(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病性腎症の将来の発症リスクを反映する新たなバイオマーカーを特定し、当該バイオマーカーを利用した一連の技術を提供する。【解決手段】糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出することもできる。該評価方法を利用した物質のスクリーニング方法、並びに、該マーカー物質を指標とした糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法も提供される。【選択図】図１
2014167477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（１）〜（４）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の物質の評価方法。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
【請求項３】
糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
【請求項４】
前記基準値は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項５】
前記糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項６】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項７】
前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項８】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項９】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の物質の評価方法。
【請求項１０】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の物質の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の物質の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする物質評価用キット。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の物質評価用キット。
【請求項１４】
糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の物質評価用キット。
【請求項１５】
被験動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項１６】
下記（１）〜（４）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１５に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
【請求項１７】
被験動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
【請求項１８】
被験動物は、ヒトであることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
【請求項１９】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
【請求項２０】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
【請求項２１】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項２０に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
【請求項２２】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キット。
【請求項２４】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項２３に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は物質の評価方法及び評価用キット、物質のスクリーニング方法、並びに、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法及び判定用キットに関し、さらに詳細には、被験物質を摂取させた動物の体液中における特定のマーカー物質の濃度を指標として被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する物質の評価方法、当該評価方法に用いるための物質の物質評価用キット、当該評価方法を利用した物質のスクリーニング方法、被験動物から採取した体液における特定のマーカー物質の濃度を指標として糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定する糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法、並びに、当該判定方法に用いるための糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる糖尿病、肥満、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発現、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
【０００３】
糖尿病は、インスリンの作用不足による高血糖が引き起こす複合疾患である。特に、インスリン非依存型糖尿病（インスリン抵抗性糖尿病、２型糖尿病）は、環境因子が引き金になって発病するとされ、過食や肥満が大きな原因の一つである。例えば、肥満のために膵臓のインスリン分泌量が激増した結果、逆に膵臓が疲労してインスリン分泌量が減少し、結局インスリンの作用不足となり高血糖となる。あるいは、脂肪の増加によってインスリン受容体が減少し、その結果、インスリンの作用不足となり高血糖となる。逆に、インスリンの作用不足から生まれる余剰のグルコースが脂肪となって蓄えられ、さらに肥満が進むこととなる。このように、肥満と糖尿病はその発症メカニズムにおいて密接に関係している。
【０００４】
糖尿病は、他の疾患との合併症を引き起こすことが多い。糖尿病合併症の例としては、網膜症、腎症、神経障害が挙げられる。この中で、腎症（糖尿病性腎症）は、高血糖状態が続くことによって糸球体の毛細血管が損傷を受け、腎臓のろ過機能が侵されることによって発症する。糖尿病性腎症が発症すると、ろ過機能の不調によってタンパク質が尿中に排出されるネフローゼ症候群や、血中に老廃物がたまる尿毒症が引き起こされ、最終的には腎不全となり、永続的な人工透析が必要となることがある。このように、糖尿病性腎症は、人間のＱｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）に重大な影響を及ぼすおそれがある疾患である。
【０００５】
糖尿病の進行及びその合併症の発症に、酸化ストレスが深く関与していることが多くの研究により明らかにされている（非特許文献１）。例えば、糖尿病モデルマウスに抗酸化剤の１つであるアスタキサンチンを投与すると、尿中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）量が減少し、同時に腎糸球体領域におけるメザンギウム細胞の増殖が抑制された旨が報告されている（非特許文献２）。なお、８−ＯＨｄＧは酸化ストレスにより尿中に多く排出される物質である。また、メザンギウム細胞は腎症を起こしている腎臓の糸球体領域において異常な増殖がみられ、腎機能に障害を与えるものである。
【０００６】
このように、糖尿病性腎症は発症初期に自覚症状がない上に進行すると治療困難となるため、予防をすることが特に重要となる。例えば、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを把握する技術や、当該発症リスクを低減する効果のある物質をスクリーニングする技術の開発が求められる。そのための方策の１つとして、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを反映するバイオマーカー（発症リスクマーカー、予防マーカー）を特定し、当該バイオマーカーを指標として発症リスクの診断や物質のスクリーニングを行うことが挙げられる。関連する従来技術としては、例えば特許文献１に、ニューロカルシンデルタ遺伝子の発現量を指標として糖尿病性腎症の診断等を行う技術が開示されている。また特許文献２には、特定の糖鎖を有する血清ＩｇＧを指標とする同様の技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１２９９０５号公報
【特許文献２】特開２００４−６７７３２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ジャネット・シュルツ・ジョハンセン（Jeanette Schultz Johansen）ら，カルディオバスキュラー・ダイアベトロジー（Cardiovascular Diabetology），第４巻，２００４年，ｐ５−１５
【非特許文献２】内藤ら，バイオファクターズ（BioFactors），第２０巻，２００４年，ｐ４９−５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし特許文献１に開示された技術では遺伝子発現量を指標とするので、検査試料から核酸を抽出する必要がある。例えば、血液を検査試料とする場合には核酸原となる白血球等を単離する必要があり操作が煩雑である。また特許文献２に開示された技術では糖鎖を指標とするが、糖鎖構造の解析はタンパク質や核酸の解析ほど容易ではない。さらに、従来技術におけるマーカーの糖尿病性腎症の発症リスクマーカーや予防マーカーとしての有用性については必ずしも明確でなく、更なる検討が必要と考えられる。このような背景の下、糖尿病性腎症の発症リスクを反映できる新規のバイオマーカーが求められている。
【００１０】
本発明の目的は、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを反映する新たなバイオマーカーを特定し、当該バイオマーカーを利用した一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、糖尿病性腎症を発症するモデル動物の体液を質量分析計によるプロテオーム解析により網羅的に解析し、糖尿病性腎症の発症リスクを反映するマーカー物質を検索した。その結果、発症リスクマーカーとなり得る複数のタンパク質を見出した。そして、当該マーカー物質を指標とした糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価・スクリーニング技術、並びに、当該マーカー物質を指標とした糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定する技術等を確立し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下の通りである。
【００１２】
本発明の１つの様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００１３】
本様相の物質の評価方法は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ａ１）〜（Ａ８）の８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また本様相の物質の評価方法では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。なお本様相における「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１４】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約２３４０」、「約７９３０」、「約１３７００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約２３４０は概ね２３４０±０．２％、約７９３０は概ね７９３０±０．２％、約１３７００は概ね１３７００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより低値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより高値を示す。
【００１５】
好ましくは、下記（１）〜（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
【００１６】
アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ−アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相の物質の評価方法によればマーカー物質（Ａ５）〜（Ａ８）の解析が容易である。
【００１７】
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱落（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１８】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００１９】
本様相の物質の評価方法は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ｂ１）〜（Ｂ４）の４種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また本発明の物質の評価方法では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。特に、アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ−アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本様相においても「動物」にはマウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００２０】
マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）はいずれも主に血液中に存在する。被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより低値を示し、（Ｂ２）、及び（Ｂ３）の濃度はより高値を示す。
【００２１】
本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱落も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００２２】
好ましくは、前記基準値は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度である。
【００２３】
この好ましい様相によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
【００２４】
好ましくは、前記糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物である。
【００２５】
この好ましい様相の物質の評価方法では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物として、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物を用いる。この好ましい様相によれば、動物の飼育が容易となり、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、きわめて容易に評価することができる。なお当該動物の例としては、２型糖尿病発症型モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス等）が挙げられる。
