(57)【要約】【課題】本発明の目的は、原核生物中でｉｎ  ｖｉｖｏで産生することができる、Ｎ−グリコシル化の効率が最適化タンパク質、ならびにこうしたタンパク質を産生するための手段および方法を提供することである。本発明の別の目的は、前記タンパク質の抗原性、安定性、生物学的、予防的、および／または治療的活性を改変するための、Ｎ−グリカンの組み換えタンパク質へのより効果的な導入を意図する。さらなる目的は、その表面上に本発明の組み換えＮ−グリコシル化タンパク質を効率的にディスプレイする宿主細胞の提供である。【解決手段】本発明は、１つまたは複数の導入されたＮ−グリコシル化された最適化アミノ酸配列を含む組み換えＮ−グリコシル化タンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸、ならびに相当するベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、医薬品を調製するための、前記タンパク質、核酸、ベクター、および宿主細胞の使用に関する。さらに、本発明は、前記タンパク質を産生するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の下記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む組み換えＮ−グリコシル化タンパク質であって：
Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ
式中、ＸおよびＺは、Ｐｒｏ以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも１つの前記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される、組み換えＮ−グリコシル化タンパク質。
【請求項２】
少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも５つの前記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む請求項１に記載の組み換えタンパク質。
【請求項３】
タンパク質が、カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＮ−グリカンの群から選択される１つまたは複数のＮ−グリカンを含み、前記Ｎ−グリカンは、グラム陰性細菌中のＯ多糖形成Ｏ抗原に転移されるオリゴ糖および多糖、あるいは、グラム陽性細菌由来の莢膜多糖、好ましくは：緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｏ９、Ｏ１１；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７、Ｏ９、Ｏ１６、Ｏ１５７、および志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）Ｏ１から得られる、請求項１または２に記載の組み換えタンパク質。
【請求項４】
タンパク質が、２つ以上の異なるＮ−グリカンを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
【請求項５】
タンパク質が、哺乳類、細菌、ウイルス、菌類、または植物タンパク質由来である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
【請求項６】
タンパク質および／またはＮ−グリカンが、治療的および／または予防的に活性である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
【請求項７】
タンパク質および／またはＮ−グリカンが、免疫原的に活性である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
【請求項８】
前記組み換えタンパク質を、グラム陰性細菌の外膜にターゲティングすることが可能な少なくとも１つのポリペプチド配列をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
【請求項９】
前記ターゲティングポリペプチド配列が、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＯｍｐＨ１、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＪｌｐＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の外膜タンパク質（好ましくはＯｍｐＳ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＡ、ＯｐｒＦ、ＰｈｏＥ、ＬａｍＢ、Ｌｐｐ；ＯｍｐＡ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のｌｎｐタンパク質の全長タンパク質またはシグナルペプチドからなる群から選択される、タイプＩＩシグナルペプチドまたは外膜タンパク質からなる群から選択される、請求項８に記載の組み換えタンパク質。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸および／または請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が、原核性または真核性、好ましくは原核性である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞が、エシェリキア亜種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｓｐ．）、カンピロバクター亜種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、サルモネラ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、シゲラ亜種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、ヘリコバクター亜種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、シュードモナス亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｓｐ．）、バチルス亜種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｓｐ．）、好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｔｏｐ１０、Ｗ３１１０、ＣＬＭ２４、ＢＬ２１、ＳＣＭ６、およびＳＣＭ７、ならびにＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株ＳＬ３２６１、ＳＬ３７４９、およびＳＬ３２６１ΔｗａａＬからなる細菌の群から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、
ｉ）以下をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子型、
ａ）脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための少なくとも１種の天然または組み換え型の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、
ｂ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の、少なくとも１種の天然または組み換え型のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）、
ｃ）請求項１から９のいずれか一項、好ましくは、請求項８または９に記載の少なくとも１種の組み換えタンパク質、および
ｉｉ）グラム陰性細菌の外膜内および／または上に位置する請求項１から９のいずれか一項に記載の組み換えＮ−グリコシル化タンパク質を含む表現型、
を有する組み換えグラム陰性細菌である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
エシェリキア亜種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｓｐ．）、カンピロバクター亜種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、シゲラ亜種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｓｐ）、ヘリコバクター亜種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、およびシュードモナス亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｓｐ．）、サルモネラ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｔｏｐ１０、Ｗ３１１０、ＣＬＭ２４、ＢＬ２１、ＳＣＭ６、およびＳＣＭ７、ならびにＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株ＳＬ３２６１、ＳＬ３７４９、およびＳＬ３２６１ΔｗａａＬからなる群から選択される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
医薬品の調製のための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質の使用。
【請求項１８】
医薬品の調製のための、請求項１０に記載の核酸および／または請求項１１に記載のベクターの使用。
【請求項１９】
医薬品の調製のための、請求項１５または１６に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２０】
その必要性のある対象の治療および／または予防用ワクチン接種のための医薬品の調製のための、請求項１７に記載のタンパク質の使用。
【請求項２１】
その必要性のある対象の治療および／または予防用ワクチン接種のための医薬品の調製のための、請求項１８に記載の核酸および／またはベクターの使用。
【請求項２２】
その必要性のある対象の治療および／または予防用ワクチン接種のための医薬品の調製のための、請求項１５または１６に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２３】
動物（好ましくは哺乳類、より好ましくはげっ歯類、ヒツジ、ウマ、イヌ、ウシ、またはヒト）においてＩｇＡ抗体を誘導するための、請求項１９または２２に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２４】
請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のタンパク質を含む薬剤組成物。
【請求項２５】
少なくとも１種の請求項１０に記載の核酸および／または請求項１１に記載のベクターを含む薬剤組成物。
【請求項２６】
請求項１６または１７に記載の少なくとも１種の宿主細胞を含む薬剤組成物。
【請求項２７】
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および／または補助剤をさらに含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
Ｎ−結合グリコシル化タンパク質を産生するための方法であって
ａ）以下をコードする核酸を含む組み換え生物、好ましくは原核生物を提供するステップ：
ｉ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロン、および
ｉｉ）１つまたは複数の下記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む、少なくとも１種の組み換え標的タンパク質であって：
Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ
式中、ＸおよびＺは、Ｐｒｏ以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも１つの前記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される組み換え標的タンパク質、および
ｂ）標的タンパク質の産生およびＮ−グリコシル化に適した方式で、組み換え生物を培養するステップ、
を含む方法。
【請求項２９】
標的タンパク質が、請求項１から９のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロンが、
ＯＴアーゼによって標的タンパク質に転移されることとなる、脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための、
ｉ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の組み換えＯＴアーゼ、および
ｉｉ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））由来の組み換え型および／または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、および／または
ｉｉｉ）カンピロバクター種以外の種由来の組み換え型および／または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、
をコードする核酸を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１５または１６に記載の宿主細胞を調製するための方法であって、
ｉ）グラム陰性細菌を提供するステップと、
ｉｉ）以下をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を前記細菌に導入するステップと、
ａ）脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための少なくとも１種の組み換え型の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、および／または
ｂ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の少なくとも１種の組み換えオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）、および／または
