(57)【要約】【課題】高い骨再生能を有する骨再生材料を提供すること。【解決手段】本発明の骨再生材料は第８リン酸カルシウムとフッ素との共沈物を含む。本発明の骨再生材料の製造方法は、例えば、フッ化物イオンおよびリン酸イオンを含む水溶液にカルシウムイオンを含む水溶液を添加して、第８リン酸カルシウムとフッ素との共沈物を形成する工程、および該共沈物を乾燥する工程を含み、該添加する速度は、７ｍＬ／分〜１３０ｍＬ／分であり、該添加は、５０℃〜８０℃にて行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウムとフッ素との共沈物を含む、骨再生材料。
【請求項２】
前記フッ素が、前記共沈物の質量に対して２質量％〜３．８質量％である、請求項１に記載の骨再生材料。
【請求項３】
骨再生材料の製造方法であって、フッ化物イオンおよびリン酸イオンを含む水溶液にカルシウムイオンを含む水溶液を添加して、第８リン酸カルシウムとフッ素との共沈物を形成する工程、ならびに
該共沈物を乾燥する工程
を含む、方法。
【請求項４】
骨再生材料の製造方法であって、フッ化物イオンおよびカルシウムイオンを含む水溶液にリン酸イオンを含む水溶液を添加して、第８リン酸カルシウムとフッ素との共沈物を形成する工程、ならびに
該共沈物を乾燥する工程
を含む、方法。
【請求項５】
前記添加する速度が、７ｍＬ／分〜１３０ｍＬ／分である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記添加が、５０℃〜８０℃にて行われる、請求項３から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
請求項３から６のいずれかの項に記載の方法により得られる骨再生材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨腫瘍の手術、唇顎口蓋裂、粉砕骨折などに伴う骨欠損を有する患者に対しては、通常、骨移植が行われる。骨移植は、脳外科、整形外科、歯科などの領域における手術に伴って生じる骨欠損を修復するために行われる場合もある。
【０００３】
骨移植には、自家骨を用いることが好ましい。しかし、自家骨を用いるには量的な制限があり、自家骨を取り出した後に残る障害などの問題もある。このため、骨移植に用いる骨として、自家骨に代わり得る人工骨の開発が行われている。
【０００４】
人工骨材としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２：以下、「ＨＡ」と記載する場合がある）セラミックス、β−第３リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）セラミックスなどが提案されている。
【０００５】
ＨＡの前駆体である第８リン酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ：以下、「ＯＣＰ」と記載する場合がある）は、ＨＡよりも優れた多くの機能を有する（特許文献１）。例えば、骨伝導能（非特許文献１）、破骨細胞による吸収性（非特許文献２）、用量依存的な骨芽細胞の分化促進（非特許文献３）に優れている。また、ＨＡの前駆体である非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）（非特許文献４）や第２リン酸カルシウム（第２リン酸カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ４）あるいは第２リン酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ））（特許文献１および非特許文献５）についてもＯＣＰと同様の性質を有することが報告されている。したがって、人工骨材としては、ＨＡよりはむしろ、ＯＣＰなどのＨＡ前駆体に対する期待が大きい。また、フッ化物イオンでドープされたＨＡやＯＣＰも公知である（特許文献３）。
【０００６】
しかし、完全に自家骨に代わり得る高い骨再生能を有する人工骨材はまだ確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２７８８７２１号公報
【特許文献２】特開２００６−１６７４４５号公報
【特許文献３】特開２００２−３５１０７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Suzuki O.ら、Tohoku J. Eng. Med.、1991年、第164巻、p.37-50
