(57)【要約】      （修正有）【課題】心血管疾患、癌、神経系疾患、筋疾患、筋ジストロフィー、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、目及び耳の疾患、糖尿病、統合失調症及びアルツハイマー病などの疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための、細胞増殖、分化及び生存を含む複数の細胞機能で重要な役割を果たすニューレグリンの徐放方法の提供。【解決手段】哺乳動物へのニューレグリンの徐放が下記の１〜４のいずれかの方法で行う。１．ニューレグリンの徐放が浸透ポンプ又はシリンジポンプの使用、２．ニューレグリンにポリ(エチレングリコール)誘導体を結合するとともにリポソームの使用、３．リポソームの使用、４．マイクロスフェアの使用【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための方法であって、哺乳動物へ
のニューレグリンの徐放を含む、前記方法。
【請求項２】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でERKシグナル伝達経路の持続的活性
化を誘導する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でAKTシグナル伝達経路の持続的活性
化を誘導する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が心不全である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のEF値を高める、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のFS値を高める、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が心肥大を予防する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が浸透ポンプ又はシリンジポンプの使用によっ
て達成される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がポリマーをニューレグリンに結合することに
よって達成される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)誘導体である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がリポソームの使用によって達成される、請求
項1記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がマイクロスフェアの使用によって達成される
、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
心臓でAKTシグナル伝達経路を活性化する方法であって、哺乳動物へのニューレグリン
の徐放を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でERKシグナル伝達経路の持続的活性
化も誘導する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のEF値を高める、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のFS値を高める、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が心肥大を予防する、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が浸透ポンプ又はシリンジポンプの使用によっ
て達成される、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がポリマーをニューレグリンに結合することに
よって達成される、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)誘導体である、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がリポソームの使用によって達成される、請求
項14記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がマイクロスフェアの使用によって達成される
、請求項14記載の方法。
【請求項２５】
心臓でERKシグナル伝達経路を活性化する方法であって、哺乳動物へのニューレグリン
の徐放を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でAKTシグナル伝達経路の持続的活性
化も誘導する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のEF値を高める、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のFS値を高める、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が心肥大を予防する、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が浸透ポンプ又はシリンジポンプの使用によっ
て達成される、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がポリマーをニューレグリンに結合することに
よって達成される、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)誘導体である、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がリポソームの使用によって達成される、請求
項25記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がマイクロスフェアの使用によって達成される
、請求項25記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物のEF値を高める方法であって、哺乳動物へのNRGの徐放を含む、前記方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でERKシグナル伝達経路の持続的活性
化を誘導する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でAKTシグナル伝達経路の持続的活性
化を誘導する、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のFS値を高める、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が心肥大を予防する、請求項36記載の方法。
【請求項４１】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が浸透ポンプ又はシリンジポンプの使用によっ
て達成される、請求項36記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がポリマーをニューレグリンに結合することに
よって達成される、請求項36記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)誘導体である、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がリポソームの使用によって達成される、請求
項36記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がマイクロスフェアの使用によって達成される
、請求項36記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物のFS値を高める方法であって、哺乳動物へのNRGの徐放を含む、前記方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でERKシグナル伝達経路の持続的活性
化を誘導する、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でAKTシグナル伝達経路の持続的活性
化を誘導する、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のEF値を高める、請求項47記載の方法。
【請求項５１】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が心肥大を予防する、請求項47記載の方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が浸透ポンプ又はシリンジポンプの使用によっ
て達成される、請求項47記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がポリマーをニューレグリンに結合することに
よって達成される、請求項47記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)誘導体である、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がリポソームの使用によって達成される、請求
項47記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がマイクロスフェアの使用によって達成される
、請求項47記載の方法。
【請求項５８】
心肥大を予防する方法であって、哺乳動物への一定低用量NRGの不断の徐放を含む、前
記方法。
【請求項５９】
前記哺乳動物への一定低用量ニューレグリンの徐放が心細胞でERKシグナル伝達経路の
持続的活性化を誘導する、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物への一定低用量ニューレグリンの徐放が心細胞でAKTシグナル伝達経路の
持続的活性化を誘導する、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物への一定低用量NRGの徐放が前記哺乳動物のFS値を高める、請求項58記載
の方法。
【請求項６２】
前記哺乳動物への一定低用量NRGの徐放が前記哺乳動物のEF値を高める、請求項58記載
の方法。
【請求項６３】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が浸透ポンプ又はシリンジポンプの使用によっ
て達成される、請求項58記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がポリマーをニューレグリンに結合することに
よって達成される、請求項58記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)である、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)誘導体である、請求項64記載の方法。
【請求項６７】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がリポソームの使用によって達成される、請求
項58記載の方法。
【請求項６８】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がマイクロスフェアの使用によって達成される
、請求項58記載の方法。
【請求項６９】
心筋細胞の増殖及び分化を引き起こす方法であって、哺乳動物に一定低用量ニューレグ
リンを徐放し、それにより心細胞でMAPキナーゼ経路を活性化し、かつ心筋細胞の増殖及
び/又は分化を引き起こすことを含む、前記方法。
【請求項７０】
心筋細胞の増殖及び分化を引き起こす方法であって、哺乳動物に一定低用量ニューレグ
リンを徐放し、それにより心細胞でERK経路を活性化し、かつ心筋細胞の増殖及び分化を
引き起こすことを含む、前記方法。
【請求項７１】
心筋細胞の増殖及び分化を引き起こす方法であって、哺乳動物に一定低用量ニューレグ
リンを徐放し、それにより心細胞でAKT経路を活性化し、かつ心筋細胞の増殖及び分化を
引き起こすことを含む、前記方法。
【請求項７２】
左心室の内径を低減させるための方法であって、哺乳動物へのニューレグリンの徐放を
含む、前記方法。
【請求項７３】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でERKシグナル伝達経路の持続的活性
化を誘導する、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が心細胞でAKTシグナル伝達経路の持続的活性
化を誘導する、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のEF値を高める、請求項72記載の方法。
【請求項７６】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のFS値を高める、請求項72記載の方法。
【請求項７７】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が心肥大を予防する、請求項72記載の方法。
【請求項７８】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放が浸透ポンプ又はシリンジポンプの使用によっ
て達成される、請求項72記載の方法。
【請求項７９】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がポリマーをニューレグリンに結合することに
よって達成される、請求項72記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)である、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
前記ポリマーがポリ(エチレングリコール)誘導体である、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がリポソームの使用によって達成される、請求
項72記載の方法。
【請求項８３】
前記哺乳動物へのニューレグリンの徐放がマイクロスフェアの使用によって達成される
、請求項72記載の方法。
【請求項８４】
前記疾患又は障害が心血管疾患、癌、神経系疾患、筋疾患、筋ジストロフィー(例えば
デュシェンヌ、肢帯)、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、目及び耳の疾患、糖尿病、統合
失調症及びアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８５】
前記ニューレグリンがNRG1、NRG2、NRG3及びNRG4を含む群から選択される、請求項1記
載の方法。
【請求項８６】
前記ニューレグリンが上皮成長因子様(EGF様)ドメインを含み、前記EGF様ドメインがニ
ューレグリン1遺伝子によってコードされる、請求項1記載の方法。
【請求項８７】
ニューレグリンの前記徐放が1日に1分間から24時間のニューレグリンの連続的注射又は
注入を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８８】
ニューレグリンの前記徐放が1日に4時間以上のニューレグリンの連続的静脈内注入又は
注射を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８９】
ニューレグリンの前記徐放が1日に6時間以上のニューレグリンの連続的皮下注入又は注
射を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９０】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、浸透
ポンプ及びニューレグリンの治療有効量を含む、前記組成物。
【請求項９１】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、PEG
及びニューレグリンの治療有効量を含む、前記組成物。
【請求項９２】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、リポ
ソーム及びニューレグリンの治療有効量を含む、前記組成物。
【請求項９３】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、マイ
クロスフェア及びニューレグリンの治療有効量を含む、前記組成物。
【請求項９４】
哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させるための方法であって、哺乳動物へのニュ
ーレグリンの徐放を含む、前記方法。
【請求項９５】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のEF値を高める、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
前記哺乳動物のEF値が約20%超、約30%超、約40%超、約50%超及び約60%超からなる群か
ら選択される割合で高められる、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が前記哺乳動物のFS値を高める、請求項94記載の方法。
【請求項９８】
前記哺乳動物のFS値が約20%超、約30%超、約40%超、約50%超及び約60%超からなる群か
ら選択される割合で高められる、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
前記哺乳動物へのNRGの徐放が左心室の内径(LVEDD又はLVESD)を低減させる、請求項94
記載の方法。
【請求項１００】
前記LVEDD値が約2%超、約5%超、約10%超及び約15%超からなる群から選択される割合で
低減される、請求項99記載の方法。
【請求項１０１】
前記LVESD値が約2%超、約5%超、約10%超、約15%超及び約20%超からなる群から選択され
る割合で低減される、請求項99記載の方法。
【請求項１０２】
ニューレグリン治療を受ける哺乳動物の副作用を低減させるための方法であって、哺乳
動物へのニューレグリンの徐放を含む、前記方法。
【請求項１０３】
前記副作用が胃腸障害又は心外膜滲出液である、請求項102記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、2005年12月30日出願の米国特許仮出願第60/755,124号及び2006年1月13日出
願の第60/758,626号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、哺乳動物へのニューレグリンの徐放によって、様々な心臓の疾患又は障害を
予防、治療又は遅延させるための組成物及び方法に一般に関する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景)
心臓(心室)肥大は、ストレス増加又は心仕事量に対する需要の増加への重要な適応性生
理反応である。肥大への刺激の後に起こる早期の細胞変化の1つは、ミトコンドリアの合
成及び筋原線維質量の増大(壁肥厚)であり、個々の細胞のサイズの比例的増加を伴うが、
細胞数の増加は全く(又は、最小限しか)伴わない。
【０００４】
心室がストレス下にあるとき、初期応答はサルコメア長の増加である。これの後に、総
筋肉質量の増加が起こる。過負荷が重度の場合、心筋収縮性は抑制される。その最も軽度
の形態では、この抑制は、無負荷の心筋の短縮速度の低下として、又は、等尺性収縮の間
の力の発生速度の低下として現れる。心筋収縮性がさらに抑制されるに従い、無負荷心筋
の短縮速度のより多大な低下が起こり、今度は、等尺性の力発生及び短縮の低下が付随す
る。この時点で、循環の補償は心臓拡張及び筋肉質量の増加によってまだ提供することが
でき、それは、壁応力を正常レベルに維持する傾向がある。収縮性がさらに低下すると、
静止時の心臓の送血量及び仕事量の低下及び/又は心室拡張終期の容積及び圧力の上昇に
反映される、明白なうっ血性心不全が起こる。
【０００５】
肥大から心不全への移行は、細胞組織のいくつかの変化を特徴とする。例えば、正常な
肥大性細胞は大きなサイズを有し、よく組織化された収縮単位の増加並びに強い細胞間接
着を伴う。対照的に、同様に大きなサイズ及びタンパク質の蓄積を有する病的肥大性細胞
は、収縮タンパク質の分裂(サルコメア構造の乱れ)及び劣った細胞間接着(筋線維の乱れ)
を示す。ゆえに、病理学的肥大では、サイズの拡大及び収縮タンパク質の蓄積は、サルコ
メア構造物の無秩序な集合及び頑健な細胞間相互作用の欠如と関連する。
【０００６】
心不全は約5,000,000人のアメリカ人が罹患し、550,000人を超える新規患者が毎年その
病状と診断される。心不全のための現在の薬物療法は、主にアンギオテンシン変換酵素(A
CE)阻害剤に向けられているが、それらは血管を拡張させ、血圧を低下させ、心臓の仕事
量を減少させる血管拡張薬である。死亡率の減少割合は有意であるが、ACE阻害剤による
実際の死亡率の減少は平均3%〜4%に過ぎず、いくつかの潜在的な副作用がある。
【０００７】
ACE阻害剤は、心臓の収縮力を増加させるジギタリス及び/又は腎臓に血流からより多く
のナトリウム及び水を除去させることによって心臓の仕事量を軽減するのを助ける利尿薬
などの、他剤と併用して投与されてもいる。しかし、少なくとも1つの研究は、クラスII
〜IIIの心不全患者で、プラセボと比較してジギタリスの使用に関連する生存性の差がな
いことを証明した。さらに、利尿薬は心不全の一部の症状を改善することができるが、そ
れは単独の治療法として適当ではない。
【０００８】
さらなる限界は、心不全を予防又は治療するための他の選択肢と関連する。例えば、心
臓移植は薬物療法より明らかに高価で侵襲性であり、それは、供与される心臓の入手可能
性によってさらに制限される。両室ペースメーカなどの機械的装置の使用は、同様に侵襲
性で高価である。ゆえに、現在の療法の欠点を考えると、新しい療法の必要性がある。
【０００９】
有望な新しい療法の1つは、心不全に罹っているかそれを発症するリスクのある患者に
対する、ニューレグリン(以下、「NRG」と呼ぶ)の投与を含む。NRGは、NRG1、NRG2、NRG3
及びNRG4並びにそのアイソフォームを含む、構造的に関係のある成長及び分化因子のファ
ミリーを含む。例えば、NRG1の15以上の異なるアイソフォームが同定され、それらの必須
の上皮成長因子(EGF)様ドメインの配列の差に基づいて、α-及びβ型として知られる2つ
の大きな群に分類された。
【００１０】
NRGは、EGFR、ErbB2、ErbB3及びErbB4を含むEGF受容体ファミリーと結合するが、その
それぞれは、細胞増殖、分化及び生存を含む複数の細胞機能で重要な役割を果たす。それ
らは、細胞外のリガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質チロシンキナーゼドメ
