(57)【要約】【課題】急性腎障害の予後予測方法、特に、急性腎障害後における腎機能が短期的・長期的に回復するかどうかを予測する方法を提供すること。【解決手段】IP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及びMCP-1は、急性腎障害後における腎機能が短期的・長期的に回復するかどうかを予測するマーカーになることを見出し、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性腎障害の予後予測をするために、急性腎障害患者から取得したサンプル中のIP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及び／又はMCP-1値を測定する方法。
【請求項２】
前記IP-10は、急性腎障害の短期の予後予測方法である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記IL-6、フラクタルカイン、IL-8及び／又はMCP-1は、急性腎障害の長期の予後予測方法である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルは、尿である請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性腎障害の予後予測方法、特に、急性腎障害後における腎機能が短期的・長期的に回復するかどうかを予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（急性腎不全）
急性腎不全（急性腎障害）とは、「外傷や手術後の大量出血、心筋梗塞などによる血液の循環障害、各種薬剤による腎障害等を起因とする、腎機能の急激な低下する病態」である。
急性腎不全は、腎臓病のなかでも危険な病気であり、予後については、約５０％で死亡に至る。原因となっている病気を治療し、早急に透析療法を受けて、血液中の老廃物や毒素を取り除く必要がある。
ただし、早期に医師の指導による食事療法等を行えば、血液中の尿素やクレアチニン値も低下し、腎機能が回復することもある。よって、早期発見、早期治療を開始することが重要である。
【０００３】
（腎障害のマーカー）
通常、日常臨床で腎障害のマーカーとして血清クレアチニンが頻用されている。しかし、急性腎障害における血清クレアチニンは、障害発症２〜３日目にしか上昇しない。また、糸球体濾過量が正常に近い場合は、腎機能障害の低下に比してクレアチニンの上昇が軽微なことが多く、臨床的に正確に診断できていない場合がある。
【０００４】
特許文献１では、「ミッドカインからなる、腎機能に関する予後推定用バイオマーカー」を開示している。
しかし、本発明で使用するマーカーとは明らかに異なる。
【０００５】
特許文献２では、「尿中ポドカリキシンと、１つ以上の他のマーカーとを組み合わせて使用することを特徴とする、腎疾患の検査方法」を開示している。
しかし、本発明で使用するマーカーとは明らかに異なる。
【０００６】
特許文献３では、「被験体から得られた尿からの腎障害の検出のためのマーカーとしてのヒトメガリンの使用」を開示している。
しかし、本発明で使用するマーカーとは明らかに異なる。
【０００７】
実臨床においては、急性腎障害を早期に診断する尿中マーカーが注目されている。
また、実臨床においては、該早期診断と同様、短期的及び長期的に腎機能が回復し得る症例か否かを判定する事は、患者への不要（過剰）な診療を避ける及び／又は腎代替療法（透析等）への準備の必要性を判断する上で非常に重要である。特に、患者は、急性腎障害後の数週間は精神的な苦痛を避けられない状態である。
しかしながら、現状では．患者の急性腎障害後の腎機能回復を予測できる実用的なマーカーは存在しておらず、該マーカーの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2009/107384号公報
【特許文献２】WO2010/143422号公報
【特許文献３】WO2010/126055号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記要望に対して、急性腎障害の予後予測方法、特に、急性腎障害後における腎機能が短期的・長期的に回復するかどうかを予測する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、日常臨床で腎障害のマーカーとして使用されている尿中クレアチニン濃度では、急性腎障害の予後予測に利用できないことを確認した（参照：図３）。加えて、白血球（WBC）、赤血球（RBC）、ヘモグロビン(Hb)、セロトニン（Ht）、血小板（Plt）、C反応性タンパク（CRP）、尿素窒素（UN）、糸球体ろ過量（eGFR）、ナトリウム（Na）、カリウム（K）、塩素（Cl）、カルシウム（Ca）、リン（P）、アルカリホスファターゼ（ALP）、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（gGTP）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT）及び総ビリブビン（TBil）濃度は、尿中クレアチニン濃度と同様に、急性腎障害の予後予測に利用できないことを確認した（参照：図２、４）。
