(57)【要約】      （修正有）【課題】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の組み換え型によるアポトーシス誘導に抵抗を示す、薬剤に対する感受性があるか否かを判定し、癌患者を治療するための医薬の提供。【解決手段】癌がアゴニスト性の抗ＤＲ４抗体又はアゴニスト性の抗ＤＲ５抗体に対する感受性を、該患者から採取した癌組織又は細胞試料におけるＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出することによって検査され、感受性であることが確認された患者に投与する、有効量のアゴニスト性の抗ＤＲ４抗体又はアゴニスト性の抗ＤＲ５抗体を含んでなる医薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の組織または細胞試料のデスレセプター抗体への感受性を予測する方法であって、
哺乳動物組織または細胞試料を採取する工程、
該組織または細胞試料を検査して、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する工程
を含んでなり、該組織または細胞試料がデスレセプター抗体のアポトーシス誘導活性に感受性があることが該ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現により予測される方法。
【請求項２】
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現がＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現を検出することによって検査されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記組織または細胞試料中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１またはＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組織または細胞試料に癌組織または癌細胞が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞が、膵臓癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、黒色腫または軟骨肉腫の細胞または組織である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記デスレセプター抗体がアゴニスト性の抗ＤＲ４抗体または抗ＤＲ５抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物組織または細胞試料においてアポトーシスを誘導する方法であって、
哺乳動物組織または細胞試料を採取する工程、
該組織または細胞試料を検査してＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する工程、
該ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出した後、有効量のデスレセプター抗体に該組織または細胞試料を曝す工程
を含んでなる方法。
【請求項９】
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現がＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現を試験することによって検査されるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、前記組織または細胞試料中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１またはＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織または細胞試料に癌組織または癌細胞が含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌細胞が、膵臓癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、黒色腫または軟骨肉腫の細胞または組織である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が有効量のアゴニストＤＲ４抗体またはアゴニストＤＲ５抗体に曝される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が図３Ａに示すＤＲ５レセプターに結合するアゴニストＤＲ５抗体の有効量に曝される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物の免疫関連疾患または癌などの疾患の治療方法であって、
哺乳動物から組織または細胞試料を採取する工程、
該組織または細胞試料を検査してＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する工程、
該ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出した後、有効量のデスレセプター抗体を該哺乳動物に投与する工程
を含んでなる方法。
【請求項１７】
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現がＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現を検出することによって検査されるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、前記組織または細胞中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１またはＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記組織または細胞試料に癌組織または癌細胞が含まれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌細胞が、膵臓癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、黒色腫または軟骨肉腫の細胞または組織である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
有効量の抗ＤＲ４抗体または抗ＤＲ５抗体が前記哺乳動物に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
また、一又は複数の化学療法剤又は放射線療法が前記哺乳動物に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
また、サイトカイン、細胞障害性剤又は増殖阻害剤が前記哺乳動物に投与される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(出願について)
この出願は、２００５年８月１６日提出の米国特許仮出願番号第６０／７０８，６７７号及び２００６年５月２４日提出の同第６０／８０８，０７６号の優先権を主張し、前記特許文献の内容はここに出典明記により援用される。
【０００２】
(発明の分野)
本明細書中に記載の発明は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及び／又はデスレセプターアゴニスト抗体に対する哺乳動物細胞の感受性を予測するバイオマーカーを検出するための方法及びアッセイに関する。具体的には、本発明は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、或いはＤＲ４又はＤＲ５アゴニスト抗体等のデスレセプターアゴニスト抗体に対する哺乳動物の癌細胞の感受性を予測できるタンパク質のＧａｌＮａｃ−Ｔファミリーに関連する分子を検出する方法とアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリーに属する様々なリガンド及びレセプターが当分野で同定されている。そのようなリガンドの中には、腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、ＬＩＧＨＴ、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド(ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される)、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が含まれる。［例えば、Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002)；Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308 (1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411；Locksley 等, Cell, 104:487-501 (2001)；Gruss及びDower, Blood, 85:3378-3404 (1995)；Schmid 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtry 等, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)；Pitti 等, J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)；Wiley 等, Immunity, 3:673-682 (1995)；Browning 等, Cell, 72:847-856 (1993)；Armitage 等 Nature, 357:80-82 (1992)；1997年1月16日公開のWO97/01633；1997年7月17日公開のWO97/25428；Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開のWO98/28426；1998年10月22日公開のWO98/46751；1998年5月7日公開のWO/98/18921；Mooreら, Science, 285:260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。
【０００４】
このようなＴＮＦファミリーリガンドによって媒介される様々な細胞性応答の誘導は、一般的に特定の細胞レセプターへの結合によって開始される。すべてではなく、いくつかのＴＮＦファミリーリガンドは、細胞表面の「デスレセプター」に結合して、それを介して様々な生物学的活性を誘導し、細胞死やアポトーシス経路を行うカスパーゼ又は酵素を活性化する(Salvesen 等, Cell, 91:443-446 (1997)。今日までに同定されたＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバーには、TNFR1、TNFR2、TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas (Apo-1又はCD95とも称される)、DR4 (TRAIL-R1とも称される)、DR5 (Apo-2又はTRAIL-R2とも称される)、DcR1、DcR2、破骨細胞分化抑制因子(OPG)、RANK及びApo-3 (DR3又はTRAMPとも称される)が含まれる。(例えば、Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002)；Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308 (1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁；Locksley 等., Cell, 104:487-501 (2001)；Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995)；Hohman 等, J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989)；Brockhaus 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990)；1991年3月20日出願の欧州特許第417,563；Loetscher 等, Cell, 61:351 (1990)；Schall 等, Cell, 61:361 (1990)；Smith 等, Science, 248:1019-1023 (1990)；Lewis 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991)；Goodwin 等, Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)；Stamenkovic 等, EMBO J., 8:1403-1410 (1989)；Mallett 等, EMBO J., 9:1063-1068 (1990)；Anderson 等, Nature, 390:175-179 (1997)；Chicheportiche 等, J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997)；Pan 等, Science, 276:111-113 (1997)；Pan 等, Science, 277:815-818 (1997)；Sheridan 等, Science, 277:818-821 (1997)；Degli-Esposti 等, J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)；Marsters 等, Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)；Tsuda 等, BBRC, 234:137-142 (1997)；Nocentini 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997)；vonBulow 等, Science, 278:138-141 (1997))。
【０００５】
これらＴＮＦレセプターファミリーメンバーの多くは、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有しており、一方、他のメンバーは膜貫通領域と細胞内ドメインを欠いた可溶性タンパク質として天然にみられる。典型的なＴＮＦＲの細胞外部位には、ＮＨ２-末端から始まる複数のシステインリッチドメイン(ＣＲＤ)の反復性のアミノ酸配列パターンを含有する。
Ａｐｏ-２Ｌ又はＴＲＡＩＬと称されるリガンドはサイトカインのＴＮＦファミリのメンバーとして数年前に同定された。［例えばWileyら, Immunity, 3:673-682 (1995)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)；国際公開公報97/01633；国際公開公報97/25428；1998年6月9日発行の米国特許第5,763,223号；2001年9月4日発行の米国特許第6284236を参照］。完全長天然配列ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。ある細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素切断によって、そのポリペプチドの天然の可溶型を生じうる［Marianiら, J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)］。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究はＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにする［Hymowitzら, Molec. Cell, 4:563-571 (1999)；Cha 等, Immunity, 11:253-261 (1999)；Mongkolsapaya 等, Nature Structural Biology, 6:1048 (1999)；Hymowitz 等, Biochemistry, 39:633-644 (2000)］。しかし、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、(ホモ三量体の各サブユニットの位置２３０の)３つのシステイン残基が併せて亜鉛原子を配位しており、亜鉛の結合が三量体の安定性と生物学的活性のために重要であるという独特の構造的特徴を有していることが分かった。［上掲のHymowitzら; Bodmerら, J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)］。
【０００６】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは関節リウマチなどの自己免疫性疾患を含む、免疫系の調節において働きうることが文献で報告されている[例として、Thomas 等, J. Immunol., 161:2195-2200 (1998)；Johnsen 等, Cytokine, 11:664-672 (1999)；Griffith 等, J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999)；Song 等, J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)を参照]。
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型は大腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳腫瘍を含む様々な癌細胞並びに黒色腫、白血病、及び多発性骨髄腫においてアポトーシスを誘導することが報告されている［例えば、上掲のWileyら；上掲のPittiら；2000年2月29日発行の米国特許第6,030,945号；2004年6月8日発行の米国特許第6,746,668号；Rieger 等, FEBS Letters, 427:124-128 (1998)；Ashkenazi 等, J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)；Walczak 等, Nature Med., 5:157-163 (1999)；Keane 等, Cancer Research, 59:734-741 (1999)；Mizutani 等, Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999)；Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999)；Yu 等, Cancer Res., 60:2384-2389 (2000)；Chinnaiyan 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)を参照のこと］。マウス腫瘍モデルでのインビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法や放射線療法と組み合わせて、実質的な抗腫瘍効果を生じうることを示唆している［例えば上掲のAshkenaziら；上掲のWalzcakら；Gliniakら, Cancer Res., 59:6153-6158 (1999)；上掲のChinnaiyanら；Rothら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)；PCT出願 US/00/15512；PCT出願 US/01/23691を参照のこと］。多くのタイプの癌細胞とは対照的に、殆どの正常なヒト細胞タイプはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え形態によるアポトーシスの誘導に対して耐性があるように思われる［上掲のAshkenaziら；上掲のWalzcakら］。ＪｏらはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジンタグ可溶型が正常な単離された非ヒトではなくヒト肝細胞においてインビトロにてアポトーシスを誘導したことを報告している［Joら, Nature Med., 6:564-567 (2000)；またNagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)を参照のこと］。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体の含有％に応じて、罹患細胞対正常細胞に対する生化学的性質及び生物学的活性に関して変動しうると考えられている。［Lawrenceら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001)；Qinら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)］。
【０００７】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、少なくとも５つの異なるレセプターに結合することが明らかとなった。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに結合するそのレセプターの少なくとも２つは、機能的な細胞質デスドメインを含有している。そのあるレセプターは「ＤＲ４」(あるいはＴＲ４又はＴＲＡＩＬ-Ｒ１)と称されている(Pan 等, Science, 276:111-113 (1997)；また、1998年7月30日公開の国際公開公報98/32856；1999年7月29日公開の国際公開公報99/37684；2000年12月7日公開の国際公開公報00/73349；2003年2月20日公開の米国特許出願公開第2003/0036168号；2002年8月13日発行の米国特許第6,433,147号；2002年10月8日発行の米国特許第6,461,823号及び2002年1月29日発行の米国特許第6,342,383号)。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの他のレセプターはＤＲ５と称されている(あるいはApo-2；TRAIL-R又はTRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2又はKILLERとも称されている) (例として、Sheridan 等, Science, 277:818-821 (1997)、Pan 等, Science, 277:815-818 (1997)、1998年11月19日公開の国際公開公報98/51793；1998年9月24日公開の国際公開公報98/41629；Screaton 等, Curr. Biol., 7:693-696 (1997)；Walczak 等, EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wu 等, Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；1998年8月20日発行の国際公開公報98/35986；1998年10月14日発行の欧州特許第870,827号；1998年10月22日公開の国際公開公報98/46643；1999年1月21日公開の国際公開公報99/02653；1999年2月25日公開の国際公開公報99/09165；1999年3月11日公開の国際公開公報99/11791；2003年5月22日公開の国際公開公報03/042367；2002年12月5日公開の国際公開公報02/097033；2003年5月8日公開の国際公開公報03/038043；2002年8月13日公開の米国特許公開2002/0072091；2001年12月7日公開の米国特許公開2002/0098550；2001年12月6日発行の米国特許第6,313,269号；2001年8月2日公開の米国特許公開2001/0010924；2003年7月3日公開の米国特許公開 2003/01255540；2002年10月31日公開の米国特許公開2002/0160446、2002年4月25日公開の米国特許公開2002/0048785；2004年7月22日公開の米国特許出願公開第2004/0141952号；2005年6月16日公開の同第2005/0129699号；2005年6月16日公開の同第2005/0129616号；2002年2月発行の米国特許第6,342,369号；2003年5月27日発行の米国特許第6,569,642号、2000年6月6日発行の米国特許第6,072,047号、2003年11月4日発行の米国特許第6,642,358号；2004年6月1日発行のIS 6,743,625を参照)。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含有し、リガンド結合時(又はリガンドの活性を擬態するアゴニスト抗体などの分子の結合時)にアポトーシスをシグナル伝達することができることが報告された。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＤＲ５とで形成される複合体の結晶構造はHymowitz 等, Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
【０００８】
リガンドが結合すると、ＤＲ４とＤＲ５はともに、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１と称されるデスドメイン含有アダプター分子を介してアポトーシスインヒビターであるカスパーゼ８を増加又は活性化することによって独立してアポトーシスを引き起こしうる[Kischkel 等, Immunity, 12:611-620 (2000)；Sprick 等, Immunity, 12:599-609 (2000)；Bodmer 等, Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]。
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合することが報告されている。そのレセプター等はシグナル伝達のトランスデューサーというよりもインヒビターとして機能すると思われている。(例えば、DCR1 (TRID、LIT又はTRAIL-R3とも称される) [Pan 等, Science, 276:111-113 (1997)；Sheridan 等, Science, 277:818-821 (1997)；McFarlane 等, J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997)；Schneider 等, FEBS Letters, 416:329-334 (1997)；Degli-Esposti 等, J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)；及びMongkolsapaya 等, J. Immunol., 160:3-6 (1998)；DCR2 (TRUNDD又はTRAIL-R4とも称される) [Marsters 等, Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)；Pan 等, FEBS Letters, 424:41-45 (1998)；Degli-Esposti 等, Immunity, 7:813-820 (1997)]、及びOPG [Simonet 等、上掲]。ＤＲ４及びＤＲ５に反して、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
【０００９】
ＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターに結合する特定の抗体が文献で報告されている。例えば、ＤＲ４レセプターに対するものであり、特定の哺乳動物細胞においてアゴニスト活性ないしはアポトーシス活性を有する抗ＤＲ４抗体は、例として、1999年7月29日公開の国際公開公報99/37684；2000年7月12日公開の国際公開公報00/73349；2003年8月14日公開の国際公開公報03/066661に記載されている。例として、Griffith 等, J. Immunol., 162:2597-2605 (1999)；Chuntharapai 等, J. Immunol., 166:4891-4898 (2001)；2002年12月2日公開の国際公開公報02/097033；2003年5月22日公開の国際公開公報03/042367；2003年5月8日公開の国際公開公報03/038043；2003年5月8日公開の国際公開公報03/037913；2003年4月17日公開の米国特許出願公開第2003/0073187号；2003年6月12日公開の同第2003/0108516号も参照のこと。特定の抗ＤＲ５抗体も同様に記載されている。例として、1998年11月8日公開の国際公開公報98/51793；Griffith 等, J. Immunol., 162:2597-2605 (1999)；Ichikawa 等, Nature Med., 7:954-960 (2001)；Hylander 等, “An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice”, Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada；2003年5月8日公開の国際公開公報03/038043 ；2003年5月8日公開の国際公開公報03/037913；2003年9月25日公開の米国特許出願公開2003/0180296を参照のこと。さらに、ＤＲ４とＤＲ５レセプターの両方と交差反応する特定の抗体が記載されている(例として、2001年6月26日発行の米国特許第6,252,050号を参照)。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書に開示される発明は、哺乳動物組織又は細胞試料における一又は複数のバイオマーカーの発現を検査する方法及びアッセイを提供するものであり、この一又は複数のバイオマーカーの発現により該組織又は細胞試料がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又は抗ＤＲ５アゴニスト抗体などの薬剤に対して感受性であるか否かを予測するものである。本発明の様々な実施態様では、該方法及びアッセイは、タンパク質のＧａｌＮａｃ−Ｔファミリー、特にＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４又はＧａｌＮＡｃ−Ｔ３における分子の発現を検査するものである。
