(57)【要約】      （修正有）【課題】インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）抗体を含む、医薬組成物の提供。【解決手段】クロマトグラフ分離工程により、精製されたＩＬ−１３抗体、より特にモノクローナルＩＬ−１３抗体、とりわけヒトＩＬ−１３モノクローナル抗体を含む、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、慢性閉塞性肺疾患、強皮症、炎症性腸疾患およびホジキンリンパ腫、特に喘息のようなＩＬ−１３関連障害の処置を行うための医薬組成物。該ＩＬ−１３抗体は酢酸緩衝液でｐＨ４．５〜６．０に緩衝状態であり、医薬組成物中に１〜２００ｍｇ／ｍｌの量で含有し、一種以上の薬学的に許容された賦形剤を含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸緩衝液で４.５−６.０のｐＨに緩衝化されている、ＩＬ−１３抗体および１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ＩＬ−１３抗体がヒトＩＬ−１３モノクローナル抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＩＬ−１３抗体が、医薬組成物中に１から２００mg／mlの量で存在する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
５.２から５.７のｐＨに緩衝化されている、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
医薬組成物中に１から１００mMの量で存在する酢酸ナトリウムを含む、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
薬学的に許容される賦形剤が、１種以上の界面活性剤、無機または有機塩、安定化剤、希釈剤、可溶化剤、還元剤、抗酸化剤、キレート剤および／または防腐剤を含む、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
界面活性剤が、医薬組成物中に０.００１から０.１％(ｗ／ｗ)の量で存在するPolysorbate 80である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
無機塩が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよび重炭酸ナトリウムを含む、請求項６から８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
無機塩が、医薬組成物中に１０から２００mMの量で存在する塩化ナトリウムである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
酢酸緩衝液で５.５±０.１のｐＨに緩衝化されている、ＩＬ−１３抗体、界面活性剤および無機塩を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
酢酸ナトリウム緩衝液で５.５±０.１のｐＨに緩衝化されている、ＩＬ−１３抗体、塩化ナトリウムおよびPolysorbate 80を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
５０mM  酢酸ナトリウム緩衝液で５.５±０.１のｐＨに緩衝化されている、５０mg／mlのＩＬ−１３抗体、８５mM  塩化ナトリウムおよび０.０１％(ｗ／ｗ)  Polysorbate 80を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
ＩＬ−１３抗体を精製する方法であって、１回以上のクロマトグラフ分離工程を含み、ここで、該分離工程の各々が、酢酸緩衝液で３.５−７.０のｐＨに緩衝化されている１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む溶出緩衝液での溶出を含む、方法。
【請求項１５】
クロマトグラフ分離工程が親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
クロマトグラフ分離を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー、続くカチオン交換クロマトグラフィー、続くアニオン交換クロマトグラフィーにより行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
１種以上の薬学的に許容される賦形剤が無機塩を含む、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
無機塩が、１０から２００mMの量で溶出緩衝液中に存在する塩化ナトリウムを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
酢酸緩衝液が、溶出緩衝液中に１から１００mMの量で存在する酢酸ナトリウムである、請求項１４から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
溶出緩衝液が、ｐＨ５.５±０.１に緩衝化された５０mM  酢酸ナトリウムおよび８５mM  塩化ナトリウムを含む、請求項１４から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１３関連障害の処置用薬剤の製造における、請求項１から１３のいずれかに記載の医薬抗体組成物の使用。
【請求項２２】
ＩＬ−１３関連障害が喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、慢性閉塞性肺疾患、強皮症、炎症性腸疾患およびホジキンリンパ腫から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
ＩＬ−１３関連障害が喘息である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
ＩＬ−１３関連障害の処置または予防の方法であって、罹患者に治療的有効量の請求項１から１３のいずれかに記載の医薬抗体組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
ＩＬ−１３関連障害の処置に使用するための、請求項１から１３のいずれかに記載の医薬抗体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−１３抗体、より特にモノクローナルインターロイキン−１３抗体、とりわけヒトインターロイキン−１３モノクローナル抗体を含む医薬組成物、該抗体を精製する方法および喘息のようなインターロイキン−１３関連障害の処置における該組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン(ＩＬ)−１３は、１２kDaのおおよその非修飾分子量を有する１１４アミノ酸のサイトカインである。ＩＬ−１３はＩＬ−４と最も密接に関係しており、それとアミノ酸レベルで３０％配列相同性を共有する。ヒトＩＬ−１３遺伝子はＩＬ−４遺伝子に隣接して染色体５ｑ３１上に存在する[McKenzie, A.N. et al., J Immunol, 1993. 150(12), 5436-5444; Minty, A. et al., Nature, 1993. 362(6417), 248-50]。
【０００３】
ＩＬ−１３は、最初はＴｈ２  ＣＤ４＋リンパ球由来サイトカインと定義されたが、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔリンパ球ＮＫ細胞、および肥満細胞、好塩基球、好酸球、マクロファージ、単球および気道平滑筋細胞のような非Ｔ細胞集団によりまた産生される。
【０００４】
ＩＬ−１３は多くの疾患、特に、炎症性応答が原因の疾患と関連している。例えば、組み換えＩＬ−１３の、未処置非感作齧歯類気道への投与は、気道炎症、粘液産生および気道過剰応答(ＡＨＲ)を含む喘息表現型の多くの状況を引き起こした[Wills-Karp, M. et al., Science, 1998. 282(5397), 2258-2261; Grunig, G. et al., Science, 1998. 282(5397), 2261-2263; Venkayya, R., et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2002. 26(2), 202-208; Morse, B. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002. 282(1), L44-49]。同様な表現型が、ＩＬ−１３が肺で特異的に過剰発現されたトランスジェニックマウスで観察された。このモデルで、ＩＬ−１３へのより慢性の暴露が線維症をもたらした[Zhu, Z. et al., J Clin Invest, 1999. 103(6), 779-788]。
【０００５】
ＩＬ−１３遺伝子における多くの遺伝子多型もまたアレルギー性疾患と関連している。特に、アミノ酸１３０のアルギニン残基がグルタミン(Ｑ１３０Ｒ)に置換されているＩＬ−１３遺伝子の変異体が、気管支喘息、アトピー性皮膚炎および上昇した血清ＩｇＥレベルと関連している[Heinzmann, A. et al., Hum Mol Genet, 2000. 9(4), 549-559; Howard, T. D. et al., Am J Hum Genet, 2002. 70(1), 230-236; Kauppi, P. et al., Genomics, 2001. 77(1-2), 35-42; Graves, P. E. et al., J Allergy Clin Immunol, 2000. 105(3), 506-513]。この特定のＩＬ−１３変異体はまた、アミノ酸の数から２０個のアミノ酸シグナル配列を除いているいくつかのグループによりＱ１１０Ｒ変異体(アミノ酸１１０のアルギニン残基がグルタミンで置換されている)とも呼ばれている。
【０００６】
ＩＬ−１３産生はまたアレルギー性喘息とも関連し[van der Pouw Kraan, T. C. et al., Genes Immun, 1999. 1(1), 61-65]、そしてＩＬ−１３の増加したレベルはまたアトピー性鼻炎(枯草熱)、アレルギー性皮膚炎(湿疹)および慢性副鼻腔炎のヒト対象で測定されている。
【０００７】
喘息以外に、ＩＬ−１３はまた他の線維性状態とも関連している。ＩＬ−４よりも１０００倍まで高いＩＬ−１３の増加したレベルが、全身性硬化症の患者の血清および肺線維症の他の形態に罹患した患者からの気管支肺胞洗浄(ＢＡＬ)サンプルにおいて測定されている[Hasegawa, M. et al., J Rheumatol, 1997. 24(2), 328-332; Hancock, A. et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 1998. 18(1), 60-65]。
【０００８】
マウス肺におけるＩＬ−１３の過剰発現が気腫、上昇した粘液産生および炎症を引き起こし、ヒト慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)の状況を反映することが証明されている[Zheng, T. et al., J Clin Invest, 2000. 106(9), 1081-1093]。
【０００９】