インからなるタンパク質チロシンキナーゼ受容体である。NRGがErbB3又はErbB4の細胞外
ドメインに結合した後、それはErbB3、ErbB4及びErbB2の間のヘテロダイマー形成又はErb
B4自体の間のホモダイマー形成をもたらす構造変化を誘導し、それは細胞膜内の受容体の
C末端ドメインのリン酸化をもたらす。リン酸化された細胞内ドメインは細胞内のさらな
るシグナルタンパク質と次に結合し、対応する下流側AKT又はERKシグナル伝達経路を活性
化し、一連の細胞反応、例えば細胞増殖、細胞分化、細胞アポトーシス、細胞移動又は細
胞接着の刺激又は低下を誘導する。これらの受容体の間で、主にErbB2及びErbB4が心臓で
発現される。
【００１１】
50〜64個のアミノ酸のサイズであるNRG1のEGF様ドメインは、これらの受容体に結合し
てそれらを活性化するのに十分であることが示された。以前の研究は、ニューレグリン-1
β(NRG-1β)が、ErbB3及びErbB4と直接的に高親和性で結合することができることを示し
た。オーファン受容体ErbB2は、ErbB3又はErbB4ホモダイマーよりも高い親和性で、ErbB3
又はErbB4とヘテロダイマーを形成することができる。神経発達の研究は、交感神経系の
形成が無傷のNRG-1β、ErbB2及びErbB3シグナル伝達系を必要とすることを示した。NRG-1
β又はErbB2又はErbB4の標的破壊は、心臓発達欠陥のために胚致死に導いた。最近の研究
は、心血管の発達並びに成体の正常な心機能の維持における、NRG-1β、ErbB2及びErbB4
の役割も鮮明にした。NRG-1βは、成体心筋細胞においてサルコメア組織を強化すること
が示された。組換えNRG-1βEGF様ドメインの短期投与は、心不全の3つの異なる動物モデ
ルにおいて心筋作用の悪化を有意に改善するか、又はそれから保護する。より重要なこと
に、NRG-1βは心不全動物の生存を有意に長くする。これらの効果は、NRG-1βを、様々な
通常疾患による心不全のための広域スペクトルの治療化合物又はリード化合物として有望
なものにする。しかし、心不全及び/又は心肥大の予防、治療又は遅延のために臨床場面
で用いることができる、NRGを使用する、より効果的な方法の必要性がまだある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
(発明の要旨)
NRGの徐放は、他の方法によって投与されるNRGと比較して、心不全及び心肥大の治療に
おけるNRGの効果を大きく改善する。NRGの徐放は、他の方法によって投与されるNRGと比
較して、NRGの有害副作用を減少させる利点も有する。ゆえに、本発明は、NRGタンパク質
若しくはその機能的断片、又はNRGタンパク質をコードする核酸若しくはその機能的断片
、又は前記NRGの生成及び/又は機能を強化する剤の放出を延長することにより、哺乳動物
、特にヒトの様々な心臓の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させる組成物及び方法に関
する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第1の態様では、哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させるための方法で
あって、それを必要とする哺乳動物へのNRGの徐放を含む方法が提供される。
哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させるための方法の一実施形態では、哺乳動物
へのNRGの徐放は、心細胞内のERKシグナル伝達経路の持続的活性化をもたらす。
それを必要とする哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させるための方法の他の実施
形態では、哺乳動物へのNRGの徐放は、心細胞内のAKTシグナル伝達経路の持続的活性化を
もたらす。
【００１４】
それを必要とする哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させるための方法の他の実施
形態では、哺乳動物へのNRGの徐放は、哺乳動物の左心室のEF値及び/又はFS値を高める。
それを必要とする哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させるための方法の他の実施
形態では、哺乳動物へのNRGの徐放は、心肥大を予防する。
それらに限定されないが、浸透ポンプ若しくはシリンジポンプ、ポリエチレングリコー
ル(「PEG」)結合及び/又はリポソーム若しくはマイクロスフェアパッケージングを含む、
当技術分野で公知である任意の徐放技術を、本発明で用いることができる。
【００１５】
本発明の第2の態様では、左心室の内径を低減させるための方法であって、それを必要
とする哺乳動物へのNRGの徐放を含む方法が提供される。好ましい一実施形態では、哺乳
動物へのNRGの徐放は、LVEDD値を、約2%を超えて減少させる。より好ましくは、哺乳動物
へのNRGの徐放は、LVEDD値を、約5%を超えて減少させる。より好ましくは、哺乳動物への
NRGの徐放は、LVEDD値を、約10%を超えて減少させる。より好ましくは、哺乳動物へのNRG
の徐放は、LVEDD値を、約15%を超えて減少させる。最も好ましくは、哺乳動物へのNRGの
徐放は、LVEDD値を、約20%を超えて減少させる。
【００１６】
他の好ましい実施形態では、哺乳動物へのNRGの徐放は、LVESD値を、約2%を超えて減少
させる。より好ましくは、哺乳動物へのNRGの徐放は、LVESD値を、約5%を超えて減少させ
る。より好ましくは、哺乳動物へのNRGの徐放は、LVESD値を、約10%を超えて減少させる
。より好ましくは、哺乳動物へのNRGの徐放は、LVESD値を、約15%を超えて減少させる。
最も好ましくは、哺乳動物へのNRGの徐放は、LVESD値を、約20%を超えて減少させる。
【００１７】
本発明の第3の態様では、心筋細胞の増殖及び/又は分化を引き起こす方法であって、そ
れを必要とする哺乳動物にNRGを徐放し、それにより心細胞でMAPキナーゼ経路を活性化し
、心筋細胞の増殖及び/又は分化を引き起こすことを含む方法が提供される。
本発明の第4の態様では、筋細胞のサルコメア及び細胞骨格の構造のリモデリング、又
は細胞間接着を誘導するための方法であって、それを必要とする哺乳動物にNRGを徐放し
、それにより心臓細胞のMAPキナーゼ経路を活性化し、細胞構造のリモデリング又は細胞
間接着を引き起こすことを含む方法が提供される。
本発明の第5の態様では、それを必要とする哺乳動物の心筋細胞間接着の分離及び/又は
サルコメア構造の乱れを治療又は予防するための方法であって、哺乳動物へのNRGの徐放
を含む方法が提供される。
【００１８】
さらに、NRGのErbB受容体との相互作用は他の疾患及び障害との関係を示唆されたので
、NRGの徐放は、他の方法によって投与されるNRGと比較して、そのような他の疾患及び障
害の治療におけるNRGの効果を大いに改善することもできる。ゆえに、本発明は、NRGタン
パク質若しくはその機能的断片、又はNRGタンパク質をコードする核酸若しくはその機能
的断片、又は前記NRGの生成及び/又は機能を強化する剤の放出を延長することにより、哺
乳動物、特にヒトの様々な疾患又は障害を予防、治療又は遅延させる組成物及び方法にも
関する。そのような疾患及び障害には、一般に中枢神経系及び末梢神経系のそれらが含ま
れる。他の疾患及び障害の例には、様々な心血管疾患、癌、神経系疾患及び/又は筋疾患
、例えば筋ジストロフィー(例えばデュシェンヌ、肢帯)及び多発性硬化症、脊髄損傷、目
及び耳の疾患、糖尿病、統合失調症並びにアルツハイマー病が含まれる。
【００１９】
本発明は、哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させるための、NRGの徐放組成物又
は製剤も提供する。一実施形態では、組成物又は製剤は、心細胞内のERKシグナル伝達経
路の活性化を持続させる。他の実施形態では、組成物又は製剤は、心細胞内のAKTシグナ
ル伝達経路の活性化を持続させる。他の実施形態では、組成物又は製剤は、哺乳動物のEF
及び/又はFS値を高める。さらに他の実施形態では、組成物又は製剤は、心肥大を予防す
る。組成物又は製剤は、それらに限定されないが、浸透圧ポンプ若しくはシリンジポンプ
、ポリエチレングリコール(PEG)結合及び/又はリポソーム若しくはマイクロスフェアパッ
ケージングを含む、当技術分野で公知である任意の徐放技術の使用を組み込むことができ
る。
【００２０】
本発明は、NRG組成物又は製剤、及びそれらに限定されないが、浸透圧ポンプ若しくは
シリンジポンプ、ポリエチレングリコール(PEG)結合及び/又はリポソーム若しくはマイク
ロスフェアパッケージングを含む、当技術分野で公知である徐放技術を含むキットも提供
する。一部の実施形態では、キットは、哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させる際
に;哺乳動物の心肥大を予防、治療又は遅延させる際に;或いは、哺乳動物の左心室の内径
を低減させる際に、NRG組成物若しくは製剤及び又は徐放技術を用いるための説明書をさ
らに含む。
本発明のそれら及び他の態様、目的、利点並びに特徴は、下でより完全に記載される本
発明の開示を読むと、当分野の技術者に明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
(発明の詳細な説明)
本発明の実施において、本明細書で記載されているものと類似若しくは同等の任意の方
法を使用できるが、好ましい方法及び材料は次に記載する。
本発明は、持続的又は変動する量のNRGの徐放によって、哺乳動物の心不全又は心肥大
を治療又は予防する方法を提供する。好ましくは、哺乳動物は心不全に患っているか又は
それの発症リスクのあるヒト患者である。
限定を目的としないが開示を明確にするために、以降の本発明の詳しい記載を以下のサ
ブセクションに分割する。本明細書で指摘される全ての刊行物は、それらと関連して刊行
物が引用される方法及び/又は材料を開示、記載するために、参照により組み込まれる。
【００２２】
(A.定義)
特に定義されていない場合は、本明細書で用いる全ての技術用語及び学術用語は、本発
明が属する分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書で参照した全て
の特許、出願、公表出願及び他の刊行物は、その全体において参照により組み込まれる。
このセクションで示す定義が本明細書で参照により組み込まれる特許、出願、公表出願及
び他の刊行物で示される定義と反するかさもなければ矛盾する場合は、このセクションで
示す定義が本明細書で参照により組み込まれる定義に優先する。
【００２３】
本明細書で用いるように、本文で明らかに別の指示がない限り、単数形「a」、「an」
及び「the」は「少なくとも1つ」又は「1つ以上」を意味する。
【００２４】
本明細書で用いるように、本発明で用いる「ニューレグリン」又は「NRG」は、ErbB2、
ErbB3、ErbB4又はそれらの組合せと結合してそれらを活性化することができるタンパク質
又はペプチド、それらに限定されないが全てのニューレグリンアイソフォーム、ニューレ
グリンEGFドメインのみ、ニューレグリンEGF様ドメインを含むポリペプチド、ニューレグ
リン突然変異体若しくは誘導体、及び以下に詳述する、上の受容体を同じく活性化する任
意の種類のニューレグリン様遺伝子産物を指す。好ましい実施形態では、本発明で用いる
ニューレグリンは、ErbB2/ErbB4又はErbB2/ErbB3ヘテロダイマーと結合して活性化する。
ニューレグリンには、ニューレグリンの活性を模倣するNRG-1、NRG-2、NRG-3、NRG-4タン
パク質、ペプチド、断片及び化合物も含まれる。本発明で用いるニューレグリンは、上記
のErbB受容体を活性化してそれらの生体反応を調節すること、例えば、乳癌細胞分化及び
ミルクタンパク質の分泌を刺激すること;神経冠細胞のシュワン細胞への分化を誘導する
こと;骨格筋細胞においてアセチルコリン受容体の合成を刺激すること;及び/又は心筋細
胞の分化、生存及びDNA合成を改善することができる。ニューレグリンには、それらの生
物活性を実質的に変化させない保存的なアミノ酸置換を有する変異体も含まれる。適当な
アミノ酸の保存的置換は、この分野の技術者に公知であり、一般に、生じる分子の生物活
性を変化させることなく形成することができる。この分野の技術者は、一般に、ポリペプ
チドの非必須領域の単一のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させないことを認識
する(例えば、Watsonら「遺伝子の分子生物学(Molecular Biology of the Gene)」、第4
版, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224を参照)。
ニューレグリンタンパク質は、ニューレグリンタンパク質及びペプチドを包含する。ニ
ューレグリン核酸は、ニューレグリン核酸及びニューレグリンオリゴヌクレオチドを包含
する。
【００２５】
本明細書で用いるように、「上皮成長因子様ドメイン」又は「EGF様ドメイン」は、そ
の内容が全て本明細書で参照により組み込まれる、WO00/64400、Holmesらの論文(Science
, 256:1205-1210 (1992));米国特許第5,530,109号及び5,716,930号; Hijaziらの論文(Int
. J. Oncol., 13:1061-1067 (1998)); Changらの論文(Nature, 387:509-512 (1997); Car
rawayらの論文(Nature, 387:512-516 (1997)); Higashiyamaらの論文(J. Biochem., 122:
675-680(1997));及びWO97/09425で開示されているように、ErbB2、ErbB3、ErbB4又はそ
れらの組合せと結合してそれらを活性化し、EGF受容体結合ドメインと構造的類似性を有
する、ニューレグリン遺伝子によってコードされるポリペプチドモチーフを指す。ある実
施形態では、EGF様ドメインは、ErbB2/ErbB4又はErbB2/ErbB3ヘテロダイマーと結合して
それらを活性化する。ある実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-1の受容体結合ドメイン
のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-1のアミノ酸残基17
7〜226、177〜237又は177〜240に対応するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、EGF
様ドメインは、NRG-2の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、E
GF様ドメインは、NRG-3の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。ある実施形態では
、EGF様ドメインは、NRG-4の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。ある実施形態で
は、EGF様ドメインは、米国特許第5,834,229号に記載されているアミノ酸配列Ala Glu Ly
s Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pr
oを含む。
【００２６】
本明細書で用いるように、特定の疾患を治療するための活性剤の「有効量」は、その疾
患と関連する症状を改善するのに、又は何らかの方法で軽減するのに十分な量である。そ
の量は疾患を治療する可能性があるが、一般的に、その疾患の症状を改善するために投与
される。
本明細書で用いるように、「活性剤」は、ヒト及び他の動物で疾患の診断、治癒、緩和
、治療若しくは予防を目的とするか、さもなければ肉体的及び精神的な健康を高めるため
の任意の物質を意味する。
本明細書で用いるように、特定の活性剤の投与による特定の障害の症状の「改善」は、
その剤の投与に帰すること又は関連付けることができる、恒久的若しくは一時的であれ、
永続的若しくは一過性であれ、任意の減少を指す。
【００２７】
本明細書で用いるように、「治療する」、「治療」及び「治療すること」は、病状、障
害又は疾患の症状が改善されるかさもなければ有益に変化させられる任意の方法を指す。
効果は、疾患若しくはその症状を完全に又は部分的に予防する観点から予防的であっても
よく、並びに/又は、疾患及び/若しくはその疾患に起因する悪影響の部分的又は完全な治
癒の観点から治療的であってもよい。治療はまた、本明細書で、組成物の任意の医薬的使
用を包含する。
【００２８】
本明細書で用いるように、「ベクター(又はプラスミド)」は、異種DNAをその発現又は
複製のために細胞に導入するために用いる個別エレメントを指す。そのような媒体の選択
及び使用は、当業者に公知である。発現ベクターには、そのようなDNA断片の発現をもた
らすことができる、プロモーター領域などの調節配列と機能的に連結したDNAを発現させ
ることができるベクターが含まれる。ゆえに、発現ベクターは、組換えDNA又はRNA構築物
、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス又は他のベクターなどの、適当な宿主
細胞への導入後にクローン化DNAの発現をもたらすものを指す。適当な発現ベクターは当
分野の技術者に公知であり、真核細胞及び/又は原核細胞内で複製可能であるもの及びエ
ピソームのままであるもの若しくは宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが含まれる。
【００２９】
本明細書で用いるように、「心筋細胞分化」は、DNA合成の10%を超える減少、他の因子
によって刺激されるDNA合成の10%を超える抑制、よく組織化されたサルコメア構造及び細
胞間接着、MAPキナーゼの持続的活性化及びp21C1P1の発現の増加を特徴とする状態を意味
する。さらなる議論はWO00/37095で提供され、その内容は参照により完全に本明細書に組
み込まれる。
【００３０】
本明細書で用いるように、「駆出分画」又は「EF」は、鼓動の結果として充満した心室
から拍出される血液の部分を意味する。それは、以下の式、(LV拡張期容積-LV収縮期容積
)/LV拡張期容積、で定義することができる。
本明細書で用いるように、「フラクショナル短縮」又は「FS」は、収縮状態及び弛緩状
態の間の左心室の直径の変化の比を意味する。それは、以下の式、(LV拡張末期直径-LV収
縮末期直径)/LV拡張末期直径、で定義することができる。
【００３１】
本明細書で用いるように、「心不全」は、心臓が、代謝組織の要求に必要とされる速度
で血液を拍出しない、心機能の異常を意味する。心不全は、うっ血性心不全、心筋梗塞、
頻拍性不整脈、家族性肥大性心筋症、虚血性心疾患、特発性拡張型心筋症、心筋炎などの
広範囲にわたる疾病状態を含む。心不全は多くの因子によって起こることができ、それら
に限定されないが虚血性、先天性、リウマチ性又は特発性の形態が含まれる。慢性心肥大
は、うっ血性心不全及び心停止の前駆型であるかなり重い病態である。
【００３２】
本明細書で用いるように、「心筋梗塞」は、重度の持続的な虚血に起因する心筋の一部
の巣状壊死をもたらす、冠状動脈の封鎖又は血流妨害を指す。本明細書で用いるように、
「徐放」は、ある期間にわたって活性剤(例えばニューレグリン)の連続的治療レベルを提
供することを指す。徐放には、それらに限定されないが、連続的放出、制御放出、遅延型
放出、デポー製剤、段階的放出、長期放出、プログラム放出、延長放出、比例放出、遷延
放出、リポジトリ、遅滞、緩放出、間隔放出、持続放出、タイムコート、時限放出、遅延
作用、徐放作用、時間層作用、長時間作用、延長作用、反復作用、緩作用、持続作用、持
続作用投薬及び制御放出などの様々な放出形態が含まれる。徐放、制御放出、時限放出、
持続性放出、遅延型放出、長時間作用、拍動送達又は即時放出を得る能力は、当業者が利
用できる周知の手法及び技術を用いて達成される。
【００３３】
活性剤の放出が継続する時間は、活性剤の特性及び用いる徐放技術によって決まるが、
全ての場合、徐放技術を用いない活性剤の投与のそれよりも長い。
本明細書で用いるように、本文で明らかに別途指示がない限り、「マイクロスフェア」
は「微小粒子」、「マイクロカプセル」、「ナノスフェア」、「ナノ粒子」及び「ナノカ
プセル」と同義である。
本明細書で用いるように、「PEG化する」は、少なくとも1つのポリ(エチレングリコー
ル)分子又はポリ(エチレングリコール)の少なくとも1つの誘導体を活性剤又は他の分子に
結合することを意味する。
【００３４】
本明細書で用いるように、「組織化された又は強化された組織のサルコメア又はサルコ
メア構造」は、心筋細胞のα-アクチニンの免疫蛍光染色で明らかにされる収縮タンパク
質の線状配列を特徴とする状態を意味する。細胞内のα-アクチニンタンパク質の線状配
列は、顕微鏡及びその連結した写真撮影によって識別することができる。本明細書で用い
るように、「無秩序な又は乱れた配列のサルコメア又はサルコメア構造」は、「組織化さ
れた又は強化された組織のサルコメア又はサルコメア構造」の反対を意味する。
【００３５】
本明細書で用いるように、「組織化された又は強化された組織の細胞骨格構造」は、心
筋細胞のファロイジン染色で明らかにされる線状アクチン線維を特徴とする状態を意味す
る。この明細書の図で例示するように、細胞内の線状アクチン線維は、顕微鏡及びその連
結した写真撮影によって識別することができる。本明細書で用いるように、「無秩序な又
は乱れた配列の細胞骨格構造」は、「組織化された又は強化された組織の細胞骨格構造」
の反対を意味する。
【００３６】
本明細書で用いるように、本文で別途明瞭に指示しない限り、「タンパク質」は、「ポ
リペプチド」又は「ペプチド」と同義である。
本明細書で用いるように、「MAPキナーゼの持続的活性化」は、MAPキナーゼのリン酸化
された状態p42/44が、細胞内で少なくとも21時間維持されることを意味する。さらなる議
論はWO00/37095で提供され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
用語「相乗的、「相乗効果」、その他は、本明細書で、1つ以上の治療剤を1つ以上のレ
チノイン酸化合物と組み合わせることによって得られる、改善された治療効果を記載する
ために用いる。一部の分野では、相乗効果は相加以上(例えば1+1=3)の効果が意味される
が、薬物療法の分野では、相加的(1+1=2)又は相加未満(1+1=1.6)の効果が相乗的であって
よい。例えば、2つの薬剤のそれぞれが、個々に投与したときに心室筋細胞肥大の発症を5
0%抑制すると仮定した場合、2つの薬剤を併用して心室筋細胞肥大の発症を完全に抑制す
ることは期待されないであろう。多くの場合、受け入れがたい副作用のために、2つの薬
剤を一緒に投与することはできない。他の場合でも、一緒に投与するとそれらの薬剤は互
