(57)【要約】【課題】加熱処理したリムルスアメーバ様細胞溶解物の提供。【解決手段】本願は、β−グルカンの検出に有用な加熱処理したリムルスアメーバ様細胞溶解物を提供する。一態様では、本発明は、（１→３）−β−Ｄ−グルカンの特異性を増加させてリムルスアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）を調製する方法に関する。この方法は、ＬＡＬを４０℃を超える温度まで加熱して、内毒素に対する反応性を減少させることを含む。本発明は、内毒素に対する感受性が減少したリムルスアメーバ様細胞溶解物を調製する方法にも関する。この方法は、ＬＡＬを加熱して、溶解物中の因子Ｃの活性を減少させる一方、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を維持することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
この出願は、２００９年６月２６日に出願された米国仮出願第６１／２２０，７８５号（この完全な内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アメリカカブトガニの血球に由来するリムルスアメーバ様細胞溶解物（Ｌｉｍｕｌｕｓ
ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）は、内毒素（非特許文献１）、または（１→３）−β−Ｄ−グルカン（非特許文献２；非特許文献３）と反応してゲルを形成する。内毒素およびβ−グルカンは２つの個別のＬＡＬ経路を起動し、これらの何れかの活性化はゲル化を生じる（非特許文献４）。内毒素はグラム陰性菌の細胞壁成分であり、発熱性、分裂促進性、および潜在的に致命的毒性である。したがって、内毒素の正確で信頼性の高い検出は、非経口薬物の安全性を確認する上で重要である。ＬＡＬアッセイは、内毒素検出において標準と認められているものである（たとえば、米国薬局方「細菌内毒素試験」参照）。
【０００３】
ＬＡＬは内毒素またはβ−グルカンの何れかと反応するため、２つの活性体のどちらがサンプル中に存在するかを把握することは必ずしも簡単なことではない。β−グルカンは一般に真菌、酵母、藻類および植物にみられ、細菌内毒素試験で偽陽性を生じる。β−グルカン汚染は、非経口薬物、たとえば血液製剤（非特許文献５）、および血液透析器などの医療デバイス（非特許文献６）に報告されている。非経口薬物および医療用デバイスのβ−グルカン汚染の検出は、拒絶されてはならない生成物が予期せずに拒絶されるのを防ぐのに有用である（非特許文献７）。
【０００４】
β−グルカンの検出は、深在性真菌症（ｄｅｅｐ  ｍｙｃｏｓｉｓ）の診断上役立つためヒトの血液サンプルにも使用することができる（Ｏｂａｙａｓｈｉ等（１９９５年）Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：１７−２０；Ｍｏｒｉ等（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５：５５３−５６０；Ｏｄａｂａｓｉ等（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３９：１９９−２０５；Ｏｓｔｒｏｓｋｙ−Ｚｅｉｃｈｎｅｒ等（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４１：６５４−６５９）。ＦＤＡおよび日本政府はそれぞれ、こうしたアッセイを臨床診断法として承認した。
【０００５】
問題は、β−グルカンの存在を内毒素の存在と区別することが可能なβ−グルカン検出のために、信頼性があり、費用効果の高いアッセイを開発することであった。ＬＡＬのβ−グルカン特異性を増加させるいくつかのプロセスが報告されている。
【０００６】
分別法（Ｏｂａｙａｓｈｉ等（１９８５年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １４９：５５−６５；Ｋｉｔａｇａｗａ等（１９９１年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ５６７：２６７−２７３：および特許文献１）は、カラムクロマトグラフィ、または固体吸着剤とＬＡＬとの間での分離ステップにより内毒素感受性因子（「因子Ｃ」）をＬＡＬから除去することに基づく。カラムクロマトグラフィおよび分離ステップは、無菌で実施しなければならない。したがって、これらのシステムは、内毒素またはβ−グルカンでシステムが汚染するのを防止するために、高価な器具や著しい努力を必要とする可能性がある。
【０００７】
もう１つの方法は、内毒素中和ペプチド（特許文献２；特許文献３；および特許文献４）を用いて、サンプル中の内毒素の活性を抑制する。内毒素の活性を抑制しようとするには、多量の内毒素によって影響され、高価で、かつ内毒素またはβ−グルカンにより汚染されるおそれがある抗内毒素物質を添加する必要が生じる可能性がある。
【０００８】
特許文献５では、ＬＡＬによるβ−グルカンアッセイに内毒素中和ペプチドを添加する。この方法では、カブトガニの血液からの内毒素中和ペプチドを精製する必要がある。精製は高く付く可能性があり、精製時に内毒素およびβ−グルカンによる汚染を防ぐことは困難である可能性がある。
【０００９】
同様に、特許文献６では、因子Ｃに対する抗体を添加する。この方法では、抗体の調製、合成および精製が必要であり、やはり費用、および精製過程の間における内毒素またはβ−グルカンによる汚染のリスクが増加する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，６８１，７１０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６１６，５５７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６２２，８３３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７５０，５００号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５７１，６８３号明細書
【特許文献６】米国特許第５，２６６，４６１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｅｖｉｎ等、Ｂｕｌｌ．Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｈｏｓｐ．（１９６４年）１１５：２６５−２７４
【非特許文献２】Ｋａｋｉｎｕｍａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８１年）１０１：４３４−４３９
【非特許文献３】Ｍｏｒｉｔａ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９８１年）１２９：３１８−３２１
【非特許文献４】Ｉｗａｎａｇａ等、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．（１９９２年）６８：１−３２
【非特許文献５】Ｉｋｅｍｕｒａ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８９年）２７（９）：１９６５−１９６８
【非特許文献６】Ｐｅａｓｏｎ等、Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ（１９８４年）８：２９１−２９８
【非特許文献７】Ｃｏｏｐｅｒ等、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７年）５１：２−６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、過去２０年にわたってβ−グルカンアッセイを開発するために努力したにも関わらず、内毒素に対する感受性が減少したＬＡＬを調製する単純な方法に対する必要性が未だに存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
アジアカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）からの溶解物を急速に４０℃を超える温度まで加熱すると、β−グルカン−感受性因子（「因子Ｇ」）が不活性化したと報告されている（Ｍｕｔａ等（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２７０：８９２−８９７）。現在、アメリカカブトガニ、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓから収集した溶解物の場合は同じことが当てはまらないことが発見されている。むしろ、Ｌｉｍｕｌｕｓ因子Ｇは、比較的熱安定性であると思われる。特に、ＬＡＬが約４０℃を超える温度まで加熱されると、内毒素に対するＬＡＬの感受性は、β−グルカンに対するＬＡＬの感受性より急速に失われる。ＬＡＬにおける内毒素とβ−グルカンの経路の熱感受性の差を利用すると、内毒素に対する反応性を減少させる一方、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を維持した状態で溶解物を調製することを可能にする。
【００１４】