上記のように、正常なヒト細胞種類の多くは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の組み換え型によるアポトーシス誘導に抵抗性を示す(上掲のAshkenazi 等；上掲のWalzcak 等)。また、罹患したヒト細胞種類のあるもの(ある種の癌細胞)もＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の組み換え型によるアポトーシス誘導に抵抗性を示すことが明らかとされている(上掲のAshkenazi 等, J. Clin. Invest., 1999；上掲のWalczak 等, Nature Med., 1999)。したがって、アッセイによって選択されたバイオマーカーの発現について哺乳動物組織又は細胞試料を検査することによって、治療する患者にとって適切ないしは効果的な治療法を判断する際の有効な情報を簡便にかつ効率よく得ることができる。例えば、哺乳動物組織又は細胞試料におけるＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出するためのアッセイから得られた情報により、医師は、癌などの疾患又は自己免疫疾患などの免疫関連疾患を患っている患者にとって適切な治療計画（Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体を用いたもの）を決定するために用いることができる有用なデータを得ることができる。
【００１１】
本発明は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体に対する哺乳動物組織又は細胞試料(例えば癌細胞)の感受性を予測する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、哺乳動物組織又は細胞試料を採取し、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現について該組織又は細胞を検査することを含む。前記方法は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を検出するアッセイ、酵素活性アッセイ、及び本明細書に記載の他のアッセイを含む、様々なアッセイ様式で行うことができる。そのような組織又は細胞がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及び／又はデスレセプター抗体のアポトーシス誘導活性に対して感受性であることが、前記組織又は細胞におけるＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現の決定により予測されうる。任意の実施態様では、前記組織又は細胞は、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターについても検査されうる。
本発明の更なる方法には、哺乳動物組織又は細胞試料を採取し、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現について該組織又は細胞を検査し、該組織又は細胞試料がＧａｌＮａｃ−Ｔ１４を発現するかを決定し、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体に該組織又は細胞試料を曝す工程を含む、哺乳動物組織又は細胞試料のアポトーシスを誘導する方法が含まれる。ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検査するための方法に含まれる工程は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質、酵素活性及び本明細書に記載の他のものの発現を検出するアッセイを含む、様々なアッセイ様式で行うことができる。任意の実施態様では、前記方法は、前記組織又は細胞をＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターの発現についても検査することを含む。場合によっては、前記組織又は細胞試料には癌組織又は癌細胞が含まれる。場合によって、組織又は細胞試料には、非小細胞肺癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、又は非ホジキンリンパ腫細胞が含まれる。
【００１２】
本発明の更なる方法には、哺乳動物から組織又は細胞試料を採取し、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現について該組織又は細胞を検査し、該組織又は細胞試料が該ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４を発現するかを決定し、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体を該哺乳動物に投与する工程を含む、免疫関連疾患や癌などの哺乳動物の疾患の治療方法が含まれる。前記一又は複数のバイオマーカーの発現を検査するための方法に含まれる工程は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質、酵素活性及び本明細書に記載の他のものの発現を検出するアッセイを含む、様々なアッセイ様式で行われうる。任意の実施態様では、前記方法は、前記組織又は細胞試料をＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターの発現についても検査することを含む。場合によっては、前記方法は哺乳動物の癌を治療することを含む。場合によっては、前記方法は、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及び／又はデスレセプターアゴニスト抗体の投与に加えて、一又は複数の化学療法剤又は放射線療法が前記哺乳動物に投与されることを含む。
本発明の更なる実施態様では、前記方法は、ＧａｌＮａｃ−Ｔ３等の他のＧａｌＮａｃ−Ｔ分子の発現について哺乳動物の組織又は細胞を検査する工程を含むことができる。
【００１３】
更なる実施態様は、以下の特許請求に例示として具体的に開示される：
１．哺乳動物の組織又は細胞試料のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性を予測する方法であって、
哺乳動物組織又は細胞試料を採取する工程、
該組織又は細胞試料を検査して、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する工程
を含んでなり、該組織又は細胞試料がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導活性に感受性であることが前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現により予測される方法。
２．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現がＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡの発現を検出することによって検査されるものである、請求項１に記載の方法。
３．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項１に記載の方法。
４．さらに、前記組織又は細胞試料中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
５．前記組織又は細胞試料に癌組織又は癌細胞が含まれる、請求項１に記載の方法。
６．前記癌細胞が、膵臓癌、リンパ腫、又は非小細胞肺癌の細胞又は組織である、請求項５に記載の方法。
７．哺乳動物組織又は細胞試料のアポトーシスを誘導する方法であって、
哺乳動物組織又は細胞試料を採取する工程、
該組織又は細胞試料を検査して、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する工程、
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が検出されたら、前記組織又は細胞試料を有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに曝す工程
を含んでなる方法。
８．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現がＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現を検出することによって検査されるものである、請求項７に記載の方法。
９．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項７に記載の方法。
１０．さらに、前記組織又は細胞試料中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項７に記載の方法。
１１．前記組織又は細胞試料に癌組織又は癌細胞が含まれる、請求項７に記載の方法。
１２．前記癌細胞が、膵臓癌、リンパ腫、又は非小細胞肺癌の細胞又は組織である、請求項１１に記載の方法。
１３．前記細胞が、図１のアミノ酸１１４−２８１を含む有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドに曝される、請求項７に記載の方法。
１４．哺乳動物の免疫関連疾患又は癌などの疾患の治療方法であって、
前記哺乳動物から組織又は細胞試料を採取する工程、
該組織又は細胞試料を検査してＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する工程、
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が検出されたら、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを前記哺乳動物に投与する工程
を含んでなる方法。
１５．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現がＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現を検出することによって検査されるものである、請求項１４に記載の方法。
１６．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項１４に記載の方法。
１７．さらに、前記組織又は細胞中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
１８．前記組織又は細胞試料に癌組織又は癌細胞が含まれる、請求項１４に記載の方法。
１９．前記癌細胞又は癌組織に、膵臓癌、リンパ腫、又は非小細胞肺癌の細胞又は組織が含まれる、請求項１８に記載の方法。
２０．図１のアミノ酸１１４−２８１を含む有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドが前記哺乳動物に投与される、請求項１４に記載の方法。
２１．また、化学療法剤又は放射線療法が前記哺乳動物に投与される、請求項１４に記載の方法。
２２．また、サイトカイン、細胞障害性剤又は成長阻害剤が前記哺乳動物に投与される、請求項１４に記載の方法。
２３．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドがポリエチレングリコール分子に連結する、請求項７に記載の方法。
２４．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドがポリエチレングリコール分子に連結する、請求項１４に記載の方法。
２５．哺乳動物の組織又は細胞試料の、デスレセプター抗体に対する感受性を予測する方法であって、
哺乳動物から組織又は細胞試料を採取する工程、
該組織又は細胞試料を検査してＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する工程
を含み、前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現により、前記組織又は細胞試料がデスレセプター抗体のアポトーシス誘発活性に対して感受性であることが予測される、方法。
２６．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現の検出によって検査されるものである、請求項２５に記載の方法。
２７．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項２５に記載の方法。
２８．さらに、前記組織又は細胞中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項２５に記載の方法。
２９．前記組織又は細胞試料に癌組織又は癌細胞が含まれる、請求項２５に記載の方法。
３０．前記癌細胞が、膵臓癌、リンパ腫、又は非小細胞肺癌の細胞又は組織である、請求項２９に記載の方法。
３１．前記デスレセプター抗体が、アゴニストの抗ＤＲ４又は抗ＤＲ５抗体である、請求項２５に記載の方法。
３２．哺乳動物の組織又は細胞試料のアポトーシスを誘導する方法であって、
哺乳動物から組織又は細胞試料を採取し、
ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出するために、該組織又は細胞試料を検査し、前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が検出されたら、前記組織又は細胞試料を有効量のデスレセプター抗体に曝す
工程を含んでなる方法。
３３．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現の検出によって検査されるものである、請求項３２に記載の方法。
３４．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項３２に記載の方法。
３５．さらに、前記組織又は細胞中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
３６．前記組織又は細胞試料に癌組織又は癌細胞が含まれる、請求項３２に記載の方法。
３７．前記癌細胞が、膵臓癌、リンパ腫、又は非小細胞肺癌の細胞又は組織である、請求項３６に記載の方法。
３８．前記細胞が、有効量のアゴニストの抗ＤＲ４又は抗ＤＲ５抗体に曝される、請求項３２に記載の方法。
３９．前記細胞が、図３Ａに示されるＤＲ５レセプターに結合する有効量のアゴニストＤＲ５抗体に曝される、請求項３８に記載の方法。
４０．哺乳動物の免疫関連疾患又は癌などの疾患の治療方法であって、
前記哺乳動物から組織又は細胞試料を採取する工程、
該組織又は細胞試料を検査してＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する工程、
前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が検出されたら、有効量のデスレセプター抗体を前記哺乳動物に投与する工程
を含んでなる方法。
４１．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現がＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現を検出することによって検査されるものである、請求項４０に記載の方法。
４２．前記ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が免疫組織化学によって検査されるものである、請求項４０に記載の方法。
４３．さらに、前記組織又は細胞中のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプターの発現を検査する工程を含んでなる、請求項４０に記載の方法。
４４．前記組織又は細胞試料に癌組織又は癌細胞が含まれる、請求項４０に記載の方法。
４５．前記癌細胞又は癌組織に、膵臓癌、リンパ腫、又は非小細胞肺癌の細胞又は組織が含まれる、請求項４４に記載の方法。
４６．前記哺乳動物に有効量の抗ＤＲ４又はＤＲ５抗体が投与される、請求項４０に記載の方法。
４７．また、一又は複数の化学療法剤又は放射線療法が前記哺乳動物に投与される、請求項４０に記載の方法。
４８．また、サイトカイン、細胞障害性剤又は成長阻害剤が前記哺乳動物に投与される、請求項４０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトＡｐｏ-２リガンドｃＤＮＡ(配列番号：２)のヌクレオチド配列及びその誘導されるアミノ酸配列(配列番号：１)を示す。ヌクレオチド位置４４７の「Ｎ」は、ヌクレオチド塩基が「Ｔ」又は「Ｇ」であってもよいことを示すために用いる。
【図２Ａ】完全長ヒトＤＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：４)及びその誘導されるアミノ酸配列(配列番号：３)を示す。また、ヒトＤＲ４のそれぞれのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、Pan 等, Science, 276:111 (1997)に報告される。
【図２Ｂ】完全長ヒトＤＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：４)及びその誘導されるアミノ酸配列(配列番号：３)を示す。また、ヒトＤＲ４のそれぞれのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、Pan 等, Science, 276:111 (1997)に報告される。
【図３Ａ】１９９８年１１月１９日の国際公開公報９８／５１７９３に公開されるヒトＤＲ５の４１１のアミノ酸配列(配列番号：５)を示す。
【図３Ｂ】ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異体は当分野で公知である。１９９８年８月２０日の国際公開公報９８／３５９８６に公開される、このＤＲ５スプライシング変異体は図３Ｂ及び図３Ｃに示されるヒトＤＲ５の４４０のアミノ酸配列(配列番号：６)をコードする。
【図３Ｃ】ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異体は当分野で公知である。１９９８年８月２０日の国際公開公報９８／３５９８６に公開される、このＤＲ５スプライシング変異体は図３Ｂ及び図３Ｃに示されるヒトＤＲ５の４４０のアミノ酸配列(配列番号：６)をコードする。
【図３Ｄ−１】完全長ヒトＤｃＲ１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：７)及びその誘導されるアミノ酸配列(配列番号：８)を示す。また、ヒトＤｃＲ１(及びその特定のドメイン)のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のそれぞれは、国際公開公報９８／５８０６２に記載される。
【図３Ｄ−２】完全長ヒトＤｃＲ１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：７)及びその誘導されるアミノ酸配列(配列番号：８)を示す。また、ヒトＤｃＲ１(及びその特定のドメイン)のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のそれぞれは、国際公開公報９８／５８０６２に記載される。
【図３Ｄ−３】完全長ヒトＤｃＲ１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：７)及びその誘導されるアミノ酸配列(配列番号：８)を示す。また、ヒトＤｃＲ１(及びその特定のドメイン)のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のそれぞれは、国際公開公報９８／５８０６２に記載される。
【図３Ｅ−１】完全長ヒトＤｃＲ２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：９)及びその誘導されるアミノ酸配列(配列番号：１０)を示す。ヒトＤｃＲ２(及びその特定のドメイン)のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のそれぞれは、国際公開公報９９／１０４８４にも示される。
【図３Ｅ−２】完全長ヒトＤｃＲ２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：９)及びその誘導されるアミノ酸配列(配列番号：１０)を示す。ヒトＤｃＲ２(及びその特定のドメイン)のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のそれぞれは、国際公開公報９９／１０４８４にも示される。
【図４Ａ−１】ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のヌクレオチド配列（配列番号：１１）及びその誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。これらの配列は、Wang等、BBRC、300:738-744 (2003)にも記載されている。
【図４Ａ−２】ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のヌクレオチド配列（配列番号：１１）及びその誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。これらの配列は、Wang等、BBRC、300:738-744 (2003)にも記載されている。
【図４Ａ−３】ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のヌクレオチド配列（配列番号：１１）及びその誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。これらの配列は、Wang等、BBRC、300:738-744 (2003)にも記載されている。
【図４Ａ−４】ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のヌクレオチド配列（配列番号：１１）及びその誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。これらの配列は、Wang等、BBRC、300:738-744 (2003)にも記載されている。
【図４Ｂ−１】ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ３のヌクレオチド配列（配列番号：１３）及びその誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。これらの配列は、Bennett等、J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996)にも記載されている。
【図４Ｂ−２】ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ３のヌクレオチド配列（配列番号：１３）及びその誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。これらの配列は、Bennett等、J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996)にも記載されている。
【図４Ｂ−３】ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ３のヌクレオチド配列（配列番号：１３）及びその誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。これらの配列は、Bennett等、J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996)にも記載されている。
【図４Ｂ−４】ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ３のヌクレオチド配列（配列番号：１３）及びその誘導されるアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。これらの配列は、Bennett等、J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996)にも記載されている。
【図５】Ａｐｏ２Ｌ(＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ)又はＤＲ５モノクローナル抗体「ＤＲ５  ａｂ」(架橋あり「ＸＬ」又は架橋なし、＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ)のアポトーシス活性に対して感受性であるか抵抗性であるかについて、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）細胞株を分析して得たデータのＩＣ５０を図表にまとめたものである。
【図６】ＭＴＴ細胞障害性アッセイで測定した場合、Ａｐｏ２Ｌ(＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ)又はＤＲ５モノクローナル抗体「ＤＲ５  ａｂ」(架橋あり「ＸＬ」又は架橋なし、＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ)のアポトーシス活性に対して感受性であるか抵抗性であるかについて、膵臓癌細胞株を分析して得たデータのＩＣ５０を図表にまとめたものである。
【図７】ＭＴＴ細胞障害性アッセイで測定した場合、Ａｐｏ２Ｌ(＋１０％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」)又はＤＲ５モノクローナル抗体「ＤＲ５  ａｂ」(架橋あり「ＸＬ」又は架橋なし、＋１０％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」)のアポトーシス活性に対して感受性であるか抵抗性であるかについて、非ホジキンリンパ腫癌（「ＮＨＬ」）を分析して得たデータのＩＣ５０を図表にまとめたものである。
【図８Ａ】ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現によって測定した、ＤＲ５抗体に対する選択ＮＳＣＬＣ、膵臓、及びＮＨＬ癌細胞株の感受性（「ｓｅｎ」）又は抵抗性（「ＲＥＳ」）の比較と、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現との相関関係を示す。
【図８Ｂ】ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現によって測定した、ＤＲ５抗体に対する選択ＮＳＣＬＣ、膵臓、及びＮＨＬ癌細胞株の感受性（「ｓｅｎ」）又は抵抗性（「ＲＥＳ」）の比較と、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現との相関関係を示す。
【図９Ａ】ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡの発現パターンのレベルにより（降順に）並べた、様々なＮＳＣＬＣ、膵臓、及びＮＨＬ細胞株の棒グラフを示す。
【図９Ｂ】ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡの発現パターンのレベルにより（降順に）並べた、様々なＮＳＣＬＣ、膵臓、及びＮＨＬ細胞株の棒グラフを示す。
【図１０Ａ】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性及び抵抗性の癌細胞株における特定のＯ−グリコシル化酵素の異なる発現を示す。異なるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの用量を用いてインキュベートした後、細胞生存度を測定した。生存度を５０％低下させるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの濃度を用いて各細胞株のＩＣ５０を計算した。ウシ胎児血清が低い場合（０．５％）と高い場合（１０％）について、細胞生存度の実験を少なくとも３回繰り返した。黒、グレイ、又は白抜きの記号はそれぞれ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性が高い、中程度である、又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対して抵抗性であることを示す。
【図１０Ｂ】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性及び抵抗性の癌細胞株における特定のＯ−グリコシル化酵素の異なる発現を示す。膵臓及び悪性黒色腫細胞株におけるｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４  ｍＲＮＡの発現レベル（プローブセット２１９２７１＿ａｔ）を示す。細胞株は、組織種別及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性によって配置されている。黒、グレイ、又は白抜きの棒グラフは、Ａと同様の細胞株を示す。