【００２６】
好ましくは、前記体液は、血液である。
【００２７】
この好ましい様相によれば、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２８】
好ましくは、前記被験物質は、食品素材である。
【００２９】
この好ましい様相によれば、機能性食品の開発を目的として、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００３０】
好ましくは、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。
【００３１】
この好ましい様相の物質の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本様相の物質の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００３２】
好ましくは、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている。
【００３３】
この好ましい様相の物質の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００３４】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【００３５】
この好ましい様相の物質の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００３６】
本発明のさらに他の様相は、本発明の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３７】
本様相は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ａ１）〜（Ａ８）及び（Ｂ１）〜（Ｂ４）から選択されるマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）及び（Ｂ１）〜（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被験物質が食品素材の場合には、糖尿病性腎症の改善効果を有する機能性食品又は将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３８】
本発明のさらに他の様相は、本発明の物質の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする物質評価用キットである。
【００３９】
本様相の物質の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００４０】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【００４１】
好ましくは、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用される。
【００４２】
本発明のさらに他の様相は、被験動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００４３】
本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法は、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定するものである。上述したように、マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相では糖尿病自体を広く検出するマーカーではなく、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することができる。また本様相では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより高値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより低値を示す。
【００４４】
ここで「将来の発症リスクを判定する」とは、疾病を発症していない時点において、将来、その疾病に罹患する可能性（危険性）の有無、又はその可能性（危険性）の程度を判定することをいう。
【００４５】
好ましくは、下記（１）〜（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
【００４６】
アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ−アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法によればマーカー物質（Ａ５）〜（Ａ８）の解析が容易である。
【００４７】
本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱落（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００４８】
本発明のさらに他の様相は、被験動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００４９】
本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法は、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定するものである。上述したように、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相では糖尿病自体を広く検出するマーカーではなく、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することができる。また本様相では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。特に、アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ−アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。
【００５０】
なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより高値を示し、（Ｂ２）、及び（Ｂ３）の濃度はより低値を示す。
【００５１】
本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱落も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００５２】
好ましくは、被験動物がヒトである。なお被験者としては、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者、糖尿病予備軍に属する者、健常者など、特に限定はない。
【００５３】
好ましくは、前記体液が血液である。
好ましくは、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。
好ましくは、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【００５４】
本発明のさらに他の様相は、本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットである。
【００５５】
本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。この好ましい様相によれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００５６】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【００５７】
本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。この好ましい様相によれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００５８】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【発明の効果】
【００５９】
本発明の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また、体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。
【００６０】
本発明の物質の評価用キットによれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果をきわめて簡便に評価することができる。
【００６１】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００６２】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法によれば、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することができる。
【００６３】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットによれば、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクをきわめて簡便に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】質量／電荷比が２３３９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２】質量／電荷比が２７８１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３】質量／電荷比が３３４２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図４】質量／電荷比が５８１５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図５】質量／電荷比が７９２５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図６】質量／電荷比が９０７２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図７】質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が１３７３４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】マーカー物質（Ａ５）の精製過程で行った２次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図１０】マーカー物質（Ａ５）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１１】マーカー物質（Ａ６）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１２】マーカー物質（Ａ６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１３】マーカー物質（Ａ７）の精製過程で行った２次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図１４】マーカー物質（Ａ７）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１５】マーカー物質（Ａ８）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１６】マーカー物質（Ａ８）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本発明の物質の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００６６】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。なお、（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、糖尿病性腎症を発症している状態又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高い状態でより高値を示すものであるので、被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより低値を示す。一方、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、糖尿病性腎症を発症している状態又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高い状態でより低値を示すものであるので、被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより高値を示す。
【００６７】
ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３、マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチンと同定される。すなわち、ある実施形態では、下記（１）〜（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
【００６８】
本発明の物質の評価方法の他の様相では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００６９】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱落（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱落、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００７０】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。例えば、補体Ｃ３はＣ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄの各ドメインを有するので、「補体Ｃ３又はその修飾体」には、各ドメインからなる補体Ｃ３のタンパク質断片（例えば、補体Ｃ３ａ）が含まれる。
【００７１】
複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。例えば、トランスサイレチンは４個のサブユニットからなる複合体タンパク質であるので、「トランスサイレチン又はその修飾体」にはトランスサイレチンのサブユニットが含まれる。
【００７２】
本発明の物質の評価方法では、上記（Ａ１）〜（Ａ８）並びに（Ｂ１）〜（Ｂ４）の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００７３】
本発明の物質の評価方法の好ましい実施形態では、上記基準値として、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を摂取させた上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００７４】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、糖尿病性腎症を発症していない動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが低い動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）糖尿病性腎症を発症していない動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが低い動物に、普通食又は被験物質を摂取させる群（正常値を示す群）、（２）糖尿病性腎症を発症している動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させる群（異常値を示す群）、及び、（３）糖尿病性腎症を発症している動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させる群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００７５】