ＩＬ−１３がまた炎症性腸疾患の病因に役割を有する可能性も提案されており[Heller, F. et al., Immunity, 2002. 17(5), 629-38]、ＩＬ−１３の増加したレベルが、正常対象と比較したときホジキン病患者の一部の血清で検出されている[Fiumara, P. et al., Blood, 2001. 98(9), 2877-2878]。
【００１０】
ＩＬ−１３阻害剤はまた腫瘍再発または転移の予防に治療的に有用であるとも考えられている[Terabe, M. et al., Nat Immunol, 2000. 1(6), 515-520]。ＩＬ−１３阻害はまた動物モデルで抗ウイルスワクチンを増強することも示されており、ＨＩＶおよび他の感染症の処置に有益であり得る[Ahlers, J. D. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(20), 13020-13025]。
【００１１】
ＩＬ−１３阻害への抗体介在性方法が記載されている。例えば、ＷＯ２００５／００７６９９(Cambridge Antibody Technology Limited)は、ＩＬ−１３活性の中和を示す一連のヒト抗ＩＬ−１３抗体分子を記載しており、ＩＬ−１３関連障害の処置への使用の可能性を主張している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の第一の局面に従って、酢酸緩衝液で４.５−６.０のｐＨに緩衝化されている、ＩＬ−１３抗体および１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
抗体精製法は、典型的にクロマトグラフィー分離(例えばタンパク質Ａクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど)のような多くの分離技術を必要とすることが広く知られている。この分離方法の結果として、多くの異なる緩衝液の使用が必要である。例えば、ＷＯ２００４／０７６４８５に記載の抗体精製法は、タンパク質Ａクロマトグラフィーのための５０mM  グリシン／グリシネートｐＨ８.０、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーのための５０mM  Ｔｒｉｓ ＨＣｌ  ｐＨ８.０および２０mM  リン酸ナトリウムｐＨ６.５、およびＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーのための２５mM  Ｔｒｉｓ ＨＣｌ  ｐＨ８.６の使用を必要とする。
【００１４】
対照的に、本発明は、本発明の組成物内に存在する固定された濃度および予め決定されたｐＨの一つの酢酸緩衝液の使用のみを必要とし、これは全ＩＬ−１３抗体精製工程を通して存在するとの利点を有する。故に、この緩衝液の使用は、本精製工程の最初だけでなく、全精製工程を通してであり、故に処理時間、費用の低下および生成物収率の増加をもたらす。
【００１５】
“抗体”への言及は、天然であれ、一部もしくは完全に合成的に製造したものであれ、免疫グロブリンへの言及を含むことは認められよう。本用語はまた抗原結合ドメインを含む全てのポリペプチドまたはタンパク質も包含する。
【００１６】
抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ；および二重特異性抗体のような分子である。
【００１７】
モノクローナルおよび他の抗体を得ること、および元の抗体の特異性を保持した他の抗体またはキメラ分子を製造するための組み換えＤＮＡ技術の使用が可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡ、または相補性決定領域(ＣＤＲ)の、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域への挿入を含み得る。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００、およびその後の多くの(a large body of)文献を参照のこと。
【００１８】
あるいは、ＣＤＲ由来配列を担持する新規ＶＨまたはＶＬ領域は、全可変ドメイン内に変異を産生するための１種以上の選択したＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子の無作為変異誘発を使用して製造し得る。このような技術はGram et al., PNAS USA, 1992. 89, 3576-3580により記載され、著者らは変異性ＰＣＲを使用する。使用できる他の方法は、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域への直接変異誘発である。このような技術は、Barbas et al., PNAS USA 1994. 91, 3809-3813およびSchier et al., J. Mol. Biol. 1996. 263, 551-567により開示される。
【００１９】
抗体が多くの方法で修飾できるため、用語“抗体”は、必要な特異性を有する抗原結合ドメインを有する全ての特異的結合メンバーまたは物質を包含すると解釈すべきである。故に、この用語は、天然であれ、完全にもしくは一部合成的に製造したもので、免疫グロブリン結合ドメインを含む全てのポリペプチドを含む、抗体フラグメントおよび誘導体を包含する。他のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメイン、または等価物を含むキメラ分子は、それ故に含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現はＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３、およびその後の多くの(a large body of)文献に記載されている。
【００２０】
抗体工学の分野で利用可能なさらなる技術は、ヒトおよびヒト化抗体の単離を可能にしている。例えば、ヒトハイブリドーマは、Kontermann et al., [2001;抗体工学, Springer Laboratory Manuals]に記載の通り製造できる。特異的結合メンバーを製造するためのもう一つの確立された技術であるファージディスプレイ法は、Kontermann et al. (supra)およびＷ０９２／０１０４７のような多くの刊行物に詳細に記載されている。マウス抗体遺伝子が不活性化され、機能的にヒト抗体遺伝子と置き換わっているが、マウス免疫系の他の要素は無傷であるトランスジェニックマウスを、ヒト抗原に対するヒト抗体の単離に使用できる。既知遺伝子配列中に変異を挿入する無細胞翻訳技術であるリボソームディスプレイ法も特異的結合メンバーの製造および／または最適化に使用できる[Hanes and Plueckthun PNAS USA, 1994. 94, 4937-4942; He and Taussig Nucleic Acids Res. 1997. 25, 5132-5134; Schaffitzel et al., J. Immunol. Methods, 1999. 231, 119-135; He et al., J. Immunol. Methods, 1999. 231, 105-117; He et al., Methods Mol. Biol. 2004. 248, 177-189]。
【００２１】
合成抗体分子は、例えばKnappik et al., J. Mol. Biol. 2000. 296, 57-86またはKrebs et al., Journal of Immunological Methods 2001. 254, 67-84により記載の通り、適当な発現ベクター内で合成および集合させたオリゴヌクレオチドの手段により製造した遺伝子からの発現により製造できる。
【００２２】
全抗体のフラグメントが、抗原を結合する機能を行うことができることが示されている。結合フラグメントの例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント；(ii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；(iii)一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；(iv)ＶＨまたはＶＬドメインから成るｄＡｂフラグメント[Ward, E. S. et al., Nature, 1989. 341, 544-546; McCafferty et al., Nature, 1990. 348, 552-554; Holt et al., Trends Biotechnol. 2003. 21(11), 484-490]；(ｖ)単離されたＣＤＲ領域；(vi)２個の結合したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ')２フラグメント、(vii)抗原結合部位を形成するように２個のドメインが結合することを可能にするペプチドリンカーによりＶＨドメインおよびＶＬドメインが結合している、一本鎖Ｆｖ分子(ｓｃＦｖ)[Bird et al., Science, 1988. 242, 423-426; Huston et al., PNAS USA, 1988. 85, 5879-5883]；(viii)二重特異性一本鎖Ｆｖダイマー(ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５)および(ix)遺伝子融合により構築された多価または多特異性フラグメントである“二重特異性抗体”[ＷＯ９４／１３８０４; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. 90, 6444-6448]である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは二重特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の取り込みにより安定化し得る[Y. Reiter et al., Nature Biotech., 1996. 14, 1239-1245]。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディも製造できる[S. Hu et al., Cancer Res., 1996. 56, 3055-3061]。
【００２３】
二重特異性抗体を使用するとき、種々の方法で製造できる[HolligerおよびWinter Current Opinion Biotechnol. 1993. 4, 446-449]、例えば化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから製造された、通常の二重特異性抗体であってよく、または上記の何らかの二重特異性抗体フラグメントであってよい。二重特異性抗体の例は、異なる特異性の２個の抗体の結合ドメインを使用でき、短可動性ペプチドを介して直接結合している、ＢｉＴＥ技術のものを含む。これは、短い一ポリペプチド鎖上に２個の抗体を合わせる。二重特異性抗体およびｓｃＦｖを、抗イディオタイプ反応の効果を低下させる可能性がある、Ｆｃ領域なしに可変ドメインのみで構築できる。
【００２４】
