(57)【要約】【課題】迅速な膜ベースのＲＮＡ抽出方法、特に術中診断用途に使用するためのＲＮＡ抽出方法を提供すること。【解決手段】生物系（細胞、細胞断片、オルガネラ、組織、器官または生物）からＲＮＡを抽出する方法であって、ＲＮＡ含有溶液をＲＮＡが結合できる基体と接触させる方法が提供される。ＲＮＡは、負圧を適用することにより、基体から回収される。３０秒を超える遠心分離ステップを含まない。好ましくは、濾過の前にＲＮＡが希釈され、また干渉物質を除去するために１以上の洗浄ステップを用いることができる。該方法の一態様ではＤＮＡ剪断および乾燥ステップは別として、抽出ステップ中には遠心分離が行われない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物系から採取されたＲＮＡ含有溶液を、ＲＮＡに結合する物質が付着された又は該物質を含有する基体と接触させるステップと、負圧を適用することによりＲＮＡを回収するステップを含んでなる、生物系からのＲＮＡの抽出方法であって、３０秒を超える遠心分離ステップを含まない方法。
【請求項２】
組織が組織グラインダーにより均質化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物系が組織であり、ＲＮＡ含有溶液の粘度が該溶液と基体との接触前に低下させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
負圧が１１．６〜１３．１ｐｓｉ（８０．０〜９０．３ｋＰａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡホモジネートを希釈するステップと、前記希釈されたＲＮＡホモジネートを含有する溶液を、ＲＮＡに結合する物質が付着された又は該物質を含有する基体と接触させるステップと、負圧を適用することによりＲＮＡを回収するステップを含んでなる、生物系からのＲＮＡの抽出方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡホモジネートが８〜２ｍｇホモジネート／ｍｌ希釈剤に希釈される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
３０秒を超える遠心分離ステップを含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
生物系のサンプルから問題のＲＮＡを含まない細胞を除去するステップと、ＲＮＡを含有する細胞を溶解させるステップと、該溶解物を、ＲＮＡが結合できる物質が付着された又は該物質を含有する基体と接触させるステップと、遠心分離の不在下で負圧を適用するステップと、該基体に結合したＲＮＡを取り出すステップを含んでなる、生物系からのＲＮＡの抽出方法であって、該方法が６分未満で行われる方法。
【請求項９】
細胞がグアニジニウムチオシアネートを含有する物質で溶解され、基体がシリカゲル膜である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該溶解物を洗浄するステップを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
基体との接触前または接触後に該溶解物を遠心分離するステップを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）生物系から細胞含有サンプルを取得するステップと、  （ｂ）該サンプルから問題のＲＮＡを含まない細胞を除去して、作業サンプルを生成するステップと、  （ｃ）問題のＲＮＡを含む細胞を溶解するステップと、  （ｄ）該作業サンプルを均質化するステップと、  （ｅ）該均質化した作業サンプルを湿潤させるステップと、  （ｆ）該湿潤した均質化した作業サンプルを、ＲＮＡが結合する物質に付着された又は該物質を含有する基体と接触させて、基体−ＲＮＡ複合体を形成するステップと、  （ｇ）該基体に負圧を適用して、ＲＮＡを抽出するステップと  （ｈ）該抽出されたＲＮＡを洗浄するステップと、  （ｉ）該基体−ＲＮＡ複合体から水を除去するステップと、  （ｊ）該ＲＮＡを溶出させるステップと、を含んでなる方法であって、該方法が６分未満で行われる方法。
【請求項１３】
問題のＲＮＡを含まない細胞が除去される前に溶解される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該均質化した作業サンプルを希釈するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該作業サンプルが８〜２ｍｇホモジネート／ｍｌ希釈剤に希釈される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該作業サンプルが約４ｍｇホモジネート／ｍｌ希釈剤に希釈される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該希釈剤がＲＮＡ保存物質を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
該物質がグアニジウムチオシアネートを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｇ，ｈ，ｉまたはｊの後に遠心分離ステップをさらに含むが、該遠心分離ステップが３０秒を超えない、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
該基体がシリカゲル膜である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はとりわけインビトロ診断用のＲＮＡの抽出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム技術およびバイオインフォマティックスにおける最近の進歩の結果として、癌および他の疾患についての診断、予後診断および治療の指標として有用な新たな遺伝子発現マーカーが急速に発見されつつある。これらのマーカーをインビトロ診断検査として評価および適用するためには、迅速で、感度がよく、かつ使用容易な細胞、組織および他の生物成分からのＲＮＡ抽出方法に対する必要性がある。
【０００３】
腫瘍学においては、サージカルマージン（外科的余地）、リンパ節または他の転移部位をより感度よく検出するために、そして組織内の癌の存否を確認するために、迅速術中分子検査法が用いられることがある。外科的処置に影響を及ぼすためには、患者が手術室にいる時間、一般には約４５分の間に、術中セッティングに有用な診断結果を処置中の外科医が利用できるようにしなければならない。分子マーカーの逆転写とこれに続く増幅および検出のための時間を考慮すると、細胞および組織からの増幅可能ＲＮＡは数分以内で抽出および精製されなければならない。
【０００４】
細胞および組織からのＲＮＡの単離および精製のために、幾つかの異なる手法が開発されている。これらの手法としては、膜ベースの方法、溶液ベースの方法および磁性ベースの方法がある。溶液ベースの方法は、一般に、実行に少なくとも９０分を要し、毒性のある溶媒の使用を伴う。磁性粒子方法が開発されているが、実行に少なくとも４５分を要する。
【０００５】