【図１０Ｃ】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性及び抵抗性の癌細胞株における特定のＯ−グリコシル化酵素の異なる発現を示す。結腸直腸癌細胞株におけるＦｕｔ−６（上図、プローブセット２１１８８５＿ｘ＿ａｔ）及びｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３（下図、プローブセット２０３３９７＿ｓ＿ａｔ）のｍＲＮＡ発現レベルを示す。細胞株はＢと同様に配置されている。図Ｂ及びＣのＰ値は、細胞株の感受性（高度及び中程度）とカットオフを上回るｍＲＮＡ発現との相関関係のフィッシャー試験に基づいている。
【図１０Ｄ】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性及び抵抗性の癌細胞株における特定のＯ−グリコシル化酵素の異なる発現を示す。確立された腫瘍異種移植片の成長に対するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの影響を示す。ＧａｌＮＡｃＴ−３／Ｆｕｔ−６−陽性（左図）又はＧａｌＮＡｃＴ−３／Ｆｕｔ−６−陰性（右図）腫瘍を持つ無胸腺ヌードマウスに対し、溶媒又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（６０ｍｇ／ｋｇ／日で０−４日目に腹腔内注入）を投与し、腫瘍の容積をモニタリングした（平均±ＳＥ、Ｎ＝１０マウス／グループ）。
【図１１Ａ】特定のＯ−グリコシル化酵素の調節によるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性の変化を示す。Ｃｏｌｏ２０５細胞を、チンパンジーのＯ−グリコシル化酵素阻害剤ベンジル−ＧａｌＮＡｃ（ｂＧａｌＮＡｃ）とともにプレインキュベートし、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで２４時間に亘って処置し、細胞生存度を決定した（ＤＭＳＯ＝溶媒コントロール）。
【図１１Ｂ】特定のＯ−グリコシル化酵素の調節によるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性の変化を示す。カスパーゼ−８又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４のｓｉＲＮＡを４８時間に亘ってＰＳＮ−１（膵臓癌腫）及びＨｓ２９４Ｔ（黒色腫）細胞に形質移入し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとともに更に２４時間インキュベートし、細胞生存度を決定した。非標的配列（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）に対するｓｉＲＮＡ二本鎖をコントロールとして使用した（ＮＴＣ）。
【図１１Ｃ】特定のＯ−グリコシル化酵素の調節によるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性の変化を示す。ｓｉＲＮＡによりｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３又はＦｕｔ−６をＤＬＤ−１結腸直腸癌腫細胞に形質移入し、Ｂと同様に試験した。
【図１１Ｄ】特定のＯ−グリコシル化酵素の調節によるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性の変化を示す。ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４又はベクターコントロールと組み合わせて図示の遺伝子をコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入した。アネキシンＶ染色（左図）により、２４時間後にアポトーシスを測定した。Ｈ１５６９黒色腫細胞にｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４発現を促すレトロウイルス又はコントロールレトロウイルスを形質導入した。結果として得られた細胞株のプールを２４時間に亘ってＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処理し、細胞生存度を決定した（右図）。抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用して、エピトープタグを付けたｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４の発現を検証した。
【図１２Ａ】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによって誘発されたカスパーゼカスケードの分析を示す。ＰＳＮ−１及びＤＬＤ−１細胞に、それぞれｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４又はＦｕｔ−６に対するｓｉＲＮＡを４８時間に亘り形質移入した。４又は８時間に亘ってＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて細胞を処理し、カスパーゼ−８、Ｂｉｄ、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３、又は添加コントロールとしてのアクチンに特異的な抗体を用いた免疫ブロットにより細胞溶解物を分析した。
【図１２Ｂ】Ａと同様に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４のｓｉＲＮＡをＰＳＮ−１細胞に形質移入し、４時間に亘ってＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理を行い、細胞可溶化物におけるカスパーゼ−３／７酵素活性を決定した。
【図１２Ｃ】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  ＤＩＳＣの分析を示す。Ａと同様に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４のｓｉＲＮＡをＰＳＮ−１細胞に形質移入した。ＦＬＡＧ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１ｍｇ／ｍｌ）を０−６０分に亘って加え、細胞を溶解させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降を行った。免疫ブロットによりＤＩＳＣに随伴するＦＡＤＤ、カスパーゼ−８、ＤＲ４を検出した。
【図１２Ｄ】ＰＳＮ−１細胞に対し、Ｃと同様の形質移入、処理、及びＤＩＳＣ免疫沈降を行い、上述のようにしてＤＩＳＣに随伴するカスパーゼ−８の酵素活性を測定した（Sharp等、J. Biol. Chem., 280:19401 (2005)）。
【図１３Ａ】ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（パルス電流検出器と組み合わせた高性能陰イオン変換クロマトグラフィー）によって実施された、ＣＨＯ細胞中に生成された組換えヒトＤＲ５（Ｌｏｎｇスプライス変異体）の単糖分析を示す。
【図１３Ｂ】ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬレセプター（ヒトＤＲ５の長形４４０ａａ「ｈＤＲ５Ｌ」、ヒトＤＲ５の短形４１１ａａ型「ｈＤＲ５Ｓ」及びｈＤＲ４）、マウスＤＲ５（ｍＤＲ５）、ヒトＦａｓ（ｈＦａｓ）並びにヒトＴＮＦＲ１（ｈＴＮＦＲ１）の配列比較である。囲み内は推定上のＯ−グリコシル化部位を示す。
【図１３Ｃ】Ｄに対応する全体の細胞溶解物の免疫ブロット分析である。ＤＲ５Ｌ−５Ｔ及びＤＲ５Ｓ−５Ｔは、５のスレオニンからアラニンへの置換を含むコンストラクトであり、ＤＲ５Ｌ−５Ｔ３Ｓ及びＤＲ５Ｓ−５Ｔ３Ｓは、潜在的なＯ−グリコシル化部位である残基中に５のスレオニンからアラニンへの置換と３のセリンからアラニンへの置換をそれぞれ含むコンストラクトである。
【図１３Ｄ】図示のＤＲ５コンストラクトをベクター又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４プラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞に４８時間に亘って形質移入し、アネキシンＶ染色によってアポトーシスを測定した。
【図１３Ｅ】皮膚の癌（ＳＣＣ＝扁平上皮癌）、肺癌、膵臓癌（Ｐａｎｃ）、乳癌、卵巣癌（Ｏｖ）、子宮内膜癌（Ｅｎｄｏ）、膀胱癌（Ｂｌａ、ＴＣＣ＝移行上皮癌）及びＮＨＬ（ＦＬ＝濾胞性リンパ腫、ＤＬＢＣＬ＝びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）から採取した原発性ヒト腫瘍試料におけるｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４のｍＲＮＡ発現レベル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ、プローブセット２１９２７１＿ａｔ）を示す。各分類の試料の発現の中央値を水平な線で示す。図１０Ｂの細胞株のデータに対応して５００及び２００（黒色腫）のカットオフが示されている。
【図１４Ａ】４８時間のｓｉＲＮＡノックダウン後の、ＰＳＮ−１又はＤＬＤ−１細胞におけるｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３のｍＲＮＡ発現の低下を示すＴａｑｍａｎ分析である。
【図１４Ｂ】空のプラスミド（Ｅｍｐｔｙ）、野生型ＧａｌＮＡｃＴ−１４（ＧａｌＮＡｃＴ−１４）又はｓｉＧａｌＮＡｃＴ−１４（１）媒介によるｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４ノックダウン後のｓｉＲＮＡサイレント変異を含むＧａｌＮＡｃＴ−１４（ＧａｌＮＡｃＴ−１４ｓｉ（１）Ｍｕｔ）の形質移入により、ＰＳＮ−１細胞中に再構成されたＧａｌＮＡｃＴ−１４の発現を示す。
【図１４Ｃ】ＲＮＡの干渉によるｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３又はＦｕｔ−６の下方制御は、Ｃ１７０（結腸直腸癌）細胞におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性の細胞死を抑制した。実験手順は１１Ｃと同様である。（表１）Ａ）ｓｉＲＮＡノックダウン表現型をまとめた表である。ＧａｌＮＡｃＴ−１４又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３及びＦｕｔ−６の下方制御がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬからの保護となった細胞株には、試験した少なくとも一つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに関して、５０％未満の保護（＋）又は５０％を超える保護（＋＋）をマークした。（０）は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する保護が観察されなかったことを示す。
【図１４Ｄ】図示のｓｉＲＮＡにより４８時間のノックダウンを行った後、濃度を増大させながらエトポシド又はスタウロスポリンにより細胞を２４時間に亘って処理し、細胞生存度アッセイを行った結果を示す。
【図１４Ｅ】図示のｓｉＲＮＡにより４８時間のノックダウンを行った後、濃度を増大させながらエトポシド又はスタウロスポリン（ＳＴＳ）により細胞を２４時間に亘って処理し、細胞生存度アッセイを行った結果を示す。
【図１４Ｆ】ＰＡ−ＴＵ−８９０２及びＰＬ−４５細胞株のプールを過剰発現するレトロウイルスｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４に対し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理を行ってから細胞生存度アッセイを行った結果を示す。抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロット分析により、レトロウイルスがこれら細胞にｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４を発現することが示された。
【図１５Ａ】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性Ｃｏｌｏ２０５及び抵抗性結腸直腸癌細胞株である、ＰＫＯ及びＳＷ１４１７におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性のカスパーゼ活性化カスケードのウエスタンブロット分析を示す。細胞は、１０００ｎｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにより８時間及び２４時間に亘って処理し、全体の細胞溶解物に対し、カスパーゼ−８、Ｂｉｄ、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３及び添加コントロールとしてのアクチンに対して特異的な抗体を用いたウエスタンブロット分析を行った。
【図１５Ｂ】Ｆｕｔ−６のノックダウンにより、ＤＬＤ−１細胞中のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  ＤＩＳＣにおけるカスパーゼ−８の補充及び活性化が低減した。実験手順は１２Ｄに従った。
【図１５Ｃ−１】図示の遺伝子を用いてｓｉＲＮＡノックダウンを行った細胞におけるＤＲ４の細胞表面発現を、ＦＡＣＳ分析により測定したものである。
【図１５Ｃ−２】図示の遺伝子を用いてｓｉＲＮＡノックダウンを行った細胞におけるＤＲ５の細胞表面発現を、ＦＡＣＳ分析により測定したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
(発明の詳細な記載)
本明細書中に記載又は参照の技術及び手順は一般的に十分理解されるものであり、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の広く利用される分子クローニング方法論などの、当分野の技術者による従来の方法論を用いて通常行われるものである。好ましくは、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、プロトコル及び／又はパラメータを定義する製造者に従って一般的に行われる。
本方法やアッセを開示する前に、本発明は、ここに記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種や属、コンストラクト及び試薬に限定されるものではなく、変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書中で用いる用語は特定の実施態様のみを開示するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の権利範囲を限定するものでないことを理解されたい。
【００１６】
本明細書で用いられる及び添付の特許請求の範囲中の単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」には、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。ゆえに、例えば「一般的な変更」なる用語にはは複数の変更が含まれ、「プローブ」なる用語は一ないし複数のプローブ及び当分野の技術者に公知のその等価物及び前述のものを言及する。
本明細書中で引用するすべての出版物は、該出版物が引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するために、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中で引用する出版物は、本出願の提出日前の開示について言及するものである。発明者等は、早い優先日又はより前の発明日のために先行する出版物に権利が与えられないことが認められると解釈されるものではない。さらに、実際の出版日は明記されているものと異なり、個々に検証が必要であろう。
【００１７】
Ｉ．定義
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」、「Ａｐｏ-２Ｌ」、及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、図１に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１１４-２８１、９５-２８１、残基９２-２８１、残基９１-２８１、残基４１-２８１、残基１５-２８１、又は残基１-２８１、並びに上記配列の生物活性な断片、欠失、挿入又は置換変異体を含むポリペプチド配列を称するために、ここでは使用される。一実施態様において、ポリペプチド配列は、図１の残基１１４-２８１を含み、場合によっては図１の残基１１４-２８１からなる。場合によっては、ポリペプチド配列は、図１の残基９２-２８１又は残基９１-２８１を有する。Ａｐｏ-２Ｌポリペプチドは、図１に示す天然のヌクレオチド配列によりコードされ得る。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９(図１)をコードするコドンは、「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」であってよい。他の一実施態様では、断片又は変異体は生物学的に活性であり、列挙されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列の何れかと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、そして更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは、図１にて提供されるコード化ポリヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によりコードされる。本定義は、少なくとも一の天然アミノ酸がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの置換変異体を包含する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の置換変異体は、少なくとも一のアミノ酸がアラニン残基で置換されたものを包含する。これらの置換変異体には、例えば「Ｄ２０３Ａ」；「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」として同定されているものが含まれる。この命名は、(図１に示されるの番号を用いて)位置２０３、２１８及び／又は２６９で、アスパラギン酸残基がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を同定するのに使用される。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ変異体はＰＣＴ出願国際公開第０１／００８３２号に公開された表１に列挙されている、一又は複数のアラニン置換基を含有していてもよい。置換変異体には、２００１年１月４日に公開されている国際公開第０１／００８３２号の表１において同定されている、一又は複数の残基置換が含まれる。また本定義は、組換え又は合成法により調製されるか、又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ供給源から単離された、天然配列Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬも包含する。本発明のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬには、ＰＣＴ出願国際公開第９７／２５４２８号及び国際公開第９７／０１６３３号に開示されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドも含まれる。「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」又は「Ａｐｏ２Ｌ」なる用語は、一量体、二量体又は三量体形態のポリペプチドを含む、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ形態のものを一般的に称するために使用される。特に記載しない限りは、Ａｐｏ２Ｌに記載されているアミノ酸残基の全てのナンバリングが、図１のナンバリングに使用されている。例えば「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は、図１に付与された配列の位置２０３にあるアスパラ���ン酸残基を意味する。
【００１８】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン」又は「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ ＥＣＤ」なる用語は、膜貫通及び細胞質ドメインが本質的にないＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの形態を称する。通常、ＥＣＤはこのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満有している。本発明のポリペプチドとして同定される任意の膜貫通ドメイン(一又は複数)は、疎水性ドメインのタイプのものを同定するのに、当該分野で常套的に使用されている基準に従い同定されると理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は多様であるが、多くの場合は、最初同定されたドメインのいずれかの末端において、約５アミノ酸を超えないと思われる。好ましい実施態様において、ＥＣＤは、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインのない(膜に結合していない)ポリペプチドの、可溶性の細胞外ドメイン配列からなる。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の細胞外ドメインは、ＰＣＴ出願国際公開第９７／０１６３３号及び国際公開第９７／２５４２８号に記載されている。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ単量体」なる用語は、Ａｐｏ２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有鎖を称する。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ二量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ二量体」なる用語は、ジスルフィド結合を介して共有結合に連結した２つのＡｐｏ-２Ｌモノマーを称する。ここで使用される場合の用語には、独立したＡｐｏ２Ｌ二量体、及び三量体形態のＡｐｏ２Ｌ内にある二量体(すなわち、互いに結合した、第２のＡｐｏ２Ｌ単量体)が含まれる。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ三量体」なる用語は、非共有結合している３つのＡｐｏ２Ｌ単量体を称する。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ凝集体」なる用語は、自己結合した高級オリゴマー性形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体、さらには六量体及びナノ量体(nanomeric)の形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを形成するものを称するために使用する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体、二量体又は三量体(又は他の凝集体)の存在性及び量の決定は、当該分野で公知の方法及びアッセイ(市販されている物質を使用)、例えば天然サイズ排除ＨＰＬＣ(「ＳＥＣ」)、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する変性サイズ排除(「ＳＤＳ-ＳＥＣ」)、逆相ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動によりなされ得る。
【００１９】
「Ａｐｏ-２リガンドレセプター」は、当分野では、図２及び３それぞれに示すポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を有する「ＤＲ４」及び「ＤＲ５」として称されるレセプターを含む。Panらにより、「ＤＲ４」と呼ばれるTNFレセプターファミリーのメンバーが開示されている(Pan等, Science, 276:111-113, 1997年；また、１９９８年７月３０日公開のＷＯ９８／３２８５６；１９９９年７月２９日公開の国際公報９９／３７６８４；２０００年１２月７日公開の国際公報００／７３３４９；２００２年８月１３日発行の米国特許第６，４３３，１４７号；２００２年１０月８日発行の米国特許第６，４６１，８２３号及び、２００２年１月２９日発行の米国特許第６，３４２，３８３号を参照)。Sheridan等によるScience, 277:818-821(1997年)及びPan等によるScience, 277:815-818(1997年)には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの他のレセプターが開示されている(１９９８年１１月１９日公開の国際公報９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公報９８／４１６２９も参照)。このレセプターはＤＲ５と称される(あるいは、該レセプターはＡｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも称される；Screaton等, Curr. Biol., 7:693-696, 1997年；Walczak等, EMBO J., 16:5386-5387, 1997年；Wu等, Nature Genetics, 17:141-143, 1997年；１９９８年８月２０日公開の国際公報９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日公開の欧州特許第８７０，８２７号；１９９８年１０月２２日公開の国際公報９８／４６６４３；１９９９年１月２１日公開の国際公報９９／０２６５３；１９９９年２月２５日公開の国際公報９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公報９９／１１７９１；２００２年８月１３日公開の米国公開特許２００２／００７２０９１；２００１年１２月７日公開の米国公開特許２００２／００９８５５０；２００１年１２月６日発行の米国特許第６，３１３，２６９号；２００１年８月２日公開の米国公開特許２００１／００１０９２４；２００３年７月３日公開の米国公開特許２００３／０１２５５５４０；２００２年１０月３１日公開の米国公開特許２００２／０１６０４４６、２００２年４月２５日公開の米国公開特許２００２／００４８７８５；２００３年５月２７日発行の米国特許第６，５６９，６４２号；２０００年６月６日発行の米国特許第６，０７２，０４７号；２００３年１１月４日発行の米国特許第６，６４２，３５８号参照)。上記のように、Ａｐｏ−２Ｌの他のレセプターはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧを含む(Sheridan等., 上掲；Marsters 等., 上掲；及びSimonet 等.,上掲)。ここで用いられるところの「Ａｐｏ−２Ｌレセプター」という用語は、天然配列レセプターとレセプター変異体を包含する。これらの用語はヒトを含む様々な哺乳動物で発現されるＡｐｏ−２Ｌレセプターを包含する。Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、多くのヒト組織株で自然に起こるように内在的に発現されてもよいし、あるいは組換え又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」には、天然由来のＡｐｏ−２Ｌレセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。ゆえに、天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、任意の動物由来の天然に生じるＡｐｏ−２Ｌレセ��ターのアミノ酸配列を持ちうる。そのような天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、天然から単離してもよいし、組み換え又は合成手法により生成することもできる。特に、「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」なる用語は、天然に生じる切断型又は分泌型のレセプター(例えば、可溶型を含む、さらには細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)、及び天然に生じる対立変異型を包含する。レセプター変異型は天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターの断片又は欠損変異型を含みうる。図３Ａは１９９８年１１月１９日公開の国際公報９８／５１７９３に公開されたヒトＤＲ５の４１１アミノ酸配列を示す。ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異体は当分野で公知である。このＤＲ５スプライシング変異体は、１９９８年８月２０日に公開の国際公報９８／３５９８６に公開された図３Ｂ及び図３Ｃに示すヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列をコードする。
【００２０】
「デスレセプター抗体」は、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーであり、アポトーシスをシグナル伝達することができるデスドメインを含有するレセプターに対する抗体(一ないし複数)を一般的に意味するものであり、このような抗体にはＤＲ５抗体及びＤＲ４抗体が含まれる。
