数である。20 歳より上の罹患しているヘテロ接合性個体のおよそ 75% が、腱の黄色腫を示す。ホモ接合性個体は、ほぼ 100%、皮膚および腱の黄色腫を有する。脂質沈着は、眼瞼の上および角膜中においても起こり得る (黄色板腫; 角膜リポイド環)。しかし、これらは正常なコレステロールレベルを伴う状態でも見出されるため、高コレステロール血症の特異的な徴候ではない。さらに、FH に伴って、急性の関節炎および腱鞘滑膜炎が頻繁に起こる。個体のリポタンパク質は、脂質の大きな部分およびタンパク質、いわゆるアポタンパク質を異なって含有するため、サイズおよび密度に関して異なる。密度は、タンパク質の増大および脂質部分の減少に伴って増大する。それらは、その異なる密度により、超遠心分離によって異なる画分へ分離することができる。これは、リポタンパク質を以下の主要なグループへ分類するための基礎である: カイロミクロン、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、リポタンパク質(a)(Lp(a))。高いアテローム生成可能性を有するリポタンパク質の中には、LDL、Lp(a) および VLDL が主に存在する。LDL は、およそ d=1.006-1.063 g/ml の密度を有する。コアは、エステル化されたコレステロール分子により形成される。この高疎水性コアは、リン脂質の膜、非エステル化コレステロールおよび１つの単一の Apo B100 分子によって囲まれている。加えて、アポタンパク質 E は、LDL 粒子の表面上において見出される。LDL の機能は、コレステロールを末梢組織へ輸送することにあり、そこで LDL は アポタンパク質 B-100 に媒介されて、LDL 受容体を介して細胞内に取り込まれる。包括的な疫学的研究において、血清コレステロールのレベルと冠動脈心疾患の発生との間の正の相関が実証され得た。160 mg/dl よりも高い LDL コレステロールレベルは、高い心血管リスクを構成する。LDL コレステロールのレベルの他に、血管を保護する HDL コレステロールのレベルもまた、心血管疾患に関するリスク特性を推定する際に重要な役割を果たす。35 mg/dl よりも下のレベルは、リスクの増大と関連する。VLDL は、低い密度(d=0.94-1.006 g/ml)および高いトリグリセリド部分を有するリポタンパク質である。実質的に、VLDL は、アポタンパク質 C ならびにアポタンパク質 B-100 および E の小さな部分を含有する。カイロミクロンとは異なり、VLDL は食物脂質から構成されないが、内因性に形成されたトリグリセリドから肝臓中において合成され、分泌されて循環する。カイロミクロンと同様に、トリグリセリドがアポタンパク質 C-II に活性化されたリポタンパク質-リパーゼによって加水分解され、遊離脂肪酸が筋肉および脂肪組織へ供給される。残りのコレステロールに富む VLDL レムナントは、そのより高い密度から中間密度リポタンパク質と称される。リポタンパク質(a)(Lp(a))は、1.05 から 1.12 g/ml の密度を有し、その組成において LDL に類似する。アポタンパク質 B-100 の他に、そのタンパク質部分は Lp(a) に特有のアポタンパク質(a)で構成される。今日まで、Lp(a) の生理および機能についてはほとんど知られていない。アポタンパク質(a)分子はプラスミノーゲンと高い配列相同性を有するため、Lp(a)はアテローム性動脈硬化のプラーク上における血栓の形成を促進し、かつアテローム生成作用も有すると想定される。Lp(a)は、アテローム性動脈硬化の病変においてアポタンパク質 B と共に見出される。後向き研究により、Lp(a) の増大と CHD との間の相関が示されている。同様に、多数の前向き研究のメタ解析によって、Lp(a) が CHD の発生に関する独立の危険因子であることが示されている。15 から 35 mg/dl の間のレベルは、正常であると考えられる。今までのところ、Lp(a) は、食事および医薬のいずれによっても影響を受け得ない。そのため、治療基準(therapy measure)は、さらなる危険因子を減少させることに制限される。特に、LDL コレステロールの低下は、Lp(a) の心血管リスクを低下させると思われる。アテローム性動脈硬化の発症において、大きな病態生理学的重要性が、さらに、凝固因子に起因する。疫学的知見により、血漿中のフィブリノーゲン濃度と冠動脈心疾患の発生との間、および主として心筋梗塞の発生との間の相関が示唆される。このような状況において、増大したフィブリノーゲンレベル (>300 mg/dl) が、心血管疾患についての独立の指標および危険因子であることが明らかになった。さらに、高濃度の組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター tPA-I も、CHD の発生と関連する。高トリグリセリド血症と冠動脈リスクとの間の関連性は、血中脂質の上昇の原因によって事例ごとに異なるものである。トリグリセリドが独立の危険因子であると考えられるか否かという議論にかかわらず、冠動脈心疾患の発症においてそれらが重要な役割を果たすことは明白である。疾患の発生率は、高い LDL コレステロールレベルおよび高いトリグリセリドレベルを示す患者において最も高い。
【０００４】
コレステロールエステル転送タンパク質(CETP)は、リポタンパク質間の中性脂質およびリン脂質の転送に関与し、HDL の血漿濃度を下方制御する、安定な血漿糖タンパク質である。CETP の脂質転送活性の阻害は、HDL 血漿レベルを増大させるための治療的アプローチとして既に示唆されている。血漿中における CETP 活性の減少が HDL レベルの増大をもたらすことを示唆する多数の根拠が存在する。したがって、CETP は、HDL から LDL および VLDL へコレステロールエステルを転送することによって、HDL 濃度を低下させる。ウサギおよびハムスターを用いた動物実験において、抗-CETP モノクローナル抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは CETP 阻害剤による CETP の一過性阻害は、HDL レベルの増大をもたらした。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる持続的な CETP 阻害は、アテローム性動脈硬化のウサギ動物モデルにおいて HDL レベルを増大させ、それによりアテローム性動脈硬化の病変の減少をもたらした。
【０００５】
文献において、いくつかの CETP 阻害剤が記載されており、そのうちいくつかは臨床試験中である (例えば Anacetrapib (Krishna R.、Lancet 370 (9603) (2007): 1907-14) および Torcetrapib (Sikorski、J.A.、J.Med.Chem. 49 (1) (2006): 1-22))。
【０００６】
US 5,512,548 および WO 93/011782 において、HDL から VLDL および LDL へのコレステロールエステルの転送を触媒する CETP を阻害することができ、そのため患者に投与されると抗-アテローム性動脈硬化活性を有するポリペプチドおよびその類縁体が記載されている。これらの文献によると、かかる CETP ポリペプチド阻害剤は様々な源のアポリポタンパク質 C-I に由来しており、特にアミノ酸 36 までの N-末端断片が CETP 阻害剤として同定されている。
【０００７】
US 5,880,095 A においても、個体において CETP の活性を阻害することができる CETP 結合性ペプチドが開示されている。該 CETP-阻害性タンパク質は、ブタのアポリポタンパク質 C-III の N-末端断片を含む。
【０００８】
US 2006/0276400 および WO 96/034888 において、CETP に由来し、T 細胞および/または B 細胞のエピトープを含むペプチドが開示されている。これらのペプチドは、インビボで CETP 特異的抗体の形成を誘導することができる。
【０００９】
US 2004/0087481 および US 6,410,022 B1 において、CETP 特異的免疫応答の誘導により、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化の治療および予防のために用いることができるペプチドが開示されている。これらのペプチドは、CETP に由来しない T ヘルパー細胞エピトープおよび少なくとも１つの CETP 由来の B 細胞 エピトープを含み、後者から直接的に得ることができる。T ヘルパー細胞エピトープは破傷風トキソイドから都合良く得られ、少なくとも１つの CETP の B 細胞 エピトープに共有結合する。生物にとって異質な T ヘルパー細胞エピトープを用いることにより、個体の体において、少なくとも１つの CETP-B 細胞エピトープから構成されるペプチド部分に対して向けられる抗体を誘導することが可能になる。
【００１０】
Mao D et al (Vaccine 24(2006): 4942-4950) において、CETP の B 細胞エピトープをコードする核酸分子を含むプラスミドの、ワクチンとしての使用が記載されている。
【００１１】
WO 2006/029982 において、アテローム性動脈硬化の治療または予防のための医薬を製造するために用いられる CETP ミモトープが記載されている。
【００１２】
ごく最近では、CETP に関するワクチンアプローチの提案が既になされている。従って、例えば、ウサギが、コレステロールエステルの転送に関与する CETP のペプチドを抗原として含有するワクチンを用いて処理されている。免疫されたウサギは、増大した HDL 値および減少した LDL 値と共に、減少した CETP 活性および変化したリポタンパク質レベルを有した。さらに、処理されたアテローム性動脈硬化モデルの被験動物も、対照の動物と比較してアテローム性動脈硬化の病変の減少を示した。
【００１３】
米国のバイオテクノロジー会社である Avant によってワクチン CETi-1 を用いて行われた第二相臨床研究の結果が発表された (BioCentury Extra For Wednesday、October 22、2003)。この第二相研究において、先行する第一相研究におけるのと同様に、問題のある副作用を何ら伴わない非常に良好な安全性が証明され、これは抗-CETP ワクチン接種アプローチからは基本的に何の副作用も予期されないという結論を導き出すことを可能にする。しかし、有効性に関しては、Avant のワクチンは、プラセボ治療によって達成されるレベルよりも有意に優れる HDL レベルの増大をもたらさなかったため、期待はずれであった。
【００１４】
CETi-1 ワクチンに伴う問題は、それが内因性の抗原を用いることである。CETP は別として、ほとんどの内因性分子に関して自己抗体が形成されないことが非常に重要であるため、ヒトの免疫系は、内因性の構造に対して寛容である。従って、内因性寛容性を打破することが CETi-1 ワクチンの目的であり、明らかに、それは十分達成されてはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、免疫系によって外来性であるとみなされ、そのため自己寛容を打破する必要がないよう選択された、抗-CETP ワクチンのための抗原を提供することが本発明の目的である。これらの抗原は、アテローム性動脈硬化、アテローム性動脈硬化のリスク疾患およびアテローム性動脈硬化の続発症を予防および/または治療するために用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、本発明は、アテローム性動脈硬化、アテローム性動脈硬化のリスク疾患およびアテローム性動脈硬化の続発症を予防および/または治療するための医薬を製造するための、コレステロールエステル転送タンパク質(CETP)の 4- から 16-mer のポリペプチド断片でも CETP-エピトープでもないか又はこれらを含まない以下のアミノ酸配列を含む、天然の CETP 糖タンパク質に特異的な抗体への結合能力を有する化合物の使用
(Z1)nX1X2X3X4(Z2)m
[式中、
Z1 は C 以外のアミノ酸残基であり、
X1 は D、A、R、E、S、N、T および G からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X2 は F、A、W、R、S、L、Q、V および M からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X3 は L、A、S、W、E、R、I および H からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X4 は Q、A、H、D、K、R、S および E からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Z2 は C 以外のアミノ酸残基であり、
