(57)【要約】【課題】      イヌトウキから抽出される抽出物を有効に活用するために、抽出物の新たな用途を提案すると共に、イヌトウキを新たな生理活性剤を生産する原料として捉え直すことを提案することを目的とする。【解決手段】  神経保護物質を生産する生産方法であって、イヌトウキから抽出物を抽出して生産する。特に、イソエポキシプテリキシン、β-アミリン、α-グルチノール、Quercetin、Kaempferol-3-O-glucoside、又は、Kaempferol-3-O-rutinosideのアセチルコリンエステラーゼ阻害効果を神経保護剤等に活用する。また、その他の抽出物を含む抽出物の活性酸素又はβ−アミロイドによる細胞毒性防止効果を神経保護剤等に活用する。【選択図】  図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経保護効果を有する物質を生産する生産方法であって、
前記神経保護効果を有する物質をイヌトウキから抽出するステップを含む、生産方法。
【請求項２】
前記神経保護効果は、アセチルコリンエステラーゼ阻害効果である、請求項１記載の生産方法。
【請求項３】
前記アセチルコリンエステラーゼ阻害効果を有する物質は、（１）式で表されるQuercetin、（２）式で表されるKaempferol-3-O-glucoside、（３）式で表されるKaempferol-3-O-rutinoside、又は、（４）式で表されるイソエポキシプテリキシン（Isoepoxypteryxin）である、請求項２記載の生産方法。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【請求項４】
前記神経保護効果は、細胞毒性の防止効果である、請求項１記載の生産方法。
【請求項５】
前記細胞毒性は、活性酸素による細胞毒性である、請求項４記載の生産方法。
【請求項６】
活性酸素による前記細胞毒性の防止効果を有する物質は、（５）式で表される3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  ester、（６）式で表される3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid、（７）式で表されるQuercetin、（８）式で表されるAdenosine、（９）式で表されるKaempferol、（１０）式で表されるLuteolin、（１１）式で表されるKaempferol-3-O-glucoside、（１２）式で表されるKaempferol-3-O-rutinoside、又は、（１３）式で表されるイソエポキシプテリキシン（Isoepoxypteryxin）である、請求項５記載の生産方法。
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
2014237635.tif 000019
【化１２】
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【化１３】
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【請求項７】
前記細胞毒性は、β−アミロイドによる細胞毒性である、請求項４記載の生産方法。
【請求項８】
β−アミロイドによる前記細胞毒性の防止効果を有する物質は、（１４）式で表されるIsoepoxypteryxin、（１５）式で表されるKaempferol-3-O-glucoside、（１６）式で表されるKaempferol-3-O-rutinoside、（１７）式で表されるKaempferol、（１８）式で表されるβ-amyrin、（１９）式で表されるα-glutinol、（２０）式で表される3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  ester、（２１）式で表される3-O-trans-caffeoyl-quinic acid、（２２）式で表されるAdenosine、（２３）式で表されるLuteolin、又は、（２４）式で表されるQuercetinである、請求項７記載の生産方法。
【化１４】
2014237635.tif 000022
【化１５】
2014237635.tif 000023
【化１６】
2014237635.tif 000024
【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
2014237635.tif 000029
【化２２】
2014237635.tif 000030
【化２３】
2014237635.tif 000031
【化２４】
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【請求項９】
（２５）式で表される3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  esterを生産する生産方法であって、
セリ科の植物から抽出物を抽出するステップを含む、生産方法。
【化２５】
2014237635.tif 000033
【請求項１０】
（２６）式で表されるα-glutinol又は（２７）式で表されるKaempferol-3-O-rutinosideを生産する生産方法であって、
シシウド属の植物から抽出物を抽出するステップを含む、生産方法。
【化２６】
2014237635.tif 000034
【化２７】
2014237635.tif 000035
【請求項１１】
（２８）式で表されるPalmitic  acid、（２９）式で表されるα-glutinol、（３０）式で表されるβ-amyrin、（３１）式で表される3-O-trans-caffeoyl-quinic acid、（３２）式で表されるKaempferol、（３３）式で表されるLuteolin、（３４）式で表されるQuercetin、（３５）式で表されるKaempferol-3-O-glucoside、又は、（３６）式で表されるAdenosineを生産する生産方法であって、
イヌトウキから抽出物を抽出するステップを含む、生産方法。
【化２８】
2014237635.tif 000036
【化２９】
2014237635.tif 000037
【化３０】
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【化３１】
2014237635.tif 000039
【化３２】
2014237635.tif 000040
【化３３】
2014237635.tif 000041
【化３４】
2014237635.tif 000042
【化３５】
2014237635.tif 000043
【化３６】
2014237635.tif 000044
【請求項１２】
（３７）式で表されるイソエポキシプテリキシン（Isoepoxypteryxin）を含有する神経保護剤。
【化３７】
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【請求項１３】
