(57)【要約】【課題】組織工学に有用な化合物（アンチセンス化合物が含まれる）の提供。【解決手段】コネキシン活性を調整するための方法および組成物（例えば、術後外傷における使用または組織工学での適用が含まれる）を提供する。これらの化合物および方法を、例えば、直接的な細胞−細胞伝達の局所的破壊が望ましい疾患および障害に関連する副作用の重症度を軽減するために治療的に使用することができる。さらに、被験体における眼病用手順に関連する組織損傷を減少させるための方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で、該手順と組み合わせて該被験体の眼に投与する工程を包含する方法を提供する。【選択図】図１６
2014122248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本発明は、ギャップ結合関連タンパク質発現の調整のための薬剤、組成物、および化合物の使用方法に関する。これらの薬剤、組成物、および方法は、例えば、インビボおよびインビトロでの組織工学（例えば、皮膚、角膜組織、および眼の外科的手順に伴う結合が含まれる）に有用である。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
疾患または損傷による組織不全または臓器不全は、臓器または組織の移植以外に完全に回復する選択肢がほとんどない世界的に主な健康上の問題である。しかし、適切なドナーを見出す際の問題は、大部分の患者がこの選択肢を利用できないことである。組織工学または再造形による完全に機能を果たすか所望の機能を果たす合成または半合成の組織または器官の模倣物は、代替手段として現在調査されている。
【０００３】
特にこのテクノロジーの重要性が増している領域の１つは、眼の角膜である。角膜移植は、世界的に実施されている固形臓器移植の最も一般的な形態である。米国と英国のみで毎年約８０，０００例が実施されている。レーザーフォトリフラクティブケラテクトミー（ＰＲＫ）およびレーザー原位置角膜切開反転術（ＬＡＳＩＫ）などの近視矯正のための屈折矯正手術の普及により、手術または疾病過程後の組織再構築および変化を操作するためのインビボでの組織操作のための適切な角膜移植片が不足している。さらに、レーザー手術を受けた患者の約５％が予期せぬ結果を経験している。
【０００４】
角膜は、眼球外膜の中心から１／６を含む透明な組織である。その統一された構造および機能により、眼に透明な屈折界面および引っ張り強さが得られ、且つ外部因子から保護される。角膜は、以下の３つの異なる主な層から構築される：上皮、間質、内皮（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、デスメー膜、ボーマン膜、および基底膜は、いくつかの点で３つの主な細胞層のうちの１つに由来する構造である。
【０００５】
角膜上皮は、外部環境と直接接触する層である。角膜上皮は、ラットおよびヒトそれぞれにおいて厚さが４０〜１００μｍの範囲の重層扁平非角質化構造である。角膜上皮は、通常は２〜３層の扁平細胞によって形成される表層領域；２〜３層の多面体翼状細胞によって形成される中間領域；および一列の円柱細胞からなる基底領域から構成される。層状角膜上皮は、眼の表面の被覆層および間質の水分補給を調節において角膜内皮を補助し、それにより角膜の透明性の保持に寄与する補助的流動物分泌層として作用する「強固な」イオン輸送機能的合胞体として特徴づけられている。角膜上皮によって付与される固有且つ特定の質は、主要な眼の屈折因子として角膜操作に不可欠であることが証明されている。したがって、いかなる環境ストレスとも無関係にその層状構造が維持されることが重要である。
【０００６】
角膜表面の外傷は、非常に一般的であり、例えば、小さな擦り傷、眼の感染症および疾患、化学的または機械的事故、ならびに手術は全て角膜を損傷し得る。角膜外傷後の１つの主な合併症は、組織の再構築による視力障害である。眼科的治癒上の問題を引き起す危険性がある患者には、手術を受けた患者が含まれる。このような手術の例には、白内障摘出（レンズ交換を伴うか伴わない）；角膜移植または他の穿通性手順（全層角膜移植（ＰＫＰ）など）；エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー；緑内障濾過手術；放射状角膜切開術；および他の型の屈折の矯正手術もしくはレンズ交換手術が含まれるが、これらに限定されない。
【０００７】
角膜は、光を眼に伝達するための外部の光学的になめらかな表面を提供する。手術により、その正常な構造に角膜を固定する力が妨害される。白内障患者では、輪部中に外科的全層切開を行う。角膜は治癒過程で罹患し、罹患領域の組織の歪みおよび付随する視野の歪み（乱視）を引き起す。
【０００８】
角膜における他の外科的創傷は、角膜屈曲の所定の局所的移動を引き起す創傷治癒過程を開始し得る。これらの技術のうちで最も広く知られているのは、放射状角膜切開術（ＲＫ）であり、これは、角膜中央を平坦にするためにいくつかの部分的な厚みの切開を行う。しかし、結果が予想不可能であることおよび視力の大きな変動（共に創傷治癒の性質および範囲に関連する）のために、この技術は制限される（非特許文献３）。例えば、ほとんどのＲＫ患者において、初期の視力改善が後退する角膜組織周囲の隆起が認められる（非特許文献４）。
【０００９】
角膜の創傷は治癒も緩やかであり、不完全な治癒が視力の不安定性（朝から夕方における視力のばらつきおよび数週間から数ヵ月にわたって起こる視力の変動）に関連する傾向がある。これは、手術から１年後に視力のばらつきを訴える放射状角膜切開術を受けた患者の３４％の原因であり得る（非特許文献５）。また、角膜創傷が完全に治癒し損なった場合、創傷の「亀裂」が生じ、進行性の遠視を引き起こし得る。ＰＫ手順を受けた患者の３０％までが創傷の亀裂に関連する遠視を罹患する（非特許文献６）。
【００１０】
外傷後の角膜再生は複雑であり、十分に理解されていない。これは、以下の３つの組織の再生を含む：上皮、間質、および内皮。３つの主な細胞間シグナル伝達経路は、組織再生を調整すると考えられる：第１の経路は、成長因子（非特許文献７）、サイトカイン（非特許文献８）、およびケモカイン（非特許文献９）によって媒介され、別の経路は、細胞−基質相互作用（非特許文献１０）によって媒介され、別の経路は、ギャップ結合およびチャネル形成タンパク質のコネクチンファミリーによって媒介される。
【００１１】
ギャップ結合は、直接細胞−細胞伝達を促進する細胞膜構造である。ギャップ結合は、２つのコネクソンから形成され、これらはそれぞれ６つのコネキシンサブユニットから構成されている。各六量体コネクソンは、対面する膜中のコネクソンと結合して１つのギャップ結合を形成する。ギャップ結合チャネルは、身体全体で見出すことができる。例えば、角膜上皮などの組織は、６つまたは８つの細胞層を有し、異なる層内で異なるギャップ結合チャネルを発現し、基底層内にコネキシン−４３を有し、基底層から中間の翼状細胞層までにコネキシン−２６を有する。一般に、コネキシンは、一般にその分子量にしたがって命名され、系統発生に基づいてα、β、およびγサブクラスに分類される。今日まで、２０人のヒトおよび１９匹のマウスのイソ型が同定されており（非特許文献１１）、おそらく、それぞれの異なるコネキシンタンパク質を機能的に特定することができることを示す。異なる組織および細胞型は、特徴的なコネキシンタンパク質発現パターンを有し、角膜などの組織は、損傷または移植後にコネキシンタンパク質発現パターンが変化することが示されている（非特許文献１２；非特許文献１３）。
【００１２】
外傷後の角膜再生過程により、角膜の透明度が低下し、それにより、屈折矯正手術の結果に影響を与え得る。損傷角膜の現在の治療には、一般に、角膜移植または再構築のための角膜細胞／組織の使用の試みが含まれる。しかし、例えば、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミーなどの手術後の角膜および周囲の軟組織に対する術後外傷により、しばしば、細胞外基質の調整に関連する細胞過形成に起因する瘢痕（レーザー誘導性病変部位における上皮細胞パターンの変化、筋線維芽細胞の分化、間質の再造形、および上皮過形成が含まれる）が生じる。
【００１３】
重症脊髄損傷では、切離、挫傷、または圧迫のいずれかによって生じる病理学的変化は、術後の瘢痕形成および組織再造形と幾らか類似する。術後２４〜４８時間以内に、損傷が拡大し、罹患領域のサイズが有意に増加する。ギャップ結合チャネルが神経毒素およびカルシウム波を損傷部位から別の健康な組織に拡大させるギャップ結合媒介性バイスタンダー効果（非特許文献１４）も含まれ得る。これは特徴的な炎症腫脹も併発する。脊髄の損傷部位は、空洞または結合組織瘢痕に置換され、これらにより軸索再生が遅れる（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。現在、治療方法が進歩しているにもかかわらず、脊髄修復は依然として非常に制限されており、浸襲性の介入自体が病変およびグリア性瘢痕形成をさらに拡大し、修復過程を遅らせ、そのリスクにより神経機能がさらに喪失する（非特許文献１８）。
【００１４】
ウイルス疾患、真菌疾患、および代謝疾患に関連する遺伝子発現の調整のためにアンチセンステクノロジーが使用されている。特許文献１は、ＨＩＶのオリゴヌクレオチドインヒビターを提案している。特許文献２は、単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５  ｍＲＮＡへのハイブリッド形成および複製阻害のためのオリゴマーを提案している。例えば、２０００年１月２７日に出願された、発明の名称が「コネキシンのアンチセンスヌクレオチドを含む処方物」であるＢｅｃｋｅｒらの特許文献３（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）は、コネキシン発現を下方制御して脳、脊髄、または視神経の局所的神経損傷を治療し、手術または火傷後の皮膚組織の創傷治癒を促進し、瘢痕形成を減少させる、アンチセンス（ＡＳ）オリゴデオキシヌクレオチドの使用を記載している。しかし、克服すべき多数の困難が依然として存在する。例えば、非標的細胞型における特定の遺伝子産物の下方制御が有害であり得る場合が多い。克服すべきさらなる問題には、このようなＯＤＮ（未修飾ホスホジエステルオリゴマー）の半減期の短さが含まれ、典型的には、細胞内ヌクレアーゼ分解（Ｗａｇｎｅｒ、１９９４年（前出））ならびに一貫し且つ信頼できる標的組織へのその送達によって細胞内半減期がたった２０分間である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，１６６，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，００４，８１０号明細書
【特許文献３】国際公開第００／４４４０９号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｐｅｐｏｓｅ，Ｊ．Ｓ．ら、「Ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅａ；Ａｄｌｅｒ’ｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｙｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、第９版、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ：Ｍｏｓｂｙ  Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ、１９９２年、ｐ．２９−４７
【非特許文献２】Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｗ．Ｈ．、「Ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅａ；Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｎ  ａｔｌａｓ  ａｎｄ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ」、第４版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、１９９６年、ｐ．１５７−６５
【非特許文献３】Ｊｅｓｔｅｒら、「Ｃｏｒｎｅａ」、１９９２年、第１１巻、ｐ．１９１
【非特許文献４】ＭｃＤｏｎｎｅｌｌおよびＳｃｈａｎｚｌｉｎ、「Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ」、１９８８年、第１０６巻、ｐ．２１２
【非特許文献５】Ｗａｒｉｎｇら、「Ａｍｅｒ．Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．」、１９９１年、第１１１巻、ｐ．１３３
【非特許文献６】Ｄｉｅｔｚら、「Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ」、１９８６年、第９３巻、ｐ．１２８４
【非特許文献７】Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｈ．Ｃ．およびＭａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．、「Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｃａｎｄ．」、２００２年、第８０巻、ｐ．２３８−４７
【非特許文献８】Ａｈｍａｄｉ，Ａ．Ｊ．およびＪａｋｏｂｉｅｃ，Ｆ．Ａ．、「Ｉｎｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｃｌｉｎｉｃｓ」、２００２年、第４２巻、第３号、ｐ．１３−２２
【非特許文献９】Ｋｕｒｐａｋｕｓ−Ｗｈｅａｔｅｒ，Ｍら、「Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ」、１９９９年、第７４巻、ｐ．１４６−５９
【非特許文献１０】Ｔａｎａｋａ，Ｔ．ら、「Ｊｐｎ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．」、１９９９年、第４３巻、ｐ．３４８−５４
【非特許文献１１】Ｗｉｌｌｅｃｋｅ，Ｋ．ら、「Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００２年、第３８３巻、ｐ．７２５−３７
【非特許文献１２】Ｑｕｉ，Ｃ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２００３年、第１３巻、ｐ．１９６７−１７０３
【非特許文献１３】Ｂｒａｎｄｅｒら、「Ｊ  ｌｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．」、２００４年、第１２２巻、第５号、ｐ．１３１０−２０
【非特許文献１４】Ｌｉｎ，Ｊ．Ｈ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」、１９９８年、第１巻、ｐ．４３１−４３２
【非特許文献１５】ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｗ．ら、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ．」、１９９９年、９月、ｐ．５５−６３
【非特許文献１６】Ｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、「Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ．」、２０００年、第３８巻、ｐ．４４９−４７２
【非特許文献１７】Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．Ｅ．およびＢａｉｅｒ  Ｌｅａｃｈ，Ｊ．、「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．」、２００３年、第５巻、ｐ．２９３−３４７
【非特許文献１８】Ｒａｉｓｍａｎ，ＧＪ．、「Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．」、第９６巻、ｐ．２５９−２６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、上記問題を解決するための化合物を開発することが必要であり、且つ多数の潜在的利点を有する。このような化合物、関連する組成物、およびその使用方法を、本明細書および特許請求の範囲に記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（簡単な要旨）
本明細書中および特許請求の範囲に記載の発明は、多数の特質および実施形態を有し、上記に記載のものまたは本要旨に記載または参照されるものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中および特許請求の範囲に記載の発明は、本要旨で特定した特徴または実施形態に制限されず、これらは、例示のみを目的として含まれ、本発明を制限しない。
【００１９】
組織工学に有用な化合物（アンチセンス化合物が含まれる）を本明細書中に提供する。眼病用手順に関連する組織損傷を軽減するためのアンチセンス化合物および方法も提供する。本方法は、例えば、アンチセンス化合物を被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質発現を阻害するのに十分な量で被験体の眼に投与する工程を含む。コネキシンタンパク質発現が阻害されることが好ましい一方で、単独の化合物（アンチセンス化合物が含まれる）またはヒトコネキシン発現を阻害するアンチセンス化合物または他の化合物との組み合わせによる修飾のために他のタンパク質を標的化することができると予想される。
【００２０】
一定の実施形態では、眼病用手順は、眼病用手術であり、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、白内障摘出、角膜移植、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、緑内障濾過手術、角膜移植術、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、角膜移植、屈折矯正手術、眼表面新生物切除、結膜もしくは羊膜の移植、翼状片および瞼裂斑の切除、眼形成手術、眼瞼腫瘍切除、先天性異常のための眼瞼再構築手順、外反症および眼瞼外反の修復、斜視手術（眼筋）、または任意の穿通性眼外傷が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
一般に、ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、発現阻害が望ましいコネキシンであることが公知である。好ましくは、アンチセンス化合物は、１つまたは複数の特定のコネキシンアイソタイプを標的化する。アンチセンス化合物によって標的化することができるコネクチンの特定のアイソタイプには、４３、３７、３１．１、および２６が含まれるが、これらに限定されない。標的化されるコネクチンはヒトであることが好ましいが、必要ではない。コネキシン（例えば、ヒト）は、例えば、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有し得る。
【００２２】
一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化する。
【００２３】
一定の他の実施形態では、第２のアンチセンス化合物を被験体（例えば、眼）に投与し、１つまたは複数の他のアンチセンス化合物が配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン（例えば、ヒト）をコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化する。少なくとも第２のアンチセンス化合物は、例えば、第１のアンチセンス化合物と異なるコネキシンを標的化する。
【００２４】
本発明の種々の態様で使用することができるアンチセンス化合物型の例には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、デオキシリボザイム、モルホリノオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＤＮＡザイム、および５’端変異Ｕｌ核内低分子ＲＮＡ、ならびに前記のアナログ；本明細書中に記載されているか当該分野で公知の他の化合物（例えば、オクタノール、グリセレチン酸（ｇｌｙｃｅｒｈｅｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、およびヘプタノールなどの非特異的脱共役剤が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。
【００２５】
一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、天然に存在する核酸塩基および未修飾のヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート結合を有するものが含まれる）である。適切なアンチセンス化合物には、例えば、少なくとも１つの修飾糖部分を含むオリゴヌクレオチドも含まれる。適切なアンチセンス化合物には、例として、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２６】
一定の実施形態では、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、別の化合物（例えば、組織損傷の軽減、炎症の軽減、治癒の促進、またはいくつかの他の所望の活性に有用な化合物）と組み合わせて投与する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、被験体へのアンチセンス化合物の投与による被験体（例えば、患者）の治療方法を含む。
【００２８】
一定の実施形態では、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、局所投与または局部投与によって投与する。本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、例えば、全身投与するか眼内注射によって投与することもできる。
【００２９】
本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、例えば、創傷形成（眼病用手順（例えば、手術）で起こる創傷など）に対して所定の時間被験体に投与することができる。例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順を実施する前、眼病用手順中、または眼病用手順後に投与することができる。例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順が行われる数分または数時間前後に被験体に投与することができる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、眼病用手順を行った後に投与し、例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順から約４時間以内、眼病用手順から約３時間以内、より典型的には、眼病用手順から２時間以内、または眼病用手順から１時間以内に投与する。
【００３０】
別の態様では、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、組織工学的方法で投与することができる。例えば、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、被験体の角膜組織の厚さを増加させる方法と組み合わせて投与することができる。このような方法を、眼病用手順（例えば、手術）と組み合わせても、組み合わせなくても良い。例として、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、被験体の角膜に関連する細胞（例えば、角膜細胞）の治癒を促進するか組織損傷を予防する方法と組み合わせて投与することができる。
【００３１】
一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、瘢痕形成を減少させる。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、炎症を軽減する。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、創傷治癒を促進する。
【００３２】
一定の好ましい実施形態では、例えば、アンチセンス化合物を、外科的移植手段に際して使用する。
【００３３】
一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物はコネキシン４３に指向し、上皮基底細胞の分裂および成長を調節するために投与する。
【００３４】
一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物はコネキシン３１．１に指向し、外層角質化を調節するために投与する。
【００３５】
一定の実施形態によれば、例えば、眼病用手順は、白内障摘である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、角膜移植である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、屈折矯正手術である。別の実施形態では、例えば、眼病用手順は、放射状角膜切開術である。別の実施形態では、例えば、眼病用手順は、緑内障濾過手術である。さらに他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、角膜移植術である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、眼表面新生物切除である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、結膜もしくは羊膜の移植である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、翼状片および瞼裂斑の切除である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、眼形成手術である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、眼瞼腫瘍切除である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、先天性異常のための眼瞼再構築手順である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、外反症および眼瞼外反の修復である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、斜視手術（眼筋）である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、任意の穿通性眼外傷である。
【００３６】
一定のさらなる実施形態では、例えば、化合物および組成物を使用して、角膜に関連する細胞の治癒を促進するか組織損傷を予防し、角膜に関連する細胞は眼の任意の細胞であり、角膜細胞が含まれるが、これに限定されない。
【００３７】
本明細書中に記載の薬剤（アンチセンス化合物が含まれる）は、被験体の角膜組織の厚さを増加させることができる。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物を、組織損傷の軽減または治癒の促進に有用な別の化合物と組み合わせて使用する。例えば、アンチセンス化合物を、成長因子またはサイトカインなどと同時投与することができる。
【００３８】
別の態様では、例えば、眼病用手術に関連する組織損傷の軽減のための薬学的組成物を提供する。例えば、被験体の眼に関連する細胞中のヒトコネキシンタンパク質発現を阻害するのに十分な量で存在するアンチセンス化合物を含む薬学的組成物を、被験体の眼への局部または局所投与のために適切に処方する。アンチセンス化合物は、例えば、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン（例えば、ヒト）をコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化することが好ましい。
【００３９】
一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物の形態であり、薬剤またはアンチセンス化合物は、被験体の創傷治癒の促進に十分な量で存在する。一定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、局部投与に適切な形態（被験体の眼への局部投与または局所投与に適切な形態が含まれる）であり得る。一定のさらなる実施形態では、例えば、組成物および処方物は、ゲル、クリーム、または本明細書中に記載されているか当該分野で公知の任意の形態（現存の形態またはこの先認められる形態）であり得る。
【００４０】
別の態様では、本発明は、アンチセンス化合物を含む薬学的組成物を含む。１つの実施形態では、例えば、眼病用手順（例えば、手術）に関連する組織損傷の軽減のための薬学的組成物であって、薬学的組成物を被験体の眼への局部投与または局所投与のために処方し、薬学的組成物が、被験体の眼に関連する細胞中にヒトコネキシンタンパク質の発現の阻害に十分な量で存在するアンチセンス化合物を含む、薬学的組成物を提供する。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン（例えば、ヒト）をコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化する。
【００４１】
一定の実施形態では、例えば、薬学的組成物は、緩衝化プルロニック酸またはゲルを含む薬学的に許容可能なキャリアを含む。これは、１つの実施形態では、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水中に約３０％までのプルロニック酸を含む。
【００４２】
別の態様では、１つまたは複数のコネキシンを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン方法を提供する。この方法は、選択された標的を有する特定のオリゴヌクレオチドの熱安定性、親和性、および特異性などの選択されたパラメータの至適化を含み得る。この方法を使用して、１つまたは複数の所望のポリヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択および開発することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、ｍＲＮＡを切断する能力またはコネキシンタンパク質の翻訳を遮断する能力と組み合わせて試験することができる。
本願発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体における眼病用手順に関連する組織損傷を減少させるための方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で、該手順と組み合わせて該被験体の眼に投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
眼病用手順に関連する組織工学のための方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害し、該被験体の眼の細胞または眼に関連する細胞の増殖、移動、または分化を調節するのに十分な量で該被験体の眼に投与する工程を包含する、方法。
（項目３）
被験体の眼または眼に関連する組織中の上皮細胞の蓄積を促進する方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で該被験体の眼に投与する工程を包含する、方法。
（項目４）
被験体の眼または眼に関連する組織中の細胞過形成を阻害する方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で該被験体の眼に投与する工程を含包含する、方法。
（項目５）
前記アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、デオキシリボザイム、モルホリノオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＤＮＡザイム、および５′末端変異Ｕ１分子核ＲＮＡ、ならびにこれらのアナログからなる群より選択される、項目１〜項目４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記眼病用手順が、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、白内障摘出、角膜移植、屈折矯正手術、レンズ置換手術、放射状角膜切開術、緑内障濾過手術、角膜移植術、または他の型の屈折の矯正手術もしくはレンズ交換手術から選択される眼病用手術である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記アンチセンス化合物が、配列番号１〜１１から選択される核酸塩基配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記アンチセンス化合物が、１つ以上のコネキシン４３、２６、３７、３０、および／または３１．１に対して標的化される、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記アンチセンス化合物が、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基に対して標的化される、項目６に記載の方法。
（項目１０）
第２のアンチセンス化合物が前記被験体の眼に投与され、該第２のアンチセンス化合物が配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基に対して標的化され、該第２のアンチセンス化合物が項目４に記載のアンチセンス化合物とは異なるコネキシンに対して標的化される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記アンチセンス化合物が、１５核酸塩基長と３５核酸塩基長との間のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目３に記載の方法。
