(57)【要約】      （修正有）【課題】炎症および／または内毒素ショックの治療および／または炎症性ケモカインのレベルの減少に関し、ならびに、炎症および／または内毒素ショックの治療における使用のためのまたは炎症性メディエータのレベルの減少のための組成物の提供。【解決手段】ケメリンタンパク質のＣ末端に由来するペプチドを含有する医薬組成物であって、ペプチドは、ケメリンタンパク質のＣ末端またはそのアナログもしくは誘導体に由来する約５から約３０の間のアミノ酸を含む。より好ましくは、ペプチドは、約５から約２５の間のアミノ酸であり、好ましくは、ペプチドは、約５から約２０の間のアミノ酸である。【選択図】図１Ｆ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症の治療のための医薬の製造における、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の使用。
【請求項２】
内毒素ショックの治療のための医薬の製造における、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の使用。
【請求項３】
１以上の炎症性メディエータのレベルを減少させるための医薬の製造における、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の使用。
【請求項４】
対象における炎症を治療、予防または回復する方法であって、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項５】
対象における内毒素ショックを治療、予防または回復する方法であって、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項６】
対象における１以上の炎症性メディエータのレベルを減少する方法であって、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項７】
前記１以上の炎症性メディエータが、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−２（ＣＣＬ８）、ＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）、ＧＲＯβ（ＣＸＣＬ２）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＴＥＣＫ（ＣＣＬ２５）、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、インターフェロンγおよびランテス（ＣＣＬ５）を含む群から選択される、請求項３に記載の使用または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
創傷の治療のための医薬の製造における、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の使用。
【請求項９】
対象における創傷を治療、予防または回復する方法であって、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記医薬が、治療的および／または予防的および／または美容的用途のためのものである請求項１、２、３、７または８に記載の使用、または、前記治療が、治療的および／または予防的および／または美容的である請求項４、５、６、７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが約５から約３０の間のアミノ酸である、前述の何れかの請求項に記載の使用または方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する約５から約３０の間のアミノ酸またはそのアナログもしくは誘導体を含む、前述の何れかの請求項に記載の使用または方法。
【請求項１３】
前記ケメリンタンパク質のＣ末端に由来するペプチドは、天然のケメリンタンパク質のＣ末端と少なくとも３０％またはそれ以上の配列同一性を有する、前述の何れかの請求項に記載の使用または方法。
【請求項１４】
前記ペプチドは、配列番号３１（ヒト配列）または配列番号３４（マウス配列）によるケメリンタンパク質の最後の５から最後の３０の間のアミノ酸と、少なくとも３０％の配列同一性を有する、前述の何れかの請求項に記載の使用または方法。
【請求項１５】
前記アナログまたは誘導体が、天然の配列を有するペプチドの少なくとも約５０％の抗炎症活性、および／または抗内毒素ショック活性、および／または炎症性メディエータのレベルを低減する活性を有する、前述の何れかの請求項に記載の使用または方法。
【請求項１６】
１以上の前記ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０の配列を有する、または、それらのアナログまたは誘導体である、前述の何れかの請求項に記載の使用または方法；または  １以上の前記ペプチドが、配列番号３７および３８の配列を有する、または、それらのアナログまたは誘導体である、前述の何れかの請求項に記載の使用または方法。
【請求項１７】
前記ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の１以上のペプチドと、少なくとも３０％の配列同一性を有する、請求項１６に記載の使用または方法；または、
前記ペプチドは、配列番号３７または３８の１以上のペプチドと少なくとも３０％の配列同一性を有する、請求項１６に記載の使用または方法。
【請求項１８】
ペプチドアナログまたは誘導体が、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来するペプチドの小分子擬態物を含む、請求項１から１５の何れか１項に記載の使用または方法。
【請求項１９】
前記ペプチド、またはそのアナログもしくは誘導体が、約１０ｐｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの間の用量の投与が意図される、前述の何れかの請求項に記載の使用または方法。
【請求項２０】
前記ペプチド、またはそのアナログもしくは誘導体が、約１０ｐｇ／ｋｇから約１００ｎｇ／ｋｇの間の用量の投与が意図される、請求項１９に記載の使用または方法。
【請求項２１】
ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が浸透した医療装置。
【請求項２２】
ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が浸透した創傷包帯または絆創膏。
【請求項２３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０の配列を有するペプチドならびにそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される１以上のペプチド、および医薬的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物；または
配列番号３７および３８の配列を有するペプチドならびにそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される１以上のペプチド、および医薬的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２４】
炎症の治療および／または予防、および／または内毒素ショックの治療および／または予防のための、および／または１以上の炎症性メディエータのレベルの減少のための、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
創傷の治療のための請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の配列を有するペプチドまたはそれらのアナログもしくは誘導体；または
配列番号３７または３８の配列を有するペプチドまたはそれらのアナログもしくは誘導体。
【請求項２７】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の配列を有するペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチド；または
配列番号３７または３８の配列を有するペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチド。
【請求項２８】
炎症の治療および／または予防、および／または内毒素ショックの治療および／または予防における使用のための、および／またはサイトカインおよびケモカインといった１以上の炎症性メディエータのレベルの減少のための、；または創傷の治療のための、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、炎症および／または内毒素ショックの治療および／または炎症性ケモカインのレベルの減少に関し、ならびに、炎症および／または内毒素ショックの治療における使用のためのまたは炎症性メディエータのレベルの減少のための組成物に関する。
【０００２】
炎症は、多くのヒトおよび動物の疾病の病因を構成し、結果として、ヒトまたは動物の体における組織に対して身体的、化学的または外傷性の損傷を生じさせる。一般に、免疫応答は、血管拡張、好中球の遊走、化学走性および血管透過性の増大をもたらす、内因性の化学的メディエータの全身的放出に帰着する。免疫応答は、どこで生じようとも、何が原因であろうとも、本質的に同じである。応答は急性でありえ（短く存続）、または、慢性であり得る（長く続く）。
【０００３】
しばしば敗血症性ショックとも言及される内毒素ショックは、炎症様応答をもたらす大量の内毒素に対して、血管内がさらされることを原因として生じると考えられる。内毒素への暴露は、ＴＮＦαおよびＩＬ−１を含む多数サイトカインの生産をもたらす。第ＶＩＩ因子を含む補体系および凝集カスケードも刺激される。この反応の結果は、組織損傷、熱、血管拡張、頻脈および血管内凝集でありえる。
【０００４】
炎症部位において、栄養素、酸素、抗体および治療剤への接触を増大させ、ならびに繊維素形成および毒素の希釈化を増大させるため、炎症反応は典型的に有益である。しかしながら、炎症が望ましくない場合または長引く場合、組織にダメージを与え得る。そのような状況において、抗炎症剤がしばしば使用される。２つの主要な種類の抗炎症剤、副腎皮質ステロイドおよび非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）が存在する。これらの薬剤のほとんどは、望ましくない副作用を有する。副腎皮質ステロイドの長引く投与は、しばしば、クッシング症候群（コルチゾールの生産過剰をもたらす副腎の不調）に似た重大な副作用に関与する。その他の潜在的な副作用は、体重増加、胸、顔、首および背中上部における脂肪蓄積、浮腫、高血圧症、糖尿病、乏しい創傷治癒、感染症に対する感受性の増大、皮膚の薄層化、情緒不安定およびうつ病を含む。ＮＳＡＩＤＳの最も重大な副作用は、損傷または外科手術の後における腎不全、肝不全、潰瘍および長引く出血である。一部の人はＮＳＡＩＤに対してアレルギーを有し、喘息の人は、アスピリンへの重大なアレルギー反応を経験するリスクがより高い。それ故、抗炎症効果を有する代替となる薬剤を同定する必要がある。
【０００５】
ケメリン（Ｃｈｅｍｅｒｉｎ）は、腹水液および関節液を含む一連のヒト炎症性滲出液中に豊富に存在するタンパク質である(Wittamer V et al. J Exp Med. Oct 6 2003;198(7):977-985; Meder Wet et al. FEBS Lett. Dec 18 2003;555(3):495-499)。ヒトケメリンは、プロケメリンと言及される１６３のアミノ酸（ａａ）前駆体（ハツカネズミおよびマウスの等価物は１６２ａａである）として分泌され、ＮおよびＣ端末の切断を受けて、１３７ａａの走化性のあるタンパク質となる（ハツカネズミでは１４０ａａ）(Wittamer V et al. J Exp Med. Oct 6 2003;198(7):977-985; Zabel BA et al. J Biol Chem. Oct 14 2005;280(41):34661-34666; Wittamer V et al. J Immunol. Jul 1 2005;175(1):487-493; Samson M et al. Eur J Immunol. May 1998;28(5):1689-1700)。ケメリンの予測される構造は、ケモカインと構造的な類似性を示し、異常のあるカルボキシル末端、αプリーツシートおよびβヘリカルアミノ末端ドメインを潜在的に有する「リバース」ケモカインとして記述されている(Zabel BA et al. Exp Hematol. Aug 2006;34(8):1021-1032)。構造は、活性化の達成するためにタンパク質分解プロセスを受けるカテリシジンおよびキニノーゲンに存在するシスタチンフォールドを暗示させる(Zabel BA et al. Exp Hematol. Aug 2006;34(8):1106-1114; Colman RW, Biol Chem. Jan 2001;382(1):65-70; Yamasaki K et al. FASEB J. October 1, 2006 2006;20(12):2068-2080)。
【０００６】
第1の側面によると、本発明は、炎症の治療のための医薬の製造における、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の使用を提供する。
【０００７】
別の側面によると、本発明は、内毒素ショックの治療のための医薬の製造における、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の使用を提供する。
【０００８】
更なる側面によると、本発明は、１以上の炎症性メディエータのレベルを減少させるための医薬の製造における、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の使用を提供する。
【０００９】
更に別の側面によると、本発明は、炎症の治療および／または内毒素ショックの治療における使用のための、および／または、１以上の炎症性メディエータのレベルを減少するための、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を提供する。
【００１０】
１以上の炎症性メディエータは、サイトカイン、ケモカインおよび炎症を仲介する脂質を含んでよい。炎症性メディエータは、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−２（ＣＣＬ８）、ＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）、ＧＲＯβ（ＣＸＣＬ２）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＴＥＣＫ（ＣＣＬ２５）、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、インターフェロンγおよびランテス（ＣＣＬ５）を含む群から選択される１以上のケモカインを含んでよい。好ましくは、医薬は、ＴＮＦαのレベルを減少することができる。
【００１１】
驚くべきことに、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来するペプチドは抗炎症特性を有し、炎症および／または内毒素ショックを治療、予防または回復するために使用してもよい。
【００１２】
医薬は、治療的および／または予防的用途を有してよい。
【００１３】
好ましくは、ペプチドは、約５から約３０の間のアミノ酸である。より好ましくは、ペプチドは、約５から約２５の間のアミノ酸であり、好ましくは、ペプチドは、約５から約２０の間のアミノ酸である。
【００１４】
好ましくは、ペプチドは、ケメリンタンパク質のＣ末端またはそのアナログもしくは誘導体に由来する約５から約３０の間のアミノ酸を含む。より好ましくは、ペプチドは、約５から約２５の間のアミノ酸であり、好ましくは、ペプチドは、約５から約２０の間のアミノ酸である。
【００１５】
ケメリンタンパク質という言及は、ケメリンのプロセスされた形態を意味し、このプロセスにおいて、プレプロケメリンに見つかるＮ末端アミノ酸がタンパク質分解的に除去され、プロケメリン前駆体に見つかるＣ末端アミノ酸がタンパク質分解的に除去され、ケメリンと称される活性を有した切断型のタンパク質が生じる。
【００１６】
好ましくは、ペプチドは、ケメリンのヒトまたは非ヒトの形態に由来する。好ましくは、ペプチドは、ケメリンのヒトまたは哺乳類の形態に由来する。哺乳類非ヒトケメリンは、ラットまたはマウスのようなげっ歯動物、馬、犬、猫、雌牛、羊またはブタに由来してよい。
【００１７】
