(57)【要約】【課題】非アルコール性脂肪肝を治療するための治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法において用いられるＤＮＡチップを提供すること。【解決手段】本発明は、β−クリプトキサンチンを含む、非アルコール性脂肪肝治療用組成物を提供する。また、本発明は、少なくとも１つの候補物質と、培養肝細胞とを接触させる接触工程と、上記接触工程の後に、β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を検出する検出工程と、β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を抑制した候補物質を選択する選択工程と、を含む非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−クリプトキサンチンを含む、非アルコール性脂肪肝治療用組成物。
【請求項２】
前記非アルコール性脂肪肝が非アルコール性脂肪肝炎である請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの候補物質と、培養肝細胞とを接触させる接触工程と、
前記接触工程の後に、β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を検出する検出工程と、
β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を抑制した候補物質を選択する選択工程と、を含む非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子がＣ１ＱＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＹＢＡ、ＣＤ６４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＬＹＺのうちのいずれか１つ以上である請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記非アルコール性脂肪肝が非アルコール性脂肪肝炎である請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
Ｃ１ＱＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＹＢＡ、ＣＤ６４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＬＹＺのうちのいずれか２つ以上のＤＮＡを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを備えるＤＮＡチップ。
【請求項７】
配列番号１〜３０記載の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを２種以上備えるＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法及びＤＮＡチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
日本における肝疾患の罹患者は急増している。罹患者が増加している肝疾患のうち、特に、食生活の欧米化に伴う、脂肪及びコレステロールの摂取量の増加を原因とする非アルコール性脂肪肝の増加が指摘されている。現在では、成人の４人に１人は非アルコール性脂肪肝に罹患しているものと推計されている。
【０００３】
非アルコール性脂肪肝は、肝臓に脂肪が蓄積した状態である単純性脂肪肝、ならびに、肝臓に脂肪が蓄積した脂肪肝の状態からさらに炎症及び線維化が生じた非アルコール性脂肪肝炎に大別される。非アルコール性脂肪肝炎は、さらに肝硬変や肝癌へと進行し得るうえ、メタボリックシンドロームを高頻度に合併し得るので問題視されている。
【０００４】
非アルコール性脂肪肝炎の予防及び治療に有効な化合物として、ビタミンＥ（非特許文献１）、ピルビン酸（特許文献１）クルクミン類（特許文献２）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許公開２０１１−２３６１６０号公報
【特許文献２】特許公開２００７−３２０８６４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，２０１０：３６２：１６７５−１６８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、非アルコール性脂肪肝について確立された治療方法は未だ存在せず、非アルコール性脂肪肝の症状を治療できる医薬品の開発が求められている。
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、非アルコール性脂肪肝を治療するための治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法において用いられるＤＮＡチップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、β−クリプトキサンチンを組成物によれば上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は下記のものを提供する。
【００１０】
（１）  β−クリプトキサンチンを含む、非アルコール性脂肪肝治療用組成物。