いに相殺し、心室筋細胞肥大の発症を50%未満だけしか遅延させない。ゆえに、2つの薬剤
が50%を超えて心室筋細胞肥大の発症を遅延させ、有害副作用の受け入れがたい増加を引
き起こさない場合、相乗効果が得られると言われる。
【００３８】
本明細書で用いるように、「心肥大」は、個々の心室筋細胞のサイズの増加、すなわち
、患者の臨床診断をもたらすのに十分な、又は細胞がより大きい(例えば、非肥大細胞よ
りも2倍以上大きい)と判定されるようにするのに十分な細胞サイズの増加を特徴とする状
態を意味する。それには、個々の心細胞中の収縮タンパク質の蓄積及び胚遺伝子発現の活
性化が付随することがある。
【００３９】
心室筋細胞肥大の存在を判定するための、インビトロ及びインビボの方法が公知である
。心室筋細胞肥大のためのインビトロアッセイには、WO00/37095で記載の方法、例えば、
細胞サイズの増加及び心房性ナトリウム利尿因子(ANP)の発現の増加が含まれる。細胞サ
イズの変化が、肥大の程度を判定するためのスコアリングシステムで用いられる。これら
の変化は逆位相差顕微鏡で見ることができ、肥大の程度は7〜0の任意のスケールで評価し
たが、7は完全に肥大した細胞、3は刺激されなかった細胞である。3及び7の状態は、Simp
sonらの論文((1982) Circulation Res. 51: 787-801)、図2のそれぞれA及びBで見ること
ができる。肥大スコア及び細胞表面積(μm2)の間の相関関係は、直線的である(相関係数=
0.99)と判定された。フェニレフリン誘導性の肥大では、曝露されない(正常な)細胞は3の
肥大スコア及び581μm2の表面積/細胞を有し、完全に肥大した細胞は7の肥大スコア及び1
811μm2若しくは正常の約200%の表面積/細胞を有する。4の肥大スコアを有する細胞は771
μm2の表面積/細胞、若しくは曝露されない細胞より約30%大きなサイズを有し;5の肥大ス
コアを有する細胞は1109μm2の表面積/細胞、若しくは曝露されない細胞より約90%大きな
サイズを有し;6の肥大スコアを有する細胞は1366μm2の表面積/細胞、若しくは曝露され
ない細胞より約135%大きなサイズを有する。心室筋細胞肥大の存在は、好ましくは、少な
くとも約15%(肥大スコア3.5)以上大きなサイズを示す細胞を含む。肥大誘導因子は、上記
のアッセイによって評価される最大の肥大性応答を誘導する能力が異なる。例えば、エン
ドセリンによって誘導される細胞サイズの最大増加は、約5の肥大スコアである。
【００４０】
本明細書で用いるように、「心肥大の抑制」は、肥大状態と比較したときの肥大を示す
パラメータの1つの低下を、又は、標準状態と比較したときの肥大を示すパラメータの1つ
の増加の阻止を意味する。例えば、心室筋細胞肥大の抑制は、肥大状態と比較して細胞サ
イズの縮小として測定することができる。心室筋細胞肥大の抑制は、肥大状態で観察され
るものと比較して細胞サイズの10%以上の減少を意味する。より好ましくは、肥大の抑制
は、細胞サイズの30%以上の減少を意味し;最も好ましくは、肥大の抑制は、細胞サイズの
50%以上の減少を意味する。フェニレフリンを誘導剤として用いる場合の肥大スコアアッ
セイと比較して、これらの減少は、それぞれ約6.5以下、5.0〜5.5及び4.0〜5.0の肥大ス
コアと相関する。異なる剤を誘導剤として用いる場合、抑制は、その誘導因子の存在下で
測定される最大細胞サイズ(又は、肥大スコア)と比較して調べられる。
【００４１】
心室筋細胞肥大の予防は、完全に肥大を誘導するのに十分な濃度の誘導因子の存在下で
、正常細胞と比較した細胞サイズの増加を予防することで判定される。例えば、肥大の予
防は、最大刺激濃度の誘導因子の存在下で非誘導細胞より200%未満大きい細胞サイズの増
加を意味する。より好ましくは、肥大の予防は、非誘導細胞より135%未満大きい細胞サイ
ズの増加を意味し;最も好ましくは、肥大の予防は、非誘導細胞より90%未満大きい細胞サ
イズの増加を意味する。フェニレフリンを誘導剤として用いる場合の肥大スコアアッセイ
と比較して、最大刺激濃度のフェニレフリンの存在下での肥大の予防は、それぞれ約6.0
〜6.5、5.0〜5.5及び4.0〜4.5の肥大スコアを意味する。
【００４２】
肥大のインビボ判定には、血圧、心拍数、体血管抵抗、収縮性、心拍動力、求心性若し
くは拡張性肥大、左室収縮期圧、左室平均有効圧、左室拡張末期圧、心送血量、拍動指数
、組織学的パラメータ及び心室のサイズ及び壁厚などの心血管パラメータの測定を含める
ことができる。インビボでの心室筋細胞肥大の発症及び抑制の判定で利用できる動物モデ
ルには、圧負荷マウスモデル、RVマウス機能障害モデル、トランスジェニックマウスモデ
ル及び心筋梗塞後ラットモデルが含まれる。ヒト患者の心室筋細胞肥大の存在、発症及び
抑制を評価するための医学的な方法は公知であり、例えば、拡張期及び収縮期のパラメー
タの測定、心室質量及び肺静脈流量の推定が含まれる。
【００４３】
肥大は、先天性ウイルス性、特発性、心臓栄養性若しくは筋栄養性の原因を含むレチノ
イン酸に応答性である任意の原因によるものでも、又は、虚血若しくは心筋梗塞などの虚
血性攻撃の結果によるものでもよい。一般的に、治療は、特に例えば虚血から心臓損傷が
起こった後に、肥大の進行を停止又は遅延させるために実施される。好ましくは、心筋梗
塞の治療のために、剤は、肥大を予防又は軽減するために、心筋梗塞の直後に与える。
【００４４】
本明細書で用いるように、「活性単位」又は「1単位」は、50%の最大反応を引き起こす
ことができる規格品の量を意味する。言い換えると、所与の活性剤の活性単位を判定する
ために、EC50値を測定しなければならない。例えば、製品バッチのEC50値が0.067μg/ml
であると仮定すると、それは1単位となる。さらに、その製品の1μgを用いる場合、14.93
U(1/0.067)が用いられる。EC50値は当技術分野で公知の任意の方法で測定することができ
、その例には、下の実施例で発明者が使用する方法が含まれる。この活性単位の測定は、
遺伝子操作製品及び臨床使用薬剤の品質管理にとって重要であり、異なる医薬及び/又は
異なるロット番号からの製品の均一な基準による定量化を可能にする。
【００４５】
ある実施形態では、下の実施例6、及びそれらの内容が参照により完全に組み込まれるW
O03/099300及びSadickらの論文(1996, Analytical Biochemistry, 235:207-14)で詳述さ
れているように、ニューレグリンの単位は、キナーゼ受容体活性化酵素結合免疫吸着検定
法(KIRA-ELISA)によりニューレグリンの活性を測定することで判定される。簡潔には、そ
のアッセイは、接着性乳癌細胞系MCF-7の上でニューレグリン誘導性のErbB2活性化及びリ
ン酸化を測定する。膜タンパク質はトリトンX-100溶解を介して可溶化し、受容体は、Erb
B3及びErbB4と交差反応のないErbB2特異抗体(例えばH4)でコーティングしたELISAウェル
で捕捉する。次に、受容体リン酸化の程度を、抗ホスホチロシンELISAによって定量化す
る。
【００４６】
(B.ニューレグリン)
本発明は、持続的又は変動する量のNRGの徐放によって、哺乳動物の心不全又は心肥大
を治療又は予防する方法を提供する。任意のNRG(例えばNRG-1、NRG-2、NRG-3及びNRG-4、
及びそのアイソフォーム)タンパク質、ペプチド又は断片を、本発明の実施で用いること
ができる。
【００４７】
ニューレグリン又はNRGは、ErbB2、ErbB3、ErbB4又はそれらの組合せと結合してそれら
を活性化することができるタンパク質又はペプチド、例えばそれらに限定されないが全て
のニューレグリンアイソフォーム、ニューレグリンEGFドメインのみ、ニューレグリンEGF
様ドメインを含むポリペプチド、ニューレグリン突然変異体若しくは誘導体、及び以下に
詳述する、上の受容体を同じく活性化する任意の種類のニューレグリン様遺伝子産物を指
す。好ましい実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、ErbB2/ErbB4又はErbB2/E
rbB3ヘテロダイマーと結合してそれらを活性化する。本発明で用いるニューレグリンは、
上記のErbB受容体を活性化してそれらの生体反応を調節すること、例えば、乳癌細胞分化
及びミルクタンパク質の分泌を刺激すること;神経冠細胞のシュワン細胞への分化を誘導
すること;骨格筋細胞でアセチルコリン受容体の合成を刺激すること;及び/又は心筋細胞
の分化、生存及びDNA合成を改善することができる。受容体結合活性を測定するためのア
ッセイは、当技術分野で公知である。例えば、ErbB-2及びErbB-4受容体でトランスフェク
トした細胞を用いることができる。受容体発現細胞を放射性標識ニューレグリンの超過量
とインキュベートした後、細胞をペレット化し、未結合の放射性標識ニューレグリンを含
有する溶液は、非標識のニューレグリン溶液を放射性標識ニューレグリンとの競合のため
に加える前に除去する。EC50は、当技術分野周知の方法によって測定する。EC50は、結合
放射性標識リガンドの50%と競合して受容体複合体から分離することができるリガンドの
濃度である。EC50値が高いほど、受容体結合親和性は低い。
【００４８】
本発明で用いるニューレグリンには、それらに限定されないがニューレグリン-1(「NRG
-1」)、ニューレグリン-1(「NRG-2」)、ニューレグリン-1(「NRG-3」)及びニューレグリ
ン-4(「NRG-43」)の全てのアイソフォームを含む、当技術分野で公知の任意のニューレグ
リン及びそのアイソフォームが含まれる。NRG-1は、例えば、米国特許第5,530,109号、5,
716,930号及び7,037,888号; Lemkeの論文(Mol. Cell.,Neurosci. 1996, 7:247-262); Pel
es及びYardenの論文(1993, BioEssays 15:815-824, 1993); Pelesらの論文(1992, Cell 6
9, 205-216); Wenらの論文(1992, Cell 69, 559-572, 1992)、Holmesらの論文(1992, Sci
ence 256:1205-1210)、Fallsらの論文(1993, Cell 72:801-815)、Marchionniらの論文(19
93, Nature 362:312-8)に記載され、それらの内容は参照により完全に組み込まれる。NRG
-2は、例えば、Changらの論文(1997, Nature 387:509-512); Carrawayらの論文(1997, Na
ture 387:512-516); Higashiyamaらの論文(1997, J. Biochem. 122:675-680)、Busfield
らの論文(1997, Mol. Cell. Biol. 17:4007-4014)及び国際特許公開97/09425に記載され
、それらの内容は参照により完全に組み込まれる。NRG-3は、例えば、Hijaziらの論文(19
98, .Int. J. Oncol. 13:1061-1067)に記載され、その内容は参照により完全に組み込ま
れる。NRG-4は、例えば、Harariらの論文(1999 Oncogene.18:2681-89)に記載され、それ
らの内容は参照により完全に組み込まれる。
【００４９】
本発明で用いるニューレグリンには、天然のニューレグリンに存在しない1つ以上のア
ミノ酸置換、欠失及び/又は付加を含むニューレグリン突然変異体又は誘導体が含まれる
。好ましくは、置換、削除又は付加されるアミノ酸の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9
又は10個のアミノ酸である。一実施形態では、そのような誘導体は、ペプチドのアミノ末
端及び/又はカルボキシ末端に1つ以上のアミノ酸欠失、置換又は付加を含む。他の実施形
態では、そのような誘導体は、ペプチド全長内の任意の残基において、1つ以上のアミノ
酸欠失、置換又は付加を含む。
【００５０】
ある実施形態では、アミノ酸置換は保存的又は非保存的なアミノ酸置換であることがで
きる。保存的なアミノ酸置換は、関係するアミノ酸残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、
親水性及び/又は両親媒性の性質の類似性に基づいて形成される。例えば、無極性の(疎水
性の)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニル
アラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ;極性中性アミノ酸には、グリシン、
セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれ;正
荷電(塩基性)アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ;負荷電(酸性)
アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。さらに、グリシン及びプロ
リンは、鎖配向に影響を及ぼすことができる残基である。非保存的置換は、これらのクラ
スの1メンバーを他のクラスと交換することを伴う。
【００５１】
ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、それらの生物活性を実質的に変
化させない保存的なアミノ酸置換を有するニューレグリン誘導体である。適当なアミノ酸
の保存的置換は、この分野の技術者に公知であり、一般に、生じる分子の生物活性を変化
させることなく形成することができる。この分野の技術者は、一般に、ポリペプチドの非
必須領域の単一のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させないことを認識している
(例えば、Watsonらの論文「遺伝子の分子生物学(Molecular Biology of the Gene)」第4
版、(1987, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224)を参照)。
【００５２】
ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンには、非古典的アミノ酸又は化学的
アミノ酸類似体を有するアミノ酸置換を有するニューレグリン突然変異体又は誘導体が含
まれる。非古典的アミノ酸には、それらに限定されないが、通常のアミノ酸のD-異性体、
α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキ
サン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、
ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグ
リシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン
、フルオロアミノ酸、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸な
どのデザイナーアミノ酸、及びアミノ酸類似体一般が含まれる。
【００５３】
本発明で用いるニューレグリンには、ニューレグリン同族体、すなわち、ニューレグリ
ン又はニューレグリンの相互作用ドメインの1つとアミノ酸配列相同性及び/又は構造的な
類似点を示し、その結果それがErbB2/ErbB4又はErbB2/ErbB3ヘテロダイマープロテインキ
ナーゼと結合してそれらを活性化することができるポリペプチドが含まれる。一般的に、
未変性タンパク質のタンパク質同族体は、未変性タンパク質と少なくとも50%、好ましく
は少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、85%、86%、87%、88%若しくは89%、さ
らに好ましくは少なくとも90%、91%、92%、93%若しくは94%、最も好ましくは95%、96%、9
7%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有することができる。
【００５４】
この関係において相同性割合は、配列を整列させ、最大の配列相同性割合を達成するた
めに必要に応じてギャップを導入した後の、ペプチドの対応するアミノ酸残基と同一であ
る(すなわち、配列内の所与の位置のアミノ酸残基が同じ残基である)か又は類似している
(すなわち、配列内の所与の位置のアミノ酸置換が、上記のように保存的置換である)、候
補配列内のアミノ酸残基の割合を意味する。ある実施形態では、ニューレグリン同族体は
、天然のニューレグリン配列との配列同一性割合又は配列類似性割合で特徴づけされる。
配列同一性及び類似性割合を含む配列相同性は、当技術分野で周知の配列整列技術、好ま
しくはこの目的ために設計されたコンピュータアルゴリズムを、前記コンピュータアルゴ
リズムのデフォルトパラメータと用いて、又はそれらを含むソフトウェアパッケージを用
いて判定される。
【００５５】
コンピュータアルゴリズム及びそのようなアルゴリズムを組み込むソフトウェアパッケ
ージの非限定的な例には、以下のものが含まれる。BLLASTプログラムファミリーは、2つ
の配列の比較のために利用される数値計算用アルゴリズムの好ましい非限定例を例示する
。(例えば、Karlin & Altschulの論文(1990, Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:2264-2268(
Karlin & Altschulの論文(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)で変更され
た)、Altschulらの論文(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410、(NBLAST及びXBLASTを記載))
、Altschulらの論文(1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (Gapped BLAST及びPSI-B
lastを記載))。他の好ましい例は、Myers及びMiller (1988 CABIOS 4:11-17)のアルゴリ
ズムであり、それは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれ、GCG配列整列ソフ
トウェアパッケージの一部として利用できる。また、FASTAプログラム(Pearson W.R.及び
Lipman D.J.、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988)も好ましく、ウィスコ
ンシン配列解析パッケージの一部として利用できる。別の例としては、2つの配列の間の
最良の単一の類似領域を見つけるために、Smith及びWaterman (Advances in Applied Mat
hematics, 2:482-489, 1981)の「局所相同性」アルゴリズムを用い、比較する2つの配列
の長さが異なる場合に好ましいBESTFIT;並びに、Neddleman及びWunsch (J. Mol. Biol. 4
8:443-354, 1970)のアルゴリズムに従って「最大類似性」を発見することによって2つの
配列を整列させ、2つの配列がほぼ同じ長さであり、整列が全長で期待される場合に好ま
しいGAPが含まれる。
【００５６】
同族体の例は、動物、植物、酵母、細菌、などを含む他の種のオルソログタンパク質で
あろう。同族体は、例えば、未変性タンパク質の突然変異誘発によって選択することもで
きる。例えば、同族体は、タンパク質間相互作用を検出するアッセイと組み合わせた、部
位特異的突然変異によって同定することができる。タンパク質アフィニティークロマトグ
ラフィー、アフィニティーブロッティング、インビトロ結合アッセイ、などの別の方法が
、本発明を知る当業者に明らかとなる。
【００５７】
2つの異なる核酸又はポリペプチド配列を比較する目的で、本開示では、1配列(試験配
列)を他の配列(参照配列)と特定の「割合同一である」と記載することができる。この点
で、試験配列の長さが参照配列の長さの90%未満の場合、同一性割合は、Myers及びMiller
の論文(Bull. Math. Biol., 51:5-37 (1989))及びMyers及びMillerの論文(Comput. Appl.
Biosci., 4(1): 11-17 (1988))のアルゴリズムによって判定される。具体的には、同一
性はALIGNプログラムで判定される。デフォルトパラメータを用いることができる。
【００５８】
試験配列の長さが参照配列の長さの少なくとも90%である場合、同一性割合は、様々なB
LASTプログラムに組み込まれているKarlin及びAltschulの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. 
USA, 90:5873-77 (1993))のアルゴリズムによって判定される。具体的には、同一性割合
は「BLAST2配列」ツールで判定される。Tatusova及びMaddenの論文(FEMS Microbiol. Let
t., 174(2): 247-250 (1999))を参照。ペアワイズDNA間比較のために、BLASTN 2.1.2プロ
グラムをデフォルトパラメータ(マッチ(Match):1;ミスマッチ(Mismatch):-2;オープンギ
ャップ(Open gap):5ペナルティ;エクステンションギャップ(extension gap):2ペナルティ
;gap x_dropoff:50;エクスペクト(expect):l0;及びワードサイズ(word size):11、フィル
ター有り)で用いる。ペアワイズタンパク質間配列比較のために、BLASTP 2.1.2プログラ
ムをデフォルトパラメータ(マトリックス(Matrix):BLOSUM62;ギャップオープン(gap open
):11;ギャップエクステンション(gap extension):1;x_dropoff:15;エクスペクト(expect)
:10.0;及びワードサイズ(wordsize):3、フィルター有り)を用いて使用する。
【００５９】
本発明で用いるニューレグリンには、ニューレグリンEGFドメイン単独、ニューレグリ
ン活性を模倣し、ErbB2、ErbB3、ErbB4又はそれらの組合せと結合してそれらを活性化す
るニューレグリンEGFドメイン又はニューレグリン様遺伝子産物を含むポリペプチドも含
まれる。本明細書で用いるように、「上皮成長因子様ドメイン」又は「EGF様ドメイン」
は、その内容が全て本明細書で参照により組み込まれる、WO00/64400、Holmesらの論文(S
cience, 256:1205-1210 (1992));米国特許第5,530,109号及び5,716,930号; Hijaziらの論
文(Int. J. Oncol., 13:1061-1067 (1998)); Changらの論文(Nature, 387:509-512 (1997
); Carrawayらの論文(Nature, 387:512-516 (1997)); Higashiyamaらの論文(J. Biochem.
