(57)【要約】      （修正有）【課題】抗がん剤を局所的に送達する薬物送達系（Drug Delivery System：ＤＤＳ）の提供【解決手段】下記一般式（１）で表される膨張化炭素繊維（ＥｘＣＦｓ）に抗がん成分（Ｘ）が結合されてなる抗がん剤。2014084296.tif 000018【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膨張化炭素繊維に抗がん成分が結合されてなる抗がん剤。
【請求項２】
下記一般式（１）で表される、請求項１に記載の抗がん剤
【化１】
2014084296.tif 000014
（式（１）中、
ＥｘＣＦｓは、膨張化炭素繊維を表し、
Ａは、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、
Ｌは、単結合又はリンカーを表し、ここでリンカーは、−（ＣＨ２）ｍ１−（ここでｍ１は、１〜２２の整数を表す。）で表されるポリエチレン鎖、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ２−（ここでｍ２は、１〜５０の整数を表す。）で表されるポリエチレングリコール鎖、−（ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ））ｍ３−（ここでｍ３は、１〜５０の整数を表す。）で表されるポリビニルアルコール鎖、及び、−ＭＳｍ４−で表される糖鎖（ここでＭＳは、各々独立に、二価の単糖成分を表し、ｍ４は、１〜３０の整数を表す。）から選択され、
Ｘは、抗がん成分を表し、
ｎは、式（１）の抗がん剤１ｇ当たり１００〜５０００μモルに相当する整数を表す。）。
【請求項３】
Ｘが、一般式（２）で表される、請求項２に記載の抗がん剤
【化２】
2014084296.tif 000015
（式（２）中、
Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子又はアルキル基を表すか、或いは、Ｒ１及びＲ２は互いに結合して、Ｒ１及びＲ２が夫々結合する炭素原子と共に、無置換又は置換の５又は６員の炭化水素環を形成していてもよく、
Ｒ３及びＲ４は各々独立に、ハロゲン、水酸基、又はＣ１〜６アルコキシ基を表すか、或いは、Ｒ３及びＲ３は互いに結合して、式（３）で表される環構造を形成していてもよい
【化３】
2014084296.tif 000016
（式（３）中、
Ｒ１１及びＲ１２は各々独立に、水素原子を表すか、或いは、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合して、Ｒ１１及びＲ１２が結合する炭素原子と共に、無置換又は置換の３〜６員の炭化水素環又は複素環を形成していてもよく、
Ｗは、単結合又は−Ｃ（＝Ｏ）−を表す。）。）。
【請求項４】
一般式（４）で表される膨張化炭素繊維誘導体
【化４】
2014084296.tif 000017
（式（４）中、ＥｘＣＦｓ、ｎ、Ｌ、Ｒ１及びＲ２は、請求項２の式（１）及び請求項３の式（２）と同じ定義を表す。）。
【請求項５】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗がん剤と、医薬的に許容し得る一又は二以上の賦形剤とを含む製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膨張化炭素繊維を用いた抗がん剤、及び、膨張化炭素繊維誘導体に関する。より具体的には、膨張化炭素繊維に抗がん成分が結合されてなる抗がん剤と、斯かる抗がん剤の中間体又は前駆体等として有用な膨張化炭素繊維誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗がん剤による化学療法は、原発病変を局所的に縮小すると共に遠隔転移を抑制するための主要な方策であり、薬物の効力は生存率に大きな影響を及ぼす。抗がん剤の毒性は腎臓や肝臓、更には他の身体器官に重篤な副作用を及ぼすため、抗がん剤を局所的に送達するより効率的な薬物送達系（Drug Delivery System：ＤＤＳ）の開発は、副作用低減の観点のみならず薬効向上の面からも極めて重要である。
【０００３】
抗がん剤のＤＤＳとしては、リポソームや高分子ミセル等が臨床段階で使用されており、がん治療に有効であることが示されている。しかし、更なる選択性や安定性の改善、生体適合性の調整、毒性低減等を目指して、現在でも新たなキャリアの開発が行われている。
【０００４】
特に、抗がん剤として現在一般に用いられている低分子薬剤は、１）標的となる病変部位だけでなく、正常細胞にも薬剤が分布してしまう、２）代謝のために血液滞留時間が短く、有効な血中濃度が維持できない、等の課題を有するため、実際の必要量よりも遥かに多量の薬剤を、しかも繰り返し投与しなければならない。斯かる低分子薬剤に伴う欠点を克服し、治療効率の向上や副作用の低減等を達成することが可能な、抗がん剤の新たなＤＤＳキャリアが望まれていた。
【０００５】
斯かる新たなＤＤＳキャリアの候補として、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン、グラフェン等のナノ炭素材料が注目されている（特許文献１〜４、非特許文献１〜４等参照）。ナノサイズの粒子は、生体から代謝されずに長時間体内に滞留することができると考えられる。また、粒径の小さい粒子は、腫瘍に効果的に集積し易いとの報告もある（ＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention）効果）。よって、ナノ炭素材料をＤＤＳのキャリアとして用いれば、薬物の血中循環時間や血中濃度を維持しつつ、多量の薬剤を目標の病変部位へ選択的に輸送し、効率的に薬効を作用させることができ、治療効率の向上や副作用の低減等を達成できると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−２９２４２６号公報
【特許文献２】特開２００５−３４３８８５号公報
【特許文献３】特開２００９−７８９７９号公報
【特許文献４】特開２００９−７８９９９３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Z. Liu, X. Sun, N. Nakayama-Ratchford, H. Dai, ACS NANO., 2007, 1, 1, 50-56
【非特許文献２】K. Ajima, M. Yudasaka, T. Murakami, A. Maigne, K. Shiba, S. Iijima, MOLECULAR PHARMACEUTICS., 2005, 2, 6, 475-480
【非特許文献３】P. Chaudhuri, A. Paraskar, S. Soni, R. A. Mashelkar, S. Swngupta, ACS NANO., 2009, 3, 9, 2505-2514
【非特許文献４】K. Yang, J. Wan, S. Zhang, Y. Zhang, S. T. Lee, Z. Liu, ACS NANO,. 2011, 5, 1, 516-522
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来のカーボンナノチューブ等のナノ炭素材料をキャリアとする抗がん剤は、薬効の向上や製造コストの削減等の面で、更に改善の余地があった。
【０００９】
以上に鑑み、本発明の目的は、ナノ炭素材料をキャリアとする抗がん剤であって、従来のカーボンナノチューブ等のナノ炭素材料をキャリアとする抗がん剤よりも、薬効に優れると共に、低コストで製造可能な抗がん剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、新たな薬物キャリアの候補となるナノ炭素材料として、膨張化炭素繊維に着目した。そして、膨張化炭素繊維に抗がん成分を担持させることにより、意外にも、従来のカーボンナノチューブ等のナノ炭素材料を薬物キャリアとする抗がん剤と比べて、薬理効果に優れ、低コストで製造できる等の利点を有する抗がん剤が得られることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
従って、本発明の主旨は、以下に存する。
［１］膨張化炭素繊維に抗がん成分が結合されてなる抗がん剤。
［２］下記一般式（１）で表される、［１］の抗がん剤
【化１】
2014084296.tif 000002
（式（１）中、
ＥｘＣＦｓは、膨張化炭素繊維を表し、
Ａは、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、
Ｌは、単結合又はリンカーを表し、ここでリンカーは、−（ＣＨ２）ｍ１−（ここでｍ１は、１〜２２の整数を表す。）で表されるポリエチレン鎖、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ２−（ここでｍ２は、１〜５０の整数を表す。）で表されるポリエチレングリコール鎖、−（ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ））ｍ３−（ここでｍ３は、１〜５０の整数を表す。）で表されるポリビニルアルコール鎖、及び、−ＭＳｍ４−で表される糖鎖（ここでＭＳは、各々独立に、二価の単糖成分を表し、ｍ４は、１〜３０の整数を表す。）から選択され、
Ｘは、抗がん成分を表し、
ｎは、式（１）の抗がん剤１ｇ当たり１００〜５０００μモルに相当する整数を表す。）。
［３］Ｘが、一般式（２）で表される、［２］の抗がん剤
【化２】
2014084296.tif 000003
（式（２）中、
Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子又はアルキル基を表すか、或いは、Ｒ１及びＲ２は互いに結合して、Ｒ１及びＲ２が夫々結合する炭素原子と共に、無置換又は置換の５又は６員の炭化水素環を形成していてもよく、
Ｒ３及びＲ４は各々独立に、ハロゲン、水酸基、又はＣ１〜６アルコキシ基を表すか、或いは、Ｒ３及びＲ３は互いに結合して、式（３）で表される環構造を形成していてもよい
【化３】
2014084296.tif 000004
（式（３）中、
Ｒ１１及びＲ１２は各々独立に、水素原子を表すか、或いは、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合して、Ｒ１１及びＲ１２が結合する炭素原子と共に、無置換又は置換の３〜６員の炭化水素環又は複素環を形成していてもよく、
Ｗは、単結合又は−Ｃ（＝Ｏ）−を表す。）。）。
［４］一般式（４）で表される膨張化炭素繊維誘導体
【化４】
2014084296.tif 000005