二特異性二重特異性抗体は、二重特異性全抗体とは逆に、大腸菌内で容易に構築し、発現できるために、特に有用であり得る。適当な結合特性の二重特異性抗体(および、抗体フラグメントのような多くの他のポリペプチド)は、ライブラリーからファージディスプレイ法(ＷＯ９４／１３８０４)を使用して容易に選択できる。二重特異性抗体の一アームを、例えば、ＩＬ−１３に対する特異性を有して、一定に保たなければならないとき、他方のアームを変え、適当な特性の抗体が選択が選択される場所であるライブラリーを製造できる。二重特異性全抗体をknobs-into-holes工学により製造できる[Ridgeway et al., Protein Eng., 1996. 9, 616-621]。
【００２５】
“ＩＬ−１３抗体”への言及は、天然に存在するＩＬ−１３を、ＷＯ２００５／００７６９９の実施例２−１０および２５に明示のアッセイに従い、５００nM未満の濃度で中和できる、全抗体または抗体フラグメントへの言及を含む。
【００２６】
好ましくは、ＩＬ−１３抗体は、天然に存在するＩＬ−１３を、ＢＡＫ５０２Ｇ９  ＶＨドメイン(ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号１５)およびＢＡＫ５０２Ｇ９  ＶＬドメイン(ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号１６)により形成されたＩＬ−１３抗原結合部位と同程度以上の効力で中和する。
【００２７】
好ましくは、ＩＬ−１３抗体はモノクローナルＩＬ−１３抗体、より好ましくはヒトＩＬ−１３モノクローナル抗体である。
【００２８】
特に好ましいＩＬ−１３抗体は、ＷＯ２００３／０３５８４７、ＷＯ２００３／０８６４５１、ＷＯ２００５／００７６９９またはＷＯ２００５／０８１８７３に記載のものから選択される抗体である。
【００２９】
例えば、一つの特に好ましい態様において、ＩＬ−１３抗体はＢＡＫ２７８Ｄ６  ＨＣＤＲ１−３およびＬＣＤＲ１−３(各々ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号１−６)である。ＢＡＫ２７８Ｄ６セットのＣＤＲ、ＢＡＫ２７８Ｄ６セットのＨＣＤＲまたはＢＡＫ２７８Ｄ６  ＬＣＤＲの一連のＣＤＲ、またはその中の一または二置換は、ＢＡＫ２７８Ｄ６系統と言う。
【００３０】
さらに特に好ましい態様において、ＩＬ−１３抗体はＢＡＫ５０２Ｇ９  ＨＣＤＲ１−３およびＬＣＤＲ１−３である(各々ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号７−１２)。
【００３１】
なおさらに特に好ましい態様において、ＩＬ−１３抗体は、ＢＡＫ１１１１Ｄ１０  ＨＣＤＲ１−３およびＬＣＤＲ１−３である(各々ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号９１−９６)。
【００３２】
なおさらに特に好ましい態様において、ＩＬ−１３抗体は、ＢＡＫ１１６７Ｆ２  ＨＣＤＲ１−３およびＬＣＤＲ１−３である(各々ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号６１−６６)。
【００３３】
なおさらに特に好ましい態様において、ＩＬ−１３抗体は、ＢＡＫ１１８３Ｈ４  ＨＣＤＲ１−３およびＬＣＤＲ１−３(ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号９７−１０２である)。
【００３４】
関連する一連のＣＤＲを、抗体フレームワーク領域または他のタンパク質骨格、例えばフィブロネクチンまたはチトクロームＢ内に入れる[Koide et al., J. Mol. Biol. 1998. 284, 1141-1151; Nygren et al., Current Opinion in Structural Biology, 1997. 7, 463-469]。好ましくは抗体フレームワーク領域を用い、そして、それらを用いるとき、それらは好ましくは生殖系列であり、より好ましくは重鎖用の抗体フレームワーク領域は、ＶＨ１ファミリーからのＤＰ１４であり得る。軽鎖用の好ましいフレームワーク領域はλ３−３Ｈであり得る。ＢＡＫ５０２Ｇ９セットのＣＤＲのために、抗体フレームワーク領域がＶＨ  ＦＲ１−３(各々ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号２７−２９)および軽ＦＲ１−３(各々ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号３０−３２)用であるのが好ましい。好ましい態様において、ＶＨドメインをＷＯ２００５／００７６９９の配列番号１５のアミノ酸配列と共に提供し、これは“ＢＡＫ５０２Ｇ９  ＶＨドメイン”と名付ける。さらに非常に好ましい態様において、ＶＬドメインを、ＷＯ２００５／００７６９９の配列番号１６のアミノ酸配列と共に提供し、これは“ＢＡＫ５０２Ｇ９  ＶＬドメインと名付ける。
【００３５】
好ましい態様において、ＩＬ−１３抗体はカニクイザル(cynomologous)ＩＬ−１３および／またはＩＬ−１３変異体、Ｑ１３０Ｒと交差反応する。
【００３６】
好ましくは、ＩＬ−１３抗体は、１から２００mg／ml、より好ましくは５０および１００mg／ml、とりわけ５０mg／mlの量で医薬組成物中に存在する。
【００３７】
好ましくは、医薬組成物は５.２から５.７、最も好ましくは５.５±０.１のｐＨに緩衝化されている。このようなｐＨの選択は、医薬組成物に顕著な安定性を付与する。この範囲内にｐＨを制御する他の緩衝液の例は、スクシネート、グルコネート、ヒスチジン、シトレート、ホスフェート、グルタレート(glutaric)、カコジレート(cacodylyte)、マレイン酸水素ナトリウム、トリス−(ヒドロキシルメチル)アミノメタン(Ｔｒｉｓ)、２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸(ＭＥＳ)、イミダゾールおよび他の有機酸緩衝液を含む。
【００３８】
好ましくは、本緩衝液は酢酸緩衝液、より好ましくは酢酸ナトリウムである。
好ましくは、本酢酸緩衝液は、１から１００mM、より好ましくは３０および７０mM、とりわけ５０mMの量で医薬組成物中に存在する。
【００３９】
“薬学的に許容される賦形剤”への言及は、医薬組成物に慣用的に使用される全ての賦形剤への言及を含むことは認められよう。このような賦形剤は、典型的に、１種以上の界面活性剤、無機または有機塩、安定化剤、希釈剤、可溶化剤、還元剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐剤などを含む。
【００４０】
典型的界面活性剤の例は：非イオン性界面活性剤(ＨＬＢ６から１８)、例えばソルビタン脂肪酸エステル(例えばモノカプリル酸ソルビタン、モノラウリル酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン)、グリセリン脂肪酸エステル(例えばモノカプリル酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン)、ポリグリセリン脂肪酸エステル(例えばモノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、モノリノール酸デカグリセリル)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(例えばモノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン)、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル(例えばテトラステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール)、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル(例えばモノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル)、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えばジステアリン酸ポリエチレングリコール)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル(例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル(例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル)、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル(例えばポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル)、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油(例えばポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油)、ポリオキシエチレン蜜蝋誘導体(例えばポリオキシエチレンソルビトール蜜蝋)、ポリオキシエチレンラノリン誘導体(例えばポリオキシエチレンラノリン)、およびポリオキシエチレン脂肪酸アミド(例えばポリオキシエチレンステアリルアミド)；
アニオン性界面活性剤、例えばＣ１０−Ｃ１８アルキル硫酸塩(例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム)、平均２から４モルのエチレンオキシドを有するポリオキシエチレンＣ１０−Ｃ１８アルキルエーテル硫酸塩(例えばポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム)、およびＣ８−Ｃ１８アルキルスルホスクシネートエステル塩(例えばナトリウムラウリルスルホスクシネートエステル)；および天然界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質(例えばスフィンゴミエリン)、およびＣ１２−Ｃ１８脂肪酸のスクロースエステルを含む。
【００４１】
好ましくは、本界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択する。特に好ましくは本界面活性剤はPolysorbate 20、21、40、60、65、80、81および85、最も好ましくはPolysorbate 20および80、とりわけPolysorbate 80である。
【００４２】
好ましくは、本界面活性剤は、０.００１から０.１％(ｗ／ｗ)、より好ましくは０.００５および０.０５(ｗ／ｗ)、とりわけ０.０１％(ｗ／ｗ)の量で医薬組成物中に存在する。
【００４３】
典型的無機塩の例は：塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸カリウムおよび重炭酸ナトリウムまたは任意の他のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を含む。好ましくは、本無機塩は塩化ナトリウムである。
【００４４】
好ましくは、本無機塩は、１０から２００mM、より好ましくは６０および１３０mM、とりわけ８５mMの量で、医薬組成物中に存在する。
【００４５】
還元剤の例は、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびそれらの塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、およびＣ１−Ｃ７チオアルカン酸を含む。
【００４６】
