(57)【要約】      （修正有）【課題】安定化した二酸化塩素（ＣｌＯ２）を用いる口腔疾患の予防および治療ならびに口臭の軽減のための組成物の提供。【解決手段】約０．５％〜約０．９％（ｗ／ｖ）の濃度範囲の安定化した二酸化塩素を、微生物環境における殺菌特性及び静菌特性により口腔疾患を予防するための組成物として使用する知見を開示する。安定化した二酸化塩素の殺菌特性は、インビトロの混合微生物群落内に生じる増加した数の嫌気性／好気性／通性グラム陰性及びグラム陽性口腔細菌の死滅を含む範囲にまで更に拡張される。曝露後の口腔細菌の再増殖速度を抑制して歯垢及び口臭の発生を著しく低下させるという、微生物環境内に存在する安定化した二酸化塩素の静菌特性の更なる知見を開示する。安定化した二酸化塩素は、溶液状の口内洗浄剤またはリンスの形をとることができる。【選択図】図１
2014040470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性およびグラム陽性歯周細菌が生息する口腔内の微生物環境における細菌を減
少および死滅させるための方法であって、約０．５％〜約０．８％（ｗ／ｖ）の範囲の濃
度を有する安定化した二酸化塩素の溶液で口腔をすすいで、口腔に存在するグラム陰性お
よびグラム陽性歯周病原菌の増殖に対する静菌干渉を生じさせる段階を含む、前記方法。
【請求項２】
歯周疾患に関連する嫌気性細菌および好気性細菌の増殖に対する静菌干渉を生じさせる
段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質の産生に干渉してグラム陰性およびグラム陽性歯周病原菌の増殖に負の作用
を及ぼす段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種類のＤＮＡおよびＲＮＡの産生に干渉してグラム陰性およびグラム陽性
歯周病原菌の増殖に負の作用を及ぼす段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細菌細胞の膜透過性制御を維持する能力に作用を及ぼす段階を含む、請求項１に記載の
方法。
【請求項６】
口腔内のポルフィロモンス・ジンジバリス、プレボテラ・インターメディア、フソブバ
クテリウム・ヌクレアタム、およびカンピロバクター・レクタスのいずれかを含むグラム
陰性歯周病原菌の存在を少なくとも減少させる段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アクチノマイセス・オドントリチカス、アクチノマイセス・ビスコス、ストレプトコッ
カス・サングイニス、ストレプトコッカス・オラーリス、ミクロモナス（ペプトストレプ
トコッカス）・ミクロス、およびエンテロコッカス・フェカーリスのいずれかを含むグラ
ム陽性歯周細菌の存在を少なくとも減少させる段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
グラム陰性およびグラム陽性歯周細菌が生息する口腔内の微生物環境における細菌を減
少および死滅させるための方法であって、約０．５％〜約０．８％（ｗ／ｖ）の範囲の濃
度を有する安定化した二酸化塩素の溶液で口腔をすすぐ段階を含む、前記方法。
【請求項９】
歯周疾患に関連する嫌気性細菌および嫌気性細菌の増殖に対する静菌干渉を生じさせる
段階を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質の産生に干渉してグラム陰性およびグラム陽性歯周病原菌の増殖に負の作用
を及ぼす段階を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種類のＤＮＡおよびＲＮＡの産生に干渉してグラム陰性およびグラム陽性
歯周病原菌の増殖に負の作用を及ぼす段階を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
細菌細胞の膜透過性制御を維持する能力に作用を及ぼす段階を含む、請求項８に記載の
方法。
【請求項１３】
口腔内のポルフィロモンス・ジンジバリス、プレボテラ・インターメディア、フソブバ
クテリウム・ヌクレアタム、およびカンピロバクター・レクタスのいずれかを含むグラム
陰性歯周病原菌の存在を少なくとも減少させる段階を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
アクチノマイセス・オドントリチカス、アクチノマイセス・ビスコス、ストレプトコッ
カス・サングイニス、ストレプトコッカス・オラーリス、ミクロモナス（ペプトストレプ
トコッカス）・ミクロス、およびエンテロコッカス・フェカーリスのいずれかを含むグラ
ム陽性歯周細菌の存在を少なくとも減少させる段階を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
カンピロバクター・レクタス、ミクロモナス・ミクロス、ポルフィロモナス・ジンジバ
リス、フソバクテリウム・ヌクリウタム、ストレプトコッカス・サングイス、エンテロコ
ッカス・フェカーリス、ストレプトコッカス・オラーリス、およびアクチノマイセス・ビ
スコーサスを含むグラム陰性菌およびグラム陽性菌が生息する口腔内の微生物環境におけ
る細菌を減少および死滅させるための方法であって、約０．４％〜約０．８％（ｗ／ｖ）
の範囲の濃度を有する安定化した二酸化塩素の溶液で口腔をすすいで、カンピロバクター
・レクタス、ミクロモナス・ミクロス、ポルフィロモナス・ジンジバリスおよびフソバク
テリウム・ヌクレアタムを最初の１時間以内に死滅させ、ストレプトコッカス・サングイ
ス、エンテロコッカス・フェカーリス、ストレプトコッカス・オブリスおよびアクチノマ
イセス・ビスコスの存在を最初の１時間以内に減少させ、ストレプトコッカス・サングイ
ス、エンテロコッカス・フェカーリス、ストレプトコッカス・オバリスおよびアクチノマ
イセス・ビスコスを１７時間以内に死滅させる段階を含む、前記方法。
【請求項１６】
安定化した二酸化塩素の溶液が約０．５％〜約０．８％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有し
、ストレプトコッカス・オバリス、およびストレプトコッカス・サングイニス（S. sangu
inis）を最初の１時間以内に死滅させる段階を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
安定化した二酸化塩素の溶液が約０．５％〜約０．８％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有し
、安定化した二酸化塩素の溶液に着香剤を添加して、カンピロバクター・レクタス、ポル
フィロモナス・ジンジバリス、およびストレプトコッカス・サングイニスを最初の１時間
以内に死滅させ、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ミクロモナス・ミクロス、エンテロ
コッカス・フェカーリス、アクチノマイセス・ビスコス、およびストレプトコッカス・オ
ラーリスの存在を最初の１時間以内に減少させ、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ミク
ロモナス・ミクロス、エンテロコッカス・フェカーリス、アクチノマイセス・ビスコーサ
ス、およびストレプトコッカス・オラーリスを１７時間以内に死滅させる段階を含む、請
求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
安定化した二酸化塩素の溶液が約０．６％〜約０．８％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有し
、カンピロバクター・レクタス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ポルフィロモナス・
ジンジバリス、ミクロモナス・ミクロス、エンテロコッカス・フェカーリス、ストレプト
コッカス・オラーリス、およびストレプトコッカス・サングイニスを最初の１時間以内に
死滅させ、アクチノマイセス・ビスコーカスの存在を最初の１時間以内に少なくとも減少
させ、アクチノマイセス・ビスコーカスを１７時間以内に死滅させる段階を含む、請求項
１５に記載の方法。
【請求項１９】
安定化した二酸化塩素の溶液に着香剤を添加する段階を含む、請求項１８に記載の方法
。
【請求項２０】
安定化した二酸化塩素の溶液が少なくとも約０．８％（ｗ／ｖ）の濃度を有し、カンピ