【非特許文献２】Imaizumi H.ら、Calcif. Tissue Int.、2006年、第78巻、p.45-54
【非特許文献３】Anada T.ら、Tissue Eng.、2008年、第14巻、p.965-978
【非特許文献４】Meyer J.L.ら、Calcif. Tissue Int.、1978年、第25巻、p.59-68
【非特許文献５】Eidelman N.ら、Calcif. Tissue Int.、1987年、第41巻、p.18-26
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、高い骨再生能を有する骨再生材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、第８リン酸カルシウム微粉末とフッ素との共沈物を含む骨再生材料が高い骨再生能を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
本発明は、第８リン酸カルシウムとフッ素との共沈物を含む骨再生材料を提供する。
【００１２】
１つの実施態様では、上記フッ素は、上記共沈物の質量に対して２質量％〜３．８質量％である。
【００１３】
本発明はまた、骨再生材料の製造方法を提供し、該方法は、フッ化物イオンおよびリン酸イオンを含む水溶液にカルシウムイオンを含む水溶液を添加して、第８リン酸カルシウムとフッ素との共沈物を形成する工程、ならびに該共沈物を乾燥する工程を含む。
【００１４】
本発明はまた、骨再生材料の製造方法を提供し、該方法は、フッ化物イオンおよびカルシウムイオンを含む水溶液にリン酸イオンを含む水溶液を添加して、第８リン酸カルシウムとフッ素との共沈物を形成する工程、ならびに該共沈物を乾燥する工程を含む。
【００１５】
１つの実施態様では、上記添加する速度は、７ｍＬ／分〜１３０ｍＬ／分である。
【００１６】
１つの実施態様では、上記添加は、５０℃〜８０℃にて行われる。
【００１７】
本発明はさらに、上記製造方法により得られる骨再生材料を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の骨再生材料は、高い骨再生能を有する。このため、機能障害を伴う骨欠損への適応のみならず、機能障害が顕在化せず看過されることが多かった手術に伴って形成される骨欠損の修復（脳外科、整形外科、歯科領域など）、骨吸収を伴う歯周病、義歯の保持を不安定化させる顎堤の低下などの障害にも適用され得、患者の生活の質（ＱＯＬ）の向上に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＣＦ−ＣａＰ、ＨＦ−ＣａＰまたはＯＣＰのＸ線回折パターンを示すチャートである。（図中、●印を付したピークはＯＣＰに特徴的なピークを示し、○印を付したピークはフッ化ハイドロキシアパタイト（以下、「ＦＨＡ」と記載する場合がある）に特徴的なピークを示す。）
【図２】ＣＦ−ＣａＰ、ＨＦ−ＣａＰまたはＯＣＰのＦ−ＣａＰのＦＴＩＲの解析結果を示すチャートである。
【図３】ＣＦ−ＣａＰ、ＨＦ−ＣａＰまたはＯＣＰのＦ−ＣａＰの結晶構造を示す走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）写真である（（ａ）はＯＣＰ、（ｂ）はＨＦ０．０９−ＣａＰ、（ｃ）はＣＦ０．０９−ＣａＰ、（ｄ）はＨＦ１．８０−ＣａＰ、（ｅ）はＣＦ１．２８−ＣａＰ、（ｆ）はＨＦ３．３３−ＣａＰ、そして（ｇ）はＣＦ３．２０−ＣａＰの結晶構造をそれぞれ示す）。（各写真中、右下に表示されている水平方向に延びる線分の長さは１μｍを表す。）
【図４】ＣＦ−ＣａＰ、ＨＦ−ＣａＰまたはＯＣＰのコーティングがコーティング表面の細胞接着に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】ＣＦ−ＣａＰ、ＨＦ−ＣａＰまたはＯＣＰのコーティングがコーティング表面の細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の骨再生材料は、第８リン酸カルシウム（ＯＣＰ）とフッ素との共沈物（以下、「ＣＦ−ＣａＰ」と記載する場合がある）を含む。ここで、共沈物とは、混合物を含有する溶液中で形成される物理的な凝集物（沈殿）をいう。