したがって、一態様では、本発明は、（１→３）−β−Ｄ−グルカンの特異性を増加させてリムルスアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）を調製する方法に関する。この方法は、ＬＡＬを４０℃を超える温度まで加熱して、内毒素に対する反応性を減少させることを含む。本発明は、内毒素に対する感受性が減少したリムルスアメーバ様細胞溶解物を調製する方法にも関する。この方法は、ＬＡＬを加熱して、溶解物中の因子Ｃの活性を減少させる一方、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を維持することを含む。加熱条件は、内毒素に対する反応性がほんのわずかに減少するか、あるいは内毒素反応性が実質的に排除される溶解物を提供するように選択すると、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的な溶解物を提供することができる。
【００１５】
重要なことに、過度な加熱（たとえば５６℃で３０分間）を回避すると、ＬＡＬの（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を維持することができる。たとえば、結果として得られる溶解物は、１００ｎｇ／ｍＬ；１０ｎｇ／ｍＬ；１ｎｇ／ｍＬ；１００ｐｇ／ｍＬ；１０ｐｇ／ｍＬ；１ｐｇ／ｍＬ；または０．１ｐｇ／ｍＬというカルボキシメチル化パキマン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｐａｃｈｙｍａｎ）（（１→３）−β−Ｄ−グルカン）の濃度に対する感受性を維持することができる。
【００１６】
一部の実施態様において、ＬＡＬの（１→３）−β−Ｄ−グルカン反応性は、１，０００分の１以上（つまり、元の反応性の少なくとも０．１％維持）、１００分の１以上（元の反応性の少なくとも１％維持）、５０分の１以上（元の反応性の少なくとも２％維持）、１０分の１以上（元の反応性の少なくとも１０％維持）、５分の１以上（元の反応性の少なくとも２０％維持）、または２分の１以上（元の反応性の少なくとも５０％維持）に減少する。
【００１７】
内毒素反応性の減少は、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性の減少を超えるべきである。内毒素反応性の実質的な減少が望ましい場合、減少は多くとも１０分の１（つまり、元の反応性の最大１０％維持）、多くとも５０分の１（元の反応性の最大２％維持）、多くとも１００分の１（元の反応性の最大１％維持）、多くとも５００分の１（元の反応性の最大０．２％維持）、多くとも１，０００分の１（元の反応性の最大０．１％維持）、多くとも５，０００分の１（元の反応性の最大０．０２％維持）、多くとも１０，０００分の１（元の反応性の最大０．０１％維持）、多くとも１００，０００分の１（元の反応性の最大０．００１％維持）、または多くとも１，０００，０００分の１（元の反応性の最大０．０００１％維持）であり得る。
【００１８】
一般に、この方法は、ＬＡＬを４０℃〜８０℃に加熱することを含むが、より高い温度（特に５６℃以上）では、加熱時間は、ＬＡＬが（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対しても非感受性になるのを避けるために対応して短時間でなければならない。たとえば５６℃を超える温度における加熱時間は、１分未満が好ましい。対照的に、内毒素反応性に望ましい減少程度に応じて、温度が４５℃以下である場合、４０分を超える加熱時間を使用してよい。
【００１９】
特定の状況では、ＬＡＬは、内毒素反応性の所望の減少を達成するため少なくとも最小時間にわたって加熱する。たとえば、加熱時間はｔＡ１時間を超えるように選択し、ここでｔＡ１＝０．８２５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）であり、Τは、℃での温度であり、場合によって約１０００倍の内毒素反応性の減少を達成する。あるいは、加熱時間はｔＡ２時間を超えるように選択することができ、ここでｔＡ２＝１．６５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）であり、場合によって約１，０００，０００倍の内毒素反応性の減少を達成する。さらに一般的には、ＬＡＬは、少なくともｔＡ時間にわたって任意に加熱され、ここでｔＡ＝Ｋ＊０．２７５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）であり；Ｋは、内毒素反応性の不活性化の所望の大きさに応じてたとえば、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０またはそれより大きくてもよい。
【００２０】
上記の方法では、ＬＡＬの加熱時間は任意にｔＢ１時間以下であり、ここでｔＢ１＝０．３５３＊２．７１８（７６５１０／（Ｔ＋２７３））／（２．２０＊１０１０３）であり、Τは℃での温度であり、場合によって（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性の少なくとも約１０％を維持する。特定の用途において高レベルの反応性が必要とされない場合、より長い時間の加熱時間を許容することができる。多様な実施態様では、必要に応じてＬＡＬ加熱時間はｔＢ時間以下であり、ｔＢ＝Ｋ＊０．１７７＊２．７１８（７６５１０／（Τ＋２７３）／（２．２０＊１０１０３）であり、Ｋは、（１→３）−β−Ｄ−グルカン反応性の不活性化に対する許容差に応じて、１０．０、９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０以下である。
【００２１】
上記の方法の何れかにより加熱した後、あらゆる沈着物が、遠心分離などにより溶解物から除去される。溶解物は、たとえば１つまたは複数の添加物（たとえば塩および／または緩衝剤）を混合するか、または凍結乾燥によって使用または保管のために調製することもできる。内毒素中和ペプチドも抗因子Ｃ抗体も加熱処理したＬＡＬを調製するプロセスが複雑になり、コストが高くなる可能性があるため、好ましくは、これらはどちらも添加されない。
【００２２】
別の態様では、本発明は、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性のＬｉｍｕｌｕｓ因子Ｇを含む加熱処理したＬＡＬを提供する。このＬＡＬは、未処理リムルスアメーバ様細胞溶解物の内毒素反応性の０．１％未満の内毒素反応性を有する。ＬＡＬは凍結乾燥し、１００ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、またはさらに０．１ｐｇ／ｍＬのカルボキシメチル化パキマンに対する感受性を維持することが好ましく、一方で２００ＥＵ／ｍＬの内毒素標準品および／または０．０１、０．１、１またはさらに１０ｍｃｇ／ｍＬのリポ多糖類（ＬＰＳ）に対して非感受性であることが好ましい。
【００２３】
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの検出を促進するために、本発明は、加熱処理したリムルスアメーバ様細胞溶解物、およびＬＡＬが活性化すると、溶解物の活性化を表す検出可能な産物を生成する基質を含む組成物も提供する。この基質は、たとえば色素生成性（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）でよく、溶解物が活性化すると、特定の波長または波長のスペクトルにおける吸光度の変化を表す。あるいは、この基質は、溶解物が活性化すると蛍光特性が変化する（たとえば波長が増減または変化する）蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）でよい。
【００２４】
本発明は、サンプルの（１→３）−β−Ｄ−グルカンを検出する方法も提供する。この方法は、サンプルと、基質、および上記の説明の何れかにしたがって加熱処理したリムルスアメーバ様細胞溶解物とを結合させることを含む。この方法は、基質と加熱処理したＬＡＬとを結合させた後のサンプルの光学特性（たとえば吸光度、透過率、蛍光または濁度）の変化の検出を含むことができる。
【００２５】
本発明は、以下の図面、明細書および請求の範囲を考慮するとさらに理解されるであろう。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する特異性が増大したリムルスアメーバ様細胞溶解物を調製する方法であって、内毒素に対する反応性を減少させるために、４０℃を超える温度まで前記リムルスアメーバ様細胞溶解物を加熱するステップを含む、方法。
（項目２）
内毒素に対する感受性が低下したリムルスアメーバ様細胞溶解物を調製する方法であって、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を維持する一方、前記リムルスアメーバ様細胞溶解物中の因子Ｃの活性を低下させるために、前記リムルスアメーバ様細胞溶解物を加熱するステップを含む、方法。
（項目３）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が、１００ｎｇ／ｍＬのカルボキシメチル化パキマンに対する感受性を維持する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が、１ｎｇ／ｍＬのカルボキシメチル化パキマンに対する感受性を維持する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が、１ｐｇ／ｍＬのカルボキシメチル化パキマンに対する感受性を維持する、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が、０．１ｐｇ／ｍＬのカルボキシメチル化パキマンに対する感受性を維持する、項目５に記載の方法。
（項目７）
結果として得られた前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的な溶解物である、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目８）