（項目１２）
前記アンチセンス化合物が、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約１２核酸塩基に対して標的化される、項目６に記載の方法。
（項目１３）
前記アンチセンス化合物が、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約１８核酸塩基に対して標的化される、項目６に記載の方法。
（項目１４）
前記アンチセンス化合物が、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約２５核酸塩基に対して標的化される、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記アンチセンス化合物が、配列番号１〜１１から選択される核酸塩基配列を含む、項目３に記載の方法。
（項目１６）
前記アンチセンス化合物が、天然に存在する核酸塩基および未修飾のヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目６に記載の方法。
（項目１７）
前記アンチセンス化合物が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目６に記載の方法。
（項目１８）
前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記アンチセンス化合物が、少なくとも１つの修飾糖部分を含むオリゴヌクレオチドである、項目６に記載の方法。
（項目２０）
前記アンチセンス化合物が、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドである、項目６に記載の方法。
（項目２１）
前記アンチセンス化合物が、局所投与または局部投与によって投与される、項目６に記載の方法。
（項目２２）
前記アンチセンス化合物が、外科的創傷への直接適用によって投与される、項目６に記載の方法。
（項目２３）
前記アンチセンス化合物が、眼内注射によって投与される、項目６に記載の方法。
（項目２４）
前記アンチセンス化合物が、組織損傷の減少または治癒の促進に有用な第２の化合物と組み合わせて使用される、項目６に記載の方法。
（項目２５）
前記第２の化合物が、成長因子またはサイトカインである、項目６に記載の方法。
（項目２６）
前記第２の化合物が、ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＮＴ３、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、インテグリン、インターロイキン、プラスミン、およびセマフォリンが含まれるが、これらに限定されない成長因子またはサイトカインなどから選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記アンチセンス化合物が所定の時間に投与される、項目６に記載の方法。
（項目２８）
前記アンチセンス化合物が、前記外科的手順が行われる前に投与される、項目６に記載の方法。
（項目２９）
前記アンチセンス化合物が、前記外科的手順の間に投与される、項目６に記載の方法。
（項目３０）
前記アンチセンス化合物が、前記外科的手順が行なわれた後２時間以内に投与される、項目６に記載の方法。
（項目３１）
前記被験体におけるエキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー手順と組み合わせて実施される、項目６に記載の方法。
（項目３２）
前記眼病用手術が白内障摘出である、項目６に記載の方法。
（項目３３）
前記眼病用手術が角膜移植である、項目６に記載の方法。
（項目３４）
前記眼病用手術が屈折矯正手術である、項目６に記載の方法。
（項目３５）
前記眼病用手術が放射状角膜切開術である、項目６に記載の方法。
（項目３６）
前記被験体の角膜に関連する細胞の治癒を促進するか組織損傷を予防する、項目６に記載の方法。
（項目３７）
前記眼病用手術が緑内障濾過手術である、項目６に記載の方法。
（項目３８）
前記眼病用手術が角膜移植術である、項目６に記載の方法。
（項目３９）
前記被験体の角膜組織の厚さを増加させる、項目６に記載の方法。
（項目４０）
前記被験体の角膜細胞における組織損傷が減少される、項目６に記載の方法。
（項目４１）
前記被験体の角膜に関連する細胞における組織損傷が減少される、項目６に記載の方法。
（項目４２）
前記被験体の眼のかすみを減少する、項目６に記載の方法。
（項目４３）
前記被験体の眼の瘢痕化を減少する、項目６に記載の方法。
（項目４４）
手術の２４〜４８時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する筋線維芽細胞分化に関連する細胞過形成を調節する、項目６に記載の方法。
（項目４５）
手術の２４〜７２時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質の再構築を調節し、かすみを減少する、項目６に記載の方法。
（項目４６）
前記眼病用手順がエキシマレーザー手順であり、該方法が前記被験体の間質細胞の細胞過形成を減少する、項目６に記載の方法。
（項目４７）
前記眼病用手順がエキシマレーザー手順であり、前記方法が前記被験体の角膜の再上皮形成を促進する、項目６に記載の方法。
（項目４８）
前記被験体の眼の上皮細胞移動を増加させる、項目６に記載の方法。
（項目４９）
前記被験体の眼への前記アンチセンス化合物の投与の１２時間以内に上皮細胞移動の増加を生じる、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記被験体の眼への前記アンチセンス化合物の投与の２４時間以内に上皮細胞移動の増加を生じる、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
処置した被験体の眼の間質後部の間質密度を増加させることなく間質前部の間質密度を増加させる、項目６に記載の方法。
（項目５２）
手術の２４〜７２時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質水腫を阻害する、項目６に記載の方法。
（項目５３）
手術の２４〜７２時間後の上皮過形成を減少する、項目６に記載の方法。
（項目５４）
手術の１週間後までの筋線維芽細胞の活性化を減少する、項目６に記載の方法。
（項目５５）
細胞外基質を改変する細胞分化を調節する、項目６に記載の方法。
（項目５６）
細胞増殖を減少する、項目６に記載の方法。
（項目５７）
中枢神経系の損傷を治療する方法であって、該方法は、該中枢神経系の損傷を治療するために被験体に実施した外科的手順に関連する中枢神経系の既存の創傷から近位の部位にアンチセンス化合物を投与する工程を包含し、該アンチセンス化合物が、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基に標的化される、方法。
（項目５８）
前記中枢神経系の損傷が、脊髄損傷である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記アンチセンス化合物が、脊髄の身体的な外傷後少なくとも２４時間で被験体に投与される、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記アンチセンス化合物が、被験体の脊髄損傷領域への神経組織の移植手順と合わせて投与される、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
前記アンチセンス化合物が瘢痕形成を減少する、項目５７に記載の方法。
（項目６２）
前記アンチセンス化合物が炎症を減少する、項目５７に記載の方法。
（項目６３）
前記アンチセンス化合物が創傷治癒を促進する、項目５７に記載の方法。
（項目６４）
外科的移植手順に関連して使用される、項目５７に記載の方法。
（項目６５）
前記アンチセンス化合物がコネキシン４３に関連し、上皮基底細胞の分裂および増殖を調節するために投与される、項目５７に記載の方法。
（項目６６）
前記アンチセンス化合物がコネキシン３１．１に関連し、外層角質化を調節するために投与される、項目５７に記載の方法。
（項目６７）
眼病用手順に関連する組織損傷を減少させるための医薬の調製におけるアンチセンス化合物の使用であって、該アンチセンス化合物が、被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害する、使用。
（項目６８）
眼病用手順に関連する組織工学のための医薬の調製におけるアンチセンス化合物の使用であって、該アンチセンス化合物が、被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害する、使用。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、コントロールおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した眼におけるレーザーフォトリフラクティブケラテクトミーから１２時間後の角膜のインビボ共焦点顕微鏡画像を示す。
【図２】図２は、エキシマレーザー光焼灼（ｐｈｏｔｏａｂｌａｔｉｏｎ）から２４時間後のコントロール（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）およびアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド処置ラット角膜（２Ｄ、２Ｅ）における角膜再造形の組織学的試験を示す。
【図３】図３は、エキシマレーザー焼灼から２４時間後のコントロール（３Ａ、３Ｂ、３Ｃ）およびアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド処置角膜（３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ）中のコネキシン４３タンパク質の発現を示す顕微鏡画像を提供する。結果は、コネキシン４３タンパク質レベルが抗コネキシン４３ＯＤＮでの処置後に減少し、間質中の細胞動員度がより小さくなることを示す。
【図４】図４は、α平滑筋アクチン抗体を使用した手術から１週間後の筋線維芽細胞標識を示す。図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、コントロールであり、４Ｄ、４Ｅ、および４Ｆは、アンチセンス処置角膜である。
【図５】図５は、レーザーフォトリフラクティブケラテクトミーから２４時間後（５Ａ〜５Ｄ）および４８時間後（５Ｅ〜５Ｈ）のコントロール（５Ａ、５Ｂ）およびコネキシン４３アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド処置角膜のラミニン−１標識を示す。２４時間後、コントロールは、焼灼領域の縁部（５Ａ）およびより中央（５Ｂ）でラミニン蓄積がほとんどない、そして／または不規則であるのに対して、アンチセンス処置角膜はこれらの両領域でのラミニン蓄積がより規則正しかった（５Ｃ、５Ｄ）。４８時間後、依然としてコントロールは連続的なラミニン蓄積はなく（５Ｅ−焼灼領域の縁部；図５Ｆ−中央）、非常に不規則であった（５Ｅ）。対照的に、アンチセンスＯＤＮ処置角膜は、創傷縁部（５Ｇ）および中央（５Ｈ）で連続的且つ相対的に平らな基底膜を有していた。
【図６】図６は、ラミニン−１の不規則性定量の略図を示す。
【図７】図７は、コントロール培養物（７Ａ）および抗コネキシン４３オリゴデオキシヌクレオチドでの２４時間にわたる処置（７Ｂ）およびコネキシン３１．１特異的アンチセンス処置（７Ｃ、７Ｄ）の３つの処置後のコネキシン２６および４３の免疫組織化学的標識を示す。
【図８】図８は、培養２４時間後のＰ７仔ラット由来の脊髄セグメントを示す。コントロールセグメント（１）は、切断端から押し出された組織の腫脹（矢印）である。点線は、元の切除部分を示す。組織学的試験は、細胞が空胞化し、浮腫を発症していることを示す。５日目までに、これらのセグメントは全体的に小グリア細胞が活性化され、生きたニューロンはほとんど認められない。対照的に、アンチセンス処置セグメント（２）は、コントロールと比較して有意に腫脹が減少し（ｐ＜０．００１）、細胞浮腫および空胞化が最小になった。培養２０日後でさえも、灰白質中のニューロンは生きたままであり、活性化された小グリア細胞は外縁に限定されている。
【図９】図９は、コントロール処置セグメント（９Ａ）およびコネキシン４３アンチセンス処置セグメント（９Ｂ）由来のニューロンを示す。コントロールセグメント中のニューロンは空胞化して浮腫を発症し、周辺組織は破壊されるが、処置セグメント中のニューロンは健康に生存しているようである。
【図１０】図１０は、培養５日後の培養脊髄セグメントの端部付近のＭＡＰ−２免疫標識を示す。コントロールセグメントは、生きたニューロンがほとんど存在せず、ＭＡＰ−２標識がほとんどない一方で（１６％が任意のＭＡＰ−２標識を示す）（１０Ａ）、６６％の処置セグメントは、培地に曝露し、そして／または残存する白質物質に隣接した切断端でＭＡＰ−２発現領域を有する。
【図１１】図１１は、デオキシリボザイムがインビトロで標的コネキシン−４３ｍＲＮＡの特異的領域を選択的に切断することを示す。２．４ｋｂのラットコネキシン−４３  ｍＲＮＡ（１１Ａ）および１．２ｋｂのマウスコネキシン−４３  ｍＲＮＡ（１１Ｂ）がインビトロでプラスミドから転写され、種々のデオキシリボザイムと１時間インキュベートした。マウスにおいてデオキシリボザイムは対応する領域のためにデザインされていないので、ラット  ｍＲＮＡの領域８９６〜９５３（１１Ａ）は決定的ではなかった。マウスｍＲＮＡ中の領域３６７〜４６６のデオキシリボザイム切断（１１Ｂ）は、ラットコネキシン−４３  ｍＲＮＡ由来の結果と適合せず、これはおそらくラットｍＲＮＡ中の５’非転写領域の２００塩基対の存在による。１つの点変異を有する欠損コントロールデオキシリボザイム（ｄｆ６０５およびｄｆ７８３）は、このような切断が特異的であることを示した。マウスｍＲＮＡに対するデオキシリボザイムによるいくつかの非特異的ミスプリンティングも、マウスｄｚ１００７およびｄｚ１０２８で認められた。全体的に、５２６〜６２２、７８３〜８８５、および１００７〜１０７６塩基領域を標的化するデオキシリボザイムは、ラットおよびマウスのｍＲＮＡ種の両方で有意な切断を示した。
【図１２】図１２は、デオキシリボザイムが標的コネキシン−２６  ｍＲＮＡの特異的領域をインビトロで選択的に切断することを示す。０．７ｋｂのラット（１２Ａ）およびマウス（１２Ｂ）コネキシン−４３  ｍＲＮＡがインビトロでプラスミドから転写され、種々のデオキシリボザイムと１時間インキュベートした。切断結果は、げっ歯類コネキシン２６  ｍＲＮＡが３１８〜３７９および４９３〜５６７塩基領域中にデオキシリボザイムによって標的化される少なくとも２つの領域を有することを示す。１つの点変異を有する欠損コントロールデオキシリボザイム（ｄｆ３５１およびｄｆ３７９）は、このような切断が特異的であることを示した。
【図１３】図１３は、１時間までの培養角膜におけるアンチセンスオリゴマーの透過および安定性を示す。Ｃｙ３標識オリゴマーは、プルロニックゲルを使用した１時間の送達後の点状の核および細胞質の標識を示す（１３Ａ）。１時間後の角膜上皮中の視覚可能なＣｙ３の透過速度は、１０〜１５μｍであった（１３Ｂ）。Ｔａｑｍａｎ標識オリゴマープローブを使用し、Ｌａｍｂｄａスキャンを使用して上皮細胞内のアンチセンスオリゴマーの安定性を測定し、各パネルは、赤色に対する５ｎｍの発光スペクトルを示す（１３Ｂ）。インタクトなＴａｑｍａｎプローブは、ＴＡＭＲＡの赤色蛍光を用いた蛍光共鳴エネルギー転移がグレースケールで示された一方で（１３Ｄ）、ＦＡＭから予想される緑色蛍光として分解産物が示されたことを示す（これもグレースケールで示す（１３Ｃ））。細胞中の有効なアンチセンスオリゴマー濃度は、蛍光技術によって検出することができる濃度よりも低いこともあり得る。
【図１４】図１４は、コネキシン−４３（明部、グレースケール）タンパク質発現およびコネキシン−２６（暗部、グレースケール）タンパク質発現に対する異なるアンチセンスオリゴマーの効果がインビトロデオキシリボザイムｍＲＮＡ切断によって示されることを示す。図４Ａは、プルロニックゲルコントロール処置角膜上皮の基底細胞における正常なコネキシン−４３タンパク質発現（明部、グレースケール）および基底細胞から中間細胞におけるコネキシン−２６タンパク質発現（暗所、グレースケール）を示す。ａｓ１４（１４Ｂ）、ａｓ７６９（１４Ｄ）、ａｓ８９２（１４Ｆ）（これら３つは全てインビトロでデオキシリボザイム切断を示さない）およびＤＢ１センスコントロール（１４Ｈ）オリゴマーは、エキソビボ培養において両方のコネキシン発現に影響を与えなかった。ａｓ６０５（１４Ｃ）、ａｓ７８３（１４Ｅ）、およびＤＢ１（１４Ｇ）（これら３つは全て陽性インビトロデオキシリボザイム切断を示す）は、処置角膜上皮中に唯一の特異的コネキシン−４３ノックダウンを示した。
【図１５】図１５は、コネキシン４３アンチセンスオリゴマーがラット角膜においてコネキシン−４３タンパク質発現を選択的に減少させることを示す。各スポットは、異なる処置を行った１つの角膜を示す。黒塗りのスポット（黒色のＤＢ１、ａｓ６０５、ａｓ７８３、ａｓ８８５、ａｓ９５３、およびａｓ１０７６）は、白色のスポット（ＤＢ１センス、ａｓ１４、ａｓ７６９、およびａｓ８９２）と比較して平均３６％〜８５％のコネキシン−４３発現の減少を示した。デオキシリボザイムによる第３の予想アッセイによって効果がほとんどないか全くないと予想された全てのアンチセンスオリゴマーは、正常なコネキシン−４３発現の平均８５％〜１３４％を示した。全実験を、ＤＢ１センスで処置した中間のコネキシン−４３密度で正規化し、結果として、２つの陰性オリゴマー（ａｓ７６９およびａｓ８９２）が、ＤＢ１センスコントロール処置よりも高いコネキシン−４３密度を示した。
【図１６】図１６は、リアルタイムＰＣＲを使用して評価したアンチセンスまたはセンスオリゴマーで処置したラット角膜中のコネキシン４３  ｍＲＮＡレベルの比較を示す。レベルを、プルロニックゲルのみで処置した角膜の比率として示す。インビトロアッセイによって機能的であると予想された３つのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＤＢ１Ａｓ、Ａｓ６０５、およびＡｓ７８３）（黒色のバー）は、コネキシン４３  ｍＲＮＡ発現がそれぞれ正常レベル（ゲルのみの白抜きのバー）の４６．８％、４４％、および２５％に減少した（＊＊ｐ＜０．００１）。ＤＢ１センスコントロールオリゴマーについては減少は認められなかった（１０６％）（ＤＢ１センスの白抜きのバー）。インビトロデオキシリボザイムによる第３の予想アッセイにおいていかなるＣｘ４３  ｃＲＮＡ切断も示さなかったＡｓ７６９を、陰性コントロールとして使用した（１４８％）（Ａｓ７６９の白抜きのバー）。
【図１７】図１７は、アンチセンスまたはセンス（コントロール）オリゴマーで処置し、リアルタイムＰＣＲを使用して評価したラット角膜中のコネキシン２６  ｍＲＮＡレベルの比較を示す。レベルを、プルロニックゲルのみで処置した角膜（ゲルのみの白抜きのバー）に対する比率として示す。Ａｓ３０およびＡｓ３７５は、Ｃｘ２６  ｍＲＮＡ発現がそれぞれ３３％および７１％に減少した（＊＊Ｐ＜０．００１）（黒色のバー）。Ｒｖ３３０センスオリゴマーについては減少は認められなかった（１０９％）（Ｒｖ３３０の白抜きのバー）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
（詳細な説明）
本発明の実施には、当業者の範囲内の種々の従来の分子生物学的技術（組換え技術が含まれる）、微生物学的技術、細胞生物学的技術、生化学的技術、核酸化学的技術、および免疫学的技術を使用することができる。このような技術は、文献で十分に説明されており、例示のみを目的として、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）（本明細書中で集合的および個別に「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」という）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７（２００１年までの増補版を含む）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄ．Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ，１９９４）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ，ａｎｄ  Ｎ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ，ｅｄｓ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，１９９３），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書中で集合的および個別に「Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ」という），Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）；ａｎｄ  Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．，Ｐｒｏｔｏｃ���ｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９３）。
【００４５】
（定義）
本発明を一般的および種々の非限定的な特定の実施形態でさらに説明する前に、発明を説明する状況下で使用される一定の用語を説明する。他で示さない限り、本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有する。明細書中の以下または他で定義されていない用語は、その分野で認識されている意味を有するものとする。
【００４６】
「アンチセンス化合物」は、遺伝子の発現、翻訳、または機能を阻害するように作用する異なる分子型を含み、治療に適用するためのｍＲＮＡの配列特異的標的化によって作用するものが含まれる。
【００４７】
したがって、アンチセンス化合物には、主な核酸ベースの遺伝子サイレンシング分子（例えば、化学修飾アンチセンスオリゴデオキシリボ核酸（ＯＤＮ）、リボザイム、およびｓｉＲＮＡ）が含まれる（Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１４５７−１４６５（２００３））。アンチセンス化合物には、アンチセンス分子（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１，４５０３−４５１０（２００２））、モルホリノホスホロジアミデート（Ｈｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３，２０９−２１４（２００２））、ＤＮＡザイム（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，５９８２−５９９２（２００３）．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ，Ｓ．ａｎｄ  Ｂａｎｅｒｊｅａ，Ａ．Ｃ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７，８１７−８２６（２００３），Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，４２６２−４２６６（１９９７））、および最近開発された５’−末端変異Ｕ１核内低分子ＲＮＡ（Ｆｏｒｔｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，８２６４−８２６９（２００３））も含まれ得る。
【００４８】
用語「アンチセンス配列」は、アンチセンス化合物活性を有するポリヌクレオチドをいい、例えば、ＲＮＡ配列に相補的であるか、部分的に相補的である配列が含まれるが、これらに限定されない。したがって、アンチセンス配列には、例えば、ｍＲＮＡまたはその一部に結合してリボゾームによってｍＲＮＡの転写を遮断する核酸配列が含まれる。アンチセンス法は、一般に、当該分野で周知である。例えば、ＰＣＴ公開Ｗ０９４／１２６３３号およびＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００４９】
本明細書中で使用される、「メッセンジャーＲＮＡ」には、３文字表記を使用してタンパク質を暗号化するための配列情報だけでなく、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、および５’キャップ領域を形成する関連リボヌクレオチド配列ならびに種々の二次構造を形成するヌクレオチド配列も含まれる。本発明にしたがって、これらの配列のいずれかの全部または一部を標的化するオリゴヌクレオチドを形成することができる。
【００５０】
一般に、核酸（オリゴヌクレオチドが含まれる）を、「ＤＮＡ様」（すなわち、２’−デオキシ糖（一般に、Ｕ塩基よりもむしろＴ塩基）を有する）または「ＲＮＡ様」（すなわち、２’−ヒドロキシル糖または２’修飾糖（一般に、Ｔ塩基よりもむしろＵ塩基）を有する）と記載することができる。核酸ヘリックスは、１つを超える構造型を選択することができ、最も一般的にはＡ形態およびＢ形態である。一般に、Ｂ形態様構造を有するオリゴヌクレオチドは「ＤＮＡ様」であり、Ａ形態様構造を有するものは「ＲＮＡ様」である。と考えられている。
【００５１】
用語「相補的」は、一般に、許容された塩および温度条件下での塩基対合によるポリヌクレオチドの天然の結合をいう。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のうちのいくつかのみが結合する場合の「部分的」であり得るか、一本鎖分子間で全て相補的である場合の「完全」であり得る。核酸分子間の相補性の程度は、分子間のハイブリッド形成の効率および強度に有意に影響を与える。「ハイブリッド形成可能な」および「相補性」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとが安定に結合するのに十分な相補性の程度を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドはハイブリッド形成するその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないと理解され、結合は標的特異的であってよく、または非特異的結合が治療または他の目的を有意または望ましくなく阻止しない限り、他の非標的分子に結合することができるとも理解される。活性を喪失または減少させるためにオリゴヌクレオチドを使用して標的分子の正常な機能を阻害し、特定の結合が望まれる条件下（すなわち、インビボアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件下またはインビトロアッセイの場合のアッセイが行われる条件下）で非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的または望ましくない結合を回避するのに十分な相補性の程度であることが好ましい。本発明の一定の実施形態の状況では、絶対的な相補性は必要ない。生理学的条件下で２０℃、３０℃、または４０℃を超える融点を有する二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するポリヌクレオチドが一般に好ましい。
【００５２】
「障害」は、本発明の分子または組成物での治療から恩恵を受ける任意の容態（本明細書中に記載されているか特許請求の範囲に期さされているものが含まれる）である。これには、慢性および急性障害または疾患（哺乳動物が問題の障害にかかりやすい病的状態
が含まれる）が含まれる。
【００５３】
選択された核酸標的へのオリゴヌクレオチドの「標的化」は、多段階過程であり得る。この過程は、その機能が調整される核酸配列の同定から開始され得る。これは、例えば、その発現が特定の病状に関連する細胞遺伝子（または遺伝子から作製されたｍＲＮＡ）または感染因子由来の外来核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり得る。標的化過程はまた、所望の効果（すなわち、タンパク質発現の阻害、タンパク質検出の減少、または他の活性の調整）が得られるようなオリゴヌクレオチド相互作用のための核酸配列内の部位の決定を含み得る。一旦標的部位が同定されると、標的と所望の調整を得るのに十分または望ましく相補的な（すなわち、十分且つ適切なまたは望ましい特異性でハイブリッド形成する）アンチセンス化合物（例えば、オリゴヌクレオチド）が選択される。本発明では、標的には、１つまたは複数のコネキシンをコードする核酸分子が含まれる。標的化過程は、所望の結果が得られるようなアンチセンス相互作用部位の決定も含み得る。例えば、好ましい遺伝子内部位は、遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは翻訳終結コドンを含む領域である。翻訳開始コドンは、典型的には、５’−ＡＵＧ（転写ｍＲＮＡ分子中；対応するＤＮＡ分子中では５’−ＡＴＧ）であり、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」ともいうことができる。少数の遺伝子は、インビボで機能することが示されているＲＮＡ配列を有する翻訳開始コドン（５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ、または５’−ＣＵＧおよび５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ、および５’−ＣＵＧ）を有する。したがって、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、典型的には、どの場合にも開始アミノ酸がメチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生物）である場合でさえ、多数のコドン配列を含み得る。真核細胞遺伝子および原核細胞遺伝子が２つまたはそれ以上の別の開始コドンを有することができ、そのうちのいずれか１つを特定の細胞型もしくは組織または特定の条件下で翻訳開始のために優先的に使用することができることも当該分野で公知である。
【００５４】
用語「オリゴヌクレオチド」には、天然に存在する塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシド単量体のオリゴマーまたはポリマーが含まれる。用語「オリゴヌクレオチド」には、同様に機能する天然に存在しない単量体またはその一部を含むオリゴマーまたはポリマーも含まれ得る。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞取り込み、ヌクレアーゼの存在下での増加した安定性、または増強された標的親和性などの性質のために、しばしば、天然形態よりも好ましい。多数のヌクレオチドおよびヌクレオシドの修飾により、未変性のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）よりも高いヌクレアーゼ消化耐性が組み込まれたオリゴヌクレオチドが作製されることが示されている。ヌクレアーゼ耐性を、細胞抽出物または単離ヌクレアーゼ溶液とのオリゴヌクレオチドのインキュベーションおよび通常はゲル電気泳動による長期間にわたり残存するインタクトなオリゴヌクレオチド範囲の測定によって日常的に測定する。そのヌクレオチド耐性を増強するために修飾されたオリゴヌクレオチドは、未修飾オリゴヌクレオチドよりも長期間インタクトで生存することができる。多数の修飾により、オリゴヌクレオチドのその標的への結合（親和性）が増加することが示されている。オリゴヌクレオチドのその標的に対する親和性を、オリゴヌクレオチド／標的対のＴｍ（融点）（オリゴヌクレオチドおよび標的が解離する温度である）によって日常的に決定する。分光光度法で解離を検出する。Ｔｍが増加するほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が増加する。いくつかの場合、標的結合親和性を増強するオリゴヌクレオチド修飾もヌクレアーゼ耐性を増強することができる。
【００５５】
「ポリヌクレオチド」は、複数のヌクレオチドを意味する。したがって、用語「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴデオキシヌクレオチド」は全て、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列をいう。これらの句はまた、一本鎖または二本鎖であってよく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または任意のＤＮＡ様物質もしくはＲＮＡ様物質に対してセンス鎖またはアンチセンス鎖を示し得るゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡをいう。
【００５６】
コネキシン、コネキシンフラグメント、またはコネキシン変異型をコードするポリヌクレオチドには、以下をコードするポリヌクレオチドが含まれる：天然に見出されるコネキシンの成熟形態；天然で見出されるコネキシンの成熟形態およびさらなるコード配列（例えば、リーダー配列、シグナル配列、またはプロタンパク質配列）；前述の配列および非コード配列（例えば、天然に見出されるポリペプチドの成熟形態のコード配列の５’および／または３’のイントロンまたは非コード配列）；天然に見出されるコネキシンの成熟形態のフラグメント；および天然に見出されるコネキシンの成熟形態の変異型。したがって、「コネキシンコードポリヌクレオチド」などは、所望のコネキシン、フラグメント、または変異型のコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００５７】