【００２１】
本発明のＣＦ−ＣａＰは共沈法によって得られる。例えば、フッ化物イオンおよびリン酸イオンを含む水溶液にカルシウムイオンを含む水溶液を添加（例えば、滴下または注加）する方法、フッ化物イオンおよびカルシウムイオンを含む水溶液にリン酸イオンを含む水溶液を添加（例えば、滴下または注加）する方法によって得られる。例えば、フッ化物イオン存在下のＯＣＰ共沈法（非特許文献１）によって得られる。例えば、フッ化ナトリウムを含むリン酸水素ナトリウム溶液２０００ｍＬに酢酸カルシウム溶液２０００ｍＬを７０℃にて１５分間〜３０３分間添加する。このようにして形成した共沈物を回収し、本発明のＣＦ−ＣａＰとする。
【００２２】
ここで、「滴下」とは、一方の溶液の液滴を他方の溶液表面に落下させて加えることをいう。「注加」とは、一方の溶液を他方の溶液に少量ずつ加えることをいい、例えば、チューブなどの中空管を用いて加えることをいう。「注加」とは、一方の溶液を他方の溶液に少量ずつ加えることをいい、例えば、チューブなどの中空管を用いて加えることをいう。
【００２３】
添加（例えば、滴下または注加）の速度は、特に限定されず、例えば、好ましくは７ｍＬ／分〜１３０ｍＬ／分、または、好ましくは５７ｍＬ／分〜８３ｍＬ／分である。７ｍＬ／分未満の場合または１３０ｍＬ／分を超えると、ＣＦ−ＣａＰが生成しにくい場合がある
【００２４】
水溶液中でリン酸イオン（ＰＯ４３−）を生じる化合物としては、特に限定されず、例えば、正リン酸、リン酸水素ナトリウム、リン酸亜鉛、リン酸アルミニウム、リン酸アンモニウム、これらの混合物が挙げられる。
【００２５】
水溶液中でカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を生じる化合物としては、特に限定されず、例えば、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、これらの混合物が挙げられる。
【００２６】
水溶液中でフッ化物イオン（Ｆ−）を生じるフッ素化合物としては、特に限定されず、例えば、フッ化ナトリウムなどの無機フッ化物、これらの混合物が挙げられる。上記共沈法の工程でフッ化物イオンおよびリン酸イオンを含む水溶液中、またはフッ化物イオンおよびカルシウムイオンを含む水溶液中のフッ化物イオンの初期濃度は、特に限定されないが、好ましくは１００ｐｐｍ〜３００ｐｐｍ、より好ましくは２００ｐｐｍ〜２３０ｐｐｍである。
【００２７】
フッ化物イオンおよびリン酸イオンを含む水溶液にカルシウムイオンを含む水溶液の添加、あるいはフッ化物イオンおよびカルシウムイオンを含む水溶液にリン酸イオンを含む水溶液の添加は、好ましくは５０℃〜８０℃、より好ましくは６０℃〜７５℃で行われる。５０℃未満の場合または８０℃を超えると、ＣＦ−ＣａＰが生成しにくい場合がある。
【００２８】
回収されたＣＦ−ＣａＰは、好ましくは、蒸留水で数回洗浄した後、空気乾燥する。乾燥温度としては、特に限定されず、例えば、１００℃〜１５０℃である。乾燥時間としては、特に限定されず、例えば、１２時間〜２４時間である。
【００２９】
本発明のＣＦ−ＣａＰは、本発明の効果が阻害されない範囲内で、一般的に骨再生材料に含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体など）、生体吸収性リン酸カルシウム（β−ＴＣＰなど）、生体非吸収性材料（ＨＡセラミックスなど）が挙げられる。このような成分は、上記共沈法の工程で共存させることができる。
【００３０】
本発明のＣＦ−ＣａＰ中のリン酸とカルシウムとのモル比（Ｃａ／Ｐモル比）は、特に限定されないが、好ましくは、リン酸１に対してカルシウムが１．５〜１．８、より好ましくは、１．５〜１．６である。Ｃａ／Ｐモル比の測定方法としては、特に限定されず、例えば、誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を用いる方法が挙げられる。
【００３１】
本発明のＣＦ−ＣａＰ中のフッ素含量は、特に限定されず、例えば、２質量％〜３．８質量％、好ましくは、３質量％〜３．８質量％である。フッ素含量の測定方法としては、特に限定されず、例えば、ＩＣＰ−ＡＥＳにフッ素電極を用いる方法が挙げられる。
【００３２】
本発明のＣＦ−ＣａＰの比表面積は、特に限定されず、例えば、５ｍ２／ｇ〜１６ｍ２／ｇ、好ましくは、５ｍ２／ｇ〜１０ｍ２／ｇである。比表面積の測定方法としては、特に限定されず、例えば、ＢＥＴ法が挙げられる。