【００１１】
次に、本発明者等は、尿中の複数のサイトカイン値を急性腎障害後の腎機能回復群及び腎機能非回復群で比較した。この比較結果により、短期の腎機能回復群のIP-10（インターフェロンγ誘導タンパク質10）値は、短期の腎機能非回復群のIP-10値と比較して、顕著に高いことを見出した。さらに、長期の腎機能回復群のフラクタルカイン（fractalkine）値、IL-6（インターロイキン-6）、IL-8（インターロイキン-8）及びMCP-1（Monocyte Chemotactic Protein-1：単球走化性タンパク質-1）は、長期の腎機能非回復群のそれらの値と比較して、有意に低いことを見出した。
これにより、IP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及びMCP-1は、急性腎障害後における腎機能が短期的・長期的に回復するかどうかを予測するマーカーになることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下からなる。
１．急性腎障害の予後予測をするために、急性腎障害患者から取得したサンプル中のIP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及び／又はMCP-1値を測定する方法。
２．前記IP-10は、急性腎障害の短期の予後予測方法である前項１に記載の方法。
３．前記IL-6、フラクタルカイン、IL-8及び／又はMCP-1は、急性腎障害の長期の予後予測方法である前項１に記載の方法。
４．前記サンプルは、尿である前項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の急性腎障害の予後予測方法は、急性腎障害患者の短期、長期の腎機能が回復するかどうかを予測することができる。これにより、該患者は、必要な治療方法を迅速に決定し開始することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】急性腎障害発症後１４日間の尿中の各マーカーの測定結果。なお、図中の「n」は、すべての患者の総測定数を意味し、「Max」は、各患者の最高値の平均を意味し、「Mean」は、すべての測定値の平均を意味する。
【図２】急性腎障害発症後１４日間の各マーカーの測定結果｛各症例の登録時（初回採血時）の平均値のデータ）。
【図３】急性腎障害発症後１４日間の尿中クレアチニン濃度の測定結果（各症例のクレアチニンの推移を実線で示した）。
【図４】急性腎障害発症後の長期での各マーカーの測定結果｛各症例の登録時（初回採血時）の平均値のデータ｝。
【図５】尿中の各サイトカインの測定結果。なお、図中の「平均値」は、各患者の最高値の平均を意味する。
【図６】各期間のIP-10の測定結果。図中の「平均値」は、各患者の最高値の平均を意味する。
【図７】尿中の各サイトカインのROC(Receiver Operating Characteristic：受信者動作特性曲線)解析結果。
【図８】尿中の各期間のIP-10のROC曲線解析結果。
【図９】尿中の各サイトカインの測定結果。なお、図中の「平均値」は、各患者の最高値の平均を意味する。
【図１０】尿中のIL-6のROC曲線解析結果。
【図１１】尿中のフラクタルカインのROC曲線解析結果。
【図１２】尿中のIL-8のROC曲線解析結果。
【図１３】尿中のMCP-1のROC曲線解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、急性腎障害患者から取得したサンプル中のIP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及び／又はMCP-1の値を指標とする急性腎障害の予後予測方法であり、特に、IP-10が高値であれば急性腎障害後の短期の腎機能の回復を予測でき、並びに、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及び／又はMCP-1が低値であれば急性腎障害後の長期の腎機能の回復を予測できる。
【００１６】
（急性腎障害患者）
本発明の「急性腎障害患者」とは、急速に腎機能が低下する病態を意味し、特に限定されないが、間質性腎炎、薬剤投与（抗癌剤、造影剤を含む）、移植、拒絶性、脱水性、虚血性、中毒性、敗血性、GBM（糸球体基底膜）、DMケトアシ、横紋筋融解、CPA等によるものが挙げられる。
また、患者は、ヒトを含む哺乳類（ネコ、イヌ、馬）を対象とする。
【００１７】
（サンプル）
本発明の急性腎障害の予後予測方法で使用する「サンプル」は、IP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及び／又はMCP-1を検出することができれば、特に限定されないが、好ましくは、尿である。また、尿は、必要に応じて、クレアチニン補正をしても良い。