用語「ペプチド模倣物」および「模倣物」は、本明細書中に提供したアンチセンスポリペプチドと実質的に同一の構造および機能的特徴を有し、コネキシン特異的阻害活性を少なくとも一部およびある程度模倣する合成化合物をいう。ペプチドアナログは、一般に、医薬産業でテンプレートペプチドに類似の性質を有する非ペプチド薬として使用される。これらの非ペプチド化合物型を、「ペプチド模倣物」または「ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」という（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ；ＴＩＮＳ；３９２（１９８５）；ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｂｅｅｌｅｙ  Ｎ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４  Ｊｕｎ；１２（６）：２１３−６．；Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；８（４）：４３５−  ４１）。治療に有用なペプチドと構造的に類似のペプチド模倣物を使用して、等価または増強された治療効果または予防効果を得ることができる。一般に、ペプチドミメティックは、アンチセンスポリヌクレオチドなどのパラダイムポリペプチド（すなわち、生物活性または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、以下からなる群より選択される結合と任意選択的に置換される１つまたは複数のペプチド結合を有する：例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−。模倣物は、完全にアミノ酸の合成非天然アナログから構成され得るか、一部が天然ペプチドアミノ酸であり、且つ一部がアミノ酸の非天然アナログであるキメラ分子である。保存的置換によって模倣物の構造および／または活性が実質的に変化しない限り、模倣物はまた、任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を組み込むことができる。例えば、模倣組成物は、例えば、ギャップ結合媒介性細胞−細胞伝達などのコネキシンタンパク質の生物活性を下方制御することができる場合、本発明の範囲内に含まれる。
【００５８】
用語「組成物」は、１つまたは複数の成分を含む生成物を含むことを意図する。
【００５９】
本明細書中で使用される、用語、コネキシン活性の「モジュレーター」および「調整」は、その種々の形態で、コネキシンの発現または活性の全部または一部の阻害を含むことを意図する。このようなモジュレーターには、コネキシン機能または発現の小分子アゴニストおよびアンタゴニスト、アンチセンス分子、リボザイム、三重鎖分子、およびＲＮＡｉポリヌクレオチド、ならびに遺伝子治療方法などが含まれる。
【００６０】
用語「同一率（％）」は、２つまたはそれ以上の配列比較で見出された配列類似性の比率をいう。同一率を、任意の適切なソフトウェアを使用して電子工学的に決定することができる。同様に、２配列間（または配列のいずれかまたは両方の１つまたは複数の一部）の「類似性」を、第１の配列と第２の配列との比較によって決定する。
【００６１】
「薬学的に許容可能な」は、例えば、処方物の他の成分と適合し、且つそのレシピエントへの投与に適切なキャリア、希釈剤、または賦形剤を意味する。
【００６２】
一般に、用語「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結した２つまたはそれ以上の各アミノ酸（天然または非天然）の任意のポリマーをいい、一方のアミノ酸（またはアミノ酸残基）のα炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が隣接アミノ酸のα炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合するようになった場合に得られる。これらのペプチド結合およびこれらを含む原子（すなわち、α炭素原子、カルボキシル炭素原子（およびその置換酸素原子）、およびアミノ窒素原子（およびその置換水素原子））は、タンパク質の「ポリペプチド骨格」を形成する。さらに、本明細書中で使用される、用語「タンパク質」には、用語「ポリペプチド」および「ペプチド」（時折、本明細書中で交換可能に使用することができる）が含まれると理解される。同様に、タンパク質のフラグメント、アナログ、誘導体、および変異型を、本明細書中で、「タンパク質」ということができ、他で示さない限り、「タンパク質」であると見なすべきである。用語、タンパク質の「フラグメント」は、タンパク質の全アミノ酸残基未満を含むポリペプチドをいう。認識されるように、タンパク質の「フラグメント」は、アミノ末端、カルボキシ末端、および内部（天然のスプライシングなどによる）で短縮されたタンパク質形態であってよく、変異型および／または誘導体であってもよい。タンパク質の「ドメイン」はフラグメントでもあり、天然に存在するタンパク質に対応する生化学的活性を付与するために必要なタンパク質のアミノ酸残基を含む。核酸分子またはポリペプチドなどの線状生体高分子である短縮分子は、分子のいずれかの末端の１つまたは複数の欠失、ならびに／または分子の非末端領域由来の１つまたは複数の欠失を有することができ、このような欠失は、約１〜１５００この連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失、好ましくは約１〜５００個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失、より好ましくは約１〜３００個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜７４、７５〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、または２５１〜２９９個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失が含まれる）であり得る。
【００６３】
用語「ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチド間でハイブリッド形成する条件をいう。ストリンジェントな条件を、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、および当該分野で周知の他の条件によって定義することができる。ストリンジェンシーを、塩濃度の減少、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度の増加、またはハイブリッド形成温度の上昇によって増加させることができる。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ  ＮａＣｌ未満および７５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭ  ＮａＣｌ未満および５０ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約２５０ｍＭ  ＮａＣｌ未満および５２５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満である。有機溶媒の非存在下で低ストリンジェンシーのハイブリッド形成を得ることができ、有機溶媒の存在下で（例えば、少なくとも約３５％のホルムアミド、最も好ましくは少なくとも約５０％ホルムアミド）、高ストリンジェンシーのハイブリッド形成を得ることができる。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が含まれる。種々のさらなるパラメータ（例えば、ハイブリッド形成時間、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、およびキャリアＤＮＡの封入または排除）は、当業者に周知である。必要に応じたこれらの種々の条件の組み合わせによって、種々のストリンジェンシーレベルが達成され、この組み合わせは当業者の範囲内である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件を、標的配列より約５℃〜約２０℃または２５℃低い融点（Ｔｍ）範囲の条件および標的と正確またはほぼ正確に相補的なプローブによって定義することもできる。本明細書中で使用される、「融点」は、二本鎖核酸分子集団の半分が一本鎖に解離する温度である。核酸のＴｍの計算方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。標準的な参考文献によって示されるように、Ｔｍ値の簡潔な推定値を、以下の式によって計算することができる：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（核酸が１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中に存在する場合）（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照のこと）。ハイブリッドの融点（およびそれによるストリンジェントなハイブリッド形成条件）は、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性質（溶液中または固定されているＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成など）、ならびに塩および他の成分（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）の濃度などの種々の要因影響を受ける。これらの因子の効果は周知であり、標準的な参考文献で考察されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｓｕｐｒａ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，ｓｕｐｒａを参照のこと）。典型的には、ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（ｐＨ７．０〜８．３）の塩濃度、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃の温度である。示すように、ストリンジェントな条件を、ホルムアミドなどの脱安定剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の付加によって達成することもでき、この場合、より低い温度を使用することができる。本発明では、ポリヌクレオチドは、約５０℃〜約６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムなどの高ストリンジェンシーの培地条件下でコネキシンｍＲＮＡとハイブリッド形成するポリヌクレオチドである。
【００６４】
用語「治療有効量」は、所望の応答（例えば、研究者、獣医、医師、または他の臨床家によって模索される組織、系、動物、またはヒトの生物学的応答または医学的応答）を誘発する本化合物の量を意味する。
【００６５】
「治療」は、治療上の処置および予防的または防止的手段をいう。治療が必要な者には、既に障害を罹患している者および障害を防止すべき者が含まれる。
【００６６】
用語「ベクター」は、細菌、酵母、無脊椎動物、および／または哺乳動物宿主細胞で機能的であり得るプラスミド、ファージ、またはウイルスへの核酸送達ためのプラスミド、ファージ、ウイルス、または他の系（天然または合成）の形態の核酸分子の増幅、複製、および／または発現のための送達体をいう。ベクターは、宿主細胞のゲノムＤＮＡと無関係なままであり得るか、全てまたは一部がゲノムＤＮＡに組み込まれていても良い。ベクターは、一般に、ベクターと適合する任意の宿主細胞で機能的であるために必要な要素を全て含むが、その必要はない。「発現ベクター」は、適切な条件下での外因性ポリヌクレオチド（例えば、結合ドメイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の発現を指示することができるベクターである。
【００６７】
本明細書中に記載される、用語「相同性およびホモログ」には、コネキシンポリヌクレオチド中の配列と相同であり得るポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が含まれる。このようなポリヌクレオチドは、典型的には、関連する配列（例えば、少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、１００またはそれ以上の（相同配列の）連続するヌクレオチド）と、少なくとも約７０％相同、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％相同である。
【００６８】
相同性を、当該分野の任意の方法に基づいて計算することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性計算に使用することができる（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを備えている（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．；（１９９０）；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載のように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、（典型的には、そのデフォルト設定での）相同性またはラインナップ配列を計算することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｌ）から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードと整列させた場合にいくつかの正の数の閾値スコアＴと適合するか満たすクエリ配列中の長さＷの短いワードの同定による高スコアの配列対の同定を含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値をいう（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。これらの初期隣接ワードのヒットは、ヒットを含むＨＳＰを見出すための検索開始のための種（ｓｅｅｄ）として作用する。累積アラインメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿った両方向にワードヒットを拡大する。各方法へのワードヒットの拡大を以下の場合に停止した：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘまで低下した場合；１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積によって累積スコアがゼロまたはそれ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定づける。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９を参照のこと）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【００６９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−  ５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の適合が偶然起こる可能性の指標が提供される最小和の確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第１の配列と比較した最小和の確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは０．０１未満、最も好ましくは０．００１未満である場合、配列は別の配列と類似すると見なされる。
【００７０】
相同配列は、典型的には、少なくとも（またはそれ未満）約１、２、５、１０、１５、２０またはそれ以上の変異（置換、欠失、または挿入であり得る）で関連配列と異なる。これらの変異を、相同性の計算に関して上記の任意の領域にわたって測定することができる。相同配列は、典型的には、バックグラウンドを有意に超えるレベルで元の配列と選択的にハイブリッド形成する。典型的には、中等度から高いストリンジェンシー条件（例えば、約５０℃〜約６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を使用して、選択的ハイブリッド形成を行う。しかし、当該分野で公知の任意の適切な条件下でこのようなハイブリッド形成を行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ
ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと）。例えば、高ストリンジェンシーが必要な場合、適切な条件には、６０℃で０．２×ＳＳＣが含まれる。より低いストリンジェンシーが必要な場合、適切な条件には、６０℃で２×ＳＣＣが含まれる。
【００７１】
「細胞」は、所望の適用に適切な任意の生きた細胞を意味する。細胞には、真核細胞および原核細胞が含まれる。
【００７２】
用語「遺伝子産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子または遺伝子によってコードされたかＲＮＡから翻訳されたポリペプチドをいう。
【００７３】
用語「組換え」は、インビトロで合成または操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、細胞もしくは他の生物系で遺伝子産物を産生するための組換えポリヌクレオチドの使用方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）をいう。したがって、「組換え」ポリヌクレオチドを、その産生方法またはその構造のいずれかによって定義する。その産生方法に関して、過程は、例えば、典型的にはヌクレオチド配列の選択または産生でのヒトによる介入を含む組換え核酸技術の使用をいう。あるいは、これは、天然には連続しない２つまたはそれ以上のフラグメントの相互の融合を含む配列の生成によって作製されたポリヌクレオチドであり得る。したがって、例えば、任意の合成オリゴヌクレオチド過程を使用して得た配列を含むポリヌクレオチドである場合、任意の天然に存在しないベクターでの細胞の形質転換によって作製された産物が含まれる。同様に、「組換え」ポリペプチドは、組換えポリヌクレオチドから発現したポリペプチドである。
【００７４】
「組換え宿主細胞」は、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を含む細胞または目的のタンパク質を発現させるための組換え技術によって操作された細胞である。
【００７５】
本発明は、創傷治癒（例えば、手術関連創傷治癒および／または組織再造形への適用）のためのギャップ結合関連タンパク質発現の部位特異的調整のための化合物および組成物の使用方法を含む。本発明は、例えば、レーザー手術と組み合わせた視覚障害の矯正、インビトロ角膜エンジニアリング、および角膜の再造形が望ましい直接的な眼の治療（単独または眼に対して行われる手順（例えば、手術）と組み合わせて行われる治療が含まれる）に有用である。直接的細胞−細胞伝達のアンチセンス調整を、組織中の細胞間の結合を直接または間接的に減少させる分子によって媒介することが好ましい。このような分子には、特異的コネキシンイソ型を標的化してタンパク質イソ型の翻訳を減少させ、細胞ギャップ結合の機能を阻害する、アンチセンスデオキシヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ＲＮＡｉ、およびデオキシリボザイムが含まれる。これらのアンチセンス化合物の投与により、コネキシン発現が下方制御される部位でギャップ部結合媒介性細胞−細胞伝達が減少する。
【００７６】
コネキシンは、ギャップ結合媒介細胞−細胞シグナル伝達で重要な役割を果たす。コネキシンの過剰発現は、術後瘢痕および外傷後誘導性組織再造形に関連する。本発明の一定の実施形態によれば、コネキシンは、角膜外傷および術後組織再造形に関連する副作用の治療ならびに直接的細胞−細胞伝達の局所的破壊が望ましい疾患および障害の有用な標的を表す。特に、コネキシン発現の調整は、組織再造形／組織エンジニアリングへの適用のためのギャップ結合関連タンパク質発現の部位特異的調整に有用であり得る。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、眼病用手順または手術（例えば、白内障手術、眼内レンズ手術、角膜移植手術、ならびにいくつかの緑内障手術型および本明細書中に記載の他の手順など）に関連するコネキシンの調整のために使用することができる。
【００７７】
一定の実施形態では、コネキシン調整を、後眼部（網膜およびレンズが含まれる）に影響を与える眼科疾患で適用することができる。本発明の別の態様では、コネキシンの調整を、前眼部（角膜、結膜、および強膜が含まれる）に影響を与える眼科疾患で適用することができる。本発明の状況では、後眼部障害には、黄斑円孔および変性、網膜裂孔、糖尿病網膜症、硝子体網膜症、および種々の障害が含まれる。また、本発明の状況では、レンズ障害には、白内障が含まれ得る。さらに別の態様では、角膜障害は、放射状角膜切除術の続発症、眼乾燥、ウイルス性結膜炎、潰瘍性結膜炎、および創傷治癒（例えば、角膜上皮創傷）における瘢痕形成、およびシェーグレン症候群などの屈折障害であることが意図される。
【００７８】
本発明は、コネキシンをコードする核酸分子機能を調整し、最終的にコネキシンの産生量を調整するのに使用されるアンチセンス化合物（特に、オリゴヌクレオチド）を開示する。コネキシンをコードする核酸（好ましくはｍＲＮＡ）と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを得ることによってこれを行う。
【００７９】
オリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物とハイブリッド形成するその相補的核酸標的との間のこの関係を、一般に、「アンチセンス」という。本明細書中で使用される、選択された核酸標的へのオリゴヌクレオチドの「標的化」は、典型的には、多段階過程である。この過程は、通常、その機能が調整される核酸配列の同定から開始される。これは、例として、発現が特定の病状に関連する細胞遺伝子（または遺伝子から作製したｍＲＮＡ）であり得る。本発明では、標的は、コネキシンをコードする核酸、言い換えれば、コネキシンをコードする遺伝子またはコネキシン遺伝子から発現したｍＲＮＡである。コネキシンをコードするｍＲＮＡは、現在、好ましい標的である。標的化過程はまた、遺伝子発現が調整されるようなアンチセンス相互作用のための核酸配列内の部位の決定を含む。
【００８０】
本発明の状況では、メッセンジャーＲＮＡは、３文字表記を使用したタンパク質をコードするための情報だけでなく、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、５’キャップ領域、およびイントロン／エクソン連結点リボヌクレオチドとして公知の領域を形成する関連リボヌクレオチドも含む。したがって、本発明にしたがって、これらの関連リボヌクレオチドならびに情報リボヌクレオチドを全部または部分的に標的化するオリゴヌクレオチドを処方することができる。したがって、オリゴヌクレオチドは、転写開始部位領域、翻訳開始コドン領域、５’キャップ領域、イントロン／エクソン連結部、コード配列、翻訳終結コドン領域、または５’もしくは３’非翻訳領域中の配列と特異的にハイブリッド形成することができる。翻訳開始コドンが、典型的には、５’−ＡＵＧ（転写ｍＲＮＡ分子中；対応するＤＮＡ分子中では５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」ともいう。少数の遺伝子は、インビボで機能することが示されているＲＮＡ配列を有する翻訳開始コドン（５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ、または５’−ＣＵＧおよび５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ、および５’−ＣＵＧ）を有する。したがって、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、典型的には、どの場合にも開始アミノ酸がメチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生物）である場合でさえ、多数のコドン配列を含み得る。真核細胞遺伝子および原核細胞遺伝子が２つまたはそれ以上の別の開始コドンを有することができ、そのうちのいずれか１つを特定の細胞型もしくは組織または特定の条件下で翻訳開始のために優先的に使用することができることも当該分野で公知である。本発明の状況では、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、このようなコドンの配列と無関係にコネキシンをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳開始させるためにインビボで使用されるコドンをいう。遺伝子の翻訳終結コドン（または「終止コドン」）が３つの配列のうちの１つ（すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ、および５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ、および５’−ＴＧＡである））を有し得ることも当該分野で公知である。用語「開始コドン領域」、「ＡＵＧ領域」、および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからいずれかの方向で（すなわち、５’または３’）約２５〜約５０の連続ヌクレオチドを含むこのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部をいう。この領域は、好ましい標的領域である。同様に、用語「終止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」は、翻訳終結コドンからいずれかの方向で（すなわち、５’または３’）約２５〜約５０の連続ヌクレオチドを含むこのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部をいう。この領域は、好ましい標的領域である。当該分野で公知の読み取り枠（ＯＲＦ）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域をいい、有効に標的化することができる領域でもある。他の好ましい標的領域には、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの一部をいうことが当該分野で公知であり、それにより遺伝子上のｍＲＮＡまたは対応するヌクレオチドの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間にヌクレオチドを含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、ならびに翻訳終結コドンから３’方向のｍＲＮＡの一部をいうことが当該分野で公知であり、それにより遺伝子上のｍＲＮＡまたは対応するヌクレオチドの翻訳終結コドンと３’末端との間にヌクレオチドを含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が含まれる。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの５’のほとんどの残基に連結したＮ７メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体およびキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むと見なされる。５’キャップ領域も好ましい標的領であり得る。
【００８１】
いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写物が直接翻訳されるにもかかわらず、多くが、「イントロン」として公知の１つまたは複数の領域を含み、イントロンは、プレｍＲＮＡ転写物から切り出されて１つまたは複数の成熟ｍＲＮＡを生成する。残存する（したがって、翻訳された）領域は、「エクソン」として公知であり、相互にスプライシングされてｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位（すなわち、エクソン−エクソンまたはイントロン−エクソン連結点）も好ましい標的領域であってよく、異常なスプライシングが疾患に関連する状況または特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰発現が疾患に関連する状況で特に有用である。再編成または欠失による異常な融合連結点も好ましい標的である。選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ中の特定のエクソンの標的化も好ましいかもしれない。イントロンも有効であり得るので、例えば、ＤＮＡまたはプレｍＲＮＡに標的化したアンチセンス化合物の好ましい標的領域であり得ることも見出された。
【００８２】
本発明の状況では、アンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、コネキシンｍＲＮＡの全部または一部とハイブリッド形成することができる。典型的には、アンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡのリボゾーム結合領域またはコード領域とハイブリッド形成する。ポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全部または一部の領域に相補的であり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全部または一部の正確な相補物であり得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンの転写および／または翻訳を阻害し得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、コネキシン遺伝子の転写および／または翻訳の特異的インヒビターであり、他の遺伝子の転写および／または翻訳を阻害しない。産物は、（ｉ）コード配列の５’、および／または（ｉｉ）コード配列、および／または（ｉｉｉ）コード配列の３’のいずれかでコネキシン遺伝子またはｍＲＮＡに結合することができる。一般に、アンチセンスポリヌクレオチドにより、減少すべき細胞中のコネキシンｍＲＮＡおよび／またはタンパク質が発現する。アンチセンスポリヌクレオチドは、一般に、コネキシンｍＲＮＡに対してアンチセンスである。このようなポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡとハイブリッド形成することができ、コネキシンｍＲＮＡ代謝の１つまたは複数の態様（転写、ｍＲＮＡプロセシング、核からのｍＲＮＡ輸送、翻訳、またはｍＲＮＡ分解が含まれる）の阻害によってコネキシン発現を阻害することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、コネキシンｍＲＮＡとハイブリッド形成してｍＲＮＡの翻訳の直接阻害および／または不安定化を引き起こし得る二重鎖を形成する。このような二重鎖は、ヌクレアーゼによる分解に感受性を示し得る。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡとのハイブリッド形成は、１つまたは複数のｍＲＮＡの正常な機能を阻害する。阻害されるｍＲＮＡの機能には、全ての生体機能（例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからタンパク質の翻訳、１つまたは複数のｍＲＮＡ種を生成するためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与し得る触媒活性など）が含まれる。ＲＮＡへの特異的タンパク質の結合を、ＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド形成によって阻害することもできる。
【００８４】
ｍＲＮＡ機能の全体的な阻害効果は、コネキシン発現の調整である。本発明の状況では、「調整」には、阻害または刺激（すなわち、発現の増加または減少のいずれか）が含まれる。この調整を、当該分野で日常的な方法（例えば、本願の実施例で教示のｍＲＮＡ発現のノーザンブロットアッセイ、逆転写ＰＣＲ、またはタンパク質発現のウェスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡ、またはタンパク質発現の免疫沈降アッセイ）で測定することができる。本願の実施例に教示のように、細胞増殖または腫瘍細胞成長に対する効果を測定することもできる。ここでは阻害が好ましい。
【００８５】
一旦標的部位が同定されると、標的と十分に相補的な（すなわち、非常に十分な特異性でハイブリッド形成して所望の調整が得られる）オリゴヌクレオチドを選択する。アンチセンス核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾、およびアナログなど）を、任意の適切な核酸産生方法を使用して作製することができる。他のコネキシンタンパク質に指向するオリゴヌクレオチドを、任意の認識されたアプローチ（例えば、コンピュータプログラムＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＯｌｉｇｏＴｅｃｈ（Ｏｌｉｇｏｓ  ｅｔｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）など）によってそのヌクレオチド配列の用語に関して選択することができる。このような合成装置は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＯｌｉｇｏＴｅｃｈ（Ｏｌｉｇｏｓ  ｅｔｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を含むいくつかの販売店を通じて利用可能である。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的方法については、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ，Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照のこと。Ｄａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１８０５（１９９１）も参照のこと。アンチセンス療法については、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）を参照のこと。典型的には、ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、発現の阻害が望ましいコネキシンで知られている。好ましくは、アンチセンス化合物は、１つまたは複数の特異的コネキシンアイソタイプを標的化する。アンチセンス化合物によって標的化することができるコネキシンの特異的アイソタイプには、４３、３７、３１．１、２６、および本明細書中に記載の他のアイソタイプが含まれるが、これらに限定されない。標的化されたコネキシンはヒトであることが好ましいが、必要というわけではない。コネキシンは、例えば、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有し得る。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも８個の核酸塩基を標的化する。