n は 0 から 10 の間、好ましくは 0 から 9 の間の整数であり、
m は 0 から 3 の間の整数である]
または
SYHATFL、TMAFPLN、HYHGAFL、EHHDIFL、TGLSVFL、WMPSLFY、SMPWWFF、TMPLLFW、DTWPGLE、SMPPIFY、MPLWWWD、SMPNLFY、RMPPIFY、NPFEVFL、TLPNWFW、SMPLTFY、SPHPHFL、NFMSIGL、SQFLASL、WSWPGLN、IAWPGLD、SKFMDTL、SMPMVFY、YEWVGLM、KGFLDHL、HQSDDKMPWWFF、YVWQDPSFTTFF、YVWQDPSFTTFF、LPQTHPLHLLED、GPVSIYADTDFL、DSNDTLTLAAFL、NGSPALSHMLFL、TDYDPMWVFFGY、IFPLDSQWQTFW、NESMPDLFYQPS、DWGDKYFSSFWN、VSAYNNV および WPLHLWQ からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む化合物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図 1 は、モノクローナル抗体“Paula”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7 をスクリーニングした後の代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【図２ａ】図 2a および 2b は、モノクローナル抗体“Paula”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12 をスクリーニングした後の 2 つの典型的な競合 ELISA の結果を示す。
【図２ｂ】上記と同様である。
【図３ａ】図 3a および 3b は、mAb Frida を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7 をスクリーニングした後の 2 つの代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【図３ｂ】上記と同様である。
【図４ａ】図 4a は、モノクローナル抗体“Frida”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12 をスクリーニングした後の代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【図４ｂ】図 4b は、ミモトープ-BSA でコートされた ELISA プレートへのモノクローナル抗体“Frida”の結合を示す。
【図５ａ】図 5a および 5b は、モノクローナル抗体“Frida”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12 をスクリーニングした後の代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【図５ｂ】上記と同様である。
【図６】図 6 は、モノクローナル抗体“Frida”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12 をスクリーニングした後の２つのミモトープの競合 ELISA の結果を示す。
【図７ａ】図 7a から 7d は、以下のミモトープ-BSA 複合体をマウスに注入したインビボ実験の抗体力価(抗マウス IgG)を示す:
【図７ｂ】上記と同様である。
【図７ｃ】上記と同様である。
【図７ｄ】上記と同様である。
【図８ａ】図 8a および 8b は、モノクローナル抗体“Frida”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7C7 をスクリーニングした後の２つの代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【図８ｂ】上記と同様である。
【図９】図 9 は、“Frida”と環状ミモトープとの間の結合の検出に関するインビトロ ELISA 試験の結果を示す。
【図１０ａ】図 10a および 10b は、FGFPSHLIIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLS および FGFPAHVYIDWLQSLS を用いた阻害 ELISA アッセイの結果を示す。
【図１０ｂ】上記と同様である。
【図１１】図 11 は、マウスに投与された本発明のミモトープによる、CETP に向けられた抗体のインビボ誘導を示す。Balb/c マウス / 30 μg のペプチド、2 週間間隔で 2 回注入。S3 = 3回目の注入後 2 週間。アジュバントとしてミョウバン。ミモトープの注入によって誘導された、オリジナルのエピトープ(p4073)に対する力価。ウェルの被覆: 50 μl の、1 μM の p4073-BSA または 1 μg/ml の活性化 KLH。検出: αIgG:
【図１２ａ】図 12a および 12b は、本発明のミモトープの投与による、CETP 特異的抗体のインビボ誘導を示す。p4073 に対する力価、および選択された群の CETP (p4073 に対して高い力価を示す) に対する力価とのその相関: gr.4、gr.9、gr.10、gr.14、gr.16-20 / 対照として gr.1 (KLH)、gr.2 (オリジナルのエピトープ)。被覆: それぞれ、組換え GST-CETP または精製されたウサギ CETP:
【図１２ｂ】上記と同様である。
【図１３】図 13 は、マウスに投与された本発明のミモトープによる、CETP に向けられた抗体のインビボ誘導を示す。各群 (各々 5 頭の Balb/c マウス) の血清を合わせ、1:100 に希釈し、それぞれ組換え GST-CETP またはウサギ CETP でコートされた ELISA プレート上で試験した。結合した抗体の検出は、algG を用いて行った。
【図１４】図 14 は、0.6 μl のヒト血清(内因性の CETP 活性を有する)を、それぞれ KLH/ミョウバン(Alum)(陰性対照群)、p4703-KLH/ミョウバン(オリジナルの CETP エピトープ) または p4361 (または p4362 または p 4325) ミモトープを用いてワクチン接種した野生型マウス(CETP 活性を含有しない)からの血清と混合する CETP 活性アッセイを示す。KLH/ミョウバン-対照のみまたはオリジナルのエピトープ(p4073-KLH/ミョウバン)でワクチン接種されたマウスからの血清の添加とは対照的に、p4361-KLH/ミョウバンでワクチン接種したマウスからの 1.2 μl および 0.6 μl の血清の添加が CETP 活性を完全に阻害すること、および 0.2 μl の血清の添加が前記活性を有意に減少させることを実証することができた。
【図１５】図 15 は、ヒト血清への p4325-KLH/ミョウバンの添加が CETP 活性を有意に阻害することを示す。
【図１６】図 16 は、ヒト血清への p4361-KLH/ミョウバンの添加が CETP 活性を有意に阻害することを示す。
【図１７】図 17 は、ヒト血清への p4362-KLH/ミョウバンの添加が CETP 活性を有意に阻害することを示す。
【図１８ａ】図 18a は、ミモトープを用いる阻害 ELISA を示す (被覆 1μM 4073 ペプチド、検出 αIgG1)。
【図１８ｂ】図 18b は、ミモトープを用いる阻害 ELISA を示す (被覆 1μM 4073 ペプチド、検出 αIgG1)。
【図１８ｃ】図 18c は、PhD12 Frida およびミモトープの特性決定のための Ala-交換 / mAb Frida をスクリーニングする、ミモトープを用いる阻害 ELISA を示す (被覆 1 μM 4073。検出 αIgG1。)
【図１９ａ】図 19a は、ペプチド ELISA、C-DFGFPAHVYIDWLQSLS (p4628-KLH/ミョウバン) を用いる免疫化、オリジナルのエピトープに対する力価を示す。
【図１９ｂ】図 19b は、ペプチド ELISA、C-FGFPAHVFIDWLQSLN (p4474-KLH/ミョウバン) を用いる免疫化、オリジナルのエピトープに対する力価を示す。
【図１９ｃ】図 19c は、ペプチド ELISA、C-FGFPAHVFIDWLQSLN (p4474-KLH/ミョウバン) を用いる免疫化、注入されたミモトープに対する力価を示す。
【図１９ｄ】図 19d は、抗-タンパク質 ELISA を示す。30 μg の、アジュバントとしてのミョウバンを伴う KLH に結合した示されるミモトープを、マウスに 3 回注入した。各群(5 頭のマウスを含む)からの血清をプールし、1:100 に希釈し、精製されたウサギ CETP でコートされた ELISA プレート上で試験した。
【図１９ｅ】図 19e は、30 μg の、アジュバントとしてのミョウバンを伴う KLH に結合した示されるミモトープをマウスに 3 回注入した、抗-タンパク質 ELISA を示す。マウス血清(単一のマウスからの)を 1:100 に希釈し、精製されたウサギ CETP でコートされた ELISA プレート上で試験した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、これらの目的のための CETP ミモトープを提供する。これらのミモトープは、CETP の酵素活性を阻害することが可能な抗体を誘導するすることができる。本発明の CETP ミモトープは、好ましくはそのアミノ酸配列が CETP もしくは CETP の断片のアミノ酸配列と異なる抗原性ポリペプチドである。この点において、本発明のミモトープは、１以上の非天然アミノ酸(すなわち 20 の“古典的”アミノ酸からではない)を含んでもよいし、あるいは完全にかかる非天然アミノ酸で構築されてもよい。さらに、抗-CETP 抗体を誘導する本発明の抗原は、D- もしくは L- アミノ酸または DL- アミノ酸の組み合わせで構築されてもよく、所望により、さらなる修飾、閉環または誘導体化によって変化させられてもよい。適切な抗-CETP-抗体を誘導する抗原は、市販のペプチドライブラリーから提供され得る。好ましくは、これらのペプチドは、長さが少なくとも 4 アミノ酸残基、特に少なくとも 7 アミノ酸であり、好ましい長さは 16 まで、好ましくは 14 または 20 アミノ酸まで(例えば 5 から 16 アミノ酸残基)であり得る。しかし、本発明によれば、より長いペプチドも抗-CETP-抗体を誘導する抗原としてとても良く採用され得る。さらに、本発明のミモトープはまた、ポリペプチドの部分であってもよく、その結果、その N- および/または C-末端において少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を含んでもよい。
【００１９】
本発明のミモトープは、KLH または他の担体と結合した C-FGFPEHLLVDFLQSLS (CETP タンパク質の 16 C-末端アミノ酸) を哺乳類へ投与することによって得られ得る抗体に結合することができる。哺乳類へ投与されると、ミモトープは、CETP に対して向けられた抗体が前記哺乳類の中において産生されるよう、対応する免疫応答を誘導することができる。
【００２０】
本発明の CETP-ミモトープ(すなわち、抗-CETP-抗体を誘導する抗原)は、ファージライブラリーまたはペプチドライブラリーを含む様々な方法によって同定および調製することができる。それらは、例えばコンビナトリアルケミストリーまたはハイスループットスクリーニング技術によって、ほとんどの様々な構造について生産および同定することができる (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor)、 et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002; 50(6):837-54)。
【００２１】