（式（４）中、ＥｘＣＦｓ、ｎ、Ｌ、Ｒ１及びＲ２は、請求項２の式（１）及び請求項３の式（２）と同じ定義を表す。）。
［５］［１］〜［３］の何れか一項に記載の抗がん剤と、医薬的に許容し得る一又は二以上の賦形剤とを含む製剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の膨張化炭素繊維を用いた抗がん剤は、従来のカーボンナノチューブ等のナノ炭素材料をキャリアとする抗がん剤と比べて、薬効に優れると共に、より低コストで製造可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１（ａ）及び（ｂ）は、ＥｘＣＦｓのＳＥＭ画像である。
【図２】図２は、ＥｘＣＦｓの粒度分布を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）及び（ｂ）は、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓのＳＥＭ画像である。
【図４】図４は、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓのＸＰＳ分析結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓのＸＰＳ分析結果を示すグラフである。
【図６】図６（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ蛍光標識ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ及び蛍光標識ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓの転移性肺病変細胞への取り込みを示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ及びＣＤＤＰ−ＣＮＴｓのＣＤＤＰ濃度と細胞生存率との関係を示すグラフである。
【図８】図８（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ無添加、ＣＮＴｓ、ＥｘＣＦｓ、遊離ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ、及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ添加細胞のＴＵＮＥＬ染色写真である。
【図９】図９は、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ及びＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ添加組織における開裂カスパーゼ３、開裂ＰＡＲＰ−１、及びＢａｘの濃度を示すウエスタンブロット分析結果である。
【図１０】図１０は、ＥｘＣＦｓ投与群、遊離ＣＤＤＰ投与群、及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ投与群におけるマウスの、投与後２０日及び４０日における肺転移腫瘍の画像である。
【図１１】図１１は、ＥｘＣＦｓ投与群、遊離ＣＤＤＰ投与群、及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ投与群におけるマウスの累積生存率を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ及びＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ投与マウスの腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。（ａ）は原発病変、（ｂ）は肺転移腫瘍を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．概要
本発明は、膨張化炭素繊維をＤＤＳキャリアとして、これに抗がん成分を結合させ、抗がん剤とするものである。
【００１５】
膨張化炭素繊維とは、既存の炭素繊維を、高温処理や電気化学的処理等により、ナノメーターサイズの繊維に微細化したものである。膨張化炭素繊維については種々の報告がなされているが（例えば特開２００６−２４９５４６号公報、特開２００８−１６３２７４号公報、特開２００８−１６６６４１号公報、特開２０１０−１１１９９０号公報等）、抗がん剤等の薬物キャリアとしての検討は全くなされていなかった。
【００１６】
本発明者等は、種々のナノ炭素材料の中から、抗がん剤等の薬物キャリアの候補として、新たに膨張化炭素繊維に着目し、検討を行った。その結果、膨張化炭素繊維に抗がん成分を担持させて抗がん剤とすることにより、これまで有力な薬物キャリア候補と看做されてきたカーボンナノチューブを用いた抗がん剤と比べて、抗がん剤を標的部位に効率的に送達することができ、より顕著な抗がん作用及び転移抑制作用が得られることを見出した。このような結果は、従来の知見からは全く予想できない、極めて意外なものである。
【００１７】
また、膨張化炭素繊維は、カーボンナノチューブやフラーレン等の他のナノ炭素材料と比較して、比較的安価且つ容易に製造できる。従って、膨張化炭素繊維を抗がん剤のキャリアとして用いることにより、カーボンナノチューブをキャリアとした場合と比較して、薬効及び製造コストの両面において、より優れた抗がん剤を得ることができる。
以下、まず膨張化炭素繊維について説明した上で、それを用いた本発明の抗がん剤について説明する。
【００１８】
２．膨張化炭素繊維
（１）膨張化炭素繊維の特徴
本発明の抗がん剤に使用される膨張化炭素繊維は、特に制限されないが、親水性を向上させ、薬剤キャリアとしての特性を高める観点からは、表面に酸性官能基を有することが好ましく、その量が多いことが好ましい。ここで酸性官能基とは、ルイスの定義による酸の性質を示す基をいうが、通常は酸素原子を含有する基である。膨張化炭素繊維が有する主な酸性官能基の例としては、カルボキシル基と水酸基が挙げられ、さらに、加水分解、もしくは酸化還元後にカルボキシル基と水酸基に変換可能なアルコキシ基、酸無水物基、エーテル基、ケトン基、エポサイド等も含まれる。本発明では、膨張化炭素繊維に親水性を付与する観点から、膨張化炭素繊維が有する酸性官能基の量が、通常１０００ｍｏｌ／ｇ以上、中でも２０００ｍｏｌ／ｇ以上、更には３０００ｍｏｌ／ｇ以上であることが好ましい。上限は特に制限されないが、膨張化炭素繊維の作成とその加工との視点から、通常１５０００ｍｏｌ／ｇ以下、中でも１２０００ｍｏｌ／ｇ以下であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明の抗がん剤では、後述のように、膨張化炭素繊維の表面に存在するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）により形成される結合基に、抗がん成分が結合することが好ましい。よって、膨張化炭素繊維としては、所定の割合以上のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含むものが好ましい。具体的には、膨張化炭素繊維の有するカルボキシル基の割合が、通常１０００ｍｏｌ／ｇ以上、中でも２０００ｍｏｌ／ｇ以上、更には３０００ｍｏｌ／ｇ以上であることが好ましい。上限は特に制限されないが、膨張化炭素繊維の合成条件とその反応性の観点からは、通常１５０００ｍｏｌ／ｇ以下、中でも１２０００ｍｏｌ／ｇ以下であることが好ましい。
【００２０】
なお、膨張化炭素繊維が有する酸性官能基及びカルボキシル基は、例えばフーリエ変換赤外分光法（Fourier Transform Infrared Spectroscopy：ＦＴ−ＩＲ）から定性分析が、不活性ガス下での昇温にともなう二酸化炭素発生（カルボキシル基など由来）量と一酸化炭素発生量（水酸基など由来）から定量分析が可能である。詳細には、例えば、実施例に記載の手法を用いることができる。
【００２１】
本発明の膨張化炭素繊維のサイズは、制限されるものではないが、例えば以下のとおりである。
膨張化炭素繊維の平均径の下限は、炭素繊維自身がアレルゲンになるのを防止する観点から、通常５０ｎｍ以上、中でも６０ｎｍ以上、更には８０ｎｍ以上の範囲であることが好ましい。一方、膨張化炭素繊維の平均径の上限は、細胞に排除されず効果的に取り込まれるという観点から、通常１０００ｎｍ以下、中でも７５０ｎｍ以下、中更には５００ｎｍ以下の範囲であることが好ましい。
【００２２】
膨張化炭素繊維の平均長の下限は、炭素繊維自身がアレルゲンになるのを防止する観点から、通常５０ｎｍ以上、中でも６０ｎｍ以上、更には８０ｎｍ以上の範囲であることが好ましい。一方、膨張化炭素繊維の平均長の上限は、細胞に排除されず効果的に取り込まれるというという観点から、通常２μｍ以下、中でも１μｍ以下、中更には６００ｎｍ以下の範囲であることが好ましい。
【００２３】
なお、膨張化炭素繊維の平均径及び平均長は、例えば走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope：ＳＥＭ）等によって測定することが可能である。詳細には、例えば、実施例に記載の手法を用いることができる。
【００２４】
（２）膨張化炭素繊維の製法
このような膨張化炭素繊維は、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程によって製造することができる。
（ａ）原料炭素繊維から層間化合物を調製する工程
（ｂ）層間化合物を加熱処理することにより、膨張化炭素繊維を調製する工程
（ｃ）膨張化炭素繊維の表面酸化処理を行うことにより、膨張化炭素繊維の表面の全酸性官能基を上昇させると共に、カルボキシル基の割合を増加させる工程
以下、各工程について具体的に説明する。
【００２５】
（ａ）層間化合物の調製工程
・原料炭素繊維：
炭素繊維には、ピッチ系炭素繊維、ＰＡＮ系炭素繊維、レーヨン系炭素繊維、気相成長炭素繊維などがあるが、本工程で用いる原料炭素繊維としては、いずれも特に制限無く用いることができる。但し、膨張化炭素繊維が得られ易いことから、ピッチ系炭素繊維、気相成長炭素繊維およびＰＡＮ系炭素繊維が好適である。また、ピッチ系炭素繊維の中でも、特に黒鉛化され易く、膨張化炭素繊維が得られ易いことから、光学的異方性相を含むピッチ系炭素繊維、即ちメソフェーズピッチ系炭素繊維が好適に用いられる。
【００２６】
炭素繊維は、各前駆体を繊維状に成形した後に、例えば８００℃を超える温度で焼成することにより得られる。本発明の膨張化炭素繊維の製造に用いる原料炭素繊維としては、例えば２９００〜３２００℃程度の熱処理のなされた、いわゆる黒鉛化繊維が好適である。
