(57)【要約】【課題】例えば、沼、池、湖、河川、海、湿地帯等の自然界や、観賞用や養殖用等の水槽等の人工装置の水環境において生じる、硝酸塩、亜硝酸塩などを効率良く低減することが可能な水浄化用液及び水浄化方法を提供すること。【解決手段】嫌気性微生物を含む微生物群を含有する原水とポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子とを含む培養液に対して、培養の開始後終了までの間に、外力を負荷して前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊してなる水浄化用液。【選択図】図１
2014132831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性微生物を含む微生物群を含有する原水とポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子とを含む培養液に対して、培養の開始後終了までの間に、外力を負荷して前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊してなる水浄化用液。
【請求項２】
前記嫌気性微生物の菌体数の増加速度が鈍化した時に、前記外力を負荷する請求項１記載の水浄化用液。
【請求項３】
前記外力が、撹拌及び／又は振動により負荷される請求項１又は２に記載の水浄化用液。
【請求項４】
自然界または人工装置の水環境から採取した、嫌気性微生物を含む微生物群を含有する原水と、ポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子と、を混合して培養を開始した後培養終了までの間に、嫌気性微生物の菌体数の増加速度が鈍化した時に、外力を負荷して前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊して得られた培養液の少なくとも一部を、前記原水を採取した前記水環境に投入する水浄化方法。
【請求項５】
培養を開始後培養終了までの間に、前記外力を２回以上負荷する請求項４に記載の水浄化方法。
【請求項６】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）である請求項４又は５に記載の水浄化方法。
【請求項７】
前記人工装置の水環境が、水生生物を飼育している水槽内の水を含む水環境であり、前記培養液が投入された後の前記水槽内の水の硝酸塩濃度が０〜５０ｍｇ／Ｌである請求項４〜６何れかに記載の水浄化方法。
【請求項８】
水生生物を飼育している水槽内の水を取水し、この取水した水を用いて培養して得られる培養液の少なくとも一部を、前記水槽内に投入するための水槽用リアクターであって、
前記取水した水とポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子とを含む培養液が充填された培養槽と、
前記培養槽から前記水槽へと培養液を排出するための排出口と、
前記ポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子の表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊するための外力を負荷する手段と、
を備えた水槽用リアクター。
【請求項９】
前記排出口の近傍に、前記排出口が閉塞することを防止する手段をさらに備える請求項８記載の水槽用リアクター。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の水槽用リアクターを備えた水槽。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水浄化方法および水浄化用液に関し、更に詳しくは、ポリヒドロキシアルカノエート（以下、「ＰＨＡ」ともいう。）を用いた沼、池、湖、河川、海、湿地帯、水槽等の水浄化方法および水浄化用液に関する。
【背景技術】
【０００２】
沼、池、湖、河川、海、湿地帯等の自然界、観賞用や養殖用等の水槽等の人工装置の水環境では、各種の生物が生存している。そして、これらの水環境中では、例えば脊椎動物などの排泄物、その死骸などに含まれる蛋白質や核酸などの窒素原子を含有する有機物が好気性微生物などにより分解されたり、無脊椎動物などから直接排泄されたりすることによりアンモニアが生成しているが、このアンモニアはその水環境中に存在する微生物により、硝酸塩、亜硝酸塩に変換されたり、更には窒素に変換され大気中に放出される。また、生物の排泄物や死骸に含まれるリン原子を含有する有機物などは、各種の微生物により変換され、水環境中あるいは土壌中にリン酸塩などとして生成されることが知られている。
【０００３】
ところで、従来より、活性汚泥、メタン発酵、浄化槽などによる廃水処理では、上記のような微生物の作用を利用した方法が用いられており、また、各種の微生物の機能に着目して汚染環境を修復する試みがなされている。しかしながら、例えば、観賞用や養殖用などの閉鎖系の水槽内や、水流の滞る自然環境下では、水生生物による排泄物、餌の残渣などは微生物などによる作用の結果、ある程度、窒素に変換されるものの、硝酸塩などが水環境中に蓄積する場合がある。その結果、自然環境下であれば、有害なアオコなどが発生したり、水槽の場合であれば、コケ類などが発生し、水槽の内壁面へ付着したりする場合がある。
【０００４】
この対策として、例えば水槽内の硝酸塩などの濃度を下げ、且つ濁りを抑制するため、特定の微生物を用いる方法（非特許文献１）、微生物の栄養源となる成分として生分解性ポリマーのペレットを用いる方法（非特許文献２）が提案されている。また非特許文献２では、生分解性ポリマーのペレットを充填したリアクターを用い、水槽内の水を水槽と当該リアクターとの間で循環させる方法が提案されている。
【０００５】
しかし、非特許文献１に記載の方法では、適切な微生物を選択しなければ、所望の水浄化効果が得られないという問題がある。また、自然界や人工装置の水環境に適した特定の微生物を選択することは、実際上極めて困難である。また、非特許文献２に記載の方法では、ペレットの表面にバイオフィルムが形成され、一定の水浄化効果は得られるものの、例えば硝酸塩の処理効果は頭打ちとなるうえ、その後、硫化水素が発生する場合があり、却って水環境の低下を招く場合がある。また、非特許文献２に記載のリアクターでは、リアクター内の水を水槽に戻すリアクター出口の辺りでペレットが詰まったり、一部ペレットが固まったりして管理が困難になる場合がある。
【０００６】
また、例えば、観賞用あるいは養殖用の水生生物の飼育を行う水槽では、水槽中の水の硝酸塩濃度は５０ｍｇ／Ｌ以下が好ましいと一般的に言われており、さらにコケの大量発生を抑制するには、硝酸塩濃度は１０ｍｇ／Ｌ以下が好ましいとされている。しかし、非特許文献１、２に記載の方法では、必ずしも、硝酸塩濃度を十分に低減することができていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】コーラルフィッシュ、エイ出版社、平成２３年４月１０日、第３１号、ｐ１１１