, 122: 675-680(1997));及びWO97/09425で開示されているように、ErbB2、ErbB3、ErbB4
又はそれらの組合せと結合してそれらを活性化し、EGF受容体結合ドメインと構造的類似
性を有する、ニューレグリン遺伝子によってコードされるポリペプチドモチーフを指す。
【００６０】
ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、NRG-1によってコードされるEGF
様ドメインを含む。一部の実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-1の受容体結合ドメイン
のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-1のアミノ酸残基17
7〜226、177〜237又は177〜240に対応するアミノ酸配列を含む。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、ヒトNRG-1のアミノ酸177〜
237に対応するアミノ酸配列
Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys 
Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe 
Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr 
Gln (配列番号1)を含む。この断片をコードするヒト核酸配列は、
agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga a
agacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctac
gtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac cag(配列番号2)である。
【００６２】
ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、NRG-2によってコードされるEGF
様ドメインを含む。ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、NRG-3によっ
てコードされるEGF様ドメインを含む。ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリ
ンは、NRG-4によってコードされるEGF様ドメインを含む。ある実施形態では、本発明で用
いるニューレグリンは、米国特許第5,834,229号に記載されているアミノ酸配列Ala Glu L
ys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn P
roを含む。
【００６３】
(C.一般の徐放技術)
本発明は、ニューレグリンの徐放のための組成物及びそれを用いて心不全などの様々な
疾患を予防、治療又は遅延させる方法を提供する。ニューレグリンの徐放は、投与スキー
ムの簡略化を可能にし、臨床効果を改善し、例えばニューレグリンの高い血中濃度に関係
する、有害事象を軽減する。ある期間にわたるニューレグリンの徐放は、心筋細胞の増殖
及び/若しくは分化、筋細胞サルコメア及び細胞骨格構造のリモデリング、又は、細胞間
接着のためのある遺伝子の発現を誘導又は維持することができるであろうと考える。
【００６４】
ニューレグリンの徐放は、当分野の技術者の判断によって、それらに限定されないが、
経口、吸入、非経口(例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内)経路を含めて、任意の経路
で投与することができる。ある実施形態では、ニューレグリンは経口投与される。ある実
施形態では、ニューレグリンは静脈内投与される。ある実施形態では、ニューレグリンは
筋肉内投与される。好ましい実施形態では、ニューレグリンは哺乳動物の血流に徐放され
る。
【００６５】
ニューレグリンは、当分野の技術者に公知である任意の徐放手段によって、又は、任意
の送達装置によって投与することができる。具体的には、当技術分野で公知のペプチドを
送達するための任意の徐放手段又は送達装置を、本発明で用いることができる。例には、
それらに限定されないが、米国特許第3,845,770号;3,916,899号;3,536,809号; 3,598,123
号;及び4,008,719号、5,674,533号、5,059,595号、5,591,767号、5,120,548号、5,073,54
3号、5,639,476号、5,354,556号、5,639,480号、5,733,566号、5,739,108号、5,891,474
号、5,922,356号、5,972,891号、5,980,945号、5,993,855号、6,045,830号、6,087,324号
、6,113,943号、6,197,350号、6,248,363号、6,264,970号、6,267,981号、6,376,461号、
6,419,961号、6,589,548号、6,613,358号、6,699,500号、6,740,634号、6,838,076号、6,
866,866号、7,087,246号に記載のものが含まれ、それぞれは本明細書で参照により組み込
まれる。そのような剤形は、様々な割合で所望の放出プロフィールを提供するために、例
えばハイドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、浸透膜、浸
透圧システム、多層膜コーティング、微小粒子、リポソーム、マイクロスフェア又はそれ
らの組合せを用いて、ニューレグリンの徐放を提供するために用いることができる。本発
明は、それらに限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルキャップ及びキャプレットなどの
、制御放出に適応させた経口投与に適当な単一の単位用量剤形も包含する。
【００６６】
ニューレグリンの徐放は、ある期間にわたってニューレグリンの連続的治療レベルを提
供する。一部の実施形態では、ニューレグリンは1時間、2時間、4時間、8時間、10時間、
12時間、14時間、16時間、20時間、24時間又はそれ以上の期間にわたって放出される。一
部の実施形態では、ニューレグリンは1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、1
0日又はそれ以上の期間にわたって放出される。他の実施形態では、ニューレグリンは1週
間、2週間、3週間、4週間又はそれ以上の期間にわたって放出される。他の実施形態では
、ニューレグリンは1ヵ月、2ヵ月、4ヵ月、8ヵ月、12ヵ月又はそれ以上の期間にわたって
放出される。他の実施形態では、ニューレグリンは1年、2年、3年、4年又はそれ以上の期
間にわたって放出される。一部の実施形態では、ニューレグリンは1時間〜2週間、2時間
〜2週間、4時間〜24時間、4日間〜10日間の期間にわたって放出される。ニューレグリン
が放出される時間は、採用する徐放技術などの様々な因子によって決まってもよい。
【００６７】
ニューレグリンの徐放は、血液中のニューレグリンをある期間所望の範囲内に、特に最
小有効治療レベル以上及び最小中毒レベル未満のレベルに維持する。徐放ニューレグリン
組成物を投与された患者のニューレグリンの血清濃度は、非徐放ニューレグリン組成物(
例えば静脈内投与)を投与された患者の血清濃度と、最大血中レベル濃度が起こる(Cmax)
ときに比較することができる。好ましい一実施形態では、徐放ニューレグリン組成物を投
与される患者は、非徐放ニューレグリン組成物を投与される患者よりも低いニューレグリ
ンの最大血清濃度(Cmax)を有する。好ましくは、徐放ニューレグリン組成物を投与される
患者は、非徐放ニューレグリン組成物を投与される患者のCmaxの約90%、80%、70%又は60%
未満のCmaxを有する。より好ましくは、徐放ニューレグリン組成物を投与される患者は、
非徐放ニューレグリン組成物を投与される患者のCmaxの約50%、40%又は30%未満のCmaxを
有する。最も好ましくは、徐放ニューレグリン組成物を投与される患者は、非徐放ニュー
レグリン組成物を投与される患者のCmaxの約20%、10%以下未満のCmaxを有する。血清中ニ
ューレグリン濃度を測定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、SKBR-3乳癌細胞
系などのErbB-2及びErbB-3受容体を発現する細胞を用いることができる。10、5、2.5、1.
25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.019及び0.0079ngのニューレグリンを氷上の
細胞を含有する異なる試験管に別々に加え、次に、放射性標識ニューレグリン(50,000cpm
)を加える。試料溶液を混合し、一晩4℃で放置する。明朝、細胞をペレット化し、上清を
吸引した後放射能を計数する。標準曲線を、放射能対非標識ニューレグリン量によって引
く。血清中ニューレグリン濃度を測定する場合、ある量の血清を氷上の細胞を含有する試
験管に加え、次に放射性標識ニューレグリン(50,000cpm)加え、試料溶液を混合し、一晩4
℃で放置する。明朝、細胞をペレット化し、上清を吸引した後放射能を計数する。放射能
を計数し、血清中のニューレグリンの量を標準曲線によって計算することができる。
【００６８】
様々な徐放プロフィールを、本発明に従って提供することができる。「徐放プロフィー
ル」は、移植/挿入又は他のニューレグリン投与方法の過程で体内で発生するニューレグ
リン総放出量の50%未満が、投与の最初の24時間以内に発生する放出プロフィールを意味
する。本発明の好ましい実施形態では、徐放プロフィールは、(a) 50%放出点が移植/挿入
又は他の投与方法から24〜48時間後の時間に起こる、(b)50%放出点が移植/挿入又は他の
投与方法から48〜96時間後の時間に起こる、(c)50%放出点が移植/挿入又は他の投与方法
から96〜168時間(1週間)後の時間に起こる、(d)50%放出点が移植/挿入又は他の投与方法
から1〜2週間後の時間に起こる、(e)50%放出点が移植/挿入又は他の投与方法から2〜4週
間後の時間に起こる、(f)50%放出点が移植/挿入又は他の投与方法から4〜8週間後の時間
に起こる、(g)50%放出点が移植/挿入又は他の投与方法から8〜16週間後の時間に起こる、
(h)50%放出点が移植/挿入又は他の投与方法から16〜52週間(1年)後の時間に起こる、及び
(i)50%放出点が移植/挿入又は他の投与方法から52〜104週間後の時間に起こる、からなる
群から選択される。
【００６９】
さらに、本発明の使用は、剤の血漿中濃度の変動程度(「DFL」)を低減させることがで
きる。DFLは、投薬間隔の間に薬剤のどれくらいの血漿レベルが変動するかの測定値であ
る。DFLがゼロ(0)に近いほど、投薬期間に存在する変動は小さい。したがって、DFLの低
下は、ピーク及びトラフの血漿レベルの差が縮小したことを示す。好ましくは、徐放組成
物を投与される患者は、非徐放組成物を投与される患者のDFLの約90%、80%、70%又は60%
のDFLを有する。より好ましくは、徐放組成物を投与される患者は、非徐放組成物を投与
される患者のDFLの約50%、40%又は30%のDFLを有する。最も好ましくは、徐放ニューレグ
リン組成物を投与される患者は、非徐放ニューレグリン組成物を投与される患者のDFLの
約20%、10%以下のDFLを有する。
【００７０】
生体分子の徐放のための当技術分野で公知の任意の技術を、本発明で用いることができ
る。一般に、投薬のサイズ及び頻度は、活性剤の薬力学的及び薬物動態学的特性によって
決定される。吸収速度が遅いほど、投薬間隔内で血中濃度の変動は小さい。これは、より
高い用量をより低い頻度で投与することを可能にする。しかし、体内で易溶である多くの
活性剤は、通常急速に吸収され、利用できる薬剤の急激なバーストを提供する。例は、急
速放出性のニフェジピン製品を服用する低血圧症患者である。徐放製品の使用は、血圧の
急降下及び反射性心頻拍などの他の重要な血行動態の変化を引き起こす初期の高血中濃度
を回避させる。
【００７１】
さらに、一部の活性剤は、体によって、例えば免疫系、プロテアーゼによって標的にさ
れ、除去又は破壊される。この理由及び他の理由のために短い半減期を有する薬剤は、血
中濃度を治療域内に維持するために、しばしば活性剤を頻繁に与える必要がある。投薬頻
度及び患者コンプライアンスの間に、逆の相関関係がある。そのような比較的短い半減期
の剤のために、徐放製品の使用は、治療的濃度を長期間維持することができる。ゆえに、
徐放製品によって提供される日用量数の減少は、コンプライアンスを改善する可能性を有
する。具体的な徐放技術が本明細書で開示されるが、本発明は、いかなる特定の徐放技術
よりも一般的である。これには、低用量のNRGの徐放が、予想外にも梗塞心臓の機能を改
善するという発見が含まれる。さらに、当技術分野で現在知られている、多数の徐放ドラ
ッグデリバリー技術がある。いくつかは好ましい徐放技術として下で一般的に議論するが
、それらは単に例示のために提供され、限定することが目的ではない。他の多くの関係の
ある及び無関係な技術が当技術分野で公知であり、本明細書で開示される本発明の実施で
使用することができる。さらに、本明細書で述べる徐放技術の組合せ及び/又は当技術分
野で公知である他の徐放技術を、本発明の実施で使用することができる。例えば、徐放ド
ラッグデリバリー技術に特定の専門知識をもつ多くの会社-例えば、Alza Corp.、Durect 
Corp.、Gilead Sciences、Baxter Pharmaceuticals、Brookwood Pharmaceuticals及びOct
oPlus-は、本発明の実施で使用することができる製品及びサービスを提供する。さらに、
特許、公開特許出願及び関連刊行物の検索は、この開示を読む当分野の技術者に、かなり
の可能な徐放技術を提供する。ゆえに、当分野の技術者は、本発明の実施で使用するため
の所望の徐放技術を選択することができる。
【００７２】
(C.1.浸透ポンプ)
本発明の一実施形態では、血液中へのNRGの徐放は、浸透ポンプの使用を含む。浸透圧
装置は、有益な活性剤を、制御された方法で長期間目標領域に送達する際の有用性を証明
した。公知の装置には、錠剤、ピル、カプセル及び植込型装置が含まれる。錠剤及びピル
は経口的に摂取することができるが、他のポンプは皮下若しくは腹腔内に移植されるか、
又は、静脈内、大脳内若しくは動脈内への注入のためにカテーテルに付着される。
【００７３】
一般に、浸透ポンプシステムでは、少なくとも1つの開口部を有する半透膜によってコ
アが包まれる。半透膜は水に透過性であるが、活性剤には不透過性である。システムが体
液にさらされると、水は半透膜を透過して浸透圧性の賦形剤及び活性剤を含有するコアに
浸透する。浸透圧がコア内で増加し、剤は、制御された所定の速度で、開口部を通して排
出される。
【００７４】
多くの浸透ポンプでは、コアは複数の内部区画を有する。例えば、第1の区画は、活性
剤を含むことができる。第2の区画は、浸透剤及び/又は「駆動部材」を含む。例えば、そ
の内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,573,776号を参照。この区画
は高いモル浸透圧を有することができ、それは、半透膜を通した水のポンプへの流入を引
き起こす。水の流入は、第1の区画を圧縮する。これは、例えば、第2の区画で、流体と接
触すると膨潤するポリマーを用いることにより達成することができる。したがって、剤は
所定の速度で排出される。
【００７５】
他の実施形態では、浸透ポンプは活性剤を含有する複数の区画を含むことができ、各区
画は同じ剤又は異なる剤を含有する。各区画の剤の濃度並びに放出速度も、同じであるか
又は異なることができる。
【００７６】
送達速度は、一般に半透膜の透水性によって制御される。ゆえに、ポンプの送達プロフ
ィールは処方される剤とは無関係にあり、剤の分子量又はその物理化学的特性は一般にそ
の送達速度と関係ない。浸透ポンプの動作原理、設計基準及び送達速度に関するさらなる
議論は、Theeuwes及びYum、「医用生体工学年報(Annals of Biomedical Engineering)」
第4巻、第4号(1976)及びUrquhartらの論文(Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199-236 
(1984))で提供され、その内容は参照により組み込まれる。
【００７７】
浸透ポンプは、当技術分野で公知であり、当分野の技術者ならば、徐放ドラッグデリバ
リーのための浸透ポンプの提供に経験のある会社から容易に入手できる。例えば、ALZAの
DUROS(登録商標)技術は、小さな薬剤、ペプチド、タンパク質、DNA及び他の生体活性巨大
分子の1年間までの送達を可能にする、植込型、非生物分解性の、浸透駆動システムであ
り;ALZAのOROS(登録商標)技術は、浸透を使用して最高24時間までの正確な制御されたド
ラッグデリバリーを提供する錠剤を具現化し;Osmotica PharmaceuticalのOsmodex(登録商
標)システムは、同じか又は異なる放出プロフィールを有する複数の薬剤層を有すること
ができる錠剤を含み;Shire LaboratoriesのEnSoTrol(登録商標)システムは、コア内の薬
剤を可溶化し、レーザーによって形成された穴を通して溶解薬剤を浸透によって送達し;A
lzet(登録商標)浸透ポンプは、マウス、ラット及び他の実験動物の研究のために用いられ
る、小型の植込型ポンプである。
【００７８】
特許、公開特許出願及び関連刊行物の検索も、この開示を読む当分野の技術者に、かな
りの可能な浸透ポンプ技術を提供する。例えば、その内容は本明細書で参照により組み込
まれる米国特許第6,890,918号;6,838,093号;6,814,979号;6,713,086号;6,534,090号;6,51
4,532号;6,361,796号;6,352,721号;6,294,201号;6,284,276号;6,110,498号;5,573,776号;
4,200,0984号及び4,088,864号は、浸透ポンプ及びそれらの製造方法を記載する。当分野
の技術者ならば、本発明の開示及びこれらの他の特許の開示を考慮して、NRGの徐放のた
めの浸透ポンプを作製することができるであろう。
【００７９】
半透膜のための一般的な物質には、当技術分野で浸透膜及び逆浸透膜として知られる半
透性ポリマー、例えばセルロースアシレート、セルロースジアシレート、セルローストリ
アシレート、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、酢酸寒天、三酢酸
アミラーゼ、βグルカンアセテート、ジメチル酢酸アセトアルデヒド、酢酸エチルカルバ
メートセルロース、ポリアミド、ポリウレタン、スルホン化ポリスチレン、酢酸フタル酸
セルロース、酢酸メチルカルバメートセルロース、酢酸コハク酸セルロース、酢酸ジメチ
ルアミノアセテートセルロース、酢酸エチルカルバメートセルロース、酢酸クロロアセテ
ートセルロース、二パルミチン酸セルロース、二オクタノン酸セルロース、二カプリル酸