ロバクター・レクタス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ポルフィロモナス・ジンジバ
リス、ミクロモナス・ミクロス、エンテロコッカス・フェカーリス、アクチノマイセス・
ビスコーサス、ストレプトコッカス・オラーリス、およびストレプトコッカス・サングイ
ニスを最初の１分以内に死滅させる段階を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
安定化した二酸化塩素の溶液に着香剤を添加する段階を含む、請求項２０に記載の方法
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定化した二酸化塩素（ＣｌＯ２）を用いる口腔疾患の予防および治療なら
びに口臭の軽減のための組成物および機序、ならびにグラム陰性嫌気性／好気性／通性口
腔細菌およびグラム陽性嫌気性／好気性／通性口腔細菌の両方に対して細菌の増殖を有意
に低下させかつ抗菌薬として作用する０．００５〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度範囲におけ
る殺菌特性および静菌特性の確証に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
関連技術
歯垢は、最近では“歯の表面にバイオフィルムとしてみられる多様な微生物群落であっ
て、宿主および微生物に由来する細胞外高分子マトリックス内に埋め込まれたもの”と定
義されている(Marsh, 2004)。歯垢バイオフィルムは歯肉ラインの上および下（それぞれ
歯肉縁上および歯肉縁下）に発生する。酸を産生する歯肉縁上の歯垢は齲歯（むし歯）の
原因である。歯肉縁下の歯の表面に形成されて歯肉溝の内張り上皮を覆う歯垢は、歯周感
染症（すなわち歯肉炎および歯周炎）の発症をもたらす(Rose et al, 2004)。
【０００３】
歯肉縁上の歯垢は、歯を洗浄した後、数時間以内に歯の上に生じる。唾液タンパク質、
たとえばムチン類、プロリンリッチタンパク質、スタヘリン（ｓｔａｈｅｒｉｎ）類、ヒ
スタチン（ｈｉｓｔａｔｉｎ）類およびクリスタチン（ｃｙｓｔａｔｉｎ）類は、歯のヒ
ドロキシアパタイト（ＨＡＰ）無機質に対して強い親和性をもつ。これらのタンパク質は
歯のＨＡＰに速やかに結合して、獲得被膜（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｐｅｌｌｉｃｌｅ）と呼
ばれる厚いコーティングを形成する。口腔内のある細菌は選択的にこの被膜に付着し、分
裂し始めてコロニーを形成する。最初は、被膜で覆われた歯の表面に定着する細菌の約８
０％は通性、グラム陽性、非運動性の球菌、たとえばストレプトコッカス・（サングイス
）サングイニス（Streptococcus (sanguis) sanguinis）である(U.S. Patent 4,889,714)
。他の２０％は、多様なグラム陰性菌、たとえばベイヨネラ属（Veillonella）の菌種を
含む。コロニーが増殖するのに伴って、これらの初期定着菌の代謝活動のため、また多様
な他の細菌グループがバイオフィルム（歯垢）塊に加わるため、環境が変化する。歯垢バ
イオフィルムにおける重大な環境変化は、局所酸化還元電位が低下して低酸素環境が形成
されることであり、これが嫌気性細菌の定着および増殖を促進する。バイオフィルム内の
微生物は、口腔環境に存在する豊富な多糖、糖タンパク質および食事糖（たとえばショ糖
）から粘液マトリックスまたはグリコカリックス（糖衣）を合成する。最終的に、歯垢は
、高度に構造化した、マトリックスに埋め込まれた、遺伝子発現が著しく異なる多様な微
生物集団を含む、特徴的なバイオフィルムになる(Marsh, 2005)。
【０００４】
歯垢バイオフィルム内の細菌は歯肉炎、慢性および進行性の歯周炎、ならびに壊死性歯
周疾患を含めた幾つかの口腔疾患の主因である。大部分の口腔感染症は、普通の口腔微生
物叢の定住菌により、および／または口腔に定着する外因性病原体により起きる、表面病
変である。これらの感染症には、齲歯、歯肉炎、歯周炎、歯内病変、ならびに口腔症状発
現を伴う可能性のある全身性感染症、たとえば結核および梅毒が含まれるが、これらに限
定されない。
【０００５】
歯垢バイオフィルムと口腔疾患には関連があるので、歯垢細菌（グラム陰性およびグラ
ム陽性病原菌）の再増殖速度を遅らせ、混合培養物またはブロス中の微生物（たとえば下
記のものであるが、これらに限定されない）の存在を減らすことにより菌苔（歯垢）の形
成を阻害する配合物が強く求められている：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyro
monas gingivalis）、アクチノマイセス・オドントリチカス（Actinomyces odontolyticu
s）、アクチノマイセス・ビスコーサス（Actinomyces viscosus）、プレボテラ・インタ
ーメディア（Prevotella intermedia）、アグレガチバクター（アクチノバチルス）・ア
クチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans
）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ミクロモナス（ペ
プトストレプトコッカス）・ミクロス（Micromonas (Peptostreptococcus) micros）、ス
トレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・
オラーリス（Streptococcus oralis）、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter re
ctus）およびエンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）。
【０００６】
歯肉炎は、歯垢により起きる歯の周囲の歯肉結合組織の炎症である(Rose et al., 2004
)。それは、臨床的には古典的な炎症徴候、たとえば発赤（潮紅、ｒｕｂｏｒ）、腫張（
腫瘤、ｔｕｍｏｒ）および組織温度上昇（熱、ｃａｌｏｒ）を特徴とする。さらに、罹患
組織は穏やかに触れた場合にも出血する。歯肉炎は日常的な口腔ケアにより予防できるが
、処置しなければ歯周炎として知られる重篤な歯肉疾患に至る可能性がある。歯周炎も歯
垢によって起き、歯を支える組織（すなわち結合組織および骨）の炎症および感染を特徴
とする。それを処置しなければ歯を失うことになるであろう。それは歯周の歯垢誘発性炎
症性疾患であり、これは探針深さの増大、ならびに歯周靭帯および隣接する支持歯槽骨の
破壊をもたらす。
【０００７】
口臭（Ｈａｌｉｔｏｓｉｓ、ｏｒａｌ  ｍａｌｏｄｏｒ）は、口腔内の有機物質の分解
を伴う細菌性代謝分解によって産生される揮発性硫黄化合物により生じる。唾液、歯垢お
よび舌苔中の細菌は、口臭の主因である硫化水素（Ｈ２Ｓ）、メチルメルカプタン（ＣＨ
３ＳＨ）およびジメチルメルカプタン（（ＣＨ３）２Ｓ）を含む揮発性硫黄化合物（ＶＳ
Ｃ）を産生する(Loesche and Kazor, 2002)。歯肉縁下の歯垢中にみられるグラム陰性嫌
気性菌を含めた口腔細菌は、ＶＳＣ、および有機酸、たとえば酪酸、プトレッシン（ｐｕ
ｔｒｅｓｃｉｎｅ）、吉草酸およびスカトールを含めた多様な悪臭化合物を産生する(Kaz
or et al., 2003)。より詳細には、歯肉縁下の歯垢に関連する細菌種は大量のＣＨ３ＳＨ
およびＨ２Ｓを産生することがインビトロ試験により示された。これらの細菌にはフソバ
クテリウム・ヌクレアタム、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、タ
ンネレラ・フォルシチア（Tannerella forsythia）（以前はバクテロイデス・フォルサイ
タス(Bacteroides forsythus)）、プレボテラ・インターメディア、ポルフィロモナス・
ジンジバリス、ポルフィロモナス・エンドドンタリス（Porphyromonas endodontalis）、
およびユーバクテリウム属（Eubacterium）菌種が含まれる(Loesche and Kazor 2002; Ka
zor et al., 2003)。本発明は安定化した二酸化塩素を殺菌薬として使用し、これにより
口腔細菌が減少し、本質的に口臭が軽減する。先行技術の安定化した二酸化塩素の口腔ケ
ア製品の組成物は、脱臭剤として作用することにより口臭を軽減すると示唆されている(U
