(57)【要約】      （修正有）【課題】稲由来の優れた抗菌活性及びエンドトキシンによる炎症抑制活性を有し、長期間処方しても安全性に優れる生体防御組成物及びその用途として口腔用抗菌剤等、並びにペプチドの提供。【解決手段】稲種子に存在する、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のタンパク質及びペプチドのいずれかを有効成分として含有する生体防御用組成物などである。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｂ）特定のアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、生体防御作用を有するタンパク質（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の一部からなり、生体防御作用を有するペプチド【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のタンパク質及びペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生体防御用組成物。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、生体防御作用を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の一部からなり、生体防御作用を有するペプチド
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１７５位〜第１９２位、及び第３５６位〜第３７２位から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチド、又は前記ペプチドにおいて１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、生体防御作用を有する請求項１に記載の生体防御用組成物。
【請求項３】
生体防御作用が、有効成分の抗菌活性に基づく請求項１から２のいずれかに記載の生体防御用組成物。
【請求項４】
抗菌活性が、有効成分と、リポ多糖及びＬｉｐｉｄ  Ａの少なくともいずれかとの結合に基づく請求項３に記載の生体防御用組成物。
【請求項５】
生体防御作用が、有効成分の炎症抑制活性に基づく請求項１から２のいずれかに記載の生体防御用組成物。
【請求項６】
炎症抑制活性が、エンドトキシン中和活性及び炎症性サイトカイン産生抑制活性の少なくともいずれかに基づく請求項５に記載の生体防御用組成物。
【請求項７】
エンドトキシン中和活性及び炎症性サイトカイン産生抑制活性の少なくともいずれかが、有効成分と、リポ多糖及びＬｉｐｉｄ  Ａの少なくともいずれかとの結合に基づく請求項６に記載の生体防御用組成物。
【請求項８】
生体防御作用が、有効成分の創傷治癒活性に基づく請求項１から２のいずれかに記載の生体防御用組成物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の生体防御用組成物を含有してなることを特徴とする飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料。
【請求項１０】
以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかのペプチド。
（ａ）配列番号２及び３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）前記（ａ）のペプチドに対して１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体防御作用を有するペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体防御用組成物及びこれを含有する飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料、並びにペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
人は、加齢とともに発音、咀嚼、嚥下、唾液分泌などの口腔機能が低下する。なかでも唾液分泌が低下すると、歯周病や口内炎、齲蝕（虫歯）、口臭といった口腔疾患が増大する。また、皮膚の疾患や傷害によって皮膚のバリア機能や保湿機能が低下する。更に、乳幼児や高齢者の免疫機能は低いため、病原菌に感染しやすい。これらの機能の低下は、国民の健康の維持と増進にとって重大な課題である。
【０００３】
これまで、口腔ケア用品等に添加される抗菌成分又は殺菌成分としては、エタノール等の有機溶剤や抗生物質などが提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、前記有機溶剤を用いた口腔ケア用品は、体質的に受け入れられないという問題、乳幼児には使用できないという問題があり、前記抗生物質を用いた口腔ケア用品では、長期間使用により耐性菌が出現するという問題がある。
【０００４】
一方、動物、植物、昆虫、微生物等の様々な生物には、外界からの病原微生物の侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っており、多糖分解酵素や溶菌酵素などのタンパク質やアミノ酸が約１０個〜約５０個程度からなる抗菌ペプチドを生物自らが産生している。これらの抗菌成分は、前記抗生物質と比較して広範囲な抗菌活性を有し、耐性菌を生じさせにくいという特性を有することから、口腔用抗菌剤としての利用が期待されている。
【０００５】
生物由来の抗菌剤として、例えば、イネ由来の抗菌タンパク質であるオリザシスタチンが知られている。しかしながら、オリザシスタチンは、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ等）のジンジパインを阻害することが知られているものの、その菌体に対して直接抗菌活性を示すものではない。
イネゲノム中にはディフェンシンなど既知の抗菌タンパク質のホモログが存在するが、イネの生体防御に対する寄与は不明である。
【０００６】
本発明者らは、イネ種子に由来し、歯周病の治療や予防に有効な、歯周病菌のプロテアーゼに対する阻害活性を有するペプチドを報告している（例えば、特許文献２参照）。
【０００７】
しかしながら、未だ、生物由来であって、菌体に対して強い抗菌作用を有し、且つ、エンドトキシンによる炎症作用を抑制する生体防御用組成物の開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−８４４７１号公報
【特許文献２】特許第４９８２９０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた抗菌活性及びエンドトキシンによる炎症抑制活性を有し、長期間処方しても安全性に優れる生体防御組成物及びその用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、優れた抗菌活性及びエンドトキシンによる炎症抑制活性を有し、長期間処方しても安全性に優れるペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  以下の（Ａ）〜（Ｃ）のタンパク質及びペプチドのいずれかを有効成分として含有することを特徴とする生体防御用組成物である。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、生体防御作用を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の一部からなり、生体防御作用を有するペプチド