「ＤＲ５レセプター抗体」、「ＤＲ５抗体」又は「抗ＤＲ５抗体」とは、広義で、図３Ａに示される１−４１１配列又は図３Ｂ−３Ｃに示される１−４４０配列等のＤＲ５レセプター、或いはその細胞外ドメインの少なくとも一形態に結合する抗体を意味する。場合によっては、ＤＲ５抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。好ましくは、異種性配列は抗体がより高次の複合体又はオリゴマー複合体を形成させる又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ５抗体はＤＲ５レセプターに結合するが、任意の付加的なＡｐｏ-２Ｌレセプター(例えばＤＲ４、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２)と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである。
場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの測定による約０．１ｎＭから約２０ｍＭの範囲の濃度でＤＲ５レセプターに結合する。場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの測定による約０．６ｎＭから約１８ｍＭのＩＣ５０値を示す。
【００２１】
「ＤＲ４レセプター抗体」、「ＤＲ４抗体」又は「抗ＤＲ４抗体」とは、広義で、ＤＲ４レセプター又はその細胞外ドメインの少なくとも一形態に結合する抗体を意味する。場合によっては、ＤＲ４抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。好ましくは、異種性配列は抗体がより高次の複合体又はオリゴマー複合体を形成させる又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ４抗体はＤＲ４レセプターに結合するが、任意の付加的なＡｐｏ-２Ｌレセプター(例えばＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２)と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ４シグナル伝達活性のアゴニストである。
場合によっては、本発明のＤＲ４抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの測定による約０．１ｎＭから約２０ｍＭの範囲の濃度でＤＲ４レセプターに結合する。場合によっては、本発明のＤＲ４抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの測定による約０．６ｎＭから約１８ｍＭのＩＣ５０値を示す。
「アゴニスト」なる用語は広義で用いられ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化する任意の分子を含む。このような生物学的活性の例には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの、ＤＲ４又はＤＲ５への結合、アポトーシス並びに更に文献に報告されているものが含まれる。アゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を起こすＤＲ４ないしＤＲ５への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでのＤＲ４ないしＤＲ５の一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために機能するかもしれない。また、アゴニストは、例えば、ＤＲ４又はＤＲ５の活性化ないしシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果としてのＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために間接的に機能するかもしれない。アゴニストは、ＤＲ４ないしＤＲ５の活性化ないし活性を亢進又は増強するように間接的に機能するエンハンサー分子として働きうることが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物の内因性のＡｐｏ−２Ｌの活性を亢進しうる。例えば、これはＤＲ４ないしＤＲ５をプレ複合体化することによって、ないし、ＤＲ４ないしＤＲ５レセプターとのそれぞれのリガンドの複合体を安定化することによって達成することができる(Ａｐｏ−２ＬとＤＲ４ないしＤＲ５との天然複合体型を安定化するなど)。
【００２２】
本出願中で用いられる「バイオマーカー」なる用語は一般的に、遺伝子、タンパク質、糖質構造又は糖脂質を含む分子を指し、哺乳動物組織又は細胞中ないしは組織又は細胞上での該分子の発現は標準的な方法(又は本明細書中で開示される方法)によって検出されうるものであり、哺乳動物細胞又は組織のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬないしはデスレセプター抗体への感受性を予測するものである。本発明で考慮されるこのようなバイオマーカーには、限定するものではないが、タンパク質のＧａｌＮａｃ−Ｔファミリーに含まれる分子が含まれる。遺伝子及びタンパク質のヒトＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（「ＧａｌＮａｃ−Ｔ」）ファミリーのメンバーが開示されており（例えば、Hang等、"The chemistry and biology of mucin-type O-linked glycosylation initiated by the polypeptide N-acetyl-galactosaminyltransferases", Bioorganic & Medicinal Chemistry (2005年5月www.sciencedirect.comにおいて閲覧可能)、及びそれに引用される参考文献；Weng等、BBRC、300:738-744(2003)及びそれに引用される参考文献参照）、タンパク質におけるＯ結合型糖鎖の数及び位置の決定に機能すると考えられる。場合によっては、このようなバイオマーカーの発現は、コントロール組織又は細胞試料に観察されるものよりも高く測定される。場合によっては、例えば、このようなバイオマーカーの発現は、遺伝子発現マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ又は免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを用いて決定される。場合によっては、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４又はＧａｌＮａｃ−Ｔ３等のＧａｌＮａｃ−Ｔバイオマーカーの発現は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ｐマイクロアレイ分析によって測定する場合、少なくとも７５０のレベルで検出され、定量的ＰＣＲを用いて該バイオマーカーの発現を検出する場合、コントロール組織又は細胞試料に観察されるものの少なくとも５００倍、好ましくは少なくとも１０００倍が試験組織又は細胞試料において検出される。
【００２３】
本明細書において使用される「ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド  Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−Ｔ１４」、「ｐｐ−ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４」、「ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４」、「ＧＡＬＮＴ１４」は、Ｎ−末端細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、基部領域及び触媒ドメインを含む分子のＧａｌＮａｃ−Ｔファミリーの特徴的性質を有する２型膜タンパク質を指す。随意的実施態様では、ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ１４分子は、図４Ａに示すように、５５２アミノ酸タンパク質をコードする１６５９の塩基対を含む。完全長ヒトｃＤＮＡは、受入番号ＡＢ０７８１４４としてＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。Wang等、BBRC, 300:738-744 (2003)に開示されているように、エクソン２、３、及び／又は４等の特定のエクソンを含む（又は含まない）ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のスプライスされたアイソフォームが同定されている。本発明は、そのようなＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の様々なアイソフォームのいずれかの発現を試験すること、及びそのようなアイソフォームのいずれか一つの発現によって、哺乳動物の組織又は細胞試料の、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体に対する感受性を予測することを考慮する。
本明細書において使用される「ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド  Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−Ｔ３」、「ｐｐ−ＧａｌＮａｃ−Ｔ３」、「ＧａｌＮａｃ−Ｔ３」、「ＧＡＬＮＴ３」は、Ｎ−末端細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、基部領域及び触媒ドメインを含む分子のＧａｌＮａｃ−Ｔファミリーの特徴的性質を有する２型膜タンパク質を指す。随意的実施態様では、ヒトＧａｌＮａｃ−Ｔ３ポリペプチドは、図４Ｂに示すアミノ酸配列を含む。ＧａｌＮａｃ−Ｔ３はさらにBennett等、J. Biol. Chemistry, 271:17006-17012 (1996)に記載されている。
【００２４】
「被検体」又は「患者」は、ヒトを含む、治療が望まれる任意の単一の被検体を意味する。また、臨床試験に用いられる疾患の臨床的な特徴を全く示さない任意の被検体、又は疫学的な研究に用いられる被検体、又はコントロールとして用いられる被検体も被検体に含まれる。
本明細書中で用いられる「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物と分類される任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを意味する。本発明の好適な実施態様では、哺乳動物がヒトである。
「組織又は細胞試料」は、被検体又は患者の組織から採取された同種の細胞の集まりを意味する。組織又は細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織試料又は生検又は吸引による固形組織；血液又は血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってもよい。また、組織試料は原発性又は培養した細胞又は細胞株であってもよい。場合によっては、組織又は細胞試料は原発性腫瘍又は転移性腫瘍から得られる。組織試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。
【００２５】
本明細書中の組織試料の「切断部分」とは、組織試料の一部又は一片、例えば組織試料から切り出した組織又は細胞の一薄片を意味する。本発明は、組織試料の同じ切断部分が形態学的及び分子的レベルで分析されるか、タンパク質及び核酸の両方に関して分析される方法を含むと理解されるならば、組織試料の複数の切断部分は採取され、本発明の分析に供されうることが理解される。
「相関」又は「相関する」は、任意の方法で、第一の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果を、第二の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコルを行う際に第一の分析又はプロトコルの結果を用いてもよいし、第一の分析又はプロトコルの結果を用いて、第二の分析又はプロトコルを行うかどうかを決定してもよい。本明細書の様々な実施態様に関し、ｍＲＮＡ発現等の分析アッセイの結果、又はＩＨＣの結果を用いて、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体を使用する特定の治療計画を実行するかどうかを決定してもよい。
「核酸」は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡを含むことを意味する。例えば、染色体性核酸、ミトコンドリア核酸、ウイルス核酸及び／又は細菌性核酸が組織試料中に存在する。「核酸」なる用語は、二本鎖の核酸分子の何れか又は両鎖を包含し、原型の核酸分子の任意の断片又は部分を包含する。
【００２６】
「遺伝子」は、タンパク質をコードする又は転写する、あるいは他の遺伝子発現を調節する際に機能的に働く任意の核酸配列又はその一部を意味する。遺伝子は、機能的なタンパク質のコード化を担うすべての核酸又はタンパク質のコードあるいは発現を担う核酸の一部のみを構成してもよい。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始領域又は終末領域、プロモータ配列、他の調節配列又は遺伝子に近接する特定の領域内に遺伝的な異常を含有してもよい。
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【００２７】
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成した多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
【００２８】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００２９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００３０】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷の抗体には５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス(イソ型)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００３１】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公報９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
【００３２】
ここで言うモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似するものである(米国特許第4,816,567号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む(米国特許第５，６９３，７８０号)。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリン(免疫グロブリン)に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ヒト免疫グロブリン配列の高頻度可変ループがＦＲのすべて又は実質的にすべてである少なくとも一又は一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００３３】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
目的の抗原に「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬又は診断剤として有用となるように十分な親和性及び／又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
ここでの目的のための「免疫治療」とは、抗体を用いた哺乳動物(好ましくはヒト患者)の治療方法を意味し、この抗体はコンジュゲートされたもの又は「ネイキッド」抗体でもよいし、又は一又は複数の細胞障害性剤などの薬剤やヘテロ分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲート」を生成してもよい。
【００３４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、抗体が９５重量％より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「有効量」という用語は、疑われる疾患又は症状を予防、寛解又は治療するのに効果的な薬剤(例えば、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、抗ＤＲ４抗体又は抗ＤＲ５抗体など)の量を意味する。
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ本質的には周期的に治療することを称する。
【００３５】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１７等のインターロイキン(ＩＬ)；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質を称する。この用語は放射性アイソトープ(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６)、化学療法剤、及び細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素等の毒素又はその断片を含むことが意図されている。
【００３６】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXANTM)のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin )；デュカロマイシン(duocarmycin )(合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin )；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin )；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンフィーＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；ビスホスホナート類、例えばクロドロナート；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カリミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(アドリアマイシンＴＭ)(モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン(mitomycins)、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、及びドキセタキセル(タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)(GemzarTM)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イフォスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)(NavelbineTM)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；エダトレキサート(edatrexate)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチ��イン酸等のレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン(NolvadexTMを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FarestonTM)を含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(SERMs)；副腎におけるエストロゲン生成を調節する、アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼインヒビター、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、酢酸メゲステロール(MegaceTM)、エグゼメスタン(exemestane)、ホルメスタン(formestane)、ファドロゾール、ボロゾール(vorozole)(RivisorTM)、レトロゾール(letrozole)(FemaraTM)、及びアナストロゾール(anastrozole)(ArimidexTM)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００３７】
ここで使用される場合の「増殖阻害剤」なる用語は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、ここで同定された任意の遺伝子が発現する細胞、特に癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。よって、増殖阻害剤とは、Ｓ期において、このような細胞が発現する細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。増殖阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ期以外の場所において)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、TAXOL、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を称する。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はＭＴＴアッセイ)、ＦＡＣＳ分析、カスパーゼ活性化、ＤＮＡ断片化(例えば、Nicolettiら, J. Immunol. Methods, 139：271-279(1991)を参照)、ポリ-ＡＤＰリボースポリメラーゼ、「ＰＡＲＰ」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
【００３８】
ここで使用される場合、「疾患」なる用語は、本明細書に記載の組成物による治療により利益を得る任意の症状を指し、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、抗ＤＲ４抗体、及び／又は抗ＤＲ５抗体により治療されうる任意の疾患又は疾病を含む。これには、慢性及び急性の疾患、並びに問題の疾患に哺乳動物を罹患させやすくする病理状態が含まれる。ここで治療される疾患の非限定的例には、良性及び悪性の腫瘍；炎症、血管由来及び免疫学的疾患、自己免疫疾患、関節炎(関節リウマチを含む)、多発性硬化症、及びＨＩＶ／ＡＩＤＳが含まれる。
「癌」、「癌性」又は「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、及び肉腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、消化器系(管)癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、メラノーマ、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形成膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、結腸癌、及び頭頸部の癌が含まれる。
【００３９】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、及び免疫欠損症が含まれる。そのうちの一部が免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症性筋疾患(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症)、自己免疫性血小板減少症(溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症)、甲状腺炎(バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、糖尿病、免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患等の炎症性及び線維性肺疾患(潰瘍性大腸炎：クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、ＡＩＤＳ(ＨＩＶ感染)、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
【００４０】
本明細書の「自己免疫疾患」という語は広義で使用され、一般的な意味で、自己の組織成分に対する個体の体液性又は細胞性免疫反応から正常又は健康な組織の破壊が生じる、哺乳動物の障害、又は状態を指す。例として、これらに限定するものではないが、エリテマトーデス、甲状腺炎、リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、及び炎症性腸疾患(ＩＢＤ)が挙げられる。
ここで使用される場合の「タグ化」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合した、抗体、又はポリペプチドを含有するキメラ分子を称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生するエピトープを提供するか、又はオリゴマー化(例えば、ロイシンジッパードメインを有するペプチドと生じるような)等の他のいくつかの機能を提供するのに十分な残基を有しているが、その長さは、一般的に抗体又はポリペプチドの活性を阻害しないよう十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、タグ特異性抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
【００４１】
「二価の金属イオン」なる用語は、２つの正電荷を有する金属イオンを称する。限定するものでないが、二価の金属イオンの例には、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム及びマンガンが含まれる。使用され得るこのような金属の特定の形態には塩の形態(例えば、製薬的に許容可能な塩の形態)、上述した二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩の形態のものが含まれる。場合によっては、本発明で使用される二価の金属イオンは亜鉛、好ましくは硫酸亜鉛又は塩化亜鉛等の塩の形態をしている。
「単離された」とは、ここで開示された種々のペプチド又はタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたペプチド又はタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ペプチド又はタンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分なほど、又は(３)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように十分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された材料には、組換え細胞内のインサイツのペプチド又はタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたペプチド又はタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００４２】
ここで同定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムALINE-2を用いて得ることができる。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, CAを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェント」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より相対的に高い温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェントを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェントの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００４３】
ここで定義される「高度のストリンジェント条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる；５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；(２)ハイブリダイゼーション中に変性剤を用いる；４２℃で、５０％(v/v)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用いて、４２℃で０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)及び５５℃の５０％ホルムアミド中にて洗浄、次いでＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣにて５５℃で高ストリンジェントな洗浄を行うことによって同定され得る。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, New York：Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にておよそ３７−５０℃でのフィルターの洗浄を含む。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させるために必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００４４】