好ましくは、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来するペプチドは、天然のケメリンタンパク質のＣ末端と、少なくとも３０％またはそれ以上の配列同一性を有する。好ましくは、ペプチドは、ケメリンタンパク質のＣ末端における天然のペプチド配列と、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００１８】
好ましくは、ペプチドは、ケメリンタンパク質のＣ末端において天然に生じるアミノ酸の最後の約５から約３０の間、好ましくは最後の約１０から約２５の間と、少なくとも３０％またはそれ以上の配列同一性を有する。好ましくは、ペプチドは、ケメリンタンパク質のＣ末端において天然に生じるアミノ酸の最後の約５から約３０の間、好ましくは最後の約１０から約２５の間と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００１９】
好ましくは、ペプチドは、ケメリンタンパク質のＣ末端において天然に生じる最後の３０アミノ酸の５から２５の間と、少なくとも３０％またはそれ以上の配列同一性を有する。好ましくは、ペプチドは、ケメリンタンパク質のＣ末端において天然に生じる最後の３０アミノ酸の５から２５の間と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００２０】
ケメリンタンパク質における「最後のアミノ酸」という言及は、タンパク質のＣ末端におけるアミノ酸を意味する。
【００２１】
ヒトおよびマウスのケメリン、プロケメリンおよびプレプロケメリンの全長配列は図２Ａに示されており、ヒトタンパク質はそれぞれ配列番号３１、３２、３３、マウスタンパク質はそれぞれ配列番号３４、３５、３６である。好ましくは、ケメリンペプチドは、配列番号３１または３４の配列を有する。 ウシやラットといったその他の種に由来するケメリンタンパク質の配列は、既にＧｅｎＢａｎｋから利用でき、当業者は容易にアクセスできる。
【００２２】
好ましくは、ペプチドは、配列番号３１（ヒト配列）および配列番号３４（マウス配列）によるケメリンの最後の５から最後の３０の間のアミノ酸と、少なくとも３０％またはそれ以上, より好ましくは、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００２３】
パーセントアミノ酸配列同一性は、配列を整列し、必要に応じて最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後における、天然のケメリンタンパク質のアミノ酸と同一の配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者に既知の多数の方法で行うことができ、例えばＢＬＡＳＴおよびＡＬＩＧＮアルゴリズムを使用する方法を含む。
【００２４】
ペプチドは、それが、本来の配列のペプチドに対して、少なくとも５０％の抗炎症活性、および／または、少なくとも５０％の抗内毒素ショック活性、および／または、少なくとも５０％までの１以上の炎症性メディエータのレベルを減少させる能力を有している限り、ケメリンタンパク質のＣ末端の本来の配列に対する付加、挿入、欠失、転換または移動を含んでよい。
【００２５】
「アナログ」または「誘導体」という用語は、天然の配列とは異なる配列を有するものの、天然の配列を有するペプチドに対して、同等以上、および少なくとも約５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％または９０％の抗炎症活性および／または抗内毒素ショック活性、炎症性メディエータ減少活性を本質的に有するペプチドを意味する。
【００２６】
ペプチドアナログまたは誘導体は、Ｎ末端またはＣ末端残基を含む任意のアミノ酸残基の、１以上の欠失、挿入または修飾を有してよい。ペプチドは、アセチル化、アシル化、アルキル化、糖鎖形成等されてよい。ペプチドは、さらに、ＣもしくはＮ末端の何れかまたは両末端に付加的なアミノ酸を含んでよい。
【００２７】
ペプチド、アナログまたは誘導体は、融合タンパク質の一部でよい。
【００２８】
ペプチドは、天然のアミノ酸配列と比較して、１以上の保存的アミノ酸配列置換を含んでよい。
【００２９】
好ましくは、１以上のペプチドは、以下を含む群から選択される配列を含む：
ＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡ（ケメリン１１−マウス；Ｃ１１ｍ；配列番号１）；
ＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１２−マウス；Ｃ１２ｍ；配列番号２）；
ＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１３−マウス；Ｃ１３ｍ；配列番号３）；
ＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡ（ケメリン１５−マウス；Ｃ１５ｍ；配列番号４）；
ＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１６−マウス；Ｃ１６ｍ；配列番号５）；
ＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１７−マウス；Ｃ１７ｍ；配列番号６）；
ＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡ（ケメリン１２Ａ−マウス；Ｃ１２Ａｍ；配列番号７）；
ＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡ（ケメリン１３Ａ−マウス；Ｃ１３Ａｍ；配列番号８）；
ＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡ（ケメリン１４Ａ−マウス；Ｃ１４Ａｍ；配列番号９）；
ＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１３Ｂ−マウス；Ｃ１３Ｂｍ；配列番号１０）；
ＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１４Ｂ−マウス；Ｃ１４Ｂｍ；配列番号１１）；
ＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１５Ａ−マウス；Ｃ１５Ａｍ；配列番号１２）；
ＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１４Ｃ−マウス；Ｃ１４Ｃｍ；配列番号１３）；
ＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１５Ｂ−マウス；Ｃ１５Ｂｍ；配列番号１４）；
ＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１６Ａ−マウス；Ｃ１６Ａｍ；配列番号１５）；
ＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡ（ケメリン１１−ヒト；Ｃ１１ｈ；配列番号１６）；
ＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１２−ヒト；Ｃ１２ｈ；配列番号１７）；
ＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１３−ヒト；Ｃ１３ｈ；配列番号１８）；
ＡＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡ（ケメリン１５−ヒト；Ｃ１５ｈ；配列番号１９）；
ＡＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１６−ヒト；Ｃ１６ｈ；配列番号２０）；
ＡＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１７−ヒト；Ｃ１７ｈ；配列番号２１）；
ＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡ（ケメリン１２Ａ−ヒト；Ｃ１２Ａｈ；配列番号２２）；
ＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡ（ケメリン１３Ａ−ヒト；Ｃ１３Ａｈ；配列番号２３）；
ＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡ（ケメリン１４Ａ−ヒト；Ｃ１４Ａｈ；配列番号２４）；
ＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１３Ｂ−ヒト；Ｃ１３Ｂｈ；配列番号２５）；
ＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１４Ｂ−ヒト；Ｃ１４Ｂｈ；配列番号２６）；
ＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦ（ケメリン１５Ａ−ヒト；Ｃ１５Ａｈ；配列番号２７）；
ＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１４Ｃ−ヒト；Ｃ１４Ｃｈ；配列番号２８）；
ＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１５Ｂ−ヒト；Ｃ１５Ｂｈ；配列番号２９）；および
ＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１６Ａ−ヒト；Ｃ１６Ａｈ；配列番号３０）；
またはそれらのアナログもしくは誘導体。
【００３０】
好ましくは、１以上のペプチドは、以下を含む群から選択される配列を含む：
ＡＱＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１９−マウス；Ｃ１９ｍ；配列番号３７）；および
ＱＲＡＧＥＤＰＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳ（ケメリン１９−ヒト；Ｃ１９ｈ；配列番号３８）；またはそれらのアナログもしくは誘導体。
【００３１】
好ましくは、ペプチドは、上において配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０として言及される１以上のペプチドと、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００３２】
好ましくは、ペプチドは、上において配列番号３７または３８として言及される１以上のペプチドと、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００３３】
好ましくは、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来するペプチドのアナログまたは誘導体は、ペプチドの小分子擬態物を含む。
【００３４】
ペプチド、アナログまたは誘導体は、本来のシステムから単離されてよく、または、合成的にまたは組み換えで生産されてよい。合成されたペプチドは、自動化された方法による合成を含む標準的化学的方法によって生産してよい。
【００３５】
組換えタンパク質は精製された形態で使用してよい。あるいは、組換えタンパク質を発現する細胞からの上清を使用してよい。
【００３６】
ペプチド、アナログまたは誘導体は、より大きなタンパク質または分子複合体の一部を形成してよい。
【００３７】
ペプチドは直鎖または環状であってよい。
【００３８】
ペプチドはプロテアーゼ耐性の骨格を含んでよい。
【００３９】
ペプチドはＣおよび／またはＮ末端における修飾を含んでよい。
【００４０】
ペプチドは、当該分野で既知の方法によって、例えば放射性ラベル、蛍光性ラベル、質量分析タグ、ビオチン等でラベルされてよい。
【００４１】
医薬は、その他の既知の抗炎症剤および／またはその他の既知の抗内毒素ショック剤および／またはケモカインレベルを減少されることが既知のその他の薬剤を含む、その他の活性成分を含んでよい。
【００４２】
医薬は、さらに、医薬的に許容可能な賦形剤を含んでよい。賦形剤は、大きな巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、トレハロース、脂質凝集物および不活性ウィルス粒子を含んでよい。そのような賦形剤は当業者に周知であろう。
【００４３】
医薬は、さらに、１以上の緩衝剤、粘性増加剤、溶剤、安定剤および防腐剤を含んでよい。
【００４４】
医薬の投与経路は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、損傷内、関節内、局所、経口、直腸、経鼻、吸入またはその他の適切な経路による注射または注入であってよい。
【００４５】
使用されるペプチドの用量は、ペプチド、標的および治療に依存するだろう。用量および投与経路の決定は、通常の医師の技術に属す。標準的投与計画は、約１ｐｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで変化してよく、より好ましくは、用量は、約１０ｐｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、約１０ｐｇ／ｋｇから約１００ｎｇ／ｋｇであろう。好ましくは、これらの用量は１日当たりの用量である。
【００４６】
驚くべきことに、本発明によるペプチドの０．３２ナノグラム／ｋｇ程度に低い用量が、マウスにおける無菌の腹膜炎に対して有効であるのに対し、同程度の効果得るためには、１．２ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンが要求されることがわかった。
【００４７】
好ましくは、本発明の使用による医薬は、約１０ｐｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの間の用量で、より好ましくは、約１０ｐｇ／ｋｇから約１００ｎｇ／ｋｇの間、または約１０ｐｇ／ｋｇから約１０ｎｇ／ｋｇの間の用量での投与を意図してよい。これらの用量は、必要とされるデキサメタゾンの用量より少なくとも３ｌｏｇ低い。
【００４８】
別の側面によると、本発明は、対象における炎症を治療、予防または回復する方法であって、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４９】
別の側面によると、本発明は、対象における内毒素ショックを治療、予防または回復する方法であって、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００５０】
別の側面によると、本発明は、対象における１以上の炎症性メディエータのレベルを減少する方法であって、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００５１】
治療は、治療的、予防的または美容的であってよい。
【００５２】
好ましくは、ペプチドは、有効な量で、すなわち、（ｉ）炎症の低下を誘導するまたは引き起こすために、または、炎症を予防または減少するために；（ｉｉ）内毒素ショックの低下を誘導するまたは引き起こすために、または、内毒素ショックを予防または減少するために；および／または（ｉｉｉ）１以上の炎症性メディエータのレベルを減少するために十分な量で投与される。
【００５３】
あるいは、本発明の医薬は、装置に関連する炎症のリスクを減らすために、医療装置に直接適用されてよい。これは、装置の表面に医薬を適用することによって、または、装置の表面にケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を浸透させることによって達成してよい。
【００５４】
別の側面によると、本発明は、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が浸透した医療装置を提供する。
【００５５】
医療装置はステントまたはカテーテルであってよい。
【００５６】
別の側面によると、本発明は、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が浸透した創傷包帯または絆創膏を提供する。
【００５７】