【００３３】
本発明のＣＦ−ＣａＰは、Ｘ線回折パターンで、好ましくは、２θ＝１０．９°、３２．０°、３２．４°および３４．３°のピークを示す。
【００３４】
本発明のＣＦ−ＣａＰは、機械的に粉砕してもよい。粉砕する手段としては、特に限定されず、例えば、硬組織破砕装置（ビーズショッカー）、ボールミル、解砕機を用いる手段が挙げられる。
【００３５】
本発明のＣＦ−ＣａＰは、粒径を均一に（整粒）しておくことが好ましい。整粒して得られるＯＣＰ顆粒の粒径は、好ましくは１００ｎｍ〜１０００μｍ、より好ましくは５００μｍ〜５００μｍである。
【００３６】
本発明のＣＦ−ＣａＰは、さらに熱架橋処理に供してもよい。熱架橋処理により、本発明のＣＦ−ＣａＰの安定性を高めることができる。熱架橋条件としては、特に限定されない。熱架橋処理温度としては、例えば、１００℃〜２００℃が挙げられ、処理時間としては、通常６時間〜４８時間が挙げられる。
【００３７】
本発明の骨再生材料は、骨再生に重要な役割を果たす骨髄由来幹細胞、ストローマ細胞など、骨芽細胞の前駆細胞または成熟骨芽細胞の接着、増殖、分化を調節し、結果として骨再生の促進に寄与する。
【００３８】
本発明の骨再生材料は、適宜成形して使用される。成形手段としては、特に限定されない。例えば、骨再生材料を適当な型に入れて固める方法、固める際に圧力を加える方法が挙げられる。成形体の形状としては、特に限定されない。例えば、ディスク、ブロック、シートが挙げられる。ディスクの大きさとしては、特に限定されない。例えば、直径は、通常３ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜１０ｍｍである。例えば、厚みは、通常０．５ｍｍ〜５ｍｍ、好ましく１ｍｍ〜２ｍｍである。ブロックの大きさとしては、特に限定されない。例えば、長さ５ｍｍ〜１５ｍｍ、幅５ｍｍ〜５０ｍｍ、高さ５ｍｍ〜１００ｍｍ、好ましくは、長さ８ｍｍ〜１２ｍｍ、幅１０ｍｍ〜３０ｍｍ、高さ１０ｍｍ〜５０ｍｍである。
【００３９】
成形体は、骨欠損部の形状に応じて適宜整形され、放射線滅菌、高圧蒸気滅菌などにより滅菌処理後、骨欠損部に埋入される。ただし、高圧蒸気滅菌は、ＯＣＰの結晶相に影響を及ぼすので、その場合は骨欠損の適用部位を考慮する。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
（調製例１：ＣＦ３．２０−ＣａＰの調製）
非特許文献１に記載の合成方法に従い、以下の表１に記載のように、２３０ｐｐｍのＦ−（ＮａＦ）を含有するリン酸水素ナトリウム溶液（ＮａＦ，ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）２Ｌに７０℃にて３０分間、酢酸カルシウム溶液（Ｃ４Ｈ６ＣａＯ４・Ｈ２Ｏ）２Ｌを注加した。析出した沈殿物を回収し、蒸留水で数回洗浄した後、１０５℃にて一晩乾燥させて、ＣＦ３．２０−ＣａＰ（Ｆ含量３．２質量％のＣＦ−ＣａＰ）を調製した。
【００４２】
（比較調製例２および３）
以下の表１に記載のように、２３０ｐｐｍのＦ−に代えて１２ｐｐｍのＦ−または９６ｐｐｍのＦ−にしたこと以外は調製例１と同様にして、それぞれＣＦ０．０９−ＣａＰ（比較調製例２：Ｆ含量０．０９質量％のＣＦ−ＣａＰ）またはＣＦ１．２８−ＣａＰ（比較調製例３：Ｆ含量１．２８質量％のＣＦ−ＣａＰ）を調製した。
【００４３】
（比較調製例４〜６：ＨＦ−ＣａＰの調製）
以下の表１に記載のように、ＯＣＰ（非特許文献１に記載の合成方法に従い調製）の微粉末を、５０ｐｐｍのＮａＦを含有する１５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．１〜９．９）中で３７℃にて１０〜６０分間インキュベートした。固形物（以下、「ＨＦ−ＣａＰ」と記載する場合がある）を回収し、蒸留水で数回洗浄した後、１０５℃にて一晩乾燥させた。ＨＦ０．０９−ＣａＰ、ＨＦ１．８０−ＣａＰおよびＨＦ３．３３−ＣａＰは、それぞれＦ含量０．０９質量％、１．８０質量％および３．３３質量％のＨＦ−ＣａＰである。
【００４４】
（試験例１：ＣＦ−ＣａＰおよびＨＦ−ＣａＰの物理化学的特性解析１）
調製例１ならびに比較調製例２および３で得られたＣＦ−ＣａＰ、比較調製例４〜６で得られたＨＦ−ＣａＰならびにＯＣＰ（以下、「試料」と記載する場合がある）の各種物性を以下のように解析した。
【００４５】
