(57)【要約】【課題】難治性神経変性疾患の検査診断並びに治療に利用することができるバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを提供する。【解決手段】本発明で特定したｍｉＲＮＡを測定することにより、難治性神経変性疾患、特に多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病を検出することができる。また、本発明におけるｍｉＲＮＡを同疾患の検査診断並び治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、神経変性疾患の検出方法。
【請求項２】
神経変性疾患が、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病のうち、いずれか１つである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、多系統萎縮症の検出方法。
【請求項４】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。
【請求項５】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、アルツハイマー病の検出方法。
【請求項６】
神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、前記治療効果の判定方法。
【請求項７】
表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つの全長あるいは一部を有効成分とする医薬組成物。
【請求項８】
表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物。
【請求項９】
表１〜表３に記載したｍｉＲＮＡの少なくとも１つの発現を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
表１〜表３に記載したｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子産物を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患の存在を検出するための検査診断および同疾患の治療標的として有用なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症を含む神経変性疾患は、一般に進行性であり、脳神経細胞の不可逆的な変性を伴うことから、早期に診断し治療を開始することが重要である。しかし、現時点では有効なバイオマーカーが確立されておらず、血清学的検査方法を用いた診断法は確立されておらず、また確実な治療法も確立されていない。その結果、難治性で、日常生活が破壊される状況となり、患者本人の肉体的負担のみならず、家族にも多大の負担を来している。神経変性疾患は患者本人だけでなく、介護者にも多大な負担が及び、社会全体の活力の大きな損失につながるという実態がある。超高齢化社会が進む我が国では、神経変性疾患対策が国家的な重要課題となってきている。すなわち、（１）高齢化社会における医療福祉行政の基幹的課題であること、（２）認知症による膨大な経済的損失（年間５兆円相当）を軽減すること、（３）医療イノベーションで日本発の革新的治療法の開発を推進し、日本の医薬品輸入赤字（２兆円超）を解消すること、（４）国の5ヵ年計画（2012）で対策が必要な重点疾患（がん、難病・希少疾病、肝炎、感染症、糖尿病、脳心血管疾患、精神神経疾患、小児疾患）に指定されていること、などである。このように、新たなバイオマーカーの開発、検査診断薬の開発、治療薬・治療法の開発が緊急の課題となっている。
【０００３】
検査診断法については、疾患関連バイオマーカーが特定され、血清学的診断法により簡便に早期の診断及び病態のモニタリングが実施できるようになれば、早期治療が可能となり、多くの患者の不可逆的なダメージを最小限に抑えることが可能となる。早期診断が可能となれば、患者だけでなく介護者のＱＯＬの向上、ひいては超高齢化を迎えた日本社会全体の活力の維持にも大きく貢献することは間違いない。治療法に関しては、病態改善薬のみならず、進行抑制薬も十分に医療上の意義が高く、そのためのバイオマーカーの神経機能への関与の解析も重要である。
【０００４】
神経変性疾患の発症や病態に関わる生体内因子は、遺伝子から細胞まで広く研究されているが、未解明な部分が非常に多く、未だに診断や治療につながる有用なバイオマーカーは見出されていない。難治性神経変性疾患のうちでも、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis：ＡＬＳ）と多系統萎縮症（Multiple System Atrophy：ＭＳＡ）は重篤な神経機能障害と死に至る疾患であり、またアルツハイマー病（Alzheimer’s Disease:ＡＤ）は深刻な認知障害を伴う疾患であり、有用なバイオマーカーの開発は緊急の課題となっている。