【非特許文献２】コーラルフィッシュ、エイ出版社、平成２３年２月１０日、第３０号、ｐ８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記問題点に鑑みて、本発明の目的とするところは、例えば、沼、池、湖、河川、海、湿地帯等の自然界や、観賞用や養殖用等の水槽等の人工装置の水環境において生じる、硝酸塩、亜硝酸塩などを効率良く低減することが可能な水浄化用液及び水浄化方法を提供することにある。また、例えば非特許文献２に記載のように、水槽内の水環境を浄化するために、ペレットなどの粒子を充填したリアクターを使用する場合に、リアクター内の液を水槽に戻す際に、リアクターの排出口やその近傍で粒子などが詰まったり、固まったりすることを抑制することが可能で簡便な水浄化方法および当該方法に使用する水槽用リアクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、例えば水生生物を飼育している水槽より採取した原水と、ポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子とを含む培養液に対して、培養の開始後終了までの間に、例えば撹拌などにより外力を負荷して、ＰＨＡ粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊して得られる培養液を、原水を採取した元の水槽に投入する（戻す）と、水槽内の水の硝酸塩濃度が著しく低下すること見出し、本発明を完成するに至った。本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１０】
（１）嫌気性微生物を含む微生物群を含有する原水とポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子とを含む培養液に対して、培養の開始後終了までの間に、外力を負荷して前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊してなる水浄化用液。
（２）前記嫌気性微生物の菌体数の増加速度が鈍化した時に、前記外力を負荷する前記（１）記載の水浄化用液。
（３）前記外力が、撹拌及び／又は振動により負荷される前記（１）又は（２）に記載の水浄化用液。
（４）自然界または人工装置の水環境から採取した、嫌気性微生物を含む微生物群を含有する原水と、ポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子と、を混合して培養を開始した後培養終了までの間に、嫌気性微生物の菌体数の増加速度が鈍化した時に、外力を負荷して前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊して得られた培養液の少なくとも一部を、前記原水を採取した前記水環境に投入する水浄化方法。
（５）培養を開始後培養終了までの間に、前記外力を２回以上負荷する前記（４）に記載の水浄化方法。
（６）前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）である前記（４）又は（５）に記載の水浄化方法。
（７）前記人工装置の水環境が、水生生物を飼育している水槽内の水を含む水環境であり、前記培養液が投入された後の前記水槽内の水の硝酸塩濃度が０〜５０ｍｇ／Ｌである前記（４）〜（６）何れかに記載の水浄化方法。
（８）水生生物を飼育している水槽内の水を取水し、この取水した水を用いて培養して得られる培養液の少なくとも一部を、前記水槽内に投入するための水槽用リアクターであって、
前記取水した水とポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子とが充填された培養槽と、
前記培養槽から前記水槽へと培養液を排出するための排出口と、
前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊するための外力を負荷する手段と、
を備えた水槽用リアクター。
（９）前記排出口の近傍に、前記排出口が閉塞することを防止する手段をさらに備える前記（８）記載の水槽用リアクター。
（１０）前記（８）または（９）に記載の水槽用リアクターを備えた水槽。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、例えば、沼、池、湖、河川、海、湿地帯等の自然界や、観賞用や養殖用等の水槽等の人工装置の水環境において生じる、硝酸塩、亜硝酸塩などを効率良く低減することが可能である。また、水槽内の水環境を浄化するために、ペレットなどの粒子を充填したリアクターを使用する場合に、リアクター内の液を水槽に戻す際に、リアクターの排出口やその近傍で粒子などが詰まったり、固まったりすることを抑制可能で、簡便な水浄化方法および当該方法に使用する水槽用リアクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の水槽用リアクターを備えた水槽の実施形態の一例を示した図である。
【図２】本発明の水槽用リアクターを備えた水槽の実施形態の他の例を示した図である。
【図３】（ａ）実施例１、３、５における水槽内の水の硝酸塩濃度の経時変化を示す図である。（ｂ）実施例２、４、および比較例１、２における水槽内の水の硝酸塩濃度の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。
【００１４】
本発明の水浄化用液は、嫌気性微生物を含む微生物群を含有する原水とポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）からなる粒子とを含む培養液に対して、培養の開始後終了までの間に、外力を負荷して前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊してなるものである。
【００１５】