前記イソエポキシプテリキシン（Isoepoxypteryxin）をアセチルコリンエステラーゼ阻害剤又は活性酸素若しくはβ-アミロイドによる細胞毒性防止剤として含有する、請求項１２記載の神経保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生産方法及び神経保護剤に関し、特に、神経保護効果を有する物質を生産する生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる日本山人参と言われるセリ科植物には、イヌトウキ（犬当季：Angelica  shikokiana）とヒュウガトウキ（日向当季：Angelica  tenuisecta  var  furcijuga）という２種類の学名のシシウド属に属する植物がある。日本山人参は、イヌトウキ及びヒュウガトウキとこれらの近似植物の総称と言われることもある。総称と捉えれば、イヌトウキとヒュウガトウキの他にも、トウキ、ホッカイトウキ、セイヨウトウキ、カラトウキ、シシウド、アシタバという同属の学名のものが含まれる。
【０００３】
従来、イヌトウキから抽出されるイソエポキシプテリキシンは、血管拡張作用、末梢循環の改善、糖尿病症状の改善、肝の脂肪蓄積防止、アレルギー症状の改善、皮膚炎等の症状軽快、糖尿病改善、高血圧改善に有効であるといわれている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。
【０００４】
他方、ヒュウガトウキについては、種々の研究により、抽出物の生理活性が明らかにされてきている（例えば、非特許文献２及び３参照。）。ヒュウガトウキは、平成１４年１１月に厚生労働省から医薬品（生薬）の認定を受けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−５３５６０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Taniguchi  M、外４名著，The  115th  Annual  Meeting  of  the  Pharmaceutical  Society  of  Japan，Sendai，March  1995，Abstract  of  Papers  II，p.194．
【非特許文献２】松下洋一、外３名著，ヒュウガトウキ（Angelica  furcijuga  Kitagawa）葉および茎の分離・分析，Memoirs  of  the  Faculty  of  Engineering，Miyazaki  University，38:87-90，2009-09-30．
【非特許文献３】藤原博士、外６名著，ヒュウガトウキ（Angelica  furcijuga）のメラニン色素産生能への影響，Jpn  Phaimacok  Ther(薬理と治療)，vol.38，no.12，2010．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、イヌトウキについては、ヒュウガトウキとは異なり、抽出物の生理活性はほとんど研究されておらず、薬理効果等について、氷山の一角を明らかにしたにすぎない。その結果、イヌトウキは、医薬品（生薬）の認定を受けておらず、イヌトウキからの抽出物を用いた製品も、実質的には実用化にまで至っていない。
【０００８】
ゆえに、本願発明は、イヌトウキから抽出される抽出物を有効に活用するために、抽出物の新たな用途を提案すると共に、イヌトウキを新たな生理活性剤を生産する原料として捉え直すことを提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明の第１の観点は、イヌトウキから抽出物を抽出する抽出方法であって、前記イヌトウキの部位を選択する選択ステップと、前記選択された前記イヌトウキの部位から、生理活性効果を促進又は抑制する抽出物を抽出する抽出ステップを含むものである。
【００１０】
本願発明の第２の観点は、第１の観点の抽出方法において、前記抽出ステップにおいて、前記生理活性効果を促進する抽出物を抽出する場合には、第１抽出溶媒を用いて前記イヌトウキから前記抽出物を抽出し、前記生理活性効果を抑制する抽出物を抽出する場合には、前記第１抽出溶媒とは異なる第２抽出溶媒を用いて前記イヌトウキから前記抽出物を抽出するものである。
【００１１】
本願発明の第３の観点は、第２の観点の抽出方法であって、前記第１抽出溶媒及び前記第２抽出溶媒は、一方が非極性溶媒であり、他方が極性溶媒である。
【００１２】
本願発明の第４の観点は、第１から第３のいずれかの観点の抽出方法であって、前記選択ステップにおいて、前記イヌトウキの部位は、根、茎、種及び葉の一部又は全部を選択するものであり、前記生理活性効果は、メラニン生合成、リパーゼ阻害活性、抗菌活性、抗アレルギー活性及び抗酸化活性の少なくとも一つである。
【００１３】
本願発明の第５の観点は、第１から第４のいずれかの観点の抽出方法であって、前記生理活性効果は、メラニン生合成であり、前記第１抽出溶媒は、前記第２抽出溶媒よりも極性が高いものである。
【００１４】
本願発明の第６の観点は、イヌトウキから抽出された抽出物であって、メラニン生合成、リパーゼ阻害活性、抗菌活性、抗アレルギー活性及び抗酸化活性の少なくとも一つを促進又は抑制する生理活性効果を発揮することを特徴とするものである。
【００１５】
本願発明の第７の観点は、第６の観点の抽出物であって、前記イヌトウキの茎から抽出されたものである。
【００１６】
本願発明の第８の観点は、第６又は第７の観点の抽出物を用いた日用品を含む製品である。
【００１７】
本願発明の第９の観点は、第８の観点の製品であって、前記抽出物は、エタノールを抽出溶媒として抽出されることにより、メラニン生合成を抑制する生理活性効果を発揮するものであり、前記日用品は、美白化粧品である。
【００１８】
本願発明の第１０の観点は、第８の観点の製品であって、前記抽出物は、水を抽出溶媒として抽出されることにより、メラニン生合成を促進する生理活性効果を発揮するものであり、前記日用品は、ヘアケア製品である。
【００１９】
本願発明の第１１の観点は、神経保護効果を有する物質を生産する生産方法であって、前記神経保護効果を有する物質をイヌトウキから抽出するステップを含む、生産方法である。
【００２０】
本願発明の第１２の観点は、第１１の観点の生産方法であって、前記神経保護効果は、アセチルコリンエステラーゼ阻害効果である。
【００２１】
本願発明の第１３の観点は、第１２の観点の生産方法であって、前記アセチルコリンエステラーゼ阻害効果を有する物質は、図１０に示される、Quercetin、Kaempferol-3-O-glucoside、Kaempferol-3-O-rutinoside、イソエポキシプテリキシン（Isoepoxypteryxin）である。
【００２２】
本願発明の第１４の観点は、第１１の観点の生産方法であって、前記神経保護効果は、細胞毒性の防止効果である。
【００２３】
本願発明の第１５の観点は、第１４の観点の生産方法であって、前記細胞毒性は、活性酸素による細胞毒性である。
【００２４】
本願発明の第１６の観点は、第１５の観点の生産方法であって、活性酸素による前記細胞毒性の防止効果を有する物質は、図１０に示される、3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  ester、3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid、Quercetin、Adenosine、Kaempferol、Luteolin、Kaempferol-3-O-glucoside、Kaempferol-3-O-rutinoside、又は、イソエポキシプテリキシン（Isoepoxypteryxin）である。