【０００５】
近年、生体内因子の重要な因子として、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略す）が注目されている。ｍｉＲＮＡは、約２２塩基の蛋白質非翻訳ＲＮＡ（small non-coding RNA）であり、ヒトには約１０００種類以上存在することが示唆されている。ｍｉＲＮＡは生体内でさまざまな遺伝子の発現抑制を行う分子として注目されている。ゲノム上には各ｍｉＲＮＡ遺伝子の領域が存在し、ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写され、約数百塩基のｍｉＲＮＡ初期転写産物が形成される。ｍｉＲＮＡ初期転写産物は核内でＤｒｏｓｈａ、細胞質内でＤｉｃｅｒと呼ばれる２種類のＲＮａｓｅ III酵素によってプロセシングされ、成熟ｍｉＲＮＡが形成される。成熟ｍｉＲＮＡは制御タンパク質複合体（RNA-induced silencing complex：ＲＩＳＣ）と協調しつつ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相互作用し、遺伝子の発現を抑制することが知られている。
【０００６】
ｍｉＲＮＡはヒト疾患に広く関連が示唆されているが、特にがんとｍｉＲＮＡの関係に関して、様々な臓器において正常組織とがん組織で多くのｍｉＲＮＡの発現様式が異なる事から、発がん過程へのｍｉＲＮＡ発現異常の関与が強く示唆されている。すなわち、腫瘍抑制的ｍｉＲＮＡの発現低下あるいは発がん促進的ｍｉＲＮＡの発現上昇がヒト発がん過程に関与している可能性が強く示唆されている（非特許文献１）。ｍｉＲＮＡの産業上の利用に関しても、もっぱらがんの領域での利用が主体であるが、ようやく各種疾患に対する創薬への利用が報告され始めてきた（非特許文献２）。
血中に存在するｍｉＲＮＡを疾患関連バイオマーカーとして、検査診断に利用できることも、がん（非特許文献３）や心疾患（非特許文献４）で報告されている。
神経疾患分野においては、血液よりも、中枢神経系の脳脊髄液（cerebrospinal fluid:ＣＳＦ）に存在するｍｉＲＮＡが診断学的な意味があることが報告され、たとえば、多発性硬化症（multiple sclerosis:ＭＳ）では、miR-922、miR-181c、miR-633などがその候補として報告されている（非特許文献５）。また一方で、損傷後の神経の再生にｍｉＲＮＡを利用する方法（特許文献１）や多能性ストローマ細胞のニューロン分化を刺激する方法（特許文献２）が報告されている。
【０００７】
神経変性疾患の病理は、神経細胞の委縮・脱落や組織破壊、脱髄、再生など多彩であり、特に多くのｍｉＲＮＡの関与が想定される。また、神経細胞変性という共通の現象では、各種神経変性疾患で共通的なｍｉＲＮＡの関与も想定される。
検査試料としては、ＣＳＦよりは血漿が、採取時の患者負荷も少なく簡便で利用性が高い。加えて、臨床検査が最終的な診断の補助的役割を果たすことからは、神経変性疾患に共通性の高いバイオマーカーを血液検査で検出することが、極めて実用性が高いと考えられる。ただし、この場合でも、神経変性疾患である以上、血液とＣＳＦとの整合性のあることが望ましい。
しかしながら、従来、血液検査で共通的に一次スクリーニングに適した神経変性疾患関連バイオマーカーという観点からのｍｉＲＮＡの探索はほとんど行われていない。特に進行性疾患で早期の診断が重要である、ＭＳＡ、ＡＬＳ、ＡＤなどの疾患では、血液検査でも利用でき、神経変性の兆候をいち早く検出できる簡便な、ｍｉＲＮＡを利用した検査診断あるいは創薬に有用な疾患バイオマーカーの開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表2011-515407号公報
【特許文献２】特表2012-530054号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】microRNAの制御異常と癌、実験医学  vol.27, No.8, 2009.
【非特許文献２】臨床・創薬利用が見えてきたmicroRNA、遺伝子医学MOOK23  2012.
【非特許文献３】Allegra A et al., Int J Oncol. 2012;41(6):1897-912.
【非特許文献４】Fichtlscherer S. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(11):2383-90.