本発明の任意の側面において言及される炎症は、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（硬皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、サーコイドーシス、自己免疫溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、自己免疫性炎症性疾病（例えば、アレルギー性脳脊髄炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、甲状腺亢進症、硬皮症、全身性紅斑狼瘡、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、限局性腸炎、遠位性回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、終末回腸炎）、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、同種異系移植片拒絶反応、糖尿病、免疫介在性腎臓病（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経および末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害またはギラン・バレー症候群、および慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆汁性疾病例えば、伝染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎およびその他の肝臓指向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、グルテン過敏性腸疾患、ホイップル病、水疱性皮膚病、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫介在性または免疫介在性皮膚病、乾癬、アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症およびじんましん、肺の免疫疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎、移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患ウイルス病を含む感染症、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染症）、疱疹など、細菌感染、真菌感染症、原生動物感染症、寄生性感染症および呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスなど、湿疹および内毒素ショックといった症状に関連してよい。
【００５８】
更なる側面によると、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の配列を有するペプチドならびにそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される、炎症を治療、予防または回復できるペプチドを提供する。
【００５９】
更なる側面によると、本発明は、配列番号３７、３８の配列を有するペプチドおよびそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される、炎症を治療、予防または回復できるペプチドを提供する。
【００６０】
更なる側面によると、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の配列を有するペプチドならびにそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される、内毒素ショックを治療、予防または回復できるペプチドを提供する。
【００６１】
更なる側面によると、本発明は、配列番号３７、３８の配列を有するペプチドおよびそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される、内毒素ショックを治療、予防または回復できるペプチドを提供する。
【００６２】
更なる側面によると、本発は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の配列を有するペプチドならびにそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される、１以上の炎症性メディエータのレベルを減少できるペプチドを提供する。
【００６３】
更なる側面によると、本発明は、配列番号３７、３８の配列を有するペプチドおよびそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される、１以上の炎症性メディエータのレベルを減少できるペプチドを提供する。
【００６４】
別の側面によると、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０の配列を有するペプチドならびにそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される１以上のペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００６５】
別の側面によると、本発明は、配列番号３７および３８の配列を有するペプチドならびにそれらのアナログまたは誘導体を含む群から選択される１以上のペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
医薬組成物は、炎症の治療および／または予防のため、および／または、内毒素ショックの治療および／または予防のため、および／または、サイトカインおよびケモカインといった１以上の炎症性メディエータのレベルの減少のためであってよい。
【００６７】
更なる側面によると、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の配列を有するペプチドまたはそれらのアナログもしくは誘導体を提供する。
【００６８】
更なる側面によると、本発明は、配列番号３７または３８の配列を有するペプチドまたはそれらのアナログもしくは誘導体を提供する。
【００６９】
更なる側面によると、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の配列を有するペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチドを提供する。好ましくは、ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の配列を有するペプチドに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するペプチドを有する。
【００７０】
更なる側面によると、本発明は、配列番号３７または３８の配列を有するペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチドを提供する。好ましくは、ペプチドは、配列番号３７または３８の配列を有するペプチドに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有する。
【００７１】
更なる側面によると、本発明は、創傷の治療のための医薬の製造における、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の使用を提供する。
【００７２】
更なる側面によると、本発明は、対象における創傷を治療、予防または回復する方法であって、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００７３】
更なる側面によると、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３７または３８の配列を有するペプチドまたはそれらのアナログもしくは誘導体を含む群から選択される１以上のペプチドを含む、創傷の治療のための医薬組成物を提供する。
【００７４】
更なる側面によると、本発明は、炎症の治療および／または予防における使用のための、および／または、内毒素ショックの治療および／または予防における使用のための、および／または、サイトカインおよびケモカインといった１以上の炎症性メディエータのレベルの減少のためのケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を提供する。
【００７５】
更なる側面によると、本発明は、創傷の治療における使用のための、ケメリンタンパク質のＣ末端に由来する１以上のペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を提供する。
【００７６】
当業者は、上に議論された任意の望ましい特徴は、本発明の任意の側面に適用することができると認識するだろう。
【００７７】
本発明の好ましい実施例を、単に例示として、以下の図および例に関連して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ケメリン１４０が、タンパク質分解依存様式でマクロファージによる炎症性メディエータの生産を抑えることを示す。マクロファージまたは活性化マクロファージ由来の上清（１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンγで処理）について、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＥＬＩＳＡのアッセイを使用して、サイトカイン発現を分析した。示された用量の組み換えマウスケメリンまたはデキサメタゾンの存在下または非存在下で、およびプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（１５ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、細胞をインキュベートした。図１Ｃ−マクロファージサイトカインｍＲＮＡレベルの量を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ＩＬ−１０、ＴＧＦβ）によって定量し、ＨＰＲＴに標準化した。図１Ｄ−ＰＭΦを、ケメリン（０．１−１ｐＭ）±百日咳毒素（ＰＴＸ；２００ｎｇ／ｍｌ）で前処理し、その後、ＬＰＳ／ＩＦＮγ−負荷に供した。図１Ｅ−ＰＭΦは、１時間ケメリン（１ｐＭ）±ＰＴＸで前処理した後、次に、４時間、８時間または１５時間ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルに対して、＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１；＊，ｐ＜０．０５。ケメリン処理サンプルに対して、＃＃＃，ｐ＜０．００１；＃＃，ｐ＜０．０１；＃，ｐ＜０．０５。図１Ｆ−腹膜マクロファージ（ＰＭΦ）は、ケメリン（１ｐＭ）、ケメリン（１ｐＭ）＋プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン［ロイ］、Ｅ−６４、ペファブロック［ペファ］、ペプスタチンＡ［ペプＡ］、カルペプチン［カル］、カテプシンＳ阻害剤［カテＳ］、カテプシンＬ阻害剤［カテＬ］）で１時間前処理した後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間刺激した。グラフは、３−８の独立した実験からの平均値±ＳＥＭを示す。ｎｄ；このアッセイの検出限界以下。ｎｓ、有意でない。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ケメリン１４０が、タンパク質分解依存様式でマクロファージによる炎症性メディエータの生産を抑えることを示す。マクロファージまたは活性化マクロファージ由来の上清（１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンγで処理）について、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＥＬＩＳＡのアッセイを使用して、サイトカイン発現を分析した。示された用量の組み換えマウスケメリンまたはデキサメタゾンの存在下または非存在下で、およびプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（１５ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、細胞をインキュベートした。図１Ｃ−マクロファージサイトカインｍＲＮＡレベルの量を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ＩＬ−１０、ＴＧＦβ）によって定量し、ＨＰＲＴに標準化した。図１Ｄ−ＰＭΦを、ケメリン（０．１−１ｐＭ）±百日咳毒素（ＰＴＸ；２００ｎｇ／ｍｌ）で前処理し、その後、ＬＰＳ／ＩＦＮγ−負荷に供した。図１Ｅ−ＰＭΦは、１時間ケメリン（１ｐＭ）±ＰＴＸで前処理した後、次に、４時間、８時間または１５時間ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルに対して、＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１；＊，ｐ＜０．０５。ケメリン処理サンプルに対して、＃＃＃，ｐ＜０．００１；＃＃，ｐ＜０．０１；＃，ｐ＜０．０５。図１Ｆ−腹膜マクロファージ（ＰＭΦ）は、ケメリン（１ｐＭ）、ケメリン（１ｐＭ）＋プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン［ロイ］、Ｅ−６４、ペファブロック［ペファ］、ペプスタチンＡ［ペプＡ］、カルペプチン［カル］、カテプシンＳ阻害剤［カテＳ］、カテプシンＬ阻害剤［カテＬ］）で１時間前処理した後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間刺激した。グラフは、３−８の独立した実験からの平均値±ＳＥＭを示す。ｎｄ；このアッセイの検出限界以下。ｎｓ、有意でない。
【図１Ｃ】図１Ａおよび１Ｂは、ケメリン１４０が、タンパク質分解依存様式でマクロファージによる炎症性メディエータの生産を抑えることを示す。マクロファージまたは活性化マクロファージ由来の上清（１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンγで処理）について、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＥＬＩＳＡのアッセイを使用して、サイトカイン発現を分析した。示された用量の組み換えマウスケメリンまたはデキサメタゾンの存在下または非存在下で、およびプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（１５ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、細胞をインキュベートした。図１Ｃ−マクロファージサイトカインｍＲＮＡレベルの量を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ＩＬ−１０、ＴＧＦβ）によって定量し、ＨＰＲＴに標準化した。図１Ｄ−ＰＭΦを、ケメリン（０．１−１ｐＭ）±百日咳毒素（ＰＴＸ；２００ｎｇ／ｍｌ）で前処理し、その後、ＬＰＳ／ＩＦＮγ−負荷に供した。図１Ｅ−ＰＭΦは、１時間ケメリン（１ｐＭ）±ＰＴＸで前処理した後、次に、４時間、８時間または１５時間ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルに対して、＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１；＊，ｐ＜０．０５。ケメリン処理サンプルに対して、＃＃＃，ｐ＜０．００１；＃＃，ｐ＜０．０１；＃，ｐ＜０．０５。図１Ｆ−腹膜マクロファージ（ＰＭΦ）は、ケメリン（１ｐＭ）、ケメリン（１ｐＭ）＋プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン［ロイ］、Ｅ−６４、ペファブロック［ペファ］、ペプスタチンＡ［ペプＡ］、カルペプチン［カル］、カテプシンＳ阻害剤［カテＳ］、カテプシンＬ阻害剤［カテＬ］）で１時間前処理した後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間刺激した。グラフは、３−８の独立した実験からの平均値±ＳＥＭを示す。ｎｄ；このアッセイの検出限界以下。ｎｓ、有意でない。