「プライマー」又は「複数のプライマー」なる用語は、相補的なＲＮＡ又はＤＮＡ標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、例えばポリメラーゼ連鎖反応で起こるような、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの働きによってモノヌクレオチドからポリヌクレオチドの段階的な合成の開始点となるオリゴヌクレオチド配列を指す。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００４５】
「抗体依存性細胞障害活性」又は「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
【００４６】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Hasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。本明細書中のＦｃＲはＦｃγＲIIIａをコードする遺伝子内に遺伝的二形性などの多型を含有し、それによってＩｇＧ１に結合するレセプターの領域内に位置するアミノ酸位置１５８がフェニルアラニン(Ｆ)又はバリン(Ｖ)となる。ホモ接合体バリンＦｃγＲIIIａ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｖ)は、ホモ接合体フェニルアラニンＦｃγＲIIIａ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｆ)又はヘテロ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｆ／Ｖ)レセプターと比較してインビトロでのＡＤＣＣ媒介を増加し、ヒトＩｇＧ１に対する親和性も高いことが示された。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した分子(例えば、抗体)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【００４７】
ＩＩ．本発明の例示的材料及び方法
本明細書に開示される発明は、哺乳動物組織又は細胞試料における一又は複数のバイオマーカーの発現の決定に関するものであり、この前記一又は複数のバイオマーカーの発現の測定により該組織又は細胞試料がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬなどの薬剤及び／又は抗ＤＲ５アゴニスト抗体又は抗ＤＲ４アゴニスト抗体などのデスレセプター抗体に対して感受性であるか否かを予測するものである。該方法及びアッセイには、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４及びＧａｌＮａｃ−Ｔ３を含む分子のＧａｌＮａｃ−Ｔファミリーのメンバーの発現を検査するものが含まれる。
上記のように、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体の影響を含む細胞死に抵抗性がある罹患したヒト細胞種類の集団がある(癌細胞の特定の集団など)。したがって、開示した方法及びアッセイは、治療中の患者にとって好ましいあるいは効果的な治療を評価する際に有用なデータ及び情報を得るために、便利で、効率的で、費用効率のよい可能性がある方法を提供すると思われる。例えば、癌又は免疫関連症状であると診断されている患者は組織又は細胞試料を得るために行われる生検を有し、該試料は様々なインビトロのアッセイによって検査され、患者の細胞がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬやデスレセプター抗体などの治療的試薬に感受性であるかどうかを決定することができる。
【００４８】
本発明は、哺乳動物組織又は細胞試料(癌細胞など)のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬやデスレセプターアゴニスト抗体に対する感受性を予測するための方法を提供する。場合によっては、哺乳動物組織又は細胞試料が採取され、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現について試験される。前記方法は、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現を検出するアッセイ（たとえば免疫組織化学アッセイ）、及び酵素のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を検出する生化学的アッセイを含む、様々なアッセイ様式で行われうる。そのような組織又は細胞がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及び／又はデスレセプター抗体の生物学的効果に対して感受性であることが、前記組織又は細胞における（又は前記組織又は細胞上の）それらのＧａｌＮａｃ−Ｔ１４バイオマーカーの発現の決定により予測されうる。驚くべきことに、出願人は、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現が、このような組織及び細胞のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びデスレセプターアゴニスト抗体に対する感受性と相関することを発見した。
【００４９】
後述するように、試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４などの様々なバイオマーカーの発現は、当分野で公知であり当業者に理解される多くの方法によって分析することができ、その方法には、免疫組織化学及び／又はウエスタンブロッティング、定量的血液ベースのアッセイ(例えば、血清ＥＬＩＳＡ)(例えば、タンパク質発現のレベルを調べるためのもの)、生化学酵素活性アッセイ、インサイツハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡのノーザン分析及び／又はＰＣＲ分析、及びゲノムのサザン分析(例えば、遺伝子欠損又は遺伝子増幅を調べるためのもの)、並びに遺伝子及び／又は組織アレイ分析によって行われうる多種多様なアッセイの何か一つが含まれるが、これらに限定するものではない。遺伝子の状態及び遺伝子産物を評価するための典型的なプロトコルは、例えばAusubel 等 編集, 1995, Current Protocols In Molecular Biology中のユニット２(ノーザンブロッティング)、４(サザンブロッティング)、１５(イムノブロッティング)及び１８(ＰＣＲ分析)にみられる。
試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の検出に関するプロトコルを、例示として以下に挙げる。
【００５０】
本発明の好適な方法には、哺乳動物組織又は細胞試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の存在について試験するあるいは検査するプロトコルが含まれる。ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４を検出するために様々な方法を用いることができ、その中には例えば免疫組織化学的分析方法、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞分類法(ＦＡＣＳ)、及び免疫沈降後のＭＳ、単糖分析などがある。例えば、組織又は試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出する好適な方法は、該試料を抗ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４抗体と接触させ、次いで、該試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４への抗体の結合を検出することを含む。
本発明の特定の実施態様では、試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を免疫組織化学法及び染色プロトコルを用いて検査する。組織切片の免疫組織化学的染色は、試料中のタンパク質の存在を評価ないしは検出するための確実な方法であることが示されている。免疫組織学法(「ＩＨＣ」)技術は、抗体を用いて、一般的には色素生産性方法又は蛍光性方法によって、インサイツで細胞性抗原を探索して視覚化する。
【００５１】
試料の調製では、哺乳動物(典型的にはヒト患者)の組織又は細胞試料を用いてもよい。試料の例として、大腸、乳房、前立腺、卵巣、肺、胃、膵臓、リンパ系及び白血球癌細胞などの癌細胞が含まれるが、これらに限定するものではない。場合によって試料には、非小細胞肺癌細胞、膵臓癌細胞又は非ホジキンリンパ腫癌細胞が含まれる。前記試料は、当分野で公知の様々な手順、限定するものではないが、外科的切除、吸引又は生検などによって採取することができる。組織は新鮮なものでも凍結したものでもよい。一実施態様では、前記試料は固定し、パラフィンなどに包埋する。
前記組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい(例として、“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,” 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.を参照)。当分野の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する試料の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の技術者は、組織試料の大きさ及び用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。実施例では、中性緩衝ホルマリン、ブアン固定液又はパラホルムアルデヒドを用いて試料を固定してもよい。
【００５２】
通常、まず試料を固定し、次いで段階的に増加させたアルコールによって、脱水し、パラフィン又は他の切片溶液に浸透させて包埋し、組織試料を切断できるようにする。別法として、組織を切断して、得られた切片を固定してもよい。例として、従来の方法によって、組織試料を包埋して、パラフィンで処理してもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。使用されうるパラフィンの例として、Paraplast、Broloid及びTissuemayがあるが、これらに限定するものではない。組織試料を包埋すると、試料をミクロトーム等によって、切断してもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。この手順の例として、切片はおよそ３ミクロンからおよそ５ミクロンの範囲の厚さでよい。切断すると、いくつかの標準的な方法によって、切片をスライドに付着させてもよい。スライド接着剤の例として、シラン、ゼラチン、ポリ‐Ｌ‐リジンなどがあるが、これに限定されるものではない。例として、パラフィン包埋切片は、正に荷電したスライド及び／又はポリ‐Ｌ‐リジンでコートしたスライドに付着させてもよい。
包埋材料としてパラフィンを用いた場合、組織切片は通常、脱パラフィン化して、水に再水和させる。組織切片は、いくつかの従来の標準的な方法によって、脱パラフィン化してもよい。例えば、キシレン及び段階的に減少するアルコールを用いてもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。別法として、Ｈｅｍｏ-Ｄｅ７(CMS, Houston, Texas)などの市販の脱パラフィン化非有機薬剤が用いられてもよい。
【００５３】
場合によって、試料の調整の後に、組織切片をＩＨＣを用いて分析してもよい。ＩＨＣは、形態学的染色及び／又は蛍光発光インサイツハイブリダイゼーションなどの付加的な技術と組み合わせて行ってもよい。ＩＨＣの直接アッセイ及び間接アッセイの２つの一般的な方法が有用である。第一のアッセイでは、標的抗原(例えばＧａｌＮａｃ−Ｔ１４)に対する抗体の結合は、直接的に測定される。この直接アッセイは、更なる抗体相互作用を必要とせずに可視化されうる酵素標識一次抗体又は蛍光タグ付加一次抗体などの標識された試薬を用いる。代表的な間接アッセイでは、コンジュゲートしていない一次抗体が抗原と結合し、次いで標識された二次抗体が一次抗体と結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートする場合、抗原を視覚化させるために色素生産性基質ないしは蛍光発生基質が加えられる。二次抗体の中には一次抗体上の異なるエピトープと反応するものもあるので、シグナルの増幅が起こる。
一般的に、免疫組織化学に使用する一次及び／又は二次抗体は、検出可能な成分にて標識されるであろう。通常、以下の種類に分類できる多くの標識が利用可能である：
【００５４】
(ａ)ラジオアイソトープ、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ。抗体は例えばImmunology, Volumes 1 and 2, Coligen 等, 編集 Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を用いて放射性同位体にて標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
(ｂ)コロイド金粒子
(ｃ)希有土類キレート(ユウロピウムキレート)、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコクリセリン(phycocrytherin)、フィコシアニン又はＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ7及びＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ7などの市販の蛍光体及び／又は上記の何れか一ないしは複数の誘導体を含むが、これらに限定されるものではない蛍光標識。蛍光標識は、例えば、上記のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
(ｄ)様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４,２７５,１４９号にはこの概説がある。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる(例えば化学発光計測器を用いて)か、又はエネルギーを蛍光アクセプターに与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４,７３７,４５６号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環のオキシダーゼ(例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivanら., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【００５５】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
(i)基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆体(例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン(ＯＰＤ)又は3,3',5,5'テトラメチルのベンジジン塩酸塩(ＴＭＢ))を酸化する；
(ii)色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ(ＡＰ)；及び
(iii)色素生産性基質(例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)又は蛍光発生基質(例えば、4-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)を有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ(β-Ｄ-Ｇａｌ)。
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４,２７５,１４９号及び４，３１８，９８０を参照。標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は当分野の技術者に公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな４つの分類のうちの何れかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテンとコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体とコンジュゲートさせる。したがって、抗体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる。
【００５６】
上記の試料調製手順以外に、ＩＨＣ前、ＩＨＣの間又はＩＨＣ後に組織切片の更なる処置が所望されてもよい。例えば、クエン酸塩バッファ中で組織サンプルを加熱するなどのエピトープ検索方法が実施されてもよい(例として、Leong 等 Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)を参照)。
場合によって行うブロック処置の後に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原と結合するような好適な条件下と十分な時間、組織切片を一次抗体に曝露させる。これを達成するための好適な条件は慣例的な実験によって決定できる。試料に対する抗体の結合の範囲は、上記の検出可能な標識の何れか一つを用いて決定される。標識は、3,3'-ジアミノベンジジンクロモゲンなどの色素生産性基質の化学変化を触媒する酵素標識(例えばＨＲＰＯ)であることが望ましい。好ましくは、酵素標識は、一次抗体(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせる。
場合によって、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出するためにＩＨＣ分析法で使用される抗体は、抗ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４抗体である。別法として、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４と交差反応性を有するほかのＧａｌＮａｃ−Ｔ抗原に対する抗体を使用してもよい。場合によって、抗ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４抗体はモノクローナル抗体である。
【００５７】
したがって、調製される検査材料はマウントしてカバーグラスをかけてもよい。その後、例えば顕微鏡を使用してスライドの評価を行い、当分野で通常用いられる染色強度判定基準を用いてもよい。染色強度判定基準は以下の通りに評価してもよい：
表１
2014237673.tif 000002
【００５８】
一般的に、ＩＨＣアッセイの２＋又はそれ以上の染色パターンスコアは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体に対する哺乳動物細胞(例えば哺乳動物癌細胞)の感受性を予測するないしは示していると考えられる。
別法では、試料を、抗体-バイオマーカー複合体が形成するために十分な条件下で該バイオマーカーに特異的な抗体と接触させ、次いで該複合体を検出してもよい。バイオマーカーの存在は、多くの方法、血漿又は血清を含む多種多様な組織及び試料を検定するためのウエスタンブロッティング（免疫沈降を含んでも含まなくてもよい）及びＥＬＩＳＡ手順によって、検定してもよい。このようなアッセイ様式を用いた広範囲にわたるイムノアッセイ技術は利用可能である。米国特許第４，０１６，０４３号、同第４，４２４，２７９号及び同第４，０１８，６５３号参照。これらには、単一の部位及び２-部位の両方、あるいは非競合型の「サンドイッチ」アッセイ、並びに従来の競合的結合アッセイが含まれる。また、これらのアッセイには、標的バイオマーカーに対する標識抗体の直接結合が含まれる。
サンドイッチアッセイは最も有用なものの一つで、一般的に用いられるアッセイである。サンドイッチアッセイ技術には多くのバリエーションあり、そのすべては本発明により包含されることを目的とする。簡潔には、代表的な最近のアッセイでは、非標識抗体を固体基板上に固定して、試験する試料を結合した分子に接触させる。抗体-抗原複合体が形成されるくらいの適当な期間インキュベートした後、検出可能なシグナルを産生できるレポーター分子で標識した、抗原特異的な第二抗体を添加して、更なる抗体-抗原-標識抗体の複合体が形成されるために十分な時間インキュベートする。反応しなかった材料を洗い流し、レポーター分子により産生されるシグナルを観察することによって抗原の存在を決定する。結果は、可視的なシグナルを単純に観察したものであれば質的なものであり、バイオマーカーを既知量含有するコントロール試料と比較したものであれば量的なものである。
【００５９】
前記のアッセイへのバリエーションには、試料及び標識抗体の両方を結合した抗体に同時に添加する同時アッセイなどがある。これらの技術は当分野の技術者には公知であり、多少のバリエーションが加えられることは容易に明らかであろう。代表的な近年のサンドイッチアッセイでは、バイオマーカーに対して特異性を有する第一抗体は固形表面に共有結合するか受動的に結合する。固形表面は一般的にガラス又はポリマーであり、最も一般的に用いられるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固形支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートの皿、又はイムノアッセイを行うために適切な他の任意の表面の形態でもあってもよい。結合方法は従来技術において周知であり、一般に、架橋性共有結合又は物理的な吸着から成り、ポリマー-抗体複合体は試験試料の調整において洗浄される。次いで、試験される試料の分割量を固相複合体に添加し、抗体中に存在する任意のサブユニットが結合するために十分な時間(例えば、より便利であるならば２〜４０分又は前夜)と適切な条件(例えば室温から４０℃、例えば２５℃から３２℃の間)下でインキュベートする。インキュベーションの後、抗体サブユニット固相を洗浄して、乾燥させ、一部のバイオマーカーに特異的な二次抗体とともにインキュベートする。二次抗体は、分子マーカーへの二次抗体の結合を表すために用いられるレポーター分子に結合させる。
別法では、試料中の標的バイオマーカーを固定して、その後レポーター分子にて標識しているか又は標識していない特異的抗体に固定された標的を曝すことを伴う。標的の量及びレポーター分子シグナルの強度に応じて、結合した標的は、抗体で直接標識することによって、検出可能でありうる。あるいは、一次抗体に特異的な二次標識抗体を標的-一次抗体複合体に曝して、標的-一次抗体-二次抗体の三位複合体を形成させる。複合体は、レポーター分子により発されるシグナルにより検出される。本明細書中で用いられる「レポーター分子」は、その化学的性質によって、抗原と結合した抗体を検出するための分析して同定可能となるシグナルを提供する分子を意味する。この種のアッセイにおいて、最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光体又は分子を含有する放射性核種(すなわち放射性同位体)及び化学発光分子である。
【００６０】
酵素イムノアッセイの場合、一般にグルタールアルデヒド又は過ヨウ素酸塩によって、酵素を二次抗体にコンジュゲートさせる。しかしながら、容易に認識されるように、技術者に容易に利用可能である多種多様な異なるコンジュゲート技術が存在する。一般的に用いられる酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ−中でもガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼなどがある。特定の酵素と共に用いられる基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解の際に生じる検出可能な色の変化で選択する。適切な酵素の例として、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼなどがある。また、上記の色素生産性基質よりも蛍光性産物を産生する蛍光性基質を用いることができる。すべての例において、酵素標識抗体を一次抗体-分子マーカー複合体に加えて、結合させ、次いで過剰な試薬を洗い流す。次いで、適当な基質を含有する溶液を抗体-抗原-抗体の複合体に加える。基質は二次抗体と結合した酵素と反応して、通常は分光測定法による量的なものでもある定性的な可視化シグナルを生じ、試料中に存在するバイオマーカーの量を表す。あるいは、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光性化合物を、抗体の結合能を変化させることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光を照射することにより活性化されると、蛍光色素標識抗体はその光エネルギーを吸収し、それによリその分子において励起状態が誘発され、続いて光学顕微鏡を用いて目視で検出可能な特徴的な色で光が放射される。ＥＩＡでは、蛍光標識抗体は、一次抗体-分子マーカー複合体に結合できる。結合していない試薬を洗い落とした後に、残りの三位複合体を適当な波長の光に曝すと、対象の分子マーカーの存在を示す蛍光発光が観察される。免疫蛍光法及びＥＩＡ技術は何れも、当分野で非常に確立されたものである。しかしながら、放射性同位体、化学発光性分子又は生物発光性分子などの他のレポーター分子も用いられてもよい。
【００６１】
また、上記の技術が、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出するために用いられうることも包含される。
本発明の方法は、組織又は細胞試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡの存在及び／又は発現を調べる手順を更に含む。細胞中のｍＲＮＡの評価方法は公知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、標識したＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のリボプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連した技術)及び様々な核酸増幅アッセイ(例えば、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４に特異的な相補的プライマーを用いたＲＴ-ＰＣＲ及び、他の増幅型の検査法、例えば枝分れＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど)が含まれる。
哺乳動物の組織又は細胞試料は、例えばノーザン、ドットブロット又はＰＣＲ分析を用いて、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡについて都合よくアッセイすることができる。例えば、定量的ＰＣＲアッセイなどのＲＴ-ＰＣＲアッセイは公知技術である。本発明の例示的実施態様では、生体試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡの検出方法は、少なくとも一のプライマーを用いて逆転写によって、試料からｃＤＮＡを生成し、該ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｃＤＮＡを増幅するために、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のポリヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて産生された該ｃＤＮＡを増幅し、そして、増幅されたＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｃＤＮＡの存在を検出することを含む。加えて、このような方法は、生体試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡのレベルを決定し得る一ないし複数の工程(例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子のコントロールｍＲＮＡ配列と該レベルを同時に検討すること)を含んでもよい。場合によって、増幅されたＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｃＤＮＡの配列を決定してもよい。
【００６２】