＜２＞  配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１７５位〜第１９２位、及び第３５６位〜第３７２位から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチド、又は前記ペプチドにおいて１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、生体防御作用を有する前記＜１＞に記載の生体防御用組成物である。
＜３＞  生体防御作用が、有効成分の抗菌活性に基づく前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の生体防御用組成物である。
＜４＞  抗菌活性が、有効成分と、リポ多糖及びＬｉｐｉｄ  Ａ（以下、「リピドＡ」と称することがある）の少なくともいずれかとの結合に基づく前記＜３＞に記載の生体防御用組成物である。
＜５＞  生体防御作用が、有効成分の炎症抑制活性に基づく前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の生体防御用組成物である。
＜６＞  炎症抑制活性が、エンドトキシン中和活性及び炎症性サイトカイン産生抑制活性の少なくともいずれかに基づく前記＜５＞に記載の生体防御用組成物である。
＜７＞  エンドトキシン中和活性及び炎症性サイトカイン産生抑制活性の少なくともいずれかが、有効成分と、リポ多糖及びＬｉｐｉｄ  Ａの少なくともいずれかとの結合に基づく前記＜６＞に記載の生体防御用組成物である。
＜８＞  生体防御作用が、有効成分の創傷治癒活性に基づく前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の生体防御用組成物である。
＜９＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の生体防御用組成物を含有してなることを特徴とする飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料である。
＜１０＞  以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかのペプチドである。
（ａ）配列番号２及び３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）前記（ａ）のペプチドに対して１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体防御作用を有するペプチド
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決することができ、優れた抗菌活性及びエンドトキシンによる炎症抑制活性を有し、長期間処方しても安全性に優れる生体防御組成物、及びその用途を提供することができる。
また、本発明によれば、従来における前記諸問題を解決することができ、優れた抗菌活性及びエンドトキシンによる炎症抑制活性を有し、長期間処方しても安全性に優れるペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの、Ｓｍｏｏｔｈ型のリポ多糖で刺激したマクロファージ細胞による一酸化窒素産生に対する抑制効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの、Ｒｃ型のリポ多糖で刺激したマクロファージ細胞による一酸化窒素産生に対する抑制効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの、Ｌｉｐｉｄ  Ａで刺激したマクロファージ細胞による一酸化窒素産生に対する抑制効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの、マクロファージ細胞に対する細胞毒性評価を示すグラフである。
【図５】図５は、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの、ヒツジ赤血球に対する溶血活性評価を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドと、リポ多糖との親和性を解析した結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドと、Ｌｉｐｉｄ  Ａとの親和性を解析した結果を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例７における管腔構造をした細胞の長さを測定した結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例７におけるコントロールの場合の顕微鏡撮影結果を示す図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、実施例７におけるＬＬ−３７ペプチドを用いた場合の顕微鏡撮影結果を示す図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、実施例７におけるＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを用いた場合の顕微鏡撮影結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（生体防御用組成物）
本発明の生体防御用組成物は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のタンパク質及びペプチドのいずれかを有効成分として含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、生体防御作用を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の一部からなり、生体防御作用を有するペプチド
【００１４】
＜タンパク質、ペプチド＞
前記タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されず、生体防御作用を有する限り配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
また、生体防御作用を有する限りこれらのタンパク質の一部からなるペプチドであってもよい。
【００１５】
2014237626.tif 000002
【００１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる前記タンパク質は、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）種子に存在し、抗菌活性を有するタンパク質として本発明者らが見出したタンパク質であり、ＩＤ：Ｏｓ０２ｇ０７６５６００としてＲｉｃｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲＡＰ−ＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）に登録されている。
【００１７】