【非特許文献５】Haghikia A. et al., Neurology. 2012;79(22):2166-2170.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のとおり、難治性のＡＬＳ、ＭＳＡ、ＡＤに対する検査法や治療法は確立しておらず、医療上の大きな課題になっている。疾患に関与すると言われているｍｉＲＮＡの神経変性疾患におけるバイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡを見出し、その利用方法を確立すれば、新しい検査診断法、病態モニタリング法、さらには治療薬への応用が可能となる。
本発明の目的は、神経変性疾患の検査と治療に対するｍｉＲＮＡの利用であり、特にＡＬＳ、ＭＳＡ、ＡＤを含む神経変性疾患に共通的あるいは個別的なバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを臨床検査や病態モニタリング、さらには治療法へ応用することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の発明に関する：
［１］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、神経変性疾患の検出方法。
［２］神経変性疾患が、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病のうち、いずれか１つである、［１］の検出方法。
［３］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、多系統萎縮症の検出方法。
［４］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。
［５］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、アルツハイマー病の検出方法。
［６］神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、前記治療効果の判定方法。
［７］表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つの全長あるいは一部を有効成分とする医薬組成物。
［８］表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物。
［９］表１〜表３に記載したｍｉＲＮＡの少なくとも１つの発現を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
［１０］表１〜表３に記載したｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子産物を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の検出方法によれば、簡便な遺伝子検査方法により、神経変性疾患、特にＭＳＡ、ＡＬＳあるいはＡＤ含む神経変性疾患を検出することができる。また、本発明におけるｍｉＲＮＡを同疾患の検査診断並び治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＭＳＡ患者の血漿とＣＳＦで変動したｍｉＲＮＡ群（２０５種類）に関して、Ｘ軸方向に、ＣＳＦ由来ｍｉＲＮＡの変動率が増大から減少の順で配列し、ＣＳＦ由来ｍｉＲＮＡの変動率（×印）と血漿由来ｍｉＲＮＡの変動率（□印）をプロットしたグラフである。
【図２】図２は、ＡＬＳ患者の血漿とＣＳＦで変動したｍｉＲＮＡ群（２０６種類）に関して、Ｘ軸方向に、ＣＳＦ由来ｍｉＲＮＡの変動率が増大から減少の順で配列し、ＣＳＦ由来ｍｉＲＮＡの変動率（×印）と血漿由来ｍｉＲＮＡの変動率（□印）をプロットしたグラフである。
【図３】図３は、ＡＤ患者の血漿とＣＳＦで変動したｍｉＲＮＡ群（３２５種類）に関して、Ｘ軸方向に、ＣＳＦ由来ｍｉＲＮＡの変動率が増大から減少の順で配列し、ＣＳＦ由来ｍｉＲＮＡの変動率（×印）と血漿由来ｍｉＲＮＡの変動率（□印）をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に特に記載すること以外は、本発明の検出方法・治療効果判定方法・治療方法・医薬組成物・治療薬のスクリーニング方法において、適宜、相互に参照することができる。
本発明の検出方法では、神経変性疾患、特にはＭＳＡ又はＡＬＳあるいはＡＤを検出する共通的あるいは個別的バイオマーカーとして、表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡを使用することができる。表１〜表３において、ｍｉＲＮＡの変動は、各疾患で健常対照に比べて増大している場合には「増」、減少している場合は「減」と表した。また、複数の神経変性疾患に共通的に検出されたｍｉＲＮＡは「共通」に丸印を付記して示したが、これらは好ましく神経変性疾患の一次スクリーニングに用いることができる。複数の疾患で共通性が高い方が好ましく、少なくとも２つの疾患、好ましくは３つの疾患、更に好ましくは４つの疾患で共通であることが挙げられる。