【図１Ｄ】図１Ａおよび１Ｂは、ケメリン１４０が、タンパク質分解依存様式でマクロファージによる炎症性メディエータの生産を抑えることを示す。マクロファージまたは活性化マクロファージ由来の上清（１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンγで処理）について、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＥＬＩＳＡのアッセイを使用して、サイトカイン発現を分析した。示された用量の組み換えマウスケメリンまたはデキサメタゾンの存在下または非存在下で、およびプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（１５ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、細胞をインキュベートした。図１Ｃ−マクロファージサイトカインｍＲＮＡレベルの量を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ＩＬ−１０、ＴＧＦβ）によって定量し、ＨＰＲＴに標準化した。図１Ｄ−ＰＭΦを、ケメリン（０．１−１ｐＭ）±百日咳毒素（ＰＴＸ；２００ｎｇ／ｍｌ）で前処理し、その後、ＬＰＳ／ＩＦＮγ−負荷に供した。図１Ｅ−ＰＭΦは、１時間ケメリン（１ｐＭ）±ＰＴＸで前処理した後、次に、４時間、８時間または１５時間ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルに対して、＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１；＊，ｐ＜０．０５。ケメリン処理サンプルに対して、＃＃＃，ｐ＜０．００１；＃＃，ｐ＜０．０１；＃，ｐ＜０．０５。図１Ｆ−腹膜マクロファージ（ＰＭΦ）は、ケメリン（１ｐＭ）、ケメリン（１ｐＭ）＋プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン［ロイ］、Ｅ−６４、ペファブロック［ペファ］、ペプスタチンＡ［ペプＡ］、カルペプチン［カル］、カテプシンＳ阻害剤［カテＳ］、カテプシンＬ阻害剤［カテＬ］）で１時間前処理した後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間刺激した。グラフは、３−８の独立した実験からの平均値±ＳＥＭを示す。ｎｄ；このアッセイの検出限界以下。ｎｓ、有意でない。
【図１Ｅ】図１Ａおよび１Ｂは、ケメリン１４０が、タンパク質分解依存様式でマクロファージによる炎症性メディエータの生産を抑えることを示す。マクロファージまたは活性化マクロファージ由来の上清（１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンγで処理）について、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＥＬＩＳＡのアッセイを使用して、サイトカイン発現を分析した。示された用量の組み換えマウスケメリンまたはデキサメタゾンの存在下または非存在下で、およびプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（１５ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、細胞をインキュベートした。図１Ｃ−マクロファージサイトカインｍＲＮＡレベルの量を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ＩＬ−１０、ＴＧＦβ）によって定量し、ＨＰＲＴに標準化した。図１Ｄ−ＰＭΦを、ケメリン（０．１−１ｐＭ）±百日咳毒素（ＰＴＸ；２００ｎｇ／ｍｌ）で前処理し、その後、ＬＰＳ／ＩＦＮγ−負荷に供した。図１Ｅ−ＰＭΦは、１時間ケメリン（１ｐＭ）±ＰＴＸで前処理した後、次に、４時間、８時間または１５時間ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルに対して、＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１；＊，ｐ＜０．０５。ケメリン処理サンプルに対して、＃＃＃，ｐ＜０．００１；＃＃，ｐ＜０．０１；＃，ｐ＜０．０５。図１Ｆ−腹膜マクロファージ（ＰＭΦ）は、ケメリン（１ｐＭ）、ケメリン（１ｐＭ）＋プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン［ロイ］、Ｅ−６４、ペファブロック［ペファ］、ペプスタチンＡ［ペプＡ］、カルペプチン［カル］、カテプシンＳ阻害剤［カテＳ］、カテプシンＬ阻害剤［カテＬ］）で１時間前処理した後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間刺激した。グラフは、３−８の独立した実験からの平均値±ＳＥＭを示す。ｎｄ；このアッセイの検出限界以下。ｎｓ、有意でない。
【図１Ｆ】図１Ａおよび１Ｂは、ケメリン１４０が、タンパク質分解依存様式でマクロファージによる炎症性メディエータの生産を抑えることを示す。マクロファージまたは活性化マクロファージ由来の上清（１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンγで処理）について、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＥＬＩＳＡのアッセイを使用して、サイトカイン発現を分析した。示された用量の組み換えマウスケメリンまたはデキサメタゾンの存在下または非存在下で、およびプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（１５ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、細胞をインキュベートした。図１Ｃ−マクロファージサイトカインｍＲＮＡレベルの量を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ＩＬ−１０、ＴＧＦβ）によって定量し、ＨＰＲＴに標準化した。図１Ｄ−ＰＭΦを、ケメリン（０．１−１ｐＭ）±百日咳毒素（ＰＴＸ；２００ｎｇ／ｍｌ）で前処理し、その後、ＬＰＳ／ＩＦＮγ−負荷に供した。図１Ｅ−ＰＭΦは、１時間ケメリン（１ｐＭ）±ＰＴＸで前処理した後、次に、４時間、８時間または１５時間ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルに対して、＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１；＊，ｐ＜０．０５。ケメリン処理サンプルに対して、＃＃＃，ｐ＜０．００１；＃＃，ｐ＜０．０１；＃，ｐ＜０．０５。図１Ｆ−腹膜マクロファージ（ＰＭΦ）は、ケメリン（１ｐＭ）、ケメリン（１ｐＭ）＋プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン［ロイ］、Ｅ−６４、ペファブロック［ペファ］、ペプスタチンＡ［ペプＡ］、カルペプチン［カル］、カテプシンＳ阻害剤［カテＳ］、カテプシンＬ阻害剤［カテＬ］）で１時間前処理した後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間刺激した。グラフは、３−８の独立した実験からの平均値±ＳＥＭを示す。ｎｄ；このアッセイの検出限界以下。ｎｓ、有意でない。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒト（上の配列）およびマウス（下の配列）のケメリン（Ｔｉｇ２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。ヒト（プロテインデータバンクアクセション番号ＮＰ＿００２８８０）およびマウス（ＮＰ＿０８２１２８）ケメリンのアミノ酸配列は、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒ（http://www.expasy.org/tools/peptidecutter）を使用して整列して分析し、予測されるトリプシン切断サイト（黒い垂線）を得た。太字および灰色の全長配列は、プレプロケメリンの配列である（ヒトについて配列番号３３およびマウスについて配列番号３６）。Ｎ末端アミノ酸の灰色を除去した配列は、プロケメリン配列（ヒトについて配列番号３２およびマウスについて配列番号３５）である。Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸の灰色を除去した太字の配列は、ケメリンの配列である（ヒトについて配列番号３１およびマウスについて配列番号３４）。
【００７９】
Ｃ末端ペプチドＣ１１ｍ（配列番号１）、Ｃ１３ｍ（配列番号２）、Ｃ１５ｍ（配列番号３）およびＣ１７ｍ（配列番号４）の配列も示される。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ケメリンのＣ端末部に由来するペプチドが、マクロファージにより活性化されたプロ炎症性メディエータ産生を抑えることを示す。図中のペプチドＣ１３、Ｃ１５およびＣ１７とは、それぞれ、上においてＣ１３ｍ、Ｃ１５ｍおよびＣ１７ｍと示されるペプチドである。
【図３】図３−ケメリンペプチドは、ケメリン１４０と比較して、マクロファージ走化特性をほとんど示さない。図中のペプチドＣ１１、Ｃ１３、Ｃ１５およびＣ１７は、それぞれ、上にてＣ１１ｍ、Ｃ１３ｍ、Ｃ１５ｍおよびＣ１７ｍと記載されるペプチドを意味する。
【図４】図４Ａ−Ｈは、ケメリン、ケメリンペプチドおよびケメリン処理した上清に仲介される化学走性を示す。３０分の百日咳毒素による前処理（ＰＴＸ；２００ｎｇ／ｍｌ）を行うまたは行わないＰＭΦ（０．４×１０６）を、４時間にわたり、修飾したボイデンチャンバーのボトムウェルにおいて、化学遊走物質（図４Ａ；ｒｍケメリン、図４Ｂ；Ｃ１５、図４Ｃ；Ｃ１１、図４Ｄ；Ｃ１３、図４Ｅ；Ｃ１９、図４Ｆ；Ｃ６、図４Ｇ；Ｃ８）の方へ移動させた。図４Ｈ−ＰＭΦ（７．５ｘ１０５）は、４時間にわたり、修飾したボイデンチャンバーのボトムウェルにおいて、未処理のマクロファージおよびＬＰＳ／ＩＦＮγ±ケメリンまたはＣ１５で処理したマクロファージからの条件培地の方へ移動させた。グラフは、それぞれの投与群の平均遊走指数±ＳＥＭ（ｎ＝４つの独立した実験）を示す。ＰＭΦ＋ＰＴＸについて、＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１；＊，ｐ＜０．０５（スチューデントのt−検定）。図中のペプチドＣ１１、Ｃ１３、Ｃ１５およびＣ１９は、上において、それぞれＣ１１ｍ、Ｃ１３ｍ、Ｃ１５ｍおよびＣ１９ｍとして示されるペプチドである。
【図５】図５−マクロファージが、ケメリン処理マクロファージからの条件培地への化学走性の減少を示したことを表す。図中のペプチドＣ１５およびＣ１７は、上において、それぞれＣ１５ｍおよびＣ１７ｍと示されるペプチドを表す。
【図６】図６−ケメリン１５−マウスが、ザイモサン誘導性腹膜炎を抑制することを示す。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。Ｚはザイモサンを示す。
【図７Ａ】図７Ａ−Ｇ−ケメリン１５は、マウスにおけるザイモサン誘導性腹膜炎を改善することを示す。図７Ａおよび７Ｂ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスは、ｉ．ｐで、ＰＢＳまたはケメリン１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を投与し、１時間後にＰＢＳまたはザイモサンを注入した（１０μｇ、〜２ｘ１０６粒子／空隙）。腹膜滲出細胞は、複数の時点で（図７Ａおよび７Ｂ；５−６マウス／投与）または４時間後に（図７Ｃ−７Ｅ；６−１５マウス／群）、腹膜洗浄によって収集した。図７Ｃ−７Ｅ−洗浄液中の全細胞数を定量し、ＦＡＣＳ分析を使用して細胞内組成（好中球対単核食細胞）を決定した。細胞は、２．４Ｇ２抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩでブロックし、Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび７／４−ＦＩＴＣで染色した。ゲートを２つの集団好中球（Ｎ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）のまわりで構築した。図７Ｅ−代表的ＦＡＣＳプロットは、ザイモサン後４時間におけるそれぞれの投与群を示す。図７Ｆ−腹膜洗浄液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαおよびＫＣならびにＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ−６、ＩＬ１βおよびＭＣＰ−１についてアッセイされる。Ｃ１５；ケメリン１５、Ｚ；ザイモサン。ザイモサン処理動物に関して、＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊，Ｐ＜０．０１  ＊＊（スチューデントのｔ−検定）。図７Ｇ−マウス（６−８／投与）に、ｉ．ｐで、１時間前（Ｃ１５前治療）または２時間後（Ｃ１５後処理）の何れかに、ザイモサン（１０μｇ）とＣ１５（８ｐｇ）またはＰＢＳとを投与した。腹膜洗浄を、ザイモサン負荷後４時間に行った。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図７Ｂ】図７Ａ−Ｇ−ケメリン１５は、マウスにおけるザイモサン誘導性腹膜炎を改善することを示す。図７Ａおよび７Ｂ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスは、ｉ．ｐで、ＰＢＳまたはケメリン１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を投与し、１時間後にＰＢＳまたはザイモサンを注入した（１０μｇ、〜２ｘ１０６粒子／空隙）。腹膜滲出細胞は、複数の時点で（図７Ａおよび７Ｂ；５−６マウス／投与）または４時間後に（図７Ｃ−７Ｅ；６−１５マウス／群）、腹膜洗浄によって収集した。図７Ｃ−７Ｅ−洗浄液中の全細胞数を定量し、ＦＡＣＳ分析を使用して細胞内組成（好中球対単核食細胞）を決定した。細胞は、２．４Ｇ２抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩでブロックし、Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび７／４−ＦＩＴＣで染色した。ゲートを２つの集団好中球（Ｎ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）のまわりで構築した。図７Ｅ−代表的ＦＡＣＳプロットは、ザイモサン後４時間におけるそれぞれの投与群を示す。図７Ｆ−腹膜洗浄液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαおよびＫＣならびにＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ−６、ＩＬ１βおよびＭＣＰ−１についてアッセイされる。Ｃ１５；ケメリン１５、Ｚ；ザイモサン。ザイモサン処理動物に関して、＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊，Ｐ＜０．０１  ＊＊（スチューデントのｔ−検定）。図７Ｇ−マウス（６−８／投与）に、ｉ．ｐで、１時間前（Ｃ１５前治療）または２時間後（Ｃ１５後処理）の何れかに、ザイモサン（１０μｇ）とＣ１５（８ｐｇ）またはＰＢＳとを投与した。腹膜洗浄を、ザイモサン負荷後４時間に行った。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図７Ｃ】図７Ａ−Ｇ−ケメリン１５は、マウスにおけるザイモサン誘導性腹膜炎を改善することを示す。図７Ａおよび７Ｂ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスは、ｉ．ｐで、ＰＢＳまたはケメリン１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を投与し、１時間後にＰＢＳまたはザイモサンを注入した（１０μｇ、〜２ｘ１０６粒子／空隙）。腹膜滲出細胞は、複数の時点で（図７Ａおよび７Ｂ；５−６マウス／投与）または４時間後に（図７Ｃ−７Ｅ；６−１５マウス／群）、腹膜洗浄によって収集した。図７Ｃ−７Ｅ−洗浄液中の全細胞数を定量し、ＦＡＣＳ分析を使用して細胞内組成（好中球対単核食細胞）を決定した。細胞は、２．４Ｇ２抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩでブロックし、Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび７／４−ＦＩＴＣで染色した。ゲートを２つの集団好中球（Ｎ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）のまわりで構築した。図７Ｅ−代表的ＦＡＣＳプロットは、ザイモサン後４時間におけるそれぞれの投与群を示す。図７Ｆ−腹膜洗浄液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαおよびＫＣならびにＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ−６、ＩＬ１βおよびＭＣＰ−１についてアッセイされる。Ｃ１５；ケメリン１５、Ｚ；ザイモサン。ザイモサン処理動物に関して、＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊，Ｐ＜０．０１  ＊＊（スチューデントのｔ−検定）。図７Ｇ−マウス（６−８／投与）に、ｉ．ｐで、１時間前（Ｃ１５前治療）または２時間後（Ｃ１５後処理）の何れかに、ザイモサン（１０μｇ）とＣ１５（８ｐｇ）またはＰＢＳとを投与した。腹膜洗浄を、ザイモサン負荷後４時間に行った。