前記（１→３）−β−Ｄ−グルカンの反応性が１０分の１を超えて低下しない、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目９）
前記内毒素の反応性が、多くとも１００分の１に低下する、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記内毒素の反応性が、多くとも１，０００分の１に低下する、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記内毒素反応性が、多くとも１０６分の１に低下する、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が４０℃〜８０℃まで加熱される、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目１３）
（ｉ）前記温度が４５℃以下である場合、前記加熱時間が４０分を超え、
（ｉｉ）前記温度が５５℃を超える場合、前記加熱時間が１分未満である、
前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記温度が４５℃以下である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記温度が４５℃を超え、５５℃未満である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記温度が４５℃を超え、５２℃未満である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記温度が４５℃を超え、５０℃未満である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記加熱時間がｔＡ１時間を超え、ここでｔＡ１＝０．８２５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）であり、ここでＴは℃での温度である、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記加熱時間がｔＡ２時間を超え、ここでｔＡ２＝１．６５＊２．７１８（５６３４０（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）であり、ここでΤは℃での温度である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記加熱時間がｔＢ１時間以下であり、ここでｔＢ１＝０．３５３＊２．７１８（７６５１０／（Τ＋２７３））／（２．２０＊１０１０３）であり、ここでΤは℃での温度である、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が少なくとも５分間加熱される、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が少なくとも２０分間加熱される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が２時間以下加熱される、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目２４）
沈着物を前記リムルスアメーバ様細胞溶解物から除去する追加のステップを含む、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物を凍結乾燥するステップをさらに含む、前記項目の何れか１項に記載の方法。
（項目２６）
（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対して感受性のあるＬｉｍｕｌｕｓ因子Ｇを含み、未処理リムルスアメーバ様細胞溶解物の前記内毒素反応性の０．１％未満の内毒素反応性を有する加熱処理したリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目２７）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が凍結乾燥される、項目２６に記載のリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目２８）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が、１ｐｇ／ｍＬのカルボキシメチル化パキマンに対する感受性を維持する、項目２６または２７に記載のリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目２９）
前記リムルスアメーバ様細胞溶解物が０．１ｐｇ／ｍＬのカルボキシメチル化パキマンに対する感受性を維持する、項目２８に記載のリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目３０）
前記溶解物が、２００ＥＵ／ｍＬの内毒素標準品に対して非感受性である、項目２６〜２９の何れか１項に記載のリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目３１）
前記溶解物が０．０１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳに対して非感受性である、項目２６〜３０の何れか１項に記載のリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目３２）
前記溶解物が０．１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳに対して非感受性である、項目３１に記載のリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目３３）
前記溶解物が１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳに対して非感受性である、項目３２に記載のリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目３４）
前記溶解物が１０ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳに対して非感受性である、項目３３に記載のリムルスアメーバ様細胞溶解物。
（項目３５）
加熱処理したリムルスアメーバ様細胞溶解物および基質を含む組成物。
（項目３６）
前記基質が色素生成性である、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
前記基質が蛍光発生性である、項目３５に記載の組成物。
（項目３８）
前記組成物が凍結乾燥される、項目３５、３６または３７に記載の組成物。
（項目３９）
サンプル中の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを検出する方法であって、前記方法は、項目２６〜３４の何れか１項に従って、前記サンプルとリムルスアメーバ様細胞溶解物とを結合するステップ、および前記サンプルの光学特性における変化を検出するステップを包含する、方法。
（項目４０）
前記サンプルの前記光学特性における前記変化を検出する前に、前記サンプルと基質とを結合するステップをさらに包含する、項目３９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、オンセット時間（ｏｎｓｅｔ  ｔｉｍｅ）と未処理ＬＡＬのカルボキシメチル化パキマンの濃度との関係を表すグラフである。
【図２】図２は、オンセット時間と未処理ＬＡＬの内毒素の濃度との関係を表すグラフである。
【図３】図３は、オンセット時間と未処理ＬＡＬ、または４７℃で３０、４５、６０または７５分間加熱したＬＡＬのカルボキシルメチル化カードランの濃度との関係を表すグラフである。
【図４】図４は、オンセット時間と未処理ＬＡＬ、または４７℃で３０、４５、６０または７５分間加熱したＬＡＬの内毒素濃度との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、２００ＥＵ／ｍＬの米国参照用標準の内毒素の有無によるカルボキシルメチル化カードランの標準曲線を比較するグラフである。
【図６】図６は、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５に由来する５００ｎｇ／ｍＬの内毒素の有無によるカルボキシルメチル化カードランの標準曲線を比較するグラフである。
【図７】図７Ａ〜図７Ｄは、本発明の加熱処理したＬＡＬによりβ−グルカンアッセイを実施する際に有用な例示的なカートリッジの斜視図（図７Ａ）、上面図（図７Ｂ）、側面図（図７Ｃ）および端面図（図７Ｄ）で示す略図である。