「１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加された」とは、部位特異的変異法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、更に好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質から単離精製したものであってもよい。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、本技術分野において周知である。更に、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。好ましい変異体は、保存性又は非保存性アミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有する。より好ましくは、保存性置換、欠失、又は付加であり、特に好ましくは、保存性置換である。
【００１８】
本発明の生体防御用組成物の有効成分が前記（Ａ）又は前記（Ｂ）のタンパク質の一部からなる前記（Ｃ）のペプチドである場合、前記ペプチドのサイズは特に限定されないが、総アミノ酸残基数が１００残基以下であることが好ましく、８０残基以下がより好ましく、５０残基以下が更に好ましく、２０残基以下が特に好ましい。前記ペプチドのサイズが小さいほど取り扱いが簡便であり、製造効率が向上し、抗原性等の副作用が軽減される点で有利である。
【００１９】
前記（ｃ）のペプチドとしては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１７５位〜第１９２位のアミノ酸配列（以下、「ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）」と称することがある。）を含むペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３５６位〜第３７２位のアミノ酸配列（以下、「ＡｍｙＩ−１（３５６−３７２）」と称することがある。）を含むペプチド、が挙げられる。また、感染防御作用を有する限り、当該ペプチドにおいて１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。具体的には、例えば以下の配列番号２（ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２））、配列番号３（前記ＡｍｙＩ−１（３５６−３７２））のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００２０】
2014237626.tif 000003
【００２１】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記生体防御用組成物中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２２】
前記生体防御用組成物の用途としては、特に制限はなく、各種用途が挙げられるが、例えば、抗菌剤、炎症抑制剤、創傷治癒剤、エンドトキシン中和剤、炎症性サイトカイン産生抑制剤、一酸化窒素産生抑制剤、リポ多糖及びＬｉｐｉｄ  Ａの少なくともいずれかとの結合剤などが好適に挙げられる。
【００２３】
（飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料）
本発明の飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料は、前記生体防御用組成物を含有してなる。
【００２４】
前記飲食品としては、特に制限はなく、例えば、各種の清涼飲料水、果汁飲料、和洋菓子、乳製品その他の畜産加工品、果実加工品、野菜加工品、穀物の加工品、水産加工品、調味料、ビタミンなどを主成分としたいわゆる各種の健康食品など数多くの飲食品が挙げられる。
前記医薬品、医薬部外品としては、特に制限はないが、歯周病治療剤、口内炎治療剤、薬用トローチ、薬用のど飴、洗口液、練歯磨き、などが好適に挙げられる。
前記化粧品又は飼料としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。なお、以下の実施例において特に説明がない場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ〔３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ〕，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ.Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ〔Ｅｄ．〕，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、該方法を修飾、改変等した方法を用いて、実験を実施することができる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明がない場合、該方法を用いることができる。また、当業者であれば本明細書の記載及び前記した標準的なプロトコール集などの記載から容易に本発明を再現することができる。
【００２６】
（実施例１）
Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドによる抗菌スペクトルの検討
（１）ペプチド
選択したタンパク質、前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００のアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、タンパク質表面にあり、α−へリックス構造を取り、疎水性残基と塩基性残基をともに含んでいる部分を検索した。
その結果、表１に記載の２種類のペプチドを合成して、抗菌スペクトルを検討した。各ペプチドは、ペプチド合成装置（ＰＳＳＭ−８、株式会社島津製作所製）を用いて合成し、カラム（Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８、インタクト株式会社製）を装着したＨＰＬＣ（１０Ａ  ｓｙｓｔｅｍ、株式会社島津製作所製）にて以下の精製条件で精製した。
＜精製条件＞
・溶媒Ａ：０．１質量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
・溶媒Ｂ：０．１質量％トリフルオロ酢酸を含む水
・流速：１．０ｍＬ／分間
・波長：２２０ｎｍ
・インジェクション容量：２０μＬ
・グラジエント条件：０．０１分間（溶媒Ａ  １０体積％、溶媒Ｂ  ９０体積％）→２５．０分間（溶媒Ａ  ３５体積％、溶媒Ｂ  ６５体積％）→２５．１分間（溶媒Ａ  １００体積％、溶媒Ｂ  ０体積％）→３０分間（停止）
【００２７】
【表１】
2014237626.tif 000004
【００２８】
（２）使用菌株
被験菌として、表２に示した疾病に関連する微生物を用いた。
【００２９】
【表２】
2014237626.tif 000005
【００３０】
（３）抗菌試験
濃度を変えて表１に記載の各ペプチドを培地に添加し、上記被験菌を培養した。
Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３２７７は、変法ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン５．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン５．０ｇ、消化血清末１０．０ｇ、酵母エキス末２．５ｇ、肉エキス末２．２ｇ、肝臓エキス末１．２ｇ、ブドウ糖０．５ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−トリプトファン０．２ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、Ｌ−アルギニン１．０ｇ、ビタミンＫ１０．００５ｇ、ヘミン０．０１ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、ｐＨ７．３）を用いて絶対嫌気条件下、３７℃で４８時間静置培養した。
Ｅ． ｃｏｌｉ  Ｋ−１２は、ＬＢ培地（１Ｌ中、トリプトン１０．０ｇ、酵母エキス５．０ｇ、塩化ナトリウム１０．０ｇ、ｐＨ７．０）又はＴＳＢ培地（１Ｌ中、カゼイン製ペプトン１７．０ｇ、ダイズ製ペプトン３．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、ブドウ糖２．５ｇ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ、ｐＨ７．３）を用いて通性嫌気条件下、３７℃で４時間静置培養した。
Ｅ． ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３８３４は、前記ＴＳＢ培地を用いて、絶対嫌気条件下、３７℃で２０時間静置培養した。
Ａ． ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ３１０ａは、前記ＴＳＢ培地を用いて、絶対嫌気条件下、３７℃で１５時間静置培養した。
Ｆ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６は、前記ＴＳＢ培地を用いて、絶対嫌気条件下、３７℃で５時間静置培養した。
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ  １２７３２は、前記ＴＳＢ培地を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で１０時間静置培養した。
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ  ＪＣＭ  ５７０５は、ＢＨＩ培地（１Ｌ中、豚脳エキス末４．０ｇ、豚ハートエキス末４．０ｇ、ペプトン１７．５ｇ、ブドウ糖２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．５ｇ、ｐＨ７．２）を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で６時間静置培養した。
Ｐ． ａｃｎｅｓ  ＪＣＭ  ６４７３は、ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１）を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で２４時間静置培養した。
Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ  １３２７５は、ＹＭ培地（１Ｌ中、グルコース１０．０ｇ、ペプトン５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、麦芽エキス１．０ｇ、ｐＨ６．２）を用いて、好気条件下、３０℃で１０時間静置培養した。
Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ  ＮＢＲＣ  １３８５の培地は、前記ＹＭ培地を用いて、通性嫌気条件下、２５℃で２４時間静置培養した。
【００３１】
上記被験菌に対する抗菌活性試験は、以下の手順で行った。
上記被験菌の培養に用いたのと同じ培地に、８０μＬの各被験菌の培養液を播種した後、所定の温度に設定したインキュベーターに入れて所定の時間培養した。その後、新たな培地に植え継いで、更に所定の時間培養した。得られた前培養液を段階希釈することでＯＤ６５０＝５．０×１０−５の菌液を調製した。
次に、リザーバーを用意して、各レーンに３００μＬの１．３３倍濃度の培地、１００μＬの各ペプチド溶液（ペプチドの濃度を様々に振った溶液）、１００μＬの前記菌液を添加してよく混合した。
コントロールとブランクには、ペプチド溶液の代わりに同量の滅菌水を添加し、更にブランクには菌液の代わりに１倍濃度の各培地を同量添加した。ペプチド溶液を添加したもの、コントロール及びブランクのそれぞれを９６ウェル培養プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のウェルに１００μＬずつ分注し、前記各被験菌の培養条件と同じ条件で培養を行った。
【００３２】
−抗菌活性の評価方法−
各ペプチドの抗菌活性は、生菌に由来するＡＴＰを定量することによって評価した。
生菌に由来するＡＴＰの定量は、ＢａｃＴｉｔｅｒ・Ｇｌｏ（登録商標）  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光法により行った。以下のように微生物からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰ量に応じた発光強度から微生物量を測定した。
具体的には、まず、培養プレートの各ウェルに分注した１００μＬ被験菌培養液に対して１０μＬのルシフェールＡＴＰ消去試薬（キッコーマン株式会社製）を添加し、１０分間撹拌することによって生菌体外に存在するＡＴＰを分解消去させてサンプルとした。
次に、あらかじめ９６穴プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）の各ウェルに分注した５０μＬのＡＴＰ発光試薬に対して、前記サンプルを５０μＬ添加した。各ウェルの生菌に由来するＡＴＰ発光強度（発光波長５６０ｎｍ）を、マイクロプレートリーダー１４２０（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ａｒｖｏ（登録商標）ＭＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用い、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として測定した。１サンプルについて３回測定を行い、測定は、各菌の対数増殖初期において行った。抗菌活性は、抗菌成分を含まないコントロールのＲＬＵを１００％とし、５０％に低下させるペプチド濃度（５０％増殖阻害濃度：ＩＣ５０値）を用いて表した。結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
2014237626.tif 000006
表３において、「−」は抗菌試験を実施していないことを表す。
【００３４】
−結果−
表３から明らかなように、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）及び前記ＡｍｙＩ−１（３５６−３７２）は、いずれもＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３２７７に対して抗菌活性を示した。