抗酸化剤の例は、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、アルファ−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミルおよび没食子酸プロピルを含む。
【００４７】
キレート剤の例は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(ＥＤＴＡ)、ピロリン酸ナトリウムおよびメタリン酸ナトリウムを含む。
【００４８】
安定化剤の例は、クレアチニン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、アスパラギン酸、アルギニン、リシンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸、スクロース、トレハロース、ソルビトール、キシリトールおよびマンノースから選択される炭水化物、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ；例えばＰＥＧ３３５０またはＰＥＧ４０００)またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(例えばPolysorbate 20またはPolysorbate 80)から選択される界面活性剤またはこれらの任意の組合せを含む。
【００４９】
一つの好ましい態様において、本安定化剤は、前記で定義の単一の炭水化物(例えばトレハロース)を含む。
【００５０】
別の好ましい態様において、安定化剤は、炭水化物と組み合わせたアミノ酸(例えばトレハロースとアラニンまたはトレハロース、アラニンとグリシン)を含む。
【００５１】
さらに別の好ましい態様において、本安定化剤は、炭水化物と界面活性剤と組み合わせたアミノ酸(例えばトレハロース、アラニンとＰＥＧ３３５０またはトレハロース、プロリンとＰＥＧ３３５０またはトレハロース、アラニンとPolysorbate 80またはトレハロース、プロリンとPolysorbate 80またはトレハロース、アラニン、グリシンとＰＥＧ３３５０またはトレハロース、アラニン、グリシンとPolysorbate 80)を含む。
【００５２】
なおさらに別の好ましい態様において、本安定化剤は、界面活性剤と組み合わせたアミノ酸(例えばアラニンとＰＥＧ３３５０またはアラニン、グリシンとＰＥＧ３３５０)を含む。
【００５３】
なおさらに別の好ましい態様において、本安定化剤は、界面活性剤と組み合わせた炭水化物(例えばトレハロースとＰＥＧ３３５０またはトレハロースとPolysorbate 80)を含む。
【００５４】
防腐剤の例は、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチル塩化アンモニウムの混合物)、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコールのような芳香族性アルコール、メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールを含む。
【００５５】
本発明の好ましい態様において、医薬組成物は、酢酸緩衝液で５.５±０.１のｐＨに緩衝化されている、ＩＬ−１３抗体、界面活性剤および無機塩を含む。
【００５６】
本発明のさらに好ましい態様において、医薬組成物は、酢酸ナトリウム緩衝液で５.５±０.１のｐＨに緩衝化されている、ＩＬ−１３抗体、塩化ナトリウムおよびPolysorbate 80を含む。
【００５７】
本発明のなおさらに好ましい態様において、医薬組成物は、５０mM  酢酸ナトリウム緩衝液で５.５±０.１のｐＨに緩衝化されている、５０mg／mlのＩＬ−１３抗体、８５mM  塩化ナトリウムおよび０.０１％(ｗ／ｗ)Polysorbate 80を含む。
【００５８】
本発明の第二の局面によって、ＩＬ−１３抗体を精製する方法であって、１回以上のクロマトグラフ分離工程を含み、ここで、該分離工程の各々が、酢酸緩衝液で３.５−７.０のｐＨに緩衝化されている１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む溶出緩衝液での溶出を含む、方法を提供する。
【００５９】
好ましくは、この１回以上のクロマトグラフ分離工程は、親和性クロマトグラフィー(例えばタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えばカチオンおよびアニオン交換クロマトグラフィー)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(例えばフェニルクロマトグラフィー)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、チオフィリック吸着クロマトグラフィー、ユーグロブリン吸着クロマトグラフィー、色素リガンドクロマトグラフィーまたは固定化ボロネートクロマトグラフィーから選択される。最も好ましくは、クロマトグラフ分離を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー、続くカチオン交換クロマトグラフィー(例えばＳＰ−セファロースマトリクスを使用して)、続くアニオン交換クロマトグラフィー(例えばＱ−セファロースマトリクスを使用して)により行う。
【００６０】
好ましくは、この１種以上の薬学的に許容される賦形剤は、塩化ナトリウムのような無機塩を含む。
【００６１】
好ましくは、本無機塩は、１０から２００mM、より好ましくは６０および１３０mM、とりわけ８５mMの量で溶出緩衝液中に存在する。
【００６２】
ｐＨを３.５−７.０の範囲に制御する別の緩衝液の例は、スクシネート、グルコネート、ヒスチジン、シトレート、ホスフェートおよび他の有機酸緩衝液を含む。
【００６３】
好ましくは、本緩衝液は酢酸緩衝液、より好ましくは酢酸ナトリウムである。
好ましくは、本酢酸緩衝液は、１から１００mM、より好ましくは３０および７０mM、とりわけ５０mMの量で溶出緩衝液中に存在する。
【００６４】
最も好ましくは、本溶出緩衝液は、ｐＨ５.５±０.１に緩衝化された、５０mM  酢酸ナトリウムおよび８５mM  塩化ナトリウムを含む。
【００６５】
本発明のＩＬ−１３抗体のいずれか(例えば、提供される通りの、ＣＤＲまたは一連のＣＤＲまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ４)をコードする核酸は、適当な条件下に、該核酸を含む組み換え宿主細胞を培養することにより、発現させ得る。発現による産生後、ＶＨまたはＶＬドメイン、または特異的結合メンバーを何らかの適当な技術により単離および／または精製してよく、その後、適当に使用する。
【００６６】
特異的結合メンバー、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、およびコードしている核酸分子およびベクターを、例えば、それらの天然環境から、実質的に純粋なまたは均質の形で、または、核酸の場合、必要な機能のポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子起源なしに、または実質的になしに、単離および／または精製して提供され得る。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、そして完全にまたは部分的に合成されていてよい。
【００６７】
ここに示した通りヌクレオチド配列への言及は、文脈から他の解釈が必要でない限り、特異的配列のＤＮＡ分子を含み、そして、ＵがＴに置換されている特異的配列のＲＮＡ分子を含む。
【００６８】
種々の宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系が既知である。適当な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系およびトランスジェニック植物および動物を含む。
【００６９】
異種ポリペプチドのために当分野で利用可能な哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞およびその他多くのものを含む。
【００７０】
好ましくは、該哺乳動物細胞株は、例えばＮＳ０細胞[Galfre and Milstein Methods Enzymology, 1981. 73, 3]のような骨髄腫細胞培養である。骨髄腫細胞は、形質細胞腫細胞、すなわちリンパ系細胞系統の細胞である。例示的ＮＳ０細胞株は、例えばthe European Collection of Cell Cultures(ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomから無料で入手可能な細胞株ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ。８５１１０５０３である。ＮＳ０は、特に組み換え抗体の産生に使用したとき、非常に高い生成物収率を生じることが可能であることが判明した。
【００７１】
別の好ましい哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。これらは、ジヒドロフォレートレダクターゼ(ｄｈｆｒ)欠損であり、故に、成長をチミジンおよびヒポキサンチンに依存している[PNAS, 1990. 77, 4216-4220]。親ｄｈｆｒ  ＣＨＯ細胞株を、抗体遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子でトランスフェクトし、これはｄｈｆｒ陽性表現型のＣＨＯ細胞形質転換体の選択を可能にする。選択を、コロニーをチミジンおよびヒポキサンチンを欠く培地上で培養することにより行い、これらの不存在は、非形質転換細胞が増殖することを妨げ、形質転換細胞が葉酸経路を再利用し、それにより選択系を迂回することを妨げる。これらの形質転換体は、トランスフェクト遺伝子両方の共統合のために、通常低レベルの産物遺伝子を発現する。抗体遺伝子の増殖レベルは、メトトレキサート(ＭＴＸ)を使用した増幅により増やし得る。この薬剤は、ｄｈｆｒ酵素の直接阻害剤であり、これらの条件下での生存に十分にｄｈｆｒ遺伝子コピー数を増幅させる耐性コロニーの単離を可能にする。ｄｈｆｒおよび抗体遺伝子が、元の形質転換体においてより密接に関連しているため、通常同時の増幅が起こり、故に望む抗体遺伝子の増加した発現が起こる。
【００７２】
ＣＨＯまたは骨髄腫細胞と共に使用するための他の選択系は、ＷＯ８７／０４４６２に記載のグルタミンシンテターゼ(ＧＳ)増幅系である。この系は、細胞の、ＧＳ酵素をコードする遺伝子および望む抗体遺伝子でのトランスフェクションを含む。次いで、無グルタミン培地で増殖する細胞を選択する。これらの選択したクローンを、次いで、メチオニンスルホキシミン(ＭＳＸ)を使用したＧＳ酵素の阻害に付す。細胞は、生存するために、ＧＳ遺伝子を増幅させ、抗体をコードする遺伝子が同時に増幅する。
【００７３】
大腸菌のような原核生物細胞中の抗体および抗体フラグメントの発現は当分野で十分確立されている。レビューのために、例えばPluckthun, A. Bio/Technology 1991. 9, 545-551を参照のこと。培養している真核細胞中の発現もまた、例えば異的結合メンバーの産生のための選択肢として当業者に利用可能である[Chadd, H.E. and Chamow, S.M., Current Opinion in Biotechnology 2001. 12, 188-194; Andersen, D.C. and Krummen, L. Current Opinion in Biotechnology 2002. 13, 117; Larrick, J.W. and Thomas, D.W. Current opinion in Biotechnology 2001. 12, 411-418]。