【００２７】
原料炭素繊維の径や長さは特に制限されないが、最終的に表面積が大きく、光吸収性や反応性の高い膨張化炭素繊維を得たいことから、径や長さは小さい方がよい。しかし、径や長さが小さ過ぎると、取扱性が悪化したり工業的な大量生産が難しくなるおそれがある。よって、通常は、直径が２μｍ以上１０μｍ以下、長さが５０μｍ以上２０ｃｍ以下の炭素繊維を用いることが好ましい。より好ましくは、直径が５μｍ以上１５μｍ以下、長さが１ｃｍ以上１５ｃｍ以下の炭素繊維を用いる。
【００２８】
・層間化合物：
炭素繊維は複数のグラファイト構造が長さ方向に重なり絡み合った構造を有し、グラファイト構造の結晶性は高く非常に堅固である一方で、層同士はファンデルワールス力で結合されているに過ぎない。よって層間には様々な低分子化合物、金属化合物、イオンなどが容易にインターカレートする。その結果得られる化合物が層間化合物である。
【００２９】
原料炭素繊維から層間化合物を得る手段としては、主に化学的処理と電気化学的処理とがある。
化学的処理は、硫酸などの酸中で、硝酸や過マンガン酸カリウムなどの強力な酸化剤を炭素繊維に作用させた後、過剰の水で処理する方法である。電気化学的処理は、酸電解質中で原料炭素繊維を陽極に固定し、定電流または定電圧で電気分解を行うものであり、層間に化合物やイオンを導入するために実施する。電解質である酸としては、硫酸、濃硫酸、硝酸、濃硝酸、リン酸などの無機酸や、蟻酸、酢酸などの有機酸を用いることができる。使用する酸電解質の濃度、電圧、電流、処理時間などは適宜調整すればよく、具体的にはＸＲＤ（X-ray Diffraction)，あるいは重量増加などで層間化合物の形成割合を確認しつつ予備実験などで決定すればよい。通常は０．１〜５Ａ程度の定電流（電流密度では数Ａ〜数十Ａ）を通電し、炭素繊維への付与電荷量が１０００〜１００００Ｃまで処理を継続すればよい。
【００３０】
化学的処理としては、例えば、ハマース−オフマン（Hummers-Offman）法が挙げられる。この場合には、まず、例えば、炭素繊維を懸濁させた硝酸ナトリウム溶液中に、氷冷下、濃硫酸を加えて攪拌した後、少量ずつ過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ4）を添加する。溶液中にＫＭｎＯ4 を少量ずつ添加するのは、添加することにより強力な酸化反応が起こるため、時間をかけて反応させることが好ましいからである。ＫＭｎＯ4 を添加後、一昼夜放置することにより反応させたのち、反応液を７０℃〜８０℃の水によって希釈し、１５分程度放置する。次いで、混合溶液中に過酸化水素を、混合溶液が発泡しなくなるまで滴下して未反応のＫＭｎＯ4を還元した後、その混合溶液が暖かいうちに吸引濾過する。これにより層間化合物として酸化黒鉛が得られる。得られた層間化合物は、例えば、４００℃から１０００℃の温度範囲で５秒から１２０秒程度の熱処理をして微小化させる。さらに、超音波破砕などの微細化処理を施すようにしてもよい。
【００３１】
層間化合物は、化合物等のインターカレーションの程度により、黒鉛の層間毎に低分子化合物、金属化合物、イオンなどがインターカレートしたもの（ステージ１）から、一層おきにインターカレートしたもの（ステージ２）、更には、高次数ステージの層間化合物のように種々のステージに分類される。本発明で用いる層間化合物としては、低次数ステージの層間化合物、例えばステージ１またはステージ２の層間化合物が好ましく、ステージ１の層間化合物がより好ましい。これは以降の工程で、微細な膨張化炭素繊維が得られ易いからである。
【００３２】
上記処理後においては、層間化合物に付着している過剰の酸などを洗浄で除去し、さらに乾燥する。洗浄は、水などを用いて行えばよい。原料炭素繊維の層間距離ｄ（００２）面は、通常、０．３ｎｍ〜０．４ｎｍである。それに対して、層間化合物の層間距離はインターカレートする化合物等によっても異なるが、おおよそ０．６５ｎｍ〜１．２ｎｍにまで広がる。よって、層間化合物の生成は、Ｘ線回折で層間距離を測定することにより確認することができる。
【００３３】
（ｂ）膨張化炭素繊維の調製工程
層間化合物は、加熱処理を施すことにより膨張化炭素繊維となる。加熱温度は適宜調整すればよいが、通常は２００℃以上、２０００℃以下とし、より好ましくは５００℃以上、１５００℃以下。加熱時間は比較的短くてもよく、通常は５秒間以上、５分間以下程度とすればよい。加熱装置は通常用いられるものでよく、例えば電気炉や管状炉などを用いることができる。
【００３４】
この加熱処理により、層間にインターカレートした化合物等が分解されて層間から排出されるが、その際に層間が押し広げられると共に層間結合の一部が破壊されて、層間化合物から膨張化炭素繊維が得られる。この膨張化炭素繊維は、原料炭素繊維に比べて層間距離が広がっており、膨張している。例えばその径は原料炭素繊維の２〜２０倍となり、その嵩密度は０．００１〜０．０１ｇ／ｃｍ3と極めて大きくなる。膨張化炭素繊維の生成は、顕微鏡観察や嵩密度測定などにより確認することができる。
【００３５】
上記加熱処理によって、層間化合物における層間距離が大きくなる他、クラックのある部分での断裂が起こり、その長さは原料炭素繊維よりも短くなる。膨張化炭素繊維の直径や長さは実測することができる。例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により数十〜数百倍に拡大し、任意の視野内に存在する膨張化炭素繊維の直径や長さを測定すればよい。
【００３６】
（ｃ）表面酸化処理工程
以上のとおり、原料炭素繊維が酸性溶液中で電気分解され且つ空気中で熱処理されていることから、膨張化炭素繊維には、その表面にカルボキシル基を含めて酸性官能基が導入されている。しかし、膨張化炭素繊維の活性は必ずしも十分でなく、全酸性官能基に対するカルボキシル基の割合を増加させることが望ましい。このようなことから本実施の形態では、更に、表面酸化処理を実施することにより、膨張化炭素繊維の表面の酸性官能基を増加させると共に、全酸性官能基に対するカルボキシル基の割合を増加させるものである。この表面酸化処理により、本実施の形態では、カルボキシル基の全酸性官能基に対する割合を、例えば５５％以上とすることができる。そのためには、以下のように、まず膨張化炭素繊維を粉末化することが望ましい。
【００３７】
・粉末化：
好適には膨張化炭素繊維を粉砕する。膨張化炭素繊維の表面積を大きくし、表面に形成されるカルボキシル基の量をより一層増大せしめるためである。
【００３８】
粉砕手段は特に制限されるものではなく、常法を用いることができる。例えば、膨張化炭素繊維を超音波処理することにより粉砕すればよい。超音波処理は、膨張化の程度に応じてその強度と処理時間を調整することにより、得られる膨張化炭素繊維の粒子サイズを容易に制御できることから好適な粉砕手段といえる。一方、ボールミルなどの機械的な粉砕手段は用いないことが好ましい。膨張化炭素繊維の表面には、炭素六角網面の積層端面、いわゆるエッジ面が多く露出している。このエッジ面は非常に反応性に富んでおり、また、特にこのエッジ面に酸性官能基が形成されている場合が多い。よって、膨張化炭素繊維を粉砕するに当たっては、このエッジ面を保存することが重要であるが、ボールミルなどで粉砕するとエッジ面が損なわれるおそれがある。
【００３９】
粉砕の程度は適宜調整すればよいが、直径で数ｎｍ〜数十ｎｍ、最大長さで１０ｎｍ以上、２μｍ以下にすることが好ましい。最大長さが１μｍ以下であれば、表面積が大きく、表面に存在するカルボキシル基の量も多くなることから、反応性の高い膨張化炭素繊維が得られる。粉砕された膨張化炭素繊維の大きさは、走査型電子顕微鏡写真により実測したり、或いはゼータ電位計などにより測定することができる。
【００４０】
・表面酸化処理：
表面酸化処理することにより膨張化炭素繊維にカルボキシル基を形成する手段は、特に制限されないが、例えば、酸、オゾンまたは過酸化物を用いる手段を適用することができる。このとき、原料炭素繊維から層間化合物または膨張化炭素繊維を得る際に、熱処理過程を経ていることから、表面には様々な酸性官能基が形成されており、表面酸化処理により容易にカルボキシル基を増加させることができる。また、上述したとおり膨張化炭素繊維の表面にはエッジ面が存在し、その部分の活性は高くなっている。そのため、表面酸化処理により酸性官能基が形成され易く、延いてはカルボキシル基が形成され易い。
【００４１】
ここに、酸性官能基とは、酸素元素を含む官能基をいい、例えば水酸基（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、ケト基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エーテル基（−Ｏ−）、カルボキシル基を挙げることができる。
【００４２】
酸を用いて膨張化炭素繊維を表面酸化処理する場合には、酸または酸水溶液に膨張化炭素繊維を浸漬した上で加熱すればよい。使用できる酸としては、硝酸、硫酸などの無機酸や、蟻酸などの有機酸を挙げることができる。加熱温度は適宜調整すればよいが、例えば６０℃以上、２００℃以下とする。処理時間も適宜調整すればよく、具体的にはＦＴ−ＩＲを用いて表面の酸性官能基の特定やその定量を行ったり、膨張化炭素繊維上の酸性官能基に対するカルボキシル基の割合を測定し、カルボキシル基が十分量形成される時間とすればよい。通常は２時間以上、２４時間以下程度とする。
【００４３】
オゾンを用いる場合には、オゾンガスに膨張化炭素繊維を曝せばよい。使用するオゾンガスにおけるオゾンの濃度は、例えば５容量％以上、１００容量％以下とする。処理時間は適宜調整すればよく、具体的には予備実験などにより決定すればよいが、通常は数分以上、５時間以下とする。
【００４４】
過酸化物を用いる場合には、過酸化物を溶媒に溶解し、当該溶液に膨張化炭素繊維を浸漬すればよい。更に、当該浸漬液を加熱してもよい。過酸化物としては、過酸化水素や発煙硝酸を挙げることができる。溶媒としては、水などを用いることができる。加熱温度は適宜調整すればよいが、例えば２０℃以上、５０℃以下とする。処理時間も適宜設定することにより、表面官能基の量を変えることができる。表面官能基の存在は具体的にはＦＴ−ＩＲを用いて確認する。その内のカルボキシル基の量を測定し、膨張化炭素繊維または全酸性官能基に対するカルボキシル基の割合を測定し、カルボキシル基が十分量形成される時間とすればよいが、通常は３０分間以上、５時間以下とする。酸または過酸化物を用いて表面酸化処理を行う場合には、処理後に膨張化炭素繊維を洗浄することが好ましい。例えば、処理後に十分量の水で繰り返し洗浄した後に、乾燥すればよい。
【００４５】