また、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）は、試験したグラム陰性菌のＥ． ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３８３４、Ｅ． ｃｏｌｉ  Ｋ−１２、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ  １３２７５、Ａ． ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ３１０ａ、及びＦ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６、グラム陽性菌のＳ． ｍｕｔａｎｓ  ＪＣＭ  ５７０５、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ  １２７３２、及びＰ． ａｃｎｅｓ  ＪＣＭ  ６４７３、並びに真菌のＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ  ＮＢＲＣ  １３８５に対して、すべて抗菌活性を示した。
【００３５】
前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）は、特に代表的な歯周病であるＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３２７７、Ａ． ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ３１０ａ、及びＦ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６に対して強い抗菌活性を示した。また、ニキビ原因菌であるＰ． ａｃｎｅｓ  ＪＣＭ  ６４７３に対しても強い抗菌活性を示した。Ｅ． ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３８３４及びＥ． ｃｏｌｉ  Ｋ−１２に対する抗菌活性は、他の病原性微生物に対する活性に比べて、低かった。
【００３６】
（実施例２）
前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドのエンドトキシン中和活性
「エンドスペシーＥＳ−５０Ｍセット」（生化学工業株式会社製）及び「エンドトキシン標準品ＣＳＥ−Ｌセット」（生化学工業株式会社製）を用いてエンドトキシン中和活性を評価した。
ペプチドとして、表１に記載の前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）を用いた。９６ウェルプレート（＃３５９５  マルチプルウェルプレート（平底）、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルにエンドトキシン標準品（０．１０ＥＵ／ｍＬ）２５μＬ及びペプチド溶液（最終濃度１μＭ及び１０μＭ）を加えて、３７℃にて３０分間又は３５分間振盪しながらインキュベーションした。次に、５０μＬの前記セットに含まれていたＬＡＬ試薬を各ウェルに添加し、３７℃で１０分間振盪しながらインキュベーションした。その後、マイクロプレートリーダー（２０３０  Ａｒｖｏ  Ｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。ペプチド溶液の代わりに蒸留水（エンドトキシンフリー）を添加したものをコントロールとし、コントロール（０μＭ）の吸光度を１００％とした時の相対値をエンドトキシン中和活性とした。結果を表４に示す。
【００３７】
【表４】
2014237626.tif 000007
【００３８】
表４から明らかなように、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは濃度依存的にエンドトキシンを中和することが示された。この中和活性は、医療用の抗菌薬であるポリミキシンＢ（Ｐ１００４−１、Ｓｉｇｍａ社製）と同等の活性であった。
【００３９】
（実施例３）
前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドの一酸化窒素産生抑制作用
マウスマクロファージＲＡＷ２６４細胞（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ）を用いて、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）を添加したときの、エンドトキシン刺激による傷害性の一酸化窒素（ＮＯ）の産生量への影響を検討した。本発明では、エンドトキシンとして、Ｓｍｏｏｔｈ型のリポ多糖であるＥ． ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５のＬＰＳ（＃２０３、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、Ｒｃ型のリポ多糖であるＥ． ｃｏｌｉ  Ｊ５のＬＰＳ（０１３０、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｔｅｃｈ社製）、及びＬｉｐｉｄ  ＡとしてＥ． ｃｏｌｉ  Ｒ５１５のＬｉｐｉｄ  Ａ（ＡＬＸ−５８１−２００、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ用いて試験した。
【００４０】
１０質量％ＦＢＳ、１０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン及び１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１５１４０−１４８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含んだＭＥＭ培地（１２４３０−０５４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて前記マウスマクロファージＲＡＷ２６４細胞を培養した後、Ｎｕｎｃ細胞培養フラスコ（１７８９０５、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）内の上清液を除去し、新しいＭＥＭ培地を添加し、Ｃｅｌｌ  ｓｃｒｅａｐｅｒ（＃３０１０、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）で付着した細胞を剥がし、遠心チューブに移して、１，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離を行った。次に上清液を吸引除去し、１０質量％ＦＢＳを含んだフェノールレッド不含のＤＭＥＭ培地（１２４３０−０５４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＡＷ２６４細胞を懸濁した。細胞数の測定を行い、細胞濃度を２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した細胞懸濁液とした。９６穴プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に前記細胞懸濁液を１００μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（ＭＣＯ−１８ＡＩＣ、三洋電機株式会社製）内で一晩培養した。その後、ＤＭＥＭ培地を吸引除去し、各ウェルに８０μＬのＤＭＥＭ培地と、１０μＬのリポ多糖（１μｇ／ｍＬ）、Ｌｉｐｉｄ  Ａ（１μｇ／ｍＬ）、又は大塚蒸留水（１Ｆ８０Ｎ、大塚製薬株式会社製）と、１０μＬのＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチド又は大塚蒸留水と、をそれぞれ添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。