【図８】図８は、絶対温度（ケルビン）による実施例２で観察された溶解物の不活性化の比率に関するアレニウスプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、（１→３）−β−Ｄ−グルカンの特異性を強化し、内毒素に対する感受性を低下させたリムルスアメーバ様細胞溶解物を調製するための方法を提供する。この目的は、内毒素中和ペプチドまたは抗体などの添加物の必要がなく、クロマトグラフ媒体に曝露することなく達成される。こうして、不要な費用および労働力が回避される。おそらくさらに重要なことに、ＬＡＬを潜在的な汚染源に不要に曝露することも回避される。本発明は、たとえば瓶または管内に密封された粗製溶解物に関して実施可能で、汚染の可能性がほとんどない単純で制御された加熱ステップを提供する。ＬＡＬは、実質的に遠心分離されてあらゆる沈着物を除去され、保管して後にβ−グルカン検出アッセイに使用するため凍結乾燥されることが可能である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「（１→３）−β−Ｄ−グルカン」という用語は、（ｉ）リムルスアメーバ様細胞溶解物中におけるコアグリンの凝塊の形成を誘発することが可能であり、（ｉｉ）（１→３）−β−Ｄ−グリコシド結合により結合されるβ−Ｄグルコシドを含む、任意の多糖またはその派生物を意味すると解釈される。こうした多糖またはその派生物は、（１→３）−β−Ｄグリコシド結合を含むほか、その他の多様なグリコシド結合、たとえば（１→４）−β−Ｄグリコシド結合および／または（１→６）−β−Ｄグリコシド結合により結合されるグルコシド部分も含み得ると考えられる。こうした（１→３）−β−Ｄ−グルカンは、植物、細菌、酵母、藻類および真菌を含むが、これらだけに限らない多様な供給源から単離することができるか、または従来の糖化学作用を用いて合成することができると考えられる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、リムルスアメーバ様細胞溶解物、またはＬＡＬは、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからの完全なアメーバ様細胞溶解物、またはその画分もしくはその成分を含むことができ、これらは天然由来か組み換えで生成されてＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ因子Ｇを含み、（１→３）−β−Ｄ−グルカンと検出可能に反応する。
【００３０】
ＬＡＬの熱処理
ＬＡＬは、一般に、汚染のリスクを最小限にするために、密封容器（たとえば密封管または瓶）内にある時に加熱される。熱は、温度制御水槽または加熱ブロック中に浸漬するなど、何らかの制御された方法で加えることができる。より短い加熱時間のために、加熱条件は、たとえば、より薄いか、および／またはより熱伝導性の壁を有する密封容器を使用し、ＬＡＬの容積を減少させることにより、または表面積／単位容積の比率がより大きい容器（たとえば、より平坦な容器、コイル状の容器など）を使用することにより、環境の温度とＬＡＬの温度との間の差異を最小限にするように選択することができる。
【００３１】
ＬＡＬは、４０℃を超える温度まで加熱される。実施例２（オンセット時間の増加は反応性の低下の尺度である）の表１および２に示すように、４０℃では、内毒素反応性は３０分後にわずかに減少するが、β−グルカンの反応性は本質的には影響を受けないままである。対照的に、４７℃では、内毒素反応性はわずか２０分後に大幅に除去されるが、β−グルカンの反応性はごくわずかに減少する。したがって、ある温度範囲に渡って、内毒素反応性はβ−グルカンの反応性より急速に減少し、その結果、内毒素反応性の減少を制御することができ、一方でβ−グルカンの反応性は維持される。必要とされるβ−グルカンに対する感受性は異なるので（たとえば、検出が臨床用か、あるいは工業目的かによる）、温度および加熱時間は、所望レベルのβ−グルカン反応性を維持し、および／または内毒素反応性の所望の割合を除去するように選択することができる。ある範囲の温度を使用することができるが、より高い温度は、顕著に短い加熱時間を必要とする。たとえば、５６℃を超える温度で、加熱時間は１分未満であることが好ましい（徐々に高温になる場合、実質的に１分未満）。
【００３２】
したがって、４０℃を超えるが、５６℃未満の温度がより好都合である可能性がある。一方、内毒素反応性の不活性化は比較的遅く、４０℃〜４５℃で、内毒素反応性の実質的な不活性化を達成するには４０分を超える必要がある場合が多いので、４５℃を超える温度（たとえば、４５℃〜５５℃、４５℃〜５２℃または４５℃〜５０℃）は、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的なＬＡＬを調製するのにより効果的なプロセスを提供することができる。
【００３３】
一般に、この方法は、ＬＡＬを４０℃〜８０℃まで加熱することを含むが、より高温（特に５６℃以上）では、加熱時間は、ＬＡＬが（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対しても非感受性になるのを避けるために対応して短時間にするべきである。たとえば、５６℃を超える温度では、加熱時間は１分未満であることが好ましい。対照的に、内毒素反応性の所望の程度の減少に応じて、温度が４５℃以下である場合、４０分を超える加熱時間を使用することができる。
【００３４】
特定の実施態様では、ＬＡＬは４０℃を超える最大温度、ただし４５℃以下（たとえば、４１℃〜４５℃、４２℃〜４５℃、４３℃〜４５℃、４４℃〜４５℃または約４５℃）まで加熱される。特定の実施態様では、ＬＡＬは、４５℃を超える温度（たとえば、４６℃〜８０℃、４６℃〜７０℃、４６℃〜６０℃、４６℃〜５５℃、４６℃〜５４℃、４６℃〜５３℃、４６℃〜５２℃、４６℃〜５１℃、４６℃〜５０℃、４６℃〜４９℃、４６℃〜４８℃、４６℃〜４７℃または約４６℃）まで加熱される。５５℃未満の温度（たとえば４１℃〜５５℃、４１℃〜５４℃、４１℃〜５３℃、４１℃〜５２℃、４１℃〜５１℃、４１℃〜５０℃、４１℃〜４９℃、４１℃〜４８℃、４１℃〜４７℃、４１℃〜４６℃）、または５３℃未満の温度（たとえば４２℃〜５３℃、４３℃〜５３℃、４４℃〜５３℃、４５℃〜５３℃、４６℃〜５３℃、４７℃〜５３℃、４８℃〜５３℃、４９℃〜５３℃、５０℃〜５３℃、５１℃〜５３℃、または５２℃〜５３℃）まで加熱すると、（１→３）−β−Ｄ−グルカン反応性の低下はより遅くなるという利点をもたらす。
【００３５】
ＬＡＬの加熱時間は、温度、所望レベルの内毒素、および（１→３）−β−Ｄ−グルカンの反応性に応じて変えることができる。たとえば、加熱時間は１分未満；１〜５分；１〜１０分；１〜２０分；１〜３０分、１〜４０分；１〜５０分；１〜６０分；１〜８０分；１〜１００分；１〜１２０分；１〜２４０分；少なくとも５分；５〜１０分；５〜２０分；５〜３０分；５〜４０分；５〜５０分；５〜６０分；５〜８０分；５〜１００分；５〜１２０分；５〜２４０分；少なくとも２０分、２０〜３０分；２０〜４０分；２０〜５０分；２０〜６０分；２０〜８０分；２０〜１００分；２０〜１２０分；２０〜２４０分；４０分超；４０〜５０分；４０〜６０分；４０〜８０分；４０〜１００分；４０〜１２０分；４０〜２４０分；２時間以下、またはより低い温度では数日間でもよい。
【００３６】
特定の実施態様では、溶解物は、４０℃まで７５０〜１３５００分、または４１℃まで４２５〜６２００分、または４２℃まで２４０〜２９００分、または４３℃まで１３７〜１３５０分、または４４℃まで７８〜６２０分、または４５℃まで４５〜２９０分、または４６℃まで２６〜１３５分、または４７℃まで１５〜６４分、または４８℃まで８．５〜３１分、または４９℃まで５〜１５分、または５０℃まで２．５〜７分、または５１℃まで１．５〜３．５分、または５２℃まで１〜１．６分、または５３℃まで０．６〜０．８分間にわたり試験される。
【００３７】
以下の表でわかるように、内毒素反応性の不活性化の速度は、インキュベーション温度に基づいて劇的に変化する。実際、内毒素反応性の不活性化の速度およびβ−グルカンの反応性の不活性化の速度の両方が、上昇する温度とともに指数関数的に増加する。加熱時間、温度、および内毒素反応性とβ−グルカン反応性の不活性化の速度を実施例８に示す。実施例８で議論するように、一連の実験で、加熱処理したＬＡＬの活性化のオンセット時間を測定した。この実験では、加熱時間、温度、および内毒素またはβ−グルカンの濃度を変えた。使用した試薬について観察した結果は、内毒素反応性を１，０００分の１に減少させるのに必要な加熱時間はｔＡ１時間であり、ここでｔＡ１＝０．８２５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）であった。ここでΤは℃での温度である。１，０００，０００分の１の減少を達成するには、２倍の長さ：ｔＡ２時間を要し、ここでｔＡ２＝１．６５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）である。内毒素反応性の所望される、必要とされるまたは許容される保持は用途ごとに異なってよい（たとえば、工業用途と診断用途では異なるため）。したがって、さらに一般的には、目標の加熱時間はｔＡ時間以上でよく、ここでｔＡ＝Ｋ＊０．２７５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）であり；Ｋは、所望の大きさの内毒素反応性の不活性化に応じて、たとえば、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０以上でよい。
【００３８】
同様に、β−グルカン反応性の減少速度は、温度の上昇とともに指数関数的に増加するが、適度な加熱温度の場合、β−グルカン反応性の損失率は、内毒素反応性の損失率よりかなり小さい可能性がある。したがって、実施例８の観察結果は、β−グルカン反応性の１０倍の損失をもたらす加熱時間はｔＢ１時間であり、ここで、ｔＢ１＝０．３５３＊２．７１８（７６５１０／（Τ＋２７３））／（２．２０＊１０１０３）であった。ここでΤは℃での温度である。再度、様々な用途で、β−グルカン反応性の損失の許容差は異なる場合があるため、目標加熱時間はｔＢ時間以下でよく、ここでｔＢ＝Ｋ＊０．１７７＊２．７１８（７６５１０／（Τ＋２７３））／（２．２０＊１０１０３）であり、ここでＫは１０．０、９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０以下である。  