セルロース、セルロースジペンタレート、酢酸吉草酸セルロース、酢酸コハク酸セルロー
ス、プロピオン酸コハク酸セルロース、メチルセルロース、酢酸p-トルエンスルホン酸セ
ルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリアニオン及びポリカチオンの共沈によって形成され
た架橋選択的半透性ポリマー、半透性ポリマー、弱架橋ポリスチレン誘導体、架橋ポリ(
スチレンスルホン酸ナトリウム)、ポリ(塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)、1
までの置換度及び50%までのアセチル含有量を有する酢酸セルロース、1〜2の置換度及び2
1〜35%のアセチル含有量を有する二酢酸セルロース、2〜3の置換度及び35〜44.8%のアセ
チル含有量を有する三酢酸セルロースが含まれ、これらは、その内容が本明細書で参照に
より組み込まれる米国特許第6,713,086号で開示されている。
【００８０】
ポンプに存在する浸透圧剤は、外部の流体に対して半透壁越しに浸透圧勾配を示す、任
意の浸透効果化合物を含むことができる。有効な剤には、それらに限定されないが、硫酸
マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、硫
酸カリウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、塩化カリウム、硫酸ナ
トリウム、d-マンニトール、尿素、ソルビトール、イノシトール、ラフィノース、ショ糖
、フルクトース、親水性ポリマー、例えばセルロースポリマー、それらの混合物などが含
まれ、これらは、その内容が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第6,713,086号
で開示されている。
【００８１】
「駆動部材」は、一般的に、体液と相互作用して膨潤又は膨張する親水性ポリマーであ
る。ポリマーは水中で膨潤し、吸収した水のかなりの部分をポリマー構造内で保持する能
力を示す。ポリマーは非常に高い程度に膨潤又は膨張し、通常2〜50倍の体積増加を示す
。ポリマーは、非架橋性のもの又は架橋性のものであることができる。本目的に適当な親
水性ポリマーは、当技術分野においては公知である。
【００８２】
開口部は、活性剤をシステムから放出するのに適当な、任意の手段及び方法を含むこと
ができる。浸透ポンプは、例えばそれに限定されないが、米国特許第4,088,864号で開示
されるレーザーの使用を含め、当技術分野で公知の物理的手法によって半透膜に設けた1
つ以上の貫通孔又は開口部を含むことができる。或いは、それは、半透膜にゼラチンプラ
グなどの浸食性のエレメントを組み込むことによって形成することができる。
【００８３】
浸透ポンプの具体的な実施形態が上で議論されているが、本発明は、いかなる特定の徐
放技術よりも一般的である。これには、NRGの徐放が梗塞心臓の機能を改善し、左心室の
内径を小さくするという発見が含まれる。現在当技術分野で公知である多くの変形形態及
び異なる種類の浸透ポンプがあり、本明細書で開示される本発明の実施で使用することが
できる。
【００８４】
(C.2.ポリ(エチレングリコール)結合)
本発明の一実施形態では、血液中へのNRGの徐放は、ポリ(エチレングリコール)(以下、
「PEG」と称す)などのポリマーへの活性剤の結合を含む。PEGを生物活性剤に結合するこ
とは、活性剤を、制御された方法で長期間目標領域に送達する際の有用性を証明した。特
に、PEGによるタンパク質の修飾は、治療的活性剤の抗原性を減少させ、それらのインビ
ボ有効性を延長させるために、バイオテクノロジー産業内で広く用いられてきた。例えば
、塩化シアヌルを用いてウシのアデノシンデアミナーゼにPEGを結合させることは、免疫
原性の低下をもたらす。同様に、ヒト成長ホルモン及び大腸菌L-アスパラギナーゼのPEG
付加物は、延長した循環内半減期を有することが示された。
【００８５】
PEGを活性剤又は他の分子、例えばリポソームの外表面に結合させることは、活性剤又
は他の分子の効力及び半減期を改善し、その毒性を低減させることもできる。特に、水性
媒体において、PEG分子は水和され、急速に運動する。この急速な運動は、PEGに大容積を
掃き出させ、他の分子、例えば免疫細胞又はプロテアーゼの接近及び干渉を予防させる。
ゆえに、PEGと結合すると、PEGポリマー鎖は、結合した分子を免疫応答及び他の排除機構
から保護し、活性剤の有効性を持続させることができる。
【００８６】
一般に、ポリエチレングリコール分子は、タンパク質上で見られる反応基を介してタン
パク質に連結される。通常、リジン残基上又はN末端にあるものなどのアミノ基が、結合
のために用いられる。米国特許第5,824,784号及び4,002,531号は、PEGを還元アルキル化
によって酵素に結合するためのそのような方法を開示する。米国特許第4,904,584号で開
示されるように、追加の結合点を提供するために、リジン残基を他のアミノ酸の代わりに
戦略的に置換するか、又はポリペプチド配列に挿入することができる。米国特許第5,932,
462号で開示されるように、タンパク質に分枝状又は「複数のアームを有する」PEG誘導体
を結合するさらなる方法が当技術分野で公知である。ポリマーをシステイン残基、カルボ
キシ基、炭水化物及び他の部分に結合するための、当技術分野で公知である他の多くの結
合方法がある。例えば、米国特許第5,900,461号は、分子上のアミノ部分の代わりにチオ
ール部分と結合することについて非常に選択的であるさらに1つの活性スルホン部分を有
するPEG誘導体及び他のポリマーを開示する。
【００８７】
PEGは、巨大分子を特定の関心領域に導くターゲティングリガンド又は部分に、巨大分
子を連結するために用いることもできる。米国特許第6,436,386号は、骨成長因子などの
活性剤の、骨などのヒドロキシアパタイト表面への送達のために、ヒドロキシアパタイト
ターゲティング部分に結合した活性剤-ポリマーコンジュゲート体を開示する。
【００８８】
PEGコンジュゲート体の調製で使用するために、多種多様なPEG誘導体が利用でき、適当
である。例えば、NOF Corp.のSUNBRIGHT(登録商標)シリーズは、様々な方法で薬剤、酵素
、リン脂質及び他の生体材料へ結合させるための、メトキシポリエチレングリコールを含
む多数のPEG誘導体、並びにメトキシPEGアミン、マレイミド及びカルボン酸などの活性化
PEG誘導体を提供し、Nektar TherapeuticsのAdvanced PEGylationも、治療法の安全及び
効力を改善するための多様なPEG結合技術を提供する。
【００８９】
特許、公開特許出願及び関連刊行物の検索も、この開示を読む当分野の技術者に、かな
りの可能なPEG結合技術及びPEG誘導体を提供する。例えば、その内容が完全に参照により
組み込まれる米国特許第6,436,386号;5,932,462号;5,900,461号;5,824,784号;4,904,584
号及び4,002,531号は、そのような技術及び誘導体、及びそれらの製造方法を記載する。
したがって、当分野の技術者ならば、本発明の開示及びこれらの他の特許の開示を考慮し
て、その徐放のためにPEG、PEG誘導体又は他の何らかのポリマーをNRGに結合させること
ができるであろう。
【００９０】
PEGは、水及び多くの有機溶媒中での溶解性、無毒性、非免疫原性、並びに透明、無色
、無臭及び安定した特性を有する公知のポリマーである。PEGの1つの用途は、ポリマーを
不溶性分子に共有結合で結合させ、生じるPEG分子コンジュゲート体を溶解性にすること
である。これらの理由及びその他のために、PEGが結合のための好ましいポリマーとして
選択されたが、それは例示のためだけに採用され、限定することが目的ではない。類似品
は、他の水溶性ポリマー、例えばそれらに限定されないが、ポリ(ビニルアルコール)、ポ
リ(プロピレングリコール)などの他のポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(オキシエチル化
グリセロール)などのポリ(オキシエチル化ポリオール)、カルボキシメチルセルロース、
デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルプルロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラ
ン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸及びポリアミノ酸で得ることが
できる。当分野の技術者は、所望の投薬量、循環時間、タンパク分解抵抗性及び他の考慮
事項に基づいて、所望のポリマーを選択することができる。
【００９１】
(C.3.リポソームパッケージング)
本発明の他の実施形態では、血液中へのNRGの徐放は、リポソームへのNRGのパッケージ
ングを含み、それは、有益な活性剤を制御された方法で長期間送達するときの有用性を証
明した。リポソームは、封入された水量を含む完全に閉じた二分子膜である。リポソーム
は、単一の膜二重層を有する単膜小胞又は複数の膜二重層を有する多重膜小胞であること
ができ、それぞれは水層によって隣接するものから分離される。生じる膜二重層の構造は
、脂質の疎水性(無極性)テールが二重層の中心に向き、親水性(極性)ヘッドは水相の方へ
向くようになっている。
一般に、リポソームドラッグデリバリーシステムにおいて、活性剤はリポソーム内に封
入され、その後、治療される患者に投与される。しかし、活性剤が親油性である場合、そ
れは脂質二重層と結合する可能性がある。
【００９２】
免疫系は従来のリポソームを外来の物体として認識し、活性剤のかなりの量が目的の疾
患部位に到達する前に、それらを破壊することができる。ゆえに、一実施形態では、リポ
ソームは、単核食細胞系の臓器、主に肝臓及び脾臓による取り込みを回避する柔軟な水溶
性ポリマーでコーティングしてもよい。リポソームを包むための適当な親水性ポリマーに
は、それらに限定されないが、その内容が完全に参照により組み込まれる米国特許第6,31
6,024号;6,126,966号;6,056,973号;6,043,094号で記載されている、PEG、ポリビニルピロ
リドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン
、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポ
リメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレ
ート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエ
チルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド(polyaspartamide)及
び親水性のペプチド配列が含まれる。
【００９３】
リポソームは、当技術分野で公知である任意の脂質又は脂質組合せで構成することがで
きる。例えば、小胞形成脂質は天然又は合成の脂質であることができ、その例には、米国
特許第6,056,973号及び5,874,104号で開示されている、ホスファチジルコリン、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグ
リセロール、ホスファチジルイノシトール及びスフィンゴミエリンなどのリン脂質が含ま
れる。小胞形成脂質は、糖脂質、セレブロシド又はカチオン性脂質、例えば1,2-ジオレイ
ルオキシ(dioleyloxy)-3-(トリメチルアミノ)プロパン(DOTAP);N-[1-(2,3-ジテトラデシ
ルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE);N-
[1[(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウム
ブロミド(DORIE);N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウ
ムクロリド(DOTMA);3[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC
-Chol);又は、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)でもよく、これらも米国特許
第6,056,973号で開示されている。米国特許第5,916,588号及び5,874,104号で開示されて
いるように、コレステロールは、小胞に安定性を付与するために適切な範囲で存在するこ
ともできる。
【００９４】
他の実施形態では、リポソームは、ターゲティングリガンド又は部分の結合によって、
哺乳動物の体内の特定の部位を標的にされる。ターゲティングリガンドは、標的細胞の表
面の受容体又は他の化合物によって認識されると考えられている。一般的な標的リガンド
には、抗体若しくは抗体フラグメント、細胞受容体リガンド、レクチンなどが含まれる。
さらなる議論のために、その内容が参照により完全に組み込まれる米国特許第6,316,024
号及び6,294,191号を参照。
【００９５】
そのようなターゲティングリガンドは、そのようなリガンドのリポソームへの共有結合
性又は非共有結合性の結合のために当技術分野で既知の任意の手段によって、リポソーム
に結合することができる。例えば、その内容が参照により完全に組み込まれる米国特許第
6,316,024号及び6,043,094号で記載されているように、ターゲティングリガンドをリポソ
ームの脂質成分の極性頭部基残基に、又は、リポソーム上で表面被覆を形成するポリマー
鎖の自由端に結合することによって、ポリマーコーティングされたリポソームは、活性剤
の部位特異送達を達成するように修飾された。そのような結合は、例えば米国特許第5,39
9,331号で記載されているように、少なくとも1つのマレイミド基及びアミン還元機能を有
する架橋剤の使用によるリポソームへのタンパク質の結合;米国特許第4,885,172号;5,059
,421号及び5,171,578号で記載されているように、糖タンパク質ストレプトアビジンの使
用によるリポソームへのタンパク質の結合;標的リポソームの多糖類によるコーティング
によって達成することができ;又は、小胞形成脂質は、親水性ポリマー鎖で誘導体化する
ことができ、それは、米国特許第6,126,966号で記載されているように、アルデヒド基に
対して反応性であるヒドラジド又はヒドラジン基の使用により抗体を結合させるために末
端を官能化する。末端官能化される基は、ジスルフィド結合により抗体又は他の分子をリ
ポソームに結合させるために、2-ピリジルジチオ-プロピオンアミドであることもできる
。
【００９６】
本発明のリポソームは、当分野の技術者に公知である標準技術によって製造することが
できる。例えば、一実施形態では、米国特許第5,916,588号で開示されているように、活
性剤の緩衝溶液が調製される。次に、適当な脂質、例えば粉末状の水素化ダイズホスファ
チジルコリン及びコレステロールをクロロホルムなどに溶解し、ロータリー蒸発によって
乾燥させる。このように形成される脂質フィルムを、ジエチルエーテルなどに再懸濁させ
、フラスコに入れ、活性剤の緩衝溶液を添加しながら水浴内で超音波処理する。エーテル
が蒸発したならば超音波処理を中止し、残りのエーテルが除去されるまで窒素気流を加え
る。他の標準の製造手順が、米国特許第6,352,716号;6,294,191号;6,126,966号;6,056,97
3号;5,965,156号及び5,874,104号で記載されている。本発明のリポソームは、それに限定
されないが上で引用した文書(その内容は本明細書で参照により組み込まれる)の方法を含
め、リポソームを作製するために当技術分野で一般に受け入れられる任意の方法によって
作製することができる。
【００９７】
リポソームは当技術分野で公知でもあり、徐放ドラッグデリバリー用のリポソームの提
供に経験のある会社から容易に入手できる。例えば、静脈内ドラッグデリバリーのための
ALZA(旧称Sequus Pharmaceuticals)のSTEALTH(登録商標)リポソーム技術は、免疫系によ
る認識を避けるためにリポソーム上のポリエチレングリコールコーティングを用い;Gilea
d Sciences(旧称Nexstar)リポソーム技術は、AmBisome(登録商標)に組み込まれ、FDAは真
菌感染の治療を承認し;NOF Corp.は、商品名COATSOME(登録商標)及びSUNBRIGHT(登録商標
)の下で、多種多様なGMP等級のリン脂質、リン脂質誘導体及びPEG-リン脂質を提供する。
【００９８】
特許、公開特許出願及び関連刊行物の検索も、この開示を読む当分野の技術者に、かな
りの可能なリポソーム技術を提供する。その内容が本明細書で参照により組み込まれる米
国特許第6,759,057号;6,406,713号;6,352,716号;6,316,024号;6,294,191号;6,126,966号;
6,056,973号;6,043,094号;5,965,156号;5,916,588号;5,874,104号;5,215,680号及び4,684
,479号は、リポソーム及び脂質コーティング微小泡並びにそれらの製造方法を記載する。
したがって、当分野の技術者ならば、本発明の開示及びこれらの他の特許の開示を考慮し
て、NRGの徐放のためのリポソームを作製することができるであろう。
【００９９】
リポソームの具体的な実施形態が上で議論されているが、本発明は、いかなる特定の徐
放技術よりも一般的である。これには、NRGの徐放が梗塞心臓の機能を改善し、左心室の
内径を小さくするという発見が含まれる。現在当技術分野で公知である多くの変形形態及
び異なる種類のリポソームがあり、本明細書で開示される本発明の実施で使用することが
できる。
【０１００】
(C.4.マイクロスフェアパッケージング)
本発明の他の実施形態では、血液中へのNRGの徐放は、NRGをマイクロスフェア内へパッ
ケージングすることを含む。マイクロスフェアは、有益な活性剤を、制御された方法で長
期間目標領域に送達する際の有用性を証明した。マイクロスフェアは一般に生物分解性で
あり、皮下、筋肉内及び静脈内の投与のために用いることができる。
【０１０１】
一般に、各マイクロスフェアは、活性剤及びポリマー分子から構成される。米国特許第
6,268,053号で開示されているように、活性剤はポリマー分子によって形成された膜内の
中央に位置することができるか、又は、内部構造が活性剤及びポリマー賦形剤のマトリッ
クスを含むので、それは代わりにマイクロスフェア全体に分散されてもよい。一般的に、
マイクロスフェアの外面は水に対して透過性であり、そのことは、水性流体がマイクロス
フェアに入ること、並びに、可溶化された活性剤及びポリマーがマイクロスフェアから出
ることを可能にする。
【０１０２】
一実施形態では、米国特許第6,395,302号で開示されているように、ポリマー膜は架橋
ポリマーを含む。架橋ポリマーの孔径が活性剤の流体力学的径以下の場合、活性剤は基本
的にポリマーが分解された場合に放出される。他方、架橋ポリマーの孔径が活性剤のサイ
ズより大きい場合、活性剤は少なくとも部分的に拡散によって放出される。