該ｍｉＲＮＡは、単独の使用も、複数の使用も、いずれも可能である。精度を高めるためには、複数を組み合わせて使用する方が好ましく、具体的には、ｍｉＲＮＡを１〜２０、好ましくは３〜１０を組み合わせて利用することが望ましい。また、公知のｍｉＲＮＡを組み合わせて利用することもできる。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【表２】
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【００１７】
【表３】
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【００１８】
後述の実施例において具体的実験データが示すとおり、血漿とＣＳＦにおいて、ＭＳＡ患者では健常者と比較して表１のｍｉＲＮＡがＣＳＦ及び血漿中で変動し、ＡＬＳ患者では健常者と比較して表２のｍｉＲＮＡが変動し、他方、ＡＤ患者では健常者と比較して表３のｍｉＲＮＡが変動していた。従って、被験者、特に、神経変性疾患が疑われる患者又は神経変性疾患患者から採取した体液である、リンパ液、唾液、涙液、鼻汁、尿等の試料中でも、これらのｍｉＲＮＡ（以下、検出用ｍｉＲＮＡと称する）の少なくとも１つを、それ自体公知の方法に従って測定することにより、神経変性疾患であるか否か、あるいはＭＳＡ、ＡＬＳ又はＡＤであるか否かを判定することができる。
【００１９】
また、減少したｍｉＲＮＡの全部または一部を医薬組成物として投与し、ｍｉＲＮＡを補充すること、あるいは増大したｍｉＲＮＡを減少させる作用の有するオリゴヌクレオチド類の核酸医薬を投与して過剰なｍｉＲＮＡの作用を抑制することは、いずれもＭＳＡ、ＡＬＳ、ＡＤを含む神経変性疾患の治療に有用な薬剤を提供することができる。
【００２０】
存在が増大しているｍｉＲＮＡの場合は、その変動率（Fold change）が高い傾向にある。よって、変動率（Ｌｏｇ２表記）が＋０．１以上、好ましくは＋０．５以上のｍｉＲＮＡを神経変性疾患バイオマーカーとして使用することができる。他方、存在が減少しているｍｉＲＮＡの場合は、その変動率（Fold change）が低い傾向にある。よって、変動率（Ｌｏｇ２表記）が−０．１以下、好ましくは−０．５以下のｍｉＲＮＡを神経変性疾患バイオマーカーとして使用することができる。ただし、変動率は測定条件によって変化する場合があるので、変動率の基準値によらず、変動幅の大きい順からバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを選定することもできる。表１〜表３のｍｉＲＮＡの配列は公知のデータベース（miRBase：http://www.mirbase.org/）から入手することができる。
【００２１】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子のｍＲＮＡを使用する場合、それ自体公知の遺伝子検査方法、例えば、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法や、ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ法により、測定することができる。
また、本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡの標的遺伝子がコードするポリペプチドを使用する場合、それ自体公知のタンパク質分析方法、例えば、抗体を用いる免疫学的分析方法、電気泳動等の生化学的分析方法や質量分析方法により実施することができ、臨床検査用の自動分析機を使用することもできる。
【００２２】
本発明方法で用いる試料としては、例えば、脳疾患部位、脳脊髄液、血液試料（例えば、末梢血、血漿、血清）、唾液、涙液、鼻汁、尿、リンパ液、その他の体液、好ましくは、脳疾患部位やその周辺部位（脳脊髄液等）を用いることができる。さらには生検で採取された臓器組織、病理組織、細胞、又はそれらからの抽出成分も利用できる。
【００２３】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡは、神経変性疾患、特にはＭＳＡ、ＡＬＳ又はＡＤの患者に対して行う各種治療の効果を判定するために使用することもできる。
本発明の治療効果判定方法は、神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含む。
【００２４】
本発明の治療効果判定方法において、ＭＳＡ患者に対する治療効果を判定する場合には、表１に記載のＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡを使用することができる。