膜ベースのＲＮＡ精製を実行するためのキットが幾つかの販売者から商業的に入手可能である。一般に、キットは、細胞および組織からのＲＮＡの小規模（３０ｍｇ以下）調製用に（例えばQIAGEN RNeasy Miniキット）、中規模（２５０ｍｇ組織）用に（例えばQIAGEN RNeasy Midiキット）および大規模（最大１ｇ）用に（例えばQIAGEN RNeasy Maxiキット）開発されている。残念なことに、現在入手可能な膜ベースのＲＮＡ抽出精製系は多数のステップを必要とし、術中診断用途のためには遅すぎることがある。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、より迅速な膜ベースのＲＮＡ抽出方法、特に術中診断(intraoperative-diagnostic）用途に使用するためのものが必要である。
【０００７】
本発明は、生物系（細胞、細胞断片、オルガネラ、組織、器官または生物）からＲＮＡを抽出する方法であって、ＲＮＡ含有溶液をＲＮＡが結合できる基体と接触させる方法である。ＲＮＡは、負圧を適用することにより、基体から回収される。３０秒を超える遠心分離ステップを含まない。好ましくは、濾過に先立ってＲＮＡが希釈され、また干渉物質を除去するために１以上の洗浄ステップを用いることができる。別の実施態様では、ＤＮＡ剪断および乾燥ステップを別として、抽出ステップ中には遠心分離が行われない。
【０００８】
本発明の別の態様においては、問題のＲＮＡを含む細胞から問題のＲＮＡを含まない細胞が除去される。問題のＲＮＡを含む細胞は次に溶解され、その溶解物が、ＲＮＡに結合する（付着する）物質を含有するか又は該物質が付着された基体と接触させられる。ある時間、好ましくは１５秒未満の間、基体に対して負圧が適用され、遠心分離を適用することなく該基体から干渉物質が除去される。
【０００９】
本発明の更に別の態様では、生物系からのＲＮＡ抽出方法は以下の諸ステップ：
（ａ）生物系から細胞含有サンプルを取得するステップと、
（ｂ）任意的に、該サンプルから問題のＲＮＡを含まない細胞を除去して、作業サンプルを生成するステップと、
（ｃ）該問題のＲＮＡを含む細胞を溶解し、該細胞のホモジネートを生成するステップと、
（ｄ）該ホモジネートを希釈するステップと、
（ｅ）該湿潤した均質化した作業サンプルを、ＲＮＡが結合する物質を含有するか又は付着させる基体と接触させるステップと、
（ｆ）該サンプルを該基体に結合させるステップと、
（ｇ）混入物質および干渉物質を除去するステップと、
（ｈ）該基体を乾燥するステップと、
（ｉ）該基体からＲＮＡを溶出させるステップと、
を有し、該方法は８分未満で行われる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に係る生物系は、細胞、細胞断片、オルガネラ、組織、器官または生物である。問題のＲＮＡを含有する溶液は、該生物系から調製されるか又は見出される何れの流体からも取得することができる。
【００１１】
完全なままのＲＮＡの良好な単離には、一般に、少なくとも以下の４ステップ：細胞または組織の効果的な破壊、核タンパク質複合体の変性、内因性リボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）の不活性化、および混入するＤＮＡとタンパク質の除去、を伴う。
【００１２】
問題のＲＮＡ（すなわちＲＮＡであってそのマーカーがアッセイの対照となるもの）を含有するサンプルによっては、問題のＲＮＡを含まない細胞を除去することが好ましい場合がある。問題のＲＮＡを含まない細胞の除去は、好ましくは、該細胞を溶解し、そしてその溶解物を該溶液から除去することにより行われる。全血を用いて作業する場合には、赤血球が多量に存在しかつ有核でないことから、問題のＲＮＡを含まない状態で存在する細胞の大部分を占めるのは赤血球である。赤血球は、低張性ショックの影響を非常に受けやすく、そのために低張性緩衝液の存在下で破裂させることができる。溶解試薬は当業界でよく知られており、数多くある中でも塩化アンモニウム−シュウ酸カリウムまたはアンモニウムを含有する溶液が挙げられる。
【００１３】
組織用の市販ＲＮＡ抽出キット、たとえばQiagenにより供与されているようなキットでは、溶解用緩衝液が使用される。好ましくは、これらのキットは、グアニジン−チオシアネート（ＧＴＣ）溶液、および１種以上の界面活性剤たとえばドデシル硫酸ナトリウム、ならびにリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）を阻害または不活性化するための強還元剤たとえば２−メルカプトエタノールを含む。ＧＴＣは特に有用な破壊特性およびＲＮＡ保護特性を有する。ＧＴＣ／界面活性剤の組合せは核タンパク質複合体を破壊するように作用し、ＲＮＡが溶液中に放出されタンパク質を含まない形で単離されることを可能にする。高濃度のＧＴＣの存在下での細胞抽出物の希釈は、ＲＮＡを溶液中に残しながら細胞タンパク質の選択的沈殿を生じさせる。最も好ましくは、ＲＬＴ緩衝液（溶解または均質化用緩衝液と称することがある）がQiagenから商業的に入手可能でそのＲＮＡ抽出キットの構成要素であることから、ＲＬＴ緩衝液が使用される。細胞および望ましくない細胞構成要素の溶解および除去は、ホモジナイザー、ビード・ミキサー、乳鉢と乳棒または他の類似の装置を用いた機械的破壊によって補助することができる。
【００１４】
組織内の転移および微小転移の分布は、節または他の組織では一様でない。従って、転移が見逃されないように、十分に大きなサンプルを取得する必要がある。本方法におけるサンプリング問題に対する１つのアプローチは、大きな組織サンプルを均質化（homogenize）し、次いで後続の分子検査法に用いられるべき十分に混合された均質化されたサンプルの希釈を行うことである。
【００１５】
希釈ステップは、均質化後であってＲＮＡ結合ステップ（後述）へのホモジネート添加前が特に有利である。希釈ステップは、ＲＮＡ不安定性を増大させることなく組織ホモジネートを希釈する試薬である希釈剤を添加することを伴う。特に、希釈剤は前述のＲＬＴ緩衝液といったような試薬である。好ましくは、ホモジネートは８〜２ｍｇホモジネート／ｍｌ希釈剤で希釈される。より好ましくは、ホモジネートは約４〜２ｍｇ／ｍｌで希釈される。最も好ましくは、ホモジネートは約４ｍｇ／ｍｌで希釈される。
【００１６】
このような希釈ステップは、例えばスピンカラムに通過させる等の高速濾過を可能とする。希釈ステップはまた、スピンカラム内の目詰りを無くすか又は大幅に減少させ、後に用いる多量の均質化用緩衝液の必要性を無くし、後の遠心分離ステップの必要性を無くし、そしてシュレッディングカラム又は装置にサンプルを通過させる必要性を無くすることができる。究極的に、このような希釈ステップはＲＮＡ抽出を容易化し、より標準化されたプロトコルをもたらす。
【００１７】
細胞、残骸または非ＲＮＡ材料は、一般に、１以上の洗浄ステップにより除去され、次に、精製されたＲＮＡが、例えば基体含有カラムからの溶出などにより、抽出される。
【００１８】
該ＲＮＡは、エタノールにより溶液から選択的に沈殿され、ガラス繊維のシリカ表面などのような膜／基体に結合する。ＲＮＡの基体への結合は、カオトロピック塩による水分子の破壊に起因して迅速に起こり、従って核酸のシリカへの吸収を有利とする。結合した全ＲＮＡは、混入する塩、タンパク質および細胞性不純物から、簡単な洗浄ステップによって更に精製される。