本発明では、このように、所定の原水とＰＨＡからなる粒子とを混合して培養液とし、培養を開始した後、培養を終了するまでの間に、培養液に対して外力を負荷し、培養液内のＰＨＡの粒子の表面に形成したバイオフィルムを破壊する処理を行う。培養の過程においては、原水に含まれる微生物群の中でも、先ず、ＰＨＡ粒子の表面でＰＨＡを資化しつつ、好気性微生物が優勢的に増殖してＰＨＡ粒子表面にバイオフィルムが形成される。このバイオフィルムが成長するに従い、バイオフィルムには好気的環境と嫌気的環境が形成されるため、原水を採取した水環境に生息していた各種の微生物群がバイオフィルムに含まれることになる。そして、バイオフィルムがさらに成長していくと、バイオフィルムの内部は嫌気的環境になることから、ＰＨＡ粒子の表面には、嫌気性微生物が優勢に生存する層と当該層の表面に好気性微生物が優勢的に生存する層が形成されると考えられる。そして、嫌気性微生物がＰＨＡ粒子の表面全体を覆うことになると、ＰＨＡの分解（資化）が進みにくくなる、即ち、バイオフィルムに含まれる各種の微生物の増殖が進みにくくなる。そこで、ＰＨＡ粒子表面に形成されたバイオフィルムを破壊して、ＰＨＡ粒子表面の少なくとも一部からバイオフィルムを剥離して、ＰＨＡ粒子の表面が培養液に接するようにすることで、バイオフィルムに含まれる各種の微生物（主として好気性微生物）が成長する増殖速度の大きい状態を維持しつつ、培養液側に存在する好気性や嫌気性の微生物を含む微生物群の数量も増加させることが可能となると考えられる。
【００１６】
上記バイオフィルムに含まれる微生物群には、ある種の分類によれば、原生生物（Ｐｒｏｔｏｚｏａ）、藻類（ａｌｇａｅ）、菌類（Ｆｕｎｇｉ）、細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）、藍藻（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）が含まれ得る。また、これらの微生物群には、ある種の分類によれば、酸素が生育に必要な好気性微生物（偏性好気性微生物）、酸素が生育を阻害する嫌気性微生物（偏性嫌気性微生物）、酸素の有無にかかわらず生育する通性嫌気性微生物が存在するといわれている。尚、本発明では、通性嫌気性微生物は嫌気性微生物に含まれるものとする。
そして、これら各種の微生物のうち水環境に適した種が増殖し、水浄化作用に寄与するものと考えられている。
【００１７】
これらの中でも、水環境中の硝酸塩の生成に着目すると、例えば、各種の水環境中に存在する微生物には、アンモニアから硝酸塩への変換を行う偏性好気性の細菌であるアンモニア酸化菌細菌と亜硝酸酸化細菌、生成した硝酸塩を窒素ガスに変換する嫌気性の細菌である脱膣菌が含まれると考えられる。そして、これらの細菌を含む微生物により、硝酸塩の生成はある程度制御されるものと思われるが、このような微生物の機能を活性化させ、安定して機能させることは必ずしも容易ではない。
【００１８】
ところが本発明では、上記のように所定の原水とＰＨＡ粒子を用いて培養し、培養の過程で意図的にバイオフィルムを破壊して得られる培養液を水浄化用液として使用し、当該水浄化用液を元の水環境に戻すだけで、水環境中の硝酸塩などの濃度を安定して低下させ、浄化することができるという極めて顕著な効果を奏するものである。
このような効果が得られる詳細な理由は明らかではないが、元の水環境ごとに適した微生物種や量のバランスがあり、採取した原水を培養することで、その水環境ごとに元々存在する、即ちその水環境に適した各種の微生物をバランスよく増やせるため、元の水環境に投入した際に、投入した水浄化液中に含まれる微生物群の作用により、効率よく浄化することができるものと考えられる。
【００１９】
本発明では、上記のように嫌気性微生物を含む微生物群を含有する原水を用いて培養を行う。本発明で原水とは、沼、池、湖、河川、海、湿地帯等の自然界や、観賞用や養殖用等の水槽等の人工装置の水環境から採集したものを意味する。従って、原水には、採取した水環境に応じて、その水環境に適した各種の微生物（微生物群）などが含まれることとなる。また、微生物群には、嫌気性微生物、好気性微生物が含まれ得る。また、上記の自然界には、海などに設けられた養殖場、釣堀などのように、一部に人工的な施設を設けた場所が含まれるものとする。
尚、本発明では、原水のことを単に「水」と称する場合がある。
【００２０】
また、本発明の水浄化用液を、原水を採取した元の水環境に投入して（戻して）、当該水環境の浄化を図る観点からは、その水環境の浄化が期待できる場所から採取するとよい。例えば、沼、池、湖、河川、海、湿地帯等の自然界に存在する水環境の場合は、局所的に水の流れが滞る傾向にある場所から採取するとよい。また、観賞用や養殖用等の水槽等の人工装置の水環境の場合は、人工装置内のみで水を循環させる装置、外部からの流入および外部への排出を行うが装置内での滞留時間が長い装置、などにおける水環境から採取するとよい。本発明の効果をより享受する観点からは、人工装置の水環境から原水を採取するのが好ましく、とりわけ、観賞用や養殖用等の水槽の水環境から原水を採取するのがより好ましい。このような水槽としては、例えば、水族館などで用いられる水槽、観賞用や食用の水生生物を販売する際の展示用の水槽、家庭用の水槽などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。また、このような水槽にて飼育される水生生物としては、特に限定はなく、各種の観賞魚、ハタゴ、ハゼなどの食用魚、海洋性哺乳類、甲殻類、サンゴ、その他の水生動植物などが挙げられ、各種の水生生物を飼育している水槽の水環境に適用可能である。
【００２１】
このような水環境から原水を採取し、所定の培養を行った後に、本発明の水浄化用液を元の水環境に投入する（戻す）ことで、水浄化用液が広範に拡散することなく、水浄化用液に含まれる微生物群の機能が効果的に発揮されるため、元の水環境において硝酸塩などの濃度が低減され、水環境における浄化がより好適に実現される。
【００２２】
本発明で用いるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）からなる粒子におけるＰＨＡとしては、特に限定はないが、例えば、下記式（１）で示される３−ヒドロキシアルカノエート、下記式（２）で示される４−ヒドロキシアルカノエートよりなる繰り返し単位を有するポリマーが挙げられる。
【００２３】
【化１】
2014132831.tif 000003
【００２４】
【化２】
2014132831.tif 000004
【００２５】
（式（１）および（２）中、ＲはＨ又はＣnＨ2n+1で表されるアルキル基で、ｎは１〜１５の整数である。）
【００２６】
式（１）、式（２）のホモポリマーでも良いし、２種以上の組み合わせから成るコポリマー、つまり、ジ−コポリマー、トリ−コポリマー、テトラ−コポリマー、など、またはこれらのホモポリマー、コポリマー等から選ばれる２種以上のブレンド物が挙げられる。中でも、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバリレート（ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ４ＨＢ）が好ましく、Ｒが嵩高いために結晶化度が低くなり、嫌気分解の起きやすい非晶部が多いという点でＰＨＢＨがより好ましい。
本発明では、既に述べたようにＰＨＡが原水に含まれる独立栄養以外の微生物群により資化される。
【００２７】
