(57)【要約】【課題】高発現が可能なヒアルロン酸合成酵素を提供することを目的とする。【解決手段】（１）〜（６）のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１種のヒアルロン酸合成酵素。（１）配列番号１に対するクエリカバレージが７０〜１００％、最大相同性が４０〜１００％のアミノ酸配列（２）配列番号２に対するクエリカバレージが６５〜１００％、最大相同性が４０〜１００％のアミノ酸配列（３）配列番号３に対するクエリカバレージが６５〜１００％、最大相同性が４０〜１００％のアミノ酸配列（４）配列番号４に対するクエリカバレージが５５〜１００％、最大相同性が４０〜１００％のアミノ酸配列（５）配列番号５に対するクエリカバレージが６０〜１００％、最大相同性が４０〜１００％のアミノ酸配列（６）配列番号６に対するクエリカバレージが６５〜１００％、最大相同性が４０〜１００％のアミノ酸配列【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（６）のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質からなるヒアルロン酸合成酵素。
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが７０〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（４）配列番号４のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが５５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（５）配列番号５のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６０〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（６）配列番号６のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
【請求項２】
下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）下記（１）〜（６）のアミノ酸配列からなる群より選ばれるいずれか１つのタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが７０〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（４）配列番号４のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが５５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（５）配列番号５のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６０〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（６）配列番号６のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸合成酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は牛の眼球、鶏冠、動物の緩衝組織、胎盤、癌細胞及び皮膚などの生体組織に多量に含まれているもので、化粧品添加剤、関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤として広範囲に使用されている。
ヒアルロン酸の生産方法としては、従来、（１）前記の生体組織から抽出する方法（特許文献１及び特許文献２）、（２）グルコース等の糖の存在下で、ヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を培養してヒアルロン酸を生産し、回収する方法（微生物培養方法）（特許文献３及び特許文献４）が用いられている。しかしながら、近年、生体組織からの抽出や微生物培養によらない第３のヒアルロン酸の生産方法として、（３）ヒアルロン酸合成酵素を用いた方法（非特許文献１）が検討されており、不純物が少なく、分子量が均一なヒアルロン酸を合成できることから注目されている。
【０００３】
ヒアルロン酸合成酵素とは、ヒアルロン酸を合成する活性を有する酵素であり、ストレプトコッカスピオゲネス由来のもの等が知られている（非特許文献２）。
しかしながら、工業的にヒアルロン酸を生産するには大量のヒアルロン酸合成酵素が必要となるが、従来のヒアルロン酸合成酵素は微生物等による生産量が少量である問題がある（非特許文献３及び４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、Ｖｏｌ．２７３、Ｎｏ．１４、Ｐ８４５４−８４５８
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００７、Ｖｏｌ．２８２、Ｎｏ．５１、Ｐ３６７７７−３６７８１
【非特許文献３】生物工学会誌、香山憲夫  他、２０００年、第７８巻、第３号、ｐ８２−９３
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、Ｖｏｌ．２７４、Ｎｏ．７、ｐ４２４６−４２５３
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，１４１，９７３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，３０３，６７６号明細書
【特許文献３】特開昭５８−０５６６９２号公報
【特許文献４】国際公開第８６／８６０４３５５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
また、従来のヒアルロン酸合成酵素は膜タンパク質であるため、可溶性タンパク質としては高発現しない問題がある。
本発明は、高発現が可能なヒアルロン酸合成酵素を提供することを目的とする。
なお、高発現とは、活性を持った酵素が多く得られることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、本発明に到達した。
即ち本発明は、下記（１）〜（６）のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質からなるヒアルロン酸合成酵素；下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）下記（１）〜（６）のアミノ酸配列からなる群より選ばれるいずれか１つのタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが７０〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（４）配列番号４のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが５５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（５）配列番号５のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６０〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（６）配列番号６のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
【発明の効果】
【０００８】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、高発現が可能になるという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、下記（１）〜（６）のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質からなるヒアルロン酸合成酵素である。
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが７０〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（４）配列番号４のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが５５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（５）配列番号５のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６０〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
（６）配列番号６のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが６５〜１００％であり、最大相同性が４０〜１００％であるアミノ酸配列
【００１０】
ヒアルロン酸合成酵素は、ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとから、ヒアルロン酸を合成するヒアルロン酸合成活性を有する酵素である。ヒアルロン酸合成活性は、具体的には、ウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位の、β１，４結合による繰り返し構造を有するオリゴ糖を合成する能力をいう。
【００１１】
本発明の配列番号１〜６のアミノ酸配列（上記において、クエリカバレージが１００％、最大相同性が１００％であるもの）からなるヒアルロン酸合成酵素は、従来のヒアルロン酸合成酵素と比較して水中で不活性の封入体となりにくく、水溶性も高い。したがって、高発現が可能となる。さらに、本発明の配列番号１〜６のアミノ酸配列からなるヒアルロン酸合成酵素は、従来のヒアルロン酸合成酵素と比較して微生物による産生量が多く、ヒアルロン酸合成酵素を大量に得ることができる。
【００１２】