さらに、基準値として、（４）糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質を摂取させる群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。
【００７６】
「糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質」の例としては、アスタキサンチンが挙げられる。アスタキサンチンはカロテノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。アスタキサンチン以外の物質でも、抗酸化作用を有する物質であれば前記既知物質となり得る。
【００７７】
「糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。また、「糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」としては、糖尿病性腎症の自然発症モデル動物、あるいはトランスジェニックやジーンターゲッティングによる遺伝子操作モデル動物が好ましく用いられる。当該動物の具体例としては、ｄｂ／ｄｂマウス等の２型糖尿病発症型モデルマウスが挙げられる。ｄｂ／ｄｂマウスは通常飼育で糖尿病性腎症を発症するので、飼育実験を容易に行うことができ、特に好適である。
【００７８】
なお、ｄｂ／ｄｂマウスを通常飼育するといずれ糖尿病性腎症を発症するが、尿中８−ＯＨｄＧを指標とした検討によると、その発症は飼育１２週目ごろから検出可能となることがわかっている（前記非特許文献２）。よって、飼育１２週目以前、例えば飼育１０週目のｄｂ／ｄｂマウスは糖尿病性腎症の発症直前段階にあるといえる。本発明の物質の評価方法で用いるマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）は、飼育１０週目のｄｂ／ｄｂマウスの体液中に存在し、糖尿病性腎症の発症直前段階にないマウス（例えば、正常マウス）と比較してその体液中の濃度に有意差を示す。したがって、本発明においてｄｂ／ｄｂマウスを用いる場合には、例えば、飼育１０週目ごろの体液を測定試料として各マーカー物質の濃度を測定すればよい。
【００７９】
一方、特定の物質を摂取すると糖尿病性腎症を発症するような自然発症モデル動物を用いることもできる。例えば、ストレプトゾトシンを投与して糖尿病性腎症を誘発する系が知られており、動物に被験物質とストレプトゾトシンとを同時摂取させることにより、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
【００８０】
本発明の物質の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００８１】
本発明の物質の評価方法における被検物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００８２】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の物質の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００８３】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法は２つの様相を含む。１つの様相では、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定する。なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより高値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより低値を示す。
【００８４】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法の他の様相では、被験動物の体液中における上記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定する。糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより高値を示し、（Ｂ２）及び（Ｂ７）の濃度はより低値を示す。
【００８５】
好ましい実施形態では、被験動物はヒトである。なお被験者としては、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者、糖尿病予備軍に属する者、健常者など、特に限定はない。なお、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者に本発明を適用すれば、その判定結果を元にその後の生活習慣指導を正確に行うことができる。
【００８６】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法で使用する基準値は、例えば、糖尿病を発症していない健常人における上記マーカー物質の体液中の濃度データを収集し、その濃度値（すなわち健常値）を元に設定することができる。なお、基準値を段階的に複数設定し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを定量的に判定することも可能である。
【００８７】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法では、上記（Ａ１）〜（Ａ８）並びに（Ｂ１）〜（Ｂ４）の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００８８】
本発明の物質の評価方法、物質のスクリーニング方法、及び糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００８９】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００９０】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００９１】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００９２】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００９３】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００９４】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００９５】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【００９６】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００９７】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００９８】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００９９】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【０１００】
本発明の物質の評価方法、物質のスクリーニング方法、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて物質評価用キット、物質スクリーニング用キット、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットを構築することができる。本発明のキットは、上記したマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。好ましい実施形態では、マーカー物質に対する親和性を有する物質が、イオン交換体又は抗体である。例えば、ＣＭ等の弱陽イオン交換体を固定化した基板（弱陽イオン交換基板）、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板（強陰イオン交換基板）を含めたキットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、各マーカー物質の標準品、各種バッファー等を含めてもよい。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【０１０１】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【０１０２】
また本発明により、マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）及び（Ｂ１）〜（Ｂ４）の、糖尿病性腎症に関係する事象、例えば、糖尿病性腎症の発症の有無、糖尿病性腎症の改善状態、糖尿病性腎症の将来の発症リスク、等を検出するためのバイオマーカーとしての使用、も提供される。
【０１０３】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０４】
１．２型糖尿病発症型モデル動物を使った動物実験
２型糖尿病発症型モデル動物としてｄｂ／ｄｂマウス（日本クレア社。以下、単に「腎症発症マウス」と略記することがある。）、正常動物としてｄｂ／ｍマウス（日本クレア社。以下、単に「正常マウス」と略記することがある。）を採用した。また、与える飼料としてＣＥ−２（日本クレア社。以下、単に「通常飼料」と略記する。）と、アスタキサンチン（富士化学工業社）を０．０２％（１０ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有するＣＥ−２（以下、単に「アスタキサンチン含有飼料」と略記する。）を採用した。
【０１０５】
マウスの種類と与える飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定し、飼育を開始した。各群の個体数は５匹以上とした。
第１群：正常マウスを通常飼料で飼育
第２群：腎症発症マウスを通常飼料で飼育
第３群：腎症発症マウスをアスタキサンチン含有飼料で飼育
第４群：正常マウスをアスタキサンチン含有飼料で飼育
すなわち、第１群は糖尿病性腎症を発症しない群、第２群は糖尿病性腎症を発症する群、第３群は糖尿病性腎症の発症が抑制される群、に相当する。第４群はアスタキサンチンの作用検証用の群である。
【０１０６】
６週齢から飼育を開始し、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて糖尿病性腎症が発症し始める飼育期間である１０週目に各群のマウスから血漿を採取し、体液試料とした。これにより、糖尿病性腎症の発症直前段階の体液試料が得られた。
【０１０７】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
採取した各体液試料２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【０１０８】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（４）の条件を指標として８個の候補ピークを選抜した。
【０１０９】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）アスタキサンチン効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【０１１０】
３．マーカー物質（Ａ１）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が２３３９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８６、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０７０であった。
【０１１１】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２３４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ１））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ１）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ１）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２３４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１２】
４．マーカー物質（Ａ２）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が２７８１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００８、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０７０であった。
【０１１３】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２７８０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ２））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ２）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ２）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２７８０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１４】
５．マーカー物質（Ａ３）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が３３４２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４１、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２８であった。
【０１１５】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３３４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ３））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ３）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ３）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３３４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１６】
６．マーカー物質（Ａ４）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５８１５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０８２であった。