.S. Patents Nos. 4689215、4696811、4786492、4788053、4792442、4793989、4808389、
4818519、4837009、4851213、4855135、4886657、4889714、4925656、4975285、5200171
、5348734、5489435、5618550)。
【０００８】
歯周疾患と全身健康状態の関係は、科学的証拠が増えるのに伴って確立されつつある。
口腔疾患は全身性疾患、たとえば心血管疾患（アテローム性硬化症、冠性心疾患、卒中）
、糖尿病、早産および出産時低体重と関連をもつことが示されている(Kim and Amar, 200
6)。
【０００９】
歯周疾患、アテローム性硬化症、冠性心疾患および糖尿病を含む慢性症状には、炎症反
応特性の増悪が共通する。この反応の増悪は、微生物攻撃に反応して起きる炎症性サイト
カインの産生増大に伴って生じる(Rose et al., 2004)。しかし、炎症反応は全身の健全
な組織に損傷を与える可能性がある。
【００１０】
歯周感染症は、身体が微生物攻撃に対する先天性免疫防御システムの一部として単球由
来のサイトカインおよびインターロイキンを分泌するのを刺激する。歯周感染部および歯
垢中に存在するグラム陰性菌は、炎症性サイトカインの分泌を誘発するリポ多糖（内毒素
）を放出する。歯周感染症は、免疫系を刺激して炎症性サイトカインを産生することによ
り心血管疾患（たとえばアテローム性硬化症および血塞栓状態）の直接的な原因となる可
能性がある(Beck et al., 1996)。
【００１１】
歯周疾患、および全身性炎症における歯周疾患の役割が、頚動脈内のアテローム中にア
グレガチバクター（アクチノバチルス）・アクチノミセテムコミタンスを含む口腔病原菌
を同定する研究で示された(Padilla et al., 2006)。Michaud et al. (2007)により報告
された証拠は、歯周疾患を伴うヒトは６３％高い膵臓癌の発症リスクをもつことを示唆し
ている。歯周疾患と慢性炎症および膵臓癌との関連については、その関係を確認するため
にさらに研究する必要がある。
【００１２】
米国における主要な死因のひとつである心血管疾患の発症リスクに歯周疾患が影響を及
ぼすことを指摘する証拠がある。アテローム性硬化症は血管の疾患であって、血管を内張
りする内皮細胞が損傷を受ける。内皮損傷は、高血圧症、喫煙、高脂血症、毒素、ウイル
ス、免疫応答および細菌を含めた広範な有害刺激により起きる可能性がある。内皮損傷に
応答して、血管壁の血管内壁（内膜）が肥厚する。肥厚した領域はアテローム（またはア
テローム斑）と呼ばれ、線維性莢膜で囲まれた脂質、コレステロールおよび脂肪酸を含む
。アテローム斑の存在により、血流低下および心筋梗塞（心臓発作）をもたらす血栓症ま
たは狭窄症のリスクが高まる。
【００１３】
心疾患と歯周疾患の最も重要な関連は炎症である。歯周疾患は身体の最も一般的な慢性
炎症状態のひとつである。炎症は身体に定着する細菌に対する防御機序として起きる。歯
周感染症の経過中に、炎症仲介物質および細菌が血流に進入し、身体の他の部分、たとえ
ば心臓へ移動する。
【００１４】
Briggs et al. (2006)は、中年男性において冠性心疾患が歯周健康状態不良と関連する
ことを示した。この研究では、肝臓で細菌に応答して産生されるＣ反応性タンパク質（Ｃ
ＲＰ）の血清濃度を測定した。ＣＲＰは炎症に関する非特異的マーカーであり、心血管疾
患発症リスクの増大と関連する。この研究で、歯周炎を伴う男性は歯周炎を伴わない個体
より高い血清ＣＲＰ濃度をもつことが見いだされた。
【００１５】
歯周感染症は虚血性発作に対する独立したリスク因子であることも示された(Grau et a
l., 2004)。これらの研究者は、重篤な歯周炎を伴う者では軽度の歯周炎を伴う者または
歯周炎を伴わない者と比較して脳虚血のリスクが４．３倍高いことを見いだした。
【００１６】
主要な歯周病原菌であるポルフィロモナス・ジンジバリスはアテローム硬化斑中で他の
細菌より高い優勢度をもつことが示された(Ford et al., 2005 & 2007)。Fordらの研究で
動脈中に有意に高いことが認められた他の細菌には、フソバクテリウム・ヌクレアタムお
よびタンネレラ・フォルシチアが含まれる(2005)。これらの研究は、歯周病原菌がアテロ
ーム硬化症の発症に役割を果たすこと、および多数の病原菌に対する免疫応答はきわめて
複雑であると思われるという事実を示す(Ford et al, 2007)。連鎖球菌属（Streptococci
）、たとえばストレプトコッカス・サングイニスは、健全な部位からの歯垢の一般的な成
分である。しかし、それらは血流に進入すると全身問題の原因となる可能性がある。Herz
berg and Meyer (1998)は、ストレプトコッカス・サングイニスをウサギの血流に導入す
るとそれらの動物はその循環系中に致命的な血栓（凝血塊）を発生することを示した。し
かし、歯周疾患が心血管疾患の発症に及ぼす影響は依然として研究領域にあり、これら両
者の因果関係を確証するためにはより多くの研究が必要である。
【００１７】
歯周疾患は、早産および出産時低体重に対する新たなリスク因子として出現しつつある
。それは、これらの合併症に対して喫煙、アルコール、薬物使用および尿生殖路感染症な
どと全く同じ程度の影響をもつ可能性がある。歯周感染症と早産および出産時低体重との
関係が研究され、歯周炎を伴う女性は有害な妊娠予後に対する高いリスクをもつことが指
摘された(Offenbacher et al., 2001; Madianos et al., 2001)。歯周炎が早産に及ぼす
影響を説明する機序は、リポ多糖（内毒素）を含む微生物が妊娠中に子宮腔に進入し、サ
イトカイン産生（炎症）を刺激することを示唆する。炎症仲介物質の産生によりプロスタ
グランジン合成が生じ、これが子宮筋を収縮させ、子宮頚部を拡張させ、膜を早期に破裂
させる(Rose et al., 2004)。
【００１８】
Buduneli et al. (2005)は、以下の歯肉縁下細菌、ペプトストレプトコッカス・ミクロ
スおよびカンピロバクター・レクタスが、両方とも早期出産時低体重のリスクを高める役
割を果たすことを見いだした。これらの口腔細菌に曝露されると、胎児性炎症および感染
症が生じ、これがさらに早産のリスクを高める(Boggess et al., 2005; Offenbacher et 
al., 2005)。グラム陰性口腔嫌気性菌であるフソバクテリウム・ヌクレアタムが胎盤壁に
定着することによって有害な妊娠予後と関連することも見いだされた(Han et al., 2004)
。歯周疾患と早産および出産時低体重との関係について統計的に有意の関連性を説明する
ためには、さらに研究を確立する必要がある(Bassani et al., 2007)。
【００１９】
糖尿病は、インスリンの活性またはその分泌に関する問題のため高血糖症（血糖増加）
が起きる一群の代謝疾患である。１型糖尿病は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の破壊
によるものである。ベータ細胞は、特定のウイルス感染または自己免疫反応などの環境傷
害により破壊される可能性がある。この疾患に対する遺伝的羅病性があり、主に北欧系の
個体に起きる。２型糖尿病は膵ベータ細胞の消耗によるものである。末梢組織に顕著なイ
ンスリン抵抗性がある。慢性高血糖症は、最終的に膵臓のインスリン産生に障害をもたら
す。肥満症は、２型糖尿病発症のリスクを著しく高めるきわめて重大な環境因子である。
糖尿病と歯周疾患の間には両方向性の関係がある。糖尿病は、細菌感染に対する応答の撹
乱のため歯周疾患発症のリスクを高める(Garcia et al., 2001)。代謝制御不良状態にあ
る糖尿病患者では、好中球（白血球）が機能不全になる。歯周疾患は糖尿病状態の増悪に
対するリスクとしても認識されている。
【００２０】
糖尿病と歯周疾患は、感染により起きる炎症とインスリン抵抗性の関係によっても関連
する。炎症はサイトカイン産生、タンパク質合成、およびインスリン抵抗性の増大をもた
らす(Kim and Amar, 2006)。糖尿病を伴う対象は細菌に曝露された際に糖尿病を伴わない
対象と比較して増強した応答を示すことが研究により示唆された(Nishimura et al., 200
7)。
【００２１】
糖尿病の代謝制御は、歯周疾患を処置していない患者では損なわれている。Lim et al.