Ｃａ／Ｐモル比およびＦ含量を、誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ）（株式会社島津製作所製ＩＣＰＳ−８０００）およびフッ素電極（サーモエレクトロン社製Ｏｒｉｏｎ９６０９ＢＮ）を用いて測定した。比表面積をＢＥＴ法により測定した。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
2014042674.tif 000002
【００４７】
表１より明らかなように、Ｆ含量が上昇するとＣａ／Ｐモル比が上昇した。ＨＦ３．３３−ＣａＰおよびＣＦ３．２０−ＣａＰのＣａ／Ｐモル比は化学量論的ＨＡのＣａ／Ｐモル比と等しく１．６７であった。ＯＣＰの比表面積である８．１３（ｍ２／ｇ）がＣＦ−ＣａＰではほぼ維持されたのに対し、ＨＦ−ＣａＰではＯＣＰよりも３〜５倍高い比表面積であった。
【００４８】
（試験例２：ＣＦ−ＣａＰおよびＨＦ−ＣａＰの物理化学的特性解析２）
Ｘ線回折パターンを、Ｘ線回折装置（株式会社リガク製Ｍｉｎｉｆｌｅｘ）を用いて、３．０°〜６０．０°の範囲で０．０５°間隔のステップスキャニングにより記録した。結果を図１に示す。
【００４９】
図１より明らかなように、ＨＦ０．０９−ＣａＰおよびＣＦ０．０９−ＣａＰはＯＣＰに特徴的なピーク（２θ＝４．９°、９．６°、９．９°、３１．７°および３３．７°、もう１つピークの位置をご教示ください）を維持していた。Ｆ含量が上昇すると、ＨＦ−ＣａＰおよびＣＦ−ＣａＰはＨＡ様パターンを示した。ＣＦ１．２８−ＣａＰは上記のＯＣＰに特徴的なピークに加えて、フッ化ハイドロキシアパタイト（以下、「ＦＨＡ」と記載する場合がある）に特徴的なピーク（２θ＝１０．９°、３２．０°、３２．４°および３４．３°）も有していた。一方、ＣＦ３．２０−ＣａＰはＯＣＰに特徴的なピークを有さず、低結晶性のＦＨＡを示すのみであった。
【００５０】
（試験例３：ＣＦ−ＣａＰおよびＨＦ−ＣａＰの物理化学的特性解析３）
試料を臭化カリウムで希釈し、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルを、ＦＴＩＲ分光光度計（日本分光株式会社製ＦＴ／ＩＲ−６３００）を用いて、１３００〜５００ｃｍ−１の範囲で４ｃｍ−１間隔にて取得した。結果を図２に示す。
【００５１】
図２より明らかなように、５６０〜６００ｃｍ−１の２つのシャープなＰＯ４の吸収バンドがリン酸カルシウムの結晶であることを示す。ＨＦ０．０９−ＣａＰおよびＣＦ０．０９−ＣａＰのスペクトルにＯＣＰ構造に特徴的な１１２２、１０７６、１０３８および１０２３ｃｍ−１の４つのシャープなＰＯバンドが観察された。Ｆ含量が上昇すると、１０３８ｃｍ−１および１０２４ｃｍ−１の２つのバンドが１０３３ｃｍ−１の１つのバンドになった。
【００５２】
（試験例４：ＣＦ−ＣａＰおよびＨＦ−ＣａＰの物理化学的特性解析４）
結晶の形態を、電界放射型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ；株式会社日立ハイテクノロジーズ製Ｓ−４３００Ｅ）を用いて観察した。結果を図３に示す。
【００５３】
図３から明らかなように、ＯＣＰは１辺が約５μｍの板状の形態を示したが、ＨＦ−ＣａＰは、Ｆ含量が上昇すると小さな結晶サイズを示した。ＨＦ３．３３−ＣａＰでは、不規則な縁を有するＦＨＡの小さな結晶が観察された。一方、ＣＦ−ＣａＰはＦ含量が１．２８質量％までは、ＯＣＰの板状構造を維持した。ＣＦ３．２０−ＣａＰでは、ＯＣＰの形態に替わり、長さ約２μｍの棒状のＦＨＡが表れた。
【００５４】
（試験例５：ＣＦ−ＣａＰおよびＨＦ−ＣａＰによるコーティング）
試料粉末を粉砕し、６５メッシュの篩で整粒し、粒径２１２μｍ未満の整粒した顆粒を、安井器械株式会社製マルチビーズショッカーを用いて、２５００ｒｐｍにて６０秒間さらに細粒に粉砕した。次いで、篩にかけた細粒を水に懸濁し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルにピペットを用いて、１．０ｍｇ／ウェルとなるように滴下した。プレートを６０℃のオーブンに一晩静置して乾燥させた。次いで、プレートをＵＶリンカー（フナコシ株式会社製ＦＳ−１５００）中にて２時間照射により滅菌した。
【００５５】