ＰＨＡからなる粒子（以下、「ＰＨＡ粒子」と称する場合がある。）の形状は、特に限定はなく、粉体状、顆粒状、ペレット状等が挙げられ、培養方法、水浄化用液の水環境への投入の仕方、などによって、適宜選択することができる。
また、粒子の大きさとしては、特に限定はなく、同じく培養方法、水浄化用液の水環境への投入の仕方、などによって、適宜選択することができる。
ＰＨＡからなる粒子として、粉体状のものを用いる場合は、表面積を大きくする観点から微粉体とすることが好ましい場合があるが、粉体の大きさが小さすぎると、原水と混合する際に粉体が舞い上がって作業性が悪化する場合があるため、平均粒径は５０μｍ以上が好ましい。また、このような微粉末の場合は、水に分散した乳化状、懸濁状とすることができる。これにより、原水との混合時に微粉末が舞い上がることがないため、粒子の平均粒径を５０μｍより小さくすることができる。尚、このようなＰＨＡ粒子の乳化液は、５０μｍ以上の粉体と水道水等の水（原水ではないものを用いるのが好ましい。）との混合液をエンドミルなどでＰＨＡ粒子を微細化することで調製することができる。
また、顆粒状、ペレット状の粒子を用いる場合は、表面積を確保する観点から、多孔質状のものを用いるのが好ましい。また、顆粒状、ペレット状の粒子の大きさは、概ね０．５〜１０ｍｍとするとよい。また、その形状は、立方体、直方体、筒状体、球状体、楕円状体など各種の構造を用いることができる。
【００２８】
本発明では、上記の原水とＰＨＡ粒子を混合し、培養を行う。原水とＰＨＡ粒子の混合比は、培養した際に、所望期間内に一定以上のＰＨＡ粒子の表面にバイオフィルムが形成されれば、特に限定はなく、適宜決定することができる。また、外力を負荷する方法によっては、ＰＨＡ粒子表面に形成したバイオフィルムの少なくとも一部が破壊されるようにＰＨＡ粒子表面に剪断力が負荷される程度の混合比であればよい。
また、原水とＰＨＡ粒子以外に、必要により、微生物群の増殖に寄与しうる無機塩類やその他の成分を添加しても良い。
【００２９】
上記の原水とＰＨＡ粒子を混合する際に使用する培養槽としては、特に限定はなく、バッチ式の培養槽を用いても良いし、水環境から原水を連続または断続的に採取（取水）し、連続または断続的に元の水環境へ投入可能な手段を備えた循環式の培養槽であっても良い。
バッチ式の培養槽としては、特に限定はなく、例えば、密封可能な透明もしくは不透明の培養槽の他、フタ付のカップ、ペットボトルといった簡易的なものなどが挙げられる。また、上記の循環式の培養槽としては、微生物の培養などで一般的に用いられる各種の培養槽を用いることができる。尚、循環式の培養槽の場合、培養槽は、水環境から培養槽へと水環境中の水を取水するための取水口と、培養槽から水環境へと培養液を排出するための排出口とを備えるものとして構成することになるが、ＰＨＡ粒子が培養槽から排出することを防止するため、培養槽から元の水環境への排出口やその近傍には、フィルターなどのＰＨＡ粒子が培養槽内から排出されるのを抑制、防止する手段や、排出口やその近傍でＰＨＡ粒子が詰まったり、固まったりすることを抑制、防止するため、撹拌羽などの排出口が閉塞することを防止する手段を設けることが好ましい。
【００３０】
本発明では、上記の原水とＰＨＡ粒子を混合して培養を開始した後、培養を終了するまでの間に、上記の原水とＰＨＡ粒子を混合した培養液に対して、外力を負荷して前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊する。これにより、上述したように、培養液中のＰＨＡ粒子表面および液中の微生物群の数量を効果的に増加させることが可能となる。
【００３１】
上記外力としては、培養液に対して負荷した時に、ＰＨＡ粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊することができれば、特に限定はない。例えば、培養液を撹拌してバイオフィルムに剪断力を付与する手段、培養液を振動させてバイオフィルムに剪断力を付与する手段、などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらの手段は、上記の培養槽の形態に応じて適宜選択することが可能である。
培養槽として、例えば、ペットボトルを使用する場合は、ペットボトル内に適量の培養液を充填し、密栓した状態で、ペットボトルごと振って、内部の培養液を撹拌することで、ＰＨＡ粒子同士の衝突などにより、ＰＨＡ粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊し、剥離させることができる。また、ペットボトルより大型で培養槽ごと振ることが困難な場合は、培養槽内に、撹拌翼、邪魔板などを設けて培養液を撹拌したり、培養槽内の水をポンプなどにより水流を起こして、ＰＨＡ粒子同士を衝突させることなどにより、ＰＨＡ粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊し、剥離させることができる。
さらに、上記の循環式の培養槽を用いる場合は、水環境から原水を取水し、同時に培養槽内から培養液を元の水環境に排水する際に生じる液の流れを利用して培養槽内でＰＨＡ粒子を対流させて、ＰＨＡ粒子同士を衝突させることなどにより、ＰＨＡ粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊し、剥離させることができる。また、同時に培養槽内に撹拌翼、邪魔板などを設けて培養液を撹拌してもよい。
また、何れの培養槽を使用する場合でも、超音波などを用いて培養液を振動させ、キャビテーションによりＰＨＡ粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊し、剥離させることができる。
【００３２】
外力を負荷する時期としては、特に限定はなく、培養開始後、例えば、ＰＨＡ粒子表面にバイオフィルムが形成され、使用したＰＨＡ粒子の略全ての粒子表面がバイオフィルムで被覆された段階で、最初の外力負荷を行い、その後も、ＰＨＡ粒子表面のバイオフィルムの形成状況を確認しながら外力の負荷を行うと良い。ＰＨＡ粒子の表面がバイオフィルムで被覆されると、培養液中の微生物群の増加速度が鈍化する傾向にあるため、バイオフィルムの形成状態が外力負荷時期の指標となり得る。
また、バイオフィルムの形成状況を確認する以外に、培養液中の微生物群の増加速度を概算することも可能である。培養液中の微生物群の増加速度は、例えば、培養液中の微生物群の重量の経時変化を把握することによって概算することが可能である。その方法としては、例えば、経時的に培養液からサンプルを採取し、ろ紙等を用いて微生物群（菌体等）を捕捉するなどして、定法に従って、重量を測定して増加速度を把握することが可能である。