(2007)は、糖血制御と歯周健康状態の関係を調べ、糖血不良が歯周疾患の存在と強く関
連していることを見いだした。糖尿病患者における歯周疾患の予防は、他の糖尿病合併症
、たとえば腎障害、心筋梗塞および卒中を発症するリスクを減らすために重要である(Nis
himura et al., 2007)。歯周状態が糖尿病および他のすべての全身状態に対して重要であ
ることを立証するためには、さらに研究が必要である。
【００２２】
感受性の者においてバイオフィルム中に一般的にみられる歯周病原菌と考えられる細菌
種には以下のものが含まれる：ポルフィロモナス・ジンジバリス、アグレガチバクター・
アクチノミセテムコミタンス、タンネレラ・フォルシチアおよびトレポネーマ・デンティ
コラ(Holt and Ebersole, 2005)。細菌の共凝集または微生物の細胞−対−細胞接着は歯
垢バイオフィルムの基本的な特徴または特色である。歯垢バイオフィルムにおける細菌の
共凝集はランダムに起きるのではなく、細菌はグループとして、または複合体状で、歯に
定着する傾向がある。考察の目的で、バイオフィルム形成の発生段階、および特定の細菌
複合体と歯周感染症の関連を反映させるために、これらの複合体にカラー表示が与えられ
た(Socransky et al., 1998)。青色、黄色、緑色および紫色複合体と表示される４グルー
プは、歯肉縁下ニッチの初期定着菌から構成される。成熟した歯肉縁下バイオフィルムの
複雑な微生物群落と関連する後期定着菌は、橙色および赤色複合体と表示される(Rose et
al., 2004)。黄色複合体は数種の連鎖球菌属菌、たとえばストレプトコッカス・サング
イニスおよびストレプトコッカス・オラーリスを含む。紫色複合体はアクチノマイセス・
オドントリチカスおよびベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）からなる。これ
らの種は初期定着菌であり、歯の表面に最初に付着するものに含まれる。それらは他の細
菌複合体の定着を容易にする環境を作り出す。緑色複合体はカプノシトファガ属（Capnoc
ytophaga）菌種、カンピロバクター・コンサイサス（Campylobacter concisus）、エイケ
ネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、およびアグレガチバクター・アクチノミセ
テムコミタンスを含む。橙色クラスターはフソバクテリウム属菌種、プレボテラ属菌種、
ミクロモナス（ペプトストレプトコッカス）・ミクロス、カンピロバクター属菌種、およ
びユーバクテリウム属菌種を含む。橙色複合体のメンバーは初期定着菌を認識してそれら
に結合し、赤色複合体菌種の定着を促進する。これらの細菌は、バイオフィルムにおいて
他の細菌が付着して定着するための’架橋’および栄養素放出と関連する。最後に、赤色
複合体は３種からなる：ポルフィロモナス・ジンジバリス、タンネレラ・フォルシチアお
よびトレポネーマ・デンティコラ。これらは、重篤な疾患を伴う部位、深い歯嚢、および
進行した病変部に、より多数見いだされる(Rose et al., 2004)。これらの３種は歯肉溝
の内張り上皮に隣接する歯垢領域内に一緒にみられる。
【００２３】
周知のグラム陰性歯周病原菌のうちの２種は、ポルフィロモナス・ジンジバリスおよび
フソバクテリウム・ヌクレアタムである。ポルフィロモナス・ジンジバリスは慢性歯周炎
の進行と関連がある。それは、宿主の組織および細胞、たとえば歯肉上皮細胞へのそれの
接着を容易にする分子成分および構造をもつことが示された。重要なことは、この微生物
が上皮細胞内に侵入して増殖しうるので細胞内病原菌であることである(Holt and Eberso
le, 2005)。ポルフィロモナス・ジンジバリスは、宿主組織に定着し、細胞外空間を経由
することなく細胞から細胞へ拡散移動することにより宿主の免疫応答を逃れる、新規な機
序をもつ(Yilmaz et al., 2006)。フソバクテリウム・ヌクレアタムは歯垢バイオフィル
ムの発生に重要な細菌であると考えられ、病原性となる潜在性をもつ。それは歯垢の増殖
を支持し、細菌の初期定着と後期定着の間の橋渡しとして作用すると考えられる(Bolstad
et al., 1996)。それらの細菌種が口腔に定着する速度を抑制することが健康にとって重
要である。
【００２４】
二酸化塩素という用語は業界で広く用いられている。当業者は、意図する特定の機能お
よび目的を実行するために利用できるその多様な形態または異形を実際に認識しているで
あろう。さらに、U.S. Patent No. 3,271,242には、ある形態の安定化した二酸化塩素お
よびその生成物を製造する方法が記載されており、これは本発明を実施する際に特に有用
である。
【００２５】
二酸化塩素の殺菌特性は、それが１９５０年代に最初に利用可能となる以前に周知であ
った(Masschelein, 1979)。二酸化塩素は亜塩素酸ナトリウムから得られ、塩素を含まな
い溶液を生成することにより、飲料水処理として用いられる。安定化した二酸化塩素は、
亜塩素酸塩および安定剤を含む水溶液である。安定化した二酸化塩素のｐＨが中性ｐＨか
ら低下すると、二酸化塩素分子が水溶液から放出される。安定化した二酸化塩素のこの作
用機序が、好気性、通性および嫌気性の病原菌の微生物生態に対して殺菌作用および静菌
作用をもつ。
【００２６】
本発明は、病原菌、菌苔（歯垢）および口臭を抑制するために、約０．８％（ｗ／ｖ）
以下の濃度の溶液状で、たとえば口内洗浄剤（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）またはリンス（ｒｉ
ｎｓｅ）として口腔の処置に使用できる、安定化した二酸化塩素を含有する組成物に関す
る。リンスをミントの油またはエキスの添加により着香することもできる。着香剤の添加
は安定化した二酸化塩素と相互作用せず、または配合物の安定性に影響を及ぼさないであ
ろう。
【００２７】
口内洗浄剤などの液体について、濃度を表わす際の標準的な測定単位は重量−容量％で
ある。すなわち、ある重量の成分（固体、液体または溶剤に溶解したもの）が、ある容量
の口内洗浄剤全体の中に存在する。本発明における安定化した二酸化塩素の好ましい濃度
は、０．００５％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【００２８】
本明細書中で用いる“局所口腔ケア組成物”または“口腔用組成物”とは、療法薬を全
身投与するために意図的に嚥下するのではなく、口腔内活性を得る目的で、実質的に歯の
表面および／または口腔粘膜組織の全体と接触するのに十分な時間、口腔内に保持する製
品を意味する。
【００２９】
従来の研究は、歯肉炎を処置するための殺菌薬および口臭を処置するための脱臭剤とし
ての、安定化した二酸化塩素の使用を考慮している(Ratcliff, US 4,689,215; Madray, U
S 6,231,830; Richter, US 5,738,840; Witt, US 6,350,438)。二酸化塩素が殺菌特性を
もつこと、および二酸化塩素が口内の悪臭をもつ揮発性硫黄化合物をスルフィド結合の切
断により攻撃する作用をすることを指摘する多量の証拠がある(Lynch, 1997; Silwood , 
2001)。
【００３０】
使用および試験された先行技術組成物は、歯周炎、歯肉炎、歯垢蓄積および口臭の治療
または予防においてある程度は有効性が受け入れられている。Ratcliffの先行特許は、ス
トレプトコッカス・サングイニスに対する安定化した二酸化塩素の殺菌作用を立証した(U
.S. Patents Nos. 4,851,213および4,889,714)。そこには、ストレプトコッカス・サング
イニスを９０％以上減少させることにより１０秒間にわたって口腔細菌の生態を変化させ
ることによって歯垢を減少させる方法が記載されている。それには、口腔に存在するグル
コシルトランスフェラーゼ中の二重結合の破壊も記載されている。
【００３１】
二酸化塩素０．００５〜０．５％（ｗ／ｖ）およびリン酸塩約０．０２％〜３．０％の
濃度範囲がU.S. Patent 5,348,734（Ratcliff）に示されている。これは先行技術にみら
れる最高の主張範囲である。本発明は、先行技術より高い濃度の安定化した二酸化塩素が
、より速やかな速度で、より複雑な微生物環境における口腔細菌に対して殺菌性であるこ
とを証明する。
【００３２】
本発明は、安定化した二酸化塩素の静菌特性に注目する。本発明の証拠は、安定化した
二酸化塩素が細菌に及ぼす作用により細菌の増殖が有意に低下することを示す。本発明を
口腔疾患および歯垢発生の予防および治療に有効な薬剤にする、歯周病原菌に対する阻害
作用を教示した先行技術はない。
【００３３】
DoyleのU.S. Patent (No. 6,846,478)には、亜塩素酸イオンを混合物中に含む口腔用組
成物は口腔における細菌性の状態および疾患を抑制するのに有効であって、細菌が血流中
へ拡散するのを阻害すると主張されている。さらにU.S. Patent No. 7,087,228 (Goodman
)は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）を含めた細菌に対し