【００１９】
「スピンカラム」(spin column）精製に基づく組織からのＲＮＡ抽出用キットが幾つか商業化されている。その全てが本発明の方法に適合する。これらのキットとしては、Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), Stratagene (La Jolla, CA), BDBiosciences Clontech (Palo Alto, CA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Ambion Inc. (Austin, TX)及び Promega Corp. (Madison, WI) により販売されるものがある。一般的に、これらのキットは、グアニジウム塩（４．０Ｍ以上）を含有する溶解結合用緩衝液、グアニジウムなどのようなカオトロピック塩の存在または不存在下で緩衝液中に異なる希釈度のエタノールを有する洗浄液、および溶出用緩衝液、通常はヌクレアーゼを含まない蒸留水である。一般的に、以下のような試薬を含む：
溶解／結合用緩衝液（４．５Ｍ塩酸グアニジウム，１００ｍＭリン酸ナトリウム），
洗浄用緩衝液Ｉ（５Ｍ塩酸グアニジウム中の３７％エタノール，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ），
洗浄用緩衝液ＩＩ（２０ｍＭ ＮａＣｌ中の８０％エタノール，２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ），
溶出用緩衝液，および
ヌクレアーゼを含まない無菌二重蒸留水。
【００２０】
ＲＮＡが結合する物質が結合するか又はＲＮＡが結合する基体の使用が、膜ベースのＲＮＡ抽出方法と本方法とを識別させる点である。例えば適した試薬による溶出などによって、ＲＮＡが該物質から又は該物質により容易に放出される限り、ＲＮＡは任意の化学的または物理的手段により該物質に結合する。膜ベースの方法では多数の基体が現在一般に使用されている。マシュレ−ナーゲル（Macherey-Nagel）シリカゲル膜技術はそのような技術の１つであって、参照により本明細書に援用されるEP 0496822に記載されている。本質的に、ＲＮＡはシリカゲル膜に吸着される。高濃度のカオトロピック塩は、溶液中で水和された分子から水を除去する試薬に含まれる。多糖とタンパク質は吸着せず、除去される。洗浄ステップ後、純粋なＲＮＡが低塩濃度条件下で溶出する。
【００２１】
イオン交換樹脂も膜ベースの系におけるＲＮＡ抽出用の基体として頻繁に使用される。例えば、Qiagenから商業的に入手できる陰イオン交換樹脂では、作業サンプルが基体にさらされる（結合する）時に低塩濃度が用いられ、ＲＮＡの洗浄時に高塩濃度が用いられ、そしてアルコールを介して沈殿が起こる。この樹脂は高密度のジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）を有するシリカベースのものである。該基体用の緩衝液の添加と使用により、塩濃度とｐＨが制御される。このようなQiagenから商業的に入手できるイオン交換樹脂の例として次式のものがある。
【化１】
2014132905.tif 000002
【００２２】
最も好ましい基体は、次式の単純シリカゲルである。
【化２】
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【００２３】
結合用緩衝液の存在下で、核酸がシリカゲルに吸着する。本発明の好ましい実施態様において、基体は、カラムなどのような容器内に収容される。最も好ましくは、このようなカラムは、Qiagen, GbH から入手できる"RNeasy"カラムなどのように商業的に入手されるものである。
【００２４】
３０ｍｇ未満の組織サンプルからＲＮＡを抽出および精製するための好ましい方法は、QIAGEN, GbH から入手できる RNeasy Miniキットに含まれる試薬を、本明細書に記載の方法に適用するものである。大きな組織サンプルからの多量ＲＮＡの抽出のために、当業者は、数ある試薬構成の中でも特に、QIAGEN, GbH からのQIAGEN RNeasy MIDIまたはQIAGEN RNeasy MAXIとして商業的に利用できるキットを使用することにより、後述される方法を容易にスケールアップすることができる。
【００２５】
このようなキットを使用する場合に、本発明による好ましい方法は以下の通りである。
【００２６】
２０ｍｇ未満の組織で開始する場合には、３５０〜６００μｌの均質化用緩衝液（好ましくはQiagenからのキット中で得られるＲＬＴ緩衝液）を組織に添加し、また２０〜３０ｍｇの組織の場合には、６００μｌの緩衝液を添加するのが好ましい。均質化用緩衝液の量は組織サンプルによって増減し得る。次に、以下：ローター・スターター・ホモジナイザー、ビード・ミキサー、乳鉢と乳棒およびハンド・グラインダーを限定されることなく包含する方法の１つにより、組織または細胞を破壊する。手動での細胞および組織の破壊を行う場合、通常、処分可能な組織グラインダー（VWR Scientific, カタログ番号15704-126または15704-124）を使用することにより、均質化を行う。より好ましくは、Omni International (Warrenton, VA)から商業的に利用できるＰＣＲ組織均質化キットなどのような、均質化を目的として作製された機械的装置の使用により、均質化を行う。
【００２７】
均質化時間は、一般的には約１分であり、好ましくは組織が視覚的に均質化され次第すぐである。
【００２８】
濃い組織サンプルを使用する場合、サンプルの粘度を低下させるのが望ましいことがある。最も好ましくは、粘度の低下は、ホモジネートに均質化用緩衝液を添加することによって行う（８ｍｇホモジネート／ｍｌ緩衝液ないし２ｍｇ／ｍｌ）。粘度の低下は、ＲＮＡ分解酵素を含まない注射器に適合した針（好ましくは約２０ゲージ）に１回以上通過させるか、又は遠心分離に使用される QIAシュレッダーカラムなどのような装置を使用することによっても行うことができる。
【００２９】
好ましくは、清澄化した溶解産物に対して１体積の７０％エタノールを添加し、ピペット処理(pipetting）により混合する。
【００３０】
こうして調製した約７００μｌまでのサンプルを、ＲＮＡ結合性マトリックスを収容する容器（好ましくはQiagenキットのRNeasyシリカゲル・miniカラム）に適用し、及び／又は（遠心分離ではなく）濾過により、好ましくは減圧（vacuum）の適用による濾過により廃棄する。好ましくは、約１５〜６０秒間、（全ての減圧ステップの場合と同様に）約１１〜１３ｐｓｉ（約７６〜９０ｋＰａ）で減圧を適用する。ここで減圧が適用される全ステップと同様に、そのような圧力に耐える該マトリックスの能力を超えない限り、減圧の増大に伴い、減圧が適用される時間を減少させることができる。
【００３１】
洗浄用緩衝液（好ましくは約７００μｌのQiagenキットのＲＷ１緩衝液）を、該ＲＮＡ結合性マトリックスを収容する容器（好ましくはRNeasyカラム）に添加し、そして濾過により、好ましくは減圧の適用による濾過により、流出液を除去し及び／又は廃棄し、そして次に収集チューブを除去し及び／又は廃棄する。
【００３２】