膨張化炭素繊維の表面への官能基の導入は、上記の方法以外でも可能であり、例えば酸性電解質中での電気化学的処理によっても行うことができる。膨張化炭素繊維を白金板と白金メッシュ中に挟み込み、それを陽極として酸性電解質中、例えば、無機酸であれば、硝酸，硫酸，酢酸，リン酸、有機酸であれば、蟻酸等に固定し、定電流あるいは定電圧条件下、電流密度０．１Ａ／ｇ〜３０Ａ／ｇの範囲で電気分解を行うことによって膨張化炭素繊維の表面に酸性官能基を導入することができる。
【００４６】
・表面酸化処理された膨張化炭素繊維：
上述した表面酸化処理によって、膨張化炭素繊維の表面、特にエッジ面には、新たに酸性官能基が形成され、また、カルボキシル基以外の酸性官能基が酸化されてカルボキシル基が生成する。
【００４７】
膨張化炭素繊維が薬剤キャリアとしての優れた効果を発揮するには、表面に存在する酸性官能基、特にカルボキシル基の量が非常に重要である。特に、上述のように、膨張化炭素繊維の有するカルボキシル基の割合が、通常１０００ｍｏｌ／ｇ以上、中でも２０００ｍｏｌ／ｇ以上、更には３０００ｍｏｌ／ｇ以上である膨張化炭素繊維は、薬剤キャリアとして非常に優れた薬物送達効果を示す。
【００４８】
なお、カルボキシル基以外の酸性官能基が活性に関与している可能性もあるが、後述の実施例に示したように、少なくとも活性とカルボキシル基との関係は確認されており、且つ表面酸化処理された膨張化炭素繊維の表面に存在する全酸性官能基に占めるカルボキシル基の割合が多いので、本発明では全酸性官能基におけるカルボキシル基の割合を基準とする。
【００４９】
３．抗がん剤
本発明の抗がん剤は、上述の膨張化炭素繊維に、抗がん成分が結合されてなる。
【００５０】
（１）膨張化炭素繊維と抗がん成分との結合様式
本発明の抗がん剤における膨張化炭素繊維と抗がん成分との結合様式は制限されないが、通常は膨張化炭素繊維の表面に、何らかの連結基を介して、抗がん成分が結合していればよい。中でも本発明では、膨張化炭素繊維の表面に存在するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）により形成される結合基に、抗がん成分が（直接、或いはリンカーを介して）結合していることが好ましい。カルボキシル基により形成される結合基としては、エステル結合（−ＣＯ−Ｏ−）、ペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）等が挙げられる。
すなわち、本発明の抗がん剤は、下記一般式（１）で表される構造を有することが好ましい。
【化５】
2014084296.tif 000006
【００５１】
上記式（１）中、ＥｘＣＦｓは、膨張化炭素繊維を表す。
上記式（１）中、Ａは、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表す。
【００５２】
上記式（１）中、Ｌは、単結合又はリンカーを表す。ここで、リンカーとは、二価の基を意味し、例えば以下から選択される基や、これらのうち２以上が組み合わされた基が挙げられる。
・−（ＣＨ２）ｍ１−で表されるポリエチレン鎖。ここでｍ１は、１〜２２の整数を表す。
・−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ２−で表されるポリエチレングリコール鎖。ここでｍ２は、１〜５０の整数を表す。
・−（ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ））ｍ３−で表されるポリビニルアルコール鎖。ここでｍ３は、１〜５０の整数を表す。
・−ＭＳｍ４−で表される糖鎖。ここでＭＳは、各々独立に、二価の単糖成分を表し、ｍ４は、１〜３０の整数を表す。単糖成分としては、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等が挙げられ、これらはＤ型でもＬ型でもよく、α型でもβ型でもよい。単糖成分の結合様式は、各単糖成分が許容するグリコシド結合様式であれば、制限されないが、例としてはα（１→４）結合、α（１→６）結合、β（１→４）結合、β（１→６）結合等が挙げられる。
【００５３】
上記式（１）中、Ｘは、抗がん成分を表す。抗がん成分については後述する。
上記式（１）中、ｎは、膨張化炭素繊維に対する抗がん成分の導入数を規定する数量であり、１ｇ当たり１００〜５０００μモルに相当する整数を表す。
【００５４】
なお、上記式（１）では模式的に、膨張化炭素繊維（ＥｘＣＦｓ）と、これに結合する抗がん成分含有基（−ＣＯ−Ａ−Ｌ−Ｘ）のみを示しているが、更に他の基が膨張化炭素繊維（ＥｘＣＦｓ）に結合していてもよい。他の基の例としては、未反応のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）や、その他の酸素含有官能基（例えば水酸基、アルコキシ基、酸無水物基、エステル基、エポキシド基等）等が挙げられる。
【００５５】
（２）抗がん成分
抗がん成分とは、抗がん剤効果を発揮する化学部分・化学基（chemical moiety/group）をいう。具体的には、公知の抗がん剤化合物から誘導される基、好ましくは１価の基であって、抗がん作用を発揮するための活性部位を保持している基が挙げられる。具体的には、以下の抗がん剤化合物から誘導される基が好ましい。
【００５６】
（ａ）アルキル化薬：
・ナイトロジェンマスタード類：シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパ等。
・ニトロソウレア類：ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、テモゾロマイド、ベンダムスチン等。
・白金系薬物：シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ダハプラチン等。
【００５７】
（ｂ）代謝拮抗剤：
・５−フルオロウラシル等。
（ｃ）葉酸代謝拮抗薬：
・ジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬：
・ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase：ＤＨＦＲ）阻害薬：メソトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン等。
【００５８】
（ｄ）ピリミジン代謝阻害薬：
・チミジル酸シンターゼ阻害薬：フルオロウラシル、フルシトシン等。
（ｅ）プリン代謝阻害薬：
・イノシン５’−リン酸脱水素酵素（Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase：ＩＭＰＤＨ）阻害薬：６−メルカプトプリン、アザチオプリン等。
・アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase：ＡＤＡ）阻害薬：ペントスタチン等。
【００５９】
（ｆ）ヌクレオチドアナログ：
・プリンアナログ：チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン等。
・ピリミジンアナログ：シタラビン、ゲムシタビン等。
（ｇ）リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬：
・リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬：ヒドロキシウレア等。
（ｈ）その他の代謝拮抗薬：
・Ｌ−アスパラギナーゼ等。
【００６０】
（ｉ）トポイソメラーゼ阻害薬：
・カンプトテシン及びその誘導体：イリノテカン、ノギテカン等。
・アントラサイクリン系薬物：ドキソルビシン等。
・エピポドフィロトキシン系薬物：エトポシド等。
・キノロン系薬物：レボフロキサシン、シプロフロキサシン等。
【００６１】
（ｉ）微小管重合阻害薬：
・ビンカアルカロイド系薬物：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン等。
・コルヒチン等。
（ｊ）微小管脱重合阻害薬：
・タキサン系：パクリタキセル、ドセタキセル等。
【００６２】
（ｋ）抗腫瘍性抗生物質：
ザルコマシシン、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン等。
【００６３】
（ｌ）分子標的薬：
・チロシンキナーゼ阻害剤：イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ等。
・Rafキナーゼ阻害薬：ソラフェニブ等。
・ＴＮＦ−α阻害剤：エタネルセプト等。
・プロテアソーム阻害剤：ボルテゾミブ等。
・モノクローナル抗体：リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、オマリズマブ、メポリズマブ、アナキンラ、ゲムツズマブオゾガマイシン、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、アバタセプト、モガムリズマブ、アダリムマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ等。
【００６４】
本発明では、上述の何れの抗がん剤化合物に由来する抗がん成分を使用することも可能である。しかし、本発明においてキャリアとして使用する膨張化炭素繊維は、比較的安価且つ容易に製造できるにもかかわらず、抗がん成分の薬効をより効率的に発揮できるという利点を有する。この点を考慮すると、抗がん成分として、標的化性能に優れてはいるが比較的高価な近年の抗がん剤化合物（例えば分子標的薬等）よりも、安価ではあるが標的化性能等の面で劣る旧来の抗がん剤化合物由来の基を用いた方が、より顕著な効果が得られるといえる（但し、斯かる観点は、分子標的薬等の近年の抗がん剤化合物の使用を決して妨げるものではない。）。
【００６５】
具体的に、本発明では上記観点から、アルキル化薬、代謝拮抗剤、葉酸代謝拮抗薬、ピリミジン代謝阻害薬、プリン代謝阻害薬、ヌクレオチドアナログ、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬、又はその他の代謝拮抗薬等に由来する基を、抗がん成分として使用することが好ましい。中でもアルキル化薬に由来する基を用いることが好ましく、特に白金系薬物に由来する基を用いることがより好ましい。
【００６６】
公知の白金系薬物としては、上述のように、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ダハプラチン等が挙げられる。本発明の抗がん剤における抗がん成分としては、これら公知の白金系薬物から誘導される基であって、抗がん活性部位を維持している基が挙げられる。