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図７Ｄ】図７Ａ−Ｇ−ケメリン１５は、マウスにおけるザイモサン誘導性腹膜炎を改善することを示す。図７Ａおよび７Ｂ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスは、ｉ．ｐで、ＰＢＳまたはケメリン１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を投与し、１時間後にＰＢＳまたはザイモサンを注入した（１０μｇ、〜２ｘ１０６粒子／空隙）。腹膜滲出細胞は、複数の時点で（図７Ａおよび７Ｂ；５−６マウス／投与）または４時間後に（図７Ｃ−７Ｅ；６−１５マウス／群）、腹膜洗浄によって収集した。図７Ｃ−７Ｅ−洗浄液中の全細胞数を定量し、ＦＡＣＳ分析を使用して細胞内組成（好中球対単核食細胞）を決定した。細胞は、２．４Ｇ２抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩでブロックし、Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび７／４−ＦＩＴＣで染色した。ゲートを２つの集団好中球（Ｎ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）のまわりで構築した。図７Ｅ−代表的ＦＡＣＳプロットは、ザイモサン後４時間におけるそれぞれの投与群を示す。図７Ｆ−腹膜洗浄液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαおよびＫＣならびにＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ−６、ＩＬ１βおよびＭＣＰ−１についてアッセイされる。Ｃ１５；ケメリン１５、Ｚ；ザイモサン。ザイモサン処理動物に関して、＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊，Ｐ＜０．０１  ＊＊（スチューデントのｔ−検定）。図７Ｇ−マウス（６−８／投与）に、ｉ．ｐで、１時間前（Ｃ１５前治療）または２時間後（Ｃ１５後処理）の何れかに、ザイモサン（１０μｇ）とＣ１５（８ｐｇ）またはＰＢＳとを投与した。腹膜洗浄を、ザイモサン負荷後４時間に行った。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図７Ｅ】図７Ａ−Ｇ−ケメリン１５は、マウスにおけるザイモサン誘導性腹膜炎を改善することを示す。図７Ａおよび７Ｂ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスは、ｉ．ｐで、ＰＢＳまたはケメリン１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を投与し、１時間後にＰＢＳまたはザイモサンを注入した（１０μｇ、〜２ｘ１０６粒子／空隙）。腹膜滲出細胞は、複数の時点で（図７Ａおよび７Ｂ；５−６マウス／投与）または４時間後に（図７Ｃ−７Ｅ；６−１５マウス／群）、腹膜洗浄によって収集した。図７Ｃ−７Ｅ−洗浄液中の全細胞数を定量し、ＦＡＣＳ分析を使用して細胞内組成（好中球対単核食細胞）を決定した。細胞は、２．４Ｇ２抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩでブロックし、Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび７／４−ＦＩＴＣで染色した。ゲートを２つの集団好中球（Ｎ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）のまわりで構築した。図７Ｅ−代表的ＦＡＣＳプロットは、ザイモサン後４時間におけるそれぞれの投与群を示す。図７Ｆ−腹膜洗浄液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαおよびＫＣならびにＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ−６、ＩＬ１βおよびＭＣＰ−１についてアッセイされる。Ｃ１５；ケメリン１５、Ｚ；ザイモサン。ザイモサン処理動物に関して、＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊，Ｐ＜０．０１  ＊＊（スチューデントのｔ−検定）。図７Ｇ−マウス（６−８／投与）に、ｉ．ｐで、１時間前（Ｃ１５前治療）または２時間後（Ｃ１５後処理）の何れかに、ザイモサン（１０μｇ）とＣ１５（８ｐｇ）またはＰＢＳとを投与した。腹膜洗浄を、ザイモサン負荷後４時間に行った。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図７Ｆ】図７Ａ−Ｇ−ケメリン１５は、マウスにおけるザイモサン誘導性腹膜炎を改善することを示す。図７Ａおよび７Ｂ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスは、ｉ．ｐで、ＰＢＳまたはケメリン１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を投与し、１時間後にＰＢＳまたはザイモサンを注入した（１０μｇ、〜２ｘ１０６粒子／空隙）。腹膜滲出細胞は、複数の時点で（図７Ａおよび７Ｂ；５−６マウス／投与）または４時間後に（図７Ｃ−７Ｅ；６−１５マウス／群）、腹膜洗浄によって収集した。図７Ｃ−７Ｅ−洗浄液中の全細胞数を定量し、ＦＡＣＳ分析を使用して細胞内組成（好中球対単核食細胞）を決定した。細胞は、２．４Ｇ２抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩでブロックし、Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび７／４−ＦＩＴＣで染色した。ゲートを２つの集団好中球（Ｎ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）のまわりで構築した。図７Ｅ−代表的ＦＡＣＳプロットは、ザイモサン後４時間におけるそれぞれの投与群を示す。図７Ｆ−腹膜洗浄液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαおよびＫＣならびにＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ−６、ＩＬ１βおよびＭＣＰ−１についてアッセイされる。Ｃ１５；ケメリン１５、Ｚ；ザイモサン。ザイモサン処理動物に関して、＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊，Ｐ＜０．０１  ＊＊（スチューデントのｔ−検定）。図７Ｇ−マウス（６−８／投与）に、ｉ．ｐで、１時間前（Ｃ１５前治療）または２時間後（Ｃ１５後処理）の何れかに、ザイモサン（１０μｇ）とＣ１５（８ｐｇ）またはＰＢＳとを投与した。腹膜洗浄を、ザイモサン負荷後４時間に行った。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図７Ｇ】図７Ａ−Ｇ−ケメリン１５は、マウスにおけるザイモサン誘導性腹膜炎を改善することを示す。図７Ａおよび７Ｂ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスは、ｉ．ｐで、ＰＢＳまたはケメリン１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を投与し、１時間後にＰＢＳまたはザイモサンを注入した（１０μｇ、〜２ｘ１０６粒子／空隙）。腹膜滲出細胞は、複数の時点で（図７Ａおよび７Ｂ；５−６マウス／投与）または４時間後に（図７Ｃ−７Ｅ；６−１５マウス／群）、腹膜洗浄によって収集した。図７Ｃ−７Ｅ−洗浄液中の全細胞数を定量し、ＦＡＣＳ分析を使用して細胞内組成（好中球対単核食細胞）を決定した。細胞は、２．４Ｇ２抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩでブロックし、Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥおよび７／４−ＦＩＴＣで染色した。ゲートを２つの集団好中球（Ｎ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）のまわりで構築した。図７Ｅ−代表的ＦＡＣＳプロットは、ザイモサン後４時間におけるそれぞれの投与群を示す。図７Ｆ−腹膜洗浄液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαおよびＫＣならびにＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ−６、ＩＬ１βおよびＭＣＰ−１についてアッセイされる。Ｃ１５；ケメリン１５、Ｚ；ザイモサン。ザイモサン処理動物に関して、＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊，Ｐ＜０．０１  ＊＊（スチューデントのｔ−検定）。図７Ｇ−マウス（６−８／投与）に、ｉ．ｐで、１時間前（Ｃ１５前治療）または２時間後（Ｃ１５後処理）の何れかに、ザイモサン（１０μｇ）とＣ１５（８ｐｇ）またはＰＢＳとを投与した。腹膜洗浄を、ザイモサン負荷後４時間に行った。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図８】図８Ａ−Ｄ−抗ケメリン抗体はケメリン種を中和し、腹膜の炎症を悪化させることを示す。図８Ａ−ＰＭΦは、マクロファージ化学走性アッセイ（図７に詳述するように行なった）に使用し、抗ｒｍケメリン抗体またはコントロールＩｇＧの存在下または非存在下でランテス、ケメリンまたはＣ１５に向けて移動させた。グラフは、それぞれの投与群の平均遊走指数±ＳＥＭを示す（ｎ＝４つの独立した実験）。化学遊走物質について、＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１；＊，ｐ＜０．０５。図８Ｂ−ＰＭΦは、抗ｒｍケメリン抗体またはコントロールＩｇＧの存在下または非存在下で、１ｐＭのＣ１５または１ｐＭのケメリンで１時間前処理し、その後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間刺激した。１６時間後のマクロファージ上清におけるランテス±ＳＥＭの平均発現を、ＥＬＩＳＡで決定した（ｎ＝４独立した実験）。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルについて、＊＊，Ｐ＜０．０１；＊，Ｐ＜０．０５。図８Ｃおよび８Ｄ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに、ＰＢＳ、抗ｒｍケメリン抗体（１００ｎｇ／マウス）またはコントロールＩｇＧ（１００ｎｇ／マウス）をｉ．ｐで投与し、１時間後、ＰＢＳまたはザイモサン（１０μｇ／空隙）を注入した。腹膜滲出細胞は、ザイモサン注入から４時間および２４時間後、腹膜洗浄によって収集し、図７に概説されるように処理した。Ｚ；ザイモサン、ＣｈＡＢ；抗ｒｍケメリン抗体。ザイモサン負荷マウスについて、＊＊，Ｐ＜０．０１。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図９】図９は、０．３２ｎｇ／ｋｇのＣ１５ｍのみの注入は、好中球またはマクロファージのリクルートメントを誘導しないが、腹膜のＴＮＦαレベルを減少させないことを示す。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図１０】図１０は、修飾ケメリン１３−ヒトペプチドは、マウスマクロファージにおけるランテスおよびＴＮＦα転写発現を抑えることを示す。図中のペプチドｈＣ１３は修飾Ｃ１３ｈペプチドを指す。
【図１１】図１１は、Ｃ１７ｍはＣ１４０誘導性マクロファージ化学走性に影響しないことを示す。図中のペプチドＣ１７は、上にて言及されるペプチドＣ１７ｍを意味する。
【図１２】図１２は、ケメリン１５−マウスおよびケメリン１７−マウスは、ザイモサンで刺激したマウスマクロファージによるＴＮＦα分泌を抑えることを示す。図中のペプチドＣ１５およびＣ１７は、それぞれ上にてＣ１５ｍおよびＣ１７ｍと記述されたペプチドを指す。デキサはデキサメタゾンを指す。
【図１３】図１３は、ケメリン１４０およびケメリン１５−マウスが、真のマクロファージ化学走性を誘導し、ケモキネシスを誘導しないことを実証するチェッカーボード分析である。図中のペプチドＣ１５は、上においてＣ１５ｍとして表されるペプチドを示す。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは、ケメリン１５は、一連のＣ１５およびザイモサンの用量にわたって、ザイモサン腹膜炎における単球および好中球のリクルートメントを抑えることを示す。図１４Ａ−Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウス（５−６動物／投与）に、ＰＢＳまたはＣ１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）をｉ．ｐで投与し、１時間後、ＰＢＳまたはザイモサン用量範囲（１０μｇ−１ｍｇ；Ａ）を注入した。図１４Ｂ−マウス（５−６動物／投与）は、ＰＢＳまたはＣ１５用量範囲をｉ．ｐで投薬（４−４０ｐｇ／マウス）し、１時間後、ＰＢＳまたはザイモサン（１０μｇ；２ｘ１０６粒子／空隙）を注入した。ザイモサン負荷から４時間後、腹膜洗浄によって腹膜滲出細胞を収集した（５−６マウス／群）。図７に記載される通りに、洗浄液中の全細胞数を定量し、ＦＡＣＳ分析を使用して細胞内組成（好中球対単核食細胞）を決定した。Ｃ１５；ケメリン１５、Ｚ；ザイモサン。ザイモサン処理動物について＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊，Ｐ＜０．０１，＊＊；Ｐ＜０．０５  ＊（スチューデントのｔ−検定）。図中のペプチドＣ１５またはケメリン１５は、上にてＣ１５ｍと示されたペプチドを指す。
【図１５】図１５は、相対的認識指標として示される、マクロファージによるザイモサン認識のための蛍光測定を示す。実験は、様々な濃度のＣ１５の存在下または非存在下で行った。データは、４つのプールし、標準化した実験の平均（±ｓ．ｅ．ｍ。）を示す。
【実施例】
【００８０】
本願におけるケメリン１４０またはＣ１４０とは、配列番号３４の１４０アミノ酸マウスケメリンタンパク質（ケメリン１４０−マウス）を意味する。
【００８１】
［ケメリン１４０は、プロテアーゼ阻害剤によって抑制される活性化されたマクロファージに対する抗炎症効果を奏する］
以前の研究において、脱顆粒後に多形核細胞（ＰＭＮ）によって放出されるセリンプロテアーゼが、プロケメリンのＣ末端を切断し、その走化性の可能性を解放することが実証された(Wittamer V et al. J Immunol. Jul 1 2005;175(1):487-493)。しかしながら、ケメリンの更なるタンパク質分解プロセシングによって生産されたペプチドの抗炎症効果は、新規且つ発明性がある。
【００８２】
マウス腹膜マクロファージ（ＰＭΘ、ここではＰＭΦとも言及される）を以下の条件で培養した：未処理；ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間；ケメリン（１ｐＭ）で１時間の前処理の後、ＬＰＳ／ＩＦＮγで１５時間；ロイペプチン（プロテアーゼ阻害剤；１５ｍｇ／ｍｌ）およびケメリン（１ｐＭ）で１時間の後、ＬＰＳ／ＩＦＮγで１５時間；またはデキサメタゾン（ポジティブコントロール；１μＭで１時間の前治療の後、ＬＰＳ／ＩＦＮγで１５時間。
【００８３】
ケメリン＋リポ多糖類／インターフェロン−γ（ＬＰＳ／ＩＦＮγ）で処理したマクロファージ由来の上清についてケモカイン量を分析すると、その結果から、ケメリン処理細胞は、ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルと比較して、ＴＮＦα（７０％）、ＩＬ−１２ｐ４０（５４％）、ランテス（ＣＣＬ５；４０％）、ＩＬ−６（４２％）およびＩＬ−１β（６０％）のレベルが有意に低いことが示された（ｎ＝５；ｐ＜０．００１ 図１Ａおよび１Ｂ）。広域スペクトルのプロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン）がマクロファージに添加された場合に、いずれの抗炎症効果も予防されることから、この抗炎症効果は、広域スペクトルのプロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン）により阻害され、このことは、これらの抗炎症ペプチドの生産における付加的なケメリン切断の重要性を示す（図１Ａおよび図１Ｆ）。
【００８４】
抗ケメリン中和抗体を使用すると、ケメリンの抗炎症効果が除去されることから、これらの効果はケメリン特異的であることも実証された（図８Ｂ）。