【００２５】
本願発明の第１７の観点は、第１４の観点の生産方法であって、前記細胞毒性は、β−アミロイドによる細胞毒性である。
【００２６】
本願発明の第１８の観点は、第１７の観点の生産方法であって、β−アミロイドによる前記細胞毒性の防止効果を有する物質は、図１０に示される、Isoepoxypteryxin、Kaempferol-3-O-glucoside、Kaempferol-3-O-rutinoside、Kaempferol、β-amyrin、α-glutinol、3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  ester、3-O-trans-caffeoyl-quinic acid、Adenosine、Luteolin、又は、Quercetinである。
【００２７】
本願発明の第１９の観点は、図１０に示される3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  esterを生産する生産方法であって、セリ科の植物から抽出物を抽出するステップを含む、生産方法である。
【００２８】
本願発明の第２０の観点は、図１０に示される、α-glutinol又はKaempferol-3-O-rutinosideを生産する生産方法であって、シシウド属の植物から抽出物を抽出するステップを含む、生産方法である。
【００２９】
本願発明の第２１の観点は、図１０に示される、Palmitic  acid、α-glutinol、β-amyrin、3-O-trans-caffeoyl-quinic acid、Kaempferol、Luteolin、Quercetin、Kaempferol-3-O-glucoside、又は、Adenosineを生産する生産方法であって、イヌトウキから抽出物を抽出するステップを含む、生産方法である。
【００３０】
本願発明の第２２の観点は、図１０に示されるイソエポキシプテリキシン（Isoepoxypteryxin）を含有する神経保護剤である。
【００３１】
本願発明の第２３の観点は、第２２の観点の神経保護剤であって、前記イソエポキシプテリキシン（Isoepoxypteryxin）をアセチルコリンエステラーゼ阻害剤又は活性酸素若しくはβ-アミロイドによる細胞毒性防止剤として含有する。
【００３２】
なお、製品としては、例えば、メラニン生合成という観点からヘアケア製品（例えば、シャンプー、リンス、髪染など）、抗菌や抗アレルギー等の観点から、歯磨き粉、食器用洗剤、入浴剤、洗濯用洗剤などがある。また、飲食品、サプリメント等の錠剤、ドリンク剤、日用雑貨品などもある。また、例えば、抗アレルギーという観点からは、アトピー等の皮膚がきれいになるなどの効果が期待される。加えて、アルツハイマー病等に効果を有する神経保護剤などの医薬品としての活用も期待される。
【発明の効果】
【００３３】
本願発明の各観点によれば、イヌトウキの各部位から、特定の生理活性効果を抑制又は促進する抽出物を抽出することができる。
【００３４】
イヌトウキの抽出物が、各部位によって機能性が具体的に異なること、特に、茎（幹）も、良い生理活性を有することは、発明者らによって明らかにされたものである。イヌトウキは、分類上は「人参」とは関係のないにもかかわらず、ヒュウガトウキと含めて「日本山人参」と称されてきたことから検討すれば、「山人参」と称されていることから、注目されている部位は、一般に薬効が高いとされる根であり、次に葉であろう。特に、茎に関しては、廃棄されるべきものとされ、活用されていない。しかしながら、発明者らは、イヌトウキの部位によって具体的な機能性が異なること、特に、茎も、良い生理活性を示すことを明らかにした。そのため、イヌトウキの抽出物の機能性については、部位を特定することが重要である。このように、抽出物の機能性について、イヌトウキの部位に着目すること、特に、茎を活用することができることは、当業者が予想できなかったものである。
【００３５】
さらに、発明者らは、例えばエタノールによる抽出物と水による抽出物を比較したとき、例えばメラニン生合成について、エタノール抽出物ではこれを抑制し、水抽出物ではこれを促進することとなることを明らかにした。ここで、エタノールは、極性が低い溶媒の一例であり、水は、極性が高い溶媒の一例ということができる。本願発明の第２の観点にあるように、イヌトウキの各部位からの抽出物が、溶媒に依存して、特定の生理活性効果を促進したり抑制したりすることは、発明者らによって明らかにされた事項である。そのため、同じイヌトウキの部位であっても、溶媒によって、特定の生理活性効果を促進又は抑制した抽出物を利用することが可能になる。このように、溶媒によって、同じ生理活性効果を促進させたり抑制させたりする抽出物が得られることは、当業者が予想できなかったものである。
【００３６】
このように、イヌトウキの部位によっても、抽出溶媒によっても、抽出成分が異なり、機能性が異なることは、当業者が容易に推測しえたものではない。
【００３７】
また、本願発明の第１１の観点によれば、イヌトウキから神経保護効果を有する物質を抽出することが可能となる。これまで、イヌトウキからの抽出物質に神経保護効果があることは知られておらず、イヌトウキを新たな生理活性剤の原料として活用することが可能となる。
【００３８】
本発明の第１２から第１８の観点によれば、イヌトウキからの抽出物質をアセチルコリンエステラーゼの阻害剤、又は、活性酸素若しくはβ−アミロイドによる細胞毒性防止剤として具体的に活用することが可能となる。
【００３９】
発明者らは、イヌトウキの抽出物質の中でも特にどの物質がどの神経保護効果を顕著に有するかを見出した。そこで、イヌトウキ由来の抽出物から神経保護剤を効率よく生産することが容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本願発明の実施の形態に係る抽出処理の一例を示すフロー図である。
【図２】メラニン生合成阻害試験の試験結果を示す表である。
【図３】リパーゼ阻害試験の試験結果を示すグラフである。
【図４】抗菌活性試験の試験結果を示すグラフである。
【図５】抗アレルギー活性試験の試験結果を示すグラフである。
【図６】抗酸化活性試験の試験結果を示すグラフである。
【図７】分画条件を示す表である。
【図８】全抽出のクロマトグラフィーの分画を示す表である。
【図９】図８のＦ１０のクロマトグラフィーの分画を示す表である。
【図１０】Ｆ２、Ｆ５及びＦ１０から単離された物質の構造式を示す図である。
【図１１】アセチルコリンエステラーゼ阻害試験の結果を示すグラフである。
【図１２】過酸化水素を用いた細胞毒性試験の試験結果を示すグラフである。
【図１３】イヌトウキの抽出物から特定した物質と過酸化水素を用いた細胞毒性試験の試験結果を示すグラフである。