【００８６】
一定の他の実施形態では、第２のアンチセンス化合物を被験体の眼に投与し、第２のアンチセンス化合物は配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする少なくとも約８個の核酸塩基を標的化し、第２のアンチセンス化合物は、第１のアンチセンス化合物と異なるコネキシンを標的化する。
【００８７】
コネキシン標的は、操作または再造形すべき組織の型に依存して変化し、本発明で使用されるアンチセンスポリヌクレオチドの正確な配列は、標的コネキシンタンパク質に依存する。オリゴヌクレオチドによって標的化されるコネキシンタンパク質は、下方制御が指示される部位に依存する。これは、コネキシンサブユニット組成の点から全身の異なる部位でのギャップ結合の不均一な構成を反映する。しかし、いくつかのコネキシンタンパク質は、組織中の分布に関して他のものより偏在する。本明細書中に記載されるように、コネキシン４３などの角膜関連コネキシンがいくつかの実施形態で好ましい。したがって、本発明の状況では、オリゴヌクレオチドは、単独または組み合わせて、角膜エンジニアリングまたは再造形への適用に適切なコネキシン４３、２６、３７、３０、および／または３１．１を標的化する（配列番号１〜１１を参照のこと）。本発明の１つの態様では、オリゴデオキシヌクレオチドは、未修飾ホスホジエステルオリゴマーであり得る。本発明の別の態様では、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。
【００８８】
個別のコネキシンタンパク質を標的化するオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することができる（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるコネキシンを標的化することができる）ことも意図される。例えば、コネキシン４３および１つまたは複数の他のコネキシンファミリーのメンバー（コネキシン２６、３０、３１．１、３７、および４３など）を標的化するＯＤＮを組み合わせて使用することができる。各アンチセンスポリヌクレオチドは特定のコネキシンに特異的であり得るか、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の異なるコネキシンを標的化ことができることも意図される。特異的ポリヌクレオチドは、一般に、コネキシン遺伝子またはコネキシン間で保存されないｍＲＮＡ中の配列を標的化するのに対して、非特異的ポリヌクレオチドは保存配列を標的化する。したがって、一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ヒトコネキシン２６、コネキシン３０、コネキシン３１．１、ヒトコネキシン３７、コネキシン４３をコードする核酸分子の少なくとも８個の核酸塩基を標的化し、アンチセンス化合物は、患者の眼に関連する細胞中のヒトコネキシンタンパク質の発現を阻害する。
【００８９】
一定の実施形態では、コネキシンをコードする核酸分子は、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有する。一定の実施形態では、組成物は、２つまたはそれ以上のヒトコネキシンタンパク質を標的化し、２つまたはそれ以上のヒトコネキシンタンパク質の発現を阻害する。さらなる一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。選択されたコネキシン４３に対する例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドには、ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ（配列番号１）、ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ
ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ（配列番号２）、およびＧＧＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ（配列番号３）が含まれる。コネキシン２６に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、配列ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＡＴＡ（配列番号４）を有する。選択されたコネキシン３７に対する例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドには、５’ＣＡＴ
ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＣ  ３’（配列番号５）および５’ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＧ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＧＧ  ３’（配列番号６）が含まれる。選択されたコネキシン３０に対する例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドには、５’ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ３’（配列番号７）および５’ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＧＧ  ３’（配列番号８）が含まれる。選択されたコネキシン３１．１に対する例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドには、５’ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  Ｃ  ３’（配列番号９）；５’  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  Ｃ  ３’（配列番号１０）および５’  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  Ｔ  ３’（配列番号１１）が含まれる。
【００９０】
さらなる実施形態では、以下の配列から選択されたオリゴデオキシヌクレオチドは、コネキシン４３発現の下方制御に特に適切である。
【００９１】
【化１】
2014122248.tif 000003
さらに別の実施形態では、以下の配列から選択されるオリゴデオキシヌクレオチドは、コネキシン２６、３７、３０、および３１．１に特に適切である。
【００９２】
【化２】
2014122248.tif 000004
【００９３】
【化３】
2014122248.tif 000005
本明細書中に提供したアンチセンス化合物は、一般に、約８〜約４０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約４０個の連結ヌクレオチド）を含み、より典型的には、約１２〜約４０個の核酸塩基を含み、より典型的には約３０個の核酸塩基を含む。ポリヌクレオチドを含むアンチセンス化合物は、少なくとも４０ヌクレオチド長（例えば、少なくとも６０または少なくとも約８０ヌクレオチド長、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、または３０００、またはそれ以上のヌクレオチド長）であり得る。適切なアンチセンス化合物には、例えば、３０量体のＯＤＮが含まれる。
【００９４】
一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化する。他の実施形態では、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約１０個、少なくとも約１２個、少なくとも約１４個、少なくとも約１６個、少なくとも約１８個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個の核酸塩基を標的化する。ヒトコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも８個と３５との間の核酸塩基を標的化するオリゴヌクレオチドが含まれるアンチセンス化合物のサイズは、８核酸塩基長またはそれ以上、８個と１００個との間の核酸塩基長、８個と５０個との間の核酸塩基長、８個と４０個との間の核酸塩基長、１０個と５０個との間の核酸塩基長、１２個と５０個との間の核酸塩基長、１４個と５０個との間の核酸塩基長、１６個と５０個との間の核酸塩基長、１８個と５０個との間の核酸塩基長、２０個と５０個との間の核酸塩基長、２５個と５０個との間の核酸塩基長、および１５個と３５個との間の核酸塩基長、であり得る。本発明の他のアンチセンス化合物は、より小さいかより大きいサイズ（例えば、１００核酸塩基長を有する）であり得る。
【００９５】
アンチセンス化合物には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、アンチセンスポリヌクレオチド、デオキシリボザイム、モルホリノオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子またはそのアナログ、ｓｉＲＮＡ分子またはそのアナログ、ＰＮＡ分子またはそのアナログ、ＤＮＡザイムまたはそのアナログ、５’末端変異Ｕｌ核内低分子ＲＮＡおよびそのアナログが含まれる。
【００９６】
本明細書中に提供されるアンチセンス化合物は、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用を含み得る。ＯＤＮは、一般に、２０ヌクレオチド長であり、プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡとのハイブリッド形成によって作用してリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）の基質を生成し、この基質は、形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を特異的に分解する。ＲＮアーゼＨの作用を妨害する方法で修飾された場合、ＯＤＮは、立体障害を介してｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、プレｍＲＮＡのスプライシングを阻害することができる。ＯＤＮおよびその修飾物を使用して、三重らせんの形成による転写阻害についてｄｓＤＮＡが標的化されている。認識された自動化合成方法によってＯＤＮを得ることができ、任意の配列のＯＤＮを得てアンチセンス塩基対合を介して遺伝子発現を遮断することは比較的容易である。
【００９７】
一定の態様では、ＯＤＮのホスホジエステル骨格を、標的特異的な遺伝子発現の遮断薬としてのその有効性を増加させるように修飾することができる。ＯＤＮの安定性を改善し、その細胞取り込みを増強するために、これらの骨格を修飾した。最も広く使用されている修飾は、隣接酸素を硫黄原子に置換してホスホロチオエートＯＤＮを作製する修飾である。少なくとも１つのホスホロチオエートＯＤＮは、ＦＤＡで承認されており、いくつかの他のホスホロチオエートアンチセンスＯＤＮは、種々の癌および炎症疾患について初期段階の臨床試験が行われている。
【００９８】
遺伝子機能の遮断に関するＯＤＮの作用機構は、ＯＤＮの骨格に依存して変化する（Ｂｒａｎｃｈ，Ａ．Ｄ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２４，１５１７−１５２９（１９９６）；Ｄｉａｓ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｏｒ．１，３４７−３５５（２００２）；Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８，２６５９−２６６８（１９８８）；Ｚｏｎ，Ｇ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，６１６，１６１−１７２（１９９０））。正味の負電荷ＯＤＮ（ホスホジエステルおよびホスホロチオエートなど）は、標的ｍＲＮＡのＲＮアーゼＨ媒介性切断を誘発する。その電荷の不足または標的ＲＮＡを使用して形成されたヘリックス型によってＲＮアーゼＨを採用しない他の骨格修飾を、立体障害ＯＤＮと分類することができる。広く使用されているこの後者の群のメンバーには、モルホリノ、Ｕ−Ｏ−メチル、２’’−Ｏ−アリル、固定核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。他の阻害標的のうちで、これらのＯＤＮは、スプライシング、翻訳、核−細胞質輸送、および翻訳を遮断することができる。
【００９９】
別の態様では、コネキシン発現の調整は、リボザイムの使用を含む。リボザイムは、完全なタンパク質の非存在下でさえも酵素として作用するＲＮＡ分子である。リボザイムは、高い特異性で共有結合を破壊および／または形成し、それにより、何桁もの大きさで標的化された反応の自発的速度を加速させる触媒活性を有する。
【０１００】
リボザイムは、ワトソン−クリック塩基対合を介してＲＮＡに結合し、ホスホジエステル骨格の加水分解の触媒によって標的ＲＮＡを分解するように作用する。いくつかの異なるリボザイムクラスが存在し、「ハンマーヘッド」リボザイムは最も広く研究されている。その名前が意味するように、ハンマーヘッドリボザイムは、その標的ｍＲＮＡとハイブリッド形成した場合に固有の二次構造を形成する。リボザイム内の触媒的に重要な残基は、標的ＲＮＡ切断部位に隣接した標的相補配列に隣接している。リボザイムによる切断には、２価のイオン（マグネシウムなど）が必要であり、標的ＲＮＡの構造および接近可能性にも依存する。局在化シグナルの使用による細胞内でのリボザイムの標的ＲＮＡとの同時局在化により、そのサイレンシング効率が非常に増加する。ハンマーヘッドリボザイムは、化学合成するのに十分に短く、ベクターから転写することができ、それにより、細胞内でリボザイムを連続的に産生可能である。
【０１０１】
テトラヒメナの自己スプライシンググループＩのイントロンおよびＲＮアーゼのＲＮＡ部分についてのＲＮＡの触媒として作用する能力が最初に証明された。これら２つのＲＮＡ酵素の発見後、酵母、真菌、および植物のミトコンドリア（ならびに葉緑体）の自己スプライシンググループＩＩイントロン、一本鎖植物ウイロイドおよびウイロイドＲＮＡ、デルタ肝炎ウイルス、およびアカパンカビミトコンドリア由来のサテライトＲＮＡに関連するＲＮＡ媒介性触媒が見出されている。リボザイムは天然に存在するが、シス（同一核酸鎖上）またはトランス（非共有結合核酸）の特定の配列の発現および標的化のために人為的に操作することもできる。インビトロ分泌プロトコールの使用およびＲＮＡ以外の基質に対して作用する新規のリボザイムモチーフの生成によって新規の生化学活性が得られる。
【０１０２】
テトラヒメナのグループＩイントロンは、ゲノム研究および可能な治療薬として有用となるトランス反応形態に変換される第１のシス切断リボザイム（本発明者らは、イントロン／リボザイムと呼ぶ）であった。トランススプライシング反応では、標的化されたｍＲＮＡの欠損エクソンを、イントロン／リボザイムに共有結合する正確なエクソンと交換することができる。これは、トランスエステル化反応において標的転写物の５’’末端に共有結合することができるようなイントロンに結合したエクソンが標的ｍＲＮＡへの塩基対合によって配置されるスプライシング反応によって起こる。この反応を使用して、野生型配列を鎌状細胞グロビン転写物および変異ｐ５３転写物にトランススプライシングし、筋緊張性ジストロフィー対立遺伝子中のプロテインキナーゼ転写物の３’’−ＵＴＲ中の拡大（ｅｘｐａｎｄｅｄ）トリプレットと置換する。
【０１０３】
エンドリボヌクレアーゼであるＲＮアーゼＰは、自然界の至るところで見出される。この酵素は、ＲＮＡおよび１つまたは複数のタンパク質成分（単離される生物に依存する）を有する。大腸菌および枯草菌の酵素由来のＲＮＡ成分は、一定の塩およびイオン条件下でのタンパク質トレーダー（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｄｅｒ）の非存在下で部位特異的切断因子として作用することができる。ヒトおよび細菌の酵素の基質要件の研究により、いずれかの酵素の最小基質はメッセンジャーＲＮＡ分子のセグメントに類似することが示されている。この構造を、標的ＲＮＡと対合して試験管および細胞の両方においてＲＮアーゼＰ媒介性部位特異的切断の基質としての役割を果たす固有にデザインしたアンチセンスＲＮＡによって模倣することができる。アンチセンス成分をＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに共有結合し、それにより、酵素が目的の標的ＲＮＡのみに指向することができることも示されている。研究者は、アンチセンスＲＮＡのデザインにおいてこの性質を活用しており、標的の部位特異的切断を刺激し、細胞培養物中の単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスの標的化阻害のために目的の標的ｍＲＮＡと対合させる。
【０１０４】
多数の小植物病原性ＲＮＡ（ウイロイド、サテライトＲＮＡ、およびウイルソイド）、アカパンカビミトコンドリアＤＮＡプラスミド由来の転写物、および動物デルタ肝炎ウイルスは、タンパク質の非存在下でインビトロにて自己切断反応を受ける。この反応には、中性ｐＨおよびＭｇ２＋が必要である。自己切断反応は、複製のインビボローリングサークル機構の不可欠な部分である。これらの自己切断ＲＮＡを、切断部位を形成する配列および二次構造による群にさらに分類することができる。小リボザイムは一本鎖植物ウイロイドおよびウイルソイドＲＮＡ中に見出されるモチーフに由来している。共有する二次構造および保存されたヌクレオチド組に基づいて、用語「ハンマーヘッド」は、この自己切断ドメインの１つの群に分類されている。ハンマーヘッドリボザイムは、３０ヌクレオチドから構成される。ハンマーヘッド触媒ドメインの簡潔さにより、トランス作用性リボザイムのデザインで一般に選択されている。ワトソン−クリック塩基対合を使用して、任意の標的ＲＮＡを切断するようにハンマーヘッドリボザイムをデザインすることができる。切断部位の要件は比較的簡素なことであり、実質的に任意のＵＨ配列モチーフ（はＵ、Ｃ、またはＡである）を標的化することができる。
【０１０５】
タバコ輪点サテライトＲＮＡのマイナス鎖で最初に同定された第２の植物由来の自己切断モチーフは、「ヘアピン」または「ペーパークリップ」と名付けられている。ヘアピンリボザイムは、２’’、Ｙ−環状リン酸、および５’’−ヒドロキシＴ１末端を生成する可逆的反応においてＲＮＡ基質を切断する−この触媒モチーフの操作バージョンもトランスで種々の標的の複数のコピーを切断して代謝回転する。ヘアピンの基質要件には、Ｇのすぐ上流が切断されるＧＵＣ含まれる。ヘアピンリボザイムは切断反応でより頻繁に使用されるにもかかわらず、ヘアピンリボザイムはライゲーション反応も触媒する。
【０１０６】
特定の細胞およびウイルス標的の下方制御のためにハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの両方が多数適用されている。Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈは、正確な標的と塩基対合するアームの修飾によって任意の標的を切断するように操作することができるハンマーヘッドモチーフをデザインした（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ；Ｎａｔｕｒｅ．１９８８  Ａｕｇ  １８；３３４（６１８３）：５８５−９１）。Ｒａｍｅｍｚａｎｉらは、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇａｇリボザイムを発現するように操作した細胞を使用してウイルスの遺伝子発現および複製が事実上完全に阻害された研究において、このハンマーヘッドリボザイムモチーフが潜在的に治療に適用されることを証明した（Ｒａｍｅｚａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７：ａ，２９−３６；２００２）。
【０１０７】
別の態様では、コネキシン発現の調整は、触媒ＤＮＡ（またはＤＮＡザイム）の使用を含む。ＲＮＡ標的を部位特異的に切断することができる小ＤＮＡを、インビトロ進化によって作製した（公知のＤＮＡ酵素が天然に存在しないので）。異なる切断部位特異性を有する２つの異なる触媒モチーフを同定した。最も一般的に使用される１０〜２０種の酵素は、ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムと同様にワトソン−クリック塩基対合を介してそのＲＮＡ基質に結合して標的ＲＮＡを部位特異的に切断して、２；３’’環状リン酸および５’’−ＯＨ末端が得られる。標的ｍＲＮＡの切断によって破壊され、ＤＮＡザイムを再利用して複数の基質を切断する。触媒ＤＮＡは比較的安価に合成され、良好な触媒特性を有し、それにより、アンチセンスＤＮＡまたはリボザイムのいずれかの基質に有用である。
【０１０８】
細胞培養におけるＤＮＡザイムのいくつかの適用が公開されており、ｖｅｇＦｍＲＮＡの阻害およびそれによる血管形成の防止、ならびに慢性骨髄性白血病に特徴的なｂｃｒ／ａｂｌ融合転写物の発現の阻害が含まれる。触媒ＤＮＡを外因的に送達させ、キャリアの非存在下での全身送達を最適にするために骨格修飾することができる。
【０１０９】
本発明の別の態様で、構成性コネキシン遺伝子の調整は、モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドの使用を含む。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄ．の米国特許第５，０３４，５０６号。
【０１１０】
本発明の別の態様では、アンチセンスポリヌクレオチドを、ヌクレアーゼ耐性を増強して細胞侵入効率を増加させるために化学修飾することができる。例えば、ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのセグメントおよび適切に配置した修飾オリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドのセグメントを含む混合骨格オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）を使用することができる。ＭＢＯは、ホスホロチオエート結合および他の修飾オリゴヌクレオチドの他のセグメント（メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホラミデート、およびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートなど）ならびに非イオン性でヌクレアーゼまたは２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドに強い耐性を示すその２’−Ｏ−アルキルアナログおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートを有する。
【０１１１】
当該分野で公知のように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。このような複素間塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドのために、リン酸基を、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成では、リン酸基は、互いに隣接するヌクレオシドに共有結合して線状ポリマー化合物を形成する。この線状ポリマー構造の各末端が次々にさらに結合して環状構造を形成することができるが、一般に、開いた線状構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格の形成をいう。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’から５’ホスホジエステル結合である。
【０１１２】
本発明で有用なアンチセンス化合物には、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれ得る。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子が保持されたものおよび骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本発明の状況では、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドと見なすことができる。
【０１１３】
本発明で有用な修飾オリゴヌクレオチド骨格を有するアンチセンス化合物には、例えば、通常の３’−５’結合を有するホスホチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが含まれる）、ホスフィネート、ホスホラミデート（３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートが含まれる）、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログおよび隣接するヌクレオシド単位の対が３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’とで結合した極性が逆のものが含まれ得る。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
【０１１４】
１つの態様では、リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格が、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有することが意図される。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成されている）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成部分を有する他の骨格を有するものが含まれる。
【０１１５】
１つの態様では、オリゴヌクレオチド模倣物（糖結合およびヌクレオシド間結合の両方（すなわち、ヌクレオチド単位の骨格））を新規の基に置換することが意図される。適切な核酸標的化合物とのハイブリッド形成のために、塩基単位を保持する。１つのこのようなオリゴマー化合物（優れたハイブリッド形成特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣物）を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−骨格を、アミド含有骨格（特に、アミノエチルグリシン骨格）に置換する。核酸塩基を保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合させる。ＰＮＡのさらなる教示を、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００）に見出すことができる。
【０１１６】
１つの態様では、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド（特に、−−ＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ−２Ｎ（ＣＨ）３−−Ｏ−−ＣＨ−−２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格）、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−（式中、未変性のホスホジエステル骨格を、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−と示す））を意図する。さらに別の態様では、モルホリノおよびアミド骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも意図する。
【０１１７】
別の態様では、修飾オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の置換糖部分も含み得ることを意図する。例えば、２’位に以下のうちの１つを含むオリゴヌクレオチド：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキル、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルケニル、またはＯ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキニル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルを、Ｃｌ〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルに置換しても置換しなくても良い）。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含み得る：Ｃｌ〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくは０−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善する基、類似の性質を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知の２’−−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ，３）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９５，７８，４８６−５０４）（すなわち、アルコキシアルコキシ基）が含まれる。他の修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、（すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、および２’−ジメチルアミノ−エトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）（すなわち、２’−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２）が含まれる。
【０１１８】
修飾には、２’−メトキシ（２’−−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれ得ることがさらに意図される。オリゴヌクレオチドの他の位置（特に、３’末端ヌクレオチド上の３’末端の糖の３’位または２’−５’結合オリゴヌクレオチド中、および５’末端ヌクレオチドの５’位）で類似の修飾を行うこともできる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有し得る。
【０１１９】
別の態様では、オリゴヌクレオチドが核酸塩基（当該分野でしばしば「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換を含み得ることを意図する。本明細書中で使用される、「未修飾」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、以下などの他の合成および天然の核酸塩基が含まれる：５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃまたはｍ５ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒドロキサンチン、２−アミノカデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に、５−ブロモ）、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示の核酸塩基、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９９０，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに開示の核酸塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９１，３０，６１３−７２２）に開示の核酸塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９３，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓに開示の核酸塩基が含まれる。これらの一定のヌクレオチドは、オリゴマー化合物の結合親和性の増加に特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン、（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンが含まれる）が含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性が０．６〜１．２℃増加することが示されおり（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐａｇｅｓ  ２７６−２７８）、現在のところ好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、さらにより好ましい。
【０１２０】