なお、サンプルを採取する時期は、特に限定されないが、急性腎障害であると判断された後の極めて早い段階又は急性腎障害の症状が見られた段階が好ましい。
【００１８】
（指標）
本発明の「指標」とは、急性腎障害後の短期・長期の腎機能の回復者（健常者）と非回復者を区別するためのマーカー値を意味する。
例えば、急性腎障害患者のIP-10値が予め設定したIP-10基準値｛Cut off（カットオフ）値｝以下の場合には、短期的に腎機能が回復しないことを予測できる（判定できる）。これにより、該患者は、シャント等の施術の早期判断、集中的な治療の実施を行うことができる。
また、例えば、急性腎障害の患者のフラクタルカイン、IL-6、IL-8及び／又はMCP-1値が予め設定した、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及び／又はMCP-1基準値（カットオフ値）を超える場合には、長期的に腎機能が回復しないことを予測できる（判定できる）。これにより、該患者は、長期的な治療方法（腎保護治療を継続し、腎機能悪化を予防する治療の導入、心血管イベントを予防する治療の導入）の選択、スケジュール等を早期に決定することができる。
【００１９】
カットオフ値の設定方法としては、IP-10の場合には、急性腎障害後の短期回復群の平均値から算出する。通常、予め決定したカットオフ値の標準偏差の90％以上、好ましくは80%以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは60％以上、最も好ましくは50％以上の場合には、腎機能が回復すると予測できる（判定できる）。
さらに、別のカットオフ値の設定方法としては、IP-10の場合には、急性腎障害後の短期回復群及び非回復群において、患者由来のサンプル中のIP-10測定値に基づき、市販の統計解析ソフトを使用してROC曲線を作成し、最適な感度及び特異度を求める。
【００２０】
（短期回復、長期回復）
本発明の「短期」とは、急性腎障害発症日（０日）〜３０日、好ましくは、０〜２０日、より好ましくは、０〜１５日を意味する。
本発明の「長期」とは、急性腎障害発症後３０日〜１１００日、好ましくは、急性腎障害発症後３０日〜１０００日、より好ましくは、急性腎障害発症後３０日〜９００日を意味する。
さらに、本発明の「短期回復」とは、上記説明した期間中（特に、１５日以内）に、尿中のクレアチニン濃度が1mg/dl以上及び／又は50％以上回復（改善）した患者を回復したと定義する。
より詳しくは、発症から約２週間以内に、尿中のクレアチニン濃度が、発症時の尿中のクレアチン濃度と比較して、1mg/dl以上低下した患者、及び／又は、発症から約２週間以内に、尿中のクレアチニン濃度が、発症時の尿中のクレアチン濃度と比較して、50％以下になった患者を意味する。
加えて、本発明の「長期回復」とは、上記説明した期間中に、eGFR（糸球体ろ過量）が 5(ml/min/1.73m2)/100日以上低下する患者以外を回復したと定義する。
【００２１】
（IP-10）
IP-10は、白血球のサブセットに対するケモタクティック活性を介して炎症応答並びに免疫応答の多くの局面を制御していることが知られている。
尿中等のIP-10は、自体公知の方法により測定することができる。また、測定時期は、下記の実施例により、急性腎障害発症日〜１５日、好ましくは、急性腎障害発症の次の日〜３日である。
さらに、下記の実施例より、本発明のIP-10（最高値）のカットオフ値は、50.0（pg/ml）〜3500.0（pg/ml）、好ましくは、200.0（pg/ml）〜2000.0（pg/ml）、より好ましくは、500.0（pg/ml）〜1500.0（pg/ml）の範囲で設定することができる。
また、IP-10（3日間平均値）のカットオフ値は、50（pg/ml）〜600.0（pg/ml）、好ましくは、100.0（pg/ml）〜500.0（pg/ml）、より好ましくは、200.0（pg/ml）〜400.0（pg/ml）の範囲で設定することができる。
【００２２】
（フラクタルカイン）
フラクタルカインは、ケモカインドメイン、ムチンドメイン、細胞膜貫通領域、細胞質内領域を有する膜結合型として細胞表面上に発現することが知られている。
尿中等のフラクタルカインは、自体公知の方法により測定することができる。
また、測定時期は、下記の実施例により、好ましくは、急性腎障害発症日〜１５日である。
さらに、下記の実施例より、本発明のフラクタルカインのカットオフ値は、60.0（pg/ml）〜180.0（pg/ml）、好ましくは、90.0（pg/ml）〜150.0（pg/ml）、より好ましくは、110.0（pg/ml）〜130.0（pg/ml）の範囲で設定することができる。
【００２３】
（IL-6）
IL-6は、B 細胞刺激因子2 (BSF2)又はインターフェロンβ2 とも呼称されるサイトカインであり、リンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として知られている。
尿中等のIL-6は、自体公知の方法により測定することができる。