【００６７】
白金系薬物由来の抗がん成分として、具体的には、下記一般式（２）で表される構造を有する基が好ましい。
【化６】
2014084296.tif 000007
【００６８】
上記式（２）中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子を表す。或いは、Ｒ１及びＲ２は互いに結合して、Ｒ１及びＲ２が夫々結合する炭素原子と共に、無置換又は置換の５又は６員の炭化水素環を形成していてもよい。５又は６員の炭化水素環としては、シクロペンタン環、シクロヘキサン環が挙げられるが、シクロヘキサン環が好ましい。
【００６９】
上記式（２）中、Ｒ３及びＲ４は各々独立に、ハロゲン、水酸基、又はＣ１〜６アルコキシ基を表す。或いは、Ｒ３及びＲ３は互いに結合して、下記式（３）で表される環構造を形成していてもよい。
【化７】
2014084296.tif 000008
【００７０】
上記式（３）中、Ｒ１１及びＲ１２は各々独立に、水素原子を表す。或いは、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合して、Ｒ１１及びＲ１２が結合する炭素原子と共に、無置換又は置換の３〜６員の炭化水素環又は複素環を形成していてもよい。３〜６員の炭化水素環又は複素環としては、制限されるものではないが、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、アゼチジン環、オキセタン環、チエタン環、アゾリジン環、オキソラン環、チオラン環等が挙げられる。中でもシクロブタン環が好ましい。
上記式（３）中、Ｗは、単結合又は−Ｃ（＝Ｏ）−を表す。
【００７１】
また、抗がん成分は、医薬的に許容可能な塩の形態であってもよい。ここで「医薬的に許容可能な塩」とは、抗がん成分の薬効及び特性を保持する任意の酸添加塩又は塩基添加塩であって、適切な非毒性の有機若しくは無機酸又は有機若しくは無機塩基から形成されるものを表わす。酸添加塩の例としては、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸）に由来するものと、有機酸（例えばｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、トリフルオロ酢酸等）に由来するものとが挙げられる。塩基添加塩の例としては、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化第四級アンモニウム（例えば水酸化テトラメチルアンモニウム）に由来するもの等が挙げられる。医薬化合物（即ち薬物）の化学修飾による塩の形成は、その物理的安定性、化学的安定性、吸湿性、流動性、溶解性を向上させる技術として、薬理化学者には周知である。例えばAnsel et al., "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995)の１９６頁及び４５６〜４５７頁を参照されたい。
【００７２】
（３）抗がん剤の製法
本発明の抗がん剤の製法は特に制限されず、公知の任意の手法で製造することが可能である。好ましくは、表面に所定量以上のカルボキシル基を有する膨張化炭素繊維を原料として、この膨張化炭素繊維のカルボキシル基と、抗がん成分又はリンカーが有する官能基（例えば水酸基やアミノ基等）とを反応させ、結合（例えばエステル結合やペプチド結合等）を形成することにより、調製することができる。
【００７３】
また、抗がん成分の一部（例えばリガンド等）を膨張化炭素繊維に結合させた上で、その後に抗がん成分の残部（例えば金属原子等）を結合させることにより、抗がん成分を形成する手法や、抗がん成分の前駆体を膨張化炭素繊維に結合させてプロドラッグを形成し、その後に生体外又は生体外で所望の抗がん成分に誘導し、抗がん剤として機能させる手法等も用いることが可能である。
【００７４】
特に、上記一般式（２）で表される白金型抗がん成分を有する抗がん剤を製造する場合には、まず以下の一般式（４）で表される膨張化炭素繊維誘導体を形成した上で、当該膨張化炭素繊維誘導体のジアミノエチル部位（−ＮＨ−ＣＨＲ１−ＣＨＲ２−ＮＨ２）を白金原子（Ｐｔ）に配位させることにより、当該所望の抗がん剤を製造することができる。
【００７５】
【化８】
2014084296.tif 000009
上記式（４）中、ＥｘＣＦｓ、ｎ、Ｌ、Ｒ１及びＲ２は、上記式（１）及び式（２）と同じ定義を表す。
【００７６】
なお、上記式（４）で表される膨張化炭素繊維誘導体は、新規の化合物であり、且つ、例えば式（２）で表される抗がん成分を有する本発明の抗がん剤の製造中間体や前駆体等として有用性を有する。
【００７７】
（４）抗がん剤の用途
本発明の抗がん剤は、その抗がん成分の種類に応じて、ヒトを含む哺乳類の種々のがんに対して有効である。対象となるがんの例としては、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、悪性黒色腫、甲状腺癌などの上皮がん；骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、繊維肉腫、白血病や悪性リンパ腫、骨髄腫等の非上皮がん、などが挙げられる。
【００７８】
本発明の抗がん剤は、通常は患者に対して治療有効量で投与される。ここで「治療有効量」とは、疾患の症状を予防、緩和、又は改善するか、或いは治療対象の生存期間を延長することが可能な量を意味する。本発明の抗がん剤の治療有効量、すなわち投与量は、当業者に公知の手法で決定することができる。斯かる投与量は、個別の事案毎に、個々の要請（例えば投与する具体的な化合物、投与経路、治療対象の疾患、治療対象の患者）に応じて調整すればよい。一般に、体重約７０ｋｇの成人への経口又は非経口投与の場合は、１日投与量約１０ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、好ましくは約２００ｍｇ〜約１，０００ｍｇが適切であるが、指示のある場合は上限を超えてもよい。１日投与量は１回で投与しても、複数回に分けて投与してもよく、非経口投与の場合は連続輸液で投与してもよい。
【００７９】
本発明の抗がん剤は、そのまま投与してもよいが、医薬的に許容可能な１又は２以上の賦形剤と組み合わせ、製剤（以降「本発明の製剤」という場合がある。）の形態で、使用することもできる。ここで「医薬的に許容可能な」とは、当該化合物を投与される患者にとって、医薬的に許容可能であり、且つ実質的に非毒性であることを意味する。賦形剤としては、ラクトース、スクロース及びコーンスターチ等の基剤、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン等の結合剤、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、コーンスターチ、グアーガム、トラガカントゴム、アラビアゴム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛等の潤滑剤、その他にｐＨ調整剤、界面活性剤、染料、着色剤、香味剤等が挙げられる。
【００８０】
本発明の製剤としては、経口、鼻腔、局所（口腔及び舌下を含む）、直腸内、膣内、及び／又は非経口投与に適した製剤が挙げられる。具体的な剤形は、癌の種類、病変部位、疾病の程度、投与対象の年齢、投与量及び投与回数、投与経路等の各種条件に応じて、適宜選択すればよいが、例としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、被覆剤、カプセル剤、溶液剤、乳化剤、懸濁剤、座剤、注射溶液、軟膏、クリーム、座薬等が挙げられる。
【００８１】
製剤は便宜上、単位投与形態で供してもよい。これは薬剤学で周知の任意の方法で調製することができる。単回投与剤形の製造において賦形剤と組み合わせ得る活性成分（本発明の抗がん剤）の量は、治療対象の患者や、具体的な投与形態に応じて異なる。単回投与形態の製造において賦形剤と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に、活性成分（本発明の抗がん剤）が治療効果を生じる量である。一般にこの量は、製剤を１００％とした場合に、活性成分（本発明の抗がん剤）が、通常１％以上、中でも５％以上、更には１０％以上、また、通常９９％以下、中でも７０％以下、更には３０％以下の範囲が好ましい。
【００８２】
本発明の製剤を調製する方法は、本発明の抗がん剤を、医薬的に許容可能な１又は２以上の賦形剤と混合する工程を有する。一般に、前記製剤は、本発明の抗がん剤を、液状担体若しくは微粉化した固状担体、又はその両方と一様且つ密に混合した後、必要に応じて製品を整形することにより調製される。
【００８３】
経口投与に適した本発明の製剤としては、カプセル、カシェ、サシェ、ピル、錠剤、ロゼンジ（風味剤、通常はスクロースとアラビアゴム又はトラガカントゴムを用いる）、粉末、顆粒の形態や、水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エリキシル、シロップ、トローチ（不活性基剤、例えばゼラチンやグリセリン等、又はスクロース及びアラビアゴムを用いる）、マウスウォッシュ等の形態であって、各々所定量の本発明の抗がん剤を活性成分として含有する形態が挙げられる。また、本発明の抗がん剤は、ボーラス、舐剤、又はペーストとして投与してもよい。
【実施例】
【００８４】
以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は決して以下の実施例に限定されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
【００８５】
１．抗がん剤の調製
（１）実施例：シスプラチン型膨張化炭素繊維（ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ）の調製
（ａ）膨張化炭素繊維（ＥｘＣＦｓ）の調製
３００ｍＬ容のビーカーに、電極として白金板（長さ５０ｍｍ×幅１０ｍｍ×厚さ０．２ｍｍ）を備え付け、陽極側の白金板の下端に、５ｃｍの長さに切り揃えたＰＡＮ（Polyacrylonitrile）系炭素繊維（東レ社製Ｍ６０ＪＢ、繊維径５μｍ）をテフロン（登録商標）テープで固定した。陽極の横に参照電極として銀／塩化銀電極を取り付けた。炭素繊維が十分に浸漬されるように、電解質として１３ｍｏｌ／ｄｍ３硝酸１００ｍＬをビーカーに入れ、炭素繊維への付与電荷量が３６００Ｃになるまで０．５Ａの定電流を通電した。当該炭素繊維を十分量の水で繰り返し水洗した後、２４時間風乾した。その後、炭素繊維を電気炉内に挿入し、空気中、２６００℃で５秒間の加熱処理を施した。処理後の炭素繊維を超音波処理により粉砕し、１３ｍｏｌ／ｄｍ３硝酸（１５０ｍＬ）に分散させ、８０℃の温度で１２時間攪拌することにより、膨張化炭素繊維の表面を酸化処理した。処理後の膨張化炭素繊維を濾別し、洗浄液のｐＨが７になるまで超純水で十分に洗浄した後、１２０℃で５時間乾燥させることにより、膨張化炭素繊維（「ＥｘＣＦｓ」と略称する場合がある。）を得た。