ｃ）１つまたは複数の下記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む少なくとも１種の組み換えタンパク質であって：
Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ
式中、ＸおよびＺは、Ｐｒｏ以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも１つの前記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される組み換えタンパク質、
ｉｉｉ）ｃ）のヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１種の組み換えＮ−グリコシル化タンパク質が、グラム陰性細菌の外膜内および／または上に位置されるまで、前記細菌を培養するステップと、
を含む方法。
【請求項３２】
組み換え型の原核生物または宿主細胞が、エシェリキア亜種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｓｐ）、カンピロバクター亜種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、サルモネラ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、シゲラ亜種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、ヘリコバクター亜種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、シュードモナス亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｓｐ．）、バチルス亜種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｓｐ．）、好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｔｏｐ１０、Ｗ３１１０、ＣＬＭ２４、ＢＬ２１、ＳＣＭ６、およびＳＣＭ７、ならびにＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株ＳＬ３２６１、ＳＬ３７４９、およびＳＬ３２６１ΔｗａａＬからなる細菌の群から選択される、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から９のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質を産生、単離、および／または精製するための方法であって、
ａ）請求項１５または１６に記載の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記組み換えグラム陰性細菌の外膜を除去するステップと、
ｃ）前記組み換えタンパク質を回収するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つまたは複数の導入されたＮグリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む組み換えＮ−グリコシル化タンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸、ならびに相当するベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、医薬品を調製するための、前記タンパク質、核酸、ベクター、および宿主細胞の使用に関する。さらに、本発明は、前記タンパク質を産生するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｎ−結合タンパク質のグリコシル化は、真核生物の小胞体で起こる本質的かつ保存されたプロセスである。それは、タンパク質のフォールディング、オリゴマー化、安定性、品質管理、選別、ならびに分泌および膜タンパク質の輸送にとって重要である（ヘレニウス，Ａ（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ａ．）およびアービィ，Ｍ．（Ａｅｂｉ，Ｍ．）（２００４年）、「Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．」「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」７３、１０１９〜１０４９）。
【０００３】
タンパク質のグリコシル化は、タンパク質の抗原性、安定性、および半減期に対して重大な影響を有する。さらに、グリコシル化は、クロマトグラフィ、例えば、タンパク質のグリコシル化された部分と相互作用する、固相に結合されたレクチンリガンドを用いるアフィニティクロマトグラフィによるタンパク質の精製を助けることができる。したがって、生物学的および薬学的に有用なグリコシル化パターンを提供するために、真核生物細胞において、組換えにより多くのグリコシル化タンパク質を産生することは、確立された手法である。
【０００４】
ごく近年、細菌、すなわち食物性の病原菌カンピロバクター  ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）も、そのタンパク質をＮ−グリコシル化することができることが実証されている（シマンスキー（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ）ら（１９９９年）、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ．」「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」３２、１０２２〜１０３０）。グリコシル化のために必要とされる機構は、いわゆるｐｇｌ遺伝子座にクラスター化される１２の遺伝子によってコードされる。Ｎ−グリコシル化の破壊は、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）の侵入および病原性に影響を及ぼすが、大抵の真核性の生物において見られるように致死的ではない（ブルダＰ．（Ｂｕｒｄａ  Ｐ．）およびＭ．アービィ（Ｍ．Ａｅｂｉ．）（１９９９年）、「Ｔｈｅ  ｄｏｌｉｃｈｏｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．」「Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ」１４２６（２）：２３９〜５７）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でｐｇｌ遺伝子座とアクセプター糖タンパク質を組換えにより同時に発現させることによって、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）タンパク質のＮ−グリコシル化を元に戻すことが可能である（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら（２００２年）「Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｅ  ｃｏｌｉ．」「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２９８、１７９０〜１７９３）。
【０００５】
欧州特許出願公開第０３  ７０２  ２７６  １号明細書（欧州特許第１  ４８１  ０５７号明細書）、すなわち本発明の発明者の以前の発明は、（ｉ）脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、（ｉｉ）コンセンサス配列「Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ」（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）を含む組み換え標的タンパク質、ならびに（ｉｉｉ）前記オリゴ糖を、標的タンパク質のコンセンサス配列に共有結合的に連結させるＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）、をコードする核酸が導入される原核生物を教示する。前記原核生物は、特定のグリコシルトランスフェラーゼのタイプによって定義される、特定の構造をもつＮ−グリカンを産生する。
【０００６】
たとえ、タンパク質中の既知のＮ−グリコシル化コンセンサス配列の存在によって、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）を含む原核生物における組み換え標的タンパク質のＮ−グリコシル化が確かに可能になったとしても、いくつかの標的タンパク質のＮ−グリコシル化は、しばしば非効率的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、原核生物中でｉｎ  ｖｉｖｏで産生することができる、Ｎ−グリコシル化の効率が最適化タンパク質、ならびにこうしたタンパク質を産生するための手段および方法を提供することである。本発明の別の目的は、前記タンパク質の抗原性、安定性、生物学的、予防的、および／または治療的活性を改変するための、Ｎ−グリカンの組み換えタンパク質へのより効果的な導入を意図する。さらなる目的は、その表面上に本発明の組み換えＮ−グリコシル化タンパク質を効率的にディスプレイする宿主細胞の提供である。
【発明を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、１つまたは複数の下記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸配列を含む、組み換えＮ−グリコシル化タンパク質を提供する：
Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ（最適化コンセンサス配列）
式中、ＸおよびＺは、Ｐｒｏ以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも１つの前記Ｎ−グリコシル化された部分的なアミノ酸コンセンサス配列が導入される。
【発明の効果】
【０００９】
驚くべきことに、特定の部分的なアミノ酸配列（最適化コンセンサス配列）をタンパク質に導入することで、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ、ＯＴアーゼ）によって、これらが導入された位置で、非常に効率的にＮ−グリコシル化されたタンパク質がもたらされることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】構築物ＡからＣより得られるＬｉｐタンパク質のＮ−グリコシル化を説明する図である（実施例１を参照のこと）。Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロン（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら、２００２年、上記）、および、構築物Ａ（レーン２）、Ｂ（レーン１）、およびＣ（レーン３）をコードするプラスミド、または突然変異Ｄ１２１Ａを伴う構築物Ｃのミュータント（レーン４）を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ  １０細胞。タンパク質を発現させ、周辺質抽出物から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および精製されたタンパク質の分画を染色しているクーマシーブリリアントブルーが示される。
【図２】プラスミドから前記タンパク質を発現する、ＣＬＭ２４細胞（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎ）ら、（２００５年）、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｏ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ」１０２、３０１６〜３０２１）、またはＴｏｐ  １０細胞（パネルＥ、レーン１〜６）、またはＳＣＭ７細胞（アライモ，Ｃ．（Ａｌａｉｍｏ、Ｃ．）、キャトレイン，Ｉ．（Ｃａｔｒｅｉｎ、Ｉ．）、モルフ，Ｌ．（Ｍｏｒｆ，Ｌ．）、マロルダ，Ｃ．Ｌ．（Ｍａｒｏｌｄａ，Ｃ．Ｌ．）、カレワエルト，Ｎ．（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｎ．）、ヴァルヴァノ，Ｍ．Ａ．（Ｖａｌｖａｎｏ、Ｍ．Ａ．）、フェルドマン，Ｍ．Ｆ．（Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．）、アービィ，Ｍ．（Ａｅｂｉ，Ｍ．）（２００６年）「Ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｂｕｔ  ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｆｌｉｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．」「ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ」２５、９６７〜９７６）（パネルＥ、レーン７，８）中で、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ｐｇｌオペロン（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら、２００２年、上記）による配列特異的なＮ−グリコシル化について分析される、様々なタンパク質のＮ−グリコシル化分析を示す図である。ニトロセルロース膜に移され、特異的な抗血清を用いて視覚化された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離された周辺質抽出物が示される。パネルＡ〜Ｄでは、上のパネルが、抗ＡｃｒＡ抗血清（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら、２００２年、上記；ニタ−ラザー，Ｍ（Ｎｉｔａ−Ｌａｚａｒ，Ｍ）ワッカー，Ｍ．（Ｗａｃｋｅｒ，Ｍ．）、シェッグ，Ｂ．（Ｓｃｈｅｇｇ、Ｂ．）、アンバー，Ｓ．（Ａｍｂｅｒ，Ｓ．）、およびアービィ，Ｍ（Ａｅｂｉ，Ｍ．）（２００５年）、「Ｔｈｅ  Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．」「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」１５、３６１〜３６７）を用いて探索される免疫ブロットを示すのに対し、下のパネルは、Ｒ１２抗血清（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら、２００２年、上記）を用いて探索される免疫ブロットを示す。＋および−は、細胞中の機能性または変異型のｐｇｌオペロンの存在を示す。パネルＡは、ｐｅｌＢシグナル配列と、ヘキサヒスチジンタグを伴う可溶性の野生型ＡｃｒＡ（レーン１、２）、ＡｃｒＡ−Ｎ２７３Ｑ（レーン３、４）、およびＡｃｒＡ−Ｄ１２１Ａ（レーン５）のサンプルを含有する。パネルＢ：ＡｃｒＡ（レーン１、２）、ＡｃｒＡ−Ｔ１４５Ｄ（レーン３）、ＡｃｒＡ−Ｎ１２３Ｑ−Ｎ２７３Ｑ−Ｔ１４５Ｄ（レーン４、５）。パネルＣ：ＡｃｒＡ−Ｆ１１５Ｄ−Ｔ１４５Ｄ（レーン１、２）、ＡｃｒＡ−Ｎ１２３Ｑ−Ｎ２７３Ｑ−Ｎ２７２Ｄ（レーン３、４）。パネルＤ：ＡｃｒＡ−Ｎ２７３Ｑ（レーン１、２）、Ａｃ��Ａ−Ｎ２７３Ｑ−Ｆ１２２Ｐ（レーン３、４）。パネルＥ：ＣｔｘＢ（レーン１、２）、ＣｔｘＢ−Ｗ８８Ｄ（レーン３、４）、ＣｔｘＢ−Ｑ５６／ＤＳＮＩＴ（レーン５、６）、およびＣｔｘＢ−Ｗ８８Ｄ−Ｑ５６／ＤＳＮＩＴ。