第２の洗浄用緩衝液（好ましくは約５００μｌのQiagenキットのＲＰＥ緩衝液）を該カラム上にピペットで注ぐ。該チューブを穏やかに閉じ、そして濾過により、好ましくは減圧の適用による濾過により、流出液を除去し及び／又は廃棄する。
【００３３】
任意に、洗浄用緩衝液（好ましくは約５００μｌのＲＰＥ緩衝液）を容器（好ましくはRNeasyカラム）に再び添加してもよい。該チューブを穏やかに閉じ、そして基体／膜を乾燥させる。好ましくは、容器を新たな２ｍｌ収集チューブに入れ、（好ましくは約８，０００ｇで１分間）遠心分離する。
【００３４】
溶出のために、好ましくは、容器を新たな１．５ｍｌ収集チューブに移し、ＲＮＡ分解酵素を含まない３０〜５０μｌの水を基体／膜上に直接にピペットで注ぐ。該チューブを穏やかに閉じ、（好ましくは約１０，０００ＲＰＭで約３０秒間）遠心分離して、ＲＮＡを溶出させる。ＲＮＡ収量が３０μｇを超えると予想される場合、この段落のステップを溶出時に繰り返すことが好ましい。
【００３５】
動物組織からの全ＲＮＡの単離のための RNAeasyプロトコル（QIAGEN RNAeasy Handbook, 2001年6月）は、少なくとも６分４５秒、および遠心分離のための加速減速時間を含める場合に８分４５秒の、全遠心分離時間を要する。これに対して、本発明の迅速方法における全濾過および遠心分離ステップに要する全時間は、２分１５秒、および遠心分離のための加速減速時間を含める場合に３分である。さらに、組織均質化に要する約３０秒〜１分およびサンプル操作（希釈および混合ステップを含む）に要する約４５秒〜１分は、本発明の方法と従来技術の方法で共通である。
【００３６】
こうして本発明の方法に要する全時間は８分未満であり、好ましくは６分未満である。サンプルが単一リンパ節である場合、５分の全抽出時間が特に望ましく、また達成可能である。
【００３７】
便利なスピンカラム並列減圧処理のために、QIA vac 24真空マニホールド(vacuum manifold）などのような真空マニホールドを使用することが好ましい。サンプルおよび洗浄液は、遠心分離の代わりに減圧によりカラム膜を通じて引き下ろされるため、処理スピードが早くなり、細胞および組織からのＲＮＡの抽出および精製における取扱い時間が短縮される。
【００３８】
本方法は、適切な破壊方法を用いることにより、植物および動物細胞ならびに細菌、酵母、植物および糸状菌からのＲＮＡを抽出するために使用することができる。
【実施例】
【００３９】
リアルタイムＰＣＲ
本発明の実施例はリアルタイムＰＣＲの使用に基づく。リアルタイムＰＣＲにおいて、ポリメラーゼ連鎖反応の生成物は、終了時点の測定によるのではなく、ＰＣＲの対数期にリアルタイムでモニターされる。従って、ＤＮＡおよびＲＮＡの定量は遥かに精度と再現性が高い。蛍光値が各サイクル中に記録され、増幅反応において当該時点までに増幅された生成物の量を表わす。反応の開始時に存在する鋳型が多いほど、蛍光信号が基準値（background）を上回る統計的に有意なものとして最初に記録される点に到達するのに要するサイクル数（これが（Ｃｔ）値の定義である）が少なくなる。閾値サイクル（Ｃｔ）の概念は、蛍光ベースのＲＴ−ＰＣＲを用いた正確かつ再現性の高い定量を可能にする。ＰＣＲ生成物の均一系測定は、２本鎖ＤＮＡ結合性色素（例えばＳＹＢＲグリーン）、蛍光原性プローブ（例えばTaqManプローブ、分子ビーコン）および直接標識型プライマー（例えばAmplifluorプライマー）に基づくものなどを含む多数の異なる検出方法を用いて実行することができる。
【００４０】
例１．短い遠心分離時間
この例では、２種の胸部リンパ節を Asterand Inc.（Detroit, MI） から購入した。１つの節は病理学により癌陽性であることが確認され（ＡＬＮＣ１）、第２の節は癌陰性であった（ＡＬＮＮ１）。
【００４１】
対照として、前述したような製造者により推奨されるQIAGEN RNeasy Mini手順を使用して、各節からの組織３０ｍｇを抽出および精製した。各サンプルについて単一ホモジネートから三重抽出を行った。ＲＰＥ洗浄用緩衝液の最終添加後に各遠心分離ステップを３０秒に短縮したことを除いては類似の方法で、三つの３０ｍｇ部分をQIAGEN RNeasy Mini手順により処理した。全ての遠心分離ステップをEppendorfモデル5415C微小遠心分離器（microcentrifuge）（Brinkman, Instrument, Inc, Westbury）で行った。
【００４２】
各節から抽出されたＲＮＡを Hewlitt-Packard HP8453 UV−可視分光システム（Waldbronn, Germany）で２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける分光測定により分析し、全ＲＮＡ収量を２６０ｎｍにおいて定量するとともにＲＮＡの質をサンプル毎に２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比に基づいて判断した。
【００４３】
以下で特記する場合を除いて、プライマーを含め全試薬をInvitrogen Corp, Carlsbad CAから購入した。
【００４４】
得られたＲＮＡを以下のように転写してｃＤＮＡコピーを作った。５μＬのアンカー型オリゴｄＴ２３、５μＬの１０ｍＭ各種ｄＮＴＰおよび５０μＬとなるまでＲＮＡ分解酵素処理水（Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo）からなるストック溶液を調製し、２．５μｇのＲＮＡを添加し、溶液を７０℃に５分間加熱し、次に氷上に置いた。次に、２０μＬの５×Superscript First-Strand緩衝液、１０μＬの０．１Ｍジチオスレイトール、３μＬの４０Ｕ／μＬ Rnasin 溶液（Promega Corp, Madison WI）および５μＬの２００Ｕ／μＬ Superscript II 逆転写酵素からなる溶液３８μＬおよび体積３８μＬまでのＲＮＡ分解酵素を含まない水を添加した。チューブを４２℃で５０分間インキュベートし、次に４０μＬの０．５Ｍ ＮａＣｌ を添加して、チューブを７０℃で５分間インキュベートした。２０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液，ｐＨ７．０を添加した後に、９０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を添加した。ＲＮＡからｃＤＮＡへの完全な変換および１μｇ＝１００，０００細胞当量（ＣＥ）の変換係数を仮定して、８０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中の１０００ＣＥ／μＬの濃度を、後続の全てのリアルタイムＰＣＲアッセイについて使用した。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲにおけるＳＹＢＲグリーン検出に基づく以下のプロトコルを、ハウスキーピング遺伝子であるポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ，配列番号２０）ならびに乳癌に特異的な遺伝子であるママグロビン（mammaglobin， 配列番号１７）およびプロラクチン誘導性タンパク質（ＰＩＰ，配列番号１８）の定量的検出のために使用した。１０μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液＃１（Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA），１０μＬの１０Ｍ ＭｇＣｌ2，２μＬの１０ｍＭ各種ｄＮＴＰ，１μＬの１００×SYBER グリーン溶液（Sigma Chemical Co, St. Louis, MO），ＴＥ緩衝液中の５μＭストック液からの各種プライマー２μＬ，および０．７５μＬの Taq／抗Taq 抗体混合物、および９４μＬまでのＲＮＡ分解酵素を含まない水からなるストックマスター混合溶液を調製した。その他の反応成分の添加に先立って、Taq ＤＮＡポリメラーゼおよび抗Taq 抗体を混合し、１０〜１５分間インキュベートした。４９μｌの上記マスター混合溶液とともに１μＬのｃＤＮＡ（１，０００ＣＥ）を各ウェルに添加した。