別の態様では、オリゴヌクレオチドの修飾が、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強するオリゴヌクレオチドへの１つまたは複数の一部または抱合体の化学結合を含むことを意図する。このような部分には、以下が含まれるが、これらに限定されない：コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９４，４，１０５３−１０５９）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  １９９３，７５，４９−５４）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９５，１４，９６９−９７３）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９６，２７７，９２３−９３７）。
【０１２１】
キメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドの使用も意図する。本発明の状況で、「キメラな」オリゴヌクレオチドまたは「キメラ」は、それぞれ少なくとも１つのヌクレオチドから構成された２つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解耐性を増加させ、細胞取り込みを増加させ、そして／または標的核酸に対する結合親和性を増加させるためにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化によってＲＮＡ標的が切断され、それにより、遺伝子発現のアンチセンス阻害効率が非常に増強される。ＲＮＡ標的の切断を、ゲル電気泳動および必要に応じて当該分野で公知の関連核酸ハイブリッド技術によって日常的に検出することができる。ＲＮＡ標的のこのＲＮアーゼＨ媒介性切断は、核酸を切断するためのリボザイムの使用とは異なる。
【０１２２】
キメラオリゴヌクレオチドの例には、通常、互いに化学的に等価であるがギャップが異なる２つの領域に隣接した中央領域を有する３つの異なる領域が存在する「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」が含まれるが、これらに限定されない。ギャップマーの好ましい例は、オリゴヌクレオチドの中央部分（「ギャップ」）がＲＮアーゼＨの基質としての役割を果たし、好ましくは、２’−デオキシヌクレオチドから構成される一方で、隣接部分（５’および３’「ウィング」）が標的ＲＮＡ分子に対する親和性がより高いが、ヌクレアーゼ活性を支持することができないように修飾された（例えば、フルオロまたは２’−Ｏ−メトキシエチル置換）オリゴヌクレオチドである。キメラオリゴヌクレオチドは、糖の修飾を有するものだけでなく、修飾骨格（例えば、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）およびホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）骨格結合領域またはＭＭＩおよびＰ＝Ｓ骨格結合領域）を有するオリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドも含まれ得る。他のキメラには、当該分野で「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）」としても公知の「ウィングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）」（すなわち、２つの異なる領域を有するオリゴヌクレオチド）が含まれる。ウィングマーの好ましい例では、オリゴヌクレオチドの５’部分はＲＮアーゼＨの基質としての役割を果たし、好ましくは、２’−デオキシヌクレオチドから構成される一方で、標的ＲＮＡ分子に対する親和性がより高いが、ヌクレアーゼ活性を支持することができないような様式（例えば、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メトキシエチル置換）で３’部分が修飾されているか、その逆である。１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分に２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）修飾を含む。この修飾により、その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の両方が増加することが示されている。本発明によれば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットの１つ、複数、または全てが２’−Ｏ−メトキシエチル（−−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）修飾を含み得る。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有する複数のヌクレオチドサブユニットを含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の任意のヌクレオチドサブユニットにこのような修飾を有することができ、キメラオリゴヌクレオチドであり得る。２１−Ｏ−メトキシエチル修飾とは別であるか、これに加えて、アンチセンス効率、有効性、または標的親和性を増強する他の修飾を含むオリゴヌクレオチドも意図する。
【０１２３】
本発明はまた、（例えば、コネキシンＲＮＡの折りたたみ領域またはコネキシン遺伝子中の）二本鎖または二重鎖コネキシン核酸に結合して三重らせんを含むか、「三重鎖」の核酸を形成するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡなど）を提供する。三重らせんの形成により、例えば、コネキシン遺伝子の転写を防止し、それにより、細胞内のコネキシン活性を減少または排除ことによってコネキシン発現が阻害される。いかなる特定の機構に拘束されることを意図しないが、三重らせん対合が、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に二重らせんを開ける能力を含むと考えられる。
【０１２４】
三重鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを、三重らせん形成の塩基対合規則（例えば、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５１１０（１９８８）；Ｆｅｒｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５４：１４９４（１９９１）；Ｒａｍｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７３９５（１９８９）；Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６３９（１９９１）；およびＲｉｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９１（１９８６）を参照のこと）、コネキシンｍＲＮＡ、および／または遺伝子配列を使用して構築する。典型的には、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、コネキシンＲＮＡまたは遺伝子中の特定の配列と「相補的な」約１０〜２５ヌクレオチドまたはそれ以上（すなわち、安定な三重らせんを形成するのに十分であるが、所望ならばインビボで投与するのには小さい（送達様式に依存する））の特定の配列を含む。この状況では、「相補的な」は、安定な三重らせんを形成することができることを意味する。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドを、コネキシン遺伝子の調節領域（例えば、コネキシン５’隣接配列、プロモーター、およびエンハンサー）または転写開始部位（例えば、転写開始部位から−１０と＋１０との間）に特異的に結合するようにデザインする。三重鎖ＤＮＡを使用した最近の治療の進歩についての概説については、例えば、Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｈｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｒｒ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｍｔ  Ｋｉｓｃｏ  ＮＹ  ａｎｄ  Ｒｉｎｉｎｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５８５４を参照のこと。
【０１２５】
本発明はまた、コネキシン活性の阻害に有用なリボザイムを提供する。リボザイムは、コネキシンｍＲＮＡに結合し、特異的に切断および不活化する。有用なリボザイムは、コネキシンｍＲＮＡに相補的な５’および３’末端配列を含むことができ、当業者がコネキシンｍＲＮＡ配列に基づいて操作することができる。本明細書中に提供したリボザイムには、グループＩイントロンリボザイムの特徴を有するリボザイム（Ｃｅｃｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３２３（１９９５））および他のハンマーヘッドリボザイム（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２５６（１９９２））が含まれることを意図する。
【０１２６】
リボザイムには、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣなどの切断部位を有するリボザイムが含まれる。切断部位を含む標的コネキシン遺伝子領域に対応する１５と２０との間のリボヌクレオチド長の短鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドをより望ましくすることができる二次構造の特徴について評価することができる。切断部位の安定性を、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用した相補オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成の容易さの試験または当該分野で公知の標準的手順によるインビトロリボザイム活性試験によって評価することもできる。
【０１２７】
アンチセンスおよびリボザイム機能を１つのオリゴヌクレオチド中で組み合わせることができるアンチセンス化合物をさらに意図する。さらに、リボザイムは、本明細書中に提供した例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドの説明と組み合わせて、上記のように、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの間の修飾結合を含み得る。
【０１２８】
本発明はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などの方法によるコネキシン活性の阻害に有用なポリヌクレオチドを提供する。この技術および他の遺伝子発現技術は、当該分野で周知である。この技術の概説は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１３７０−１３７２（２０００）に見出される。ＲＮＡｉは、転写後レベルに合わせて操作し、配列特異的である。過程は、細胞または細胞外環境への部分的または全ての二本鎖の特徴を有するＲＮＡ、このようなＲＮＡの前駆体、またはこのようなＲＮＡをコードする前駆体の移入を含む。
【０１２９】
Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，５０６，５５９号に記載のように、ＲＮＡは、１つまたは複数の重合リボヌクレオチド鎖を含み得る。１つの自己相補ＲＮＡ鎖または２つの相補ＲＮＡ鎖によって二本鎖構造を形成することができる。ＲＮＡは、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかを修飾することができる。細胞内または細胞外のいずれかでＲＮＡ二重鎖形成を開始することができる。
【０１３０】
研究により、１つまたは複数のリボヌクレアーゼが二本鎖ＲＮＡに特異的に結合して短いフラグメントに切断することが証明されている。リボヌクレアーゼはこれらのフラグメントに会合したままであり、その後相補ｍＲＮＡに特異的に結合する（すなわち、コネキシン遺伝子の転写ｍＲＮＡ鎖に特異的に結合する）。コネキシン遺伝子のｍＲＮＡはまた、リボヌクレアーゼによって短いフラグメントに分解され、それにより、コネキシン遺伝子の翻訳および発現を回避されてコネキシン活性が阻害される。さらに、ＲＮＡポリメラーゼは、短いフラグメントの多数のコピーの合成を促進するように作用し、それにより、系の効率が指数関数的に増加させることができる。この遺伝子発現経路の固有の特徴は、スプライシングが開始される細胞に制限されないことである。遺伝子サイレンシング効果を生物の他の部分に拡大し、生殖系列を介して数世代にわたり伝達させることができる。
【０１３１】
１つの態様では、ＲＮＡｉの二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性遺伝子特異的転写後サイレンシングストラテジーは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を含む。一般的なＲＮＡｉアプローチの使用は、一定の制限（長いｄｓｓＲＮＡ分子に応答して活性化された哺乳動物細胞における非特異的抗ウイルス防御機構が含まれる）に制約される（Ｇｉｌ  Ｊ，Ｅｓｔｅｂａｎ  Ｍ，”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｓＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＰＫＲ）：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ”．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ２０００，５：１０７−１１４）。この分野の進展により、２１個のヌクレオチドＲＮＡの合成二重鎖が遺伝的抗ウイルス防御機構を誘発することなく哺乳動物細胞中で遺伝子特異的ＲＮＡｉを媒介することができることが証明された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４１１：４９４−４９８；Ｃａｐｌｅｎ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００１，９８：９７４２−９７４７）。したがって、ｓｉＲＮＡは、遺伝子特異的調整のための強力なツールとして認識されつつある。
【０１３２】
本明細書中で記載されるように、ＲＮＡｉは、末端エフェクター分子が、例えば、小さな２１〜２３ヌクレオチドのアンチセンスＲＮＡである（これに限定されない）多数の共通の生化学成分を共有する関連遺伝子サイレンシング機構群を含む。１つの機構は、細胞酵素であるＤｉｃｅｒによって、例えば、短いｓｉＲＮＡと呼ばれる２１〜２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ（これに制限されない）にプロセシングされる比較的長いｄｓＲＮＡ「トリガー」を使用する。標的ＲＮＡに相補的なｓｉＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多タンパク質複合体に組み込まれるようになり、標的部位内のｍＲＮＡ鎖のエンドヌクレアーゼ的切断のガイドとしての役割を果たす。これにより、全ｍＲＮＡが分解され、アンチセンスｓｉＲＮＡを再利用することができる。下等生物では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはまた、プライマーとしてアニーリングされたガイドｓｉＲＮＡを使用し、標的からより多数のｄｓＲＮＡが生成され、これがＤｉｃｅｒ基質としての役割を果たし、それにより、より多くのｓｉＲＮＡが生成され、ｓｉＲＮＡシグナルが増幅される。この経路は、植物においてウイルス防御機構として一般に使用される。
【０１３３】
本明細書中に記載されるように、ｓｉＲＮＡは、例えば、末端の２つの３’’−ヌクレオチドが対合していない（３’’オーバーハング）２１〜３２個のヌクレオチドの２つの個別のアニーリングされた一本鎖（これに限定されない）からなり得る。あるいは、ｓｉＲＮＡは、しばしば短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれる１つのステム−ループの形態であり得る。典型的には（しかし、常にではない）、ｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖はまた、ｓｉ／ｓｈＲＮＡのセンスパートナー鎖に完全に相補的である。
【０１３４】
哺乳動物細胞では、長鎖ｄｓＲＮＡ（通常、３０ヌクレオチド長を超える）は、インターフェロン経路を誘発し、タンパク質キナーゼＲおよび２；５’’−オリゴアデニレートシンセターゼを活性化する。インターフェロン経路の活性化により、翻訳の全体的下方制御および全体的ＲＮＡ分解が起こり得る。しかし、哺乳動物細胞に外因的に移入されたより短いｓｉＲＮＡは、インターフェロン経路を迂回することが報告されている。
【０１３５】
ｓｉＲＮＡアンチセンス産物はまた、内因性ミクロＲＮＡに由来し得る。ヒト細胞では、最初の形態（ｓｉＲＮＡおよびミクロＲＮＡ）またはプロセシング経路に関係なく、最終成熟（例えば、ｍＲＮＡに完全に相同的な２１〜２３ヌクレオチドのアンチセンスＲＮＡ（これに限定されない））が、ｍＲＮＡ切断を指示する。一般に、ｓｉＲＮＡと標的部位との間のミスマッチの効果により、部分的にしか理解されていない理由によってほとんど効果なしから活性の完全な無効に変化し得るが、少なくとも１つの場合、部分的相同性によってｍＲＮＡ翻訳が阻害された。一般に、原型的なミクロＲＮＡ−標的相互作用を模倣するようにデザインした標的ミスマッチを有するｓｉＲＮＡは、特異的相互作用およびｍＲＮＡ中の標的部位数の両方に依存して、種々の程度の翻訳抑制を媒介することができる。事前に形成したｓｉＲＮＡの外因性送達またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡのプロモーターベースの発現によってＲＮＡｉを活性化することができる。
【０１３６】
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、化学合成するか、ＤＮＡベースのベクター系によって生成することができる。一般に、これは、細胞内で効率的にプロセシングしてｓｉＲＮＡを形成する短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡの転写を含む（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ，Ｃａｕｄｙ  Ａ，Ｈａｎｎｏｎ  Ｇ：Ｓｔａｂｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２，９９：１４４３−１４４８；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ，Ｃａｕｄｙ  Ａ，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ，Ｈａｎｎｏｎ  Ｇ，Ｃｏｎｋｌｉｎ  Ｄ：Ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）ｉｎｄｕｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ  ２００２，１６：９４８−９５８；Ｓｕｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００２，８：５５１５−５５２０；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９６：５５０−５５３）。したがって、この状況では、ｓｉＲＮＡを、遺伝子発現の組織特異的標的化および調整のための有効なストラテジーとして使用することができる。
【０１３７】
本発明で使用されるオリゴヌクレオチドを、周知の固相合成技術によって都合良く且つ日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、当該分野で公知のいくつかの業者から販売されている。任意の他の合成手段も使用することができ、実際のオリゴヌクレオチド合成は、当該分野で十分に認識されている。ホスホロチオエートおよび２’−アルコキシまたは２１−アルコキシアルコキシ誘導体（２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチド）などのオリゴヌクレオチドを調製するための類似の技術を使用することが周知である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９５，７８，４８６−５０４）。蛍光標識されたビオチン化オリゴヌクレオチドまたは他の抱合オリゴヌクレオチドを合成するために、類似の技術、市販の修飾アミダイト、および多孔質ガラス（ＣＰＧ）製品（ビオチン、フルオレセイン、アクリジン、またはソラレン修飾アミダイト、および／またはＣＰＧなど）（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．から市販されている）を使用することが周知である。
【０１３８】
（方法）
別の態様では、本発明は、被験体へのアンチセンス化合物の投与による被験体（例えば、患者）の治療方法を含む。一般に、これらの方法は、医学的手順（眼病用手順が含まれるが、これらに限定されない）に関連する組織エンジニアリングおよび組織損傷の軽減方法を含む。
【０１３９】
方法は、例えば、アンチセンス化合物を被験体の眼または眼に関連する細胞中のヒトコネキシンタンパク質発現を阻害するのに十分な量で被験体の眼に投与する工程を含み得る。ヒトコネキシンタンパク質の発現が阻害されることが好ましいが、他のタンパク質は、アンチセンス化合物のみまたはヒトコネキシン発現を阻害するアンチセンス化合物との組み合わせによる調整のための標的であり得ると予想される。
【０１４０】
一定の実施形態では、眼病用手順は、眼病用手術であり、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、白内障摘出、角膜移植、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、緑内障濾過手術、角膜移植術、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、角膜移植、屈折矯正手術、眼表面新生物切除、結膜もしくは羊膜の移植、翼状片および瞼裂斑の切除、眼形成手術、眼瞼腫瘍切除、先天性異常のための眼瞼再構築手順、外反症および眼瞼外反の修復、斜視手術（眼筋）、穿通性眼外傷が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
一定の実施形態では、本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、局所または局部投与によって投与する。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、例えば、全身または眼内注射によって投与することもできる。
【０１４２】
本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、例えば、眼病用手順（例えば、手術）で起こる創傷などの創傷の形成に対する所定時間に被験体に投与することができる。例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順を行う前、眼病用手順中、または眼病用手順後に投与することができる。例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順の数分または数時間前後以内に被験体に投与することができる。
【０１４３】
一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、眼病用手順後の実施後に投与し、例えば、アンチセンス化合物を、手順から約４時間以内、手順から約３時間以内、より典型的には、眼病用手順から約２時間以内、または眼病用手順から約１時間以内に投与する。あるいは、アンチセンス化合物を、眼病用手順から数分以内（例えば、眼病用手順から５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分以内）に投与することができる。アンチセンス化合物を、眼病用手順から４時間後に投与することもできる。
【０１４４】
別の態様では、本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、組織エンジニアリング法で投与することができる。これらの実施形態および本明細書中に提供したいくつかの他の実施形態では、アンチセンス化合物を、典型的には、長期間（例えば、数日、数週間、数ヵ月、またはそれ以上）にわたって投与し、患者に行った特定の手順（眼に行った手順など）と無関係に投与することができる。
【０１４５】
本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の角膜組織の厚さを増加させる方法（眼病用手順と関連しない方法およびアンチセンス化合物を眼病用手順（例えば、手術）と関連させて投与する方法が含まれる）と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、例えば、被験体の角膜に関連する細胞（例えば、角膜細胞）の治癒を促進するか組織損傷を予防する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼の瘢痕を減少させる方法と組み合わせて投与することができる。
【０１４６】
本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼のかすみを軽減する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、好ましくは、手術から２４〜４８時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する筋線維芽細胞分化に関連する細胞過形成を調節する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、好ましくは、手術から２４〜７２時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質の再造形を調整し、かすみを軽減する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼の上皮細胞移動が増加する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼へのアンチセンス化合物の投与から１２時間以内に上皮細胞移動が増加する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼へのアンチセンス化合物の投与から２４時間以内に上皮細胞移動が増加する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、間質細胞密度の増加を防止する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、手術から２４〜７２時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質水腫を阻害する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、手術から２４〜７２時間後の上皮過形成を軽減する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、手術後１週間までの筋線維芽細胞の活性化を軽減する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、細胞外基質を調整する細胞分化を調整する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、細胞増殖を軽減する方法と組み合わせて投与することができる。
【０１４７】
一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、瘢痕形成を減少させる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、炎症を軽減する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、創傷治癒を促進する。一定の好ましい実施形態では、アンチセンス化合物を、外科的移植手順に際して使用する。一定の好ましい実施形態では、アンチセンス化合物はコネキシン４３に指向し、上皮基底細胞の分裂および成長を調節するために投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物はコネキシン３１．１に指向し、外層角質化を調節するために投与する。
【０１４８】
他の実施形態では、被験体の角膜に関連する細胞の治癒を促進するか組織損傷を予防する方法。一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、被験体の角膜組織の厚さを増加させる方法、被験体の角膜細胞における組織損傷を減少させる方法、被験体の角膜に関連する細胞における組織損傷を減少させる方法、被験体におけるエキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミーに際して行った方法、好ましくは手術から２４〜４８時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する筋線維芽細胞分化に関連する細胞過形成を調節する方法、好ましくは手術から２４〜７２時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質の再造形を調整し、かすみを軽減する方法、手術から２４〜７２時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質水腫を阻害する方法、好ましくは手術から２４〜７２時間後の上皮過形成を軽減する方法、手術後１週間までの筋線維芽細胞の活性化を軽減する方法、細胞外基質を調整する細胞分化を調整する方法、または細胞増殖を軽減する方法で使用する。
【０１４９】
一定の実施形態では、眼病用手順は、白内障摘出である。他の実施形態では、眼病用手順は、角膜移植である。他の実施形態では、眼病用手順は、屈折矯正手術である。他の実施形態では、眼病用手順は、放射状角膜切開術である。他の実施形態では、眼病用手順は、緑内障濾過手術である。さらに他の実施形態では、眼病用手順は、角膜移植術である。
【０１５０】
一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、局所投与または局部投与によって投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、外科的創傷への直接適用によって投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、眼内注射によって投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、手術手順を行う前に投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、手術手順中に投与する。一定の制限されない実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、眼病用手順を行う１５分前までまたは眼病用手順を行った２時間後までに投与する。一定の他の実施形態では、例えば、組織エンジニアリングのために、本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、数日または数ヵ月間でさえも投与することができる。
【０１５１】
一定のさらなる実施形態では、化合物および組成物を使用して、角膜に関連する細胞中の組織損傷の治癒を促進するか予防し、角膜に関連する細胞は、眼内の任意の細胞（角膜細胞が含まれるが、これに限定されない）であり得る。本明細書中に提供した薬剤（アンチセンス化合物が含まれる）は、被験体の角膜の厚さを増加させることができる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、組織損傷の減少または治癒の促進に有用な別の化合物と組み合わせて使用する。例えば、アンチセンス化合物を、成長因子またはサイトカインなど（ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＮＴ３、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、インテグリン、インターロイキン、プラスミン、およびセマフォリンが含まれるが、これらに限定されない）と同時投与することができる。
【０１５２】
別の態様では、眼病用手術に関連する組織損傷の減少のための薬学的組成物を提供する。被験体の眼に関連する細胞中でのヒトコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で存在するアンチセンス化合物を含む薬学的組成物を、被験体の眼への局部投与または局所投与のために適切に処方する。アンチセンス化合物は、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化することが好ましい。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物の形態であり、薬物またはアンチセンス化合物は、被験体の創傷治癒の促進に有効な量で存在する。一定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、局部投与に適切な形態（被験体の眼への局部投与または局所投与に適切な形態が含まれる）であり得る。一定のさらなる実施形態では、組成物および処方物は、ゲル、クリーム、または本明細書中に記載の任意の形態であり得る。
【０１５３】