【図１４】イヌトウキの抽出物から特定した物質とβ−アミロイドを用いた細胞毒性試験の試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図１は、本願発明の実施の形態に係る抽出処理の一例を示すフロー図である。まず、イヌトウキの部位を選択する（図１のステップＳＴ１）。例えば、根、茎、葉、種などである。続いて、抽出溶媒を選択する（図１のステップＳＴ２）。抽出溶媒は、例えば、水、エタノールなどである。続いて、ステップＳＴ１において選択された部位を例えば粉末状にし、ステップＳＴ２において選択された抽出溶媒を用いて、抽出物を調製する（ステップＳＴ３）。続いて、ステップＳＴ３において調製された抽出物を含む製品を製造する（ステップＳＴ４）。
【００４２】
以下では、まず、イヌトウキの根、茎、葉及び種について、水抽出物とエタノール抽出物について、生理活性に関する実験結果について説明する。この実験結果によれば、イヌトウキは部位ごとに様々な生理活性（メラニン生合成阻害、抗アレルギー、抗リパーゼ、抗菌、抗酸化）を持つことが明らかになった。なお、具体的な実験については、例えば、食品機能性の科学編集委員会，“食品機能性の科学”，2008年などを参照されたい。
【００４３】
まず、植物試料の調製について説明する。
【００４４】
イヌトウキの各部位（根、茎、葉、種）を各20ｇ用意し、それぞれを150mLのエタノールで３回抽出した。３回の抽出は、常温で、ときどき攪拌し、それぞれ一昼夜後にろ過して抽出を行った。エタノール抽出液は、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。これにより、エタノール抽出物を得た。エタノール抽出物はDimethylsulfoxide（DMSO）に溶解させ、160、40、20、10、5、2.5、1.25mg/mLに調製し、その後の実験に用いた。
【００４５】
また、イヌトウキの各部位（根、茎、葉、種）を各20ｇ用意し、それぞれを100mLの水で３回抽出した。抽出方法は、先と同様である。水抽出液は、凍結乾燥器TAITEC(Freeze  Dryer)VD-250Rを用いて溶媒を除去した。これにより、水抽出物を得た。水抽出物は水：DMSO＝１：１の溶液に溶解させ、160、40、20、10、5、2.5、1.25mg/mLに調製し、その後の実験に用いた。
【００４６】
表１は、部位ごとの抽出率（溶媒重量当たりの抽出物の重量％）を示す。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
続いて、メラニン生合成試験について説明する。各抽出物が、B16メラノーマ細胞のメラニン生合成量に与える影響を評価した。また、化粧品等の製品化にあたっては、細胞が死なないことが重要である。そのため、細胞生存率も評価した。
【００４９】
シャーレ上に培養したB16メラノーマ細胞培養液（Eagle's  Minimum  Essential  Medium  Alpha（EMEM））を血球計測板に10μL添加し、顕微鏡を用いて細胞数を測定した。その後、細胞培養液にEMEM培地を加え、細胞濃度を1.0×105cells/mLとなるよう調製した。これを24ウェルプレートの各ウェルに１mLずつ播種し、５モル％CO2、37℃で24時間静置培養した。培養後、24ウェルプレートの培地を除去し、新たにEMEM培地998μLとサンプル溶液2μLを添加した。これを５モル％CO2、37℃で48時間静置培養した。培養後、再び培地を除去し、EMEM培地998μLとサンプル溶液2μLを添加し、５モル％CO2、37℃で24時間静置培養した。培養後、下記の方法で細胞生存率とメラニン生合成量を測定した。
【００５０】
各ウェルにMTT染色液（5mg/mL  PBS（リン酸緩衝生理食塩水））を50μL添加し、５モル％CO2、37℃で4時間静置培養した。培地を除去し、各wellに塩酸−イソプロパノール溶液を1mLずつ加え、遮光し、4時間室温で放置した。マイクロプレートリーダーで570nmにおける吸光度を測定し、細胞生存率の指標とした。
【００５１】
培地を除去し、各ウェルに300μLのPBS（−）（すなわち、カルシウムが含まれないもの）を加えて洗浄した。PBS（−）を除去し、各ウェルに1M  NaOH水溶液を1mLずつ添加し、細胞を溶解させた。室温で遮光し、4時間放置した。マイクロプレートリーダーで405nmにおける吸光度を測定し、メラニン生合成量の指標とした。
【００５２】
続いて、メラニン生合成阻害試験について、説明する。図２は、実験結果を示す表である。MCは、メラニン生合成量（％）であり、CVは、細胞生存率（％）である。Typeについて、Ａは、ＭＣ45％（又はそれよりも少ない）を与えたサンプル、Ｂは、ＭＣ45〜60％を与えたサンプル、Ｃは、ＭＣ60〜80％を与えたサンプル、Ｄは、メラニン合成を10％以上促進されたサンプルであり、Ｅは、それ以外である。また、＊は、ＣＶ＞80％のサンプル、＊＊は、ＣＶ＝70〜80％である。
【００５３】
根のエタノール抽出物（ＲＥ）は、濃度依存的にメラニン生合成を阻害した。最も阻害活性が強かったのは、根のエタノール抽出物（40μg/mL）で、阻害率は73.57％であった。しかし、同時に強い細胞毒性（細胞死亡率41.47％）も確認された。低濃度（20、10μg/mL）においても、メラニン生合成阻害活性（62.77％、45.05％）を示し、また、細胞毒性はそれぞれ14.63％、7.32％であった。この値は、ポジティブコントロールとして使用したarbutinよりメラニン生合成阻害活性が強く、細胞毒性が低いことを示している（arbutin：メラニン生合成阻害率49.7％、細胞毒性：14.53％）。
【００５４】
茎のエタノール抽出物（ＳＴＥ）は、40μg/mLにおいて強いメラニン生合成阻害活性（65.1％）を示した。20μg/mLにおいても、強いメラニン生合成阻害活性（56.61％）、低い細胞毒性（4.36％）を示した。さらに低濃度（10μg/mL）では、メラニン生合成阻害活性は低下し（28.38％）、細胞毒性は検出されなくなった。
【００５５】
葉のエタノール抽出物（ＬＥ）は、40、20μg/mLにおいて、弱いメラニン生合成阻害活性（29.2％、22.53％）と細胞毒性（27.65％、20.48％）を示した。10μg/mLにおいては、メラニン生合成阻害活性が15.62％、細胞毒性が18.23％と、抽出物の活性は低かった。
【００５６】
種のエタノール抽出物（ＳＥ）は、40μg/mLにおいて強いメラニン生合成阻害活性（53.6％）と、弱い細胞毒性（29.81％）を示した。また、20、10μg/mLにおいては、弱いメラニン生合成阻害活性（26.58％、22.98％）と同じく弱い細胞毒性（16.3％、15.0％）を示した。
【００５７】
他方、ほとんどの水抽出物（ＲＷ、ＳＴＷ、ＬＷ、ＳＷ）でメラニン生合成の抑制効果は観察されなかった。茎（10μg/mL）は、メラニン生合成を21.6％で促進した。
【００５８】
このように、エタノール抽出物は、メラニン生合成阻害活性を示し、他方、水抽出物は、メラニン生合成促進活性を示す。化粧品等の商品化をするためには、溶媒として、例えば、メタノールのような毒性があるものを使用することは困難である。そのため、商品化に向けた溶媒としては、エタノールと水が有力な候補となる。水は、極性の高い溶媒（極性溶媒）と評価できる。エタノールは、極性の低い溶媒（非極性溶媒）と評価できる。そして、極性溶媒と非極性溶媒（特に、水とエタノール）によって、どのような性質の抽出物が得られるかは、当業者が予測できない事項である。これにより、非極性溶媒（特に、エタノール）による抽出物は、例えば美白化粧品への応用が可能であり、極性溶媒（特に、水）抽出物は、例えば、サンタン剤、白髪予防等のヘアケア製品（例えば、シャンプー、リンス、育毛剤等）への応用が可能である。