【００４６】
以下のプライマー対を使用した：ＰＢＧＤについて配列番号１および配列番号２；ママグロビンについて配列番号３および配列番号４；およびＰＩＰについて配列番号５および配列番号６。
配列番号１：  ATGACTGCCT TGCCTCCTCA GTA（ＰＢＧＤ）
配列番号２：  GGCTGTTGCT TGGACTTCTC TAAAGA（ＰＢＧＤ）
配列番号３：  CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA（ママグロビン）
配列番号４：  TCTGTGAGCC AAAGGTCTTG CAGA（ママグロビン）
配列番号５：  GGCCAACAAA GCTCAGGACA ACA（ＰＩＰ）
配列番号６：  GCAGTGACTT CGTCATTTGG ACGTA（ＰＩＰ）
【００４７】
リアルタイムＰＣＲ測定は、Applied Biosystems 7900（Foster City, CA）で行った。９４℃で２分間の後に、５０サイクルの９４℃で１５秒間、６２℃で１５秒間および７２℃で４５秒間という温度プロファイルならびに閾値２７５を使用した。
【００４８】
これらの実験の結果を表１にまとめる。これらの結果は、標準QIAGEN手順と比較して短縮した遠心分離ステップで抽出されたサンプル間で、ハウスキーピング遺伝子ＰＢＧＤまたは癌遺伝子ママグロビンおよびＰＩＰのＲＮＡ収量または増幅効率のいずれにも大きな差を示さない。
【００４９】
【表１】
2014132905.tif 000004
【００５０】
この迅速プロトコルにおける良好なＲＮＡの質についての追加的な証拠として、6000 Nano-chip Kitを使用する Agilent 2100Bioanalyzer（Agilent Technologies, Wilmington DE）により、上記サンプルの全てについてＲＮＡの質を評価した。電気泳動図の結果は、最小限のＲＮＡ分解とともに明確な１８ｓおよび２８ｓリボソームのピークの存在に基づく同程度の良好なＲＮＡの質を示した。全てのサンプルが Agilent Bioanalyzerデータに基づく約１．６以上のリボソームピーク比を有し、このことからも短縮した遠心分離プロトコルからの高品質のＲＮＡが確認された。ＲＮＡ抽出に要する全時間は５分１５秒であった。
【００５１】
例２．ＲＮＡ収量、逆転写およびリアルタイムＰＣＲ増幅
この実験では、腺管癌を有する胸部腋窩節を使用した。試薬は全てQIAGEN RNeasy キット（カタログ番号74181, QIAGEN, Inc. Valencia Corporation）からのものを使用した。以下の備品と機材もQIAGEN INCより購入した：QIAvac24濾過装置（カタログ番号 19403），QIAシュレッダー（カタログ番号79656），QIAvacコネクタ（カタログ番号19409）およびVacコネクタ（カタログ番号19407）。他の試薬は全て例１に記載の供給源より購入した。
【００５２】
この実験の組織均質化については、５４０ｍｇの胸部節組織を１０．８ｍｌのＲＬＴ緩衝液中に懸濁させ、使用に先立って均質化した。得られたホモジネートを幾つかの異なる方法で以下のように処理した。
【００５３】
パートＩ．真空マニホールドの評価。この実験は減圧を適用してQIAvac24濾過装置を使用して行った。
１．  ７００μＬのホモジネートを QIAシュレッダーカラムに入れ、１４，０００ＲＰＭで２分間遠心分離した。
２．  該溶解物に等体積の７０％エタノールを添加し、ピペット処理により混合した。遅滞なく次のステップを続けた。
３．  ７００μＬのサンプルを、真空マニホールドに取り付けられた RNeasy miniカラムに適用した。１２ｐｓｉ（約８３ｋＰａ）で１０秒間減圧を適用した。
４．  ７００μＬのＲＷＩ緩衝液を該カラムに適用し、同じ減圧を同じ時間、適用した。
５．  ５００μＬのＲＰＥ緩衝液を該カラム上にピペットで注ぎ、同じ減圧を同じ時間、適用した。別の５００μＬのＲＰＥ緩衝液を該カラムに添加し、同じ減圧を同じ時間、適用した。
６．  該カラムを収集チューブに入れ、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、カラムを乾燥させた。
７．  該カラムを新たな１．５ｍｌチューブに移した。ＲＮＡ分解酵素を含まない２５μＬの水を膜上に直接にピペットで注いだ。
８．  膜を６０秒間遠心分離して溶出させた。
【００５４】
パートＩＩ．この実験は真空マニホールドの使用とともに遠心分離時間を３０秒に短縮する効果を決定するために行った。
１．  ７００μＬのホモジネートを QIAシュレッダーカラムに入れ、１４，０００ＲＰＭで３０秒間遠心分離した。
２．  該溶解物に等体積の７０％エタノールを添加し、ピペット処理により混合した。遅滞なく次のステップを続けた。
３．  ７００μＬのサンプルを、真空マニホールドに取り付けられた RNEasy miniカラムに適用した。１２ｐｓｉ（約８３ｋＰａ）で１０秒間減圧を適用した。
４．  ７００μＬのＲＷＩ緩衝液を該カラムに適用し、上記と同じ減圧を適用した。
５．  ５００μＬのＲＰＥ緩衝液を該カラム上にピペットで注ぎ、上記と同じ減圧を適用した。別の５００μＬのＲＰＥ緩衝液を該カラムに適用し、上記と同じ減圧を適用した。
６．  該カラムを収集チューブに入れ、１４，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して、カラムを乾燥させた。
７．  該カラムを新たな１．５ｍｌチューブに移した。ＲＮＡ分解酵素を含まない２５μＬの水を膜上に直接にピペットで注いだ。
８．  膜を３０秒間遠心分離して溶出させた。
【００５５】
パートＩＩＩ．低速遠心分離器の使用。
この実験では、上記パートＩＩのステップ１、ステップ６およびステップ７において、VWR Scientific, West Chester, PAより購入したモデル10MVSS遠心分離器を１０，０００ｒｐｍで使用した。
【００５６】
パートＩＶ．カラム乾燥ステップの削除。
負の対照として、パートＩＩに記載の手順からステップ６（パートＩＩ）を削除した実験を含ませた。
【００５７】
これらの各パートにおけるＲＮＡ収量、ＲＮＡの２６０／２８０ｎｍ比（ＲＮＡ純度の推定値）ならびに３’および５’プライマーを用いたハウスキーピング遺伝子ＰＢＧＤについてのＳＹＢＲグリーンに基づくリアルタイムＰＣＲアッセイを下の表２に示す。手順と試薬は例１に記載した通りである。