表１に記載のＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡ（ＭＳＡ患者において存在率が増加しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＭＳＡ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。また、表１に記載のＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡ（ＭＳＡ患者において存在率が減少しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＭＳＡ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。
【００２５】
本発明の治療効果判定方法において、ＡＬＳ患者に対する治療効果を判定する場合には、表２に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡを使用することができる。
表２に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡ（ＡＬＳ患者において存在率が増加しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。また、表２に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡ（ＡＬＳ患者において存在率が減少しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。
【００２６】
表３に記載のＡＤ検出用ｍｉＲＮＡ（ＡＤ患者において存在率が増加しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＤ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。また、表３に記載のＡＤ検出用ｍｉＲＮＡ（ＡＤ患者において存在率が減少しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＤ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。
【００２７】
本発明の治療方法では、神経変性疾患、特にはＭＳＡ、ＡＬＳ又はＡＤで存在率が減少している、それぞれ表１、表２又は表３で変動が「減」と表記されているｍｉＲＮＡの全長又は一部を血中あるいはＣＳＦ中に補充することで、神経変性疾患を治療することができる。他方、それぞれ表１、表２又は表３で変動が「増」と表記されているｍｉＲＮＡの全長又は一部に対しては、増加しているｍｉＲＮＡを患者体内において抑制することにより、神経変性疾患を治療することができる。生体内のｍｉＲＮＡを抑制する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、例えば、対象ｍｉＲＮＡの全長または一部とハイブリダイズ可能な相補的配列を含むオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を投与することによって行うことができる。
【００２８】
上記の、ｍｉＲＮＡあるいは抑制性オリゴヌクレオチドを患者に投与する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、ｍｉＲＮＡ又はその誘導体を、エキソソームを模倣したリポソームに封入する方法、コラーゲンとの複合体として徐放化させる方法、ＲＮＡの糖部分のＯ(酸素) をＳ (硫黄) で置き換えた４’−チオＲＮＡ化による化学修飾体の利用、オリゴヌクレオチドの糖の部分を２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルに修飾した化学修飾体の利用、などで生体内において安定的に補充することができる。同時に、ｍｉＲＮＡは複数分子で標的遺伝子を制御する可能性が高いため、上記の核酸補充法に関しても、複数の核酸カクテルによる補充を好んで用いることができる。これらは、本発明における医薬組成物である。
なお、本明細書において、用語「治療」には、疾患発症後の患者を処置する狭義の「治療」と、疾患発症前の患者を処置する「予防」が含まれる。
【００２９】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡは、神経変性疾患、特にはＭＳＡ、ＡＬＳ又はＡＤを含む神経変性疾患の治療薬をスクリーニングするために使用することができる。
本発明において、ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の遺伝子産物を標的とする候補物質（例えば化合物）をスクリーニングする方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、直接標的に結合する候補物質を分光学的な変化で調べる方法や培養細胞に候補物質を暴露させて培養細胞中の標的（ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の遺伝子産物）の発現を調べる方法などが適用され、さらにｉｎ  ｖｉｖｏでは、モデル動物にて神経変性症状または神経変性病理像の改善を指標とした方法などが適用される。