さらに、本発明によれば、核酸に基づく抗-CETP-抗体を誘導する抗原(“アプタマー”)も採用することができ、これらも、ほとんどの様々な(オリゴヌクレオチド)ライブラリー(例えば 2-180 核酸残基のもの)を用いて見出すことができる (例えば Burgstaller et al.、Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002)、690-700; Famulok et al.、Acc. Chem. Res. 33 (2000)、591-599; Mayer et al.、PNAS 98 (2001)、4961-4965、等)。核酸に基づく抗-CETP-抗体を誘導する抗原において、核酸骨格は、例えば天然のホスホジエステル(phosphor-diester)化合物によって、またはホスホロチオエートまたは組み合わせまたは化学的バリエーション(例えば PNA)によって提供され得、塩基として、本発明によれば主に U、T、A、C、G、H および mC が採用され得る。本発明によって用いることができるヌクレオチドの 2'-残基は、好ましくは H、OH、F、Cl、NH2、O-メチル、O-エチル、O-プロピルまたは O-ブチルであり、核酸は、オリゴヌクレオチド合成において普通に採用されるのと同様に、異なって修飾、即ち、例えば保護基を用いて修飾されてもよい。従って、アプタマーに基づく抗-CETP-抗体を誘導する抗原もまた、本発明の範囲内における好ましい抗-CETP-抗体を誘導する抗原である。
【００２２】
本発明によれば、“ミモトープ”との用語は、それがその模倣体であるエピトープと等価なトポロジーを有するコンフォメーションを有する分子をいう。ミモトープは、所望の抗原に免疫特異的に(immunospecifically)結合する抗体の同じ抗原結合領域に結合する。ミモトープは、それがその模倣体である抗原に対して反応性である宿主において免疫学的応答を誘発する。ミモトープはまた、エピトープおよび前記エピトープに結合する抗体を含むインビトロ阻害アッセイ(例えば ELISA 阻害アッセイ)において、それがその模倣体であるエピトープの競合者としても働き得る。しかし、本発明のミモトープは、哺乳類に投与されると特異的免疫応答を誘導することができるが、インビトロ阻害アッセイにおいて必ずしもそれがその模倣体であるエピトープの結合を妨害したりエピトープと競合したりするわけではない。
【００２３】
本明細書において用いる場合、“エピトープ”との用語は、特定の抗体分子によって認識される抗原の免疫原性の領域をいう。一般的に、抗原は１以上のエピトープを有し、各々が該特定のエピトープを認識する抗体と結合することができる。
【００２４】
本発明において開示されるアミノ酸残基の略号は、IUPAC 勧告に従う:
2014040438.tif 000002
【００２５】
本発明のミモトープは、単離されたペプチドとしてまたは別のペプチドもしくはポリペプチドの一部として、当該技術分野において周知の化学合成方法によって合成的に生産することができる。あるいは、ペプチドミモトープは、該ペプチドミモトープを産生する微生物において生産することができ、それは次いで単離され、所望により、さらに精製される。ペプチドミモトープは、微生物、例えば細菌、酵母または真菌において、真核生物細胞、例えば哺乳類細胞または昆虫細胞において、または組換えウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ(Simliki)森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスまたはセンダイウイルスにおいて、生産することができる。ペプチドミモトープを生産するのに適する細菌は、大腸菌(E.coli)、枯草菌(B.subtilis)またはペプチド、例えばペプチドミモトープを発現することができるあらゆる他の細菌を包含する。ペプチドミモトープを発現するのに適する酵母の型は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ属(Candida)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)またはペプチドを発現することができるあらゆる他の酵母を包含する。対応する方法は、当該技術分野において周知である。組換え生産されたペプチドを単離および精製する方法もまた、当該技術分野において周知であり、例えばゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を包含する。
【００２６】
ペプチドミモトープの単離を促進するため、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする異種性ポリペプチドにペプチドミモトープが翻訳的に融合(共有結合)している融合ポリペプチドを作成してもよい。典型的な異種性ポリペプチドは、His-タグ (例えば His6; 6 ヒスチジン残基)、GST-タグ (グルタチオン-S-トランスフェラーゼ) 等である。融合ポリペプチドは、ミモトープの精製を促進するのみならず、ミモトープポリペプチドが精製中に分解するのを防ぐこともできる。精製後に異種性ポリペプチドを除去することを望む場合には、融合ポリペプチドは、ペプチドミモトープと異種性ポリペプチドとの間の接合部において切断部位を含み得る。切断部位は、該部位におけるアミノ酸配列に特異的な酵素(例えばプロテアーゼ)によって切断されるアミノ酸配列からなる。
【００２７】
本発明のミモトープはまた、その N- および/または C-末端またはその近傍においてシステイン残基が結合するよう修飾されてもよい。好ましい態様において、末端に位置する(ペプチドの N- および C-末端に位置する)システイン残基が、ジスルフィド結合を介してペプチドを環化させるために用いられる。
【００２８】
本発明のミモトープはまた、様々なアッセイおよびキット、特に免疫学的アッセイおよびキットにおいて用いられ得る。従って、ミモトープが別のペプチドまたはポリペプチド、特に免疫学的アッセイにおいてレポーターとして用いられる酵素の部分であり得ることが、特に好ましい。かかるレポーター酵素は、例えばアルカリフォスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼを包含する。
【００２９】
“アテローム性動脈硬化続発症”または“アテローム性動脈硬化の続発症”との用語は、アテローム性動脈硬化(atherosclerose)の結果である疾患をいう。これらの疾患は、とりわけ、末梢動脈閉塞疾患、冠動脈心疾患および卒中性大脳発作を包含する (例えば Steinberg D. J. Lipid Res. (2005) 46: 179-190; Steinberg D et al. J. Lipid Res (2006) 47: 1339-1351 を参照されたい)。
【００３０】
本発明の別の好ましい態様によれば、X1 は D であり、X4 は Q または H、好ましくは Q である。かかる分子は、好ましくは、その N-末端において、配列 Xa Xb Xc Xd Xe Xf を有するさらなるアミノ酸残基を含み、ここで Xa は P、Y、T または K であり、Xb は C 以外のアミノ酸残基であり、Xc は H であり、Xd は Y、L、H、V、T、I または F であり、Xe は Y、I、P、L、Q、S、R、T、F または A であり、Xf は A、W、V、Q、L、S、I、R または T である。
【００３１】
本発明の好ましい態様によれば、n は 7、8 または 9 であり、Z1 は C 以外のアミノ酸残基または F、G、F、A、P、W、Y、S、G、D、L、E、K、T、P、I および M からなる群から、好ましくは F、G、F、A、P、Y、T、S、G、K および D からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、Z2 は S、L、A、W、L、N、T、I、Y および H からなる群から選択される。
【００３２】
本発明のさらに好ましい態様によれば、X1 は D、A、R、E および L からなる群から選択され、X2 は F、A、W、Q および R からなる群から選択され、X3 は L、A および S からなる群から選択され、X4 は Q、A および H からなる群から選択される。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、X1 は D であり、X2 は F、Q および W からなる群から選択され、X3 は L または S であり、X4 は Q または H である。
【００３４】
本発明の好ましい態様によれば、化合物はアミノ酸配列 FX8(F)oPX9HX10X11X12DX2X3X4X5X6X7 を含む
[式中、
X8 は G、A、F、Y および K からなる群から選択され、
X9 は E、Y、A、Q、K および S からなる群から選択され、
X10 は H、V、L、F および I からなる群から選択され、
X11 は L、W、S、I、F および Y からなる群から選択され、
X12 は V、T、F または I であり、
X5 は S または Y であり、
X6 は L、A または I であり、
X7 は S、N または T であり、および
o は 0 または 1 である]。
【００３５】
本発明の化合物は、好ましくはアミノ酸配列 X1X2X3X4X5X6X7 を含み、ここで、X1 は D、S、N、T および G からなる群から選択され、X2 は F であり、X3 は L であり、X4 は Q、D、K、R、S および E からなる群から選択され、X5 は S または T であり、X6 は L であり、X7 は C 以外のアミノ酸残基、好ましくは S、T、A、M、F および W からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【００３６】
本発明の好ましい態様によれば、アミノ酸配列は、SSLELFL、SFLDTLT、NFLKTLS、DFLRTLT、AFLDTLV、TFLSSLA、GFLDSLM、SPHPHFL、SNFLKTL、TGFLATL、SDFLRAL、SANPRDFLETLF、RMFPESFLDTLW、TIYDSFLDSLAS、KPYLLKDFLEAL、AMGPYDALDLFL、TWNPIESFLESL、QYQTPLTFLEAL、RHISPATFLEAL、HTDSFLSTFYGD、ADSTFTSFLQTL、GPVSIYADTDFL、DSNDTLTLAAFL、TPTHYYADFSQL、LPGHLIWDSLHY、LPQTHPLHLLED、IPYHHLVDQLHH、YPYHVQVDVLQN、IPSHHLQDSLQL、EYAHHTSLDLRQ、EPLHFRSDRIQA、ATPSHLIIDRAQ、APKHLYADMSQA、FKPAHVSIDWLQ、MPAHLSRDLRQS、NPKHYSIDRHQA、SPQHLTTDRAQA、TPFHFAQDSWQW、TPTHYYADFSQLLS、TPTHYYADFSQSLS、GTPTHYYADFSQLL、GTPTHYYADFSQSL、FGTPTHYYADFSQSLS、FGFPTHYYADFSQSLS、LPGHLIWDSLHY、LPGHLIWDSLHYL、LPGHLIWDSLHYLS、LPGHLIWDSLHSL、LPGHLIWDSLHSLS、GLPGHLIWDSLHYL、GLPGHLIWDSLHSL、FGLPGHLIWDSLHSLS、FGFPGHLIWDSLHSLS、LPQTHPLHLLED、IPYHHLVDQLHH、IPYHHLVDQLHLS、IPYHHLVDQLHSLS、FGIPYHHLVDQLHHLS、FGFPYHHLVDQLHSLS、YPYHVQVDVLQN、YPYHVQVDVLQNLS、YPYHVQVDVLQSLS、FGYPYHVQVDVLQNLS、FGFPYHVQVDVLQSLS、IPSHHLQDSLQL、IPSHHLQDSLQLLS、IPSHHLQDSLQSLS、GIPSHHLQDSLQLL、FGIPSHHLQDSLQLLS、FGFPSHHLQDSLQSLS、EYAHHTSLDLRQ、EPLHFRSDRIQA、EPLHFRSDRIQALS、EPLHFRSDRIQSLS、GEPLHFRSDRIQAL、FGEPLHFRSDRIQALS、FGFPLHFRSDRIQSLS、APKHLYADMSQA、APKHLYADMSQALS、APKHLYADMSQSLS、GAPKHLYADMSQAL、FGFPKHLYADMSQSLS、MPAHLSRDLRQS、MPAHLSRDLRQSL、MPAHLSRDLRQSLS、GMPAHLSRDLRQSL、FGFPAHLSRDLRQSLS、NPKHYSIDRHQA、TPFHFAQDSWQW、TPFHFAQDSWQWLS、TPFHFAQDSWQSLS、GTPFHFAQDSWQWL、FGFPFHFAQDSWQSLS、ACSFAYLYRC、ACFMGDKWVC、ACVLYPKAIC、ACYMGQQFVC、ACLTAYLHWC、ACTLFPVAYC、ACWLFPYAHC、ACKSINMWLC、ACQTINRWLC、FGFPEHLLVDFLQSLS、FGFPEHLLVDFLQSLS、FPEHLLVDFLQSL、AGFPEHLLVDFLQSLS、FAFPEHLLVDFLQSLS、FGAPEHLLVDFLQSLS、FGFAEHLLVDFLQSLS、FGFPAHLLVDFLQSLS、FGFPEALLVDFLQSLS、FGFPEHALVDFLQSLS、FGFPEHLAVDFLQSLS、FGFPEHLLADFLQSLS、FGFPEHLLVAFLQSLS、FGFPEHLLVDALQSLS、FGFPEHLLVDFAQSLS、FGFPEHLLVDFLASLS、FGFPEHLLVDFLQALS、FGFPEHLLVDFLQSAS、FGFPEHLLVDFLQSLA、FAFPAHLLVDFLQALA、AAFPAHLLADFLQALA、SPQHLTTDRAQA、SPQHLTTDRAQALS、SPQHLTTDRAQSLS、GSPQHLTTDRAQAL、FGFPQHLTTDRAQSLS、FGFPQHLTTDWAQSLS、FGFPQHLTTDRLQSLS、FGFPQHLTTDWLQSLS、ATPSHLIIDRAQ、ATPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDWAQSLS、FGFPSHLIIDWLQSLS、FGFPSHLIIDWSQSLS、FATPSHLIIDWLQSLS、FKPAHVSIDWLQ、FKPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQSLS、AGFPAHVSIDWLQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FGAPAHVSIDWLQSLS、FGFAAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQALS、FGFPAHVSIDWLQSLA、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFAAHVSIDWLQSLS、FGFFAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIRWLQSLS、FGFPAHVSIEWLQSLS、FGFPAHVSIDWLNSLS、FGFPAHVSIDWLHSLS、AGFPAHVSIDWLQSLS、PGFPAHVSIDWLQSLS、WGFPAHVSIDWLQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FSFPAHVSIDWLQSLS、FYFPAHVSIDWLQSLS、FDFPAHVSIDWLQSLS、FGAPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQLLS、FGFPAHVSIDWLQWLS、FGFPAHVSIDWLQNLS、FGFPAHVSIDWLQTLS、FGFPAHVSIDWLQYLS、FGFPAHVSIDWLQSIS、FGFPAHVSIDWLQSLT、FGFPAHVSIDWLQSLY、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFPAHVSIDRAQSLS、FGFPTHVSIDWLQSLS、FGFPFHVSIDWLQSLS、FGFPAHISIDWLQSLS、FGFPAHIIIDWLQSLS、FGFPAHLTTDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVSLDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、TPTHYYADFSQSLS、FGFPAHVSIDWSQSLS、FGFPAHVSIDFSQSLS、FGFPSHIIIDWLQSLS、FGFPSHLIIEWLQSLS、AAFPAHLLADAAQALA、AAFPAHAAADFLQALA、AAFAAHLLADFLQAAA、AAAPAHLLVDAAQAAA、FAFPAHVFIDWLQSLS; FGFPAHVFIDWLQALS、FGFPAHVFIDWLQSLA、GFPAHVFIDWLQSLS、FPAHVFIDWLQSLS、PAHVFIDWLQSLS、FAFPAHVFIDWLQALA、FGFPEHLFVDFLQSLS、FGFPAHVHIDWLQSLS、FGFPAHVPIDWLQSLS、FGFPSHLFIDWAQSLS、PGFPAHVFIDWLQLIT、PAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQ、FGFPAHVFIDWLQ、DFGFPSHLIIDWLQSLS、DFGFPAHVFIDWLQSLN、PSHLIIDWLQ、PAHVFIDWLQ、DFGFPAHVTIDWLQSLN、DFGFPAHVLIDWLQSLN、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLN および FGFPAHVFIDWLQSLA からなる群から選択される。
【００３７】
本発明に従って用いられる特に好ましいミモトープは、SANPRDFLETLF、RMFPESFLDTLW、SFLDTLT、NFLKTLS、DFLRTLT、TFLSSLA、GFLDSLM、FGFPYHVQVDVLQSLS、FGFPSHLIIDRAQSLS、FKPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQSLS、FGFPQHLTTDRAQSLS、FGFPTHYYADFSQSLS、FGFPGHLIWDSLHSLS、FGFPYHHLVDQLHSLS、FGFPSHHLQDSLQSLS、FGFPLHFRSDRIQSLS、FGFPKHLYADMSQSLS、FGFPAHLSRDLRQSLS および FGFPFHFAQDSWQSLS である。
【００３８】
本発明の特に好ましいミモトープは、FGFPSHLIIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLS および FGFPAHVYIDWLQSLS である。
【００３９】
さらなる好ましいミモトープは、FGFPAHVWIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLN、FGFPAHFSIDWLQSLS、FGFPAHVSFDWLQSLS、FGFPEHVFIDWLQSLS、DFGFPAHVFIDWLQSLS、DFGFPSHLIIDWLQSLS、DFGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPQHLFTDWLQSLS および FGFPKHLLVDFLQSLS である。
【００４０】
本発明の好ましい態様によれば、化合物は、医薬上許容される担体、好ましくは KLH (キーホールリンペットヘモシアニン)、破傷風トキソイド、アルブミン結合性(albumin-binding)タンパク質、ウシ血清アルブミン、デンドリマー(MAP; Biol. Chem. 358: 581)、ペプチドリンカー(またはフランキング領域)、ならびに Singh et al.、Nat. Biotech. 17 (1999)、1075-1081 (特に該文献の表 1 におけるもの) および O'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2 (9) (2003)、727-735 (特に、該文献中に記載される内因性の免疫増強性(immuno-potentiating)化合物および送達系) に記載されるアジュバント物質、またはこれらの混合物と結合させられる。かかる状況において、複合体化の化学(conjugation chemistry)(例えば、ヘテロ二官能性化合物、例えば GMBS を介するもの、および当然“Bioconjugate Techniques”, Greg T. Hermanson に記載される他のものも含む)は、当業者に公知の反応から選択することができる。さらに、ワクチン組成物を、アジュバント、好ましくは低溶解性アルミニウム組成物、特に水酸化アルミニウムを用いて製剤することができる。もちろん、MF59 リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン (例えば IL-2、IL-12、GM-CSF)、サポニン (例えば QS21)、MDP 誘導体、CpG オリゴ、LPS、MPL、ポリホスファゼン、エマルジョン (例えば フロイント(Freund's)、SAF)、リポソーム、ビロソーム、イスコム(iscom)、蝸牛状剤(cochleate)、PLG 微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、熱不安定性エンテロトキシン(LT)、コレラ毒素(CT)、突然変異体毒素 (例えば LTK63 および LTR72)、微粒子および/または重合リポソーム等のアジュバントを用いることもできる。
【００４１】
本発明の化合物は、好ましくは、NHS-ポリ(エチレンオキサイド)(PEO)(例えば NHS-PEO4-マレイミド)からなる群から選択されるリンカーを介して、担体またはアジュバントに結合する。
【００４２】
本発明の化合物(ミモトープ)および医薬上許容される担体を含むワクチンは、あらゆる適切な適用様式、例えば、皮内(i.d.)、静脈内(i.v.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、鼻腔内、経口、皮下等によって、およびあらゆる適切な送達装置において、投与され得る (O'Hagan et al.、Nature Reviews、Drug Discovery 2 (9)、(2003)、727-735)。本発明の化合物は、好ましくは 静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与のために製剤される (例えば“Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations”、Sarfaraz Niazi、CRC Press Inc、2004 を参照されたい)。
【００４３】
典型的には、ワクチンは、本発明の化合物を、0.1 ng から 10 mg、好ましくは 10 ng から 1 mg、特に 100 ng から 100 μg の量で、あるいは、例えば 100 fmol から 10 μmol、好ましくは 10 pmol から 1 μmol、特に 100 pmol から 100 nmol の量で含有する。典型的には、ワクチンは、補助的物質、例えばバッファー、安定剤等をも含み得る。
【００４４】
本発明の別の側面は、SYHATFL、TMAFPLN、HYHGAFL、EHHDIFL、SSLELFL、TGLSVFL、WMPSLFY、SMPWWFF、TMPLLFW、DTWPGLE、SMPPIFY、MPLWWWD、SMPNLFY、RMPPIFY、NPFEVFL、TLPNWFW、SMPLTFY、SFLDTLT、NFLKTLS、DFLRTLT、AFLDTLV、TFLSSLA、GFLDSLM、SPHPHFL、NFMSIGL、SQFLASL、SNFLKTL、TGFLATL、WSWPGLN、IAWPGLD、SKFMDTL、SDFLRAL、SMPMVFY、YEWVGLM、KGFLDHL、SANPRDFLETLF、RMFPESFLDTLW、TIYDSFLDSLAS、HQSDDKMPWWFF、KPYLLKDFLEAL、AMGPYDALDLFL、TWNPIESFLESL、YVWQDPSFTTFF、QYQTPLTFLEAL、RHISPATFLEAL、HTDSFLSTFYGD、YVWQDPSFTTFF、ADSTFTSFLQTL、GPVSIYADTDFL、DSNDTLTLAAFL、NGSPALSHMLFL、TDYDPMWVFFGY、IFPLDSQWQTFW、NESMPDLFYQPS、DWGDKYFSSFWN、VSAYNNV、WPLHLWQ、TPTHYYADFSQL、LPGHLIWDSLHY、LPQTHPLHLLED、IPYHHLVDQLHH、YPYHVQVDVLQN、IPSHHLQDSLQL、EYAHHTSLDLRQ、EPLHFRSDRIQA、ATPSHLIIDRAQ、APKHLYADMSQA、FKPAHVSIDWLQ、MPAHLSRDLRQS、NPKHYSIDRHQA、SPQHLTTDRAQA、TPFHFAQDSWQW、TPTHYYADFSQLLS、TPTHYYADFSQSLS、GTPTHYYADFSQLL、GTPTHYYADFSQSL、FGTPTHYYADFSQSLS、FGFPTHYYADFSQSLS、LPGHLIWDSLHY、LPGHLIWDSLHYL、LPGHLIWDSLHYLS、LPGHLIWDSLHSL、LPGHLIWDSLHSLS、GLPGHLIWDSLHYL、GLPGHLIWDSLHSL、FGLPGHLIWDSLHSLS、FGFPGHLIWDSLHSLS、LPQTHPLHLLED、IPYHHLVDQLHH、IPYHHLVDQLHLS、IPYHHLVDQLHSLS、FGIPYHHLVDQLHHLS、FGFPYHHLVDQLHSLS、YPYHVQVDVLQN、YPYHVQVDVLQNLS、YPYHVQVDVLQSLS、FGYPYHVQVDVLQNLS、FGFPYHVQVDVLQSLS、IPSHHLQDSLQL、IPSHHLQDSLQLLS、IPSHHLQDSLQSLS、GIPSHHLQDSLQLL、FGIPSHHLQDSLQLLS、FGFPSHHLQDSLQSLS、EYAHHTSLDLRQ、EPLHFRSDRIQA、EPLHFRSDRIQALS、EPLHFRSDRIQSLS、GEPLHFRSDRIQAL、FGEPLHFRSDRIQALS、FGFPLHFRSDRIQSLS、APKHLYADMSQA、APKHLYADMSQALS、APKHLYADMSQSLS、GAPKHLYADMSQAL、FGFPKHLYADMSQSLS、MPAHLSRDLRQS、MPAHLSRDLRQSL、MPAHLSRDLRQSLS、GMPAHLSRDLRQSL、FGFPAHLSRDLRQSLS、NPKHYSIDRHQA、TPFHFAQDSWQW、TPFHFAQDSWQWLS、TPFHFAQDSWQSLS、GTPFHFAQDSWQWL、FGFPFHFAQDSWQSLS、ACSFAYLYRC、ACFMGDKWVC、ACVLYPKAIC、ACYMGQQFVC、ACLTAYLHWC、ACTLFPVAYC、ACWLFPYAHC、ACKSINMWLC、ACQTINRWLC、FGFPEHLLVDFLQSLS、FGFPEHLLVDFLQSLS、FPEHLLVDFLQSL、AGFPEHLLVDFLQSLS、FAFPEHLLVDFLQSLS、FGAPEHLLVDFLQSLS、FGFAEHLLVDFLQSLS、FGFPAHLLVDFLQSLS、FGFPEALLVDFLQSLS、FGFPEHALVDFLQSLS、FGFPEHLAVDFLQSLS、FGFPEHLLADFLQSLS、FGFPEHLLVAFLQSLS、FGFPEHLLVDALQSLS、FGFPEHLLVDFAQSLS、FGFPEHLLVDFLASLS、FGFPEHLLVDFLQALS、FGFPEHLLVDFLQSAS、FGFPEHLLVDFLQSLA、FAFPAHLLVDFLQALA、AAFPAHLLADFLQALA、SPQHLTTDRAQA、SPQHLTTDRAQALS、SPQHLTTDRAQSLS、GSPQHLTTDRAQAL、FGFPQHLTTDRAQSLS、FGFPQHLTTDWAQSLS、FGFPQHLTTDRLQSLS、FGFPQHLTTDWLQSLS、ATPSHLIIDRAQ、ATPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDRAQSLS、FGFPSHLIIDWAQSLS、FGFPSHLIIDWLQSLS、FGFPSHLIIDWSQSLS、FATPSHLIIDWLQSLS、FKPAHVSIDWLQ、FKPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQSLS、AGFPAHVSIDWLQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FGAPAHVSIDWLQSLS、FGFAAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQALS、FGFPAHVSIDWLQSLA、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFAAHVSIDWLQSLS、FGFFAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIRWLQSLS、FGFPAHVSIEWLQSLS、FGFPAHVSIDWLNSLS、FGFPAHVSIDWLHSLS、AGFPAHVSIDWLQSLS、PGFPAHVSIDWLQSLS、WGFPAHVSIDWLQSLS、FAFPAHVSIDWLQSLS、FSFPAHVSIDWLQSLS、FYFPAHVSIDWLQSLS、FDFPAHVSIDWLQSLS、FGAPAHVSIDWLQSLS、FGFPAHVSIDWLQLLS、FGFPAHVSIDWLQWLS、FGFPAHVSIDWLQNLS、FGFPAHVSIDWLQTLS、FGFPAHVSIDWLQYLS、FGFPAHVSIDWLQSIS、FGFPAHVSIDWLQSLT、FGFPAHVSIDWLQSLY、FAFPAHVSIDWLQALA、FGFPAHVSIDRAQSLS、FGFPTHVSIDWLQSLS、FGFPFHVSIDWLQSLS、FGFPAHISIDWLQSLS、FGFPAHIIIDWLQSLS、FGFPAHLTTDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVSLDWLQSLS、FGFPAHVSADWLQSLS、TPTHYYADFSQSLS、FGFPAHVWIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLN、FGFPAHFSIDWLQSLS、FGFPAHVSFDWLQSLS、FGFPEHVFIDWLQSLS、DFGFPAHVFIDWLQSLS、DFGFPSHLIIDWLQSLS、DFGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPQHLFTDWLQSLS、FGFPKHLLVDFLQSLS、FGFPAHVSIDWSQSLS、FGFPAHVSIDFSQSLS、FGFPSHIIIDWLQSLS、FGFPSHLIIEWLQSLS、AAFPAHLLADAAQALA、AAFPAHAAADFLQALA、AAFAAHLLADFLQAAA、AAAPAHLLVDAAQAAA、FAFPAHVFIDWLQSLS; FGFPAHVFIDWLQALS、FGFPAHVFIDWLQSLA、GFPAHVFIDWLQSLS、FPAHVFIDWLQSLS、PAHVFIDWLQSLS、FAFPAHVFIDWLQALA、FGFPEHLFVDFLQSLS、FGFPAHVHIDWLQSLS、FGFPAHVPIDWLQSLS、FGFPSHLFIDWAQSLS、PGFPAHVFIDWLQLIT、PAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQ、FGFPAHVFIDWLQ、DFGFPSHLIIDWLQSLS、DFGFPAHVFIDWLQSLN、PSHLIIDWLQ、PAHVFIDWLQ、DFGFPAHVTIDWLQSLN、DFGFPAHVLIDWLQSLN、FGFPAHVYIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLN および FGFPAHVFIDWLQSLA からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるペプチドに関する。
【００４５】
本発明のペプチドは、CETP に対するミモトープであることが判明し、従って、該ミモトープは CETP 断片 C-FGFPEHLLVDFLQSLS(CETP タンパク質の 16 C-末端アミノ酸)に結合する抗体と結合することができた。
【００４６】
さらに、本発明の別の側面は、少なくとも１つの本発明のペプチドを含む医薬製剤に関する。
【００４７】
本発明のペプチドは、個体へ投与し得る医薬製剤に製剤化することができる。これらの製剤は、例えば、アテローム性動脈硬化、アテローム性動脈硬化のリスク疾患およびアテローム性動脈硬化の続発症を予防および/または治療するために用い得る。
【００４８】
製剤におけるペプチドは、本明細書において開示されるペプチドのプールから組み合わせることができる。さらに、１以上の本発明のペプチドを含み、必要としている個体へ別々にまたは共に投与することができる医薬製剤を提供することも可能である。
【００４９】
本発明のペプチドは、１つの単一の医薬製剤中へ混合することができ、あるいは２つまたは３つを組み合わせることもできる。得られる製剤は、同時にまたは異なる時に投与することができる。本発明の好ましい態様によれば、製剤中に存在するペプチドは、医薬上許容される担体、好ましくは KLH (キーホールリンペットヘモシアニン) と結合している。
【００５０】
本発明を、以下の図および実施例によって、しかしこれらに限定することなく、さらに説明する。
【００５１】
図 1 は、モノクローナル抗体“Paula”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7 をスクリーニングした後の代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【００５２】
図 2a および 2b は、モノクローナル抗体“Paula”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12 をスクリーニングした後の 2 つの典型的な競合 ELISA の結果を示す。
【００５３】
図 3a および 3b は、mAb Frida を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7 をスクリーニングした後の 2 つの代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【００５４】
図 4a は、モノクローナル抗体“Frida”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12 をスクリーニングした後の代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【００５５】
図 4b は、ミモトープ-BSA でコートされた ELISA プレートへのモノクローナル抗体“Frida”の結合を示す。
【００５６】
図 5a および 5b は、モノクローナル抗体“Frida”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12 をスクリーニングした後の代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【００５７】
図 6 は、モノクローナル抗体“Frida”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12 をスクリーニングした後の２つのミモトープの競合 ELISA の結果を示す。
【００５８】
図 7a から 7d は、以下のミモトープ-BSA 複合体をマウスに注入したインビボ実験の抗体力価(抗マウス IgG)を示す:
2014040438.tif 000003
【００５９】
図 8a および 8b は、モノクローナル抗体“Frida”を用いてファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7C7 をスクリーニングした後の２つの代表的な競合 ELISA の結果を示す。
【００６０】
図 9 は、“Frida”と環状ミモトープとの間の結合の検出に関するインビトロ ELISA 試験の結果を示す。
【００６１】
図 10a および 10b は、FGFPSHLIIDWLQSLS、FGFPAHVFIDWLQSLS および FGFPAHVYIDWLQSLS を用いた阻害 ELISA アッセイの結果を示す。
2014040438.tif 000004
2014040438.tif 000005
【００６２】
図 11 は、マウスに投与された本発明のミモトープによる、CETP に向けられた抗体のインビボ誘導を示す。Balb/c マウス / 30 μg のペプチド、2 週間間隔で 2 回注入。S3 = 3回目の注入後 2 週間。アジュバントとしてミョウバン。ミモトープの注入によって誘導された、オリジナルのエピトープ(p4073)に対する力価。ウェルの被覆: 50 μl の、1 μM の p4073-BSA または 1 μg/ml の活性化 KLH。検出: αIgG:
2014040438.tif 000006
【００６３】
図 12a および 12b は、本発明のミモトープの投与による、CETP 特異的抗体のインビボ誘導を示す。p4073 に対する力価、および選択された群の CETP (p4073 に対して高い力価を示す) に対する力価とのその相関: gr.4、gr.9、gr.10、gr.14、gr.16-20 / 対照として gr.1 (KLH)、gr.2 (オリジナルのエピトープ)。被覆: それぞれ、組換え GST-CETP または精製されたウサギ CETP:
2014040438.tif 000007
2014040438.tif 000008
【００６４】
図 13 は、マウスに投与された本発明のミモトープによる、CETP に向けられた抗体のインビボ誘導を示す。
【００６５】
各群 (各々 5 頭の Balb/c マウス) の血清を合わせ、1:100 に希釈し、それぞれ組換え GST-CETP またはウサギ CETP でコートされた ELISA プレート上で試験した。結合した抗体の検出は、algG を用いて行った。
2014040438.tif 000009
【００６６】
図 14 は、0.6 μl のヒト血清(内因性の CETP 活性を有する)を、それぞれ KLH/ミョウバン(Alum)(陰性対照群)、p4703-KLH/ミョウバン(オリジナルの CETP エピトープ) または p4361 (または p4362 または p 4325) ミモトープを用いてワクチン接種した野生型マウス(CETP 活性を含有しない)からの血清と混合する CETP 活性アッセイを示す。KLH/ミョウバン-対照のみまたはオリジナルのエピトープ(p4073-KLH/ミョウバン)でワクチン接種されたマウスからの血清の添加とは対照的に、p4361-KLH/ミョウバンでワクチン接種したマウスからの 1.2 μl および 0.6 μl の血清の添加が CETP 活性を完全に阻害すること、および 0.2 μl の血清の添加が前記活性を有意に減少させることを実証することができた。
【００６７】
図 15 は、ヒト血清への p4325-KLH/ミョウバンの添加が CETP 活性を有意に阻害することを示す。
【００６８】
図 16 は、ヒト血清への p4361-KLH/ミョウバンの添加が CETP 活性を有意に阻害することを示す。
【００６９】
図 17 は、ヒト血清への p4362-KLH/ミョウバンの添加が CETP 活性を有意に阻害することを示す。
【００７０】
図 18a は、ミモトープを用いる阻害 ELISA を示す (被覆 1μM 4073 ペプチド、検出 αIgG1)。
2014040438.tif 000010
2014040438.tif 000011
【００７１】
図 18b は、ミモトープを用いる阻害 ELISA を示す (被覆 1μM 4073 ペプチド、検出 αIgG1)。
2014040438.tif 000012
2014040438.tif 000013
【００７２】
図 18c は、PhD12 Frida およびミモトープの特性決定のための Ala-交換 / mAb Frida をスクリーニングする、ミモトープを用いる阻害 ELISA を示す (被覆 1 μM 4073。検出 αIgG1。)
2014040438.tif 000014
【００７３】
図 19a は、ペプチド ELISA、C-DFGFPAHVYIDWLQSLS (p4628-KLH/ミョウバン) を用いる免疫化、オリジナルのエピトープに対する力価を示す。
【００７４】
図 19b は、ペプチド ELISA、C-FGFPAHVFIDWLQSLN (p4474-KLH/ミョウバン) を用いる免疫化、オリジナルのエピトープに対する力価を示す。
【００７５】
図 19c は、ペプチド ELISA、C-FGFPAHVFIDWLQSLN (p4474-KLH/ミョウバン) を用いる免疫化、注入されたミモトープに対する力価を示す。
【００７６】
図 19d は、抗-タンパク質 ELISA を示す。30 μg の、アジュバントとしてのミョウバンを伴う KLH に結合した示されるミモトープを、マウスに 3 回注入した。各群(5 頭のマウスを含む)からの血清をプールし、1:100 に希釈し、精製されたウサギ CETP でコートされた ELISA プレート上で試験した。
【００７７】
図 19e は、30 μg の、アジュバントとしてのミョウバンを伴う KLH に結合した示されるミモトープをマウスに 3 回注入した、抗-タンパク質 ELISA を示す。マウス血清(単一のマウスからの)を 1:100 に希釈し、精製されたウサギ CETP でコートされた ELISA プレート上で試験した。
【実施例】
【００７８】
実施例:
高密度リポタンパク質(HDL)中のコレステロールの血漿濃度と冠動脈心疾患(CHD)の発生との間には強い逆相関が存在する。従って、CHD の危険は HDL が減少する場合により高くなる。CHD を有する患者の 33% は HDL の低い血漿レベルを有しているが、HDL の血漿濃度を増大させるための有効な治療は現在のところ存在しない。食事および適度な運動は効果が無く、スタチンはわずか 5 から 7% の HDL の増大しか達成せず、ナイアシンは副作用およびその使用を制限する服薬遵守特性(compliance profile)を有する。
【００７９】
CETP 活性の阻害は、血漿 HDL レベルを増大させる治療的アプローチとして提案されている。CETP は、リポタンパク質間における中性脂質およびリン脂質の転送を促進し、血漿 HDL の濃度を調節する血漿糖タンパク質である。CETP 活性の阻害は、いくつかの理由により、血漿 HDL 濃度を増大させると期待される。CETP は、コレステリルエステルを HDL から VLDL および LDL へと移動させることによって、HDL 濃度を低下させる。ウサギおよびハムスターにおける、モノクローナル抗体、小分子 (Sikorski、J.A.、J.Med.Chem. 49 (1) (2006): 1-22) またはアンチセンスオリゴヌクレオチドによる CETP の一過性阻害は、HDL の増大をもたらす。アテローム性動脈硬化のウサギモデルにおいて、アンチセンスヌクレオチドを用いる持続性の CETP 阻害は、血漿 HDL を増大させ、アテローム性動脈硬化の病変を減少させた。CETP-トランスジェニックマウスおよびラットは、減少した血漿 HDL を示す。減少した CETP 活性を有するヒトは、上昇した血漿 HDL を有する。
【００８０】
近年、ワクチンアプローチが提案された。ウサギが、中性脂質転送機能にとって重大な意味をもつ CETP の領域を含有するヒト CETP-由来のペプチドで免疫された。ワクチン接種されたウサギは、減少した CETP 活性ならびにより低い LDL およびより高い HDL 濃度を伴う変化したリポタンパク質特性を有した。さらに、CETP-ワクチン接種されたウサギは、対照動物よりも小さいアテローム性動脈硬化の病変を有することが示された。
【００８１】
上記の抗-CETP ワクチンアプローチの問題は、ワクチン製剤が自己ペプチドを含み、そのため自己抗原に対する自然寛容を打破しなければならないことである。本発明は、ワクチン接種のために用いることができる CETP ミモトープを記載する: 該ミモトープは、CETP に対する抗体の産生を誘導する。CETP ミモトープは、自己配列を有さず、そのため寛容性を打破する必要がない。従って、抗-CETP 抗体応答の誘導が大いに促進される。ミモトープは、モノクローナル抗体(mAb)および(市販の)ペプチドライブラリーを用いて同定される。CETP 活性を中和する抗-CETP モノクローナル抗体が用いられる。この mAb は、中性脂質転送活性に必要な CETP の C-末端の 26 アミノ酸の中の配列を検出する。
【００８２】
実施例 1: ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングのために用いられるモノクローナル抗体の生成
A.) “Fusion F”に由来する 2 つの抗体:
Balb/c マウスを、アジュバントとしての KLH およびミョウバンに結合したオリジナルの CETP エピトープ C-FGFPEHLLVDFLQSLS (CETP タンパク質の 16 C-末端アミノ酸) で免疫した。
【００８３】
2 つのハイブリドーマクローン(両方とも IgG1)を精製し、スクリーニングのために用いた: F5AF9G4 (“Paula”) および F6F11D1 (“Felix”)。
【００８４】
これらの 2 つのモノクローナル抗体は、ELISA において、注入されたエピトープならびに CETP タンパク質を認識する。それらは、CETP タンパク質(細菌において発現される組換えタンパク質ならびにウサギ血清から単離されるタンパク質)を検出するためにウエスタンブロットにおいて用いることもできる。両方の抗体はともに、CETP 酵素活性を阻害しない (Roar CETP Activity Assay Kit を用いて試験した。例えば US 5,585,235; US 5,618,683; US 5,770,355 を参照されたい)。
【００８５】
B.) “Fusion I”に由来する 2 つの抗体:
Balb/c マウスを、アジュバントとしての KLH およびミョウバンに結合したオリジナルの CETP エピトープ C-FGFPEHLLVDFLQSLS (CETP タンパク質の 16 C-末端アミノ酸) で免疫した。
【００８６】
2 つのハイブリドーマクローン(両方とも IgG1)を精製し、スクリーニングのために用いた: I2G6H5 (“Frida”) および I2G6H7 (“James”)。
【００８７】
これらの 2 つのモノクローナル抗体は、ELISA において、注入されたエピトープならびに CETP タンパク質を認識する。それらは、CETP タンパク質(細菌において発現される組換えタンパク質ならびにウサギ血清から単離されるタンパク質)を検出するためにウエスタンブロットにおいて用いることもできる。“Fusion F”に由来する抗体(A.) を参照)とは対照的に、抗体“Frida”および“James”の両方が、CETP 酵素活性(Roar CETP Activity Assay Kit を用いて試験した)を阻害する。
【００８８】
実施例 2: ファージディスプレイ、インビトロ阻害 ELISA およびミモトープのインビボ試験
本実施例において用いたファージディスプレイライブラリーは以下であった:
Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (直鎖状 7mer ライブラリー)
Ph.D. C7C: New England BioLabs E8121L (7mer ライブラリー、環化ペプチド)
Ph.D. 12: New England BioLabs E8111L (直鎖状 12mer ライブラリー) 
製造者のプロトコール(www.neb.com)に従ってファージディスプレイを行った。
【００８９】
その後の 2 または 3 巡のパニングの後、単一のファージクローンを拾い、ファージ上清を、パニング手順のために用いた抗体でコートされたプレート上での ELISA に供した。この ELISA において陽性であったファージクローン(標的に対しては強いシグナル、非特異的対照に対してはシグナルなし)を、配列決定した。DNA 配列から、ペプチド配列を推定した。これらのペプチドを合成し、阻害 ELISA において特性決定した。
【００９０】
1. インビトロ阻害アッセイ (ELISA)
ファージディスプレイから得られた異なる量のペプチド(それぞれの図において示される通り、2 および 20 μg)を、スクリーニング手順のために用いたモノクローナル抗体と共にインキュベートした。ELISA プレート上にコートされたオリジナルの CETP エピトープ (CETP タンパク質の C-末端 16 アミノ酸) へのその後の抗体の結合を減弱させるペプチドを、阻害性であるとみなした。(結果については、とりわけ、前記の図 19a から 19c を参照されたい。)
【００９１】
2. ミモトープのインビボ試験
阻害性のペプチドおよびいくつかの非阻害性のペプチドを、KLH に結合させ、適切なアジュバント(マウスについては水酸化アルミニウムおよび Gerbu 100、ウサギについては水酸化アルミニウムまたは CFA/IFA)と共に、マウス(野生型または CETP-トランスジェニックマウス; 脇腹(flank)へ皮下注入または耳へ皮内注入)またはウサギ(脇腹へ皮下注入)に注入した。
【００９２】
注入されたペプチドおよびオリジナルの CETP エピトープに対する力価を決定した。さらに、選択された血清についても CETP タンパク質に対する免疫応答を測定した(結果については、図 7a から 7d および図 19a から 19e を参照されたい)。
【００９３】
3. 結果
3.1. “Fusion F”に由来する 2 つの抗体:“Paula”および“Felix”を用いるスクリーニング
3.1.1. ファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7