【００５８】
【表２】
2014132905.tif 000005
【００５９】
これらの実験の結果は、スピードを向上させ機器コストを低下させたプロトコルによりＲＮＡ収量に若干の損失が生じることを示す。しかしながら、この修正プロトコルによるＲＮＡ収量は、逆転写酵素反応に必要な量（２〜２．５ｇ）を十分に上回る。リアルタイムＰＣＲ結果は、この迅速プロトコルがリアルタイムＰＣＲにより転写および定量化され得るＲＮＡを生じることを確認する。
【００６０】
例３．迅速プロトコル、対、従来技術プロトコル（Taqmanアッセイを用いたリアルタイムＰＣＲに基づく）
全体で１６のＨ＆Ｅ陽性節および１５のＨ＆Ｅ陰性胸部節サンプルをGenomics Collaborativeより購入した。各節から２つの３０ｍｇ組織片を切り取った。
【００６１】
パートＩ．一方の３０ｍｇ組織片を以下のように処理した。すなわち、６００μｌのＲＬＴ緩衝液を添加し、組織サンプルを処分可能な組織グラインダー（カタログ番号15704-126, VWR Scientific, West Chester, PA）により２０〜４０秒間手動で均質化した。チューブをEppendrofモデル5415C微小遠心分離器内で最大速度で３分間遠心分離した。上清液を新たなチューブに移し、１体積の７０％エタノールを添加した。サンプル（７００μＬ）を、QIA vac 24真空マニホールド上に配置された RNeasy miniカラム上に適用し、減圧を適用した。ＲＷＩ緩衝液（７００μＬ）を該カラムを通じて濾過させた。ＲＰＥ緩衝液（５００μＬ）を該カラム上にピペットで注ぎ、該カラムを通じて濾過させた。別の５００μＬのＲＰＥ緩衝液を該カラムに添加し、該カラムを通じて濾過させた。該RNeasy mini カラムを２ｍｌ収集チューブに入れ、微小遠心分離器(microfuge）内で最大速度で１分間遠心分離した。次に、該RNeasyカラムを新たな１．５ｍｌ収集チューブに移し、ＲＮＡ分解酵素を含まない５０μｌの水を添加し、８０００×ｇで１分間遠心分離することによって、該カラムからＲＮＡを溶出させた。
【００６２】
パートＩＩ．胸部節の第２の３０ｍｇ組織片を以下のような迅速プロトコルにより処理した。すなわち、（１）組織片を６００μＬのＲＬＴ緩衝液に添加し、処分可能な組織グラインダーにより２０〜４０秒間手動で均質化した。（２）そのホモジネートを QIAシュレッダーカラムを通じて最大速度で３０秒間遠心分離した。（３）該溶解物に１体積の７０％エタノールを添加し、ピペット処理により混合した。（４）次にサンプルを、QIAvac24真空マニホールド上に配置された RNeasy miniカラム上に適用し、減圧を適用した。（５）７００μｌのＲＷＩ緩衝液を該カラムに添加し、該カラムを通じて濾過させた。（６）５００μｌのＲＰＥ緩衝液を該カラム上に添加し、該カラムを通じて濾過させた。（７）該カラムを２ｍｌの収集チューブに移し、１０，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。（８）ＲＮＡ分解酵素を含まない２５μＬの水を膜に添加し、該カラムを１０，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して、ＲＮＡを溶出させた。迅速プロトコルにおける遠心分離ステップは全てモデル10MVSS VWR遠心分離器で行った。
【００６３】
抽出されたＲＮＡを、例１に記載したように逆転写し、ＲＮＡおよびｃＤＮＡを定量した。
【００６４】
Taqmanアッセイについて、Taqman Core試薬キット、Gene Amp １０×ＰＣＲ緩衝液、Amp Erase ウラシルＮ−グリコシダーゼおよびAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼをApplied Biosystems, Foster City, CAより購入した。他の試薬は全て例１に記載の商業的供給源より購入した。グリセロールはSigma Chemical Co（St. Louis, MO）より、またTween 20はEastman Organic Chemicals（Rochester, NY）より購入した。
【００６５】
ママグロビンプライマー（配列番号３および配列番号４）はInvitrogen Corp.（Carlsbad, CA）により合成され、ママグロビンTaqmanプローブ（配列番号７）はEpoch Biosciences（San Diego, CA）から入手した。ＰＢＧＤプライマー（配列番号８および配列番号９）はQIAGEN Operon（Alameda, CA）により合成され、そのプローブ（配列番号２３）はSYNTHEGEN, LLC （Houston, TX）により合成された。Ｂ３０５Ｄプライマー（配列番号１１および配列番号１２）はInvitrogen Corp.で合成され、そのプローブ（配列番号１３）はApplied Biosystems, Inc.により合成された。全てのTaqmanプローブについて、カルボキシフルオレセイン（FAM） およびカルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA） を色素およびクエンチャー対として使用した。
配列番号３：  CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA
配列番号４：  TCTGTGAGCC AAAGGTCTTG CAGA
配列番号７：  6-FAM-TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTC TTTGTG-TAMRA
配列番号８：  CTGAGGCACC TGGAAGGAGG
配列番号９：  CATCTTCATG CTGGGCAGGG
配列番号２３：  6-FAM-CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAGTGT-TAMRA
配列番号１１：  TCTGATAAAG GCCGTACAAT G
配列番号１２：  TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC
配列番号１３：  6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTA CACC-TAMRA
【００６６】
Taqmanアッセイについて、１０μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液＃１、１４μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、８μＬの１０ｍＭ各種ｄＮＴＰ、１μＬのAmpErase ＵＮＧ（１Ｕ／μＬ）、１６μＬのグリセロール、１μＬの１％ｗ／ｖ Tween 20、０．７５μＬのAmpliTaq Gold（５Ｕ／μＬ）、５μＭストック液からの各種プライマー６μＬ、１０μＭプローブストック液からの０．４μＬ、および最終体積９６μＬとなるまでの水を添加することによって、マスター混合液を調製した。マスター混合液（４８μＬ）および各節サンプルからのｃＤＮＡ２μＬを、各光学反応微小検定プレートウェルに加えた。光学的キャップ形成剤でキャップ形成した後に、該プレートを ABI Prism 7900 HT配列検出システム（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA） で処理した。Taqman PCR Core 試薬キット、Taqman ＤＮＡ鋳型試薬およびTaqman Ｂ−アクチン検出試薬は、Applied Biosystems（Foster City, CA）より購入し、アッセイは該製造者により推奨されるプロトコルに従って行った。ママグロビンアッセイを用いた分析には０．０２の閾値を使用し、Ｂ３０５Ｄアッセイには０．０３、Ｂ−アクチンアッセイには０．０８、そしてＰＢＧＤアッセイには０．１の閾値を使用した。Taqmanによる三重測定の平均を表３および表４に示す。