【０１１７】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５８２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ４））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ４）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ４）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５８２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１８】
７．マーカー物質（Ａ５）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７９２５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２８、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００７であった。
【０１１９】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７９３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ５））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ５）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ５）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７９３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２０】
８．マーカー物質（Ａ６）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が９０７２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４１、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００４であった。
【０１２１】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９０７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ６））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ６）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ６）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９０７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２２】
９．マーカー物質（Ａ７）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０９６であった。
【０１２３】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ７））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ７）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ７）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２４】
１０．マーカー物質（Ａ８）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３７３４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４であった。
【０１２５】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ８））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ８）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ８）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【実施例２】
【０１２６】
１．マーカー物質（Ａ５）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、及び１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で順に洗浄した後、溶出バッファー（３３．３％ イソプロパノール、１６．７％ アセトニトリル、０．１％ トリフルオロ酢酸）でステップワイズ溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１２７】
分取した画分の一部をＴＣＡ沈澱処理した後、２次元電気泳動を行った（図９）。１次元目にはＧＥヘルスケア社製Immobiline DryStrip pH4-7, 7cmを、２次元目にはＤＲＣ社製ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ２Ｔを用いた。さらに、図９の矢印で示したスポットを切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１０）。
【０１２８】
あらためて同様の２次元電気泳動を行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１０１９．５３」、「１１９３．６８」、及び「１８３１．９６」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１０１９．５３」、「１１９３．６８」、及び「１８３１．９６」のペプチドはそれぞれ配列番号１〜３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。
【０１２９】
【表１】
2014167477.tif 000003
【０１３０】
なお、成熟型のマウス由来アポリポタンパク質Ａ２は、配列番号４で表わされる７８個のアミノ酸からなり、分子量が８７３６、等電点が４．９４、と報告されている。一方、本実施例でアポリポタンパク質Ａ２と同定されたタンパク質の分子量は約７９００、等電点は４．９４であった。このことから、当該タンパク質は配列番号４のアミノ酸番号１（Ｇｌｕ）から７０（Ｌｅｕ)に相当するアポリポタンパク質Ａ２の断片であることが示唆された。当該アポリポタンパク質Ａ２断片のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【０１３１】
２．マーカー物質（Ａ６）の精製と同定
強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。添加時の素通り画分を回収した。
【０１３２】
強陽イオン交換カラムＭｏｎｏＳ ５／５０ ＧＬ（ＧＥヘルスケア社）を前記平衡化バッファーで平衡化した。このカラムに回収画分を添加した。バッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）とバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌ）を用いたグラジエント溶出（バッファーＢ：０％−１５％／２０ＣＶ，１５％−１００％／５ＣＶ，流速：１ｍＬ／分）により、２０ｍＬ付近に溶出されたピークを分取した。このピークに対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１３３】
分取した画分をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲルＤＲＣ ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１１）。分離されたバンド（図１１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１２）。
【０１３４】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は、「７２５．３５」、「８６２．４５」、「９９４．５７」、「１０１８．５５」、「１１０８．５８」、「１２３６．６７」、「１３１２．６３」、及び「１４８２．７４」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「７２５．３５」、「８６２．４５」、「９９４．５７」、「１０１８．５５」、「１１０８．５８」、「１２３６．６７」、「１３１２．６３」、及び「１４８２．７４」のペプチドはそれぞれ配列番号６〜１３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「補体Ｃ３ａ」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。
【０１３５】
【表２】
2014167477.tif 000004
【０１３６】
なお、報告されているマウス由来補体Ｃ３ａのアミノ酸配列は配列番号１４で表される７８個のアミノ酸からなり、分子量が９２２５、等電点が９．４５、と報告されている。一方、本実施例で「補体Ｃ３ａ」と同定されたタンパク質の分子量は約９１００、等電点は９．２７であった。このことから、当該タンパク質は配列番号１４のアミノ酸番号１（Ｓｅｒ）から７７（Ａｌａ）の部分に相当する、補体Ｃ３ａからＣ末端アミノ酸のＡｒｇが欠失したタンパク質「補体Ｃ３ａ  ｄｅｓ  Ａｒｇ」であることが示唆された。「補体Ｃ３ａ  ｄｅｓ  Ａｒｇ」のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【０１３７】
３．マーカー物質（Ａ７）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤＦ（日本ポール社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿３００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を４５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。添加時の素通り画分を回収した。
【０１３８】
分取した画分の一部をアセトン沈澱処理した後、２次元電気泳動を行った（図１３）。１次元目にはＧＥヘルスケア社製Immobiline DryStrip pH6-11, 7cmを、２次元目にはＤＲＣ社製ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔを用いた。さらに、図１３の矢印で示したスポットを切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１４）。
【０１３９】
上記１と同様にして２次元電気泳動による精製、ゲル内消化、及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１１９３．６６」、「１６５７．７９」、及び「１８３１．９７」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１１９３．６６」、「１６５７．７９」、及び「１８３１．９７」のペプチドはそれぞれ配列番号１６〜１８で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「プロ−アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。
【０１４０】
【表３】
2014167477.tif 000005
【０１４１】
なお、マウス由来プロ−アポリポタンパク質Ａ２のアミノ酸配列は配列番号１９のとおりであり、これは、配列番号４に示したアポリポタンパク質Ａ２のＮ末端側に５個のアミノ酸からなるプロペプチドが付加された構造と同じである。
【０１４２】
４．マーカー物質（Ａ８）の精製と同定
強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。洗浄バッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０）でカラムを洗浄し、さらに洗浄バッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０）にてカラムを洗浄した。次に溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ）にてステップワイズ溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１４３】
分取した画分をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲルＤＲＣ ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１５）。分離されたバンド（図１５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１６）。
【０１４４】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１３８２．６３」、「１５１０．７３」、「１５５４．８２」、「２４３８．１７」、「２５１７．２０」、及び「３１２３．４８」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１３８２．６３」、「１５１０．７３」、「１５５４．８２」、「２４３８．１７」、「２５１７．２０」、及び「３１２３．４８」のペプチドはそれぞれ配列番号２０〜２５で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。
【０１４５】
【表４】
2014167477.tif 000006
【０１４６】
なお、報告されているマウス由来トランスサイレチンのアミノ酸配列は配列番号２６に示すとおりである。
【図１】
2014167477.tif 000007
【図２】
2014167477.tif 000008
【図３】
2014167477.tif 000009
【図４】
2014167477.tif 000010
【図５】
2014167477.tif 000011
【図６】
2014167477.tif 000012
【図７】
2014167477.tif 000013
【図８】
2014167477.tif 000014
【図９】
2014167477.tif 000015
【図１０】
2014167477.tif 000016
【図１１】
2014167477.tif 000017
【図１２】
2014167477.tif 000018
【図１３】
2014167477.tif 000019
【図１４】
2014167477.tif 000020
【図１５】
2014167477.tif 000021
【図１６】
2014167477.tif 000022
【配列表】
2014167477000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月30日(2014.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
（マーカー物質）
ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じ、かつ配列番号６〜１３で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
（マーカー物質）
ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じ、かつ補体Ｃ３又はその修飾体であるタンパク質。
【請求項３】
糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
（マーカー物質）
補体Ｃ３又はその修飾体。
【請求項４】
前記基準値は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項５】