【００８６】
得られたＥｘＣＦｓの形態を、走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope：ＳＥＭ、日本電子株式会社製JSM-6701F）で観察した。得られたＳＥＭ画像の例を図１（ａ）及び（ｂ）に示す。また、得られた画像をWinRoof（三谷商事株式会社製）によるイメージ分析で２値化することにより、ＥｘＣＦｓの粒度分布を求めた。結果を図２のグラフに示す。図２に示すように、４００ｎｍ未満の粒子の割合は９．１７％であった。
【００８７】
また、得られたＥｘＣＦｓが有するカルボキシル基（−ＣＯ２Ｈ）の量を、フーリエ変換赤外分光法（Fourier Transform Infrared Spectroscopy：ＦＴ−ＩＲ）と昇温しながら二酸化炭素発生量を定量する方法で測定したところ、約３２４μｍｏｌ／ｇであった。
【００８８】
（ｂ）ＥｘＣＦｓへのエチレンジアミン部位及び白金の導入
【化９】
2014084296.tif 000010
【００８９】
上記ＥｘＣＦｓ１．００ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸５．７０ｇ（３０．０ｍｍｏｌ）、及び２−（２−アミノエチル）エタノール０．１０ｍＬ（０．９９ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬトルエン中で混合し、Dean Starkトラップを用いて二日間還流した。デカンテーションによりトルエンを除去した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液約５０ｍＬを加えて混合した。得られたＥｘＣＦｓをメンブランフィルター（孔径１０．０μｍ）で濾集し、フィルター上でそのままトルエン、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、メタノールで洗浄することにより、ＥｘＣＦｓの−ＣＯ２Ｈ基にエチレンジアミン部位（−Ｃ２Ｈ４−ＮＨ−Ｃ２Ｈ４−ＮＨ２）が導入された誘導体（ＥｘＣＦｓ−ＥＤＡ）１．００ｇを得た。
【００９０】
エチレンジアミン部位が導入されたことを確認するために、元のＥｘＣＦｓ及び得られたＥｘＣＦｓ−ＥＤＡの各水溶液又は分散液（０．０１ｇ／１５ｍＬ）を調製し、そのｐＨを比較した。その結果、元のＥｘＣＦｓの水溶液が酸性（ｐＨ６．１６）であったのに対し、得られたＥｘＣＦｓ−ＥＤＡの水中分散液は塩基性（ｐＨ８．４８）であった。ここから、得られたＥｘＣＦｓ−ＥＤＡでは、ＥｘＣＦｓの−ＣＯ２Ｈ基にエチレンジアミン部位が導入されていることが確認された。
【００９１】
上記ＥｘＣＦｓ−ＥＤＡ１０．０ｍｇを、テトラクロロ白金(II)酸カリウム（Ｋ２［ＰｔＣｌ４］、和光純薬工業株式会社製）の２４．１μｍｏｌ水溶液（１０．０ｍｇ／２．０ｍＬ）に懸濁して反応させた。反応後のＥｘＣＦｓをメンブランフィルター（孔径１０．０μｍ）でフィルター上でそのままトルエン、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、メタノールで洗浄することにより、エチレンジアミン部位を配位子として白金原子が導入されたシスプラチン型ＥｘＣＦｓ誘導体（ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ）９．４２ｍｇを得た。
【００９２】
得られたＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓを、ＳＥＭで観察するとともに、エネルギー分散型Ｘ線分析（Energy dispersive X-ray spectrometry：ＥＤＳ）で分析した。得られたＳＥＭ画像の例を図３（ａ）に、対応するＥＤＳのカラーマッピング画像を図３（ｂ）に示す。図３（ａ）において、ＥｘＣＦｓ上に存在する白色粒子は、白金原子（Ｐｔ）を表す。図３（ａ）において、赤色及び黄色のドットは、白金原子の濃度が高いことを表す。
【００９３】
ＥＤＳにより算出されたＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓの原子分布から得られる元素分析値を下記表に示す。白金原子（Ｐｔ）が約５質量％程度含まれていることが分かる。また、相当量の窒素も含まれていることから、シスプラチン型抗がん成分（ＣＤＤＰ）が形成されていることが分かる。
【表１】
2014084296.tif 000011
【００９４】
また、得られたＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓを、Ｘ線光電子分光法（X-ray Photoelectron Spectroscopy：ＸＰＳ）で分析し、導入された白金原子（Ｐｔ）の価数を確認した。ＸＰＳによる分析結果のグラフを図４に示す。図４に示すように、７６、７３ｅＶにＰｔ(II)のピークが観察され、７４、７１ｅＶにＰｔ(０)のピークが確認された。以上から、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ中の白金原子は、０価及び２価で存在することが分かる。
【００９５】
（２）比較例：シスプラチン型カーボンナノチューブ（ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ）の調製
（ａ）酸化カーボンナノチューブ（ＣＮＴｓ）の調製
カーボンナノチューブ（ＣＮＴｓ）の合成は、熱ＣＶＤ（thermal Chemical Vapor Deposition）法で行った。即ち、ＣＮＴｓの原料となるエタノールガスを反応系に導入し、高温の基板表面で化学反応を生じさせることにより、マルチウォール型（多層）ＣＮＴｓを合成した。具体的には、エタノールガスを、キャリアガスとなるアルゴンと共に、炉内温度８００℃、炉内圧力３．０〜４．０×１００Ｐａに設定された炉内に、流量１３０〜１８０ｓｃｃｍで流すことにより、基板上にＣＮＴｓを形成させた。
【００９６】
得られた多層ＣＮＴｓ３０．０ｍｇを５０ｍＬナスフラスコに加え、濃硝酸（ｄ＝１．３８）１５ｍＬに懸濁した。油浴１２０℃で１．５時間還流し、反応を終了した。反応混合液に蒸留水を加え、遠心分離（３５００ｒｐｍ、３０分）を行い、デカンテーショにより上澄みを分離した。再び蒸留水を加え同様の操作を３回繰り返し、上澄みが中性になったのを確認し、酸化処理後ＣＮＴｓを回収した。
【００９７】
酸化処理後のＣＮＴｓが有するカルボキシル基（−ＣＯ２Ｈ）の量をＦＴ−ＩＲと昇温しながら二酸化炭素発生量を定量する方法で測定したところ、約９．７２μｍｏｌ／ｇであった。
【００９８】
（ｂ）ＣＮＴｓへのエチレンジアミン部位及び白金の導入
酸化処理ＣＮＴｓ５．０ｍｇ、ｐ−トルエンスルホン酸１．１４ｇ（６．０ｍｍｏｌ）及び２−（２−アミノエチル）エタノール０．２０ｍＬ（１．９７ｍｍｏｌ）を、２００ｍＬトルエン中で混合した。Dean-Starkトラップを用いて一晩還流した。室温まで放冷し、デカンテーションによりトルエンを除去した。得られた反応物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、軽く混合した後、水で希釈し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、３０分）後、デカンテーションにより分離した。同様の操作を蒸留水で３回繰り返し、洗浄した。蒸留水をデカンテーションで分離することにより、ＣＮＴｓの−ＣＯ２Ｈ基にエチレンジアミン部位（−Ｃ２Ｈ４−ＮＨ−Ｃ２Ｈ４−ＮＨ２）が導入された誘導体（ＣＮＴｓ−ＥＤＡ）４．８ｍｇを得た。
【００９９】
エチレンジアミン部位が導入されたことを確認するために、元のＣＮＴｓ及び得られたＣＮＴｓ−ＥＤＡの各水溶液又は分散液（０．０１ｇ／１５ｍＬ）を調製し、そのｐＨを比較した。その結果、元のＣＮＴｓの水溶液は酸性（ｐＨ４．８１〜５．１）であったのに対し、得られたＣＮＴｓ−ＥＤＡの水中分散液は塩基性（ｐＨ８．１〜９．１）であった。ここから、得られたＣＮＴｓ−ＥＤＡでは、ＣＮＴｓの−ＣＯ２Ｈ基にエチレンジアミン部位が導入されていることが確認された。
【０１００】
上記ＣＮＴｓ−ＥＤＡ５．０ｍｇを、テトラクロロ白金(II)酸カリウム（Ｋ２［ＰｔＣｌ４］、和光純薬工業株式会社製）の１２．０μｍｏｌ水溶液（５．０ｍｇ／２．０ｍＬ）に懸濁して反応させた。撹拌を止め、反応懸濁液に水約７０ｍＬを加え、遠心分離（３５００ｒｐｍ、３０分）を行い、デカンテーションにより反応物を水から分離した。再び水約７０ｍＬを加え、同様の操作を３回繰り返し、ＣＮＴｓを洗浄した。デカンテーションにより水を除去することにより、エチレンジアミン部位を配位子として白金原子が導入されたシスプラチン型ＣＮＴｓ誘導体（ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ）４．９ｍｇを得た。
【０１０１】
得られたＣＤＤＰ−ＣＮＴｓをＸＰＳ測定により分析した。ＸＰＳによる分析結果のグラフを図５に示す。図５に示すように、７６、７３ｅＶにＰｔ(II)のピークが観察され、７４、７１ｅＶにＰｔ(０)の小さなピークが確認された。以上から、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ中の白金原子も、０価及び２価で存在することが分かる。
【０１０２】
２．抗がん剤の評価
（１）予備評価：細胞取り込み
上記手順で調製した抗がん剤ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ及びＣＤＤＰ−ＣＮＴｓの評価に先立ち、予備評価として、対応する担体ＥｘＣＦｓ及びＣＮＴｓを蛍光（フルオレセイン）標識し、腫瘍への集積効果を確認した。
【０１０３】
（ａ）蛍光標識ＥｘＣＦｓ及びＣＮＴｓの調製
蛍光標識ＥｘＣＦｓ及びＣＮＴｓの調製は、Meng et al., Dyes and Pigments, (2007), 73, 254-260 に記載の手法に従って行った。具体的には以下のとおりである。
【０１０４】
・フルオレセイン−ＮＨＳ−エステルの調製