【００３９】
熱処理後、あらゆる沈着物を、遠心分離（たとえば２５００×Ｇで２０分）、ろ過またはその他の分離ステップにより沈着物を溶解物から除去することができる。
【００４０】
加熱処理したＬＡＬは、たとえば凍結乾燥により、固体表面（瓶、カートリッジまたは１２ウェルまたは９６ウェルのプレートなど）上で乾燥させてもよい。乾燥前に、１つまたは複数の添加物を任意に加熱処理したＬＡＬと混合する。たとえば、再溶解剤および／または抗フレーキング剤（ａｎｔｉ−ｆｌａｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含むことができる。再溶解剤は、単独で、あるいは別の再溶解剤と組み合わせて、ＬＡＬが流体サンプルに曝露された後、ＬＡＬの１つまたは複数の成分の再溶解を促進する薬剤である。再溶解剤はさらに、好ましくは乾燥形態で溶解物を安定化する。混合物中で提供される再溶解剤は、アッセイの間に試薬の安定性およびその溶解を促進する。再溶解剤は、たとえば１つまたは複数種類の糖、塩、またはこれらの組合せを含む。好ましい糖再溶解剤としては、たとえば、マンニトール、マンノース、ソルビトール、トレハロース、マルトース、デキストロース、スクロース、およびその他の単糖類または二糖類が挙げられる。この混合物に含まれる抗フレーキング剤は試薬をさらに安定化させ、乾燥溶解物のフレーキングを減少させる。抗フレーキング剤は好ましくは、乾燥形態の溶解物も安定化させる。好ましい抗フレーキング剤としては、たとえば１つまたは複数のポリマー、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、マンニトール、デキストラン、およびタンパク質、たとえば血清アルブミンが挙げられる。ポリビニルアルコールまたはポリプロピレングリコールなどの消泡剤を含んでもよい。実施例１に例示されている塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、およびＨＥＰＥＳ緩衝剤などの塩および／または緩衝剤を含んでもよい。反応に好ましいｐＨの範囲であるｐＨ７〜ｐＨ８の緩衝能力を有するその他の緩衝剤と同様、その他の種類の緩衝剤、たとえばＴＲＩＳ−ＨＣ１緩衝剤、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、トリシン、およびリン酸塩を使用することができる。サンプルと混合した後の組成物の目標ｐＨは、７．３〜８．０であることが好ましい。
【００４１】
この混合物は、約４℃〜約４０℃、さらに好ましくは約１０℃〜約３５℃、さらに好ましくは約１５℃〜約３０℃の温度、および約０％〜約３０％、さらに好ましくは約２％〜約２０％、さらに好ましくは約４％〜約１０％の相対湿度を有する環境で、導管の表面上で乾燥させることができる。好ましくは、この温度は約２５℃、相対湿度は約５％である。乾燥は、温度調節された乾燥チャンバ内で好ましくは約１０分〜約８時間、さらに好ましくは約１時間実施する。
【００４２】
もう１つの実施態様では、この混合物は、０℃未満、たとえば約−７５℃〜約−１０℃、さらに好ましくは約−３０℃〜約−２０℃の温度で凍結乾燥つまりフリーズドライにより、導管の表面で乾燥させる。
【００４３】
β−グルカンアッセイ
加熱処理したＬＡＬは、多様なエンドポイントアッセイまたは動力学アッセイの何れかを用いてβ−グルカンを検出するために使用することができる。例示的なエンドポイントアッセイとしては、エンドポイント色素生成性アッセイまたはエンドポイント濁度測定アッセイが挙げられる。例示的な動力学アッセイとしては、動力学的濁度測定アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）、１ステップ動力学アッセイ、またはマルチステップ動力学アッセイが挙げられる。各々のアッセイについて、以下でさらに詳細に説明する。さらにアッセイは、特定のアッセイの形式、たとえばカートリッジ内、または９６ウェルプレートなどのプレートのウェル内で実施するように修正してよいものと理解される。
【００４４】
（１）  動力学アッセイ
例示的な動力学アッセイとしては、マルチステップ動力学アッセイ、１ステップ動力学アッセイ、および動力学的濁度測定アッセイが挙げられる。
【００４５】
（ｉ）  マルチステップ動力学アッセイ
マルチステップ動力学アッセイ（たとえば、米国特許第７，３２９，５３８号に記載されているアッセイ）は、被試験サンプルとある量の加熱処理したＬＡＬとを結合してサンプル−ＬＡＬ混合物を生成することによって開始する。この混合物は次に、予め決められた期間でインキュベートする。この混合物は次に、色素生成性基質または蛍光発生性基質などの基質と接触させて、サンプル−ＬＡＬ−基質混合物を生成する。その後、光学特性の予め選択した変化（たとえば吸光度値の特定の変化、または透過値の特定の変化）が生じる時間を測定する。
【００４６】
このアッセイは、一定量のカルボキシメチル化パキマンまたはその他のβ−グルカンがアッセイに導入された時に、光学特性の予め選択した変化が生じる時間を測定して校正することができる。試験サンプルにより生成された結果と、１つまたは複数の公知の量のβ−グルカンにより生成された結果とを比較することによって、試験サンプル中のβ−グルカンの存在または量を検出することができる。
【００４７】
マルチステップ動力学アッセイは、カートリッジ形式で実施ができると考えられる。カートリッジは好ましくは、光学検出器、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．Ｄｅｓ．３９０，６６１に図示および説明されている携帯式光学検出器とともに使用する。
【００４８】
一例として、図７Ａ〜７Ｄに示すように、カートリッジ１は、たとえば成形可能な生体適合性材料から製作された実質的に平坦な筺体を有する。この筺体は任意の材料から製作してよいが、透明および／または半透明のガラスまたはポリマーが好ましい。好ましいポリマーとしては、たとえばポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル、ポリエステル、光学グレードのポリマー、または光学セルが実質的に透明であるような任意のプラスチックが挙げられる。この筺体は、少なくとも１つの流体入口ポート４、少なくとも１つの光学セル６、および流体入口ポート４と光学セル６との間に流体連通（ｆｌｕｉｄ  ｆｌｏｗ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）を提供するための流体接触面を有する少なくとも１つの導管８を有する。光学セル６の唯一の要件は、光学セル６が被試験サンプルを収容することが可能な空隙を画定し、光学セル６の一部が光に対して透過性であることである。カートリッジ１は、カートリッジ１をポンプに取り付けるために、流体入口ポート４および光学セル６と流体連通する少なくとも１つのポンプポート１２も有することができる。このポンプは次に、ポンプポート１２を介して負圧を付与して、サンプルを流体入口ポート４から光学セル６に引っ張ることができる。加熱処理したＬＡＬは、導管８の流体接触面の第１領域１４に配置され、その結果、サンプルが流体入口ポート４に入れられると、サンプルは領域１４を横断して、サンプルが光学セル６方向に移動する時にＬＡＬをサンプル中に可溶化または再構成する。
【００４９】
導管８の流体接触面の第２領域１６は、第１領域１４から離して第１領域１４の下流に配置される。この構成では、ＬＡＬは第１領域１４に配置され、色素生成性基質または蛍光発生性基質は第２領域１６に配置されるため、サンプルが領域１４のＬＡＬに接触した後、サンプル−溶解物の混合物は導管８を横断して、領域１６の基質と接触する。サンプル−溶解物−基質の混合物は次に、導管８を光学セル６まで横断する。
【００５０】
カートリッジは、必要な試験のタイプおよび／または回数に応じて設計および使用することができる。たとえば１つのサンプルは、たとえば研究所用途または医療用デバイス、および生物薬剤学的試験のために、たとえば二連または三連で試験することができる。あるいは、２つ以上の異なるサンプルを別個に試験してよい。カートリッジは、好ましくは、１回使用した後に廃棄される単回使用用の使い捨てカートリッジである。このカートリッジは、マルチウェルプレートで実施される従来のエンドポイント色素生成性または動力学的色素生成性アッセイで使用されるよりも、サンプル当たりで一般に約２０〜１００分の１の血球（ｈｅｍｏｃｙｔｅ）溶解物を使用するため、より安価で環境にもよい試験を提供する。
【００５１】
図７Ａを参照して、例示的なカートリッジ１でマルチステップ動力学アッセイを実施するには、サンプルを最初に、たとえばポンプ動作により、加熱処理したＬＡＬを収容する第１領域１４に移動させて、そこでサンプルを混合し、予め決められた期間インキュベートする。サンプル−ＬＡＬの混合物は次に、たとえばポンプ動作により、色素生成性基質または蛍光発生性基質などの基質を収容する第２領域１６に移動され、そこで可溶化される。サンプル−基質の混合物は次に、光学特性の測定を行うために光学セル６に移動される。混合およびインキュベーションステップに必要な時間間隔は、対象となるβ−グルカン濃度範囲に最適な特異性および感受性に関して予めプログラムされる。
【００５２】
マルチステップアッセイは、先に議論されたタイプのカートリッジ内で実施できるが、たとえばマイクロタイタープレートのウェル内で、他の多様な形式で使用してもよい。このタイプのアッセイでは、対象サンプルは加熱処理したＬＡＬと結合され、予め決められた期間にわたってインキュベートされる。次に、予め決められた期間後、色素生成性基質または蛍光発生性基質がウェルに添加される。混合後、光学特性に予め選択した変化が生じる時間を測定する。次に、結果を１つまたは複数の標準値と比較して、サンプル中のβ−グルカンの存在または量を測定することができる。