【００５９】
続いて、リパーゼ活性阻害試験について説明する。各抽出物が、リパーゼの活性に与える影響を評価した。
【００６０】
各抽出物を3%DMSO（3ml  ＤＭＳＯ／97ml水溶液（体積％））とし、13mM  Tris-HCl、150mM  NaCl、1.3mM  CaCl2緩衝液（リパーゼ緩衝液：pH  7.98）で25μLにメスアップした。この溶液に、リパーゼ緩衝液に溶かした0.05mM  4-methylumbelliferyl  oleate（4-MUO）を50μL加え、続いて、50U/mL、150μg/mL膵臓由来リパーゼ25μLを上記と同様の緩衝液に溶かし系内に加えることで反応を開始させた。25℃で30分間反応させ、0.1Mクエン酸緩衝液（pH  4.2）100μLを加えて反応を停止させた後、蛍光強度を測定した（Em：355nm、Ex：460nm）。4-MUOにリパーゼが作用して遊離した4-methylumbelliferoneの蛍光強度を測定することで、リパーゼ活性に与える影響を評価する。リパーゼ活性（％）は、数１の計算式により算出した。ここで、Ｓは、試料添加系の反応後の蛍光強度であり、ＳBlankは、試料と4-MUOのみの蛍光強度であり、Ｃは、試料無添加系の反応後の蛍光強度であり、ＣBlankは、4-MUOのみの蛍光強度である。なお、ポジティブコントロールに、リパーゼ阻害剤として用いられるorlistatを使用した。
【００６１】
【数１】
2014237635.tif 000004
【００６２】
続いて、リパーゼ阻害試験の試験結果について説明する。図３は、各抽出物がリパーゼ活性に与える影響を示すグラフである。最終濃度は、μg/mLである。全ての値は、４つのレプリカの平均である。＊は、コントロールグループからの有意な差異が認められた試料である。実験中に群間差が偶然生じる可能性を示す尺度であるＰ値について、P<0.01とした。P<0.01とは、この結果を偶然生じることが100回に1回未満であることを意味する。このＰ値が小さくなるほど、コントロール群と、サンプル群との差は、サンプルの効果によるものであることをあらわしている。通常は、0.05以下であれば、有効と考えられる。Orlistat（1μg/mL)をポジティブコントロールとして使用した。
【００６３】
茎、根、葉のエタノール抽出物（400μg/mL）（ＲＥ400、ＳＴＥ400、ＬＥ400）において、強いリパーゼ阻害活性（81.2％、76.41％、57.09％）が確認された。200μg/mLでは、リパーゼ阻害活性は、それぞれ49.65％、45.61％、40.26％に減少した。
【００６４】
水抽出物では、種が400μg/mLにおいて阻害活性（31.7%）を示した（SW400）。他の水抽出物については、15.09〜4.44％の弱い阻害活性しか検出されなかった。
【００６５】
このように、非極性溶媒（エタノール）によれば、阻害活性を示すのに対し、極性溶媒（水）によれば、阻害活性を示しにくくなる。このように、溶媒によって、抽出物の性質が異なることは、発明者らによって初めて見出されたものである。
【００６６】
続いて、抗菌活性試験について説明する。各抽出物がEschericia  coli（NBRC13276）とStaphylococcus  aureus（NBRC3301）の増殖に与える影響を評価した。
【００６７】
Nutrient  agar（NA）培地上に培養した菌のコロニーを5mLのNutrient  broth（NB）培地に加え、37℃で18時間振とう培養（160rpm）して定常期の菌体を得た。得られた定常期の培養液をNB培地で希釈し、OD660＝0.4になるよう調製した（E．coli：109  CFU/mL、S．aureus：108  CFU/mL)。さらに、これを滅菌水で希釈し、菌濃度を105  CFU/mLとして抗菌試験に用いた。
【００６８】
抗菌活性の測定は以下のようにした。エッペンチューブに445μLのNB培地、50μLの菌液、5μLのサンプル溶液を加え、十分に混合した。この溶液を96ウェルプレートに150μLずつ分注し（ｎ＝３）、37℃で18時間振とう培養（1150rpm）した。培養後、630nmにおける濁度を測定し、抗菌活性の指標とした。
【００６９】
続いて、抗菌活性試験の試験結果について説明する。図４は、各抽出物の大腸菌（E.coli）と黄色ブドウ球菌（S.aureus）に対する抗菌活性を示すグラフである。結果の値は、３回繰り返し実験での平均値±標準偏差で示した。最終濃度は、エタノール抽出物では、400μg/mLであり、水抽出物では、1600μg/mLとした。統計処理としては、スチューデントのｔ検定を行うことにより、抽出物未添加群（コントロール群）との差の有無を検定した。P<0.05の場合は*を、P<0.01の場合は**を記載した。
【００７０】
E.coliに対する抗菌活性は、全抽出物を通して確認できなかった。一方で、根と茎のエタノール抽出物が、400μg/mLにおいてS.aureusに対する強い抗菌活性を示した。また、葉のエタノール抽出物は400μg/mLにおいてS.aureusに対する弱い抗菌活性を示した。
【００７１】
このように、E.coliに対しては、全体として抗菌活性を示さず、S.aureusに対しては、非極性溶媒（エタノール）抽出物は、全体としてよい抗菌活性を示し、極性溶媒（水）抽出物は、全体として弱い抗菌活性を示す。このように、一部の菌に対してのみ抗菌活性を示すこと、さらに、溶媒によって、抽出物の性質が異なることは、発明者らによって初めて見出されたものである。本願発明を、イヌトウキの葉及び／又は茎のエタノール抽出物であって、S.aureusに対して抗菌活性を示すものとして捉えてもよい。
【００７２】
本願発明を、イヌトウキの葉、根及び茎の一部又は全部のエタノール抽出物であって、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を示すものとして捉えてもよい。
【００７３】
続いて、抗アレルギー活性試験について説明する。食品中の成分に抗アレルギー活性を評価するため、ラット肥満細胞様細胞株RBL-2H3を用いて脱顆粒抑制作用の有無を調べた。
【００７４】
96ウェルプレートにRBL-2H3細胞溶液を100μL（1×106cells/well）播種し、37℃、５モル％CO2条件下で24時間培養した。培養後、1μg/mLの抗DNP-IgE抗体を1μL添加した。同様の条件でさらに24時間培養後、培地を除去し、100μLのTyroid  bufferと1μLの抽出物溶液を添加した。これを30分培養後、培地を除去し、100μLのTyroid  bufferと20μL/mLのDNP-BSAを1μL添加した。さらに30分培養後、各ウェルから50μLを取り、別の96ウェルプレートに移した。ここに、基質として1mM  p-nitrophenyl-N-acetyl-β-glucosaminideを50μL添加し、室温で1時間静置した。最後に、100mM  Na2CO3水溶液（pH=10）を100μL加えて反応を停止させ、405nmの吸光度を測定した。