フルオレセイン（和光純薬工業株式会社製）０．２０ｇ（０．６０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、和光純薬工業株式会社製）０．０７ｇ（０．６０ｍｍｏｌ）を、５ｍＬのＴＨＦと混合した。懸濁液を攪拌しながら、ジシクロヘキシルカルボジイミド（キシダ化学株式会社製、０．１２ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を室温で２日間かけて加えた。反応混合物を濾過し、溶媒を減圧除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、富士シリシア化学株式会社製BW80S）で処理することにより、フルオレセイン−ＮＨＳ−エステル（Ｒｆ０．８、アセトン、キーゼルゲルＴＬＣ）を橙色粉末として得た（０．１５ｇ、収率５８％）。
【０１０５】
・蛍光標識ＥｘＣＦｓの調製
上記１（１）（ａ）で調製されたＥｘＣＦｓ（−ＣＯＯＨ基約３２４μｍｏｌ／ｇ含有）５０ｍｇを２００ｍＬの三角フラスコに加え、トルエン１００ｍＬに懸濁し、ｐ−トルエンスルホン酸３．７０ｇ（１９．５ｍｍｏｌ）とエタノールアミン１．０ｍＬ（１７ｍｍｏｌ）を加え、約３分間超音波処理を行った。Dean-Starkトラップを用いて２４時間還流した。トルエンをデカンテーションし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を約５０ｍＬ加えて振り混ぜ、超音波処理により分散した。メンブランフィルター（孔径１０．０μｍ）でＥｘＣＦｓを濾集し、そのままフィルター上でトルエン、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、メタノールで洗浄することにより、ＥｘＣＦｓにアミノ基を導入した。このアミノ基含有ＥｘＣＦｓ０．０２ｇを水５ｍＬに懸濁し、上述のフルオレセイン−ＮＨＳ−エステル０．０２ｇ（５０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル５ｍＬに溶解し、ＥｘＣＦｓの懸濁液に加えて一晩撹拌した。メンブランフィルター（孔径１０．０μｍ）でＥｘＣＦｓを濾集し、そのままフィルター上で水、メタノールで洗浄することにより、蛍光（フルオレセイン）標識ＥｘＣＦｓ０．０７ｇを得た。
【０１０６】
・蛍光標識ＣＮＴｓの調製
上記１（２）（ａ）で調製された酸化処理ＣＮＴｓ１３．３ｍｇ（−ＣＯＯＨ基約９．７２μｍｏｌ／ｇ）をトルエン１００ｍＬに懸濁し、ｐ−トルエンスルホン酸１．８８ｇ（９．８８ｍｍｏｌ）とエタノールアミン０．５０ｍＬ（８．２７ｍｍｏｌ）を加え、Dean-Starkトラップを用いて２４時間還流した。室温まで放冷し、デカンテーションによりトルエンとＣＮＴｓを分離した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を約５０ｍＬ加え混合し、分散した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）後、デカンテーションにより分離した。同様の操作を蒸留水で３回繰り返し、洗浄した。蒸留水をデカンテーションで分離することにより、アミノ基を導入したＣＮＴｓを得た。このアミノ基含有ＣＮＴｓ１０ｍｇを水５ｍＬに懸濁し、上述のフルオレセイン−ＮＨＳ−エステル１０ｍｇをアセトニトリル５ｍＬに溶解し、炭素繊維の懸濁液に加えて一晩撹拌した。遠心分離（３５００ｒｐｍ、３０分）後、デカンテーションにより分離した。同様の操作を蒸留水・メタノールで６回繰り返し、洗浄した。蒸留水をデカンテーションで分離することにより、蛍光（フルオレセイン）標識ＣＮＴｓ１０ｍｇを得た。
【０１０７】
（ｂ）蛍光標識ＥｘＣＦｓ及びＣＮＴｓの調製
得られた蛍光標識ＥｘＣＦｓ及びＣＮＴｓの転移性肺病変細胞への取り込みを検討するべく、濃度０．１ｍｇ／ｍｌの蛍光標識ＣＮＴｓ及びＥｘＣＦｓ懸濁液を、ヒト骨肉腫細胞株MG63（米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）から入手）の細胞培地に加え、共焦点顕微鏡を備えた顕微鏡システム（株式会社キーエンス製、BZ-9000）を用いて観察した。
【０１０８】
得られた顕微鏡画像の例を図６（ａ）及び（ｂ）に示す。両画像に示すように、蛍光標識ＣＮＴｓ及びＥｘＣＦｓは、何れもMG63細胞に取り込まれた。蛍光標識ＣＮＴｓの画像（図６（ａ））と蛍光標識ＥｘＣＦｓの画像（図６（ｂ））とを比較すると、蛍光標識ＥｘＣＦｓの方が強い蛍光を発している。蛍光標識ＣＮＴｓと蛍光標識ＥｘＣＦｓの蛍光（フルオレセイン）導入率が同じであると仮定すると、ＥｘＣＦｓの方がＣＮＴｓよりもガン細胞へ集積し易いと考えられる。
【０１０９】
（２）In vitro細胞毒性評価
ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓのin vitro細胞毒性を、ヒト型骨肉腫細胞（MG63）のＭＴＴ（３−（４，５−ジ−メチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）還元アッセイを実施した。
【０１１０】
（ａ）材料及び方法
・材料：
遊離シスプラチン（以下「遊離ＣＤＤＰ」と称する場合がある。）としては、協和キリン社製プラトシン注（１バイアル１０ｍｇ）を用いた。
ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ及びＣＤＤＰ−ＣＮＴｓは、上記調製したものを用いた。
薬物未導入ＥｘＣＦｓとしては、上記１（１）（ａ）で調製したものを用いた。
薬物未導入ＣＮＴｓとしては、上記１（２）（ａ）で原料とした自作した多層ＣＮＴを酸化処理して用いた。
【０１１１】
・方法：
ヒト骨肉腫細胞株MG63（米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）から入手）を、９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。各ウェルの細胞に対し、遊離ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ、又はＣＤＤＰ−ＣＮＴｓを、夫々ＣＤＤＰ当量１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で加え、各々２４時間に亘ってインキュベートした。また、上記ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ又はＣＤＤＰ−ＣＮＴｓに対応する量の薬物未導入ＥｘＣＦｓ又は薬物未導入ＣＮＴｓを加えた細胞と、何も添加しない細胞（対照）とを、各々２４時間インキュベートした。
【０１１２】
（ｂ）結果
結果として得られたＣＤＤＰ濃度と細胞生存率との関係を示すグラフを図７に示す。無添加細胞と、薬物未導入ＣＮＴｓ及び薬物未導入ＥｘＣＦｓとの間で、細胞毒性に有意差は見られなかった。
遊離ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ又はＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓの投与後における２４時間後の細胞（MG63）生存率は、以下の表に示すとおりであった。
【０１１３】
【表２】
2014084296.tif 000012
【０１１４】
以上の結果から、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓは、何れも遊離ＣＤＤＰよりも毒性が高かったが、特にＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓは、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓよりも更に毒性が高く、優れた抗がん作用を示すことが明らかになった。
【０１１５】
（３）ＴＵＮＥＬ免疫組織学アッセイ
抗ガン剤によるアポトーシス（細胞自死）を視覚化するべく、ＴＵＮＥＬ（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling）染色による免疫組織学的検査を行った。
【０１１６】
（ａ）材料及び方法
・材料：
遊離シスプラチン（以下「遊離ＣＤＤＰ」と称する場合がある。）としては、協和キリン社製プラトシン注（１バイアル１０ｍｇ）を用いた。
ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ及びＣＤＤＰ−ＣＮＴｓは、上記調製したものを用いた。
薬物未導入ＥｘＣＦｓとしては、上記１（１）（ａ）で調製したものを用いた。
薬物未導入ＣＮＴｓとしては、上記１（２）（ａ）で調製した酸化処理多層ＣＮＴを用いた。
【０１１７】
・方法：
ヒト骨肉腫細胞株MG63（米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）から入手）に対し、遊離ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ、又はＣＤＤＰ−ＣＮＴｓを、夫々ＣＤＤＰ当量０〜１０μｇ／ｍＬの濃度で加え、２４時間に亘ってインキュベートした。また、上記ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ又はＣＤＤＰ−ＣＮＴｓに対応する量の薬物未導入ＥｘＣＦｓ又は薬物未導入ＣＮＴｓを加えた細胞と、何も添加しない細胞（対照）とを、各々２４時間インキュベートした。
【０１１８】
マウスの腫瘍組織を切片にしてそれを免疫染色するために、生体から取り出した腫瘍組織をパラフィン切片にした後、ＴＵＮＥＬのキットで染色した。その後、共焦点顕微鏡を備えたＢＩＯＲＥＶＯ顕微鏡システム（株式会社キーエンス製、ＢＺ−９０００）で細胞を観察した。
【０１１９】
（ｂ）結果
得られた顕微鏡写真を図８（ａ）〜（ｆ）に示す。無添加（図８（ａ））、薬物未導入ＣＮＴｓ（図８（ｂ））及び薬物未導入ＥｘＣＦｓ（図８（ｃ））で処理した細胞では、何れもＴＵＮＥＬ陽性（蛍光）は殆どみられず、アポトーシスは確認されなかった。遊離ＣＤＤＰ（図８（ｄ））、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ（図８（ｅ））及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ（図８（ｆ））で処理した細胞では、何れもＴＵＮＥＬ陽性（蛍光）が検出された。ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓは、何れも遊離ＣＤＤＰよりも強い蛍光を示したが、特にＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓは、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓよりも更に強い蛍光を示し、優れた抗がん作用を示すことが明らかになった。