あらかじめ２０μＬの生理的食塩を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を添加した新しいプレートに、８０μＬの細胞培養液を添加した。各ウェルに、１００μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬（ＮＯ２／ＮＯ３Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−Ｃ  ＩＩ（Ｇｒｉｅｓｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ）、株式会社同仁化学研究所製）を添加した。反応１５分後に、マイクロプレートリーダー（２０３０  Ａｒｖｏ  Ｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて５６０ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｇｒｉｅｓｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔに附属のＮａＮＯ２標準溶液を用いて作成した検量線と比較して、ＮＯの産生量を二酸化窒素（ＮＯ２）として定量した。一酸化窒素の産生量は、リポ多糖又はＬｉｐｉｄ  Ａのみを添加したときの産生量を１００％とした相対値を用いて表した。
【００４１】
Ｓｍｏｏｔｈ型のリポ多糖、Ｒｃ型のリポ多糖、及びＬｉｐｉｄ  Ａを用いて、ＲＡＷ２６４細胞をそれぞれ刺激した結果を、図１〜図３に示した。いずれの場合もコントロールと比較してＮＯ産生量が大幅に増加した。前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを添加することによって、添加した前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの濃度に依存してＮＯ産生量は減少した。これらの値は、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを添加しないときの値と比較して、統計的に有意な差があり、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは抗炎症作用を有することがわかった。Ｌｉｐｉｄ  Ａで刺激した場合のＮＯ産生量を減少させるには、Ｓｍｏｏｔｈ型のリポ多糖を用いて刺激した場合に比べて、より高濃度の前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを添加する必要があった。これは、Ｌｉｐｉｄ  Ａがレセプター結合作用の中心部位であり、同じ濃度で添加した場合には、Ｓｍｏｏｔｈ型のリポ多糖に比べてエンドトキシン作用が強いためであると考えられた。更に、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドのみを添加した場合、ＮＯ産生量は増加しなかったことから、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチド自体はＮＯ産生に影響しないことが分かった。図３に示すように、Ｌｉｐｉｄ  Ａで刺激したときのＮＯ産生量を、エンドトキシンの抑制作用が強いポリミキシンＢ（Ｐ１００４−１、Ｓｉｇｍａ社製）を添加した場合と比較した結果、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは１／４〜１／５の抑制作用があった。
【００４２】
（実施例４）
前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドの細胞毒性の検討
マウスマクロファージＲＡＷ２６４細胞（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ）を用いて、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを添加したときの生存率を測定することによって、細胞毒性を検討した。
９６穴プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて１０質量％ＦＢＳを含んだフェノールレッド不含のＤＭＥＭ培地（１２４３０−０５４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した後、培養液だけを吸引除去した。
ＤＭＥＭ培地と、水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を発色基質として含むＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（３４３−０７６２３、株式会社同仁化学研究所製）を１０：１で混合した混合液を作製した。前記混合液を、前記培養液を吸引除去した各ウェルに１００μＬずつ添加した後、ＣＯ２インキュベーター（ＭＣＯ−１８ＡＩＣ、三洋電機株式会社製）内で５分間反応させた。マイクロプレートリーダー（２０３０  Ａｒｖｏ  Ｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを添加していないコントロールウェルの値と比較することによって、細胞生存率を測定し、細胞毒性を評価した。ＲＡＷ２６４細胞に対する毒性を評価した結果を図４に示す。
一酸化窒素産生抑制の実験において用いた最大の濃度１，０００μＭよりも高い１，２００μＭを添加しても、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは、ＲＡＷ２６４細胞に対して毒性を示さなかった。
【００４３】
（実施例５）
前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドの溶血活性の検討
緬羊脱繊維無菌血液（０１０２−１、株式会社日本バイオテスト研究所製、以下「赤血球」とも称する）を用いて、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの溶血活性を試験した。
マイクロチューブ中にて、４０μＬの赤血球を９６０μＬの生理的食塩を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ：  ｐＨ  ７．２）に４体積％になるように懸濁して懸濁液とした。前記懸濁液を５，０００ｒｐｍにて、５分間遠心分離した後、上清液を除き、新たに９６０μＬのＰＢＳを加えて赤血球を再懸濁した。この操作を３回繰り返した後、得られた赤血球をサンプルとして用いた。任意の濃度に希釈された前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチド溶液、又は０．１質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（５９５−１３１３５、和光純薬工業株式会社製）を９６穴プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに５０μＬずつ分注した。次に、４体積％の赤血球懸濁液を各ウェルに５０μＬずつ分注した後、３７℃にて１時間インキュベーションした。その後、４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。遠心分離によって得られた５０μＬの上清液を、あらかじめ５０μＬのＰＢＳ又は水を分注しておいたウェルに添加した。マイクロプレートリーダー（２０３０  ＡｒｖｏＴＭ  Ｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光を測定した。前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを添加しないときの吸光度を０％、及び前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの代わりに０．１質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度を１００％として、次の式を用いて溶血活性を評価した。