て口腔を処置することにより歯垢および感染性心内膜炎を予防するための組成物を提供し
ている。しかしこれらの発明は、口腔内の多菌状態による口腔疾患を予防および治療する
ための有効成分としての安定化した二酸化塩素に特定のものではない。
【００３４】
歯周疾患は歯肉縁下の歯垢の多菌生態に対する応答から生じる。多様で複雑な口腔生態
は、免疫系および抗菌薬に対して、より抵抗性の応答をもたらす。歯周疾患を伴う口腔の
より自然な環境について調べるためには、細菌生態の多様性および複雑さを模倣した実験
条件を開発することが重要である。そのような微生物環境での注目すべき細菌死および歯
垢発生阻害を証明する研究の数は限られている。本発明は多様な自然生態を考慮して、歯
周疾患に関連する多数の口腔細菌の混合微生物懸濁液中における殺菌特性および静菌特性
の両方を調べる。従来の発明およびこれまでの研究は、単一細菌の懸濁培養に関するもの
であり、それらは自然な口腔生態を実際に表わすものではない。
【００３５】
本発明の抗菌特性を支持する証拠は、個々の菌を二酸化塩素濃厚錠で阻害するBotha an
d Molobelaの研究(2006)で観察されている。この研究は、二酸化塩素が下記の口腔病原菌
に対して試験した際に有効な抗菌薬であると結論した：ストレプトコッカス・ミュータン
ス、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ポルフィロモナス・ジンジバリ
ス、アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス、プレボテラ・インターメディア
、タンネレラ・（フォルサイテンシス）フォルシチア（T. (forsythensis) forsythia）
、およびエイケネラ・コロデンス。菌が異なるのに伴って感受性は変動したが、増殖阻害
は実際に観察された。これらの結果は、二酸化塩素に対する細菌の感受性が二酸化塩素濃
度の上昇に対して直線的な抗菌作用を示さないことも示唆している。本発明はこれらの所
見を支持し、多様な環境としての口腔生態に対応する包括的な方法へと拡張したものであ
る。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
安定化した二酸化塩素を含有する組成物を、約０．００５％〜約０．８％（ｗ／ｖ）の
範囲の濃度の口内洗浄剤として、病原菌、菌苔（歯垢）および口臭を抑制するために使用
する。殺菌特性には、混合微生物群落中に存在する嫌気性／好気性／通性グラム陰性およ
びグラム陽性口腔細菌の死滅が含まれる。口内洗浄剤は、曝露された多くの歯周病原菌を
死滅させるのに有効であるだけでなく、口腔細菌の経時的な再定着も遅延または阻止でき
る。
【００３７】
したがって、本発明の第１目的は、歯垢および口臭の発生を軽減するための口内洗浄剤
として安定化した二酸化塩素を提供することである。
【００３８】
本発明の他の目的は、約０．００５％〜約０．８％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度の安定化し
た二酸化塩素を含む口内洗浄剤を提供することである。
【００３９】
本発明のさらに他の目的は、口腔内の混合微生物群落中の細菌を死滅させるための口内
洗浄剤中の安定化した二酸化塩素を提供することである。
【００４０】
本発明のさらに他の目的は、口腔内の嫌気性／好気性／通性グラム陰性菌およびグラム
陽性菌を死滅させるための口内洗浄剤中の安定化した二酸化塩素を提供することである。
【００４１】
本発明のさらに他の目的は、それの殺菌特性および静菌特性により口腔疾患を予防する
ための、約０．００５％〜約０．８％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度の安定化した二酸化塩素を
含む口内洗浄剤を提供することである。
【００４２】
本発明のさらに他の目的は、口腔内の混合微生物群落中の細菌を死滅させるための方法
を提供することである。
【００４３】
本発明のさらに他の目的は、口腔内の嫌気性／好気性／通性グラム陰性菌およびグラム
陽性菌を死滅させるための方法を提供することである。
【００４４】
本発明のさらに他の目的は、口腔内の混合微生物群落における歯垢および口臭の発生を
軽減するための方法を提供することである。
【００４５】
本発明のこれらおよび他の目的は、本発明の記載が進むのに伴って当業者に明らかにな
るであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
図面を参照して本発明をより詳細に記載する：
【図１】図１は、着香剤無添加の０．１％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスを０時間、１７時間および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示す。
【図２】図２は、蒸留水（対照）に０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で１分間曝露した後の細菌の生存量を示し、これは図１に示す０．１％濃度の口内リンスと比較するための陰性対照として用いられる。
【図３】図３は、着香剤無添加の０．４％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスを０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示す。
【図４】図４は、着香剤無添加の０．５％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスを０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示す。
【図５】図５は、蒸留水（対照）を０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示し、これは図４に示す着香剤無添加の０．５％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスに対する比較として用いられる。
【図６】図６は、着香剤添加した０．５％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスを０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示す（曝露３におけるフソバクテリウム・ヌクレアタム数の回復が注目される；これは細菌の耐性または技術的誤りによるものと思われる）。
【図７】図７は、蒸留水（対照）を０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示し、これは図６に示す着香剤添加した０．５％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスに対する比較として用いられる。
【図８】図８は、着香剤添加した０．６％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスを０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示す。
【図９】図９は、着香剤無添加の０．６％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスを０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示す；この口内リンスと対照（ｄＨ２ＯおよびＥＴＳＢ−ＹＥ）の比較も示す。
【図１０】図１０は、着香剤添加した０．８％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスを０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示す；この口内リンスと対照（ｄＨ２ＯおよびＥＴＳＢ−ＹＥ）の比較も示す。
【図１１】図１１は、着香剤無添加の０．８％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスを０、１７および３６時間目のインキュベーション時点で混合細菌懸濁液に１分間曝露した後の細菌の生存量を示す；この口内リンスと対照（ｄＨ２ＯおよびＥＴＳＢ−ＹＥ）の比較も示す。
【図１２】図１２は、着香剤無添加の口内リンスに１分間曝露した後のポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ  ３３２７７）の増殖阻害を示す（Ｔ０アッセイ濃度＝１０８）；この試験に含めた対照は、クロルヘキシジン、中和ブロス、ｄＨ２ＯおよびＰｇ（ポルフィロモナス・ジンジバリス）ブロスである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、安定化した二酸化塩素を含む溶液状の、口内洗浄剤またはリンスを含めた口
腔ケア組成物に関する。本発明は、口腔疾患に関与する微生物、たとえばポルフィロモナ
ス・ジンジバリス、アクチノマイセス・オドントリチカスおよびアクチノマイセス・ビス