また、上記のように重量の経時変化を求める方法以外には、培養液中の微生物群の菌体数を概算することで、培養液中の微生物群の増加速度を把握することが可能である。菌体数の測定は、寒天等の培地上で培養し、生成したコロニーを教えれば良い。また、嫌気性微生物の数は、市販の嫌気培養パック等を用いて、嫌気条件下で培養し、コロニー数を数えれば良い。本発明では、硝酸塩を減少させるのが狙いであるため、特に嫌気性微生物の菌体数の増加速度が鈍化した時に外力を負荷するのが好ましい。
本発明において、菌体数の増加速度が鈍化した時とは、培養日数と菌体数の関係をグラフにプロットした時に、傾きがゆるやかになった時を意味する。
【００３３】
もっとも、バイオフィルムの形成状況などにかかわらず、定期的に外力の負荷を行っても良い。
【００３４】
本発明では、外力の負荷を行う時期としては、バイオフィルムの形成状況を考慮しつつ、１〜７日に１回行うと良いが、一旦ＰＨＡ粒子の表面にバイオフィルムが形成した後は、経験的に、好ましくは少なくとも７日に１回、より好ましくは３日に１回、さらに好ましくは１日１回である。尚、培養条件にもよるが、培養開始後で、バイオフィルム破壊のための最初の外力の負荷は、バイオフィルムが相応に形成される培養開始後３日以上経過した後に行うのが好ましい。もっとも、条件によっては、１日でも培養液中の微生物群の増殖は認められる場合はあるため、培養開始後１日で外力を負荷してもよい場合はある。
また、外力の負荷の回数は、特に限定はないが、培養液中の微生物群の数量を増加させて水浄化をより効果的に行う観点からは、培養期間中に２回以上負荷するのが好ましい。
【００３５】
培養時の温度は、原水を採取した水環境に準じた温度であれば、特に限定はないが、温度が低すぎると微生物群の増殖速度が下がるため、３℃以上が好ましく、１０℃以上がより好ましい。温度コントロールの容易性を考慮すると、８０℃以下が好ましい。また、温度コントロールを行うことなく、室温（常温）で行うことも可能である。
【００３６】
培養期間は、ＰＨＡ粒子の形態、大きさ、原水の状況、培養温度等の諸条件により異なるため一概には言えないが、培養液中の微生物群を相応に増殖させる観点からは、３日以上が好ましい。もっとも、条件によっては、１日でも培養液中の微生物群の増殖は認められる場合はあるため、培養期間が１日であってもよい場合はある。
【００３７】
本発明の水浄化用液は、上記のように、原水とＰＨＡ粒子とを混合し、所定の処理を行って得られた培養液であるため、培養液中には、バイオフィルムに被覆されたＰＨＡ粒子とバイオフィルム外の微生物群が含まれる。この水浄化用液を、原水を採取した元の水環境になどに投入する際には、水浄化用液の上澄み液（ＰＨＡ粒子を殆ど含まない状態の液）を用いても良いし、懸濁状態のバイオフィルムで被覆されたＰＨＡ粒子を含む液を用いても良い。ＰＨＡは、生分解性が高いポリマーであるため、各種の水環境中に投入されても、各種の環境中で、分解され、消失しやすいため、元の水環境を悪化させることは殆どないと考えられる。
【００３８】
本発明の水浄化方法は、自然界または人工装置の水環境から採取した、嫌気性微生物を含む微生物群を含有する原水と、ポリヒドロキシアルカノエートからなる粒子と、を混合して培養を開始した後培養終了までの間に、嫌気性微生物の菌体数の増加速度が鈍化した時に、外力を負荷して前記粒子表面に形成されたバイオフィルムの少なくとも一部を破壊して得られた培養液の少なくとも一部を、前記原水を採取した前記水環境に投入するものである。
【００３９】
即ち、本発明の水浄化方法は、上述した本発明の水浄化用液（培養液でもある）を、原水を採取した元の水環境に投入する（戻す）ものである。従って、共通する部分の詳細な説明は、省略する。
本発明の水浄化方法においては、元の水環境に投入する培養液の投入方法としては、元の水環境の状況に応じて行えばよい。例えば、原水を用いて予め調製した水浄化用液を、各所に適量ずつ定期的に散布する方法、浄化対象とする水環境の近辺に、１ヶ所以上循環式の培養槽を設置して、連続的または断続的に、原水の採取とともに培養液（水浄化用液）の投入を行う方法などが挙げられる。
また、この際の、培養液（水浄化用液）を元の水環境に投入する量としては、その環境に応じて適宜決定すればよく、一概にはいえないが、一度に多量の培養液を投入すると、原水を採取した元の水環境中の微生物バランスが崩れる可能性があるため、硝酸塩濃度などを測定し、状況を確認しながら少量ずつ、投入するのが好ましい。
【００４０】
また、培養液の投入方法によっては、予め調製した培養液（水浄化用液）が減少するため、同じ水環境から原水を再び採取して培養槽に添加してもよいし、必要に応じてＰＨＡ粒子も添加してよい。そして、これらを適宜添加した後に、上述したように、外力を付与しつつ、培養を行い、培養液（水浄化用液）を調製するとよい。
【００４１】
本発明の水浄化方法を、特に、水生生物を飼育している水槽の水環境に適用した場合、水槽中の水の硝酸塩濃度を０〜５０ｍｇ／Ｌにすることが可能である。
【００４２】
本発明の水槽用リアクターは、主として、上述した本発明の水浄化用液を調製する際に用いた培養槽および、外力を負荷する手段を備えたものである。また、原水を採取する水環境が、水生生物を飼育している水槽内の水環境の場合に特に好適に使用可能である。従って、共通する部分の詳細な説明は、省略する。
本発明の水槽用リアクターは、水槽内からの原水が直接培養槽内に流入するように水槽と接続しても良いし、濾過材システムを介して接続しても良い。濾過材システムでは、原水に含まれる微生物群が濾過材の部分に一部捕捉、維持され、水槽用リアクターへ供給される微生物群の種を調整することができる場合がある。濾過材の材質は特に限定は無く、市販の濾過材を適宜選択して使用することできる。例えば、各種の繊維、多孔質の石、などが挙げられる。また、濾過材において、リン酸塩が堆積する場合があるため、濾過材を定期的に交換すれば、水槽内の水環境からリン酸塩などのリン原子含有物を除去できる場合がある。
【００４３】
以下では、本発明の水槽用リアクターおよびそれを備えた水槽の実施形態を、図面をもとに説明する。
【００４４】
図１は、本発明の水槽用リアクターを備えた水槽の実施形態の一例を示した図である。図１に示した例では、主要な構成として、水槽１０、水槽用リアクター２０および濾過材システム３０とを備えたものである。また、図示しないが、水槽には、通気用ポンプ、水槽内の水温を調整するためのヒーター、などの水生生物飼育のための各種の装置を配しても良い。
【００４５】
本例では、水槽１０内の原水１１を排水管１２の排水口１５からオーバーフローさせ、濾過材システム３０の濾過容器３２と排水管１２との連結部に設けられた受水口３１から原水１１を濾過材システム３０内に通水させる。原水１１は、濾過容器３２の濾過空間３３に配された濾過材３４を通って、空間３５に至る。本例では、濾過容器３２は、濾過空間３３と空間３５とは複数の小孔３８を備えた分離板３７により分割されている。空間３５内の濾過原水１１’は、排水口３６からポンプ４０により水槽用リアクター２０へ送液される。