【００８５】
図１Ａの棒グラフは、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって決定されるサイトカインの平均発現±ＳＥＭを示す。実験は、それぞれの処理について、三重の測定を行った。異なる群のＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウス由来の細胞を使用する３つの独立した実験からの代表的データが示される。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルに関して、特に規定のない限り、ｐ＜０．００１  ＊＊＊；  ｐ＜０．０１  ＊＊。デキサはデキサメタゾン（１ｍＭ）を意味する。
【００８６】
図１Ｂは、図１Ａに関して上記した結果と同様の結果を示しており、０．１ｐＭ、０．５ｐＭおよび１．０ｐＭの異なる濃度のケメリンの効果を示すデータを付加している。
【００８７】
さらに、図１Ｃは、ケメリンが、抗炎症サイトカインＴＧＦβ（５４％）およびＩＬ−１０（８９％）のｍＲＮＡの発現を誘導したことを示す。
【００８８】
ケメリンの効果は、１ｐＭにおいて観察される応答を最大として用量依存的であり（図１Ｂおよび図１Ｃ）、百日咳毒素感受性であり、このことは、Ｇαｉに関連するＧＰＣＲの関与を示している（図１Ｄ）。
【００８９】
さらに、抗炎症効果は、ＬＰＳ／ＩＦＮγ投与の後に４時間、８時間および１５時間で観察され、全ての時点でＰＴＸによって抑制された（図１Ｅ）。
【００９０】
以前の研究によって、脱顆粒後の顆粒細胞によって放出されるセリンプロテアーゼが、プロケメリンのＣ末端を切断し、その走化性の可能性を解放することが示された(Wittamer, V., et al., (2005), J Immunol 175:487-493)。マウスケメリンが、マウスＭФ活性化によって放出される酵素によってタンパク質分解プロセシングを更に受ける可能性を調べた。図１Ａに関して上で議論したように、ケメリンとロイペプチン（セリンおよびシステインプロテアーゼ阻害剤）との共投与は、その抗炎症効果を抑制した（図１Ａおよび図１Ｆ）。この効果は、Ｅ−６４（システインプロテアーゼ阻害剤）についても実証されたが、酸性プロテアーゼ阻害剤ペプスタチンＡおよびセリンプロテアーゼ阻害剤ペファブロックは、ＭФ活性化のケメリンが介在する抑制に対して何ら効果を発揮しなかった（図１Ｆ）。これらのデータは、ケメリンは、システインプロテアーゼに依存する様式で、ＭФ活性化に阻害作用を及ぼすことを実証する。ケメリン切断に関与する特異的システインプロテアーゼを更に調べるために、カテプシンＬ阻害剤（Ｚ−ＦＦ−ＦＭＫ）、カテプシンＳ阻害剤（Ｚ−ＦＬ−ＣＯＣＨＯ）、およびカルパインＩおよびＩＩ阻害剤、カルペプチンを使用した（図１Ｆ）。ケメリンの抗炎症効果は、カルパインおよびカテプシンＳに依存するが、カテプシンＬに依存しないこともわかった。まとめると、結果は、典型的に活性化されたマウスＭФが、カルパインＩＩおよびカテプシンＳに最も関連するようである親分子の特異的システインプロテアーゼ介在切断により、ケメリンをＭФ活性化の強力なペプチド阻害剤に変換することができることを初めて実証する。
【００９１】
［抗炎症活性を有するＣ末端ケメリンペプチド］
重要な保存残基の指標としてのＥｎｓｅｍｂｌにおける配列アラインメント機能を使用して、１１−２０ａａの一連のペプチドを設計し、Ｃ１１ｍ（Ｐ１４４−Ａ１５４；ＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦ  Ａ配列番号１）、Ｃ１３ｍ（Ｐ１４４−Ｓ１５６；ＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ  配列番号３）、Ｃ１５ｍ（Ａ１４０−Ａ１５４；ＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡ  配列番号４）、Ｃ１７ｍ（Ａ１４０−Ｓ１５６；ＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ  配列番号６）、Ｃ１９（Ａ１３８−Ｓ１５６；ＡＱＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ  配列番号３７）、Ｎ１９（Ｅ２３−Ｋ４１；ＥＬＳＥＴＱＲＲＳＬＱＶＡＬＥＥＦＨＫ  配列番号４４）およびＭ２０（Ｋ８６−Ｋ１０５；ＫＰＥＣＴＩＫＰＮＧＲＲＲＫＣＬＡＣＩＫ  配列番号４５）と名付けた。図２Ａは、これらのペプチドの一部の配列アラインメントを示す。ケメリンペプチド（１ｐＭ−１００ｎＭ）は、記述したプロトコールによるマクロファージ活性化アッセイにて特徴づけられた。
【００９２】
マウスＰＭΘを様々な条件下で培養した：未処理、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間；ケメリンペプチド（１ｐＭ−１００ｎＭの濃度）で１時間前処理、その後ＬＰＳ／ＩＦＮγで１５時間。示される濃度は、両アッセイにおけるそれぞれのペプチドについての最適な効果用量を表す。図２Ｂにおける棒グラフは、ランテスおよびＴＮＦαタンパク質の平均発現±ＳＥＭを示す。実験は、それぞれの処理において三重の測定を行った。異なる群のＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに由来する細胞を使用する５つの独立した実験からの代表的データを示す。ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルについて、ｐ＜０．０１  ＊＊；  ｐ＜０．００１  ＊＊＊。
【００９３】
Ｃ末端ペプチドＣ１３ｍ（１００ｐＭ）、Ｃ１５ｍ（１ｐＭ）およびＣ１７ｍ（１ｐＭ）は、ＬＰＳ／ＩＦＮγ誘導性ランテス分泌（Ｃ１３ｍ−３２％；Ｃ１５ｍ−４１％；Ｃ１７ｍ−４９％）およびＴＮＦα発現（Ｃ１３ｍ−１０％；Ｃ１５ｍ−５６％；Ｃ１７ｍ−６６％、図２Ｂ）を抑制した。Ｃ１５ｍおよびＣ１７ｍは、同じ濃度で使用した場合に、Ｃ１４０と同程度でマクロファージ活性化を阻害した。
【００９４】
同様の結果が表１に示されており、Ｃ末端ペプチドＣ１３およびＣ１９は、最適用量１００ｐＭで、ＬＰＳ／ＩＦＮγ誘導性ランテスおよびＴＮＦα発現を中程度に抑制する（表１）。しかしながら、ケメリン１５（Ｃ１５）は、ケメリンと同様の効果および力価で（最適用量１ｐＭ）、タンパク質分解されたケメリンによって示される抗炎症活性を保持し、サイトカイン発現を抑制した。さらに、Ｃ１１、Ｎ末端ペプチド（Ｎ１９）、途中のペプチド（Ｍ２０）およびコントロールペプチド（スクランブルドＣ１５；Ｃ１５−Ｓ、ＧＬＦＨＤＱＡＧＰＰＡＧＹＥＦ；配列番号３９、および、変異体Ｃ１５；Ｃ１５Ｍ、ＡＧＥＤＰＨＧＹＡＬＰＧＱＡＡ；配列番号４０）は、ＭФ活性化アッセイにおいて、抗炎症活性がなかった。凝析および繊維素溶解のカスケードのプロテアーゼによるプロケメリン切断の際に除去される６ａａ（ＲＡＬＲＴＫ；配列番号４１）および８ａａ（ＦＳＲＡＬＲＴＫ；配列番号４２）ペプチド（それぞれＣ６およびＣ８と名付けられる）が、ＭФ活性化アッセイにおいて、検出可能な抗炎症活性を有さないこともわかった。
【表１】
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【００９５】
表１に関して、ケメリン誘導ペプチドの抗炎症活性−マウスＰＭΦを図１Ｂに記載されるとおりに培養し、１時間のペプチド（０．１ｐＭ−１００ｎＭ）による前処理を行って／行わずに、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）により１５時間負荷した。ペプチドが抗炎症特性を示す場合、ＬＰＳ／ＩＦＮγ誘導性マクロファージ活性化のパーセンテージ阻害は、最適用量で効果を表わす（１ｐＭのケメリンおよびＣ１５または１００ｐＭのＣ１３およびＣ１９）。ペプチド配列は次のとおりである：Ｃ１１（Ｐ１４４−Ａ１５４；ＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡ）、Ｃ１３（Ｐ１４４−Ｓ１５６；ＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ）、Ｃ１５（Ａ１４０−Ａ１５４；ＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡ）、Ｃ１９（Ａ１３８−Ｓ１５６；ＡＱＡＧＥＤＰＨＧＹＦＬＰＧＱＦＡＦＳ；配列番号３７）、Ｎ１９（Ｅ２３−Ｋ４１；ＥＬＳＥＴＱＲＲＳＬＱＶＡＬＥＥＦＨＫ；配列番号４４）およびＭ２０（Ｋ８６−Ｋ１０５；ＫＰＥＣＴＩＫＰＮＧＲＲＲＫＣＬＡＣＩＫ；配列番号４５）。コントロールペプチド：スクランブルドＣ１５（Ｃ１５−Ｓ；ＧＬＦＨＤＱＡＧＰＰＡＧＹＥＦ）および変異体Ｃ１５（Ｃ１５Ｍ；ＡＧＥＤＰＨＧＹＡＬＰＧＱＡＡ；Ｆ１４８Ａ＆Ｆ１５３Ａ）。データは、ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって決定される、４−８の独立した実験からの、典型的に活性化されたマクロファージによるサイトカイン生産の平均パーセンテージ阻害を示す。
【００９６】
［ケメリン１４０は、強力なマクロファージ化学遊走物質であるが、そのＣ末端由来抗炎症ペプチドは異なる。］
改変したボイデンチャンバーアッセイを利用して、Ｃ１４０のマクロファージ化学遊走物質特性を実証した。マウスケメリン１４０は、典型的な正規曲線を示し、１０ｎＭにて最適な化学走性を示し、その後低下し、おそらく次に、化学遊走物質勾配の受容体脱感作またはブレークダウンを示した（図３）。図４Ａでは、百日咳毒素前処理の効果（ＰＴＸ：２００ｎｇ／ｍｌ）を示す付加的データも示される。
【００９７】
ＰＭΘ（０．５×１０６）を、改変ボイデンチャンバーのボトムウェルにおいて、化学遊走物質（ケメリン１４０またはケメリンペプチド）に向けて４時間にわたり移動させた。フィルターを４％ホルマリンで固定し、その後、移動した細胞核をＤＡＰＩで染色して視覚化した。無血清培地（ＳＦＭ）をネガティブコントロールとして使用し、マクロファージ化学遊走物質ランテス（２５ｎｇ／ｍｌ；３ｎＭ）をポジティブコントロールとして使用した。グラフは、それぞれの投与群（ｎ＝５−６）についての、平均遊走指数（化学遊走物質％しきい値領域／ＳＦＭ％しきい値領域）±ＳＥＭを意味する。ＳＦＭ処理ウェルについて、ｐ＜０．００１  ＊＊＊；ｐ＜０．０１  ＊＊；ｐ＜０．０５  ＊。
【００９８】
Ｃ１１ｍ、Ｃ１３ｍおよびＣ１５ｍ（１ｐＭ−１００ｎＭ）は、Ｃ１４０（１ｐＭ−５０ｎＭ）またはポジティブコントロール、ＣＣケモカインランテス（２５ｎｇ／ｍｌ；３ｎＭ）と比較して、走化活性が少ないことが観察された。最大のマクロファージ遊走は、１００ｐＭのＣ１５ｍおよび１０ｎＭのＣ１３ｍおよびＣ１１ｍで観察された。しかしながら、Ｃ１７ｍは、試験した全濃度において、走化活性を示さなかった（０．１ｐＭ−５００ｎＭ；ｎ＝５回の独立した実験）（図３）。この結果は、図４Ｂ−Ｄにおいても見られ、付加的に百日咳毒素前処理（ＰＴＸ：２００ｎｇ／ｍｌ）の効果のデータが示される。図４Ｅに関して、Ｃ１９は、さらに、試験した全濃度で走化活性を示さなかった（０．１ｐＭ−５００ｎＭ；図４Ｅ）。したがって、ケメリン誘導ペプチドは、抗炎症活性を保持するが、ＭФにとって走化活性を示さないと同定され、このことは、治療学的に開発可能な、ケメリンの明確な機能特異的成分の存在を示す。ＭФ抗炎症活性を欠くことがわかっているプロケメリン由来ペプチドＣ６およびＣ８は、さらに、試験した全ての濃度でＭФ遊走を誘導することができなかった（０．１ｐＭ−５００ｎＭ；図４Ｆ−Ｇ）。それ故、データから、主要な走化性種は、切断されたケメリン分子自体またはまだ未確認のペプチドのいずれかであるようである。
【００９９】
［ケメリンおよびケメリン１５が、マクロファージによる化学遊走物質生産の全般的な抑制を誘導することを示す付加的例］
炎症の際の免疫細胞のリクルートメントにおけるＭФ由来の化学遊走物質の十分確立された役割に基づいて(Glabinski, A.R., et al., (1998).Neuroimmunomodulation 5:166-171; Huang, D. J. et al., (2001). J. Exp. Med. 193:713-726)、未処理のＭФ、および、化学走性アッセイにおいてケメリン＋ＬＰＳ／ＩＦＮγ、Ｃ１５＋ＬＰＳ／ＩＦＮγ、およびＬＰＳ／ＩＦＮγ単独で処理したＭФからの条件培地を使用して、ケメリンおよび合成Ｃ末端ペプチド、Ｃ１５によるＭФ活性化の抑制が、更なるＭФリクルートメントにどのように影響するかを調べた（図４Ｈを参照）。未処理ＭФ条件培地自体は、ＭФの走化活性を示さなかった（遊走指数１．０±０．１５）；しかしながら、ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理マクロファージ培地は、ＭФ化学走性にて著しい増加を誘導した（遊走指数９．３±０．４；  図４Ｈ）。更に、ＭФは、ケメリン＋ＬＰＳ／ＩＦＮγおよびＣ１５＋ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理マクロファージからの条件培地に向かう化学走性において、それぞれ４９％および５５％の減少を示した（図４Ｈ）。このことは、条件培地の走化活性が影響を受ける程度まで、ケメリンおよびＣ１５が、広範囲のＭФ由来ＭФ化学遊走物質の一般的な抑制を誘導することを意味する。
【０１００】
さらに二次的な化学走性アッセイは、ケメリン１４０−マウス、ケメリン１５−マウスおよびケメリン１７−マウスで処理したマクロファージからの上清へ向かうマクロファージ化学走性を抑制することを明らかにした。これらの結果は、Ｃ１５ｍおよびＣ１７ｍによる活性化マクロファージの前処理は、マクロファージによって放出される化学遊走物質の量および／または生物活性を減少させ、それゆえ、これらのペプチドが、炎症部位への単球／マクロファージの継続するリクルートメントを著しく低減できることを示す。
【０１０１】
Ｃ１４０＋ＬＰＳ／ＩＦＮγ、Ｃ１５ｍ＋ＬＰＳ／ＩＦＮγ、Ｃ１７ｍ＋ＬＰＳ／ＩＦＮγおよびＬＰＳ／ＩＦＮγ単独で処理したマクロファージ条件培地を第二の化学走性アッセイに使用し、Ｃ１４０およびそのＣ末端ペプチドによるマクロファージ活性化の抑制に関する潜在的な病態生理学の影響を評価した。
【０１０２】
細胞（０．５×１０６）を、４時間にわたり、改変ボイデンチャンバーのボトムウェルにおいて、化学遊走物質（ケメリンペプチド）または条件培地に移動させた。無血清培地（ＳＦＭ）はネガティブコントロールとして使用した。フィルターを４％のホルマリンにおいて固定し、その後、核をＤＡＰＩで染色して視覚化した。棒グラフは、それぞれ投与群について、平均遊走指数（化学遊走物質％しきい値領域／ＳＦＭ％しきい値領域）±ＳＥＭを示す。それぞれのバーは少なくとも三重のウェルを示し、一処理あたり６枚の画像がとられた。特記されない限り、ｐ＜０．００１  ＊＊＊；  ｐ＜０．０１  ＊＊  有意性は、ＬＰＳ／ＩＦＮγ条件培地に関する。ＡＢは抗マウスケメリン抗体を指す。
【０１０３】
図５に示された結果から見ることができるように、マクロファージ条件培地自体は、マクロファージに対して走化活性を示さないが、しかしながら、ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理マクロファージ培地は、マクロファージ化学走性における劇的な増加を誘導した。さらに、マクロファージは、Ｃ１４０＋ＬＰＳ／ＩＦＮγ、Ｃ１５ｍ＋ＬＰＳ／ＩＦＮγおよびＣ１７ｍ＋ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理マクロファージからの条件培地に対する化学走性を減少させ、このことは、Ｃ１４０、Ｃ１５ｍおよびＣ１７ｍの広範囲のマクロファージ化学遊走物質の一般的な抑制を誘導する能力を示す。
【０１０４】
ケメリン処理上清が、ケメリン誘導型走化性タンパク質／ペプチドを保護する可能性を排除するために、上清を、マクロファージ遊走の評価に先立って中和ケメリン抗体とともにインキュベートした。ケメリンは、ケメリン処理上清において、遊走に寄与しないようであった。
【０１０５】
［ケメリン１５−マウスはザイモサン誘導性腹膜炎を抑制する］
腹膜炎症は、急性炎症反応を誘発するザイモサン粒子（酵母菌壁成分）の腹腔内注入によって誘導することができる。ザイモサン誘導性腹膜炎は、マウス腹腔における好中球その後の単球の十分記述された時間依存的蓄積に続く(Lawrence T et al. Nat Rev Immunol. Oct 2002;2(10):787-795参照)。このモデルを、組織の構造および機能の初期の回復並びに好中球および単球の血管外遊走の抑制を伴う炎症の時間的経過を典型的に短くする確立されたメディエーター、リポキシンＡ４およびアネキシン−１のプロ分解（ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）特性を実証するために使用した。文献中で報告された前の実験では、一連の用量のザイモサンＡ粒子（１０μｇ−１ｍｇ）が使用された (Taylor PR et al. Eur J Immunol. Jul 2005;35(7):2163-2174; Arita M et al. J. Biol. Chem. August 11, 2006 2006;281(32):22847-22854)。