前記糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項６】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項７】
前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項８】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
【請求項９】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の物質の評価方法。
【請求項１０】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の物質の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の物質の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする物質評価用キット。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の物質評価用キット。
【請求項１４】
糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の物質評価用キット。
【請求項１５】
被験動物から採取した体液における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法。
（マーカー物質）
ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じ、かつ配列番号６〜１３で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１６】
被験動物から採取した体液における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法。
（マーカー物質）
ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じ、かつ補体Ｃ３又はその修飾体であるタンパク質。
【請求項１７】
被験動物から採取した体液における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法。
（マーカー物質）
補体Ｃ３又はその修飾体。
【請求項１８】
被験動物は、ヒトであることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法。
【請求項１９】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法。
【請求項２０】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法。
【請求項２１】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項２０に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法。
【請求項２２】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出用キット。
【請求項２４】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項２３に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は物質の評価方法及び評価用キット、物質のスクリーニング方法、並びに、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法及び検出用キットに関し、さらに詳細には、被験物質を摂取させた動物の体液中における特定のマーカー物質の濃度を指標として被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する物質の評価方法、当該評価方法に用いるための物質の物質評価用キット、当該評価方法を利用した物質のスクリーニング方法、被験動物から採取した体液における特定のマーカー物質の濃度を指標として糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出する糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法、並びに、当該検出方法に用いるための糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる糖尿病、肥満、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発現、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
【０００３】
糖尿病は、インスリンの作用不足による高血糖が引き起こす複合疾患である。特に、インスリン非依存型糖尿病（インスリン抵抗性糖尿病、２型糖尿病）は、環境因子が引き金になって発病するとされ、過食や肥満が大きな原因の一つである。例えば、肥満のために膵臓のインスリン分泌量が激増した結果、逆に膵臓が疲労してインスリン分泌量が減少し、結局インスリンの作用不足となり高血糖となる。あるいは、脂肪の増加によってインスリン受容体が減少し、その結果、インスリンの作用不足となり高血糖となる。逆に、インスリンの作用不足から生まれる余剰のグルコースが脂肪となって蓄えられ、さらに肥満が進むこととなる。このように、肥満と糖尿病はその発症メカニズムにおいて密接に関係している。
【０００４】
糖尿病は、他の疾患との合併症を引き起こすことが多い。糖尿病合併症の例としては、網膜症、腎症、神経障害が挙げられる。この中で、腎症（糖尿病性腎症）は、高血糖状態が続くことによって糸球体の毛細血管が損傷を受け、腎臓のろ過機能が侵されることによって発症する。糖尿病性腎症が発症すると、ろ過機能の不調によってタンパク質が尿中に排出されるネフローゼ症候群や、血中に老廃物がたまる尿毒症が引き起こされ、最終的には腎不全となり、永続的な人工透析が必要となることがある。このように、糖尿病性腎症は、人間のＱｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）に重大な影響を及ぼすおそれがある疾患である。
【０００５】
糖尿病の進行及びその合併症の発症に、酸化ストレスが深く関与していることが多くの研究により明らかにされている（非特許文献１）。例えば、糖尿病モデルマウスに抗酸化剤の１つであるアスタキサンチンを投与すると、尿中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）量が減少し、同時に腎糸球体領域におけるメザンギウム細胞の増殖が抑制された旨が報告されている（非特許文献２）。なお、８−ＯＨｄＧは酸化ストレスにより尿中に多く排出される物質である。また、メザンギウム細胞は腎症を起こしている腎臓の糸球体領域において異常な増殖がみられ、腎機能に障害を与えるものである。
【０００６】
このように、糖尿病性腎症は発症初期に自覚症状がない上に進行すると治療困難となるため、予防をすることが特に重要となる。例えば、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを把握する技術や、当該発症リスクを低減する効果のある物質をスクリーニングする技術の開発が求められる。そのための方策の１つとして、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを反映するバイオマーカー（発症リスクマーカー、予防マーカー）を特定し、当該バイオマーカーを指標として発症リスクの診断や物質のスクリーニングを行うことが挙げられる。関連する従来技術としては、例えば特許文献１に、ニューロカルシンデルタ遺伝子の発現量を指標として糖尿病性腎症の診断等を行う技術が開示されている。また特許文献２には、特定の糖鎖を有する血清ＩｇＧを指標とする同様の技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１２９９０５号公報
【特許文献２】特開２００４−６７７３２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ジャネット・シュルツ・ジョハンセン（Jeanette Schultz Johansen）ら，カルディオバスキュラー・ダイアベトロジー（Cardiovascular Diabetology），第４巻，２００４年，ｐ５−１５
【非特許文献２】内藤ら，バイオファクターズ（BioFactors），第２０巻，２００４年，ｐ４９−５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし特許文献１に開示された技術では遺伝子発現量を指標とするので、検査試料から核酸を抽出する必要がある。例えば、血液を検査試料とする場合には核酸原となる白血球等を単離する必要があり操作が煩雑である。また特許文献２に開示された技術では糖鎖を指標とするが、糖鎖構造の解析はタンパク質や核酸の解析ほど容易ではない。さらに、従来技術におけるマーカーの糖尿病性腎症の発症リスクマーカーや予防マーカーとしての有用性については必ずしも明確でなく、更なる検討が必要と考えられる。このような背景の下、糖尿病性腎症の発症リスクを反映できる新規のバイオマーカーが求められている。
【００１０】
本発明の目的は、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを反映する新たなバイオマーカーを特定し、当該バイオマーカーを利用した一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、糖尿病性腎症を発症するモデル動物の体液を質量分析計によるプロテオーム解析により網羅的に解析し、糖尿病性腎症の発症リスクを反映するマーカー物質を検索した。その結果、発症リスクマーカーとなり得る複数のタンパク質を見出した。そして、当該マーカー物質を指標とした糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価・スクリーニング技術、並びに、当該マーカー物質を指標とした糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出する技術等を確立し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下の通りである。
【００１２】
本発明に関連する発明の１つの様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００１３】
本様相の物質の評価方法は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ａ１）〜（Ａ８）の８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また本様相の物質の評価方法では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。なお本様相における「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１４】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約２３４０」、「約７９３０」、「約１３７００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約２３４０は概ね２３４０±０．２％、約７９３０は概ね７９３０±０．２％、約１３７００は概ね１３７００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより低値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより高値を示す。
【００１５】
好ましくは、下記（１）〜（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
【００１６】
アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ−アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相の物質の評価方法によればマーカー物質（Ａ５）〜（Ａ８）の解析が容易である。
【００１７】
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱落（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１８】
同様の課題を解決するための本発明に関連する発明の他の様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００１９】
本様相の物質の評価方法は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ｂ１）〜（Ｂ４）の４種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また本発明の物質の評価方法では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。特に、アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ−アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本様相においても「動物」にはマウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００２０】
マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）はいずれも主に血液中に存在する。被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより低値を示し、（Ｂ２）、及び（Ｂ３）の濃度はより高値を示す。
【００２１】
本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱落も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００２２】
本発明の１つの様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（マーカー物質）
ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じ、かつ配列番号６〜１３で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００２３】
本発明の他の様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（マーカー物質）
ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じ、かつ補体Ｃ３又はその修飾体であるタンパク質。
【００２４】
本発明の他の様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（マーカー物質）
補体Ｃ３又はその修飾体。
【００２５】
好ましくは、前記基準値は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度である。
【００２６】
この好ましい様相によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
【００２７】
好ましくは、前記糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物である。
【００２８】