溶血活性（％）＝（Ａｐｅｐｔｉｄｅ−Ａ０）×１００／（ＡＴｒｉｔｏｎＸ−１００−Ａ０）
ここで、Ａ０は無添加のときの吸光度、ＡｐｅｐｔｉｄｅはＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを添加したときの吸光度、及びＡＴｒｉｔｏｎＸ−１００は０．１質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度をそれぞれ示す。
溶血活性を測定した結果を図５に示す。
【００４４】
強い抗菌活性を有するが、同時に強い細胞毒性や溶血活性を持つハチ毒中の抗菌ペプチドであるＭｅｌｉｔｔｉｎ（５１１−９７５３１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社製）は、１００μＭにおいても非常に高い溶血活性を示した。一方、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは、５００μＭの濃度までは溶血活性を示さなかったが、１，０００μＭの濃度で添加したときには、約２０％の弱い溶血活性を示した。したがって、前記ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは、抗菌活性や抗炎症活性を示す濃度範囲において、溶血活性を示さないことがわかった。
【００４５】
（実施例６）
前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドとエンドトキシンとの親和性解析
表面プラズモン共鳴を利用した生体分子間相互作用解析装置  Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ：  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドであるＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドとリポ多糖（Ｅ． ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５；  ＃２０３，  Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）との親和性、及び前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドであるＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドとＬｉｐｉｄ  Ａ（Ｅ． ｃｏｌｉ  Ｒ５１５，  ＬＸ−５８１−２００，  Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｎｅｃｅ社製）との親和性を解析した。
最初に、チオールカップリング法によってＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドをセンサーチップＣＭ５（ＢＲ−１０００−１２：  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に固定化した。具体的には、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドのアミノ末端にシステインを付加し、そのシステインとセンサーチップ表面のカルボキシメチルデキストランとをＴｈｉｏｌ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＲ−１００５−５７：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてジスルフィド結合を形成させることによって固定化した。
生理的食塩を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐＨ  ７．２）中のリポ多糖、又はＬｉｐｉｄ  Ａを分散させるために超音波で５分間処理した後に、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した。その後、流速を１０μＬ／分間に設定して流路へ添加した。このときの結合時間は、２４０秒間に調節した。次に、解離するためにリン酸緩衝液だけを５００秒間流した。センサーチップの再生には、１ｍＭ  ＮａＯＨを用いた。
Ｂｉａｃｏｒｅ付属のデータ編集ソフトウェア  ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて、各濃度のセンサーグラムを解析した。具体的には、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎのＧｌｏｂａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇを用いてセンサーグラムの同時解析を行い、解離定数ＫＤを算出した。リポ多糖及びＬｉｐｉｄ  Ａの分子量は、それぞれ２０，５００Ｄａ、１，７９８．８Ｄａとした。
【００４６】
ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを固定化したセンサーチップに、１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）をそれぞれ添加した結果を、図６Ａに示した。同じようにＬｉｐｉｄ  Ａを添加した結果を図６Ｂに示した。リポ多糖を添加した後、２４０秒まで添加したリポ多糖の濃度に依存して、レスポンスが増加した。次に２４０秒目から解離状態に切り替えた結果、レスポンスは徐々に低下した。また、同じようにしてＬｉｐｉｄ  Ａを添加した結果、リポ多糖の場合と同様に、Ｌｉｐｉｄ  Ａの濃度に依存してレスポンスは増加した。
Ｂｉａｃｏｒｅ付属のデータ編集ソフトウェア  ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて、解離定数ＫＤを算出した結果、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドとリポ多糖との間のＫＤは４．２８×１０−１０Ｍとなり、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドとＬｉｐｉｄ  Ａとの間のＫＤは５．５６×１０−１０Ｍとなり、それぞれ非常に高い親和性を示すことがわかった。