3.1.1.1. モノクローナル抗体“Paula”を用いるスクリーニング
このスクリーニングにおいて、17 の配列を同定した:
P2_8                  SYHATFL
P2_9                  TMAFPLN
P2_11                 HYHGAFL
P2_12                 EHHDIFL
P2_15                 SSLELFL
P2_16                 TGLSVFL
P3_2                  WMPSLFY
P3_6、14、28          SMPWWFF
P3_9                  TMPLLFW
P3_13                 DTWPGLE
P3_16                 SMPPIFY
P3_17                 MPLWWWD
P3_18                 SMPNLFY
P3_19                 RMPPIFY
P3_21                 NPFEVFL
P3_25                 TLPNWFW
P3_26                 SMPLTFY
【００９４】
代表的な競合 ELISA の結果を、図 1 に示す。
【００９５】
3.1.1.2. モノクローナル抗体“Felix”を用いるスクリーニング
インビトロ競合実験において、モノクローナル抗体“Felix”の結合を阻害する 6 つの配列を同定した:
F2-9           C SFLDTLT
F3-6           C NFLKTLS
F3-18          C DFLRTLT
F3-23          C AFLDTLV
F3-34          C TFLSSLA
F3-38          C GFLDSLM
【００９６】
インビトロ競合実験において、モノクローナル抗体“Felix”の結合を阻害しないさらなる 12 の配列を同定した:
F2-2+5         SPHPHFL
F2-6           NFMSIGL
F2-16/F3-30    SQFLASL
F2-29          SNFLKTL
F3-1-_         TGFLATL
F3-11-_        WSWPGLN
F3-17-         IAWPGLD
F3-32-         SKFMDTL
F3-41-         SDFLRAL
F3-44-_        SMPMVFY
F3-49-         YEWVGLM
F3-64-         KGFLDHL
【００９７】
モノクローナル抗体“Felix”の結合をインビトロで阻害する全てのミモトープを、KLH に結合させ、それぞれ野生型マウス(CETP タンパク質を有さないマウス)、CETP-tg マウスまたはウサギへ、皮下注入(脇腹へ; 皮下(s.c.))または皮内(i.d.)注入により注入し、試験された全てのアジュバント(ミョウバンおよび CFA (完全フロイントアジュバント); Gerbu)と共に注入されたペプチドに対する免疫応答を誘導した。
【００９８】
上記の全てのインビトロ阻害性ミモトープについて、オリジナルの CETP エピトープに対して反応する抗体を、マウスおよびウサギにおいて検出することができた。
【００９９】
6 つのミモトープのうち 5 つについて(以下および表 1 を参照)、精製されたヒト CETP および組換え発現されたヒト CETP と反応する抗体を、ELISA においてウサギ血清から検出することができた: 
F2-9             C SFLDTLT
F3-6             C NFLKTLS
F3-18            C DFLRTLT
F3-34            C TFLSSLA
F3-38            C GFLDSLM
【０１００】
脇腹における皮下注入を、マウスあたり 30 μg のペプチド-KLH を用いて、1 週目、3 週目および 7 週目において行った。耳における皮内注入を、マウスあたり 10 μg のペプチド-KLH を用いて、1 週目、3 週目および 6 週目において、行った。血清を、3 回目の注入の後２週間において採取した。ミョウバンを伴うワクチン製剤(常にマウスあたり 1 mg): 250 μl まで、一方の脇腹へ注入。マウスあたり 1 ml を有するミョウバン製剤(各々の脇腹へ 500 μl)は、バッファーとしての 1x PBS 中に存在した。
【０１０１】
Gerbu アジュバント 100 (Gerbu Cat. Nr. #3100; 常にマウスあたり 50 μl のアジュバント) を用いるワクチン製剤: 200 μl、100 μl を各々の脇腹へ注入、バッファーとして 1x HEPES を含む。
【表１−１】
2014040438.tif 000015
【表１−２】
2014040438.tif 000016
【表１−３】
2014040438.tif 000017
【０１０２】
3.1.2. ファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12
3.1.2.1. モノクローナル抗体“Paula”を用いるスクリーニング
このスクリーニングから得られた 20 のアミノ酸配列のうち、3 つがインビトロ阻害実験において阻害性であった:
P12-19                SANPRDFLETLF
P12-21                RMFPESFLDTLW
P12-37                TIYDSFLDSLAS
【０１０３】
非阻害性のペプチドは以下であった:
P12-5/44/46/49        HQSDDKMPWWFF
P12-9                 KPYLLKDFLEAL
P12-24/43-_           AMGPYDALDLFL
P12-25                TWNPIESFLESL
P12-28+42             YVWQDPSFTTFF
P12-30                QYQTPLTFLEAL
P12-35-               RHISPATFLEAL
P12-39-               HTDSFLSTFYGD
P12-42-               YVWQDPSFTTFF
P12-45-               ADSTFTSFLQTL
P12-50-_              GPVSIYADTDFL
P12-51-    _          DSNDTLTLAAFL
P12-52-_              NGSPALSHMLFL
P12-53-               TDYDPMWVFFGY
P12-56-               IFPLDSQWQTFW
P12-58-               NESMPDLFYQPS
P12-61-               DWGDKYFSSFWN
【０１０４】
2 つの典型的な競合 ELISA の結果を、図 2A および 2b に示す。
【０１０５】
3 つ全てのミモトープを、KLH に結合させ、それぞれ野生型マウス(CETP タンパク質を有さないマウス)、CETP-tg マウスまたはウサギへ注入し、試験した全てのアジュバント(ミョウバンおよび CFA; Gerbu)を有する注入されたペプチドに対する免疫応答を誘導した。
【０１０６】
ミモトープ P12-19; C-SANPRDFLETLF および P12-21; C-RMFPESFLDTLW は、wt マウスおよびウサギにおいて、オリジナルの CETP エピトープに対する免疫応答を誘導した。
【０１０７】
それとは対照的に、ミモトープ P12-37 C-TIYDSFLDSLAS は、オリジナルのエピトープに対する抗体応答を誘導しなかった。
【０１０８】
3.2 “Fusion I”に由来する 2 つの抗体:“Frida”および“James”を用いるスクリーニング
3.2.1. ファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7
3.2.1.1. モノクローナル抗体“Frida”および“James”を用いるスクリーニング
２つの異なるペプチド配列を、これらのスクリーニングにおいて同定し、配列決定された 12 のクローンのうち 11 のクローンが同一の配列を有していた。これらのペプチドは、インビトロ競合実験において阻害性ではない。
【０１０９】
Fr7-2-2
Fr7-2B-65
Fr7-3-7 
Fr7-3-13
Fr7-3-26
Fr7-3-32
Ja7-2-22
Ja7-3-28
Ja7-3-41
Ja7-3-52
Ja7-3-56        VSAYNNV
Ja7-3-89        WPLHLWQ
【０１１０】
mAb “Frida”を用いた 2 つの代表的な競合 ELISA の結果を、図 3A および 3b に示す。同じパターンが、mAb“James”についても見られた。
【０１１１】
3.2.2. ファージディスプレイライブラリー Ph.D. 12
3.2.2.1. モノクローナル抗体“Frida”を用いるスクリーニング
Fr12/2/6             TPTHYYADFSQL
Fr12/2/11            LPGHLIWDSLHY
Fr12/2/27            LPQTHPLHLLED
Fr12/3/1
Fr12/3/19
Fr12/3/88            IPYHHLVDQLHH
Fr12/3/26
Fr12/3/65            YPYHVQVDVLQN
Fr12/3/68            IPSHHLQDSLQL
Fr12/3/12            EYAHHTSLDLRQ
Fr12/3/83            EPLHFRSDRIQA
Fr12/3/55            ATPSHLIIDRAQ
Fr12/3/63            APKHLYADMSQA
Fr12/3/84            FKPAHVSIDWLQ
Fr12/3/47            MPAHLSRDLRQS
Fr12/3/80            NPKHYSIDRHQA
Fr12/3/40            SPQHLTTDRAQA
Fr12/3/35            TPFHFAQDSWQW
【０１１２】
このスクリーニングにおいて同定された 15 のアミノ酸配列のいずれも、インビトロ競合実験において阻害性ではなかった。しかし、配列解析によって、該ミモトープの多くについて、オリジナルのタンパク質配列とのかなり高い相同性が明らかになった。他方、いくつかのペプチドについて、ミモトープ-BSA でコートされた ELISA プレートへのモノクローナル抗体“Frida”の結合を示すことができた (図 4a および 4b 参照)。
【０１１３】
これは、固定化されたミモトープへのモノクローナル抗体の結合が、インビトロ競合 ELISA において必ずしも阻害の予測を可能にするわけではないことを示す。
【０１１４】
オリジナルの配列 FGFPEHLLVDFLQSLS (CETP タンパク質の 16 C-末端 AA) のバリエーションを用いるインビトロ阻害実験によって、2 より多くのアミノ酸を N-末端から除去するか、あるいは 1 より多くのアミノ酸を C-末端から除去すると、阻害が消失することが示された(モノクローナル抗体“Frida”および“James”について。“Paula”および“Felix”はオリジナルの配列の別の部分を認識する)。
【０１１５】
さらに、N-末端から 2 つのアミノ酸を、そして C-末端から 1 つのアミノ酸を同時に除去することもまた、もはやインビトロで阻害性ではないペプチドをもたらす。
【０１１６】
C-FGFPEHLLVDFLQSLS    “オリジナルの”配列(CETP に由来するペプチド) / インビトロで阻害性
C- GFPEHLLVDFLQSLS      配列 N-1 / インビトロで阻害性 
C-  FPEHLLVDFLQSLS      配列 N-2 / インビトロで阻害性
C-   PEHLLVDFLQSLS      配列 N-3 / evtl. インビトロでわずかに阻害性
C-FGFPEHLLVDFLQSL       配列 C-1 / インビトロで阻害性
C-FGFPEHLLVDFLQS        配列 C-2 / インビトロで阻害性でない
C-  FPEHLLVDFLQSL       配列 N-2 および C-1 / インビトロで阻害性でない!