コーサス、プレボテラ・インターメディア、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ミクロモ
ナス・ミクロス、ストレプトコッカス・サングイニスおよびストレプトコッカス・オラー
リス、カンピロバクター・レクタス、ならびにエンテロコッカス・フェカーリス（これら
に限定されない）に対する殺菌薬および静菌薬としての安定化した二酸化塩素の使用を考
慮する。この組成物についての機序には、歯周の疾患および健康と関連する単一細菌また
は多菌群落としての口腔細菌スペクトルに対する安定化した二酸化塩素の殺菌活性が判定
されたことが含まれる。
【００４８】
本発明は、０．００５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で口腔細菌群落に対して殺菌
薬および静菌薬として作用する安定化した二酸化塩素組成物からなる。それは先行技術に
おいて知られているより高い濃度でグラム陰性菌およびグラム陽性菌を死滅させ、数を減
少させる効果をもつ。細菌死滅量に直線関係が示されると信じられていたので、この効果
は予想外であった。しかし、指数的割合の細菌死が起きることがインビトロ試験で見いだ
された。直線関係で判定して、０．２％（ｗ／ｖ）濃度では死滅率は０．１％（ｗ／ｖ）
濃度の死滅の２倍であろうと推定された。本発明の証明として実施した試験では、この相
関関係は観察されなかった。安定化した二酸化塩素の濃度が上昇するのに伴って、微生物
に対して指数的効果があると思われる。
【００４９】
本発明は、混合細菌群落に対する０．００５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度範囲におけ
る安定化した二酸化塩素の抗菌特性の殺菌動態を確立する。口腔細菌は単一種として口内
に存在するのではなく複雑かつ多様な細菌種の群落として存在するので、単一菌としてで
はなく群落としての細菌を評価する実験方法が重要である。一般的な試験法は、この実験
において行なうように歯垢様の環境または多菌懸濁液中での細菌死を試験するものではな
い。この環境は、抗菌薬に対する感受性を低下させ、疾病状態への進行を抑制および阻止
するのをより困難にする。
【００５０】
本発明は下記の細菌に対して殺菌薬として作用する：ポルフィロモナス・ジンジバリス
、アクチノマイセス・オドントリチカスおよびアクチノマイセス・ビスコーサス、プレボ
テラ・インターメディア、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ミクロモナス・ミクロス、
ストレプトコッカス・サングイニスおよびストレプトコッカス・オラーリス、カンピロバ
クター・レクタス、ならびにエンテロコッカス・フェカーリス。本発明は口腔疾患および
歯周炎の進行に関連する大部分の口腔細菌に対して有効であると考えられる。本発明は、
多種の口腔細菌の多菌培養物に懸濁すると、口腔疾患に関連する口腔細菌、および健康に
関連するものを含めた日和見細菌、より具体的にはグラム陰性嫌気性／好気性／通性口腔
細菌およびグラム陽性嫌気性／好気性／通性口腔細菌の両方を死滅させ、再増殖を低下さ
せる。
【００５１】
本発明は、混合培養物中の口腔細菌に対する４８時間にわたる静菌処置として用いるた
めの安定化した二酸化塩素口内リンスの使用を主張する。本発明は、歯周疾患に関与する
口腔細菌に対する静菌薬としての安定化した二酸化塩素の能力を考慮している。たとえば
、本発明においてポルフィロモナス・ジンジバリスの再増殖が阻害されることが示され、
これはこの特定のグラム陰性歯周病原菌に対する静菌作用を示す。安定化した二酸化塩素
に曝露した後のポルフィロモナス・ジンジバリスなどの口腔細菌の増殖阻害を主張した技
術はこれまでほとんどまたは全く無い。研究により、安定化した二酸化塩素は細菌細胞に
対する静菌作用をもたらして、最終的に細胞死に至ることが示唆される。この細胞代謝お
よび細胞機能の阻害は、口腔疾患および歯垢形成の主因である菌苔（歯垢）および悪臭を
もつ揮発性硫黄化合物の形成を効果的に阻害または抑制する。
【００５２】
二酸化塩素が細菌を不活性化する具体的な機序は、現在、仮説を立てて研究中である。
したがって本発明の静菌特性は、タンパク質合成の阻害によるもの、および／または細胞
が膜透過性を維持できず代謝プロセスが阻害されることによるものであると考えられる。
細菌に対するこれらの作用のため、０．００５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度範囲の安定
化した二酸化塩素の溶液ですすぐことにより、歯垢の生成および口腔疾患への進行を阻止
することができる。悪臭をもつ口腔内化合物（ＶＳＣ）の産生を阻害することもできる。
以下の作用機序は、二酸化塩素による細菌死の説明を詳述する。
【００５３】
細胞に対する二酸化塩素の具体的な作用機序は長年にわたって議論されてきた。初期の
研究は、二酸化塩素の主な作用がタンパク質合成の撹乱であり、これにより細胞死に至る
ことを示した(Benarde et al., 1967)。Benardeの研究から得られた結果は、タンパク質
合成に対する急激な阻害を明瞭に示した。細胞に対するこの出来事の説明は、二酸化塩素
によるアミノ酸の活性化阻害、メッセンジャーＲＮＡの不活性化（これは翻訳を妨げる）
、およびリボソームの破壊（これは漏出により細胞内容物の損失を引き起こす）の可能性
を含んでいた。
【００５４】
しかし、その後の研究で、これが該当しない可能性があることが指摘された。Rollerら
は二酸化塩素が細菌のデヒドロゲナーゼ酵素、タンパク質合成、およびデオキシリボ核酸
に及ぼす作用を調べた(Roller et al., 1986)。結果は、全デヒドロゲナーゼ酵素が二酸
化塩素による反応の最初の５秒以内に完全に阻害され、タンパク質合成が部分的に阻害さ
れることを示した。二酸化塩素の使用量は阻害の程度に比例することが認められた。これ
らの研究では、二酸化塩素が細胞に及ぼす主な作用はデヒドロゲナーゼ酵素、タンパク質
合成複合体、またはＤＮＡ以外の細胞内領域で起きていると結論された。細胞のタンパク
質合成の阻害が実際には細胞死に関与すると判定された。しかしRollerらは、タンパク質
合成以前にすら細胞の機能の損傷が起きると結論した。二酸化塩素は細胞のＤＮＡを変化
させることにより細胞の不活性化を引き起こすのではないことが示された。この研究にお
ける二酸化塩素による細胞死の説明または理論は、細胞の酵素活性に関係する成分との反
応またはその酸化によるものである(Roller et al., 1986)。
【００５５】
二酸化塩素の作用機序についてのより最近の研究が、Berg et al. (1986)により行なわ
れた。Bergらは、二酸化塩素が大腸菌（Escherichia coli）の膜機能に及ぼす作用を調べ
て、透過性制御が損なわれ、これにより細胞死に至ることを見いだした。二酸化塩素によ
る不活性化は、細胞の内側に存在する細胞内高分子の周囲への著しい損失を起こさないこ
とも示された。しかし、膜の損傷は細胞内カリウムの損失をもたらして膜内外イオン勾配
を破壊し、これが代謝プロセスの致死的阻害および細胞死をもたらすと理解される。した
がって、二酸化塩素に対する感受性および細胞の増殖特性にとって細胞の透過性バリヤー
が重要であると判定された。
【００５６】
本発明の研究による証拠は、安定化した二酸化塩素が細菌細胞に対して殺菌作用および
静菌作用を引き起こし、これにより最終的に細胞死に至ることを示唆する。これらの作用
は、口腔疾患の主因である菌苔（歯垢）および悪臭をもつ揮発性硫黄化合物の形成の抑制
をもたらすことができる。
【実施例】
【００５７】
安定化した二酸化塩素が単一の口腔細菌および混合細菌懸濁液に及ぼす殺菌特性を試験
するために、特定濃度（０．１％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度範囲）の溶液をインビトロ
で、細菌を含むアッセイにおいて試験した。実験には、着香剤無添加および着香剤添加の
両方の口内リンス溶液の試験が含まれていた。
【００５８】
安定化した二酸化塩素の静菌特性を試験するために、０．１％（ｗ／ｖ）濃度の安定化
した二酸化塩素を含む溶液をインビトロで口腔細菌について試験した。
【００５９】
材料：
アクチノマイセス・ビスコーサス  ＡＴＣＣ  ４３１４６
アクチノマイセス・オドントリチカス  ＡＴＣＣ  １７９２９
カンピロバクター・レクタス  ＡＴＣＣ  ３３２３８
エンテロコッカス・フェカーリス  ＡＴＣＣ  １０７４１
フソバクテリウム・ヌクレアタム  ＡＴＣＣ  ４９２５６
ミクロモナス（ペプトストレプトコッカス）・ミクロス  ＡＴＣＣ  ３３２７０
ポルフィロモナス・ジンジバリス  ＡＴＣＣ  ４９４１７
プレボテラ・インターメディア  ＡＴＣＣ  ２５６１１
ストレプトコッカス・サングイニス  ＡＴＣＣ  １０５５６
ストレプトコッカス・オラーリス  ＡＴＣＣ  ３５０３７
着香剤を含む口内リンス
着香剤を含まない口内リンス
Ｄｉｆｃｏ（商標）中和ブロス（約８００ｍＬ）
強化ＴＳＢＹＥ（約４００ｍＬ）
人工唾液＋５％トリプトン＋５％酵母エキス（約２，５００ｍＬ）（ＡＳ＋Ｔ＋Ｙ）