また、配列番号１〜６のアミノ酸配列に対するクエリカバレージが上記範囲であり、最大相同性が上記範囲であるアミノ酸配列からなるヒアルロン酸合成酵素も、配列番号１〜６のアミノ酸配列からなるヒアルロン酸合成酵素と同様に、従来のヒアルロン酸合成酵素と比較して高発現が可能であり、微生物による産生量が多い。
【００１３】
クエリカバレージ（Ｑｕｅｒｙ  Ｃｏｖｅｒａｇｅ）とは、配列番号１〜６のアミノ酸配列と、あるアミノ酸配列とを比較した場合、あるアミノ酸配列全体において、配列番号１〜６のアミノ酸配列と相同な領域を含む割合を示す。クエリカバレージは、ＢＬＡＳＴプログラムで用いられる数値である。クエリカバレージを求めるプログラムは、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞に掲載されており、このプログラムにより求める。
上記（１）のアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列に対するクエリカバレージは、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性及び水溶性の観点から、８０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（２）のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列に対するクエリカバレージは、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性及び水溶性の観点から、８０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（３）のアミノ酸配列において、配列番号３のアミノ酸配列に対するクエリカバレージは、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性及び水溶性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは７１〜１００％であり、次にさらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（４）のアミノ酸配列において、配列番号４のアミノ酸配列に対するクエリカバレージは、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性及び水溶性の観点から、６５〜１００％が好ましく、さらに好ましくは６９〜１００％であり、次にさらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（５）のアミノ酸配列において、配列番号５のアミノ酸配列に対するクエリカバレージは、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性及び水溶性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは７３〜１００％であり、次にさらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（６）のアミノ酸配列において、配列番号６のアミノ酸配列に対するクエリカバレージは、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性及び水溶性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは７３〜１００％であり、次にさらに好ましくは９０〜１００％である。
【００１４】
最大相同性（Ｍａｘ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、配列番号１〜６のアミノ酸配列と、あるアミノ酸配列とを比較した場合、あるアミノ酸配列において配列番号１〜６のアミノ酸配列と相同性が高い部分において、配列番号１〜６のアミノ酸配列と相同な割合を示す。最大相同性は、ＢＬＡＳＴプログラムで用いられる数値である。最大相同性を求めるプログラムは、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞に掲載されており、このプログラムにより求める。
上記（１）のアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列に対する最大相同性は、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（２）のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列に対する最大相同性は、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（３）のアミノ酸配列において、配列番号３のアミノ酸配列に対する最大相同性は、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（４）のアミノ酸配列において、配列番号４のアミノ酸配列に対する最大相同性は、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（５）のアミノ酸配列において、配列番号５のアミノ酸配列に対する最大相同性は、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは９０〜１００％である。
上記（６）のアミノ酸配列において、配列番号６のアミノ酸配列に対する最大相同性は、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性の観点から、７０〜１００％が好ましく、さらに好ましくは９０〜１００％である。
【００１５】
上記（１）〜（６）のアミノ酸配列は、配列番号１〜６のアミノ酸配列のアミノ酸が１〜１５０個欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるヒアルロン酸合成酵素が含まれ、ヒアルロン酸合成酵素の高発現性の観点から、欠失、置換及び／又は付加されるアミノ酸の個数は、１〜５０個が好ましく、さらに好ましくは１〜２０個である。
【００１６】
上記（１）〜（６）のアミノ酸配列からなるヒアルロン酸合成酵素として、具体的には、配列番号１３（配列番号１に対するクエリカバレージが８０％、最大相同性が１００％、配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ酸５７個を欠失させたもの）、配列番号１４（配列番号２に対するクエリカバレージが８０％、最大相同性が９９％、配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸６４個が付加したもの）、配列番号１５（配列番号３に対するクエリカバレージが７１％、最大相同性が１００％、配列番号３のアミノ酸配列にアミノ酸１０６個が付加したもの）、配列番号１６（配列番号４に対するクエリカバレージが６９％、最大相同性が１００％、配列番号４のアミノ酸配列にアミノ酸１３９個が付加したもの）、配列番号１７（配列番号５に対するクエリカバレージが７３％、最大相同性が１００％、配列番号５のアミノ酸配列にアミノ酸１４０個が付加したもの）、配列番号１８（配列番号６に対するクエリカバレージが７３％、最大相同性が１００％、配列番号６のアミノ酸配列にアミノ酸１４１個が付加したもの）、等が挙げられる。
【００１７】
本発明のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子を微生物等の宿主に導入し、宿主を培養液中で培養し、培養液中からヒアルロン酸合成酵素を採取及び生成することによって生産することができる。
なお、本発明のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。
【００１８】
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡからなり、本発明のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子である。
（ａ）上記（１）〜（６）のアミノ酸配列からなる群より選ばれるいずれか１つのタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１９】
本発明の遺伝子には、配列番号１〜６のアミノ酸配列をコードする配列番号７〜１２からなるＤＮＡ、配列番号１３〜１８のアミノ酸配列をコードする配列番号１９〜２４からなるＤＮＡ及び該塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡからなる遺伝子が含まれる。これら以外にも、本発明のヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡからなる遺伝子が含まれる。
【００２０】
本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５重量％  ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００２１】
本発明に記載の遺伝子をクローニングする方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の方法等が挙げられる。
【００２２】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、本発明の遺伝子を、例えばバチラス属に属する微生物、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等から、ショットガン法、ＰＣＲ法を用いてクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。
【００２３】
本発明の遺伝子を用いてヒアルロン酸合成酵素を生産する方法は、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、本発明のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子を組込み、この組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、組み換えベクターを含む形質転換体を得る。得られた形質転換体を培養し、この培養液からヒアルロン酸合成酵素を採取すればよい。