【００７４】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じて他の配列を含む適当な調節配列を含む、適当なベクターを選択または構築できる。ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えばファージ、またはファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning : a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。例えば核酸構築物の製造、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への挿入および遺伝子発現のための核酸の操作、およびタンパク質の分析のための多くの既知技術およびプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. , John Wiley & Sons, 1988, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 4th edition 1999に詳細に記載されている。Sambrook et al.およびAusubel et al. (両方)を、引用により本明細書に包含させる。
【００７５】
核酸の宿主細胞への挿入は何らかの利用可能な技術を用い得る。真核細胞について、適当な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェクションおよびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニアまたは、昆虫細胞については、バキュロウウイルスを使用したトランスダクションを含み得る。核酸の宿主細胞、特に真核細胞への挿入は、ウイルスまたはプラスミドがベースの系を使用し得る。プラスミド系はエピソームに維持され得るか、または宿主細胞にもしくは人工染色体内に取りこまれ得る[Csonka, E. et al., Journal of Cell Science, 200. 113, 3207-3216; Vanderbyl, S. et al., Molecular Therapy, 2002. 5(5), 10]。取り込みは、一箇所または複数箇所の座位での１個以上のコピーの無作為または標的化統合のいずれかであり得る。細菌細胞について、適当な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用した感染を含み得る。
【００７６】
本導入は、その後、例えば遺伝子発現のための条件下での宿主細胞の培養により、核酸の発現を引き起こすか、可能とし得る。
【００７７】
一つの態様において、本発明の核酸を宿主細胞のゲノム(例えばクロモソーム)に統合する。
【００７８】
統合は、標準技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列の包含により促進し得る。
【００７９】
本発明の第三の局面に従い、ＩＬ−１３関連障害の処置用薬剤の製造のための、ここで定義の医薬抗体組成物の使用が提供される。
【００８０】
好ましくは、本ＩＬ−１３関連障害は、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、慢性閉塞性肺疾患、強皮症、炎症性腸疾患およびホジキンリンパ腫から選択される。本発明の組成物はまた、ＩＬ−１３抗体がＩＬ−１３仲介免疫抑制を抑制するため、腫瘍およびウイルス感染の処置にも使用できる。最も好ましくは、本ＩＬ−１３関連障害は喘息である。
【００８１】
本発明は、さらに、治療的有効量のここで定義の医薬抗体組成物を投与することを含む、ＩＬ−１３関連障害を処置または予防する方法を提供する。
【００８２】
本発明は、さらに、ＩＬ−１３関連障害の処置に使用するための、ここで定義の医薬抗体組成物を提供する。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、液体製剤、または、使用前に再構成する凍結乾燥製剤であり得る。凍結乾燥製剤の賦形剤として、例えば、糖アルコールまたはサッカライド(例えばマンニトールまたはグルコース)を使用できる。液体製剤の場合、本発明の医薬組成物は、通常、密封および滅菌プラスチックまたはガラスバイアル、アンプルおよびシリンジを含む規定容量の容器の形で、ならびにビンのような大容量の形で提供される。好ましくは、本発明の組成物は液体製剤である。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、経口で、注射により(例えば、皮下、静脈内、腹腔内または筋肉内)、吸入により、または局所的に(例えば眼内、鼻腔内、直腸、傷に、皮膚上に)投与し得る。投与経路は処置の生化学的特性、疾患についての具体的考察、または最適効果のためのまたは副作用を最小にするための要求により、決定できる。
【００８５】
好ましくは、本発明の組成物を皮下注射により投与する。処置は病院での使用に限定されないことが考えられる。故に、無針デバイスを使用した皮下注射もまた好ましい可能性がある。
【００８６】
本発明に従って、提供される組成物は個体に投与できる。投与は、好ましくは“治療的有効量”であり、これは患者に対して利益を示すのに十分である。このような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善である。投与される実際量、ならびに投与速度および時間的経過は、処置しているものの性質および重症度に依存する。処置の規範、例えば投与量の決定などは一般的な実施者および他の医師の責任の範囲内である。抗体の適当な投与量は当分野で既知である[Ledermann, J.A. et al., Int. J. Cancer, 1999. 47, 659-664; Bagshawe, K.D. et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1991. 4, 915-922]。
【００８７】
厳密な投与量は、処置すべき領域の大きさおよび部位、抗体の厳密な性質(例えば全抗体、フラグメントまたは二重特異性抗体)、および抗体に結合している何らかの検出可能な標識または分子の性質を含む多くの因子に依存する。典型的抗体投与量は、全身投与については１００pgから１０ｇ、および局所投与については１μgから１００mgである。
【００８８】
典型的に、本抗体は全抗体、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプである。成人患者の一回処置のための用量を小児および幼児のために比例的に調製してよく、およびまた、分子量に比例して他の抗体形態ついて調節する。処置は、医師の判断で、毎日、週に２回、毎週または毎月の間隔で繰り返し得る。本発明の好ましい態様において、処置は定期的であり、処置間の間隔は約２週間以上、好ましくは約３週間以上、好ましくは約４週間以上、またはおおよそ一月に１回である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の組成物の２８日安定性評価の１日目のサンプルの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２】本発明の組成物の２８日安定性評価の２１日目のサンプルの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図３】本発明の組成物の２８日安定性評価の１日目のサンプルの、ＧＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図４】２−８℃での本発明の組成物の２８日安定性評価中のサンプルの、ＧＰ−ＨＰＬＣ分析から得られた結果を合わせて示す。
【図５】２５℃での本発明の組成物の２８日安定性評価中のサンプルの、ＧＰ−ＨＰＬＣ分析から得られた結果を合わせて示す。
【図６】種々の緩衝液を含む本組成物の２８日安定性評価中のサンプルの、ＧＰ−ＨＰＬＣ分析から得られた結果を合わせて示す。
【図７】本発明の組成物の２８日安定性評価の２８日目のサンプルの、ＩＥＦ分析の結果を示す。
【図８】−７０℃で貯蔵した種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価のゲル濾過ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図９】＋５℃で貯蔵した種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価のゲル濾過ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１０】＋２５℃で貯蔵した種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価のゲル濾過ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１１】＋３７℃で貯蔵した種々の製剤の、８週間安定性評価のゲル濾過ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１２】＋４５℃で貯蔵した種々の製剤の、５日間安定性評価のゲル濾過ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１３】−７０℃で貯蔵したときの種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価中の０、６および１２ヶ月目での還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１４】−７０℃で貯蔵したときの図１３における還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、ＢＡＫ５０２Ｇ９重および軽鎖の富化パーセント(percentage abundance)を示す。
【図１５】＋５℃で貯蔵したときの種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価中の０、６および１２ヶ月目での還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１６】＋５℃で貯蔵したときの図１５における還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、ＢＡＫ５０２Ｇ９重および軽鎖の富化パーセントを示す。
【図１７】＋２５℃で貯蔵したときの種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価中の０、６および１２ヶ月目での還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１８】＋２５℃で貯蔵したときの図１７における還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、ＢＡＫ５０２Ｇ９重および軽鎖の富化パーセントを示す。