【００１１】
（２）  上記非アルコール性脂肪肝が非アルコール性脂肪肝炎である（１）に記載の治療用組成物。
【００１２】
（３）  少なくとも１つの候補物質と、培養肝細胞とを接触させる接触工程と、
上記接触工程の後に、β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を検出する検出工程と、
β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を抑制した候補物質を選択する選択工程と、を含む非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法。
【００１３】
（４）  上記β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子がＣ１ＱＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＹＢＡ、ＣＤ６４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＬＹＺのうちのいずれか１つ以上である（３）に記載のスクリーニング方法。
【００１４】
（５）  上記非アルコール性脂肪肝が非アルコール性脂肪肝炎である（４）に記載のスクリーニング方法。
【００１５】
（６）  Ｃ１ＱＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＹＢＡ、ＣＤ６４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＬＹＺのうちのいずれか２つ以上のＤＮＡを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを備えるＤＮＡチップ。
【００１６】
（７）  配列番号１〜３０記載の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを２種以上備えるＤＮＡチップ。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、非アルコール性脂肪肝を治療するための治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法において用いられるＤＮＡチップが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】β−クリプトキサンチンによる非アルコール性脂肪肝炎の治療効果を示す、マウス肝臓組織の染色結果を示す図である。
【図２】β−クリプトキサンチンによるマウスの脂肪肝炎の治療効果を示す、ＤＮＡチップを用いた評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。
【００２０】
＜非アルコール性脂肪肝を治療するための治療用組成物＞
本発明の治療用組成物は、β−クリプトキサンチンを含む。β−クリプトキサンチンは、ウンシュウミカン等の柑橘類等に多く含まれるカロテノイドであり、プロビタミンＡとしての特性を備えており、抗酸化性、抗癌作用、歯周病の予防及び改善等の作用を有することが知られている（例えば、Ｂｉｏｌ，Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，１９９５：１８（２）：２２７、特許公開２００７−２４６４４８号公報等を参照）。
【００２１】
また、β−クリプトキサンチンの血中濃度と、肝障害マーカーの１つである血中γ−ＧＴＰ濃度との間に負の相関があることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００５）。また、喫煙者における血中β−クリプトキサンチンが酸化ストレスに対する保護効果を有し、メタボリックシンドロームの発症を抑制し得ることが報告されている（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（２００８），１００，１２９７−１３０６）。
【００２２】
しかし、本発明者らの検討による結果、β−クリプトキサンチンは、特定の遺伝子の発現を制御することにより、非アルコール性脂肪肝の治療効果をも有することが実証された。このような治療効果は、β−クリプトキサンチンの血中濃度と、特定の肝障害マーカー及び酸化ストレスとの関連を示唆しているに過ぎない従来の知見からは予測しがたいことである。
【００２３】
なお、本発明において「非アルコール性脂肪肝」とは、単純性脂肪肝又は非アルコール性脂肪肝炎を指す。また、本発明において「治療」とは、非アルコール性脂肪肝の完治や根治だけではなく、非アルコール性脂肪肝の症状の軽減をも指す。
【００２４】
本発明の治療用組成物の形態は特に限定されない。本発明の治療用組成物は、公知の製剤化技術によって所望の剤形（液剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、錠剤等）に調製できる。
【００２５】
本発明の治療用組成物の使用量は特に限定されず、得ようとする治療効果に応じて適宜調整できる。例えば、β−クリプトキサンチンの血中濃度が、１時間〜数日間（例えば、１〜１４日間）にわたって、０．２μｇ／ｍＬ〜２．０μｇ／ｍＬとなるように、単回又は複数回投与してもよい。また、本発明の治療用組成物は経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の投与方法で使用できる。また、本発明の治療用組成物の投与対象は、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ等）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等であってもよい。