【００５３】
ウェルタイプ形式では、サンプルおよび試薬は、好ましくはロボットなどの自動システムを使用して各々のウェルに添加され、プレートは、各々のウェルの吸光度を繰り返し順に読み取るようにプログラム可能なマイクロプレートリーダーによって処理される。
【００５４】
（ｉｉ）  １ステップ動力学アッセイ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｓｓａｙ）
１ステップ動力学アッセイ、たとえば１ステップ−色素生成性アッセイは、米国特許第５，３１０，６５７号に記載されている。簡潔に述べると、動力学的色素生成性アッセイは、（ｉ）加熱処理したＬＡＬを被分析サンプルおよび色素生成性基質などの基質と同時に可溶化するステップ、（ｉｉ）結果として得られる混合物を約０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度で、予め決められた時間範囲にわたりインキュベートするステップ、および（ｉｉｉ）従来の分光光度計を使用して、比色測定の変化（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｎｇｅ）が予め選択した値に達するのに必要な時間、または比色測定読み出しの変化を測定するステップを含む。
【００５５】
このタイプのアッセイは、マルチステップ動力学アッセイと同様、カートリッジまたはウェルタイプ形式で実施することができる。マルチステップ動力学アッセイに関して上記で説明したカートリッジに類似するカートリッジは、１ステップ動力学アッセイで使用するように修正することができる。図７Ａを参照して、色素生成性基質または蛍光発生性基質は、たとえば、加熱処理したＬＡＬとともに、第１領域１４にある導管８の表面に適用される。カートリッジ１で、図７Ａに関連して動力学アッセイを実施するために、サンプルを、たとえばポンプ動作により、ＬＡＬおよび基質を共に収容する導管８の第１領域１４に移動させ、そこで、たとえば順方向および逆方向のポンプ動作を繰り返すことによって可溶化される。サンプル−ＬＡＬ−基質の混合物は次に光学セル６に移動され、光学検出器によってサンプルの吸光度または透過率の特性などの光学特性を測定する。検出器は、各々の光学特性が、たとえば光透過率の５％低下を示すのに要する時間を測定することができる。複数のアッセイ、たとえば２回のアッセイの結果は平均することができる。
【００５６】
このアッセイは、一定量のβ−グルカンがアッセイに導入された時に、光学特性の予め選択した変化が生じる時間を測定することによって校正することができる。試験サンプルによって生成された結果と、公知の量のβ−グルカンによる１つまたは複数の結果と比較することによって、試験サンプル中のβ−グルカンの存在または量を測定することができる。
【００５７】
このタイプのアッセイの形式は、その他の多様な形式、たとえばマイクロタイタープレートのウェル内で使用することができる。このタイプのアッセイでは、対象サンプルは加熱処理したＬＡＬおよび色素生成性基質または蛍光発生性基質と混合される。混合後、光学特性の予め選択した変化が生じる時間を測定する。次に、この結果を標準値と比較し、対象サンプルのβ−グルカンの存在または量を測定することができる。
【００５８】
（ｉｉｉ）  動力学的濁度測定アッセイ
動力学的濁度測定β−グルカンアッセイは、（ｉ）加熱処理したＬＡＬを被分析サンプルとともに可溶化するステップ、（ｉｉ）結果として得られる混合物を約０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度で、予め決められた時間範囲にわたりインキュベートするステップ、および（ｉｉｉ）従来の凝固計（ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）、比濁計（ｎｅｐｈｅｒｏｍｅｔｅｒ）または分光光度計を使用して、凝固によって生じる濁度の変化が予め選択した値に達するのに要する時間、または濁度の変化率のいずれかを測定するステップを含む。
【００５９】
このタイプのアッセイは、従来のアッセイと同様、カートリッジまたはウェルタイプ形式で実施することができる。マルチステップまたは１ステップ動力学アッセイに関して上記で説明したカートリッジに類似するカートリッジは、動力学的濁度測定アッセイに使用するように修正することができる。図７Ａを参照して、色素生成性基質または蛍光発生性基質を、第１領域１４または第２領域１６のどちらにも適用する必要はない。
【００６０】
図７Ａを参照して、カートリッジ１で動力学的濁度測定アッセイを実施するために、サンプルは、たとえば、加熱処理したＬＡＬを収容する導管８の第１領域１４に移動され、そこで、たとえば順方向および逆方向のポンプ動作を繰り返すことによって可溶化される。サンプル−溶解物の混合物は次に光学セル６に移動され、光学検出器を使用してサンプル−溶解物の混合物の吸光度または透過率などの特性を測定することによって、濁度などの光学特性を測定する。検出器は、各々の光学特性が、たとえば光透過率が５％低下するのにどの程度の時間を要するかを測定することができる。複数のアッセイ、たとえば２回のアッセイの結果は平均することができる。
【００６１】
このアッセイは、一定量のβ−グルカンがアッセイに導入された時に、濁度などの光学特性の予め選択した変化が生じる時間を測定して校正することができる。試験サンプルにより生成された結果と、公知の量のβ−グルカンにより生成された１つまたは複数の結果とを比較することによって、試験サンプル中のβ−グルカンの存在または量を検出することができる。
【００６２】
このタイプのアッセイの形式は、その他の多様な形式、たとえばマイクロタイタープレートのウェル内に使用することができる。このタイプのアッセイでは、対象サンプルは加熱処理したＬＡＬと混合される。混合後、濁度などの光学特性の予め選択した変化が生じる時間を測定する。次に、この結果を標準値と比較し、対象サンプルのβ−グルカンの存在または量を測定することができる。
【００６３】
（２）  エンドポイントアッセイ
例示的なエンドポイントアッセイとしては、エンドポイント色素生成性アッセイまたはエンドポイント蛍光発生性アッセイおよびエンドポイント濁度測定アッセイが挙げられる。
【００６４】
（ｉ）エンドポイント色素生成性アッセイまたはエンドポイント蛍光発生性アッセイ
エンドポイント色素生成性または蛍光発生性β−グルカンアッセイは、（ｉ）加熱処理したＬＡＬを被分析サンプルとともに可溶化するステップ、（ｉｉ）結果として得られる混合物を約０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度で、予め決められた時間インキュベートするステップ、（ｉｉｉ）色素生成性基質または蛍光発生性基質などの基質と、インキュベートしたサンプル−ＬＡＬ混合物とを接触させるステップ、（ｉｖ）任意に酢酸などの反応阻害剤を添加する、および（ｖ）たとえば比色測定の変化により、酵素活性により基質から生成される物質を測定するステップを含むことができる。
【００６５】
このタイプのアッセイは、カートリッジまたはウェルタイプ形式で実施することができる。エンドポイント色素生成性アッセイまたはエンドポイント蛍光発生性アッセイがカートリッジ１内で実施される時（図７Ａ参照）、サンプルは、たとえば、加熱処理したＬＡＬを収容する導管８の第１領域１４に移動され、そこで、たとえば順方向および逆方向のポンプ動作を繰り返すことによって可溶化される。予め決められたインキュベーション期間後、サンプル−ＬＡＬの混合物は次に、たとえばポンプ動作により色素生成性基質または蛍光発生性基質を収容する導管８の第２領域１６に移動され、そこで、たとえば順方向および逆方向のポンプ動作を繰り返すことによって可溶化される。サンプル−ＬＡＬ−基質の混合物は次に任意に、反応阻害剤を収容する第３の領域に移動される。その後、サンプル−ＬＡＬ−基質の混合物は光学セル６に移動されて、光学検出器によってサンプルの吸光度または透過率の特性などの光学特性を測定する。しかし、カートリッジ内でエンドポイント色素生成性アッセイまたはエンドポイント蛍光発生性アッセイを実施する場合、反応阻害剤を使用して反応を停止する必要はない。このタイプのアッセイでは、最終的な光学的読み取り（エンドポイント読み取り）は予め決められた時間に記録される。
【００６６】
このアッセイは、一定量のβ−グルカンがアッセイに導入された時に、吸光度または透過率などの光学特性を測定することによって校正することができる。試験サンプルにより生成された結果と、公知の量のβ−グルカンによる１つまたは複数の結果とを比較することによって、試験サンプル中のβ−グルカンの存在または量を検出することができる。
【００６７】
議論されたとおり、このタイプのアッセイの形式は、その他の多様な形式、たとえばマイクロタイタープレートのウェル内で使用することができる。このタイプのアッセイでは、対象サンプルは加熱処理したＬＡＬと混合され、予め選択した時間インキュベートされる。次に、色素生成性基質または蛍光発生性基質をこの混合物に添加し、サンプルをさらにある期間インキュベートする。次に、酢酸などの反応阻害剤をサンプルに添加し、吸光度または透過率などのサンプルの光学特性を測定する。次に、この結果を標準値と比較し、対象サンプルのβ−グルカンの存在または量を測定することができる。
【００６８】
（ｉｉ）  エンドポイント濁度測定アッセイ