本発明の態様の材料の実施態様では、本発明のポリヌクレオチド又はその任意の特定部分を特異的に増幅させるＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のプライマー及びプライマー対と、本発明の核酸分子又はその任意の一部に選択的又は特異的にハイブリダイズするプローブが含まれる。プローブは、検出可能なマーカー、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素にて標識されてもよい。このようなプローブ及びプライマーを、試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のポリヌクレオチドの存在を検出するため、及び、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として用いることができる。技術者に理解されるように、多数の異なるプライマー及びプローブは、本願明細書中で示される配列に基づいて調製されてもよく、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡの存在及び／又はレベルを増幅、クローニング及び／又は決定するために効率的に用いてもよい。
【００６３】
本発明の任意の方法には、マイクロアレイ技術によって、組織又は細胞試料中のｍＲＮＡ、例えばＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡを調べるか又は検出する手順が含まれる。核酸マイクロアレイを用いて、試験及びコントロールの組織試料から得た試験及びコントロールのｍＲＮＡ試料を逆転写させて、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識する。次いで、プローブを、固形支持体に固定した核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイの配列及び各々のメンバーの位置がわかるように、アレイを設定する。例えば、特定の疾患状態において、発現されうる遺伝子の選別を、固形支持体上に配列してもよい。特定のアレイメンバーと標識プローブとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。疾患組織の差次的遺伝子発現分析は、貴重な情報を提供する。マイクロアレイ技術は、単一の実験で何千もの遺伝子のｍＲＮＡ発現性質を評価するために、核酸ハイブリダイゼーション技術及び演算技術を利用する。(２００１年１０月１１日公開の国際公開公報０１／７５１６６を参照、(例えば米国特許第５，７００，６３７号、同第５，４４５，９３４号及び同第５，８０７，５２２号、Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)）、アレイ製作の考察のためにはCheung, V.G.等, Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999)を参照)。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス又は他の基質上で染色されるか直接合成される遺伝子断片を含有する微小なアレイである。何千もの遺伝子は、通常単一のアレイ上に現れる。代表的なマイクロアレイ実験は以下の工程を伴う：１．試料から単離したＲＮＡからの蛍光性標識標的の調製、２．マイクロアレイへの標識した標的のハイブリダイゼーション、３．洗浄、染色及びアレイのスキャニング、４．走査画像の分析、そして５．遺伝子発現性質の生成。一般に、ＤＮＡマイクロアレイには２つの主要な種類、ｃＤＮＡから調製されたＰＣＲ産物を含有する遺伝子発現アレイ及びオリゴヌクレオチドアレイ(通常２５〜７０マー)が用いられる。アレイを形成する際に、オリゴヌクレオチドは、事前に作製して表面にスポットしても、(インサイツで)表面上で直接合成してもよい。
【００６４】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ(登録商標)システムは、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することにより製造されるアレイを含んでなる市販のマイクロアレイシステムである。プローブ／遺伝子アレイ：オリゴヌクレオチド（通常２５マー）は、半導体ベースのフォトリソグラフィーと固相化学合成技術との組合せによって、ガラスウェーハ上へ直接合成される。各々のアレイは最高４００，０００の異なるオリゴを含有し、各々のオリゴは何百万ものコピーで存在する。オリゴヌクレオチドプローブがアレイ上の既知の位置で合成されるので、ハイブリダイゼーションのパターン及びシグナル強度は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアによる遺伝子同一性と相対的な発現レベルに置き換えて解釈できる。各々の遺伝子は、一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって、アレイ上に表される。各々のプローブ対は、完全一致のオリゴヌクレオチドと、不一致のオリゴヌクレオチドからなる。完全一致プローブは、特定の遺伝子に対して完全に相補的な配列を有するため、遺伝子の発現を測定する。不一致プローブは、中心塩基位置での単一塩基置換によって、完全一致プローブとは異なり、標的遺伝子転写物の結合を妨げる。これによって、完全一致オリゴを決定するシグナルの一因となるバックグラウンド及び非特異的ハイブリダイゼーションを決定できる。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアは、完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度から不完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度を減算して、それぞれのプローブセットの絶対値又は特異的強度の値を決定する。プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋ及び他のヌクレオチド貯蔵所の当時の情報に基づいて選択される。この配列は遺伝子の３'末端の特定の領域を認識すると思われている。ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションオーブン(「回転式(rotisserie)」オーブン)を用いて、一度に最高６４アレイのハイブリダイゼーションを行う。ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎでは、プローブアレイの洗浄と染色が行われる。これは完全に自動化しており、４つのモジュールを含有しており、その各々のモジュールが一つのプローブアレイを保持している。各々のモジュールは、事前にプログラム化されたfluidicsプロトコルを用いたＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアにより個々に制御される。スキャナは、プローブアレイ結合した標識ｃＲＮＡにより発される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光発光スキャナである。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアを有するコンピュータワークステーションがｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎとスキャナを制御する。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアは、プローブアレイについて事前にプログラム化したハイブリダイゼーション、洗浄及び染色プロトコルを用いてｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎを８つまで制御できる。また、ソフトウェアは、ハイブリダイゼーション強度データを得て、適切なアルゴリズムを使用して各々の遺伝子の存在／非存在情報に変換する。最後に、ソフトウェアは、比較分析によって、遺伝子発現における実験間の変化を検出して、テキストファイルに出力する。このファイルは更なるデータ分析のために他のソフトウェアプログラムに用いることができる。
【００６５】
また、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを用いて、標識プローブを使用し、バイオマーカーのｍＲＮＡの発現を検出することができる。このようなアッセイは従来技術に既知である（例えば、Kallioniemi等、1992; 米国特許第6,358,682号参照）。
また、選択されたバイオマーカーの発現は、遺伝子欠損又は遺伝子増幅を調べることにより評価されてもよい。遺伝子欠損又は遺伝子増幅は、当分野で公知の様々なプロトコルの何れか一つ、例えば、慣例的なサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201 5205 (1980))、ドットブロット(ＤＮＡ分析)、又は適切に標識したプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション(例えばＦＩＳＨ)、適切に標識したプローブを用いた細胞遺伝学的方法又は比較ゲノムハイブリダイゼーション(ＣＧＨ)によって、測定できる。例として、これらの方法は、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の遺伝子の増幅の欠失を検出するために用いてもよい。
加えて、組織又は細胞試料中のバイオマーカー、例えばＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の遺伝子のメチル化状態を調べてもよい。遺伝子５'調節領域内のＣｐＧ島の異常な脱メチル化及び／又は過剰メチル化は、不死化細胞及び形質転換細胞内でしばしば起こり、様々な遺伝子の発現が変化する。遺伝子のメチル化状態を調べるための様々なアッセイは、公知技術である。例えば、サザンハイブリダイゼーション方法では、ＣｐＧ島のメチル化状態を評価するために、メチル化されたＣｐＧ部位を含有する配列を切断することができないメチル化感受性制限酵素を利用できる。加えて、ＭＳＰ(メチル化特異的ＰＣＲ)は、与えられる遺伝子のＣｐＧ島に存在するすべてのＣｐＧ部位のメチル化状態の分布を迅速に測定できる。この手順は、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡの初期修飾(すべてのメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する)の後に、メチル化されたＤＮＡ対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いた増幅を伴う。また、メチル化干渉を伴うプロトコルは、例えばCurrent Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995、De Marzo 等, Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)、Brooks 等, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536)、及び、Lethe 等, Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)にみられる。
【００６６】
また、組織又は細胞試料中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現は、機能的なアッセイ又は活性に基づくアッセイにより検査されてもよい。例えば、組織又は細胞試料中の所定の酵素のＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性の存在を決定又は検出するために公知技術のアッセイを行ってもよい（例えば、Bennett等、J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996); Wang等、BBRC、300:738-744 (2003); Hang等、上掲、2005年5月にwww.sciencedirect.comで閲覧可能、参照）。
本発明の方法において、組織又は細胞試料も、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの発現又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体を結合する試料中のレセプターについて検査されうることが考慮される。上記及び当分野で記載されるように、現在、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが少なくとも５つの異なるレセプター、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと結合すると思われている。本明細書中で記載のものを含め、当分野で公知の方法を用いて、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２及び／又はＯＰＧの発現を、ｍＲＮＡレベルで、そして、タンパク質レベルで検出してもよい。例として、上記のＩＨＣ技術を用いて、試料中の一ないし複数の上記分子の存在を検出してもよい。組織又は試料をＧａｌＮａｃ−Ｔ１４マーカーの存在についてだけでなく、例えばＤＲ４、ＤＲ５又はＤｃＲ１の存在についても検査する方法では、同じ組織又は試料から異なるスライドを調製して、各々のスライドをそれぞれ特異的なバイオマーカー又はレセプターに特異的な試薬で試験してもよいことが考えられる。あるいは、組織又は細胞試料から単一のスライドを調製してもよく、各々のバイオマーカー又はレセプターに対する抗体を多色染色プロトコルとともに用いて、それぞれのバイオマーカー又はレセプターの可視化と検出を行ってもよい。
【００６７】
組織又は細胞試料がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体の活性に感受性であることを示すＧａｌＮａｃ−Ｔ１４を組織又は細胞試料が発現すると決定すると、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体を哺乳動物に投与して、哺乳動物を苦しめている癌又は免疫系関連疾患などの疾患を治療することが考慮される。本明細書中に記載の様々な病的状態の哺乳動物の診断は、熟練した実務者によって、することができる。診断用技術は、例えば、哺乳動物の癌又は免疫系関連疾患の診断又は検出が許可される当分野で有用である。例えば、癌は、限定するものではないが、触診、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲなどの技術によって、同定してもよい。また、免疫系関連疾患は容易に同定できる。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体は、周知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨膜内、くも膜腔内、経口、局所的又は吸入の経路により投与することができる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプ注入によって実施することができる。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体の投与にとって有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。一回又は複数回服用を用いることができる。単独で使用されるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの効果的な用量又は量は、１日当り体重の約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれより多い範囲であると現在考えられている。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordentiら, Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような、当該分野において既知の方法を用いて実施することができる。
【００６８】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲又は１日当たりより多く、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。特定の用量及び送達方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号を参照のこと。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で送達することが必要であることが予想される。
さらに付加的な治療が本方法において使用され得ることを考慮する。一又は複数の他の治療には、限定されるものではないが、放射線治療、サイトカイン(一ないし複数)、成長阻害剤(一ないし複数)、化学治療剤(一ないし複数)、細胞障害剤(一ないし複数)、チロシンキナーゼインヒビター、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、血管形成インヒビター、及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターなど、当該分野で公知であり、更に上記に定義されるものの投与が含まれる。このような他の治療法を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体とは異なる試薬として用いられうることが考えられる。さらに、治療は、リツキサンＴＭ又はハーセプチンＴＭ等の腫瘍抗原を標的にする治療用抗体、並びに抗ＶＥＧＦ等の抗-血管形成抗体をベースにしている。
【００６９】
化学治療剤の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定されて使用される。また、このような化学治療の調製と用量スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体の投与の前でも後でもよく、同時であってもよい。
また、他の抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮因子(ＶＥＧＦ)、又は他のＴＮＦＲファミリーのメンバー(例えば、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、Ａｐｏ-３、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＢＲ３)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、あるいは付加的に、ここに開示した同一の又は二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。投与後、インビトロで処理した細胞を分析することができる。インビボ処理の場合、熟練した実務者に公知の様々な方法により処理された哺乳動物をモニタリングすることができる。例えば、腫瘍細胞を病理学的に検査してネクローシスについてアッセイしてもよいし、血清を免疫系応答について分析してもよい。
【００７０】
上記に記載又は提案した用途への使用のために、本発明ではキット又は製造品も提供される。このようなキットは、ガラス瓶、チューブなどの一ないし複数の密閉した容器内に収容するために区分けされている運搬容器を具備しており、それぞれの容器には本方法に使用する別個の成分の何れか一つを含んでいる。例えば、容器の一つには検出可能なように標識してあるないしは標識することができるプローブを含む。このプローブは、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のタンパク質又はＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の遺伝子ないしは信号のそれぞれに特異的な抗体ないしはポリヌクレオチドであってもよい。標的核酸を検出するためにキットに核酸ハイブリダイゼーションが必要な場合には、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを収容する容器、及び／又は、酵素標識、蛍光標識又は放射性標識などのレポーター分子に結合した、ビオチン結合タンパク質(例えばアビジン又はストレプトアビジン)などのレポーターの働きをするものを収容する容器も具備する。
典型的に、本発明のキットは、上記の容器と、商業的及び使用者の観点からみて望ましい物質、例えばバッファ、希釈液、フィルター、針、注射器及び使用のための指示書を有するパッケージ挿入物を収容する一ないし複数のその他の容器とを具備する。特定の治療又は非治療的用途に該組成物が使用されることを示すために容器上にラベルがあってもよく、またそのラベルは上記のようなインビボの使用又はインビトロの使用の何れかについての指導を示すものであってもよい。
【００７１】
本発明のキットは多くの実施態様を有する。典型的な実施態様は、容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される組成物を具備するキットであり、この場合の組成物はＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のポリペプチド配列に結合する一次抗体を含有するものであり、該容器上のラベルは、該組成物を用いて少なくとも一種類の哺乳動物細胞中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のタンパク質の存在を評価することができることと、少なくとも一種類の哺乳動物細胞中のタンパク質の存在を評価するためのＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の抗体の使用についての指示書を示すものである。さらに、キットは、組織試料を調整して組織試料の同一片に抗体及びプローブを適用するための一組の指示書と材料を具備しうる。キットは、一次抗体と、酵素標識などの標識にコンジュゲートしている二次抗体の両方を具備してもよい。
他の実施態様は、容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される組成物を具備するキットであり、この場合の組成物はストリンジェントな条件下でＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のポリヌクレオチドの相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有するものであり、該容器上のラベルは、該組成物を用いて少なくとも一種類の哺乳動物細胞中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の存在を評価することができることと、少なくとも一種類の哺乳動物細胞中のＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のＲＮＡ又はＤＮＡの存在を評価するためのＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のポリヌクレオチドの使用についての指示書を示すものである。
キットの他の任意の成分には、一ないし複数のバッファ(例えばブロックバッファ、洗浄バッファ、基質バッファなど)、酵素標識によって化学的に変化する基質などの他の試薬(例えば色素原)、エピトープ探索溶液、コントロール試料(ポジティブコントロール及び／又はネガティブコントロール)、コントロールスライド(一ないし複数)などがある。
【実施例】
【００７２】
さらに、本発明の様々な態様を以下の実施例によって記載し、例示する。これらは本発明の権利範囲を減縮するためのものではない。
方法及び材料
細胞培養物及び細胞株
以下のヒト細胞株：非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）系：Ｈ２１２２、Ａ４２７、Ｈ６４７、ＳＫ−ＭＥＳ−１、Ｈ８３８、Ｈ３５８、Ｈ２１２６、Ｈ４６０、Ｈ１７０３、Ｈ２４０５、Ｈ６５０、Ｈ１５６８、Ｈ１６６６、Ｈ３２２Ｔ、ＳＷ１５７３、Ｈ２９２、Ｈ１６５０、Ｈ５２２、ＥＫＶＸ、Ｈ６６１、Ｈ２３、ＬＸＦＬ５２９、Ｈ２２６、A５４９、Ｈ１７８１、Ｈ１２９９、ＨＯＰ６２、Ｈ２００９、ＨＯＰ９２、Ｈ１７９３、Ｈ１９７５、Ｈ１６５１、ｃａｌｕ−１、Ｈ１４３５、ＨＯＰ１８、Ｈ５２０、Ｈ４４１、Ｈ２０３０、Ｈ１１５５、Ｈ１８３８、Ｈ５９６、ＨＬＦａ；膵臓癌系：Ｐａｎｃ０５．０４、ＢｘＰＣ３、ＨＰＡＣ、ＳＵ．８６．８６、ＨｕＰ−Ｔ３、ＰＳＮ１、Ｐａｎｃ０８．１３、ＭｉａＰａＣａ−２、ＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｔ、Ｐａｎｃ０３．２７、Ｃａｐａｎ−１、ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ−１、ＰＡ−ＴＵ−８９０２、Ｐａｎｃ０２．０３、Ｐａｎｃ０４．０３、ＰＬ４５、Ａｓｐｃ−１、Ｈｓ７６６Ｔ、Ｐａｎｃ１０．０５、Ｐａｎｃ１、Ｃａｐａｎ−２、ＨＰＡＦ−ＩＩ及びＮＨＬ：ＪＥＫＯ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＯＣＩ−ＬＹ−１９、ＳＲ、Ｆａｒａｇｅ、ＤＯＨＨ-２、Ｔｏｌｅｄｏ、ＷＳＵ−ＮＨＬ、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＧＲＡＮＴＡ−５１９、Pfeiffer、ＨＴ、ＳＣ−１、ＤＢ。これら細胞株は、ＡＴＣＣ寄託機関(Manassas, Virginia)、ＤＳＭＺ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)、ＪＣＲＢ(日本の細胞バンク)又はＥＣＡＣＣ( ヨーロッパの細胞培養株寄託機関)から得て、１０％熱不活性ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ-グルタミン及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ-１６４０培地で培養した。
【００７３】
細胞障害性アッセイ
可溶性黄色テトラゾリウム塩(ＭＴＴ)を青いホルマザン結晶に還元する生存細胞の能力に基づいた比色アッセイであるＭＴＴアッセイ(Promegaから入手のCellTiter96(登録商標) Non-Radioactive Cell Proliferation Assay)を用いてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＤＲ５抗体で処理した後の生存細胞の量を測定した。ＭＴＴアッセイは、様々な濃度(０〜１０００ｎｇ／ｍｌ)のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＤＲ５抗体を含有する９６ウェルプレートの培養ウェルに、予め混合した好適な色素溶液を添加することにより行った。４時間のインキュベーションの間、生細胞は、色素溶液のテトラゾリウム成分をホルマザン(formazan)産物に変換する。次いで、溶解液／停止液を培養ウェルに添加して、ホルマザン産物を溶解し、９６ウェルプレート読み取り機(SpectraMax)を使用して５７０ｎｍの吸光度を記録した。読み取った５７０ｎｍの吸光度は、増殖アッセイにおいて、通常使用される細胞の数に正比例する。ホルマザン産物の吸光度の最大は５７０ｎｍであり、純粋な溶液が青く見えるにもかかわらず、アッセイ終了時の色は青ではなく、培養液中の他の成分(血清、酸性化フェノールレッド及び非還元ＭＴＴを含む)と関連して存在するホルマザンの量に依存する。
細胞の力価測定を行うことによって、細胞数を最大限に利用して、アッセイの線形範囲の上限に近いアッセイシグナルを産生した。種類が異なる細胞は異なるレベルの代謝活性を有するので、細胞株ごとに行った。試験する多くの腫瘍細胞は、１ウェル当たり５，０００から２０，０００個の細胞を用いた。
【００７４】
以下は、行ったアッセイの工程ごとの説明である：
１．  保存培養物の細胞をバイオアッセイに使用した。
２．  細胞数とトリパンブルー生存度を測定し、最終的に１ウェル当たり５,０００〜２０,０００個の細胞を懸濁した。
３．  ９６ウェルプレートへ５０μｌの細胞懸濁液を分注した。
４．  プレートを３７℃の加湿した５％ＣＯ２大気中にて終夜インキュベートした。
５．  ０から１,０００ｎｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＤＲ５抗体を含有する５０μｌの培養液を９６ウェルプレートの試料に添加した。５０μｌの培養液(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＤＲ５抗体なし)及び１００μｌ培養液(細胞なし)をコントロールとした。
すべての実験は３日間で３通り行った。ウェルの総容積は１００μｌ／ウェルであった。
６．  プレートを３７℃の加湿した５％ＣＯ２大気中で７２時間インキュベートした。
７．  各々のウェルに１５μｌの色素溶液を添加した。
８．  プレートを３７℃の加湿した５％ＣＯ２大気中で最大４時間インキュベートした。
９．  各々のウェルに１００μｌの溶解液／停止液を添加した。
１０．プレートを３７℃で終夜インキュベートした。
１１．９６ウェルプレート読み取り機を使用して５７０ｎｍ波長の吸光度を記録した。７５０ｎｍの参照波長を用いて、細胞片、指紋及び他の非特異的な吸光度によって、生じるバックグラウンドを減算した。
１２．ネガティブコントロールの吸光度値の平均を、ブランク値(空試験値)として用いて、他の全ての読み取り値から減算した。各濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＤＲ５抗体の吸光度値の平均を、ポジティブコントロールの吸光度値の平均で割って(１００％生存細胞−無処理細胞)、生存細胞の量(％)を算出した。
１３．Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＤＲ５抗体の濃度(Ｘ軸、対数値)に対するパーセント生存細胞(Ｙ軸)をプロットして、５０％の生存細胞に相当するＸ軸値(ｎｇ／ｍｌ)の位置を決めることによって、ＩＣ５０値を決定した。
【００７５】
Affymetrix標識プロトコル
すべての試料についてＯＤ２６０／２８０を読み取り、試料をBioAnalyzerにかけた。５μｇの高純度の総ＲＮＡを用いた。
Ａ．  First StrandｃＤＮＡ合成：
１．  プライマーハイブリダイゼーション
ＤＥＰＣ-Ｈ２Ｏ  ｘμｌ    ボルテックスによって混合。少し遠心。