【図３】ＯｍｐＨ１中の複数のグリコシル化部位の操作を示す図である。ΔｗａａＬ株ＳＣＭ６を、プラスミドｐＡＣＹＣｐｇｌ（全ｐｇｌ遺伝子座をコードする）と、野生型ＯｍｐＨ１（レーン１）、ＯｍｐＨ１Ｎ１３９ｓ−ｍｙｃ（レーン２）、ＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ−ｍｙｃ（レーン３）、ＯｍｐＨ１ＲＧＤ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ−ｍｙｃ（レーン４）、ＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＲＧＤ→ＮＩＴ−ｍｙｃ（レーン５）、ＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＲＧＤ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ−ｍｙｃ（レーン６）、またはＯｍｐＨ１ＲＧＤ→ＮＩＴ  Ｖ８３Ｔ−ｍｙｃ（レーン７）を発現するプラスミドを用いて同時形質転換させた。細胞を好気的に増殖させ、分析の前に３時間、０．５％アラビノースで誘導させた。全細胞溶解物を、材料および方法のセクションに述べた通りに、培養物の光学濃度を均一にした後にＴＣＡ沈殿させた。１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜上に移した。最初のパネル；抗ｍｙｃタグ抗体を用いて探索された全細胞溶解物の免疫ブロット。下のパネル；グリカン特異的な抗血清を用いて探索された全細胞溶解物の免疫ブロット。非グリコシル化およびグリコシル化されたＯｍｐＨ１の位置は、右側に示される。
【図４】様々なＯｍｐＨ１変異体を発現する細胞の蛍光顕微鏡検査を示す図である。野生型ＯｍｐＨ１およびその変異体のための発現プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＬＭ２４またはＳＣＭ６の培養物を、等しくＯＤ６００の０．２５／ｍｌにした。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ  ７．４）で２回洗浄し、１００μｌ細胞懸濁液を、ゼラチンを塗ったスライドガラス上に滴下し、加湿チャンバー内で３０分間、室温（ＲＴ）でインキュベートした。全細胞免疫蛍光標識化におけるその後のステップはすべて、加湿チャンバー内で室温で行った。結合していない細胞を除去し、残留物を、室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで固定した。重要なことに、パラホルムアルデヒドは、細胞を透過させないが、膜が無損傷であることによって区画化が保たれると考えられる。固定された細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、５％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）を含有するブロッキング緩衝液に再懸濁した。ブロック後、細胞を、抗ｍｙｃモノクローナルマウスＩｇＧ（１：５０、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））および／または抗グリカン抗血清（１：４０００）と共に、５％  ＢＳＡを含有する１００μｌのＰＢＳ中で、１時間インキュベートした。細胞を、１００μｌのＰＢＳで３回、各５分間洗浄し、ＦＩＴＣと結合させた抗ウサギ二次抗体（１：２５０、ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、および／またはＣｙ３と結合させた抗マウス抗体（１：２５０、ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共に、５％  ＢＳＡを含有する１００μｌのＰＢＳ中で１時間インキュベートした。必要とされる場合、細菌のＤＮＡを染色するために、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））（０．５μｇ／ｍｌ）を、二次抗体インキュベーション時に加えた。二次抗体を、ＰＢＳで細胞から洗い落とし、ベクタシールド（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））マウンティングメディアを使用することによって、カバースリップをスライドに載せ，マニキュア液を用いて密閉した。Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡（カールツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ））を使用することによって、蛍光顕微鏡検査を実施した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（バージョンＣＳ２）を使用することによって、画像を組み合わせた。ＳＣＭ６細胞は、以下を発現する：ＯｍｐＨ１（パネルＡ）、ＯｍｐＨ１Ｎ１３９Ｓ（パネルＢ）、ＯｍｐＨ１Ｃ２０Ｓ（パネルＣ）、ＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ（パネルＤ）、ＯｍｐＨ１ＲＧＤ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ（パネルＥ）、ＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＲＧＤ→ＮＩＴ（パネルＦ）、ＯｍｐＨ１Ｖ８３Ｔ、ＫＧＮ→ＮＩＴ（パネルＧ）、およびＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＲＧＤ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ（パネルＨ）。第１列は、黒色バックグラウンド上に灰色のトーンで表された、第２、３、および４列の画像の組合せである。第２列：ＤＡ���Ｉ染色による灰色のトーン中の青色蛍光、第３列：グリカン特異的な蛍光による緑色蛍光、第４列：抗ｍｙｃ染色による赤色蛍光。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において使用される用語「部分的なアミノ酸配列」はまた、「最適化コンセンサス配列」とも称される。最適化コンセンサス配列は、カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ、ＯＴアーゼ）によって、従来技術で知られている通常のコンセンサス配列「Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ」よりもかなり効率的にＮ−グリコシル化される。
【００１２】
一般に、用語「組み換えＮ−グリコシル化タンパク質」は、前記タンパク質をコードする核酸を天然には含まない宿主細胞中で産生される任意の異種ポリペプチドまたはオリゴペプチドを指す。本発明において、この用語は、任意の宿主細胞、例えば真核または原核生物の宿主細胞、好ましくは原核の宿主細胞、例えばエシェリキア亜種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｓｐ．）、カンピロバクター亜種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、サルモネラ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、シゲラ亜種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、ヘリコバクター亜種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、シュードモナス亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｓｐ．）、バチルス亜種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｓｐ．）、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター  ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、サルモネラ  チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの中で、組換えによって産生されるタンパク質を指す。ここでは、前記タンパク質をコードする核酸が、前記宿主細胞に導入される。また、コードされたタンパク質は、カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＯＴアーゼ、天然に存在する、あるいは組換えにより前記宿主細胞に導入される前記トランスフェラーゼ酵素によってＮ−グリコシル化される。
【００１３】
アミノ酸について国際的に認められた１文字記号によれば、省略形Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、およびＴはそれぞれ、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、およびトレオニンを表す。本発明のタンパク質は、１つまたは複数の最適化コンセンサス配列Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔが導入され、かつＮ−グリコシル化されるという点で、天然または従来技術のタンパク質とは異なる。したがって、本発明のタンパク質は、天然に存在するＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）タンパク質（これも、最適化コンセンサス配列を含有するが、任意のさらなる（導入された）最適化コンセンサス配列は含まない）とは異なる。
【００１４】
最適化コンセンサス配列の導入は、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠損、および／または置換によって達成することができる。最適化コンセンサス配列を導入するための、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠損、および／または置換は、固相支持型の化学ペプチド合成などの、当業者によく知られている化学合成戦略によって達成することができる。あるいは、より大きなポリペプチドにとって好ましいことだが、本発明のタンパク質は、標準の組み換え技術によって調製することができる。
【００１５】
本発明のタンパク質は、高効率で、かつ、カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロンを含む任意の原核の宿主中で産生され得るという利点を有する。本発明の態様および実施形態を実践するためのカンピロバクター種由来の好ましい代替のＯＴアーゼは、カンピロバクター  コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）およびカンピロバクター  ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）である（シマンスキーＣ．Ｍ．（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ  Ｃ．Ｍ．）およびレン  Ｂ．Ｗ．（Ｗｒｅｎ  Ｂ．Ｗ．）（２００５年）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．」「Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」３：２２５〜２３７を参照のこと）。前記原核宿主がカンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）である場合、機能性のｐｇｌオペロンは、天然に存在するものであり得る。しかし、当分野で以前に実証された通り、また、上述した通り、ｐｇｌオペロンは、細胞に導入することができ、前記新規の細胞の環境中で機能性のままでいることが可能である。
【００１６】
用語「カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロン」は、カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）の機能性のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）、および脂質担体上にオリゴ糖を構築することが可能な１種または複数の特異的なグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸のクラスターを指すものとする。ここでは、前記オリゴ糖は、ＯＴアーゼによって、脂質担体から、１つまたは複数の最適化アミノ酸配列：Ｄ／Ｅ−ＸＮ−Ｚ−Ｓ／Ｔを有する標的タンパク質に転移することができる。用語「カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロン」は、本発明において、必ずしも単一の転写単位としてのオペロンを指すというわけではないことを理解するべきである。この用語は、単に、ある宿主細胞における、組み換えタンパク質のＮ−グリコシル化のための機能性の成分の存在を要するだけである。これらの成分は、１つまたは複数の別々のｍＲＮＡとして転写されてもよく、一緒にあるいは別々に調節されてもよい。例えば、この用語はまた、ある宿主細胞中のゲノムＤＮＡおよびプラスミド中に位置する機能性の成分も包含する。効率のためには、機能性のｐｇｌオペロンのすべての成分が、調節されおよび同時に発現されることが好ましい。