【００６７】
１５のＨ＆Ｅ陰性節サンプルならびに１６のＨ＆Ｅ陽性節サンプルおよび２つの対照ｃＤＮＡサンプルにおける、ハウスキーピング遺伝子であるＢ−アクチン（配列番号１９）およびＰＢＧＤのリアルタイムＰＣＲ測定の比較を表３に示す。これらの実験の結果は、従来技術プロトコルにより得られるＣｔ値と本発明の迅速方法により得られるＣｔ値との間で良好な一致を示し、迅速ＲＮＡ抽出プロトコルにより抽出されたＲＮＡが従来技術プロトコルに基づき抽出されたＲＮＡと類似する程度に逆転写およびＰＣＲ増幅され得ることを確認するものである。
【００６８】
表４は、表３で評価するのと同じ胸部リンパ節サンプルを用いた、乳癌マーカーであるママグロビンおよびＢ３０５Ｄ（アイソフォームＣ，配列番号１４）についてのＣｔ値に基づく遺伝子発現結果を比較するものである。リアルタイムＰＣＲに基づきＨ＆Ｅ陽性およびＨ＆Ｅ陰性胸部節サンプル間で相関させることができるかどうかを決定するために、Ｈ＆Ｅ陰性節サンプルにおける各マーカーについての最低Ｃｔ値を、ママグロビンとＢ３０５Ｄの両方について特定した。Ｈ＆Ｅ陰性節サンプル中のこの最低値よりも２．５Ｃｔ値小さいという任意的であるが堅実なカットオフを、Ｈ＆Ｅ陽性サンプルに適用した。表４において影を付けて示すサンプルは、Ｃｔ値がＨ＆Ｅ陰性節サンプル中で見られるＣｔ値よりも少なくとも２．５Ｃｔ値低いという点で、これら２つの胸部マーカーについて高い発現を有する。該キットの製造者であるQIAGENにより推奨される従来技術の方法と本発明の迅速方法の両方を使用するこれらのマーカーの発現には良好な相関があった。
【００６９】
１５のＨ＆Ｅ陰性節サンプルの１つであるGCLNC-24におけるマーカーとしてママグロビンを使用すると、実験誤差の範囲内である０．４というＣｔ値の差を示した。第２のサンプルは、節における転移の確固とした不均一な分布に起因するサンプリング問題の可能性とともに、これらサンプル中のＲＮＡのスペクトル的定量の困難性に起因して、ママグロビンとＢ３０５Ｄの両方の場合にＣｔ値において大きな差を示した。（Csermi. 1999. Metastases in axillary sentinel lymph nodes in breast canser as detected by intensive histopathological work up（集中的組織病理学研究により検出された乳癌中の腋窩リンパ節における転移）. J. Clin Pathol, 52:0922-924）
【００７０】
【表３】
2014132905.tif 000006
【００７１】
【表４】
2014132905.tif 000007
【００７２】
例４．QIAシュレッダーカラムの評価
この例の目的はリンパ節組織の均質化後に QIAシュレッダーカラムを使用し得ること、および僅か３０秒間のホモジネートの遠心分離により許容可能なＲＮＡ抽出が生じることを実証することである。
【００７３】
Ｈ＆Ｅ陰性である胸部腋窩節をGenomics Collaborative（Cambridge, MA）より入手した。４９０ｍｇの組織切片を５．５ｍｌのＲＬＴ緩衝液と混合し、節を均質化した。６００マイクロリットルのホモジネートを取り出し、例２に記載のプロトコル短縮化修正の全てを使用してＲＮＡを抽出した。対照として、 QIAシュレッダーカラムの代わりに３分間の遠心分離を用いる点を除いては例２に記載のプロトコル短縮化修正の全てを使用して６００μＬのホモジネートを処理した。各反応からのＲＮＡを、例１に記載したように逆転写し、定量した。例３に記載のようにTaqmanプローブを使用してリアルタイムＰＣＲを行った。
【００７４】
これらの研究の結果は、遠心分離プロトコルにおける０．３４μｇ／μＬと比較して、 QIAシュレッダープロトコルを伴うプロトコルにおける０．３１μｇ／μＬという類似のＲＮＡ収量を示した。両方のサンプルで２．１という同一の２６０／２８０ｎｍ比が得られ、高い質のＲＮＡを示した。リアルタイムＰＣＲアッセイも、遠心分離を伴うプロトコルと比較して QIAシュレッダーカラムにより抽出されたＲＮＡを用いた場合のママグロビンについて類似のＣｔ値（２２．５対２２．０）を示し、Ｂ３０５Ｄの場合（２６．７対２６．６）ならびにハウスキーピング遺伝子であるＰＢＧＤの場合（２９．１対２９．０）およびＢ−アクチンの場合（１８．５対１８．２）も同様であった。
【００７５】
要約すると、この実験は、均質化後に３分間の遠心分離ステップの代わりに QIAシュレッダーを伴うプロトコルを用いた場合に類似のＲＮＡ収量、質、リアルタイムＰＣＲ増幅結果を示す。この修正はＲＮＡ抽出を行うために要する時間を２．５分短縮し、このことは患者の処置に影響を及ぼすために迅速な結果が必要とされる術中その他の適用に適したプロトコルの開発において重要である。
【００７６】
例５．大腸組織での迅速ＲＮＡ抽出方法と標準（従来技術）QIAGENプロトコルの比較
以下の例は、本発明の方法と従来技術の両方を用いた大腸組織からのＲＮＡの抽出を比較するものである。２０ｍｇの大腸組織を６００μｌのＲＬＴ緩衝液に加え、例３に記載のように均質化した。均質化された大腸癌組織の１つのサンプルを例３Ａに記載の迅速プロトコルに従って処理し、１つのサンプルを例３、パートＢに記載のQIAGENプロトコルに従って処理した。両手順から得られたＲＮＡをAgilent bioanalyerで試験した。
【００７７】
迅速方法および従来技術を用いて抽出されたＲＮＡの電気泳動図は、QIAGENプロトコルを用いて処理したサンプルのＲＮＡ比が１．５４であり、迅速プロトコルを用いて処理したサンプルのＲＮＡ比が１．３７であることを示した。一般に、ＲＮＡ比が１．１を超えるサンプルは許容可能であると考えられている。Agilent bioanalyerにより決定される通り、迅速プロトコルを用いて処理したサンプルはＲＮＡ収量が１３６μｇ／ｍｌであったのに対し、QIAGEN方法を用いて処理したサンプルは収量が２８０μｇ／ｍｌであった。両プロトコルにより得られる収量は逆転写酵素反応に必要とされる量（２〜２．５μｇ）を十分に上回る。
【００７８】