また、本発明のスクリーニング方法のうち、表１〜表３に記載のｍｉＲＮＡの発現を指標とする態様では、例えば、候補物質を培養細胞、組織、又は動物個体（特には、非ヒト動物）に投与する工程、前記個体から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含む方法により、実施することができる。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法で評価する候補物質は、特に限定されるものではないが、各種化合物に加え、各種抽出物、例えば、微生物の培養上清、各種生物若しくはその組織由来の天然成分若しくは抽出物を挙げることができる。また、使用する細胞は、組織から分離された培養細胞、樹立された培養細胞株、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが、非ヒト動物においては、特定遺伝子のノックアウトあるいはノックインの処理を施したモデルマウス、モデルラットなどを挙げることができる。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法において、表１〜表３で変動が「減」と表記されているｍｉＲＮＡの少なくとも１つを測定する場合、そのｍｉＲＮＡ量を増加させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。他方、表１〜表３で変動が「増」と表記されているｍｉＲＮＡの少なくとも１つを測定する場合、そのｍｉＲＮＡ量を減少させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
《実施例１：ＭＳＡ、ＡＬＳ及びＡＤの患者の血漿と脳脊髄液中のｍｉＲＮＡの分析》
確定診断された多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者、確定診断された筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者、確定診断されたアルツハイマー病（ＡＤ）患者、並びに健常者から、末梢血並びに脳脊髄液（ＣＳＦ）を、本人の同意の下に採取した。本試験に参加された被験者の内訳は表４のとおりであった。性別カラムのＭは男性、Ｆは女性の例数を示す。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
採血は被験者の上腕静脈から２０ｍＬの末梢血を採取し、速やかに４℃、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心処理し、上清を０．６ｍＬずつポリプロピレンチューブに分注して−８０℃で凍結保存した。
【００３６】
ＣＳＦは、被験者に対して腰椎穿刺を行い約３ｍＬを採取した。採取後、速やかに４℃、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心処理し、上清（血漿）を０．６ｍＬずつポリプロピレンチューブに分注して−８０℃で凍結保存した。凍結保存した各群３例から、それぞれＲＮＡ抽出後、マイクロアレイによるｍｉＲＮＡ分析を行った。
マイクロアレイは３Ｄ-ｇｅｎｅチップ（東レ（株）製）を用い、メーカー指定のｍｉＲＮＡ抽出液並びにハイブリダイゼーション試薬セットとHuman miRNA Oligo chip（データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約１８００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載）で行い、プローブに結合したｍｉＲＮＡのシグナル値を標準化（global normalization）して用いた。健常対照群に対する患者群のシグナル強度の変化を変動率（Fold change）として求め、変動率はLｏｇ２表記で表した。
Lｏｇ２表記の変動率で「0.1以上」を「増大したｍｉＲＮＡ（upregulated miRNA）」、「-0.1以下」を「減少したｍｉＲＮＡ（downregulated miRNA）」と規定した。
【００３７】
ＣＳＦから得られたｍｉＲＮＡは、中枢神経系の病態情報を反映し、他方、血漿中のｍｉＲＮＡは全身状態のｍｉＲＮＡを反映していると考えられる。全身状態としては、中枢神経系のみならず、循環器系や免疫系の影響も大きいと考えられ、中枢神経系の整合性がどこまででているかが、神経変性疾患関連バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡ選定の重要な鍵となる。
【００３８】
これを検討するために、ＣＳＦと血漿から得られたｍｉＲＮＡのプロファイルを調べた。図１は、ＭＳＡ患者の場合、図２はＡＬＳ患者の場合、図３はＡＤ患者の場合である。ＣＳＦにおけるｍｉＲＮＡの変動を軸としてプロットすると、血漿中のｍｉＲＮＡのプロファイルはＣＳＦ中のｍｉＲＮＡプロファイルと必ずしも全体としては一致せず、一部のｍｉＲＮＡがＣＳＦと血漿とで変動が一致すると読み取ることができる。
それゆえ、各図から、変動の整合性が得られたｍｉＲＮＡを表１〜表３に抽出してまとめた。表１はＭＳＡ患者の血漿とＣＳＦで共通して変動したｍｉＲＮＡ群、表２はＡＬＳ患者の血漿とＣＳＦで共通して変動したｍｉＲＮＡ群、表３はＡＤ患者の血漿とＣＳＦで共通して変動したｍｉＲＮＡ群である。