【００４６】
尚、原水１１の濾過を行わない場合は、濾過材３４を配さないようにしたり、濾過材システム３０全体（符号３０〜３８）を用いないようにしたりして構成すればよい。
【００４７】
水槽用リアクター２０の培養槽２１には、その略中心部の上部から下部に亘り取水管２２が配され、取水管２２の下部の取水口２３から、濾過原水１１’が培養槽２１内へ送液される。培養槽２１は、筒状の形状を有し、その下部には培養槽内の培養液２４、ＰＨＡ粒子２５が滞留することなく流動することができるように、傾斜面２１ａが設けられている。そして、培養槽２１の略中心部の底部に配された取水口２３から流入する濾過原水１１’が傾斜面２１ａにより上昇流を形成し（図１中の矢印２７参照）、上昇流によりＰＨＡ粒子２５は特に培養槽２１の側壁面部分で上昇する。傾斜面２１ａは、２つ以上の平面にて構成されてもよいし、局面にて構成されてもよく、培養槽２１の形状などに応じて適宜決定することができる。一方上昇したＰＨＡ粒子は、培養槽２１の上部の上壁面２１ｂに突き当たると取水管２２付近で下降し、培養液２４の一部は、培養槽２１の側壁上側に側壁から突出して設けられた排水部２９の排出口２９ａから排出され、水槽１０へと投入される。このように、本例では、上述した培養槽２１内でのＰＨＡ粒子が上昇および下降する際にＰＨＡ粒子同士が衝突することで、ＰＨＡ粒子表面に形成されたバイオフィルムが破壊されることになる。また、図示しないが、他のバイオフィルムを破壊するための構成として、培養槽２１内に超音波振動子を配したり、培養槽２１の外部から超音波を照射するように構成しても良い。
【００４８】
また、培養液の温度を調整する場合は、培養槽２１内にヒーターを設けても良いし、培養槽２１外部にジャケットなどを配しても良い。
【００４９】
本例では、上記のように、培養槽２１の側壁上側に側壁から突出し、培養槽２１内と連通する排水部２９を設けている。また、排出部２９の上側の壁面には、水槽１０へと連通する排出口２９ａを設けるとともに、フィルター２８を設けている。さらに、排出部２９の内側側壁部には、撹拌羽２６が配され、撹拌羽２６が回転することにより、培養槽２１内へ向かう流れ、フィルター２８へ向かう流れなどが生じ、排出口２９ａやその近傍（例えばフィルター２８）でＰＨＡ粒子が詰まったり、固まったりすることを抑制、防止することができる。
【００５０】
フィルター２８は、培養液２４（水浄化用液）が通過可能で、ＰＨＡ粒子２５の通過を抑制、防止可能な小孔などが配されていれば、その構成は問わない。
【００５１】
水槽用リアクター２０の排出口２９ａから排出された培養液２４（水浄化用液でもある。）は、水槽１０の注水管１３を介して注水口１４から水槽１０内へ投入される。尚、本例では、注水管１３は排水管１２内部に配され、注水管１２の側壁に設けられた開口部から注水管１３の下部が突出するように構成されているが、その他の構成を採用してもよい。
【００５２】
以上のような構成により、ポンプ４０を作動させて、水槽１０内の原水を取水して水槽用リアクター２０で培養し、培養液２４の一部を水槽１０内へ投入することができる。そして、ポンプ４０を作動させているうちに、水槽用リアクター２０の培養槽２１内では、ＰＨＡ粒子表面へのバイオフィルムの形成とともに、ＰＨＡ粒子の流動とその衝突により、バイオフィルムの破壊が連続的、即ち１回または２回以上起こり、培養槽２１内の微生物群の増殖が図られる。尚、ポンプ４０を停止させた場合でも、バイオフィルムの少なくとも一部を破壊して、培養槽２１内の微生物群の増殖を図る場合は、図示しない他の撹拌羽、超音波振動子を培養槽２１内に配するなどすればよい。このような構成を採用することにより、断続的な培養液２４の水槽１０内への投入も可能である。
【００５３】
尚、水槽用リアクター２０を用いない場合は、濾過材システム３０の排水口３６と水槽用リアクター２０の取水管２２との間、および、水槽用リアクター２０の排水口２９ａと取水管１３との間に、それぞれ配された３方コック４１を用いることにより、排水口３６と注水管１３とを直接連通させると良い。そして、その間、上述したペットボトルを用いて調製した培養液（水浄化用液）を水槽１０内に投入するようにしても良い。
【００５４】
図２は、本発明の水槽用リアクターを備えた水槽の実施形態の他の例を示した概略図である。図２に示すように、本実施形態では、図１における水槽１０に代えて、６台の水槽１０ａ〜１０ｆを使用している点で異なる。濾過材システム３０、水槽用リアクター２０およびこれらの連結部分の構成は、図１に示した構成と実質的に同じであるので、これらの詳細な説明は省略し、同じ構成には同一の符号を付した。また、各水槽１０ａ〜１０ｆ、排水管１２ａ〜１２ｆ、注水管１３ａ〜１３ｆの構成も、それぞれ、図１に示した水槽１０、排水管１２、注水管１３の構成と同じであるので、詳細な説明は省略する。尚、本例では６台の水槽を繋げた例を示しているが、適宜変更することができる。
【００５５】
本実施形態では、水槽１０ａ〜１０ｆ内の原水１１ａ〜１１ｆが、全て一つの濾過材システム３０と水槽用リアクター２０へと通水される。そして、水槽用リアクター２０において培養された培養液が水浄化用液として各水槽１０ａ〜１０ｆに投入される（戻される）。尚、図２中の各矢印は、流れ方向を示したものである。本実施形態は、同種の水生生物を別々の水槽にて飼育する場合に好適である。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５７】
（硝酸塩濃度測定法）
水槽中の水を定期的にサンプリングし、レッドシー社製「ＮＯ３テスター」を用いて測定した。
【００５８】
（製造例１）  ３ＨＨ率１２ｍｏｌ％のＰＨＢＨの作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてＡ．ｃａｖｉａｅのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。Ａ．ｃａｖｉａｅのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１および配列番号２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＥｃｏＲＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−５Ｐ＋Ｅｃｏとした。
次に、特開２００８−０２９２１８号公報［００３８］に記載のＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定し、以下の手順で該遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