【図１９】＋３７℃で貯蔵したときの種々の製剤の、８週間安定性評価中の０および８週目での還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２０】＋３７℃で貯蔵したときの図１９における還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、ＢＡＫ５０２Ｇ９重および軽鎖の富化パーセントを示す。
【図２１】＋４５℃で貯蔵したときの種々の製剤の、５日間安定性評価中の０および５日目の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２２】＋４５℃で貯蔵したときの図２１の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、ＢＡＫ５０２Ｇ９重および軽鎖の富化パーセントを示す。
【図２３】−７０℃で貯蔵したときの種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価中の０、６および１２ヶ月目での非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２４】−７０℃で貯蔵したときの図２３における非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、完全なＢＡＫ５０２Ｇ９モノマーの富化パーセントを示す。
【図２５】＋５℃で貯蔵したときの種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価中の０、６および１２ヶ月目での非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２６】＋５℃で貯蔵したときの図２５における非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、完全なＢＡＫ５０２Ｇ９モノマーの富化パーセントを示す。
【図２７】＋２５℃で貯蔵したときの種々の製剤の、１２ヶ月安定性評価中の０、６および１２ヶ月目での非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２８】＋２５℃で貯蔵したときの図２７における非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、完全なＢＡＫ５０２Ｇ９モノマーの富化パーセントを示す。
【図２９】＋３７℃で貯蔵したときの種々の製剤の、８週間安定性評価中の０および８週目での非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図３０】＋３７℃で貯蔵したときの図２９における非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、完全なＢＡＫ５０２Ｇ９モノマーの富化パーセントを示す。
【図３１】＋４５℃で貯蔵したときの種々の製剤の、５日間安定性評価中の０および５日目の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図３２】＋４５℃で貯蔵したときの図３１における非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の、完全なＢＡＫ５０２Ｇ９モノマーの富化パーセントを示す。
【実施例】
【００９０】
本発明を、ここで、以下の方法および実施例を参照して、単に例示の目的で説明する。
【００９１】
実施例１：ＢＡＫ５０２Ｇ９の発現
ＢＡＫ５０２Ｇ９を、ＷＯ８７／０４４６２およびＷＯ２００４／０７６４８５に記載のものに準じた方法でＧＳ  ＮＳ０細胞株中で発現させ、５９８mg／ｌ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を含む培養上清を得た。
【００９２】
実施例２：ＢＡＫ５０２Ｇ９の精製
(ａ)ｒｍｐタンパク質Ａセファロース精製
ｒｍｐタンパク質Ａセファロース高速流クロマトグラフィー工程のために使用したカラムは、２.６cm直径であり、０.９％ｗ／ｖ  塩化ナトリウム中１４.５cmの床高まで充填されており、７７mlのカラム容量であった。樹脂はGE Healthcare/Amersham Biosciences 17-5138から供給された。クロマトグラフィーはAmersham Biosciences  Ｐ−５０ポンプ、ＵＶ１ディテクターおよびフローセルを使用して行った。本カラムは使用前に６Ｍ塩酸グアニジンで浄化した。
ｒｍｐタンパク質Ａセファロース高速流カラムを、その後、３５０ml  リン酸緩衝化食塩水ｐＨ７.２で平衡化し、続いて水洗浄および浄化した。２.６ｌ培養上清を２００cm／時間および室温で直接カラムにかけた。
本カラムを、次いで５６７ml  リン酸緩衝化食塩水ｐＨ７.２、続いて５６８ml  ５０mM  酢酸ナトリウムｐＨ５.５５で洗浄した。ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体は、カラムから、３８０ml  ５０mM  酢酸ナトリウムｐＨ３.７５での洗浄により溶出した。溶出後、カラムを５０mM  酢酸ｐＨ３.０で洗浄した。
溶出ピークを、ピークの上方傾斜および下方傾斜の２％最大ＵＶ偏向間で回収した。１.５ｇ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を２１７ml中に回収した。
【００９３】
(ｂ)低ｐＨウイルス不活性化
ｒｍｐタンパク質Ａセファロース高速流溶出液を１７３ml  １００mM  酢酸でｐＨ３.７０に調製した。この調製した溶出液を、次いで、６０分、ウイルス不活性化のために静置した。この時間の後、調節した溶出液を４３７ml  ５０mM  水酸化ナトリウムでｐＨ５.５０に中和し、Millipore stericup(product number SCGPU11RE)を使用して、０.２２μm濾過した。１.４ｇ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を８２３ml中に回収した。
【００９４】
(ｃ)ＳＰセファロース精製
ＳＰセファロース高速流クロマトグラフィー工程のために使用したカラムは１.６cm直径であり、リン酸緩衝化食塩水ｐＨ７.２中１５.５cmの床高まで充填されており、３１mlのカラム容量であった。樹脂はGE Healthcare／Amersham Biosciences 17-0729から供給された。クロマトグラフィーはAmersham Biosciences  Ｐ−５０ポンプ、ＵＶ１ディテクターおよびフローセルを使用して行った。本カラムは、使用前に０.５Ｍ  水酸化ナトリウムで浄化した。
ＳＰセファロース高速流カラムを、その後、１４５ml  ５０mM  酢酸ナトリウムｐＨ５.５０で平衡化し、続いて水洗浄および浄化した。
ｒｍｐタンパク質Ａ溶出液として中和した４００ml  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を、２００cm／時間および室温で直接カラムにかけた。
本カラムを、次いで３０２ml  ５０mM  酢酸ナトリウム＋３０mM  塩化ナトリウムｐＨ５.５０で洗浄した。
ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体は、カラムから、１５０ml  ５０mM  酢酸ナトリウム＋８５mM  塩化ナトリウムｐＨ５.５０での洗浄により溶出した。溶出後、カラムを５０mM  酢酸ナトリウム＋２Ｍ  塩化ナトリウムｐＨ５.５０で洗浄した。
本溶出ピークを、ピークの上方傾斜の２％最大ＵＶ偏向および下方傾斜の３０％間で回収した。溶出液を、Millipore stericup(product number SCGPOO525)を使用して、０.２２μm濾過した。０.６７ｇ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を５４ml中に回収した。
この工程を、ｒｍｐタンパク質Ａ溶出液で中和された残りの３９２ml  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体で繰り返した。さらに０.６７ｇ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を５４ml中に回収した。２個の濾過したＳＰセファロース溶出液を、次工程に使用する前に溜めた。
【００９５】
(ｄ)Ｑセファロース高速流クロマトグラフィー
Ｑセファロース高速流クロマトグラフィー工程のために使用したカラムは１.６cm直径であり、リン酸緩衝化食塩水ｐＨ７.２中１３.３cmの床高まで充填されており、２７mlのカラム容量であった。樹脂はGE Healthcare/Amersham Biosciences 17-0510から供給された。クロマトグラフィーはAmersham Biosciences  Ｐ−５０ポンプ、ＵＶ１ディテクターおよびフローセルを使用して行った。本カラムは、使用前に０.５Ｍ  水酸化ナトリウムで浄化した。
Ｑセファロース高速流カラムを、その後、１３８ml  ５０mM  酢酸ナトリウム＋８５mM  塩化ナトリウムｐＨ５.５０で平衡化し、続いて水洗浄および浄化した。
ＳＰセファロース溶出液としての４４ml  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を、２００cm／時間および室温で直接カラムにかけた。
ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体の定組成溶離を、カラムを１２４ml  ５０mM  酢酸ナトリウム＋８５mM  塩化ナトリウムｐＨ５.５０で洗浄することにより行った。溶出後、カラムを５０mM  酢酸ナトリウム＋２Ｍ  塩化ナトリウムｐＨ５.５０で洗浄した。
溶出ピークピークの上方傾斜の２％最大ＵＶ偏向および下方傾斜の２％間で回収した。溶出液を、Millipore stericup(product number SCGPU01RE)を使用して、０.２２μm濾過した。０.５２ｇ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を８８ml中に回収した。この工程を、ＳＰセファロース溶出液としての残りの４４ml  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体で繰り返した。さらに０.５４ｇ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を５１ml中に回収した。２個の濾過したＱセファロース溶出液を次いで溜めた。
【００９６】
(ｅ)濃縮
生成物は５０mM  酢酸ナトリウム＋８５mM  塩化ナトリウムｐＨ５.５０中に得られ、ダイアフィルトレーションは必要なかった。
１７.５ｌ中のＱセファロース溶出液としての９５.３１ｇ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を１.５ｌｎ濃縮した。Millipore Pellicon 2 TFFシステムおよび0.1 M2 30KDa膜(Millipore P2B030A01)を使用して濃縮を行った。次いで、ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を装置から回収し、装置を、次いで、５０mM  酢酸ナトリウム＋８５mM  塩化ナトリウムｐＨ５.５０で緩衝液フラッシュした。次いで、濃縮した抗体を緩衝液フラッシュと合わせた。１.６７ml  １０％ｗ／ｖ  Polysorbate 80をこのプールに添加し、最終Polysorbate 80濃度を０.０１％ｗ／ｖとした。次いで、このプールを０.２２μm濾過した。９１.６ｇ  ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体を１.６７ｌに回収した。