【００１７】
機能性のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）だけは、カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に由来するべきであること、また、脂質担体上にオリゴ糖を構築することが可能な１つまたは複数の特異的なグリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に由来するものであっても組換えにより前記宿主細胞に導入されるものであってもよいが、唯一の機能的制約は、前記グリコシルトランスフェラーゼによって構築されるオリゴ糖が、ＯＴアーゼによって、脂質担体から、１つまたは複数の最適化コンセンサス配列を有する標的タンパク質に転移可能であるということであることを認識することは重要である。したがって、特異的なグリコシルトランスフェラーゼを天然に含む宿主細胞の選択および／または前記宿主中に天然に存在する特異的なグリコシルトランスフェラーゼを無能力化することおよび異種特異的なグリコシルトランスフェラーゼの導入によって、当業者は、本発明のタンパク質中の最適化Ｎ−グリコシル化コンセンサス部位に結合されたＮ−グリカンを変えることが可能となる。
【００１８】
上記の結果として、本発明は、本発明のタンパク質上のＮ−グリカン−パターンの個々の設計を提供する。したがって、タンパク質は、生物学、薬学、および精製の要件に合わせるために、そのＮ−グリカンパターンにおいて個別化させることができる。
【００１９】
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、１つ、さらに２つ以上、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも５つの前記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸配列を含んでよい。
【００２０】
本発明のタンパク質中の１つまたは複数のＮ−グリコシル化された最適化アミノ酸配列の存在は、その抗原性を増大させること、その安定性を増大させること、その生物活性に影響を及ぼすこと、その生物学的半減期を延長させること、および／またはその精製を単純化させることのために好都合であり得る。
【００２１】
最適化コンセンサス配列は、位置ＸおよびＺに、プロリン以外の任意のアミノ酸を含んでよい。用語「任意のアミノ酸」は、最適化コンセンサス配列を、ＯＴアーゼによってＮ−グリコシル化させることが可能となる、一般的および稀な天然のアミノ酸、ならびに合成アミノ酸誘導体および類似体を包含するものとする。天然に存在する一般的および稀なアミノ酸が、ＸおよびＺに対して好ましい。ＸとＺは、同じであっても異なってもよい。
【００２２】
ＸおよびＺが、本発明のタンパク質中の最適化コンセンサス配列各々について異なっていてもよいことに注意されたい。
【００２３】
ＯＴアーゼによる転移のために、脂質担体上にオリゴ糖を構築する場合、最適化コンセンサス配列に結合されるＮ−グリカンは、特異的なグリコシルトランスフェラーゼおよびその相互作用によって決定されることとなる。当業者は、所望の宿主細胞中に存在する特異的なグリコシルトランスフェラーゼのタイプおよび量を変化させることによって、Ｎ−グリカンを設計することができる。
【００２４】
Ｎ−グリカンは、本明細書では、Ｎグリコシド結合を介してタンパク質中のアスパラギン残基のε−アミド窒素と連結された、様々な組成の単糖、オリゴ糖、または多糖と定義される。好ましくは、ＯＴアーゼによって転移されるＮ−グリカンは、グラム陰性または陽性細菌の細胞膜に存在するウンデカプレノール−ピロリン酸脂質−アンカー上に構築される。これは、Ｏ抗原、Ｏ多糖、およびペプチドグリカンの合成に関与する（ビュック，Ｔ．Ｄ．（Ｂｕｇｇ，Ｔ．Ｄ．）およびブランディッシュ，Ｐ．Ｅ．（Ｂｒａｎｄｉｓｈ，Ｐ．Ｅ．）（１９９４年）、「Ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｔｏ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｃｏｍｍｏｎ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．」「ＦＥＭ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ」１１９、２５５〜２６２；ヴァルヴァノ，Ｍ．Ａ．（Ｖａｌｖａｎｏ，Ｍ．Ａ．）（２００３年）、「Ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．」「Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ」８、ｓ４５２〜４７１）。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明の組み換えタンパク質は、カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＮ−グリカンの群から選択される１種または複数のＮ−グリカンを含み、Ｎ−グリカンは、グラム陰性細菌中のＯ多糖形成Ｏ抗原に転移されるオリゴ糖および多糖、あるいはグラム陽性細菌由来の莢膜多糖、好ましくは：緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｏ９、Ｏ１１；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７、Ｏ９、Ｏ１６、Ｏ１５７、および志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）Ｏ１ならびに多糖構造に影響を及ぼすグリコシルトランスフェラーゼおよびエピメラーゼを挿入するあるいは欠損させることによって得られるそれらの操作された変異体から得られる。
【００２６】
さらなる好ましい実施形態では、本発明の組み換えタンパク質は、２つ以上の異なるＮ−グリカンを含む。
【００２７】
例えば、同じタンパク質上の異なるＮ−グリカンは、早いまたは遅いプロモーターを使用して、あるいは個々の特異的なグリコシルトランスフェラーゼのプロモーター活性を開始する、静まらせる、強化する、および／または低下させるための因子を導入して、特異的なグリコシルトランスフェラーゼの発現のタイミングを制御することによって調製することができる。それらの活性を制御する適切なプロモーターおよび因子は、当分野でごく普通に利用可能なものであるので、これ以上は論じない。
【００２８】
本発明の組み換えタンパク質の起源に対する制約はない。好ましくは、前記タンパク質は、哺乳類、細菌、ウイルス、菌類、または植物のタンパク質から得られる。より好ましくは、タンパク質は、哺乳類、最も好ましくはヒトのタンパク質から得られる。本発明の抗原性の組み換えタンパク質を調製するために、好ましくはワクチン中で活性成分を使用するためには、組み換えタンパク質は、細菌、ウイルス、または菌類のタンパク質から得られることが好ましい。
【００２９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、組み換えタンパク質を提供する。ここでは、タンパク質および／またはＮ−グリカンは、治療および／または予防的に活性である。少なくとも１つの最適化Ｎ−グリコシル化されたコンセンサス配列を導入することによって、タンパク質における治療および／または予防的活性を改変する、さらには導入することができる。より好ましい実施形態では、これは、免疫原的に活性であるタンパク質および／またはＮ−グリカンである。この場合、導入されるＮ−グリコシル化は、タンパク質の生物活性に対する改変効果を有していてもよく、および／または新規の抗原性部位を導入し、および／または分解ステップを避けるためにタンパク質をマスキングしてもよく、および／または半減期を増大する。
【００３０】
本発明の組み換えタンパク質を、宿主細胞、好ましくは細菌、より好ましくはグラム陰性細菌の外膜および／または表面に効率的にターゲティングすることができる。表面ディスプレイおよび／または外膜局在化を助けるために、本発明の組み換えタンパク質は、細菌、好ましくはグラム陰性細菌の外膜および／または細胞表面に前記組み換えタンパク質をターゲティングすることが可能な少なくとも１つのポリペプチド配列をさらに含むことが好ましい。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明の組み換えタンパク質は、前記ターゲティングするポリペプチド配列が、タイプＩＩシグナルペプチド（パエトゼル，Ｍ．（Ｐａｅｔｚｅｌ，Ｍ．）、カリア，Ａ．（Ｋａｒｉａ、Ａ．）、ストリナドカ，Ｎ．Ｃ．（Ｓｔｒｙｎａｄｋａ，Ｎ．Ｃ．）、およびダルビー，Ｒ．Ｅ．（Ｄａｌｂｅｙ，Ｒ．Ｅ．）、２００２年、「Ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ．」「Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ」１０２：４５４９〜４５８０）、または外膜タンパク質（ウェメラス，Ｈ．（Ｗｅｍｅｒｕｓ，Ｈ．）およびシュタール，Ｓ．（Ｓｔａｈｌ，Ｓ．）２００４年、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．」「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ」４０：２０９〜２２８に概説）からなる群から選択される、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＯｍｐＨ１、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＪｌｐＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の外膜タンパク質、好ましくはＯｍｐＳ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＡ、ＯｐｒＦ、ＰｈｏＥ、ＬａｍＢ、Ｌｐｐ’ＯｍｐＡ（表面ディスプレイ技術のための融合タンパク質、フランシスコ，Ｊ．Ａ．（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．）、エアハート，Ｃ．Ｆ．（Ｅａｒｈａｒｔ，Ｃ．Ｆ．）、およびジョルジオ，Ｇ．（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．、１９９２年、「Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ」８９：２７１３〜２７１７を参照のこと）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のｌｎｐタンパク質の全長タンパク質またはシグナルペプチドからなる群から選択されるものである。
【００３２】
異なる態様では、本発明は、本発明の組み換えタンパク質をコードする核酸に関する。好ましくは、前記核酸は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＰＮＡ、より好ましくは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡである。核酸は、前記タンパク質をコードする配列、また、それに加えて制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、終止コドン、開始コドン）などの他の配列、および、挙げられた制御配列などを介して組み換えタンパク質の発現を調節するために必要とされる遺伝子を含む可能性がある。用語「本発明の組み換えタンパク質をコードする核酸」は、前記コード配列と、場合によっては任意のさらなる核酸配列（カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロンを含有する宿主細胞中で、この核酸が本発明の組み換えタンパク質を産生することが可能な限り、配列情報を問わない）とを含む核酸を指す。より好ましくは、本発明は、プロモーターに作動可能に連結される、好ましくは、原核生物の既知の誘導性の恒常的プロモーターからなる群から選択されるプロモーター、より好ましくは、テトラサイクリンプロモーター、アラビノースプロモーター、サリチル酸プロモーター、ｌａｃ、ｔｒｃ、およびｔａｃプロモーター（バネイクス，Ｆ．（Ｂａｎｅｙｘ、Ｆ．）（１９９９年）、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」「Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」１０、４１１〜４２１；ビルマン−ヤコブ，Ｈ．（Ｂｉｌｌｍａｎ−Ｊａｃｏｂｅ，Ｈ．）（１９９６年）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」「Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」７、５００〜５０４）に連結される、単離および精製された核酸を提供する。前記作動可能に連結された核酸は、例えばワクチン接種のために使用することができる。
【００３３】