【０１２０】
（４）ウエスタンブロット分析
抗ガン剤によるアポトーシス（細胞自死）を視覚化するべく、Bax、PARP-1及びカスパーゼ３のウエスタンブロット分析も行った。Baxは、アポトーシスを促進する作用を有するたんぱく質である。PARP-1は、抗がん剤等により損傷したＤＮＡを修復する作用を有する酵素である。カスパーゼ３は、PARP-1を分解し、ＤＮＡの修復を抑制する作用を有する酵素である。ＤＮＡの損傷等によりアポトーシスが開始されると、Baxの誘導やカスパーゼ−３及びPARP-1の分解が促進され、ＤＮＡの修復が阻害される。
【０１２１】
（ａ）材料及び方法
・材料：
遊離シスプラチン（以下「遊離ＣＤＤＰ」と称する場合がある。）としては、協和キリン社製プラトシン注（１バイアル１０ｍｇ）を用いた。
ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ及びＣＤＤＰ−ＣＮＴｓは、上記調製したものを用いた。
薬物未導入ＥｘＣＦｓとしては、上記１（１）（ａ）で調製したものを用いた。
薬物未導入ＣＮＴｓとしては、上記１（２）（ａ）で調製した酸化処理多層ＣＮＴを用いた。
【０１２２】
・方法：
上記２（３）（ａ）と同様に、ヒト骨肉腫細胞株MG63を、遊離ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ、薬物未導入ＥｘＣＦｓ、薬物未導入ＣＮＴｓの各存在下、又は無添加条件下（対照）でインキュベートした。インキュベート後のマウスの腫瘍組織を取り出しホモジナイズし、そこに含まれるタンパク質である、開裂カスパーゼ３（カスパーゼ３の分解物）、開裂ＰＡＲＰ−１（ＰＡＲＰ−１の分解物）、及びＢａｘの濃度を、ウエスタンブロット分析で測定した。
【０１２３】
タンパク質濃度の測定は、バイオ・ラッド（Bio-Rad）タンパク質アッセイ溶液を用いたブラッドフォード（Bradford）アッセイにより行った。タンパク質（３０μｇ）を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidene difluoride：ＰＶＤＦ）膜（Santa Cruz Biotechnology社製）に移した。免疫ブロッティングは、ウサギ由来抗Baxポリクローナル抗体、ウサギ由来抗開裂カスパーゼ−３ポリクローナル抗体、及び、マウス由来抗開裂PARP-１モノクローナル抗体（１：５００；Santa Cruz Biotechnology社製）を用いて行った。また、対照としてウサギ由来抗β−アクチン抗体（１：５００；Sigma社製）を用い、各サンプルが均一にロードされていることを確認した。この膜を、ヤギ由来ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（１：１０００；Santa Cruz Biotechnology社製）をプローブとして試験した。
【０１２４】
（ｂ）結果
結果を図９に示す。無添加、薬物未導入ＣＮＴｓ及び薬物未導入ＥｘＣＦｓで処理した細胞では、何れもBaxの誘導、カスパーゼ−３の分解、及びPARP-１の分解は殆どみられず、アポトーシスは確認されなかった。一方、遊離ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ、及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓで処理した細胞では、何れもBaxの誘導、カスパーゼ−３の分解、及びPARP-１の分解が検出され、アポトーシスが生じていることが確認された。ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓは、何れも遊離ＣＤＤＰよりも強いBaxの誘導、カスパーゼ−３の分解、及びPARP-１の分解を示したが、特にＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓは、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓよりも更に強いBaxの誘導、カスパーゼ−３の分解、及びPARP-１の分解を示し、優れた抗がん作用を示すことが明らかになった。
【０１２５】
（５）肺転移性病変の測定によるin vivo評価 
臀部に腫瘍を移植したマウスに、遊離シスプラチン、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ又はＣＤＤＰ−ＣＮＴｓを投与し、肺に存在するガン細胞の大きさを調査することで、抗がん作用を評価した(図１０)。
【０１２６】
（ａ）材料と方法
・骨肉腫細胞株
ヒト骨肉腫細胞株MG63を、米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）から入手した。何れの動物についても、４週以内に肉眼及び顕微鏡により肺転移を確認した。
【０１２７】
・動物
無菌の雌BALB/cヌードマウス（６〜８週齢）を日本クレア株式会社から購入した。何れの動物も、各実験の少なくとも１週間前から無菌動物施設で飼育した。何れの実験も、大分大学医学系研究科が定める動物実験規程に従って実施した。
【０１２８】
・試験計画
骨肉腫を導入する既知の手法を用いて、１×１０６のMG63細胞を、６〜８週齢の雌ヌードマウスの臀部に皮下移植した。何れの動物も腫瘍を発症した。移植から２週間後、動物を６群に分割し、以下の処理を施した。
【表３】
2014084296.tif 000013
また、予備実験を実施し、更に２０頭のマウスについて、肺転移の存在を確認した。
【０１２９】
・結果の評価及び分析
各群の動物について、マイクロＣＴ機器（R_mCT）を用い、移植した原発病変（primary lesion）及び肺転移腫瘍（lung metastatis）のスライスＣＴ画像を撮影した。I-view-R（株式会社モリタ製作所社製）をビューワーとしてＣＴ画像を分析し、腫瘍のサイズを測定し、腫瘍体積を式（π×長軸×短軸×短軸）／６により算出した。
グループ間の差異の分析は、非反復測定分散分析法（non-repeated measures analysis of variance：ＡＮＯＶＡ）及びシェフェ（Scheffe）試験により行った。何れの分析にもSPSS（登録商標）18.0ソフトウェア（ＳＰＳＳジャパン社製）を用いた。
【０１３０】
（ｂ）結果
薬物無担持ＥｘＣＦｓ投与群、遊離ＣＤＤＰ投与群、及びＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ投与群における、肺転移腫瘍の画像の例を図１０に、マウスの累積生存率の経時変化を表すグラフを図１１にそれぞれ示す。図１０の画像において、肺に見られる白い影は、ガン細胞を表す。薬物無担持ＥｘＣＦｓ投与群のマウスの肺は、ガン細胞が投与後２０日で肺に広がっており、更に投与後４０日で肺全体に及んでいることから、ＥｘＣＦｓ自体には抗がん作用が殆ど無いことがわかる。遊離ＣＤＤＰ投与群のマウスでは、投与後２０日ではガン細胞の転移は殆ど確認されなかったものの、投与後４０日では、薬物無担持ＥｘＣＦｓと比較すると小さいものの、ガン細胞の増殖が確認された。ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ投与群のマウスでは、投与後２０日及び４０日の何れの時点でも、ガン細胞は殆ど増殖していなかった。ここから、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓは遊離ＣＤＤＰと比べて、より高い抗ガン作用を有することが分かる。
【０１３１】
６群全てにおけるマウスの原発病変（primary lesion）及び肺転移腫瘍（lung metastatis）の体積の経時変化を、夫々図１２（ａ）及び（ｂ）のグラフに示す。薬物無担持ＥｘＣＦｓ投与群及び薬物無担持ＣＮＴｓ投与群における原発病変及び肺転移腫瘍の増大速度は、何れも対照群と同程度であり、抗がん効果や転移抑制効果は見られなかった。
【０１３２】
これに対して、遊離ＣＤＤＰ投与群、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ投与群及びＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ投与群では、原発病変及び肺転移腫瘍の何れについても増殖速度が抑制されており、抗がん効果や転移抑制効果が確認された。その効果は、遊離ＣＤＤＰ投与群よりもＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ投与群の方が高かったが、これは、ナノ炭素材料（ＥｘＣＦｓ及びＣＮＴｓ）ががん細胞に特異的に集積することで、導入された抗がん部位ががん細胞に効率的に作用したためであると考えられ、これらのナノ炭素材料が抗がん剤のキャリアとして有効であることを示している。
【０１３３】
更に、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ投与群では、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ投与群よりも、選りすぐれた原発病変及び肺転移腫瘍の抑制効果が見られた。具体的に、投与後４５日経過時点における原発病変の体積は、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ投与群では２７７．８４±４１．３４ｍｍ３であり、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ投与群の４２６．７８．５３±３３．１６ｍｍ３よりも有意に縮小していた（ｐ＜０．０１）。また、投与後４５日経過時点における肺転移腫瘍の体積は、ＣＤＤＰ−ＥｘＣＦｓ投与群では３３４．９４±１１８．１３ｍｍ３であり、ＣＤＤＰ−ＣＮＴｓ投与群の５２３．６１±９４．７５ｍｍ３）よりもやはり有意に縮小していた（ｐ＜０．０１）。これらの結果は、ＣＮＴｓよりもＥｘＣＦｓの方が、抗がん剤のキャリアとしてより優れていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明の抗がん剤は、医療分野、特に各種のがんの治療及び予防において有用であり、その産業上の利用価値は極めて高い。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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