エンドポイント濁度測定β−グルカンアッセイは、（ｉ）加熱処理したＬＡＬを被分析サンプルとともに可溶化するステップ、（ｉｉ）結果として得られる混合物を約０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度で、予め決められた時間インキュベートするステップ、（ｉｉｉ）任意に、酢酸などの反応阻害剤を添加するステップ、および（ｉｖ）凝固の結果として濁度が増加した場合、従来の凝固計、比濁計または分光光度計を使用して濁度の増加を測定するステップを含むことができる。
【００６９】
エンドポイント濁度測定アッセイは、カートリッジタイプの形式で実施することができる。図７Ａを参照して、サンプルはカートリッジ１に適用され、たとえば、血球（ｈｅｍｏｃｙｔｅ）溶解物を収容する導管８の第１領域１４に移動され、そこで、たとえば順方向および逆方向のポンプ動作を繰り返すことによって可溶化される。サンプル−溶解物の混合物は次に光学セル６に移動され、光学検出器を使用して、濁度などの光学特性を測定する。複数のアッセイ、たとえば２回のアッセイの結果は平均することができる。
【００７０】
このアッセイは、一定量のβ−グルカンがアッセイに導入された時に、たとえば、予め選択した時間に濁度を測定することによって校正することができる。試験サンプルにより生成された結果と、公知の量のβ−グルカンによる１つまたは複数の結果とを比較することによって、試験サンプル中のβ−グルカンの存在または量を測定することができる。
【００７１】
このタイプのアッセイの形式は、その他の形式、たとえばマイクロタイタープレートのウェル内で使用することができる。このタイプのアッセイでは、対象サンプルは加熱処理したＬＡＬと混合され、予め選択した期間インキュベートされる。この反応は次に、抑制剤を添加して停止することができる。次に、サンプルの濁度などの光学特性は、予め選択した時点で測定する。次に、この結果を標準値と比較し、対象サンプルのβ−グルカンの存在または量を測定することができる。
【００７２】
内毒素の検出
溶解物の熱処理は、内毒素およびβ−グルカンに対する溶解物の差異的な感受性を減少させるために実施することもできる。こうして、内毒素およびβ−グルカンに対する溶解物の相対的反応性を滴定して、二重−特異性検出試薬を提供することができる。
【００７３】
内毒素のアッセイは、β−グルカンアッセイに関連して上記で説明したアッセイ形式の何れかを用いて実施できるが、ただし、陽性対照は、リポ多糖類の調製物などの内毒素源である。こうしたアッセイは、β−グルカンに特異的な加熱処理した溶解物の特異性を確認するか、または内毒素に対する十分な感受性を維持している溶解物を用いて、試験サンプル中の内毒素を検出するために使用することができる。
【００７４】
標本の収集および調製の考察
一般に、被試験サンプルを収集、保管、またはさもなければ接触させるために使用される材料および試験試薬は、細菌による汚染がなく、たとえばパイロジェンを含まないべきである。材料は、たとえば２５０℃で３０分間加熱することによってパイロジェンを含まないようにすることができる。脱パイロジェン化された（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）物質をその後の環境汚染から守るため、適切な対策を取らなければならない。
【００７５】
加熱処理したＬＡＬは、流体中、たとえば哺乳動物に対して局所的もしくは全身的に（例えば、非経口的に）投与される流体、またはたとえば血液、リンパ液、尿、血清、血漿、腹水、肺の吸引液などを含む感染に関して試験される体液中の対象サンプル中のβ−グルカンの存在または量を測定するために使用することができる。さらに、このアッセイは、表面に存在するβ−グルカンを検出するために使用することができる。たとえば、対象表面はスワブで拭き取り、スワブは液体中に導入するか、または溶解させる。次に、この液体は、本明細書に記載されているようにアッセイを実施することができる。
【実施例】
【００７６】
実施例１．内毒素およびβ−グルカンとの粗製ＬＡＬの反応性
粗製ＬＡＬは、血液リンパ液をアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）から収集して調製した。結果として得られる血液リンパ液は１５０Ｇで１５分間遠心分離して、アメーバ様細胞を収集した。アメーバ様細胞は、３％塩化ナトリウムですすいで、１５０Ｇで１５分間にわたって再度遠心分離した。３％塩化ナトリウムで２回目の洗浄を行い、１５０Ｇで１５分間遠心分離した後、結果として得られるアメーバ様細胞は、注射用水を添加して浸透圧衝撃により溶解させ、結果として得られる粗製ＬＡＬは、その後使用するまで２〜８℃で保管した。
【００７７】
測定用のＬＡＬは、０．３４Ｍの塩化ナトリウム、０．０４Ｍの硫酸マグネシウム、０．３５％（ｗ／ｖ）のデキストラン、および０．０４ＭのＨＥＰＥＳ衝撃剤（ｐＨ８．０）を２０％（ｖ／ｖ）粗製ＬＡＬに添加して調製した。β−グルカンとしてカルボキシメチル化パキマン（ＣＭ−パキマン、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｌｏｔ９０５０１）および大腸菌Ｏ５５：Ｂ５に由来するリポ多糖類（内毒素）（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂ．  Ｉｎｃ．、ｌｏｔ２０３１５Ａ５）は、洗浄用の水（ＷＦＩ、Ｂａｘｔｅｒ）で溶解させて希釈し、１０倍の希釈系列を入手した。０．００１〜１ｎｇ／ｍＬのＣＭ−パキマン希釈物、および１〜１０００ｎｇ／ｍＬの内毒素希釈物を測定した。
【００７８】
各サンプル０．０５ｍＬをマイクロプレート（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）のウェル内に分配した後、０．０５ｍＬのＬＡＬを各ウェルに添加した。その後、５ｍＭの色素生成性基質（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ）０．０１ｍＬを各ウェルに添加した。マイクロプレートは、マイクロプレートリーダー（ＥＬｘ  ８０８、ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ，Ｉｎｃ．）に取り付けて測定を開始した。測定は、３７℃で実施して４０５ｎｍにおける各ウェルの吸光度を監視し、オンセット時間を決定した。
【００７９】
図１および２は、それぞれＣＭ−パキマン（β−Ｄ−グルカン）および内毒素の用量反応曲線を示す。ＬＡＬの活性化の増加は、動力学的ＬＡＬ法でより短時間の「オンセット時間」に反映されている。予想通り、内毒素またはカルボキシメチル化パキマンの濃度はオンセット時間との良好な相関関係を示した。
【００８０】
実施例２．内毒素およびβ−グルカンカスケードの不活性化に対する温度の影響
実施例１に記載されているように調製した粗製ＬＡＬ各１ｍＬは、脱パイロジェン化した１３ｍｍのガラス管内に分配した。これらのガラス管は、４０℃〜５０℃の温度のアルミニウムブロック加熱器上でインキュベートした。ガラス管は、予定されたインキュベーション時間でサンプル抽出し、冷蔵庫内に保管した。このガラス管は、冷蔵遠心器を使って１７０Ｇで２０分間遠心分離した。ガラス管内の上清は、加熱処理した粗製ＬＡＬとして使用した。
【００８１】
アッセイに使用するＬＡＬは、サンプル抽出した粗製ＬＡＬを使用して、実施例１に記載されているように調製した。大腸菌Ｏ５５：Ｂ５に由来する５０ｎｇ／ｍＬの内毒素の溶液、および１００ｎｇ／ｍＬのカルボキシメチル化カードラン（ＣＭ−カードラン、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（β−Ｄ−グルカン）の溶液をＬＡＬにより測定した。オンセット時間は、実施例１に記載されているように測定した。結果を表１および２にまとめた。
【００８２】
【表１】
2014178336.tif 000002
【００８３】
【表２】
2014178336.tif 000003
表１は、内毒素との粗製ＬＡＬの反応性に対する温度の影響を示す。より高温の場合、内毒素との粗製ＬＡＬの反応性はより早く減少することを示した。表２は、β−グルカンとの粗製ＬＡＬの反応性に対する温度の影響を示す。粗製ＬＡＬのβ−グルカン反応性は、内毒素反応性の場合と比べて、温度が上昇しても比較的より安定的であった。これらのデータによって、内毒素との有意な反応性がないβ−グルカンを測定するためのＬＡＬ試薬は、内毒素反応性およびβ−グルカン反応性の不活性化の速度の違いを利用することにより調製できることを示す。
【００８４】
実施例３．内毒素およびβ−グルカンの用量反応曲線に対する加熱の影響
実施例１に記載されているように調製した各５ｍＬの粗製ＬＡＬを、脱パイロジェン化した１０ｍＬのガラス瓶に分配した。このガラス瓶は、アルミニウムブロック加熱器上で４７℃でインキュベートした。ガラス瓶は、予定されたインキュベーション時間にサンプル抽出し、冷凍庫に保管した。瓶内の粗製ＬＡＬはポリプロピレン遠心分離管に移動させて、冷蔵遠心器を使って遠心分離管を２５００Ｇで２０分間にわたって遠心分離した。遠心分離管中の上清は、加熱処理した粗製ＬＡＬとして使用した。
【００８５】
アッセイに使用するＬＡＬは、サンプル抽出した粗製ＬＡＬを使用して、実施例１に記載されているように調製した。大腸菌Ｏ５５：Ｂ５に由来する１０ｎｇ／ｍＬ〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの内毒素の希釈系列、および１ｐｇ／ｍＬ〜１０００ｐｇ／ｍＬのＣＭ−パキマンの希釈系列は、ＬＡＬを使用して測定した。測定手順は、実施例１に記載した手順と同じであった。この結果を図３および４にまとめた。
【００８６】
図３および４は、それぞれ内毒素およびβ−グルカン（ＣＭ−パキマン）の用量反応曲線に対する加熱の影響を示す。様々なインキュベーション時間（３０分〜７５分）で用量反応曲線の著しい差異はなかった。一方、内毒素の用量反応は、４７℃で加熱することによって著しく低下した。