次いで、コーティングしたプレートの各ウェルにαＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社）を入れ、プレートを３７℃にて３日間インキュベートした。αＭＥＭ中のＯＣＰ、ＨＡおよびリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）に関する過飽和度を計算し、ＣＦ−ＣａＰおよびＨＦ−ＣａＰの溶解度特性を評価した。結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
2014042674.tif 000003
【００５７】
表２より明らかなように、すべての上清の過飽和度はＨＡに関して過飽和（ＨＡの結晶が成長する余地がある状態）であったが、ＤＣＰＤに関して不飽和（ＤＣＰＤの結晶が溶解し易い状態）であった。一方、ＨＦ−ＣａＰとＣＦ−ＣａＰとの間に過飽和度の顕著な差異があった。ＨＦ−ＣａＰでは、Ｆ含量が上昇すると過飽和度が低下したが、ＣＦ−ＣａＰのすべてはＯＣＰに関して飽和に近い状態（ＯＣＰの結晶が成長も溶解もしない状態）であった。すなわち、ＯＣＰと同等の溶解度を示した。
【００５８】
（試験例６：ＣＦ−ＣａＰおよびＨＦ−ＣａＰの細胞接着に及ぼす影響）
試料のマウス骨髄ストローマ細胞ＳＴ−２の接着に及ぼす影響を調べた。マウス骨髄ストローマ細胞ＳＴ−２（理研細胞バンク）を５％ＣＯ２環境下、３７℃にて、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ社）中に維持した。
【００５９】
ＳＴ−２細胞を１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ培地中に調製し、試験例４で調製したコーティングプレートに１×１０４細胞／ウェル（１００μＬ）の細胞密度で播種した。５時間のインキュベートの後、新鮮な培地と交換した。コーティング上およびポリスチレン培養プレート（コーティングなし）上の細胞数を、ＷＳＴ−８アッセイ（株式会社同仁化学研究所）を用いて測定した。結果を図４に示す。
【００６０】
図４より明らかなように、ＨＦ−ＣａＰコーティング表面に接着した細胞数は、ＯＣＰコーティング表面に接着した細胞数よりも少なかった。特に、ＨＦ１．８０−ＣａＰ上の細胞接着は最も少なく、ＯＣＰコーティングの７８％であった。逆に、ＣＦ３．２０−ＣａＰはすべてのコーティング中で最も高い細胞接着性を示した。ＣＦ０．０９−ＣａＰおよびＣＦ１．２８−ＣａＰ上の細胞数はＯＣＰ上の細胞数とほとんど同じであった。
【００６１】
（試験例７：ＣＦ−ＣａＰおよびＨＦ−ＣａＰの細胞増殖に及ぼす影響）
試料のマウス骨髄ストローマ細胞ＳＴ−２の増殖に及ぼす影響を調べた。マウス骨髄ストローマ細胞ＳＴ−２（理研細胞バンク）を５％ＣＯ２環境下、３７℃にて、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ培地中に維持した。
【００６２】
１×１０４細胞／ウェル（１００μＬ）に代えて２×１０４細胞／ウェル（１００μＬ）としたこと以外は試験例６と同様にして細胞を播種し、３日毎に新鮮な培地と交換し、７日後および１４日後にＷＳＴ−８アッセイ（株式会社同仁化学研究所）を行った。結果を図５に示す。
【００６３】
図５より明らかなように、ＣＦ３．２０−ＣａＰは７日間のインキュベートでコーティングなしよりも細胞増殖を促進した。対照的に、ＨＦ１．８０−ＣａＰ上の細胞数は、最も少なかった。１４日までに細胞増殖はコンフルエントに達し、すべてのコーティングで同じ増殖になった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の骨再生材料は、高い骨再生能を有する。このため、機能障害を伴う骨欠損への適応のみならず、機能障害が顕在化せず看過されることが多かった手術に伴って形成される骨欠損の修復（脳外科、整形外科、歯科領域など）、骨吸収を伴う歯周病、義歯の保持を不安定化させる顎堤の低下などの障害にも適用され得、患者の生活の質（ＱＯＬ）の向上に寄与し得る。
【図１】
2014042674.tif 000004
【図２】
2014042674.tif 000005
【図３】
2014042674.tif 000006
【図４】
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【図５】
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