各表には、ｍｉＲＮＡ名、血漿（Ｐｌａｓｍａ）と脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるシグナル値、変動率（ＦＣ＝Fold change）、変動の程度（「増」は増大、「減」は減少）、さらに、後述するＭＳも含む複数の疾患で共通して検出され、神経変性疾患に一般的な検査用に好適な分子を「共通」で示した。「共通」以外のｍｉＲＮＡは、それぞれ疾患個別的を検出するためのバイオマーカーとして利用できる。
さらに、これらのｍｉＲＮＡ群は、それぞれの疾患の検査診断バイオマーカーあるいは治療のためのｍｉＲＮＡ情報として利用することができる。
なお、本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、先述したとおり、データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約１８００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載した市販の３Ｄ-ｇｅｎｅチップ（東レ（株）製）を使用したため、データベースmiRBase Release17.0に基づいた名称（ID）を使用している。本明細書に記載したｍｉＲＮＡの名称と、データベースmiRBase（http://www.mirbase.org/）におけるAccession No.を表５〜表７に示す。
【００３９】
【表５】
2014132863.tif 000006
【００４０】
【表６】
2014132863.tif 000007
【００４１】
【表７】
2014132863.tif 000008
【００４２】
《実施例２：多発性硬化症（ＭＳ）患者の血漿と脳脊髄液中のｍｉＲＮＡの分析》
多発性硬化症multiple sclerosis（ＭＳ）は中枢神経系の慢性炎症性脱髄疾患であり、時間的・空間的に病変が多発するのが特徴である。ＭＳの原因はいまだ明らかでないが、病巣にはリンパ球やマクロファージの浸潤があり、自己免疫機序を介した炎症により、最終的に中枢神経系ミエリン構成蛋白に対する自己免疫状態を惹起して。脱髄が起こると考えられる。したがって、ＭＳは神経変性疾患ではあるが、自己免疫疾患でもあり、小脳の変性・萎縮を伴うＭＳＡ、運動ニューロンの変性・消失と伴うＡＬＳ、アミロイドβの沈着と脳萎縮を伴うＡＤなどの神経変性機序とは異なると考えられている。それゆえ、炎症と免疫が大きく関与するＭＳでは、疾患バイオマーカーｍｉＲＮＡは、ＭＳＡ、ＡＬＳ、ＡＤなどとは異なる可能性が高いが、神経細胞の変性・破壊、新生、再構成という神経組織のリモデリングに関する部分は共通している可能性がある。
以上の理由から、神経変性に共通的なｍｉＲＮＡを抽出するために、ＭＳ患者のＣＳＦと血漿のｍｉＲＮＡを調べた。
【００４３】
被験者は、確定診断されたＭＳ患者６例（３Ｍ+３Ｆ、32.7±4.03歳）及び健常対照者６例（血漿採取者：３Ｍ+３Ｆ、41.0±12.6歳、ＣＳＦ採取者：３Ｍ+３Ｆ、60.6±1.8）で、末梢血並びに脳脊髄液（ＣＳＦ）を、本人の同意の下に採取した。ｍｉＲＮＡの抽出・分析方法は、実施例１と同一である。
その結果、疾患の違いによる増減の変化は一部に観察されるものの、表８に示したように、ＭＳＡ、ＡＬＳ及びＡＤの患者で変動していたｍｉＲＮＡがＭＳ患者でも同様に検出され、これらが神経変性疾患に共通的なｍｉＲＮＡであることが示された。
また、表９にｍｉＲＮＡ毎に各疾患の共通性をまとめた。hsa-miR-1280は、４つの疾患全てで共通に変動が認められた。表中の血漿とCSFの数値は、マイクロアレイ測定時のシグナル値（発現強度）を示す。
【００４４】
本発明者らの現時点での考えは、一部でＭＳＡ、ＡＬＳ、ＡＤ、ＭＳの各疾患の共通的ｍｉＲＮＡの間で、異なる変動（「増」と「減」が逆となる変動）が発現する場合があるが、これは疾患の病理機序によるものである。すなわち、ＭＳＡ、ＡＬＳ、ＡＤは神経細胞変性が主たる病理像であるが、ＭＳは神経線維の脱髄が主たる病理像で、炎症と免疫反応が強いのが特徴ある。これによって、ＭＳＡ、ＡＬＳ、ＡＤにおけるｍｉＲＮＡの挙動とＭＳのｍｉＲＮＡの挙動では、当該病理機序の影響を受けて、ｍｉＲＮＡの挙動が異なることにつながると考えられる。しかしながら、本発明における表１〜表３に示したｍｉＲＮＡは神経組織に関与し、神経病理に鋭敏な特徴を有する共通的なｍｉＲＮＡであり、各疾患毎に変動の傾向を規定することにより、神経変性疾患関連バイオマーカーとしての有用性は高いといえる。
【００４５】
【表８】
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【００４６】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、神経変性疾患、特にＭＳＡ、ＡＬＳあるいはＡＤ含む神経変性疾患の検査診断並びに治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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