【００７５】
また、抽出物が細胞の生存率に与える影響をMTT法により評価した。96ウェルプレートにRBL-2H3細胞溶液を100μL（1×106  cells/well）播種し、37℃、５モル％CO2条件下で24時間培養した。培養後、抽出物溶液を1μL添加した。さらに24時間培養後、5mg/mL  MTT溶液を10μLずつwellに添加し、37℃、５モル％CO2条件下で4時間培養した。培養後、培地を除去し、100μLのイソプロパノールで細胞を溶解させ、遮光し一晩放置した。プレートリーダーで570nmの吸光度を測定し、生細胞数の指標とした。
【００７６】
続いて、抗アレルギー活性試験の試験結果について説明する。図５は、RBL-2H3細胞へのイオノフォアA23187ならびにIgEにより誘導されるβ−ヘキソアミダーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。結果の値は、５回繰り返し実験での平均値±標準偏差で示した。統計処理としては、スチューデントのt検定を行うことにより、抽出物未添加群（コントロール群）との差の有無を検定した。P<0.01の場合には、*を記載した。没食子酸（100μM)を陽性コントロールとして用いた。
【００７７】
MTT試験の結果から、試験濃度における抽出物がRBL-2H3細胞に対して細胞毒性を示さないことが分かった。免疫グロブリン、イオノフォアを用いた実験はある程度相関のある結果となった。Β−ヘキソアミダーゼ分泌に対する最も強い阻害活性を示したのは葉のエタノール抽出物であり（95.68％：IgE、69％：A23187）、次いで、種の水抽出物（63％：IgE、77.6％：A23187)、葉の水抽出物（61％：IgE、77.6％：A23187）であった。他の抽出物も両試験において穏やかな阻害活性を示した。この結果より、RBL-2H3細胞において、IgE又はイオノフォアにより産生されるβ−ヘキソアミダーゼの分泌は、試験した抽出物により阻害できることが分かった。
【００７８】
続いて、ORAC（Oxygen  Radical  Absorbance  Capacity）法による抗酸化活性試験について説明する。各抽出物のペルオキシラジカル消去能をORAC法により評価した。
【００７９】
96ウェルプレートにトロロックス標準試料溶液（75mM）20μL、又は、抽出物溶液（Blankは75mMリン酸緩衝液）20μLを入れ、94.4nMフルオレセイン溶液（リン酸緩衝液に溶かしている）200μL添加した。これを37℃の湯浴で10分間加温した。さらに、37℃で10分間加温した31.7mM  AAPH（2,2'−azobis  (2-amidino-propane)-dihydrochloride）溶液を75μLずつ8連ピペットで添加した。AAPHを添加して30秒後に装置を起動させ、37℃で反応させながら、30秒間隔で90分間蛍光強度を測定した。数２の計算式を用いて、各サンプルのAUCを、得られた各ウェルでの蛍光強度の測定結果から算出した。ここで、ＡＵＣは、蛍光強度の曲線下面積（AUC：Area  Under  the  Curve）のことであり、ｆ0は、０秒時（計測開始時）の蛍光強度であり、ｆiは、ｉ秒後の蛍光強度である。
【００８０】
【数２】
2014237635.tif 000005
【００８１】
また、トロロックス  0μMのデータをブランクとし、トロロックス各標準液濃度（6.33、3.16、1.58、0.79μg/mL）で得られたデータのAUCの増加量（AUCTrolox−AUCBlank）をnetAUCとした。X軸にトロロックスのnetAUCの平均値、Y軸にトロロックス濃度をとり一次回帰式（Y=aX+b）を作成した。数３の回帰式を用いて相対ORAC値を算出した。
【００８２】
【数３】
2014237635.tif 000006
【００８３】
続いて、抗酸化活性試験の試験結果を説明する。図６は、各抽出物のORAC値を示す図である。横軸は、それぞれ部位毎抽出物の種類を示し、縦軸は、その部位の乾燥重量１００グラムあたりのトロロックス相当ORAC値を示している。
【００８４】
ORAC値は、μM  TE/100ｇ（生重量）で示してあり、既報（Wu、外５名著，Lipophilic  and  hydrophilic  antioxidant  capacities  of  common  foods  in  the  United  States，J.Agric.Food  Chem.，52，4026−4037（2004））の食品のORAC値と比較した。葉の水抽出物と茎のエタノール抽出物が最も高いORAC値を示し、それぞれ11181.1、10831.6であった。これらの値は100ｇのエルダーベリー（10655）に匹敵する値である。根と茎の水抽出物のORAC値は少し低く、8673.1と8064.8であった。これらの値は100ｇのリンゴ（7781）に相当する値である。種の水抽出物のORAC値は6650.6であり、100ｇのザクロに近い値（5923）であった。他の抽出物のORAC値は低く（3809.4〜2141.5）、100ｇのブロッコリーと同程度であった。このように、抽出物は、全体として、抗酸化活性を示す。
【００８５】
続いて、日本山人参地上部からの生理活性物質の単離について説明する。
【００８６】
まず、大量抽出について説明する。10kgのA.furcijuga地上部粉末を室温でメタノールを用いて抽出した（14L×4回）。抽出液を減圧濃縮して、メタノール抽出物700gを得た。
【００８７】
続いて、メタノール抽出物の分画について説明する。650ｇのメタノール抽出物をメタノールに溶解させ、700ｇのシリカゲルと混合した後、すり潰した。その後、室温で乾燥させ、シリカゲルカラム（50cm×19cm  i.d.，3.5kg）に充填した。その後、ヘキサン−酢酸エチル（100：0−0：100，グラジエント）、酢酸エチル−メタノール（100：0−0：100，グラジエント）、メタノール−水（1：1）で溶出させた。溶離液は20Lずつ分取し、濃縮した後にシリカゲルTLCで分析した。
【００８８】
図７は、分画条件を示す表である。
【００８９】
次に、神経保護物質の単離について説明する。日本山人参の抽出物は、血圧調整や食欲増進、免疫賦活効果、皮膚細胞の代謝調節、疲労回復、炭水化物代謝調節など様々な生理活性が報告されている。
【００９０】
アルツハイマー病は、進行性の特に先進諸国の高齢者に発症する脳変性障害である。アルツハイマー病は、学習、記憶、行動、情動行動を扱っている脳領域でのアセチルコリンの減少によるコリン機構の喪失と関連があると示唆されている。神経病理学的には、アルツハイマー病は、β−アミロイドのプラークの存在や、神経原繊維変化、前脳基底核のコリン神経系の変性・委縮により特徴づけられている。前脳基底核のコリン細胞の喪失は、シナプスにおけるアセチルコリン利用能を減退させ、アルツハイマー病における認知障害を引き起こす。したがって、アルツハイマー病の症状緩和に最も有効な方法は、アセチルコリンを加水分解するアセチルコリンエステラーゼの阻害によるシナプス内のアセチルコリンの増加である。
【００９１】
そこで、以下では、日本山人参からアセチルコリンエステラーゼ阻害物質を単離し、アルツハイマー病の新規治療薬の可能性について検討する。