別の態様では、中枢神経系の損傷を治療する方法を提供する。この方法は、中枢神経系の損傷を治療するために患者に実施した手術手順に関連する中枢神経系の既存の創傷から近位の部位にアンチセンス化合物を投与する工程と、前記アンチセンス化合物が、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化することを含む。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、脊髄の身体的な外傷によるニューロンの欠損に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、外傷の結果である創傷に隣接する部位に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、手術の結果である創傷に隣接する部位に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、脊髄損傷に隣接する部位に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物はコネキシン４３に指向し、上皮基底細胞の分裂および成長を調節するために投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物は創傷治癒を促進する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物は炎症を軽減する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物は瘢痕形成を軽減する。方法の一定の実施形態では、中枢神経系の損傷は脊髄損傷である。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、脊髄の身体的な外傷から少なくとも２４時間で患者に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、外科的移植手順と組み合わせて投与する。方法の一定のさらなる実施形態では、外科的移植手順を、創傷治癒を促進するためにアンチセンス化合物で前処置した移植片と組み合わせる。別の態様では、アンチセンス化合物は、ニューロン損失によって特徴づけられる患者の既存の創傷の治療手順と組み合わせてニューロンの再生を促進することができる。一定の実施形態では、薬剤は、ヒトコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化する４０核酸塩基長までのアンチセンス化合物であり、アンチセンス化合物は、患者の既存の創傷の治療のためにニューロン再生を促進する手順と組み合わせて１つまたは複数のヒトコネキシン発現を阻害する。創傷には、ニューロン損失によって特徴づけられる創傷が含まれる。標的化することができるコネキシンには、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンが含まれる。これらの実施形態では、アンチセンス化合物を、ニューロン損失が起こる患者の脊髄の身体的な外傷から少なくとも２４時間で患者に投与する。アンチセンス化合物を、ニューロン損失が起こる身体的な外傷から数週間、数ヵ月、または数年の期間脊髄の身体的な外傷から少なくとも２４時間を超えて患者に投与する。
【０１５４】
薬学的組成物および方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ヒトコネキシン３０またはヒトコネキシン３７をコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化する。好ましくは、アンチセンス化合物は、患者の眼に関連する細胞中のトコネキシン３０または３７タンパク質の発現を阻害する。他の薬学的組成物は、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン（例えば、ヒト）をコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化するアンチセンス化合物であり、好ましくは、アンチセンス化合物は、ニューロン損失によって特徴づけられる患者の既存の創傷の治療のためにニューロン再生を促進する手順と組み合わせてヒトコネキシン発現を阻害する。
【０１５５】
（薬学的組成物）
別の態様では、本発明は、アンチセンス化合物を含む薬学的組成物を含む。１つの実施形態では、眼病用手順（例えば、手術）に関連する組織損傷の減少のための薬学的組成物であって、薬学的組成物を被験体の眼への局部投与または局所投与のために処方し、薬学的組成物が、被験体の眼に関連する細胞中のヒトコネキシンタンパク質発現を阻害するのに十分な量で存在するアンチセンス化合物を含む、薬学的組成物を提供する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号１２〜３１から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン（例えば、ヒト）をコードする核酸分子の少なくとも約８核酸塩基を標的化する。一定の実施形態では、薬学的組成物は、緩衝化プルロニック酸またはゲル（例えば、約３０％までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水）を含む薬学的に許容可能なキャリアを含む。アンチセンス組成物は、異なる量のプルロニック酸またはゲル（約５％までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、約１０％までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、約１５％までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、約２０％までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、約２５％までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、および約３０％までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。
【０１５６】
本明細書中に提供したアンチセンス化合物はまた、２価の化合物（薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグが含まれる）を含み得る。これは、任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、動物（ヒトが含まれる）に投与した場合に生物活性代謝産物またはその残渣を（直接または間接的に）得ることができる任意の他の化合物を含むことを意図する。したがって、例えば、核酸の薬学的に許容可能な塩およびこのような核酸のプロドラッグも開示する。「薬学的に許容可能な塩」は、本明細書中に提供した核酸の生理学的および薬学的に許容可能な塩（すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持するが、望ましくない毒物学的効果に影響を与えない塩）である（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．１９７７，６６，１−１９を参照のこと）。
【０１５７】
オリゴヌクレオチドのために、薬学的に許容可能な塩の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオンを使用して形成された塩、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなど、（ｂ）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸など）を使用して形成した酸付加塩、（ｃ）有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸など）を使用して形成した塩、ならびに（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成された塩。
【０１５８】
さらにまたはあるいは、本明細書中に提供したオリゴヌクレオチドを、「プロドラッグ」形態で送達させるように調製することができる。用語「プロドラッグ」は、内因性酵素または他の化学物質および／もしくは条件の作用によって体内またはその細胞内で活性形態（すなわち、薬物）に変換される不活性形態で調製される治療薬を示す。特に、オリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンを、１９９３年１２月９日公開のＧｏｓｓｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．のＷＯ９３／２４５１０号に開示の方法にしたがって、ＳＡＴＥ（リン酸（Ｓ−アセチル−２−チオエチル））として調製することができる。
【０１５９】
アンチセンス化合物を、薬学的組成物（オリゴヌクレオチドに加えて、薬学的に許容可能なキャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、界面活性剤、中性またはカチオン性の脂質、脂質複合体、リポソーム、透過増強剤、キャリア化合物、および他の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤などが含まれ得る）に処方することができる。
【０１６０】
薬学的組成物はまた、インターフェロン、抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬などの１つまたは複数の有効成分を含み得る。非経口投与のための処方物は、緩衝液、リポソーム、希釈剤、および他の適切な添加物も含み得る滅菌水溶液を含み得る。本明細書中に提供したオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物は、オリゴヌクレオチドの栄養送達を増強するための透過増強剤を含み得る。透過増強剤を、５つの広範なカテゴリー（すなわち、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、界面活性剤、および非界面活性剤）のうちの１つに属するように分類することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９１，８，９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９０，７，１−３３）。１つまたは複数のこれらの広範なカテゴリー由来の１つまたは複数の透過増強剤が含まれ得る。
【０１６１】
透過増強剤として作用する種々の脂肪酸およびその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸塩、レシンレエート（ｒｅｃｉｎｌｅａｔｅ）、モノオレイン（ａ．ｋ．ａ．１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アクリルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、ジグリセリド、およびその生理学的に許容可能なその塩（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノレン酸塩など）が含まれるが、これらに限定されない。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９０，７，１；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９２  ４４，６５１−６５４）。
【０１６２】
胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８  Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６，ｐａｇｅｓ  ９３４−９３５）。種々の天然の胆汁塩およびその合成誘導体は、透過増強剤として作用する。用語「胆汁塩」には、任意の天然に存在する胆汁成分および任意のその合成誘導体が含まれる。
【０１６３】
１つまたは複数の透過増強剤を含む複雑な処方物を使用することができる。例えば、胆汁塩を、脂肪酸と組み合わせて使用して複雑な処方物を作製することができる。キレート剤には、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸、およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．１９９０，１４，４３−５１）。キレート剤は、ＤＮアーゼインヒビターとしての役割を果たすという利点もある。
【０１６４】
界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９１，ｐａｇｅ  ９２）；およびＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物乳濁液（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．１９８８，４０，２５２−２５７）が含まれる。非界面活性剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １９９１，ｐａｇｅ  ９２）；および非ステロイド系抗炎症薬（ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなど）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８７，３９，６２１−６２６）が含まれる。
【０１６５】
本明細書中で使用される、「キャリア化合物」は、不活性（すなわち、それ自体は生物活性を示さない）であるが、例えば、生物活性核酸の分解または循環からのその除去の促進によって生物活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるインビボ過程によって核酸として認識される核酸またはそのアナログをいう。核酸とキャリア化合物（典型的には、過剰量の後者の物質）の同時投与により、おそらく、キャリア化合物と核酸との間の共通の受容体の競合によって、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵所（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）に回収される核酸量が実質的に減少し得る。キャリア化合物と対照的に、「薬学的に許容可能なキャリア」（賦形剤）は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁液、または任意の他の薬理学的に不活性な賦形剤である。薬学的に許容可能なキャリアは、液体であっても固体であってもよく、核酸および所与の薬学的組成物の他の成分と組み合わせた場合に所望のかさ、一貫性などが得られることを考慮した計画された投与様式を使用して選択する。典型的な薬学的に許容可能なキャリアには、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６６】
本明細書中に提供した組成物は、従来よりその技術で確立された使用レベルで薬学的組成物中で見出される他の付加成分をさらに含み得る。したがって、例えば、組成物は、さらなる適合可能な薬学的に活性な物質（例えば、止痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬など）を含み得るか、本発明の組成物の種々の投薬形態の物理的処方に有用なさらなる物質（色素、香味物質、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤など）を含み得る。しかし、このような物質は、添加した場合、本明細書中に提供した組成物の成分の生物活性を過度に阻害すべきではない。
【０１６７】
オリゴヌクレオチドを患者に移入する方法に関係なく、コロイド分散系を送達賦形剤として使用して、オリゴヌクレオチドのインビボ安定性を向上させ、そして／または特定の器官、組織、または細胞型にオリゴヌクレオチドを標的化することができる。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油滴型乳濁液、ミセル、混合ミセル、リポソーム、および特徴づけられていない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。好ましいコロイド分散系は、複数のリポソームである。リポソームは、二重層構造に配置された脂質から作製された１つまたは複数の外層に囲まれた水性コアを有する微視的球体である（一般に、Ｃｈｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９５，６，６９８−７０８を参照のこと）。
【０１６８】
アンチセンスポリヌクレオチドは、実質的に単離された形態で存在し得る。生成物を、生成物の意図する目的を妨害しないキャリアまたは希釈剤と混合することができ、この生成物は依然として実質的に単離されていると見なされると理解される。生成物はまた、実質的に精製された形態であり得るが、この場合、一般に、調製物のポリヌクレオチドまたは乾燥質量の９０％（例えば、少なくとも約９５％、９８％、または９９％）を含む。
【０１６９】
アンチセンスポリヌクレオチドを、局所的に（治療すべき部位に）投与することができる。好ましくは、アンチセンスポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて薬学的組成物を生成する。適切なキャリアおよび希釈剤には、等張生理学的食塩水（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）が含まれる。組成物を、非経口投与、筋肉内投与、脳内投与、静脈内投与、皮下投与、または経皮投与のために処方することができる。哺乳動物細胞による核酸取り込みを、いくつかの公知のトランスフェクション技術（例えば、トランスフェクション剤を使用する技術）によって増強する。投与される処方物は、このような薬剤を含み得る。これらの薬剤の例には、カチオン性薬剤（例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクタント（例えば、リポフェクタム（商標）およびトランスフェクタム（商標））が含まれる。
【０１７０】
１つの態様では、オリゴヌクレオチドは、部位特異的送達が必要であり得る。これらはまた、長期間にわたって送達する必要がある。明らかに、送達期間が、下方制御が誘導される部位および所望の治療効果の両方に依存する一方で、２４時間またはそれ以上の連続的送達がしばしば必要である。本発明の１つの態様では、特に、局部投与のための処方物形態で、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と共にアンチセンス化合物を処方物に含めることによってこれを行う。特に、本明細書中に記載のクリームおよびドロップなどの局所処方物を使用して、上皮基底細胞の分裂および成長（コネキシン４３を標的化するアンチセンス化合物を使用）ならびに外層角質化（コネキシン３１．１を標的化するアンチセンス化合物を使用）を調節することができる。
【０１７１】
局部投与用処方物には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれる。従来の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性の基剤、および増粘剤などは、必要であるか、望ましいかもしれない。コーティングされたコンドームおよびグローブなども有用であり得る。経口投与用組成物には、顆粒、水性溶媒または非水性溶媒の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味物質、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいかもしれない。非経口投与用組成物には、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物を含むことができる滅菌水溶液が含まれ得る。いくつかの場合、治療計画の有効性を増大させるための他の伝統的な治療法と組み合わせてオリゴヌクレオチドを使用して患者を治療するのにより有効であり得る。本明細書中で使用される、用語「治療計画」は、治療法、緩和療法、および予防法を含むことを意味する。
【０１７２】
治療組成物の処方およびその後の投与は、当業者の範囲内と考えられる。投与は、治療すべき病状の重症度および応答性に依存し、治癒するか病態が軽減するまで、治療を数日から数ヵ月間継続する。選択的投薬計画を、患者の体内の薬物蓄積量の測定値から計算することができる。当業者は、適切な投薬量、投与方法、および繰り返し率を容易に決定することができる。至適投薬量は、各オリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化し得るが、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルで有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて評価することができる。一般に、投薬量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、１日、１週間、１ヶ月、または１年に１回またはそれ以上、または２〜２０年毎に１回投与することができる。当業者は、測定した体液または組織中の薬物の滞留時間および濃度に基づいて投与繰り返し率を容易に評価することができる。首尾の良い治療後、病状の再発を予防するために、患者は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の維持量のオリゴヌクレオチドを１日１回またはそれ以上から２０年毎に１回投与する維持療法を受けることが望ましい。コネキシン調整が必要な容態の治療または予防において、適切な投薬量レベルは、一般に、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重／日であり、単回または複数回投与することができる。好ましくは、投薬量レベルは、約１〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１７３】
本発明のオリゴヌクレオチドを、診断、治療、予防、研究試薬として、およびキットで使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドがコネキシンをコードする核酸とハイブリッド形成するので、この事実を活用するために、サンドイッチアッセイ、熱量測定アッセイ、および他のアッセイを容易に構築することができる。オリゴヌクレオチドのコネキシン遺伝子またはｍＲＮＡとのハイブリッド形成の検出手段の準備を日常的に行うことができる。このような準備には、酵素の抱合、放射性標識、または任意の他の適切な検出システムが含まれ得る。コネキシンの有無の検出キットも準備することができる。
【０１７４】
本発明のオリゴヌクレオチドを、研究目的で使用することもできる。したがって、オリゴヌクレオチドによって示された特異的ハイブリッド形成を、アッセイ、精製、細胞生成物の調製、および当業者が認識することができる他の方法で使用することができる。
【０１７５】
本明細書中に記載の一定の実施形態で標的化することができる例示的コネキシンには、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
【化４】
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【０１７７】
【化５】
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【０１７８】
【化６】
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【０１７９】
【化７】
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【０１８０】
【化８】
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【０１８１】
【化９】
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【０１８２】
【化１０】
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【０１８３】
【化１１】
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【０１８４】
【化１２】
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【０１８５】
【化１３】
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【０１８６】
【化１４】
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【０１８７】
【化１５】
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【０１８９】
【化１７】
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【０１９０】
【化１８】
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本発明の種々の態様を、以下の実験の部を参照して記載し、これらの態様は、例示のみを目的として提供し、本発明の範囲を制限するものではないと理解される。
【０１９１】
以下の実施例を、例示を目的として記載し、これらは、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【０１９２】
（実施例１：インビボ分析）
（材料と方法）
（レーザー処置）
雌Ｗｉｓｔａｒラット（ｄ３２〜３４）を、実験動物の使用に関するＡＲＶＯ規則と一致した条件下で飼育した。動物を、Ｈｙｐｎｏｒｍ（商標）（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｊａｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）とＨｙｐｎｏｖｅｌ（登録商標）（５ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）との１：１混合物の０．８３ｍｌ／１００ｇ体重の用量での腹腔内投与によって麻酔した。
【０１９３】
Ｔｅｃｈｎｏｌａｓ  ２１７  Ｚエキシマレーザー（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，ＵＳＡ）を使用して、インタクトな上皮に対してエキシマレーザー処置を行った。眼を、瞳孔が中心になるようにし、以下のパラメータを使用して焼灼を行った：処置領域は直径２．５ｍｍ、深さ７０μｍであった。これにより、間質前部および全上皮を薄く除去した。エキシマレーザー処置を優先的に使用して再生可能な病変を作製し、角膜再造形および外傷後のエンジニアリングに対するコネキシン４３  ＡＳ  ＯＤＮの効果を調査した。
【０１９４】
術後、全動物を、各ケージに収容し、任意の不快症状について詳細にモニタリングした。細隙灯生体顕微鏡および／またはスリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用して、術後インビボ評価を行った。
【０１９５】
（スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡法）
角膜レーザー治処置前後に、各動物を、Ｃｏｎｆｏｓｃａｎ  ２（Ｆｏｒｔｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，ＵＳＡ）スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用して臨床的に観察した。Ｃｏｎｆｏｓｃａｎ  ２は、収集時間毎に画像を直接デジタル化するという明確な利点を有するスリットスキャニングテクノロジーの改良型である。動物を麻酔し、それぞれ収集ヘッドの前にインビボ強焦点顕微鏡の対物レンズの位置がくるように調整した特別にデザインしたプラットフォームに置いた。
【０１９６】
スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡により、角膜の全厚さにわたって異なるレベルで生きた角膜を光学的に切片にする。内皮から実験を開始し、前部−後部切片数は、カスタマイズされた設定に依存する。スリットスキャニングテクノロジーは、実験領域に対して垂直の軸に沿って前後して移動する対物レンズを使用する。簡潔に述べれば、ハードウェアは、ハロゲンランプ（１００Ｗ／１２Ｖ）、２つのスリット、２つのチューブレンズ、前部対物レンズ、および高感度デジタル（ＣＣＤ）カメラからなる。スキャニング前に、浸漬物質として１滴のＶｉｓｃｏｔｅａｒｓ（ＣＩＢＡＶｉｓｉｏｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ）を対物レンズの先端に滴下する。スキャニング中、動物の眼を大きく見開いたままにし、角膜面が常に接眼レンズ（４０倍、Ｎ．Ａ．０．７５）の光軸に対して垂直となるように配向させる。画像収集時間は、約１４秒である。ゲルによって常に対物レンズに眼が接触しないようにする。ラット角膜について、実験あたり２５０枚までの連続デジタル画像が得られ、ハードディスクドライブに直接保存した。予備実験で収集パラメータを調整し、その後の全実験で一定に保持した。パラメータは以下であった：光度をヒト患者で一般的に使用される光度の半分に減少し、４回の通過（１回の通過は、完全な往復移動と見なす）を使用し、４００μｍの作業距離を選択した。ラット角膜について、瞳孔の明確な視覚化によってセントレーションを容易にし、それにより非常に良好な局所的再現性が得られる。
【０１９７】
（インビボ共焦点画像）
スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用して収集した全画像を、ハードディスクドライブに保存し、その後、ＮＡＶＩＳプロプラエタリソフトウェア（Ｃｏｎｆｏｓｃａｎ  ２，Ｎｉｄｅｋ  Ｃｏ  Ｌｔｄ）によって分析した。
【０１９８】
立体学的原理に従って、間質の力学的性質を評価した。間質前部および間質後部の細胞数を記録した。光学的解剖器具（間隙を介して等しい確率粒子（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ
ｐａｒｔｉｃｌｅ）をサンプリングするプローブ）として機能するので、インビボ共焦点顕微鏡自体によって主な立体成分（ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を得た。実際、インビボ共焦点顕微鏡によって特定体積の光学的薄片が得られ、薄片はそれぞれ切片にされた組織サンプルである。結果として、間質細胞の計数は、１対のフレーム（インビボ共焦点顕微鏡によって記録された連続写真）の選択からなり、一方のフレームは、焦点の合った粒子（間質細胞）を有し、コフレームは、ピンぼけしているが、同一粒子の画像を認識可能である（光学的な影）。定義領域Ａ（μｍ２）中の最も明瞭なフレームから細胞数（ｎ）を記録する。２フレーム間の距離ｄ（μｍ）も記録する。したがって、単位体積（Ｖ）あたりの細胞数は、以下に相当する：Ｖ＝細胞数（ｎ）／ｄ（μｍ）×Ａ（μｍ２）。
【０１９９】
（エキソビボ共焦点画像）
適切な角膜切片を、異なる目的のための異なるマーカーで免疫組織化学的に染色した。核染色剤Ｈｏｅｃｈｓｔ３３  ２５８を使用して染色を使用して、角膜中心または周辺角膜の上皮細胞数および間質細胞数を評価した。この目的のために、ＡｎａｌｙＳＩＳ（登録商標）３．２ソフトウェア（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）を使用して、目的の領域を、最初に適切な角膜領域のＴＩＦＦファイル画像上にフリーハンドで描き、領域の値をソフトウェアによって自動的に得た。次いで、手動計数オプションを使用して、その領域内の細胞を計数し、単位領域あたりで示す。
【０２００】
（アンチセンス化合物の適用）
３０％プルロニック酸ゲル（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（分子グレードの水）を使用して、未修飾のα１コネキシン（コネキシン４３）特異的アンチセンスＯＤＮをレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー後の麻酔ラットの結膜下に送達させた。ＦＩＴＣタグを使用した予備試験では、処方物は２４時間まで眼の前房に残存することが示された（示さず）。
【０２０１】
これらの実験で使用したアンチセンス分子は、ＤＢＩ（ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ（配列番号６５））であった。共焦点レーザースキャニング顕微鏡法を使用して観察したところ、ＤＢＩ  ＯＤＮへのＦＩＴＣタグの添加は、プローブの細胞内透過を証明した。
【０２０２】
ＯＤＮを、最終濃度２μＭで適用した。
【０２０３】
（組織エンジニアリングまたは再造形効果のモニタリング）
アンチセンス適用後、レーザー手術から２時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１週間、および２週間後の角膜を、スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用して試験した。コントロールラットは、レーザー手術のみを受けた。
【０２０４】
表１は、各測定点で調査した角膜数をまとめている。
【０２０５】
（表１  スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用したインビボ追跡のために使用したコントロール（Ｃ）およびＡＳ（ＯＤＮ）処置角膜数）
ＯＤＮ＝ＡＳ  ＯＤＮ処置した眼（レーザー手術後１回投与）。
【０２０６】
【表１−１】
2014122248.tif 000021
【０２０７】
【表１−２】
2014122248.tif 000022
角膜の各細胞層を分析し、コントロール群とＯＤＮ処置群との間で細胞型、数、および外観を比較した。
【０２０８】
（再上皮形成）
抗コネキシン４３  ＯＤＮでの処置により、上皮回復が促進された。ＡＳ  ＯＤＮ処置角膜の９０％で、ＰＲＫレーザー手術から１２時間以内に擦過性上皮細胞が認められ、コントロールでは認められなかった（図１Ｂ）。この段階で、３０％のコントロール角膜で停止内皮細胞のみが認められた（図１Ａ）。２４時間までに、全コントロール細胞およびアンチセンス処置角膜で上皮細胞が認められたが、コントロールの６１％に対して処置群の７２％が活発な擦過性細胞が認められた。これは、再上皮形成は、コントロールよりもコネキシン４３特異的ＡＳ  ＯＤＮ処置角膜で迅速に進行することを示す。
【０２０９】
（間質細胞密度）