特開２００８−０２９２１８号公報［００３６］に記載のＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号３および配列番号４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏとした。
ＰＡｃ−５Ｐ＋ＥｃｏおよびＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号２で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で５０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をｂＰａｃ−５Ｐ＋Ｂａｍとした。
次に、該遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号５および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。
ｂＰａｃ−５Ｐ＋ＢａｍとＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをｂＡＯ／ｐＢｌｕとした。ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。
続いて、特開２００８−０２９２１８号公報［００３７］に記載のｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＡＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。
【００５９】
＜遺伝子挿入株Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
次に、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。遺伝子挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換した。得られた形質転換体をＫＮＫ−００５ＡＳ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して２回目の組換えが生じた株を取得した。さらにＰＣＲによる解析により所望の遺伝子挿入株を単離した。
この遺伝子挿入株をＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
【００６０】
＜ｃｃｒ遺伝子のクローニング及び発現ユニット構築＞
クロトニル−ＣｏＡを、３ＨＨモノマーの前駆体であるブチリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードするｃｃｒ遺伝子を、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）Ｏｋａｍｉ株（ＤＳＭ  １０４２）の染色体ＤＮＡからクローニングした。配列番号７及び配列番号８記載のＤＮＡをプライマーとしＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、６８℃で９０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩで切断した。ＥＥ３２ｄ１３断片（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１（１９９７））を、ｐＵＣ１９ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、このプラスミドをＢｇｌＩＩとＡｆｌＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩ断片としたｃｃｒ遺伝子と断片を置換することによってｃｃｒ発現ユニットを構築した。
【００６１】
＜ｐｈａＣ遺伝子のクローニング及び発現ユニット調製＞
配列番号１１を含むｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製した。特開２００７−２２８８９４号公報［００３１］に記載のＨＧ：：ＰＲｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕを鋳型とし、配列番号９と配列番号１０に示すプライマーとしてＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＳｐｅＩで切断して発現ユニットを調製した。
発現ベクターｐＣＵＰ２−６３１は以下のようにして構築した。
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒにおける発現ベクター構築用のプラスミドベクターとしては、国際公開公報ＷＯ／２００７／０４９７１６号公報［００４１］に記載のｐＣＵＰ２を用いた。まず実施例７で構築したｃｃｒ遺伝子発現ユニットをＥｃｏＲＩ処理により切り出し、この断片をＭｕｎＩで切断したｐＣＵＰ２と連結した。次に実施例８で作製したｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製し、ｃｃｒ遺伝子発現ユニットを含むｐＣＵＰ２のＳｐｅＩ部位に挿入してｐＣＵＰ２−６３１ベクターを構築した。
【００６２】
＜形質転換体の作製＞
ｐＣＵＰ２−６３１ベクターの種々の細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体を取得した。
【００６３】
＜形質転換体の培養＞
上記で作製した形質転換体の培養を行った。前培地の組成は１％（ｗ／ｖ）Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９％（ｗ／ｖ）Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、および、０．１５％（ｗ／ｖ）ＫＨ2ＰＯ4で、ｐＨ６．７に調整した。
ポリエステル生産培地の組成は１．１％（ｗ／ｖ）Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．１９％（ｗ／ｖ）ＫＨ2ＰＯ4、０．６％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５％（ｖ／ｖ）微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、１％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１６％（ｗ／ｖ）ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１２％（ｗ／ｖ）ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＣｒＣｌ3・６Ｈ2Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源としてＰＫＯＯ（Ｐａｌｍ  ｋｅｒｎｅｌ  ｏｌｅｉｎ、パーム核油オレイン画分）を流加する流加培養にて行った。