０．１４７ｇ／Ｌ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）
０．４２６ｇ／Ｌ  リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）
１．６８ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）
９０〜５０ｍＬ遠心管
２５ｍＬ、１０ｍＬ、５ｍＬおよび０．１ｍＬピペット
ピペットエイドピペッター
９個の無菌エルレンマイヤーフラスコ
無菌試験管
３９−各選択寒天、合計３１２のプレート用（４８時間、前還元したもの）
最適増殖培地および選択寒天（培地を２４時間、前還元したもの）：
ＣＲブロスおよびＣＲ寒天−カンピロバクター・レクタス
ＢＨＩＢブロスおよびＢＨＩＢ  ｐＨ＝９．６寒天−エンテロコッカス・フェカーリ
ス
ＴＳＢＹＥインベルターゼ処理ブロスおよびＭＳｓｓ／ＭＳＮ寒天−ストレプトコッ
カス・サングイニスおよびストレプトコッカス・オラーリス
シェードラー（Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ）ブロスおよびＣＶＥ寒天−フソバクテリウム・
ヌクレアタム
ＰｍブロスおよびＭＳＣＮ寒天−ミクロモナス・ミクロス
ＰｇブロスおよびＢＰＢ＋ＭＵＰ寒天−ポルフィロモナス・ジンジバリス
ＢＨＩＢブロスおよびＣＦＡＴ＋ＭＵＰ寒天−アクチノマイセス・ビスコーサス
ＥＴＳＢＹＥ−すべての細菌用
血液寒天
安定化した二酸化塩素リンスの殺菌活性の測定を、歯肉炎、歯周の疾患および健康状態
に関連する個々の口腔細菌の懸濁液について実施した。下記の細菌を個々にマイクロタイ
タープレートアッセイシステムによりアッセイした：ポルフィロモナス・ジンジバリス、
プレボテラ・インターメディア、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ミクロモナス・ミク
ロス、アクチノマイセス・ビスコーサス、アクチノマイセス・オドントリチカス、ストレ
プトコッカス・サングイニス、ストレプトコッカス・オラーリス、カンピロバクター・レ
クタスおよびエンテロコッカス・フェカーリス。
【００６０】
実験に用いた細菌は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）分
離株であり、最初に口腔感染症から得られた。すべての細菌がクリオライブラリーとして
−９０℃で永久保存されている。
【００６１】
初代培養物をその種に適した標準強化培地で嫌気チャンバー（Ｃｏｙ）内において３７
℃で４８時間、増殖させた。細胞を遠心により収穫し、前還元した無菌培地で２回洗浄し
た。細胞を前還元した無菌培地に懸濁し、細胞濃度と分光分析による吸光度との標準曲線
に基づいて標準濃度に調整した。
【００６２】
殺菌アッセイをマイクロタイタープレート設定で実施した。アッセイ成分は、標準化し
た細菌懸濁液（出発細胞濃度１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍＬ）、抗菌剤希釈液、および無菌
培地からなっていた。無菌蒸留水に希釈したある範囲の濃度のリンスを用いた。陽性対照
は０．１２％クロルヘキシジンからなり、陰性対照は無菌蒸留水（ｄＨ２Ｏ）であった。
多数回の実験において、着香剤もアッセイに際して含有させた。
【００６３】
マイクロタイタープレートをアッセイ時点間は嫌気チャンバー内でインキュベートした
。試料を種々の期間で取り出して、Ｓｐｉｒａｌ  Ｐｌａｔｅ  ４０００システムを用い
るらせん平板培養法により生存細胞数を測定するために処理した。らせん平板培養システ
ムを用いて、細菌細胞数および抗菌薬感受性の程度を測定した。１、５および１０分間の
曝露時間について観察した。
【００６４】
統計分析を実施する前にデータを正規化するために、粗微生物数をまずｌｏｇ１０値に
換算した。これは標準法であり、抗菌アッセイにおいて細菌数を評価するために広く用い
られている。データを大部分は一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析した。場合により
、不等分散が生じた際にはノンパラメトリック  クルスカル−ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ
ｌ−Ｗａｌｌｉｓ）ＡＮＯＶＡによってもデータを分析した。前者の場合、統計的有意性
がみられた際には、グループ間の差を判定するためにチューキー−クレイマー事後検定（
Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を行なった。後者の場合、ダンの多重
比較検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ’ｓ  ｔｅｓｔ）を
行なった。統計的有意性をα＝０．０５に設定した。データをスチューデントのｔ−検定
により分析した。
【００６５】
グラム陰性嫌気性菌における全般的傾向を観察して、これらの細菌は０．１％（ｗ／ｖ
）濃度の安定化した二酸化塩素リンスに対して、より感受性であった（データは示してい
ない）。１分間曝露後の生存細胞数の減少がフソバクテリウム・ヌクレアタムについてみ
られたが、データは統計的に有意ではなかった。同様に、生存細胞の減少がポルフィロモ
ナス・ジンジバリスについてみられた。しかし、１０分間曝露の実験では接種菌の完全な
死滅がみられた。
【００６６】
嫌気性グラム陰性菌プレボテラ・インターメディアについては、わずかに異なる感受性
プロフィールがみられた。統計的に有意の生存細胞数減少が１および５分間曝露の両方に
ついてみられ、５分間で完全な死滅が起きた。
【００６７】
カンピロバクター・レクタス実験からの結果は、口内リンス濃度に１分間曝露すると統
計的に有意の生存細胞数減少がアッセイにおいて生じることを示す。この口内リンスは、
カンピロバクター・レクタス（嫌気性グラム陰性菌）に対する１分間の曝露で＞９５％の
死滅をもたらした。
【００６８】
結論として、このリンスはグラム陰性嫌気性口腔細菌に対して細菌の生存性に対する強
い作用を示した。さらに、これらの細菌を、歯周の疾患および感染症の発症および進行と
関連する多菌混合物において試験した。
【００６９】
多菌混合物の組成は、健康状態および疾患と関連する菌を含むように設計された（前記
の個々の口腔細菌懸濁液の試験に用いたものと同じ細菌からなる）。
【００７０】
この実験の目的は、混合細菌懸濁液を複数の時点で（０、１７および３６時間目）０．
１％から０．８％（ｗ／ｖ）までの範囲の濃度の口内リンスに１分間曝露した際に懸濁液
に対する殺菌作用があるかを判定することであった。下記の方法は０．４％（ｗ／ｖ）の
口内リンス濃度について詳述したものであり、０．１％、０．３％、０．４％、０．５％
、０．６％および０．８％（ｗ／ｖ）濃度を含む他の濃度については、それに応じてこれ
を変更した。
【００７１】
実施した試験は、個々の細菌について行なったものと同様であり、口内リンスを混合細
菌懸濁液に対して評価したにすぎない。それぞれの細菌（好気性菌については０．１ｍＬ
、嫌気性菌については０．５ｍＬ）を５０ｍＬの最適増殖培地に接種し、２４時間（好気
性菌）および４８時間（嫌気性菌）インキュベートした。インキュベーション期間が終了
すると、２５ｍＬの細菌原液を７５００×重力（７５００×ｇ）で１０分間遠心し、２５
ｍＬのＥＴＳＢＹＥに再懸濁した。これらの再懸濁液からＥＴＳＢＹＥ中へ２回の１０−
２希釈を行なった（０．１ｍＬの再懸濁液を１０ｍＬのＥＴＳＢＹＥ中に）。元の増殖培
養物のＣＦＬ／ｍＬを求めるために、２回目の希釈液を血液寒天で平板培養した。混合懸
濁液についてフソバクテリウム・ヌクレアタムの出発濃度を確認するために、３．５ｍＬ
の初期培養物を６．５ｍＬのシェードラーブロスに添加した。次いでこれを１０−２およ
び１０−４希釈し、血液寒天およびＣＶＥ寒天でらせん平板培養した。
【００７２】
次表は、３５ｍＬの１．２×１０８ＣＦＵ／ｍＬ混合培養物懸濁液を作成するために添
加した各細菌の容量を示す。混合懸濁液が作成されると、この懸濁液を１０−２および１
０−３希釈し、それぞれ選択寒天および血液寒天でらせん平板培養した。Ａ６６０は６６
０ｎｍにおける吸光度であり、これにより懸濁液中の細胞数を判定する。
【００７３】
【表１】
2014040470.tif 000003
【００７４】
E. faecalis  エンテロコッカス・フェカーリス
S. oralis  ストレプトコッカス・オラーリス
S. sanguinis  ストレプトコッカス・サングイニス
A. viscosus  アクチノマイセス・ビスコーサス
C. rectus  カンピロバクター・レクタス
F. nucleatum  フソバクテリウム・ヌクレアタム
M. micros  ミクロモナス・ミクロス
P. gingivalis  ポルフィロモナス・ジンジバリス
＊−−細菌がフラスコの底に付着したのでＡ６６０がきわめて低かった。フラスコの
底を無菌ループで掻き取ってそれらを懸濁させると、そのアッセイのＣＦＵ／ｍＬ数は予
想どおりになった；
＊＊−−Ａ６６０による濃度が２倍に見えたが、標準曲線によればわずかな差があり