したがって、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドのグラム陰性菌に対する抗菌活性は、細胞表層に存在するリポ多糖やその構成成分であるＬｉｐｉｄ  Ａとの強い結合によって、細胞膜の機能を損傷することに起因していることがわかった。また、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドのエンドトキシン中和活性や一酸化窒素産生抑制作用は、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドがリポ多糖又はＬｉｐｉｄ  Ａに直接結合することによって発揮されることがわかった。また、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドとリポ多糖との間、及びＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドとＬｉｐｉｄ  Ａとの間の親和性は、ほぼ同じであることからＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは、リポ多糖のＬｉｐｉｄ  Ａ部分に結合して作用を発揮していることもわかった。
【００４７】
（実施例７）
前記Ｏｓ０２ｇ０７６５６００由来ペプチドの創傷治癒作用
ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの創傷治癒作用を、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−４１０９）の管腔形成促進作用に基づいて評価した。
９６穴プレート（＃３５９５，  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、ＨＵＶＥＣを３日間〜４日間コンフルエントな状態になるまで培養した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３３２０）を用いて洗浄し、不純物を取り除いた。次に、トリプシン／ＥＤＴＡ（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３１２０）で３分間処理し、剥がれてきたＨＵＶＥＣを回収し、トリプシン中和液（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３２２０）に添加した。この細胞懸濁液を８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−２１５０Ｓ）を加えて細胞濃度を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。得られた細胞懸濁液とＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドとを１：１の割合で混合した。
本実験では、ヒト由来の創傷治癒作用を有する生体防御ペプチドとして知られているＬＬ−３７（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ：配列番号４；株式会社ペプチド研究所製、４４４５−ｓ）をポジティブコントロールとして用いて、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの管腔形成促進作用と比較した。なお、ＬＬ−３７がヒト由来の創傷治癒作用を有する生体防御ペプチドであることは、例えば、１）  Ｍ．  Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｅｓｃａｍｅｚ，  Ｍ．  Ｇａｒｃｉａ，  Ｂ．  Ｄｕａｒｔｅ，  Ａ．  Ｈｏｌｇｕｉｎ，  Ｌ．  Ｒｅｔａｍｏｓａ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｊｏｒｃａｎｏ，  Ｍ．  ｄｅｌ  Ｒｉｏ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｌａｒｃｈｅｒ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ＬＬ−３７．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，  （２００８）  Ｖｏｌ．１２８，  ｐｐ．２３３−２３６．、２）  Ｒ．  Ｒａｍｏｓ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｓｉｌｖａ，  Ａ．  Ｃ．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，  Ｒ  Ｃｏｓｔａ，  Ｌ．  Ｇｕａｒｄａｏ，  Ｆ．  Ｓｃｈｍｉｔｔ，  Ｒ．  Ｓｏａｒｅｓ，  Ｍ．  Ｖｉｌａｎｏｖａ，  Ｌ．  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｇａｍａ：  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＬＬ３７．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  （２０１１）  Ｖｏｌ．３２，  ｐｐ．１４６９−１４７６．などに記載されている。
【００４８】
マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｅｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、３５４２３４）は常温では固まり、４℃で液体状態になるため、はじめに４０μＬのマトリゲルを氷上で９６穴プレート（＃３５９５，  Ｃｏｒｉｎｉｇ社製）に添加した。添加したマトリゲルを３７℃で３０分間インキュベートした後、予め準備しておいた細胞懸濁液とＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチド、又はＬＬ−３７との混合液（１００μＬ）を添加し、１５時間培養した。
マトリゲル内でＨＵＶＥＣが形成した管腔構造を、顕微鏡を用いて４０倍の倍率で観察し、写真撮影を行った。また、得られた画像から３００×４００ｐｉｘｅｌの範囲を抽出し、形成された管腔構造をした細胞の長さの合計値を測定し、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドの創傷治癒作用を評価した。
【００４９】
ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチド及びＬＬ−３７のＨＵＶＥＣに対する管腔形成促進作用を図７Ａ〜７Ｄに示した。ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは、ＬＬ−３７と同じ濃度範囲で管腔形成促進作用を示し、その作用は濃度に依存していた。また、顕微鏡観察した結果から、１μＭのＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドを添加したときに、１μＭのＬＬ−３７を添加したときと同じように、無添加の場合に比べて細胞の増殖が促進され、管腔構造をした細胞の長さが増加していることがわかった。したがって、ＡｍｙＩ−１（１７５−１９２）ペプチドは、ＬＬ−３７と同じようにＨＵＶＥＣの管腔形成促進作用を有することから、創傷治癒作用があることがわかった。
【図１】
2014237626.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【配列表】
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