【００９７】
(ｆ)使用した物質
上記緩衝液の製造に使用した化学物質は以下の通りであった：
塩酸グアニジン。Sigma Aldrich. G4505
オルトリン酸水素二ナトリウム。VWR. 1038349
オルトリン酸二水素ナトリウム。VWR. 102454R
酢酸ナトリウム三水和物。VWR. 102354X
塩化ナトリウム。VWR. 10241AP
酢酸。VWR. 10001CU
Polysorbate 80。J. T. Baker. 7394
【００９８】
実施例３：２８日間安定性分析
方法
ｒｍｐタンパク質Ａクロマトグラフィーを以下の表１に明示の通り行った：
【表１】
2014040461.tif 000002
溶出緩衝液の１.６  ＣＶが、ピークを溶出し、そして、吸光度が＜２％フルスケール偏向(ＡｕＦＳ)に戻るのに必要であった。この後、緩衝液をストリップ緩衝液に変えた。
【００９９】
次いで、低ｐＨウイルス不活性化を、以下の表２に明示の通りのタンパク質Ａ溶出液を使用して行った：
【表２】
2014040461.tif 000003
【０１００】
全サンプルを２００ml  Hyclone BioProcess容器に入れ、それはポリエチレン製であり、Ｃ−ｆｌｅｘ入口および出口管系が接続されていた。
加えて、ウイルス不活性化タンパク質Ａ溶出液の５０ml  サンプルを、元の緩衝液(５０mM  水酸化ナトリウム)で中和し、分析前、バイオプロセス容器に２から８℃で２８日間貯蔵した。
全サンプルは、必要に応じて、クラス１００,０００コールドルーム(２から８℃、チャートレコーダーおよびアラームで監視)または２５℃に設定した温度制御されたインキュベータ中のいずれかに貯蔵した。
５つの時点と２種の貯蔵温度(２から８℃および２５℃)、すなわち１０個の別々のサンプリング点が存在した。
濾過し、中和したタンパク質Ａ溶出液を１０個のロットに分けた；５このロットは該温度のいずれかで貯蔵した。濾過していない、中和タンパク質Ａ溶出液のさらなる容器を２から８℃で貯蔵した。
各バイオプロセス容器を満たすために、中和したタンパク質Ａ溶出液を０.２μm  Millipakフィルターを通して２００ml  バイオプロセス容器にポンプ輸送した。各バイオプロセス容器を、最終２,０００ｌ規模産生が予測される表面接触のために生成物の比率を摸倣するために、約１００mlで満たした。
１個のバイオプロセス容器を各温度および各時点でのサンプリングに使用し、貯蔵中、管系中に物質が残らないように注意した。
各温度から１個のバイオプロセス容器を１、３、１５、２１および２８日目に取り出した。各バイオプロセス容器の中身をサンプリングする前に室温に到達させた。
サンプルをBijoux容器または５０ml  Falconチューブに取った。サンプルの最初の数mlを、それらが貯蔵中管系と幾分接触していた可能性があるため、廃棄した。
サンプリング後、残りの物質を含む容器を−７０℃で凍結させた。
以下の分析を、各時点および各貯蔵温度について各日に行い、これらのサンプルの互いのおよび標準対照との同等製を決定した。ＢＡＫ５０２Ｇ９標準の新鮮バイアルを試験物質の安定性比較のために各時点で使用した。対照を−７０℃貯蔵から室温で解凍した。この抗体の融解後に多量体レベルが増加し得ることが既知であり、故に、ＧＰ−ＨＰＬＣ分析は最後に行った。
【０１０１】
(Ａ)濁度分析
濁度を、経時的なタンパク質分解の指標として評価し、故に、本発明の組成物の有用な安定性評価として用いる。
濁度は、Ａ３４０および３６０nm間のサンプルの平均吸光度を取ることにより測定した(Eckhardt et al. 1993)。このアッセイをさらに濾過することなく行った。
ｒｍｐタンパク質Ａクロマトグラフィーから得られたデータを表３に要約し、クロマトグラムを図１に示す。
【０１０２】
【表３】
2014040461.tif 000004
＊５０mlを、５０mM  水酸化ナトリウムでの調整のためにウイルス−不活性化溶出液から除去。最終容量はサンプリング後。
【０１０３】
ｒｍｐタンパク質Ａクロマトグラフィーは予想通り機能し、大規模で見られるのと同等な緩衝液の容量をもたらした。中和した溶出液は、５０mM  水酸化ナトリウムで中和した溶出液で通常見られるようりも目で見てより濁っていた。バイオプロセス容器への濾過中、沈殿が観察され始め、これは中和の１時間以内に起こった。濁度は、この時間の後までアッセイしなかった。回収は、濾過後の予測範囲内であった。
全溶出液サンプルを、濁度について１日目にアッセイした。両方の温度で貯蔵した濾過した溶出液を、濁度について以下の日にアッセイした：１、３、１５、２１および２８。加えて、未濾過で貯蔵した溶出液(５０mM  水酸化ナトリウムまたは１００mM  水酸化ナトリウムのいずれかで調整)を、濁度について、濾過前および濾過後２８日目の両方でアッセイした。濁度分析の結果を表４に示し、そこでは、２５℃で貯蔵したサンプルについて２８日目の濁度のかなりの上昇があるが、本サンプルは２５℃で少なくとも２１日間安定であったことを見ることができる。
【０１０４】
【表４】
2014040461.tif 000005
【０１０５】
(Ｂ)タンパク質濃度分析
ＩｇＧ濃度を２８０nmの吸光度および
【数１】
2014040461.tif 000006
の吸光度計数を使用して測定し、計算した。
中和時に濾過した溶出液は、タンパク質濃度を測定および計算する２８０nmでの吸光度の前に再濾過しなかった。濁度が全て低かったため、これは結果に影響しないであろうと考えた。２８０nmでの吸光度は、貯蔵温度および時点に一致し、それは表５に示す。
【表５】
2014040461.tif 000007
【０１０６】
(Ｃ)ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、４から１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲルを使用して行った。ゲルを、ＭＥＳランニング緩衝液で流し、Pierce gel code blueで染色した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、半分の抗体のレベルにおける偏差を証明したが、明白な傾向はなく、これはアッセイの偏差内であるように思える(図１および２および表６および７参照)。２１日目に、２５℃サンプルでいくつかの付加的な小さなバンドが見られた。これらのバンドは２８日目には見られなかった。故にこれらは、本アッセイの検出限界にあるかもしれない。これらのバンドはＧＰ−ＨＰＬＣ(実施例３Ｄ参照)に見られる小さな付加的ピークと一致し得る。
元のサンプルに存在するものと長い貯蔵の結果である変化を区別することが不可能であるため、サンプルを試験の最後に流さなかった。参照標準の新たに融解したバイアルを各ゲルで流した。これは、異なる時点間で同等であり、分析が予測通り機能することを示唆した。２１日目、２５℃サンプルで見られた付加バンドは、同じゲルで流した参照標準または２から８℃サンプルでは見られなかった。明瞭にするために、図２中のすべてのバンドは円で示す。
【０１０７】
【表６】
2014040461.tif 000008
【０１０８】
【表７】
2014040461.tif 000009
【０１０９】
(Ｄ)ＧＰ−ＨＰＬＣ分析
サンプルを、ＴＳＫ  ＧＳ３０００ＳＷサイズ除外カラムと移動相としての２００mM  リン酸ナトリウムおよび０.０５％ナトリウムアジドｐＨ７.０および２８０nmでの検出を使用して分析した。
タンパク質Ａクロマトグラフィーからの全フラクションを１日目にアッセイした。両方の温度で貯蔵した溶出液を、次いで以下の日にアッセイした：１、３、１５、２１および２８。参照サンプルも全ての時点で流した。１００mM  水酸化ナトリウムまたは５０mM  水酸化ナトリウムのいずれかで１日目に別々に中和したが、２８日目まで濾過しなかった溶出液を、２８日目にＧＰ−ＨＰＬＣによりアッセイした。
１日目ＧＰ−ＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを図３に示す。これらは、予測される通り、＞９５％モノマーである最終溶出液であり、これは、ＢＡＫ５０２Ｇ９のための最終明細と合う。
試験経過中のサンプルのＧＰ−ＨＰＬＣ分析は、２５℃で、切断された(特に９.９および１０.３分の間に溶出する小ピーク)ＢＡＫ５０２Ｇ９のわずかな増加を確認した(表８および図４および５)。モノマーレベルは、全試験を通して一貫して９７.０から９８.２％の間であった。
５０mM  水酸化ナトリウムで中和した溶出液は、１００mM  水酸化ナトリウム(９７.４％モノマー)で中和した溶出液よりも高いレベルのモノマー(９９.２％モノマー)を有し、両方とも最終生成物で必要な９５％モノマーの必要なレベルより高かった(表９および図６)。
自動集積により得られた結果は不正確であることが判明し、故に、ＧＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを手動で再集積した。
【０１１０】
【表８】
2014040461.tif 000010
【０１１１】
【表９】
2014040461.tif 000011
【０１１２】
(Ｅ)：ＩＥＦ分析
サンプルを、Invitrogen  ｐＨ３から１０  ＩＥＦゲルで、Invitrogen緩衝液を使用して分析した。
ＢＡＫ５０２Ｇ９のＩＥＦ分析は、この試験を通して一貫した見かけを示した(図７)。７.１および６.４のｐＩ間に３個の主要なバンドおよび２個の小さなバンドが見られた。
【０１１３】
(Ｆ)：エンドトキシン分析
両方の貯蔵温度から２８日目に取ったサンプルを、ＬＡＬアッセイを使用してエンドトキシンレベルについてアッセイした。
両方の温度で貯蔵したサンプル中のエンドトキシンレベルは低かった。これは、本試験の経過中にグラム陰性細菌による汚染がなかったことを証明した。
２から８℃で貯蔵した溶出液＝０.８７ＥＵ／mg。
２５℃で貯蔵した溶出液＜０.４４ＥＵ／mg。
【０１１４】
２８日安定性分析結果の要約
２から８℃または２５℃で１５日目まで貯蔵したＢＡＫ５０２Ｇ９は、実施例３で行った全アッセイで同じである。２１日目の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(実施例３Ｃ)およびＧＰ−ＨＰＬＣ(実施例３Ｄ)分析において幾分かのわずかな差異が見られるが、産物は２８日目まで同等なままである。
【０１１５】
実施例４：１２ヶ月安定性分析
１２ヶ月安定性分析を、実施例３の２８日安定性分析と同様の方法で行った。
本試験は、異なる温度(例えば−７０、＋５、＋２５、＋３７および＋４５℃)で貯蔵したときの種々の濃度のＢＡＫ５０２Ｇ９の安定性を長鎖するために設計した。この分析に使用した種々の製剤を以下の表１０に示す：
【０１１６】
【表１０】
2014040461.tif 000012
サンプルの分析は、種々の時点で行い、例えば、−７０、＋５、＋２５℃で貯蔵したサンプルは０、３、６、９および１２ヶ月目に測定し、＋３７℃で貯蔵したサンプルは０、１、２、４および８週目に測定し、そして＋４５℃で貯蔵した製剤は０、１、２および５日目に測定した。
【０１１７】
(Ａ)ｐＨ分析
ｐＨを小容量ｐＨ電極(ＢＤＨ)に適合させたPHM220 ｐＨメーター(Radiometer Analytical)で測定し、各温度での製剤ＣＦ、ＴＦ１Ａ、ＴＦ１ＢおよびＴＦ１ＣのｐＨ測定の結果を以下の表１１−１５に示す：
【表１１】
2014040461.tif 000013
【０１１８】
【表１２】
2014040461.tif 000014
【０１１９】