【０１０６】
ケメリンの高い走化性の可能性およびタンパク質分解の本来の要求に基づいて、Ｃ末端合成ペプチドケメリン１５を、無菌腹膜炎モデルにおける抗炎症効果のインビボの特徴づけに使用した。これは、Ｃ１５が、走化活性をほとんど欠くものの（図３および図４Ｂ）、タンパク質分解されたケメリンに匹敵する抗炎症効果を発揮するためである（表１）。
【０１０７】
図６に示される結果に関連して、この研究は１０μｇ／マウス（１−２粒子／常在性マクロファージ）を使用した。これは、これがより緊密に病態生理学の用量を表わすと予想されるためである。
【０１０８】
より具体的には、オスＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウス（８−１２週）に対し、０．５ｍｌのＰＢＳまたは０．５ｍｌのケメリン１５−マウス（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を腹膜内に注射し、１時間後、０．５ｍｌのＰＢＳまたはザイモサン（２ｘ１０６粒子／空隙）を注射した。４時間後、動物を殺処分し、腹腔を５ｍｌのＰＢＳ−３ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄した。トリパンブルー排除試験を使用して、前細胞数を得た。細胞内組成（好中球対単核食細胞）の決定のために、細胞を、２．４Ｇ２抗ＦｃｇＲＩＩ／ＩＩＩｍＡＢで５分間ブロックし、ＰＥ複合抗マウスＬｙ−６ＧおよびＦＩＴＣ複合抗マウス７／４ｍＡＢで１０分間染色した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによるＦＡＣＳ分析の前に、１％ホルムアルデヒドで細胞を固定した。ゲートを２つの集団のまわりで構築した：好中球（Ｎ；  ７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ）。Ｃ１５はケメリン１５−マウスを指す。Ｚはザイモサンを指す。ザイモサン処理に関して、ｐ＜０．０１  ＊＊  ；  ｐ＜０．０５  ＊。
【０１０９】
好中球（７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）、単球（７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）および常在性マクロファージ集団（７／４ｌｏｗ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）を、文献の記載に基づいて決定した（Gordon S and Taylor PR Nat Rev Immunol. 2005;5(12):953; Taylor PR et al. Eur J Immunol. Aug 2003;33(8):2090-2097; and Taylor PR et al. Eur J Immunol. Jul 2005;35(7):2163-2174）。
【０１１０】
この研究の結果は、０．３２ｎｇ／ｋｇ（８ｐｇ／マウス）の用量でＣ１５ｍで処理したマウスが、ザイモサンに誘発される単球および好中球リクルートメントを、それぞれ４２％および５２％減少したことを示す（図６）。ＴＮＦαのレベルも、Ｃ１５ｍで処理したマウスにおいて減少した。
【０１１１】
上記の結果をさらに調査した。インビボのＣ１５ペプチドの抗炎症特性を決定するために、４８時間にわたって時間的経過実験を行った。腹膜洗浄液中の好中球（７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および単球（７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）集団を、公表されたプロトコールによるＦＡＣＳ分析によって決定した(Taylor, P.R. et al., (2005). Eur J Immunol 35:2163-2174; Taylor, P.R., (2003). Eur J Immunol 33:2090-2097)。マウス腹腔へのザイモサンの投与は、腹腔への炎症細胞の時間依存的血管外遊走をもたらし、その後、急性炎症反応の典型的なプロファイルを示した（図７Ａ−Ｂ、実線）。好中球は、空隙を浸透する最初の白血球であり、ザイモサン後２時間で検出可能となり、４時間後に好中球増加がピークとなった（１．９５×１０６細胞）。炎症を起こした腹腔への単球流入は、最初に４時間後に検出され（０．６９×１０６細胞）、ザイモサン注入後２４時間でピークに達し（１．２５×１０６細胞）、その後減少した。ザイモサン負荷の１時間前における、８ｐｇ／マウスの用量（ほぼ０．３２ｎｇ／ｋｇ）によるＣ１５の前処理は、ザイモサン負荷マウスの約５０％の大きさで、２時間早く好中球増加のピークに達した（１．２５ｘ１０６から０．６２×１０６細胞への減少；図７Ａ、点線）。Ｃ１５による好中球浸潤の顕著な抑制が２時間（５０％）、４時間（６６％）および２４時間（５０％）にてみられた。１回量８ｐｇのＣ１５ペプチドもまた、全時点において、炎症を起こした空隙における腹膜単球の数の減少に有効であった（６０％を超える抑制が見られた、４時間（６３％）、８時間（６１％）および４８時間（６４％）、図７Ｂ、点線）。単球浸潤の速度は、ザイモサン注入後２−４時間において最も高く（０．５１ｘ１０６／ｈ）、Ｃ１５の投与は、炎症を起こした空隙への流入速度を減少した（０．１８ｘ１０６／ｈ）。ザイモサン負荷に先立つ単一量のＣ１５ペプチドは、それゆえ、実験の４８時間にわたり、ザイモサン誘導性腹膜炎症に対する顕著な保護を提供した。
【０１１２】
時間的経過実験は、Ｃ１５の抗炎症活性の確認のための適切なポイントとして、ザイモサン後４時間の時点を同定した。この研究では、単一用量のＣ１５は、ザイモサン誘発好中球および単球リクルートメントにおける用量依存的な減少をもたらしたものの（最大８ｐｇ／マウスＣ１５（ほぼ０．３２ｎｇ／ｋｇ；図７Ｃ−Ｅおよび１６Ａ−Ｂ））、、顕著な抗炎症効果は、４ｐｇ／マウスと同程度に低い用量が見られた（ほぼ０．１６ｎｇ／ｋｇ；  図１４Ｂ）。ザイモサン負荷の１時間前にＣ１５を投与する場合、好中球数は、１．９ｘ１０６から０．７８×１０６まで減少し（６３％の減少；図７Ｃ）、単球レベルは、０．６９×１０６から０．３０×１０６に減少した（６２％の減少；図７Ｄ、４時間の時点の代表的なＦＡＣＳプロットが、図７Ｅに示される）。Ｃ１５投与は、４時間で、腹膜洗浄液におけるプロ炎症性サイトカインの発現をさらに著しく減少させた：ＴＮＦα（５１％）、ＩＬ−１β（６７％）、ＩＬ−６（６７％）、ＭＣＰ−１（５９％）およびＫＣ（３８％）（図７Ｆ）。インビトロ抗炎症活性を欠くコントロールペプチドＣ１５−ＳおよびＣ１５−Ｍもまた（表１）、インビボでＣ１５と同じ用量および時間で投与された場合、単球および好中球レベルで判断して保護性でないことがわかった（図７Ｃ−Ｄ）。同じ用量のＣ１５がザイモサン注入後２時間で与えられた場合、単球（０．６９×１０６から０．４２×１０６細胞；４２％の減少）および好中球リクルートメント（１．９×１０６から０．８３×１０６細胞；６０％の減少）の顕著な抑制がザイモサン後４時間においてもみられた（図７Ｇ）。このことは、Ｃ１５は、既に確立している炎症性状態において、好中球および単球リクルートメントを減少できることを実証し、Ｃ１５／Ｃ１５−誘導体が、炎症性病理をターゲットとする魅力的なファルマコフォアを表わす可能性があることも示唆する。
【０１１３】
［内因性ケメリン種の遮断は腹膜の炎症を悪化させる］
４時間または２４時間のザイモサン負荷の１時間前に、中和ポリクローナル抗ｒｍケメリン抗体（ＣｈＡｂ）またはコントロールＩｇＧをｉ．ｐでマウスに注入することで、ケメリンおよびケメリン由来ペプチドの潜在的な内因性の役割を調べた。コントロールＩｇＧではなくＣｈＡｂが、インビトロで、Ｃ１５およびケメリンに誘導されるＭФ化学走性および抗炎症効果を阻害することができることが以前にわかっている（図８Ａ−Ｂ）。インビボでは、内因性のケメリン種の中和によって、腹膜の好中球数の６３％の上昇および４時間の時点でコントロールＩｇＧ処理マウスと比較して単球レベルの４５％の増加およびザイモサン注入の２４時間後において腹膜の好中球および単球レベルの１７０％および８６％の増加がもたらされることがわかった（図８Ｃ−Ｄ）。２４時間にわたる腹膜の炎症のこのような悪化は、インビボにおけるケメリン種の重要な内因性の抗炎症性の役割を示唆する。
【０１１４】
［ケメリン１５−マウス単独は、好中球またはマクロファージのリクルートメントを誘導しないが、ＴＮＦαレベルを低下させる］
オスＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウス（８−１２週）の腹膜内に、０．５ｍｌのＰＢＳまたは０．５ｍｌのケメリン１５−マウス（０．３２ｎｇ／ｋｇ）を注入した。４時間後、投与群当たり３匹の動物を犠牲にし、腹腔を５ｍｌのＰＢＳ−３ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄した。トリパンブルー排除試験を使用して、全細胞数を得た。細胞内組成（好中球対単核食細胞）の決定のために、細胞を、２．４Ｇ２抗ＦｃｇＲＩＩ／ＩＩＩｍＡＢで５分間ブロックし、ＰＥ複合抗マウスＬｙ−６ＧおよびＦＩＴＣ複合抗マウス７／４ｍＡＢで１０分間染色した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによるＦＡＣＳ分析の前に、１％ホルムアルデヒドで細胞を固定した。ゲートを２つの集団のまわりで構築した；好中球（Ｎ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）および炎症性単球（Ｍｏ；７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）。Ｃ１５は、ケメリン１５−マウスを意味する。ＰＢＳ処理について、ｐ＜０．０１  ＊＊。Ｎｓは統計的有意差ｐ＞０．０５がないことを意味する。
【０１１５】
図９の結果からわかるように、０．３２ｎｇ／ｋｇのＣ１５ｍは、単球または好中球の遊走を引き起こさない。しかしながら、ＴＮＦαの顕著な減少が観察される。
【０１１６】
マウスにおける無菌の腹膜炎を研究するこのモデルは、実験医学および薬理学で広く使用されており、中程度の組織外傷または感染症により引き起こされる軽度の炎症を表す。結果は、Ｃ１５ｍが治療的抗炎症効果を達成できることを示す。
【０１１７】
［改変ケメリン１３−ヒトは、マウスマクロファージにおけるランテスおよびＴＮＦαの転写発現を抑制する］
マウス腹膜マクロファージ（ＰＭΘ）を、様々な条件下で培養した：未処理、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１５時間、改変ケメリン１３−ヒト（１ｎＭ）で１時間の前処理、その後ＬＰＳ／ＩＦＮγで１５時間。棒グラフは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定し、ハウスキーパー、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＨＰＲＴに対して標準化した、サイトカイン転写の平均発現を示す。実験は、それぞれの処理について三重の測定を行った（ｎ＝１つの独立した実験）。特記しないかぎり、ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理サンプルについてｐ＜０．０１  ＊＊；  ｐ＜０．０５  ＊。改変Ｃ１３ｈペプチドの配列は、ＮＨ２−ＦＨＳＦＹＦＰＧＱＦＡＦＳ−ＣＯＯＨ（配列番号４３）であり、この配列において、Ｃ１３ｈにおけるＮ末端Ｐはアミノ酸Ｆと置換され、それ故、ペプチドは、改変Ｃ１３ｈと言及される。
【０１１８】
図１０の結果から見ることができるように、改変Ｃ１３ｈは、ＴＮＦαおよびランテスの発現を著しく減少した。
【０１１９】
［ケメリン１７−マウスはＣ１４０に誘導されるマクロファージ化学走性に影響しない］
ＢｉｏＧＥＬビーズによる４日の腹膜刺激後に、ＰＭΘをリクルートした。オスＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスの腹腔を５ｍｌのＰＢＳ−２ｍｌのＥＤＴＡで洗浄した。細胞を遠心分離し、０．５％のＢＳＡおよび２５ｍＭのＨｅｐｅｓを添加したＲＰＭＩに再懸濁した。細胞（０．５×１０６）を、４時間にわたり、ボトムウェルにおいて、化学遊走物質（Ｃ１４０、Ｃ１７ｍまたはＣ１７ｍ＋Ｃ１４０）に向けて移動させた。フィルターを４％のホルマリンで固定し、その後、核をＤＡＰＩで染色して視覚化した。無血清培地はネガティブコントロール（−／−）として使用した。細胞は、化学走性アッセイの３０分前に百日咳毒素（ＰＴＸ）で前培養した。図１１における棒グラフは、それぞれの投与群の平均遊走指数±ＳＥＭを示す。棒はそれぞれ、少なくとも三重のウェルを表わし、１つの処理当たり少なくとも３つの写真を撮影した。特記しないかぎり、ＳＦＭ処理ウェルについて、ｐ＜０．００１  ＊＊＊；  ｐ＜０．０１  ＊＊  ；  ｐ＜０．０５  ＊。
【０１２０】
図１１の結果は、Ｃ１７ｍとＣ１４０の共投与は、Ｃ１４０へのマクロファージ遊走に影響しないようであることを示す。
【０１２１】
［ケメリン１５−マウスおよびケメリン１７−マウスは、ザイモサンで刺激されたマウスマクロファージによるＴＮＦα分泌を抑制する］
ＰＭΘを様々な条件の下で培養した：未処理；ザイモサンで１５時間；ケメリン（１ｐＭ）１時間の前処理＋ザイモサンで１５時間。棒グラフは、ＥＬＩＳＡ±ＳＥＭによって決定されるＴＮＦαの平均発現を示す。実験は、それぞれの処理について三重の測定を行った。異なるドナーからの細胞を使用する３つの独立した実験からの代表的データを図１２に示す。ザイモサン処理サンプルについて、ｐ＜０．００１  ＊＊＊；  ｐ＜０．０１  ＊＊。デキサはデキサメタゾン（１ｍＭ）を指し、ｎｄは、検出下限値（０．２５ｎｇ／ｍｌ）より下であることを指す。
【０１２２】
示されるように、Ｃ１５ｍ（１ｐＭ）およびＣ１７ｍ（１ｐＭ）の処理は、ザイモサン誘導性ＴＮＦ発現を抑制した（Ｃ１５ｍ；２１％、Ｃ１７ｍ；３０％）。それ故、Ｃ１５ｍおよびＣ１７ｍは、細菌（ＬＰＳ）および酵母（ザイモサンＡ）の両方によって誘導されるマクロファージ活性化を抑える。
【０１２３】
［チェッカーボード分析は、ケメリン１４０およびケメリン１５−マウスはマクロファージ化学走性を誘導し、ケモキネシスを誘導しないことを実証する］
チェッカーボード分析は、化学走性とケモキネシスとの間の区別を可能にする。化学走性は、下部ウェルにおけるより高い濃度の化学遊走物質に向かう遊走によって示される。ケモキネシスは、非方向性の細胞運動の増大に関与し、濃度勾配の存在にかかわらず生じる。チェッカーボード分析は、Ｃ１４０（１０−５００ｐＭ）またはＣ１５ｍ（１０−１０００ｐＭ）で細胞をプレインキュベートし、それぞれ下部ウェルにおいて、それらをＣ１４０（１０−１０００ｐＭ）またはＣ１５ｍ（１０−１０００ｐＭ）の方へ移動させて濃度のチェッカーボードを形成することで行った。
【０１２４】
より具体的には、ＢｉｏＧＥＬビーズによる４日の腹膜刺激後に、ＰＭΘをリクルートした。オスＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスの腹腔を５ｍｌのＰＢＳ−２ｍｌのＥＤＴＡで洗浄した。細胞を遠心分離し、０．５％のＢＳＡおよび２５ｍＭのＨｅｐｅｓを添加したＲＰＭＩに再懸濁した。細胞（０．５×１０６）を、化学走性アッセイの３０分前にＣ１４０またはＣ１５ｍでインキュベートし、その後、４時間にわたり、ボトムウェルで化学遊走物質に向けて移動させた。フィルターを４％のホルマリンで固定し、その後、核をＤＡＰＩで染色して視覚化した。無血清培地（ＳＦＭ）をネガティブコントロール（−／−）として使用し、ＣＣケモカインランテスを、ポジティブコントロール（２５ｎｇ／ｍｌ）として使用した。図１３における棒グラフは、それぞれの投与群の平均遊走指数±ＳＥＭを示す。棒はそれぞれに少なくとも三重のウェルを表わし、１つの処理当たり少なくとも３つの写真を撮影した。ＳＦＭ処理ウェルについて、ｐ＜０．００１  ＊＊＊。
【０１２５】
ボイデンチャンバーの下部ウェルへの遊走は、より高い濃度の化学遊走物質がそこに置かれた場合にのみ生じ、フィルターの上部の側に置かれた場合に生じないため、Ｃ１４０およびＣ１５ｍは、ケモキネシスではなく真の化学走性を誘発することがわかった。
【０１２６】
Ｃ１５ｍは、マクロファージ化学走性Ｃ１４０のはるかに弱い誘導物であることが示される。
【０１２７】
［Ｃ１５はザイモサンのマクロファージ食作用を誘導する］