選択された測定点でのコントロールとＯＤＮ処置角膜との間の間質細胞数を比較するための時間とＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック統計的検定との関数としての各群内間質前部および間質後部の細胞密度を比較するための反復測定を使用した両側サンプルｔ検定を使用して、レーザー手術から２４時間後のみで統計的に有意な結果が得られた（表２）。この測定点で、コントロールおよびＯＤＮ処置群では、間質前部の間質細胞密度は、術前値と比較して非常に増加した（ｐ値＜０．０５）。コントロール角膜の間質後部では、間質細胞密度はまた、術前値と比較して増加したが（ｐ値＜０．０５）、ＯＤＮ処置角膜の間質後部では、間質細胞密度は術前値と統計的に有意に異ならない（ｐ値＞０．０５）。間質前部および間質後部の２群間の間質細胞密度を比較した場合、ＯＤＮ処置角膜は、常にコントロール角膜よりも間質細胞密度が低かった（ｐ値＜０．０５）。これは、コントロール角膜と比較してＯＤＮ処置角膜がより少数の細胞が間質再造形またはエンジニアリングに関与するという概念を支持する。これは、抗コネキシン４３  ＯＤＮの適用によって手術部位の細胞過形成が減少することを示す最初の報告である。エキソビボ組織化学分析（実施例ＩＩ）は、この細胞過形成が望ましくない間質マトリクス（ｓｔｒｏｍａｌ  ｍａｔｒｉｘ）再造形および瘢痕を誘導する筋肉線維芽細胞に関連することを示す。
【０２１０】
（表２．レーザーフォトリフラクティブケラテクトミー前およびその２４時間後のコントロールおよびＡＳ  ＯＤＮ処置角膜中の間質細胞数。細胞密度を、標準偏差の平均として示す）
【０２１１】
【表２】
2014122248.tif 000023
（実施例ＩＩ−エキソビボ分析）
（材料と方法）
（組織学：組織の採取および固定）
適正な数の動物（Ｗｉｓｔｒａｒラット）を、レーザーフォトリフラクティブケラテクトミー後の選択された測定点で屠殺し、上記の実施例１に記載のようにＤＢ１抗コネキシンＯＤＮを麻酔ラットに投与し、組織学的分析のために角膜切片を調製した。コントロールラットには、レーザー手術のみを受けさせた。眼全体およびコントロール組織を、Ｏｘｏｉｄ  ＰＢＳでリンスし、その後にＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，ＵＳＡ）に包埋し、液体窒素中で凍結させた。必要に応じて（いくつかの抗体の使用のために）、凍結組織を、冷アセトン（−２０℃）中で５分間固定し、クリオカットで切断した。
【０２１２】
（組織の切断）
低温切片作製手順は以下のように行った：非固定組織の凍結塊を−８０℃での貯蔵庫から取り出し、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓクルオスタットに約２０分間入れて、クリオスタットと同一の温度（すなわち、−２０℃）に平衡化した。組織の平衡化が達成された時点で、標本をＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴを備えた標本皿に置いた。厚さが１２μｍの切片（Ｈ／Ｅ染色のため）または２５μｍ（免疫標識のため）の切片に切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ｓｌｉｄｅｓ（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌｅｓｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に置いた。低温切断直後に、組織塊を−８０℃の貯蔵庫に戻し、低温切片を支持するスライドを直後に使用するか、−８０℃で保存した。眼の光軸と平衡に切片にした。
【０２１３】
（ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ／Ｅ）染色および核染色）
一連の異なる染色試薬への浸漬を容易にするために、スライドをガラスラックに入れた。表面張力を下げるための試薬にラックを入れて震盪し、各溶液を交換する毎に排出させた。Ｇｉｌｌ’ｓＩＩヘマトキシリン／エオシン染色前に、−８０℃で保存していたスライドを、最初に１〜２分間室温まで加温し、冷アセトン中で固定し、そして／または直後に水道水に短期間浸して水和した。スライドをＧｉｌｌ’ｓＩＩヘマトキシリン中で２分間染色し、その後、過剰な染色を水道水でリンスオフした。Ｓｃｏｔｔの水道水代替物（ＳＴＷＳ）への４秒間の浸漬によって識別染色（ｓｔａｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を行った。次いで、流水で１分間リンスし、３０分間の継続的な浸漬により１％エオシンで染色した。最後に、切片を水道水で即座にリンスし、９５％、１００％ＥｔＯＨで脱水し、キシレンで洗浄し、ＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ）を使用してマウントした。核の対比染色（Ｈ／Ｅまたは免疫組織化学分析と並行）のために、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３
２５８（Ｓｉｇｍａ）を使用した。Ｈ／Ｅ染色切片に対して角膜の厚さを測定した。
【０２１４】
（免疫組織化学）
切片を、部位特異的モノクローナル抗体を使用してコネキシン４３について免疫標識し、α平滑筋アクチンを認識する抗体を使用して筋線維芽細胞について免疫標識し、抗ラミニン−１抗体を使用して基底膜蓄積について免疫標識した。さらに、抗ビメンチン抗体を使用して、角膜間質細胞と筋線維芽細胞とを識別し、Ｋｉ−６７抗体を使用して細胞増殖を示した。
【０２１５】
（エキソビボ組織学分析）
結果は、エキシマレーザー光焼灼によって作製された病変が術後２４時間までに閉じることを示した（図２）。角膜の周囲および中心への単核／多核および／または円形、卵形細胞による間質への典型的な侵入が両群で認められ、術後２４時間で最も顕著であるが、アンチセンスＯＤＮ処置群は、コントロール群と比較してこれらの細胞数が有意に少なかった（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）。これは、実施例１で認められたインビボ共焦点顕微鏡写真由来の所見に匹敵する。上皮の厚さは、レーザー誘導性病変部位の図２で認められるコントロール角膜（図Ａ、Ｂ）、焼灼領域下の瘻孔（図Ａ、Ｂ）、および周囲間質（図Ｃ）で様々であり、コントロール角膜中の円形細胞による広範な侵入（細胞過形成）が認められた。図Ｂおよび図Ｃで顕著な間質水腫も認められた。アンチセンスＯＤＮ処置角膜では、上皮は均一な厚さであり（図Ｄ、Ｅ）、中央領域（図Ｄ）および周囲間質（図Ｅ）では、間質水腫の徴候はほとんどなかった。さらに、間質では、円形細胞はほとんど存在しなかった。図２のスケールバーは、２０ミクロンを示す。
【０２１６】
レーザー処置後のコネキシン４３ＯＤＮでの処置後の間質の厚さの変化を、表３に示し、これは、コントロールとＯＤＮ処置角膜との間の間質の厚さの変化を比較している。間質の厚さを、適切な組織染色切片から測定した。両側サンプルｔ検定を使用してＯＤＮ処置群について得たデータの統計的分析により、調査した３つ全ての測定点で（術後２４時間、４８時間、および７２時間）、中央の間質の厚さが術後の値よりも統計的に有意に薄く（ｐ値＜０．０５）、周囲間質の厚さは術前値と有意に異ならないことが示された。対照的に、コントロール角膜は、中央角膜および周囲角膜の両方において有意な間質腫脹（浮腫）を示す（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）（術前値と比較して間質の厚さが２倍）。
【０２１７】
（表３．コントロールおよびＡＳ処置角膜におけるエキシマレーザー手術後の間質の厚さの変化）
手術に供していない角膜の中央間質の厚さは２５０μｍであるが、エキシマレーザー手術を使用して、７０μｍの角膜組織（上皮および間質の一部を含む）を除去した。正常な角膜上皮の厚さは５０μｍ（平均）であるので、２０μｍの間質組織をレーザー手術によって除去した。したがって、創傷から２４時間後、４８時間後、および７２時間後の中央間質の厚さと術前の中央間質の厚さとを統計的に比較するために、除去した厚さと術前の中央間質の厚さとを調整して使用した（２５０−２０＝２３０μｍ）。
【０２１８】
【表３】
2014122248.tif 000024
（コネキシン４３発現の減少は、間質侵入の減少および上皮過形成の減少と関連する）
顕微鏡による観察により、コントロール角膜と比較してＯＤＮ処置角膜中に存在するコネキシン４３レベルの減少が認められた。図３は、顕微鏡画像の組み合わせを示す。上の列はコントロール角膜を示し、下の列はアンチセンスＯＤＮ処置角膜を示す。円形細胞による典型的な間質の侵入が、縁部、周囲、および中央領域で２４時間以内に両群で認められた。しかし、ＯＤＮ処置角膜における円形細胞の密度はより低かった。両群の縁部で、抗コネキシン４３は間質に均一に分布したが（３Ａ、Ｄ）、処置群は、コントロール（３Ｂ）と比較して周囲（３Ｅ）のレベルが低かった。この段階では、コネキシン４３レベルは、両群の上皮で正常に戻ったが、コントロール群では、瘢痕様間質（３Ｃ）または過形成（以下の図４を参照のこと）が認められたのに対し、アンチセンス処置角膜では、正常レベルのコネキシン４３を有する正常な上皮が認められた（３Ｆ）。スケールバーＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆは、１０ミクロンを示し、ＢおよびＣは２０ミクロンを示す。これらの図では、コネキシン４３は、白色の点状標識として認められ、細胞核が灰色で出現する。図３に示した結果により、コネキシン４３タンパク質レベルが抗コネキシン４３ＯＤＮでの処置後に減少し、それにより、間質中の細胞動員度がより小さくなることが示唆される。さらに、コントロール角膜の３１％（術後２４時間で２５％、術後４８時間で６７％、術後７２時間で０％）と比較して、たった７％（術後２４時間で０％、術後４８時間で０％、術後７２時間で２０％）のＯＤＮ処置角膜しか上皮過形成の徴候を示さない。これを、Ｈ／Ｅ染色切片およびＫｉ−６７標識切片に対して評価した。
【０２１９】
（筋線維芽細胞標識）
ビメンチン抗体での標識は、ＡＳ  ＯＤＮ処置角膜と比較したコントロール角膜の間質中の細胞数の増加が未分化の角膜間質細胞起源ではないことを示したので、α平角筋アクチン抗体を使用して標識を行った。この標識は、コントロール角膜が手術部位下により多数の筋線維芽細胞を有するが、周辺の周囲間質にも有することを示した。この筋線維芽細胞数および罹患領域の増加は、術後２４時間で顕著になり、４８時間および７２時間から少なくとも１週間にわたって持続した（表４）。図４は、レーザー手術から１週間後の筋線維芽細胞標識（抗α平滑筋アクチン）を示す。図４Ａ、Ｂ、およびＣはコントロールであり、図４Ｄ、Ｅ、およびＦはアンチセンス処置角膜である。創傷後１週間までに、コントロール角膜では、少数から中程度の数の筋線維芽細胞が周囲間質の前半部に存在し（４Ａ）、中程度から密集レベルで中間周囲間質領域に存在し（４Ｂ）、中程度のレベルで中央領域の間質の後半部に認められる（４Ｃ）。対照的に、処置角膜では、非常に少数の筋線維芽細胞が周囲間質（４Ｄ）または中間周囲間質（４Ｅ）に存在し、中程度から少数が中央間質に存在する（４Ｆ）。中央間質のいくつかの場合、筋線維芽細胞は、上皮の真下の領域に密集している（示さず）。したがって、上記実施例１（細胞過形成）および図２で認められた細胞数の増加は、筋線維芽細胞の分化および侵入に起因するようである。筋線維芽細胞は、瘻孔中の瘢痕組織蓄積、それに伴う結晶蓄積の減少および創傷コラーゲンＩＩＩ分泌の減少を担うことが公知である（Ａｈｍａｄｉ  Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｉｅｃ  Ｆ．Ａ．；２００２；Ｉｎｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｃｌｉｎ．Ｓｕｍｍｅｒ；４２（３）：１３−  ２２．）。
【０２２０】
（表４：コントロールおよびアンチセンスＯＤＮ処置角膜における筋線維芽細胞のα平滑筋アクチン標識のまとめ）
【０２２１】
【表４−１】
2014122248.tif 000025
【０２２２】
【表４−２】
2014122248.tif 000026
筋線維芽細胞数を、密集（Ｄ）、中程度（Ｍ）、少数（Ｌ）、またはなしとして定量する。比率は、特定レベルで罹患した動物の比率をいう。ｓｔ＝間質、ｅｐｉ＝上皮。コントロールとアンチセンス処置角膜との間の有意差を、太字で強調している。
【０２２３】
（基底膜蓄積）
レーザーフォトリフラクティブケラテクトミー後、再生上皮と共に基底膜が再形成される。ラミニン−１に対する抗体での標識は、再形成された基底膜が不連続であり、上皮−間質が不規則に結合していることを示す（図５）。２４時間後、コントロールは焼灼領域の縁部（図５Ａ）およびより中央の領域（図５Ｂ）にラミニン蓄積はほとんどなく、そして／または不規則であるのに対して、アンチセンス処置角膜は、これらの両領域でより規則的なラミニン蓄積を示した（図５Ｃ、図５Ｄ）。４８時間後、コントロールは連続的にラミニンを蓄積せず（図５Ｅ−焼灼領域の縁部；図５Ｆ−中央）、非常に不規則であった（図５Ｅ）。対照的に、アンチセンスＯＤＮ処置角膜は、創傷縁部（図５Ｇ）および中央（図５Ｈ）で連続的且つ比較的平らな基底膜を有していた。図５中の全スケールバーは、２０ミクロンを示す。コネキシン４３アンチセンス処置角膜は、２４時間以内にあまり不規則でないより密集したより連続的な基底膜を形成した。
【０２２４】
図６に示すように、ラミニンの不規則性を定量した。図６中の黒色の実線は、ラミニン−１の蓄積を示す。各領域について、分散を、山と谷の間の差として測定した（図６Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。アンチセンスＯＤＮ処置角膜の平均分散の４．７４ミクロンと比較して、コントロール角膜の平均分散は、６．９８ミクロンであった。２群間の相違は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。
【０２２５】
（実施例ＩＩＩ−エキソビボ組織エンジニアリング）
角膜を、エキソビボ臓器培養モデルおよびアンチセンスＯＤＮを使用して調整した特異的コネキシンに置いた。２つのコネキシン（コネキシン４３およびコネキシン３１．１）がこれらの実験で標的化された。コネキシン４３の下方制御を使用して、コネキシンをインビトロで制御することができることを証明し、コネキシン３１．１は、角膜から剥がれ落ちようとしている細胞中の角膜の上皮外層中に発現するので、コネキシン３１．１が標的化された。コネキシン３１．１発現の減少によって上皮組織の肥厚を操作することを目的とした。
【０２２６】
（材料と方法）
３０〜３４日齢のＷｉｓｔｒａｒラットを、Ｎｅｍｂｕｔａｌまたは二酸化炭素で安楽死させ、ラットの全眼を切り出した。眼表面を切り出し、０．１ｍｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンで５分間殺菌し、滅菌ＰＢＳでリンスした。次いで、全眼を、角膜を上にして６０ｍｍの培養皿中の滅菌ホルダー上に移した。眼を、空気−培地界面に角膜上皮を曝露させてマウントし、無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ，インビトロｇｅｎ）中にて３４℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養した。上皮を湿らせるために、１００μｌの培地を８時間〜１２時間毎に表面に滴下した。培地レベルを、結膜縁部レベルに維持した。
【０２２７】
アンチセンスオリゴマーを、最終濃度が２μＭになるまで氷上で３０％（ｗ／ｗ）のプルロニックＦ１２７ゲル（Ｓｉｇｍａ）と混合し、１０μｌを角膜に適用した。３〜４つの角膜が実験あたりの各処置のサンプルサイズであった。予備試験は、本発明者らのポジティブコントロール（ＤＢ１）の８時間の二重処置が本発明者らの角膜培養においてコネキシン４３タンパク質発現に対する効果がほとんどないことを示した。したがって、角膜を２４時間培養し、コネキシン特異的オリゴマーを８時間毎に適用した。
【０２２８】
コネキシン４３、２６（コントロール）、および３１．１に対する抗体を使用して、実験２に記載のように免疫組織化学的標識を行った。上記のように、組織をＨ／Ｅでも染色した。核を、０．２μＭヨウ化プロピジウムで対比染色した。コネキシンレベルを定量するために実験群内に維持された電圧およびオフセット設定を備えたＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ４ＤまたはＴＣＳ  ＳＰ２共焦点レーザースキャニング顕微鏡で画像を収集した。定量のために、３ミクロンにわたる４つの光学スライスを、ＴＣＳ  ４Ｄ上の質量重心解剖学的投影オプション（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｏｎ）を使用して、単一の焦点を拡大した光学画像に処理した。コネキシンレベルを、２５６階調のグレースケール画像に対する９０〜１００ピクセル強度での閾値化後に、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）を使用して定量した。
【０２２９】
手術を受けていない角膜では、インビトロコネキシン代謝回転率は、上記の実施例１および２に記載のエキシマレーザー焼灼角膜中の組織再造形過程と比較して、比較的低かった。それにもかかわらず、アンチセンスＯＤＮでの３回の処置後、コネキシンレベルは、コントロールと比較して５０％以上減少した（図７Ａ、Ｂは、コントロールと比較したＡＳ  ＯＤＮ処置角膜でのコネキシン４３の減少を示す）。コネキシン４３特異的アンチセンスＯＤＮを適用した場合、コネキシン２６レベルは一定のままであった（コネキシンレベルの減少は特異的であり、処置の副作用は認められないことを示す）。これらの画像では、コネキシン４３は上皮の２つの基底層により大きな点として出現し、コネキシン２６は層２〜６中の支配的により細かい点状標識として出現する。コネキシン３１．１アンチセンスＯＤＮはコネキシン３１．１レベルを減少させたが、予備段階の結果は、２４時間以内に上皮の厚さ（層の数）が増加することも示した（図７Ｃ、Ｄ）。この厚さの増加は、Ｈ／Ｅ染色を使用した免疫組織化学的に（図７Ｃ）標識した切片で認められた。
【０２３０】
本研究に記載の結果は、組織エンジニアリング（特に、角膜のエキシマレーザー手術後が含まれる）または組織エンジニアリングおよび移植のためのインビトロ臓器培養におけるコネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの使用の基礎をなす。本明細書中に提供した実験結果は、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー後のコネキシン４３特異的アンチセンスＯＤＮでの１回の処置が多数の使用上の利点を有する（そのうちのいくつかを、以下に記載する）ことを証明する。
【０２３１】
コネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの投与により、上皮細胞移動が促進される。術後１２時間で、９０％のアンチセンス処置角膜でレーザー誘導性病変部位に擦過性上皮細胞の存在が認められたが、コントロールでは認められない。上皮細胞は、３０％のコントロール角膜に存在したが、静止／非擦過性であった。したがって、コネキシンによる直接細胞−細胞伝達の制御を使用して、上皮細胞の模様づけ（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）の変化を操作することができる。
【０２３２】
コネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの投与により、術後２４時間〜４８時間でレーザー誘導性病変部位での筋線維芽細胞分化に関連する細胞過形成の制御が促進される。この期間中、アンチセンスＯＤＮ処置角膜（３９％）より多くのコントロール角膜（６３％）が、全間質中で強い細胞過形成を示す。したがって、直接細胞−細胞伝達の制御を使用して、細胞分化を調整して細胞外基質を調整することができる。
【０２３３】
コネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの投与により、術後２４時間〜７２時間で間質の再造形を調節し、それによりレーザー誘導性病変部位のかすみが軽減される。この期間で、アンチセンス処置角膜（３９％）より多くのコントロール角膜（６４％）が、全間質中で強いかすみを示す。
【０２３４】
コネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの投与により、再造形の初期段階での間質水腫が阻害される。したがって、直接細胞−細胞伝達の制御により、レーザー手術由来の結果が改善される。
【０２３５】
コネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの投与により、再造形の初期段階での細胞増殖が減少する。したがって、直接細胞−細胞伝達の制御を使用して、組織再造形中の細胞増殖を制御することができる。
【０２３６】
コネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの投与により、上皮過形成が７８％まで減少し、均一の上皮を操作することができる（術後２４〜７２時間に評価）。
【０２３７】
コネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの投与により、術後１週間まで筋線維芽細胞の活性化が減少する（より早い段階で角膜間質細胞が喪失する）。直接細胞−細胞伝達の制御により、外科的再造形中の組織損傷をより正確に調節することができ、結果の予測が改善され、視覚的欠点がより少なくなる。
【０２３８】
コネキシン特異的アンチセンスＯＤＮの投与により、組織再造形中の上皮−間質接着基質がより規則正しく且つ密になる。したがって、直接細胞−細胞伝達の制御を使用して、組織基底膜を操作することができる。
【０２３９】
さらに、本明細書中で使用されるエキソビボ角膜培養モデルは、直接細胞−細胞伝達の制御を使用して、インビトロで組織を操作するのに使用することができる（例えば、コネキシン３１．１アンチセンスＯＤＮを使用した上皮の厚さの増加）ことを示す。この処置はまた、インビボでの、例えば、円錐角膜（上皮の肥厚）などの角膜疾患の緩和のための肥厚角膜の操作を意図する。
【０２４０】
結果は、細胞−細胞伝達を妨害する活性分子を組織エンジニアリングおよび再造形に使用することができることを示す。詳細には、コネキシンタンパク質を標的化するアンチセンスデオキシヌクレオチドを特に矯正レーザー手術後の角膜再造形ならびにインビボおよびインビトロの組織エンジニアリングで使用することができることが示される。
【０２４１】
したがって、本明細書中に記載のアンチセンス化合物および方法は、手術介入の結果の改善ならびに眼の疾患過程の改善および組織エンジニアリングに有意な潜在性を有する。
【０２４２】
（実施例ＩＶ：エキソビボ培養モデル）
成体動物モデルにおける脳または脊髄損傷後のギャップ結合タンパク質コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用により、病変の拡大が遮断され、炎症反応およびその後の瘢痕形成が軽減される。本発明者らは、本発明者らのアンチセンスアプローチを、確立された病変のための修復ストラテジーを精査するための脊髄セグメントおよびインタクトな脊髄についてのエキソビボ培養モデルのためになおさらに開発した。
【０２４３】
脊髄を、Ｐ７〜Ｐ１４仔ラットから切り出し、尾部セグメント、胸郭セグメント、および吻側セグメントに分ける。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含むプルロニックゲルを、培地に入れる間に脊髄セグメントの切断末端に適用し、これにより、コネキシン４３タンパク質レベルが２４〜４８時間減少し、組織の生存可能性が有意に改善される。最優先される注目すべき所見は、腫脹が起こらないことである（培養への配置から２４時間後の脊髄セグメントを示す図８Ａ〜Ｂ）。この処置により、脊髄の切断末端からの拡大が遮断される。処置サンプルの灰白質中のニューロン生存の増加は、トルイジンブルー染色樹脂切片で非常に明らかである（図９Ａ）。際立って対照的に、図９Ｂでは、ニューロンの浮腫および空胞化はコントロール組織全体に認められる（未処置、ゲルのみ、無作為なオリゴデオキシヌクレオチドを含むゲル）。
【０２４４】
その後の２０日目までの標識および免疫組織化学研究は、処置脊髄セグメント中のニューロン（Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識）がこの期間生存するのに対して、コントロールセグメントではたった３日後にほとんど生存していないことを示す。イソレクチン−Ｂ４標識は、培養５日目以内にコントロールセグメントの強く活性化された（マクロファージ表現型）小グリア侵入を示す。処置サンプルでは、活性化小グリア細胞は、外縁（白質軸索神経路が予め且つ切断末端に制限される）に制限される。顕著には、ＭＡＰ−２標識（ニューロン過程のマーカー）は、ＭＡＰ−２標識を全く示さないコントロールセグメントと比較して、処置脊髄セグメントで再生の有意な潜在性を示す（図１０Ａ〜Ｂ）。
【０２４５】
（実施例Ｖ：脊髄病変にわたる末梢神経の移植）
末梢神経移植のために、本発明者らは、移植時にコネキシン４３特異的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで組織を再処置し、それにより、移植部位からの病変の拡大および宿主組織の神経集団が単離されてニューロン修復が制限される小グリアの活性化を予防する。
【０２４６】
（末梢神経移植）
脊髄セグメントを、３５ｍｍ皿中の培養インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）に入れ、セグメント上にメニスカス（ｍｉｎｉｓｃｕｓ）が形成されるまで培養培地レベルを増加させた。コネキシン４３特異的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（３０量体、濃度１μＭ）を含む３０％プルロニックゲルを、直ちに脊髄組織上に注ぐ。生理学的温度に加温されるとゲルは固化し、アンチセンスオリゴヌクレオチドが徐放される。この処置により、２４時間と４８時間との間のコネキシン４３タンパク質レベルが減少し、処置から６〜８時間後に最も減少する。培養で安定化し、その後切創に再曝露したこのような脊髄セグメントは、インビボでの手術介入と同一の症状（切断領域への病変拡大および組織腫脹が含まれる）を示す。この効果を、切開時のコネキシン４３特異的アンチセンスオリゴマーでの処置によって防止することができ、したがって、切断末端は鋭いままであり、浮腫または組織腫脹の明らかな徴候は認められない。
【０２４７】
セグメントの末端同士を向き合わせるが、１〜５ｍｍの間隙をあける。１〜３日間の培養物の安定化後、Ｐ７〜Ｐ１４仔ラット由来の座骨神経の移植片を、ギャップと交わるように置く。以前の研究では、両座骨神経（またはその伏在枝）（Ｙｉｃｋ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ
ａｌ．，１９９９，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１５９：１３１−１３８；Ａｇｕａｙｏ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ：Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．９５：２３１−２４０）または肋間神経（Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：５１０−５１３）移植が軸索延長およびニューロンの生存を誘導する高い可能性を有することが示されている。
【０２４８】
移植直後に、コネキシン４３特異的アンチセンスオリゴマーから再処置を開始し、その後数日間にわたりニューロン挙動評価を行った。インビボ研究（術後１５日から７ヶ月）と比較して移植後の培養期間が比較的短いので（１５日まで）、以下に詳述の修復応答（結果の判定）を評価するための種々のマーカーを使用する。ニューロンの増殖および／または移動の誘導で役割を果たし得る外因性成長因子（ＦＧＦまたはＮＧＦ）を添加するか添加しないで実験を行う。
【０２４９】
（実施例ＶＩ：末端同士を向き合わせたセグメントの間のシュワン細胞シード移植物の挿入）
処置セグメントの間の移植物のために、軸索再生の強力なプロモーターであることが示されているので、シュワン細胞を選択した（Ｘｕ，Ｘ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：１７２３−１７４０；Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５９：２２５−２３６）。
【０２５０】
移植された細胞は、中枢神経系軸索再生のための許容性環境を提供することができ、軸索再生の誘導に有効であることが証明されている。末端同士を向き合わせた脊髄セグメントの間に配置したシュワン細胞シードミニチャネル移植物またはマトリゲルを、この適用のために使用すべきである。ここでの原則は、脊髄修復介入では、最終的に瘢痕組織を切除してその空間に移植物質を充填することを望むであろうということである。使用した方法は、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：２４３３−２４４２；Ｘｕ，Ｘ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５１：１４５−１６０）に記載されている。本質的に、座骨神経を成体ラットから採取し、次いで、神経上膜および結合組織を除去し、長さ１ｍｍの外植片を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）を含む培地に入れる。遊走細胞の生成物は、主に、線維芽細胞であり、外植片がコンフルエントに到達した場合、外植片を新規の皿に移す。出現した細胞が主にシュワン細胞であるようになるまで、これを３〜５世代にわたり繰り返す。これらを分離し、コポリマーまたはマトリゲルガイダンスチャネルへの播種のために成長させる（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂａｉｅｒ  Ｌｅａｃｈ，Ｊ．，２００３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．５：２９３−３４７）。一旦移植物物質が調製されると、培養セグメントを、瘢痕切除を模倣するためにその末端を再切断し、末端同士を向き合わせ、移植物物質をその間に押し込む。移植直後に、サンプルを、コネキシン４３アンチセンスオリゴマーで再処置し、ニューロン挙動をその後数日間にわたりモニタリングする。
【０２５１】
（測定結果）
移植片組織に対する即時型応答、遅延型応答、または連続的応答が存在することを確立するために末梢移植片および移植物の両方についての経時変化実験を行う。いくつかのマーカーを使用して、ニューロン応答および修復潜在性を評価する。これらには、以下が含まれる：ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎに対する抗体）、神経細繊維（ＭＡＰ−２およびＳＭＩ−３１に対する抗体）、および細胞質マーカー（ＣＭＦＤＡ）、および膜色素（Ｄｉ−ＩまたはＡｘｏｎ  ｇｒｅａｓｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）。ニューロン新芽形成の増加、軸索移動距離の増加（距離移動比に対する橋長）、および移植片に向かうか通過する軸索成長数の増加を特にモニタリングする。細胞特異的マーカー（樹状細胞についてはＧＦＡＰ、小グリア細胞についてはＩｓｏｌｅｃｔｉｎ−Ｂ４、およびシュワン細胞についてはＳ−１００）。グリア細胞の分布および密度、ならびに髄鞘形成レベルを評価する。脊髄セグメントから再生した軸索とは対照的に、抗ＣＧＲＰ（末梢神経マーカー）を使用して、末梢神経起源の軸索を識別する。ＧＡＰ−４３（成長関連タンパク質）抗体を使用して、ニューロン成長錐体を同定する。トルイジンブルー染色半薄切片および移植片断面の電子顕微鏡法を、形態学的分析のために使用する。
【０２５２】
二次抗体を、Ａｌｅｘａ色素と抱合する。二重または三重標識のために、本発明者らは、必要に応じて、Ｚｅｎｏｎプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用する。全抗体および色素標識を、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄ’ｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｕｎｉｔ  Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ４ＤおよびＳＰ２共焦点レーザースキャニング顕微鏡を使用して分析する。ＨＩｔａｃｈｉ  Ｈ−７０００電子顕微鏡にて電子顕微鏡法を行う。画像分析プログラム（ＡｎａｌｙＳＩＳまたはＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を使用して、コントロールと処置移植片との間の装置を定量する。
【０２５３】
（実施例７−アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドデザイン）
（材料）
本明細書中で使用した材料には、当該分野で認識されている抗体およびプラスミド（例えば、ラットコネキシン４３（Ｔ７２９１）およびコネキシン２６のプラスミド；マウスコネキシン４３およびコネキシン２６（インビボｇｅｎ，ＵＳＡ）、マウス抗ラットコネキシン４３およびウサギ抗ラットコネキシン２６（Ｚｙｍｅｄ）（５１−２８００）のプラスミド；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  ５６８二次抗体など）が含まれる。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素（Ｓｉｇｍａ）を使用して核を染色した。全てのデオキシリボザイムおよびオリゴデオキシヌクレオチドを、脱塩オリゴマーとしてＳｉｇｍａ
Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから購入した。ＴａｑＭａｎ標識オリゴマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡから購入した。全てのオリゴデオキシヌクレオチドを、未修飾ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドとして購入した。
【０２５４】
（デオキシリボザイムのデザイン）