【００９２】
加えて、スーパーオキシドアニオン（O-2）などのフリーラジカルや、過酸化水素（H2O2）などのnon-free  radical  speciesといった活性酸素種が引き起こす酸化ダメージは神経症の原因となる。そこで、日本山人参の地上部位がもつ、neuro-2A細胞における抗過酸化水素能を検討する。
【００９３】
実験方法を説明する。まず、サンプルを準備する。日本山人参の地上部位の粉末10kgを室温(14Lx4)においてメタノールにて抽出した。抽出液は、45℃未満の湯浴に浸しロータリーエバポレーターにかけて、溶媒を除去し、メタノール抽出物を700g得た。メタノール抽出物は緑色の粘性がある物質であった。メタノール抽出物はシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。オープンカラム（50x19cm）にシリカゲル4.2kg、メタノール抽出物を充填し、nヘキサンと酢酸エチル（100：0−0：100，gradient）、酢酸エチルとメタノール（100：0〜0：100，gradient）、メタノールと水（1：1）の順に流した。各画分のTLC分析結果より、類似の成分が含有されている画分をひとまとめにして、整理した。
【００９４】
画分の中でも、特に、２番目、５番目、１０番目の画分（Fr.2，Fr.5，Fr.10）は、アセチルコリンエステラーゼ阻害効果を強く示した上、過酸化水素水を用いた細胞毒性試験でも細胞生存率を効果的に増加させたため、これらの画分に着目した。
【００９５】
Fr.2（F2，13.2g）は、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分画を行った。溶媒として、ｎヘキサン及び酢酸エチルを用いた。得られた画分の物質をクロロホルム及びメタノールを溶媒として結晶化させてPalmitic  acid（化合物１）88mg、α-glutinol（ α−グルチノール）（化合物２）68mg、β-amyrin（β‐アミリン）（化合物３）10mgを得た。
【００９６】
Fr.5（F5，12.5g）は、メタノール及び水を溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけてIsoepoxypteryxin（イソエポキシプテリキシン）（化合物４）4mgを得た。
【００９７】
Fr.10（F10，200g）はさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分画を行った。オープンカラム（30x8cm）にシリカゲル800g、F10を充填し、クロロホルムとメタノール（100：0−0：100,  gradient）を流した。各溶出画分はシリカゲルTLCにて、類似の成分が含有されているものをひとまとめにした。
【００９８】
なお、抽出された物質の特定は、例えば、既報の文献に記載されたＮＭＲデータとの比較や、市販の標品とのＮＭＲデータの比較により行った。
【００９９】
試験結果について、説明する。図８は、全抽出のクロマトグラフィーの分画を示す表である。図８にあるように、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、計12の画分に分画した。F1は0.003mgとごく微量だったため、後の試験には供さなかった。図９は、Ｆ１０のクロマトグラフィーの分画を示す表である。F10の分画では、図９に示すように、計7つの画分に分画した。得られた７つの画分のうち、４番目の画分14.587gをさらに分画を行った。
【０１００】
このとき得られた１１の画分のうち、２番目の画分40mgから、ｎヘキサン及び酢酸エチルを溶媒とするPTLCを経て、5-(hydroxy  methyl)-furan-2-caraldehyde（化合物５）12mgを得た。また、４番目の画分223mgから、クロロホルム及びメタノールを溶媒とするゲルろ過クロマトグラフィーを経て、Kaempferol（化合物６）6mgを得た。また、５番目の画分328mgを結晶化して、Luteolin（化合物７）6mgを得た。また、６番目の画分2gから、クロロホルム及びメタノールを溶媒として分画を行って1番目の画分303mgをさらにクロロホルム及びメタノールを溶媒とするカラムクロマトグラフィーを経て、3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  ester（化合物８）35mgを得た。また、６番目の画分2gから、クロロホルム及びメタノールを溶媒として分画を行って２番目の画分185mgをさらに水及びメタノールを溶媒とするゲルろ過クロマトグラフィーを経て、3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid（化合物９）16mg、Quercetin（化合物１０）6mg、Kaempferol-3-O-glucoside（化合物１１）61mgを得た。また、９番目の画分3.1gから、クロロホルム及びメタノールを溶媒として分画を行って1番目の画分43mgをさらに水及びメタノールを溶媒とするゲルろ過クロマトグラフィーを経て、Kaempferol-3-O-rutinoside（化合物１２）6mgを得た。また、９番目の画分3.1gから、クロロホルム及びメタノールを溶媒として分画を行って２番目の画分1.9gをさらに水及びメタノールを溶媒とするゲルろ過クロマトグラフィーを経て、Adenosine（化合物１３）10mgを得た。
【０１０１】
図１０に、単離された物質の構造式を示す。
【０１０２】
続いて、アセチルコリンエステラーゼ阻害試験（Ellman’s  Method）について説明する。
【０１０３】
アセチルコリンエステラーゼ酵素は基質のアセチルコリンを加水分解し、チオコリンを生成する。チオコリンはEllman試薬である5,5−dithiobis[2−nitrobenzoic  acid](DTNB)と反応し、2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine及び5-thio-2-nitrobenzoateを生じさせる。これらは405nmにおいて吸光を示す。
【０１０４】
96ウェルプレートに、トリス緩衝液（50mM，pH=8.0，0.1％  BSA  for  stabilizing  the  enzyme）100μL、0.25  U/mL  アセチルコリンエステラーゼ10μL、10mM  DTNB  10μL、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分画した画分F2からF12（２，10mg/mLエタノール，最終濃度；76.92、384.6μg/mL）10μL又は5μLを加え、混合し、30℃で5分間インキュベートした。次に、基質として75mMアセチルコリン5μLを加え、再び30℃で10分間インキュベートした。インキュベート後、405nmにて吸光度を測定した。
【０１０５】
阻害率（％）の算出方法は、数４の計算式による。ここで、ＡControlは、サンプルの代わりとして、エタノールを加えた系の吸光度であり、ABlankは、サンプルと酵素の代わりに同量の緩衝液を加えた系の吸光度であり、ASampleは、サンプルを加えた系の吸光度であり、ASample  Blankは、サンプルと基質の代わりに、緩衝液を加えた系の吸光度である。ポジティブコントロールとして、ガランタミンを用いた。T−testを用いて、有意差を調べた。