ＲＮＡ(５ｕｇ)  ｙμｌ    １０分間７０℃でインキュベート。
スパイク(Spike)(５ｕｇに対して１：４で保存液を希釈)  １μｌ    少し遠心して氷上に置く。
Ｔ７-(ｄＴ)２４プライマー  １μｌ
容量  １２μｌ
２．  温度調節
５×First StrandｃＤＮＡバッファ  ４μｌ
各試料に７μｌを(混合物の７μｌを左側に)添加。
０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ    ボルテックスによって混合。少し遠心。
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液  １μｌ    ２分間４２℃でインキュベート。
容量  ７μｌ
３．  First Strand合成
１μｌのＳＳＩＩ ＲＴを各々の試料に加える。
ＳＳＩＩ ＲＴ  １μｌ    上下にピペッティングするか、軽くボルテックスをかけて混合。少し遠心。
総容積  ２０μｌ    １時間４２℃でインキュベート。
【００７６】
Ｂ．  Second StrandｃＤＮＡ合成
１．  First Strand反応物を氷上に置く。しばらく遠心してチューブの側面の凝集塊を落とす。
２．  以下のSecond Strandマスター混合液を作る。
ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ  ９１μｌ
５×Second Strand反応バッファ  ３０μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液  ３μｌ
１０Ｕ／μｌ  ＤＮＡリガーゼ  １μｌ
１０Ｕ／μｌ  ＤＮＡポリメラーゼＩ  ４μｌ
２Ｕ／μｌ  ＲＮアーゼＨ  １μｌ
総容積  １３０μｌ
３．  １３０μｌのSecond Strandマスター混合液を２０μｌのFirst StrandｃＤＮＡに加える。(最終的な容量＝１５０μｌ)
４．  上下にピペッティングするか、軽くボルテックスをかけて混合。少し遠心。
５．  冷却用ウォーターバスにて１６℃で２時間インキュベート。
６．  ２μｌの[１０Ｕ] Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを添加。上下にピペッティングするか、軽くボルテックスをかけて混合。少し遠心。
７．  １６℃で５分間インキュベート。
８．  １０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加える。軽くボルテックスにかける。少し遠心。
９．  ｃＤＮＡの精製手順に進むか、その後の使用のために−２０℃で保存。
【００７７】
二本鎖ｃＤＮＡの精製(GeneChip 試料精製 Module)
１．  ６００μｌのｃＤＮＡ結合バッファを１６２μｌの最終的な二本鎖ｃＤＮＡ合成調製物に添加。
３秒間ボルテックスにかけて混合。
２．  混合物の色が黄色であることを確認(ｃＤＮＡ合成反応を含まないｃＤＮＡ結合バッファと同様)。
混合物の色が橙又は紫である場合、１０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を加えて混合する。
混合物の色は黄色に変化する。
３．  ２ｍｌの収集チューブにセットしたｃＤＮＡ精製スピンカラムに５００μｌの試料を入れて、
８,０００×ｇ以上(１０,０００回転数／分以上)で１分間遠心。流れ出たものを有害廃棄物として廃棄。
４．  残りの混合物(２６２μｌ)とともにスピンカラムを再び流し、上記のように遠心した。
流れ出たものを有害廃棄物として廃棄して、収集チューブを廃棄した。
５．  新しい２ｍｌの収集チューブ(購入品)に、スピンカラムを移す。スピンカラムに７５０μｌのｃＤＮＡ洗浄液を注入する。８,０００×ｇ以上(１０,０００回転数／分以上)で１分間遠心。
流れ出たものを廃棄する。
６．  スピンカラムの蓋を開け、最大速度(２５,０００の×ｇ以下)で５分間遠心。第二のバケットを用いて遠心器内にカラムを置く。キャップが回転に対して反対方向に向くように隣接しているバケットを越えてキャップを位置する、すなわち回転が時計回りの場合、反時計回りにキャップを配置する。これによって、キャップへの損傷を防ぐ。
流れ出たものと収集チューブを廃棄する。
７．  １．５ｍｌの収集チューブ内にスピンカラムを移す。スピンカラム膜上に１０μｌのｃＤＮＡ溶出バッファを注入する。ｃＤＮＡ溶出バッファが膜上へ直接分配されることを確認する。
室温で１分間インキュベートして、最大速度(２５,０００×ｇ以下)で１分間遠心して溶出させる。
【００７８】
ＩＶＴ反応の準備と実施
Enzo：バイオアレイ高収率 RNA転写物標識キット(Part No.９００１８２)
１．  １０μｌの精製した二本鎖ｃＤＮＡを用いる。
２．  以下のＩＶＴマスター混合物を作る：
蒸留水又は脱イオン化水  １２μｌ
１０×ＨＹ反応バッファ  ４μｌ
１０×ビオチン標識リボヌクレオチド  ４μｌ
１０×ＤＴＴ  ４μｌ
１０×ＲＮアーゼインヒビター混合物  ４μｌ
２０×Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ  ２μｌ
総容積：  ３０μｌ
３．  ３０μｌのＩＶＴマスター混合物を１０μｌの二本鎖ｃＤＮＡに加える。(総容積＝４０μｌ)
４．  上下にピペッティングするか、軽くボルテックスをかけて混合。少し遠心。
５．  すぐにチューブを３７℃のウォーターバスに置く。５時間インキュベートする。
６．  すぐにＲＮＡを精製しない場合は−２０℃に貯蔵。
【００７９】
ビオチン標識ｃＲＮＡの精製(GeneChip 試料精製 Module)
１．  ６０μｌのＨ２ＯをＩＶＴ反応に加えて、３秒間ボルテックスにかけて混合する。
２．  ３５０μｌのＩＶＴ  ｃＲＮＡ結合用バッファを試料に加えて、３秒間ボルテックスにかけて混合する。
３．  ２５０μｌのエタノール(９６〜１００％)を溶解物に加えて、ピペッティングによって、ウェルを混合する。遠心分離しない。
４．  ２ｍｌの収集チューブに配置したＩＶＴ  ｃＲＮＡ精製スピンカラムに、試料(７００μｌ)を添加する。
８,０００×ｇ以上(１０,０００回転数／分以上)で１５秒間遠心分離する。
５．  もう一度溶出物をカラムに通す。
８,０００×ｇ以上(１０,０００回転数／分以上)で１５秒間遠心分離する。
流れ出たものを有害廃棄物として廃棄して、収集チューブを廃棄する。
６．  新しい２ｍｌの収集チューブ(購入品)内にスピンカラムを移す。
７．  ５００μｌのＩＶＴ  ｃＲＮＡ洗浄バッファを加えて、８,０００×ｇ以上(１０,０００回転数／分以上)で１５秒間遠心して洗浄する。
流れ出たものを廃棄する。
８．  ５００μｌの８０％(ｖ／ｖ)エタノールをスピンカラムに注入し、
８,０００×ｇ以上(１０,０００回転数／分以上)で１５秒間遠心分離する。流れ出たものを廃棄する。
９．  スピンカラムのキャップを開け、最大速度(２５,０００×ｇ以下)で５分間遠心する。
流れ出たものと収集チューブを廃棄する。
１０．新しい１．５ｍｌの収集チューブにスピンカラムを移す。
１１．１１μｌの無ＲＮアーゼ水をスピンカラム膜上に直接注入する。１分間放置する。
最大速度(２５,０００×ｇ以下)で１分間遠心して、溶出させる。
１２． １０μｌの無ＲＮアーゼ水をスピンカラム膜上に直接注入する。１分間放置する。
最大速度(２５,０００×ｇ以下)で１分間遠心して、溶出させる。
【００８０】
ｃＲＮＡ(ＩＶＴ生成物)の定量化 
吸光光度分析法を用いてＲＮＡ収率を測定する。２６０ｎｍの１ＯＤが４０μｇ／ｍｌのＲＮＡに等しくなる定値を適用する。
２６０ｎｍ及び２８０ｎｍのＯＤをチェックして試料濃度及び純度を測定する。
純粋なＲＮＡの２．０に近いＡ２６０／Ａ２８０比を維持する(１．９と２．１との間の比は許容範囲内である)。
出発原料として総ＲＮＡを用いた場合のｃＲＮＡの定量化では、調整されたｃＲＮＡ収率を算出して非標識の総ＲＮＡの超過量を示さなくてはいけない。１００％超過量を見積もって、以下の式にあてはめて調整されたｃＲＮＡ収率を決定する：
調整されたｃＲＮＡ収率＝ＲＮＡｍ  ― (総ＲＮＡｉ)(ｙ)
ＲＮＡｍ＝ＩＶＴ後の測定したｃＲＮＡの量(μｇ)
総ＲＮＡｉ＝総ＲＮＡの開始量(μｇ)
ｙ＝ＩＶＴで用いたｃＤＮＡ反応の分画
【００８１】
標的物調節のためのｃＲＮＡ断片化
断片化のために、調整されたｃＲＮＡ濃縮物を使用する。
１．  ８μｌのＲＮＡとＨ２Ｏに対して２μｌの５×断片化バッファを添加。
２０μｇ  ｃＲＮＡ  １〜３２μｌ
５×断片化バッファ  ８μｌ
無ＲＮアーゼ水で４０μｌにする
総容積：  ４０μｌ
２．  ９４℃で３０分間インキュベート。インキュベーション後すぐに氷上に置く。
【００８２】
ハイブリダイゼーション標的物の調製
１．  ２０×真核生物のハイブリダイゼーションコントロールとオリゴＢ２を６５℃で５分間暖める。
Affymetrix GeneChip真核生物のハイブリダイゼーションコントロールキット、Ｐａｒｔ＃９００３６２(１５０ｒｘｎｓに対して)
２．  軽く混合して遠心して側面の付着物を落とす。
３．  マスター混合物(断片化したｃＲＮＡ濃度を０．５μｇ／μｌと仮定する場合)：
標準的アレイ(μｌ)                          最終濃度
断片化されたｃＲＮＡ  １５μｇ  ３０        ０．０５μｇ／μｌ
オリゴＢ２(３ｎＭ)  ５                      ５０ｐＭ
２０×コントロールスパイク  １５            １．５、５、２５、１００ｐＭ
(Ｂｉｏ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｃｒｅ)
ニシン精液ＤＮＡ  ３                        ０．１ｍｇ／ｍｌ
アセチル化ＢＳＡ  ３                        ０．５ｍｇ／ｍｌ
Ｈｕ ｃｏｔ-１ ＤＮＡ(１ｍｇ／ｍｌ)  ３０   ０．１ｍｇ／ｍｌ
２×ＭＥＳ  Ｈｙｂバッファ  １５０            １×
Ｈ２Ｏ  ６４
終容量  ３００
４．  ２７０μｌのマスター混合物をチューブ内に分注して、各々のチューブに３０μｌの断片化ｃＲＮＡを添加。これをハイブリダイゼーション混合物とする。
５．  プローブアレイを使用の直前に室温に戻す。
６．  プローブアレイを１×ＭＥＳ  Ｈｙｂバッファで満たして、４５℃で６０回転数／分、１０分間、回転式オーブンでインキュベート。
７．  ハイブリダイゼーション混合物を９９℃のウォーターバスで５分間加熱する。
８．  ハイブリダイゼーション混合物を４５℃のウォーターバスに移し５分間置く。
９．  ハイブリダイゼーション混合物を最大速度で５分間遠心分離する。
１０．プローブアレイから１×ＭＥＳ  Ｈｙｂバッファを取り除く。
１１．プローブアレイを２００μｌのハイブリダイゼーション混合物で満たす。
１２．粘性の斑点(Tough-Spots)を有する隔壁(septa)を密閉する。
１３．４５℃、６０回転数／分で１９時間、プローブアレイをハイブリダイズさせる。
１４．Affymetrixプロトコルに従ってプローブアレイを洗浄し、着色し、スキャンする。
【００８３】
Affymetrix材料
2014237673.tif 000003
【００８４】
量的ＰＣＲ
ｃＤＮＡ合成：
2014237673.tif 000004
【００８５】
インキュベーション条件：
２５℃で１０分間
３７℃で２時間
ＡＢＩプリズム７７００配列決定検出器を用いたＴａｑＭａｎ反応：
2014237673.tif 000005
【００８６】
サーマルサイクル条件：
９５℃で１０分間
４０サイクル：９５℃で１５秒間
６０℃で１分間
・TaqManプローブ：Assays-on-DemandTM(TaqMan(登録商標) MGBプローブ、FAMTM色素標識)
・内在性コントロールであるＧＡＰＤＨの増幅(プローブ濃度１００ｎＭ、フォワード及びリバースプライマー濃度２００ｎＭ)を行い、各反応液に加えた試料ＲＮＡ(ｃＤＮＡ)の量を標準化する。
標準曲線法を用いて相対的な定量を行った。内在性コントロールへの正規化される定量のために、標的及び内在性コントロールの両方について標準曲線を作製した。各実験試料については、標的及び内在性コントロールの量は、適当な標準曲線から決定した。次いで、標的量を内在性コントロール量で割って標準化された標的値を求めた。実験試料のうちの１つを較正物質又は１×試料とした。次いで、各々の正規化した標的値を較正物質正規化標的値で割って、相対的な発現レベルを求めた。
【００８７】
実験結果：
実験は前述の方法及び材料を使用して行った。後述するように、これらの実験の結果は、図５−９に示す。
図５は、ＭＴＴ細胞障害性アッセイで測定した場合、ＤＲ５モノクローナル抗体「ｍａｂ」(架橋あり「ＸＬ」又は架橋なし、＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ)又はＡｐｏ２Ｌ(＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ)のアポトーシス活性に対して感受性であるか抵抗性であるかについて、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）の細胞株を分析して得たデータのＩＣ５０をまとめたものである。
図６は、ＭＴＴ細胞障害性アッセイで測定した場合、ＤＲ５モノクローナル抗体「ｍａｂ」（架橋あり「ＸＬ」又は架橋なし、＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ)又はＡｐｏ２Ｌ（＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ）のアポトーシス活性に対して感受性であるか抵抗性であるかについて、膵臓癌細胞株を分析して得たデータのＩＣ５０をまとめたものである。
図７は、ＭＴＴ細胞障害性アッセイで測定した場合、ＤＲ５モノクローナル抗体「ｍａｂ」（架橋あり「ＸＬ」又は架橋なし、＋０．５％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」又は１０％ＦＢＳ)又はＡｐｏ２Ｌ（＋１０％ウシ胎児血清「ＦＢＳ」）のアポトーシス活性に対して感受性であるか抵抗性であるかについて、非ホジキンリンパ腫癌（ＮＨＬ）細胞株を分析して得たデータのＩＣ５０をまとめたものである。
図８は、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡ発現によって測定した場合の、ＤＲ５抗体に対する選択ＮＳＣＬＣ、膵臓、及びＮＨＬ癌細胞株の感受性（「ｓｅｎ」）又は抵抗性（「ＲＥＳ」）の比較と、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現との相関関係を示す。
図９は、ＧａｌＮａｃ−Ｔ１４のｍＲＮＡの発現パターンのレベルにより（降順に）並べた、様々なＮＳＣＬＣ、膵臓、及びＮＨＬ細胞株の棒グラフを示す。
【００８８】
アポトーシス細胞死プログラムは、多細胞生物の発生及び恒常性に重要な役割を果たす（Danial等、Cell, 116:205 (2004)）。細胞内刺激により、細胞内因性の経路を介してアポトーシスを引き起こすことができ、これはアポトーシスカスパーゼ機構の活性化をＢｃ１−２遺伝子のスーパーファミリーのメンバーに依存する（Cory等、Nat. Rev. Cancer, 2:647 (2002)。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する特定のサイトカインは、機能的アポトーシス誘発性「デスドメイン」（ＤＤ）を含む幾つかのレセプターと相互作用することにより、細胞外因性経路を介してアポトーシスを活性化することができる（Ashkenazi等, Science, 281:1305 (1998)）。Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、Ｆａｓ（Ａｐｏ１／ＣＤ９５）によりアポトーシスを刺激し、一方Ａｐｏ−２リガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘発性リガンド（Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）は、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）及び／又はＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）によりアポトーシスを引き起こす（LeBlanc等、Cell Death Differ., 10:66 (2003)）。これらのレセプターは、その同族リガンドと結合すると、アダプター分子ＦＡＤＤ（Ｆａｓ随伴デスドメイン）を結合し、これによってアポトーシス誘導型カスパーゼ−８が補強されて細胞死誘発シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）が形成される（例えば、Kischkel等、EMBO J., 14:5579 (1995); Kischkel等、Immunity, 12:611 (2000)を参照）。ＤＩＳＣの群生はカスパーゼ−８を刺激し、するとカスパーゼ−３、６、及び７等のエフェクタープロテアーゼが切断及び活性化されて、アポトーシス細胞死プログラムが実行される。多くの細胞種類において、細胞内因性経路へのクロストークにより、細胞外細胞死シグナルを更に増幅させることができる（Scaffidi等、J. Biol. Chem., 274:1541 (1999)）。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、正常組織に殆ど／又は全く影響を及ぼすことなく様々な腫瘍細胞種類においてアポトーシスを誘発する。これは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが癌治療に有用であり得ることを示唆するものである（例えば、Ashkenazi, Nat. Rev. Cancer, 2:420 (2002); Kelley等、Curr. Opin. Pharmacol., 4:333 (2004)参照）。アポトーシス経路の様々な成分を変化させることで、特定の癌細胞株のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性を低下させることができる（specific cancer cell lines (2002)）。
【００８９】
以下に定める方法及びプロトコルに従って、様々な実験を実施し、そのデータを図１０−１５に示した。
レセプター活性に対する感受性を試験するため、一組のヒト癌細胞株におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの濃度の変化に伴う細胞生存を試験した。このヒト癌細胞株の組には、２３の膵臓腺癌、１８の悪性黒色腫、及び３６の結腸直腸腺癌が含まれていた（図１０Ａ。データは示さない）。この分析で、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに高度又は中程度の感受性として分類された細胞株は、７７のうち２９（３８％）であった。これら２９の細胞株に５０％の細胞死を引き起こすのに必要なＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの濃度は３〜８００ｎｇ／ｍＬであり、平均は２５０ｎｇ／ｍＬであった。
【００９０】
また、５４６１３の遺伝子プローブ組のマイクロアレイを使用し、遺伝子発現プロファイリングにより前記細胞株の組を試験した。いくらかの例外はあったが、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対して強い又は中程度の感受性を示した膵臓癌及び黒色腫細胞株は、対応する抵抗性の細胞株より有意に高いＯ−グリコシル化酵素ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４のｍＲＮＡレベルを発現した（フィッシャーの正確確率検定によりｐ＝０．５×１０−４、膵臓癌腫については７５０で、黒色腫については３００で、繰り返しカットオフを行った）（図１０Ｂ）。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに感受性の結腸直腸癌細胞株の大部分は、関連するＯ−グリコシル化酵素ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３の高いｍＲＮＡ発現を示した。複数の抵抗性細胞株も同じ遺伝子を発現したが、その発現は弱く、有意な差異が認められた（ｐ＝０．０２６、２０００でカットオフ）（図１０Ｃの下のグラフ）。パネル全体の中の例外として、（ａ）感受性であるがカットオフレベルを下回るｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３を発現した５／２９の（１７％）の細胞株、（ｂ）それでもカットオフを上回るｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４、又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３レベルを有する１６／４８（３３％）の抵抗性細胞が存在した。結腸直腸細胞株の他のＯ−グリコシル化酵素のｍＲＮＡの発現を試験することにより、６／２４（２５％）の抵抗性細胞株より高いレベルのＦｕｔ−６が１０／１２（８３％）の感受性細胞株において検出された（ｐ＝０．０１３、２００でカットオフ）（図１０Ｃの上のグラフ）。膵臓癌及び黒色腫におけるｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４の発現と、結腸直腸癌細胞株におけるＦｕｔ−６との組み合わせは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性と非常に強く相関していた（ｐ＝１．８３×１０−７、Ｎ＝７７）。この遺伝子の組は、２３／３２（７２％）のマーカー陽性細胞株及び３９／４５（８７％）のマーカー陰性細胞株について感受性か抵抗性かをそれぞれ正確に予測した。
また、腫瘍異種移植片を用いて、インビボにおいてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性を試験した。Ｆｕｔ−６−陽性結腸直腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５及びＤＬＤ−１由来の腫瘍を持つマウスを、５日に亘ってＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置したところ、腫瘍が退縮し、次いで腫瘍の進行速度が大きく低下した（図１０Ｄ）。対照的に、Ｆｕｔ−６−陰性結腸直腸癌細胞株Ｃｏｌｏ３２０及びＲＫＯ由来の腫瘍はこの処置に応答しなかった。
【００９１】
チンパンジーのＯ−グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤ベンジル−ＧａｌＮＡｃを用いたｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３／Ｆｕｔ−６−陽性Ｃｏｌｏ２０５細胞株のプレインキュベーション（Delannoy等、Glycoconj., 13:717 (1996)）は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性を著しく低下させた（図１１Ａ）。これは、Ｏ−グリコシル化とＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬシグナル伝達が機能的にリンクしていることを示唆するものである。これを更に試験するため、ｐｐＧａｌＮａｃＴ−１４、ｐｐＧａｌＮａｃＴ−３、又はＦｕｔ−６のｍＲＮＡを標的とする特定の小分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用した。標的外の効果を除外するため、各遺伝子について複数の重複しないｓｉＲＮＡを合成し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりそれらの標的発現の低減能を検証した（図１４Ａ）。ｓｉＲＮＡの特異性は、ｓｉＲＮＡ標的領域内に６の「サイレント」ヌクレオチドの変化を含む変異ｐｐＧａｌＮａｃＴ−１４プラスミドにより更に確認された（Editorial, Nat. Cell. Biol., 5:489 (2003)）（図１４Ｂ）。ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４−陽性のＰＳＮ−１膵臓癌腫及びＨｓ２９４Ｔ黒色腫細胞株をｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４  ｓｉＲＮＡを用いて形質移入したところ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性が実質的に低下し、一方予想通り、カスパーゼ−８  ｓｉＲＮＡによる保護はほぼ完全であった（図１１Ｂ）。同様に、ＧａｌＮＡｃＴ−３又はＦｕｔ−６  ｓｉＲＮＡによるＤＬＤ−１又はＣ１７０結腸直腸癌細胞の形質移入により、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性が有意に低下した（図１１Ｃ及び図１４Ｃ）。つまり、ＧａｌＮＡｃＴ−１４のｓｉＲＮＡは、４／５の膵臓癌及び２／２の黒色腫細胞株において、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性を低下させ、一方ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３又はＦｕｔ−６  ｓｉＲＮＡはいずれも、２／３の結腸直腸癌細胞株において感受性を低下させた。それに比べて、ＧａｌＮＡｃＴ−１４のｓｉＲＮＡを用いたＰＳＮ−１又はＨｓ２９４Ｔ細胞の形質移入は、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤エトポシドに対する感受性を変化させなかった（図１４Ｄ）。同様に、ＧａｌＮＡｃＴ−１４又はＧａｌＮＡｃＴ−３のｓｉＲＮＡを用いたＰＳＮ−１又はＣ１７０細胞の形質移入は、広域性プロテインキナーゼ阻害剤スタウロスポリンに対する感受性に影響しなかった（図１４Ｅ）。エトポシド及びスタウロスポリンはどちらも細胞内因性経路を介してアポトーシスを刺激する（Wei等、Science, 292:727 (2001)）ので、これらの研究により、Ｏ−グリコシル化酵素が、細胞外因性経路を介したアポトーシスシグナル伝達を調節させ得ることが示唆される。
【００９２】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４を用いたＨＥＫ２９３細胞の形質移入は、ＤＲ４又はＤＲ５を同時形質移入したときに細胞死を示したが、関連レセプターであるＦａｓ及びＴＮＦＲ１又は細胞内因性経路アゴニストＢａｘの場合はそうではなかった（図１１Ｄ）。更に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４の形質移入により、抵抗性細胞株Ｈ１５６８黒色腫（図１１Ｅ）、並びにＰＡ−ＴＵ−８９０２及びＰＬ−４５膵臓癌種（図１４Ｆ）のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性が増大したが、エトポシドに対する感受性には変化がなかった（データは示さない）。総合すると、ＧａｌＮＡｃＴ−１４の過剰発現は４／７の細胞株をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対して感作した。
ｐｐＧａｌＮａｃＴ−１４又はＦｕｔ−６のｓｉＲＮＡノックダウンの影響を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性カスパーゼプロセシングで試験した。コントロールｓｉＲＮＡを用いて形質移入したＰＳＮ−１及びＤＬＤ−１細胞において、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはカスパーゼ−８のほぼ完全なプロセシングを誘発し、Ｂｉｄ、カスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の切断を導いた（図１２Ａ）。カスパーゼ−８のｓｉＲＮＡを用いた形質移入は、これらの現象を防止した。ＰＳＮ−１細胞中のｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４、又はＤＬＤ−１細胞中のＦｕｔ−６のノックダウンも、カスパーゼ−８、Ｂｉｄ、カスパーゼ−９、及びカスパーゼ−３のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性プロセシング（図１２Ａ）、及びカスパーゼ３／７活性の刺激（図１２Ｂ）を著しく減弱した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ抵抗性ＲＫＯ及びＳＷ１４１７結腸直腸癌細胞株は、低レベルのｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３及びＦｕｔ−６を発現し、カスパーゼ−８プロセシングのレベルにおいて同様のブロックを示した（図１５Ａ）。このように、Ｏ−グリコシル化酵素は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ経路上流の、カスパーゼ−８の活性に繋がる現象を変化させることができる。
【００９３】