デオキシリボザイムのデザインおよび教示は、以前の研究で記載されているものに類似していた（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９７），９４，４２６２−４２６６  ａｎｄ  Ｃａｉｒｎｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７，４８０−４８６）。簡潔に述べれば、標的コネキシンのｍＲＮＡ配列中の全てのＡＵおよびＧＵ部位を、ＡまたはＧの各端上の８または９ヌクレオチドを使用して選択した。デオキシリボザイムは、「Ａ」または「Ｇ」が「１０〜２３」触媒コア「ｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａ」に置換されたセンスコード配列の相補物である。コントロールデオキシリボザイムは、１つの点変異（ｇ→Ａ）を有する欠損触媒コア「ｇｇｃｔａＡｃｔａｃａａｃｇａ」を有していた（Ｓ．Ｗ．ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７，１３３３０−１３３４２）。本発明者らはまた、以下の３つの要件を満たさないＡＵおよびＧＵデオキシリボザイムによって残存するギャップを対象とするためのＧＣおよびＡＣ特異的デオキシリボザイムをデザインした。各デオキシリボザイムを、ＡＴＧ開始コドンからの「Ａ」または「Ｇ」の位置にしたがって命名した。インビトロアッセイのために選択したデオキシリボザイムは、以下の３つの要件を満たさなければならなかった。
【０２５５】
（１）温度安定性：選択されたデオキシリボザイムは安定な二次構造（ヘアピンループまたはホモ二量体）を形成すべきではない。生理学的温度での標的配列に結合することができないと仮定すると、３７℃を超えるヘアピンまたはホモ二量体の融点を有する任意のデオキシリボザイムを破棄した。
【０２５６】
（２）親和性：両結合アームの総ΔＧ値は、−３０Ｋｃａｌよりも高くあるべきではない。それぞれの各結合アームは、−１０ｋｃａｌと−１５ｋｃａｌとの間である。これは、結合特異性／誤プライミング（高ＣＧ含量による）とデオキシリボザイムについての有効な結合／代謝回転率要件との間で妥協される。いずれかの切断部位の結合アームの長さを、理想のΔＧ値が見出されるように調整し、チェックのために工程（１）を繰り返す。
【０２５７】
（３）特異性：全標的結合配列は、特異性をチェックするためにＧｅｎｅ  Ｂａｎｋを使用して検索するＢＬＡＳＴｎであった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。他のコネキシン遺伝子または他の公知のげっ歯類遺伝子と相同するデオキシリボザイムを破棄した。
【０２５８】
（デオキシリボザイムのインビトロ試験）
マウスコネキシン４３およびコネキシン２６のｃＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩを使用してｐＯＲＦベクター（インビボｇｅｎ）から切り出し、インビトロ転写の前にｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン化した。全長２．４ｋｂラットコネキシン４３ｃＤＮＡおよび２００ヌクレオチドの５’非翻訳領域を含む全長コード１．４ｋｂラットコネキシン４３ｃＤＮＡを、インビトロ転写のために使用した。全長ｍＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅキットを使用して、線状化プラスミドＤＮＡから転写した。得られたｍＲＮＡを、ＰＣＲスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。濃度を、２６０ｎｍのＯＤの分光光度計読み取りによって決定した。次いで、デオキシリボザイム（最終濃度４０μＭ）およびｍＲＮＡ（０．０１〜０．０５μｇ／μｌ総ｍＲＮＡ）を、２×切断緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ７．５；２０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２；３００  ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０２％  ＳＤＳ）を使用して３７℃５〜１０分間個別に予め平衡化した。次いで、ｍＲＮＡおよびデオキシリボザイムとの混合物を、３７℃で１時間インキュベートし、その後、１０×Ｂｌｕｅｊｕｉｃｅ（インビトロｇｅｎ）を添加して切断反応を停止させ、混合物を氷上に保持した。次いで、反応混合物を、１×ＴＢＥ緩衝液および７Ｍ尿素を含む予備泳動４％ポリアクリルアミドゲル（１９：１アクリル：ビス比、ＢｉｏＲａｄ）にロードし、２時間まで泳動した。ゲルを、１００００倍希釈のＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（Ｍｏｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を含むＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒで染色し、ＢｉｏＲａｄ  Ｃｈｅｍｉ  Ｄｏｃ  ｓｙｓｔｅｍを使用して画像化した。
【０２５９】
（アンチセンスオリゴマーのデザイン）
インビトロで首尾よくｍＲＮＡを切断するデオキシリボザイム結合アームの２０ヌクレオチド配列に基づいて、アンチセンス配列を選択した。選択した配列を、３０量体のオリゴのデザインで使用するために選択した（Ｂｒｙｓｃｈ，Ｗ．（１９９９）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｖｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ  ２１−  ４１）および（Ｗａｌｔｏｎ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８２，３６６−３７７）。簡単に述べれば、無関係の遺伝子（ＧＧＧＧおよびＣｐＧモチーフ）との８〜１０ＣＧ対合の部分的配列相補性などの配列に関連する悪影響を回避した。できれば誤プライミングを防止するために、最後の５ヌクレオチド中にチミジンまたは３つを超えるＣまたはＧを有する３’末端を有するアンチセンスも回避する。ホモ二量体、回文モチーフ、または二次ヘアピン構造などの安定な二次構造を形成するオリゴマーは、標的ｍＲＮＡに結合するオリゴマーを妨害する。交差ハイブリッド形成、非特異的タンパク質結合、および毒性に起因する化学的に関連する悪影響の可能性を評価するために、コントロールオリゴマー（センス、スクランブル、逆、およびミスマッチオリゴマーが含まれる）もデザインした。
【０２６０】
（角膜臓器培養およびアンチセンスオリゴマーでの処置）
３０〜３４日齢のＷｉｓｔｒａｒラットを、二酸化炭素で安楽死させ、ラットの全眼を切り出した。眼表面を切り出し、０．１ｍｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンで５分間殺菌し、滅菌ＰＢＳでリンスした。次いで、全眼を、角膜を上にして６０ｍｍの培養皿中の滅菌ホルダー上に移した。眼を、空気−培地界面に角膜上皮を曝露させてマウントし、無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ，インビトロｇｅｎ）中にて３４℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養した。上皮を湿らせるために、１００μｌの培地を８時間〜１０時間毎に表面に滴下した。培地レベルを、結膜縁部レベルに維持した。
【０２６１】
以前に記載のように、アンチセンスオリゴマーを、最終濃度が２μＭになるまで氷上で３０％（ｗ／ｗ）のプルロニックＦ１２７ゲル（Ｓｉｇｍａ）と混合し、１０μｌを角膜に適用した。（  Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．；（１９９９ｂ）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３３−４２；Ｇｒｅｅｎ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．；（２００１），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，１７５−１８５を参照）。３〜４つの角膜が実験あたりの各処置のサンプルサイズであった。予備試験は、本発明者らのポジティブコントロール（ＤＢ１）の８時間の二重処置が本発明者らの角膜培養においてコネキシン４３タンパク質発現に対する効果がほとんどないことを示した。したがって、角膜を２４時間培養し、コネキシン特異的オリゴマーを８時間毎に適用した。しかし、本発明者らは、培養を２４時間維持した場合、内因性コネキシン２６発現が影響をうけることを見出した。したがって、本発明者らは、コネキシン２６特異的オリゴマー処置角膜の培養期間を１２時間に減少し、アンチセンスオリゴマーの適用を４時間毎とした。培地を、アンチセンスまたはコントロールオリゴマーの反復適用前に１０回交換した。所定時間で、角膜をＰＢＳでリンスし、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ，Ｊａｐａｎ）に浸漬し、液体窒素中で瞬間冷凍した。次に、２５μｍの低温切片を、Ｌｅｉｃａクリオスタット（ＣＭ３０５０ｓ）で切断し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にマウントした。Ｃｘ４３およびＣｘ２６ｍＲＮＡ分析のために、角膜を、１回のアンチセンス処置から８時間後に採取した。
【０２６２】
（ＲＮＡの単離およびリアルタイムＰＣＲ）
製造者のプロトコールにしたがってＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ，インビトロｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して、単離ラット角膜から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡサンプルの質を、臭化エチジウム染色アガロースゲルでの電気泳動によって評価し、１８Ｓおよび２８Ｓ
ｒＲＮＡバンドをＵＶ照明下で視覚化した。抽出収率を、２６０ｎｍでの分光光度法で定量した。リアルタイムＰＣＲのために、ｃＤＮＡを、２０μｌの最終反応体積でのオリゴｄＴおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲｎアーゼＨ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，インビトロｇｅｎ，ＵＳＡ）の使用によって５μｇの総ＲＮＡから調製した。製造者の説明書に従ってＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用して、５０μｌの体積の各サンプルについて１００ｎｇの総ＲＮＡのｃＤＮＡ等価物を使用した９６ウェル光学反応プレート中で定量的ＰＣＲ反応を行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システム装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）にてＰＣＲを実施した。サーマルサイクリング条件は、製造者の標準的プロトコールを使用して、９５℃で１０分間の最初の変性、５０サイクルの２工程ＰＣＲ（９５℃で１５秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング−伸長が含まれる）を含んでいた。全実験を、３連で繰り返した。各標的についてのネガティブコントロールのモニタリングでは、キャリーオーバーは認められなかった。
【０２６３】
他のＲＮＡ値を標準化することができる内部標準として１８Ｓ  ｒＲＮＡの増幅を行った。標的および１８Ｓ  ｒＲＮＡの増幅効率はほぼ等しく、式２−ΔΔＣｔを使用して、検量線を必要とすることなくｍＲＮＡの相対レベルを計算した。標的および１８Ｓ  ｒＲＮＡの増幅効率が有意に異なる場合、相対検量線法を使用して、測定したＣｔ由来の各実験についてのｍＲＮＡおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡの絶対量を計算し、標的遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルを、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対する正規化後に定量したコントロールと比較した。
【０２６４】
全計算を、ＰＲＩＳＭ  ３．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して行った。群間の統計的相違を、スチューデントｔ検定の使用によって決定した。ＡＮＯＶＡによって数群間の比較を行い、ダネットの多重比較検定の使用によって有意性を計算した。
【０２６５】
（翻訳遮断に対するアンチセンスオリゴマー効率の評価）
Ｃｙ３およびＴａｑＭａｎ（Ｆａｍ，Ｔａｍｒａ）標識オリゴマーを使用して、透過および安定性を評価した。Ｃｙ３標識オリゴマー（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）およびＴａｑＭａｎ（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）標識オリゴマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、プルロニックゲルと共に適用して、オリゴマーの安定性および角膜上皮への透過の両方を測定した。処置した角膜を、４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、１％寒天にマウントし、４０×浸水レンズ下でホールマウントとして観察した。オリゴマー透過の深さを、ＬｅｉｃａＳＰ２共焦点顕微鏡のＺ−スキャンオプションおよび測定したｚ距離に対する強度のプロットを使用して測定した。ＴａｑＭａｎオリゴマーの破壊を、共焦点のＬａｍｄｂａスキャンオプションを使用して測定した。ＦＡＭ（ドナー）とＴＡＭＲＡ（受容体）分子との間の蛍光共鳴エネルギー転移（またはＦＲＥＴ）は、インタクトな３０量体オリゴマー中で起こる。オリゴマーが破壊される場合、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡはもはや極めて接近せず、ＦＲＥＴはもはや生じない。
【０２６６】
（免疫蛍光標識）
前に記載のように、角膜切片に対するコネキシンの免疫標識を行った。簡潔に述べれば、切片を、１０％ヤギ血清でブロッキングし、２５０倍希釈（マウス抗ラットコネキシン４３）または５００倍希釈（ウサギ抗ラットコネキシン２６）の一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、４００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識二次抗体と室温で２時間インキュベートし、その後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２μＭヨウ化プロピジウムまたは５０倍希釈のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２３５８で１０分間対比染色を行った。切片を、Ｃｉｔｉｆｌｕｒｏ  ａｎｔｉｆａｄｅ倍地（Ａｇａｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＫ）にマウントした。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−４ＤまたはＬｅｉｃａ  ＳＰ２共焦点レーザースキャニング顕微鏡を使用して全画像を収集し、ＴＩＦファイルとして保存した。全画像を、一定の電圧（５２０〜５４０Ｖ）およびオフセット（−２）設定を使用して収集した。コントロール組織の画像のグレースケールを最大にするようにグロー−垂直二連式ディスプレイ（ｇｌｏｗ−ｏｖｅｒ−ｕｎｄｅｒ  ｄｉｓｐｌａｙ）オプションを使用して、電圧およびオフセットを設定した。次いで、、同一実験内の全サンプルについて、同一の設定を使用した。
【０２６７】
定量のために、３μｍにわたる４つの光学スライスを、ＴＣＳ  ４Ｄ上の質量中心局所投影オプションを使用して、単一の焦点を拡大した光学画像に処理した。コネキシンレベルのスポットを、２５６階調のグレースケール画像に対する９０〜１００ピクセル強度での閾値化後に、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）を使用して計数した。角膜上皮領域も測定し、単位領域あたりのコネキシン密度を計算した。４つの拡大焦点画像の平均を使用して、各角膜の絶対コネキシン密度を計算した。次いで、この数を、センスコントロール処置またはゲル処置した角膜の中程度のコネキシン密度を使用して正規化した。本発明者らは、異なる処置と比較した場合の比率の低下（ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ）としてデータを示した。
【０２６８】
（デオキシリボザイムは、インビトロで選択的にｍＲＮＡを切断する）
げっ歯類コネキシン４３ｍＲＮＡに対して特異的に６６種のデオキシリボザイムをデザインした（表５）。マウスおよびラットコネキシン４３ｍＲＮＡの両方を認識するために、２２種のデオキシリボザイムをデザインした。本発明者らはまた、ネガティブコントロールとして、「１０−２３」触媒コア中に１つの点変異を有する２つの欠損デオキシリボザイムを購入した。デオキシリボザイム切断結果は、ラットコネキシン４３ｍＲＮＡ（１．１Ｋｂ長）（示さず）およびラットコネキシン４３ｍＲＮＡ（２．４Ｋｂ長）（図１１Ａ）と類似していた。両ラット（図１１Ａ）およびマウスｋ（図１１Ｂ）では、コネキシン４３ｍＲＮＡは、デオキシリボザイムに接近可能な類似の領域を有するようである。結果は、曝露されてデオキシリボザイム切断に利用可能なげっ歯類コネキシン４３ｍＲＮＡ上の４つの領域を示す。これらの領域は、ＡＴＧ開始コドンからおよそ３６７〜４６６塩基、５２６〜６２２塩基、７８３〜８８５塩基、および１００７〜１０７６塩基に位置する。２つの欠損デオキシリボザイム（ｄｆ６０５およびａ１ｄｆ７８３）は、げっ歯類コネキシン４３ｍＲＮＡの切断は認められなかった。ラットコネキシン４３ｍＲＮＡの非翻訳領域の２００塩基対に対してデザインされたデオキシリボザイムも、いかなる切断活性も示さなかった。
【０２６９】
（表５．ラットコネキシン４３に対して種々の程度のインビトロおよびインビボ活性を示すデオキシリボザイム（ｄｚ）およびアンチセンス（ａｓ）オリゴデオキシヌクレオチドのまとめ）
【０２７０】
【表５−１】
2014122248.tif 000027
【０２７１】
【表５−２】
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表５は、インビボ分析（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベル）のためのインビトロリボザイム切断研究に基づいて選択したか、欠損リボザイムコントロール（配列番号５６および配列番号５９）を正常なリボザイムと比較した場合のリボザイムおよびアンチセンス配列を示す。
【０２７２】
オリゴマーの名称は、ラットコネキシン４３のみと特異的な場合に接頭辞ｒ４３を有し、接頭辞ａ１は、マウスおよびラットの両方に対する特異性を示す。全オリゴマー配列は、未修飾ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドである。「ｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａ」は、デオキシリボザイムの「１０〜２３」触媒コアを示し、「ｇｇｃｔａＡｃｔａｃａａｃｇａ」は、欠損変異コントロールである。ＤＢ１は、ａｓ８８５（小文字で示す）の３０量体バージョンであり、ＤＢｌｓは、ＤＢ１配列のセンスコントロールである。インビトロ効果を、各デオキシリボザイムによるｍＲＮＡ切断の比率として測定した。インビボ効果を、角膜切片中のコネキシン４３の免疫標識（図１５）または残存ｍｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ評価（図１６）によって測定した。＋＋＋は＞７５％を意味し、＋＋は５０％〜７０％を意味し、＋は２５％〜５０％を意味し、−は０％〜２５％のｍＲＮＡのインビトロ切断またはタンパク質およびｍＲＮＡ発現のインビボでの減少を意味する。ｕｐは、ＤＢ１センス処置またはゲルのみのコントロール処置と比較した場合のコネキシン４３タンパク質発現の増加を意味する。
【０２７３】
本発明者らはまた、げっ歯類コネキシン２６ｍＲＮＡに対して特異的にデザインした４種のデオキシリボザイムを試験し（表６）、そのうちの１７種がマウスおよびラットのコネキシン２６ｍＲＮＡの両方と適合する。ラットコネキシン２６ｍＲＮＡは、クローニングプラスミド上の２つのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの存在によってゲル上に二重鎖として出現した。切断結果は、コネキシン２６ｍＲＮＡが、３１８〜３７９および４９３〜５６７塩基領域にデオキシリボザイムに接近可能な少なくとも２つの領域を有することを示す（図１２Ａ、１２Ｂ）。これらの図は、最も一貫して切断したデオキシリボザイムは１時間以内に両ｍＲＮＡ種を切断するｃｘ２６ｄｚ３３０であることを示す。２つの欠損デオキシリボザイム（ｂ２ｄｆ３５１およびｂ２ｄｆ３７９）は、げっ歯類コネキシン２６ｍＲＮＡを切断しなかった。デオキシリボザイムｃｘ２６ｄｚ３４１、ｄｚ３５１、ｄｚ３７５、ｄｚ３７９は、マウスコネキシン２６ｍＲＮＡと比較して、より高い比率でラットコネキシン２６ｍＲＮＡを一貫して切断する。他方では、ｍｃｘ２６ｄｚｌ５３およびｄｚ５６７は、ラットと比較した場合、マウスでより優れたコネキシン２６デオキシリボザイムのようである。
【０２７４】
（表６．げっ歯類コネキシン２６に対して種々の程度のインビトロおよびインビボ活性を示すデオキシリボザイム（ｄｚ）およびアンチセンス（ａｓ）オリゴデオキシヌクレオチド配列）
【０２７５】
【表６】
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表６は、インビトロで一貫して切断されるｍＲＮＡを、インビボ分析のためのインビトロリボザイム切断研究に基づいて選択するか（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベル）、欠損リボザイムコントロールとして使用する場合のリボザイムおよびアンチセンスを示す。オリゴマーの名称は、マウスまたはラットコネキシン２６ｍＲＮＡのみと特異的な場合に接頭辞ｍ２６またはｒ２６を有し、接頭辞ｂ２は、両方の種に対する特異性を示す。全オリゴマー配列は、未修飾ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドである。「ｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａ」は、デオキシリボザイムの「１０〜２３」触媒コアを示し、「ｇｇｃｔａＡｃｔａｃａａｃｇａ」は、欠損変異コントロールである。逆コントロール（ｒｖ）を使用して、アンチセンスオリゴマーの任意の非特異的効果も調節した。インビボ効果を、角膜切片中のコネキシン２６の免疫標識および標的ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲによって測定した（図１７）。＋＋＋は＞７５％を意味し、＋＋は５０％〜７０％を意味し、＋は２５％〜５０％を意味し、−は０％〜２５％のｍＲＮＡのインビトロ切断またはタンパク質およびｍＲＮＡ発現のインビボでの減少を意味する。
【０２７６】
（プルロニックゲルにおける蛍光標識ＯＤＮは、角膜上皮を透過することができる）
ラット角膜は、臓器培養におけるコネキシン４３およびコネキシン２６の発現を維持し、３０％プルロニックＦ−１２７ゲルによるアンチセンスオリゴマーの送達に容易に利用可能である。したがって、ラット角膜臓器培養を、インビトロモデル由来のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドデザインの有効性を試験するためのモデル系として選択した。本発明者らは、ラット角膜を２４時間培養し、内皮がインタクトなままであることを見出した。しかし、４８時間を超える培養時間は、角膜の不透明度に影響をあたえるようであり、それにより、使用しなかった。Ｃｙ３標識オリゴマーを使用して、培養角膜へのオリゴマーの透過度を決定した。インタクトな角膜全体の共焦点光学スライドは、蛍光シグナルがＣＹ３標識オリゴマーと共に存在することを示し、図１３Ａは、最初の処置から１時間後の培養角膜の蛍光シグナルの深さが１０μｍであることを示す。オリゴデオキシヌクレオチドに抱合したＴａｑＭａｎプローブを使用して、３０％プルロニックゲルを含むインタクトなオリゴデオキシヌクレオチドの角膜上皮への送達を測定し、照明した。有意なオリゴマーの比率は、治療１時間後にインタクトなままであった（図１３Ｂ、１３Ｃ）。インタクトなオリゴマーの点状シグナル（図１３Ｃで起こるＦＲＥＴ）は、赤色（グレースケールで示す）の波長として認められる一方で、分解オリゴマー由来のシグナル（ＦＲＥＴなし）は、緑色（グレースケールで示す）の発光スペクトルで出現する（図１３Ｂ）。
【０２７７】
（デオキシリボザイムアッセイは、角膜上皮でコネキシン４３タンパク質をノックダウンすることができるＯＤＮを予測する）
予備実験では、本発明者らは、本発明者らのポジティブコントロール（ＤＢ１）を１回適用したラット角膜を試験し、８時間後にコネキシン４３タンパク質発現の有意な変化は認められなかった。８時間間隔で３回適用した２４時間後に明らかなタンパク質ノックダウンが認められた。デオキシリボザイム切断アッセイ由来の結果に一部基づいて、本発明者らは、インビボで一定のアンチセンスオリゴマー（ＤＢ１、ｒ４３ａｓ６０５、ｒ４３ａｓ７８３、ｒ４３ａｓ８８５、ｒ４３ａｓ９５３、およびｒ４３ａｓｌＯ７６）、非機能的と予想されるアンチセンスオリゴマー（ｒ４３ａｓｌ４、ｒ４３ａｓ７６９、およびｒ４３ａｓ８９２）、およびネガティブコントロール（ＤＢ１センス）を試験した。本発明者らは、コントロールと比較した治療から２４時間後のコネキシン４３タンパク質レベルのノックアウトを見出し（図１４Ａ）、決定された全アンチセンスオリゴマーが陽性のはずである（図１４Ｃ、１４Ｅ、１４Ｇ）。陰性と予想される３つ全てのオリゴマーおよびネガティブコントロールオリゴマーは、コネキシン４３発現に影響を与えなかった。（図１４Ｂ、１４Ｄ、４Ｆ、４Ｈ）。ＤＢ１（ａｓ８８５の３０量体）は、より短いａｓ８８５と類似のノックダウン率を示した（ほぼ５０％ノックダウン）本実験で同定されたより良好なアンチセンスオリゴマーの１つは、タンパク質レベルを６４％減少させるａｓ６０５のようであった。これらの定量結果のまとめを、図１５に示す。
【０２７８】
他のコネキシンのための技術を試験するために、さらなるオリゴデオキシヌクレオチドをデザインし、コネキシン２６について試験した。ｒ２６ａｓ３３０Ｎおよび３７５Ｎと命名した３０量体のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを、その適切な逆コントロールオリゴデオキシヌクレオチドと共に、ｂ２ｄｚ３３０およびｂ２ｄｚ３７５の切断領域内の領域に基づいてコネキシン２６に対してデザインした。しかし、本発明者らは、アンチセンスオリゴマー処置培養物を逆コントロール処置角膜と比較した場合、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ａｓ３３０Ｎおよびａｓ３７５Ｎ）はこれらの実験の１２時間以内のタンパク質発現レベルが有に異なることを見出した。
【０２７９】
（アンチセンスＯＤＮは、コネキシン４３ｍＲＮＡおよびコネキシン２６ｍＲＮＡを減少させる）
リアルタイムＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡレベルに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの効果を決定した。コネキシン４３タンパク質発現をノックダウンするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ａｓ６０５、ａｓ８８５、ＤＢ１）はまた、処置後８時間以内にコントロール角膜と比較してコネキシン４３ｍＲＮＡレベルが低いことが確認された。コネキシン４３ｍＲＮＡの相対レベルの減少率は、コネキシン４３タンパク質の減少レベルと十分に相関した。ネガティブアンチセンスオリゴマー（ａｓ７６９）およびネガティブコントロール（ＤＢ１センス、ゲルのみ）は、コントロール角膜と比較してコネキシン４３ｍＲＮＡレベルが変化しなかった。
【０２８０】
コネキシン２６ｍＲＮＡ発現も、アンチセンス処置から８時間以内にａｓ３０Ｎおよびａｓ３７５Ｎによって有意に減少した（図１７）。ａｓ３３０Ｎの逆配列コントロールおよびゲルのみのコントロールは、ｍＲＮＡに対する効果は示されなかった。
【０２８１】
全ての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、ならびに他の書類および本明細書中で引用または言及された資料は、本発明に属する当業者のレベルを示し、このような各々の引用された書類および資料は、あたかもその全体が個別に参考として援用されているか、その全体が本明細書中に記載されているのと同一の範囲で本明細書中で参考として援用される。出願人は、任意のこのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電気的に利用可能な情報、および他の引用された資料または書類由来の任意および全ての資料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。
【０２８２】
本明細書中に記載の特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を代表し、本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者の本明細書の考慮により他の目的、態様、および実施形態が得られ、これは、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神の範囲内に含まれる。本発明の範囲および精神を逸脱することなく本明細書中に開示の本発明に関する種々の代替形態および修正形態を得ることができることが当業者に容易に理解される。本明細書中に適切に例示した本発明は、本明細書中で特に不可欠と開示していないいかなる要素または制限を用いることなく実施することができる。したがって、本明細書中の各々の例、実施形態、または本発明の実施例において、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」、および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」のいずれかを、明細書中で他の２つの用語のいずれかと置換することができる。また、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」などは、広く且つ制限することなく読み取るべきである。本明細書中に例示的に記載した方法およびプロセスを、工程の異なる順序で実施することができ、本明細書中または特許請求の範囲に示した工程の順序に制限される必要はない。他で明確に示さない限り、本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数形が含まれる。いかなる場合でも、本特許を、本明細書中に開示の特定の例、実施形態、または方法に制限されると解釈されない。いかなる場合でも、本特許を、任意の審査官、特許庁の任意の他の職員によって作製された記述が具体的に留保（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）または保留（ｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）することなく出願人の応答書で明確に採用されない限り、このような記述に制限されると解釈されない。
【０２８３】
使用した用語および表現は、説明のために使用し、本発明を制限せず、表示および記載した特徴の任意の等価物またはその一部を排除するためのこのような用語および表現の使用を意図しないが、特許請求の範囲に記載の発明の範囲内で種々の修正形態が可能であると認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態および最適な特徴によって具体的に開示しているが、当業者は本明細書中に開示の概念の修正形態および変形形態を使用することができ、このような修正形態および変形形態は添付の特許請求の範囲に定義の本発明の範囲内に含まれると見なされると理解される。
【０２８４】
本発明を、本明細書中に広範且つ一般的に記載している。属概念の開示内に含まれるそれぞれのより狭い種概念および下位概念も本発明の一部を形成する。これには、除外された要素が具体的に本明細書中で引用されるかどうかに関係なく、類概念から任意の主題を除く条件または消極的限定を含む本発明の属概念の記述が含まれる。
【０２８５】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本発明の特長または態様がマーカッシュ形式で記載されているが、当業者は、マーカッシュ形式により、本発明がマーカッシュ形式の任意の各選択肢（ｍｅｍｂｅｒ）または選択肢の下位集団に関して記載されると認識する。
【表７−１】
2014122248.tif 000030
【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
2014122248.tif 000044
【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【図３】
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【図５】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
2014122248.tif 000059
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
2014122248.tif 000065
【配列表】
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【外国語明細書】
2014122248000001.pdf