この好ましい様相の物質の評価方法では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物として、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物を用いる。この好ましい様相によれば、動物の飼育が容易となり、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、きわめて容易に評価することができる。なお当該動物の例としては、２型糖尿病発症型モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス等）が挙げられる。
【００２９】
好ましくは、前記体液は、血液である。
【００３０】
この好ましい様相によれば、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００３１】
好ましくは、前記被験物質は、食品素材である。
【００３２】
この好ましい様相によれば、機能性食品の開発を目的として、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００３３】
好ましくは、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。
【００３４】
この好ましい様相の物質の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本様相の物質の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００３５】
好ましくは、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている。
【００３６】
この好ましい様相の物質の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００３７】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【００３８】
この好ましい様相の物質の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００３９】
本発明に関連する発明のさらに他の様相は、上記の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００４０】
本様相は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ａ１）〜（Ａ８）及び（Ｂ１）〜（Ｂ４）から選択されるマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）及び（Ｂ１）〜（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被験物質が食品素材の場合には、糖尿病性腎症の改善効果を有する機能性食品又は将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００４１】
本発明の他の様相は、本発明の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００４２】
本発明のさらに他の様相は、本発明の物質の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする物質評価用キットである。
【００４３】
本様相の物質の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００４４】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【００４５】
好ましくは、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用される。
【００４６】
本発明に関連する発明のさらに他の様相は、被験動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００４７】
本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法は、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出するものである。上述したように、マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相では糖尿病自体を広く検出するマーカーではなく、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することができる。また本様相では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより高値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより低値を示す。
【００４８】
ここで「将来の発症リスクを検出する」とは、疾病を発症していない時点において、将来、その疾病に罹患する可能性（危険性）の有無、又はその可能性（危険性）の程度を検出することをいう。
【００４９】
好ましくは、下記（１）〜（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
【００５０】
アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ−アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法によればマーカー物質（Ａ５）〜（Ａ８）の解析が容易である。
【００５１】
本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱落（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００５２】
本発明に関連する発明のさらに他の様相は、被験動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００５３】
本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法は、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出するものである。上述したように、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相では糖尿病自体を広く検出するマーカーではなく、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することができる。また本様相では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。特に、アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ−アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。
【００５４】
なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより高値を示し、（Ｂ２）、及び（Ｂ３）の濃度はより低値を示す。
【００５５】
本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱落も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００５６】
本発明の他の様相は、被験動物から採取した体液における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法である。
（マーカー物質）
ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じ、かつ配列番号６〜１３で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００５７】
本発明の他の様相は、被験動物から採取した体液における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法である。
（マーカー物質）
ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じ、かつ補体Ｃ３又はその修飾体であるタンパク質。
【００５８】
本発明の他の様相は、被験動物から採取した体液における下記マーカー物質の濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法である。
（マーカー物質）
補体Ｃ３又はその修飾体。
【００５９】
好ましくは、被験動物がヒトである。なお被験者としては、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者、糖尿病予備軍に属する者、健常者など、特に限定はない。
【００６０】
好ましくは、前記体液が血液である。
好ましくは、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。
好ましくは、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【００６１】
本発明のさらに他の様相は、本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出用キットである。
【００６２】
本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。この好ましい様相によれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００６３】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【００６４】
本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。この好ましい様相によれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００６５】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
【発明の効果】
【００６６】
本発明の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また、体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。
【００６７】
本発明の物質の評価用キットによれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果をきわめて簡便に評価することができる。
【００６８】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００６９】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法によれば、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出することができる。
【００７０】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出用キットによれば、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクをきわめて簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】質量／電荷比が２３３９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２】質量／電荷比が２７８１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３】質量／電荷比が３３４２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図４】質量／電荷比が５８１５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図５】質量／電荷比が７９２５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図６】質量／電荷比が９０７２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図７】質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が１３７３４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】マーカー物質（Ａ５）の精製過程で行った２次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図１０】マーカー物質（Ａ５）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１１】マーカー物質（Ａ６）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１２】マーカー物質（Ａ６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１３】マーカー物質（Ａ７）の精製過程で行った２次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図１４】マーカー物質（Ａ７）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１５】マーカー物質（Ａ８）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１６】マーカー物質（Ａ８）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明の物質の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００７３】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。なお、（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、糖尿病性腎症を発症している状態又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高い状態でより高値を示すものであるので、被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより低値を示す。一方、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、糖尿病性腎症を発症している状態又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高い状態でより低値を示すものであるので、被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより高値を示す。
【００７４】
ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３、マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチンと同定される。すなわち、ある実施形態では、下記（１）〜（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
【００７５】
本発明の物質の評価方法の他の様相では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ−アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００７６】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱落（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱落、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００７７】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。例えば、補体Ｃ３はＣ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄの各ドメインを有するので、「補体Ｃ３又はその修飾体」には、各ドメインからなる補体Ｃ３のタンパク質断片（例えば、補体Ｃ３ａ）が含まれる。