さらに、本発明の別の態様は、本発明の核酸および／またはベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞のタイプは、それがＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロン、および本発明の組み換え標的タンパク質をコードする１種または複数の核酸に適応する限り、制限されない。好ましい宿主細胞は、原核生物の宿主細胞、より好ましくは細菌、最も好ましくは以下からなる群から選択されるものである：エシェリキア亜種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｓｐ．）、カンピロバクター亜種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、サルモネラ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、シゲラ亜種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、ヘリコバクター亜種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、シュードモナス亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｓｐ．）、バチルス亜種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｓｐ．）、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｔｏｐ１０、Ｗ３１１０、ＣＬＭ２４、ＢＬ２１、ＳＣＭ６、およびＳＣＭ７（Ｆｅｌｄｍａｎ（フェルドマン）ら（２００５年）、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｏ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ」１０２、３０１６〜３０２１；アライモ，Ｃ．（Ａｌａｉｍｏ、Ｃ．）、キャトレイン，Ｉ．（Ｃａｔｒｅｉｎ、Ｉ．）、モルフ，Ｌ．（Ｍｏｒｆ，Ｌ．）、マロルダ，Ｃ．Ｌ．（Ｍａｒｏｌｄａ，Ｃ．Ｌ．）、カレワエルト，Ｎ．（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｎ．）、ヴァルヴァノ，Ｍ．Ａ．（Ｖａｌｖａｎｏ、Ｍ．Ａ．）、フェルドマン，Ｍ．Ｆ．（Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．）、アービィ，Ｍ．（Ａｅｂｉ，Ｍ．）（２００６年）、「Ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｂｕｔ  ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｆｌｉｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｄｅｓ．」「ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ」２５、９６７〜９７６）、およびＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株ＳＬ３２６１（サルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｓｖ．ティフィリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２（デルタ）ａｒｏＡ、ヘイセト，Ｓ．Ｋ．（Ｈｏｉｓｅｔｈ，Ｓ．Ｋ．）およびストッカー，Ｂ．Ａ．（Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｂ．Ａ．）、１９８１年、「Ａｒｏｍａｔｉｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｒｅ  ｎｏｎ−ｖｉｒｕｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｓ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．」「Ｎａｔｕｒｅ」２９１：２３８〜２３９を参照のこと）、ＳＬ３７４９（サルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｓｖ．ティフィリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２  ｗａａＬ、カニュク（Ｋａｎｉｕｋ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７９：３６４７０〜３６４８０を参照のこと）、およびＳＬ３２６ΔｗａａＬ。
【００３４】
より好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、本発明の組み換えタンパク質の外膜および／または表面ディスプレイへのターゲティングに有用であるもの、好ましくは、前記宿主細胞が、組み換えグラム陰性細菌であって：
ｉ）以下をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子型
ａ）脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための少なくとも１種の天然または組み換え型の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、
ｂ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の少なくとも１種の天然または組み換え型の原核生物オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）、
ｃ）本発明の少なくとも１種の組み換えタンパク質、好ましくは、ターゲティングポリペプチドをさらに含むタンパク質、および
ｉｉ）グラム陰性細菌の外膜内および／または上に位置する、本発明の組み換えＮ−グリコシル化タンパク質を含む表現型、
を有するグラム陰性細菌である。
【００３５】
上記形態のための宿主細胞は、好ましくは、以下からなる群から選択される：エシェリキア亜種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｓｐ．）、カンピロバクター亜種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、シゲラ亜種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、ヘリコバクター亜種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、およびシュードモナス亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｓｐ．）、サルモネラ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｔｏｐ１０、Ｗ３１１０、ＣＬＭ２４、ＢＬ２１、ＳＣＭ６、およびＳＣＭ７、ならびにＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株ＳＬ３２６１、ＳＬ３７４９、およびＳＬ３２６１ΔｗａａＬ．（ヘイセト，Ｓ．Ｋ．（Ｈｏｉｓｅｔｈ，Ｓ．Ｋ．）およびストッカー，Ｂ．Ａ．（Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｂ．Ａ．）、１９８１年、「Ａｒｏｍａｔｉｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｒｅ  ｎｏｎ−ｖｉｒｕｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｓ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．」「Ｎａｔｕｒｅ」２９１：２３８〜２３９を参照のこと）、ＳＬ３７４９（カニュク，Ｎ．Ａ．（Ｋａｎｉｕｋ，Ｎ．Ａ．）、ビノグラードフ，Ｅ．（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，Ｅ．）、およびホイットフィールド，Ｃ．（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｃ．）２００４年、「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：  ＷａａＬ“ｌｉｇａｓｅ”ｉｓ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  ｓｏｌｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７９：３６４７０〜３６４８０）。
【００３６】
本発明の好ましいタンパク質は、それ自身で、および／または導入されたＮ−グリコシル化部位に起因して、治療または予防的活性を有する可能性があるので、これらは、医薬品の調製のために使用することができる。本発明を実施するのためのタンパク質のタイプは、限定されないので、数例を挙げると、その中に最適化されたＮ−グリコシル化されたコンセンサス配列が導入された、ＥＰＯ、ＩＦＮ−アルファ、ＴＮＦアルファ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、インターロイキン、サイトカイン；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）タンパク質のようなワクチン接種のためのウイルスおよび細菌のタンパク質など（ＨｉｓＪ（Ｃｊ０７３４ｃ）、ＡｃｒＡ（Ｃｊ０３６７ｃ）、ＯｍｐＨ１（Ｃｊ０９８２ｃ）、ジフテリア毒素（ＣＲＭ１９７）、コレラ毒素、緑膿菌エキソプロテイン（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）など）の本発明のタンパク質が、医薬品を調製するために有用である（ウィシンスカ，Ａ（Ｗｙｓｚｙｎｓｋａ，Ａ．）、ラズコー，Ａ．（Ｒａｃｚｋｏ，Ａ．）、リス，Ｍ．（Ｌｉｓ，Ｍ．）、およびジャグシン−クリニカ（Ｊａｇｕｓｚｔｙｎ−Ｋｒｙｎｉｃｋａ），Ｅ．Ｋ．（２００４年）、「Ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ７２Ｄｚ／９２  ｃｊａＡ  ｇｅｎｅ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ．」「Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２」、１３７９〜１３８９）。
【００３７】
さらに、本発明の核酸および／またはベクターも、医薬品の調製のために、好ましくは遺伝子治療で使用するために有用である。
【００３８】
さらに、本発明の宿主細胞、好ましくは、細菌（好ましくはグラム陰性細菌、より好ましくは上記に列挙したグラム陰性細菌のうちの１種）の外膜内および／または上に位置する本発明のＮ−グリコシル化された組み換えタンパク質を含む表現型を有するものが、医薬品の調製のために特に有用である。
【００３９】
より好ましくは、本発明のタンパク質は、その必要がある対象の治療および／または予防用ワクチン接種のための医薬品の調製のために使用される。
【００４０】
より好ましい実施形態では、本発明は、好ましくは遺伝子治療による、その必要がある対象の治療および／または予防用ワクチン接種のための医薬品の調製のための、本発明の核酸および／またはベクターの使用に関する。
【００４１】
ディスプレイされたＮ−グリコシル化タンパク質が、宿主細胞の表面上に多量に存在し、免疫細胞、特に、その親水性Ｎ−グリカンによって十分に利用可能であるので、また、宿主細胞が、アジュバントのそれ以上の効果を有する（生存する場合、さらにある程度複製し、そのワクチン接種効果を増幅してもよい）ので、前記Ｎ−グリコシル化された組み換えタンパク質をディスプレイする本発明の宿主細胞は、ワクチンを調製するために特に有用である。
【００４２】
好ましくは、本発明の医療態様を実践するための宿主細胞は、弱毒化されたあるいは殺された宿主細胞である。
【００４３】
医薬品、好ましくはワクチンを調製することに対する本発明の宿主細胞の使用の別の利点は、それが、細胞の成分に起因するＩｇＡ抗体を誘導することである。
【００４４】
好ましくは、前記宿主細胞は、動物（好ましくは哺乳類、げっ歯類、ヒツジ、ウマ、イヌ、ウシ、またはヒト）中にＩｇＡ抗体を誘導するために、本発明に従って使用される。
【００４５】
ワクチン接種を必要とする前記対象は、鳥類、哺乳類、または魚類、好ましくは哺乳類、より好ましくは、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、およびヒトからなる群から選択される哺乳類、最も好ましくはヒトであることが好ましい。家禽類もまた、好ましい。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも１種のタンパク質、少なくとも１種の核酸、少なくとも１種のベクター、および／または少なくとも１種の宿主細胞を含む薬剤組成物に関する。タンパク質または宿主細胞、好ましくは弱毒化されたあるいは殺された宿主細胞を含む医薬品の調製、および、遺伝子治療のための核酸および／またはベクターを含む医薬品の調製は、当分野でよく知られている。最終の薬剤組成物のための調製スキーム、ならびにその投与の方式および詳細は、用いられるタンパク質、宿主細胞、核酸、および／またはベクターに依存することとなる。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明の薬剤組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および／または補助剤を含む。
【００４８】
本発明は、以下のうちの少なくとも１種を含む薬剤組成物を提供する：（ｉ）本発明の組み換えタンパク質である／をコードする／を発現する組み換えタンパク質、宿主細胞、核酸、および／または組み換えベクター、および（ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および／または補助剤。
【００４９】
適切な賦形剤、希釈剤、および／または補助剤は、当分野でよく知られている。賦形剤または希釈剤は、活性成分のための媒体または媒質として働いてよい固体、半固体、または液体材料であってよい。組成物を調製する分野における当業者であれば、選択される産物の特定の特性、治療される疾患または状態、疾患または状態の段階、および他の関連する状況に応じて、投与の適切な形および様式を容易に選択することができる（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、マックパブリッシング（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）（１９９０年））。薬学的に許容される希釈剤または賦形剤の割合および性質は、選択される薬学的に活性な化合物の溶解性および化学的性質、選択される投与経路、および標準の薬務によって決定される。製剤は、経口、非経口、または局所使用に適合されてもよく、また、錠剤、カプセル、座薬、液剤、懸濁剤などの形で患者に投与されてもよい。本発明の薬学的に活性な化合物は、それ自体で有効でありながら、安定性、結晶化の都合、溶解性の増大などの目的で、酸付加塩または塩基付加塩などの薬学的に許容されるその塩の形で調製および投与することもできる。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、Ｎ−結合グリコシル化タンパク質を産生するための方法であって、