カスパーゼ−８の活性化には、ＤＩＳＣアセンブリが必要である（Ashkenazi等、Science, 281:1305 (1998)）。ＰＳＮ−１及びＤＬＤ−１細胞におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＤＩＳＣの分析（Kischkel等、Immunity, 12:611 (2000)）により、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４又はＦｕｔ−６のノックダウンが、ＤＩＳＣに対するＦＡＤＤ及びカスパーゼ−８の補充、ＤＩＳＣに結合したカスパーゼ−８のプロセシング、及びＤＩＳＣに随伴するカスパーゼ−８酵素活性の刺激を低減することが示唆された（Sharp等、J. Biol. Chem., 280:19401 (2005)）（図１２Ｃ、１２Ｄ及び図１５Ｂ）。ｐｐＧａｌＮａｃＴ−１４及びＦｕｔ−６のｓｉＲＮＡはいずれも、ＤＩＳＣ中のＤＲ４及びＤＲ５の量を実質的に変化させず、またＤＲ４とＤＲ５を両方発現するＰＳＮ−１又はＤＬＤ−１細胞に対するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの用量依存性の結合を変化させなかった（図１２Ｃ、図１５Ｂ、及びデータなし）。このように、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４及びＦｕｔ−６は、細胞表面のレセプターレベル又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結合に影響することによりアポトーシスを調節するとは思われない。これと一貫して、７７の細胞株の組におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性は、同族のシグナル伝達レセプターであるＤＲ４及びＤＲ５、又はデコイレセプターのＤｃＲ１及びＤｃＲ２の細胞表面における発現と有意な相関を示さなかった（データなし）。更に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４、ｐｐＧａｌＮａｃＴ−３、又はＦｕｔ−６に対する大部分のｓｉＲＮＡは、ＰＳＮ−１、Ｃ１７０、又はＤＬＤ−１細胞におけるＤＲ４及びＤＲ５のレベルを変化させなかった（図１５Ｃ）。二つのｓｉＲＮＡは、特定の細胞株中のＤＲ４及びＤＲ５のレベルに検出可能な低下を引き起こさなかった（図１５Ｃ）。しかしながら、同じ酵素に対する他のｓｉＲＮＡは、レセプターのレベルに影響を与えることなくＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性のアポトーシスを抑制した。
ヒトＤＲ５の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をチャイニーズハムスターの卵巣細胞中に発現させ、分泌されたタンパク質を精製し、酸加水分解させ、付随する単糖を分析した（図１３Ａ）。ＤＲ５のＥＣＤに予測されたＮ−グリコシル化部位が存在しないことと一致して、Ｎ−結合型グリカンは検出されなかった。しかしながら、２つの独立した実験における２つの試料は、ＤＲ５のＥＣＤ１モル当たり３モルのＧａｌＮＡｃ及び３モルのＧａｌを示し（図１３Ａ）、これにより、コアグリカンＧａｌＮＡｃ−ＧａｌによるＤＲ５上の３つの部位のＯ結合型修飾が示唆された。
【００９４】
タンパク質のＯグリコシル化によって、セリン又はスレオニンが修飾される。潜在的なＯグリコシル化部位を予測する従来の生物情報学の手段を使用して（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc）(Julenius等、 Glycobiology, 15:153 (2005))、ヒトＤＲ５の長い（ＤＲ５−Ｌ）及び短い（ＤＲ５−Ｓ）結合変異型の共通ＥＣＤ配列において２つの上記領域と、オルタナティブスプライス領域内に３つ目の領域を確認した（図１３Ｂ）。第１アミノ酸セグメント（７４−７７）にはセリンが３つ含まれ、第２アミノ酸セグメント（１３０−１４４）には、スレオニンが５つ、第３アミノ酸セグメントにはスレオニンが４つとセリンが３つ含まれる。マウスのＤＲ５は第１の２つのアミノ酸セグメントと同様の配列を持ち、それぞれセリン２つとスレオニン４つを含み、ヒトＤＲ４にも同様の配列が２つあり、セリン１つとスレオニン５つを含む。これらの部位がＤＲ５の翻訳後修飾に重要なものとなるのかどうか検査するために、セグメント１３０−１４４（ＤＲ５Ｌ−５Ｔ、ＤＲ５Ｓ−５Ｔ）のスレオニン５つ又はこれら５つのスレオニンと共にセグメント７４−７７（ＤＲ５Ｌ−５Ｔ３Ｓ、ＤＲ５Ｓ−５Ｔ３Ｓ）のセリン３つをアラニンと置換して、一組のＤＲ５Ｌ及びＤＲ５Ｓの変異株を作製した。ＤＲ５Ｌ又はＤＲ５Ｓを形質移入したＨＥＫ２９３細胞から得た溶解物のＤＲ５抗体免疫ブロット法の結果から、予測されたＤＲ５Ｌ及びＤＲ５Ｓのバンドの存在が確認された（図１３Ｃ）。抗体は更に、より高分子量（ＭＷ）のＤＲ５バンドを検出し、このＤＲ５バンドは、ＤＲ５Ｌ又はＤＲ５ＳをｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４と共に同時形質移入すると、コントロールと比べてより多くになった（図１３Ｃのアスタリスク）。多くの高分子バンド及びｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４による増加は、野生型コンストラクトと比較して、ＤＲ５Ｌ−５Ｔ又はＤＲ５Ｓ−５Ｔにより大幅に減少し、ＤＲ５Ｌ−５Ｔ３Ｓ又はＤＲ５Ｓ−５Ｔ３Ｓによりほとんどなくなった。これらの結果から、高分子バンドはＤＲ５のＯグリコシル化した形態を表し、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４によりこれらの形成が促進され、アラニン置換による予測されたＯグリコシル化部位の漸進的除去により、この影響が徐々に後退することが分かる。ＨＥＫ２９３細胞にマウスＤＲ５又はヒトＤＲ４、ＤＲ５Ｌ、又はＤＲ５Ｓを形質移入することにより、細胞死が起こり（図１３Ｄ）、各変異ＤＲ５は、対応する野生型コンストラクトよりも弱い活性を示し、（３つの部位全てを持たない）ＤＲ５Ｓ−５Ｔ３Ｓが一番活性が弱かった。ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４との同時形質移入により、非常に弱い活性を示したＤＲ５Ｓ−５Ｔ３Ｓ以外の全てのＤＲ４及びＤＲ５コンストラクトにより細胞死が促進された。
【００９５】
正常細胞及び皮膚癌、肺癌、膵臓癌、乳がん、卵巣がん、子宮内膜癌、膀胱がん、又は非ホジキンリンパ腫からの腫瘍サンプルの多くは、カットオフ値未満のｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４のｍＲＮＡ発現をｒ示した（ほとんどの癌のカットオフ値は５００、皮膚がんのカットオフ値は２００において測定、図１３Ｅ）。しかし、小葉乳がんの１０％から肺がんの３０％に至る範囲の、腫瘍サンプルのかなりの割合のサブセット、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４の過剰発現を示した。一部の癌サンプルのｍＲＮＡ発現レベルは、対応する正常な組織の１０００倍以上であった。癌サンプルにおけるダイナミックなｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４発現の結果から、この遺伝子、そして場合によっては他の関連酵素が、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬへの感受性がより大きい腫瘍を同定するのに有用なバイオマーカーとなり得ることがわかる。
Ｏ結合型グリカンはその構造において広範囲の多様性を示し、細胞の接着活性及びシグナル伝達活性と共に、構造、凝集、輸送、半減期を含む原形質膜タンパク質生物学の様々な態様を調節する（Hang等、Bioorg. Med. Chem., 13:5021 (2005)；Hanisch, Bio. Chem., 382:143 (2001)）。癌細胞は多くの場合、Ｏグリカンの形態を大きく変化させ、独特の腫瘍関連の糖鎖抗原を生成する（Brockhausen, Biochim. Biophys. Acta, 1473:67 (1999)；Dube等、Nat. Rev. Drug Discovery, 4:477 (2005)；Fuster等、nat. Rev. Cancer, 5:526 (2005)）。Ｏグリコシル化も、腫瘍細胞の転移の特定部位へのホーミングにおいて重要な役割を果たす（Fuster等、Cancer Res., 63:2775 (2003)；Ohyama等、EMBO J., 18:1516 (1999)；Takada等、Cancer Res., 53:354 (1993)）。結腸及び結腸直腸細胞サンプル、黒色腫細胞サンプル、及び軟骨肉腫細胞サンプルを含む様々なヒト癌からの主要な腫瘍サンプルの重要なサブセットは、様々なヒト癌からの主要な腫瘍サンプルの重要なサブセットは、Ｏグリコシル化酵素ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４の過剰発現を示す。
【００９６】
方法
材料
細胞培養試薬をＧｉｂｃｏ（Invitrogen/Gibco, Carlsbad, CA）より購入し、ノンタグの水溶性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを前述したように作製し（Lawrence等、Nat. Med., 7:383 (2001)）、Ｏ結合型グリコシル化阻害剤のベンジル−ａ−ＧａｌＮＡｃをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍより、その他全ての（エトポシド及びスタウロスポリンを含む）化学薬品をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（St. Louis, MO）より購入した。
細胞培養物及び細胞株
１１９種すべてのヒト癌腫細胞株（名前及びカタログ番号は添付資料を参照）をＡＴＣＣ又はＤＳＭＺ（Braunschweig, Germany）より入手し、ペニシリン／ストレプトマイシンなどの抗生剤を加えず、１０％加熱不活性化胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを加えたＲＰＭＩ１６４０にて、温度３７℃及び５％二酸化炭素の条件で、培養した。２９３ヒト胎児の腎臓細胞（カタログ番号：ＣＲＬ−１５７３）もまたＡＴＣＣより入手し、１０％ＦＢＳを加えた１００％ダルベッコ変法イーグル培地で培養した。Ｏグリコシル化変異株ＣＨＯ細胞株であるｌｄｌＤ  ＣＨＯは、マサチューセッツ工科大学（Boston MA）のＭｏｎｔｙ  Ｋｒｅｉｇｅｒ博士より許可を得た。
【００９７】
細胞生死判別アッセイ及びアポトーシスアッセイ
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＩＣ５０を測定するために、細胞を９６ウェルプレート内に三通り置き、２４時間かけて付着させ、その後濃度を１０００ｎｇ／ｍｌに到達するまで増加させながら組み換えヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処理した。７２時間インキュベートした後、細胞の生死判別アッセイ−ＭＴＴアッセイ（Pierce）又はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生死判別アッセイ(Promega)を、製造会社の手順に従って行った。各細胞生死判別実験は、低（０．５％）及び高（１０％ＦＢＳ）血清で少なくとも３回繰り返して行い、中程度の感受性を有する細胞株を、個々の実験から得たＩＣ５０間及び低血清と高血清の間のばらつきにより決定した。細胞株は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ濃度１ｕｇ／ｍｌにおいて少なくとも５０％の細胞のアポトーシス誘発がある場合に、感受性があると判断され、個々の実験または低（０．５％）血清対高（１０％）血清の存在下において誘発されたアポトーシス量の変動に基づいて中程度の感受性があると判断された。アポトーシスは、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  (BD Pharmingen)で着色した採取細胞（付着＋倍地中に浮遊）の平均割合のフローサイトメトリーによる分析により、数値化した。
マイクロアレイハイブリタイゼーション及びデータ分析
ＲＮｅａｓｙキット(Quiagen)を使用して、未処理の細胞（３×１０６）から全細胞ＲＮＡを調製した。前述したように（Hoffman等、Nat. Rev. Genetics, 5:229 (2004); Yauch等、Clin. Cancer Res., 11:8686 (2005))、標識ｃＲＮＡを調製し、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（U133P  GeneChip; Affymetrix Incorporated, Santa Clara, CA）にハイブリダイズさせた。走査画像ファイルをＧＥＮＥＣＨＩＰ  ３．１ (Affymetrix)、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ、ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ及びＣｌｕｓｔｅｒ／ＴｒｅｅＶｉｅｗで分析した。感受性細胞株及び抵抗性細胞株の間で、最も特異的に発現した遺伝子を特定するため、遺伝子発現の値を、サンプル全体の倍率変化と絶対変動の試験によって分析されるサンプル全体において、変動が最小である細胞を除外する変動フィルターにかけて、最大値と最小値の割合（最大値／最小値）及び最大値と最小値の間の差（最大値−最小値）を特定の値と比較し、両方の条件に合わない遺伝子を除外した。
【００９８】
発現コンストラクト及びレトロウイルス形質導入
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４をコードするＤＮＡ断片をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ感受性細胞株からプールしたｃＤＮＡからクローニングし、Ｎ−末端フラッグ・タグを有する発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen)に挿入した。次にこのコンストラクトの部位特異的変異生成を行い（Quickchange Mutagenesis kit, Stratagene）、タンパク質配列を変化させることなく、ｓｉＲＮＡと同種の配列において４〜６のゆらぎ塩基対変異を有するｓｉＲＮＡサイレント変異株を生成した。この変異は、１９ｂｐのｓｉＲＮＡ結合配列の中央において、１０ｂｐの領域に及んだ。ＤＲ５Ｌｏｎｇ、ＤＲ５Ｓｈｏｒｔ、ＤＲ４、マウスＴＲＡＩＬレセプター、ＤＲ４、Ｆａｓ（変異形１）、ＴＮＦＲ１及びＢａｘ（ベータ変異形）のＤＮＡ配列をｃＤＮＡプールからクローニングし、ｐＲＫ発現ベクター(Genentech)に挿入した。ＤＲ５Ｌ及びＤＲ５ＳのＯ−グリコシル化変異株は、４つのスレオニンのアラニン残基への部位特異的変異であるＭｕｔ４ｘＴＡ（Ｔ１３０、Ｔ１３１、Ｔ１３２、Ｔ１３５）、又は５つのスレオニンのアラニン残基への部位特異的変異であるＭｕｔ５ｘＴＡ（Ｔ１３０、Ｔ１３１、Ｔ１３２、Ｔ１３５、Ｔ１４３）により生成した。６つのウェルプレートで、０．５ｕｇ／ウェルのプロアポトーシス分子と２．０ｕｇのｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４又はベクターコントロールの濃度で、ＨＥＫ２９３細胞にプロアポトーシス分子の発現コンストラクトを一過性的に形質移入した。製造会社の手順に従い、リポフェクタミン２０００を使用して、細胞に形質移入した。４８時間の培養後、細胞のアポトーシス分析を行った。
レトロウイルスコンストラクトを生成するために、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４及び変異株を、ｐＱＣＸＩＰレトロウイルスベクター(Clontech)にクローニングした。ΦＮＸ−Ａｍｐｈｏヘルパー細胞株を使用して、高力価レトロウイルス上清を生成した。リン酸カルシウム(Invitrogen)を使用して、パッケージ細胞に形質移入した。形質移入の４８時間後に上清を単離し、１０マイクロｇ／ｍｌのポリブレンと共に標的細胞に添加し、その後、感染を促進するため２７００ｒｐｍで１時間の遠心分離処理を行った。形質導入の後、２マイクロｇ／ｍｌのピューロマイシンを使用して、細胞を選別した。
【００９９】
ｓｉＲＮＡの設計及び形質移入手順
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−１４、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ−３、カスパーゼ８及びＤＲ５に対するｓｉＲＮＡは、独自の選択基準を使用して、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ(Lafayette, CO)により設定されたものである。選択された配列は、
siGalNAcT-14 (1): 5' GACCATCCGCAGTGTATTA-dTdT 3' (=14-4) (配列番号:15)
siGalNAcT-14 (2): 5' ATACAGATATGTTCGGTGA-dTdT 3' (=14-6) (配列番号:16)
siGalNAcT-3 (1): 5' CCATAGATCTGAACACGTT-dTdT 3' (=3-2) (配列番号:17)
siGalNAcT-3 (2): 5' GCAAGGATATTATACAGCA-dTdT 3' (=3-7) (配列番号:18)
siFut-6 (1) 5' GUACCAGACACGCGGCAUA-dTdT 3' (=6-1) (配列番号:19)
siFut-6 (2) 5' ACCGAGAGGUCAUGUACAA-dTdT 3' (=6-2) (配列番号:20)
siCaspase-8: 5' GGACAAAGTTTACCAAATG-dTdT 3' (配列番号:21)
ｓｉＲＮＡを二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドとして購入し、それぞれの細胞株に、各ｓｉＲＮＡの最終濃度が２５ｎＭとなるように形質移入した。非標的配列(Dharmacon)に対するｓｉＲＮＡの二本鎖をコントロールとして用いた。上清に細胞を加えたリバーストランスフェクションにより、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用いて、予めプレートにまいた脂質−ｓｉＲＮＡ複合体に細胞をトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００の濃度は、製造会社の手順による。４８時間のインキュベーション後、細胞をｍＲＮＡ分析用に採取、又は組み替えヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、エトポシド又はスタウロスポリンとともに、生死判別アッセイ用に更に２４〜７２時間、ウエスタンブロット分析用に４時間、８時間又は２４時間インキュベートした。
【０１００】
ベンジル−ａ−ＧａｌＮＡｃを使用したＯ−グリコシル化の抑制
Ｃｏｌｏ２０５細胞をベンジル−ａ−ＧａｌＮＡｃ（２ｍＭ又は４ｍＭ）の存在下で７２時間成長させた。この時点で、阻害剤の存在下のまま、９６ウェルプレートに再度まき、２４時間かけて付着させた。次に細胞を、前述したようにＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの濃度を増加させながら刺激し、生死判別アッセイを行った。
定量的ＰＣＲ
ＧａｌＮａｃＴ−１４及びＧａｌＮａｃＴ−３の転写発現レベルを標準Ｔａｑｍａｎ技術を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲで評価した。転写レベルはハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨに規準化し、結果を規準化発現値（＝２−ＤＣｔ）として表した。ＧａｌＮａｃＴ−１４（カタログ番号：Hs00226180_m1_GT14）、ＧａｌＮａｃＴ−３（カタログ番号：Hs00237084_m1_GT3）及びＧＡＰＤＨ（カタログ番号：402869）のプライマー／プローブ一式は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ(Foster City, CA)より購入した。
【０１０１】
免疫沈降法、ウエスタンブロット分析及び抗体
ＩＰ：  抗Ａｐｏ２Ｌ（2E11; ＡＴＣＣ預託番号 HB-12256）、抗ＤＲ４（3G1及び4G7, ＡＴＣＣ預託番号PTA-99）、及び抗ＤＲ５（3H3, ATCC Accession No. 12534及び5C7）のモノクローナル抗体は、ジェネンテック社においてレセプター−Ｆｃ融合タンパク質を抗原として用いて生成された。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  ＤＩＳＣの免疫沈降法に用いられる抗ＤＲ４（4G7）及び抗ＤＲ５(5C7)モノクローナル抗体は、Ｐｉｅｒｃｅ製のＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＩｇＧ  Ｐｌｕｓ  オリエンテーションキット（カタログ番号44990）を使用してアガロースに結合させた。ＤＩＳＣ免疫沈降法においてＤＲ４／５の免疫検出に用いられる抗ＤＲ４（3G1）及び抗ＤＲ５(3H3)モノクローナル抗体を、Ｐｉｅｒｃｅ製のＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ  ビオチン化キット（カタログ番号21217）を使用して、ビオチン化した。ＦＬＡＧ−タグ化Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを調製し、前述したように（Kischkel,  Immunity, 12:611 (2000)）、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Sigma）と架橋させた。これらの実験は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  ＦＬＡＧ＋抗ＦＬＡＧ  ＤＩＳＣ解析（Kischkel、上掲)について前述したように行った。ＤＲ４／５  ＤＩＳＣ  免疫沈降実験も、免疫沈降のために抗ＤＲ４（4G7）及び抗ＤＲ５（5C7）モノクローナル抗体を直接アガロースに結合させた以外は、前述したように行った（Sharp等、 J. Biol. Chem., 280:19401 (2005)）。 
ＷＢ：  ６つのウェルプレートに、１つのウェルに対し５×１０５の細胞を播種した。ＲＮＡｉノックダウン実験では、細胞を異なるｓｉＲＮＡで４８時間処理した後、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで４時間、８時間あるいは２４時間処理を行った。表示した時間経過後に、細胞を氷冷のＰＢＳで洗浄し、１％トリトンＸ−１００含有の低浸透圧性の溶解緩衝液(20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCL, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA及び1 mM DTT)に溶解した。各サンプルでは、４０μｇのタンパク質を還元条件下で１０％又は１０〜２０％勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。ニトロセルロース膜（Schleicher 及び Schuell）に移した後に、１０％脱脂粉乳で１時間インキュベートし、その後下記の一次抗体：ヤギ抗カスパーゼ３抗体（1:1000, R&D）、ウサギ抗カスパーゼ８抗体（1:1000, Pharmingen）、マウス抗カスパーゼ９抗体５Ｂ４（1:1000, MBL）、ウサギ抗Ｂｉｄ抗体（1:1000, Pharmingen）、ウサギ抗ＤＲ５抗体（1:500, Cayman）又はヤギ抗アクチン抗体（1:200, Santa Cruz Biotechnology）とともに１時間インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎでメンブランを５回洗浄し、それから各ペルオキシダーゼ抱合親和性精製二次抗体（1:5000, Biorad）とともに３０分間インキュベートした。メンブランを再び５回洗浄し、高感度化学発光（ECL, Amersham）を使用して発光させ、コダック バイオマックスフィルムに露光させた。
【０１０２】
フローサイトメトリー／ＦＡＣＳ分析
ＴＮＦファミリレセプター、ＤＲ４及びＤＲ５の表面発現は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  フロー部位メーター（Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA）を用いた蛍光表示式細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定した。表示のｓｉＲＮＡの形質移入を４８時間行ったＣ１７０とＰＳＮ−１細胞を、１０μｇ／ｍｌの一次抗体、４Ｇ７（抗ＤＲ４）又は３Ｈ３（抗ＤＲ５）又はマウスＩｇＧコントロール抗体にて４℃で１時間かけて染色した。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）抱合ヤギ抗マウス第二次抗体（Jackson Laboratories）とともに４℃で３０分インキュベートした。その後ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  フロー部位メーターを用いたフローサイトメトリーにて細胞を分析した。
カスパーゼアッセイ
カスパーゼ−３／−７活性を１００μＭの蛍光発生ペプチドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣを含有する４０μｌのカスパーゼ緩衝液（50mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 % sucrose, 1mM EDTA, 0.1% CHAPS及び10 mM DTT）中で３７℃で試験した。活性の表示の時間にわたる連続測定を、モレキュラーデバイス蛍光光度計のキネティックモードと４０５−５１０フィルターペアを使用して、ＤＥＶＤ−ＡＦＣからＡＦＣを放出させることにより行った。カスパーゼ活性の評価には、４０μｌのカスパーゼ緩衝液（１００μＭのＤＥＶＤ−ＡＦＣ含有）に対し２０μｇの総細胞タンパク質（Triton X-100 抽出物）を使用した。
【０１０３】
ＣＨＯ由来ＤＲ５の炭水化物分析
ＣＨＯ細胞由来ＤＲ５の単糖組成物を４Ｎ  ＴＦＡによる加水分解後に得た。遊離した単糖の分析は、パルス電流検出器と組み合わせた高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたＤｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣ  ＨＰＬＣ  システムにより、実施した。
動物及び皮下注射異種移植の研究
雌の胸腺欠損ヌードマウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA）を、実験研究に用いる前に最低一週間ジェネンテックの動物収容施設に順応化した。全ての実験手順は、ジェネンテックの施設内動物実験委員会（ＩＡＣＡＵＣ）により認可された。Ｃｏｌｏ２０５、ＤＬＤ−１、及びＲＫＯをマウス１匹に対し５×１０６ 細胞、又はＣｏｌｏ３２０ＨＳＲヒト結腸癌細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）をマウス１匹に対し２０×１０６ 細胞の割合で、皮下注射により接種した。腫瘍の測定はデジタルカリパスによって行い、腫瘍量は数式、（Ａ＝長さ）×（Ｂ＝幅）２を使用して算出した。腫瘍量が一旦約１５０〜２００ｍｍ３に到達すると、マウスを任意にグループ分けし、０日目〜４日目に溶媒あるいはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（６０ｍｇ／ｋｇ／日）を腹腔内（ｉ．ｐ．）へ投与した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ−１】
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【図３Ｄ−２】
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【図３Ｄ−３】
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【図３Ｅ−１】
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【図３Ｅ−２】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ａ−３】
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【図４Ａ−４】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｂ−３】
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【図４Ｂ−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
2014237673.tif 000055
【図１５Ｂ】
2014237673.tif 000056
【図１５Ｃ−１】
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【図１５Ｃ−２】
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【配列表】
2014237673000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月18日(2014.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者を治療するための医薬であって、
癌がアゴニスト性の抗ＤＲ４抗体又はアゴニスト性の抗ＤＲ５抗体に感受性であることが、該患者から採取した癌組織又は細胞試料におけるＧａｌＮａｃ−Ｔ１４の発現を検出することによって検査されており、
有効量のアゴニスト性の抗ＤＲ４抗体又はアゴニスト性の抗ＤＲ５抗体を含んでなる、医薬。
【外国語明細書】
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