【００７８】
複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。例えば、トランスサイレチンは４個のサブユニットからなる複合体タンパク質であるので、「トランスサイレチン又はその修飾体」にはトランスサイレチンのサブユニットが含まれる。
【００７９】
本発明の物質の評価方法では、上記（Ａ１）〜（Ａ８）並びに（Ｂ１）〜（Ｂ４）の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００８０】
本発明の物質の評価方法の好ましい実施形態では、上記基準値として、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を摂取させた上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８１】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、糖尿病性腎症を発症していない動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが低い動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）糖尿病性腎症を発症していない動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが低い動物に、普通食又は被験物質を摂取させる群（正常値を示す群）、（２）糖尿病性腎症を発症している動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させる群（異常値を示す群）、及び、（３）糖尿病性腎症を発症している動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させる群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８２】
さらに、基準値として、（４）糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質を摂取させる群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。
【００８３】
「糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質」の例としては、アスタキサンチンが挙げられる。アスタキサンチンはカロテノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。アスタキサンチン以外の物質でも、抗酸化作用を有する物質であれば前記既知物質となり得る。
【００８４】
「糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。また、「糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」としては、糖尿病性腎症の自然発症モデル動物、あるいはトランスジェニックやジーンターゲッティングによる遺伝子操作モデル動物が好ましく用いられる。当該動物の具体例としては、ｄｂ／ｄｂマウス等の２型糖尿病発症型モデルマウスが挙げられる。ｄｂ／ｄｂマウスは通常飼育で糖尿病性腎症を発症するので、飼育実験を容易に行うことができ、特に好適である。
【００８５】
なお、ｄｂ／ｄｂマウスを通常飼育するといずれ糖尿病性腎症を発症するが、尿中８−ＯＨｄＧを指標とした検討によると、その発症は飼育１２週目ごろから検出可能となることがわかっている（前記非特許文献２）。よって、飼育１２週目以前、例えば飼育１０週目のｄｂ／ｄｂマウスは糖尿病性腎症の発症直前段階にあるといえる。本発明の物質の評価方法で用いるマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）は、飼育１０週目のｄｂ／ｄｂマウスの体液中に存在し、糖尿病性腎症の発症直前段階にないマウス（例えば、正常マウス）と比較してその体液中の濃度に有意差を示す。したがって、本発明においてｄｂ／ｄｂマウスを用いる場合には、例えば、飼育１０週目ごろの体液を測定試料として各マーカー物質の濃度を測定すればよい。
【００８６】
一方、特定の物質を摂取すると糖尿病性腎症を発症するような自然発症モデル動物を用いることもできる。例えば、ストレプトゾトシンを投与して糖尿病性腎症を誘発する系が知られており、動物に被験物質とストレプトゾトシンとを同時摂取させることにより、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
【００８７】
本発明の物質の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００８８】
本発明の物質の評価方法における被検物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００８９】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の物質の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００９０】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法は２つの様相を含む。１つの様相では、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出する。なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより高値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより低値を示す。
【００９１】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法の他の様相では、被験動物の体液中における上記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出する。糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより高値を示し、（Ｂ２）及び（Ｂ７）の濃度はより低値を示す。
【００９２】
好ましい実施形態では、被験動物はヒトである。なお被験者としては、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者、糖尿病予備軍に属する者、健常者など、特に限定はない。なお、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者に本発明を適用すれば、その検出結果を元にその後の生活習慣指導を正確に行うことができる。
【００９３】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法で使用する基準値は、例えば、糖尿病を発症していない健常人における上記マーカー物質の体液中の濃度データを収集し、その濃度値（すなわち健常値）を元に設定することができる。なお、基準値を段階的に複数設定し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを定量的に検出することも可能である。
【００９４】
本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法では、上記（Ａ１）〜（Ａ８）並びに（Ｂ１）〜（Ｂ４）の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００９５】
本発明の物質の評価方法、物質のスクリーニング方法、及び糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００９６】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００９７】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００９８】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００９９】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【０１００】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【０１０１】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【０１０２】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【０１０３】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【０１０４】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【０１０５】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【０１０６】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【０１０７】
本発明の物質の評価方法、物質のスクリーニング方法、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて物質評価用キット、物質スクリーニング用キット、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの検出用キットを構築することができる。本発明のキットは、上記したマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。好ましい実施形態では、マーカー物質に対する親和性を有する物質が、イオン交換体又は抗体である。例えば、ＣＭ等の弱陽イオン交換体を固定化した基板（弱陽イオン交換基板）、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板（強陰イオン交換基板）を含めたキットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、各マーカー物質の標準品、各種バッファー等を含めてもよい。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【０１０８】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【０１０９】
また本発明により、マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ８）及び（Ｂ１）〜（Ｂ４）の、糖尿病性腎症に関係する事象、例えば、糖尿病性腎症の発症の有無、糖尿病性腎症の改善状態、糖尿病性腎症の将来の発症リスク、等を検出するためのバイオマーカーとしての使用、も提供される。
【０１１０】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１１】
１．２型糖尿病発症型モデル動物を使った動物実験
２型糖尿病発症型モデル動物としてｄｂ／ｄｂマウス（日本クレア社。以下、単に「腎症発症マウス」と略記することがある。）、正常動物としてｄｂ／ｍマウス（日本クレア社。以下、単に「正常マウス」と略記することがある。）を採用した。また、与える飼料としてＣＥ−２（日本クレア社。以下、単に「通常飼料」と略記する。）と、アスタキサンチン（富士化学工業社）を０．０２％（１０ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有するＣＥ−２（以下、単に「アスタキサンチン含有飼料」と略記する。）を採用した。
【０１１２】
マウスの種類と与える飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定し、飼育を開始した。各群の個体数は５匹以上とした。
第１群：正常マウスを通常飼料で飼育
第２群：腎症発症マウスを通常飼料で飼育
第３群：腎症発症マウスをアスタキサンチン含有飼料で飼育
第４群：正常マウスをアスタキサンチン含有飼料で飼育
すなわち、第１群は糖尿病性腎症を発症しない群、第２群は糖尿病性腎症を発症する群、第３群は糖尿病性腎症の発症が抑制される群、に相当する。第４群はアスタキサンチンの作用検証用の群である。
【０１１３】
６週齢から飼育を開始し、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて糖尿病性腎症が発症し始める飼育期間である１０週目に各群のマウスから血漿を採取し、体液試料とした。これにより、糖尿病性腎症の発症直前段階の体液試料が得られた。
【０１１４】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
採取した各体液試料２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【０１１５】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（４）の条件を指標として８個の候補ピークを選抜した。
【０１１６】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）アスタキサンチン効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【０１１７】
３．マーカー物質（Ａ１）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が２３３９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８６、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０７０であった。
【０１１８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２３４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ１））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ１）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ１）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２３４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１９】
４．マーカー物質（Ａ２）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が２７８１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００８、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０７０であった。
【０１２０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２７８０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ２））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ２）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ２）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２７８０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２１】