、したがってこの実験は予め計算したとおりに行なわれた。
【００７５】
着香剤添加および無添加口内リンスの試験管を一緒に三重試験法で試験し、ｄＨ２Ｏお
よびＥＴＳＢＹＥの試験管（対照）を一緒に三重試験法で試験した。各管を下記に従って
調製した：細菌懸濁液を添加し、遠心管を１分間ボルテックス撹拌した。この１分間の曝
露の直後に、２２ｍＬを取り出し、２２ｍＬの中和ブロスを入れた遠心管に添加した。次
いでこの遠心管を３０秒間ボルテックス撹拌した。遠心管を還元し、次いで８，０００×
ｇで１０分間遠心した。上清を取り出し、４４ｍＬの前還元したＡＳ＋Ｔ＋Ｙを添加した
。次いで遠心管を８，０００×ｇでさらに１０分間遠心した。上清を再び取り出し、３ｍ
ＬのＡＳ＋Ｔ＋Ｙを添加した。１０−２希釈を行ない、選択寒天上にらせん播種した。次
いで遠心管を３７℃のインキュベーター内で１７時間、嫌気的にインキュベートし、そし
て、その処理を繰り返した。この処理を０、１７および３６時間目に行なった。
【００７６】
前記で実施した試験と同様に、マイクロタイタープレートをアッセイ時点間は嫌気チャ
ンバー内でインキュベートした。種々の時点で試料を取り出して、Ｓｐｉｒａｌ  Ｐｌａ
ｔｅ  ４０００システムを用いるらせん平板培養法により生存細胞数を測定するために処
理した。
【００７７】
前記の個々の細菌懸濁液の試験について行なったものと同じ方法で統計分析を実施した
。
【００７８】
多菌懸濁液に対する０．１％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスの作用についての結果を図１
に示す。グラム陰性嫌気性歯周病原菌であるカンピロバクター・レクタスの完全死滅が、
０．１％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスへの２回目（１７時間目）の曝露後に起きた。フソ
バクテリウム・ヌクレアタムおよびポルフィロモナス・ジンジバリスを含めた他の被験細
菌の生存細胞数も有意に減少した。図２は蒸留水曝露の対照を示す；これは、図１と比較
した場合に多菌細菌の死滅に対する口内リンスの有意の作用を指摘する。口内リンス溶液
中に着香剤を含有させて実施した試験は、２回目の曝露後にカンピロバクター・レクタス
およびポルフィロモナス・ジンジバリスの両方の完全死滅を示した（データは示していな
い）。
【００７９】
普通は口腔の健康状態に関連するグラム陽性菌は、０．１％（ｗ／ｖ）濃度の口内リン
スでは複数回曝露計画後にほとんど変化を示さなかった。しかし、より高い濃度のリンス
（０．４、０．５、０．６および０．８％）は、これよりはるかに高いレベルの殺菌活性
を示した。これらの濃厚リンスに多菌懸濁液を曝露すると、すべてのグラム陰性菌および
グラム陽性菌が２回目の曝露直後に完全に死滅した。
【００８０】
結果は、多菌懸濁液中の嫌気性グラム陰性歯周病原菌は安定化した二酸化塩素口内リン
スへの複数回の短時間曝露に対して著しく感受性であることを示した。図３に示すように
、０．４％（ｗ／ｖ）の口内リンスはきわめて強い殺菌活性を示し、多菌懸濁液中のすべ
ての細菌のレベルに有意の減少を生じた。より詳細には、４種類のグラム陽性菌（ストレ
プトコッカス・サングイニス、エンテロコッカス・フェカーリス、ストレプトコッカス・
オラーリス、およびアクチノマイセス・ビスコーサス）のみが口内リンスへの初回曝露で
生存した。重要なことに、ポルフィロモナス・ジンジバリス、フソバクテリウム・ヌクレ
アタムおよびカンピロバクター・レクタスなどのグラム陰性嫌気性菌は、口内リンスへの
初回曝露後に完全に排除された。
【００８１】
０．３％（ｗ／ｖ）リンスについての殺菌活性レベルは、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のリ
ンスときわめて類似していた（データは示していない）。０．４％（ｗ／ｖ）以上の濃度
の口内リンスに応答して細菌生存量が急激に増加するので、この出来事はこの口内リンス
による細菌に対する指数的な死滅作用であると考えられる。この結果は、０．４、０．５
、０．６および０．８％口内リンス試験からの結果を表わす図に表わされる。着香剤を含
む、または含まない０．５％濃度の安定化した二酸化塩素では、図４および６に示すよう
に３６時間をかけた複数回曝露後に多菌懸濁液中のすべての細菌の完全な死滅が生じる。
図４に示すように、２種類の口腔細菌のみが初回曝露後に生存し、１７時間後の２回目の
曝露で完全に死滅排除された；これら２種類の細菌はエンテロコッカス・フェカーリス（
グラム陽性嫌気性菌）およびアクチノマイセス・ビスコーサス（グラム陽性好気性菌）で
あった。これらの有意差を明瞭に比較および観察するために、安定化した二酸化塩素への
曝露により得られた結果を図５および７に示す蒸留水曝露の対照と比較することができる
。
【００８２】
図８〜１１は、着香剤を含む、または含まない（着香剤添加および無添加）０．６％お
よび０．８％（ｗ／ｖ）濃度の口内リンスの殺菌活性を示す。０．６％濃度の口内リンス
は、混合細菌懸濁液中のすべての細菌を着香剤無添加の口内リンス中での初回曝露後に完
全に死滅させた。着香剤添加した口内リンス中での初回曝露で生存した唯一の細菌は、グ
ラム陽性菌アクチノマイセス・ビスコーサスであった。しかしこの細菌は、１７時間後の
２回目の曝露後に死滅した。図９に示すように、ｄＨ２ＯおよびＥＴＳＢ−ＹＥ対照も０
．６％リンスと共に分けて示す。対照には生存細胞があったことが分かる。
【００８３】
試験した最高濃度０．８％（ｗ／ｖ）では、それぞれ図１０および１１に示すように、
着香剤添加および無添加の両方の口内リンスにおいて初回曝露後に生存細菌の徴候がなか
った。この場合も、両図中の対照を口内リンスと比較することができる。
【００８４】
結論として、０．８％（ｗ／ｖ）に及ぶ濃厚な安定化した二酸化塩素口内リンスは、グ
ラム陰性嫌気性菌およびグラム陽性好気性菌／嫌気性菌に対する高レベルの殺菌活性をも
つ。これらの結果は、口内リンスの殺菌作用と濃度との上昇ステップ関数関係を立証する
。０．４％以上で多菌懸濁液において細菌死が有意に増大する。口腔細菌に対する０．１
％および０．３％濃度の口内リンスから０．４％濃度の口内リンスへの作用の変化からみ
て、直線的な増大が起きるのではないと思われる。
【００８５】
安定化した二酸化塩素リンスがポルフィロモナス・ジンジバリスなどの口腔細菌に及ぼ
す静菌作用を立証するために、歯垢の再増殖実験を実施した。アッセイ濃度１０６〜１０
８ＣＦＵ／ｍＬに調整したポルフィロモナス・ジンジバリス懸濁液を０．１％（ｗ／ｖ）
濃度の口内リンスに１分間曝露した。懸濁液を直ちに新鮮な培地中に希釈し、次いで嫌気
チャンバー内において３７℃でインキュベートした。
【００８６】
安定化した二酸化塩素口内リンスは有効な静菌剤であって４８時間にわたって口腔細菌
の増殖を阻害することが証拠により示唆される。二酸化塩素の静菌特性は、それが外因性
および内因性のタンパク性物質、口腔上皮、食物屑ならびに唾液の分解を阻止するのに有
効な溶液であることを示す。最も重要なことであるが、これは歯垢および揮発性硫黄化合
物の発生を制限するであろう。
【００８７】
蒸留水または新鮮な培地に曝露した細胞は正常な増殖速度を示し、３６時間のインキュ
ベーション後に高い吸光度に達した。しかし、口内リンスに曝露した細胞は、着香剤添加
および無添加のいずれであっても、４８時間を超えて増殖することはできなかった。この
作用はポルフィロモナス・ジンジバリスについて１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍＬでみられた
。ポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖阻害を、図１２に着香剤無添加０．１％（ｗ／
ｖ）濃度口内リンスの結果として示す。得られたデータに基づいて、口内リンスへの短期
間曝露がグラム陰性歯周病原菌ポルフィロモナス・ジンジバリスに対して有意の静菌作用
をもつことが認められた。他の口腔細菌に対しても有効であると思われる。
【００８８】
口内リンスへの着香剤添加も、ポルフィロモナス・ジンジバリス増殖を阻害する同じ作
用をもつ（データは示していない）。着香剤は通常は殺菌特性をもつことが知られており
、その作用がこれらの試験で認められた。さらに、着香剤は安定化した二酸化塩素口内リ
ンスと共に使用した際に有益な効果をもつと判定できる。
【図１】
2014040470.tif 000004
【図２】
2014040470.tif 000005
【図３】
2014040470.tif 000006
【図４】
2014040470.tif 000007
【図５】
2014040470.tif 000008
【図６】
2014040470.tif 000009
【図７】
2014040470.tif 000010
【図８】
2014040470.tif 000011
【図９】
2014040470.tif 000012
【図１０】
2014040470.tif 000013
【図１１】
2014040470.tif 000014
【図１２】
2014040470.tif 000015
【外国語明細書】
2014040470000001.pdf