【００２４】
組換えベクターは、適当なベクターに本発明のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子を挿入することによって得ることができる。
ベクターは種々のものが公知であり、市販品も多く存在する。当業者であれば、宿主の種類に応じて適切なベクターを容易に選択することができる。ベクターの具体例としては、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣシリーズなどが挙げられる。
組換えベクターの調製方法自体は公知である。適当なベクターにヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子を挿入し、宿主を形質転換する具体的な方法としては、エレクトロポレーション法、カルシウム法等が挙げられる。
【００２５】
本発明において、宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物、植物細胞などが挙げられる。
動物細胞としては、特に限定されないが、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞及びＣＨＯ細胞等が挙げられる。
昆虫細胞としては、特に限定されないが、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等が挙げられる。
微生物としては、特に限定されないが、細菌及び酵母等が挙げられる。
細菌としては、真正細菌及び古細菌が含まれる。
真正細菌には、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属)、ラクトコッカス属 (Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属)、エンテロコッカス属 (Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属)、ペディオコッカス属(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属)、リューコノストック属 (Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属)、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。
植物細胞としては、特に限定されないが、ＢＹ−２細胞等が挙げられる。
【００２６】
本発明において、宿主としては、クローニングの容易さの観点から、微生物が好ましく、さらに好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）であり、特に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）である。
【００２７】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２８】
本発明において、培養液からヒアルロン酸合成酵素を採取及び精製する方法としては、常法に準じて行うことができる。例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【実施例】
【００２９】
以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
＜実施例１＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１）発現株の作成］
ｐＭＸベクターに組み込まれた配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合した。ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株にこのプラスミドを形質転換して配列番号１のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１）を発現する発現株（ａ）を作成した。
【００３１】
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１）の製造］
発現株（ａ）の終夜培養液１ｍｌを作成し、０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い前培養液を作成した。前培養液を５０ｍＬの培養液（酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（III）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を開始した。培養開始３時間後１Ｍ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％  グリセリン、５０ｇ／Ｌ  ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ  消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン）の滴下を開始し、培養を継続した。
培養開始後、２０時間で培養液を回収した。培養液を遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌した。集菌した細菌を当業者が行う一般的な超音波破砕法によって破砕し、ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１）を含む抽出液を得た。抽出液を用いて、ヒアルロン酸合成酵素量、ヒアルロン酸合成量、ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１）の比活性を測定した。結果を表１に示す。
【００３２】
＜実施例２＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−２）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号８の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号２のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−２）を発現する発現株（ｂ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−２）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｂ）」を用いる以外は同様に行った。
【００３３】
＜実施例３＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−３）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号９の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号３のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−３）を発現する発現株（ｃ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−３）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｃ）」を用いる以外は同様に行った。
【００３４】
＜実施例４＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−４）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１０の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号４のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−４）を発現する発現株（ｄ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−４）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｄ）」を用いる以外は同様に行った。
【００３５】
＜実施例５＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−５）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１１の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号５のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−５）を発現する発現株（ｅ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−５）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｅ）」を用いる以外は同様に行った。
【００３６】
＜実施例６＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−６）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１２の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号６のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−６）を発現する発現株（ｆ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−６）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｆ）」を用いる以外は同様に行った。
【００３７】