マクロファージによるザイモサンのインビトロの認識のために、腹膜滲出細胞は、４日前にＢｉｏｇｅｌビーズ（２％ｗ／ｖ）で腹膜内を処理したマウスから、氷冷した２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳによる洗浄液によって単離した。マクロファージを、２４ウェルプレートに、Ｏｐｔｉｍｅｍ培地で１ウェル当たり２．５ｘ１０５細胞の密度でプレーティングした。細胞を培地で３回洗浄したあと、認識アッセイにおいて、０．１ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭまたは１ｎＭのいずれかのケメリン１５の存在下、１０：１のマクロファージ／粒子比で、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ザイモサン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。ベヒクル＝ケメリン１５を含まないコントロールサンプル。ＦＩＴＣ−ザイモサン取り込みを、ＦＡＣＳ分析の後に行い、相対的認識指標、すなわち、ザイモサンを取り込む％細胞の比ｘ幾何平均Ｃ１５処理マクロファージ／ベヒクルで処理したマクロファージの幾何平均の比として表現する。
【０１２８】
図１５の結果は、ケメリン１５が、ザイモサンのマクロファージ食作用を誘導することを示す。マクロファージ食作用の誘導は、ケメリン１５が１０ｐＭの濃度のときにもっとも大きい。これらの結果は、ケメリンペプチドが、アポトーシス性細胞、細胞残屑、病原体および病原体生成物のマクロファージ食作用を増加させることにより、創傷修復を促進する可能性があることを実証する。
【０１２９】
［考察］
複数のメディエータが、急性炎症の初期の事象を調整することが知られている。例えば、脂質由来エイコサノイド、サイトカインおよびケモカインは、血管変化および炎症細胞リクルートメントを調節する。ＴＮＦαおよびＩＬ−１γを含むプロ炎症性サイトカインは、内皮細胞におけるシグナル経路を活性化し、接着分子発現のアップレギュレーションをもたらし、循環する白血球の捕獲を促進する。上に示された結果は、ケメリン１４０に由来するＣ末端ペプチドが、炎症反応のすべての成分を抑制できることを示す。結果は、さらに、ケメリン１４０に由来するＣ末端ペプチドが、ケモカインレベルを低下させ、内毒素ショックのための療法として使用できたことを示す。
【０１３０】
この研究の中で使用したペプチドは、すべてケメリン由来であり、非常に高い力価（１０−１２Ｍ）を示し、このことは、これらのメディエータが、補体由来ケモタキシン、Ｃ５ａ  ｄｅｓ−ａｒｇ（１０−１２Ｍ）、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ；１０−１１Ｍ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４；１０−１１Ｍ）、ＴＮＦα（１０−１１Ｍ）、ＬＰＳ（１０−１５Ｍ）およびＩＬ−１（１０−１４Ｍ）のランクに加わることを確かなものとする。出願人は、１０−１１Ｍ−１０−１５Ｍで生理的な効果を示すことが実証された医薬を知らない。確かに、デキサメタゾンは、インビトロでミクロモルの範囲の濃度で一般に投与され、ザイモサン誘導性腹膜炎モデルにおいて、３０μｇ／マウス（１．２ｍｇ／ｋｇ）で、単球および好中球流入の５０％のダウンレギュレーションを達成する。ケメリン１５−マウスは、単球および好中球リクルートメントを、３０ｇのデキサメタゾンと同様の程度にダウンレギュレートした。ケメリン１５−マウスは、８ｐｇ／マウスの用量（０．３２ｎｇ／ｋｇ）で、この炎症のマウスモデルにおいて等価な抗炎症効果をもたらす。
【０１３１】
第２の化学走性アッセイは、マクロファージ活性化アッセイからの上清の走化性の可能性の定量を可能とし、培地の走化性の特性に対するケメリン介在ケモカイン抑制の効果の決定を可能にする。これらの結果の分析から、ＬＰＳ／ＩＦＮγ単独と比較して、ケメリン＋ＬＰＳ／ＩＦＮγ処理マクロファージからの上清へのマクロファージ遊走の減少が明らかとなり、広範囲のマクロファージ化学遊走物質の一般的な抑制が示唆される。示された例は、Ｃ１４０と比較した、ケメリン由来抗炎症ペプチドの限られた現存しない化学遊走物質の特性を実証する。
【０１３２】
結論として、結果から、ケメリンのＣ末端ペプチドは、インビトロおよびインビボで、非常に強力な抗炎症特性を発揮することが示される。
【０１３３】
［材料および方法］
［動物］
全ての動物実験は、局所的な倫理承認および英国内務省規則に基づいて行った(Guidance on the Operation of Animals, Scientific Procedures Act, 1986)。
【０１３４】
［抗体および試薬］
抗ヒトケメリン、抗マウスケメリンＡＢ、ｈケメリン１３７（配列番号３１、組み換えＧｌｕ２１−Ｓｅｒ１５７としてＲａｎｄＤから入手可能）、ｍケメリン１４０（配列番号３４）、抗ｍランテス捕獲ＡＢ、抗ｍランテス検出ＡＢ、ｍランテス、ｍＴＮＦα、抗ｍＴＮＦα捕獲ＡＢ、抗ｍＴＮＦα検出ＡＢは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ケメリンペプチド（Ｃ１１ｍ、Ｃ１３ｍ、Ｃ１３ｈ、Ｃ１５ｍ、Ｃ１７ｍ）は、生合成によって合成した(www.biosyn.com)。デキサメタゾン、リポ多糖類（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ロイペプチンはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）はＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。ＯＰＤ錠剤はＤａｋｏｃｙｔｏｍａｔａから入手し、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＳｔｒｅｐＡｖ−ＨＲＰ希釈緩衝液はＥｎｄｏｇｅｎから購入した。Ｌｕｍｉｎｅｘ６−ｐｌｅｘキット（ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα、ＩＬ−１０）はＢｉｏ−ｒａｄから提供され、Ｂｉｏ−ｒａｄバイオアナライザーおよびＸソフトウェアを使用して分析した。
【０１３５】
［マクロファージ活性化の阻害−マクロファージ活性化アッセイ］
無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１ｍｌの２％のＢｉｏＧＥＬポリアクリルアミドビーズを、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの腹膜内に（ｉｐ）注入した。ＢｉｏＧＥＬのｉｐ投与の４日後、マウスを、内務省ガイドラインに従うＣＯ２方法によって犠牲にした。腹腔を１０ｍｌの無菌のＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄し、ＢｉｏＧＥＬに誘起／誘発された細胞浸潤物を採取した。収集した細胞の懸濁液を、４℃、１０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、２ｍＭグルタミン、５０ユニット／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した６ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地に懸濁した。マクロファージは、チュルク液による５−１０分間の氷上でのインキュベートの後、血球計算器を使用して定量した。細胞懸濁液（２ｍｌ；１．５ｘ１０６／ウェル）を、６ウェル組織培養プレート（直径３５ｍｍ：Ｃｏｓｔａｒ，ＵＫ）にプレーティングし、３７℃で２時間、５％のＣＯ２を含む加湿した大気中で接着させ、接着によりマクロファージ集団を単離した。これは、サイトスピン、メチレンブルーおよびエオシンによる細胞の染色および細胞形態学に基づく計測によって評価すると、９５％を超える純度を与えた。非付着細胞（主として顆粒細胞）を破棄し、ウェルを無菌ＰＢＳで３回洗浄して、弱く付着している細胞または死細胞を除去した。マクロファージ活性化の潜在的な抑制を評価し、それによって、プロ炎症性メディエータの発現の減少を評価するために、マクロファージ（１．５ｘ１０６細胞／ウェル）を、ケメリンペプチド（Ｃ１１ｍ、Ｃ１３ｍ、Ｃ１５ｍ、Ｃ１７ｍ；１０−１２−１０−８Ｍ）またはポジティブコントロール（デキサメタゾン；１μＭ）と共に１時間プレインキュベートし、その後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）を１５時間負荷した。タンパク質分解におけるＰＴＸ感受性および依存性を決定するために、細胞を、ＰＴＸ（２００ｎｇ／ｍｌ）またはロイペプチン（１５μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。付加的な細胞をペプチド単独で処理した。上清を採集し、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびＬｕｍｉｎｅｘアッセイで使用するまで−２０℃で保存した。細胞を溶解し、ＴＲＩＺＯＬ法により全ＲＮＡの抽出を行った。ライセートを、説明書に従うＲＮＡ抽出（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙミニプレップキット）まで−８０℃で保存した。
【０１３６】
［ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘによる、分泌されたタンパク質の検出］
ランテス、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）およびＣＣＬ９の細胞上清中の濃度をＥＬＩＳＡで評価した。ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１（単球化学遊走物質タンパク質−１）およびＩＬ−６レベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスビーズアッセイ（Ｂｉｏ−ｒａｄ６プレックスアッセイ）で決定した。ＥＬＩＳＡの検出下限値は、０．１−０．５ｎｇ／ｍｌであり、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイでは、１０−５０ｐｇ／ｍｌであった。
【０１３７】
［ＲＮＡ作製およびＲＴ−ＰＣＲ］
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを使用して全ＲＮＡを抽出し、逆転写し、Ｓｙｂｒ−Ｇｒｅｅｎ法を用いてｑＲＴ−ＰＣＲに供した。データは２−ΔΔＣＴ法を使用して分析した(Livak, K.J. & Schmittgen T.D. (2001), Methods 25:402-408)。
【０１３８】
［化学走性アッセイ］
細胞遊走はトランスウェル膜（ＣｈｅｍｏＴＸ、直径６ｍｍ、孔径８μｍ）を使用して評価した。簡潔には、ＢｉｏＧＥＬに誘発された細胞を採取し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓおよび０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＲＰＭＩを用いて、トランスウェル膜にプレーティングした（２５０，０００細胞／膜）。細胞を、ケメリンペプチド（１ｐＭ−１００ｎＭ）に向けて４時間移動させた。細胞をトランスウェル膜に置く前に、百日咳毒素（ＰＴＸ、２００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間細胞をプレインキュベートすることで、Ｇタンパク質共役受容体を介した信号伝達を遮断した。膜の下側に移動した細胞を固定し（３％ホルムアルデヒド）、ＤＡＰＩで染色した。共焦点顕微鏡下、遊走を、ＤＡＰＩ染色した核のピクセル数の合計として定量した（１つの処理当たり、２つの写真／膜および最小で３つの複製ウェル）。画像はＭｅｔａｍｏｒｐｈオフラインソフトウェアを使用して分析し、移動した細胞によって占領されたパーセンテージしきい領域（ＴＡ）を決定した。遊走の指標を、無血清培地ＴＡで処理ＴＡを割ることにより得た。第二の化学走性アッセイのために、ＣｈｅｍｏＴｘ（３ｍｍの直径、８μｍ孔）の膜を、５０，０００細胞／膜で使用した。
【０１３９】
［マウス腹膜炎］
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、５００μのケメリン１５−マウス（０．３２ｎｇ／ｋｇ）またはベヒクル単独（無菌ＰＢＳ）をｉ．ｐ．で投与し、その１時間後、１０μｇザイモサンＡを５００μｌでｉ．ｐ．投与した。４時間後、人道的に犠牲にした後に、５ｍｌの無菌ＰＢＳ−３ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて腹膜洗浄することで、腹膜滲出を採集した。無細胞洗浄液をＥＬＩＳＡでの使用のために取得し、滲出細胞を、後述する分析のために準備した。
【０１４０】
［鑑別血球計算およびＦＡＣＳ分析］
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、５００μｌのケメリン１５（０．３２ｎｇ／ｋｇ）またはベヒクル（ＰＢＳ）をｉ．ｐ．投与し、その１時間後、１０μｇザイモサンＡを５００μｌでｉ．ｐ．投与した。２時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間後、人道的に犠牲にした。洗浄細胞の一部を、全数および鑑別血球計算の測定のために準備した。細胞内組成（ＰＭＮ対単核細胞）の決定のために、細胞を抗マウス２．４２Ｇ  ＦｃμＩＩ／ＩＩＩ（０．５μｇ／０．１ｘ１０６細胞）で１０分間ブロックし、ＦＩＴＣ複合抗マウス７／４およびＰＥ複合抗マウスＬｙ−６Ｇ（０．５μｇ／０．５ｘ１０６細胞；クローンｒｍＣ５−３およびＲＢ６−８Ｃ５、それぞれＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）で染色した（１０分）。細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフロー血球計上で分析した。それぞれのサンプルのために、最低１０，０００の事象を得た。ゲートを３つの集団のまわりで構築した：好中球（７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ）、単球（７／４ｈｉｇｈ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）および常在性マクロファージ（７／４ｌｏｗ、Ｌｙ−６Ｇｌｏｗ）。それぞれの集団における事象の合計のパーセンテージを測定した。さらに、ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイで使用するために、無細胞洗浄液を回収した。
【０１４１】
［統計］
スチューデントのｔ−検定および一元配置ＡＮＯＶＡを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。
【図１Ａ】
2014237663.tif 000004
【図１Ｂ】
2014237663.tif 000005
【図１Ｃ】
2014237663.tif 000006
【図１Ｄ】
2014237663.tif 000007
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
2014237663.tif 000009
【図２Ａ】
2014237663.tif 000010
【図２Ｂ】
2014237663.tif 000011
【図３】
2014237663.tif 000012
【図４】
2014237663.tif 000013
【図５】
2014237663.tif 000014
【図６】
2014237663.tif 000015
【図７Ａ】
2014237663.tif 000016
【図７Ｂ】
2014237663.tif 000017
【図７Ｃ】
2014237663.tif 000018
【図７Ｄ】
2014237663.tif 000019
【図７Ｅ】
2014237663.tif 000020
【図７Ｆ】
2014237663.tif 000021
【図７Ｇ】
2014237663.tif 000022
【図８】
2014237663.tif 000023
【図９】
2014237663.tif 000024
【図１０】
2014237663.tif 000025
【図１１】
2014237663.tif 000026
【図１２】
2014237663.tif 000027
【図１３】
2014237663.tif 000028
【図１４】
2014237663.tif 000029
【図１５】
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【配列表】
2014237663000001.app
【外国語明細書】
2014237663000001.pdf