ａ）以下をコードする核酸を含む組み換え生物、好ましくは原核生物を提供するステップと、
ｉ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロン、および
ｉｉ）１つまたは複数の下記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む少なくとも１種の組み換え標的タンパク質であって：
Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ
式中、ＸおよびＺは、Ｐｒｏ以外の任意の天然のアミノ酸であり得、少なくとも１つの前記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される組み換え標的タンパク質、および
ｂ）標的タンパク質の産生およびＮ−グリコシル化に適した方式で、組み換え生物を培養するステップと、
を含む方法に関する。
【００５１】
好ましくは、標的タンパク質は、本発明の上記の組み換えタンパク質のうちの１つである。
【００５２】
本発明の好ましい方法では、カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌオペロンは、
ＯＴアーゼによって標的タンパク質に転移されることとなる、脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための、
ｉ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の組み換えＯＴアーゼ、および
ＯＴアーゼによって標的タンパク質に転移されることとなる、脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための、
ｉｉ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の組み換え型および／または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、および／または
ｉｉｉ）カンピロバクター種以外の種から得られる組み換え型および／または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、
をコードする核酸を含む。
【００５３】
さらに、好ましい実施形態では、本発明は、本発明の宿主細胞を調製するための方法であって、
ｉ）グラム陰性細菌を提供するステップと、
ｉｉ）以下をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を前記細菌に導入するステップと、
ａ）脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための少なくとも１種の組み換え型の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、および／または
ｂ）カンピロバクター種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の少なくとも１種の組み換えオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）、および／または
ｃ）１つまたは複数の下記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む少なくとも１種の組み換えタンパク質であって：
Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ
式中、ＸおよびＺは、Ｐｒｏ以外の任意の天然のアミノ酸であり得、少なくとも１つの前記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される組み換えタンパク質、
ｉｉｉ）ｃ）のヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１種の組み換えＮ−グリコシル化タンパク質が、グラム陰性細菌の外膜内および／または上に位置されるまで、前記細菌を培養するステップと、
を含む方法に関する。
【００５４】
上記好ましい方法を実施するために、組み換え型の原核生物または宿主細胞は、好ましくは、エシェリキア亜種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｓｐ．）、カンピロバクター亜種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、サルモネラ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、シゲラ亜種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、ヘリコバクター亜種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、シュードモナス亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｓｐ．）、バチルス亜種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｓｐ．）、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｔｏｐ１０、Ｗ３１１０、ＣＬＭ２４、ＢＬ２１、ＳＣＭ６、およびＳＣＭ７、ならびにＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株ＳＬ３２６１、ＳＬ３７４９、およびＳＬ３２６１ΔｗａａＬからなる細菌の群から選択される。
【００５５】
本発明の組み換えタンパク質を産生、単離、および／または精製するための別の好ましい方法は、次のステップを含む：
ａ）請求項１５または１６に記載の宿主細胞を培養するステップ、
ｂ）前記組み換えグラム陰性細菌の外膜を除去するステップ、および
ｃ）前記組み換えタンパク質を回収するステップ。
【００５６】
細胞、好ましくは原核細胞、より好ましくはグラム陰性細菌細胞の外膜を除去するための例示的な方法は、適切な酵素処理方法、浸透圧衝撃、界面活性剤可溶化、およびフレンチプレス法である。
【００５７】
最も好ましくは、本発明は、カンピロバクター種以外の種、好ましくはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）から得られる組み換え型または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼが、前記宿主細胞中で機能的に発現させることが可能である細菌、古細菌、および／または真核生物に由来するグリコシルトランスフェラーゼおよびエピメラーゼの群から選択される方法に関する。
【００５８】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する役割を果たすものであり、いずれにせよその範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例
Ｎ−グリコシル化を最適化するためのモデルタンパク質としてのＡｃｒＡの選択
Ｎ−グリコシル化のためのアクセプタータンパク質の要件を最適化するために、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）糖タンパク質ＡｃｒＡ（Ｃｊ０３６７ｃ）に対して、詳細な研究を実施した。ＡｃｒＡは、３５０アミノ酸残基の周辺質リポタンパク質である。脂質に固定されるのではなく周辺質に分泌されることが、グリコシル化のための必要条件であることが示されている（ニタ−ラザー（Ｎｉｔａ−Ｌａｚａｒ）ら、２００５年、上記）。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で発現される場合、搬出のためのシグナルは、天然のＡｃｒＡシグナル配列または異種起源のＰｅｌＢシグナルであり得る。５つの潜在的なＮ−結合グリコシル化シークオン（ｓｅｑｕｏｎ）（Ｎ１１７、Ｎ１２３、Ｎ１４７、Ｎ２７３、Ｎ２７４）のうち、２つの同じものが、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）および大腸菌中で使用される（Ｎ１２３およびＮ２７３（ニタ−ラザー（Ｎｉｔａ−Ｌａｚａｒ）ら、２００５年、上記））。ＡｃｒＡは、詳細な構造情報が利用可能であるＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）の唯一の周辺質Ｎ−糖タンパク質であるので、モデルとして選択された。近年では、ＡｃｒＡ相同体、すなわちグラム陰性細菌緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＭｅｘＡタンパク質の結晶構造が公開されている（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ら（２００４年）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐ．」「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ」１０１、９９９４〜９９９９）。どちらのタンパク質も、いわゆる周辺質排出ポンプタンパク質のメンバーである（ＰＥＰ、（ジョンソン，Ｊ．Ｍ．（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．）およびチャーチ，Ｇ．Ｍ．（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．）（１９９９年））「Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ：ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐｓ．」「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７、６９５〜７１５））。細長い分子は、３つの直線的に配置されたサブドメイン：αらせんの逆平行のコイルドコイルを含有し、これは、リポイルドメインによって塩基で結びつけられ、これに、６本鎖のβバレル構造ドメインが続く。Ｎ末端の２３〜２８残基およびＣ末端における９５〜１０１残基は、結晶中に組み込まれていない。ＭｅｘＡタンパク質とＡｃｒＡタンパク質の配列は、２９．３％同一であり、５０％類似である。したがって、２つのタンパク質はおそらく、全体的に類似の折りたたみを示す。
【００６０】
実施例１  グリコシル化を誘発する第１のペプチド配列の解明
緑膿菌のＭｅｘＡと類似である、したがってまた、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＡｃｒＡ中にあるリポイルドメインは、大腸菌において個々に発現させることができるコンパクトなタンパク質を形成することが知られている（バーグ，Ａ．（Ｂｅｒｇ，Ａ．）、およびデコック，Ａ．（ｄｅ  Ｋｏｋ，Ａ．）（１９９７年）、「２−Ｏｘｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．」「Ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｙｌ  ｄｏｍａｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」３７８、６１７〜６３４によって概説される）。どのアクセプターペプチド配列が、大腸菌におけるｐｇｌ機構によるＮ−グリコシル化に必要とされるのかを確認するために、ＡｃｒＡのリポイルドメインを取り出した。これを、異なる長さのペプチドを周辺質に輸送し、それらをｉｎ  ｖｉｖｏでｐｇｌ機構に与えるための分子骨格として使用した。
【００６１】
したがって、リポイルドメイン（Ｌｉｐ）をコードするプラスミドを構築し、ＯｍｐＡ（チェ，Ｊ．Ｈ．（Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｈ．）およびリー，Ｓ．Ｙ．（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．）（２００４年）、「Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」「Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」６４、６２５〜６３５）のシグナル配列にＮ末端を、ヘキサヒスチジンタグにＣ末端を融合させた。クローニングを行い、アラビノースプロモーターの制御下で、遺伝子発現を行った。Ｌｉｐドメイン境界については、ＭｅｘＡ中でのリポイルドメイン部分のドメイン境界と同じ位置で出現すると考えられるアミノ酸位を選択した。Ｎ−グリカンを受け入れるその能力について、異なるペプチドを試験するために、配列のストレッチを、Ｌｉｐドメインの２つのハンマーヘッド様部分の間に挿入した。ストレッチは、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡのＮ−グリコシル化部位Ｎ１２３を含む配列からなるものであった。得られたオープンリーディングフレームは、ＯｍｐＡシグナル配列をコードする配列、ＡｃｒＡのＮ末端基ハンマーヘッド様部分（Ｄ６０〜Ｄ９５、アミノ酸の番号付けは、成熟したＡｃｒＡポリペプチドの配列番号付けに関連する）、ＡｃｒＡの天然のＮ１２３グリコシル化部位を含有する別のストレッチ（下記参照）、ＡｃｒＡ−Ｌｉｐ（Ｌ１６７−Ｄ２１０）のＣ末端のハンマーヘッド様部分、およびＣ末端のｈｉｓ−タグからなるものであった。
【００６２】
プラスミドの構築は、標準の分子生物学技術によって達成された。異なる長さのＡｃｒＡの天然のＮ１２３グリコシル化部位を含有する３つのストレッチを、Ｌｉｐの中間に挿入し、３つの異なるＯＲＦをもたらした：
構築物Ａは、次のタンパク質配列をもたらすＡ１１８−Ｓ１３０を含有する：
【化１】
2014042533.tif 000002
構築物Ｂは、次のタンパク質配列をもたらすＦ１２２−Ｅ１３８を含有する：
【化２】
2014042533.tif 000003
構築物Ｃは、次のタンパク質配列をもたらすＤ１２１−Ａ１２７を含有する：
【化３】
2014042533.tif 000004