【００２６】
本発明の治療用組成物は、脂肪の蓄積を抑制できるだけではなく、線維化や炎症をも抑制できるため、非アルコール性脂肪肝のうち、非アルコール性脂肪肝炎を好ましく治療できる。
【００２７】
非アルコール性脂肪肝の治療効果は、非アルコール性脂肪肝や、該脂肪肝から生じる炎症、線維化において特徴的に発現する遺伝子（後述する）の発現の有無、その発現量、ＡＬＴ（ＧＰＴ）及びＡＳＴ（ＧＯＴ）等の測定結果を確認することで判断できる。また、肝臓組織の染色により、脂肪の蓄積量や、線維化及び／又は炎症の有無を確認することでも判断できる。炎症の有無は、組織中のクッパー細胞及び／又は星細胞等の活性化の有無を確認することで判断できる。
【００２８】
＜スクリーニング方法＞
本発明者は、非アルコール性脂肪肝（高脂肪食や高コレステロール食の摂取によって生じた脂肪肝及び脂肪肝炎等）、及び、本発明の治療用組成物によって非アルコール性脂肪肝が治療された後の肝臓等における遺伝子発現プロファイルを、ＤＮＡマイクロアレイを用いて解析した。その結果、非アルコール性脂肪肝において特徴的に発現する遺伝子を特定した（表１参照）。従って、候補物質による、該遺伝子の発現の有無や発現量を検討し、所望の効果を奏する候補物質を選択することにより、本発明の治療用組成物と同様に非アルコール性脂肪肝を治療できる治療剤の候補物質をスクリーニングできる。
【００２９】
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、少なくとも１つの候補物質と、培養肝細胞とを接触させる接触工程と、上記接触工程の後に、β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を検出する検出工程と、β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を抑制した候補物質を選択する選択工程と、を含む。なお、本発明において、「遺伝子」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡを指すが、ＤＮＡの発現は、ＰＣＲやサザンブロッティング等によって直接的に検出することができる。また、ｍＲＮＡの発現は、逆転写ＰＣＲやノーザンブロッティング等によって直接的に検出することができる。また、ウエスタンブロッティング等によって、ＤＮＡやｍＲＮＡの発現に伴って合成されるタンパク質を検出することで、ＤＮＡやｍＲＮＡの発現を間接的に検出することもできる。また、本発明において遺伝子の発現が「抑制される」とは、β−クリプトキサンチンの投与の有無以外は同一の条件下で遺伝子の発現を比較した場合に、β−クリプトキサンチンを投与した場合における遺伝子の発現量が、β−クリプトキサンチンを投与しない場合における遺伝子の発現量よりも低いことを指す。
【００３０】
接触工程において使用される培養肝細胞は、肝由来の細胞であれば特に限定されないが、マウス初代肝細胞、正常ヒト肝細胞、ＨｅｐＧ２肝細胞、Ｈ４ＩＩＥ肝細胞等が挙げられる。
【００３１】
検出工程における、β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現の有無や発現量は、ＤＮＡマイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色法等公知の方法で特定できる。「β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子」とは、β−クリプトキサンチンと接触した肝細胞内において発現が抑制される遺伝子を指す。具体的に、「β−クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子」としては、表１に記載されたヒトＤＮＡが挙げられる。表１に記載されたヒトＤＮＡのうち、Ｃ１ＱＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＹＢＡ、ＣＤ６４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＬＹＺのうちのいずれか１つ以上は、非アルコール性脂肪肝において特徴的に誘導される遺伝子であり、該遺伝子の発現を抑制する候補物質を探索することにより、本発明の治療用組成物と同様の効果を奏する治療剤の候補物質を効率的にスクリーニングできる点で好ましい。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