例６．ＲＮＡ収量および精度に対する溶解物の希釈の効果  以下の例は、ＲＮＡ収量およびＲＮＡ回収の精度に対する溶解物の希釈の効果を例証するものである。この例では、２０ｍｇ、１０ｍｇまたは５ｍｇの凍結ブタ節組織を切断した。５０ｍｌの処分可能な組織グラインダーを用いて組織を３０秒間すりつぶし、該サンプルをボルテックス処理した。各々の節重量について三重の調製を行った。各溶解物の１ｍｌを１．７ｍｌの微小遠心分離器チューブに移し、これを次に Eppendorf微小遠心分離器内で最大速度（１４，０００ＲＰＭ）で３０秒間遠心分離した。７００マイクロリットルを QIAシュレッダーカラムを通じて遠心分離し、該サンプルを最大速度で３０秒間遠心分離した。次に、例２、パートＩ、ステップ４〜８に記載のように、カラムを洗浄し、カラムを乾燥し、ＲＮＡを溶出させた。Gene Spec IIによりＲＮＡを定量した。これらの研究の結果を表５に示す。これらの結果は、１０ｍｇおよび２０ｍｇの節組織を含む比較的高重量のサンプルと比較して、６００ｍｌの均質化用緩衝液中で均質化された２．５ｍｇの初期節組織重量での優れた精度を示す。これらの結果は、改善された精度のＲＮＡ回収を低重量の節で実現できることを示す。さらに、ホモジネートが希薄であるほど該カラムを通じて速く濾過されること、そして濾過装置の目詰りに伴う問題の可能性が一層低くなることが予想される。
【００７９】
【表５】
2014132905.tif 000008
【００８０】
例７．以下の例は、ホモジネートの希釈により均質化後の遠心分離ステップの必要性がなくなること、および QIAシュレッダーなどの装置を通じた処理がＲＮＡを迅速に抽出するために必要でないことを実証するために行った。
【００８１】
この例では、ブタリンパ節の各２００ｍｇ組織片を４ｍｌの均質化用ＲＬＴ緩衝液に懸濁させ、処分可能な５０ｍｌの組織グラインダー内で３０秒間均質化した。組織の最終濃度が緩衝液６００ｍｌ中５ｍｇとなるように追加の２０ｍｌのＲＬＴ緩衝液を添加した。サンプルを１５秒間ボルテックス処理し、組織濃度をＲＬＴ緩衝液６００ｍｌ中２．５ｍｇ、１．２５ｍｇまたは０．６２５ｍｇのいずれかに希釈した。以下の可変項について三重測定を行った：（Ｉ）均質化後の遠心分離および QIAシュレッダーステップ有り（ＩＩ）遠心分離有り、 QIAシュレッダーステップ無し、（ＩＩＩ） QIAシュレッダー有り、遠心分離ステップ無し（ＩＶ）組織均質化後のホモジネートの遠心分離無し、 QIAシュレッダー無し。各サンプルを等体積の７０％エタノールで希釈し、混合した。該サンプル（７００μｌ）を RNeasy miniカラムに適用し、QIAGEN真空マニホールド上に配置した。該サンプルを減圧により濾過し、該カラムを７００μｌのＲＷＩ緩衝液で洗浄した後に、５００μｌのＲＰＥ緩衝液で洗浄した。該カラムを新たな収集チューブに添加し、最大速度（１４，０００ＲＰＭ）で３０秒間遠心分離して、該カラムを乾燥させた。次に、各カラムを新たな収集チューブに移し、ＲＮＡ分解酵素を含まない５０μｌの水を膜上にピペットで注ぎ、該チューブを１４，０００×ｇで３０秒間遠心分離して、ＲＮＡを溶出させた。ＲＮＡ収量を分光学的に定量した。これらの研究の結果を表６にまとめる。これらの結果は、比較的低い重量の組織（２．５ｍｇ，１．２５ｍｇおよび０．６２５ｍｇ）をもったサンプルでは、 QIAシュレッダー、または均質化後の遠心分離ステップ、またはその両方がアッセイに含まれる場合に何ら改善が見られないことを示す。
【００８２】
【表６】
2014132905.tif 000009
【配列表】
2014132905000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月16日(2014.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物系からＲＮＡを抽出する方法であって、ここで前記方法は３分以下で行われ、そして以下のステップ：
（ｉ）ＲＮＡに結合する物質が付着された又は該物質を含有する基体へ、均質化された組織、又は血液を含むサンプル溶液を添加し、
（ｉｉ）前記基体を３０秒以下で遠心分離し、
（ｉｉｉ）第一の洗浄用緩衝液を前記基体へ添加し、
（ｉｖ）前記第一の洗浄用緩衝液を前記基体を通じて濾過し、
（ｖ）第二の洗浄用緩衝液を前記基体へ添加し、
（ｖｉ）前記基体を３０秒以下で遠心分離するか、または前記基体へ負圧を適用し、
（ｖｉｉ）前記基体を収集チューブに移し、
（ｖｉｉｉ）前記収集チューブ中の前記基体へ水を添加し、
（ｉｘ）前記基体を３０秒以下で遠心分離し、そしてRNAを前記収集チューブから回収すること
からなる、前記方法。
【請求項２】
組織が組織グラインダーにより均質化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
負圧が１１．６〜１３．１ｐｓｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル溶液を調製するステップをさらに含み、ここで、前記サンプル溶液を前記基体へ添加する前に、前記サンプル溶液から問題のＲＮＡを含まない細胞が除去され、問題のＲＮＡを含有する細胞が溶解され、均質化された組織、又は血液を含むサンプル溶液が前記溶解された細胞から調製され、ここで、請求項１に記載のＲＮＡを抽出する方法が、前記サンプル溶液を調製するステップと一緒になって６分未満で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞がグアニジニウムチオシアネートを含有する物質で溶解され、基体がシリカゲル膜である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生物系からＲＮＡを抽出する方法であって、ここで前記方法は６分未満で行われ、そして以下のステップ：
（ａ）生物系から細胞含有サンプルを取得するステップと、
（ｂ）該サンプルから問題のＲＮＡを含まない細胞を除去して、作業サンプルを生成するステップと、
（ｃ）問題のＲＮＡを含む細胞を溶解するステップと、
（ｄ）該作業サンプルを均質化するステップと、
（ｅ）該均質化した作業サンプルを湿潤させるステップと、
（ｆ）該湿潤した均質化した作業サンプルを、ＲＮＡが結合する物質に付着された又は該物質を含有する基体と接触させて、基体−ＲＮＡ複合体を形成するステップと、
（ｇ）該基体に負圧を適用して、ＲＮＡを抽出するステップと
（ｈ）該抽出されたＲＮＡを洗浄するステップと、
（ｉ）該基体−ＲＮＡ複合体から水を除去するステップと、
（ｊ）該ＲＮＡを溶出させるステップと、
を含んでなり、そして
前記ステップ（ｉ）および（ｊ）において遠心分離が行われ、そして各遠心分離は３０秒を超えない、前記方法。
【請求項７】
問題のＲＮＡを含まない細胞が除去される前に溶解される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該均質化した作業サンプルを希釈剤で希釈するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
該作業サンプルが８〜２ｍｇホモジネート／ｍｌ希釈剤に希釈される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該作業サンプルが４ｍｇホモジネート／ｍｌ希釈剤に希釈される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該希釈剤がＲＮＡ保存物質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
該物質がグアニジウムチオシアネートを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該基体がシリカゲル膜である、請求項６に記載の方法。
【外国語明細書】
2014132905000001.pdf