それぞれの形質転換体のグリセロールストックを前培地に接種して２０時間培養し、２．５Ｌのポリエステル生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤ−５００型）に１０％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍとし、ｐＨは６．６から６．８の間でコントロールした。コントロールには１４％のアンモニア水を使用した。培養は６５時間まで行った。培養後遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、ＰＨＢＨを得た。
生産されたポリエステルの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＢＨの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＢＨ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰＨＢＨ分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、３ＨＨ比率が１２％のＰＨＢＨであった。重量平均分子量は約６６万、Ｔｇは０℃であった。
【００６４】
（実施例１）
５００ｍｌペットボトルに製造例１で作製したＰＨＢＨの粉体（平均粒子径１５０μｍ）を約３０ｇとサンゴを飼育している水槽（水量：４００Ｌ）から採取した原水約４００ｍＬを入れた。この時点を培養開始とした。ペットボトルにフタをして、約５秒間強めにボトルを振って攪拌した。その後フタを閉めた状態で室温にて静置した。その後、１日に１回、約５秒間強めに振って攪拌した。
培養液を元の水槽に戻す前に水槽中の水の硝酸塩濃度を上記の方法にて測定し、測定値から培養液（水浄化用液）を水槽に投入する量を設定した。硝酸塩濃度が５０ｍｇ／Ｌ以上の場合は水槽の水量１００Ｌに対し培養液を１０ｍＬ、２５ｍｇ／Ｌ以上５０ｍｇ／Ｌ未満の場合は１００Ｌに対し４ｍＬ、２５ｍｇ／Ｌ未満の場合は１００Ｌに対し１ｍＬとした。
最初の硝酸塩濃度測定は、培養開始から７２時間後に行い、それを１日目とし、測定直後に培養液を戻した。その後は、２日目、３日目、４日目、７日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、２０日目に培養液を投入した。硝酸塩濃度の経時測定結果を図３（ａ）に示す。
水槽（１５００ｍｍ×５００ｍｍ×６００ｍｍ）は、水量４００Ｌで、水をオーバーフローにて循環させ、濾過材を用いないナチュラルシステムとした。
【００６５】
（実施例２）
ハタゴを飼育している水量２００Ｌの水槽（１１００ｍｍ×４００ｍｍ×４５０ｍｍ）を水環境として用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で、培養と水槽への培養液（水浄化用液）の投入を行い、硝酸塩濃度を測定した。硝酸塩濃度の経時測定結果を図３（ｂ）に示す。
【００６６】
（実施例３）
ハゼを飼育している水量２５０Ｌの水槽（１２００ｍｍ×４５０ｍｍ×４５０ｍｍ）を水環境として用い、濾過材システムを用いて水槽内の水を循環させたことを除き、実施例１と同様の方法で、培養と水槽への培養液（水浄化用液）の投入を行い、硝酸塩濃度を測定した。硝酸塩濃度の経時測定結果を図３（ａ）に示す。
【００６７】
（実施例４）
観賞魚を飼育している、１つの濾過材システムを介して６台が繋がった水槽（各水槽の大きさは全て６９０ｍｍ×４００ｍｍ×４００ｍｍとし、総水量は７００Ｌとした。）を水環境として用いこと以外は、実施例１と同様の方法で、培養と水槽への培養液（水浄化用液）の投入を行い、各水槽の硝酸塩濃度を測定した。硝酸塩濃度（各水槽の測定値の平均値）の経時測定結果を図３（ｂ）に示す。尚、６台の繋がった水槽の構成と濾過材システムについては、図２に準じたものである。
【００６８】
（実施例５）
観賞魚を飼育している、１つの濾過材システムを介して４台が繋がった水槽（各水槽の大きさは全て６９０ｍｍ×４００ｍｍ×４００ｍｍとし、総水量は７００Ｌとした。）を水環境として用いこと以外は、実施例１と同様の方法で、培養と水槽への培養液（水浄化用液）の投入を行い、各水槽の硝酸塩濃度を測定した。硝酸塩濃度（各水槽の測定値の平均値）の経時測定結果を図３（ａ）に示す。尚、４台の繋がった水槽の構成と濾過材システムについては、図２に準じたものである。
【００６９】
図３（ａ）、（ｂ）に示す実施例１から５の結果から、硝酸塩濃度を低いレベルで制御できていることが分かる。
尚、培養液（水浄化用液）を水槽に投入した直後に、その水槽内での硝酸塩の濃度が増加する場合があったが（例えば図３（ａ）において、実施例５の２０日目と２１日目参照。）、一定期間経過後には低下した。この原因は明らかではないが、水環境中に存在する各種の微生物のバランスがより望ましいバランスに移行する過程で一時的に硝酸塩が増えたものと推測される。
【００７０】
（比較例１）
培養液を水槽に投入しなかったことを除き、実施例３と同様にして、硝酸塩濃度を測定した。硝酸塩濃度の経時測定結果を図３（ｂ）に示す。５日目以降は常に２５０ｍｇ／Ｌを超える高い値であった。尚、図では５日目以降は省略した。
【００７１】
（比較例２）
培養液を一度も攪拌しないこと以外は、実施例３と同様にして、培養と水槽への培養液（水浄化用液）の投入を行い、硝酸塩濃度を測定した。硝酸塩濃度の経時測定結果を図３（ｂ）に示す。１４日目以降は常に２５０ｍｇ／Ｌを超える高い値であった。尚、図では１４日目以降は省略した。
【符号の説明】
【００７２】
１０、１０ａ〜１０ｆ  水槽
１１、１１ａ〜１１ｆ  原水
１１’  濾過原水
１２、１２ａ〜１２ｆ  排水管
１３、１３ａ〜１３ｆ  注水管
１４  注水口
１５  排水口
２０  水槽用リアクター
２１  培養槽
２１ａ  傾斜面
２１ｂ  上壁面
２２  取水管
２３  取水口
２４  培養液（水浄化用液）
２５  ＰＨＡ粒子
２６  撹拌羽
２７  矢印
２８  フィルター
２９  排水部
２９ａ  排水口
３０  濾過材システム
３１  受水口
３２  濾過容器
３３  濾過空間
３４  濾過材
３５  空間
３６  排水口
３７  分離板
３８  小孔
４０  ポンプ
４１  ３方コック
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年12月28日(2011.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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