また、測定時期は、下記の実施例により、好ましくは、急性腎障害発症日〜１５日である。
さらに、下記の実施例より、本発明のIL-6のカットオフ値は、7.0（pg/ml）〜600.0（pg/ml）、好ましくは、30.0（pg/ml）〜150.0（pg/ml）、より好ましくは、50.0（pg/ml）〜130.0（pg/ml）の範囲で設定することができる。
【００２４】
（IL-8）
IL-8は、好中球、Tリンパ球に走化性を示し、白血球の血管内皮細胞への接着の増加、好中球機能活性化を有していることが知られている。
尿中等のIL-8は、自体公知の方法により測定することができる。
また、測定時期は、下記の実施例により、好ましくは、急性腎障害発症日〜１５日である。
さらに、下記の実施例より、本発明のIL-8のカットオフ値は、40.0（pg/ml）〜650.0（pg/ml）、好ましくは、50.0（pg/ml）〜250.0（pg/ml）、より好ましくは、100.0（pg/ml）〜150.0（pg/ml）の範囲で設定することができる。
【００２５】
（MCP-1）
MCP-1は、内皮細胞、平滑筋細胞及びマクロファージ等から産生され、血管内皮細胞に接着した単球、マクロファージ、Ｔリンパ球の内皮下への遊走を強力に誘導することが知られている。
また、測定時期は、下記の実施例により、好ましくは、急性腎障害発症日〜１５日である。
さらに、下記の実施例より、本発明のMCP-1のカットオフ値は、300.0（pg/ml l）〜5200.0（pg/ml）、好ましくは、1000.0（pg/ml）〜3000.0（pg/ml）、より好ましくは、1500.0（pg/ml ）〜2000.0（pg/ml）の範囲で設定することができる。
【００２６】
（本発明の予後予測の測定方法）
本発明の予後予測の測定方法は、自体公知の測定方法により得られたマーカー測定値を、カットオフ値と比較して、下記のように、急性腎障害患者の短期・長期の腎機能回復を判定する。
（１）IP-10値が、カットオフ値よりも高い場合には、短期的に腎機能が回復すると判定する。
（２）IL-6値が、カットオフ値よりも低い場合には、長期的に腎機能が回復すると判定する。
（３）フラクタルカイン値が、カットオフ値よりも低い場合には、長期的に腎機能が回復すると判定する。
（４）IL-8値が、カットオフ値よりも低い場合には、長期的に腎機能が回復すると判定する。
（５）MCP-1値が、カットオフ値よりも低い場合には、長期的に腎機能が回復すると判定する。
【００２７】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。すべての本実施例は、金沢大学医学部の倫理委員会によって承認されており、かつ参加者に対するインフォームドコンセントの後に行われた。
【実施例１】
【００２８】
（急性腎障害発症後の短期・長期の尿中の各マーカーの測定）
本実施例では、16例（参照：表１）の短期の急性腎障害患者の尿中の各マーカー並びに15例（表１のうち観察期間が短かった「脱水の一例」を除く）の長期の急性腎障害患者の尿中の各マーカーを測定した。詳細は、以下の通りである。
【００２９】
【表１】
2014238303.tif 000002
【００３０】
（急性腎障害発症後の尿中の各マーカーの測定結果）
尿中の各マーカーは、Procarta Cytokine Plex kit (Panomics, USA) を使用して、 Bio-Plex Cytokine Assay System (Bio-Rad Laboratories, Herucules, CA) で測定した。
急性腎障害発症後の尿中の各マーカーの測定結果を図１〜４に示す。
急性腎障害発症後の短期で測定した各マーカーに関し、回復群と非回復群では、白血球（WBC）、赤血球（RBC）、ヘモグロビン(Hb)、セロトニン（Ht）、血小板（Plt）、C反応性タンパク（CRP）、尿素窒素（UN）、ナトリウム（Na）、カリウム（K）、塩素（Cl）、カルシウム（Ca）、リン（P）、アルカリホスファターゼ（ALP）、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（gGTP）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT）及び総ビリブビン（TBil）は統計的に差異がないことを確認した（参照：図２）。すなわち、前記各マーカーは、短期回復群と非回復群での臨床的背景には差異がない。
【００３１】
さらに、日常臨床で腎障害のマーカーとして使用されている血中クレアチニン濃度の回復群と非回復群には統計的に差異がないことを確認した（参照：図３）。
加えて、急性腎障害発症後の長期で測定した各マーカーに関し、回復群と非回復群では、白血球（WBC）、赤血球（RBC）、ヘモグロビン(Hb)、セロトニン（Ht）、血小板（Plt）、C反応性タンパク（CRP）、尿素窒素（UN）、クレアチニン（Cr）、eGFR（糸球体ろ過量）、ナトリウム（Na）、カリウム（K）、塩素（Cl）、カルシウム（Ca）、リン（P）、アルカリホスファターゼ（ALP）、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（gGTP）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT）及び総ビリブビン（TBil）は統計的に差異がないことを確認した（参照：図４）。すなわち、前記各マーカーは、長期回復群と非回復群での臨床的背景には差異がない。