【０１０３】
マイクロスフェア膜の他の製造方法が当技術分野で公知で使用され、本明細書で開示さ
れる本発明の実施で使用することができる。外膜のための一般的な材料には、以下のカテ
ゴリーのポリマーが含まれる:すなわち、(1)炭水化物ベースのポリマー、例えばメチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロースベースのポリマー、デキストラン、ポリデキスト
ロース、キチン、キトサン及びデンプン(ヘタスターチ(hetastarch)を含む)、及びそれら
の誘導体;(2)ポリ脂肪族アルコール、例えばポリエチレンオキシド及びその誘導体、例え
ばポリエチレングリコール(PEG)、PEG-アクリレート、ポリエチレンイミン、ポリビニル
アセテート、及びそれらの誘導体;(3)ポリ(ビニル)ポリマー、例えばポリ(ビニル)アルコ
ール、ポリ(ビニル)ピロリドン、ポリ(ビニル)ホスフェート、ポリ(ビニル)ホスホン酸、
及びそれらの誘導体;(4)ポリアクリル酸及びそれらの誘導体;(5)ポリ有機酸、例えばポリ
マレイン酸、及びそれらの誘導体;(6)ポリアミノ酸、例えばポリリジン、及びポリイミノ
酸、例えばポリイミノチロシン、及びそれらの誘導体;(7)コポリマー及びブロックコポリ
マー、例えばpoloxamer 407又はPluronic L-101(商標)ポリマー、及びそれらの誘導体;(8
) tert-ポリマー及びそれらの誘導体;(9)ポリエーテル、例えばポリ(テトラメチレンエー
テルグリコール)、及びそれらの誘導体;(10)天然のポリマー、例えばゼイン、キトサン及
びプルラン、及びそれらの誘導体;(11)ポリイミド、例えばポリn-トリス(ヒドロキシメチ
ル)メチルメタクリレート、及びそれらの誘導体;(12)界面活性剤、例えばポリオキシエチ
レンソルビタン、及びそれらの誘導体;(13)ポリエステル、例えばポリ(エチレングリコー
ル)(n)モノメチルエーテルモノ(スクシンイミジルスクシネート)エステル、及びそれらの
誘導体;(14)分枝状及び環状ポリマー、例えば分枝状PEG及びシクロデキストリン、及びそ
れらの誘導体;並びに(15)ポリアルデヒド、例えばポリ(ペルフルオロプロピレンオキシド
-b-ペルフルオロホルムアルデヒド)、及びそれらの誘導体であり、これらは、その内容が
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,268,053号で開示されている。当分野の
技術者に公知である他の一般的なポリマーには、ポリ(ラクチド-コグリコリド、ポリラク
チドホモポリマー;ポリグリコリドホモポリマー;ポリカプロラクトン;ポリヒドロキシブ
チレート-ポリヒドロキシバレレートコポリマー;ポリ(ラクチド-コカプロラクトン);ポリ
エステルアミド;ポリオルトエステル;ポリ13-ヒドロキシ酪酸;及びポリ無水物が含まれ、
これらは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,517,859号で開示
されている。
【０１０４】
一実施形態では、本発明のマイクロスフェアは、別の分子に結合されるか又はそれでコ
ーティングされる。そのような分子は、ターゲティングを促進し、受容体媒介を強化し、
エンドサイトーシス又は破壊からの脱出を可能にすることができる。典型的な分子には、
リン脂質、受容体、抗体、ホルモン及び多糖類が含まれる。さらに、1つ以上の切断可能
な分子をマイクロスフェアの外面に結合させ、それを、所定部位を目標とさせることがで
きる。次に、適当な生物学的条件下で分子を切断し、標的からマイクロスフェアを放出さ
せる。
【０１０５】
本発明のマイクロスフェアは、標準の技術によって作製される。例えば、一実施形態で
は、米国特許第6,268,053号で開示されているように、エネルギー源の存在下で、粒子形
成に十分な時間溶液中の活性剤を溶液中のポリマー又はポリマー混合物と混合することに
よって、量排除が実施される。溶液のpHは、巨大分子の等電点(pI)近くのpHに調節される
。次に、溶液を熱、放射線又はイオン化などのエネルギー源に、単独で又は、超音波処理
、ボルテキシング、混合若しくは撹拌と組み合わせて曝露させ、微小粒子を形成する。次
に、生じる微小粒子を、当業技術者に公知である物理的分離法によって溶液に存在する組
み込まれなかった成分から分離し、次に洗浄することができる。他の標準の製造手順が、
その内容が完全に参照により組み込まれる米国特許第6,669,961号;6,517,859号;6,458,38
7号;6,395,302号;6,303,148号;6,268,053号;6,090,925号;6,024,983号;5,942,252号;5,98
1,719号;5,578,709号;5,554,730号;5,407,609号;4,897,268号及び4,542,025号で記載され
ている。
【０１０６】
マイクロスフェアは、当分野の技術者に公知であり、徐放ドラッグデリバリーのための
そのような技術の提供に経験のある会社から容易に入手できる。例えば、Baxter Healthc
are Corp.の子会社Epic Therapeuticsは、完全に水ベースの工程で生物浸食性のタンパク
質マイクロスフェアを生成するタンパク質-基質ドラッグデリバリーシステムであるPROMA
XX(登録商標)を開発し;OctoPlusは、表面浸食に基づくよりはむしろマトリックスの大量
分解に基づいて有効成分を放出する架橋デキストランマイクロスフェアである、OctoDEX(
登録商標)を開発し;Brookwood Pharmaceuticalsは、ドラッグデリバリーのためのその微
小粒子技術の有効性を宣伝している。
【０１０７】
特許、公開特許出願及び関連刊行物の検索も、この開示を読む当分野の技術者に、かな
りの可能なマイクロスフェア技術を提供する。例えば、その内容が完全に参照により組み
込まれる米国特許第6,669,961号;6,517,859号;6,458,387号;6,395,302号;6,303,148号;6,
268,053号;6,090,925号;6,024,983号;5,942,252号;5,981,719号;5,578,709号;5,554,730
号;5,407,609号;4,897,268号及び4,542,025号は、マイクロスフェア及びそれらの製造方
法を記載している。当分野の技術者ならば、本発明の開示及びこれらの他の特許の開示を
考慮して、NRGの徐放のためのマイクロスフェアを作製、使用することができるであろう
。
【０１０８】
(D.投薬用量及び頻度)
本発明で用いるニューレグリンの量は、疾患又は病状の性質及び重症度、並びに有効成
分が投与される経路によって異なる。頻度及び投薬量は、投与される特定の療法(例えば
治療剤又は予防剤)、障害、疾患又は病状の重症度、投与経路、並びに患者の年齢、体重
、応答及び過去の病歴によって、各患者に特異的な因子に従っても異なる。有効用量は、
インビトロ又は動物モデル試験系から導かれた用量反応曲線から推定できる。
【０１０９】
ニューレグリンの例示的な用量には、対象又は試料の1キログラム重量あたりのニュー
レグリンのミリグラム又はマイクログラム量(例えば、1キログラムにつき約1マイクログ
ラム〜1キログラムにつき約500ミリグラム、1キログラムにつき約100マイクログラム〜1
キログラムにつき約5ミリグラム、又は、1キログラムにつき約1マイクログラム〜1キログ
ラムにつき約50マイクログラム)が含まれる。本発明で用いるニューレグリンの徐放のた
めに、患者に投与される投薬量は、活性ペプチドの重量換算で、患者の体重1kgにつき一
般的に0.001mg〜15mgである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重あた
りで0.001mg/kg〜15mg/kg、0.005mg/kg〜10mg/kg、0.01mg/kg〜5mg/kg、0.001mg/kg〜4mg
/kg、0.005mg/kg〜3mg/kg、0.01mg/kg〜2mg/kg、0.001mg/kg〜1mg/kg、0.005mg/kg〜0.5m
g/kg、0.010mg/kg〜0.2mg/kg、0.005mg/kg〜0.050mg/kgである。
【０１１０】
ニューレグリンの例示的な用量には、対象又は試料の1キログラム重量あたりのニュー
レグリンの単位(U)又は単位量(例えば、1キログラムにつき約1U〜1キログラムにつき約50
00U、1キログラムにつき約10U〜1キログラムにつき約1000U、又は、1キログラムにつき約
100U〜1キログラムにつき約500U)も含まれる。本発明で用いるニューレグリンの徐放のた
めに、患者に投与される投薬量は、活性ペプチドの重量換算で、患者の体重1kgにつき一
般的に10U〜1000Uである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重あたりで
1U/kg〜10,000U/kg、1U/kg〜5000U/kg、10U/kg〜5000U/kg、10U/kg〜1000U/kg、50U/kg〜
2000U/kg、50U/kg〜1000U/kg、50U/kg〜500U/kg、100U/kg〜1000U/kg、100U/kg〜500U/kg
、100U/kg〜200U/kgである。
【０１１１】
一般には、本明細書で記載される病状のための本発明の方法におけるニューレグリンの
推奨日用量範囲は、約0.001mg〜約1000mg/日の範囲にある。具体的には、総日用量範囲は
、0.001mg/日〜15mg/日、0.005mg/日〜10mg/日、0.01mg/日〜5mg/日、0.001mg/日〜4mg/
日、0.005mg/日〜3mg/日、0.01mg/日〜2mg/日、0.001mg/日〜1mg/日、0.005mg/日〜0.5mg
/日、0.010mg/日〜0.2mg/日の範囲になければならない。患者を管理する際には、療法は
より低い用量で、恐らく約0.1μg〜約1μgで開始し、必要に応じて、患者の全体的応答に
よって単一用量又は分割用量として約20μg〜約1000μg/日まで増加させることができる
。場合によっては、当分野の技術者に明らかとなるように、本明細書で開示する範囲外の
有効成分投薬量を用いることが必要なことがある。さらに、臨床医又は治療担当医師が、
個々の患者の応答に伴い、どのように、いつ療法を中断、調節又は終了すべきかがわかる
ことに留意されたい。ある実施形態では、ニューレグリンは約1U/日〜約10,000U/日の量
で投与される。一部の実施形態では、ニューレグリンは約1U/日〜約5000U/日の量で投与
される。一部の実施形態では、ニューレグリンは約10U/日〜約2000U/日の量で投与される
。一部の実施形態では、ニューレグリンは約10U/日〜約1000U/日の量で投与される。一部
の実施形態では、ニューレグリンは約100U/日〜約200U/日の量で投与される。
【０１１２】
ニューレグリンは、投薬予定で又は「治療周期」で投与することもできる。治療周期内
のニューレグリンの日用量は、上で詳述する。治療周期は、2日、5日、7日、10日、2週間
、3週間、4週間、5週間又は6週間持続することができる。
ある実施形態では、ニューレグリンは治療周期の各日のために、毎日投与される。ある
実施形態では、ニューレグリンは、治療周期内で3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12日
の間、連続して投与される。
ある実施形態では、治療周期においてニューレグリンは周期の1日目に投与され、周期
は、1日以上のニューレグリンを投与しない日で終わる。一部の実施形態では、ニューレ
グリンは治療周期内で3、5、7又は10日の間毎日投与され、その後休止期が続く。
【０１１３】
(E.併用療法)
一実施形態では、本発明は、心肥大又は心不全を引き起こす薬剤、例えば酢酸フルドロ
コルチゾン又はherceptinで治療中の患者において、心不全及び心筋症を予防することに
役立つ。NRGは、そのような心臓疾患を引き起こす薬剤の前に、同時に又は後に投与する
ことができる。
本発明の他の実施形態では、NRGは、NRGとは異なる肥大誘導経路を抑制する作用をする
化合物の有効量と併用投与される。代わりの実施形態では、NRGは、そのような肥大サプ
レッサー及び/又は追加の成分、それらに限定されないが、うっ血性心不全の場合は、心
臓栄養阻害剤、例えばCt-1 (カルディオトロフィン-1)アンタゴニスト、ACE阻害剤、例え
ばカプトプリル(Capoten(登録商標))及び/又はヒト成長ホルモン及び/又はIGF-I(インス
リン様成長因子I)と一緒に、或いは、他の型の心不全若しくは心臓障害の場合は、他の抗
肥大性、筋心臓栄養因子、抗不整脈剤又は変力性因子と一緒に投与される。
本発明の他の実施形態では、NRGは、心不全の治療のための現行の治療手段、例えばそ
れらに限定されないが、ACE阻害剤及び他の血管拡張薬、利尿薬、ジギタリス製剤、β遮
断薬、血液抗凝結薬、アンギオテンシンII受容体遮断薬、カルシウムチャンネル遮断薬又
はカリウムと併用投与される。
【０１１４】
アンギオテンシンIからアンギオテンシンIIへの変換を阻止するACE阻害剤は、血管を拡
張させ、血圧を低下させ、心臓の仕事量を減少させる血管拡張薬である。本発明の実施形
態での使用に適当な血管拡張薬には、それらに限定されないが、以下の薬剤が含まれる:
キナプリル(Accupril(登録商標))、ラミプリル(Altace(登録商標))、カプトプリル(Capot
en(登録商標))、ベナゼプリル(Lotensin(登録商標))、フォシノプリル(Monopril(登録商
標))、リシノプリル(Prinivil(登録商標)又はZestril(登録商標))、エナラプリル(Vasote
c(登録商標))、モエキシプリル(Univasc(登録商標))、トランドラプリル及びペリンドプ
リル。本発明に役立つさらなる血管拡張薬には、それらに限定されないが、硝酸イソソル
ビド(Isordil(登録商標))、ネシリチド(Natrecor(登録商標))、ヒドララジン(アプレソリ
ーン(登録商標))、硝酸塩及びミノキシジルが含まれる。
【０１１５】
利尿薬は、腎臓に血流からナトリウム及び水を除去させ、心臓の仕事量を減少させ、そ
の例としては、それらに限定されないが以下の薬剤が含まれる:ヒドロクロロチアジド(Hy
droDIURIL(登録商標))、クロロチアジド(Diuril(登録商標))、フロセミド(Lasix(登録商
標))、ブメタニド(Bumex(登録商標))、スピロノラクトン(Aldactone(登録商標))、トリア
ムテレン(Dyrenium(登録商標))、メトラゾン(Zaroxolyn(登録商標))、トルセミド、イン
ダパミド、ポリチアジド、アミロライド及び組合せ剤(Dyazide(登録商標))。
【０１１６】
ジギタリス製剤は心臓の収縮力を増加させ、例としては、それらに限定されないが、ジ
ゴキシン(Lanoxin(登録商標))及びジギトキシンが含まれる。
β遮断薬は、より速く拍動しようとする心臓の傾向を弱め、例としては、それらに限定
されないが以下の薬剤が含まれる:カルベジロール(Coreg(登録商標))メトプロロール(Lop
ressor(登録商標)又はToprol XL(登録商標)、アテノロール、ビソプロロール、ラベタロ
ール、プロプラノロール、ソタロール、ピンドロール、ペンブトロール、アセブトロール
、チモロール、ナドロール及びベタキソロール。
【０１１７】
本発明の実施形態で使用するための血液抗凝結薬には、それらに限定されないが、ワル
ファリン(Coumadin(登録商標))及びヘパリンが含まれる。
本発明の実施形態はアンギオテンシンII受容体遮断薬を用いることもでき、それは、(A
CE阻害剤がそうするように)アンギオテンシンIIのレベルを低下させるのではなく、アン
ギオテンシンIIが心臓及び血管に影響を及ぼすことを阻止する。本発明での使用に適当な
アンギオテンシンII受容体遮断薬には、それらに限定されないが、イオサルタン(Cozaar(
登録商標))、バルサルタン(Diovan(登録商標))、イルベサルタン(Avapro(登録商標))、カ
ンデサルタン、エプロサルタン、テルミサルタン及びオルメサルタンが含まれる。
【０１１８】
カルシウムチャンネル遮断薬は、一般に、しばしば心不全と関連する高血圧症を治療す
るために用いられる。本発明での使用に適当なカルシウムチャンネル遮断薬には、それに
限定されないが、アムロジピン(Norvasc(登録商標))が含まれる。
本発明の代わりの実施形態では、NRGの徐放は、高血圧症などの心疾患の治療のための
薬物療法の投与と併用することもできる。例えば、NRGは、エンドセリン受容体に対する
抗体などのエンドセリン受容体アンタゴニスト、及びペプチド若しくは他のそのような小
分子アンタゴニスト;カルベジロールなどの3-アドレナリン受容体アンタゴニスト; x、-
アドレナリン受容体アンタゴニスト;抗酸化剤;複数の活性(例えば3-遮断薬/a-遮断薬/抗
酸化剤)を有する化合物;カルベジロールで見られる複数の機能を提供するカルベジロール
様化合物又は化合物の組合せ;成長ホルモン、その他と一緒に投与することができる。
ニューレグリンアゴニストは、単独で又は他の肥大サプレッサー経路アゴニスト若しく
は既知の肥大誘導経路に拮抗する分子との併用で、心不全の影響を予防又は軽減するため
に、心不全の哺乳動物のインビボ治療のための薬剤として役立つ。
【０１１９】
心臓障害を治療するためのアゴニストの治療製剤が、任意選択の生理的に許容される担
体、賦形剤又は安定剤(レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第16
版、Oslo, A.編、1980)で所望の純度を有するアゴニストを混合することによって、凍結
乾燥ケーキ又は水溶液の形で保管のために調製される。許容される担体、賦形剤又は安定
剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに無毒であり、その例としては、リン酸
、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(約10
残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロビンなどのタンパク質
;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ア
ルギニン又はリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単
糖、二糖及び他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;マンニトール又はソルビトールなど
の糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成対イオン;並びに/或いはツイーン、プルロニッ
クス(Pluronics)又はポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が含まれ
る。アンタゴニストは、様々な非タンパクポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポ
リプロピレングリコール又はポリアルキレンの1つと、米国特許第4,640,835号;4,496,689