５．マーカー物質（Ａ３）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が３３４２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４１、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２８であった。
【０１２２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３３４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ３））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ３）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ３）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３３４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２３】
６．マーカー物質（Ａ４）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５８１５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０８２であった。
【０１２４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５８２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ４））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ４）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ４）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５８２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２５】
７．マーカー物質（Ａ５）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７９２５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２８、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００７であった。
【０１２６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７９３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ５））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ５）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ５）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７９３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２７】
８．マーカー物質（Ａ６）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が９０７２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４１、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００４であった。
【０１２８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９０７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ６））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ６）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ６）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９０７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２９】
９．マーカー物質（Ａ７）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０９６であった。
【０１３０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ７））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ７）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ７）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３１】
１０．マーカー物質（Ａ８）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３７３４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４であった。
【０１３２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ８））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ８）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ８）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを検出できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【実施例２】
【０１３３】
１．マーカー物質（Ａ５）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、及び１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で順に洗浄した後、溶出バッファー（３３．３％ イソプロパノール、１６．７％ アセトニトリル、０．１％ トリフルオロ酢酸）でステップワイズ溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１３４】
分取した画分の一部をＴＣＡ沈澱処理した後、２次元電気泳動を行った（図９）。１次元目にはＧＥヘルスケア社製Immobiline DryStrip pH4-7, 7cmを、２次元目にはＤＲＣ社製ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ２Ｔを用いた。さらに、図９の矢印で示したスポットを切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１０）。
【０１３５】
あらためて同様の２次元電気泳動を行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１０１９．５３」、「１１９３．６８」、及び「１８３１．９６」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１０１９．５３」、「１１９３．６８」、及び「１８３１．９６」のペプチドはそれぞれ配列番号１〜３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。
【０１３６】
【表１】
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【０１３７】
なお、成熟型のマウス由来アポリポタンパク質Ａ２は、配列番号４で表わされる７８個のアミノ酸からなり、分子量が８７３６、等電点が４．９４、と報告されている。一方、本実施例でアポリポタンパク質Ａ２と同定されたタンパク質の分子量は約７９００、等電点は４．９４であった。このことから、当該タンパク質は配列番号４のアミノ酸番号１（Ｇｌｕ）から７０（Ｌｅｕ)に相当するアポリポタンパク質Ａ２の断片であることが示唆された。当該アポリポタンパク質Ａ２断片のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【０１３８】
２．マーカー物質（Ａ６）の精製と同定
強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。添加時の素通り画分を回収した。
【０１３９】
強陽イオン交換カラムＭｏｎｏＳ ５／５０ ＧＬ（ＧＥヘルスケア社）を前記平衡化バッファーで平衡化した。このカラムに回収画分を添加した。バッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）とバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌ）を用いたグラジエント溶出（バッファーＢ：０％−１５％／２０ＣＶ，１５％−１００％／５ＣＶ，流速：１ｍＬ／分）により、２０ｍＬ付近に溶出されたピークを分取した。このピークに対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１４０】
分取した画分をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲルＤＲＣ ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１１）。分離されたバンド（図１１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１２）。
【０１４１】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は、「７２５．３５」、「８６２．４５」、「９９４．５７」、「１０１８．５５」、「１１０８．５８」、「１２３６．６７」、「１３１２．６３」、及び「１４８２．７４」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「７２５．３５」、「８６２．４５」、「９９４．５７」、「１０１８．５５」、「１１０８．５８」、「１２３６．６７」、「１３１２．６３」、及び「１４８２．７４」のペプチドはそれぞれ配列番号６〜１３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「補体Ｃ３ａ」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。
【０１４２】
【表２】
2014167477.tif 000024
【０１４３】
なお、報告されているマウス由来補体Ｃ３ａのアミノ酸配列は配列番号１４で表される７８個のアミノ酸からなり、分子量が９２２５、等電点が９．４５、と報告されている。一方、本実施例で「補体Ｃ３ａ」と同定されたタンパク質の分子量は約９１００、等電点は９．２７であった。このことから、当該タンパク質は配列番号１４のアミノ酸番号１（Ｓｅｒ）から７７（Ａｌａ）の部分に相当する、補体Ｃ３ａからＣ末端アミノ酸のＡｒｇが欠失したタンパク質「補体Ｃ３ａ  ｄｅｓ  Ａｒｇ」であることが示唆された。「補体Ｃ３ａ  ｄｅｓ  Ａｒｇ」のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【０１４４】
３．マーカー物質（Ａ７）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤＦ（日本ポール社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿３００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を４５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。添加時の素通り画分を回収した。
【０１４５】
分取した画分の一部をアセトン沈澱処理した後、２次元電気泳動を行った（図１３）。１次元目にはＧＥヘルスケア社製Immobiline DryStrip pH6-11, 7cmを、２次元目にはＤＲＣ社製ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔを用いた。さらに、図１３の矢印で示したスポットを切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１４）。
【０１４６】
上記１と同様にして２次元電気泳動による精製、ゲル内消化、及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１１９３．６６」、「１６５７．７９」、及び「１８３１．９７」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１１９３．６６」、「１６５７．７９」、及び「１８３１．９７」のペプチドはそれぞれ配列番号１６〜１８で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「プロ−アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。
【０１４７】
【表３】
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【０１４８】
なお、マウス由来プロ−アポリポタンパク質Ａ２のアミノ酸配列は配列番号１９のとおりであり、これは、配列番号４に示したアポリポタンパク質Ａ２のＮ末端側に５個のアミノ酸からなるプロペプチドが付加された構造と同じである。
【０１４９】
４．マーカー物質（Ａ８）の精製と同定
強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。洗浄バッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０）でカラムを洗浄し、さらに洗浄バッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０）にてカラムを洗浄した。次に溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ）にてステップワイズ溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１５０】
分取した画分をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲルＤＲＣ ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１５）。分離されたバンド（図１５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１６）。
【０１５１】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１３８２．６３」、「１５１０．７３」、「１５５４．８２」、「２４３８．１７」、「２５１７．２０」、及び「３１２３．４８」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１３８２．６３」、「１５１０．７３」、「１５５４．８２」、「２４３８．１７」、「２５１７．２０」、及び「３１２３．４８」のペプチドはそれぞれ配列番号２０〜２５で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。
【０１５２】
【表４】
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【０１５３】
なお、報告されているマウス由来トランスサイレチンのアミノ酸配列は配列番号２６に示すとおりである。