下線が引かれた配列のストレッチは、ＯｍｐＡシグナルペプチドを示し、単独で下線が引かれた残基は、クローン化のために、あるいはタンパク質を分解に対して耐性にするために導入されたものである。太字：ＡｃｒＡのＮ１２３に相当するグリコシル化部位。イタリック体：ヘキサ−ヒスチジンタグ。相当する遺伝子を、プラスミドｐＥＣ４１５（シュルツ，Ｈ．（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｈ．）、ヘンネック，Ｈ．（Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｈ．）、およびトニー−マイヤー，Ｌ．（Ｔｈｏｎｙ−Ｍｅｙｅｒ，Ｌ．）（１９９８年）、「Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ａ  ｈｅｍｅ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．」「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８１、１９９７〜１２００）の主鎖中のアラビノースプロモーターの制御下で発現させた。
【００６３】
３つのストレッチのうちのどれがＬｉｐタンパク質のグリコシル化を誘発したかを確認するために、タンパク質発現実験を実施した。ｐＡＣＹＣｐｇｌまたはｐＡＣＹＣｐｇｌｍｕｔ（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら、２００２年、上記）と、構築物Ａ、Ｂ、またはＣをコードするプラスミドを保有する大腸菌Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢ媒質中で３７℃で０．５ＯＤまで増殖させた。誘導のために１／１０００体積の２０％アラビノース（ｗ／ｖ）溶液を加え、さらに２時間細胞を増殖させた。細胞を、遠心分離によってその後収集し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、２０％スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１ｇ／ｌ（ｗ／ｖ）リゾチーム中に再懸濁させ、４℃で１時間保温した。球状の芽球（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔｓ）をペレット化すると、周辺質抽出物が得られ、これを１／９体積（ｖ／ｖ）の１０×緩衝液Ａ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、および０．１Ｍ  イミダゾール）で希釈し、ＭｇＳＯ４を加えて２．５ｍＭにした。Ｎｉ−アフィニティ精製は、緩衝液Ａ中で、アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））からの１ｍｌ  Ｎｉ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム上で実施した。タンパク質は、０．２５Ｍ  イミダゾールを含有する緩衝液Ａで溶出させた。
【００６４】
図１は、クーマシーブリリアントブルー染色した、Ｎｉ−精製された周辺質抽出物からのピーク溶出分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。発現分析によって、構築物Ｂが、突出した単一のタンパク質種を産生することが示された（図１、レーン１）。構築物ＡとＣは両方とも、突出したタンパク質に加えて、電気泳動移動度がより遅い第２のタンパク質バンドをもたらす（図１、レーン２および３）。より重いタンパク質種が確かにグリコシル化されたことが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって証明された（図示せず）。構築物Ｂ中では失われたが、ＡおよびＣでは存在する唯一のアミノ酸は、Ｄ１２１、すなわちグリコシル化されたＮ１２３に対して２つＮ末端方向に位置するアスパラギン酸残基であった。このことは、Ｄ１２１が、ＯＴアーゼによるグリコシル化のために重要な役割を果たすことを実証している。Ｄ１２１がグリコシル化に不可欠なものであるということを検証するために、それは構築物Ｃ発現分析においてアラニンへ突然変異され、１つだけのタンパク質バンドをもたらし（図１、レーン４）、その結果、Ｄ１２１がグリコシル化に重要であることを示した。さらに、人工のペプチドディスプレイタンパク質がグリコシル化され得るという事実は、Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｙ−Ｓ／Ｔタイプの短いペプチドが、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）が担うＮ−グリコシル化が起こるためのすべての情報を含有することを示す。
【００６５】
実施例２  実施例１の検証；ＡｃｒＡ−Ｄ１２１Ａは、Ｎ１２３でグリコシル化されない
ペプチドディスプレイ手法による発見を確認するために、アスパラギン酸からアラニンへの突然変異を、位置１２１（Ｄ１２１Ａ、すなわちグリコシル化されたＮ１２３よりも２つ前の残基）に挿入し、ＡｃｒＡタンパク質の全長の可溶性バージョンにおいて、部位Ｎ１２３が大腸菌中で依然としてグリコシル化され得るかどうかを試験した。試験を行うために、このＡｃｒＡ−Ｄ１２１Ａを発現させ、そのグリコシル化状態を分析した。分析のために、操作されたＡｃｒＡを使用した。これは、周辺質への分泌のためのＰｅｌＢシグナル配列（チェ（Ｃｈｏｉ）およびリー（Ｌｅｅ）、２００４年、上記）、および、精製のためのＣ末端のヘキサヒスチジンタグを含有するという点で、本来のＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）遺伝子とは異なっていた。このＡｃｒＡ変異体は、脂質に固定された未変性タンパク質として分泌され、シグナルペプチド切断され、グリコシル化されることが示されている（ニタ−ラザー（Ｎｉｔａ−Ｌａｚａｒ）ら、２００５年、上記））。以下は、可溶性のＡｃｒＡタンパク質のタンパク質配列である。
【化４】
2014042533.tif 000005
【００６６】
下線が引かれた残基は、ＰｅｌＢシグナルペプチドであり、イタリック体は、ヘキサ−ヒスチジンタグであり、太字は、Ｎ１２３およびＮ２７３の２つの天然のグリコシル化部位である。ｐＥＣ４１５プラスミド（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｚ）ら、１９９８年）中に上記のタンパク質に対するＯＲＦを含有するプラスミドを、ｐＡｃＡｐｅｒを産生するために構築した。
【００６７】
ＡｃｒＡおよびそのミュータント（下記参照）のグリコシル化状態を試験するアッセイは、以下の通りであった：その活性または不活性の形の、プラスミドが担うｐｇｌオペロン（ｐＡＣＹＣｐｇｌまたはｐＡＣＹＣｐｇｌｍｕｔ、（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら、２００２年、上記）を参照のこと）と、ＡｃｒＡをコードするプラスミド（ｐＡｃｒＡｐｅｒ）を含有する、指数的に増殖する大腸菌ＣＬＭ２４（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎ）ら、２００５年、上記）細胞において、０．０２％アラビノースを用いて、ＡｃｒＡの発現を誘導した。４時間の誘導の後、周辺質抽出物を、上述した通りに調製し、抗ＡｃｒＡ抗血清またはＲ１２抗血清のいずれかを用いる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）、および免疫検出によって分析した。Ｒ１２抗血清は、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｎ−グリカンを含有するタンパク質に対して特異的である（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら、２００２年、上記）。
【００６８】
図２Ａの最初の２本のレーンは、機能性のｐｇｌオペロンが存在する場合と存在しない場合のＡｃｒＡを示す。機能性のｐｇｌオペロンが存在しない場合には、１つのバンドのみが現れ、存在する場合には３つのバンドが現れる（図２Ａ、上のパネル）。これらは、非グリコシル化ＡｃｒＡ（レーン１）、ならびに、非グリコシル化、モノグリコシル化、およびジグリコシル化ＡｃｒＡ（レーン２）に相当する。レーン２中の２つのより重いタンパク質がグリコシル化されたことを、Ｒ１２ウェスタンブロットによって確認した（レーン２、下のパネル）。ミュータントＡｃｒＡ−Ｎ２７３Ｑを同じ方法で発現させた場合、機能性のグリコシル化ｐｇｌオペロンが存在する場合には、モノグリコシル化されたＡｃｒＡだけが検出された（レーン３）。機能性のｐｇｌ遺伝子座が存在しない場合には、非グリコシル化ＡｃｒＡが検出された（レーン４）。ミュータントＡｃｒＡ−Ｄ１２１Ａの分析は、２つのバンドのみをもたらし、これらのうちの１つは、レーン３においてＡｃｒＡ−Ｎ２７３Ｑで観察されるように、グリコシル化されたものであった（レーン５）。これは、Ｄ１２１が、位置１２３〜１２５での効率的なグリコシル化のために必須であることを意味する。
【００６９】
実施例３  人工のグリコシル化部位のＡｃｒＡへの導入
アスパラギン酸残基の導入が、グリコシル化部位をもたらすことができるかどうか試験するために、可溶性のＡｃｒＡの位置Ｎ１１７およびＮ１４７の使用されないグリコシル化部位の−２位置の残基がアスパラギン酸（Ｆ１１５Ｄ、Ｔ１４５Ｄ）と交換されたＡｃｒＡミュータントを産生した。改変されたグリコシル化部位を、実施例２に記載されるのと同じアッセイによってグリコシル化することができるかどうかを、その後試験した。両方の突然変異を、ＡｃｒＡの可溶性のバージョンの野生型配列に、あるいは、（どちらも使用されるグリコシル化部位を欠損させた）（Ｎ１２３ＱおよびＮ２７３Ｑ）二重のミュータント中に、個々に挿入した。４時間誘導させた培養物の周辺質抽出物を調製し、ＳＤＳページによって分離し、ウェスタンブロッティングによって分析した（図２Ｂ）。対照として、野生型のサンプルをグリコシル化し、非グリコシル化されたＡｃｒＡを、同じゲル上に流した（レーン１および２）。Ｔ１４５Ｄ突然変異は、天然には使用されないグリコシル化シークオンＮ１４７−Ｓ１４９の−２位置に影響を及ぼした。ＡｃｒＡ−Ｔ１４５Ｄを発現させると、抗ＡｃｒＡ抗血清を用いるウェスタンブロッティングは、４つのバンドをもたらし、それらの最も高いものは、レーン２における２重にグリコシル化されたタンパク質よりも電気泳動移動度が遅かった（図２Ｂにおけるレーン３）。Ｒ１２ブロットによって、第４のバンドは、３重にグリコシル化されたＡｃｒＡであることが確認された。抗ＡｃｒＡに対する低い強度にもかかわらず、最も重いバンドは、グリコシル化特異的なＲ１２抗血清を用いると最も強いシグナルを示した。同じミュータントＡｃｒＡ−Ｔ１４５Ｄが、天然のＮ−グリコシル化配列（ＡｃｒＡ−Ｎ１２３Ｑ−Ｎ２７３Ｑ−Ｔ１４５Ｄ）の非存在下で発現された場合、機能性のｐｇｌオペロンの存在下で、モノグリコシル化されたＡｃｒＡのみが検出され（図２Ｂ、レーン４）、機能性のｐｇｌオペロンの非存在下では検出されなかった（レーン５）。これは、レーン４中のより重いバンドが、グリコシル化されたことを実証する。したがって、単純にＴ１４５Ｄ突然変異を導入することによって、最適化グリコシル化部位がもたらされた（ＤＦＮＮＳ）。
【００７０】
アスパラギン酸残基を−２位置に挿入することによって、グリコシル化部位を導入することが可能であることをさらに確認するために、天然には使用されない部位Ｎ１１７−１１９およびＮ２７４−Ｔ２７６を、Ｎ−グリコシル化を最適化するために変化させた。この目的のために、さらなるミュータントを産生した（図２Ｃ）。上記のシステムにおけるＡｃｒＡ−Ｆ１１５Ｄ−Ｔ１４５Ｄの発現は、抗ＡｃｒＡ抗血清を用いて検出される５つのタンパク質種をもたらした（レーン２）。これは、同じＡｃｒＡ分子上に起こる４つのグリコシル化の指標となる。Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｎ−グリカン特異的なＲ１２抗血清を用いる検出を実施すると、５つのバンドのラダーが検出された。最も低いかすかなバンドは、非グリコシル化ＡｃｒＡであり、これは、グリコシル化の非存在下でも存在するからであり（レーン１）、最も高いものは、４重にグリコシル化されたＡｃｒＡ中の５つの抗原性の決定因子におそらく起因する、強いシグナルをもたらす。したがって、２つの導入された部位（Ｎ１１７およびＮ１４７で）および２つの天然に使用される部位（Ｎ１２３およびＮ２７３）が使用され、ｐｇｌ機構によってグリコシル化される。ｐｇｌオペロンを含むおよび含まないＡｃｒＡ−Ｎ１２３Ｑ−Ｎ２７３Ｑ−Ｎ２７２Ｄの発現は、第３の人工的に導入されたグリコシル化部位、Ｎ２７４（ＤＮＮＳＴ）も、ｐｇｌオペロンによって認識されたことを実証した（図２Ｃ、レーン３および４）。
【００７１】
上記の実験によって、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＯＴアーゼによって認識される細菌のＮ−グリコシル化部位は、部分的に真核性のものと同じコンセンサスからなるが（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ、Ｘ≠Ｐ）、さらに、効率を増大するために、−２位置におけるアスパラギン酸が必要とされるという知見が確認される。さらに、これらの実験は、こうした最適化コンセンサス配列を組換えにより導入することによって、所望の部位でタンパク質をグリコシル化することが可能性であることを実証する。
【００７２】
実施例４  最適化Ｎ−グリコシル化配列における位置−１の確認