号;4,301,144号;4,670,417号;4,791,192号又は4,179,337号で示される方法で適切に結合
されもする。製剤で用いる担体の量は、重量換算で約1〜99%、好ましくは約80〜99%、最
適には90〜99%の範囲でよい。
【０１２０】
インビボ投与で用いるためのアゴニストは、無菌でなければならない。これは、凍結乾
燥及び再構成の前又は後に、当技術分野で既知の方法、例えば、滅菌濾過膜による濾過に
よって容易に達成される。アゴニストは、通常、凍結乾燥された形態で又は溶液で保存さ
れる。
治療アゴニスト組成物は、一般に、無菌取出口を有する容器、例えば皮下注射針によっ
て貫通可能な栓を有する静注液バッグ又はバイアルに入れる。アゴニストの投与は、緩慢
方式だけであり、例えば、以下の経路の1つである:静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼
内、動脈内若しくは病巣内経路による注射又は注入、経口投与又は上記の持続放出システ
ムの使用。
【０１２１】
上記のように、徐放調製物の適当な例には、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマー
の半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは造形品、例えばフィルム又はマイク
ロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例え
ば、Langerら(1981) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277及びLanger (1982) Chem. Tec
h. 12: 98-105に記載のポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)又はポリ(ビニルアルコ
ール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L-グルタミン酸及びγエチ
ルL-グルタメートのコポリマー(Sidmanら(1983) Biopolymers 22: 547-556)、非分解性エ
チレン-酢酸ビニル(Langerら(1981)前掲)分解性乳酸グリコール酸コポリマー、例えばLup
ron Depot(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成される注射
可能なマイクロスフェア)、並びにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(欧州特許第133,988号)
が含まれる。
【０１２２】
アゴニストは、コロイドドラッグデリバリーシステム(例えばリポソーム、アルブミン
マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマ
ルジョンで、例えばコアセルベーション手法又は界面重合によって調製されたマイクロカ
プセル(例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及び
ポリ[メタアクリル酸メチル]マイクロカプセル)に閉じ込めることもできる。そのような
技術は、前掲のレミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)で開示されて
いる。
【０１２３】
エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは100日以上の分子放出を
可能にするが、あるヒドロゲルは、より短い期間分子を放出する。封入分子が長期間体内
に留まる場合、それらは、37℃の湿気にさらされる結果、変性又は凝集を起こし、生物活
性の消失及び免疫原性の可能な変化をもたらす可能性がある。関係する機構によって安定
化のために、例えば適当な添加剤の使用及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発に
より、合理的な戦略を考案することができる。
【０１２４】
徐放アゴニスト組成物には、リポソームに閉じ込められたアゴニストも含まれる。アゴ
ニストを含有するリポソームは、当技術分野で公知の方法、例えばDE3,218,121;Epstein
ら(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692;Hwangら(1980) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 77:4030-4034;EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;特願83-11
8008;米国特許第4,485,045号及び同第4,544,545号;及びEP102,324で開示されているもの
によって調製される。適当な徐放製剤の具体例は、EP647,449内にある。
【０１２５】
本発明の他の実施形態では、NRGは、ACE阻害剤(上記)、CT-1阻害剤、ヒト成長ホルモン
及び/又はIGF-Iを含め、うっ血性心不全を治療するための他の剤と併用されるか又は一緒
に投与される。使用される場合そのような剤の有効量は、臨床医の判断で決まる。投薬量
の管理及び調整は、うっ血性心不全の最高の管理を達成するように当分野の技術者に公知
の方法で決定され、理想的には、利尿薬又はジギタリスの使用及び低血圧症及び腎機能障
害などの病状が考慮される。用量は、さらに、用いる薬剤の種類及び治療患者の特性など
の因子によって決まる。一般的に、使用量は、薬剤がアゴニストなしで投与される場合の
使用量と同じ用量であるが、副作用の存在、治療する病状、患者の型並びにアゴニスト及
び薬剤の型などの因子によってはより低い用量を使用することができ、その場合、剤の総
量は治療する病状の有効量を提供するものとする。
具体的な実施形態で示すように、広義に記載するように、本発明の精神又は範囲から逸
脱することなく多数の変更及び/又は修正を本発明に加えることができることが、当分野
の技術者によって理解される。現在の実施形態は、したがって、あらゆる点で例示的であ
り、限定的ではないと考えるべきである。
【０１２６】
(F.キット)
本発明は、本発明の治療計画を実施するためのキットも提供する。そのようなキットは
、本明細書で記載のNRGの治療有効量を、単独で又は他の剤と組み合わせて、医薬として
許容し得る形態で、及び、本明細書で記載の徐放技術と組み合わせて1つ以上の容器に含
む。医師又は患者による徐放NRG組成物の投与のために、説明書が任意選択で含まれる。
【実施例】
【０１２７】
(G.実施例)
実施例で示すように、本発明は、NRGの徐放が他の方法によって送達されるNRGと同じく
らい効果的にAKT又はERKシグナル伝達経路を活性化し、他の方法によって送達されるNRG
よりも大きく梗塞心臓の機能を改善するという発見に存す。しかし、NRGのErbB受容体と
の相互作用が他の疾患及び障害、例えば中枢及び末梢の神経系の疾患と関連付けされてい
ることを考えると、本発明は、他の疾患及び障害にもより広い適用を有する。他の疾患及
び障害の例には、様々な心血管疾患、癌、神経系疾患及び/又は筋疾患、例えば筋ジスト
ロフィー(例えばデュシェンヌ、肢帯)及び多発性硬化症、脊髄損傷、目及び耳の疾患、糖
尿病、統合失調症並びにアルツハイマー病が含まれる。
【０１２８】
本発明は、以下のそれには限定されない実施例を参考に、さらに例示される。実施例は
、本発明の作製方法及び使用方法の完全な開示及び記載を当分野の技術者に提供するため
に提示するものであり、発明者らが彼らの発明と考えるものの範囲を限定するものではな
く、また、下の実験が全てであること又は実施した唯一の実験であることを示すものでも
ない。用いる数字に関して正確を期する努力を払ったが、多少の実験誤差及び偏差は考慮
されなければならない。
【０１２９】
(実施例1)
NRGを異なる方法によって注入した後の正常ラットの左心室におけるAKT及びERKのリン
酸化。
左心室の心筋細胞中のシグナル伝達に及ぼすNRGの影響を様々な治療方法と比較するた
めに、静脈内(以下「IV」と称す)、筋肉内(以下「IM」と称す)及びIVグルコース負荷試験
(以下「IVGTT」と称す)によってNRGを注入した。
【０１３０】
体重が180±20グラムのウィスター雄ラット(Shanghai Animal Center of Chinese Acad
emy of Science)に番号を付け、計量し、群に分割した。各群には、3匹のラットが含まれ
た。1群は、溶媒(10mM Na2HPO4-NaH2PO4、150mM NaCl、0.2%ヒト血清アルブミン(HSA)、5
%マンニトール、pH6.0)の4ml/kg(量/体重)のIV注射を投与し、対照とした。他の4群のラ
ットは、溶媒(先に述べたもの)に溶解したNRG(37.3U/mlの組換えヒトNRG断片(ヒトNRG1β
2の第177〜237番目のアミノ酸配列、Zensun Science & Technology製-バッチ番号2005030
02))の4ml/kg(量/体重)のIM注射を投与した。他の4群のラットは、NRG(先に述べたもの)
の4ml/kg(量/体重)のIV注射を投与した。他の5群のラットは、2時間のIV注射(IVGTT)によ
って、NRG(先に述べたもの)の20μl/分間のグルコース負荷試験注入を投与した。ゆえに
、各ラット(溶媒群を除く)に投与したNRGの総量は、149.3U/kg体重であった。
【０１３１】
ラットは、20分、1時間、2時間、4時間及び6時間時に別々に屠殺した。プール後、各群
のラットの左心室を冷却溶解緩衝液(50mMトリスpH7.4、5mM EDTA、150mM NaCl、1%トリト
ンX-100、2mM Na2VO4、50mM NaF、2mM PMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル(無EDTA、Roch
e))中で細断し、冷却PBSで洗浄した。次に心室を氷水中でホモジナイズし、1.5mlエッペ
ンドルフ試験管を用いて4℃で5分間12,000rpmにより遠心分離した(Kendro Biofuge)。上
清を収集し、さらに1度回転させ、-80℃で保存した。使用時に試料を解凍し、再び回転さ
せた。各試料のタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ(Pierce BCAタンパク質アッセ
イキット)で測定した。各試料のある量を2倍の試料緩衝液(0.125Mトリスph6.8、20%グリ
セロール、4% SDS、0.2M DTT、0.012%ブロモフェノールブルー)と混合し、電気泳動のた
めに沸騰させてからPVDF膜(Millipore)へ移した。AKT及びERKのリン酸化、並びに各試料
中のAKT及びERKの量は、抗体(ERK抗体及びリン酸化ERK抗体(Santa Cruz Biotechnology);
AKT抗体及びリン酸化AKT抗体(Cell Signaling))で検出した。
【０１３２】
NRGをこれらの異なる方法のそれぞれによって注入したときの正常ラットの左心室にお
けるAKT及びERKのリン酸化の経過を、図1に示す。溶媒と比較して、IM、IV及びIVGTTによ
って注入したNRGの全ては、ERKの持続的リン酸化を活性化した。各方法によって誘導され
たAKTリン酸化は20分時にピークに達し、1時間時に減少したが、2時間時に再び増加し、4
時間〜6時間時に高レベルを維持した。ゆえに、ERK及びAKTのリン酸化を持続させるそれ
らの能力に関して、NRGを注射する異なる方法の間に明らかな差はない。これは、継続的
に注入されるNRGがNRGの注射と同程度に有効であることを示す。ゆえに、IVGTT注入は、
悪い心臓状態を治療するための可能な方法である。
【０１３３】
(実施例2)
異なる方法によりニューレグリンで治療した後の左心室冠状動脈結紮ラット心臓の機能
浸透ポンプは(IVGTTのように)継続的にNRGを送達する方法であるので、浸透ポンプによ
って注入されたNRGが心筋梗塞(MI)心臓の機能の回復において従来のIV注射と同程度に有
効かどうかを試験した。
【０１３４】
(A.ラット左心室冠状動脈結紮及び心エコー検査)
体重が200±20グラムのウィスター雄ラット(Shanghai Animal Center of Chinese Acad
emy of Science)を、100mg/kg(薬剤/体重)のケタミンの腹腔内注射により麻酔をかけた。
首及び胸部を脱毛し、清潔にした。中央前部の首を切開して気管を露出させた。18G套管
針を、気管の第3及び第5の軟骨の間の気管に挿入した。針を引き抜いた後、プラスチック
カニューレを1〜2cm気管に押し込み、固定してローデントベンチレータ(SAR-830/Pベンチ
レータ-吸気流速、1ml/100g/呼吸;呼吸数、60呼吸/分)を連結した。左前胸部も切開した
。皮膚を遠慮なく切開して第4及び第5本目の肋骨を露出させ、次に、第4肋骨を肘状のモ
スキート鉗子で切断した。ベンチレータ(先に述べたもの)をカニューレに連結し、オンに
し、心臓を露出させて肺及び心臓の状態を確認した。心臓を切開を通して露出させた後に
、心膜を引き裂き、左心房及び肺動脈円錐を特定した。それらの間の左心室冠動脈前下行
枝を6/0医学縫合糸で強く結紮した後、心臓を胸郭に戻した。胸壁を縫合した。ベンチレ
ータをブロックして肺を満たした。胸腔内の空気を穏やかに引き出した後、胸部の筋肉及
び皮膚を縫合した。継続的自発呼吸が再開するまで、ベンチレータをラットから取り出し
た。
次に、結紮後14日目に、ラットの心機能を心エコー検査(Philips Sonos 7500 S4 probe
)によって検査した。30〜50%の駆出分画(以下「EF」)値を有するラットを分離して、グル
ープ分けした(群につき15ラット)。
【０１３５】
(B.結紮ラットのニューレグリンによる治療。)
左心室冠状動脈結紮の後15日目にラットを計量して、必要とされるNRGの量を決定した
。溶媒群のラットは、IV注射により0.4ml/100g(量/体重)の溶媒を投与した。溶媒は5日間
1日に1回注射し、2日間停止し、次にまた5日間注射した。
IM及びIV群のラットは、それぞれNRGのIM及びIV注射を投与した(NRGの量は149.3U/kg(
タンパク質/体重)であり、量は0.4ml/100gであった)。NRGは5日間1日に1回注射し、2日間
停止し、次にまた5日間注射した。
【０１３６】
さらに下で述べるように、IVGTT群は、グループ分け後5日目に浸透ポンプ(ALZET浸透ポ
ンプ2ML1)を移植した。各ポンプは2mlのNRG溶液を含有し、それは933.1UのNRG(ラットの
体重が約250gになっていたので)を含有し、注入速度は約18.7U/kg/時間であった。ゆえに
、最大薬剤濃度は、IV注射による約2.67U/kgに匹敵した。
7日後、全てのラットの心機能を心エコー検査(Philips Sonos 7500 S4 probe)によって
再度検査した。その翌日、ラットの心機能をさらに確認するために、血液動態パラメータ
検査及び解剖学的検査も実施した。
【０１３７】
(B.1.ラットへの浸透ポンプの移植(全ての工程を無菌で行うべきである))
1mlの滅菌水及び1mlの滅菌0.9%生理食塩水を、フード内で連続してNRGのバイアルに注
入した(993.1U、62.5μg)。NRG溶液を滅菌注射器に引き抜いた。注射器の先の鈍くなった
針は交換し、注射器内の泡は除去した。ポンプを直立に保持し、針を、直立ポンプの上端
の小径孔を通して行けるところまで挿入した。プランジャーをゆっくり押し、溶液がポン
プからオーバーフローし始めるまでポンプにNRG溶液を加えた。針を抜き、ポンプを清潔
に拭いた。流量調節器の透明キャップをはずし、短いステンレス鋼管を露出させた。次に
鋼管を5cmのPE60管の一端に挿入した。注射器針をPE60管の他の端に挿入した。注射器の
プランジャーを押して、それが満ちるまでNRG溶液を流量調節器に加えた。次に、流量調
節器の長い管を、その白色のフランジがポンプに付くまで、ポンプに挿入した。針を流量
調節器から引き抜いてから、ポンプを37℃で一晩、滅菌0.9%生理食塩水に浸した。
【０１３８】
ラットは、ケタミンで麻酔をかけた(先に述べたように)。ラットの首及び肩の間の領域
を脱毛させ、清潔にした。体は、滅菌の湿った布で覆った。次に、肩甲骨の間の皮膚を注
意深く切開し、外頸静脈を見つけて分離した。心臓からの静脈の遠位末端を結紮した。外
頸静脈の壁に目ばさみで小さな穴をあけ、微鉗子で拡大させた。浸透ポンプに連結したPE
60管を、その穴を通して2cm静脈に挿入した。次に、心臓からの静脈の近位端をPE60管と
結合させ、管を固定した。PE60管周辺の静脈の遠位末端を固く縛り、さらに管を固定した
。止血剤を用いて、切開部から肩甲骨まで皮膚を遠慮なく分離してトンネルを形成した。
最後に、さらに皮膚を広げることによって、ラットの背中の肩甲骨中間領域にポケットを
形成した。ポンプは、トンネルを通してポケット内へ滑らせ、流量調節器は切開部から遠
位を向いていた。次に、皮膚切開部を縫合した。復活後、ラットを動物室に戻し、通常通
り飼育した。
【０１３９】
(C.実験結果)
IVGTT及びIVによるNRG注入後のMI心臓の機能を、下の表1で示す。表1で、「IVS」、「L
VEDD」、「PW」、「LVESD」、「EF」、「FS」及び「CC」は、それぞれ心室中隔、左心室
拡張終期寸法、後部肉厚、左心室収縮終期寸法、駆出分画、分画短縮及び心臓周期を表す
。ここでは、EF及びFSは、心臓の、特に左心室の収縮性を反映する。
EF=(拡張終期容積-収縮終期容積)/拡張終期容積
FS=(拡張終期の寸法-収縮終期の寸法)/拡張終期の寸法
【０１４０】
表1で、溶媒群のそれらの対応物と比較してIVGTT又はIV群のLVEDD、LVESD、EF及びFSに
ついてはP＜0.01であり、非常に有意な差を示す。
【表１】
2014122214.tif 000002
【０１４１】
浸透ポンプによって注入されたNRGは、IV群と比較してMIラットの心機能を劇的に強化
した。特に、左心室の機能を推定するために用いることのできる心臓の血液ポンピング効
率の測定法であるEF値は、IVGTT群では溶媒群のそれより59.18%高く、IV群より34.81%高
かった。さらに、左心室の能力を測定する方法でもあるFS値は、IVGTT群では溶媒群のそ
れより73.79%高く、IV群より44.0%高かった。これらの結果は、NRGの徐放が、心機能を改
善するための従来のIV注射よりも有効であることを示す。
【０１４２】
驚くべきことに、浸透ポンプによって注入されたNRGは、IV群と比較してMIラットの心
機能を大きく向上させただけでなく、左心室の内径を低減させた。具体的には、IVGTT群
の平均左心室拡張終期寸法(以下「LVEDD」と称す)は、溶媒群のそれより9.98%小さく、IV
群より6.03%小さかった。さらに、IVGTT群の左心室収縮終期寸法(以下「LVESD」と称す)
は、溶媒群のそれより21.37%小さく、IV群より15.15%小さかった。これらの結果は、継続
的にNRGを投与することが左心室容積及び質量を低減させ、それによって左心室の健康及
び能力を改善することができることを示す。
【０１４３】
(実施例3)
ニューレグリンをシリンジポンプ(Zhejiang University Medical Instrument Co. LTD.