また、本発明の治療用組成物と同様に非アルコール性脂肪肝を治療できる候補物質のスクリーニングにおいては、Ｃ１ＱＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＹＢＡ、ＣＤ６４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＬＹＺのうちのいずれか２つ以上の遺伝子を検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを備えるＤＮＡチップを使用できる。また、本発明の治療用組成物と同様に非アルコール性脂肪肝を治療できる候補物質のスクリーニングにおいては、配列番号１〜３０記載の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを２種以上備えるＤＮＡチップを使用できる。さらに、Ｃ１ＱＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＹＢＡ、ＣＤ６４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＬＹＺのうちのいずれか２つ以上の遺伝子や、配列番号１〜３０記載の配列又はその相補配列に対応するタンパク質を検出可能なプロテインチップも使用できる。
【００３４】
本発明のＤＮＡチップやプロテインチップは公知の製造方法によって、基板にオリゴヌクレオチドプローブやタンパク質を配置することで得られ、該ＤＮＡチップ又はプロテインチップによって、候補物質の非アルコール性脂肪肝に対する治療効果を簡便に検討することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
＜実施例１：β−クリプトキサンチンによる非アルコール性脂肪肝炎の治療効果−１＞
（１）高脂肪高コレステロール食によって脂肪肝炎を誘導したマウス（図１中「ＣＬ」）、（２）高脂肪高コレステロール食によって脂肪肝炎を誘導した後に、β−クリプトキサンチンを摂取させたマウス（図１中「ＣＬ＋ＣＸ」）のそれぞれの肝臓組織の染色を行った。なお、（２）のマウスには、β−クリプトキサンチン量が０．００３質量％である試料を８４日間にわたって摂食させた。
【００３７】
なお、本試験において行った染色は下記の通りである。
（Ａ）Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｅｏｓｉｎ染色（図１中「Ｈ＆Ｅ」）：該染色により、細胞核、細胞質等が染色される。脂肪は染色されず、白い部分として残る。
（Ｂ）Ａｚａｎ染色（図１中「Ａｚａｎ」）：該染色により、線維化された部分が染色される。
（Ｃ）Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色（図１中「Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ」）：該染色により、線維化された部分が染色される。
（Ｄ）αＳＭＡ染色（図１中「αＳＭＡ」）：該染色により、活性化された星細胞を染色する。星細胞の活性化は、肝臓中に炎症反応が生じさせ、コラーゲンの過剰産生をもたらして肝臓中に沈着させる。
（Ｅ）Ｆ４／８０染色（図１中「Ｆ４／８０」）：該染色により、活性化されたクッパー細胞を染色する。クッパー細胞の活性化は、肝臓中に炎症反応が生じていることを示す。
【００３８】
図１に示される通り、β−クリプトキサンチンは、肝臓の脂肪化を抑制した（Ａ）。また、β−クリプトキサンチンは、線維化を抑制した（Ｂ、Ｃ）。また、β−クリプトキサンチンは、炎症を抑制した（Ｄ、Ｅ）。
【００３９】
＜実施例２：β−クリプトキサンチンによる非アルコール性脂肪肝炎の治療効果−２＞
（１）正常肝を有するマウス（図２中「コントロール」）、（２）高脂肪高コレステロール食によって脂肪肝炎を誘導したマウス（図２中「脂肪肝炎」）、（３）高脂肪高コレステロール食によって脂肪肝炎を誘導した後に、β−クリプトキサンチンを摂取させたマウス（図２中「脂肪肝炎＋β−クリプトキサンチン」）のそれぞれの肝臓組織中の遺伝子発現を、ＤＮＡチップを用いて検討した。なお、（３）のマウスには、β−クリプトキサンチン量が０．００３質量％である試料を８４日間にわたって摂食させた。
【００４０】
各遺伝子の発言量を蛍光強度の相対値として示した結果を図２に示す。なお、本試験で用いたＤＮＡチップによって検出した遺伝子は図２の横軸に示される。
【００４１】
なお、図２中のマウス遺伝子記号について、「Ｃｃｌ６」、「Ｈ２−ａａ」、「Ｈ２−ａｂ１」、「Ｈ２−ｅｂ１」、「Ｌｙｚ２」は、それぞれ、表１中のヒト遺伝子記号「ＣＣＬ１５又はＣＣＬ２３」、「ＨＬＡ−ＤＱＡ１又はＨＬＡ−ＤＱＡ２」、「ＨＬＡ−ＤＱＢ１又はＨＬＡ−ＤＱＢ２」、「ＨＬＡ−ＤＲＢ１又はＨＬＡ−ＤＲＢ５」、「ＬＹＺ」に対応する。
【００４２】
図２に示される通り、脂肪肝炎において特徴的に誘導される遺伝子の発現が、β−クリプトキサンチンの摂取によって低減されていた。脂肪肝炎において特徴的に誘導される遺伝子のうち、特に、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ５２、Ｃｄ６８、Ｃｄ７４、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｙｂａ、Ｃｄ６４、Ｈ２−ａａ（ＨＬＡ−ＤＱＡ１又はＨＬＡ−ＤＱＡ２）、Ｈ２−ａｂ１（ＨＬＡ−ＤＱＢ１又はＨＬＡ−ＤＱＢ２）、Ｈ２−ｅｂ１（ＨＬＡ−ＤＲＢ１又はＨＬＡ−ＤＲＢ５）、Ｌｙｚ２（ＬＹＺ）の発現が、β−クリプトキサンチンの摂取によって低減されていた。
【図２】
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【図１】
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【配列表】
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