細菌のグリコシル化部位における−１の位置が、真核生物における＋１の位置と同じ制限を示すかどうか試験するために、さらなる実験を実施した（インペリアリ，Ｂ．（Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．）およびシャノン，Ｋ．Ｌ．（Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｋ．Ｌ．）（１９９１年）、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．」「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」３０、４３７４〜４３８０；ラッド，Ｐ．Ｍ．（Ｒｕｄｄ，Ｐ．Ｍ．）およびドゥウェック，Ｒ．Ａ．（Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ａ．）（１９９７年）、「Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ３Ｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、「Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」３２、１〜１００）。＋１のプロリン残基は、グリコシル化が抑制されるように、ペプチドを制限すると考えられる。類似の効果が、−１の位置でも観察されることができるかどうか試験するために、第２の天然の部位がノックアウトされた点変異体（ＡｃｒＡ−Ｎ２７３Ｑ−Ｆ１２２Ｐ）において、第１の天然に使用される部位のその位置に、プロリン残基を導入した。ＡｃｒＡ−Ｎ２７３Ｑの対照発現は、機能性のｐｇｌオペロンが存在する場合には、モノグリコシル化されたタンパク質を示した（図２Ｄ、レーン１および２）。しかし、ＡｃｒＡ−Ｎ２７３Ｑ−Ｆ１２２Ｐは、グリコシル化されなかった（図２Ｄ、レーン３および４）。これは、プロリンは、これがアスパラギンと−２位置の負に荷電する残基との間に残基を構成する場合、細菌のＮ−グリコシル化を抑制することを示している。
【００７３】
Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ｐｇｌ機構によってグリコシル化されることが知られているすべての部位の配列アラインメントは、これらがすべて、−２位置にＤまたはＥを含むことを示す（ニタ−ラザー（Ｎｉｔａ−Ｌａｚａｒ）ら、２００５年、上記；ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）ら、２００２年、上記；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、（２００２年）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃａｎ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｏｎ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ．」「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７７、４２５３０〜４２５３９）。したがって、細菌のグリコシル化コンセンサス配列は、−２位置の負に荷電するアミノ酸によって最適化され、Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ（式中、ＸおよびＺ≠Ｐ）をもたらす可能性があることが確立された。
【００７４】
実施例５  非Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）タンパク質のＮ−グリコシル化
第１の配列要件（最適化コンセンサス配列）が、細菌におけるＮ−グリコシル化に十分であることを実証するために、非Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）タンパク質を、上記の戦略を適用することによってグリコシル化させることができるかどうかを試験した。コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣｔｘＢ）を、グリコシル化標的として用いた。相当する遺伝子を、それが、まさに実施例１における構築物ＡからＣと同様の、Ｎ末端上のＯｍｐＡシグナル配列のコード配列とＣ末端のヘキサヒスチジンタグを含有するような方式で、コレラ菌から増幅させた。得られたＤＮＡを、実施例１で用いられたプラスミド中の構築物Ａと置き換えるようにクローン化した。Ｗ８８のＤへの点突然変異、またはＷ８８の後のＤ挿入は、最適化グリコシル化部位（ＤＮＮＫＴ）をもたらした。野生型、ならびにシグナル配列およびｈｉｓ−タグを含有するＷ８８Ｄ  ＣｔｘＢタンパク質を、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の機能性のｐｇｌ遺伝子座の存在下および非存在下で、大腸菌Ｔｏｐ  １０および他の細胞型中で発現させた。Ｔｏｐ  １０細胞由来の周辺質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、電気移動、およびＣｔｘＢ抗血清を用いる連続的な免疫ブロット法によって分析すると、ＣｔｘＢ  Ｗ８８Ｄだけは、ｐｇｌ遺伝子座バックグラウンドにおいて、より高い、したがって、グリコシル化されたバンドを産生していた（図２Ｅ、レーン３と４を比較せよ）。コンセンサス配列（ＤＳＮＩＴ）はまた、ＣｔｘＢのＧ５４またはＱ５６（後者は、ＣｔｘＢ−Ｑ５６／ＤＳＮＩＴと表される）、すなわち、ＣｔｘＢのガングリオシドＧＭ１結合活性に寄与することが報告されたループのうちの１つの中のものを置き換えることによって挿入された。図２Ｅのレーン５および６は、操作されたタンパク質（Ｔｏｐ  １０細胞中に発現されるＱ５６ではなくペプチド配列ＤＳＮＩＴを含有する構築物によって例示される）が、上で述べたのと同様に分析した場合、グリコシル化を欠く細胞ではなくグリコシル化コンピテントな細胞において、より移動性が低い、したがって、グリコシル化されたバンドをもたらしたことを実証している。２つの操作、すなわち、Ｗ８８の後のＤの挿入ならびにＤＳＮＩＴのＱ５６の置き換えを含むＣｘｔＢは、ＳＣＭ７細胞（アライモ（Ａｌａｉｍｏ）ら、「ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ」２５：９６７〜９７６（２００６年））において２重にグリコシル化されたことも実証された（パネルＥ、レーン７および８）。レーン７に示される２重にグリコシル化されたタンパク質ＣｔｘＢを、Ｎｉ２＋アフィニティ精製し、標準のプロトコルによるゲル内トリプシン処理の後、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。予測されるグリコペプチドが検出され、細菌のＮ−グリコシル化はまた、本発明の細菌のＮ−グリコシル化のための最適化コンセンサス配列を突然変異させる、あるいは挿入することによって、非Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）タンパク質も対象とすることが可能であることが確認された（図示せず）。本発明を実践するための他の適切な例示的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例は、Ｗ３１１０、ＣＬＭ２４、ＢＬ２１（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国カリフォルニア州、ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＳＣＭ６、およびＳＣＭ７である。
【００７５】
ここで使用されるＣｔｘＢタンパク質のアミノ酸配列を、以下に示す（組み換えＯｍｐＡシグナル配列は下線部、ヘキサ−ヒスチジンタグはイタリック体、Ｗ８８は太字）：
【化５】
2014042533.tif 000006
【００７６】
実施例６  Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）外膜タンパク質（ＯｍｐＨ１）への人工のＮ−グリコシル化部位の導入
細菌におけるＮ−グリコシル化の潜在的な用途は、遺伝子型に表現型を連結し、それによって特定の遺伝子突然変異について選択するための、細菌の宿主細胞の表面上のグリカンのディスプレイである。Ｎ−グリカンを、外膜タンパク質上に提示することが可能であることを実証するために、ＯｍｐＨ１タンパク質を、それが、本発明の複数の最適化コンセンサス部位を含有するように設計した。既知の結晶構造から推測される通り、この部位をタンパク質のループ領域に設計した（ミュラー，Ａ．（Ｍｕｌｌｅｒ，Ａ．）、トーマス，Ｇ．Ｈ．（Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｈ．）、ホーラー、Ｒ．（Ｈｏｒｌｅｒ，Ｒ．）、ブラニガン，Ｊ．Ａ．（Ｂｒａｎｎｉｇａｎ，Ｊ．Ａ．）、ブラゴヴァ，Ｅ．（Ｂｌａｇｏｖａ，Ｅ．）、レヴディコフ，Ｖ．Ｍ．（Ｌｅｖｄｉｋｏｖ，Ｖ．Ｍ．）、フォッグ，Ｍ．Ｊ．（Ｆｏｇｇ，Ｍ．Ｊ．）、ウィルソン，Ｋ．Ｓ．（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．）、およびウィルキンソン，Ａ．Ｊ（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｊ．）２００５年、「Ａｎ  ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｔｙｐｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｉｎｆｅｒｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」５７：１４３〜１５５）。以前の実験では、最良のグリコシル化配列は、突然変異Ｖ８３Ｔ、Ｋ５９Ｎ−Ｇ６０Ｉ−Ｎ６１Ｔ、Ｒ１９０Ｎ−Ｇ１９１Ｉ−Ｄ１９２Ｔ、およびＨ２６３Ｄ−Ｆ２６４Ｓ−Ｇ２６５Ｎ−Ｄ２６６Ｉ−Ｄ２６７Ｔによって産生されたことが示されている。表面ディスプレイについては、最大にＮ−グリカン特異的なサンプルを確立するために、それらの導入された部位の異なる組み合わせを評価することが所望された。こうした組み合わせを、プラスミド構築物をコードする野生型ＯｍｐＨ１中に作り出し、ＡｃｒＡについて述べられたのと同様の方式で試験した。図３は、既存の野生型シークオンに加えて、複数のグリコシル化シークオンを有する様々なＯｍｐＨ１変異体の分析を示す。ＯｍｐＨ１変異体は、３つ（レーン３、４、５および７）、および４つ（レーン６）のグリコシル化シークオンを伴って産生された。グリコシル化シークオンを１つだけ有する野生型ＯｍｐＨ１と、グリコシル化のための重要なアスパラギンを欠くミュータントもまた、この実験に含まれた。ここで試験されるすべての変異体は、高レベルのグリコシル化効率を実証するものに限られるわけではなく、あらゆるグリコシル化シークオンが利用された。結果は、カンピロバクターＮ−グリカン特異的な免疫血清を用いて確認した（図３、下のパネル）。
【００７７】
以下は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（８１−１７６株）のＯｍｐＨ１タンパク質のタンパク質配列である。付着されたｍｙｃタグは、イタリック体である。
【化６】
2014042533.tif 000007
タンパク質中の天然のグリコシル化部位は太字であり、シグナル配列には下線が引かれている。
【００７８】
実施例７  大腸菌細胞の外膜上のＯｍｐＨ１上のＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のＮ−グリカンの表面ディスプレイ
複数のグリコシル化されたＯｍｐＨ１変異体を、細菌細胞の表面上にディスプレイさせることができるかどうかという問題に答えるために、様々なＯｍｐＨ１変異体を発現している細菌のＣＬＭ２４またはＳＣＭ６（これは、ＳＣＭ７ΔｗａａＬである）細胞に、免疫蛍光法を実施した。野生型ＯｍｐＨ１と、グリコシル化のための重要なアスパラギンを欠くミュータントを、実験に含めた。さらに、周辺質内にタンパク質を保持する、したがって、この実験における対象としての役割を果たすために、Ｃ２０Ｓミュータントを構築した。パラホルムアルデヒドで処理した細胞に対して免疫染色を行った。パラホルムアルデヒドは、細胞の構造または区画化を壊さずに細胞を固定する。ＦＩＴＣおよびＣｙ３に結合させた相当する二次抗体と組み合わせて、ｃ−Ｍｙｃ−およびＮ−グリカン−特異的な免疫血清を使用して、細菌細胞表面上のタンパク質（赤色蛍光）およびＮ−グリカン（緑色）をそれぞれ検出した。さらに、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青色）を用いて、細菌のＤＮＡを染色し、細菌細胞と細胞残屑を明確に区別した。野生型ＯｍｐＨ１を発現している細胞が染色された場合、タンパク質ならびにＮ−グリカンに特異的な免疫蛍光が検出された（図４Ａ）。重要なアスパラギンＮ１３９Ｓを欠くミュータントが、抗−Ｍｙｃ−とＮ−グリカン−の両方に特異的な免疫血清で染色された場合、グリカン特異的なシグナルではなく、タンパク質のみに特異的なシグナルが得られ（パネル４Ｂ）、これは、Ｎ−グリカン特異的な免疫血清の特異性を示した。タンパク質が、Ｃ２０Ｓミュータントにおいて見られるように周辺質内に保持された場合、タンパク質特異的な赤い免疫蛍光は検出されず、これは、抗体が細胞内に拡散することが不可能であっても、任意の表面現象を検出するのに十分コンピテントであったことを示していた（４Ｃパネル）。次に、グリコシル化において異なる複数のＯｍｐＨ１変異体を発現している細胞が染色された：ＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ（パネル４Ｄ）、ＯｍｐＨ１ＲＧＤ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ（パネル４Ｅ）、ＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＲＧＤ→ＮＩＴ（パネル４Ｆ）、ＯｍｐＨ１Ｖ８３Ｔ、ＫＧＮ→ＮＩＴ（パネル４Ｇ）、およびＯｍｐＨ１ＫＧＮ→ＮＩＴ、ＲＧＤ→ＮＩＴ、ＨＦＧＤＤ→ＤＳＮＩＴ（パネル４Ｈ）。すべてのＯｍｐＨ１変異体は、２重に染色され、これは、細菌の表面上のグリコシル化タンパク質の存在を示していた。図４は、グレースケールで表したものであり、第１行は、同じ列の他の画像を組合せた画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月20日(2013.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の下記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む組み換えＮ−グリコシル化タンパク質であって：
Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ
式中、ＸおよびＺは、Ｐｒｏ以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも１つの前記Ｎ−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される、組み換えＮ−グリコシル化タンパク質。
【外国語明細書】
2014042533000001.pdf