WZS 50-F2)によって継続的に静脈内注入した後の心筋梗塞性ラットの心臓機能
この例では、ヒト患者でニューレグリンの徐放のためにシリンジポンプが用いられる。
シリンジポンプは、ラット尾部の静脈に刺した針によって、溶液を一定の速度で連続的に
血流に送ることができる。シリンジポンプでは、注入時間及び速度を制御することは簡単
である。治療のための時間及び速度を改善するために、ニューレグリンを1日につき異な
る速度で異なる時間シリンジポンプによってMIラットに静脈内注入した。
【０１４４】
グループ分けしたMIラットは、10日間毎日4ml/kg(量/体重)の溶媒の静脈注射で(A群);
又は、10日間毎日10μg/kgのニューレグリン(2.5μg/ml)の静脈注射で(B群);又は、10日
の間1.25μg/kg/時間で1日4時間のニューレグリン(0.625μg/ml)の静脈内シリンジポンプ
注入で(C群);又は、10日の間2.5μg/kg/時間で1日4時間のニューレグリン(1.25μg/ml)の
静脈内シリンジポンプ注入で(D群);又は、10日の間0.625μg/kg/時間で1日8時間のニュー
レグリン(0.625μg/ml)の静脈内シリンジポンプ注入で(E群);又は、10日の間1.25μg/kg/
時間で1日8時間のニューレグリン(1.25μg/ml)の静脈内シリンジポンプ注入で(F群)で処
置した。次に、心臓の機能を検査するために、全ての群について心エコー検査を実施した
。
【０１４５】
【表２】
2014122214.tif 000003
【０１４６】
表2で示すように、溶媒群と比較して、IVによるニューレグリン(B群)はMIラットのEF値
を20.29%高め、4時間/日の静脈内シリンジポンプ注入(C、D群)はIVと同程度に有効であっ
たが、8時間/日の静脈内シリンジポンプ注入によるニューレグリン(E、F群)はEF値を約37
.10%高めた。同時に、溶媒群と比較して、IV注射によるニューレグリン(B群)はMIラット
のFS値を23.61%高め、4時間/日の静脈内シリンジポンプ注入(C、D群)はIVと同程度に有効
であったが、8時間/日の静脈内シリンジポンプ注入によるニューレグリン(E、F群)はFS値
を約45.49%高めた。驚くべきことに、E群のMIラットにはF群のニューレグリンの半量だけ
を投与したが、EF又はFS値はほとんど同じである。結果は、ニューレグリンを1日8時間以
上シリンジポンプによって連続的に静脈内注入した後、それが心機能を高めることができ
ることを示した。
【０１４７】
(実施例4)
浸透ポンプによるNRGの徐放皮下注入の後のMIラットの心機能
左心室冠状動脈結紮及びラットへの浸透ポンプの移植は実施例2の場合と同様に実施し
たが、ポンプに注入したNRGの量は1791.3U(125μg)であり、ポンプは、NRG注入を皮下に
するために管を静脈に連結せずに包埋した。注入速度は、37.33U/kg/時間である。
【０１４８】
IV注入は徐放皮下注入と同時に開始されたので、IV群は7日間NRGで治療された。IV群の
NRGの量も、223.95U/kgに変更した。
徐放皮下及びIVによるNRG注入後のMI心臓の機能を、表3で示す。表3で、溶媒群のそれ
らの対応物と比較してIVGTT及びIV群のLVEDD、LVESD、EF及びFSについてはP＜0.01であり
、非常に有意な差を示す。
【０１４９】
【表３】
2014122214.tif 000004
【０１５０】
表3は、NRGの徐放皮下注入が、IV群及び溶媒群と比較して、MIラットの心機能を有意に
強化したことを示す。溶媒群と比較して、NRGの徐放皮下注入は、MI心臓のEF値を42.77%
、FS値を51.75%高めた。上記のように、EF及びFS値は、心臓の血液ポンピング効率を測定
する方法であり、左心室の機能を推定するために用いることができる。したがって、これ
らの結果は、NRGの徐放が、心機能を改善するための従来のIV注射よりもかなり有効であ
ることを示す。
【０１５１】
NRGの徐放皮下注入は、左心室の内径も低減させた。具体的には、溶媒群と比較して、M
I心臓のLVEDDは10.98%減少し、LVESDは18.72%減少した。この実験でのNRGのIV注射は、溶
媒と比較して、MI心臓の心機能に明らかな影響を及ぼさなかった。結果は、NRGの徐放皮
下注入が左心室の容積及び質量を減少させ、それによって左心室の健康及び能力を改善す
ることができることを示し、そのことは、それを心不全の治療法として用いることもでき
ることを示唆する。
【０１５２】
(実施例5)
ニューレグリンをシリンジポンプによって継続的に皮下注入した後の心筋梗塞性ラット
の心臓機能
ニューレグリンを1日につき異なる速度で異なる時間、シリンジポンプによってMIラッ
トにさらに注入した。
【０１５３】
グループ分けしたMIラットは、10日間毎日4ml/kg(量/体重)の溶媒の静脈注射で(A群);
又は、10日間毎日10μg/kgのニューレグリン(2.5μg/ml)の静脈注射で(B群);又は、10日
間毎日10μg/kgのニューレグリン(2.5μg/ml)の皮下注射(HI)で(C群);又は、10日の間2.5
μg/kg/時間で1日4時間のニューレグリン(1.25μg/ml)の皮下シリンジポンプ注入で(D群)
;又は、10日の間1.67μg/kg/時間で1日6時間のニューレグリン(1.11μg/ml)の皮下シリン
ジポンプ注入で(E群);又は、10日の間1.25μg/kg/時間で1日8時間のニューレグリン(1.25
μg/ml)の皮下シリンジポンプ注入で(F群)で処置した。次に、心臓の機能を検査するため
に、全ての群について心エコー検査を実施した。
【０１５４】
【表４】
2014122214.tif 000005
【０１５５】
表4で示すように、溶媒群と比較して、IVによるニューレグリン(B群)はMIラットのEF値
を10.43%高め、皮下注射によるニューレグリン(C群)はMIラットのEF値を7.12%高めたが、
4時間/日の皮下シリンジポンプ注入によるニューレグリン(D群)はEF値を12.47%高め、6時
間/日の皮下シリンジポンプ注入によるニューレグリン(E群)はEF値を一気に22.90%に高め
、8時間/日の皮下シリンジポンプ注入によるニューレグリン(E群)もEF値を20.10%高めた
。これと同時に、溶媒群と比較して、IVによるニューレグリン(B群)はMIラットのFS値を1
1.24%高め、皮下注射によるニューレグリン(C群)はMIラットのFS値を7.10%高めたが、4時
間/日の皮下シリンジポンプ注入によるニューレグリン(D群)はFS値を14.20%高め、6時間/
日の皮下シリンジポンプ注入によるニューレグリン(E群)はFS値を一気に26.63%に高め、8
時間/日の皮下シリンジポンプ注入によるニューレグリン(E群)もFS値を26.04%高めた。結
果は、ニューレグリンを1日6時間以上シリンジポンプによって連続的に皮下注入した後、
それが心機能を劇的に高めることができることを示した。
【０１５６】
(実施例6)
NRGのPEG結合及びPEG結合NRGの活性
A、PEG結合及びPEG結合NRGの単離
PEG(mPEG-SPA-5000、NEKTAR)を1mg/ml NRG(PEG:NRG=1:1、モル比)を含有する10mlの20m
M PBS(pH8.0)に加え、速やかに混合し、混合物を室温で30分間穏やかに撹拌し、次に、氷
酢酸の一定量を加えて結合反応を停止させた。次に、成分を分離するために、混合物をゲ
ル濾過カラム(S100、Pharmacia)に加えた。各ピークの分画を収集し、SDS-PAGEのために
その試料を調製した。電気泳動の後、ゲルをBaI2及びクーマシーブリリアントブルーによ
って順番に染色し、PEG及びNRGを別々に検出した。
【０１５７】
BaI2染色したゲルについて図2で示すように、混合物はPEGモノマー、NRG-モノPEG、NRG
-ジPEG及びNRG-ポリPEGを含む。混合物をS100ゲル濾過カラムに加えた後、成分はNRG-ポ
リPEG及びNRG-ジPEG(ピーク1)、NRG-モノPEG及びPEG(ピーク2)にきれいに分離された。
図3のクマシー染色ゲルは、ピーク1及びピーク2がPEGに結合したNRGを含み、ピーク3が
NRGだけを含むことをさらに確認した。
【０１５８】
B、PEG結合NRGの活性の測定
MCF-7細胞を収集、計数、ペレット化し、DMEM(10%血清及び9μg/mlインスリンを含む)
で5×104細胞/mlに再懸濁した。100μl細胞懸濁液を96穴プレートの各ウェルに加え、プ
レートを37℃で一晩インキュベートした。次に細胞をPBSで3回洗浄し、さらに24時間無血
清DMEMで増殖させた。
ErbB2抗体H4(Zensun、抗ErbB2モノクローナル抗体)をコーティング緩衝液(50mM Na2CO3
-NaHCO3、pH9.6)で6μg/mlに希釈し、96穴プレートに50μl/ウェルで加えた。プレートを
4℃で一晩放置し、抗体でコーティングした。
【０１５９】
DMEMを飢餓させたMCF-7細胞から吸引し、DMEM中のNRG、NRG-モノPEG又はNRG-ジPEGの連
続希釈液100μlを、各ウェルに別々に加えた。ブランクとして、DMEMを2つのウェルに加
えた。プレートは37℃で20分間インキュベートした。細胞をPBSで1度洗浄した後、100μl
/ウェルの溶解緩衝液(25ml溶液につき50mM Hepes、pH8.0、150mM NaCl、2mMオルトバナジ
ウム酸ナトリウム、0.01%チメロサール、1%トリトンX-100及び1プロテアーゼ阻害剤カク
テル錠剤)を加え、4℃で30分間溶解した。次にプレートを穏やかに振盪し、細胞を完全に
溶解してプレートから取り出し、15000rpmで15分間遠心分離にかけた。
コーティング抗体を有するプレートを洗浄緩衝液(10mM PBS、pH7.4、0.05%ツイーン20)
で5回洗浄してから、脱脂乳の5%洗浄緩衝液溶液200μl/ウェルを加えた。プレートを37℃
で2時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で再び3回洗浄した。
【０１６０】
90μlの溶解細胞溶液を培養プレートの各ウェルから引き抜き、コーティングしたプレ
ート中の対応ウェルへ移した。37℃で1時間インキュベートした後、細胞溶解物を含むコ
ーティングされたプレートを洗浄緩衝液で再び5回洗浄し、適当な濃度の西洋ワサビペル
オキシダーゼ(HRP)結合抗ホスホチロシンモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology
)の100μlにより、37℃で1時間処理した。プレートを洗浄緩衝液で再び5回洗浄した後、1
00μlの新たに調製したHRP基質溶液[50mMクエン酸、100mM Na2PO4、pH5.0、0.2mg/ml 3,3
',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)、0.003% H2O2]を各ウェルに加えてから、プレート
を37℃で10分間インキュベートした。最後に、50μlの2N H2SO4を各ウェルに加えて、HRP
活性を破壊した。各ウェルの450nmでのOD値をマイクロプレートリーダー(BIORAD Model 5
50)で読むと、EC50値は、最大OD値の50%を達成したNRGの濃度であった。EC50値が低いほ
ど、活性は高い。
NRG、NRG-モノPEG及びNRG-ジPEGのEC50値は、表5で示した。
【０１６１】
【表５】
2014122214.tif 000006
表5から、NRG-モノPEGのEC50値はNRGのそれと同じであるが、NRG-ジPEGのEC50値は40%
高いことを明らかに見ることができる。これは、NRG-モノPEGはインビトロでNRGと同じ活
性を有するが、NRG-ジPEGの活性は40%低いことを意味する。
【０１６２】
(実施例7)
ニューレグリンの徐放は、ニューレグリン投与の副作用を減少させる
この実施例は、長期又は高用量投与と比較して、ニューレグリンの徐放は、ニューレグ
リン投与に付随する胃腸障害又は心外膜滲出液などの副作用を軽減することができること
を示す。
NRG-1βを、それぞれ24匹の健康なアカゲザル(雄12匹雌12匹、体重約5〜7kg)からなる2
群のサルに、シリンジポンプによって静脈内投与した。第I群には、14日間、NRG-1βを1
μg/kg/時間の速度で1日12時間注入した。この群では、副作用は観察されなかった。第II
群には、14日間、1μg/kg/時間の速度で1日24時間注入した。第II群では、サルの心臓で
約3〜5mlの心外膜滲出液が観察された。
【０１６３】
2群の健康な個体に、1日につき同量のNRG-1βを10日間投与した。第I群の8個体には、1
0日間、NRG-1βを0.3μg/kg/時間の速度で1日4時間注入した。この群では、各個体は、10
日の期間中に平均で約2回胃腸障害を経験した。6個体には、10日間、NRG-1βを0.6μg/kg
/時間の速度で1日2時間注入した。第II群では、各個体は、10日の期間中に平均で約5回胃
腸障害を経験した。
これらの結果は、ニューレグリンの徐放が、長期又は高用量のニューレグリン投与に付
随する有害副作用を軽減することができることを示す。これらの結果は、短期又は低い日
用量の静脈内又は皮下注入が、24時間ニューレグリン注入の副作用を軽減することができ
ることを示唆する。
【０１６４】
(実施例8)
心筋梗塞ラットの左心室における徐放されたNRGによる遺伝子発現
この実施例では、心筋梗塞ラットにNRG-1βを注入し、これらのラットの左心室におけ
る遺伝子発現パターンをマイクロアレイによって分析した。溶媒を注入した心筋梗塞ラッ
トと比較して、NRGを注入したラットは異なる遺伝子発現パターンを有する。NRGの徐放の
後、サイモシンβ様タンパク質のmRNAレベルは、3.10倍増加し;デフェンシンβ1のmRNAレ
ベルは、2.87倍増加し;増殖関連タンパク質のmRNAレベルは、2.16倍増加し;サイモシンβ
4、ラミニンγ1、ミオカルジン、PI3Kγ調節サブユニットのmRNAレベルは、ほとんど全て
2倍になり、エラスチン及びPI3KγのmRNAレベルは前とほとんど同じであった。それは、
ニューレグリンが心臓の様々なタンパク質の発現レベルを変化させることを示す。
【０１６５】
本発明の範囲は、実施例の記載に限定されない。本発明の範囲及び精神から逸脱するこ
となく、本発明の修正及び変更が当分野の技術者にとっては明らかになろう。したがって
、本発明の範囲は、例として提示されている具体的実施例によってではなく、添付の請求
項によって規定されるべきであることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】NRGが筋肉内注射、静脈内注射及び静脈内ブドウ糖負荷試験注入によって注入された後の、ラットの左心室におけるAKT及びERKのリン酸化を経時的に示す図である。「P-AKT」、「P-ERK」及び「NRG」は、リン酸化されたAKT、リン酸化されたERK及びニューレグリンを意味する。「im」、「iv」及び「ivgtt」は、それぞれ筋肉内注射、静脈内注射及び静脈内ブドウ糖負荷試験を意味する。
【図２】PEGを検出するためにBaI2によって染色したゲルを示す図である。図では、「混合物」はそれらの反応後の、PEG及びNRGの混合物の溶液を意味する。「M」、「ピーク1」、「ピーク2」及び「ピーク3」は、タンパク質マーカー並びにS100カラムからの混合液の溶出ピーク分画1、2及び3を表す。「NRG-モノ-PEG」、「NRG-ジ-PEG」及び「NRG-ポリ-PEG」は、それぞれ1つのPEG、2つのPEG及び複数(少なくとも3つ)のPEGに結合したNRGを意味する。
【図３】NRGタンパク質を検出するためにクマシー染色したゲルを示す図である。略記号は、図2の場合と同じである。Mレーンでは、各バンド(下から上へ)の分子量は、それぞれ14.4kD、20.1kD、31.0kD、43.0kD、66.2kD及び97.4kDである。
【図１】
2014122214.tif 000007
【図２】
2014122214.tif 000008
【図３】
2014122214.tif 000009
【配列表】
2014122214000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月19日(2013.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、ニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項２】
心臓でAKTシグナル伝達経路を活性化する徐放組成物であって、ニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項３】
心臓でERKシグナル伝達経路を活性化する徐放組成物であって、ニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項４】
哺乳動物のEF値を高める徐放組成物であって、NRGを含む、前記組成物。
【請求項５】
哺乳動物のFS値を高める徐放組成物であって、NRGを含む、前記組成物。
【請求項６】
心肥大を予防する徐放組成物であって、一定低用量NRGの徐放のために製剤された、NRGを含む、前記組成物。
【請求項７】
心筋細胞の増殖及び分化を引き起こす徐放組成物であって、一定低用量ニューレグリンを徐放し、それにより心細胞でMAPキナーゼ経路を活性化し、かつ心筋細胞の増殖及び/又は分化を引き起こすために製剤された、ニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項８】
心筋細胞の増殖及び分化を引き起こす徐放組成物であって、一定低用量ニューレグリンを徐放し、それにより心細胞でERK経路を活性化し、かつ心筋細胞の増殖及び分化を引き起こすために製剤された、ニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項９】
心筋細胞の増殖及び分化を引き起こす徐放組成物であって、一定低用量ニューレグリンを徐放し、それにより心細胞でAKT経路を活性化し、かつ心筋細胞の増殖及び分化を引き起こすために製剤された、ニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項１０】
左心室の内径を低減させるための徐放組成物であって、ニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項１１】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、浸透ポンプ及び治療有効量のニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項１２】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、PEG及び治療有効量のニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項１３】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、リポソーム及び治療有効量のニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項１４】
哺乳動物の疾患又は障害を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、マイクロスフェア及び治療有効量のニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項１５】
哺乳動物の心不全を予防、治療又は遅延させるための徐放組成物であって、ニューレグリンを含む、前記組成物。
【請求項１６】
ニューレグリン治療を受ける哺乳動物の副作用を低減させるための、ニューレグリンを含む、徐放組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本明細書で用いるように、「上皮成長因子様ドメイン」又は「EGF様ドメイン」は、その内容が全て本明細書で参照により組み込まれる、WO00/64400、Holmesらの論文(Science, 256:1205-1210 (1992));米国特許第5,530,109号及び5,716,930号; Hijaziらの論文(Int. J. Oncol., 13:1061-1067 (1998)); Changらの論文(Nature, 387:509-512 (1997); Carrawayらの論文(Nature, 387:512-516 (1997)); Higashiyamaらの論文(J. Biochem., 122: 675-680(1997));及びWO97/09425で開示されているように、ErbB2、ErbB3、ErbB4又はそれらの組合せと結合してそれらを活性化し、EGF受容体結合ドメインと構造的類似性を有する、ニューレグリン遺伝子によってコードされるポリペプチドモチーフを指す。ある実施形態では、EGF様ドメインは、ErbB2/ErbB4又はErbB2/ErbB3ヘテロダイマーと結合してそれらを活性化する。ある実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-1の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-1のアミノ酸残基177〜226、177〜237又は177〜240に対応するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-2の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-3の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、EGF様ドメインは、NRG-4の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、EGF様ドメインは、米国特許第5,834,229号に記載されているアミノ酸配列Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro（配列番号：3）を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、NRG-2によってコードされるEGF様ドメインを含む。ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、NRG-3によってコードされるEGF様ドメインを含む。ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、NRG-4によってコードされるEGF様ドメインを含む。ある実施形態では、本発明で用いるニューレグリンは、米国特許第5,834,229号に記載されているアミノ酸配列Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro（配列番号：3）を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014122214000001.app
【外国語明細書】
2014122214000001.pdf