【表１３】
2014040461.tif 000015
【０１２０】
【表１４】
2014040461.tif 000016
【０１２１】
【表１５】
2014040461.tif 000017
ＮＴ＝試験せず
【０１２２】
(Ｂ)濃度分析
サンプルを適切な緩衝液で適当に適当なレベルに希釈し、２８０nmでの吸光度をＨＰ８４５３  ＵＶ／可視分光光度計(Agilent Technologies)を使用して決定した。吸光度値を１.７２３の既知の吸光係数を使用して、ＢＡＫ５０２Ｇ９濃度に変換した。各温度での製剤ＣＦ、ＴＦ１Ａ、ＴＦ１ＢおよびＴＦ１Ｃの吸光度測定の結果を以下の表１６−２０に示す：
【表１６】
2014040461.tif 000018
【０１２３】
【表１７】
2014040461.tif 000019
【０１２４】
【表１８】
2014040461.tif 000020
【０１２５】
【表１９】
2014040461.tif 000021
【０１２６】
【表２０】
2014040461.tif 000022
ａｎ＝３
ＮＴ＝試験せず
【０１２７】
(Ｃ)ゲル濾過ＨＰＬＣ分析
ゲル濾過ＨＰＬＣをＨＰ１１００系(Agilent Technologies)で行った。ＴＳＫ−ゲル３０００Ｓカラムを０.２Ｍ  リン酸ナトリウムｐＨ７.５で平衡化した。サンプルを的ｓつな緩衝液で１mg／mlに希釈し、１０分１３,０００rpmで遠心して、何らかの粒子物質を除去した。カラムに各サンプルを３×２０μl注入し、それを１ml／分で流した。可変波長ディテクターを使用して２２０および２８０nmの吸光度をモニターした。
各温度での製剤ＣＦ、ＴＦ１Ａ、ＴＦ１ＢおよびＴＦ１Ｃのゲル濾過分析の結果を図８−１２に示す。
【０１２８】
(Ｄ)還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプルを、的鉄名緩衝液で１mg／mlに希釈し、１６.７μlを１２.５μlの４×ＬＤＳサンプル緩衝液(Invitrogen)、１５.８μlのMilli-Q  水および５μl  還元剤(Invitrogen)に添加した。サンプルを９５℃で１分加熱し、その後氷上に置いた。１５μlの各サンプルを、１×ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液を含むタンク中の４−１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル(Invitrogen)に載せ、ゲルを３５分、５００mAの一定電流で流した。電気泳動後、ゲルをそのケースから取り出し３×１０分  Milli-Q  水で洗浄し、Gelcode(登録商標) Blue染色試薬(Pierce)で最短で１時間染色し、次いでMilli-Q  水で脱染色した。ゲルを撮影し、ＵＶＰ  ＧＤＳ８０００ゲルドキュメンテーション・システムを使用して分析した。各サンプル中のＢＡＫ５０２Ｇ９重および軽の相対的富化を決定した。
各温度での製剤ＣＦ、ＴＦ１Ａ、ＴＦ１ＢおよびＴＦ１Ｃの還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図１３、１５、１７、１９および２１に示す。各温度でのＢＡＫ５０２Ｇ９重および軽鎖富化の測定をまた図１４、１６、１８、２０および２２に示す。
【０１２９】
(Ｅ)非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプルを適切な緩衝液で１mg／mlに希釈し、１６.７μlを２５μlの２×非還元サンプル緩衝液(０.１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６.８、４％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ、３０％(ｖ／ｖ)グリセロール、０.００４％(ｗ／ｖ)ブロモフェノールブルー)、３.３μlのMilli-Q  水および５μl  １Ｍ  ヨードアセトアミドに添加した。サンプルを９５℃で１分加熱し、次いで氷上に置いた。１５μlの各サンプルを、１×ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液を含むタンク中の４−１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル(Invitrogen)に載せ、ゲルを３５分、５００mAの一定電流で流した。電気泳動後、ゲルをそのケースから取り出し、３×１０分  Milli-Q  水で洗浄し、Gelcode(登録商標) Blue染色試薬(Pierce)で最短で１時間染色し、次いでMilli-Q  水で脱染色した。ゲルを撮影し、ＵＶＰ  ＧＤＳ８０００ゲルドキュメンテーション・システムを使用して分析した。各サンプル中のＢＡＫ５０２Ｇ９モノマーの相対的富化を決定した。
各温度での製剤ＣＦ、ＴＦ１Ａ、ＴＦ１ＢおよびＴＦ１Ｃの非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図２３、２５、２７、２９および３１に示す。各温度での完全なＢＡＫ５０２Ｇ９モノマー富化の測定をまた図２４、２６、２８、３０および３２に示す。
【０１３０】
(Ｆ)等電点電気泳動法分析
サンプル負荷前に、電気泳動床を冷却し、ｐＨ３−１０  ＩＥＦゲル(Cambrex)を、１０分、１Ｗ、２０００Ｖ、１５０mAで、Apelex PS9009TXパワーパックを使用して予備焦点化(prefocused)した。サンプルを適切な緩衝液で１mg／mlに希釈した。サンプルマスクをゲルの表面に置き、各サンプルの５μlを充填した。ゲルを再び予備焦点化し、サンプルマスクを除去した。次いで、ゲルを６０分、２５Ｗ、１５００Ｖ、５０mAで焦点化(focusing)した。電気泳動後、ゲルを５０％(ｖ／ｖ)メタノール、６％(ｗ／ｖ)トリクロロ酢酸、３.６％(ｗ／ｖ)５−スルホサリチル酸(sulhosalicyclic acid)で３０分固定し、次いで水で洗浄し、４０−５０℃のオーブンでで１時間乾燥させた。ゲルを３０分、PhastGel Blue R(Pharmacia；１錠を６０％(ｖ／ｖ)メタノールに溶解)を使用して洗浄しMilli-Q  水で洗浄して過剰の染色を除去し、次いで、約３分、９％(ｖ／ｖ)氷酢酸、２５％(ｖ／ｖ)エタノール溶液で脱染色した。ゲルを４０−５０℃のオーブンで１時間乾燥させた。乾燥させたゲルを撮影し、ＵＶＰ  ＧＤＳ８０００ゲルドキュメンテーション・システムを使用して、分析する。各サンプルのアイソフォームの数およびｐＩ範囲を決定し、各温度で製剤ＣＦ、ＴＦ１Ａ、ＴＦ１ＢおよびＴＦ１Ｃで見られた結果を以下の表２１−２５に示す：
【表２１】
2014040461.tif 000023
【０１３１】
【表２２】
2014040461.tif 000024
【０１３２】
【表２３】
2014040461.tif 000025
【０１３３】
【表２４】
2014040461.tif 000026
【０１３４】
【表２５】
2014040461.tif 000027
ＮＴ＝試験せず
【０１３５】
安定性分析結果の要約
−７０℃での安定性
ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方とも１２ヶ月、−７０℃で安定であった。分析プロファイルは、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる完全なＩｇＧ％以外０および１２ヶ月で同等であり、完全なＩｇＧ％はＣＦについてｔ＝０の９５.９％が１２ヶ月目に８９.９％に減少し、ＴＦ１Ａについてｔ＝０の９６.２％が１２ヶ月目に８９.２％に減少した。１２ヶ月後のＨＰＬＣにより、ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方のサンプルのパーセンテージモノマーは１００％であった。ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方のサンプルとも１２ヶ月後のＩＥＦで４個のバンドを示した。この結果は、ＣＦおよびＴＦ１Ａがこの温度で同等であることを示す。
【０１３６】
５℃での安定性
ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方とも１２ヶ月、５℃で安定であった。分析プロファイルは、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる完全なＩｇＧ％以外０および１２ヶ月で同等であり、完全なＩｇＧ％はＣＦについてｔ＝０の９５.９％が１２ヶ月目に８９.５％に減少し、ＴＦ１Ａについてｔ＝０の９６.２％が１２ヶ月目に８８.９％に減少した。１２ヶ月後のＨＰＬＣにより、ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方のサンプルのパーセンテージモノマーは１００％であった。ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方のサンプルとも１２ヶ月後のＩＥＦで４個のバンドを示した。この結果は、ＣＦおよびＴＦ１Ａがこの温度で同等であることを示す。
【０１３７】
２５℃での安定性
ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方とも１２ヶ月、２５℃で安定であった。非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる完全なＩｇＧ％は、ＣＦについてｔ＝０の９５.９％が１２ヶ月目に８９.１％に減少し、ＴＦ１Ａについてｔ＝０の９６.２％が１２ヶ月目に８７.５％に減少した。両方の製剤で、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に小さい高分子量(＞２２０kDa)が存在し、それはｔ＝０で観察されなかたｔ。１２ヶ月後のＨＰＬＣにより、ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方のサンプルのパーセンテージモノマーはそれぞれ９８.９および９６.４２％であった。ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方のサンプルとも１２ヶ月後のＩＥＦで４個のバンドを示した。この結果は、ＣＦおよびＴＦ１Ａがこの温度で同等であることを示す。
【０１３８】
３７℃での安定性
ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方とも４週間、３７℃で安定であったが、８週間後のいくつかのパラメータ、すなわち、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度(両製剤)およびＧＦ−ＨＰＬＣによるモノマー％(ＴＦ１Ａのみ；ボーダーライン結果)について、明細の草稿と合わなかった。この結果は、ＣＦがこの温度で８週間の期間にわたりＴＦ１Ａよりも安定であることを示す。
【０１３９】
４５℃での安定性
ＣＦおよびＴＦ１Ａの両方とも５日間、４５℃であったが、この時間の後の分析プロファイルにわずかな変化があった(ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦゲル上にいくつかの付加的な小さいバンド)。この結果は、ＣＦおよびＴＦ１Ａがこの温度で５日間にわたり同等であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【外国語明細書】
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