＜実施例７＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−７）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号１３のアミノ酸配列をコードする配列番号１９の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号１３のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−７）を発現する発現株（ｇ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−７）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｇ）」を用いる以外は同様に行った。
【００３８】
＜実施例８＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−８）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号１４のアミノ酸配列をコードする配列番号２０の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号１４のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−８）を発現する発現株（ｈ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−８）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｈ）」を用いる以外は同様に行った。
【００３９】
＜実施例９＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−９）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列番号２１の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号１５のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−９）を発現する発現株（ｉ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−９）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｉ）」を用いる以外は同様に行った。
【００４０】
＜実施例１０＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１０）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号２２の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号１６のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１０）を発現する発現株（ｊ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１０）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｊ）」を用いる以外は同様に行った。
【００４１】
＜実施例１１＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１１）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号１７のアミノ酸配列をコードする配列番号２３の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号１７の改ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１１）を発現する発現株（ｋ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１１）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｋ）」を用いる以外は同様に行った。
【００４２】
＜実施例１２＞
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１２）発現株の作成］
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「配列番号１８のアミノ酸配列をコードする配列番号２４の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号１８の改ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１２）を発現する発現株（ｌ）を作成した。
［ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１２）の製造］
実施例１において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｌ）」を用いる以外は同様に行った。
【００４３】
＜比較例１＞
[ストレプトコッカスピオゲネス由来のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ’−１）発現株の作成]
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「ストレプトコッカスピオゲネス由来の配列番号２５のヒアルロン酸合成酵素をコードする配列番号２７の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号２５のストレプトコッカスピオゲネス由来のヒアルロン酸合成酵素を発現する発現株（ｍ）を作成した。
［ストレプトコッカスピオゲネス由来のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ’−１）の製造］
実施例１の「ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１）の製造」において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｍ）」を用いる以外は同様に行った。
【００４４】
＜比較例２＞
[ストレプトコッカスウベリス由来のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ’−２）発現株の作成]
実施例１において、「配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号７の核酸配列遺伝子」に代えて「ストレプトコッカスピオゲネス由来の配列番号２６のヒアルロン酸合成酵素をコードする配列番号２８の核酸配列遺伝子」を用いる以外は同様にして、配列番号２６のストレプトコッカスウベリス由来のヒアルロン酸合成酵素を発現する発現株（ｎ）を作成した。
［ストレプトコッカスウベリス由来のヒアルロン酸合成酵素（Ｘ’−２）の製造］
実施例１の「ヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１）の製造」において、「発現株（ａ）」に代えて「発現株（ｎ）」を用いる以外は同様に行った。
【００４５】
＜抽出液中のヒアルロン酸合成酵素量の測定＞
実施例１〜１２及び比較例１〜２で得られた上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、抽出液中に含まれるヒアルロン酸合成酵素（Ｘ−１）〜（Ｘ−１２）及び（Ｘ’−１）〜（Ｘ’−２）の量を測定した。
タンパク質量の検量線として１μｇ、２．５μｇ、５μｇの牛血清アルブミンをＳＤＳ−ＰＡＧＥした。クーマシーブリリアントブルー染色液によってタンパク質を染色した。牛血清アルブミンのバンドから検量線を作成した。検量線を用いて、抽出液中に含まれるヒアルロン酸合成酵素量（ｍｇ／Ｌ）を算出した。
【００４６】
＜ヒアルロン酸合成量の測定＞
実施例１〜１２及び比較例１〜２で得られた抽出液０．１ｍｌに、それぞれ０．１重量％になるようにＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンとＵＤＰ−グルクロン酸とを添加し、緩衝液中で混合し、３０℃で２時間反応させた。
反応後、反応液をポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。電気泳動したゲルをアルシアンブルー染色液によって染色した。同時に精製ヒアルロン酸を１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇを電気泳動し、染色した。電気泳動した際に見られるヒアルロン酸のバンドからヒアルロン酸検量線を作成した。検量線を用いて、電気泳動した際に見られるヒアルロン酸のバンドからヒアルロン酸合成量（ｍｇ／Ｌ／ｈ）を算出した。
【００４７】
＜ヒアルロン酸合成酵素の比活性＞
得られたヒアルロン酸合成酵素量及びヒアルロン酸合成量の値を用いて、下記数式により、ヒアルロン酸合成酵素の比活性（ｍｇ／ｍｇ／ｈ）を算出した。
ヒアルロン酸合成酵素の比活性＝（ヒアルロン酸合成量）／（ヒアルロン酸合成酵素量）
【００４８】
【表１】
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【００４９】
表１の結果から、実施例１〜１２のヒアルロン酸合成酵素と比較例１〜２のヒアルロン酸合成酵素とを比較すると、実施例１〜１２のヒアルロン酸合成酵素を用いた場合、ヒアルロン酸合成量が多く、活性を持った酵素が多く得られたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、高発現が可能なので、工業利用しやすく、ヒアルロン酸の酵素合成の工業化が可能である。また、このヒアルロン酸合成酵素を用いて得たヒアルロン酸は、化粧品用だけでなく、医療用等にも用いることができる。
【配列表】
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