【００３２】
以上により、白血球（WBC）、赤血球（RBC）、ヘモグロビン(Hb)、セロトニン（Ht）、血小板（Plt）、C反応性タンパク（CRP）、尿素窒素（UN）、クレアチニン（Cr）、糸球体ろ過量（eGFR）、ナトリウム（Na）、カリウム（K）、塩素（Cl）、カルシウム（Ca）、リン（P）、アルカリホスファターゼ（ALP）、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（gGTP）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT）及び総ビリブビン（TBil）は、急性腎障害発症後の短期・長期の予後予測のマーカーに利用できなことを確認した。
【実施例２】
【００３３】
（急性腎障害発症後の短期回復を示すマーカーの確認）
実施例１と同様に方法により、尿中の各サイトカイン｛IP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8、MCP-1、PDGFb（血小板由来増殖因子b）｝を測定した。
尿中の各サイトカインの測定結果を図５及び各期間のIP-10の測定結果を図６に示す。
図５の結果から明らかなように、IP-10は、他のサイトカインとは異なり、回復群と非回復群では高い有意差が認められた。
図６の結果から明らかなように、急性腎障害発生後１日〜３日のIP-10の測定値は、急性腎障害発生後１日〜７日のIP-10の測定値、急性腎障害発生後５日〜７日のIP-10の測定値及び急性腎障害発生後１日〜１４日のIP-10の測定値と比較して、回復群と非回復群ではより高い有意差が認められた。
【００３４】
尿中の各サイトカイン（IP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8、MCP-1、PDGFb）の測定値をROC曲線により解析した。
解析結果を図７及び図８に示す。
図７の結果から明らかなように、IP-10は、他のサイトカインとは異なり、高い感度及び特異度を示した。
図８の結果から明らかなように、急性腎障害発生後１日〜３日のIP-10の測定値は、急性腎障害発生後１日〜７日のIP-10の測定値、急性腎障害発生後５日〜７日のIP-10の測定値及び急性腎障害発生後１日〜１４日のIP-10の測定値と比較して、同程度に高い感度及び特異度を示した。
【００３５】
以上により、IP-10、特に、急性腎障害発生後１日〜３日のIP-10は、急性腎障害後における腎機能が短期的に回復するかどうかを予測するマーカーになることを確認した。
【実施例３】
【００３６】
（急性腎障害発症後の長期回復を示すマーカーの確認）
実施例１と同様に方法により、尿中の各サイトカイン（IP-10、フラクタルカイン、IL-6、IL-8、MCP-1、PDGFb）を測定して、２週間の平均値を算出した。
尿中の各サイトカインの測定結果を図９に示す。
図９の結果から明らかなように、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及びMCP-1は、他のサイトカインとは異なり、回復群と非回復群では高い有意差が認められた。
【００３７】
尿中の各サイトカインの測定値を受信者動作特性曲線（ROC曲線）により解析した。
解析結果を図１０〜１３に示す。図１０の結果から明らかなように、IL-6は、高い感度及び特異度を示した。同様に、図１１〜１３の結果から明らかなように、フラクタルカイン、IL-8及びMCP-1も同様に高い感度及び特異度を示した。
【００３８】
以上により、フラクタルカイン、IL-6、IL-8及びMCP-1は、急性腎障害後における腎機能が長期的に回復するかどうかを予測するマーカーになることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明では、急性腎障害の予後予測方法を提供することができる。
【図１】
2014238303.tif 000003
【図２】
2014238303.tif 000004
【図３】
2014238303.tif 000005
【図４】
2014238303.tif 000006
【図５】
2014238303.tif 000007
【図６】
2014238303.tif 000008
【図７】
2014238303.tif 000009
【図８】
2014238303.tif 000010
【図９】
2014238303.tif 000011
【図１０】
2014238303.tif 000012
【図１１】
2014238303.tif 000013
【図１２】
2014238303.tif 000014
【図１３】
2014238303.tif 000015