【０１０６】
【数４】
2014237635.tif 000007
【０１０７】
図１１は、アセチルコリンエステラーゼ阻害試験の結果を示す。縦軸は、アセチルコリンエステラーゼ阻害率（ｎ＝４）を示す。F2、9、10、11、12においては低濃度（76.92μg/mL）では阻害がほとんど見られなかったが、高濃度（384.6μg/mL）では顕著な阻害がみられた。F3、F4、F5、F6においては、低濃度、高濃度両方で高い阻害がみられた。
【０１０８】
表２は、アセチルコリンエステラーゼ阻害試験のIC50の値を一覧にしたものである。イヌトウキの抽出物が含む成分として発明者らが特定した物質の中でも、Quercetin、Kaempferol-3-O-glucoside、Kaempferol-3-O-rutinoside、Isoepoxypteryxinが、表２に示す量でアセチルコリンエステラーゼの酵素活性を50%以上抑制した。Isoepoxypteryxinは、Quercetin、Kaempferol-3-O-glucoside、Kaempferol-3-O-rutinosideに比べると反応性が低いことが示唆されている。しかし、体内では適度の反応性が好ましいことを考慮すれば、アセチルコリンエステラーゼ阻害効果が穏やかであることは医薬品としてはむしろ好ましいともいえる。
【０１０９】
【表２】
2014237635.tif 000008
【０１１０】
続いて、euro  2A細胞の細胞毒性試験（MTT試験）及び過酸化水素のもつ細胞毒性試験について説明する。
【０１１１】
まず、細胞毒性試験（MTT試験）について説明する。neuro-2A細胞を96ウェルプレート中に播種し（1x105  cells/well）CO2インキュベーター（５モル％CO2,  37℃）にて24時間インキュベートした。培地を交換し99μL入れ、1μLのDMSOに溶かしたF2〜F12のサンプルをそれぞれ添加し、再び24時間インキュベートした。MTT溶液（5mg/mLリン酸緩衝液）20μLを添加した。4時間インキュベートしたのち、１５０μLのDMSOを加えることによって、沈殿したホルマザンを溶解させた。暗黒条件下でさらに4時間後、マイクロプレートリーダーにて570nmの吸光度を測定した。有意差はt−testを用いて算出した。
【０１１２】
続いて、過酸化水素のもつ細胞毒性試験について説明する。neuro-2A細胞を96ウェルプレート中に播種し（1x105cells/well）CO2インキュベーター（５モル％CO2，37℃）にて12時間インキュベートした。培地に、1μLのDMSOに溶かしたF2〜F12のサンプルをそれぞれ添加し、再び1時間インキュベートした。1つのプレートには99μLの新しい培地と交換し、H2O2  1μLを添加した。もう一つのプレートには、コントロールのウェルを除いて、培地を交換せずにH2O2  1μLを添加した。そして、さらに24時間インキュベートしたのち、細胞生存率を測定した。細胞生存率は、MTT法と同様に測定した。有意差はt-testを用いて算出した。
【０１１３】
図１２は、実験結果を示すグラフである。図１２（ａ）は、neuro-2A細胞における細胞毒性試験の結果を示す。F2、F8、F9、F10、F11、F12は、400μg/mLにおいて、細胞生存率が80%以上を示した。全体としては、F4、F5、F7は200μg/mL、F3、F6は100μg/mLの際に細胞生存率80%以上を示した。そして、これらの濃度を次の過酸化水素が持つ細胞毒性試験に供した。90μMの過酸化水素は、細胞生存率の40％から50％の減少を引き起こす。しかし、F2、F3、F4、F5を加えることで、細胞生存率は86%〜94%まで改善した。過酸化水素を加えない系での細胞生存率は81%から100%であった。したがって、これらの画分は神経細胞膜を通過できるだけでなく、細胞内の酸化ストレスを低下させ、細胞外のラジカルにより生成された過酸化水素と反応することが可能だと示唆された。一方で、F7、F9、F10、F11は、過酸化水素を加えない系ではCVが66%~78%まで上昇した。したがって、これらの画分は、細胞膜を通過する能力は低いが、細胞外の過酸化水素がもたらす酸化ストレスを強力に低下させる働きを持つと判明した。
【０１１４】
図１３は、物質を特定した後の実験結果を示すグラフである。縦軸は、細胞生存率を表す。物質ごとに５つの棒グラフで細胞生存率が示してあり、左から順に6.25mM、12.5mM、25mM、50mM、100mMの物質を加えたことを表す。イヌトウキから得られた化合物群の中でも、3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  ester、3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid、Quercetinを加えた場合に、特に細胞生存率が高い傾向にあった。その他、Adenosine、Kaempferol、Luteolin、Kaempferol-3-O-glucoside，Kaempferol-3-O-rutinoside、Isoepoxypteryxinを加えた場合にも細胞生存率が有意に増大した。
【０１１５】
さらに、Aβ25-35で表されるβ‐アミロイドを用いた細胞毒性試験について説明する。まず、過酸化水素を用いた細胞毒性試験と同様に、細胞を50%減少させるAβ25-35の濃度を決定した。発明者らは、19mMのAβ25-35を３７℃で３日間インキュベートすることにより、72時間のインキュベートで50%±3%の細胞毒性を示すことを見出した。そこで、単離された各化合物を濃度を変えて（6.25 mM、12.5 mM、25 mM、50 mM、100 mM）細胞と共に３時間インキュベートし、続いて、上記のAβ25-35を加えて72時間インキュベートした。その後、細胞生存率を決定した。
【０１１６】
図１４は、実験結果を示すグラフである。縦軸は、細胞生存率を表す。物質ごとに５つの棒グラフで細胞生存率が示してあり、左から順に6.25mM、12.5mM、25mM、50mM、100mMの物質を加えたことを表す。イヌトウキから得られた化合物群の中でも、Isoepoxypteryxin、kaempferol  glucoside、rutinoside、kaempferolの順に高い細胞生存率が示された。これらの物質を加えない場合と比べると、それぞれ、37±4%、36±3%、31±4％、26±3％だけ細胞生存率が増加した。その他、β-amyrin、α-glutinol、methyl  ester  of  chlorogenic  acid（3-O-trans-caffeoyl-quinic  acid-1-methyl  ester）、chlorogenic  acid（3-O-trans-caffeoyl-quinic acid）、Adenosine、Luteolin、Quercetinを加えた場合にも細胞生存率が有意に増大した。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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