“オリジナル”FGFPEHLLVDFLQSLS
Fr12/2/6      TPTHYYADFSQL  
Fr12/2/11     LPGHLIWDSLHY  
Fr12/2/27     LPQTHPLHLLED  
Fr12/3/1      IPYHHLVDQLHH  
Fr12/3/19     IPYHHLVDQLHH  
Fr12/3/88     IPYHHLVDQLHH  
Fr12/3/26     YPYHVQVDVLQN  
Fr12/3/65     YPYHVQVDVLQN  
Fr12/3/68     IPSHHLQDSLQL  
Fr12/3/12    EYAHHTSLDLRQ  
Fr12/3/83     EPLHFRSDRIQA  
Fr12/3/55    ATPSHLIIDRAQ  
Fr12/3/63     APKHLYADMSQA  
Fr12/3/84    FKPAHVSIDWLQ  
Fr12/3/47     MPAHLSRDLRQS  
Fr12/3/80     NPKHYSIDRHQA  
Fr12/3/40     SPQHLTTDRAQA  
Fr12/3/35     TPFHFAQDSWQW  
【０１１７】
そこで、より長いペプチドを用いてインビトロでの阻害が可能かどうかを確認するため、オリジナルの CETP 配列を鋳型として用い、このファージディスプレイ手順において獲得したペプチド配列を N-末端および/または C-末端において伸長させた。
【０１１８】
3.2.2.2. ミモトープ Frida Ph.D.12 およびそのバリエーション:
Fr12/2/6                   TPTHYYADFSQL                  
Fr12/2/6 ext1              TPTHYYADFSQLLS        
Fr12/2/6 ext2              TPTHYYADFSQSLS        
Fr12/2/6 ext3             GTPTHYYADFSQLL            
Fr12/2/6 ext4             GTPTHYYADFSQSL            
Fr12/2/6 ext5            FGTPTHYYADFSQSLS      
Fr12/2/6 ext6            FGFPTHYYADFSQSLS      
Fr12/2/11                  LPGHLIWDSLHY                
Fr12/2/11 ext1             LPGHLIWDSLHYL            
Fr12/2/11 ext2             LPGHLIWDSLHYLS        
Fr12/2/11 ext3             LPGHLIWDSLHSL            
Fr12/2/11 ext4             LPGHLIWDSLHSLS        
Fr12/2/11 ext5            GLPGHLIWDSLHYL            
Fr12/2/11 ext5            GLPGHLIWDSLHSL            
Fr12/2/11 ext6           FGLPGHLIWDSLHSLS      
Fr12/2/11 ext7           FGFPGHLIWDSLHSLS      
Fr12/2/27                 LPQTHPLHLLED                  
Fr12/3/1/19/88 ext1        IPYHHLVDQLHLS          
Fr12/3/1/19/88 ext2        IPYHHLVDQLHSLS    
Fr12/3/1/19/88 ext3      FGIPYHHLVDQLHHLS    
Fr12/3/1/19/88 ext4      FGFPYHHLVDQLHSLS    
Fr12/3/26/65ext1           YPYHVQVDVLQNLS
Fr12/3/26/65ext2           YPYHVQVDVLQSLS
Fr12/3/26/65ext3         FGYPYHVQVDVLQNLS
Fr12/3/26/65ext4         FGFPYHVQVDVLQSLS
Fr12/3/68 ext1             IPSHHLQDSLQLLS
Fr12/3/68 ext2             IPSHHLQDSLQSLS
Fr12/3/68 ext3            GIPSHHLQDSLQLL        
Fr12/3/68 ext4           FGIPSHHLQDSLQLLS
Fr12/3/68 ext5           FGFPSHHLQDSLQSLS  
Fr12/3/83 ext1             EPLHFRSDRIQALS
Fr12/3/83 ext2             EPLHFRSDRIQSLS
Fr12/3/83 ext3            GEPLHFRSDRIQAL        
Fr12/3/83 ext4           FGEPLHFRSDRIQALS
Fr12/3/83 ext5           FGFPLHFRSDRIQSLS
Fr12/3/55 ext1            ATPSHLIIDRAQSLS
Fr12/3/55 ext2           FGFPSHLIIDRAQSLS
Fr12/3/55 ext2 R->W      FGFPSHLIIDWAQSLS
Fr12/3/55 ext2 RA->WL    FGFPSHLIIDWLQSLS
Fr12/3/63 ext1             APKHLYADMSQALS
Fr12/3/63 ext2             APKHLYADMSQSLS
Fr12/3/63 ext3            GAPKHLYADMSQAL        
Fr12/3/63 ext4           FGFPKHLYADMSQSLS
Fr12/3/84 ext1            FKPAHVSIDWLQSLS
Fr12/3/84 ext2           FGFPAHVSIDWLQSLS
Fr12/3/47 ext1            MPAHLSRDLRQSL        
Fr12/3/47 ext2            MPAHLSRDLRQSLS
Fr12/3/47 ext3           GMPAHLSRDLRQSL        
Fr12/3/47 ext4          FGFPAHLSRDLRQSLS
Fr12/3/40 ext1            SPQHLTTDRAQALS
Fr12/3/40 ext2            SPQHLTTDRAQSLS
Fr12/3/40 ext3           GSPQHLTTDRAQAL        
Fr12/3/40 ext4          FGFPQHLTTDRAQSLS
Fr12/3/35 ext1            TPFHFAQDSWQWLS
Fr12/3/35 ext2            TPFHFAQDSWQSLS
Fr12/3/35 ext3           GTPFHFAQDSWQWL        
Fr12/3/35 ext4          FGFPFHFAQDSWQSLS
【０１１９】
阻害 ELISA の代表的な例を、図 5A および 5b に示す。伸長したペプチド Fr12/3/84 ext2 および Fr12/3/55 ext3 は、有意な阻害を示した:
C-FGFPSHLIIDRAQSLS          Fr12/3/55 ext3
C-FGFPAHVSIDWLQSLS          Fr12/3/84 ext2
【０１２０】
３つのさらなるペプチドも、このアッセイにおいて阻害性であった:
C-FGFPYHVQVDVLQSLS          Fr12/3/26/65ext4
C-FKPAHVSIDWLQSLS           Fr12/3/84 ext1
C-FGFPQHLTTDRAQSLS          Fr12/3/40 ext4
【０１２１】
オリジナルのエピトープとファージディスプレイスクリーニングから得られた全てのミモトープとを比較する配列解析の後、さらなる 2 つのペプチドを作成した。
【０１２２】
ミモトープ Fr12/3/55 ext3 C-FGFPSHLIIDRAQSLS (ELISA において阻害性、上記参照) について、阻害 ELISA においてアミノ酸交換を試験した:
強く阻害性:
2014040438.tif 000018
わずかに阻害性:
2014040438.tif 000019
変更された配列を有するペプチド(阻害性、図 6 参照):
2014040438.tif 000020
【０１２３】
さらなる好ましいミモトープを、以下の例示的設定(example-set-up)によって特徴付けした:
2014040438.tif 000021
2014040438.tif 000022
【０１２４】
3.2.2.3. ミモトープのインビボ試験
群あたり５頭の雌の Balb/c マウスを、KLH に結合した 30 μg のペプチドを用いて皮下に免疫した。対照群に、KLH または C-FGFPEHLLVDFLQSLS を投与した。アジュバントとしてミョウバンを用いた。これらのペプチドのうちいくつかはインビトロで(インビトロ阻害アッセイにおいて)“Frida”への CETP の結合を阻害しなかったが、投与されたペプチドは全て、“Frida”に結合することができ、CETP に対する免疫応答を誘導することができた。２週間間隔での２回のワクチン接種の後、プールされた血清を用いて、抗体の力価を決定するためのインビトロ ELISA アッセイを行った (S2; 図 7a から 7d を参照)。ELISA プレートのウェルは、KLH (陽性対照)、ミモトープ-BSA 複合体、C-FGFPEHLLVDFLQSLS および無関係なペプチド-BSA 複合体 (陰性対照) で被覆した。検出は、抗-マウス IgG を用いて行った。
【０１２５】
3.2.3. ファージディスプレイライブラリー Ph.D. 7C7
3.2.3.1. モノクローナル抗体“Frida”および“James”を用いるスクリーニング
Fr2-1         ACSFAYLYRC
Fr2-5
Fr2-6
Fr2-18
Fr2-19
Fr2-28
Ja2-5
Ja2-20
Ja2-23
Ja2-24
Ja2-30        ACFMGDKWVC
Fr2-7
Fr2-9         ACVLYPKAIC 
Fr2-11
Ja2-19        ACYMGQQFVC
Fr2-16        ACLTAYLHWC
Fr2-20        ACTLFPVAYC
Fr2-25        ACWLFPYAHC
Fr2-26        ACKSINMWLC
Fr2-27        ACQTINRWLC
【０１２６】
これらのミモトープ-ペプチドは環状の性質を有するため、その合成は直鎖状ペプチドの合成よりも複雑である。9 つの環状配列のうち７つを、阻害 ELISA におけるインビトロ解析のために選択した (図 8a および 8b 参照)。これらの配列のいずれも、ファージディスプレイスクリーニングに用いたモノクローナル抗体の、オリジナル CETP エピトープへの結合を阻害しなかった。さらに、これらのペプチドは、BSAと結合させて ELISA プレート上にコートした場合、モノクローナル抗体によって検出されなかった (図 9 参照)。この事は、同定されたミモトープを BSA と結合させて ELISA プレート上にコートした場合にこれらのペプチドのほとんどに対しモノクローナル抗体が結合した Ph.D.7 または Ph.D.12 ライブラリーから得られたミモトープを用いたデータとは対照的であった。
【０１２７】
実施例 3: CETP 活性アッセイ:
市販の(例えば ROAR CETP Activity Assay)、例えば US 5,585,235、US 5,618,683 および US 5,770,355 において記載されるアッセイを用いて、CETP 活性アッセイを行った。アッセイは、製造者の推奨に従って行う。
【図１】
2014040438.tif 000023
【図２ａ】
2014040438.tif 000024
【図２ｂ】
2014040438.tif 000025
【図３ａ】
2014040438.tif 000026
【図３ｂ】
2014040438.tif 000027
【図４ａ】
2014040438.tif 000028
【図４ｂ】
2014040438.tif 000029
【図５ａ】
2014040438.tif 000030
【図５ｂ】
2014040438.tif 000031
【図６】
2014040438.tif 000032
【図７ａ】
2014040438.tif 000033
【図７ｂ】
2014040438.tif 000034
【図７ｃ】
2014040438.tif 000035
【図７ｄ】
2014040438.tif 000036
【図８ａ】
2014040438.tif 000037
【図８ｂ】
2014040438.tif 000038
【図９】
2014040438.tif 000039
【図１０ａ】
2014040438.tif 000040
【図１０ｂ】
2014040438.tif 000041
【図１１】
2014040438.tif 000042
【図１２ａ】
2014040438.tif 000043
【図１２ｂ】
2014040438.tif 000044
【図１３】
2014040438.tif 000045
【図１４】
2014040438.tif 000046
【図１５】
2014040438.tif 000047
【図１６】
2014040438.tif 000048
【図１７】
2014040438.tif 000049
【図１８ａ】
2014040438.tif 000050
【図１８ｂ】
2014040438.tif 000051
【図１８ｃ】
2014040438.tif 000052
【図１９ａ】
2014040438.tif 000053
【図１９ｂ】
2014040438.tif 000054
【図１９ｃ】
2014040438.tif 000055
【図１９ｄ】
2014040438.tif 000056
【図１９ｅ】
2014040438.tif 000057
【配列表】
2014040438000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月25日(2013.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化、末梢動脈閉塞疾患、冠動脈心疾患または卒中性大脳発作を予防および/または治療するための、FGFPAHVFIDWLQSLS または FGFPAHVYIDWLQSLS または FGFPAHVFIDWLQSLN のアミノ酸配列を含む化合物を含む医薬組成物。
【請求項２】
化合物が医薬上許容される担体と結合していることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
化合物が皮内、皮下または筋肉内投与のために製剤されていることを特徴とする、請求項１から２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
化合物がアジュバントと共に製剤されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
FGFPAHVFIDWLQSLS、FGFPAHVYIDWLQSLS および FGFPAHVFIDWLQSLNからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の少なくとも１つのペプチドを含む医薬製剤。
【請求項７】
ペプチドが医薬上許容される担体と結合していることを特徴とする、請求項６に記載の医薬製剤。
【外国語明細書】
2014040438.tif 000058
2014040438.tif 000059
2014040438.tif 000060
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【配列表】
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