【００８７】
実施例４．加熱処理したＬＡＬによるβ−グルカンの測定に対する内毒素標準品の影響
実施例１に記載したように調製した各３ｍＬの粗製ＬＡＬを、１０個の脱パイロジェン化した１３ｍｍガラス管内に分配した。ガラス管は、アルミニウムブロック加熱器上で、４７℃で１５分間インキュベートした。加熱した粗製ＬＡＬはポリプロピレン遠心分離管内に収集し、冷蔵遠心器を使って遠心分離管を１７０Ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離管中の上清は、加熱処理した粗製ＬＡＬとして使用した。
【００８８】
アッセイに使用されるＬＡＬは、加熱した粗製ＬＡＬを使用して、実施例１に記載したように調製した。１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＣＭ−カードランの希釈系列は、米国内毒素標準品（ＲＳＥ）２００ＥＵ／ｍＬを使用するか、使用せずに調製した。この希釈物は、ＬＡＬにより測定した。測定の手順は、実施例１に記載した手順と同じであった。結果を図５にまとめた。
【００８９】
図５は、β−グルカン標準曲線に対するＲＳＥの影響を示す。標準曲線は、２００ＥＵ／ｍＬのＲＳＥを添加することによって影響されなかった。一般的に測定した内毒素レベルが５０ＥＵ／ｍＬ未満であることを考慮すると、通常の内毒素汚染は、β−グルカンレベルを正確に測定する加熱処理したＬＡＬの能力を妨げない。
【００９０】
実施例５．加熱処理したＬＡＬによるβ−グルカンの測定に対する大腸菌Ｏ５５：Ｂ５由来の内毒素の影響
実施例１に記載したように調製した各３ｍＬの粗製ＬＡＬを、１０個の脱パイロジェン化した１３ｍｍガラス管内に分配した。ガラス管は、アルミニウムブロック加熱器上で、４７℃で２０分間インキュベートした。加熱した粗製ＬＡＬはポリプロピレン遠心分離管内に収集し、冷蔵遠心器を使って遠心分離管を１７０Ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離管中の上清は、加熱処理した粗製ＬＡＬとして使用した。
【００９１】
アッセイに使用するＬＡＬは、加熱した粗製ＬＡＬを使用して、実施例１に記載したように調製した。１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＣＭ−カードランの希釈系列は、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５に由来する５００ｎｇ／ｍＬの内毒素を使用するか、使用せずに調製した。この希釈物は、ＬＡＬにより測定した。この測定手順は、実施例１に記載した手順と同じであった。結果は、図６にまとめた。
【００９２】
図６は、β−グルカンの標準曲線に対するＲＳＥの影響を示す。この標準曲線は、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５に由来する１００ｎｇ／ｍＬの内毒素を添加することによって影響されなかった。大腸菌Ｏ５５：Ｂ５に由来する５００ｎｇ／ｍＬの内毒素が約５０００ＥＵ／ｍＬであることを考慮すると、通常レベルの内毒素汚染は、β−グルカンのレベルを正確に測定する加熱処理したＬＡＬの能力を妨げないであろう。
【００９３】
実施例６．加熱処理したＬＡＬによる動力学的濁度測定アッセイ
実施例１に記載したように調製した各５ｍＬの粗製ＬＡＬを、脱パイロジェン化した１０ｍＬのガラス瓶に分配した。このガラス瓶は、アルミニウムブロック加熱器上で、４７℃で６０分間インキュベートした。瓶内の粗製ＬＡＬを、ポリプロピレン遠心分離管に移動させて、遠心分離管は、冷蔵遠心器を使って２５００Ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離管中の上清は、加熱処理した粗製ＬＡＬとして使用した。
【００９４】
測定用のＬＡＬは、加熱した粗製ＬＡＬを使用して、実施例１に記載したように調製した。大腸菌Ｏ５５：Ｂ５に由来する１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの内毒素の希釈系列、および１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＣＭ−パキマンの希釈系列は、ＬＡＬを使って測定した。この測定手順は、実施例１に記載した手順と同じであった。
【００９５】
表３は、動力学的濁度測定アッセイ（ＫＴＡ）を使用することにより、内毒素およびβ−グルカンとの加熱処理したＬＡＬの反応性を示す。β−グルカンは、ＫＴＡにより検出したが、内毒素は、１０００ｎｇ／ｍＬでも何ら反応性を示さず、再度β−グルカンに対するアッセイの特異性を確認した。
【００９６】
【表３】
2014178336.tif 000004
実施例７．患者におけるβ−グルカン検出
血液培養物が陽性である患者に由来する血清サンプルを、注射用蒸留水で１０倍に希釈し、希釈した血清サンプルは８０℃で１０分間インキュベートした。前処理したサンプルは、動力学的色素生成法によって、凍結乾燥した加熱処理したＬＡＬにより測定した。凍結乾燥した加熱処理したＬＡＬは、実施例５に記載されているＬＡＬから調製した。ＣＭ−パキマンを、β−グルカン標準として使用した。健康な被験体に由来する血清サンプルも、同じ方法で前処理して測定した。
【００９７】
表４に示すように、患者に由来する血清サンプルのβ−グルカン値は１００ｐｇ／ｍＬを超えており、健康な被験体に由来するサンプルは３４ｐｇ／ｍＬ未満だった。患者の血液培養物の結果は、酵母（Ｃａｎｄｉｄａ）および真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）を示し、これらの患者は真菌血症と証明された。これらの結果を考慮すると、加熱処理したＬＡＬによるβ−グルカンアッセイは、深在性真菌症の診断に有用である。
【００９８】
【表４】
2014178336.tif 000005
実施例８．温度および加熱時間の関数としての内毒素およびβ−グルカン反応性の減少
実施例２に記載されている実験の分析で、加熱温度の関数としての内毒素およびβ−グルカン反応性の不活性化の速度が、アレニウスプロットを使用して表すことができる指数関数的関係を有することが明らかになった。表１および２に示すオンセット時間対加熱時間の対数を比較すると、表５および６に示す回帰パラメータが得られた。傾きおよび温度を使用して、内毒素反応性およびβ−グルカン反応性に関するアレニウスプロットは、傾きの対数と温度との相関関係を実証した。図８に示すように、試験した各々の温度について、表５（「ｌｎ（Ｅｔｘ）」）または表６（「ｌｎ（ＢＧ）」）の傾きの自然対数を１０００／絶対温度（ケルビン）でプロットして、内毒素反応性の不活性化の速度およびβ−グルカン反応性の不活性化の速度の両方の相関関係が得られた。
【００９９】
【表５】
2014178336.tif 000006
【０１００】
【表６】
2014178336.tif 000007
不活性化の速度および加熱時間および温度の間に観察された関係に基づいて、ある程度の不活性化を達成するのに必要な加熱時間を実施例２で試験した溶解物について計算した。たとえば、実施例２の溶解物の内毒素反応性の１，０００分の１の減少は、以下の加熱時間に対応する。
ｔＡ１＝０．８２５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）（時間）。
【０１０１】
内毒素反応性の１，０００，０００分の１の減少は、２倍の長さの加熱時間に対応する。
ｔＡ２＝１．６５＊２．７１８（５６３４０／（Τ＋２７３））／（９．５４＊１０７６）（時間）。
【０１０２】
同様に、実施例２の溶解物のβ−グルカンの１０分の１の減少は、以下の加熱時間後に得られる。
ｔＢ１＝１．０５９＊２．７１８（７６５１０／（Τ＋２７３））／（２．２０＊１０１０３）（時間）。
【０１０３】
内毒素反応性は、穏やかな加熱に曝露された際、β−グルカン反応性より急速に低下するため、これは、内毒素反応性が適度または実質的に減少した溶解物の調製が可能になる。たとえば、表７は、多くとも１，０００分の１である内毒素反応性の減少、および／または約１０分の１以上であるβ−グルカン反応性の減少（太字で記載）を可能にするために提案される様々な加熱時間および温度範囲を示す。
【０１０４】
【表７】
2014178336.tif 000008
均等物
本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形式で具現することができる。したがって、上記の実施態様は、本明細書に記載されている発明を制限するのではなく、あらゆる点で具体的に説明するものであると考えられる。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく、添付の請求の範囲により示され、請求の範囲に等価な意味および範囲内のすべての変更は本明細書に包含することを意図する。
【０１０５】
基礎出願の援用
本明細書で引用するすべての文献および特許文献は、個々の文献または特許文献の全体の内容が本明細に包含されたのと同様に、引用することにより全体的にあらゆる目的で本願に援用する。
【図１】
2014178336.tif 000009
【図２】
2014178336.tif 000010
【図３】
2014178336.tif 000011
【図４】
2014178336.tif 000012
【図５】
2014178336.tif 000013
【図６】
2014178336.tif 000014
【図７】
2014178336.tif 000015
【図８】
2014178336.tif 000016
【外国語明細書】
2014178336000001.pdf